(57)【要約】【課題】植林のための優良木についてのより正確な情報を、より簡便に得るための方法の提供。【解決手段】植林地の木を伐採した後の場所に新たな植林地を形成する方法であって、以下の工程を含む方法：（ａ）木が伐採される前の植林地において、生育が他の木より優れている木を特定する工程；（ｂ）前記生育が他の木より優れている木の個体の幹の組織の一部を採取する工程；（ｃ）前記採取された組織の一部からＤＮＡを抽出する工程；（ｄ）該ＤＮＡにおける塩基配列の部分のうち、クローンを特定することができる特徴的な部分により、前記生育が他の木より優れている木のクローンを特定する工程；および（ｅ）前記植林地の木を伐採し、伐採後の植林地に、前記特定されたクローンと同一のクローンである品種の苗を植林する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植林地の木を伐採した後の場所に新たな植林地に植える木の品種を決定するための、以下の工程を含む方法：
（ａ）木が伐採される前の植林地において、生育が他の木より優れている木を特定する工程；
（ｂ）前記生育が他の木より優れている木の個体の幹の組織の一部を採取する工程；
（ｃ）前記採取された組織の一部からＤＮＡを抽出する工程；
（ｄ）該ＤＮＡにおける塩基配列の部分のうち、クローンを特定することができる特徴的な部分により、前記生育が他の木より優れている木のクローンを特定する工程；および
（ｅ）前記特定されたクローンと同一のクローンである品種を決定する工程。
【請求項２】
伐採される前の植林地における木の樹高が１０ｍ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生育が他の木より優れている木として２本以上の木を選択し、該２本以上の木のクローンを特定することおよび生育が優れていない木を少なくとも１本選択し、該少なくとも１本の木のクローンを特定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組織の一部の採取に成長錘が用いられる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
クローンを特定することができる特徴的な部分がマイクロサテライトである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
木の種類がスギまたはヒノキである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法により決定された品種の苗を伐採後の植林地に植林する工程を含む、新たな植林地を形成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ同定による優良木の植林、とくに優良木の品種を選定・決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工植林地においては、同じ林地に同じ樹種を植林した場合でも、樹種内のクローン（品種）の違いにより局所的に成長量の差が生じる場合がある。したがって、優良な植林地を形成するためには、土地ごとに固有の生育環境に適した品種を植林する必要がある。
【０００３】
植林のためのクローンを同定・決定するための方法には、
（イ）植栽時の記録をたどる
（ロ）植林木の形態から推定する
（ハ）様々な品種を植えた次世代検定林での成長結果から判定する（特許文献１）
といった方法がある。
また近年においては、ＤＮＡ同定によりクローンを決定する方法も知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１１５７６８号公報
【特許文献２】再公表２００８−１２０６５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記（イ）〜（ハ）の方法には、いずれにも資料や知見の確実性や、結果取得に長い時間を要するといった問題点がある。また、ＤＮＡ同定によるクローンの決定による方法は、葉や根の部分の剥皮にて形成層を取得することによって得られる材料からＤＮＡの抽出を行う必要がある。すなわち、この方法にも、材料のサンプリングに多大なる手間と時間を要するといった欠点がある。
したがって、植林のための優良木についての正確な情報を簡便に得ることは困難であるのが現状である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡを用いる方法において、ＤＮＡを抽出するための材料として葉や根の形成層以外の部位を用いることができる可能性があることを見出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、少なくとも以下の発明に関する。
（１）植林地の木を伐採した後の場所に新たな植林地に植える木の品種を決定するための、以下の工程を含む方法：
（ａ）木が伐採される前の植林地において、生育が他の木より優れている木を特定する工程；
（ｂ）前記生育が他の木より優れている木の個体の幹の組織の一部を採取する工程；
（ｃ）前記採取された組織の一部からＤＮＡを抽出する工程；
（ｄ）該ＤＮＡにおける塩基配列の部分のうち、クローンを特定することができる特徴的な部分により、前記生育が他の木より優れている木のクローンを特定する工程；および
（ｅ）前記特定されたクローンと同一のクローンである品種を決定する工程。
【０００７】
（２）伐採される前の植林地における木の樹高が１０ｍ以上である前記方法。
（３）生育が他の木より優れている木として２本以上の木を選択し、該２本以上の木のクローンを特定すること、および生育が優れていない木を少なくとも１本選択し、該少なくとも１本の木のクローンを特定することを含む、前記いずれかの方法。
【０００８】
（４）組織の一部の採取に成長錘が用いられる、前記いずれかの方法。
（５）クローンを特定することができる特徴的な部分がマイクロサテライトである、前記いずれかの方法。
（６）木の種類がスギまたはヒノキである、前記いずれかの方法。
（７）前記いずれかの方法により決定された品種の苗を伐採後の植林地に、植林する工程を含む、新たな植林地を形成する方法。
【０００９】
本発明は、クローン間の生育に差を生じさせる、植林予定地に固有の環境の影響を優良木の選定において考慮するとともに、木の幹の組織からＤＮＡを有効に抽出することが可能であるという本発明者らによって初めて見出された新たな知見に基づいてなされたものである。
【００１０】
遺伝学的な手法を用いる方法として、胸高直系や繊維長といった木の生育パラメータと相関を有するバイオマーカーを特定し、植林５年後の形態を予測するといった方法もある（特許文献２）。しかしながら、かかる方法においては環境要因の影響が考慮されていないため、必ずしも最適なクローンを選定できるとは限らないのである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法は、植栽時の記録に頼ったり検定林を設定したりする必要がないため、いかなる植林地または人工林にも適用可能であるばかりでなく、植林のための優良木についてのより客観的かつ正確な情報を、より簡便に得ることが可能にする。また、本発明の方法は、季節や年次変動といった環境要因の影響を受けることなく正確な情報を与えるものである。
また、本発明の方法は、樹種や品種あるいはクローンの種類による影響を受けないばかりでなく、クローン間の生育の差を積極的に利用するものである。
【００１２】
本発明のうち、伐採される前の植林地における木の樹高が１０ｍ以上である方法においては、従来はＤＮＡ抽出のための材料を採取し難かった木からも該材料を容易に取得することができる。
本発明のうち、生育が他の木より優れている木として２本以上の木を選択し、該２本以上の木のクローンを特定すること、および生育が優れていない木を少なくとも１本選択し、該少なくとも１本の木のクローンを特定することを含む上記いずれかの方法によれば、植林のための優良木についてのさらにより一層正確な情報を得ることができる。
【００１３】
本発明のうち、組織の一部の採取に成長錘が用いられる方法によれば、組織の採取を、木を傷めることなくより簡便に行うことができる。
本発明のうち、クローンを特定することができる特徴的な部分がマイクロサテライトである方法によれば、植林のための優良木について、さらにより一層正確な情報を得ることができる。
本発明のうち、木の種類がスギまたはヒノキである方法によれば、これらの樹種の優良な植林地を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ある林地において測定したスギの個体サンプルの胸高直径と樹高とを示す図である。模様を付けた記号は、アオシマアラカワであることが事後的に判明した個体についてのデータであることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明についてより詳細に説明する。
本発明の方法は、前記のとおり植林地の木を伐採した後の場所に新たな植林地に植える木の品種を決定するための、以下の工程を含む方法である：
（ａ）木が伐採される前の植林地において、生育が他の木より優れている木を特定する工程；
（ｂ）前記生育が他の木より優れている木の個体の幹の組織の一部を採取する工程；
（ｃ）前記採取された組織の一部からＤＮＡを抽出する工程；
（ｄ）該ＤＮＡにおける塩基配列の部分のうち、クローンを特定することができる特徴的な部分により、前記生育が他の木より優れている木のクローンを特定する工程；および
（ｅ）前記特定されたクローンと同一のクローンである品種を特定する工程。
【００１６】
上記（ａ）〜（ｅ）の工程は生育が他の木より優れている木のクローンを特定し、もって植林に供試するべき品種を決定するための工程である。品種の決定にデータベースを用いることは好ましい。
クローンによっては品種が特定・決定できない場合や適した品種の苗木が入手できない場合がある。このような場合には、二番目に生育が優れた品種を特定し、植林対象品種とするといった作業を順次繰り返せばよい。
【００１７】
前記（ａ）工程において、生育の度合いの指標は限定されないところ、胸高直径や樹高、比重、繊維長等が用いられる。
前記（ｂ）工程において、採取される組織の量としては、例えば１ｃｍ３程度でよい。また、組織は幹から採取されたものであれば、採取される部位は限定されない。
【００１８】
組織の一部を採取する方法は、とくに限定されないところ、成長錘を用いる方法またはノミやオノを用いる方法等が用いられる。成長錘を用いる方法は好ましい。幹を傷めることなく組織を採取できるため、採取に用いられた木の生育を阻害しない上に建築用材資源としての価値を低減させないからである。
成長錘とは、樹齢を調査するために年輪を含む組織を採取するために通常用いられる器具であるところ、成長錘は本発明における組織の採取にも好適に用いられる。
【００１９】
伐採される前の植林地における木の種類や樹高、あるいは樹齢等は限定されない。植林地における木の樹高が１０ｍ以上の場合があるところ、このような場合であっても本発明の方法は容易に行うことができる。すなわち、従来の方法が、葉の採取を要し、そのため脚立等の用具を用いるといった手間がかかるばかりでなく危険を伴うこととは著しい対照をなす。したがって、植林地における木の樹高が１０ｍ以上である場合、本発明の方法は従来の方法に対する優位性を有する。
【００２０】
本発明の方法のうち、生育が他の木より優れている木として２本以上の木を選択すれば生育がより優良な木を選定することができるため好ましい。この場合、２本以上の木のクローンが一致すればそのクローンを選定すればよい。クローンが一致しない場合には、さらに別の木のクローンを特定し、クローンの種類と生育との相関を調べることによって最も生育が優れたクローンを選定することができる。
【００２１】
本発明の方法のうち、生育が他の木より優れている木として５本以上の木を用いるものはより好ましく、１０本以上の木を用いるものはさらにより好ましい。
また、本発明の方法のうち、生育が他の木より優れている木として２本以上の木を選択し、さらに、生育が優れていない他の木を少なくとも１本選択し、該少なくとも１本の木のクローンを特定することを含む方法は好ましい。かかる方法においては、最も生育が優れたクローンの選定をさらにより一層正確に行うことができる。
【００２２】
前記（ｃ）工程において、組織の一部からＤＮＡを抽出する工程としては、本技術分野において通常用いられる方法を用いることができる。
【００２３】
前記（ｄ）工程において、ＤＮＡにおける塩基配列の部分のうちクローンを特定することができる特徴的な部分はとくに限定されないところ、マイクロサテライト、ＲＡＰＤ法およびＲＦＬＰ法に用いられるもの等が例示される。本発明のうち、マイクロサテライトを用いる方法は好ましい。
マイクロサテライトとは、細胞核やオルガネラのゲノム上に存在する反復配列で、とくに数塩基の単位配列の繰り返しからなるものである。マイクロサテライトは、ゲノム中に広く散在しており、普通は中立で共優性を示すことから、個体識別のための遺伝マーカーとして利用されているものである。
【００２４】
前記（ｅ）工程において、前記特定されたクローンと同一のクローンである品種を特定するには、主要な品種についてのデータベースを用いることができる。かかるデータベースとして既存のものを用いてよいし、新たに作成されたものを用いてもよい。
なお、これらのデータベースの作成において用いられる植物体の部位は限定されず、幹のみならず葉や根を用いてもよい。
【００２５】
本発明において木の種類はもちろん限定されないところ、スギ、ヒノキ、カラマツ、ポプラ、ユーカリ等が例示される。スギまたはヒノキといった樹種に対しても本発明の方法は好ましく用いられる。
【００２６】
本発明の伐採後の植林地に新たな植林地を形成する方法は、上記いずれかの方法により特定されたクローンと同一のクローンである品種の苗を植林する工程を含むものである。植林の方法自体は限定されず、通常の方法を用いることができ。
【００２７】
実施例によって、本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例はいかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【００２８】
（実施例１）
（１）試料採取
（ａ）樹齢４０〜５０年生程度のいくつかのスギ植林地において、生育が優れた個体および該生育が優れた個体より生育が劣る個体を選択した。
（ｂ）樹高および胸高直径（地際から１２０ｃｍの部位）を測定した。
（ｃ）成長錐により、樹皮を含む木部を採取した。
（ｄ）試料はＤＮＡが分解しないようにシリカゲル（乾燥剤）を入れた袋に入れて持ち帰った。
【００２９】
（２）ＤＮＡ抽出
Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ社製  ＤＮＡ抽出キット  Ｃｈｌｏｒｏｐｕｒｅを用いて、キット付属のプロトコールを一部改変してＤＮＡ抽出した。すなわち、
（ａ）２ｍＬのチューブに５ｍｍ角程度の木部と、ステンレスビーズおよび３００μＬのキット付属のｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加える。
（ｂ）ＴＯＭＹ製の粉砕機  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ（型番ＭＳ−１００）で粉砕する（５０００ｒｐｍ、６０秒）。
（ｃ）遠心機で上清と残渣に分離し、上清１５０μＬを９６穴プレートに入れる。
（ｄ）６μＬのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと１５０μＬの１００％  イソプロパノールを加え、ピペッティングにより撹拌する。
（ｅ）室温で５分間、インキュベートする。
（ｆ）マグネットプレートに９６穴プレートを２〜４分間載せ、ＤＮＡの結合したマグネットビーズを分離する。
（ｇ）ピペットにより上清を除く。
（ｈ）３００μＬのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングにより撹拌する。
（ｉ）マグネットプレートに９６穴プレートを２〜４分間載せ、ＤＮＡの結合したマグネットビーズを分離する。
（ｊ）ピペットにより上清を除く。
（ｋ）３００μＬの７０％  エタノールを加え、ピペッティングにより撹拌する。
（ｌ）マグネットプレートに９６穴プレートを２〜４分間載せ、ＤＮＡの結合したマグネットビーズを分離する。
（ｍ）ピペットにより上清を除く。
（ｎ）ｋから繰り返し、エタノールで合計２回洗浄する。
（ｏ）室温で５分間、乾燥させる。
（ｐ）５０μＬの滅菌水を加え、ピペッティングにより撹拌する。
（ｑ）室温で２分間、インキュベートし、マグネットビーズからＤＮＡを溶出させる。
（ｒ）マグネットプレートに９６穴プレートを２〜４分間載せ、マグネットビーズを分離する。
（ｓ）ＤＮＡを含む上清を回収し、以下の実験に供する。
【００３０】
（３）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
キアゲン社製  Ｔｙｐｅ−ｉｔ  Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用いてマイクロサテライト領域を増幅した。すなわち、
２  Ｘ  Ｔｙｐｅ−ｉｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ５．０μＬに抽出したＤＮＡを１．０μＬ、キット付属のＱ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１．０μＬ、蛍光ラベルしたプライマーＭｉｘ（それぞれ２０ｐｍｏｌ／μＬ）を１．０μＬ加え、ＲＮａｓｅフリー水で全量を１０μＬにした。
【００３１】
ＰＣＲはアプライドバイオシステムズ社製  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用い、以下の反応条件で行った。すなわち、
９５℃  ５分間の酵素活性化ステップの後、
９５℃  ３０秒、５３℃  ９０秒、７２℃  ３０秒のサイクルを３５回行い、
６０℃  ３０分、加温した。
【００３２】
（４）遺伝子型の決定
増幅産物  １μＬに、１０μＬのＨｉＤｉホルムアミドと０．２μＬのＧｅｎｅＳｃａｎ  ６００  ＬＩＺ  ｓｉｚｅ  ｓｔａｎｄａｒｄを加えた後、９５℃で２分間加熱し、直ちに氷上で急冷した。
サンプルをアプライドバイオシステムズ社製  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析し、アプライドバイオシステムズ社製  Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒで遺伝子型を決定した。
【００３３】
（５）品種データベースの作成
日本国内の林業技術センターからそれぞれ提供された品種名が既知のスギの葉を、上記と同じ方法で分析し遺伝子型を決定し、品種と遺伝子型についてのデータベースを作製した。該データベースの一部を以下に示す。
【表１】
2013172688.tif 000002
【００３４】
（６）解析
各林地で採取したスギサンプルの分析データと前記データベースとを照合し、各サンプルの品種またはクローンを決定した。
（７）結果
品種と測樹データ（樹高、胸高直径）から、林地ごとに適した品種を決定した。
たとえばある林地では、アオシマアラカワが植林するべき次世代品種として決定された（図１）。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明により、植林のための優良木についてのより正確な情報を、より簡便に得るための方法が提供される。とくに本発明は、日本国内における国産の建築用材を産出するための森林資源の維持・増大に資する方法としての利用価値が極めて大きい。したがって、本発明は国内外の植林産業およびその関連産業の発展に寄与するところ大である。
【図１】
2013172688.tif 000003