(57)【要約】【課題】微量分析及び高速検出が可能なフローサイトメータを提供する。【解決手段】本発明に係るフローサイトメータでは、フローセル２の下流に、レーザ照射部１０及び光検出部１１を含む光学検出系と、高速度カメラ２０及びストロボランプ２１を含む撮像系と、セルソータ３０と、が順に配設されている。高速度カメラ２０とストロボランプ２１は、撮影トリガ発生部４２から出力される撮影トリガ信号に基づいて、候補粒子への照明と候補粒子の撮影を行う。撮影トリガ信号は、第一抽出部４１が候補粒子であると判定した被検粒子が光学検出系において測定された時点から所定の遅延時間が経過した時点で撮影トリガ発生部４２から出力される。高速度カメラ２０は、撮影トリガ信号が入力された時点から一定の時間、複数枚の画像を連続して撮影し、画像データをデータ処理部４０の第二抽出部４３に送る。【選択図】図１
2013015357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検粒子の中から所定の形態を有する目的粒子を検出するフローサイトメータにおいて、
被検粒子を流す流路と、
前記流路を流れる被検粒子の流速を調整する流速調整手段と、
前記流路の所定の検出領域に光を照射する光照射手段と、
前記検出領域からの光を検出する光検出手段と、
前記光検出手段の出力に基づいて、前記検出領域を流れる被検粒子の中から前記目的粒子の光学的特性を有する候補粒子を抽出する第一抽出手段と、
前記流路の前記検出領域よりも下流の所定の撮影領域を撮影する撮影手段と、
前記検出領域と前記撮影領域の間の流路内長さと前記流速とに基づいて、前記撮影領域を流れる前記候補粒子の撮影を実行するタイミングを前記撮影手段に指示する撮影タイミング指示手段と、
前記撮影手段が撮影した画像より、前記候補粒子の形態に基づいて前記候補粒子の中から前記目的粒子を抽出する第二抽出手段と、
を有することを特徴とするフローサイトメータ。
【請求項２】
さらに、
前記流路の前記撮影領域よりも下流の所定の分取領域において前記目的粒子を分取する分取手段と、
前記撮影領域と前記分取領域の間の流路内長さと前記流速とに基づいて、前記目的粒子を分取するタイミングを前記分取手段に指示する分取タイミング指示手段と、
を有することを特徴とする請求項１に記載のフローサイトメータ。
【請求項３】
前記撮影手段が、画素領域の各画素に対応した複数の記憶部を有し、所定フレーム数分の画像をまとめて読み出すバースト型のCCDイメージセンサ又はCMOSイメージセンサであることを特徴とする請求項１又は２に記載のフローサイトメータ。
【請求項４】
前記第一抽出手段が、統計的手法に基づいて前記候補粒子を抽出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のフローサイトメータ。
【請求項５】
前記第一抽出手段が、前記光検出手段において取得される受光強度の時間的変化のピーク及び積分ピークの形状に基づいて前記候補粒子を抽出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のフローサイトメータ。
【請求項６】
前記第一抽出手段が、連続時間符号化振幅顕微鏡法により得られた時間的な強度変化パターンに基づいて前記候補粒子を抽出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のフローサイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量分析、高速検出が可能なフローサイトメータに関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメータとは、層流が形成される流路に粒子を流し、個々の粒子を順番に分析する装置のことである。主に細胞の分析のために、分子生物学や医療の分野で多く使用される。また、分析した粒子の中から目的の粒子を分取することにも用いられる。
【０００３】
非特許文献１には、個々の粒子にレーザ光を照射し、それによって発生する散乱光や蛍光等の複数種類の光を検出し、これらの光検出データを統計的に解析することにより、粒子を分類する装置が示されている。また、非特許文献２には、個々の粒子を撮影し、その撮影画像から解析される各粒子の形態の違いによって粒子を分類する装置が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００９／０３１３０１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】"サイトメトリー"、[online]、ベックマンコールター（Beckman Coulter）、[平成２３年６月１７日検索]、インターネット<URL:http://www.bc-cytometry.com/cytometry.html>
【非特許文献２】"ビーエム機器株式会社  フローサイトメトリー ImageStream -イメージストリーム-"、[online]、ビーエム機器株式会社、[平成２３年６月１７日検索]、インターネット<URL:http://www.bmbio.com/product_catalog/imagestream.html>
【非特許文献３】K. Goda, K. K. Tsia & B. Jalali, "Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena", Nature（英国）, 30 April 2009, vol. 458, pp. 1145-1149
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
例えば医療の分野では、癌の早期発見のため、採取した血液中に癌の幹細胞が含まれているか否かを検出したいという要求がある。しかしながら、癌幹細胞は、血液中に含まれていたとしても非常に微量であり、10億個中に数個程度の割合でしか検出されない。
【０００７】
非特許文献１の装置を用いた場合、毎秒数万〜数十万個もの細胞が測定され、各々の光学的特性によって分類される。しかしながら、癌幹細胞のみを特定することは難しく、分類した細胞の中には、癌幹細胞以外の、同じような光学的特性を有する多数の細胞が含まれる。この中から癌幹細胞を分離するために、例えば癌幹細胞に結合しやすい蛋白質に磁性体材料を付着させて分取した細胞群と混合し、該蛋白質に結合した癌幹細胞を磁石で集める、といった方法が用いられるが、コストが高く、余計な手間と時間を要する。
【０００８】
一方、非特許文献２の装置では、撮影画像を解析することにより得られる形態から癌幹細胞のみを特定することができるが、測定速度が遅いという問題がある。例えば、非特許文献２には、毎秒1000個の速度で細胞の解析を行うことできると記載されているが、この速度では10億個の細胞を検査するために約12日もの時間が必要となる。そのため、何らかの高速化が必要となるが、非特許文献２の装置を高速化すると、大量の画像が撮影され、扱うデータ量が大きくなりすぎること、そのデータ処理に時間がかかりすぎること、等の問題が生じる。
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、微量分析及び高速検出が可能なフローサイトメータを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために成された本発明は、被検粒子の中から所定の形態を有する目的粒子を検出するフローサイトメータにおいて、
被検粒子を流す流路と、
前記流路を流れる被検粒子の流速を調整する流速調整手段と、
前記流路の所定の検出領域に光を照射する光照射手段と、
前記検出領域からの光を検出する光検出手段と、
前記光検出手段の出力に基づいて、前記検出領域を流れる被検粒子の中から前記目的粒子の光学的特性を有する候補粒子を抽出する第一抽出手段と、
前記流路の前記検出領域よりも下流の所定の撮影領域を撮影する撮影手段と、
前記検出領域と前記撮影領域の間の流路内長さと前記流速とに基づいて、前記撮影領域を流れる前記候補粒子の撮影を実行するタイミングを前記撮影手段に指示する撮影タイミング指示手段と、
前記撮影手段が撮影した画像より、前記候補粒子の形態に基づいて前記候補粒子の中から前記目的粒子を抽出する第二抽出手段と、
を有することを特徴とする。
【００１１】
本発明に係るフローサイトメータは、さらに、
前記流路の前記撮影領域よりも下流の所定の分取領域において前記目的粒子を分取する分取手段と、
前記撮影領域と前記分取領域の間の流路内長さと前記流速とに基づいて、前記目的粒子を分取するタイミングを前記分取手段に指示する分取タイミング指示手段と、
を有することが望ましい。
【００１２】
非特許文献２の装置では、画像の撮影と解析は連続的に行われる。一方、本発明に係るフローサイトメータでは、光照射手段及び光検出手段により被検粒子の光学的特性を取得し、第一抽出手段により候補粒子を絞り込んでから該候補粒子を撮影するといった２段階の構成を用いている。そのため、本発明のフローサイトメータでは、画像の撮影と解析は断続的に行われることになる。癌幹細胞のような微量な粒子の検出を行う場合、短い時間間隔で連続して目的粒子が検出されることはないため、画像データが減り、データ処理に時間的な余裕が生まれる。また、その分だけ流速を速く設定することが可能となる。
【００１３】
なお、例えば10億個の被検粒子の中から数分以内で目的粒子を検出する場合、毎秒数百万個の速度で測定を行う必要がある。それに応じて、撮影手段も毎秒数百万フレームといった非常に高速な撮影速度が必要となる。このような高速撮影を行う撮影手段として、例えば特許文献１に記載されているような、バースト型のCCD（Charge Coupled Device）イメージセンサ又はCMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサを用いることができる。バースト型のCCDイメージセンサ又はCMOSイメージセンサは、画素領域の周辺に配置した記憶部に、各画素から出力された信号を所定のフレーム数分だけ記憶させ、まとめて読み出すことにより、撮影速度の高速化を図ったものである。この特許文献１の装置は連続撮影には適していないものの、本発明のように断続的に撮影する用途には、その高速の撮影速度もあって非常に好適に用いることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るフローサイトメータでは、画像の撮影と解析を適切なタイミングで断続的に行うことにより、画像データを減らし、データ処理の高速化を行うことができる。また、その分だけ流路内の流速を速くすることができるため、微量粒子の検出を従来よりも短時間で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明に係るフローサイトメータの一実施例の概略構成図。
【図２】ヒストグラムによる候補粒子の判定方法を説明するための図。
【図３】ピークパルスによる候補粒子の判定方法を説明するための図。
【図４】連続時間符号化振幅顕微鏡法を用いる場合の光学検出系の概略構成図。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１６】
本発明に係るフローサイトメータの一実施例を、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のフローサイトメータの概略構成図である。
【００１７】
図１のフローサイトメータでは、フロー制御部１からシース液が導入され、フローセル２内に一定の流速に保たれた層流が形成されるように、シース液の流れが制御されている。サンプル導入部３からフローセル２内に導入された各被検粒子は、層流が形成されたフローセル２の中を順番に流れていく。
【００１８】
フローセル２には、レーザ照射部１０及び光検出部１１を含む光学検出系と、高速度カメラ２０及びストロボランプ２１を含む撮像系と、セルソータ３０と、が上流から順に配設されている。
【００１９】
レーザ照射部１０は１又は複数のレーザ光源を含み、フローセル２の検出領域１２にレーザ光を照射する。光検出部１１は検出領域１２の周囲に配設された１又は複数の光検出器を含み、検出領域１２を流れる被検粒子にレーザ光が照射されることによって生じる透過光、反射光、散乱光、蛍光等を検出する。
【００２０】
光検出部１１の各検出器は、受光強度に応じた検出信号を信号処理部１３に出力する。この検出信号は信号処理部１３において増幅やデジタル化等の所定の信号処理を受け、データ処理部４０に入力される。
【００２１】
データ処理部４０は例えば、所定のデータ処理プログラムがインストールされたパーソナルコンピュータによって構成される。データ処理部４０は、機能ブロックとして、第一抽出部４１、撮影トリガ発生部４２、第二抽出部４３、分取トリガ発生部４４を含む。
【００２２】
第一抽出部４１では、信号処理部１３からの入力データに基づいて、測定対象の被検粒子の光学的特性が目的粒子の光学的特性に一致するか否かを判定する。この第一抽出部４１における判定には、例えば非特許文献１に記載されている、ヒストグラムやゲーティング等の様々な統計的手法を用いることができる。
【００２３】
ここでは、ヒストグラムによる判定方法について簡単に説明する。光検出部１１の各検出器から得られる検出データをパラメータとして被検粒子毎にプロットしていくと、図２のような頻度分布グラフが得られる。この頻度分布グラフのことをヒストグラムと呼ぶ。なお、図２は側方散乱光強度と前方散乱光強度の相関関係を示す２パラメータヒストグラムである。
【００２４】
図２のようなヒストグラムを予備実験により予め作成しておけば、目的粒子がヒストグラムのどの領域に現れるかを知ることができる。従って、測定対象の被検粒子の検出データが、ヒストグラム上の所定の領域に現れるかを否かを判定することにより、目的粒子の候補粒子であるか否かを容易に判定することができる。
【００２５】
第一抽出部４１において、測定対象の被検粒子が候補粒子でないと判定された場合、その被検粒子は撮像系において撮影されることなく通過する。撮像系を通過した該被検粒子は、セルソータ３０によって分取されることなく容器３１に滴下される。
【００２６】
一方、第一抽出部４１において、測定対象の被検粒子が候補粒子であると判定された場合、光学検出系の下流にある撮像系においてより詳細な測定が行われる。この撮像系における測定の具体的な手順を以下に示す。
【００２７】
撮像系は、高速度カメラ２０とストロボランプ２１を含み、撮影トリガ発生部４２から出力される撮影トリガ信号に基づいて、候補粒子への照明と候補粒子の撮影を行う。撮影トリガ信号は、第一抽出部４１が候補粒子であると判定した被検粒子が光学検出系において測定された時点から所定の遅延時間が経過した時点で撮影トリガ発生部４２から出力される。なお、この遅延時間はフローセル２の検出領域１２と撮影領域２２の間の流路長さと、フロー制御部１が設定した流速によって決まる。
【００２８】
高速度カメラ２０は、撮影トリガ信号が入力された時点から一定の時間、複数枚の画像を連続して撮影する。このように候補粒子毎に複数枚の画像を撮影する理由は、候補粒子が撮影領域を通過する間に回転していた場合に、撮影した画像の中から適切な画像を選択するためである。
【００２９】
高速度カメラ２０が撮影した画像のデータは、データ処理部４０の第二抽出部４３に送られる。第二抽出部４３では、各画像データに対して二値化等の画像処理を施した後、予め撮影された目的粒子の画像データとの類似度を算出する。この類似度が所定の閾値以上となる画像データが含まれていれば、撮影した候補粒子が目的粒子であると判定する。
【００３０】
第二抽出部４３において、撮影した候補粒子が目的粒子であると判定された場合、分取トリガ発生部４４は、撮像系が撮影を行った時点から所定の遅延時間が経過した時点でセルソータ３０に分取トリガ信号を出力し、セルソータ３０の分取領域３３に来た目的粒子を容器３２へと分取させる。この遅延時間はフローセル２の撮影領域２２と分取領域３３の間の流路長さと、フロー制御部１が設定した流速によって決まる。
セルソータ３０における分取は、例えば非特許文献１に記載されているように、フローセル２の出口端から滴下される目的粒子を含む液滴を帯電させ、この液滴が落下する間に特定の電場を液滴に印加することにより、落下方向を容器３２へと制御する方法を用いることができる。
【００３１】
第二抽出部４３において、撮影した候補粒子が目的粒子でないと判定された場合は、該候補粒子を含む液滴は、セルソータ３０において電場を印加されることなく、そのまま容器３１に落下する。
【００３２】
以上、本実施例のフローサイトメータの各部の処理について概略的に説明したが、このような構成を用いることによって、どのように高速化が達成されるかを説明する。
【００３３】
一般に第二抽出部４３のデータ処理に要する時間がフローサイトメータの高速化を妨げる要因である。そのため、全ての被検粒子に対して撮像系が撮影を行い、第二抽出部４３がそのデータ処理を行うと、流速が速い場合、データ処理が間に合わなくなることがある。しかしながら、本実施例の装置では、第二抽出部４３のデータ処理は断続的に、候補粒子に対してのみ行われるため、候補粒子の出現確率が十分に低ければ、流速が速くても、処理を遅延させることなく第二抽出部４３はデータ処理を行うことが可能となる。
具体的に言えば、第二抽出部４３が毎秒1000個のデータ処理を行うことができ、候補粒子の出現確率が100個に高々1個の割合であった場合、本実施例の装置では毎秒10万個の高速測定が可能となる。
【００３４】
なお、このような高速測定を行う場合、高速度カメラ２０の撮影速度は少なくとも単位時間当たりの測定可能個数（測定速度）と同じ毎秒10万フレームは必要となる。実際には、上記のように1個あたり複数枚の撮影画像を取得することが望ましいため、仮に1個あたりの撮影枚数を10とすると、毎秒100万フレームの撮影速度が必要となる。このような高速撮影が可能なカメラとして、特許文献１に記載のバースト型のCCDイメージセンサ又はCMOSイメージセンサを用いることができる。
【００３５】
光学検出系及び第一抽出部４１には、装置の測定速度に対応することができるだけの検出速度と、絞り込みの精度とが求められる。絞り込みの精度が向上すると、その分だけ候補粒子の出現確率が減少し、測定速度をより向上させることができる。
【００３６】
従って、光学検出系及び第一抽出部４１における検出・判定方法を、目的粒子の光学的特性に応じて適切に選択することが重要である。この検出・判定方法としては、上記実施例の統計的手法の他、以下に挙げる方法を用いることができる。
【００３７】
図３は、被検粒子がレーザ光の照射領域を通過（図３(a)）する際の透過光強度の時間的変化を示したものである。図３(b)に示すように、各検出器では受光強度はピーク状に検出される。また、この検出信号を積分回路に通すと、図３(c)に示すような積分ピークが検出される。これらのピーク形状は被検粒子の形状や性質に応じた情報を有するため、被検粒子の強度ピーク及び積分ピークの形状を目的粒子のピーク及び積分ピークの形状と比較することにより、該被検粒子が候補粒子であるか否かを判定することができる。
【００３８】
また、非特許文献３に記載の連続時間符号化振幅顕微鏡法（Serial time-encoded amplified microscopy：STEAM）の原理を用いて検出及び判定を行うことができる。以下、STEAMの原理を図４を用いて説明する。
【００３９】
STEAMでは、レーザ照射部６０から波長幅の十分に広いレーザパルスを一定時間間隔で出射し、２次元空間分散器６１により各パルスを２次元的に波長分散させる。２次元空間分散器６１により分散された各波長のレーザ光は試料上の異なる位置に照射され、反射される。この反射された各波長のレーザ光は２次元空間分散器６１を逆に通過することにより、１つのパルスに戻る。このパルスをフーリエ変換器６２に通し、周波数成分を時間に変換したうえでフォトダイオード６３により検出する。
【００４０】
フォトダイオード６３で検出される受光強度のグラフは、非特許文献３のFig.2dに示されるようなものとなる。連続時間符号化振幅顕微鏡法では周波数（波長）は試料上の位置に対応し、周波数成分がフーリエ変換器６２により時間に変換されたので、時間が試料上の位置の情報を持つことになる。すなわち、２次元的な強度分布を時系列に変換したものになる。このように取得された各パルスの強度信号の時間変化をフーリエ逆変換することで、被検粒子の表面構造の情報を得ることができる。なお、上記の連続時間符号化振幅顕微鏡法を本実施例のフローサイトメータに適用する場合、フーリエ逆変換を行わなくとも、パルス毎の時間的な強度変化パターンを、予め実測又は計算により取得した目的粒子の強度変化パターンと比較することにより、候補粒子であるか否かの判定を行うことができる。
【００４１】
以上、本発明に係るフローサイトメータについて実施例を用いて説明したが、本発明の趣旨の範囲内で変更可能であることは明らかである。
【符号の説明】
【００４２】
１…フロー制御部
２…フローセル
３…サンプル導入部
１０…レーザ照射部
１１…光検出部
１２…検出領域
１３…信号処理部
２０…高速度カメラ
２１…ストロボランプ
２２…撮影領域
３０…セルソータ
３１、３２…容器
３３…分取領域
４０…データ処理部
４１…第一抽出部
４２…撮影トリガ発生部
４３…第二抽出部
４４…分取トリガ発生部
６０…レーザ照射部
６１…２次元空間分散器
６２…フーリエ変換器
６３…フォトダイオード
【図１】
2013015357.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
2013015357.tif 000006