(57)【要約】【課題】ギ酸オキシダーゼを利用して酢酸に含まれるギ酸を精度良く且つ高感度に定量する酢酸中のギ酸定量方法を提供する。【解決手段】測定対象となる酢酸を希釈した酢酸水溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液又は酸性領域に緩衝能を有する緩衝液等を用いてｐＨ４．０〜４．５に調整した後、酢酸水溶液にギ酸とギ酸オキシダーゼ又はギ酸オキシダーゼのみを加え、所定時間反応させる。酢酸水溶液に含まれるギ酸は、酸素により二酸化炭素に酸化され、その過程で生成する酸素が還元されて過酸化水素が生成される。そして、生成される過酸化水素をぺルオキシダーゼを用いた酵素法で測定する。測定された結果に基づいて測定対象となる酢酸に含まれるギ酸の濃度を定量する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象となる酢酸を希釈して所定濃度の酢酸水溶液を調製し、調製した酢酸水溶液のｐＨを調整するとともにギ酸オキシダーゼを添加して所定時間反応させ、反応により生成する過酸化水素を測定して酢酸に含まれるギ酸の濃度を定量する酢酸中のギ酸定量方法。
【請求項２】
希釈した酢酸水溶液のｐＨを４．０〜４．５に調整する請求項１に記載の酢酸中のギ酸定量方法。
【請求項３】
希釈した酢酸水溶液にギ酸オキシダーゼとともに所定濃度のギ酸を添加して所定時間反応させ、反応により生成する過酸化水素を測定し、得られた測定結果と添加したギ酸濃度に基づいて酢酸に含まれるギ酸の濃度を定量する請求項１又は２に記載の酢酸中のギ酸定量方法。
【請求項４】
得られた過酸化水素の測定結果を、前記酢酸水溶液と同じ酢酸濃度で同じｐＨに調整されるとともに既知濃度のギ酸を含む参照用の酢酸水溶液を同じ条件でギ酸オキシダーゼにより反応させて生成された過酸化水素の測定結果と比較することにより、酢酸に含まれるギ酸の濃度を定量する請求項１又は２に記載の酢酸中のギ酸定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酢酸中のギ酸を、精度良く且つ高感度に定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸は、石炭化学合成において重要な中間生成物で、ポリエチレンや酢酸セルロース、ポリビニル、合成繊維などの製造に使用されている。経済産業省生産動態統計における酢酸の生産量は、平成２２年度で４５万トンであり、今後その生産量は高水準を維持するものと見込まれる。全世界での酢酸の生産量は、およそ年５百万トンと見積もられる。残り１．５百万トンは毎年再利用されており、都合、全世界での市場流通量は年６．５百万トンとなる。酢酸は世界で最も広く生産されている酸である。
【０００３】
酢酸は、主に石油化学原料から製造される。また、生物資源からの製造も行われているが、現在は大規模なものには至っていない。しかし、今後生物資源からの製造が増加すると考えられる。これらの製造において、ギ酸は酢酸に含まれるおもな不純物の１つである。酢酸中のギ酸の含有率は、最終的な製品の品質を左右するため、酢酸中のギ酸濃度の測定は不可欠である。
【０００４】
酢酸の再利用においては、抽出あるいは蒸留操作により酢酸を回収する方法が採られる。ギ酸は、抽出、蒸留などの酢酸回収工程で、酢酸に同伴する挙動を示し、酢酸とギ酸の分離は難しい。酢酸中のギ酸の含有は、最終的な製品の品質を左右する。
【０００５】
特許文献１では、酢酸以外の有機物を選択的に触媒湿式酸化処理して酢酸を処理水中に残存させた後、酢酸含有処理水を抽出あるいは蒸留操作により酢酸を回収する方法が提案されている。この回収方法においては、触媒湿式酸化処理が不十分で処理水中に未処理のギ酸が残存した場合に、残存したギ酸が抽出、蒸留などの酢酸回収工程で酢酸に同伴する挙動を示し、精製酢酸に濃縮されるために、酢酸品質の低下をもたらす。従って、高品質酢酸を回収するためには、処理水中のギ酸濃度を常に一定基準以下に管理する必要がある。また、特許文献２では、回収した酢酸の導電率を測定して酢酸の純度を定量的に分析することが提案されているが、ギ酸濃度について管理することは行われていない。
【０００６】
従来の酢酸中のギ酸の定量方法としては、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを用いた方法が開発されている。しかし、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを用いた方法では、酢酸中のギ酸の測定限界は濃度０．０５ｗｔ％以上で（アジレント・テクノロジー株式会社「Agilent 7820A GCによる工業用酢酸中のギ酸分析」資料による）、それ以下のギ酸濃度は測定が困難であり、測定には高価な装置が必要となって実用的ではない。また、ギ酸デヒドロゲナーゼを用いる方法も開発されているが、ギ酸デヒドロゲナーゼは、最適なｐＨが中性〜アルカリ性領域であるため、酢酸中のギ酸の分析には適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平６−９１２７９号公報
【特許文献２】特開平１０−２９８１３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記した従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、ギ酸オキシダーゼを用いて、酢酸中に存在するギ酸を精度良く且つ高感度に定量する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る酢酸中のギ酸定量方法は、測定対象となる酢酸を希釈して所定濃度の酢酸水溶液を調製し、調製した酢酸水溶液のｐＨを調整するとともにギ酸オキシダーゼを添加して所定時間反応させ、反応により生成する過酸化水素を測定して酢酸に含まれるギ酸の濃度を定量する。さらに、希釈した酢酸水溶液のｐＨを４．０〜４．５に調整する。さらに、希釈した酢酸水溶液にギ酸オキシダーゼとともに所定濃度のギ酸を添加して所定時間反応させ、反応により生成する過酸化水素を測定し、得られた測定結果と添加したギ酸濃度に基づいて酢酸に含まれるギ酸の濃度を定量する。さらに、得られた過酸化水素の測定結果を、前記酢酸水溶液と同じ酢酸濃度で同じｐＨに調整されるとともに既知濃度のギ酸を含む参照用の酢酸水溶液を同じ条件でギ酸オキシダーゼにより反応させて生成された過酸化水素の測定結果と比較することにより、酢酸に含まれるギ酸の濃度を定量する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ギ酸オキシダーゼを用いることで、短時間に酢酸中の極低濃度〜高濃度のギ酸を定量することができる。そして、本発明に係るギ酸の定量方法は、高価な機器を必要としないため、分析機器を備えていない工場における酢酸の製造工程や酢酸の回収工程において酢酸の品質確認を行う際に特に有効で実用的である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１の測定結果を示すグラフである。
【図２】実施例２の測定結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の測定結果を示すグラフである。
【図４】実施例４の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例５の測定結果を示すグラフである。
【図６】実施例６の測定結果を示すグラフである。
【図７】実施例６の測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例７の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例８の測定結果を示すグラフである。
【図１０】実施例９の測定結果を示すグラフである。
【図１１】実施例９の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。本発明者は、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、酢酸中のギ酸定量方法として、測定対象となる酢酸を希釈した酢酸水溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液、酢酸ナトリウム水溶液又は酸性領域に緩衝能を有する緩衝液を用いて調整し、ｐＨ調整した酢酸水溶液に所定量のギ酸及びギ酸オキシダーゼを加えて所定時間反応させ、反応により生成する過酸化水素の量を測定することで、極低濃度〜高濃度（０．００１ｗｔ％〜１０ｗｔ％）のギ酸を精度良く且つ高感度で定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、ｐＨを調整した酢酸水溶液にギ酸及びギ酸オキシダーゼを加え、酢酸水溶液に含まれるギ酸を酸素を用いて二酸化炭素に酸化し、その過程で生成する酸素が還元されて生成する過酸化水素を、例えばぺルオキシダーゼを用いた酵素法で測定し、測定結果に基づいて測定対象の酢酸中に含まれるギ酸を定量化することができる。ｐＨ調整した後の酢酸水溶液のｐＨは４．０〜４．５であることが好ましい。また、ギ酸オキシダーゼの反応時における酢酸水溶液の酢酸濃度は１．０Ｍ（モル）以下であることが好ましく、酢酸水溶液にギ酸を添加する場合のギ酸濃度は０．００５ｍＭ（ミリモル）〜０．２０ｍＭであることが好ましい。反応時のギ酸オキシダーゼの酵素濃度は、０．１Ｕ／ｍＬ（ミリリットル）〜０．８Ｕ／ｍＬであることが好ましく、０．２Ｕ／ｍＬの酵素濃度では反応時間は３０から６０分が好ましい。なお、Ｕ（ユニット）は、１分間に１μoleのギ酸を二酸化炭素に酸化する酵素量である。
【００１４】
また、本発明に係るギ酸オキシダーゼを用いる定量方法は、低〜高濃度（０．０２ｗｔ％〜１０ｗｔ％）のギ酸を含む酢酸にも適用可能である。測定対象の酢酸を希釈してｐＨを調整した酢酸水溶液中にギ酸オキシダーゼを加えて所定時間反応させ、酢酸水溶液中に含まれるギ酸を酸素を用いて二酸化炭素に酸化し、その過程で生成する酸素が還元されて生成する過酸化水素の量を測定する。過酸化水素の測定には、例えば、ぺルオキシダーゼを用いた酵素法又は酸素電極法により行うことができる。
【００１５】
そして、参照対象として、同様にｐＨを調整して既知濃度のギ酸を含む酢酸水溶液を調製し、調製した酢酸水溶液中でギ酸オキシダーゼを同様に反応させて生成する過酸化水素量を測定し、参照対象の過酸化水素量と比較することにより測定対象の酢酸に含まれるギ酸の濃度を決定することができる。この場合、ｐＨ調整した後の測定対象及び参照対象の酢酸水溶液のｐＨは４．０〜４．５であることが好ましい。また、ギ酸オキシダーゼの反応時における測定対象及び参照対象の酢酸水溶液の酢酸濃度は０．０１Ｍ以下であることが好ましい。また、反応時のギ酸オキシダーゼの酵素濃度は、０．０５Ｕ／ｍＬ〜０．４Ｕ／ｍＬであることが好ましく、０．２Ｕ／ｍＬの酵素濃度では反応時間は３０分が好ましい。
【００１６】
本発明に係る酢酸中のギ酸定量方法は、まず、希釈した酢酸のｐＨを調整することによってギ酸オキシダーゼの反応の条件を整える。次に、ギ酸オキシダーゼを添加して所定時間反応させる。酢酸中のギ酸の濃度が極低濃度（０．００１ｗｔ％〜０．０２ｗｔ％）である場合にはギ酸オキシダーゼとともにギ酸を添加する。そして、反応により生成する過酸化水素をペルオキシダーゼを用いた酵素法で測定して、測定結果に基づいて酢酸中のギ酸の濃度を定量するものである。
【００１７】
希釈した酢酸のｐＨ調整には、水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ性水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、又は、酸性領域に緩衝能を有する緩衝液等を用いることができるが、水酸化ナトリウム等のアルカリ性水溶液を用いることが好ましい。調整するｐＨは、使用するギ酸オキシダーゼに応じて設定すればよく、後述するギ酸オキシダーゼを使用する場合には、ｐＨ４．０〜４．５に調整することが好ましい。酸性領域に緩衝能を有する緩衝液としては、リン酸クエン酸緩衝液やクエン酸緩衝液が挙げられる。
【００１８】
ギ酸の高感度定量には、酢酸に対して感受性が低いギ酸オキシダーゼが好ましい。例えば、アスペルギルス・ノミウス（Aspergillus nomius IRIO13）由来の酵素、デバリオマイセス・バンリジアエ（Debaryomyces vanrijiae MH201）由来の酵素、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae RIB40）由来の酵素が挙げられる。MH201株由来の酵素に関しては、本発明者によりその特性が確認されている（H. Uchida et al.," Purification, characterization, and potential applications of formate oxidase from Debaryomyces vanrijiae MH201", Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74 p.805-812）。また、RIB40株に関しても、本発明者によりその特性が確認されている（Y. Maeda et al., "Expression in Escherichia coli of an Unnamed Protein Gene from Aspergillus oryzae RIB40 and Cofactor Analyses of the Gene Product as Formate Oxidase", Biosci. Biotechnol. Biochem. (2009) 73(12) p.2645-2649）。
【００１９】
酢酸の希釈倍率は、含有するギ酸量及びギ酸オキシダーゼの酢酸に対する感受性を考慮して決定することが望ましい。即ち、希釈の目安としては、極低濃度のギ酸の定量にはギ酸オキシダーゼが反応できる範囲で出来る限り高い酢酸濃度になることが好ましく、具体的にはギ酸オキシダーゼの反応時の水溶液中の酢酸濃度は０．４〜１．０Ｍが好ましい。
【００２０】
酢酸中のギ酸をギ酸オキシダーゼと所定時間反応させるが、反応時間は使用する酵素量を考慮して決定することが望ましい。即ち、反応時間の目安としては、高濃度酢酸存在下では、具体的には３０分〜１２０分が好ましい。
【００２１】
反応により生成された過酸化水素の測定方法は、公知の方法を用いればよく、例えば、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンピシリン、（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン, ナトリウム塩, 二水和物）と反応させ、産出するキノン色素量を吸光度５５５ｎｍで測定する。
【００２２】
酢酸中のギ酸が低〜高濃度の場合には、上述したように、まず、希釈した酢酸のｐＨを調整することによって、ギ酸オキシダーゼの反応の条件を整える。次に、ギ酸オキシダーゼのみを添加し、所定時間反応させる。そして、反応により生成する過酸化水素をペルオキシダーゼを用いた酵素法で測定して、酢酸中のギ酸の濃度を定量するものである。ギ酸の濃度の定量には、既知濃度のギ酸を含む酢酸中におけるギ酸オキシダーゼによる過酸化水素の生成量に基づいてギ酸を定量することができる。
【００２３】
希釈した酢酸のｐＨ調整には、水酸化ナトリウム等のアルカリ性水溶液、酢酸ナトリウム水溶液、又は、酸性領域に緩衝能を有する緩衝液等を用いることができるが、酸性領域に緩衝能を有する緩衝液を用いることが好ましい。こうした緩衝液としては、リン酸クエン酸緩衝液やクエン酸緩衝液が挙げられる。極低濃度のギ酸の定量には、添加するギ酸オキシダーゼとしては、酢酸に対して感受性が低いギ酸オキシダーゼが好ましいが、低〜高濃度のギ酸の定量には、酢酸に対して感受性が低くないギ酸オキシダーゼも使用することができる。
【００２４】
低〜高濃度（０．０５ｗｔ％〜１０ｗｔ％）のギ酸を定量する場合には、酢酸の希釈倍率は、酢酸中に含有するギ酸量を考慮して決定することが望ましい。即ち、希釈の目安としては、酵素反応液中のギ酸濃度が、０．００５〜０．２０ｍＭになるように希釈することが好ましい。酢酸中のギ酸及びギ酸オキシダーゼを所定時間反応させるが、反応時間は使用する酵素量を考慮して決定することが望ましい。即ち、反応時間の目安としては、ギ酸濃度を０．００５ｍＭ〜０．２０ｍＭに調整した場合には、３０分以下が好ましい。
【００２５】
反応により生成された過酸化水素の測定方法は、上述した酵素法を用いて行うことができる。また、生成する過酸化水素を測定する以外にも酸素消費量を測定して得られたデータに基づいてギ酸を定量することもできる。
【実施例】
【００２６】
［実施例１］
市販の特級酢酸（濃度１７．３Ｍ）及び特級ギ酸（濃度２６．２Ｍ）を使用した。ギ酸オキシダーゼは、Aspergillus oryzae RIB40株由来の酵素を使用した。まず、ギ酸２０μＬ（マイクロリットル）を１０ｍＬの蒸留水に加え、５２．４ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。調製したギ酸水酸溶液を、蒸留水を用いて、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍及び２５６倍にそれぞれ希釈し、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。酢酸４００μＬと１０Ｍの濃度の水酸化ナトリウム水溶液２００μＬを、３０００μＬの蒸留水に加え、ｐＨ４．２の１．９２Ｍの酢酸水溶液を調製した。また、調製した酢酸水溶液を蒸留水を用いて２倍に希釈し、ｐＨ４．２の０．９６１Ｍの酢酸水溶液を調製した。
【００２７】
調製した０．９６１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬをそれぞれ加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。また、比較のため、調製した０．９６１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、蒸留水２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬを加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。即ち、これらの反応液中における添加したギ酸の濃度は、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭ、０．０１０３ｍＭ及び０ｍＭとなり、反応液中における酢酸濃度は０．８６６Ｍとなる。
【００２８】
得られた反応液５００μＬに、２．６９ｍＭの濃度の４−アミノアンピシリン１６７μＬ、１５ｍＭの濃度の（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−ｍ−トルイジン, ナトリウム塩, 二水和物) ３３μＬ、蒸留水６７μＬ、ペルオキシダーゼ溶液（１００Ｕ／ｍＬ）３３μＬを加え、室温で発色反応を行った。５分後に０．５ｍＭの濃度のＮａＮ3水溶液２００ｍＬを加えて発色反応を停止し、５５５ｎｍの吸光度をＵ２００１吸光光度計（株式会社日立製作所製）により測定した。
【００２９】
蒸留水５００μＬに、２．６９ｍＭの濃度の４−アミノアンピシリン１６７μＬ、１５ｍＭの濃度の（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−ｍ−トルイジン, ナトリウム塩, 二水和物) ３３μＬ、蒸留水６７μＬ、ペルオキシダーゼ溶液（１００Ｕ／ｍＬ）３３μＬを加え、室温で発色反応を行い、５分後に０．５ｍＭの濃度のＮａＮ3水溶液２００ｍＬを加えて発色反応を停止して、５５５ｎｍの吸光度を同様に測定したものをコントロールとした。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００３０】
図１に測定結果を示す。図１に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。３０分、６０分及び１２０分のすべての反応時間において、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度と添加ギ酸濃度は良い直線性を示した。各反応時間の測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
＜３０分の場合＞
ｙ＝２．８８９ｘ＋０．０４１（Ｒ2＝０．９９８７）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０４１／２．８８９＝０．０１４２
＜６０分の場合＞
ｙ＝４．８３２２ｘ＋０．０６（Ｒ2＝０．９９９６）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０６／４．８３２２＝０．０１２４
＜１２０分の場合＞
ｙ＝７．０６１１ｘ＋０．０９２６（Ｒ2＝０．９９９５）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０９２６／７．０６１１＝０．０１３１
また、３０分、６０分及び１２０分の反応時間における測定結果に基づいて、ギ酸添加前に８６６ｍＭの濃度の酢酸中に含まれるギ酸の濃度は、それぞれ、０．０１３１ｍＭ、０．０１２４ｍＭ、０．０１４２ｍＭと算出される。これらの値の平均値０．０１３２ｍＭ、ギ酸の分子量４６、酢酸の分子量６０に基づいて以下の計算式により、
０．０１３２／８６６×１００＝０．００１５２４（ｍｏｌ％）
０．００１５２４×４６／６０＝０．００１１７（ｗｔ％）
使用した酢酸中に含まれるギ酸の濃度は、０．００１１７ｗｔ％と算出される。
【００３１】
［実施例２］
実施例１と同様の酢酸、ギ酸及びギ酸オキシダーゼを使用した。まず、ギ酸２０μＬを１０ｍＬの蒸留水に加え、５２．４ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。調製したギ酸水酸溶液を、蒸留水を用いて、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍及び２５６倍にそれぞれ希釈し、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。酢酸４００μＬと１０Ｍの濃度の水酸化ナトリウム水溶液２００μＬを、３０００μＬの蒸留水に加え、ｐＨ４．２の１．９２Ｍの酢酸水溶液を調製した。
【００３２】
調製した１．９２Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬをそれぞれ加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。また、比較のため、調製した１．９２Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、蒸留水２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬを加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。即ち、これらの反応液中における添加したギ酸の濃度は、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭ、０．０１０３ｍＭ及び０ｍＭとなり、反応液中における酢酸濃度は１．７３Ｍとなる。
【００３３】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００３４】
図２に測定結果を示す。図２に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。実施例１に比べて酵素反応は遅くなっており、酵素が高濃度の酢酸により阻害されていることが示唆されている。しかし、３０分、６０分及び１２０分のすべての反応時間において、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度と添加ギ酸濃度は良い直線性を示した。各反応時間の測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
＜３０分の場合＞
ｙ＝１．３７１５ｘ＋０．０２０９（Ｒ2＝０．９６９９）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０２０９／１．３７１５＝０．０１５２
＜６０分の場合＞
ｙ＝２．３７６３ｘ＋０．０３９３（Ｒ2＝０．９８）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０３９３／２．３７６３＝０．０１６５
＜１２０分の場合＞
ｙ＝４．０６８１ｘ＋０．０７０６（Ｒ2＝０．９８５）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０７０６／４．０６８１＝０．０１７４
また、３０分、６０分及び１２０分の反応時間における測定結果に基づいて、ギ酸添加前に１．７３Ｍの濃度の酢酸中に含まれるギ酸の濃度は、それぞれ、０．０１７４ｍＭ、０．０１６５ｍＭ、０．０１５２ｍＭと算出される。これらの値の平均値０．０１６４ｍＭ、ギ酸の分子量４６、酢酸の分子量６０に基づいて以下の計算式により、
０．０１６４／１７３０×１００＝０．０００９４８（ｍｏｌ％）
０．０００９４８×４６／６０＝０．０００７２７（ｗｔ％）
使用した酢酸中に含まれるギ酸の濃度は、０．０００７２７ｗｔ％と算出される。
【００３５】
［実施例３］
実施例１と同様の酢酸、ギ酸及びギ酸オキシダーゼを使用した。まず、ギ酸２０μＬを１０ｍＬの蒸留水に加え、５２．４ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。調製したギ酸水酸溶液を、蒸留水を用いて、３２倍、６４倍、１２８倍及び２５６倍にそれぞれ希釈し、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。酢酸４００μＬと１０Ｍの濃度の水酸化ナトリウム水溶液２００μＬを、３０００μＬの蒸留水に加え、ｐＨ４．３の１．９２Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。また、調製した１．９２Ｍの濃度の酢酸水溶液を蒸留水を用いて４倍に希釈し、ｐＨ４．３の０．４８１Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。
【００３６】
調製した０．４８１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬをそれぞれ加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。また、比較のため、調製した０．４８１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、蒸留水２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬを加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。即ち、これらの反応液中における添加したギ酸の濃度は、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭ、０．０１０３ｍＭ及び０ｍＭとなり、反応液中における酢酸濃度は０．４３３Ｍとなる。
【００３７】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００３８】
図３に測定結果を示す。図３に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。３０分、６０分及び１２０分のすべての反応時間において、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度と添加ギ酸濃度は良い直線性を示した。各反応時間の測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
＜３０分の場合＞
ｙ＝４．７１６６ｘ＋０．０１１（Ｒ2＝０．９９９６）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０１１／４．７１６６＝０．００２３３
＜６０分の場合＞
ｙ＝６．９３５２ｘ＋０．０２２１（Ｒ2＝０．９９９４）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０２２１／６．９３５２＝０．００３１９
＜１２０分の場合＞
ｙ＝８．７０３３ｘ＋０．０３１２（Ｒ2＝０．９９９７）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０３１２／８．７０３３＝０．００３５８
また、３０分、６０分及び１２０分の反応時間における測定結果に基づいて、ギ酸添加前に０．４３３Ｍの濃度の酢酸中に含まれるギ酸の濃度は、それぞれ、０．００２３３ｍＭ、０．００３１９ｍＭ、０．００３５８ｍＭと算出される。これらの値の平均値０．００３０３ｍＭ、ギ酸の分子量４６、酢酸の分子量６０に基づいて以下の計算式により、
０．００３０３／４３３×１００＝０．０００７（ｍｏｌ％）
０．０００７×４６／６０＝０．０００５３７（ｗｔ％）
使用した酢酸中に含まれるギ酸の濃度は、０．０００５３７ｗｔ％と算出される。
【００３９】
［実施例４］
実施例１と同様の酢酸、ギ酸及びギ酸オキシダーゼを使用した。まず、ギ酸２０μＬを１０ｍＬの蒸留水に加え、５２．４ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。調製したギ酸水酸溶液を、蒸留水を用いて、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍及び２５６倍にそれぞれ希釈し、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。酢酸４００μＬ、１０Ｍの濃度の水酸化ナトリウム水溶液２００μＬ、０．２０５ｍＭのギ酸水溶液１３６６μＬを、１６３４μＬの蒸留水に加え、０．７７９Ｍの濃度のギ酸を含むｐＨ４．２で１．９２Ｍの酢酸水溶液を調製した。また、調製した１．９２Ｍの濃度の酢酸水溶液を蒸留水を用いて２倍に希釈し、０．３８９ｍＭの濃度のギ酸を含むｐＨ４．２の０．９６１Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。この場合、使用した酢酸に０．００３１０ｗｔ％の濃度のギ酸を添加したことになる。
【００４０】
調製した０．９６１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬをそれぞれ加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。また、比較のため、調製した０．９６１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、蒸留水２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬを加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。即ち、これらの反応液中において新たに添加したギ酸の濃度は、３．２８ｍＭ、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭ、０．０１０３ｍＭ及び０ｍＭとなる。また、これらの反応液中のギ酸の濃度は、それぞれ、（３．２８＋０．３５０＋α）ｍＭ、（０．１６４＋０．３５０＋α）ｍＭ、（０．０８１９＋０．３５０＋α）ｍＭ、（０．０４０９＋０．３５０＋α）ｍＭ、（０．０２０５＋０．３５０＋α）ｍＭ、（０．０１０３＋０．３５０＋α）ｍＭ及び（０＋０．３５０＋α）ｍＭ（αは、使用した酢酸に含まれているギ酸に由来するギ酸濃度）となり、反応液中における酢酸濃度は０．８６６Ｍとなる。
【００４１】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００４２】
図４に測定結果を示す。図４に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。３０分、６０分及び１２０分のすべての反応時間において、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度と添加ギ酸濃度は良い直線性を示した。各反応時間の測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
＜３０分の場合＞
ｙ＝１．９７７７ｘ＋０．０９５３（Ｒ2＝０．９９９９）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０９５３／１．９７７７＝０．０４８２
＜６０分の場合＞
ｙ＝３．６２６５ｘ＋０．１７７２（Ｒ2＝０．９９９９）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．１７７２／３．６２６５＝０．０４８９
＜１２０分の場合＞
ｙ＝５．９６１６ｘ＋０．２９４９（Ｒ2＝０．９９９７）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．２９４９／５．９６１６＝０．０４９５
また、３０分、６０分及び１２０分の反応時間における測定結果に基づいて、反応液中に含まれるギ酸の濃度は、それぞれ、０．０４８２ｍＭ、０．０４８９ｍＭ、０．０４９５ｍＭと算出される。これらの値の平均値０．０４８９ｍＭ、ギ酸の分子量４６、酢酸の分子量６０に基づいて以下の計算式により、
０．０４８９／８６６×１００＝０．００５６５（ｍｏｌ％）
０．００５６５×４６／６０＝０．００４３３（ｗｔ％）
反応前のギ酸を含む酢酸水溶液では、ギ酸の濃度が０．００４３３ｗｔ％と算出される。この定量結果をみると、反応前に酢酸水溶液では、添加したギ酸の濃度が０．００３１０ｗｔ％となるように調製したことから、使用した酢酸のギ酸の濃度が０．００１２３ｗｔ％となって実施例１で求めた０．００１１７ｗｔ％とほぼ一致することがわかった。
【００４３】
［実施例５］
実施例１と同様の酢酸、ギ酸及びギ酸オキシダーゼを使用した。まず、ギ酸２０μＬを１０ｍＬの蒸留水に加え、５２．４ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。調製したギ酸水酸溶液を、蒸留水を用いて、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍及び２５６倍にそれぞれ希釈し、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。酢酸４００μＬ、１０Ｍの濃度の水酸化ナトリウム水溶液２００μＬ、０．２０５ｍＭのギ酸水溶液１３６６μＬを、１６３４μＬの蒸留水に加え、０．７７９Ｍの濃度のギ酸を含むｐＨ４．２で１．９２Ｍの酢酸水溶液を調製した。また、調製した１．９２Ｍの濃度の酢酸水溶液を蒸留水を用いて４倍に希釈し、０．１９５ｍＭの濃度のギ酸を含むｐＨ４．２の０．４８１Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。この場合、使用した酢酸に０．００３００ｗｔ％の濃度のギ酸を添加したことになる。
【００４４】
調製した０．４８１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭ及び０．２０５ｍＭの濃度のギ酸水溶液２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬをそれぞれ加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。また、比較のため、調製した０．４８１Ｍの酢酸水溶液３６００μＬに、蒸留水２００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）２００μＬを加え、室温で３０分、６０分、１２０分反応させた。即ち、これらの反応液中において新たに添加したギ酸の濃度は、３．２８ｍＭ、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭ、０．０１０３ｍＭ及び０ｍＭとなる。また、これらの反応液中のギ酸の濃度は、それぞれ、（３．２８＋０．１７６＋α）ｍＭ、（０．１６４＋０．１７６＋α）ｍＭ、（０．０８１９＋０．１７６＋α）ｍＭ、（０．０４０９＋０．１７６＋α）ｍＭ、（０．０２０５＋０．１７６＋α）ｍＭ、（０．０１０３＋０．１７６＋α）ｍＭ及び（０＋０．１７６＋α）ｍＭ（αは、使用した酢酸に含まれているギ酸に由来するギ酸濃度）となり、反応液中における酢酸濃度は０．４３３Ｍとなる。
【００４５】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００４６】
図５に測定結果を示す。図５に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。３０分、６０分及び１２０分のすべての反応時間において、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度と添加ギ酸濃度は良い直線性を示した。各反応時間の測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
＜３０分の場合＞
ｙ＝３．０９１１ｘ＋０．０６３７（Ｒ2＝０．９９９２）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．０６３７／３．０９１１＝０．０２０６
＜６０分の場合＞
ｙ＝５．１３１５ｘ＋０．１１０７（Ｒ2＝０．９９９７）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．１１０７／５．１３１５＝０．０２１６
＜１２０分の場合＞
ｙ＝７．４９１９ｘ＋０．１７７２（Ｒ2＝０．９９８６）
ｙ＝０とすると、ｘ＝０．１７７２／７．４９１９＝０．０２３７
また、３０分、６０分及び１２０分の反応時間における測定結果に基づいて、反応液中に含まれるギ酸の濃度は、それぞれ、０．０２０６ｍＭ、０．０２１６ｍＭ、０．０２３７ｍＭと算出される。これらの値の平均値０．０２２０ｍＭ、ギ酸の分子量４６、酢酸の分子量６０に基づいて以下の計算式により、
０．０２２０／４３３×１００＝０．００５０８（ｍｏｌ％）
０．００５０８×４６／６０＝０．００３９０（ｗｔ％）
反応前のギ酸を含む酢酸水溶液では、ギ酸の濃度が０．００３９０ｗｔ％と算出される。この定量結果をみると、反応前に酢酸水溶液では、添加したギ酸の濃度が０．００３１０ｗｔ％となるように調製したことから、使用した酢酸のギ酸の濃度が０．０００８０ｗｔ％となって実施例２で求めた０．０００７２７ｗｔ％とほぼ一致することがわかった。
【００４７】
［実施例６］
実施例１と同様の酢酸、ギ酸及びギ酸オキシダーゼを使用した。まず、酢酸に蒸留水を加えて１０倍に希釈し、１．７３Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。ギ酸に蒸留水を加えて、８倍、１６倍、３２倍、６４倍及び１２８倍にそれぞれ希釈し、３．２８Ｍ、１．６４Ｍ、０．８１９Ｍ、０．４０９Ｍ及び０．２０５Ｍのギ酸水溶液を調製した。希釈した酢酸水溶液１０ｍＬに、希釈したギ酸水溶液２０μＬを加え、６．５５ｍＭ、３．２７ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１６ｍＭ及び０．４０９ｍＭの濃度のギ酸を含む１．７３Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。
【００４８】
調製した異なる濃度のギ酸を含む１．７３Ｍの濃度の酢酸水溶液１００μＬと１．０Ｍの濃度の酢酸ナトリウム水溶液約１００μＬとを混合した後、蒸留水に加えて総量１９００μＬとした。これらのｐＨ４．１〜４．４に調製したギ酸を含む酢酸水溶液１９００μＬに、１００μＬの酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）を加え、室温で３０分反応させた。この反応液中の添加したギ酸濃度は、それぞれ０．３２８ｍＭ、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭとなり、酢酸濃度は８６．６ｍＭとなる。ｐＨ４．１〜４．４のギ酸を含まない酢酸水溶液１９００μＬに、１００μＬの酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）を加え、室温で３０分反応したものを、コントロールとした。
【００４９】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００５０】
図６及び図７に測定結果を示す。図６に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。図７に示すグラフでは、横軸に反応液中におけるギ酸の酢酸に対するｗｔ％をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。図６及び図７をみると、０．０２ｗｔ％〜０．３ｗｔ％の範囲ではすべてのｐＨにおいて良い直線性を示した。図６に示す各ｐＨにおける測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
＜ｐＨ４．１の場合＞
ｙ＝５．７７４ｘ＋０．０１７３（Ｒ2＝０．９９７２）
＜ｐＨ４．２の場合＞
ｙ＝５．７７４６ｘ＋０．０２１４（Ｒ2＝０．９９５）
＜ｐＨ４．３の場合＞
ｙ＝６．１１０３ｘ−０．００５（Ｒ2＝０．９９９９）
＜ｐＨ４．４の場合＞
ｙ＝５．５２２６ｘ＋０．０１１１（Ｒ2＝０．９９７８）
図７に示す各ｐＨにおける測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
＜ｐＨ４．１の場合＞
ｙ＝３．７００４ｘ＋０．０１３９（Ｒ2＝０．９９７２）
＜ｐＨ４．２の場合＞
ｙ＝３．７００８ｘ＋０．０１８（Ｒ2＝０．９９５）
＜ｐＨ４．３の場合＞
ｙ＝３．９１５９ｘ−０．００８６（Ｒ2＝０．９９９９）
＜ｐＨ４．４の場合＞
ｙ＝３．５３９３ｘ＋０．００７９（Ｒ2＝０．９９７８）
また、ｐＨ４．１〜ｐＨ４．４において酵素反応に対するｐＨの影響はほとんどみられなかった。この結果は、０．０２ｗｔ％〜０．３ｗｔ％のギ酸を含む酢酸水溶液とギ酸オキシダーゼを用いた定量方法により、標準となる複数種類のギ酸濃度に対応する標準線を図６及び図７に示すように予め作成しておき、測定対象となる酢酸の測定結果を標準線と比較することで、０．０２ｗｔ％〜０．３ｗｔ％のギ酸を含む酢酸の場合にはギ酸濃度を正確に決定できることを示している。
【００５１】
［実施例７］
実施例１と同様の酢酸、ギ酸及びギ酸オキシダーゼを使用した。まず、酢酸に蒸留水を加えて１０倍に希釈し、１．７３Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。ギ酸に蒸留水を加えて、８倍、１６倍、３２倍、６４倍及び１２８倍にそれぞれ希釈し、３．２８Ｍ、１．６４Ｍ、０．８１９Ｍ、０．４０９Ｍ及び０．２０５Ｍのギ酸水溶液を調製した。希釈した酢酸水溶液１０ｍＬに、希釈したギ酸水溶液２０μＬを加え、６．５５ｍＭ、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８２ｍＭ及び０．４１ｍＭの濃度のギ酸を含む１．７３Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。
【００５２】
調製した異なる濃度のギ酸を含む１．７３Ｍの濃度の酢酸水溶液１００μＬと０．２Ｍの濃度のリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）１０００μＬとを混合した後、蒸留水に加えて総量１９００μＬとした。これらのｐＨ４．１〜４．４に調製したギ酸を含む酢酸水溶液１９００μＬに、１００μＬの酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）を加え、室温で３０分反応させた。この反応液中の添加したギ酸濃度は、それぞれ０．３２８ｍＭ、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭとなり、酢酸濃度は８６．６ｍＭとなる。即ち、反応液は、酢酸に対して、０．０３１９ｗｔ％、０．０６３７ｗｔ％、０．１２７ｗｔ％、０．２５５ｗｔ％、０．５１０ｗｔ％の濃度のギ酸を含む。ギ酸を含まない酢酸水溶液を用いて、同様の操作をしたものを、コントロールとした。即ち、ｐＨ４．１〜４．４のギ酸を含まない酢酸水溶液１９００μＬに、１００μＬの酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）を加え、室温で３０分反応したものを、コントロールとした。
【００５３】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００５４】
図８に測定結果を示す。図８に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。図８をみると、０．０２ｗｔ％〜０．３ｗｔ％の範囲において良い直線性を示した。図８に示す測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
ｙ＝６．６５５９ｘ−０．０４１８（Ｒ2＝０．９９９７）
以上の結果からみて、酸性領域に緩衝能を有する緩衝液を用いても、酢酸中のギ酸濃度を決定できることを示している。さらに、反応液中の酢酸濃度は、２０ｍＭ程度まで下げることが可能であり、酢酸中のギ酸濃度が酢酸濃度に対して１．０ｗｔ％までの場合でも定量可能である。
【００５５】
［実施例８］
実施例１と同様の酢酸、ギ酸及びギ酸オキシダーゼを使用した。まず、酢酸に蒸留水を加えて５００倍に希釈し、３．４６ｍＭの濃度の酢酸水溶液を調製した。ギ酸に蒸留水を加えて、８倍、１６倍、３２倍、６４倍及び１２８倍にそれぞれ希釈し、３．２８Ｍ、１．６４Ｍ、０．８１９Ｍ、０．４０９Ｍ及び０．２０５Ｍのギ酸水溶液を調製した。希釈した酢酸水溶液１０ｍＬに、希釈したギ酸水溶液２０μＬを加え、６．５５ｍＭ、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８２ｍＭ及び０．４１ｍＭの濃度のギ酸を含む３．４６ｍＭの濃度の酢酸水溶液を調製した。
【００５６】
調製した異なる濃度のギ酸を含む３．４６ｍＭの濃度の酢酸水溶液１００μＬと０．２Ｍの濃度のリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１０００μＬとを混合した後、蒸留水に加えて総量１９００μＬとした。この混合液のｐＨは４．２であった。このｐＨ４．２に調製したギ酸を含む酢酸水溶液１９００μＬに、１００μＬの酵素溶液（５．２Ｕ／ｍＬ）を加え、室温で３０分反応させた。この反応液中の添加したギ酸濃度は、それぞれ０．３２８ｍＭ、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭとなり、酢酸濃度は１．７３ｍＭとなる。即ち、反応液は、酢酸に対して、１４．１ｗｔ％、７．０３ｗｔ％、３．５１ｗｔ％、１．７５ｗｔ％、０．８７９ｗｔ％の濃度のギ酸を含む。ギ酸を含まない酢酸水溶液を用いて、同様の操作をしたものを、コントロールとした。即ち、ｐＨ４．２のギ酸を含まない酢酸水溶液１９００μＬに、１００μＬの酵素溶液（５．２Ｕ／ｍＬ）を加え、室温で３０分反応したものを、コントロールとした。
【００５７】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００５８】
図９に測定結果を示す。図９に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。図９をみると、０．８７９ｗｔ％〜１４．１ｗｔ％の範囲において良い直線性を示した。図９に示す測定結果に基づく近似式は以下の通りである。
ｙ＝６．７５４２ｘ−０．０３３６（Ｒ2＝０．９９９５）
以上の結果からみて、酸性領域に緩衝能を有する緩衝液を用いて、酢酸中の高濃度のギ酸濃度を決定できることを示している。
【００５９】
以上の測定結果によれば、ｐＨ調整にアルカリ性溶液を用いてギ酸オキシダーゼを添加する定量方法では、酢酸中に含まれる０．０００５ｗｔ％〜１０．０ｗｔ％の濃度のギ酸を定量可能であると考えられる。
【００６０】
［実施例９］
実施例１と同様の酢酸及びギ酸を使用し、ギ酸オキシダーゼはDebaryomyces vanrijiae MH201由来の酵素を使用した。まず、蒸留水１０ｍＬにギ酸２０μＬを加え、５２．４ｍＭのギ酸水溶液を調製した。調製したギ水酸溶液を、蒸留水を用いて、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍に希釈し、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭの濃度のギ酸水溶液を調製した。酢酸４００μＬ及び１０Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００μＬを３０００μＬの蒸留水に加え、ｐＨ４．２で１．９２Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。調製した酢酸水溶液を、蒸留水を用いて、２０倍及び４０倍希釈し、ｐＨ４．３で０．０９６２Ｍ及び０．０４８１Ｍの濃度の酢酸水溶液を調製した。
【００６１】
調製した０．０９６２Ｍ及び０．０４８１Ｍの濃度の酢酸水溶液１８００μＬに、３．２８ｍＭ、１．６４ｍＭ、０．８１９ｍＭ、０．４０９ｍＭの濃度のギ酸水溶液１００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）１００μＬとをそれぞれ加え、室温で３０分反応させた。また、調製した０．９６１Ｍの濃度の酢酸水溶液１８８μＬに、蒸留水１００μＬと酵素溶液（４．０Ｕ／ｍＬ）１００μＬとを加え、室温で３０分反応させた。即ち、これらの反応液中の添加したギ酸の濃度は、０．１６４ｍＭ、０．０８１９ｍＭ、０．０４０９ｍＭ、０．０２０５ｍＭ及び０ｍＭとなり、反応液中の酢酸濃度は０．０８６６Ｍ及び０．０４３３Ｍとなる。
【００６２】
得られた反応液５００μＬに対して実施例１と同様の発色反応を行って吸光度を測定した。また、コントロールについても実施例１の場合と同様に蒸留水５００μＬに対して行って、吸光度を測定した。そして、反応液中におけるギ酸に由来する吸光度は、各濃度の添加ギ酸の存在下で測定した吸光度からコントロールで測定した吸光度を引いた値とした。
【００６３】
図１０及び図１１に測定結果を示す。図１０に示すグラフでは、横軸に反応液中における添加したギ酸濃度をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。図１１に示すグラフでは、横軸に反応液中におけるギ酸の酢酸に対するｗｔ％をとり、縦軸に反応液中におけるギ酸に由来する吸光度をとった。図１０及び図１１をみると、Debaryomyces vanrigiae MH201由来のギ酸オキシダーゼは、酢酸による阻害を受けやすく、酢酸中の極低濃度のギ酸濃度の決定には用いることはできないが、酢酸中の低〜高濃度のギ酸濃度を決定に用いることができることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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