(57)【要約】【課題】γ−プロテオバクテリアを用いて効率よくＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンを生産するための方法を提供する。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有するγ−プロテオバクテリアに属する細菌、例えばエシェリヒア・コリ等の腸内細菌を、グリセロールを炭素源として含む培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記Ｌ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記細菌として、Cnuタンパク質の活性が低下するように改変された細菌を用いる。【選択図】図１
2013013329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するγ−プロテオバクテリアに属する細菌を、グリセロールを炭素源として含む培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記Ｌ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記細菌は、Cnuタンパク質の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
【請求項２】
染色体上のCnuタンパク質をコードするydgT遺伝子を破壊すること、又は該遺伝子の発現量を低下させることにより、Cnuタンパク質の活性が低下した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Cnuタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項１又は２に記載の方法。
（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−アミノ酸生産能が向上するタンパク質。
【請求項４】
前記ydgT遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである請求項２又は３に記載の方法。
（ａ）配列番号１３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１３の塩基配列に相補的な塩基配列、または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸が、アスパラギン酸系アミノ酸である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が腸内細菌科に属する細菌である、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌がエシェリヒア属細菌である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌がエシェリヒア・コリである請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−プロテオバクテリアを用いたＬ−アミノ酸の製造方法、特にＬ−リジンの製造法に関する。Ｌ−リジンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
エシェリヒア・コリにおいて、ydgT遺伝子はCnu（oriC-binding nucleoid-associated）タンパク質と呼ばれる全長71アミノ酸のタンパク質をコードしており（非特許文献１）、Cnuタンパク質はそのアミノ酸配列から、環境変化に応答する遺伝子制御因子であるHha/YmoAファミリーに属すると考えられていた（非特許文献２）。サルモネラのydgT遺伝子産物は、サルモネラの動物への全身感染に関与する遺伝子群をコードする領域SPI-2の発現を、H-NSタンパク質との相互作用により制御すると考えられていた（非特許文献３）。
【０００３】
しかしながら、いずれのバクテリアにおいても、ydgT遺伝子の糖消費やアミノ酸生産など代謝への関与はよくわかっていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kim, M. S. et al. (2005) J. Bacteriol., 187:6998-7008
【非特許文献２】Paytubi, S. et al (2004) Mol. Microbiol. 54(1):251-63
【非特許文献３】Coombes, B. K. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102:17460
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、γ−プロテオバクテリアを用いて効率よくＬ−アミノ酸、特にＬ−リジンを生産するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Cnuタンパク質の機能活性が低下した細菌を用いることでＬ−アミノ酸を効率よく生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有するγ−プロテオバクテリアに属する細菌を、グリセロールを炭素源として含む培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記Ｌ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記細菌は、Cnuタンパク質の活性が低下するように改変された細菌であることを特徴とする方法。
（２）染色体上のCnuタンパク質をコードするydgT遺伝子を破壊すること、又は該遺伝子の発現量を低下させることにより、Cnuタンパク質の活性が低下した、前記方法。
（３）前記Cnuタンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である前記方法。
（Ａ）配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−アミノ酸生産能が向上するタンパク質。
（４）前記ydgT遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである前記方法。
（ａ）配列番号１３の塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１３の塩基配列に相補的な塩基配列、または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ−アミノ酸生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）前記Ｌ−アミノ酸が、アスパラギン酸系アミノ酸である、前記方法。
（６）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジンである、前記方法。
（７）前記細菌が腸内細菌科に属する細菌である、前記方法。
（８）前記細菌がエシェリヒア属細菌である前記方法。
（９）前記細菌がエシェリヒア・コリである前記方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを非常に効率よく発酵生産することができる。また、本発明の一形態では、細菌の増殖速度及びグリセロール資化能が向上する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】エシェリヒア・コリの対照株及びydgT遺伝子欠損株をＬ−リジン生産培地で培養したときの培地中の（ａ）Ｌ−リジン濃度、及び（ｂ）グリセロール濃度を示す図。
【図２】エシェリヒア・コリの対照株及びydgT遺伝子欠損株をＬ−リジン生産培地で培養したときの（ａ）生育曲線、及び（ｂ）培地中のグリセロール濃度、をそれぞれ示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜１＞本発明のγ−プロテオバクテリア
本発明で使用されるγ−プロテオバクテリアは、、γ−プロテオバクテリアに属する微生物であって、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するもの、又はＬ−リジンの生産能を付加され得るものであれば、特に限定はされない。本発明の細菌は、γ−プロテオバクテリアに属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌を、Cnuタンパク質の活性が低下するように改変することによって取得することができる。
【００１１】
以下に、ydgT遺伝子の発現量が低下するように改変される、本発明の細菌の親株として使用される細菌、及びL−アミノ酸生産能の付与又は増強の方法を以下に例示する。尚、本発明の細菌は、ydgT遺伝子の発現量が低下するように改変されたγ−プロテオバクテリアにＬ−アミノ酸生産能を付与するか、ydgT遺伝子の発現量が低下するように改変されたγ−プロテオバクテリアのＬ−アミノ酸生産能を増強することによっても、取得することができる。
【００１２】
本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌とは、培地に培養したとき、Ｌ−アミノ酸を生産し、培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量で培地に蓄積させることができる細菌をいう。
【００１３】
本発明におけるＬ−アミノ酸とは、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン（シスチン）、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−ホモセリンが挙げられるが、特にアスパラギン酸系アミノ酸または芳香族アミノ酸が望ましい。アスパラギン酸系アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニンが挙げられ、特にＬ−リジンが好ましい。また芳香族アミノ酸としてはＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンが挙げられる。Ｌ−アミノ酸は、１種でもよく、２種以上であってもよい。
【００１４】
なお、本発明において、Ｌ−アミノ酸とは、フリー体のＬ−アミノ酸のみならず、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩も含む。
【００１５】
＜１−１＞本発明の親株として使用される細菌
本発明の細菌は、γ−プロテオバクテリアに属し、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌である。
γ−プロテオバクテリアは、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の腸内細菌科に属する細菌、及び、ビブリオ等の属に属する細菌を含む。本発明においては、特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法によりγ−プロテオバクテリアに分類されている細菌が挙げられ、腸内細菌科に属するエシェリヒア属、パントエア属、またはビブリオ属細菌を用いることが好ましい。
【００１６】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられるが、これに限定されない。
【００１７】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１８】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００１９】
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２０】
ビブリオ属細菌は、γ−プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属するグラム陰性の通性嫌気性菌で、極在性の鞭毛１本を持って運動し、淡水や海水に見られる細菌である。本発明で用いるビブリオ属細菌は、非病原性のものが望ましく、病原性が知られていないビブリオ細菌は、Biosafety level 1(Office of Health and Safety (OHS) 発行のBiosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 4th Edition)に挙げられており、以下のようなビブリオ属細菌が利用できる。
【００２１】
Vibrio abalonicus ATCC27390
Vibrio adaptatus ATCC19263
Vibrio aerogenes ATCC700797
Vibrio aestuarianus ATCC35048
Vibrio alginolyticus ATCC14582
Vibrio algosus ATCC14390
Vibrio anguillarum ATCC43305
Vibrio calviensis ATCC BAA-606
Vibrio campbellii ATCC25920
Vibrio carchariae ATCC35084
Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450
Vibrio costicola ATCC43147
Vibrio cyclitrophicus ATCC700982
Vibrio cyclosites ATCC14635
Vibrio diazotrophicus ATCC33466
Vibrio fischeri ATCC25918
Vibrio gazogenes ATCC29988
Vibrio halioticoli ATCC700680
Vibrio harveyi ATCC14126
Vibrio hispanica ATCC51589
Vibrio ichthyoenteri ATCC700023
Vibrio iliopiscarius ATCC51760
Vibrio lentus ATCC BAA-539
Vibrio liquefaciens ATCC17058
Vibrio logei ATCC15382
Vibrio marinagilis ATCC14398
Vibrio marinofulvus ATCC14395
Vibrio marinovulgaris ATCC14394
Vibrio mediterranei ATCC43341
Vibrio metschnikovii ATCC7708
Vibrio mytili ATCC51288
Vibrio natriegens ATCC14048
Vibrio navarrensis ATCC51183
Vibrio nereis ATCC25917
Vibrio nigripulchritudo ATCC27043
Vibrio ordalii ATCC33509
Vibrio orientalis ATCC33933
Vibrio pectenicida ATCC700783
Vibrio pelagius ATCC33504
Vibrio penaeicida ATCC51841
Vibrio ponticus ATCC14391
Vibrio proteolyticus ATCC53559
Vibrio psychroerythrus ATCC27364
Vibrio salmonicida ATCC43839
Vibrio shiloii ATCC BAA-91
Vibrio splendidus ATCC33125
Vibrio tyrosinaticus ATCC19378
Vibrio viscosus ATCC BAA-105
Vibrio wodanis ATCC BAA-104
Beneckea pelagia ATCC25916
Listonella anguillarum ATCC19264
【００２２】
Beneckea pelagia、Listonella anguillarumはビブリオ属細菌と近縁であり、現在の分類ではビブリオ属細菌に分類されるものもある（Thompson, F. L. et al. (2004) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 23, 403-431およびMacian, M. C. et al. (2000) Syst. Appl. Microbiol., 23, 373-375.)。したがって、このような細菌も本発明においてビブリオ属細菌として使用することができる。
【００２３】
なかでもVibrio natriegens（ビブリオ・ナトリージェンス）を用いることが好ましい。Vibrio natriegensは、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属する海洋性の通性嫌気性細菌であり、1958年にウロン酸酸化細菌として分離された（Payne, W. J. (1958) J. Bacteriology, 76, 301）。当初は同じγ−プロピオバクテリアのシュードモナス（Psuedomonas）に属するとされていたが、ベネケア（Beneckea）属に再分類された後、他のBeneckea属と同様にビブリオ属（Vibrio）に編入された．ATCCではBiosafety level 1に分類されており、DSMZ  (the German National Resource Centre for Biological Material)でも、Risk Group 1(German classification))に分類されており、病原性は知られていない。
【００２４】
ビブリオ・ナトリージェンスとしては、ビブリオ・ナトリージェンスIFO15636株（ATCC14048）株を用いることが出来る。
【００２５】
上記のビブリオ属細菌を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２６】
ビブリオ属細菌は、アミノ酸発酵の培養後半の物質が高蓄積する高浸透圧条件、あるいは糖の濃度が高い高浸透圧条件で、従来Ｌ−アミノ酸生産に使用されてきた微生物（例えばエシェリヒア・コリやコリネ型細菌）の生育が不十分であるのに比べ、好適に生育できる。ここで、高浸透圧下とは、例えば、925mOsm以上、好ましくは1100mOsm以上、より好ましくは1500mOsm以上の条件であることが好ましい。高浸透圧条件の上限はアミノ酸発酵が可能であれば特に制限されないが、例えば、2000mOsmである。また、「高浸透圧下で好適に生育できる」とは、例えば、E. coli野性株、例えばMG1655株（ATCC 47076）の増殖速度が最大時の50%以下に低下する1100mOsmにおいて、増殖速度が最大時の50%より高く保たれることを意味し、好ましくは増殖速度が最大時の90%程度にしか低下しないことが挙げられる。
【００２７】
以下、前記のような細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は前記のような細菌Ｌ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
【００２８】
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２９】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００３０】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００３１】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは腸内細菌科において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。腸内細菌科で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００３２】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する具体的方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００３３】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001−346578号）等が挙げられる。
【００３４】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００３５】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００３６】
このようにＬ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００３７】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのL−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００３８】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００３９】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００４１】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、L−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００４２】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００４３】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００４４】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００４５】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００４６】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００４７】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−L−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びEscherichia coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００４８】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ−リジン排出遺伝子であるybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００４９】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００５０】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【００５１】
pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
【００５２】
Ｌ−メチオニン生産菌としては、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサー（metJ）を欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性(metA)が増強され、又はＳ−アデノシルメチオニンシンテース活性（metK）が弱化したエシェリヒア属細菌を用いることが出来る（日本特許04110641号公報）。
【００５３】
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼ（pheA）、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビンシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる（欧州出願公開763127号明細書）。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御されることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇してもよい（欧州特許763127号明細書参照）。
【００５４】
また、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、aroFの場合、Ｎ末端より１４７位のＬ−アスパラギン酸または１８１位のＬ−セリンが他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より１４６位のＬ−アスパラギン酸、１４７位のＬ−メチオニン、１５０位のＬ−プロリンもしくは２０２位のＬ−アラニンの１アミノ酸残基、または１５７位のＬ−メチオニン及び２１９位のＬ−アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族生産アミノ酸生産菌を得ることができる（EP0488424）。また、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼも、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。
【００５５】
芳香族アミノ酸はそれぞれ生合成系が共通しており、目的とするＬ−アミノ酸以外の芳香族アミノ酸に固有の生合成系を弱化した株を用いることが好ましい。例えば、目的アミノ酸がＬ−トリプトファンの場合、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン固有の生合成系を弱化すること、目的アミノ酸がＬ−フェニルアラニンの場合、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン固有の生合成系を弱化することによって、目的Ｌ−アミノ酸を効率よく生産する菌株を得ることができる。生合成系を弱化することは、その生合成系の酵素をコードする遺伝子に変異を導入すること、また弱化したい生合成系により合成されるＬ−アミノ酸を要求する株を、同Ｌ−アミノ酸を含有する合成培地を用いて取得することにより達成できる（US4,371,614）。
【００５６】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００５７】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の１種又は２種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164（trpE8）、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5をE. coli SV164に導入することにより得られたSV164 (pGH5)が挙げられる。
【００５８】
前記E. coli SV164 (trpE8)は、Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻害が解除されたアントラニレートシンターゼをコードする変異型trpE遺伝子を、trpE欠失株であるE. coli KB862（DSM7196）に導入することによって得られた株である（WO94/08031、特表平7-507693号）。E. coli SV164 (pGH5)は、このSV164株に、セリンによるフィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異型serA5遺伝子を含むプラスミドpGH5（WO94/08031）を導入することによって得られた株である。E. coli SV164 (pGH5)は、Ｌ−トリプトファンだけでなく、Ｌ−セリンも生産する（米国特許第7,045,320号）。
【００５９】
上記E. coli KB862は、AJ13828と命名され、2000年12月21日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づいて国際寄託され、受託番号FERM BP-7405が付与されている。
【００６０】
また、Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例として、３−フォスフォセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株(WO2004/090125)、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化された株（WO2005/103275）が挙げられる。
【００６１】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株（特開昭57-71397号、特開昭62-244382号、米国特許第4,371,614号）も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli AJ12479(FERM BP-4796)(EP 1484410A)、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)、及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６３】
また、Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、副生物を細胞内に取り込むように改変すること、例えば、Ｌ−トリプトファンの取り込み遺伝子tnaB、mtrや、Ｌ−チロシンの取り込み遺伝子であるtyrPの発現量を向上させることによっても、効率よくＬ−フェニルアラニンを生産する菌株を取得することができる（EP1484410）。
【００６４】
Ｌ−チロシン生産菌
チロシン生産菌としては、チロシンによる阻害を受けない脱感作型のプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子(tyrA)を有するエシェリヒア属細菌（欧州特許出願公開1616940号公報）が挙げられる。
【００６５】
遺伝子組換えにより本発明に用いる細菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、それらの遺伝子のバリアント、すなわち、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、それらの遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００６６】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1〜2個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【００６７】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、コードされるアミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。
【００６８】
保存的変異を有する遺伝子は、変異剤処理等、通常変異処理に用いられる方法によって取得されたものであってもよい。
【００６９】
また、遺伝子は、公知の遺伝子配列の相補配列又はその相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、公知の遺伝子産物と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７０】
プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００７１】
上記した遺伝子のバリアントに関する記載は、下記のydgT遺伝子及び本明細書に記載した他の遺伝子についても同様に適用される。
【００７２】
本発明に用いる細菌は、グリセロールの資化性を有する細菌であり、元来グリセロールの資化性を有する細菌、又はグリセロールの資化性を付与された組換え株でもよい。
【００７３】
本発明におけるＬ−アミノ酸生産菌は、グリセロールの資化能力を高めるように改変されていてもよい。グリセロールの資化能力は、グリセロール代謝に関与する遺伝子を改変することによって付与又は増強することができる。
【００７４】
グリセロールの資化性を高めるために、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が強化されていてもよい。特にグリセロール資化性を高めるために、グリセロールデヒドロゲナーゼ（gldA）、ジハイドロキシアセトンキナーゼ(dhaKLM, dak)遺伝子、フルクトース−６−リン酸アルドラーゼ（fsaB）の発現が強化されていることが好ましい（WO2008/102861）。
また、グリセロールキナーゼ(glpK)においては、フルクトース-1,6-リン酸によるフィードバック阻害が解除された脱感作型glpK遺伝子を用いることが好ましい（WO2008/081959,WO2008/107277）。
【００７５】
＜１−２＞Cnuタンパク質の活性の低下
次に、Cnuタンパク質の活性を低下させる改変について説明する。
Cnuタンパク質は、ydgT遺伝子（Synonyms: Cnu, ECK1621, b1625）がコードしている。具体的には、エシェリヒア・コリのydgT遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1702973〜1703188に位置する、配列番号１３に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１４には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
ydgT遺伝子産物は、B1625、YdgT、又はびH-NS- and StpA-binding proteinとしても知られており、また、CnuタンパクはレプリケーションオリジンoriCに結合することが報告されている（Kim, M. S. et al. (2005) J. Bacteriol., 187:6998-7008）。
本発明においては、「Cnuタンパク質の活性」とは、細菌内のその活性を低下させたとき、例えばCnuタンパク質の細胞内の量を低下させたときに、非改変株に比べてＬ−アミノ酸生産能、例えばＬ−リジン生産能、又は、細菌の増殖速度もしくはグリセロール資化能を向上させる性質をいう。
【００７６】
Cnuタンパク質としては、例えばエシェリヒア・コリに関しては、配列番号１４のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、タンパク質の機能が変わらない限り、これらのアミノ酸配列において、保存的変異を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。すなわち、配列番号１４のアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等を含む配列を有するタンパクであってもよい。
【００７７】
ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからAsn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように公知の遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【００７８】
Cnuタンパク質をコードする遺伝子は、Cnuタンパク質をコードする限り、配列番号１３からなる塩基配列と相補的な塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７９】
プローブとしては、遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することが出来る。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp〜1Kbpである。またプローブとして300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
【００８０】
「Cnuタンパク質の活性が低下するように改変された」とは、細菌の細胞あたりのCnuタンパク質の活性が、非改変株、例えば野生型の腸内細菌科に属する菌株よりも低くなったことをいう。例えば、細胞あたりのCnuタンパク質の分子数が低下した場合や、分子あたりの活性が低下した場合等が該当する。尚、活性の「低下」には、活性が完全に消失した場合も含まれる。
【００８１】
Cnuタンパク質の活性が低下したとは、例えばCnuタンパク質の活性が、非改変株、例えば野生株と比較して、菌株当たり50％以下、好ましくは30％以下、さらに好ましくは10％以下に低下されていることが好ましい。比較の対照となる野生型のエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリMG1655株などが挙げられる。
【００８２】
Cnuタンパク質の活性が低下するような改変は、具体的には、染色体上のydgT遺伝子の一部または全部を欠損させたり、同遺伝子のプロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。発現の低下には、転写の低下と翻訳の低下が含まれる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現を低下させることができる。染色体上の標的遺伝子の前後の配列を含めて、標的遺伝子全体を欠失させてもよい。また、染色体上の遺伝子のコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分を欠失させることによっても達成出来る（Journal of biological Chemistry 272:8611-8617（1997） Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266,20833-20839(1991)）。
上記のように、遺伝子又はその発現産物の機能が低下又は欠損するようにその遺伝子を改変することは、遺伝子破壊とも呼ばれる。本発明においては、Cnu遺伝子の破壊は、同遺伝子のプロモーター及び／又はコード領域の全体、又は３０％以上、好ましくは、５０％以上、より好ましくは７０％以上を欠失させることにより行うことが好ましい。
【００８３】
遺伝子の改変は、遺伝子組換えにより行われることが好ましい。遺伝子組換えによる方法として具体的には、相同組換えを利用して、染色体上の標的遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入すること、フレームシフト、ナンセンス変異、ミスセンス変異を導入することが挙げられる。
【００８４】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、各遺伝子が産生するタンパク質の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に標的遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【００８５】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入する位置は標的遺伝子のいずれに領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に標的遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、標的遺伝子がコードするタンパク質の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【００８６】
染色体上の標的遺伝子を上記のように改変するには、例えば、標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の標的遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型標的遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、又は、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号明細書、または特開平05-007491号公報）。
【００８７】
標的遺伝子の転写量が低下したことの確認は、標的遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株、あるいは非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。転写量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して低下していれば、いずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下に低下していることが望ましく、全く発現していないことが特に好ましい。
【００８８】
標的遺伝子がコードするタンパク質の量が低下したことの確認は、同タンパク質に結合する抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質量の低下は、野生株あるいは非改変株と比較して、低下していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて、野生株あるいは非改変株と比べて少なくとも75%以下、50％以下、25％以下、又は10％以下以下に減少していることが望ましく、全くタンパク質を産生していない（完全に活性が消失している）ことが特に好ましい。
【００８９】
また、ydgT遺伝子を変異処理して、低活性のCnuタンパク質をコードする遺伝子を取得することもできる。
【００９０】
Cnuタンパク質の活性を低下させるには、上述の遺伝子操作法以外に、例えば、エシェリヒア属細菌を紫外線照射または、Ｎ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、Cnuタンパク質の活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。
【００９１】
＜２＞本発明のL−アミノ酸の製造法
本発明においては、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ、Cnuタンパク質の活性が低下するように改変されたγ−プロテオバクテリアに属する細菌を、グリセロールを炭素源として含む培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地に生成蓄積させ、該培地より前記Ｌ−アミノ酸を採取する。Ｌ−アミノ酸としては、前記したＬ−アミノ酸が挙げられ、特に特にアスパラギン酸系アミノ酸または芳香族アミノ酸が挙げられ、中でもＬ−リジンが好ましい。
【００９２】
本発明においては、グリセロールを炭素源として用いる。グリセロールは、L−アミノ酸を製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の単独の炭素源として用いる場合、好ましくは０．１ｗ／ｖ％〜５０ｗ／ｖ％程度、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％〜４０ｗ／ｖ％程度、特に好ましくは１ｗ／ｖ％〜３０ｗ／ｖ％程度培地に含有させる。グリセロールは、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、グリセロールと他の炭素源は任意の比率で混合することが可能であるが、炭素源中のグリセロールの比率は、１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上であることが望ましい。他の炭素原として好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。これらの中ではグルコースが好ましい。
【００９３】
培養開始時のグリセロールの好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中のグリセロールの消費に応じて、グリセロールを添加してもよい。
使用するグリセロールは、純粋なグリセロールであってもよいが、粗グリセロールであってもよい。粗グリセロールとは、工業的に生産される不純物を含むグリセロールをいう。粗グリセロールは、油脂を高温、高圧下で水と接触させ加水分解することによって、あるいは、バイオディーゼル燃料生産のためのエステル化反応によって、工業的に生産される。バイオディーゼル燃料とは、油脂とメタノールからエステル交換反応により生成する脂肪酸メチルエステルのことであり、この反応の副生物として粗グリセロールが生成する（Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H. 2001, J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416を参照のこと）。バイオディーゼル燃料生産プロセスでは、エステル交換にはアルカリ触媒法が用いられることが多く、中和時に酸を加えるため、水と不純物を含んだ純度７０〜９５重量％程度の粗グリセロールが生成する。バイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールは、水に加えて、残存メタノールや触媒であるNaOH等のアルカリとその中和に用いられるK2SO4等の酸との塩を不純物として含んでいる。メーカーや製法により差はあるが、このような塩類やメタノールは数パーセントに達する。ここでナトリウム、カリウム、塩化物イオン、硫酸イオン等の、アルカリやその中和に用いられた酸に由来するイオン類は、粗グリセロールの重量に対し、2〜7％、好ましくは3〜6%、さらに好ましくは4〜5.8%含まれていることが好ましい。メタノールは、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。
【００９４】
さらに、粗グリセロール中には、微量の金属、有機酸、リン、脂肪酸などを含むことがある。含まれる有機酸としては、蟻酸、酢酸等が挙げられ、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。粗グリセロールに含まれる微量の金属としては、微生物の生育に必要な微量金属が好ましく、例えばマグネシウム、鉄、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛等が挙げられる。マグネシウム、鉄、カルシウムは、粗グリセロールの重量に対し、合計で0.00001〜0.1%、好ましくは0.0005〜0.1%、より好ましくは0.004〜0.05％、さらに好ましくは0.007〜0.01%含まれていることが好ましい。マンガン、銅、亜鉛としては、合計で0.000005〜0.01%、より好ましくは0.000007〜0.005%、さらに好ましくは0.00001〜0.001%含まれていることが好ましい。
【００９５】
粗グリセロールのグリセロールの純度としては１０％以上であればよく、好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。不純物の含有量が上記の範囲を満たす限り、グリセロールの純度は９０％以上であってもよい。
粗グリセロールを用いる場合は、グリセロールの純度に応じて、グリセロールの量として上記濃度となるように粗グリセロールを培地に添加すればよい。また、グリセロール及び粗グリセロールの両方を培地に添加してもよい。
【００９６】
培地中に添加するその他の成分としては、炭素源に加えて、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源を１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含んでいてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地と変更してもよい。
【００９７】
本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【００９８】
また、培地には、炭素源、窒素源、硫黄源の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【００９９】
また、培地には、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。特に本発明に用いることができるＬ−リジン生産菌は、前述のようにＬ−リジン生合成経路が強化されており、Ｌ−リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１００】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のL−アミノ酸が蓄積される。蓄積されるL−アミノ酸の濃度は野生株より高く、培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
【０１０１】
本発明においては、Ｌ−アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、微生物の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【０１０２】
目的アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合は、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養期があるようにし、前期重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-065287号参照）。
【０１０３】
発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法（Nagai,H.et al., Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【０１０４】
尚、回収されるＬ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸以外に細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたＬ−アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
【０１０５】
また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０１０６】
本発明の方法によって製造されたフェニルアラニンは、例えば、α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステル（「アスパルテーム」とも呼ばれる）の製造に使用することができる。すなわち、本発明の方法は、L−フェニルアラニンを原料として用いるα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの製造法を含む。同方法は、上記の本発明の方法によって製造されたL−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する工程を含む。低級アルキルエステルとしては、メチルエステル、エチルエステル及びプロピルエステル等が挙げられる。
【０１０７】
本発明の方法においては、L−フェニルアラニン、及びアスパラギン酸又はその誘導体からα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルを合成する方法は、α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルの合成にL−フェニルアラニン又はその誘導体が用いられる限り特に制限されない。具体的には、例えば、α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの低級アルキルエステルは、以下の方法により製造することができる（米国特許第3,786,039号）。L−フェニルアラニンをL−フェニルアラニンの低級アルキルエステルにエステル化する。このL−フェニルアラニンアルキルエステルを、β−カルボキシル基が保護され、α−カルボキシル基がエステル化されて活性化されたL−アスパラギン酸の誘導体と反応させる。前記誘導体としては、Ｎ−ホルミル−、Ｎ−カルボベンゾキシ−、又はＮ−ｐ−メトキシカルボベンゾキシ−L−アスパラギン酸無水物のようなＮ−アシル−L−アスパラギン酸無水物が挙げられる。この縮合反応により、Ｎ−アシル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンと、Ｎ−アシル−β−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンの混合物が得られる。この縮合反応を、37℃における酸解離定数が10-4以下の有機酸の存在下で行うと、β−体に対するα−体の割合が上昇する（特開昭51-113841）。続いて、Ｎ−アシル−α−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンを混合物から分離し、水素化してα−L−アスパルチル−L−フェニルアラニンを得る。
【実施例】
【０１０８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
〔実施例１〕エシェリヒア・コリW3110株でのydgT遺伝子欠失
Datsenkoらの方法（Datsenko, K. A. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H. et al. (2002) J. Bacteriol., 184, 5200-5203）を組み合わせた方法（WO2005/010175）に従いエシェリヒア・コリ W3110株染色体上のydgT遺伝子を欠失させた。
【０１０９】
具体的には、プラスミドpMW118-attL-cat-attR（WO2005/010175）を鋳型DNAとして使い配列番号１と配列番号２に示す合成オリゴDNAを用いてPCRを行った。pMW118-attL-Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL−cat-attRの順で挿入されている。
【０１１０】
PCR後、鋳型DNAを制限酵素DpnIにより完全消化し、得られたPCR産物をWizardR SV Gel and PCR Clean-Up System（promega社、USA）で精製した。そのPCR産物を温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46（WO2005/010175、Datsenko, K. A. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 6640-6645）を含むエシェリヒア・コリW3110株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、第31088〜33241位）を含む、温度感受性のプラスミドである。エレクトロポレーション用のコンピテントセルを調製するために、W3110/pKD46を100 mg/Lのアンピシリンを含むLB培地1 ml中で30℃、18時間培養した。得られた培養液300μlを100 mg/L アンピシリンと1 mM Ｌ−アラビノースを含むLB培地50 ml に添加し、30℃で3時間フラスコ培養した。得られた菌体を10 %グリセロールで3回洗浄し、エレクトロポレーション用のコンピテントセルとした。そのコンピテントセル300μlに約100 ngのPCR産物を加えエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の細胞を1ml LB培地中で37℃、1時間培養した後、LB寒天培地（40 mg/L クロラムフェニコールを含む）に植えた。37℃で18時間培養し、クロラムフェニコール耐性株を取得することで染色体上のydgT遺伝子がattL-cat-attR遺伝子で置換されたW3110株を得た。この株をW3110ydgT::cat株と名付けた。
【０１１１】
続いて、W3110ydgT::cat株からattL-cat-attR遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-ts（WO2005/010175）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Xis）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。pMW-intxis-tsが細胞に導入されると、同プラスミドと染色体上のattL、又はattRとの間で組換えが起り、attLとattRの間の遺伝子を切り出し、染色体上にはattL、又はattR配列のみ残る。
【０１１２】
W3110ydgT::cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で100 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地で24時間培養し、アンピシリン耐性株を選択した。次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、ＬB寒天培地上に植菌し37℃で18時間培養した。得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、attL-cat-attRとpMW-intxis-tsが脱落しているydgT遺伝子破壊株W3110ΔydgTを得た。染色体上のydgT遺伝子の破壊は、配列番号７と８に示す合成DNAをプライマーとして用いたPCRにより確認した。そして、W3110ΔydgT株に抗生物質耐性マーカーを付与するために、W3110ΔydgTのコンピテントセルを常法に従って作製し、pSTV29を導入した。
【０１１３】
〔実施例２〕ydgT遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリＬ−リジン生産菌によるＬ−リジン生産（１）
ydgT遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリを用いてＬ−リジン生産を行った。Ｌ−リジン生産菌として、WC196ΔcadAΔldcC株（「WC196LC株」とも呼ばれる。WO96/17930号、EP0796912B）を使用した。
【０１１４】
W3110ydgT::cat株を用いて、P1トランスダクションによりWC196ΔcadAΔldcC株の染色体上のydgT遺伝子を破壊した。具体的には、以下のようにして行った。W3110ydgT::cat株を1ml LB培地で37℃、18時間培養した。得られた培養液50μlをLB培地4 mlに加え、37℃で1時間培養した。その培養液から集菌し、新しいLB培地（5 mM 塩化カルシウムを含む）1 mlに懸濁した。その菌液にP1ファージを加え、37℃で1時間放置した。P1ファージが感染した菌液に2.5 ml R-Top Agar（10 g/L トリプトン、1 g/L 酵母抽出液、8 g/L NaCl、8 g/L 寒天、2mM CaCl2および0.1% グルコースを含む）を加え、LB寒天培地に重層し、37℃で14時間培養した。続いて、プレート上に2 ml LB培地を加え、R-Top AgarごとP1ファージと菌を回収し、30μl クロロホルムを加え、遠心分離により上清を回収した。クロロホルム添加と上清回収を3回行った後、孔径0.2μmのフィルターに通し、ydgT遺伝子破壊用P1ファージ液を得た。
【０１１５】
次に、WC196ΔcadAΔldcC株を1 ml LB培地で37℃、18時間培養した。得られた培養液50μlを4 ml LB培地に加え、37℃で1時間培養した。得られた菌を集菌し、新しいLB培地（5 mM 塩化カルシウムを含む）1 mlに懸濁し、ydgT遺伝子破壊用P1ファージ液を加え、室温で15分間放置した。その溶液に1% クエン酸を含むLB培地5 mlを添加し、30℃で15分間放置した後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を新しい1% クエン酸を含むLB培地5 mlに懸濁し、30℃で30分間放置した。その後、菌体をLB培地で2回洗浄し、LB寒天培地（40 mg/L クロラムフェニコールを含む）に植え、37℃で18時間培養した。こうして、ydgT遺伝子がattL-cat-attR遺伝子で置換された株WC196ΔcadAΔldcC ydgT::cat株を得た。
【０１１６】
上記で得られたWC196ΔcadAΔldcC ydgT::cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-ts（WO2005/010175）にて形質転換した。そして、30℃で100 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地で24時間培養し、アンピシリン耐性株を選択した。次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、ＬB寒天培地上に植菌し37℃で18時間培養した。得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、attL-cat-attRとpMW-intxis-tsが脱落しているydgT破壊株WC196ΔcadAΔldcCΔydgT株を得た。染色体上のydgT遺伝子の破壊は、配列番号７と８に示す合成DNAをプライマーとして用いたPCRにより確認した。
【０１１７】
得られたWC196ΔcadAΔldcCΔydgT株と、その親株WC196ΔcadAΔldcC株に、pCABD2(WO95/16042)を導入し、WC196ΔcadAΔldcCΔydgT/pCABD2株とWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株を得た。それら２種類の株を、LB寒天培地（100 mg/L ストレプトマイシンを含む）にまき、37℃で24時間培養した。生育した菌をかきとり、100 mg/L ストレプトマイシンを含むＬ−リジン生産培地Ａ［60 g/L グリセロール、16 g/L (NH4)2SO4、1.0 g/L KH2PO4、1.0 g/L MgSO4・7H2O、0.01 g/L FeSO4・7H2O、0.01 g/L MnSO4・7H2O、2.0 g/L Yeast Extract、30 g/L CaCO3（和光純薬）］に懸濁した。
【０１１８】
得られた菌液を20 mlの培地Ａへ、培地の比濁度OD660が0.1となるように植菌し、37℃で培養を行った。培養途中に0.5 mlずつサンプリングを行い、培養液の比濁度（OD660）、培養液中のＬ−リジン濃度とグリセロール濃度をそれぞれ測定した。OD660を測定するため、培養液を0.1 M HClで51倍希釈し、分光光度計DU-800（Beckman coulter社、USA）で660nmの比濁度を測定した。培養液中のＬ−リジン濃度は、培養液を水で20倍希釈し、バイオテックアナライザーAS-310（サクラ精機株式会社、日本）を用いて測定した。培養液中のグリセロール濃度は、培養液を水で20倍あるいは40倍希釈し、多機能バイオセンサBF-5（王子測定機器株式会社）を用いて測定した。各時間において4サンプルずつ測定を行った。特に、培養開始直後と培養開始後48時間目のサンプルについては9サンプルずつ測定を行った。
【０１１９】
その結果、ydgT遺伝子の欠損により、培養液中のL-リジン蓄積は125.3±5.0 mMから136.3±4.5 mMまで上昇した（図１）。また、対グリセロール・Ｌ−リジン収率は34.9±1.5 (%)から37.5±1.5 (%)に向上した。
【０１２０】
〔実施例３〕ydgT遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリＬ−リジン生産菌によるＬ−リジン生産（２）
Ｌ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリVKPM B-5318株（EP0593792B、以下「B5318株」と記載する）のcadA遺伝子及びldcC遺伝子を破壊した株を用いた。
【０１２１】
B5318株の染色体上のリジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子及びldcC遺伝子の破壊は、実施例１のydT遺伝子の破壊と同様の方法に従って行った。
【０１２２】
具体的には、鋳型DNAとしてプラスミドpMW118-attL-cat-attRを使い、配列番号３と配列番号４、または配列番号５と配列番号６に示す合成オリゴDNAを用いてそれぞれPCRを行った。PCR後、鋳型DNAを制限酵素DpnIにより完全消化し、得られたPCR産物をそれぞれWizardR SV Gel and PCR Clean-Up System（promega社）精製した。それぞれのPCR産物を温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリW3110株にエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーション用のコンピテントセルは、実施例１と同様にして調製した。コンピテントセル300μlに約100 ngのPCR産物を加えエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後の細胞を１ｍl LB培地中で37℃、1時間培養した後、LB寒天培地（40 mg/L クロラムフェニコールを含む）に植えた。37℃で18時間培養し、クロラムフェニコール耐性株を取得することで、染色体上のcadA遺伝子あるいはldcC遺伝子がattL-cat-attR遺伝子で置換されたW3110株を得た。
【０１２３】
続いて、それらの遺伝子破壊株を用いて、P1トランスダクションによりB5318株の染色体上のcadA遺伝子とldcC遺伝子を順次破壊するため、各破壊株の染色体が取り込まれたP1ファージを調製した。はじめに、cadA遺伝子が破壊されたW3110株を1ml LB培地で37℃、18時間培養した。得られた培養液50μlをLB培地4 mlに加え、37℃で1時間培養した。得られた菌を集菌し、新しいLB培地（5 mM 塩化カルシウムを含む）1 mlに懸濁し、P1ファージを加え、37℃で1時間放置した。P1ファージが感染した菌液に2.5 ml R-Top Agarを重層し、LB寒天培地にまき37℃で14時間培養した。続いて、プレート上に2ml LB培地を加え、R-Top AgarごとP1ファージと菌を回収し、30μl クロロホルムを加え、遠心分離により上清を回収した。クロロホルム添加と上清回収を3回行った後、孔径0.2μmのフィルターに通し、cadA遺伝子破壊用P1ファージ液を得た。一方、同様にして、ldcC遺伝子が破壊されたW3110株を用いて、ldcC遺伝子破壊用P1ファージ液を得た。
【０１２４】
次に、cadA遺伝子破壊用P1ファージを用いて、B5318株の染色体上のcadA遺伝子を破壊した。具体的には、B5318株を1ml LB培地で37℃、18時間培養した。得られた培養液50μlをLB培地4 mlに加え、37℃で1時間培養した。得られた菌を集菌し、新しいLB培地（5 mM 塩化カルシウムを含む）1 mlに懸濁し、P1ファージを加え、室温で15分間放置した。その溶液に1% クエン酸を含むLB培地5 mlを添加し、30℃で15分間放置した後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を新しい1% クエン酸を含むLB培地5 mlに懸濁し、30℃で30分間放置した。その後、菌体をLB培地で2回洗浄し、LB寒天培地（40 mg/L クロラムフェニコールを含む）に植え、37℃で18時間培養し、cadA遺伝子がattL-cat-attR遺伝子で置換された株B5318 cadA::cat株を得た。
【０１２５】
上記で得られたB5318 cadA::cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で100 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地で24時間培養し、アンピシリン耐性株を選択した。次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、ＬB寒天培地上に植菌し37℃で18時間培養した。得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、attL-cat-attRとpMW-intxis-tsが脱落しているcadA遺伝子破壊株B5318ΔcadA株を得た。染色体上のcadA遺伝子の破壊は、配列番号９と１０に示す合成DNAをプライマーとして用いたPCRにより確認した。
【０１２６】
続いて、ldcC遺伝子破壊用P1ファージを用いて、上記の同様の手順により、B5318ΔcadA株のldcC遺伝子を破壊し、さらにattL-cat-attRとpMW-intxis-tsを脱落させて、B5318ΔcadAΔldcC株を得た。同株から、ydgT遺伝子破壊用P1ファージを用いて、ydgT遺伝子を破壊し、さらにattL-cat-attRとpMW-intxis-tsを脱落させて、B5318ΔcadAΔldcCΔydgT株を得た。染色体上のldcC遺伝子の破壊は、配列番号１１と１２に示す合成DNAをプライマーとして用いたPCRにより確認した。また、染色体上ydgT遺伝子の破壊は、配列番号８と９に示す合成DNAをプライマーとして用いたPCRにより確認した。
【０１２７】
B5318ΔcadAΔldcCΔydgT株及びB5318ΔcadAΔldcC株に、pCABD2を導入し、B5318ΔcadAΔldcCΔydgT/pCABD2株とB5318ΔcadAΔldcC/pCABD2株を得た。
【０１２８】
それら２種類の株を、LB寒天培地(100 mg/L ストレプトマイシンを含む)にまき、37℃で24時間培養した。生育した菌をかきとり、100 mg/L ストレプトマイシンを含むＬ−リジン生産培地Ｂ［40 g/L グリセロール、16 g/L (NH4)2SO4、1.0 g/L KH2PO4、1.0 g/L MgSO4・7H2O、0.01 g/L FeSO4・7H2O、0.01 g/L MnSO4・7H2O、2.0 g/L Yeast Extract、30 g/L CaCO3（和光純薬）］に懸濁した。得られた菌液を20mlの培地Ｂへ、培地の比濁度OD660が0.1となるように植菌し、37℃で培養を行った。各3サンプルずつ培養を行い、培養液の比濁度OD660、培養液中のＬ−リジン濃度とグリセロール濃度をそれぞれ測定した。
【０１２９】
その結果、ydgT遺伝子の破壊により、増殖速度やグリセロール資化能の向上が観察された（図２）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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