(57)【要約】      （修正有）【課題】還元反応に利用可能な変異型還元酵素及びその利用等を提供する。【解決手段】ロドコッカスエリスロポリス由来の特定のアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には元のアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。＜基本的なアミノ酸変異＞（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
【請求項２】
アミノ酸変異が４個のみであることを特徴とする請求項１記載の酵素。
【請求項３】
アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）を１個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
【請求項４】
アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）を１個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
【請求項５】
アミノ酸変異が６個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）及び（ｇ）を２個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
【請求項６】
アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
【請求項７】
アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｈ）及び（ｉ）を３個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
【請求項８】
アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
【請求項９】
アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を４個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異
【請求項１０】
アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）を４個含むことを特徴とする請求項１記載の酵素。
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異
【請求項１１】
下記の配列番号２乃至９のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素。
【請求項１２】
アミノ酸変異が５個以上８個以下であることを特徴とする請求項１記載の酵素。
【請求項１３】
アミノ酸変異が５個以上７個以下であることを特徴とする請求項１記載の酵素。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１４記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
【請求項１７】
請求項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は請求項１５記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１８】
宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項１７記載の形質転換体。
【請求項１９】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項１８記載の形質転換体。
【請求項２０】
請求項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は請求項１６記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
【請求項２１】
ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、請求項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素若しくはそれらを産生する微生物又は請求項１７乃至１９のいずれかの請求項記載の形質転換体、或いは、それらの処理物を作用させることを特徴とするアルコール化合物の製造方法。
【請求項２２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列になるように、アミノ酸変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
【請求項２３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的な塩基変異（ａ’）から（ｄ’）までの全てを含む塩基変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と同等な塩基配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法。
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元反応に利用可能な変異型還元酵素及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
還元反応に利用可能な酵素、即ち、還元酵素は、基質を還元する能力を有し、医農薬の有効成分となる化合物やその製造中間体、特に光学活性化合物等を製造する為の有機合成反応に利用されている。
例えば、特許文献１には、ライフソニア  エスピー(Leifsonia sp.)Ｓ−７４９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９１）から還元酵素の遺伝子をクローニングし、当該還元酵素を発現する形質転換体を用いて光学活性アルコールを製造する方法が開示されている。また、種々のアミノ酸変異を導入して得られる変異型還元酵素も報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
光学活性化合物やその製造中間体等を製造する為に工業的に利用される還元酵素は、当該酵素による還元反応における反応生成物の光学純度が高いこと、基質の絶対立体配置に対する当該酵素の認識性が高いこと、温度・ｐＨ・溶媒・圧力等の各種反応条件に対する安定性が高いこと等の性能を備えていることが望ましい。中でも温度に対する還元酵素の安定性（即ち、熱安定性）が高いと、反応温度を高くすることが可能となり、反応速度を高めるだけでなく、反応中の還元酵素の失活を軽減することができる（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４３６６０９７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Applied Microbiology Biotechnology，８０，８０５−８１２（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、還元反応に利用可能な変異型還元酵素及びその利用等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、このような状況下鋭意検討を行った結果、ある種の野生型還元酵素のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸が他の特定のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する還元酵素（即ち、変異型還元酵素）が優れた熱安定性を示すことを見い出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素（以下、本発明酵素と記すこともある。）；
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
【０００８】
２．アミノ酸変異が４個のみであることを特徴とする前項１記載の酵素；
３．アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）を１個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
４．アミノ酸変異が５個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）を１個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
５．アミノ酸変異が６個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）及び（ｇ）を２個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
【０００９】
６．アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
７．アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｈ）及び（ｉ）を３個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
【００１０】
８．アミノ酸変異が７個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）及び（ｈ）を３個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
９．アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｊ）を４個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異
【００１１】
１０．アミノ酸変異が８個であり、且つ、前記の基本的なアミノ酸変異の４個以外に、下記の追加的なアミノ酸変異（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｋ）を４個含むことを特徴とする前項１記載の酵素；
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異
１１．下記の配列番号２乃至９のいずれかのアミノ酸配列を有し、かつ、基質を還元する能力を有することを特徴とする酵素；
１２．アミノ酸変異が５個以上８個以下であることを特徴とする前項１記載の酵素；
１３．アミノ酸変異が５個以上８個以下であることを特徴とする前項１記載の酵素；
【００１２】
１４．前項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある。）；
１５．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１４記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド；
１６．前項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
１７．前項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は前項１６記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１８．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１７記載の形質転換体；
１９．微生物が大腸菌であることを特徴とする前項１８記載の形質転換体；
２０．前項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は前項１６記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法（以下、本発明形質転換体製造方法と記すこともある。）；
【００１３】
２１．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項１乃至１３のいずれかの請求項記載の酵素若しくはそれらを産生する微生物又は前項１７乃至１９のいずれかの請求項記載の形質転換体、或いは、それらの処理物を作用させることを特徴とするアルコール化合物の製造方法（以下、本発明アルコール化合物製造方法と記すこともある。）；
２２．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列になるように、アミノ酸変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法（以下、本発明酵素改変方法と記すこともある。）；
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
【００１４】
２３．配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的な塩基変異（ａ’）から（ｄ’）までの全てを含む塩基変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と同等な塩基配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入する工程を含むことを特徴とする方法（以下、本発明ポリヌクレオチド改変方法と記すこともある。）；
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異
等を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコール化合物を製造するために優れた変異型還元酵素等が提供可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１７】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
本出願において、例えば「E12G」とは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１２番目（「12」：アミノ酸配列のＮ末端からの位置番号）のグルタミン酸（「E」：一文字表記）がグリシン（「G」：一文字表記）に置換されるアミノ酸変異を有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有する酵素を意味している。
【００１８】
本発明において「熱安定性」とは、例えば、６５℃で３０分間の保温処理を行った後の還元酵素活性の残存率が、同様に処理した野生型還元酵素の還元酵素活性の残存率よりも高いことを意味する。
【００１９】
まず、本発明における変異型還元酵素、即ち、本発明酵素について説明する。
配列番号１で示される野生型還元酵素のアミノ酸配列とは、３４８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、ロドコッカス(Rhodococcus)属（好ましくは、ロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物由来の還元酵素である。当該還元酵素及び本発明酵素の還元酵素活性（即ち、基質を還元する能力）は、これらのタンパク質を、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライド、ＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、遊離するＮＡＤ＋量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。
【００２０】
尚、ロドコッカス(Rhodococcus)属（好ましくは、ロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物は、天然から分離してもよいし、菌株保存機関等から購入してもよい。
【００２１】
天然から分離する場合、まず、土壌を野外から採取する。採取された土壌を滅菌水で懸濁させた後、当該懸濁液を、例えば、ＰＹ培地（Bacto Peptoneを５ｇ／Ｌ、Yeast Extractを５ｇ／Ｌの割合で水に溶解した後、ｐＨを７．０に調整）等の微生物分離用固体培地上に塗布し、これを２５℃で培養する。数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、得られたコロニーを新鮮な培地、例えば、ＰＹ培地等の微生物分離用固体培地に移植した後、これを更に２５℃で培養する。生育してきた菌について、SNEATH, (P.H.A.), MAIR, (N.S.) SHARPE, (M.E.) and HOLT, (J.G.): Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.等に記載される方法等に従って、ロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物であるかを同定することにより、ロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物を選抜すればよい。
【００２２】
次いで、選抜されたロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物から、当該微生物の３−オキソ酪酸エチル等のケトン化合物を還元して３−ヒドロキシ酪酸エチル等のアルコール化合物を生産する能力の有無を、例えば、後述の実施例に記載されるような方法に従って確認することにより、本発明に用いられるロドコッカス(Rhodococcus)属に属する微生物を選抜すればよい。
【００２３】
このように選抜されたロドコッカス(Rhodococcus)に属する微生物のうち、ロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)ＳＴ−１０株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３１５０の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成４年９月８日）。
【００２４】
本発明酵素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、基質を還元する能力を有する。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
尚、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、且つ、基質を還元する能力を有する酵素（野生型還元酵素）は、ロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)ＳＴ−１０株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）由来の公知の還元酵素である。
【００２５】
本発明酵素としては、４個以上のアミノ酸変異（例えば、４個以上８個以下のアミノ酸変異、好ましくは４個以上７個以下のアミノ酸変異、より好ましくは４個以上６個以下のアミノ酸変異、特に好ましくは４個以上５個以下のアミノ酸変異、５個のアミノ酸変異）を含むが、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までのアミノ酸変異の他に、他のアミノ酸変異（例えば、１個以上４個以下の他のアミノ酸変異、好ましくは１個以上３個以下の他のアミノ酸変異、より好ましくは１個以上２個以下の他のアミノ酸変異、１つの他のアミノ酸変異）を含むことができる。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
【００２６】
前記の「他のアミノ酸変異」としては、例えば、
＜追加的なアミノ酸変異＞
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異
等を挙げることができる。
【００２７】
前記の「・・・アミノ酸変異を４個以上有する・・・」としては、例えば、４個のアミノ酸変異、５個のアミノ酸変異、６個のアミノ酸変異、７個のアミノ酸変異、８個のアミノ酸変異等を挙げることができる。
【００２８】
前記の「５個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００２９】
前記の「５個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００３０】
前記の「６個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００３１】
また、前記の「７個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００３２】
また、前記の「７個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｉ）３３９番目のセリンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００３３】
また、前記の「７個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００３４】
また、前記の「８個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）１０７番目のセリンがプロリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｊ）２８番目のバリンがイソロイシンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００３５】
また、前記の「８個のアミノ酸変異」としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｆ）２２８番目のアラニンがバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｇ）３３９番目のセリンがアスパラギンに置換されるアミノ酸変異
（ｈ）２７番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されるアミノ酸変異
（ｋ）２８番目のバリンがメチオニンに置換されるアミノ酸変異
を挙げることができる。
【００３６】
本発明酵素は、熱安定性の向上した変異型還元酵素である。当該還元酵素は、基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物の存在下であっても活性を高く保持でき、及び／または、高い基質濃度下で変換反応が可能であることから、工業的なアルコール化合物の製造において有利である。
本発明酵素は、例えば、６５℃で３０分間保温処理した後、３μｍｏｌの３−オキソ酪酸エチルの存在下において２５℃で還元反応を行った場合の還元酵素活性が、同様に保温処理した場合の、野生型還元酵素、特許第４５５８４１４号公報に記載される変異型還元酵素等の還元酵素活性よりも高く、耐熱性に優れる。
【００３７】
次いで、本発明ポリヌクレオチドについて説明する。
本発明ポリヌクレオチドは、天然に存在する変異型遺伝子であってもよく、又は天然の野生型遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された変異型遺伝子であってもよい。また、特許第４５５８４１４号公報や、特許第４７４５７６２号公報に記載される還元酵素をコードするポリヌクレオチドを人工合成したものに変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された変異型遺伝子であってもよい。更には、人工的に全ヌクレオチドを合成した人工合成ポリヌクレオチドであってもよい。上記のような変異型遺伝子及び野生型遺伝子を検索する場合には、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えば、ロドコッカス(Rhodococcus)属（好ましくは、ロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物をその対象として挙げることができる。
【００３８】
本発明酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、本発明ポリヌクレオチド）を取得するには、例えば、以下の方法を用いればよい。
まず、野生型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド（即ち、野生型遺伝子）を取得するとよい。ここで、野生型遺伝子とは、配列番号１０に示される塩基配列を有する遺伝子であり、例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis著；モレキュラー  クローニング  第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）に属する微生物から取得することができる。
【００３９】
具体的には、ロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)）ＳＴ−１０株（尚、当該菌株は、例えば、特許第４５５８４１４号公報の段落番号「0011」等に記載される公知の菌株であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、微工研菌寄第１３１５０号の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成４年９月８日））から「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、且つ、適切なプライマー（具体的には例えば、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの両者）を用いてＰＣＲを行うか、または、Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 386-392等に記載される公知のプラスミドであるｐＵＡＲ（野生型還元酵素の遺伝子を保有するプラスミド、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２７）を鋳型として、且つ、適切なプライマー（具体的には例えば、配列番号１１に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１２に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの両者）を用いてＰＣＲを行う。
【００４０】
そして、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１０で示される塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド等を増幅し、これを回収することにより、野生型遺伝子及び本発明ポリヌクレオチドを作製するためのポリヌクレオチドを調製する。
【００４１】
次いで、調製された野生型遺伝子及び本発明ポリヌクレオチドを作製するためのポリヌクレオチドに部位特異的な塩基変異を順次導入することによって、本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。部位特異的な塩基変異の導入法としては、例えば、Olfert Landt ら(Gene 96 125-128 1990)、Smithら(Genetic Engineering 3 1 Setlow, J. and Hollaender, A Plenum: New York)、Vlasukら(Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye, M.: Academic Press, New York)、Hos. N. Huntら(Gene 77 51 1989)の方法やMutan-Express Km（宝酒造社製）やTaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）の市販キットの利用等を挙げることができる。このようにして、例えば、配列番号１の野生型還元酵素のアミノ酸配列において、４個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
【００４２】
また、同様にして５個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして５個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, A228V)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして６個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S339N)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして７個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S399N, E27Q)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして７個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, E27Q, S399R)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして７個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, A228V, S399N, E27Q)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして８個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, S107P, S399N, E27Q, V28I)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
また、同様にして８個のアミノ酸変異(E12G, D42V, K67R, S317A, A228V, S399N, E27Q, V28M)が導入されている変異型還元酵素を得ることができる。
【００４３】
具体的には例えば、Ｏｌｆｅｒｔ  Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ  ９６  １２５−１２８  １９９０）の方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入してなるポリヌクレオチドを調製するには、まず、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）を、例えば、Ｊ．Sａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等に記載される方法に準じて調製する。
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異
【００４４】
また、本発明ポリヌクレオチドは、例えば、微生物又はファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、当該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
【００４５】
染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
【００４６】
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、当該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
【００４７】
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、更に軟寒天培地と混合した後、当該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
【００４８】
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを当該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを当該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、当該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで当該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
【００４９】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００５０】
プローブに用いられるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
【００５１】
プローブに用いられるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いられるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
【００５２】
また、プローブに用いられるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
【００５３】
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymus DNAを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ２当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
【００５４】
次いで、例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymus DNAを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ２当たり１．０×１０４〜２．０×１０６ｃｐｍ相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ２当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
【００５５】
当該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２ｘＳＳＣ（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
【００５６】
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。
【００５７】
更に、本発明のポリヌクレオチドは、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ７「植物のＰＣＲ実験プロトコール」、９５頁〜１００頁、島本巧・佐々木卓治監修秀潤社、１９９７年７月１日刊行に記載の方法などを参考に合成することもできる。この方法では、長い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してＤＮＡを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の３’末端に約１０ｂｐ〜約１２ｂｐの相補鎖またはオーバーラップをもつように合成され、お互いのプライマーを鋳型としてＤＮＡ合成を行う。プライマーの全長は、約６０ｍｅｒ〜約１００ｍｅｒ、好ましくは約８０ｍｅｒ〜約１００ｍｅｒである。
【００５８】
具体的には、まず、設計された塩基配列をもとに例えば約９０塩基ごとにプライマーとするＤＮＡオリゴマーを設計し、合成する。ＤＮＡオリゴマーの合成は、β−シアノエチルホスホアミダイド法によりＤＮＡ合成機を用いて行うことができる。
設計した塩基配列の中央部付近から５’側約９０残基上流までの配列を用いて第１のＤＮＡオリゴマーを設計し、合成する。次にこの第１のＤＮＡオリゴマーの３’側１２残基の配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第２のＤＮＡオリゴマーとする。また、第１のＤＮＡオリゴマーの５’側１２残基を含み、この部分より遺伝子の５’上流側に９０残基程度の長さの相補鎖オリゴマーを合成し、これを第３のＤＮＡオリゴマーとする。更に、第２のＤＮＡオリゴマーの５’側（遺伝子側からみると３’側）の１２残基の配列を含み、この部分より遺伝子の３’下流側に第２のＤＮＡオリゴマーの相補鎖を合成し、これを第４のＤＮＡオリゴマーとする。以下同様に第５、第６とＤＮＡオリゴマーを合成し、全部の領域をカバーできるまで更にオリゴマーを合成する。
【００５９】
次に、これらオリゴマーを順番にＰＣＲ反応により結合する。まず第１のＤＮＡオリゴマーと第２のＤＮＡオリゴマーとの両者をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。次にこのＰＣＲ産物を鋳型として、第３のＤＮＡオリゴマーと第４のＤＮＡオリゴマーとの両者をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、例えば、変性温度９４℃１分、アニール温度５１℃１分、伸長温度７２℃２分を１セットとして５サイクル反応させた後、変性温度９４℃１分、アニール温度６０℃１分、伸長温度７２℃２分を１セットして２０サイクル反応を行う。反応に使用するＤＮＡポリメラーゼは塩基の取り込みエラー率の低い酵素を使用することが好ましい。以下この操作を繰り返し、塩基配列を伸長し、目的の塩基配列を得る。目的の塩基配列の両端には、必要に応じて制限酵素部位を設け、常法に従いクローニングベクターに導入し、サブクローニングしたり、セルフライゲーションによってプラスミドを構築する。得られたポリヌクレオチドの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで確認し、目的の塩基配列が得られたことを確認する。
【００６０】
上記のようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)、John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ (Invitrogen社製)、ｐＴｒｃ９９Ａ (Pharmacia社製)、ｐＫＫ２２３−３ (Pharmacia社製)等を挙げることができる。
【００６１】
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著, Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００６２】
上述のようにして得られるＤＮＡが、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを優先して生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００６３】
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで当該形質転換体の培養物をｍ−クロロフェナシルクロライドに作用させる。反応生成物中の１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
【００６４】
次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、更に７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する条件を挙げることができる。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする１個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。
【００６５】
次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、上記と同様な操作で、配列番号１で示されるアミノ酸配列における４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする２個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。
【００６６】
次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、上記と同様な操作で、配列番号１で示されるアミノ酸配列における６７番目のリジンがアルギニン酸に置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする２個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。
【００６７】
次いで、得られたベクター（ＤＮＡ）を鋳型にして、上記と同様な操作で、配列番号１で示されるアミノ酸配列における３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を片側のプライマーとして用い、配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、得られたＤＮＡ断片に、配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）と、配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーとを加え、ＰＣＲ法によりＤＮＡ断片の増幅を行う。増幅されたＤＮＡ断片を、例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った配列番号１０で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする２個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むベクター（ＤＮＡ）を得ることができる。
【００６８】
尚、必要に応じて、上記の基本的なアミノ酸変異を導入する方法と同様な操作で、上記の追加的なアミノ酸変異を1個または複数個導入することにより、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００６９】
本発明ベクターは、本発明ポリヌクレオチド又は宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド等を含有する。
【００７０】
本発明ベクターの調製は、本発明ポリヌクレオチド又は宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチド等を、本発明ポリヌクレオチドが導入される宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマーカーを持つベクター（以下、基本ベクターと記すこともある。）に通常の遺伝子工学的手法に準じて、組み込むことにより構築すればよい。
【００７１】
ここで「基本ベクター」としては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造社製）、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等を挙げることができる。また、出芽酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のベクター、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等を挙げることができる。また、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを挙げることができる。
【００７２】
尚、本発明ベクターを、自律複製起点を含むベクター（具体的には例えば、酵母用ベクターｐＡＣＴ２、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４等）を用いて構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
【００７３】
尚、本発明ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すればよい。
【００７４】
ここで、「機能可能な形で」とは、本発明ポリヌクレオチドが導入される宿主細胞において、プロモーターの制御下に本発明ポリヌクレオチドが発現されるように、当該プロモーターと本発明ポリヌクレオチドとを接続させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡを挙げることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファージのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等を挙げることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等を挙げることができる。また、宿主細胞が出芽酵母である場合には、例えば、ＡＤＨ１プロモーター（尚、ＡＤＨ１プロモーターは、例えば、ＡＤＨ１プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５  〔Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ  ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）等を挙げることができる。
【００７５】
また、宿主細胞において機能するプロモーターを予め保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続するように、上記のプロモーターの下流に本発明ポリヌクレオチドを挿入すればよい。例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等である場合には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本発明ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本発明ポリヌクレオチドを発現させることができる。これらのベクターには予めＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、ＣＯＳ細胞等に当該ベクターを導入すると、細胞内でベクターのコピー数が非常に増大し、結果として当該ベクターに組み込まれた本発明ポリヌクレオチドを大量発現させることもできる。また上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモーターを有しており、当該ベクター又はその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本発明ポリヌクレオチドを挿入すれば、本発明ポリヌクレオチドを、例えば、ＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターが構築できる。 
【００７６】
本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を、宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換体を作製する。次いで作製された本発明形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養することにより、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。
【００７７】
宿主細胞としては、微生物の場合には、例えば、真核生物、原核生物等を挙げることができる。好ましくは、例えば、大腸菌等を挙げることができる。当該宿主細胞に、通常の遺伝子工学的方法により、上記のようなベクターを導入することにより、宿主細胞を形質転換することができる。
【００７８】
本発明ベクターを宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すればよい。大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；「モレキュラー・クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等の通常の遺伝子導入法を挙げることができる。また、酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等で用いられるリチウム法の通常の方法を挙げることができる。尚、ウイルスをベクターとして用いる場合には、上記のように一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを宿主細胞に導入できるほか、本発明遺伝子の挿入されたウイルスのゲノムを含有するウイルス粒子を、宿主細胞へ感染させることによっても、当該ウイルスのゲノムを宿主細胞に導入することができる。
【００７９】
自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２や、ウシパピローマウイルスベクターｐＢＰＶ、ＥＢウイルスベクターｐＣＥＰ４等を用いて本発明ベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。
尚、基本ベクターとして選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
【００８０】
また本発明ベクターは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有してもよい。このような本発明ベクターを用いることにより、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に保有する本発明形質転換体を作製することもできる。
【００８１】
更には、上記、本発明ポリヌクレオチドと基本ベクターとを含み、更には酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを更に含有していてもよいポリヌクレオチドを人工合成したポリヌクレオチドとして、本発明ベクターを合成し、宿主細胞に導入してなる本発明形質転換体を作製することもできる。また、特許第４７４５７６２号公報に記載されるベクターｐＨＡＲ１のポリヌクレオチドを人工合成したものに（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された本発明ベクターを構築し、宿主細胞に導入してなる本発明形質転換体を作製することもできる。
【００８２】
宿主細胞において本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物等を挙げることができる。
【００８３】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,「Current Protocols in Molecular Biology」(1987)、John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００８４】
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
【００８５】
本発明酵素は、例えば、後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養することにより製造することができる。
【００８６】
本発明遺伝子又は本発明ベクターを含有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、通常の細胞培養方法によって行えばよい。
本発明形質転換体が微生物である場合には、例えば、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。
【００８７】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜等を挙げることができる。これらの炭素源の培地への添加量としては培養液に対して通常０．１％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００８８】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー(Corn Steep Liquor)、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素等を挙げることができる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量としては培養液に対して通常０．１％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）程度を挙げることができる。
【００８９】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩等を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウム等を挙げることができる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量としては培養液に対して通常０．０００１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）程度を挙げることができる。
【００９０】
尚、あらかじめ培地中に原料となる基質を少量添加しておくと、本発明形質転換体が有する基質を還元する能力を高めることができる。添加する基質の量としては、例えば、０．００１％程度以上を挙げることができる。好ましくは０．１％程度〜１％程度を挙げることができる。
【００９１】
更に、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプの宿主細胞内において機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００９２】
後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、微生物等の宿主細胞の培養における通常使用される方法に準じて行えばよい。例えば、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター(JarFermenter)培養、タンク培養等）等が可能である。特に、ジャーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液量の約０．１倍／分〜約２倍／分の通気条件を用いる。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約１５℃〜約４０℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養することが好ましい。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約５日間が望ましい。温度シフト型やＩＰＴＧ誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は１日間以内が好ましく、通常数時間である。
【００９３】
後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養物から本発明酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００９４】
まず、当該形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明酵素を精製することができる。
【００９５】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）、TSK-gel G3000SW（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００９６】
尚、本発明酵素を含む画分を選抜するには、例えば、本発明における還元酵素活性の存在有無又はその程度に基づき選抜すればよい。勿論、基質となるケトン化合物（具体的には例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライド）を還元して対応するアルコール化合物（具体的には例えば、１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノール）を優先的に生産する能力を測定することにより選抜してもよい。
【００９７】
本発明形質転換体を選抜するには、例えば、本発明ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本発明ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本発明ベクターが導入された細胞を培養すればよい。また本発明遺伝子を宿主細胞で発現させることが可能な本発明ベクターを導入した場合には、本発明酵素の酵素活性に基づく検出方法を用いることもできる。
【００９８】
本発明遺伝子が宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本発明ベクターとマーカー遺伝子を有するベクターとを制限酵素等で消化することにより直鎖状にした後、これらを前述の方法で宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を通常数週間培養した後、導入されたマーカー遺伝子の発現量に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、まず上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本発明ベクターを前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で数週間以上継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。導入された本発明遺伝子が宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本発明遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記本発明遺伝子の存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて試験を実施することが可能となる。 
【００９９】
本発明形質転換体が本発明ポリヌクレオチドを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
【０１００】
このようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを用いて、前述の如く、通常の遺伝子工学的方法及び微生物培養方法等に準じ、本発明酵素を大量に製造し、取得することができる。
【０１０１】
このようにして調製された本発明酵素を産生する本発明形質転換体又はその処理物は、基質を還元するバイオリアクターとして、例えば医農薬の有効成分となる化合物やその製造中間体、特に光学活性化合物やその製造中間体等を製造する為の有機合成反応に利用することが可能である。
【０１０２】
次に、本発明アルコール化合物製造方法について説明する。
ケトン化合物又はアルデヒド化合物としては、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、ｔｅｒｔ−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、メチル  ３−オキソブタノエート、エチル  ３−オキサブタノネート、エチル  ４−クロロアセトアセテート、メチル  ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、エチル  ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル  ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル  ３−オキソペンタノエート、ｍ−クロロフェナシルクロライド、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、Ｎ−ベンジルピロリジノン、Ｎ−Ｂｏｃ−ピロリジノン、４−アセチル安息香酸、Ｄ−（＋）−グルコース等を挙げることができる。
【０１０３】
本発明アルコール化合物製造方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１０４】
本発明アルコール化合物製造方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物等を挙げることができる。
【０１０５】
本発明アルコール化合物製造方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜ｐＨ１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０℃〜６０℃の範囲である。
【０１０６】
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常、０．５時間から１０日間の範囲である。
【０１０７】
反応液からのアルコール化合物の回収は、一般に知られている方法を適宜選んで行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法を挙げることができる。
【０１０８】
本発明酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で本発明アルコール化合物製造方法に用いることができる。
【０１０９】
具体的な形態としては、例えば、本発明形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物を挙げることができる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物を挙げることができる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明酵素等を閉じ込める方法）を挙げることができる。
【０１１０】
尚、本発明形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、未処理状態の形質転換体を用いる方法よりも当該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法の方が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン、抗生物質）を挙げることができる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明酵素の還元酵素活性を失活させず、且つ、反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【０１１１】
また、本発明アルコール化合物製造方法は、ＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ＋は、ＮＡＤ＋を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨに戻すことができるので、本発明アルコール化合物製造方法の反応系内には、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
【０１１２】
ＮＡＤ+を、ＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等を挙げることができる。
【０１１３】
また、ＮＡＤ+、ＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
【０１１４】
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素を持つ微生物又は該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。更にまた、ＮＡＤ+を、ＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
【０１１５】
更に、本発明アルコール化合物製造方法では、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
【０１１６】
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等を挙げることができる。更に、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
【０１１７】
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。
【０１１８】
本発明酵素改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素の改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、下記の基本的なアミノ酸変異（ａ）から（ｄ）までの全てを含むアミノ酸変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列になるように、アミノ酸変異を導入する工程を含む。
＜基本的なアミノ酸変異＞
（ａ）１２番目のグルタミン酸がグリシンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）４２番目のアスパラギン酸がバリンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）６７番目のリジンがアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）３１７番目のセリンがアラニンに置換されるアミノ酸変異
本発明酵素改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明ポリヌクレオチドの調製等に関する説明）及び後述の実施例と同様な方法に準じて行なえばよい。
【０１１９】
本発明遺伝子改変方法は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの改変方法であり、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、下記の基本的な塩基変異（ａ’）から（ｄ’）までの全てを含む塩基変異を４個以上有すること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と同等な塩基配列を有し、且つ、酵素が基質を還元する能力を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列になるように、塩基変異を導入する工程を含む。
＜基本的な塩基変異＞
（ａ’）３４番目から３６番目までの、グルタミン酸をコードするコドンが、グリシンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｂ’）１２４番目から１２６番目までの、アスパラギン酸をコードするコドンが、バリンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｃ’）１９９番目から２０１番目までの、リジンをコードするコドンが、アルギニンをコードするコドンに置換される塩基変異
（ｄ’）９４９番目から９５１番目までの、セリンをコードするコドンが、アラニンをコードするコドンに置換される塩基変異
本発明遺伝子改変方法に含まれる工程は、前述の説明（例えば、本発明酵素及び本発明ポリヌクレオチドの調製等に関する説明）及び後述の実施例と同様な方法に準じて行なえばよい。
【実施例】
【０１２０】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【０１２１】
実施例１  （多重変異型プラスミドＤＮＡの調製）
（１−１）  部位特異的な塩基変異の導入用プライマー合成（その１）
１２５番目のメチオニンをロイシンに、１７３番目のプロリンをセリンに、３２７番目のバリンをアラニンに変換するための変異プライマーとして、配列番号１７から配列番号２２に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリゴヌクレオチド（変異プライマー）を合成した。アミノ酸変異と対応する配列番号及び塩基配列を表１に示す。
【０１２２】
【表１】
2013172682.tif 000002
【０１２３】
（１−２）プラスミドｐＳＡＲ２５６８の調製
配列番号１７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、特許第４５５８４１４号公報に記載されるベクターｐＳＡＲ２６８を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ａ）と記す。
【０１２４】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ２６８ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１２５】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１２６】
得られたＰＣＲ反応液（Ａ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１２７】
（１−３）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐSAR２５６８）を含有する形質転換体を取得した。
【０１２８】
（１−４）プラスミドｐＳＡＲ２５６７８の調製
配列番号１９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、（１−３）にて得られたベクターｐＳＡＲ２５６８を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（B）と記す。
【０１２９】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ２５６８ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１３０】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 
【０１３１】
得られたＰＣＲ反応液（B）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１３２】
（１−５）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−４）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐSAR２５６７８）を含有する形質転換体を取得した。
【０１３３】
（１−６）プラスミドｐＳＡＲ１３４の調製
配列番号２１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、（１−５）にて得られたベクターｐＳＡＲ２５６７８を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（C）と記す。
【０１３４】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ２５６７８ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１３５】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 
【０１３６】
得られたＰＣＲ反応液（C）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１３７】
（１−７）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−６）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐSAR１３４）を含有する形質転換体を取得した。
【０１３８】
（１−８）  部位特異的な塩基変異の導入用プライマー合成（その２）
２７番目のグルタミン酸をグルタミンに、２８番目のバリンをメチオニンに、１０７番目のセリンをプロリンに、２２８番目のアラニンをバリンに、３１７番目のをセリンにアラニンに、３３９番目のセリンをアスパラギンに、３３９番目のセリンをアルギニンに、２８番目のバリンをイソロイシンに変換するための変異プライマーとして、配列番号２３から配列番号３８に示すように、各アミノ酸に対応する各種合成オリゴヌクレオチド（変異プライマー）を合成した。アミノ酸変異と対応する配列番号及び塩基配列を表２に示す。
【０１３９】
【表２】
2013172682.tif 000003
【０１４０】
（１−９）プラスミドｐＳ３１７Ａの調製
配列番号３１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−７）で得られたベクターｐＳＡＲ１３４を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（D）と記す。
【０１４１】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳＡＲ１３４ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１４２】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１４３】
得られたＰＣＲ反応液（D）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１４４】
（１−１０）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−９）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐS３１７A）を含有する形質転換体を取得した。
【０１４５】
（１−１１）プラスミドｐＨＰＡＲ１−１３の調製
配列番号２７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１０）で得られたベクターｐＳ３１７Ａを鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｅ）と記す。
【０１４６】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳ３１７Ａベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１４７】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１４８】
得られたＰＣＲ反応液（Ｅ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１４９】
（１−１２）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１１）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ１−１３）を含有する形質転換体を取得した。
【０１５０】
（１−１３）プラスミドｐＨＰＡＲ１−２の調製
配列番号３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１２）で得られたベクターｐＨＰＡＲ１−１３を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（Ｆ）と記す。
【０１５１】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＨＰＡＲ１−１３ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１５２】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 
【０１５３】
得られたＰＣＲ反応液（Ｆ）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１５４】
（１−１４）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ１−２）を含有する形質転換体を取得した。
【０１５５】
（１−１５）プラスミドｐＨＰＡＲ６７−１１の調製
配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１４）で得られたベクターｐＨＰＡＲ１−２を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（G）と記す。
【０１５６】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＨＰＡＲ１−２ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１５７】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１５８】
得られたＰＣＲ反応液（G）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１５９】
（１−１６）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１５）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ６７−１１）を含有する形質転換体を取得した。
【０１６０】
（１−１７）プラスミドｐＨＰＡＲ８４−２の調製
配列番号３７で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３８で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１６）で得られたベクターｐＨＰＡＲ６７−１１を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（H）と記す。
【０１６１】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＨＰＡＲ６７−１１ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１６２】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１６３】
得られたＰＣＲ反応液（H）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１６４】
（１−１８）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１５）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ８４−２）を含有する形質転換体を取得した。
【０１６５】
（１−１９）プラスミドｐＨＰＡＲ１−７の調製
（１−１９−１）プラスミドｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)の調製
配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１２）で得られたベクターｐHPAR1-13を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（I）と記す。
【０１６６】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR1-13ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１６７】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 
【０１６８】
得られたＰＣＲ反応液（I）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１６９】
（１−１９−２）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１９−１）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)）を含有する形質転換体を取得した。
（１−１９−３）プラスミドｐHPAR1-7の調製
配列番号３５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１９−２）で得られたベクターｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（J）と記す。
【０１７０】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR1-１3(Ｅ２７Ｑ)ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１７１】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１７２】
得られたＰＣＲ反応液（J）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１７３】
（１−１９−４）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−１９−３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR1-7）を含有する形質転換体を取得した。
【０１７４】
（１−２０）プラスミドｐＨＰＡＲ８４−４の調製
配列番号２９で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３０で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−１０）で得られたベクターｐＳ３１７Ａを鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（K）と記す。
【０１７５】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐＳ３１７Ａベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１７６】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。
【０１７７】
得られたＰＣＲ反応液（K）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１７８】
（１−２１）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２０）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ８４−４）を含有する形質転換体を取得した。
【０１７９】
（１−２２）プラスミドｐＨＰＡＲ８３−４の調製
（１−２２−１）プラスミドｐHPAR８４-４(S339N)の調製
配列番号３３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号３４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−２１）で得られたベクターｐHPAR８４-４を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（L）と記す。
【０１８０】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR８４-４ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１８１】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 
【０１８２】
得られたＰＣＲ反応液（L）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１８３】
（１−２２−２）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２２−１）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR８４-４(S339N)を含有する形質転換体を取得した。
（１−２２−３）プラスミドｐHPAR８３-４の調製
配列番号２３で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２４で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−２２−２）で得られたベクターｐHPAR８４-４(S339N)を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（M）と記す。
【０１８４】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR８４-４(S339N)ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１８５】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 
【０１８６】
得られたＰＣＲ反応液（M）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１８７】
（１−２２−４）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２２−３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐHPAR８３-４）を含有する形質転換体を取得した。
【０１８８】
（１−２３）プラスミドｐＨＰＡＲ６８Ｆａｓｔ−１の調製
配列番号２５で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２６で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、上記（１−２２−４）で得られたベクターｐHPAR８３-４を鋳型にして、以下のＰＣＲ反応液組成及びＰＣＲ反応条件でＰＣＲを行った（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを使用）。得られたＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液（N）と記す。
【０１８９】
＜ＰＣＲ反応液組成＞
ｐHPAR８３-４ベクター溶液    １．７μｌ
ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
センスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
アンチセンスプライマー（５０μＭ）    ０．４μｌ
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）    ５μｌ
ＰｆｕＵｌｔｒａ  （上記Ｋｉｔに付属されたもの）    １μｌ
超純水    ４１．５μｌ
【０１９０】
＜ＰＣＲ反応条件＞
上記のＰＣＲ反応液組成のＰＣＲ反応液が入った容器を、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ−ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２４００にセットし、９５℃で1分間保温した後、９５℃（50秒間）−５５℃（１分間）−６８℃（５分間）のサイクルを１２回行った後、４℃で保存した。 
【０１９１】
得られたＰＣＲ反応液（N）に、ＤｐｎＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ（上記Ｋｉｔに付属されたもの）を１μｌ添加した後、３７℃で１時間保温した。得られた保温液を用いてＥ．ｃｏｌｉ  JM109を形質転換した。
【０１９２】
（１−２４）  変異型ベクターが有する塩基配列における塩基変異の決定
（１−２３）で得られた形質転換体からベクターを抽出した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設計どおりの塩基変異が導入されていることを確認した。このようにして、変異型ベクター（ベクターｐＨＰＡＲ６８Ｆａｓｔ−１）を含有する形質転換体を取得した。
【０１９３】
実施例２  （本発明形質転換体による本発明酵素の産生）
実施例１によって得られた８種類の本発明酵素を宿主細胞内で発現させるためのプラスミド（pHPAR1-13、pHPAR1-２、pHPAR67-11、pHPAR８４-２、pHPAR1-7、pHPAR８４-４、pHPAR８３-４、pHPAR68FAST-1）を有する形質転換体（大腸菌）、特許第４５５８４１４号公報に記載されるベクターｐＥＡＲ２を有する形質転換体（大腸菌）を、各々別々にして、終濃度０．０１％となるように塩化亜鉛を加えたＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０. ５％，ＮａＣｌ０. ５％）に接種後、３７℃で培養し、対数増殖期にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度０．４ｍＭになる様に添加することにより、本発明酵素の宿主細胞内での発現を誘導した。培養終了後、遠心分離（１００００ｇ、１０分、４℃）により菌体を回収した後、回収された菌体をバイディングバッファー（２０ｍMリン酸ナトリウムバッファー（ｐH7.4）、４０ｍMイミダゾール、２００ｍM塩化ナトリウム）に懸濁し、超音波破砕機を用いて破砕した。得られた破砕液を再び遠心分離することにより、粗酵素液として上清液を得た。得られた粗酵素液をバイディングバッファーと溶出バッファー（２０ｍMリン酸ナトリウムバッファー（ｐH7.4）、５００ｍMイミダゾール）とを用いて、Ni Sephaorose(GEヘルスケア・ジャパン)処理することにより、８種類の本発明酵素（HPAR1-13、HPAR1-２、HPAR67-11、HPAR８４-２、HPAR1-7、HPAR８４-４、HPAR８３-４、HPAR68FAST-1）、及びＥＡＲ２（野生型酵素）を各々別々に取得した。
【０１９４】
実施例３  （本発明酵素が有する熱安定性の評価）
実施例２で得られた８種類の本発明酵素と、ＥＡＲ２(野生型酵素)を、各々別々にして、６５℃で３０分間保温処理した。このように保温処理された供試酵素１０μｍｏｌに、３−オキソ酪酸エチルを３μｍｏｌ、ＮＡＤＨを０．３μｍｏｌ、リン酸カリウムバッファー（ｐH７．０）５０ｍＭを添加した。これを２５℃、１０分間保温した後、３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
尚、１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを消費する酵素量とし、上記の保温処理を行った後の供試酵素の還元酵素活性を、上記の保温処理を行う前の供試酵素の還元酵素活性を１００％として、残存活性率を算出した。その結果を表３に示す。
【０１９５】
【表３】
2013172682.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明により、医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性化合物やその製造中間体等を製造する為の有機合成反応に利用される、熱安定性に優れた還元酵素等が提供可能となる。そして、本発明酵素を利用すれば、反応時間の短縮および反応効率の向上が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１９７】
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【配列表】
2013172682000001.app