(57)【要約】【課題】  培養細胞の増殖を促進することが可能な細胞培養表面を有する細胞培養用デバイス、該デバイスの製造方法、および該デバイスを用いたシート状細胞培養物の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  ２以上のチオール基を結合させた重合体を細胞培養表面に有する細胞培養用デバイスにより、上記課題が解決された。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材を含む細胞培養用デバイスであって、該基材を２以上のチオール基を有する重合単位が連結した重合体で被覆した細胞培養表面を有する、前記デバイス。
【請求項２】
２以上のチオール基を有する重合単位が、１，２−エタンジチオール、１，２−プロパンジチオール、１，３−プロパンジチオール、１，４−ブタンジチオール、２，３−ブタンジチオール、１，５−ペンタンジチオール、１，６−ヘキサンジチオール、１，８−オクタンジチオール、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、ビス（２−メルカプトエチル）スルフィド、１，２−ベンゼンジチオール、１，４−ベンゼンジチオール、１，４−ビス（メルカプトメチル）ベンゼン、トルエン−３，４−ジチオール、１，５−ジメルカプトナフタレン、４，４’−ビフェニルジチオール、４，４’−チオビスベンゼンチオール、テトラエチレングリコールビス（３−メルカプトプロピオネート）、１，３，５−ベンゼントリチオール、トリス−［（３−メルカプトプロピオニルオキシ）−エチル］−イソシアヌレート、トリアジントリチオール、トリメチロールプロパントリス（３−メルカプトプロピオネート）、ペンタエリスリトールテトラキス（メルカプトアセテート）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトブチレート）、ジペンタエリスリトールヘキサキス（３−メルカプトプロピオネート）およびそれらの誘導体からなる群より選択される１種または２種以上含むかまたはそれらが重合してなるものである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
重合体が、重合単位をプラズマ処理によって連結したものである、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
さらに、細胞培養表面に、培養細胞よりも小さい凹状構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイスを用いて、シート状細胞培養物を製造する方法。
【請求項６】
シート状細胞培養物が、骨格筋芽細胞のシート状培養物である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞の増殖を促進する細胞培養用デバイス、および該細胞培養用デバイスを用いたシート状細胞培養物、特にヒト及び動物の疾病、傷病の治療に用いるシート状細胞培養物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。
【０００３】
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
【０００４】
この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。
【０００５】
その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
【０００６】
近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。
【０００７】
培養皿の細胞培養表面を様々に加工することにより、細胞の接着性を変化させ得ることもまた知られている。例えば細胞培養表面の官能基や親水性に関しては、非特許文献１には、プラスチック表面を短時間ガスプラズマ処理することにより、接着性の表面を形成可能であることが記載されている。また非特許文献２には、プラスチック表面を、様々な有機蒸気と酸素の混合物を用いて高周波蒸着処理することにより、プラスチック表面にヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基などを形成すること、およびウシ大動脈内皮細胞の増殖が、表面ヒドロキシル基およびカルボキシル基の濃度には依存しないが、表面カルボニル基の濃度に依存することが記載されている。
【０００８】
さらに細胞培養表面の表面粗さに関しては、特許文献２には、材質がポリカプロラクトンの無孔性担体であり、表面粗さ（Ｒａ）が１０５ｎｍ以下である細胞培養基材が開示され、かかる基材は、より大きな表面粗さを有する細胞培養基材と比較して、効果的に細胞を増殖させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２００７−２０９２１８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ramsey et al., In Vitro, 1984 Oct;20(10):802-8
【非特許文献２】Ertel et al., J Biomater Sci Polym Ed. 1991;3(2):163-83.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、培養細胞の増殖を促進することが可能な細胞培養表面を有する細胞培養用デバイス、該デバイスの製造方法、および該デバイスを用いたシート状細胞培養物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
シート状細胞培養物、特に再生医療に用いるための移植用シート状細胞培養物は、細胞のバイアビリティが高いことが直接治療効果に影響するため、使用の直前に製造することが好ましい。そしてシート状細胞培養物の製造においては、拒否反応の少なさ等の観点から自家細胞を用いることが好ましいところ、本発明者らは、自家細胞を用いてシート状細胞培養物を製造する場合、細胞の増殖や分化に時間を要するため、製造工程を律速してしまうという新たな課題に直面した。かかる課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究する中で、細胞培養表面に２以上のチオール基を有する重合単位を塗布し、プラズマ処理によって重合体化して被膜を形成した細胞培養表面を有するデバイスをシート状細胞培養物の製造に用いると、未処理のデバイスを用いた場合と比較して、細胞の増殖速度が顕著に向上し、短時間でシート状細胞培養物を製造できることを新たに見出した。そしてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］基材を含む細胞培養用デバイスであって、該基材を２以上のチオール基を有する重合単位が連結した重合体で被覆した細胞培養表面を有する、前記デバイス。
［２］２以上のチオール基を有する重合単位が、１，２−エタンジチオール、１，２−プロパンジチオール、１，３−プロパンジチオール、１，４−ブタンジチオール、２，３−ブタンジチオール、１，５−ペンタンジチオール、１，６−ヘキサンジチオール、１，８−オクタンジチオール、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、ビス（２−メルカプトエチル）スルフィド、１，２−ベンゼンジチオール、１，４−ベンゼンジチオール、１，４−ビス（メルカプトメチル）ベンゼン、トルエン−３，４−ジチオール、１，５−ジメルカプトナフタレン、４，４’−ビフェニルジチオール、４，４’−チオビスベンゼンチオール、テトラエチレングリコールビス（３−メルカプトプロピオネート）、１，３，５−ベンゼントリチオール、トリス−［（３−メルカプトプロピオニルオキシ）−エチル］−イソシアヌレート、トリアジントリチオール、トリメチロールプロパントリス（３−メルカプトプロピオネート）、ペンタエリスリトールテトラキス（メルカプトアセテート）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトブチレート）、ジペンタエリスリトールヘキサキス（３−メルカプトプロピオネート）およびそれらの誘導体からなる群より選択される１種または２種以上含むかまたはそれらが重合してなるものである、［１］に記載のデバイス。
【００１４】
［３］重合体が、重合単位をプラズマ処理によって連結したものである、［１］または［２］に記載のデバイス。
［４］さらに、細胞培養表面に、培養細胞よりも小さい凹状構造を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載のデバイス。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のデバイスを用いて、シート状細胞培養物を製造する方法。
［６］シート状細胞培養物が、骨格筋芽細胞のシート状培養物である、［５］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞培養において、細胞増殖の速度を顕著に増大することができ、また同じ時間で細胞数を顕著に増大させることができる。また、本発明の細胞培養デバイスの有する細胞培養表面は、細胞との接着性が高められていると考えられるため、例えば血管内皮細胞、表皮角化細胞など、通常の細胞培養デバイスには接着しづらい細胞も接着させ、培養することが可能である。さらに、本発明のデバイスを用いてシート状細胞培養物を製造する場合、従来よりも短時間で製造することができる。これは特に移植用のシート状細胞培養物など、オーダーメイドで製造することが好ましいシート状細胞培養物において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＴＥＭＰＩＣを塗布してプラズマ処理した場合の表面形態を観察したものである。１５０ｎｍ〜２５０ｎｍ程度の大きさの孔が全体に亘って散在していることが分かる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、２以上のチオール基を有する重合単位の重合体で被覆した細胞培養表面を有する、細胞培養用デバイスに関する。
本発明において、「細胞培養用デバイス」とは、細胞培養に用いるデバイスであって、接着細胞を表面に接着させることが可能なデバイスのことをいう。本発明の細胞培養用デバイスとしては、これに限定するものではないが例えば、培養皿、培養ボトル、マルチウェルプレートなどの培養容器が含まれる。また、培地中に浮遊させ、細胞をその表面に接着、増殖させて細胞構造物の芯とするような細胞培養担体、免疫染色用セルチャンバー、細胞数カウント用チャンバーなど、培養容器以外の構造物であってもよい。
【００１８】
本発明において、「基材」とは、デバイスの基本構造を形作る材質および該材質によって形作られる構造体部分のことをいう。また本発明において、「細胞培養表面」とは、細胞培養時に接着細胞が接着する表面のことをいう。細胞培養表面としては、これに限定するものではないが、例えば培養容器の内側底面、前記細胞培養担体の表面などが挙げられる。本発明の細胞培養表面としては、典型的には基材を重合体で被覆した重合体表面である。
【００１９】
本発明において、「重合単位」とは、本発明の重合体を形成する繰り返し単位を意味する。本発明の「重合単位」には、単一の化合物の他、複数の化合物が混合された組成物や、複数の化合物が重合した重合体も含まれる。重合単位が重合体である場合、必ずしも該重合体を形成する繰り返し単位それぞれが複数のチオール基を有していることや繰り返し単位同士がジスルフィド結合を介して結合している必要はなく、重合単位として複数のチオール基を有していればよい。
【００２０】
本発明において、「培養細胞」とは、本発明のデバイスによって培養可能な細胞を意味し、典型的には細胞培養表面に接着した状態で培養される接着細胞である。本発明の効果の恩恵を大きく受けることができる点で、より好ましくは移植用シート状細胞培養物を形成可能な細胞であり、これに限定するものではないが、例えば筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、内皮細胞などが挙げられ、中でも好ましくは骨格筋芽細胞である。
【００２１】
基材として用いられる物質は特に限定されないが、細胞および／または培地に直接接触する可能性があるため、好ましくは細胞毒性を有さないものである。当該技術分野において一般的に用いられる基材であれば本発明の基材として用いることができ、かかる基材としては、これに限定するものではないが例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリル樹脂、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタンなどの樹脂、ガラス、金属などが挙げられる。
【００２２】
本細胞培養表面において細胞増殖が促進される理由は必ずしも明らかではないが、例えば重合体形成のための酸化過程における副産物としてチオール基から生成された硫酸基の存在により接着性が向上していることなどが考えられる。すなわち、細胞接着が生体内の硫酸基含有高分子を介して成されているところ、本発明の細胞培養用デバイスが有する細胞培養表面は、これらを模倣した構造を形成することにより、細胞接着性が向上していると予想される。しかしながら、本発明の細胞培養用デバイスが発揮する増殖活性促進の作用機序はこれに限られたものではない。
【００２３】
生体内の硫酸基含有高分子としては、例えばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸などムコ多糖の存在が知られており、酸性ムコ多糖が骨格筋成長剤として発明されていたり（例えば特開平１０−２６５５０３）、ナチュラルキラー細胞の増殖促進方法へ用いられていたりする（特開２００６−１１５８２６）。特にヘパラン硫酸は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）との相互作用を介した増殖や分化の制御への関与、コンドロイチン硫酸は細胞接着などへの関与が報告されている。
【００２４】
本態様の好ましい一態様において、重合体は、複数のチオール基を有する重合単位が連結して重合体化したものである。網目状の重合体を形成可能である、分子中の硫酸基の数が多くなりやすいなどの点から、より好ましくは、重合単位が３つ以上のチオール基を有している。
チオール基は酸化的に処理されるとチオール基同士で結合してジスルフィド結合を形成する。したがって、本態様において複数のチオール基を有する重合単位もまた、酸化的に処理されることによって、ジスルフィド結合を介して連結し、重合体を形成する。
【００２５】
上記の通り、本態様の重合単位を重合体化するには、酸化的に処理する必要がある。本態様において用いられる酸化的処理は、チオール基間でジスルフィド結合を形成し得る処理であれば何でもよく、これに限定するものではないが例えば、プラズマ処理、オゾン処理、ＵＶ処理、ＥＢ線照射などが挙げられる。表面形態に影響を与えることができる、別の官能基も同時に付加することができる、などの観点から、プラズマ処理もしくはＵＶ処理による酸化的処理が好ましい。
【００２６】
本態様の重合単位として用い得るチオール化合物は、上述の通り、分子内に複数のチオール基を有し、細胞毒性を示さないものであれば特に限定されず、その分子骨格も直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれであってもよい。かかるチオール化合物としては、これに限定するものではないが、例えば、１，２−エタンジチオール、１，２−プロパンジチオール、１，３−プロパンジチオール、１，４−ブタンジチオール、２，３−ブタンジチオール、１，５−ペンタンジチオール、１，６−ヘキサンジチオール、１，８−オクタンジチオール、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、ビス（２−メルカプトエチル）スルフィド、１，２−ベンゼンジチオール、１，４−ベンゼンジチオール、１，４−ビス（メルカプトメチル）ベンゼン、トルエン−３，４−ジチオール、１，５−ジメルカプトナフタレン、２，６−ジメルカプトプリン、４，４’−ビフェニルジチオール、４，４’−チオビスベンゼンチオール、テトラエチレングリコールビス（３−メルカプトプロピオネート）等の分子内にチオール基を２つ有する化合物、１，３，５−ベンゼントリチオール、トリス−［（３−メルカプトプロピオニルオキシ）−エチル］−イソシアヌレート（ＴＥＭＰＩＣ）、トリアジントリチオール、トリメチロールプロパントリス（３−メルカプトプロピオネート）（ＴＭＭＰ）等の分子内にチオール基を３つ有する化合物、ペンタエリスリトールテトラキス（メルカプトアセテート）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）（ＰＥＭＰ）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトブチレート）等の分子内にチオール基を４つ有する化合物、ジペンタエリスリトールヘキサキス（３−メルカプトプロピオネート）等の分子内にチオール基を６つ有する化合物、およびそれらの誘導体などが挙げられる。上記化合物の誘導体には、複数のチオール基を含み、細胞毒性を示さない限りにおいて、当該技術分野において知られたあらゆる誘導体化プロセスによって誘導体化されたものを含み得る。
【００２７】
本発明における重合単位としては、上述の通り、１種のチオール化合物でも、またこれらチオール化合物を複数混合した組成物でもよい。さらにまた、本発明の重合単位は、１種または２種以上のチオール化合物を２以上結合させて重合体としたものであってもよい。３つ以上のチオール基を有している、構造的および電子的に安定した分子骨格を有する、１分子の大きさが程よい、連鎖移動が起きやすいなどの観点から、特に好ましくはトリス−［（３−メルカプトプロピオニルオキシ）−エチル］−イソシアヌレート（ＴＥＭＰＩＣ）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）、ジペンタエリスリトールヘキサキス（３−メルカプトプロピオネート）である。
【００２８】
また、チオール化合物同士を重合させる場合、該重合を促進するための添加剤を、適時適量添加して用いてもよい。これにより、反応（重合）効率をさらに向上して、より強固な重合体層を形成することができる。かかる添加剤としては、これらを添加した状態において細胞毒性を示さないものであればいかなるものを用いてもよい。
【００２９】
添加剤の例としては、これに限定するものではないが、熱重合開始剤としては、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２−メチルブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオン酸）ジメチル、４，４’−アゾビス−４−シアノバレリアン酸、アゾビスイソバレロニトリル、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライド、２，２’−アゾビス［２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロライド、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二硫酸塩、２，２’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−ジメチレンイソブチルアミジン）ジヒドロクロライド、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ハイドレートなどのアゾ系化合物（アゾ系開始剤）；過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；ジベンゾイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルペルマレエート、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、過酸化水素などの過酸化物（過酸化物系開始剤）；フェニル置換エタンなどの置換エタン系開始剤；過硫酸塩と亜硫酸水素ナトリウムとの混合剤、過酸化物とアスコルビン酸ナトリウムとの混合剤などのレドックス系開始剤などが挙げられ、光重合開始剤としては、例えば、アセトフェノン、ｐ−アニシル、ベンジル、ベンゾイン、ベンゾインエチルエーテル、ベンゾインイソプロピルエーテル、ベンゾインメチルエーテル、ベンゾフェノン、２−ベンゾイルベンゾイン酸、４−ベンゾイルベンゾイン酸、４，４’−ビス（ジエチルアミノ）ベンゾフェノン、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン、ジフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィンオキサイド、２−エチルアントラキノン、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオキノン、２−イソニトロソプロピオフェノン、メチル２−ベンゾイルベンゾエイトなどのラジカル重合開始剤、２−（３，４−ジメトキシスチリル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン、ジフェニルインドニウムヘキサフルオロホスフェイト、ジフェニルインドニウムトリフルオロメタンサルフェイト、４−イソプロピル−４’−メチルジフェニルインドニウムテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレイト、２−（４−メトキシフェニル）−４，６−ビス（トリクロロメチル）−１，３，５−トリアジン、トリフェニルサルフォニウムテトラフルオロボレイト、トリ−ｐ−トリルスルホニウムヘキサフルオロホスフェイト、トリ−ｐ−トリルスルホニウムトリフルオロメタンサルフェイトなどのカチオン重合剤、ニフェジピンなどのアニオン重合開始剤などが挙げられる。重合条件は特に制限されず、当業者であれば、重合体形成プロセスの簡便さや重合体の安全性などと考慮して適宜選択できる。
【００３０】
上記重合単位は、基材表面に塗布され、続いて酸化的に処理されて重合体化することで、基材表面の重合体被覆を形成する。塗布の方法としては当該技術分野において知られたあらゆる方法を用いることが可能であるが、溶媒に溶解して塗布するのが、コストや効率の点から好ましい。溶媒としては、上記重合単位を溶解することができるものであれば特に限定されず、例えば水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、酢酸エチルなどのエステル類、クロロホルムなどのハロゲン化物、ブタン、ヘキサンなどのオレフィン類、テトラヒドロフラン、ブチルエーテルなどのエーテル類、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などのアミド類などが挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は１種のみで用いてもよいし、２種以上混合してもよい。また、溶媒に溶解して塗布する方法としては当該技術分野において知られたあらゆる方法が使用可能であり、これに限定するものではないが例えばディッピング、キャスティング、スプレーコート、スピンコート、インクジェットなどが挙げられる。平面へのコーティングの簡易さの点で、好ましくは、キャスティングおよびスピンコートである。
【００３１】
好ましい一態様において、重合体化は、プラズマ処理によって行われる。本発明において、「プラズマ処理」はプラズマを照射して処理することを意味する。プラズマ処理の条件としては、酸化的処理が行えればいかなる条件下で行われてもよいが、好ましくは大気圧下プラズマ処理、酸素を含むガス下でのプラズマ処理などである。上述の通り、プラズマ処理によって基材表面の重合単位が有するチオール基同士がジスルフィド結合を形成し、該重合単位を重合体化させる。
【００３２】
プラズマ処理による重合体形成の利点としては、第一に、重合体形成と同時に、細胞接着性に影響を与え得る様々な官能基を付加、生成できる点である。第二に、形成された重合体にｎｍオーダーの微小な孔を形成することが可能な点である。本明細書において「ｎｍオーダー」という場合、ｎｍの単位で表すのが適切な程度の大きさを意味し、典型的には１ｎｍ以上１μｍ未満である。プラズマ処理によりｎｍオーダーの微小な孔が形成できる理由は必ずしも明らかではないが、微小粒子の衝突によるエッチング効果、または重合体形成時に重合体膜に張力がかかることによる多孔化もしくは溶媒中の水分を鋳型とした多孔化が生じているものと考えられる。
【００３３】
本発明の別の一態様において、細胞培養表面は、培養細胞よりも小さい凹状構造を有している。かかる凹状構造を有することにより、培養細胞が細胞培養表面により接着しやすくなり、細胞増殖をより促進することができる。
本発明において「凹状構造」とは、平坦な状態からくぼんだ構造のことをいい、典型的には孔である。したがって「培養細胞より小さい凹状構造」とは、凹状構造の径が培養細胞よりも小さいことを意味する。
【００３４】
凹状構造は、培養表面に１以上存在していれば構わないが、好ましくは複数存在しており、より好ましくは多数の凹状構造が細胞培養表面全体にわたって散在している。
凹状構造の大きさは、培養細胞より小さければ特に限定されない。培養細胞より大きいと、凹状構造の中に培養細胞が完全に入り込んでしまうため、好ましくない。培養細胞の大きさは細胞腫によって異なるため、最適な凹状構造の大きさは一概には特定できないが、培養細胞は、通常１〜１００μｍ程度の大きさであるため、好ましくは１ｎｍ以上１μｍ未満の凹状構造であり、より好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍ程度である。一例として培養細胞に骨格筋芽細胞を用いた場合、好ましい凹状構造の大きさは５０ｎｍ〜３００ｎｍ程度となる。
【００３５】
さらに本発明には、上記細胞培養表面および該細胞培養表面を有する細胞培養用デバイスの製造方法も包含される。上述の通り、細胞培養表面にプラズマ処理を施すと、ｎｍオーダーの微少な孔、すなわち凹状構造が形成される。したがって、好ましい態様において、チオール基を有する重合単位を細胞培養表面に塗布した状態でプラズマ処理を施し、本発明の細胞培養表面を形成すると同時に、培養細胞より小さい凹状構造を形成することができる。
【００３６】
本発明の細胞培養用デバイスは任意の接着細胞を培養し得るため、本発明の細胞培養用デバイスを用いて、シート状細胞培養物を製造することもできる。シート状細胞培養物には、シート状細胞培養物を形成し得る任意の細胞が含まれる。かかる細胞の例としては、限定されずに、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、心筋細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、内皮細胞などが含まれる。これらのうち、本発明においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞などが好ましい。
【００３７】
細胞は、細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどが含まれる。また、シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。本発明の好ましい態様において、細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞培養物製造終了時において、６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上である。
【００３８】
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいい、典型的には１の細胞層からなるものであるが、２以上の細胞層から構成されるものも含む。細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
【００３９】
本発明の細胞培養用デバイスを用いてシート状細胞培養物を製造することにより、従来よりも短時間でシート状細胞培養物を製造することが可能である。これは特に移植用のシート状細胞培養物を製造する際、拒絶反応を起こさないようにするために自家細胞を用いて製造するのが好ましいところ、オーダーメイドのシート状細胞培養物を迅速に準備できる点で有利である。本発明の細胞培養用デバイスは、近年心臓疾患の再生治療において有用であることが示され、自家細胞を用いることが可能であるが、分化、増殖に時間がかかる骨格筋芽細胞のシート状培養物の製造に特に好ましく用いることができる。
【００４０】
以下に本発明の具体的な態様を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
例１．細胞培養表面処理
細胞培養用シャーレ（FalconＴＭ）にプラズマ照射装置（PT-2000P Duradyne Plasma Treatment System、Tri-Star Technologies社製）を用いて、大気圧下、ガスフロー：１５ＳＣＦＨ、プラズマ電流：０．７Ａの条件で、アルゴンイオンガスプラズマ処理を３０秒間施した（前処理）。
上記前処理を施したシャーレを、１．０重量％の濃度に調製したトリス−［（３−メルカプトプロピオニルオキシ）−エチル］−イソシアヌレート（ＴＥＭＰＩＣ）（ＳＣ有機化学株式会社製）（１分子中のチオール基３個）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液に浸漬し、乾燥した後、上記プラズマ照射装置を用いて、再度大気圧下でアルゴンイオンガスプラズマ照射を３０秒行った。その後、８０℃で５時間加熱処理を施し、ＥＢ線照射（４０ｋＧｙ）により滅菌を行い、サンプルとした。
【００４２】
例２．表面形態の観察
例１で作製したサンプルの表面形態を観察した。サンプルの細胞培養表面にION  SPUTTER  E-1010（HITACHI製）を用いて白金を蒸着した。その後、走査電子顕微鏡システムS-3400N（HITACHI製）を用いて、５０００倍で表面形状を観察した。
【００４３】
結果を図１に示す。例１の細胞培養表面処理によって、無数の孔が形成されており、孔のサイズは平均で１５０ｎｍ〜２５０ｎｍ程度であることが分かる。
【００４４】
例３．細胞培養実験
例１において溶媒をメタノールとしたおよびエタノールとした以外は同様に表面処理をしたサンプルを作製した。比較例として未処理のシャーレおよび前処理のみ（６０秒間のプラズマ照射）したシャーレをサンプルとして作製した。これらのシャーレに播種細胞数が１×１０４個／ディッシュとなるように、骨格筋芽細胞をそれぞれ播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で５日間培養した。培養後、ディッシュに１枚あたり２ｍＬのトリプシン様タンパク質分解酵素を細胞解離剤として添加し、解離した細胞を回収した。回収した細胞の一部をとり、トリパンブルー染色法により生細胞数をカウントし、全生細胞数（回収細胞数）を算出した。得られた回収細胞数を同様にして得られたコントロール（未処理のシャーレ）の回収細胞数により除し、１００倍したものを細胞増加率とした。
【００４５】
結果を下表に示す。
【表１】
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【００４６】
前処理のみ施したサンプルは、未処理のサンプルと比較してわずかに回収細胞数が増加した（４．１％）が、本発明のサンプルは、溶媒の違いに関係なく、未処理のサンプルと比較して回収細胞数が１５％前後増加していた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明によれば、従来よりも高い効率で細胞を培養し、増殖させることが可能な細胞培養用デバイスを提供することができる。また、本発明のデバイスをシート状細胞培養物の製造に応用することで、移植用のシート状細胞培養物など調製に時間がかかるものであっても、より迅速に準備し、移植することが可能となり、医療の現場などにおいても非常に有用である。
【図１】
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