(57)【要約】【課題】種々の適用（例えば、遺伝子治療および組換えタンパク質生成を含む）で使用される選択された所望の表現型を有する組換えベクターを提供し、そしてさらに他の関連の利点を提供することを、本発明の解決すべき課題とする。【解決手段】単離された核酸分子であって、変更されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含み、これは組換えアルファウイルス粒子中に作動可能に組み込まれた場合、哺乳動物細胞での発現の後に、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するために必要な時間を野生型アルファウイルスに比べて増大させる、単離された核酸分子を提供することによって、上記課題は解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は同時係属中の米国特許出願第８３３，１４８号（１９９７年４月４日出願）の一部継続出願であり；これは米国特許出願第０８／６７９，６４０号（１９９６年７月１２日出願）の米国一部継続出願の一部継続出願であり；これは米国特許出願第０８／６６８，９５３号（１９９６年６月２４日出願）の一部継続出願であり、これは米国特許出願第０８／６２８，５９４号（１９９６年４月５日出願）の一部継続出願であり、これらのすべては本明細書中にその全体が援用される。
【０００２】
（政府の権利の言明）
本発明は政府の支持の下、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ
ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた認可番号ＡＩ１１３７７号の下で一部行われている。政府は本発明に対して一定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は一般に組換えＤＮＡ技術に関する。そしてより詳細には１つ以上の異種遺伝子産物の発現を導くのに有用な組換えベクターの開発に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
アルファウイルスは、トガウイルス科のうちの遺伝的、構造的、および血清学的に関連した節足動物保有ウイルスの一組を含む。これらのウイルスは全世界に分布し、そして蚊から脊椎動物の一群を通じて天然に存続している。鳥類、げっ歯類、ウマ、霊長類、およびヒトがとりわけ明確なアルファウイルスの脊椎動物の保有者／宿主である。
【０００５】
２６種の既知のウイルスおよびウイルスサブタイプが、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイを利用してアルファウイルス属に分類されている。このアッセイは２６種のアルファウイルスを３つの主要な群（ｃｏｍｐｌｅｘ）に分離する：ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）群、セムリキ森林（ＳＦ）群、および西部ウマ脳炎（ＷＥＥ）群である。加えて、他の４種のウイルス、すなわち東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）、バルマー（Ｂａｒｍａｈ）森林、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）、およびヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）が、ＨＩ血清学的アッセイに基づいて個別に分類されている。
【０００６】
アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるその相対的な臨床的特徴に基づいて以下のように分類される：主として脳炎に関連するアルファウイルス、および主として発熱、発疹、および多発性関節炎に関連するアルファウイルス。前者にはＶＥＥおよびＷＥＥ群、ならびにＥＥＥが含まれる。一般に、このグループの感染は永続的な後遺症（行動の変化および学習障害が含まれる）をもたらし得、あるいは死に至らしめ得る。後者のグループに含まれるのはＳＦ群であり、これは個々のアルファウイルス、すなわちセムリキ森林、シンドビス、ロス川、チクングニヤ、オニョンニョン、およびマヤロ（Ｍａｙａｒｏ）から構成される。このグループに関しては深刻な流行が報告されてはいるが、感染は一般に自己限定性であり、永続的な後遺症は生じない。
【０００７】
シンドビスウイルスはトガウイルス科アルファウイルス属の原型的なメンバーである。その細胞への感染後の複製戦略（図１参照）は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）および仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞において充分に特徴づけられている。ここでシンドビスウイルスは急速に、かつ高力価まで増殖し、他のアルファウイルスに関するモデルとして役立つ。簡単にいうと、シンドビスウイルス由来のゲノムは（他のアルファウイルスと同様に）約１２ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡ分子であり、これはキャップおよびポリアデニル化されており、そしてウイルスがコードするキャプシドタンパク質の殻の中に入っている。このヌクレオキャプシドはさらに宿主由来の脂質エンベロープで取り囲まれ、ここに２つのウイルス特異的糖タンパク質Ｅ１およびＥ２が挿入され、そしてヌクレオキャプシドに固定される。特定のアルファウイルス（例えばＳＦ）はまた、さらなるタンパク質Ｅ３を維持し、これはＥ２前駆体タンパク質ＰＥ２の切断産物である。ウイルス粒子が標的細胞へ吸着し、浸透し、そしてヌクレオキャプシドを脱いで、ウイルスゲノムＲＮＡを細胞質中に放出した後、ウイルスゲノムの５’側から３分の２の非構造タンパク質（ｎｓＰ）の翻訳によって複製プロセスが開始される。４つのｎｓＰ（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）が、２つのポリタンパク質（ｎｓＰ１２３またはｎｓＰ１２３４）のうちの１つとしてゲノムＲＮＡテンプレートから直接翻訳され、そして翻訳後、Ｃ末端ドメインｎｓＰ２において活性プロテアーゼによってプロセシングされて、モノマー単位になる。ほとんどのアルファウイルスのｎｓＰ３とｎｓＰ４との間に存在する漏出性オパール（ＵＧＡ）コドンは、ｎｓＰ１２３４ポリタンパク質がｎｓＰ１２３ポリタンパク質と比べて１０から２０％多い原因を説明する。これらの非構造ポリタンパク質およびそれら由来のモノマー単位の両方がＲＮＡ複製プロセスに関与し得、これは５’末端および３’末端に存在する保存ヌクレオチド配列エレメント（ＣＳＥ）、ならびにゲノムの内部に位置する接合領域サブゲノムプロモーターに対する結合を伴う（さらに以下で論じる）。
【０００８】
ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡは、ｎｓＰが触媒する全長の相補的ネガティブ鎖の合成のためのテンプレートとして役立つ。相補的なネガティブ鎖の合成は、ｎｓＰ複合体がポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの３’末端ＣＳＥに結合した後に触媒される。次にこのネガティブ鎖はさらなるポジティブ鎖ゲノムＲＮＡおよび豊富に発現される２６ＳサブゲノムＲＮＡの合成のためのテンプレートとして役立ち、これは接合領域プロモーターにおいて内部的に開始される。さらなるポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの合成は、ｎｓＰ複合体が相補的なネガティブ鎖ゲノムＲＮＡテンプレートの３’末端ＣＳＥに結合した後に起こる。ネガティブ鎖ゲノムＲＮＡテンプレートからのサブゲノムｍＲＮＡの合成は、接合領域プロモーターから開始される。従って、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの５’末端および接合領域ＣＳＥは、これらがネガティブ鎖ゲノムＲＮＡ相補体に転写された後にのみ機能性である（すなわち、５’末端ＣＳＥはこれがゲノムネガティブ鎖相補体の３’末端である場合に機能性である）。構造タンパク質（ｓＰ）はサブゲノム２６Ｓ  ＲＮＡから翻訳され、これはゲノムの３’側の３分の１を表し、そしてｎｓＰと同様に、翻訳後プロセシングされて個別のタンパク質となる。
【０００９】
いくつかのグループが、アルファウイルス属の特定のメンバーを発現ベクターとして利用することを示唆しており、これには、例えば、シンドビスウイルス（非特許文献１〜３）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１９Ａ：１０，１９９５）が含まれる。さらに、１つのグループは、アルファウイルス由来のベクターを治療用遺伝子をインビボで送達するために用いることを示唆している。しかし上記のベクターを用いる１つの難しさは、宿主細胞支配の（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）巨大分子合成（すなわち、タンパク質またはＲＮＡの合成）の阻害が感染の数時間後に始まること、および細胞変性効果（ＣＰＥ）が感染後１２時間から１６時間（ｈｏｕｒｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｈｐｉ））のうちに生じることである。宿主細胞タンパク質合成の阻害および回避（ｓｈｕｎｔｏｆｆ）は、組換えウイルス粒子で感染したＢＨＫ細胞では、構造タンパク質発現の存在または非存在下で２ｈｐｉ以内で始まり、このことは、ウイルス感染後の初期事象（例えば、ｎｓＰおよびマイナス鎖ＲＮＡの合成）が宿主細胞タンパク質合成の阻害、ならびにそれに続くＣＰＥの発達および細胞死に直接影響を与え得ることを示唆する。
【００１０】
ＳＩＮ−１は野生型シンドビス由来の改変体株であり、シンドビスウイルスで１ヶ月の期間にわたって永続的に感染したＢＨＫ細胞の培養物から単離された（Ｗｅｉｓｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３−４７４，１９８０）。単一のプラークからの増殖によって得られた純粋なＳＩＮ−１ウイルスストックは、それが感染したＢＨＫ細胞を殺傷しない。重要なことには、ウイルスの収率（＞１０3ＰＦＵ／細胞）は野生型シンドビスウイル
スで感染したＢＨＫ細胞でも、改変体ＳＩＮ−１ウイルスで感染したＢＨＫ細胞でも同じである。従って、感染したＢＨＫ細胞におけるＳＩＮ−１の原則的な表現型は、野生型レベルの感染ウイルスを、ウイルスに誘導される細胞死なしで生成することによって特徴づけられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８−１１９１、１９８９
【非特許文献２】Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９−２６８３、１９９２
【非特許文献３】Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９、１９９６
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、種々の適用（例えば、遺伝子治療および組換えタンパク質生成を含む）で使用される選択された所望の表現型を有する組換えベクターを提供し、そしてさらに他の関連の利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
簡単に述べると、本発明は、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物層状ベクター（ｌａｙｅｒｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ）開始系、および組換えアルファウイルス粒子を提供し、これらは細胞巨大分子合成（例えば、タンパク質またはＲＮＡの合成）の阻害の低減、遅延、または非阻害を示し、そのためこれらのベクターはタンパク質発現、遺伝子治療などに使用することが可能であり、ＣＰＥまたは細胞死の発生が低減、遅延され、または発生しない。このようなベクターは広範囲な種々のアルファウイルス（例えば、セムリキ森林ウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはシンドビスウイルス）から構築され得、そして多数の異種配列（例えば、タンパク質に対応する配列、アンチセンスＲＮＡに対応する配列、非コードセンスＲＮＡに対応する配列、またはリボザイムに対応する配列）を発現するように設計され得る。
【００１４】
本発明の１つの局面において、単離された核酸分子が提供され、これは変更されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含み、これは組換えアルファウイルス中に作動可能に組み込まれた場合、哺乳動物細胞での発現の後、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するために必要な時間を野生型アルファウイルスに比べて増大させる。本発明の文脈内で利用された場合、「変更されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子」とは、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物層状ベクター開始系中に作動可能に組み込まれたときに、所望の表現型（例えば、細胞巨大分子合成の阻害の低減、遅延、または非阻害）を生ずる遺伝子をいう。このような変更されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、１つ以上のヌクレオチド置換、欠失、または挿入を有し、これはヌクレオチド配列を野生型アルファウイルス遺伝子のものから変化させる。遺伝子は、人工的に誘導されてもよいし（例えば、指向性選択手順（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）から：以下の実施例２参照）、または天然に存在するウイルス改変体に由来してもよい（以下の実施例１参照）。加えて、本発明の単離された核酸分子がアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物層状ベクター開始系の中に上記のように取り込まれたとき、これらは、特定の実施態様において、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するために必要とされる時間を、宿主細胞支配の巨大分子合成の検出可能な阻害が（任意の期間にわたって）実質的になされない程度まで、そしてその程度を含めて、実質的に増大させ得ることが理解されるべきである。宿主細胞支配の巨大分子合成の阻害パーセントを検出するのに適したアッセイは、例えば、実施例１に記載のアッセイを含む。
【００１５】
本発明の他の局面において、単離された核酸分子が提供され、これは変更されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含み、これは、組換えアルファウイルス粒子、真核生物層状ベクター開始系、またはＲＮＡベクターレプリコンに作動可能に取り込まれた場合、野生型に比べて低減されたレベル（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍を越える）のベクター特異的ＲＮＡ合成をもたらし、そして野生型組換えアルファウイルス粒子、野生型真核生物層状ベクター開始系、または野生型ＲＮＡベクターレプリコンに比べて同じかまたはそれより高いレベルの、ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡでコードされるタンパク質をもたらす。ＲＮＡレベルを定量するための代表的なアッセイは、実施例１に記載のような［3Ｈ］ウリジン取り込み、またはノーザン
ブロット分析で検出されるようなＲＮＡ蓄積（実施例４参照）を包含する。タンパク質レベルを定量するための代表的アッセイは、スキャニングデンシトメトリー（実施例４を参照）および種々の酵素的アッセイ（実施例３〜５を参照）を含む。
【００１６】
上記の１つの実施態様において、単離された核酸分子は、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）をコードする。さらなる実施態様では、単離された核酸分子はｎｓＰ２のＬＸＰＧＧモチーフ中に変異を有する。
【００１７】
本発明の別の局面において、発現ベクターが提供され、これは上記の核酸分子のうちの１つに作動可能に連結されたプロモーターを含む。１つの実施態様では、発現ベクターはさらに、核酸分子に対して３’側にポリアデニル化配列または転写終結配列を含む。
【００１８】
本発明のさらに別の局面において、アルファウイルスベクター構築物が提供され、これは、インビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記のような単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクト（３’  ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ
ｔｒａｃｔ）を含む。
【００１９】
関連の局面において、このような構築物はさらに、選択された異種配列を、ウイルス接合領域の下流に、かつそれに作動可能に連結されて含む。関連の局面において、アルファウイルスベクター構築物が提供され、これはインビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで上記のインビトロで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子中にパッケージングされ、そしてその粒子が哺乳動物宿主細胞に導入されると、哺乳動物細胞中で発現した後、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するのに必要とされる時間を野生型アルファウイルス粒子に比べて増大させる。
【００２０】
さらなる局面において、アルファウイルスベクター構築物が提供され、これはインビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで上記のインビトロで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子中にパッケージングされ、そしてその粒子が哺乳動物宿主細胞に導入されると、野生型アルファウイルス粒子に比べて低減されたレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、かつ野生型アルファウイルス粒子に比べて同じかまたはそれより高いレベルの、ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡによってコードされるタンパク質を有する。
【００２１】
本発明のさらに他の局面では、真核生物系において翻訳され得るＲＮＡベクターレプリコンが提供され、これは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記の単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスのウイルス接合領域、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含む。
【００２２】
関連の局面では、真核生物系において翻訳され得るアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンが提供され、これは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで上記アルファウイルスＲＮＡは、アルファウイルス粒子中にパッケージングされ、そしてその粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、哺乳動物細胞中で発現した後、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するのに必要とされる時間を、野生型アルファウイルス粒子に比べて増大させる。
【００２３】
他の局面において、真核生物系において翻訳され得るアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンが提供され、これは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで上記アルファウイルスＲＮＡは、アルファウイルス粒子中にパッケージングされ、そしてその粒子が哺乳動物宿主細胞に導入されると、野生型アルファウイルス粒子に比べて低減したレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、かつ野生型アルファウイルス粒子に比べて同じかまたはそれより高いレベルの、ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡによってコードされるタンパク質を有する。
【００２４】
別の実施態様において、このようなＲＮＡベクターレプリコンはさらに、選択された異種配列を、ウイルス接合領域の下流に、かつそれに作動可能に連結されて含む。本発明のさらなる局面において、宿主細胞が提供され、これは本明細書中に記載されるＲＮＡベクターレプリコンのうちの１つを含む。本発明のさらなる局面において、薬学的組成物が提供され、これは上記のようなＲＮＡベクターレプリコンおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。
【００２５】
本発明の他の局面において、組換えアルファウイルス粒子が提供され、これは、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、および本明細書中に記載のようなＲＮＡベクターレプリコンを含む。１つの実施態様では、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質が、ＲＮＡベクターレプリコンが由来するアルファウイルスとは異なるアルファウイルスに由来する。他の実施態様では、アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープは異なる種に由来する。さらなる局面において、薬学的組成物が提供され、これは上記で開示されたような組換えアルファウイルス粒子、および薬学的に受容可能なキャリアおよび希釈剤を含む。さらに、このような組換えアルファウイルス粒子で感染した哺乳動物細胞もまた提供される。
【００２６】
本発明の特定の実施態様において、上記ベクターまたは粒子はさらに耐性マーカーを含み得、これは異種配列にインフレームで融合している。このような耐性マーカーの代表例はハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼを包含する。
【００２７】
本発明の他の局面において、本明細書に記載の宿主細胞支配の巨大分子合成の阻害の低減、遅延、または非阻害の表現型を示すアルファウイルスまたは組換えアルファウイルスベクター改変体を選択するための方法が提供される。このような方法の代表例は選択可能な薬物または抗原性マーカーの使用を包含し、そして以下の実施例２でより詳細に提供される。
【００２８】
本発明の他の局面では、トガウイルスキャプシド粒子が提供され、これは、ゲノム（すなわち野生型ウイルスゲノム）またはＲＮＡベクターレプリコン核酸を実質的に含まない。トガウイルスの代表例は、例えば、アルファウイルスおよびルビウイルス（例えば、風疹ウイルス）を含む。特定の実施態様において、キャプシド粒子は、１つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質エンベロープをさらに含む。他の実施態様では、キャプシド粒子はさらにアルファウイルスエンベロープ（すなわち、脂質二重層および糖タンパク質補体）を含む。本発明の関連の局面では、薬学的組成物が提供され、これは上記のキャプシド粒子（脂質二重層（例えば、アルファウイルス糖タンパク質を含むウイルスエンベロープ）有りまたは無し）を薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と共に含む。さらなる局面において、このようなキャプシド粒子（脂質二重層（例えば、アルファウイルス糖タンパク質を含むウイルスエンベロープ）有りまたは無し）または薬学的組成物は、所望のトガウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチン剤として利用され得る。
【００２９】
本発明のさらなる局面では、誘導性プロモーターが提供され、これはコアＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、コアプロモーター配列からの転写を活性化するタンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列、およびコアプロモーター配列からの転写を抑制するタンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列を含む。このようなプロモーターは、本明細書に記載の遺伝子送達ビヒクル、ならびに当業者に公知の広範な種々の他のベクターにおいて利用され得る。
【００３０】
他の局面では、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットが提供され、これは、ＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、１つ以上の機能性アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子、発現カセットの転写に作動可能に連結される選択マーカー、および必要に応じて転写終結を制御する３’配列を含む。１つの実施態様では、このような発現カセットはさらに、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、ウイルス接合領域プロモーター、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。別の実施態様では、発現カセットはさらに、触媒的リボザイムプロセシング配列、核からのＲＮＡの搬出を容易にする翻訳後転写調節エレメント、および／または多シストロン性ｍＲＮＡの翻訳を可能にするエレメント（内部リボソーム侵入部位エレメント、リボソーム読み通しを促進するエレメント、およびＢｉＰ配列からなる群から選択される）を含む。他の実施態様では、選択マーカーは、ｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーターに作動可能に連結している。さらなる実施態様では、選択マーカーは、接合領域プロモーターから、およびアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子から下流に位置する。さらに他の実施態様では、５’プロモーターは本明細書に記載のような誘導性プロモーターである。別の実施態様では、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットはさらに、アルファウイルスキャプシドタンパク質遺伝子、または他の配列（例えば、タバコエッチウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、すなわち「ＴＥＶ」のリーダー）を含み、これはエンハンサー配列の３’側に位置する１つ以上の機能性アルファウイルス構造タンパク質遺伝子の翻訳を増強し得る。好ましくは、キャプシドタンパク質遺伝子配列は、アルファウイルス構造遺伝子をコードする配列が得られるアルファウイルスとは異なるアルファウイルス由来である。
【００３１】
本発明のさらに他の局面では、アルファウイルスパッケージング細胞株が提供され、これは上記のようなアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含む細胞を含む。特定の実施態様においては、アルファウイルスパッケージング細胞株は本明細書で提供されるアルファウイルス構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換されている。関連の局面では、アルファウイルスプロデューサー細胞株が提供され、これは、安定に形質転換されたアルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ならびにＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、および真核生物層状ベクター開始系からなる群から選択されるベクターを含む細胞を含む。
【００３２】
本発明のさらに他の局面では、真核生物層状ベクター開始系が提供され、これは、インビボでｃＤＮＡからのＲＮＡの５’合成を開始し得る５’プロモーター、この５’プロモーターの後にアルファウイルスＲＮＡの転写を開始する配列；４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記のような単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含む。
【００３３】
また、真核生物層状ベクター開始系が提供され、これは、インビボでｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの５’合成を開始し得る５’プロモーター、５’プロモーターの後にアルファウイルスＲＮＡの転写を開始する配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで上記のインビボで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子中にパッケージングされ、そしてその粒子が哺乳動物宿主細胞に導入されると、哺乳動物細胞中での発現の後、野生型アルファウイルス粒子に比べて、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するために必要な時間を増大させる。
【００３４】
関連の真核生物層状ベクター開始系もまた提供され、これは、インビボでｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの５’合成を開始し得る５’プロモーター、５’プロモーターの後にアルファウイルスＲＮＡの転写を開始する配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで上記のインビボで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子中にパッケージングされ、そしてその粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、野生型アルファウイルス粒子に比べて低減したレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、かつ野生型アルファウイルス粒子に比べて同じかまたはそれより高いレベルの、ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡによってコードされるタンパク質を有する。
【００３５】
真核生物層状ベクター開始系に適した５’プロモーターの代表例は、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＲＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ＭｏＭＬＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターおよびＣＭＶプロモーターを包含する。好適な実施態様では、５’プロモーターは本明細書に記載のような誘導性プロモーターである。
【００３６】
特定の実施態様では、真核生物層状ベクター開始系が提供され、これはさらに、ウイルス接合領域に作動可能に連結された異種配列、および／または核からのＲＮＡの搬出を容易にする翻訳後調節エレメントを含む。さらなる実施態様では、本明細書で提供される真核生物層状ベクター開始系はさらに、転写終結シグナルを含み得る。
【００３７】
関連の局面では、本発明はまた宿主細胞（例えば、脊椎動物または昆虫）を提供し、これは、上記のような安定に形質転換された真核生物層状ベクター開始系を含む。本発明のさらなる局面では、選択された異種配列を脊椎動物または昆虫に送達するための方法が提供され、これは、脊椎動物または昆虫に本明細書に記載のようなアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物層状ベクター開始系を投与する工程を包含する。特定の実施態様では、アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物層状ベクター開始系は脊椎動物の細胞にエクスビボで投与され、次にこのベクターまたは粒子を含む細胞が温血動物に投与される。
【００３８】
他の局面では、薬学的組成物が提供され、これは、上記のような真核生物層状ベクター開始系、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。特定の実施態様では、薬学的組成物はリポソーム処方物として提供される。
【００３９】
さらなる局面では、組換えアルファウイルス粒子を作製する方法が提供され、これは、（ａ）上記のような真核生物層状ベクター開始系、ＲＮＡベクターレプリコン、またはアルファウイルスベクター粒子のようなベクターを、組換えアルファウイルス粒子の生成を可能にするに十分な条件下で、かつ十分な時間をかけてパッケージング細胞の集団中に導入する工程、および（ｂ）組換えアルファウイルス粒子を採取する工程を包含する。関連の局面では、選択されたタンパク質を作製する方法が提供され、これは、（ａ）例えば、上記のような真核生物層状ベクター開始系、ＲＮＡベクターレプリコン、またはアルファウイルスベクター粒子のような選択された異種タンパク質をコードするベクターを、パッケージング細胞の集団または他の細胞中に、選択されたタンパク質の生成を可能にするに十分な条件下で、かつ十分な時間をかけて導入する工程、および（ｂ）このベクター含有細胞によって生成されるタンパク質を採取する工程を包含する。さらに他の局面では、選択されたタンパク質を作製する方法が提供され、これは、選択された異種タンパク質を生成し得る真核生物層状ベクター開始系を、選択されたタンパク質の発現を可能にするに十分な条件下で、かつ十分な時間をかけて宿主細胞中に導入する工程を包含する。さらなる局面では、宿主細胞株が提供され、これは本明細書に記載のようなＲＮＡベクターレプリコンを含む。
【００４０】
本発明のさらに他の局面では、アルファウイルスワクチンが提供され、これは上記のアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子のうちの１つを含み、これは本明細書で提供される異種配列の１つを発現してもよく、発現しなくてもよい（例えば、これらはアルファウイルス性疾患の処置または予防のために単独でワクチンとして利用され得る）。例えば、本発明の１つの実施態様では、組換えトガウイルス粒子が提供され、これは、核酸またはＲＮＡベクターレプリコン核酸を実質的に有さない。さらなる実施態様では、組換えトガウイルス粒子が提供され、これは異種ウイルス核酸（すなわち、トガウイルス粒子とは異なるウイルス由来）を含む。さらに別の実施態様では、組換えトガウイルス粒子はＴ＝３以上である。
【００４１】
本発明のさらなる局面では、組換えキメラトガウイルス粒子（空か、または核酸を含むかのいずれか）が提供され、ここでウイルス粒子は異なるトガウイルス科から得られるか、またはそれに由来するウイルス構造成分を有する（例えば、キャプシドタンパク質および糖タンパク質が異なるアルファウイルス供給源から得られる）。
【００４２】
本発明の他の局面では、脊椎動物における免疫応答を刺激するための方法が提供され、これは、脊椎動物に、アルファウイルスベクター構築物、一致したアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または真核生物層状ベクター開始系を投与する工程を包含し、ここでアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、粒子、または真核生物層状ベクター開始系は上記脊椎動物における免疫応答を刺激する抗原を発現する（例えば、適切な抗原について米国出願第０８／４０４，７９６号を参照のこと）。関連の局面では、脊椎動物における病原性因子を阻害する方法が提供され、これは、脊椎動物に、アルファウイルスベクター構築物、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、組換えアルファウイルス粒子、または一致した真核生物層状ベクター開始系を投与する工程を包含し、ここで上記アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、粒子、または真核生物層状ベクター開始系は、病原性因子を阻害し得る緩和剤を発現する（例えば、適切な緩和剤について米国出願第０８／４０４，７９６号を参照のこと）。
【００４３】
本発明は、例えば、以下を提供する： 
（項目１）  単離された核酸分子であって、変更されたアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含み、これは組換えアルファウイルス粒子中に作動可能に組み込まれた場合、哺乳動物細胞での発現の後に、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するために必要な時間を野生型アルファウイルスに比べて増大させる、単離された核酸分子。
（項目２）  単離された核酸分子であって、アルファウイルス非構造タンパク質遺伝子を含み、これは組換えアルファウイルス粒子中に作動可能に組み込まれた場合、野生型に比べて低減したレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、そして野生型組換えアルファウイルス粒子に比べて同じかまたはそれより高いレベルの、ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡでコードされるタンパク質を有する、単離された核酸分子。
（項目３）  アルファウイルスベクター構築物であって、インビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子であって、項目１または２に記載の核酸分子を包含する核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含む、アルファウイルスベクター構築物。
（項目４）  アルファウイルスベクター構築物であって、インビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで該インビトロで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子にパッケージングされ、そして該粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、哺乳動物細胞中で発現した後、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するのに必要とされる時間を野生型アルファウイルス粒子に比べて増大させる、アルファウイルスベクター構築物。
（項目５）  アルファウイルスベクター構築物であって、インビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで該インビトロで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子にパッケージングされ、そして該粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、野生型アルファウイルス粒子に比べて低減したレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、そして野生型アルファウイルス粒子に比べて同じかまたはそれより高いレベルの、該ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡでコードされるタンパク質を有する、アルファウイルスベクター構築物。
（項目６）  真核生物系において翻訳され得るアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンであって、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子であって、項目１または２に記載の核酸分子を包含する、核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含む、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン。
（項目７）  真核生物系において翻訳され得るアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンであって、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで該アルファウイルスＲＮＡは、アルファウイルス粒子にパッケージングされ、そして該粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、哺乳動物細胞中で発現した後、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するのに必要とされる時間を野生型アルファウイルス粒子に比べて増大させる、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン。
（項目８）  真核生物系において翻訳され得るアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンであって、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスのウイルス接合領域プロモーター、アルファウイルスポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで該アルファウイルスＲＮＡは、アルファウイルス粒子にパッケージングされ、そして該粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、野生型アルファウイルス粒子に比べて低減したレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、そして野生型アルファウイルス粒子に比べて同じかまたはそれより高いレベルの、該ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡでコードされるタンパク質を有する、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン。
（項目９）  項目６、７または８のいずれか一項に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。（項目１０）  １つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、および項目６、７または８のいずれか一項に記載のＲＮＡベクターレプリコンを含む、組換えアルファウイルス粒子。
（項目１１）  前記アルファウイルス構造タンパク質および脂質エンベロープが異なるアルファウイルス種由来である、項目１０に記載の組換えアルファウイルス粒子。
（項目１２）  項目１０または１１に記載の組換えアルファウイルス粒子、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
（項目１３）  項目１０または１１に記載の組換えアルファウイルス粒子に感染した宿主細胞。
（項目１４）  ゲノムまたはＲＮＡベクターレプリコン核酸を実質的に含まない、トガウイルスキャプシド粒子。
（項目１５）  １つ以上のアルファウイルス糖タンパク質を含む脂質エンベロープをさらに含む、項目１４に記載のキャプシド粒子。
（項目１６）  さらにアルファウイルスエンベロープを含む、項目１４に記載のキャプシド粒子。
（項目１７）  前記キャプシドが、アルファウイルス、ルビウイルス、フラビウイルス、およびペスチウイルスからなる群から選択されるトガウイルス由来である、項目１４に記載のキャプシド粒子。
（項目１８）  項目１４から１７のいずれか一項に記載のキャプシド粒子、および薬学的に受容可能なキャリアおよび希釈剤を含む、薬学的組成物。
（項目１９）  アルファウイルス構造タンパク質発現カセットであって、ＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、１つ以上の機能的アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸分子、該発現カセットの転写に作動可能に連結される選択マーカー、および転写終結を制御する３’配列を含む、アルファウイルス構造タンパク質発現カセット。
（項目２０）  アルファウイルスパッケージング細胞株であって、項目１９に記載のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含む細胞を含む、アルファウイルスパッケージング細胞株。
（項目２１）  アルファウイルスプロデューサー細胞株であって、安定に形質転換されたアルファウイルス構造タンパク質発現カセット、ならびに、項目６から８のいずれか一項に記載のＲＮＡベクターレプリコン、項目３から５のいずれか一項に記載のアルファウイルスベクター構築物、および項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系からなる群から選択されるベクターを含む細胞を含む、アルファウイルスプロデューサー細胞株。
（項目２２）  真核生物層状ベクター開始系であって、インビボでｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの５’合成を開始し得る５’プロモーター、該５’プロモーターの後にアルファウイルスＲＮＡの転写を開始する配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子であって、項目１または２に記載の核酸分子を含む、核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含む、真核生物層状ベクター開始系。
（項目２３）  真核生物層状ベクター開始系であって、インビボでｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの５’合成を開始し得る５’プロモーター、該５’プロモーターの後にアルファウイルスＲＮＡの転写を開始する配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで該インビボで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子にパッケージングされ、そして該粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、哺乳動物細胞中で発現した後、宿主細胞支配の巨大分子合成の５０％阻害に達するのに必要とされる時間を野生型アルファウイルス粒子に比べて増大させる、真核生物層状ベクター開始系。
（項目２４）  真核生物層状ベクター開始系であって、インビボでｃＤＮＡからのアルファウイルスＲＮＡの５’合成を開始し得る５’プロモーター、該５’プロモーターの後にアルファウイルスＲＮＡの転写を開始する配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含み、ここで、該インビボで合成されるＲＮＡは、アルファウイルス粒子にパッケージングされ、そして該粒子が哺乳動物宿主細胞中に導入されると、野生型アルファウイルス粒子に比べて低減したレベルのベクター特異的ＲＮＡ合成を有し、そして野生型アルファウイルス粒子に比べて同じかまたはそれより高いレベルの、該ウイルス接合領域プロモーターから転写されるＲＮＡでコードされるタンパク質を有する、真核生物層状ベクター開始系。
（項目２５）  項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系を含む、宿主細胞。
（項目２６）  項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系、および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
（項目２７）  選択された異種配列を脊椎動物または昆虫に送達する方法であって、脊椎動物または昆虫に、項目３から５のいずれか一項に記載のアルファウイルスベクター構築物、項目６から８のいずれか一項に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、項目１０に記載の組換えアルファウイルス粒子、または項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系を投与する工程を包含する、方法。
（項目２８）  脊椎動物における免疫応答を刺激する方法であって、脊椎動物に、項目３から５のいずれか一項に記載のアルファウイルスベクター構築物、項目６から８のいずれか一項に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、項目１０に記載の組換えアルファウイルス粒子、または項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系を投与する工程を包含し、ここで該アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、粒子、または真核生物層状ベクター開始系が該脊椎動物における免疫応答を刺激する抗原を発現する、方法。
（項目２９）  脊椎動物における病原性因子を阻害する方法であって、脊椎動物に、項目３から５のいずれか一項に記載のアルファウイルスベクター構築物、項目６から８のいずれか一項に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、項目１０に記載の組換えアルファウイルス粒子、または項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系を投与する工程を包含し、ここで該アルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、粒子、または真核生物層状ベクター開始系が、病原性因子を阻害し得る緩和剤を発現する、方法。
（項目３０）  組換えアルファウイルス粒子を作製する方法であって：
（ａ）項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系、項目６から８のいずれか一項に記載のＲＮＡベクターレプリコン、および項目１０に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子からなる群から選択されるベクターを、項目２０に記載のパッケージング細胞の集団の中に、組換えアルファウイルス粒子の生成を可能とするに十分な条件下、かつ十分な時間にわたって導入する工程；および
（ｂ）組換えアルファウイルス粒子を採取する工程
を包含する、方法。
（項目３１）  選択されたタンパク質を作製する方法であって：
（ａ）選択された異種タンパク質をコードするベクターであって、かつ項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系、項目６から８のいずれか一項に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、および項目１０に記載の組換えアルファウイルスベクター粒子からなる群から選択されるベクターを、項目２０に記載のパッケージング細胞の集団の中に、該選択されたタンパク質の生成を可能とするに十分な条件下、かつ十分な時間にわたって導入する工程；および
（ｂ）該パッケージング細胞によって生成されたタンパク質を採取する工程
を包含する、方法。
（項目３２）  選択されたタンパク質を作製する方法であって、項目２２から２４のいずれか一項に記載の真核生物層状ベクター開始系を、宿主細胞中に、該選択されたタンパク質の発現を可能とするに十分な条件下、かつ十分な時間にわたって導入する工程を包含する、方法。
（項目３３）  項目６から８のいずれか一項に記載のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含む、宿主細胞株。
本発明のこれらのおよび他の局面および実施態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると明らかとなる。加えて、種々の参考文献が本明細書中に述べられ、これはより詳細に特定の手順または組成（例えば、プラスミド、配列など）を説明し、従って、個別に援用が言及されているかのように、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、シンドビスウイルスおよび一般的なアルファウイルスのゲノム構成および複製戦略の模式図である。
【図２】図２は、ＭＯＩが１０でＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ１−４、Ｔｏｔｏ１１０１、またはＳｉｎ−１／ｎｓＰ２ウイルスに感染したＢＨＫ細胞からのウイルスの放出のグラフである。細胞培養液を感染後３、６、９および１２時間で採取した。ウイルス力価をプラークアッセイによって決定した。
【図３】図３は、Ｔｏｔｏ１１０１、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ２、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ１−４、またはＳＩＮ−１ウイルスで感染した後のＢＨＫ細胞におけるウイルスＲＮＡ合成を示すグラフである。細胞を１０のＭＯＩで感染させ、そして感染後１時間で、アクチノマイシンＤおよび3Ｈウリジンを加えた。３、６、９、および１２ｈｐｉで、3Ｈウリジン取り込みの量を決定した。
【図４】図４は、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ１、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ２、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ３、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ３−４、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ４，ＳＩＮ−１／ｎｓＰ２−Ｃ、ＳＩＮ−１／ｎｓＰ２−Ｎ、Ｔｏｔｏ１１０１、ＳＩＮ−１、またはＳＩＮ−１／ｎｓＰ１−４に感染したＢＨＫ細胞におけるウイルスＲＮＡ合成を示すグラフである。3Ｈウリジン取り込みのレベルを野生型（Ｔｏｔｏ１１０１）感染に対して相対的に表す。
【図５】図５は、ＳＩＮ−ＩｎｓＰ１−４、ＳＩＮ−１、ＳＩＮ−１ｎｓＰ２、またはＴｏｔｏ１１０１ウイルスに感染したＢＨＫ細胞における宿主細胞タンパク質合成の遮断（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＳＩＮ−１ウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０１）。
【図７Ａ】図７Ａは、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＳＩＮＣＧウイルスの８０００塩基のｃＤＮＡ配列である（配列番号１０２）。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｄ】図８Ｄは、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｅ】図８Ｅは、Ｔｏｔｏ１１０１ウイルスのｃＤＮＡ配列である（配列番号１０３）。
【図８Ｆ】図８Ｆは、選択マーカーを用いての所望の表現型を発現するベクターの選択を示す模式図である。
【図８Ｇ】図８Ｇは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを発現する改変体シンドビスウイルスベクターまたはセムリキ森林ウイルスベクターで安定に形質転換されたＧ４１８耐性ＢＨＫ−２１細胞プールから単離されたＲＮＡのノーザンブロット分析である。
【図８Ｈ】図８Ｈは、改変体シンドビスウイルスベクターにおける所望の表現型の原因となる遺伝的決定因子の模式図である。
【図９Ａ】図９Ａは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされ、そして放射性標識されたウイルスＲＮＡプローブとハイブリダイズしたＢＨＫ−２１細胞から単離されたＲＮＡのノーザンブロット分析である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるアルカリホスファターゼ発現の７日間の時間経過を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるルシフェラーゼ発現の４日間の時間経過を示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされ、そして放射性標識されたウイルスＲＮＡプローブでハイブリダイズされたＢＨＫ−２１細胞から単離されたＲＮＡのノーザンブロット分析である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡのいずれかでトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞中のβ−ｇａｌ発現を検出するウェスタンブロット分析である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞におけるアルカリホスファターゼ発現の５日間の時間経過を示すグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＨＢＶ  ＰＲＥ配列有りまたは無しのＥＬＶＳ  β−ｇａｌベクターでトランスフェクトされたＨＴ１０８０およびＢＨＫ−２１細胞における、ＲＬＵ（相対光単位）で測定されたβ−ｇａｌ発現を示すグラフである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＨＢＶ  ＰＲＥ配列有りまたは無しのＥＬＶＳ  β−ｇａｌベクターでトランスフェクトされたＨＴ１０８０およびＢＨＫ−２１細胞における、ＲＬＵ（相対光単位）で測定されたβ−ｇａｌ発現を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＲＮＡ増幅、構造タンパク質発現、およびベクター誘導性アルファウイルスパッケージング細胞株によるベクターパッケージングの模式図である。
【図１４】図１４は、アルファウイルスパッケージング細胞株の生成で用いられるベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。
【図１５】図１５は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラーゼベクターパッケージング（発現の移入）を示すグラフである。
【図１６】図１６は、アルファウイルスベクター（ＥＬＶＳ−βｇａｌ）によるトランスフェクトおよびそれに続く発現の後にアルファウイルスパッケージング細胞株により、構造タンパク質の発現が誘導されるが、従来のプラスミドＤＮＡ発現ベクター（ｐＣＭＶ−βｇａｌ）では誘導されないことを示すウェスタンブロット分析である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚ構造タンパク質発現カセットを含むＣ６／３６蚊細胞によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏで安定に形質転換されたヒト２９３パッケージング細胞によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。
【図１８】図１８は、異なるアルファウイルスパッケージング細胞株によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。
【図１９】図１９は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺベクター粒子に感染したＢＨＫ細胞由来の3Ｈウリジン標識ＲＮＡを示すＲＮＡゲルのオートラジオグラフである。
【図２０】図２０は、アルファウイルスパッケージング細胞株から生成されたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺベクター粒子に感染したＢＨＫ細胞由来の35Ｓメチオニン標識タンパク質を示すタンパク質ゲルのオートラジオグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、構造タンパク質によるアルファウイルスベクターのパッケージングを示す模式図であり、ここでキャプシドタンパク質および糖タンパク質は別個の、すなわち、「分断」発現カセットから発現される。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、構造タンパク質発現カセットを示す模式図であり、ここでキャプシドタンパク質および糖タンパク質は分離しており、安定な分断構造遺伝子パッケージング細胞株を誘導するために用いられる。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、トランスフェクトおよびそれに続くアルファウイルス発現ベクター（ＥＬＶＳ−１．５ＰＥ［１．５ＰＥ］、またはＥＬＶＳ−βｇａｌ［βｇａｌ］）由来のアルファウイルス糖タンパク質またはβｇａｌの合成後の、いくつかのクローン細胞株によるアルファウイルスキャプシドタンパク質合成の誘導を示すウェスタンブロット分析である。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、アルファウイルス発現ベクター（ＥＬＶＳ−βｇａｌ）によるトランスフェクトおよびそれに続く発現の後の、いくつかのクローン細胞株によるアルファウイルスキャプシドタンパク質合成の誘導を示すウェスタンブロット分析である。
【図２２】図２２は、野生型または欠失変異ロス川ウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含む構造タンパク質発現カセットの領域の模式図である。
【図２３】図２３は、野生型または欠失変異ロス川ウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含むベクター誘導性構造タンパク質発現カセットの模式図である。
【図２４】図２４は、ロス川ウイルスキャプシドタンパク質遺伝子配列をシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の上流に含む「分断」構造タンパク質遺伝子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。
【図２５】図２５は、１つのカセット上でロス川ウイルスキャプシドタンパク質遺伝子配列をシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子の上流に含み、そして別個のカセット中にシンドビスウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を含む、「分断」構造タンパク質遺伝子発現カセットによるベクターパッケージングの模式図である。
【図２６Ａ】図２６Ａは、上記の「分断」構造タンパク質遺伝子発現カセットを用いるベクター粒子パッケージングの結果を示す表である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、図２１Ｂに示す分断構造タンパク質遺伝子発現カセットによる安定なトランスフェクトに由来する薬物耐性細胞プール由来の２５個のクローン細胞株のパッケージング活性を、ゲノム構造タンパク質遺伝子ＰＣＬ（９８７ｄｌｎｅｏ）に対して示す、２つのグラフである。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、アルファウイルスベクター（ＥＬＶＳ−βｇａｌ）によるトランスフェクトおよびそれに続く発現の後の３つの分断構造遺伝子アルファウイルスパッケージング細胞株によって構造タンパク質の発現が誘導されるが、従来のプラスミドＤＮＡ発現ベクター（ｐＣＩ−βｇａｌ）によっては誘導されないことを示すウェスタンブロット分析である。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、いくつかの分断構造遺伝子アルファウイルスパッケージング細胞株（クローン９ＴＤ、クローン２ＴＤ、クローン２４ＴＤ、クローン２０ＳＳ）におけるβ−ｇａｌタンパク質の増幅および生成を、ゲノム構造タンパク質遺伝子ＰＣＬ（９８７ゲノムＰＣＬ）に対して経時的に示すグラフである。
【図２７】図２７は、パッケージされたベクター粒子調製物の増幅および組換えタンパク質の大規模生成のための、アルファウイルスパッケージング細胞株の使用の模式図である。
【図２８】図２８は、アルファウイルスパッケージング細胞株を用いるβ−ｇａｌタンパク質の増幅および生成を経時的に示すグラフである。
【図２９】図２９は、インビボでのｃＤＮＡからのアルファウイルスベクターＲＮＡの発現の制御のためのテトラサイクリン調節プロモーター系の使用の模式図である。
【図３０】図３０は、インビボでのｃＤＮＡからのアルファウイルスベクターＲＮＡの発現を制御するための、連結された転写リプレッサーおよび転写インデューサー／アクチベーターで調節されるプロモーター系の使用の模式図である。
【図３１】図３１ＡおよびＢは、変性グリオキサールゲル上で電気泳動された［3Ｈ］ウリジン標識ＲＮＡのオートラジオグラフであり、このＲＮＡはＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコンおよびＤＨ構築物を含む種々のＲＲＶキャプシド由来のＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションされたＢＨＫ細胞から、およびエレクトロポレーションの１８時間後の培養液中に存在するベクター粒子から単離された。
【図３２】図３２ＡおよびＢは、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコンおよびＤＨ構築物を含む種々のＲＲＶキャプシド由来のＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションされたＢＨＫ細胞由来、およびエレクトロポレーションの１８時間後の培養液中に存在するベクター粒子由来の35Ｓメチオニン標識タンパク質のタンパク質ゲルオートラジオグラフである。
【図３３Ａ】図３３Ａは、野生型遺伝子（Ａ）から発現された種々のロス川ウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、欠失変異体ＣΔ１ｒｒｖ（Ｂ）から発現された種々のロス川ウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、欠失変異体ＣΔ２ｒｒｖ（Ｃ）から発現された種々のロス川ウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、欠失変異体ＣΔ３ｒｒｖ（Ｄ）から発現された種々のロス川ウイルス（ＲＲＶ）キャプシドタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロットである。
【図３４】図３４は、野生型遺伝子（配列番号１１４）、および３つの欠失変異体ＣΔ１ｒｒｖ（配列番号１１５）、ＣΔ２ｒｒｖ（配列番号１１６）、およびＣΔ３ｒｒｖ（配列番号１１７）から発現されるアミノ末端ＲＲＶキャプシドタンパク質を示す模式図である。ＲＲＶキャプシド遺伝子変異体中で欠失したリジン残基を示す。
【図３５】図３５は、高ＭＯＩでＴｏｔｏ１１０１野生型ウイルスに感染したＢＨＫ細胞中のウイルス粒子に取り込まれた［35Ｓ］メチオニンおよび［3Ｈ］ウリジンの相対レベルを示すグラフである。
【図３６】図３６は、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）Ｃｒｒｖ  ＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションされたＢＨＫ細胞中のウイルス粒子に取り込まれた［35Ｓ］メチオニンおよび［3Ｈ］ウリジンの相対レベルを示すグラフである。
【図３７】図３７は、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺおよびＲＲＶキャプシド欠失変異体ＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）ＣΔ３ｒｒｖ  ＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションされたＢＨＫ細胞中のウイルス粒子に取り込まれた［35Ｓ］メチオニンおよび［3Ｈ］ウリジンの相対レベルを示すグラフである。
【図３８】図３８は、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺおよびＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションされた、またはＴｏｔｏ１１０１野生型ウイルスに感染したＢＨＫ細胞中のウイルス粒子に取り込まれた［35Ｓ］メチオニンおよび［3Ｈ］ウリジンの相対レベルを示す、図３５〜３７に示す結果を集計したグラフである。
【図３９】図３９は、ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｈｙｇで安定に形質転換されたＢＨＫ細胞によるルシフェラーゼベクターパッケージングを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（用語の定義）
以下の用語は明細書全体を通じて用いられる。特に指示のない限り、これらの用語は以下のように定義される：
「ゲノムＲＮＡ」は、標的細胞内でインビボでそれ自体の増幅または自己複製を支配するために必要な遺伝情報のすべてを含むＲＮＡをいう。それ自体の複製を支配するために、ＲＮＡ分子は：１）１つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ、あるいはウイルスまたは宿主細胞由来のタンパク質、核酸、またはリボヌクレオタンパク質と相互作用してＲＮＡ増幅プロセスを触媒し得る他のタンパク質をコードし得る；そして２）複製に必要シスＲＮＡ配列を含み得、これは複製のプロセスの間、その自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来のタンパク質、核酸もしくはリボヌクレオタンパク質、またはこれらの成分のいずれかの間の複合体によって結合され得る。アルファウイルス由来のゲノムＲＮＡ分子は以下の順序づけられたエレメントを含むべきである：シスで複製に必要とされる５’ウイルスまたは干渉性欠損ＲＮＡ配列、発現されると生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、シスで複製に必要とされる３’ウイルス配列、およびポリアデニル化トラクト。アルファウイルス由来のゲノムＲＮＡベクターレプリコンはまた、ウイルスサブゲノム「接合領域」プロモーター（これは、特定の実施態様では、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を妨害、増大、または低減するために改変され得る）、および発現されたときに生物学的活性アルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列を含み得る。一般に、用語ゲノムＲＮＡは正の極性の分子、または「メッセージ」センスのことをいい、そしてゲノムＲＮＡは任意の既知の天然に存在するアルファウイルスの長さとは異なる長さであり得る。好適な実施態様では、ゲノムＲＮＡは任意のアルファウイルス構造タンパク質をコードする配列を含まない。むしろこれらの配列は異種配列で置換される。ゲノムＲＮＡが組換えアルファウイルス粒子中にパッケージングされる場合の例では、これは粒子の形成を導くアルファウイルス構造タンパク質との相互作用を開始するのに役立つ１つ以上の配列を含まなくてはならず、そして好ましくは、使用されるパッケージング系によって効率的にパッケージングされる長さである。
【００４６】
「サブゲノムＲＮＡ」、または「２６Ｓ」ＲＮＡは、それが由来するゲノムＲＮＡよりも短い長さまたは小さいサイズのＲＮＡ分子をいう。サブゲノムＲＮＡは内部プロモーターから転写されるべきであり、その配列はゲノムＲＮＡまたはその相補体中に存する。サブゲノムＲＮＡの転写は、ウイルスがコードするポリメラーゼ、宿主細胞がコードするポリメラーゼ、転写因子、リボヌクレオタンパク質、またはこれらの組み合わせによって媒介され得る。好適な実施態様においては、サブゲノムＲＮＡは本発明によるベクターから産生され、そして目的の遺伝子または配列をコードまたは発現する。サブゲノムＲＮＡは、沈降係数２６を必ずしも有する必要はない。
【００４７】
「アルファウイルスベクター構築物」は、目的の配列または遺伝子の発現を支配することができるアセンブリをいう。このようなベクター構築物は、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（背景において５’ＣＳＥとも称する）、ならびに発現したとき、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景において３’ＣＳＥとも称する）から構成される。加えて、ベクター構築物は、ウイルスサブゲノム「接合領域」プロモーター（これは特定の実施態様では、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を妨害、増大、または低減するために、改変され得る）、そしてまたポリアデニル化トラクトを含むべきである。ベクターはまた、その１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部由来の配列、生存ウイルスの産生を可能とするに十分なサイズの外来核酸分子、インビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、発現される異種配列、ならびに異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位を含み得る。
【００４８】
「アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン」、「ＲＮＡベクターレプリコン」および「レプリコン」は、標的細胞内で、インビボでそれ自体の増幅または自己複製を支配し得るＲＮＡ分子をいう。それ自体の増幅を支配するために、ＲＮＡ分子は：１）１つ以上のポリメラーゼ、レプリカーゼ、あるいはウイルスまたは宿主細胞由来のタンパク質、核酸、またはリボヌクレオタンパク質と相互作用して、ＲＮＡ増幅を触媒し得る他のタンパク質をコードし得る；そして２）複製に必要なシスＲＮＡ配列を含み得、これはその自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来のタンパク質、核酸もしくはリボヌクレオ核酸、またはこれらの成分のいずれかの間の複合体によって結合され得る。特定の実施態様では、増幅はまたインビトロで起こり得る。アルファウイルス由来のＲＮＡベクターレプリコン分子は以下の順序づけられたエレメントを含むべきである：シスで複製に必要とされる５’ウイルス配列（背景において５’ＣＳＥとも称される）、発現されると生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、シスで複製に必要とされる３’ウイルス配列（背景において３’ＣＳＥとも称される）、およびポリアデニル化トラクト。アルファウイルス由来のＲＮＡベクターレプリコンはまた、ウイルスサブゲノム「接合領域」プロモーター（これは、特定の実施態様では、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を妨害、増大、または低減するために改変され得る）、１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部由来の配列、生存ウイルスの産生を可能とするに十分なサイズの外来核酸分子、ならびに発現される異種配列を含み得る。細胞中のＲＮＡベクターレプリコンの供給源は、ウイルスまたは組換えアルファウイルス粒子での感染由来であり得、あるいはプラスミドＤＮＡはまたインビトロで転写されるＲＮＡのトランスフェクション由来であり得る。
【００４９】
「組換えアルファウイルス粒子」はアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含むビリオン単位をいう。一般に、組換えアルファウイルス粒子は１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、およびＲＮＡベクターレプリコンを含む。好ましくは、組換えアルファウイルス粒子はヌクレオキャプシド構造を含み、これは宿主細胞由来の脂質二重層、例えば原形質膜の中に入っており、ここにアルファウイルスがコードするエンベロープ糖タンパク質が包埋される。粒子はまた、アルファウイルスが由来する粒子の向性を支配する他の成分（例えば、ビオチンのような標的化エレメント、他のウイルス構造タンパク質、または他のレセプター結合リガンド）、あるいは他のＲＮＡ分子を含み得る。
【００５０】
「構造タンパク質発現カセット」は、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質の合成を支配し得る核酸分子をいう。発現カセットは、インビボでｃＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、ならびに発現されると１つ以上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列、および転写終止を制御する３’配列を含むべきである。発現カセットはまた、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（背景において５’ＣＳＥとも称する）、ウイルスサブゲノム「接合領域」プロモーター、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景において３’ＣＳＥとも称する）を含み得る。特定の実施態様において、発現カセットはまた、スプライス認識配列、触媒的リボザイムプロセシング配列、選択マーカーをコードする配列、核外搬出シグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。加えて、アルファウイルス構造タンパク質の発現は、特定の実施態様において、誘導性プロモーターの使用によって調節され得る。
【００５１】
「安定な形質転換」は、核酸分子を生存細胞に導入し、そしてこの核酸分子を生殖細胞中で細胞分割の連続的なサイクルを通じて長期間または永続的に維持することを意味する。核酸分子は、任意の細胞コンパートメント（核、ミトコンドリア、または細胞質を包含するがこれらに限定されない）中で維持され得る。好適な実施態様においては、核酸分子は核の中に維持され得る。維持はエピソーム事象のように、染色体内（組み込み）あるいは染色体外であり得る。
【００５２】
「アルファウイルスパッケージング細胞株」は、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含み、かつアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物層状ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子を導入した後、組換えアルファウイルス粒子を産生する細胞をいう。親細胞は哺乳動物または非哺乳動物起源であり得る。好適な実施態様では、パッケージング細胞株は構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換される。
【００５３】
「アルファウイルスプロデューサー細胞株」は、組換えアルファウイルス粒子を産生し得る細胞株を意味し、アルファウイルスパッケージング細胞株を含み、これはまたアルファウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物層状ベクター開始系、または組換えアルファウイルス粒子を含む。好ましくは、アルファウイルスベクター構築物は真核生物層状ベクター開始系であり、そしてプロデューサー細胞株はベクター構築物で安定に形質転換される。好適な実施態様では、アルファウイルスベクター構築物の転写およびそれに続く組換えアルファウイルス粒子の産生は、アルファウイルスプロデューサー細胞株の１つ以上の因子、または分化状態への応答においてのみ生じる。
【００５４】
「欠損ヘルパー構築物」は、ＲＮＡ増幅または複製、ならびにトランスで供給される生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質に応答して１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質の発現が可能であるアセンブリをいう。欠損ヘルパー構築物は以下の順序づけられたエレメントを含むべきである：シスで複製に必要とされる５’ウイルスまたは干渉性欠損ＲＮＡ配列、ウイルスサブゲノム接合領域プロモーター、発現されると１つ以上の生物学的に活性なアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列、シスで複製のために必要とされる３’ウイルス配列、およびポリアデニル化トラクト。欠損ヘルパー構築物はまた、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、転写終止を制御する３’配列、スプライス認識配列、触媒的リボザイムプロセシング配列、選択マーカーをコードする配列、および核外搬出シグナルを含み得る。
【００５５】
「真核生物層状ベクター開始系」は、目的の配列または遺伝子の発現を支配し得るアセンブリをいう。真核生物層状ベクター開始系は、インビボ（すなわち細胞内）でｃＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および真核生物細胞中でそれ自体の複製を支配し得、かつまた異種配列を発現し得る核酸ベクター配列を含むべきである。それ自体の増幅を支配し得る核酸配列はウイルスまたは非ウイルス起源であり得る。特定の実施態様では、核酸ベクター配列はアルファウイルス由来の配列であり、そしてアルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（背景において５’ＣＳＥとも称される）、ならびに発現されると生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景において３’ＣＳＥとも称される）から構成される。加えて、ベクター配列はウイルスサブゲノム「接合領域」プロモーター（これは特定の実施態様では、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を妨害、増強、または低減するために改変され得る）、１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部由来の配列、至適な増幅を可能とするに十分なサイズの外来核酸分子、発現される異種配列、異種配列の挿入のための１つ以上の認識部位、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。真核生物層状ベクター開始系はまた、スプライス認識配列、触媒的リボザイムプロセシング配列、核外搬出シグナル、および転写終止配列を含み得る。特定の実施態様では、ｃＤＮＡからのベクター核酸配列のインビボ合成は、誘導性プロモーターの使用によって調節され得る。
【００５６】
「アルファウイルスｃＤＮＡベクター構築物」は、目的の配列または遺伝子の発現を支配し得るアセンブリをいう。このベクター構築物は、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（５’ＣＳＥとも称される）、ならびに発現されると、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（背景において３’ＣＳＥと称される）から構成される。加えて、ベクター構築物は、インビボでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、および転写終止を制御する３’配列を含むべきである。特定の実施態様では、ベクター構築物はさらに、ウイルスサブゲノム「接合領域」プロモーターを含み得、これは、特定の実施態様では、サブゲノムフラグメントのウイルス転写の妨害、増強、または低減のために改変され得る。ベクターはまた、１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部由来の配列、外来核酸分子（これは生存ウイルスの生産を可能にするに十分なサイズである）、発現される異種配列、異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位、スプライス認識配列、触媒的リボザイムプロセシング配列、核酸エクスポートシグナル、ならびにポリアデニル化配列を含み得る。特定の実施態様では、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡのインビボ合成は誘導性プロモーターの使用によって調節され得る。
【００５７】
「遺伝子送達ビヒクル」は、遺伝子または目的の配列を送達するために使用され得る構築物をいう。代表例は、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物層状ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子を包含する。
【００５８】
本発明の多数の局面および利点は、本発明の実施を明らかにする以下の詳細な説明を考慮すれば当業者には明らかである。
【００５９】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は新規な遺伝子送達ビヒクルを提供し、これには例えば、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物層状ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子が含まれる。簡単に述べると、本発明のプラスミドＤＮＡ−、インビトロ転写されたＲＮＡ−、または粒子ベースのベクターを細胞に導入すると、野生型由来のアルファウイルスベクターの発現レベルと比べて、等価な、あるいは高いレベルの異種遺伝子発現がもたらされる。しかし予期し得ぬことに、合成されるベクター特異的ＲＮＡのレベルは本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む培養細胞において、野生型由来のベクターと比べて少なくとも約５倍から１０倍低い。さらに、このような遺伝子送達ビヒクルは、宿主細胞に導入した後、野生型由来のベクターと比べて、宿主細胞支配の巨大分子合成の阻害の低減、遅延、または非阻害を示す。
【００６０】
以下より詳細に論じるように、本発明は：（Ａ）本発明の遺伝子送達ビヒクルを構築するのに適した野生型アルファウイルスの供給源；（Ｂ）所望の表現型を有するアルファウイルスの選択方法；（Ｃ）アルファウイルスベクター構築物およびアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンの構築；（Ｄ）真核生物層状ベクター開始系の構築；（Ｅ）組換えアルファウイルスの構築；（Ｆ）本発明の遺伝子送達ビヒクルで発現され得る異種配列；（Ｇ）アルファウイルスパッケージングまたはプロデューサー細胞株の構築；（Ｈ）薬学的組成物；および（Ｉ）アルファウイルスベースのベクターを利用する方法、を提供する。
【００６１】
（Ａ．野生型アルファウイルスの供給源）
上記のように、本発明は多様なアルファウイルスベースのベクター（例えば、ＲＮＡベクターレプリコン、アルファウイルスベクター構築物、真核生物層状ベクター開始系、および組換えアルファウイルス粒子）、ならびにこのようなベクター構築物および粒子を利用する方法を提供する。簡単に述べると、上記のベクターの調製において使用するのに適した野生型アルファウイルスをコードする配列は、本明細書中で提供される開示があれば、天然に存在する供給源から、あるいは寄託（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から容易に得られ得る。加えて、野生型アルファウイルスは、野生型アルファウイルスに感染した細胞における宿主細胞支配の巨大分子合成のレベルを、本発明の遺伝子送達ビヒクルを含む細胞における宿主細胞支配の巨大分子合成のレベルと比較するために使用され得る。
【００６２】
適切なアルファウイルスの代表例は、アウラウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、Ｂｅｂａｒｕウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングンヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲＮ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、Ｍａｙａｒｏウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミデルブルグウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、Ｍｕｃａｍｂｏウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、Ｎｄｕｍｕウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、Ｐｉｘｕｎａウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロス川ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ
ＶＲ−１２４８；ＣＭＣＣ＃４６４０、後述もまた参照のこと）、Ｔｏｎａｔｅウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、Ｔｒｉｎｉｔｉウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、Ｕｎａウイルス（ＡＴＣＣ
ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ
ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ１２５２）、Ｗｈａｔａｒｏａウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）を包含する。
【００６３】
細胞巨大分子合成のレベルを比較する目的で、以下のプラスミドもまた野生型アルファウイルスストックの標準源として使用され得る。これらのプラスミドは以下が含まれる：セムリキ森林ウイルスには、ｐＳＰ６−ＳＦＶ４（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６５：４１０７−４１１３，１９９１）；ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスには、ｐＶ２０００（Ｄａｖｉｓら、Ｖｉｒ．１８３：２０−３１，１９９１）；ロス川ウイルスには、ｐＲＲ６４（Ｋｕｈｎら、Ｖｉｒ．１８２：４３０−４４１，１９９１）。簡単に述べると、これらのプラスミドについては、ウイルスはプラスミド由来のインビトロで転写されたゲノムＲＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞から得られ得る。シンドビスウイルスについては、感染性ウイルスはｐＶＧＥＬ  ＶＩＳ（ＡＴＣＣ番号７５８９１）プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされたＢＨＫ細胞から直接単離され得、あるいは野生型ウイルスストックとして得られ得る（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２５２６に関して以下提供される寄託情報参照のこと）。
【００６４】
（Ｂ．所望の表現型を有するアルファウイルスの選択）
アルファウイルスベースのベクターからのインビボでの異種遺伝子発現の持続は、宿主細胞支配の巨大分子合成の阻害を含むいくつかの機構によって影響を受ける。しかし、本発明以前には、非細胞変性表現型をもたらすコーディングまたは非コーディングベクターウイルス特異的配列変化を選択あるいは同定するための明らかな方法は無かった。従って、本発明の１つの局面では、宿主細胞支配の巨大分子合成の阻害が低減された、または非阻害のアルファウイルス由来の遺伝子送達ビヒクルを単離および／または構築するための方法が提供される。
【００６５】
（１．ウイルス改変体の生物学的選択）
（ａ．ＤＩ粒子を含むウイルスストックからの選択）
非細胞変性性アルファウイルス改変体を単離するための１つのアプローチは、野生型ウイルス調製物中の干渉性欠損（ＤＩ）粒子の存在を利用する。簡単に述べると、特定のＲＮＡウイルス、例えばラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）およびアルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス）は高度に細胞変性性であるが、それにもかかわらずこれらはＤＩ粒子の存在下で培養細胞中で長期間の永続的感染を確立し得る。ＤＩ粒子は定義上、野生型ウイルス由来であり、そして野生型ゲノムと比べて１つ以上の変異（例えば、欠失、再配列、ヌクレオチド置換など）を含み、これはＤＩによる自律的複製を妨げる。一般に、ＤＩ粒子のゲノムは野生型ウイルスに比べてより小さく、かつ複雑性が低く、そしてタンパク質コード領域が欠失しているが、シスで複製に必要とされる領域は維持されている。このようなシス配列はしばしば重複および／または再配列される。特定のアルファウイルス（例えばシンドビスウイルス）の場合、ＤＩ  ＲＮＡゲノムの配列および構成は分析されており、野生型ウイルスゲノムの先端３’末端から最小で５０ｎｔを含み、そしてその５’末端に、野生型配列または細胞ｔＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡAsp）配列のいずれかを、ウイルス配列に加えて含むことが見いだ
されている。すべての場合において、変異したＤＩゲノムの増殖および維持には感染細胞中に親ヘルパーウイルスが共に存在することが必要とされる。しかし、これらの遺伝子構造の結果として、ＤＩゲノム複製は、その野生型対応物に比べて非常に優勢であり、かつ比較的豊富である。この特徴は、野生型ゲノム複製の妨害、感染性ウイルスの非存在または低レベルの産生、および長期の永続的な細胞の感染の樹立をもたらす。
【００６６】
従って、以下実施例１および２に記載されるように、許容細胞（例えば、ヒト起源の細胞を含む哺乳類細胞）における長期の永続的感染をＤＩ粒子の集団を含む混合アルファウイルスストックによる感染によって樹立する能力は、長期にわたって、ＤＩ粒子の非存在下でさえ永続的な感染を樹立し得る完全にインタクトなウイルス改変体を単離する機構を提供する。このような感染性ウイルス改変体は長期の永続的に感染した培養から、複数回のプラーク精製によって単離され得、そして宿主細胞において多産性、永続的、かつ非細胞変性性の感染を開始させることが見いだされている。さらに、このような多産性、永続的、かつ非細胞変性性感染から生産される変異ウイルスのレベルは、野生型ウイルス感染由来のものと区別できない。この観察は、ＤＩ粒子の混合物を含むウイルスストックによる永続的な感染の樹立のための、今までの必要条件とは明らかに対照的である。
【００６７】
（ｂ．ＤＩ粒子を含まないウイルスストックからの選択）
干渉性欠損粒子を含むウイルスストックからの選択に加えて、本発明での使用に適したウイルス改変体は精製されたウイルスストック（ＤＩ粒子無し）から得れられ得、これは感受性の培養細胞の感染の前にランダムに変異誘発に供されているか、あるいは培養細胞によるＲＮＡ複製の間に非特異的な変異を発生させられているかのいずれかである。簡単に述べると、初期のウイルスストックは、天然単離体またはそれに由来する生物学的改変体として得られ得、あるいはゲノムｃＤＮＡクローンまたはインビトロで転写されたＲＮＡを含む感染性核酸分子によってトランスフェクトした培養細胞によって生成され得る。所望であれば、ウイルスストックは次に物理的または化学的変異誘発に供され得る（好適ではあるが、このような変異誘発は必ずしも必要ではない）。化学的変異誘発の場合、好適な実施態様は容易に入手可能な変異誘発性物質、例えば、亜硝酸、５−アザシチジン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、またはエチルメタンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をウイルス感染の前に使用する。ランダム変異誘発の後、実施例２でより詳細に後述するように、特異的選択手順を適用して所望の表現型をプロセシングするウイルス改変体を単離する。
【００６８】
（２．ウイルス改変体の遺伝子選択）
関連のアプローチにおいて、変異誘発はウイルスストックを用いず、むしろクローン化されたウイルスのゲノムｃＤＮＡを用いて得ることができ、これを用いて次に感染性ウイルスＲＮＡをインビトロ（例えば、シンドビスウイルス（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３８０９−３８１９，１９８７；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，ｌ９９６）、ＳＦＶ（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４１０７−４１１３，１９９１，ＶＥＥ（Ｄａｖｉｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８３：２０−３１，１９９１），ロス川ウイルス（Ｋｕｈｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２：４３０−４４１，ｌ９９１），ポリオウイルス（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｗｅｒｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２３３０−２３３４，１９８６））またはインビボ（シンドビスウイルス（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同箇所）、ポリオウイルス（ＲａｃａｎｉｅｌｌｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１４：９１６−９１９，１９８ｌ））で転写し得る。簡単に述べると、感染性核酸を感受性培養細胞（例えば、ヒト起源の細胞を含む哺乳類細胞）に直接、または上記の方法のうちの１つを用いて行う変異誘発の後のに、いずれかで導入する。あるいは、ベクター核酸を最初に粒子中にパッケージングし、そしてこの粒子を用いてベクターを選択のための標的細胞集団に送達し得る。次に所望の表現型をプロセシングするウイルス改変体の単離のための特異的選択手順を適用し、そしてこれは以下に記載する。
【００６９】
特定の実施態様では、ランダム変異誘発は、最初にウイルスｃＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｒｅｄ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中に含むプラスミドを増殖することによって行われ得、これはｍｕｔＳ、ｍｕｔＤ、およびｍｕｔＴ変異の結果、３つの一次ＤＮＡ修復経路に欠損がある。しかし、他の変異誘発手順には、リンカー−スキャニング変異誘発（Ｈａｌｔｉｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：１０１５，１９８５；Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４２０２，１９８５）、ランダムオリゴヌクレオチド支配の変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：１６６，１９８７；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９，１９８７；Ｈｉｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：５５８，１９８７；Ｈｅｒｍｅｓら、Ｇｅｎｅ  ８４：１４３，１９８９）およびＰＣＲ変異誘発（ＨｅｒｌｉｔｚｅおよびＫｏｅｎｅｎ，Ｇｅｎｅ  ９１：１４３，１９９０）が含まれるがこれらに限定されず、これらは公開されたプロトコルを使用して容易に置き換えられ得る。得られる変異したｃＤＮＡクローンの混合集団を感受性培養細胞に直接、あるいはインビトロでの転写の後に導入する。所望の表現型の変異ウイルスを含むトランスフェクト細胞の富化は、以下記載するように、野生型ウイルス感染細胞以上に増大された生存時間に基づいて達成される。
【００７０】
（３．ウイルス由来のベクターを用いた改変体の遺伝子選択）
他のアプローチにおいて、変異はウイルス由来の発現ベクター中の任意の領域（調節、非翻訳領域、またはタンパク質コード遺伝子領域を含む）で生成され得る。例えば、本方法の１つの局面では、宿主細胞支配の巨大分子合成の阻害の低減または非阻害を示すウイルス改変体を選択するための方法が提供され、この方法は：（ａ）細胞中に、免疫原性細胞表面タンパク質（ベクター含有細胞の検出に適する）あるいは選択マーカー（薬物または非薬物マーカーのいずれかであって、ここで非ベクター含有細胞は、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ｇｐｔ、ピューロマイシン、またはヒスチジノールのような薬物を添加すると死滅する）の発現を支配する、真核生物層状ベクター開始系、ＲＮＡベクターレプリコン、または組換えアルファウイルス粒子を導入する工程；（ｂ）細胞を所望の表現型を示すベクター含有細胞を選択するに十分な条件下、および十分な時間、インキュベートまたは培養する工程；次に、（ｃ）所望の表現型のベクターを含む細胞を単離する工程、および（ｄ）ベクターを原因の変異について分析する工程を包含する。
【００７１】
上記のように、本発明のウイルスベクターは広範な種々のウイルス由来であり得る（例えば、シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｎｅｃｅ  ２４３：１１８８−１１９１、１９８９；Ｈａｈｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９−２６８３、１９９２；Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：１８−２２，１９９３；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同箇所）、セムリキ森林ウイルス（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１９Ａ：３１０，１９９５）、ポリオウイルス（Ｃｈｏｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２８７５−２８８３，１９９１；Ａｎｓａｒｄｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６３５９−６３６４，１９９４；およびＡｎｄｉｎｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１４４８−１４５１，１９９４）。上記方法の代表例は以下の実施例２でより詳細に論述される。
【００７２】
（４．ウイルス改変体の使用）
本明細書でより詳細に論じられるように、本明細書で提供される方法を使用して選択または生成されたウイルス改変体は、所望の表現型を示す広範囲の組換え遺伝子送達ビヒクルを構築するために使用され得る。特定の実施態様では、遺伝子送達ビヒクルはｎｓＰ２遺伝子のＬｅｕ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（「ＬＸＰＧＧ」）モチーフ内に変異を含む。簡単に述べると、ｎｓＰ２遺伝子の公開された配列が入手可能なアルファウイルスでは、高度に保存されたアミノ酸モチーフ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（「ＬＸＰＧＧ」）が観察される。標準的なタンパク質モデル化アルゴリズム（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍ．４７：４５−１４８，１９７８）で予測されるように、このモチーフの残基はおそらく構造中にβターンを含む。シンドビスウイルスのｎｓＰ２のプロリン７２６がこのモチーフの中心残基である。他のアルファウイルスにおける対応のモチーフを以下の表に示す。
【００７３】
【表１】
2013090630.tif 000002
それゆえ、本発明の種々の実施態様において遺伝子送達ビヒクルが提供され、この遺伝子送達ビヒクルはＬＸＰＧＧモチーフ中に変異を有するｎｓＰ２遺伝子を含む。他の実施態様において、Ｌｅｕコドンが、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌまたは他の希少なあるいは非タンパク質アミノ酸からなる群から選択される別のアミノ酸に変異される（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．Ｎ．Ｙ．，１９７５参照のこと）。他の実施態様では、ＰｒｏコドンがＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｘ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ｌｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、または他の希少な、あるいは非タンパク質アミノ酸からなる群から選択される別のアミノ酸に変異される。他の実施態様では、Ｇｌｙコドンのいずれかまたは両方が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｘ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｘ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、または他の希少な、または非タンパク質アミノ酸からなる群から選択される別のアミノ酸に変異され得る。さらに他の実施態様では、Ｘａａアミノ酸、またはＬＸＰＧＧモチーフの１から３残基上流または下流のアミノ酸が、得られる遺伝子送達ビヒクルの表現型に影響を及ぼすために野生型アミノ酸から変異され得る。本発明の特定の実施態様では、ＬＸＰＧＧモチーフは１つより多いのコドンの変更、あるいは１つ以上のコドンの挿入または欠失を含むように変異され得る。
【００７４】
（Ｃ．アルファウイルスベクター構築物およびアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン）
上記のように、本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡ構築物を提供し、これらはアルファウイルス由来である。簡単に述べると、本発明の１つの局面では、アルファウイルスベクター構築物が提供され、これは、インビトロでｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記のような単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含む。他の局面では、ＲＮＡベクターレプリコンが提供され、これは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始する５’配列、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸分子（上記の単離された核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および３’ポリアデニル化トラクトを含む。上記の好適な実施態様では、上記の構築物はさらにウイルス接合領域を含む。これらの局面の各々は以下、より詳細に論じる。
【００７５】
（１．ウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター）
上記のように、本発明の特定の実施態様では、アルファウイルスベクター構築物が提供され、これは、インビトロ転写のプロセスによるｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーター（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む。好適な実施態様では、このようなプロモーターは、例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる。同様に、真核生物層状ベクター開始系が提供され（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）、これはインビボ（すなわち細胞内）でｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始する５’プロモーターを含む。特定の実施態様では、このようなＲＮＡポリメラーゼプロモーターは（アルファウイルスベクター構築物または真核生物層状ベクター開始系のいずれかについて）原核および真核生物生物由来の両方であり得、そして例えば、細菌β−ガラクトシドおよびｔｒｐＥプロモーター、および真核生物ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、即時初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターを含む。
【００７６】
（２．転写を開始する配列）
上記のように、好適な実施態様では、本発明のアルファウイルスベクター構築物およびＲＮＡベクターレプリコンは、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（５’−末端ＣＳＥ、または５’シス複製配列とも称する）を含む。このような配列の代表例は、ヌクレオチド１−６０を含み、そしてもっと少ない程度で、野生型シンドビスウイルスの塩基１５０−２１０にわたるヌクレオチド、ｔＲＮＡASPに対するヌクレオチド１０
−７５（アスパラギン酸、Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、米国特許第５，０９１，３０９号）、および転写を開始する他のアルファウイルス由来の５’配列を含む。これはこれらの配列の相補体であり、これはマイナス鎖ゲノムコピーの３’末端（これはｎｓＰレプリカーゼ複合体によって結合される）、およびおそらく、さらなる宿主細胞因子に対応し、ここからポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの転写が開始される。
【００７７】
（３．アルファウイルス非構造タンパク質）
本明細書で提供されるアルファウイルスベクター構築物およびＲＮＡベクターレプリコンはまた、４つすべてのアルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列を必要とし、これは上記の所望の表現型を提供する配列を含む。簡単に述べると、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする多様な配列が、本明細書で明示的に提供されている配列に加えて、本発明で使用され得、従って、句「アルファウイルス非構造タンパク質」の範囲に入るものと考えられる。例えば、遺伝子コードの縮重のせいで、１つより多くのコドンが所定のアミノ酸をコードし得る。従って、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする多様な核酸配列が生成され得る。さらに、任意の多数の位置でアミノ酸が置換、付加、または欠失してもなお、機能的または生物学的に活性な非構造タンパク質が提供され得る。本発明の文脈内で、アルファウイルス非構造タンパク質は、ベクター構築物の自己複製（すなわち、ウイルス核酸の複製であり、感染性ウイルスの産生を必ずしも必要としない）を促進するならば生物学的に活性であると考えられ、そして時間の経過にわたって行われる代謝標識またはＲＮａｓｅ保護アッセイによって容易に決定され得る。このような誘導体の作製方法は、本明細書で提供される開示があれば、当業者によって容易に達成される。
【００７８】
アルファウイルスは、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４と名付けられる４つの非構造タンパク質を発現する。アルファウイルス由来の本発明のベクターは４つの非構造タンパク質をコードする配列を含むべきである。野生型シンドビスウイルスでは、非構造タンパク質１−３はヌクレオチド６０から５７４７によってコードされ、他方、ｎｓＰ４はヌクレオチド５７６９から７５９８によってコードされる（図１を参照のこと）。非構造タンパク質は、ゲノムポジティブ鎖ＲＮＡから２つの大きなポリプロテイン（各々Ｐ１２３またはＰ１２３４として知られる）のうちの１つとして、（ｉ）コーディング領域ｎｓＰ３とｎｓＰ４の間にオパール終止コドンが存在するかどうか、あるいは（ｉｉ）そのようなオパール終止コドンが存在する場合、発生期のポリペプチドの翻訳がこの点で終止するか、あるいはリードスルーされ、それゆえＰ１２３４が産生するかどうかに応じて、翻訳される。オパール終止コドンは、アルファウイルスＳＩＮ（ＡＲ３３９株、および本明細書に記載されるＳＩＮ−１株）、ＡＵＲＡ、ＷＥＥ、ＥＥＥ、ＶＥＥ、およびＲＲのｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合に存在し、そのためＰ１２３およびＰ１２３４種はこれらのウイルスで感染した細胞で発現される。対照的に、アルファウイルスＳＩＮ（ＡＲ８６、ＳＦ、およびＯＮＮ株）のｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合には終止コドンは存在せず、そのためこれらのウイルスで感染した細胞ではＰ１２３４種が発現される。ポリプロテインおよびプロセスされたモノマー形態の非構造タンパク質の両方が、アルファウイルスＲＮＡゲノムの複製において機能する。アルファウイルス非構造タンパク質切断改変体の増殖特性を検査する実験は、ポリプロテインがゲノムネガティブ鎖ＲＮＡの合成に関与し、他方、個々のモノマータンパク質がゲノムおよびサブゲノムポジティブ鎖ＲＮＡ種の合成を触媒することを示唆している（ＳｈｉｒａｋｏおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１８７４−１８８５，１９９４）。翻訳のリードスルーは通常、オパール終止コドンをｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合に含む野生型シンドビスウイルスで感染した細胞において、約１０％〜２０％の機会で生じる。Ｐ１２３およびＰ１２３４のプロセシングは、非構造タンパク質の１つによってコードされるプロテイナーゼ活性により、以下さらに論じられる。プロセシングの順序は、シスでもトランスでも、感染の段階を含む種々の因子に依存する。例えば、シンドビスウイルスおよびＳＦＶは感染の初期にはＰ１２３とｎｓＰ４を産生し、そして感染の後期にはＰ１２とＰ３４を産生する。次にさらなるプロセシングにより個別の非構造タンパク質が遊離する。各非構造タンパク質はいくつかの機能を有し、そのいくつかを以下記載する。
【００７９】
（ａ．ｎｓＰ１）
非構造タンパク質１はマイナス鎖ＲＮＡ合成の開始（または持続）のために必要とされる。これはまた、転写の際のゲノムおよびサブゲノムアルファウイルスＲＮＡの５’末端のキャッピングにおいて役割を果たす。なぜならｎｓＰ１は、メチルトランスフェラーゼ（ＭｉおよびＳｔｏｌｌａｒ，Ｖｉｒ．１８４：４２３−４２７，１９９１）およびグアニルトランスフェラーゼ活性（ＳｔｒａｕｓｓおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８（３）：４９１−５６２，１９９４）の両方を有するからである。ｎｓＰ１はまたｎｓＰ２のプロテイナーゼ活性を調節する。なぜなら、ｎｓＰ１を含むポリプロテインはｎｓＰ２とｎｓＰ３の間の開裂の効率が悪いからである（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２６３１−２６３８，１９９０）。
【００８０】
（ｂ．ｎｓＰ２）
非構造タンパク質２は多機能タンパク質であり、ウイルスＲＮＡの複製および非構造ポリプロテインのプロセシングに関与する。タンパク質のＮ−末端ドメイン（最初の約４６０アミノ酸にわたる）はヘリカーゼであると考えられており、これはＲＮＡ複製および転写の際の二重鎖の巻き戻しにおいて活性である。２６ＳサブゲノムｍＲＮＡは本発明によるベクター中で目的の遺伝子をコードし、その合成は機能性ｎｓＰ２を必要とする。ｎｓＰ２のＣ−末端ドメインはシンドビスウイルスのアミノ酸残基４６０−８０７の間であり、これはトランスおよびシスで非構造ポリプロテインをｎｓＰ１／ｎｓＰ２、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３、およびｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合の間でタンパク質加水分解で切断する。アルファウイルスｎｓＰ２のＣ末端ドメインの一次配列の整列は、ｎｓＰ２がパパイン様プロテイナーゼであることを示唆する（ＨａｒｄｙおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６３：４６５３−４６６４，１９８８）。
【００８１】
ｎｓＰ２の観察される他の特徴はまだ、アルファウイルスの増殖に直接関連する機能に帰属されていない。例えば、ｎｓＰ２はＳＦＶ感染細胞中のリボソームに密接に会合し、そしてＵＶ照射によってrＲＮＡに架橋し得ることが示されている（Ｒａｎｋｉら、ＦＥ
ＢＳ  Ｌｅｔｔ．１０８：２９９−３０２，１９７９）。さらに、ｎｓＰ２の５０％は核マトリックス中、特にＳＦＶ感染ＢＨＫ細胞核小体の領域に位置する（Ｐｅｒａｎｅｎら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６４：１８８８−１８９６，１９９０）。ｎｓＰ２の核への局在化はおそらく活性な輸送によって進行する。なぜなら、サイズが小さいタンパク質および代謝物（約２０−６０ｋＤ）が多いからである。これらは核のコア複合体を通しての拡散によって核中に侵入し得る（Ｐａｉｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５４：１０９−１１４，１９７５）。推定ＮＬＳ配列はアルファウイルスＳＦＶ、ＳＩＮ、ＲＲ、ＯＮＮ、ＯＣＫ、およびＶＥＥ中で同定されている（Ｒｉｋｋｏｎｅｎら、Ｖｉｒ．１８９：４６２−４７３，１９９２）。
【００８２】
（ｃ．ｎｓＰ３）
非構造タンパク質ｎｓＰ３は２つの区別されるドメインを含むが、ウイルス複製におけるこれらの正確な役割は詳しく理解されていない。Ｎ末端ドメインは異なるアルファウイルスにおいて３２２から３２９残基の長さにわたる範囲であり、２つのアルファウイルス間で最小で５１％のアミノ酸配列同一性を示す。しかし、Ｃ末端ドメインは既知のアルファウイルス間で、長さまたは配列が保存されておらず、複数の変化が許容される（Ｌｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７９：４１６−４２７）。このタンパク質は多量にホスホリル化された状態で複製複合体と会合することが見いだされる。ｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合の間にオパール終止コドンを含むゲノムのアルファウイルスにおいては、２つの異なるタンパク質が、オパール終止シグナルのリードスルーが存在するか否かに応じて産生される。リードスルーの結果、ポリプロテインの切断の後に７つの追加カルボキシ末端アミノ酸を含むｎｓＰ３タンパク質が得られる。ｎｓＰ３はウイルスＲＮＡ合成のいくつかの能力に必要とされることが明白である。なぜならこのタンパク質の特定の改変体はＲＮＡネガティブであり、そしてＰ１２３ポリプロテインがマイナス鎖ＲＮＡ合成に必要とされるからである。
【００８３】
（ｄ．ｎｓＰ４）
ｎｓＰ４はウイルスがコードするＲＮＡポリメラーゼであり、そしてこのような酵素に特徴的なＧＤＤモチーフを含む（ＫａｍｅｒおよびＡｒｇｏｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７２６９−７２８２，１９８４）。それゆえ、ｎｓＰ４はアルファウイルスＲＮＡ複製に不可欠である。ｎｓＰ４の濃度は感染細胞中で厳密に調節される。大部分のアルファウイルスにおいて、ｎｓＰ４の翻訳はｎｓＰ３およびｎｓＰ４コーディング領域の間のオパールコドンのリードスルーを必要とし、その結果、他の非構造タンパク質と比べてより低い細胞内レベルとなる。さらに、大量のｎｓＰ４は、Ｎ末端ルール（ｒｕｌｅ）経路による分解を通じて、代謝的に不安定である（Ｇｏｎｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６７００−１６７１２，１９８９）。しかし、ｎｓＰ４のいくつかは、分解シグナルを隠蔽する複製複合体との会合によって安定である。従って、アミノ末端残基の改変による酵素の安定化は、本明細書に記載のベクターによってコードされるタンパク質のさらに長期の発現を促進するのに有用であることが証明され得る。アミノ末端残基の安定化は、メチオニン、アラニン、およびチロシンを含む。
【００８４】
（４．ウイルス接合領域）
アルファウイルス接合領域は通常、サブゲノムｍＲＮＡの転写の開始を制御する。従って、このエレメントはまたサブゲノムｍＲＮＡプロモーターとも称される。シンドビスウイルスの場合、通常のウイルス接合領域は典型的にはおよそヌクレオチド番号７５７９から始まり、そして少なくともヌクレオチド番号７６１２を通って（そして可能であればその先まで）続く。最小でも、ヌクレオチド７５７９から７６０２（５’−ＡＴＣ  ＴＣＴ
ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＡ
ＡＡＴ  ＡＧＴ−配列番号１）はサブゲノムフラグメントの転写に必要であると考えられている。この領域（ヌクレオチド７５７９から７６０２）を以下「最小接合領域コア」とよぶ。
【００８５】
本発明の特定の局面では、ウイルス接合領域はサブゲノムフラグメントの合成を妨げるために失活される。本明細書の文脈で使用される場合、「失活」はサブゲノムｍＲＮＡに対応する種が、（ＦｒｏｌｏｖおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１７２１−１７２７，１９９４）記載のように、これらのベクターを含む細胞から精製され、そして１μｇ／ｍｌのダクチノマイシンで処理され、そして［3Ｈ］−ウリジンで標
識された、電気泳動されたＲＮＡの変性ゲルからのオートラジオグラムで観察されないことを意味する。
【００８６】
本発明の１つの実施態様では、遺伝子送達ビヒクルは、リボソームリードスルーまたは内部リボソームエントリーのいずれかを促進するシグナルを、失活した接合領域プロモーターのすぐ下流に置くことによて構築され得る。このベクター配置では、サブゲノムメッセージの合成は起こり得ない。しかし、異種タンパク質はゲノム長のｍＲＮＡから、リボソームのリードスルー（スキャニング）または内部リボソームエントリーのいずれかによって発現される。
【００８７】
本明細書に記載の遺伝子送達ビヒクルの特定の用途では、１つより多い異種遺伝子の発現が所望される。例えば、ゴーシェ病のような代謝障害を処置するためには、遺伝子送達ビヒクルまたは粒子の複数回投与が必要とされ得る。なぜなら治療的緩和剤の持続期間は限定され得るからである。従って、本発明の特定の実施態様において、標的細胞中でアデノウイルス２Ｅ３遺伝子をグルコセレブロシダーゼ遺伝子のような治療的緩和剤と共に発現することが所望され得る。野生型ウイルスでは、構造タンパク質（ｓＰ）ポリシストロンメッセージは単一のポリプロテインに翻訳され、これが次にｓＰキャプシドプロテイナーゼによってプロセスされて、一部分が個別のタンパク質になる。従って、ポリシストロンメッセージからの複数の異種遺伝子の発現は、野生型ウイルスとは異なる機構を必要とする。なぜなら、キャプシドｓＰのプロテアーゼ活性、または切断のために認識されるペプチドは、アルファウイルスベクターの置換領域に存在しないからである。従って、本発明のさらなる実施態様では、複数の独立した異種配列（リボソームリードスルー、キャップ非依存性翻訳、内部リボソームエントリー、または最小接合領域コア配列を含む）の翻訳を可能とする機能性エレメントが使用され得る。
【００８８】
（５．アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、およびポリ（Ａ）トラクト）
上記のように、本発明のアルファウイルスベクター構築物またはＲＮＡベクターレプリコンはまた、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（「アルファウイルスレプリカーゼ認識配列」、「３’終止ＣＳＥ」、または「３’シス複製配列」ともよばれる）を含むべきである。簡単に述べると、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列はポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの３’末端領域に位置し、これはウイルスがネガティブ鎖の合成によって複製を始める認識部位を提供する。多様な配列がアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列として使用され得る。例えば、１つの実施態様では、その中のポリメラーゼ認識が切断されてより小さい領域になり、これがなお認識配列（例えば、ヌクレオチド１１，６８４から１１，７０３）として機能するような、シンドビスウイルスベクター構築物が使用され得る。本発明の他の実施態様では、非翻訳領域全体がＥ１ｓＰ遺伝子の下流からポリメラーゼ認識部位を含むウイルスゲノムの３’末端までである（例えば、ヌクレオチド１１，３８２から１１，７０３）、シンドビスウイルスベクター構築物が使用され得る。
【００８９】
本発明の好適な実施態様では、アルファウイルスベクター構築物またはＲＮＡベクターレプリコンはさらにポリ（Ａ）トラクトを含み得、これはアルファウイルス由来のベクターに感染した細胞における異種遺伝子発現の観察レベルを劇的に上昇させる（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、前出を参照のこと）。簡単に述べると、ポリ（Ａ）トラクトは細胞質中での安定性を促進するに十分な任意のサイズであり得、それによりウイルスのライフサイクルの開始の効率を増大させる。本発明の種々の実施態様において、ポリ（Ａ）配列は少なくとも１０のアデノシンヌクレオチドを含み、そして最も好ましくは、少なくとも２５のアデノシンヌクレオチドを含む。１つの実施態様では、ポリ（Ａ）配列はシンドビスウイルスヌクレオチド１１，７０３に直接結合する。
【００９０】
（Ｄ．真核生物層状（ｌａｙｅｒｅｄ）ベクター開始系）
完全長ゲノムであるアルファウイルスｃＤＮＡクローンのサイズのために、完全長キャップＲＮＡ分子のインビトロ転写はかなり非効率である。これは、トランスフェクトされるインビトロ転写ＲＮＡの量と比較したウイルス感染中心（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｅｎｔｅｒ）（プラーク形成により測定される）の点からみると、トランスフェクション効率のより低い低下をもたらす。このような非効率はまた、アルファウイルス発現ベクターのインビトロ転写に関連する。従って、候補ｃＤＮＡクローンおよび他のアルファウイルスｃＤＮＡ発現ベクターの、感染周期を開始するか、または異種配列発現を指向するそれらの能力についての試験は、ｃＤＮＡクローンがＤＮＡ分子として感受性細胞にトランスフェクトされ、次いで、これがウイルスＲＮＡ合成をインビボで指向する場合に、非常に容易にされ得る。
【００９１】
従って、本発明の１つの局面において、ウイルスＲＮＡ（ゲノムまたはベクター）の合成をインビボで指向し得る、ＤＮＡに基づくベクター（「真核生物層状ベクター開始系」と呼ばれる）が提供される。一般的に、真核生物層状ベクター開始系は、ｃＤＮＡからＲＮＡへの５’合成をインビボで（すなわち、細胞内で）開始し得る５’プロモーター、細胞においてそれ自身の複製を指向し得る構築物（この構築物はまた、異種核酸配列を発現し得る）、および転写終結を制御する３’配列（例えば、ポリアデニル化領域）を含む。このような真核生物層状ベクター開始系は、異種ヌクレオチド配列の発現を制御する、２段階機構または「層状」機構を提供する。簡単には、第１層は、第２層の転写を開始し、そしてｃＤＮＡからＲＮＡへの５’→３’合成をインビボで開始し得るプロモーター（例えば、５’真核生物プロモーター）を含み、そして所望であれば、３’転写終結／ポリアデニル化部位、１つ以上のスプライス部位、ならびに他のＲＮＡ核輸送エレメント（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７４７６，１９９３；Ｈｕａｕｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３１９３，１９９４；Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３８６４−３８６９，１９９５）、メイソン−パイツアーサルウイルス構成輸送エレメント（ＣＴＥ）（Ｂｒａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２５６−１２６０，１９９４）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答エレメント（Ｍａｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２５４−２５７，１９８９；Ｃｕｌｌｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６：３４６，１９９１、および他の類似のエレメントを含む）を所望ならば含む、他のエレメントをさらに含み得る。本発明での使用に適した代表的なプロモーターは、真核生物プロモーター（例えば、ｐｏｌＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ）および原核生物プロモーターの両方、ならびに誘導性または非誘導性（すなわち、構成性）プロモーター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスプロモーター、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのアクチン５Ｃ遠方（ｄｉｓｔａｌ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、熱ショックタンパク質６５プロモーター、熱ショックタンパク質７０プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、マウスポリオーマウイルスプロモーター（Ｐｙ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルスプロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、アルファウイルス接合領域（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルスＥ１プロモーターまたはＶＡ１ＲＮＡプロモーター、ｒＲＮＡプロモーター、ｔＲＮＡメチオニンプロモーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、テトラサイクリン応答プロモーター、ならびにｌａｃプロモーター）を含む。
【００９２】
本発明のなお他の実施態様において、誘導性プロモーターが利用され得る。例えば、１つの実施態様において、コアＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、および転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列、および転写リプレッサータンパク質のＤＮＡ結合を指向する作動可能に連結された核酸配列を含む、ＤＮＡからＲＮＡへの合成を開始する誘導性プロモーターが提供される。さらなる実施態様において、転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合を指向する核酸配列は、テトラサイクリンリプレッサー／ＶＰ１６転写アクチベーター融合タンパク質を結合する配列である。なお別の実施態様において、転写リプレッサータンパク質のＤＮＡ結合を指向する核酸配列は、ラクトースリプレッサー／クルッペルドメイン融合タンパク質を結合する配列である。
【００９３】
第２層は、１つ以上の異種ヌクレオチド配列を発現し得、そして、自律的に、または１つ以上の因子に応答して（すなわち、誘導性である）のいずれかで、細胞においてそれ自身の複製を指向し得る、自己触媒ベクター構築物を含む。第２層は、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る。本発明の１つの実施態様において、第２層構築物は、上記のアルファウイルスベクター構築物であり得る。
【００９４】
例えば、ＤＮＡウイルス（例えば、ポックスウイルス科に分類されるＤＮＡウイルス（例えば、カナリア痘ウイルスまたはワクシニアウイルスを含む）から開発されたウイルスベクター構築物（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、ＰＮＡＳ  ８６：３１７−３２１，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７−２１，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ  ８９／０１９７３）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖｉｒｉｄａｅ）に分類されるウイルス（例えば、ＢＫＶ、ＪＣＶ、またはＳＶ４０）から開発されたウイルスベクター構築物（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８−１１４，１９７９）；アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）から開発されたウイルスベクター構築物（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７，１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４，１９９１）；パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）から開発されたウイルスベクター構築物（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２−３８２８，１９８９；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４−１６５，１９８８：ＰＡ
７／２２２，６８４）；ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス）から開発されたウイルスベクター構築物（例えば、Ｋｉｔ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９−２３６，１９８９）；ならびにヘパドナウイルス科（例えば、ＨＢＶ）から開発されたウイルスベクター構築物、ならびにＤＮＡ中間体を通して複製するある種のＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス科）から開発されたウイルスベクター構築物（例えば、米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ  ２，２００，６５１、ＥＰ  ０，３４５，２４２、およびＷＯ９１／０２８０５）を含む、広範な種々のベクター系が、真核生物層状ベクター開始系の第１層として利用され得る；レトロウイルス科は、白血病ウイルス（例えば、ＭｏＭＬＶ）および免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）（例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５３２−５３６，１９９１）を含む。
【００９５】
同様に、例えば、以下の科のウイルスに由来するベクター系を含む、広範な種々のベクター系が、真核生物層状ベクター開始系の第２層として利用され得る：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス）、カルシウイルス科、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス、風疹）、フラビウイルス科（例えば、黄熱、ＨＣＶ）、コロナウイルス科（例えば、ＨＣＶ、ＴＧＥＶ、ＩＢＶ、ＭＨＶ、ＢＣＶ）、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科（例えば、ＲＳＶ、ＭｏＭＬＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）、デルタ型肝炎ウイルス、およびアストロウイルス。さらに、非哺乳動物ＲＮＡウイルス（ならびに、それらに由来する成分）（例えば、細菌レプリカーゼおよびバクテリオファージレプリカーゼ、ならびに植物ウイルス（例えば、ポテックスウイルス（例えば、ＰＶＸ）、カルラウイルス（例えば、ＰＶＭ）、トブラウイルス（例えば、ＴＲＶ、ＰＥＢＶ、ＰＲＶ）、トバモウイルス（例えば、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、ＰＰＭＶ）、ルテオウイルス（例えば、ＰＬＲＶ）、ポチウイルス（例えば、ＴＥＶ、ＰＰＶ、ＰＶＹ）、トンブスウイルス（例えば、ＣｙＲＳＶ）、ネポウイルス（例えば、ＧＦＬＶ）、ブロモウイルス（例えば、ＢＭＶ）、およびトパモウイルス）に由来する成分を含む）もまた利用され得る。
【００９６】
真核生物ベクター開始系の第２層に含まれる、自己触媒ベクター構築物の複製能は、当業者に公知の種々のアッセイ（例えば、細胞ＲＮＡ合成インヒビター（例えば、ダクチノマイシン）の存在下でトランスフェクト細胞における＋センスおよび−センスの両方の増加を経時的に測定するリボヌクレアーゼ保護アッセイ、およびトランスフェクト細胞におけるサブゲノムＲＮＡ合成または異種レポーター遺伝子発現を測定するアッセイもまた含む）により測定され得る。
【００９７】
本発明の特に好ましい実施態様において、ｃＤＮＡからアルファウイルスＲＮＡへの合成をインビボで開始し得る５’プロモーター（すなわち、ＲＮＡ合成ＤＮＡプロモーター）、引き続いて、アルファウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列、４つ全てのアルファウイルス非構造タンパク質を作動可能にコードする核酸配列（組換えアルファウイルス粒子に作動可能に取り込まれた場合、所望の表現型をもたらす上記の核酸分子を含む）、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および転写終結／ポリアデニル化を制御する３’配列を含む、真核生物層状ベクター開始系が提供される。さらに、発現される異種配列に作動可能に連結されるウイルス接合領域が含まれ得る。種々の実施態様において、ウイルス接合領域は、サブゲノムフラグメントのウイルス転写が増大、低減、または不活化されるように改変され得る。第２の実施態様において、別のウイルス接合領域は、第１の不活化ウイルス接合領域の後に挿入され得、第２のウイルス接合領域は、活性であるか、またはサブゲノムフラグメントのウイルス転写が増大もしくは低減されるように改変されているかのいずれかである。
【００９８】
真核生物層状ベクター開始系のインビボ転写後に得られるアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン分子は、アルファウイルスＲＮＡ転写を開始し得る５’配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス接合領域、異種ヌクレオチド配列、アルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列、およびポリアデニル化配列からなる。
【００９９】
アルファウイルス転写を開始し得る５’配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ウイルス接合領域（サブゲノムフラグメントのウイルス転写が妨げられるように不活化された接合領域を含む）、およびアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む、アルファウイルスｃＤＮＡベクター構築物の種々の局面は上記で議論された。さらに、改変接合領域およびタンデム接合領域もまた上記で議論された。
【０１００】
本発明の別の実施態様において、真核生物層状ベクター開始系は、特定の真核生物種（特に、哺乳動物種（例えば、ヒト））に由来する１つ以上の細胞株において複製するように適合されたアルファウイルスベクター（例えば、シンドビスベクター構築物）に由来する。例えば、発現される組換えタンパク質をコードする遺伝子がヒト起源であり、そしてこのタンパク質がヒト治療用途に意図される場合、適切なヒト細胞株における生成は、このタンパク質が、ヒトにおいて生じるのが求められるように翻訳後修飾されるために好ましくあり得る。このアプローチは、（以下でより詳細に議論されるように）組換えタンパク質生成をさらに増強させることにおいて有用であり得る。ウイルスレプリカーゼの不正確性のためにアルファウイルスゲノムの全適応性があれば、選択された真核生物細胞（例えば、ヒト、マウス、イヌ、ネコなど）において高力価である増殖性感染を確立する能力を増強した変異株が選択され得る。さらに、真核生物細胞において高力価な持続性感染を確立する能力を増強した変異アルファウイルス株もまた、このアプローチを用いて単離され得る。次いで、アルファウイルス発現ベクターは、本明細書中に提供される手順に従って、これらの変異株のｃＤＮＡクローンから構築され得る。
【０１０１】
本発明の別の実施態様において、真核生物層状ベクター開始系は、分化細胞型でしか転写活性でない、初期アルファウイルスベクター転写プロモーターを含む。簡単には、培養哺乳動物細胞（例えば、ハムスターに由来する細胞（例えば、乳児ハムスター腎臓細胞）またはニワトリ由来の細胞（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞））のアルファウイルス感染が代表的に細胞傷害性をもたらすことは、十分に確証されている。従って、安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞株を作製するために、初期ベクター増幅を可能にするプロモーターが転写不活性であるが誘導性のプロモーターである、真核生物層状ベクター開始系を宿主細胞に導入し得る。特に好ましい実施態様において、このようなプロモーターは分化状態依存性である。この構成において、プロモーター活性化およびその後のアルファウイルスＤＮＡベクターの活性化は、細胞分化の誘導と同時に起こる。ある細胞数のこのような安定に形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞株への増殖の際に、適切な分化の刺激が提供され、それによりベクター構築物の転写および所望の遺伝子およびコードされたポリペプチドの増幅発現を開始する。特定の刺激の適用により分化するように誘導され得る細胞株と同様に、多くのこのような分化状態依存性プロモーターが当業者に公知である。代表的な例は、細胞株Ｆ９およびＰ１９、ＨＬ６０、ならびにＦｒｅｕｎｄ赤白血病細胞株、ならびにＨＥＬを含み、これらは、レチノイン酸、ウマ血清、およびＤＭＳＯによりそれぞれ活性化される。
【０１０２】
好ましい実施態様において、このようなプロモーターは、２つの別々の成分により調節され得る。例えば、実施例７に記載のように、転写アクチベーターおよび転写リプレッサー両方の結合部位は、作動可能依存性の様式で、「コア」プロモーターに隣接して配置される。この構成において、非誘導状態は、転写アクチベーターがその認識部位を見出す能力をブロックする一方、転写リプレッサーが構成的に発現され、そしてその認識部位に結合することを可能にすることにより維持される。誘導は、転写リプレッサーをブロックし、そして転写アクチベーターブロックを解除することにより可能とされる。例えば、テトラサイクリン応答プロモーター系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：５５４７−５５５１，１９９２）は、アルファウイルスベクターＲＮＡの誘導転写のために利用され得る。この系において、「融合」タンパク質（ｒＴＡ）としての、テトラサイクリンリプレッサーおよびＨＳＶ−ＶＰ１６転写アクチベータードメインの発現は、最小「コア」プロモーター（例えば、ＣＭＶ）のきわめて隣接して位置するテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）に特異的に結合することにより、アルファウイルスベクターＲＮＡのインビボ転写を刺激する。結合およびトランス活性化事象は、テトラサイクリンの存在により可逆的にブロックされ、そしてテトラサイクリンを培養培地から除去することにより「活性化（ｔｕｒｎ  ｏｎ）」され得る。転写の非誘導基底レベルは異なる細胞型間で異なることから、他の異なる最小コアプロモーター（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ）は、アルファウイルスベクターヌクレオチド１での処置またはそれにきわめて近接した並置を可能にするために転写開始部位が既知であれば、テトラサイクリンオペレーター配列に連結され得る。
【０１０３】
ｒＴＡトランスアクチベーターは、さらなる発現カセット（これもまた同じ細胞株に安定に形質転換されている）により提供され得；そして特定の実施態様において、ｒＴＡ発現カセット自身は自己調節性であり得る。自己調節性ｒＴＡ発現カセットの使用は、発現と、ｒＴＡ自身が結合する同じｔｅｔＯ連結プロモーターによる転写制御とを組み合せることにより、ｒＴＡの構成性高レベル発現と関連する潜在的な毒性問題を回避する。この型の系は、テトラサイクリン存在下においてｒＴＡは全く生成されないが、テトラサイクリンが除去された場合に高度に活性になることを確実にする、負のフィードバックサイクルを作り出す。このような自己調節性ｒＴＡ発現カセットは、プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋにおいて提供される（Ｓｈｏｓｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６５２２−６５２６，１９９５）。
【０１０４】
転写抑制のために、特定のジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢ抑制ドメインもまた利用され得る。簡単には、ＫＲＡＢ（クルッペル結合ボックス）ドメインは、全てのクルッペルクラスであるＣｙｓ2Ｈｉｓ2ジンクフィンガータンパク質のうちの１／３を超えるタンパク質のアミノ末端領域に存在する、高度に保存された配列である。このドメインは、２つの推定される両親媒性α−ヘリックスを含み、そしてＤＮＡ結合依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写リプレッサーとして機能することが示された（例えば、Ｌｉｃｈｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：７６−７９，１９９０）。他の転写因子と同様に、活性抑制ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインは、別個であり、分離している。従って、抑制ドメインは、融合タンパク質として、標的化のための任意の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に連結され得る。従って、ＤＮＡ結合タンパク質成分は、調節可能な様式での結合を可逆的に妨げられ、それにより転写サイレンシングを「止め」得る。例えば、ヒトＫｏｘ１に由来するＫＲＡＢドメイン（Ｔｈｉｅｓｅｎ，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．２：３６３−３７４，１９９０）は、ＤＮＡ結合ラクトース（ｌａｃ）リプレッサータンパク質に融合され、ｔｅｔ応答プロモーターにきわめて隣接して操作されたｌａｃオペレーター配列への可逆的で配列特異的な結合を有する、ハイブリッド転写サイレンサーを形成する。この構成において、ｌａｃリプレッサー／ＫＲＡＢドメイン融合物（ｒＫＲ）の構成性発現は、ｌａｃオペレーター配列への結合、および非誘導性ｔｅｔ応答プロモーターからのいずれについての「漏れやすい」基底転写の排除をももたらす。ベクター発現が所望され、そしてテトラサイクリンがこの系から除去された場合、ＩＰＴＧが、ｒＫＲ媒介性転写サイレンシングを妨げるために添加される。
【０１０５】
さらに、他のジンクフィンガータンパク質（例えば、ＺＮＦ１３３（Ｔｏｍｍｅｒｕｐら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１５７１−１５７５，１９９３）、ＺＮＦ９１（Ｂｅｌｌｅｆｒｏｉｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：１３６３−１３７４，１９９３）、ＺＮＦ２（Ｒｏｓａｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１９：５６６１−５６６７，１９９１））に由来するＫＲＡＢドメイン、ならびに他の転移可能なリプレッサードメイン（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｎまたはｅｖｅ遺伝子（ＪａｙｎｅｓおよびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１４２７−１４３３，１９９１；ＨａｎおよびＭａｎｌｅｙ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：４９１−５０３，１９９３）、ヒトジンクフィンガータンパク質ＹＹ１（Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  ６７：３７７−３８８，１９９１）、ウィルムス腫瘍サプレッサータンパク質ＷＴ１（Ｍａｄｄｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１５５０−１５５３，１９９１）、甲状腺ホルモンレセプター（Ｂａｎｉａｈｍａｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１０１５−１０２３，１９９２）、レチノイン酸レセプター（Ｂａｎｉａｈｍａｄら、同書）、Ｋｉｄ−１（Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４５１４−４５１８，１９９４））は、同様に、本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルとして容易に使用され得る。さらに、この系のｌａｃリプレッサー／ｌａｃオペレーター成分は、他の供給源に由来する他の任意の数の調節可能な系（例えば、トリプトファンおよびマルトースオペロンまたはＧＡＬ４）で代用され得る。
【０１０６】
（Ｅ．組換えアルファウイルス粒子、ならびに「空の」トガウイルス粒子または非相同ウイルスＲＮＡを含むトガウイルス粒子の作製および使用）
本発明の別の局面において、真核生物標的細胞の感染が可能な、ＲＮＡアルファウイルスベクターを含む組換えアルファウイルス粒子の作製が記載される。簡単には、このような組換えアルファウイルス粒子は、一般的に、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープ、および本明細書中に記載のＲＮＡベクターレプリコンを含む。
【０１０７】
組換えアルファウイルスベクター粒子を作製するための方法は、例えば、インビトロ転写ＲＮＡに由来する相補ベクターおよび欠損ヘルパー（ＤＨ）分子、またはプラスミドＤＮＡの同時トランスフェクションにより、あるいはウイルスの同時感染により容易に達成され得る（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１１８８−１１９１，１９８９、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：５０８−５１９，１９９６、およびＤｕｂｅｎｓｋｙら、Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４を参照のこと）。
【０１０８】
他の局面において、組換えアルファウイルスベクター粒子を、アルファウイルスに由来するパッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株から作製するための方法が提供される。簡単には、このようなＰＣＬおよびそれらの安定に形質転換される構造タンパク質発現カセットは、Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４に記載の方法を用いるか、または本発明に記載の新規の方法を用いて得られ得る。例えば、組換えアルファウイルスベクター粒子のＰＣＬによる生成は、所望の特性を有するアルファウイルスに基づくベクター分子のＰＣＬへの導入後に達成され得（実施例６を参照のこと）、このベクターは、インビトロ転写ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または以前に得られた組換えアルファウイルス粒子に由来する。なおさらなる例において、アルファウイルスベクタープロデューサー細胞株からの組換え粒子の生成が記載される（実施例７を参照のこと）。
【０１０９】
他の実施態様において、いずれのゲノムＲＮＡも含まず（すなわち、実質的にウイルスＲＮＡを含まない）、またはＲＮＡベクターレプリコンをも含まない、高力価安定トガウイルスキャプシド粒子を生成するための方法が提供される。本発明において利用される、「実質的ではない」ゲノムまたはＲＮＡベクターのレプリコン核酸は、（野生型と比較して）１０：１を超え、そして好ましくは１５：１を超える、ウイルス粒子への35Ｓメチオニン対3Ｈウリジン取り込み比をいうことが理解されるべきである（例えば、実施例８お
よび図３８を参照のこと）。例えば、１つの実施態様において、空のキャプシド粒子（好ましくは、脂質２重層およびリコタンパク質（ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）相補物を有する）は、トガウイルス科に由来する選択された病原性ウイルス（例えば、アルファウイルスまたはルビウイルス）から構築され、そして野生型トガウイルス感染に対する防御免疫を確立するための免疫原として使用される。空のウイルス粒子は、それらが複製し得ず、そしてウイルスを生成し得ないが、細胞性または体液性両方の免疫応答を生じ得るので、望ましい免疫原代替である。従って、実施例８により詳細に記載される方法を利用して、トガウイルス由来の空のキャプシド粒子（脂質２重層および糖タンパク質相補物を有するかまたは有さない）は、広範な種々のトガウイルス（アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス（例えば、ＳＩＮ−１または野生型シンドビスウイルス））、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ロス川ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびルビウイルス（例えば、風疹）を含むが、それらに限定されない）から作製され得る。
【０１１０】
第二の実施態様において、ゲノムウイルスＲＮＡに結合するペプチドをコードする異種ウイルスに由来する配列は、アルファウイルスキャプシド遺伝子のアミノ末端領域において欠損ヘルパー（ＤＨ）発現カセットに挿入され得る。このカセットは、相同アルファウイルスゲノムＲＮＡに結合するタンパク質領域をコードする配列が欠失されている。例えば、ＢＨＫ細胞は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、異種ウイルスゲノムＲＮＡ結合ペプチドをコードする配列を含むＤＨ  ＲＮＡ、および同じ異種ウイルスに由来するレプリコンと共にエレクトロポレーションされ得る。従って、生成されたアルファウイルス粒子は、異種ウイルスに由来するゲノムＲＮＡを含み、そしてアルファウイルスの宿主範囲親和性を有する。１つの可能な例として、レトロウイルスＲＮＡ結合に必要とされるタンパク質をコードするｇａｇ配列は、ＤＨ配列カセット構築物に含まれる。この構成において、得られるアルファウイルス粒子は、レトロウイルスベクターＲＮＡを含む。
【０１１１】
（Ｆ．異種配列）
上記のように、広範な種々のヌクレオチド配列が、本発明の遺伝子送達ビヒクルにより運ばれ、そして発現され得る。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生存可能なウイルスの生成を可能にするのに十分なサイズのヌクレオチド配列であるべきである。本発明の状況において、組換えアルファウイルス粒子による任意の測定可能な力価の生成、またはＲＮＡもしくはＤＮＡベクターによる検出可能なレベルの異種遺伝子産物の発現（例えば、感染ウイルスの、適切な感受性単層上でのプラークアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、もしくはβ−ガラクトシダーゼアッセイによる）は、「生存可能なウイルスの生成」とみなされる。これは、最小の、いずれの付加異種配列も含まないアルファウイルスベクター構築物であり得る。しかし、他の実施態様において、ベクター構築物は、付加異種配列または外来配列を含み得る。好ましい実施態様において、異種配列は、少なくとも約１００塩基、２ｋｂ、３．５ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂの異種配列、または少なくとも約８ｋｂの異種配列でさえも含み得る。
【０１１２】
本明細書中に提供される開示があれば当業者に明らかであるように、組換えアルファウイルス粒子パッケージングの効率、従ってウイルス力価は、パッケージングされる配列のサイズにある程度依存する。従って、パッケージング効率および生存可能なウイルスの生成を増大させるために、さらなる非コード配列がベクター構築物に付加され得る。さらに、本発明の特定の実施態様において、ウイルス力価を増大または減少させることが望ましくあり得る。この増大または減少は、異種配列のサイズ、従ってパッケージング効率を増大または減少させることにより達成され得る。
【０１１３】
上記で簡単に言及されたように、広範な種々の異種配列（例えば、緩和剤（ｐａｌｌｉａｔｉｖｅ）（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）、毒素、プロドラック変換酵素、免疫応答を刺激する抗原、リボザイム、治療適用のためのタンパク質（例えば、増殖因子または調節因子）、および免疫応答を介助または阻害するタンパク質、ならびにアンチセンス配列（または「アンチセンス適用」のためのセンス配列）をコードする配列を含む）は、本明細書中に記載の遺伝子送達ビヒクル内に含まれ得る。さらに、上記で議論されたように、本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルは、２つ以上の異種配列を含み得る（そして特定の実施態様において発現し得る）。
【０１１４】
（１．リンホカイン）
本発明の１つの実施態様において、異種配列はリンホカインをコードする。簡単には、リンホカインは、免疫エフェクター細胞を増殖するか、活性化するか、または分化するように作用する。リンホカインの代表例は、γインターフェロン、腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、およびＧ−ＣＳＦを含む。
【０１１５】
本発明の関連する実施態様において、異種配列は、免疫調節補因子（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｆａｃｔｏｒ）をコードする。簡単には、本発明の状況において利用する「免疫調節補因子」は、免疫応答に関与する１つ以上の細胞により作られた場合または細胞に外因的に添加された場合に、補因子の非存在下で生じた免疫応答とは質または効力が異なる免疫応答を引き起こす、因子をいう。応答の質または効力は、当業者に公知の種々のアッセイ（例えば、細胞増殖（例えば、3Ｈチミジン取り込み）を測定するイ
ンビトロアッセイ、および（例えば、51Ｃｒ放出を測定する）インビトロ細胞傷害アッセイを含む）により測定され得る（Ｗａｒｎｅｒら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７：６４５−６５５，１９９１を参照のこと）。
【０１１６】
免疫調節補因子の代表例は、α−インターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒら、Ｄｒｕｇｓ  ４２（５）：７４９−７６５，１９９１；米国特許第４，８９２，７４３号；米国特許第４，９６６，８４３号；ＷＯ  ８５／０２８６２；Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：３１６−３２０，１９８０；Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４，１９８１；Ｔｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２０４６−２０５０，１９８９；Ｆａｋｔｏｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：８６７−８７２，１９９０）、βインターフェロン（Ｓｅｉｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１，１９９１）、γインターフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄら、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：２００８−２０１５，１９９１；Ｗａｔａｎａｂｅら、ＰＮＡＳ  ８６：９４５６−９４６０，１９８９；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：７８２０−７８２５，１９９０；Ｍａｉｏら、Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２、１９８９；米国特許第４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）、Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＷＯ  ８５／０４１８８）、ＴＮＦ（Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４：９４２−９５１，１９９０）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｋａｒｕｐｉａｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４：２９０−２９８，１９９０；Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３，１９８７；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４，１９９０；米国特許第４，７３８，９２７号）、ＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら、Ｃｅｌｌ  ５７：５０３−５１２，１９８９；Ｇｏｌｕｍｂｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：７１３−７１６，１９９１；米国特許第５，０１７，６９１号）、ＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１，１９８７；ＷＯ  ９０／０６３７０）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６５−９６８，１９９４；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＥＭＢＬ登録番号Ｖ０３０９９）、ＩＣＡＭ−１（Ａｌｔｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ
３３８：５１２−５１４，１９８９）、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、2−ミクログロブリン、シャペロン、ＣＤ３、
Ｂ７／ＢＢ１、ＭＨＣ関連トランスポータータンパク質、またはそのアナログを含む。
【０１１７】
アルファウイルスベクター構築物内に含有する、これらの免疫調節補因子の選択は、補因子の既知の治療効果に基づくか、または経験的に決定され得る。例えば、慢性Ｂ型肝炎感染において、αインターフェロンは、患者の免疫欠損を補うことに効力があり、それにより疾患からの回復を助けることが見出されている。あるいは、適切な免疫調節補因子は経験的に決定され得る。簡単には、最初に、血液サンプルが肝臓疾患を有する患者から採取される。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、自己細胞またはＨＬＡ適合細胞（例えば、ＥＢＶ形質転換細胞）を用いてインビトロで再刺激し、そして肝炎抗原の免疫原部分および免疫調節補因子の発現を指向するアルファウイルスベクター構築物で形質導入する。標的としてＨＬＡ適合形質導入細胞を用いるＣＴＬアッセイにおいて、刺激ＰＢＬをエフェクターとして使用する。ＨＬＡ適合刺激因子および抗原単独をコードするベクターで形質導入された標的細胞を用いて行われた同じアッセイにおいて見られるものを超える、ＣＴＬ応答の増大は、有用な免疫調節補因子を示す。本発明の１つの実施態様において、免疫調節補因子であるγインターフェロンが特に好ましい。
【０１１８】
免疫調節補因子の別の例は、Ｂ７／ＢＢ１補助刺激因子である。簡単には、Ｔ細胞の完全な機能活性の活性化には、２つのシグナルを必要とする。１つのシグナルは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターと主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとの相互作用により提供され、そして補助刺激と呼ばれる第２のシグナルは、抗原提示細胞によりＴ細胞に送達される。第２のシグナルは、Ｔ細胞によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）生成に必要とされ、そして抗原提示細胞上でのＢ７／ＢＢ１と、Ｔリンパ球上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４レセプターとの相互作用を必要とすると思われる（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０，１９９１ａ、およびＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５７０，１９９１）。本発明の１つの実施態様において、ＣＤ８+Ｔ細胞が拡大し、そして完全活性化されるのに十分なＩＬ−２を生成するように、
ＣＤ８+Ｔ細胞の補助刺激を引き起こすために、Ｂ７／ＢＢ１は腫瘍細胞に導入され得る
。これらのＣＤ８+Ｔ細胞は、さらなるＣＴＬ機能のために補助刺激をもはや必要としな
いので、Ｂ７を発現していない腫瘍細胞を殺傷し得る。補助刺激Ｂ７／ＢＢ１因子、および例えば、免疫原性ＨＢＶコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書中に記載の方法を利用して作られ得る。これらのベクターで形質導入された細胞は、より効果的な抗原提示細胞になる。ＨＢＶコア特異的ＣＴＬ応答は、補助刺激リガンドＢ７／ＢＢ１を介して完全活性化ＣＤ８+Ｔ細胞から増大される。
【０１１９】
（２．毒素）
本発明の別の実施態様において、異種配列は毒素をコードする。簡単には、毒素は、細胞増殖を直接阻害するように作用する。毒素の代表例は、リシン（Ｌａｍｂら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８：２６５−２７０，１９８５）、アブリン（Ｗｏｏｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：７２３−７３２，１９９１；Ｅｖｅｎｓｅｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６８４８−６８５２，１９９１；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８６６５−８６６９，１９９０；Ｃｈｅｎら、Ｆｅｄ．ｏｆ  Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．３０９：１１５−１１８，１９９２）、ジフテリア毒素（Ｔｗｅｔｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０３９２−１０３９４，１９８５）、コレラ毒素（Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：５５１−５５７，１９８３；ＳａｎｃｈｅｚおよびＨｏｌｍｇｒｅｎ，ＰＮＡＳ  ８６：４８１−４８５，１９８９）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）（Ｓｔｉｒｐｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６９４７−６９５３，１９８０）、ヤマゴボウ（Ｉｒｖｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２１：３７１−３８７，１９８３）、抗ウイルスタンパク質（Ｂａｒｂｉｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０３：５５−５９，１９８２；Ｉｒｖｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００：４１８−４２５，１９８０；Ｉｒｖｉｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６９：５２２−５２８，１９７５）、トリチン（ｔｒｉｔｉｎ）、赤痢菌毒素（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄら、ＰＮＡＳ
８４：４３６４−４３６８，１９８７；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２：１４７−１５３、１９８７）、シュードモナス外毒素Ａ（ＣａｒｒｏｌｌおよびＣｏｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８７０７−８７１１，１９８７）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）（Ｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１１５−１２４，１９８０）、およびＥ．ｃｏｌｉのグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む。
【０１２０】
（３．プロドラック変換酵素）
本発明の他の実施態様において、異種配列は、プロドラック変換酵素をコードする。簡単には、本発明の状況において利用されるプロドラック変換酵素は、ほとんどまたは全く細胞傷害性を有さない化合物（プロドラック）を毒性産物に活性化する遺伝子産物をいう。このような遺伝子産物の代表例は、ＨＳＶＴＫおよびＶＺＶＴＫ（ならびにそのアナログおよび誘導体）を含み、これらは、特定のプリンアラビノシドおよび置換ピリミジン化合物を選択的に１リン酸化して、それらを細胞傷害性または細胞増殖抑制性の代謝産物に変換する。より詳細には、ガンシクロビル、アシクロビル、または任意のそれらのアナログの薬物（例えば、ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ）のＨＳＶＴＫへの暴露は、この薬物を、その対応する活性ヌクレオチド３リン酸形態にリン酸化する。
【０１２１】
本発明の状況においてまた使用され得る、他のプロドラック変換酵素の代表例は、以下を含む：チオキサンチンを毒性チオキサンチン一リン酸に変換する、Ｅ．ｃｏｌｉグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｂｅｓｎａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４１３９−４１４１，１９８７）；不活性リン酸化化合物（例えば、マイトマイシンホスフェートおよびドキソルビシンホスフェート）を毒性脱リン酸化化合物に変換する、アルカリホスファターゼ；５−フルオロシトシンを毒性化合物である５−フルオロウラシルに変換する、真菌（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）または細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎ，ＰＮＡＳ  ８９：３３，１９９２）；パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタミン酸からグルタミン酸を切断し、それにより毒性安息香酸マスタードを作り出す、カルボキシペプチダーゼＧ２；ならびにドキソルビシンおよびメルファランのフェノキシアセタバイド（ｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔａｂｉｄｅ）誘導体を毒性化合物に変換する、ペニシリン−Ｖアミダーゼ（一般的に、Ｖｒｕｄｈｕｌａら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６（７）：９１９−９２３，１９９３；Ｋｅｒｎら、Ｃａｎｃ．Ｉｍｍｕｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１（４）：２０２−２０６，１９９０を参照のこと）。
【０１２２】
（４．アンチセンス配列）
本発明の別の実施態様において、異種配列はアンチセンス配列である。簡単には、アンチセンス配列は、ＲＮＡ転写物に結合し、それにより特定のタンパク質細胞合成を妨げるか、または細胞によるそのＲＮＡ配列の使用を妨げるように設計されている。このような配列の代表例は、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭａｈｅｒおよびＤｏｌｎｉｃｋ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５３：２１４−２２０，１９８７；Ｂｚｉｋら、ＰＮＡＳ  ８４：８３６０−８３６４，１９８７）、アンチセンスＨＥＲ２（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−１１３９，１９８５）、アンチセンスＡＢＬ（Ｆａｉｎｓｔｅｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：１４７７−１４８１，１９８９）、アンチセンスＭｙｃ（Ｓｔａｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：４２３−４２５，１９８４）、およびアンチセンスｒａｓ、ならびにヌクレオチド生合成経路酵素をブロックする任意の細胞周期シグナル成分（例えば、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン依存性キナーゼインヒビター）またはアンチセンス配列を含む。さらに、本発明の他の実施態様において、インターフェロンおよび２ミクログロブリンに対するアンチセンス配列が、免疫応答を減少するために利用され得る。
【０１２３】
さらに、本発明のさらなる実施態様において、アンチセンスＲＮＡは、強力なクラスＩ制限応答を誘導するために抗腫瘍剤として利用され得る。簡単には、高レベルの特異的アンチセンス配列は、ＲＮＡを結合させ、それにより特定のｍＲＮＡの翻訳を妨げることに加えて、多量の２本鎖ＲＮＡの形成によりインターフェロン（γ−インターフェロンを含む）発現の増大を誘導するために送達される。次いで、このγインターフェロン発現の増大は、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現を高める。この点についての使用に好ましいアンチセンス配列は、アクチンＲＮＡ、ミオシンＲＮＡ、およびヒストンＲＮＡを含む。アクチンＲＮＡとミスマッチを形成するアンチセンスＲＮＡが特に好ましい。
【０１２４】
（５．リボザイム）
本発明の他の局面において、宿主細胞感染の際にリボザイムを生成する遺伝子送達ビヒクルが提供される。簡単には、リボザイムは、特異的ＲＮＡを切断するために使用され、そして１つの特異的ＲＮＡ配列にのみに影響を及ぼし得るように設計される。一般的に、リボザイムの基質結合配列は、１０〜２０ヌクレオチド長である。この配列の長さは、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション、および切断ＲＮＡからのリボザイムの解離を可能にするのに十分である。
【０１２５】
本発明の状況において、広範な種々のリボザイム（例えば、グループＩ型イントロンリボザイム（Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号）；ヘアピン型リボザイム（Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：２９９−３０４，１９９０、米国特許第５，２５４，６７８号、および欧州特許公報第０  ３６０  ２５７号）；ハンマーヘッド型リボザイム（Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．５０：２４５−２５４，１９９１；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  ４８：２１１−２２０，１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：５９６−６００，１９８８；ＷａｌｂｏｔおよびＢｒｕｅｎｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：１９６，１９８８；ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５，１９９８），デルタ型肝炎ウイルスリボザイム（ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１：１６，１９９２）；ＲＮアーゼＰリボザイム（Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌｌ  ３５：８４９，１９８３）；ならびに他の型のリボザイム（例えば、ＷＯ
９５／２９２４１およびＷＯ  ９５／３１５５１を参照のこと）を含む）が利用され得る。リボザイムのさらなる例は、米国特許第５，１１６，７４２号、同第５，２２５，３３７号、および同第５，２４６，９２１号に記載されるリボザイムを含む。
【０１２６】
（６．タンパク質および他の細胞構成物）
本発明の他の局面において、広範な種々のタンパク質または他の細胞構成物が、本明細書中に提供される遺伝子送達ビヒクルにより運ばれ、そして／または発現され得る。このようなタンパク質の代表例は、ネイティブな細胞成分または変化（ａｌｔｅｒｅｄ）細胞成分、ならびに例えば、ウイルス、細菌、寄生体、または真菌に見出される外来タンパク質または細胞構成物を含む。
【０１２７】
（ａ．変化細胞成分）
１つの実施態様において、免疫原性で非腫瘍形成性の変化細胞成分（例えば、ＷＯ  ９３／１０８１４を参照のこと）の発現を指向する、遺伝子送達ビヒクルが提供される。本明細書中で適用される用語「免疫原性の」は、適切な条件下で免疫応答を引き起こし得る変化細胞成分をいう。この応答は、細胞媒介応答でなければならず、そしてまた体液性応答を含み得る。用語「非腫瘍形成性の」は、細胞形質転換を引き起こさず、ヌードマウスにおいて腫瘍形成を誘導もしない、変化細胞成分をいう。句「変化細胞成分」は、細胞を腫瘍形成性することに関連するか、または一般的に腫瘍形成性細胞と関連するが、細胞を腫瘍形成性にすることに必要とされないか、もしくは必須ではないかのいずれかである、タンパク質および他の細胞構成物をいう。
【０１２８】
簡単には、変化前に、細胞成分は、正常な細胞増殖および調節に必須であり、そして例えば、細胞内タンパク質分解、転写調節、細胞周期制御、および細胞−細胞相互作用を調節するタンパク質を含み得る。変化後に、細胞成分は、それらの調節機能をもはや行わず、従って、この細胞は無制御な増殖を経験し得る。変化細胞成分の代表例は、ｒａｓ*、
ｐ５３*、Ｒｂ*、ウィルムス腫瘍遺伝子によりコードされる変化タンパク質、ユビキチン*、ムチン*、ＤＣＣ、ＡＰＣ、およびＭＣＣ遺伝子によりコードされるタンパク質、乳ガン遺伝子ＢＲＣＡ１*、ならびにレセプターまたはレセプター様構造（例えば、ｎｅｕ、
甲状腺ホルモンレセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、インスリンレセプター、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）レセプター）を含む。
【０１２９】
一旦、変化細胞成分をコードする配列が得られたら、この配列が非腫瘍形成性タンパク質をコードすることを確実にする必要がある。特定の細胞成分の腫瘍形成性を評価する種々のアッセイが公知であり、そして容易に実施され得る。代表的なアッセイは、ラット線維芽細胞アッセイ、ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成、軟寒天におけるコロニー形成、およびトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）の調製を含む。
【０１３０】
ヌードマウスまたはラットにおける腫瘍形成は、特定の細胞成分の腫瘍形成性を決定するための、特に重要かつ感度の高い方法である。ヌードマウスは、機能的な細胞免疫系を欠き（すなわち、ＣＴＬを有さず）、従って、細胞の腫瘍形成能を試験するための有用なインビボモデルを提供する。正常な非腫瘍形成性細胞は、ヌードマウスに感染した場合、無制御な増殖特性を示さない。しかし、形質転換細胞はヌードマウスにおいて急速に増殖し、そして腫瘍を生成する。簡単には、１つの実施態様において、アルファウイルスベクター構築物は同系マウス細胞に投与され、続いてヌードマウスに注射される。マウスは、腫瘍増殖を測定するために、注射後の２〜８週間で視覚によって調べられる。マウスはまた屠殺され、そして腫瘍が存在するかどうか決定するために解剖され得る。（Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４８：１５３１−１５３３，１９７２；Ｆｕｒｅｓｚら、Ａｂｎｏｒｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｗ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｒｉｓｋ，ＨｏｐｐｓおよびＰｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ（編）、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９８５；ならびにＬｅｖｅｎｂｏｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔｄ．１３：１３５−１４１，１９８５）。
【０１３１】
腫瘍形成性はまた、軟寒天におけるコロニー形成を視覚化することにより評価され得る（ＭａｃｐｈｅｒｓｏｎおよびＭｏｎｔａｇｎｉｅｒ，Ｖｉｒｏｌ．２３：２９１−２９４，１９６４）。簡単には、正常な非腫瘍形成性細胞の１つの特性は、「接触阻害」である（すなわち、細胞が隣接細胞に接触した場合に、増殖を停止する）。細胞が半固形寒天支持培地にプレートされた場合、正常細胞は急速に接触阻止性になり、そして増殖を停止するが、腫瘍形成性細胞は増殖し続け、そして軟寒天においてコロニーを形成する。
【０１３２】
変化細胞成分が、細胞を腫瘍形成性にすることに関連するのであれば、その時は変化細胞成分を非腫瘍形成性にすることが必要である。例えば、１つの実施態様において、変化細胞成分をコードする目的の配列または遺伝子は、遺伝子産物を非腫瘍形成性にするために短縮される。変化細胞成分をコードする遺伝子は、種々のサイズに短縮され得るが、変化細胞成分をできるだけ保持することが好ましい。さらに、いずれの短縮も、変化細胞成分の少なくともいくつかの免疫原配列をインタクトなままにしておくことが必要である。あるいは、複数の翻訳終結コドンが、免疫原領域の下流に導入され得る。終結コドンの挿入は、タンパク質発現を尚早に終結させ、それによりタンパク質の形質転換部分の発現を妨げる。
【０１３３】
上記のように、適切な免疫応答を生じさせるために、変化細胞成分もまた免疫原性でなければならない。特定の配列の免疫原性はしばしば予測しにくいが、Ｔ細胞エピトープは、しばしば、免疫原性の両親媒性α−ヘリックス成分を有する。しかし、一般的に、アッセイにおいて免疫原性を決定することが好ましい。代表的なアッセイは、新たに導入されたベクターに対する抗体の存在を検出するＥＬＩＳＡ、ならびにＴヘルパー細胞について試験するアッセイ（例えば、γ−インターフェロンアッセイ、ＩＬ−２生成アッセイ、および増殖アッセイ）を含む。
【０１３４】
上記のように、本発明の別の局面において、いくつかの異なる変化細胞成分が、一般的な抗ガン治療を形成するために同時発現され得る。一般的に、種々の組み合せがなされ得ることが、当業者に明らかである。好ましい実施態様において、この治療は、特定の型のガンに標的化され得る。例えば、ほとんど全ての結腸ガンは、ｒａｓ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＡＰＣ、またはＭＣＣ遺伝子において変異を有する。多数のこれらの変化細胞成分を同時発現するアルファウイルスベクター構築物が、全ての可能な変異を処置するために結腸ガン患者に投与され得る。この方法論はまた、他のガンを処置するために利用され得る。従って、ムチン*、ｒａｓ*、ｎｅｕ、ＢＲＣＡ１*、およびｐ５３*を同時発現するアルファウイルスベクター構築物が、乳ガンを処置するために利用され得る。
【０１３５】
（ｂ．外来生物または他の病原体に由来する抗原）
本発明の他の局面において、外来生物または他の病原体に由来する抗原の免疫原部分の発現を指向するベクターが提供される。このような抗原の代表例は、細菌抗原（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、連鎖球菌、ブドウ状球菌、マイコバクテリウムなど）、真菌抗原、寄生体抗原、およびウイルス抗原（例えば、インフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、免疫不全ウイルス（例えば、ネコ免疫不全ウイルス（「ＦＩＶ」）またはヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」））、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ、「ＨＡＶ」、「ＨＢＶ」、および「ＨＣＶ」）、ＲＳウイルス、ヒトパピローマウイルス（「ＨＰＶ」）、エプスタイン−バーウイルス（「ＥＢＶ」）、単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）、ハンタウイルス、ＨＴＬＶ  Ｉ、ＨＴＬＶ  ＩＩ、ならびにサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」））を含む。本発明の状況において利用する「免疫原部分」は、適切な条件下で免疫応答（すなわち、細胞媒介性または体液性）を引き起こし得る、それぞれの抗原の部分をいう。「部分」は、可逆的なサイズであり得るが、好ましくは、少なくとも９アミノ酸長であり、そして全抗原を含み得る。細胞性免疫応答は、主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）クラスＩ提示、ＭＨＣクラスＩＩ提示、またはその両方により媒介され得る。
【０１３６】
本発明の１つの局面において、Ｂ型肝炎抗原の免疫原部分の発現を指向するアルファウイルスベクター構築物が提供される（例えば、ＷＯ  ９３／１５２０７を参照のこと）。Ｂ型肝炎ウイルスは、いくつかの異なる抗原（特に、３つのＨＢ「Ｓ」抗原（ＨＢｓＡｇｓ）、ＨＢｃ抗原（ＨＢｃＡｇ）、ＨＢｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、およびＨＢｘ抗原（ＨＢｘＡｇ）を含む）を示す（Ｂｌｕｍら、ＴＩＧ  ５（５）：１５４−１５８，１９８９を参照のこと）。簡単には、ＨＢｅＡｇは、Ｐ２２プレコア中間体のタンパク質分解切断から生じ、そして細胞から分泌される。ＨＢｅＡｇは、１７ｋＤタンパク質として血清中に見出される。ＨＢｃＡｇは１８３アミノ酸のタンパク質であり、そしてＨＢｘＡｇは、１４５〜１５４アミノ酸のサブタイプに依存するタンパク質である。
【０１３７】
ＨＢｓＡｇｓ（「大」、「中」、および「小」と呼ばれる）は、Ｂ型肝炎ゲノムの３つの領域：Ｓ、プレＳ２、およびプレＳ１によりコードされる。３８９〜４４０アミノ酸で変化する長さを有する大タンパク質は、プレＳ１、プレＳ２、およびＳ領域によりコードされ、そしてグリコシル化形態および非グリコシル化形態で見出される。中タンパク質は２８１アミノ酸長であり、そしてプレＳ２およびＳ領域によりコードされる。小タンパク質は２２６アミノ酸長であり、そしてＳ領域によりコードされる。これは、グリコシル化（ＧＰ２７S）および非グリコシル化（Ｐ２４S）の２つの形態で存在する。これらの領域の各々が別々に発現される場合、プレＳ１領域は、約１１９アミノ酸のタンパク質をコードし、プレＳ２領域は、約５５アミノ酸のタンパク質をコードし、そしてＳ領域は、約２２６アミノ酸のタンパク質をコードする。
【０１３８】
当業者に明らかなように、本明細書中に記載のアルファウイルスベクター構築物の１つにより投与された場合に免疫応答を誘導するために、上記のＳ抗原の種々の免疫原部分が組み合わされ得る。さらに、異なる地域においてＨＢＶのＳオープンリーディングフレームについて見出される大きな免疫学的変化性のために、抗原の特定の組み合わせは、特定の地域における投与に好ましくあり得る。
【０１３９】
ｐｏｌ（「ＨＢＶ  ｐｏｌ」）、ＯＲＦ５、およびＯＲＦ６抗原もまた、ＨＢＶにより示される。簡単には、ＨＢＶのポリメラーゼオープンリーディングフレームは、感染肝臓中のビリオンおよびコア様粒子において見出される逆転写酵素活性をコードする。このポリメラーゼタンパク質は、少なくとも２つのドメイン：逆転写をプライムするタンパク質をコードするアミノ末端ドメイン、および逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ活性をコードするカルボキシル末端ドメインからなる。ＨＢＶ  ｐｏｌの免疫原部分は、本明細書中に記載の方法を利用し、以下に記載のアルファウイルスベクター構築物を利用して決定され得、そして温血動物内での免疫応答を生じさせるために投与され得る。同様に、他のＨＢＶ抗原（例えば。ＯＲＦ５およびＯＲＦ６（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ９：３２２−３２７，１９８９））は、本明細書中に記載のアルファウイルスベクター構築物を利用して発現され得る。
【０１４０】
上記のように、外来生物に由来する抗原の少なくとも１つの免疫原部分は、遺伝子送達ビヒクルに取り込まれる。遺伝子送達ビヒクルに取り込まれる免疫原部分は、種々の長さの変化であり得るが、一般的に、この部分は、少なくとも９アミノ酸長であり、そして全抗原を含み得ることが好ましい。特定の配列の免疫原性は、しばしば予測しにくいが、Ｔ細胞エピトープは、潜在的なＴヘルパー部位およびＣＴＬ部位のコード領域をスキャンするコンピューターアルゴリズム（例えば、ＴＳＩＴＥＳ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））を利用して予測され得る。この解析から、ペプチドが合成され、そしてインビトロ細胞傷害アッセイにおける標的として使用される。しかし、他のアッセイ（例えば、新たに導入されたベクターに対する抗体の存在を検出するＥＬＩＳＡ、ならびにＴヘルパー細胞について試験するアッセイ（例えば、γ−インターフェロンアッセイ、ＩＬ−２生成アッセイ、および増殖アッセイ）を含む）もまた利用され得る。
【０１４１】
免疫原部分はまた、他の方法により選択され得る。例えば、ＨＬＡ  Ａ２．１トランスジェニックマウスは、ウイルス抗原のヒトＴ細胞認識のモデルとして有用であることが示されてきた。簡単には、インフルエンザウイルスおよびＢ型肝炎ウイルス系において、マウスＴ細胞レセプターのレパートリーは、ヒトＴ細胞により認識される同じ抗原決定基を認識する。両方の系において、ＨＬＡ  Ａ２．１トランスジェニックマウスにおいて生じるＣＴＬ応答は、ＨＬＡ  Ａ２．１ハプロタイプのヒトＣＴＬにより認識されるエピトープと実質的に同じエピトープに指向される（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７−１０１５，１９９１；Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｏｆ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ，１９９２）。
【０１４２】
上記のように、１を超える免疫原部分は、遺伝子送達ビヒクルに取り込まれ得る。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｓＡｇｓ、ＨＢｘＡｇの全てまたは免疫原部分、ならびにＨＣＶ抗原Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、またはＮＳ５の免疫原部分を（別々にまたは１構築物としてのいずれかで）発現し得る。
【０１４３】
（７．異種配列の供給源）
上記のタンパク質をコードする配列は、種々の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような寄託機関を含む）から、または商業的供給源（例えば、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））から容易に得られ得る。代表例は、ＢＢＧ１２（１２７アミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）；ＢＢＧ６（γインターフェロンをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ番号３９６５６（ＴＮＦをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ番号２０６６３（αインターフェロンをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ番号３１９０２、３１９０２および３９５１７（βインターフェロンをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ番号６７０２４（インターロイキン−１ｂをコードする配列を含む）；ＡＴＣＣ番号３９４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６、および３９６７３（インターロイキン−２をコードする配列を含む）；ＡＴＣＣ番号５９３９９、５９３９８、および６７３２６（インターロイキン−３をコードする配列を含む）；ＡＴＣＣ番号５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ番号５９３９４および５９３９５（インターロイキン−５をコードする配列を含む）、ならびにＡＴＣＣ番号６７１５３（インターロイキン−６をコードする配列を含む）を含む。
【０１４４】
上記の変化細胞成分をコードする配列は、種々の供給源から容易に得られ得る。例えば、変化細胞産物をコードする配列を含むプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような寄託機関、またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような商業的供給源から得られ得る。上記の配列のいくつかを含むプラスミドの代表例は、ＡＴＣＣ番号４１０００（ｒａｓの１２番目のコドンにおけるＧからＴへの変異を含む）およびＡＴＣＣ番号４１０４９（１２番目のコドンにおけるＧからＡへの変異を含む）を含む。
【０１４５】
あるいは、正常細胞成分をコードするプラスミドもまた、ＡＴＣＣのような寄託機関から得られ（例えば、正常なｒａｓタンパク質をコードする配列を含む、ＡＴＣＣ番号４１００１；ａｂ１をコードする、ＡＴＣＣ番号５７１０３；およびｂｃｒ遺伝子座をコードする、ＡＴＣＣ番号５９１２０または５９１２１を参照のこと）、そして変化細胞成分を形成するために変異され得る。特定の部位で変異誘発するための方法は、当該分野で公知の方法を用いて容易に達成され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１５．３および以下を参照のこと）。特に、正常細胞成分（例えば、ｒａｓ）の点変異は、特定のコドン（例えば、コドン１２、１３、または６１）の部位特異的変異誘発により容易に達成され得る。
【０１４６】
上記のウイルス抗原をコードする配列は、種々の供給源から同様に得られ得る。例えば、ウイルスの分子クローニングされた遺伝子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のような寄託機関から得られ得る。例えば、ＡＴＣＣ番号４５０２０は、（精製デーン粒子から抽出された）Ｂ型肝炎の総ゲノムＤＮＡ（Ｂｌｕｍら、ＴＩＧ  ５（５）：１５４−１５８，１９８９の図３を参照のこと）を、ｐＢＲ３２２（Ｍｏｒｉａｒｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２６０６−２６１０，１９８１）のＢａｍＨＩ部位に含む。
【０１４７】
あるいは、上記の異種配列をコードするｃＤＮＡ配列は、この配列を発現するか、または含む細胞から得られ得る。簡単には、１つの実施態様において、目的の遺伝子を発現する細胞に由来するｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチドｄＴまたはランダムプライマーを用いて逆転写酵素を用いて逆転写される。次いで、１本鎖ｃＤＮＡは、所望の配列の両側の配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号を参照のこと。ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ（編），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９もまた参照のこと）により増幅され得る。特に、２本鎖ＤＮＡは、耐熱性Ｔａｑポリメラーゼ、配列特異的ＤＮＡプライマー、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの存在下で加熱することにより変成される。２本鎖ＤＮＡは、合成が完了した時に生成される。このサイクルは、しばしば多くの回数で繰り返され、所望のＤＮＡの階乗増幅をもたらし得る。
【０１４８】
上記のタンパク質をコードする配列はまた、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＤＮＡ合成機（例えば、ＡＰＢ  ＤＮＡ合成機モデル３９２（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））において合成され得る。
【０１４９】
（Ｇ．アルファウイルスパッケージング／プロデューサー細胞株）
本発明のさらなる局面において、アルファウイルスパッケージング細胞株およびプロデューサー細胞株が提供される。特に、本発明の１つの局面において、アルファウイルスパッケージング細胞株が提供され、ここでウイルス構造タンパク質は、１つ以上の安定形質転換発現ベクターからトランスに供給され、そしてトランスフェクトされたか、形質導入されたか、または細胞内で生成されたベクターＲＮＡ転写物を細胞質においてキャプシドに包み、そして細胞膜を通して感染パッケージングベクター粒子を放出し得る。好ましい実施態様において、パッケージングに必要な構造タンパク質は、ＲＮＡベクターレプリコン自身または他のいくつかの提供される刺激物による誘導の後でしか高レベルで合成されず、そしてこれらの構造タンパク質をコードする転写物は、天然ウイルス感染の発現レベルを模倣するのに十分な発現レベルを可能にするように、細胞質増幅が可能である。さらに、他の実施態様において、選択マーカーの発現は、構造タンパク質発現カセットと作動可能に連結される。このような連結選択マーカーは、機能的な安定形質転換ＰＣＬの効率的な作製を可能にする。
【０１５０】
例えば、パッケージングされる所望の表現型のアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン分子（これ自体は、細胞の細胞質において自己触媒複製が可能である）は、インビトロ転写ＲＮＡ、組換えアルファウイルス粒子、またはアルファウイルスｃＤＮＡベクター構築物としてパッケージング細胞に導入され得る。次いで、ＲＮＡベクター転写物は高レベルに複製し、構造タンパク質遺伝子転写物（単数または複数）増幅およびその後のタンパク質発現を刺激し、続いて、ウイルス構造タンパク質によりパッケージングされ、感染ベクター粒子を生じる。アルファウイルスタンパク質および／またはベクターＲＮＡのあるレベル以上の細胞内発現は、パッケージング細胞株またはプロデューサー細胞株において細胞傷害効果をもたらし得る。従って、本発明の特定の実施態様において、これらの要素は、それらの発現構造タンパク質の細胞傷害性の低減、宿主巨大分子合成の阻害の低減、および／または持続感染を確立する能力について選択されたウイルス変異体に由来することが望ましくあり得る。
【０１５１】
ベクターパッケージング細胞株性能および最終ベクター力価を最適化するために、遺伝子移入およびベクターパッケージングの連続サイクルが行われ得る。例えば、パッケージング細胞株のベクタートランスフェクション由来の感染パッケージングベクター粒子を含む上清を使用して、アルファウイルスパッケージング細胞の新鮮な単層または懸濁培養物を感染または「形質導入」し得る。パッケージングベクター粒子および新鮮なパッケージング細胞を用いた連続形質導入は、細胞へのそのより高いＲＮＡ導入効率、細胞におけるベクターの最適な生物学的位置、およびますます多数のパッケージング細胞からベクター生成プロセスを「拡大」する能力のために、核酸トランスフェクション以上に行われ得る。これは、パッケージング感染組換えアルファウイルスベクターのより高い発現およびより高い力価を導く。
【０１５２】
本発明の他の局面において、安定に組込まれる、またはエピソームにより維持されるＤＮＡ発現ベクターを使用して、アルファウイルスベクターＲＮＡ分子を細胞内で生成し得る。簡単には、このようなＤＮＡ発現ベクターは、好ましい実施態様において、誘導性であるように（アルファウイルスベクターＲＮＡ転写は、細胞が所望の密度まで増殖された場合でしか起こらず、その後に誘導されるように）構成され得る。一旦転写されたら、アルファウイルスベクターは、自己触媒的に自己複製する能力を維持し、そしてパッケージングベクター粒子生成となる事象カスケードを誘発する。このアプローチは、長期の培養にわたって連続したベクター発現を可能にする。なぜなら、組込まれたＤＮＡベクター発現系は薬物または他の選択マーカーにより維持され、そしてＤＮＡ系は一旦誘導されれば、欠損ＲＮＡコピーにより希釈され得ない非変化ＲＮＡベクターレプリコンを構成的に発現するからである。大規模な高力価パッケージングアルファウイルスベクターの生成は、このアルファウイルス「プロデューサー細胞株」構成において可能であり、ＤＮＡに基づくアルファウイルスベクターが最初にトランスフェクションによりパッケージング細胞に導入される。なぜなら、形質導入のためのウイルスベクター粒子への発現ベクターのパッケージングは、サイズ制限により妨げられ得るからである。
【０１５３】
（Ｈ．薬学的組成物）
上記のように、本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、またはレシピエントと組み合せた本明細書中の遺伝子送達ビヒクルを含む薬学的組成物を提供する。例えば、１つの実施態様において、本発明のＲＮＡまたはＤＮＡベクター構築物は、長期貯蔵および輸送のために凍結乾燥され得、そして種々の物質を用いて投与前に再構成され得るが、好ましくは、水を用いて再構成される。ある場合において、最終処方物を等張にする希釈塩溶液もまた使用され得る。さらに、活性を増強するか、または再構成核酸調製物を物理的に保護する成分を含む水溶液を使用することが有利であり得る。このような成分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ポリカチオン（例えば、プロタミン硫酸）、脂質処方物、または他の成分）を含む。凍結乾燥または脱水された組換えベクターは、凍結乾燥または脱水されたサンプルの実質的な、好ましくは全ての可溶化を可能にする、任意の便利な容量の水または上記の再構成剤を用いて再構成され得る。
【０１５４】
組換えアルファウイルス粒子または感染組換えウイルス（両方とも以下でウイルスと呼ばれる）は、粗形態または精製形態のいずれかで保存され得る。粗形態のウイルスを生成するために、生成細胞は、最初に、バイオリアクターまたはフラットストック（ｆｌａｔ
ｓｔｏｃｋ）培養において培養され得、ここでウイルス粒子は、細胞から培養培地に放出される。次いで、ウイルスは、最初に十分な量の処方緩衝液を組換えウイルス含有培養培地に添加して、水性懸濁物を形成することにより粗形態で保存され得る。特定の好ましい実施態様において、処方緩衝液は、水中に糖類、高分子量構造添加剤、および緩衝化成分を含む、水溶液である。この水溶液はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。
【０１５５】
組換えウイルスはまた、精製形態で保存され得る。より詳細には、処方緩衝液の添加前に、上記の粗組換えウイルスは、それをフィルターに通すことにより清澄化され、次いで、例えば、クロスフロー（ｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ）濃縮システム（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）により濃縮され得る。１つの実施態様において、ＤＮアーゼは、外因性ＤＮＡを消化するために濃縮物に添加される。次いで、消化物は、余分な培地成分を除去し、そしてより望ましい緩衝化溶液中に組換えウイルスを確立するためにダイアフィルトレーションされる。次いで、ダイアフィルトレートは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ−５００ゲルカラムに通され、そして精製組換えウイルスは溶出される。次いで、十分な量の処方緩衝液は、構成物の所望の最終濃度に達し、そして組換えウイルスを最小に希釈するために、この溶出物に添加される。次いで、水性懸濁物は、好ましくは−７０℃で貯蔵されるか、または直ぐに乾燥され得る。上記のように、処方緩衝液は、水中に糖類、高分子量構造添加剤、および緩衝化成分を含む水溶液であり得る。この水溶液はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。
【０１５６】
粗組換えウイルスはまた、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製され得る。簡単には、粗組換えウイルスは、最初にそれをフィルターに通し、続いて濾過物を、高スルホン化セルロースマトリクス含有カラムにロードすることにより清澄化され得る。次いで、組換えウイルスは、高塩緩衝液を使用することにより精製形態でカラムから溶出され、そして高塩緩衝液は、溶出物を分子排除カラムに通すことにより、より望ましい緩衝液に交換され得る。次いで、十分な量の処方緩衝液は、上記で議論されるように、精製組換えウイルスに添加され、そして水性懸濁物は、直ぐに乾燥されるか、または好ましくは−７０℃で貯蔵されるかのいずれかである。
【０１５７】
粗形態または精製形態の水性懸濁物は、凍結乾燥または室温での蒸発により乾燥され得る。簡単には、凍結乾燥は、水性懸濁物を、水性懸濁物の気体転移温度以下または共融点温度以下に冷却し、そして昇華により冷却懸濁物から水を除去して、凍結乾燥ウイルスを形成する工程を含む。１つの実施態様において、処方された組換えウイルスのアリコートは、凍結乾燥機（Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ
１２Ｋ）に取り付けられたＥｄｗａｒｄｓ冷凍室（３棚ＲＣ３Ｓユニット）に入れられる。Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １８：４１４，１９８１）により記載の多工程凍結乾燥手順を使用して、処方された組換えウイルスを、好ましくは−４０℃〜−４５℃の温度で凍結乾燥する。得られた組成物は、１０重量％未満の水の凍結乾燥ウイルスを含む。一旦凍結乾燥されたら、組換えウイルスは安定であり、そして以下により詳細に議論されるように−２０℃〜２５℃で貯蔵され得る。
【０１５８】
蒸発方法において、水は、蒸発により室温で水性懸濁物から除去される。１つの実施態様において、水は、スプレードライ（ｓｐｒａｙ−ｄｒｙｉｎｇ）（ＥＰ  ５２０，７４８）により除去される。スプレードライプロセスにおいて、水性懸濁物は予め熱せられた気体（通常、空気）の流れに送達され、その結果、水は、懸濁物小滴から急速に蒸発する。スプレードライ装置は、多数の製造業者（例えば、Ｄｒｙｔｅｃ，Ｌｔｄ．，Ｔｏｎｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｌａｂ−Ｐｌａｎｔ，Ｌｔｄ，．Ｈｕｄｄｅｒｓｆｉｅｌｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手可能である。一旦脱水されると、組換えウイルスは安定であり、そして−２０℃〜２５℃で貯蔵され得る。本明細書中に記載の方法において、乾燥または凍結乾燥ウイルスの得られた水分含有量は、Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｃｈｅｒ装置（ＥＭ
Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｑｕａｓｔａｒ1  Ｖ１Ｂ容量滴定機（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｔ
ｉｔｒａｔｏｒ），Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の使用により、または重量測定法により決定され得る。
【０１５９】
上記のように、処方に使用される水溶液は、好ましくは、糖類、高分子量構造添加剤、緩衝化成分、および水からなる。この溶液はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。これらの成分の組み合わせは、凍結および凍結乾燥または蒸発による乾燥の際に組換えウイルス活性を保存するように作用する。利用され得る１つの糖類はラクトースであるが、同様に、他の糖類（例えば、スクロース、マンニトール、グルコース、トレハロース、イノシトール、フルクトース、マルトース、またはガラクトースを含む）が利用され得る。さらに、糖類の組み合わせ（例えば、ラクトースおよびマンニトール、またはスクロースおよびマンニトール）が使用され得る。ラクトースの特に好ましい濃度は、３重量％〜４重量％である。好ましくは、糖類の濃度は、１重量％〜１２重量％の範囲である。
【０１６０】
高分子量構造添加剤は、凍結間のウイルス凝集の防止を助け、そして凍結乾燥状態または乾燥状態における構造的支持を提供する。本発明の状況において、構造添加剤は、それらが５０００分子量より大きい場合、「高分子量」であるとみなされる。好ましい高分子量構造添加剤は、ヒト血清アルブミンである。しかし、他の物質（例えば、ヒドロキシエチル−セルロース、ヒドロキシメチル−セルロース、デキストラン、セルロース、ゼラチン、またはポビドン）もまた使用され得る。ヒト血清アルブミンの特に好ましい濃度は、０．１重量％である。好ましくは、高分子量構造添加剤の濃度は、０．１重量％〜１０重量％の範囲である。
【０１６１】
アミノ酸は、存在する場合、水性懸濁物の冷却および解凍の際にウイルス感染性をさらに保存するように機能する。さらに、アミノ酸は、冷却水性懸濁物の昇華の間および凍結乾燥状態中、ウイルス感染性をさらに保存するように機能する。好ましいアミノ酸はアルギニンであるが、他のアミノ酸（例えば、リジン、オルニチン、セリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸）もまた使用され得る。特に好ましいアルギニンの濃度は、０．１重量％である。好ましくは、アミノ酸濃度は、０．１重量％〜１０重量％の範囲である。
【０１６２】
緩衝化成分は、比較的一定したｐＨを維持することにより、溶液を緩衝化するために作用する。所望のｐＨ範囲（好ましくは、７．０〜７．８）に依存して、種々の緩衝液が使用され得る。適切な緩衝液は、リン酸緩衝液およびクエン酸緩衝液を含む。組換えウイルス処方物の特に好ましいｐＨは７．４であり、そして好ましい緩衝液はトロメタミンである。
【０１６３】
さらに、水溶液は、最終処方組換えアルファウイルスを適切な等浸透圧塩濃度に合わせるために使用される中性塩を含むことが好ましい。適切な中性塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、または塩化マグネシウムを含む。好ましい塩は、塩化ナトリウムである。
【０１６４】
上記所望の濃度の成分を含む水溶液は、濃縮ストック溶液として調製され得る。
【０１６５】
本明細書中に提供される開示があれば、凍結乾燥ウイルスが室温での貯蔵に意図される場合、水溶液中に特定の糖類を利用することが好ましくあり得ることは当業者に明らかである。より詳細には、特に、室温での貯蔵のために２糖（例えば、ラクトースまたはトレハロース）を利用することが好ましい。
【０１６６】
本発明の凍結乾燥または脱水ウイルスは、種々の物質を用いて再構成され得るが、好ましくは水を用いて再構成される。特定の場合においては、最終処方物を等張にする希釈塩溶液もまた使用され得る。さらに、再構成ウイルスの活性を増強することが知られている成分を含む水溶液を使用することは有利であり得る。このような成分は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）、ポリカチオン（例えば、硫酸プロタミン）、または再構成ウイルスの形質導入効率を増強する他の成分を含む。凍結乾燥または脱水された組換えウイルスは、凍結乾燥または脱水されたサンプルの実質的な、そして好ましくは全ての可溶化を可能にする、任意の便利な容量の水または上記の再構成剤を用いて再構成され得る。
【０１６７】
（Ｉ．遺伝子送達ビヒクルを利用するための方法）
上記のように、本発明はまた、選択された異種配列を、脊椎動物（例えば、哺乳動物（例えば、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットもしくはマウス）））あるいは昆虫に送達するための方法を提供し、この方法は、選択された異種配列を発現し得る本明細書中に記載の遺伝子送達ビヒクルを脊椎動物または昆虫に投与する工程を含む。このような遺伝子送達ビヒクルは、直接（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経口、直腸、眼球内、鼻腔内に）、または種々の物理的方法（例えば、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，１９８９）、直接ＤＮＡ注入（Ｆｕｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３５３−３５７，１９８３；Ｓｅｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５８４９−５８５２；Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１５−８１８，１９９１）；マイクロプロジェクタイルボンバードメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ
８８：２７２６−２７３０，１９９１）；いくつかの型のリポソーム（例えば、Ｗａｎｇら、ＰＮＡＳ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照のこと）；ＣａＰＯ4（Ｄ
ｕｂｅｎｓｋｙら、ＰＮＡＳ  ８１：７５２９−７５３３，１９８４）；ＤＮＡリガンド（Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）；核酸単独投与（ＷＯ  ９０／１１０９２）；または殺傷アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２）；ポリカチオン化合物（例えば、ポリリジン）を介してレセプター特異的リガンドの利用；ならびにプソラレン不活化ウイルス（例えば、センダイウイルスもしくはアデノウイルス）を使用する）によるかのいずれかで投与され得る。さらに、遺伝子送達ビヒクルは、直接（すなわち、インビボで）投与され得るか、または取り出された細胞に（すなわち、エクスビボで）投与され、その後に戻される。
【０１６８】
以下でより詳細に議論されるように、遺伝子送達ビヒクルは、広範な種々の治療目的および／または他の生成目的物のために（例えば、特異的免疫応答を刺激する目的のために；薬剤と宿主細胞レセプターとの相互作用を阻害する目的のために；毒性緩和剤（例えば、条件的毒性緩和剤を含む）を発現するために；免疫系を免疫学的に調節するために；細胞分裂を妨げるために、置換遺伝子治療のためのマーカーを発現するために、創傷治癒を促進するために、および／または組換えタンパク質を生成するために、を含む）脊椎動物または昆虫に投与され得る。これらおよび他の使用は、以下でより詳細に議論される。
【０１６９】
（１．免疫刺激）
本発明の１つの局面において、感染症、ガン疾患、自己免疫疾患、または免疫疾患を予防、阻害、安定化、または逆転し得る遺伝子送達ビヒクルを投与するための組成物および方法が提供される。このような疾患の代表例は、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ  Ｉ、ＨＴＬＶ  ＩＩ、ＣＭＶ、ＥＢＶ、およびＨＰＶ）、黒色腫、糖尿病、対宿主性移植片病、アルツハイマー病ならびに心臓疾患を含む。より詳細には、本発明の１つの局面において、病原因子（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）が殺傷または阻害のいずれかがなされるように、病原因子に対する免疫応答（体液性または細胞媒介性のいずれか）を刺激するための組成物および方法が提供される。病原因子の代表例は、細菌、真菌、寄生体、ウイルス、およびガン細胞を含む。
【０１７０】
本発明の１つの実施態様において、病原因子はウイルスであり、そして（１）ウイルス抗原に対する免疫応答を開始し得るか、または（２）ウイルス相互作用に必要とされる細胞レセプターをふさぐことによりウイルス蔓延を予防し得るかのいずれかである感受性標的細胞に、抗原またはその改変形態の発現に関する遺伝子送達ビヒクルを用いることにより、特異的免疫応答を刺激し、そしてウイルス蔓延を阻害するための方法が提供される。ベクター核酸によりコードされるタンパク質の発現は、一過性であり得るか、または経時的に安定であり得る。病原因子に対する免疫応答が刺激される場合、遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、免疫応答を刺激し、そしてネイティブな抗原と比較して病原性を低減した、改変形態の抗原を発現するように設計される。この免疫応答は、細胞が正しい様式で（すなわち、アクセサリー分子（例えば、ＣＤ３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、またはそのアナログ（例えば、Ａｌｔｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５１２，１９８９））を伴うＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩ分子の状況において）抗原を提示する場合に達成される。遺伝子送達ビヒクルに感染した細胞は、これを効率的に行うことが予測される。なぜなら、遺伝子送達ビヒクルは、本物のウイルス感染を厳密に模倣し、そして（ａ）非複製細胞を感染し得、（ｂ）宿主細胞ゲノムに組込まず、（ｃ）いずれの生命を脅かす疾患とも関連せず、そして（ｄ）高レベルの異種タンパク質を発現するからである。これらの違いのために、遺伝子送達ビヒクルは、ワクチン使用について健常な健康個体において使用され得る安全なウイルスベクターと容易にみなされ得る。
【０１７１】
本発明のこの局面は、提示（ｐｒｅｓｅｎｔｅｒ）細胞が完全に生存能力があり、そして健康であり、そして異種遺伝子と比較して低レベルのウイルス抗原が発現される点で、同様に機能すると予測され得る他の系以上にさらなる利点を有する。これは、発現される抗原エピトープが、抗原遺伝子サブフラグメントの組換えアルファウイルスへの選択的クローニングにより変えられ、免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープにより他の状態で保護され得る免疫原エピトープに対する応答を導き得るので、別個の利点を示す。このようなアプローチは、複数のエピトープ（エピトープの１つ以上は異なるタンパク質に由来する）を有するペプチドの発現に拡大され得る。さらに、本発明のこの局面は、細胞内合成およびこれらのペプチドフラグメントとＭＨＣクラスＩ分子との結合により、抗原エピトープおよび遺伝子サブフラグメントによりコードされる抗原ペプチドフラグメントに対して指向される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の効率的な刺激を可能にする。このアプローチは、ＣＴＬ誘導のための主要な免疫優性エピトープを位置付けるために利用され得る。
【０１７２】
免疫応答はまた、目的の抗原を認識する特異的Ｔ細胞レセプター（必要であれば、適切なＭＨＣ分子の状況における）、目的の抗原を認識する免疫グロブリン、またはＭＨＣ状況の非存在下でＣＴＬ応答を提供する２つのハイブリッドの遺伝子を、適切な免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球）に移すことにより達成され得る。従って、遺伝子送達ビヒクル細胞は、免疫刺激剤、免疫調節剤、またはワクチンとして使用され得る。
【０１７３】
本発明の別の実施態様において、阻害緩和剤を生成するための方法が提供され、ここで遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス組み立てを阻害する欠陥干渉性ウイルス構造タンパク質を送達および発現する。このような遺伝子送達ビヒクルは、欠陥ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、または他のウイルス粒子タンパク質もしくはペプチドをコードし得、そしてこれらは、優勢にウイルス粒子の組み立てを阻害する。これらは、ウイルス粒子の正常サブユニットの相互作用が、欠陥サブユニットとの相互作用により妨げられるために起こる。
【０１７４】
本発明の別の実施態様において、ウイルスプロテアーゼに特異的な阻害ペプチドまたはタンパク質の発現のための方法が提供される。簡単には、ウイルスプロテアーゼは、ウイルスｇａｇおよびｇａｇ／ｐｏｌタンパク質を多数のより小さなペプチドに切断する。全ての場合でのこの切断の失敗は、感染性レトロウイルス粒子生成の完全な阻害を導く。例として、ＨＩＶプロテアーゼは、アスパラギン酸プロテアーゼであることが知られ、そしてこれらは、タンパク質またはアナログに由来するアミノ酸から作られたペプチドにより阻害されることが知られている。ＨＩＶを阻害する遺伝子送達ビヒクルは、このようなペプチドインヒビターの１つまたは複数の融合コピーを発現する。
【０１７５】
別の実施態様は、欠失されたか、変異されたか、または細胞型において発現されなかった場合に、その細胞型において腫瘍形成を導く、サプレッサー遺伝子の送達を含む。遺伝子送達ビヒクルによる欠失遺伝子の再導入は、これらの細胞における腫瘍表現型の後退を導く。このようなガンの例は、網膜芽腫およびウィルムス腫瘍である。悪性腫瘍は、細胞増殖と比較して細胞終末分化の阻害であると考えられるので、腫瘍分化を導く遺伝子産物のアルファウイルスベクター送達および発現もまた、一般的に、後退を導くはずである。
【０１７６】
なお別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、病原機能に対応するＲＮＡ分子を切断し、従って不活化する、リボザイム（ＲＮＡ酵素）（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５，１９８９）を転写することにより治療効果を提供する。リボザイムは、標的ＲＮＡにおける特異的配列を認識することにより機能し、そしてこの配列は通常１２〜１７ｂｐであるので、これは、特定のＲＮＡ種（例えば、ＲＮＡまたはレトロウイルスゲノム）の特異的認識を可能にする。いくつかの場合において、さらなる特異性は、これを条件毒性緩和剤（以下を参照のこと）にすることにより達成され得る。
【０１７７】
阻害緩和剤の有効性を増大させる１つの方法は、問題のウイルスによる耐性細胞感染の可能性を増大させる遺伝子の発現と共に、ウイルス阻害遺伝子を発現することである。この結果は、増殖性感染事象のために完了する、非増殖性「行き止まり（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）」事象である。ＨＩＶの特定の場合において、ＨＩＶ複製を（上記のように、アンチセンスｔａｔなどを発現することにより）阻害し、そしてまた感染に必要とされるタンパク質（例えば、ＣＤ４）を過剰発現する、遺伝子送達ビヒクルが送達され得る。この方法において、比較的少数のベクター感染ＨＩＶ耐性細胞は、遊離ウイルスまたはウイルス感染細胞による複数の非増殖性融合事象の「吸い込み装置（ｓｉｎｋ）」または「引き付けるもの（ｍａｇｎｅｔ）」として作用する。
【０１７８】
（２．ブロッキング剤）
多くの感染症、ガン、自己免疫疾患、および他の疾患は、ウイルス粒子と細胞との、細胞と細胞との、または細胞とそれら自身もしくは他の細胞により生成される因子との相互作用を必要とする。ウイルス感染において、ウイルスは、一般的に、感受性細胞表面上のレセプターを介して細胞に侵入する。ガンまたは他の増殖状態（例えば、再狭窄）において、細胞は、他の細胞からのシグナルもしくは因子と不適切に応答するか、もしくは全く応答しないかもしれないか、または特定の因子は、変異、過剰発現、もしくは過小発現されて、適切な細胞周期制御の喪失をもたらしているかもしれない。自己免疫疾患において、「自己」マーカーの不適切な認識がある。本発明において、このような相互作用は、相互作用におけるパートナーのいずれかに対するアナログをインビボで生成することによりブロックされ得る。あるいは、細胞周期制御は、存在しないか、または過小発現されているブロッキング因子を使用して、１つの期から別の期への（例えば、Ｇ１期からＳ期への）移行を妨げることにより回復され得る。このブロッキング作用は、細胞内で、細胞膜上で、または細胞外で起こり得、そしてブロッキング剤遺伝子を有するアルファウイルスベクターの作用は、感受性細胞内部から、または１バージョンのブロッキングタンパク質を分泌して病原相互作用を局所的にブロックすることによるかのいずれかで媒介され得る。
【０１７９】
ＨＩＶの場合、相互作用の２つの因子は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープタンパク質およびＣＤ４レセプター分子である。従って、適切なブロッカーは、病原効果を引き起こすことなくＨＩＶ侵入をブロックするＨＩＶ  ｅｎｖアナログ、またはＣＤ４レセプターアナログのいずれかを発現する遺伝子送達ビヒクルである。ＣＤ４アナログは分泌され、そして隣接細胞を保護するように機能するが、一方、ｇｐ１２０／ｇｐ４１は、ベクター含有細胞だけを守るように細胞内でのみ分泌または生成される。安定性または補体溶解を増強するために、ＣＤ４に対するヒト免疫グロブリン重鎖または他の成分を添加することは有用であり得る。このようなハイブリッド可溶性ＣＤ４をコードする遺伝子送達ビヒクルの宿主への投与は、安定なハイブリッド分子の連続供給をもたらす。処置効力は、疾患進行の有用な指標（抗体レベル、ウイルス抗原生成、感染ＨＩＶレベル、または非特異的感染レベルを含む）を測定することによりアッセイされ得る。
【０１８０】
無制御な増殖状態（例えば、ガンまたは再狭窄）の場合、細胞周期進行は、サイクリンまたはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によるシグナリングに影響を及ぼす、多数の異なる因子の発現により休止され得る。例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ１６、ｐ２１、およびｐ２７は各々、サイクリン：ＣＤＫにより媒介される細胞周期シグナリングを調節する。遺伝子送達ビヒクルによる細胞内でのこれらの因子の過剰発現は、細胞増殖の細胞増殖抑制性の抑制をもたらす。細胞増殖を妨げるためのブロッキング剤または標的として、治療上使用され得る他の因子は、例えば、野生型または変異体Ｒｂ、ｐ５３、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ＧＡＸ、レンチウイルスｖｐｒ、およびｐ１５を含む。関連する実施態様において、心臓血管疾患（例えば、再狭窄またはアテローム性動脈硬化症）は、再内皮化（ｒｅ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）または血管再造形を促進する産物（例えば、ＶＥＧＦ、ＴＦＰＩ、ＳＯＤ）を発現するベクターを用いて処置または予防され得る。
【０１８１】
（３．緩和剤の発現）
上記のものと同様の技術を使用して、病原因子または遺伝子の機能を阻害し得る薬剤（または「緩和剤」）の発現に関する、遺伝子送達ビヒクルを生成し得る。本発明において、「機能を阻害し得る」は、緩和剤が直接的に機能を阻害することか、または間接的に（例えば、細胞に存在する薬剤を、病原因子機能を通常阻害しない薬剤から阻害する薬剤に変換することにより）阻害すること、いずれかを意味する。ウイルス疾患についての、このような機能の例は、吸着、複製、遺伝子発現、組み立て、および感染細胞からウイルスが出ることを含む。ガン細胞、ガン促進増殖因子、または無制御な増殖状態（例えば、再狭窄）についての、このような機能の例は、生存能力、細胞複製、外部シグナル（例えば、接触阻止）に対する変化した感受性、および抗ガン遺伝子タンパク質生成の欠如またはその変異形態の生成を含む。
【０１８２】
（ａ．インヒビター緩和剤）
本発明の１つの局面において、遺伝子送達ビヒクルは、例えば、ウイルス疾患または悪性疾患において、病原因子の機能を妨げ得る遺伝子の発現に関する。このような発現は、本質的に、連続的であるか、または病原状態もしくは特定の細胞型のいずれかと関連する別の因子（「同定因子（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」）の細胞における存在に応答するかのいずれかであり得る。さらに、ベクター送達は、ベクター侵入を、上記で議論されたように所望の細胞型（例えば、ウイルス感染細胞または悪性細胞）に特異的に標的化することにより制御され得る。
【０１８３】
投与の１つの方法は、白血球伝達（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）であり、ここで個体のＰＢＬの約２０％はどの時点においても取り出され、そしてインビトロで操作される。従って、約２×１０9個の細胞が処理され得、そして取り替えられ得る。反復処理もまた
行われ得る。あるいは、骨髄が上記のように処置され、そしてその効果を増幅させられ得る。さらに、ベクターを生成するパッケージング細胞株は被験体に直接注射され、組換えビリオンの連続生成を可能にし得る。
【０１８４】
１つの実施態様において、重要な病原遺伝子転写物（例えば、ウイルス遺伝子産物または活性化細胞ガン遺伝子）に相補的なＲＮＡを発現する遺伝子送達ビヒクルを使用して、その転写物のタンパク質への翻訳を阻害し得る（例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の翻訳阻害）。このタンパク質の発現はウイルス複製に必須であるので、この遺伝子送達ビヒクルを含む細胞はＨＩＶ複製耐性である。
【０１８５】
第２の実施態様において、病原因子がパッケージングシグナルを有する１本鎖ウイルスである場合、ウイルスパッケージングシグナル（例えば、緩和剤がＨＩＶに対して指向される場合、ＨＩＶパッケージングシグナル）に相補的なＲＮＡが発現され、その結果、これらの分子とウイルスパッケージングシグナルとの結合は、レトロウイルスの場合、アルファウイルスＲＮＡゲノムの正しいキャプシド包膜（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）または複製に必要とされる、ステムループ形成またはｔＲＮＡプライマー結合を阻害する。
【０１８６】
第３の実施態様において、病原遺伝子の発現を選択的に阻害し得る緩和剤、または病原因子により生成されるタンパク質の活性を阻害し得る緩和剤を発現する、遺伝子送達ビヒクルが導入され得る。ＨＩＶの場合、１つの例は、ＨＩＶ  ＬＴＲからの発現をトランス活性化する能力を欠き、そしてｔａｔタンパク質の正常機能を（トランス優性（ｔｒａｎｓｄｏｍｉｎａｎｔ）の様式で）妨げる、変異体ｔａｔタンパク質である。このような変異体は、ＨＴＬＶ  ＩＩ  ｔａｔタンパク質について同定された（「ＸＩＩ  Ｌｅｕ5」
変異体；Ｗａｃｈｓｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：６７４，１９８７を参照のこと）。変異体トランスリプレッサーｔａｔは、ＨＳＶ−１の類似変異体リプレッサーについて示された（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４５２，１９８８）のと同じくらい複製を阻害するはずである。
【０１８７】
このような転写リプレッサータンパク質は、その発現が（上記のような）ウイルス特異的トランス活性化タンパク質により刺激される、任意のウイルス特異的転写プロモーターを用いて組織培養において選択され得る。ＨＩＶの特定の場合において、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質、およびＨＩＶプロモーターにより駆動されるＨＳＶＴＫ遺伝子を発現する細胞株は、ＡＣＶの存在下で死ぬ。しかし、一連の変異ｔａｔ遺伝子がこの系に導入された場合、適切な特性を有する（すなわち、野生型ｔａｔ存在下でＨＩＶプロモーターからの転写を抑制する）変異体は増殖し、そして選択される。次いで、変異体遺伝子は、これらの細胞から再単離され得る。条件致死ベクター／ｔａｔ系の複数コピーを含む細胞株は、細胞クローンの生存が、これらの遺伝子における内因性変異により引き起こされないことを確実にするために使用され得る。次いで、一連のランダム変異誘発されたｔａｔ遺伝子は、「レスキュー可能な」アルファウイルスベクター（すなわち、変異体ｔａｔタンパク質を発現し、そして細菌における増殖および選択のために細菌複製起点および薬物耐性マーカーを含む、ベクター）を用いて、これらの細胞に導入される。これは、多数のランダム変異が評価されることを可能にし、そして所望の変異体細胞株の容易なそれに続く分子クローニングを可能にする。この手順を使用して、潜在的な抗ウイルス治療のための、種々のウイルス転写アクチベーター／ウイルスプロモーター系における変異を同定および利用し得る。
【０１８８】
（ｂ．条件毒性緩和剤）
病原因子を阻害するための別のアプローチは、病原状態を示す細胞に対して毒性の緩和剤を発現することである。この場合、遺伝子送達ビヒクルからの緩和剤の発現は、非病原細胞の破壊を避けるために、病原因子に関連する物（例えば、病原状態を同定する特異的ウイルスＲＮＡ配列）の存在により制限されるべきである。
【０１８９】
この方法の１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、（上記で議論されたような）毒性遺伝子を細胞特異的応答ベクターから発現するために利用され得る。このように、細胞特異的応答ベクターを活性化し得るＲＮＡ配列を含む、急速に複製する細胞は、遺伝子送達ビヒクルにより生成される細胞傷害剤により優先的に破壊される。
【０１９０】
前述の実施態様と同様に、この遺伝子送達ビヒクルは、プリンまたはピリミジンに基づく薬物のリン酸化、ホスホリボシル化、リボシル化、または他の代謝についての遺伝子を有し得る。この遺伝子は、哺乳動物細胞において等価物を有さないかもしれず、そしてウイルス、細菌、真菌、または原生動物のような生物から生じ得る。この例は、チオキサンチンの存在下で致死性である、Ｅ．ｃｏｌｉグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子産物である（Ｂｅｓｎａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４１３９−４１４１，１９８７を参照のこと）。この型の条件致死遺伝子産物（上記の「プロドラック変換酵素」とも呼ばれる）は、効果的な細胞傷害剤になるために細胞内リボシル化またはリン酸化をしばしば必要とする、多くの現在公知のプリンまたはピリミジンに基づく抗ガン薬物に対する適用を有する。条件致死遺伝子産物はまた、プリンまたはピリミジンアナログでない非毒性薬物を、細胞傷害形態に代謝し得る（Ｓｅａｒｌｅら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：３７７−３８４，１９８６を参照のこと）。
【０１９１】
一般的に、哺乳動物ウイルスは、他のウイルスプロモーターエレメントからの後の転写活性化に必要な、「前初期」遺伝子を有する傾向がある。この性質のＲＮＡ配列は、ウイルス感染のアルファウイルスベクター細胞内シグナル（または「同定因子」）を活性化するための優れた候補である。従って、これらのウイルス「即時初期」遺伝子産物に応答するアルファウイルス細胞特異的ベクターから発現される条件致死遺伝子は、任意の特定のウイルスに感染した細胞を特異的に殺傷し得る。さらに、ヒトおよびインターフェロンプロモーターエレメントは、広範な種々の非関連ウイルスによる感染に応答して転写活性化されるので、例えば、インターフェロン生成に応答してＨＳＶＴＫのような条件致死遺伝子産物を発現するベクターの導入は、種々の異なるウイルスに感染した細胞の破壊をもたらし得る。
【０１９２】
本発明の別の局面において、他の点で不活性な前駆体を、病原因子の活性なインヒビターに活性化し得る遺伝子産物の発現に関する、遺伝子送達ビヒクルが提供される。例えば、ＨＳＶＴＫ遺伝子産物を使用して、潜在的に抗ウイルス性のヌクレオシドアナログ（例えば、ＡＺＴまたはｄｄＣ）を、より効果的に代謝し得る。ＨＳＶＴＫ遺伝子は、細胞特異的応答ベクターの制御下で発現され得、そしてこれらの細胞型に導入され得る。ＡＺＴ（および他のヌクレオシド抗ウイルス薬）は、レトロウイルス逆転写酵素、従ってＨＩＶ複製を特異的に阻害するために、細胞機構によりヌクレオチド３リン酸形態に代謝されなければならない（Ｆｕｒｍａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８３３３−８３３７，１９８６）。ＨＳＶＴＫ（非常に広い基質特異性を有する、ヌクレオシドおよびヌクレオシドキナーゼ）の構成性発現は、これらの薬物の、それらの生物学的に活性なヌクレオチド３リン酸形態へのより効果的な代謝をもたらす。それによりＡＺＴまたはｄｄＣ治療は、より効果的であり、より少ない用量、より少ない全身毒性、および増殖性感染に対するより高い効力を可能にする。そのヌクレオチド３リン酸形態がレトロウイルス逆転写酵素に対して感受性を示すが、細胞のヌクレオシドおよびヌクレオチドキナーゼの基質特異性の結果としてリン酸化されない、さらなるヌクレオシドアナログは、より効力があるようにされる。
【０１９３】
これらの遺伝子送達ビヒクルのヒトＴ細胞およびマクロファージ／単球細胞株への投与は、レトロウイルスベクター処理のない同じ細胞と比較して、ＡＺＴおよびｄｄＣ存在下でのそれらのＨＩＶ耐性を増大させ得る。ＡＺＴでの処置は、毒性副作用を避けるために標準レベルより低いが、ＨＩＶ蔓延をさらに効率的に阻害する。処置経過は、ブロッカーについて記載された通りである。
【０１９４】
１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、本来毒性ではないが、ウイルスまたは他の病原体に特異的なタンパク質（例えば、プロテアーゼ）によりプロセシングまたは改変された場合に、毒性形態に変換される産物を特定する遺伝子を有する。例えば、遺伝子送達ビヒクルは、リシンＡ鎖のプロタンパク質をコードする遺伝子を有し得、これは、ＨＩＶプロテアーゼによるプロセシングの際に毒性になる。より詳細には、毒性リシンまたはジフテリアＡ鎖の合成不活性プロタンパク質形態は、ＨＩＶウイルスによりコードされるプロテアーゼが適切な「プロ」エレメントを認識および切断するように準備することにより、活性形態に切断され得る。
【０１９５】
別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、細胞における同定因子の存在（例えば、ウイルス遺伝子の発現）に応答して、標的細胞表面上に「レポーティング産物」を発現し得る。この表面タンパク質は、細胞傷害剤（例えば、レポーティングタンパク質の抗体）により、または細胞傷害性Ｔ細胞により認識され得る。同様に、このような系は、同定タンパク質を発現する特定の遺伝子を有するこれらの細胞を簡単に同定するための検出系（以下を参照のこと）として使用され得る。
【０１９６】
同様に、別の実施態様において、それ自体が治療上有益な表面タンパク質が発現され得る。ＨＩＶの特定の場合において、特にＨＩＶ感染細胞におけるヒトＣＤ４タンパク質の発現は、以下の２つの点で有益であり得る：
１．細胞内のＣＤ４のＨＩＶ  ｅｎｖへの結合は、可溶性ＣＤ４が遊離ウイルスに対して阻害することが示されたのと同じくらいであるが、系統的なクリアランスおよび可能な免疫原性の問題なく、生存能力のあるウイルス粒子の形成を阻害し得る。なぜならこのタンパク質は膜に結合したままであり、そして（患者が免疫学的に寛容であるはずの）内因性ＣＤ４と構造的に同一であるからである。
【０１９７】
２．ＣＤ４／ＨＩＶ  ｅｎｖ複合体は細胞死の原因として関与してきたので、（ＨＩＶ感染細胞に存在する過剰なＨＩＶ−ｅｎｖの存在下での）ＣＤ４のさらなる発現はより迅速な細胞死を導き、従って、ウイルス播種を阻害する。これは、特に、ＨＩＶ誘導細胞傷害性に対するそれらの相対的な抵抗性（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｉｔｙ）（これは、順に、明らかに、それらの細胞表面上の相対的なＣＤ４欠如のためである）の結果として、ウイルス生成のための貯蔵庫（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）として作用する単球およびマクロファージに適用可能であり得る。
【０１９８】
別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、ベクター感染細胞の生存能力に必須のＲＮＡ分子を切断および不活化するリボザイムを提供し得る。リボザイム生成を、病原状態と対応する特異的ＲＮＡ配列（例えば、ＨＩＶ  ｔａｔ）依存性にすることにより、毒性は病原状態に特異的である。
【０１９９】
（４．マーカー発現）
特異的ＲＮＡ配列に応答して細胞において緩和剤を発現する上記の技術はまた、同定タンパク質を発現する細胞における特定の遺伝子（例えば、特定のウイルスにより有される遺伝子）の検出を可能にし、従って、そのウイルスを有する細胞の検出を可能にするように改変され得る。さらに、この技術は、ウイルスと関連する同定タンパク質を有する細胞の臨床サンプル中のウイルス（例えば、ＨＩＶ）の検出を可能にする。
【０２００】
この改変は、産物をコードするゲノムを提供することにより達成され得、この存在は、感染細胞における同定タンパク質の存在に応答する遺伝子送達ビヒクルにおいて容易に同定され得る（「マーカー産物」）。例えば、ＨＩＶが適切な細胞を感染すると、ｔａｔおよびｒｅｖを作る。従って、指標細胞は、ｔａｔおよび／またはｒｅｖ  ＲＮＡ転写物による活性化の際に組換えアルファウイルスにより発現されるマーカー遺伝子（例えば、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、またはルシフェラーゼ遺伝子）をコードするゲノムを用いて（例えば、適切な組換えアルファウイルス感染により）提供され得る。β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼの場合、細胞の基質アナログへの暴露は、サンプルがＨＩＶ陽性であれば、色または蛍光変化をもたらす。ルシフェラーゼの場合、サンプルのルシフェリンへの暴露は、サンプルがＨＩＶ陽性であれば、ルミネセンスをもたらす。細胞内酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ）については、ウイルス力価は、着色細胞または蛍光細胞を数えることによるか、細胞抽出物を作り、そして適切なアッセイを行うことにより、直接測定され得る。膜結合形態のアルカリホスファターゼについては、ウイルス力価はまた、蛍光基質を用いて細胞表面上で酵素アッセイを行うことにより測定され得る。分泌酵素（例えば、操作された形態のアルカリホスファターゼ）については、培養上清の少量サンプルが活性についてアッセイされ、これは、経時的に単一培養物を連続モニタリングすることを可能にする。従って、このマーカー系の異なる形態は、異なる目的のために使用され得る。これらは、活性ウイルスを数えることか、または培養物中のウイルス蔓延および種々の薬物によるこの蔓延の阻害を、感度よくおよび簡単に測定することを含む。
【０２０１】
ウイルスの存在を、そのウイルスに対する中和抗体の存在下または非存在下のいずれかで試験することにより、さらなる特異性が前述の系に組込まれ得る。例えば、試験される臨床サンプルの一部において、ＨＩＶに対する中和抗体は存在し得るが；別の部分において中和抗体はない。この試験が、抗体がある系において陰性であり、そして抗体がない系において陽性であれば、これは、ＨＩＶの存在を確かめるのを助けるだろう。
【０２０２】
インビトロアッセイのための類似する系において、特定の遺伝子（例えば、ウイルス遺伝子）の存在は、細胞サンプル中で決定され得る。この場合、サンプルの細胞を、適切なウイルスＲＮＡ転写物の存在下でのみ発現されるレポーター遺伝子を有する適切な遺伝子送達ビヒクルに感染させる。サンプル細胞への侵入後、レポーター遺伝子は、宿主細胞が適切なウイルスタンパク質を発現する場合にのみ、そのレポーティング産物（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）を発現する。
【０２０３】
これらのアッセイは、より迅速でかつ感度が高い。なぜなら、レポーター遺伝子は、存在する同定因子より多量のレポーティング産物を発現し得、増幅効果をもたらすからである。
【０２０４】
（５．免疫ダウンレギュレーション）
上記のように、本発明はまた、アルファウイルスに感染した標的細胞において免疫系の１つ以上の要素を抑制し得る遺伝子送達ビヒクルを提供する。簡単には、慢性肝炎または異種組織（例えば、骨髄）移植片におけるような不適切なまたは所望でない免疫応答の特異的ダウンレギュレーションは、移植（ＭＨＣ）抗原の表面発現を抑制する免疫抑制ウイルス遺伝子産物を用いて操作され得る。Ｃ群アデノウイルスＡｄ２およびＡｄ５は、ウイルスのＥ３領域にコードされる１９ｋｄ糖タンパク質（ｇｐ１９）を有する。このｇｐ１９分子は、細胞の小胞体においてクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合し、そしてクラスＩ  ＭＨＣの末端グリコシル化およびその細胞表面への移動を妨げる。例えば、骨髄移植の前に、ドナー骨髄細胞を、ｇｐ１９発現の際にＭＨＣ  クラスＩ移植抗原の表面発現を阻害する、ｇｐ１９コード遺伝子送達ビヒクルに感染させ得る。これらのドナー細胞は、低い危険性の移植片拒絶を伴って移植され得、そして移植患者のために最小の免疫抑制レジメを必要とし得る。これは、合併症がより少なく、受容可能なドナー−レシピエントキメラ状態が存在することを可能にし得る。同様の処置を使用して、いわゆる自己免疫疾患（ループス  エリテマトーデス（ｅｒｙｔｈｒｏｍｉａｔｉｓ）、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、または慢性Ｂ型肝炎感染を含む）の範囲を処置し得る。
【０２０５】
代替方法は、事実上自己反応性の、Ｔ細胞クローンに特異的なアンチセンスメッセージ、リボザイム、または他の特異的遺伝子発現インヒビターの使用を含む。これらは、自己免疫応答を担う特定の所望でないクローンのＴ細胞レセプター発現をブロックする。アンチセンス、リボザイム、または他の遺伝子は、ウイルスベクター送達系を用いて導入され得る。
【０２０６】
（６．置換または増加遺伝子治療）
本発明の１つのさらなる局面は、脊椎動物または昆虫の細胞を、治療タンパク質を発現し得る遺伝子配列を供給する遺伝子送達ビヒクルで形質転換することに関する。本発明の１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、代謝、免疫調節、ホルモン調節、酵素機能、または膜関連構造機能における遺伝性または非遺伝性の遺伝子欠陥を予防、阻害、安定化、または逆転し得る治療タンパク質を発現するように設計される。この実施態様はまた、個々の細胞を形質導入し得る遺伝子送達ビヒクルを説明し、それにより治療タンパク質は、全身的に、または特定の細胞もしくは組織から局所的に発現され得、それにより治療タンパク質は、（ａ）欠失した、もしくは欠陥のある細胞タンパク質もしくは酵素の置換、または（ｂ）欠陥のある、もしくは低発現細胞タンパク質もしくは酵素の補充生成、が可能である。このような疾患は、嚢胞性線維症、パーキンソン病、高コレステロール血症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、β−グロブリン病、血友病ＡおよびＢ、ゴシェ病、糖尿病、および白血病を含み得る。
【０２０７】
本発明の例として、遺伝子送達ビヒクルを構築および利用して、ゴシェ病を処置し得る。簡単には、ゴシェ病は、グルコセレブロシダーゼ酵素欠損により特徴付けられる遺伝病である。この型の治療は、機能的細胞酵素を提供することによる、単一遺伝子置換治療の例である。この酵素欠損は、身体内全細胞のリソソーム中にグルコセレブロシド蓄積を導く。しかし、疾患表現型は、この疾患の非常に稀な神経障害形態を除いて、マクロファージにおいてのみ顕著である。この疾患は、通常、肝臓および脾臓の腫脹ならびに骨損傷を導く（概説については、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：７９４，１９９２およびＴｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第６版，Ｓｃｒｉｖｅｒら、第２巻，１６７７頁を参照のこと）。
【０２０８】
同様に、遺伝子送達ビヒクルを利用して、広範な種々の治療タンパク質を送達し、疾患または疾患プロセスを処置、治癒、予防し得る。このような遺伝子の代表例は、インシュリン（Ｕ．Ｓ．４，４３１，７４０およびＢＥ  ８８５１５９６Ａを参照のこと）、ヘモグロビン（Ｌａｗｎら、Ｃｅｌｌ  ２１：６４７−５１，１９８０）、エリスロポエチン（ＥＰＯ；Ｕ．Ｓ．４，７０３，００８を参照のこと）、巨核球増殖および分化因子（ＭＧＤＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：４１５−４１８，１９８６）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ（ＷＯ  ８７０６９５４を参照のこと）、ｆｌｔ３リガンド（Ｌｙｍａｎら（１９９３），Ｃｅｌｌ  ７５：１１５７−１１６７）、ＥＧＦ、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキンまたはインターフェロンファミリーのメンバー（前述）、神経栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：１２８９−１２９４，１９９１、ＮＴ−３；ＷＯ  ９１０３５６９を参照のこと、ＣＮＴＦ；ＷＯ  ９１０４３１６を参照のこと、ＮＧＦ；ＷＯ  ９３１０１５０を参照のこと）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）、血栓崩壊因子（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）（例えば、ｔ−ＰＡ（ＥＰ  ２９２００９、ＡＵ  ８６５３３０２、およびＥＰ  １７４８３５を参照のこと）およびストレプトキナーゼ（ＥＰ  ４０７９４２を参照のこと））、ヒト成長ホルモン（ＪＰ  ９４０３０５８２およびＵ．Ｓ．４，７４５，０６９を参照のこと）および他の動物ソマトトロピン、インテグリンおよび他の細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ）（上記で議論された、他の「異種配列」もまた参照のこと）、ならびに他の増殖因子（例えば、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−１（Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２０８５−２０９３，１９９０、ならびに他の骨形態発生タンパク質（例えば、ＢＭＰ−４，Ｎａｋａｓｅら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９：６５１−６５９，１９９４））を含むが、それらに限定されない。
【０２０９】
（７．リンホカインおよびリンホカインレセプター）
上記のように、本発明はまた、数ある機能の中で、１つ以上のサイトカインまたはサイトカインレセプターの発現を指向し得る遺伝子送達ビヒクルを提供する。簡単には、サイトカインは、ガン治療剤としてのそれらの役割に加えて、ある病理状態をもたらす負の効果を有し得る。例えば、たいていの休止Ｔ細胞、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、および単球は、ＩＬ−２Ｒ（レセプター）を発現しない。正常休止細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現の欠如とは対照に、ＩＬ−２Ｒは、ある白血病（ＡＴＬ、ヘアリーセル、ホジキン、急性および慢性顆粒球性）、自己免疫疾患を有する患者の異常細胞により発現され、そして同種移植拒絶と関連する。興味深いことに、これらの患者の大部分において、可溶性形態のＩＬ−２Ｒの血清濃度は上昇している。従って、本発明の特定の実施態様において、可溶性形態のサイトカインレセプターの血清濃度を増大させることにより、治療がもたらされ得る。例えば、ＩＬ−２Ｒの場合、遺伝子送達ビヒクルは、可溶性ＩＬ−２ＲおよびＩＬ−２Ｒの両方を生成して、高親和性可溶性レセプターを作り出すように操作され得る。この構成において、血清ＩＬ−２レベルは減少し、パラクリンループを阻害する。この同じストラテジーはまた、自己免疫疾患に対して効果的であり得る。特に、いくつかの自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ）もまたＩＬ−２の異常発現と関連するので、レセプターの血清レベルを増大させることによるＩＬ−２作用のブロックはまた、このような自己免疫疾患を処置するために利用され得る。
【０２１０】
他の場合、ＩＬ−１レベルの阻害が有益であり得る。簡単には、ＩＬ−１は、２つのポリペプチドＩＬ−１およびＩＬ−１からなり、これらの各々は、多面的効果（ｐｌｉｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を有する。ＩＬ−１は、主に、細菌生成物または炎症による刺激に応答して単核食細胞により合成される。ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（「ＩＬ−１Ｒａ」）と呼ばれる、ＩＬ−１Ｒの天然に生じるアンタゴニストがある。このＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、成熟ＩＬ−１と同じ分子サイズを有し、そして構造的にそれと関連する。しかし、ＩＬ−１ＲａのＩＬ−１Ｒへの結合は、いずれのレセプターシグナリングも開始しない。従って、この分子は、可溶性レセプターと異なる作用機構を有し、これは、サイトカインと複合体化し、従って、レセプターとの相互作用を妨げる。ＩＬ−１は、正常なホメオスタシスにおいて重要な役割を果たさないらしい。動物において、ＩＬ−１レセプターに対する抗体は、内毒素および他の炎症誘導因子による炎症および食欲不振を低減する。
【０２１１】
敗血症性ショックの場合、ＩＬ−１は、強力な血管拡張薬である２次化合物を誘導する。動物において、外部から供給されたＩＬ−１は平均動脈圧を減少させ、そして白血球減少を誘導する。ＩＬ−１に対する中和抗体は、動物において内毒素により誘導される熱を低減した。３日間一定注入のＩＬ−１Ｒで処置された敗血症性ショック患者の研究において、２８日死亡率は、偽薬注入を受けた患者の４４％と比較して１６％であった。自己免疫疾患の場合、ＩＬ−１活性の低減は炎症を低減する。同様に、ＩＬ−１活性の組換えレセプターでのブロックは、さらに、恐らく炎症を減少させることにより、動物における同種移植片生存の増大をもたらし得る。
【０２１２】
これらの疾患は、遺伝子送達ビヒクルが可溶性レセプターまたはより詳細にはＩＬ−１Ｒａ分子を生成するように操作され得る、さらなる例を提供する。例えば、敗血症性ショックにかかっている患者において、ＩＬ−１Ｒａ生成ベクター粒子の単一注射は、組換えＩＬ−１Ｒの一定注入を必要とする現在のアプローチに取って代わり得る。
【０２１３】
サイトカイン応答、またはより詳細には間違ったサイトカイン応答はまた、感染症を管理または消散することの失敗に関与し得る。恐らく、最もよく研究された例は、強力であるが逆効果のＴH２優位応答を有する、マウスおよびヒトリーシュマニア症の非治癒形態
である。同様に、らい腫らい病は、優位であるが、不適切なＴH２応答と関連する。これ
らの条件において、固形腫瘍治療のために提案された位置指定アプローチとは反対に、遺伝子送達ビヒクルは、ＩＦＮγの循環レベルを増大させるのに有用であり得る。ＩＦＮγはＴH−１  Ｔ細胞により生成され、そしてＴH−２サブタイプ増殖の負のレギュレーターとして機能する。ＩＦＮγはまた、Ｂ細胞に対するＩＬ−４媒介効果（ＩｇＥへのアイソタイプスイッチを含む）の多くに拮抗する。
【０２１４】
ＩｇＥ、マスト細胞、および好酸球は、アレルギー反応の媒介に関与する。ＩＬ−４は、ＴH−２発達を刺激するように、分化しているＴ細胞に作用するが、一方、ＴH−１応答を阻害する。従って、アルファウイルスに基づく遺伝子治療はまた、従来のアレルギー治療と共に達成され得る。１つの可能性は、少量のオフェンディングアレルゲン（ｏｆｆｅｎｄｉｎｇ  ａｌｌｅｒｇｅｎ）（すなわち、伝統的なアレルギーショット）と共に、ＩＬ４Ｒを生成する遺伝子送達ビヒクルを送達することである。可溶性ＩＬ−４ＲはＩＬ−４活性を妨げ、従って、強力なＴH−２応答の誘導を妨げ得る。
【０２１５】
（８．自殺ベクター）
本発明の１つのさらなる局面は、パッケージング／プロデューサー細胞株における野生型アルファウイルス蔓延を制限するための、遺伝子送達ビヒクル自殺ベクターの使用に関する。簡単には、１つの実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、ベクター接合領域の３’配列とパッケージング細胞株発現ベクターの５’アルファウイルス構造配列との間のＲＮＡ組換え事象から作製される野生型アルファウイルス配列に特異的な、アンチセンスまたはリボザイム配列からなる。アンチセンスまたはリボザイム分子は、特異的組換え配列の存在下でのみ耐熱性であり、そしてアルファウイルスパッケージング／プロデューサー細胞株にいずれの他の影響も及ぼさない。あるいは、毒性分子（例えば、本明細書中に開示される毒性分子）もまた、野生型アルファウイルスの存在下でしか発現しないベクターの状況において発現され得る。
【０２１６】
（９．転移性腫瘍の蔓延を予防するための遺伝子送達ビヒクル）
本発明の１つのさらなる局面は、悪性新生物の侵襲性を阻害または低減するための遺伝子送達ビヒクルの使用に関する。簡単には、悪性度は、代表的に、腫瘍の血管化に関連する。腫瘍血管化の１つの原因は、いくつかの腫瘍により発現される、可溶性腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）（Ｐａｗｅｌｅｔｚら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９：１９７，１９８９）の生成である。本発明の１つの局面において、腫瘍血管化は、ＴＡＦに特異的なアンチセンスまたはリボザイムＲＮＡ分子を発現する遺伝子送達ビヒクルを利用して、遅らされ得る。あるいは、腫瘍血管化を遅くするか、または阻害するために、抗血管新生因子（Ｍｏｓｅｓら、Ｓｉｅｎｃｅ  ２４８：１４０８，１９９０；Ｓｈａｐｉｒｏら、ＰＮＡＳ  ８４：２２３８，１９８７）は、単独で、または上記のリボザイムもしくはアンチセンス配列と組み合せてのいずれかで発現され得る。あるいは、遺伝子送達ビヒクルはまた、周囲組織におけるＴＡＦレセプターに特異的な抗体を発現するために使用され得る。
【０２１７】
（１０．遺伝子送達ビヒクルの投与）
本発明の１つの局面において、遺伝子送達ビヒクルを脊椎動物または昆虫に投与するための方法が提供される。簡単には、遺伝子送達ビヒクル投与の最終的な態様は、通常、特定の治療適用、ベクター効力を増大させる最良の態様、および最も便利な投与経路による。一般的に、この実施態様は、例えば、（１）血流への直接注射；（２）特定の組織または腫瘍への直接注射；（３）経口投与；（４）鼻吸入；（５）粘膜組織への直接適用；または（６）形質導入自己細胞の脊椎動物または昆虫へのエクスビボ投与により送達されるように設計され得る、遺伝子送達ビヒクルを含む。本発明の特定の実施態様において、エクスビボ適用のために、細胞は、最初に宿主から取り出され、少なくとも部分的に精製された細胞（例えば、ＣＤ３４+幹細胞、Ｔ細胞など）の集団を得るために正および／また
は負に選択され、本発明の遺伝子送達ビヒクルで形質導入されるか、トランスフェクトされるか、またはそれに感染させられ、そして同じ宿主または別の個体のいずれかに再導入され得る。
【０２１８】
従って、治療遺伝子送達ビヒクルは、ベクターが、（ａ）正常健康細胞を形質導入し、そしてこの細胞を、全身的または局所的に分泌される治療タンパク質または薬剤のプロデューサーに形質転換し得る、（ｂ）異常または欠陥のある細胞を形質転換して、この細胞を正常機能表現型に形質転換し得る、（ｃ）異常細胞を形質転換して、それを破壊し得る、そして／または（ｄ）細胞を形質導入して、免疫応答を操作し得るように、投与され得る。
【０２１９】
（１１．転写因子活性の調節）
さらに別の実施態様において、遺伝子送達ビヒクルは、感染細胞における転写因子の増殖制御活性を調節するために利用され得る。簡単には、転写因子は、配列特異的トランス活性化または抑制により遺伝子発現パターンに直接影響を及ぼす（Ｋａｒｉｎ，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２１：１２６−１３１，１９９０）。従って、変異転写因子が、ガン遺伝子ファミリーを示すことは驚くべきことではない。遺伝子送達ビヒクルは、例えば、腫瘍細胞に制御を戻すために使用され得、この腫瘍細胞の無秩序な増殖は、腫瘍形成転写因子ならびにホモ２量体およびヘテロ２量体のトランス活性化または抑制転写因子複合体の形成における共同結合を促進または阻害するタンパク質により活性化される。
【０２２０】
細胞増殖を逆転するための１つの方法は、ｃ−ｍｙｃ／Ｍａｘヘテロ２量体転写因子複合体のトランス活性化能力を阻害することである。簡単には、核ガン遺伝子ｃ−ｍｙｃは増殖細胞により発現され、そしていくつかの別個の機構（レトロウイルス挿入、増幅、および染色体転座を含む）により活性化され得る。Ｍａｘタンパク質は静止細胞において発現され、そしてｃ−ｍｙｃとは独立して、単独または未同定因子と共にのいずれかで、ｍｙｃ／Ｍａｘヘテロ２量体により活性化される同じ遺伝子の発現を抑制するように機能する（Ｃｏｌｅ，Ｃｅｌｌ  ６５：７１５−７１６，１９９１）。
【０２２１】
腫瘍細胞のｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃ／Ｍａｘ増殖阻害は、遺伝子送達ビヒクルにより制御される、標的細胞におけるＭａｘ過剰発現により達成され得る。Ｍａｘタンパク質は、（４８０ヌクレオチドＲＮＡ長に対応する）１６０アミノ酸しかなく、そして独立して、あるいは他の遺伝子および／または細胞の増殖制御を開放する因子に標的化されたアンチセンス／リボザイム部分と組み合せて、遺伝子送達ビヒクルに容易に取り込まれる。
【０２２２】
ホモ／ヘテロ複合体会合の調節は、転写因子により活性化される遺伝子発現を制御するための別のアプローチである。例えば、細胞質から核へのトランス活性化転写因子ＮＦ−Ｂの輸送は、インヒビタータンパク質ＩＢによりヘテロ２量体複合体の間に妨げられる。種々の薬剤（特定のサイトカインを含む）による誘導の際に、ＩＢはリン酸化され、そしてＮＦ−Ｂは放出され、そして核に輸送され、ここでＮＦ−Ｂは、その配列特異的トランス活性化機能を発揮し得る（ＢａｅｕｅｒｌｅおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：５４０−５４６，１９８８）。ＮＦ−Ｂ／ＩＢ複合体の解離は、ＩＢのリン酸化部位を抗体でマスクすることにより妨げられ得る。このアプローチは、ＮＦ−ＩＢ転写因子のトランス活性化活性を、その核への輸送を妨げることにより効果的に阻害する。標的細胞におけるＩＢリン酸化部位特異的抗体またはタンパク質の発現は、アルファウイルス遺伝子導入ベクターを用いて達成され得る。ここに記載したものと同様のアプローチを使用して、ｊｕｎとｆｏｓタンパク質との間の会合を阻害することにより、トランス活性化転写ヘテロ２量体因子ＡＰ−１（ＴｕｒｎｅｒおよびＴｉｊａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９−１６９４，１９８９）の形成を妨げ得る。
【０２２３】
（１２．組換えタンパク質の生成）
本発明の別の局面において、トガウイルス（アルファウイルスを含む）遺伝子送達ビヒクルは、真核生物細胞（エクスビボ、インビボ、または樹立細胞株）において１つ以上の組換えタンパク質の発現を指向するために利用され得る。本明細書中で使用する「組換えタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、酵素、またはそのフラグメントをいう。このアプローチを使用して、治療適用または他の商業的適用を有するタンパク質は、より費用効果的に生成され得る。さらに、真核生物細胞において生成されるタンパク質は、原核生物細胞において生成されたタンパク質と比較して、より忠実に翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、硫酸化、アセチル化など）され得る。さらに、このような系は、種々の化学化合物（例えば、精製化学製品または特別化学製品）のインビボ生成において使用され得る。
【０２２４】
この局面において、（所望の化学製品の生成に必要とされ得るような）所望のタンパク質、酵素、または酵素経路をコードする遺伝子送達ビヒクルは、適切な真核生物細胞に形質転換されるか、トランスフェクトされるか、形質導入されるか、または別の方法で導入される。このような系を用いて生成され得るタンパク質の代表例は、インシュリン（米国特許第４，４３１，７４０号およびＢＥ  ８８５１９６Ａを参照のこと）、ヘモグロビン（Ｌａｗｎら、Ｃｅｌｌ  ２１：６４７−５１，１９８０）、エリスロポエチン（ＥＰＯ；米国特許第４，７０３，００８号を参照のこと）、巨核球増殖および分化因子（ＭＧＤＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：４１５−４１８，１９８６）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ（ＷＯ  ８７０６９５４を参照のこと）、ｆｌｔ３リガンド（Ｌｙｍａｎら（１９９３），Ｃｅｌｌ  ７５：１１５７−１１６７）、ＥＧＦ、酸性および塩基性ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、インターロイキンまたはインターフェロンファミリーのメンバー（前述）、神経親和性因子（例えば、ＢＤＮＦ；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２９：１２８９−１２９４，１９９１、ＮＴ−３；ＷＯ  ９１０３５６９を参照のこと、ＣＮＴＦ；ＷＯ  ９１０４３１６を参照のこと、ＮＧＦ；ＷＯ  ９３１０１５０を参照のこと）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子）、血栓崩壊因子（例えば、ｔ−ＰＡ（ＥＰ  ２９２００９、ＡＵ  ８６５３３０２、およびＥＰ  １７４８３５を参照のこと）およびストレプトキナーゼ（ＥＰ
４０７９４２を参照のこと））、ヒト成長ホルモン（ＪＰ  ９４０３０５８２およびＵ．Ｓ．４，７４５，０６９を参照のこと）および他の動物ソマトトロピン、インテグリンおよび他の細胞接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１およびＥＬＡＭ）（上記で議論された、他の「異種配列」もまた参照のこと）、ならびに他の増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質−１（Ｏｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２０８５−２０９３，１９９０）、ならびに他の骨または軟骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ−４，Ｎａｋａｓｅら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．９：６５１−６５９，１９９４）を含むが、それらに限定されない。当業者が認識するように、任意の遺伝子は、一旦特徴付けされたら、本発明に従って遺伝子送達ビヒクルに容易にクローニングされ、次いで適切な宿主細胞に導入し、そして所望の遺伝子を発現し得る。さらに、このようなベクターは、所望の治療効果（例えば、創傷治癒適用）を促進するために、局所的または全身的のいずれかで、インビボで直接送達され得る。
【０２２５】
本明細書中に記載のベクターおよびアルファウイルスパッケージング細胞株を用いて組換えタンパク質を生成するための方法が提供される（実施例６および７を参照のこと）。簡単には、組換えタンパク質をコードするインビトロ転写ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または組換えベクター粒子の形態の遺伝子送達ビヒクルは、培養細胞の少量の画分（≦１％）しかベクター分子を含まないように、アルファウイルスパッケージング細胞株（ＰＣＬ）に（トランスフェクションまたは感染を介して）導入され得る。ベクターレプリコンは、シンドビスウイルス複製ストラテジーに従って進行するベクターＲＮＡ増幅後に、ＰＣＬによりトランスで供給されるｓＰｓによりパッケージングされる。次いで、生成された組換えベクター粒子は、培養物の残存細胞を感染する。従って、組換えベクター粒子が生成され、続いて、ＰＣＬ培養中の全細胞を感染するにつれて、組換えタンパク質発現の最盛期（ｂｌｏｏｍ）が経時的に生じる。同様に、ＰＣＬによるベクター粒子の増幅を使用して、他の適用のための多量の高力価粒子ストックを作成し得る。本発明のさらに別の局面において、プロデューサー細胞株からの組換えタンパク質発現が記載される（実施例７を参照のこと）。簡単には、遺伝子要素（ベクターレプリコンおよび欠損ヘルパー発現カセットを含む）の全てを含む細胞株が得られ、これからベクター粒子の産生は、培養物への細胞外刺激物の添加を介して誘導され得る。従って、ベクターによりコードされる組換えタンパク質の発現は、アルファウイルスベクター粒子プロデューサー細胞株の誘導の結果として生じる。本発明のなおいっそうさらなる局面において、真核生物層状ベクター開始系で安定に形質転換された細胞株からの組換えタンパク質発現が記載される（実施例７を参照のこと）。簡単には、目的の組換えタンパク質をコードする誘導性真核生物層状ベクター開始系カセットで安定に形質転換された細胞株が得られる。従って、ベクターにコードされる組換えタンパク質の発現は、真核生物層状ベクター開始系カセットの誘導の結果として生じる。
【０２２６】
本明細書中で提供される所定の開示が容易に理解されるべき場合、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物層状ベクター開始系、または組換えベクター粒子を利用するタンパク質産生はまた、パッケージングまたはプロデューサー細胞株への導入以外の方法により達成され得る。例えば、このようなベクターは、所望のタンパク質を産生するために、広範な種々の他の真核生物宿主細胞株（例えば、ＣＯＳ、ＢＨＫ，ＣＨＯ、２９３、またはＨｅＬａ細胞）、ならびに直接投与インビボまたはエクスビボ細胞に導入され得る。
【０２２７】
（Ｊ．寄託情報）
以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている：
【０２２８】
【表２】
2013090630.tif 000003
上記の材料は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより寄託された。寄託番号は、ＡＴＣＣから電話番号（３０１）８８１−２６００で入手可能である。
【０２２９】
これらの寄託物は、当業者の都合の良いように提供され、そして寄託が米国特許法第１１２条により要件とされる承認ではない。これらの寄託物の核酸配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中に記載の配列に誤りがある場合には参照されるべきである。寄託材料を製造、使用、または販売するためにライセンスが必要とされ得、そしてこれによって、このようなライセンスは許可されない。
【０２３０】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために含まれる。さらに、これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を提供し、そしてその範囲を限定することを意味されない。以下の実施例に記載された手順の多くのための標準的な方法、または適切な代替手順は、分子生物学の広く認められたマニュアル（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９０））において提供される。
【実施例】
【０２３１】
（実施例１：ＳＩＮ１の単離および特徴付け）
以下、同じウイルスの溶解性の細胞病原性野生型株と比較して、宿主巨大分子合成阻害の低減を示し、そして脊椎動物細胞において持続感染を確立し得る、＋鎖ＲＮＡウイルスの同定および分子特徴付けを記載する。例えば、シンドビスウイルスを、アルファウイルス属を代表する原型として使用する。
【０２３２】
（Ａ．野生型シンドビスウイルスストックからのＳＩＮ−１の単離、プラーク精製、および特徴付け）
シンドビスウイルス変異体株の単離、分子クローニング、および特徴付けを記載する。この株は、細胞変性なく増殖性持続感染を確立するが、野生型ウイルスレベルと等価なウイルスレベルを生じ得る。
【０２３３】
高力価（＞１０8ＰＦＵ／ｍｌ）野生型ストックを、低ＭＯＩ（≦０．１）でのＢＨＫ
細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０）のシンドビスウイルス（ＣＭＣＣ＃４６３９）感染により得た。感染を容易にするために、ウイルス接種物は、細胞に添加した場合に、単層を覆うのにちょうど十分な容量で含まれた。ＢＨＫ細胞を維持し、そして全てのウイルス希釈を、１０％胎児ウシ血清を補充したイーグル最小必須培地中で行った。細胞を、５％ＣＯ2空気中、３７℃で培養した。「球状化（ｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｕｐ）」、接着喪失、お
よび単層内の個々の細胞の光屈折増大、さらに単層の全細胞密度の減少により証明されるような大規模なＣＰＥを、感染後４８時間（ｈｐｉ）以内に観察した。細胞培養液を収集し、細胞残査を、低速遠心分離（４，０００ｒｐｍ、室温、１０分）により除去し、そしてウイルスストックをアリコートに分け、そして−７０℃で貯蔵した。シンドビスウイルスストック力価を、以前に記載されたように（Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：１５４−１６８，１９７６）、プラークアッセイにより決定した。簡単には、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）単層を種々の希釈のウイルスストックに感染させ、そして単層を、０．７５％アガロースを補充した培地で重層した。２４〜４８ｈｐｉで、細胞溶解のためにプラークは目に見えるようになり、そしてアガロース重層を除去した後に、直接あるいはクリスタルバイオレット染色によるかのいずれかで定量した。ウイルス力価を、プラークを正確に定量したウイルス希釈物感染サンプルから決定した。
【０２３４】
ＤＩ粒子を富化したシンドビスウイルスストックを、ＢＨＫ細胞における反復高ＭＯＩ継代（≧５）により得た。最初に、ＢＨＫ単層を、ＭＯＩ＝５で、シンドビスウイルスウイルスシードストックに感染させた。感染培養物の完全細胞溶解を観察した後に（通常、２４ｈｐｉ）、培養培地を収集し、そして低速遠心分離により清澄化した。次いで、感染培養物から収集した清澄化培地を使用して、新鮮なＢＨＫ単層を感染させた。例えば、２ｍｌのウイルス接種物を、１０ｃｍペトリ皿中の新鮮なＢＨＫ単層に添加した。１ｈｐｉで８ｍｌの新鮮な培地を、ウイルス感染培養物に添加した。上記のように、培養物の完全細胞溶解の観察後に、培養培地を収集し、そして清澄化した。ＢＨＫ単層における細胞変性が感染後に発生する速度を少なくとも４日まで遅らせるまで、このプロセスを繰り返した。感染後の細胞変性開始の遅延は、ウイルス調製物における高レベルのＤＩ粒子の存在を示す。
【０２３５】
感染細胞培地の多連続非希釈継代から得たウイルス調製物における高レベルのＤＩ粒子の存在を、干渉アッセイまたはＢＨＫ感染細胞のＲＮＡ分析により決定した。最初の方法において、相同体干渉アッセイを、ＤＩ粒子の存在の測定法として行った。簡単には、ＢＨＫ細胞を、ＭＯＩ＝１０で、上記のように調製した高力価（＞１０8ＰＦＵ／ｍｌ）野
生型ストックのみに感染させた。１６ｈｐｉで、ウイルス収量を、上記のようにプラークアッセイにより決定した。この実験からのウイルス収量は、代表的に、１×１０9〜１×
１０10ＰＦＵ／ｍｌであった。別の実験群において、ＢＨＫ細胞を、野生型ストック（ＭＯＩ＝１０）および感染細胞培地の多連続非希釈継代から調製したウイルスストック（ＭＯＩ＝５）に同時に同時感染させた。前述のように、１６ｈｐｉで、ウイルス収量をプラークアッセイにより決定した。２番目の実験群からのウイルスストックが高レベルのＤＩ粒子を含む場合、ウイルス収量は、最初の実験より少なくとも２〜３桁少ない（例えば、≦１×１０7ＰＦＵ／ｍｌ）。
【０２３６】
ウイルス調製物におけるＤＩ粒子の存在を証明するためのより決定的な方法として、１６ｈｐｉでのＢＨＫ感染細胞中のウイルス特異的ＲＮＡを分析した。簡単には、ＢＨＫ細胞を、高力価（＞１０8ＰＦＵ／ｍｌ）野生型ストックまたはＤＩ粒子を含むウイルスス
トックに感染させた（ＭＯＩ＝１０）。モック（ｍｏｃｋ）感染コントロールおよび感染細胞をダクチノマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）で処理し、そして１〜１６ｈｐｉで［3Ｈ］ウリジン（２０ｍＣｉ／ｍｌ）を標識した。ＲＮＡを、製造者（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，Ｔｅｘａｓ）により記載されたようにＲＮＡｚｏｌ  Ｂを用いることにより、感染細胞およびコントロール細胞から単離した。あるいは、ＲＮＡを、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）を用いるか、またはＷｅｉｓｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４：１１８９−１１９８，１９７４）に記載のように、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎおよび０．５％再結晶化ナフタレンジスルホン酸を含む緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に溶解した細胞のフェノール抽出を用いる従来の方法により単離した。ＲＮＡをグリオキサールで変性し、そして０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に調製した１．１％水平アガロースゲルに通して５Ｖ／ｃｍで電気泳動した（ＭｃＭａｓｔｅｒおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：４８３５−４８３８，１９７７）。あるいは、ＲＮＡを、ホルムアルデヒドゲルに通して電気泳動し得る。電気泳動後、全水分を、ゲルドライヤーを用いて減圧下でゲルから除去し、そして乾燥ゲルを蛍光間接撮影のために処理し、そしてフィルムに暴露した。ゲノムおよびサブゲノム種に対応する２つのＲＮＡ（それぞれ、４２Ｓおよび２６Ｓ）が、野生型ウイルスストックに感染したＢＨＫ細胞に由来するサンプルにおいて観察された。対照に、標準的な４２Ｓおよび２６Ｓ  ＲＮＡとは異なる多数のＲＮＡ種が、ＤＩ粒子を含むウイルスストックに感染したＢＨＫ細胞に由来するサンプルにおいて観察された。ＤＩ  ＲＮＡに対応する複数のＲＮＡは、野生型ウイルスに由来する２６Ｓ  ＲＮＡ種より小さな分子量で主に移動した。ＤＩ粒子を含むウイルスストックに感染したＢＨＫ細胞において観察された４２Ｓおよび２６Ｓ種に加えて、複数のＲＮＡの例は、Ｗｅｉｓｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３３：４６３−４７４，１９８０）の図３、レーン３に示され得る。
【０２３７】
細胞変性を減少した、増殖性持続感染を確立し得るシンドビスウイルス変異体株を単離し、そしてＤＩ粒子を富化したウイルスストックから分子クローニングした。ＢＨＫ細胞を、高多重度（ＭＯＩ＝５）で、ＤＩ粒子を富化したシンドビスウイルスストックに感染させた。細胞変性は、ＢＨＫ細胞の野生型ウイルス感染と比較してゆっくり発生したが；たいていの細胞は最後には溶解され、そしてプレートから剥がされた。細胞残査および非接着細胞を、２日毎に培地交換により除去した。最初の感染後２週間以内に、分離したおよび別個のコロニーが観察された。これらのコロニーは増殖性であり、そして非感染ＢＨＫ細胞コントロールと比較してＣＰＥの形態的証拠を示さなかった。３〜４週間以内で、細胞コロニーは大きく、そして裸眼で識別できた。コロニーをクローニングリング（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｒｉｎｇ）を用いて単離し、そして細胞を、３ｍＭ  ＥＤＴＡまたはトリプシンのいずれかを用いて分散させた。各コロニーからの分散細胞を、希釈なしで再プレートした。その後、コンフルエンシーに達した際に（一般的に、４日以内）、細胞を１：１０希釈で継代培養した。ＢＨＫ（ＳＩＮ−１）と呼ぶ細胞アリコートを、液体窒素中での長期貯蔵のために、５回目の継代後にクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）中に調製した。ＢＨＫ（ＳＩＮ−１）細胞は、増殖速度または形態に関して、最初の非感染ＢＨＫ細胞と区別がつかなかった。
【０２３８】
（Ｂ．ＳＩＮ−１の分子クローニング）
ＳＩＮ−１の実質に低減した細胞病原性の発生と相関する、シンドビスウイルスゲノム中の変異（単数または複数）を特徴付けるために、以下により完全に記載されるように、ＳＩＮ−１ビリオンに由来するゲノムＲＮＡを単離し、逆転写し、そして得られた非構造タンパク質遺伝子含有ｃＤＮＡを配列決定した。
【０２３９】
簡単には、ＳＩＮ−１ウイルスを、ＲＮＡ単離のために使用したストックの調製前に、３回プラーク精製した。ＢＨＫ（ＳＩＮ−１）細胞を上記のように増殖させ、培養液を収集し、そして種々の希釈物を使用して、初代ニワトリ胚線維芽細胞単層（ＣＥＦ、３％胎児ウシ血清を補充した最小必須培地において増殖させた）を感染させた。感染後、０．５％不活性（ｎｏｂｌｅ）寒天を含む培地を単層に添加した。さらに、ＳＩＮ−１プラークサイズを増大させるために、ＤＥＡＥ−デキストラン（１００μｇ／ｍＬ）を寒天重層培地に含有させ得る。個々の目立たないプラークは、適切に希釈したＢＨＫ（ＳＩＮ−１）培養液接種物に感染したプレートにおいて、３日間の３０℃でのインキュベーション後に観察された。３回目の精製後に、クローニングされたＳＩＮ−１ウイルスを、ＭＯＩ＝１で感染したＣＥＦ細胞において３０℃で１回継代した。プラーク精製されたＳＩＮ−１ウイルス調製物は、上記のような干渉アッセイおよびＢＨＫ感染細胞におけるＲＮＡ分析により、ＤＩ粒子がないことが決定された。
【０２４０】
ＢＨＫ細胞をプラーク精製ＳＩＮ−１ストックに感染させて（ＭＯＩ＝１０）、この野生型シンドビスウイルス変異体株が持続性を確立する能力を決定した。上記のように、ＢＨＫ細胞における野生型シンドビスウイルス持続感染の確立は、ウイルス調製物中のＤＩ粒子の存在、およびそれらのほんの少しの生存細胞が増殖し得るためのかなりの時間を必要とする。対照的に、ＳＩＮ−１変異体に３７℃で感染したＢＨＫ細胞において、持続感染は、ＤＩ粒子がウイルス接種物中に存在してもしなくても容易に確立された。ＳＩＮ−１感染の６日後に、ＢＨＫ細胞は、野生型シンドビスウイルス重感染に完全に耐性であり、これは、持続感染の確立を実証する。しかし、これらの細胞は、異種ウイルス、ＶＳＶによる感染に感受性であり、これは、インターフェロンが、ＳＩＮ−１持続感染の確立に関与しないことを証明する。
【０２４１】
ＣＥＦ細胞をプラーク精製ＳＩＮ−１ストックに感染させ（ＭＯＩ＝１０）、ＲＮＡ単離のための高力価ウイルスストックを生成した。９０ｍｌの培養液（２×１０10ＰＦＵ／ｍｌ）を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローター中での２，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により清澄化した。ＳＩＮ−１ウイルスを、ＳＷ２７．１ローター中での、２４，０００ｒｐｍで４℃、２時間の遠心分離により清澄化培養液からペレット化した。次いで、ウイルスペレットを３ｍｌの培養培地に再懸濁し、反復ピペッティングによりホモジナイズし、そして２５〜４０％（ｗ／ｗ）スクロース勾配の上に重層した。この後に、ＳＷ２７．１ローター中で、２４，０００ｒｐｍ、４℃で４時間遠心分離した。ウイルスバンドを白熱光照明で視覚化し、そして２２ゲージ針／注射器で収集した。ＲＮＡを、プロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）消化（５６℃、１時間）、次いで等容量のＨ2Ｏ飽和フェノール：クロロホルム
（１：１、ｐＨ７．０）での抽出、次いで２容量のエタノールおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）での沈殿によりさらに精製した。
【０２４２】
あるいは、ＳＩＮ−１ウイルスを、感染ＢＨＫ細胞培地のポリエチレングリコール沈殿（Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３３：１５４−１６８，１９７６）により、あるいはスクロースクッション（ｃｕｓｈｉｏｎ）によるペレット化（Ｐｏｌｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２１２４−２１３３，１９８８）によりさらに精製し得る。
【０２４３】
２回の第１鎖ｃＤＮＡ合成を、製造者の推奨条件に従ってモロニーマウス白血病ウイルスまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して、精製ウイルスＲＮＡを用いて行った。６つの別々の反応を、以下に示す、＋鎖に相補的なシンドビスウイルス特異的プライマー（Ｒで印を付けた）を用いて行った。クローニングを容易にするために第１鎖合成反応前に、Ｒで印を付けた全プライマーを、それらの５’末端でポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてリン酸化した。
【０２４４】
【表３】
2013090630.tif 000004
上記のｃＤＮＡ鋳型からの第２鎖合成を、６つの別々の反応において、製造者の推奨条件に従ってＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて達成した。−鎖に相補的なシンドビスウイルス特異的プライマー（上記で示すＦで印を付けたプライマー）を使用した。２本鎖ＤＮＡ産物を、完全長シンドビスウイルスゲノム（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１：３８０９−３８１９，１９８７）を含むプラスミドＴｏｔｏ１１０１の対応領域の代わりに段階的に置換した。例えば、Ｔ７／１Ｆ−１４６５Ｒ産物を、ＳａｃＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで消化し、そしてＳａｃＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩで消化し、ＣＩＡＰ処理したＴｏｔｏ１１０１プラスミドに挿入し、これを、１％アガロースゲル／ＴＡＥ（５０Ｘ／リットル：２４２ｇ  Ｔｒｉｓベース／５７．１ｍｌ氷酢酸／１００ｍｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））電気泳動およびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩにより、ＳａｃＩ／Ｅｃｏ４７ＩＩＩ小フラグメント（ＳＰ６プロモーター、シンドビスウイルスｎｔｓ．１〜１４０７）から除いて精製した。次いで、この構築物を、Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＡｖｒＩＩ（それぞれ、シンドビスウイルスｎｔ番号１４０７および４２８１）で消化し、ＣＩＡＰで処理し、その後に、Ｅｃｏ４７ＩＩＩおよびＡｖｒＩＩで消化した、１００３Ｆ−４３０３Ｒ産物から単離した３３００ｂｐフラグメントの挿入を行った。完全に組み立てられたクローンはｐＲＳＩＮ−１ｇと呼ばれ（完全長ゲノムクローンとの参照として、ｇ）、そして全１１，７０３ｂｐのウイルスゲノムを含んだ。上記の表に列挙されたプライマーのサブセットは、ＳＩＮ−１ゲノム内で、重複２本鎖ＤＮＡ反応産物を生じる。例えば、４０５１Ｆ／８１１５Ｒ産物の配列は、１６８０Ｆ／８１１５Ｒ産物内にある。これらの重複産物は、ＳＩＮ−１ゲノムクローンの構築代替物として提供され；すなわち、一般的に、ｃＤＮＡクローニング効率は、所望のフラグメントの長さと反比例する。
【０２４５】
上記の方法により得られないウイルスゲノムの部分をクローニングするために、ＳＩＮ−１  ＲＮＡウイルスゲノムを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりクローニングした。第１鎖合成を、上記のように達成した。上記で示されたプライマー対によるシンドビスｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、Ｋｌｅｎｔａｑ１酵素およびＢａｒｎｅｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２２１６−２２２０，１９９４）に記載のような反応条件を用いた別々の反応として行った。あるいは、Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を、供給者により提供される１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2含有緩衝液を用いて、Ｋｌｅｎｔａｑ１酵
素の代わりに用いた。あるいは、ＶｅｎｔＲ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を、増幅反応において使用した。さらに、反応物は、５％ＤＭＳＯおよび「ＨＯＴ  ＳＴＡＲＴ  ＷＡＸ」ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含んだ。使用したＰＣＲ増幅プロトコルを以下に示す（７２℃伸長インキュベーション期間を、鋳型ＤＮＡ  １ｋｂあたり１分に調節した）：
【０２４６】
【表４】
2013090630.tif 000005
あるいは、以前に記載された方法（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）と同様に完全長ＳＩＮ−１  ＲＮＡゲノムのクローニングを行い得る。簡単には、第１鎖ｃＤＮＡ合成を、ランダムヘキサマープライマー（５０ｎｇ／ｍｌ反応濃度）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびプライマー４Ｂ（この配列を以下の表に示す）の混合物を用いて達成する。次いで、ゲノム長シンドビスウイルスＳＩＮ−１変異体ｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。６対の重複プライマーを用いた６つの別個のセグメントは、全ゲノムをクローニングするのに十分である。ウイルス相補配列に加えて、ＳＩＮ−１  ５’末端正方向プライマーは、細菌ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびその５’末端に連結したＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列に対応する１９ヌクレオチド配列を含む。細菌ＳＰ６
ＲＮＡポリメラーゼは、インビトロでの転写が、本物のシンドビスウイルス５’末端に対応するＡリボヌクレオチドに連結した単一非ウイルスＧリボヌクレオチドだけの含有をもたらすように準備されている。ＡｐａＩ認識配列の含有は、プラスミドベクターｐＫＳＩＩ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ポリリンカ
ー配列へのＰＣＲアンプリコンの挿入を容易にする。５ヌクレオチドの「緩衝配列」伸長もまた、効率的な酵素消化を容易にするために、ＡｐａＩ認識配列の上流に連結される。全ＳＩＮ−１ゲノムを増幅するのに必要な、ＳＰ６−５’ＳＩＮ−１正方向プライマーおよび全プライマー対の配列を、以下の表に示す。（下文で利用する「ｎｔ」および「ｎｔｓ」は、それぞれ、「ヌクレオチド（単数）」および「ヌクレオチド（複数）」をいうことに留意のこと）。参照配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０２３６３、遺伝子座：ＳＩＮＣＧ）は、Ｓｔｒａｕｓｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３３：９２−１１０，１９８４に由来する。
【０２４７】
【表５】
2013090630.tif 000006
上記で示すプライマー対を用いたシンドビスｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ＴｈｅｒｍａｌａｓｅまたはＶｅｎｔR  ＤＮＡポリメラーゼ（上記）、上記のような反応条件、および
ＰＣＲ増幅条件を用いて別々の反応として行う。
【０２４８】
増幅産物間の配列重複領域は、ＰＣＲアンプリコン内の独特の酵素認識部位に対応する。ＰＣＲ産物を精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、そしてｐＫＳ  ＩＩ+ベクターに、ＡｐａＩ部
位とＸｂａＩ部位との間に段階的に挿入する。完全に組み立てられたクローンはｐＫＳＲＳＩＮ−１ｇ（完全長ゲノムクローンに対する参照として、ｇ）と呼ばれ、そして全１１，７０３ｂｐのウイルスゲノムを含む。
【０２４９】
（Ｃ．ＳＩＮ−１表現型の配列）
ｐＲＳＩＮ−１ｇクローンのＳＩＮ−１特異的ヌクレオチド配列を、ジデオキシチェインターミネーション法により決定した。８，０００ｂｐのウイルス配列の配列比較は、本明細書中に記載のＳＩＮ−１クローンと、ＧｅｎＢａｎｋにおいて提供されるシンドビスウイルス（ＨＲｓｐ株）配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０２３６３、遺伝子座：ＳＩＮＣＧ）との間に複数の差異を明らかにした。ＳＩＮ−１（図６）、ＳＩＮＣＧ（図７）、およびＴｏｔｏ１１０１（図８）間の配列の差異を以下に示す。
【０２５０】
【表６】
2013090630.tif 000007
*この変異は、１個のｃＤＮＡクローンにおいて見出された。これは、Ｓｉｎ−１ウイル
スＲＮＡを配列決定した場合に検出されなかった。これは、ＲＮＡ集団における微量種を示すようである。
【０２５１】
配列変化が、本明細書中に記載のクローンに独特である（そしてクローニング人工産物の結果ではない）という確認を、上記のようにＳＩＮ−１ビリオンＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、問題のヌクレオチドを含む配列をＲＴ−ＰＣＲアンプリコン産物の直接配列決定により確認し、そしてこの配列と対応するＳＩＮ−１配列とを比較することにより決定した。
【０２５２】
（Ｄ．分子クローンを用いたＳＩＮ−１表現型の特徴付けおよび遺伝子マッピング）
持続性確立のための表現型の位置をマッピングするために、ＳＩＮ−１ゲノムの種々の領域を、Ｔｏｔｏ１１０１プラスミド（Ｒｉｃｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３８０９−３８１９，１９８７）において対応する野生型シンドビスウイルス領域と置換した。種々のＳＩＮ−１  ｎｓＰ遺伝子を、以下の表に例示されるようにｐＲＳＩＮ−１ｇから精製した制限酵素フラグメントを用いて、Ｔｏｔｏ  １１０１野生型シンドビスウイルスバックグラウンドに置換した。
【０２５３】
【表７】
2013090630.tif 000008
非構造遺伝子をコード領域の位置を、以下の表に提供する：
【０２５４】
【表８】
2013090630.tif 000009
種々のＳＩＮ−１、Ｔｏｔｏ、およびキメラＳＩＮ−Ｔｏｔｏクローンである、ｐＲＳＩＮ−１ｇ、Ｔｏｔｏ、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ１、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ２、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ２−Ｎ、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ２−Ｃ、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ３、ｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ４、およびｐＲＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４を、ＸｈｏＩでの消化により線状化した。ＸｈｏＩは、シンドビスウイルス３’末端（ウイルスｎｔ．１１７０３）後の２１ヌクレオチドポリｄＡ：ｄＴ領域のすぐ隣接およびその下流に、ｃＤＮＡクローンの単一切断を作る。線状化クローンを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（ＢＩＯ  １０１，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で精製し、そして０．５μｇ／μｌの濃度に調節した。線状化クローンの転写を、以下の反応条件に従って、４０℃で９０分間インビトロで行った：２μｌ  ＤＮＡ／４．２５μｌ  Ｈ2Ｏ；１０μｌ  ２．５ｍＭ  ＮＴＰ（ＵＴＰ、
ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ）；１．２５μｌ  ２０ｍＭ  Ｍｅ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログ；１．２５μｌ  １００ｍＭ  ＤＴＴ；５μｌ  ５×転写緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；０．５μｌ  ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；０．２５μｌ  １０μｇ／μｌウシ血清アルブミン；および０．５μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）。インビトロ転写反応産物を、ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、連続フェノール：ＣＨＣｌ3およびエーテル抽出によ
り精製し、次いでエタノール沈殿を行った。あるいは、インビトロ転写反応産物を、トランスフェクションのために直接使用し得る。インビトロ転写反応産物または精製ＲＮＡを、市販のカチオン脂質化合物（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と複合体化し、そして７５％コンフルエンシーで６０ｍｍペトリ皿に維持したベビーハムスター腎臓−２１（ＢＨＫ−２１）細胞に適用した。あるいは、ＢＨＫ細胞を、以前に記載されたように（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１）正確に、インビトロ転写反応産物または精製ＲＮＡでエレクトロポレーションした。トランスフェクト細胞を、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの４８時間後に、培養培地を収集し、そして各ウイルス力価を、上記のようにプラークアッセイにより決定した。これらのインビトロ転写反応物に由来する力価測定したウイルスストックを、以下の表に示すように命名した。
【０２５５】
【表９】
2013090630.tif 000010
ＳＩＮ−１持続表現型をマッピングするために、８×１０5個のＢＨＫ細胞を、上で調
製したウイルスストックの各々に感染させた（ＭＯＩ＝５）。感染の３日後に、培養物生存能力を、トリパンブルー色素排除により決定した。この実験結果（以下に示す）は、持続性非細胞破壊性感染を確立するＳＩＮ−１表現型が非構造遺伝子に、そして、特にｎｓＰ２遺伝子に位置することを実証する。モック感染培養物における細胞数は、これらの細胞が定常期に達するまで、その増殖が続いたことを示す。３ｄｐｉで、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１、ＳＩＮ−１ｎｓＰ３、ＳＩＮ−１−ｎｓＰ３−４、およびＳＩＮ−１ｎｓＰ４に感染した細胞は全て死んだ。ＳＩＮ−１ｎｓＰ２およびＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４感染から生き残った細胞は増殖し続け、そしてシンドビスウイルスに特異的な抗体を用いた染色に基づいて、持続的に感染する。
【０２５６】
【表１０】
2013090630.tif 000011
上記に示すように、非細胞破壊性持続感染を確立する観察されたＳＩＮ−１表現型は、ｓＰｓとは対照的に、ウイルスｎｓＰｓに位置する。この結論は、ＴｏｔｏまたはＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４ウイルスストックに感染した培養物間の細胞生存レベルの比較により明らかに証明された。ＴｏｔｏおよびＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４ウイルスの両方は、野生型ｓＰｓを含む；しかし、細胞生存は、ＳＩＮ−１クローンに由来するｎｓＰｓを含むウイルス（ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４）に感染した培養物にしか観察されなかった。これらの実験において、細胞生存は、シンドビスウイルスｓＰｓの供給源に依存性ではなかった。重要なことに、ＳＩＮ−１表現型をさらにｎｓＰ２にマッピングした。細胞生存レベルは、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４またはＳＩＮ−１ｎｓＰ２ウイルスに感染した培養物間で同等であった。さらに、ＳＩＮ−１  ｎｓＰ２遺伝子のヌクレオチド３８５５でのＣ→Ｔ転移は、ＳＩＮ−１ウイルスに感染した細胞における持続感染確立の特徴的な表現型の原因である。キメラウイルスＳＩＮ−１ｎｓＰ２−Ｃに感染した細胞において産生されるｎｓＰ２タンパク質の単一のプロリンからセリンへの変化は、野生型シンドビスウイルス（Ｔｏｔｏ
１１０１）を感染細胞全てを殺傷するウイルスから感染細胞の多くが生存し、そしてウイルスを産生し続けるウイルスに変換するために必要とされる全てであった。ＳＩＮ−１
ｎｓＰ１、ｎｓＰ３、またはｎｓＰ４遺伝子のＴｏｔｏバックグラウンドへの挿入に由来するキメラウイルスの表現型は野生型と区別できず、そして完全溶解物がこれらのウイルスに感染した培養物において観察された。
【０２５７】
ＢＨＫ細胞における増殖性感染レベルに対する、ＳＩＮ−１  ｎｓＰｓのアミノ酸変化の可能な効果を、種々のＳＩＮ−１、野生型（Ｔｏｔｏ）、またはＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株を接種したＢＨＫ細胞において、時間経過にわたってウイルス収量を比較することにより決定した。簡単には、ＢＨＫ細胞を、ＳＩＮ−１（上記のプラーク精製ストック）、Ｔｏｔｏ、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４、またはＳＩＮ−１ｎｓＰ２ウイルスに感染させ（ＭＯＩ＝２０）、そして培養液を、感染の３、６、９、および１２時間後に収集した。次いで、培養液におけるウイルス力価を、上記のようにプラークアッセイにより決定した。図２に示すこの研究の結果は、等価なレベルのウイルスが、野生型またはＳＩＮ−１株に感染したＢＨＫ細胞において生成されたことを実証する。１２ｈｐｉ時点での実際のウイルス力価を以下の表に示す。野生型株と等価なウイルス生成レベルと組み合わせて、半分を超えるＢＨＫ細胞が、ＳＩＮ−１ウイルス（およびＳＩＮ−１ｎｓＰｓ１−４またはＳＩＮ−１ｎｓＰ２を含むキメラウイルス）での感染から生き残った。
【０２５８】
【表１１】
2013090630.tif 000012
ウイルス特異的ＲＮＡ合成レベルに対する、ＳＩＮ−１ｎｓＰｓアミノ酸変化の可能な効果を、種々のＳＩＮ−１、野生型（Ｔｏｔｏ）、またはＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株を接種したＢＨＫ細胞において、時間経過にわたって［3Ｈ］ウリジン取り込みレベル比
較することにより決定した。ＢＨＫ細胞（３×１０5個細胞／３５ｍｍディッシュ）を、
本明細書中に記載の条件に従って、３７℃で増殖させた。この細胞を、ＳＩＮ−１、Ｔｏｔｏ１１０１、ＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４、またはＳＩＮ−１ｎｓＰ２ウイルスに感染させた（ＭＯＩ＝２０）。感染後３０分で、培養培地を、１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤに調整した。さらに３０分のインキュベーション後、培養培地を、１０μＣｉ／ｍｌ［3Ｈ
］ウリジンに調整した。３、６、９、および１２ｈｐｉで、処理細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２００μｌのＴＴＥ緩衝液（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の添加により溶解した。ＲＮＡを、２００μｌの２５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）溶液の添加により４℃で沈殿させた。ＲＮＡを、１４，０００ｒｐｍで５分間の微量遠心分離によりペレット化し、５％ＴＣＡで１回リンスし、そして５５℃で、５０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．１％ＳＤＳからなる溶液に溶解した。溶解ＲＮＡを含む溶液をシンチレーションバイアルに移し、そして取り込まれた［3
Ｈ］ウリジンのレベルを、ＥｃｏＬｕｍｅ（ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）シンチレーション液を用いて決定した。図３に示すこの研究の結果は、ＳＩＮ−１に感染したＢＨＫ細胞におけるウイルス特異的ＲＮＡレベルが、野生型ウイルスと比較して劇的に低いことを実証する。この低レベルのウイルス特異的ＲＮＡ合成の表現型は、野生型と比較して、ＳＩＮ−１またはＳＩＮ−１ｎｓＰ１−４株に感染したＢＨＫ細胞において生成される等しく低レベルのＲＮＡにより示されるように、ｎｓＰｓに位置する。
【０２５９】
【表１２】
2013090630.tif 000013
感染ＢＨＫ細胞におけるウイルス特異的ＲＮＡ合成をまた、ＳＩＮ−１、Ｔｏｔｏ、およびＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株の全てを用いて決定した。９ｈｐｉでの野生型感染（Ｔｏｔｏ）に関する［3Ｈ］ウリジン取り込みのレベルを図４に示し、そして以下の表に示す。
【０２６０】
【表１３】
2013090630.tif 000014
従って、ＢＨＫ細胞は、ＳＩＮ−１ウイルス（およびＳＩＮ−１  ｎｓＰｓ１−４またはＳＩＮ−１  ｎｓＰ２を含むキメラウイルス）感染から生き残り、野生型株と等価なＳＩＮ−１ウイルスレベルがＢＨＫ細胞において産生され、そして合成ウイルス特異的ＲＮＡレベルは、野生型ウイルスと比較して１０倍低い。
【０２６１】
宿主細胞タンパク質合成阻害レベルに対する、ＳＩＮ−１  ｎｓＰｓのアミノ酸変化の可能な効果を、種々のＳＩＮ−１、野生型（Ｔｏｔｏ）、またはＳＩＮ−１／Ｔｏｔｏキメラ株を接種したＢＨＫ細胞において、時間経過にわたって非感染細胞に関するタンパク質合成レベルを比較することにより決定した。簡単には、２×１０5個ＢＨＫ細胞を接種
した３５ｍｍディッシュを、ＰＢＳ／１％胎児ウシ血清からなる緩衝液中の０．５ｍｌウイルス接種物における種々のシンドビスウイルス株に感染させた（ＭＯＩ＝２０）。プレートを、連続して穏やかに振盪しながら、４℃で１時間インキュベートした。この接種物を、１０％ウシ胎児血清を含む、以前に記載した２ｍｌの培地と交換し、そしてこのディッシュを、３７℃のＣＯ2インキュベーターに置いた。５、８、および１１時間後に、こ
の培地を、メチオニンを欠き（Ｍｅｔ−）、２％ウシ胎児血清を含む２ｍｌのＭＥＭと交換し、そして３０分間インキュベートした。次いで、培地を、２％ウシ胎児血清および１０μＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］メチオニンを含む１ｍｌのＭＥＭ（Ｍｅｔ−）と交換した。３７℃で３０分のインキュベーション期間の後、１０％ウシ胎児血清を含む１ｍｌの培地を各ウェルに添加し、そしてこのディッシュを、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。この希釈は、放射性標識のタンパク質へのさらなる取り込みを阻害するのに十分であり、そしてポリアクリルアミドゲル中で検出される遊離［35Ｓ］メチオニンのバックグラウンドを有意に減少させる。次いで、培地をこのウェルから除去した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ディッシュからＰＢＳにこそぎ落とし、遠心分離によりペレット化し、そして２５μｌのローディング緩衝液（０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．７）、２％  ＳＤＳ、５％  β−メルカプトエタノール、５％  グリセロール、０．０５％  ブロモフェノールブルー）に溶解した。このサンプルの１／５をゲル上で分析した。電気泳動後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲで染色し、乾燥し、そしてオートラジオグラフした。宿主細胞タンパク質合成の阻害率を、宿主タンパク質のみを含むゲル切片の放射能量を定量することにより比較した。この研究の結果を図５に示し、そしてこれは、宿主細胞タンパク質合成の阻害レベルが、野生型ウイルス感染細胞と比較して、ＳＩＮ−１ウイルス感染細胞において、特に感染後、初期の６および９時間の時点で有意に低いことを実証する。
【０２６２】
要約すると、ＢＨＫ細胞はＳＩＮ−１感染から生き残り、野生型株と等価なウイルスレベルがＢＨＫ細胞において生成され、合成されたウイルス特異的ＲＮＡレベルは野生型ウイルスより１０倍少なく、そしてＳＩＮ−１ウイルス感染細胞における宿主細胞タンパク質合成の阻害レベルは、野生型ウイルス感染細胞と比較して有意に低い。本明細書中に記載されたＳＩＮ−１ウイルスの表現型は、ウイルスｎｓＰ遺伝子に位置する。
【０２６３】
（実施例２：宿主巨大分子合成の減少した阻害を示すプラス鎖ＲＮＡウイルスの単離および特徴づけ）
宿主細胞巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または無阻害の所望の表現型を示すウイルス改変体の誘導は、野生型ウイルスのものとは異なる配列の生成、特徴づけ、および単離に依存する。しかし、実施例１の他に、巨大分子合成のこのウイルスに基づく阻害の変化、または溶解性よりもむしろ持続性の感染を導くウイルスの生成を生じる、コードまたは非コードウイルス配列の変化の選択または同定するための、明らかなまたは既に開示された方法はない。本発明は、これらの障害を克服することを可能にする、一例としてアルファウイルスを使用する、特定の方法を提供する。
【０２６４】
（Ａ．ウイルス改変体の生物学的選択）
宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または無阻害を生じる、あるいは持続性感染を確立する、ウイルス改変体の生物学的誘導は、細胞内の天然の自発的変異を可能にすること、あるいは最初に所望のウイルスストックに物理的、化学的、または他の人工的変異誘発を受けさせること、次いで感染しやすい細胞の感染、および変異したウイルスがいる細胞集団についての連続的富化によって、行われ得る。変異誘発の前に、必要とされないが、適切な変異の生成を容易にすることが可能である。選択は、所望の改変体に感染した細胞が野生型ウイルスに感染した細胞よりも著しく長い期間生存する能力に基づく。以下の実施例は、一例としてシンドビスウイルスを使用して、代表的方法を詳細に提供する；しかし、他のウイルスは、詳細な説明に記載のように、容易に置換される。
【０２６５】
詳細には、化学的変異誘発の場合、１０9ｐｆｕ／ｍｌ以上または等しい力価を有する
シンドビスウイルスストック懸濁液を、１００ｕｇ／ｍｌの最終濃度でニトロソグアニジンで処理する。室温にて１５分後、ニトロソグアニジンを、４℃での透析によって除去し、そして変異誘発したストックを、続いて、感染のために使用する。フラットストック培養物で増殖した、所望のタイプ（例えば、ＢＨＫ−２１）の約５×１０6細胞に、約５の
感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）で変異誘発したウイルスを感染させて、あらゆる細胞が感染することを確実にする。感染後１２、２４、３６、および４８時間目に、細胞単層を、新鮮培地で２回洗浄して死亡細胞を除去し、そして５０％新鮮培地および５０％馴化培地の混合物からなる培地に置換する。感染後の所望の時間（例えば、７２時間）後、残りの細胞を、穏やかにトリプシン処理して培養ディッシュから細胞を脱離させ、そして何らかの細胞結合した細胞外ウイルスをストリッピングし、次いで、分別遠心分離によって細胞から分離する。次いで、残りの細胞を、あらゆる１０3非感染細胞について１感染細胞の比
で、半コンフルエント非感染細胞単層を含む組織培養ディッシュに直接的に再播種する。選択の追加のラウンドを、増幅のための非感染細胞上に播種すること、次いで上記の洗浄および採取工程によって行う。あるいは、初回感染を、低Ｍ．Ｏ．Ｉ．で野生型ウイルスストックを使用して行い、細胞内での複製中の自発的変異を可能にし得る。このアプローチを使用して、変異体ウイルスの異種集団を、感染した細胞によって産生する。トリプシン処理後に回収した感染した細胞の集団が、著しく多くの非生存またはひどく損傷を受けた細胞を含む場合には、１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＨＣｌでｐＨ  ７．６５）中の０．７５％
ＮＨ4Ｃｌでの簡単な処理（室温にて５分）、またはＰｅｒｃｏｌｌTMによる遠心分離
を、非感染細胞単層上に再播種する前に、残りの死亡または損傷を受けた細胞を除去するために含む。選択の最小の２つの連続ラウンドの後、所望の表現型を提示するウイルス改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、そして実施例１に記載のようにｃＤＮＡクローニングにかける。改変体表現型の原因である特定の配列の単離および特徴づけを、ゲノムクローンまたは発現ベクターへのｃＤＮＡの所定の領域の置換、および実施例に概説するように、併行表現型変化についてテストすることによって達成する。
【０２６６】
（Ｂ．ウイルス改変体の遺伝学的選択）
関連のアプローチでは、天然の変異またはランダム変異誘発を、ウイルスストックではなく、インビトロまたはインビボで感染性ウイルスＲＮＡに転写され得るウイルスのクローニングしたゲノムｃＤＮＡを使用して行う。例えば、前の変異誘発の場合には、バクテリオファージＳＰ６プロモーター（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）に機能的に連結した全長ゲノムシンドビｃＤＮＡを含むプラスミドｐＲＳＩＮｇを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｒｅｄミューテーター細胞に形質転換し、そしてアンピシリンプレート上にプレーティングしてコロニーを得る。少なくとも２００コロニーをランダムに選択し、プールし、そしてアンピシリンを含む１０ｍｌブロス培養物中での一晩増殖のために接種する。プラスミドＤＮＡを、培養物から調製して、種々の変異のあるｐＲＳＩＮｇの異種集団を得る。ＤＮＡを、Ｘｂａ  Ｉで線状化し、そして既述（Ｒｉｃｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３８０９−３８１９，１９８７）のように、ＳＰ６ポリメラーゼを使用してインビトロで転写する。続いて、ＲＮＡ転写物を、シンドビスウイルス感染サイクルの開始のために、エレクトロポレーション（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１）によって所望の細胞タイプ（例えば、ＢＨＫ細胞）に転写する。あるいは、非変異誘発テンプレートからのインビトロ転写したＲＮＡも、トランスフェクトされ得る。持続性感染を確立するかまたは宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または無阻害を示す、ウイルス変異体の選択を、上記のように行う。所望の表現型を有する選択したウイルス改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、ｃＤＮＡクローニングにかけ、そして改変体表現型の原因である配列を、既述のように単離および特徴づけする。
【０２６７】
（Ｃ．ウイルス由来ベクターを使用する改変体の遺伝学的選択）
（１．免疫原性タンパク質を発現するベクター）
もう１つのアプローチでは、自発的細胞内変異、またはランダム変異誘発を、ウイルスベースのベクターのウイルス由来配列で行う。これらの配列には、非コードおよび調節領域、ならびに非構造タンパク質コード領域が挙げられる。ある場合には、構造タンパク質コード配列も含まれ得る。このようなランダム変異誘発または自発的細胞内変異を、インビトロまたはインビボでＲＮＡに転写され得るウイルス由来ベクターのクローニングしたｃＤＮＡとともに、本発明に記載される技法のいずれかを使用して、行い得る。例えば、複製コンピテントシンドビスウイルス発現ベクターを使用して、感染した細胞に付加された特異的抗体によって結合され得る免疫原性細胞表面タンパク質または他のペプチドを発現し得る。機能的ベクターを含む細胞を、ベクターがコードした異種抗原の発現およびコードした抗原に特異的な抗原によって結合する能力によって同定する。長期間（上を参照のこと）生存する細胞に対する選択プロセスを限定することによって、所望の表現型を提示するベクター改変体のある細胞のみを富化する。
【０２６８】
詳細には、ランダム変異誘発の場合には、異種遺伝子の発現のための二重になったサブゲノムプロモーターを含む全長ゲノムシンドビスウイルスｃＤＮＡに作動可能に連結したＳＰ６プロモーターを含む、プラスミドｐＴＥ３’２Ｊ（Ｈａｈｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２６７９−２６８３，１９９２）を、上記のように変異誘発する。このプロセスは、ランダム変異を含む異種プラスミドの集団の単離を生じる。同時に、所望の異種細胞表面タンパク質またはマーカーペプチド遺伝子を、変異誘発したｐＴＥ３’２Ｊベクターへの挿入のためのシャトルベクターにクローニングする。マーカーとしての使用のために好ましい細胞表面タンパク質には、ヒトＢ７．１（Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４−２７２２，１９８９）およびマウスＨ−２ＫbクラスＩ分子（Ｓｏ
ｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７０２４−７０２９，１９９４）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトＢ７．１遺伝子を、フランキングＸｂａ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位を含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、全長ｃＤＮＡ配列（Ｆｒｅｅｍａｎら，同書）を含むｐＣＤＭ８ベクターから、１．５分伸長で標準的３サイクルのＰＣＲによって増幅する。
正方向プライマー：ｈＢ７．１ＦＸ（５’−制限部位／Ｂ７．１配列）（配列番号２４）５’−ＡＴＡＴＡＴＣＴＡＧＡ／ＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧＣＡＧ−３’
逆方向プライマー：ｈＢ７．１  ＲＢ（５’−制限部位／Ｂ７．１配列）（配列番号２５）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＣＴＧＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＣ−３’。
【０２６９】
増幅後、約８７５ｂｐ  ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ
ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製し、Ｘｂａ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断し、そしてＸｂａ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断されそしてウシ小腸アルカリホスファターゼでも処理されているシンドビシャトルベクターｐＨ３’２Ｊ１（Ｈａｈｎら，同書）に連結して、構築物ｐＨ３’Ｂ７．１を生成する。
【０２７０】
上記のように、ｐＴＥ３’２Ｊ二重サブゲノムベクターのランダム変異誘発の後、プラスミドｐＨ３’Ｂ７．１、およびプラスミドｐＴＥ３’２Ｊの変異した集団を、Ａｐａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉで切断し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ＩＩTM（Ｂｉｏ１０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を使用して０．７％アガロースゲルから精製し、そして連結してＢ７．１発現ベクターの異種集団を形成し、ｐＴＥ３’Ｂ７．１と命名する。Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換することおよび個々のクローンを単離することなく、連結したベクターの集団全体を、Ｘｈｏ  Ｉで線状化し、そして上記のように、インビトロでＳＰ６転写反応のためのテンプレートとして使用する。次いで、ランダムに変異誘発したＢ７．１ベクター転写物の異種集団を、シンドビスウイルス複製サイクルの開始のための所望の細胞タイプ（例えば、ＢＨＫ細胞）にエレクトロポレートする。持続性感染を確立するかまたは宿主巨大分子合成の減少した阻害、遅延した阻害、または無阻害を示す、ウイルス変異体の選択を、Ｂ７．１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に特異的なモノクローナル抗体、および磁性または蛍光のいずれかの活性化した細胞ソーティングプロトコルを使用して行う。好ましい二次抗体タグには、磁性細胞ソーティング（ｍｉｎｉＭＡＣＳ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉら，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：２３１−２３８，１９９０）のための磁性マイクロビーズに結合したラット抗マウスＩｇＧ、および蛍光活性化した細胞ソーティングのためのＦＩＴＣ結合したラットマウスＩｇＧ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。このようなアプローチを使用しそして長期間後に細胞を採取して（上を参照のこと）、所望の表現型を提示する、機能的ウイルス由来ベクター（Ｂ７．１発現によって示されるような）を含む生存細胞のみが富化される。
【０２７１】
詳細には、ランダムに変異誘発したＢ７．１ベクター転写物の異種集団を、ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ（１９９１，同書）の手順に従って、１×１０7細胞にエレクトロポレートし、そしてフラットストック培養物としてプレーティングする。感染後１２、２４、３６、および４８時間目に、細胞単層を新鮮培地で２回洗浄して、死亡細胞を除去し、そして５０％新鮮培地および５０％馴化培地の混合物からなる培地で置換する。感染後の所望の時点（例えば、７２時間）に、残りの細胞を穏やかにトリプシン処理して、培養ディッシュから細胞を脱離させ、そして１０００ｒｐｍ、４℃での遠心分離によってペレットにする。細胞を、２ｍｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ＋１０％ウシ胎児血清＋１％ＢＳＡ）に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートし、そして再度ペレットにする。次に、細胞を、２００ｕｌの一次抗Ｂ７．１抗体溶液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに希釈される）中に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートする。細胞を、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで２回洗浄し、ペレットにし、そして２００ｕｌの磁性ビーズ溶液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ中の２００ｕｌの洗浄した磁性ラット抗マウスコーティングしたビーズ）に再懸濁する。４℃にて３０分間のインキュベーション後、ビーズに結合した細胞を、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡで２回洗浄し、そして１ｍｌの同じ緩衝液に再懸濁する。次いで、ビーズに結合した細胞を、製造業者の指示に従って、ＭｉｎｉＭａｃｓ磁石カラムを使用して精製する。次いで、溶出した陽性細胞を、あらゆる１０4非感染細胞に対して１感染細胞の比で、半コンフルエント非感染細胞単
層を含む組織培養ディッシュに直接的に再播種する。選択の追加のラウンドを、増幅／富化について上記のように行う。所望の表現型を有する選択されたベクター改変体を、限界希釈またはプラーク精製によって単離し、ｃＤＮＡクローニングにかけ、そして改変体表現型の原因となる配列を、既述のように単離および特徴づけする。
【０２７２】
あるいは、Ｂ７．１発現ベクター、ｐＴＥ３’Ｂ７．１は、前の変異誘発なしにインビトロ転写のために直接的に使用され得る。これらのＲＮＡ転写物のトランスフェクション後、所望の表現型の変異体についての選択を、上記のように行う。
【０２７３】
（２．選択マーカーを発現するベクター）
あるいは、抗生物質耐性マーカーを、所望の表現型を提示するウイルスベクター改変体の選択のために使用し得る（図８Ｆ）。例えば、シンドビベクターｐＲＳＩＮ−βｇａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同書）を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択マーカーとのβガラクトシダーゼレポーター遺伝子の置換によって改変し、そして変異誘発前に改変するかまたは直接的に使用したかのいずれかであった。ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性をコードする遺伝子を、フランキングＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ制限部位を含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から、１．５分の伸長で、標準的３サイクルＰＣＲ増幅によって単離した：
正方向プライマー：ＮｅｏＦＸ（５’−制限部位／ｎｅｏ配列）（配列番号２６）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧ／ＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧ−３’
逆方向プライマー：ＮｅｏＲＮ（５’−制限部位／ｎｅｏ配列）（配列番号２７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣ／ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧ−３’。
【０２７４】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで切断し、そしてＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉでもまた切断され、ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理されているｐＲＳＮ−βｇａｌベクターに連結し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して、そのこれまでのβガラクトシダーゼインサートから、０．７％アガロースゲルから精製した。ネオマイシン耐性マーカーを含む新しく構築したシンドビ発現ベクターを、ｐＳｉｎ−Ｎｅｏと命名した。プラスミドｐＳｉｎ−Ｎｅｏを、直接的にあるいはＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１  Ｒｅｄによる継代によって前の変異誘発の１、２、または３ラウンドでのいずれかで、Ｐｍｅ  Ｉで線状化した。線状ＤＮＡを、インビトロＳＰ６転写反応のためのテンプレートとして使用し、次いでベクター転写物を、シンドビ複製サイクルおよび異種遺伝子発現の開始のための所望の細胞タイプ（例えば、ＢＨＫ細胞）にトランスフェクトした。トランスフェクション後約２４時間目に、ＢＨＫ細胞をトリプシン処理し、そして０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む培地に置換した。その後、培地を、約２４時間間隔で交換して、死亡細胞を除去し、そして５０％新鮮培地および５０％馴化培地の混合物からなるＧ４１８含有培地に置換した。大多数の死亡細胞を洗い流した後、培地交換を減少し、そして細胞中心（ｃｅｌｌ  ｆｏｃｉ）を形成し始めた。この時、レポーター遺伝子のみを発現するシンドビベクターＲＮＡでトランスフェクトしたコントロールプレート中のすべての細胞を、薬物によって殺傷した。この選択を使用して、所望の表現型（ネオマイシン耐性によって示されるように）を提示する、機能的シンドビスウイルス由来ベクターを含む生存細胞のみを、富化した。安定に形質転換したネオマイシン耐性プールを、変異誘発したおよび変異誘発していない両方のテンプレートについてのこのアプローチを使用して得、その後プールを特徴づけた。類似の選択アプローチを、より高レベルのインターフェロンを発現する細胞、例えば、Ｌ９２９細胞で作用することを証明した。
【０２７５】
所望の表現型を提示する変異体ベクター改変体を、ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ（Ｔｅｌ−ＴｅｓｔＦｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して安定に形質転換した細胞から直接的にＲＮＡを採取すること、次いでポリＡ選択によって単離した。ＲＮＡを、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子プローブを使用して、ノーザンブロットによって分析して、ゲノムおよびサブゲノムの両方のウイルスベクターＲＮＡ種の存在を証明した（図８Ｇ）。レーンＳ１、Ｓ２、およびＳ３は、３つの独立して誘導したＧ４１８耐性プールからのＲＮＡを表す。ＢＨＫレーンは、トランスフェクトしていない細胞性ＲＮＡを表すが、Ｓｉｎ−Ｎｅｏレーンは、もともとのインビトロ転写したＲＮＡベクターを表す。明らかに、ゲノム対サブゲノムＲＮＡの比の著しい差を、プール間で観察し、これは、異なる原因の変異を含むベクターからの誘導を示唆する。単離したＲＮＡをまた、ネオマイシン耐性表現型を天然のままの細胞にトランスファーするために使用した。詳細には、ＢＨＫ−２１細胞を、上記の単離したＲＮＡまたはコントロールテンプレートＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＧ４１８薬物で処理した。単離したＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、薬物に対して直ちに耐性であり、そしてコントロールトランスフェクションとは異なって、数日以内にコンフルエントまで増殖した。最終的に、相補性アッセイを、ヌクレオチド４２２と７０５４との間の非構造遺伝子配列が欠失する、欠損シンドビスウイルスβ−ガラクトシダーゼベクター（Ｓｉｎ−ｄｌ−βｇａｌと命名される）を使用して行った。このような欠損ベクターからのβ−ガラクトシダーゼレポーターの発現は、欠損した非構造タンパク質がトランスで提供される後のみ生じ得る。上記のＧ４１８耐性プールへのＳｉｎ−ｄｌ−βｇａｌ  ＲＮＡのトランスフェクションは、同様にトランスフェクトしたコントロールＢＨＫ細胞で見られないβ−ガラクトシダーゼの発現レベルを生じた。
【０２７６】
減少した細胞病原性の原因となるシンドビベクターの遺伝子座をマッピングするために、ＰＣＲプライマー対を合成し、３つの異なる切片：ヌクレオチド１−２２８８、ヌクレオチド２２８９−４８４５、およびヌクレオチド４８４６−７６４４（図８Ｈ）におけるベクター配列（３’−末端ＵＴＲを除く）の分裂および遺伝子置換を可能にする。これらのプライマー対を使用して、Ｇ４１８耐性細胞から単離したベクター改変体ＲＮＡから直接的にｃＤＮＡを増幅し得る。例えば、Ｓ２プール（図８Ｇを参照のこと）からのＲＮＡは、ｃＤＮＡクローニングおよび野生型ｐＳｉｎ−Ｎｅｏベクターへの置換を受けた。インビトロ転写後、野生型およびＳ２変異体ベクターＲＮＡを、ＢＨＫ細胞にトランスフェクトし、そしてＧ４１８薬物選択を適用した。Ｓ２変異体ベクターＲＮＡのみが、数日以内に迅速な薬物耐性およびコンフルエント細胞増殖を生じ、これは、原因となる変異が遺伝子置換のこの領域内にあることを示唆した。この領域内の野生型とＳ２変異体ベクターとの間の配列分析は、高度に保存されたアルファウイルスＬｅｕ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙモチーフ内のｎｓＰ２アミノ酸７２６でプロリン→トレオニン置換を表した。さらに、プールＳ１に由来するｃＤＮＡとの同じ領域の遺伝子置換（図８Ｇを参照のこと）は、ベクターを産生する類似のＧ４１８耐性細胞を生じず（図８Ｈ）、また置換された配列は、保存されたＬｅｕ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙモチーフ内に変異を含まなかった。これらのデータは、置換の領域外の代替変異が、観察された表現型に必要とされることを示す。
【０２７７】
【表１４】
2013090630.tif 000015
もう１つの例では、セムリキ森林ウイルス由来ベクター、ｐＳＦＶ−１（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を、抗生物質耐性マーカーの挿入および所望の表現型のその後の選択のために使用した。ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性をコードする遺伝子を、フランキングＢａｍＨＩ制限部位を含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、１．５分の伸長で、標準的３サイクルＰＣＲ増幅によって、単離した：
正方向プライマー：５’ＢＡＭＨＩ−Ｎｅｏ（配列番号１１８）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣ−３’
逆方向プライマー：３’ＢＡＭＨＩ−Ｎｅｏ（配列番号５７）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ−３’。
【０２７８】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＢａｍＨＩで切断し、そしてまたＢａｍＨＩで切断され、ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理されたｐＳＦＶ−１ベクターに連結し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ
ＩＩを使用して、０．７％アガロースゲルから精製した。ネオマイシン耐性マーカーを含む得られるＳＦＶベクター構築物を、ＳＦＶ−Ｎｅｏと命名した。変異誘発した、または変異誘発していないＳＦＶ−Ｎｅｏ  ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡベクターのインビトロ転写を行い、そしてトランスフェクション、その後の所望の表現型の変異体についての選択を、シンドビスウイルスベクターについて本質的に上記のように行った。いくつかの独立して由来する安定に形質転換したＧ４１８耐性プールを得て特徴づけした。２つのこのようなプール、ＳＦ１およびＳＦ２についてのノーザンブロット分析を、元のコントロールＲＮＡベクター転写物（ＳＦＶ−Ｎｅｏ）とともに、図８Ｇに示す。これらのデータは、本発明に記載の選択方法が、複数のＲＮＡウイルスベクター系についての有用性を有することを証明する。
【０２７９】
（実施例３：ＳＩＮ−１ベースのＲＮＡベクターレプリコンの調製）
（Ａ．ＳＩＮ−１基本ベクターの構築）
ＳＩＮ−１由来ベクター骨格を構築し、そしてバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプラスミドＤＮＡに挿入し、そのため転写はインビトロで、感受性細胞への導入の際に自己複製分子（レプリコン）として作用するＲＮＡ分子を産生した。基本ＳＩＮ−１ＲＮＡベクターレプリコンを、以下の順のエレメントから構成した：ＳＩＮ−１  ｎｓＰｓ遺伝子、サブゲノムＲＮＡプロモーター領域、異種配列挿入を含み得るポリリンカー配列、ＳＩＮ−１  ３’非翻訳領域（ＮＴＲ）、およびポリアデニレート配列。さらに、実施例２のような方法を使用して誘導した、所望の表現型のｎｓＰｓ遺伝子もまた置換し得る。感受性細胞へのトランスフェクション後、ＲＮＡベクターレプリコンの自律複製は、ウイルスについて生じ、そして異種配列を、非常に豊富なサブゲノムｍＲＮＡ分子として合成し、これは、次に、異種遺伝子産物についての翻訳テンプレートとして用いる。
【０２８０】
ＳＩＮ−１  ｎｓＰｓ遺伝子およびサブゲノムプロモーターから構成される、ベクターの５’領域は、キャプシド遺伝子翻訳開始点の２つのヌクレオチド内まで広がる。この領域を、最初に、Ａｐａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ部位との間のｐＫＳＩＩ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入した。ベクターの５’領域を、２つの重複フラグメントにおけるｐＲＳＩＮ−１ｇプラスミドからＰＣＲによって増幅した。第１のフラグメントを、以下のプライマー対とのＰＣＲ反応で生成した：
正方向プライマー：ＳＰ６−１Ｆ（Ａｐａ  Ｉ部位／ＳＰ６プロモーター／ＳＩＮヌクレオチド１〜１８）：（配列番号１２）
５’−ＴＡＴＡＴＧＧＧＣＣＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＴＡＣＡＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ５１６０Ｒ（ＳＩＮヌクレオチド５１６０〜５１４０）：（配列番号２８）
５’−ＣＴＧＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧ。
第２のフラグメントを、以下のプライマー対とのＰＣＲ反応で生成した：
正方向プライマー：５０７９Ｆ（ＳＩＮヌクレオチド５０７９〜５１００）：（配列番号２９）
５’−ＧＡＡＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＧ
逆方向プライマー：ＳＩＮ７６４３Ｒ（緩衝配列／Ｘｈｏ  Ｉ部位／ＳＩＮヌクレオチド７６４３〜７６２１）：（配列番号３０）
５’−ＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＧ。
【０２８１】
２つのＰＣＲ反応を、Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、またはＫｌｅｎ  Ｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、上で示すプライマー対と用いて行った。さらに、反応は、５％ＤＭＳＯおよび「ＨＯＴ  ＳＴＡＲＴ  ＷＡＸ」ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含んだ。以下に示すＰＣＲ増幅プロトコルを使用した。伸長期間は、ＳＰ６−１Ｆ／ＳＩＮ５１６０Ｒまたは５０７９Ｆ／ＳＩＮ７６４３Ｒプライマー対を用いる反応について、それぞれ５分または２．５分であった。
【０２８２】
【表１５】
2013090630.tif 000016
ＰＣＲ後、５１４２ｂｐ（ＳＰ６−１Ｆ／ＳＩＮ５１６０Ｒプライマー対）および２５３２ｂｐ（５０７９Ｆ／ＳＩＮ７６４３Ｒプライマー対）の２つの増幅した産物を精製し（ＰＣＲ精製キット，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、そしてＡｐａ  ＩおよびＳｆｉ  Ｉ（５１４２ｂｐアンプリコン産物）またはＳｆｉ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ（２５３２ｂｐアンプリコン産物）で切断した。切断した産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（Ｂｉｏ  １０１，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）で精製し、そしてＡｐａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉでの切断によって調製しそしてＣＩＡＰでホスファターゼ処理したｐＫＳ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）とともに連結した。この構築は、ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ５’として公知である。
【０２８３】
ウイルス３’末端、ポリアデニレートトラクト、および独特の制限認識配列から構成される、ベクターの３’領域を、プラスミドｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ５’のＮｏｔ  ＩとＳａｃ  Ｉ部位との間に挿入した。ベクターの３’領域を、以下のプライマー対を含む反応物においてｐＲＳＩＮ−１ｇプラスミドからＰＣＲによって増幅した：
正方向プライマー：ＳＩＮ１１３８６Ｆ（緩衝配列／Ｎｏｔ  Ｉ部位／ＳＩＮヌクレオチド１１３８６〜１１４０７）：（配列番号３１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ１１７０３Ｒ（緩衝配列／Ｓａｃ  ＩおよびＰｍｅ  Ｉ部位／Ｔ４０／ＳＩＮヌクレオチド１１７０３〜１１６９８）：（配列番号３２）
５’−ＣＴＡＴＡＧＡＧＣＴ  ＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ  ＡＡＡＴＧ。
【０２８４】
上で示すプライマー対に加えて、ＰＣＲ反応物は、Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ、Ｖｅｎｔ、またはＫｌｅｎ  Ｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、５％ＤＭＳＯ、および「Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｗａｘ」ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含んだ。増幅プロトコルを、上で示したが、３０秒の７２℃伸長期間であった。
【０２８５】
３’ベクター末端に対応する３７７ｂｐ増幅した産物を精製し、Ｎｏｔ  ＩおよびＳａｃ  Ｉで切断し、精製し、そしてＮｏｔ  ＩおよびＳａｃ  Ｉでの切断およびＣＩＡＰでの処理によって調製したｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ５’に連結した。このプラスミドは、ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶとして公知である。
【０２８６】
上記の技法を使用して、β−ガラクトシダーゼレポータータンパク質をコードするｌａｃＺ遺伝子を、Ｂａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩでプラスミドｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から遊離し、そして対応する酵素認識部位でｐＫＳ＋に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子を、このプラスミドｐＫＳ−β−ｇａｌから、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで切断し、そしてＸｈｏ  ＩとＮｏｔ  Ｉ部位との間でｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに挿入した。このプラスミドは、ＳＩＮｒｅｐ／ＳＩＮ−１  ｎｓＰ１−４／ｌａｃＺとして公知である。
【０２８７】
あるいは、ルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするホタルルシフェラーゼ遺伝子を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩでの切断によってプラスミドｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から遊離し、そして複数のクローニング配列に含まれる対応する酵素認識部位でｐＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に挿入して、ｐＫＳ−ｌｕｃを生成した。ルシフェラーゼ遺伝子を、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉでの切断によってｐＫＳ−ｌｕｃから遊離し、そしてＸｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ切断したｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに挿入した。このプラスミドは、ＳＩＮｒｅｐ／ＳＩＮ−１  ｎｓＰ１−４／ｌｕｃとして公知である。
【０２８８】
さらに、アルカリホスファターゼの分泌された形態（ＳＥＡＰ）をコードする遺伝子を、ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに挿入した。簡単にいえば、ＳＥＡＰ遺伝子を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉでの切断によってプラスミドｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から遊離し、そして複数のクローニング配列に含まれる対応する認識部位でｐＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に挿入して、ｐＳＫ−ＳＥＡＰを生成した。次いで、ＳＥＡＰ遺伝子を、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉでの切断によってｐＳＫ−ＳＥＡＰから遊離し、そしてｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶの対応する酵素認識部位に挿入した。このプラスミドは、ＳＩＮｒｅｐ／ＳＩＮ−１  ｎｓＰ１−４／ＳＥＡＰとして公知である。
【０２８９】
個々のＳＩＮ−１  ｎｓＰ遺伝子を、ＳＩＮ−１および野生型発現ベクターの発現特性を比較するために、既述（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３）のシンドビスウイルスベースのｌａｃ  Ｚレプリコンの対応する野生型ウイルス領域に置換した。ＳＩＮ−１  ｎｓＰ遺伝子のＴｏｔｏ１１０１由来ｌａｃ
Ｚレプリコンへの置換を、実施例１に記載のように行った。これらのベクターを、以下の表に示すように命名した。
【０２９０】
【表１６】
2013090630.tif 000017
ＳＰ６転写物を、実施例１に記載のように、Ｘｈｏ  Ｉでの線状化の後、上の表に示すレプリコンから調製した。ＲＮＡ転写物は、シンドビスウイルスの転写を開始し得る５’配列、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子１−４、パッケージングに必要とされるＲＮＡ配列、シンドビスウイルス連結領域、ｌａｃＺ遺伝子、およびマイナス鎖ＲＮＡの合成に必要とされるシンドビスウイルス３’末端近位配列を含んだ。
【０２９１】
インビトロ転写反応産物または精製されたＲＮＡを、既述（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１）のようにベビーハムスター腎臓−２１（ＢＨＫ−２１）細胞にエレクトロポレートした。あるいは、ＢＨＫ−２１細胞を、実施例１に記載のように市販のカチオン性脂質化合物と複合体化し、そして７５％コンフルエンシーで維持したＢＨＫ−２１細胞に塗布した。トランスフェクトした細胞を、３５ｍｍディッシュに繁殖し、そして３７℃にてインキュベートした。
【０２９２】
９時間後のＢＨＫ−２１細胞のＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃ  Ｚ  ＲＮＡでのトランスフェクションの効率を、２つの代替方法によって決定した。第１の方法では、β−ガラクトシダーゼを発現するトランスフェクトした細胞を、既述（ＭａｃＧｒｅｇｏｒら，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：２５３−２６５，１９８７）のように、２％冷メタノールで細胞を最初に固定した後、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）での直接染色によって決定した。第２の方法では、β−ガラクトシダーゼの発現を、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗体を使用して、免疫蛍光によって決定した。上記のいずれかの方法によってトランスフェクトした細胞の一部を、３５ｍｍディッシュに含まれた、円形ガラスカバースリップ上で繁殖した。トランスフェクションの９時間後（ｈｐｔ）、培地をアスピレーションによって除去し、そして細胞をＰＢＳで２回リンスし、そして−２０℃で一晩のインキュベーションによってメタノールで固定した。メタノールをアスピレーションによって除去し、細胞をＰＢＳで３回リンスし、次いで、室温にて３０分間２％ＢＳＡ（フラクションＶ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにインキュベートした。非特異的抗体結合を抑制するためにＢＳＡとのインキュベーション後、細胞を、室温にて１時間一次抗β−ガラクトシダーゼ抗体（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：８００希釈した）とともにインキュベートした。次いで、過剰の一次抗体をアスピレーション、およびＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで３回リンスすることによって除去した。ＰＢＳ中２％ＢＳＡでの１：１００希釈後、１００ｍｌのヤギ抗ウサギＦＩＴＣ結合体二次抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、カバースリップに添加し、そして室温にて４５分間暗中でインキュベートした。過剰の二次抗体を、カバースリップをＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで２回、およびＰＢＳで１回リンスすることによって除去した。次いで、カバースリップを、顕微鏡スライド上に置いた、Ｃｙｔｏｓｅａｌ  ６０マウント培地（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｉｖｅｒｄａｌｅ，ＮＪ）の１滴を細胞の下側にマウントした。蛍光顕微鏡を使用して、トランスフェクション効率を決定するために、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞の頻度を決定した。
【０２９３】
全体のトランスフェクトした細胞ライセートにおけるβ−ガラクトシダーゼのレベルを、２つの代替方法によって、９ｈｐｔで決定した。第１の方法では、トランスフェクトした細胞を、培地のアスピレーション後にＰＢＳでリンスし、そして１０6細胞当たり２５
０μｌのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ディッシュに添加した。β−ガラクトシダーゼ発現レベルを、市販の基質検出システム（Ｌｕｍｉ−ｇａｌ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、次いでルミノメトリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、室温で１分間１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．でのマイクロ遠心分離によってプロセシングした、細胞ライセートからの上清画分を混合することによって決定した。第２の方法では、β−ガラクトシダーゼの活性を、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）によって既述のように決定した。簡単にいえば、トランスフェクトした細胞を、培地のアスピレーション後ＰＢＳでリンスし、そして１０6細胞当たり２
００μｌのＴＴＥ溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を各ディッシュに添加した。室温にて１分間１４，０００ｒ．ｐ．ｍ．でマイクロ遠心分離によって細胞ライセートからの細胞細片をペレットにした後、５０μｌの上清を、０．５ｍｌのＺ緩衝液  ｐＨ７．０（６０ｍＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4／４０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／１０ｍＭ  ＫＣｌ／１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4／
５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）に添加し、そして３７℃にて５分間インキュベートした。次いで、試料におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｚ緩衝液中、４ｍｇ／ｍｌの色素原性基質ｏ−ニトロフェニル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ；ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む溶液の０．２ｍｌの添加後に、分光光度計（４２０ｎｍ）によって決定した。試料を、黄色が発色するまで（約５分）３７℃にてインキュベートし、そして反応を、０．５ｍｌの０．５Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3の添加によって停止した。
【０２９４】
トランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現のレベルを、上記の方法に従って決定し、そして以下に示す表に例示する。示したデータは、上記のように、変化するトランスフェクション効率について標準化される。
【０２９５】
【表１７】
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結果は、ＳＩＮ−１改変体株に由来するレプリコンベクターが実際に機能的であることを示す。ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトした場合、発現したレポータータンパク質のレベルは、野生型ウイルス由来ベクターでトランスフェクトした細胞で観察されるよりも高い。さらに、生産的持続性感染の確立についての表現型でのように、ＳＩＮ−１由来レプリコンベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現のより高いレベルは、主としてｎｓＰ  ２遺伝子にマッピングした。
【０２９６】
（実施例４：ＳＩＮ１ベースのＤＮＡベクターの調製）
（Ａ．プラスミドＤＮＡ  ＳＩＮ−１由来発現ベクターの構築）
シンドビスウイルス感染サイクルの効率的開始は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ発現カセット（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：５０８−５１９，１９９６）内に含まれるゲノムｃＤＮＡクローンからインビボで生じ得る。ＤＮＡ形式から機能的アルファウイルス遺伝子を発現する能力は、開発されるべき２つの新しいアルファウイルスベースの遺伝子発現系を可能にしている：（１）遺伝学的免疫投与のための適用に関するプラスミドＤＮＡベースのベクター、および（２）ベクターレプリコンおよびＤＨプラスミドＤＮＡで同時トランスフェクトした細胞におけるパッケージしたアルファウイルスの産生。これまでに、感染性シンドビスウイルスＲＮＡおよびそれに由来する相補的ベクターを産生するための分子アプローチを、主としてバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターからのｃＤＮＡクローンのインビトロ転写、次いで許容細胞へのトランスフェクションに制限した。
【０２９７】
プラスミドＤＮＡベースのアルファウイルス由来発現ベクターは、ＥＬＶＳTM（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｌａｙｅｒｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）として公知である。ＥＬＶＳTMプラスミドＤＮＡベクターは、層になったＤＮＡベースの発現系への自己複製するベクターＲＮＡ（レプリコン）の変換を含む。ある実施態様内では、第１の層は、ＲＮＡベクターレプリコンに対応する、第２の層の転写を開始する真核生物（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）発現カセットを有する。核から細胞質への第１層から発現したレプリコンの輸送後、ベクターの自己触媒増幅は、ウイルス（例えば、アルファウイルス）複製サイクルに従って進行し、異種遺伝子の発現を生じる。
【０２９８】
ＳＩＮ−１ウイルスまたは実施例２で教示されたように選択した改変体に由来するプラスミドＤＮＡ発現ベクターの構築を、既述（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：５０８−５１９，１９９６）方法の改変で行った。発現ベクターを、ｐＵＣ９（Ｓｐｒａｔｔら，Ｇｅｎｅ  ４１：３３７−３４２，１９８６）のカナマイシン耐性アナログであるプラスミドベクターｐＢＧ１３１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３７４４３）でアセンブリした。ｐＢＧＳ１３１およびそれに由来するプラスミドを、２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で繁殖した。
【０２９９】
発現ベクターへの異種配列の挿入を容易にするために、ｐＢＧ１３１におけるカナマイシン遺伝子の翻訳リーディングフレーム内に位置するＸｈｏ  Ｉ認識配列を、Ｘｈｏ  Ｉ付着末端を含む部分的に相補的な１２マーオリゴヌクレオチド対を挿入することによって除去した。Ｘｈｏ  Ｉ認識部位を、以下に示すように、挿入の結果として欠失した：
オリゴヌクレオチド１：（配列番号３３）
５’−ＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡ
【０３００】
【表１８】
2013090630.tif 000019
（Ｘｈｏ  Ｉ部位：ＣＴＣＧＡＧ）（配列番号３３〜３６および１０４）。
【０３０１】
オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2の存在下で等モル濃度中でゲルアニール
し、１００℃にて５分間加熱し、ゆっくり室温まで冷却し、そしてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化する。オリゴヌクレオチドを、Ｘｈｏ  Ｉ切断およびＣＩＡＰ処理によって調製したｐＢＧＳ１３１に対するインサート：プラスミドベクターの２００：１比で連結した。得られるプラスミドを、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉと呼ぶ。２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中のｐＢＧＳ１３１またはｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉプラスミドで形質転換したＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の増殖比は、１．５と８時間との間の時間経過にわたって区別不可能であった。
【０３０２】
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写終結／ポリアデニル化シグナルを、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  ＩのＳａｃ  ＩとＥｃｏ  ＲＩ部位との間に挿入した。ＢＧＨ転写終結配列を、テンプレートとして以下に示すプライマー対およびｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＰＣＲ増幅によって単離した。正方向プライマーＢＧＨＴＴＦ（緩衝配列／Ｓａｃ  Ｉ部位／ｐＣＤＮＡ３ヌクレオチド１１３２〜１１６１）：（配列番号３７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣ
逆方向プライマーＢＧＨＴＴＲ（緩衝配列／Ｅｃｏ  ＲＩ部位／ｐＣＤＮＡ３ヌクレオチド１１８０〜１１５４）：（配列番号３８）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＧＡＴＧＣ。
【０３０３】
上で示すプライマーを、３０秒伸長期間を使用して、３温度サイクルプログラムでのＰＣＲ反応で使用した。５８ｂｐ増幅した産物を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で精製し、Ｓａｃ  ＩおよびＥｃｏ
ＲＩで切断し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製し、そしてＳａｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ切断しＣＩＡＰ処理したｐＢＧＳ１３１に連結した。プラスミドは、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉ−ＢＧＨＴＴとして公知である。
【０３０４】
次いで、シンドビスウイルス由来プラスミドＤＮＡ発現ベクターの３’末端を、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉ−ＢＧＨＴＴ構築物に挿入した。ベクターのこの領域は、以下の順のエレメントを含む：シンドビスウイルス３’末端非翻訳領域（３’ＮＴＲ）；４０マーポリ（Ａ）配列；Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）抗原性リボザイム；およびＳａｃ  Ｉ認識配列。これらの順のエレメントの構築を、テンプレートとして以下に示すプライマーおよびｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶプラスミド（実施例４）を使用して、ネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）によって行った。
正方向プライマー：ＳＩＮ１１３８６Ｆ（緩衝配列／Ｎｏｔ  Ｉ部位／ＳＩＮヌクレオチド１１３８６〜１１４０７）：（配列番号３１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＣＣＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＣ
ネスティッドプライマー：ｐＡＨＤＶ１Ｆ（ポリ（Ａ）／ＨＤＶ  ＲＢＺヌクレオチド１〜４６）：（配列番号３９）
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＧＧＧＴＣＧＧＣＡＴ  ＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡ  ＣＣＴＣＣＴＣＧＣＧ  ＧＴＣＣＧＡＣＣＴＧ  ＧＧＣＡＴＣ
逆方向プライマー：ＳａｃＨＤＶ７７Ｒ（緩衝配列／Ｓａｃ  Ｉ部位／ＨＤＶ  ＲＢＺヌクレオチド７７〜２７）：（配列番号４０）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡＧＣＣＡＴＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＧＴＧＣＧＴＣＣＴＣＣＴＴ  ＣＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣＧ。
【０３０５】
上で示すプライマーを、実施例４に記載の反応条件および３温度サイクリングプログラムに従って、３０秒の伸長時間で、ＰＣＲ増幅で使用した。４２２ｂｐ増幅した産物を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で精製し、Ｎｏｔ  ＩおよびＳａｃ  Ｉで切断し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製し、そしてＮｏｔ  Ｉ／Ｓａｃ  Ｉ切断したＣＩＡＰ処理したｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶに連結した。この構築物は、ｐＫＳＳＩＮ−１ＢＶ／ＨＤＶＲＢＺとして公知であり、そしてシンドビヌクレオチド２２８９でのＢｇｌ  ＩＩ部位から、ＨＤＶリボザイム配列を含むベクターの３’末端まで広がる、シンドビスウイルス由来プラスミドＤＮＡ発現ベクター配列を含む。
【０３０６】
次いで、プラスミドｐＫＳＳＩＮ−１ＢＶ／ＨＤＶＲＢＺをＢｇｌ  ＩＩおよびＳａｃ
Ｉで切断し、５８１５ｂｐフラグメントを、１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動によって単離し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製し、そしてＢｇｌ  ＩＩ／Ｓａｃ  Ｉ切断したＣＩＡＰ処理ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉ−ＢＧＨＴＴに挿入して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１ＢｇｌＬＦとして公知のプラスミド構築物を生成した。この構築物は、ｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏ  Ｉプラスミド上のＢＧＨ転写終結配列に融合した３’末端を有する、上記のプラスミドｐＫＳＳＩＮ−１ＢＶ／ＨＤＶＲＢＺからのシンドビスウイルス発現ベクターの領域を含む。
【０３０７】
シンドビスウイルスプラスミドＤＮＡベクターのアセンブリを、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１ＢｇｌＬＦプラスミドへの、シンドビスウイルスゲノムの最初の２２８９ヌクレオチド（５’ウイルス末端およびｎｓＰｓ遺伝子の一部を含む）と並列のＣＭＶプロモーターの挿入によって完了した。重複ＰＣＲアプローチを使用して、ＣＭＶプロモーターを、転写開始が、シンドビスウイルスベクターレプリコンＲＮＡの５’末端での単一非ウイルスヌクレオチドの付加を生じるように、５’ウイルス末端に配置した。ＣＭＶプロモーターを、以下のプライマー対を使用して、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から第１のＰＣＲ反応で増幅した：
正方向プライマー：ｐＣＢｇｌ２３３Ｆ（緩衝配列／Ｂｇｌ  ＩＩ認識配列／ＣＭＶプロモーターヌクレオチド１〜２２）：（配列番号４１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ
逆方向プライマー：ＳＮＣＭＶ１１４２Ｒ（ＳＩＮヌクレオチド８〜１／ＣＭＶプロモーターヌクレオチド１１４２〜１１０８）：（配列番号４２）
５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＡＣＣ。
【０３０８】
上で示すプライマーを、実施例４に記載の反応条件および３温度サイクリングプログラムに従って、１分の伸長時間で、ＰＣＲ反応で使用した。
【０３０９】
ＳＩＮ−１  ５’末端を、以下のプライマー対を使用して、ｐＫＳＲＳＩＮ−１ｇクローン（実施例１）からの第２のＰＣＲ反応で増幅した：
正方向プライマー：ＣＭＶＳＩＮ１Ｆ（ＣＭＶプロモーターヌクレオチド１１２４〜１１４２／ＳＩＮヌクレオチド１〜２０）：（配列番号４３）
５’−ＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ３１８２Ｒ（ＳＩＮヌクレオチド３１８２〜３１６０）：（配列番号４４）
５’−ＣＴＧＧＣＡＡＣＣＧＧＴＡＡＧＴＡＣＧＡＴＡＣ。
【０３１０】
上で示すプライマーを、３分の伸長時間を使用して、３温度サイクリングプログラムでのＰＣＲ反応で使用した。
【０３１１】
９３０ｂｐおよび３２００ｂｐの増幅した産物を、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そして以下のプライマー対を用いるＰＣＲ反応で一緒に使用した：
正方向プライマー：ｐＣＢｇｌ２３３Ｆ：（配列番号４１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧ
逆方向プライマー：（ＳＩＮヌクレオチド２３００〜２２７８）：（配列番号４５）
５’−ＧＧＴＡＡＣＡＡＧＡＴＣＴＣＧＴＧＣＣＧＴＧ。
【０３１２】
上で示すプライマーを、３．５分の伸長時間を使用して、３温度サイクリングプログラムでのＰＣＲ反応で使用した。
【０３１３】
第１のＰＣＲ増幅産物の２６の３’末端塩基は、第２のＰＣＲ増幅産物の２６の５’末端塩基と重複する；得られる３２００ｂｐ重複二次ＰＣＲ増幅産物を、１％アガロース／ＴＢＥ電気泳動によって精製し、Ｂｇｌ  ＩＩで切断し、そしてＢｇｌ  ＩＩ切断したＣＩＡＰ処理ｐＢＧ／ＳＩＮ−１ＢｇｌＬＦに連結した。この構築物を、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５と呼ぶ。
【０３１４】
実施例１で議論したように、野生型シンドビスウイルスのｎｓＰｓ遺伝子配列における比較的少数のヌクレオチド点変化は、ＳＩＮ−１に特徴的な表現型を生じる。野生型およびＳＩＮ−１遺伝子型に由来するクローンを容易に区別することを促進するこれらのヌクレオチド変化の結果として、新しい制限酵素認識部位は生じない。したがって、ＰＣＲベースの診断アッセイを、ＳＩＮ−１由来クローンの同定のための迅速な方法として考案した。簡単にいえば、ＳＩＮ−１と野生型との間の特定の塩基変化を、プライマーの３’末端塩基に配置するように、正方向プライマーを設計した。１つのプライマーは、ＳＩＮ−１ヌクレオチドを含むが、もう１つは野生型ヌクレオチドを含んだ。両方の遺伝子型間で保存された下流の領域における逆方向プライマーを、各正方向プライマーと組み合わせて使用した。正確なアニーリング温度で、ＳＩＮ−１テンプレートを、ＳＩＮ−１正方向プライマーを含む反応物中でのみ増幅した。野生型およびＳＩＮ−１遺伝子型を区別するために使用したプライマー配列を、以下に示す。反応条件は、本明細書に含まれる実施例全体を通して記載されるとおりであった。
【０３１５】
【表１９】
2013090630.tif 000020
【０３１６】
【表２０】
2013090630.tif 000021
【０３１７】
【表２１】
2013090630.tif 000022
レポータータンパク質発現ベクターを、ｌａｃＺ、ＳＥＡＰ、またはルシフェラーゼレポーター遺伝子をｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５ベクター骨格に挿入することによって構築した。別々の反応で、ｐＫＳ−β−ｇａｌ、ｐＳＫ−ＳＥＡＰ、およびｐＫＳ−ｌｕｃプラスミド（実施例４）を、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで切断した。ｌａｃＺ、ＳＥＡＰ、またはルシフェラーゼ遺伝子を含むフラグメントを、１％アガロース／ＴＢＥゲル電気泳動によって単離し、そしてその後ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製した。次いで、これらのレポーター遺伝子を、別々の反応で、Ｘｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ切断したＣＩＡＰ処理ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５プラスミドと連結した。これらの構築物は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ、およびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃとして公知である。
【０３１８】
（Ｂ．ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃ、またはｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ発現ベクターでトランスフェクトした細胞における異種タンパク質の発現）
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５またはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５ベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞における分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現のパターンを比較した。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５プラスミドは、ＳＩＮ−１改変体よりもむしろ、野生型シンドビスウイルスに由来する配列を含む。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターの構築は、野生型シンドビスウイルスに由来する全長ゲノムｃＤＮＡ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，ＷＯ  ９５／０７９９４）を、ベクター構築のためのテンプレートとして使用したことを除いては、正確に、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターについて本明細書に記載のとおりであった。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターの構築は、既に記載されており（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，前出）；したがって、株、およびそれゆえ配列は異なるが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５およびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクターに含まれるシンドビスウイルス特異的領域は同じである。
【０３１９】
１２ｍｍディッシュ中に７５％コンフルエンシーで維持されるベビーハムスター腎臓−２１（ＢＨＫ−２１）細胞を、４．０μｌの市販の脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）と複合体化した１．０μｇのｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５またはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５発現ベクタープラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。他の点では、トランスフェクション条件は、この脂質製造業者によって示唆されたとおりであった。５％ウシ胎仔血清を補充したイーグル最小必須培地を、他に指示がなければ、トランスフェクションの４時間後（ｈｐｔ）に細胞に添加した。トランスフェクトした細胞を、３７℃にてインキュベートした。トランスフェクション後の種々の時間に、以下に示すように、いくつかのアッセイを行って、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５またはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした細胞における分泌したアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子のベクター特異的ＲＮＡ合成と発現を比較した。
【０３２０】
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ
１．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培養培地に分泌されたアルカリホスファターゼのレベルを比較した。細胞培養培地を、製造業者（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，ＢｅｄＦｏｒｄ，ＭＡ）の指示に従って、Ｐｈｏｓｐｈａ−ＬｉｇｈｔTM化学発光レポーター遺伝子アッセイでのアルカリホスファターゼの存在についてアッセイした。簡単にいえば、１０μｌの細胞培養上清を、３０μｌの希釈緩衝液と混合し、そして６５℃にて３０分間インキュベートした。この試料を、４０μｌのアッセイ緩衝液と混合する前に、室温まで冷却した。この試料を、室温で５分間インキュベートし、次いで４０μｌの反応緩衝液を添加した。試料を、室温にて２０分間インキュベートした。発光の合計を、サイクルモードでＭＬ３０００マイクロタイタープレートルミノメーター（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）上で測定し、そしてｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培養培地中のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を、４８ｈｐｔに決定し、そして結果を、以下の表に示す。
【０３２１】
【表２２】
2013090630.tif 000023
さらに、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞で合成したベクター特異的ＲＮＡのレベルを、トランスフェクション後４８時間に、正確に既述（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，前出）のように、ノーザンブロット分析によって決定した。この実験の結果を、図９Ａに示す。総細胞性ＲＮＡを、製造業者に記載のようにＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）でトランスフェクトしたＢＨＫ細胞から単離した。トランスフェクトしたＢＨＫ細胞からの試料に存在する総細胞性ＲＮＡ濃度を、分光学的に決定した。さらに、トランスフェクトした細胞から単離した物質を、１０μｌ／ｍｌのエチジウムブロミド染色した０．７％アガロース／ＴＢＥミニゲルによる０．５μｇの総細胞性ＲＮＡの電気泳動によってインタクトであることを決定した。ノーザンブロット分析を、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に従って行った。すべてのトランスフェクトした試料からのＲＮＡを、単一のノーザンブロット分析からのオートラジオグラムで可視化し得るために、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰおよびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰトランスフェクトした細胞からの１レーン当たり、それぞれ、２．５μｇおよび３０μｇのＲＮＡをロードした。テストした両方のプラスミドでの個々のトランスフェクションからの、ＲＮＡの４つの試料を、４８ｈｐｔおよび７２ｈｐｔの両方にて、０．７％ホルムアルデヒドアガロースゲルによって電気泳動し、そしてＺｅｔａ−プローブメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）にトランスファーした。このブロットを、アルカリホスファターゼ遺伝子に対応するランダムプライムしたプローブとハイブリダイズした。トランスフェクトしたＢＨＫ細胞におけるベクター特異的ＲＮＡ合成およびＡＰ発現のレベルを４８ｈｐｔに比較したこの実験の結果は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ  ＤＮＡでトランスフェクトした細胞中で合成されるベクター特異的ＲＮＡのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰトランスフェクトした細胞におけるよりも少なくとも１００倍低かったが、ＡＰのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ  ＤＮＡと比較して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰ
ＤＮＡでトランスフェクトした細胞で５倍のみ低かったことを証明する。
【０３２２】
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ
１．５−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞の培養培地に分泌されたアルカリホスファターゼのレベルもまた、７日の時間経過にわたって比較した。図９Ｂに示したこの研究の結果は、初期の時点での培養培地に存在するＡＰのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ＳＥＡＰプラスミドと比較して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１
ＥＬＶＳ−１  １．５−ＳＥＡＰプラスミドでトランスフェクトした細胞ではるかに低かったことを証明する。しかし、ＳＩＮ−１シンドビスウイルス改変体株由来ベクターでトランスフェクトした細胞で発現したＡＰのレベルは、迅速に増加し、そして９６ｈｐｔの時点まで野生型ウイルス由来ベクターでトランスフェクトした細胞においてより高かった。
【０３２３】
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−ｌｕｃまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞に存在するルシフェラーゼレベルを、２４、４８、および７２ｈｐｔで比較した。ルシフェラーゼ発現レベルを、１０6トランスフェクトした細胞当たり２５０μｌのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を添加すること、１４，０００ｒｐｍにて１分間溶解物を遠心分離すること、次いで市販の基質検出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）と細胞溶解物からの上清画分を混合すること、次いでルミノメトリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって定量した。この実験からの結果（以下の表に示す）、および図１０にグラフで示す結果は、アルカリホスファターゼ発現ベクターで観察した結果に類似する。トランスフェクション後の早い時間では、ルシフェラーゼ発現レベルは、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドと比較して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−ｌｕｃプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞でより低かった。しかし、４８ｈｐｔおよび７２ｈｐｔの時点で、ルシフェラーゼレベルは、シンドビスウイルスＳＩＮ−１改変体株由来および野生型由来発現ベクターでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞で類似した。
【０３２４】
【表２３】
2013090630.tif 000024
β−ガラクトシダーゼを発現する細胞の数を直接測定するために、４８ｈｐｔでのＢＨＫ細胞におけるｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌおよびｐＢＧ／ｗｔ
ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドのトランスフェクションの効率を、細胞単層の直接Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）染色（ＭａｃＧｒｅｇｏｒ，Ｃｅｌｌ
Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：２５３−２６５，１９８７）によって決定した。トランスフェクション効率は等価であり、そして以下の表に示す。
【０３２５】
【表２４】
2013090630.tif 000025
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞で合成したベクター特異的ＲＮＡのレベルを、トランスフェクション後４８時間および７２時間に、正確に既述（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，前出）のように、ノーザンブロット分析によって決定した。総細胞性ＲＮＡを、製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）によって記載のように、Ｔｒｉ−ＲｅａｇｅｎｔでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞から単離した。ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞からの試料に存在するトータル細胞性ＲＮＡ濃度を、分光学的に決定した。さらに、トランスフェクトした細胞から単離した物質を、１０ｕｌ／ｍｌのエチジウムブロミド染色した、０．７％アガロース／ＴＢＥミニゲルによって０．５μｇの総細胞性ＲＮＡの電気泳動によって未処理であることを決定した。ノーザンブロット分析を、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に従って行った。すべてのトランスフェクトした試料からのＲＮＡを、単一のノーザンブロット分析からのオートラジオグラムで可視化し得るために、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌおよびｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌトランスフェクトした細胞からの１レーン当たり、それぞれ、２．５μｇおよび５μｇのＲＮＡをロードした。テストした両方のプラスミドでの個々のトランスフェクションからの、ＲＮＡの２つの試料を、０．７％ホルムアルデヒドアガロースゲルによって電気泳動し、そしてＺｅｔａ−プローブメンブラン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）にトランスファーした。このブロットを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に対応するランダムプライムしたプローブとハイブリダイズした。図１１Ａに示すこの実験の結果は、トランスフェクション後４８時間および７２時間でのｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ  ＤＮＡでトランスフェクトした細胞で合成したベクター特異的ＲＮＡのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌトランスフェクトした細胞において検出されるＲＮＡのレベルよりも少なくとも１００倍低かったことを証明する。
【０３２６】
さらに、β−ガラクトシダーゼ発現レベルを、１０6トランスフェクトした細胞当たり
２５０μｌのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ
ＷＩ）を添加すること、１４，０００ｒｐｍにて１分間溶解物を遠心分離すること、次いで市販の基質検出システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）と細胞溶解物からの上清画分を混合すること、次いでルミノメトリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって定量した。この実験からの結果（以下の表に、および図９Ｃにグラフで示す）は、トランスフェクション後の早い時間に、βガラクトシダーゼ発現レベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドと比較して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌでトランスフェクトしたＢＨＫ細胞で有意に低かったことを証明する。しかし、β−ガラクトシダーゼレベルが、最終の１２０時間時点で野生型ウイルスでトランスフェクトした細胞におけるよりも高いので、レポーター発現は、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌトランスフェクトした細胞にける時間経過よりも迅速に増加した。
【０３２７】
【表２５】
2013090630.tif 000026
ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌまたはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現もまた、最終の１２０ｈｐｔ時点で、レポータータンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に特異的なモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロット分析によって直接測定した。１２０ｈｐｔで決定したレポータータンパク質活性と同様に、β−ガラクトシダーゼタンパク質のレベルは、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌと比較して、ＰＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ−１  １．５−β−ｇａｌトランスフェクトしたＢＨＫ細胞において、同じレベルかまたはそれを超えており、そして図１１Ｃで証明する。
【０３２８】
ひとまとめにして考えると、本明細書に記載の結果は、合成したベクター特異的ＲＮＡのレベルが、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳトランスフェクトした細胞と比較して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳトランスフェクトした細胞において少なくとも１００倍少ないことを証明する。しかし、重要なことには、４８〜７２時間遅延後、レポーター遺伝子発現のレベルは、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳトランスフェクトした細胞と比較して、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳトランスフェクトした細胞において、等価であるかまたはより高い。トランスフェクトした細胞における低いベクター特異的ＲＮＡ合成と組み合わせた高い発現レベルによって特徴づけられる、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳの表現型は、宿主細胞タンパク質合成の減少、または不在、阻害のためであるようである。したがって、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳのこの特性は、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳと比較して、トランスフェクトした細胞においてサブゲノムｍＲＮＡ翻訳テンプレート当たり非常に高レベルの発現したレポータータンパク質を生じる。要約すると、ＳＩＮ−１改変体株に由来するプラスミドＤＮＡ発現ベクターの表現型は、野生型ウイルス由来ベクターと比較して、比較的低レベルのＲＮＡ合成と組み合わせて、等価の発現レベルの点で、親ウイルスに倣う。ベクターは、シンドビスウイルス構造タンパク質のいずれも含まないので、この表現型は、ＳＩＮ−１ウイルス改変体の非構造遺伝子にマッピングされなければならない。
【０３２９】
（実施例５：プラスミドＤＮＡ  ＳＩＮ−１由来発現ベクターの改変）
アルファウイルスベースのベクターからの標的細胞における異種遺伝子の発現レベルは、宿主属およびベクター立体配置を含む、いくつかの因子によって影響を受ける。例えば、β−ガラクトシダーゼ発現レベルは、ｐＢＧ／ＥＬＶＳベクターでトランスフェクトした、ＨＴ１０８０のような、いくつかのヒト細胞と比較して、ＢＨＫ細胞で１０〜１００倍高い。目的のインビボ標的属に由来する細胞タイプにおけるベクター特異的発現の相対レベルを確立するために、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡ（実施例４を参照のこと）でトランスフェクトしたＢＨＫおよびいくつかのヒト細胞株におけるレポーター遺伝子発現のレベルを比較した。ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドで、または従来のプラスミド発現ベクターでトランスフェクトした、ＢＨＫ細胞、およびヒト線維肉腫株であるＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １２１）細胞における、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルを決定した。従来のプラスミドベクターを、ＣＭＶプロモーター駆動ｐＵＣ由来発現プラスミド複数クローニング部位（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）へのｌａｃＺ遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の挿入によって構築し、そしてｐＣＭＶ−β−ｇａｌとして公知である。図１２Ａに示す、この研究の結果は、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルが、ＢＨＫ細胞と比較して、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞においてほぼ１００倍低かったことを証明する。細胞はまた、シンドビスウイルスベクターレプリコン発現からＲＮＡポリメラーゼＩＩ発現を分離するために、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌでトランスフェクトした。この実験では、発現は、ＢＨＫ細胞と比較して、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞で５〜１０倍減少したが、発現は、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞でほぼ１００倍減少した。したがって、結果は、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ
１．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞におけるレポーター遺伝子発現の劇的な減少が、一部は、これらのヒト細胞におけるシンドビスウイルスベクターレプリコンの減少した活性に起因することを示す。
【０３３０】
ＲＮＡアルファウイルスゲノムの全体の可形成およびＢＨＫ細胞におけるウイルスの増殖があれば、異種遺伝子の発現レベルが、ベクターが由来した宿主細胞株で最高であることは、驚くべきことではない。したがって、宿主細胞タンパク質合成の遅延したまたは不在の阻害と組み合わせて、かなり低いウイルスＲＮＡレベルおよび等価のウイルス産生レベルによって特徴づけられる、ＳＩＮ−１表現型を有するアルファウイルスの選択（実施例１および２に記載のように）を、何らかのヒト初代、または二倍体、もしくは多倍数体ヒト細胞で行い得る。
【０３３１】
インビボで標的細胞に最も密接に類似する細胞（例えば、ヒト）において所望の表現型を有するアルファウイルスを選択することの他に、表現型プラスミドＤＮＡ発現カセット成分のいくつかの代替改変も行い得る。例えば、より強いＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーターとのＭｏＭＬＶ  ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの置換は、トランスフェクトした細胞における異種遺伝子発現のレベルを著しく増強する（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６、およびＤｕｂｅｎｓｋｙら，Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４）。さらに、異種遺伝子の上流または下流のいずれかの、イントロン、例えば、ＳＶ４０スモールｔ抗原またはＣＭＶイントロンＡ、の並置は、いくつかのトランスフェクトした細胞タイプにおける異種遺伝子発現のレベルを増加し得る（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，前出）。
【０３３２】
原型プラスミドＤＮＡ発現カセット成分のいくつかのさらなる代替改変はまた、インビトロまたはインビボでトランスフェクトした細胞において全体の発現を増強するために利用され得る。１つの改変では、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）翻訳後調節エレメント（ＰＲＥ）を、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡに挿入した。ＰＲＥ配列は、核から細胞質へのシスでのＨＢＶ
Ｓ転写の輸送を活性化する。ＰＲＥ配列は、スプライスドナーおよびアクセプター部位とは独立して機能するようであり、そしてイントロンを含まないβ−グロビン転写物の細胞質発現を活性化することが示されている。ＰＲＥが、スプライシング経路と効率的に相互作用しない核転写物の輸出を可能にするためにシスで機能し、したがって核から十分に輸送されないことが提案されている（Ｈｕａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：３８６４−３８６９，１９９５）。
【０３３３】
ＰＲＥ配列を、ＡＤＷウイルス株、ｐＡＭ６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９６３０）の全長ゲノムクローンからＨＢＶのＰＣＲ生成した５６４ｂｐフラグメントを最初に単離することによって、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌにクローニングした。増幅したフラグメントは、ＨＢＶゲノムの塩基１２３８〜１８０２に広がる。プライマー配列を以下に示す。
正方向プライマー：ＮＴＰＲＥ１２３８Ｆ（配列番号４６）
５’−ＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣ
逆方向プライマー：ＥＡＰＲＥ１８０２Ｒ（配列番号４７）
５’−ＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣ。
【０３３４】
プライマーは、フラグメントの５’末端のＮｏｔ  Ｉ認識部位および３’末端のＥａｅ
Ｉ認識部位を導入する。Ｎｏｔ  ＩおよびＥａｅ  Ｉは、適合可能な付着末端を有する。Ｅａｅ  Ｉ認識部位は、Ｎｏｔ  Ｉ部位の内部にあり、そのためＥａｅ  Ｉは両方の部位を消化する。
【０３３５】
ＰＣＲフラグメントを、Ｅａｅ  Ｉで消化し、そしてＮｏｔ  Ｉ消化／ＣＩＡＰ処理ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌにクローニングした。正確なクローンは、ＰＲＥの５’末端にＮｏｔ  Ｉ部位を保持し、そしてｐＢＧ／ｗｔ
ＥＬＶＳ／ＰＲＥ  １．５−βｇａｌと呼ぶ。
【０３３６】
トランスフェクトした細胞での異種遺伝子発現におけるＥＬＶＳプラスミドに含まれるＰＲＥ配列の潜在的効果を決定した。簡単にいえば、ＢＨＫおよびＨＴ１０８０細胞を、７５％コンフルエンシーまで１２ｍｍディッシュ中で培養し、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と複合体化した５００ｎｇのｐＣＭＶ−β−ｇａｌ、ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌ、またはｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ／ＰＲＥ  １．５−βｇａｌプラスミドＤＮＡでトランスフェクトし、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現のレベルを、４８時間後に決定した。トランスフェクション効率を、実施例４に記載のように、トランスフェクトした単層の直接的Ｘｇａｌ染色によって決定し、そして以下の表に示す。
【０３３７】
【表２６】
2013090630.tif 000027
結果は、β−ガラクトシダーゼを発現するＥＬＶＳプラスミドでトランスフェクトしたＢＨＫまたはＨＴ１０８０細胞の数が、ベクターにおけるＲＮＡ輸送ＰＲＥ配列の包含によって劇的に増加したことを明らかに証明する。さらに、これらの結果は、ＥＬＶＳプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした、ＢＨＫ細胞と比較して、ＨＴ１０８０細胞において減少した異種遺伝子発現レベルについての１つの原因が、核からの一次転写物の非能率的輸送であることを示す。
【０３３８】
ＰＲＥ配列を含むＥＬＶＳプラスミドでトランスフェクトしたレポータータンパク質を発現するＨＴ１０８０細胞のより高い頻度に並行して、β−ガラクトシダーゼのレベルは、ＰＲＥ配列を含むＥＬＶＳベクターでトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞からの溶解物中で劇的により高かった。これらの結果を、図１２Ｂに示し、そして上の表に示す結果とともにひとまとめにすると、機能的ベクターレプリコンを、ＥＬＶＳプラスミドでトランスフェクトしたヒト細胞において核から非効率的に輸送することを証明する。さらに、ＥＬＶＳプラスミド構築物におけるＰＲＥ配列の包含は、テストしたすべての細胞において異種遺伝子発現のレベルを増加させ、これは、細胞質ベクターレプリコン輸送の効率と全体の異種遺伝子発現レベルとの間の明らかな関係を証明する。
【０３３９】
スプライスされていないＲＮＡを輸送するためにシスで操作するいくつかの他のウイルス配列エレメントも同定されている。例えば、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス（ＭＰＭＶ）ゲノムの３’末端の近くのヌクレオチド８０２２と８２４０との間に位置する、２１９ｂｐ配列は、Ｒｅｖ非依存性のヒト免疫欠損ウイルス１型（ＨＩＶ−１）複製を可能にすることが示されている（Ｂｒａｙら，ＰＮＡＳ  ９１：１２５６−１２６０，１９９４）。構成性輸送エレメント（ＣＴＥ）として公知の、ＭＰＭＶ  ＲＮＡ輸送エレメントを、全長ゲノムクローンテンプレートからのＭＰＳＶのＰＣＲ生成した２１９ｂｐフラグメント（Ｓｏｎｉｇｏら，Ｃｅｌｌ  ４５：３７５−３８５，１９８６）、またはＭＰＳＶサブゲノムクローンｐＧＥＭ７ＦＺ（−）ＭＰＳＶ  ８００７−８２４０（Ｄ．Ｒｅｋｏｓｈ，Ｈａｍ−Ｒｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳＵＮＹ  ａｔ  Ｂｕｆｆａｌｏ，３０４  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｈａｌｌ，Ｂｕｆｆａｌｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を最初に単離することによって、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌプラスミドに挿入する。増幅したフラグメントは、ＭＰＳＶゲノムの塩基８０２２〜８２４０に広がる。プライマー配列を以下に示す。
正方向プライマー：ＮＭＰＶＭ８０２１Ｆ（配列番号４８）
５’−ＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＣＧ
逆方向プライマー：ＥＭＰＭＶ８２４１Ｒ（配列番号４９）
５’−ＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＡＧ。
【０３４０】
プライマーは、フラグメントの５’末端にＮｏｔ  Ｉ認識部位および３’末端にＥａｅ
Ｉ認識部位を導入する。Ｎｏｔ  ＩおよびＥａｅ  Ｉは、適合可能な付着末端を有する。Ｅａｅ  Ｉ認識部位は、Ｎｏｔ  Ｉ部位の内部にあり、そのためＥａｅ  Ｉは両方の部位を消化する。
【０３４１】
ＰＣＲフラグメントを、Ｅａｅ  Ｉで消化し、そしてＮｏｔ  Ｉ消化／ＣＩＡＰ処理ｐＢＧ／ｗｔ  ＥＬＶＳ  １．５−βｇａｌにクローニングする。正確なクローンは、ＰＲＥの５’末端にＮｏｔ  Ｉ部位を保持し、そしてｐＢＧ／ｗｔ
ＥＬＶＳ／ＣＴＥ  １．５−βｇａｌと呼ぶ。
【０３４２】
ＨＢＶ  ＰＲＥおよびＭＰＳＶ  ＣＴＥ配列の他に、他のウイルスまたは細胞性ソースからのいくつかのＲＮＡ輸送エレメントが、上記のように、ＥＬＶＳプラスミド構築物に挿入され得る。例えば、これらのエレメントのいくつかには、ＨＩＶ  Ｒｅｖ応答性エレメント（Ｍａｌｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３３８：２５４−２５７，１９８９）、ＨＴＬＶ
１  Ｒｅｘエレメント（Ａｈｍｅｄら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，４：１０１４−１０２２，１９９０）、およびシミアンレトロウイルス１型からのもう１つのシス作用配列（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：７９４４−７９５２，１９９４）が挙げられる。さらに、上記のＲＮＡ輸送エレメントのそれぞれもまた、構造タンパク質発現カセット、パッケージング細胞株、または実施例６および７に記載のプロデューサー細胞株に組込まれ得る。
【０３４３】
原型ＥＬＶＳベクターのさらにもう１つの改変では、アルファウイルスレプリコンの発現は、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターによって駆動され得る。簡単にいえば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは組織特異的ではなくそして体中の本質的にすべてのヒト細胞で発現されるので、このプロモーターは、トランスフェクトした細胞におけるプラスミドＤＮＡ特異的アルファウイルスレプリコン発現に魅力的な代替物を提供する。例えば、ヒトｒＤＮＡプロモーター（プラスミドｐｒＨＵ３、ＬｅａｒｎｅｄおよびＴｊｉａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．，１：５７５−５８４，１９８２）は、異種遺伝子発現のためのベクターを構築するために使用されている（Ｐａｌｍｅｒら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２１：３４５１−３４５７，１９９３）。
【０３４４】
したがって、本発明の１つの実施態様内では、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターは、トランスフェクトした細胞で転写した第１のヌクレオチドが、真正のアルファウイルス５’末端に対応するように、レプリコンｃＤＮＡの５’末端と並置され得る。転写開始が生じるＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（例えば、プラスミドｐｒＨＵ３）ヌクレオチドの同定を、既述（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｗ／Ｏ  ９５／０７９９４）のように決定する。
【０３４５】
本明細書に記載のすべての改変を、シンドビスウイルス野生型またはＳＩＮ−１  ｎｓＰ、あるいは任意のアルファウイルスからのｎｓＰ遺伝子を含むＥＬＶＳ構築物を用いて行い得る。例えば、実施例５で提供される構築のすべてはまた、その構築が実施例４に記載される、プラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ
１．５−βｇａｌで行い得る。
【０３４６】
（実施例６：アルファウイルスパッケージング細胞株の構築）
本発明では、アルファウイルスパッケージング細胞株（ＰＣＬ）が提供され、それによってＲＮＡパッケージングおよび組換えアルファウイルスベクター粒子の形成に必要なウイルス由来構造タンパク質が、１つ以上の安定に形質転換した構造タンパク質発現カセットによってコードされる。これらのタンパク質の合成は、好ましくは、誘導性の様式で、および特に好ましい実施態様では、ネイティブな「連結領域」プロモーターからのサブゲノムｍＲＮＡの転写によって生じる。誘導性サブゲノム転写を、投入アルファウイルスベクターＲＮＡ自体によって媒介する（図１３）。構造タンパク質発現カセットからの一次転写後、ＲＮＡ転写物の細胞質増幅を、ベクターがコードした非構造タンパク質によって開始し、そして最終的に、連結領域プロモーターからの転写および高レベルの構造タンパク質発現を導く。構造タンパク質発現カセットは、ＲＮＡ輸送エレメント（例えば、ＨＢＶ  ＰＲＥおよびＭＰＭＶ  ＣＴＥ）およびスプライシング配列を含む、本発明の既述のエレメントのいずれかを含み得る。このようなＰＣＬおよびその安定に形質転換した構造タンパク質発現カセットは、ＰＣＴ出願ＷＯ  ９５／０７９９４内に記載の方法を使用して、または本発明内に記載の新規アプローチを使用して、誘導され得る。ＰＣＬは、哺乳動物および非哺乳動物の両方の細胞を含む、ほとんどの任意の現存する親細胞タイプに由来し得る。ＰＣＬの誘導に好ましい実施態様は、ヒト起源の細胞株である。
【０３４７】
（Ａ．ベクター誘導性アルファウイルスＰＣＬの構築）
例えば、ＣＭＶ前初期プロモーターからの一次転写が、ベクターＲＮＡからの非構造レプリカーゼタンパク質の翻訳後にのみ効率的な細胞質増幅および構造タンパク質発現を可能にするＲＮＡ分子を産生する、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットを、構築した。詳細には、プラスミドｐＤＣＭＶ−ｄｌｎｓＰＳＩＮ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）はＤＮＡベースのシンドビス欠損ヘルパー（ＤＨ）ベクターであり、これを、３’末端ＲＮＡプロセシングのためのＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）抗ゲノムリボザイム配列（ＰｅｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ
３５０：４３４−４３６，１９９１）および非構造タンパク質遺伝子欠損の領域内に挿入されたＳＶ４０スモールｔ抗原イントロンの両方を含むように改変した。ＨＤＶリボザイム配列の挿入に関連する制限部位複製のため、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（同上）からさらなるプラスミドであるｐＤＬＴＲＳＩＮｇＨＤＶを、開始物質として使用して、改変したＣＭＶベースのＤＨ構築物を再構築した。ＨＤＶリボザイムを含むＬＴＲベースのシンドビスゲノムクローンであるプラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇＨＤＶを、Ｂｇｌ  ＩＩで切断して、現存するＬＴＲプロモーターおよびシンドビスヌクレオチド１〜２２８９（Ｓｔｒａｕｓｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３３：９２−１１０，１９８４に従った番号付け）を取り出し、ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩTM（Ｂｉｏ１０１，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して０．７％アガロースゲルから精製した。ＣＭＶプロモーターを有する、対応する５’末端フラグメントを、シンドビスゲノムクローンｐＤＣＭＶＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上）のＢｇｌ  ＩＩ切断およびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用する１％アガロースゲルからの精製によって得、次いでＢｇｌ  ＩＩ欠損したｐＤＬＴＲＳＩＮｇＨＤＶベクターに連結して、構築物ｐＤＣＭＶＳＩＮｇＨＤＶを生成した。ＨＤＶリボザイムを有するこのＣＭＶベースのゲノムプラスミドは、ＢＨＫ細胞へのトランスフェクション後２４時間以内に感染性シンドビスウイルスおよび細胞変性効果を生じることが示された。次いで、ＨＤＶリボザイムを含む、欠損ヘルパープラスミドｐＤＣＭＶｄｌｎｓＰＳＩＮｇＨＤＶを、希釈条件下でＢｓｐＥＩ切断および再連結（ｒｅｌｅｇａｔｉｏｎ）によって構築して、ヌクレオチド４２２と７０５４との間の非構造遺伝子配列を取り出した。その後、ＳＶ４０イントロンを、ＰＣＲによって合成し、そして非構造タンパク質遺伝子欠損の領域に挿入した。ＳＶ４０イントロン配列の増幅を、テンプレートとしてプラスミドｐＢＲ３２２／ＳＶ４０（株７７６、ＡＴＣＣ＃４５０１９）およびフランキングＢｓｐＥ  ＩまたはＢａｍ  ＨＩ部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、３０秒伸長時間で標準的３サイクルＰＣＲによって行った。
正方向プライマー：ＢｓｐＳＶＳＤＦ（５’制限部位／ＳＶ４０イントロン配列）（配列番号５０）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＣＣＧＧＡ／ＡＡＧＣＴＣＴＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴ−３’
逆方向プライマー：ＢａｍＳＶＳＡＲ（５’制限部位／ＳＶ４０イントロン配列）（配列番号５１）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＴＡＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＡＣ−３’。
【０３４８】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して精製し、ＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化し、ＭｅｒｍａｉｄTM（Ｂｉｏ１０１，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して１．２％アガロースゲルから精製し、そして欠損ヘルパープラスミドｐＤＣＭＶ−ｄｌｎｓＰＳＩＮに連結し、これをまた、ＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化し、ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製して、構築物ｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚを生成した（図１４）。プラスミドｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚはまた、プラスミドのもう１つの部分にＳＶ４０プロモーター誘導ネオマイシン耐性選択マーカーを含み、これを、製造業者によって記載のように、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用してＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後約２４時間に、細胞を、トリプシン処理し、そして６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ネオマイシン）を含む培地中に再プレーティングした。この培地を、新鮮なＧ４１８含有培地と定期的に交換し、そして耐性細胞の増殖巣を増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル培養ディッシュにおいて限界希釈によってクローニングし、そして個々の細胞クローンを増殖しそしてスクリーニングのために広げた。
【０３４９】
個々のクローンについてのポジティブのパッケージング活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上に記載される）を発現するシンドビスベクターＲＮＡでのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）トランスフェクション、トランスフェクション後約２４時間に培養上清を採取すること、およびパッケージングしたシンドビスウイルス−ルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセイすることによって同定した。さらに、開始トランスフェクションレベルを、レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してトランスフェクトした細胞溶解物を採取すること、および製造業者によって記載のようにルシフェリン基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによってルシフェラーゼ活性の存在についてテストすることによって決定した。培養上清中のパッケージングされたベクター粒子についてアッセイするために、１ｍｌの未希釈の澄明にした上清を使用して、約１８時間新鮮なＢＨＫ細胞単層に感染させた。その後、細胞を、上記のように溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を決定した。感染したＢＨＫ細胞におけるルシフェラーゼ活性の存在は、トランスフェクトした細胞上清におけるパッケージしたベクター粒子の確認であった。ｐＤＣＭＶ−ｉｎｔＳＩＮｒｂｚ構造タンパク質発現カセットの組込まれたコピーを有し、そしてＰＣＬとして機能する、いくつかのポジティブ細胞クローンを、同定した。群の代表であった、個々のＰＣＬクローン（＃１０ｓ−１９および＃１０ｓ−２２）のうちの２つについてのパッケージングデータを、図１５に示す。さらに、産生されるパッケージしたベクター粒子の力価を、個々のＰＣＬクローン（＃１０ｓ−２２）をＳＩＮ−β−ｇａｌベクターＲＮＡ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上に記載される）でトランスフェクトすることによって決定した。培養上清を、トランスフェクション後４８時間で回収し、０．４５ｍｍフィルターを通すことによって澄明にし、そして新鮮なＢＨＫ単層を、上清の１０倍希釈に感染した。感染後約１４時間に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで再度洗浄し、そしてＸ−ｇａｌで染色した。次いで、ベクター粒子単位を、個々の青色に染色した細胞をカウントすることによって決定した。このＰＣＬクローンからのパッケージングされたβ−ｇａｌベクター力価は、約１０6感染ユニット／ｍｌの
上清であった。シンドビス構造タンパク質発現のベクター制御した誘導性を、構造タンパク質に特異的なポリクローナルウサギ抗血清を使用して、ウエスタンブロット分析によって証明した。ポジティブ１０ｓ−２２  ＰＣＬおよびネガティブコントロールＢＨＫ細胞溶解物を、ＳＩＮ−β−ｇａｌベクターＲＮＡでのトランスフェクションの前（Ｕ；非誘導）または後（Ｉ；誘導）のいずれかに、Ｌａｍｅｌｉ試料緩衝液中で行った。図１６に示すように、シンドビス構造タンパク質の発現を示した唯一の細胞溶解物は、ベクターＲＮＡでのトランスフェクション後の１０ｓ−２２  ＰＣＬクローンであった。キャプシドタンパク質とエンベロープ糖タンパク質との間の発現の見かけのレベルの差は、作成されるタンパク質の実際の量を反映するどころか、逆に、この特定の実験に使用された細胞溶解手順中のエンベロープ糖タンパク質のより低い安定性を反映した。
【０３５０】
ＣＭＶベースのＤＨ構築物のパッケージング活性はまた、非哺乳動物細胞、例えば、Ｃ６／３６蚊細胞で非常に効率的であった。ＰＣＬの誘導のためのこのような非哺乳動物親細胞タイプの使用を、ベクタープロデューサー細胞株の生成のための開始物質としてのその後の使用について意図する。この細胞タイプの利点は、宿主巨大分子合成および得られる細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害の哺乳動物細胞関連表現型を含まない、アルファウイルスが持続性感染を確立する天然の能力である。したがって、適切な選択マーカーを有する、ＤＮＡベースのアルファウイルスベクター（実施例４および５）を、蚊または他の非哺乳動物細胞由来ＰＣＬに安定に形質転換し得る。図１７Ａは、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ＤＮＡベースのルシフェラーゼレポーターベクターおよびシンドビス構造タンパク質を発現するＤＨヘルパーベクターの両方が、ルシフェラーゼベクターパッケージングによって証明されるように、Ｃ６／３６細胞で十分に機能的であったことを示す。
【０３５１】
（Ｂ．作動可能に連結した選択マーカーを有するＰＣＬの構築）
本発明の他の実施態様では、選択可能マーカーを、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットの転写に作動可能に連結する。好ましい実施態様では、この作動可能な連結を、残りのｎｓＰ１アミノ酸との融合物として、非構造タンパク質遺伝子欠損の領域へのマーカーの挿入によって、あるいは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列の翻訳制御下で、構造タンパク質遺伝子の下流への挿入によってのいずれかで行う。また、一次構造タンパク質遺伝子ｍＲＮＡ転写物の増幅および構造タンパク質発現の誘導を、投入ベクターＲＮＡ分子およびその合成した非構造タンパク質によって制御する。
【０３５２】
詳細には、構造タンパク質発現カセットの構築について、プラスミドｐＢＧＳ１３１（Ｓｐｒａｔｔら，Ｇｅｎｅ  ４１：３３７−３４２，１９８６；ＡＴＣＣ  ＃３７４４３）を改変して、外来配列を除去し、そしてカナマイシン耐性遺伝子内の現存するＸｈｏ  Ｉ部位を非機能的にした。プラスミドｐＢＧＳ１３１を、Ｘｈｏ  Ｉで切断し、そしてＸｈｏ  Ｉ適合可能な末端を有する合成二本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、この部位に連結した。以下に示した合成１２マーオリゴヌクレオチドを、連結のためにＸｈｏ  Ｉ付着末端を生成し、そして４つのインフレームアミノ酸を挿入することによってカナマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームを維持してそれ自体にアニールする、部分パリンドロームとして設計した。
ｄｌＸｈｏリンカー（配列番号５２）
５’−ＴＣＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡ。
【０３５３】
このオリゴヌクレオチドの挿入は、Ｘｈｏ  Ｉ部位欠失プラスミドを生じ、ｐＢＧＳ１３１ｄｌＸｈｏＩと命名した。次に、このプラスミドを、ＢｓｐＨ  Ｉで切断し、そしてＣｏｌＥ１レプリコンとカナマイシン耐性マーカーとの間の外来配列の８２９ｂｐを除去するための希釈条件下で、それ自体に再連結し、プラスミドｐＢＧＳ１３１ｄｌＢを生じた。次に、ＢｓｐＨ  Ｉ部位を、ＢｓｐＨ  ＩでｐＢＧＳ１３１ｄｌＢを消化し、クレノウ酵素およびｄＮＴＰでその末端を平滑にし、そして過剰のＰａｃ  Ｉリンカーと連結することによって、Ｐａｃ  Ｉ部位に変更した。
Ｐａｃ  Ｉリンカー（配列番号５３）
５’−ＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣ。
【０３５４】
ｐＢＧＳ１３１ｄｌＢ−Ｐと命名したこの構築物を、Ｆｓｐ  ＩおよびＰｖｕ  ＩＩで切断して複数クローニング部位（ＭＣＳ）を含む追加の４７２ｂｐを除去し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して１％アガロースゲルから残りのベクターを精製することによって、さらに改変した。置換ＭＣＳを、２つの相補的オリゴヌクレオチドＰＭＥ．ＭＣＳＩおよびＰＭＥ．ＭＣＳＩＩをアニールし、そして直線プラスミドと連結することによって、改変したベクターに挿入した。
ＰＭＥ．ＭＣＳＩ（配列番号５４）
５’−ＣＴＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡ−３’
ＰＭＥ．ＭＣＳＩＩ（配列番号５５）
５’−ＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧ−３’。
【０３５５】
新しい約２４７５ｂｐのクローニングベクターを、ｐＢＧＳＶＧと命名し、そしてこのベクターは以下の複数クローニング部位を含んだ：＜Ｐｍｅ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ−Ｘｈｏ
Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＩ−Ｐｍｅ  Ｉ＞。作動可能に連結した選択マーカーを含む構造タンパク質発現カセットの挿入は、以下のように段階的に行った。シンドビスウイルスの３’末端、合成Ａ40トラクト、抗ゲノムＨＤＶリボザイム、およびＢＧＨ転写終結シグナルを含むＤＮＡフラグメントを、Ｎｏｔ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉでの消化、ならびにＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用する１％アガロースゲルからの精製によって、プラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５（実施例５）を除去した。プラスミドｐＢＧＳＶＧもまた、Ｎｏｔ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して１％アガロースゲルから精製し、精製した３’末端／Ａ４０／ＨＤＶ／ＢＧＨフラグメントと連結して、構築物ｐＢＧＳＶ３’を生成した。次に、構造タンパク質遺伝子および非構造タンパク質をコードする領域の多くを含む、約９２５０ｂｐシンドビスｃＤＮＡフラグメントを、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＦｓｐ  Ｉでの消化によってプラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上）から取り出し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した。次いで、シンドビスｃＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＢＧＳＶ３’に連結し、これもまた、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＦｓｐ
Ｉ位で消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した。新しい構築物を、ｐＢＧＳＶ３’ＢＦと命名した。その後、この構築物を、Ｂｇｌ  ＩＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＣＭＶ  ＩＥプロモーターとともに、残りの５’末端および非構造遺伝子配列の挿入のためにＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩで精製した。残りの配列を、Ｂｇｌ  ＩＩでのプラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙｒａ，同上）の消化、ＧＥＮＥＮＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用する１％アガロースゲルからのフラグメントの精製、および直線ｐＢＧＳＶ３’ＢＦベクターとの連絡によって得て、ＣＭＶ駆動シンドビスゲノム構築物、ｐＢＧＳＶＣＭｇｅｎを生成した。シンドビスウイルス複製サイクルの開始についてのこの構築物の機能性を、ＢＨＫ細胞へのｐＢＧＳＶＣＭＶｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ媒介トランスフェクション、およびトランスフェクション後２４時間以内のＣＰＥの観察によって決定した。
【０３５６】
その後、プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｇｅｎを使用して、非構造タンパク質遺伝子配列のほとんどを欠失すること、およびｎｓＰ１オープンリーディングフレームの残りのコドンとのインフレーム融合物としてネオマイシン耐性遺伝子を挿入することによって、ＤＨ構造タンパク質発現カセットを構築した。簡単にいえば、ネオマイシン耐性遺伝子を、隣接するＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉ部位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から標準的３サイクルＰＣＲによって増幅した。
正方向プライマー：ＮＥＯ５’ＦＵＳＥ（５’制限部位／ｎｅｏ遺伝子）（配列番号５６）５’−ＡＴＡＴＡＴＣＣＧＧＡ／ＧＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡ
逆方向プライマー：ＮＥＯ３’ＢＡＭ（５’制限部位／ｎｅｏ遺伝子）（配列番号５７）５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ。
【０３５７】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化した。そして、これを、またＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製されているプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｇｅｎに連結した。得られた構築物を、ｐＢＧＳＶＭＶｄｌｎｅｏと命名し、そして図１４に概略的に示す。ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏの配置は、構造タンパク質発現カセットの一部として、同じプロモーターによって制御され、ｎｓＰ１の開始メチオニンおよびアミノ末端１２１アミノ酸、ならびにそのメチオニン開始コドンおよび次の１０アミノ酸を欠くネオマイシン耐性遺伝子を含む融合タンパク質を含む。
【０３５８】
プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏを、製造業者によって記載されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後約２４時間に、この細胞をトリプシン処理し、そして６００μｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８（ネオマイシン）を含む培地中に再プレーティングした。培地を、新鮮なＧ４１８含有培地と定期的に交換し、そして耐性細胞の増殖巣を増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル培養ディッシュにおいて限界希釈によってクローニングし、そして個々の細胞クローンを増殖しそしてスクリーニングのために広げた。個々のクローンについてのポジティブのパッケージング活性を、先の節で記載のように、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡでトランスフェクトし、そしてパッケージングしたシンドビスルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセイすることによって同定した。ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ構造タンパク質遺伝子発現カセットの組込まれたコピーを有し、そしてＰＣＬとして機能する、いくつかのポジティブ細胞クローンを同定した。その群の代表である個々のクローン（Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１５）、ならびに既述の１０ｓ−２２  ＰＣＬ株についてのＳＮＢＳTM−ルシフェラーゼベクターパッケージングデータを、図１８に示す。
【０３５９】
シンドビスルシフェラーゼベクターとの機能的パッケージング活性を証明することの他に、同じＰＣＬを使用して行われるさらなる実験もまた、他のアルファウイルス由来のベクターもまたパッケージングされ得ることを示した。例えば、β−ガラクトシダーゼを発現するシンドビ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上）およびセムリキ森林（ｐＳＦＶ３−ｌａｃＺ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の両方のベクターＲＮＡを、Ｆ１５パッケージング細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクション後の約４８時間に、培養上清を採取し、澄明にし、連続希釈し、そしてベクター粒子力価の決定のために新鮮なＢＨＫ細胞単層に感染させるために使用した。感染後１８時間に、ＢＨＫ細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌで染色し、そして青色に染色する細胞を、既述のようにカウントした。シンドビスβ−ｇａｌについて得たベクター力価は、約５×１０6ＩＵ／ｍｌであ
ったが、ＳＦＶ  β−ｇａｌについての力価は、約４×１０6ＩＵ／ｍｌであった。これ
らのデータは、２つの異なるアルファウイルスおよびその対応するベクターが、類似のパッケージングシグナルを有し、そして本明細書に記載のシンドビス系に由来するＰＣＬが、他のアルファウイルスとともに使用される場合に十分に機能的であることを証明する。
【０３６０】
ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ構築物のパッケージング活性もまた、ヒト起源の細胞、例えば、２９３細胞において非常に効率的であった。ＰＣＬの誘導のためのこのようなヒト親細胞タイプの使用は、相補的耐性組換えアルファウイルス粒子の生成に特に有利であり得る。図１７Ｂは、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方のベースのルシフェラーゼレポーターベクターを、ＢＨＫ細胞へのルシフェラーゼ発現の上清トランスファーによって証明されるように、Ｇ４１８耐性のｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ形質転換した２９３ＰＣＬへのトランスフェクション後に効率的にパッケージングしたことを示す。
【０３６１】
別の薬物耐性選択マーカーもまた、そのＮ末端での残りのｎｓＰ１アミノ酸との融合タンパク質として、類似のＰＣＬ立体配置で機能することを示した。簡単にいえば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイシン耐性マーカー、ｈｙｇｒｏr）を、現存するネオマイシン耐性マーカーの代わりに、プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶ
ｄｌｎｅｏに置換した。ｈｙｇｒｏr遺伝子を、隣接するＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ部
位を含むように設計した以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プラスミドｐ３’ＳＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からの標準的３サイクルＰＣＲによって増幅した。
正方向プライマー：５’ＨＹＧＲＯＥＶ（５’制限部位／ｈｙｇｒｏ遺伝子）（配列番号１１２）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＴＡＴＣ／ＡＡＡＡＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＧＡＣＧ
逆方向プライマー：３’ＨＹＧＲＯＢＡ（５’制限部位／ｈｙｇｒｏ遺伝子）（配列番号１１３）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣ／ＴＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＧ。
【０３６２】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮを使用して精製し、そしてプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏに連結した。このプラスミドは、ＢｓｐＥＩで消化し、クレノウで平滑末端にし、ＢａｍＨＩでさらに消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎを使用して０．７％ゲルから精製された。得られる構築物を、ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｈｙｇと命名した。
【０３６３】
プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｈｙｇを、製造業者によって記載のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの約２４時間後に細胞をトリプシン処理し、そして１．２ｍｇ／ｍｌの薬物ハイグロマイシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む培地中に再プレーティングした。培地を新鮮なハイグロマイシン含有培地で定期的に交換し、そして耐性細胞の増殖巣を、プールに増殖させた。選択したパッケージング細胞の機能性を、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡでトランスフェクトし、そして上の節に記載のようにパッケージングされたシンドビスルシフェラーゼベクター粒子の存在についてアッセイすることによって証明した。これらのパッケージング実験からのポジティブ結果を、図３９に示す。
【０３６４】
代わりのパッケージング細胞株構造タンパク質発現カセットでは、選択マーカー（この場合はネオマイシン耐性）を、シンドビス構造タンパク質遺伝子の下流に、および内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の翻訳制御下で挿入した。したがって、ネオマイシン耐性をコードするｍＲＮＡの転写は、ゲノムレベル（ＲＳＶプロモーターから）でおよびまたサブゲノム連結領域プロモーターからの両方で生じる。この構築物に独特なさらなる特徴は、一次転写のためのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターおよびシンドビス欠損妨害ＲＮＡクローンＤＩ２５（ＭｏｎｒｏｅおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：３２７９−３２８３，１９８３）由来のｔＲＮＡAsp５’末端配列を含む。この特定のＰＣＬ発現カセット立体配置を、９８
７ＤＨＢＢＮｅｏと命名し、そして図１４に概略的に示す。詳細には、プラスミド９８７ＤＨＢＢＮｅｏを、開始物質として改変したプラスミドベクターｐＢＧＳ１３１ｄｌＢ−Ｐ（上記）を使用して、段階的に構築し得る。連結領域プロモーター、構造タンパク質遺伝子配列、および３’非翻訳領域＋ポリＡを含むｃＤＮＡフラグメントを、全長シンドビスｃＤＮＡクローンｐＲＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上）のＢａｍＨ  ＩおよびＸｂａ  Ｉでの消化、およびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用する０．７％アガロースゲルからの精製によって得る。シンドビスｃＤＮＡ  ＤＮＡフラグメントを、これもまたＢａｍＨ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製されたプラスミドベクターｐＢＧＳ１３１ｄｌＢ−Ｐと連結して、構築物ｐＢＧＳＩＮｓｐを生成した。
【０３６５】
次に、ＳＶ４０初期領域からの転写終結シグナルを、シンドビス配列のすぐ下流の、ｐＢＧＳＩＮｓｐのＳａｃ  ＩとＥｃｏ  ＲＩ部位との間に挿入する。初期領域転写終結配列を含む、ＳＶ４０ウイルスヌクレオチド２６４３〜２５６３を、テンプレートとして以下に示すプライマー対およびｐＢＲ３２２／ＳＶ４０プラスミド（ＡＴＣＣ  ＃４５０１９）を使用してＰＣＲ増幅によって単離する。
正方向プライマー：ＦＳＶＴＴ２６４３（５’制限部位／ＳＶ４０ヌクレオチド２６４３〜２６１３）（配列番号５８）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣ
逆方向プライマー：ＲＳＶＴＴ２５６３（制限部位／ＳＶ４０ヌクレオチド２５６３〜２５８８）（配列番号５９）
５’−ＴＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧ。
【０３６６】
プライマーを、３０秒の伸長期間での標準的３サイクルＰＣＲ反応で使用する。増幅産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、Ｓａｃ  ＩおよびＥｃｏ
ＲＩで消化し、Ｍｅｒｍａｉｄキットで再度精製し、そして９０ｂｐフラグメントを、これもまたＳａｃ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースから精製されたプラスミドｐＢＧＳＩＮｓｐに連結する。この構築は、ｐＢＧＳＩＮｓｐＳＶとして公知である。
【０３６７】
次に、ＲＳＶプロモーターおよびＤＩ  ｔＲＮＡAsp構造を含むシンドビス５’末端配
列を、重複ＰＣＲによって構築し、そして全体のフラグメントを、構造タンパク質遺伝子ベクターｐＢＧＳＩＮｓｐＳＶに挿入する。ＰＣＲ反応＃１では、ＲＳＶプロモーターフラグメントを、一方のプライマーにおける隣接するＢｇｌ  ＩＩ部位および他方におけるｔＲＮＡ  ５’末端を重複する配列も含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＲＳＶプロモーター含有テンプレートプラスミド（例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、１分の伸長で、標準的３サイクルＰＣＲによって増幅する。シンドビスｔＲＮＡ  ５’末端を、ＲＳＶプロモーター転写開始部位にすぐに隣接して配置する。
正方向プライマー：５’ＲＳＶｐｒｏ（５’制限部位／ＲＳＶ配列）（配列番号６０）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴ／ＡＧＴＣＴＴＡＴＧＣＡＡＴＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＴ
逆方向プライマー：３’ＲＳＶｔＲ（５’シンドビスｔＲＮＡ配列／ＲＳＶ配列）（配列番号６１）
５’−ＧＧＧＡＴＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＧＧＴＡＧＧＧＣＡＣＴ。
【０３６８】
ＰＣＲ反応＃２では、シンドビス５’末端＋ｔＲＮＡを、一方のプライマーにおける隣接するＢａｍＨ  Ｉ部位および他方における３’ＲＳＶｔＲプライマーを重複する配列も含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、テンプレートプラスミドＴｏｔｏｌ  １０１（５’ｔＲＮＡAsp）（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら，Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３）から、１分の伸長で、標準的３サイクルＰＣＲによって増幅する。
正方向プライマー：５’ｔＲＮＡＳｉｎ（５’−シンドビス＋ｔＲＮＡ配列のみ）（配列番号６２）
５’−ＧＡＴＡＴＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＡＴＣＣＣＣＧ
逆方向プライマー：３’ＳｉｎＢａｍ（３’制限部位／シンドビス配列）（配列番号６３）
５’−ＴＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣ／ＡＧＴＡＣＧＧＴＣＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧ。
【０３６９】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、そしてさらなる５’ＲＳＶｐｒｏおよび３’ＳｉｎＢａｍプライマーを使用して、２分伸長を有するその後の３サイクルＰＣＲ反応においてテンプレートとして一緒に使用する。得られる重複ＰＣＲアンプリコンを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、これもまたＢｇｌ
ＩＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製されたプラスミドｐＢＧＳＩＮｓｐＳＶに連結する。欠損ヘルパーを発現する得られる構造タンパク質を、９８７ＤＨＢＢと命名する。
【０３７０】
次に、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）からのＩＲＥＳ配列を、重複ＰＣＲによって、選択マーカーとして、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子のすぐ上流に配置し、そして全体のアンプリコンを、９８７ＤＨＢＢのＮｓｉ  Ｉ部位に挿入する。Ｎｓｉ  Ｉ部位での挿入は、構造タンパク質ＯＲＦのすぐ下流に選択マーカーを配置する。ＰＣＲ反応＃１では、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳフラグメント（ヌクレオチド２６０〜８２７）を、一方のプライマーにおける隣接するＮｓｉ  Ｉ部位および他方におけるｎｅｏ遺伝子を重複する配列も含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、テンプレートプラスミドｐＢＳ−ＥＣＡＴ（Ｊａｎｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１６５１，１９８９）から、３０秒の伸長で、標準的３サイクルＰＣＲによって増幅する。
正方向プライマー：５’ＥＭＣＶＩＲＥＳ（５’制限部位／ＥＭＣＶ配列）（配列番号６４）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴ／ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＧ
逆方向プライマー：３’ＥＭＣＶＩＲＥＳ（５’ｐｃＤＮＡ＋ｎｅｏ配列／ＥＭＣＶ配列）（配列番号６５）
５’−ＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣ／ＣＴＴＡＣＡＡＴＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ。
【０３７１】
ＰＣＲ反応＃２では、ｎｅｏ耐性マーカーを、一方のプライマーにおける隣接するＮｓｉ  Ｉ部位および他方における３’ＥＭＣＶＩＲＥＳプライマーを重複する配列も含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、テンプレートプラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、１．５分の伸長で、標準的３サイクルＰＣＲによって増幅する。
正方向プライマー：５’Ｎｅｏ／ｐｃＤＮＡ（５’−ｐｃＤＮＡ＋ｎｅｏ配列のみ）（配列番号６６）
５’−ＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡ
逆方向プライマー：３’Ｎｅｏ／ｐｃＤＮＡ（３’制限部位／ｎｅｏ配列）（配列番号６７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴ／ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡ。
【０３７２】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−Ｓｐｉｎで精製し、そしてさらなる５’ＥＭＣＶＩＲＥＳおよび３’Ｎｅｏ／ｐｃＤＮＡプライマーを使用して、２分の伸長で、その後の３サイクルＰＣＲ反応でテンプレートとして一緒に使用する。得られる重複ＰＣＲアンプリコンを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、Ｎｓｉ  Ｉで消化し、これもまたＮｓｉ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製されたプラスミド９８７ＤＨＢＢに連結する。シンドビス３’−非翻訳領域におけるＩＲＥＳ／ｎｅｏインサートを有する得られる構造タンパク質発現構築物を、９８７ＤＨＢＢＮｅｏと命名する。
【０３７３】
安定なパッケージング細胞株を生成するために、ＢＨＫ細胞を、標準的リン酸カルシウム沈降プロトコルを使用して、１０ｕｇのプラスミド９８７ＤＨＢＢＮｅｏでトランスフェクトした。トランスフェクション約２４時間後に、培地を、１ｍｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８を含む新鮮な培地と置換した。さらに１日後、細胞を、トリプシン処理し、そして５００ｕｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む培地中に１／１０密度で再プレーティングした。数継代以上後、細胞を、希釈クローニングに供し、そして個々のクローンを広げた。個々のクローンがパッケージング細胞株として機能する能力を、β−ｇａｌを発現するシンドビスＤＮＡベクターであるプラスミドＲＳＶ／Ｓｉｎｒｅｐ／ＬａｃＺのリン酸カルシウムトランスフェクション、および４８時間後に上清におけるパッケージングされたベクター粒子の存在についてアッセイすることによって決定した。パッケージングされたベクターレプリコンを、ＦｒｏｌｏｖおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１７２１−１７２７，１９９４）に記載のＣＰＥアッセイによって滴定し、そして９８７ＤＨ−ＢＢＮｅｏと命名したパッケージングされた粒子の高力価を与えるものを、さらなる特徴づけのために使用した。パッケージングされたベクターの力価を、いくつかの異なるトランスフェクション技法を使用して、β−ｇａｌを発現するＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかに基づくシンドビスベクターのトランスフェクションの４８時間後に決定した。結果は以下の通りであった：
【０３７４】
【表２７】
2013090630.tif 000028
さらに、その後、９８７ＤＨ−ＢＢ細胞株を使用してパッケージングされたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ粒子を使用して、新鮮なＢＨＫ細胞単層に感染させ、そしてＲＮＡおよびタンパク質の両方の発現パターンを調べた。図１９は、ＢＨＫ細胞が、細胞当たり１５０感染ユニットのＭＯＩでのＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ粒子の２つの異なる調製物（レーン１および２）、またはコントロールとして野生型シンドビスウイルス（レーン３）で感染させた後のＲＮＡパターンを示す。感染７時間後、ダクチノマイシン（１ｕｇ／ｍｌ）および［3Ｈ］ウリジン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を添加し、次いで、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら（Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３）に従って、４時間後にＲＮＡの採取および分析を行った。可能性のある組換え体を検出するために、高いＭＯＩを使用した。ゲルレーンの右に対して水平線は、目的のシンドビスおよびβ−ｇａｌ  ＲＮＡを示す。最高の分子量バンドは、レプリコンまたはウイルスのゲノムＲＮＡを示す（レーン１および２、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ；レーン３  シンドビスウイルス）。示した次の２つのＲＮＡは、９８７ＤＨ−ＢＢＮｅｏ  ＰＣＬ発現カセットのゲノムＲＮＡおよび同じ９８７ＤＨ−ＢＢＮｅｏ  ＰＣＬカセットからの誘導性サブゲノム構造タンパク質ｍＲＮＡである。後者の２つのバンドの存在は、パッケージング細胞株に由来するヘルパーゲノムＲＮＡも同時パッケージングされることを証明する。最も多く豊富に存在する、次のＲＮＡバンドは、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ（レーン１および２）またはシンドビスウイルスゲノム（レーン３）のいずれかに由来するサブゲノムＲＮＡである。
【０３７５】
タンパク質分析を、２０感染ユニット／細胞のＭＯＩでパッケージングされたＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコンでのＢＨＫ２１細胞の感染後に行った。感染１５時間後に、細胞を、［35Ｓ］メチオニンで３０分間標識し、溶解物を作成し、そしてタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２０（レーン２および３）に示すように、β−ガラクトシダーゼおよびシンドビスウイルスキャプシドタンパク質の両方とも、ベクター粒子感染した細胞では標識されるが、非感染細胞（レーン１）では標識されない。キャプシドの存在は、いくつかのパッケージングされた粒子もまた、ＰＣＬからの構造タンパク質遺伝子ＲＮＡ転写物を含むことを示す。
【０３７６】
（Ｃ．「分断構造遺伝子」ＰＣＬ立体配置の構築）
本発明の他の実施態様では、ＰＣＬが提供され、ここで、アルファウイルス構造タンパク質は、そのネイティブな翻訳後プロセシングを有する単一のｍＲＮＡからのポリタンパク質としてではなく、むしろ、複数のカセットによって転写される独立したｍＲＮＡからの別々のタンパク質として発現される。このアプローチを、図２１Ａに概略的に図示する。このような立体配置は、レプリコンコンピテントまたは感染性ウイルスの形成を導く組換えまたは同時パッケージング事象の可能性を、非常に最小化する。好ましい実施態様では、キャプシドタンパク質を、１つの安定に形質転換したカセットから発現し、そしてエンベロープ糖タンパク質を、第２の安定に形質転換したカセットから一緒に発現し、そしてそれぞれを、連結領域プロモーター（上記）からベクター誘導性様式で発現する。
【０３７７】
例えば、シンドビスウイルスキャプシドタンパク質遺伝子を、隣接するＸｈｏ
Ｉ部位およびキャプシドタンパク質遺伝子開始コドンまたは隣接するＮｏｔ  Ｉ部位および翻訳停止コドンを含むように設計された以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、１．５分間伸長での標準的３サイクルＰＣＲによって、プラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上）から増幅した。
正方向プライマー：ＳＩＮ５’ＣＸｈｏ（５’制限部位／キャプシド配列）（配列番号６８）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧ／ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣ
逆方向プライマー：ＳＩＮ３’ＣＮｏｔ（５’制限部位／停止コドン／キャプシド配列）（配列番号６９）
５’−ＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣ／ＴＡＴＴＡ／ＣＣＡＣＴＣＴＴＣＴＧＴＣＣＣＴＴＣＣＧＧＧＧＴ。
【０３７８】
増幅後、キャプシドＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−Ｓｐｉｎで精製し、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、そしてまたＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化してそのルシフェラーゼレポーター遺伝子インサートを除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製された、ＤＮＡに基づくシンドビス発現ベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、同上）に連結した。得られるキャプシドタンパク質発現構築物を、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−Ｃと命名した。プラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮ−Ｃを、その後、ＢｓｐＥ  Ｉで消化してほとんどの非構造タンパク質遺伝子配列を除去し、そして希釈条件下でそれ自体に再連結して、ＤＨベクター構築物ｐＤＣＭＶＳＩＮｄｌ−Ｃを作製した。
【０３７９】
あるいは、ベクター骨格を、９８７ＤＨＢＢについて既述のＲＳＶプロモーターおよび／または５’末端ｔＲＮＡ配列を含むように、最初に改変し得る。詳細には、これを、開始物質としてプラスミドｐＢＧＳＶ３’（上記を参照のこと）を使用して段階的置換によって行った。連結領域プロモーター＋Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉクローニング部位を、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃ（上記を参照のこと）からのルシフェラーゼレポーター含有フラグメントとして得た。プラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃを、Ｂａｍ  ＨＩおよびＦｓｐ  Ｉで消化し、そしてルシフェラーゼレポーター含有フラグメントを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製した。フラグメントを、これもまたＢａｍ  ＨＩおよびＦｓｐ  Ｉで消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理されたプラスミドｐＢＧＳＶ３’に連結して、ｐＢＧＳＶ３’ＢａＦＬｕｃと命名したプラスミドを生成した。次いで、ＲＳＶプロモーター／５’末端ｔＲＮＡ配列を、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＢａｍ  ＨＩでの消化ならびにＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用する１％アガロースゲルからの精製によって９８７ＤＨＢＢから得た。このフラグメントを、同様にＢｇｌ
ＩＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化したｐＢＧＳＶ３’ＢａＦＬｕｃに連結して、構築物ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｌｕｃを生成し、これは、キャプシドまたはエンベロープ糖タンパク質のいずれかの発現構築物のための開始物質として使用され得る。
【０３８０】
ＲＳＶプロモーターおよびｔＲＮＡ  ５’末端配列を有するキャプシド遺伝子発現構築物を生成するために、現存するルシフェラーゼレポーター遺伝子インサートを、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉでの消化によって除去し、そしてこれもまたＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ
Ｉで消化されたＰＣＲ増幅されたキャプシドタンパク質遺伝子（上記を参照のこと）と置換した。得られる構築物を、ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｃと命名した。非構造タンパク質遺伝子欠失の領域へのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択マーカーの挿入を、ＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩでの消化、ならびに、これもまたＢｓｐＥ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化し、そして１％アガロースゲルから精製されＰＣＲ増幅されたｎｅｏr遺
伝子（上記を参照のこと）との置換によって達成した。得られる構築物を、ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌｎｅｏ−Ｃと命名し、そして図２１Ｂに概略的に示す。
【０３８１】
ネオマイシン耐性選択マーカーを含む、プラスミドｐＤＣＭＶＳＩＮｄｌ−ＣおよびｐＢＲＳＶ９８７ｄｌｎｅｏ−Ｃを、製造業者によって記載のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの約２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、そして６００ｕｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８（ネオマイシン）を含む培地に再プレーティングした。培地を、新鮮なＧ４１８含有培地と定期的に交換し、そして耐性細胞の増殖巣を増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュ中で限界希釈によってクローニングし、そして個々の細胞クローンを増殖し、そしてスクリーニングのために広げた。投入ベクターに応じてキャプシドタンパク質を誘導的に発現した細胞を、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡまたはシンドビスβ−ガラクトシダーゼＤＮＡベクターでトランスフェクトし、トランスフェクションの約２４または４８時間後に細胞溶解物を作成し、そしてウサギ抗シンドビスポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析を行うことによって同定した。キャプシドタンパク質遺伝子発現カセットの組込まれたコピーを有しそしてタンパク質を誘導的に発現するいくつかのポジティブ細胞クローンを同定し、そして図２１Ｄに示す。
【０３８２】
「分断構造遺伝子」カセットの状況において発現したキャプシドの誘導性および機能性の両方を証明するために、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を発現したさらなる構築物を、ｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃから生成した。簡単にいえば、シンドビスエンベロープ糖タンパク質遺伝子を、２．５分間伸長の標準的３サイクルＰＣＲによって、ならびに良好なＫｏｚａｋの状況で隣接するＸｈｏ  Ｉ部位および翻訳開始コドン、または隣接するＮｏｔ  Ｉ部位および翻訳停止コドンを含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プラスミドｐＤＬＴＲＳＩＮｇから増幅した。
正方向プライマー：５’ＧＬＹＣＯ−Ｘ（５’制限部位／開始コドン／糖タンパク質配列）（配列番号７０）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧ／ＡＧＣＡＡＴＧ／ＴＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＣＡ
逆方向プライマー：３’ＧＬＹＣＯ−Ｎ（５’制限部位／糖タンパク質配列）（配列番号７１）
５’−ＡＴＡＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ／ＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧＣＡＴＣ。
【０３８３】
増幅後、糖タンパク質遺伝子ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、そしてこれもまたＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化してそのルシフェラーゼレポーター遺伝子インサートを除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製されたＤＮＡに基づくシンドビス発現ベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃに連結した。得られる糖タンパク質発現構築物を、ｐＤＣＭＶＳＩＮ１．５ＰＥと命名した。
【０３８４】
図２１Ｃは、２つの異なるクローンのキャプシド株（９−３および９−９）細胞株のベクター制御した誘導性を証明するウエスタンブロットであり、これを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、エンベロープ糖タンパク質（１．５ＰＥレーン）またはβ−ガラクトシダーゼレポーターのｐＤＣＭＶＳＩＮ−β−ｇａｌ（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら，同上；１．５β−ｇａｌレーン）、またはトランスフェクトした「模擬（ｍｏｃｋ）」（Ｍレーン）を発現するシンドビスＤＮＡベクターでトランスフェクトした。細胞溶解物を、トランスフェクション４８時間後に作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてメンブランにトランスファーし、ここで、細胞溶解物を、シンドビス構造タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼに特異的な抗体の組み合わせを用いてプローブした。ブロットは、いずれかのベクターによって供給される非構造タンパク質に応じてキャプシドタンパク質の誘導性、ならびにβ−ガラクトシダーゼおよびエンベロープ糖タンパク質の発現を明らかに示す。相補性およびベクター粒子パッケージングによる、「分断構造遺伝子」キャプシド細胞株の機能性を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してキャプシド細胞株にβ−ガラクトシダーゼおよびエンベロープ糖タンパク質ベクターを同時トランスフェクトし、そして培養上清においてパッケージした粒子についてアッセイすることによって証明した。トランスフェクションの約４８時間後に、上清を採取し、そしてパッケージングアッセイおよびベクター力価決定のために澄明にした。さらに、細胞を、Ｌａｍｅｌｉ試料緩衝液を使用して溶解し、そしてポリクローナル抗シンドビス抗体を用いるウエスタンブロット分析によって試験し、これは、キャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を供給したベクターの両方の発現を証明した。次いで、上清を、約１８時間未処置のＢＨＫ細胞を感染させ、そしてこの実施例に既述のように、β−ｇａｌレポーター遺伝子発現について染色することによって、パッケージングされたベクター粒子の存在について試験した。相補性およびパッケージングについての細胞株の機能性を、青色染色したβ−ｇａｌ発現細胞の観察によって証明した。
【０３８５】
キャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質の両方について別々のベクター誘導性発現カセットを有する安定な「分断構造遺伝子」ＰＣＬを生成するために、上記のキャプシド細胞株のいずれかを、異なる選択マーカー（例えば、ハイグロマイシンＢ耐性）を含むさらなるエンベロープ糖タンパク質発現構築物とともに、使用し得る。１つの例では、ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｌｕｃを、開始物質として使用して、ＲＳＶプロモーターおよびｔＲＮＡ  ５’末端配列を有する糖タンパク質遺伝子発現構築物を生成した。ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｌｕｃの現存するルシフェラーゼレポーター遺伝子インサートを、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉでの消化によって除去し、そしてこれもまたＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、そして０．７％アガロースゲルから精製されたＰＣＲ増幅した糖タンパク質遺伝子（ｐＥ２／Ｅ１）産物（上記を参照のこと）と置換した。得られる構築物を、ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｇｌｙｃｏと命名した。非構造タンパク質遺伝子欠損の領域へのハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ選択マーカーの挿入を、ＢｓｐＥ  ＩによるプラスミドｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｇｌｙｃｏの消化、クレノウによる平滑末端化、およびＢａｍ  ＨＩによるさらなる消化することによって行った。ハイグロマイシンrイ
ンサートを、ＥｃｏＲ  ＶおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、そして調製したｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｇｌｙｃｏベクターに連結したＰＣＲ増幅した産物（上記を参照のこと）として得た。この構築物を、ＲＮＡ放出エレメントを含むようにさらに改変した。ＰＲＥ配列を、実施例５に記載のように、ＡＤＷウイルス株の全長ゲノムクローンｐＡＭ６（ＡＴＣＣ番号３９６３０）からＨＢＶのＰＣＲ生成した５６４ｂｐフラグメントを最初に単離することによって挿入した。増幅および精製後、精製したＨＢＶ  ＰＲＥフラグメントを、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）プラスミドベクターにクローニングして、構築物ｐＨＢＶ−ＰＲＥを得た。次いで、ＨＢＶ  ＰＲＥエレメントを、Ｎｏｔ  Ｉでの消化および２％アガロースゲル電気泳動によってｐＨＢＶ−ＰＲＥから単離し、そしてこれもまたＮｏｔ  Ｉで消化しそしてＣＩＡＰで処理されたｐＢＲＳＶ９８７ｄｌ−Ｇｌｙｃｏに由来するハイグロマイシン耐性マーカー含有構築物に連結して、最終構築物、ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌｈｙｇ−Ｇｌｙｃｏを得た。
【０３８６】
ある実施態様では、同種または異種アルファウイルスのキャプシド遺伝子配列に由来し得る翻訳増強エレメントも含むことが所望であり得る。ロス川ウイルス翻訳エンハンサーの含有のために、適切な配列は、実施例８に記載のＤＨ−ＢＢ
ＣΔ３ｒｒｖ構築物から得られ得る。詳細には、ＤＨ−ＢＢ  ＣΔ３ｒｒｖを、Ｂａｍ
ＨＩおよびＢｓｉ  ＷＩで消化し、そして連結領域プロモーター、ロス川ウイルス翻訳エンハンサー、およびｐＥ２遺伝子のアミノ末端配列を含むフラグメントを、１．２％アガロースゲルおよびＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して単離した。このフラグメントを、Ｂａｍ  ＨＩおよびＢｓｉ  ＷＩで同様に消化したプラスミドｐＢＲＳＶ９８７ｄｌｈｙｇ−Ｇｌｙｃｏに連結して、ｐＢＲＳＶ９８７ｄｌｈｙｇ−ｒｒｖ−Ｇｌｙｃｏと命名した発現カセットを産生し、そして図２１Ｂに概略的に示した。
【０３８７】
あるいは、プラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌ（実施例５）を、ＢａｍＨ  ＩおよびＦｓｐ  Ｉでの消化によって、開始物質として使用して、連結領域プロモーター、β−ｇａｌレポーター遺伝子、およびいくつかの３’末端配列を含む配列を単離し得る。所望のフラグメントを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して１％アガロースゲルから精製し、そしてこれもまたＢａｍ  ＨＩおよびＦｓｐ  Ｉで消化してすべての構造タンパク質遺伝子配列を除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製されたプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｎｅｏ（上記を参照のこと）に連結する。得られる構築物を、ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｓＰ−ｌｕｃと命名する。プラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｓＰ−ｌｕｃを、次に、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ
ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製し、そして上記のものからのＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ消化したエンベロープ糖タンパク質ＰＣＲアンプリコンを、その後、消化したｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌｓＰ−ｌｕｃベクターに連結して、エンベロープ糖タンパク質を発現するＤＨ構築物、ｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌ−Ｇを生成する。このプラスミドへの、ハイグロマイシン耐性マーカーカセット、ならびに隣接するＨＳＶ  ＴＫプロモーターおよびポリアデニル化配列の挿入を、２．５分間伸長を用いる標準的３サイクルプロトコル、テンプレートとしてのプラスミドｐＤＲ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、および隣接するＰａｃ  Ｉ部位を含むように設計される以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅によって達成する。
正方向プライマー：５’ＨＹＧＲＯ／Ｐｒｏ−Ｐ（５’制限部位／ｐＤＲ２配列）（配列番号７２）
５’−ＡＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＣＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＧＡＡ
逆方向プライマー：３’ＨＹＧＲＯ／ｐＡ−Ｐ（５’制限部位／ｐＤＲ２配列）（配列番号７３）
５’−ＡＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＧＴＡＴＴＧＧＣＣＣＣＡＡＴＧＧＧＧＴＣＴ。
【０３８８】
増幅後、ＤＮＡフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、Ｐａｃ  Ｉで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製し、そしてこれもまたＰａｃ  Ｉで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して精製されたプラスミドｐＢＧＳＶＣＭＶｄｌ−Ｇに連結する。得られる構築物を、ｐＢＧＳＶｈｙｇｒｏ−Ｇと命名する。
【０３８９】
ハイグロマイシン選択マーカーを含む、プラスミドｐＢＲＳＶ９８７ｄｌｈｙｇ−ｒｒｖ−Ｇｌｙｃｏを、製造業者によって記載のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してクローンキャプシド細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクションの約２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、そして５００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含む培地に再プレーティングした。培地を、新鮮なハイグロマイシン含有培地で定期的に交換し、そして耐性細胞の増殖巣を増殖させた。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュにおいて限定希釈によってクローニングし、そして個々の細胞クローンを増殖させそしてスクリーニングのために広げた。この方法で誘導した分断構造遺伝子ＰＣＬを、Ｃ／ＧＬＹＣＯ  ＰＣＬと命名した。投入ベクターに応じて生物学的に活性なキャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を誘導的に発現するポジティブ細胞を、２つの方法で同定した。最初に、発現実験のトランスファーを行って、トランスフェクトされたベクター分子が、構造タンパク質発現を誘導し得、次に未処置の細胞を感染させるために使用され得るベクター粒子のパッケージングおよび分泌を生じることを、証明した。β−ガラクトシダーゼを発現するシンドビスウイルスプラスミドＤＮＡベクターを、２つの独立して選択されたプール（図２６Ｂ、プールＣおよびＥ）に由来する潜在的Ｃ／ＧＬＹＣＯ  ＰＣＬクローンのパネルにトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に、上清を採取し、そしてさらに１８時間、未処置のＢＨＫ−２１細胞に感染させるために使用した。感染した細胞溶解物を採取し、そして酵素的β−ガラクトシダーゼ活性を決定した。図に示すように、いくつかのクローンは、ベクターをパッケージし得、未処置の細胞へのベクターの高レベルのトランスファーを生じた。第２の実験では、トランスフェクトされたＰＣＬを溶解し、そして既述のようにウエスタンブロット分析に供した。図２６Ｃに示すように、キャプシドおよびエンベロープ糖タンパク質の両方の誘導は、ＰＣＬへのベクターの導入後に生じる。
【０３９０】
（Ｄ．「ハイブリッド」構造タンパク質を有するＰＣＬの構築）
ＤＨとベクターＲＮＡとの間の同時パッケージングまたは組換えのレベルを減少させるために、糖タンパク質遺伝子の翻訳を増強させるために、あるいはパッケージングされた組換えアルファウイルスベクター粒子の細胞または組織特異性を変化させるために、利用され得るさらなるアプローチは、他のアルファウイルスまたはトガウイルスに由来する構造タンパク質遺伝子を使用する。より詳細には、シンドビスウイルスまたは異なるアルファウイルスベクターとの使用のためのアルファウイルスまたはトガウイルス構造タンパク質遺伝子の多くの組み合わせを想定し得る。例えば、Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒウイルス（ＲＲＶ）のキャプシドタンパク質遺伝子を、（同じまたは異なる構築物から発現される）シンドビスウイルスのエンベロープ糖タンパク質遺伝子とともに使用して、実施例３、４、または５に記載のシンドビスウイルス由来ベクターをパッケージングし得る。さらに、ＲＲＶキャプシドタンパク質遺伝子の欠失した形態を、シンドビス糖タンパク質遺伝子配列のすぐ上流に配置して、翻訳エンハンサーエレメントとして機能し得る。別の実施例として、シンドビスウイルスの構造タンパク質を使用して、セムリキ森林ウイルスＲＮＡベクターをパッケージングし得る。
【０３９１】
詳細には、欠損ヘルパー（ＤＨ）構造タンパク質構築物は、以下の未処理または欠失した形態を含む。
【０３９２】
【表２８】
2013090630.tif 000029
ＰＣＲ反応を、３０秒間伸長およびＶｅｎｔポリメラーゼでの標準的３サイクルプロトコルで、以下に示すプライマー対を使用して行って、これも以下に示す対応するＤＮＡフラグメントを産生した。
ＰＣＲフラグメント：プライマー対、プラスミドテンプレート
フラグメント１：ｐｒ１＋ｐｒ２，ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント２：ｐｒ３＋ｐｒ４，ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント３：ｐｒ５＋ｐｒ６，ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント４：ｐｒ３＋ｐｒ７，ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント５：ｐｒ４＋ｐｒ８，ＲＲＶ６４１５プラスミド
フラグメント６：ｐｒ９＋ｐｒ１０，Ｔｏｔｏ１１０１プラスミド
フラグメント７：ｐｒ１１＋ｐｒ１２，Ｔｏｔｏ１１０１プラスミド
増幅後、ＰＣＲ産物を所定の酵素で消化し、そしてｐＵＣ１８プラスミドアナログｐＲＳ２（これは、さらなるポリリンカー部位を含み、そしてまた同じ酵素組み合わせで消化されている）に連結した。：フラグメント１をＥｃｏＲ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し；フラグメント２をＢａｍＨ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し；フラグメント３をＢａｍＨ
Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し；フラグメント４をＢａｍＨ  Ｉ＋Ａｆｌ  ＩＩで切断し；フラグメント５をＨｉｎｄ  ＩＩＩ＋Ａｆｌ  ＩＩで切断し；フラグメント６をＢａｍＨ  Ｉ＋Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し；そしてフラグメント７をＢａｍＨ  Ｉ＋Ｂｓｕ  ３６Ｉで切断した。すべての挿入物を配列決定して、人工物がＰＣＲ中に獲得されていないことを確認した。
【０３９３】
その後、フラグメントを、以下に示す酵素を使用してｐＲＳ２プラスミドから放出し、そして構築物の次のセットを生成するために示すように正確に連結した。ＦＲ８を生成するために、フラグメント６（Ｂａｍ  ＨＩおよびＡｖａ  ＩＩによって切断した）を、フラグメント１（Ａｖａ  ＩＩおよびＮｃｉ  Ｉによって切断した）、フラグメント２（Ｎｃｉ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩによって切断した）、およびプラスミドｐＲＳ２（Ｂａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩによって切断した）と連結した。ＦＲ９を生成するために、フラグメント６（ＢａｍＨ  ＩおよびＡｖａ  ＩＩによって切断した）を、フラグメント１（Ａｖａ  ＩＩおよびＮｃｉ  Ｉによって切断した）、フラグメント４（Ｎｃｉ  ＩおよびＡｆｌ  ＩＩによって切断した）、およびプラスミドｐＲＳ２（ＢａｍＨ  ＩおよびＡｆｌ  ＩＩによって切断した）と連結した。ＦＲ１０を生成するために、フラグメント５（Ａｆｌ  ＩＩおよびＡｐａＬ  Ｉによって切断した）を、フラグメント３（ＡｐａＬ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩによって切断した）、およびプラスミドｐＲＳ２（Ａｆｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩによって切断した）と連結した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換後、制限分析によって分析し、そしてその挿入物を、再び消化によって単離し、そしてクローニングの次の工程のために使用した。
【０３９４】
ＦＲ８インサート（ＢａｍＨ  ＩおよびＡｐａＬ  Ｉによって切断した）を、フラグメント３（ＡｐａＬ  ＩおよびＢｓｐＭ  ＩＩによって切断した）、フラグメント７（ＢｓｐＭ  ＩＩおよびＢｓｕ３６  Ｉによって切断した）、およびプラスミドＤＨ−ＢＢ（ＢａｍＨ  ＩおよびＢｓｕ３６  Ｉによって切断した）と連結した。同じフラグメントをまた使用して、プラスミドＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）のＢａｍＨ  Ｉ−Ｂｓｕ３６  Ｉフラグメントを置換した。得られるプラスミドを、それぞれ、ＤＨ−ＢＢ  ＣｒｒｖおよびＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）Ｃｒｒｖと命名した（図２３を参照のこと）。ＦＲ９インサート（ＢａｍＨ  ＩおよびＡｆｌ  ＩＩによって切断した）を、ＦＲ１０インサート（Ａｆｌ
ＩＩおよびＢｓｐＭ  ＩＩによって切断した）、フラグメント７（ＢｓｐＭ  ＩＩおよびＢｓｕ３６  Ｉによって切断した）、およびプラスミドＤＨ−ＢＢ（ＢａｍＨ
ＩおよびＢｓｕ３６  Ｉによって切断した）と連結した。同じフラグメントをまた使用して、プラスミドＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）のＢａｍＨ  Ｉ−Ｂｓｕ３６  Ｉフラグメントを置換した。得られるプラスミドを、ＤＨ−ＢＢ  ＣΔｒｒｖおよびＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）  ＣΔｒｒｖと命名した（図２３を参照のこと）。
【０３９５】
キメラ構造タンパク質遺伝子を含むＤＨ構築物についての複数使用は可能であり、そして２つのこのようなアプローチを、図２４および２５に示す。図２４では、インタクトなロス川キャプシドタンパク質遺伝子を、欠損ヘルパー構築物の一部として、シンドビス糖タンパク質遺伝子配列（ＤＨ−ＢＢ  ＣｒｒｖまたはＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）  Ｃｒｒｖ）と連結し、そしてシンドビスレポーターＲＮＡベクターレプリコンと同時トランスフェクトして、組換えアルファウイルス粒子へのパッケージングを証明する（図２６）。図２５では、ロス川キャプシドタンパク質遺伝子の欠失形態を、翻訳エンハンサー、およびＤＨ構築物の一部として、シンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子配列（ＤＨ−ＢＢ  ＣΔｒｒｖおよびＤＨ−ＢＢ（５’ＳＩＮ）  ＣΔｒｒｖ）と連結するが、シンドビスキャプシドタンパク質遺伝子を、第２のＤＨ構築物から発現する。ＤＨ構築物の両方を、シンドビスレポーターＲＮＡベクターレプリコンと同時トランスフェクトして、組換えアルファウイルス粒子へのパッケージングを証明する（図２６）。さらに、ロス川キャプシドタンパク質遺伝子を、１つのＤＨ構築物から単独で発現し得るが、シンドビス糖タンパク質を、パッケージングにおける使用のために、別のものから発現させる。この知見および構造タンパク質遺伝子配列を誘導するためのいくつかの他のアルファウイルスの利用可能性を使用して、多数の異なるタンパク質の組み合わせを、類似のアプローチで生成し得る。
【０３９６】
あるいは、１つのアルファウイルス、またはトガウイルス科の他のメンバー（例えば、風疹ウイルス）からの構造タンパク質遺伝子の全体の相補物を使用して、ＳＦＶベクターおよびシンドビス構造タンパク質について上記に示すように、別のものに由来するＲＮＡベクターをパッケージし得る。代替的な実施態様では、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスからの構造タンパク質遺伝子を使用して、シンドビスウイルス由来ベクター（野生型あるいは実施例４または５に記載の表現型を提示する）をパッケージングし得る。このような方法は、宿主巨大分子合成の遅延した阻害、減少した阻害、または無阻害のような、本発明の所望の特性を提示するベクターＲＮＡを含む組換えアルファウイルス粒子、および組換え粒子の向性を向け直す構造タンパク質を提供する。ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）は、そのシンドビスウイルス対応物とは異なり、リンパ系起源の細胞についての向性を示すアルファウイルスである。したがって、ＶＥＥ構造タンパク質を発現する細胞株によってパッケージングされるシンドビス由来ベクター構築物は、パッケージング細胞構造タンパク質遺伝子カセットを得た親のＶＥＥウイルスと同じリンパ親和性特性を提示する。
【０３９７】
詳細には、ＶＥＥウイルスのトリニダードロバ株（ＡＴＣＣ  ＃ＶＲ−６９）を、ＢＨＫ−２１細胞で増殖させ、そしてビリオンＲＮＡを、実施例１に記載の手順と類似の手順を使用して抽出する。全体の構造タンパク質コード領域を、５’末端が、それぞれ、周囲のコザックコンセンサス配列を含むオーセンティックなＡＵＧ翻訳開始部位、およびＵＧＡ翻訳停止部位に位置するプライマー対とのＰＣＲによって増幅する。正方向プライマーは、ＶＥＥヌクレオチド７５５３〜７５７９に相補的であり、そして逆方向プライマーは、ＶＥＥヌクレオチド１１２０６〜１１１８６に相補的である（Ｋｉｎｎｅｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：１９−３０，１９８９からの配列）。構造タンパク質遺伝子に対応するＶＥＥ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、上記のような逆転写酵素−ＰＣＲプロトコル、テンプレートとしてのＶＥＥゲノムＲＮＡ、および隣接するＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉ部位を含む以下のオリゴヌクレオチド対を使用して達成する：
正方向プライマー：ＶＥＥ  ７５５３Ｆ（５’制限部位／ＶＥＥキャプシド配列）（配列番号８６）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＴＴＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡ−３’
逆方向プライマー：ＶＥＥ  １１２０６Ｒ（５’制限部位／ＶＥＥ  Ｅ１糖タンパク質配列）（配列番号８７）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＴ−３’。
【０３９８】
ＰＣＲ増幅後、約３８００ｂｐフラグメントを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製し、そしてＸｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化する。得られるフラグメントを、次いで、これもまた、Ｘｈｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化してそのルシフェラーゼレポーター遺伝子インサートを除去し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを使用して０．７％アガロースゲルから精製された、ＤＮＡベースのシンドビス発現ベクターｐＤＣＭＶＳＩＮ−ｌｕｃ（上記を参照のこと）に連結する。得られるＶＥＥ構造タンパク質発現構築物を、ｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｓｐと命名する。その後、プラスミドｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｓｐを、限定部分消化条件下で、ＢｓｐＥ  Ｉで消化して、大部分の非構造タンパク質遺伝子配列を除去し、そして構造タンパク質発現ＤＨベクター構築物、ｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｄｌを作製するために再連結する。
【０３９９】
ネオマイシン耐性マーカーも含むプラスミドｐＤＣＭＶ−ＶＥＥｄｌを、製造業者によって記載のように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＢＨＫ細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの約２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、そして６００μｇ／ｍｌの薬物Ｇ４１８を含む培地中に再プレーティングする。培地を、新鮮なＧ４１８含有培地と定期的に交換し、そして耐性細胞の増殖巣を増殖させる。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養ディッシュ中で限界希釈によってクローニングし、そして個々の細胞クローンを増殖させ、そしてスクリーニングのために広げた。投入ベクターに応じてＶＥＥ構造タンパク質を誘導的に発現する細胞を、シンドビスルシフェラーゼベクターＲＮＡでトランスフェクトし、そして既述のように、細胞溶解物中のＶＥＥ構造タンパク質発現または上清中のパッケージされたルシフェラーゼベクターについてアッセイすることによって同定する。ＶＥＥの改変体、または他のアルファウイルスおよび組織向性が異なるその改変体から得た構造タンパク質遺伝子も、このアプローチに従う場合、有用である。さらに、分断構造遺伝子ＰＣＬを含む、この実施例に記載の種々の構造タンパク質遺伝子発現カセット立体配置のそれぞれが使用され得る。
【０４００】
（Ｅ．ＰＣＬからのパッケージングされたアルファウイルスベクターの産生）
この実施例全体を通して記載されるアルファウイルス由来ＰＣＬは、組換えアルファウイルス粒子ストックを産生するための多くの種々の方法で使用され得、そしてＲＮＡまたはＤＮＡ分子のいずれかのトランスフェクションによるベクターの導入、これまでに産生されたパッケージングされたベクター含有粒子による感染、または安定に形質転換した発現カセットからベクターの細胞内産生を含む。ベクター粒子の産生についてのアルファウイルスＰＣＬの有用性を、最初に、レポーターベクター構築物で証明し、そして後で、所望の異種配列を発現する任意の他のベクター構築物に適用し得る。例えば、パッケージングされたシンドビスβ−ｇａｌベクター粒子のストックを、（ＬｉｌｊｅｓｔｒｏｍおよびＧａｒｏｆｆ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３５６−１３６１，１９９１）に記載の手順を使用して、５〜１０ｕｇ  ｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ−β−ｇａｌまたは−ルシフェラーゼＲＮＡ（実施例４）あるいはｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌまたは−ルシフェラーゼＤＮＡ（実施例５）を用いる、約１０7アルファウイル
スＣ／ＧＬＹＣＯまたは他のＰＣＬ細胞（上記を、および例えば、図１５、１７、１８を参照のこと）のエレクトロポレーションによって得る。トランスフェクトしたＰＣＬを、所望の温度（例えば、３７℃）で、およびトランスフェクション約４８時間後にインキュベートし、上清を採取し、そして０．４５ミクロンフィルターを通過させることによって澄明にする。さらなる処方を、本発明の詳細な説明に例示するパラメータを使用して行い得る。
【０４０１】
あるいは、パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子のストック（上記のようなＰＣＬを使用して、またはベクターおよびＤＨ構築物の同時トランスフェクションによって得たもの）を使用して、さらなる増幅のために、ＰＣＬの未処置の培養物に感染させる。例えば、５×１０7のアルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯまたは他のＰＣＬ細胞に、約
１感染ユニット／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でのパッケージングされたｐＫＳＳＩＮ−１−ＢＶ−β−ｇａｌベクターのストックに感染させる。細胞質に達する際に、ＲＮＡベクターを送達した粒子を、自己触媒的に増幅し、そしてさらなる子孫粒子にパッケージングする。所望の温度（例えば、３７℃）での約４８時間のインキュベーション後、培養上清を採取し、０．４５ミクロンフィルターを通過させることによって澄明にし、そして所望のように処方する。
【０４０２】
パッケージングされた組換えアルファウイルスベクター粒子をさらに増幅するＰＣＬの能力を利用するなお別の方法では、パッケージングされた粒子のストックを使用して、ベクター含有ＰＣＬ（ベクター産生細胞、図２７）の作業細胞バンクを作製するためにＰＣＬの未処置の培養物に感染させ、これを、その後ＰＣＬの別の未処置の培養物を播種するために使用し得る。例えば、このような作業細胞バンクを、アルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯまたはＭ．Ｏ．Ｉ．＝５でのパッケージングされたベクターストックを有する他のＰＣＬ細胞の感染によって得る。感染約２〜３時間後に、ベクター含有ＰＣＬを穏やかに脱着し、そして細胞数を測定する。ベクター含有ＰＣＬを、この時点で直接使用し得るか、またはアリコートにしそしてベクター産生細胞バンクとして液体Ｎ2中で貯蔵する。所望
の場合、細胞を、大量の高力価のパッケージングされたベクター粒子の産生のために、１０００の新鮮なＰＣＬ当たり約１のベクター産生細胞の比で、未処置のアルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯまたは他のＰＣＬの先に増殖中の培養物に直接播種する。培養上清のアリコートを、最大組換えアルファウイルス粒子産生の時間を決定するために同時培養後の種々の時間で採取し、そしてその時間を、上記のように、さらなる採取、精製、および処方について選択する。ベクター産生細胞を使用する同じ逐次的な増幅方法論は、任意の所望の組換えタンパク質の大規模産生のために有用である（図２７）。組換えタンパク質の産生のために、上清または細胞溶解物を、組換えタンパク質の性質に依存して、採取し得る。
【０４０３】
パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子の高力価または大規模ストックを産生するためのなお別の方法では、所望の発現ベクターを、本明細書に記載のように、普通に受容された試薬または方法（例えば、それぞれ、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎまたはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、あるいは低ＭＯＩ［≦０．１］でのベクターウイルスによる感染）を使用するインビトロ転写したＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡベクターのトランスフェクションによって、１〜５％の未処置のアルファウイルスＰＣＬ培養物中に導入する。ベクターを導入した最初の細胞によって産生される組換えベクター粒子は、その後、培養物中で他の未処置のパッケージング細胞に感染し、これは次に、さらに多くのパッケージングされた粒子を産生する。一時的増幅のこのプロセスは、パッケージングされた組換えアルファウイルス粒子を、ＰＣＬ培養物のすべての細胞中で産生するまで持続する。
【０４０４】
増幅プロセスを、図２６Ｄおよび２８で証明する。ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌプラスミドＤＮＡを、９８７ＤＨＢＢＮｅｏパッケージング細胞にまたはＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトし、そして細胞溶解物に存在するβ−ガラクトシダーゼのレベルを、トランスフェクション後の所定の時間に、既述のように測定した。ＢＨＫ−２１細胞では、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルは、感染後約４８時間までに最大に達し、そしてプラトーになった。対照的に、β−ガラクトシダーゼ発現のレベルは、ＥＬＶＳ  １．５−β−ｇａｌトランスフェクトされた９８７ＤＨＢＢＮｅｏ  ＰＣＬ培養物においてより長い時間にわたり増加し続け、これは、組換えベクター粒子増幅プロセス、および培養物の細胞のすべてにおけるβ−ガラクトシダーゼの最終的発現を反映した。さらに、シンドビスベクター粒子を用いる分断構造遺伝子ＰＣＬの感染（図２６Ｄ）はまた、粒子増幅を生じた。すべての場合では、組換えアルファウイルスベクター粒子のストックを、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、薬学的に受容可能であるように処方し得る。
【０４０５】
（実施例７：アルファウイルス産生細胞株の構築）
上記で述べたように、宿主細胞の高分子合成の阻害が低減するか、遅延するか、または高分子合成を阻害しないＤＮＡを基礎にしたアルファウイルスベクターの構築と組み合わせたアルファウイルスＰＣＬの生成は（実施例１、２、４、および５）、アルファウイルスベクター産生細胞株を得るための比較的簡単な機構を提供する。本発明のある実施態様においては、ベクター産生細胞株は、１つ以上の安定に形質転換された構造タンパク質遺伝子発現カセット、およびトランスフェクトされたか、形質導入されたか、または細胞内に産生された、上記の表現型を持つアルファウイルスＲＮＡ発現ベクター分子も含み、パッケージングされたベクター粒子を産生する。好ましい実施態様では、ＲＮＡベクターレプリコンは、組み込まれた形態またはエピソームＤＮＡのいずれかとして存在する、安定に形質転換されたＤＮＡ分子（真核生物層状（ｌａｙｅｒｅｄ）ベクター開始システム）から、所望の時間に与えられる１つ以上の刺激によって誘導的に制御されるベクターＲＮＡの転写によって、細胞内で産生される。この型のアルファウイルス産生細胞株の構成は、本質的に、次のような事象のカスケードを引き起こす。すなわち、ベクターＲＮＡの誘導による産生およびその結果としての自己触媒的なＲＮＡの細胞質増幅、ベクターが供給する非構造タンパク質による高レベルの構造タンパク質発現の誘導、発現した構造タンパク質によるベクターＲＮＡのパッケージング、およびパッケージングされたベクター粒子の放出を引き起こす。一旦産生細胞集団が所望の数に達したなら、ＤＮＡ分子からの誘導によるベクターＲＮＡの発現は緊密に調節されることが好ましい。それは、ベクター複製の低レベルの細胞毒性可能性のため、または、非構造タンパク質の合成を制御する必要があるためである。なぜなら、それは＋鎖対−鎖ベクターＲＮＡの比の調節に関連するからである。
【０４０６】
（Ａ．単一レベルの調節を持つアルファウイルスＤＮＡベクター）
本発明のある実施態様においては、ＤＮＡを基礎にしたアルファウイルスベクターを提供する。そこでは、所望の時間に刺激を与えることにより調節可能なプロモーターから、自己触媒的増幅能を持つアルファウイルスベクターＲＮＡ分子のインビボにおける転写が起こる。そのようなＤＮＡを基礎にしたアルファウイルスベクターを次に、アルファウイルスパッケージング細胞株（ＰＣＬ）中に安定に形質転換して、誘導可能なアルファウイルス産生細胞株を作成し得る。従って、本明細書中で述べた産生細胞株の構成は「フィードフォワード」システムである。そこでは、１）刺激を細胞に与え、効率的なアルファウイルスベクターＲＮＡの転写を起こす；２）ベクターＲＮＡは自己触媒的に複製し、そして非構造タンパク質を産生する；３）非構造タンパク質が、構造タンパク質発現カセットｍＲＮＡの増幅および高レベルの構造タンパク質の発現を刺激する；および４）構造タンパク質が、ベクターＲＮＡと相互作用し、そして次に組換えアルファウイルス粒子のパッケージングが起こり、それが培養培地中に放出される。１つ以上の誘導アルファウイルス構造タンパク質発現カセットで安定に形質転換された、先に記載の任意のアルファウイルスＰＣＬが、産生細胞株を得るための親株になり得る。
【０４０７】
例えば、図２９に示したように、テトラサイクリン応答性プロモーターシステム（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１、１９９２）を、アルファウイルスベクターＲＮＡの誘導による転写のために利用し得る。このシステムにおいて、テトラサイクリンリプレッサーおよびＨＳＶ−ＶＰ１６トランスアクチベータードメインの発現は、「融合」タンパク質（ｒＴＡ）として、最小「コア」プロモーター（例えばＣＭＶ）のすぐ隣に位置するテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）に特異的に結合することにより、アルファウイルスベクターＲＮＡのインビボにおける転写を刺激する。結合およびトランスアクチベーション事象はテトラサイクリンの存在によって可逆的に阻害され、そして培養培地からテトラサイクリンを除去することによって「スイッチオン」し得る。誘導されていない転写の基礎レベルは異なる細胞型によって違うので、もし転写開始部位が既知であるなら、他の異なった最小コアプロモーター（例えばＨＳＶ−ｔｋ）をテトラサイクリンオペレーター配列に連結して、アルファウイルスベクターヌクレオチド１のすぐ近傍またはその中に並列で配置し得る。
【０４０８】
ｒＴＡトランスアクチベーターは、同じ細胞株中に安定に形質転換された追加の発現カセットにより提供し；そして、ある実施態様においては、ｒＴＡ発現カセットはそれ自身自己調節的であり得る。自己調節ｒＴＡ発現カセットの使用は、発現を、ｒＴＡ自身が結合している同じｔｅｔＯ連結プロモーターによる転写制御に連結することにより、構成的なｒＴＡの高レベル発現に関連した毒性の問題の可能性を回避する。この型のシステムは、テトラサイクリン存在下でｒＴＡがほとんど産生されないことを保証するが、テトラサイクリンを除去すると高度に活性化されるネガティブフィードバックサイクルを作成する（図２９）。そのような自己調節ｒＴＡ発現カセットは、プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋ中に提供される（Ｓｈｏｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９２：６５２２−６５２６、１９９５）。
【０４０９】
このようなテトラサイクリンで調節されるＤＮＡを基礎にしたアルファウイルスベクターの機能性は、テトラサイクリンオペレーター／ＣＭＶ最小プロモーターによって駆動される、改変されたＳＩＮ−１由来ルシフェラーゼプラスミドベクターを構築することによって証明される。プラスミドｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ１．５−ｌｕｃ（実施例４）およびｐＢＧＳＶ３’（実施例６）を出発材料として用い、ＳＩＮ−１非構造タンパク質をコードする領域の大部分、結合領域部位プロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子、および３’−ＵＴＲの一部分を含む約７２００ｂｐの断片を、ｐＢＧ／ＳＩＮ−１  ＥＬＶＳ１．５−ｌｕｃをＢｇｌＩＩおよびＦｓｐＩで消化し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製することによって単離する。この７２００ｂｐの断片を次に、ＢｇｌＩＩおよびＦｓｐＩで消化してアルカリホスファターゼ処理し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製したプラスミドｐＢＧＳＶ３’に連結する。その結果できた構築物をｐＢＧＳＶｄ１Ｂ／ＳＩＮ１−ｌｕｃと呼ぶ。Ｓｉｎｄｂｉｓヌクレオチド１−２２８９に連結した７量体テトラサイクリンオペレーターおよび最小ＣＭＶプロモーター（ｔｅｔＯ／ＣＭＶ）を含む残りの配列の挿入を、重複ＰＣＲによって、転写がＳｉｎｄｂｉｓヌクレオチド１の５’方向の、１つの追加の非ウイルス性ヌクレオチドから始まるように達成する。ＰＣＲ反応＃１では、その配列の約３７０ｂｐのｔｅｔＯ／ＣＭＶ部分を、伸長時間３０秒の標準的な３サイクルＰＣＲで、鋳型プラスミドｐＵＨＣ１３−３（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、前出）から、次のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて増幅する。これらのプライマーは、１つのプライマー上に、隣接するＢｇｌＩＩおよびＡｓｃＩ部位をまた含み、他方に５’−Ｓｉｎｄｂｉｓヌクレオチドに重複する配列も含むようにプライマーを設計されている。
【０４１０】
正方向プライマー：５’ＢＡｔｅｔＯＦ（５’−制限部位／ｔｅｔＯヌクレオチド）（配列番号８８）
５’−ＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣ／ＴＴＴＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧ−３’
逆方向プライマー：３’ＣＭＶｐｒｏ／ＳＩＮＲ（５’−Ｓｉｎｄｂｉｓヌクレオチド／ＣＭＶヌクレオチド）（配列番号８９）
５’−ＴＡＣＧＣＣＧＴＣＡＡＴ／ＡＣＧＧＴＴＣＡＣＴＡＡＡＣＧＡＧＣＴＣＴＧＣ−３’
ＰＣＲ反応＃２では、その配列の２２８９ｂｐのＳｉｎｄｂｉｓ  ５’末端部分を、伸長時間３分の標準的な３サイクルＰＣＲで、鋳型プラスミドｐＫＳＲＳＩＮ−１（実施例１）から、次のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて増幅する。これらのプライマー類は、１つのプライマー上に、ＣＭＶプロモーターヌクレオチドに重複する配列をまた含むように設計されている。
【０４１１】
正方向プライマー：ＣＭＶＳＩＮ５’末端Ｆ（５’−ＣＭＶヌクレオチド／Ｓｉｎｄｂｉｓヌクレオチド）（配列番号９０）
５’−ＴＡＧＴＧＡＡＣＣＧＴ／ＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣＴＡＴＴ
逆方向プライマー：ＳＩＮ２４００Ｒ（全てのＳｉｎｄｂｉｓヌクレオチド）（配列番号９１）
５’−ＣＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＡＣＣＧＡＡＴＣＴＡＣ。
【０４１２】
増幅の次に、ＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、次に伸長時間３．５分の３サイクルＰＣＲ反応で、さらなる５’ＢＡｔｅｔＯＦおよびＳＩＮ２４００Ｒプライマーを用いて、鋳型として共に使用する。その結果できた約２６６０ｂｐの重複ＰＣＲアンプリコンを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製し、ＢｇｌＩＩで消化する。そして、これを、同じくＢｇｌＩＩで消化してアルカリホスファターゼ処理し、そして０．７％アガロースゲルからＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製したプラスミドｐＢＧＳＶｄ１Ｂ／ＳＩＮ１−ｌｕｃに連結する。その結果できた構築物をｐｔｅｔＳＩＮ１−ｌｕｃと呼ぶ。目的の他の異種配列を含むベクター構築物を、同様のアプローチを用いて、またはＸｈｏＩおよび／またはＮｏｔＩ部位に直接クローニングすることによって生成する。次に、選択可能なＥ．ｃｏｌｉ  ｇｐｔ遺伝子（キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）発現カセットを生成し、そしてプラスミドｐｔｅｔＳＩＮ１−ｌｕｃの唯一のＰａｃＩ部位に挿入して、さらなる選択マーカーを提供する。まず、ｇｐｔ遺伝子オープンリーディングフレームに連結したＳＶ４０プロモーターを含む断片を、プラスミドｐＭＡＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から、伸長時間２分の標準的な３サイクルＰＣＲによって、次のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて増幅する。これらのプライマー類は、上流に隣接するＳａｃＩおよびＰａｃＩ部位を、および下流にＳａｃＩ部位を含むように設計されている。
【０４１３】
正方向プライマー：ＳＶ４０ｐｒｏＳＰＦ（５’−制限部位／ＳＶ４０プロモーター配列）（配列番号９２）
５’−ＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴＴＡＣＴＴＣ
逆方向プライマー：３’ＥＣｇｐｔＲ（５’−制限部位／ｇｐｔ遺伝子配列）（配列番号９３）
５’−ＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣ／ＡＧＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＧＡＴＴＡＧＣＧＡＣＣＧ。
【０４１４】
増幅の次に、ＳＶ４０プロモーター／ｇｐｔ遺伝子ＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＳａｃＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製する。そして、これを、同じくＳａｃＩで消化してアルカリホスファターゼ処理し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製したプラスミドｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ＢＧＨＴＴ（実施例５）に連結する。正しい向きの挿入片を有するクローンを制限分析によって同定する。この構成では、プロモーターおよびｇｐｔ遺伝子はウシ成長ホルモン転写終止シグナルのすぐとなりに位置する。その結果できたｇｐｔ発現構築物をｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ｇｐｔと呼ぶ。次に、全発現カセットを、プラスミドｐＢＧＳ１３１  ｄｌＸｈｏＩ−ｇｐｔから、伸長時間２分の標準的な３サイクルＰＣＲによって、次のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて増幅する。これらのプライマー類は、隣接するＰａｃＩ部位を含むようを設計されている。
【０４１５】
正方向プライマー：ＳＶ４０ｐｒｏＳＰＦ、上記に示した（配列番号９２）
逆方向プライマー：ＢＧＨＴＴｐａｃＲ（５’−制限部位／ＢＧＨ配列）（配列番号９４）
５’−ＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＴＡＡ／ＡＴＡＧＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＣＧＡＴＧＣ。
【０４１６】
増幅の次に、ｇｐｔ遺伝子発現カセット断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、ＰａｃＩで消化し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製する。そして、同じくＰａｃＩで消化してアルカリホスファターゼ処理し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製した、ｔｅｔ誘導性アルファウイルスベクター構築物であるｐｔｅｔＳＩＮ１−ｌｕｃに連結する。その結果できた構築物をｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃと呼ぶ。
【０４１７】
最初のテトラサイクリン誘導性アルファウイルスベクター産生細胞株を構築するために、ｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ構築物およびテトラサイクリンリプレッサー／ＶＰ１６トランスアクチベーター（ｒＴＡ）発現カセットを、所望のアルファウイルスＰＣＬ中に安定に形質転換する。例えば、アルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯ  ＰＣＬ細胞（上記より）を、選択マーカーをコードするもう１つのプラスミドと同時にトランスフェクトすることにより、プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋ（上記参照）で安定に形質転換する。プラスミドｐＴｅｔ−ｔＴＡｋおよびヒスチジノールデヒドロゲナーゼマーカーをコードするｐＳＶ２−Ｈｉｓ（Ｓｃｈａｔｚら、１９８９、Ｃｅｌｌ  ５９：１０３５−１０４８）を、Ｃ／ＧＬＹＣＯ  ＰＣＬ細胞（または他のＰＣＬ）中に、それぞれ４０：１のモル比で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて製造会社が述べているように、同時にトランスフェクトする。トランスフェクトして約２４時間後、細胞をトリプシン処理して、ヒスチジノールおよび０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む培地中で再びプレート培養する。培地を定期的に、新鮮な、薬剤を含む培地と交換し、そして耐性細胞の細胞増殖巣が成育させる。細胞をトリプシン処理し、９６ウェル組織培養皿に制限希釈することによってクローン化し、そして成育した個々の細胞クローンをスクリーニングのために増殖させる。、ｐＴｅｔ−ｔＴＡｋを含むパッケージングする陽性細胞クローンを、Ｃ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ細胞と呼び、ｔｅｔＯ／プロモーターの制御下に、テトラサイクリンの存在下または非存在下で、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＵＨＣ１３−３（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、前出）をトランスフェクトすることによって同定する。テトラサイクリン非存在下で、陽性Ｃ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ  ＰＣＬ細胞は、ｔｅｔＯ／プロモーターからの誘導および誘導による高レベルのルシフェラーゼを提供する。
【０４１８】
次に、ＤＮＡを基礎にしたアルファウイルスベクター構築物であるｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、製造会社が述べているように、Ｃ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ細胞中に安定にトランスフェクトする。トランスフェクトしてから約２４時間後、細胞をトリプシン処理して、特定の細胞型に最適化した（ＤＭＥＭ＋１０％透析ウシ胎児血清、２５０μｇ／ｍｌのキサンチン、１５μｇ／ｍｌのヒポキサンチン、１０μｇ／ｍｌのチミジン、２μｇ／ｍｌのアミノプテリン、２５μｇ／ｍｌのミコフェノール酸）、および０.５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む選択培地中で再びプ
レート培養する。培地を、定期的に、新鮮な選択培地と交換し、耐性細胞の細胞増殖巣を成長させる。細胞をトリプシン処理し、９６ウェル組織培養皿に制限希釈することによってクローン化し、そして成育した個々の細胞クローンをスクリーニングのために増殖させる。ｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃで安定に形質転換された陽性産生細胞株を、テトラサイクリンを培地から少なくとも２４時間除去し、そして細胞溶解物中のルシフェラーゼを試験することにより、そしてまた前に述べたように培養上清中のパッケージングされたルシフェラーゼベクターを試験することにより、同定する。
【０４１９】
（Ｂ．２レベルの調節を持つアルファウイルスＤＮＡベクター）
好ましい実施態様において、ＤＮＡを基礎にしたアルファウイルスベクター（野生型または宿主の高分子合成の阻害が減少するか、遅延するか、または高分子合成を阻害しない所望の表現型）を構築することが所望され得る。そこでは、自己触媒的に増幅し得るＲＮＡベクター分子の転写が、基礎レベルの転写をすべて排除するために、２レベルの調節によって極めて緊密に制御されるプロモーターから起こる。そのようなアプローチは、１つの誘導可能な成分（例えば、上記からのｔｅｔシステム）を可逆的な転写サイレンシング成分と組み合せ得る。例えば、特定のジンクフィンガータンパク質のＫＲＡＢ抑制領域を使用し得る。
【０４２０】
簡単に述べれば、ＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｏｘ）ドメインは、全ＫｒｕｐｐｅｌクラスのＣｙｓ2Ｈｉｓ2ジンクフィンガータンパク質の３分の１を超えるアミノ末端領域に存在する高度に保存された配列である。この領域は２つの予測された両親媒性αへリックスを含み、ＤＮＡ結合依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写リプレッサーとして機能することが示されている（例えば、Ｌｉｃｈｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：７６−７９、１９９０）。他の転写因子のように、活性な抑制ドメインとＤＮＡ結合領域は別個で、かつ分離可能である。従って、リプレッションドメインは、標的するために、融合タンパク質として、あらゆる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に連結され得る。理想的には、ＤＮＡ結合タンパク質成分は、調節可能な様式で、可逆的に結合を阻害し、したがって、転写のサイレンシングをスイッチ「オフ」し得る。例えば、１つの実施態様においては、ヒトＫｏｘ１由来のＫＲＡＢドメイン（Ｔｈｉｅｓｅｎ、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．２：３６３−３７４、１９９０）を、ＤＮＡ結合ラクトース（ｌａｃ）リプレッサータンパク質に融合し、ｔｅｔ応答性プロモーターのすぐ隣に配置されたｌａｃオペレーター配列に、可逆的な配列特異的結合とともに、ハイブリッド転写サイレンサーを形成する（図３０）。この構成においては、ｌａｃリプレッサー／ＫＲＡＢドメイン融合（ｒＫＲ）の構成的発現は、ｌａｃオペレーター配列への結合を生じ、そして誘導されないｔｅｔ応答性プロモーターからの任意の「漏出性」基礎転写が排除される。ベクター発現が所望され、そしてテトラサイクリンがこの系から除去される場合、ＩＰＴＧを添加してｒＫＲで仲介される転写サイレンシングを防ぐ。
【０４２１】
それに加えて、他のジンクフィンガータンパク質、例えばＺＮＦ１３３（Ｔｏｍｍｅｒｕｐら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：１５７１−１５７５、１９９３）、ＺＮＦ９１（Ｂｅｌｌｅｆｒｏｉｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：１３６３−１３７４、１９９３）、ＺＮＦ２（Ｒｏｓａｔｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５６６１−５６６７、１９９１）および他のタンパク質由来のＫＲＡＢドメイン、ならびに他の移入可能なリプレッサードメイン、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのｅｎまたはｅｖｅ遺伝子（ＪａｙｎｅｓおよびＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１４２７−１４３３、１９９１；ＨａｎおよびＭａｎｌｅｙ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：４９１−５０３、１９９３）、ヒトジンクフィンガータンパク質ＹＹ１（Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  ６７：３７７−３８８、１９９１）、ウィルムス腫瘍サプレッサータンパク質ＷＴ１（Ｍａｄｄｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１５５０−１５５３、１９９１）、甲状腺ホルモン受容体（Ｂａｎｉａｈｍａｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１０１５−１０２３、１９９２）、レチノイン酸受容体（Ｂａｎｉａｈｍａｄら、前出）、Ｋｉｄ−１（Ｗｉｔｚｇａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４５１４−４５１８、１９９４）がこのような系で即座に用いられる。さらに、この系のｌａｃリプレッサー／ｌａｃオペレーター成分は、他の供給源、例えばトリプトファンおよびマルトースオペロン、ＧＡＬ４などに由来する、任意の数の他の制御可能な系で代替し得る。
【０４２２】
より詳細には，ヒトＫｏｘ１のＫＲＡＢドメインと融合したｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）タンパク質を、タンパク質が核へ戻るのをより効果的に指示するために連結された核局在化配列（ＮＬＳ：Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号１００）；Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３９：４９９−５０９、１９８４）とともに含む発現カセットを、重複ＰＣＲで構築する。ＰＣＲ反応＃１では、約１１００ｂｐのｌａｃＩ配列を、伸長時間１．５分の標準的な３サイクルＰＣＲで、鋳型プラスミドｐ３’ＳＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から、次のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて増幅する。これらのプライマー類は、上流のプライマー上に、隣接するＸｈｏＩ部位および良好な転写開始関係にあるＡＵＧ開始コドンを含み、他方にＳＶ４０  ｌａｒｇｅＴ抗原核局在化配列も含むように設計されている。
【０４２３】
正方向プライマー：ＬａｃＩ５’Ｆ（５’−制限部位／ＡＵＧ＋ｌａｃＩ配列）（配列番号９５）
５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＣＡ／ＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡＣＧＴＴＡＴＡＣ
逆方向プライマー：ＬａｃＩ３’ＮＬＳＲ（５’−ＮＬＳ／ｌａｃＩ配列）（配列番号９６）
５’−ＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧ／ＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡＡＣ。
【０４２４】
ＰＣＲ反応＃２では、ヒトＫｏｘ１のＫＲＡＢドメインのアミノ末端１２１残基を含む約４００ｂｐのアンプリコンを、伸長時間１分の標準的な３サイクルＰＣＲで、鋳型プラスミドｐＫｏｘ１（Ｔｈｉｅｓｅｎ、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．２：３６３−３７４、１９９０）から、次のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて増幅する。これらのプライマー類もまた、１つのプライマー上に、配列が重複するＮＬＳおよびｌａｃＩを含み、そして他方にＳａｃＩ制限部位および終止コドンを含むように設計されている。
【０４２５】
正方向プライマー：ＫＲＡＢ５’Ｆ（５’−ＮＬＳ＋ｌａｃＩ重複配列／ＫＲＡＢ配列）（配列番号９７）
５’−ＣＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧ／ＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴ
逆方向プライマー：ＫＲＡＢ３’Ｒ（５’−制限部位＋終止コドン／ＫＲＡＢ配列）（配列番号９８）
５’−ＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＡ／ＡＡＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＧＣ。
【０４２６】
増幅の次に、このＤＮＡ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎで精製し、次に伸長時間２．５分の３サイクルＰＣＲ反応において、さらなるＬａｃＩ５’ＦおよびＫＲＡＢ３’Ｒプライマーを用いて、鋳型として共に使用する。その結果できた約１５００ｂｐの重複ＰＣＲアンプリコンを、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて精製し、ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで消化する。そして、これを、同じくＸｈｏＩおよびＳａｃＩで消化してアルカリホスファターゼ処理し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて０．７％アガロースゲルから精製した真核生物発現ベクタープラスミドｐＥＵＫ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に連結する。その結果できたｌａｃＩ／ＫＲＡＢ発現構築物をｐＥＵＫ−ｒＫＲと呼ぶ。
【０４２７】
ｌａｃＩ／ＫＲＡＢ発現カセットを含む安定なＰＣＬ形質転換体を生成するために、すでにｒＴＡ  ｔｅｔ／トランスアクチベーター融合タンパク質カセットでの形質転換について既に選択されたアルファウイルスＰＣＬを、出発材料として使用する。例えば、アルファウイルスＣ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ  ＰＣＬ細胞（上記より）を、選択マーカーをコードするもう１つのプラスミドと同時にトランスフェクトすることによって、プラスミドｐＥＵＫ−ｒＫＲで安定に形質転換する。プラスミドｐＥＵＫ−ｒＫＲおよびピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ選択マーカー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をコードするｐＰＵＲを、Ｃ／ＧＬＹＣＯ／ＴＡｋ  ＰＣＬ細胞（または他のＰＣＬ）中に、それぞれ４０：１のモル比で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、製造会社が述べているように、同時にトランスフェクトする。トランスフェクトして約２４時間後、細胞をトリプシン処理して、５μｇ／ｍｌのピューロマイシンおよび０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む培地中で再びプレート培養する。培地を、定期的に、新鮮な、薬剤含有培地と交換し、耐性細胞の細胞増殖巣を成育させる。細胞をトリプシン処理し、そして９６ウェル組織培養皿に制限希釈してクローン化し、そして成育した個々の細胞クローンをスクリーニングするために増殖させる。ｐＥＵＫ−ｒＫＲを含むパッケージングする陽性細胞クローンをＣ／Ｇ／ＴＡｋ／ｒＫＲ細胞と呼び、ｌａｃＩに特異的なポリクローナル抗血清（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いる免疫染色によって同定する。
【０４２８】
次に、特異的なｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）配列を、望ましいｐｔｅｔベースのアルファウイルスベクター（上記参照）に挿入しなければならない。例えば、ベクター構築物ｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃを、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、ｌａｃＯの複数のコピーを含むように改変する。ＬａｃＯオリゴヌクレオチドを、全長２２ｂｐのパリンドロームオペレーター配列（Ｓｉｍｏｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１６２４−１６２８、１９８４；Ｓａｄｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：６７８５−６７８９、１９８３）を含み、そして２本鎖分子に自己アニーリングした場合、ＡｓｃＩ部位に隣接する、左右対称のｌａｃＯ配列を含むように設計する。
ＬａｃＯｓｙｍＡ（配列番号９９）
５’−ＣＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＧＧ。
【０４２９】
ＬａｃＯｓｙｍＡオリゴは自己アニーリングしてＡｓｃＩ「付着末端」を持つＤＮＡ断片を形成し、次にＡｓｃＩで消化してアルカリホスファターゼ処理し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて、０．７％ゲルから精製したプラスミドｐｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃにライゲーションする。１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のｌａｃＯ配列のタンデムなコピーを含むクローンを配列分析によって同定し、ｐＯＩｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ、ｐＯＩＩｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ、ｐＯＩＩＩｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ等と呼ぶ。次に、異なった数のｌａｃＯのコピーを持つ個々のクローンを下記に詳述するようにトランスフェクトし、最も厳しいレベルの転写制御について試験する。
【０４３０】
アルファウイルスベクター産生細胞株を生成するために、ＤＮＡベースのｐＯｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃベクター構築物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、製造業者が記載するように、Ｃ／Ｇ／ＴＡｋ／ｒＫＲ細胞に安定にトランスフェクトする。トランスフェクトしてから約２４時間後、細胞をトリプシン処理して、特定の型の細胞に最適化された、０．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む選択培地（ＤＭＥＭ＋１０％透析ウシ胎児血清；２５０μｇ／ｍｌのキサンチン；１５μｇ／ｍｌのヒポキサンチン；１０μｇ／ｍｌのチミジン；２μｇ／ｍｌのアミノプテリン；２５μｇ／ｍｌのミコフェノール酸）に、再びプレートする。培養液を定期的に新しい選択培地と交換し、耐性細胞の細胞増殖巣を増殖させる。細胞をトリプシン処理して、９６穴組織培養皿に限界希釈することによりクローニングし、増殖した個々の細胞クローンをスクリーニングのために拡大する。ｐＯｔｅｔＳＩＮ１ｇｐｔ−ｌｕｃ構築物で安定に形質転換された陽性産生細胞株を、テトラサイクリンを培養液から除去して、そして誘導のために２０ｍＭのＩＰＴＧを加えてから少なくとも２４時間後に、ルシフェラーゼの発現によって同定する（前述）。ルシフェラーゼ活性を、産生細胞溶解物において、および培養上清を用いる移入物の発現実験（ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｏｆ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）の後の両方において決定する。
【０４３１】
さらなるレベルの制御は、アルファウイルスベクター分子の転写を担うプロモーターに対する、３番目、４番目までもの調節レベルを加えることによって組み込まれ得る。そのようなさらなる調節レベルは、最小（ｍｉｎｉｍａｌ）プロモーターに組み込まれ得、他の誘導システムおよび／または細胞分化の制御に関与し得る。上記のそれぞれの場合、宿主細胞染色体へ組み込まれたものとして、または染色体外のエピソームとして、例えばＥＢＶエピソームベースのベクタープロモーターを用いて（組み込まれない場合）、安定な形質転換を達成し得る。
【０４３２】
（実施例８：アルファウイルス由来の空またはキメラウイルス粒子の生成方法）
実施例６で示したように、個々の欠損ヘルパー（ＤＨ）発現カセットを、複数のアルファウイルスまたはその変異体由来のエレメントを含むように構築し得る。従って、実施例６で記載したように、ウイルス糖タンパク質を発現するための分断構造遺伝子ＤＨカセットを、異なったアルファウイルスの種由来のキャプシドおよび糖タンパク質遺伝子を含むように構築し得る。例えば、そのような異種のアルファウイルス糖タンパク質ＤＨカセットは、ロス川ウイルス（ＲＲＶ）由来のキャプシド遺伝子およびシンドビスウイルス由来の糖タンパク質遺伝子を含み得る。この構成においては、ＲＲＶキャプシド遺伝子は糖タンパク質遺伝子の翻訳レベルを高めるように働く。
【０４３３】
異種のアルファウイルス糖タンパク質ＤＨカセットについて本明細書中で記載した構成を、ベクターレプリコンのアルファウイルス粒子へのパッケージングを改良し、その上組換えの可能性を減らすように設計し、これによって複製コンピテントアルファウイルスの形成を生じる。異種のアルファウイルス糖タンパク質ＤＨ発現カセットは、実施例６（「ゲノム」構造タンパク質遺伝子ＰＣＬ）において記載したＤＨ発現カセット中のシンドビスウイルスキャプシド遺伝子を、異種のアルファウイルスキャプシド遺伝子（例えばＲＲＶ）で代替したものである。分断構造遺伝子ＰＣＬ中の２番目のＤＨ発現カセットは、例えばシンドビスウイルスキャプシド遺伝子を含む。従って、シンドビスウイルス構造タンパク質を持つ組換えアルファウイルスベクター粒子生成のための分断構造遺伝子ＰＣＬは、例えば個々のＤＨ発現カセット上のシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子およびキャプシド遺伝子に由来し得る。
【０４３４】
シンドビスウイルス由来のキャプシド遺伝子以外は全てのＲＲＶの遺伝子を含むキメラウイルス、または相互キメラウイルスは、感染性ウイルス粒子に組み立てられないことが以前に示された（Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１３１６−１３２３、１９９４）。著者らはこの報告の中で、ウイルスの組み立てにおける糖タンパク質Ｅ２のカルボキシル末端とキャプシドタンパク質との間の相互作用が、異種のアルファウイルスの構造タンパク質間では起こり得ないと結論を下した。従って、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子（ベクターレプリコン由来）、ＲＲＶキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなる、実施例６において記載した分断構造遺伝子アルファウイルスＰＣＬで発生する組換えゲノムは、複製コンピテントでなく、ウイルスの増殖を引き起こさない（複製コンピテントシンドビスウイルス、ＲＣＳＶ）。異種のアルファウイルス種間のパッケージングの制限は、１つのアルファウイルス由来の翻訳増強エレメントを含むキャプシド遺伝子、および異なったアルファウイルス由来の糖タンパク質遺伝子からなるＤＨカセットの構築を可能にする。
【０４３５】
しかし、図３１に示したように、異種のアルファウイルスの構造タンパク質間では組み立ては起こり得ないというＬｏｐｅｚら（前出）の観察は誤りである。実際、ＲＲＶキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなるＤＨカセットは、感染性ウイルス粒子を産生する。簡単には、ＢＨＫ細胞を、ＳＩＮｒｅｐ／Ｌａｃ  Ｚレプリコン（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６、１９９３）、およびＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ／ＳＩＮ）Ｃｒｒｖ（実施例６および図２４、ＲＲＶキャプシド／シンドビスウイルス糖タンパク質）のインビトロで転写したＲＮＡで同時にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションおよびインビトロでの転写は実施例１で記載したように行った。エレクトロポレーションの次に、実施例１で記載したのと全く同じように、ＢＨＫ細胞をダクチノマイシンで処理し、[3Ｈ]ウリジンで標識
した。エレクトロポレーションから１８時間後、培養培地を回収し、６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより澄明にした。上清に残っているベクター粒子を、最初にスクロースクッション（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｃｕｓｈｉｏｎ）上に重層した後、超遠心でペレット化した。エレクトロポレーションから１８時間後、実施例１で記載したのと全く同じように、ＢＨＫ細胞、およびウイルスペレットからＲＮＡを単離し、変性グリオキサールアガロースゲル上で電気泳動し、オートラジオグラフィーで目に見えるようにした。ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞、およびウイルス粒子に存在するウイルスＲＮＡを図３１に示す（レーン１、パネルＡ、およびレーン１、パネルＢ）。ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡに対するゲノムおよびサブゲノム複製種に対応するＲＮＡが、エレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞、および産生されたウイルス粒子の両方に存在した。この結果は、Ｌｏｐｅｚら（前出）と対照的に、ＲＲＶキャプシドタンパク質およびシンドビスウイルス糖タンパク質からなるキメラアルファウイルス粒子の形成を証明している。さらに、キメラアルファウイルス粒子における、ゲノムおよびサブゲノムＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡの無差別なパッケージングは、ロス川ウイルスのキャプシドタンパク質が、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺベクターレプリコンのｎｓＰ１遺伝子に存在するシンドビスウイルスパッケージング配列を特異的に認識できないことを示している。
【０４３６】
エレクトロポレーションから１８時間後に、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ
Ｃｒｒｖ  ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞、および産生されたウイルス粒子に存在するウイルスタンパク質を図３２に示す（レーン１、パネルＡ、およびレーン１、パネルＢ）。エレクトロポレーションした細胞および産生されたキメラアルファウイルス粒子中の、ウイルス特異的構造タンパク質は区別がつかなかった。すなわち、図３２はＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  Ｃｒｒｖ  ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞から産生されたウイルス粒子は、ＲＲＶのキャプシドおよびシンドビスウイルスの糖タンパク質Ｅ１およびＥ２を含んでいたことを、明白に証明している。この結果はＬｏｐｅｚら（前出）とは対照的に、異種のアルファウイルスのキャプシドと糖タンパク質との間での組み立てに、キメラウイルス粒子の形成を妨げるような制限は無いという明白な証拠を提供する。
【０４３７】
従って、Ｌｏｐｅｚらの結果および考察とは明らかに対照的に、ＲＲＶキャプシドタンパク質のアミノ末端は異種のシンドビスウイルスゲノムと結合し得、感染性キメラアルファウイルス粒子を形成し得る。重要なことに、異種のアルファウイルスキャプシドタンパク質と糖タンパク質との間でのウイルスの組み立てに制限が存在するという以前の結論は誤りである。次いで、本明細書中で記載したようなキメラアルファウイルス粒子の生成はまた、上記で記載した分断構造遺伝子ＰＣＬ中でのＲＣＳＶの形成を生じる。なぜなら、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子（ベクターレプリコン由来）、ＲＲＶキャプシド遺伝子、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなる組換えゲノムは、感染性ウイルスを生成するからである。あるいは、別のアルファウイルス構造タンパク質とベクターレプリコンとの間のパッケージングに制限が無いことは、ベクター粒子の属性を改変することを可能にする。リンパ指向性の組換えベクター粒子を生成するために、例えば、シンドビスウイルスレプリコンをベネズエラウマ脳炎ウイルス構造遺伝子でパッケージングし得る。
【０４３８】
前に行われた、２つの別の研究において記載された結果は、インビトロで、三角分割数（Ｔ）＝３を有する２つの二十面体ウイルス、カブ縮葉病ウイルス（ｔｕｒｎｉｐ  ｃｒｉｎｋｌｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＣＶ）、およびサザンビーン（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｅａｎ）モザイクウイルス（ＳＢＭＶ）のキャプシドタンパク質とポジティブＲＮＡ鎖ゲノムとの間の相互作用を無くすと、ウイルス粒子の解離、および核酸を持たないＴ＝１粒子の形成が起こることを示した（Ｓｏｒｇｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９１：６３９−６５６、１９８６、およびＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１１６：１２８−１３６、１９８２）。核酸非存在下では、野生型ウイルスと類似するＴ＝３粒子は、インビトロで形成されなかった。ＯｗｅｎおよびＫｕｈｎ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２７５７−２７６３、１９９６）は、インビボでのキャプシド形成反応の特異性を決めるのに必要なキャプシドタンパク質の領域を同定するために、キャプシドに欠失を含むシンドビスウイルスゲノムのパッケージングの性質を調査した。キャプシドの９７−１０６残基に相当する欠失を含む１つの変異ウイルス[ＣＤ（９７−１０６）]は、ゲノムおよびサブゲノムＲＮＡをどちらもキャプシド化した。これは、キャプシドタンパク質のドメインがゲノムＲＮＡパッケージングシグナルの特異的な認識に必要であることを示している。さらに、他の報告では、アウラアルファウイルスのパッケージングの性質が調査された（Ｒｕｍｅｎａｐｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１７４１−１７４６、１９９５）。この研究において、キャプシドタンパク質−キャプシド形成配列相互作用の開始複合体に関与するアルファウイルスパッケージング機構が提案された。この提案された機構は、著者らおよび他の研究者（ＯｗｅｎおよびＫｕｈｎ、前出を含む）の、２６Ｓおよび４９ＳアルファウイルスＲＮＡはＴ＝１、Ｔ＝３、Ｔ＝４、およびＴ＝７ウイルス粒子にパッケージングされるという観察に基づき、そして空のキャプシドがアルファウイルス感染中に発生するということは報告されていない。
【０４３９】
上記に提示された文献およびその中に含まれる考察に基づいて、キャプシド形成反応の特異性を決めるのに必要なキャプシドタンパク質ドメインに対応し、さらに、静電気的にウイルスＲＮＡと結合する塩基性残基を取り囲む領域を欠失したＲＲＶキャプシド遺伝子は、ウイルスＲＮＡを含む安定なキャプシド粒子を形成できないはずである。従って、この欠失したＲＲＶキャプシド遺伝子およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなる、異種のアルファウイルスＤＨカセットから発現されたアルファウイルス構造タンパク質は、安定なキメラアルファウイルス粒子に組み立てられないはずである。従って、上記および実施例６で議論した分断構造遺伝子ＰＣＬにおいて、シンドビスウイルス非構造タンパク質遺伝子、ＲＲＶキャプシド遺伝子（パッケージング特異性に対応する領域および周囲の塩基性残基を欠失）、およびシンドビスウイルス糖タンパク質遺伝子からなる組換えゲノムは、感染性ウイルスを生成し得ない。実施例６で記載したように、シンドビスウイルスキャプシドタンパク質は別のＤＨ発現カセットから発現される；従って、３つのシンドビスウイルス構造タンパク質がまとめて発現され、組換えベクター粒子の産生が起こる。
【０４４０】
シンドビスウイルスパッケージング配列に結合すると予測される、発現タンパク質の領域に対応するＲＲＶキャプシド遺伝子のヌクレオチド（静電気的にウイルスＲＮＡに結合する塩基性残基を含む）（Ｗｅｉｓｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：７８０−７８６、１９９４およびＬｏｐｅｚら、前出）を、異種のアルファウイルスキャプシド−糖タンパク質ＤＨを構築するために、欠失させた。このことは、翻訳の増強、および翻訳後切断によってプロセシングされている、正しいｐＥ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質を提供したが、安定なキメラＲＲＶ／シンドビスウイルス粒子を組み立てられなかった。図３３は、ＲＲＶキャプシドタンパク質、およびウイルスパッケージング配列ＲＮＡと相互作用するリシンを豊富に含むタンパク質をコードする様々な量のキャプシド遺伝子が欠失した、３つの別のＲＲＶキャプシド遺伝子変異体（ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、ＣΔ３ｒｒｖ）から発現されたキャプシドタンパク質の疎水性プロファイル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｌｉｔｔｌｅ）を示す。ＲＲＶキャプシドタンパク質の、リシンを豊富に含む塩基性領域を図３３に示す。さらに、疎水性プロファイルは、このリシンを豊富に含む塩基性領域が、３つの別のＲＲＶキャプシド遺伝子変異体、ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、およびＣΔ３ｒｒｖで徐々に除去されていることを示している。図３４は、変異体ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、およびＣΔ３ｒｒｖでの欠失の結果として、発現したＲＲＶキャプシドタンパク質中のリシン残基が除去されたことを示している。下記に示す表は、構築物ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、およびＣΔ３ｒｒｖのＲＲＶゲノムで欠失させたヌクレオチドを示す。
【０４４１】
【表２９】
2013090630.tif 000030
ＲＲＶキャプシド遺伝子の欠失は、図２３に示し、実施例６で記載したＤＨ−ＢＢ  ＣｒｒｖプラスミドＤＮＡ上に構築した。示されたＲＲＶキャプシド遺伝子配列を、ＰＣＲによって、プライマーおよび実施例６で示した他のクローニング工程を用いて欠失させた。
【０４４２】
上記で議論した図３１および３２は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ  ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、またはＣΔ３ｒｒｖ  ＲＮＡをエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞で合成され、これらの細胞培養液中に含まれるウイルス粒子に存在するウイルス特異的ＲＮＡ（図３１）およびタンパク質（図３２）を示す。ゲノムおよびサブゲノム分子を、エレクトロポレーションした細胞中の、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺレプリコンおよび３つすべてのＤＨ−ＢＢ  ＣΔ１ｒｒｖ、ＣΔ２ｒｒｖ、またはＣΔ３ｒｒｖ  ＤＨ  ＲＮＡの両方で検出した（図３１、パネルＡ）。しかし、ウイルス粒子にレプリコンゲノムＲＮＡが存在しないことで示されたように（図３１、パネルＢ）、ＲＲＶキャプシド遺伝子に欠失を含むＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞では、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺレプリコンはベクター粒子にパッケージングされなかった。さらに、細胞をＲＲＶキャプシドのより大きな欠失を含むＤＨ分子（ＣΔ２ｒｒｖまたはＣΔ３ｒｒｖ）でエレクトロポレーションした場合、ヘルパーゲノムおよびサブゲノムＲＮＡのパッケージングは非常に効率が悪く、変性ゲルでのオートラジオグラフでほとんど見えなかった（図３１、パネルＢ、レーン３および４）。対照的に、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺゲノムＲＮＡ（およびＣΔ２ｒｒｖまたはＣΔ３ｒｒｖでエレクトロポレーションした時のＤＨ  ＲＮＡ）は、ＲＲＶキャプシド遺伝子に欠失を含むＤＨでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞からのウイルス粒子中に検出されなかったが、ＲＲＶキャプシド遺伝子が欠失を含むか否かに関わらず、全てのＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞からのウイルス粒子中では、同量のＲＲＶキャプシドタンパク質およびシンドビスウイルス糖タンパク質が観察された（図３２、パネルＡおよびＢ）。この結果は、ベクターレプリコンまたは他のウイルス特異的ＲＮＡを含まない安定なキメラウイルス粒子が、ＳＩＮｒｅｐ／ｌａｃＺゲノムＲＮＡおよびＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞中に形成され、そこからゲノムＲＮＡに結合できないキャプシドタンパク質が発現されたことを証明している。安定な空の異種のアルファウイルス粒子の形成は、以前の研究の結果および考察に基づいて、予期されず、かつ想到されない（Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１３１６−１３２３、１９９４、Ｓｏｒｇｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９１：６３９−６５６、１９８６、ＥｒｉｃｋｓｏｎおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１６：１２８−１３６、１９８２、およびＲｕｍｅｎａｐｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１７４１−１７４６、１９９５）。
【０４４３】
産生されたウイルス粒子の構成を決定するために、ＢＨＫ細胞を、本明細書中で記載したように、ＳＩＮｒｅｐ  ＬａｃＺおよび様々なＲＲＶキャプシド遺伝子構成を含むＤＨ
ＲＮＡでエレクトロポレーションし、次に、実施例１で記載したように、ダクチノマイシンで処理し、[35Ｓ]メチオニンおよび[3Ｈ]ウリジンで標識した。澄明にした細胞培養
液を、２０％−４０％（ｗ／ｗ）ショ糖勾配上で、ＳＷ−４１ローターを用いて、３５，０００ｒｐｍで２時間超遠心することにより、産生されたウイルス粒子の構成を決定した。この研究の結果を図３５−３７に示す。これらは、再び安定な空の異種のアルファウイルス粒子の形成を証明している。図３５は、野生型ウイルスであるＴｏｔｏ１１０１を高いＭＯＩ（５）で感染させたＢＨＫ細胞で合成された粒子に取り込まれた[35Ｓ]メチオニンおよび[3Ｈ]ウリジンの相対的な量を示す。図３６は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよび
ＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）Ｃｒｒｖ（図２３）ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞で合成された粒子に取り込まれた[35Ｓ]メチオニンおよび[3Ｈ]ウリジンの相対
的な量が、野生型ウイルスを感染させた細胞と同程度であることを示している。対照的に、図３７は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺおよびＤＨ−ＢＢ（５’ｔＲＮＡ）ＣΔ３ｒｒｖでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞で産生された粒子が、極めて低レベルの[3Ｈ]ウ
リジンしか取り込まないことを示す。図３８は図３５−３７を編集したものであり、粒子に取り込まれた[35Ｓ]メチオニンおよび[3Ｈ]ウリジンの相対的な量は、野生型アルファ
ウイルスキャプシド遺伝子を含むＲＮＡを感染させたまたはエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞においては同程度であるが、ＲＲＶキャプシド遺伝子のヌクレオチド７７６０−７８９１の欠失を含むＤＨ  ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞は、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡを欠いた安定な空のキメラアルファウイルス粒子を形成することを明確に示す。ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡおよびＤＨ−ＢＢ  ＣＤ３ｒｒｖのインビトロで転写されたＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞株で産生され、[35Ｓ]メチオニンで標識した空のアルファウイルス粒子の力価を、Ｔｏｔｏ１１０１野生型ウイルスを感染させて、[35Ｓ]メチオニンで標識したＢＨＫ細胞と比較して決定した。Ｔｏｔｏ１１０１を感染させた細胞からのウイルスを含むショ糖勾配画分中に存在する放射活性レベルを定量化し、実施例１で記載した方法に従って、プラークアッセイによって決定した、これらの同じ画分に存在するウイルスの力価と関連付けた。空のアルファウイルス粒子の力価を決定するために、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡおよびＤＨ−ＢＢ  ＣＤ３ｒｒｖのインビトロで転写されたＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞からのウイルス粒子を含むショ糖勾配画分に存在する放射活性レベルを定量化し、Ｔｏｔｏ１１０１を感染させた細胞からの[35Ｓ]メチオニン／ウイルス力価と関連付けた。欠失したロス川ウイルスキャプシドおよびシンドビスウイルス糖タンパク質を含み、ＳＩＮｒｅｐ／ＬａｃＺ  ＲＮＡおよびＤＨ−ＢＢ  ＣＤ３ｒｒｖのインビトロで転写されたＲＮＡでエレクトロポレーションした細胞で産生された、空のキメラウイルス粒子の力価は１×１０9粒子／ｍｌであった。
【０４４４】
本発明は、一般的に、および好ましい実施態様の両方に関して、上記で記載されたが、前出の説明に鑑みて、変更および改変が当業者に想到されることが理解される。従って、添付の請求の範囲は、本願発明の範囲内に入るそのようなすべての変更を含むことを意味する。
【０４４５】
さらに、本発明の背景を明らかにするために、および特に、詳細な説明および実施例で記載したような、その実施に関係するさらなる詳細を提供するために引用された刊行物および他の資料は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０４４６】
（配列表）
SEQUENCE LISTING 
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANTS: NOVARTIS VACCINES AND DIAGNOSTICS, INC.
Washington University
(ii) TITLE OF INVENTION: RECOMBINANT ALPHAVIRUS-BASED VECTORS
WITH REDUCED INHIBITION OF CELLULAR MACROMOLECULAR
SYNTHESIS
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 118
(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) ADDRESSEE: SEED and BERRY LLP
(B) STREET: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue
(C) CITY: Seattle
(D) STATE: Washington
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 98104-7092
(v) COMPUTER READABLE FORM:
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(B) COMPUTER: IBM PC compatible
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(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) CURRENT APPLICATION DATA:
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(B) FILING DATE: 06-OCT-1998
(C) CLASSIFICATION: 
(viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION:
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ACACATTAAT TAAGTATTGG CCCCAATGGG GTCT 34
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CCACAAGCTT CCGGGCGAGG CCGCC 25
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CCACAAGCTT CCGGAGTTAC CCGAGTGACC 30
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CCACCTTAAG CGTCGGCTTT TTCTTC 26
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CCACAAGCTT GGACCACCGT AGAG 24
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CCGCGTGGCG GATCCCCTG 19
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CCACGGATCC GGAAGGGACA GAAG 24
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TATATATATC TCGAGACCGC CAAGATGTTC CCGTTCCAGC CA 42
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TATATATATG CGGCCGCTCA ATTATGTTTC TGGTTGGT 38
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TATATAGATC TGGCGCGCCT TTACCACTCC TATCAGTGAT AG 42
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 base pairs
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TACGCCGTCA ATACGGTTCA CTAAACGAGC TCTGC 35
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 base pairs
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TAGTGAACCG TATTGACGGC GTAGTACACA CTATT 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:91:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
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CGTTGAGCAT AACCGAATCT AC 22
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 42 base pairs
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ATATAGAGCT CTTAATTAAT CTTTGTGAAG GAACCTTACT TC 42
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:93:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 base pairs
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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:93:
ATATAGAGCT CAGGCGTTGA AAAGATTAGC GACCG 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:94:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 46 base pairs
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TATATATTAA TTAAATAGAA TGACACCTAC TCAGACAATG CGATGC 46
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:95:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 40 base pairs
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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:95:
ATATACTCGA GTAGCAATGG TGAAACCAGT AACGTTATAC 40
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:96:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 45 base pairs
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(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:96:
GCCCTTTCTC TTCTTTTTTG GCTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAAC 45
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:97:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 39 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:97:
CCAAAAAAGA AGAGAAAGGG CGGTGGTGCT TTGTCTCCT 39
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:98:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 38 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:98:
ATATAGAGCT CTTAAACTGA TGATTTGATT TCAAATGC 38
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:99:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
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(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:99:
CGCGCCGAAT TGTGAGCGCT CACAATTCGG 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:100:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 7 amino acids
(B) TYPE: amino acid
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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:100:
Pro Lys Lys Lys Lys Arg Lys 
1 5 
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:101:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 8000 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:101:
ATTGACGGCG TAGTACACAC TATTGAATCA AACAGCCGAC CAATCGCACT ACCATCACAA 60
TGGAGAAGCC AGTAGTAAAC GTAGACGTAG ACCCCCAGAG TCCGTTTGTC GTGCAACTGA 120
AAAAAAGCTT CCCGCAATTT GAGGTAGTAG CACAGCAGGT CACTCCAAAT GACCATGCTA 180
ATGCCAGAGC ATTTTCGCAT CTGGCCAGTA AACTAATCGA GCTGGAGGTT CCTACCACAG 240
CGACGATCTT GGACATAGGC AGCGCACCGG CTCGTAGAAT GTTTTCCGAG CACCAGTATC 300
ATTGTGTCTG CCCCATGCGT AGTCCAGAAG ACCCGGACCG CATGATGAAA TACGCCAGTA 360
AACTGGCGGA AAAAGCGTGC AAGATTACAA ACAAGAACTT GCATGAGAAG ATTAAGGATC 420
TCCGGACCGT ACTTGATACG CCGGATGCTG AAACACCATC GCTCTGCTTT CACAACGATG 480
TTACCTGCAA CATGCGTGCC GAATATTCCG TCATGCAGGA CGTGTATATC AACGCTCCCG 540
GAACTATCTA TCATCAGGCT ATGAAAGGCG TGCGGACCCT GTACTGGATT GGCTTCGACA 600
CCACCCAGTT CATGTTCTCG GCTATGGCAG GTTCGTACCC TGCGTACAAC ACCAACTGGG 660
CCGACGAGAA AGTCCTTGAA GCGCGTAACA TCGGACTTTG CAGCACAAAG CTGAGTGAAG 720
GTAGGACAGG AAAATTGTCG ATAATGAGGA AGAAGGAGTT GAAGCCCGGG TCGCGGGTTT 780
ATTTCTCCGT AGGATCGACA CTTTATCCAG AACACAGAGC CAGCTTGCAG AGCTGGCATC 840
TTCCATCGGT GTTCCACTTG AATGGAAAGC AGTCGTACAC TTGCCGCTGT GATACAGTGG 900
TGAGTTGCGA AGGCTACGTA GTGAAGAAAA TCACCATCAG TCCCGGGATC ACGGGAGAAA 960
CCGTGGGATA CGCGGTTACA CACAATAGCG AGGGCTTCTT GCTATGCAAA GTTACTGACA 1020
CAGTAAAAGG AGAACGGGTA TCGTTCCCTG TGTGCACGTA CATCCCGGCC ACCATATGCG 1080
ATCAGATGAC TGGTATAATG GCCACGGATA TATCACCTGA CGATGCACAA AAACTTCTGG 1140
TTGGGCTCAA CCAGCGAATT GTCATTAACG GTAGGACTAA CAGGAACACC AACACCATGC 1200
AAAATTACCT TCTGCCGATC ATAGCACAAG GGTTCAGCAA ATGGGCTAAG GAGCGCAAGG 1260
ATGATCTTGA TAACGAGAAA ATGCTGGGTA CTAGAGAACG CAAGCTTACG TATGGCTGCT 1320
TGTGGGCGTT TCGCACTAAG AAAGTACATT CGTTTTATCG CCCACCTGGA ACGCAGACCT 1380
GCGTAAAAGT CCCAGCCTCT TTTAGCGCTT TTCCCATGTC GTCCGTATGG ACGACCTCTT 1440
TGCCCATGTC GCTGAGGCAG AAATTGAAAC TGGCATTGCA ACCAAAGAAG GAGGAAAAAC 1500
TGCTGCAGGT CTCGGAGGAA TTAGTCATGG AGGCCAAGGC TGCTTTTGAG GATGCTCAGG 1560
AGGAAGCCAG AGCGGAGAAG CTCCGAGAAG CACTTCCACC ATTAGTGGCA GACAAAGGCA 1620
TCGAGGCAGC CGCAGAAGTT GTCTGCGAAG TGGAGGGGCT CCAGGCGGAC ATCGGAGCAG 1680
CATTAGTTGA AACCCCGCGC GGTCACGTAA GGATAATACC TCAAGCAAAT GACCGTATGA 1740
TCGGACAGTA TATCGTTGTC TCGCCAAACT CTGTACTGAA GAATGCCAAA CTCGCACCAG 1800
CGCACCCGCT AGCAGATCAG GTTAAGATCA TAACACACTC CGGAAGATCA GGAAGGTACG 1860
CGGTCGAACC ATACGACGCT AAAGTACTGA TGCCAGCAGG AGGTGCCGTA CCATGGCCAG 1920
AATTCCTAGC ACTGAGTGAG AGCGCCACGT TAGTGTACAA CGAAAGAGAG CTTGTGAACC 1980
GCAAACTATA CCACATTGCC ATGCATGGCC CCGCCAAGAA TACAGAAGAG GAGCAGTACA 2040
AGGTTACAAA GGCAGAGCTT GCAGAAACAG AGTACGTGTT TGACGTGGAC AAGAAGCGTT 2100
GCGTTAAGAA GGAAGAAGCC TCAGGTCTGG TCCTCTCGGG AGAACTGACC AACCCTCCCT 2160
ATCATGAGCT AGCTCTGGAG GGACTGAAGA CCCGACCTGC GGTCCCGTAC AAGGTCGAAA 2220
CAATAGGAGT GATAGGCACA CCGGGGTCGG GCAAGTCAGC TATTATCAAG TCAACTGTCA 2280
CGGCACGAGA TCTTGTTACC AGCGGAAAGA AAGAAAATTG TCGCGAAATT GAGGCCGACG 2340
TGCTAAGACT GAGGGGTATG CAGATTACGT CGAAGACAGT AGATTCGGTT ATGCTCAACG 2400
GATGCCACAA AGCCGTAGAA GTGCTGTACG TTGACGAAGC GTTCGCGTGC CACGCAGGAG 2460
CACTACTTGC CTTGATTGCT ATCGTCAGGC CCCGCAAGAA GGTAGTACTA TGCGGAGACC 2520
CCATGCAATG CGGATTCTTC AACATGATGC AACTAAAGGT ACATTTCAAT CACCCTGAAA 2580
AAGACATATG CACCAAGACA TTCTACAAGT ATATCTCCCG GCGTTGCACA CAGCCAGTTA 2640
CAGCTATTGT ATCGACACTG CATTACGATG GAAAGATGAA AACCACGAAC CCGTGCAAGA 2700
AGAACATTGA AATCGATATT ACAGGGGCCA CAAAGCCGAA GCCAGGGGAT ATCATCCTGA 2760
CATGTTTCCG CGGGTGGGTT AAGCAATTGC AAATCGACTA TCCCGGACAT GAAGTAATGA 2820
CAGCCGCGGC CTCACAAGGG CTAACCAGAA AAGGAGTGTA TGCCGTCCGG CAAAAAGTCA 2880
ATGAAAACCC ACTGTACGCG ATCACATCAG AGCATGTGAA CGTGTTGCTC ACCCGCACTG 2940
AGGACAGGCT AGTGTGGAAA ACCTTGCAGG GCGACCCATG GATTAAGCAG CTCACTAACA 3000
TACCTAAAGG AAACTTTCAG GCTACTATAG AGGACTGGGA AGCTGAACAC AAGGGAATAA 3060
TTGCTGCAAT AAACAGCCCC ACTCCCCGTG CCAATCCGTT CAGCTGCAAG ACCAACGTTT 3120
GCTGGGCGAA AGCATTGGAA CCGATACTAG CCACGGCCGG TATCGTACTT ACCGGTTGCC 3180
AGTGGAGCGA ACTGTTCCCA CAGTTTGCGG ATGACAAACC ACATTCGGCC ATTTACGCCT 3240
TAGACGTAAT TTGCATTAAG TTTTTCGGCA TGGACTTGAC AAGCGGACTG TTTTCTAAAC 3300
AGAGCATCCC ACTAACGTAC CATCCCGCCG ATTCAGCGAG GCCGGTAGCT CATTGGGACA 3360
ACAGCCCAGG AACCCGCAAG TATGGGTACG ATCACGCCAT TGCCGCCGAA CTCTCCCGTA 3420
GATTTCCGGT GTTCCAGCTA GCTGGGAAGG GCACACAACT TGATTTGCAG ACGGGGAGAA 3480
CCAGAGTTAT CTCTGCACAG CATAACCTGG TCCCGGTGAA CCGCAATCTT CCTCACGCCT 3540
TAGTCCCCGA GTACAAGGAG AAGCAACCCG GCCCGGTCGA AAAATTCTTG AACCAGTTCA 3600
AACACCACTC AGTACTTGTG GTATCAGAGG AAAAAATTGA AGCTCCCCGT AAGAGAATCG 3660
AATGGATCGC CCCGATTGGC ATAGCCGGTG CAGATAAGAA CTACAACCTG GCTTTCGGGT 3720
TTCCGCCGCA GGCACGGTAC GACCTGGTGT TCATCAACAT TGGAACTAAA TACAGAAACC 3780
ACCACTTTCA GCAGTGCGAA GACCATGCGG CGACCTTAAA AACCCTTTCG CGTTCGGCCC 3840
TGAATTGCCT TAACTCAGGA GGCACTCTCG TGGTGAAGTC CTATGGCTAC GCCGACCGCA 3900
ACAGTGAGGA CGTAGTCACC GCTCTTGCCA GAAAGTTTGT CAGGGTGTCT GCAGCGAGAC 3960
CAGATTGTGT CTCAAGCAAT ACAGAAATGT ACCTGATTTT CCGACAACTA GACAACAGCC 4020
GTACACGGCA ATTCACCCCG CACCATCTGA ATTGCGTGAT TTCGTCCGTG TATGAGGGTA 4080
CAAGAGATGG AGTTGGAGCC GCGCCGTCAT ACCGCACCAA AAGGGAGAAT ATTGCTGACT 4140
GTCAAGAGGA AGCAGTTGTC AACGCAGCCA ATCCGCTGGG TAGACCAGGC GAAGGAGTCT 4200
GCCGTGCCAT CTATAAACGT TGGCCGACCA GTTTTACCGA TTCAGCCACG GAGACAGGCA 4260
CCGCAAGAAT GACTGTGTGC CTAGGAAAGA AAGTGATCCA CGCGGTCGGC CCTGATTTCC 4320
GGAAGCACCC AGAAGCAGTA GCCTTGAAAT TGCTACAAAA CGCCTACCAT GCAGTGGCAG 4380
ACTTAGTAAA TGAACATAAC ATCAAGTCTG TCGCCATTCC ACTGCTATCT ACAGGCATTT 4440
ACGCAGCCGG AAAAGACCGC CTTGAAGTAT CACTTAACTG CTTGACAACC GCGCTAGACA 4500
GAACTGACGC GGACGTAACC ATCTATTGCC TGGATAAGAA GTGGAAGGAA AGAATCGACG 4560
CGGCACTCCA ACTTAAGGAG TCTGTAACAG AGCTGAAGGA TGAAGATATG GAGATCGACG 4620
ATGAGTTAGT ATGGATCCAT CCAGACAGTT GCTTGAAGGG AAGAAAGGGA TTCAGTACTA 4680
CAAAAGGAAA ATTGTATTCG TACTTCGAAG GCACCAAATT CCATCAAGCA GCAAAAGACA 4740
TGGCGGAGAT AAAGGTCCTG TTCCCTAATG ACCAGGAAAG TAATGAACAA CTGTGTGCCT 4800
ACATATTGGG TGAGACCATG GAAGCAATCC GCGAAAAGTG CCCGGTCGAC CATAACCCGT 4860
CGTTTAGCCC GCCCAAAACG TTGCCGTGCC TTTGCATGTA TGCCATGACG CCAGAAAGGG 4920
TCCACAGACT TAGAAGCAAT AACGTCAAAG AAGTTACAGT ATGCTCCTCC ACCCCCCTTC 4980
CTAAGCACAA AATTAAGAAT GTTCAGAAGG TTCAGTGCAC GAAAGTAGTC CTGTTTAATC 5040
CGCACACTCC CGCATTCGTT CCCGCCCGTA AGTACATAGA AGTGCCAGAA CAGCCTACCG 5100
CTCCTCCTGC ACAGGCCGAG GAGGCCCCCG AAGTTGTAGC GACACCGTCA CCATCTACAG 5160
CTGATAACAC CTCGCTTGAT GTCACAGACA TCTCACTGGA TATGGATGAC AGTAGCGAAG 5220
GCTCACTTTT TTCGAGCTTT AGCGGATCGG ACAACTCTAT TACTAGTATG GACAGTTGGT 5280
CGTCAGGACC TAGTTCACTA GAGATAGTAG ACCGAAGGCA GGTGGTGGTG GCTGACGTTC 5340
ATGCCGTCCA AGAGCCTGCC CCTATTCCAC CGCCAAGGCT AAAGAAGATG GCCCGCCTGG 5400
CAGCGGCAAG AAAAGAGCCC ACTCCACCGG CAAGCAATAG CTCTGAGTCC CTCCACCTCT 5460
CTTTTGGTGG GGTATCCATG TCCCTCGGAT CAATTTTCGA CGGAGAGACG GCCCGCCAGG 5520
CAGCGGTACA ACCCCTGGCA ACAGGCCCCA CGGATGTGCC TATGTCTTTC GGATCGTTTT 5580
CCGACGGAGA GATTGATGAG CTGAGCCGCA GAGTAACTGA GTCCGAACCC GTCCTGTTTG 5640
GATCATTTGA ACCGGGCGAA GTGAACTCAA TTATATCGTC CCGATCAGCC GTATCTTTTC 5700
CTCTACGCAA GCAGAGACGT AGACGCAGGA GCAGGAGGAC TGAATACTGA CTAACCGGGG 5760
TAGGTGGGTA CATATTTTCG ACGGACACAG GCCCTGGGCA CTTGCAAAAG AAGTCCGTTC 5820
TGCAGAACCA GCTTACAGAA CCGACCTTGG AGCACAATGT CCTGGAAAGA ATTCATGCCC 5880
CGGTGCTCGA CACGTCGAAA GAGGAACAAC TCAAACTCAG GTACCAGATG ATGCCCACCG 5940
AAGCCAACAA AAGTAGGTAC CAGTCTCGTA AAGTAGAAAA TCAGAAAGCC ATAACCACTG 6000
AGCGACTACT GTCAGGACTA CGACTGTATA ACTCTGCCAC AGATCAGCCA GAATGCTATA 6060
AGATCACCTA TCCGAAACCA TTGTACTCCA GTAGCGTACC GGCGAACTAC TCCGATCCAC 6120
AGTTCGCTGT AGCTGTCTGT AACAACTATC TGCATGAGAA CTATCCGACA GTAGCATCTT 6180
ATCAGATTAC TGACGAGTAC GATGCTTACT TGGATATGGT AGACGGGACA GTCGCCTGCC 6240
TGGATACTGC AACCTTCTGC CCCGCTAAGC TTAGAAGTTA CCCGAAAAAA CATGAGTATA 6300
GAGCCCCGAA TATCCGCAGT GCGGTTCCAT CAGCGATGCA GAACACGCTA CAAAATGTGC 6360
TCATTGCCGC AACTAAAAGA AATTGCAACG TCACGCAGAT GCGTGAACTG CCAACACTGG 6420
ACTCAGCGAC ATTCAATGTC GAATGCTTTC GAAAATATGC ATGTAATGAC GAGTATTGGG 6480
AGGAGTTCGC TCGGAAGCCA ATTAGGATTA CCACTGAGTT TGTCACCGCA TATGTAGCTA 6540
GACTGAAAGG CCCTAAGGCC GCCGCACTAT TTGCAAAGAC GTATAATTTG GTCCCATTGC 6600
AAGAAGTGCC TATGGATAGA TTCGTCATGG ACATGAAAAG AGACGTGAAA GTTACACCAG 6660
GCACGAAACA CACAGAAGAA AGACCGAAAG TACAAGTGAT ACAAGCCGCA GAACCCCTGG 6720
CGACTGCTTA CTTATGCGGG ATTCACCGGG AATTAGTGCG TAGGCTTACG GCCGTCTTGC 6780
TTCCAAACAT TCACACGCTT TTTGACATGT CGGCGGAGGA TTTTGATGCA ATCATAGCAG 6840
AACACTTCAA GCAAGGCGAC CCGGTACTGG AGACGGATAT CGCATCATTC GACAAAAGCC 6900
AAGACGACGC TATGGCGTTA ACCGGTCTGA TGATCTTGGA GGACCTGGGT GTGGATCAAC 6960
CACTACTCGA CTTGATCGAG TGCGCCTTTG GAGAAATATC ATCCACCCAT CTACCTACGG 7020
GTACTCGTTT TAAATTCGGG GCGATGATGA AATCCGGAAT GTTCCTCACA CTTTTTGTCA 7080
ACACAGTTTT GAATGTCGTT ATCGCCAGCA GAGTACTAGA AGAGCGGCTT AAAACGTCCA 7140
GATGTGCAGC GTTCATTGGC GACGACAACA TCATACATGG AGTAGTATCT GACAAAGAAA 7200
TGGCTGAGAG GTGCGCCACC TGGCTCAACA TGGAGGTTAA GATCATCGAC GCAGTCATCG 7260
GTGAGAGACC ACCTTACTTC TGCGGCGGAT TTATCTTGCA AGATTCGGTT ACTTCCACAG 7320
CGTGCCGCGT GGCGGATCCC CTGAAAAGGC TGTTTAAGTT GGGTAAACCG CTCCCAGCCG 7380
ACGACGAGCA AGACGAAGAC AGAAGACGCG CTCTGCTAGA TGAAACAAAG GCGTGGTTTA 7440
GAGTAGGTAT AACAGGCACT TTAGCAGTGG CCGTGACGAC CCGGTATGAG GTAGACAATA 7500
TTACACCTGT CCTACTGGCA TTGAGAACTT TTGCCCAGAG CAAAAGAGCA TTCCAAGCCA 7560
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CTGACTAATA CTACAACACC ACCACCATGA ATAGAGGATT CTTTAACATG CTCGGCCGCC 7680
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TGCCTGCCCG CAACGGGCTG GCTTCTCAAA TCCAGCAACT GACCACAGCC GTCAGTGCCC 7800
TAGTCATTGG ACAGGCAACT AGACCTCAAC CCCCATGTCC ACGCCCGCCA CCGCGCCAGA 7860
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CCGACAGATT GTTCGACGTC 8000
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(A) LENGTH: 8000 base pairs
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AACTGGCGGA AAAAGCGTGC AAGATTACAA ACAAGAACTT GCATGAGAAG ATTAAGGATC 420
TCCGGACCGT ACTTGATACG CCGGATGCTG AAACACCATC GCTCTGCTTT CACAACGATG 480
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CAGTAAAAGG AGAACGGGTA TCGTTCCCTG TGTGCACGTA CATCCCGGCC ACCATATGCG 1080
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AAAATTACCT TCTGCCGATC ATAGCACAAG GGTTCAGCAA ATGGGCTAAG GAGCGCAAGG 1260
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TGTGGGCGTT TCGCACTAAG AAAGTACATT CGTTTTATCG CCCACCTGGA ACGCAGACCT 1380
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ACGCAGCCGG AAAAGACCGC CTTGAAGTAT CACTTAACTG CTTGACAACC GCGCTAGACA 4500
GAACTGACGC GGACGTAACC ATCTATTGCC TGGATAAGAA GTGGAAGGAA AGAATCGACG 4560
CGGCACTCCA ACTTAAGGAG TCTGTAACAG AGCTGAAGGA TGAAGATATG GAGATCGACG 4620
ATGAGTTAGT ATGGATCCAT CCAGACAGTT GCTTGAAGGG AAGAAAGGGA TTCAGTACTA 4680
CAAAAGGAAA ATTGTATTCG TACTTCGAAG GCACCAAATT CCATCAAGCA GCAAAAGACA 4740
TGGCGGAGAT AAAGGTCCTG TTCCCTAATG ACCAGGAAAG TAATGAACAA CTGTGTGCCT 4800
ACATATTGGG TGAGACCATG GAAGCAATCC GCGAAAAGTG CCCGGTCGAC CATAACCCGT 4860
CGTCTAGCCC GCCCAAAACG TTGCCGTGCC TTTGCATGTA TGCCATGACG CCAGAAAGGG 4920
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CTAAGCACAA AATTAAGAAT GTTCAGAAGG TTCAGTGCAC GAAAGTAGTC CTGTTTAATC 5040
CGCACACTCC CGCATTCGTT CCCGCCCGTA AGTACATAGA AGTGCCAGAA CAGCCTACCG 5100
CTCCTCCTGC ACAGGCCGAG GAGGCCCCCG AAGTTGTAGC GACACCGTCA CCATCTACAG 5160
CTGATAACAC CTCGCTTGAT GTCACAGACA TCTCACTGGA TATGGATGAC AGTAGCGAAG 5220
GCTCACTTTT TTCGAGCTTT AGCGGATCGG ACAACTCTAT TACTAGTATG GACAGTTGGT 5280
CGTCAGGACC TAGTTCACTA GAGATAGTAG ACCGAAGGCA GGTGGTGGTG GCTGACGTTC 5340
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CAGCGGCAAG AAAAGAGCCC ACTCCACCGG CAAGCAATAG CTCTGAGTCC CTCCACCTCT 5460
CTTTTGGTGG GGTATCCATG TCCCTCGGAT CAATTTTCGA CGGAGAGACG GCCCGCCAGG 5520
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CCGACGGAGA GATTGATGAG CTGAGCCGCA GAGTAACTGA GTCCGAACCC GTCCTGTTTG 5640
GATCATTTGA ACCGGGCGAA GTGAACTCAA TTATATCGTC CCGATCAGCC GTATCTTTTC 5700
CACTACGCAA GCAGAGACGT AGACGCAGGA GCAGGAGGAC TGAATACTGA CTAACCGGGG 5760
TAGGTGGGTA CATATTTTCG ACGGACACAG GCCCTGGGCA CTTGCAAAAG AAGTCCGTTC 5820
TGCAGAACCA GCTTACAGAA CCGACCTTGG AGCGCAATGT CCTGGAAAGA ATTCATGCCC 5880
CGGTGCTCGA CACGTCGAAA GAGGAACAAC TCAAACTCAG GTACCAGATG ATGCCCACCG 5940
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AGCGACTACT GTCAGGACTA CGACTGTATA ACTCTGCCAC AGATCAGCCA GAATGCTATA 6060
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AGTTCGCTGT AGCTGTCTGT AACAACTATC TGCATGAGAA CTATCCGACA GTAGCATCTT 6180
ATCAGATTAC TGACGAGTAC GATGCTTACT TGGATATGGT AGACGGGACA GTCGCCTGCC 6240
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GAGCCCCGAA TATCCGCAGT GCGGTTCCAT CAGCGATGCA GAACACGCTA CAAAATGTGC 6360
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ACGACGAGCA AGACGAAGAC AGAAGACGCG CTCTGCTAGA TGAAACAAAG GCGTGGTTTA 7440
GAGTAGGTAT AACAGGCACT TTAGCAGTGG CCGTGACGAC CCGGTATGAG GTAGACAATA 7500
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GAGGAGACAG CGGTCGTCCG ATCATGGATA ACTCCGGTCG GGTTGTCGCG ATAGTCCTCG 8340
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GCGAACCTTC CAGAGCCCTC GACATCCTTG AAGAGAACGT GAACCATGAG GCCTACGATA 8580
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AGCAGTGCGT CGCCTATAAG AGCGACCAAA CGAAGTGGGT CTTCAACTCA CCGGACTTGA 9360
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CGCTCAATTT GGAGATCACT GTCATGTCCT CGGAGGTTTT GCCTTCCACC AACCAAGAGT 10200
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85 
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ATATAGGATC CTTCGCATGA TTGAACAAGA TGGATTGC 38
【図１】
2013090630.tif 000031
【図２】
2013090630.tif 000032
【図３】
2013090630.tif 000033
【図４】
2013090630.tif 000034
【図５】
2013090630.tif 000035
【図８Ｆ】
2013090630.tif 000036
【図８Ｇ】
2013090630.tif 000037
【図８Ｈ】
2013090630.tif 000038
【図９Ａ】
2013090630.tif 000039
【図９Ｂ】
2013090630.tif 000040
【図１０】
2013090630.tif 000041
【図１１Ａ】
2013090630.tif 000042
【図１１Ｂ】
2013090630.tif 000043
【図１１Ｃ】
2013090630.tif 000044
【図１２Ａ】
2013090630.tif 000045
【図１２Ｂ】
2013090630.tif 000046
【図１３】
2013090630.tif 000047
【図１４】
2013090630.tif 000048
【図１５】
2013090630.tif 000049
【図１６】
2013090630.tif 000050
【図１７Ａ】
2013090630.tif 000051
【図１７Ｂ】
2013090630.tif 000052
【図１８】
2013090630.tif 000053
【図２１Ａ】
2013090630.tif 000054
【図２１Ｂ】
2013090630.tif 000055
【図２１Ｃ】
2013090630.tif 000056
【図２１Ｄ】
2013090630.tif 000057
【図２２】
2013090630.tif 000058
【図２４】
2013090630.tif 000059
【図２５】
2013090630.tif 000060
【図２６Ａ】
2013090630.tif 000061
【図２６Ｂ】
2013090630.tif 000062
【図２６Ｃ】
2013090630.tif 000063
【図２６Ｄ】
2013090630.tif 000064
【図２７】
2013090630.tif 000065
【図２８】
2013090630.tif 000066
【図２９】
2013090630.tif 000067
【図３０】
2013090630.tif 000068
【図３１】
2013090630.tif 000069
【図３２】
2013090630.tif 000070
【図３３Ａ】
2013090630.tif 000071
【図３３Ｂ】
2013090630.tif 000072
【図３３Ｃ】
2013090630.tif 000073
【図３３Ｄ】
2013090630.tif 000074
【図３５】
2013090630.tif 000075
【図３６】
2013090630.tif 000076
【図３７】
2013090630.tif 000077
【図３８】
2013090630.tif 000078
【図３９】
2013090630.tif 000079
【図６Ａ】
2013090630.tif 000080
【図６Ｂ】
2013090630.tif 000081
【図６Ｃ】
2013090630.tif 000082
【図６Ｄ】
2013090630.tif 000083
【図７Ａ】
2013090630.tif 000084
【図７Ｂ】
2013090630.tif 000085
【図７Ｃ】
2013090630.tif 000086
【図７Ｄ】
2013090630.tif 000087
【図８Ａ】
2013090630.tif 000088
【図８Ｂ】
2013090630.tif 000089
【図８Ｃ】
2013090630.tif 000090
【図８Ｄ】
2013090630.tif 000091
【図８Ｅ】
2013090630.tif 000092
【図１９】
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【図２０】
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【図２３】
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【図３４】
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