(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便且つ安価に、魚介類の免疫作用を賦活することができる魚介類の免疫賦活方法の提供。【解決手段】５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上であり、且つ遊離アミノ酸の含有量が１０質量％以上である酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させることを特徴とする、魚介類の免疫賦活方法及び、魚介類の飼育方法。【選択図】図１
2013066399.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上であり、且つ遊離アミノ酸の含有量が１０質量％以上である酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させることを特徴とする、魚介類の免疫賦活方法。
【請求項２】
前記５’−ヌクレオチド類がイノシン酸及びグアニル酸を含有する、請求項１に記載の魚介類の免疫賦活方法。
【請求項３】
β−グルカン及びマンナンの含有量が、それぞれ１質量％未満である請求項１又は２に記載の魚介類の免疫賦活方法。
【請求項４】
前記魚介類がコイ又はエビである請求項１〜３のいずれか一項に記載の魚介類の免疫賦活方法。
【請求項５】
前記酵母エキスが、トルラ酵母、ビール酵母及びパン酵母からなる群から選ばれる１種以上から得られた酵母エキスである請求項１〜４のいずれか一項に記載の魚介類の免疫賦活方法。
【請求項６】
５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上であり、且つ遊離アミノ酸の含有量が１０質量％以上である酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させることを特徴とする、魚介類の飼育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚介類の免疫賦活方法及び魚介類の飼育方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年では、多くの種類の魚介類が食用や観賞用として、人工的に飼育（養殖）されている。人工的な飼育においては通常、自然の河川や湖沼内で魚介類が生息している際よりも過密な状態で飼育が行わる。このような場合、生産効率の向上は達成されるが、一方で、細菌類やウィルスによる感染症が発生した場合、同一区域内で飼育されている魚介類において感染症が蔓延する率が高いという問題があった。
細菌類やウィルスの感染防止を目的として、近年では魚介類に対する抗生物質やワクチン等の薬剤も使用されている。しかしながら、未だワクチンの開発されていないウィルスが多いという問題や、薬剤耐性を獲得する細菌類やウィルスが発生するという問題、薬剤の価格による飼育コスト高騰の問題、さらには食用魚介類に薬剤を使用することによる安全面の問題等があり、さらなる解決策が求められていた。
【０００３】
そのため最近では、免疫賦活作用を有し、且つ自然由来の物質を魚介類に投与する方法が提案されている。免疫賦活作用を有する物質としては、β−グルカンが広く知られている。
たとえば引用文献１には、５‘−ヌクレオチド類、遊離アミノ酸、β−グルカン及びマンナンを含有する酵母エキス組成物が、子豚、子牛及び雛において摂餌促進作用を有し、マウス及びモルモットにおいて免疫増強作用を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−１８４５９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、魚介類の飼育において、ワクチンが開発されていないウィルスが多いという問題があるが、特に甲殻類においては有効なワクチンがほとんど開発されていないため、対策が急務となっている。例えば甲殻類に感染する代表的なウィルスとしては、Ｗｈｉｔｅ  Ｓｐｏｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）が挙げられる。ＷＳＳＶはエビ等の甲殻類において非常に感染性及び致死性の高いウィルスであって、垂直感染のみならず水平感染で伝播するため、該ウィルスが伝播した際の水産業におけるダメージは大きいものであった。
【０００６】
しかしながら、引用文献１に記載された免疫賦活用酵母エキス組成物は、魚介類に投与した際に、該魚介類が抗菌能や上述したようなウィルスに対して抗ウィルス能を獲得するか否か、即ち魚介類において免疫賦活能を有するか否かは明らかにされていない。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、簡便且つ安価に、魚介類の免疫作用を賦活することができる魚介類の免疫賦活方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、５’−ヌクレオチド類及び遊離アミノ酸を特定の割合で含有する酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させることにより、簡便且つ安価に、魚介類の免疫作用を賦活することができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有する魚介類の免疫賦活方法及び魚介類の飼育方法を提供するものである。
（１）５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上であり、且つ遊離アミノ酸の含有量が１０質量％以上である酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させることを特徴とする、魚介類の免疫賦活方法。
（２）前記５’−ヌクレオチド類がイノシン酸及びグアニル酸を含有する、（１）の魚介類の免疫賦活方法。
（３）β−グルカン及びマンナンの含有量が、それぞれ１質量％未満である（１）又は（２）の魚介類の免疫賦活方法。
（４）前記魚介類がコイ又はエビである（１）〜（３）のいずれかの魚介類の免疫賦活方法。
（５）前記酵母エキスが、トルラ酵母、ビール酵母及びパン酵母からなる群から選ばれる１種以上から得られた酵母エキスである（１）〜（４）のいずれかの魚介類の免疫賦活方法。
（６）５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上であり、且つ遊離アミノ酸の含有量が１０質量％以上である酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させることを特徴とする、魚介類の飼育方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の魚介類の免疫賦活方法及び魚介類の飼育方法によれば、５’−ヌクレオチド類及び遊離アミノ酸を特定の割合で含有する酵母エキスを投与するまたは該酵母エキス配合の飼料を摂餌させることにより、簡便且つ安価に、魚介類の免疫作用を賦活することが可能となる。そのため、本発明の免疫賦活方法を用いることにより、魚介類を細菌やウィルス等による感染症に耐えうるものとすることができるため、魚介類の工業的生産における生産効率向上が達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実験例１における、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏに感染したクルマエビの生存率を示すグラフ図である。
【図２】実験例１における、Ｗｈｉｔｅ  Ｓｐｏｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓに感染したクルマエビの生存率を示すグラフ図である。
【図３】実験例２における、コイのタイプＩインターフェロン遺伝子の頭腎組織における発現解析の結果を示すグラフ図である。
【図４】実験例２における、コイのインターフェロンγ１遺伝子の頭腎組織における発現解析の結果を示すグラフ図である。
【図５】実験例２における、コイのインターフェロンγ２遺伝子の頭腎組織における発現解析の結果を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において魚介類としては特に限定されるものではなく、魚類、甲殻類、貝類、頭足類等のいずれであってもよい。具体的には、コイ、アユ、マス、フナ、サケ等の淡水魚；ブリ、タイ、カンパチ、フグ、マグロ、アジ等の海水魚；クルマエビ、ウシエビ、イセエビ、タラバガニ、ロブスター等の甲殻類；カキ、ホタテ、アサリ、シジミ、ハマグリ、サザエ等の貝類；タコ、イカ等の頭足類が挙げられる。なかでも、本発明における魚介類としては、魚類又は甲殻類であることが好ましく、コイ又はエビであることがより好ましい。
本発明において免疫賦活とは、生体が本来有する免疫系を活性化し、免疫機能を高めることを意味する。
【００１２】
本発明の魚介類の免疫賦活方法は、５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上であり、且つ遊離アミノ酸の含有量が１０質量％以上である酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させるものである。このような効果が得られる理由は明らかではないが、従来の酵母エキスに比して比較的多い含有量の５’−ヌクレオチド類及び遊離アミノ酸を含むことで、これらが魚介類の免疫系に直接又は間接的に作用し、魚介類の免疫作用が賦活すると考えられる。
【００１３】
本発明において酵母エキスとは、酵母が有する様々な成分を抽出したものであり、アミノ酸やペプチド、核酸、ミネラル等が含まれている。また、酵母の種類や培養条件、抽出条件によって、各種成分の含有比を調整することができる。
【００１４】
本発明において用いられる酵母エキスの原料となる酵母は、特に限定されるものではなく、食品製造の分野において通常用いられている可食性の酵母を用いることができる。可食性の酵母由来の酵母エキスであれば、薬剤を投与した場合とは異なり、魚介類内の投与物の蓄積を懸念する必要がなく、好ましい。
このような酵母として具体的には、食料や飼料等の製造に用いられているトルラ酵母、パン製造に用いられているパン酵母、ビール製造に用いられているビール酵母等がある。
なかでも増殖性が良好であることから、パン酵母又はトルラ酵母であることが好ましく、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属菌又はキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属菌であることがより好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はキャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）であることが特に好ましい。
【００１５】
酵母エキスの原料としては、１種類の酵母を用いてもよく、複数種類の酵母を用いてもよい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエとキャンディダ・ユーティリスとをそれぞれ別個に培養及び集菌した後、得られた菌体を混合して混合菌体を成し、該混合菌体から抽出することにより得られた酵母エキスであってもよく；培養した各酵母を別個に抽出することにより得られた酵母エキスを混合することにより得られた酵母エキスであってもよい。なお、酵母の培養は、常法により行うことができる。
【００１６】
酵母エキスの抽出方法は特に限定されるものではなく、酵母等の生物原料からエキスを抽出する際に通常用いられる方法のうち、いずれの方法を用いてもよい。該抽出方法として、例えば、自己消化法、酵素分解法等がある。ここで、自己消化法とは、酵母が本来有している酵素の働きにより、酵母を可溶化し、抽出する方法であり、遊離アミノ酸含有量の多い酵母エキスを得ることができる。一方、酵素分解法とは、熱処理等により、酵母が有する酵素等を不活性化した後、分解酵素を添加して酵母を可溶化し、抽出する方法である。外部から適当な酵素を添加することにより、酵素反応を簡便に制御し得るため、遊離アミノ酸や核酸の含有量を調整することができる。
【００１７】
酵素分解法において用いられる酵素は、通常生体成分を分解する際に用いられる酵素であれば、特に限定されるものではなく、任意の酵素を用いることができる。該酵素として、例えば、酵母の細胞壁を分解し得る酵素、タンパク質分解酵素、核酸分解酵素等があり、これらを適宜併用することにより、酵母から各種成分を効率よく抽出することができる。
【００１８】
該タンパク質分解酵素として、エンド型プロテアーゼとエキソ型プロテアーゼを併用することがより好ましい。酵母エキス中の遊離アミノ酸含量を多くすることができるためである。また、該核酸分解酵素として、５’−ホスホジエステラーゼを用いることがより好ましい。核酸成分のうち、主な呈味成分である５’−リボヌクレオチド類の酵母エキス中の含量を多くすることができるためである。
【００１９】
本発明において用いられる酵母エキスの５’−ヌクレオチド類の含有量は、２０質量％以上であれば、特に限定されるものではないが、２０〜６０質量％であることが好ましい。作用機序は明らかではないが、酵母エキス中の５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上と比較的多いことにより、免疫賦活化がより良好となる。上限は特に限定されるものではないが、６０質量％以下であることが好ましい。
５’−ヌクレオチド類として具体的には、５’−リボヌクレオチド類が好ましく、該５’−リボヌクレオチド類として、例えば、５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、５’−アデニル酸、５’−ウリジル酸、５’−シチジル酸、及びこれらの金属塩等が挙げられる。
本発明において用いられる酵母エキスは、イノシン酸及びグアニル酸の合計量、すなわち、酵母エキス中に含まれている５’−イノシン酸、５’−グアニル酸、及び、これらの金属塩等の合計量が多い酵母エキスであることがより好ましい。特に、酵母エキス中のイノシン酸含有量とグアニル酸含有量の合算値（以下、ＩＧ核酸含量という。）が１質量％以上であることがより好ましく、５質量％以上であることがさらに好ましく、２０質量％以上であることが特に好ましい。上限は特に限定されるものではないが、４０質量％以下であることが好ましい。
【００２０】
本発明において用いられる酵母エキスの遊離アミノ酸含有量は、５質量％以上であれば、特に限定されるものではないが、１０質量％以上であることが好ましい。上限は特に限定されるものではないが、４０質量％以下であることが好ましい。
【００２１】
本発明において用いられる酵母エキスは、上述した５’−ヌクレオチド類、遊離アミノ酸以外の成分として、タンパク質、ペプチド、ミネラル、有機酸、ビタミン類等を含有していてもよいが、β−グルカンやマンナン等の酵母の細胞壁に由来する成分を含有しないことが好ましい。
β−グルカン及びマンナンを含有しない酵母エキスは、常法により製造することができる。例えば、自己消化法、酵素分解法等によって酵素消化及び抽出された酵母エキスを分画し、細胞壁に由来する不溶性画分を除去することより、β−グルカン及びマンナンを含有しない酵母エキスを得ることができる。
【００２２】
酵母エキスの形態は特に限定されるものではなく、後述する投与の形態や対象とする魚介類の種類等を考慮して、様々な形態の酵母エキスを用いることができる。例えば、粉末状、ペースト状、液体状のいずれであってもよい。
【００２３】
本発明において魚介類に酵母エキスを投与する方法は特に限定されるものではなく、例えば、ゾンデ、シリンジ等を用いて酵母エキス自体を魚介類の体内に直接注入する方法、魚介類の飼育された水中に酵母エキスを溶解又は分散し、魚介類に自発的に摂取させる方法、等が挙げられる。
また、魚介類に酵母エキス配合の飼料を摂餌させる方法において、飼料としては上述したような酵母エキスを含むものであれば特に限定されるものではなく、酵母エキスのみからなる飼料であってもよく、一般的な魚介類用飼料に酵母エキスを含有させた飼料を摂餌させるものであってもよい。魚介類飼料は、通常魚介類の飼育に使用される飼料を用いることができる。酵母エキスを魚介類用飼料に含有させて用いる場合、該酵母エキスは魚介類用飼料の製造段階で含有されていてもよく、製造された魚介類用飼料に振りかける、コーティングする等により含有や担持させてもよい。
【００２４】
なかでも、魚介類の酵母エキス摂取量を容易に調整でき、使用する酵母エキス量を低減することが可能であるため、酵母エキス配合の飼料を摂餌させる方法、又は酵母エキス自体を魚介類の体内に直接注入する方法を用いることが好ましく、簡便に投与が行えることから、酵母エキス配合の飼料を摂餌させる方法が特に好ましい。
【００２５】
酵母エキスを魚介類体内へ摂取させる量は、免疫賦活作用を奏し得る量であれば、特に限定されるものではなく、酵母エキスの種類や濃度、魚介類の種類等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、酵母エキス含有飼料を摂餌する場合であれば、魚介類体重１ｋｇに対して、１日あたりの酵母エキス投与量が５〜２０００ｍｇとなるように調整することが好ましく、１０〜１０００ｍｇであることがより好ましく、１０〜５００ｍｇであることがさらに好ましい。また、注入により投与する場合であれば、魚介類体重１ｋｇに対して、１回あたりの酵母エキス投与量が５〜２０００ｍｇとなるように調製することが好ましく、１０〜１０００ｍｇであることがより好ましく、１０〜８００ｍｇであることがさらに好ましい。
本発明では、有効成分と考えられる５’−ヌクレオチド類や遊離アミノ酸を上述したように比較的多く含有するため、該酵母エキスの魚介類における使用量を比較的少ないものとすることができ、酵母エキスにかかるコストの低減が可能であるため好ましい。
酵母エキスの投与、または酵母エキス含有飼料の摂餌は、１回でまとめて行ってもよく、複数回に分けて行ってもよい。１日に複数回行う場合は、該複数回の酵母エキス摂取量の合計が、上記１日あたりの酵母エキス摂取量の範囲内となることが好ましい。
【００２６】
本発明の魚介類の飼育方法は、５’−ヌクレオチド類の含有量が２０質量％以上であり、且つ遊離アミノ酸の含有量が１０質量％以上である酵母エキスを投与する、または該酵母エキス配合の飼料を摂餌させるものであって、上記魚介類の免疫賦活方法と同様に、魚介類の免疫を賦活化させることができる。
本発明の魚介類の飼育方法において、５’−ヌクレオチド類、遊離アミノ酸、それらの含有量、投与方法、摂餌する方法、摂取させる量は上記魚介類の免疫賦活方法と同様である。
投与以外の魚介類の飼育方法については特に限定されるものではなく、通常の方法により海水又は淡水内において魚介類を飼育することができる。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
なお、以下に示す本実施例においては、酵母エキスとして「バーテックスＩＧ２０」（商品名、テーブルマーク社製）、及び「ＣＷ−Ｉ」（商品名、テーブルマーク社製）を用いた。これらはいずれもパン酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ由来の酵母エキスである。これらの酵母エキスに含有されている遊離アミノ酸量、全アミノ酸量、及び核酸量を表１に示す。なお、核酸量は、５’−イノシン酸ナトリウムと５’−グアニル酸ナトリウムの合計量（７水和物として計算）を酵母エキス中の含有比（質量％）で示している。
表１から明らかなように、ＩＧ２０は遊離アミノ酸含有量とＩＧ含有量とが共に高い酵母エキスである。また、ＣＷ−Ｉは遊離アミノ酸及びＩＧを含有するがその濃度は高くなく、その一方で細胞壁由来の不溶性成分であるβ−グルカンを含有する酵母エキスである。
【００２８】
【表１】
2013066399.tif 000003
【００２９】
［実験例１］
酵母エキスを含む飼料を摂餌させたクルマエビの、細菌及びウィルスに対する生存率について検討した。
まず、平均体重約１０ｇのクルマエビ（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）を、２０℃の人工海水で満たした６０ｃｍ水槽内で飼育した。上記酵母エキス  バーテックスＩＧ２０又はＣＷ−Ｉを、０．１質量％又は０．５質量％含有する混合試料を１日あたり０．５ｇ、計７日間摂餌させ、その後細菌又はウィルスに人工的に感染させ、感染試験後の生存率を調べた。対照区（コントロール群）には酵母エキスを含まない混合試料を摂餌させた。
【００３０】
具体的には、細菌感染群では、摂餌期間終了から２４時間後にＶｉｂｒｉｏ  ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏを、直接腹腔内に１００μＬ（１×１０６ｃｆｕ／個体）注射した。Ｖ．ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏは、ウォーターバスを用いて２７℃で１４時間培養し、上記濃度に調製した。
また、ウィルス感染群では、まず、Ｗｈｉｔｅ  Ｓｐｏｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ（ＷＳＳＶ）に感染したクルマエビから組織（エラ、肝膵臓、心臓、リンパ様器官）を摘出し、ＰＢＳ内でホモジナイズし、ＰＢＳで１／１０００に希釈したホモジナイズ液を調整した。海水４Ｌを入れたタンク中に、該ホモジナイズ液を５０ｍＬ添加した。上記摂餌期間終了から２４時間経過後のクルマエビを、該タンク内に２時間浸漬し、２時間後、元の水槽に戻した。
Ｖ．ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏに感染させたクルマエビの生存試験の結果を図１に、ＷＳＳＶに感染させたクルマエビの生存試験の結果を図２に示す。なお、ＷＳＳＶ感染実験は、バーテックスＩＧ２０摂餌群及びコントロール群では１３日間経過観察を行い、ＣＷ−Ｉ摂餌群のみ１０日間経過観察を行った。
【００３１】
図１の結果から、Ｖ．ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ感染後１１日目において、バーテックスＩＧ２０摂餌群は生存率が６５％であったのに対し、ＣＷ−Ｉ摂餌群の生存率は４０％、コントロール群の生存率は１３％と顕著に低いことが明らかである
また、図２の結果から、ＷＳＳＶ感染後１３日目において、バーテックスＩＧ２０  ０．１質量％又は０．５質量％摂餌群は生存率がそれぞれ７１％、５９％であった。また、ＣＷ−Ｉ  ０．１質量％摂餌群の１０日目の生存率は４２％であり、コントロール群の１３日目の生存率は１２％であって、バーテックスＩＧ２０摂餌群に比べて生存率が顕著に低いことが明らかである。
上記の結果から、バーテックスＩＧ２０を摂餌させたクルマエビでは、ウィルス及び細菌に感染した場合の生存率が向上し、バーテックスＩＧ２０が免疫賦活効果を奏することが確認できた。
【００３２】
［実験例２］
酵母エキスを接種したコイにおける、免疫関連遺伝子の発現量の変化について検討した。
まず、平均体重約１００ｇのコイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  Ｌ．）を、２０℃の人工海水で満たした水槽内で飼育し、試験開始前に予備飼育を１日間行った。接種量０．１ｃｃが酵母エキス５０ｍｇ／体重１ｋｇとなるように上記酵母エキス  バーテックスＩＧ２０をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０）で調整し、経口ゾンデを用いて０．１ｃｃを１日１回、計３日間経口投与した。対照区（コントロール群）には０．１ｃｃのＰＢＳを同様に経口投与した。
これらのコイを投与期間終了１日後、３日後、５日後に回収し、以下の様に免疫関連遺伝子の発現量について調べた。
【００３３】
明らかになっているコイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ  Ｌ．）のｃＤＮＡ塩基配列より、タイプＩ  ＩＦＮ、ＩＦＮ-γ１、ＩＦＮ-γ２遺伝子に対して、プライマーを作製し、ＰＣＲに用いるＹｏｉｃｈｉ Ｋｉｔａｏらの手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４６（２００９）２５４８−２５５６）を用いた。まず、コイの頭腎組織（約２０μｇ）を用い、常法に従ってＲＮＡの抽出を行い、このＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応をサーマルサイクラーＣ１０００（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて行い、コイ頭腎組織内のｃＤＮＡを合成した。さらに、β−アクチン及びタイプＩ  ＩＦＮ、ＩＦＮ-γ１、ＩＦＮ-γ２遺伝子をそれぞれプライマーを用いてＰＣＲを、サーマルサイクラーＣ１０００（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＵＳＡ）にて行った。ＰＣＲ終了後、１．５％アガロースゲルにて電気泳動を行った後、デジタル撮影によりバンドをＴＩＦＦ画像ファイルとして保存した。保存したファイルを、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ  ９９  Ｉｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（富士フィルム社製）を用い定量化し、バンドの密度からＰＣＲ産物の増幅率を求めた。これをもとに、β−アクチン遺伝子に対する各遺伝子の発現率を求め、グラフを作成した。図３にタイプＩ  ＩＦＮ遺伝子、図４にインターフェロンγ１遺伝子、図５にインターフェロンγ２遺伝子の発現解析の結果を示す。図３〜５中のコントロールは、ＰＢＳ経口投与終了１日後の結果である。
なお、タイプＩ  ＩＦＮは、主にウィルス感染細胞によって産生されることが知られており、抗ウィルス作用に関与すると考えられるサイトカインである。一方、インターフェロンγ１／２は、主にマクロファージを活性化する作用を有することが知られており、細胞性免疫応答において重要な役割を担うと考えられるサイトカインである。
【００３４】
上記発現解析の結果、バーテックスＩＧ２０を投与したコイ頭腎組織でのタイプＩ  ＩＦＮ遺伝子は投与期間終了後１日目と３日目において１％水準で有意な発現の増加を示した（図３）。インターフェロンγ１とγ２はともに投与期間後３日目において１％水準で有意な発現量の増加を示した（図４，５）。上記の結果から、バーテックスＩＧ２０を投与したコイでは、免疫関連遺伝子の発現量が変化し、バーテックスＩＧ２０が免疫賦活効果を有することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の魚介類の免疫賦活方法は、水産業において好適に利用可能である。
【図１】
2013066399.tif 000004
【図２】
2013066399.tif 000005
【図３】
2013066399.tif 000006
【図４】
2013066399.tif 000007
【図５】
2013066399.tif 000008