(57)【要約】      （修正有）【課題】木質等のリグノセルロース系バイオマスの分解において、キシロースを十分に回収することができるキシロシダーゼ、該キシロシダーゼを発現することができるキシロシダーゼ遺伝子、それを含有する組み換えＤＮＡ、それらを含有する発現ベクター及びそれを宿主に導入した形質転換体の提供。【解決手段】（Ａ）特定の塩基配列からなる核酸；（Ｂ）特定のアミノ酸配列をコードする核酸；及び（Ｃ）特定の塩基列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、又は、該核酸と相補的な塩基配列を有する核酸；からなる群より選択された核酸を含むキシロシダーゼ遺伝子である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる核酸；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸；及び
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、又は、該核酸と相補的な塩基配列を有する核酸；
からなる群より選択された核酸を含むキシロシダーゼ遺伝子。
【請求項２】
アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）から単離された請求項１記載キシロシダーゼ遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のキシロシダーゼ遺伝子を組み換えた組み換えＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のキシロシダーゼ遺伝子又は請求項３記載の組み換えＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターを糸状菌に導入した形質転換体。
【請求項６】
前記糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の形質転換体が発現するキシロシダーゼ。
【請求項８】
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が６０％以上のタンパク質；及び
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質；
からなる群より選択されたキシロシダーゼ活性を有するタンパク質からなるキシロシダーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なキシロシダーゼ遺伝子、それを含有する組み換えＤＮＡ、それらを含有する発現ベクター、それを宿主に導入した形質転換体及びそれから発現される新規なキシロシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
木質等のリグノセルロース系バイオマスを加水分解し、セルロースやヘミセルロースとし、さらにこれらを酵素加水分解して単糖やエタノールにする研究が行われている。
これらの分解反応において、単糖やエタノールの生産効率を向上させるためには、セルロースのみならず、ヘミセルロースの酵素加水分解が重要視される。すなわち、セルロースを糖化する酵素であるセルラーゼのみならず、ヘミセルロースを糖化するヘミセルラーゼが重要となっている。
【０００３】
ところで、ヘミセルロースの構造は植物の種類によって異なる。例えば、針葉樹のヘミセルロースは、マンナンが主要構成成分であるが、被子植物である広葉樹、草本等はキシランが主要構成成分となっている。
一般に、キシランはキシラナーゼによりキシロビオースやキシロオリゴ糖に分解され、キシロシダーゼにより単糖であるキシロースに分解される。
かかるキシロシダーゼは、試薬レベルでは市販されているが極めて高価であり、実用的に使用できる単一酵素は入手できないのが現状である。
【０００４】
これに対し、キシロシダーゼを産生させる方法が研究されている。
例えば、所定のアミノ酸配列からなるヌクレオチド配列やキシラナーゼポリペプチドが知られている。これらによれば、β−キシロシダーゼを産生できる（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００５】
また、アスペルギルス・オリゼからキシロシダーゼ遺伝子を取り出し、そのＤＮＡ配列を決定し、これをアスペルギルス属菌株に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を用いてキシロシダーゼを産生する方法が開示されている（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０７８３７号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１０６１３号公報
【特許文献３】特表２００４−５０９６２６号公報
【特許文献４】特開平１１−３１３６８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献１〜４に記載の方法で発現されるキシロシダーゼは、実用的な木質等のリグノセルロース系バイオマスの分解におけるキシロースの回収には必ずしも効果的とはいえない。
【０００８】
本発明は、木質等のリグノセルロース系バイオマスの分解において、キシロースを十分に回収することができるキシロシダーゼ、該キシロシダーゼを発現することができるキシロシダーゼ遺伝子、それを含有する組み換えＤＮＡ、それらを含有する発現ベクター及びそれを宿主に導入した形質転換体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、セルラーゼ生産菌として単離される糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスが、セルラーゼのみならず、各種のヘミセルラーゼも生産することに着目した。そして、アクレモニウム・セルロリティカスのゲノムＤＮＡ配列を解析し、キシロシダーゼの遺伝子を取得することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、（１）（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる核酸；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸；及び
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、又は、該核酸と相補的な塩基配列を有する核酸；
からなる群より選択された核酸を含むキシロシダーゼ遺伝子に存する。
【００１１】
本発明は、（２）アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）から単離された上記（１）記載キシロシダーゼ遺伝子に存する。
【００１２】
本発明は、（３）上記（１）又は（２）に記載のキシロシダーゼ遺伝子を組み換えた組み換えＤＮＡに存する。
【００１３】
本発明は、（４）上記（１）又は（２）に記載のキシロシダーゼ遺伝子又は上記（３）記載の組み換えＤＮＡを含有する発現ベクターに存する。
【００１４】
本発明は、（５）上記（４）記載の発現ベクターを糸状菌に導入した形質転換体に存する。
【００１５】
本発明は、（６）糸状菌がアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である上記（５）記載の形質転換体に存する。
【００１６】
本発明は、（７）上記（５）又は（６）に記載の形質転換体が発現するキシロシダーゼに存する。
【００１７】
本発明は、（８）（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が６０％以上のタンパク質；及び
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質；
からなる群より選択されたキシロシダーゼ活性を有するタンパク質からなるキシロシダーゼに存する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のキシロシダーゼ遺伝子によれば、キシロシダーゼを効率良く生産することが可能となり、得られるキシロシダーゼは、木質等のリグノセルロース系バイオマスの分解において、キシロースを十分に回収することができる。
また、本発明のキシロシダーゼ遺伝子を含有する組み換えＤＮＡ、それらを含有する発現ベクター又はそれを宿主に導入した形質転換体によれば、キシロシダーゼをより効率良く生産することが可能となり、得られるセルラーゼは、上記同様、木質等のリグノセルロース系バイオマスの分解において、キシロースを十分に回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例の評価１において、アクレモニウム・セルロリティカスの野生株と形質転換株との酵素活性を示したグラフである。
【図２】図２は、実施例の評価２において、アクレモニウム・セルロリティカスの野生株又は形質転換株を用いた場合のキシロースの収率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
（キシロシダーゼ遺伝子）
本発明のキシロシダーゼ遺伝子は、
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる核酸；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする核酸；及び
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、又は、該核酸と相補的な塩基配列を有する核酸；
からなる群（（Ａ）〜（Ｃ））より選択された核酸を含む。
【００２１】
ここで、（Ａ）「配列表の配列番号１に示される塩基配列」は、アクレモニウム・セルロリティカス (Acremonium cellulolyticus)のゲノムＤＮＡ配列情報から複数の生物種のキシロシダーゼにおいて保存されているアミノ酸配列を基に、キシロシダーゼをコードしている遺伝子領域を推定し、これをポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）により増幅した後、単離したものである。
【００２２】
（Ｂ）「配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列」とは、後述する本発明のキシロシダーゼ（酵素タンパク質）のアミノ酸配列である。なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有し、同様の性質を示すキシロシダーゼも本発明に包含される。
【００２３】
（Ｃ）「配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」における上述した配列番号１に示される塩基配列と６０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９５％以上の相同性が配列間に存在するときにハイブリダイゼーションが起こるＤＮＡである。
【００２４】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ．０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃で４時間〜一晩保温を行う条件をいう。
ハイブリダイゼーション操作の詳細は、例えば、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）に記載されている。
【００２５】
また、「該核酸と相補的な塩基配列を有する核酸」とは、配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸から転写反応などで相補的に合成された核酸等を意味する。
【００２６】
本発明のキシロシダーゼ遺伝子によれば、キシロシダーゼを効率良く生産することが可能となる。
【００２７】
（組み換えＤＮＡ）
本発明の組み換えＤＮＡは、上記キシロシダーゼ遺伝子を組み換えたものであり、遺伝子工学的手法により得られた本発明の遺伝子を含有したＤＮＡである。
例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ分子の中のある部分が切断と再結合により他のＤＮＡ分子の一部と混ぜ合わされたものである。
【００２８】
（発現ベクター）
本発明の発現ベクターは、キシロシダーゼ遺伝子又は上記組み換えＤＮＡを含有する。具体的には、キシロシダーゼ遺伝子又は上記組み換えＤＮＡに、糸状菌で遺伝子を発現できるプロモーターを結合したものを、プラスミド、ファージ、ウイルス等のベクターに導入したものである。
【００２９】
プラスミドベクターとしてはｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴ等の市販品が好適に使用でき、ファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１等のラムダファージベクターなどの市販品が好適に使用でき、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が使用できる。これらのベクターは、用いる宿主細胞に応じて、適宜選ばれる。かかるベクターには、誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していてもよい。
【００３０】
上記プロモーターとしては、糸状菌で遺伝子を発現させる能力を有するものであれば特に限定されないが、タンパク質高発現性のプロモーターであることが好ましく、セルラーゼ生産糸状菌のcellobiohydrolase I のプロモーターであることがより好ましい。
【００３１】
ベクターにキシロシダーゼ遺伝子又は上記組み換えＤＮＡを挿入する方法としては、例えば、精製されたアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）のゲノムＤＮＡ配列を適当な制限酵素で切断してキシロシダーゼ遺伝子（又はそれを組み換えた組み換えＤＮＡ）とし、選択マーカー遺伝子を含む適当なベクターのＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトにインフレームで挿入してベクターに連結する方法等が採用される。これにより、発現ベクターが得られる。
【００３２】
（形質転換体）
本発明の形質転換体（非ヒト形質転換体）は、発現ベクターを糸状菌に導入したものである。
発現ベクターの宿主への導入は、常法に従ってすることができ、例えばエレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法等が用いられる。これらの中でも、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法を用いることが好ましい。この場合、エレクトロポレーション法のような特殊な機器、あるいはアグロバクテリウム法のような特殊な微生物を必要とせず、簡易に実施できるという利点がある。
これによりキシロシダーゼ遺伝子が導入されたクローンを選択マーカーによって選抜し、得られた菌株を培養することにより、効率良くキシロシダーゼを生産させることが可能となる。生産された酵素が細胞外に分泌されればその回収・利用に有用である。
【００３３】
ここで、用いられる糸状菌は、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）であることが好ましい。この場合、キシロシダーゼをより効率良く生産することが可能となる。
【００３４】
（キシロシダーゼ）
本発明のキシロシダーゼは、上述した形質転換体により発現される。
本発明のキシロシダーゼは、（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する相同性が６０％以上のタンパク質；及び
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質；
からなる群より選択されたキシロシダーゼ活性を有するタンパク質からなる。
【００３５】
ここで、（Ａ）「配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列」は、本発明のキシロシダーゼのアミノ酸配列を解析したものである。かかるアミノ酸配列は、菌体破砕液由来全ＲＮＡを鋳型に逆転写反応を行うことにより同定される。なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有し、同様の性質を示すキシロシダーゼも本発明に包含される。
【００３６】
（Ｂ）「配列表の配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、上述した配列番号１に示される塩基配列と６０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９５％以上の相同性が配列間に存在するときにハイブリダイゼーションが起こるＤＮＡである。
【００３７】
本発明のキシロシダーゼによれば、木質等のリグノセルロース系バイオマスの分解において、キシロースを十分に回収することができる。また、キシロース配糖体からのアグリコンの分離、キシロース転移作用を利用した各種キシロシドの合成等にも利用できる。
【００３８】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【００３９】
例えば、発現ベクターを導入する宿主として、糸状菌が用いられているが、これに限定されず、酵母、大腸菌、枯草菌等であってもよい。
【００４０】
また、糸状菌として、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）が用いられているが、これに限定されず、ペニシリウム属、トリコデルマ属、アスペルギルス属に属する糸状菌、及びこれらのテレオモルフ等であってもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例で具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４２】
１．ゲノムＤＮＡの抽出
まず、ゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）をＰＤ (ポテトデキストロース) 培地で一晩培養し、得られた培養液を遠心分離によって集菌した。
次に、菌体の２倍量から３倍量のＴＥ＋２％ＳＤＳで菌体を懸濁し、５０℃で１時間保温し、５Ｍ酢酸カリウムを全量の１０分の１量加えて、氷上で１時間冷却した後、遠心して上清を回収した。
そして、得られた上清に対し、フェノール・クロロホルム処理を２回行い、１００％エタノールを２．５倍量加えて、マイナス２０℃で１時間以上冷却した後、７０％エタノールで２回洗い、適当量のＴＥに懸濁してＲＮａｓｅ処理を行った。
【００４３】
２．キシロシダーゼ遺伝子の探索と取得
次に、多種のキシロシダーゼと相同性を持つ、β−キシロシダーゼをアクレモニウム・セルロリティカスのゲノムデータベースの中から、ＩＭＣ（in silico molecular cloning、in silico biology inc.,）で相同性検索をし、β-キシロシダーゼ遺伝子を推定した。
配列情報をもとにプライマーを設計しβ-キシロシダーゼ増幅させた。プライマーの配列はそれぞれ、
（１）forward primer（５’−ＧＣＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧ）
（２）Reverse primer（５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＧＧＣ）
とした。
【００４４】
３．キシロシダーゼ遺伝子による形質転換
増幅したＰＣＲ産物をセロビオヒドラーゼＩ（セルロース分解酵素）プロモーターに連結させ、PLD10 プラスミド（Dr. Kistler, USAより寄贈）を用い、作成した発現ベクターをプロトプラスト−ポリエチレングリコール法にて形質転換した。
ＰＤ培地に一晩培養したアクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株を遠心分離によって集め、０．８ＭのＮａＣｌで菌糸を洗浄した。
洗浄した菌糸に対し、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．８ＭのＮａＣｌ、０．２％のYatalase（タカラバイオ株式会社）を用いて３０℃で１時間処理し、顕微鏡にて菌糸がプロトプラストになっていることを確認し、プロトプラストを遠心分離にて集めた。
その後、プロトプラストを、０．８ＭのＮａＣｌで２回洗浄し、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液及び１０ｍＭのＣａＣｌ２からなる溶液Ａに加え、懸濁した。
そして、得られたプロトプラスト懸濁液に、プラスミド（１０μｇ）を加え、更に４０％のＰＥＧ４０００、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液及び１０ｍＭのＣａＣｌ２からなる溶液Ｂを５０μｌ加え、氷中で３０分冷却した後、１５分室温で放置した。
次に、溶液Ａを８．５ｍｌ加えてプロトプラスト懸濁液を希釈し、これをＹＰＳＡプレート（１％のBacto yeast extract、１％のBacto tryptone、１ＭのSucrose及び２％の寒天Agar) にスプレッドして、３０℃で一晩培養した。
そして、５００μｇのハイグロマイシンを含む、０．２％寒天のＰＤ培地をＹＰＳＡプレートの上に重層した３日後にコロニーを単離し、５００μｇのハイグロマイシンを含むＰＤプレートで培養し、形質転換糸状菌株（ＹＫＸ１)を得た。
【００４５】
（評価１）酵素活性
形質転換糸状菌株（ＹＫＸ１)を、セルロースを炭素源として培養し、その培養液を遠心分離によって分離し、酵素活性を測定して酵素の生産を確認した。
酵素活性は、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを用い、４５℃で１０分間、酵素液および基質をインキュベートすることにより、遊離されたｐ−ニトロフェノールを比色定量することで測定した。
培養した日数と酵素活性との関係を図１に示す。なお、図１中、右側の棒グラフは、本発明の形質転換糸状菌株（ＹＫＸ１)の酵素活性の実験結果を示しており、左側の棒グラフは、比較対象として野生型のアクレモニウム・セルロリティカスを用いて同様の評価を行った場合の酵素活性の実験結果を示している。
図１に示すように、酵素活性の値が、野生型と比べて顕著に高いことが明らかになった。
【００４６】
（評価２）糖化実験
また、得られたキシロシダーゼを含む培養液を用いて、キシロオリゴ糖（和光純薬製）の糖化実験を行った。
時間とキシロースの収率との関係を図２に示す。なお、図２中、上側の折れ線グラフは、形質転換糸状菌株（ＹＫＸ１)を用いた糖化実験の実験結果を示しており、下側の折れ線グラフは、比較対象として野生型のアクレモニウム・セルロリティカスを用いて同様の評価を行った場合の糖化実験の実験結果を示している。
図２に示すように、本発明の形質転換糸状菌株（ＹＫＸ１)によれば、キシロオリゴ糖からのキシロース収率が極めて高くなることがわかった。
【００４７】
以上より、本発明のキシロシダーゼ遺伝子、形質転換体によれば、効率良くキシロシダーゼを産生させることができ、本発明のキシロシダーゼによれば、木質等のリグノセルロース系バイオマスの分解において、キシロースを十分に回収することができることが確認された。なお、キシロシダーゼ遺伝子を用いた組み換えＤＮＡ、発現ベクターでも同様の効果が得られると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のキシロシダーゼ遺伝子、組み換えＤＮＡ、発現ベクター、形質転換体及びキシロシダーゼにより、キシロシダーゼ生産の低コスト化、およびリグノセルロース系バイオマス糖化におけるキシロースの収量増加への利用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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