(57)【要約】【課題】  光で遺伝子発現を制御する新たな手段を提供する。【解決手段】  BLUFタンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、転写因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、前記遺伝子を前記非ヒト生物内で発現させる工程、前記非ヒト生物へ照射される青色光によって転写因子の機能を制御する工程を有することを特徴とする転写因子の機能制御方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（４）の工程を有することを特徴とする転写因子の機能制御方法、
（１）BLUFタンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、
（２）BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、転写因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、
（３）（２）の遺伝子を（１）の非ヒト生物内で発現させる工程、
（４）（３）の非ヒト生物へ照射される青色光によって転写因子の機能を制御する工程。
【請求項２】
以下の（１）〜（４）の工程を有することを特徴とする請求項１に記載の転写因子の機能制御方法、
（１）BLUFタンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、
（２）BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、ドミナントネガティブ型の転写因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、
（３）（２）の遺伝子を（１）の非ヒト生物内で発現させる工程、
（４）青色光を非ヒト生物に照射することにより、ドミナントネガティブ型の転写因子を機能させ、それにより、内在性の転写因子を機能させないか、または、青色光を非ヒト生物に照射しないことにより、ドミナントネガティブ型の転写因子を機能させず、それにより内在性の転写因子を機能させる工程。
【請求項３】
以下の（１）〜（４）の工程を有することを特徴とする請求項１に記載の転写因子の機能制御方法、
（１）BLUFタンパク質と、転写因子の一部分との融合タンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、
（２）BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、前記転写因子の残りの部分との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、
（３）（２）の遺伝子を（１）の非ヒト生物内で発現させる工程、
（４）青色光を非ヒト生物に照射することにより、転写因子の一部分と残りの部分とを結合させず、それにより転写因子を機能させないか、または、青色光を非ヒト生物に照射しないことにより、転写因子の一部分と残りの部分とを結合させ、それにより転写因子を機能させる工程。
【請求項４】
BLUFタンパク質がPixDであり、BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質がPixEであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の転写因子の機能制御方法。
【請求項５】
BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域が、配列番号２に示したアミノ酸配列における第1〜256番目のアミノ酸残基からなる領域に相当する領域を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の転写因子の機能制御方法。
【請求項６】
非ヒト生物が、ゼブラフィッシュであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の転写因子の機能制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青色光の照射によって転写因子の機能を制御する方法に関する。本発明の方法により、簡便な操作で、時間的及び空間的分解能の高い遺伝子発現制御が可能になる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現を人工的に制御する技術は、IPTGやテトラサイクリンといった薬剤添加や温度等の摂動を加える方法が主流である。しかしその方法では、遺伝子発現誘導の時間的、空間的分解能が低いことが問題であった。光で遺伝子発現を制御する系として、Caged法がある（非特許文献１）。この方法では、光照射で解除することのできる修飾を加えたmRNAをゼブラフィッシュの胚に注入することで達成される。その後、任意の時間に光をあてるとその場所でだけ、導入したmRNAに依存した翻訳や翻訳の抑制が起こる。しかしこの方法では、１）スイッチをOFFにできない、２）導入したmRNAが細胞分裂に伴って希釈されるため発生後期では用いることができない、等の問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ando et al. 2001 Nature Genet. 28:317
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上述したCaged法の問題を解消し、光で遺伝子発現を制御する新たな手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
シアノバクテリアで見つかった光受容体PixDは、別のタンパク質であるPixEと光依存的に相互作用する（暗所で相互作用し、青色光照射下では相互作用しない）（Okajima et al. 2005 J. Biochem. 137:741; Masuda et al. 2008 Plant Cell Physiol. 49:1600; Yuan & Bauer 2008 PNAS 105:11715）。
【０００６】
本発明者は、まず、PixEのPixDとの相互作用部位がN末端領域であることを明らかにし、更に、PixEのN末端部分をゼブラフィッシュの転写因子に融合させ、そのキメラ遺伝子を、PixDを恒常的に発現するゼブラフィッシュ内に導入すると、１）暗所でその転写因子の活性が阻害されること、２）青色光照射によりその阻害が解除されること、を見出した。そして、これらの知見から、前記した系を利用すれば、PixEのN末端領域をゼブラフィッシュの任意の転写因子と融合させるだけで、その転写因子の機能を青色光依存的に制御できるという発想を得、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
〔１〕以下の（１）〜（４）の工程を有することを特徴とする転写因子の機能制御方法、
（１）BLUFタンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、
（２）BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、転写因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、
（３）（２）の遺伝子を（１）の非ヒト生物内で発現させる工程、
（４）（３）の非ヒト生物へ照射される青色光によって転写因子の機能を制御する工程。
〔２〕以下の（１）〜（４）の工程を有することを特徴とする〔１〕に記載の転写因子の機能制御方法、
（１）BLUFタンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、
（２）BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、ドミナントネガティブ型の転写因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、
（３）（２）の遺伝子を（１）の非ヒト生物内で発現させる工程、
（４）青色光を非ヒト生物に照射することにより、ドミナントネガティブ型の転写因子を機能させ、それにより、内在性の転写因子を機能させないか、または、青色光を非ヒト生物に照射しないことにより、ドミナントネガティブ型の転写因子を機能させず、それにより内在性の転写因子を機能させる工程。
〔３〕以下の（１）〜（４）の工程を有することを特徴とする〔１〕に記載の転写因子の機能制御方法、
（１）BLUFタンパク質と、転写因子の一部分との融合タンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、
（２）BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、前記転写因子の残りの部分との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、
（３）（２）の遺伝子を（１）の非ヒト生物内で発現させる工程、
（４）青色光を非ヒト生物に照射することにより、転写因子の一部分と残りの部分とを結合させず、それにより転写因子を機能させないか、または、青色光を非ヒト生物に照射しないことにより、転写因子の一部分と残りの部分とを結合させ、それにより転写因子を機能させる工程。
〔４〕BLUFタンパク質がPixDであり、BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質がPixEであることを特徴とする〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の転写因子の機能制御方法。
〔５〕BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域が、配列番号２に示したアミノ酸配列における第1〜256番目のアミノ酸残基からなる領域に相当する領域を含むことを特徴とする〔１〕乃至〔４〕のいずれかに記載の転写因子の機能制御方法。
〔６〕非ヒト生物が、ゼブラフィッシュであることを特徴とする〔１〕乃至〔５〕のいずれかに記載の転写因子の機能制御方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の転写因子の機能制御方法は、従来法に比べ、例えば、以下のような有利な効果を持つと考えられる。
１）遺伝子発現を調節する際に、薬剤添加や温度変化等の物理的な刺激が必要ない。
２）簡便な遺伝子組換え操作により達成できる。
３）安価なLED光源による照射で遺伝子発現制御を行うことができる。
４）任意の時間に任意の期間発現誘導を行うことができる。
５）光源を工夫することで、任意の箇所に対し局所的に発現誘導を行うことができる。
６）組換え転写因子遺伝子を染色体に組み込めば、いかなる発生段階の胚でも遺伝子発現誘導を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】酵母ツーハイブリッド実験用コンストラクトの模式図。図中の数字はアミノ酸残基の位置を表す。
【図２】酵母ツーハイブリッド実験の結果を示す図。
【図３】酵母ツーハイブリッド実験用コンストラクトと実験の結果を示す図。図中の数字はアミノ酸残基の位置を表す。
【図４】Ntl-EnRを機能させたゼブラフィッシュを示す図。
【図５】青色光によってゼブラフィッシュの尻尾を形成する遺伝子を制御する原理を示す図。
【図６】青色光によって尻尾形成を制御可能なゼブラフィッシュの作製方法を示す図。
【図７】PixD遺伝子を導入したゼブラフィッシュ及びその後代のゲノムPCRの結果を示す図。
【図８】PixE_del1-Ntl-EnRをコードするmRNAを注入したゼブラフィッシュを示す図。
【図９】PixE_del1-Ntl-EnRをコードするmRNAの濃度と尻尾のないゼブラフィッシュの出現割合との関係を示す図。
【図１０】青色光照射又は非照射下における尻尾のないゼブラフィッシュの出現割合を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の転写因子の機能制御方法は、BLUFタンパク質を発現する非ヒト生物を作製する工程、BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域と、転写因子との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する工程、前記遺伝子を前記非ヒト生物内で発現させる工程、前記非ヒト生物へ照射される青色光によって転写因子の機能を制御する工程を有することを特徴とするものである。
【００１２】
BLUF（blue-light using FAD）タンパク質は、フラビンを発色団として持つ青色光受容体タンパク質であり、PixD（Okajima et al. 2005 J. Biochem. 137: 741）、AppA（Masuda & Bauer 2002 Cell 110: 613）、PapB（Kanazawa et al. 2010 Biochemistry 49: 10647）などが知られている。本発明においては、これらいずれのBLUFタンパク質を使用してもよいが、PixDを使用することが好ましい。
【００１３】
PixDとしては、例えば、シネコシスティス（Synechocystis）属由来のPixD、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）属由来のPixDなどが知られている。シネコシスティス属由来のPixDのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、それぞれ配列番号２及び１に示す通りである。また、サーモシネココッカス属由来のPixDのアミノ酸配列も公知であり、データベース上で公開されている（NC_004113.1）。使用するPixDとしては、前記したいずれのPixDでもよいが、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるシネコシスティス属由来のPixDが好ましい。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、BLUFタンパク質としての機能を有するタンパク質や配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して高い同一性（例えば、90％以上の同一性、好ましくは95％以上の同一性、更に好ましくは98％以上の同一性）を有するアミノ酸配列からなり、BLUFタンパク質としての機能を有するタンパク質をPixDとして使用してもよい。
【００１４】
BLUFタンパク質を発現させる生物の種類は限定されず、動物、植物、微生物のいずれであってもよい。BLUFタンパク質は、フラビンと結合してその機能を発揮するが、フラビンは全生物に共通して存在するため、どのような生物に発現させても、BLUFタンパク質の機能を発揮させることができると考えられるからである。BLUFタンパク質を発現させる生物の具体例としては、例えば、動物では、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、ホヤ、培養細胞などを挙げることができ、植物では、シロイヌナズナ、タバコ、イネなどを挙げることができ、微生物では、大腸菌、根粒菌、酵母などを挙げることができる。前記のように、生物の種類は限定されないので、対象となる生物にはヒトも含まれるが、ヒト以外の生物であることが好ましい。
【００１５】
BLUFタンパク質を発現する生物の作製方法は特に限定されず、一般的なトランスジェニック生物の作製方法に従って作製することができる。
【００１６】
生物中で発現させるBLUFタンパク質は、他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。例えば、後述するように、転写因子の一部分との融合タンパク質とすることもできる。
【００１７】
BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質としては、PixE（Okajima et al. 2005 J. Biochem. 137: 741）、PpsR（AppA（Masuda & Bauer 2002 Cell 110: 613）、PapA（Kanazawa et al. 2010 Biochemistry 49: 10647）などが知られている。より具体的には、３つのBLUFタンパク質（PixD, AppA, PapA）は、それぞれPixE, PpsR, PapAと相互作用する。ha本発明においては、これらいずれの組み合わせを利用してもよいが、PixDとPixEの組み合わせを使用することが好ましい。
【００１８】
PixEとしては、例えば、シネコシスティス属由来のPixE、サーモシネココッカス属由来のPixEなどが知られている。シネコシスティス属由来のPixEのアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子の塩基配列は公知であり、それぞれ配列番号４及び３に示す通りである。また、サーモシネココッカス属由来のPixEのアミノ酸配列も公知であり、データベース上で公開されている（NC_004113.1）。使用するPixEとしては、前記したいずれのPixEでもよいが、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるシネコシスティス属由来のPixEが好ましい。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質や配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して高い同一性（例えば、90％以上の同一性、好ましくは95％以上の同一性、更に好ましくは98％以上の同一性）を有するアミノ酸配列からなり、BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質をPixEとして使用してもよい。
【００１９】
BLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のN末端領域は、BLUFタンパク質と相互作用するという機能を失わない限り、どのような領域であってもよい。例えば、シネコシスティス属由来のPixEでは、配列番号２に示したアミノ酸配列における第1〜256番目のアミノ酸残基からなる領域（実施例におけるDeletion 1、以下「1-256領域」という場合がある。）はBLUFタンパク質（PixD）と相互作用するので、1-256領域を含む領域（1-256領域及び1-256領域を更にC末端側に延長した領域）を好ましい領域として例示できる。シネコシスティス属由来のPixE以外のBLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質では、1-256領域に相当する領域を含む領域を好ましい領域として例示できる。ここで、「1-256領域に相当する領域」とは、配列番号２に示したアミノ酸配列（アミノ酸配列Ａ）と、それ以外のBLUFタンパク質と相互作用をするタンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列Ｂ）とを、最大のアミノ酸配列の同一性（％）が得られるように、整列（アラインメント）させた場合において、アミノ酸配列Ｂにおけるアミノ酸配列Ａの第1〜256番目のアミノ酸残基に対応する領域をいう。
【００２０】
転写因子の種類は特に限定されず、任意の転写因子を使用できる。例えば、ゼブラフィッシュのNtl、Tbx、Gataなどを使用して融合タンパク質を作製することができる。また、転写因子は野生型のものだけでなく、変異型のもの、例えば、ドミナントネガティブ型のものを使用してもよい。また、転写因子全体ではなく、転写因子の一部分だけを使用してもよい。
【００２１】
転写因子を含む融合タンパク質は常法に従って作製することができる。融合タンパク質における両タンパク質の配置は、転写因子がN末端側に配置されてもよいし、C末端側に配置されてもよい。
【００２２】
融合タンパク質遺伝子を生物内で発現させる方法は特に限定されず、外来遺伝子を発現させる一般的な方法に従って行うことができる。
【００２３】
転写因子の機能制御に用いる青色光としては、BLUFタンパク質に吸収され得る波長のものであれば特に限定されないが、430〜470 nmの波長の光を用いるのが好ましい。
【００２４】
青色光によって転写因子の機能を制御する方法は特に限定されないが、以下のような方法を例示できる。
（１）ドミナントネガティブ型転写因子を用いる方法
この方法では、融合タンパク質とする転写因子として、ドミナントネガティブ型転写因子を用いる。これにより、青色光を照射しないと、PixD等とPixE等のN末端領域は相互作用をするので、PixE等のN末端領域と融合しているドミナントネガティブ型転写因子はその機能を発揮できず、この結果、内在性の転写因子は正常に機能することになる。一方、青色光を照射するとPixD等とPixE等のN末端領域は相互作用をしないので、ドミナントネガティブ型転写因子はその機能を発揮し、この結果、内在性の転写因子は正常に機能しなくなる。
（２）転写因子を分割する方法
転写因子は、通常、DNA結合ドメインと転写活性化ドメインの二つのドメインを持っている。この方法では、これら二つのドメインを分割し、一方をPixD等融合させ、他方をPixE等のN末端領域と融合させる。これにより、青色光を照射しないと、PixD等とPixE等のN末端領域は相互作用をするので、二つに分けられていたドメインが一体となり、転写因子は正常に機能することになる。一方、青色光を照射すると、PixD等とPixE等のN末端領域は相互作用をしないので、二つに分けられていたドメインが一体化せず、この結果、転写因子は正常に機能しないことになる。
（３）内在性の転写因子を用いる方法
この方法では、融合タンパク質とする転写因子として、生物が元々持っている内在性の転写因子を用いる。この方法においては、青色光を照射しないと、PixD等とPixE等のN末端領域は相互作用をするので、PixE等のN末端領域と融合している内在性の転写因子はその機能を発揮できない。一方、青色光を照射するとPixD等とPixE等のN末端領域は相互作用をしないので、PixE等のN末端領域と融合している内在性の転写因子は正常にその機能を発揮する。この結果、生物内に元々存在する転写因子に、融合タンパク質遺伝子として導入した転写因子も加わることになり、生物内での転写因子の量が増大することになる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
１）まずまずまずまPixEのPixDとの相互作用の領域を決定した。先に、酵母ツーハイブリッド実験により、PixDとPixEの相互作用が報告されている（Okajima et al. 2005 J. Biochem. 137: 741）。そこでInvitrogen社が提供している酵母ツーハイブリッド実験システム（ProQuest Two-Hybrid System）を用いて、PixEのC末端もしくはN末端を様々に削ったコンストラクト（Deletion 1〜 Deletion 5）をGAL4のDNA結合ドメイン（GAL4 BD）のC末端に融合させた（図１）。それぞれの組換え遺伝子を、PixDとGAL4の転写活性化ドメイン（GAL4 AD）を融合させたコンストラクトと共に酵母に導入した。この実験では、PixDとPixEの間に相互作用がある時のみ、酵母は選択培地上で育つことができるようになる。図２に示すように、Deletion 1との組み合わせのみ成育できることがわかった。つまり、PixEのN末端領域（１〜２５６aa）がPixDとの相互作用に必要であることがわかった（図３）。このPixEのN末端領域をPixE_del1と呼ぶことにする。
【００２６】
２）次にゼブラフィッシュの転写因子Ntl-EnRの活性を光で制御することを試みた。Ntl-EnRはドミナントネガティブ型に改変したNtl転写因子で、この転写因子が機能すると、ゼブラフィッシュは尻尾が短い個体に成長する（図４）。Ntl-EnRのN末端にPixE_del1を融合させ、PixDを恒常的に発現するゼブラフィッシュ内で機能させると、暗所ではその機能が阻害されるため尻尾は正常に形成され、青色光を照射した時のみ、個体の尻尾が短くなると予想を立てた（図５）。
【００２７】
３）まずPixDを恒常的に発現するゼブラフィッシュを作製した。恒常的に発現すると考えられる翻訳伸長因子遺伝子（EF1a）由来のプロモータ下流に、PixD遺伝子を配置し、その両側にトランスポゾンのターゲット配列を配置したコンストラクト作製した（図６左上）。このコンストラクトをTol2システム（Kawakami 2007 Genome Biol. 8(Suppl I):S7）を用いて野生型ゼブラフィッシュの染色体に組み込んだ。何世代かの継代を経て、全ての個体がPixD遺伝子を持つラインを作製した（図７）。またRT-PCRにより、このラインにおけるPixD遺伝子の転写を確認した（図７右下）。
【００２８】
４）次にPixE_del1をNtl-EnRのN末端に融合したキメラ遺伝子を作製し、Sp6プロモータ下流に配置した。このベクターを鋳型にし、Ambion社製mMESSAGE mMACHINE Kitを用いてPixE_del1-Ntl-EnRをコードするmRNAを合成した（図６）。PixE_del1-Ntl-EnRが機能するのかを野生型ゼブラフィッシュを用いて調べた。具体的には、合成したmRNAを野生型ゼブラフィッシュの胚に注入し、その後の発生を観察した（図８）。期待した通り、mRNAを注入した個体でのみ尻尾の短い個体が観察された。異なったmRNA濃度でこの実験を行うと、濃度依存的に尻尾の短い個体の割合が増えていった（図９）。
【００２９】
５）上で合成したPixE_del1-Ntl-EnRのmRNAを野生型もしくはPixDを発現するゼブラフィッシュに導入した。その後、胚を暗所または青色光照射条件に置き、その後の発生を観察した（図１０）。打ち込むmRNAの濃度は、ネガティブもしくはポジティブな効果が見られると期待された0.2 mg/mlで行った（図９）。その結果、暗所に置いたサンプルにおいて、PixDを発現しているラインでは、尻尾の無い個体の割合が野生型に比べ有為に低かった。すなわち、PixDによりPixE_del1-Ntl-EnRの活性が阻害されることがわかった。また明所においては、PixDの発現するゼブラフィッシュにおける尻尾の無い個体の割合が、暗所に比べ有為に高かった。つまり、青色光照射により、PixDの機能が阻害され、PixE_del1-Ntl-EnRの機能が回復することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明の転写因子の機能制御方法により、簡便な操作で、時間的及び空間的分解能の高い遺伝子発現制御が可能になる。このため、本発明は、遺伝子の発現制御が必要とされるすべての産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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