(57)【要約】      （修正有）【課題】二次構造の形成が抑制される温度条件下においても、効率よく逆転写反応を行なうことができる変異型逆転写酵素、その核酸、その製造方法、逆転写方法、逆転写反応キットおよび検出キットを提供すること。【解決手段】逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素であって、特定のアミノ酸配列からなる野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有することを特徴とする変異型逆転写酵素、それをコードする核酸、製造方法、逆転写方法、逆転写反応キットおよび検出キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素であって、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有することを特徴とする変異型逆転写酵素。
【請求項２】
前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域が、配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応する配列からなる領域である請求項１に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項３】
前記ＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基が、配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応するアミノ酸残基、３８８位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基および４５０位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基である請求項２に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項４】
（ａ）配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）配列番号：２の３８８位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｃ）配列番号：２の４５０位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有する請求項３に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項５】
前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、ＤＮＡ相互作用領域中にアミノ酸残基の保存的置換を有するアミノ酸配列である請求項１〜４のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。
【請求項６】
前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、
（１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、ＤＮＡ相互作用領域を除く配列中に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有し、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、または
（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、ＤＮＡ相互作用領域を除く配列に対する配列同一性が少なくとも８０％であり、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
である請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（Ａ）  請求項７に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（Ｂ）  前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む、変異型逆転写酵素の製造方法。
【請求項９】
前記細胞が、昆虫細胞である請求項８に記載の変異型逆転写酵素の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法。
【請求項１１】
逆転写反応を行なうためのキットであって、請求項１〜６のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット。
【請求項１２】
生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、請求項１〜６のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型逆転写酵素に関する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子解析、疾患などの検査などに有用な、変異型逆転写酵素、それをコードする核酸、前記変異型逆転写酵素を用いる逆転写方法、逆転写反応キットおよび検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していることから、例えば、生体で発現しているタンパク質に対応するｍＲＮＡの量または塩基配列の解析、ｃＤＮＡライブラリーの構築などの用途に用いられている。かかる用途には、従来、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（以下、「ＭＭＬＶ逆転写酵素」という）またはトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（以下、「ＡＭＶ逆転写酵素」という）が用いられている。
【０００３】
ＭＭＬＶ逆転写酵素は、遺伝子工学的手法により、大腸菌内で可溶性タンパク質として容易に生産させることができる。また、ＭＭＬＶ逆転写酵素は、単量体酵素であるので、異なる種類のサブユニットから構成されるヘテロ多量体酵素と比べて、当該ＭＭＬＶ逆転写酵素における特定アミノ酸残基の改変による酵素活性への影響が現れやすい傾向がある。
【０００４】
一方、ＡＭＶ逆転写酵素には、ＭＭＬＶ逆転写酵素よりもｃＤＮＡ合成時における反応速度が大きいという長所がある。しかしながら、ＡＭＶ逆転写酵素には、大腸菌など原核生物内では、可溶性タンパク質として生産させにくいという欠点がある。そこで、原核生物の生育温度を下げることによって可溶性のＡＭＶ逆転写酵素を発現させる方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
ところで、ｍＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が前記二次構造によって妨げられるため、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが望まれる。しかしながら、野生型ＡＭＶ逆転写酵素は、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制されるような温度では、失活することがある。また、野生型ＡＭＶ逆転写酵素には、ヘテロ多量体酵素であることから、特定アミノ酸残基の改変によって改良しがたいという欠点がある。
【０００６】
そこで、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができ、効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性の高い逆転写酵素が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特願２００１−２８９８５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができ、効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性の高い変異型逆転写酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる、核酸および前記変異型逆転写酵素の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができ、効率よく逆転写反応を行なうことができ、かつ汎用性が高い逆転写反応キットおよび検出キットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても、効率よく逆転写反応を行なうことができる逆転写方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素であって、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有することを特徴とする変異型逆転写酵素、
〔２〕前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域が、配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応する配列からなる領域である前記〔１〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔３〕前記ＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基が、配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応するアミノ酸残基、３８８位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基および４５０位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基である前記〔２〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔４〕（ａ）配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）配列番号：２の３８８位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｃ）配列番号：２の４５０位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有する前記〔３〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔５〕前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、ＤＮＡ相互作用領域中にアミノ酸残基の保存的置換を有するアミノ酸配列である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、
〔６〕前記配列番号：２に対応するアミノ酸配列が、
（１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、ＤＮＡ相互作用領域を除く配列中に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有し、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、または
（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、ＤＮＡ相互作用領域を除く配列に対する配列同一性が少なくとも８０％であり、かつ逆転写酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列
である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、
〔７〕前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸、
〔８〕前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（Ａ）  前記〔７〕に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（Ｂ）  前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む、変異型逆転写酵素の製造方法、
〔９〕前記細胞が、昆虫細胞である前記〔８〕に記載の変異型逆転写酵素の製造方法、
〔１０〕前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法、
〔１１〕逆転写反応を行なうためのキットであって、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット、ならびに
〔１２〕生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の変異型逆転写酵素は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができ、効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高いという特徴を有する。また、本発明の核酸および前記変異型逆転写酵素の製造方法は、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の逆転写反応キットおよび検出キットは二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができ、効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高いという特徴を有する。また、本発明の逆転写方法は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても、効率よく逆転写反応を行なうことができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】製造例１（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴαの構造を示す概略説明図である。
【図２】製造例２（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴβの構造を示す概略説明図である。
【図３】試験例２において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を示す図面代用写真である。
【図４】試験例３において、基質〔ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〕濃度と、初期反応速度との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図５】試験例４において、インキュベーション時間と、ｌｎ［残存活性（％）］との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図６】試験例４において、熱処理温度と、１／Ｔ×１０3と、ｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図７】試験例５において、各反応温度での反応によって得られた産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した結果を示す図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．変異型逆転写酵素
本発明の変異型逆転写酵素は、逆転写酵素活性を有する変異型逆転写酵素であって、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有することを特徴とする。
【００１３】
本発明の変異型逆転写酵素は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有するので、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても、野生型逆転写酵素と比べて高い残存活性を有し、しかもＭＭＬＶ逆転写酵素と比べてｃＤＮＡ合成反応などの際の反応速度が大きい。そのため、本発明の変異型逆転写酵素は、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができるうえ、効率よく逆転写反応を行なうことができ、汎用性が高い。したがって、本発明の変異型逆転写酵素によれば、鋳型となるＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合であっても、反応温度を高くすることができ、二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。
【００１４】
なお、本明細書において、「野生型」とは、人為的に変異が導入されていないもの、「変異型」とは、人為的に変異が導入されたものを意味する。
【００１５】
また、本明細書において、「配列同一性」は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして算出した値をいう。
【００１６】
配列番号：２は、野生型ＡＭＶ逆転写酵素のアミノ酸配列である。本明細書において、「配列番号：２に対応するアミノ酸配列」とは、配列番号：２に示される配列との配列同一性が少なくとも２０％であり、かつ野生型ＡＭＶ逆転写酵素と同じ条件下に同等の酵素活性を示すポリペプチドのアミノ酸配列をいう。前記配列同一性は、ｃＤＮＡ合成反応などの際の反応速度を大きくする観点から、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％、特に好ましくは１００％である。また、「野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基に対応する残基」とは、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基と同じ機能を有する残基をいう。
【００１７】
さらに、本明細書において、「ＤＮＡ相互作用領域」とは、逆転写酵素中において、ＤＮＡとの間で、水素結合、静電結合、疎水性相互作用などを介して相互作用を生じるアミノ酸残基が局在する領域をいう。
【００１８】
また、本明細書において、「野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する」とは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨが６．０〜９．５）において、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域の正の実効電荷よりも大きいことを意味する。
【００１９】
前記野生型逆転写酵素は、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる。かかる野生型逆転写酵素は、ＤＮＡ相互作用領域を除く配列中に１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有し、かつ逆転写酵素活性を有する酵素であってもよく、ＤＮＡ相互作用領域を除く配列に対する配列同一性が少なくとも８０％であり、かつ逆転写酵素活性を有する酵素であってもよい。
【００２０】
前記「１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加」は、逆転写酵素活性を示す範囲の個数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を意味する。前記「１個もしくは数個」とは、１〜３０個をいう。前記「１個もしくは数個」は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個または２個をいう。
【００２１】
前記ＤＮＡ相互作用領域を除く配列に対する配列同一性は、逆転写酵素活性を示す範囲であればよく、ｃＤＮＡ合成反応などの際の反応速度を大きくする観点から、少なくとも８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。
【００２２】
また、前記野生型逆転写酵素は、本発明の目的を妨げない範囲で、ＤＮＡ相互作用領域中にアミノ酸残基の保存的置換をさらに有していてもよい。前記保存的置換としては、例えば、特定のアミノ酸残基と、疎水性、電荷、ｐＫａ、立体構造上における特徴などの点で当該特定のアミノ酸残基に類似した機能を発揮するアミノ酸残基との置換などが挙げられる。前記保存的置換としては、より具体的には、例えば、下記グループＩ〜ＶＩのいずれかに属する１つのアミノ酸残基を同じグループに属する他のアミノ酸残基に置換することなどが挙げられる。
グループＩ：グリシン残基およびアラニン残基
グループＩＩ：バリン残基、イソロイシン残基およびロイシン残基
グループＩＩＩ：アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基およびグルタミン残基
グループＩＶ：セリン残基およびスレオニン残基
グループＶ：リジン残基およびアルギニン残基
グループＶＩ：フェニルアラニン残基およびチロシン残基
【００２３】
前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域は、二次構造の形成が抑制される温度条件下での高い熱安定性を確保する観点から、好ましくは配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応する配列からなる領域である。
【００２４】
前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に局在するアミノ酸残基としては、例えば、配列番号：２の２０位のヒスチジン残基〜４４位のグルタミン酸残基に対応する領域（以下、「領域H20-E44」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の５５位のアスパラギン残基〜１１４位のフェニルアラニン残基に対応する領域（以下、「領域N55-F114」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の１４８位のグルタミン残基〜１５２位のシステイン残基に対応する領域（以下、「領域Q148-C152」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の１７８位のロイシン残基〜１９１位のヒスチジン残基に対応する領域（以下、「領域L178-H191」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の２１５位のアスパラギン酸残基〜２３３位のセリン残基に対応する領域（以下、「領域D215-S233」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の２３４位のスレオニン残基〜２４０位のグリシン残基に対応する領域（以下、「領域T234-G240」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の２５４位のグルタミン酸残基〜２８９位のアラニン残基に対応する領域（以下、「領域Q254-A289」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の３１０位のアラニン残基〜３２８位のシステイン残基に対応する領域（以下、「領域A310-C328」という）に局在するアミノ酸残基、配列番号：２の３４９位のトリプトファン残基〜３９０位のロイシン残基に対応する領域（以下、「領域W349-L390」という）に局在するアミノ酸残基および配列番号：２の４０８位のロイシン残基〜４１７位のセリン残基に対応する領域（以下、「領域L408-S417」という）に局在するアミノ酸残基などが挙げられるが、本発明はかかる例示のみに限定されるものではない。これらのアミノ酸残基のなかでは、二次構造の形成が抑制される温度条件下での高い熱安定性を確保する観点から、好ましくは配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応するアミノ酸残基、３８８位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基および４５０位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基である。
【００２５】
ＤＮＡ相互作用領域が、前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有するかどうかの評価は、例えば、
１）評価対象のＤＮＡ相互作用領域中に局在する正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、評価対象のＤＮＡ相互作用領域中に局在する負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「−１」とした場合、評価対象のＤＮＡ相互作用領域中に局在するリジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの数に基づき、式（Ｉ）：
［実効電荷の大きさのスコア］
＝（＋１×ｋ）＋（＋１×ｒ）＋（−１×ｄ）＋（−１×ｅ）          （Ｉ）
（式中、ｋはリジン残基の数、ｒはアルギニン残基の数、ｄはアスパラギン酸残基の数、およびｅはグルタミン酸残基の数を示す）
で表わされる式に基づいて算出する方法、
２）  評価対象のＤＮＡ相互作用領域からなるポリペプチドと、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域からなるポリペプチドとを等電点電気泳動に供して、各ポリペプチドの移動距離を相互に比較する方法
などにより、行なうことができる。これらの方法のなかでは、評価対象のＤＮＡ相互作用領域の正の実効電荷を簡便かつ高い精度で評価することができることから、好ましくは前記２）の方法である。
【００２６】
本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域は、前記式（Ｉ）を用いて正の実効電荷の大きさのスコアを算出した場合、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域における正の実効電荷のスコア（＋２）よりも大きいスコアを示す。本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域の正の実効電荷の大きさのスコアは、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基の組成などによって異なることから、一概には決定することができないので、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基の組成などに応じて、適宜決定することが望ましい。本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域の正の実効電荷の大きさのスコアは、例えば、野生型逆転写酵素が配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる場合、二次構造の形成が抑制される温度条件下での高い熱安定性を確保する観点から、好ましくは＋３〜＋１２、より好ましくは＋４〜＋１０である。本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域と野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域との間の正の実効電荷の大きさのスコアの差は、二次構造の形成が抑制される温度条件下での高い熱安定性を確保する観点から、好ましくは１〜１０、より好ましくは２〜８である。
【００２７】
前記正電荷アミノ酸残基としては、例えば、アルギニン残基、リジン残基などが挙げられる。これらの正電荷アミノ酸残基のなかでは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨが６．０〜９．５）において、正に荷電しており、かかるｐＨ条件下で高い熱安定性を確保することができることから、好ましくはアルギニン残基およびリジン残基である。
【００２８】
前記非極性アミノ酸残基としては、例えば、アラニン残基、グリシン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、システイン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基などが挙げられる。これらの非極性アミノ酸残基のなかでは、側鎖のサイズが小さく、かつ置換によりもたらされる形状の変化が小さいと考えられることから、好ましくはアラニン残基である。
【００２９】
前記逆転写酵素活性は、下記ステップ１）〜６）：
１）  反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15（ｐ（ｄＴ）15換算濃度）、および０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ〕中で逆転写酵素を３７℃でインキュベーションするステップ、
２）  前記ステップ１）で得られた産物２０μＬを採取し、ガラスフィルターにスポットするステップ、
３）  前記ステップ２）後のガラスフィルターを、冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄して、前記ガラスフィルター上の産物からポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去するステップ、
４）  前記ステップ３）後のガラスフィルターを乾燥させた後、前記ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントするステップ、
５）  前記ステップ４）で得られた放射活性に基づき、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（以下、「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出するステップ、および
６）  前記ステップ５）で算出されたｄＴＴＰ取り込み量に基づき、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量を求めるステップ
を行なうことによって測定することができる。
【００３０】
本発明の変異型逆転写酵素は、二次構造の形成が抑制される温度条件下での高い熱安定性を確保する観点から、（ａ）配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）配列番号：２の３８８位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｃ）配列番号：２の４５０位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選ばれた少なくとも１つを有していることが好ましく、（ａ’）配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換、
（ｂ’）配列番号：２の３８８位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換、および
（ｃ’）配列番号：２の４５０位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
からなる群より選ばれた少なくとも１つを有していることがより好ましい。なかでも、本発明の変異型逆転写酵素は、二次構造の形成が抑制される温度条件下での高い熱安定性を確保する観点から、前記（ａ’）〜（ｃ’）の置換を有する多重変異体であることが好ましい。
【００３１】
２．変異型逆転写酵素をコードする核酸
本発明の核酸は、本発明の変異型逆転写酵素をコードする核酸である。本発明の核酸は、前記変異型逆転写酵素をコードしているため、当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる。
【００３２】
核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の核酸は、例えば、野生型逆転写酵素をコードする核酸に対して、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
【００３４】
核酸への部位特異的変異の導入は、例えば、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように設計されたプライマーを用いたＰＣＲなどにより行なうことができる。
【００３５】
３．変異型逆転写酵素の製造方法
本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の核酸を用いて当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより得ることができる。本発明には、かかる変異型逆転写酵素の製造方法も包含される。
【００３６】
本発明の製造方法は、前述した変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（Ａ）  請求項５に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（Ｂ）  前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む方法である。
【００３７】
まず、本発明の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る〔「工程（Ａ）」〕。
【００３８】
前記核酸を保持する細胞は、例えば、前記核酸を含む遺伝子導入用担体を用いて宿主細胞を形質転換することなどにより得られる。
【００３９】
前記宿主細胞としては、例えば、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、大腸菌などの細菌の細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、可溶性の変異型逆転写酵素を大量に生産することができ、しかもその精製が容易であることから、好ましくは昆虫細胞、より好ましくはＳｆ９などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４０】
前記遺伝子導入用担体は、生物担体であってもよく、非生物担体であってもよい。生物担体としては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどのベクターが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、非生物担体としては、例えば、金粒子、デキストラン、リポソームなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる遺伝子導入用担体は、用いられる宿主細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が昆虫細胞である場合、昆虫細胞に導入可能なバキュロウイルスのシャトルベクター、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミド〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕などを用いることができる。
【００４１】
前記ベクターは、変異型逆転写酵素の精製をより容易にするためのエレメント、例えば、Ｈｉｓタグ、細胞外分泌シグナルなどを含有していてもよい。
【００４２】
前記遺伝子導入用担体が、前記生物担体であるベクターである場合、当該遺伝子導入用担体は、ベクターのクローニングサイトに前記核酸を挿入し、プロモーターの制御下に作動可能に連結させることにより作製することができる。なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、核酸によりコードされるポリペプチドの発現が、プロモーターなどのエレメントによる制御下に生物学的活性を示す状態で発現するように連結されていることを意味する。
【００４３】
一方、前記遺伝子導入用担体が、前記非生物担体である場合、当該遺伝子導入用担体は、必要に応じて、前記核酸を、プロモーターの制御下に作動可能に連結させて得られた核酸構築物を、当該非生物担体に担持させることにより作製することができる。なお、かかる核酸構築物は、複製開始起点、ターミネーターなどの遺伝子の発現に必要なエレメントを適宜含有してもよい。
【００４４】
宿主細胞への遺伝子導入用担体の導入は、用いられた遺伝子導入用担体の種類、宿主細胞の種類などに応じた方法で行なうことができる。かかる形質転換法としては、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、パーティクルガン法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４５】
前記工程（Ａ)において、前記核酸を保持する細胞の培養条件は、用いられた宿主細胞の種類などによって異なることから、一概には決定することができないので、用いられた宿主細胞の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記核酸が誘導可能なプロモーターの制御下に作動可能に連結されている場合、かかるプロモーターの種類に応じた発現誘導条件下に、前記核酸を保持する細胞を培養すればよい。
【００４６】
つぎに、前記工程（Ａ）で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する〔「工程（Ｂ）」〕。
【００４７】
変異型逆転写酵素が細胞外に分泌される場合、培養物を遠心分離や濾過などに供して培養上清を回収し、培養上清中の変異型逆転写酵素を精製して単離することができる。かかる精製を行なう方法としては、遠心分離、超遠心分離、限外濾過、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどが挙げられるが、本発明は係る例示のみに限定されるものではない。一方、変異型逆転写酵素が細胞内に蓄積される場合、工程（Ｂ）において、培養物を遠心分離などに供して細胞を回収し、細胞から変異型逆転写酵素を単離することができる。この場合、例えば、前記細胞を超音波破砕法、溶菌法、凍結破砕法などによって破砕し、得られた細胞抽出液中の変異型逆転写酵素を精製して単離することができる。
【００４８】
４．逆転写方法
本発明の逆転写方法は、本発明の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴としている。本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素の熱安定性と比べて高い熱安定性を有している。そのため、本発明の逆転写方法によれば、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制される温度を含む幅広い温度範囲で逆転写反応を行なうことができる。したがって、本発明の逆転写方法は、種々のＲＮＡを鋳型として用いることができ、しかも効率よく逆転写反応を行なうことができる。
【００４９】
本発明の逆転写方法では、前記変異型逆転写酵素と、ＲＮＡと、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを、逆転写反応用緩衝液中でインキュベーションすることにより逆転写反応を行なうことができる。
【００５０】
逆転写反応における反応温度は、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などによって異なることから、一概には決定することができないので、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが野生型逆転写酵素の至適反応温度で二次構造を形成しにくいＲＮＡである場合、当該至適反応温度に設定することができる。また、前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡが野生型逆転写酵素の至適反応温度で二次構造を形成しやすいＲＮＡである場合、野生型逆転写酵素の至適反応温度よりも高い温度、例えば、４５〜６５℃となるように設定することができる。
【００５１】
逆転写反応の際の反応系中における逆転写酵素の濃度は、本発明の逆転写方法の用途などによって異なることから、一概には決定することができないので、前記用途などに応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写酵素の濃度は、通常、０．００１〜０．１μＭである。
【００５２】
逆転写反応の際の反応系中におけるオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、通常、０．１〜１０μＭである。
【００５３】
逆転写反応の際の反応系中における４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて異なることから、一概には決定することができないので、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて適宜設定することが好ましい。前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、通常、０．０１〜１μＭである。
【００５４】
前記逆転写反応用緩衝液は、用いられる変異型逆転写酵素の種類に応じて、適宜選択することができる。前記逆転写反応用緩衝液は、２価の陽イオン、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどを含有してもよい。また、前記逆転写反応用緩衝液は、本発明の目的を妨げない範囲で、必要に応じて、還元剤（例えば、ジチオスレイトールなど）、安定化剤（例えば、グリセロール、トレハロースなど）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなど）などの成分を含有していてもよい。
【００５５】
前記逆転写反応用緩衝液中における２価の陽イオンの濃度は、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なることから、一概には決定することができないので、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記２価の陽イオンの濃度は、通常、１〜３０ｍＭである。
【００５６】
前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なることから、一概には決定することができないので、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、通常、６．０〜９．５である。
【００５７】
５．逆転写反応キット
本発明の逆転写反応キットは、逆転写反応を行なうためのキットであって、本発明の変異型逆転写酵素を含有することを特徴としている。本発明の逆転写反応キットは、高い熱安定性を有する本発明の変異型逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制される温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の逆転写反応キットは、ＲＮＡの種類によらず、逆転写反応を効率よく行なうことができるので、汎用性が高い。
【００５８】
本発明の逆転写反応キットは、前記変異型逆転写酵素に加えて、逆転写反応を行なうのに必要な試薬を含有していてもよい。かかる試薬としては、例えば、逆転写反応のテンプレートとして用いられるＲＮＡ、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒などが挙げられる。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
【００５９】
本発明の逆転写反応キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液としては、前記変異型逆転写酵素のｐＨ安定性に応じたｐＨを有する緩衝液が挙げられる。
【００６０】
また、前記逆転写反応を行なうのに必要な試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、前記試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。これにより、ユーザーが、各試薬を逆転写反応に適した量となるように混合する必要がなくなるので、取り扱いが容易である。
【００６１】
６．検出キット
本発明の検出キットは、生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、前記変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴としている。本発明の検出キットは、高い熱安定性を有する前記変異型逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制される温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の検出キットは、種々の試料に対して用いることができ、汎用性が高い。
【００６２】
前記マーカーとしては、生体中に含まれるウイルスまたは細菌に特有の塩基配列、疾患に特有の塩基配列を有するＲＮＡなどが挙げられる。なお、本明細書において、「ウイルスまたは細菌に特有の塩基配列」とは、ウイルスまたは細菌には存在するが、生体には存在しない塩基配列をいう。また、「疾患に特有の塩基配列」とは、疾患に罹患した生体には存在するが、疾患に罹患していない正常な生体には存在しない塩基配列をいう。
【００６３】
前記ウイルスとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＰＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ノロウイルス、ウエストナイルウイルスなどが挙げられる。また、前記細菌としては、例えば、食中毒の原因となるバチルス・セレウス、サルモネラ、腸管出血性大腸菌、ビブリオ、カンピロバクター、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などが挙げられる。前記疾患としては、癌、糖尿病、心臓病、高血圧、感染症などが挙げられる。
【００６４】
前記マーカーの検出用試薬としては、例えば、前記マーカーとなるＲＮＡに相補的であり、かつ蛍光物質または放射性物質が結合したプローブ、二本鎖核酸に特異的にインターカレートする蛍光物質（例えば、エチジウムブロマイドなど）などが挙げられる。
【００６５】
本発明の検出キットは、前記変異型逆転写酵素および前記マーカーの検出用試薬に加えて、例えば、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒、陽性対照となるＲＮＡ、陰性対照となるＲＮＡなどを含有していてもよい。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
【００６６】
本発明の検出キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液は、前記逆転写反応キットにおける保存用緩衝液と同様である。
【００６７】
また、前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液などの試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、かかる試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、前記逆転写反応キットの場合と同様の観点から、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。
【００６８】
７．その他の応用
なお、配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基からなるＤＮＡ相互作用領域と立体構造上類似する核酸相互作用領域または配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基の配列との配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列からなる核酸相互作用領域を有する核酸関連酵素については、野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の前記核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対して、野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように設計されたプライマーを用いたＰＣＲなどにより、前記核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる前記変異型逆転写酵素の場合と同様の変異を導入して、前記野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する核酸相互作用領域を形成させることによって熱安定性が向上した核酸関連酵素を得ることができることが期待される。熱安定性が向上した核酸関連酵素は、変異が導入された核酸を用い、前記変異型逆転写酵素の製造方法と同様の手法により製造することができる。変異の対象となるアミノ酸残基の位置は、核酸関連酵素の種類に応じて異なるが、核酸関連酵素の核酸相互作用領域中において、核酸のリン酸基と近接し、かつ核酸関連酵素の活性を妨げる形状の変化をもたらさないアミノ酸残基の位置、核酸関連酵素の負電荷を有するアミノ酸残基と近接し、かつ核酸関連酵素の活性を妨げる形状の変化をもたらさないアミノ酸残基の位置などが挙げられる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００７０】
なお、本実施例において、「Ｖ２３８Ｒ」は２３８位のバリン残基のアルギニン残基への置換、「Ｌ３８８Ｒ」は３８８位のロイシン残基のアルギニン残基への置換および「Ｄ４５０Ａ」は４５０位のアスパラギン酸残基のアラニン残基への置換を示す。
【００７１】
製造例１
（１）ＡＭＶ逆転写酵素α鎖の発現プラスミドの構築
野生型ＡＭＶ逆転写酵素α鎖（以下、「ＷＴα」ともいう）をコードするＤＮＡ（配列番号：１）を、昆虫細胞での組換えタンパク質発現用キット〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃTM  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ〕に含まれるプラスミド（商品名：ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミド）に挿入することにより、ＷＴα発現プラスミドであるｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴα（製造例１）を構築した。ＷＴα発現プラスミドは、Ｃ末端に（Ｈｉｓ）６が付加されたＨｉｓタグポリペプチドとしてＷＴαを発現する。製造例１（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴαの構造を図１に示す。図中、数字は配列番号：２におけるアミノ酸残基の番号を示す。
【００７２】
（２）変異型ＡＭＶ逆転写酵素（α鎖）の発現プラスミドの構築
配列番号：２に示されるアミノ酸配列中の２３８位のバリン残基をアルギニン残基に置換するための部位特異的変異用プライマー対（プライマーＶ２３８ＲおよびプライマーＶ２３８Ｒ＿ＣＰ）、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中３８８位のロイシン残基をアルギニン残基に置換するための部位特異的変異用プライマー対（プライマーＬ３８８ＲおよびプライマーＬ３８８Ｒ＿ＣＰ）ならびに配列番号：２に示されるアミノ酸配列中の４５０位のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置換するための部位特異的変異用プライマー対（プライマーＤ４５０ＡおよびプライマーＤ４５０＿ＣＰ）を表１に示す。
【００７３】
【表１】
2013165669.tif 000002
【００７４】
前記（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴαと、部位特異的変異用プライマー対と、部位特異的変異用キット〔ストラタジーン(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)社製、商品名：ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅTM  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ〕とを用い、ｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴα中のＷＴαをコードするＤＮＡ中の２３８位のバリン残基、３８８位のロイシン残基および４５０位のアスパラギン酸残基それぞれに部位特異的変異を導入した。得られたプラスミド中のＷＴαをコードするＤＮＡに部位特異的変異が導入されたかどうかを、ＤＮＡシークエンサー〔（株）島津製作所製、商品名：ＤＳＱ−２０００〕によって確認した。その結果、ＡＭＶ逆転写酵素のα鎖の多重変異体（Ｖ２３８Ｒ／Ｌ３８８Ｒ／Ｄ４５０Ａ；以下、「ＡＭ４α」ともいう）（変異型ＡＭＶ逆転写酵素）を発現させるためのプラスミドとして、変異体発現用プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＡＲＴαＡＭ４が得られた。
【００７５】
製造例２
（１）ＡＭＶ逆転写酵素β鎖の発現プラスミドの構築
ＷＴβをコードするＤＮＡ（配列番号：３）を、前記ｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドに挿入することにより、ＷＴβ発現プラスミドであるｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴβを構築した（製造例２）。ＷＴβ発現プラスミドは、Ｃ末端に（Ｈｉｓ）６が付加されたＨｉｓタグポリペプチドとしてＷＴβを発現する。製造例２（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴβの構造を図２に示す。図中、数字は配列番号：４におけるアミノ酸残基の番号を示す。
【００７６】
（２）変異型ＡＭＶ逆転写酵素（β鎖）の発現プラスミドの構築
ＷＴαのアミノ酸配列（配列番号：２）は、ＷＴβのアミノ酸配列である配列番号：４に示されるアミノ酸配列のうち、１位〜５７２位のアミノ酸残基からなる配列と同一である。したがって、プライマーＶ２３８ＲおよびプライマーＶ２３８Ｒ＿ＣＰは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列中の２３８位のバリン残基をアルギニン残基に置換するための部位特異的変異用プライマー対として用いることができる。また、プライマーＬ３８８ＲおよびプライマーＬ３８８Ｒ＿ＣＰは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列中３８８位のロイシン残基をアルギニン残基に置換するための部位特異的変異用プライマー対として用いることができる。さらに、プライマーＤ４５０ＡおよびプライマーＤ４５０＿ＣＰは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中の４５０位のアスパラギン酸残基をアラニン残基に置換するための部位特異的変異用プライマー対として用いることができる。
【００７７】
そこで、製造例１において、製造例１（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴαの代わりに、製造例２（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴβを用いたことを除き、製造例１と同様の操作を行ない、ＡＭＶ逆転写酵素のβ鎖の多重変異体（Ｖ２３８Ｒ／Ｌ３８８Ｒ／Ｄ４５０Ａ；以下、「ＡＭ４β」ともいう）（変異型ＡＭＶ逆転写酵素）を発現させるためのプラスミドとして、変異体発現用プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ＡＲＴβＡＭ４を得た。
【００７８】
製造例３
（１）組換えバクミドの調製
製造例１（２）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＡＲＴαＡＭ４を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃを形質転換した。つぎに、得られた形質転換体から組換えバクミドを単離した。
【００７９】
（２）変異型ＡＭＶ逆転写酵素（ＡＭ４α）の昆虫細胞での発現
得られた組換えバクミドを昆虫細胞Ｓｆ９に導入し、得られた細胞を、３．５％ウシ血清〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：非働化ウシ胎児血清〕を含有する昆虫細胞培養用培地〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＩＰＬ−４１〕中、２８℃で３日間培養した。得られた培養物１００ｍＬから組換えバキュロウイルスを含有する培養上清９８ｍＬを回収した。
【００８０】
つぎに、１×１０６細胞／ｍＬの昆虫細胞Ｓｆ９を含有する昆虫細胞培養用培地〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製、商品名：ＩＰＬ−４１〕１００ｍＬに、前記組換えバキュロウイルスを含有する培養上清１ｍＬを添加して昆虫細胞Ｓｆ９に前記組換えバキュロウイルスを感染させた後、得られた細胞を２８℃で５日間培養することにより、ＡＭ４αを発現させた。
【００８１】
得られた細胞を、サスペンジョン緩衝液〔組成：１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．４体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００、１０体積％グリセロールおよび１０体積％フェニルメタンスルホニルフルオリド〕２０ｍＬに懸濁し、超音波処理で破砕した。つぎに、得られた破砕物を遠心分離（５８４０×ｇ）に供し、上清を回収して、ＡＭ４αを含有する可溶性画分を得た。
【００８２】
製造例４
製造例３において、製造例１（２）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＡＲＴαＡＭ４の代わりに、製造例２（２）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＡＲＴβＡＭ４を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ＡＭ４βを含有する可溶性画分を得た。
【００８３】
試験例１
製造例３で得られた可溶性画分または製造例４で得られた可溶性画分を、その濃度が１０体積％となるように、反応液｛組成：２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、２５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕および０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕｝０．０６６ｍＬに添加した。その後、得られた混合物を３７℃でインキュベーションした。
【００８４】
インキュベーション開始から２．５分間、５．０分間または７．５分間経過後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、氷上で冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、氷上で冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄することにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回、エタノール水溶液による洗浄は１回行なった。
【００８５】
つぎに、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノスティックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、液体シンチレーションカウンターで放射活性をカウントした。前記放射活性に基づき、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出した。つぎに、ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて初期反応速度を算出し、逆転写酵素活性を算出した。
【００８６】
ＡＭ４αを含有する可溶性画分およびＡＭ４βを含有する可溶性画分の逆転写酵素活性を調べた結果を表２に示す。なお、逆転写酵素活性における１ユニットは、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量として定義した。
【００８７】
【表２】
2013165669.tif 000003
【００８８】
表２に示された結果から、ＡＭ４αを含有する可溶性画分およびＡＭ４βを含有する可溶性画分のいずれもが逆転写酵素活性を示すが、ＡＭ４αを含有する可溶性画分の全活性は、ＡＭ４βを含有する可溶性画分の全活性よりも顕著に高いことがわかる。
【００８９】
なお、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２３８位のバリン残基、３８８位のロイシン残基および４５０位のアスパラギン酸残基は、ＡＭＶ逆転写酵素において、ＤＮＡと相互作用する領域（ＤＮＡ相互作用領域）に存在すると考えられるアミノ酸残基である。また、２３８位のバリン残基のアルギニン残基への置換、３８８位のロイシン残基のアルギニン残基への置換および４５０位のアスパラギン酸残基のアラニン残基への置換は、ＤＮＡ相互作用領域における正の実効電荷を、野生型ＡＭＶ逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域における正の実効電荷と比べて、増加させていると考えられる。
【００９０】
したがって、かかる結果から、野生型ＡＭＶ逆転写酵素α鎖のＤＮＡ相互作用領域における正の実効電荷を増加させる変異は、野生型ＡＭＶ逆転写酵素β鎖のＤＮＡ相互作用領域における正の実効電荷を増加させる変異と比べて、高い活性を確保することが可能であることが示唆される。
【００９１】
実施例１
製造例３と同様の操作を行ない、ＡＭ４αを含有する可溶性画分を得た。この可溶性画分に固体の硫酸アンモニウムを４０％飽和となるように添加した。得られた混合物を遠心分離（２００００×ｇ）に供して沈殿を得た。得られた沈殿を、０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ溶液〔組成：２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２．０ｍＭジチオスレイトール、２．０体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１０体積％グリセロール〕に溶解させた。得られた溶液を、０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ溶液に対して透析した。
【００９２】
得られた透析物にＤＧＴ溶液〔組成：２．０ｍＭジチオスレイトール、２．０体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１０体積％グリセロール〕５４ｍＬを添加した。得られた混合物を、０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ溶液で予め平衡化された陰イオン交換レジン〔東ソー（株）製、商品名：ＤＥＡＥ６５０Ｍ〕が充填されたカラムに供した後、０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ溶液で前記レジンを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。
【００９３】
つぎに、溶出緩衝液として０．３Ｍ  ＰＤＧＴ溶液〔組成：３００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２．０ｍＭジチオスレイトール、２．０体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１０体積％グリセロール〕を用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出し、ＡＭ４αを含有する画分を回収した。回収した溶液を、透析溶液〔２０ｍＭイミダゾール含有０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ溶液〕に対して透析した。
【００９４】
得られた透析物を、２０ｍＭイミダゾール含有０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ溶液で予め平衡化されたヒスチジンタグ結合タンパク質精製用プレパックカラム〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  １ｍＬ〕に供した。その後、洗浄溶液〔８０ｍＭイミダゾール含有０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ溶液〕を用いてカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。つぎに、溶出緩衝液〔５００ｍＭイミダゾール含有０．０２Ｍ  ＰＤＧＴ〕を用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出し、ＡＭ４αを含有するアフィニティー精製画分を回収した。
【００９５】
比較例１
製造例３において、製造例１（２）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＡＲＴαＡＭ４の代わりに、製造例１（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴαを用いたことを除き、製造例３と同様の操作を行ない、ＷＴαを含有するアフィニティー精製画分を得た。
【００９６】
試験例２
実施例１で得られたＡＭ４αを含有するアフィニティー精製画分および比較例１で得られたＷＴαを含有するアフィニティー精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００９７】
試験例２において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった結果を図３に示す。図中、レーン１は分子量マーカー、レーン２は比較例１で得られたＷＴαを含有するアフィニティー精製画分、レーン３は実施例１で得られたＡＭ４αを含有するアフィニティー精製画分およびレーン４はＭＭＬＶ逆転写酵素標品を示す。
【００９８】
図３に示された結果から、実施例１で得られたＡＭ４αを含有するアフィニティー精製画分および比較例１で得られたＷＴαを含有するアフィニティー精製画分は、いずれも、６３ｋＤａの単一のバンドを示したことから、高い純度のＡＭ４αおよびＷＴαが得られたことがわかる。
【００９９】
試験例３
実施例１で得られた精製ＡＭ４αまたは比較例１で得られた精製ＷＴαを、その濃度が１０ｎＭとなるように、反応液{組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、０〜２５μＭの範囲の濃度のポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕および０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕}に添加し、得られた混合物を３７℃でインキュベーションした。
【０１００】
インキュベーション開始から２．５分間、５．０分間または７．５分間経過後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、氷上で冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、氷上で冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄することにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回、エタノール水溶液による洗浄は１回行なった。
【０１０１】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノスティックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、液体シンチレーションカウンターで放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいてｄＴＴＰ取り込み量を算出した。
【０１０２】
前記ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて初期反応速度を算出した。つぎに、グラフ作成ソフトウェア〔シナジー・ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）製、商品名：Ｋａｌｅｉｄａ  Ｇｒａｐｈ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５〕を用い、用いられた基質〔ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〕濃度と、初期反応速度と、ミカエリス−メンテンの速度式とに基づいて非線形最小２乗回帰法にしたがって、ｋcat値、Ｋm値およびｋcat／Ｋm値を算出した。試験例３において、基質〔ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〕濃度と、初期反応速度との関係を調べた結果を図４に示す。図中、白三角は実施例１で得られたＡＭ４α、白丸は比較例１で得られたＷＴαを示す。また、実施例１で得られたＡＭ４αおよび比較例１で得られたＷＴαそれぞれのｋcat値、Ｋm値およびｋcat／Ｋm値を調べた結果を表３に示す。
【０１０３】
【表３】
2013165669.tif 000004
【０１０４】
図４に示された結果から、実施例１で得られたＡＭ４αの初期反応速度は、比較例１で得られたＷＴαの初期反応速度と比べて大きいことがわかる。また、表３に示された結果から、実施例１で得られたＡＭ４αのＫm値は、比較例１で得られたＷＴαのＫm値の４０％であることがわかる。したがって、これらの結果から、テンプレートプライマー（ＤＮＡ）に対する実施例１で得られたＡＭ４αの親和性は、テンプレートプライマー（ＤＮＡ）に対する比較例１で得られたＷＴαの親和性よりも高いことが示唆される。
【０１０５】
試験例４
実施例１で得られたＡＭ４αまたは比較例１で得られたＷＴαを、その濃度が３０ｎＭとなるように、インキュベーション用溶液Ａ〔組成：２８μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１０体積％グリセロール〕に添加した。得られた混合物を４６℃で５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間または３０分間インキュベーションして実施例１で得られたＡＭ４αまたは比較例１で得られたＷＴαに熱処理を施した。つぎに、熱処理後のＡＭ４αまたは熱処理後のＷＴαを含有する混合物を、氷上で３０〜６０分間インキュベーションした。
【０１０６】
つぎに、得られたＡＭ４αまたはＷＴαを、その濃度が３０ｎＭとなるように、反応液｛組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、２５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕、０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕｝に添加し、得られた混合物３７℃でインキュベーションして逆転写酵素反応を行なった。
【０１０７】
インキュベーション開始から２．５分間、５．０分間または７．５分間経過後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、氷上で冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、氷上で冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄することにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回、エタノール水溶液による洗浄は１回行なった。
【０１０８】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノスティックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、液体シンチレーションカウンターで放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいてｄＴＴＰ取り込み量を算出した。
【０１０９】
また、インキュベーション用溶液Ａの代わりに、インキュベーション用溶液Ｂ〔組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１０体積％グリセロール〕を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、ｄＴＴＰ取り込み量を算出した。
【０１１０】
ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて初期反応速度を算出した。つぎに、熱処理を行なっていない場合の初期反応速度（「初期反応速度ａ」という）と、熱処理を行なった場合の初期反応速度（「初期反応速度ｂ」という）とから、残存活性を算出した。前記残存活性は、式（ＩＩ）：
［残存活性（％）］＝（初期反応速度ｂ／初期反応速度ａ）×１００    （ＩＩ）
で表わされる式に基づいて算出した。その後、熱処理におけるインキュベーション時間に対して残存活性の対数値をプロットした。試験例４において、インキュベーション時間と、ｌｎ［残存活性（％）］との関係を調べた結果を図５に示す。図中、ｌｎ［残存活性（％）］は、残存活性の自然対数値を示す。また、図中、白三角はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂ中で熱処理されたＡＭ４α、黒三角はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含有するインキュベーション用溶液Ａ中で熱処理されたＡＭ４α、白丸はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂ中で熱処理されたＷＴα（比較例１）、黒丸はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含有するインキュベーション用溶液Ａ中で熱処理されたＷＴα（比較例１）を示す。
【０１１１】
つぎに、式（ＩＩＩ）：
ｌｎ［Ｂ］＝Ａ−ｋobsｔ                                            （ＩＩＩ）
（式中、Ａは定数項を示し、Ｂは残存活性(%)を示し、ｔは熱処理時間を示す）
で表わされる式に基づいて熱不活性化一次速度定数ｋobsを決定した。
【０１１２】
また、熱処理温度に対してｋobsの対数値をプロットした。試験例４において、熱処理温度と、１／Ｔ×１０3と、ｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］との関係を調べた結果を図６に示す。図中、ｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］は、ｋobsの自然対数値を示す。また、図中、白三角はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂ中で熱処理されたＡＭ４α、黒三角はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含有するインキュベーション用溶液Ａ中で熱処理されたＡＭ４α、白丸はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂ中で熱処理されたＷＴα（比較例１）、黒丸はポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含有するインキュベーション用溶液Ａ中で熱処理されたＷＴα（比較例１）を示す。
【０１１３】
つぎに、図６に示された結果に基づき、実施例１で得られたＡＭ４αおよび比較例１で得られたＷＴαそれぞれを１０分間インキュベーションしたときにインキュベーション前の逆転写酵素活性の５０％に減少させるのに必要な温度Ｔ50を算出した。
【０１１４】
さらに、図６に示された結果に基づき、式（ＩＶ）：
ｌｎ（ｋobs）＝Ａ−（Ｅa／Ｒ）（ｌ／Ｔ）                            （ＩＶ）
（式中、Ａは定数項を示し、Ｒは気体定数（＝８．３１４Ｊ／Ｋ・ｍｏｌ）を示し、Ｔは絶対温度（Ｋ）である）
で表わされる式に基づき、アレニウスプロットを用い、実施例１で得られたＡＭ４αおよび比較例１で得られたＷＴαそれぞれの熱不活性化に対する活性化エネルギーＥaを算出した。
【０１１５】
図５に示された結果から、比較例１で得られたＷＴαの残存活性は、２５分間のインキュベーションで１０％未満に減少するのに対し、実施例１で得られたＡＭ４αの残存活性は、ほとんど減少しないことがわかる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られたＡＭ４αの４６℃での熱安定性は、比較例１で得られたＷＴαの４６℃での熱安定性と比べ、高いことがわかる。
【０１１６】
また、実施例１で得られたＡＭ４αでは、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂを用いたときのＴ50は５０．１℃であるのに対して、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含有するインキュベーション用溶液Ａを用いたときのＴ50は４９．３℃であると推定された。一方、比較例１で得られたＷＴαでは、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂを用いたときのＴ50は４４．３℃であるのに対して、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含有するインキュベーション用溶液Ａを用いたときのＴ50は４４．１℃であると推定された。これらの結果から、実施例１で得られたＡＭ４αのＴ50は、比較例１で得られたＷＴαのＴ50と比べて高いことがわかる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られたＡＭ４αの熱安定性は、比較例１で得られたＷＴαの熱安定性と比べ、高いことがわかる。また、これらの結果から、ＡＭ４αの熱失活の速度は、ＷＴαの速度よりも遅いことがわかる。
【０１１７】
さらに、実施例１で得られたＡＭ４αでは、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂを用いたときのＥaは２４０ｋＪ／ｍｏｌ、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）155を含有するインキュベーション用溶液Ａを用いたときのＥaは２９８ｋＪ／ｍｏｌであると推定された。一方、比較例１で得られたＷＴαでは、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15を含まないインキュベーション用溶液Ｂを用いたときのＥaは１９４ｋＪ／ｍｏｌ、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）155を含有するインキュベーション用溶液Ａを用いたときのＥaは２４４ｋＪ／ｍｏｌと推定された。これらの結果から、実施例１で得られたＡＭ４αのＥaは、比較例１で得られたＷＴαのＥaと比べて高いことがわかる。したがって、これらの結果から、実施例１で得られたＡＭ４αの熱安定性は、比較例１で得られたＷＴαの熱安定性と比べ、高いことがわかる。また、これらの結果から、ＤＮＡ相互作用領域の正の実効電荷を大きくする方法が、鋳型プライマー存在下と非存在下のいずれにおいても、ＡＭＶ逆転写酵素の熱安定性を上げることに有効であることがわかる。
【０１１８】
以上の結果から、実施例１で得られたＡＭ４αは、比較例１で得られたＷＴαよりも高い熱安定性を有しているため、配列番号：２で示されるアミノ酸配列中のＤＮＡ相互作用領域における正の実効電荷を増加させることによって、野生型逆転写酵素と比べて熱安定性を向上させることができることが示唆される。
【０１１９】
試験例５
ＰＣＲ用チューブに、水１２μＬと１０×逆転写酵素緩衝液〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウムおよび２０ｍＭジチオスレイトール〕２μＬと、２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物１μＬと、１０μＭ  ＲＶ−Ｒ２６プライマー水溶液１μＬと、標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）１μＬと、大腸菌ＲＮＡ溶液（１．０μｇ／μＬ）１μＬと、実施例１で得られたＡＭ４αまたは比較例１で得られたＷＴαを含む酵素溶液〔１０ｎＭ  ＡＭ４αまたはＷＴα、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００、１０体積％グリセロール〕２μＬとを入れて混合し、反応混合液２０μＬを得た。
【０１２０】
なお、標準ＲＮＡとして、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のｃｅｓＡ遺伝子（ジーンバンクアクセッション番号：ＤＱ３６０８２５）の塩基配列の塩基番号：８３５３〜９３６６に対応する１０１４ヌクレオチドからなるＲＮＡをイン・ビトロ転写によって調製したものを用いた。なお、ＲＶ−Ｒ２６プライマーの塩基配列および配列番号は、表４に示されるとおりである。
【０１２１】
【表４】
2013165669.tif 000005
【０１２２】
得られた反応混合液を、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃または６６℃の反応温度で３０分間インキュベーションした後、９５℃で５分間加熱した。つぎに、得られた産物３μＬと、水１８μＬと１０×ＰＣＲ緩衝液〔組成：５００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）および１５ｍＭ塩化マグネシウム〕３μＬと、１０μＭ  Ｆ５プライマー水溶液１μＬと、１０μＭ  ＲＶプライマー水溶液１μＬと、２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物３μＬと、組換Ｔａｑポリメラーゼ溶液〔東洋紡（株）製、１Ｕ／μＬ〕１μＬとを混合し、ＰＣＲ用混合物３０μＬを得た。得られたＰＣＲ用混合物を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間のインキュベーションの後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なうことによって実施した。なお、Ｆ５プライマーおよびＲＶプライマーそれぞれの塩基配列および配列番号は、表４に示されるとおりである。
【０１２３】
得られた増幅産物を、１．０質量％アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、エチジウムブロマイド（１μｇ／ｍＬ）で染色した。試験例５において、各反応温度での反応によって得られた産物をアガロースゲル電気泳動によって解析した結果を図７に示す。図中、（Ａ）は実施例１で得られたＡＭ４α、（Ｂ）は比較例１で得られたＷＴαを示す。
【０１２４】
図７に示された結果から、実施例１で得られたＡＭ４αは、反応温度が６４℃までの範囲でｃＤＮＡ合成活性を示すのに対して、比較例１で得られたＷＴαは、反応温度が６０℃までの範囲でしかｃＤＮＡ合成活性を示さないことがわかる。これらの結果から、実施例１で得られたＡＭ４αは、比較例１で得られたＷＴαよりも高い温度でｃＤＮＡ合成活性を示すことがわかる。
【０１２５】
以上の結果から、配列番号：２で示されるアミノ酸配列中のＤＮＡ相互作用領域における正の実効電荷を増加させることによって、野生型逆転写酵素と比べて熱安定性を向上させることができることが示唆される。
【０１２６】
実施例２
製造例１（１）で得られたｐＦａｓｔＢａｃ１−ＷＴαを用い、製造例１（２）および実施例１と同様の操作を行ない、配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基からなる領域（ＤＮＡ相互作用領域）中のアミノ酸残基に存在する負電荷アミノ酸残基（アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基）および当該配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基からなる領域中の他のアミノ酸残基を、対応する領域の正の実効電荷が配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基からなる領域の正の実効電荷よりも大きくなるように、正電荷アミノ酸残基（アルギニン残基もしくはリジン残基）または非極性アミノ酸残基（アラニン残基、グリシン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、システイン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基またはプロリン残基）に置換されたポリペプチドによって構成された変異型逆転写酵素を得る。
【０１２７】
つぎに、試験例３〜５において、実施例１で得られたＡＭ４αの代わりに、得られた変異型逆転写酵素を用いることを除き、試験例３〜５と同様の操作を行ない、ＷＴαに対する変異型逆転写酵素における耐熱性の向上の度合いを調べる。
【０１２８】
その結果、配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基からなる領域（ＤＮＡ相互作用領域）、特に、領域H20-E44、領域N55-F114、領域Q148-C152、領域L178-H191、領域D215-S233、領域T234-G240、領域Q254-A289、領域A310-C328、領域W349-L390および領域L408-S417からなる群より選ばれた少なくとも１つにおける正の実効電荷を増加させることによって、野生型逆転写酵素と比べて熱安定性を向上させることができることがわかる。
【０１２９】
実施例１で得られたＡＭ４αのＤＮＡ相互作用領域（配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応する領域）においては、正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「−１」とすると、式（Ｉ）の値が６となり、ＷＴαのものよりも＋４大きくなっている。また、実施例２で得られた変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域（配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応する領域）においては、前記式（Ｉ）の値が＋２〜＋８の範囲となる傾向が見られる。
【０１３０】
かかる結果より、配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基（野生型逆転写酵素のα鎖のＤＮＡ相互作用領域）に対応する領域において、前記式（Ｉ）の値が＋２〜＋８の範囲となるように、配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基（野生型逆転写酵素のα鎖のＤＮＡ相互作用領域）中のアミノ酸残基に存在する負電荷アミノ酸残基および当該配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基からなる領域中の他のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、野生型逆転写酵素と比べて高い熱安定性を有する変異型逆転写酵素を得ることができることが示唆される。
【０１３１】
以上説明したように、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域（配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応する領域）に局在するアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換し、かつ前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域とすることにより、二次構造の形成が抑制される温度での逆転写酵素の熱安定性が向上することから、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても用いることができ、効率よく逆転写反応を行なうことができる汎用性の高い変異型逆転写酵素が得られることがわかる。
【０１３２】
かかる変異型逆転写酵素（本発明の変異型逆転写酵素）は、高い熱安定性を有していることから、高い反応温度での反応に用いた場合であっても、高い逆転写酵素活性を発現する。そのため、本発明の変異型逆転写酵素によれば、テンプレートとして用いられるＲＮＡが二次構造を形成しやすい配列を含む場合であっても、逆転写反応の際の反応温度を高い温度に設定して二次構造の形成を抑制し、かつ逆転写することができる。
【０１３３】
したがって、本発明の変異型逆転写酵素は、用いられるＲＮＡ含有試料に制限されることのない汎用性の高い分析用試薬（例えば、逆転写反応キット）、ウイルス、細菌、疾患などの検出用試薬（例えば、検出キット）などとして有用であることが示唆される。
【０１３４】
処方例
以下、逆転写反応キットおよび検出キットの例を示す。
【０１３５】
（逆転写反応キット）
−  実施例１で得られたＡＭ４α
−  １０×逆転写酵素緩衝液
〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、
２０ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、〕
−  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
【０１３６】
（検出キット）
−  実施例１で得られたＡＭ４α
−  １０×逆転写酵素緩衝液
〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、
２０ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、〕
−  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
−  １０μＭプライマー水溶液（検出対象のウイルス、細菌、疾患に特異的な配列を
有するＲＮＡを増幅するためのプライマー対を含有する水溶液）
−  標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）
【０１３７】
実施例３
配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基に対応するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基からなるＤＮＡ相互作用領域と立体構造上類似する核酸相互作用領域または配列番号：２の１位のスレオニン残基〜４２６位のアラニン残基の配列との配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列からなる核酸相互作用領域を有する核酸関連酵素をコードするＤＮＡに対し、配列番号：２の２３８位のバリン残基に対応するアミノ酸残基、３８８位のロイシン残基に対応するアミノ酸残基および４５０位のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基からなる群より選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基を正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換するための変異を導入する。変異が導入されたＤＮＡを細胞内で発現させる。得られた産物を用い、野生型核酸関連酵素の至適反応温度よりも高い温度で酵素反応を行ない、酵素活性を測定する。これにより、野生型核酸関連酵素を用いたときよりも高い酵素活性を示す熱安定性が高い核酸関連酵素を得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１３８】
配列番号：５は、プライマーＶ２３８Ｒの配列である。
配列番号：６は、プライマーＶ２３８Ｒ＿ＣＰの配列である。
配列番号：７は、プライマーＬ３８８Ｒの配列である。
配列番号：８は、プライマーＬ３８８＿ＣＰの配列である。
配列番号：９は、プライマーＤ４５０Ａの配列である。
配列番号：１０は、プライマーＤ４５０Ａ＿ＣＰの配列である。
配列番号：１１は、プライマーＲＶ−Ｒ２６の配列である。
配列番号：１２は、プライマーＦ５の配列である。
配列番号：１３は、プライマーＲＶの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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