(57)【要約】【課題】  ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域を含むポリペプチドからなるＦｃ結合性タンパク質を遺伝子工学的手法を用いて製造する際、より効率的に製造可能なＦｃ結合性タンパク質、およびその製造方法を提供すること。【解決手段】  ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域を含むポリペプチドからなるＦｃ結合性タンパク質のうち、特定の位置にあるアミノ酸をリジンに置換することにより、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、２０番目から２８９番目までのアミノ酸を含むポリペプチドからなるＦｃ結合性タンパク質であって、
少なくとも、配列番号１の２７４番目のプロリン、配列番号１の２７５番目のグルタミン酸、配列番号１の２７９番目のグルタミン、配列番号１の２８３番目のロイシン、配列番号１の２８６番目のプロリン、のいずれかがリジンに置換された、前記Ｆｃ結合性タンパク質。
【請求項２】
さらに、以下の（１）から（１４４）に示すいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含む、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンまたはイソロイシンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（４）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（５）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（６）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（７）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（８）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（９）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１０）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（１１）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニン、プロリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（１２）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（１３）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（１４）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１５）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（１６）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（１７）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（１８）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１９）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２０）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（２１）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（２２）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２３）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンまたはグルタミン酸に置換
（２４）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシン、ロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（２５）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（２６）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（２７）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（２８）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２９）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンに置換
（３０）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（３１）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンまたはチロシンに置換
（３２）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（３３）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（３４）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（３５）配列番号１の７７番目のバリンがアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはリジンに置換
（３６）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸、セリンまたはグリシンに置換
（３７）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（３８）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（３９）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（４０）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（４１）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（４２）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（４３）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４４）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（４５）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（４６）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（４７）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（４８）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（４９）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（５０）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（５１）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（５２）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（５３）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（５４）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（５５）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（５６）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（５７）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（５８）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（５９）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニン、プロリンまたはグルタミンに置換
（６０）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（６１）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（６２）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（６３）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（６４）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（６５）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（６６）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（６７）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（６８）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（６９）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（７０）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（７１）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンまたはアルギニンに置換
（７２）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（７３）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（７４）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（７５）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンまたはヒスチジンに置換
（７６）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（７７）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（７８）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニン、スレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（７９）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（８０）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（８１）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（８２）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（８３）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（８４）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（８５）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（８６）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（８７）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（８８）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（８９）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（９０）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（９１）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンまたはアラニンに置換
（９２）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（９３）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（９４）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンまたはアラニンに置換
（９５）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（９６）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（９７）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（９８）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（９９）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（１００）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリン、グルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１０１）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０２）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１０３）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１０４）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１０５）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１０６）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリン、イソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１０７）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１０８）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１０９）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１１０）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１１１）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１１２）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１１３）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１１４）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１１５）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１１６）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１７）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１１８）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１１９）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１２０）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンまたはイソロイシンに置換
（１２１）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１２２）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１２３）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１２４）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１２５）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１２６）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１２７）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１２８）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１２９）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１３０）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１３１）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１３２）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１３３）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１３４）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１３５）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１３６）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１３７）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１３８）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１３９）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンまたはヒスチジンに置換
（１４０）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミン、アルギニンまたはヒスチジンに置換
（１４１）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１４２）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１４３）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１４４）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
【請求項３】
配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち、１０番目から２７９番目までのアミノ酸を含むポリペプチドからなる、請求項２に記載のＦｃ結合性タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質を製造する方法。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、免疫グロブリン吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンと親和性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質に関するものである。より詳しくは、遺伝子工学的手法を用いて製造する際、より効率的に製造可能なＦｃ結合性タンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ガンや感染症等の治療薬として抗体医薬が注目を浴びている。抗体医薬は、例えば、遺伝子工学的手法を用いて当該抗体を発現可能なＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞を作製後、作製したＣＨＯ細胞を培養することで細胞外に抗体を分泌発現させ、その後、遠心分離による細胞除去工程、精密ろ過または限外ろ過による清澄化工程、クロマトグラフィーによる精製工程を経て、工業的に製造する。
【０００３】
クロマトグラフィーによる精製工程では、大きく分けて、清澄化された培養液中の抗体を捕捉する捕捉段階と捕捉した抗体を高度に精製する精製段階の二段階で精製を行なう。捕捉段階では、培養液中の抗体を高純度に分離するため、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に対して特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィーが利用されている。
【０００４】
抗体のＦｃ領域に対して結合する物質としてヒトＦｃ受容体が知られている。このうち、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する受容体として、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでもＦｃγＲＩは、抗原と結合していない抗体（ＩｇＧ）に対しても高度な親和性を有する特性があり、前述したアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして機能するのに十分な特性を備えている。
【０００５】
ＦｃγＲＩは、シグナルペプチド領域、細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域に大別され、抗体（ＩｇＧ）との結合は、抗体（ＩｇＧ）のＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後両者の結合のシグナルが細胞質へと伝達される。ＦｃγＲＩは抗体ＩｇＧとの結合に直接関わるα鎖とγ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜貫通領域と細胞外領域の境界にあるシステインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している。ＦｃγＲＩの細胞外領域（以下、Ｆｃ結合性タンパク質ととする）のアミノ酸配列および遺伝子のヌクレオチド配列は非特許文献２により明らかにされている。また遺伝子工学的手法を用いたＦｃ結合性タンパク質の発現については、動物細胞を用いた例（非特許文献３）や、大腸菌を用いた例（特許文献１）が報告されている。しかしながら、従来の発現系ではＦｃ結合性タンパク質の発現量が十分とはいえず、このことがＦｃ結合性タンパク質の工業的利用の妨げとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７：１９９１
【非特許文献２】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８：１９８９
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１：２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、遺伝子工学的手法を用いてＦｃ結合性タンパク質を製造する際、より効率的に製造可能なＦｃ結合性タンパク質、およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質中の特定箇所にあるアミノ酸をリジンに置換することにより、Ｆｃ結合性タンパク質の発現量が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明の第一の態様は、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、２０番目から２８９番目までのアミノ酸を含むポリペプチドからなるＦｃ結合性タンパク質であって、
少なくとも、配列番号１の２７４番目のプロリン、配列番号１の２７５番目のグルタミン酸、配列番号１の２７９番目のグルタミン、配列番号１の２８３番目のロイシン、配列番号１の２８６番目のプロリン、のいずれかがリジンに置換された、前記Ｆｃ結合性タンパク質である。
【００１１】
また本発明の第二の態様は、さらに、以下の（１）から（１４４）に示すいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含む、前記第一の態様に記載のＦｃ結合性タンパク質である。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンまたはイソロイシンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（４）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（５）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（６）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（７）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（８）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（９）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１０）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（１１）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニン、プロリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（１２）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（１３）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（１４）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１５）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（１６）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（１７）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（１８）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１９）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２０）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（２１）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（２２）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２３）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンまたはグルタミン酸に置換
（２４）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシン、ロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（２５）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（２６）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（２７）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（２８）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２９）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニン、スレオニンまたはアラニンに置換
（３０）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（３１）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンまたはチロシンに置換
（３２）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（３３）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（３４）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（３５）配列番号１の７７番目のバリンがアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはリジンに置換
（３６）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸、セリンまたはグリシンに置換
（３７）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（３８）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（３９）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（４０）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（４１）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（４２）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（４３）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４４）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（４５）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（４６）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（４７）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（４８）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（４９）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（５０）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（５１）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（５２）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（５３）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（５４）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（５５）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（５６）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（５７）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（５８）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（５９）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニン、プロリンまたはグルタミンに置換
（６０）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（６１）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（６２）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（６３）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（６４）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（６５）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（６６）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（６７）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（６８）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（６９）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（７０）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（７１）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンまたはアルギニンに置換
（７２）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（７３）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（７４）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（７５）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンまたはヒスチジンに置換
（７６）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（７７）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（７８）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニン、スレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（７９）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（８０）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（８１）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（８２）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（８３）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（８４）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（８５）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（８６）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（８７）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（８８）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（８９）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（９０）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（９１）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンまたはアラニンに置換
（９２）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（９３）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（９４）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンまたはアラニンに置換
（９５）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（９６）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（９７）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（９８）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（９９）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（１００）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリン、グルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１０１）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０２）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１０３）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１０４）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１０５）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１０６）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリン、イソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１０７）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１０８）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１０９）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１１０）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１１１）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１１２）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１１３）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１１４）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１１５）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１１６）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１７）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１１８）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１１９）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１２０）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンまたはイソロイシンに置換
（１２１）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１２２）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１２３）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１２４）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１２５）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１２６）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１２７）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１２８）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１２９）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１３０）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１３１）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１３２）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１３３）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１３４）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１３５）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１３６）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１３７）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１３８）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１３９）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンまたはヒスチジンに置換
（１４０）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミン、アルギニンまたはヒスチジンに置換
（１４１）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１４２）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１４３）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１４４）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
また本発明の第三の態様は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち、１０番目から２７９番目までのアミノ酸を含むポリペプチドからなる、前記第二の態様に記載のＦｃ結合性タンパク質である。
【００１２】
また本発明の第四の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
また本発明の第五の態様は、前記第四の態様に記載のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００１４】
また本発明の第六の態様は、前記第五の態様に記載のベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体である。
【００１５】
また本発明の第七の態様は、前記第六の態様に記載の形質転換体を培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質を製造する方法である。
【００１６】
また本発明の第八の態様は、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られる、免疫グロブリン吸着剤である。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのα鎖は図１に示す構造をとり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目のスレオニンまでの領域）から構成される。
【００１９】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の少なくとも２０番目のスレオニンから２８９番目のバリンまでの領域を含むポリペプチドであって、かつ、以下の（ｉ）から（ｖ）に示すいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含むポリペプチドであればよい。
（ｉ）配列番号１の２７４番目のプロリンがリジンに置換
（ｉｉ）配列番号１の２７５番目のグルタミン酸がリジンに置換
（ｉｉｉ）配列番号１の２７９番目のグルタミンがリジンに置換
（ｉｖ）配列番号１の２８３番目のロイシンがリジンに置換
（ｖ）配列番号１の２８６番目のプロリンがリジンに置換
すなわち、ＥＣ領域Ｎ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳＳ領域）の全てまたは一部を含んでいてもよいし、ＥＣ領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）または細胞内領域（図１のＣ）を含んでいてもよい。リジンへの置換数に限定はなく、生産性を考慮した上で、１置換から５置換の中から適宜選択すればよい。
【００２０】
本発明のＦｃ結合性タンパク質の一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、細胞外領域（図１のＥＣ領域）の一部である２０番目のスレオニンから２８９番目のバリンまでの領域を含み、
Ｐｒｏ２７４Ｌｙｓ（この表記は、配列番号１の２７４番目のプロリンがリジンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｇｌｕ２７５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２７９Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２８３Ｌｙｓ、Ｐｒｏ２８６Ｌｙｓのいずれかの置換を１つ以上含み、かつ、
Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２０Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｔｈｒ２５Ｍｅｔ、Ｔｈｒ２５Ａｒｇ、Ｇｌｎ２７Ｐｒｏ、Ｇｌｎ２７Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３５Ｍｅｔ、Ｇｌｕ３５Ａｒｇ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ａｌａ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｇｌｕ４４Ａｓｐ、Ｖａｌ４５Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ａｒｇ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｌｅｕ４６Ａｌａ、Ｌｅｕ４６Ａｓｎ、Ｌｅｕ４６Ａｓｐ、Ｌｅｕ４６Ｇｌｎ、Ｌｅｕ４６Ｇｌｙ、Ｌｅｕ４６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ４６Ｌｙｓ、Ｌｅｕ４６Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４６Ｔｒｐ、Ｈｉｓ４７Ｇｌｎ、Ｈｉｓ４７Ｌｅｕ、Ｈｉｓ４７Ａｓｎ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｐｒｏ４９Ａｌａ、Ｇｌｙ５０Ａｒｇ、Ｇｌｙ５０Ｇｌｕ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ５１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ５１Ｐｒｏ、Ｓｅｒ５１Ｖａｌ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｓｅｒ５３Ｌｅｕ、Ｓｅｒ５３Ｔｈｒ、Ｓｅｒ５３Ｐｒｏ、Ｇｌｎ５５Ａｒｇ、Ｐｈｅ５７Ｔｙｒ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６１Ａｌａ、Ｔｈｒ６１Ｓｅｒ、Ａｌａ６２Ｖａｌ、Ａｌａ６２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６３Ｌｅｕ、Ｔｈｒ６３Ｐｈｅ、Ｇｌｎ６４Ｐｒｏ、Ｇｌｎ６４Ｈｉｓ、Ｇｌｎ６４Ｌｅｕ、Ｇｌｎ６４Ｌｙｓ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｔｈｒ６５Ｖａｌ、Ｓｅｒ６６Ｔｈｒ、Ｔｈｒ６７Ａｌａ、Ｔｈｒ６７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ６９Ｐｈｅ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｓｅｒ６９Ａｌａ、Ｔｙｒ７０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ａｒｇ７１Ｔｙｒ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｔｈｒ７３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ７４Ｐｈｅ、Ｓｅｒ７６Ａｓｎ、Ｖａｌ７７Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ｖａｌ７７Ａｓｐ、Ｖａｌ７７Ｌｙｓ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ａｓｎ７８Ｓｅｒ、Ａｓｎ７８Ｇｌｙ、Ｓｅｒ８０Ａｌａ、Ａｒｇ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｙ８８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ８９Ｇｌｎ、Ｌｅｕ８９Ｐｒｏ、Ｓｅｒ９０Ｇｌｙ、Ａｒｇ９２Ｃｙｓ、Ａｒｇ９２Ｌｅｕ、Ａｓｐ９４Ｇｌｕ、Ｉｌｅ９６Ｖａｌ、Ｉｌｅ９６Ｌｙｓ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｇｌｎ９７Ｌｙｓ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｈｉｓ１０１Ｌｅｕ、Ａｒｇ１０２Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０２Ｌｅｕ、Ｇｌｙ１０３Ａｓｐ、Ｇｌｙ１０３Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１１０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｐｈｅ１１４Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１１４Ｍｅｔ、Ｐｈｅ１１４Ｐｒｏ、Ｐｈｅ１１４Ｔｈｒ、Ｐｈｅ１１４Ｖａｌ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ｔｈｒ１１５Ｐｈｅ、Ｇｌｕ１１８Ａｓｐ、Ａｌａ１２１Ｔｈｒ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｈｉｓ１２５Ａｒｇ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｌｙｓ１２８Ｇｌｙ、Ａｓｐ１２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ１３１Ａｒｇ、Ｌｅｕ１３１Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１３１Ｇｌｎ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３３Ａｒｇ、Ａｓｎ１３４Ｓｅｒ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ｔｙｒ１３８Ｈｉｓ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ａｓｎ１４０Ａｓｐ、Ｇｌｙ１４１Ａｓｐ、Ｇｌｙ１４１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１４２Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４２Ａｒｇ、Ｐｈｅ１４４Ｉｌｅ、Ｐｈｅ１４７Ｓｅｒ、Ｈｉｓ１４８Ａｒｇ、Ｈｉｓ１４８Ｇｌｎ、Ｔｒｐ１４９Ｌｅｕ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｉｌｅ、Ａｓｎ１５２Ｐｒｏ、Ｔｈｒ１５４Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｅｕ１５６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ａｓｎ１５９Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５９Ａｓｐ、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ｉｌｅ１６０Ｖａｌ、Ｉｌｅ１６０Ｌｅｕ、Ｓｅｒ１６１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｍｅｔ１７１Ｔｈｒ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｈｉｓ１７４Ｇｌｎ、Ｔｈｒ１７７Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｓｅｒ１８２Ｖａｌ、Ｓｅｒ１８２Ｇｌｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ｐｒｏ１９０Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９３Ｌｅｕ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ａｓｎ１９５Ａｌａ、Ａｌａ１９６Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９８Ｇｌｙ、Ｖａｌ１９８Ｍｅｔ、Ｔｈｒ１９９Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｓｅｒ２００Ｇｌｙ、Ｓｅｒ２００Ａｒｇ、Ｌｅｕ２０２Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２０３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２０３Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２０３Ｔｙｒ、Ｌｅｕ２０３Ａｒｇ、Ｌｅｕ２０３Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２０４Ｖａｌ、Ａｓｎ２０６Ｌｙｓ、Ａｓｎ２０６Ｓｅｒ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｌｅｕ２０７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２０７Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２０７Ａｒｇ、Ｔｈｒ２０９Ａｌａ、Ｓｅｒ２１１Ａｒｇ、Ｓｅｒ２１１Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｇｌｕ２１３Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２１５Ａｒｇ、Ｌｙｓ２１５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ２１７Ａｒｇ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｌｅｕ２１８Ｍｅｔ、Ｌｅｕ２１８Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２１９Ｐｒｏ、Ｇｌｎ２１９Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２３Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２３Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２２３Ｍｅｔ、Ｇｌｎ２２４Ａｒｇ、Ｌｅｕ２２５Ｇｌｎ、Ｐｈｅ２２７Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓ、Ｍｅｔ２３１Ａｒｇ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｓｅｒ２３３Ａｓｎ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ａｓｎ２４０Ｇｌｙ、Ｇｌｕ２４４Ｖａｌ、Ｔｙｒ２４５Ｈｉｓ、Ｔｙｒ２４５Ｇｌｕ、Ｇｌｎ２４６Ａｒｇ、Ｇｌｎ２４６Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２４８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ２４８Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｔｈｒ２４９Ｓｅｒ、Ａｌａ２５０Ｖａｌ、Ａｒｇ２５１Ｓｅｒ、Ａｒｇ２５２Ｈｉｓ、Ｇｌｕ２５３Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２５７Ａｒｇ、Ｌｅｕ２５７Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２６１Ｖａｌ、Ｇｌｕ２６１Ａｌａ、Ａｌａ２６２Ｖａｌ、Ａｌａ２６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ２６４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ２６５Ａｌａ、Ｇｌｕ２６５Ｇｌｙ、Ａｓｎ２６８Ｓｅｒ、Ａｓｎ２６８Ｉｌｅ、Ａｓｎ２６８Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２７０Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２７０Ａｒｇ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｌｙｓ２７１Ａｒｇ、Ａｒｇ２７２Ｇｌｎ、Ｇｌｕ２７７Ｖａｌ、Ｇｌｎ２７９Ａｒｇ、Ｇｌｎ２７９Ｈｉｓ、Ｇｌｙ２８２Ａｓｐ、Ｌｅｕ２８３Ｐｒｏ、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２８５Ａｒｇ、Ｌｅｕ２８５Ｈｉｓ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｎ、Ｐｒｏ２８６Ａｒｇ、Ｐｒｏ２８６Ｇｌｕ、Ｔｈｒ２８７Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２８７Ｐｒｏ、Ｔｈｒ２８７Ａｌａ、Ｔｈｒ２８７Ｖａｌ、Ｐｒｏ２８８Ａｌａ、Ｐｒｏ２８８Ｓｅｒ、Ｐｒｏ２８８Ｔｈｒ、Ｖａｌ２８９Ａｌａ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ、Ｖａｌ２８９Ｇｌｙ、Ｖａｌ２８９ＬｅｕまたはＶａｌ２８９Ｉｌｅのいずれかの置換を１つ以上含むポリペプチドがある。
【００２１】
本発明のＦｃ結合性タンパク質の具体的態様の一例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、細胞外領域（図１のＥＣ領域）の一部である２０番目のスレオニンから２８９番目のバリンまでの領域を含み、かつ以下に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチド、すなわち配列番号１２に記載のアミノ酸配列のうち１０番目のスレオニンから２７９番目のアスパラギン酸までの領域を含むポリペプチド、があげられる。
Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔ、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒ、Ｓｅｒ５１Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｇｌｙ６０Ａｓｐ、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ、Ｔｈｒ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅ、Ａｒｇ７１Ｈｉｓ、Ｔｈｒ７３Ａｌａ、Ｖａｌ７７Ｇｌｕ、Ａｓｎ７８Ａｓｐ、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕ、Ｉｌｅ１００Ｖａｌ、Ｓｅｒ１１１Ａｌａ、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅ、Ａｌａ１２１Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇ、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅ、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓ、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇ、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒ、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒ、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏ、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇ、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒ、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔ、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇ、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕ、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒ、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌ、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎ、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅ、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅ、Ｍｅｔ２３１Ｌｙ、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕ、Ａｓｎ２４０Ａｓｐ、Ｔｈｒ２４９Ａｌａ、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌ、Ｐｒｏ２７４Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２７５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ２７９Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２８３Ｌｙｓ、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎ、Ｐｒｏ２８６Ｌｙｓ、Ｖａｌ２８９Ａｓｐ
本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、特定のアミノ酸については抗体結合活性を有する限り、前述した置換以外のアミノ酸置換を行なってもよい。一例として、アミノ酸間の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換がある。保守的置換はＦｃ結合性タンパク質に限らず一般にタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例として、グリシンとアラニン間の置換、アスパラギン酸とグルタミン酸間の置換、セリンとプロリン間の置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９：２００５）。
【００２２】
さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製（夾雑物質を除去）するのに有用なオリゴペプチドを付加してよい。当該オリゴペプチドとして、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸が例示できる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に、クロマトグラフィー用担体等の固相へ固定化するのに有用なオリゴペプチドを付加してもよい。当該オリゴペプチドとして、ポリシステインやシステイン残基を１残基以上有するオリゴペプチド（例えば配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド、特願２０１１−２７０２７２号）があげられる。なお、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドのアミノ酸残基数は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が有する抗体（免疫グロブリン）結合性や安定性を損なわない限り制限はなく、例えば１残基から１００残基の範囲、好ましくは２残基から５０残基の範囲、さらに好ましくは３残基から１０残基の範囲である。前記ポリペプチドを付加した本発明のＦｃ結合性タンパク質は、化学的に合成した前記ポリペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に直接付加して作製してもよいし、本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端側または３’末端側に当該オリゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドをＰＣＲ法等当業者に周知の方法を用いて作製後、遺伝子工学的手法を用いて作製してもよい。
【００２３】
本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとする）の作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製後、適当な方法で連結する方法
があげられる。
【００２４】
なお、前記（Ｉ）においてアミノ酸配列からヌクレオチド配列への変換は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換すると好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。
【００２５】
なお、本発明のポリヌクレオチドの５’末端側に、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における、前記シグナルペプチドの一例として、ｐｅｌＢ（配列番号１７）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミドなど）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお、当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はない。宿主が大腸菌である場合の前記ベクターの一例として、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターがあげられる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカーおよび伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結されるよう発現ベクターに挿入すると好ましい。宿主が大腸菌である場合の前記プロモータの一例として、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータやλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータがあげられる。
【００２７】
前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株や大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株など）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法などにより形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体より適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を取得することができる。当該形質転換体から本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを調製するには、アルカリ抽出法やＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体をスクリーニングするには、例えばＦｃ結合性タンパク質に対する抗体（免疫グロブリン）の結合活性を測定することで行なうことができる。抗体の結合活性は、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥＬＩＳＡ法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定することができる。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１が特に好ましい。
【００２８】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主（形質転換体）を培養することで製造できる。具体的には、前記形質転換体を培養後、その培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体（細胞）のほか、培養に用いた培地等も意味する。本発明のＦｃ結合性タンパク質の回収は、例えば培養物からＦｃ結合性タンパク質を抽出することにより行なうことができる。本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造するのに用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお形質転換体の選択を、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入の有無によって可能とするために、培地に当該発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらに、グリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃の範囲、好ましくは２５℃から３５℃の範囲、より好ましくは３０℃前後であるが、発現させるＦｃ結合性タンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、好ましくはｐＨ７．０前後である。
【００２９】
なお本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに、誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導すればよい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５ｍＭから１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１ｍＭから０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００３０】
本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体の培養液から、Ｆｃ結合性タンパク質を抽出するには、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。Ｆｃ結合性タンパク質が培養上清に発現する場合は、遠心分離操作によって菌体を分離し、得られた培養上清からＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。一方、Ｆｃ結合性タンパク質が細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤の添加または超音波により菌体を破砕してＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。抽出したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液からＦｃ結合性タンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよい。一例として、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといった液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられ、これらクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に精製することができる。
【００３１】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ領域を有する免疫グロブリンを分離精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして有用である。本発明のＦｃ結合性タンパク質を当該リガンドとして適用させるには、本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性の固相に固定化させればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を固定化させる固相としては、親水性ビニルポリマー、シリカ、ガラス、セファロース（商品名）、アガロース、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリスチレンを含む物質が例示できる。なお固相の形態を、空孔が制御された形態またはメンブランの形態とすると分離能がよくなるため好ましい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を固相に固定化させるには、例えば、固相表面にエポキシ基、ホルミル基、アミノ基、カルボキシル基などの活性基を導入後、本発明のＦｃ結合性タンパク質表面に存在するアミノ酸残基と当該固相表面に導入された活性基とを共有結合させればよい。
【００３２】
前記方法で得られた、免疫グロブリンを分離精製するための吸着剤（以下、単に本発明の吸着剤とする）は、少なくとも免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域の一部を含むタンパク質であれば吸着可能である。具体例として、ＩｇＧそのもの、ＩｇＧのうちＦｃ領域の一部を含む断片、ＩｇＧのＦｃ領域ならびにヒンジおよび／またはＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインを含むタンパク質、ＩｇＧのＦｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体があげられる。本発明の吸着剤を用いて分離精製可能なＩｇＧとしては、ヒトＩｇＧ、ヒト化ＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ラクダＩｇＧ等があげられる。その中でもヒトＩｇＧまたはヒト化ＩｇＧが好ましい。本発明の吸着剤を用いて分離精製するヒトＩｇＧとしては、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３およびヒトＩｇＧ４があげられる。
【００３３】
本発明の吸着剤を用いて免疫グロブリンを分離精製するには、本発明の吸着剤に免疫グロブリンを含む溶液を添加して、免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させた後、吸着剤に吸着した免疫グロブリンを、適切な溶出液を用いて溶出させればよい。本発明の吸着剤に免疫グロブリンを吸着させるには、例えば、本発明の吸着剤を適切な容量の空カラムに充填して得られる分離精製用カラムに、適切な送液システムを用いて免疫グロブリンを含む溶液を、直接またはｐＨ調整した状態で送液し、吸着させればよい。前記送液システムの例として、液体クロマトグラフィーで通常用いられる高圧ポンプやペリスタリックポンプがあげられる。免疫グロブリンを含む溶液をｐＨ調整する場合、免疫グロブリンが変性しない条件で調整すればよい。具体的にはｐＨ３からｐＨ１０の範囲であればよく、ｐＨ４からｐＨ８の範囲であると特に好ましい。本発明の吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、吸着後直ちに溶出させてもよいが、好ましくは、溶出前に適切な洗浄液を用いて夾雑タンパク質を除去するとよい。当該洗浄液としては免疫グロブリンが溶出しないｐＨ条件で調整した緩衝液であればよい。当該緩衝液の構成成分の一例として、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、リン酸、ホウ酸、アンモニウム塩（例えば酢酸アンモニウムやコハク酸アンモニウム）、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）およびこれらの組み合わせがあげられる。当該緩衝液のｐＨは溶出させる免疫グロブリンの性質により異なるが、一般的にはｐＨ３からｐＨ１０の範囲であればよく、ｐＨ４からｐＨ８の範囲だと好ましい。なお、前記洗浄液には前述した緩衝液成分の他にも、必要に応じて、添加剤を存在させてもよい。一例して、緩衝液イオン強度を調整するための、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウムなどの塩や、グリシン、ヒスチジン、アルギニンなどのアミノ酸、尿素などのカオトロピック試薬、エタノール、マンニトール、グリセロール、ベンジルアルコールなどのアルコール、スクロース、マルトース、トレハロース、フルクトースなどの糖などがあげられる。
【００３４】
本発明の吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させるには、適切な溶出液を用いて免疫グロブリンを吸着剤から解離（溶出）させ、適切な容器に回収すればよい。当該溶出液としては免疫グロブリンが変性しない条件下で溶出可能なｐＨに調整した緩衝液であればよい。溶出液として用いる緩衝液のｐＨは、一般的にはｐＨ２からｐＨ１１の範囲であればよく、ｐＨ２．５からｐＨ６の範囲であると好ましい。なお必要に応じて、前記緩衝液に添加剤を存在させてもよく、例えば、免疫グロブリンを安定化させるための界面活性剤や塩類、糖類があげられる。
【００３５】
本発明の吸着剤を用いて分離精製された免疫グロブリンは、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーに供することで、さらに高純度に精製することもできる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、２０番目から２８９番目までのアミノ酸を含むポリペプチドからなり、かつ、少なくとも、配列番号１の２７４番目のプロリン、配列番号１の２７５番目のグルタミン酸、配列番号１の２７９番目のグルタミン、配列番号１の２８３番目のロイシン、配列番号１の２８６番目のプロリン、のいずれかがリジンに置換されていることを特徴としており、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる野生型のヒトＦｃγＲＩと比較し、生産性を向上させることができる。そのためＦｃ結合性タンパク質の効率的な生産に有利といえる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩα鎖の構造概略を示す図である。
【図２】Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣＧとＦｃＲ６０ｍｃｐＫ５ＣＧのアミノ酸配列を比較した図である。
【図３】Ｆｃ結合性タンパク質を固相に固定化して得られる吸着剤を充填したカラムによって、抗体を分離したときのクロマトグラムを示す図である。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１  Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの作製（その１）
（１）以下に示す方法により、ｐｅｌＢシグナルペプチド（配列番号１７）をコードするオリゴヌクレオチドをベクターｐＴｒｃ９９ａに挿入した。
（１−１）配列番号４（５’―ＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣ―３’）および配列番号５（５’―ＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを等量混合後、９５℃で５分間保持し、その後溶液温度が１５℃になるまで、１分間で１℃の割合で温度を下げた。
（１−２）（１−１）で調製した混合液を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩで処理したベクターｐＴｒｃ９９ａにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、ヒートショック後、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ培地を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（１−３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ培地により培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて定法に従いベクターを抽出した。ここで得られたベクターをｐＴｒｃｐｅｌとした。
（２）以下に示す方法により、Ｃ末端側にシステインタグ（配列番号１６）を付加したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣＧをコードするポリヌクレオチドを調製した。
（２−１）鋳型として５０ｎｇのベクターｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃ（特開２０１１−２０６０４６号公報）を、プライマーとして配列番号６（５’−ＡＡＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ−３’）および配列番号７（５’−ＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド各１０ｐｍｏｌを、ＰＣＲ酵素として１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を、それぞれ用い、さらにＰＣＲ酵素の添付のバッファー、ｄＮＴＰを添加した上でＰＣＲを実施した（反応液量５０μＬ）。ＰＣＲは、９８℃で１分間熱処理後、９８℃で１０秒間−６０℃で５秒間−７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返すことで実施した。
（２−２）ＰＣＲ後、反応液をアガロース電気泳動に供し、設計サイズ約０．９ｋｂｐのバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。
（２−３）精製したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＴｒｃｐｅｌにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションした。
（２−４）ライゲーション後、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ培地により大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（２−５）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（タカラバイオ社製）を添加した２×ＹＴ液体培地（１．６％  Ｔｒｙｐｔｏｎ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。
（２−６）培養液から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてベクターを抽出し、後述する実施例４の方法に従い、挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を解析した。
【００４０】
解析の結果、挿入したＤＮＡの配列は設計通りであることを確認した。これをｐＴｒｃＦｃＲｍ６０ｃＣＧとした。ＦｃＲｍ６０ｃＣＧのアミノ酸配列を配列番号８に、それをコードするヌクレオチド配列を配列番号９に記載した。なお、配列番号８において、１０番目のスレオニンから２７９番目のアスパラギンまでがＦｃ結合性タンパク質（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２０番目から２８９番目までのアミノ酸からなるポリペプチドに相当）のアミノ酸配列、２８０番目のグリシンから２８６番目のグリシンまでがシステインタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは配列番号８において１５番目、Ｇｌｕ３５Ｌｅｕのロイシンは２５番目、Ｇｌｕ３６Ｇｌｙのグリシンは２６番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは２８番目、Ｌｅｕ４１Ｍｅｔのメチオニンは３１番目、Ｈｉｓ４２Ｌｅｕのロイシンは３２番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは３６番目、Ｐｒｏ４９Ｓｅｒのセリンは３９番目、Ｓｅｒ５１Ａｌａのアラニンは４１番目、Ｓｅｒ５２Ｇｌｙのグリシンは４２番目、Ｌｅｕ５８Ａｒｇのアルギニンは４８番目、Ｇｌｙ６０Ａｓｐのアスパラギン酸は５０番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは５３番目、Ｔｈｒ６５Ａｌａのアラニンは５５番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは５９番目、Ｔｙｒ７０Ｐｈｅのフェニルアラニンは６０番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは６１番目、Ｔｈｒ７３Ａｌａのアラニンは６３番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は６７番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は６８番目、Ｇｌｎ９７Ｌｅｕのロイシンは８７番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは９０番目、Ｓｅｒ１１１Ａｌａのアラニンは１０１番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１０４番目、Ｔｈｒ１１５Ｉｌｅのイソロイシンは１０５番目、Ａｌａ１２１Ｖａｌのバリンは１１１番目、Ｌｙｓ１２８Ａｒｇのアルギニンは１１８番目、Ｔｙｒ１３３Ｈｉｓのヒスチジンは１２３番目、Ｔｙｒ１３７Ｐｈｅのフェニルアラニンは１２７番目、Ａｒｇ１３９Ｈｉｓのヒスチジンは１２９番目、Ｔｒｐ１４９Ａｒｇのアルギニンは１３９番目、Ｓｅｒ１５１Ｔｈｒのスレオニンは１４１番目、Ａｓｎ１５２Ｔｈｒのスレオニンは１４２番目、Ｌｅｕ１５６Ｐｒｏのプロリンは１４６番目、Ｌｙｓ１５７Ａｒｇのアルギニンは１４７番目、Ｉｌｅ１６０Ｔｈｒのスレオニンは１５０番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１５３番目、Ｔｈｒ１６５Ｍｅｔのメチオニンは１５５番目、Ｌｙｓ１７３Ａｒｇのアルギニンは１６３番目、Ｉｌｅ１８１Ｔｈｒのスレオニンは１７１番目、Ｓｅｒ１８２Ｌｅｕのロイシンは１７２番目、Ｔｈｒ１８４Ｓｅｒのセリンは１７４番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは１８５番目、Ｔｈｒ１９９Ａｌａのアラニンは１８９番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは１９６番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは１９７番目、Ｇｌｕ２１３Ｖａｌのバリンは２０３番目、Ｌｅｕ２１７Ｇｌｎのグルタミンは２０７番目、Ｌｅｕ２１８Ｉｌｅのイソロイシンは２０８番目、Ｔｙｒ２３０Ｐｈｅのフェニルアラニンは２２０番目、Ｍｅｔ２３１Ｌｙｓのリジンは２２１番目、Ｓｅｒ２３３Ｇｌｙのグリシンは２２３番目、Ｌｙｓ２３４Ｇｌｕのグルタミン酸は２２４番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２３０番目、Ｔｈｒ２４９Ａｌａのアラニンは２３９番目、Ｌｅｕ２７０Ｖａｌのバリンは２６０番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは２７３番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは２７５番目、Ｖａｌ２８９Ａｓｐのアスパラギン酸は２７９番目の位置にそれぞれある。
【００４１】
実施例２  Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの作製（その２）
実施例１で作製したＦｃＲｍ６０ｃＣＧのうち、Ｃ末端側の一部のアミノ酸をリジンに置換したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧを作製した。
（１）鋳型として５０ｎｇのベクターｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃＣＧ（実施例１で作製）を、プライマーとして配列番号１０（５’−ＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＣＧＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＴＴＧ−３’）および配列番号１１（５’−ＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド各１０ｐｍｏｌを、それぞれ用いた他は実施例１（２−１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。
（２）実施例１（２−２）から（２−６）と同様な方法でベクターを作製し、ｐＴｒｃＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧと命名した。また後述する実施例４の方法に従い、挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を解析した。
【００４２】
解析の結果、挿入したＤＮＡの配列は設計通りであることを確認した。ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧのアミノ酸配列を配列番号１２に、それをコードするヌクレオチド配列を配列番号１３に記載した。なおＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ（配列番号１２）は、ＦｃＲｍ６０ｃＣＧ（配列番号８）より、Ｐｒｏ２７４Ｌｙｓ（配列番号８では２６４番目）、Ｇｌｕ２７５Ｌｙｓ（配列番号８では２６５番目）、Ｇｌｎ２７９Ｌｙｓ（配列番号８では２６９番目）、Ｌｅｕ２８３Ｌｙｓ（配列番号８では２７３番目）およびＰｒｏ２８６Ｌｙｓ（配列番号８では２７６番目）の置換をさらに導入したＦｃ結合性タンパク質である。
【００４３】
実施例３  ヌクレオチド配列の解析
ｐＴｒｃｐｅｌに挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列を、チェーンターミネーター法に基づくＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、シークエンスプライマーとして配列番号１４（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）および配列番号１５（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。ＦｃＲｍ６０ｃＣＧのアミノ酸配列（配列番号８）とＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧのアミノ酸配列（配列番号１２）とを比較した結果を図２に示す。
【００４４】
実施例４  Ｆｃ結合性タンパク質の調製
Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃＣＧおよびＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧをそれぞれ以下の方法により調製した。
（１）大腸菌ＪＭ１０９株を用いて作製した、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加した２×ＹＴ液体培地にそれぞれ接種し、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加した２×ＹＴ培地（１５０ｍＬ）に、（１）の培養液を添加し、３７℃で振とう培養した。
（３）培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換え、さらに０．５時間培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を添加した。
（４）引き続き２０℃で一晩振とう培養し、培養液から遠心分離により培地を取り除き、得られた菌体からタンパク質抽出試薬であるＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて、発現したＦｃ結合性タンパク質を含む抽出液を得た。
（５）抽出液に含まれるＦｃ結合性タンパク質の量を以下に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定し（４℃で１８時間）、固定化終了後、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、抽出液と濃度測定の対照となる濃度既知のＦｃ結合性タンパク質を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈し、固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識の抗ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ抗体試薬（ＢＥＴＨＹＬ社製）を添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、数分間発色後、１Ｍリン酸溶液を加え反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定し、その結果から、Ｆｃ結合性タンパク質の濃度を算出した。
【００４５】
抽出液に含まれるＦｃ結合性タンパク質を定量すると、ＦｃＲｍ６０ｃＣＧが１６ｍｇ／Ｌ（培養液）であったのに対し、特定の位置にあるアミノ酸をリジンに置換したＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧは２１ｍｇ／Ｌ（培養液）となり、リジンへの置換により生産性が１．３倍向上したことがわかる。
【００４６】
実施例５  Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧの大量調製
以下に示す方法で、ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧを大量調製した。
（１）実施例２で作製した、ｐＴｒｃＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換して得られる形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ）を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加した２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。
（２）（１）の前培養液を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを添加した２×ＹＴ培地（２Ｌ）に添加し３７℃で振とう培養した。
（３）培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換え、終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離（１００００ｇ、２０分）により得られた湿菌体を、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、Ｋｕｂｏｔａ  ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ２０１Ｍを用いて４℃に冷却しながら超音波破砕（１５０Ｗ、１０分、４℃）を行なった。
（５）破砕物を遠心分離（１００００ｇ、２０分、４℃）し、遠心上清を得ることで、タンパク質抽出液を調製した。
（６）得られた抽出液に１１４ｇ／Ｌとなるように冷却した硫酸アンモニウムを添加し、生成した沈殿を遠心分離（１００００ｇ、２０分、４℃）により除去した。
（７）（６）の遠心上清を緩衝液Ａ（１１４ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で平衡化した３００ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラムに添加した。
（８）緩衝液Ａで洗浄後、２０％のグリセロールを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（９）（８）の溶出液に純水を添加することで導電率を１０ｍＳ／ｃｍ以下まで低下させ、終濃度１Ｍとなるように尿素を添加後、緩衝液Ｂ（１Ｍの尿素を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０））で平衡化した１００ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラムに添加した。
（１０）緩衝液Ｂで洗浄後、１Ｍの尿素および２ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、吸着したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧを溶出した。
（１１）（１０）の溶出液に、緩衝液Ｃ（１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で平衡化した９０ｍＬのＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに添加した。
（１２）０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０および１０％のグリセリンを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で、Ｆｃ結合性タンパク質を溶出した。なお溶出の際は、溶出液を中性付近に戻すため、溶出量に対して約１／４量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した試験管に集めた。
（１３）（１２）の溶出液に含まれるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧの純度をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色で確認し、タンパク質的に均一であることを確認した。
（１４）（１２）で精製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ溶液を緩衝液Ｄ（２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．３））で透析後、緩衝液Ｄで平衡化した１２ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０Ｍ（東ソー社製）を充填したカラムに添加した。
（１５）緩衝液Ｄで洗浄後、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０および２０％のグリセリンを含んだ２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）でＦｃ結合性タンパク質を濃縮溶液として溶出させた。
（１６）（１５）の濃縮溶液を２００ｍＭの硫酸ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）にて平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（内径１６ｍｍ×長さ２．５ｃｍ、ＧＥヘルスケア社製）に１ｍＬ／分で通液し、緩衝液の交換を行なった。
（１７）調製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧにトリスカルボキシエチルフォスフィンを添加（終濃度１ｍＭ）し、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、標準タンパク質：キット添付の抗体）を用いてタンパク量を定量した。
【００４７】
結果、濃縮溶液２．０ｍＬに含まれるＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ量は８．８ｍｇ（濃度：４．４ｍｇ／ｍＬ）であった。
【００４８】
実施例６  Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ固定化担体の作製
（１）トヨパール（東ソー社製）にある水酸基に１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルおよびエチレンジアミンを反応させることでアミノ基を導入後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルを添加しマレイミド化することで、マレイミド基を導入したトヨパール（マレイミドトヨパール）を得た。
（２）５０μＬのマレイミドトヨパールをスピンカラムに充填後、実施例５で作製したＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ溶液０．４ｍＬを添加し、さらに３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１１２μＬを添加して、２０℃で５時間反応した。
（３）反応終了後、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液にてカラムを洗浄することでＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧを固定化したトヨパールを作製した。
【００４９】
マレイミドトヨパールへのＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ固定量を、プロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、標準タンパク質は添付のイムノグロブリンを使用）を用いて反応残渣中に含まれるＦｃ結合性タンパク質の量を測定し、反応に供した量から差し引いくことで計算した。その結果、ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧのマレイミドトヨパールへの固定化率は７５．９％であり、マレイミドトヨパール１ｍＬ当たり２６．５ｍｇのＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧが固定化されていた。
【００５０】
実施例７  ＣＨＯ細胞抽出物からの抗体精製
（１）１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を用いて、常法に従いＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞を培養した。
（２）遠心分離（３０００ｇ、１０分）により培養細胞を回収し、緩衝液Ｅ（１５０ｍＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））に懸濁後、超音波破砕（１５０Ｗ、１０分、４℃）を行なった。
（３）破砕液を遠心分離（８０００ｇ、１０分）後、０．４５μｍのフィルターに通すことで清澄化した。これにガンマグロブリン製剤を２ｍｇ／ｍＬとなる様に添加した（以下、模擬培養液）。
（４）実施例６で作製したＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ固定化トヨパールを緩衝液Ｅで平衡化後、模擬培養液を０．５ｍＬ添加した。
（５）緩衝液Ｅで洗浄し、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で更に洗浄することで非特異的に吸着する夾雑成分を取り除いた後、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧ固定化トヨパールに吸着した抗体を溶出させた。溶出液はただちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨを中性に戻した。
【００５１】
模擬培養液および（５）の溶出液をサイズ排除クロマトグラフィー成分分析法（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ）（東ソー社製）、溶離液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、流速：１．０ｍＬ／分、検出波長：２８０ｎｍ）にて成分分析を行ない、液中のタンパク質組成を確認した。結果を図３に示す。ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧをリガンドとして用いることにより、模擬培養液からヒト抗体を高純度に回収できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のＦｃ結合性タンパク質は大腸菌を利用した発現系において発現量が向上するため、工業的な製造において有用である。
【図１】
2013172655.tif 000002
【図２】
2013172655.tif 000003
【図３】
2013172655.tif 000004
【配列表】
2013172655000001.app