(57)【要約】【課題】複数検体の塩基配列を、各検体と配列を対応付けて一度に決定する方法【解決手段】複数からなる核酸検体を特定の組み合わせで混合したグループを複数作成し、各グループ特有のＩｎｄｅｘ配列を付与した後に、次世代シーケンサー（あるいは超並列シーケンサー、NGS）を用いて配列解析を行い、検体相当部分が同一の配列について、付与されているＩｎｄｅｘ配列の組み合わせパターンに基づいて各検体と対応付けを行い、同一検体に対応付けられた配列群をアセンブルすることで、各検体とその配列を対応付けて一度に決定する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数からなる核酸検体（プラスミドＡ,Ｂ,Ｃ,Ｄ）のそれぞれに対して、複数のＩＤ（１,２,３,４）を同一の組み合わせにならないように付与し（Ａ=１＆２、Ｂ=１＆３,Ｃ=２＆４,Ｄ=３＆４）、同一のＩＤを有する検体を合わせたサブグループを構成し（分割・混合：１=Ａ+Ｂ,２=Ａ+Ｃ,３=Ｂ+Ｄ,４=Ｃ+Ｄ）、各サブグループを断片化し、各サブグループを構成する核酸にサブグループ特有のＩｎｄｅｘ配列（１=AA,２=CT,３=CG,４=AT、Ｉｎｄｅｘ結合）を付与した後、全てを混合して配列解析を行い（混合シーケンス）、得られた配列をＩｎｄｅｘ配列に応じて分類することで各検体との対応付けを行い（Ｉｎｄｅｘに応じてグループ化：Ａ=AA+CT,Ｂ=AA+CG,Ｃ=AT+CT,Ｄ=AT+CG）、対応付けられた配列をアセンブルすることで各検体の塩基配列を決定する方法。（括弧内は４サンプル同時解析を例示した図２の場合を示す）
【請求項２】
請求項１における検体数が、ｎ０個の検体と、（aのｎ乗−ｎ0）個のモック検体から構成されるaのｎ乗個の検体である、塩基配列の決定方法。
【請求項３】
請求項２におけるサブグループの構成方法が、Ｘ番目の検体について（Ｘ−１）をa進数で表記し、各桁と各数値の組み合わせをＩＤとみなして、各桁ごとに同一の数値を有する検体をまとめて１つのサブグループとすることを、全ての桁について繰り返すことと同義の操作からなる、塩基配列の決定方法。
【請求項４】
請求項３におけるａが２、あるいは２の倍数である、塩基配列の決定方法。
【請求項５】
請求項１における得られた配列をＩｎｄｅｘ配列に応じて分類することで各検体との対応付けを行う方法が、同一配列に付与された種々のＩｎｄｅｘ配列の組み合わせと、検体に付与されたＩＤの組み合わせとの照合により成される、塩基配列の決定方法。
【請求項６】
請求項１における核酸検体がＤＮＡもしくはＲＮＡである、塩基配列の決定方法。
【請求項７】
請求項１における配列解析技術が次世代シーケンサーを用いたものである、塩基配列の決定方法。
【請求項８】
請求項１におけるＩｎｄｅｘ配列がＤＮＡ、ＲＮＡもしくはその混合物質である、塩基配列の決定方法。
【請求項９】
請求項８におけるＩｎｄｅｘ配列がパリティー因子を含む、塩基配列の決定方法。
【請求項１０】
請求項１から５に、請求項６から９記載の方法を任意に組み合わせた、塩基配列の決定方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法を計算機により実行する際の、コンピュータープログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の核酸検体を特定の組み合わせで混合したサブグループを作成し、各サブグループ特有のＩｎｄｅｘ配列を付与した後に、超並列シーケンサーを用いて配列解析を行い、得られた配列をＩｎｄｅｘ配列に応じて分類したものをアセンブルすることで、各検体と配列を対応付けて決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
次世代シーケンサーは並列処理により一度に大量の配列を出力することが出来るが、検体を混合して反応を行うため、検体と出力配列を対応付けることが出来ない。そのため、ゲノム解析やトランスクリプトーム解析など１検体に由来するＤＮＡ、ＲＮＡの解析や、メタゲノム解析などポピュレーションを明らかにすることを目的とした解析に用いられる（図１）。
【０００３】
一方、次世代シーケンサーの解析力を有効に利用するため、検体を処理する際に数塩基から十数塩基からなる人工的な塩基配列（Ｉｎｄｅｘ）を付与することで検体と出力配列を対応付け、多検体処理を行う方法としてマルチプレックス法が知られているが、並列可能な数は数十検体にとどまる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】細胞工学 ２０１１年８月号 次世代シークエンサーを使いこなす  基礎の基礎
【非特許文献２】細胞工学 ２０１１年８月号 次世代シークエンサーを使いこなす  マルチプレックス法によるバクテリアゲノムのｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ配列解読
【非特許文献３】細胞工学 ２０１１年８月号 次世代シークエンサーを使いこなす  マルチプレックス法によるバクテリアゲノムのｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ配列解読
【非特許文献４】Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  Ｉｎｔ．  ２０１１  Ｊｕｎ；６０（２）：１９９−２０２．  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｍａｒ  ２１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ．
【非特許文献５】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；１０（３）：Ｒ２５．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｍａｒ  ４．  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、Ｉｎｄｅｘ付与方法の改良によりマルチプレックス法を超える多検体化を達成し、次世代シーケンサーの解析力を有効に利用する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、Ｉｎｄｅｘ付与方法と次世代シーケンサーから出力される配列の解析方法を鋭意検討した結果、各サンプルを特定の組み合わせで混合した後、元サンプル数の根に比例する数へ圧縮された各混合サンプルにＩｎｄｅｘを付与して次世代シーケンサーにより塩基配列を取得し、出力された配列から混合前の配列を検体のＩＤと対応付けて復元する方法を見出し、本発明を完成した（図２）。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の態様からなる。
【０００８】
（１）複数からなる核酸検体（プラスミドＡ,Ｂ,Ｃ,Ｄ）のそれぞれに対して、複数のＩＤ（１,２,３,４）を同一の組み合わせにならないように付与し（Ａ=１＆２、Ｂ=１＆３,Ｃ=２＆４,Ｄ=３＆４）、同一のＩＤを有する検体を合わせたサブグループを構成し（分割・混合：１=Ａ+Ｂ,２=Ａ+Ｃ,３=Ｂ+Ｄ,４=Ｃ+Ｄ）、各サブグループを断片化し、各サブグループを構成する核酸にサブグループ特有のＩｎｄｅｘ配列（１=AA,２=CT,３=CG,４=AT、Ｉｎｄｅｘ結合）を付与した後、全てを混合して配列解析を行い（混合シーケンス）、得られた配列をＩｎｄｅｘ配列に応じて分類することで各検体との対応付けを行い（Ｉｎｄｅｘに応じてグループ化：Ａ=AA+CT,Ｂ=AA+CG,Ｃ=AT+CT,Ｄ=AT+CG）、対応付けられた配列をアセンブルすることで各検体の塩基配列を決定する方法。（括弧内は４サンプル同時解析を例示した図２の場合を示す）
【０００９】
（２）上記（１）における検体数が、ｎ０個の検体と、（aのｎ条−ｎ0）個のモック検体から構成されるaのｎ条個の検体である、塩基配列の決定方法。
【００１０】
（３）上記（２）におけるサブグループの構成方法が、Ｘ番目の検体について（Ｘ−１）をa進数で表記し、各桁と各数値の組み合わせをＩＤとみなして、各桁ごとに同一の数値を有する検体をまとめて１つのサブグループとすることを、全ての桁について繰り返すことと同義の操作からなる、塩基配列の決定方法。
【００１１】
（４）上記（３）におけるａが２、あるいは２の倍数である、塩基配列の決定方法。
【００１２】
（５）上記（４）における得られた配列をＩｎｄｅｘ配列に応じて分類することで各検体との対応付けを行う方法が、同一配列に付与された種々のＩｎｄｅｘ配列の組み合わせと、検体に付与された付与されたＩＤの組み合わせとの照合により成される、塩基配列の決定方法。
【００１３】
（６）上記（１）における核酸検体がＤＮＡもしくはＲＮＡである、塩基配列の決定方法。
【００１４】
（７）上記（１）における配列解析技術が次世代シーケンサーを用いたものである、塩基配列の決定方法。
【００１５】
（８）上記（１）におけるＩｎｄｅｘ配列がＤＮＡ、ＲＮＡもしくはその混合物質である、塩基配列の決定方法。
【００１６】
（９）上記（８）におけるＩｎｄｅｘ配列がパリティー因子を含む、塩基配列の決定方法。
【００１７】
（１０）上記（１）から（５）に、上記（６）から（９）記載の方法を任意に組み合わせた、塩基配列の決定方法。
【００１８】
（１１）上記（１１）記載の方法を計算機により実行する際の、コンピュータープログラム。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、１回の次世代シーケンサー解析で、使用するＩｎｄｅｘ数の累乗に相当する検体数の配列を決定することが可能となる（図１、図２）。
【００２０】
例えば、２０種類のＩｎｄｅｘ配列を用いることで、２の１０乗、すなわち１，０２４検体の配列を、４０種類のＩｎｄｅｘ配列を用いることで、２の２０乗、すなわち１，０４８、５７６検体の配列を、検体と出力配列の対応情報を保持した状態で、１回の次世代シーケンサー解析で決定することが出来る。
【００２１】
具体的には、これまでキャピラリー法で行われていたプラスミドＤＮＡの塩基配列解析を、当該発明と次世代シーケンサーの組み合わせで置き換えることが可能であり、その結果、費用対効果の大幅な向上が見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】発明の効果
【図２】発明概要
【図３】検体混合方法の概要
【図４】パリティーとは
【図５】発明概要（２）
【図６】実施例（１）に用いた塩基配列のアクセッション番号
【図７】実施例（１）で用いた混合グループの構成
【図８】実施例（１）復元率
【図９】実施例（１）復元率
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２４】
本発明において次世代シーケンサーとは、近年開発された、並列処理によって飛躍に解析能力を向上させた一群の塩基配列解析装置で、具体的には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社ＨｉＳｅｑ２０００、Ｒｏｃｈｅ社Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ライフテクノロジー社Ｉｏｎ ＰＧＭ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ等を指す（非特許文献１）が、今後開発される装置も含み、ここに示したもの限定されるものではない。
【００２５】
本発明において核酸検体とは、同一配列からなるＤＮＡあるいはＲＮＡ分子の集合体である。すなわち、大腸菌を用いた系で増幅およびクローニングされたプラスミドが当てはまる。核酸検体はＰＣＲ産物でもよい。また上記の同一配列とは、完全に一致した配列だけではなく、部分的に同一の配列も含む分子の集合体も含む。さらに、一定量のコンタミネーションを含んでいてもよい。
【００２６】
核酸検体の混合方法について、図３と以下に例示するが、ここに示すもの限定されるものではない。
【００２７】
検体数をｎ0とした場合、ａを整数の定数として、aのｎ乗>ｎ0となる最少のｎを求め、（aのｎ乗−ｎ0）個のモック検体を加えることで０番から（aのｎ乗−１）番からなるaのｎ乗個の検体を準備し、Ｘ番目の検体について（Ｘ−１）をa進数で表記し、各桁と各数値の組み合わせをＩＤとみなして、各桁ごとに同一の数値を有する検体をまとめて１つのサブグループとして混合する。
【００２８】
以下にａ＝２の場合における具体例を表１と共に示すが、混合方法は例示した方法に限定されるものではない。
【００２９】
＃０から＃２のｎ乗‐１までの２のｎ乗種類からなる核酸サンプルを並列解析する場合、以下のルールに基づいて検体の混合を行う。
【００３０】
検体番号を２進数で表記し、ｋ桁目の数値が０ならば混合グループＩＤ（２×（ｎ−ｋ）＋１）、１ならば混合グループＩＤ（２×（ｎ−ｋ）＋２）を付与することを、１からｎを満たす全てのｋについて繰り返し行う。
【００３１】
例えば、ｎ＝３の時、総検体数は８で、検体番号＃６の検体は、２進法で１１０と表記され、３桁目の数は１なので、（２×（３−３）＋２）＝２、２桁目の数は１なので、（２×（３−２）＋２）＝４、１桁目の数は０なので、（２×（３−１）＋１）＝５となり、結果、検体番号＃６には、混合グループＩＤ２，４，５が付加されることになる。逆に、ＩＤ２を付加される検体は、検体＃６（１１０）、検体＃７（１１１）、検体＃５（１０１）、検体＃４（１００）なので、これらをまとめた混合検体を作成する。
【００３２】
２ｎ種類からなる核酸検体を上記のルールによって２ｎ種類の混合検体に編成したものを、次世代シーケンサーを用いた既知マルチプレックス法（非特許文献２）に供し、塩基配列を取得する。
【００３３】
この時に用いるＩｎｄｅｘにはパリティー塩基を付与することが出来る（図４）。
【００３４】
塩基配列の再構成を以下の様に行う（図２、図５）。
【００３５】
次世代シーケンサーから出力された配列にはＩｎｄｅｘが付与されており、Ｉｎｄｅｘに基づいて配列と混合ＩＤを対応付けすることができる。
【００３６】
２ｎ種類からなる核酸検体を２ｎ種類の混合検体に編成した後に並列解析する場合、例えば、混合ＩＤ０，２，４，・・・，２ｎ−２には検体番号＃０が含まれている。同様に、混合ＩＤ０，２，４，・・・，２ｎ−１には検体番号＃１が含まれている。
【００３７】
すなわち、検体番号＃０由来の配列には、混合ＩＤ０，２，４，・・・，２ｎ−２に相当するＩｎｄｅｘが付与されている。同様に、検体番号＃１由来の配列には、混合ＩＤ０，２，４，・・・，２ｎ−１に相当するＩｎｄｅｘが付与されている。
【００３８】
逆に、同一の配列に付与されていたＩｎｄｅｘを集計し、その分布を解析することで、元々の検体番号を特定することができる。
【００３９】
例えば、次世代シーケンサーから出力されたある塩基配列に混合ＩＤ１，３，５，・・・，２ｎ−２に相当するＩｎｄｅｘが付与されていた場合、その配列は検体番号＃０を構成する配列であることが解る。同様に、ある配列に混合ＩＤ２，４，５，・・・，２ｎ−１に相当するＩｎｄｅｘが付与されていた場合、その配列は検体番号＃１を構成する配列であることが解る。
【００４０】
元々の検体番号に対応付けられた次世代シーケンサーからの出力配列を基にアセンブラーでコンティグを作成することで、各サンプルの塩基配列を得ることができる。ここでアセンブラーはＡＢｙＳＳ（非特許文献３）あるいはＶｅｌｖｅｔ等を用いてもよいが、それらに限らない。
【００４１】
次世代シーケンサーからの出力配列は適宜短縮して上記の解析に供しても良い。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を持って本発明の実施の態様を説明するが、これは単なる例示であり本発明を何等制限するものではない。
【００４３】
（実施例１）計算機による模擬解析
１，０６６配列からなるクリプトスポリジウムパルバムの既知完全長ｃＤＮＡ配列を模擬解析の対象配列とした。この配列は、サンガー法で明らかにされた配列断片、および、次世代シーケンサーを用いたショットガン解析により明らかにされた１８，３０８，２５０個の配列断片（アクセッション番号：ＳＲＸ００４５３６〜ＳＲＸ００４５３８）を、既知のクリプトスポリジウムパルバムのゲノム配列と比較することで決定されたものである（非特許文献４）。
【００４４】
本実施例では、請求項２に記載のａを２に、ｎを８とし、上記１，０６６配列の中から２５６配列を選択した（図６）。また、上記１８，３０８，２５０断片配列の中から２５６配列に相当する５，４７４，１６４断片配列を選抜し、以降に用いた。
【００４５】
本実施例では、当該発明に基づいた処理により、上記５，４７４，１６４断片配列から２５６配列を再構成することを、計算機を用いた模擬解析により試みた。
【００４６】
対象となる２５６配列を図７に示す組み合わせで混合することで、１６グループを構成した。すなわち各配列は８種類のグループに属することになる。
【００４７】
マッピングツールであるＢｏｗｔｉｅ（非特許文献５）を用いることで、上記５，４７４，１６４断片配列を対象となる２５６配列に対応付け、さらにこれらを上記の８グループにランダムに割り振った。これは模擬解析に特有の操作であり、実解析ではＩｎｄｅｘ配列に基づく処理に置き換えられる。また、５’側の４塩基をＩｎｄｅｘ相当配列として除去し、残った３２塩基を続く解析に用いた。
【００４８】
解析対象の３２塩基を連続する２２塩基を単位として抽出することで、１配列から１１配列のサブセットを作成した。
【００４９】
同一配列を有する２２塩基の配列を集計し、それらに付与されていたＩｎｄｅｘ配列のパターンを解析することで、その２２塩基が２５６配列のうちのどの配列に由来するものかを推定した。
【００５０】
２５６配列のそれぞれについて、対応付けられた２２塩基の配列を集計し、アセンブラーであるＡＢｙＳＳ（非特許文献３）によりコンティグの作成を行った。
【００５１】
作成されたコンティグ配列を元の配列を比較することにより、復元度を見積もった。
【００５２】
ここで復元度は、（最大長コンティグの長さ／元の配列の長さ）で定義する。
【００５３】
その結果、当該方法により大部分の配列が復元できることが示された。すなわち、２５６配列のうち、９９%以上の領域を復元できたものが１０４配列、９５%以上の領域を復元できたものが１６０配列、９０%以上の領域を復元できたものが１９９配列となる成績が得られた。詳細を図８および図９に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
これまでキャピラリー法で行われていたプラスミドＤＮＡの塩基配列解析を、当該発明と次世代シーケンサーの組み合わせで置き換えることが可能であり、その結果、費用対効果の大幅な向上が見込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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