(57)【要約】【課題】容易に分配され、好ましくは、最小限の貯蔵後操作しか必要としない単純な処方によって、安定化した、長期間持続するタンパク質治療分子の処方物が必要である。【解決手段】本発明は、アルブミン融合タンパク質を含む。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子はまた、これらの核酸を含むベクター、これらの核酸ベクターで形質転換される宿主細胞、ならびに本発明のアルブミン融合タンパク質を生成し、そしてこれらの核酸、ベクター、および／または宿主細胞を使用する方法として、本発明によって包含される。さらに、本発明は、アルブミン融合タンパク質を含む薬学的組成物、および本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して、疾患、障害または状態を処置し、予防し、または改善する方法を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端を介して、配列番号１０３８のアミノ酸配列を含むヒトアルブミンのＮ末端に融合した、２つの縦列配向したＧＬＰ−１（７−３６（Ａ８Ｇ））を含むアルブミン融合タンパク質であって、該アルブミンが該ＧＬＰ−１（７−３６（Ａ８Ｇ））の保存寿命を非融合状態のＧＬＰ−１（７−３６（Ａ８Ｇ））よりも延長させ、かつ、該融合タンパク質がＧＬＰ−１活性を有する、アルブミン融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１記載のアルブミン融合タンパク質であって、該アルブミン融合タンパク質を発現する構築物を含む宿主細胞から生産され、ここに、該構築物が下記の構築物：
ｃ．配列番号１２３１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ２８０３）、
ｄ．配列番号１２３２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ２８０４）、
ｇ．配列番号１２８０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ３０７０）、
ｈ．配列番号１６０７のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ３０２７）、
ｊ．配列番号１６０９のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ３０４５）、
ｌ．配列番号１６２１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ３０６９）、
ｍ．配列番号１６２２のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ３０７１）、および
ｎ．配列番号１６２３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む構築物（構築物ＩＤ３０７２）
から選択される、アルブミン融合タンパク質。
【請求項３】
ａ．配列番号１２３１のアミノ酸２５〜６６９、
ｂ．配列番号１２３２のアミノ酸２５〜６６９、
ｈ．配列番号１２８０のアミノ酸３０〜６７４、
ｉ．配列番号１６０７のアミノ酸２０〜６６４、
ｋ．配列番号１６０９のアミノ酸１９〜６６３、
ｍ．配列番号１６２１のアミノ酸２４〜６６８、
ｎ．配列番号１６２２のアミノ酸８６〜７３０、および
ｏ．配列番号１６２３のアミノ酸１８〜６６２
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃ末端を介してヒトアルブミンのＮ末端に融合した、２つの縦列配向したＧＬＰ−１（７−３６（Ａ８Ｇ））を含むアルブミン融合タンパク質であって、ここに、該アルブミンが該ＧＬＰ−１（７−３６（Ａ８Ｇ））の保存寿命を非融合状態のＧＬＰ−１（７−３６（Ａ８Ｇ））よりも延長させ、かつ、該融合タンパク質がＧＬＰ−１活性を有する、アルブミン融合タンパク質。
【請求項４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４６７１に含まれる構築物３０７０のアミノ酸配列を含む宿主細胞から生産される、Ｃ末端を介してヒトアルブミンのＮ末端に融合した、２つの縦列配向したＧＬＰ−１（７−３６（Ａ８Ｇ））を含むアルブミン融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項６記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
グリコシル化または非グリコシル化されている、請求項１〜４のいずれか１項記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項９】
酵母において発現される、請求項１〜４のいずれか１項記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１０】
酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはピキア・パトリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）である、請求項９記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１１】
酵母がグリコシル化欠損性である、請求項９または１０記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１２】
酵母がグリコシル化欠損性で、かつ、プロテアーゼ欠損性である、請求項９〜１１のいずれか１項記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１３】
哺乳動物細胞中で発現される、請求項１〜４のいずれか１項記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１４】
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞またはＮＳＯ細胞である、請求項１３記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１５】
分泌リーダー配列をさらに含んでなる、請求項１〜４および８〜１４のいずれか１項記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜４および８〜１５のいずれか１項記載のアルブミン融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
高血糖、糖尿病、尿崩症、真性糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、インスリン抵抗性、インスリン欠損症、高脂血症、高ケトン尿症、非インスリン依存性真性糖尿病、インスリン依存性真性糖尿病、肥満、心臓疾患、網膜症、潰瘍、体重抑制、食欲抑制、代謝障害、免疫障害、感染症、血管障害、またはＸ症候群の治療において使用するための、請求項１６または１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
糖尿病の治療において使用するための、請求項１６または１７記載の医薬組成物。
【請求項２０】
２型糖尿病の治療において使用するための、請求項１６または１７記載の医薬組成物。
【請求項２１】
肥満または体重抑制の治療において使用するための、請求項１６または１７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、アルブミンまたはアルブミンのフラグメントもしくは改変体に融合された治療用タンパク質（少なくとも１つのポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントおよび改変体を含むが、これらに限定されない）に関する。本発明は、治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、治療用アルブミン融合タンパク質、組成物、薬学的組成物、処方物およびキットを包含する。治療用アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞もまた、本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチド、および／または宿主細胞を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法も同様に、本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
その成熟形態において５８５アミノ酸のタンパク質（図１（配列番号１０３８）において示されるように）であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、またはＨＡ）は、血清の浸透圧の重要な部分を担い、内因性リガンドおよび外因性リガンドのキャリアとしても機能する。現在では、臨床的使用のためのＨＡは、ヒト血液からの抽出によって生成される。微生物における組換えＨＡ（ｒＨＡ）の生成は、ＥＰ３３０４５１およびＥＰ３６１９９１に開示されている。
【０００３】
それらのネイティブな状態または組換え生成される場合の治療用タンパク質（例えば、インターフェロンおよび成長ホルモン）は、代表的には、短い貯蔵寿命を示す不安定な分子であり、特に水溶液中に処方される場合には、短い貯蔵寿命を示す不安定な分子である。投与のために処方される場合のこれらの分子の不安定性は、貯蔵の間の全てのときに分子の多くが凍結乾燥または冷蔵されなければならず、それによって、この分子を輸送および／または貯蔵するのが困難になることを支配する。貯蔵の問題は、薬学的処方物が、病院の環境の外で貯蔵および分配されなければならないときに、特に深刻である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
不安定なタンパク質分子の貯蔵問題に対する実際的な解決手段は、ほとんど提唱されていない。従って、容易に分配され、好ましくは、最小限の貯蔵後操作しか必要としない単純な処方によって、安定化した、長期間持続するタンパク質治療分子の処方物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（一部）もしくは改変体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは改変体）を含む、アルブミン融合タンパク質を包含する。本発明は、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは改変体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは改変体）をコードする核酸分子を含むかあるいはこれらからなるポリヌクレオチドもまた含む。本発明は、治療用タンパク質の貯蔵寿命を長期化し、そして／あるいはインビトロもしくはインビボでの治療用タンパク質および／または溶液中（もしくは薬学的組成物中）のその活性を安定化するために十分な、アルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは改変体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは改変体）をコードする核酸分子を含むかあるいはこれらからなるポリヌクレオチドもまた含む。本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアルブミン融合タンパク質もまた、本発明によって包含され、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞、ならびにこれら本発明のポリヌクレオチドおよび／または宿主細胞を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する方法もまた本発明によって包含される。
【０００６】
本発明の好ましい局面において、アルブミン融合タンパク質は、表２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるものを含むが、これらに限定されない。
【０００７】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および薬学的に受容可能な賦形剤もしくはキャリアを含む薬学的処方物を含む。このような処方物は、キットまたは容器中に存在し得る。このようなキットまたは容器は、治療用タンパク質の長期化した貯蔵寿命に関する説明書とともに包装され得る。このような処方物は、患者、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける疾患または疾患徴候を処置、予防、改善または診断する方法において使用され得、この方法は、この薬学的処方物を患者に投与する工程を包含する。
【０００８】
他の実施形態において、本発明は、疾患または傷害を予防、処置、または改善する方法を含む。好ましい実施形態において、本発明は、表１の「好ましい適応症Ｙ」列において列挙される疾患または障害を処置する方法を包含し、この方法は、このような処置、予防または改善が所望される患者に、この疾患または障害を処置、予防または改善するに有効な量において、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列に（処置される疾患または障害が、表１の「好ましい適応症Ｙ」列において列挙されるのと同じ行に）開示される治療用タンパク質または治療用タンパク質に対応する部分（そのフラグメントもしくは改変体）を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。
【０００９】
一実施形態において、表１または２に記載されるアルブミン融合タンパク質は、長期化した貯蔵寿命を有する。
【００１０】
第２の実施形態において、表１または２に記載されるアルブミン融合タンパク質は、表１に記載される、対応する非融合治療分子よりも安定である。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の核酸分子（表１および２に記載されるポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない）を含むように改変された、好ましくは本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように改変されたトランスジェニック生物を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒトアルブミンの成熟形態のアミノ酸配列（配列番号１０３８）およびこれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０３７）を示す。
【図２】図２は、ｐＰＰＣ０００５クローニングベクター（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７８）の制限マップを示す。
【図３】図３は、ｐＳＡＣ３５酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクター（Ｓｌｅｅｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２（１９９０））の制限マップを示す。
【図４】図４は、ＴＦ−１細胞の増殖に対する、構築物ＩＤ番号（本明細書中以降、ＣＩＤ）１９６６および１９８１に含まれるＤＮＡによってコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質、ならびに組換えヒトＥＰＯの種々の希釈物の効果を示す（実施例８および９を参照のこと）。細胞を３回洗浄して、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、ＣＩＤ１９６６タンパク質またはＣＩＤ１９８１タンパク質の３倍希釈物の存在下で、７２時間にわたり、１０，０００細胞／ウェルにてプレートした。使用される濃度は、ＨＳＡ＋Ｅｐｏではなく、Ｅｐｏ単独の重量に基づいて計算した。組換えヒトＥｐｏ（ｒｈＥｐｏ）をポジティブコントロールとして使用し、１００ｎｇ／ｍｌ〜０．０１ｎｇ／ｍｌまで３倍連続希釈した。細胞を、さらに１８時間、０．５ｍＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンに曝した。（白四角）ｒｈＥｐｏ；（逆向黒三角）ＨＳＡ−Ｅｐｏ１９８１；（黒丸）Ｅｐｏ−ＨＳＡ１９９６。
【図５】図５は、用量応答分析であり、０日目および７日目からのヘマトクリットの％変化に対する、組換えヒトＥＰＯならびにＣＩＤ１９６６およびＣＩＤ１９８１に含まれるＤＮＡによってコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の種々の用量の効果を示す（実施例８および９を参照のこと）。４８週齢のメスＤＢＡ／２ＮＨｓｄマウスを、各４匹の動物の１２群に分けた。組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥｐｏ）を、０．５、１．５、４．５および１２μｇ／ｋｇにて、０日目、２日目、４日目および６日目に、皮下注射した。構築物ＣＩＤ１９６６およびＣＩＤ１９８１から作製したＥｐｏアルブミン融合タンパク質を、２、６、１８および５４μｇ／ｋｇにて、０日目、２日目、４日目および６日目に、皮下注射した。より高用量のＥｐｏアルブミン融合タンパク質は、組換えヒトＥｐｏとのほぼ等モル比較を可能にする（融合物の重量は、非グリコシル化Ｅｐｏの重量の約４．３５倍であることに留意すること）。実験の０日目および７日目に、動物から尾静脈を介して採血し、ヘマトクリットを遠心分離により決定した。（黒四角）ｒｈＥｐｏ；（白丸）ＣＩＤ１９８１；（逆向黒三角）ＣＩＤ１９６６。
【図６Ａ】図６Ａは、０日目〜８日目までのヘマトクリットの％変化に対する、ＣＩＤ１９６６およびＣＩＤ１９９７それぞれに含まれるＤＮＡによってコードされるＥｐｏアルブミン融合タンパク質の種々の皮下投与の効果を示す（実施例８および１０を参照のこと）。＊、ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非母数分析によって決定される場合、ｒｈＥｐｏと比較した（ｎ＝６）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、０日目〜１４日目までのヘマトクリットの％変化に対する、ＣＩＤ１９９７およびＣＩＤ１９６６に含まれるＤＮＡによってコードされるＥｐｏアルブミン融合タンパク質の皮下投与の効果を示す（実施例８および１０を参照のこと）。＊、ｐ＜０．００５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非パラメーター分析によって決定される場合、ｒｈＥｐｏと比較した（ｎ＝６）；＊＊、ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ非パラメーター分析によって決定される場合、ｒｈＥｐｏと比較した（ｎ＝６）。
【図７】図７は、ＴＦ−１細胞増殖に対する、ＣＩＤ１９８１およびＣＩＤ１９９７それぞれに含まれるＤＮＡによりコードされる種々の希釈アルブミン融合タンパク質の効果を示す（実施例９および１０を参照のこと）。細胞を３回洗浄して、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、ＣＩＤ１９８１またはＣＩＤ１９９７によってコードされるＥｐｏアルブミン融合タンパク質の３倍希釈物の存在下で、７２時間にわたり、１０，０００細胞／ウェルにてプレートした。等モル量のｒｈＥｐｏをポジティブコントロールとして使用した（非グリコシル化Ｅｐｏの重量は、２０ｋｄであるのに対して、Ｅｐｏアルブミン融合タンパク質は、８７ｋｄであるので、約４．３５分の１のタンパク質を添加した）。細胞を、さらに２４時間、０．５μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンに曝した。（黒四角）ｒｈＥｐｏ標準；（黒三角）ＣＩＤ１９８１（ＣＨＯ）；（白丸）ＣＩＤ１９９７（ＮＳＯ）。
【図８】図８は、０日目〜８日目までのヘマトクリットの％変化に対する、組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥｐｏ）ならびに構築物１９９７（ＣＩＤ１９９７）に含まれるＤＮＡによってコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の種々の用量の効果を示す（実施例１０を参照のこと）。（黒三角）＝ｒｈＥｐｏ；（白四角）＝ＣＩＤ１９９７。
【図９】図９は、ＣＴＬＬ−２増殖に対する、ＣＩＤ１８１２に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例１５を参照のこと）。１×１０４細胞／ウェルを、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質（ＣＩＤ１８１２）の示された量を含む最終容積２００μｌの完全培地中、９６ウェルプレートに播種した。全サンプルを、三連で行った。細胞を３７℃で４０分間インキュベートし、次いで２０μｌのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを添加し、細胞を８時間インキュベートした。５３０／５９０の吸光度を、増殖の尺度として使用した。ＥＣ５０＝０．３８６±０．０２１。（白三角）＝ＣＩＤ１８１２。
【図１０】図１０は、２１日目のＲＥＮＣＡ腫瘍増殖に対する、ＣＩＤ１８１２に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の効果を示す（実施例１５を参照のこと）。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）に、１０５ＲＥＮＣＡ細胞を、ＳＣ注射（脇腹中央部）した。１０日後、ｒＩＬ２（０．９ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質（ＣＩＤ１８１２タンパク質；０．６ｍｇ／ｋｇ）、もしくはＰＢＳ（プラシーボ）の１日１回の注射（ＱＤ）、またはＣＩＤ１８１２タンパク質（０．６ｍｇ／ｋｇ）の一日おきの注射（ＱＯＤ）をマウスに与えた。腫瘍容積を、ＲＥＮＣＡ接種後の２１日目に決定した。データを、散乱分析で示す（各ドットは、１匹の動物を表す）。各群の平均値は、水平線によって示される。＊、ｐ＝０．００３５、プラシーボコントロールとＣＩＤ１８１２タンパク質との間。括弧の中の数字は、一群あたりのマウスの総数に対する生存していたマウスの数を示す。（白丸）＝プラセボ；（黒丸）＝ＩＬ２；（白三角）＝ＣＩＤ１８１２タンパク質（ＱＤ）；（白四角）＝ＣＩＤ１８１２タンパク質（ＱＯＤ）。
【図１１】図１１は、ＮＦＳ−６０細胞増殖に対する、ＣＩＤ１６４２およびＣＤＩ１６４３に含まれるＤＮＡによってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例１９および２０を参照のこと）。（黒四角）＝ＣＩＤ１６４２；（黒三角）＝ＣＩＤ１６４３；（白丸）＝ＨＳＡ。
【図１２】図１２は、総白血球数に対する組換えヒトＧＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）およびＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の効果を示す（実施例１９を参照のこと）。各日における総ＷＢＣ（１０３細胞／μｌ）を、群平均±ＳＥＭとして示す。ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を、４日ごとに４回（Ｑ４Ｄ）、２５μｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇのいずれかで、あるいは７日ごとに２回（Ｑ７Ｄ）、１００μｇ／ｋｇでｓｃ注射した。ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質１００μｇ／ｋｇ  Ｑ７についての８日目および９日目のデータを、他の群との比較を容易にするために、それぞれ、９日目および１０日目として示す。コントロールは、４日ごとに４回ｓｃ注射した生理食塩水ビヒクル（ビヒクルＱ４Ｄ）または毎日１回１４回ｓｃ投与したＮｅｕｐｏｇｅｎ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ  ５μｇ／ｋｇ  ＱＤ）であった。処置期間は、１〜１４日目、回復期間は、１５から２８日目と考えられる。
【図１３】図１３は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞におけるＳＥＡＰ活性に対する、ＣＩＤ２０１１およびＣＩＤ２０５３に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例２５を参照のこと）。タンパク質を、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で５ｅ−７〜ｌｅ−１４ｇ／ｍｌまで連続希釈し、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞を処理するために使用した。２４時間後に、上清をレポーター細胞から取り出し、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした。ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質を３つの安定なクローン：２９３Ｆ／＃２０１１、ＣＨＯ／＃２０１１およびＮＳＯ／＃２０５３から精製した。哺乳動物由来ＩＦＮｂであるＡｖｏｎｅｘはＢｉｏｇｅｎ製であり、２．０ｅ５  ＩＵ／μｇの比活性を有することが報告された。
【図１４】図１４は、ＧＬＰ−１または構築物ＩＤ３０７０（ＣＩＤ３０７０タンパク質）によってコードされるＧＬＰ−１アルブミン融合タンパク質で処置した後のＩＮＳ−１（８３２／１３）細胞におけるインスリンｍＲＮＡの定常レベルを例示する。ＧＬＰ−１およびＣＩＤ３０７０タンパク質の両方とも、ＩＮＳ−１細胞におけるインスリン遺伝子の転写を刺激する。最初のバー（黒）は、非処理細胞を示す。バー２〜４（白）は、示された濃度のＧＬＰ−１で処理した細胞を示す。バー５〜７（灰色）は、示された濃度のＣＩＤ３０７０タンパク質で処理した細胞を示す。
【図１５】図１５は、Ｈｓ２９４Ｔ黒色腫細胞に対する、ＣＩＤ３１６５（ＣＩＤ３１６５タンパク質）によってコードされるＩＦＮアルブミン融合タンパク質および組換えＩＦＮａ（ｆＩＮＦα）の抗増殖活性を比較する。細胞を、種々の濃度のＣＩＤ３１６５タンパク質またはｒＩＦＮａのいずれかとともに培養し、増殖を、培養の３日後にＢｒｄＵ組み込みによって測定した。ＣＩＤ３１６５タンパク質は、１０ｎｇ／ｍｌを上回る濃度で細胞増殖の測定可能な阻害を引き起こし、５０％阻害は、約２００ｎｇ／ｍｌで達成された。（黒四角）＝ＣＩＤ３１６５タンパク質、（黒菱形）＝ｒＩＦＮａ。
【図１６】図１６は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞におけるＳＥＡＰ活性に対する、ＩＦＮａアルブミン融合タンパク質の種々の規約物の効果を示す。アルブミンの上流に融合したＩＦＮａの１つの調製物（黒菱形）を試験し、アルブミンの下流に融合したＩＦＮａの２つの異なる調製物（黒三角）および（黒四角）もまた試験した。
【図１７】図１７は、処置サルにおけるＯＡＳ（ｐ４１）のｍＲＮＡレベルに対する、時間および構築物２２４９（ＣＩＤ２２４９タンパク質）に含まれるＤＮＡによってコードされるＩＦＮａアルブミン融合タンパク質の用量の効果を示す（実施例３１を参照のこと）。時点あたり：最初のバー＝ビヒクルコントロール、第２のバー＝３０μｇ／ｋｇ  ＣＩＤ２２４９タンパク質１日目ｉｖ、第３のバー＝３０μｇ／ｋｇ  ＣＩＤ２２４９タンパク質１日目ｓｃ、第４のバー＝３００μｇ／ｋｇ  ＣＩＤ２２４９タンパク質１日目ｓｃ、第５のバー＝４０μｇ／ｋｇ  組換えＩＦＮａ１日目、３日目、および５日目ｓｃ。
【図１８】図１８は、３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞におけるグルコース取り込みに対する、構築物２２５０および２２７６に含まれるＤＮＡによってコードされるインスリンアルブミン融合タンパク質の種々の希釈物の効果を示す（実施例３３および３５を参照のこと）。
【図１９】図１９は、ＮＦＳ細胞増殖に対する、種々のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質（ＣＩＤ＃１６４３およびＣＩＤ＃２７０２（Ｌ−１７１，実施例１１４を参照のこと）によりコードされるものを含む）の効果を示す。水平破線は、最小検出レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
（定義）
以下の定義は、本明細書を通して使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも１つの治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメントもしくは改変体）の対してインフレームで連結される少なくとも一分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）を含むかあるいはこれらからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｙのアミノ酸配列（表２の第６列に記載される）またはそのフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｘに示される配列を含むかあるいはこれからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号Ｚのアミノ酸配列を含むかあるいはこれからなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；表２または実施例に記載されるように生成される本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子；本発明の治療用アルブミン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子、表２に記載されるアルブミン融合構築物中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいはＡＴＣＣに寄託されたアルブミン融合構築物（表３に記載される）中に含まれるヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「アルブミン融合構築物」とは、少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結される少なくとも１分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードするポリヌクレオチドをふくむかあるいはこれらからなる核酸分子；表２または実施例に記載されるように生成される少なくとも一分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで融合される少なくとも１つのアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはこれらからなる核酸分子；あるいは例えば、以下のエレメント：（１）機能的な自己複製ベクター（シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクター、および／または複製系）、（２）転写の開始のための領域（例えば、調節可能プロモーターまたは誘導性プロモーター、構成プロモーターのようなプロモーター領域）、（３）転写の終結のための領域、（４）リーダー配列、および（５）選択マーカー、のうちの１以上をさらに含む少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結される少なくとも一分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）をコードするポリヌクレオチドを含むかあるいはこれらからなる核酸。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一旦アルブミン融合構築物の一部になると、各々、アルブミン融合構築物の「一部」、「領域」、または「部分」ともいわれ得る。
【００１６】
本発明は、一般に、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；アルブミン融合タンパク質；アルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、疾患または障害を処置、予防、または改善する方法に関する。本明細書中で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」とは、少なくとも一分子の治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）への少なくとも一分子のアルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の融合によって形成されるタンパク質をいう。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体を含み、これらは、遺伝的融合によって互いに結合される（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチドにインフレームで連結される核酸の翻訳によって生成される）。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、一旦アルブミン融合タンパク質の一部になると、おのおの、アルブミン融合タンパク質の「一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）」、「領域」または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」（例えば、「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）といわれ得る。非常に好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、少なくとも一分子の治療用タンパク質Ｘまたはそのフラグメントもしくは改変体（治療用タンパク質Ｘの成熟形態を含むが、これらに限定されない）および少なくとも一分子のアルブミンまたはそのフラグメントもしくは改変体（アルブミンの成熟形態を含むが、これらに限定されない）を含む。
【００１７】
さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主細胞によってプロセシングされ、周りの培養培地に分泌される。発現のために使用される宿主の分泌経路において生じる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングは、シグナルペプチド切断；ジスルフィド結合形成；適切な折りたたみ；糖質の付加およびプロセシング（例えば、Ｎ結合型グリコシル化およびＯ結合型グリコシル化）；特異的タンパク質切断；およびマルチマータンパク質へのアセンブリが挙げられ得るが、これらに限定されない。
本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、プロセシングされた形態である。最も好ましい実施形態において、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」とは、Ｎ末端シグナルペプチド切断をうけたアルブミン融合タンパク質産物をいう（本明細書中「成熟アルブミン融合タンパク質」ともいう）。
【００１８】
いくつかの例において、本発明のアルブミン融合構築物を含む代表的クローンを、アメリカンタイプカルチャーコレクション（本明細書中、「ＡＴＣＣ（登録商標）」と称する）に寄託した。さらに、当該分野で公知の技術および本明細書中に記載の技術によって、寄託物から所定のアルブミン融合構築物を回収することが可能である。ＡＴＣＣ（登録商標）は、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。
好ましい実施形態において、本発明は、表２に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらに好ましい実施形態において、本発明は、表２において配列番号Ｙとしてその配列が示されるアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメント、ならびに血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な改変体、ならびに血清アルブミンタンパク質を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟形態である。本発明はさらに、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００２０】
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントを含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性な改変体を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟形態である。さらに好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の細胞外可溶性ドメインである。代替的実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の活性形態である。本発明はさらに、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００２１】
さらなる実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体、ならびに血清アルブミンの生物学的に活性なおよび／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟形態を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質を提供する。本発明は、これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに包含する。
【００２２】
（治療用タンパク質）
上記のように、本発明のポリヌクレオチドは、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるタンパク質をコードし、これらは、互いに、好ましくは遺伝的融合によって結合している。
【００２３】
さらなる実施形態は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるタンパク質をコードし、これらは、互いに化学的結合体化によって連結されている。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「治療用タンパク質」とは、１以上の治療的および／または生物学的活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体をいう。本発明によって包含される治療用タンパク質は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が挙げられるが、これらに限定されない（用語ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドは、本明細書中で交換可能に使用される）。用語「治療用タンパク質」は、抗体、およびそのフラグメントもしくは改変体を包含する。従って、本発明のタンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体、および／または抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含み得る。さらに、用語「治療用タンパク質」は、治療用タンパク質の内因性相関物または天然に存在する相関物をいい得る。
【００２５】
「治療的活性」を示すポリペプチドまたは「治療的に活性」であるタンパク質とは、本明細書中に記載の治療用タンパク質またはさもなければ当該分野で公知の１以上の治療用タンパク質のような、治療用タンパク質と関連する１つ以上の既知の生物学的活性および／または治療的活性を保有するポリペプチドを意味する。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、状態または障害を処置、予防、または改善するために有用なタンパク質である。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、特定の細胞型（正常（例えば、リンパ球）または異常（例えば、癌細胞））に特異的に結合するタンパク質であり、従って、その細胞型化合物（薬物または細胞傷害性薬剤）を特異的に標的化するために使用され得る。
【００２６】
例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質によって含まれ得る「治療用タンパク質」部分の非網羅的列挙は、以下を含むが、これらに限定されない：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、インスリン、カルシトニン、成長ホルモン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＰＴＨ、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＢＬｙＳ、ＢＬｙＳ単鎖抗体、Ｒｅｓｉｓｔｉｎ、成長ホルモン放出因子、ＶＥＧＦ−２、ＫＧＦ−２、Ｄ−ＳＬＡＭ、ＫＤＩ、およびＴＲ２、ＧＬＰ−１、Ｅｘｔｅｎｄｉｎ  ４およびＧＭ−ＣＳＦ。
【００２７】
インターフェロンハイブリッドはまた、アルブミンのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合されて、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質を形成し得る。
インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、インターフェロン活性（例えば、抗ウイルス応答、細胞増殖の調節および免疫応答の調節）を増強し得るか、あるいはインターフェロン活性を抑制し得る（Ｌｅｂｌｅｕら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，７３：３１０７−３１１１（１９７６）；Ｇｒｅｓｓｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５１：５４３−５４５（１９７４）；およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ，３５：３５７−３６９（１９７７））。各インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、ウイルス感染（例えば、肝炎（例えば、ＨＣＶ）；またはＨＩＶ）、多発性硬化症、または癌を処置、予防または改善するために使用され得る。
【００２８】
一実施形態において、そのインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンα−インターフェロンαハイブリッド（本明細書中、α−αハイブリッドといわれる）を含む。例えば、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンα  Ｄに融合されるインターフェロンα  Ａからなるかあるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、そのＡ／Ｄハイブリッドは、インターフェロンα  Ｄに共通のＢｇＥ制限部位において融合される。ここでＡ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα  Ａのアミノ酸１−６２に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα  Ｄのアミノ酸６４−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００２９】
【化１】
2013172734.tif 000002
ここでＸ１は、ＲまたはＫであり、Ｘ２はＡまたはＶであり（例えば、構築物＃２８７５を参照のこと）。さらなる実施形態において、このＡ／Ｄハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位において融合される。ここでこのＡ／ＤハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα  Ａのアミノ酸１−９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα  Ｄのアミノ酸９３−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００３０】
【化２】
2013172734.tif 000003
ここでＸ１は、ＲまたはＫであり、第２のＸ２は、ＡまたはＶである（例えば、構築物ＩＤ＃２８７２を参照のこと）。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。
【００３１】
さらなる実施形態において、そのインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンα  Ｆに融合されたインターフェロンα  Ａからなるかあるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、このＡ／Ｆハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位に融合され、ここでＡ／ＦハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα  Ａのアミノ酸１−９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα  Ｆのアミノ酸９３−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｆハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００３２】
【化３】
2013172734.tif 000004
ここでＸはＲまたはＫのいずれかである（例えば、構築物ＩＤ＃２８７４）。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。さらなる実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−αハイブリッド部分は、インターフェロンα  Ｂに融合されたインターフェロンα  Ａからなるかあるいはこれらを含む。代替的実施形態において、このＡ／Ｂハイブリッドは、一般的なＰｖｕＩＩＩ制限部位において融合され、ここでこのＡ／ＢハイブリッドのＮ末端部分は、インターフェロンα  Ａのアミノ酸１−９１に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα  Ｂのアミノ酸９３−１６６に対応する。例えば、このＡ／Ｂハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００３３】
【化４】
2013172734.tif 000005
ここでＸ１はＲまたはＫであり、Ｘ２からＸ５は、ＳＣＶＭまたはＶＬＣＤである（例えば、構築物ＩＤ＃２８７３を参照のこと）。これらのハイブリッドは、米国特許第４，４１４，５１０号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。
【００３４】
別の実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンβ−インターフェロンαハイブリッド（本明細書中で、β−αハイブリッドといわれる）を含む。例えば、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のβ−αハイブリッド部分は、インターフェロンα  Ｄに融合されるインターフェロンβ−１からなるかあるいはこれらを含む（インターフェロンα−１ともいわれる）。さらなる実施形態において、このβ−１／α  Ｄ  ハイブリッドが融合され、ここでＮ末端部分は、インターフェロンβ−１のアミノ酸１−７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンα  Ｄのアミノ酸７４−１６７に対応する。例えば、このβ−１／α  Ｄハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００３５】
【化５】
2013172734.tif 000006
ここでＸは、ＡまたはＶである。これらのハイブリッドは、米国特許第４，７５８，４２８号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）においてさらに記載される。
【００３６】
別の実施形態において、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンα−インターフェロンβハイブリッド（本明細書中で、α−βハイブリッドといわれる）を含む。例えば、インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のα−βハイブリッド部分は、インターフェロンβ−１に融合された、インターフェロンα  Ｄ（インターフェロンα−１ともいわれる）からなるかあるいはこれらを含む。さらなる実施形態において、このαＤ／β−１ハイブリッドは融合され、ここでＮ末端部分は、インターフェロンα  Ｄのアミノ酸１−７３に対応し、Ｃ末端部分は、インターフェロンβ−１のアミノ酸７４−１６６に対応する。
例えば、このαＤ／β−１ハイブリッドは、以下のアミノ酸配列を有する：
【００３７】
【化６】
2013172734.tif 000007
これらのハイブリッドは、米国特許第４，７５８，４２８号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）にさらに記載される。
【００３８】
さらなる実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、α−αインターフェロンハイブリッド、α−βインターフェロンハイブリッド、およびβ−αインターフェロンハイブリッドのさらなる組み合わせを含み得る。さらなる実施形態において、このインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質のインターフェロンハイブリッド部分は、インターフェロンハイブリッドのアミノ酸配列に対して変異、置換、欠失、または付加を含むように改変され得る。インターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質に対するこのような改変は、例えば、生成のレベルを改善し、安定性を増大し、活性を増大または減少し、あるいは新たな生物学的特性を付与するように行われ得る。
【００３９】
上記のインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、本発明によって包含され、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞およびベクターも同様に包含される。一実施形態において、上記のポリヌクレオチドによってコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、長期化した貯蔵寿命を有する。さらなる実施形態において、上記のポリヌクレオチドによってコードされるインターフェロンハイブリッドアルブミン融合タンパク質は、インビトロおよび／またはインビボにおいて、対応する非融合インターフェロンハイブリッド分子より長い血清半減期および／または溶液中（または薬学的組成物中）でのより安定した活性を有する。
【００４０】
別の非限定的例において、「治療用タンパク質」は、生物学的活性、特に、疾患を処置、予防または改善するために有用な生物学的活性を有するタンパク質である。治療用タンパク質によって保持され得る生物学的活性の非包括的列挙は、免疫応答の増強、新脈管形成の促進、新脈管形成の阻害、内分泌機能の調節、造血機能の調節、神経性腸の刺激、免疫応答の増強、免疫応答の阻害、あるいは以下の「生物学的活性」の節に記載され、そして／または表１（第２列）の所定の治療用タンパク質について開示される生物学的活性のうちの任意の１つ以上を含む。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「治療活性」または「活性」は、その効果が、ヒトにおける所望の治療的結果と一致するか、あるいは非ヒト哺乳動物または他の種もしくは生物において所望の効果に一致する活性をいい得る。治療的活性は、インビボまたはインビトロで、測定され得る。例えば、所望の効果は、細胞培養物中でアッセイされ得る。例として、ＥＰＯが治療用タンパク質である場合、実施例８に記載されるように、ＥＰＯの細胞増殖に対する効果は、治療的活性が測定されるエンドポイントとして使用され得る。このようなインビトロまたはアッセイまたは細胞培養物アッセイは、当該分野で記載されるように、多くの治療用タンパク質について市販されている。アッセイの例としては、実施例の節または表１の「例示的活性アッセイ」の列（第３列）において本明細書中で記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（例えば、細胞表面タンパク質および分泌タンパク質）は、しばしば、１以上のオリゴサッカリド基の結合によって改変される。グリコシル化といわれる改変は、タンパク質の物理的特性に劇的な影響を及ぼし得、タンパク質安定性、分泌および局在化において重要であり得る。グリコシル化は、ポリペプチド骨格に沿った特定の位置で起こる。グリコシル化には通常、２つの主要な型がある：Ｏ結合オリゴサッカリドにより特徴付けられるグリコシル化（これは、セリン残基またはスレオニン残基に結合される）；およびＮ結合型オリゴサッカリドによって特徴付けられるグリコシル化（これは、Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ配列におけるアスパラギン残基に結合され、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）。Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸としても公知）は、通常、Ｎ結合型オリゴサッカリドおよびＯ結合型オリゴサッカリドの両方の末端残基である。変数（例えば、タンパク質構造および細胞型）は、異なるグリコシル化部位における鎖内の糖質ユニットの数および性質に影響を及ぼす。グリコシル化アイソマーはまた、所定の細胞型内の同じ部位では共通する。
【００４３】
例えば、ヒトインターフェロンのいくつかの型は、グリコシル化されている。天然のヒトインターフェロン−α２は、スレオニン１０６においてＯグリコシル化されており、インターフェロン−α１４では、アスパラギン７２においてＮグリコシル化されている。（Ａｄｏｌｆら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２７６：５１１（１９９１）；Ｎｙｍａｎ  ＴＡら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２９：２９５（１９９８））。天然のインターフェロン−β１αのアスパラギン８０におけるオリゴサッカリドは、タンパク質の溶解性および安定性において重要な要因を担い得るが、その生物学的活性に必須ではない。このことは、安定性を増強するように配列改変により操作された非グリコシル化アナログ（インターフェロン−βｌｂ）の生成を可能にする（Ｈｏｓｏｉら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．８：３７５（１９８８；Ｋａｒｐｕｓａｓら，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５４：１２０３（１９９８）；Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．２：４２１（１９８２）；Ｒｕｎｋｅｌら，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １５：６４１（１９９８）；Ｌｉｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９６：９７（１９９８））。インターフェロン−γは、２５位および９７位において２つのＮ結合型オリゴサッカリド鎖を含み、これらはともに、生体活性組換えタンパク質の効率的な形成に重要であり、そのタンパク質の薬物動態特性に対して影響を有する（Ｓａｒｅｎｅｖａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４２：１９１（１９９６）；Ｓａｒｅｎｅｖａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０３：８３１（１９９４）；Ｓａｒｅｎｅｖａら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１３：２６７（１９９３））。混合されたＯ結合型グリコシル化およびＮ結合型グリコシル化もまた、例えば、ヒトエリスロポエチンにおいて存在し、Ｎ結合型グリコシル化は、２４位、３８位および８３位に位置するアスパラギン残基において存在する一方で、Ｏ結合型グリコシル化は、１２６位に位置するセリン残基において存在する（Ｌａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３１１６（１９８６）；Ｂｒｏｕｄｙら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６５：３２９（１９８８））。
【００４４】
ＥＰＯアルブミン融合タンパク質のグリコシル化は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の活性および／または安定性に影響を及ぼし得る。アルブミン融合タンパク質のＥＰＯ部分は、グリコシル化のための３つのＮ結合部位を含み得、その部位の各々は、１つのテトラアンテナリー構造を有し得る。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、グリコシル化される場合、その分子の半減期は、増大され得る。一実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、グリコシル化される。別の実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、過剰にグリコシル化される（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）。
【００４５】
オリゴサッカリドにおいて共通して見出される糖の１つの型は、シアル酸である。ＥＰＯのＮ結合型グリコシル化部位の各テトラアンテナリー構造は、４つのシアル酸残基を有し得る。従って、好ましい実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、シアル酸を含む糖質基でグリコシル化される。さらなる実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、４つのシアル酸残基／テトラアンテナリー構造／部位を含む、シアル酸  対  タンパク質が１２：１以上のモル比で完全にシアル化されたＥＰＯタンパク質を含む。代替的実施形態において、このＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、過剰シアル化ＥＰＯタンパク質を含む。ここで、１つ、２つ、または３つのシアル酸残基は、シアル酸  対  タンパク質が１２：１未満のモル比で、各テトラアンテナリー構造／部位に結合される。
【００４６】
ＥＰＯアルブミン融合タンパク質のシアル化において使用され得る２つの型のシアル酸は、  Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）である。好ましい実施形態において、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎｅｕ５Ａｃを含む。より好ましくは、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の総シアル酸含有量は、少なくとも９７％  Ｎｅｕ５Ａｃである。最も好ましいのは、Ｎｅｕ５Ｇｃがほとんどまたは全くないＥＰＯアルブミン融合タンパク質構造である。
【００４７】
好ましくは、アルブミンＥＰＯ融合タンパク質は、少なくとも４モルのシアル化、より好ましくは、少なくとも８〜９モルのシアル化を有する。さらなる実施形態は、４モルのシアル化、５モルのシアル化、６モルのシアル化、７モルのシアル化、８〜９モルのシアル化、８モルのシアル化、９モルのシアル化、１０モルのシアル化、１１モルのシアル化、または１２モルのシアル化を有するアルブミンＥＰＯ融合タンパク質を含む。
【００４８】
タンパク質のシアル化の程度は、タンパク質の電荷およびクロマトグラフィーカラムに対するその保持時間を変化させる。従って、精製プロセスにおいて使用される特定のカラムクロマトグラフィー工程は、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質についてモニターまたは富化するために使用され得る。好ましい実施形態において、シアル化の量は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによってモニターされ得る。さらなる実施形態において、ＥＰＯアルブミン融合物の精製プロセスにおける工程は、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質について富化するために使用され得る。好ましい実施形態において、過剰シアル化ＥＰＯアルブミン融合タンパク質について富化するために使用され得る精製工程は、高アンモニウム塩によるウイルス粒子を除去するためのブチルセファロースＦＦ精製工程および最終的な精製工程のためのｐＨ６．８でのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを包含する。
【００４９】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、ならびにそれらのアナログおよび改変体に対応する治療用タンパク質は、１以上の部位でのグリコシル化が、それらが発現される宿主細胞により、またはそれらの発現の他の条件に起因して、それらの核酸配列の操作の結果として変化するように改変され得る。例えば、グリコシル化アイソマーは、グリコシル化部位を除去または導入することによって（例えば、アミノ酸残基の置換または欠失（例えば、グルタミンのアスパラギンへの置換）によって）生成され得るか、あるいは非グリコシル化組換えタンパク質が、タンパク質をグリコシル化しない宿主細胞において（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはグリコシル化欠損酵母において）タンパク質を発現することによって生成され得る。これらのアプローチは、以下でより詳細に記載され、当該分野で公知である。
【００５０】
治療用タンパク質、特に、表１に記載される治療用タンパク質、ならびにそれらの核酸およびアミノ酸配列は、当該分野で周知であり、公のデータベース（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ（例えば、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ）および定期購読契約型提供データベース（例えば、ＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）から入手可能である。本発明のポリヌクレオチドを誘導するために使用され得る治療用タンパク質の例示的ヌクレオチド配列は、表２の第７列「配列番号Ｘ」に示される。配列番号Ｘとして示される配列は、所定の治療用タンパク質（例えば、全長または成熟のいずれか）をコードする野生型ポリヌクレオチド配列であり得るか、またはいくつかの場合において、その配列は、この野生型ポリヌクレオチド配列（例えば、野生型治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の改変体であり得る。ここでこのポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、例えば、特定の種における発現；または野生型治療用タンパク質の改変体の改変体（すなわち、部位指向性変異体；対立遺伝子改変体））をコードするポリヌクレオチドのために最適化されている。同じ行に記載される構築物を得るために、配列番号Ｘとして示される配列を使用することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、配列番号Ｘが、全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部のみが、特定のＣＩＤを生成するために使用される場合、特定のフラグメントを増幅し、適切なベクターにこれをクローニングするために、分子生物学的技術（例えば、ＰＣＲ）によることは、当業者の技術範囲内である。
【００５１】
治療用タンパク質部分の本発明のアルブミン融合タンパク質に対応するさらなる治療用タンパク質は、表１の「治療用タンパク質Ｘ」の列（第１列）に開示される治療用タンパク質またはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変数改変体（ｖａｒｉａｂｌｅ）のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドによってコードされるアルブミン融合タンパク質の非網羅的列挙を提供する。第１列「治療用タンパク質Ｘ」は、治療用タンパク質分子を開示し、その次に、括弧には治療用タンパク質分子またはそのフラグメントもしくは改変体を含むかあるいはこれらからなるタンパク質の科学名および商標名を含む。「治療用タンパク質Ｘ」は、本明細書中で使用される場合、個々の治療用タンパク質分子、またはこの列において開示される所定の治療用タンパク質分子と関連する治療用タンパク質の群全体いずれかをいう。「生物学的活性」列（第２列）は、治療用タンパク質分子と関連した生物学的活性を記載する。第３列は、「例示的活性アッセイ」は、治療用タンパク質Ｘ、または治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質の治療的および／または生物学的活性を試験するために使用され得るアッセイを記載する参考文献を提供する。「例示的活性アッセイ」列に引用される参考文献の各々は、表１の「生物学的活性」列に示される対応する生物学的活性をアッセイするために、特に、参考文献に記載されるそれぞれの活性アッセイの記載に関して、それらの全体が本明細書中に参考として援用される（例えば、それらの材料および方法を参照のこと）。第５列「好ましい適応症Ｙ」は、治療用タンパク質Ｘまたは治療用タンパク質Ｘ（またはそれらのフラグメント）部分を含むアルブミン融合タンパク質によって処置、予防、診断、および／あるいは改善され得る疾患、障害、および／または状態を記載する。「構築物ＩＤ」列（第５列）は、参照される治療用タンパク質Ｘ（またはそのフラグメント）部分を含むかあるいはこれらからなるアルブミン融合タンパク質をコードする、表２に開示される例示的アルブミン融合構築物に対する関連を提供する。
【００５３】
【表１−１】
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【００５４】
【表１−２】
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【００５５】
【表１−３】
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【００５６】
【表１−４】
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【００５７】
【表１−５】
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【００５８】
【表１−６】
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【００５９】
【表１−７】
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【００６０】
【表１−８】
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【００６１】
【表１−９】
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【００６２】
【表１−１０】
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【００６３】
【表１−１１】
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【００６４】
【表１−１２】
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【００６５】
【表１−１３】
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【００６６】
【表１−１４】
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【００６７】
【表１−１５】
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【００６８】
【表１−１６】
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【００６９】
【表１−１７】
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【００７０】
【表１−１８】
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【００７１】
【表１−１９】
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【００７２】
【表１−２０】
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【００７３】
【表１−２１】
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【００７４】
【表１−２２】
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【００７５】
【表１−２３】
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【００７６】
【表１−２４】
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【００７７】
【表１−２５】
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【００７８】
【表１−２６】
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【００７９】
【表１−２７】
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【００８０】
【表１−２８】
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【００８１】
【表１−２９】
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【００８２】
【表１−３０】
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【００８３】
【表１−３１】
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【００８４】
【表１−３２】
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【００８５】
【表１−３３】
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【００８６】
【表１−３４】
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【００８７】
【表１−３５】
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【００８８】
【表１−３６】
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【００８９】
【表１−３７】
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【００９０】
【表１−３８】
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【００９１】
【表１−３９】
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【００９２】
【表１−４０】
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【００９３】
【表１−４１】
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【００９４】
【表１−４２】
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【００９５】
【表１−４３】
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【００９６】
【表１−４４】
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【００９７】
【表１−４５】
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【００９８】
【表１−４６】
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【００９９】
【表１−４７】
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【０１００】
【表２−１】
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【０１０１】
【表２−２】
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【０１０２】
【表２−３】
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【０１０３】
【表２−４】
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【０１０４】
【表２−５】
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【０１０５】
【表２−６】
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【０１０６】
【表２−７】
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【０１０７】
【表２−８】
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【０１０８】
【表２−９】
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【０１０９】
【表２−１０】
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【０１１０】
【表２−１１】
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【０１１１】
【表２−１２】
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【０１１２】
【表２−１３】
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【０１１３】
【表２−１４】
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【０１１４】
【表２−１５】
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【０１１５】
【表２−１６】
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【０１１６】
【表２−１７】
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【０１１７】
【表２−１８】
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【０１１８】
【表２−１９】
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【０１１９】
【表２−２０】
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【０１２０】
【表２−２１】
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【０１２１】
【表２−２２】
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【０１２２】
【表２−２３】
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【０１２３】
【表２−２４】
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【０１２４】
【表２−２５】
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【０１２５】
【表２−２６】
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【０１２６】
【表２−２７】
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【０１２７】
【表２−２８】
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【０１２８】
【表２−２９】
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【０１２９】
【表２−３０】
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【０１３０】
【表２−３１】
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【０１３１】
【表２−３２】
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【０１３２】
【表２−３３】
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【０１３３】
【表２−３４】
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【０１３４】
【表２−３５】
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【０１３５】
【表２−３６】
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【０１３６】
【表２−３７】
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【０１３７】
【表２−３８】
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【０１３８】
【表２−３９】
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【０１３９】
【表２−４０】
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【０１４０】
【表２−４１】
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【０１４１】
【表２−４２】
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【０１４２】
【表２−４３】
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【０１４３】
【表２−４４】
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【０１４４】
【表２−４５】
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【０１４５】
【表２−４６】
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【０１４６】
【表２−４７】
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【０１４７】
【表２−４８】
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【０１４８】
【表２−４９】
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【０１４９】
【表２−５０】
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【０１５０】
【表２−５１】
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【０１５１】
【表２−５２】
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【０１５２】
【表２−５３】
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【０１５３】
【表２−５４】
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【０１５４】
【表２−５５】
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【０１５５】
【表２−５６】
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【０１５６】
【表２−５７】
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【０１５７】
【表２−５８】
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【０１５８】
【表２−５９】
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【０１５９】
【表２−６０】
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【０１６０】
【表２−６１】
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【０１６１】
【表２−６２】
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【０１６２】
【表２−６３】
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【０１６３】
【表２−６４】
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【０１６４】
【表２−６５】
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【０１６５】
【表２−６６】
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【０１６６】
【表２−６７】
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【０１６７】
【表２−６８】
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【０１６８】
【表２−６９】
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【０１６９】
表２は、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる、本発明のポリヌクレオチドの非網羅的列挙を提供する。第５カラム「融合数」は、各ポリヌクレオチドの融合数を示す。第２列は、「構築物ＩＤ」は、本発明の各ポリヌクレオチドについての固有の数字による識別子を提供する。この構築物ＩＤは、表１の対応する行に列挙される所定の治療用タンパク質Ｘに対応する治療用タンパク質部分を含むかあるいはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するために使用され得る。ここでその構築物ＩＤは、第５列に列挙される。「構築物名」列（第３列）は、所定のアルブミン融合構築物またはポリヌクレオチドの名称を提供する。
【０１７０】
表２の第４列「説明」は、所定のアルブミン融合構築物の一般的な説明を提供し、第５列の「発現ベクター」は、所定のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれらからなるポリヌクレオチドがクローニングされたベクターを列挙する。
ベクターは、当該分野で公知であり、市販されるかまたは何れか他のところに記載される。例えば、実施例において記載される場合、（１）所定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターをうちの１つ以上を含むかあるいはこれらのうちの１以上からなる「発現カセット」は、簡便なクローニングベクターにアセンブリされ得、続いて、例えば、発現ベクターのような代わりのベクター（例えば、酵母発現ベクターまたは哺乳動物発現ベクターを含む）にアセンブリされ得る。一実施形態において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる発現カセットが、ｐＳＡＣ３５にクローニングされる。別の実施形態において、ＣＨＯ細胞における発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる発現カセットが、ｐＣ４にクローニングされる。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなるポリヌクレオチドは、ｐＣ４：ＨＳＡにクローニングされる。なおさらなる実施形態において、ＮＳ０細胞における発現のために、アルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなる発現カセットが、ｐＥＥ１２にクローニングされる。他の有用なクローニングおよび／または発現ベクターは、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【０１７１】
第６列「配列番号Ｙ」は、本発明のアルブミン融合タンパク質の全長アミノ酸配列を提供する。大部分の例において、配列番号Ｙは、コードされるアルブミン融合タンパク質の非プロセシング形態を示す（言い換えると、配列番号Ｙは、特定の構築物によってコードされるシグナル配列、ＨＳＡ部分、および治療部分全てを示す。本発明により具体的に意図されるのは、配列番号Ｙをコードするポリヌクレオチド全てである。これらのポリヌクレオチドが、細胞からコードタンパク質を発現するために使用される場合、その細胞の天然の分泌およびプロセシング工程は、表２の第４列および／または第１１列に列挙されるシグナル配列を欠くタンパク質を生成する。列挙されるシグナル配列の具体的アミノ酸配列は、後に、本明細書中に示されるか、または当該分野で周知である。従って、本発明の最も好ましい実施形態は、細胞によって生成されるアルブミン融合タンパク質（表２の第４列および／または第１１列に示されるリーダー配列を欠く）を含む。最も好ましいのは、表２の第４列および／または第１１列に列挙される特定のリーダー配列なしで、配列番号Ｙを含むポリペプチドである。これら２つの好ましい実施形態を含む組成物（薬学的組成物を含む）もまた、好ましい。さらに、表２の第４列および／または第１１列に列挙されるシグナル配列を、異なるシグナル配列（例えば、プロセシングされたアルブミン融合タンパク質の分泌を容易にするために、本明細書中で後に記載されるシグナル配列）で弛緩することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【０１７２】
第７列「配列番号Ｘ」は、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが得られ得る親核酸配列を提供する。一実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが得られ得るこの親核酸配列は、表Ｉに示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列を含む。代替的実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドが得られ得るこの親核酸配列は、表Ｉに示される治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の改変体もしくは誘導体（例えば、治療用タンパク質をコードする野生型遺伝子配列の、合成コドンで最適化された改変体）を含む。
【０１７３】
第８列「配列番号Ｚ」は、親核酸配列（配列番号Ｘ）の推定翻訳物を提供する。この親配列は、特定の構築物を得るために使用される全長親タンパク質、親タンパク質の成熟部分、野生型タンパク質の改変体もしくはフラグメント、または記載される構築物を作製するために使用され得る人工配列であり得る。当業者は、配列番号Ｚに示されるこのアミノ酸配列を使用して、所定の構築物によってコードされるアルブミン融合タンパク質のどのアミノ酸残基が、治療用タンパク質によって提供されるかを決定し得る。さらに、同じ行に記載される構築物を得るために、配列番号Ｚとして示される配列を使用することは、十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、配列番号Ｚが、全長タンパク質に対応するが、そのタンパク質の一部のみが、特定のＣＩＤを生成するために使用される場合、特定のフラグメントを増幅し、適切なベクターにこれをクローニングするために、分子生物学的技術（例えば、ＰＣＲ）によることは、当業者の技術範囲内である。
【０１７４】
第９列および第１０列においてそれぞれ提供される増幅プライマー「配列番号Ａ」および「配列番号Ｂ」は、所定のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードする核酸分子を含むかあるいはこれからなるポリヌクレオチドを生成するために使用される例示的プライマーである。本発明の一実施形態において、第９列および第１０列において示される配列（配列番号Ａおよび／またはＢ）を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する行の第７列に提供されるヌクレオチド配列（配列番号Ｘ）を含むかあるいはこれからなる核酸分子をテンプレートＤＮＡとして使用して、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用される。ＰＣＲ法は、当該分野で十分に確立されている。さらなる有用なプライマー配列は、容易に想定され得、当業者によって利用され得る。
【０１７５】
代替的実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートＤＮＡ配列内に変異を生成するために、重複ＰＣＲ反応において使用され得る。ＰＣＲ法は、当該分野で公知である。
【０１７６】
表３に示されるように、本出願において開示される特定のアルブミン融合構築物は、ＡＴＣＣ（登録商標）に寄託されている。
【０１７７】
【表３】
2013172734.tif 000124
2013172734.tif 000125
当該分野で公知の技術および本明細書中他の箇所に記載される技術（例えば、実施例４０を参照のこと）により、寄託物から構築された所定のアルブミン融合構築物を回収することが可能である。ＡＴＣＣは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに存在する。
ＡＴＣＣへの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の規定に準じてなされた。
【０１７８】
本発明のさらなる実施形態において、（１）所定のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）リーダー配列、（３）プロモーター領域、および（４）転写ターミネーターのうちの１つ以上を含むかあるいはそれらからなる「発現カセット」が、１つのベクターから他のベクターへと移動または「サブクローニング」され得る。サブクローニングされるフラグメントは、当該分野で周知の方法（例えば、ＰＣＲ増幅（例えば、配列番号ＡまたはＢに示される配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて）および／または制限酵素消化）により生成され得る。
【０１７９】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療活性および／または治療活性に対応する生物学的活性および／または表１の対応する行に列挙されるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質の生物学的活性を有し得る。さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療活性タンパク質部分は表２の配列番号Ｘの列に示される配列によりコードされるタンパク質のフラグメントまたは改変体であり、対応する治療タンパク質の治療活性および／または生物学的活性を有し得る。
【０１８０】
（成長ホルモンの非ヒトアルブミン融合タンパク質）
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質では、非ヒト動物種の１つ以上の血清アルブミンタンパク質が、同じ非ヒト動物種の１つ以上の成長ホルモンタンパク質に、そのＮ末端またはＣ末端のいずれかでタンデムかつインフレームで融合されている。非ヒト血清アルブミンおよび成長ホルモンタンパク質は、当該分野で周知であり、かつ公開されているデータベースにて利用可能である。例えば、表４は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて見出される非ヒト血清アルブミン配列（第２列）および非ヒト成長ホルモン配列（第３列）に対応する登録番号を示す。好ましい実施形態において、表４に列挙される非ヒト動物種由来の血清アルブミンタンパク質は、同じ非ヒト動物種由来の成長ホルモンタンパク質に融合される。
【０１８１】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質では、表４、第２列に列挙される１つ以上のＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓ血清アルブミンタンパク質が、表４、第３列に列挙される１つ以上のＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓ成長ホルモンに、そのＮ末端またはＣ末端でタンデムかつインフレームで融合されている。
【０１８２】
非ヒト血清アルブミンのフラグメントまたは改変体（例えば、血清アルブミンの成熟形態）を含む融合タンパク質もまた、本発明により包含される。非ヒト成長ホルモンタンパク質（例えば、成長ホルモンの成熟形態）のフラグメントまたは改変体を含む融合タンパク質もまた、本発明により包含される。好ましくは、非ヒト成長ホルモンフラグメントおよび改変体は、成長活性を保持する。
【０１８３】
本発明のポリヌクレオチドは、上記の非ヒトアルブミン融合タンパク質をコードする１つ以上の核酸分子を含むかあるいはそれらからなる。例えば、そのポリヌクレオチドは、対応する非ヒト動物種の非ヒト成長ホルモンタンパク質（例えば、表４、第３列に列挙される成長ホルモン参照配列）をコードする１つ以上の核酸分子を含むかあるいはそれらからなるポリヌクレオチドに、５’または３’のいずれかで、タンデムかつインフレームで融合された、表４、第１列に列挙される非ヒト動物種由来の血清アルブミンタンパク質（
例えば、表４、第２列に列挙される非ヒト血清アルブミン参照配列）をコードする１つ以上の核酸分子を含むかあるいはそれらからなり得る。
【０１８４】
上記の非ヒトアルブミン融合タンパク質は、本発明により包含され、これらのポリヌクレオチドを含む宿主細胞およびベクターもまた同様である。１つの実施形態において、上記のポリヌクレオチドによりコードされる非ヒトアルブミン融合タンパク質は、延長された有効期間を有する。さらなる実施形態において、上記のポリヌクレオチドによりコードされる非ヒトアルブミン融合タンパク質は、対応する非融合成長ホルモン分子よりも、インビトロおよび／またはインビボで、溶液（または薬学的組成物）中でより長い血清半減期および／またはより安定した活性を有する。
【０１８５】
本発明はまた、非ヒト動物種における疾患または障害を予防、処置、または緩和する方法を包含する。特定の実施形態において、本発明は、獣医学的疾患または障害を処置する方法を包含し、この方法は、このような処置、予防、または緩和が所望される非ヒト動物種に、この疾患または障害を処置、予防、または緩和するのに有効な量で、成長ホルモンタンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に対応する成長ホルモン部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。処置、予防、または緩和され得る獣医学的疾患および／または障害としては、成長障害（例えば、下垂体性小人症）、皮膚疼痛、肥満、成長ホルモン応答性皮膚疾患、拡張型心筋症、食餌障害、生殖障害、および内分泌障害が挙げられる。
【０１８６】
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、皮膚創傷、角膜損傷、骨折、および関節、腱、または靱帯の損傷の治療を促進するのに使用され得る。
【０１８７】
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、製乳動物におけるミルク生成を増加させるために使用され得る。好ましい実施形態において、製乳動物は、乳牛である。
【０１８８】
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、老化動物における身体の状態を改善するのに使用され得る。
【０１８９】
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、飼育用動物における受胎、妊娠率、および生殖成功を増加させるのに使用され得る。
【０１９０】
本発明の非ヒトアルブミン融合タンパク質はまた、消耗について上昇した動物における赤身  対  脂肪の比を改善するのに、食欲を改善するのに、ならびに身体の大きさおよび成長率を増加させるのに使用され得る。
【０１９１】
【表４】
2013172734.tif 000126
2013172734.tif 000127
（ポリペプチドおよびポリヌクレオチドのフラグメントおよび改変体）
（フラグメント）
本発明はさらに、表１に記載される治療タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントに関する。
【０１９２】
本発明はまた、表１に記載される治療タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１９３】
タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失がその治療タンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または喪失を生じるとしても、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質、他の治療活性および／または機能活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンド結合能力）がなおも保持され得る。例えば、このポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、Ｎ末端欠失を有するポリペプチドの能力は、完全ポリペプチドの残基の大部分未満がＮ末端から除去される場合に、一般的には保持される。完全ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野で公知の方法により容易に決定され得る。多くのＮ末端アミノ酸残基が欠失したムテインがいくつかの生物学的活性または免疫学的活性を保持し得る可能性は低い。実際、６アミノ酸残基程度で構成されるペプチドは、しばしば、免疫学的応答を惹起し得る。
【０１９４】
従って、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質のフラグメントとしては、全長タンパク質および、１つ以上の残基が参照ポリペプチド（すなわち、表１に示される治療タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から欠失したポリペプチドが挙げられる。特に、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜ｑにより記載され得、ここで、ｑは参照ポリペプチド（例えば、表１に示される治療タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１９５】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応する血清アルブミンポリペプチドのフラグメントとしては、全長タンパク質および、１つ以上の残基が参照ポリペプチド（すなわち、血清アルブミン、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の血清アルブミン部分）のアミノ酸配列のアミノ末端から欠失したポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜５８５により記載され得、ここで、５８５は成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１０３８）中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜５７９の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。さらなる実施形態において、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜６０９により記載され得、ここで、６０９は全長ヒト血清アルブミン（配列番号１０９４）中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜６０３の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１９６】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のフラグメントとしては、全長アルブミン融合タンパク質および、１つ以上の残基がアルブミン融合タンパク質（例えば、表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質；または表２の第６列に開示されるアミノ酸配列を有するアルブミン融合タンパク質）のアミノ末端から欠失したポリペプチドが挙げられる。特に、Ｎ末端欠失は、一般式ｍ〜ｑにより記載され得、ここで、ｑはアルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基総数を示す全整数であり、そしてｍは２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として規定される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０１９７】
上述のように、参照ポリペプチド（例えば、治療タンパク質；血清アルブミンタンパク質；または本発明のアルブミン融合タンパク質）のＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そのタンパク質の１つ以上の生物学的機能の改変または喪失を生じるとしても、他の機能活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンド結合能力）および／または治療活性がなおも保持され得る。例えば、このポリペプチドの完全形態または成熟形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、Ｃ末端欠失を有するポリペプチドの能力は、完全ポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の大部分未満がＣ末端から除去される場合に、一般的には保持される。参照ポリペプチドのＮ末端残基および／またはＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが治療活性を保持するか否かは、実際には、本明細書中に記載される慣用的な方法および／またはそうでなければ当該分野で公知の方法により容易に決定され得る。
【０１９８】
本発明はさらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分（例えば、表１に示される治療タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）に対応する治療タンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。特にＣ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜ｑ−１までの範囲の任意の全整数であり、そしてｑは参照ポリペプチド（例えば、表１に示される治療タンパク質、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分）中のアミノ酸残基の総数を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
【０１９９】
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分（例えば、血清アルブミン、または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分）に対応するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜５８４までの範囲の任意の全整数であり、ここで５８４は成熟ヒト血清アルブミン（配列番号１０３８）中のアミノ酸残基の総数−１を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。特にＣ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜６０８までの範囲の任意の全整数であり、ここで６０８は血清アルブミン（配列番号１０９４）中のアミノ酸残基の総数−１を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
【０２００】
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から１つ以上の残基が欠失したポリペプチドを提供する。特にＣ末端欠失は、一般式１〜ｎにより記載され得、ここで、ｎは６〜ｑ−１までの範囲の任意の全整数であり、そしてｑは本発明のアルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基の総数を表す全整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
【０２０１】
さらに、上記のＮ末端欠失またはＣ末端欠失のいずれかは、Ｎ末端およびＣ末端欠失参照ポリペプチドを生成するために組み合わされ得る。本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失したポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、参照ポリペプチド（例えば、表１に示される治療タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされる治療タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１０３８）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質）の残基ｍ〜ｎを有すると一般的に記載され得る。
ここで、ｎおよびｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
【０２０２】
本発明の適用はまた、本明細書中に示される参照ポリペプチド配列（表１に示される治療タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされる治療タンパク質部分、または血清アルブミン（例えば、配列番号１０３８）、または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分、または表２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミンタンパク質部分、またはアルブミン融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク質、またはそのフラグメントに関する。好ましい実施形態において、その適用は、上記のようなＮ末端欠失およびＣ末端欠失のアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含むタンパク質に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。
【０２０３】
本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列がフラグメントである治療タンパク質または血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／または機能活性（例えば、生物学的活性）を示すアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなる。
【０２０４】
他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリペプチドの活性と類似するが、必ずしも同一でない活性を示すフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した望ましくない活性を含み得る。
【０２０５】
（改変体）
「改変体」とは、参照核酸またはポリペプチドとは異なるがそれらの本質的な特性は保持している、ポリヌクレオチドまたは核酸をいう。一般的に、改変体は全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、参照核酸またはポリペプチドと同一である。
【０２０６】
本明細書中で使用される場合、「改変体」とは、それぞれ治療的タンパク質（例えば、表１の「治療的」欄を参照のこと）、アルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質と配列が異なるが、本明細書の他の箇所に記載されるかそうでなければ当該分野で公知のような、その少なくとも１つの機能的特性および／または治療的特性を保持している、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、または本発明のアルブミン融合タンパク質をいう。一般的に、改変体は、全体的に非常に類似しており、そして多くの領域において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と同一である。これらの改変体をコードする核酸はまた、本発明に包含される。
【０２０７】
本発明はまた、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１に開示される治療的タンパク質：Ｘのアミノ酸配列；または表１および２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分のアミノ酸配列、またはそのフラグメントもしくは改変体）、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１および２に記載されるポリヌクレオチドもしくはアルブミン融合構築物によりコードされるアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分のアミノ酸配列；配列番号１０３８に示されるアミノ酸配列；またはそれらのフラグメントもしくは改変体）、および／またはアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一なアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。これらのポリペプチドのフラグメントもまた提供される（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）。本発明に含まれるさらなるポリペプチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃で、フィルター結合ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、その後０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、約５０〜６５℃で１回以上洗浄する）、高度にストリンジェントな条件下で（例えば、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で、約４５℃で、フィルター結合ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で、約６８℃で１回以上洗浄する）、または当業者に公知である他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．、６．３．１〜６．３．６および２．１０．３頁を参照のこと）、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２０８】
問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が問い合わせ配列に同一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、対象配列におけるアミノ酸残基の５％までが、挿入されても、欠失されても、別のアミノ酸で置換されてもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、または参照配列中の残基間で個々に、もしくは参照配列内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで散在される、それらの末端位置の間のどこにでも生じ得る。
【０２０９】
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメント（例えば、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分またはアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分）のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致を決定するための好ましい方法（全体的配列整列とも呼ばれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ  ＝  配列の長さ、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０２１０】
対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合に、対象配列のＮ末端開裂およびＣ末端切断を考慮しないからである。問い合わせ配列に比べて、Ｎ末端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントは、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって特定のパラメーターを使用して計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ末端およびＣ末端の残基の外側に位置する。
【０２１１】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、それゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）に相当するので、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わせ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０２１２】
改変体は、この改変体と同じ長さの正常ＨＡまたは治療的タンパク質の長さと少なくとも７５％（好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）の配列同一性を通常有する。ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列レベルの相同性または同一性は、配列類似性検索用に調整されたプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析（Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）（参考として援用される））により決定される。
【０２１３】
ＢＬＡＳＴプログラムにより使用されるアプローチは、最初に問い合わせ配列とデータベース配列との間で類似のセグメントを考慮し、次いで同定される全てのマッチの統計学的有意性を評価し、そして最終的に有意性の予め選択した閾値を満足するマッチのみをまとめることである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の考察については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１１９−１２９（１９９４））（全て参考として援用される）を参照のこと。ヒストグラム、説明、整列、期待値（すなわち、データベース配列に対してマッチを報告するための統計的に有意な閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルトの設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）（全て参考として援用される））である。ｂｌａｓｔｎについては、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、一対のマッチした残基についての見返り（ｒｅｗａｒｄ）スコア）対Ｎ（すなわち、ミスマッチ残基についてのペナルティスコア）の比により設定される（ここで、ＭおよびＮについてのデフォルト値は、それぞれ５および−４である）。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは、以下のように調整され得る：Ｑ＝１０（ギャップ生成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（問い合わせ配列に沿ってｗｉｎｋ番目の位置毎にワードヒットを生じる）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップアラインメントが生成されるウインドウ幅を設定する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用し、そしてタンパク質比較における等価設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【０２１４】
本発明のポリヌクレオチド改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、コードされるポリペプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌクレオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、または５〜５０個、５〜２５個、５〜１０個、１〜５個、もしくは１〜２個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されるポリペプチド改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の宿主についてのコドン発現を至適化するため（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、酵母またはＥ．ｃｏｌｉのような細菌宿主に好ましいコドンに変化させる））のために、生成され得る。
【０２１５】
好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。さらなる好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分をコードする本発明のポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。なおさらなる好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、酵母または哺乳動物細胞における発現のために最適化される。
【０２１６】
代替の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、治療的タンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でアルブミンタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。別の実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で治療的タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分をコードする野生型ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない。
【０２１７】
さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、その治療的タンパク質の天然に存在する配列を含まないか、あるいはその配列から構成されない。さらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、アルブミンタンパク質の天然に存在する配列を含まないか、あるいはその配列から構成されない。代替の実施形態において、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療的タンパク質部分またはアルブミンタンパク質部分の天然に存在する配列を含まないか、その配列から構成されない。
【０２１８】
天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つをいう。（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリペプチドレベルのいずれかで変化し得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【０２１９】
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、本発明のポリペプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損失することなく本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。例として、Ｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。
同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８））。
【０２２０】
さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ改変体を作製した。複数の変異が、全ての可能なアミノ酸の位置で試験された。この研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質を生成した。
【０２２１】
さらに、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、１つ以上の生物学的機能の改善または損失を生じたとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の過半数より少ない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得る。
【０２２２】
従って、本発明は、機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するポリペプチド改変体をさらに含む。一実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質の１つ以上の生物学的活性および／または治療的活性に対応する機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するアルブミン融合タンパク質の改変体を提供する。別の実施形態において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する治療タンパク質の１つ以上の生物学的および／または治療的活性に対応する機能的活性（例えば、生物学的活性および／または治療的活性）を有するアルブミン融合タンパク質の改変体を提供する。このような改変体は、当該分野で公知の一般的規則に従って、活性に対してほとんど影響を及ぼさないように選択される、欠失、挿入、反転、反復、および置換を含む。このような改変体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２２３】
好ましい実施形態において、本発明の改変体は、保存的置換を有する。「保存的置換」により、以下のようなグループ内の交換を意図する：脂肪族または疎水性のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さいサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換。
【０２２４】
表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する。
【０２２５】
第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然選択によるアミノ酸置換の寛容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することにより、保存されるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質の機能について重要であるようである。対照的に、置換が自然選択によって寛容されたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は、タンパク質の生物学的活性をなおも維持しながら改変され得る。
【０２２６】
第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クローン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（分子中の各残基毎に１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照のこと。次いで、得られた変異体分子は生物学的活性について試験され得る。
【０２２７】
著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されない。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的なアミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸残基の置換（ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基であってもそうでなくてもよい）を含むポリペプチド、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基の置換を含むポリペプチド、または（ｉｉｉ）別の化合物（例えば、ポリペプチドの安定性および／もしくは可溶性を増加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））と融合もしくは化学的に結合体化されたポリペプチド、（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ポリペプチドは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０２２８】
例えば、他の荷電したアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電したアミノ酸のアミノ酸置換を含むポリペプチド改変体は、改善された特性（例えば、より少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもたらす。Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（１９９３）を参照のこと。
【０２２９】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、アルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列、治療的タンパク質および／またはヒト血清アルブミンのアミノ酸配列のフラグメントまたは改変体を含むか、あるいはこれらのアミノ酸配列からなり、ここでこのフラグメントまたは改変体は、参照アミノ酸配列と比較した場合に、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０〜１５０のアミノ酸残基の付加、置換、および／または欠失を有する。好ましい実施形態において、このアミノ酸置換は保存的である。
これらのポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明に含まれる。
【０２３０】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。このポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学改変技術によってのいずれかで、改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこにでも生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じまたは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０２３１】
（機能的活性）
「機能的活性を有するポリペプチド」とは、治療的タンパク質の全長形態、プロタンパク質形態、および／または成熟形態に関連する１以上の既知の機能的活性を示し得るポリペプチドをいう。このような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合（または結合についてポリペプチドと競合）する能力］、免疫原性（本発明の特定のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチドとマルチマーを形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプターまたはリガンドに結合する能力が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３２】
「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいて測定した場合に、用量依存性ありまたはなしで、本発明の治療的タンパク質の活性と類似の活性であるが、その活性と必ずしも同一でない活性を示すポリペプチド（成熟形態を含む）をいう。用量依存性が存在する場合、用量依存性は、そのポリペプチドの用量依存性と同一である必要はなく、むしろ本発明のポリペプチドと比較した場合の所定の活性における用量依存性と実質的に類似である（すなわち、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較してより高い活性、または約１／２５以下、好ましくは１／１０以下、そして最も好ましくは、約１／３以下の活性を示す）。
【０２３３】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されない場合の治療的タンパク質部分（またはそのフラグメントもしくは改変体）に関連する少なくとも１つの生物学的活性および／または治療的活性を有する。
【０２３４】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知のアッセイおよび本明細書中に記載されるアッセイを使用するかそれらを慣用的に改変して、機能的活性（例えば、生物学的活性）についてアッセイされ得る。さらに、当業者は、表１の対応する列（例えば、表１の３欄）に言及されるアッセイを使用して、活性についてアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイし得る。さらに、当業者は、当該分野で公知のアッセイを使用して、かつ／または以下の実施例の項に記載されるアッセイを使用して活性についてアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のフラグメントを慣用的にアッセイし得る。
【０２３５】
例えば、アルブミン融合タンパク質が治療的タンパク質に結合するかまたは抗治療的ポリペプチド抗体および／または抗アルブミン抗体への結合についてこの治療タンパク質と競合する能力についてアッセイする、１つの実施形態において、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このようなアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０２３６】
好ましい実施形態において、治療的タンパク質の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）が同定される場合、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、融合物の治療的タンパク質部分としてその治療的タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質による結合パートナーへの結合が、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照のこと。別の実施形態では、融合物の治療的タンパク質部分に対応する治療的ポリペプチドの基質に結合する、アルブミン融合タンパク質の生理学的相関の能力が、当該分野で公知の技術を使用して慣用的にアッセイされ得る。
【０２３７】
代替の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の多量体化する能力が評価されている場合、その多量体の他の成分との会合は、例えば、当該分野で周知の手段（例えば、還元および非還元のゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティブロッティング）によりアッセイされ得る。一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙら（前出）を参照のこと。
【０２３８】
好ましい実施形態において、治療的タンパク質に結合する抗体の全てまたは一部をふくむアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の治療的タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体に関連する少なくとも１つの生物学的活性および／または治療的活性（例えば、ポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合すること）を有する。他の好ましい実施形態において、治療的タンパク質に結合する抗体の全てまたは一部を含むアルブミン融合タンパク質の生物学的活性および／または治療的活性は、治療的タンパク質に結合する抗体により特異的に結合されるポリペプチドに関連する生物学的活性および／または治療的活性の１つ以上の阻害（すなわち、拮抗作用）または活性化（すなわち、アゴニスト作用）である。
【０２３９】
治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、種々の方法で特徴付けされ得る。特に、治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質に結合する抗体により特異的に結合される同じ抗原に特異的に結合する能力について、本明細書中に記載される技術を使用して、または当該分野で公知の技術を慣用的に改変してアッセイされ得る。
【０２４０】
アルブミン融合タンパク質（例えば、治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む）の、特定のタンパク質またはエピトープに（特異的に）結合する能力についてのアッセイが、溶液において（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上で（例えば、Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌上で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上で（例えば、米国特許第５，５７１，６９８；５，４０３，４８４；および５，２２３，４０９）、プラスミド上で（例えば、Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９（１９９２））、またはファージ上で（例えば、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；ならびにＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））（これらの参考文献の各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される）、実施され得る。治療的抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質はまた、特定のタンパク質またはエピトープについてのそれらの特異性および親和性について、本明細書中に記載される技術または当該分野で公知の他の方法を使用するか、慣用的に改変してアッセイされ得る。
【０２４１】
治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療的タンパク質部分に対応する治療的タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体により特異的に結合される分子との配列／構造保存性を有する分子）との交差反応性について当該分野で公知の任意の方法によりアッセイされ得る。
【０２４２】
（免疫特異的）結合および交差反応性を分析するために使用され得る免疫アッセイとしては、少し例を挙げれば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、およびプロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫アッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
【０２４３】
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％  Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療的タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む）を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４０℃でインキュベートする工程、例えば、抗アルブミン抗体に結合したセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４０℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。アルブミン融合タンパク質の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、アルブミン融合タンパク質の抗原への結合を増加するように、そしてバックグラウンドを減少させる（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにすること）ように改変され得るパラメーターに関して、知識があり得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０２４４】
ウェスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製する工程、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（例えば抗原の分子量に依存した８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン）へ移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルクを含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングする工程、メンブレンを洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄する工程、（ブロッキング緩衝液で希釈された）本発明のアルブミン融合タンパク質をメンブレンに適用する工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈された、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合体化した２次抗体（これはアルブミン融合タンパク質（例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体）を認識する）を適用する工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、および抗原の存在を検出する工程、を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバックグランドノイズを減少するように改変され得るパラメータをよく知っている。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１０．８．１）を参照のこと。
【０２４５】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合体化した本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含む）をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、非結合アルブミン融合タンパク質または非特異的結合アルブミン融合タンパク質を洗い流す工程、およびウェルをコートする抗原に特異的に結合したアルブミン融合タンパク質の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は、検出可能な化合物に結合体化している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合体化した第二の抗体（アルブミン融合タンパク質を認識する）がウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、アルブミン融合タンパク質がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な分子は、検出可能な化合物（酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）に結合体化された抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、知識を有し得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０２４６】
タンパク質、抗原、またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性およびアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用のオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での本発明のアルブミン融合タンパク質とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。
アルブミン融合タンパク質の、特定のタンパク質、抗原またはエピトープに対する親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。アルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープに結合する第２のタンパク質との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、このタンパク質、抗原、またはエピトープは、漸増量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合体化したアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートされる。
【０２４７】
好ましい実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ速度論分析が、タンパク質、抗原もしくはエピトープに対する本発明のアルブミン融合タンパク質の結合のオン速度およびオフ速度を決定するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ速度論分析は、アルブミン融合タンパク質、または特定のポリペプチド、抗原、もしくはエピトープの結合、および表面上に固定された特定のポリペプチド、抗原、もしくはエピトープまたはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ備えるチップからのアルブミン融合タンパク質、または特定のポリペプチド、抗原、もしくはエピトープの解離を分析する工程を包含する。
【０２４８】
アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質に結合する抗体もまた、所定のタンパク質または抗原（好ましくは、それらの交代が特異的に結合する抗原）に対する結合親和性に関して、記載または特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。より好ましい結合親和性としては、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−８Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。なおより好ましい結合親和性としては、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合していない）の親和性と類似する所定のタンパク質もしくはエピトープに対する親和性を、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体を含む）の価およびその対応する抗体の価を考慮すると、有する。さらに、本明細書中に記載される（実施例および表１を参照のこと）かさもなければ当該分野で公知であるアッセイは、アルブミン融合タンパク質ならびにそのフラグメント、改変体および誘導体が、そのアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン部分のいずれかに関連する生物学的活性および／またはＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ活性を（インビトロまたはインビボのいずれかで）惹起する能力を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【０２４９】
（アルブミン）  
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体と、ヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体とを含み、これらは、互いに、好ましくは遺伝子融合によって結合されている。
【０２５０】
さらなる実施形態は、治療用タンパク質のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体と、ヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントもしくは改変体とを含み、これらは互いに、化学結合によって連結されている。
【０２５１】
用語、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）は、本明細書中で互換可能に使用される。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」は、より広範であり、ヒト血清アルブミン（ならびにそのフラグメントおよび改変体）ならびに他の種由来のアルブミン（ならびにそのフラグメントおよび改変体）を包含する。
【０２５２】
本明細書中で使用される場合、「アルブミン」とは、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する、アルブミンのタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミンのフラグメントもしくは改変体を集合的に指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンまたはそのフラグメント（例えば、ＥＰ  ２０１  ２３９、ＥＰ  ３２２  ０９４、ＷＯ  ９７／２４４４５、ＷＯ  ９５／２３８５７）を指し、特に、図１および配列番号１０３８に示されるヒトアルブミンの成熟形態、あるいは他の脊椎動物由来のアルブミン、またはこれらの分子もしくはフラグメントのアナログもしくは改変体を指す。
【０２５３】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質において使用されるヒト血清アルブミンは、配列番号１０３８に関する以下の組の点変異のうちの１つまたは両方を含む：Ｌｅｕ−４０７→Ａｌａ、Ｌｅｕ−４０８→Ｖａｌ、Ｖａｌ−４０９→Ａｌａ、およびＡｒｇ−４１０→Ａｌａ；またはＡｒｇ−４１０→Ａ、Ｌｙｓ−４１３→Ｇｌｎ、およびＬｙｓ−４１４→Ｇｌｎ（例えば、本明細書中に全体が参考として援用される、国際公開番号ＷＯ９５／２３８５７を参照のこと）。なおより好ましい実施形態において、上記の点変異の組の１つまたは両方を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク質分解切断に対する改善した安定性／抵抗性を有し、これにより、酵母宿主細胞中で発現される組換えアルブミン融合タンパク質の生成増加が可能である。
【０２５４】
本明細書中で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または寿命を延長するに十分なアルブミン部分とは、このタンパク質の治療活性を安定化または延長するために長さまたは構造が十分であり、その結果、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の寿命が、非融合状態における寿命と比較して延長または伸長している、アルブミン部分を指す。このアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上記のようなＨＡ配列の全長を含み得るか、またはその治療活性を安定化可能または延長可能である１つ以上のそのフラグメントを含み得る。そのようなフラグメントは、長さが１０個以上のアミノ酸であり得るか、またはＨＡ配列からの約１５個、２０個、２５個、３０個、５０個以上連続するアミノ酸を含み得るか、またはＨＡの特定のドメインの部分またはすべてを含み得る。
例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインに広がるＨＡの１つ以上のフラグメントが、使用され得る。好ましい実施形態において、このＨＡフラグメントは、ＨＡの成熟形態である。
【０２５５】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、正常ＨＡの改変体であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク部分はまた、本明細書中に記載されるような治療用タンパク質の改変体であり得る。用語「改変体」は、保存的または非保存的のいずれかである、挿入、欠失、および置換を包含し、ここでそのような変化は、アルブミンの腫脹の（ｏｎｃｏｔｉｃ）有用なリガンド結合特性および非免疫原性特性のうちの１つ以上も、その治療用タンパク質の治療活性を付与する活性部位もしくは活性ドメインも、実質的には変化しない。
【０２５６】
詳細には、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンの天然に存在する多型改変体、およびヒトアルブミンのフラグメント（例えば、ＥＰ  ３２２  ０９４に開示されるフラグメント（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）であり、ここで、ｎは、３６９〜４１９である））を包含し得る。このアルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンとしては、雌鳥およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。このアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、この治療用タンパク質部分とは異なる動物由来であり得る。
【０２５７】
一般的に述べると、ＨＡのフラグメントまたは改変体は、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは、少なくとも１５０アミノ酸長である。このＨＡ改変体は、ＨＡの少なくとも１つのドメイン全体、例えば、ドメイン１（配列番号１０３８のアミノ酸１〜１９４）、ドメイン２（配列番号１０３８のアミノ酸１９５〜３８７）、ドメイン３（配列番号１０３８のアミノ酸３８８〜５８５）、ドメイン１および２（配列番号１０３８の１〜３８７）、ドメイン２および３（配列番号１０３８の１９５〜５８５）、またはドメイン１および３（配列番号１０３８のアミノ酸１〜１９４および配列番号１０３８のアミノ酸３８８〜５８５）からなり得るか、あるいはこれらを含み得る。各ドメイン自体は、２つの相同なサブドメイン、すなわち、１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１、および５１２〜５８５から構成され、可撓性のサブドメイン間リンカー領域が、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５、およびＧｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含む。
【０２５８】
好ましくは、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメインまたはその保存的改変体を含む。その融合物がサブドメインをベースとする場合、隣接リンカーのうちのいくらかまたはすべては、好ましくは、治療用タンパク質部分に結合するために使用される。
【０２５９】
（治療用タンパク質に特異的に結合する抗体もまた、治療用タンパク質である）
本発明はまた、表１に開示される治療用タンパク質に特異的に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む、アルブミン融合タンパク質を包含する。用語「治療用タンパク質」は、治療用タンパク質に結合する抗体（例えば、表１の欄Ｉに記載される）ならびにそのフラグメントおよび改変体を包含することが、特に企図される。従って、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは改変体、および／または治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含み得る。
【０２６０】
（抗体の構造およびバックグラウンド）
基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含むことが公知である。各テトラマーは、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域ｆを含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３〜５章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第４版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）（すべての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０２６１】
従って、インタクトなＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二官能性抗体または二重特異性抗体において以外では、その２つの結合部位は同じである。
【０２６２】
これらの鎖はすべて、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）により結合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。このＣＤＲ領域は、一般に、その抗原と接触してその特異性を決定する抗体部分である。各対の重鎖および軽鎖に由来するＣＤＲは、フレームワーク領域により整列され、それにより、特異的エピトープに結合することが可能である。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。これらの可変領域は、重鎖定常領域または軽鎖定常領域に連結される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８〜８８３（１９８９）の定義に従う。
【０２６３】
本明細書中で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ領域を含む分子））を指す。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体としては、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に特異的な抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメント（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、または１つ以上のＣＤＲ領域）を含むが、これらに限定されない。
【０２６４】
（治療用タンパク質に結合する抗体）
本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に開示される）に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体を包含する。
【０２６５】
治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネズミ（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリの抗体である。より好ましくは、その抗体は、ヒト抗体である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、およびヒト抗体を生成するように遺伝子操作された異種マウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）もしくは他の生物から単離された抗体を包含する。
【０２６６】
治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラスであり得る。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ１である。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ２である。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体分子は、ＩｇＧ４である。
【０２６７】
最も好ましくは、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、本発明のヒト抗原結合フラグメントであり、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶＬドメインまたはＶＨドメインのいず
れかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独でか、または以下の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。
【０２６８】
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多重の特異性であり得る。多重特異的抗体は、治療用タンパク質の異なるエピトープに対して特異的であり得るか、または治療用タンパク質および異種エピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）の両方に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／１７７１５；同ＷＯ  ９２／０８８０２；同ＷＯ  ９１／００３６０；同ＷＯ  ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０２６９】
治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体は、二重特異的または二官能性であり得、これは、その抗体が２つの異なる重鎖／軽鎖対と２つの異なる結合部位とを有する人工的ハイブリッド抗体であることを意味する。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含む、種々の方法により生成され得る。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。さらに、二重特異的抗体は、「ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」（Ｈｏｌｌｉｇｎｅｒら、「Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ’：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８（１９９３））または「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （Ｊａｎｕｓｉｎｓ）  ｔａｒｇｅｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｏｎ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５〜３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら「Ｊａｎｕｓｉｎ：ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅａｇｅｎｔｓ」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  ７：５１〜５２（１９９２））として見出され得る。
【０２７０】
本発明はまた、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知である抗体のフラグメントまたは改変体（誘導体を含む）を含む、アルブミン融合タンパク質を提供する。当業者に公知である標準的技術は、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列中に変異を導入するために使用され得る（例えば、アミノ酸置換を生じる、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発）。好ましくは、この改変体（誘導体を含む）は、参照ＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３と比較して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。特定の実施形態において、それらの改変体は、ＶＨＣＤＲ３の置換をコードする。好ましい実施形態において、その改変体は、１つ以上の推定非必須アミノ酸残基にて、保存的アミノ酸置換を有する。
【０２７１】
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、これらが認識または特異的に結合する、治療用タンパク質のエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。治療用タンパク質または治療用タンパク質の特定のエピトープに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本発明は、治療用タンパク質を特異的に結合し、そしてその排除を可能にする、抗体を含む。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、その抗体自体の非融合フラグメントまたは改変体と同じエピトープに結合する。
【０２７２】
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。治療用タンパク質の任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合しない抗体が、含まれる。
治療用タンパク質に対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算した場合）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、ヒトタンパク質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに対応するそれらのエピトープと交差反応する。治療用タンパク質に対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の配列同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算した場合）を有するポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一の特異的な抗原性ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチド、あるいはその特異的な抗原性ポリペプチドおよび／または免疫原性ポリペプチドのうちの２個、３個、４個、５個以上の組み合わせに関する。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、特定の抗体自体のフラグメントまたは改変体と比較して、同様であるかまたは実質的に同一な交差反応性を有する。
【０２７３】
さらに本発明に含まれるのは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを結合する抗体である。治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体はまた、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ未満、１０−２Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−４Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。より好ましい結合親和性としては、５×１０−５Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、または１０−８Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。なおより好ましい結合親和性としては、５×１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１５Ｍ未満または１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質に結合する対応する抗体（アルブミンに融合していない）の親和性と類似する所定のタンパク質もしくはエピトープに対する親和性を、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質に結合する抗体のうちの少なくともフラグメントもしくは改変体を含む）の価およびその対応する抗体の価を考慮すると、有する。
【０２７４】
本発明はまた、競合的結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、治療用タンパク質のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、そのエピトープへの結合を競合的に阻害する。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープへの第２の抗体の結合を競合的に阻害する。他の好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープへの第２の抗体の結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競合的に阻害する。
【０２７５】
治療用タンパク質に結合しかつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、その治療用タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を部分的に破壊するかまたは完全に破壊する抗体を含む。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降とそれに続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検出することにより、決定され得る。特定の実施形態においては、この抗体の非存在下のリガンド活性またはレセプター活性を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、その治療用タンパク質に結合する抗体の非融合フラグメントまたは改変体と比較して、リガンド結合の防止および／またはレセプター活性化の防止に関して、類似するかまたは実質的に類似する特徴を有する。
【０２７６】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、かつ好ましくは、結合していないレセプターも結合していないリガンドも特異的には認識しない、レセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合しかつレセプターへのそのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、そのリガンドがレセプターを結合することを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、そのレセプターを活性化する抗体を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、そのレセプターの二量体化を誘発することによって、リガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性の全てまたはサブセットのいずれかを増強し得るかまたは活性化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される治療用タンパク質（例えば、表１に開示される）の特異的生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、全て、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。好ましい実施形態において、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、その治療用タンパク質に結合する抗体の非融合フラグメントまたは改変体と比較して、類似するかまたは実質的に同一であるアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を有する。
【０２７７】
治療用タンパク質に結合しかつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、例えば、治療用タンパク質を精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロおよびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は、生物学的サンプルにおける治療用タンパク質のレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける有用性を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照のこと。同様に、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質は、例えば、治療用タンパク質を精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロおよびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。
【０２７８】
治療用タンパク質に結合しかつアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、改変された（すなわち、その抗体への任意の型の分子の共有結合によって）誘導体を包含する。例えば、限定はしないが、この抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合などによって、改変された抗体を包含する。多数の化学的改変のいずれかが、公知の技術によって実行され得、その技術としては、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、その誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。本発明のアルブミン融合タンパク質もまた、上記のように改変され得る。
【０２７９】
（治療用タンパク質に結合する抗体の生成方法）
治療用タンパク質に結合しかつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応し得る抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって産生され得る。例えば、治療用タンパク質が種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、その抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバントが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そしてフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０２８０】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定されない。
用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来し、それが生成される方法に由来するのではない、抗体をいう。
【０２８１】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法は、当該分野で慣用的かつ周知である。非限定的な実施例において、マウスは、治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体、アルブミン融合タンパク質、あるいはそのような治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体またはアルブミン融合タンパク質を発現する細胞を用いて、免疫され得る。一旦免疫応答が検出される（例えば、上記抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって、産生され得る。
【０２８２】
従って、本発明は、モノクローナル抗体、および抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成する方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。
【０２８３】
ポリクローナルヒトＢ細胞株およびモノクローナルヒトＢ細胞株の両方を生成するための別の周知の方法は、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用する形質転換である。
ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株を生成するためのプロトコルは、当該分野で一般に公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９４、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（これは、その全体が参考として本明細書中に援用される）の第７．２２章に概説されるプロトコルがある。
形質転換用のＢ細胞源は、一般的にヒト末梢血であるが、形質転換用Ｂ細胞はまた、他の供給源（リンパ節、扁桃、脾臓、腫瘍組織、および感染組織が挙げられるが、これらに限定されない）に由来し得る。組織は、一般には、ＥＢＶ形質転換前に、単一細胞懸濁物にされる。さらに、Ｂ細胞含有サンプル中のＴ細胞を物理的に除去するかまたは（例えば、シクロスポリンＡでの処理によって）不活化するための工程が、行われ得る。なぜなら、抗ＥＢＶ抗体に対して血清陽性である個体由来のＴ細胞は、ＥＢＶによるＢ細胞不死化を抑制し得るからである。
【０２８４】
一般に、ヒトＢ細胞を含むサンプルに、ＥＢＶが接種され、そして３〜４週間培養される。代表的なＥＢＶ供給源は、Ｂ９５−８細胞株（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１４９２）の培養上清である。ＥＢＶ形質転換の物理的徴候は、一般には、この３〜４週間の培養期間の終わりに観察され得る。位相差顕微鏡によって、形質転換細胞は、大きく、透明で、毛様に見え得、緊密な細胞クラスター状態に凝集する傾向があり得る。最初は、ＥＢＶ株は、一般的にはポリクローン性である。しかし、長期の細胞培養期間、ＥＢＶ株は、特定のＢ細胞クローンの選択的増殖の結果として、モノクローン性またはポリクローン性になり得る。あるいは、ポリクローン性ＥＢＶ形質転換株は、（例えば、限界希釈培養により）サブクローン化され得るか、または適切な融合パートナーと融合され得、モノクローナルＢ細胞株を得るために限界希釈でプレートされてもモノクローナルＢ細胞株を得る。ＥＢＶ形質転換細胞株のために適切な融合パートナーとしては、マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＳＰ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ヘテロミエローマ細胞株（ヒト×マウス；例えば、ＳＰＡＭ−８、ＳＢＣ−Ｈ２０、およびＣＢ−Ｆ７）、およびヒト細胞株（例えば、ＧＭ  １５００、ＳＫＯ−０００７、ＲＰＭＩ  ８２２６、およびＫＲ−４）が挙げられる。従って、本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントに対するヒトポリクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体の生成方法（ヒトＢ細胞のＥＢＶ形質転換を含む）を提供する。
【０２８５】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成され得る。
例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０２８６】
例えば、治療用タンパク質に結合する抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得る（例えば、標識した抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）である。治療用タンパク質に結合する抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０２８７】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は
、以下に開示される：ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参考として援用される）。
【０２８８】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される））。抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０２８９】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、ＷＯ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、およびＷＯ  ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０２９０】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そしてキメラマウスを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８  ８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７７１号；同第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；および同第６，１１４，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。
【０２９１】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイドされた（ｇｕｉｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０２９２】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェントまたはより低いストリジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で（例えば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、治療用タンパク質と特異的に結合する、そしてより好ましくは、表２の「配列番号Ｚ」の欄に開示される「治療用タンパク質Ｘ」のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０２９３】
このポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そしてそのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、その抗体のヌクレオチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるような）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いで連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅。
【０２９４】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））から、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る（実施例１０７を参照のこと）。
【０２９５】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成し得る。
【０２９６】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって包含されそして当該分野の技術の範囲内にある。
【０２９７】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０２９８】
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２９９】
（抗体の組換え発現）
抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖または単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードする本発明のポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングされ得る。
【０３００】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのトランスフェクトされた細胞は、次いで、抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。
【０３０１】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要即時性初期（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０３０２】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生されるべき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０３０３】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体をコードする配列は、このウイルスの非必須の領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０３０４】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルスに基づく発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体をコードする配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を発現する能力のある組換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０３０５】
さらに、宿主細胞株が選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、または、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株を含むが、これらに限定されない。
【０３０６】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、次にこれはクローニングされ得、増殖して細胞株になることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０３０７】
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））の遺伝子（これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ使用され得る）を含むが限定されない。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する耐性を与える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２章および１３章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５０：１（１９８１）（これらはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０３０８】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０３０９】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを選択マーカーとして使用するベクターは、それぞれ、薬物メチオニンスルホキシミン（ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）またはメトトレキセートの存在下で、増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼネガティブの細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株のＮＳ０）の入手可能性である。グルタミンシンターゼ発現系はまた、内因性遺伝子の機能を防止するためにさらなるインヒビターを提供することによって、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において機能し得る。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成要素は、以下のＰＣＴ公開において詳述される：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；ＷＯ８９／１０４０４およびＷＯ９１／０６６５７（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）。さらに、本発明に従って使用され得るグルタミンシンターゼ発現ベクターは、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）を含む業者から市販される。マウス骨髄腫細胞においてＧＣ発現系を使用する、モノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）（これらは、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載される。
【０３１０】
宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコードする第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖両方のポリペプチドをコードし、そして発現することができる、単一のベクターが使用され得る。このような状況において、過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０３１１】
一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティーによる）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。さらに、治療タンパク質に結合し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に応答し得る、抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され得、精製を容易にする。
【０３１２】
（抗体の改変）
治療タンパク質に結合する抗体、またはフラグメントもしくは改変体は、精製を容易にするペプチドのような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する赤血球凝集素タグ（「ＨＡ」タグともまた称される）（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定されない。
【０３１３】
本発明は、診断剤または治療剤に結合体化される、抗体またはそのフラグメントをさらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメンの効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）に対して、直接的、または当該分野で公知の技術を使用する媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して間接的のいずれかで、連結または結合体化され得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げられる。検出可能な物質の他の例は、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【０３１４】
さらに、本発明の抗体は、治療用部分（例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０３１５】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０３１６】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるがそれらに限定されない。
【０３１７】
このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０３１８】
あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる記載のような抗体の異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る。
【０３１９】
単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬として使用され得る。
【０３２０】
（抗体−アルブミン融合物）
治療タンパク質に結合し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応し得る抗体としては、表１の「治療タンパク質Ｘ」の欄に開示される治療タンパク質に結合する抗体、またはそのフラグメントもしくは改変体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２１】
特定の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨドメインを含むかまたはＶＨドメインからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、１つ、２つまたは３つのＶＨ  ＣＤＲを含むかまたはこれらからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨ  ＣＤＲ１を含むかまたはＶＨ  ＣＤＲ１からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨ  ＣＤＲ２を含むかまたはＶＨ  ＣＤＲ２からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＨ  ＣＤＲ３を含むかまたはＶＨ  ＣＤＲ３からなる。
【０３２２】
特定の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬドメインを含むかまたはＶＬドメインからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、１つ、２つまたは３つのＶＬ  ＣＤＲを含むかまたはこれらからなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬ  ＣＤＲ１を含むかまたはＶＬ  ＣＤＲ１からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬ  ＣＤＲ２を含むかまたはＶＬ  ＣＤＲ２からなる。他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ＶＬ  ＣＤＲ３を含むかまたはＶＬ  ＣＤＲ３からなる。
【０３２３】
他の実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＶＬ  ＣＤＲおよび／またはＶＨ  ＣＤＲを含むかまたはこれらからなる。
【０３２４】
好ましい実施形態において、治療タンパク質に免疫特異的に結合し、そしてアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する抗体のフラグメントまたは改変体は、ペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１０９２））によって治療抗体のＶＬドメインに連結された、治療抗体のＶＨドメインを含むｓｃＦｖを含むかまたはこれらからなる。
【０３２５】
（免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
本発明の抗体、あるいは治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。本発明の治療タンパク質は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体（あるいは治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むルブミン融合タンパク質）は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体（あるいは治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含むルブミン融合タンパク質）を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パンニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照のこと）が挙げられる。
【０３２６】
これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にする。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖および／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可能にする。
【０３２７】
（治療タンパク質に結合する抗体、および治療タンパク質に結合する抗体のフラグメントまたは改変体を含むアルブミン融合タンパク質の特徴づけ）
本発明の抗体、または治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、種々の方法で特徴づけされ得る。特に、治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは改変体を含む、本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書中に記載される技術を使用してか、または当該分野で公知の技術を慣用的に改変して、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に結合する抗体に対応する、治療タンパク質に結合する抗体によって特異的に結合される同じ抗原に特異的に結合する能力について、アッセイされ得る。
【０３２８】
本発明の抗体、または治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質が、特異的タンパク質またはエピトープに（特異的に）結合する能力についてのアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１（１９９２））、あるいはビーズ（例えば、Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌上で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（例えば、米国特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（例えば、Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９（１９９２））またはファージ（例えば、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；Ｆｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０（１９９１））（これらの参考文献の各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）で実施され得る。本発明の抗体、または治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、本明細書中に記載される技術または他の当該分野で公知の技術を使用または慣用的に改変して、特定のタンパク質またはエピトープに対するそれらの特異性および親和性について、アッセイされ得る。
【０３２９】
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知の任意の方法によって、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する、治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体によって特異的に結合される分子との、配列保存／構造保存を有する分子）との交差反応性についてアッセイされ得る。
【０３３０】
（免疫特異的な）結合および交差反応性を分析するために使用され得る免疫アッセイとしては、いくつかのものについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そして当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫アッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図されない）。
【０３３１】
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％  Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、本発明の抗体あるいは治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間）４０℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ（あるいは、アルブミン融合タンパク質が治療抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む場合、適切な抗イディオタイプ抗体または抗アルブミン抗体でコーティングされたビーズ）を細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上４０℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およびＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。
本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により、アッセイされ得る。当業者は、抗体またはアルブミン融合タンパク質の抗原への結合を増加するように、そしてバックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、知識があり得る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０３３２】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプルをそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％  ＢＳＡまたは脱脂粉乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）中でその膜を洗浄する工程、（ブロッキング緩衝液中に希釈した）本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質を膜に適用する工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体）を適用する工程、洗浄緩衝液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウンドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、知識があり得る。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０３３３】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルをその抗原でコーティングする工程、そのウェルに結合しなかった抗原を洗浄除去する工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合した本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質（治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む）をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程、未結合のアルブミン融合タンパク質または非特異的に結合したアルブミン融合タンパク質を洗浄除去する工程、およびその抗体またはウェルをコーティングする抗原に特異的に結合するアルブミン融合タンパク質の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、抗体またはアルブミン融合タンパク質は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物に結合した第二の抗体（それぞれ、抗体またはアルブミン融合タンパク質を認識する）が、ウェルに添加され得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体またはアルブミン融合タンパク質がウェルにコーティングされ得る。この場合、検出可能な分子は、検出可能な化合物（例えば、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ））に結合体化された抗原であり得る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、知識があり得る。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０３３４】
タンパク質、抗原またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合親和性および抗体−またはアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む。特定のタンパク質、抗原またはエピトープに対する本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の親和性、および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。抗体またはアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープに結合する第二のタンパク質との競合はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、タンパク質、抗原またはエピトープは、本発明のアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープに結合する、漸増量の非標識の第二のタンパク質の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合した本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートされる。
【０３３５】
好ましい実施形態において、ＢＩＡｃｏｒｅ反応速度分析は、タンパク質、抗原またはエピトープに対する、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の結合のオン（ｏｎ）速度およびオフ（ｏｆｆ）速度を決定するために使用される。ＢＩＡｃｏｒｅ反応速度分析は、その表面上にそれぞれ固定化された、特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープ、抗体もしくはアルブミン融合タンパク質との、チップからの抗体、アルブミン融合タンパク質、または特異的ポリペプチド、抗原もしくはエピトープの、結合および解離を分析する工程を包含する。
【０３３６】
（治療用途）
本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）、本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）、治療タンパク質に結合する抗体の少なくとも１つのフラグメントまたは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびにこのようなアルブミン融合タンパク質をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定されない。本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０３３７】
特異的かつ好ましい実施形態において、本発明は、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の疾患、障害、または状態（以下が挙げられるが、これらに限定されない：神経障害、免疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎障害、増殖障害ならびに／または癌性の疾患および状態、ならびに／あるいは本明細書中の他の箇所に記載されるもの）を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を投与する工程を包含する。本発明の治療化合物としては、本発明の抗体（例えば、哺乳動物細胞の細胞表面上に発現される全長タンパク質に対する抗体；治療タンパク質のエピトープに対する抗体）ならびに本発明の抗体をコードする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログおよび誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体、または治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは改変体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０３３８】
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質が治療的に使用され得る方法の概要は、結合治療タンパク質を、身体において局所的もしくは全身的に、または抗体の直接的な細胞傷害性（例えば、補体による媒介（ＣＤＣ）もしくはエフェクター細胞による媒介（ＡＤＣＣ））により結合させる工程を包含する。これらのアプローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教示があれば、当業者は、治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質を、過度の実験なくして、診断、モニタリングまたは治療の目的のために使用する方法を知る。
【０３３９】
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて、または例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７のようなリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせて、有利に利用され得る。
【０３４０】
治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む本発明の抗体または本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線治療、化学療法、ホルモン性治療、免疫治療および抗腫瘍薬剤）と組み合わせて投与され得る。一般的に、患者のそれと同じ種である本来の種または反応性種の産物の投与（抗体の場合において）は、好まれる。従って、好ましい実施形態において、ヒト抗体、フラグメント誘導体、アナログまたは核酸は、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０３４１】
治療タンパク質、そのフラグメントもしくは領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に直結するイムノアッセイおよびそれに関連する障害の治療の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、解離定数、または５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ未満のＫｄ（解離定数）を含む。さらに好ましい結合親和性は、それらと同じ解離定数、または５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、もしくは１０−８Ｍ未満のＫｄ（解離定数）を含む。なお、さらに好ましい結合親和性は、それらと同じ解離定数、または５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、もしくは１０−１５Ｍ未満のＫｄ（解離定数）を含む。
【０３４２】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む治療タンパク質またはアルブミン融合タンパク質に結合する抗体をコードする配列を含む核酸は、遺伝子治療の方法によって、治療タンパク質の異常な発現および／または活性に関連する疾患または障害を処置、阻害または妨害するために投与される。遺伝子治療とは、発現されるまたは発現可能な核酸の被験体への投与によって実施される治療をいう。本発明の実施形態において、核酸は、治療的効果を媒介するこれらのコードされたタンパク質を作製する。
【０３４３】
当該分野で利用可能な遺伝子治療についての任意の方法は、本発明に従い使用され得る。代表的な方法は、本明細書中の他の部分により詳細に記載される。
【０３４４】
（治療的または予防的活性の説明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０３４５】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい実施形態において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体としては、好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０３４６】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０３４７】
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０３４８】
具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と組み合わせること）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０３４９】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０３５０】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出系において送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出系は、治療標的、例えば、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０３５１】
他の制御された放出系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０３５２】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態において、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそれが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクターの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【０３５３】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。
水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０３５４】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０３５５】
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもののようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののようなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０３５６】
この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿され得る。
【０３５７】
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０３５８】
（診断および画像化）
治療タンパク質（またはフラグメントもしくはそれらの変異体）（治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を含む）に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およびそのアナログは、診断目的のために使用されて、治療タンパク質の異常な発現および活性に関連する疾患、障害または／および状態を検出、診断またはモニターし得る。本発明は、治療タンパク質の異常な発現の検出について提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の治療タンパク質の発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０３５９】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（ａ）治療タンパク質に特異的な少なくとも抗体の変異体のフラグメントを含む治療タンパク質またはアルブミン融合タンパク質に特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞または体液中の治療タンパク質の発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされた治療タンパク質遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
【０３６０】
本発明の抗体または治療タンパク質に特異的な抗体の変異体の少なくともフラグメントを含むアルブミン融合タンパク質を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、他の抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンが挙げられる。
【０３６１】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトにおける、治療タンパク質の異常な発現と関連する疾患または障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）この治療タンパク質が発現する被験体内の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバックグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が治療タンパク質の異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０３６２】
被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体、抗体フラグメントまたは治療タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、特定の治療タンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０３６３】
用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間である。
【０３６４】
１つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
【０３６５】
標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされないが、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、および超音波診断法が挙げられる。
【０３６６】
特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の実施形態においては、この分子は陽電子放出金属で標識され、そして陽子射出断層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態においては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴映像（ＭＲＩ）を用いて患者から検出される。アルブミン融合タンパク質を特異的に検出するが、アルブミンまたは治療タンパク質を単独で検出しない抗体は、好ましい実施形態である。これらは、明細書全体にわたって記載されるようなアルブミン融合タンパク質を検出するために使用され得る。
【０３６７】
（キット）
本発明は、上記の方法において用いられ得るキットを提供する。１つの実施形態においては、キットは、１以上の容器中に、抗体（好ましくは精製された抗体）を備える。特定の実施形態においては、本発明のキットは、このキットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に分離されたポリペプチドを備える。好ましくは、本発明のキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を、さらに備える。別の特定の実施形態においては、本発明のキットは、目的のポリペプチドとの抗体の結合（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物）と結合体化され得るか、あるいは第一の抗体を認識する第二の抗体は、検出可能な基質と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。
【０３６８】
本発明の別の特定の実施形態においては、このキットは、増殖性および／または癌性のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットである。このようなキットは、目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含む、実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。さらに、このようなキットは、この抗体の抗原への結合（例えば、この抗体は、フローサイトメトリーにより検出され得る、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光化合物と結合体化され得る）を検出するための手段を備える。特定の実施形態においては、このキットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。このキットのポリペプチド抗原はまた、固体支持体に付着され得る。
【０３６９】
より特定の実施形態においては、上記のキットの検出手段は、このポリペプチド抗原が付着される固体支持体を含む。このようなキットはまた、非付着レポーター標識抗ヒト抗体を備える。この実施形態においては、抗体のポリペプチド抗原との結合はこのレポーター標識抗体の結合により検出され得る。
【０３７０】
さらなる実施形態においては、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングする際に用いる診断用キットを含む。この診断用キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質的に単離された抗体、およびこのポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の抗体との結合を検出する手段を備える。１つの実施形態においては、この抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態においては、この抗体は、モノクロナール抗体であり得る。このキットの検出手段は、第二の標識されたモノクロナール抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識された、競合抗原を含み得る。
【０３７１】
１つの診断の構成においては、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合抗原を有する固相試薬と反応する。特異的な抗原抗体をこの試薬と結合させ、そして結合されない血清成分を洗浄により除去した後、固体支持体上に結合する抗抗原抗体の量に応じて、レポーターをこの試薬と結合させるために、この試薬をレポーター標識抗ヒト抗体と反応させる。この試薬は、結合されない標識抗体を除去するため、再び洗浄され、そしてこの試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、レポーターは、適切な蛍光測定基質、発光基質または比色基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、この固相をインキュベートすることにより検出される酵素である。
【０３７２】
上記のアッセイにおける固体表面試薬は、タンパク質材料を固体支持体材料（例えば、高分子ビーズ、計深棒、９６ウェルプレートまたは濾過材料）に付着させるための公知の技術により調製される。これらの付着方法としては、一般的に、支持体へのタンパク質の非特異的な吸着または固体支持体上の化学的に活性な基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基）とのタンパク質の共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（代表的には、遊離アミン基を介する）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンでコートされたプレートが、ビオチン化された抗原と共に使用され得る。
【０３７３】
従って、本発明は、この診断方法を行うためのアッセイ系またはキットを提供する。このキットは、一般的に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、および表面結合された抗抗原抗体を検出するための、レポーター標識された抗ヒト抗体を備える。
【０３７４】
（アルブミン融合タンパク質）
本発明は、アルブミン融合タンパク質および疾患または障害を処置、妨害、または改善する方法に一般的に関する。本明細書において使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」とは、少なくとも一つのアルブミン分子（もしくはフラグメントまたはそれらの変異体）の少なくとも一つの治療タンパク質（もしくはフラグメントまたはそれらの変異体）への融合によって形成されるタンパク質をいう。本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の少なくともフラグメントまたは変異体およびヒト血清アルブミンの少なくともフラグメントまたは変異体を含み、好ましくは遺伝子融合によって（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドと骨格内で結合される核酸の翻訳によって発生される）別の一つとともに連結され、または別の一つに連結される。治療タンパク質およびアルブミンタンパク質は、いったんアルブミン融合タンパク質の部分になると、各々アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」と言われ得る。
【０３７５】
好ましい実施形態において、本発明は、表１または表２に記載されるポリヌクレオチドまたはアルブミン融合構築物によってコードされるアルブミン融合タンパク質を提供する。これらのアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によって包含される。
【０３７６】
本発明の好ましいアルブミン融合タンパク質としては、以下によってコードされるアルブミン融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない：治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる核酸分子；表１、表２または実施例中に記載されるように生成される、治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる核酸分子；あるいは、例えば、以下のエレメントのうちの１つ以上をさらに含む、治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドにインフレームで連結された、アルブミン（またはそのフラグメントもしくは改変体）の少なくとも１つの分子をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれからなる核酸分子：（１）機能的自己複製ベクター（例えば、シャトルベクター、発現ベクター、組み込みベクターおよび／または複製系が挙げられるが、これらに限定されない）、（２）転写開始のための領域（例えば、プロモーター領域（例えば、調節可能プロモーターまたは誘導性プロモーター、構成的プロモーター））、（３）転写終結のための領域、（４）リーダー配列、および（５）選択マーカー。
【０３７７】
１実施形態において、本発明は、治療タンパク質（例えば、表１に記載されるような）および血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療的に活性なフラグメントならびに血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性な改変体および／または治療的に活性な改変体ならびに血清アルブミンタンパク質を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、このアルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。
【０３７８】
さらなる実施形態において、本発明は、治療タンパク質ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または治療的に活性なフラグメントを含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、治療タンパク質ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性な改変体および／または治療的に活性な改変体を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、このアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分は、治療タンパク質の成熟部分である。
【０３７９】
さらなる実施形態において、本発明は、治療タンパク質の生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体、ならびに血清アルブミンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および／または治療的に活性なフラグメントもしくは改変体を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、治療タンパク質の成熟部分および血清アルブミンの成熟部分を含むかまたはこれらからなる、アルブミン融合タンパク質を提供する。
【０３８０】
好ましくは、このアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてＨＡを含み、そしてＣ末端部分として治療タンパク質を含む。あるいは、Ｎ末端部分として治療タンパク質を含み、そしてＣ末端部分としてＨＡを含むアルブミン融合タンパク質もまた、使用され得る。
【０３８１】
他の実施形態において、このアルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合した治療タンパク質を有する。好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、同じ治療タンパク質である。代替の好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、異なる治療タンパク質である。別の好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、同じかまたは関連する疾患、障害または状態（例えば、表１の「好ましい適応症Ｙ」の欄に列挙されるようなもの）を処置または予防するために使用され得る、異なる治療タンパク質である。別の好ましい実施形態において、Ｎ末端で融合した治療タンパク質とＣ末端で融合した治療タンパク質とは、一般に、患者において同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時発生的に（ｃｏｎｓｕｒｒｅｎｔｌｙ）または連続的に発生するか、あるいは一般に、患者において互いに関連して発生することが、当該分野で公知である疾患または障害（例えば、表１の「好ましい適応症Ｙ」の欄に列挙されるようなもの）を処置、軽減または予防するために使用され得る、異なる治療タンパク質である。
【０３８２】
複数の、アルブミンのＮ末端で融合した治療タンパク質およびＣ末端で融合した治療タンパク質を含む本発明の例示的な融合タンパク質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、ＩＦＮα−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＩＦＮα、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＩＬ３−ＨＳＡ−ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＨＳＡ−ＩＬ３、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ−ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、ＩＬ２−ＨＳＡ−ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ−ＨＳＡ−ＩＬ２、ＰＴＨ−ＨＳＡ−カルシトニン、カルシトニン−ＨＳＡ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡ−カルシトニン、カルシトニン−ＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−カルシトニン−ＨＳＡ−ＰＴＨ、またはＰＴＨ−ＨＳＡ−カルシトニン−ＰＴＨ。
【０３８３】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端、ならびに／あるいはアルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合した、所定の治療タンパク質Ｘまたはその改変体の、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の分子を含むタンパク質を包含する。所定の治療タンパク質Ｘまたはその改変体の分子は、任意の数の方向（以下が挙げられるが、これらに限定されない：「頭から頭」方向（例えば、治療タンパク質Ｘの１つの分子のＮ末端が、治療タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合した場合）または「頭から尾」方向（例えば、治療タンパク質Ｘの１つの分子のＣ末端が、治療タンパク質Ｘの別の分子のＮ末端に融合した場合））であり得る。
【０３８４】
１実施形態において、縦列配向した治療タンパク質Ｘポリペプチド（またはそのフラグメントもしくは改変体）の１つ、２つ、３つまたはそれ以上は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端、ならびに／またはアルブミンもしくはその改変体のＮ末端および／もしくはＣ末端に融合される。
【０３８５】
特定の実施形態において、縦列配向したＰＴＨ分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。例えば、縦列配向したＰＴＨ分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上（アミノ酸１〜３４を含むかまたはこれらからなるＰＴＨ分子が挙げられるが、これに限定されない）は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。ＰＴＨの複数のタンパク質部分を含む本発明の例示的融合タンパク質としては、以下が挙げられるが、これに限定されない：ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ、ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＨＳＡまたはＨＳＡ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ−ＰＴＨ。
【０３８６】
別の特定の実施形態において、縦列配向したＧＬＰ−１分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。例えば、縦列配向したＧＬＰ−１分子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上（アミノ酸７〜３６を含むかまたはこれらからなるＧＬＰ−１分子（残基８は、アラニンからグリシンに変異している）が挙げられるが、これに限定されない）（例えば、米国特許第５，５４５，６１８号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示される変異体を参照のこと）は、アルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合される。ＧＬＰ−１の複数のタンパク質部分を含む本発明の例示的融合タンパク質としては、以下が挙げられるが、これに限定されない：ＧＬＰ１−ＧＬＰ１−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＧＬＰ１−ＧＬＰ１、ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１変異体−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１変異体、ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１−ＨＳＡ、ＨＳＡ−ＧＬＰ１変異体−ＧＬＰ１、ＧＬＰ１−ＧＬＰ１変異体−ＨＳＡまたはＨＳＡ−ＧＬＰ１−ＧＬＰ１変異体。特に好ましい実施形態は、構築物ＩＤ番号３０７０のようなＧＬＰ−１縦列融合物およびこのような構築物によってコードされるタンパク質である。
【０３８７】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端、ならびに／あるいはアルブミンまたはその改変体のＮ末端またはＣ末端に融合した、所定の治療タンパク質Ｘまたはその改変体の、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の分子を含むタンパク質をさらに包含し、ここで、これらの分子は、ペプチドリンカーを介して連結されている。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中で参考として援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって分離された複数の治療タンパク質Ｘポリペプチドを含むアルブミン融合タンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を使用して生成され得る。リンカーは、大きいＨＳＡ分子に小さいペプチドを融合させる場合に、特に重要である。ペプチド自体は、ペプチドの縦列コピー（例えば、ＧＬＰ−１を参照のこと）を融合させることによってリンカーであり得るか、または他の公知のリンカーが使用され得る。リンカーを組み込む構築物は、表２に記載されるか、または配列番号Ｙを試験して明らかとなる。
【０３８８】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、分子内および／または分子間のマルチマー形態の形成を可能にするような様式で、アルブミンまたはその改変体のＮ末端および／またはＣ末端に、治療タンパク質Ｘまたはその改変体を融合させることによって、生成され得る。本発明の１実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、モノマー形態またはマルチマー形態（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高次のマルチマー）であり得る。本発明のさらなる実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分は、モノマー形態またはマルチマー形態（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高次のマルチマー）であり得る。特定の実施形態において、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分は、マルチマー形態（すなわち、ダイマー、トリマー、テトラマーおよびより高次のマルチマー）であり、そしてそのアルブミンタンパク質部分は、モノマー形態である。
【０３８９】
アルブミン部分が治療タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合されたアルブミン融合タンパク質に加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、目的の治療タンパク質またはペプチド（例えば、表１に開示されるような治療タンパク質Ｘ、あるいは治療タンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントもしくは改変体）を、ＨＡの内部領域に挿入することによって、生成され得る。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列において、多数のループまたはターンが、αヘリックスの終点と開始点との間に存在し、これらは、ジスルフィド結合によって安定化される。ＨＡの結晶構造から決定されるようなループ（ＰＤＢ同定子１ＡＯ６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉおよび１ＵＯＲ）は、大部分、分子本体からはなれて延びている。これらのループは、治療的に活性なペプチド（特に、二次構造が機能的であることを要するもの）または治療タンパク質の挿入または内部融合のために有用であり、特定の生物学的活性を有するアルブミン分子を本質的に生成する。
【０３９０】
本発明のアルブミン融合タンパク質を生成するためにペプチドまたはポリペプチドが挿入され得るヒトアルブミン構造中のループは、以下を含む：Ｖａｌ５４〜Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６〜Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２〜Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７〜Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６〜Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０〜Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２〜Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９〜Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２〜Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８〜Ｐｒｏ４８６およびＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６。より好ましい実施形態において、ペプチドまたはポリペプチドは、成熟ヒトアルブミン（配列番号１０３８）のＶａｌ５４〜Ａｓｎ６１ループ、Ｇｌｎ１７０〜Ａｌａ１７６ループおよび／またはＬｙｓ５６０〜Ｔｈｒ５６６ループ中に挿入される。
【０３９１】
挿入されるべきペプチドは、特定の生物学的活性についてスクリーニングされたファージディスプレイライブラリーまたは合成ペプチドライブラリーのいずれか、あるいは所望の機能を有する分子の活性な部分に由来し得る。さらに、ランダムペプチドライブラリーは、ＨＡ分子の特定のループ内に生成され得るか、またはＨＡ分子の特定のループへとランダム化ペプチドを挿入することによって生成され得、ここで、アミノ酸の全ての可能な組み合わせが提示される。
【０３９２】
このようなライブラリーは、以下の方法の１つによって、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントに対して作製され得る：
ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメント内の１つ以上のペプチドループ内のアミノ酸のランダム化変異。ループ内の１つ、より多くまたは全ての残基のいずれかが、この様式で変異され得る。
【０３９３】
長さＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）のランダム化ペプチドの、ＨＡもしくはＨＡのドメインフラグメンの１つ以上のループの置換またはＨＡもしくはＨＡのドメインフラグメンの１つ以上のループへの挿入（すなわち、内部融合）；
（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端のペプチド／タンパク質融合。
【０３９４】
ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントはまた、同じＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントへの異なる標的に対する、異なるループの異なるスクリーニングに由来するペプチドを移植することによって、多官能性にされ得る。
【０３９５】
好ましい実施形態において、ヒト血清アルブミンのループに挿入されるペプチドは、表１に開示される治療タンパク質のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体である。より具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループに挿入された、少なくとも７、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＮ末端に融合した、少なくとも７、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＣ末端に融合した、少なくとも７、少なくとも８アミノ酸長、少なくとも９アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１１アミノ酸長、少なくとも１２アミノ酸長、少なくとも１３アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長または少なくとも４０アミノ酸長のペプチドフラグメントまたはペプチド改変体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。例えば、表１および表２に記載される短いペプチド（例えば、治療剤Ｙ）は、アルブミンループ中に挿入され得る。
【０３９６】
一般に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのＨＡ由来領域および１つの治療タンパク質由来領域を有し得る。しかし、各タンパク質の複数の領域が、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用され得る。同様に、１つより多い治療タンパク質が、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用され得る。例えば、治療タンパク質は、ＨＡのＮ末端およびＣ末端の両方に融合され得る。このような構成において、治療タンパク質部分は、同じ治療タンパク質分子でも異なる治療タンパク質分子でもよい。二重機能的アルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＹ−ＨＡ−Ｘとして示され得る。
【０３９７】
例えば、抗ＢＬｙｓＴＭｓｃＦｖ−ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物は、抗ＢＬｙｓＴＭｓｃＦｖによって、ＩＦＮα−２ｂに対する免疫応答を調節するために、調製され得る。代替法は、ＨＡ−抗ＢＬｙｓＴＭｓｃＦｖ融合物または他のＨＡ融合物と、機能（半減期など）に依存して種々の比率で混合した、ＨＡ融合物（例えば、ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物）の二重（または多重でも）機能的用量を生成することである。
【０３９８】
二重機能的または多重機能的なアルブミン融合タンパク質はまた、ＨＡの反対側の末端にて、タンパク質またはペプチドを介して標的器官または細胞型に、融合物の治療タンパク質部分を標的化するために、調製され得る。
【０３９９】
公知の治療分子の融合物の代替として、これらのペプチドは、代表的には、６、８、１２、２０または２５またはＸｎ（ここで、Ｘはアミノ酸（ａａ）であり、ｎは残基の数である）のランダム化アミノ酸の、ＨＡまたはＨＡのドメインフラグメントのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端への融合物として構築されたライブラリーをスクリーニングすることによって、獲得され得、ここで、アミノ酸の全ての可能な組み合わせが提示された。このアプローチの特定の利点は、ＨＡ分子上のペプチドがインサイチュで選択され得、従って、任意の他の方法によって誘導され、次いでＨＡに結合されるペプチドについての場合と同様に、このペプチドの特性が、改変されるのではおそらくなく選択され得ることである。
【０４００】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合部分間にリンカーペプチドを含んで、これらの部分間のより大きい物理的分離を提供し得、従って、治療タンパク質部分のアクセス可能性（例えば、その同族レセプターへの結合について）を最大化し得る。このリンカーペプチドは、アミノ酸からなり得、その結果、これは、可撓性またはより剛性である。
【０４０１】
リンカー配列は、プロテアーゼによってかまたは化学的に切断されて、成長ホルモン関連部分を生じ得る。好ましくは、このプロテアーゼは、宿主によって天然に産生されるプロテアーゼ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロテアーゼｋｅｘ２または等価なプロテアーゼ）である。
【０４０２】
従って、上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下の式：Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１を有し得、ここで、Ｒ１は、少なくとも１つの治療タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの配列であるが、同じ治療タンパク質では必ずしもなく、Ｌはリンカーであり、そしてＲ２は血清アルブミン配列である。
【０４０３】
好ましい実施形態において、治療タンパク質を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンと融合していない場合の同じ治療タンパク質の有効期間と比較して、有効期間が延びている。有効期間は、代表的に、溶液中またはいくつかの他の保存処方物中の治療タンパク質の治療活性が、治療活性の過度の損失なしに安定である期間をいう。多数の治療タンパク質は、その非融合状態では、高度に不安定である。以下に記載するように、これらの治療タンパク質の代表的な有効期間は、本発明のアルブミン融合タンパク質に組み込まれると、顕著に延長される。
【０４０４】
「延長した（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ）」または「延長した（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）」有効期間を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ保存条件および取扱い条件に供された標準と比較して、より高い治療活性を示す。この標準は、非融合の全長治療タンパク質であり得る。アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分がアナログである場合、改変体である場合、または他のように変更されている場合、またはそのタンパク質についての完全配列を含まない場合、治療活性の延長は、そのアナログ、改変体、変更されたペプチドまたは完全配列の非融合の等価物と、代替的に比較され得る。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、所定の時点で比較した場合に、標準と同じ保存条件および取り扱い条件に供された場合、標準の治療活性の約１００％より高い活性、または標準の治療活性の約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％もしくは２００％より高い活性を保持し得る。
【０４０５】
有効期間はまた、保存開始時の治療活性に対して正規化した、保存後に残存する治療活性について、評価され得る。延長された治療活性によって示されるような、延長した有効期間を有する本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ条件に供された場合の、等価な非融合の治療タンパク質の治療活性の、約５０％より高い治療活性、約６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の治療活性を保持し得る。例えば、実施例３８に考察されるように、全長ＨＡ配列に融合したｈＧＨを含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、種々の温度条件下で、５週間以上までの期間にわたって、溶液中でその元の活性の約８０％以上を保持し得る。
【０４０６】
（融合タンパク質の発現）
本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、細菌のような微生物、またはヒトもしくは動物の細胞株からの分泌によって、組換え分子として産生され得る。好ましくは、このポリペプチドは、宿主細胞から分泌される。
【０４０７】
本発明の特定の実施形態は、酵母において分泌を指向するのに有効なシグナル配列（特に、酵母由来のシグナル配列（特に、酵母宿主と同種のもの））をコードするＤＮＡ構築物、および本発明の第一の局面の融合分子を含み、シグナルポリペプチドと成熟ポリペプチドとの間には、酵母由来のプロ配列は存在しない。
【０４０８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナルは、酵母由来のシグナル配列の好ましい例である。
【０４０９】
Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：１８（１９８８））によって調製される種類の結合体（ここで、別々に調製されたポリペプチドは、化学的架橋によって連結されている）は、企図されない。
【０４１０】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように形質転換された、細胞（好ましくは酵母細胞）を包含する。形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中の、これらの細胞の培養物（好ましくは、モノクローナル（クローン性均質な）培養物またはモノクローナル培養物由来の培養物）を企図する。ポリペプチドが分泌される場合、この培地は、細胞と共に、または細胞が濾過もしくは遠心分離によって除去されている場合には細胞を含まずに、ポリペプチドを含む。多くの発現系（細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、糸状菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を含む）が公知であり、そして使用され得る。
【０４１１】
アルブミン融合タンパク質の生成において使用されるのに好ましい酵母株は、Ｄ８８、ＤＸＹ１およびＢＸＰ１０である。Ｄ８８［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４］は、親株ＡＨ２２ｈｉｓ＋（ＤＢ１としても公知；例えば、Ｓｌｅｅｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２−４６（１９９０）を参照のこと）の誘導体である。この株は、ＬＥＵ２遺伝子を含む２ミクロンベースのプラスミドの栄養要求性選択を可能にする、ｌｅｕ２変異を含む。Ｄ８８はまた、グルコース過剰条件で、ＰＲＢ１の抑制を示す。ＰＲＢ１プロモーターは、通常、グルコースレベルおよび増殖段階をモニタリングする、２つのチェックポイントによって制御される。このプロモーターは、グルコース枯渇および静止期への進入の際に、野生型酵母において活性化される。株Ｄ８８は、グルコースによる抑制を示すが、静止期への進入の際に、誘導を維持する。ＰＲＡ１遺伝子は、酵母空胞プロテアーゼであるＹｓｃＡエンドプロテアーゼＡをコードし、このプロテアーゼは、ＥＲに局在する。ＵＢＣ４遺伝子は、ユビキチン化経路にあり、そしてユビキチン依存的な分解のための、短命なタンパク質および異常なタンパク質の標的化に関与している。このｕｂｃ４変異の単離は、細胞における発現プラスミドのコピー数を増大させ、そしてプラスミドから発現される所望のタンパク質の発現レベルを増大させることが見出されている（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／００５０４（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０４１２】
Ｄ８８の誘導体であるＤＸＹ１は、以下の遺伝子型を有する：［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３：：ｙａｐ３］。Ｄ８８において単離された変異に加えて、この株は、ＹＡＰ３プロテアーゼのノックアウトもまた有する。このプロテアーゼは、主に二塩基性残基（ＲＲ、ＲＫ、ＫＲ、ＫＫ）の切断をもたらすが、タンパク質中の単一の塩基性残基での切断もまた、促進し得る。このｙａｐ３変異の単離は、高レベルの全長ＨＳＡ産生を生じた（例えば、米国特許第５，９６５，３８６号およびＫｅｒｒｙ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｙｅａｓｔ  １４：１６１−１６９（１９９８）（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０４１３】
ＢＸＰ１０は、以下の遺伝子型を有する：［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、ｐｍｔ１：：ＵＲＡ３］。ＤＸＹ１において単離された変異に加えて、この株はまた、ＰＭＴ１遺伝子およびＨＳＰ１５０遺伝子のノックアウトを有する。このＰＭＴ１遺伝子は、ドリチル（ｄｏｌｉｃｈｙｌ）−ホスフェート−Ｄ−マンノースタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）の、進化的に保存されたファミリーのメンバーである。Ｐｍｔ１ｐの膜貫通トポロジーは、これが、Ｏ結合グリコシル化において役割を有する、小胞体の膜内在性タンパク質であることを示唆する。この変異は、ＨＳＡ融合物のＯ結合グリコシル化を、低減／排除するように働く（例えば、国際公開番号ＷＯ００／４４７７２（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。研究により、Ｈｓｐ１５０タンパク質が、イオン交換クロマトグラフィーによって、ｒＨＡから不十分に分離されることが明らかとなった。ＨＳＰ１５０遺伝子における変異は、標準的な精製技術による除去が困難であると証明されている、潜在的な混入物を除去する。例えば、米国特許第５，７８３，４２３号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０４１４】
所望のタンパク質は、例えば、宿主染色体に挿入されたコード配列または遊離プラスミド上のコード配列から、従来の方法で産生される。酵母は、エレクトロポレーションのような通常の方法のいずれかにおいて、所望のタンパク質のコード配列で形質転換される。
エレクトロポレーションによる酵母の形質転換方法は、ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示される。
【０４１５】
首尾よく形質転換された細胞（すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞）は、周知技術によって同定され得る。例えば、発現構築物の導入から生じる細胞は、所望のポリペプチドを産生するように増殖し得る。細胞は収集され、そして溶解され、そのＤＮＡ内容物が、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３またはＢｅｒｅｎｔら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８によって記載されるような方法を使用して、ＤＮＡの存在について試験され得る。あるいは、上清中のタンパク質の存在は、抗体を使用して検出され得る。
【０４１６】
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３〜４０６およびｐＲＳ４１３〜４１６が挙げられ、そしてこれらは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ  ９２０３７，ＵＳＡから一般に入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーのＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は、酵母染色体プラスミド（Ｙｃｐ）である。
【０４１７】
酵母においてアルブミン融合タンパク質を発現させるために好ましいベクターとしては、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡが挙げられ、これらは、実施例１において詳細に記載される。図２は、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドがクローニングされてＨＡ融合物を形成し得る、基本ベクターとして使用され得る、ｐＰＰＣ０００５プラスミドのマップを示す。これは、ＰＲＢ１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーター（ＰＲＢ１ｐ）、融合リーダー配列（ＦＬ）、ＨＡ（ｒＡＨ）をコードするＤＮＡおよびＡＤＨ１  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターミネーター配列を含む。融合リーダー配列の配列は、ヒト血清アルブミンのシグナルペプチド（配列番号１０９４）の最初の１９アミノ酸および接合因子α１プロモーターの最後の５アミノ酸（ＳＬＤＫＲ、その全体が本明細書中で参考として援用される、ＥＰ−Ａ−３８７  ３１９を参照のこと）からなる。
【０４１８】
プラスミドｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡは、２００１年４月１１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に寄託され、そしてそれぞれ、受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３２７８、ＰＴＡ−３２７６、ＰＴＡ−３２７９およびＰＴＡ−３２７７を与えられた。酵母でのアルブミン融合タンパク質の発現のために有用な別のベクターである、ｐＳＡＣ３５ベクターは、Ｓｌｅｅｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２（１９９０）中に記載され、これは、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
【０４１９】
アルブミン融合タンパク質を発現するために使用され得る別の酵母プロモーターは、ＭＥＴ２５プロモーターである。例えば、Ｄｏｍｉｎｉｋ  Ｍｕｍｂｕｒｇ，Ｒｏｌｆ  ＭｕｌｌｅｒおよびＭａｒｔｉｎ  Ｆｕｎｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．２５、ｐｐ．５７６７−５７６８を参照のこと。
このＭｅｔ２５プロモーターは、３８３塩基長（塩基−３８２〜−１）であり、そしてこのプロモーターによって発現される遺伝子もまた、Ｍｅｔ１５、Ｍｅｔ１７およびＹＬＲ３０３Ｗとして公知である。好ましい実施形態は、以下の配列を使用し、ここで、以下の配列の５’末端において、クローニングに使用されるＮｏｔ１部位に下線を付し、そして３’末端において、ＡＴＧ開始コドンに下線を付している。
【０４２０】
【化７】
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相補的な接着末端を介して、ＤＮＡをベクターに作動可能に連結するための種々の方法が、開発されている。例えば、相補的なホモポリマー区域が、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加され得る。次いで、このベクターおよびＤＮＡセグメントは、相補的なホモポリマーテイル間での水素結合によって連結されて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０４２１】
１つ以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化によって生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（これらは、その３’５’エキソヌクレオチド分解活性によって、突出したγ一本鎖末端を除去し、そしてそれらの重合活性によって、凹んだ３’末端を満たす（ｆｉｌｌ  
ｉｎ）酵素である）で処理される。
【０４２２】
従って、これらの活性の組み合わせは、平滑末端のＤＮＡセグメントを生成する。次いで、この平滑末端のセグメントは、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒し得る酵素（例えば、バクテリオファージのＴ４  ＤＮＡリガーゼ）の存在下で、モル濃度大過剰のリンカー分子とともにインキュベートされる。従って、反応産物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するＤＮＡセグメントである。次いで、これらのＤＮＡセグメントは、適切な制限酵素で切断され、そしてこのＤＮＡセグメントの末端と適合する末端を生成する酵素を用いて切断された発現ベクターに連結される。
【０４２３】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡを含む多数の供給源から市販される。
【０４２４】
本発明に従ってＤＮＡを改変するための所望の方法は、例えば、ＨＡ改変体が調製される場合、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７−４９１によって開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。この方法において、酵素的に増幅されるべきＤＮＡは、それ自体増幅されたＤＮＡに組み込まれる２つの特異的オリゴヌクレオチドプライマーによって隣接される。これらの特異的プライマーは、当該分野で公知の方法を使用して発現ベクター中にクローニングするために使用され得る制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み得る。
【０４２５】
アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として本発明の実施において有用であることが企図される酵母の例示的な属は、以下である：Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓなど。好ましい属は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａからなる群より選択される属である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．の例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓおよびＳ．ｒｏｕｘｉｉである。
【０４２６】
Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．の例は、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓである。適切なＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ種は、Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）ｓｐｐ．の例は、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（以前にはＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（以前にはＨ．ａｎｏｍａｌａ）およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換方法は、一般に、ＥＰ  ２５１  ７４４、ＥＰ  ２５８  ０６７およびＷＯ  ９０／０１０６３において教示され、これらは全て、参考として本明細書中で援用される。
【０４２７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの好ましい例示的な種としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓおよびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉが挙げられる。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの好ましい例示的な種としては、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓが挙げられる。Ｈａｎｓｅｎｕｌａの好ましい例示的な種としては、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在ではＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｈ．ａｎｏｍａｌａ（現在ではＰｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）およびＰｉｃｈｉａ  ｃａｐｓｕｌａｔａが挙げられる。Ｐｉｃｈｉａ種のさらなる好ましい例示的な種としては、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの好ましい例示的な種としては、Ａ．ｎｉｇｅｒおよびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓが挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａの好ましい例示的な種としては、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。多くの好ましい酵母種が、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、そしてアルブミン融合タンパク質の発現において有用である：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３  ｙａｐ３変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２２７３１）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３  ｈｓｐ１５０変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２１２６６）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈａｎｓｅｎ、有性世代株ＢＹ４７４３  ｐｍｔ１変異体（ＡＴＣＣ  受託番号４０２３７９２）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈａｎｓｅｎ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４および６２９９５）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ  Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｘ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号６２９８７）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号７６４９２）；Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎら）Ｋｕｒｔｚｍａｎ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ｄｅ  Ｍｏｒａｉｓ  ｅｔ  Ｍａｉａとして寄託される有性世代、有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２６０１２）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号９０２９）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｅｉｄａｍ）Ｗｉｎｔｅｒ、無性世代（ＡＴＣＣ受託番号４８７５６）；およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍら）ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ  ｅｔ  ｖｏｎ  Ａｒｘ，有性世代（ＡＴＣＣ受託番号２０１８４７）。
【０４２８】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについての適切なプロモーターとしては、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１遺伝子、もしくはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨＯ５、ＴＲＰＩ、ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼについての遺伝子、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸塩デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸塩イソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−交配因子フェロモン、［交配因子フェロモン］、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、および他のプロモーターの５’調節領域の部分または上流活性部位を有する５’調節領域の部分のハイブリッドに関するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８０６７のプ
ロモーター）に関連するものが挙げられる。
【０４２９】
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅにおける使用のための便利な調節可能プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１０８５７−１０８６４によって記載されるようなｎｍｔ遺伝子由来のチアミン抑制プロモーターおよびＨｏｆｆｍａｎ＆Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２４、  ８０７−８１６によって記載されるようなグルコース抑制ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
【０４３０】
異種遺伝子の発現のためにＰｉｃｈｉａを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇら（１９９３）、および様々なＰｈｉｌｌｉｐ特許（例えば、参考として本明細書中に援用された米国特許第４，８５７，４６７号）において教示され、そしてＰｉｃｈｉａ発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，Ｌｅｅｋ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている。適切なプロモーターとしては、ＡＯＸＩおよびＡＯＸ２が挙げられる。Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２、３４５９−３４６５は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａベクターおよび形質転換に関する情報を含み、適切なプロモーターは、ＭＯＸ１およびＦＭＤ１である；一方ＥＰ  ３６１  ９９１、Ｆｌｅｅｒら（１９９１）およびＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒからの他の公報は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．における異種タンパク質を発現する方法を教示し、適切なプロモーターは、ＰＧＫＩである。
【０４３１】
転写終結シグナルは、好ましくは転写終結およびポリアデニル化のための適切なシグナルを含む真核細胞遺伝子の３’隣接配列である。適切な３’隣接配列は、例えば、使用される発現制御配列に自然に連結される遺伝子の配列であり得る（すなわち、プロモーター
に相当し得る）。あるいは、それらは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＤＨＩ遺伝子の終結配列が好ましい場合に異なり得る。
【０４３２】
所望のアルブミン融合タンパクシ質は、選択された酵母において効果的な任意のリーダーであり得る分泌リーダー配列で最初に発現され得る。酵母において有用なリーダーは、以下である：
ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ  （配列番号２１３２）
スタンニオカルシン（ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ）シグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号１０５４）  
ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ（ｐｒｅ−ｐｒｏ）領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号１１７６）
ＨＳＡシグナル配列のプレ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ，  配列番号１１７７）またはそれらの改変体（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ）（配列番号１１６８）  
転化酵素シグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１０８）
酵母交配因子αシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１１０９もしくはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１１０９）
Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１１１０）
ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としてもまた公知）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１１１１）
Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１１６９）
免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１０９５）
Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１０９６）
クラスター前駆体シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１０９７）
インスリン様増殖因子結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１０９８）
ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ前領域の改変体（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号１１６７））、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号１０９９）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号１１００），
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号１１０１），
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ  ＃６４
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２１３３）；
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ  ＃６６   
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２１３４）；
改変されたＨＳＡ（Ａ１４）リーダー−
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号１１０２）；
改変されたＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（改変されたＨＳＡ  ＃６５としてもまた公知）−  ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号１１０３）
改変されたＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー-
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号１１０４）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号１１０５）
コンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号１０５５）
酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ  配列番号２１３５）
ＭＦｏｚ−１のプレ配列
０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
キラー毒素リーダー
キラー毒素のプレ配列
ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素プレプロ（２９アミノ酸；プレの１６アミノ酸およびプロの１３アミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号２１３６）
Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアルニラーゼ（ｇｌｕｃｏａｎｙｌａｓｅ）Ｉ１分泌リーダー配列
Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓαガラクトシド（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌｕｃｏａｒｎｙｌａｓｅリーダー配列
ＥＰ−Ａ−３８７  ３１９（参考として本明細書中で援用される）において開示されたハイブリッドリーダー
ｇｐ６７シグナル配列（バキュロウイルス発現系との関連）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
治療タンパク質Ｘの天然リーダー；
ＪＰ  ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として認可される、参考として本明細書中で援用される）において開示されるような、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素（ＳＵＣ２）リーダー；または
イヌリナーゼ−ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号２１３７）．
改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体  ＃１-ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号２１２８）
改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体  ＃２−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号２１２９）
（アルブミン融合タンパク質の組換え産生および合成的産生のさらなる方法）
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および合成技術および組換え技術によるアルブミン融合タンパク質の産生に関連する。例えば、ベクターは、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補完性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
【０４３３】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のような沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイルスである場合、このベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０４３４】
ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。この構築物によって発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、および翻訳されるべきポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０４３５】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。
このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該分野で公知である。
【０４３６】
細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母系における使用のために好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるがこれらに限定されない。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０４３７】
一つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の限局化を原核生物細胞または真核生物細胞の特定の画分を方向付け、そして／または原核生物細胞または真核生物細胞由来の本発明のタンパク質の分泌を方向付けるシグナル配列に融合され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、周辺質空間にタンパク質の発現を方向づけることが望まれ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質が、細菌の周辺質空間にポリペプチドの発現を方向づけるために融合され得るシグナル配列またはタンパク質（それらのフラグメント）の例としては、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、周辺質Ｅ．ｃｏｌｉ熱−不安定エンテロトキシンＢサブユニットのシグナル配列、およびアルカリンホスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのベクターは、タンパク質（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なベクターのｐＭＡＬ種（特定のｐＭＡＬ−ｐ種）の限局化を方向付ける融合タンパク質の構築のために市販されている。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクチン酸塩リアーゼシグナル配列に融合され得、グラム陰性細菌におけるこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増加する。
米国特許第５，５７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号（この内容は、それら全体について参考として本明細書中で援用される）を参照のこと。
【０４３８】
哺乳動物細胞におけるその分泌を方向付けるために本発明のアルブミン融合タンパク質に融合され得るシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）ＭＫＶＳＶＡＡＬＳＣＬＭＬＶＴＡＬＧＳＱＡ（配列番号２１３２）
ｂ）スタンニオカルシン（ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ）シグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号１０５４）
ｃ）ＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ、配列番号１１７６）
ｄ）ＨＳＡシグナル配列のプレ領域（例えば、ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、配列番号１１７７）またはそれらの改変体、例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ、（配列番号１１６８）
ｅ）転化酵素シグナル配列（例えば、ＭＬＬＱＡＦＬＦＬＬＡＧＦＡＡＫＩＳＡ、配列番号１１０８）
ｆ）酵母交配因子αシグナル配列（例えば、ＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＥＫＲ、配列番号１１０９またはＭＲＦＰＳＩＦＴＡＶＬＡＦＡＡＳＳＡＬＡＡＰＶＮＴＴＴＥＤＥＴＡＱＩＰＡＥＡＶＩＧＹＳＤＬＥＧＤＦＤＶＡＶＬＰＦＳＮＳＴＮＮＧＬＬＦＩＮＴＴＩＡＳＩＡＡＫＥＥＧＶＳＬＤＫＲ、配列番号１１０９）
ｇ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素リーダー配列
ｈ）ハイブリッドシグナル配列（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＥＫＲ、配列番号１１１０）
ｉ）ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドシグナル配列（ＨＳＡ／ｋｅｘ２としてもまた公知）（例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号１１１１）ｊ）Ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー／ＭＦα−１融合リーダー配列（例えば、ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＳＬＤＫＲ、配列番号１１６９）
ｋ）免疫グロブリンＩｇシグナル配列（例えば、ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ、配列番号１０９５）
ｌ）Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ前駆体シグナル配列（例えば、ＭＥＲＡＡＰＳＲＲＶＰＬＰＬＬＬＬＧＧＬＡＬＬＡＡＧＶＤＡ、配列番号１０９６）
ｍ）クルステリン（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）前駆体シグナル配列（例えば、ＭＭＫＴＬＬＬＦＶＧＬＬＬＴＷＥＳＧＱＶＬＧ、配列番号１０９７）
ｎ）インスリン様増殖因子結合タンパク質４シグナル配列（例えば、ＭＬＰＬＣＬＶＡＡＬＬＬＡＡＧＰＧＰＳＬＧ、配列番号１０９８）
ｏ）以下のようなＨＳＡシグナル配列のプレ−プロ−領域の改変体、例えば、ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲ（配列番号１１６７）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＬＧ（配列番号１０９９）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＬＧ（配列番号１１００）、
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧ（配列番号１１０１）、
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ  ＃６４
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号２１３３）；
改変されたＨＳＡリーダーＨＳＡ  ＃６６   
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号２１３４）；
改変されたＨＳＡ（Ａ１４）リーダー−
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＡＧＶＳＧ（配列番号１１０２）；
改変されたＨＳＡ（Ｓ１４）リーダー（改変されたＨＳＡ  ＃６５としてもまた公知）−             ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＧＶＳＧ（配列番号１１０３）、
改変されたＨＳＡ（Ｇ１４）リーダー−
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＳＧ（配列番号１１０４）、またはＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＧＧＶＬＧＤＬＨＫＳ（配列番号１１０５）
ｐ）コンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号１０５５）
ｑ）酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）リーダー（例えば、ＭＦＫＳＶＶＹＳＩＬＡＡＳＬＡＮＡ、配列番号２１３５）
ｒ）ＭＦｏｚ−１のプレ配列
ｓ）０  グルカナ−ゼ（ＢＧＬ２）のプレ配列
ｔ）キラー毒素リーダー
ｕ）キラー毒素のプレ配列
ｖ）ｋ．ｌａｃｔｉｓキラー毒素プレプロ（２９アミノ酸；プレの１６アミノ酸およびプロの１３アミノ酸）ＭＮＩＦＹＩＦＬＦＬＬＳＦＶＱＧＬＥＨＴＨＲＲＧＳＬＤＫＲ（配列番号２１３６）
ｗ）Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアミラーゼＩＩ分泌リーダー配列
ｘ）Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓαガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）分泌リーダー配列
ｙ）Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌｕｃｏａｒｎｙｌａｓｅリーダー配列
ｚ）ＥＰ−Ａ−３８７  ３１９（参考として本明細書中で援用される）において開示されるハイブリッドリーダー
ａａ）ｇｐ６７シグナル配列（バキュロウイルス発現系との関連）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ信託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）または
ｂｂ）治療用タンパク質Ｘの天然リーダーＸ；
ｃｃ）ＪＰ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として認可され、参考として本明細書中で援用される）において開示されるような、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素（ＳＵＣ２）リーダー；または
ｄｄ）イヌリナーゼ−ＭＫＬＡＹＳＬＬＬＰＬＡＧＶＳＡＳＶＩＮＹＫＲ（配列番号２１３７）
ｅｅ）改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体  ＃１−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＫＲ（配列番号２１２８）。
ｆｆ）改変されたＴＡ５７プロペプチドリーダー改変体  ＃２−ＭＫＬＫＴＶＲＳＡＶＬＳＳＬＦＡＳＱＶＬＧＱＰＩＤＤＴＥＳＱＴＴＳＶＮＬＭＡＤＤＴＥＳＡＦＡＴＱＴＮＳＧＧＬＤＶＶＧＬＩＳＭＡＥＥＧＥＰＫＲ（配列番号２１２９）
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを、選択マーカーとして用いるベクターは、薬物（それぞれメチオニンスルホキシミン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）またはメトトレキサート）の存在下で、増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性の細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ））が利用可能であることである。グルタミンシンターゼ発現系はまた、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）においても、さらなるインヒビターを提供して内因性遺伝子の機能を妨げることにより、機能し得る。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成要素は、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号；同第ＷＯ８６／０５８０７号；同第ＷＯ８９／０１０３６号；同第ＷＯ８９／１０４０４号；および同第ＷＯ９１／０６６５７号（これらの全体が本明細書中で参考として援用される）において記載される。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）から得られ得る。ＧＳ発現系を用いた、マウス骨髄腫細胞におけるモノクローナル抗体の発現および生成は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）（本明細書中で参考として援用される）において記載される。
【０４３９】
本発明はまた、本明細書中で記載される上記ベクター構築物を含む宿主細胞にも関し、そして本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞をさらに含む。このヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を使用して、１つ以上の異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と作動可能に連結される。宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）などの高等な真核生物細胞もしくは酵母細胞などの下等な真核生物細胞であり得るか、または宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。挿入遺伝子配列の発現を調節する宿主菌株、または遺伝子産物を所望の特別な様式で改変もしくはプロセシングする宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導因子の存在下で、増大し得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチドの発現は、制御され得る。その上、別々の宿主細胞は、翻訳ならびに翻訳後のタンパク質のプロセシングおよび改変（例えば、リン酸化、切断）について、特徴および特定の機構を有する。適切な細胞株は、発現する外来性のタンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にするように、選択され得る。
【０４４０】
本発明の核酸および核酸構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって達成され得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）などの、多くの標準的研究室マニュアルにおいて記載される。本発明のポリペプチドが、実際に組換えベクターを欠く宿主細胞によって発現され得ることが、特に企図される。
【０４４１】
本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、治療タンパク質に相当するコード配列は、治療タンパク質に相当するアルブミン融合タンパク質と置き換えられ得る）を欠失または置換するように操作されており、そして／または遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように設計される（例えば、治療タンパク質に相当する本発明のアルブミン融合タンパク質のような異種ポリヌクレオチド配列が含まれる）。内因性ポリヌクレオチドと作動可能に連結する遺伝物質は、内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、および／または増幅し得る。
さらに、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体をコードするポリヌクレオチド）および／または異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、治療タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と、作動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；国際公開第ＷＯ  ９６／２９４１１号；国際公開第ＷＯ  ９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それら全体において参考として援用される）。
【０４４２】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために使用される。
【０４４３】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。アニオン交換クロマトグラフィーとしては、Ｑ−セファロースカラム、ＤＥＡＥセファロースカラム、ポロス（ｐｏｒｏｓ）ＨＱカラム、ポロスＤＥＡＥカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｑカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥカラム、リソース／ソースＱカラムおよびリソース／ソースＤＥＡＥカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＱカラムならびにＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＥＡＥカラムが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。陽イオン交換クロマトグラフィーとしては、ＳＰ−セファロースカラム、ＣＭセファロースカラム、ポロス（ｐｏｒｏｓ）ＨＳカラム、ポロスＣＭカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭカラム、リソース／ソースＳカラムおよびリソース／ソースＣＭカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳカラムおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＣＭカラムならびにこれらの等価物および類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４４】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して精製される。疎水性相互作用クロマトグラフィーとしては、フェニル−セファロースカラム、ブチル−セファロースカラム、メチル−セファロースカラム、オクチル−セファロースカラム、ヘキシル−セファロースカラム、ポロスフェニルカラム、ポロスブチルカラム、ポロスメチルカラム、ポロスオクチルカラム、ポロスヘキシルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌメチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌオクチルカラム、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌヘキシルカラム、リソース／ソースフェニルカラム、リソース／ソースブチルカラム、リソース／ソースメチルカラム、リソース／ソースオクチルカラム、リソース／ソースヘキシルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌフェニルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌブチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌメチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌオクチルカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌヘキシルカラム、ならびにこれらの等価物および類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製される。サイズ排除クロマトグラフィーとしては、セファロースＳ１００カラム、セファロースＳ２００カラム、セファロースＳ３００カラム、セファデックスレジンカラムならびにこれらの等価物および類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４５】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。アフィニティークロマトグラフィーとしては、Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｙｅアフィニティーカラム、ペプチドアフィニティーカラムおよび抗体アフィニティーカラムが挙げられるが、これらに限定されない。これらのカラムは、ＨＳＡまたは「融合標的」分子のどちらかに選択的である。
【０４４６】
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、上に列挙した１つ以上のクロマトグラフィー方法を使用して精製される。他の好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下の１つ以上のクロマトグラフィーカラムを使用して精製される：ＱセファロースＦＦカラム、ＳＰセファロースＦＦカラム、Ｑセファロース高性能カラム、ブルーセファロースＦＦカラム、ブルーカラム、フェニルセファロースＦＦカラム、ＤＥＡＥセファロースＦＦカラム、またはメチルカラム。
【０４４７】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ００／４４７７２号（本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載された過程を使用して精製され得る。当業者は、この中で記載される過程を、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製における使用のために、容易に変更し得る。
【０４４８】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下から回収され得る：化学合成手順の産物；および組換え技術により原核細胞宿主または真核細胞宿主から生成される産物（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる）。組換え生成手順において使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化ポリペプチドまたは非グリコシル化ポリペプチドであり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、（幾つかの場合では、宿主媒介過程の結果として）冒頭のメチオニン残基の改変も含み得る。従って、全ての真核細胞において、翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、任意のタンパク質から、一般に、翻訳後に効率的に除去されることは、当該分野で周知である。殆どのタンパク質におけるＮ末端メチオニンはまた、殆どの原核生物においても効率的に除去されるが、幾つかのタンパク質については、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存して、この原核生物除去過程が非効率的である。
【０４４９】
１つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核細胞系において、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させるために使用される。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素供給源として代謝し得るメチル栄養性（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝経路における主要な工程は、Ｏ２を使用してのホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼによって触媒される。その唯一の炭素供給源としてメタノールを代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ２に対するアルコールオキシダーゼの比較的低い親和性に部分的に起因して、高レベルのアルコールオキシダーゼを生成しなければならない。結果的に、主要な炭素供給源としてメタノールに依存する増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領域は、非常に活性である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける総可溶性タンパク質のうちのおよそ３０％までを含む。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１〜２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ  ５：１６７〜７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３８５９〜７６（１９８７）を参照のこと。従って、ＡＯＸ１調節配列の全てまたは一部の転写調節下の異種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチド）は、メタノールの存在下で増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において、非常に高レベルで発現される。
【０４５０】
１つの例において、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８）において本質的に記載されるように、Ｐｉｃｈｅａ酵母系において、本明細書中に示されるように本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現させるために使用される。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターの効力によって、本発明のポリペプチドの発現および分泌を可能にする。
【０４５１】
多くの他の酵母ベクター（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５）は、当業者が容易に理解するように、提案された発現構築物が必要とされる場合インフレームのＡＵＧを含む転写、翻訳、分泌（所望される場合）などの適切に配置されたシグナルを提供する限り、ｐＰＩＣ９Ｋの代わりに使用され得る。
【０４５２】
別の実施形態において、異種コード配列（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドなど）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαなど）中にクローニングし、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させることによって達成され得る。
【０４５３】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０４５４】
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変される本発明のアルブミン融合タンパク質を含む。任意の多数の化学的改変は、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
【０４５５】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下が挙げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このアルブミン融合タンパク質また、検出可能な標識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０４５６】
適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；そして適切な放射活性物質の例としては、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素  （１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｕが、挙げられる。
【０４５７】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体は、以下に挙げられるが限定はされない放射性金属イオンと結合する大環状のキレーターに結合する：１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍ。このキレーターはポリペプチドに対する。好ましい実施形態において、大環状のキレーターと結合する放射性金属イオンは、１１１Ｉｎである。別の好ましい実施形態においては、大環状のキレーターと結合する放射性金属イオンは、９０Ｙである。特定の実施形態において、大環状のキレーターは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。他の特定の実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して本発明の抗体またはそのフラグメントに結合する。ＤＯＴＡが
ポリペプチドに結合するために有用なリンカー分子の例は、一般に当該分野で公知である。例えば、ＤｅＮａｒｄｏら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０（１９９８）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７（１９９９）；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（１９９９）を、参照のこと。これらは、本明細書中で全体が参考として援用される。
【０４５８】
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、天然プロセス（例えば、翻訳後プロセシング）または当該分野で周知の化学的改変技術のいずれかによって、改変され得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ程度または種々の程度で存在し得ることが、理解される。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝状であり得、そしてそのポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状であり得る。環状ポリペプチド、分枝状ポリペプチドおよび分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリチル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加（例えば、アルギニル化）、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０４５９】
本発明のアルブミン融合タンパク質、および治療用タンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体に結合する抗体は、マーカー配列（例えば、精製を容易にするためのペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態において、このマーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）にて提供されるタグである）であり、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１〜８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、「ＨＡ」タグおよび「ｆｌａｇ」タグが挙げられるがこれらに限定されない。この「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））。
【０４６０】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用部分（例えば細胞毒（例えば細胞増殖抑制因子もしくは細胞殺傷因子））、治療剤または放射性金属イオン（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒または細胞毒性因子は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログが、挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４６１】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために用いられ得、治療薬剤または薬物成分は、古典的な化学的治療薬剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を所有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。
このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、またはジフテリアトキシンのようなトキシン；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス作用因子、例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開番号第ＷＯ９７／３３８９９を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開番号第ＷＯ９７／３４９１１を参照のこと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号第ＷＯ９９／２３１０５を参照のこと）、血栓性因子または抗血管形成因子、例えば、アンギオスタチンまたはエンドスタチンのようなタンパク質；または、例えば、リンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、またはその他の成長因子のような生物学的応答改変剤を含み得る。このような治療成分をタンパク質（例えば、アルブミン融合タンパク質）に結合体化する技法は、当該分野で周知である。
【０４６２】
アルブミン融合タンパク質はまた、固体支持体に付着され得、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質よって結合されるか、それに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライドまたはポリプロピレンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０４６３】
アルブミン融合タンパク質は、それに結合体化した治療成分とともに、またはなしで、単独、または細胞傷害性因子（単数または複数）および／またはサイトカイン（単数または複数）と組み合わせて、治療剤として用いられ得る。
【０４６４】
本発明のアルブミン融合タンパク質が治療タンパク質を結合する抗体のＶＨドメインのみを含む実施形態では、治療タンパク質を結合する同じ抗体のＶＬドメインとの融合タンパク質を、ＶＨアルブミン融合タンパク質およびＶＬタンパク質が、翻訳後、（共有結合または非共有結合のいずれかにより）会合するように、同時発現することが必要および／または所望され得る。
【０４６５】
本発明のアルブミン融合タンパク質が、治療タンパク質を結合する抗体のＶＬドメインのみを含む実施形態では、治療タンパク質を結合する同じ抗体のＶＨドメインとの融合タンパク質を、ＶＬアルブミン融合タンパク質およびＶＨタンパク質が、翻訳後、（共有結合または非共有結合のいずれかにより）会合するように、同時発現することが必要および／または所望され得る。
【０４６６】
いくつかの治療抗体は、二特異性抗体であり、治療タンパク質を結合する抗体が、２つの異なる重鎖／軽鎖対、および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体であることを意味する。その治療タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質を創製するために、このアルブミンタンパク質成分のＮ末端およびＣ末端の両方に融合されたｓｃＦｖフラグメントを有するアルブミン融合タンパク質を創製することが可能である。より詳細には、アルブミンのＮ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療タンパク質を結合する当初の抗体の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の一方に対応し得、そしてアルブミンのＣ末端に融合されたｓｃＦｖは、治療タンパク質を結合する当初の抗体の重鎖／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の他方に対応し得る。
【０４６７】
本発明によってまた提供されるのは、ポリペプチドの増加した溶解度、安定性および循環時間、または低下した免疫原性のようなさらなる利点を提供し得る、本発明のアルブミン融合タンパク質の化学的に改変された誘導体である（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどのような水溶性ポリマーから選択され得る。アルブミン融合タンパク質は、この分子内のランダムな位置、またはこの分子内の所定の位置で改変され得、そして１つ、２つ、３つまたはそれ以上の付加された化学的成分を含み得る。
【０４６８】
このポリマーは、任意の分子量であり得、そして分枝または非分枝であり得る。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、取扱いおよび製造における容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間である（用語「約」は、ポリエチレングリコールの調製物中で、いくつかの分子が述べられた分子量よりいくらか大きいか、または小さい重量であることを示す）。その他のサイズも、所望の治療プロフィール（例えば、所望の持続放出の持続期間、存在する場合生物学的活性に対する効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールのその他の既知の効果）に依存して用いられ得る。例えば、このポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０４６９】
上記のように、このポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエチレンは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）に記載されており、その各々の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０４７０】
このポリエチレングリコール分子（またはその他の化学的成分）は、タンパク質の機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する影響を考慮してタンパク質に付着されるべきである。当業者に利用可能な以下のような多くの付着方法があり、例えば、本明細書に参考として援用されるＥＰ  ０  ４０１  ３８４に開示される方法（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧの結合）；トレシルクロライドを用いるＧＭ−ＣＳＦのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を報告する、Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２８−１０３５（１９９２）もまた参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離のアミノ基またはカルボキシル基のような、反応性基を経由してアミノ酸残基を通じて共有結合され得る。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合し得るような基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み得；遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を含み得る。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を付着するための反応性基として用いられ得る。治療目的のための好ましいのは、Ｎ末端またはリジン基における付着のような、アミノ基における付着である。
【０４７１】
上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の数のアミノ酸残基への結合を経由してタンパク質に付着され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基への共有結合を経由してタンパク質に結合され得る。１つ以上の反応化学薬品が、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）、またはタンパク質の１つ以上のタイプのアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組合せ）に付着するために採用され得る。
【０４７２】
Ｎ末端において化学的に改変されるタンパク質が、具体的に所望され得る。本発明の組成物の例示として、ポリエチレングリコールを使用して、当業者は、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによって）、反応混合物中のポリエチレングリコール分子  対  タンパク質（ポリペプチド）分子の割合、行われるペグ化反応の型、および選択されるＮ末端ペグ化タンパク質を得る方法から選択し得る。Ｎ末端ペグ化調製物を得る（すなわち、この部分を、必要であれば、他のモノペグ化部分から分離する）方法は、Ｎ末端ペグ化物質をペグ化タンパク質分子の集団から精製することによってであり得る。Ｎ末端改変において化学的に改変された選択的タンパク質は、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（Ｎ末端に対してリジン）の異なる反応性を利用する還元型アルキル化によって達成され得る。適切な反応条件の下で、カルボキシル基含有ポリマーを用いたＮ末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０４７３】
上記に示されるように、本発明のアルブミン融合タンパク質のペグ化は、任意の数の手段により達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、アルブミン融合タンパク質に、直接にかまたは介在リンカーによってかのいずれかで結合され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するためのリンカーなしの系は、Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；およびＷＯ９８／３２４６６（これらの各々の開示は、本明細書中に参考として援用される）記載される。
【０４７４】
ポリエチレングリコールをタンパク質のアミノ酸残基に介入リンカーを使用せずに直接結合するための１つの系は、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）のトレシルクロリド（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を使用した修飾により生成される、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）ＭＰＥＧを使用する。タンパク質とトレシル化ＭＰＥＧとの反応の際に、ポリエチレングリコールは、そのタンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク質と、２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホニル基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって生成される、タンパク質−ポリエチレングリコール結合体を包含する。
【０４７５】
ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介入リンカーを使用してタンパク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（これらの開示全体は、本明細書中に参考として援用される）は、ポリエチレングリコールをタンパク質に連結するためのウレタンリンカーを開示する。タンパク質−ポリエチレングリコール結合体（ここでこのポリエチレングリコールは、リンカーによってタンパク質に結合される）はまた、タンパク質と、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロペニル（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌ）カーボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカーボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような化合物との反応によって生成され得る。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するための、多くのさらなるポリエチレングリコール誘導体および反応化学は、国際公開番号ＷＯ９８／３２４６６（これらの開示全体は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。本明細書中に記載される反応化学を使用して生成されるペグ化タンパク質生成物は、本発明の範囲内に包含される。
【０４７６】
本発明の各アルブミン融合タンパク質に結合されるポリエチレングリコール部分の数（すなわち、置換の程度）もまた変化し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、平均して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、１７個、２０個またはそれ以上のポリエチレングリコール分子に連結され得る。同様に、平均した置換の程度は、１タンパク質分子あたり、１〜３個、２〜４個、３〜５個、４〜６個、５〜７個、６〜８個、７〜９個、８〜１０個、９〜１１個、１０〜１２個、１１〜１３個、１２〜１４個、１３〜１５個、１４〜１６個、１５〜１７個、１６〜１８個、１７〜１９個、または１８〜２０個のような、ポリエチレングリコール部分の範囲である。置換の程度を決定するための方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において議論される。
【０４７７】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない標準的な方法によって、化学合成および組換え細胞培養物から回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）は、精製のために使用される。タンパク質の再折りたたみのための周知の技術は、そのポリペプチドが、単離および／または精製の間に変性される場合、活性なコンホメーションを再生するために使用され得る。
【０４７８】
本発明のアルブミン融合タンパク質の存在または量は、当該分野で周知のイムノアッセイであるＥＬＩＳＡを使用して決定され得る。１つのＥＬＩＳＡにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質を検出／定量するために有用なプロトコルは、ＥＬＩＳＡプレートを、抗ヒト血清アルブミン抗体でコーティングする工程、プレートをブロッキングして、非特異的結合を防止する工程、そのＥＬＩＳＡプレートを洗浄する工程、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む溶液を（１以上の異なる濃度で）添加する工程、検出可能な標識に連結された二次抗治療用タンパク質特異的抗体を添加する工程（本明細書中に記載されるかまたはさもなければ当該分野で公知のように）、および二次抗体の存在を検出する工程を包含する。このプロトコルの代替的バージョンにおいて、ＥＬＩＳＡプレートは、抗治療用タンパク質特異的抗体でコーティングされ得、その標識二次試薬は、抗ヒトアルブミン特異的抗体であり得る。
【０４７９】
（ポリヌクレオチドの使用）
本明細書中で同定されるポリヌクレオチドの各々は、多くの様式において試薬として使用され得る。以下の記載は、例示的であると見なされるべきであり、公知の技術を利用する。
【０４８０】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を生成するために有用である。以下により詳細に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド（アルブミン融合タンパク質をコードする）は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってコードされるアルブミン融合タンパク質を発現する細胞、細胞株、または組織を作製するために、遺伝子操作において有用な組換えＤＮＡ法において使用され得る。
【０４８１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治療の１つの目的は、遺伝的欠損を矯正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物に正常な遺伝子を挿入することである。本発明において開示されるポリヌクレオチドは、非常に正確な様式でこのような遺伝的欠損を標的化する手段を提供する。別の目的は、宿主ゲノムに存在しなかった新たな遺伝子を挿入し、それにより宿主細胞において新たな形質を生じさせることである。本発明によって包含される遺伝子治療法のさらなる非例示的例は、本明細書中で他の箇所により綿密に記載される（例えば、「遺伝子治療」と表された節ならびに実施例６３および６４を参照のこと）。
【０４８２】
（ポリペプチドの使用）
本明細書中で同定される各々のポリペプチドは、多くの方法において使用され得る。以下の記述は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０４８３】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、組織（例えば、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用である。
【０４８４】
アルブミン融合タンパク質を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的な方法を用いて、生物学的サンプル中のポリペプチドのレベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の遺伝子発現を検出するのに有用な他の方法には、免疫学的検定（例えば、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が含まれる。適切なアッセイの標識は、当該分野で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０４８５】
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質のインビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）により検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水素）を含み、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する細胞株に生じた栄養分を標識することによりアルブミン融合タンパク質中に取り込まれ得る。
【０４８６】
放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ、（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識された、アルブミン融合タンパク質は、免疫系の障害について検査されるべき哺乳動物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識されたアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、一つ以上のレセプター、リガンドまたは基質（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療タンパク質のものに相当する）が配置される体（例えば、器官、細胞、細胞外空間または細胞外マトリックス）中の位置に蓄積する。あるいは、アルブミン融合タンパク質が、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含む場合において、次いで標識されたアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、治療抗体（本発明のアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される）によって結合されるものに相当するポリペプチド／エピトープが配置される体（例えば、器官、細胞、細胞外空間または細胞外マトリックス）中の位置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。本明細書中に記載されるプロトコルは、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて使用するために当業者によって容易に改善され得る。
【０４８７】
１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、細胞への本発明のアルブミン融合タンパク質の特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０４８８】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連する本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０４８９】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定含有部分））、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「毒素」はまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金属イオン（例えば、α−放射体（例えば、２１３Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例えば、１０３Ｐｄ、１３３Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０イットリウム、１１７スズ、１８６レニウム、１６６ホルミウム、および１８８レニウム）；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンを含む。特定の実施形態において、本発明は、放射性同位体９０Ｙに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な消滅（例えば、腫瘍細胞の消滅）のための方法を提供する。別の特定の実施形態において、本発明は、放射性同位体１１１Ｉｎに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な消滅（例えば、腫瘍細胞の消滅）のための方法を提供する。さらに特定の実施形態において、本発明は、放射性同位位１３１Ｉに関連する本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を投与することによって、細胞の特異的な消滅（例えば、腫瘍細胞の消滅）のための方法を提供する。
【０４９０】
当該分野において公知の技術は、本発明のポリペプチドを標識化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書中に参考としてその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定されない。
【０４９１】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくはヒト中の様々な障害の診断、処置、妨害および／または予後のために有用である。このような障害としては、以下の節の見出しである「生物学的活性」の下で本明細書中に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９２】
従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）本発明のアルブミン融合タンパク質を使用して個体の細胞または体液における特定のポリペプチドの発現レベルをアッセイする工程；および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準のポリペプチドの発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイされたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。癌に関しては、個体由来の生検された組織中の相対的に高い量の転写物の存在は、疾患の発症の素因を示し得るか、または実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾患を検出するための手段を提供し得る。より決定的なこのタイプの診断は、保健専門家がより早く予防策または積極的な処置を使用し、それによって癌の発症またはさらなる進行を防ぐことを可能にし得る。
【０４９３】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて疾患または状態（例えば、神経障害、免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、増殖障害ならびに／または癌性疾患および状態など）を処置または予防し得る。例えば、患者は、ポリペプチドの非存在またはレベルの減少を元に戻すこと（例えば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充すること（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセプターに結合させることによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をもたらすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドが投与され得る。
【０４９４】
特に、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質もまた用いられ、疾患（上記、および本明細書中のどこかに記載されるような）を処置し得る。例えば、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、ポリペプチドを結合し得、そして／またはアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドを中和し得、そして／またはアルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドの過剰産生を低減し得る。同様に、治療抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質の投与は、膜（レセプター）に結合されるポリペプチドに結合することによって、アルブミン融合タンパク質を作製するために使用される治療抗体が特異的に結合するポリペプチドを活性化し得る。
【０４９５】
少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、本発明のアルブミン融合タンパク質がまた用いられて、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用されて、組換え細胞からの治療タンパク質、アルブミンタンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質発現を測定する。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質が使用され、以下の生物学的活性を試験し得る。
【０４９６】
（診断アッセイ）
本発明の化合物は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の障害の診断、処置、予防および／または予測のために有用である。このような障害としては、表１の相当する列、ならびに「免疫アッセイ」、「血液関連障害」、「過剰増殖障害」、「腎臓障害」、「心臓血管障害」、「呼吸障害」、「抗新脈管形成活性」、「細胞レベルでの疾患」、「創傷治癒および上皮細胞増殖」、「神経活性および神経学的疾患」、「内分泌障害」、「生殖系障害」、「感染障害」、「再発症」、および／または「胃腸障害」と見出しをつけた節のもとで本明細書において、各治療タンパク質について記載されたものが挙げられるが、これに限定されない。
【０４９７】
多数の障害について、遺伝子発現の実質的に変更した（増大または減少した）レベルが、このような障害を有する個体から得た細胞または体液（例えば、血清、血漿、尿、精液、滑液または髄液）で、「標準」の遺伝子発現レベル、すなわち、障害を有さない個体由来の組織または体液中の発現レベルに比較して、検出され得る。従って、本発明は、障害の診断中に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体由来の組織、細胞または体液でのポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、および測定した遺伝子発現レベルを標準遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、そのことにより、標準と比較される遺伝子発現レベルの増加または減少が、障害の指標となる。これらの診断アッセイは、例えば、血液サンプル、生検組織、または剖検組織などにおいて、インビボまたはインビトロで実施され得る。
【０４９８】
本発明はまた、予想指標として有用であり、これにより遺伝子発現の上昇または低下を示す患者は、悪い臨床結果を被る。
【０４９９】
「ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、特定のポリペプチドのレベル、または本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベルを、第一の生物学的サンプルで、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの決定または評価によって）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対する比較によって）に、定性または定量的に測定または評価することを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルは、測定または評価され、そして標準ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルと比較され、この標準は、障害を有さない個体から得た第二の生物学的サンプルから得られるか、または免疫系の障害を有さない個体集団からのレベルを平均して決定される。当該分野で理解されるように、一旦、標準ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
【０５００】
「生物学的サンプル」とは、本発明のポリペプチド（その一部を含む）またはｍＲＮＡを含有する、個体、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得られた、任意の生物学的サンプルを意図する。示されるように、生物学的サンプルとしては、ポリペプチドの全長またはそのフラグメントまたはｍＲＮＡを発現することが見出された体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）および組織供給源が挙げられる。哺乳動物から組織生検および体液を得る方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルが、ｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０５０１】
全細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７））により記載される一段階グアニジウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム方法のような任意の適切な技術を用いて生物学的サンプルから単離され得る。次いで、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）を包含する。
【０５０２】
本発明はまた、ポリペプチドの正常なレベルおよび異常なレベルの決定を含む、生物学的サンプル（例えば、細胞および組織）中のポリペプチドのレベルを検出する定量アッセイおよび診断アッセイのような診断アッセイに関する。従って、例えば、正常なコントロール組織サンプルと比較した、アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドの過剰発現を検出するための本発明に従う診断アッセイは、腫瘍の存在を検出するために使用され得る。宿主由来のサンプルにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドのレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ方法としては、放射性免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。生物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルのアッセイは、任意の当該分野に公知の方法を用いて可能である。
【０５０３】
生物学的サンプル中のポリペプチドレベルをアッセイすることは、技術を用いて可能である。例えば、組織におけるポリペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ、Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて研究され得る。ポリペプチド遺伝子発現を検出するために有用な他の方法は、免疫アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ））を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）および放射性同位元素（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならびにビオチンを包含する。
【０５０４】
分析されるべき組織または細胞型としては、一般的には、目的の遺伝子を発現することが公知であるか、またはそのことが予測される組織または細胞型（例えば、癌など）が挙げられる。本明細書中で使用されるタンパク質単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される））に記載される方法であり得る。単離された細胞は、細胞培養物または患者由来であり得る。培養物から採取された細胞の分析は、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として、あるいは遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するために使用され得る細胞の評価において必須の工程であり得る。
【０５０５】
例えば、アルブミン融合タンパク質を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドの存在を定量的にまたは定性的に検出し得る。これは、例えば、光学顕微鏡検出、フローサイトメトリー検出、または蛍光比色検出と一緒に蛍光的に標識されたアルブミン融合タンパク質を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
【０５０６】
好ましい実施形態において、本明細書中に開示される（表１に開示される）またはそうでなければ当該分野で公知である少なくとも治療タンパク質に特異的に結合する抗体の少なくともフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、遺伝子産物、またはその保存された改変体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的にまたは定性的に検出するために用いられ得る。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み合わせた、蛍光標識した抗体を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
【０５０７】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドのインサイチュ検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡または非免疫学的アッセイとしてさらに組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者由来の組織学的標本を除去すること、およびそれに本発明の標識した抗体またはポリペプチドを適用することによって達成され得る。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、生物学的サンプル上に標識したアルブミン融合タンパク質を覆うことによって適用される。このような手順の使用を通して、アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドの存在だけでなく、試験した組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明を使用して、当業者は、広範種々の組織学的方法のいずれか（例えば、染色手順）が、例えば、インサイチュ検出を達成するために変更され得ることを容易に理解する。
【０５０８】
アルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチドを検出する免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、代表的に、遺伝子産物または保存された変異体もしくはそのペプチドフラグメントを結合し得る検出可能に標識された抗体の存在下で、サンプル（例えば、生物学的液体、組織抽出物、新鮮な収集された細胞、または細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解物）をインキュベートする工程、ならびに当該分野で周知の多数の技術のいずれかによって結合した抗体を検出する工程を包含する。
【０５０９】
生物学的サンプルは、固相支持体またはキャリア（例えば、ニトロセルロース）あるいは細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定し得る他の固体支持体と接触させられ得る。次いで、この支持体を、適切な緩衝液で洗浄し、続いて、本発明の検出可能なアルブミン融合タンパク質で処理し得る。この固相支持体を、次いで、緩衝液で２回洗浄し、非結合の抗体またはポリペプチドを除去し得る。必要に応じて、この抗体は、その後標識される。次いで、固体支持体上の固定された標識の量は、従来の方法によって検出され得る。
【０５１０】
「固相支持体またはキャリア」とは、ポリペプチド（例えば、アルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連するポリペプチド）を結合し得る任意の支持体を意図する。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然のおよび改変したセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的のためにある程度可溶性であるかまたは不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合した分子が、ポリペプチドに結合し得る限り、実質的に任意の可能な構造配置を有し得る。従って、支持体の構造は、ビーズの場合は球状、あるいは試験管の内表面またはロッドの外表面の場合は円筒形であり得る。あるいは、表面は、平面（例えば、シート、試験ストリップなど）であり得る。好ましい支持体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者には、抗体または抗原を結合し得る多くの他の適切なキャリアが公知であるか、または慣用的な実験の使用によって同一か確認することができる。
【０５１１】
アルブミン融合タンパク質の所定のロットの結合活性は、周知の方法に従って決定され得る。当業者は、慣用的な実験を使用することによって各々の決定のための有効でかつ最適のアッセイ条件を決定し得る。
【０５１２】
個体から得られた生物学的サンプルにおいてポリペプチドレベルをアッセイすることに加えて、ポリペプチドはまた、画像化によってインビボでも検出され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、疾患の細胞または新生物細胞を画像化するために使用される。
【０５１３】
本発明のアルブミン融合タンパク質をインビボで画像化するための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンもしくはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影のために、適切な標識としては、検出可能な放射線を放射するが被験体に対して明らかに有害でない、放射線同位元素（例えば、バリウムまたはセシウム）が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切なマーカーとしては、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば、重水素）が挙げられ、これらは、関連のハイブリドーマのための栄養素の標識化によりアルブミン融合タンパク質に取り込まれ得る。
【０５１４】
さらに、存在が検出され得る本発明のアルブミン融合タンパク質が、投与され得る。例えば、放射性不透過性（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）化合物または他の適切な化合物で標識された本発明のアルブミン融合タンパク質は、投与され、標識抗体に関して上記に記載されるようにインビボで画像化され得る。さらにこのようなポリペプチドは、インビトロ診断手順のために使用され得る。
【０５１５】
適切な検出可能な画像化部分（例えば、放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料）で標識されたポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントが、障害について試験される哺乳動物に（例えば、非経口で、皮下で、もしくは腹腔内で）導入される。被験体および使用される画像化システムの大きさが、診断画像を生じるのに必要とされる画像化部分の量を決定することは、当該分野で理解される。放射線同位元素部分の場合、ヒト被験体については、注入される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。標識されたアルブミン融合タンパク質は、次いで、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、アルブミン融合タンパク質によって結合される、またはアルブミン融合タンパク質と関連する、ポリペプチドまたは他の基質を含む体内の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍イメージングは、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ」により記載される（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）の１３章）。
【０５１６】
本発明のアルブミン融合タンパク質が検出可能に標識され得る１つの方法は、レポーター酵素へ同様に連結し、そしてこの連結された産物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）に用いることによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．「Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」１９７８、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編）１９８０、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＰＴＰａｓｅＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ら（編）１９８１、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合するレポーター酵素は、適切な基質（好ましくは色素基質）と、例えば、分光光度法、蛍光法または可視手段によって検出され得る化学部分を生成するような様式で反応する。抗体を検出可能に標識するために使用されるレポーター酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、この検出は、このレポーター酵素に対する色素基質を用いる比色方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準物質と比較して、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成され得る。
【０５１７】
アルブミン融合タンパク質はまた、放射標識され得、そして種々の他の免疫アッセイのいずれかにおいて使用され得る。例えば、アルブミン融合タンパク質を放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）においてアルブミン融合タンパク質を使用することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６を参照のこと（これは、本明細書中に参考として援用される））。放射性同位元素は、γカウンター、シンチレーションカウンター、またはオードラジオグラフィーを含む手段によって検出され得るが、これらに限定されない。
さらに、当該分野で公知のキレート剤分子は、アルブミン融合タンパク質を標識するために使用され得る。キレート剤は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合し、前記タンパク質を、放射性核種または蛍光標識を含む金属イオンで標識することを容易にし得る。
例えば、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｒ．およびＭｅａｒｅｓ，Ｃ．Ｆ．，「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ編）Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ）；Ｓａｊｉ，Ｈ．，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ：ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１６：２０９−２４４（１９９９）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ．Ｃ．およびＭｅａｓｅ  Ｒ．Ｃ．，「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｌｉｇａｎｄｓ，ｎｕｃｌｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｂ  １８：５８９−６０３（１９９１）；およびＬｉｕ，Ｓ．およびＥｄｗａｒｄｓ，Ｄ．Ｓ．，「Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｌａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．」Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１２：７−３４（２００１）を参照のこと。前記アルブミン融合タンパク質に共有結合し得る任意のキレート剤は、本発明に従って使用され得る。キレート剤は、アルブミン融合タンパク質に対するキレート部分と結合するリンカー部分をさらに含み得る。
【０５１８】
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式（キレート剤（例えば、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）、ＤＰＴＡのアナログ、およびＤＰＴＡの誘導体と結合する。非限定的な例として、
キレート剤は、２−（ｐ−イソチオシアネートベンジル）−６−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（１Ｂ４Ｍ−ＤＰＴＡ、ＭＸ−ＤＴＰＡとしても公知）、２−メチル−６−（ρ−ニトロベンジル）−１，４，７−トリアザヘプタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ニトロ−１Ｂ４Ｍ−ＤＰＴＡまたはニトロ−ＭＸ−ＤＴＰＡ）；２−
（ｐ−イソチオシアネートベンジル）−シクロヘキシルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＣＨＸ−ＤＴＰＡ）、またはＮ−［２−アミノ−３−（ρ−ニトロフェニル）プロピル］−トランス−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ニトロ−ＣＨＸ−Ａ−ＤＴＰＡ）であり得る。
【０５１９】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、非環式テルピリジンキレート剤（例えば、６，６’’−ビス［［Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−テトラ（カルボキシメチル）アミノ］メチル］−４’−（３−アミノ−４−メトキシフェニル）２，２’：
６’，２’’−テルピルジン（ＴＭＴ−アミン））と結合する。
【０５２０】
特別な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。別の特定の実施形態において、ＤＯＴＡは、リンカー分
子により、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合するポリペプチドへのＤＯＴＡ結合に有用なリンカー分子の例は、当該分野で一般的に公知である−例えば、ＤｅＮａｒｄｏら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３−９０，１９９８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５５３−７，１９９９；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：９４３−５０（これらの全体は、参考として本明細書によって援用される）を参照のこと。さらに、抗体に結合し得るキレート剤およびそれらを製造しかつ使用するための方法を開示する米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号は、それらの全体を参考として本明細書によって援用される。抗体へのキレート剤の結合に焦点を合わせた米国特許第５，６５２，３６１号および同第５，７５６，０６５号を通じて、当業者は、それらに開示される方法を容易に適合させ、他のポリペプチドにキレート剤を結合させ得る。
【０５２１】
結合が、活性化アーム、または官能基を介して、リガンドの炭素骨格に結合される大環状リガンドに基づく二官能性キレート剤は、以下により記載されるように利用され得る；Ｍ．Ｍｏｉら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４９：２６３９（１９８９）（２−ｐ−ニトロベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）；Ｓ．Ｖ．Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１
：４７３（１９９０）；Ｇ．Ｒｕｓｅｒら，  Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１：３４５（１９９０）；Ｃ．Ｊ．Ｂｒｏａｎら，Ｊ．Ｃ．  Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２３：１７３９（１９９０）；およびＣ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３６：８５０（１９９５）。
【０５２２】
１つの実施形態において、大環状キレート剤（例えば、ポリアザ大環状キレート剤）（必要に応じて１つ以上のカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキサメート基、ホスファネート基、またはリン酸基を含む）は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する。別の実施形態において、キレート剤は、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡのアナログ、およびＤＯＴＡの誘導体からなる群より選択されるキレート剤である。
【０５２３】
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る適切なキレート剤分子としては、ＤＯＸＡ（１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカントリ酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザノナントリ酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンテトラ酢酸）、およびＴＨＴ（４’−（３−アミノ−４−メトキシ−フェニル）−６，６’’−ビス（Ｎ’，Ｎ’−ジカルボキシメチル−Ｎ−メチルヒドラジノ）−２，２’：６’，２’’−テルピリジン）、およびそれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。例えば、Ｏｈｍｏｎｏら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：１５７−１６２（１９９２）；Ｋｕｎｇら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２５：３２６−３３２（１９８４）；Ｊｕｒｉｓｓｏｎら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９３：１１３７−１１５６（１９９３）；および米国特許第５，３６７，０８０号を参照のこと。別の適切なキレート剤としては、米国特許第４，６４７，４４７号；同第４，６８７，６５９号；同第４，８８５，３６３号；ＥＰ−Ａ−７１５６４；ＷＯ８９／００５５７；およびＥＰ−Ａ−２３２７５１に開示されるキレート剤が挙げられる。
【０５２４】
別の実施形態において、本発明において使用され得る適切な大環状カルボン酸キレート剤としては、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）；１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（１５Ｎ４）；１，４，７−テトラアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（９Ｎ３）；１，５，９−トリアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリ酢酸（１２Ｎ３）；および６−ブロモアセトアミド−ベンジル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＢＡＴ）が挙げられる。
【０５２５】
本発明のアルブミン融合タンパク質に結合し得る好ましいキレート剤は、α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＭｅＯ−ＤＯＴＡ−ＮＣＳとしても公知）である。α−（５−イソチオシアナート−２−メトキシフェニル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸の塩またはエステルもまた使用され得る。
【０５２６】
記載されるようなキレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、（キレート剤の配位部位を介して）、治療目的、診断目的、または治療および診断目的に適切な放射性核種を用いて標識され得る。適切な金属の例としては、Ａｇ、Ａｔ、Ａｕ、Ｂｉ、Ｃｕ、Ｇａ、Ｈｏ、Ｉｎ、Ｌｕ、Ｐｂ、Ｐｄ、Ｐｍ、Ｐｒ、Ｒｂ、Ｒｅ、Ｒｈ、Ｓｃ、Ｓｒ、Ｔｃ、Ｔｌ、Ｙ、およびＹｂが挙げられる。診断目的のために使用される放射性核種の例は、Ｆｅ、Ｇｄ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、または６８Ｇａである。別の実施形態において、診断目的で使用される放射性核種は、１１１Ｉｎまたは６７Ｇａである。治療目的で使用される放射性核種の例は、１６６Ｈｏ、１６５Ｄｙ、９０Ｙ、１１５ｍＩｎ、５２Ｆｅ、または７２Ｇａである。１つの実施形態において、治療目的で使用される放射性核種は、１６６Ｈｏまたは９０Ｙである。治療目的および診断目的の両方に使用される放射性核種の例としては、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１７５Ｙｂ、または４７Ｓｃが挙げられる。１つの実施形態において、放射性核種は、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１７５Ｙｂ、または１５９Ｇｄである。
【０５２７】
好ましい金属放射性核種としては、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９７Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、４７Ｓｃ、６７Ｇａ、５１Ｃｒ、１７７ｍＳｎ、６７Ｃｕ、１６７Ｔｍ、９５Ｒｕ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂおよび１４１Ｃｅが挙げられる。
【０５２８】
特定の実施形態において、キレート剤が共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、２１５Ｂｉ、および２２５Ａｃからなる群より選択される金属イオンを用いて標識され得る。
【０５２９】
さらに、γ放射放射性核種（例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、および１６９Ｙｂ）は、診断画像化のための研究下で改良されるが、β放射体（例えば、６７Ｃｕ、１１１Ａｇ、１８６Ｒｅ、および９０Ｙ）は腫瘍治療における適用のために使用される。
他の有用な放射性核種としては、γ放射体例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、１６９Ｙｂ）およびβ放射体（例えば、６７Ｃｕ、１１１Ａｇ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅおよび９０Ｙ）ならびに目的の他の放射性核種（例えば、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、１７７Ｌｕ、８６Ｒｂ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、１９８Ａｕ、１４９Ｐｍ、８５Ｓｒ、１４２Ｐｒ、２１４Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１６６Ｈｏ、２０８Ｔｌ、および４４Ｓｃ）が挙げられる。キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、上記の放射性核種を用いて標識され得る。
【０５３０】
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、遷移金属およびランタニド金属のイオンを含む常磁性金属イオン（例えば、原子番号２１〜２９、４２、４３、４４、または５７〜７１を有する金属、特にＣｒ、Ｖ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕのイオン）を用いて標識され得る。磁気応答画像化のための組成物において使用される常磁性金属としては、原子番号２１〜２９、４２、４４および５８〜７０を有する要素が挙げられる。
【０５３１】
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、蛍光金属イオン（ランタニド、特にＬａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ（例えば、１５２Ｅｕ）、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＬｕを含む）を用いて標識され得る。
【０５３２】
別の実施形態において、キレート剤に共有結合する本発明のアルブミン融合タンパク質は、レポーター（Ｍｏ、Ｂｉ、Ｓｉ、およびＷの原子を含み得る）含有重金属を用いて標識され得る。
【０５３３】
アルブミン融合タンパク質を蛍光化合物で標識することもまた可能である。蛍光標識されたアルブミン融合タンパク質が適切な波長の光に曝露される場合、次いでその存在は、蛍光に起因して検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の間では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンがある。
【０５３４】
アルブミン融合タンパク質はまた、１５２Ｅｕまたは他のランタニド系列のような蛍光発光金属を用いて検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＴＤＡ）のような金属キレート群を用いてアルブミン融合タンパク質に結合され得る。
【０５３５】
アルブミン融合タンパク質はまた、化学発光化合物に結合することによって検出可能に標識され得る。次いで、化学発光タグ化アルブミン融合タンパク質の存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルである。
【０５３６】
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質を標識し得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識目的のための重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
（トランスジェニック生物体）
本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック生物体もまた、本発明に含まれる。トランスジェニック生物体は、一般的に組換え体、外因性または転移されたクローン化遺伝材料に改変された生物体である。このような遺伝材料は、しばしば形質転換体として言われる。形質転換体の核酸配列は、コードタンパク質の最適な発現および分泌に必要とされ得る、１つ以上の転写制御配列および他の核酸配列（例えば、イントロン）を含み得る。形質転換体は、生物体または生物体により生産される産物（例えば、生物体の乳（ｍｉｌｋ）、血液、尿、卵、髪または種子）からの再生を容易にする様式で、コードタンパク質の発現を支配するように設計され得る。形質転換体（は、標的動物の種と同種のゲノムまたは異種のゲノムに由来する核酸配列からなり得る。形質転換体は、特定の核酸配列が他の方法で普通見出されないゲノムの位置でか、または形質転換体の正常位置のいずれかで組み込まれ得る。
【０５３７】
用語「生殖細胞株トランスジェニック生物体」とは、遺伝的変化または遺伝的情報が生殖細胞株に導入されたトランスジェニック生物体を言い、それにより、子孫に遺伝情報を伝えるためのトランスジェニック生物体の能力を与える。このような子孫が、実際にそのような変化または遺伝情報のいくつかまたは全てを有する場合、それらもまたトランスジェニック生物体である。変化または遺伝情報は、レシピエントが属する生物体の種と異なり得、特定のレシピエント個体とのみ異なり得、またはレシピエントによりすでに保有される遺伝的情報であり得る。最後の場合、その変化または誘導された遺伝子は、天然の遺伝子とは異なって発現され得る。
【０５３８】
トランスジェニック生物体は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物であり得る。トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚性幹細胞における遺伝子ターゲティングならびに組換えウイルス感染および組換えレトロウイルス感染を含む種々の異なる方法で作製され得る（米国特許第４，７３６，８６６号；同第５，６０２，３０７号；Ｍｕｌｌｉｎｓら（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２２（４）：６３０−６３３；Ｂｒｅｎｉｎら（１９９７）Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６（２）９９−１１０；Ｔｕａｎ（編），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｎｏ．６２，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと）。核酸フラグメントを組換えコンピテント哺乳類動物細胞に導入する方法は、複数の核酸分子の共形質転換に有利な任意の方法であり得る。トランスジェニック動物を作製する詳細な手順は、当業者に容易に入手可能であり、米国特許第５，４８９，７４３号および同第５，６０２，３０７号における開示を含む。
【０５３９】
多くの組換えマウスまたはトランスジェニックマウスが作製され、これらは、活性化したオンコジーン配列を発現するマウス（米国特許第４，７３６，８６６号）；サルＳＶ４０  Ｔ抗原配列発現マウス（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１）の発現欠損マウス（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン作用性機能不全を示すマウス（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧調節に関係する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するマウス（米国特許第５，７３１，４８９号）；自然に生じるアルツハイマー病において示される状態により大きな類似点を示すマウス（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を媒介する能力が減少したマウス（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を保有するマウス（Ｃｌｕｔｔｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３（４）：１７５３−１７６０）；または十分なヒト抗体応答を生成する能力のあるマウス（ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９７）Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４９（９０４９）：４０５）を含む。
【０５４０】
マウスおよびラットは、多くのトランスジェニック研究のために選択された動物であるが、いくつかの例において、代替の動物種を使用することが好ましいか、または必要でさえある。トランスジェニックの手順は、種々の非マウス動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよびモルモットを含む）において首尾よく利用される（例えば、Ｋｉｍら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４６（４）：５１５−５２６；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９５）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｎｕｔｒ．Ｄｅｖ．３５（６）：６０９−６１７；Ｐｅｔｔｅｒｓ（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６（５）：６４３−６４５；Ｓｃｈｎｉｅｋｅら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８（５３４６）：２１３０−２１３３；ａｎｄ  Ａｍｏａｈ（１９９７）Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７５（２）：５７８−５８５）を参照のこと）。
【０５４１】
トランスジェニック哺乳動物の乳中に、本発明の形質転換体コードタンパク質の分泌を方向付けるため、形質転換体は、哺乳動物の上皮細胞において優先的に活性化されるプロモーターの制御下に置かれ得る。乳タンパク質をコードする遺伝子を調節するプロモーターは、矢酔えば、カゼイン、β―ラクトグロブリン、ホエー酸タンパク質、またはラクトアルブミンのプロモーターが好ましい（例えば、ＤｉＴｕｌｌｉｏ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７４−７７；Ｃｌａｒｋら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：４８７−４９２；Ｇｏｒｔｏｎら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：１１８３−１１８７；およびＳｏｕｌｉｅｒら（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．  ２９７：１３を参照のこと）。選択されたトランスジェニック哺乳動物は、大量の乳を生成し、長い授乳期を有する（例えば、ヤギ、ウシ、ラクダまたはヒツジ）。
【０５４２】
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、トランスジェニック植物（例えば、ＤＮＡ形質転換体が、核ゲノムまたは色素体ゲノムに挿入された植物）において発現され得る。
外因性核酸を植物細胞またはプロトプラストに誘導するために使用される植物形質転換手順は、当該分野で公知である。一般的に、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５３（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔ  Ｄ」）１９８７，ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓおよび欧州特許出願ＥＰ  ６９３５５４を参照のこと。遺伝子操作された植物を生成するための方法はさらに、米国特許第５，２８３，１８４号、同第５，  ４８２，８５２号、および欧州特許出願ＥＰ  ６９３  ５５４（これらの全ては、参考として本明細書により援用される）において記載される。
【０５４３】
（薬学的組成物または治療的組成物）
本発明のアルブミン融合タンパク質またはそれらの処方物は、任意の従来の方法（非経口（例えば、皮下または筋肉内）注入または静脈内注入を含む）により投与され得る。処置は、期間にわたって、単一の用量または複数の用量からなり得る。
【０５４４】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で投与されることが可能であるが、１つ以上の受容可能なキャリアと共に薬学的処方物として存在することが好ましい。このキャリアは、アルブミン融合タンパク質と矛盾しないという意味で「受容可能」であるべきであり、それらのレシピエントに有害であるべきではない。代表的に、キャリアは、滅菌および無発熱物質である水または生理食塩水である。溶液中のそれらの拡張保存寿命に起因して、本発明のアルブミン融合タンパク質は、水性キャリア（例えば、滅菌無発熱物質水、生理食塩水または溶液中のそれらの拡張された保存寿命に起因する別の等張溶液）中の処方物に特によく適する。例えば、本発明の薬学的組成物は、あらかじめ水性形態で、例えば、分散される前、数週間または数ヶ月あるいはそれより長い時間に、十分に処方され得る。
【０５４５】
例えば、アルブミン融合タンパク質を含有する処方物は、水性処方物におけるアルブミン融合タンパク質の拡張された保存寿命に考慮して調製され得る。上記のように、ＨＡに融合後、これら治療的タンパク質の多くの保存寿命が、著しく増加されるか、または延期される。
【０５４６】
エアロゾル投与が適切な例において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準手順を使用するエアロゾルとして処方され得る。用語「エアロゾル」は、細気管支または鼻経路に吸入可能な、本発明のアルブミン融合タンパク質の任意のガス保有懸濁相を含む。特に、エアロゾルは、定量吸入用量吸入器または噴霧器、あるいはミスト噴霧器において生成されるような、本発明のアルブミン融合タンパク質の水滴のガス保有懸濁液を含む。エアロゾルはまた、例えば、吸入デバイスから吸入によって送達され得る空気または他のキャリアガスに懸濁された本発明の化合物の乾燥粉末組成物を含む。ＧａｎｄｅｒｔｏｎおよびＪｏｎｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｔｒａｃｔ，Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９−８７）；Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ    ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ６：２７３−３１３；およびＲａｅｂｕｒｎら，（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７：１４３−１５９を参照のこと。
【０５４７】
本発明の処方物はまた、一部分、適切な種に由来するアルブミン融合タンパク質の成分の使用のため、代表的に非免疫原性であり得る。例えば、ヒトの使用に対し、治療的タンパク質およびアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分の両方は、代表的にヒトである。いずれかの成分が非ヒト由来であるいくつかの場合において、その成分は主要アミノ酸の置換によりヒト化され得、その結果特異的なエピトープが、ヒト免疫系に対し、外因性というよりは、むしろ天然のヒトのようになる。
【０５４８】
処方物は、単位投与形態で都合よく存在し得、そして薬学の当該分野で周知の任意の方法により調製され得る。このような方法は、１つ以上の付属成分を構成するキャリアとアルブミン融合タンパク質を結合させる工程を包含する。一般的に、活性成分を液体キャリアまたは微細な誘導固体キャリア、またはそれら両方と均一にかつ親密に結合させることによって、処方物が調製され、次いで、必要な場合、産物を形成する。
【０５４９】
非経口投与に適切な処方物としては、抗酸化物、緩衝液、静菌剤および意図されるレシピエントのために処方物を適切にする溶液を含み得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液；および懸濁剤および濃化剤を含み得る水性滅菌注入溶液または非水性滅菌注入溶液が挙げられる。処方物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、密封されたアンプル、バイアルまたはシリンジ）中に存在し得、そして、使用の直前に滅菌キャリア（例えば、注入用の水）の添加のみを必要とする凍結乾燥（親液性）状態で保存され得る。
即席注入溶液および懸濁液は、滅菌散剤から調製され得る。投与処方物は、本発明の多くのアルブミン融合タンパク質により示される拡張された血清半減期を供給する治療的タンパク質のための非融合標準処方物と比較して低いモル濃度またはより低い投与量で治療用タンパク質の一部を含み得る。
【０５５０】
例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が、１つ以上の治療的タンパク質領域として表１の「治療タンパク質：Ｘ」欄に列挙されたタンパク質の１つを含む場合、天然ｈＧＨの半減期と比較して、延長された血清半減期およびアルブミン融合タンパク質の半減期を考慮する間、投与形態は、ｈＧＨの有効性に比例するアルブミン融合タンパク質の有効性に基づいて計算され得る。成長ホルモンは、代表的に０．３〜３０．０  ＩＵ／ｋｇ／週（例えば、０．９〜１２．０  ＩＵ／ｋｇ／週）で投与され、１年またはそれ以上の間に、３つまたは７つに分けた投与量で与えられる。完全長ＧＨに融合する完全長ＨＡからなるアルブミン融合タンパク質において、等しい用量は、単位という点で、因子のより大きな重量を示すが、投与回数は、減少され得る（例えば、１週間に２回、１週間に１回またはそれ以下）。
【０５５１】
本発明の処方物または組成物は、指示書またはアルブミン融合タンパク質成分の延長された半減期を言及する包装挿入物と共に包装され得るか、または共にキットに含まれ得る。例えば、このような指示書または包装挿入物は、本発明のアルブミン融合タンパク質の延期されたか、または延長された半減期に考慮した、推薦の保存状態（例えば、時間、温度、および光）に注意を向け得る。このような指示書または包装挿入物はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質の特定の利点（例えば、野外において（調節された病院、診療所またはオフィス状態の外で）使用が求められ得る処方物のための保存の容易さ）に注意を向け得る。上記のように、本発明の処方物は、水性形態であり得、そして治療的活性の有意な欠損のないが決して理想的ではない環境下で保存され得る。
【０５５２】
本発明のアルブミン融合タンパク質はまた、栄養補助として含まれ得る。例えば、本発明の特定のアルブミン融合タンパク質は、天然産物（アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック哺乳動物から得られる、乳、または乳製品）中に投与され得る。このような組成物はまた、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物から得られる、植物体または植物産物を含み得る。アルブミン融合タンパク質はまた、他の公知の添加剤、キャリア、増量剤および希釈剤を有するか、または有さずに、粉末形態または錠剤形態で提供され得る。栄養補助は、Ｓｃｏｔｔ  Ｈｅｇｅｎｈａｒｔ，Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｃ．１９９３に記載される。
【０５５３】
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアにおいて、有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（アルブミン融合ポリヌクレオチド）を被験体に投与することによって、疾患または障害（例えば、本明細書中に開示される任意の１以上の疾患または障害）を処置および／または予防する方法を提供する。
【０５５４】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、個々の患者の臨床状態（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを単独で用いた処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【０５５５】
一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるアルブミン融合タンパク質の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、アルブミン融合タンパク質を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０５５６】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０５５７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（散剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによる）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与される。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる場合、用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０５５８】
徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドのさらなる例としては、適切なポリマー材料（例えば、成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル））、適切な疎水性材料（例えば、受容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、および低可溶性誘導体（例えば、低可溶性塩）が挙げられる。
【０５５９】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０５６０】
徐放性アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドはまた、リポソームに封入された本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む（一般には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適な治療剤のために調整される。
【０５６１】
なおさらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ポンプによって送達される（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０５６２】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
【０５６３】
非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０５６４】
一般に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０５６５】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０５６６】
アルブミン融合タンパク質は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０５６７】
治療的投与に用いられる任意の医薬品は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【０５６８】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥したアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０５６９】
特定かつ好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質処方物は、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１５ｍＭ  塩化ナトリウム、融合タンパク質１ｍｇ当たり０．１６マイクロモル  オクタン酸ナトリウム、１５マイクログラム／ミリリットル  ポリソルベート８０、ｐＨ７．２を含む。別の特定かつ好ましい実施形態において、アルブミン融合タンパク質処方物は、０．０１Ｍ  リン酸ナトリウム、０．１５ｍＭ  塩化ナトリウム、融合タンパク質１ｍｇ当たり０．１６マイクロモル  オクタン酸ナトリウム、１５マイクログラム／ミリリットル  ポリソルベート８０、ｐＨ７．２から成る。ｐＨおよび緩衝液は、生理学的条件に調合するように選択され、そして塩が、強壮剤として加えられる。オクタン酸ナトリウムは、溶液中のタンパク質の熱安定性を増加するためにその報告された能力に起因して選択された。最後に、ポリソルベートは、溶液の表面張力を低くし、そして容器密封系に対してアルブミン融合タンパク質の非特異的吸着を低くする遺伝子界面活性剤として加えられた。
【０５７０】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【０５７１】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバン＋デオキシコール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ  Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ（例えば、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標））、ＭＰＬおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍの生育不能調製物。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＱＳ−２１と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、百日咳（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｉｓ）に対する防御に指向するワクチン。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０５７２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独で、または他の治療的薬剤と組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組合せて投与され得るアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド薬剤としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：化学療法剤、抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、ならびに／または以下に記載される治療処置。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される説明を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０５７３】
一つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、反凝固薬と組み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る反凝固薬としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリンナトリウム（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））、ジクマロール、４−ヒドロキシクマリン、アニシンジオン（例えば、ＭＩＲＡＤＯＮＴＭ）、アセノクマロール（例えば、ニクマロン、ＳＩＮＴＨＲＯＭＥＴＭ）、インダン−１，３−ジオン、フェンプロクーモン（例えば、ＭＡＲＣＵＭＡＲＴＭ）、エチルビスクマセテート（ｅｔｈｙｌ  ｂｉｓｃｏｕｍａｃｅｔａｔｅ）（例えば、ＴＲＯＭＥＸＡＮＴＭ）、およびアスピリン。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワルファリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み合わせて投与される。
【０５７４】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血栓溶解薬物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る血栓溶解薬物としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：プラスミノゲン、ｌｙｓ−プラスミノゲン、α２−抗プラスミン、ストレプトキナーゼ（例えば、ＫＡＢＩＫＩＮＡＳＥＴＭ）、アンチリスプラーゼ（ａｎｔｉｒｅｓｐｌａｃｅ）（例えば、ＥＭＩＮＡＳＥＴＭ）、組織プラスミノゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ、アルテバーゼ（ａｌｔｅｖａｓｅ）、ＡＣＴＩＶＡＳＥＴＭ）、ウロキナーゼ（例えば、ＡＢＢＯＫＩＮＡＳＥＴＭ）、サウルプラーゼ（ｓａｕｒｕｐｌａｓｅ）（プロウロキナーゼ、単鎖ウロキナーゼ）、およびアミノカプロ酸（例えば、ＡＭＩＣＡＲＴＭ）。特定の実施形態において、本発明の組成物は、組織プラスミノゲン活性化剤およびアスピリンと組み合わせて投与される。
【０５７５】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗血小板薬物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗血小板薬物としては、アスピリン、ジピリダモール（例えば、ＰＥＲＳＡＮＴＩＮＥＴＭ）、およびチクロピジン（例えば、ＴＩＣＬＩＤＴＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７６】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせる抗凝固薬、血栓溶解薬物および／または抗血小板薬物の使用は、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血（乏血）発作、不安定狭心症の妨害、診断および／または処置について企図される。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせる抗凝固薬、血栓溶解薬物および／または抗血小板薬物の使用は、血管形成手順を伴い得る肛門周囲の血栓症の危険性を減少するため、非リウマチ性動脈原線維性を含む動脈原線維性を有する患者内の脳卒中の危険性を減少するため、人工心臓バルブおよび／または僧帽弁のバルブ疾患に関連する塞栓症の危険性を減少するため、伏在の移植片の不顕性出血について企図される。単独で、または抗血小板薬物、抗凝固薬および／または血栓溶解薬物と組み合わせての本発明の治療についての他の用途は、体外のデバイス（例えば、脈管内カニューレ、血液透析患者内の脈管アクセスシャウト、血液透析機器、および心肺バイパス機器）における不顕性出血の妨害が挙げられるが、これに限定されない。
【０５７７】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素インヒビター（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（ＮＮＲＴＩ）、および／またはプロテアーゼインヒビター（ＰＩ）と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るＮＲＴＩとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲＴＭ（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸＴＭ（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤＴＭ（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴＴＭ（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲＴＭ（ラミブジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲＴＭ（ジドブジン／ラミブジン）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るＮＮＲＴＩとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥＴＭ（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲＴＭ（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡＴＭ（エファビレンズ）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲＩＸＩＶＡＮＴＭ（インディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲＴＭ（リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥＴＭ（サキナビル（ｓａｑｕｉｎａｖｉｒ））、およびＶＩＲＡＣＥＰＴＴＭ（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ））。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、および／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するため、および／またはＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとの任意の組み合わせで使用され得る。
【０５７８】
さらなるＮＲＴＩとしては、以下を含む：ＬＯＤＥＮＯＳＩＮＥＴＭ（Ｆ−ｄｄＡ；酸安定性アデノシンＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ；ＣＯＶＩＲＡＣＩＬＴＭ（エントリシタビン（ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）／ＦＴＣ；構造的にラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）（３ＴＣ）に関連があるが、インビトロで３〜１０倍大きな活性を有する；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ｄＯＴＣ（ＢＣＨ−１０６５２もまた構造的にラミブジンに関連があるが、ラミブジン耐性単離物の実質的な割合に対して活性を維持したままである；Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａ）；Ａｄｅｆｏｖｉｒ（ＦＤＡによって抗ＨＩＶ治療に対する認可を拒絶された；Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＰＲＥＶＥＯＮ（登録商標）（Ａｄｅｆｏｖｉｒ  Ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）の活性なプロドラック；その活性形態はＰＭＥＡ−ｐｐである）；ＴＥＮＯＦＯＶＩＲＴＭ（ビス−ＰＯＣ  ＰＭＰＡ、ＰＭＰＡプロドラック；Ｇｉｌｅａｄ）；ＤＡＰＤ／ＤＸＧ（ＤＡＰＤの活性な代謝物；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；Ｄ−Ｄ４ＦＣ（３ＴＣに関連し、ＡＺＴ／３ＴＣ−耐性ウイルスに対する活性を有する）；ＧＷ４２０８６７Ｘ（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＺＩＡＧＥＮＴＭ（アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）／１５９Ｕ８９；Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｉｎｃ．）；ＣＳ−８７（３’アジド−２’，３’−ジデオキシウリジン；ＷＯ９９／６６９３６）；およびＳ−アシル−２−チオエチル（ＳＡＴＥ）を保有するβ−Ｌ−ＦＤ４Ｃおよびβ−Ｌ−Ｆｄ
ｄＣのプロドラック形態（ＷＯ９８／１７２８１）。
【０５７９】
さらなるＮＮＲＴＩとしては、以下が挙げられる：ＣＯＡＣＴＩＮＯＮＴＭ（Ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ／ＭＫＣ−４４２、ＨＥＰＴクラスの強力なＮＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ＣＡＰＲＡＶＩＲＩＮＥＴＭ（ＡＧ−１５４９／Ｓ−１１５３、Ｋ１０３Ｎ改変体を含むウイルスに対する活性を有する次世代のＮＮＲＴＩ；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＰＮＵ−１４２７２１（前駆体（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ）よりも２０〜５０倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）；ＤＰＣ−９６１およびＤＰＣ−９６３（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ）の第二世代の誘導体、Ｋ１０３Ｎ変異を有するウイルスに対して活性であるように設計される；ＤｕＰｏｎｔ）；ＧＷ−４２０８６７Ｘ（ＨＢＹ０９７よりも２５倍大きな活性を有し、そしてＫ１０３Ｎ変異体に対して活性である；Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＣＡＬＡＮＯＬＩＤＥ  Ａ（ラテックスの木由来の天然に存在する薬剤；Ｙ１８１ＣおよびＫ１０３Ｎ変異のいずれかまたは両方を含むウイルスに対して活性）；ならびにＰｒｏｐｏｌｉｓ（ＷＯ９９／４９８３０）。
【０５８０】
さらなるプロテアーゼインヒビターとしては、以下が挙げられる：ＬＯＰＩＮＡＶＩＴＭ（ＡＢＴ３７８／ｒ；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ＢＭＳ−２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｒｅｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ＴＩＰＲＡＮＡＶＩＲＴＭ（ＰＮＵ−１４０６９０、非ペプシンジヒドロピロン；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）；ＰＤ−１７８３９０（非ペプチド性ジヒドロピロン；Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）；ＢＭＳ  ２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；Ｌ−７５６、４２３（インディナルビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）アナログ；Ｍｅｒｃｋ）；ＤＭＰ−４５０（環状ウレア化合物；Ａｖｉｄ  ＆  ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＧ−１７７６（プロテアーゼインヒビター耐性ウイルスに対するインビトロ活性を有するペプチド模倣物；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＶＸ−１７５／ＧＷ−４３３９０８（アンプレナビル（ａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）のリン酸プロドラック；Ｖｅｒｔｅｘ  ＆  Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｃｏｍｅ）；ＣＧＰ６１７５５（Ｃｉｂａ）；ならびにＡＧＥＮＥＲＡＳＥＴＭ（アンプレナビル；Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｉｎｃ．）。
【０５８１】
さらなる抗レトロウイルス剤としては、融合インヒビター／ｇｐ４１結合剤が挙げられる。融合インヒビター／ｇｐ４１結合剤としては、以下が挙げられる：Ｔ−２０（ＨＩＶ  ｇｐ４１膜貫通タンパク質外部ドメインの残基６４３−６７８由来のペプチド（休止期においてｇｐ４１と結合し、そして紡錘細胞状態に対する形質転換を防止する；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）ならびにＴ−１２４９（第２世代融合インヒビター；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）。
【０５８２】
さらなる抗レトロウイルス剤としては、融合インヒビター／ケモカインレセプターアンタゴニストが挙げられる。融合インヒビター／ケモカインレセプターアンタゴニストとしては、以下が挙げられる：ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えば、ＡＭＤ  ３１００（ビシクラム（ｂｉｃｙｃｌａｍ）））、ＳＤＦ−１およびそのアナログ、ならびにＡＬＸ４０−４Ｃ（カチオン性ペプチド）、Ｔ２２（１８個のアミノ酸ペプチド；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）ならびにＴ２２アナログＴ１３４およびＴ１４０；ＣＣＲ５アンタゴニスト（例えば、ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＡＫ−７７９）；ならびにＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（例えば、ＮＳＣ  ６５１０１６（ジスタマイシンアナログ））。ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３、およびＣＣＲ６アンタゴニストがまた挙げられる。ケモカインレセプターアゴニスト（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βなど）はまた、融合を阻害し得る。
【０５８３】
さらなる抗レトロウイルス剤は、インテグラーゼインヒビターを含む。インテグラーゼインヒビターとしては、以下が挙げられる：ジカフェオイルキナ酸（ＤＦＱＡ）；Ｌ−チコリ酸（ジカフェオイル酒石酸（ＤＣＴＡ））；キナリザリン（ＱＬＣ）および関連するアントラキノン；ＺＩＮＴＥＶＩＲＴＭ（ＡＲ  １７７、真のインテグラーゼインヒビターでなく細胞表面で恐らく作用するオリゴヌクレオチド；Ａｒｏｎｄｅｘ）；ならびにナフトール（例えば、ＷＯ９８／５０３４７に記載されるナフトール）。
【０５８４】
さらなる抗レトロウイルス剤としては、以下が挙げられる：ヒドロキシウレア様化合物（例えば、ＢＣＸ−３４（プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；Ｂｉｏｃｒｙｓｔ）；リボヌクレオチドレダクターゼインヒビター（例えば、ＤＩＤＯＸＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ））；イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）インヒビター（例えば、ＶＸ−４９７  （Ｖｅｒｔｅｘ））；ならびにマイコフォリック酸（ｍｙｃｏｐｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、ＣｅｌｌＣｅｐｔ（マイコフェノラートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ）；Ｒｏｃｈｅ）。
【０５８５】
さらなる抗レトロウイルス剤としては、以下が挙げられる：ウイルスインテグラーゼのインヒビター、ウイルスゲノム核転座のインヒビター（例えば、アリーレンビス（メチルケトン）化合物）；ＨＩＶ侵入のインヒビター（例えば、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲＡＮＴＥＳの溶解性複合体およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ならびにＡＭＤ−３１００；ヌクレオカプシドジンクフィンガーインヒビター（例えば、ジチアン化合物；ＨＩＶ  ＴａｔおよびＲｅｖの標的；ならびに薬学的エンハンサー（例えば、ＡＢＴ−３７８））。
【０５８６】
他の抗レトロウイルス治療剤および補助治療剤としては、以下が挙げられる：サイトカインおよびリンホカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮＴＭ（アデスロイキン（ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）／Ｌ２−７００１；Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３）；インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α２ａ；ＴＮＦｓ、ＮＦkＢ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１０のアンタゴニスト）；免疫活性を調節する薬剤（例えば、シクロスポリンおよびプレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ））；ワクチン（例えば、ＲｅｍｕｎｅＴＭ（ＨＩＶ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）、ＡＰＬ  ４００−００３（Ａｐｏｌｌｏｎ）、組換えｇｐ１２０およびフラグメント、二価（Ｂ／Ｅ）組換えエンベロープ糖タンパク質、ｒｇｐ１２０ＣＭ２３５、ＭＮ  ｒｇｐ１２０、ＳＦ−２ｒｇｐ１２０、ｇｐ１２０／可溶性ＣＤ４錯体、Ｄｅｌｔａ  ＪＲ−ＦＬタンパク質、不連続ｇｐ１２０  Ｃ３／Ｃ４ドメイン由来の分枝合成ペプチド、融合成分イムノゲン、ならびにＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｎｅｆ、およびＴａｔワクチン）；遺伝子ベース治療剤（例えば、遺伝子抑制エレメント（ＧＳＥ；ＷＯ９８／５４３６６）、およびイントラキン（ｉｎｔｒａｋｉｎｅｓ）（新しく合成されたＣＣＲ５の表面発現を遮断するためにＥＲに対して標的された、一般に改変されたＣＣケモカイン（Ｙａｎｇら、ＰＮＡＳ９４：１１５６７−７２（１９９７）；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１１０−１６（１９９７））；抗体（例えば、抗−ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５、抗−ＣＣＲ５抗体２Ｄ７、５Ｃ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、およびＰＡ１４、抗−ＣＤ４抗体Ｑ４１２０およびＲＰＡ−Ｔ４、抗−ＣＣＲ３抗体７Ｂ１１、抗−ｇｐ１２０抗体１７ｂ、４８ｄ、４４７−５２Ｄ、２５７−Ｄ、２６８−Ｄおよび５０．１、抗−Ｔａｔ抗体、抗−ＴＮＦ−α抗体、およびモノクローナル抗体３３Ａ）；アリール炭化水素（ＡＨ）レセプターアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、ＴＣＤＤ、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、およびα−ナフトフラボン（ＷＯ９８／３０２
１３））；ならびに抗酸化剤（例えば、g−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステル（g−ＧＣＥ；ＷＯ９９／５６７６４）。
【０５８７】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗ウイルス剤と組合せて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る抗ウイルス剤としては、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、レマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、マキサミン（ｍａｘａｍｉｎｅ）、またはチマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、インターフェロンアルブミン融合タンパク質は、これらの任意の薬剤と組み合わせて投与され得る。さらに、インターフェロンαアルブミン融合タンパク質はまた、これらの任意の薬剤とともに投与され得、そして好ましくは、インターフェロンα２ａまたは２ｂアルブミン融合タンパク質は、これらの任意の薬剤とともに投与される。さらに、インターフェロンβアルブミン融合タンパク質はまた、これらの任意の薬剤とともに投与され得る。さらに、任意のＩＦＮハイブリッドアルブミン融合タンパク質はまた、これらの任意の薬剤と組み合わせて投与され得る。
【０５８８】
最も好ましい実施形態において、インターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンαアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンα２ａアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンα２ｂアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、インターフェロンβアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。さらに好ましい実施形態において、ハイブリッドインターフェロンアルブミン融合タンパク質は、リバビリンと組み合わせて投与される。
【０５８９】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗日和見感染症薬剤と組み合わせて投与され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥＴＭ、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭ、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬＴＭ、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴＭ、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭ、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥＴＭ、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭ、ＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ（フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥＴＭ（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置または予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥＴＭ、ＤＡＰＳＯＮＥＴＭ、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥＴＭ、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤＴＭ、ＲＩＦＡＭＰＩＮＴＭ、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥＴＭ、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮＴＭ、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭ、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予防するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲＴＭ、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴＴＭ、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見真菌感染を予防的に処置または予防するために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭ、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲＴＭおよび／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥＴＭおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、日和見細菌感染を予防的に処置または予防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮＴＭおよび／またはＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭとの任意の組み合わせで使用される。
【０５９０】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗生物質と組合せて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、ラパマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびバンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９１】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫刺激剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る免疫刺激剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レバミゾ−ル（例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬＴＭ）、イソピリノサイン（ｉｓｏｐｒｉｎｏｓｉｎｅ）（例えば、ＩＮＯＳＩＰＬＥＸＴＭ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα）、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）。
【０５９２】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る免疫抑制剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド  メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、および応答するＴ細胞の機能を抑制することにより作用する他の免疫抑制剤。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る他の免疫抑制剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：プレドニゾロン（ｐｒｅｄｏｎｉｓｏｌｏｎｅ）、メトトレキサート、サリドマイド、メトキサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリビン（ＢＲＥＤＩＮＩＮＴＭ）、ブレキナル、デオキシスペルグアリン、およびアザスピラン（ａｚａｓｐｉｒａｎｅ）（ＳＫＦ  １０５６８５）、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ  ＯＫＴ（登録商標）  ３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥＴＭ、ＮＥＯＲＡＬＴＭ、ＳＡＮＧＤＹＡＴＭ（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）（ＦＫ５０６、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ））、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）（マイコフェノラートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｔｅｆｉｌ），その活性な代謝産物は、ミコフェノール酸である）、ＩＭＵＲＡＮＴＭ（アザチオプリン）、グルココルチコステロイド、副腎皮質ステロイド（例えば、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ（プレドニゾン）およびＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬＴＭ（プレドニゾロン））、ＦＯＬＥＸＴＭおよびＭＥＸＡＴＥＴＭ（メトトレキサート）、ＯＸＳＯＲＡＬＥＮ−ＵＬＴＲＡＴＭ（メトトレキサレン）ならびにＲＡＰＡＭＵＮＥＴＭ（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））。特定の実施形態において、免疫抑制剤を使用して、器官移植または骨髄移植の拒絶を予防し得る。
【０５９３】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独または１以上の静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲＴＭ、ＩＶＥＥＧＡＭＴＭ、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮＴＭ、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  Ｓ／ＤＴＭＡＴＧＡＭＴＭ（抗胸腺細胞グロブリン（ｇｌｕｂｕｌｉｎ））およびＧＡＭＩＭＹＮＥＴＭが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０５９４】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、癌の治療のために、患者にインビボ、または細胞にインビトロのいずれかにおいて、単独で、または組み合わせ治療の一部として投与される。特定の実施形態において、アルブミン融合タンパク質、特にＩＬ−２−アルブミン融合は、癌についての消極的な免疫治療（例えば、Ｄｕｄｌｅｙら、ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓ．ｏｒｇでのＳｃｉｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、２００２年９月１９日（ここで、この全体は、参考として本明細書中で援用される）に記載されるような転移性メラノーマについての養子細胞転移治療）の間、繰り返し投与される。
【０５９５】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独でかまたは抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得る抗炎症剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンおよびトリアムシノロン）、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ジクロフェナク  ジフルニサル、エトドラク（ｅｔｏｄｏｌａｃ）、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビフロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナメート（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｍａｔｅ）、メフェナム酸、メロキシカム（ｍｅｌｏｘｉｃａｍ）、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸，およびトルメチン）、ならびに抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体，アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類，ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン（ｇｕａｉａｚｕｌｅｎｅ）、ナブメトン、ニメスリド（ｎｉｍｅｓｕｌｉｄｅ）、オルゴテイン（ｏｒｇｏｔｅｉｎ）、オキサセプロール（ｏｘａｃｅｐｒｏｌ）、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、ピフオキシム（ｐｉｆｏｘｉｍｅ）、プロカゾン（ｐｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、プロキサゾール、およびテニダプ（ｔｅｎｉｄａｐ）。
【０５９６】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗脈管形成剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗脈管形成剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）（Ｅｎｔｒｅｍｅｄ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、トロポニン（Ｔｒｏｐｏｎｉｎ）−１（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、ＶＥＧＩ、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」遷移金属。
【０５９７】
より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
【０５９８】
バナジウム錯体の代表的な例としては、オキソバナジウム錯体（例えば、バナジン酸錯体およびバナジル錯体）が挙げられる。適切なバナジン酸錯体としては、メタバナジン酸錯体およびオルトバナジン酸錯体（例えば、メタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウム）が挙げられる。適切なバナジル錯体としては、例えば、バナジルアセチルアセトネート、ならびに硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のような硫酸バナジル水和物を含む、硫酸バナジルが挙げられる。
【０５９９】
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステン酸およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングテン酸錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステンオキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデン酸錯体、モリブデンオキシド錯体およびモリブデニル錯体が挙げられる。
適切なモリブデン酸錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル錯体としては、例えば、モリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０６００】
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ  ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によって、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝のモジュレーター（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン（Ｅｐｏｎｅｍｙｃｉｎ）；カンプトセシン；フマギリン（Ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３６：３１２〜３１６、１９９２）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０６０１】
本発明の状況においてまた、利用され得るさらなる抗脈管形成因子としては、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）；血管拡張性ステロイド；ＡＧＭ−１４７０（Ｈ．ＢｒｅｍおよびＪ．Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２８：４４５−５１（１９９３））；インテグリンαｖβ３アンタゴニスト（Ｃ．Ｓｔｏｒｇａｒｄ  ら．，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：４７−５４（１９９９））；カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ｃｏｎｂｒｅｔａｓｔａｔｉｎ  Ａ−４（ＣＡ４Ｐ）（ＯＸｉＧＥＮＥ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；Ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ（Ｍａｇａｉｎｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）；ＴＮＰ−４７０，（Ｔａｐ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）；ＺＤ−０１０１  ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）；ＡＰＲＡ（ＣＴ２５８４）；Ｂｅｎｅｆｉｎ，Ｂｙｒｏｓｔａｔｉｎ−１（ＳＣ３３９５５５）；ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ  ４１２）；ＣＭ１０１；Ｄｅｘｒａｚｏｘａｎｅ（ＩＣＲＦ１８７）；ＤＭＸＡＡ；エンドスタチン；Ｆｌａｖｏｐｒｉｄｉｏｌ；Ｇｅｎｅｓｔｅｉｎ；ＧＴＥ；ＩｍｍＴｈｅｒ；Ｉｒｅｓｓａ（ＺＤ１８３９）；Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ（ソマトスタチン）；Ｐａｎｒｅｔｉｎ；Ｐｅｎａｃｉｌｌａｍｉｎｅ；Ｐｈｏｔｏｐｏｉｎｔ；ＰＩ−８８；Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ（ＡＧ−３３４０）Ｐｕｒｌｙｔｉｎ；Ｓｕｒａｄｉｓｔａ（ＦＣＥ２６６４４）；タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）；Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ；テトラチオモリブデート；Ｘｅｌｏｄａ（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）；および５−フルオロウラシルが挙げられる。
【０６０２】
本発明の化合物と組合わせて投与され得る抗脈管形成薬剤は、種々の機構を通じて作用し得、これらの機構としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞外マトリックスのタンパク質分解の阻害、増殖因子のような脈管形成誘導因子の機能を拮抗することによる内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能のブロック、および増殖している内皮細胞において発現されるインテグリンレセプターの阻害。細胞外マトリックスタンパク質分解を妨害し、そして本発明の組成物と組合わせて投与され得る抗脈管形成インヒビターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＧ−３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ＢＡＹ−１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ，Ｗｅｓｔ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＣＧＳ−２７０３２Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＭｅｔａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ，Ｓｔ−Ｆｏｙ，Ｑｕｅｂｅｃ）。内皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能をブロックすることにより作用し、そして本発明の組成物と組合わせて投与され得る抗脈管形成インヒビターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＥＭＤ−１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ  ＫｃｇａＡ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＶｉｔａｘｉｎ（Ｉｘｓｙｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）。脈管形成誘導因子と直接拮抗するかまたはこの誘導因子を阻害することにより作用し、そして本発明の組成物と組合わせて投与され得る抗脈管形成薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＰＴＫ−７８７／ＺＫ−２２５８４６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＳＵ−１０１（Ｓｕｇｅｎ，Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＳＵ−５４１６（Ｓｕｇｅｎ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、およびＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ）。他の抗脈管形成薬剤は、脈管形成を間接的に阻害するように作用する。本発明の組成物と組合わせて投与され得る脈管形成の間接的インヒビターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＭ−８６２（Ｃｙｔｒａｎ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）、インターフェロン−α、ＩＬ−１２（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）、およびペントサンポリスルフェート（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。
【０６０３】
特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に記載の自己免疫疾患）の処置、予防、および／または回復のために企図される。
【０６０４】
特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、関節炎の処置、予防、および／または回復のために企図される。さらに特定の実施形態において、抗脈管形成薬剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、慢性関節リウマチの処置、予防、および／または回復のために企図される。
【０６０５】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質または脈管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて投与される。本発明の組成物と共に投与され得る脈管形成タンパク質の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよび表皮増殖因子β、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、ならびに一酸化窒素シンターゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【０６０６】
さらなる実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る化学療法剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、シクロホスファミド  イホスファミド（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、およびクロランブシル）、エチレンイミン類およびメチルメラミン類（例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート類（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ））、トリアゼン類（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド））、葉酸アナログ（例えば、メトトレキサート（アメトプテリン））、ピリミジンアナログ（例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（Ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）（フルオロデオキシウリジン；ＦｕｄＲ）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））、プリンアナログおよび関連インヒビター（例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）、およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｆｏｒｍｙｃｉｎ）））、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ、硫酸ビンブラスチン））およびビンクリスチン（硫酸ビンクリスチン））、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、生物学的応答改変剤（例えば、インターフェロン−αおよびインターフェロン−α−２ｂ）、白金配位化合物（例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）およびカルボプラチン）、アントラセンジオン（ミトキサントロン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン；ＭＩＨ）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、エストラジオール、およびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（テストステロンプロプリオネート（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、およびフルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ（例えば、ロイプロリド）、その他のホルモンおよびホルモンアナログ（例えば、メチルテストステロン、エス���ラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）、ならびにその他（例えば、ジカルバジン、グルタミン酸、およびミトタン）。
【０６０７】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、１以上の次の薬物と組み合わせて投与され得る：ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ  Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．としても公知）、Ｔｒｏｃａｄｅ（Ｒａｏｃｈｅ，ＲＯ−３２−３５５５）、Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｒｏｕｓｓｅｌ製のＡｒａｖａＴＭとしても公知）、ＫｉｎｅｒｅｔＴＭ（Ａｍｇｅｎ、Ｉｎｃ．製のＡｎａｋｉｎｒａとしても公知である、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト）。
【０６０８】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投与されるか、ＣＨＯＰの１以上の成分の組み合わせで投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ−２０抗体（ヒトモノクローナル抗ＣＤ２０抗体）と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、抗ＣＤ２０抗体およびＣＨＯＰと組み合わせて投与されるか、または抗ＣＤ２０抗体ならびにＣＨＯＰの１以上の成分（特定のシクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組合せで投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰと共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの１以上の成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組み合わせと共に投与される。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂと組み合わせて投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂおよびＣＨＯＰと共に、またはｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂおよびＣＨＯＰの１以上の成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の任意の組合せと共に投与される。抗ＣＤ２０抗体は、必要に応じて、放射性同位体、毒素または細胞毒性薬物に結合し得る。
【０６０９】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＺｅｖａｌｉｎＴＭとの組合せで投与される。さらなる実施形態において、本発明の組成物は、ＺｅｖａｌｉｎＴＭおよびＣＨＯＰと共に、またはＺｅｖａｌｉｎＴＭおよびＣＨＯＰの成分（詳細には、シクロホスファミドおよび／またはプレドニゾン）の１以上の任意の組み合わせと共に投与される。
ＺｅｖａｌｉｎＴＭは、１以上の放射性同位体と結合し得る。特に好ましい同位体は、９０Ｙおよび１１１Ｉｎである。
【０６１０】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、サイトカインと組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、任意のインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに限定されない）と共に投与され得る。
【０６１１】
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＴＮＦファミリーのメンバーと組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得るＴＮＦ分子、ＴＮＦ関連分子またはＴＮＦ様分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−β中に見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３。
【０６１２】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る脈管形成タンパク質としては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるような神経膠腫誘導増殖因子（Ｇｉｌｉｏｍａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＧＦ）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板誘導増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子−２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるような血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるような血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１５号に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；血管内皮増殖因子−Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号に開示されるような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許ＤＥ１９６３９６０１に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書でその全体が参考として援用される。
【０６１３】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、線維芽細胞増殖因子と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドとともに投与され得る線維芽細胞増殖因子としては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１４】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、造血増殖因子と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る造血増殖因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（サルグラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）、ＬＥＵＫＩＮＥＴＭ、ＰＲＯＫＩＮＥＴＭ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（フィルグラスチン（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、ＮＥＵＰＯＧＥＮＴＭ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）エリトロポイエチン（エポエチンα、ＥＰＯＧＥＮＴＭ、ＰＲＯＣＲＩＴＴＭ）、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、スチール因子（ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ））、巨核球コロニー刺激因子、ＰＩＸＹ３２１（ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質）、インターロイキン（特に、ＩＬ−１〜ＩＬ−１２のうちの任意の１つ以上）、インターフェロンγ、またはトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）。
【０６１５】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アドレナリン作動遮断薬（例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、およびチモロールと組み合わせて投与される。
【０６１６】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗不整脈薬（例えば、アデノシン、アミドアロン（ａｍｉｄｏａｒｏｎｅ）、ブレチリウム、ジギタリス、ジゴキシン、ジギトキシン、ジリアゼン（ｄｉｌｉａｚｅｍ）、ジソピラミド、エスモロール、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、モリシジン（ｍｏｒｉｃｉｚｉｎｅ）、フェニトイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、プロパフェノン、プロプラノロール、キニジン、ソタロール、トカイニド、およびベラパミル）と組み合わせて投与される。
【０６１７】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、利尿薬（例えば、カルボニックアンヒドラーゼ−阻害剤（例えば、アセタゾラミド、ジクロルフェナミド、およびメタゾルアミド）、浸透圧性利尿薬（例えば、グリセリン、イソソルビド、マンニトール、および尿素）、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−シンポートを阻害する利尿薬（例えば、フロセミド、ブメタニド、アゾセミド、ピレタニド、トリパミド、エタクリン酸、ムゾリミン、およびトルセミド）、チアジドおよびチアジド様利尿薬（例えば、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリコルメチアジド（ｔｒｉｃｈｏｒｍｅｔｈｉａｚｉｄｅ）、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾン、およびキネサゾン（ｑｕｉｎｅｔｈａｚｏｎｅ））、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロライドおよびトリアムテレン）、ならびに鉱質コルチコイドレセプターアンタゴニスト（例えば、スピロノラクトン、カンレノン、およびカンレノ酸カリウム）と組み合わせて投与される。
【０６１８】
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための処置と組み合わせて投与される。内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のための処置としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１２７Ｉ、ヨウ素の放射性同位体（例えば、１３１Ｉおよび１２３Ｉ）；組換え成長ホルモン（例えば、ＨＵＭＡＴＲＯＰＥＴＭ（組換えソマトロピン）；成長ホルモンアナログ（例えば、ＰＲＯＴＲＯＰＩＮＴＭ（ソマトレム））；ドーパミンアゴニスト（例えば、ＰＡＲＬＯＤＥＬＴＭ（ブロモクリプチン）；ソマトスタチンアナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮＴＭ（オクトレオチド）；ゴナドトロピン調製物（例えば、ＰＲＥＧＮＹＬＴＭ、Ａ．Ｐ．Ｌ．ＴＭおよびＰＲＯＦＡＳＩＴＭ（絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ））、ＰＥＲＧＯＮＡＬＴＭ（メノトロピン）、およびＭＥＴＲＯＤＩＮＴＭ（尿性卵胞性刺激ホルモン（ｕＦＳＨ））；合成ヒトゴナドトロピン放出ホルモン調製物（例えば、ＦＡＣＴＲＥＬＴＭおよびＬＵＴＲＥＰＵＬＳＥＴＭ（塩酸ゴナドレリン）；合成ゴナドトロピンアゴニスト（例えば、ＬＵＰＲＯＮＴＭ（酢酸ロイプロリド）、ＳＵＰＰＲＥＬＩＮＴＭ（酢酸ヒストレリン（ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ））、ＳＹＮＡＲＥＬＴＭ（酢酸ナファレリン）、およびＺＯＬＡＤＥＸＴＭ（酢酸ゴセレリンｅ）；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの合成調製物（例えば，ＲＥＬＥＦＡＣＴ  ＴＲＨＴＭおよびＴＨＹＰＩＮＯＮＥＴＭ（プロチレリン）；組換えヒトＴＳＨ（例えば、ＴＨＹＲＯＧＥＮＴＭ）；甲状腺ホルモンの天然異性体のナトリウム塩の合成調製物（例えば、Ｌ−Ｔ４ＴＭ、ＳＹＮＴＨＲＯＩＤＴＭおよびＬＥＶＯＴＨＲＯＩＤＴＭ（レボチロキシンナトリウム）、Ｌ−Ｔ３ＴＭ、ＣＹＴＯＭＥＬＴＭおよびＴＲＩＯＳＴＡＴＴＭ（リオチロインナトリウム（ｌｉｏｔｈｙｒｏｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ））、およびＴＨＹＲＯＬＡＲＴＭ（リオトリックス））；抗甲状腺化合物（例えば、６−ｎ−プロピルチオウラシル（プロピルチオウラシル）、１−メチル−２−メルカプトイミダゾールおよびＴＡＰＡＺＯＬＥＴＭ（メチマゾール）、ＮＥＯ−ＭＥＲＣＡＺＯＬＥＴＭ（カルビマゾール）；β−アドレナリン作動性レセプターアンタゴニスト（例えば、プロプラノロールおよびエスモロール）；Ｃａ２＋チャネル遮断薬；デキサメタゾンおよびヨウ素化放射線造影剤（例えば、ＴＥＬＥＰＡＱＵＥＴＭ（ヨーパン酸（ｉｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））およびＯＲＡＧＲＡＦＩＮＴＭ（イポダートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｐｏｄａｔｅ））。
【０６１９】
内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のさらなる処置としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エストロゲンまたは結合型エストロゲン（例えば、ＥＳＴＲＡＣＥＴＭ（エストラジオール）、ＥＳＴＩＮＹＬＴＭ（エチニルエストラジオール）、ＰＲＥＭＡＲＩＮＴＭ、ＥＳＴＲＡＴＡＢＴＭ、ＯＲＴＨＯ−ＥＳＴＴＭ、ＯＧＥＮＴＭおよびエストロピペート（ｅｓｔｒｏｐｉｐａｔｅ）（エストロン）、ＥＳＴＲＯＶＩＳＴＭ（キネストロール）、ＥＳＴＲＡＤＥＲＭＴＭ（エストラジオール）、ＤＥＬＥＳＴＲＯＧＥＮＴＭおよびＶＡＬＥＲＧＥＮＴＭ（吉草酸エストラジオール）、ＤＥＰＯ−ＥＳＴＲＡＤＩＯＬ  ＣＹＰＩＯＮＡＴＥＴＭおよびＥＳＴＲＯＪＥＣＴ  ＬＡＴＭ（サイピオン酸（ｃｙｐｉｏｎａｔｅ）エストラジオール））；抗エストロゲン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸＴＭ（タモキシフェン）、ＳＥＲＯＰＨＥＮＥＴＭおよびＣＬＯＭＩＤＴＭ（クロミフェン）；プロゲスチン（例えば、ＤＵＲＡＬＵＴＩＮＴＭ（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン）、ＭＰＡＴＭおよびＤＥＰＯ−ＰＲＯＶＥＲＡＴＭ（酢酸メドロキシプロゲステロン）、ＰＲＯＶＥＲＡＴＭおよびＣＹＣＲＩＮＴＭ（ＭＰＡ）、ＭＥＧＡＣＥＴＭ（酢酸メゲストロール）、ＮＯＲＬＵＴＩＮＴＭ（ノルエチンドロン）、ならびにＮＯＲＬＵＴＡＴＥＴＭおよびＡＹＧＥＳＴＩＮＴＭ（酢酸ノルエチンドロン））；プロゲステロンインプラント（例えば、ＮＯＲＰＬＡＮＴ  ＳＹＳＴＥＭＴＭ（ノルゲストレルの皮下移植物））；抗黄体ホルモン（例えば、ＲＵ  ４８６ＴＭ（ミフェプリストン）；ホルモン性避妊薬（例えば、ＥＮＯＶＩＤＴＭ（ノルエチノドレル＋メストラノール）、ＰＲＯＧＥＳＴＡＳＥＲＴＴＭ（プロゲステロンを放出する子宮内デバイス）、ＬＯＥＳＴＲＩＮＴＭ、ＢＲＥＶＩＣＯＮＴＭ、ＭＯＤＩＣＯＮＴＭ、ＧＥＮＯＲＡＴＭ、ＮＥＬＯＮＡＴＭ、ＮＯＲＩＮＹＬＴＭ、ＯＶＡＣＯＮ−３５ＴＭおよびＯＶＡＣＯＮ−５０ＴＭ（エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）、ＬＥＶＬＥＮＴＭ、ＮＯＲＤＥＴＴＥＴＭ、ＴＲＩ−ＬＥＶＬＥＮＴＭおよびＴＲＩＰＨＡＳＩＬ−２１ＴＭ（エチニルエストラジオール／レボノルゲストレル（ｌｅｖｏｎｏｒｇｅｓｔｒｅｌ）ＬＯ／ＯＶＲＡＬＴＭおよびＯＶＲＡＬＴＭ（エチニルエストラジオール／ノルゲストレル）、ＤＥＭＵＬＥＮＴＭ（エチニルエストラジオール／二酢酸エチノジオール）、ＮＯＲＩＮＹＬＴＭ、ＯＲＴＨＯ−ＮＯＶＵＭＴＭ、ＮＯＲＥＴＨＩＮＴＭ、ＧＥＮＯＲＡＴＭ、およびＮＥＬＯＶＡＴＭ（ノルエチンドロン／メストラノール）、ＤＥＳＯＧＥＮＴＭおよびＯＲＴＨＯ−ＣＥＰＴＴＭ（エチニルエストラジオール／デスゲストレル）、ＯＲＴＨＯ−ＣＹＣＬＥＮＴＭおよびＯＲＴＨＯ−ＴＲＩＣＹＣＬＥＮＴＭ（エチニルエストラジオール／ノルゲスチメート（ｎｏｒｇｅｓｔｉｍａｔｅ））、ＭＩＣＲＯＮＯＲＴＭおよびＮＯＲ−ＱＤＴＭ（ノルエチンドロン）、ならびにＯＶＲＥＴＴＥＴＭ（ノルゲストレル））。
【０６２０】
内分泌物および／またはホルモン不均衡障害のためのさらなる処置としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：テストステロンエステル類（例えば、酢酸メテノロンおよびウンデカン酸テストステロン；非経口および経口アンドロゲン（例えば、ＴＥＳＴＯＪＥＣＴ−５０ＴＭ（テストステロン）、ＴＥＳＴＥＸＴＭ（プロピオン酸テストステロン）、ＤＥＬＡＴＥＳＴＲＹＬＴＭ（テストステロンエナンタート）、ＤＥＰＯ−ＴＥＳＴＯＳＴＥＲＯＮＥＴＭ（サイピオン酸テストステロン）、ＤＡＮＯＣＲＩＮＥＴＭ（ダナゾール）、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮＴＭ（フルオキシメステロン）、ＯＲＥＴＯＮ  ＭＥＴＨＹＬＴＭ、ＴＥＳＴＲＥＤＴＭおよびＶＩＲＩＬＯＮＴＭ（メチルテストステロン）、およびＯＸＡＮＤＲＩＮＴＭ（オキサンドロロン（ｏｘａｎｄｒｏｌｏｎｅ））；テストステロン経皮系（例えば、ＴＥＳＴＯＤＥＲＭＴＭ）；アンドロゲンレセプターアンタゴニストおよび５−α−レダクターゼインヒビター（例えば、ＡＮＤＲＯＣＵＲＴＭ）（酢酸シプロテロン）、ＥＵＬＥＸＩＮＴＭ（フルタミド）、およびＰＲＯＳＣＡＲＴＭ（フィナステリド）；副腎皮質刺激ホルモン調製物（例えば、ＣＯＲＴＲＯＳＹＮＴＭ（コシントロピン）；副腎皮質ステロイドおよびその合成アナログ（例えば、ＡＣＬＯＶＡＴＥＴＭ）（ジプロピオン酸アルクロメタゾン）、ＣＹＣＬＯＣＯＲＴＴＭ（アムシノニド）、ＢＥＣＬＯＶＥＮＴＴＭおよびＶＡＮＣＥＲＩＬＴＭ（ジプロピオン酸ベクロメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥＴＭ（ベタメタゾン）、ＢＥＮＩＳＯＮＥＴＭおよびＵＴＩＣＯＲＴＴＭ（安息香酸ベタメタゾン）、ＤＩＰＲＯＳＯＮＥＴＭ（ジプロピオン酸ベタメタゾン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭ（ベタメタゾンリン酸ナトリウム）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ  ＳＯＬＵＳＰＡＮＴＭ（ベタメタゾンリン酸ナトリウムおよび酢酸塩）、ＢＥＴＡ−ＶＡＬＴＭおよびＶＡＬＩＳＯＮＥＴＭ（吉草酸ベタメタゾン）、ＴＥＭＯＶＡＴＥＴＭ（プロピオン酸クロベタゾール）、ＣＬＯＤＥＲＭＴＭ（ピバル酸クロコルトロン）、ＣＯＲＴＥＦＴＭおよびＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥＴＭ（コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ  ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＬＯＣＯＩＤＴＭ（酪酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭ（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）リン酸ナトリウム）、Ａ−ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＴＭおよびＳＯＬＵ  ＣＯＲＴＥＦＴＭ（コルチゾール（ヒドロコルチゾン）コハク酸ナトリウム）、ＷＥＳＴＣＯＲＴＴＭ（吉草酸コルチゾール（ヒドロコルチゾン））、ＣＯＲＴＩＳＯＮＥ  ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸コルチゾン）、ＤＥＳＯＷＥＮＴＭおよびＴＲＩＤＥＳＩＬＯＮＴＭ（デソニド）、ＴＯＰＩＣＯＲＴＴＭ（デスオキシメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮＴＭ（デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ  ＬＡＴＭ（酢酸デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭおよびＨＥＸＡＤＲＯＬ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥＴＭ（デキサメタゾンリン酸ナトリウム、ＦＬＯＲＯＮＥＴＭおよびＭＡＸＩＦＬＯＲＴＭ（ジ酢酸ジフロラゾン）、��ＬＯＲＩＮＥＦ  ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸フルドロコルチゾン）、ＡＥＲＯＢＩＤＴＭおよびＮＡＳＡＬＩＤＥＴＭ（フルニソリド）、ＦＬＵＯＮＩＤＴＭおよびＳＹＮＡＬＡＲＴＭ（フルオシノロンアセトニド）、ＬＩＤＥＸＴＭ（フルオシノニド）、ＦＬＵＯＲ−ＯＰＴＭおよびＦＭＬＴＭ（フルオロメトロン）、ＣＯＲＤＲＡＮＴＭ（フルランドレノリド）、ＨＡＬＯＧＴＭ（ハルシノニド）、ＨＭＳ  ＬＩＺＵＩＦＩＬＭＴＭ（メドリゾン）、ＭＥＤＲＯＬＴＭ（メチルプレドニゾロン）、ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬＴＭおよびＭＥＤＲＯＬ  ＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（酢酸メチルプレドニゾン）、Ａ−ＭＥＴＨＡＰＲＥＤＴＭおよびＳＯＬＵＭＥＤＲＯＬＴＭ（メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム）、ＥＬＯＣＯＮＴＭ（モメタゾンフロエート（ｍｅｍｏｔａｓｏｎｅ  ｆｕｒｏａｔｅ））、ＨＡＬＤＲＯＮＥＴＭ（酢酸パラメタゾン）、ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦＴＭ（プレドニゾロン）、ＥＣＯＮＯＰＲＥＤＴＭ（酢酸プレドニゾロン）、ＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬＴＭ（プレドニゾロンリン酸ナトリウム）、ＨＹＤＥＬＴＲＡ−Ｔ．Ｂ．ＡＴＭ（プレドニゾロンテブテート（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  ｔｅｂｕｔａｔｅ））、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ（プレドニゾン）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴＴＭおよびＫＥＮＡＣＯＲＴＴＭ（トリアムシノロン（ｔｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ））、ＫＥＮＡＬＯＧＴＭ（トリアムシノロンアセトニド）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴＴＭおよびＫＥＮＡＣＯＲＴ  ＤＩＡＣＥＴＡＴＥＴＭ（トリアムシノロンジアセテート）、ならびにＡＲＩＳＴＯＳＰＡＮＴＭ（トリアムシノロンヘキサアセトニド）；副腎皮質ステロイドの生合成および作用のインヒビター（例えば、ＣＹＴＡＤＲＥＮＴＭ（アミノグルテチミド）、ＮＩＺＯＲＡＬＴＭ（ケトコナゾール）、ＭＯＤＲＡＳＴＡＮＥＴＭ（トリロスタン）、およびＭＥＴＯＰＩＲＯＮＥＴＭ（メチラポン）；ウシ、ブタまたはヒトのインスリンまたはその混合物；インスリンアナログ；組換えヒトインスリン（例えば、ＨＵＭＵＬＩＮＴＭおよびＮＯＶＯＬＩＮＴＭ）；経口血糖降下剤（例えば、ＯＲＡＭＩＤＥＴＭおよびＯＲＩＮＡＳＥＴＭ（トルブタミド）、ＤＩＡＢＩＮＥＳＥＴＭ（クロルプロパミド）、ＴＯＬＡＭＩＤＥＴＭおよびＴＯＬＩＮＡＳＥＴＭ（トラザミド）、ＤＹＭＥＬＯＲＴＭ（アセトヘキサミド）、グリベンクラミド、ＭＩＣＲＯＮＡＳＥＴＭ、ＤＩＢＥＴＡＴＭおよびＧＬＹＮＡＳＥＴＭ（グリブリド）、ＧＬＵＣＯＴＲＯＬＴＭ（グリピジド）、およびＤＩＡＭＩＣＲＯＮＴＭ（グリクラジド）、ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥＴＭ（メトホルミン）、シグリタゾン、ピオグリタゾン、およびα−グルコシダーゼインヒビター；ウシまたはブタのグルカゴン；ソマトスタチン（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮＴＭ（オクトレオチド）；ならびにジアゾキシド（例えば、ＰＲＯＧＬＹＣＥＭＴＭ（ジアゾキシド））。
【０６２１】
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、子宮運動性障害のための処置と共に投与される。子宮運動性障害のための処置としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エストロゲン薬剤（例えば、結合型エストロゲン（例えば、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（登録商標）およびＥＳＴＲＡＴＡＢ（登録商標））、エストラジオール（例えば、ＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）およびＡＬＯＲＡ（登録商標））、エストロピペート（ｅｓｔｒｏｐｉｐａｔｅ）、およびクロロトリアニセン）；プロゲスチン薬剤（例えば、ＡＭＥＮ（登録商標）（メドロキシプロゲステロン）、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（登録商標）（酢酸ノルエチンドロン（ｎｏｒｅｔｈｉｄｒｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ））、ＰＲＯＭＥＴＲＩＵＭ（登録商標）プロゲステロン、および酢酸メゲストロール）；ならびにエストロゲン／プロゲステロンの組合せ治療剤（例えば、結合型エストロゲン／メドロキシプロゲステロン（例えば、ＰＲＥＭＰＲＯＴＭおよびＰＲＥＭＰＨＡＳＥ（登録商標））および酢酸ノルエチンドロン／エチニルエストラジオール（例えば、ＦＥＭＨＲＴＴＭ）。
【０６２２】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、鉄欠乏症および低色素性貧血を処置する際に有効な薬物と組み合わせて投与される。これらの薬物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：硫酸第一鉄（硫酸鉄、ＦＥＯＳＯＬＴＭ）、フマル酸第一鉄（例えば、ＦＥＯＳＴＡＴＴＭ）、グルコン酸第一鉄（例えば、ＦＥＲＧＯＮＴＭ）、ポリサッカリド−鉄複合体（例えば、ＮＩＦＥＲＥＸＴＭ）、鉄デキストラン注射剤（例えば、ＩＮＦＥＤＴＭ）、硫酸第二銅、ピロキシジン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、シアノコバラミン注射剤（例えば、ＲＥＤＩＳＯＬＴＭ、ＲＵＢＲＡＭＩＮ  ＰＣＴＭ）、ヒドロキソコバラミン、葉酸（例えば、ＦＯＬＶＩＴＥＴＭ）、ロイコボリン（ホリニン酸、５−ＣＨＯＨ４ＰｔｅＧｌｕ、シトロボラム因子）またはＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（ロイコボリンのカルシウム塩）、トランスフェリンまたはフェリチン。
【０６２３】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、精神医学的障害を処置するために使用される薬剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る精神医学的薬物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗精神病薬（例えば、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、クロザピン、フルフェナジン、ハロペリドール、ロキサピン、メソリダジン、モリンドン、オランザピン、ペルフェナジン、ピモジド、クエチアピン、リスペリドン、チオリダジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、およびトリフルプロマジン）、抗躁薬（例えば、カルバマゼピン、ジバルプロックスナトリウム（ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘ  ｓｏｄｉｕｍ）、炭酸リチウム、およびクエン酸リチウム）、抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、アモキサピン、ブプロピオン（ｂｕｐｒｏｐｉｏｎ（アムフェブタモン））、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、フルボキサミン、フルオキセチン、イミプラミン、イソカルボキサジド、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、パロキセチン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシプロミン、トラゾドン、トリミプラミン、およびベンラファキシン）、抗不安薬（例えば、アルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、およびプラゼパム）、ならびに興奮薬（例えば、ｄ−アンフェタミン、メチルフェニデート、およびペモリン）。
【０６２４】
他の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、神経学的障害を処置するために使用される薬剤と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る神経学的薬剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：鎮痙薬（例えば、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトスクシミド、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、バルプロ酸、ジバルプロックスナトリウム、フェルバメート、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、オクスカルバゼピン、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、トピラマート、ゾニサミド、ジアゼパム、ロラゼパム、およびクロナゼパム）、抗振せん麻痺薬（例えば、レボドパ／カルビドパ、セレジリン、アマンチジン（ａｍａｎｔｉｄｉｎｅ）、ブロモクリプチン、ペルゴリド、ロピニロール、プラミペキソール、ベンズトロピン；ビペリデン；エトプロパジン；プロシクリジン；トリヘキシフェニジル、トルカポン（ｔｏｌｃａｐｏｎｅ））、およびＡＬＳ治療薬（例えば、リルゾール（ｒｉｌｕｚｏｌｅ））。
【０６２５】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血管拡張剤および／またはカルシウムチャネル遮断薬と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る血管拡張剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アンギオテンシン変換酵素阻害薬（ＡＣＥ）インヒビター（例えば、パパベリン、イソクスプリン、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプリル、およびニリドリン）ならびに硝酸塩（例えば、イソソルビドジニトレート、イソソルビジドモノニトレート、およびニトログリセリン）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与され得るカルシウムチャネルブロッキング薬剤の例としては、アムロジピン、ベプリジル、フェロジピン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、およびベラパミルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２６】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、胃腸障害に対する処置と組み合わせて投与される。本発明のアルブミン癒合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと共に投与され得る胃腸障害の処置剤としては、Ｈ２ヒスタミンレセプターアンタゴニスト（例えば、ＴＡＧＡＭＥＴＴＭ（シメチジン）、ＺＡＮＴＡＣＴＭ（ラニチジン）、ＰＥＰＣＩＤＴＭ（ファモチジン）、およびＡＸＩＤＴＭ（ニザチジン））；Ｈ＋、Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤＴＭ）およびＰＲＩＬＯＳＥＣＴＭ（オメプラゾール））；ビスマス化合物（例えば、ＰＥＰＴＯ−ＢＩＳＭＯＬＴＭ（ビスマスサブサリシレート）およびＤＥ−ＮＯＬ（ビスマスサブシトレートＴＭ））；種々の制酸剤；スクラルフェート；プロスタグランジンアナログ（例えば、ＣＹＴＯＴＥＣＴＭ（ミソプロストール））；ムスカリンコリンアンタゴニスト；緩下剤（例えば、表面緩下剤、刺激緩下剤、生理食塩水および浸透性緩下剤）；抗下痢剤（例えば、ＬＯＭＯＴＩＬＴＭ（ジフェノキシレート）、ＭＯＴＯＦＥＮＴＭ（ジフェノキシン）、およびＩＭＯＤＩＵＭＴＭ（ロペルアミド塩化水素））、ソマトスタチンの合成アナログ（例えば、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮＴＭ（オクトレオチド）、抗嘔吐剤（例えば、ＺＯＦＲＡＮＴＭ（オンダンセトロン）、ＫＹＴＲＩＬＴＭ（グラニセトロン塩化水素）、トロピセトロン、ドラセトロン、メトクロプラミド、クロロプロマジン、ペルフェナジン、プロクロペラジン、プロメタジン、チエチルペラジン、トリフルプロマジン、ドンペリドン、ハロペリドール、ドロペリドール、トリメトベンザミド、デキサメサゾン、メチルプレドニソロン、ドロナビノール、およびナビロン）；Ｄ２アンタゴニスト（メトクロプラミド、トリメトベンザミドおよびクロロプロマジン）；胆汁塩；ケノデオキシコリン酸；ウルソデオキシコリン酸；および膵臓酵素調製物（例えば、膵臓および膵臓リパーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２７】
さらなる実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、他の治療レジメンまたは予防レジメン（例えば、放射線治療）と組み合わせて投与される。
【０６２８】
本発明はまた、薬学的組成物（本発明のアルブミン融合タンパク質を含む）の１つ以上の成分で埋められる、１つ以上の内容物を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器に付随するものは、薬学的製品および生物学的製品の製造、使用または販売を制御する政府機関に指示された形態の注意書きであり得、この注意書きは、ヒト投与物の製造、使用または販売の機関による承認を反映する。
【０６２９】
（遺伝子治療）
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物は、遺伝子治療プロトコールの一部として使用され得、アルブミン融合タンパク質の治療有効投与量を送達し得る。核酸の、細胞へのインビボ導入に関する好ましいアプローチは、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸を含む、ウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターを用いる細胞の導入は、標的細胞の大きな集団が、核酸を受け取り得るという利点を有する。
さらに、ウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルスベクター内に含まれたｃＤＮＡとして）は、ウイルスベクター核酸を得た細胞内で効果的に発現される。
【０６３０】
レトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターは、アルブミン融合タンパク質をインビボでコードする外来性核酸分子の輸送のための組換え遺伝子送達系として使用され得る。これらのベクターは、細胞内への有効な核酸の送達を提供し、そして輸送された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。複製欠損レトロウイルスのみを生成する特異化細胞株（「パッケージ細胞」と名付けられた）の開発は、遺伝子治療に対する、レトロウイルスの有用性を高め、そして欠損レトロウイルスは、遺伝子治療の目的に対する、遺伝子輸送における使用に対し、特徴付けられる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，（Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７  １を参照のこと）。複製欠損レトロウイルスは、ビリオン（標準技術により、ヘルパーウイルスの使用を介して、標的細胞を感染させるために使用され得る）に閉じ込められ得る。組換えレトロウイルスを生成するため、およびインビボまたはインビトロで、このようなウイルスで細胞を感染させるプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），９．１０−９．１４章および他の標準的な実験室マニュアルにおいて見出され得る。
【０６３１】
本発明で有用な、別のウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを使用する。アデノウイルスゲノムは処理され得、その結果、目的の遺伝子産物をコードし、かつ発現するが、正常の溶解性ウイルスのライフサイクルにおいて複製する能力の観点では、非活性化されている。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄ１３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得ない特定の環境において有利であり得、そして幅広い種類の細胞型（上皮細胞を含む（上に引用されたＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２））を感染するために使用され得る。さらに、ウイルス粒子は比較的安定かつ精製および濃縮のために修正可能であり、そして、上記のように、感染性のスペクトラムに影響するように、改変され得る。さらに、アデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含まれる外来性のＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに取り込まれないが、エピソームに残り、それにより、ＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルス）中に組み込まれることを誘導する挿入突然変異誘発の結果として起り得る、可能性のある問題を避ける。しかし、大きな外因性ＤＮＡ（８キロベース）に対するアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターに関連する（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上に引用される；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７（１９８６））。
【０６３２】
別の実施形態において、本発明の非ウイルス遺伝子送達は、標的化細胞により、被験核酸分子の吸収のためのエンドサイトーシス経路に関する。この型の例示的な遺伝子送達システムとしては、リポソーム由来系、ポリリジン結合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。代表的な実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子は、表面上に陽電荷を保有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）中にトラップされ得、そして（必要に応じて）、標的組織の細胞表面抗原に対し、抗体でタグが付けられる（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉ  Ｇｅｋａ  ２０：５４７−５  ５  １；ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／０６３０９；日本特許出願１０４７３８１；および欧州特許公開公報ＥＰ−Ａ−４３０７５Ａ）。
【０６３３】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子送達系は、任意の数の方法により、患者に導入され得る。例えば、遺伝子送達系の薬学的調製物は、全身に（例えば、静脈内注入により）導入され得、そして特定の標的細胞におけるタンパク質の特異的な変換が、遺伝子送達ビヒクル、レセプター遺伝子の発現を調節する転写制御配列に起因する、細胞型発現または組織型発現、あるいはそれらの組み合わせによって提供された。他の実施形態において、組換え遺伝子の初期送達は、確実に局在する動物に誘導することにより、より制限される。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、カテーテル（米国特許第５，３２８，４７０を参照のこと）または定位注入（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７）により誘導され得る。遺伝子治療構築物の薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子送達システムから本質的に成り得るか、または遺伝子送達ビヒクルが取り込まれる遅延放出マトリックスを含み得る。アルブミン融合タンパク質が、組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）よりインタクトに生成される場合、薬学的調製物は、アルブミン融合タンパク質を生成する１つ以上の細胞を含み得る。
【０６３４】
（さらなる遺伝子治療方法）
また本発明によって包含されるものは、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のアルブミン融合タンパク質の発現を達成するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこの融合タンパク質の発現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。
【０６３５】
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて操作され得、次いで、操作された細胞は、本発明の融合タンパク質を用いて処置される患者に提供される。このような方法は、当該分野において周知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらは、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作される細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接的な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
【０６３６】
以下により詳細に考察されるように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア中で送達され得る。
【０６３７】
１つの実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡとは、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物中およびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０６３８】
遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複製を可能にする配列を含まない構築物である。
適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０６３９】
当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明のポリヌクレオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０６４０】
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０６４１】
ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）内または骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポリヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現する能力において、特に適格である。
【０６４２】
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態および投与経路に依存し得る。
【０６４３】
好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって動脈に送達され得る。
【０６４４】
裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該分野で公知である。
【０６４５】
この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような送達方法は、当該分野で公知である。
【０６４６】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
【０６４７】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは特に有用であり、そして商標ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもとにＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと、）より入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０６４８】
当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
【０６４９】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジル、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知である。
【０６５０】
例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、各５０ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。このサンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次いで、浴を、１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ）プローブを装備したＨｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  モデル３５０超音波処理器を使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あるいは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得るか、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知でありそして利用可能である。
【０６５１】
このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２〜５２７を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブの壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９））１７：７７）；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ，Ａ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ、Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｕｏｌｏｓ，Ｄ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考として援用される。
【０６５２】
一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までである。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までである。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより好ましくは、その割合は約１：１である。
【０６５３】
米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカチオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入について報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提供する。
【０６５４】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする配列を含むＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。レトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６５５】
このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５〜１４（１９９０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられるが、それらに限定されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポソームにカプセル化し得るか、または脂質に結合し得て、次いで宿主に投与し得る。
【０６５６】
このプロデューサー細胞株は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちらかで、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞は、本発明の融合タンパク質を発現する。
【０６５７】
特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイルスは、それが本発明の融合タンパク質をコードし、そして発現し、それと同時に通常の溶菌性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化されるように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配が軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れた安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら（１９７４）、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８）。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら（１９９１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５）。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら（１９７９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６）。
【０６５８】
本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．  ３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ．  ４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４号に記載されており、これらの文献および特許は本明細書中で参考として援用される。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、本発明において有用である。
【０６５９】
好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠損アデノウイルスは、次の遺伝子のすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたはＬ１〜Ｌ５。
【０６６０】
特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エキソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成するためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、非分裂細胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０６６１】
例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において見出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意の標準的技術を使用して、この組換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェクトおよび感染されると、それらはそのポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして本発明の融合タンパク質を発現する。
【０６６２】
遺伝子治療の別の方法は、相同組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードしている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０６６３】
当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とともに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は、プロモーター−標的化配列と内在性配列との相同組換えを可能にするに十分にその内在性配列に対して相補的である。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレオチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、そのプロモーターは、その内在性配列に作動可能に連結される。
【０６６４】
このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ましくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０６６５】
裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるようなリポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、このプロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０６６６】
プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列は、このプロモーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在性配列の発現を駆動する。
【０６６７】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、そのタンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配列は、コード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列は、目的のポリヌクレオチドに対して同種であってもよいしまたは異種であってもよく、そしてトランスフェクトされる細胞に対して同種であってもよいしまたは異種であってもよい。さらに、当該分野で公知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０６６８】
その投与形態によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子が発現される限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投与形態が使用され得る。これは、直接針注射、全身性注射、カテーテル注入、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅｐｏｔ）物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティング（ｄｅｃａｎｔｉｎｇ）または局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈澱した裸のプラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミドの直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０６６９】
局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビヒクルと複合体を形成した本発明のアルブミン融合タンパク質は、動脈領域内部に直接注射により投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメートルで注射することを言う。
【０６７０】
局所投与の別の方法は、本発明のポリヌクレオチド構築物を外科的創傷中または外科的創傷の周囲に接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこのポリヌクレオチド構築物がその創傷の内側の組織の表面上にコーティングされ得るか、またはこの構築物が、その創傷の内側の組織の領域に注入され得る。
【０６７１】
全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体を形成した本発明の融合タンパク質を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソームを含む。特定の実施形態において、全身投与で使用するための適切な送達ビヒクルは、特定の部位にビヒクルを標的化するための本発明のアルブミン融合タンパク質を含むリポソームを含む。
【０６７２】
全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射が実行され得る。
当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １８９：１１２７７〜１１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐える能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物を複合体形成することにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、当該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌクレオチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０６７３】
送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造および生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康および病歴のような、多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０６７４】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、特にヒトが好ましい。
【０６７５】
（生物学的活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは１つ以上の生物学的活性を試験するアッセイにおいて使用され得る。あるアルブミン融合タンパク質および／またはアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ある特定のアッセイにおいて活性を示した場合、その融合タンパク質に対応する治療タンパク質はその生物学的活性に関連する疾患に関与している可能性がある。従って、その融合タンパク質は関連する疾患の治療に使用され得る。
【０６７６】
好ましい実施形態において、本発明は、表１の「好ましい指標Ｙ」カラムに記載されている疾患および障害を治療する工程、患者に投与する工程を包含し、ここで、このような処置、予防、または改善は、治療タンパク質に一致する治療タンパク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を所望し、この治療タンパク質は、表１の「治療タンパク質Ｘ」（表１の「好ましい指標Ｙ」カラムに列挙される処置されるべき疾患または障害同じぐらい新鮮な）において開示されている。
【０６７７】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、患者に対して投与する工程を含む、表１の「好ましい指標：Ｙ」カラムに特定の治療タンパク質に関して列挙される疾患または障害を処置する方法を包含し、ここで、このような治療、予防または改善は、治療タンパク質と一致する治療タンパク質部分を含む、本発明のアルブミン融合タンパク質が所望され、ここで、実施例における指標は、治療、予防または改善に有効な量で関連する。
【０６７８】
配列番号Ｙをコードするポリヌクレオチドによりコードされる場合、アルブミン融合タンパク質が細胞より生成される本発明により特に企図される。ポリヌクレオチドが、細胞由来のコードタンパク質を発現するために使用される場合、細胞の天然分泌およびプロセシング工程は、表２のカラム４および／または１１にはっきりと列挙されるシグナル配列を欠くタンパク質を生成する。列挙されたシグナル配列の特定のアミノ酸配列は、本明細書中に示されるか、または当該分野で周知である。従って、本発明の最も好ましい実施形態は、細胞より誘導されたアルブミン融合タンパク質（これは、表２のカラム４および／または１１に示される、リーダー配列を欠く）を含む。最も好ましいポリオペプチドは、表２のカラム４および／または１１に列挙された特定のリーダー配列なしで、配列番号Ｙを含む。これらの２つの好ましい実施形態を含む組成物（薬学的組成物を含む）もまた、好ましい。これらのアルブミン融合タンパク質は、表１の「好ましい指標：Ｙカラムにおいて特定の治療タンパク質に関して列挙された疾患または障害の処置、予防、または改善のために、特に企図される。
【０６７９】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、内分泌系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「内分泌障害」を参照のこと）、神経系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「神経学的障害」を参照のこと）、免疫系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「免疫活性」を参照のこと）、呼吸器系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「呼吸器障害」を参照のこと）、心臓血管系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「心臓血管障害」を参照のこと）、生殖系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「生殖系障害」を参照のこと）、消化系の疾患および障害（例えば、以下のセクションの「胃腸障害」を参照のこと）、細胞増殖に関連する疾患および／または障害（例えば、以下のセクションの「過剰増殖障害」を参照のこと）、ならびに／あるいは血液に関連する疾患および／または障害（例えば、以下のセクションの「血液関連障害」を参照のこと）に関連する疾患ならびに／あるいは障害の診断、予後、予防および／または処置において使用され得る。
【０６８０】
ある種の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は本発明の融合タンパク質の治療タンパク質の一部に対応する遺伝子が発現する組織に関連する疾病および／または疾患の診断および／または予後に使用しうる。
【０６８１】
従って、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコード化するポリヌクレオチドは、以下の活性に関連する疾患および／または障害の診断、検知および／または治療に有用であり、これらの活性としては、ホルモン活性化、神経伝達活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、および細胞移動が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６８２】
より一般的には、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは次の系に関連する疾病および／または疾患の診断、予後、予防および／または治療に利用され得る。
【０６８３】
（免疫活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、免疫細胞の増殖、分化もしくは動員（走化性）を活性化または阻害することによる、免疫系の疾患、障害および／または状態を処置、予防、診断および／または予後診断において有用であり得る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発生し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これらの免疫疾患、障害および／または状態の病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌およびいくつかの自己免疫性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０６８４】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫系の疾患および障害を処置するためおよび／または本発明のポリペプチドが発現される組織に関連する細胞によって生じた免疫応答を阻害または増強するために使用され得る。
【０６８５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全症（先天性または後天性の免疫不全症の両方を含む）の処置、予防、診断および／または予後に有用であり得る。免疫グロブリンレベル、Ｂ細胞機能および／またはＢ細胞数が減少するＢ細胞免疫不全症の例としては、以下が挙げられる：Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ブルートン病）、Ｘ連鎖小児性無ガンマグロブリン血症、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不全症、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫不全症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、無ガンマグロブリン血症（先天性および後天性無ガンマグロブリン血症を含む）、成体発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、不特定（ｕｎｓｐｅｃｉｆｅｄ）低ガンマグロブリン血症、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、選択的ＩｇＭ欠損症、選択的ＩｇＡ欠損症、選択的ＩｇＧサブクラス欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症（ＩｇＡ欠損症を伴うかまたは伴わない）、Ｉｇ欠損症（ＩｇＭの増加を伴う）、ＩｇＧおよびＩｇＡ欠損症（ＩｇＭの増加を伴う）、正常なＩｇまたはＩｇの上昇を伴う抗体欠損症、Ｉｇ重鎖欠乏、κ鎖欠損症、Ｂ細胞リンパ球増殖障害（ＢＬＰＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、および一過性乳児低ガンマグロブリン血症。
【０６８６】
特定の実施形態において、毛細血管拡張性運動失調または毛細血管拡張性運動失調に関連する状態が、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防、診断および／または予後診断され得る。
【０６８７】
Ｔ細胞および／またはＢ細胞の機能および／または数が減少される先天性の免疫不全症の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ディ・ジョージ異常、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）（Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、常染色体劣性ＳＣＩＤ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）欠損症、クラスＩＩ  ＭＨＣ欠損症（不全リンパ球症候群）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、および毛細血管拡張性運動失調を含むが、これらに限定されない）、胸腺発育不全、３次および４次咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損症（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋Ｔリンパ球減少症、優性Ｔ細胞欠損（不特定）を伴う免疫不全症、および細胞媒介免疫の不特定免疫不全症。
【０６８８】
特定の実施形態において、ディ・ジョージ異常またはディ・ジョージ異常に関連する状態が、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防、診断および／または予後診断され得る。
【０６８９】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して処置、予防、診断および／または予後診断され得る、他の免疫不全症としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性肉芽腫症、チェディアック−東病、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、リンパ球グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、リンパ球接着欠損症、補体成分欠損症（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８および／またはＣ９欠損症を含む）、網様発育不全、胸腺リンパ形成不全、胸腺腫を伴う発育不全、重篤な先天性リンパ球減少症、免疫不全症を伴う形成異常、新生児好中球減少症、短肢小人症、およびＩｇによる免疫不全症を共存するネゼロフ症候群。
【０６９０】
好ましい実施形態において、これらの免疫不全症および／または上記の免疫不全症に関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して処置、予防、診断および／または予後診断され得る。
【０６９１】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用され得る。
【０６９２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫障害の処置、予防、診断および／または予後診断において有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって自己物質を外来物質として不適切に認識されることによって生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を誘導する免疫応答を生じる。従って、免疫応答（特に、Ｔ細胞の増殖、分化または走化性）を阻害し得る本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与は、自己免疫障害の予防における効果的な治療であり得る。
【０６９３】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置、予防、診断および／または予後診断され得る自己免疫疾患または障害としては、以下の１以上が挙げられるが、これらに限定されない：全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺病、自己免疫溶血性貧血、溶血性貧血、血小板減少症、自己免疫血小板減少症紫斑病、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少症紫斑病、紫斑病（例えば、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）、自己免疫性血球減少症、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病（甲状腺機能亢進症）、およびインスリン耐性糖尿病。
【０６９４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防および／または診断され得る自己免疫成分を有するであろうさらなる障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、ライター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎、自閉症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼障害。
【０６９５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断および／または予後診断され得る自己免疫成分を有するであろうさらなる障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（例えば、核小体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例えば、体液性および細胞媒介性の副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜におけるＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けられる）、シューグレン症候群（例えば、多組織抗体および／または特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、およびアドレナリン作用性薬物耐性（ぜん息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）（例えば、β−アドレナリン作用性レセプター抗体によってしばしば特徴付けられる）。
【０６９６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断および／または予後診断され得る自己免疫成分を有するであろうさらなる障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性活動性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合における特異的組織抗体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によってしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、血管壁におけるＩｇおよび補体ならびに／または低い血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮膚炎（ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、ぜん息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性、肉芽腫性、変性および萎縮性障害。
【０６９７】
好ましい実施形態において、これらの自己免疫疾患および障害ならびに／または上記のこれらの疾患および障害に関連する障害および／または状態は、例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防、診断および／または予後診断される。特定の好ましい実施形態において、慢性関節リウマチは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、処置、予防および／または診断される。
【０６９８】
別の特定の好ましい実施形態において、全身性エリテマトーデスが、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置、予防、診断および／または予測される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、特発性血小板減少性紫斑病が処置、予防および／または診断される。
【０６９９】
別の特定の好ましい実施形態において、ＩｇＡネフロパシーは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防および／または診断される。
【０７００】
好ましい実施形態において、自己免疫疾患および自己免疫障害ならびに／または上記の疾患および障害と関連する状態は、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断および／または予測される。
【０７０１】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制剤として使用される。
【０７０２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血細胞の疾患、障害および／または状態の処置、予防、予測および／または診断において有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症、好中球減少症、貧血、および血小板減少症が挙げられるが、それらに限定されない、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害および／または状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組織球増殖症が挙げられるが、それらに限定されない、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害および／または状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を増加させるために用いられ得る。
【０７０３】
アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸障害）はまた、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、処置、予防、診断および／または予測され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏性、または血液型不適合を処置、予防、予測および／または診断するために用いられ得る。
【０７０４】
さらに、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を処置、予防、診断および／または予測するために使用され得る。このようなアレルギー反応としては、喘息、鼻炎および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボにおいてＩｇＥ濃度の調節に有用であり得る。
【０７０５】
さらに、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症状態の診断、予測、予防および／または処置に使用される。例えば、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症応答に関与する細胞の活性化、増殖および／または分化を阻害し得るので、これらの分子を使用して、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を、予防および処置し得る。このような炎症状態は以下を含むがこれらに限定されない。例えば、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応答症候群）、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症、呼吸器障害（例えば、喘息およびアレルギー）；胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患）；癌（例えば、胃癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、および乳癌）；ＣＮＳ障害（例えば、多発性硬化症、虚血性脳損傷、および／または発作、外傷性脳損傷、神経変性性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）、ＡＩＤＳ関連痴呆、およびプリオン病）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心血管疾患、および心肺バイパス合併症）；ならびに炎症によって特徴付けられる多くのさらなる疾患、状態、および障害（例えば、肝炎、慢性関節リウマチ、痛風、外傷、膵炎、サルコイドーシス、皮膚炎、腎虚血再還流障害、グレーヴス病、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、および同種異系移植拒絶）。
【０７０６】
炎症は、基礎的な防御機構なので、炎症障害は、実質的に体の任意の組織に影響を与え得る。従って、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を挙げられるがこれらに限定されない、組織特異的炎症障害の処置に使用される。副腎炎、肺胞炎、胆管炎、虫垂炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液胞炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮管炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸牛炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、繊維組織炎、濾胞炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、迷路炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、縦隔炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨髄炎、耳炎、心膜炎、腱周囲炎、腹膜炎、喉頭炎、静脈炎、灰白髄炎、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、強膜脈絡膜炎、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃炎、尿道炎、および膣炎。
【０７０７】
特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、器官移植拒絶および対宿主性移植片病の診断、予測、予防および／または処置に有用である。器官拒絶は、免疫応答を通した移植された組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。
同様に、免疫反応はまた、ＧＶＨＤに関するが、この場合、外来の移植された免疫細胞が、宿主組織を破壊する。本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレオチドおよび／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト（免疫応答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する）は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であり得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（免疫応答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する）は、実験的アレルギー拒絶および超急性異種移植拒絶を予防するのに有効な治療であり得る。
【０７０８】
他の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下に挙げられるが、それらに限定されない、免疫複合疾患の診断、予測、予防および／または処置に有用であり得る。血清病、後連鎖球菌性糸球体腎炎（ｐｏｓｔ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、結節性多発動脈炎、および免疫複合誘導性脈管炎。
【０７０９】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染性因子の処置、検出および／または予防に使用され得る。例えば、免疫応答を増大することによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖、活性化および／または分化を増大することによって、感染性疾患は、処置、検出、および／または予防され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を増大するか、または新しい免疫応答を惹起するかのいずれかによって、増大され得る。あるいは、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、免疫応答の必然的な惹起なしに、感染性因子（感染性因子の適用列挙の節などで述べる）を直接阻害し得る。
【０７１０】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗原に対する免疫応答を増大するワクチンアジュバントとして使用される。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍特異的な免疫応答を増大するアジュバントとして使用される。
【０７１１】
別の特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗ウイルス免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を用いて増強され得る抗ウイルス免疫応答としては、ウイルスおよび本明細書において記載されるかさもなければ当該分野で公知のウイルス関連疾患もしくは症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より選択される、ウイルス、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのアジュバントとして用いられる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング、ロタウイルス、日本脳炎、インフルエンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、Ｊｕｎｉｎウイルス、チクングニヤウイルス、リフトバレー熱、単純疱疹、および黄熱病からなる群より選択されるウイルス、疾患または症状に対する免疫応答を増強するアジュバントとして用いられる。
【０７１２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を使用して増大され得る抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答としては、細菌または真菌、および本明細書中に記載されるか、または、さもなくば当該分野で公知の疾患または症状に関連する細菌または真菌が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、または症状（これは、破傷風、ジフテリア、ボツリスム、およびＢ型髄膜炎からなる群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
【０７１３】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、または症状（これは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉからなる群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
【０７１４】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗寄生生物免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。アジュバントとして本発明の組成物を使用して増大され得る抗寄生生物免疫応答としては、寄生生物、および本明細書中に記載されるかまたはさもなくば、当該分野で公知の疾患または症状に関連する寄生生物が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａに対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
【０７１５】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、単核性食細胞の漸増および活性化を予防することによって、珪胚症、サイコイドーシス、および特発性肺線維症を含む感染疾患の処置に使用され得る。
【０７１６】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに対する免疫介在応答を阻害するか、または増大する抗体の産生のための抗体として使用される。
【０７１７】
１つの実施形態として、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫系をブーストし、１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）の量の増大を生じ、高い親和性の抗体産生および免疫グロブリンクラス転換（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導し、および／または免疫応答を増大するための動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒト、最も好ましくはヒト）に投与される。
【０７１８】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、病原体に対するＢ細胞応答性の刺激物質として使用される。
【０７１９】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｔ細胞のアクチベーターとして使用される。
【０７２０】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制性治療を受ける前の、個体の免疫状態を増大させる薬剤として使用される。
【０７２１】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、より高い親和性抗体を誘導するための薬剤として使用される。
【０７２２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清免疫グロブリン濃度を増加するための薬剤として使用される。
【０７２３】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫無防備状態の個体の回復を促進するための薬剤として使用される。
【０７２４】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、高齢の集団および新生児の間の免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。
【０７２５】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種異系または外因性の器官移植）の前、間、または後の免疫系エンハンサーとして使用される。移植に関して、本発明の組成物は、移植の前、同時、および／または後に投与され得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始前に投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始後であるが、Ｂ細胞集団の完全な回復の前に最初に投与される。
【０７２６】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによって寛解または処置され得る、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７２７】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一時的な免疫不全を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤として使用される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによって寛解または処置され得る、一時的な免疫不全を生じる状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復および手術からの回復が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７２８】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原提示のレギュレーターとして使用される。１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、インビトロまたはインビボで抗原提示を増強するかまたは抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形態において、この抗原提示の増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置としてかまたは免疫系を調節するために有用であり得る。
【０７２９】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、個体の免疫系を、ＴＨ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に指向するための薬剤として使用される。
【０７３０】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍増殖を誘導し、従って、腫瘍を抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にするための手段として使用される。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ）の疾患であり、従って、実質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性である。これらの細胞は、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロフィールは、おそらく変化するであろう。
【０７３１】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能性免疫不全症（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような病理におけるＢ細胞の産生の刺激因子として使用される。
【０７３２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、手術、外傷または遺伝的欠陥後のリンパ組織の生成および／または再生のための治療として使用される。別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、移植前の骨髄サンプルの前処理として使用される。
【０７３３】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全症／免疫欠損を生じる遺伝性の障害のための遺伝子ベースの治療として使用される。
【０７３４】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球に影響を及ぼす寄生生物疾患（例えば、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ））に対して防御するために単球／マクロファージを活性化する手段として使用される。
【０７３５】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段として使用される。
【０７３６】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、獣医学的医療に適用され得るような、本明細書中に記載の１つ以上の適用において使用される。
【０７３７】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外来因子または自己に対する種々の局面の免疫応答をブロックする手段として使用される。所望され得る特定の局面の免疫応答をブロックする疾患または状態の例としては、狼瘡および関節炎のような自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギー、炎症、腸疾患、損傷に対する免疫応答性および病原体に関する疾患／障害が挙げられる。
【０７３８】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデスおよびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を妨げるための治療として使用される。
【０７３９】
別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニストおよび／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内皮細胞におけるＢ細胞および／またはＴ細胞の遊走のインヒビターとして使用される。この活性は、組織構造または同属の応答を破壊し、そして例えば、免疫応答の破壊および敗血症のブロックにおいて有用である。
【０７４０】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、未定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単一クローン性高ガンマグロブリン血症、およびプラスマ細胞腫のような疾患における、慢性の高ガンマグロブリン血症事象のための治療として使用される。
【０７４１】
別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、特定の自己免疫疾患および慢性炎症疾患および感染性疾患における、マクロファージおよびその前駆体、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化Ｔ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞）の、ポリペプチド走化性および活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾患の例は、本明細書中に記載され、その自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。
【０７４２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、好酸球の産生および遊走を妨げることによって、特発性好酸球増多症候群を処置するために使用され得る。
【０７４３】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、相補的介在細胞溶解を増大する、または阻害するために使用される。
【０７４４】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗体依存性細胞性細胞毒性を増大する、または阻害するために使用される。
【０７４５】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、例えば、動脈壁における単球浸潤を妨げることによって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。
【０７４６】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）を処置するために使用され得る。
【０７４７】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷および組織の修復の刺激、新脈管形成の刺激、および／または血管またはリンパの疾患または障害の修復の刺激において有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。
【０７４８】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原発性または後天性の免疫不全、欠損性の血清免疫グロブリン産生、再発性の感染および／または免疫系機能不全によって特徴付けられる障害を診断、予測、処置および／または予防するために使用される。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、関節、骨、皮膚および／または耳下腺の感染、血液由来の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症性関節炎および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるような自己免疫疾患）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／あるいはこれらの感染、疾患および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の原発性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状ヘルペス（例えば、重篤な帯状ヘルペス）および／またはニューモシスティスを含むが、これらに限定されない）を処置または予防するために使用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって予防、診断、予測、および／または処置され得る他の疾患および傷害として、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、血小板減少、およびヘモグロビン尿症が挙げられるが、それらに限定されない。
【０７４９】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分類不能型免疫不全疾患（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）（「ＣＶＩＤ」；「後天性無ガンマグロブリン血症」および「後天性低ガンマグロブリン血症」としても公知である）またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置および／または診断するために使用される。
【０７５０】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫細胞あるいは、免疫組織関連癌または新生物を含む癌または新生物の診断、予測、予防および／または処置に使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、予防、診断または処置され得る癌または新生物の例として、以下に挙げられるが、それらに限定されない。急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、プラスマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患、および／または本明細書中の他の箇所で「過剰増殖障害」と題される節に記載される疾患および障害。
【０７５１】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少するための治療として使用される。
【０７５２】
別の特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少する手段として使用される。
【０７５３】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞免疫不全個体（例えば、部分的または完全な脾臓摘出術をうけた個体など）の間で免疫応答性をブーストするための因子として使用される。
【０７５４】
（血液関連障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、止血性活性（出血を止めること）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活性を増大させることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用し、血液凝固の疾患、障害および／または状態（例えば、無線維素原血症、因子欠損症、血友病）、血液血小板の疾患、障害および／または状態（例えば、血小板減少症）、あるいは外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置または予防し得る。あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用し、凝血を阻害または溶解し得る。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕の処置または予防において、これらの分子は重要であり得る。
【０７５５】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、予測および／または処置に使用され得る。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、伏在静脈移植片の閉塞の予防のため血管形成術の手順に伴い得るような処置した周囲で起きる血栓症（ｐｅｒｉｐｒｏｃｅｄｕｒａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）の危険性を減らすために、非リウマチ性心房細動を含む心房細動を有する患者における発作の危険性を減らすために、人工心臓弁および／または増帽弁疾患に関連した塞栓症の危険性を減らすために、使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのための他の使用としては、体外装置（例えば、脈管内カニューレ、血液透析の患者における脈管アクセスシャント、血液透析機、および心肺バイパス機）における閉塞の予防が挙げられるが、それらに限定されない。
【０７５６】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドが発現している組織に関連する血液および／または血液形成器官の疾患および障害の予防、診断、予測および／または処置に使用され得る。
【０７５７】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血活性（血球の形成）を調節に使用され得る。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全ての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）、脊髄細胞（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板など）の量を増大するのに使用される。血球の量、または血球のサブセットの量を減少する能力は、以下に記載される貧血および白血球減少症の予防、検出、診断および／または処置に有用であり得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、全ての、またはサブセットの血球（例えば、赤血球、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞）、脊髄細胞（例えば好塩基球、好酸球、好中球、肥満細胞、マクロファージ）および血小板）の量を減らすのに使用され得る。血球の量、または血球のサブセットの量を減少する能力は、白血球増加症（例えば、好酸球増加症など）の予防、検出、診断および／または処置に有用であり得る。
【０７５８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液悪液質を予防、処置、または診断するために使用され得る。
【０７５９】
貧血は、赤血球の数またはその中のヘモグロビン（酸素を運ぶタンパク質）の量が正常を下回る、状態である。貧血は、過度の出血、減少した赤血球生成、または増加した赤血球細胞破壊（溶血）によって引き起こされ得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、貧血を処置、予防、および／または診断する際に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置、予防または診断され得る貧血としては、鉄欠乏性貧血、血色素減少症、小球性貧血、萎黄病、遺伝性鉄芽球性貧血、特発性後天性鉄芽球性貧血、赤血球形成不全症、巨赤芽球性貧血（例えば、悪性貧血、（ビタミンＢ１２欠乏）および葉酸欠乏性貧血）、再生不良性貧血、溶血性貧血（例えば、自己免疫溶血性貧血、細血管異常性溶血性貧血、および発作性夜間血色素尿症）が、挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、疾患に関連する貧血を処置、予防、および／または診断する際に有用であり得、この疾患に関連する貧血としては、全身性エリテマトーデスに関連する貧血、ガンに関連する貧血、リンパ腫に関連する貧血、慢性腎疾患に関連する貧血、および腫脹した脾臓に関連する貧血が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、薬物処置から生じる貧血を処置、予防および／または診断する際に有用であり得、そのような貧血は、例えば、メチルドパに関連する貧血、ダプソンに関連する貧血、および／またはサルファ剤に関連する貧血である。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、異常な赤血球構造に関連する貧血を処置、予防、および／または診断する際に有用であり得、このような貧血としては、遺伝性球状赤血球、遺伝性楕円赤血球症、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損、および鎌状赤血球貧血が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７６０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘモグロビン異常（例えば、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＳ−Ｃ症、およびヘモグロビンＥ症に関連した異常）を処置、予防、および／または診断するにおいて有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サラセミア（α−サラセミアおよびβ−サラセミアのメジャー形態およびマイナー形態を含むが、これらに限定されない）を診断、予後判定、予防および／または処置するにおいて有用であり得る。
【０７６１】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、および血栓性血小板減少性紫斑病）、ヴォン・ヴィレブランド病、遺伝性血小板障害（例えば、蓄積プール症（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｏｏｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）（例えば、チェディアック−東病およびヘルマンスキー−パドラック症候群）、トロンボキサンＡ２機能不全、血小板無力症、およびベルナール−スーリエ症候群）、溶血性尿毒症症候群、血友病（ｈｅｍｏｐｈｅｌｉａ）（例えば、血友病Ａまたは第ＶＩＩ因子欠損、およびクリスマス病または第ＩＸ因子欠損）、遺伝性出血性毛細管拡張症（ランデュ−オースラー−ウェーバー症候群としてもまた公知）、アレルギー性紫斑病（ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）および汎発性血管内凝固症候群が挙げられるが、これらに限定されない出血障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
【０７６２】
血液の凝固時間に対する、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの効果は、全血部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性凝固時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性凝固時間またはリー−ホワイト凝固時間が挙げられるが、これらに限定されない、当該分野で公知の任意の凝固試験を使用してモニターされ得る。
【０７６３】
いくつかの疾患および種々の薬物は、血小板機能不全を引き起こし得る。従って、特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、後天性血小板機能不全（例えば、腎不全、白血病、多発性骨髄腫、肝臓の肝硬変、および全身性エリテマトーデスに関連する血小板機能不全、ならびに薬物処置（高用量でのアスピリン、チクロピジン、非ステロイド性抗炎症薬（関節炎、疼痛、および捻挫に使用される）、およびペニシリンによる処置を含む）に関連する血小板機能不全）を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
【０７６４】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球数の増加もしくは減少によって特徴付けられるか、または白血球数の増加もしくは減少に関連する疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。白血球減少症は、白血球数が、正常未満に減少する場合に生じる。白血球減少症としては、好中球減少症およびリンパ球減少症が挙げられるが、これらに限定されない。正常と比較した白血球数の増加は、白血球増加症として公知である。身体は、感染の間に、増加した数の白血球を産生する。従って、白血球増加症は、単純に、感染を反映する通常の生理的パラメーターであり得る。あるいは、白血球増加症は、損傷または癌のような他の疾患の指標であり得る。
白血球増加症（Ｌｅｏｋｏｃｙｔｏｓｅｓ）としては、好酸球増加症およびマクロファージの蓄積が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球減少症を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。他の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球増加症を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
【０７６５】
白血球減少症は、すべての型の白血球が概して減少した状態であり得るか、または特定の型の白血球の特異的枯渇であり得る。従って、特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球数の減少（好中球減少症として公知）を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または処置され得る好中球減少症としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：乳児遺伝性顆粒球減少症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｏｓｉｓ）、家族性好中球減少症、周期性好中球減少症、食事性欠損（例えば、ビタミンＢ１２欠損または葉酸欠損）から生じるかまたはこれに関連する好中球減少症、薬物処置（例えば、抗生物質レジメン（例えば、ペニシリン処置）、スルホンアミド処置、抗凝固薬処置、鎮痙薬物、抗甲状腺性薬物、および癌化学療法）から生じるかまたは薬物処置に関連した好中球減少症、およびいくつかの細菌感染またはウイルス感染、アレルギー性障害、自己免疫疾患、個体が膨張した脾臓を有し（例えば、フェルティ症候群、マラリア、およびサルコイドーシス）、そしていくつかの薬物処置レジメンを有する状態に関連して生じ得る好中球破壊の増加から生じる好中球減少症。
【０７６６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ストレス、薬物処置（例えば、コルチコステロイドを用いる薬物処置、癌化学療法、および／または放射線治療）、ＡＩＤ感染、および／または他の疾患（例えば、癌、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、慢性感染、いくつかのウイルス感染、および／または遺伝性障害（例えば、ディ・ジョージ症候群、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、重症複合型免疫不全、毛細血管拡張性運動失調）など）から生じるかまたはそれらに関連するリンパ球減少症を含むが、これに限定されないリンパ球減少症（Ｂリンパ球および／またはＴリンパ球の数の減少）を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
【０７６７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ゴシェ病、ニーマン−ピック病、レテラー−ジーヴェ病、およびハンド−シュラー−クリスチャン病を含むが、これらに限定されない、マクロファージ数および／またはマクロファージ機能に関連した疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
【０７６８】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特発性好酸球増多症候群、好酸球増多−筋痛症候群、およびハンド−シュラー−クリスチャン病を含むが、これらに限定されない、好酸球数および／または好酸球機能に関連した疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
【０７６９】
さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、骨髄芽球性または骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、セザリー症候群、およびヘアリーセル白血病）、慢性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）または顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および菌状息肉腫を含むが、これらに限定されない白血病およびリンパ腫を診断、予後判定、予防および／または処置するにおいて有用であり得る。
【０７７０】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、形質細胞異形成、単一クローン性高ガンマグロブリン血症、意義不明の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｉｅｓ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、クリオグロブリン血症、およびレーノー現象を含むが、これらに限定されないプラスマ細胞の疾患および障害を診断、予後判定、予防および／または処置する際に有用であり得る。
【０７７１】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性赤血球増加症、相対的赤血球増加症、二次的赤血球増加症（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ）、骨髄線維症、急性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生、血小板血症（一次的および二次的血小板血症の両方を含む）、および慢性骨髄性白血病を含むが、これらに限定されない、骨髄増殖性障害を処置、予防および／または診断する際に有用であり得る。
【０７７２】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科手術の前に、血球産生を増加させるための処置として有用であり得る。
【０７７３】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球、食作用、スーパーオキシド産生、抗体依存性細胞傷害性、好酸球およびマクロファージの移動を増強するための薬剤として有用であり得る。
【０７７４】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、幹細胞フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増加させるための薬剤として有用であり得る。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板フェレーシスの前に、循環系の幹細胞数を増加させるための薬剤として有用であり得る。
【０７７５】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、サイトカイン産生を増加させるための薬剤として有用であり得る。
【０７７６】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一次造血障害を予防、診断および／または処置する際に有用であり得る。
【０７７７】
（過剰増殖性障害）
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害（新生物を含む）を処置または検出するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、直接的相互作用または間接的相互作用を通して、障害の増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖性障害を阻害し得る他の細胞を増殖し得る。
【０７７８】
例えば、免疫応答を増加させることによって、特に、過剰増殖性障害の抗原性の質を増加させることかまたはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強することか、または新たな免疫応答を開始することのいずれかによって増加され得る。あるいは、免疫応答を減少させることはまた、過剰増殖性障害を処置する方法であり得る（例えば、化学療法剤）。
【０７７９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置または検出され得る過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（腎上体、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、および泌尿性器管に位置づけられる新生物。
【０７８０】
同様に、他の過剰増殖性障害もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置または検出され得る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性小児性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成体（原発性（ｐｒｉｍａｒｙ））肝細胞癌、成体（原発性（ｐｒｉｍａｒｙ））肝臓癌、成体急性リンパ性白血病、成体急性骨髄性白血病、成体ホジキン病、成体ホジキンリンパ腫、成体リンパ性白血病、成体非ホジキンリンパ腫、成体原発性肝臓癌、成体軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性疾患、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨の癌、脳幹グリオーム、脳腫瘍、乳癌、腎盤および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児性（原発性）肝細胞癌、小児性（原発性）肝臓癌、小児性急性リンパ芽球性白血病、小児性急性骨髄性白血病、小児性脳幹グリオーム、小児性小脳星状細胞腫、小児性大脳星状細胞腫、小児性頭蓋外胚細胞腫瘍（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ）、小児性ホジキン病、小児性ホジキンリンパ腫、小児性視床下部および視路グリオーム（Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｇｌｉｏｍａ）、小児性リンパ芽急性白血病、小児性髄芽腫、小児性非ホジキンリンパ腫、小児性松果体およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児性原発性肝臓癌、小児性横紋筋肉腫、小児性軟組織肉腫、小児性視路および視床下部グリオーム、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連の腫瘍、膵外分泌癌（Ｅｘｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）、頭蓋外胚細胞腫瘍（Ｅｘｔｒａｃｒａｎｉａｌ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ）、性腺外胚細胞腫瘍（Ｅｘｔｒａｇｏｎａｄａｌ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ）、肝外胆管癌、眼の癌、雌性乳癌、ゴシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍（Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ）、妊娠期栄養膜腫瘍（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒ）、ヘアリーセル白血病、頭頸部の癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸の癌、眼内黒色腫、島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポージ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇および口腔の癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害、マクログロブリン血症、雄性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、転移性原発性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、転移性扁平上皮頸癌（Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／プラスマ細胞新生物、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性障害、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠期の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌（Ｎｏｎｍｅｌａｎｏｍａ  Ｓｋｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌（Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣境界型腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、プラスマ細胞新生物／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盤および尿管の癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盤および尿管の移行上皮癌、移行性の腎盤および尿管の癌、栄養膜腫瘍、尿管および腎盤細胞の癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣の癌、視路および視床下部グリオーム、外陰部の癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫、ならびに任意の他の過剰増殖性疾患、および新形成であって、上記に列挙された器官系に位置付けられるもの。
【０７８１】
別の好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、前悪性状態の診断、予後判断、予防および／または処置、ならびに上に記載されるような障害を含むがこれらに限定されない腫瘍性状態または悪性状態への進行の予防を行う。このような使用が示されるのは、腫瘍性または癌（特に、ここで、過形成、化生、または最も特には形成異常からなる非腫瘍性の細胞増殖が起こっている（このような異常な増殖状態の総説について、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ，１９７６，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，第２版，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，６８〜７９頁）を参照）への前述の進行が知られるか、または疑われる状況においてである。
【０７８２】
過形成は、制御された細胞増殖形態であり、これは、構造または機能において有意な変化を伴わない、組織または器官における細胞数の増大を含む。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る過形成障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖、好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺増生症、嚢胞性増殖、乳房嚢胞性過形成、義歯性線維症、導管過形成、子宮内膜過形成、線維筋過形成、局所性上皮肥厚、歯肉増殖、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭状過形成、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性増殖、老年性脂腺増生症、ならびに疣贅性肥厚。
【０７８３】
化生は、成体の細胞または完全に分化した細胞の１つの型が、別の型の成体の細胞に代わる制御された細胞増殖形態である。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る化生障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化性（ａｔｙｐｉｃａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、異形成性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄様化生、二次性骨髄様化生、扁平化生、羊膜の扁平化生、および症候性骨髄化生。
【０７８４】
形成異常は、頻繁に癌の前兆であり、そして主に上皮において見出される；形成異常は、非腫瘍性細胞増殖の最も乱れた形態であり、これは、個々の細胞の一様性の損失および細胞の構築的配向の喪失を含む。形成異常細胞は、しばしば異常に大きく、深く染色される核を有し、そして多態性を呈する。形成異常は、特徴的に慢性的な過敏または炎症の存在するところに生じる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る形成異常障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：無汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指（ａｔｒｉｏｄｉｇｉｔａｌ）形成異常、気管支肺異形成症、終脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋骨手根骨足根骨形成不全、頭蓋骨幹端形成異常、ぞうげ質異形成症、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳−眼球異形成（ｅｎｃｅｐｈａｌｏ−ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、足根骨肥大、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性顎骨の線維性形成障害、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、開花性骨異形成症、遺伝性腎性−網膜性形成異常（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｒｅｎａｌ−ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、発汗性外胚葉性形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディーニ型内耳形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質異形成症、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔−視覚異形成症、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常。
【０７８５】
さらに本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、診断、予後判断、予防および／または処置し得る前腫瘍性障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性の異常増殖障害（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道形成異常）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光性角化症。
【０７８６】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ポリペプチドが発現される組織に関する障害の診断および／または予後判断し得る。
【０７８７】
別の実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に結合した、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、本明細書中に記載されるものを含むが、これらに限定されない癌および新生物を処置し得る。さらなる好ましい実施形態において、本明細書において記載されるように毒素または放射性同位元素に結合した、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、急性骨髄性白血病を処置し得る。
【０７８８】
さらに本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスに影響し得、したがって細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する多くの疾患を処置する際に有用である。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて診断、予後判断、予防、および／または処置し得る細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関する疾患としては、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモン依存性腫瘍（以下を含むが、これらに限定されない：結腸癌、心臓性腫瘍（ｃａｒｄｉａｃ  ｔｕｍｏｒｓ）、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫、および卵巣癌））；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、ならびに免疫性糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節リウマチ）ならびにウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶。
【０７８９】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、癌（特に上に列挙したもの）の増殖、進行、および／または転移を阻害する。
【０７９０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る、細胞の生存を増大させることに関するさらなる疾患または状態としては、以下の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない：悪性腫瘍および関連する障害（例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病を含む））、ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（顆粒球性白血病）および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性赤血球増加、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（これらは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮性肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫、頚部癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、聴神経鞘腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、ならびに網膜芽腫））。
【０７９１】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る、アポトーシスを増大させることに関する疾患は、以下を含む：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、および脳腫瘍または原発性関連疾患（ｐｒｉｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ））；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、および免疫関連糸球体腎炎（ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）および慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発作、および再灌流障害に起因するもの）、肝障害（例えば、肝炎に関連する肝障害、虚血／再灌流障害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管障害）、および肝癌）；毒素誘導性肝疾患（例えば、アルコールに起因するもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０７９２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る、過剰増殖性の疾患および／または障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肝、腹部、骨、胸、消化器系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭、および首、神経系（中枢神経および末梢神経）、リンパ系、骨盤、皮膚、柔組織、脾臓、胸郭および泌尿性器路に位置する新生物。
【０７９３】
同様に、他の過剰増殖障害もまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって、診断、予後判断、予防および／または処置され得る。このような過剰増殖障害の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖障害、パラプロテイン血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および新形成に加えて、上に列挙した器官系に位置する他の任意の過剰増殖疾患。
【０７９４】
別の好ましい実施形態は、本発明および／またはそのタンパク質融合物またはそのフラグメントを使用する遺伝子治療によって、異常な細胞分裂を阻害するために本発明のポリヌクレオチドを利用する。
【０７９５】
従って、本発明は、異常に増殖する細胞中に、本発明のポリヌクレオチドを挿入することによって細胞増殖性障害を処置するための方法を提供し、ここでこのポリヌクレオチドは、その発現を抑制する。
【０７９６】
本発明の別の実施形態は、個体において細胞増殖性障害を処置する方法を提供し、この方法は、異常に増殖する細胞（単数または複数）に本発明の１つ以上の活性遺伝子コピーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現する際に有効な、組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物は、レトロウイルス（またはより好ましくは、アデノウイルスベクター）を利用して処置されるべき細胞中に、挿入される（Ｇ．Ｊ．Ｎａｂｅｌら、ＰＮＡＳ  １９９９  ９６：３２４〜３２６（本明細書により参考として援用される）を参照のこと）。最も好ましい実施形態において、このウイルスベクターは欠損性であり、そして、非増殖細胞を形質転換せず、増殖する細胞のみ形質転換する。さらに、好ましい実施形態において、単独でか、他のポリヌクレオチドと組み合わせてか、または他のポリヌクレオチドと融合されてのいずれかで、増殖する細胞中に挿入される本発明のポリヌクレオチドは、その後、外部刺激（すなわち、磁気、特定の低分子、化学物質または薬物の投与など）を介して調節され得、この外部刺激は、コードされるタンパク質産物の発現を誘導するように、このポリヌクレオチドの上流のプロモーターに対して作用する。
このように、本発明の有益な治療効果は、この外部刺激に基づいて明らかに調節され（すなわち、本発明の発現を増加、減少または阻害し）得る。
【０７９７】
本発明のポリヌクレオチドは、腫瘍性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に有用であり得る。「腫瘍性遺伝子の発現を抑制する」とは、この遺伝子の転写の抑制、この遺伝子転写物（プレメッセージＲＮＡ）の破壊、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後改変の妨害、タンパク質の崩壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害を意図する。
【０７９８】
異常に増殖している細胞への局所投与のために、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知の任意の方法によって投与され得る。この方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞の微量注入、もしくはリポソームのようなビヒクル、リポフェクション、または裸のポリヌクレオチドとして、あるいは、本明細書全体を通して記載される任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５）、または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１２（１９８５））のような公知の遺伝子送達系（しかし、これらの限定されない）によって送達され得る。これらの参考文献は例示のみであり、そして本明細書中で参考として援用される。異常に増殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、そして非分裂の細胞を残すために、当業者に公知のレトロウイルス、またはアデノウイルス（当該分野において記載され、そして本明細書中の他の箇所において記載されるような）送達系を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は、レトロウイルスＤＮＡを組み込むために必要とされ、そしてレトロウイルスは、その生活環に必要とされるレトロウイルス遺伝子を欠損するので、自律複製し得ない。本発明のポリヌクレオチドのためにこのようなレトロウイルス送達系を利用することは、この遺伝子および構築物を異常に増殖している細胞へと標的化し、そして分裂していない正常細胞を残す。
【０７９９】
本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接的に注射針をガイドするために使用される画像化デバイスを使用することによって、内部の器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／疾患の部位に直接的に送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、外科的介入の時点で、疾患部位に投与され得る。
【０８００】
「細胞増殖性疾患」とは、良性であろうと悪性であろうと、細胞、細胞群、または組織の単一または複数の局所的異常増殖によって特徴付けられる、器官、腔、または身体部分のいずれか１つまたはいずれかの組み合わせに罹患する、ヒトまたは動物の任意の疾患または障害を意味する。
【０８０１】
本発明のポリヌクレオチドの任意の量が、それらが処理された細胞の増殖に対して生物学的に阻害する効果を有する限り、投与され得る。さらに、同一部位に同時に、本発明の１より多くのポリヌクレオチドを投与することが可能である。「生物学的に阻害する」とは、部分的または全体的な増殖阻害、ならびに細胞の増殖または成長の速度減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、組織培養物中の標的の悪性細胞増殖または異常増殖の細胞増殖、動物および細胞培養物中の腫瘍増殖に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価することによって、または当業者に公知の任意の他の方法によって、決定され得る。
【０８０２】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単独でか、タンパク質融合物としてか、または本明細書中の他の箇所に記載されるように直接的または間接的に他のポリペプチドと組み合わせるかのいずれかで、増殖性の細胞または組織の新脈管形成を阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態では、この抗新脈管形成作用は、例えば、造血性腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の阻害を通して、間接的に達成され得る（Ｊｏｓｅｐｈ  ＩＢら，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，９０（２１）：１６４８−５３（１９９８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０８０３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスの誘導を通して増殖性の細胞または組織を阻害する際に有用であり得る。これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、死ドメイン（ｄｅａｔｈ−ｄｏｍａｉｎ）レセプター（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター−１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介性タンパク質（ＴＲＡＭＰ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター−１および−２（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））の活性化において、増殖性の細胞および組織のアポトーシスを誘導するように、直接的または間接的のいずれかで作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形態では、これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アポトーシスを活性化する他のタンパク質の活性化におけるような他の機構を通してか、あるいは単独または低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン（ａｐｏｐｔｏｎｉｎ）、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質（例えば、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ４００（１−２）：４４７−５５（１９９８），Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９８），Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ  ２４；１１１−１１２：２３−３４（１９９８），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２（１９９８），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５（１９９８）（これらはすべて、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））と組み合わせてかのいずれかで、このタンパク質の発現を刺激することを通して、アポトーシスを誘導し得る。
【０８０４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害は、本明細書中他の箇所に記載されるように、これらのアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；２３１：１２５−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０８０５】
別の実施形態において、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質によって結合された、このタンパク質に結合する、またはこのタンパク質に関連するポリペプチドを発現する標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて結合され得る。
【０８０６】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質が「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対して応答するように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のいずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強する際に有用である。
【０８０７】
（腎臓障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、腎臓系の障害を、処置、予防、診断、および／または予後判定し得る。本発明の組成物を用いて診断、予後判定、予防、および／または処置され得る腎臓障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腎不全、腎炎、腎臓の血管障害、代謝性腎臓障害および先天性腎臓障害、腎臓の尿障害、自己免疫障害、硬化症および壊死、電解質不均等、および腎臓癌。
【０８０８】
本発明の組成物を用いて診断、予後判定、予防、および／または処置され得る腎疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性腎不全、慢性腎不全、アテローム塞栓症、末期腎臓疾患、腎臓の炎症性疾患（例えば、急性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、膜性糸球体腎炎、家族性ネフローゼ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎ＩおよびＩＩ、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急性尿細管間質性腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、急性溶連菌感染後性糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、腎盂腎炎、ループス腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、および溶連菌感染後性糸球体腎炎）、腎臓の血管障害（例えば、腎感染、アテローム塞栓症性腎臓疾患、皮質壊死、悪性腎硬化症、腎静脈血栓症、腎貫流低下（ｒｅｎａｌ  ｕｎｄｅｒｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、腎性網膜症（ｒｅｎａｌ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、腎虚血再灌流（ｒｅｎａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）、腎動脈塞栓症、および腎動脈狭窄）、そして尿管疾患に起因する腎障害（例えば、腎盂腎炎、水腎症、尿石症（腎結石症、腎石症）、逆流性腎症、尿管感染、尿閉（ｕｒｉｎａｒｙ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、および急性または慢性片側閉塞性尿路疾患）。
【０８０９】
さらに、本発明の組成物を用いて、腎臓の代謝障害および先天性障害（例えば、尿毒症、腎アミロイドーシス、腎性骨形成異常症、尿細管性アシドーシス、腎性糖尿、腎原性尿崩症、シスチン尿症、ファンコーニ症候群、腎性くる病（ｒｅｎａｌ  ｆｉｂｒｏｃｙｓｔｉｃ  ｏｓｔｅｏｓｉｓ（ｒｅｎａｌ  ｒｉｃｋｅｔｓ））、ハートナップ病、バーター症候群、リドル症候群、多発性嚢胞腎疾患、髄質嚢胞病、髄質海綿腎、アルポート症候群、爪−膝蓋骨症候群、先天性ネフローゼ症候群、クラッシュ症候群、馬蹄腎、糖尿病性ニューロパシー、腎原性尿崩症、鎮痛薬性腎症、腎結石、および膜性腎症）、ならびに腎臓の自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、ＩｇＡ腎症、およびＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎））を診断、予後判定、予防、および／または処置し得る。
【０８１０】
本発明の組成物をまた用いて、以下を診断、予後判定、予防、および／または処置し得る：腎臓の硬化性障害または壊死性障害（例えば、糸球体硬化症、糖尿病性腎症、巣状分節状糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、壊死性糸球体腎炎、および腎乳頭壊死）、腎臓の癌（例えば、腎腫、副腎腫、腎芽細胞腫、腎細胞癌、移行上皮癌、腎腺癌、扁平上皮癌、およびウィルムス腫）、ならびに電解質不均等（例えば、腎石灰、膿尿、水腫、水腎、蛋白尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、低リン酸血症、および高リン酸血症）。
【０８１１】
本発明の組成物は、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。本発明の組成物は、下記でより詳細に記載される、治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の一部として投与され得る。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
【０８１２】
（心臓血管障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含むが、これらに限定されない心臓血管障害を処置、予防、診断、および／または予後判定し得る。
【０８１３】
心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｆｉｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群のような心臓血管異常が挙げられるが、これらに限定されない。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄（ａｏｒｔｉｃ  ｏａｒｃｔａｔｉｏｎ）、三房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖｅｓｓｅｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ  ｄｕｃｔｕｓ  ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合症、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１４】
心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｈｅａｒｔ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１５】
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ  ＱＴ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ  ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられるが、これらに限定されない。頻拍としては、発作性頻拍、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｏｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０８１６】
心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａｒ  ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０８１７】
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、および心筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１８】
心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１９】
心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｃｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾患が挙げられる。
【０８２０】
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８２１】
動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉塞性血栓性血管炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８２２】
脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８２３】
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チアノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられるが、これらに限定されない。血栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８２４】
虚血性障害としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられるが、これらに限定されない。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ  ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８２５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、これらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。ポリヌクレオチドを送達する方法は本明細書中でより詳細に記載される。
【０８２６】
（呼吸性障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、呼吸系の疾患および／または障害の処置、予防、診断、および／または予後判定するために用いられ得る。
【０８２７】
呼吸系の疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：鼻前庭炎、非アレルギー性鼻炎（例えば、急性鼻炎、慢性鼻炎、アトロピン様鼻炎、血管運動神経性鼻炎）、鼻ポリープ、および副鼻腔炎、若年性血管線維腫、鼻の癌および若年性乳頭腫、声帯ポリープ、声帯結節（歌手結節）、接触潰瘍、声帯麻痺、喉頭気腫、咽頭炎（例えば、ウイルス性および細菌性）、扁桃炎、扁桃蜂巣炎、副咽頭間隙膿瘍、喉頭炎、喉頭気腫、ならびに咽頭癌（例えば、鼻咽頭の癌、扁桃癌、咽頭癌）、肺癌（例えば、扁平上皮細胞腫、小細胞腫（燕麦細胞腫）、大細胞腫、および腺癌）、アレルギー性障害（好酸球性肺炎、過敏性肺炎（例えば、外因性アレルギー性肺胞炎、アレルギー性間質肺炎、有機塵埃塵肺症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、喘息、ヴェーゲナー肉芽腫症（肉芽腫性脈管炎）、グッドパスチャー症候群））、肺炎（例えば、細菌肺炎（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（連鎖球菌肺炎）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ブドウ球菌肺炎）、グラム陰性細菌肺炎（例えば、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌおよびＰｓｅｕｄｏｍａｓ  ｓｐｐ．により引き起こされる）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ肺炎、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（レジオネラ性疾患）、ならびにＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ（オウム病））、そしてウイルス肺炎（例えば、インフルエンザ、水痘（Ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）（水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ））。
【０８２８】
呼吸系のさらなる疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細気管支炎、ポリオ、クループ、ＲＳウイルス感染、おたふくかぜ、伝染性紅斑（第五病）、小児バラ疹、進行性風疹汎脳炎、風疹、および亜急性硬化性汎脳炎）、真菌肺炎（例えば、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス真菌症、ブラストミセス症、重篤に抑制される免疫系を有する人々における真菌感染（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓにより引き起こされるクリプトコックス症；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．により引き起こされるアスペルギルス症；Ｃａｎｄｉｄａにより引き起こされるカンジダ症；およびムコール菌症）、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ（ニューモシスティス肺炎）、異型肺炎（例えば、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａおよびＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．）、日和見感染性肺炎、院内感染肺炎、化学性肺炎、ならびに吸引性肺炎、胸膜疾患（例えば、胸膜炎、胸水、および気胸症（例えば、単純自発性気胸症、複雑自発性気胸症、緊張気胸症））、気道閉塞疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、急性気管支炎または慢性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、珪肺症、黒色肺（炭坑夫塵肺症）、石綿肺症、ベリリウム症、職業性喘息、綿肺症、ならびに良性塵肺症）、浸潤性肺疾患（例えば、肺線維症（例えば、線維化肺胞炎、通常型間質性肺炎）、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、原因不明性組織球増殖症（例えば、レテラー−ジーヴェ病、ハンド−シュラー−クリスチャン病、好酸球性肉芽腫）、特発性肺ヘモジデリン沈着、サルコイドーシスおよび肺胞蛋白症）、急性呼吸窮迫症候群（例えば、成人呼吸促進症候群とも呼ばれる）、水腫、肺動脈塞栓症、気管支炎（例えば、ウイルス性、細菌性）、気管支拡張症、無気肺、肺膿瘍（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａによって引き起こされる）、そして嚢胞性線維症。
【０８２９】
（抗新脈管形成活性）
新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ  ５６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下において生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０８３０】
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与による新生血管形成に関連する疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態および転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、その処置の必要な個体に投与する工程を包含する。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌または腫瘍を治療的に処置するために、種々のさらなる方法で利用され得る。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠芽腫；カポージ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような癌を処置するために、局所送達され得る。
【０８３１】
なお他の局面において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置するために利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、注射またはカテーテルを介して、腫瘍に直接的に、または腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するように、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本明細書中において議論される。
【０８３２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０８３３】
例えば、本発明の１つの局面において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを過形成性瘢痕またはケロイドに投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法が提供される。
【０８３４】
本発明の１つの実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これらの病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕およびケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖および黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０８３５】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
【０８３６】
従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を患者に対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁されるようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０８３７】
特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物において一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与のために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、その純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
【０８３８】
他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すなわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自体から生じる炎症を低減し得る。
【０８３９】
本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前方角（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ  ａｎｇｌｅ）の領域に注入によって移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与する工程を包含する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０８４０】
本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜における本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置され得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に開始されるべきである。
【０８４１】
本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、患者に、治療有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を介して局所投与され得る。
【０８４２】
さらに、この本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。
【０８４３】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで処置、予防、診断、および／または予後判定され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ  ｂｏｒｎ）腫瘍（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎）、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾患。
【０８４４】
産児制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ  ａｆｔｅｒ）」方法を提供する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０８４５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ得る。
【０８４６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面において、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするために利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面において、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る。
【０８４７】
本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血管の形成が阻害されるように、切除後に本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手術後に適用される。
【０８４８】
本発明の１つの局面において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
【０８４９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態のより軽い「ｄ群」遷移金属。
【０８５０】
より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
【０８５１】
バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体のようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネートおよび硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のような硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
【０８５２】
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステンオキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０８５３】
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ  ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によって、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３６：３１２〜３１６、１９９２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０８５４】
（細胞レベルでの疾患）
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置、予防、診断、および／または予後判定され得る細胞生存の増大あるいはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。
【０８５５】
好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。
【０８５６】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されない）。
【０８５７】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置、予防、診断、および／または予後判定され得るアポトーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０８５８】
（創傷治癒および上皮細胞増殖）
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的のため、例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激するため、ならびに毛包生成および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するプロセスが提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む創傷治癒を刺激する際に臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮および表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯組織の創傷、口腔創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露または化学物質から生ずる熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射線療法および抗腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚損失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０８５９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、創傷床（ｗｏｕｎｄ  ｂｅｄ）への皮膚移植片の接着を増大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが創傷床への接着を増大するために使用され得る、移植片の型である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ  ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、層板状移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網移植片、パッチの移植片（ｐａｔｃｈ  ｇｒａｆｔ）、茎状移植片、全層移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｓｐｌｉｔ  ｓｋｉｎ  ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｔｈｉｃｋ  ｓｐｌｉｔ  ｇｒａｆｔ）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚の強度を助長するため、および加齢した皮膚の外見を改善するために使用され得る。
【０８６０】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸、および大腸における上皮細胞増殖における変化を生じると考えられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞（ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの前駆体）の増殖を促進し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る。
【０８６１】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、放射線、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、小腸粘膜に対して細胞保護的な（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を有し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、化学療法およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口潰瘍）の治癒を刺激し得る。
【０８６２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、やけどを含む、完全な厚さおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮膚の完全な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表皮水疱症（これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水疱を生じる、下層の真皮への表皮の接着の欠損）を処置するために使用され得る。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、胃潰瘍および十二指腸（ｄｏｕｄｅｎａｌ）潰瘍を処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびに腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生による治癒を、より迅速に補助するために使用され得る。炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の破壊を生じる疾患である。従って、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再表面形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な炎症性腸疾患の治癒を補助し、そして炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる処置は、胃腸管全体の粘液の産生に対して有意な効果を有すると予期され、そして摂取された有害な物質からかまたは外科手術後に、腸粘膜を有害な物質から保護するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その発現不足に関連する疾患を処置するために使用され得る。
【０８６３】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治癒するために使用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性または慢性の肺損傷を予防または処置するために、肺胞および細気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の増殖および分化を刺激し得、そしてその修復を促進し得る。例えば、肺胞（ａｖｅｏｌｉ）の進行性の損失を生じる気腫、および細気管支上皮および肺胞の壊死を生じる吸入傷害（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ）（すなわち、煙の吸入およびやけどから生じる）は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを使用して、効果的に処置され得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＩ型肺胞上皮細胞の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における肺硝子膜症（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防するのを助け得る。
【０８６４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、肝細胞の増殖および分化を刺激し得、従って、肝臓の疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、ウイルス性肝炎および毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ  ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および当該分野で公知の他の肝臓毒素）により生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために用いられ得る。
【０８６５】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いくらかの島細胞機能が残っている場合、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、その疾患の永続的な発現を、緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植における補助として使用され得る。
【０８６６】
（ニューロンの活性および神経学的疾患）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳および／または神経系の疾患、障害、損傷、または傷害の診断および／または処置のために使用され得る。本発明の組成物（例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を用いて処置され得る神経系の疾患には、軸索の切断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系損傷および疾患、障害および／または状態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って、患者（ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者を含む）において処置され得る神経系病変には、以下の中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの病変が挙げられるが、これらに限定されない：（１）虚血病変（ここで、神経系の一部における酸素不足により、ニューロンの損傷または死が生じ、これには大脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が挙げられる）；（２）外傷病変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関連する病変、例えば、神経系の一部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）；（３）悪性病変（ここで、神経系の一部分は、神経系関連悪性疾患もしくは非神経系組織由来の悪性疾患のいずれかである悪性組織により破壊または損傷される）；（４）感染性病変（ここで、神経系の一部分は、例えば、膿瘍による感染の結果として、破壊または損傷されるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染と関連するか、ライム病、結核、梅毒に関連する）；（５）変性病変（ここで、神経系の一部分は、変性プロセスの結果として破壊または損傷され、これには、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（６）栄養性の疾患、障害および／または状態に関連する病変（ここで、神経系の一部分は、栄養障害または代謝障害によって破壊または損傷され、これには、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコール弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（７）全身性疾患に関連する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌または類肉腫症が挙げられるが、これらに限定されない）；（８）毒性物質（アルコール、鉛または特定の神経毒を含む）により生じる病変；ならびに（９）脱髄性病変（ここで、神経系の一部分は、脱髄性執権によって破壊または損傷され、これには、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断脊髄障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０８６７】
１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、低酸素症の損傷効果から神経細胞を保護するために用いられる。さらに好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳低酸素症の損傷作用から神経細胞を保護するために用いられる。この実施形態によると、本発明の組成物は、大脳低酸素症に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。この実施形態の１つの非限定局面において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳虚血と関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。この実施形態の別の非限定局面において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大脳梗塞に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０８６８】
別の好ましいこの実施形態において本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、脳卒中に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０８６９】
別の好ましいこの実施形態において本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、心臓発作に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０８７０】
神経系障害を処置または予防するのに有用な本発明の組成物は、ニューロンの生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって、選択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のいずれかを誘発する本発明の組成物は、本発明によると有用であり得る：（１）低酸素または低酸素状態の存在または非存在下のいずれかの培養におけるニューロンの増加した生存時間；（２）培地またはインビボにおけるニューロンの増加した出芽；（３）培地またはインビボにおけるニューロン関連分子（例えば、運動ニューロンに関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンステラーゼ）の増加した産生；あるいは（４）インビボにおけるニューロン機能障害の軽減した症状。このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によって測定され得る。
好ましくは、非制限的な実施形態において、ニューロンの増加した生存時間は、本明細書中に記載される方法、またはそうでなければ当該分野で公知の方法（例えば、Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：３６３７−４２（２０００）、または、Ａｒａｋａｗａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３５０７〜３５１５（１９９０）など）を使用して慣用的に測定され得；ニューロンの増加した出芽は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｓｔｒｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５〜８２（１９８０））またはＢｒｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２（１９８１））に記載される方法）によって検出され得；ニューロン関連分子の増加した産生は、当該分野で公知の技術を使用し、測定されるべき分子に基づいて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノーザンブロットアッセイなどによって、測定され得；そして運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価することによって、測定され得る。
【０８７１】
特定の実施形態において、本発明に従って処置され得る運動ニューロンの障害には、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を与え得る障害（例えば、梗塞、感染、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、ならびにニューロンに選択的に影響する障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症）が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれには、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児期の進行性球麻痺（ファチオ−ロンデ病）、ポリオおよびポリオ後症状、ならびに遺伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−トゥース病）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８７２】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ニューロン生存、シナプス形成；伝達；神経分化などにおいて役割を果たし得る。従って、本発明の組成物（本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む）は、学習および／または認識の障害を含むがこれに限定されない、これらの役割に関連する疾患または障害を、診断、および／または処置または予防するのに用いられ得る。本発明の組成物は、神経変性性疾患状態および／または行動障害の処置または予防において有用であり得る。このような神経変性性疾患状態および／または行動障害としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、鬱病、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、および知覚の障害を含む）。さらに、本発明の組成物は、発生中の胚、または伴性障害に関連する発生の障害の処置、予防および／または検出において役割を果たし得る。
【０８７３】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含むが挙げられるがこれらに限定されない脳血管障害に関連する、疾患、傷害、障害または、損傷から、神経細胞を防御するのに有用であり得る：脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄またはモヤモヤ病）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳低酸素症、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓（例えば、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群）、硬膜上血腫（例えば、硬膜外血腫または硬膜下血腫およびクモ膜下出血）、脳亀裂骨折、脳虚血（例えば、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、または椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血管性痴呆（たとえば、多発脳梗塞性痴呆）、脳室周囲白質軟化症、ならびに血管性頭痛（例えば、群発性頭痛）。
【０８７４】
本発明のなおさらなる局面によれば、治療目的で、例えば神経学的細胞増殖および／または分化を刺激するために、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用するためのプロセスが提供される。
従って、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、神経学的疾患を処置、および／または検出するために用いられ得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の神経系疾患または傷害のマーカーまたは検出因子として用いられ得る。
【０８７５】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のような小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎のようなびまん性脳硬化。
【０８７６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびモヤモヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血腫およびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、脳室周囲白質軟化症、群発性頭痛のような血管性頭痛。
【０８７７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては以下が挙げられる：エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アルツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツハイマー病および進行性核上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、びまん性軸周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マダニ媒介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球性硬化性汎脳炎のような髄膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣を含む全身てんかんのようなてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・間代てんかん、複雑部分てんかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのような部分てんかん、外傷後てんかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持続状態、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群。
【０８７８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症のような水頭症、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、大脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ  ｐｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ痴呆複合症のような中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎のような脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、ならびに大脳マラリア。
【０８７９】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リステリア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎菌性脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎のような真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、横行脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄ろうのような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオン病（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコン−シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）、ならびに大脳トキソプラスマ症。
【０８８０】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：テント下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中枢神経系新生物、脈絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のような脳室新生物、髄膜新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病のような脱髄疾患、副腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患、筋萎縮性側索硬化症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧搾、硬膜外新生物のような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、母親由来１５  ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガングリオシドーシス、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロンセロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニルケトン尿症、プラーダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無能症（ｈｙｄｒａｎｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎のような脊髄癒合不全。
【０８８１】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感覚ニューロン障害、遺伝性  視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感覚および自律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候群を含む失認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発作、難聴、部分聴覚欠失、大声（ｌｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび耳鳴を含む聴覚障害のような情報伝達障害、失書症、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語発育障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のような発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発語障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５  ｑ‐１３微少欠損、運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオクローヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群のような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経麻痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエーン症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、球麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全のような味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視覚（ｓｕｂｎｏｒｍａｌ  ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィン症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のような痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天性筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェルドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性期性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐａｒａｍｙｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端肢端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系疾患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患、顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱視を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋麻痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性���行性外眼筋麻痺症、内斜視および外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のような眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫、三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖尿病性足のような糖尿病性ニューロパシー。
【０８８２】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下が挙げられる：手根管症候群のような神経圧搾症候群、足根管症候群、頸肋症候群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神経根炎（例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例えば、シャルコー−マリエ疾患、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ−ホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー（先天性痛覚脱失および家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症候群およびテタニー））のような神経炎。
【０８８３】
（内分泌障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、ホルモンアンバランスに関連する障害および／または疾患、ならびに／あるいは内分泌系の障害または疾患を処置、予防、診断、および／または予後し得る。
【０８８４】
内分泌系の腺により分泌されるホルモンは、身体発育、性的機能、代謝、および他の機能を制御する。障害は、２つの方法で分類される：ホルモンの産生における障害、およびホルモンに応答する組織の不全。これらのホルモンアンバランスおよび内分泌系疾患、障害または状態の病因は、遺伝的、体細胞性（例えば、癌およびいくつかの自己免疫疾患）、後天性（例えば、化学治療、損傷または毒素によって）、または感染性であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内分泌系および／またはホルモンアンバランスに関連する特定の疾患または障害のマーカーまたはディテクターとして使用され得る。
【０８８５】
内分泌系および／またはホルモンアンバランスおよび／または疾患は、子宮運動の障害を含み、これには以下が挙げられるが、これらに限定されない：妊娠および分娩時の合併症（例えば、早期分娩、過期妊娠、自然流産、ならびに遅延分娩および停止した分娩）；ならびに月経周期の障害および／または疾患（例えば、月経困難症および子宮内膜症）。
【０８８６】
内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患としては、膵臓の障害および／または疾患（例えば、真性糖尿病、尿崩症、先天性白内障欠損、褐色細胞腫−島細胞腫瘍症候群）；副腎の障害および／または疾患（例えば、アディソン病、コルチコステロイド欠損、男性化作用疾患、多毛症、クッシング症候群、高アルドステロン症、褐色細胞腫）；下垂体の障害および／または疾患（例えば、下垂体機能亢進症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、下垂体腺腫、汎下垂体機能低下症、先端巨大症、巨人症）；甲状腺の障害および／または疾患（甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、プラマー病、グレーヴズ病（毒性散在甲状腺腫）、毒性小結節甲状腺種、甲状腺炎（橋本甲状腺炎、亜急性肉芽腫性甲状腺炎、およびサイレントリンパ球性甲状腺炎）、ペンドレッド症候群、粘液水腫、クレチン病、甲状腺中毒症、甲状腺ホルモン縮合障害、チミン形成不全症、甲状腺のヒュルトレ細胞腫瘍、甲状腺癌、甲状腺悪性腫瘍、髄様甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されない）；副甲状腺の障害および／または疾患（例えば、上皮小体機能亢進症、上皮小体機能低下症）；視床下部の障害および／または疾患。
【０８８７】
さらに、内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患はまた、癌を含む精巣または卵巣の障害および／または疾患を含み得る。他の精巣または卵巣の障害および／または疾患としては、例えば、卵巣癌、多嚢胞性卵巣症候群、クラインフェルター症候群、バニシング精巣症候群（両側性無精巣）、ライディヒ細胞先天性欠損、潜伏精巣症、ヌーナン症候群、筋緊張性ジストロフィー、精巣の毛細血管種（良性）、精巣の新形成および新精巣がさらに挙げられる。
【０８８８】
さらに、内分泌系および／またはホルモンアンバランス障害および／または疾患はまた、例えば、多内分泌腺機能低下症候群、褐色細胞腫、神経芽細胞腫、多発性内分泌腺腫症、ならびに内分泌組織の障害および／または癌を含み得る。
【０８８９】
別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に相当する治療タンパク質が発現される組織に関連する内分泌疾患および／または障害を診断、予後、予防および／または処置するために使用され得る。
【０８９０】
（生殖器系障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、生殖器系の疾患および／または障害を診断、処置または予防するために使用され得る。本発明の組成物によって処置され得る生殖器系の障害としては、生殖器損傷、感染、腫瘍性障害、先天性欠損、および不妊症を生じる疾患または障害、妊娠、分娩または出産の合併症、および出産後の困難が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９１】
生殖器系障害および／または疾患としては、以下を含む精巣の疾患および／または障害が挙げられる：精巣萎縮症、精巣性女性化症候群、潜在精巣症（片側および両側）、無精巣症、異所性精巣、精巣上体および／または耳下腺性精巣（典型的に、感染（例えば、淋疾、おたふくかぜ、結核、および梅毒）から生じる）、精巣捻転症、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍（例えば、精上皮腫、胎児性細胞癌、奇形癌、絨毛癌、卵黄嚢腫瘍、奇形腫）、支質腫瘍（例えば、ライディヒ細胞腺腫）、水瘤、血種、精索静脈瘤、精液瘤、鼡径ヘルニア、および精液産生の障害（例えば、線毛不動症候群、無精液症、精子無力症、無精子症、精子過少症、奇形精子症）。
【０８９２】
生殖器系障害としてはまた、例えば以下のような前立腺の障害が挙げられ得る：急性非細菌性前立腺炎、慢性非細菌性前立腺炎、急性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎、前立腺膀胱炎、前立腺症、肉芽腫性前立腺炎、マラコプラキア、良性前立腺肥大または肥厚、および前立腺腫瘍性障害（腺癌をふくむ）、移行上皮癌、腺管癌、および扁平上皮癌。
【０８９３】
さらに、本発明の組成物は、以下を含む陰茎または尿道の障害または疾患の診断、処置および／または予防において有用である：炎症性障害（例えば、亀頭包皮炎、閉塞性乾燥性亀頭炎、包茎、嵌頓包茎、梅毒、単純疱疹ウイルス、淋疾、非淋菌性尿道炎、クラミジア、マイコプラスマ、トリコモナス、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、ライター症候群、尖圭コンジローム、扁平コンジローム、および真珠陰茎丘疹）；尿道障害（例えば、尿道下裂、尿道上裂、および包茎）；前悪性病巣（ケーラー紅色肥厚症、ボーエン病、ボーエノイド・バピュローシス、ブシュケ−レーヴェンシュタインの巨大コンジローム、およびいぼ状癌を含む）；陰茎癌（扁平上皮癌、インサイチュにおける癌、いぼ状癌、および播種性陰茎癌を含む）；尿道新形成障害（尿道海綿体癌、球海綿体筋尿道癌、および尿道前立腺部癌を含む）；ならびに勃起障害（例えば、プリアピスム、ペーロニー病、勃起不全、およびインポテンス）。
【０８９４】
さらに、精管の疾患および／または障害としては、脈管炎およびＣＢＡＶＤ（精管の先天性両側性欠損）が挙げられ；さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、精嚢の疾患および／または障害（包虫症、先天性塩化物下痢、および多発性嚢胞腎疾患を含む）を診断、処置および／または予防するために使用され得る。
【０８９５】
他の男性生殖器系の障害および／または疾患としては、例えば、クラインフェルター症候群、ヤング症候群、早漏、真性糖尿病、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群、高熱、多発性硬化症、および女性型乳房が挙げられる。
【０８９６】
さらに、ポリヌクレオチド、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含む膣および外陰の疾患および／または障害の診断、処置および／または予防において使用され得る：細菌性腟炎、カンジダ膣炎、単純疱疹ウイルス、軟性下疳、鼡径部肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、疥癬、ヒト乳頭腫、膣外傷、外陰外傷、腺疾患、クラミジア膣炎、淋疾、腟トリコモナス、尖圭コンジローム、梅毒、伝染性軟属腫、萎縮性腟炎、パジェット病、硬化性萎縮、扁平苔癬、外陰病変、トキシックショック症候群、腟痙、外陰腟炎、外陰腟前庭炎、および新形成障害（例えば、扁平上皮過形成、腎臓明細胞癌、基底細胞癌、黒色腫、バルトリン腺の癌、および外陰上皮新形成）。
【０８９７】
子宮の障害および／または疾患としては、以下が挙げられる：月経困難症、後傾子宮、子宮内膜症、フィブロイド、腺筋症、無排卵性出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、性的早熟、子宮ポリープ、機能不全性不正子宮出血（例えば、迷走ホルモンシグナルに起因する）、および新形成障害（例えば、腺癌、平滑筋肉腫、および肉腫）。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下のような子宮異常のマーカーまたはディテクターとして、ならびに子宮異常の診断、処置および／または予防において有用であり得る：双角子宮、中隔子宮、単角子宮、非空腔性不全角を有する単角子宮、非交通空腔不全角を有する単角子宮、交通空腔角を有する単角子宮、弓状子宮、子宮二空洞およびＴ型子宮。
【０８９８】
卵巣疾患および／または障害としては、以下が挙げられる：無排卵、多嚢胞性卵巣（スタイン−リーヴェンサール症候群）、卵巣嚢胞、卵巣機能不全、ゴナドトロピンに対して非感受性の卵巣、アンドロゲンの卵巣過剰産生、右卵巣静脈症候群、無月経、多毛症、および卵巣癌（一次および二次癌増殖、セルトリ−ライディヒ腫瘍、卵巣の類内膜癌、卵巣乳頭漿液性腺癌、卵巣粘液性腺癌、および卵巣クルーケンベルク腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０８９９】
頸部疾患および／または障害としては、以下が挙げられる：子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、粘液膿性子宮頸管炎、子宮頸部形成異常、頸部ポリープ、ナーボト嚢胞、頸部びらん、頸部機能不全、および頸部新形成（例えば、頸部癌、扁平化生、扁平上皮癌、腺扁平上皮細胞新形成および円柱細胞新形成を含む）。
【０９００】
さらに、生殖器系の疾患および／または障害としては、以下を含む妊娠の障害および／または疾患が挙げられる：流産および死産（例えば、早期流産、晩期流産、自然流産、人工流産、治療的流産、切迫流産、稽留流産、不全流産、完全流産、習慣性流産、稽留流産、および敗血性流産）；異所性妊娠、貧血、Ｒｈ不適合、妊娠中の膣出血、妊娠糖尿病、子宮内発育遅延、羊水過多症、ＨＥＬＬＰ症候群、常位胎盤早期剥離、前置胎盤、悪阻、子かん前症、子かん、妊娠性ヘルペス、および妊娠のじんま疹。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリオペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む妊娠を複雑にし得る疾患を診断、処置および／または予防するために使用され得る：心臓疾患、心不全、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、僧帽弁逸脱症、高血圧、貧血、腎臓疾患、感染症（例えば、風疹、サイトメガロウイルス、トキソプラスマ症、感染性肝炎、クラミジア、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および陰部ヘルペス）、真性糖尿病、グレーヴズ病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症、橋本甲状腺炎、慢性活動性肝炎、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、ぜん息、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、虫垂炎、卵巣嚢胞、胆嚢障害、および腸の閉塞症。
【０９０１】
分娩および出産に関連する合併症としては、膜の早期破裂（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、早産、後期妊娠（ｐｏｓｔ−ｔｅｒｍ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）、過熟妊娠、非常に遅く進行する分娩（ｌａｂｏｒ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ  ｔｏｏ  ｓｌｏｗｌｙ）、胎児仮死（例えば、異常な心拍数（胎児性または母性）、呼吸の問題、および異常な胎児位置）、肩甲難産、臍帯脱出症、羊水塞栓症、および異常な子宮の出血が、挙げられる。
【０９０２】
さらに、分娩期後の疾患および／または障害としては、子宮内膜炎、子宮筋層炎、子宮傍結合組織炎、腹膜炎、骨盤血栓性静脈炎、肺動脈塞栓症、内毒素血症、腎盂腎炎、伏在性血栓性静脈炎、乳腺炎、膀胱炎、分娩後出血、および反転性子宮（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｕｔｅｒｕｓ）が挙げられる。
【０９０３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、処置、および／または予防され得る雌性生殖器系の他の障害ならびに／または疾患としては、例えば、ターナー症候群、偽半陰陽、月経前緊張症候群、骨盤炎症性疾患、骨盤うっ血（ｐｅｌｖｉｃ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）（血管充血（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｇｏｒｇｅｍｅｎｔ））、不感症、無オルガスム症、性交疼痛症、破裂性（ｒｕｐｔｕｒｅｄ）ファローピウス管、および中間痛。
【０９０４】
（感染性疾患）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染因子を処置または検出するするために使用され得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０９０５】
ウイルスは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置または検出され得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎Ｂ型、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され得る。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下の処置に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さらに特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳを処置するために使用される。
【０９０６】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって処置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｓｉｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄｉａ、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｄｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅ���ｍｏｃｏｃｃｕｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＡ群、Ｂ群およびＣ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびＵｒｅａｐｌａｓｍａｓ。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし得る：抗生物質耐性の感染、菌血症、心内膜炎、敗血症、眼感染症（例えば、結膜炎）、ブドウ膜炎、結核、歯肉炎、細菌性の下痢、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、虫歯、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、セプシス、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、レジオネラ症、慢性炎および急性炎、紅斑、酵母感染、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、ブルセラ病、消化性潰瘍、炭疽、自然流産、出生時欠損、肺炎、肺の感染、難聴、失明、傾眠、倦怠、嘔吐、慢性下痢、クローン病、大腸炎、腟の病気、不妊症、骨盤炎症性疾患、カンジタ症、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症、ｎｏｓｃｏｍｉａｌ感染。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し得る。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を処置するために使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄膜炎。
【０９０７】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより処置、予防および／または診断され得る、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、住血吸虫症（Ｓｃｈｉｓｔｉｓｏｍａ）、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置、予防および／または診断し得る。特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、マラリアを処置、予防および／または診断するために使用される。
【０９０８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、患者に有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質を投与するか、または患者から細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として使用されて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０９０９】
（再生）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：５９−８７（１９９７）を参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、または保護し得る。
【０９１０】
本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０９１１】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
【０９１２】
同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的および外傷性の障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて処置、予防および／または診断され得る。
【０９１３】
（胃腸障害）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、炎症性疾患および／または状態、感染、癌（例えば、腸の新生物（小腸のカルチノイド類癌腫、小腸の非ホジキンリンパ腫、小腸のリンパ腫））、および潰瘍（例えば、消化性潰瘍）を含む胃腸傷害を処置、予防、診断、および／または予後を判定し得る。
【０９１４】
胃腸障害として、えん下困難、えん下痛、食道の炎症、消化性食道炎、胃逆流（ｇａｓｔｒｉｃ  ｒｅｆｌｕｘ）、粘膜下線維症および狭窄、マロリー−ヴァイス病変、平滑筋腫、脂肪腫、表皮癌、腺癌、胃の遺残障害、胃腸炎、胃の萎縮症、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）／胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、胃のポリープ、悪性貧血のような自己免疫疾患、幽門狭窄症、胃炎（細菌性、ウイルス性、好酸性、ストレス誘導性、慢性びらん性、萎縮性、プラスマ細胞、およびメネトリエ病）、および腹膜疾患（例えば、、乳び腹水、腹腔内出血、腸管膜嚢、腸間膜リンパ節炎、腸管膜血管閉塞、皮下脂肪組織炎、新生物、腹膜炎、気腹、乳児横隔膜膿瘍（ｂｕｂｐｈｒｅｎｉｃ  ａｂｓｃｅｓｓ））が挙げられる。
【０９１５】
胃腸障害としてはまた、小腸に関連する障害（例えば、吸収不良症候群、膨満、過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糖不耐性、腹腔疾患、十二指腸潰瘍、十二指腸炎、熱帯性スプルー、ホウィップル病、腸リンパ管拡張症、クローン病、虫垂炎、回腸の便秘、メッケル憩室、複数の憩室（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌａ）、小腸および大腸の完全な回旋不全、リンパ腫）、ならびに細菌性および寄生虫性疾患（例えば、旅行者下痢、チフスおよびパラチフス、コレラ、回虫（Ａｓｃａｒｉａｓｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｉｄｅｓ）、鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、線虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、条虫類（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、およびＴ．ｓｏｌｉｕｍによる感染）が挙げられる。
【０９１６】
肝臓疾患および／または障害として、肝臓内胆汁うっ滞（アラギール（ａｌａｇｉｌｌｅ）症候群、胆汁性肝硬変）、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、ライ症候群）、肝静脈血栓症、ヘパトレントリキュラー（ｈｅｐａｔｏｌｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）変性、肝腫、肝肺症候群、肝腎症候群、門脈圧亢進症（食道静脈瘤および胃静脈瘤）、肝膿瘍（アメーバ性肝膿瘍）、肝硬変（アルコール性、胆汁および実験的）、アルコール性肝疾患（脂肪肝、肝炎、肝硬変）、寄生虫性（肝性エキノコックス症、肝蛭症、アメーバ性肝膿瘍）、黄疸（溶血性、肝細胞性、および胆汁うっ滞性）、胆汁うっ滞、門脈圧亢進症、肝肥大、腹水、肝炎（アルコール性肝炎、動物性肝炎、慢性肝炎（自己免疫性、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、薬物誘導性）、毒性肝炎、ウイルス性ヒト肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、ウィルソン病、肉芽腫性肝炎、二次性胆汁性肝硬変（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝性脳障害、門脈圧亢進症、静脈瘤、肝性脳障害、一次性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、原発性硬化性胆管炎、肝細胞腺腫、血管腫、胆汁石、肝不全（肝性脳障害、急性肝不全）、および肝性新生物（ｌｉｖｅｒ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）（血管筋脂肪腫、石灰化肝転移（ｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）、嚢胞性肝転移、上皮腫瘍、線維層板肝細胞癌（ｆｉｂｒｏｌａｍｅｌｌａｒ  ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、病巣結節過形成（ｆｏｃａｌ  ｎｏｄｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、肝細胞腺腫、血性胆汁嚢胞腺腫（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｃｙｓｔａｄｅｎｏｍａ）、胚芽腫、肝細胞癌、肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓血管内皮腫、間葉過誤腫（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｈａｍａｒｔｏｍａ）、肝臓の間葉腫瘍、結節再生過形成（ｎｏｄｕｌａｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、良性肝癌（肝嚢胞（単純嚢胞（Ｓｉｍｐｌｅ  ｃｙｓｔ）、多嚢胞性肝疾患、血性胆汁嚢胞腺腫（Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  ｃｙｓｔａｄｅｎｏｍａ）、総胆管嚢胞）、間葉腫瘍（間葉過誤腫、乳児先天性血管内皮腫、血管腫、肝臓紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍、ミスセラネウス（Ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ））、上皮腫瘍（胆管上皮（胆管過誤腫、胆管腺腫）、肝細胞（腺腫、病巣結節過形成、結節再生過形成））、転移性肝臓腫瘍（肝細胞、胚芽腫、肝細胞癌、胆管細胞（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃｅｌｌｕｌａｒ）、胆管癌、嚢胞腺癌、血管の癌、血管肉腫、カポージ肉腫、血管内皮腫、他の腫瘍、胎生期肉腫（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、奇形腫、カルチノイド、扁平上皮癌、原発性リンパ腫））、肝臓紫斑病、赤芽肝性ポルフィリン症（ｅｒｙｔｈｒｏｈｅｐａｔｉｃ  ｐｏｒｐｈｙｒｉａ）、肝性ポルフィリン症（急性間欠性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症）、ツェルヴェーガー症候群）が挙げられる。
【０９１７】
膵臓疾患および／または障害として、急性膵炎、慢性膵炎（急性壊死膵炎（ａｃｕｔｅ  ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、アルコール性膵炎）、新生物（膵臓の腺癌、嚢胞腺癌、インスリノーマ、ガストリノーマ、およびグルカゴノーマ、嚢胞性新生物、島細胞腫瘍、膵臓芽腫（ｐａｎｃｒｅｏｂｌａｓｔｏｍａ）、および他の膵臓疾患（例えば、嚢胞性線維症、嚢胞（膵臓偽嚢胞、膵臓フィステル、不全））が挙げられる。
【０９１８】
胆嚢疾患として、胆石（胆石症および総胆管結石症）、胆嚢摘出後症候群、胆嚢の憩室症、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、胆管腫瘍および涙嚢腫が挙げられる。
【０９１９】
大腸の疾患および／または障害として、抗生物質関連大腸炎、憩室炎、潰瘍性大腸炎、後天性巨大結腸、膿瘍、真菌性感染および細菌性感染、肛門直腸疾患（例えば、裂溝、痔）、結腸疾患（大腸炎、結腸新生物（結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、腺腫様結腸ポリープ（例えば、絨毛腺腫）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸直腸癌）、結腸憩室炎、大腸憩室、巨大結腸（ヒルシュスプルング病、有害な巨大結腸）；Ｓ状疾患（ｓｉｇｍｏｉｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）（直腸結腸炎、シグモイン（ｓｉｇｍｏｉｎ）新生物））、便秘症、クローン病、下痢（乳児期下痢、赤痢）、十二指腸疾患（十二指腸新生物、十二指腸閉塞症、十二指腸潰瘍、十二指腸炎）、腸炎（ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）（腸炎（ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｓ））、ＨＩＶ腸症、回腸疾患（回腸新生物、回腸炎）、免疫増殖性小腸疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、腸閉鎖、寄生虫病（アニサキス症、バランチジウム症、ブラストシスティス属感染症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、アメーバ赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、腸フィステル（直腸フィステル）、腸新生物（盲端新生物、結腸新生物、十二指腸新生物、回腸新生物、腸ポリープ、空腸新生物、直腸新生物）、腸閉塞（輸入脚症候群、十二指腸閉塞、楔合便（ｉｍｐａｃｔｅｄ  ｆｅｃｅｓ）、腸偽閉塞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｓｅｕｄｏ−ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（盲腸捻転）、重積症）、腸閉鎖（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｒｆｏｒａｔｉｏｎ）、腸ポリープ（結腸ポリープ、ガードナー症候群、ポイツ−ジェガーズ症候群）、空腸疾患（空腸新生物）、吸収不良症候群（盲係蹄症候群、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、乳糖不耐症、短腸症候群、熱帯性スプルー、ホウィップル病）、腸間膜血管閉塞（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、腸壁嚢胞状気腫、蛋白喪失性腸症（腸リンパギエクタシス（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｌｙｍｐｈａｇｉｅｃｔａｓｉｓ））、腸疾患（肛門疾患、便失禁、痔、直腸炎、腸フィステル、脱腸、直腸瘤）、消化性潰瘍（十二指腸潰瘍、消化性食道炎、出血、穿孔、胃潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群）、胃切除後症候群（ダンピング症候群）、胃障害（例えば、塩酸欠乏症、胃十二指腸の逆流（胆汁逆流）、胃洞血管膨張（ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｔｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｃｔａｓｉａ）、胃フィステル、胃排出口閉塞（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｕｔｌｅｔ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、胃炎（萎縮性または肥大性）、胃不全麻痺、胃拡張、胃憩室、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、増殖性胃ポリープ）、胃破裂、胃潰瘍、胃閉塞）、結核、内臓下垂症、嘔吐（例えば、吐血、妊娠悪阻、手術後悪心（ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｎａｕｓｅａ）および手術後嘔吐）および出血性大腸炎が挙げられる。
【０９２０】
さらに胃腸系の疾患および／または障害として、胆汁管障害（例えば、胃壁破裂症）、フィステル（例えば、胆道フィステル、食道フィステル、胃フィステル、腸フィステル、膵臓フィステル）、新生物（例えば、胆汁管新生物、食道新生物（例えば、食道の腺癌）、食道扁平上皮癌、胃腸新生物、膵臓新生物（例えば、膵臓の腺癌）、膵臓のムチン嚢胞性新生物、膵臓嚢胞性新生物、膵臓芽腫および腹膜新生物）、食道疾患（例えば、水疱性疾患、カンジダ症、グリコゲンアカントシス、潰瘍形成、バレット食道静脈瘤、閉鎖症、嚢胞、憩室（例えば、ツェンカー憩室）、フィステル（例えば、気管食道フィステル）、運動性疾患（例えば、ＣＲＥＳＴ症候群、嚥下疾患、アカラシア、痙縮、食道逆流）、新生物、穿孔（例えば、ブールハーフェ症候群、マロリー−ヴァイス症候群）、狭窄症、食道炎、横隔膜ヘルニア（例えば、裂孔ヘルニア）；胃腸疾患（例えば、胃腸炎  （例えば、コレラ病、ノーウォークウイルス感染））、出血（例えば、吐血、メレナ、消化性潰瘍出血）、胃新生物（胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、胃癌））、ヘルニア（例えば、先天性横隔膜ヘルニア、大腿ヘルニア、鼡径ヘルニア、閉鎖孔ヘルニア、臍ヘルニア、腹壁ヘルニア）、および腸疾患（例えば、盲端疾患（虫垂炎、盲端新生物））が挙げられる。
【０９２１】
（走化性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常性を撃退および／または治癒し得る。
【０９２２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させることによって、炎症、感染、過剰増殖性の疾患、障害および／もしくは状態、または任意の免疫系障害を処置し得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る。
【０９２３】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分子はまた障害を処置するために使用され得る。従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性のインヒビターとして使用され得る。
【０９２４】
（結合活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質は、この融合タンパク質の治療タンパク質部分に結合する分子、またはこの融合タンパク質の治療タンパク質部分が結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。この融合タンパク質とこの分子との結合は、結合した融合タンパク質または分子の活性を活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または低分子が挙げられる。
【０９２５】
好ましくは、この分子は、本発明の融合タンパク質の治療タンパク質部分の天然のリガンド（例えば、リガンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：第５章（１９９１）を参照のこと）。同様に、この分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質が結合する天然のレセプター、または少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分によって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【０９２６】
好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。
【０９２７】
アッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質への候補化合物の結合を単純に試験し得、ここで結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこの融合タンパク質への結合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０９２８】
あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着された融合タンパク質／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。アッセイはまた、候補化合物を、アルブミン融合タンパク質を含む溶液と混合する工程、融合タンパク質／分子の活性または結合を測定する工程、および融合タンパク質／分子の活性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０９２９】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用して、サンプル（例えば、生物学的サンプル）における融合タンパク質のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、アルブミン融合タンパク質への直接的もしくは間接的のいずれかの結合、または基質についてのアルブミン融合タンパク質との競合によって、融合タンパク質のレベルまたは活性を測定し得る。
【０９３０】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分が結合するレセプターは、当業者に公知の多くの方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポリアデニル化ＲＮＡがこのアルブミン融合タンパク質に応答する細胞から調製される場合に用いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、およびこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そしてこのアルブミン融合タンパク質に応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされた細胞は、それらを標識化した後に、本発明のアルブミン融合タンパク質に曝露される。このアルブミン融合タンパク質は、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０９３１】
固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクトして、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０９３２】
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識アルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質成分についてレセプター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分解され、そしてＸ線フィルムに曝露される。融合タンパク質のレセプターを含む標識複合体が切り出され得、ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微量配列決定に供され得る。微量配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０９３３】
さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」という）を利用して、融合タンパク質、および／または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分もしくはアルブミン成分の活性を調節し得、それによって本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡセグメントの、所望の分子への構築を含む。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびコードされたアルブミン融合タンパク質は、組換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施形態において、この異種分子は、ファミリーのメンバーである。さらに好ましい実施形態において、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０９３４】
他の好ましいフラグメントは、治療タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、治療タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の活性に類似の活性を示すが、必ずしも治療タンパク質部分および／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン成分の活性に同一ではないフラグメントである。このフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されない活性を含み得る。
【０９３５】
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の作用を調節する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は、哺乳動物線維芽細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質、スクリーニングされるべき化合物および３［Ｈ］チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせる工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量と比較して、各々の場合における３［Ｈ］チミジンの取り込みの決定によって、この化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この手順により同定され得る。
【０９３６】
別の方法において、本発明の融合タンパク質の治療タンパク質成分に対するレセプターを発現する哺乳動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明の融合タンパク質とともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングされるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答およびレセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセカンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９３７】
これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、融合タンパク質／分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、あるいは患者に特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のアルブミン融合タンパク質の産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。
【０９３８】
従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する化合物を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）融合タンパク質の生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
【０９３９】
（標的化された送達）
別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質の成分についてのレセプターを発現する標的化細胞に送達する方法を提供する。
【０９４０】
本明細書中で議論される場合、本発明の融合タンパク質は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明の融合タンパク質（抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０９４１】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合した本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０９４２】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９４３】
（薬物スクリーニング）
本発明のアルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に相当するタンパク質の活性を改変する分子についてスクリーニングするための、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはこれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、融合タンパク質を、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された化合物と接触させる工程、および結合に続いてこの融合タンパク質の活性をアッセイする工程を包含する。
【０９４４】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるアルブミン融合タンパク質は、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリーニングの１つの方法は、アルブミン融合タンパク質を発現する組換え核酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のアルブミン融合タンパク質との間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
【０９４５】
従って、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質によって媒介される活性に影響を及ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のアルブミン融合タンパク質もしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのアルブミン融合タンパク質もしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない標識の量は、特定の薬剤が本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する能力の尺度である。
【０９４６】
薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のアルブミン融合タンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物に対するハイスループットスクリーニングを提供し、そして欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、本発明のアルブミン融合タンパク質と反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したペプチドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたアルブミン融合タンパク質は、前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディングされる。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持体上にそれを固定し得る。
【０９４７】
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質を結合し得る中和抗体は、アルブミン融合タンパク質またはそのフラグメントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、抗体を使用して、本発明のアルブミン融合タンパク質と１つ以上の抗原性エピトープを共有する任意のペプチドの存在を検出する。
【０９４８】
（結合ペプチドおよび他の分子）
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定された結合分子を含む。これらの結合分子は、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明に従って、以下に詳細に記載される治療実施形態において使用され得る。
【０９４９】
この方法は、以下の工程を包含する：
ａ．本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させる工程；および
ｂ．アルブミン融合タンパク質に結合する分子を同定する工程。
【０９５０】
本発明のアルブミン融合タンパク質を多数の分子と接触させる工程は、多数の方法によってもたらされ得る。例えば、アルブミン融合タンパク質を固体支持体上に固定化させ、そして多数の分子の溶液を固定したポリペプチドと接触させることを意図し得る。このような手順は、固定した本発明のアルブミン融合タンパク質から構成される親和性マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィープロセスに類似している。次いで、アルブミン融合タンパク質に対して選択的な親和性を有する分子が、親和性選択によって精製され得る。固体支持体の性質、アルブミン融合タンパク質のこの固体支持体への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離または親和性選択の条件は、大部分が慣用的であり、そして当業者に周知である。
【０９５１】
あるいは、多数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々のポリペプチドを含む実質的に別々の画分へ分離され得る。例えば、多数のポリペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどポリペプチドの分離に関して当業者に公知の方法によって、分離され得る。個々のポリペプチドはまた、宿主細胞の外部表面上またはほぼ外部表面に発現されるような様式で、形質転換された宿主細胞（例えば、組換えファージ）によって産生され得る。次いで、個々の単離物は、アルブミン融合タンパク質によって「プローブ化」され得、必要に応じて発現に必要とされるであろうインデューサーの存在下で、アルブミン融合タンパク質と個々のクローンとの間で任意の選択的親和性相互作用が起こったか否かが決定される。アルブミン融合タンパク質を個々のポリペプチドを含む各画分と接触させる前に、これらのポリペプチドはまず、さらなる簡便性のために固体支持体に移され得る。そのような固体支持体は、単に、例えばニトロセルロースまたはナイロンでできたフィルター膜の断片であり得る。この様式において、陽性クローンは、形質転換宿主細胞の発現ライブラリーの集団（これらは、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を持つ）から同定され得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段によって直接決定され得るか、またはこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列が、頻繁により簡便に決定され得る。次いで、一次配列が、対応するＤＮＡ配列から推定され得る。アミノ酸配列がポリペプチド自身から決定されるものである場合、微小配列決定技術を使用し得る。この配列決定技術は、質量分析法を含み得る。
【０９５２】
特定の状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと試みる前に、未結合のポリペプチドを、本発明のアルブミン融合タンパク質および多数のポリペプチドの混合物から洗浄除去することが望ましくあり得る。このような洗浄工程は、本発明のアルブミン融合タンパク質または多数のポリペプチドが固体支持体に結合している場合に、特に望ましくあり得る。
【０９５３】
本方法に従って提供される多数の分子は、多様性ライブラリー（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質へ特異的に結合する分子をスクリーニングし得るランダムまたはコンビナトリアルの、ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリー）として提供され得る。使用され得る多くのライブラリー（例えば、化学合成ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）が、当該分野で公知である。化学合成ライブラリーの例は、以下に記載される：Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２；ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３。
【０９５４】
ファージディスプレイライブラリーの例は、以下に記載される：ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８）；Ｌｅｎｓｔｒａ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７；Ｋａｙら、１９９３、Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日）。
【０９５５】
インビトロ翻訳ベースのライブラリーとしては、以下：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０５０５８（１９９１年４月１８日）；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０９５６】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１）がまた使用され得る。使用され得るライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２）によって記載され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、過剰にメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅ）されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリーを生成する。
【０９５７】
本発明において有用である種々の非ペプチドライブラリーは、大きい。例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３５１−３６０）は、種々のライブラリーの基礎を形成する化学種の間として、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖アナログ、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペラジン、ベンゾピラン、キューバン（ｃｕｂａｎｅ）、キサンチン、アミンイミドおよびオキサゾロンを列挙している。
【０９５８】
非ペプチドライブラリーは、２つの型に大きく分類され得る：修飾されたモノマーおよびオリゴマー。修飾モノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造を使用し、この上に種々の官能基が付加される。しばしば、骨格は、既知の有用な薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であり得る。
【０９５９】
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの順序に依存して新規な形状を作製する様式で共にアセンブルされる、多数のモノマーを使用する。使用されるモノマー単位の間には、カルバメート、ピロリノン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｎｅ）およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がα炭素よりもαアミノ基に結合するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別のバージョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単一型のモノマーを使用し、従って、反復骨格を含む。近年のライブラリーは、１つより多くのモノマーを使用し、自由度が添加されたライブラリーを与える。
【０９６０】
ライブラリーをスクリーニングすることは、多様な一般的に公知の方法のいずれかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照のこと：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８９、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら、１９９４、Ｃｅｌｌ  ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−８５２；米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、および米国特許第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒらに対して）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３；ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８。
【０９６１】
特定の実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質を結合する分子を同定するためのスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固相に固定化された本発明のアルブミン融合タンパク質と接触させ、そしてアルブミン融合タンパク質に結合するこれらのライブラリーメンバーを収集することによって実行され得る。そのようなスクリーニング方法の例の、「パニング」と呼ばれる技術は、例として、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８；ならびにその中に引用される参考文献に記載される。
【０９６２】
別の実施形態において、酵母中の相互作用タンパク質を選択するためのツーハイブリッドシステム（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２）が、本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子を同定するために使用され得る。
【０９６３】
結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、任意のペプチドライブラリー（ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチドライブラリーを含む）から簡便に選択され得る。用語「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」は、この場合のペプチドにおいて、ライブラリーを作製する方法が、生じる分子収集の多様性を支配する１つ以上のパラメーターを制限するように操作されることを意味するために本明細書中に使用される。
【０９６４】
従って、本当にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸を見出す可能性が全て２０のアミノ酸に関して同じである、ペプチドの収集物を作製する。しかし、例えば、リジンがアミノ酸５つ毎に生じることを特定するかまたはデカペプチドライブラリーの４位、８位および９位がアルギニンのみを含むように固定して特定することによって、バイアスがライブラリーに導入され得る。明らかに、バイアスの多くの型は、意図され得、そして本発明は、任意の特定のバイアスに制限されない。さらに、本発明は、特定の型のペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリーおよびＤＮＡ挿入物と共にλファージベクターを含むＤＮＡ構築物を使用するライブラリー）を意図する。
【０９６５】
上記のように、結合分子（ポリペプチドである）の場合、このポリペプチドは、約６から約６０未満のアミノ酸残基を有し、好ましくは約６〜約１０アミノ酸残基、そしてより好ましくは約６〜約２２アミノ酸であり得る。別の実施形態において、結合ポリペプチドは、１５〜１００の範囲のアミノ酸、または２０〜５０の範囲のアミノ酸を有する。
【０９６６】
選択された結合ポリペプチドは、化学合成または組換え発現によって得られ得る。
【０９６７】
（他の活性）
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生を刺激するための処置において利用され得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
【０９６８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、傷害、熱傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創傷の処置にもまた利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ損傷した組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０９６９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複合体）において生じるニューロンの損傷を処置および予防するために利用し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、これらは、骨および歯周の再形成を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され得る。
【０９７０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。
【０９７１】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０９７２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または一次組織の細胞培養を支持するために使用し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織を誘導するために利用され得る。
【０９７３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増殖を増加または減少し得る。
【０９７４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するために使用され得る。同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０９７５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性の障害を含む）、暴力の傾向、痛に対する耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
【０９７６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。
【０９７７】
上記で引用される適用は、広範な種々の宿主における用途を有する。そのような宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまたはネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ましい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０９７８】
本発明を一般的に記載したように、同様のことは、以下の実施例に参考として容易に理解され、そして指示されるように提供され、そして制限することを意図されない。
【０９７９】
さらなる説明を有することなく、当業者は、前記説明および以下の指示例を使用して、本発明において見出される変化を作製し、そして利用し得、そして請求の範囲に記載される方法を実施し得る。従って、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を特異的に指示し、そして任意の方法において開示の残部を制限するように構築されない。
【実施例】
【０９８０】
（実施例１：ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡの生成
ベクターｐＳｃＮＨＳＡ  （ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７９）およびｐＳｃＣＨＳＡ  （ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７６）ｐＰＰＣ０００５  （ＡＴＣＣ信託番号ＰＴＡ−３２７８）の誘導体であり、そして治療用タンパク質またはフラグメントまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが、ヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドを有する翻訳フレームに隣接してまたは翻訳フレーム中に挿入されるクローニングベクターとして使用される。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質ＨＳＡ融合を生じるために使用され得、一方ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生じるために使用され得る。
【０９８１】
（ｐＳｃＣＨＳＡの生成：治療的部分に対するアルブミン部分Ｃ末端とのアルブミン融合）
成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡに対する治療的タンパク質Ｎ末端をコードするＤＮＡのクローニングを促進させるためのベクターを、ｐＰＰＣ０００５におけるキメラＨＳＡシグナルペプチドをコードする核酸配列がＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位を含むように変更することによって作製した。
【０９８２】
まず、ｐＰＰＣ０００５に固有のＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位（ＡＤＨ１終結配列の３’に位置する）を、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩでｐＰＰＣ０００５を消化することによって排除し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで突出末端を削り、平滑末端を再ライゲーションしてｐＰＰＣ０００６を作製した。
【０９８３】
次に、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位およびＣｌａＩ制限酵素認識部位を、２ラウンドＰＣＲを用いて、ｐＰＰＣ０００６中のＨＳＡ（ＨＳＡリーダーのキメラおよび接合因子α「ＭＡＦ」由来のｋｅｘ２部位）のシグナルペプチドをコードする核酸配列中に操作した。
ＰＣＲの第一ラウンドにおいて、配列番号１０３９および配列番号１０４０として示したプライマーを用いた増幅を行った。配列番号１０３９として示したプライマーは、ＨＳＡのシグナルペプチド配列の部分、接合因子αリーダー配列由来のｋｅｘ２部位、およびＨＳＡの成熟形態のアミノ末端の部分をコードする核酸配列を含む。この配列に４つの点変異を導入し、キメラシグナルペプチドおよびＨＳＡの成熟形態の接合部に見出されるＸｈｏＩ部位およびＣｌａＩ部位を作製した。これらの４つの点変異は、以下に示した配列中に下線を引いて示す。ｐＰＰＣ０００５において、５’から３’までのこれらの４つの位置のヌクレオチドは、Ｔ、Ｇ、ＴおよびＧである。
【０９８４】
５’−ＧＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ−３’    （配列番号１０３９）および５’−ＡＡＴＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴ
ＣＴＣＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＡＧＣ−３’  （配列番号１０４０）。次いで、ＰＣＲの第二円形は、上流隣接プライマー５’−ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＴＡＧＣ−３’  （配列番号１０４１）および下流隣接プライマー５’−ＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴ−３’  （配列番号１０４２）を用
いて実施された。  次いで、得られたＰＣＲ産物を精製し、そしてＡｆｌ  ＩＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、そしてｐＰＰＣ０００６中の同じ部位に連結して、ｐＳｃＣＨＳＡを作製した。得られたプラスミドは、シグナル配列へと操作された、Ｘｈｏ  Ｉ部位およびＣｌａ  Ｉ部位を有する。Ｘｈｏ  Ｉ部位の存在は、ＬＤＫＲからＬＥＫＲへの、シグナル配列の末端に１アミノ酸変化を生じる。このＤからＥへの変化は、５’  Ｓａｌ  Ｉ部位（これは、Ｘｈｏ  Ｉ部位と適合性である）および３’  Ｃｌａ  Ｉ部位を有する、アルブミン融合タンパク質の治療剤部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸配列が、ｐＳｃＣＨＳＡのＸｈｏ  Ｉ部位およびＣｌａ  Ｉ部位に連結される場合、最終的なアルブミン融合タンパク質発現プラスミド中に存在しない。Ｓａｌ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉの連結は、シグナルペプチド配列の元のアミノ酸配列を回復させる。アルブミン融合タンパク質の治療剤部分をコードするＤＮＡは、Ｋｅｘ２部位（Ｋｅｘ２は、シグナルペプチドの最後の二塩基性アミノ酸配列ＫＲの後ろで切断する）の後ろでかつＣｌａ  Ｉ部位の前に挿入され得る。
【０９８５】
（ｐＳｃＮＨＳＡの作製：治療剤部分に対するアルブミン部分Ｎ末端のアルブミン融合体）
成熟アルブミンタンパク質をコードするＤＮＡのＣ末端へと、治療剤タンパク質部分をコードするＤＮＡをクローニングするのを容易にするベクターを、３つの８塩基対制限部位をｐＳｃＣＨＳＡに付加することにより作製した。Ａｓｃ  Ｉ制限部位、Ｆｓｅ  Ｉ制限部位、およびＰｍｅ  Ｉ制限部位を、成熟ＨＳＡタンパク質をコードする核酸配列の末端にて、Ｂｓｕ３６  Ｉ部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位との間に添加した。これを、下線を付したＡｓｃ  Ｉ制限部位、Ｆｓｅ  Ｉ制限部位、およびＰｍｅ  Ｉ制限部位を含む２つの相補的合成プライマー（配列番号１０４３および配列番号１０４４）の使用により達成した。
【０９８６】
５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴ−３’  （配列番号１０４３）および
５−ＡＧＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴ−３’  （配列番号１０４４）．これらのプライマーを、Ｂｓｕ３６  Ｉ  およびＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いてアニールし、そして消化し、そしてｐＳｃＮＨＳＡを作製するｐＳｃＣＨＳＡにおける同様の部位に結合した。
【０９８７】
（実施例２：酵母形質転換のための一般的な構築物生成）
ベクターｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＳｃＣＨＳＡは、治療用タンパク質またはフラグメントまたはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドが、成熟したヒト血清アルブミン「ＨＳＡ」をコードするポリヌクレオチドに隣接して挿入されるクローニングベクターとして使用され得る。ｐＳｃＣＨＳＡは、治療用融合ＨＳＡ融合を生じるために使用されるが、ｐＳｃＮＨＳＡは、ＨＳＡ治療用タンパク質融合を生じるために使用され得る。
【０９８８】
（ＨＳＡ−治療タンパク質融合産物を含むアルブミン融合構築物の産生）
治療タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号Ｘで示される、または当該分野で公知の配列）は、融合構築物の産生を容易にするプライマー（例えば、制限部位を加えることにより、継ぎ目のない融合をコードすることにより、リンカー配列をコードすることにより、など）を用いてＰＣＲ増幅され得る。例えば、当業者は、治療タンパク質をコードする（かつＢｓｕ３６Ｉ部位を含む）ＤＮＡの５’末端上にＨＳＡの成熟形態の最後の４つのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える５’プライマー；そして停止コドンおよび配列をコードする治療タンパク質の３’末端上の適切なクローニング部位を加える３’プライマーを設計し得る。例えば、治療タンパク質をコードするのに用いられる順方向プライマーは、配列
【０９８９】
【化８】
2013172734.tif 000129
（配列番号１０４５）を有し得、ここで下線が引かれた配列は、Ｂｓｕ３６Ｉ部位であり、大文字のヌクレオチドは、成熟ＨＳＡタンパク質の最後の４つのアミノ酸（ＡＬＧＬ）をコードし、そして（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するのに用いられる逆方向プライマーは、配列
【０９９０】
【化９−１】
2013172734.tif 000130
（配列番号１０４６）を有し得、ここでイタリック体で書かれた配列は、Ｐｍｅ  Ｉ部位であり、二重に下線が引かれた配列は、Ｆｓｅ  Ｉ部位であり、単一の下線が引かれた配列は、Ａｓｃ  Ｉ部位であり、囲まれたヌクレオチドは、２つの直列の停止コドンの逆方向の相補鎖であり、（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最後の１５のヌクレオチドの相補鎖と同一である。一旦ＰＣＲ産物が増幅されると、この産物はＢｓｕ３６Ｉおよび（Ａｓｃ  Ｉ、Ｆｓｅ  Ｉ、またはＰｍｅ  Ｉ）の１つで切られ、ｐＳｃＮＨＳＡに連結される。
【０９９１】
ＨＳＡキメラリーダー配列中のＸｈｏ  Ｉ部位の存在は、キメラシグナル配列（すなわち、ＬＤＫＲ（配列番号２１３９）からＬＥＫＲ（配列番号２１４０）へのＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナル配列）の末端における単一のアミノ酸変化を作り出す。
【０９９２】
（遺伝子−ＨＳＡ融合産物を含むアルブミン融合構築物の産生）
上記の方法と同様に、治療タンパク質をコードするＤＮＡは、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る：Ｓａｌ  Ｉ部位を含み、治療タンパク質をコードするＤＮＡの５’末端上のＨＳＡリーダー配列、ＤＫＲの最後の３つのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを加える５’プライマー；および治療タンパク質をコードするＤＮＡの３’末端上にＣｌａ  Ｉ部位を含む成熟ＨＳＡの最初のいくつかのアミノ酸をコードするポリヌクレ
オチドを加える３’プライマー。例えば、治療タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するのに用いられる順方向プライマーは、配列
【０９９３】
【化９−２】
2013172734.tif 000131
（配列番号１０４７）を含み得、ここで下線を引いた配列は、Ｓａｌ  Ｉ部位であり、大文字のヌクレオチドは、ＨＳＡリーダー配列の最後の３つのアミノ酸（ＤＫＲ）をコードし、そして（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最初の１５のヌクレオチドと同一である。同様に、治療タンパク質をコードするＤＮＡを逆方向プライマーは、配列  
【０９９４】
【化９−３】
2013172734.tif 000132
（配列番号１０４８）であり、ここでイタリック体の配列は、Ｃｌａ  Ｉ部位であり、下線が引かれたヌクレオチドは、ＨＳＡ
【０９９５】
【化９−４】
2013172734.tif 000133
の成熟形態の最初の９アミノ酸をコードするＤＮＡの逆方向相補鎖であり、そして（Ｎ）１５は、目的の治療タンパク質をコードする最後の１５ヌクレオチドの逆方向の相補鎖である。一旦ＰＣＲ産物が増幅されると、この産物は、Ｓａｌ  ＩおよびＣｌａで切られ、Ｘｈｏ  ＩおよびＣｌａ  Ｉで消化されたｐＳｃＣＨＳＡに連結される。異なるシグナル配列またはリーダー配列が、所望され得、例えば、転化酵素「ＩＮＶ」（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ００７２４）、交配因子α「ＭＡＦ」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＡ１８４０５）、ＭＰＩＦ（遺伝子配列ＡＡＦ８２９３６）、フィブリン  Ｂ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ２３１４２）、クラステリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ１０９０９）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託Ｐ２２６９２）、およびＨＳＡリーダー配列の順列は、当該分野で公知の標準的な方法によって適切なベクターにサブクローニングされ得る。
【０９９６】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現に適合性のアルブミン融合構築物の産生）
次いで、ｐＳｃＮＨＳＡまたはｐＳｃＣＨＳＡから作製されるＮ末端またはＣ末端アルブミン融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡを含むＮｏｔ  Ｉフラグメントが、ＬＥＵ２選択マーカーを有するｐＳＡＣ３５のＮｏｔ  Ｉ部位にクローニングされ得る。
次いで、生じるベクターは、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの発現システムの形質転換に用いられる。
【０９９７】
（実施例３：酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける一般的発現）
酢酸リチウム形質転換、エレクトロポレーション、または当該分野で公知の、およびもしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ．１９８９．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版”１−３巻、およびＡｕｓｕｂｅｌら、２０００．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１−４巻に記載されるような他の方法により、酵母発現に適合性の発現ベクターが、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に形質転換され得る。この発現ベクターは、形質転換により、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＤＸＹ１、Ｄ８８、またはＢＸＰ１０に導入される。個々の形質転換体が、例えば、１０ｍＬ  ＹＥＰＤ（１％  ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ｗ／ｖ、ペプトン、２％ｗ／ｖ、デキストロース）中３０℃で３日間の間、増殖し得、そして細胞は、６０時間の増殖の後、固定相に集められ得る。上清は、１０分間３０００ｇで細胞を除去することで集められ得る。
【０９９８】
ｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２そして図３を参照のこと）は、ＬＥＵ選択マーカーに加えて、完全酵母２μｍプラスミドを含み、複製機能、ＰＲＢ１プロモーター、およびＡＤＨ１終止シグナルを提供する。
【０９９９】
（実施例４：酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるアルブミン融合から発現されるアルブミン融合タンパク質の一般的精製）
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質またはその部分の成熟形態（例えば、表１に列挙される治療タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療タンパク質の成熟形態）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは異種シグナル配列（例えば、特定の治療タンパク質の非天然シグナル配列）（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリン  Ｂ、クラステリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。表２に列挙されるシグナル配列ならびに／または上の明細書中の「融合タンパク質の発現」および／もしくは「アルブミン融合タンパク質の組み換えおよび合成的産生のさらなる方法」節において列挙されるシグナル配列として、特に好ましい。好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１０００】
上記のような酵母中で発現されるアルブミン融合タンパク質は、以下のようなＤｙａｘペプチド親和カラム上の小規模で精製され得る。アルブミン融合タンパク質を発現する酵母からの上清は、３ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．２、２０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に対してダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）し、体積を減少し、色素を除去する。次いで、この溶液を０．２２μｍデバイスを通して濾過する。この濾液を、Ｄｙａｘペプチド親和カラム上に装填する。このカラムを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．２緩衝液で溶出する。タンパク質を含むピークフラクションを、５倍に濃縮した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で集め、分析する。
【１００１】
大規模な精製のために、以下の方法を利用し得る。２Ｌを超える上製を、ダイアフィルターし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．０の５００ｍＬに濃縮する。濃縮されたタンパク質溶液を、予め平衡化した５０ｍＬ  ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム上に装填し、このカラムを洗浄し、そしてタンパク質を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０における０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌからのＮａＣｌの直線的勾配で溶出する。タンパク質を含むこれらのフラクションをプールし、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）を有するｐＨ６．８に調節する。最終濃度０．９Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４が、タンパク質溶液に加えられ、そして全ての溶液を、予め平衡化した５０ｍＬ  Ｂｕｔｙｌ６５０Ｓカラム上に装填した。このタンパク質を、硫酸アンモニウム（０Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４に対して０．９）の直線的勾配で溶出する。アルブミン融合を有するこれらのフラクションを再びプールし、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸緩衝液ｐＨ５．７５に対してダイアフィルトレートし、５０ｍＬの予め平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム上に装填する。このタンパク質を、０−０．５ＭのＮａＣｌ直線勾配で溶出する。目的のタンパク質を含むフラクションを混合し、この緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎコンセントレーター（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）で１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／クエン酸ｐＨ６．２５に変え、この伝導率は、２．５ｍＳ／ｃｍより低い。このタンパク質溶液は、１５ｍＬの予め平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム上に装填され、このカラムを洗浄し、そしてこのタンパク質を０〜０．１５Ｍ  ＮａＣｌのＮａＣｌ直線勾配で溶出する。次いで、この精製されたタンパク質を、緩衝液交換により特異的な緩衝液組成物に処方し得る。
【１００２】
（実施例５：哺乳動物細胞トランスフェクションについての一般的な構築物の産生）
（哺乳動物細胞株においての発現に適合性のアルブミン融合構築物の産生）
アルブミン融合構築物が、哺乳動物細胞培養系における使用のための発現ベクターにおいて産生され得る。治療タンパク質をコードするＤＮＡが、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、ＰＣＲ増幅、制限消化、および結合）により哺乳動物発現ベクターにおいてＨＳＡへのＮ末端またはＣ末端をクローニングし得る。一旦発現ベクターが構築されると、哺乳動物発現系へのトランスフェクションが、進行し得る。適切なベクター（例えば、ｐＣ４ベクター、および／またはＬｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）から入手可能なベクターを含むが、これらに限定されない）が、当該分野で公知である。
【１００３】
ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡを、哺乳動物培養系に適切な、プラスミドｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７７）を作り出すｐＣ４ベクターにクローニングする。このベクターは、メトトレキサートの存在下、選択を可能にする遺伝子ジヒドロ葉酸レダクターゼ「ＤＨＦＲ」を有する。
【１００４】
ｐＣ４：ＨＳＡベクターは、ＣＨＯ細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現について適切である。発現のために、他の哺乳動物細胞培養系において、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、あるいはこれから成るフラグメントを代替の発現ベクターにサブクローニングすることが所望され得る。例えば、成熟アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、あるいはこれから成るフラグメントを、別の発現ベクター（本明細書中に記載される任意の哺乳動物発現ベクターを含むが、これらに限定されない）にサブクローニングさせ得る。
【１００５】
好ましい実施形態において、アルブミン融合構築物をコードするＤＮＡが、ＮＳ０細胞における発現について当該分野で公知の手段により、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供されるベクターに、サブクローニングされる。
【１００６】
（ＨＳＡ治療タンパク質融合産物を含むアルブミン融合構築物の生成）
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７７）を用いて、治療タンパク質部分が、成熟アルブミン配列のＣ末端である、アルブミン融合構築物を生成する。例えば、ベクターのＢｓｕ  ３６ＩとＡｓｃ  Ｉ制限部位との間の治療タンパク質のフラグメントまたはその改変体をコードするＤＮＡを、クローニングし得る。Ｂｓｕ  ３６ＩおよびＡｓｃ  Ｉへクローニングする場合、酵母ベクター系（配列番号１０４５および配列番号１０４６）にクローニングするのに用いられる同じプライマー設計が、利用され得る（実施例２を参照のこと）。
【１００７】
（遺伝子ＨＳＡ融合産物を含むアルブミン融合構築物の産生）
ｐＣ４：ＨＳＡ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３２７７）を用いて、治療タンパク質部分が成熟アルブミン配列のＮ末端にクローニングされるアルブミン融合構築物が、産生され得る。例えば、ｐＣ４：ＨＳＡのＢａｍ  ＨＩ（またはＨｉｎｄ  ＩＩＩ）とＣｌａ  Ｉとの間の治療タンパク質自体のシグナル配列を有する治療タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし得る。Ｂａｍ  ＨＩまたはＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位のいずれかにクローニングするとき、Ｋｏｚａｋ配列
【１００８】
【化１０−１】
2013172734.tif 000134
を含み、その後に治療タンパク質をコードするＤＮＡの翻訳開始部分を含むことが好ましい。治療タンパク質が、シグナル配列を含まない場合、治療タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐＣ４：ＨＳＡのＸｈｏ  ＩとＣｌａ  Ｉ部位との間でクローニングし得る。Ｘｈｏ  Ｉ部位を用いる場合、以下の５’（配列番号１０５２）および３’（配列番号１０５３）例示的プライマーが、用いられ得る：
【１００９】
【化１０−２】
2013172734.tif 000135
５’プライマー（配列番号１０５２）において、下線が引かれた配列は、Ｘｈｏ部位である；そしてこのＸｈｏ部位およびＸｈｏ  Ｉ部位に続くＤＮＡは、天然のヒト血清アルブミンのリーダー配列の最後の７つのアミノ酸をコードする。配列番号１０５２において、「（Ｎ）１８」は、目的の治療タンパク質をコードする最初の１８ヌクレオチドと同一なＤＮＡである。３’プライマー（配列番号１０５３）において、下線が引かれた配列は、Ｃｌａ  Ｉ部位であり、そしてこのＣｌａ  Ｉ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０アミノ酸をコードするＤＮＡの逆方向補完物である。配列番号１０５３において、「（Ｎ）１８」は、目的の治療タンパク質をコードする最後の１８ヌクレオチドをコードするＤＮＡの逆方向相補鎖である。これらの２つのプライマーを用いて、目的の治療タンパク質をＰＣＲ増幅し得、ＰＣＲ産物を精製し得、Ｘｈｏ  ＩおよびＣｌａ  Ｉ制限酵素でこの産物を消化し得、そしてｐＣ４：ＨＳＡベクター中のＸｈｏ  ＩおよびＣｌａ部位にクローニングし得る。
【１０１０】
代替のリーダー配列が所望される場合、天然のアルブミンリーダー配列は、キメラアルブミンリーダー、すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド、または当該分野で公知の標準的な方法による代替のリーダーで置換され得る。（例えば、当業者が、代替のリーダーを所定の順序でＰＣＲ増幅し、リーディングフレームを維持する一方、ＰＣＲ産物をアルブミンリーダーの代わりにアルブミン融合構築物にサブクローニングする）
（実施例６：哺乳動物細胞株における一般的な発現）
哺乳動物細胞株における発現と適合性の発現ベクターにおいて産生されるアルブミン融合構築物が、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、エレクトロポレーション、または当該分野で公知のおよび／またはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ  １９８９「分子クローニング：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２版」およびＡｕｓｕｂｅｌら、２０００  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｎｄ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１−４巻に記載されるような、他のトランスフェクション方法により、適切な細胞株にトランスフェクトし得る。次いで、トランスフェクトされる細胞を、発現ベクターにおける選択可能なマーカーにより決定される選択剤の存在により選択する。
【１０１１】
ｐＣ４発現ベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）は、プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体である。ｐＣ４は、強力なプロモーター、Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  ＶｉｒｕｓのＬｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔｓ「ＬＴＲ」（Ｃｕｌｌｅｎら、１９８５年３月，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４３８−４４７）およびＣｙｔｏＭｅｇａｌｏ  Ｖｉｒｕｓ「ＣＭＶ」エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０）のフラグメントを含む。このベクターはまた、３’イントロン、ポリアデニル化およびラットプレプロインスリン遺伝子の終止シグナル、ならびにＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣「ＣＨＯ」細胞または活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠失している他の細胞株が、トランスフェクションのために用いられる。当該分野で公知の方法によるｐＣ４におけるアルブミン融合構築物のＣＨＯ細胞へのトランスフェクションが、ＣＨＯ細胞中のアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂および上清への分泌が続く。次いで、アルブミン融合タンパク質を、上清からさらに精製する。
【１０１２】
ｐＥＥ１２．１発現ベクターが、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）により提供され、これはｐＥＥ６（ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＣｏｃｋｅｔｔ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７１１０）の誘導体である。このベクターは、プロモーター、エンハンサーおよび目的の配列の上流である、ヒトＣｙｔｏＭｅｇａｌｏ  Ｖｉｒｕｓ「ｈＣＭＶ−ＭＩＥ」のＭａｊｏｒ  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ遺伝子（国際公開番号ＷＯ８９／０１０３６）の完全５’非翻訳領域、ならびに選択的なメチオニンスルフォキシミン（ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）含有媒体におけるトランスフェクトされた細胞の選択の目的のためのＧｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ遺伝子（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２２７：２７７−２７９；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９−１７５；米国特許ＵＳ５，１２２，４６４）を含む。当該分野で公知の方法によりｐＥＥ１２．１において作られるアルブミン融合構築物のＮＳ０細胞（国際公開番号ＷＯ８６／０５８０７）へのトランスフェクションが、ＮＳ０細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現を可能にし、これにリーダー配列開裂、および上清への分泌が続く。次いで、アルブミン融合タンパク質を、本明細書中で記載される技術または当該分野で公知の他の方法を用いて、上清からさらに精製する。
【１０１３】
アルブミン融合タンパク質の発現が、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット、逆相ＨＰＬＣ分析、または当該分野で公知の他の方法により、分析され得る。
【１０１４】
アルブミン融合タンパク質でトランスフェクトされる安定なＣＨＯおよびＮＳ０細胞株が、当該分野で公知の方法（例えば、リポフェクトアミントランスフェクション）により生成され、例えば、選択可能なマーカーとして、またはグルタミンが存在しない場合の増殖を介してジヒドロ葉酸レダクターゼを有するベクターについて１００ｎＭメトトレキサートで選択される。発現レベルが、例えば、第一に、第一の抗体として抗ＨＳＡ血清を用いて、または、第二に、第一の抗体として所定のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に指向される血清含有抗体を用いて免疫ブロットすることにより、試験され得る。
【１０１５】
発現レベルが、第一の抗体として抗ＨＳＡ血清で免疫ブロット検出することにより、試験される。特異的な生産速度が、捕捉抗体が、アルブミン融合の治療タンパク質部分に向かうモノクローナル抗体であり得、検出抗体が、モノクローナル抗ＨＳＡビオチン化抗体であり得る（または逆もまた同じ）、ＥＬＩＳＡを経て決定され、これにホースラディッシュペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン結合および製造者のプロトコルに従う分析が続く。
【１０１６】
（実施例７：哺乳動物細胞株におけるアルブミン融合タンパク質から発現されるアルブミン融合タンパク質の一般的な精製）
好ましい実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質またはその部分（例えば、表１に列挙される治療タンパク質の成熟形態、または表２に配列番号Ｚとして示される治療タンパク質の成熟形態）の成熟形態のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合されたＨＳＡの成熟形態を含む。本発明の１実施形態において、本発明のアルブミン融合タンパク質は、さらに発現のために用いられる宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは異種シグナル配列（例えば、特定の治療タンパク質の非天然シグナル配列）（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリン  Ｂ、クラステリン、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。表２に列挙されるシグナル配列ならびに／または上の明細書中の「融合タンパク質の発現」および／もしくは「アルブミン融合タンパク質の組み換えおよび合成的産生のさらなる方法」節において列挙されるシグナル配列として、特に好ましい。好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１０１７】
哺乳動物細胞株上清由来のアルブミン融合タンパク質が、用いられる発現系に従う異なるプロトコルに従って精製される。
【１０１８】
（ＣＨＯおよび２９３細胞株からの精製）
ＣＨＯ細胞上清由来または一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞上清由来のアルブミン融合タンパク質の精製は、リン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸塩勾配溶出を用いるアニオン性ＨＱ樹脂を有する最初の捕捉を含み得、塩勾配溶出を用いるＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム上の親和クロマトグラフィーがこれに続く。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦは、主なＢＳＡ／ｆｅｔｕｉｎ汚染物質を除去する。リン酸塩勾配を用いるＰｏｒｏｓ  ＰＩ  ５０樹脂のさらなる精製が、エンドトキシン汚染物質を除去および低減させ得、ならびにアルブミン融合タンパク質を濃縮し得る。
【１０１９】
（ＮＳ０細胞株から精製）
ＮＳ０細胞上清由来のアルブミン融合タンパク質の精製は、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアニオン交換クロマトグラフィーを含み得、段階溶出を用いるＳＰ−セファロース精製がこれに続き、段階溶出を用いるＰｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ、および、最終的には、ダイアフィルトレーションがこれに続く。
【１０２０】
次いで、精製したタンパク質が、緩衝液交換により処方され得る。
【１０２１】
（実施例８：構築物ＩＤ１９６６、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１９６６（ｐＣ４．ＥＰＯ：Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）は、ＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ＥＰＯネイティブリーダー配列および哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、最終Ａｒｇ残基（すなわち、Ｍ１−Ｄ１９２）を除く成熟ＥＰＯタンパク質を含む。
【１０２２】
（構築物１９６６についてのＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＥＰＯ１およびＥＰＯ２を使用して増幅し、Ｂａｍ  ＨＩ／Ｃｌａ  Ｉで切断し、そしてＢａｍ  ＨＩ／Ｃｌａ  Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９６６は、成熟ＨＳＡタンパク質、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（表２における構築物１９６６についての配列番号２９７を参照のこと）。
【１０２３】
天然のリーダー配列を含む全長ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ１およびＥＰＯ２）を合成した。
【１０２４】
【化１１】
2013172734.tif 000136
ＥＰＯ１は、Ｂａｍ  ＨＩクローニング部位（斜体で示される）を組み込み、全長ＥＰＯのＯＲＦの最初の３５アミノ酸をコードするＤＮＡの前にｋｏｚａｋ配列（二重下線を引いて示される）を結び付ける。ＥＰＯ２において、下線を引かれた配列は、Ｃｌａ  Ｉ部位であり；そしてＣｌａ  Ｉ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体である（配列番号１０３８）。ＥＰＯ２において太字の核酸配列は、ＥＰＯの全長形態のアミノ酸残基Ｇｌｕ−１８６〜Ａｓｐ１９２をコードする最後の２２個のヌクレオチドの逆相補体である。これらの２つのプライマーを使用して、最終Ａｒｇ残基を除いた全長ＥＰＯタンパク質を、ＰＣＲ増幅した。アニーリング温度および伸長温度ならびにアニーリング回数および伸長回数が、各々の特異的なプライマー対およびテンプレートについて経験的に決定されなければならない。
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ））、続いてＢａｍ  ＨＩおよびＣｌａ  Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＢａｍ  ＨＩ−Ｃｌａ  Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＢａｍ  ＨＩ／Ｃｌａ  Ｉで消化されたｐＣ４：ＨＳＡにクローニングし、構築物番号１９６６を産生した。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析により、予測されたＥＰＯ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
【１０２５】
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９６６の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞またはＣＨＯ細胞のいずれかにおける発現）
構築物１９６６を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして１００ｎＭメトトレキサートを用いて選択した（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いる免疫ブロット検出によって、試験し、特異的な産生速度を、捕捉のためのモノクローナル抗ヒトＥＰＯ抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）および検出のためのＢｉｏｔｒｅｎｄモノクローナル抗ＨＳＡビオチン化抗体を用いるＥＬＩＳＡを介して、続いてホースラディシュペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン結合および分析により決定した。
【１０２６】
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９６６から２９３Ｔ細胞において発現された、分泌ＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、最初の捕捉を、陰イオン性ＨＱ−５０樹脂を用いて、段階溶出を使用してｐＨ７．２で、実施し、続いてｐＨ７．２で、段階溶出を再び利用するＢｌｕｅセファロースカラムクロマトグラフィーを使用して実施した。プールされたフラクションは、段階溶出を用いてＨＱ−５０樹脂を通過させた。この溶出したサンプルを、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍカラム上に載せ、ｐＨ７．２で勾配溶出で溶出した。溶出したサンプルを、ＨＱ−５０樹脂を三回通過させた。目的のフラクションは、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）にダイアフィルトレーションされた。Ｎ末端配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＡＰＰＲＬＩ）を生じた。９０ｋＤａのおよその分子量のタンパク質が得られた。１リットルの２９３Ｔ細胞上清あたり０．４２ｍｇのタンパク質の最終収量が得られた。
【１０２７】
（ＣＨＯ細胞上清からの精製）
ＣＨＯ細胞において構築物番号１９６６から発現されるＥＰＯアルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、濃縮された１．４Ｌのサンプルの最初の捕捉を、リン酸ナトリウム緩衝液およびリン酸塩勾配溶出（０−１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を使用して、アニオン性Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ  ５０樹脂を用いて実施した。カラムに載せる前に、このサンプルを、伝導性が５．０ｍＳより小さくなるまで、さらなるカラムクロマトグラフィー精製と同様に３ｍＭリン酸塩に希釈した。ＨＱ樹脂を１０ｍＭリン酸ナトリウム（サンプル装填の前でｐＨ７．２）で平衡化した。ＥＰＯ−ＨＳＡを２０ｍＳ、または５０ｍＳリン酸ナトリウムで溶出した。
第２の精製工程は、親和クロマトグラフィーを含んだ。３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いる５ｍＳ未満の伝導性に適合した、以前のＨＱ樹脂からの組み合わされたフラクションを、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で平衡化したＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに載せた。０−３Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配が、０．５Ｍと１．０ＭＮａＣｌとの間のＥＰＯ−ＨＳＡを溶出した。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦは、主なＢＳＡ／ｆｅｔｕｉｎ汚染物質を除去する。エンドトキシン汚染物質を除去し、および低減し、ならびにＥＰＯ−ＨＳＡタンパク質を濃縮するＰｏｒｏｓ  ＰＩ５０樹脂を含む第３のカラムに、所望されるフラクションの伝導性は、再び適合され、そしてプールされたフラクションが、載せられた。その樹脂は、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で平衡化された。ＥＰＯ−ＨＳＡを、１０ｍＭ−１００ｍＭリン酸塩勾配で溶出した。最終緩衝組成物は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）であった。８７．７ｋＤａのおよそのタンパク質分子量を得た。１リットルの上清あたり８．９ｍｇのタンパク質の最終収量を得た。Ｎ末端配列決定が、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬを産生した。
【１０２８】
（インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の生物学的活性を、インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて測定し得る。ＴＦ１細胞株が、Ｋｉｔａｍｕｒａら（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９８９、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４０：３２３−３３４）により確立された。ＴＦ−１細胞が、重症の汎血球減少症の３５歳の日本人男性由来のヘパリン化された骨髄吸引サンプルから誘導された。ＴＦ−１細胞株は、複数のサイトカインに応答性の結果としての骨髄先祖細胞の増殖および分化を調査するために良好なシステムを提供する。
【１０２９】
ＴＦ−１細胞増殖アッセイ（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ら、１９８９、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４０：３２３−３３４）：ヒトＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）を、１０％ＦＢＳ、１Ｘ  ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１Ｘ  Ｌ−グルタミン、および２ｎｇ／ｍＬヒトＧＭ−ＣＳＦをＲＰＭＩ  １６４０培地に１×１０６細胞／ｍＬまで拡散する。細胞を、新鮮な培地中１：１０または１：２０に希釈することにより、２〜３日毎に継代した。アッセイ開始の日において、細胞を、５０ｍＬの容量のＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳで３回洗い、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、そしてＲＰＭＩ１６４０／１０％中１×１０５細胞／ｍＬで再懸濁する。細胞を、底が平らなＴＣ処理された９６ウェルプレート中、１０，０００細胞／ウェルで平板培養する。コントロールタンパク質の３倍連続希釈を、１０Ｕ／ｍＬ〜０．００１Ｕ／ｍＬ（最終濃度）の範囲でＲＰＭＩ中行ない、ここで１Ｕ＝１０ｎｇタンパク質である；各々の希釈液の０．１ｍＬを、各々のウェルにおいて０．２ｍＬの最終容積について細胞を含む３重ウェルに加える。コントロールタンパク質に応答する細胞増殖およびアルブミン融合タンパク質を、３Ｈ−チミジン（０．５ｕＣｉ／ウェル）の取り込みを測定することにより、決定する。このアッセイを、３Ｈ−チミジンを加える前の２４時間、４８時間、または７２時間のインキュベーション時間にて、および加えた後の４〜２４時間の間、実行する。アルブミン融合タンパク質の分子量の部分のみが、希釈液がまた、モル比に対して適合され得る場合、事実上治療タンパク質分子（すなわち、融合の治療タンパク質部分）である。
【１０３０】
（構築物１９６６によりコードされるアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
ＴＦ−１細胞増殖アッセイ：ヒトＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２００３）を、１０％ＦＢＳ、１Ｘ  ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１Ｘ  Ｌ−グルタミン、および２ｎｇ／ｍＬヒトＧＭ−ＣＳＦをＲＰＭＩ培地に１×１０６細胞／ｍＬの最大密度まで拡散する。細胞を、新鮮な培地中１：１０または１：２０に希釈することにより、２〜３日毎に継代した。アッセイ開始の日において、細胞を、５０ｍＬの容量のＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳで３回洗い、ＧＭ−ＣＳＦを除去し、そしてＲＰＭＩ１６４０／１０％中１×１０５細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を、底が平らなＴＣ処理された９６ウェルプレート中、１０，０００細胞／ウェルで平板培養した。ｈｒＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，ＲＤＩ）の３倍連続希釈を、１０Ｕ／ｍＬ〜０．００１Ｕ／ｍＬ（最終濃度）の範囲でＲＰＭＩ１６４０／１０％中行ない、ここで１Ｕ＝１０ｎｇタンパク質であった；各々の希釈液の０．１ｍＬを、各々のウェルにおいて０．２ｍＬの最終容積について細胞を含む３重ウェルに加えた。ｈｒＥＰＯに応答する細胞増殖応答およびＥＰＯアルブミン融合タンパク質を、３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）の取り込みを測定することにより、決定した。このアッセイを、３Ｈ−チミジンを加える前の２４時間、４８時間、または７２時間のインキュベーション時間にて、および加えた後の４〜２４時間の間、実行した。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の分子量の１／３のみが、希釈液がまた、モル比に対して適合され得る場合、事実上ＥＰＯ分子である。
【１０３１】
（結果）
構築物１９６６を発現する２９３Ｔ細胞由来の上清または構築物１９６６を発現するＣＨＯ細胞から誘導されたＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン誘導タンパク質を、ＥＰＯ活性についての上のアッセイで試験した。平均して、ｒｈＥＰＯの５倍より大きいＥＣ５０が、確立された（図４を参照のこと）。
【１０３２】
（ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスＨａｒｌａｎ）
（方法）
このマウスモデルは、ヘマトクリット上の効果を測定することによりインビボのタンパク質の治療活性を測定する手段を提供する。
【１０３３】
インビボマウスモデル（すなわち、６〜８週齢雌ＤＢＡ／２ＮＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ））を、静脈内に、腹腔内に、または皮下に、７日間の間毎日、または１日おきに２μｇ／ｋｇにて、および他の濃度にてコントロールタンパク質または３０μｇ／ｋｇにて、および他の濃度にてアルブミン融合タンパク質の投与におけるヘマトクリットに対する効果をモニタリングすることを、確立した。ヘマトクリットを、針で尾静脈を刺し、ヘパリン処理されたマイクロキャピラリーチューブで血液を集め、次いで実験の期間にわたってチューブをスピニングさせることで決定する。また、特定の実験に対して、脾臓を収集し、秤量する。他の投薬スケジュールは、当該分野の範囲内で公知であり、このアッセイの使用のために容易に適合され得る。
【１０３４】
（構築物１９６６によりコードされるアルブミン融合タンパク質の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを用いてアッセイされ得る。）  （方法）
６〜８週齢雌ＤＢＡ／２ＮＨｓｄマウス（Ｈａｒｌａｎ）のインビボマウスモデルを用いて、０日目、２日目、４日目および６日目に０．５μｇ／ｋｇ、１．５μｇ／ｋｇ、４．５μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇの投薬量で、ｒｈＥＰＯ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，カタロク番号ＲＤＩ−ＰＢ１１９６５）の投与、ならびに皮下、「ＳＣ」で０日目、２日目、４日目、および６日目に２μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、１８μｇ／ｋｇ、および５４μｇ／ｋｇの濃度で構築物１９６６によりコードされる精製したアルブミン融合タンパク質の投与において、ＥＰＯ活性の程度をモニタリングした。
ヘマトクリットを、０日目および７日目に針で尾静脈を刺し、へパリン処理されたマイクロキャオイラリーチューブで血液を収集し、そして続いて実験の期間にわたってチューブをスピニングすることにより、決定した。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質のより多くの投薬量は、コントロール組換えヒトＥＰＯ、「ｒｈＥＰＯ」（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，カタロク番号ＲＤＩ−ＰＢ１１９６５）と比べて、大よそ等モルである。
【１０３５】
（結果）
組換えヒトＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかで処理された０日〜７日のヘマトクリットにおいて有意な増加があった（実施例５を参照のこと）。しかし、構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ヘマトクリットレベルにおいてｒｈＥＰＯコントロールよりもより強烈な効果を有するようであった。
構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の５２μｇ／ｋｇの３投薬量／週または１５６μｇ／ｋｇの１投薬量／週の皮下投与が、０日〜８日のヘマトクリットにおける４０％を超える変化またはこれに等しい変化を引き起こした（図６を参照のこと）。ヘマトクリットにおける％変化は、三重投薬量に対して４０％近くに保たれるか、または一週間の間にｒｈＥＰＯの１２μｇ／ｋｇの３投薬量皮下投与に対して３０％近くから１０％未満までの低下と反対に、１４日目において単一の投薬量に対して２０％以下に抑制されるかのいずれかである。高められたヘマトクリットは、より通常のレベルに低下するｒｈＥＰＯタンパク質により誘導されるヘマトクリットレベルと比較して、最後の皮下投与の後１週間の期間にわたって構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質で保たれるようである。
【１０３６】
アルブミン融合タンパク質の１５０μｇ／ｋｇで静脈内注射されたＤＢＡマウスが、ｒｈＥＰＯより７倍ゆっくりとこのＥＰＯアルブミン融合タンパク質を取り除いた。
【１０３７】
（実施例９：構築物ＩＤ１９８１、ＨＳＡ−ＥＰＯ、産生）
構築物ＩＤ１９８１（ｐＣ４．ＥＰＯ：ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ネイティブＨＳＡリーダー配列および哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に融合した、最終Ａｒｇ残基を除くＤＮＡを含む。
【１０３８】
（構築物１９８１についてのＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＥＰＯ３およびＥＰＯ４を使用して増幅し、Ｂｓｕ  ３６Ｉ／Ａｓｃ  Ｉで切断し、そしてＢｓｕ  ３６Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９８１は、ＨＳＡの成熟形態、およびＥＰＯの成熟形態、Ａｌａ  ２８〜Ａｓｐ１９２を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（Ｇｅｎｂａｎｋ登録ＡＡＡ５２４００）。
【１０３９】
ＥＰＯの成熟形態（表２における構築物１９８１についての配列番号Ｘを参照のこと）コードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ３およびＥＰＯ４）を合成した。
【１０４０】
【化１２】
2013172734.tif 000137
ＥＰＯ３は、Ｂｓｕ  ３６Ｉクローニング部位（下線で示される）およびＥＰＯの成熟形態の最初の８アミノ酸をコードするＨＳＡの最後の４アミノ酸残基および２６ヌクレオチド（イタリック体）をコードするヌクレオチドを組み込む。ＥＰＯ４において、Ａｓｃ  Ｉ部位は、下線を引かれ（配列番号８０６）、そして最後の２８ヌクレオチド（イタリック体）は、最終Ａｒｇ残基を除いたＥＰＯの最後の９個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（一般的な構築物クローニングについては実施例５を参照のこと）。これらのプライマーを使用して精製されたＰＣＲ増幅体を精製し、Ｂｓｕ  ３６Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＣ４：ＨＳＡベクターのＢｓｕ  ３６Ｉ／Ａｓｃ  Ｉ部位へクローニングした。
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ））、続いてＢｓｕ  ３６ＩおよびＡｓｃ  Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＢｓｕ  ３６Ｉ−Ａｓｃ  Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＢｓｕ  ３６Ｉ／Ａｓｃ  Ｉで消化されたｐＣ４：ＨＳＡにクローニングし、構築物番号１９８１を産生した。
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
【１０４１】
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９８１の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞の発現）
構築物１９８１を、実施例６および８に記載されるように、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。発現レベルおよび特異的な産生速度を、実施例８に記載されるように決定した。
【１０４２】
（ＣＨＯ上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９８１からＣＨＯ細胞において発現された、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および８に記載されるように精製した。Ｎ末端配列決定が、ＤＡＨＫＳ（ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端の配列）を産生した。１リットルの上清あたり１４ｍｇのタンパク質を得た。およその分子量８５．７ｋＤａを得た。
【１０４３】
（構築物１９８１についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物１９８１によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイが、実施例８において「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」で始まる副節で記載されたように以前に実行した。
【１０４４】
（結果）
構築物１９８１を発現するＣＨＯ細胞からの上清を、ＨＳＡ−ＥＰＯアルブミン融合タンパク質について９０％以上精製し、そして実施例８記載されるようなアッセイにおいて試験した。平均して、ｒｈＥＰＯの５倍より大きいＥＣ５０が、確立された（実施例４および７を参照のこと）
（構築物１９８１の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る）
（方法）
インビボＨａｒｌａｎマウスモデルを、構築物１９８１によりコードされるコントロールｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかの皮下投与において、ヘマトクリットレベルを測定するために使用した。このアッセイを、実施例８において副節表題「構築物１９６６の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る」で以前に記載されるように実行した。
【１０４５】
（結果）
ｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかで処理された動物について、０日〜７日のヘマトクリットにおける有意な増加があった（図５を参照のこと）。しかし、構築物１９８１によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ヘマトクリットレベルにおいてｒｈＥＰＯコントロールよりもより強烈な効果を有するようであった。
【１０４６】
アルブミン融合構築物１９８１によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の１５０μｇ／ｋｇで静脈内注射されたＤＢＡマウスが、ｒｈＥＰＯより７倍ゆっくりとこのＥＰＯアルブミン融合タンパク質を取り除いた。
【１０４７】
（実施例１０：構築物ＩＤ１９９７、ＨＳＡ−ＥＰＯ、産生）
構築物ＩＤ１９９７（ｐＥＥ１２．１：ＥＰＯ  Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、最終Ａｒｇ残基を除く全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブリーダー配列を含む）、すなわちＭ１−Ｄ１９２を有し、および哺乳動物発現ベクターｐＥＥ１２．１にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合されている。
【１０４８】
（構築物１９９７についてのＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯをコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＥＰＯ５およびＥＰＯ６を使用して増幅し、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｃｌａ  Ｉで切断し、そしてＥｃｏ  ＲＩ／Ｃｌａ  Ｉ切断されたｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ９２００８）に連結した。ｐｃＤＮＡ３．ＥＰＯ  Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡを、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを消化してＥＰＯ  Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ発現カセットフラグメントを放出し、Ｅｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化されたｐＥＥ１２．１．にクローニングした。構築物ＩＤ番号１９９７は、リーダー配列を含むアルブミン融合タンパク質およびＥＰＯの成熟形態、続いて成熟ＥＰＯタンパク質をコードする（構築物１９９７についての表２における配列番号Ｙを参照のこと）。
【１０４９】
ＥＰＯ（配列番号Ｘ、構築物１９９７についての表２）、ＥＰＯ５およびＥＰＯ６をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ５およびＥＰＯ６）を合成した。
【１０５０】
【化１３】
2013172734.tif 000138
ＥＰＯ５は、Ｅｃｏ  ＲＩ部位（イタリック体で示される）およびｋｏｚａｋ配列（下線で示される）を組み込み、続いて、全長ＥＰＯのＯＲＦの最初の３５アミノ酸をコードするＤＮＡを組み込む。ＥＰＯ６において、イタリック体の配列は、Ｃｌａ  Ｉ部位であり、下線を引かれた配列は、ＨＳＡタンパク質の成熟形態の最初の最初の９アミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり（ＤＡＨＫＳＥＶＡＨ、配列番号１１０６）、そしてＨＳＡの逆相補体に続く配列は、最後のＡｒｇ−１９３アミノ酸を含まないＥＰＯの最後の７アミノ酸をコードする、最後の２３ヌクレオチドの逆相補体である。これらの２つのプライマーを使用して、全長ＥＰＯタンパク質をコードするＤＮＡを、実施例８のようにＰＣＲ増幅した。
【１０５１】
ＰＣＲ産物を精製し、続いてＥｃｏ  ＲＩおよびＣｌａ  Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＥｃｏ  ＲＩ−Ｃｌａ  Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＥｃｏ  ＲＩ／Ｃｌａ  Ｉで消化されたｐｃＤＮＡ３にクローニングした。発現カセットを含むＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩフラグメントをｐｃＤＮＡ３．ＥＰＯ．Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡから生成し、そしてＥｃｏ  ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＥＥ１２．１にサブクローニングし、構築物番号１９９７を得た。
さらに、アミノ酸配列決定によるアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確かめた。（以下を参照のこと）。
【１０５２】
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
（構築物ＩＤ１９９７の発現および精製）
（ＮＳ０細胞の発現）
構築物１９９７を、実施例６に記載されるように、ＮＳ０細胞にトランスフェクトした。発現レベルおよび特異的な産生速度を、実施例８に記載されるように決定した。
（ＮＳ０細胞上清からの精製）
構築物１９９７でトランスフェクトされるＮＳ０細胞由来の５００ｍＬ細胞上清からのアルブミン融合タンパク質の精製は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を使用する、ｐＨ７．４におけるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー、続いて５〜４０ｍＭのクエン酸ナトリウム勾配を用いる、ｐＨ６．５におけるＰｏｒｏｓ  ＰＩ  ５０陰イオン交換クロマトグラフィー、および１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌの最終緩衝液濃度（実施例７を参照のこと）への、６ＤＶについてのダイアフィルトレーションを包含する。Ｎ末端配列決定は、配列ＡＰＰＲＬＩを生じるはずであり、これは、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端である。このタンパク質は、８７．７ｋＤａのおよそのＭＷを有する。上清１リットル当たり５２．２ｍｇのタンパク質の最終収量が、得られた。
【１０５３】
より大きい規模の精製（例えば、５０ＬのＮＳ０細胞上清）については、約８〜１０Ｌに濃縮され得る。次いで、濃縮されたサンプルは、ｐＨ７．５で、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる段階溶出を使用して、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換カラム（１０×１９ｃｍ、１．５Ｌ）に通され得る。次いで、溶出されたサンプルは、０．７５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００とともに、室温で６０分間ウイルス感染され得る。次いで、ＳＤＲ−逆相クロマトグラフィー（１０ｃｍ×１０ｃｍ、０．８Ｌ）を、ｐＨ６．０で、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌとともに、またはその逆で使用して、サンプルをＳＰ−セファロースカラムに、ｐＨ４．８で、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用して通され得る。続いて、ＤＶ５０濾過して、全てのウイルス成分を除去する。続いて、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍクロマトグラフィー（２０ｃｍ×１２ｃｍ、３．８Ｌ）を、３５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および５０ｍＭ  ＮａＯＡｃからなる段階溶出、あるいは５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）からなる段階溶出を使用して、ｐＨ６．０で行い得る。６〜８ＤＶについてのダイアフィルトレーションは、緩衝液の、所望の最終濃度の緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋５８ｍＭスクロース＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）または１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌのいずれかへの交換を可能にする。
（構築物１９９７についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物１９９７によりコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイが、実施例８において「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」で始まる副節で記載されたように以前に実行した。
【１０５４】
構築物１９９７を発現するＮＳ０細胞からの上清を、ＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合タンパク質について９０％以上精製し、そして実施例８記載されるようなアッセイにおいて試験した。平均して、ｒｈＥＰＯの５倍より大きいＥＣ５０が、確立された（実施例７を参照のこと）
（構築物１９９７の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る）
（方法）
インビボＨａｒｌａｎマウスモデルが、０日、２日、４日および６日の種々の投薬量での構築物１９８１によりコードされるコントロールｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかの皮下投与において、ヘマトクリットレベルを測定するために使用した。このアッセイを、実施例８において副節表題「構築物１９６６の活性が、ヘマトクリットを測定するためのインビボマウスモデルＨａｒｌａｎを使用してアッセイされ得る」で以前に記載されるように実行した。ヘマトクリットを、０日目、８日目、および１４日面で決定した。
【１０５５】
（結果）
ｒｈＥＰＯまたはＥＰＯアルブミン融合タンパク質のいずれかで処理された動物について、０日〜８日のヘマトクリットにおける有意な増加があった（図８を参照のこと）。しかし、構築物１９６６によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の場合として、構築物１９９７によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の５２μｇ／ｋｇの３投与量／週の皮下投与は、一週間当たりｒｈＥＰＯの１２μｇ／ｋｇ皮下投与レベルの３回の投与量について３０％〜１０％未満の衰退と反対に、１４日目の１５％未満に軽減される０日〜８日のヘマトクリットにおける３０％に近い変化を引き起こした。
【１０５６】
ＥＢＯアルブミン融合構築物によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質の１５０μｇ／ｋｇで静脈内注射されたＤＢＡマウスが、ｒｈＥＰＯより７倍ゆっくりとこのＥＰＯアルブミン融合タンパク質を取り除いた。
【１０５７】
（実施例１１：構築物ＩＤ２２９４、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２２９４（ｐＣ４．ＥＰＯ  Ｒ１４０Ｇ．ＨＳＡ）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブリーダー配列を含む）、すなわちＭ１−Ｄ１９２を有し、および哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、最終Ａｒｇ残基を除くＤＮＡを含む。
【１０５８】
（構築物２２９４についてのＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ番号２２９４は、リーダー配列およびＥＰＯの成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質、続いて成熟ＨＳＡタンパク質をコードする。構築物ＩＤ番号２２９４が、２工程のＰＣＲ法においてテンプレートとして、構築物ＩＤ番号１９６６（すなわちｐＣ４：ＥＰＯ．Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）を用いることにより生成された。
【１０５９】
ＥＰＯ（配列番号Ｘ、構築物２２９４について、表２）をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な４つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ７、ＥＰＯ８、ＥＰＯ９およびＥＰＯ１０）を合成した。
【１０６０】
【化１４】
2013172734.tif 000139
ＰＣＲ増幅の最初の段階で、構築物１９６６の最初のＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントが、独立して増幅された。Ｎ末端フラグメントを、プライマーＥＰＯ７およびＥＰＯ８を用いて生成した。ＥＰＯ７は、Ｂａｍ  ＨＩ（イタリック体で示される）を組み込み、そしてｋｏｚａｋ配列（下線で示される）、続いて全長ＥＰＯのＯＲＦの最初の６アミノ酸をコードする最初の１８ヌクレオチドを有する。ＥＰＯ８プライマーは、アミノ酸１４０でのＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調される）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更される。Ｃ末端フラグメントを、プライマーＥＰＯ９およびＥＰＯ１０を用いて生成した。ＥＰＯ９において、下線が引かれた配列は、Ｃｌａ  Ｉ部位であり、そしてＣｌａ  Ｉ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０アミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体である。ＥＰＯ９において、最後の５ヌクレオチドは、全長ＥＰＯにおける最後の５ヌクレオチドの逆相補体に対応し、これは最終Ａｒｇ−１９３残基を欠失する。ＥＰＯ１０プライマーは、アミノ酸１４０でのＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調される）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されることを除いて、ＥＰＯの全長形態の１３６〜１４３アミノ酸をコードする核酸配列を含む。ＰＣＲ増幅の第２の段階において、プライマーＥＰＯ７およびＥＰＯ９が、Ａｒｇ−１４０を有する全長ＥＰＯを、反応混合物が、ＰＣＲ増幅されたＮ末端フラグメントおよびＰＣＲ増幅されたＣ末端フラグメントの両方を含んだ、Ｇｌｙ変異まで増幅するのに用いた。
【１０６１】
ＰＣＲ産物を精製し、続いてＢａｍ  ＨＩおよびＣｌａ  Ｉで消化した。そしてゲル電気泳動によるＢａｍ  ＨＩ−Ｃｌａ  Ｉフラグメントのさらなる精製の後、この産物をＢａｍ  ＨＩ／Ｃｌａ  Ｉで消化されたｐＣ４：ＨＳＡにクローニングし、構築物番号２２９４を得た。
さらに、アミノ酸配列決定によるアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確かめた。（以下を参照のこと）。
【１０６２】
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最終Ａｒｇ残基を欠失するＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１０６３】
（構築物ＩＤ２２９４の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
実施例６および８に記載されるようにして、構築物２２９４をＣＨＯ細胞にトランスフェクト得る。発現レベルおよび比産生率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｒａｔｅ）を、実施例８に記載されるようにして決定し得る。
【１０６４】
（ＣＨＯ上清からの精製）
ＣＨＯ細胞において構築物ＩＤ  ＃２２９４から発現されたＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および８のようにして精製し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬＩ（配列番号２１４１）を生じるはずであり、約８７．７ｋＤａのＭＷのタンパク質を生じるはずである。
【１０６５】
（構築物２２９４についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２９４によってコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合物についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイを、実施例８において副節の表題「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようにして実施し得る。
【１０６６】
（構築物２２９４の活性は、ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る）
実施例８において副節の表題「ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデル」の下で先に記載されるようなインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用して、構築物２２９４によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質のヘマトクリットレベルを測定し得る。
【１０６７】
（実施例１２：構築物ＩＤ２２９８、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２２９８（ｐＥＥ１２．１：ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇ．ＨＳＡ）は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、哺乳動物発現ベクターｐＥＥ１２．１にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、最後のＡｒｇ残基を除く全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブのリーダー配列を含む）（すなわち、Ａｒｇ−１４０をＧｌｙに変異する点変異を有するＭ１−Ｄ１９２）を有する。
【１０６８】
（構築物２２９８についてのＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ  ＃２２９８は、ＥＰＯのリーダー配列および成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質、続いて成熟ＨＳＡタンパク質をコードする。構築物ＩＤ  ＃２２９８を、構築物ＩＤ  ＃１９９７（すなわち、ｐＥＥ１２．１：ＥＰＯ．Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）をＰＣＲ変異誘発のためのテンプレートとして使用することによって作製した。
【１０６９】
構築物ＩＤ  ＃１９９７のテンプレートのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＥＰＯ１１およびＥＰＯ１２）を、合成した。
【１０７０】
【化１５】
2013172734.tif 000140
ＥＰＯ１１アンチセンスプライマーは、全長形態のＥＰＯのアミノ酸１３５〜１４５にわたる配列の逆相補体を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇをコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。ＥＰＯ１２センスプライマーは、全長形態のＥＰＯのアミノ酸１３５〜１４５をコードする核酸配列を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）が、Ｇｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。部位特異的変異誘発キットおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのプロトコルを使用して、ＰＣＲ反応は、ＡｒｇからＧｌｙへの変異を除く、構築物ＩＤ  ＃１９９７の全テンプレートを作製した。このＰＣＲ産物をＤｐｎ  Ｉで消化し、コンピテントＸＬ１  Ｂｌｕｅ細菌に形質転換し、そしてコロニーを配列決定して、確認した。Ｄｐｎ  Ｉエンドヌクレアーゼは、メチル化および半メチル化されたＤＮＡに対して特異的であり、そして配列５’−ＧｍＡＴＣ−３’を標的化する。Ｄｐｎ  Ｉを使用して、親ＤＮＡテンプレートを消化し、変異含有合成ＤＮＡを選択する。
【１０７１】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１０７２】
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最後のＡｒｇ残基を欠くＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１０７３】
（構築物ＩＤ２２９８の発現および精製）
（ＮＳ０細胞における発現）
実施例６および１０に記載されるようにして、構築物２２９８をＮＳ０細胞にトランスフェクトし得る。発現レベルおよび比産生率を、実施例８に記載されるようにして決定し得る。
【１０７４】
（ＮＳ０細胞上清からの精製）
ＮＳ０細胞において構築物ＩＤ  ＃２２９８から発現されたＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および１０のようにして精製し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬＩ（配列番号２１４１）を生じるはずであり、約８７．７ｋＤａのＭＷのタンパク質を生じるはずである。
【１０７５】
（構築物２２９８についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２９８によってコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイを、実施例８において副節の表題「構築物１９６６によってコードされるアルブミン融合タンパク質についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」、および実施例１０において副節の表題「構築物１９９７についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようにして実施し得る。
【１０７６】
（構築物２２９８の活性は、ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る）
実施例８において副節の表題「ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデル」の下および実施例１０で先に記載されるようなインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用して、構築物２２９８によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質のヘマトクリットレベルを測定し得る。
【１０７７】
（実施例１３：構築物ＩＤ２３２５、ＥＰＯ−ＨＳＡ、産生）
最適化された構築物ＩＤ２３２５（ｐＣ４．ＥＰＯ：Ｍ１−Ｄ１９２．ＨＳＡ）コドンは、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、全長ＥＰＯタンパク質（ネイティブのリーダー配列を含む）（すなわち、Ａｒｇ−１４０からＧｌｙへの点変異を有するＭ１−Ｄ１９２）を有する。
【１０７８】
（構築物２３２５についてのＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＥＰＯオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡは、野生型ＥＰＯ遺伝子配列にハイブリダイズしないように最適化されたコドンであった。ＥＰＯをコードするポリヌクレオチドを、６個の重複オリゴヌクレオチドによってＰＣＲ生成し、そしてＴＡベクターにクローニングした。構築物ＩＤ  ＃２３２５は、リーダー配列およびＥＰＯの成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
【１０７９】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＥＰＯ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１０８０】
本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、最後のＡｒｇ残基を欠くＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＥＰＯシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１０８１】
（構築物ＩＤ２３２５の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
実施例６および８に記載されるようにして、構築物２３２５をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし得る。発現レベルおよび比産生率を、実施例８に記載されるようにして決定し得る。
【１０８２】
（ＣＨＯ上清からの精製）
ＣＨＯ細胞において構築物ＩＤ  ＃２３２５から発現されたＥＰＯ−ＨＳＡ融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例７および８に記載の方法により精製し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＰＲＬＩ（配列番号２１４１）を生じるはずであり、約８７．７ｋＤａのＭＷのタンパク質を生じるはずである。
【１０８３】
（構築物２３２５についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ）
（方法）
構築物２３２５によってコードされるＥＰＯ−ＨＳＡアルブミン融合物についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイを、実施例８において副節の表題「構築物１９６６についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようにして実施し得る。
【１０８４】
（構築物２３２５の活性は、ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る）
実施例８において副節の表題「ヘマトクリットの測定のためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデル」の下で先に記載されるようなインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用して、構築物２３２５によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質のヘマトクリットレベルを測定し得る。
【１０８５】
（実施例１４：ＥＰＯアルブミン融合タンパク質の適応症）
上記のインビトロアッセイおよびインビボアッセイからの結果は、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、種々の状態（末期腎臓疾患（透析患者）、透析前の慢性腎不全、ジドブジン処置されたＨＩＶ患者、化学療法中の癌患者、および未熟児が挙げられるが、これらに限定されない）によって引き起こされる出血障害および貧血の処置において使用され得ることを示す。ＥＰＯアルブミン融合タンパク質はまた、選択的な非心臓の非脈管の手術を受けている貧血患者における手術前において、輸血の必要性を減少させるために使用され得る。これらの薬剤の開発における適応症としては、以下が挙げられる：再生不良性貧血および他の難治性貧血、炎症性腸疾患における難治性貧血、ならびに選択的整形外科手術における輸血逃避。腎疾患および腫瘍における貧血は、構築物１９６６、１９８１、１９９７、２２９４、２２９８および２３２５によりコードされるＥＰＯアルブミン融合タンパク質についての２つの主な適応症である。
【１０８６】
（実施例１５：構築物ＩＤ１８１２、ＩＬ２−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１８１２（ｐＳＡＣ３５：ＩＬ２．Ａ２１−Ｔ１５３．ＨＳＡ）は、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）、成熟ＩＬ２タンパク質形態（すなわち、Ａ２１−Ｔ１５３）を有する。
【１０８７】
（ＩＬ２  ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＬ２−１およびＩＬ２−２を使用してＰＣＲ増幅した。これらの増幅体（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を、Ｓａｌ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉで切断し、そしてＸｈｏ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉで切断したｐＳｃＣＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ  ＃１８１２は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、ＩＬ２の成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
【１０８８】
ＩＬ２の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＬ２−１およびＩＬ２−２）を合成した：
【１０８９】
【化１６】
2013172734.tif 000141
ＩＬ２−１は、Ｓａｌ  Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＬ２の成熟形態の最初の８アミノ酸残基をコードする２４ヌクレオチドを組み込む。ＩＬ２−２において、Ｃｌａ  Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の２４個のヌクレオチドは、ＩＬ２の最後の８個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＩＬ２−ＨＳＡのＰＣＲ増幅体を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｓａｌ  Ｉ制限酵素およびＣｌａ  Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏ  Ｉ部位およびＣｌａ  Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、Ｎｏｔ  Ｉフラグメントとして、ｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
【１０９０】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＩＬ２配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１０９１】
本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくはＩＬ２の成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２１〜Ｔｈｒ−１５３）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＬ２アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＬ２シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１０９２】
（構築物ＩＤ  １８１２の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物１８１２の、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０へのトランスフェクションを、当該分野で公知の方法によって実施し（実施例３を参照のこと）、細胞を、増殖の７２時間後に、定常状態において収集した。構築物１８１２によりトランスフェクトされた酵母由来の上清を、３０００ｇで１０分間、細胞を浄化することによって収集した。
発現レベルを、抗ＨＳＡ血清（Ｋｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を一次抗体として用いて、免疫ブロット検出によって試験した。約８５ｋＤａの分子量のＩＬ２アルブミン融合タンパク質を得た。比産生率を、ＥＬＩＳＡによって決定し、ここで捕獲抗体は、ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＃Ａ１３２７−５３モノクローナル抗ＨＳＡ抗体またはモノクローナル抗ヒトＩＬ２抗体（例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ＃ＡＨＣＯ４２２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５５０５１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＭＡＢ２０２、またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＭＡＢ６０２由来）であり、そして検出抗体は、それぞれ、モノクローナル抗ヒトＩＬ２−ビオチン化抗体（例えば、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ＃ＡＨＣ０６９またはＥｎｄｏｇｅｎ／Ｐｉｅｒｃｅ  ＃Ｍ−６００−Ｂ由来）、またはモノクローナル抗ＨＳＡ抗体（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ  ＃４Ｔ２４）であり、結合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＳＡ−５００４）であり、そして基質は、ＫＰＬ  ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ  ＃５０−７６−０１）であった。分析を、製造者のプロトコルに従って、および／または当該分野で公知の方法によって、実施した。
【１０９３】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞における構築物ＩＤ  ＃１８１２から発現されたＩＬ２アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティーカラムによる小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５工程による大スケールのいずれかで精製した：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＱ−セファロース高速カラムクロマトグラフィーを使用する高速クロマトグラフィー（実施例４を参照のこと）。ＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムから、１００〜２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムから、１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、そして、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから、５〜７．５ｍＳ／ｃｍで溶出した。Ｎ末端配列決定は、ＩＬ２の成熟形態のアミノの末端に対応する配列ＡＰＴＳＳＳＴを生じるはずである。
【１０９４】
（ＩＬ２の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
マウスＣＴＬＬ  Ｔ細胞株を使用し、これは細胞の増殖および生存について、ＩＬ２に対して完全に依存性である。この細胞株は、高レベルの高親和性ＩＬ２レセプターを発現し、そして非常に低い用量のＩＬ２に対して極めて感受性である。
【１０９５】
（方法）
ＣＴＬＬ−２細胞（マウスＩＬ２依存性Ｔ細胞株）を、５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ２およびＢＭＥを含むＲＰＭＩ  １０％  ＦＢＳ中で増殖させる。アッセイの前に、これらの細胞を、ＰＢＳで二回洗浄して、ＩＬ２を除去する。１×１０４細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに、ＲＰＭＩ  １０％  ＦＢＳの最終容量２００μｌで播種した。酵母および２９３Ｔの上清を、１０％、５％および１％の最終濃度で試験する。さらに、組換えヒトＩＬ２、「ｈｆＩＬ２」を、ネガティブコントロールの上清（ＨＳＡのみ）中で希釈して、組換えタンパク質の安定性に対する培地の影響を試験する。これらの細胞を、３７℃で２０時間培養し、次いで、１μＣｉの３Ｈ−チミジンで６時間パルスする。増殖を、チミジン取り込みによって測定し、各サンプルを三重で試験する。
【１０９６】
（構築物１８１２によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
ＣＴＬＬ−２細胞（マウスＩＬ２依存性Ｔ細胞株）を、５ｎｇ／ｍＬの組換えＩＬ２およびＢＭＥを含むＲＰＭＩ  １０％  ＦＢＳ中で増殖させた。アッセイの前に、これらの細胞を、ＰＢＳで二回洗浄して、ＩＬ２を除去した。１×１０４細胞／ウェルを、９６ウェルプレートに、ＲＰＭＩ  １０％  ＦＢＳの最終容量２００μｌで播種した。酵母および２９３Ｔの上清を、１０％、５％および１％の最終濃度で試験した。さらに、組換えヒトＩＬ２、「ｒｈＩＬ２」を、ネガティブコントロールの上清（ＨＳＡのみ）中で希釈して、組換えタンパク質の安定性に対する培地の影響を試験した。これらの細胞を、３７℃で２０時間培養し、次いで、１μＣｉの３Ｈ−チミジンで６時間パルした。増殖を、チミジン取り込みによって測定し、各サンプルを三重で試験した。
【１０９７】
（結果）
ＩＬ２アルブミン融合構築物ＩＤ  ＃１８１２は、用量依存性の様式で、ＣＴＬＬ−２細胞の増殖を刺激した（図９を参照のこと）。
【１０９８】
（構築物１８１２によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得る：治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答）
マウスモデルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＲＥＮＣＡ腺癌を用いる。これらの研究で使用されるＲＥＮＣＡ腫瘍は自然に生じた。このＲＥＮＣＡ腫瘍は、元々、ＮＣＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のＤｒ．Ｓａｒａｈ  Ｓｔｅｗａｒｔによって単離された。ＲＥＮＣＡ腫瘍は、５０個程度の少ない生存細胞の移入後、次第に増殖し、そして、腎臓内移植物から局所的リンパ節、肺、肝臓および脾臓、ならびに他の器官へ自発的に転移する。ＲＥＮＣＡの免疫原性は、低〜中程度であることが決定されている。ＲＥＮＣＡ保有マウスは、通常、１×１０５個のＲＥＮＣＡ腫瘍細胞の腎臓内注射後３５〜４０日以内に、死亡する。同じ数の細胞のＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を腹腔内投与されたマウスは、通常、３０〜５０日以内に死亡する。
【１０９９】
（方法）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）（ｎ＝１０）の中腹部に、インビボ第４継代から得られた１０５個のＲＥＮＣＡ細胞を皮下注射した。プラセボ（ＰＢＳ）、ＨＳＡ、ｒｈＩＬ２（０．１２２ｍｇ／ｋｇ／ＱＤまたは２００，０００または３００，０００Ｕ／マウス）、またはＩＬ２アルブミン融合タンパク質（０．６１ｍｇ／ｋｇ）での毎日（ＱＤ）または一日おき（ＱＯＤ）の１０日後、マウスを、腫瘍播種後１４、１７、２１、２５、２８または３１日目における腫瘍サイズにおける変化についてモニタリングした。データを、ドット分析において表し、ここで各ドットは単一の動物を表す。各群における横線は、平均値を表す（図１０を参照のこと）。
【１１００】
（結果）
構築物ＩＤ  ＃１８１２によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質を、上記アッセイにおいて試験した。
【１１０１】
毎日または一日おきの、構築物ＩＤ  ＃１８１２から発現されたＩＬ２アルブミン融合タンパク質の投与は、腫瘍増殖に対して有意な影響を示し、増殖の遅延および／または腫瘍サイズの縮小を生じた。一日おきの投与は、より有利であった。なぜなら、耐性レベルがより大きかったからである（図１０を参照のこと）。播種の日から３１日目までに、ＩＬ２アルブミン融合産物を投与された１０匹のマウスのうち３匹のマウスは、腫瘍を有さず、２匹のみが、減少した腫瘍の徴候を示し、そして４匹のマウスが、収縮したと考えられる小さな腫瘍を有していた。１匹のマウスのみが、この処置に対して有利に応答しなかった。ＩＬ２アルブミン融合タンパク質での毎日の処置はまた、腫瘍の増殖の遅延または実際の収縮を生じた（実験終了日において、１０匹のうち２匹は、腫瘍を有さず、残りの７匹のマウスは小さな腫瘍を有し、そして２匹は、大きな腫瘍を有した）。０．６１ｍｇ／ｋｇのＩＬ２アルブミン融合タンパク質を投与されたすべての動物は、終了日に生存しており、一方、プラセボ（ＰＢＳ）を投与されたマウスのうちわずか４０％、およびＨＳＡを投与されたマウスの７０％が生存していた。生物学的効果は、２００，０００Ｕ／マウスまたは３００，０００Ｕ／マウスのいずれかの組換えヒトＩＬ２の毎日の投与よりもはるかに大きく示された。組換えヒトＩＬ２は、腫瘍増殖に対する乏しい効果しか有さなかった（ｒｈＩＬ２を投与されたすべてのマウスは、腫瘍を発生し、そして観察された唯一の効果は増殖遅延であった）。ｒｈＩＬ２（２００，０００または３００，０００Ｕ／ｍＬ）を投与された１０匹のマウスのうち、３匹は、３１日までに死亡した。試験された０．１２２ｍｇ／ｋｇ／日の低い投与量は、腫瘍増殖を阻害することも、腫瘍関連の死からマウスを助けることもなかった。ＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、インビボＲＥＮＣＡ増殖を強力に阻害し、そしていくつかの場合において、腫瘍からの完全な回復を生じた。
【１１０２】
（実施例１６：構築物ＩＤ２０３０、ＩＬ２−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２０３０（ｐＳＡＣ３５：ｙｃｏＩＬ２．Ａ２１−Ｔ１５３．ＨＳＡ）は、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）、ＩＬ２タンパク質の成熟形態（すなわち、Ａ２１−Ｔ１５３）を有する。
【１１０３】
（ＩＬ２  ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＬ２オープンリーディングフレーム「ＯＲＦ」ＤＮＡは、野生型ＩＬ２遺伝子にハイブリダイズしないように最適化されたコドンであった。コドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、６個の重複オリゴヌクレオチドによってＰＣＲ生成し、そしてＴＡベクターにクローニングした。このコドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＬ２−３およびＩＬ２−４を使用してこのクローンからＰＣＲ増幅し、Ｓａｌ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉで切断し、そしてＸｈｏ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉで切断したｐＳｃＣＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ  ＃２０３０は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、およびＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合されたＩＬ２の成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
【１１０４】
ＩＬ２の成熟形態をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＬ２−３およびＩＬ２−４）を合成した。
【１１０５】
【化１７】
2013172734.tif 000142
ＩＬ２−３は、Ｓａｌ  Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＬ２の成熟形態の最初の８アミノ酸残基をコードする２４ヌクレオチドを含む。ＩＬ２−４において、Ｃｌａ  Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の２４個のヌクレオチドは、ＩＬ２の最後の８個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＰＣＲ増幅体を、３つのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｓａｌ  Ｉ制限酵素およびＣｌａ  Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏ  Ｉ部位およびＣｌａ  Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＮｏｔ  Ｉフラグメント含有ＩＬ２ｂアルブミン融合タンパク質発現カセットを、Ｎｏｔ  Ｉで切断されるｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
【１１０６】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＩＬ２配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１１０７】
本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくはＩＬ２の成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２１〜Ｔｈｒ−１５３）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＬ２アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＬ２シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１１０８】
（構築物２０３０の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０へのトランスフェクションを、当該分野で公知の方法によって（実施例３を参照のこと）、構築物ＩＤ  １８１２について先に記載されたようにして（実施例１５を参照のこと）実施し得る。
【１１０９】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞における構築物ＩＤ  ＃２０３０から発現されたＩＬ２−ＨＳＡを含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティーカラムによる小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５工程による大スケールのいずれかで精製し得る：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＱ−セファロース高速カラムクロマトグラフィーを使用する高速クロマトグラフィー（実施例４および実施例１５を参照のこと）。Ｎ末端配列決定は、ＩＬ２の成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＡＰＴＳＳＳＴ（配列番号２１４２）を生じるはずである。
【１１１０】
（構築物２０３０によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
構築物ＩＤ２０３０の活性は、実施例１５のようなインビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。
【１１１１】
（構築物２０３０によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得る：治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答）
構築物２０３０によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、実施例１５に記載されるようなインビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得、ここで治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答がモニタリングされる。
【１１１２】
（実施例１７：構築物ＩＤ２０３１、ＨＳＡ−ＩＬ２、産生）
構築物ＩＤ２０３１（ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．ｙｃｏＩＬ２．Ａ２１−Ｔ１５３）は、ＩＬ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＩＬ２の成熟形態（Ａ２１−Ｔ１５３）のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）を含むＨＳＡ全長配列を有する。
【１１１３】
（ＩＬ２  ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＬ２オープンリーディングフレーム「ＯＲＦ」ＤＮＡは、野生型ＩＬ２遺伝子にハイブリダイズしないように最適化されたコドンであった。コドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、６個の重複オリゴヌクレオチドによってＰＣＲ生成し、そしてＴＡベクターにクローニングした。このコドン最適化ＩＬ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＬ２−５およびＩＬ２−６を使用してこのコドンからＰＣＲ増幅し、Ｂｓｕ  ３６Ｉ／Ｐｍｅ  Ｉで切断し、そしてＢｓｕ  ３６Ｉ／Ｐｍｅ  Ｉで切断したｐＳｃＮＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ  ＃２０３１は、ＨＳＡのキメラリーダー配列および成熟形態、ならびにＩＬ２の成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
【１１１４】
ＩＬ２の成熟形態をコードするポリヌクレオチドの最適化されたコドンのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＬ２−５およびＩＬ２−６）を合成した。
【１１１５】
【化１８】
2013172734.tif 000143
ＩＬ２−５は、Ｂｓｕ  ３６Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡの成熟形態の最後の４アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＬ２の成熟形態の最初の８アミノ酸残基をコードする２４ヌクレオチドを含む。ＩＬ２−６において、Ｐｍｅ  Ｉ部位は、下線を引いて示され（配列番号８３４）、そして最後の２４ヌクレオチドは、ＩＬ２の最後の８アミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＰＣＲ増幅体を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｂｓｕ  ３６Ｉ制限酵素およびＰｍｅ  Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＮＨＳＡベクターのＢｓｕ  ３６Ｉ部位およびＰｍｅ  Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＩＬ２アルブミン融合タンパク質発現カセットを含むＮｏｔ  Ｉフラグメントを、Ｎｏｔ  Ｉで切断したｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
【１１１６】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１１１７】
本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくはＩＬ２の成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２１〜Ｔｈｒ−１５３）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＬ２アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＬ２シグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＬ２アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１１１８】
（構築物ＩＤ  ２０３１の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０へのトランスフェクションを、当該分野で公知の方法によって（実施例３を参照のこと）、構築物ＩＤ  １８１２について先に記載されたようにして（実施例１５を参照のこと）実施し得る。
【１１１９】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において構築物ＩＤ  ＃２０３１から発現されたＨＳＡ−ＩＬ２を含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティーカラムによる小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５工程による大スケールのいずれかで精製し得る：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用する陽イオン交換クロマトグラフィーまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー、およびＱ−セファロース高速カラムクロマトグラフィーを使用する高速クロマトグラフィー（実施例４および実施例１５を参照のこと）。Ｎ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノの末端に対応する配列ＤＡＨＫＳ（配列番号２１４３）を生じるはずである。
【１１２０】
（構築物２０３１によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
構築物ＩＤ  ２０３１の活性は、実施例１５に記載されるようにして、インビトロＴおよびＮＫ細胞株増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。
【１１２１】
（構築物２０３１によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、インビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得る：治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答）
構築物２０３１によってコードされるＩＬ２アルブミン融合タンパク質の活性は、実施例１５に記載されるようなインビボＢＡＬＢ／ｃモデルを使用してアッセイされ得、ここで治療に対するＲＥＮＣＡ腫瘍応答がモニタリングされる。
【１１２２】
（実施例１８：ＩＬ２アルブミン融合タンパク質についての適応症）
ＩＬ２アルブミン融合タンパク質（構築物１８１２、２０３０および２０３１によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない）の適応症としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固形腫瘍、転移性腎細胞癌腫、転移性黒色腫、悪性黒色腫、腎細胞癌腫、ＨＩＶ感染の処置（ＡＩＤＳ）、炎症性腸障害、カポージ肉腫、白血病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、移植拒絶、Ｉ型糖尿病、肺癌、急性骨髄性白血病、Ｃ型肝炎、非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌。
【１１２３】
（実施例１９：構築物ＩＤ１６４２、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１６４２（ｐＳＡＣ３５：ＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｐ２０４．ＨＳＡ）は、ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）、顆粒球コロニー刺激因子、「Ｇ−ＣＳＦ」タンパク質（すなわち、Ｔ３１−Ｐ２０４）の「短い形態」の成熟形態を有する。
【１１２４】
（ＧＣＳＦ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＧＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＧＣＳＦ−１およびＧＣＳＦ−２を使用してＰＣＲ増幅した。増幅体を、Ｓａｌ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉで切断し、Ｘｈｏ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉで切断されたｐＳｃＣＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ  ＃１６４２は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、ＧＣＳＦの成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含む、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。
【１１２５】
ＧＣＳＦの成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＧＣＳＦ−１およびＧＣＳＦ−２）を合成した：
【１１２６】
【化１９】
2013172734.tif 000144
ＧＣＳＦ−１は、Ｓａｌ  Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、ＨＳＡキメラリーダー配列の最後の３アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＧＣＳＦの成熟形態の最初の６アミノ酸残基をコードする２０ヌクレオチドを含む。ＧＣＳＦ−２において、Ｃｌａ  Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の２１個のヌクレオチドは、ＧＣＳＦの最後の７個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である。ＰＣＲ増幅体（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｓａｌ  Ｉ制限酵素およびＣｌａ  Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏ  Ｉ部位およびＣｌａ  Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＧＣＳＦアルブミン融合発現カセットを含むＮｏｔ  Ｉフラグメントを、Ｎｏｔ  Ｉで切断されたｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
【１１２７】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＧＣＳＦ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
【１１２８】
本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、好ましくはＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２０４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１１２９】
（構築物ＩＤ  １６４２の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物１６４２の、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｄ８８、ＢＸＰ１０およびＤＸＹ１−ａＹＡＰ３変異体への形質転換を、当該分野で公知の方法によって実施した（実施例３を参照のこと）。この形質転換された酵母が、融合構築物によってコードされるタンパク質を産生する場合、予備的な「ハロアッセイ（ｈａｌｏ  ａｓｓａｙ）」を実施した。ＨＳＡ融合タンパク質の、抗ＨＳＡ抗体を含む寒天培地への分泌は、不溶性「沈降素」のリングまたはハロの形成を生じる。このハロのサイズは、産生されるＨＳＡタンパク質の量に比例する。ＬＥＵ２＋原栄養菌を、デキストロースを含有する合成完全ロイシンドロップアウト培地（「ＳＣＤ−Ｌｅｕ」）上で選択した。選択されたコロニーおよびポジティブコントロールを、抗ＨＳＡ抗体を含有するＢＭＭＤプレートにグリッド（ｇｒｉｄ）した。増殖後、これらのプレートを、４℃でインキュベートして、沈降素リングを形成させた。「ハロアッセイ」に基づいて、構築物１６４２の形質転換からのコロニーは、タンパク質を産生した。分泌の程度を確立するために、形質転換された細胞を、懸濁液中で４８時間増殖させた後に、定常期で収集した。３０００ｇで１０分間細胞を除去することによって、上清を収集した。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清（Ｋｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、またはアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分（すなわちＧＣＳＦ）に対する抗体を用いる免疫ブロット検出によって試験した。約８８ｋＤａの分子量のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を得た。精製のための作業可能な量を得るために、酵母形質転換体を、１ＬのＢＭＭ培地中、１５０ｒｐｍで２９．５℃で播種した。この培養物を、遠心分離し、０．４５  ｍフィルターに通した。比産生率を、ＥＬＩＳＡによって決定し、ここで、例えば、捕獲抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｌｏｎｅ  ３３１６．１１１モノクローナルマウス抗ＧＣＳＦであり、検出抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＡＦ２１４（すなわち、Ｃｌｏｎｅ  ＡＣＮ０３００８１）ビオチン化ヤギ抗ヒトＧＣＳＦ抗体であり、結合体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＳＡ−５００４）であり、そして基質は、ＫＰＬ  ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ  ＃５０−７６−０１）であり、ここで、この分析は、製造者のプロトコルに従って、および／または当該分野で公知の方法によって実施される。
【１１３０】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質の一般的な精製手順は、実施例４に記載されている。ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の精製は、以下に詳細に記載される。別の精製スキームは、実施例２０に記載される。
【１１３１】
（工程１：フェニル高速フロークロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））
構築物１６４２によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡを含有する酵母培養物上清（３Ｌ）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの硫酸アンモニウムを含むフェニル高速フローカラムに充填した。このカラムを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中０．２Ｍの硫酸アンモニウム、次いで緩衝液で洗浄した。ＧＣＳＦ−ＨＳＡ融合タンパク質を、水（Ｗａｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ  ＷＦＩ）で溶出した。
【１１３２】
（工程２：ＳＰ高速フロークロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））
工程１の溶出物を、等量の溶液（１０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４．８５ｍＭのクエン酸から構成される、ｐＨ５．０）と混合した。この混合物を、ＳＰ高速フローカラムに充填し、そして溶液（１０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４．８５ｍＭのクエン酸中０．５ＭのＮａＣｌからなる、ｐＨ５．０）で溶出した。次いで、このカラムを、溶液（１０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４．８５ｍＭのクエン酸中１ＭのＮａＣｌからなる、ｐＨ５．０）でストリップした。
【１１３３】
（工程３：メチルＨＩＣクロマトグラフィー（ＢｉｏＲａｄ））
工程２の溶出物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの硫酸アンモニウム（１４３ｍＳ）の最終濃度まで滴定し、メチルＨＩＣカラムに充填した。このカラムを、ベースラインまで洗浄し、次いで５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）中０．６Ｍの硫酸アンモニウムで洗浄した。０．６Ｍの硫酸アンモニウムから０Ｍの硫酸アンモニウムの勾配を開始した。最後に、このカラムを、ＷＦＩおよび０．５ＭのＮａＯＨでストリップした。サンプル中の多量の不純物は、より低い硫酸アンモニウム濃度で溶出し、それにより高純度のＧＣＳＦ−ＨＳＡ融合物を与えた。
【１１３４】
（工程４：ＣＭ高速フロークロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））
工程３の溶出物を、ＷＦＩで５ｍＳ（ｐＨ５．５）まで希釈し、そしてＣＭカラムに３００ｃｍ／時間で充填した。このカラムを、１１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４ｍＭのクエン酸中０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）で溶出した。このカラムを、１１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および４ｍＭのクエン酸中１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）でストリップした。
【１１３５】
（工程５：限外濾過／ダイアフィルトレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）
精製された産物を、リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）（ｐＨ７．２）中に限外濾過およびダイアフィルトレーションした。
【１１３６】
構築物１６４２によってコードされる精製されたＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって、純度について分析した。これは、＞９５％純粋であった。このタンパク質を配列決定して確認し、またこのタンパク質は、「ＴＰＬＧＰ」（配列番号２１４４）のＮ末端配列を用いるＮ末端配列分析によって、９０％の純度を示した。
【１１３７】
（ＧＣＳＦの活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイによってアッセイされ得る）
（方法）
ＧＣＳＦ活性を評価するために、ＮＳＦ−６０細胞、ＮＦＳマウスのＰｒｉｍａｒｙ  Ｌａｋｅ  Ｃａｓｃｉｔｕｓ野生エコトロピックウイルス誘導性腫瘍由来の骨髄性因子依存性細胞株を用いる。
【１１３８】
（細胞の増殖および調製）
細胞を、最初に、Ｔ−７５ｃｍ２のフラスコ中に、増殖培地（１０％  ウシ胎児血清、「ＦＢＳ」、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｌ−グルタミン（最終濃度２ｍＭ）、および組換えマウスインターロイキン−３（ＩＬ３）（３０ｎｇ／ｍＬ）を含む、ＲＰＭＩ  １６４０）中約１．５×１０４細胞／ｍＬで播種する。細胞を、２日おきに、１：１０〜１：２０のどこかでスプリットし、そして新鮮な培地中に再播種する。
【１１３９】
（ＮＦＳ−６０バイオアッセイ）
ＮＦＳ−６０アッセイを、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐｐ５０１０−４）に記載されるようにして実施する。簡単に述べると、アッセイを実施する前日に、細胞を、ＩＬ３を含む新鮮なアッセイ増殖培地中に、１．０×１０５まで再播種する。翌日、細胞を、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、低速で遠心分離し、そして血清も増殖因子も含まないプレーンＲＰＭＩで２回洗浄する。ペレットを、２５ｍＬに再懸濁し、続いて細胞を計数する。細胞を、もう一度遠心分離し、そして作業濃度であるが、ＩＬ３を含まない増殖培地（上記）中に再懸濁する。細胞を、９６ウェル丸底ＴＣ処理プレートに、１×１０５細胞／ウェルでプレーティングする。漸増する用量のＧＣＳＦを各ウェルに、最終容量０．１ｍＬまで添加する。アッセイを、三重で行う。細胞を、２４時間培養し、細胞増殖のレベルを決定する。３Ｈ−チミジン（５μＣｉ／ｍＬ）を、実験の終了の４時間前に添加する。次いで、細胞を、ガラス繊維フィルター上に、細胞収集器を使用して収集し、そして３Ｈ−チミジンで標識されたＤＮＡの量を、ＴＯＰ−Ｃｏｕｎｔを使用して計数する。
【１１４０】
（構築物ＩＤ  ＃１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る）
（方法）
構築物１６４２によってコードされるＧＳＣＦアルブミン融合タンパク質を、上記のインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖バイオアッセイで試験した。
【１１４１】
（細胞の増殖および調製）
細胞を、上記のようにして調製した。
【１１４２】
（ＮＦＳ−６０バイオアッセイ）
アッセイを実施する前日に、細胞を、ＩＬ３を含む新鮮なアッセイ増殖培地中に、１．０×１０５まで再播種した。翌日、細胞を、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、低速で遠心分離し、そして血清も増殖因子も含まないプレーンＲＰＭＩで２回洗浄した。ペレットを、２５ｍＬに再懸濁し、続いて細胞を計数した。細胞を、もう一度遠心分離し、そして作業濃度であるが、ＩＬ３を含まない増殖培地（上記）中に再懸濁した。細胞を、９６ウェル丸底ＴＣ処理プレートに、１×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。漸増する用量のＨＳＡ、組換えヒトＧＣＳＦ（ｒｈＧＣＳＦ）または酵母上清から部分的に精製されたＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質のいずれかを、個々のウェルに、最終容量０．１ｍＬまで添加する。アッセイを、三重で行った。細胞を、２４時間培養し、細胞増殖のレベルを決定した。３Ｈ−チミジン（５μＣｉ／ｍＬ）を、実験の終了の４時間前に添加した。次いで、細胞を、ガラス繊維フィルター上に、細胞収集器を使用して収集し、そして３Ｈ−チミジンで標識されたＤＮＡを、ＴＯＰ−Ｃｏｕｎｔを使用して計数した。
【１１４３】
（結果）
構築物１６４２は、ＮＦＳ−６０細胞増殖活性を、用量依存性の様式で引き起こす能力を実証し、一方で、ＨＳＡ単独を発現する酵母由来のコントロール上清は、いずれの活性をも生じなかった（図１１を参照のこと）。
【１１４４】
（ＧＣＳＦの活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用してインビボでアッセイされ得る）  （固定剤としてのＧＣＳＦ）
Ｇ−ＣＳＦは、顆粒球を周囲に固定し得、かつマウスに投与された場合、全白血球（ＷＢＣ）数を増加させ得る。組換えヒトＧＣＳＦ（ｒｈＧＣＳＦ）は、組換えマウスＧＣＳＦ（ｒｍＧＣＳＦ）と交差反応する。
【１１４５】
（方法）
注射を開始する前に、マウスの耳にタグを付ける。マウスに、７日間連続して、１日二回、５ｇ（ｎ＝５）または１０ｇ（ｎ＝５）のいずれかで、ｒｈＧＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ，ＡＭＥＮ）を腹腔内注射する。コントロールマウス（ｎ＝３）には、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳＳ）を投与する。最後のｒｈＧＣＳＦ投与の２４時間後、末梢血を尾から採取し、そして顆粒球数および全ＷＢＣ数について分析する。
【１１４６】
（結果）
両方の用量のｒｈＧＣＳＦは、顆粒球の頻度および全数の両方、ならびに全ＷＢＣ数を効率的に増加させる（図１２を参照のこと）。この効果は、最終のｒｈＧＣＳＦ腹腔内投与の２４時間後に明白である。この効果は、一過性であり、顆粒球の数は、５日目までに通常の値に戻る。
【１１４７】
（構築物ＩＤ＃１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用してインビボでアッセイされ得る：固定剤としてのＧＣＳＦ−ＨＳＡ）
（方法）
構築物１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、上記の手順に従ってアッセイされ得る。簡単に述べると、注射を開始する前に、マウスの耳にタグを付ける。マウスに、７日間連続して、１日二回、５ｇ（ｎ＝５）または１０ｇ（ｎ＝５）のいずれかで、ｒｈＧＣＳＦ（コントロールとして）、またはＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を腹腔内注射する。さらなるコントロールマウス（ｎ＝３）には、Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（「ＨＢＳＳ」）を投与する。最後のＧＣＳＦ投与の２４時間後、末梢血を尾から採取し、そして顆粒球数および全ＷＢＣ数について分析し得る。
【１１４８】
（実施例２０：構築物ＩＤ１６４３、ＨＳＡ−ＧＣＳＦ、産生）
構築物ＩＤ１６４３（ｐＳＡＣ３５：ＨＳＡ．ＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｐ２０４）は、ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５におけるＧＣＳＦタンパク質の成熟形態（すなわち、Ａ２１−Ｔ１５３）のアミノ末端に融合された、ＨＳＡキメラリーダー配列（すなわち、ＨＳＡ−ｋｅｘ２シグナルペプチド）を含む全長ＨＳＡタンパク質を有する。
【１１４９】
（ＧＣＳＦ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＧＣＳＦをコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＧＣＳＦ−３およびＧＣＳＦ−４を使用してＰＣＲ増幅した。増幅体を、Ｂｓｕ  ３６Ｉ／Ａｓｃ  Ｉで切断し、Ｂｓｕ  ３６Ｉ／Ａｓｃ  Ｉで切断されたｐＳｃＮＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ  ＃１６４３は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、およびＨＳＡの成熟形態、およびＧＣＳＦの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
【１１５０】
ＧＣＳＦの成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＧＣＳＦ−３およびＧＣＳＦ−４）を合成した：
【１１５１】
【化２０】
2013172734.tif 000145
ＧＣＳＦ−３は、Ｂｓｕ  ３６Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、およびＨＳＡの成熟形態の最後の４アミノ酸残基をコードするヌクレオチド、ならびにＧＣＳＦの成熟形態の最初の６アミノ酸残基をコードする２０ヌクレオチドを含む。ＧＣＳＦ−４において、Ａｓｃ  Ｉ部位は、下線を引いて示され、そして最後の２４ヌクレオチドは、ＧＣＳＦの最後の８アミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である。ＨＳＡ−ＧＣＳＦのＰＣＲ増幅体を、これらのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｂｓｕ  ３６Ｉ制限酵素およびＡｓｃ  Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＮＨＳＡベクターのＢｓｕ  ３６Ｉ部位およびＡｓｃ  Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、このＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットを、Ｎｏｔ  ＩフラグメントとしてｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
【１１５２】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
【１１５３】
本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２０４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１１５４】
（構築物ＩＤ１６４３の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物１６４３の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内への形質転換を、当該分野において公知の方法によって（実施例３を参照のこと）、そして構築物ＩＤ１６４２について以前に記載されたように（実施例１９を参照のこと）実施した。
【１１５５】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質の精製のための一般的な手順は、実施例４に記載されている。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において、構築物ＩＤ番号１６４３から発現されるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、以下の方法に従って精製した。別の精製スキームは、実施例１９に記載されている。
【１１５６】
（工程１：フェニルセファロース迅速フロー（ｈｓ）、ｐＨ７．２）
醗酵上清（３．５Ｌ）を、硫酸アンモニウムで１３９ｍＳおよびｐＨ７．２に調整し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）中１Ｍの最終濃度にした。フェニルセファロースカラムを、３００ｃｍ／ｈｒの流量で充填した。このカラムを５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄した。一連の低塩溶出を実施して、夾雑タンパク質を除去し、その後、ＷＦＩ溶出によって、標的タンパク質を溶出した。このカラムのＮａＯＨ除去は、かなりの部分の標的タンパク質が、先の処理によって除去されないことを明らかにした。
【１１５７】
（工程２：Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅ、ｐＨ６．５）
溶出した標的タンパク質を、２０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液（ＣＰＢ）（ｐＨ６．５）でダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）し、次いで、予め２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）緩衝液で平衡化したＭｉｍｅｔｉｃ  Ｂｌｕｅカラムに充填した。このカラムを、１０カラム体積で、平衡化緩衝液で洗浄した。次いで、標的タンパク質の大部分を、０．２Ｍ  ＮａＣｌ洗浄で溶出した。より高い塩濃度の溶出溶液（１Ｍおよび２ＭのＮａＣｌ）は、何らかの標的タンパク質を明らかにした。しかし、ＨＰＬＣ−ＳＥＣをこれらの画分に対して実施した場合、大部分の標的タンパク質は、凝集物として観察された。この精製工程は、８５％より高純度の標的タンパク質を生じた。
【１１５８】
（工程３：Ｑ  ＨＰ、ｐＨ６．５）
標的タンパク質を２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）（５倍）で希釈して、５ｍＳ未満の導電率にし、そしてＱ  ＨＰ樹脂に充填した。一連の溶出（１００ｍＭ、２００ｍＭ、５００ｍＭ、および１ＭのＮａＣｌ）を実施した。標的タンパク質は、１００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。
【１１５９】
（工程４：ＳＰ  ＦＦ、ｐＨ５．５）
標的タンパク質を、２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ５．０）で希釈し、そしてｐＨを５．０に調整した。標的タンパク質を、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに充填した。このカラムを、５カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。４５ｋＤａの夾雑タンパク質（ＨＳＡのタンパク質分解したフラグメント）は、この樹脂に結合せず、そして充填フロースルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｕ）（ＬＦＴ）中で観察された。標的タンパク質は、０〜５００ｍＭのＮａＣｌの浅い傾斜で溶出した。標的タンパク質は、約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。標的タンパク質を、２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）の最終貯蔵緩衝液中にダイアフィルトレーションした。
【１１６０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、９５％より高純度の８８ｋＤａのタンパク質を同定した。Ｎ末端配列決定の結果、主要な配列は「ＤＡＨＫＳ」（配列番号２１４３）であり、これは、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端である。最終的な緩衝液の組成は、２０ｍＭのＣＰＢ（ｐＨ６．５）である。３．５Ｌの培養上清から、１．９４ｍｇのタンパク質が精製された。
【１１６１】
（構築物ＩＤ番号１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。）
（方法）
構築物１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質を、副節の表題「ＧＣＳＦの活性はインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」および「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性はインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」の下の実施例１９において先に記載されたインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖バイオアッセイにおいて試験した。
【１１６２】
（結果）
構築物１６４３は、ＮＦＳ−６０細胞増殖を、用量依存性の様式で引き起こす能力を実証し、一方で、ＨＳＡ単独を用いたコントロール上清は、いずれの活性をも生じなかった（図１１を参照のこと）。
【１１６３】
（構築物ＩＤ番号１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡを改変剤として、インビボでアッセイされ得る。）
（方法）
構築物１６４３によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、副節の表題「ＧＣＳＦの活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡを改変剤として、インビボでアッセイされ得る」および「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡを改変剤として、インビボでアッセイされ得る。」の下の実施例１９において先に記載された手順に従って、アッセイされ得る。
【１１６４】
（実施例２１：ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の適応症）
上記アッセイにおけるＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質の活性に基づいて、ＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質は、炎症性障害、骨芽細胞白血病、一次好中球減少症（例えば、Ｋｏｓｔｍａｎｎ症候群）、二次好中球減少症、好中球減少症の予防、ＨＩＶ感染患者における好中球減少症の予防および処置、化学療法に関連する好中球減少症の予防および処置、好中球減少症に関連する感染、脊髄嚢胞（ｍｙｅｌｏｐｙｓｐｌａｓｉａ）、ならびに自己免疫障害、造血前駆細胞の動員、骨髄移植、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、亢進性骨髄回復、およびグリコゲン貯蔵疾患を、化学的予防、処置、予防、ならびに／または診断する際に、有用である。
【１１６５】
（実施例２２：構築物ＩＤ２３６３、ＧＦＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２、産生）
構築物ＩＤ２３６３（ｐＣ４：ＧＣＳＦ．ＨＳＡ．ＥＰＯ−Ａ２８−Ｄ１９２）は、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。この三重融合タンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の全長形態を有し、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合するタンパク質であり、このＨＳＡは、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端（すなわち、アミノ酸Ａ２８−Ｄ１９２）に融合しており、ＣＨＯ哺乳動物細胞株発現ベクターｐＣ４における最後のＡｒｇ残基を例外とする。
【１１６６】
（ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ番号１６４２、すなわち、ｐＳＡＣ３５：ＨＧＣＳＦ．Ｔ３１−Ｐ２０４．ＨＳＡ（実施例１９）をテンプレートとして使用して、構築物２３６３の一部を産生した。以下のポリヌクレオチドを合成した：
【１１６７】
【化２１】
2013172734.tif 000146
ＧＣＳＦの全長配列を、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−１、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−３、およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４の組み合わせを使用して、３段階オーバーラッピングＰＣＲ反応において産生した。プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−１、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−３およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４は、ＧＣＳＦの全長のアミノ末端にまたがる配列からなる。プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２は、ＨＳＡのアミノ酸Ｓｅｒ−２１６〜Ａｌａ−２２５にまたがる配列の逆相補体からなる。第一のＰＣＲ反応は、構築物１６４２をテンプレートとして、ならびにプライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−１およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２を含んだ。第一のＰＣＲ反応から得られた産物を、第二のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用し、この反応は、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−３およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２を含んだ。第二のＰＣＲ反応から得られた産物を、第三のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用し、この反応は、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−２を含んだ。プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−４は、Ｂａｍ  ＨＩ部位（斜体で示される）、引き続いてＫｏｚａｋ配列（下線を引かれて示される）を有する。最後のＰＣＲ産物は、５’Ｂａｍ  ＨＩ制限部位、引き続いて適切なＫｏｚａｋ配列、その全長ＧＣＳＦコード配列全体およびＨＳＡオープンリーディングフレーム（Ａｓｐ−２５〜Ａｌａ−２２５）の一部を含む。Ｃｌａ  Ｉ部位は、ＨＳＡの成熟形態のポリヌクレオチド配列に固有であり、そしてＨＳＡの成熟形態の５’末端のすぐ近くに位置する。Ｂａｍ  ＨＩ−Ｃｌａ  Ｉフラグメントを、同様に消化したｐＣ４．ＨＳＡ．ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２構築物ＩＤ番号１９８１にクローニングした。
【１１６８】
構築物ＩＤ番号２３６３は、ＧＣＳＦのリーダーおよび成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質、続いてＥＰＯの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
【１１６９】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質の、アミノ酸配列決定によるＮ末端の分析は、予測されたＧＣＳＦ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１１７０】
本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２０４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合し、そしてＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ−２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＳＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付ける、シグナル配列をさらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドは、除去され、そして成熟ＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養倍地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列またはネイティブＥＰＯシグナル配列のいずれかを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１１７１】
（構築物ＩＤ２３６３の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
構築物２３６３は、実施例６および８に先に記載されるように、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクトされ得る。
【１１７２】
（ＣＨＯ上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質についての一般的な精製手順は、実施例７に記載されている。構築物２３６３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯは、実施例７および９において先に記載されたように精製され得る。Ｎ末端配列決定は、ＧＣＳＦの成熟形態に対応する、配列ＴＰＬＧＰ（配列番号２１４４）を生じるはずである。
【１１７３】
（構築物ＩＤ番号２３６３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯの活性は、インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイおよびインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。）
（方法）
構築物２３６３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようなインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、および実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたようなインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイにおいて、アッセイした。
【１１７４】
（結果）
構築物２３６３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯアルブミン融合物は、ＴＦ−１細胞とＮＦＳ−６０細胞との両方の増殖を実証した。
【１１７５】
（構築物ＩＤ番号２３６３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯアルブミン融合物の活性はインビボでアッセイされ得る。）
構築物２３６３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１の活性は、ヘマトクリットを測定するためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、インビボＨａｒｌａｎマウスモデルにおいて、およびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて（ここで、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯは動員剤である）、実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して：ＧＣＳＦ−ＨＳＡを動員剤としてインビボでアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、アッセイし、ヘマトクリットレベルを測定し得る。
【１１７６】
（実施例２３：構築物ＩＤ２３７３、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ａ２８−Ｄ１９２、産生）
構築物ＩＤ２３７３（ｐＣ４：ＧＣＳＦ．ＨＳＡ．ＥＰＯ−Ａ２８−Ｄ１９２．Ｒ１４０Ｇ）は、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。この三重融合タンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子「Ｇ−ＣＳＦ」の全長形態を有し、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合するタンパク質であり、このＨＳＡは、ＥＰＯの成熟形態のアミノ末端（すなわち、Ａ２８−Ｄ１９２）に融合しており、ＣＨＯ哺乳動物細胞株発現ベクターｐＣ４において、Ａｒｇ−１４０のＧｌｙへの変異を有する。
【１１７７】
（構築物２３７３についてのＥＰＯ  ｃＤＮＡのクローニング）
構築物ＩＤ番号２３７３は、ＧＣＳＦのリーダー配列および成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質、続いてＥＰＯの成熟形態（これは、Ａｒｇ−１４０からＧｌｙへの変異を有する）を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（配列番号４０１）。構築物ＩＤ番号２３７３を、構築物ＩＤ番号２３６３（すなわち、ｐＣ４：ＧＣＳＦ．ＨＳＡ．ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇ）をＰＣＲ変異誘発のためのテンプレートとして使用して、産生した。
【１１７８】
構築物ＩＤ番号２３６３のテンプレートのＰＣＲ増幅のために適切な４つのオリゴヌクレオチド（ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−６、ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−７、およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８）を合成した。
【１１７９】
【化２２】
2013172734.tif 000147
構築物２３７３を、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ増幅によって、構築物２３６３をテンプレートとして使用して産生した。第一回のＰＣＲ増幅において、構築物ＩＤ２３６３のＮ末端フラグメントおよびＣ末端フラグメントを、独立して増幅した。Ｎ末端フラグメントを、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−６を使用して産生した。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５は、ＨＳＡの全長形態のアミノ酸残基３３４〜３４０をコードする核酸配列に対応する。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−６プライマーは、ＥＰＯの全長形態のアミノ酸１３６〜１４３にわたる配列の逆相補体を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）がＧｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。Ｃ末端フラグメントを、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−７およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８を使用して産生した。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−７プライマーは、ＥＰＯの全長形態のアミノ酸１３６〜１４３をコードする核酸配列を含む（アミノ酸１４０におけるＡｒｇ残基をコードするコドンＣＧＡ（太字で強調されている）がＧｌｙ残基をコードするコドンＧＧＡに変更されていることを例外とする）。ＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８において、この配列は、終止コドンの下流のｐＣ４ベクター内のヌクレオチドを含む。第二回のＰＣＲ増幅において、プライマーＧＣＳＦ／ＥＰＯ−５およびＧＣＳＦ／ＥＰＯ−８を使用して、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合タンパク質を増幅した。この三重融合タンパク質は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合するＧ−ＣＳＦの全長形態を有し、このＨＳＡは、Ａｒｇ−１４０からＧｌｙへの変異を有するＥＰＯの全長形態のアミノ末端（すなわち、Ａ２８−Ｄ１９２）に融合している。この反応混合物は、ＰＣＲ増幅されたＮ末端フラグメントおよびＰＣＲ増幅されたＣ末端フラグメントの両方を含んだ。
【１１８０】
ＰＣＲ産物を精製し、次いで、Ｂｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩで消化した。Ｂｓｕ３６Ｉ−ＡｓｃＩフラグメントの、ゲル電気泳動によるさらなる精製の後、この産物を、Ｂｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩで消化された構築物２３６３にクローニングして、構築物ＩＤ番号２３７３を生じた。
【１１８１】
さらに、アミノ酸配列決定によるアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予測されたＧＣＳＦ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１１８２】
本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＧＣＳＦの成熟形態（すなわち、Ｔｈｒ−３１〜Ｐｒｏ−２４０）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合し、そしてＥＰＯの成熟形態（すなわち、Ａｌａ２８〜Ａｓｐ−１９２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＧＣＳＦシグナル配列またはネイティブＥＰＯシグナル配列のいずれかを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＧＣＳＦ／ＥＰＯアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１１８３】
（構築物ＩＤ２３７３の発現および精製）
（ＣＨＯ細胞における発現）
構築物２３７３は、実施例６および８に先に記載されるように、ＣＨＯ細胞内にトランスフェクトされ得る。
【１１８４】
（ＣＨＯ上清からの精製）
アルブミン融合タンパク質についての一般的な精製手順は、実施例７に記載されている。構築物２３７３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇは、実施例７および８において先に記載されたように精製され得る。Ｎ末端配列決定は、ＧＣＳＦの成熟形態に対応する、配列ＴＰＬＧＰ（配列番号２１４４）を生じるはずである。
【１１８５】
（構築物ＩＤ番号２３７３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇの活性は、インビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイおよびインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る。）
（方法）
構築物２３７３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１についてのインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイ」の下で先に記載されたようなインビトロＴＦ−１細胞増殖アッセイにおいて、および実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、インビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたようなインビトロＮＦＳ−６０細胞増殖アッセイにおいて、アッセイし得る。
【１１８６】
（結果）
構築物２３７３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇアルブミン融合物は、ＴＦ−１細胞とＮＦＳ−６０細胞との両方の増殖を実証した。
【１１８７】
（構築物ＩＤ番号２３７３によってコードされるＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇアルブミン融合物の活性はインビボでアッセイされ得る。）
（方法）
構築物２３７３によってコードされる三重融合タンパク質ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ．Ｒ１４０Ｇの活性を、実施例９において副節の表題「構築物１９８１の活性は、ヘマトクリットを測定するためのインビボＨａｒｌａｎマウスモデルを使用してアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、インビボＨａｒｌａｎマウスモデルにおいて、およびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて（ここで、ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯは動員剤である）、実施例１９において副節の表題「構築物ＩＤ番号１６４２によってコードされるＧＣＳＦアルブミン融合物の活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して：ＧＣＳＦ−ＨＳＡを動員剤としてインビボでアッセイされ得る」の下で先に記載されたように、アッセイし、ヘマトクリットレベルを測定し得る。
【１１８８】
（実施例２４：ＧＣＳＦ−ＨＳＡ−ＥＰＯ三重融合物の適応症）
ＧＣＳＦ、ＥＰＯおよびＨＳＡを含む三重融合タンパク質（構築物２３６３および２３７３によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない）の適応症としては、ＥＰＯアルブミン融合タンパク質およびＧＣＳＦアルブミン融合タンパク質について詳述した適応症が挙げられ得、種々の状態（末期腎臓疾患（透析患者）、透析前の慢性腎不全、ジドブジン処置されたＨＩＶ患者、化学療法中の癌患者、および未熟児が挙げられるが、これらに限定されない）によって引き起こされる出血障害および貧血；輸血の必要性を減少させるために、選択的な非心臓の非脈管の手術を受けている貧血患者における手術前；再生不良性貧血および他の難治性貧血、炎症性腸疾患における難治性貧血、ならびに選択的整形外科化学防御における輸血逃避；炎症性障害、骨髄細胞白血病、一次好中球減少症（例えば、Ｋｏｓｔｍａｎｎ症候群）、二次好中球減少症の処置、予防、および／または診断、好中球減少症の予防、ＨＩＶ感染患者における好中球減少症の予防および処置、化学療法に関連する好中球減少症の予防および処置、好中球減少症に関連する感染、脊髄嚢胞、ならびに自己免疫障害、造血前駆細胞の動員、骨髄移植、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ホジキン病、加速骨髄回復、ならびにグリコゲン貯蔵疾患；が挙げられるが、これらに限定されない。
【１１８９】
（実施例２５：構築物ＩＤ２０５３、ＩＦＮｂ−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２０５３（ｐＥＥ１２．１：ＩＦＮｂ．ＨＳＡ）は、ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、この融合タンパク質は、ＮＳ０発現ベクターｐＥＥ１２．１におけるＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、ネイティブＩＦＮｂリーダー配列を含む全長ＩＦＮｂタンパク質を有する。
【１１９０】
（ＩＦＮｂ  ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＦＮｂをコードするポリヌクレオチドを、以下に記載されるプライマーＩＦＮｂ−１およびＩＦＮｂ−２を使用してＰＣＲ増幅し、Ｂａｍ  ＨＩ／Ｃｌａ  Ｉで切断し、そしてＢａｍ  ＨＩ／Ｃｌａ  Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結して、構築物２０１１を生じた。構築物ＩＤ番号２０１１由来のＥｃｏ  ＲＩ／Ｅｃｏ  ＲＩフラグメントを、ｐＥＥ１２．１のＥｃｏ  ＲＩ部位にサブクローニングし、構築物ＩＤ番号２０５３を産生した。構築物ＩＤ番号２０５３は、ＩＦＮｂのリーダー配列および成熟形態、続いて成熟ＨＳＡタンパク質を含む、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。
【１１９１】
ＩＦＮｂの全長をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのオリゴヌクレオチド（ＩＦＮｂ−１およびＩＦＮｂ−２）を合成した：
【１１９２】
【化２３】
2013172734.tif 000148
ＩＦＮｂ−１プライマーは、Ｂａｍ  ＨＩクローニング部位（下線を引いて示される）、Ｅｃｏ  ＲＩクローニング部位、およびＫｏｚａｋ配列（斜体で示される）、続いてＩＦＮｂの全長形態の最初の２７個のアミノ酸をコードする８０個のヌクレオチドを含む。ＩＦＮｂ−２において、Ｃｌａ  Ｉ部位（下線を引いて示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１０３８）の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体であり、そして最後の１８個のヌクレオチドは、ＩＦＮｂの最後の６個のアミノ酸残基をコードするＤＮＡの逆相補体である（実施例２を参照のこと）。ＰＣＲ増幅体（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を、３つのプライマーを使用して産生し、精製し、Ｂａｍ  ＨＩ制限酵素およびＣｌａ  Ｉ制限酵素で消化し、そしてｐＣ４：ＨＳＡベクターのＢａｍ  ＨＩ部位およびＣｌａ  Ｉ部位にクローニングした。配列を確認した後に、ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質発現カセットを含むＥｃｏ  ＲＩフラグメントを、Ｅｃｏ  ＲＩ消化されたｐＥＥ１２．１にサブクローニングした。
【１１９３】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＩＦＮｂ配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１１９４】
本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＦＮｂの成熟形態（すなわち、Ｍｅｔ−２２〜Ａｓｎ−１８７）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、ネイティブＩＦＮｂを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１１９５】
（構築物ＩＤ２０５３の発現および精製）
（マウス骨髄腫ＮＳ０細胞株における発現）
構築物ＩＤ番号２０５３（ｐＥＥ１２．１：ＩＦＮｂ−ＨＳＡ）を、当該分野において公知の方法によって、ＮＳ０細胞にエレクトロポレーションした（実施例６を参照のこと）。
【１１９６】
（ＮＳ０細胞上清からの精製）
ＮＳ０細胞上清からのＩＦＮｂ−ＨＳＡの精製は、実施例１０に記載される方法に従い得る。この方法は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を使用する、ｐＨ７．４におけるＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィー、続いて５〜４０ｍＭのクエン酸ナトリウム勾配を用いる、ｐＨ６．５におけるＰｏｒｏｓ  ＰＩ  ５０陰イオン交換クロマトグラフィー、および１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌの最終緩衝液濃度への、６ＤＶについてのダイアフィルトレーションを包含する。Ｎ末端配列決定は、配列ＭＳＹＮＬＬを生じるはずであり、これは、ＩＦＮｂの成熟形態のアミノ末端である。このタンパク質は、８８．５ｋＤａのおよそのＭＷを有する。
【１１９７】
より大きい規模の精製（例えば、５０ＬのＮＳ０細胞上清）については、約８〜１０Ｌに濃縮され得る。次いで、濃縮されたサンプルは、ｐＨ７．５で、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる段階溶出を使用して、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換カラム（１０×１９ｃｍ、１．５Ｌ）に通され得る。次いで、溶出されたサンプルは、０．７５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００とともに、室温で６０分間ウイルス不活性化され得る。次いで、ＳＤＲ−逆相クロマトグラフィー（１０ｃｍ×１０ｃｍ、０．８Ｌ）を、ｐＨ６．０で、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌとともに、またはその逆で使用して、サンプルをＳＰ−セファロースカラムに、ｐＨ４．８で、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌの段階溶出を使用して通され得る。続いて、ＤＶ５０濾過して、全てのウイルス成分を除去する。続いて、Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍクロマトグラフィー（２０ｃｍ×１２ｃｍ、３．８Ｌ）を、３５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４および５０ｍＭ  ＮａＯＡｃからなる段階溶出、あるいは５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ６．０）からなる段階溶出を使用して、ｐＨ６．０で行い得る。６〜８ＤＶについてのダイアフィルトレーションは、緩衝液の、所望の最終濃度の緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋５８ｍＭスクロース＋１２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）または１０ｍＭクエン酸（ｐＨ６．５）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌまたは２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）のいずれか）への交換を可能にする。
【１１９８】
（ＩＦＮｂの活性は、インビトロＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイを使用してアッセイされ得る。）
全てのＩ型インターフェロンタンパク質は、共通のレセプター複合体および類似のＪａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路（これは最終的に、インターフェロン配列応答性エレメント（「ＩＳＲＥ」）を介する、インターフェロン（「ＩＦＮ」）応答性遺伝子の活性化となる）を介してシグナル伝達する。Ｉ型ＩＦＮ活性についての好都合なアッセイは、下流レポーター遺伝子に融合したＩＳＲＥエレメントの複数のコピーを含む、プロモーター−レポーターベースのアッセイ系である。安定なＨＥＫ２９３細胞株が産生され得、そしてＩＳＲＥ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子の安定に一体化されたコピーを含み、この細胞株は、Ｉ型ＩＦＮに対して非常に感受性であり、そして濃度の５ｌｏｇにわたる直線性を示す。
【１１９９】
（ＩＦＮｂ−ＨＳＡ  ＮＳ０安定クローンのスクリーニングの方法）
構築物２０５３を、ＮＳ０細胞に、実施例６に記載されるようにエレクトロポレーションした。構築物ＩＤ番号２０５３でトランスフェクトしたＮＳ０細胞を、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて馴化した増殖培地を試験することによって、活性についてスクリーニングした。ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞を、３×１０４細胞／ウェルで、９６ウェルのポリＤ−リジンでコーティングされたプレートに、処理の１日前にプレートした。レポーター細胞を、構築物ＩＤ２０５３によってコードされるＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質またはコントロールとしてｒｈＩＦＮｂの馴化上清または精製調製物の種々の希釈物（１：５００および１：５０００が挙げられるが、これらに限定されない）で処理した。次いで、レポーター細胞を、２４時間インキュベートし、その後、ＳＥＡＰレポーター遺伝子化学発光アッセイ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１７７９８４２）において使用するために、４０Ｌを取り出した。組換えヒトインターフェロンβ（「ｒｈＩＦＮｂ」（Ｂｉｏｇｅｎ））を、陽性コントロールとして使用した。
【１２００】
（結果）
ＮＳ０発現したＩＦＮｂ−ＨＳＡの精製調製物は、ｒｈＩＦＮｂ（Ｂｉｏｇｅｎ）（これは、１．８×１０−１０ｇ／ｍＬのＥＣ５０を有した）より大きいＥＣ５０（９．３×１０−９ｇ／ｍＬ）を有した（図１３を参照のこと）。
【１２０１】
（インターフェロンによるＯＡＳのインビボ導入）
（方法）
ＯＡＳ酵素（２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼ）を、抗ウイルス感染に応答して、インターフェロンによって、転写レベルで活性化する。インターフェロン構築物の効果を、処置されたサルから血液サンプルを得、そしてこれらのサンプルを２つのＯＡＳ  ｍＲＮＡ（ｐ４１およびｐ６９）の転写活性化について分析することによって測定し得る。０．５ｍＬの体積の白血球が、１つの群あたり４匹の動物から、７の異なる時点（１匹の動物あたり０日目、１日目、２日目、４日目、８日目、１０日目、および１４日目）で得られ得る。種々の群は、ビヒクルコントロールの注射を、静脈内および／または皮下注射で、１日目に３０ｇ／ｋｇおよび／または３００ｇ／ｋｇのＩＦＮアルブミン融合タンパク質、ならびに１日目、３日目、および５日目に、陽性コントロールとして４０ｇ／ｋｇのインターフェロンα（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の皮下注射を含み得る。ｐ４１  ｍＲＮＡ転写物およびｐ６９  ｍＲＮＡ転写物のレベルを、リアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって、ｐ４１−ＯＡＳおよびｐ６９−ＯＡＳに特異的なプローブを使用して、決定し得る。ＯＡＳ  ｍＲＮＡレベルを、１８ＳリボソームＲＮＡ内因性コントロールに対して定量し得る。
【１２０２】
（構築物ＩＤ２０５３によってコードされるインターフェロンβアルブミン融合物による、ＯＡＳのインビボ導入）
（方法）
構築物２０５３によってコードされるＨＳＡ−ＩＦＮｂ融合タンパク質の活性を、副節の表題「インターフェロンによるＯＳのインビボ導入」の下で先に上に記載されたようなインビボＯＡＳアッセイにおいて、アッセイし得る。
【１２０３】
（実施例２６：ＩＦＮｂアルブミン融合タンパク質についての適応症）
ＩＦＮβアルブミン融合タンパク質（構築物２０５３によってコードされるものが挙げられるが、これらに限定されない）は、多発性硬化症を処置し、予防し、軽減し、そして／または検出するために使用され得る。他の適応症としては、黒色腫、固体腫瘍、癌、細菌感染、化学防御、栓球減少症、ＨＩＶ感染、前立腺癌、癌、血液学的悪性腫瘍、血液学的障害、前白血病、神経膠腫、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、肺繊維症、加齢性黄斑変性、脳癌、神経膠腫多型、肝癌、悪性黒色腫、結腸直腸癌、クローン病、神経変性、非小細胞肺癌、慢性関節リウマチ、および潰瘍性大腸炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【１２０４】
（実施例２７：構築物ＩＤ１９４１、ＨＳＡ−ＰＴＨ８４、産生）
構築物ＩＤ１９４１（ｐＣ４．ＨＳＡ．ＰＴＨ８４）は、ＨＳＡ−ＰＴＨ８４融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたヒト副甲状腺ホルモン（「ＰＴＨ８４」）の成熟形態のＳｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４に融合した、ネイティブＨＳＡリーダー配列を含むＨＳＡの全長を含む。
【１２０５】
（構築物１９４１についてのＰＴＨ８４  ｃＤＮＡのクローニング）
ＰＴＨ８４をコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＰＴＨ８４−１およびＰＴＨ８４−２を使用して増幅し、Ｂｓｕ  ３６Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉで切断し、そしてＢｕｓ  ３６Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９４１は、ネイティブＨＳＡリーダー配列、続いて成熟ＰＴＨ８４タンパク質を含む、ＨＳＡの全長形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
【１２０６】
ＰＴＨ８４の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのプライマー（ＰＴＨ８４−１およびＰＴＨ８４−２）を合成した。
【１２０７】
【化２４】
2013172734.tif 000149
ＰＴＨ８４−１は、Ｂｕｓ−３６Ｉクローニング部位（下線を引いて示される）、続いてＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ酸残基Ｓｅｒ−１〜Ａｓｎ−１０と結合体化した、ＨＳＡの成熟形態の末端（最後のＬｅｕが存在しない）に対応するアミノ酸残基Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含む。ＰＴＨ８４−２において、Ｎｏｔ  Ｉ部位は、下線を引いて示され、そしてそれに続く核酸配列は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質の最後の１１個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する。これらの２つのプライマーを使用して、ＰＴＨ８４タンパク質をＰＣＲ増幅した。
【１２０８】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＨＳＡ配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
【１２０９】
本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＰＴＨ８４を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１２１０】
（構築物ＩＤ１９４１の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞における発現）
構築物１９４１を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして１００ｎＭメトトレキサートを用いて選択した（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いる免疫ブロット検出によって、試験した。
【１２１１】
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９４１から２９３Ｔ細胞において発現された、分泌ＨＳＡ−ＰＴＨ８４融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、最初の捕捉を、陰イオン性ＨＱ−５０樹脂を用いて、ｐＨ７．２で、リン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２））および０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの１６カラム体積の塩勾配溶出、続いてＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈａａｓ製）を用いて、３６カラム体積の２．７５〜０Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の塩勾配溶出を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）を使用して実施した。ここで、サンプルは、１８０ｍＳの最終導電率を有した。このサンプルを、ＨＱ  Ｐｏｒｏｓ  ５０樹脂および０．１５Ｍ  ＮａＣｌ増分の塩段階溶出を使用して濃縮した。最終緩衝組成物は、２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）からなった。Ｎ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＤＡＨＫＳ、配列番号２１４３）を生じた。７８ｋＤａのおよそのＭＷのタンパク質が得られた。１リットルの２９３Ｔ細胞上清あたり０．７８ｍｇのタンパク質の最終収量が得られた。
【１２１２】
（ＳａＯＳ２細胞における環状ＡＭＰのインビトロ導入）
（方法）
ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質の生物学的活性を、ＳａＯＳ−２（骨肉腫細胞株）が使用されるインビトロアッセイにおいて測定し得る。ＰＴＨは、アデニレートシクラーゼを活性化し、これによって、細胞内環状ＡＭＰレベルを増加させる。
【１２１３】
（ＳａＯＳ−２細胞におけるｃＡＭＰの導入：）
ＳａＯＳ−２細胞を、８．０×１０４細胞／ウェルの密度で、実験の開始の２４時間前に継代培養する。実験の日に、細胞を２時間、血清飢餓させ、次いで、陽性コントロール（例えば、５ｍｇ／ｍＬのフォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ））、組換えＰＴＨ、またはＰＴＨアルブミン融合タンパク質で１０分間処理する。処理後、これらの細胞をリンスし、そして細胞内環状ＡＭＰを冷エタノールで抽出する。エタノール抽出物を凍結乾燥させ、そしてさらなる使用のために−８０℃で貯蔵する。サンプル中に存在する環状ＡＭＰの量を、ＥＬＩＳＡによって、製造業者のプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）に従って定量する。
【１２１４】
（構築物１９４１によってコードされるアルブミン融合タンパク質による、ＳａＯＳ２細胞中の環状ＡＭＰのインビトロ導入）
（方法）
構築物１９４１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質による、ＳａＯＳ２細胞中の環状ＡＭＰの導入を測定するためのインビトロアッセイを、先に上で記載したように実施し得る。
【１２１５】
（インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導された放出）
（方法）
ＰＴＨ活性を、ＰＴＨアルブミン融合タンパク質が、低カルシウム食餌の甲状腺上皮小体切除術（「ＴＰＴＸ」）の施行、および副甲状腺ホルモン処理の後に骨の鉱物質除去を低下させる能力をモニタリングすることによって、試験する。
【１２１６】
これらの動物は、Ｖｏｔｔａら、１９９７、Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．，１２：１３９６−１４０６；Ｍｉｌｌｅｓｔら、１９９７、Ｂｏｎｅ，２０：４６５−４７１；ならびにＩｗａｔａら、１９９７、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４０：４９９−５０９によって示唆されるように、薬理学的応答における変動性を示す。従って、１群あたり５匹と８匹との間の甲状腺上皮小体切除された動物（外部販売者から購入した）を使用する。これらの動物は、１日おきにサイロキシンの補充注射を受ける。各実験は、いくつかの群を含む：（１）プラシーボおよび服甲状腺ホルモン（ＰＴＨ１〜３４）注射群（それぞれ、陰性コントロールおよび陽性コントロールに対応する）；（２〜５）ＰＴＨアルブミン融合タンパク質を、０．１〜１２μｇ／ｋｇの範囲の種々の濃度で、静脈内、腹腔内、皮下、および筋肉内に、副甲状腺ホルモン処理の前、間または後に注射される；（６）いくつかの実験について、システインプロテアーゼインヒビターが試験される。
【１２１７】
イソフルオラン麻酔された状態で、左大腿静脈および左大腿動脈または甲状腺動脈のいずれかに、ヘパリン化生理食塩水を満たしたＰＥ−５０ポリエチレンチュービングに融合させたＰＥ−１０チュービングをカニューレ挿入する。これらのカテーテルを皮下に通し、首筋において外に出し、そして皮膚に固定する。動物を、実験のために使用される前に約１８時間回復させ、この時間の間に、これらの動物は、カルシウムのない食事を与えられる。実験の経過の間、３つの血液サンプル（各２００ｍＬ）を、甲状腺または大腿のカテーテルを介して、注入の２時間後、４時間後、および６時間後に採取する。より長い時点（例えば、１８時間目）もまた望ましくあり得る。
【１２１８】
ヒトＰＴＨ１〜３４、陽性コントロール、および全血におけるイオン化カルシウムレベルの外観の間の用量関係を確立した（データは示されない）。
【１２１９】
（構築物１９４１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、ＴＰＴＸ動物を使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物、および表題「インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導された放出」の下で上に記載されたインビボアッセイを使用して、測定し得る。
【１２２０】
（インビボで卵巣切除された雌性ラットモデル）
（方法）
ＰＴＨ活性を、卵巣切除された雌性のＬｅｗｉｓラットまたはＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおいて骨形成を誘導する能力をモニタリングすることによって、試験する。
【１２２１】
手術を、８から９週齢の雌性のＬｅｗｉｓラットまたはＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに対して実施し、そして実験を、手術後７〜１０日目まで開始しない。血液、尿および左脛骨由来のサンプルを、１群あたり９〜１２匹の動物から毎週得る。種々の群は、４週間毎日生理食塩水を注射された偽コントロール、４週間毎日生理食塩水を注射された卵巣切除ラット、および毎週５回ラットＰＴＨペプチド１〜３４を１０ｇ／ｋｇで皮下注射された卵巣切除ラットを含み得る。組織収集の第４週であり最終週に続いて、骨密度測定分析のために、脛骨を、Ｓｌｅｌｅｔｅｃｈに送付する。
【１２２２】
試験したパラメータは、体重、７０％エタノール中での左脛骨における骨密度測定、血液からの血清ピリジノリン（ｐｙｒｉｄｉｎｏｌｉｎｅ）、ならびに尿デオキシピリジノリンおよびα螺旋タンパク質である。尿サンプルを、午前中に採取する。血液を、心臓を出血させることにより得、そして血清をＥＬＩＳＡ分析のためにとっておく。骨密度測定を、近位脛骨において実施する。左大腿を、ひざのすぐ上で骨切断器で切断し得る。前足もまた、遠位脛骨を切断することによって除去し得る。エタノール中で皮膚に横方向に切込みを入れ、前足の残りを７０％エタノールを満たした５０ｃｃチューブに入れる。このチューブを、輸送まで室温で貯蔵する。ラット脛骨の標本を、試験の日に室温に解凍する。切除したラット脛骨を、抹消定量コンピュータ連動断層撮影（ｐＱＣＴ、ＸＣＴ−ＲＭ、Ｎｏｒｌａｎｄ／Ｓｔｒａｔｅｃ）を使用する骨鉱物密度の密度測定に供する。走査を、近位脛骨部位（近位端から離れて全長の１２％）において実施する。１つの０．５ｍｍスライスを採取する。走査を、全体として（骨全体）、または実験および内部境界の閾値図示を使用して（皮質骨）、または外側縁部から剥離することによって骨組織全体の４５％である領域として（海綿骨）分析する。次いで、骨鉱物の密度、面積および内容物を、システムソフトウェアによって決定する。偽動物と卵巣切除動物との間の差異を、各異なる時点において、ＳＡＳ統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｏｒｙ，ＮＣ）を使用して、両側ｔ検定によって決定する。Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を、平均の統計学的比較のために使用する。０．０５未満のＰ値を、統計学的に有意とみなす。
【１２２３】
（構築物１９４１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、インビボ卵巣切除雌性ラットモデルを使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、表題「インビボで卵巣切除された雌性ラットモデル」の下で上に記載されたインビボアッセイを使用して測定し得る。
【１２２４】
（実施例２８：構築物ＩＤ１９４９、ＨＳＡ８４−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ１９４９（ｐＣ４．ＨＳＡ８４．Ｓ１−Ｑ８４．ＨＳＡ）は、ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ＭＰＩＦリーダー配列、続いて哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）を含む。
【１２２５】
（構築物１９４９についてのＰＴＨ８４  ｃＤＮＡのクローニング）
ＰＴＨ８４をコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＰＴＨ８４−３およびＰＴＨ８４−４を使用して増幅し、Ｂａｍ  ＨＩ／ＳｐｅＩで切断し、そしてＢａｍ  ＨＩ／ＸｂａＩ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号１９４９は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質、続いてＨＳＡの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする。
【１２２６】
ＰＴＨ８４の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのプライマー（ＰＴＨ８４−３およびＰＴＨ８４−４）を合成した。
【１２２７】
【化２５】
2013172734.tif 000150
ＰＴＨ８４−３は、Ｂａｍ−ＨＩクローニング部位（斜体で示される）、続いてＭＰＩＦシグナルペプチドをコードする核酸配列（下線を引いて示される）およびＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ酸残基Ｓｅｒ−１〜Ｍｅｔ−８をコードする核酸配列（太字で示される）を含む。ＰＴＨ８４−４において、ＳｐｅＩ部位は、斜体で示され、そしてそれに続く核酸配列は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質の最後の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する（太字で示される）。これらの２つのプライマーを使用して、ＰＴＨ８４タンパク質をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅体を精製し、Ｂａｍ  ＨＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてＢａｍ  ＨＩ／ＸｂａＩ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。
【１２２８】
ＰＴＨ８４−４プライマーへのＳｐｅＩクローニング部位の導入の結果として、２つのさらなるアミノ酸残基（すなわち、ＴｈｒおよびＳｅｒ）が、ＰＴＨ８４とＨＳＡとの間に存在する。
【１２２９】
発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定によるさらなる分析は、予測されたＰＴＨ８４配列の存在を確認した（以下を参照のこと）。
【１２３０】
本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＰＴＨ８４を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１２３１】
（構築物ＩＤ１９４９の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞における発現）
構築物１９４９を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、そして１００ｎＭメトトレキサートを用いて選択した（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清を一次抗体として用いる免疫ブロット検出によって、試験した。
【１２３２】
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
構築物ＩＤ番号１９４９から２９３Ｔ細胞において発現された、分泌ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７に記載されるように精製した。具体的には、最初の捕捉を、陰イオン性ＨＱ−５０樹脂を用いて、ｐＨ７．２で、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２））および０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの１６カラム体積の塩勾配溶出、続いてＰｈｅｎｙｌ  ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈａａｓ製）を用いて、３６カラム体積の２．７５〜０Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）の塩勾配溶出を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）を使用して実施した。ここで、サンプルは、１８０ｍＳの最終導電率を有した。このサンプルを、ＨＱ  Ｐｏｒｏｓ  ５０樹脂および０．１５Ｍ  ＮａＣｌ増分の塩段階溶出を使用して濃縮した。最終緩衝組成物は、２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）からなった。Ｎ末端配列決定は、ＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＳＶＳＥＩ、配列番号２１４５）を生じた。７８ｋＤａのおよそのＭＷのタンパク質が得られた。１リットルの２９３Ｔ細胞上清あたり０．３２ｍｇのタンパク質の最終収量が得られた。
【１２３３】
（構築物１９４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質による、ＳａＯＳ２細胞中の環状ＡＭＰのインビトロ導入）
（結果）
構築物１９４９を発現する２９３Ｔ細胞由来の精製ＨＳＡ−ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質を、副題の表題「ＳａＯＳ２細胞における環状ＡＭＰのインビトロ導入」の下で実施例２７において記載されたインビトロアッセイにおいて、試験した。ＨＳＡ−ＰＴＨ８４は、細胞内環状ＡＭＰレベルの増加を誘導した。
【１２３４】
（構築物１９４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、ＴＰＴＸ動物を使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４９によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物、および副節の表題「インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導された放出」の下で実施例２７に記載されたインビボアッセイを使用して、測定し得る。
【１２３５】
（構築物１９４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性は、インビボで卵巣切除された雌性ラットモデルを使用してアッセイされ得る。）
構築物１９４９によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物、および副節の表題「インビボで卵巣切除された雌性ラットモデル」の下で実施例２７に記載されたインビボアッセイを使用して、測定し得る。
【１２３６】
（実施例２９：構築物ＩＤ２０２１、ＰＴＨ８４−ＨＳＡ、産生）
構築物ＩＤ２０２１（ｐＣ４．ＰＴＨ８４．Ｓ１−Ｑ８４．ＨＳＡ）は、ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質をコードし、この融合タンパク質は、ネイティブＨＳＡリーダー配列、続いて哺乳動物発現ベクターｐＣ４にクローニングされたＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に融合した、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）を含む。
【１２３７】
（構築物２０２１についてのＰＴＨ８４  ｃＤＮＡのクローニング）
ＰＴＨ８４をコードするＤＮＡを、以下に記載されるプライマーＰＴＨ８４−５およびＰＴＨ８４−６を使用して増幅し、Ｘｈｏ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉで切断し、そしてＸｈｏ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。構築物ＩＤ番号２０２１は、成熟ＰＴＨ８４タンパク質、続いてＨＳＡの成熟形態を含む、アルブミン融合タンパク質をコードする（実施例５を参照のこと）。
【１２３８】
ＰＴＨ８４の成熟形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために適切な２つのプライマー（ＰＴＨ８４−５およびＰＴＨ８４−６）を合成した。
【１２３９】
【化２６】
2013172734.tif 000151
ＰＴＨ８４−５は、Ｘｈｏ  Ｉクローニング部位（斜体で示される）を組み込む。Ｘｈｏ  Ｉ部位は、それに続く核酸配列（下線を引いて示される）と組み合わせられて、ＨＳＡのキメラシグナルペプチドの最後の４つのアミノ酸残基をコードする。太字の核酸配列は、ＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ酸残基Ｓｅｒ−１〜Ａｓｎ−１０をコードする。ＰＴＨ８４−６において、Ｃｌａ  Ｉ部位は、斜体で示され、そしてそれに続く核酸配列（下線を引いて示される）は、ＨＳＡの成熟形態の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する。ＰＴＨ８４−６において太字で強調される核酸配列は、ＰＴＨ８４の成熟形態の最後の１１個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補体に対応する。これらの２つのプライマーを使用して、ＰＴＨ８４タンパク質をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅体を精製し、Ｘｈｏ  ＩおよびＣｌａ  Ｉで消化し、そしてＸｈｏ  Ｉ／Ｃｌａ  Ｉ切断されたｐＣ４：ＨＳＡに連結した。
【１２４０】
さらに、発現されたアルブミン融合タンパク質のＮ末端の、アミノ酸配列決定による分析は、予測されたＰＴＨ８４配列の存在を確認し得る（以下を参照のこと）。
【１２４１】
本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＰＴＨ８４の成熟形態（すなわち、Ｓｅｒ−１〜Ｇｌｎ−８４）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、発現のために使用される宿主の分泌経路における発生期の融合ポリペプチドを方向付けるシグナル配列を、さらに含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドが除去され、そして成熟ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が、培養培地中に直接分泌される。本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、Ｆｉｂｕｌｉｎ  Ｂ、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、インスリン様増殖因子結合タンパク質４、改変体ＨＳＡリーダー配列（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）、または当該分野において公知である他の異種シグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない）を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、ネイティブＰＴＨ８４を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニン残基をさらに含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）もまた、本発明に包含される。
【１２４２】
（構築物ＩＤ２０２１の発現および精製）
（２９３Ｔ細胞における発現）
構築物２０２１を、当該分野において公知の方法（例えば、リポフェクタミントランスフェクション）によって２９３Ｔ細胞細胞にトランスフェクトし得、そして１００ｎＭメトトレキサートで選択し得る（実施例６を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いた免疫ブロット検出によって試験し得る。
【１２４３】
（２９３Ｔ細胞上清からの精製）
２９３Ｔ細胞中で構築物ＩＤ番号２０２１から発現した分泌性ＰＴＨ８４−ＨＳＡ融合タンパク質を含む２９３Ｔ細胞上清を、実施例７で記載するように精製し得る。特に、サンプルが１８０ｍＳの最終伝導性を有する場合、初期の捕捉を、陰イオンＨＱ−５０樹脂でｐＨ７．２でリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２））および１６倍のカラム容量の０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配溶離を使用して実行し得、そのあと３６倍のカラム容量の２．７５〜０Ｍ  ＮａＣｌの塩勾配溶離をｐＨ７．２で使用するＰｈｅｎｙｌ６５０Ｍ樹脂（Ｔｏｓｏｈａａｓから）での疎水的相互作用クロマトグラフィー、「ＨＩＣ」を行う。サンプルを、ＨＱ  Ｐｏｒｏｓ  ５０樹脂および０．１５ｍＭの増加ＮａＣｌの塩段階溶離を使用して濃縮し得る。最終的な緩衝組成は、２５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）からなり得る。Ｎ末端の配列決定は、ＰＴＨ８４の成熟形態のアミノ末端配列（すなわち、ＳＶＳＥＩ）を生じるはずである。およそＭＷが７８ｋＤａのタンパク質が得られるはずである。
【１２４４】
（構築物２０２１によってコードされるアルブミン融合タンパク質によるＳａＯＳ２細胞におけるサイクリックＡＭＰのインビトロ誘導）
構築物２０２１を発現する２９３Ｔ細胞に由来するＨＳＡ−ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質を、表題「ＳａＳＯ２細胞におけるサイクリックＡＭＰのインビトロ誘導」の下で、実施例２７において記載するインビトロアッセイにおいて試験し得る。
【１２４５】
（構築物２０２１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、ＴＰＴＸ動物を使用してアッセイし得る）
構築物２０２１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性を、表題「インビボ：ＴＰＴＸ動物におけるカルシウムの誘導放出」の下で実施例２７において記載するＴＰＴＸ動物およびインビボアッセイを使用して測定し得る。
【１２４６】
（構築物２０２１によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、インビボで卵巣摘出された雌性ラットモデルを使用してアッセイし得る）
構築物２０２１によってコードされるＰＴＨアルブミン融合タンパク質の活性は、表題「インビボで卵巣摘出された雌性ラットモデル」の下で実施例２７において記載するインビボアッセイを使用して測定し得る。
【１２４７】
（実施例３０：ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質についての指標）
上述したインビトロおよびインビボアッセイからの結果は、ＰＴＨ８４アルブミン融合タンパク質が骨粗鬆症、悪性の高カルシウム血症、およびパジェット病の処置、予防、および／または診断のために有用であることを示す。
【１２４８】
（実施例３１：構築物ＩＤ２２４９（ＩＦＮａ２−ＨＳＡ）生成）
構築物ＩＤ２２４９（ｐＳＡＣ３５：ＩＦＮａ２．ＨＳＡ）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５においてＨＳＡの成熟形態のアミノ酸末端に融合した、ＨＳＡキメラリーダー配列、続くＩＦＮａ２タンパク質の成熟形態（すなわち、Ｃ１−Ｅ１６５）を有するＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む。
【１２４９】
（ＩＦＮａ２  ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＦＮａ２をコードするポリヌクレオチドを、以下に記載するプライマーＩＦＮａ２−１およびＩＦＮａ２−２を使用してＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅物をＳａｌＩ／ＣｌａＩで切断し、そしてＸｈｏＩ／ＣｌａＩ切断したｓＰｃＣＨＳＡにライゲーションした。構築物ＩＤ番号２２４９は、ＨＳＡのキメラリーダー配列、ＩＦＮａ２の成熟形態、続く成熟ＨＳＡタンパク質を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
【１２５０】
成熟形態ＩＦＮａ２、ＩＦＮａ２−１およびＩＦＮａ２−２をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な２つのオリゴヌクレオチドを合成した；
【１２５１】
【化２７】
2013172734.tif 000152
ＩＦＮａ２−１プライマーは、ＳａｌＩクローニング部位（下線で示される）、キメラＨＳＡリーダー配列の最後の３個のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド、およびＩＦＮａ２の成熟形態の最初の７個のアミノ酸残基をコードする２２ヌクレオチド（太字で示される）を組み込む。ＩＦＮａ２−２において、ＣｌａＩ部位（下線で示される）およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖であり、そして最後の２２個のヌクレオチド（太字で示される）は、ＩＦＮａ２の最後の７個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖である（実施例２を参照のこと）。ＩＦＮａ２−ＨＳＡのＰＣＲ増幅物をこれらのプライマーを使用して生成し、精製し、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ制限酵素で消化し、そしてｐＳｃＣＨＳＡベクターのＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位でクローニングした。配列を確認した後、このＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をコードする発現カセットはＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
【１２５２】
さらに、アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端の分析は、予想されるＩＦＮａ２配列の存在を確認し得る（以下の参照）。
【１２５３】
異なるリーダー配列を使用する他のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、当該分野において公知の方法によって構築してきた（実施例２を参照のこと）。種々のリーダー配列の例としては、インベルターゼ「ＩＮＶ」（構築物２３４３および２４１０）および交配接合α因子「ＭＡＦ］（構築物２３６６）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を以前に記載したようなｐＣ４（構築物２３８２）およびｐＥＥ１２．１のような哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし得る（実施例５を参照のこと）。ＨＳＡにＣ末端を融合させた治療部分を有するＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質をまた構築し得る（構築物２３８１）。
【１２５４】
本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＦＮａ２の成熟形態（すなわち、Ｃｙｓ−１〜Ｇｌｕ−１６５）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合した、ＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用される宿主の分泌経路に初期の（初期の）融合ポリペプチドを指示するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、当該分野で公知の異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＦＮａ２を含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
【１２５５】
（構築物ＩＤ２２４９の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２４９の、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＸＰ１０での形質転換を、当該分野で公知の方法によって実行した（実施例３を参照のこと）。細胞を７２時間の増殖後、定常期に回収し得る。上清を、細胞を３０００ｇで１０分間不純物除去することで回収する。発現レベルを、抗ＨＳＡ血清（Ｋｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、またはこの１次抗体として免疫ブロット検出によって試験し得る。およそ８８．５ｋＤａの分子量のＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を回収し得る。
【１２５６】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞において構築物ＩＤ番号２２４９から発現したＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、Ｄｙａｘペプチドアフィニティカラム上で小スケールで（実施例４を参照のこと）、または以下の５ステップ：ダイアフィルトレーション、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｓカラムを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗカラムまたはＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーを使用する陽イオン交換クロマトグラフィー、およびＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｍａｎｃｅカラムクロマトグラフィーを使用する高性能クロマトグラフィーによる大スケール（実施例４を参照のこと）のいずれかで精製し得る。ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、１００〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌでＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムから、１５０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌでＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムから、および５〜７．５ｍＳ／ｃｍでＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラムから溶出し得る。Ｎ末端の配列決定は、ＩＦＮａ２の成熟形態に対応する配列ＣＤＬＰＱ（配列番号２１４６）を生じるはずである。
【１２５７】
（ＩＦＮａ２の活性を、インビトロＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイを使用してアッセイし得る）
（方法）
構築物ＩＤ番号２２４９によってコードされるＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質を、実施例２５において前もって記載したようなＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて、活性について試験し得る。簡単に言えば、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞株に対してＩＳＲＥシグナル伝達を指向する能力について、馴化酵母上清を１：１０００の希釈で試験した。ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰ／２９３Ｆレポーター細胞を、処理１日前に、３×１０４細胞／ウェルで９６ウェルのポリ−Ｄ−リジンでコートされたプレート中にプレーティングした。次いで、ＳＥＡＰ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１７７９８４２）における使用のために４０μＬを除去する前に、レポーター細胞を１８時間または２４時間インキュベートした。組み換えヒトＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎβ「ｒｈＩＦＮｂ」（Ｂｉｏｇｅｎ）を、陽性コントロールとして使用した。
【１２５８】
（結果）
ＩＦＮａ２−ＨＳＡの精製された調製物は、ＩＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイにおいて、１０−１〜１０１ｎｇ／ｍＬ（図１５を参照のこと）または１０−１０〜１０−８ｎｇ／ｍＬ（図１６を参照のこと）の範囲にある濃度にわたって比較的直線的な増加を証明した。
【１２５９】
（構築物ＩＤ２２４９によってコードされるインターフェロンα融合物によるＯＡＳのインビボ誘導）
（方法）
ＯＡＳ酵素（２’−５’−オリゴアデニレートシンテターゼ）を、抗ウイルス感染に応じてインターフェロンによって、転写レベルで活性化する。インターフェロン構築の効果
を、処置したサルから血液サンプルを回収すること、およびこれらのサンプルを２つのＯＡＳ  ｍＲＮＡ（ｐ４１およびｐ６９）の転写活性について分析することによって測定し得る。０．５ｍＬ容量の全血を、１群あたり４頭の動物から７つの異なる時間点（１匹の動物あたり、０日目、１日目、２日目、４日目、８日目、１０日目、および１４日目）で回収した。種々の群は、ビヒクルコントロール（１日目に３０μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの静脈注射、１日目に３０μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの皮下注射、１日目に３００μｇ／ｋｇのＨＳＡ−ＩＦＮの皮下注射）、ならびに陽性コントロールとして、１日目、３日目、および５日目に４０μｇ／ｋｇのインターフェロンα（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）の皮下注射を含む。ｐ４１およびｐ６９のｍＲＮＡ転写物のレベルを、ｐ４１−ＯＡＳおよびｐ６９−ＯＡＳに特異的なプローブを使用するリアルタイム定量ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によって決定した。ＯＡＳのｍＲＮＡレベルを、１８ＳリボソームＲＮＡ内因性制御と比較して定量した。構築物２２４９によってコードされるアルブミン融合タンパク質を類似の実験に供し得る。
【１２６０】
（結果）
ｐ４１ＯＡＳおよびｐ６９ＯＡＳの両方についてのｍＲＮＡ転写レベルにおける有意な増加が、ＩＦＮａを処置したサルとは対照的にＨＳＡ−インターフェロンを処置したサルにおいて観察された（ｐ４１のデータについて図１７を参照のこと）。効果は１０日近く続いた。
【１２６１】
（実施例３２：ＩＦＮａ２アルブミン融合タンパク質についての指標）
多発性硬化症を処置し、予防し、改善し、そして／または検出するためにＩＦＮαアルブミン融合タンパク質（構築物２２４９、２３４３、２４１０、２３６６、２３８２、および２３８１によってコードされるタンパク質を含むが、これらに限定されない）を使用し得る。他の指標としては、Ｃ型肝炎、腫瘍学での使用、癌、肝炎、ヒトパピローマウイルス、線維筋腫症、シェーグレン症候群、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連のカポージ肉腫、慢性Ｂ型肝炎、悪性黒色腫、非ホジキンリンパ種、外部尖圭コンジローム、ＨＩＶ感染、小細胞肺癌、血液学的な悪性疾患、単純ヘルペスウイルス感染、多発性硬化症、ウイルス性出血熱、固形腫瘍、腎臓癌、骨髄傷害、骨傷害、膀胱癌、胃癌、Ｄ型肝炎、多発性骨髄腫、Ｉ型糖尿病、ウイルス感染、皮膚型Ｔ細胞リンパ腫、子宮頚部形成異常、慢性疲労症候群、および腎臓癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【１２６２】
好ましくは、ＩＦＮα−アルブミン融合タンパク質またはＩＦＮハイブリッド融合タンパク質は、ＣＣＲ５アンタゴニストとの組み合わせ、さらに、少なくとも１つのリバビリン、ＩＬ−２、ＩＬ−１２と関連して、処置が施されていない成人患者および小児患者ならびに処置が施された成人患者および小児患者におけるＨＩＶ−１感染、ＨＣＶ、またはＨＩＶ−１とＨＣＶの共感染の処置のための薬剤の調製のために、ペンタフサイド（ｐｅｎｔａｆｕｓｉｄｅ）単独または抗ＨＩＶ薬物治療（例えば、ＨＡＡＲＴ）との組み合わせで投与される。
【１２６３】
（実施例３３：構築物ＩＤ２２５０（ＨＳＡ−インスリン（ＧＹＧ））生成）
構築物ＩＤ２２５０（ｐＳＡＣ３５．ＨＳＡ．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）．Ｆ１−Ｎ６２）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングした３２位のＴｙｒで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹ３２Ｇ））のアミノ末端に融合した全長のＨＳＡ（ネイティブなＨＳＡリーダー配列を含む）を含む、ＨＳＡ−ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）融合タンパク質をコードする。
【１２６４】
（構築物２２５０のためのＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ合成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、インスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。配列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。このＰＣＲフラグメントを消化し、そしてＢｓｕ３６１／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにサブクローニングした。次いで、ＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２２５０は、合成一本鎖形態のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）のアミノ末端に融合した全長ＨＳＡ（ネイティブなＨＳＡリーダー配列を含む）をコードする。
【１２６５】
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−１およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−２の合成一本鎖形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複するオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
【１２６６】
【化２８】
2013172734.tif 000153
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−１は、Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（イタリック体で示される）を組み込み、そしてＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態のＯＲＦの最初の２１個のアミノ酸（太字で示される）をコードする。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−２において、イタリック体にした配列は、ＡｓｃＩ部位である。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−２において、太字にされた配列は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態のアミノ酸残基Ｃｙｓ−４９〜Ａｓｎ−６３をコードする最後の４９個のヌクレオチドの逆相補鎖である。これらの２つのプライマーで、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態をＰＣＲ増幅した。それぞれ特異的なプライマー対およびテンプレートについてのアニーリング温度および時間ならびに伸長温度および時間を、経験的に決定しなければならない。
【１２６７】
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）を使用して）、ついでＢｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩで消化した。ゲル電気泳動によるＢｓｕ３６Ｉ−ＡｓｃＩフラグメントのさらなる精製後、この産物をＢｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにクローニングした。さらにＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５にサブクローニングして、構築物ＩＤ番号２２５０を得た。
【１２６８】
アミノ酸配列決定による発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端のさらなる分析は、予想される成熟ＨＳＡ配列の存在を確認するはずである（以下を参照のこと）。
【１２６９】
本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＮＳＵＬＩＮの合成一本鎖アナログ（すなわち、Ｐｈｅ−１〜Ａｓｎ−６２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む；プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、インスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用する宿主の分泌経路に初期の融合ポリペプチドを指向するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または当該分野において公知の他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＮＳＵＬＩＮを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
【１２７０】
（構築物ＩＤ２２５０の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２５０を、当該分野において公知の方法によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで形質転換し得る（実施例３を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出法によって試験し得る。
【１２７１】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２２５０から発現した分泌性のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載したように精製し得る。このアルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に対応する配列ＤＡＨＫＳ（配列番号２１４３）を生じるはずである。
【１２７２】
（構築物２２５０によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下でのインビトロでの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
（方法）
構築物２２５０によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下での３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の糖の取り込みを測定するためのインビトロアッセイを、実施例４１において以下に記載したように実行した。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を試験するために使用され得る当該分野において公知の他のアッセイとしては、グリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を介するＬ６ラット筋芽細胞増殖アッセイならびにラットリンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｒＭＥＰ）−ＳＥＡＰレポーター、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−ＳＥＡＰレポーター，脂肪酸合成（ＦＡＳ）−ＳＥＡＰレポーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）−ＳＥＡＰレポーターを含むＨＡＩＩｅレポーターアッセイ（実施例４８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【１２７３】
（結果）
構築物２２５０によってコードされるインスリンアルブミン融合タンパク質を発現する形質転換された酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する上清は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における糖の取り込み／輸送活性を証明した（図１８を参照のこと）。
【１２７４】
（構築物２２５０によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下での、インビトロ膵臓細胞株の増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２５０によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下で管上皮膵臓ＡＲＩＰ細胞株のインスリン産生β細胞への分化および増殖を測定し、そして／またはインスリン産生ＲＩＮ−Ｍβ細胞株の増殖を測定するためのインビトロアッセイを、表題「実施例４２：膵臓細胞株への［３Ｈ］チミジン取り込みのインビトロでのアッセイ」の下で以下に記載するように実行し得る。
【１２７５】
（構築物２２５０によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、糖尿病ＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用してインビボでアッセイし得る）
構築物２２５０によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の活性を、表題「実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生」、「実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的実験」、および「実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル」の下で以下に記載するＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用して測定し得る。
【１２７６】
（実施例３４：構築物ＩＤ２２５５（インスリン（ＧＹＧ）−ＨＳＡ）生成）
構築物ＩＤ２２５５（ｐＳＡＣ３５．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）．Ｆ１−Ｎ６２．ＨＳＡ）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングした３２位のＴｙｒで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹ３２Ｇ））のアミノ末端に融合し、これは、次にＨＳＡの成熟形態に融合されたＨＳＡのＨＳＡキメラリーダー配列を含み、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−ＨＳＡ融合タンパク質をコードする。
【１２７７】
（構築物２２５５のためのＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ生成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列をインスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。配列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。このＰＣＲフラグメントをＳａｌＩ／ＣｌａＩで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＣｌａＩで消化したｐＳｃＣＨＳＡにサブクローニングした。次いで、ＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２２５０は、合成一本鎖形態のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）のアミノ末端に融合したＨＳＡのキメラリーダー配列をＨＳＡの成熟形態に続いてコードする。
【１２７８】
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−３およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−４の合成一本鎖形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複するオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
【１２７９】
【化２９】
2013172734.tif 000154
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−３は、ＳａｌＩクローニング部位（イタリック体で示される）およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態のＯＲＦの最初の２１個のアミノ酸（太字で示される）をコードするＤＮＡを組み込む。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）−４において、イタリック体化された配列は、ＣｌａＩ部位であり；そしてこのＣｌａＩ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質の最初の１０個のアミノ酸をコードするＤＮＡの逆相補鎖である。太字にされた配列は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態の最後の１５個のアミノ酸残基Ｃｙｓ−４９〜Ａｓｎ−６３をコードする４６個のヌクレオチドの逆相補鎖である。これらの２つのプライマーで、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖形態を、アニーリング、アニーリングされたプライマーの伸長、ＳａｌＩおよびＣｌａＩでの消化、およびＸｈｏＩ／ＣｌａＩで消化したｐＳｃＣＨＳＡへのサブクローニングによって生成した。次いで、このクローン由来のＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にライゲーションして、構築物ＩＤ２２５５を生成した。構築物ＩＤ番号２２５５は、キメラリーダー配列、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）の合成一本鎖、およびＨＳＡの成熟形態を含むアルブミン融合タンパク質をコードする。
【１２８０】
アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端のさらなる分析は、予想されるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）配列の存在を確認するはずである（以下を参照のこと）。
【１２８１】
本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＮＳＵＬＩＮの合成一本鎖アナログ（すなわち、Ｐｈｅ−１〜Ａｓｎ−６２）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合するＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む；プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、インスリン成長因子１（「ＩＧＦ−１」）のＣドメイン（ＧＹ３２ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ、配列番号２１４７）によって置換した。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらに、発現のために使用する宿主の分泌経路に初期の融合ポリペプチドヲ指向するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または当該分野において公知の他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＮＳＵＬＩＮを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
【１２８２】
（構築物ＩＤ２２５５の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２５５を、当該分野において公知の方法によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで形質転換し得る（実施例３を参照のこと）。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出法によって試験し得る。
【１２８３】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２２５５から発現した分泌性のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載するように精製し得る。この発現しそして精製したアルブミン融合タンパク質のＮ末端配列決定は、合成一本鎖形態で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹ３２Ｇ））のアミノ末端に対応するＦＶＮＱＨを生じるはずである。
【１２８４】
（構築物２２５５によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下でのインビトロでの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
（方法）
構築物２２５５によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下での３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の糖の取り込みを測定するためのインビトロアッセイを、実施例４１において以下に記載するように実行した。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質を試験するために使用され得る当該分野において公知の他のアッセイとしては、グリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を介するＬ６ラット筋芽細胞増殖アッセイならびにラットリンゴ酸酵素プロモーター（ｒＭＥＰ）−ＳＥＡＰレポーター、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−ＳＥＡＰレポーター，脂肪酸合成（ＦＡＳ）−ＳＥＡＰレポーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）−ＳＥＡＰレポーターを含むＨ４ＩＩｅレポーターアッセイ（実施例４８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【１２８５】
（構築物２２５５によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下での、インビトロ膵臓細胞株の増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２５５によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下で管上皮膵臓ＡＲＩＰ細胞株のインスリン産生β細胞への分化および増殖を測定し、そして／またはインスリン産生ＲＩＮ−Ｍβ細胞株の増殖を測定するためのインビトロアッセイを、表題「実施例４２：膵臓細胞株への［３Ｈ］チミジン取り込みのインビトロでのアッセイ」の下で以下に記載するように実行し得る。
【１２８６】
（構築物２２５５によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、糖尿病ＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用してインビボでアッセイし得る）
構築物２２５５によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＹＧ）アルブミン融合タンパク質の活性を、表題「実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生」、「実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的実験」、および「実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル」の下で以下に記載するＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用して測定し得る。
【１２８７】
（実施例３５：構築物ＩＤ２２７６（ＨＳＡ−インスリン（ＧＧＧ））の生成）
構築物ＩＤ２２７６（ｐＳＡＣ３５．ＨＳＡ．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）．Ｆ１−Ｎ５８）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングした３２位のＧｌｙで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧ３２Ｇ））のアミノ末端に融合した、全長ＨＳＡ（ネイティブのＨＳＡリーダー配列を含む）を含む、ＨＳＡ−ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）融合タンパク質をコードする。
【１２８８】
（構築物２２７６のためのＩＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ生成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を合成リンカー（「ＧＧ３２ＧＰＧＫＲ」）（配列番号２１４８）によって置換した。配列は酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためにコドン最適化した。このＰＣＲフラグメントを消化し、そしてＢｓｕ３６１／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにサブクローニングした。次いで、ＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５プラスミドにサブクローニングした。構築物ＩＤ番号２２７６は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態のアミノ末端に融合する、ネイティブのＨＳＡリーダー配列を含む全長ＨＳＡをコードする。
【１２８９】
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−１およびＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−２の合成一本鎖形態をコードするポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に適切な４つの重複するオリゴヌクレオチドの５’プライマーおよび３’プライマーを合成した：
【１２９０】
【化３０】
2013172734.tif 000155
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−５は、Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（イタリック体で示される）を組み込み、そしてＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態のＯＲＦの最初の２１個のアミノ酸（太字で示される）をコードする。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−６において、イタリック体化された配列は、ＡｓｃＩ部位である。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−６において、太字にされた配列は、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態のアミノ酸残基Ｃｙｓ−４４〜Ａｓｎ−５８をコードする最後の４９個のヌクレオチドの逆相補鎖である。これらの２つのプライマーで、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態をＰＣＲ増幅した。それぞれ特異的なプライマー対およびテンプレートについてのアニーリング温度および時間ならびに伸長温度および時間を、経験的に決定しなければならない。
【１２９１】
ＰＣＲ産物を精製し（例えば、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）を使用して）、ついでＢｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩで消化した。ゲル電気泳動によるＢｓｕ３６Ｉ−ＡｓｃＩフラグメントのさらなる精製後、この産物をＢｓｕ３６Ｉ／ＡｓｃＩで消化したｐＳｃＮＨＳＡにクローニングした。構築物ＩＤ番号２２７６を供するために、さらにＮｏｔＩフラグメントをｐＳＡＣ３５にサブクローニングした。
【１２９２】
アミノ酸配列決定による、発現したアルブミン融合タンパク質のＮ末端のさらなる分析により、予想される成熟ＨＳＡ配列の存在を確認するはずである（以下を参照のこと）。
【１２９３】
本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、ＩＮＳＵＬＩＮの合成一本鎖アナログ（すなわち、Ｐｈｅ−１〜Ａｓｎ−５８）のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合されるＨＳＡの成熟形態（すなわち、Ａｓｐ−２５〜Ｌｅｕ−６０９）を含む；プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、合成リンカー（「ＧＧ３２ＧＰＧＫＲ」）（配列番号２１４８）によって置換した。本発明の１つの実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらに発現のために使用される宿主の分泌経路における成り始めの融合ポリペプチドを指向するシグナル配列を含む。さらに好ましい実施形態において、シグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを除去し、そして成熟ＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質が培養培地中に直接分泌される。本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、当該分野において公知の異種シグナル配列（ＭＡＦ、ＩＮＶ、Ｉｇ、フィブリンＢ、クラステリン、インスリン様成長因子結合タンパク質４、ＨＳＡリーダー配列改変体（キメラＨＳＡ／ＭＡＦリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）または他の異種シグナル配列を含み得る。好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、ネイティブのＩＮＳＵＬＩＮを含む。さらに好ましい実施形態において、本発明のＩＮＳＵＬＩＮアルブミン融合タンパク質は、さらにＮ末端メチオニン残基を含む。これらのポリペプチド（フラグメントおよび／または改変体を含む）をコードするポリヌクレオチドがまた、本発明によって含まれる。
【１２９４】
（構築物ＩＤ２２７６の発現および精製）
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現）
構築物２２７６を、当該分野において公知の方法（実施例３を参照のこと）によって酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換し得る。発現レベルを、１次抗体として抗ＨＳＡ血清を用いる免疫ブロット検出法によって試験し得る。
【１２９５】
（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞上清からの精製）
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、構築物ＩＤ番号２２７６から発現した分泌性のＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質を含む細胞上清を、実施例４において記載されたように精製し得る。Ｎ末端配列決定は、ＨＳＡの成熟形態のアミノ末端に対応するＤＡＨＫＳ（配列番号２１４３）を生じるはずである。
【１２９６】
（構築物２２７６によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下でのインビトロでの［３Ｈ］−２−デオキシグルコース取り込みアッセイ）
（方法）
構築物２２７６によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下での３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の糖の取り込みを測定するためのインビトロアッセイを、実施例４１において以下に記載するように実行した。ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質を試験するために使用され得る当該分野において公知の他のアッセイとしては、グリコーゲン合成キナーゼ−３（ＧＳＫ−３）を介するＬ６ラット筋芽細胞増殖アッセイならびにラットリンゴ酸デヒドロゲナーゼプロモーター（ｒＭＥＰ）−ＳＥＡＰレポーター、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）−ＳＥＡＰレポーター，脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）−ＳＥＡＰレポーター、およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）−ＳＥＡＰレポーターを含むＨＡＩＩｅレポーターアッセイ（実施例４８を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【１２９７】
（結果）
構築物２２７６によってコードされるインスリンアルブミン融合物を発現する形質転換された酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する上清は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコースの取り込み／輸送活性を証明した（図１８を参照のこと）。
【１２９８】
（構築物２２７６によってコードされるアルブミン融合タンパク質の存在下での、インビトロ膵臓細胞株の増殖アッセイ）
（方法）
構築物２２７６によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の存在下で管上皮膵臓ＡＲＩＰ細胞株のインスリン産生β細胞への分化および増殖を測定し、そして／またはインスリン産生ＲＩＮ−Ｍβ細胞株の増殖を測定するためのインビトロアッセイを、表題「実施例４２：膵臓細胞株への［３Ｈ］チミジン取り込みのインビトロでのアッセイ」の下で以下に記載するように実行し得る。
【１２９９】
（構築物２２７６によってコードされるアルブミン融合タンパク質の活性を、糖尿病ＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用してインビボでアッセイし得る）
構築物２２７６によってコードされるＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）アルブミン融合タンパク質の活性を、表題「実施例４４：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生」、「実施例４５：ＮＯＤマウスの組織学的試験」、および「実施例４７：ＮＩＤＤＭのインビボマウスモデル」の下で以下に記載するＮＯＤおよび／またはＮＩＤＤＭマウスモデルを使用して測定され得る。
【１３００】
（実施例３６：構築物ＩＤ２２７８（インスリン（ＧＧＧ）−ＨＳＡ）の生成）
構築物ＩＤ２２７８（ｐＳＡＣ３５．ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）．ＨＳＡ）は、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ発現ベクターｐＳＡＣ３５にクローニングされたＨＳＡのＨＳＡキメラリーダー配列を含む、３２位のＧｌｙで合成一本鎖で長時間作用型のインスリンアナログ（ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧ３２Ｇ））のアミノ末端に融合された、次にＨＳＡの成熟形態に融合され、ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）−ＨＳＡ融合タンパク質をコードする。
【１３０１】
（構築物２２７８のためのＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）ｃＤＮＡのクローニング）
ＩＮＳＵＬＩＮ（ＧＧＧ）の合成一本鎖形態をコードするＤＮＡを、４つの重複するプライマーを使用してＰＣＲ生成した。プロインスリンのプロセシングの必要性を除去し、そして正確な一本鎖タンパク質の折り畳みを確実にするために、プロインスリンｃＤＮＡの中間領域のＣペプチドに対応する配列を、合成リンカー（「ＧＧ３２ＧＰＧＫＲ」）（配列番号２１４８）によって置換した。配列は酵母Ｓ．뷯薽뷯薽뷯覽뷯覽뷯薽臣誁臣讂駧뺏臣龁苣ꮁ苣覃菣肜臩隌臣龁胣鎁臣낼볯늼菣ꦃ苣ꆃ菣袃苣뎼뷯貽볯込볯貽뷯ꦼ臣袶賥鞁胣鶁臣ꚁ볯袽뷯ꦼ볯ꎼ뷯膽볯ꞁ뛦隌臣龁뷯뎼뷯ꎼ볯뎼볯ꮁ苣隃苣궃菣讃菣낂臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣꺼뷯钽볯閃菣낂菣뎃菣銂뷯뎼볯ꎼ볯閼菣ꦃ苣龃菣ꮁ苣隃苣궃菣讃菣낂臣龁胣讧꿧ꦉ볯꒼闧랏볯銼볯颼臣膀郥邈룤겜軩ꊽ藦꺁볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼臣ꊂ菣躃鳦꾫臣閼臣骶臣ꚁ볯뎼볯꺁裦龆뷥讅臣趞郥鞁臣ꢼ볯ꆼ臣궂菣ꦃ菣벃菣벃藩鞈苣뎂菣覃臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼胣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼볯Ꞽ볯Ꞽ볯銈볯誁苣뎁볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼裢颼臣袐裦肸鳦階뷥讅苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣낼볯늼ꋥ薹臣ꦁ裥ꪁ볯ꒁ臣趇ꓨ馁苣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃臣閼胢鞃菣ꒂ菣벃臣袂臣鎼胢鞃菣ꒂ菣벃苣袐裦鞁臣骼㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣隌볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㌱㜱㜲㐳琮晩㸢〲㌱㜱㜲㐳琮晩ꃂ〰㄰㘵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ†볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼裢鞼臣膀볯膽뷯ꦼ苣궃菣讃菣낂菩趽볯ꒂ苣ꪃ菣꾂뷤ꞁꓧ閁苣讂볯誁苣뎁볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼臣袐裦肸鳦階뷥讅臣꾼볯ꚼ臣肜裥꺁볯醼胥꺁苣龃菣뢅볯ꪤ귥ꞁꓧ閁苣讂볯銂苣벃菣馁苣꒼볯ꆼ苣蒵臣벾苣芀볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼裢颼臣誁臣ꚁ胣ꒂ苣ꪃ菣꾂뷤隌臣貂臣超裥꾁胣ꎼ뷯膽볯ꢃ뷤ꞁ臣誂볯鶁臣ꚁ臣꺁볯貽뷯ꦼ菩趽臣袂臣鶁苣ꮁ뛧辁볯꺼볯꾁胣邈蛧ꢼ볯ꆼ苣뎃菣꾂돨꺁鳦鶈臣醼볯讀臣ꊂ菣躃藩銂苣벃菣馁苣꒼볯ꆼ臣蚀鯧鲣軩ꞁ臣讂胣ꪤ귥ꮁ臣貂臣超裥꾁胣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼볯Ꞽ볯Ꞽ볯꺁郥邈룤겜軩ꊽ藦꺁鳦貾臣醼볯讀臣ꊂ菣躃藩议鿥ꎼ뷯鎽裢钼볯鲀볯鎽뷯銈볯颼苣뎂菣覃臣讂볯隼胥꺁菣꾂菣ꪂ菣覃臣蚀鯧鲣軩ꞁ臣讂胣鎁苣覂臣銼臣꺁菣ꦃ苣麃菣ꞁ胣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼볯Ꞽ볯Ꞽ볯꺁郥邈룤겜軩ꊽ藦銂胣ꊂ菣벃菣뎃苣鞁胣ꊂ菣벃菣뎃苣閁苣龁菣ꦃ苣麃菣꺁볤랕胣뎼뷯貽볯誁苣뎁볯貽뷯ꦼ臣꺁뛦隌胣誁苣뎁볯袽뷯ꦼ볯ꎼ뷯膽볯ꞁ뛦隌臣龁뷯뎼뷯ꎼ볯뎼볯뢁臣떂菣꾂菣벃菣뎃苣ꮁ苣ꎁ臣龔裦鞁臣芀곦蒁臣膀꟦覯觧ꦼ볯銼볯鞼볯銂铧邈臣讂臣膂臣膀臣꺁苣궃菣뎃铧ꖝ臣꺼뷯钽볯閃菣낂菣뎃菣銂胣邽볯ꆼ볯鎼볯꺁볯辽뷯ꦼ菩趽臣ꦃ苣늂菣랂菣뎃臣龁胣讧꿧ꦉ볯꒼闧랏볯銼볯颼臣膀苣ꆃ菣ꪃ菣肃菣超裥膀볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼臣袐裦肸鳦階胣誁苣뎁볯뎼볯꺁裦龆뷥讅苣ꮐ苣ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 ꊂ菣躃藩超裥몱껥ꮁ苣讂胣몙迧鞁臣ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꺁볯ꮜꯧ꺁臣覂臣讂裥邞臣膀뫤뎃臣貂苣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼볯Ꞽ볯Ꞽ볯超裥꺁귥ꢜ苣몢ꫨ馁苣꾁臣ꞁ臣讂볯ꖻ룤銂迥ꞅ臣鎁臣覼胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦꺁볯꺼볯떼볯ꦼ볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꾁胣붥臣鞁臣꾁胣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼臣袐裦肸鳦階苣誃菣낂볯馁臣辂臣膀볯袽뷯銈볯鲀볯鎽뷯銈볯颼볯꺁볯ꮜꯧ뺁臣꾁볯ꮜꯧ꺁臣骁苣讁臣趞郥馁苣ꢼ볯ꆼ臣邈蛧ꊽ藦袼臣ꪁ苣ꆁ胣ꆼ뷯邽裢銼볯鲀볯薽뷯銈볯邼볯覼苣ꮐ苣鮼菣궃苣뎃苣ꪃ菣莽볯꺼볯꺁룤鎖ꃩ龟臣ꎼ菣鞃菣覃臣뺯뿥馁苣超裥銂胣袐裦ꪃ菣ꮂ菣袼胣Ꞽ볯㲧畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銼⼼畳㹰볯낼볯ꮼ볯趀볯袼藩鞈闧랏볯醼볯颼볯ꮁ苣ꎁ臣꺽迦鞁臣芀鳦몙飦꺁볯ꒁ臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꺁볯꺼볯떼볯ꦼ볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꾁胣閁苣ꮁ駧뺏臣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣讂껥뮸臣蚈돦貵럨ꮁ臣醁苣邈苣讧苣꺁黨袐菣ꪃ菣鞃菣覃苣螌郥馁苣랂苣誃菣超裥銂郥肂胣閁苣ꮁꗥ뺁臣蒁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣랂苣誃菣超裥ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣랂苣誃菣骃菣膃菣銂駩뮎臣膀臣鞁臣邈蛧ꦼ볯뎼볯겼볯꺼苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣릟ꓩ릟鳥궸臣뒛軦蚈돦閁苣讂胣겜駧躘臣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣膀뷥늩裥躇臣誁臣ꚁ藥ꖟ臣낕꣧랂苣誃菣超裥袼볯ꆼ볯膀볯꺼볯膀볯螽胣閃苣隃菣뎃볯膀苣ꦃ苣蚃菣뎃胣ꒂ菣릂菣뎃꟦邈闩ꂛ귥邵郥뾂菣醃苣ꪳ볯膀볯뎼볯ꪃ菣肃菣超裥릔ꓥ鎽볯궂菣ꦃ볯뎼볯込볯ꆼ볯ꪃ菣肃菣超裥貁賦銁苣貂苣貁胣鎁苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁볯貁賦銁苣貂苣貁胣鎁苣覂臣邙껥閁苣ꪁ臣覼臣龁臣隻臣낕꣧랂苣誃菣超裥銂郥뾁뻥讂胣붥臣鞁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꺁볯꺼볯떼볯ꦼ볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꾁胣趃苣蚃苣隃臣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼苣ꮐ苣芀臣覂臣붥臣鞁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꺁볯꺼볯떼볯ꦼ볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꾁胣閁苣ꮁ볯ꮜꯧꆃ菣ꪂ菣뎃껦몟苣ꮐ苣芀臣貂苣꺁菣ꪃ菣鞃菣覃볯閃菣낂菣뎃菣誁苣뎁볯뺁臣꾁铦覤뷤銂郥肂볯銂苣벃菣馁苣鶃菣貃苣것苣膃菣貁臣龁胣겜駧躘臣袂臣ꚁ郥뺁苣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†볯讧꿧ꦉ볯꒼볯銼볯颼臣몙迧誁苣뎁닧붣볯㲉牢ਾ†볯떅꿦뎼볯莽뷯銽뷯隽뷯鎽뷯膽뷯ꮁ臣醁苣몙迧覼戼㹲 讧꿧ꦉ볯銼볯颼苣膀뷥늩裥躇臣誁臣ꚁ藥ꖟ臣릖돦ꮁ苣ꎁ臣떅꿦뎼볯莽뷯銽뷯隽뷯鎽뷯膽뷯ꞁ뷥ꪳ믨鮏臣鞾苣袼껥붖뻤鎼苣芏藧꺁臣ꢁ볯芀駧뺏菣馃菣銂胣醼곦鞊뷤ꢁ臣ꚁ諦ꢼ볯ꆼꇨ薸苣ꢔ臣讂藥ꮖ菣궃菣袃ꓦ몇돦ꮁ苣ꎁ臣ꚩ꣩鞁뻥讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯떅꿦뎼볯莽뷯銽뷯隽뷯鎽뷯膽뷯내菨誸룦讁苣꺁닧붣볯㲉牢ਾ†藩趯볯躼뷯薽뷯薽뷯覽뷯覽뷯薽臣誁臣ꚁ胣讧꿧ꦉ볯꒼闧랏볯銼볯颼臣覂駧뺏臣龁裥貳胦꺁볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ苣내菨誸룦銂胣龮雦设볯ꮁ臣蒁臣風볨閁苣龁苣蚁臣뺲ꏨ鞁뻥讂胣鎁臣몙迧鞁臣鞁臣뺲ꏨ鞁臣ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꺁볯ꮜꯧ超裥몱껥꾁胣袐裦肸鳦階뷥讅臣랕駦鎖뷤ꢔ黥꺁苣뎃苣ꪃ菣ꊂ菣궃苣袼볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼볯㲒猯灵Ꞽ볯覼臣ꊂ菣躃鳦꾫臣뺯뿥馁苣ꚼ볯꺼볯ꢼ볯超裥ꪕ迥銼볯钼볯覼苣龔臣讂臣骁臣芁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯邼볯醀⼼䥄㹖 袼꟦覯觧銼볯鞼볯ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꺁귥ꢜ룤ꞁ臣ꒂ菣鎃菣궃臣꺁볯㲻畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꢼ볯銈볯銈菣ꪂ苣랂苣ꮃ苣벃苣随苣벾臣ꊂ菣뮂苣覼戼㹲 袼雦閳볯㲉牢ਾ†꟦覯觧銼볯鞼볯ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꺁귥ꢜ룤ꞁ臣鎼볯鎼裢겼볯芄苨내菨궸臣낂菣뎂菣릂臣随苣벾臣銂룦骮臣讂臣膂臣ꒂ菣鎃菣궃苣莃苣ꒂ苣膀껥붖뻤钼볯ꮁ臣蒁臣ꖻ룤ꮁ꣨覼臣讂苣蚁臣龮ꇨ鞁뻥讂胣ꦼ볯뎼볯겼볯꺼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨銂ꧨ鎨臣讂臣膂臣뾽铧閁苣鞾苣鎽ꧨ蚈蟩ꮁ臣蒁臣겅鿧꺁믤꺁苣莃苣ꒂ臣鞁臣꾁胣낂菣뎂菣늂菣袐裦궂菣벃苣銈볯袼볯뎼볯銈볯覼苣讻臣讂볯隼菣莃菣训諨내菨鞢껦ꊂ菣뮂苣ꪁ苣뎁臣ꦃ菣袃菣뎃苣뢅藩ꂴ菣궃菣벃苣벃볯銽볯ꖼ볯覼裢뎼볯ꆼ볯것菣벃苣벃胣릂菣궃菣ꮃꫨ肯苣것菣뎃菣邵郥뾂菣醃苣ꪳ볯뎼볯ꖼ볯낼볯銈볯ꖼ볯낼菣鶃菣뾂菣貼蓨ꪂ藩袐裦떅듧袼볯ꆼ볯覼裢뎼볯ꆼ볯것菣벃苣벃胣誁苣뎁菣릂菣ꢂ菣벃菣钃菣鎃菣뢅苣ꮃ菣궂苣궂菣벃苣袼볯ꖼ볯ꎼ볯覼裢뎼볯ꆼ볯것菣벃苣벃苣ꮐ苣ꢼ볯ꦼ볯薽菣鶃菣뾂菣ꊂ菣뮂苣袼껥붖뻤钼볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼臣馌臣覂苣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣貂臣蒁胣ં䐼噉邀볯鎼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯讧꿧ꦉ볯銼볯颼臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣颭鳥许臣꺁胣ꒂ菣鎃菣궃蛨鎇듧麃ꃦ꺁ꋥ隮苣莃苣ꒂ볯㲉牢ਾ†볯릖돦覼戼㹲 讧꿧ꦉ볯銼볯颼臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣颭鳥许臣ꆮ룤꺚蛨鎇볯늼볯낼듧麃ꃦ꺁苣뎃苣ꪃ菣ꎔ铧캟내菨뢁臣蚈賥誁苣뎁ꋥ隮苣겸껥鞁胣鶁臣ꚁ볯뺁臣꾁苣뎃苣ꪃ菣ꎔ铧늼볯꺼裢궼닎듧麃ꃦ꺁ꋥ隮苣겸껥馁苣龁苣꺁苣뎃菣袃菣ꊂ菣뮂苣銂胣ꢡꇩ貀껥붖뻤钼볯骼蛨鎇듧麃ꃦ뢁臣뮼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰볯붼菣龃苣뎃迥誂뻨뾁臣ꒂ菣鎃菣궃臣꺁苣莃苣ꒂ胣꺁룤ꞁ믤许臣風볨馁苣袂臣ꮁ껥財臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯醼볯醀⼼䥄㹖 袼꟦覯觧銼볯鞼볯ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꺁듦Ꞁ苣膀돧뾰韧꺼볯꒼臣袂臣込臣龁臣꺼볯꒼볯궼菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ苣뾽铧鞁臣ꒂ菣鎃菣ꞁ苣莃苣ꒂ臣鞾苣覼戼㹲 讧꿧ꦉ볯銼볯颼臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯꺼볯떼볯ꦼ볯袼볯Ꞽ볯覼苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣뮴胦銂胣ꢡꇩ貀껥붖뻤钼볯骼볯꾼볯麃苣릂臣誁臣讂돧뾰韧꺁駧龔胣膀胣龮雦设볯閼볯꺼볯꒼菣Ꚃ苣꺁뗧钹귥蒚ꧨ鎨胣膀臣袂臣貀껥붖뻤钼볯骼볯ꦼ볯꒼볯꺁苣뎃菣鲃菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ胣꺁룤ꞁ믤许臣風볨馁苣꺼볯꒼臣袂臣込臣龁臣꺼볯꒼볯궼菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ苣뾽铧鞁臣겸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覽뷯薽†뷯薽뷯貽†뷯覽뷯薽뷯ₓ蒽뷯銽뷯隽뷯蒽†뷯銽뷯趽†뷯銽뷯躽뷯邽뷯膽뷯钽뷯芽뷯薽†뷯閽뷯辽뷯鎽胣뚼뷯钽뷯辽†볯隼볯銼볯銼볯袼볯馼볯邼볯鮼볯辽뷯讽뷯貽뷯貼볯躼苣膀胣ꦼ뷯薽뷯钽뷯蚽뷯莽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆膽†뷯薽뷯貽裢鎽뷯薽뷯覽뷯覽뷯₃꒼볯ꆼ裢芽뷯躽뷯覽뷯螽†뷯莽뷯覽뷯覽뷯馽†뷯袽뷯钽†뷯躽뷯薽뷯膽뷯钽뷯ₓ鞽뷯钽뷯₈膽†뷯銽뷯躽뷯莽뷯覽뷯钽뷯辽뷯膽뷯₌膽뷯钽뷯隽뷯钽뷯銽†뷯蚽†뷯薽뷯薽뷯ₓ薽뷯邽뷯薽뷯鎽뷯蒽†뷯躽†뷯袽뷯₅膽뷯覽뷯膽뷯ₒ邽뷯躽뷯銽뷯膽뷯趀볯辽뷯躼볯薽뷯貽볯ꊼ뷯辽뷯躼볯骼볯钼볯钼裢銼볯鞼볯貼볯醼볯颼볯覼볯늼뷯閽뷯貼볯躼苣膀胣뒼뷯薽†뷯薽뷯貽裢鎽뷯薽뷯覽뷯覽뷯₃钽뷯膽뷯鎽뷯銽뷯邽뷯覽뷯躽†뷯膽뷯钽뷯銽볯뒼볯醼†뷯辽뷯钽뷯覽뷯鎽†뷯鞽뷯₏蒽뷯蚽뷯薽뷯薽뷯钽†뷯閽뷯閽뷯覽뷯鎽†뷯袽뷯钽†뷯躽뷯薽뷯膽뷯钽†뷯覽뷯袽†뷯袽뷯₅꒼볯ꆼ胣Ꞽ뷯躽뷯鎽†볯薽뷯躼볯骼볯隼볯鎼裢醼볯銼볯貼볯醼볯颼볯覼볯ꪁ苣뎁臣ꢼ뷯覽볯ꢼ볯覂胣貀볯貽뷯莽뷯螽뷯躽裢貽뷯讽뷯₅邽뷯邽뷯覽뷯薽†볯ₑ覽뷯蒽뷯莽뷯鎽†뷯覽뷯蚽뷯銽뷯躽뷯覽뷯钽뷯辽뷯₎辽뷯₆覽뷯貽뷯钽†뷯閽뷯蒽뷯躽뷯貽뷯辽뷯薽뷯芽뷯颽裢醼裢ₒ邽뷯鎽뷯钽뷯隽뷯₅邽뷯躽뷯銽뷯膽뷯覽뷯₃蒽뷯莽뷯膽뷯₌莽뷯貽뷯鎽†뷯躽뷯辽†뷯躽뷯閽뷯覽뷯銈뷯薽뷯銽뷯钽뷯躽뷯₇莽뷯貽뷯鎽胣꒼뷯膽뷯薽뷯薽뷯ₓ閼볯骼볯颼볯銈볯馼볯袼볯邼볯醼볯节臣龁迥ꞅ臣鎁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 袼듧麃臣뾪ꏨ覼戼㹲 늼볯꺼裢궼듧麃ꃦ銂胣醼볯薼苣랂菨钻ꇨ薸볯ꢼ뷯莽뷯辽뷯薽볯莼볯ꢼ볯邼볯颼볯躼볯鎼볯銂郥肂볯낼볯ꦼ†볯隼볯邼鿥난볯ꢼ뷯莽뷯辽뷯薽볯莼볯ꢼ볯邼볯邼볯鞼볯邼볯覼룤ꞁꋥ隮臣膀볯骼볯鲀볯骼볯꺁꿦ꞁ胣隼胣颼韦躯臣趤臣馶臣貂苣芀鿥난苣膀볯鲀볯ꖗ꿦ꮁ뫤鮏臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볯늼볯낼볯ꆼ볯ꎼ볯莼볯늼볯銈볯隼볯钼볯내菨ꪠ苣膀볯躼볯螽볯겼臣趇苧뢅菣袃菣Ꚃ菣誁苣뎁볯邼볯Ꚃ苣躃믤股룦銂郥肂苣蚁臣뾪ꏨ閁苣龁胣銼뷯궼†볯銈苣ꮃ苣龃菣銂郥肂菣ꂃ臣ꚼ볯銼볯릟鳥袼볯뒼볯ꎼ볯鎼볯銈볯邼볯钼볯궸臣鞢껦閁苣讂胣ꆼ볯ꦼ볯내菨ꪠ苣膀볯骼볯鲀볯骼볯꺁꿦ꞁ胣醼胩鎖臣銼鯥趤臣馶臣芀鿥난苣膀볯鲀볯ꖗ꿦ꮁ뫤鮏臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꊂ菣뮂苣鞃菣袃苣ꮃ볯㲉牢ਾ†듧麃苣膀볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣궸臣钼볯邼볯내菨込苣Ꞃ菣ꞁ軦꺨臣膀臣鞁臣閼볯薼뫤骼臣ꞁ볯颼胣鞼볯芙雩릟ꓩ鞁臣芀듧麃苣膀볯邼볯캐겼볯Ꚃ苣ꮃ臣股룦銂郥뺁臣蒁ꫥ鎽臣覤臣龁胣钼볯鲀볯銼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣貾胣ꮊ꣩몙飦꺁ꇨ薸臣袂臣込臣龁臣뮲駧袼뻤袁臣膀鳦몙飦꺁苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ臣袂臣閃菣낂菣뎃菣誁苣뎁臣貂苣꺁铦覤뷤覼苣膀苣Ꞃ菣ꮁ諥袁苣芀苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣꾁胣閁苣ꮁ볯隼駦鎖뛧骶臣讂胣뮼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰볯붼裢뒼뷯馽뷯覽뷯覽뷯薽볯閼裢銼볯ꎼ뷯込뷯趽뷯貽볯袼볯趽뷯銽뷯袽뷯趽†볯袽뷯銽뷯膽뷯覽뷯膀볯뒼볯ꮼ볯銼볯覼苣膀菣ꒂ苣궃볯閽뷯覽뷯鎽볯閼菣ꒂ苣궃菣莃菣ꮃ臣貸蟩馁苣芀볯隼駦鎖臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃뻥膀볯麃苣꾂菣ꪃ菣袃菣銂胣閁苣ꮁ볯钼駦鎖臣醼苣Ꞃ菣鎽臣誂諥袁苣芀臣꺁迥鲿苣膀蛥낼뷯辽뷯邽뷯膽뷯薽裢ꊼ뷯蚽뷯薽뷯薽뷯₄뎼뷯貽†뷯躽뷯膀胣낼볯뎼胣ꞁ룤ꚺ胣邾胣ꮁ듧麃苣鞴뗦馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣芵뗧鞁臣芀곦蒁臣膀듧麃苣膀볯莄臣醼볯蚈雩膀볯邼볯麃苣꾂菣ꪃ菣袃菣꺁볯邼볯랰蛥뒼볯ꆼ臣몛껥馁苣芀볯ꊼ볯銂駩뮎臣膀臣鞁臣銼볯邼菣ꒂ苣궃菣莃菣ꮃ臣邼볯銼볯₮꺼뷯꾼볯銂諥袁苣芀菣것菣袃苣膀鋦貋臣ꪁ臣覂껥ꦸ臣醼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀뫦늶苣膀苣뎃菣것菣랂菣뎃菣ꒂ苣ꮃ臣뮧该鞁胣鶁臣ꚁ냦뚺뛦ꢁ臩袐臣讂볯趽볯꺁苣뎃菣것菣랂菣뎃뗦鎽苣ꂊ臣膀臣鞁臣뮴駧ꮁ鋦貋臣讂胣邃苣ꊂ菣銂胣캁랂菣膃菣벃苣ꞃ菣袨闦ꢙ臣袨闦馁苣芀駩Ꞁ苣뎃菣궃菣ꮃ臣뒠郥膀럧鶡뛦ꂁ臣銂뷤ꢔ臣讂胣붙胦뎂菣袃菣벃菣꺁ꃥ袐胣躃藥邭苣랂ꇨ薸苣뾽铧馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 袼껥붖뻤钼볯骼돧뾰볯Ꞽ뷯馽뷯辽뷯銽뷯躽뷯覼臣ꒁ臣ꚁ臣ꊂ菣뮂苣覼戼㹲 隳냥袼臣ꪁ苣ꆁ胣뾰룤꺁臩낉臣隳裥覼臣膀돧뾰韧꺁雧ꎂ諧讅臣螌꣦銂迦鮾臣讂臣膂臣膀껥鎘臣ꊂ菣뮂苣閁苣鞾苣芀귦뢸臣ꎂ胨떂菣鞃菣ꢁ꿦莼臣龁ꃥ袐臣ꎂ胨떂菣隃菣ꮁ臣醁苣躁觥꺁냥꾁胣ꦼ볯꒼볯誁苣뎁볯ꦼ볯꒼볯꺁韧뚊臣芁苣芀볯꒼볯궼臣袂臣꺼볯꒼볯궼苣ꎂ臣ꎂ胨꺁蟥꺽臣覜諥Ꞁ臣膀냥궸臣躁觥꺁苣ꮃ苣벃苣辇臣鞾苣貂臣鮸냥ꮁ苣ꎁ臣몤臣貂苣芀볯꒼볯궼臣袂臣꺼볯꒼볯궼苣ꊃ菣뾂菣뎃苣馁苣붥臣鞁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀苦薀臣覂臣뾰苣뎃菣ꮃ苣膀뷥늩裥躇臣겅鿧꺁諦鎡苣뾽铧鞁臣膀苣ꮃ苣벃苣꺁귥ꢜ臣ꒁ臣ꚁ苣莃苣ꒂ臣讂胣銃菣ꮁ臣醁苣隳냥꾁胣醼볯邼뷯貽臣龁苣醼볯邼뷯螽苣薶臣讂냥낂菣뎂菣릂뿦ꚺ臣袂臣ꚁ껥ꦾ臣貂苣芀돧뾰苣몤臣ꎂ胨ꮁ臣醁苣躁觥ꪁ돧蚈菣馃菣꾁胣股뛦떂菣隃菣銂뻥膀臣鞁臣股룦낂菣뎂菣릂苣ꊂ菣뮂苣馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣膀臣ꎁ臣袂苣ꎭꋧꮁ룦骮臣貂뻥讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†볯龮雦设볯钼볯꺼볯꒼菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣隳냥薗臣몙韧覼戼㹲 貛胦꺼볯꒼볯麝苨肺胦隳냥薗볯麃苣릂苣膀菣袃臣誁臣ꚁꛨ몇臣貂苣뎂菣릂臣貐꟦꺁苣벃苣銂铧蒁臣ꦼ볯꒼볯銂ꇨ馁臣ꢁ臣袂臣ꚁ觧뒾믤醁苣貂苣貁胣鎁臣뺖苦꾁鯩Ꞁ볯꾼볯麃苣릂苣誂鯩Ꞁ볯꾼볯麃苣릂臣誁臣ꚁ苣誂럦뮈臣芁苣芀믤貾胣隻臣辦껥閁苣ꪁ臣ꪁ苣膀铧麪胣꺼볯꒼菣Ꚃ苣趀臣꾁胣貛胦꺼볯꒼菣Ꚃ苣銂臣蚁胣꺼볯꒼菣Ꚃ苣꾁胣ꊅ胦ꪇ럥超雧뺖苦ꮁ苣ꎁ臣閼臣략臣閁苣讂胣馃菣뾂듧麃臣늀ꇨꞀ臣ꦴꏥ銂鳦馁苣芀뻥ꎁ臣膀볯꾼볯麃苣릂臣膀귦뢸ꇨ隳胥袼뷯閽뷯貽뷯莽뷯趽뷯膽볯뺁臣꾁귦뢸ꇨ궸苣ꮃ苣벃苣것菣ꮃ苣覜臣ꚁ铧銂꟥膂苣芀臣讁臣膀듧醼볯鲀볯隼胩ꊽ臣ꞁ臣膀볯꾼볯麃苣릂臣颫ꇨ隳胥ꮁ臣誂꟥膂苣芀臣꺁臣ꢁ臣膀臣꺁菣Ꚃ苣꺁ꓥꢃ裥꺁蛨鎇닎듧麃臣ꦴꏥ膀臣袂臣鶁苣ꮁ꿥鲿臣ꚁ蛨鎇臣膍裥ꪁ苣뎃苣ꪃ菣銂铧龔룤붃臣芁苣鎁臣銂ꓧ馁胣鎾臣ꚁ胣뺖苦꺁軥ꂛ臣袂臣늀ꇨ꺁룤릖臣膀菣袃볯꒼볯궼苦薀臣貐꟦ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鎼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†藥ꮖ蟥꺽菣뢂菣뎃臣覜諥Ꞁ臣ꒁ臣ꚁ臣ꒂ菣鎃菣ꊂ菣뮂苣銂胣貛胦꺼볯꒼볯겼뷯ꪼ菣Ꚃ苣袼볯袽뷯₅ꪼ뷯莽뷯鎽뷯躽†볯膽뷯辽뷯膽뷯辽뷯馽볯ꊼ뷯銽†볯膽뷯芽뷯銽볯궼뷯袂苣芸단閁苣讂볯ꮁ臣蒁臣閩뻤鞁뻥讂胣螖賧ꮁ臣蒁臣膀볯邼볯꺁鯩Ꞁ菣Ꚃ苣貁볯钼胩ꊽ臣ꞁ臣隳냥薗苣늀ꇨ閁臣膀臣鞁臣떆돥躂볯覽뷯鎽뷯貽뷯钽뷯鎽볯꺁駧螗臣隼胩ꊽ臣颼胩设臣꺁雩ꮁ胩財臣鮁苣鎁臣貁胣놠釥閁苣ꚁ臣讂胣꺼볯꒼菣Ꚃ苣꾁胣貐돧꒺藩閁苣膀臣鞁臣꺨胣꺁藥ꮖ裥ꆾ胦릂菣ꦃ菣뢂菣ꮁ꿥鞁臣颫뫥ꮁ뿥钭胦ꞁ臣讂胣邈뷤꺁볯꾼볯麃苣릂볯隼胣颼胩ꊽ볯꾁胣뎹鷥趇蟩銼볯鲀볯閼뷯銂鳦馁苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 鎁苣覂臣麃苣릂臣膀鳦ꚇ뷧ꞁ臣讂臣袼苣뎃菣궃菣ꮃ볯膀臣龁臣颍诧ꞁ臣节臣辁臣誸꣨꺁믤꺁닦芙觥蒵裦ꦉ臣떽铧鞁臣膀鳦몙飦꺁닦芙돦袼뻤袁臣膀鳦몙飦꺁苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ胣ꪁ苣뎁臣鶁苣覂臣閃菣낂菣뎃菣誁苣뎁铦覤뷤覼臣ꚇ뷧閁苣讂胣隳냥薗臣늀ꇨꮁ꿥馁苣鎁苣覂臣꺨胣꺁蟥꺽臣覜諥Ꞁ苣膀믤许臣袂臣ꮁ룦骮臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 醼볯놀뷩ꞁ胣貛胦꺼볯꒼菣Ꚃ苣銂胣낂菣뎂菣릂꿥릮胦ꮁ뻥ꎁ臣ꢡ迧讞뇦骮볯邽뷯薽뷯辽뷯馽뷯薽볯鞁뻥讂胣낂菣뎂菣릂꿥릮胦銂胣릅蛨薆苣ꮃ苣벃苣鮯껥Ꞁ菣릂菣袼볯낼볯뒼볯覼臣겸껥鞁뻥讂胣ꆰ뷦ꮁ뿨릁苣ꢁ胣邼裥誁苣뎁苣ꮃ苣벃苣릅蛨薆돦蒰볯鎽蟩醼뷯螽臣龁苣醼뷯覼臣隼볯蚈뻥膀†ꇨ늶苣벜ꫧ醿若ꊏ볯邽뷯銽뷯辽뷯芽뷯钽뷯貽†뷯貽뷯颽뷯鎽볯袂苣閼臣몇臣芀귦뢸臣鮯껥Ꞁ臣膀볯蚈臣醼볯钼뷯螽볯ꪜ뫦꺁ꇨ뾼苣ꮃ苣벃苣膀臣龁臣隼볯蚈臣醼볯邼뷯螽鳦肺臣股볦낂菣뎂菣릂臣鞁臣骮뻧閁苣讂胣股룤낂菣뎂菣릂菣馃菣銂胣Ꞽ뷯閽뷯辽뷯薽뷯薽뷯ₒꖼ뷯覽뷯薽ꏨ꺽苣ꢔ臣ꚁ뇦骮臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 鎁臣ꢡ迧讞裥邞臣몟臣趁胣開觧銂闧ꪁ苣龮꣩낂菣벃菣ꮁ藩蚈臣鞾苣芀藥鎽髧ꮁ臣膀苣誂ꇨ궸苣ꮃ苣벃苣것菣ꮃ苣誸飦閁臣龁该ꦉ苣膀룤붃胦꺁苣ꮃ苣벃苣鮯껥Ꞁ苣ꮃ菣鞃臣늉苣鎽臣鞾苣芀臣貂苣꺁菣Ꚃ苣ꮁ胣뮻蓦ꮁ뗧貤臣鞾胣鶁臣ꚁ藩Ꞁ賥鞁臣뒰볯邽볯銼볯鎼볯銂뻤ꚵ臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 낂菣뎂菣릂꿥릮胦麃苣릂臣袂臣낂菣뎂菣릂룤鮯껥Ꞁ菣Ꚃ苣銂胣閁苣ꮁ胣뎂菣袃菣벃菣낂菣벃菣膀鳦몙飦꺁苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ苣ꮃ菣鞃胣誁苣뎁苣ꮃ菣龃菣趞郥뾂菣醃苣ꪳ볯뮲駧ꒉ뗧邈觧떽铧낂菣벃菣ꮁ裥醁뻥讂胣뎂菣袃菣벃菣낂菣벃菣꺁菣Ꚃ苣꾁胣躯韦袼胩芁臣誂볯麛볯鎃菣꾂菣꺁藨鲆蛥ꢳ냥銂迥醁뻥讂胣ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨낂菣벃菣꺁菣Ꚃ苣꾁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銈볯내菨ꮁ臣醁苣ꒂ菣릂菣뎃뷯늼볯ꆼ臣ꒂ菣鎃菣궃裥肿臣袂苣겸껥閁苣讂胣讧꿧ꦉ볯邼볯邼볯Ꞽ볯낼裢醼†苣ꮃ菣龃菣趞郥ꦉ볯꺁듦Ꞁ볯㲉牢ਾ†뿨뒹胣Ꞽ볯낼裢醼臣膀蛨鎇닎듧麃臣誁臣ꚁ胣ꒂ菣릂菣뎃뷯늼볯ꆼ臣몙迧銂ꋥꂊ臣鮁苣鎁臣貁ꓧ閁苣ꚁ臣讂볯ꊼ뷯钽뷯膽뷯覂볯꒼뷯膽뷯薽뷯辽뷯辽뷯覽뷯₁醼볯馼볯ₙꪼ뷯貽볯钼볯袼볯覼볯颼볯隼裢隼볯覼胣鎾臣ꚁ胣ꎼ볯꒼†볯邼볯邼臣袂臣ꚁ苣벃菣閁苣讂볯겼볯銈볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨꺁胣ꒂ菣릂菣뎃뷯늼볯ꆼ苣몈뿦馁苣붃諥銂胣떆蟨캓내菨ꪠ볯꺼볯銈볯袼볯鎼볯込볯鎼볯銂뷤ꢔ臣ꚁ胣閩뻤鞁臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 뎛볯钼臣膀볯꺼볯銈볯袼볯鎼볯込볯鎼볯내菨ꮁ臣醁苣膀볯겼볯銈볯뺁臣꾁꟦覯觧ꦼ볯鎼볯鞼볯ꮁ苣誂苣벃菣閁苣讂볯겼볯銈볯ꊂ菣隃菣뎃黨袐苣뎃菣꾂돨袼볯ꦼ볯₤鎼볯鞼볯뾂菣醃苣ꪳ볯銂铧蒁臣ꚇ郧貾臣膀苣뎃苣ꪃ菣趽볯꺼볯꺁껥뢸諧讅菣馃菣銂胣뎛ꓧ馁苣芀볯겼볯銈볯誁苣뎁볯ꦼ볯₤鎼볯鞼볯뾂菣醃苣ꪳ臣ꆸ雦貁胣ꒂ菣릂菣뎃臩鶼귥꺁믨馆苣몈뿦馁苣芀鳦鶈臣邃菣袼믩覼臣膀蓧ꚇ郧꺁듧麃苣ꢡ臣芀菣벃볯鲀볯袼駧覼臣膀ꓧ閁苣龁뿦ꚺ臣Ꞽ볯낼裢醼臣ꚇ郧鞁臣내菨銂ꇨ馁胣邃菣閼胣鞼볯낁觨覼臣膀ꓧ閁苣龁뿦ꚺ臣ꎼ볯꒼†볯邼볯邼苣뎃菣꾂돨ꞁ蟥蚐臣龁듧麃苣ꢡ臣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣膀룤낿臣風볨誁苣뎁껥붖뻤ꞁ觧ꮁꫨ躘臣貂臣ꖻꓥ꺁苣誂雦ꞁ胣龮雦閁苣鞾苣鎁臣貁飦覂臣ꞁ臣讂胣겜駧躘臣骤臣꺁铦覤臣袂臣覤鯦貁胣誸뿨꺁闦몤臣覂ꛨꚁ迥붃臣芁苣膀뻥ꎁ臣膀럦颻臣貂苣讫뇦꺁꿧늛蛥ꮁ臣讂胣ં䐼噉邀볯鞼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†볥ꢔ臣貂臣鶁苣麁苣꺁雦꺌臣讖ꓧꢅ뷤袼觧놨胣릉꣨몇ꇩ膀觧놨藥놠胣醛ꫨ꺁ꯨ螖胣膦듧膀ꃧ뚩껥麃菣ꖃ苣ꮃ胣뢛뇧膀臣龁臣隻臣讖ꓧ覼臣膀鳦몇ꇩꮁ臣蒁臣芏藧閁苣龁胣螃菣뾂菣벃苣袼볯薽뷯ꊼ뷯躽뷯膀볯薽뷯薽볯薽뷯膀臣龁臣ꎼ볯뎼†볯薽뷯覽뷯钽뷯馽臣ꦁ볯ꮁ觧낕髧ꪁ苣ꒂ菣뎃菣ꎂ菣ꆂ苣ꊂ菣銂胩鞁臣鞾苣貂苣薃ꃥꢁ郥颁臣膀臣꺁藥鎽臣겜飦내鯦궸臣芏胨ꢁ臣ꚁ迦ꢔ臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 閁苣ꮁ胣ꖻ룤꺁臣貂臣貂臣뎱鯥몇ꇩ꺁飦내鯦誁苣뎁藩鞈ꇨ꾁胣鶁臣ꢅ뷤貁鳦躘듧뢛룤ꞁ迥莀臣鞁臣뒏铧閁苣讂볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯醼볯颼볯醼迥袼볯邼볯醼맥醼볯袜볯醼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯邼볯邼볯邼迥袼볯邼볯銼맥銼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯鞼볯貼볯閼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯邼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯颼볯邼볯颼迥袼볯邼볯銼맥鞼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯醼볯貼볯閼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯颼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯钼볯钼볯馼볯钼迥袼볯邼볯銼맥醼볯袜볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯醼볯貼볯醼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯邼鳦醼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯銼볯貼볯钼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯邼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯銼볯貼볯銼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯醼鳦閼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯邼볯鎼볯颼迥袼볯邼볯銼맥醼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯閼볯貼볯鞼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯隼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯鞼볯閼볯邼迥袼볯邼볯銼맥鎼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯邼볯貼볯鎼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯邼볯貼볯邼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯鎼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯醼볯鎼볯邼迥袼볯邼볯銼맥醼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯颼볯貼볯醼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯钼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯鎼볯醼볯鎼迥袼볯邼볯銼맥閼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯颼볯貼볯邼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯馼볯貼볯銼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯邼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯钼볯醼볯钼볯隼迥袼볯邼볯銼맥馼鳦醼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯鞼볯貼볯銼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯閼볯貼볯隼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯颼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯銼볯隼볯鞼迥袼볯邼볯銼맥閼鳦銼볯ꖗ蟥颡볯鮼뇧붛蟥颡闧랏곧隼볯込볯颼볯貼볯銼볯랏볯銼볯邼볯뒹볯袜볯颼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯閼볯鞼볯颼迥袼볯邼볯銼맥隼鳦閼韦몇ꇩ覼볯뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯鎼볯钼볯隼볯閼迥袼볯邼볯銼맥鞼鳦醼볯ꖗ蟥颡볯鮼臣袂臣뎱鯥몇ꇩꪕ迥견볯邼볯钼볯醼볯钼볯隼迥袼볯邼볯銼맥馼鳦醼볯ꖗ蟥颡볯芀臣覂臣膀鳦躘듧뢛臣貐駦ꮁ胣銼볯邼볯뒹볯銼鳦銼볯ꖗ臣몇ꇩ閁苣讂胣ꢼ뷯趽뷯躽†볯薽뷯辽뷯薽†볯莽뷯薽뷯莽뷯鎽볯ꦼ뷯莽볯ꎻ郧몺闦蚐闧랏볯ꚼ볯鞼볯낼볯뒼臣뎱鯥몇ꇩ꺁飦내鯦誁苣뎁藩鞈ꇨ꾁胣겜飦내鯦ꞁ臣꺁藥鎽臣芏胨ꢁ臣ꚁ迦ꢔ臣貂苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢㄰ㄳ㈷㌷⸴楴≦㈾㄰ㄳ㈷㌷⸴楴쉦゠〰㜱㰸愯㰾䐯噉ਾ 袼苣誃菣覼戼㹲 몇ꇩ몺臣膀蟥颡臣몟臣趁苣誃菣붛觧놨臣몙ꇨ閁苣讂臣膀臣讂臣꾁郥몇ꇩ貁详뚵臣龁臣뺔ꏦ閁苣ꚁ鯥ꦾ臣貂뻥ꪁ臣ꪁ苣讁苣鞁臣꾁迥誂룤銁苣貂苣뺁臣꾁胣릉꣨膺闩颮볯ꎼ뷯趽뷯覽뷯鎽뷯辽뷯薽뷯ₒ辽뷯₆낼뷯钽뷯躽뷯鎽볯貁胣랕껥ꮁ苣誂賦趐臣貂臣겋ꯧ꺁냥肖껥ꮁ꿥鞁臣꺁臣몇ꇩ궸臣肨迥閁苣龁꿥鞨룦뾁臣龔觧ꚭ髧邝雦꺁苣뎃菣ꮃ臣鮾룤銂꣨꾏臣讂韦銂ꯨ花臣膀蟥颡뫤꾁胣붛髩몇ꇩ꺁藥ꢡ臣龁苣꺁諦鎡髧ꪁ뫦馂臣貮뫤馁苣趉臣膀鯦ꊝ臣袂苣鶁臣ꢗ苣붛髩论该肱臣誑鿧鞁臣醁苣낁臣覂臣蒁胣ં䐼噉邀볯鞼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†볯躃菣Ꚃ苣벃볯㲉牢ਾ†蟥颡뫤꾁臣鎁臣誁臣ꚁ胣몇ꇩ貁볯躃菣Ꚃ苣벃觧놨뫥ꮁ苣誂볯겅雩ꮁ믤閁苣讂臣芁苣蒁臣겅雩銂뗧骁臣躃菣Ꚃ苣벃觧놨뫥ꮁ苣讂뇦骮苣鞏臣讂臣ꞁ臣膀苣뎃菣ꮃ臣鮾룤꾁뷥늩諦鎡臣芰雩뚮臣뺯臣ꚁ臣뾁ꇨ辂苣讂韦銂胣讫뇦馁苣芀臣꺁韦꺁ꯨ花臣膀菣ꮃ苣Ꞃ菣릉꣨閳곧銼볯ꆝ臣袂臣견볯鎼鷦袼볯覼臣몟臣趁蟥颡臣겅臣ꦈ铧꾏菨ꮁ臣貂苣芙苧ꖻ觥ꮁ胣몇ꇩ몺臣袂苣躃菣Ꚃ苣벃觧놨뫥ꮁ꿥鞁臣ꪁ臣貂苣节臣ꢁ臣讂胣鶁臣袂臣ꪁꯨ花臣몇ꇩ몺臣袂苣ꪁ臣貂臣뒠郥꾁胣견룤薀臣袂苣떂菣鞃菣꺁뻤躸臣蒁臣ꪁ苣讫뇦ꮁ臣蒁臣节胣ꦈ铧閁苣讂냥肖껥銂ꇨ몤臣讂苣꺁臣馁苣芀냥肖껥꾁胣躃菣Ꚃ苣벃觧놨뫥ꮁ苣誂뷤邈臣貂臣겅ꫨ芰雩뚮臣ꪃ苣袃볯貽뷯鎽뷯ₔ辽뷯₆銽뷯莽뷯螽뷯覽뷯薽뷯₄薽뷯邽뷯銽뷯鎽볯ꮁ꣨覼臣貂臣뮻蓦꺁胨讁胣芁苣蒁臣膀胥薀臣뒠郥ꮁ臣蒁臣몇ꇩ몺臣袂苣뾉ꫨ閁苣龁믤辄臣薀臣芁苣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 袼苣벃苣袃菣ꪃ苣覼戼㹲 몇ꇩ몺臣鎁臣ꮁ臣蒁臣膀뻥龔觧꺁苣뎃菣ꮃ臣鮾룤꾁胣릉꣨꺁믤躸觥ꮁ臣蒁臣膀臣讂臣꾁蟥颡臣뺔ꏦ袼뷯膽뷯鎽뷯躽뷯覼胣銋뗧芁苣蒁臣随苣许臣趉臣誁臣ꚁ胣몙飦ꮁ꿥鞁裥뎮雩芿苣覜臣ꪁ臣鎽ꗦ薀臣芁苣뺯뇨薀볯鎽뷯覽뷯貽뷯蒽†뷯蒽뷯銽뷯鎽뷯薽뷯覼臣뺯臣ꚁ臣뾁ꇨ辂苣讂韦銂胣誑鿧馁苣节臣ꞁ臣讂볯ꪂ菣릂菣ꦃ菣ꊂ鯥릉꣨閳곧鎼볯銼볯袼볯覼迥辦껥覼胣ં䐼噉邀볯鞼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볯閃苣뎃菣뎃菣覼戼㹲 몇ꇩ몺臣鎁臣ꮁ臣蒁臣膀蟥颡臣袼觧놨臣袂臣놵裥钧鏥骼볯꺼뷯钽뷯辽뷯膽뷯₌ꊼ뷯膽뷯蒽†뷯蚽†볯膽뷯薽뷯钽뷯ₓ膽뷯蒽†볯薽뷯閽뷯膽뷯覽뷯躽뷯覼臣袂苣覼藥讖臣颻臣貂苣讁臣讂臣꾁藥讖苣貵臣ꮁ鯥讫觧놨臣袂臣閳ꛨ钧鏥骼臣袂苣몱껥銂迥醁苣뺁臣꾁胣떂菣鞃菣꺁뻤躸臣鎽ꧨ肊ꇨ꺁냥肖껥ꮁ꿥鞁臣꺁臣財苣貂苣ꢗ苣膀ꯨ花臣讂胣ં䐼噉邀볯鞼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†볯놋鯥覼戼㹲 몇ꇩ몺臣鎁臣ꮁ臣蒁臣膀뻥龔觧꺁苣뎃菣ꮃ臣芰雩뚮臣뺯臣ꚁ臣뾁裥ꢔ迥붃臣閁苣讂韦銂胣讫뇦馁苣芀臣꺁韦꺁ꯨ花臣膀蟥颡臣붛髩겅ꇨ꺁臣膂臣肊ꇨ蒚臣隺若貁껥蚺臣讂觥ꮁ胣몇ꇩ몺臣袂苣붛髩论该肱臣뺯臣ꚁ臣閁苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 袼菣뎃菣벃苣覼戼㹲 몇ꇩ몺臣鎁臣ꮁ臣蒁臣膀蟥颡臣袼菣뎃菣벃苣릉꣨膺臣袂苣覼藥讖臣颻臣貂苣讁臣讂臣꾁藥讖苣貵臣ꮁ菣뎃菣벃苣릉꣨膺臣袂苣몱껥銂迥醁苣뺁臣꾁胣떂菣鞃菣꺁뻤躸臣鎽ꧨ肊ꇨ꺁냥肖껥ꮁ꿥鞁臣꺁臣財苣貂苣ꢗ苣膀ꯨ花臣讂胣鎁臣ꢗ臣讫뇦꾁胣螃菣麃菣꾂觧놨돦견볯銼鷦誁苣뎁곧鎼볯ꆝ볯鎼볯ꮁ鿥ꖁ臣몇ꇩ貁藥ꮁ裥ꢔ迥붃臣閁苣讂駦릂믤趉臣膀蟥颡뫤ꮁ苣誂菣뎃菣벃苣릉꣨膺臣뺯臣ꚁ臣閁苣讂苣꺁臣馁苣芀臣꺁苣蚁臣讫뇦貁蟥颡뫤ꮁ苣誂臣閁苣龁ꃥ袐臣膀곧覸胨ꮁ苣讂苣뎃菣ꮃ臣鮾룤꺁臣讁臣讂ꯨ花臣誁臣ꚁ苣膀裥ꢔ臣貂苣芰雩뚮苣ꢡꓧ馁苣节臣ꢁ臣讂胣芰雩뚮臣膀菣뎃菣벃苣릉꣨膺臣袂苣鲽裦閁苣龁藥趪냥肖껥꺁菣릂菣袼뷯覽뷯钽†뷯蚽†뷯薽뷯辽뷯躽뷯骽뷯蒽†뷯颽뷯薽뷯钽뷯覼臣風볨閁苣龁믤辄臣薀臣膀臣讂臣꾁胣讀胣꺁ꃥ袐臣誁臣ꚁ蟥颡뫤ꮁ苣誂触趪臣貂臣뮻蓦꺁胨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