(57)【要約】【課題】特定の細胞に特徴的な細胞表面の標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡ鎖等の核酸鎖を用いた細胞機能制御方法の提供。【解決手段】特定の細胞表面の標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡ鎖等の核酸鎖を精製回収するために、細胞表面のタンパク質等にＤＮＡ鎖等の核酸鎖を結合させ、異なる複数種の機能を制御した細胞を作成し、これらを基板状に空間配置してことなる細胞を空間的に共存させる。【選択図】図１
2013202018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的細胞または標的細胞の集団を準備し、前記標的細胞の細胞表面に発現している標的分子に特異的に結合する核酸または核酸誘導体もしくは核酸修飾体を前記標的細胞の表面に発現している前記標的分子に特異的に結合させて、核酸修飾細胞を作製する工程、
（ｉｉ）前記標的細胞の表面に発現している前記標的分子に特異的に結合しなかった核酸を除去する工程、
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）からの核酸修飾細胞に対して、前記標的細胞の細胞表面に発現している、前記標的分子とは異なる標的分子に特異的に結合する核酸または核酸誘導体あるいは核酸修飾体を用いて、前記工程（ｉ）および（ｉｉ）を行う工程、
（ｉｖ）前記工程（ｉ）および（ｉｉ）の操作、または前記工程（ｉｉｉ）の操作を繰り返すことによって作製した２種類以上の異なる核酸修飾細胞を、共通の細胞培養環境中の培養基板上で、前記各核酸修飾細胞の空間配置を制御して配列して細胞ネットワークを構築する工程、
を含む、細胞機能制御方法。
【請求項２】
さらに、
（ｖ）前記工程（ｉｖ）で培養している前記核酸修飾細胞の前記標的分子に特異的に結合する前記核酸または前記核酸誘導体もしくは前記核酸修飾体を分解させる核酸分解酵素を前記細胞培養環境中に導入する工程、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸が一本鎖核酸またはアプタマーである、請求項１または２に記載の細胞機能制御方法。
【請求項４】
前記標的細胞が、心筋細胞、神経細胞、線維芽細胞、グリア細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、または幹細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞機能制御方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞機能制御方法により作製された核酸修飾細胞を含む細胞ネットワーク。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞ネットワークを使用して細胞機能を検査する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞表面の標的分子に特異的に結合する核酸鎖を用いて、細胞の機能を制御した細胞を製造し利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一本鎖核酸はその高次構造により、特定の標的分子に対して結合能を有することが、１９９０年にC. Tuerkらのグループによって報告（非特許文献１：Science, 249, 505-510 (1990)）され、それらの核酸は「アプタマー」と命名された。これまでイオンや糖鎖、タンパク質、生細胞表面上の分子に親和性のあるアプタマー、さらにはタンパク質のリン酸化状態を判別するアプタマーなどが先行研究により多数報告されている。アプタマーは大別して一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡから成るが、他にもペプチドアプタマーなどが報告されている。またそれらの中には人工塩基を用いたアプタマー、ポリエチレングリコールなどの有機分子により修飾されたアプタマーなど、使用目的に合わせた修飾アプタマーも開発されている。
【０００３】
これらアプタマーは、C. Tuerkらによって提案されたＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）という、目的の核酸分子の選別と、それら分子の増幅という２つのステップによって選択される。
【０００４】
一般的には、まず、１０１４〜１０１６分子種の、両端が１８〜３８塩基ほどのプライマー配列に挟まれた３０〜１００塩基のランダム配列からなる全長が約６０〜１４０塩基の核酸プールを準備する。次に、この核酸プールから、標的分子に親和性をもつ配列を選別するが、この操作にはこれまで様々な方法が開発されている。一般に、標的分子のみを用いて親和性をもつ核酸を選別する場合、最終的に得られたアプタマーの中には、非標的分子にも親和性を持つ（抗体で言う“cross reactivity”）アプタマーが存在することも珍しくない。そのため、用いることが想定される多種類の分子が混合されているようなサンプルにおいて、標的分子には親和性をもつが非標的分子に親和性を持たないというアプタマーを、対向選別法（Counter Selection）によって選別することも行われている。
【０００５】
その例として、２０００年にScott D Seiwertらによって報告（非特許文献２：Chemistry & Biology, 7, 833-843 (2000)）された、同じタンパク質のリン酸化状態を１０倍の親和性の違いで識別するアプタマーがある。これは、はじめリン酸化状態のタンパク質ppERK2に結合するＲＮＡを選別し、同時に非標的タンパク質として、リン酸化されていないタンパク質ERK2に選別されたＲＮＡを導入して、それに結合しなかったＲＮＡを回収する、という目的のＲＮＡアプタマーを取得するものである。
【０００６】
他方、ヒト幹細胞を用いた分化細胞の製造も、ヒトiPS細胞の発明によって大きく前進したが、そこでの課題として、化学物質による分化誘導で産生した分化細胞は、決して同一の細胞の集団ではなく、発現しているイオンチャンネルや細胞表面タンパク質等の物質が少しずつ異なるヘテロな細胞集団であり、現状におけるこのような分化誘導の手法での細胞分化制御についての限界が課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Science, 249, 505-510 (1990)
【非特許文献２】Chemistry & Biology, 7, 833-843 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、従来の核酸から作成したアプタマーは、細胞表面の標識抗原物質の同定をするためのマーカーとして用いたり、あるいは、この標的物質をターゲットにした細胞精製のためのプローブとして用いられて来たが、in vitro 計測で用いる細胞の機能を制御するためのツールとしての利用はなされていない。
【０００９】
また、分化誘導によって作成したヘテロな細胞集団の状態を制御する技術として、従来は、たとえばイオンチャンネルの機能制御には、特定のイオンチャンネルに結合する薬剤を用いてイオンチャンネルの動作、機能を制御することがなされて来たが、この手法を用いると、薬剤が添加された細胞培養液中のすべての細胞の状態を同一にブロックする等の制御となってしまい、異なる制御操作によって異なる状態に制御された細胞を同じ培養液中で用いることは難しかった。
【００１０】
あるいは、上記特定のイオンチャンネル等をブロックする薬物による同一の機能を発現している細胞の状態をそれぞれ異なる細胞表面のターゲット分子の機能制御手法によって同一培養環境内で、異なる機能を示す細胞として共存させることは難しかった。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、従来の手法では困難であった、細胞の機能状態をさまざまな状態に制御して、この制御された細胞を同一の環境内で、異種の機能細胞として共存させて利用する方法を提案することである。
また、細胞培養中に、細胞の状態を変化させる手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、以下を提供する。
［１］（ｉ）標的細胞または標的細胞の集団を準備し、上記標的細胞の細胞表面に発現している標的分子に特異的に結合する核酸または核酸誘導体もしくは核酸修飾体を上記標的細胞の表面に発現している上記標的分子に特異的に結合させて、核酸修飾細胞を作製する工程、
（ｉｉ）上記標的細胞の表面に発現している上記標的分子に特異的に結合しなかった核酸を除去する工程、
（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）からの核酸修飾細胞に対して、上記標的細胞の細胞表面に発現している、上記標的分子とは異なる標的分子に特異的に結合する核酸または核酸誘導体あるいは核酸修飾体を用いて、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）を行う工程、
（ｉｖ）上記工程（ｉ）および（ｉｉ）の操作、または上記工程（ｉｉｉ）の操作を繰り返すことによって作製した２種類以上の異なる核酸修飾細胞を、共通の細胞培養環境中の培養基板上で、上記各核酸修飾細胞の空間配置を制御して配列して細胞ネットワークを構築する工程、
を含む、細胞機能制御方法。
［２］さらに、
（ｖ）上記工程（ｉｖ）で培養している上記核酸修飾細胞の上記標的分子に特異的に結合する上記核酸または上記核酸誘導体もしくは上記核酸修飾体を分解させる核酸分解酵素を上記細胞培養環境中に導入する工程、を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記核酸が一本鎖核酸またはアプタマーである、上記［１］または［２］に記載の細胞機能制御方法。
［４］上記標的細胞が、心筋細胞、神経細胞、線維芽細胞、グリア細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、または幹細胞である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞機能制御方法。
［５］上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載の細胞機能制御方法により作製された核酸修飾細胞を含む細胞ネットワーク。
［６］上記［５］に記載の細胞ネットワークを使用して細胞機能を検査する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、特定の細胞の特定のターゲット分子に結合するＤＮＡ鎖等の核酸鎖を短時間で修飾する事で、機能制御を行った細胞を簡便に得ることができる。また、異なる機能を持った標的細胞を基板上に配置し、配置後に細胞表面の機能制御に用いたＤＮＡ鎖等の核酸鎖を任意の時間にヌクレアーゼにより除去することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１は本発明の細胞表面の特定の標的分子に特異的に結合する機能を有する１本鎖ＤＮＡ等の核酸または核酸誘導体あるいは核酸修飾体を用いた細胞機能制御方法を説明するフロー図である。本発明において対象とする細胞には、心筋細胞、神経細胞、線維芽細胞、グリア細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、幹細胞等種々の細胞が含まれるがこれらに限定されない。また、本発明において対象とする細胞表面に発現する分子には、受容体タンパク質、表面抗原、イオンチャンネルタンパク質等種々の分子が存在するがこれらに限定されない。ここではイオンチャンネルタンパク質を例に説明する。すなわち、細胞１０１表面の標的イオンチャンネルタンパク質１０２１，１０２２，１０２３等の分子に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡ等の核酸または核酸誘導体あるいは核酸修飾体１０３１，１０３２，１０３３を、それぞれの細胞に修飾して、標的イオンチャンネルタンパク質１０２１，１０２２，１０２３等の分子の機能を制御した後、これら異なる細胞１０１１，１０１２，１０１３を、同一の細胞培養基板１０４上に配置して、簡便に機能の異なる細胞を同一の細胞培養環境に空間分布を制御して配置する本発明の方法の過程の一例を示している。本明細書中、「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むものとする。ここで核酸鎖については、主にＤＮＡ鎖を例に説明を行うが、対象はＤＮＡ鎖、ＲＮＡ鎖、または核酸誘導体あるいは核酸修飾体などのタンパク質分解酵素によって分解されないが核酸鎖分解酵素（ヌクレアーゼ）によって分解することができるものである。
【００１５】
なお、アプタマーのような核酸鎖は、生体中に存在する核酸分解酵素の作用を受けて分解しやすいことから、核酸鎖を修飾して核酸鎖に分解耐性を与える方法が種々開発されている（例：特開２０１０−１１５１７７）。例えば、ヌクレアーゼ耐性の向上については、SELEX法でアプタマーを得た後で化学修飾（例：フッ素化、PEG化、etc.）を施すという方法、あるいは予め核酸分子に化学修飾を施した人工核酸のライブラリの中からアプタマーを選別する方法等が開発されている（特開２００４−２３８３５３；ＷＯ２０１０／０２１３４４；Kuwahara et al., Nucleic Acids Res., (2008), 36, 4257）。あるいは、核酸鎖の主鎖の五員環や5'または3'末端での主鎖の一部をSやNで置換することによってヌクレアーゼ耐性を付与することもできる（例：DNAやRNAの糖部分のO (酸素) をS (硫黄) で置き換えた4’-チオDNAやRNA）（松田  彰「ヌクレアーゼ抵抗性化学修飾核酸の開発研究」薬学雑誌, 2011, 131, 285-298. DOI:10.1248/yakushi.131.285）。
【００１６】
本明細書中、「核酸誘導体」または「核酸修飾体」とは、ヌクレアーゼ耐性を向上させるための化学修飾が施された核酸鎖のことをいうものとする。
【００１７】
本明細書中、ある核酸があるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その核酸が、そのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して、他の（タンパク質またはその断片の）アミノ酸配列に対する親和性よりも、実質的に高い親和性で不可逆的に結合することを意味し、これは抗原抗体反応において抗体分子が抗原分子に結合する事と同意である。ここで、「実質的に高い親和性」とは、当業者に利用可能な所望の測定装置または方法によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００１８】
図１に示すように、本発明の方法によれば、細胞１０１の表面に発現した複数の異なる種類の分子１０２１，１０２２，１０２３に対してそれぞれ特異的に結合する核酸鎖（以降アプタマーと呼ぶ）１０３１，１０３２，１０３３を結合させて、機能が異なる細胞１０１１，１０１２，１０１３を作ることができる。ここで、本実施例では、細胞にそれぞれ１種類のアプタマーを結合させ、異なる一種類の細胞表面分子が機能制御された細胞を作成しているが、それぞれの細胞について別の種類の核酸鎖を用いて同様の工程を繰り返す事で、たとえば分子１０２１と１０２２にそれぞれ特異的に結合する核酸鎖を結合させて２つの分子をともに機能制御した細胞を作成して用いても良い。
【００１９】
次に、この工程によって細胞１０１から作成した細胞１０１１，１０１２，１０１３をチップ１０４上に、たとえばそれぞれの種類の細胞を帯状に配置して異なる機能細胞の領域とこれらの境界が存在する細胞シートあるいは細胞ネットワークを作成することができる。また、本手法では、アプタマーの核酸分解酵素を添加することで、細胞の機能を制御していたアプタマーを分解して、細胞の機能をもとの状態に戻す事ができる。
【００２０】
このように本手法の特徴は同一のチップ１０４上に異なる機能制御を行われた細胞を共存させることができることにある。特定のイオンチャンネルを特異的にブロックする薬剤等を用いても、特定のイオンチャンネル分子のブロックは実現できるが、その場合には、この溶液と接するすべての細胞が等しくイオンチャンネルブロックをされてしまい、図１のチップ１０４に示したような、１つのチップ上に機能状態の異なる細胞を共存させることはできない。
【００２１】
図１のチップ１０４では、細胞１０１１、１０１２、１０１３をシート状に分布させた状態を模式的に示したが、図２では、その他の細胞の配置技術の例として、図２（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）では、心室筋型に分化した心筋細胞２０１１と、心筋細胞２０１１のK１イオンチャンネルに特異的に結合するアプタマーによってK１イオンチャンネルをブロックした膜電位が上昇して不安定化した心筋細胞２０１２を組み合わせて１細胞単位でネットワークを構築したものである。このように一般の心室筋細胞では豊富に発現しているK１イオンチャンネルをブロックする事で、擬似的にプルキンエ細胞あるいはＨｉｓ細胞のような細胞膜のインピーダンスが高く自律拍動能を持つ異なる特性を持った細胞２０１２を、同一の心室筋細胞２０１１から作り、かつ、同一の細胞ネットワークの中で擬似的に異種細胞として用いることができる。
【００２２】
図３は、本手法を神経細胞ネットワークに用いたものである。神経細胞ネットワークにおいて細胞間の化学物質の伝導の機能を構成的に解明する事は重要であるが、特定の分泌物質だけを伝達させることは難しかった。図３では、模式的に、本課題を解決する手法を説明する。たとえば結合した２つの神経細胞３０１、３０２について、その２つの細胞を結合するシナプス３０３の表面に存在する２つの伝達物質３０４、３０５を放出する機能を有しているとき、培養液中に伝達物質３０５をブロックするアプタマーを混入させて神経伝達の実験を行い、伝達物質３０４のみの伝達特性を計測した後、アプタマー分解酵素を導入することによって、本来、分泌されるはずであった伝達物質３０５がリリースされ、その応答を計測することができる。
【００２３】
以上、本発明の例示的実施形態を説明したが、種々の変更、改変、および改良が当業者に容易に想起される。上記は、本発明の原理を例示的に示したものに過ぎず、当業者であれば、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変を為し得る。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
本発明によれば細胞表面の標的分子に特異的に結合するＤＮＡ鎖等の核酸鎖を修飾する事で容易に異種細胞を得ることができるので、創薬、医療分野の研究発展に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】細胞表面のさまざまな標的分子に特異的に結合するＤＮＡ鎖等の核酸鎖を用いて機能的に異種細胞を製作し、これを空間配置する手法の手順を示した模式図である。
【図２】アプタマーによるイオンチャンネルブロックによって異種心筋細胞を空間配置した例を示した図である。
【図３】神経細胞ネットワークを用いた例を示した模式図である。
【符号の説明】
【００２６】
１０１、１０１１、１０１２、１０１３…細胞
１０２１、１０２２、１０２３…細胞表面の標的分子
１０３１，１０３２，１０３３…標的分子に結合するＤＮＡ鎖等の核酸鎖
２０１１、２０１２…心筋細胞
３０１、３０２…神経細胞
３０３…シナプス結合
３０４、３０５…神経伝達物質
【図１】
2013202018.tif 000003
【図２】
2013202018.tif 000004
【図３】
2013202018.tif 000005