(57)【要約】【課題】試料を像表示するための方法および光学顕微鏡装置において、ドリフトによって生じる結像の不正確性を簡単に且つ確実に回避できるようにする。【解決手段】前記光学顕微鏡装置において、像処理ユニットは、一連の個別像の撮影中に、イメージドリフトを生じさせる温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を測定する少なくとも１つの温度センサ（５０，５２，５４，５６，５８，６０）と、測定した前記温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を記憶する記憶モジュール（３０２）と、所定の関連付けデータ（４００）を用いて前記イメージドリフトを生じさせる温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を、温度に依存するドリフト量（ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ）に関連付ける関連付けモジュール（３０８）と、前記ドリフト量（ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ）を用いて、検出した重心位置（８２，８４，８６）を修正する修正モジュール（３１０）とを含んでいる。【選択図】図２
2013008030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結像光学系（４０）とイメージセンサ（２８）とを含んでいる光学顕微鏡装置（１００）を使用した試料（１６）を像表示するための方法であって、
前記結像光学系（４０）を用いて前記イメージセンサ（２８）に前記試料（１６）をシーケンシャルに結像させることによって一連の個別像を撮影し、
その際に各試料（１６）の撮影のため、前記結像光学系（４０）を用いて、空間的に互いに分離可能な光分布（８２）の形態で前記イメージセンサ（２８）にマーカーを結像させることのできるマーカーパターンを前記試料（１６）にそれぞれ備えさせるステップと、
それぞれの個別像において結像されるマーカーを表わす、前記光分布（８２）の重心位置（８４，８６，８８）を検出するステップと、
検出した前記重心位置（８４，８６，８８）を重畳させて前記試料（１６）の全体像を形成させるステップと、
を含んでいる前記方法において、
前記一連の個別像を撮影している間に、イメージドリフトを生じさせる温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を測定し、
前記イメージドリフトを生じさせる温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）に、所定の関連付けデータ（４００）を用いて、温度に依存するドリフト量（ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ）を関連付け、
検出した前記重心位置（８４，８６，８８）を前記ドリフト量（ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ）を用いて修正する、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記関連付けデータ（４００）を実験的に特定して前記光学顕微鏡装置（１００）に記憶させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記関連付けデータ（４００）を特定するため、少なくとも１つの参照マーカーを備えた参照パターンを作成し、
前記イメージドリフトを生じさせる温度量を複数の参照温度値に調整し、
各参照温度値ごとに前記参照パターンの参照個別像を撮影し、その際前記参照パターンの前記参照マーカーを前記結像光学系を用いて参照光分布の形態で前記イメージセンサに結像させ、
各参照温度値ごとに前記参照光分布の参照重心位置を検出し、
前記参照温度値に依存する前記参照重心位置の変化から、前記温度に依存するドリフト量を特定する、
ことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記光学顕微鏡装置（１００）の少なくとも１つの構成要素（１２，１４，４２）の温度を、前記イメージドリフトを生じさせる温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）として測定することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記温度を、試料テーブル（１４）の内部または表面、および／または、前記結像光学系（４０）のために設けられている保持装置（４２）の内部または表面、および／または、前記試料テーブル（１４）を載置するスタンド（１２）の内部または表面で測定することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
測定した前記温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を慣性修正値ぶんだけ変化させ、前記ドリフト量（ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ）を、変化させた前記温度量に基づいて特定することを特徴とする、請求項１から５までのいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
前記慣性修正値を、測定した前記温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）が時間的に変化する変化率に依存して調整することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試料（１６）を結像させるための結像光学系（４０）と、
前記結像光学系（４０）によって生成させた、結像されるマーカーを表わす個々の光分布（８２）を、互いに空間的に切り離して検出するためのイメージセンサ（２８）と、
それぞれの個別像において結像される前記マーカーを表わす前記光分布（８２）の重心位置を検出するための検出モジュール（３０６）と、検出した重心位置（８２，８４，８６）を重畳させて前記試料（１６）の全体像を形成させる重畳モジュール（３１２）とを備えた像処理ユニットと、
を備えた、請求項１から７までのいずれか一つに記載の方法を実施するための光学顕微鏡装置（１００）において、
前記像処理ユニットが、さらに、
一連の個別像の撮影中に、イメージドリフトを生じさせる温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を測定する少なくとも１つの温度センサ（５０，５２，５４，５６，５８，６０）と、
測定した前記温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を記憶する記憶モジュール（３０２）と、
所定の関連付けデータ（４００）を用いて前記イメージドリフトを生じさせる温度量（ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ）を、温度に依存するドリフト量（ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ）に関連付ける関連付けモジュール（３０８）と、
前記ドリフト量（ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ）を用いて、検出した前記重心位置（８２，８４，８６）を修正する修正モジュール（３１０）と、
を含んでいることを特徴とする光学顕微鏡装置（１００）。
【請求項９】
前記関連付けデータ（４００）が記憶されている不揮発性データメモリー（３１４）が設けられていることを特徴とする、請求項８に記載の光学顕微鏡装置（１００）。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの温度センサが、試料テーブル（１４）の内部または表面に配置されている第１の温度センサ（５０，５２，５４）、および／または、前記結像光学系（４０）のために設けられる保持装置（４２）の内部または表面に配置されている第２の温度センサ（５６）、および／または、前記試料テーブル（１４）が載置されているスタンド（１２）の内部または表面に配置されている第３の温度センサ（６０）とを含んでいることを特徴とする、請求項８または９に記載の光学顕微鏡装置（１００）。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの温度センサのうちの１つの温度センサ（６０）が、前記光学顕微鏡装置（１００）の表面に取り付けられるセンサ本体（６２）と、該センサ本体（６２）に接続し、前記光学顕微鏡装置（１００）の内部と熱連結されている温度ピックアップ（６４）とを有していることを特徴とする、請求項８から１０までのいずれか一つに記載の光学顕微鏡装置（１００）。
【請求項１２】
前記結像光学系（４０）が試料テーブル（１４）に装着される保持装置（４２）で保持されていることを特徴とする、請求項８から１１までのいずれか一つに記載の光学顕微鏡装置（１００）。
【請求項１３】
前記試料テーブル（１４）に装着され、前記保持装置（４２）と連結される、前記結像光学系（４０）の光軸（Ｏ）に沿って前記保持装置を移動させるアクチュエータ（４４）が設けられていることを特徴とする、請求項１２に記載の光学顕微鏡装置（１００）。
【請求項１４】
前記保持装置（４２）が前記結像光学系（４０）の光軸（Ｏ）に関し実質的に回転対称に構成されていることを特徴とする、請求項１３に記載の光学顕微鏡装置（１００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の上位概念に記載の、光学顕微鏡装置を使用して試料を像表示するための方法、および、請求項８の上位概念に記載の光学顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
いくつかのマーカーの、特に蛍光分子のシーケンシャルな確率論的な局在化をベースにして、古典的な光学顕微鏡の回折による解像限界よりも小さな試料を表示させる光学顕微鏡結像システムが最近になって開発された。このような方法はたとえば特許文献１−５および非特許文献１−２から知られている。顕微鏡のこの新たな部門は局在化顕微鏡とも呼ばれる。使用される方法は文献中でたとえば(F)PALM ((Fluorescence) Photoactivation Localization Microscopy),  PALMIRA (PALM with Independently Running Acquisition),  GSD(IM) (Ground State Depletion Individual Molecule return) Microscopy) or (F)STORM ((Fluorescence) Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)という名称で知られている。
【０００３】
これらの新規な方法に共通していることは、結像すべき試料にマーカーで感光性を与えることである。マーカーは２つの異なる状態を提供し、すなわち「明」状態と「暗」状態とを提供する。たとえばー蛍光色素をマーカーとして使用する場合には、明状態は蛍光状態であり、暗状態は非蛍光状態である。試料に結像光学系の古典的な解像限界よりも高い解像度を備えさせるため、マーカーの少分量を再三明状態へ移行させる。この「アクティブな」分量はマーカーパターンを形成し、その個々の、明状態に移行したマーカーは、結像光学系の解像限界よりも大きな平均間隔を互いに有している。次に、それぞれのマーカーパターンを、個々のマーカーを空間的に切り離し可能な光分布の形態で検出する空間解像性イメージセンサに結像させる。
【０００４】
このようにして多数の個別像が撮影され、これら個別像のそれぞれには他のマーカーパターンが形成されている。その後、像分析プロセスにおいて、各個別像内で光分布の重心位置が特定される。光分布の重心位置は明状態にあるマーカーを表わしている。次に、生データ個別像から検出した光分布の重心位置を集めて全体像の形態で全体表示する。この全体表示によって生じる高解像度全体像は、マーカーの分布を表わしている。
【０００５】
結像すべき試料の代表再生を行うには、十分に多くのマーカー信号を検出しなければならない。しかしながら、それぞれのアクティブなマーカーパターン内部のマーカーの数量は、明状態にある２つのマーカーが互いに維持しなければならない最小平均間隔によって制限されているために、試料を完全に結像させるには、かなり多くの個別像を撮影しなければならない。典型的には、１００００ないし１０００００個の範囲の個別像を撮影する必要がある。
【０００６】
１つの個別像を撮影すために必要な時間は、下限をイメージセンサの最大像撮影効率によって制限されている。このため、全体表示のために必要な一連の個別像に対しては比較的長い全撮影時間を要する。従って、全撮影時間が数時間に及ぶことがある。
【０００７】
この長い全撮影時間にわたって結果的に熱作用が発生し、たとえば光学顕微鏡の機械的構成要素の熱膨張、収縮或いはひずみが発生して、結像すべき試料を結像光学系に対し相対的にドリフトさせる。高解像度の全体像を作成するために、重心特定後にすべての個別像をまとめるので、２つの連続する個別像の撮影中に試料と結像光学系との間に相対運動が生じれば、全体像の空間解像度を悪化させる。
【０００８】
以下では、上述した問題点を図１を用いて説明する。
【０００９】
図１は従来の倒立光学顕微鏡１０の概略構成図である。光学顕微鏡１０はスタンド１２を有し、スタンド１２には試料テーブル１４が載置されている。試料テーブル１４上には試料ホールダ１５が装着され、試料ホールダ１５上に、結像すべき試料１６が配置されている。
【００１０】
試料１６は、試料テーブル１４の上方に配置されている光源１７によって照射される。光源１７は回動アーム１８に取り付けられている。回動アーム１８にはホールダ２０も取り付けられ、ホールダ２０は図１には図示していない種々の光学システムを含んでおり、これらの光学システムはたとえば標準的な透過光照明または位相コントラスト照明のような種々の照明モードを実現させるために用いる。このため、ホールダ２０内にそれぞれの照明モードのために設けられる光学システムを図１で２２で示した照明光路内へ回動させる。光源１７から放出される照明光は、ホールダ２０の下面に装着されているコンデンサ２３を介して試料１６へ誘導される。試料１６の操作を容易にするため、回動アーム１８を前述の光学システムとともに試料テーブル１４から離間するように傾動させることができる。
【００１１】
試料テーブル１４の下方には、複数個の対物レンズ２６を担持している電動式の対物レンズレボルバー２４が設けられている。対物レンズ２６は、図１においてＯで示した光軸のまわりに対物レンズレボルバー２４を回転させることにより、光軸Ｏによって設定される結像光路内へ選択的に回動可能である。結像光路内を回動した対物レンズ２６は、試料１６を、試料テーブル１４内に形成されている貫通穴１９を通じてイメージセンサ２８へ結像させる。イメージセンサ２８は、イメージセンサ２８を制御するセンサドライバー２９に接続されている。センサドライバー２９はイメージセンサ２８によって受信されるセンサ信号から像信号を形成させて、更なる像処理を可能にする。
【００１２】
顕微鏡スタンド１２は制御器３０（たとえばコンピュータ）と連結され、制御器３０を介して顕微鏡の機能および特に像処理を制御することができる。このため、制御器３０はセンサドライバー２９によって生成された像信号を受信する。制御器３０はモニター３２に接続され、モニター３２上には、手動で処理された像信号を生じさせる試料像が表示される。試料像は接眼レンズ３４を介して補助的に観察することができる。
【００１３】
図１の光学顕微鏡１０の場合、対物レンズレボルバー２４はＵ字状のスタンド１２に取り付けられており、その結果イメージドリフトを生じさせるうえで決定的な、結像対物レンズ２６と試料１６との間の間隔は比較的大きい。このように、試料１６は、試料ホールダ３４と試料テーブル１４とＵ字状のスタンド１２と対物レンズレボルバー２４とを介して対物レンズ２６と接続されている。前記の比較的大きな間隔のために、図１の光学顕微鏡１０は特に前記間隔にわたっていわば合計した熱的不安定性に対し抵抗力がない。このような熱的不安定性は、周囲空気の温度変動或いは光学顕微鏡１０自体の温度変動（たとえば発熱性の電子部品により発生する）に起因している。温度変動が生じると、たとえば、試料１６と対物レンズ２６の位置を保持している金属性構成部材のサイズが熱膨張または収縮により変化し、これによって試料１６と対物レンズ２６との間で相対運動が生じる。
【００１４】
高解像度局在化顕微鏡（その解像度は２０ｎｍの値以下であることが多い）の分野でこのような熱的不安定性がいかに問題であるかを以下に説明する。顕微鏡の金属製構成部材の製造の際に典型的に使用される材料としてのアルミニウムは、２３・１０−６Ｋ−１以上の熱膨張率を有している。たとえば、図１に図示した光学顕微鏡１０において、イメージドリフトを生じさせるうえで決定的な、試料１６と対物レンズ２６との間隔が１０ｃｍであり、且つこの間隔がアルミニウムから成っている顕微鏡構成部材を介して生じるものであると仮定すると、１Ｋ温度変化するごとに２．３μｍだけ機械的なドリフトが生じる。この温度変化を前述の空間解像度との関連で見ると、温度変動が撮影品質をかなり損なわせることは明らかである。
【００１５】
図１に図示した光学顕微鏡１０の場合、ドリフトを発生させる熱源は、例えば電子構成要素から成っていてスタンド１２を加熱するセンサドライバー２９内に設けられている。同様のことは、たとえば対物レンズレボルバー２４を回転させるために用いる電動式構成部材に対しても言える。さらに、光源１７もホールダ２０内に設けられている機械的アクチュエータも、結像品質に悪影響を与える熱を発生させる。
【００１６】
熱で発生するドリフトを回避するため、特許文献６では、温度変動を検出する温度センサを光学顕微鏡に装着することが提案されている。この温度変動を介して、試料を結像させる間に試料テーブルを移動させてドリフトを補償するようにモータを制御するための調整量が決定される。像撮影中に行われる試料テーブルの位置制御は技術的に比較的複雑である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２７６９２Ａ２号パンフレット
【特許文献２】独国特許第１０２００６０２１３１７Ｂ３号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／１２８４３Ａ１号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０１３４３４２Ａ１号明細書
【特許文献５】独国特許第１０２００８０２４５６８Ａ１号明細書
【特許文献６】国際公開第２００４／０３４１２４Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】M.J.Rust, M.Bates, X. Zhuang著  "Subdiffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM)", Nature Methods 3, 793-796 (2006)
【非特許文献２】Geisler C. et al著  "Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching", Appl. Phys. A, 88, 223-226 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の課題は、冒頭で述べた種類の、試料を像表示するための方法および光学顕微鏡装置において、ドリフトによって生じる結像の不正確性を簡単に且つ確実に回避できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、この課題を、前記方法に対しては請求項１の構成によって解決し、前記装置に対しては請求項８の構成によって解決する。
【００２１】
有利な他の構成はそれぞれの従属項に記載されている。
【００２２】
本発明によれば、一連の個別像を撮影している間、イメージドリフトを発生させる温度量が測定される。このイメージドリフトを発生させる温度量には、所定の関連付けデータを用いて、温度に依存するドリフト量が関連付けられる。最後に、イメージセンサ上に生じる光分布から検出される重心位置がドリフト量を用いて修正される。この修正された重心位置は重畳されて試料の１つのドリフトのない全体像が形成される。
【００２３】
本発明は、使用する方法においては、試料の像表示のために使用される重要な像情報は、それぞれの個別像の撮影の間に集められる生データ自体の中に含まれているのではなく、（通常は本来の測定後に）この生データから得られる重心位置の中に含まれていることを利用する。これにより、ドリフト修正を追加的に行うことが可能であり、すなわち個別像を表わす生データの撮影後に行うことが可能である。これは、たとえば検出したドリフト量に対応して個別像自体を追加的にシフトさせる場合よりも明らかに簡単である。というのは、後者の場合、かなりの像処理コストを要するからである。
【００２４】
このように、本発明によれば、本来の測定中にドリフト運動を許容し、生データから得られる重心位置を考慮してドリフト運動を追加的に修正することが可能になる。
【００２５】
このため、測定中に、すなわち個別像を撮影している間に、イメージドリフトを発生させる温度量を記録し、記憶させる。これは連続的にまたは所定の時間間隔で行うことができる。いずれにしろ重要なことは、温度量を後で、すなわち本来の測定が終了した後に、それぞれの個別像に関連付け、よってこの個別像から得られる重心位置に関連付けることができるように、温度量を像撮影中に記録することである。測定中に記録した温度量から、ドリフト修正のベースとなる温度に依存するドリフト量を特定することができる。
【００２６】
本発明の認識は、とりわけ、光学顕微鏡の構成部材内部に温度を誘発するドリフト運動が典型的には高程度に再現可能な挙動を示す点にある。具体的な幾何学的状況に依存して、且つ光学顕微鏡の製造に使用される材料に依存して、顕微鏡の構成部材は温度変動の影響で頻繁に移動し、この点は予測可能である。この運動の大きさも運動方向も予測可能である。この再現可能な挙動という認識は、本発明によれば、温度量を温度に依存するドリフト量に関連付ける関連付けデータを作成するために利用する。この関連付けデータに基づいて、個別像の撮影中に測定した温度量に対応的に温度に依存するドリフト量を関連付けることができ、このドリフト量を用いて、撮影後に、検出した重心位置を修正することができる。
【００２７】
好ましくは、関連付けデータを実験的に特定して光学顕微鏡装置に記憶させる。合目的には、たとえば、本来の像撮影の前段階で、一連の測定を１回実施して、温度量に依存するドリフト量を特定し、次にたとえばテーブル、較正曲線等の形態でこれを記憶する。関連付けデータは、例えば顧客に装置を提供する前に好ましくは１回だけ検出し、後でドリフト量の検出のために使用する。
【００２８】
関連付けデータを特定するため、好ましくは、少なくとも１つの参照マーカーを備えた参照パターンを作成する。次に、イメージドリフトを生じさせる温度量を複数の参照温度値に調整する。次に、各参照温度値ごとに参照パターンの参照個別像を撮影し、その際参照パターンの参照マーカーを結像光学系を用いて参照光分布の形態で前記イメージセンサに結像させる。各参照温度値ごとに参照光分布の参照重心位置を検出する。参照温度値に依存する参照重心位置の変化から、温度に依存するドリフト量を特定する。この有利な構成では、このようにして関連付けデータは、後で光学顕微鏡装置を本来の像撮影のために作動するようにした方法に実質的に対応する方法に従って検出される。これにより、関連付けデータの中に含まれているドリフト量が予想されるイメージドリフトを正確に反映するよう保証されている。
【００２９】
好ましくは、光学顕微鏡装置の少なくとも１つの構成要素の温度を、イメージドリフトを生じさせる温度量として測定する。これとは択一的に、または、これに加えて、周囲温度を温度量として検出してもよい。しかしながら、光学顕微鏡においてダイレクトに温度を測定することは、イメージドリフトに影響する状況をより正確に検出することを可能にする。
【００３０】
有利な他の構成では、温度を、試料テーブルの内部または表面、および／または、結像光学系のために設けられている保持装置の内部または表面、および／または、試料テーブルを載置するスタンドの内部または表面で測定する。これらの構成部材はいずれも、結像すべき試料または結像光学系に間接または直接に連結されている。従って、熱によって生じるこれら構成部材の運動は光学顕微鏡の結像能を著しく悪化させる。測定中にこれら構成部材の温度を測定し、測定した温度に依存して重心位置の修正を行うことにより、熱で誘導される像ずれを特に確実に補償することができる。温度測定はそれぞれの構成部材の表面および／または内部で行ってよい。有利には、温度測定はたとえば、イメージドリフトを生じさせる温度変動を光学顕微鏡の内部または表面に生じさせる熱源が設けられている個所で行う。特に、電動駆動部が設けられている個所がよい。
【００３１】
有利な構成では、測定した温度量を慣性修正値ぶんだけ変化させ、ドリフト量を、変化させた温度量に基づいて特定する。この構成は、特に、温度測定をそれぞれの構成部材の表面でのみ行う場合に有利である。これにより、構成部材の表面で温度測定を行うと、該構成部材のイメージドリフトに決定的な温度状況を、特にその慣性を十分正確に反映しないという状況が考慮される。従って、たとえば、構成部材の表面に装着された温度ピックアップ（熱絶縁されずに直接外気に触れている）が短時間で光学顕微鏡の周囲の温度変動を検出するものの、構成部材の熱的慣性のために温度変動が対応するイメージドリフトに置換されないことが考えられる。すなわち前記構成では、イメージドリフトに決定的な構成部材の熱的挙動を正確に再現して適当なドリフト量を検出するために、構成部材の熱的慣性が追加的にいわばシミュレートされる。これにより、すでに作動している光学顕微鏡装置に本発明に従って追装備することがより簡単になる。というのは、前述のように慣性修正を適用すると、場合によっては、ドリフトに対し抵抗力のない構成部材の表面にだけ温度ピックアップを取り付ければ十分であり、それにもかかわらず正確なドリフト修正が得られるからである。
【００３２】
好ましくは、慣性修正値を、測定した温度量が時間的に変化する変化率に依存して調整する。たとえば、非常に短時間の温度変動は、本発明によればイメージドリフトに影響しないので、修正ドリフト量を検出する際に測定される温度量の時間的平均値だけでは十分考慮できないことが考えられる。
【００３３】
本発明によるほ法を実施するために特定された光学顕微鏡装置の有利な構成では、関連付けデータが記憶されている不揮発性データメモリーが設けられている。この不揮発性データメモリには、たとえば光学顕微鏡装置の使用開始前に実験的に特定した関連付けデータをファイルすることができ、光学顕微鏡装置の本来の作動時に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
次に、本発明を図面を用いて詳細に説明する。
【図１】従来の光学顕微鏡の図である。
【図２】本発明による光学顕微鏡の１実施形態を示す図である。
【図３】像撮影中に測定した温度値に基づいてドリフトずれ値を関連付ける関連付けテーブルの図である。
【図４】本発明による方法の１実施形態を示すフローチャートである。
【図５】図４の方法で実施する像処理のフローチャートである。
【図６】互いに連続し、それぞれ個々のマーカーの検出した光分布を示す複数個の個別像の図である。
【図７】図６に図示した、重心位置特定後の個別像の図である。
【図８】２つの個別像の撮影中に生じるイメージドリフトの作用を説明する図である。
【図９】図８の両個別像の、本発明に従ってイメージドリフトを修正した後の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図２は、本発明による装置の実施形態としての光学顕微鏡１００を示している。以下では、光学顕微鏡１００の構成要素および構成のうち、図１に記載した従来の光学顕微鏡１０と異なる構成要素および構成のみを説明することにする。光学顕微鏡１００の構成要素のうち、図１に記載の装置ですでに設けられていた構成要素には、図１で使用した参照符号を付し、以下では再度説明しないことにする。
【００３６】
光学顕微鏡１００が図１に図示した顕微鏡１０と異なるのは、まず、対物レンズ２６を保持している電動対物レンズレボルバー２４に加えて、他の撮影対物レンズ４０が設けられていることである。撮影対物レンズ４０はホールダ４２で保持され、該ホールダ４２は試料テーブル１４の下面に装着されている圧電アクチュエータ４４と連結されている。ホールダ４２は光軸Ｏに関し実質的に回転対称に構成されている。試料テーブル１４に回動可能に保持されている圧電アクチュエータ４４を用いると、ホールダ４２を、よって撮影対物レンズ４０を光軸Ｏに沿って移動させて、撮影対物レンズ４０を試料１６に対し合焦させることができる。
【００３７】
付加的な撮影対物レンズ４０は、対物レンズレボルバー２４で保持されている対物レンズ２６に対し、像撮影中に予想されるイメージドリフトに関して利点があり、すなわち撮影対物レンズ４０は、顕微鏡スタンド１２を介して試料テーブル１４と連結されているのではなく、ホールダ４２とアクチュエータ４４のみを介して、試料１６を担持する試料担持体１５が設けられている試料テーブル１４と連結されている。従って、撮影対物レンズ４０と試料１６とを結ぶ距離は、対物レンズレボルバー２４で保持されている対物レンズ２６と試料１６とを結ぶ距離よりも著しく短い。さらに、ホールダ４２も、光軸Ｏに関し回転対称に構成されているために、イメージドリフトの減少に貢献している。というのは、この構成により、たとえば、光軸Ｏのまわりで撮影対物レンズ４０に作用する熱的ひずみが互いに解消し合うからである。
【００３８】
しかしながら、以下でさらに詳細に述べる本発明による解決手段は、撮影対物レンズ４０がホールダ４２とアクチュエータ４４とを介して試料テーブル１４に装着されている図２の実施形態に限定されるものではなく、たとえば図１に図示したような従来の配置構成に対しても適用することができる。
【００３９】
光学顕微鏡１００には、種々の個所に温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０が配置されている。詳細には、温度センサ５０と５２はテーブルプレート１４の上面にして貫通穴１９の両側に装着されている。温度センサ５４は試料テーブル１４の貫通穴１９内に取り付けられ、温度センサ５６はホールダ４２に装着されている。温度センサ５８は試料テーブル１４への移行部に位置するように顕微鏡スタンド１２内に取り付けられている。温度センサ６０は顕微鏡スタンド１２の外面に取り付けられている。
【００４０】
温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０としては、温度を評価可能な量、好ましくは電気量に変換するのに適していれば任意の構成要素を使用することができる。例としては、その電気抵抗が温度ともに変化する構成要素、たとえば温度が上昇すると電気抵抗が減少するＮＴＣサーミスタ、或いは、温度が上昇すると電気抵抗が増大すＰＴＣサーミスタが挙げられる。また、温度に依存してダイレクトに処理可能な電気信号を発する構成要素、例えば半導体温度センサも使用可能である。
【００４１】
温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０は、光学顕微鏡１００の、像撮影中の温度測定が温度依存のイメージドリフトの検出を可能にする（後述する）個所に、配置されている。なお、図２に図示した温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０の配置は単に一例にすぎず、実際には、実際の幾何学的状況および光学顕微鏡の温度変動に対する具体的な抵抗力に応じて選定される。特に、個々のケースでは、試料テーブルおよび対物レンズに装着される調整機構の温度変動に対する抵抗力が考慮される。
【００４２】
図２に図示した実施形態では、温度センサ５０，５２，５４，５６，５８は光学顕微鏡１００の上面に取り付けられ、或いは、少なくとも上面付近に取り付けられている。詳細には、温度センサ５０と５２は試料テーブル１４の上面の温度を測定するように設けられている。これに対し、貫通穴１９に取り付けられている温度センサ５４は、試料テーブル１４の中央領域の温度を検出する。温度センサ５６はホールダ４２の温度を検出する。温度センサ５８は熱を発生する顕微鏡スタンド１２と試料テーブル１４との間の移行部の温度を測定する。
【００４３】
これに対し、温度センサ６０は、顕微鏡スタンド１２の内部の温度を測定する。これに対応して、温度センサ６０は、顕微鏡スタンド１２の表面に取り付けられたセンサ本体６２と、該センサ本体に接続している温度ピックアップ６４とを有している。温度ピックアップ６４は顕微鏡スタンド１２の内部に挿着されてそこで温度を測定する。もう一度述べるが、この配置構成は一例にすぎず、たとえば温度センサ６０に対応するセンサを試料テーブル１４および／またはホールダ４２に装着することも考えられる。また、温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０の一部のみを、たとえば１つのセンサのみを、イメージドリフトを誘導する温度変動を検出するために設けることも考えられる。
【００４４】
光学顕微鏡１００は制御器３００（たとえばコンピュータ）に接続されている。制御器３００は、センサドライバ２９から提供された像信号をベースにして顕微鏡の機能および像処理を制御するために用いる。このため、制御器３００は種々の処理モジュール３０２，３０４，３０６，３０８，３１０，３１２を含んでおり、これらの処理モジュールは温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０と協働して像処理ユニットを形成している。像処理ユニットの機能については後述する。この像処理ユニットは、制御器３００内部に設けられている非揮発性データメモリ３１４に記憶されている関連付けデータを活用する。
【００４５】
図３には、データメモリ３１４内に含まれている、前記の関連付けデータの一例としてデータテーブル４００が図示されている。データテーブル４００には温度量ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎが記載され、これらにはそれぞれＸ方向のずれ値ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎおよびＹ方向のずれ値ΔＹ１，ΔＹ２，．．．，ΔＹｎが関連付けられている。温度値ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎはそれぞれ所定の参照温度に対する温度変動を表わしている。ずれ値ΔＸ１，ΔＸ２，．．．，ΔＸｎおよびずれ値ΔＹ１，ΔＹ２，．．．，ΔＹｎは、その都度温度変動ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎがあったときに予想されるイメージドリフトの結果変位する、イメージセンサ２８で生じる光分布から検出される重心位置を中心にしたＸ方向またはＹ方向のずれを表わしている。なお、本実施形態では、Ｘ方向およびＹ方向は、撮影対物レンズ４０の像面に対し平行で且つ互いに垂直に延びる方向を表わしている。
【００４６】
データテーブル４００内に記載されている関連付けデータは、光学顕微鏡１００を使用開始する前に実験的に求めたものであり、非揮発性メモリ３１４に記憶されている。光学顕微鏡１００の使用を開始すると非揮発性メモリ３１４が作動して、以下に述べるドリフト修正が行われる。
【００４７】
なお、図３に図示したデータテーブル４００はあくまでも一例であり、たとえば較正曲線のような任意の他の形態のデータテーブルも可能である。また、Ｘ方向およびＹ方向の２次元のずればかりでなく、光軸Ｏに沿ったＺ方向でのそれぞれの重心位置の変位を表わす３次元のずれも考慮することができる。
【００４８】
次に、図４のフローチャートを参照して、本発明による方法を実施するための１実施形態を説明する。
【００４９】
ステップＳ１で制御変数を値ゼロでもって初期化した後、工程はステップＳ２ないしＳ６によって形成されるループに入る。まずステップＳ２で制御変数を値１だけ増やす。
【００５０】
ステップＳ３では、前記のループに初めて入るときに、第１のマーカーパターンを作成する。冒頭で述べたように、このようなマーカーパターンは、マーカー（たとえば蛍光色素）の全体から一部のみを作動させること、すなわち明状態へ移行させることを特徴としている。このマーカーパターンに含まれているマーカーは、撮影対物レンズ４２の解像限界よりも大きな平均間隔を互いに有している。
【００５１】
ステップＳ４では、図２に図示した温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０を用いて温度を測定して記憶させる。この温度を記憶させたるため、本実施形態では、像処理ユニット３００内に含まれている機能ユニット３０２を使用する。
【００５２】
次にステップＳ５で、試料１６を撮影対物レンズ４２によってイメージセンサ２８へ結像させることににより、マーカーパターンで作成した試料１６の個別像を撮影する。センサドライバ２９は、イメージセンサ２８によって受信したセンサ信号から像信号を発生させ、該像信号はイメージメモリとして機能する機能モジュール３０４内に記憶される。
【００５３】
ステップＳ６では、制御変数ｉが最大値ｉｍａｘよりも小さいか等しいかを照会する。小さいか等しければ、ステップＳ２へ戻り、その結果次の個別像のために前述のような方法ステップを実施する。これに対し制御変数ｉが最大値ｉｍａｘよりも大きければ、ステップＳ７へ進む。
【００５４】
ステップＳ２ないしＳ６に従って個別像の完全なシーケンスを処理した後、ステップＳ７で個別像の像処理を行う。ステップＳ７による像処理では、以下に説明するドリフト修正を行う。
【００５５】
ステップＳ８では、ドリフト修正した個々の個別像を重畳して１つの全体像を形成し、モニター３２上に全体像を表示する。
【００５６】
図５のフローチャートには、ステップＳ７で実施する像処理の一例が図示されている。
【００５７】
ステップＳ１１で制御変数ｉをゼロに初期化した後、ステップＳ１２ないしＳ１７によって形成されるループに入る。このループは順次すべての個別像に対し実施する。
【００５８】
まずステップＳ１２で、制御変数を値１だけ増やす。次にステップＳ１３で、機能モジュール３０６は機能モジュール３０４に記憶されている像信号から、ｉ番目の個別像の重心位置を特定する。この場合機能モジュール３０６は、像信号により表わされる光分布を適当に分析することにより、公知の態様で重心位置の特定を行う。
【００５９】
ステップＳ１４では、機能モジュール３０８は、処理された個別像に対しステップＳ４で測定され機能モジュール３０２に記憶されている温度値を提供し、次にステップＳ１５で、データメモリ３１４に記憶されているデータテーブルを参照して、前記測定した温度値に関連付けられるＸ方向およびＹ方向のずれ値を求める。
【００６０】
その後、ステップＳ１６で、機能モジュール３１０は、ステップＳ１５で求めた温度に依存するずれ値を用いて重心位置を修正する。その後、機能モジュール３１２はこれら修正した重心位置を、ステップＳ８で全体像を表示するために援用する。
【００６１】
ステップＳ１７では、制御変数ｉが最大値ｉｍａｘよりも小さいか等しいかをチェックする。制御変数ｉが最大値ｉｍａｘよりも小さければ、再びステップＳ１２に戻り、ステップＳ１３ないしＳ１６で行ったドリフト修正を次の個別像のために繰り返す。これに対し制御変数ｉが最大値ｉｍａｘよりも大きければ、すべ他の個別像に対するドリフト修正を終了し、図４のステップＳ８を続ける。
【００６２】
図４および図５に図示した実施形態では、それぞれ１つの個別像に対し、検出した重心位置をそれぞれ、温度に依存する同じずれ値でもって修正し、すなわち与えられた温度では、各個別像に対し、ただ１つのＸ方向のずれ値とただ１つのＹ方向のずれとが設けられているにすぎない。しかしながら、各重心位置に対し適当な関連付けデータを準備することにより、温度に依存する別個のずれ値を設けてもよい。これは、たとえば、イメージドリフトが個別像の全体にわたって統一的に表示されるのではなく、個別像の種々の個所でイメージドリフトが異なっている場合に有利である。
【００６３】
図４および図５の実施形態で説明したモードは、個別像を像処理する前に、すなわちそれぞれの個別像の重心位置を特定し、次に温度にいぞ成するずれ値で修正する（ステップＳ７、ステップＳ１２、ステップＳ１７）前に、個別像の完全シーケンスが撮影されるモードである。しかしながら、像処理をいわば「オンライン」で行い、すなわち各個別像を撮影した後に直接重心位置を特定し、その後重心位置を、温度に依存するずれ値でもって修正するようにしてもよい。
【００６４】
さらに、図４および図５に図示した実施形態では、各個別像の撮影中に温度を測定し記憶していた（ステップＳ４）。しかしながら、これは必ずしも必要でない。温度は１つの個別像の撮影に必要な時間に比べて通常はゆっくりと変化するので、温度をより大きな時間間隔で測定し、その間に存在する個別像に対しては、簡単に最後の測定温度値を利用することも可能である。
【００６５】
図３に図示したデータテーブルは、ドリフト修正のためにただ１つの個別像を利用し、すなわち図２に図示した温度センサ５０，５２，５４，５６，５８，６０のうちの１つの温度センサの検出信号を使用するケースのために設けられている。しかしながら、複数個の温度センサを、よって複数個の温度値を適当な関連付けデータを介してドリフト修正のために利用するようにしてもよい。
【００６６】
図６ないし図９は、結像すべき試料１６と撮影対物レンズ４０との間の相対運動の結果として熱により生じるイメージドリフトを本発明による方法によっていかに阻止できるかをもう一度説明するものである。なお、図を簡潔にするため、結像すべき試料構造は３つの同心の円形レンズから成っているものとする。これらの円形レンズは図６ないし図９において８０で示してある。
【００６７】
図６には、左から右へ連続する生データ個別像が図示され、この生データ個別像には、それぞれ１つの他のアクティブなマーカーパターンが結像されている。アクティブなマーカーは、生データ個別像では膨張した光分布８２のように見え、その大きさは撮影対物レンズ４０の解像限界によって決定される。図６からわかるように、光分布８２はそれぞれ互いに平均間隔を有しており、この間隔は光分布８２の大きさを特定する解像限界よりも大きい。
【００６８】
図７は、図６の生データ個別像から光分布８２の重心位置８４をいかに求めるかを説明する図である。
【００６９】
図８は、たとえば２つの連続する生データ個別像の撮影中に生じる結像すべき試料構造８０と撮影対物レンズ４０との間の相対運動の結果、全体像の空間解像度がいかに悪化するかを説明する図である。なお、説明のみを目的として用いるこの例では、第１の生データ個別像から特定される重心位置を円８６で示し、後で撮影される第２の生データ個別像から特定される重心位置を正方形８８で示した。また、生データ個別像の撮影中に測定される、これら両生データ個別像の温度は、異なる値を有するものとする。
【００７０】
図８は、熱で生じるイメージドリフトが第１の生データ個別像に対し第２の生データ個別像を変位させることを示している。これに対応して、第２の生データ個別像から導出される重心位置８６はそれぞれ位置ずれを有しており、この位置ずれは結果的に、両個別像から組み立てられる全体像の空間解像度を悪化させる。図８の例では、位置ずれをΔＸで示した。
【００７１】
図９には、重心位置８６と８８から組み立てられる全体像のドリフト修正後のものが図示されている。この例では、検出した図８の重心位置が図３に例示したような関連付けデータを参照してずれ値で修正されることで、位置ずれΔＸを修正する点に本発明によるドリフト修正の特徴が見られる。図９からわかるように、ドリフト修正した全体像は、ドリフト修正していない全体像よりも高空間解像度を備えた試料構造８０を反映している。
【符号の説明】
【００７２】
１６          試料
２８          イメージセンサ
４０          結像光学系
８２          光分布
８４，８６，８８      光分布の重心位置
１００        光学顕微鏡
４００        関連付けデータ
ΔＴ１，ΔＴ２，．．．，ΔＴｎ      イメージドリフトを生じさせる温度量
ΔＸ１，ΔＸ２，．．．ΔＸｎ；ΔＹ１，ΔＴ２，．．．ΔＹｎ      温度に依存するドリフト量
【図１】
2013008030.tif 000003
【図２】
2013008030.tif 000004
【図３】
2013008030.tif 000005
【図４】
2013008030.tif 000006
【図５】
2013008030.tif 000007
【図６】
2013008030.tif 000008
【図７】
2013008030.tif 000009
【図８】
2013008030.tif 000010
【図９】
2013008030.tif 000011