(57)【要約】      （修正有）【課題】ミドリゾウリムシを用いて効率的に糖を生産可能な糖の生産方法を提供する。【解決手段】ミドリゾウリムシの体内から共生藻を取り出す工程と、取り出した共生藻のクローニングを行う工程と、クローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させ、再共生可能な共生藻をスクリーニングする工程と、再共生可能なクローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させて培養し、糖を生産させる工程とを備える、糖の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミドリゾウリムシの体内から共生藻を取り出す工程と、
取り出した共生藻のクローニングを行う工程と、
クローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させ、再共生可能な共生藻をスクリーニングする工程と、
再共生可能なクローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させて培養し、糖を生産させる工程と、を備える、
ことを特徴とする糖の生産方法。
【請求項２】
光を１日当たり１２時間より長い時間照射して無藻ミドリゾウリムシを培養して糖を生産させる、
ことを特徴とする請求項１に記載の糖の生産方法。
【請求項３】
光量子量４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ以上の条件下で培養する、
ことを特徴とする請求項２に記載の糖の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖は人類にとって重要な栄養成分であり、食品産業をはじめ、種々の産業でも重要な物質である。糖は主にサトウキビ、テンサイから生産されている。ところが、近年世界各地で多発する豪雨や干ばつなど地球規模の天候不純の影響でサトウキビ畑、テンサイ畑が破壊され、安定的な糖の供給が望めない状況が頻発に生ずる事態になっている。また、発展途上国などでは、年々、糖の需要量が多くなってきている。このため、サトウキビ、テンサイの他に、糖の供給源の確保が望まれている。
【０００３】
原生生物であるミドリゾウリムシの体内には、約４００〜５００個の共生藻と呼ばれる藻類が共存している。共生藻は光合成を行い、糖をミドリゾウリムシ体内に放出するので、ミドリゾウリムシの体内に糖が蓄積していることが明らかにされている（非特許文献１）。従って、ミドリゾウリムシに蓄積される糖を利用できれば、新たな糖源の確保につながると考えられる。
【０００４】
なお、ミドリゾウリムシに関する発明として、ミドリゾウリムシから共生藻を除去し、無藻ミドリゾウリムシを創製する方法（特許文献１）、また、ミドリゾウリムシの共生藻を取り出し、クローニングする方法（特許文献２）がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J.A. Brown and P.J. Nielsen, J. Protozool., 21, 569-570, 1974
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−８４号公報
【特許文献２】特開平１０−２９５３６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１では、ミドリゾウリムシ体内に糖が蓄積していることが記載されているだけであり、糖を生産させる方法については開示されていない。また、特許文献１及び２には、ミドリゾウリムシによる糖の生産について何ら記載されていない。
【０００８】
本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、ミドリゾウリムシを用いて効率的に糖を生産可能な糖の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る糖の生産方法は、
ミドリゾウリムシの体内から共生藻を取り出す工程と、
取り出した共生藻のクローニングを行う工程と、
クローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させ、再共生可能な共生藻をスクリーニングする工程と、
再共生可能なクローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させて培養し、糖を生産させる工程と、を備える、
ことを特徴とする。
【００１０】
また、光を１日当たり１２時間より長い時間照射して無藻ミドリゾウリムシを培養して糖を生産させることが好ましい。
【００１１】
また、光量子量４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ以上の条件下で培養することが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る糖の生産方法では、ミドリゾウリムシから取り出した共生藻をクローニングし、再共生可能なクローン化共生藻を、無藻ミドリゾウリムシに摂取させて培養し、糖を生産させている。これにより、ミドリゾウリムシを用いて効率的に糖を生産することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ミドリゾウリムシの増殖速度の比較を示すグラフである。
【図２】ミドリゾウリムシ体内糖量の比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本実施の形態に係る糖の生産方法は、ミドリゾウリムシの体内から共生藻を取り出す工程と、取り出した共生藻のクローニングを行う工程と、クローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させ、再共生可能な共生藻をスクリーニングする工程と、再共生可能なクローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させて培養し、糖を生産させる工程とを備える。
【００１５】
（ミドリゾウリムシの体内から共生藻を取り出す工程）
まず、ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ）体内から共生藻を取り出す工程について説明する。共生藻を取り出す方法について、特に限定されないが、特許文献２に記載の方法にて共生藻を取り出すことができ、具体的には以下のようにして取り出すことができる。
【００１６】
予め、ミドリゾウリムシの有機栄養源となるバクテリアとして、クレブジエラ・ニューモニアイ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を接種した野菜浸出液培地中で、ミドリゾウリムシを培養しておく。ミドリゾウリムシの培養は、例えば、１２時間明期：１２時間暗期、２３±１℃の条件で行う。
【００１７】
野菜浸出液培地は、野菜、特に緑色野菜の浸出液に少量の無機成分を含む半合成培地であることが好ましく、このような野菜浸出液としてはレタス浸出液が好ましい。野菜浸出液培地は、例えば、乾葉レタス粉末に少量のＣａＣＯ３を加え、約１０００〜１５００倍容量の水で数分間煮沸浸出し、濾過した後、オートクレーブ処理して調製する。野菜浸出液培地には、その他、酵母抽出物、ペプトン、グルコース等、微生物用培地に慣用される有機成分が適宜添加されてもよい。
【００１８】
ミドリゾウリムシから共生藻を分離するには、野菜浸出液培地中に懸濁したミドリゾウリムシに超音波処理を施す。超音波処理は、ミドリゾウリムシを完全に破砕するが、共生藻には影響を及ぼさない程度の適宜な出力及び処理時間を選定して行う。例えば、処理時間は３０秒〜１分でミドリゾウリムシを破砕することができる。そして、ミドリゾウリムシを破砕した液を遠心処理し、上清を除去すれば、共生藻が得られる。
【００１９】
（取り出した共生藻をクローニングする工程）
続いて、ミドリゾウリムシから取り出した共生藻をクローニングする工程について説明する。共生藻のクローニングは、種々の方法で行い得るが、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００２０】
ミドリゾウリムシから分離した共生藻に、培地を添加して十分に洗浄し、その懸濁液を培地に接種し、２４時間照明下、約２４±１℃で培養する。培地として、貧栄養培地を用いるとよい。富栄養培地を用いると、バクテリアの増殖が盛んになり、共生藻のコロニーが形成され難いからである。貧栄養培地として、好ましくは、特許文献２に記載されているＣＡ培地（ＣＡ液体培地）、より好ましくはＣＡ液体培地を含む２％寒天培地（ＣＡ寒天培地）がよい。
【００２１】
約１カ月後に、共生藻の任意のコロニーを選んでかきとり、再びＣＡ寒天培地に植え替え培養する。１回の培養期間は少なくとも３０日間とするとよい。これらの操作による継代を複数回繰り返すことにより、クローン化共生藻を得ることができる。
【００２２】
また、上述の手法によりＣＡ寒天培地でクローン化した共生藻を、ＣＡ液体培地で約２４±１℃、２４時間照明下の条件で振盪培養し、培養約７日後に共生藻の一部を新鮮なＣＡ培地に接種し、以後約７日おきに継代を繰り返すことにより、クローン化共生藻を大量培養することができる。
【００２３】
（クローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させ、再共生可能なクローン化共生藻をスクリーニングする工程）
まず、無藻ミドリゾウリムシを準備する。本明細書において、無藻ミドリゾウリムシとは、体内から共生藻が取り除かれ、共生藻をほとんど或いは全く有していないミドリゾウリムシをいう。
【００２４】
無藻ミドリゾウリムシは、ミドリゾウリムシ体内から、体内の共生藻を除去することで準備することができる。この無藻ミドリゾウリムシを創製する方法については、ミドリゾウリムシが死滅することなく、共生藻を除去できればどのような方法でもよいが、一例として、特許文献１に記載の方法に基づいて得ることができ、具体的には、以下のようにして得ることができる。
【００２５】
ミドリゾウリムシの共生藻を除去するには、上記のバクテリアを接種した培地を用いて、ミドリゾウリムシを、その生存許容量の除草剤の存在下で培養する。除草剤として、パラコートが挙げられる。広葉除草剤であるパラコートは、酸化されたフェレドキシンに優先的に対抗して、照明された葉緑体の光システムからの電子流の転換により植物に作用するので、この除草剤が内共生藻の葉緑体中の電子流に影響を及ぼし、それを損傷するものと考えられる。
【００２６】
ミドリゾウリムシから共生藻を完全に除去するには、ミドリゾウリムシの生育段階によって異なるが、一般にはパラコートの濃度を高々１０５μｇ／Ｌとし、少なくとも５日間培養すればよい。特に対数期にあるミドリゾウリムシの場合には、約１０３μｇ／Ｌ〜１０５μｇ／Ｌのパラコートの濃度で、約５日間培養すれば完全無藻ミドリゾウリムシを得ることができる。パラコート濃度を１０２μｇ／Ｌ程度に減少した場合には、培養期間を少なくとも１０日、場合によっては１５日程度とすることによって共生藻の除去が可能である。一方、定常期にあるミドリゾウリムシの場合、少なくとも１μｇ／Ｌのパラコート濃度において、少なくとも１０日間、好ましくは、少なくとも１５日間の培養期間を要する。
【００２７】
なお、ミドリゾウリムシ或いは無藻ミドリゾウリムシの共生藻の有無は、例えば、ニコン社製ノマルスキー（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）微分干渉コントラスト顕微鏡（ＤＩＣ）による観察で確認することができる。即ち、Ｂ２フィルターを標本と接眼レンズとの間に置いて紫外光を除けば、ミドリゾウリムシ中の共生藻のクロロフィルは赤色に蛍光を発するので、赤色の像として観察される。この蛍光顕微鏡検査に基づき「無藻」が確認された無藻ミドリゾウリムシを取り出せばよい。取り出した無藻ミドリゾウリムシは、０．０５％（ｖ／ｖ）のファント・ホッフ人工海水で数回洗浄して除草剤を除去し、培養基中に保存しておくとよい。以上のようにして、無藻ミドリゾウリムシを準備することができる。
【００２８】
そして、クローンニングした共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させ、クローン化共生藻がミドリゾウリムシ中で共生しているか否かを確認し、再共生可能なクローン化共生藻をスクリーニングする。
【００２９】
まず、無藻ミドリゾウリムシにクローン化共生藻を摂取させる。例えば、培地にクローン化共生藻及び無藻ミドリゾウリムシを添加して培養する。これにより、無藻ミドリゾウリムシは共生藻を経口摂取し、無藻ミドリゾウリムシ体内にクローン化共生藻が取り込まれる。
【００３０】
例えば、以下のようにして、無藻ミドリゾウリムシにクローン化共生藻を摂取させるとよい。クローン化共生藻を遠心（例えば、７２０ｘｇで５分間）し、レタス浸出液で洗浄し、この懸濁液に無藻ミドリゾウリムシを加える。この際、無藻ミドリゾウリムシ一個体に対し、クローン化共生藻を１０３以上に調整するとよい。原因は定かではないが、無藻ミドリゾウリムシ一個体に対し、クローン化共生藻が１０３以上添加されていないと、共生藻が無藻ミドリゾウリムシに共生しないからである（特許文献２参照）。そして、例えば、１２時間明期：１２時間暗期、２３±１℃の条件で、２４時間培養する。
【００３１】
培養後、ミドリゾウリムシを含む懸濁液をとり、レタス浸出液中で洗浄し、ミドリゾウリムシに取り込まれた共生藻以外の藻を除去し、クローン化共生藻が再共生しているか否かを確認する。
【００３２】
例えば、シャーレ等にバクテリアを接種したレタス浸出液を置き、この培養液にミドリゾウリムシを移す。さらに、シャーレの蓋の内側に濾紙を置いて、蒸留水で湿らせ、この上に水滴を置いた側を下にして（ｕｐ−ｓｉｄｅ  ｄｏｗｎ）シャーレをかぶせ、以後このハンギング・ドロップ（ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ）状態で培養する。ミドリゾウリムシに再感染できなかった共生藻は消化吸収されるか、細胞外に排出されると考えられるため、その後、２４時間、４８時間後にミドリゾウリムシを前述したように洗い、培養液中に出現してくる共生藻を除去する。そして、ハンギング・ドロップで培養後（例えば培養開始から５日後）、ミドリゾウリムシの細胞内に共生藻が存在するか否かを観察する。共生藻は赤色の自家蛍光を発するため、共生藻の有無は、例えば、蛍光顕微鏡（ニコン、Ｏｐｔｉｐｈｏｔ  ＢＦＤ２ＴＭ  ）を用いて判定することができ、全細胞系のうち共生藻が再感染した細胞系の割合を再共生率として表すことで、再共生可能なクローン化共生藻、再共生率の高いクローン化共生藻をスクリーニングすることができる。
【００３３】
（再共生可能なクローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させ、糖を生産させる工程）
上記と同様の手法により、無藻ミドリゾウリムシにスクリーニングした再共生可能なクローン化共生藻を摂取させる。クローン化共生藻は光合成により、糖を生産してミドリゾウリムシ体内に放出する。そして、ミドリゾウリムシ体内に糖が蓄積する。
【００３４】
なお、培地中に添加する無藻ミドリゾウリムシとクローン化共生藻との比率は、上記同様、無藻ミドリゾウリムシ一個体に対してクローン化共生藻が１０３以上とすることが好ましい。無藻ミドリゾウリムシ一個体に対しクローン化共生藻が１０３よりも少ないと、クローン化共生藻が無藻ミドリゾウリムシに共生せず、クローン化共生藻による糖の生産が行われないためである。
【００３５】
また、培養は光を一日当たり１２時間より長い時間照射して行うとよく、好ましくは２４時間明期の光条件下で行うとよい。常時光を照射して培養することで、クローン化共生藻が光合成を継続的に行い、糖を生産するので、糖の生産量が向上する。また、光量子量が４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ以上の条件下で培養を行うことが好ましい。なお、２４時間光を照射して培養する場合、光量子量が４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ程度の条件下で行うことが好ましい。原因は定かではないが、光量子量が大きすぎると、糖の生産量が低下することになる。
【実施例】
【００３６】
以下の実験で用いたミドリゾウリムシ、無藻ミドリゾウリムシ、共生藻、クローン化共生藻野菜浸出培地等を以下に記す。
【００３７】
＜ミドリゾウリムシ、無藻ミドリゾウリムシ＞
表１に記載したミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ）を実験に用いた。
【００３８】
【表１】
2013165680.tif 000002
【００３９】
また、株ＫＲＳｗ−Ｆ１は、特許文献１記載の方法に基づいて、株ＫＲＳ−Ｆ１をパラコート処理して得られた無藻ミドリゾウリムシである。これらの株は、バクテリア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を接種した野菜浸出液培地で２４−４８時間２３℃で培養した後に使用した。
【００４０】
＜共生藻＞
共生藻は、特許文献２記載の方法に基づいて、ミドリゾウリムシ株ＫＲＳ−Ｆ１、株ＡＧＦ−１３、株ＡＧＦ−２１、株ＫＮ−２、株ＫＳ−４６及び株ＥＺ−３７から単離したものである。
【００４１】
＜クローン化共生藻＞
クローン化共生藻は、ミドリゾウリムシ株ＫＲＳ−Ｆ１、株ＡＧＦ−１３、株ＡＧＦ−２１、株ＫＮ−２、株ＫＳ−４６及び株ＥＺ−３７から単離した共生藻をクローニングして得た。具体的には、次の手順で単離し、クローニングした。
ミドリゾウリムシ各株を野菜浸出液で３回洗い、その後、再び野菜浸出液中に懸濁し、超音波発振装置、ソニファー・モデル・４５０TM（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用い、出力２で３０秒間超音波破砕した。この破砕条件では、ミドリゾウリムシは完全に破砕されたが、共生藻には影響はなかった。
この破砕液を７２０ｘｇで５分間遠心し、上清を除去した後、培養液を加え洗浄した。この操作を３回繰り返し、共生藻をよく洗った。この懸濁液を培養液を含む２％寒天（Ｄｉｆｃｏ社製）培地に接種し、２４時間照明下（約２０００ルクス）、２４℃で培養し、共生藻のコロニーを形成した。
培養開始後、約１カ月で共生藻のコロニーが形成され、それぞれ１つのコロニーを任意に選んでかきとり、再び同じ培養液を含む寒天培地に植え替えた。これらの操作を繰り返すことで共生藻のクローンを得た。このようにして、表２に示す２９種の共生藻のクローンを得た。
【００４２】
【表２】
2013165680.tif 000003
【００４３】
＜野菜浸出液培地＞
培地の調製に使用する野菜浸出液は次のようにして調製した。レタスの葉を洗浄して３０−６０秒間煮沸し、６０−８０℃で乾燥して粉末にし、デシケーターに貯えた。この乾燥レタス粉末０．５ｇをＣａＣＯ３（片山化学）２ｍｇと共に再蒸留水０．７リットル中で５−１０分煮沸して浸出液を調製し、室温まで冷却後濾過した。濾液に再蒸留水を加えて全容１０００ｍＬとし、及びオートクレーブ処理（約１５分）後、培地に使用した。
【００４４】
（実験１：ミドリゾウリムシ及び無藻ミドリゾウリムシに含まれる糖分析）
ミドリゾウリムシ及び無藻ミドリゾウリムシそれぞれの体内中の糖量の測定は、ポストカラム法により測定した。測定された糖種は、還元性単糖（８種）、還元性二糖（４種）、非還元性二糖（１種）である。ミドリゾウリムシ及び無藻ミドリゾウリムシそれぞれの糖の分析結果を表３に示す。
【００４５】
【表３】
2013165680.tif 000004
【００４６】
一個体あたりの糖量は、ミドリゾウリムシでは３．６１ｎｇ、無藻ミドリゾウリムシでは０．４６ｎｇであり、共生藻の存在により、ミドリゾウリムシの体内には多くの糖が蓄積されていることを確認した。
【００４７】
また、単糖が最も多く含まれていることがわかった。例えば、デンプンから糖を生産する場合、液化処理、糖化処理が行われるが、ミドリゾウリムシの体内に蓄積される糖は単糖であるので、液化処理が不要という利点がある。
【００４８】
現状の培養方法においては、ミドリゾウリムシの細胞密度は７〜１０日間で１０６［ｃｅｌｌｓ］に達する。仮に深さ２ｍ×１ｈａの培養池で１０日間ミドリゾウリムシを培養した場合、ミドリゾウリムシは、２０，０００［ｋＬ］×１０６［ｃｅｌｌｓ］＝２．０×１０１３［ｃｅｌｌｓ］となる。
そして、ミドリゾウリムシ一個体あたりから生産される糖量が上記の如く３．６１ｎｇとし、深さ２ｍ×１ｈａの培養池で１０日間ミドリゾウリムシを培養した場合には、糖の収量は３．６１［ｎｇ／ｃｅｌｌ］×２．０［ｃｅｌｌｓ］＝７２，２００［ｇ］となる。
そして、１年間で、３６．５回（３６５［日］／１０［日］）ミドリゾウリムシを培養し、糖を回収したとすれば、３６．５［回］×７２，２００［ｇ］＝２，６３５．３［ｋｇ］となる。
【００４９】
平成２２年６月公表の農林水産統計によれば、平成２１年にサトウキビから１ｈａ当たり７．６５ｔの甘ショ糖が生産されており、上記のようにミドリゾウリムシから糖を生産した場合では、サトウキビに対する生産収率は約３４．４％程度を占めることがわかる。
【００５０】
（実験２：ミドリゾウリムシ体内の糖量と共生藻内の糖量との比較）
続いて、ミドリゾウリムシ体内の糖量と、共生藻を単独培養した場合の共生藻内の糖量との比較を行った。
【００５１】
フェノール硫酸法により、糖量を測定した。測定した糖種は還元糖である。ミドリゾウリムシ体内の糖量を表４に、共生藻を単独培養した場合の共生藻内の糖量を表５にそれぞれ示す。なお、培養時の光条件は、いずれも光周期が１２時間明期：１２時間暗期（１２Ｌ／Ｄ）、光量子量が４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓとした。また、表５では、ミドリゾウリムシ体内にはおよそ５００の共生藻が共生していることを考慮して、ミドリゾウリムシ一個体中の共生藻細胞数に相当するよう、共生藻５００細胞内の糖量に換算して示している。
【００５２】
【表４】
2013165680.tif 000005
【００５３】
【表５】
2013165680.tif 000006
【００５４】
共生藻を単独で培養した場合、１５日培養しても糖量はほとんど増加していない。一方、ミドリゾウリムシ体内の糖量は、培養期間が１５日間で、およそ６−７倍にまで増加している。この結果から、共生藻はミドリゾウリムシに共生してこそ、糖の生産量が増加することがわかる。
【００５５】
なお、上記実験では、採取して培養したミドリゾウリムシを用いており、糖の生産量が高い共生藻、糖の生産量が低い共生藻が混在して共生しているミドリゾウリムシである。選択的に糖の生産量が高い共生藻をミドリゾウリムシに共生させていれば、より糖の生産量を高め得ると考えられる。つまり、クローン化した共生藻であって、かつ糖の生産量の高い共生藻をミドリゾウリムシに再共生させることで、より糖の生産量の高いミドリゾウリムシを作成しそれを利用して糖を生産することができる。
【００５６】
（実験３：光量子量、光周期を変化させた際のミドリゾウリムシの増殖速度並びにミドリゾウリムシ体内糖量の比較）
光量子量、光周期を変化させてミドリゾウリムシを培養し、増殖速度並びにミドリゾウリムシ体内糖量の比較を行った。光周期は１２時間明期：１２時間暗期（１２Ｌ／Ｄ）、２４時間明期（２４Ｄ）、２４時間暗期（２４Ｄ）とし、光量子量は０、４０、１７０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓとした。なお、培養期間は２日間とした。培養は１０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で開始して、培養終了後のミドリゾウリムシの細胞密度を測定するとともに、培養開始時及び終了時のミドリゾウリムシ一個体当たりの糖量を測定した。
【００５７】
ミドリゾウリムシの増殖速度の比較を図１に、ミドリゾウリムシ体内糖量の比較を図２に示す。また、ミドリゾウリムシの細胞密度、細胞内糖量、培養液１ｍＬ中の総糖量を表６に示す。
【００５８】
【表６】
2013165680.tif 000007
【００５９】
光周期が１２Ｌ／Ｄ、光量子量が４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓで培養した場合に、ミドリゾウリムシは最も増殖した。一方で、ミドリゾウリムシ一個体当たりの糖量は、１．３ｎｇであり、培養液１ｍＬ中の総糖量は２．７μｇであった。
【００６０】
光周期が２４Ｌの場合、光周期が１２Ｌ／Ｄの場合に比べて、ミドリゾウリムシの増殖速度は低いものの、ミドリゾウリムシ一個体当たりの糖量は大きい。特に、光周期が２４Ｌ、光量子量が４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓの場合、５．９ｎｇであり、培養液１ｍＬ中の総糖量は１１．８μｇとなった。これは、光周期が１２Ｌ／Ｄの場合に比べ、約５倍の糖量である。
【００６１】
これらの結果から、光を一日当たり１２時間より長い時間照射してミドリゾウリムシを培養すすること、また、光量子量が４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ以上の条件下でミドリゾウリムシを培養することで、糖の生産量を増加させ得ることがわかる。そして、適切な光量子量（４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ程度）であれば、２４時間明期でミドリゾウリムシを培養することにより、ミドリゾウリムシを効率的に増殖させられるとともに、ミドリゾウリムシ一個体当たりの糖量を増加させ得ることがわかる。
【００６２】
（実験４：再共生可能なクローン化共生藻のスクリーニング）
続いて、無藻ミドリゾウリムシに表１に示したクローン化共生藻をそれぞれ摂取させ、それぞれの再共生率を検証した。
【００６３】
無藻ミドリゾウリムシ（ＫＲＳｗ−Ｆ１）１細胞に対し１×１０４細胞のクローン化共生藻をKlebsiella pneumoniaを含むレタス液（以下培養液）にそれぞれ混ぜ合わせ、丸一日インキュベートした。ウォッシュしてミドリゾウリムシ細胞外の共生藻を除去した後、新たな培養液で丸５日間インキュベートした。ウォッシュを行い、ミドリゾウリムシ細胞を回収しホルムアルデヒドで固定後、ミドリゾウリムシの細胞内に共生藻が存在するか否かを観察した。共生藻は赤色の自家蛍光を発するため、共生藻の有無は蛍光顕微鏡（ニコン、Ｏｐｔｉｐｈｏｔ  ＢＦＤ２ＴＭ）を用いて判定した。
【００６４】
自家蛍光観察の際、ミドリゾウリムシ細胞内に赤いスポットが一つでも見られたものを共生とし、共生したミドリゾウリムシ細胞数を観測したミドリゾウリムシ細胞数で割ったものを共生率とした。
【００６５】
その結果を表７に示す。クローン化共生藻によっては、再共生率が高い株、低い株が存在することがわかる。このなかで、ＳＡ−２３ｃ、ＳＡ−２３ｅ、ＳＡ−２３ｈ、ＳＡ−２３ｉ、ＳＡ−２３ｊ、ＳＡ−２５ｃ、ＳＡ−２５ｄ、ＳＡ−２６ａ、ＳＡ−２８ａ、ＳＡ−２８ｂが再共生率が９０％を超えている。
【００６６】
【表７】
2013165680.tif 000008
【００６７】
（実験５：ミドリゾウリムシ体内の糖量と共生藻を単独培養した場合の共生藻内の糖量との比較）
【００６８】
実験４で再共生率を測定したクローン化共生藻（株ＳＡ−２３ｅ、ＳＡ−２３ｊ、ＳＡ−２４ａ、ＳＡ−２４ｅ、ＳＡ−２４ｆ、ＳＡ−２６ｂ、ＳＡ−２８ｂ）を、単独で培養し、生成された糖量を測定した。ＣＡ寒天培地上で培養しているクローン化共生藻をＣＡ液体培地に移し、細胞密度を測定後、遠心して細胞ペレットを回収した。ペレットは−８０℃で凍結後、フェノール硫酸法によりペレットの糖量を求めた。その結果を表８に示す。
【００６９】
【表８】
2013165680.tif 000009
【００７０】
また、無藻ミドリゾウリムシ（株ＫＲＳｗ−Ｆ１）に上記のクローン化共生藻（株ＳＡ−２４ａ、ＳＡ−２４ｅ）を摂取させて得られたミドリゾウリムシを培養し、ミドリゾウリムシ体内にて生成された糖量を測定した。培養条件は、光量子量：４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ、光周期：１２Ｌ／Ｄ、培地：野菜浸出液培地、培養期間：２日間、培養開始時の細胞密度：１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌである。その結果を表９に示す。
【００７１】
【表９】
2013165680.tif 000010
【００７２】
ミドリゾウリムシから取り出した共生藻をクローン化して、無藻ミドリゾウリムシに共生させて糖を生産可能であることを立証した。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上説明したように、本発明では、ミドリゾウリムシから取り出してクローン化したクローン化共生藻を無藻ミドリゾウリムシに摂取させて培養することで糖を生産することができる。このため、サトウキビ、テンサイに代わる糖源の確保への応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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