(57)【要約】【課題】  細胞試料を自然乾燥した後、常温状態で長期に保存することを可能にする乾燥保護剤を提供する。【解決手段】  アミノ酸配列：Ala Lys Asp Gly Thr Lys Glu Lys Ala Gly Gluを２以上含むペプチドを有効成分として含有することを特徴とする細胞の乾燥保護剤、及び前記ペプチドを細胞懸濁液中に添加し、その後、懸濁液中の水分を蒸発させ、細胞を乾燥条件下で保存することを特徴とする細胞の保存方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を２以上含むペプチドを有効成分として含有することを特徴とする細胞の乾燥保護剤。
【請求項２】
ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細胞の乾燥保護剤。
【請求項３】
乾燥条件下で保存する細胞に用いる請求項１又は２に記載の細胞の乾燥保護剤。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を２以上含むペプチドを細胞懸濁液中に添加し、その後、懸濁液中の水分を蒸発させ、細胞を乾燥条件下で保存することを特徴とする細胞の保存方法。
【請求項５】
ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項４に記載の細胞の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の乾燥保護剤及び細胞の保存方法に関する。本発明の乾燥保護剤又は細胞の保存方法を利用することにより、電力などのエネルギー用いずに、細胞を長期保存することが可能になる。
【背景技術】
【０００２】
ネムリユスリカやワムシなどの生物は、LEA（late embryogenesis abundant）タンパク質を合成及び蓄積することにより、乾燥耐性を発揮する。このLEAタンパク質は、配列によりいくつかのグループに分けられており、そのうち、Group 3に属するLEAタンパク質は特徴的な１１アミノ酸残基の繰り返し構造を有している。
【０００３】
Group 3に属するLEAタンパク質は、タンパク質の不可逆的な凝集を抑制するはたらきがあることが知られているが（D. Tolleter et al., Plant Cell. 19 (5), 1580-1589 (2007)、K. Goyal et al., Biochem. J., 388 (1), 151-157 (2005)）、上述した１１アミノ酸残基の２回繰り返した配列を持つペプチドも、LEAタンパク質と同様に、タンパク質の凝集抑制能を持つことが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
生物が乾燥耐性を発揮するためには、タンパク質の凝集を抑制するだけでなく、細胞膜の保護も不可欠であるが、LEAタンパク質やLEAタンパク質に含まれる繰り返し配列からなるペプチドが、細胞膜保護効果を持つかどうかについては明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】山川賢太郎、古木隆生、櫻井実 (2011) 低温生物工学会誌57, 143-146
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来多くの場合、貴重な細胞試料は、-80℃または液体窒素下での冷凍保存、あるいは凍結乾燥処理をした後保存されてきた。いずれの場合も、保存中あるいは保存試料の調製段階で、多大のエネルギーを消費していた。したがって、従来の方法は、停電のときや電源事情の悪い低開発地域では使えなかった。そのため、地震の後のような突発的な停電により、貴重な試料が失われることがあった。
【０００７】
このような問題は、電力などのエネルギーを使わずに、細胞試料を長期乾燥保存できれば解消する。本発明は、細胞試料を自然乾燥した後、常温状態で長期に保存することを可能にする乾燥保護剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、上述したGroup 3に属するLEAタンパク質に含まれる繰り返し配列を２回繰り返した配列からなるペプチド（以下、「LEAペプチド」という場合がある）が、タンパク質の凝集抑制効果だけでなく、細胞膜保護効果をも有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
タンパク質の凝集抑制効果も細胞膜保護効果も共に乾燥耐性に必要な性質であることから、一見すると、タンパク質の凝集抑制効果を持つLEAペプチドが、細胞膜保護効果も有することは容易に予想できたことであるかのように見える。しかし、例えば、ワムシにおいては、タンパク質の凝集抑制効果を持つLEAタンパク質（ArLEA1A）と、このLEAタンパク質とアミノ酸配列が類似するが、タンパク質の凝集抑制効果を持たず、細胞膜保護効果を持つと推測されるLEAタンパク質（ArLEA1B）が存在する（Pouchkina-Stantcheva N. N. et al., Science.2007 Oct 12 ; 318(5848):268-71.）。このようなワムシのLEAタンパク質の事実を考慮すると、LEAペプチドがタンパク質の凝集抑制効果と細胞膜保護効果とを併せ持つということは、本願出願時において全く予想できないことであった。
【００１０】
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（５）を提供する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を２以上含むペプチドを有効成分として含有することを特徴とする細胞の乾燥保護剤。
（２）ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（１）に記載の細胞の乾燥保護剤。
（３）乾燥条件下で保存する細胞に用いる（１）又は（２）に記載の細胞の乾燥保護剤。
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列を２以上含むペプチドを細胞懸濁液中に添加し、その後、懸濁液中の水分を蒸発させ、細胞を乾燥条件下で保存することを特徴とする細胞の保存方法。
（５）ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする（４）に記載の細胞の保存方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、多大なエネルギーを消費することなく、細胞を保存することが可能になる。このため、停電時や電源事情の悪い地域においても、細胞の保存が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】巨大リポソーム溶液の作製工程を模式的に表した図。
【図２】実施例で行った粒径分布測定方法を模式的に表した図。
【図３】LEAペプチド添加時の巨大リポソームの粒径分布を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明の細胞の乾燥保護剤は、アミノ酸配列：Ala Lys Asp Gly Thr Lys Glu Lys Ala Gly Glu（配列番号１）を２以上含むペプチドを有効成分として含有することを特徴とするものである。
【００１６】
上記ペプチド中の上記アミノ酸配列の繰り返し回数は２以上であればよく、その上限に制限はないが、合成の困難性などを考慮すると、繰り返し回数は４以下であることが好ましい。
【００１７】
上記ペプチドは、このペプチドの持つ細胞膜保護効果に影響を与えない範囲で上記アミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含んでもよいが、上記アミノ酸配列のみからなるものであることが好ましい。最も好ましいペプチドは、上記アミノ酸配列を２回繰り返したアミノ酸配列：Ala Lys Asp Gly Thr Lys Glu Lys Ala Gly Glu Ala Lys Asp Gly Thr Lys Glu Lys Ala Gly Glu（配列番号２）からなるペプチドである。
【００１８】
本発明の細胞の乾燥保護剤の対象となる細胞は特に限定されず、動物細胞、植物細胞のほか、微生物なども乾燥から保護することができる。具体的な細胞としては、iPS細胞、ES細胞などを例示することができる。
【００１９】
本発明の細胞の乾燥保護剤は、上記ペプチド以外に他の成分を含んでもよい。
【００２０】
本発明の細胞の乾燥保護剤は、細胞の保存に使用することができる。具体的な細胞の保存方法としては、本発明の細胞の乾燥保護剤を細胞懸濁液中に添加し、その後、懸濁液中の水分を蒸発させ、細胞を乾燥条件下で保存する方法を例示できる。この際、添加するペプチドの量は、細胞の種類などによって異なるが、少なくとも細胞表面全体をカバーする量が必要である。ペプチド鎖1本でカバーできる表面積は約4.32 nm2なので、１細胞（直径4μm程度と仮定）に対して少なくとも300万分子のペプチドを添加するのが好ましい。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００２２】
細胞膜のモデルとなる巨大リポソーム(Giant Vesicle: GV)を用いた実験により、LEAペプチド（配列番号２）の細胞膜保護活性を調べた。
【００２３】
クロロホルムとメタノールの比が9:1の混合溶媒に、卵黄由来のリン脂質(l-α-Phosphatidylcholine)を0.5 mg/mlの濃度になるように溶かし、観察のために蛍光色素DiA(4-Di-16-ASP;Abs. =491 nm, Ems. =613 nm)を0.05 mM添加し、リン脂質溶液を作製した。この試料を直径24 mmの円形のガラス板に200μl滴下し、室温で10分間放置した後に窒素ガスを吹きかけ溶媒を蒸発させリン脂質をガラス板に固定した。このガラス板の裏面と積層圧電アクチュエータを密着させて、乾燥リン脂質に500μLの純水を滴下した。その後、ガラス面垂直方向に振幅2μm、1kHzの正弦波振動を10分間印加した後、10Hz の正弦波振動を10分間与えてGVを生成した。生成したGVを含むガラス板の上澄みを回収し、GV溶液を作製した(図1)。
【００２４】
乾燥前のポジティブコントロールとして、得られたGV溶液の試料100μlを粒径分布測定器(F520-P;Sysmex)にて測定を行った。残りの溶液を100μlずつ３つの試料に分け、そのうちの2つにLEAペプチドの濃度が2mM、5mMとなるようにLEAペプチドを添加した。また、比較のためネガティブコントロールとして無添加の系を作製した。作製した３つの溶液をそれぞれテフロンシート上に滴下し、25℃で3日間の自然乾燥を行った後、100μlの純水を加えGVの再水和を行った。再水和した３つの系それぞれについて粒径分布を測定し、乾燥前の系と合わせて４つの系について粒径分布の比較を行った（図２）。
【００２５】
各系での粒径分布の測定結果は図３のようになった。乾燥前の系を見てみると4.5μm付近をピークとする粒径分布がはっきり得られているが、LEAペプチド無添加で乾燥・再水和を行った系では、ピークの位置が確認できず、粒子数もほとんど確認ができない結果となった。しかし、細胞膜保護物質であるLEAペプチドを加えた系では粒子数の減少は見られるものの無添加の系に比べ4.5μm付近にピークを持つ乾燥前と同様の粒径分布が確認できた。LEAペプチドの濃度が2mMから5mMに上がると粒子数が多くなり保護効果が高くなっていることがわかった。なお、上の実験では、試料を、シリカゲルを入れたデシケータ中で自然乾燥した。すなわち、乾燥には電気エネルギー等を一切使用していない。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明は、細胞試料の保存が必要とされる各種産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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