(57)【要約】【課題】KIF5B遺伝子とRET遺伝子との間の転座を検出する方法を提供することを課題とする。【解決手段】KIF5B遺伝子とRET遺伝子との間の転座の有無を反映した蛍光パターンを生成するように設計したプローブセットを用いて蛍光in situハイブリダイゼーションアッセイを行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）アッセイを行うことを特徴とする、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座を検出する方法：
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。
【請求項２】
前記第１染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第２染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第３染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第４染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プローブ１Ａの長さが100kb〜500kbであり、前記プローブ１Ｂの長さが300kb〜800kbであり、前記プローブ２Ａの長さが300kb〜800kbであり、前記プローブ２Ｂの長さが400kb〜900kbであり、前記プローブ４Ａの長さが800kb〜1,500kbであり、前記プローブ４Ｂの長さが900kb〜1,700kbである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブ１Ａ、前記プローブ１Ｂ、前記プローブ２Ａ、前記プローブ２Ｂ及び前記プローブ４Ａの少なくとも一つが、同一の蛍光物質で標識された複数のDNA断片から構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
以下の(i)〜(iv)のステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
(i)染色体サンプルに、前記(1)〜(4)のいずれかのプローブセットを接触させるステップ；
(ii)染色体サンプルを洗浄し、標的に対して特異的にハイブリダイズしていないプローブを除去するステップ；
(iii)蛍光シグナルを検出するステップ；
(iv)蛍光シグナルのパターンに基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定するステップ。
【請求項６】
ステップ(i)において前記(1)のプローブセット又は前記(3)のプローブセットを用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記(1)〜(4)の中から二以上のプローブセットを選択し、選択した各プローブセットを用いて個別に前記ステップ(i)〜(iii)を行い、
前記ステップ(iv)では、各プローブセットについて取得された蛍光シグナルのパターンを総合してKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記(1)のプローブセット及び前記(3)のプローブセットが選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ(i)で使用する前記染色体サンプルを調製するステップを更に含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記染色体サンプルが肺癌患者由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記染色体サンプルが非小細胞肺癌患者由来である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌を罹患していると決定するステップを含む、非小細胞肺癌を検出する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をRETキナーゼ阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
【請求項１４】
RETキナーゼ阻害剤が、スニチニブ、ソラフェニブ又はバンデタニブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
RETキナーゼ阻害剤が、RETの発現をノックダウンする化合物からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
RETの発現をノックダウンする化合物が、抗体、小分子、ペプチド及びアプタマーからなる群より選択される一以上の化合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をRETキナーゼ阻害剤に加えてEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
【請求項１９】
EGFR阻害剤がゲフィチニブ、エルロチニブ、ラバチニブ、TAK-285、EKB-569又はバンデタニブであり、ALK阻害剤がクリゾチニブ又はCEP-28122である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座がないと判定された場合であって、前記染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌の患者であるときに、該対象には肺癌特異的な他の遺伝子異常が存在すると判定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法によって決定された治療方針に従って対象を処置するステップを含む、治療方法。
【請求項２２】
前記処置に加えて、放射線処置及び／又は外科的処置を行うステップを含む、請求項２１に記載の治療方法。
【請求項２３】
以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットを含む、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座を検出するためのキット：
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。
【請求項２４】
プローブの使用についての説明書、DNA対比染色剤、ハイブリダイゼーション用バッファー、封入剤、コントロールスライドからなる群より選択される一以上の要素を更に含む、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１０番染色体上の転座を検出する蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）アッセイに関する。詳しくは、KIF5B遺伝子及びRET遺伝子の転座を検出するFISHアッセイ及びその用途等に関する。本発明は例えば非小細胞肺癌の検出に有用であり、非小細胞肺癌の診断、治療などに有益な情報を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在までに、癌化関連遺伝子がいくつか知られている。特にチロシンキナーゼ遺伝子は細胞の増殖を直接制御する重要な酵素をコードしており、アミノ酸配列や欠失などによる自己リン酸化の亢進として検出されるキナーゼ活性の自発活性化により細胞を癌化に導くことが知られている。例えば、甲状腺乳頭癌ではPTC（おもに１〜３）とRETチロシンキナーゼとの融合遺伝子が２０〜６０％の頻度で認められ、PTC／RETによる腫瘍細胞の増殖にはRETキナーゼの活性化が重要である事が示されている（非特許文献１、２、３）。
【０００３】
近年、非小細胞肺癌に存在する新規な異常キナーゼの存在がつぎつぎと報告されている。従来、固形癌（特に肺癌）では遺伝子転座は殆どないと思われていたが、ALK遺伝子と棘皮動物微小管結合タンパク質様４（EML4）の融合が、日本人の非小細胞肺癌（NSCLC）のサブセットで検出された（非特許文献４）。EML4-ALK融合遺伝子の頻度は日本人の非小細胞肺癌では６％程度である。男女ともに非喫煙者に多いものの、現喫煙者からも検出されている。また、腺癌患者に多いものの、扁平上皮癌患者からも検出されている。EML4-ALK融合遺伝子を生成する遺伝子転座の検索方法としてFISHが採用されている（特許文献１）。
【０００４】
ALK遺伝子はKIF5B遺伝子(10p11.22)とも融合することが報告されている(KIF5B-ALK)（非特許文献５）。KIF（kinesin family member）は微小管依存性の神経の軸索輸送に関与する。KIF5A、KIF5B及びKIF5CはGRIP1（グルタミン酸受容体仲介蛋白１）を介して、重鎖がAMPA型グルタミン酸受容体を含む膜小胞を微小管のプラス端方向に輸送している。ヒトKIF5B遺伝子の情報は公共のデータベースに登録されている（EntrezGene ID: 3799、SWISS-PROT ID:P33176）。
【０００５】
２０１１年に韓国のYoung Seok JuらのグループはKIF5B遺伝子とRET遺伝子との間の転座によってKIF5B遺伝子の一部（5'側末端）とRET遺伝子の一部（RETキナーゼ活性を有する3'側末端側）が融合することを報告した（非特許文献６）。この論文では、KIF5B遺伝子とALK遺伝子との間の転座と同様に、KIF5B-RET融合遺伝子について若年、非喫煙者の腺癌患者から三つのバリアントが同定されている。
【０００６】
RET遺伝子はrearranged during transfectionから命名され、二つのヒトDNA配列が組み換えられた遺伝子（NIH-3T3（NIH Swissマウスの胎児の線維芽細胞から分離した培養細胞）へのトランスフェクションの過程で生じたと考えられている）として単離された。末梢神経系に発現しているRET遺伝子（10q.11.21）は受容体型チロシンキナーゼであるc-Ret受容体をコードしている。多発性内分泌腺腫症(MEN)家系ではRET遺伝子の変異を認める（非特許文献７）しかし、肺癌におけるRET遺伝子の点変異の報告はなされていない。
【０００７】
甲状腺癌において、オンコジェニックなRETの転座を有する細胞株は、in vivo及びin vitroにおいて、RETの阻害剤(sunitinib、vandetanib、sorafenib)に対して感受性を示す（非特許文献８、９、１０、１１）。これらRET阻害剤は既に腎臓がん、甲状腺がんなどで保険適応がなされており、ヒトに対して使用可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１１−５１１９４９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「キャンサーリサーチ(Cancer Research)」（米国）、１９９７年、５７巻、ｐ１６９０−１６９４。
【非特許文献２】「サイロイド(Thyroid)」（米国）、１９９８年、８巻、ｐ４８５−４８９。
【非特許文献３】「ジャーナルオブクリカルエンドクリノロジーアンドメタボリズム(The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism)」（米国）、２０００年、８５巻、ｐ１１７０−１１７５。
【非特許文献４】「ナイチャー(Nature)」（米国）、２００７年、４４８巻、ｐ５６１−５６６。
【非特許文献５】「クリニカルキャンサーリサーチ(Clinical Cancer Research)」（米国）、２００９年、１５巻、ｐ３１４３−３１４９。
【非特許文献６】「ジェノムリサーチ(Genome Research)」（米国）、２０１１年、オンラインで公開 ２０１１年１２月２２日
【非特許文献７】「ジャーナルオブセルフィジオロジー(J Cell Physiol)」、２００３年、１９５巻、ｐ１６８−１８６。
【非特許文献８】「クリニカルキャンサーリサーチ(Clinical Cancer Research)」（米国）、２００８年、１４巻、ｐ４９０８−４９１４。
【非特許文献９】「ジャーナルオブナショナルキャンサーインスト(J Natl Cancer Inst)」２００６年、９８巻、ｐ３２６−３３４。
【非特許文献１０】「ジャーナルオブクリカルエンドクリノロジーアンドメタボリズム(The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism)」（米国）、２００６年、９１巻、ｐ４０７０−４０７６。
【非特許文献１１】「アンチキャンサードラッグ(Anti Cancer Drug)」（米国）、２００８年、１９巻、ｐ５４７−５５２。
【非特許文献１２】「ジャーナルオブコロモソーマ(J Chromosoma)」（米国）、２０００年、１０９巻、ｐ３８１−３８９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上の背景の下で本発明は、癌の新たな原因遺伝子であるKIF5B-RET融合遺伝子を治療戦略に利用ないし活用せんとするものであり、KIF5B遺伝子とRET遺伝子との間の転座を検出する方法及びその用途、当該検出法に利用可能なキット等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、非小細胞肺癌患者（日本人サンプル）から得た試料より、染色体転座によって産生される、KIF5B遺伝子の5'側の一部とRET遺伝子の3'側の一部とが融合したKIF5B-RET融合遺伝子を単離することに成功した（図９）。また、複数の検体から、韓国のグループ（非特許文献６）も報告しているバリアント1つと、類似のバリアント１つについて、そのcDNAを単離することにも成功した。一方、検討を進めた結果、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座（以下、説明の便宜上、「KIF5B-RET転座」と称する）が乳癌や大腸癌或いは甲状腺癌には認められず、肺癌に特異的なことが明らかとなった。更には、EGFR遺伝子やEML4-ALK融合遺伝子などの既知の癌遺伝子とは排他的にKIF5B-RET融合遺伝子が存在していることが判明した。即ち、KIF5B-RET融合遺伝子が癌の原因遺伝子であり、非小細胞肺癌の腫瘍形成能を示すことが示唆された。これらの事実は、KIF5B-RET転座を検出することが肺癌（特に非小細胞肺癌）の治療戦略上、極めて重要であることを意味する。
【００１２】
以上の知見を得た後、本発明者は更に検討を重ね、独自の蛍光プローブを用いたKIF5B-RET転座の検出法を考案し、その有用性を検証した。その結果、当該方法がKIF5B-RET転座の検出に極めて有効であることが確認された。
【００１３】
以下に示す本発明は、主として上記の成果ないし知見に基づく。
［１］以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）アッセイを行うことを特徴とする、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座を検出する方法：
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。
［２］前記第１染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第２染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第３染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbであり、前記第４染色体部位の長さが0.5 Mb〜2.0 Mbである、［１］に記載の方法。
［３］前記プローブ１Ａの長さが100kb〜500kbであり、前記プローブ１Ｂの長さが300kb〜800kbであり、前記プローブ２Ａの長さが300kb〜800kbであり、前記プローブ２Ｂの長さが400kb〜900kbであり、前記プローブ４Ａの長さが800kb〜1,500kbであり、前記プローブ４Ｂの長さが900kb〜1,700kbである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記プローブ１Ａ、前記プローブ１Ｂ、前記プローブ２Ａ、前記プローブ２Ｂ及び前記プローブ４Ａの少なくとも一つが、同一の蛍光物質で標識された複数のDNA断片から構成される、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］以下の(i)〜(iv)のステップを含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法：
(i)染色体サンプルに、前記(1)〜(4)のいずれかのプローブセットを接触させるステップ；
(ii)染色体サンプルを洗浄し、標的に対して特異的にハイブリダイズしていないプローブを除去するステップ；
(iii)蛍光シグナルを検出するステップ；
(iv)蛍光シグナルのパターンに基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定するステップ。
［６］ステップ(i)において前記(1)のプローブセット又は前記(3)のプローブセットを用いる、［５］に記載の方法。
［７］前記(1)〜(4)の中から二以上のプローブセットを選択し、選択した各プローブセットを用いて個別に前記ステップ(i)〜(iii)を行い、
前記ステップ(iv)では、各プローブセットについて取得された蛍光シグナルのパターンを総合してKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する、［５］に記載の方法。
［８］前記(1)のプローブセット及び前記(3)のプローブセットが選択される、［７］に記載の方法。
［９］ステップ(i)で使用する前記染色体サンプルを調製するステップを更に含む、［５］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］前記染色体サンプルが肺癌患者由来である、［９］に記載の方法。
［１１］前記染色体サンプルが非小細胞肺癌患者由来である、［９］に記載の方法。
［１２］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌を罹患していると決定するステップを含む、非小細胞肺癌を検出する方法。
［１３］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をRETキナーゼ阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［１４］RETキナーゼ阻害剤が、スニチニブ、ソラフェニブ又はバンデタニブである、［１３］に記載の方法。
［１５］RETキナーゼ阻害剤が、RETの発現をノックダウンする化合物からなる、［１３］に記載の方法。
［１６］RETの発現をノックダウンする化合物が、抗体、小分子、ペプチド及びアプタマーからなる群より選択される一以上の化合物である、［１５］に記載の方法。
［１７］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［１８］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、前記染色体サンプルが由来する対象をRETキナーゼ阻害剤に加えてEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［１９］EGFR阻害剤がゲフィチニブ、エルロチニブ、ラバチニブ、TAK-285、EKB-569又はバンデタニブであり、ALK阻害剤がクリゾチニブ又はCEP-28122である、［１７］又は［１８］に記載の方法。
［２０］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座がないと判定された場合であって、前記染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌の患者であるときに、該対象には肺癌特異的な他の遺伝子異常が存在すると判定するステップを含む、治療方針を決定する方法。
［２１］［１３］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法によって決定された治療方針に従って対象を処置するステップを含む、治療方法。
［２２］前記処置に加えて、放射線処置及び／又は外科的処置を行うステップを含む、［２１］に記載の治療方法。
［２３］以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットを含む、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座を検出するためのキット：
(1)RET遺伝子を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的とした第１プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなり、
プローブ１Ａは、前記第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ１Ｂは、前記第１染色他部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第１プローブセット；
(2)KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的とした第２プローブセットであって、
第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなり、
プローブ２Ａは、前記第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的であり、
プローブ２Ｂは、前記第２染色体部位内の3'側領域であって、前記第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であり、
KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点が、前記第１領域の3'末端部、前記第１領域と前記第２領域の間、又は前記第２領域の5'末端部に位置する、第２プローブセット；
(3)前記プローブ２Ａと前記プローブ１Ｂとからなる第３プローブセット；
(4)RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる第４プローブセット。
［２４］プローブの使用についての説明書、DNA対比染色剤、ハイブリダイゼーション用バッファー、封入剤、コントロールスライドからなる群より選択される一以上の要素を更に含む、［２３］に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第１プローブセット（RET Split Dual Color FISH Probe）の一例（第１プローブセットａ）の構成を模式的に示した図。当該プローブセットは、TexRed標識プローブ１Ａ（約200kb）とFITC標識プローブ１Ｂ（約630kb）からなる。この例の第１プローブセットの詳細は図５に示す。
【図２】第２プローブセット（KIF5B Split Dual Color FISH Probe）の構成を模式的に示した図。当該プローブセットは、TexRed標識プローブ２Ａ（約620kb）とFITC標識プローブ２Ｂ（約750kb）からなる。第２プローブセットの詳細は図６に示す。
【図３】第３プローブセット（KIF5B/RET, SY Translocation Dual Color FISH Probe）の構成を模式的に示した図。当該プローブセットは、TexRed標識プローブ２Ａ（約620kb）とFITC標識プローブ１Ｂ（約630kb）からなる。
【図４】第４プローブセット（KIF5B/RET, DY Translocation Dual Color FISH Probe）の構成を模式的に示した図。当該プローブセットは、TexRed標識プローブ４Ａ（約1,180kb）とFITC標識プローブ４Ｂ（約1,370kb）からなる。
【図５】第１プローブセットａを構成するTexRed標識プローブ１Ａ（約200kb）とFITC標識プローブ１Ｂ（約630kb）の詳細。FITC標識プローブ１Ｂとして、５種類のDNA断片が併用される。
【図６】第２プローブセットを構成するTexRed標識プローブ２Ａ（約620kb）とFITC標識プローブ２Ｂ（約750kb）の詳細。TexRed標識プローブ２Ａとして、４種類のDNA断片が併用される。また、FITC標識プローブ２Ｂとして、５種類のDNA断片が併用される。
【図７】非小細胞肺癌患者由来の検体を用いたFISH解析の結果。第１プローブセットａ（約200kbのTexRed標識プローブ１Ａと約630kbのFITC標識プローブ１Ｂ）を使用した。KIF5B-RET転座を示す蛍光パターン（鮮明な赤色のドットと緑色のドットが離れた状態で観察される）を認める（丸囲い）。
【図８】非小細胞肺癌患者由来の検体を用いたFISH解析の結果。第３プローブセットを使用した。KIF5B-RET転座を示す蛍光パターン（赤色のドットと緑色のドットが併合することによる黄色のドットが観察される）を認める（丸囲い）。
【図９】バリアント１タイプのKIF5B-RET融合遺伝子の構造を示す図。
【図１０】新規バリアントの転座を示す図。
【図１１】第１プローブセット（RET Split Dual Color FISH Probe）の一例（第１プローブセットｂ）の構成を模式的に示した図。当該プローブセットは、TexRed標識プローブ１Ａ（約490kb）とFITC標識プローブ１Ｂ（約630kb）からなる。この例の第１プローブセットの詳細は図１２に示す。
【図１２】第１プローブセットｂを構成するTexRed標識プローブ１Ａ（約490kb）とFITC標識プローブ１Ｂ（約630kb）の詳細。TexRed標識プローブ１Ａとして、３種類のDNA断片が併用される。FITC標識プローブ１Ｂとして、５種類のDNA断片が併用される。
【図１３】非小細胞肺癌患者由来の検体を用いたFISH解析の結果。第１プローブセットｂ（約490kbのTexRed標識プローブ１Ａと約630kbのFITC標識プローブ１Ｂ）を使用した。KIF5B-RET転座を示す蛍光パターン（鮮明な赤色のドットと緑色のドットが離れた状態で観察される）を認める。第１プローブセットａを使用した場合（図７）よりも、鮮明なスプリットシグナルが得られている。
【図１４】免疫組織化学的解析の結果。Epitomics社anti-RET rabbit monoclonal antibody, 3454抗体を1：250の希釈率で用いた。染まり方をG1(顆粒状)、G2(び慢性)に分類し、G2且つ染色範囲が50％以上であればRETの転座がある可能性が高いとした（相関が有ると思われる）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．KIF5B-RET転座の検出方法
本発明の第１の局面はKIF5B-RET転座を検出する方法に関する。本発明の方法では、特定のプローブセットを用いたFISHアッセイを行う。プローブセットとして、以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一以上のプローブセットが用いられる。尚、本明細書で言及する染色体上の位置や配列等はヒトゲノム国際プロジェクトBuild37の結果に基づいている。
(1)第１プローブセット
RET遺伝子（43572475〜43625799:build37）を含む染色体部位（第１染色体部位）を標的としたプローブセットである。第１蛍光物質で標識されたプローブ１Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ１Ｂとからなる。プローブ１Ａは、第１染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的である。プローブ１Ｂは、第１染色他部位内の3'側領域であって、第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的である。KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのRET遺伝子における切断点は、第１領域の3'末端部、第１領域と第２領域の間、又は第２領域の5'末端部に位置する。RET遺伝子における切断点は、通常、１０番染色体のプラス鎖43611118番塩基周辺と推測されている。
【００１６】
第１染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましく1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第１染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置42,500,000と43,500,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置44,000,000と45,000,000の間とする。
【００１７】
プローブ１Ａの長さは、例えば100kb〜500kb、好ましくは200kb〜490kbである。プローブ１Ａの具体例の一つは、BACクローンGSP1506F09（このクローンの他、以下で言及するBACクローンの具体例はいずれも株式会社GPS研究所から入手することができる）のインサート（１０番染色体の塩基位置43020444〜43224507に対応する配列からなる）を蛍光標識したものである。当該インサートは約200kbの長さである。一方、プローブ１Ａの他の具体例は、BACクローンGSP1506F09のインサート（１０番染色体の塩基位置43020444〜43224507に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、GSP3023D06のインサート（１０番染色体の塩基位置43276632〜43432432に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、GSP3012B07のインサート（１０番染色体の塩基位置43342754〜43512026に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。当該インサートは約490kbの長さである。
【００１８】
プローブ１Ｂの長さは、例えば300kb〜800kb、好ましくは500kb〜700kbである。プローブ１Ｂの具体例は、BACクローンGSP1877H08のインサート（１０番染色体の塩基位置43563936〜43735238（NCBI:Build37.2）に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1018G02のインサート（１０番染色体の塩基位置43670474〜43814797に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1070C12のインサート（１０番染色体の塩基位置43809245〜44003042に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0369G08のインサート（１０番染色体の塩基位置43893593〜44100865に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0075D03のインサート（１０番染色体の塩基位置44076856〜44195623に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。
【００１９】
(2)第２プローブセット
KIF5B遺伝子（32297938〜32345359:buid37）を含む染色体部位（第２染色体部位）を標的としたプローブセットである。第１蛍光物質で標識されたプローブ２Ａと第２蛍光物質で標識されたプローブ２Ｂとからなる。プローブ２Ａは、第２染色体部位内の5'側領域である第１領域に相補的である。プローブ２Ｂは、第２染色体部位内の3'側領域であって、第１領域と距離をおいて存在する第２領域に相補的であるKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座によってKIF5B-RET融合遺伝子が生成するときのKIF5B遺伝子における切断点は、第１領域の3'末端部、第１領域と第２領域の間、又は第２領域の5'末端部に位置する。KIF5B-RET融合遺伝子には少なくとも４種類のバリアント（非特許文献６で報告された３種類と、新規バリアント１種類）が存在し、それらの間でKIF5B遺伝子における切断点は異なる（非特許文献６）。KIF5B遺伝子のエクソン１〜１５までを含む領域とRET遺伝子のチロシンキナーゼ領域が融合したバリアントの場合、KIF5B遺伝子における切断点は１０番染色体のマイナス鎖の32316377番塩基の後ろに存在する。また、新規に同定されたバリアント（図１０を参照）では、KIF5B遺伝子の切断点はエクソン２２の後ろにずれる。本発明では、例えば、特定の切断点に注目してプローブを設計する。或いは、二以上の切断点を考慮し、例えば、それらの両者が第１領域の3'末端部、第１領域と第２領域の間、又は第２領域の5'末端部に位置するように、プローブを設計する。
【００２０】
第２染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましくは1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第２染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置31,000,000と32,000,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置32,500,000と33,500,000の間とする。
【００２１】
プローブ２Ａの長さは、例えば300kb〜800kb、好ましくは500kb〜700kbである。プローブ２Ａの具体例は、BACクローンGSP1528C10のインサート（１０番染色体の塩基位置32417786〜32584317に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3158B05のインサート（１０番染色体の塩基位置32572458〜32735258に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1107C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32715505〜32884442に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1094C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32870561〜33033340に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。
【００２２】
プローブ２Ｂの長さは、例えば400kb〜900kb、好ましくは600kb〜800kbである。プローブ２Ｂの具体例は、BACクローンGSP1544E09のインサート（１０番染色体の塩基位置31658954〜31808161に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1541C10のインサート（１０番染色体の塩基位置31800804〜31962808に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1023E07のインサート（１０番染色体の塩基位置31903114〜32124185に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1581D09のインサート（１０番染色体の塩基位置32067160〜32239503に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3119B09のインサート（１０番染色体の塩基位置32233254〜32404265（NCBI:Build37.2）に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。
【００２３】
(3)第３プローブセット
KIF5B遺伝子に関するプローブと、RET遺伝子に関するプローブを組み合わせたプローブセットである。具体的には、プローブ２Ａとプローブ１Ｂを組み合わせてプローブセットとする。
【００２４】
(4)第４プローブセット
KIF5B遺伝子に関するプローブと、RET遺伝子に関するプローブを組み合わせたプローブセットである。RET遺伝子を含む染色体部位（第３染色体部位）に相補的であり、第１蛍光物質で標識されたプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子を含む染色体部位（第４染色体部位）に相補的であり、第２蛍光物質で標識されたプローブ４Ｂとからなる。プローブ４ＡはRET遺伝子の全長をカバーし、プローブ４ＢはKIF5B遺伝子の全長をカバーする。
【００２５】
第３染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましくは1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第３染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置42,500,000と43,500,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置44,000,000と45,000,000の間とする。一方、第４染色体部位の長さは、好ましくは0.5 Mb〜2.0 Mb、更に好ましくは1.0 Mb〜1.5 Mbである。例えば、第４染色体部位の開始位置を１０番染色体の塩基位置31,000,000と32,000,000の間とし、同終了位置を１０番染色体の塩基位置32,500,000と33,500,000の間とする。
【００２６】
プローブ４Ａの長さは、例えば800kb〜1,500kb、好ましく1,000kb〜1,300kbである。プローブ４Ａの具体例は、BACクローンGSP1506F09のインサート（１０番染色体の塩基位置43020444〜43224507に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1877H08のインサート（１０番染色体の塩基位置43563936〜43735238に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1018G02のインサート（１０番染色体の塩基位置43670474〜43814797に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1070C12のインサート（１０番染色体の塩基位置43809245〜44003042に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0369G08のインサート（１０番染色体の塩基位置43893593〜44100865に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP0075D03のインサート（１０番染色体の塩基位置44076856〜44195623に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。
【００２７】
プローブ４Ｂの長さは、例えば900kb〜1,700kb、好ましくは1,200kb〜1,500kbである。プローブ４Ｂの具体例は、BACクローンGSP1544E09のインサート（１０番染色体の塩基位置31658954〜31808161に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1541C10のインサート（１０番染色体の塩基位置31800804〜31962808に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1023E07のインサート（１０番染色体の塩基位置31903114〜32124185に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1581D09のインサート（１０番染色体の塩基位置32067160〜32239503に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3119B09のインサート（１０番染色体の塩基位置32233254〜32404265に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1528C10のインサート（１０番染色体の塩基位置32417786〜32584317に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP3158B05のインサート（１０番染色体の塩基位置32572458〜32735258に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1107C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32715505〜32884442に対応する配列からなる）を蛍光標識したもの、BACクローンGSP1094C12のインサート（１０番染色体の塩基位置32870561〜33033340に対応する配列からなる）を蛍光標識したものの組合せ（混合物）である。尚、これらのインサートは全て同一の蛍光物質で蛍光標識される。
【００２８】
本発明では、比較的長いプローブ（上記の具体例においては約200kb（プローブ１Ａ）〜約1370kb（プローブ４Ｂ））を使用する。従って、プローブと標的配列との相補性は、本発明で意図する特異的なハイブリダイゼーションが達成される限りにおいて、高度に厳密でなくてもよい。標的配列との間の配列同一性は、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上である。
【００２９】
各プローブは、転座の切断点及びKIF5B-RET転座の配列データに関して本明細書で提供される情報、及び本明細書で引用する文献の記載に基づいて設計可能である。KIF5B-RET転座についてはいくつかの変異体（バリアント）の存在が知られているが、別の変異体の存在の可能性は否定されない。特定の変異体を認識するように設計したプローブが一又は複数の別のバリアントを認識できることもある。
【００３０】
上記の通り、本発明において使用するプローブは株式会社GSP研究所のBAC(バクテリア人工染色体)クローンを利用して調製することができる。BACは大腸菌細胞において比較的長いDNA断片をクローニングするために使用されるベクターである。上記の具体例においては、プローブ１Ａを除き、複数のBACクローンを利用することによって、カバーする範囲の広いプローブ（同一の蛍光物質で標識された複数のDNA断片から構成される）を得ている。
【００３１】
本発明で使用する第１プローブセット及び第２プローブセットは、いわゆる「ブレイクアパート(break-apart)」プローブに該当する。これらのプローブセットを用いた場合、典型的には、プローブセットを構成する各プローブの蛍光シグナルが、KIF5B-RET転座が生じていないサンプルでは隣接して或いは重なって検出され、KIF5B-RET転座が生じているサンプルでは染色体の分離のために離れた位置に検出される。
【００３２】
第１プローブセットはRET遺伝子に関するプローブセットである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ１Ａとプローブ１Ｂが近接した状態で染色体にハイブリダイズし、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ１Ａとプローブ１Ｂが離間した状態で染色体にハイブリダイズする。従って、プローブ１Ａの蛍光シグナルとプローブ１Ｂの蛍光シグナルの位置関係によってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。
【００３３】
第２プローブセットはKIF5Bに関するプローブセットである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ２Ｂが近接した状態でハイブリダイズし、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ２Ｂが離間した状態で染色体にハイブリダイズする。従って、プローブ２Ａの蛍光シグナルとプローブ２Ｂの蛍光シグナルの位置関係によってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。
【００３４】
第３プローブセットはKIF5B遺伝子の5'末端側（即ち、KIF5B−RET融合遺伝子を構成する領域）を標的としたプローブ２Ａと、RET遺伝子の3'末端側（即ち、KIF5B−RET融合遺伝子を構成する領域）を標的としたプローブ１Ｂの組合せである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ１Ｂが離間した状態で染色体にハイブリダイズし、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ２Ａとプローブ１Ｂが近接した状態でハイブリダイズする。従って、プローブ２Ａの蛍光シグナルとプローブ１Ｂの蛍光シグナルの位置関係によってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。第３プローブセットによれば、転座に伴うKIF5Bの切断及びRET遺伝子の切断の両者を把握することができる。従って、本発明の目的において最も有用性の高いプローブセットであるといえる。また、現在までに報告される（本願明細書で新規に報告するものも含む）全てのバリアントを認識するプローブセットと考えられる。
【００３５】
第４プローブセットはRET遺伝子に関するプローブ４Ａと、KIF5B遺伝子に関するプローブ４Ｂの組合せである。当該プローブセットを採用すると、KIF5B-RET転座が生じなければ（即ち非転座型のサンプルの場合）プローブ４Ａとプローブ４Ｂが染色体にハイブリダイズ可能であり、KIF5B-RET転座が生じていれば（即ち転座型のサンプルの場合）プローブ４Ａとプローブ４Ｂは染色体にハイブリダイズできない。従って、蛍光シグナルが検出できるか否かによってKIF5B-RET転座の有無を判定することが可能となる。
【００３６】
本発明の各プローブセットを構成するプローブは片方が第１蛍光物質で標識されており、他方が第２蛍光物質（第１蛍光物質と異なる蛍光シグナルを生ずる蛍光物質）で標識されている。これによって、各プローブに由来する蛍光シグナルを識別しつつ検出することが可能となる。蛍光物質を例示すると、Texas Red（登録商標）、FITC、7-AAD、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、CyTM 2、DsRED、PerCPTM、R-Phycoerythrin、Propidium Iodide、AMCA、DAPI、ECFP、MethylCoumarin、Allophycocyanin、CyTM 3、CyTM 5、Rhodamine-123、Tetramethylrhodamine、PE、PE-CyTM5、PE-CyTM5.5、PE-CyTM7、APC、APC-CyTM7、オレゴングリーン、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテートである。プローブの蛍光標識は公知の方法で行えばよい。例えば、標準的プロトコールに従い、ランダムプライミング法やニックトランスレーション法で標識化することができる。
【００３７】
本発明の好ましい一態様では、第１プローブセット又は第３プローブセットを用いる。より好ましい態様では第３プローブセットを用いる。上記の通り、第３プローブセットによれば、KIF5B遺伝子の転座と、RET遺伝子の転座の両方を把握することができることから、最も信頼性の高い判定が可能となる。第３プローブセットを用いる場合において、他のプローブセットを併用すれば、更に信頼性の高い判定結果を得ることができる。ここでの併用の例としては、第３プローブセットと第１プローブセットの併用、全プローブセット（第１プローブセット〜第４プローブセット）の併用を挙げることができる。
【００３８】
本発明の方法では、例えば、以下のステップ(i)〜(iv)を行う。
(i)染色体サンプルに、前記(1)〜(4)のいずれかのプローブセット（即ち第１プローブセット、第２プローブセット、第３プローブセット、第４プローブセットのいずれか）を接触させるステップ；
(ii)染色体サンプルを洗浄し、標的に対して特異的にハイブリダイズしていないプローブを除去するステップ；
(iii)蛍光シグナルを検出するステップ；
(iv)蛍光シグナルのパターンに基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定するステップ。
【００３９】
ステップ(i)の染色体サンプルは、対象から採取した試料（例えば、血液、皮膚組織、毛髪）から常法によって調製される。本発明において用語「対象」は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物をいう。ヒト以外の哺乳動物は、家畜動物、ペット、実験動物、及びヒト以外の霊長類を含み、具体例を挙げれば、ニワトリ、ウマ、雌牛、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク及びウサギである。典型的な対象はヒトである。好ましい対象は肺癌患者である。肺癌患者の中でも非小細胞肺癌患者又は非小細胞肺癌を罹患するリスクのある肺癌患者は特に好ましい対象である。
【００４０】
ステップ(i)〜(iii)は、FISHアッセイにおいて必須且つ基本的な工程であり、当業者であれば後述の実施例を参考にして適切な条件を設定することができる。また、その実施の際には、in situハイブリダイゼーションの一般的な条件を記述するLeitch at al. In situ Hybridization: a practical guide, Oxford BIOS Scientific Publishers, Microscopy handbooks v 2 (1994)を参照することができる。ここで、FISHアッセイでは、核酸プローブと染色体上の標的配列（プローブ特異的なDNA配列）との間のハイブリダイゼーションを検出する。ここでの用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のDNA又はDNAとRNA相補鎖の結合過程、または形成された二本鎖分子を意味する。本発明におけるハイブリダイゼーション条件は、染色体サンプルや採用するプローブセットによって変動し得るが、当業者であれば予備実験を通して容易に設定可能である。また、ハイブリダイゼーション条件として、高ストリンジェンシー条件ないし低ストリンジェンシー条件を採用可能である。温度、塩濃度、ホルムアミド濃度等のパラメータの調整によって、適切なハイブリダイゼーション条件を設定することができる。また、ハイブリダイゼーションに基づく蛍光シグナルを至適化するために、ハイブリダイゼーション工程（即ちステップ(i)）或いはそれに続く洗浄工程（即ちステップ(ii)）の中でハイブリダイゼーション条件を変動させることにしてもよい。一般に、高ストリンジェンシー条件を採用すればバックグラウンドシグナルを低減させることができるが、同時に感度も低下する。高ストリンジェンシー条件の例は、0.1 x SSPE、0.1% SDS、65℃での反応であり、中ストリンジェンシー条件の例は、0.2 x SSOE、0.1%SDS、50℃での反応であり、低ストリンジェンシー条件の例は、1 x SSPE、0.1% SDS、50℃での反応である。
【００４１】
ステップ(ii)に続くステップ(iii)では、蛍光シグナルを検出する。FISHアッセイにおけるハイブリダイゼーションシグナルは、核酸プローブの蛍光標識を蛍光顕微鏡等を通して可視化することによって検出される。
【００４２】
本発明では、ステップ(iii)で得られた蛍光シグナルのパターン（蛍光像）に基づき、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する（ステップ(iv)）。ここでの判定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。本発明で使用するプローブセットでは、片方のプローブが特定の蛍光物質で標識されており、他方のプローブは当該蛍光物質と異なる蛍光シグナルを生ずる別の蛍光物質で標識されている。例えば、第３プローブセットとして、TexRed標識のプローブ２ＡとFITC標識のプローブ１Ｂを採用した場合、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座が生じている染色体サンプルでは、典型的には、二つの蛍光シグナルが併合したシグナル（黄色）が検出される。他方、転座が生じていない染色体サンプルでは、二つの蛍光シグナル（赤色のシグナルと緑色のシグナル）が離れて別々に検出される。第１プローブセットや第２プローブセットを採用した場合にあっては、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座が生じている染色体サンプルでは二つの蛍光シグナルが離れて別々に検出され、転座が生じていない染色体サンプルでは、典型的には、二つの蛍光シグナルが近接して観察されるか、或いは二つの蛍光シグナルが併合したシグナル（黄色）が検出される。このように、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無は、蛍光シグナルのパターンに反映される。従って、蛍光シグナルのパターンによって、KIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定できる。
【００４３】
ステップ(iv)での判定は、好ましくは対照（テストサンプル）との比較に基づき行われる。ここでの対照は、例えば、非小細胞肺癌患者由来の染色体サンプル、或いは前癌性の病変を示す患者由来の染色体サンプルである。また、前癌性の病変がない患者の染色体サンプル、癌を罹患していない患者由来のサンプル、健常者由来の染色体サンプル等を対照として用いることもできる。細胞株由来の染色体サンプルを対照として採用することもできる。
【００４４】
本発明の一態様では、二以上のプローブセットを選択し、選択した各プローブセットを用いて個別にステップ(i)〜(iii)を行う。そして、ステップ(iv)では、各プローブセットについて取得された蛍光シグナルのパターンを総合してKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座の有無を判定する。このように、複数のプローブセットを併用すれば、より信頼性の高い判定結果が得られる。好ましくは、この態様において選択されるプローブセットの中に、第１プローブセットと第３プローブセットを含めることとする。
【００４５】
２．KIF5B-RET転座の検出方法の応用
本発明の第２の局面は、本発明の検出方法の応用・用途に関する。この局面の一態様は、非小細胞肺癌を検出する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象（患者）が非小細胞肺癌を罹患していると決定するステップを含む。ここでの決定は、その判定基準から明らかな通り、医師や検査技師など専門知識を有する者の判断によらずとも自動的／機械的に行うことができる。対象が非小細胞肺癌を罹患しているか否かを明らかにすることは、適切な治療方針を決定する上で重要である。本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象が腺癌を罹患していると決定することにしてもよい。また、本発明の検出方法の結果に基づき、予後の判定を行うことにしてもよい。例えば、予後不良、中間、良好な予後のいずれかに分類されるかを決定することができる。
【００４６】
他の一態様は治療方針を決定する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象（患者）をRETキナーゼ阻害剤で処置すべきであると決定する。換言すれば、RETキナーゼ阻害剤で処置を受けるべき候補として対象が同定される。当該決定に基づき治療方針が決定され得る。例えば、一又は二以上のRETキナーゼ阻害剤による処置が推薦又は処方されることになる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。尚、第１プローブセット又は第３プローブセットの使用によってRET遺伝子の転座が証明される染色体サンプルが由来する患者に対しても、同様の決定を行ってもよい。
【００４７】
本明細書において用語「処置」又は「治療」を使用する場合には、疾病（例えば非小細胞肺癌）又は病態の予防、寛解、防止または治癒が意図される。症状が現れた後の処置は、当該症状及び／又は関連する症状の減少、寛解又は除去、或いは悪化の防止を目的とする。症状が現れる前の処置（即ち、予防処置は）は、典型的には、症状が現れるリスクを減少すること、或いは症状が現れた場合に重症度を和らげることを目的とする。
【００４８】
RETキナーゼ阻害剤の例は、スニチニブ（SUNITINIB）、ソラフェニブ（SORATINIB）及びバンデタニブ（VANDETANIB）である。RETキナーゼ阻害剤として、RETの発現をノックダウンする化合物を使用することもできる。当該化合物の例は、抗体、小分子、ペプチド、アプタマーである。RETの発現を阻害可能な分子であれば、一般に、RETの発現をノックダウンすることが可能である。例えばRNAi、アンチセンスRNA、リボザイム、miRNA等を利用可能である。当該技術分野で既知の様々な遺伝子ノックダウン戦略を採用することができる。
【００４９】
RETキナーゼ阻害剤が、RET及び／又はRETキナーゼ活性の発現（例えば、転写、翻訳及び／又は安定性）を阻害するものであってもよい。阻害剤はRET特異的であっても、非特異的（例えば、非特異的キナーゼ阻害剤、マルチターゲットインヒビター）であってもよい。いくつかのRETキナーゼ阻害剤が開発され、その臨床応用が検討されている。RETキナーゼ活性の下流には、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ(PI3K)や細胞外シグナルキナーゼ１／２(ERK)(Wixted JH et al. J Biol Chem 2011)、STAT3(Hwang JH et al. Mol Endocrinol 2003;17: 1155-1166)などがある。このような下流シグナル伝達経路を阻害する薬剤をRETキナーゼ阻害剤の代替又は補助として使用することもできる。
【００５０】
スニチニブは、2008年4月に承認され、同年6月に発売された消化管間質腫瘍(GIST)と腎臓癌を対象とした抗癌剤であり、血管新生に関与するVEGF（血管内皮細胞増殖因子）受容体と、腫瘍増殖に関与するPDGF（血小板由来増殖因子）受容体、RETなど複数の受容体を標的としている。ソラフェニブは、腎臓癌および切除不能肝細胞癌に適応拡大された、Braf、RETなどをターゲットとした複数の受容体を標的とする阻害剤である。バンデタニブは、EGFR、VEGFをターゲットとするため血管新生抑制作用が有るが、RETも阻害するため米国FDAでは甲状腺髄様癌に適応が承認されている。
【００５１】
ある態様では、KIF5B-RET転座を有すると判定された対象は、転座部位以降の部位にRET変異を有するとも判定される。RET変異は例えば活性化変異である。RETの活性化変異は、野生型変異と比較して活性の増加をもたらす任意の変異である。例えば、RETの活性化変異がRETの恒常的活性化をもたらしてもよい。また、RET阻害剤の使用に関連する或いは起因する二次的なRET活性化の変異型であってもよい。RETシグナル活性の増加を生じる変異は、例えば、RETシグナルの増加を起こすキナーゼドメインでの点変異、欠失、挿入、複製、逆位、或いはこれらの中の二つ以上の組合せによって生ずる。KIF5B-RET転座及び他のRET変異の両方を有すると判定された対象について、RETキナーゼ阻害剤で処置されるべきであると決定することもできる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。
【００５２】
本発明の更なる一態様は治療方針を決定する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座があると判定された場合に、染色体サンプルが由来する対象（患者）をEGFR阻害剤及び／又はALK阻害剤で処置すべきであると決定する。この態様では、(1)KIF5B-RET転座を有すると判定された対象はEGFR変異を有する、(2)KIF5B-RET転座を有すると判定された対象はALK転座変異を有する、或いは(3)KIF5B-RET転座を有すると判定された対象はEGFR変異とALK転座変異を有する、と判断されることになる。EGFR変異は例えば活性化変異である。EGFRの活性化変異は、野生型変異と比較して活性の増加をもたらす任意のEGFR変異である。EGFRの活性化変異がEGFRの恒常的活性化をもたらしてもよい。EGFRシグナルの増加と関連する癌が、細胞外ドメイン内に欠失があるEGFRの変異型を発現していてもよい。ある態様では、変異型のEGFRはEGFRvIIIである。EGFRシグナル活性の増加を生じる変異は、例えば、EGFRシグナルの増加を起こすキナーゼドメインでの点変異、欠失、挿入、複製、逆位或いはこれらの中の二つ以上の組合せによって生ずる。KIF5B-RET転座及びEGFR変異の両方を有すると判定された対象について、RETキナーゼ活性及び／又はEGFR活性阻害剤で処置されるべきであると決定することもできる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。EGFR阻害剤の例はゲフィチニブ、エルロチニブ、ラバチニブ、TAK-285、EKB-569及びバンデタニブである。
【００５３】
ALK転座変異は、例えば、EML4-ALKである。ALK転座変異は例えば活性化変異である。ALKの活性化変異は、野生型変異と比較して活性の増加をもたらす任意のALK変異である。ALKの活性化変異がALKの恒常的活性化をもたらしてもよい。ALK活性の増加を生じる変異は、例えば、ALKの点変異、欠失、挿入、複製、或いはこれらの中の二つ以上の組合せによって生ずる。KIF5B-RET転座及びALK転座等変異の両方を有すると判定された対象について、RETキナーゼ活性及び／又はALK活性阻害剤で処置されるべきであると決定することもできる。また、当該決定に基づき、処置／治療等を当該対象に施すことにしてもよい。ALK阻害剤の例はクリゾチニブ及びCEP-28122である、
【００５４】
ところで、本発明の検出方法（FISH解析）の結果から、KIF5B-RET転座が存在しないことが判明した場合には、EGFR変異やEML4-ALK転座など、肺癌特異的な遺伝子異常が存在する可能性が高くなり、これらの遺伝子異常の検索を更に進めることが重要となる。そこで、本発明の更なる一態様は治療方針を決定する方法に関し、本発明の検出方法によってKIF5B遺伝子とRET遺伝子の間の転座がないと判定された場合であって、染色体サンプルが由来する対象が非小細胞肺癌の患者であるときに、当該対象には肺癌特異的な他の遺伝子異常が存在すると判定する。
【００５５】
以上の説明から明らかな通り、本願では、本発明の方法によって決定された治療方針に従って対象を処置するステップを含む治療方法も提供される。本発明の治療方法の治療対象疾患は、典型的には非小細胞肺癌（NSCLC）である。但し、他の癌の治療への本発明の適用も想定される。用語「癌」は広義に解釈される。また、本発明において用語「癌」は「腫瘍」と互換的に使用される。また、病理学的に診断が確定される前の段階、すなわち腫瘍としての良性、悪性のどちらかが確定される前には、良性腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍を総括的に含む場合もあり得る。癌はその発生の母体となった臓器の名、もしくは発生母組織の名で呼ばれ、主なものを列記すると、舌癌、歯肉癌、咽頭癌、上顎癌、喉頭癌、唾液腺癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、胆嚢癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、副腎癌、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、子宮癌、卵巣癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、尿道癌、網膜芽細胞腫、結膜癌、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、睾丸腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫などである。そして、さらに発生臓器の部位の特徴によって、上・中・下咽頭癌、上部・中部・下部食道癌、胃噴門癌、胃幽門癌、子宮頚癌、子宮体癌などと細分類されているが、これらが限定的ではなく本発明の「癌」としての記載に含まれる。
【００５６】
本発明の治療方法によれば、例えば、癌の発生を防止すること、癌の症状を減少させること、及び／又は癌の成長を阻害することができる。本発明の治療方法の一態様では、RET阻害剤、ALK阻害剤、EGFR阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物が投与される。これらの化合物は、癌の処置を目的とした外科手術及び／又は放射線療法の前又は後に投与されてもよい。手術や放射線療法は癌を処置するための一般的な方法である。手術は癌発生のリスクを減少させる予防的措置としても採用され得る。例えば、大腸癌発生のリスクのある対象（例えば家族性大腸ポリポージスの患者）は、癌発生リスクを減少させるため、大腸の切除を受けることがある。肺癌の前癌病変AAH(異型性腺腫様過形成)の患者も肺切除を受けることがある。一態様では、これらの患者に対しても、RET阻害剤が手術前又は後に投与される。
【００５７】
本発明の治療方法の一態様では、RET阻害剤、ALK阻害剤、EGFR阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物とともに、一以上の癌医薬が使用される。例えば、RET阻害剤とともに、化学療法剤及び／又は免疫療法剤が投与される。癌医薬は、癌を罹患した患者或いは癌発生リスクのある対象を処置する目的で使用される医薬である。癌医薬は、例えば、免疫療法剤、化学療法剤及び癌ワクチンからなる群より選択される一以上の成分を含有する。
【００５８】
化学療法剤とは、癌細胞を直接ターゲットとする化学的又は生物学的な剤である。化学療法剤のいくつかは、持続的生存に依存する癌細胞の細胞活性を阻害するように機能する。化学療法剤の例は、アルキル化剤／アルカロイド、代謝拮抗剤、ホルモン又はホルモン類似体、抗悪性腫瘍剤である。化学療法剤の具体例は、これらに限定されるものではないが、アミノグリコシド、アスパラキナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル、シタラビンHCL、シスプラチン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンHCL、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エトポシド(VP-16-2139)、フロクスウリジン、フルオロウラシル（5-FU）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ2a、リュープロリド酢酸塩(LHRH放出因子類似体)、ロムスチン（CCNU）、メクロレタミンHCL(ナイトロジェンマスタード)、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（op'-DDD）、ミトキサントロンHCL、オクトレオチド、ブリカマイシン、プロカルバジンHCL、ストレプトゾシン、タミキシフェンクエン酸塩、ペメトレキセート、チオグアニン、チオテバ、ブンブラスチン硫酸塩、アムサクリン(m-AMSA)、アザシチジン、エリスロポエチン、ヘキサメチルメラミン(HMM)、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチルーGAG、メチルグリオキサールビスーグアニルヒドラゾンーMGBG）、ベントスタチン（２‘デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチルーCCNU）、テニポシド（VM−２６）及びビンデシン硫酸塩である。
【００５９】
本発明の治療方法を実施する際、ホルモン療法を併用することにしてもよい。ホルモン療法では、癌を有する又は癌を有するリスクがある対象に対してホルモン又はホルモン代替物或いはホルモン誘導体を投与する。具体例はエストロゲン療法（例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール（例えば乳癌および前立腺癌）の使用）、抗エストロゲン療法（例えば、タモキシフェン（例えば乳癌）の使用）、プロゲステロン療法（例えばメドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール（例えば乳癌および子宮体癌）の使用）、アンドロゲン遮断（例えばフルタミドなどの抗アンドロゲン物質（例えば前立腺癌）の使用）である。
【００６０】
３．KIF5B-RET転座の検出用キット
本発明の更なる局面はKIF5B-RET転座を検出するためのキットに関する。本発明のキットは、本発明の検出方法を簡便且つ効率的に行うことを可能にする。本発明のキットは必須要素（必須成分）として、上記の第１プローブセット、第２プローブセット、第３プローブセット又は第４プローブセットを含む。２種類以上のプローブセットを含んでいても良い。例えば、第１プローブセットと第３プローブセットを含むキットが提供される。各プローブセットの詳細は上述の通りであるため、ここでの説明は省略する。
【００６１】
本発明のキットが他の要素を含んでいてもよい。他の要素の例は、プローブの使用にすいての説明書、DAPIなどのDNA対比染色剤、ハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄バッファー、溶媒、封入剤(mounting media)、コントロールスライド、反応容器、その他の器具である。診断目的の説明書を更に含んでいてもよい。また、癌患者由来の染色体サンプルにおけるKIF5B-RET転座の検出（陽性同定）が、当該患者をRETキナーゼ阻害剤で処置すべきであることを示す説明書等を更に含んでいてもよい。更には、治療方針を決定するための指針や説明を含んでいてもよい。
【実施例】
【００６２】
＜肺癌におけるKIF5B-RET転座＞
１．材料と方法
（１）サンプルの調製
非小細胞肺癌（n=277）は、RNA抽出に十分な材料が入手可能である外科的切除例から回収した。癌のステージ分類は、IASLCの肺癌ステージガイドラインに従った。２００４年WHO分類システムによって腫瘍を分類した。７０％以上の腫瘍含量のある凍結腫瘍組織を更なる分析に使用した。腫瘍の大部分（n=157）を、RT-PCRによるmRNAレベルの解析にも使用した。得られたデータは、β−アクチンのmRNAレベルで補正した（即ち、β−アクチンの発現が十分に証明された検体が使用された）。
【００６３】
腫瘍を外科的切除後、急速冷凍し、−８０℃で保存した。トータルRNAをIsogen(Nippon gene, Tokyo, Japan)キットで抽出した。RNA濃度を測定し、十分量回収されたものを逆転写に供した。Superscript II enzyme (Roche社)を用いたキットによって、0.5〜1μgのトータルRNAからcDNAを合成した。
【００６４】
（２）RT-PCR及び変異解析
KIF5B-RETのRT−PCR解析には以下の配列のプライマーセットを用いた。フォワードプライマー(AAATGAGCTCAACAGATGGCGTAA：配列番号１)はKIF5B遺伝子のエクソン１２に対応する。一方、リバースプライマー(AGAACCAAGTTCTTCCGAGGGAAT：配列番号２)はRET遺伝子のエクソン１２に対応する。PCRによる増幅は、調製したcDNAを用い、製造元のガイドラインに基づいてTakara EXTaq(Takara Bio Inc. Shiga Japan)を使用して行った。４０サイクルの増幅を行った。得られたPCR産物（バリアントタイプ１であれば681bp、バリアントタイプ３であれば1395bp）をアガロースゲル電気泳動で分析するとともに、ダイレクトシーケンスも行った。
【００６５】
非小細胞肺癌におけるEGFRの遺伝子解析は、現在日本では保険適応の範囲内で行われている。パラフィン切片を解析会社に送付し、ゲノムDNAからのダイレクトシーケンスを依頼した。Kras遺伝子変異解析は、過去に発明者らが報告した方法に準じて施行された。Braf遺伝子変異及びErbB2遺伝子変異は、既知の変異を有する特異的な部位を含むプライマーを使用したダイレクトシーケンスで解析した。
【００６６】
（３）蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）
（３−１）プローブ
KIF5B遺伝子用のプローブとして、バクテリア人工染色体（BAC）（GSP研究所保有のもの）を利用した。また、RET遺伝子用のプローブにもBACを利用した。詳細には、株式会社GSP研究所が保有する20万種類のバクテリア人工染色体（BAC）クローンライブラリーからRET遺伝子座周辺に対応するBACクローンと、KIF5B遺伝子座周辺に対応するBACクローンを米国特許６,６６２,１１３号（Digital correlation of test samples and the screening of interactions between the same）の方法を使用して検索した。その結果、RET遺伝子座周辺BACクローン8種類（GSP1506F09、GSP3023D06、GSP3012B07、GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08、GSP0075D03）とKIF5B遺伝子座周辺BACクローン9種類（GSP1544E09、GSP1541C10、GSP1023E07、GSP1581D09、GSP3119B09、GSP1528C10、GSP3158B05、GSP1107C12、GSP1094C12）を選択した。BACクローンは、クロラムフェニコールを含有するLB寒天プレート上にストリークし、37℃、オーバーナイトで生育させた。各BACクローン由来のシングルコロニーを選択し、37℃、オーバーナイトで生育させ、確立した手法を用いてBAC DNAを抽出した。これらのBAC DNAにFluorescein12-dUTP(FITC)（PerkinElmer,Massachusetts,USA）又はTexRed-5-dUTP（PerkinElmer, Massachusetts,USA）をNickTranslation Kit (株式会社GSP研究所)を使用して標識し、以下の4種類のFISHプローブセットを作製した（図１〜６、１１、１２を参照）。
【００６７】
（第１プローブセット）
プローブ１Ａとプローブ１ＢからなるRETスプリット二重カラーFISHプローブセット（RET Split Dual Color FISH Probe）。２種類のプローブセット（第１プローブセットａと第１プローブセットｂ）を用意した。
＜第１プローブセットａ＞
プローブ１Ａ：GSP1506F09のインサートをTexRed標識したもの
プローブ１Ｂ：GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08及びGSP0075D03の各インサートをFITC標識したもの（５種類のDNA断片の混合物）
＜第１プローブセットｂ＞
プローブ１Ａ：GSP1506F09、GSP3023D06及びGSP3012B07のインサートをTexRed標識したもの(3種類のDNA断片の混合物)
プローブ１Ｂ：GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08及びGSP0075D03の各インサートをFITC標識したもの（５種類のDNA断片の混合物）
【００６８】
（第２プローブセット）
プローブ２Ａとプローブ２ＢからなるKIF5Bスプリット二重カラーFISHプローブセット（KIF5B Split Dual Color FISH Probe）
プローブ２Ａ： GSP1528C10、GSP3158B05、GSP1107C12及びGSP1094C12の各インサートをTexRed標識したもの（４種類のDNA断片の混合物）
プローブ２Ｂ： GSP1544E09、GSP1541C10、GSP1023E07、GSP1581D09及びGSP3119B09をFITC標識したもの（５種類のDNA断片の混合物）
【００６９】
（第３プローブセット）
プローブ１Ｂとプローブ２ＡからなるKIF5B/RET, SY転座二重カラーFISHプローブセット（KIF5B/RET, SY Translocation Dual Color FISH Probe）
【００７０】
（第４プローブセット）
プローブ４Ａとプローブ４ＢからなるKIF5B/RET, DY転座二重カラーFISHプローブセット（KIF5B/RET, DY Translocation Dual Color FISH Probe）
プローブ４Ａ：GSP1506F09、GSP1877H08、GSP1018G02、GSP1070C12、GSP0369G08及びGSP0075D03の各インサートをTexRed標識したもの（６種類のDNA断片の混合物）
プローブ４Ｂ：GSP1544E09、GSP1541C10、GSP1023E07、GSP1581D09、GSP3119B09、GSP1528C10、GSP3158B05、GSP1107C12及びGSP1094C12の各インサートをFITC標識したもの（９種類のDNA断片の混合物）
【００７１】
（３−２）FISH用薄切スライド標本の作製
FISH用のスライドは、標準の細胞遺伝学的な手法を用いて調製した。パラフィン包埋した標本は、ミクロトームで5μmに薄切し、アミノシランコーティングスライドガラスに貼り付け40±3℃の恒温槽内で一昼夜十分に乾燥させた。
【００７２】
（３−３）脱パラフィン操作
染色操作の直前に脱パラフィンを行う。検体を60℃のオーブンの中に30分間置き、続いて、スライドを下記の順に各液に浸す。
キシレン（100vol%）5分→キシレン（100vol%）5分→キシレン（100vol%）5分→エタノール（100vol%）3分→エタノール（100vol%）3分→エタノール（95vol%）3分→エタノール（80vol%）3分→エタノール（70vol%）3分→エタノール（50vol%）3分→精製水3分→精製水3分
【００７３】
（３−４）FISH検出用キット試薬(K5599)の調製
（ａ）濃縮前処理試薬(K5599, Vial 1)の調製法
濃縮前処理試薬を精製水で20倍希釈し、前処理試薬とする。調製後の前処理試薬は2〜8℃保存で1ヶ月間安定である。保存中、前処理液が混濁した場合は使用せず廃棄する。
（ｂ）濃縮SSC緩衝液(K5599、Vial4)の調製法
濃縮SSC緩衝液を精製水で20倍希釈し、SSC緩衝液とする。調製後のSSC緩衝液は2〜8℃保存で1ヶ月間安定である。保存中、洗浄液が混濁した場合は使用せず廃棄する。
（ｃ）濃縮洗浄液(K5599、Vial 3)の調製法
濃縮洗浄液を精製水で20倍希釈し、洗浄液とする。調製後の洗浄液は2〜8℃保存で1ヶ月間安定である。保存中、洗浄液が混濁した場合は使用せず廃棄する。尚、その他の試薬はそのまま用いる。
【００７４】
（３−５）FISH検出法
（ａ）前処理
前処理試薬を染色ドーゼに入れ、あらかじめ温浴槽で前処理試薬が95〜99℃に達するまで温める。温まった前処理試薬に検体組織スライドを浸漬し、温浴槽で前処理試薬の温度を95〜99℃に保ちながら10分間反応させる。染色ドーゼを温浴槽から取り出し、検体組織スライドを浸漬したまま常温で15分間放置する。検体組織スライドを前処理試薬から取り出し、精製水に浸漬し、軽くすすぐ。更に精製水を新しいものに交換し、同様の操作を2回行う。検体組織スライドを洗浄液中に5分間浸漬する。更に洗浄液を新しいものに交換し、5分間浸漬する。
【００７５】
（ｂ）タンパク分解酵素処理
検体組織スライドの過剰水分を注意深く拭き取る。タンパク分解酵素試薬5〜8滴（250μL）で検体組織を覆い、室温で5〜15分反応させる。噴射ビンに入れた洗浄液で静かにすすぎ、洗浄液中に3分間浸漬する。更に洗浄液を新しいものに交換し、3分間浸漬する。検体組織スライドを下記のエタノール上昇系列の順に各液に浸漬したのち、検体組織を乾燥させる。
エタノール（70％）2分→エタノール（85％）2分→エタノール（100％）2分
【００７６】
（ｃ）プローブ試薬の熱変性及びハイブリダイゼーション
検体組織にプローブ試薬(10μL)を滴下し、更にカバーグラスで検体組織を覆い、カバーグラスの周りをカバーグラスシーラーで封入する。検体組織スライドをHybridizer (S2450)に設置して、82℃の5分間のプローブ及び標的DNAを変性させる。変性の後、引き続いて37℃で16時間〜72時間反応させる。尚、過剰なFISHプローブを洗浄後（以下を参照）、検体は４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI）で対比染色した。
【００７７】
（ｄ）プローブ試薬の洗浄
SSC緩衝液を染色ドーゼに入れ、あらかじめ温浴槽でSSC緩衝液が65℃に達するまで温める。検体組織スライドをオーブンから取り出し、カバーグラスシーラーをゆっくりとはがす。溝つき染色ドーゼに常温のSSC緩衝液を入れ、カバーグラスをつけたままの検体組織スライドを浸漬し、ピンセットでゆっくりとカバーグラスをはずす。65℃に加温したSSC緩衝液を入れた染色ドーゼに検体組織スライドを移し替え、温浴槽でSSC緩衝液の温度を65℃に保ちながら10分間浸漬する。検体組織スライドを染色ドーゼから取り出し、洗浄液に3分間浸漬する。更に洗浄液を新しいものに交換し、3分間浸漬する。検体組織スライドを下記のエタノール上昇系列の順に各液に浸漬したのち、検体組織を乾燥さる。
エタノール（70％）2分→エタノール（85％）2分→エタノール（100％）2分
【００７８】
（ｅ）封入
検体組織スライドに封入剤(DAPI含有封入剤、Vial 5 10〜15μL)を滴下し、カバーグラスをかけて封入する。
（４）免疫組織染色
抗体製造元のガイドラインに従って行った。抗体の結合は、Linkerを用いた増強システムを用いて検出した(ダコ・ジャパン株式会社)。抗RET抗体としてRETのC末端を認識するもの（Vector Laboratories 社製のclone 3F8抗体ならびにEpitomics社anti-RET rabbit monoclonal antibody, 3454-1）を使用した。Dako社のDouble staining chromogenic in situ hybridization kit(Dako DuoCISH SK108)を用いてアルカリフォスファターゼ標識した抗Tex RED抗体（赤で発色）及びペルオキシダーゼ標識した抗FITC抗体（青で発色）にて蛍光ラベルを可視化し、光学顕微鏡での観察が可能とし、免疫組織染色との比較を行った。
【００７９】
２．結果
RT-PCR法及び長距離ゲノムPCR法は、細胞株又は新鮮腫瘍標本からKIF5B-RET融合遺伝子の検出に適用可能な方法である。しかしながら、大多数の臨床的NSCLC腫瘍試料はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)標本であり、いずれの方法もFFPEからKIF5B-RET転座を検出するのは事実上、極めて困難である。本発明者は、上記の通り、KIF5B-RET転座を検出するためのプローブセットを新たに設計するとともに、それを用いたFISH法を開発した。プローブセットの性能を評価するために、臨床検体（KIF5B-RET融合遺伝子を認める検体と、KIF5B-RET融合遺伝子を認めないNSCLC標本）を用いて検討した。この検討では第１プローブセットを用いた。第１プローブセットは、RET遺伝子の5'側の領域にハイブリダイズするTexRed標識プローブ（プローブ１Ａ）とRET遺伝子及びその3'側の領域にハイブリダイズするFITC標識プローブ（プローブ１Ｂ）からなる。KIF5B-RET転座が存在すれば、二つのプローブは離れた位置で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが離れた位置に観察される。KIF5B-RET転座が存在しなければ、二つのプローブがごく近接した状態で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが併合し、黄色のドットが観察される。KIF5B-RET融合遺伝子を認める検体についてのFISH（第１プローブセットａを使用）の結果（蛍光検出像）を図７に示す。鮮明な赤色のドットと緑色のドットが離れた状態で検出されている（丸囲い）。別の第１プローブセット（第１プローブセットｂ）を用いると、より鮮明なスプリットシグナルを認めた（図１３）。
【００８０】
一方、第３プローブセットを用いて同様の検討を行った。第３プローブセットは、KIF5B遺伝子の5'側の領域にハイブリダイズするTexRed標識プローブ（プローブ２Ａ）とRET遺伝子及びその3'側領域にハイブリダイズするFITC標識プローブ（プローブ１Ｂ）からなる。KIF5B-RET転座が存在すれば、二つのプローブはごく近接した状態で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが併合し、黄色のドットが観察される。KIF5B-RET転座が存在しなければ、二つのプローブが離れた状態で染色体にハイブリダイズし、その結果、赤色のドットと緑色のドットが離れた位置に観察される。KIF5B-RET融合遺伝子を認める検体についてのFISHの結果（蛍光検出像）を図８に示す。赤色のドットと緑色のドットが併合した黄色のドットが認められる（丸囲い）。以上の通り、KIF5B-RET転座の検出に各プローブセットが有効であることが示された。
【００８１】
最近、１０番染色体にともに存在するKIF5B-RET融合遺伝子が複数の韓国人の非小細胞肺癌（NSCLC）において検出された（非特許文献６）。この報告では３種類の異なる変異体が同定されている。本発明者らの研究グループは、日本人検体（腺癌１７６例、扁平上皮癌１０１例）の患者由来の非小細胞肺癌（２７７例）における、KIF5B-RET融合遺伝子の頻度をRE-PCRで検討した。その結果、先の報告と同一の２種類の変異体が３人について検出された。図９に示したのはバリアント１タイプの転座であり、KIF5B遺伝子のエクソン１５以前とRET遺伝子のエクソン１２以降が融合して転座している。新規バリアントはKIF5Bのエクソン２２とRET遺伝子のエクソン１２が融合していた（図１０）。KIF5B-RET融合遺伝子を認める全ての腫瘍は腺癌であり、また、たばこ非喫煙者である非小細胞肺癌患者であり、喫煙者と比較して頻繁に発生した。コントロールとして乳癌（６０例）、大腸癌（１０例）、甲状腺乳頭腺癌（１例）でも検討を行ったが、変異体は認めなかった。変異体を認めた３人の正常肺組織からは変異体は検出されなかった。EGFR、Kras、Braf、ErbB2、EML4-ALK転座など、既知の肺癌発生関連遺伝子異常をもつ腺癌（１４８例）中にはKIF5B-RET転座は認めなかった。扁平上皮癌からも転座は認めなかった。これらの結果は、KIF5B-RET融合遺伝子が癌発生関連遺伝子であることを示唆する。また、mRNAレベルでRET遺伝子発現を検討した結果（１５７例の腺癌症例）、RETの発現は、KIF5B-RET転座例で(腫瘍／正常比)161.760±123.488、KIF5B-RET転座陰性例では5.901±17.148(n=154)であり、で有意に高値であった（p=0.0044）。このことからも、KIF5B-RET転座を起こしているとRETが活性化されているため、RET阻害剤が効果的な治療であるといえる。尚、シークエンスの結果から変異が確認された症例に免疫組織化学的検討を行ったところ、Epitomics社の抗体を用いて染色陽性が確認された（図１４）。染まり方をG1(顆粒状)、G2(び慢性)に分類し、G2且つ染色範囲が50％以上であればRETの転座がある可能性が高いとした（相関が有ると思われる）。Vector Laboratories社製の抗体では転座例との有意な相関を認めなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の検出方法によれば、KIF5B-RET転座の有無を判定可能である。KIF5B-RET転座の存在を確認することは肺癌（特に非小細胞肺癌）の治療方針を決定する上で重要且つ有益である。本発明には、テーラーメイド医療の実現への貢献が期待される。
【００８３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１、２：人工配列の説明：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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