(57)【要約】【課題】十分なクロロエテン類の分解活性を持つ、新規なＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌を提供すること、及び、該微生物を用いた汚染土壌等の汚染物の浄化方法を提供すること。【解決手段】Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１のゲノムとの相同性が高く、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノムとの相同性が低く、且つ、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるｖｃｒＡを有するデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌、及び、該細菌をクロロエテン類を含む汚染物に作用させて該クロロエテン類を脱塩素化することを特徴とする汚染物の浄化方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１のゲノムとの相同性が高く、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノムとの相同性が低く、且つ、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるｖｃｒＡを有することを特徴とするデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌。
【請求項２】
ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター受託番号（ＮＩＴＥ  １１３４）として寄託された微生物群に含まれる細菌である請求項１記載のデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌。
【請求項３】
請求項１または２記載のデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌を含有する微生物群。
【請求項４】
さらに、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ属細菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌及びＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ属細菌からなる群から選ばれる１種以上の細菌を含有する、請求項３に記載の微生物群。
【請求項５】
ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター受託番号（ＮＩＴＥ  １１３４）として寄託された微生物群。
【請求項６】
請求項１または２記載のデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌、又は、請求項３〜５のいずれか一項記載の微生物群を、クロロエテン類を含む汚染物に作用させて該クロロエテン類を脱塩素化することを特徴とする汚染物の浄化方法。
【請求項７】
クロロエテン類の脱塩素化の最終産物がエテンである、請求項６記載の汚染物の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオレメディエーションに利用可能な微生物、及び、該微生物を用いる浄化方法に関し、詳しくはクロロエテン類の脱塩素が可能な微生物、及び、該微生物を用いるクロロエテン類を含有する汚染物の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
土地の土壌や地下水は、天然あるいは人工のさまざまな化学物質により汚染されている場合がある。このような土地の汚染は、その土地を食糧生産のための農地として使用する場合はもちろん、居住や商業利用を企図する場合にも大きな問題となる。
【０００３】
しかし、直接口にする飲食物や、肌に接触する衣類・化粧品・装身具などと異なり、土地の汚染、とくに土壌汚染はあまり関心が払われることなく、過去には化学物質が穴を掘って埋め立て処理されたりする例もあった。
このような土地の汚染の浄化は最近になって大きな問題となっており、それに対して様々な浄化処理方法が提案され実行されてきた。
【０００４】
この土地の浄化方法を大きく分類すると、高温加熱により化学物質を分解したり活性炭に吸着させるなどの物理的処理、化学反応により化学物質を無害化する化学的処理、化学物質を分解する能力を有する微生物を利用する微生物浄化法、そして、化学物質を吸収あるいは吸着する能力を有する植物を利用する植物浄化法の４種に分類することができる。
【０００５】
なかでも、微生物や植物を用いる方法は環境への配慮やコストを抑えることが可能である点で最近注目を集めるところであり、微生物を利用する浄化方法は「バイオレメデーション」、植物を利用する浄化方法は「ファイトレメデーション」とも言われ、さまざまな研究開発が行われており、処理可能な土壌体積が大きいことから、バイオレメデーションの研究開発が活発化している。
【０００６】
バイオレメデーションには２つの技術がある。ひとつは、対象汚染物質の分解に効果を発揮することが予め確認されている微生物を汚染場所に適用する技術であり、バイオオーグメンテーションといわれる。もうひとつは、汚染場所の土着微生物に酸素や栄養源を与えることで、微生物の働きを活性化させ、浄化作用を促す技術であり、バイオスティミュレーションといわれる。
【０００７】
また、バイオレメデーションには２つの工法がある。ひとつは、汚染された土壌や地下水を除去し、別の場所で処理する工法であり、「施設型処理」と言われる。もうひとつは、その場所において汚染された土壌や地下水を浄化する工法であり、「原位置浄化」と呼ばれる。
【０００８】
近年大きな問題となっている汚染物質としてテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、ダイオキシン類、ポリ塩素化ビフェニル類などの有機塩素化合物に代表される有機ハロゲン化合物がある。なかでもテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレンなどのクロロエテン類（揮発性有機ハロゲン化合物）は、呼吸を通して人体への影響が懸念されることから早急な対応が必要とされる場面が多く見られるようになってきている。
【０００９】
この揮発性有機ハロゲン化合物は、土壌に浸透しやすく、地下水脈にまで到達してしまい、広範囲に汚染が拡大しやすい。このような揮発性有機ハロゲン化合物を分解する土壌微生物も存在するが、一般に土壌は表面に近いほど有機物が多く土壌微生物も多く存在しているが、表層から深部に向かうにつれ有機物も土壌微生物も減少し、１ｍ以上深くなると微生物の活性は表層の１／１００以下にまで減少してしまう。これらの事情により、一度揮発性有機ハロゲン化合物に汚染された土地は長期間にわたり比較的低濃度で広範囲に汚染されたままになってしまうという問題がある。
【００１０】
このような比較的低濃度で広範囲に汚染された土地の浄化はバイオレメディエーションが有効な手段であることから、揮発性有機ハロゲン化合物による汚染の浄化を目的とした提案が各種行われている。
【００１１】
クロロエテン類に汚染された土地の浄化に使用する微生物としては嫌気性細菌、とくにデハロコッコイデス属細菌が知られている。この微生物が存在しない状態であると、クロロエテン類は最終的なエテンまでの分解がなされず中間物質であるジクロロエテンで分解が止まってしまい、有害なシス−１，２−ジクロロエテンや塩化ビニルモノマーが蓄積してしまう。しかし、たとえデハロコッコイデス属細菌であっても通常はその種類により分解可能な化合物が決まっており、テトラクロロエテンからエテンまでの分解には数種のデハロコッコイデス属細菌が関与し、必要となることも知られている（非特許文献１及び２参照）。そのため、デハロコッコイデス属細菌の各種クロロエテン類分解速度は必ずしも速いものではなく、また、デハロコッコイデス属細菌が存在していてもクロロエテン類の分解に関与しているとは限らない。
【００１２】
ここで、ジクロロエテンを分解可能なデハロコッコイデス属細菌として現在まで見出された例は少なく、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ  １９５（非特許文献３参照）、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＢＡＶ１（非特許文献４参照）、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＶＳ（非特許文献５及び６参照）などが知られているのみである。しかも、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ  １９５は塩化ビニル（ＶＣ）の分解酵素をもたず、ＶＣは共代謝で分解されるだけなので分解効率が悪く、最終的にエテンにまで分解されずにＶＣが蓄積してしまう問題がある。
【００１３】
近年、ＶＣ分解遺伝子に関し、相次いで２例の報告がなされている。一方はＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＢＡＶ１株のｂｖｃＡ（非特許文献７）であり、他方はＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＶＳ株のｖｃｒＡ（非特許文献８）である。これら２つの報告には、特定のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属微生物株のＶＣ分解遺伝子の存在およびその配列について記載されている。さらに近年、ｂｖｃＡ遺伝子およびｖｃｒＡ遺伝子の定量検出方法についても提案がなされている（非特許文献９）。しかし、これらのＶＣ分解酵素遺伝子の塩基配列に多様性はあるのか、またＶＣ分解酵素としてはこれら２種類以外には存在しないのか、菌株の遺伝子の相同性とＶＣ分解酵素の種類に相関があるのかといった点についてはまだ、明らかとなっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】崎原盛他「クロロエテン類を対象とした原位置バイオエメディエーションにおけるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌の挙動解析」地下水・土壌汚染とその防止対策に関する研究集会講演集（２００８年）
【非特許文献２】矢木修身「土地修復技術の現状と今後の展望」「食と環境の安全を求めて  −農林水産生態系における有害化学物質―  要旨集  １０ページ」（２００７年）
【非特許文献３】Maymo-Gatell X, Anguish T, Zinder SH., Appl Environ Microbiol. 1999Jul;65(7):3108-13.
【非特許文献４】He J, Ritalahti KM, Yang KL, Koenigsberg SS, Loffler FE.,Nature.2003 Jul 3;424(6944):62-5.
【非特許文献５】Cupples AM, Spormann AM, McCarty PL., Appl Environ Microbiol. 2003 Feb;69(2):953-9.
【非特許文献６】He J, Sung Y, Krajmalnik-Brown R, Ritalahti KM, Loffler FE. EnvironMicrobiol. 2005 Sep;7(9):1442-50.
【非特許文献７】Krajmalnik-Brown R, Holscher T,Thomson IN, Saunders FM, Ritalahti KM, Loffler FE., Appl Environ Microbiol. 2004 Oct;70(10):6347-51.
【非特許文献８】Muller JA, Rosner BM, Von Abendroth G, Meshulam-Simon G, McCarty PL,Spormann AM., Appl Environ Microbiol. 2004 Aug;70(8):4880-8.
【非特許文献９】Ritalahti KM, Amos BK, Sung Y,Wu Q, KoenigsbergSS, Loffler FE.,ApplEnviron Microbiol. 2006 Apr;72(4):2765-74.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このように、クロロエテン類の分解はＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌を含む数種類の微生物により行われることが知られているが、ジクロロエテン（ＤＣＥ）異性体から塩化ビニル（ＶＣ）、さらにはエテンまでの分解（以下、下流分解ともいう）は、一部のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＢＡＶ１株，  ＶＳ株など）のみが行うことができる。
【００１６】
しかし、今後のバイオレメディエーションに対する需要の高まりを考慮した場合、様々な土壌条件においても適用可能なように、様々な特性のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌を準備することが必要となってきている。
【００１７】
したがって本発明の目的は、十分なクロロエテン類の分解活性（脱塩素化活性）を持つ、新規なＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌を提供することにある。
また本発明の目的は該微生物を用いた汚染土壌等の汚染物の浄化方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上記の課題の解決に向けて、クロロエテン類により汚染された様々な土壌や地下水からシス−１，２−ジクロロエテンをエテンまで脱塩素化できる微生物群の探索を行い、その中で、十分なクロロエテン類分解活性を持つ、新規なＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌を見出した。
【００１９】
すなわち本発明のデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌は、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１のゲノムとの相同性が高く、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノムとの相同性が低く、且つ、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるｖｃｒＡを有することを特徴とするものである。
【００２０】
本発明のデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌は、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター受託番号（ＮＩＴＥ  １１３４）として寄託された微生物群に含まれる細菌であることが好ましい。
【００２１】
本発明の微生物群は、上記デハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌を含有することを特徴とするものである。
【００２２】
本発明の微生物群は、さらに、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ属細菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属細菌及びＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ属細菌からなる群から選ばれる１種以上の細菌を含有することが好ましい。
【００２３】
また、本発明の微生物群は、ＮＩＴＥ特許微生物寄託センター受託番号（ＮＩＴＥ  １１３４）として寄託されたものであることが好ましい。
【００２４】
本発明の汚染物の浄化方法は、上記いずれかのデハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌、又は、上記いずれかの微生物群を、クロロエテン類を含む汚染物に作用させて該クロロエテン類を脱塩素化することを特徴とするものである。
【００２５】
本発明の汚染物の浄化方法は、クロロエテン類の脱塩素化の最終産物がエテンであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の微生物は、バイオレメディエーション、とくにバイオオーグメンテーションに好適に利用できる。
また、本発明の浄化方法によれば、低コストで、環境に対する負荷をかけることなく、クロロエテン類を含む汚染物を浄化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１におけるシス−１，２−ジクロロエテン、塩化ビニルおよびエテンの濃度変化を表すグラフ図である。
【図２】実施例１において、Ｃｏｒｏｎａ  Ｌｉｔｅによりゲノムの相同性を評価した結果を表すグラフ図である。
【図３】実施例１において、クロロエテン類分解酵素遺伝子についての相同性を評価した結果を表すグラフ図である。
【図４】実施例１におけるＰＣＲの結果を確認する為のアガロース電気泳動結果を示す写真図である。
【図５】実施例２、比較例１におけるクロロエテン類の濃度変化を表すグラフ図である。
【図６】実施例３、比較例２におけるクロロエテン類の濃度変化を表すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
［本発明の微生物］
（１）概略
本発明の微生物は、既存のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌、とくにＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１の遺伝子に、遺伝子工学的手法により塩化ビニル分解酵素遺伝子であるｖｃｒＡを組み込んで得られる組換え微生物として得ることも可能であるが、好ましくは、クロロエテン類による汚染土壌や汚染地下水等の汚染物において、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１のゲノムとの相同性が高く、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノムとの相同性が低く、且つ、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるｖｃｒＡを保有する菌株をサンプリングし、これを継代培養や集積培養を行うことにより得ることが好ましい。なお、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるｖｃｒＡ  の存在の確認は、遺伝子のＰＣＲ増幅とシークエンシング（配列決定）を行うことにより実行することができる。また、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１、及び、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノムとの相同性の比較については、定法により得られたゲノム情報を、既知のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１、及び、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノム情報と、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の次世代ＤＮＡシークエンサーＳＯＬｉＤ  ３を用い、相同性を評価する。本発明の微生物と微生物群の取得過程の概略は下記の通りである。より具体的な内容については、実施例の欄において後述する。
【００２９】
（２）微生物の取得
クロロエテン類により汚染された土壌や地下水を微生物源として用い、例えば、ミネラル基礎培養液に、滅菌した土壌、酢酸、水素、シス−１，２−ジクロロエテンを添加して、嫌気培養を行う。その後、液量に対して４質量％の継代培養を繰り返し、微生物群（微生物コンソーシア）を構築する。ガスクロマトグラフィー測定し３週間程度で１０ｍｇ／Ｌのシス−１，２−ジクロロエテンをエテンにまで脱塩素化可能な微生物のコンソーシアを選抜する。
【００３０】
Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌の存在は、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析を行なうことによって確認することができる。さらに、脱塩素酵素遺伝子の解析を行い、該コンソーシアに存在するＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌に、塩化ビニル分解酵素遺伝子であるｖｃｒＡ  が存在していることを確認する。得られた微生物のコンソーシアは、次世代ＤＮＡシークエンサーによりゲノムを解析し、さらに、既知のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１、及び、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノム情報との、相同性を評価する。例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の次世代ＤＮＡシークエンサーＳＯＬｉＤ  ３を用いた場合は、ゲノム配列が５０塩基のタグ配列として得られる。このタグ配列を既知の配列とマッチングを行い、５０塩基のうちミスマッチが３個以内のタグ配列の数（Ｃｏｖｅｒａｇｅ  Ｄｅｐｔｈ）をカウントし、グラフにすることで相同性を可視化することができる。そして、上記タグの数が多いほうを相同性が高いと判断する。
該微生物群は、寄託番号ＮＩＴＥ  １１３４として独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００３１】
［本発明の浄化方法］
本発明の浄化方法は、上述の本発明の微生物又は微生物群（以下、本発明の微生物等ともいう）を、クロロエテン類を含む汚染物に作用させて該クロロエテン類を脱塩素化することを特徴とする、浄化方法である。
【００３２】
ここで「クロロエテン類を含む汚染物」とは、トリクロロエテン（ＴＣＥ）、ジクロロエテン（ＤＣＥ）異性体、及び、塩化ビニル（ＶＣ）から選ばれる１種以上のクロロエテン類を含有する汚染物である。また、汚染物は、通常は汚染された土壌、地下水等が該当するが、必要に応じて他の対象物、例えば、廃棄物や排水処理後の汚泥等も汚染物として例示される。また、土壌や地下水は環境から分離されている状態であっても、非分離の状態、すなわち汚染された土地（地下部分を含む）そのものであってもよい。
【００３３】
分離の状態とは、いわゆる「汚染土壌の掘削による汚染物質の除去」を行う場合であり、事前調査により把握した範囲の汚染土壌を掘削し、掘削した汚染土壌以外の清浄な土壌の他、浄化処理を行った該掘削土壌にて埋め戻す作業であり、「施設型浄化」とも言われる。浄化された掘削土壌は、別の場所に載置する場合もある。いずれにしても、本発明の浄化方法を掘削土壌に適用する場合には、ランドファーミング、バイオパイル、スラリーバイオ等の手法を用いることが可能である。ランドファーミングは、掘削した汚染土壌を敷き広げ、栄養源や水を添加することにより汚染土壌中の微生物の活性を高めて有害物質を分解する方法である。バイオパイルは、掘削した汚染土壌を畝型に成型して、栄養源と水を供給しつつ微生物の活性を高め有害物質を分解する方法である。スラリーバイオは、掘削した汚染土壌に水を加えてスラリー状に調整して、これをスラリーリアクターという反応槽に移し、そこに栄養源を供給して混合することにより微生物を活性化する方法である。
【００３４】
ここで栄養源の中には、本発明の微生物等の電子供与体となる物質を含めることが好適である。具体的には、ポリ乳酸を主成分とするＨＲＣ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（Ｒｅｇｅｎｅｓｉｓ社）、アデカジオメイト（ＡＤＥＫＡ社）、ＥＤＣ（エコサイクル社）等の水素徐放剤を挙げることができる。また、酢酸や水素ガスを用いることもできる。
【００３５】
非分離の状態とは、汚染土壌を掘削せずに、原位置において浄化する「原位置浄化（原位置バイオレメディエーション）」を意味するものである。本発明の微生物等は嫌気性細菌であるために、本発明の浄化方法ではこの手法を用いることが好適である。原位置浄化法にて、本発明の浄化方法を行う場合には、本発明の微生物等とＨＲＣ等の電子供与体は、浄化領域の上流（地下水の上流を意味する）に設けた１個又は２個以上の井戸から供給することが好適である。このようにすることにより、地下水により本発明の微生物等と電子供与体が、クロロエテン類を脱塩素化しつつ徐々に下流に移行し、結果として汚染全領域におけるクロロエテン類のエテンへの浄化を行うことができる。
【００３６】
本発明の微生物は絶対嫌気性であり、高密度培養が困難であるという問題がある。本発明の微生物の培養液をそのまま井戸から汚染サイトに投入することも可能であるが、より効果的にするためには、培養した微生物を濃縮し、嫌気的に土壌や地下水中に投入し、安定に保持することが必要である。様々な手法が考えられるが、固定化担体に固定化することが１つの方法として考えられる。固定化することにより、徐放性を付与することができ、また、微生物の空気との接触容積を減ずることができる点で、嫌気性菌である本発明の微生物等を扱う上では好適である。
【００３７】
なお、本発明の浄化方法における本発明の微生物又は微生物群の投与量は、十分な浄化効果が得られる程度であれば良く、予め事前調査により汚染領域の範囲、汚染の程度、汚染物質の種類、存在する微生物の種類等を確認し、クロロエテン濃度のモニタリングを行いながら逐次追加設定すればよい。
【実施例】
【００３８】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
〔実施例１〕
＜Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌を含む微生物群の構築＞
１００ｍＬ容バイアル瓶に、クロロエテン類による汚染土壌から採取し、水素徐放剤の投入によりＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌が増殖し、エテンまでの分解が促進されていることが分かっている地下水２５ｍＬを、以下に示すオートクレーブ滅菌済みのミネラル基礎培地５０ｍＬに加えて、窒素置換後、水素２．５ｍＬおよびシス−１，２−ジクロロエテン０．５８μＬ（１０ｍｇ／Ｌに相当）を封入し、定期的にヘッドスペース中のクロロエテン類の濃度をＧＣ−ＦＩＤにより測定しながら集積培養したところ、３週間でシス−１，２−ジクロロエテンをほぼ完全に脱塩素化し、エテンを生成する微生物群を得た。該微生物群を、同一組成の培地で５代以上継代培養を行ない、同様のシス−１，２−ジクロロエテン分解活性を確認した。
【００４０】
＜ミネラル基礎培地（ｐＨ  ７．０〜７．５の製造＞
下記Ｓａｌｔ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０ｍｌ、下記Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａを１ｍｌ、下記Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを１ｍｌ、レザズリンナトリウム溶液（０．５％ｗ／ｖ）を５０μｌ、酢酸ナトリウムを０．１ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物を０．３ｇ、炭酸水素ナトリウムを２．５２ｇ、硫化ナトリウム九水和物を０．０４８ｇを１０００ｍｌにフィルアップし、これをミネラル基礎培地とした。
【００４１】
＜Ｓａｌｔ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎの製造＞
下記の成分を水で溶解し１０００ｍｌにフィルアップし、Ｓａｌｔ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとした。
１００ｇＮａＣｌ，５０ｇＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，２０ｇＫＨ２ＰＯ４，３０ｇＮＨ４Ｃｌ，３０ｇＫＣｌ，１．５ｇＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
【００４２】
＜Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａの製造＞
下記の成分を水で溶解し１０００ｍｌにフィルアップし、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａとした。
１０ｍＬ  ＨＣｌ（２５％ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｗ／ｗ），１．５ｇ  ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，０．１９ｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．１ｇ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ，７０ｍｇ  ＺｎＣｌ２，６ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３，３６ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，２４ｍｇ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，２ｍｇ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
【００４３】
＜Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂの製造＞
下記の成分を水で溶解し１０００ｍｌにフィルアップし、Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂとした。
６ｍｇ  Ｎａ２ＳｅＯ３・５Ｈ２Ｏ，８ｍｇ  Ｎａ２ＷＯ４・２Ｈ２Ｏ，０．５ｇ  ＮａＯＨ
【００４４】
図１は第４世代培養液中のシス−１，２−ジクロロエテン、塩化ビニル及びエテンの濃度変化を示したものである。シス−１，２−ジクロロエテンの分解に伴い、塩化ビニルが生成し、約３週間でほぼ完全にエテンまで脱塩素化が進んだことがわかる。なお、以後の継代培養時でも、ほぼ同じ速度で分解が進むことが確認された。
【００４５】
＜得られた微生物群のゲノム解析＞
得られたシス−１，２−ジクロロエテン分解活性を有する微生物群からゲノムＤＮＡを抽出し、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の次世代ＤＮＡシークエンサーＳＯＬｉＤ  ３によりゲノムを解析し、さらに、既知のＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１、及び、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳのゲノム情報との相同性を、解析ソフトウエアＣｏｒｏｎａ  Ｌｉｔｅにより評価した。その相同性評価方法を具体的に述べると、ＳＯＬｉＤ  ３によりゲノム配列を５０塩基のタグ配列として得て、このタグ配列を既知の配列とＣｏｒｏｎａ  Ｌｉｔｅによりマッチングを行い、５０塩基のうちミスマッチが３個以内のタグ配列の数（Ｃｏｖｅｒａｇｅ  Ｄｅｐｔｈ）をカウントし、グラフにすることで相同性を可視化する。そして相同性の高低は、上記タグの数が多いほうを相同性が高いと判断した。その結果、既に知られているＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌の中では、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＢＡＶ１との相同性が高く、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＶＳとの相同性が低いＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌が存在することが判明した（図２）。一方で、クロロエテン類分解酵素遺伝子について調べると、ｂｖｃＡではなくｖｃｒＡと高いマッチングを示したことからｖｃｒＡを保有することが判明した（図３）。このような特徴を示すＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌はこれまで報告されていないため、この微生物群には新規なＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌が含まれることが判明した。
【００４６】
既知の全ての微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を対象として同様の解析を行った。その結果、表１に示す微生物種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在が確認された。それらの配列にマッチするタグの数からそれぞれの微生物の存在率を推定した。Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ属細菌の存在割合は３２．６％と計算された。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
表１に示す微生物が存在することを確認するため、表２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動したところ、図４に示す結果が得られ、何れも増幅していることが確認された。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
〔実施例２〕
１００ｍＬ容バイアル瓶に市販黒ボク土を７０ｇ入れ、酢酸０．１ｇ／Ｌを含むミネラル培地３５ｍＬと、実施例１で得られた１１回継代培養を行った本発明の微生物群を含有する培養液１ｍＬを加え、窒素置換してからシス−１，２−ジクロロエテンを０．６μＬおよび水素ガスを２．５ｍＬ封入し、暗所室温で静置培養した。定期的にヘッドスペース中のクロロエテン類の濃度をＧＣ−ＦＩＤにより測定した。シス−１，２−ジクロロエテンと、それが脱塩素化されて生成する塩化ビニルモノマーは、６週間後に検出限界以下となった。ここで、微生物群を添加しなかった場合（比較例１）は、８週間経ってもジクロロエテンがほとんど減少しておらず、またその分解物である塩化ビニルもまた検出されなかった。結果を図５に示す。
【００５１】
〔実施例３〕
１Ｌ容ねじ口瓶に、トリクロロエテンにより汚染された土壌から採取した土を７００ｇ、同じ場所から採取した地下水を３００ｇ入れ、栄養源および水素供与体として乳酸ナトリウム０．５ｇおよび酵母エキス０．５ｇを加えた後、実施例１で得られた１１回継代培養を行った本発明の微生物群を含有する培養液５ｍＬを加え、窒素置換してから、暗所室温で静置培養した。定期的にヘッドスペース中のクロロエテン類の濃度をＧＣ−ＦＩＤにより測定した。汚染土および地下水に含まれていたトリクロロエテンを始めとするクロロエテン類は、８週間後に検出限界以下となった。ここで、微生物群を添加しなかった場合（比較例２）は、１２週間経過しても一部のトリクロロエテンがシス−１，２−ジクロロエテンに脱塩素化されただけであり、両者とも環境基準値以上であった。結果を図６に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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