(57)【要約】      （修正有）【課題】ジアセチル産生能を有する乳酸菌株をＰＣＲによって簡便かつ短時間にスクリーニングする方法、およびそれにより得られる菌株を提供する。【解決手段】ジアセチルを生成する経路において、菌体内へのクエン酸の取り込みを担う酵素遺伝子を標的としたＰＣＲによって、簡便にかつ効率良くジアセチル生産株をスクリーニングする。この方法により選抜された乳酸菌株を得て、該乳酸菌株を使用することにより、従来にない強い発酵風味を持つ飲食品を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の一種以上について、Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部をＰＣＲによって増幅することで、ジアセチルを生産する菌株を検出することを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング方法。
【請求項２】
Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーが配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号２（Ｒ１）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とする請求項１に記載のジアセチル生産株のスクリーニング方法。
【請求項３】
Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーが配列表配列番号３（Ｆ２）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とする請求項１に記載のジアセチル生産株のスクリーニング方法。
【請求項４】
Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーが配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とする請求項１に記載のジアセチル生産株のスクリーニング方法。
【請求項５】
Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーであって、配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号２（Ｒ１）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング用プライマー。
【請求項６】
Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーであって、配列表配列番号３（Ｆ２）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング用プライマー。
【請求項７】
Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーであって、配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング用プライマー。
【請求項８】
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の一種以上について、Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部をＰＣＲによって増幅することで、ジアセチルを生産する菌株を検出することを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング方法によって選抜されたジアセチル生産株。
【請求項９】
請求項８に記載のジアセチル生産株を使用して製造された発酵風味が増強された飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌株のうち、発酵乳、カッテージチーズ、サワークリームや発酵バター等の香気成分であるジアセチルを生産する菌株をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって簡便に選択できるスクリーニング方法に関する。また、本発明は、該スクリーニング方法に使用するＰＣＲプライマー、該スクリーニング方法により選抜されるジアセチル生産株および該生産株を使用して製造した飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジアセチルおよびアセトインは発酵乳を主原料とする発酵乳製品、例えば発酵乳、カッテージチーズ、サワークリームや発酵バター等において発酵風味の主体となる香気成分である。これらの成分は製品を発酵させる過程でスターター乳酸菌によって生成される。そのため、ジアセチルおよびアセトインの生成量が多いスターター乳酸菌を用いることで、発酵風味が増強された飲食品を得ることができる。
【０００３】
このような乳酸菌のうち、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の一部の菌株は、ジアセチルの産生能が高いことが明らかになっており、これらの菌株は発酵乳製品のスターター乳酸菌として利用されている。
これらのジアセチル生産株は、クエン酸を前駆体としてジアセチルを産生することから（非特許文献１）、クエン酸を添加して発酵を行ったり、菌株におけるクエン酸の利用性を向上したりすることにより、発酵乳製品において、ジアセチルの産生を増強する方法が報告されている（特許文献１、特許文献２）。
クエン酸を前駆体として、ジアセチルを産生する経路では、菌体内へのクエン酸の取り込みが重要である。クエン酸の取り込みを担っているＣｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ、以下、Ｃｉｔ−Ｐと示す場合がある）は膜タンパク質であり、プラスミド上にコードされていることが開示されている（非特許文献２）。
また、これまでのジアセチル生産株の選択は、クエン酸代謝に着目した寒天培地（非特許文献３）、または、液体培養物を用いて呈色反応を実施することで行われていた。
【０００４】
一方で、近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって特定の微生物を検出する簡便な方法が報告されている（特許文献３）。これまでに実施されているＰＣＲによる菌種同定・菌株識別法は１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に由来する特定遺伝子領域を用いるものが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１−１４８１８２号
【特許文献２】特開平３−２１９８８４号
【特許文献３】特開２００３−２５５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３１，４８１−４８６
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６１，３１７２−３１７６
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３９，９２６−９２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１、２には、クエン酸の添加やクエン酸の利用性を向上することにより、発酵乳製品におけるジアセチルの産生を増強する方法が報告されていたが、あくまでジアセチルの産生能が高い菌株を用いることで発酵風味を増強していたに過ぎない。
非特許文献３に開示されているジアセチル生産株の選択方法は、複雑な組成の培地を調製する煩雑な工程が必要であるうえに、培養から検出まで２日程度の時間がかかる。さらに、菌株に応じた培養条件の設定が必要であった。
特許文献３には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって特定の微生物を検出する簡便な方法が開示されているが、この検出方法は菌種もしくは亜種を識別するものであり、同菌種間では１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の相同性が高いため、次亜種を識別することは困難である。例えば、この検出方法では、ジアセチルを産生しないラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）とジアセチルを生産するラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス・バイオバー・ジアセチルラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ｂｉｏｖａｒ．ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）を区別することが著しく困難である。さらに、菌種を分類するのみでは産業上有益な活性を持つ菌を識別することができなかった。
【０００８】
本発明は、ジアセチルを産生する経路において、菌体内へのクエン酸の取り込みを担う酵素遺伝子を標的として、ＰＣＲによって増幅を行うことにより、ジアセチル産生能を有する乳酸菌株を簡便かつ短時間に検出・識別するスクリーニング方法の提供を目的とするものである。
また、本発明は、該スクリーニング方法に使用するＰＣＲプライマーセットの提供を目的とするものである。さらに、本発明は、このスクリーニング方法によって選抜された乳酸菌株と、該乳酸菌株を使用して、従来にない強い発酵風味を持つ飲食品およびその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ジアセチルを生産する経路において、菌体内へのクエン酸の取り込みを担う酵素遺伝子として、Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子に着目した。
本発明において、Ｃｉｔ−Ｐ遺伝子の塩基配列におけるジアセチル生産株で保存性の高い領域を増幅し得るプライマーセットを設計し、それらを用いてＰＣＲを行うことでジアセチル生産菌株を簡便に効率よく識別することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の一種以上について、Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を、ＰＣＲにより増幅することで、ジアセチルを生産する菌株を検出することを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング方法。
（２）Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーが配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号２（Ｒ１）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とする上記（１）に記載のジアセチル生産株のスクリーニング方法。
（３）Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーが配列表配列番号３（Ｆ２）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とする上記（１）に記載のジアセチル生産株のスクリーニング方法。
（４）Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーが配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とする上記（１）に記載のジアセチル生産株のスクリーニング方法。
（５）Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーであって、配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号２（Ｒ１）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング用プライマー。
（６）Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーであって、配列表配列番号３（Ｆ２）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング用プライマー。
（７）Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部を増幅するためのプライマーであって、配列表配列番号１（Ｆ１）で示される塩基配列を含むプライマーと、配列表配列番号４（Ｒ２）で示される塩基配列を含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング用プライマー。
（８）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）またはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の一種以上について、Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部をＰＣＲにより増幅することで、ジアセチルを生産する菌株を検出することを特徴とするジアセチル生産株のスクリーニング方法によって選抜されたジアセチル生産株。
（９）上記（８）に記載のジアセチル生産株を使用して製造された発酵風味が増強された飲食品。
【００１１】
なお、上記（５）および（６）のプライマーの組み合わせは、プライマーセットとしてジアセチル生産株を識別するために利用することができる。上記（７）のプライマーの組み合わせは、プライマーセットとして特にジアセチル生産能の高い菌株を識別するために利用することができる。
本発明により、上記（５）〜（７）のプライマーのいずれかを検体に加え、ＰＣＲによりＣｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅの部分配列を増幅し、得られた遺伝子断片を検出することによってジアセチル生産株を選抜できるスクリーニング方法を提供することができる。また、該スクリーニング方法によって、選抜されたジアセチル生産株、および該乳酸菌株を使用して製造した飲食品等を提供することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、乳酸菌株ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）について、ＰＣＲによって短時間かつ簡便にジアセチル生産株を識別することが可能となる。本発明は通常のＰＣＲを用いるため、特殊な技術を必要とせず、精度および再現性がよい。また、目的とする物質の代謝経路に関与する遺伝子を直接検出するため、効率よく産業上有益な菌株を選抜することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は、公知のラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）のＣｉｔＰ遺伝子の塩基配列を標的とし、この全部または一部をＰＣＲで増幅することにより、ジアセチル生産株を選抜できるプライマーを用いることを特徴とする。
このような本発明のスクリーニング方法に用い得るプライマーセットは以下のように設計することができる。
【００１４】
＜プライマーの設計＞
Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子は、ゲノム上に存在する遺伝子配列と、プラスミド上に存在する遺伝子配列の両方が公開されている。プラスミドは菌体内に複数コピーがあるため発現量が多くなり、効率良くクエン酸を取り込むことができると考えられる。そこでＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の塩基配列データベースに公開されているＣｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子の塩基配列情報のうち、５菌株のプラスミド上に存在するＣｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ遺伝子の配列（表１）に着目し、検出するプライマーを設計した。得られた塩基配列をＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔｅ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ｖｅｒ．１．８３）を用いてアライメントした。５菌株で保存されていた配列のうち、全ての配列に共通な部分から、通常のＰＣＲ条件で増幅可能であり、目的の配列を持つもののみを増幅し、他の領域や目的の配列を持たない菌株では増幅断片が生じないＦ１（配列表配列番号１）、Ｆ２（配列表配列番号２）、Ｒ１（配列表配列番号３）、Ｒ２（配列表配列番号４）を設計した（表２）。
【００１５】
【表１】
2013202013.tif 000002
【００１６】
【表２】
2013202013.tif 000003
【００１７】
スクリーニングする検体は乳酸菌培養液をそのままＰＣＲに供してもよく、菌体から核酸を抽出したものを用いてもよい。菌体から目的の核酸を抽出するには、例えば、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ−ＳＤＳ法や極東製薬工業株式会社のＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ等の市販のキットも使用することができ、特に限定されるものではない。
本発明のスクリーニング法におけるＰＣＲならびに増幅産物の検出には通常用いられる試薬および機器を使用することが可能であり、特に限定されるものではない。
これらのＰＣＲプライマーセットにより増幅産物が確認された検体は、クエン酸からジアセチルを産生するタンパク質群をコードするプラスミドを有していると考えられ、ジアセチル産生能を持つと判断できる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法により、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）のジアセチル生産株を取得することができる。
このようなジアセチル生産株のうち、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）の菌株としては、ＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）、ＳＢＴ１６８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）の菌株としては、ＮＣＩＭＢ７０１００７、ＮＣＩＭＢ７００１７６、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）の菌株としては、ＳＢＴ０９０５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４０）を挙げることができるが、本発明のスクリーニング方法によって選抜されるジアセチル生産株であればよく、特にこれらに限定されるものではない。なお、本発明のスクリーニング方法を用いることにより、ジアセチル生産株を識別することができるし、Ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ（Ｃｉｔ−Ｐ）遺伝子の全部または一部をＰＣＲによって増幅した特異的なバンドの評価により、ジアセチル生産株を選択することができる。
なお、ジアセチル生産株とは、グルコースの代謝産物のジアセチルおよびアセトインを検出するＶｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒテスト（ＶＰテスト）により、ジアセチルおよびその代謝産物であるアセトインの産生によって発色が確認できる、また、は、ガスクロマトグラフィーで測定した場合に培養物中のジアセチル量が０．０１ｐｐｍ以上である菌株のことをいう。ジアセチル高生産株とは、ＶＰテストにより、強い発色（赤色）が確認できる、または、ガスクロマトグラフィーで測定した場合に培養物中のジアセチル量が０．５ｐｐｍ以上、好ましくは１．０ｐｐｍ以上である菌株のことをいう。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法により選抜されたジアセチル生産株を使用して発酵風味が増強された飲食品を製造することができる。飲食品としては、発酵乳、乳酸菌飲料、カッテージチーズ、サワークリームや発酵バター等を挙げることができるが、特に限定されるものではなく、発酵風味を増強することが期待される飲食品に利用することができる。飲食品への利用方法であるが、発酵工程を有する飲食品では、通常の乳酸菌と同様に用いることができるし、原材料の一部として用いることもできる。よって、該飲食品の一般的な製造方法、製造装置を用いて、本発明における飲食品を製造することができる。
【実施例】
【００２０】
以下に本発明の実施例等をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
［実施例１］
１．ＰＣＲによる特異的検出（Ｆ１プライマー／Ｒ１プライマー）
以下の菌株について、本発明のプライマーセット（Ｆ１プライマーおよびＲ１プライマー）を用いてＰＣＲを実施した。
１）ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）
（１）ＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）
（２）ＳＢＴ１６８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０）
２）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）
（１）ＪＣＭ５８０５Ｔ
（２）ＮＣＩＭＢ７０１００７
（３）ＮＣＩＭＢ７００１７６
３）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）
（１）ＳＢＴ０９０５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４０）
（２）ＳＢＴ０９８７（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４１）
【００２２】
各菌株の培養菌体を用いて、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、４００ｕＭ  ｄＮＴＰ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４μＭ  プライマー（Ｆ１プライマー／Ｒ１プライマー）、２０ｎｇ／ｕｌ程度に希釈したＤＮＡ  １μｌを入れ、滅菌水で全量を２５μｌにした。ＰＣＲは、９４℃３分変性後、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒で３０サイクル、最後に７２℃１０分反応を行った。ＰＣＲ後、２％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色によりＰＣＲで増幅した特異的なバンドを検出した。
【００２３】
２．ＶＰテストによるジアセチル産生の有無の確認
グルコースの代謝産物のジアセチルおよびアセトインを検出するＶｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒテスト（ＶＰテスト）を利用して、供試菌株のジアセチルおよびその代謝産物であるアセトインの産生の有無を調べた。
脱脂乳培地に、供試菌株の培養液をそれぞれ３％接種し、３０℃（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓは２５℃）で１６時間、培養した。脱脂乳の培養物を小試験管にとり、α−ナフトール溶液と４０％ＫＯＨを加えた。試験管をよく振った後、斜めに傾けて、一時間後に溶液の発色を確認し、赤色になったものを陽性とした。
３．ジアセチル産生量の確認
脱脂乳培地に、供試菌株の培養液をそれぞれ３％接種し、３０℃（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓは２５℃）で１０時間、静置培養した。ガスクロマトグラフィーを用いて、Ｋｉｅｒｏｎｃｚｙｋらの方法（Ａ．  Ｋｉｅｒｏｎｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔ  Ｄａｉｒｙ  Ｊ，  １４：２２７−２３５）に準じて脱脂乳培養物中のジアセチル量を測定した。
試験結果を表３に示した。
【００２４】
【表３】
2013202013.tif 000004
【００２５】
（バンド評価）
＋＋：濃いバンド検出（明確にバンドが検出される。バンドの発色が明確で
あり、染色して検出する際に明確な白色のバンドが認められる。）
＋  ：薄いバンド検出（バンドが検出される。バンドの検出が明確であり、
染色して検出する際に灰色のバンドが認められる。）
−  ：バンド未検出
（ＶＰテスト評価）
＋＋：赤色
＋  ：オレンジ色
−  ：変化なし
（ジアセチル量）
ＮＤ：検出限界（０．１ｐｐｍ）以下
【００２６】
表３の結果から、Ｆ１プライマーおよびＲ１プライマーを用いたＰＣＲにより５菌株のｃｉｔＰ遺伝子検出株ＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）、ＳＢＴ１６８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０）、ＮＣＩＭＢ７０１００７、ＮＣＩＭＢ７００１７６、ＳＢＴ０９０５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４０）が得られた。このうちＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）、ＳＢＴ１６８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０）、ＮＣＩＭＢ７０１００７、ＮＣＩＭＢ７００１７６の４菌株は、ＶＰテストにより脱脂乳培養物中にジアセチルおよびアセトインの強い産生が、ＳＢＴ０９０５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４０）は、ジアセチルおよびアセトインの産生が認められた。表３に示したように、バンド評価で明確なバンドが認められた菌株は、ＶＰテストでも、ジアセチルおよびアセトインの強い産生を示し、バンドの明確さとジアセチルの産生との関係が示唆された。
【００２７】
［実施例２］
ＰＣＲによる特異的検出
Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーを用いて、実施例１と同様にＰＣＲを実施した。結果を表４に示した。
【００２８】
【表４】
2013202013.tif 000005
【００２９】
表４の結果から、実施例１と同様に、Ｆ２プライマーおよびＲ２プライマーを用いたＰＣＲにより、５菌株のｃｉｔＰ遺伝子検出株ＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）、ＳＢＴ１６８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０）、ＮＣＩＭＢ７０１００７、ＮＣＩＭＢ７００１７６、ＳＢＴ０９０５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４０）が得られた。このうちＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）、ＳＢＴ１６８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０）、ＮＣＩＭＢ７０１００７、ＮＣＩＭＢ７００１７６の４菌株は、ＶＰテストにより脱脂乳の培養物中にジアセチルおよびアセトインの強い産生が、ＳＢＴ０９０５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４０）は、ジアセチルおよびアセトインの産生が認められた。
【００３０】
［実施例３］
ＰＣＲによる特異的検出
Ｆ１プライマーおよびＲ２プライマーを用いて、実施例１と同様にＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９４℃３分変性後、９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃１分で３０サイクル、最後に７２℃１０分反応を行った。結果を表５に示した。
【００３１】
【表５】
2013202013.tif 000006
【００３２】
表５の結果から、Ｆ１プライマーおよびＲ２プライマーを用いたＰＣＲによりＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）、ＳＢＴ１６８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０）、ＮＣＩＭ７０１００７、ＮＣＩＭＢ７００１７６の４菌株のｃｉｔＰ遺伝子検出株が得られた。検出された全ての菌株について、ＶＰテストにより脱脂乳の培養物中にジアセチルおよびアセトインの強い産生が認められた。従って、この結果より、Ｆ１プライマーおよびＲ２プライマーを用いたＰＣＲにより、ジアセチル生産株の中でも高生産株を効率的にスクリーニング可能であることが確認された。
【００３３】
［実施例４］
発酵乳の製造
温水８９６５．５ｇ、脱脂乳９００ｇ、無塩バター１００ｇ、ゼラチン４ｇ、ペクチン０．５ｇを入れて攪拌し、溶解して原料ミックスとした。この原料ミックスを均質機で処理後、殺菌し、乳酸菌スターターとしてジアセチル生産株のラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）を３％添加して発酵ミックスを調製した。
対照として、同様にラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ５８０５Ｔを３％添加した発酵ミックスを調製した。
これらの発酵ミックスを、それぞれ３０℃で酸度０．８％になるまで発酵させた。
４℃で保存後、製造した発酵乳について、９名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「発酵風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価を行い、平均点を表６に示した。
【００３４】
【表６】
2013202013.tif 000007
【００３５】
表６の結果から、実施例５で製造した発酵乳は、対照品に比べて発酵風味が強く、好ましい評価が得られた。
したがって本発明のスクリーニング方法により得られた菌株を用いることにより、発酵風味が増強されたおいしい発酵乳を製造することができることが確認できた。
【００３６】
［実施例５］
カッテージチーズの製造
脱脂乳を殺菌し、３２℃まで冷却後、ジアセチル産生菌のラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＳＢＴ１１７８（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９）を５％添加した。対照として、同様にラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクチス（（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ５８０５Ｔを５％添加したものも作成した。レンネット０．１％を添加し、３１℃で５時間発酵させた。ｐＨ４．６に下がったカードをカッティングし、２０分静置後、お湯を入れて徐々に温度を上げた。５１℃になったところで２０分間おき、ホエーを排除後、水洗したものにドレッシングクリームを混合した。
５℃で保存後、製造したカッテージチーズについて、実施例５と同様に、９名のパネラーで官能評価を行った。「発酵風味の強さ」（−２：弱い、−１：やや弱い、０：どちらともいえない、＋１：やや強い、＋２：強い）「発酵風味の好ましさ」（−２：好ましくない、−１：やや好ましくない、０：どちらともいえない、＋１：やや好ましい、＋２：好ましい）「おいしさ」（−２：おいしい、−１：ややおいしい、０：どちらともいえない、＋１：ややおいしくない、＋２：おいしくない）について、５段階で評価行った平均点を表７に示した。
【００３７】
【表７】
2013202013.tif 000008
【００３８】
表７の結果から、実施例６で作成したカッテージチーズは対照品に比べ風味が強く、好ましいとの評価が得られた。本発明のスクリーニング方法により得られた菌株を用いて、発酵乳やカッテージチーズ等のおいしい乳製品を製造することが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によってスクリーニングされたジアセチル生産株を用いることにより、従来にない強い発酵風味を持つ飲食品を製造することが可能となる。このように本発明のスクリーニング方法および該方法によってスクリーニングされた菌株は、発酵バター、発酵乳、チーズ等の乳製品の製造分野において、幅広く利用することが可能である。
【受託番号】
【００４０】
［寄託生物材料への言及］
（１）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＳＢＴ１１７８
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成９年９月１７日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４２９
（２）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＳＢＴ１６８９
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
上記（１）に同じ
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成９年９月１７日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１６４３０
（３）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ＳＢＴ０９０５
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１９年３月６日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４０
（４）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ＳＢＴ０９８７
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
上記（３）に同じ
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１９年３月６日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４１
【配列表】
2013202013000001.app