(57)【要約】      （修正有）【課題】消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地や、消化器系がん幹細胞を培養する方法、特に長期間安定して増殖培養する方法を提供すること。【解決手段】神経生存因子−１に加えて、トランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（Basic ＦＧＦ）、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加してなる無血清培地に、消化器系がん細胞試料から単離した細胞を浮遊培養し、消化器系がん幹細胞の細胞塊（Sphere）を形成させ、該細胞塊を単離し、細胞接着分子をコーティングした培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養し、漸次無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して培養を継続することにより、消化器系がん幹細胞を三月以上にわたり増殖させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、神経生存因子−１（ＮＳＦ−１）を添加してなることを特徴とする消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地。
【請求項２】
トランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（Basic ＦＧＦ）、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに添加してなることを特徴とする、請求項１記載の無血清培地。
【請求項３】
亜セレン酸又はその塩、ヘパリン、及びＮ−アセチルシステインをさらに添加してなることを特徴とする、請求項１又は２記載の無血清培地。
【請求項４】
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地が、グルコース添加ＤＭＥＭ/Ｆ１２であることを請求項１〜３のいずれか記載の無血清培地。
【請求項５】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする消化器系がん幹細胞の増殖方法。
（ａ）消化器系がん細胞を、請求項１〜４のいずれか記載の無血清培地中で浮遊培養し、消化器系がん幹細胞の細胞塊（Sphere）を形成させる工程；
（ｂ）前記細胞塊を単離し、単離した細胞塊を、細胞接着分子をコーティングした培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養することにより、消化器系がん幹細胞を増殖させる工程；
【請求項６】
細胞接着分子が、ラミニンであることを特徴とする請求項５記載の増殖方法。
【請求項７】
工程（ｂ）の後に、無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して培養を継続する工程（Ｃ）を備えたことを特徴とする請求項５又は６記載の増殖方法。
【請求項８】
少なくとも一月以上増殖し続けたことを特徴とする消化器系がん幹細胞の集団。
【請求項９】
少なくとも三月以上増殖し続けたことを特徴とする請求項８記載の消化器系がん幹細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地や、かかる無血清培地を用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法や、消化器系がん幹細胞の集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類などの多細胞生物において、組織を構成する細胞は、大きく分化細胞と幹細胞とに分けられる。分化細胞は、組織特有の機能を発揮する成熟した細胞である。他方、幹細胞は、活発な増殖能、分化能及び自己複製能を有する細胞である。分化細胞は、細胞老化や細胞損傷により細胞死するため、組織特有の機能を維持するための供給源が必要となるが、かかる供給源としての役割を担う細胞が幹細胞である。幹細胞による組織構築のシステム（幹細胞システム）において、分化細胞の多くは、それぞれの組織中に存在する体性幹細胞を起源とすることが多く、例えば血液系の細胞は造血幹細胞から、肝細胞は肝幹細胞から、また、神経系の細胞は神経幹細胞から分化することが知られている。
【０００３】
幹細胞システムは、がん組織においても同様に存在している可能性が示唆されている。がん組織における一部のがん細胞には、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞に特徴的な性質である、自身と同じ細胞を作り出す自己複製能と多種類の細胞に分化できる多分化能とを有するがん細胞（がん幹細胞［cancer stem cells；ＣＳＣｓ］）が存在し、かかるがん幹細胞が、自己複製能により自身と同じ細胞を維持しながら、多分化能によりがん組織における多数の分化したがん細胞を生み出していると考えられている。
【０００４】
がん幹細胞の存在は、すでに１９７０年代に示唆されていたが、それを実験的に証明することが技術的に困難であった。しかし、フローサイトメトリーの発展によって特定の細胞集団のみを分離することが可能になったことや、正常組織の体性幹細胞の解析が進んだことや、がん細胞の移植により腫瘍形成を評価できる免疫不全マウスなどの実験モデル動物が開発されたことなどによって、血液のがんである白血病で、がん幹細胞の存在が確認された（非特許文献１）。その後、白血病におけるがん幹細胞仮説を基に、ＣＤ１３３等の幹細胞マーカーを発現しているがん幹細胞が乳がん、脳腫瘍、大腸癌等のがん組織において存在することが知られている。
【０００５】
がん幹細胞は、がん発生のメカニズムを解明する上で重要なツールであるとともに、がん細胞が他の臓器に転移するためには、がん細胞が原発巣から遊離するだけではなく、到達した部位で新しくがんを形成する能力が必要となることから、転移のメカニズムや治療方法を確立する上でも重要なツールであると考えられている（非特許文献２）。
【０００６】
また、一般的な抗がん剤による治療において、固形腫瘍の縮小が治療の指針とされていることから、かかる治療に用いられる抗がん剤の標的は、がん幹細胞ではなく、腫瘍の大部分を占める分化したがん細胞である可能性が考えられる。実際に、がん幹細胞の中には、薬剤耐性を獲得しているものがあることが報告されている（非特許文献３）。したがって、治療によって大部分のがん細胞を除いても、ごく少数のがん幹細胞が生き残っていれば再発が起こりうることになり、これが、がんにおいてしばしば再発が起きる理由の一つとして考えられている。したがって、がん幹細胞を標的として除去することができれば、がんの転移や再発の防止にも有用な治療法の開発につながることが期待されている。
【０００７】
このためには、がん幹細胞を単離して培養する技術の確立が必要不可欠であるが、がん幹細胞を単離する方法としては、フローサイトメトリーによるソーティング法や、非接着条件下で浮遊培養することにより浮遊細胞塊を形成させる方法（特許文献１）等が知られているものの、がん幹細胞を培養する方法、特に長期間安定して増殖培養する方法については、ほとんど確立されていないのが現状であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１０−５１６２５９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bonnet, D. and Dick, J.E. Nature Medicine 3: 730-737 (1997)
【非特許文献２】Li, F. et al. Cell Research 17: 3-14 (2007)
【非特許文献３】Dean, M. et al. Nature Review Cancer 5: 275-284 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地や、消化器系がん幹細胞を培養する方法、特に長期間安定して増殖培養する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
がん幹細胞を培養する方法、特に長期間安定して増殖培養する方法については、ほとんど確立されていないため、消化器系がん幹細胞を培養するために最適な無血清培地や培養方法を確立することは困難であることが予想されたが、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、神経細胞の培養に有用である神経生存因子−１（ＮＳＦ−１；Neural Survivor Factor-1）に着目した。そして、ＮＳＦ−１が消化器系がん幹細胞の増殖培養においてきわめて重要な因子であることを見いだした。また、このＮＳＦ−１に加えて、トランスフェリン（Transferrin）、インスリン（Insulin）、プトレシン（Putrcine）、プロゲステロン（Progesterone）、上皮成長因子（Epidermal Growth Factor；ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（Basic fibroblast growth factor；Basic ＦＧＦ）、及び白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor；ＬＩＦ）を添加してなる無血清培地に、消化器系がん細胞を浮遊培養し、消化器系がん細胞に含まれていた消化器系がん幹細胞の細胞塊（Sphere）を形成させ、該細胞塊を単離し、細胞接着分子をコーティングした培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養し、漸次無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して培養を継続することにより、消化器系がん幹細胞を通常二月以上にわたり増殖させることができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、神経生存因子−１（ＮＳＦ−１）を添加してなることを特徴とする消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地や、（２）トランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（Basic ＦＧＦ）、及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）をさらに添加してなる上記（１）の無血清培地や、（３）亜セレン酸又はその塩、ヘパリン、及びＮ−アセチルシステインをさらに添加してなる上記（１）又は（２）の無血清培地や、（４）血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地が、グルコース添加ＤＭＥＭ/Ｆ１２である上記（１）〜（３）のいずれかの無血清培地に関する。
【００１３】
また本発明は、（５）消化器系がん細胞試料から単離した細胞を、上記（１）〜（４）のいずれかの無血清培地中で浮遊培養し、消化器系がん幹細胞の細胞塊（Sphere）を形成させる工程（ａ）と、前記細胞塊を単離し、単離した細胞塊を、細胞接着分子をコーティングした培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養することにより、消化器系がん幹細胞を増殖させる工程（ｂ）とを順次備えた消化器系がん幹細胞の増殖方法や、（６）細胞接着分子が、ラミニンである上記（５）の増殖方法や、（７）工程（ｂ）の後に、無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して培養を継続する工程（Ｃ）を備えた上記（５）又は（６）の増殖方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、（８）少なくとも一月以上増殖し続けた消化器系がん幹細胞の集団や、（９）少なくとも三月以上増殖し続けた上記（８）の消化器系がん幹細胞の集団に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、膵臓がん幹細胞、肝がん幹細胞等の消化器系がん幹細胞を三月以上にわたり増殖させることができる。その結果、少なくとも一月、好ましくは少なくとも二月、より好ましくは少なくとも三月増殖し続けた消化器系がん幹細胞の集団を得ることができる。また、ＳＫ−ＨＥＰ−１等の低分化型（分化度が低い、或いはがん細胞が発生した組織本来の細胞に形態学的にも機能的にも類似性が低い）肝がん由来の細胞株には、がん幹細胞がほとんど含まれていないため（<0.5%, Chen, X. et al., J Hepatol., 2011, 55: 838-845）、がん幹細胞を単離することは困難とされていたが、本発明によると、ＳＫ−ＨＥＰ−１等の低分化型肝がん由来の細胞株からも高効率で肝がん幹細胞等の消化器系がん幹細胞の集団を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞の顕微鏡画像を示す図である。
【図２】フローサイトメトリーを用いて、単離した膵臓がん幹細胞におけるがん幹細胞マーカー因子を解析した結果を示す図である。
【図３】超免疫不全マウス（NOD-Rag -/-  IL-2Common  gamma chain -/-）（ＮＲＧマウス）を用いて、単離した膵臓がん幹細胞による腫瘍形成を解析した結果を示す図である。
【図４】本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞の顕微鏡画像を示す図である。
【図５】本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞の抗がん剤耐性能を、３種類の抗がん剤（５−フルオロウラシル［５−ＦＵ］、シスプラチン［ＣＤＤＰ］、及び酪酸ナトリウム［ＮａＢ］）を用いて解析した結果を示す図である。横軸には、抗がん剤の濃度を、また、縦軸には、抗がん剤存在下で培養した場合の細胞の生存率を、抗がん剤非存在下で培養した場合の細胞の生存率に対する比率として示す。
【図６】本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞におけるがん幹細胞マーカー因子（ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２、及びＡＬＤＨ１Ａ１）や上皮間葉転換（Epithelial to Mesenchymal Transition；ＥＭＴ）に関連する因子（ＴＧＦβ１）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である（ｎ＝６）。縦軸の「ｍＲＮＡの発現量」は、コントロール（血清含有培地で培養したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株）におけるｍＲＮＡの発現量に対する比率として示す。
【図７】本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞におけるがん幹細胞マーカー因子（ＰＲＯＭ１［ＣＤ１３３］及びＮＡＮＯＧ）やＥＭＴに関連する因子（ＦＮ１、ＶＩＭ、ＴＷＩＳＴ２、及びＳＮＡＩ３）のｍＲＮＡの発現を解析した結果を示す図である（ｎ＝４）。縦軸の「ｍＲＮＡの発現量」は、コントロール（血清含有培地で培養したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株）におけるｍＲＮＡの発現量に対する比率として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地（以下、単に「本発明の無血清培地」という）は、胃がん、大腸がん、肝がん、膵臓がん等の消化器系がん幹細胞を培養するために用いられ、ＮＳＦ−１を含有するものである。本発明において消化器系がん幹細胞とは、幹細胞の性質を有する消化器系がん細胞のことをいい、より具体的には、１）複数系統の消化器系がん細胞に分化できる能力（多分化能）、２）細胞分裂を経ても多分化能を維持できる能力（自己複製能）、及び３）元の消化器系がんと同じ表現型の腫瘍を高い効率で形成できる能力（高腫瘍形成能）の１）〜３）の能力のうち、少なくとも１の能力を有する消化器系がん細胞（幹細胞）のことを意味する。
【００１８】
本発明において用いられるＮＳＦ−１としては、カンブレックス社製、ロンザジャパン社製などの市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。ＮＳＦ−１を自ら調製する場合、例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning,A laboratorymanual）などに記載の方法に基づき、ＮＳＦ−１遺伝子を組み込んだ発現ベクターを生細胞に導入し、生細胞中にＮＳＦ−１を発現させ、単離・精製することができる。
【００１９】
本発明において用いられるＮＳＦ−１の濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であれば特に制限されず、通常０．１７％（w/v）以上であり、好ましくは０．６％（w/v）以上であり、より好ましくは１．７％（w/v）以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常２４％（w/v）以下、好ましくは７．２％（w/v）以下、より好ましくは２．４％（w/v）以下である。
【００２０】
上記血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆ１２培地等の公知の化学合成培地などの培地、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium:NutrientMixture F12）培地（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）、ヒト間葉系幹細胞用無血清培地（ＳＴＫ２）等のこれらの培地のいずれか１又は２以上を適当な割合で混合した培地等を挙げることができるが、中でもＲＰＭＩ１６４０培地（日研生物医学研究所製）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（シグマ−アルドリッチ社製社製）、ＳＴＫ２培地（ＤＳファーマバイオメディァル社製）を好適に例示することができる。また、これら培地にはグルコース等の糖類や、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等の抗生物質や、Ｈｅｐｅｓ等の緩衝剤などを添加することが好ましい。
【００２１】
本発明の無血清培地は、さらに消化器系がん幹細胞の培養に好ましい成分である、鉄源（トランスフェリン等）、成長因子（インスリン、ＥＧＦ、Basic ＦＧＦ、グリア細胞由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ；Glial cell line-derived neurotrophic factor］、幹細胞因子［ＳＣＦ；Stem Cell Factor］等）、ポリアミン類（プトレシン等）、ステロイド（プロゲステロン、β-エストラジオール等）、幹細胞の分化抑制剤（ＬＩＦ、Wnt、TGF-β等）、ミネラル（亜セレン酸［Selenous acid］又はその塩）、接着因子（例えば、ヘパリン（Heparin）、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン等）、還元剤（Ｎ−アセチルシステイン［N-acetylcysteine］、２−メルカプトエタノール、カタラーゼ等）などを含有するものが好ましく、具体的には、トランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、ＥＧＦ、Basic ＦＧＦ、及びＬＩＦを含有するものが好ましく、さらに、亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸又はその塩、ヘパリン、及びＮ−アセチルシステインを含有するものがより好ましい。
【００２２】
本発明において用いられるトランスフェリン、インスリン、プトレシン、プロゲステロン、ＥＧＦ、Basic ＦＧＦ、及びＬＩＦや、亜セレン酸ナトリウム等の亜セレン酸又はその塩、ヘパリン、及びＮ−アセチルシステインとしては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販のものとしては、例えばシグマ−アルドリッチ社製等の市販のトランスフェリンや、シグマ−アルドリッチ社製等の市販のインスリンや、シグマ−アルドリッチ社製、Alexis Biochemicals社製等の市販のプトレシンや、シグマ−アルドリッチ社製等の市販のプロゲステロンや、シグマ−アルドリッチ社製、和光純薬工業社製等の市販のＥＧＦや、和光純薬工業社製等の市販のBasic ＦＧＦや、ケミコン社製、ミリポア社製等の市販のＬＩＦや、ナカライテスク社製等の市販の亜セレン酸又はその塩や、シグマ社製等の市販のヘパリンや、シグマ−アルドリッチ社製、ナカライテスク社製等の市販のＮ−アセチルシステインを挙げることができる。また、自ら調製したものとしては、例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning,A laboratorymanual）などに記載の方法に基づき、トランスフェリン、インスリン、ＥＧＦ、Basic ＦＧＦ、及びＬＩＦの遺伝子を組み込んだ発現ベクターを生細胞に導入し、生細胞中にかかる遺伝子を発現させ、単離・精製して得られたものを挙げることができる。
【００２３】
本発明において用いられるトランスフェリンの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常８μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは２７μｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは８０μｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常１２０００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは３６０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１２０μｇ／ｍｌ以下である。
【００２４】
また、本発明において用いられるインスリンの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度でよく、通常２μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは７μｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは２０μｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常３００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは９０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下である。
【００２５】
また、本発明において用いられるプトレシンの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常１６μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは５４μｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは１６０μｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常２３００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは６９０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２３０μｇ／ｍｌ以下である。
【００２６】
また、本発明において用いられるプロゲステロンの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常１．７μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは６μｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは１７μｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常２４０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは７２μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２４μｇ／ｍｌ以下である。
【００２７】
また、本発明において用いられるＥＧＦの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常１．７ｎｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは６ｎｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは１７ｎｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常２４０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは７２ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２４ｎｇ／ｍｌ以下である。
【００２８】
また、本発明において用いられるBasic ＦＧＦの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常１．７ｎｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは６ｎｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは１７ｎｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常２４０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは７２ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２４ｎｇ／ｍｌ以下である。
【００２９】
また、本発明において用いられるＬＩＦの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常０．８ｎｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは３ｎｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは８ｎｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常１２０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは３６ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１２ｎｇ／ｍｌ以下である。
【００３０】
また、本発明において用いられる亜セレン酸又はその塩の濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常２．５ｎＭ以上であり、好ましくは９ｎＭ以上であり、より好ましくは２５ｎＭ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常３６０ｎＭ以下、好ましくは１０８ｎＭ以下、より好ましくは３６ｎＭ以下である。
【００３１】
また、本発明において用いられるヘパリンの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常０．１７μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは０．６μｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは１．７μｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常２４μｇ／ｍｌ以下、好ましくは７．２μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２．４μｇ／ｍｌ以下である。
【００３２】
また、本発明において用いられるＮ−アセチルシステインの濃度は、消化器系がん幹細胞が効率よく増殖できる濃度であればよく、通常５μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは１７μｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは５０μｇ／ｍｌ以上であり、また、費用対効果を考慮すると、通常７２０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは２１６μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは７２μｇ／ｍｌ以下である。
【００３３】
本発明の消化器系がん幹細胞の増殖方法は、本発明の無血清培地に、胃がん、大腸がん、肝がん、膵臓がん等の消化器系がん細胞を浮遊培養し、複数の消化器系がん幹細胞からなる細胞塊（Sphere）を形成させる工程（ａ）と、前記細胞塊を単離し、単離した細胞塊を、細胞接着分子をコーティングしたマルチウエルプレート、培養皿（シャーレ、ディッシュ）、フラスコ等の培養器を用いて前記無血清培地中で接着培養することにより、消化器系がん幹細胞を増殖させる工程（ｂ）とを備えており、上記工程（ｂ）に続いて、無血清培地の一部を、新しい無血清培地で置換して継代培養をする工程（Ｃ）を備えていることが特に好ましい。培養した無血清培地の一部、例えば２０〜８０％（v/v％）、好ましくは３０〜７０％（v/v％）、より好ましくは４０〜６０％（v/v％）を新しい無血清培地で置換することから、元の培養後の培地の一部はそのまま再利用されることになる。この再利用される培養後の培地中には、がん幹細胞から分泌された、がん幹細胞の増殖を支援する、ＩＬ−1ｂｅｔａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Basic ＦＧＦ、エオタキシン（Eotaxin）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor；Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球単球コロニー刺激因子（Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor ；ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＰ−１０、腫瘍壊死因子アルファ（Tumor Necrosis Factor-alpha；TNF-alpha）、血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor；ＶＥＧＦ）等のサイトカインなどが含まれている。このため、消化器系がん幹細胞を、長期間（少なくとも一月）に亘って培養・増殖することができる。
【００３４】
本発明の増殖方法における消化器系がん細胞としては、胃がん細胞株（ＭＫＮ７、ＴＭＫ−１、ＭＫＮ−２８等）、大腸がん細胞株（ＣＯＬＭ−５、Ｃｏｌｏ２０５等）、肝細胞がん細胞株（ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨＬＥ、ＨＬＦ、ＨｅｐＧ２等）、膵臓がん細胞株（ＹＰＫ１〜５等）などの細胞株として樹立されたものの他、医師等当業者が通常用いる基準に照らして明らかにがん化していると判断される消化器系の組織や器官から採取された細胞も含まれる。
【００３５】
本発明の増殖方法における浮遊培養する条件としては、消化器系がん幹細胞の細胞塊が形成できる培養条件（温度、時間等）であれば適宜選択することができる。例えば、培養温度としては、３０〜４０℃の範囲から選択することができ、培養時間としては、３時間〜２週間の範囲から選択することができるが、消化器系がん細胞が死滅し、且つ消化器系がん幹細胞が生存できる培養時間が好ましく、具体的には、１〜２週間を好適に例示することができる。また、培養は、５〜１０％の二酸化炭素ガスを満たしたインキュベーター内で行うことができる。細胞塊を構成する消化器系がん幹細胞数としては、細胞塊形成されたことを顕微鏡などにより判別できれば特に制限されず、通常少なくとも２、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも２０を挙げることができる。
【００３６】
本発明の増殖方法における工程（ｂ）において、がん幹細胞塊を単離する場合、消化器系がん細胞が死滅しない条件下でがん幹細胞塊を形成させたときは、顕微鏡下で細胞を観察し、ピペットマン等を用いて単一細胞（シングル）の状態の消化器系がん細胞を含まないように細胞塊を単離（回収）することが好ましく、また、消化器系がん細胞が死滅する条件下でがん幹細胞塊を形成させたときは、細胞塊を含む無血清培地をそのまま単離（回収）することが好ましい。
【００３７】
本発明の増殖方法における細胞接着分子としては、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ニドジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フィブリノーゲンなどを挙げることができ、ラミニンが好ましい。また、上記細胞接着分子は単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよいし、或いはポリ−Ｌ−オルニチンやポリ−リジンでコーティングした培養皿にオーバーコートしてもよい。
【００３８】
本発明の増殖方法における細胞接着分子をコーティングした培養器は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販のものとしては、例えばＢＤ バイオコート ラミニンコート製品（日本ＢＤ社製）、バイオコート ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン ディッシュ（コスモバイオ社製）、バイオコート ポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニン プレート（コスモバイオ社製）、バイオコート ラミニン／フィブロネクチン プレート（コスモバイオ社製）等の市販品を挙げることができる。また、自ら調製する場合、例えばポリ−Ｌ−オルニチンやポリ−リジンを培養皿の表面全体が覆われる程度に浸し、１５〜６０分間、１５〜３７℃で静置し、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）等の溶液で培養皿を洗浄する一連の処理を必要に応じて行った後、細胞接着分子を含むＰＢＳ等の溶液を培養皿の表面全体が覆われる程度に浸し、３０分〜２４時間、１５〜４０℃で静置し、溶液を除くことにより得ることができる。また、使用前にＰＢＳ等の溶液で培養皿を洗浄してもよい。
【００３９】
本発明の増殖方法における接着培養する条件としては、消化器系がん幹細胞が接着培養できる培養条件（温度等）であれば適宜選択することができる。例えば、培養温度としては、３０〜４０℃の範囲から選択することができ、また、培養は、５〜１０％の二酸化炭素ガスを満たしたインキュベーター内で行うことができる。また、細胞は、コンフルエントになる前に適宜その一部（例えば、５０％、２５％、１２％等）をトリプシン等の消化酵素を用いて培養器から剥離・単離し、新しい培養器を用いて継代代培養してもよい。
【００４０】
本発明の増殖方法を用いて単離した細胞塊や、細胞塊を接着培養することにより得られた細胞が消化器系がん幹細胞であることは、例えば消化器系がん幹細胞特異的な表面抗原の発現や、高腫瘍形成能などを解析することにより確認することができる。消化器系がん幹細胞特異的な表面抗原の発現を解析する場合、例えばＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＥＳＡ（Epithelial-specific antigen）等の表面抗原に対する抗体とセルソーター、フローサイトメーター等の細胞解析装置とを用いて文献（Proc Natl Acad Sci USA, 101, 3781-3786 (2004)、Cancer Res, 65, 6207-6219 (2005)）等に記載の方法にしたがってフローサイトメトリーを行い、本発明の方法で得られた消化器系がん幹細胞が消化器系がん幹細胞特異的な表面抗原を発現することを検出する。また、高腫瘍形成能を解析する場合、免疫不全のモデル動物に、本発明の方法で得られた消化器系がん幹細胞を皮下移植等で投与し、組織学的解析などの解析法により腫瘍形成を検出する。免疫不全のモデル動物は、異物に対する排除能力が低下するため、外部から投与された細胞が定着しやすく、このため腫瘍形成能を容易に検出することができる。投与する消化器系がん幹細胞の細胞数としては、高腫瘍形成能を評価できる細胞数であれば特に制限されず、例えば１〜１０００００、好ましくは１００〜１００００、より好ましくは４００〜４０００を挙げることができる。また、使用する免疫不全のモデル動物としては、自然に免疫不全になったモデル動物であっても、Ｔ細胞やＢ細胞等の免疫系に関与する遺伝子をノックアウト等の手法により破壊したモデル動物であっても、あるいはこれらモデル動物を交配して得られたものであってもよく、具体的には、ＮＯＤ(nonobese diabetic 痩せ型糖尿病)マウスとＳＣＩＤ（severe combined immunodeficiency 重症複合免疫不全）マウスとを交配して作製されたNOD-scidマウスや、NOD-scidマウスとIL-2rγノックアウトマウスとを交配して作製されたNOD/Shi-scid-IL2Rγnullマウス（ＮＯＧマウス）（Ito, M. et al., Blood., 2002, 100: 3175-3182）や、Ｂ細胞とＴ細胞が完全に欠損したRag欠損(Ragnull)マウスや、Rag欠損(Ragnull)マウスとIL-2rγノックアウトマウスを交配して作製されたＮＲＧマウス（Pearson, T. et al., Clin. Exp. Immunol., 2008, 154: 270-284）などの（超）免疫不全のモデルマウスを挙げることができる。上記モデル動物としてマウスの他、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物モデルを例示することができる。
【００４１】
消化器系がん幹細胞をターゲットとした治療薬の開発には、多数の消化器系がん幹細胞が必要となるが、本発明の無血清培地を用いて消化器系がん幹細胞を長期間増殖し続けることにより、多数の消化器系がん幹細胞からなる集団を得ることができる。ここで長期間増殖し続ける期間としては、好ましくは少なくとも一月、より好ましくは少なくとも二月、さらに好ましくは少なくとも三月を挙げることができる。長期間増殖し続けて得られた消化器系がん幹細胞は、使用するまでの間、５〜２５％ＤＭＳＯや、mFreSR hESC freezing medium（ベリタス社製）、セルバンカー３（和光純薬社製）等の市販の細胞凍結保存液を用いて凍結保存してもよい。
【００４２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
本発明の消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地と、オルニチン及びラミニンでコーティングしたシャーレを作製した。
１．材料
本発明の無血清培地として、以下の成分Ａ、Ｂ、及びＣからなるものを作製した。
１−１  無血清培地
（１）成分Ａ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（シグマ−アルドリッチ社製社製）  ８６ｍＬ
１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) ９００μｌ
Antibiotic/antimycotic liquid (１００倍濃度) ９００μｌ
３０％ グルコース  １．７ｍｌ
（２）成分Ｂ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（シグマ−アルドリッチ社製） ８．６ｍｌ
３０ ％ グルコース（シグマ−アルドリッチ社製） ２００μｌ
トランスフェリン（シグマ−アルドリッチ社製） １０ ｍｇ＋Ｈ２Ｏ ２００μｌ
インスリン（シグマ−アルドリッチ社製） ２．５ｍｇ＋０．１Ｎ ＨＣｌ １００μｌ(先にインスリンを溶解)＋Ｈ２Ｏ ９００μｌ(溶解後に加える) 計１ｍｌ
プトレシン（Alexis Biochemicals社製）１９．３３ｍｇ
０．３ｍＭ 亜セレン酸ナトリウム（シグマ−アルドリッチ社製） １０μｌ
２ｍＭ プロゲステロン（シグマ−アルドリッチ社製） １μｌ
（３）成分Ｃ
２００μｇ／ｍｌ ヒトＥＧＦ（シグマ−アルドリッチ社製） １０μｌ
４μｇ／ｍｌ Basic ＦＧＦ（和光純薬工業社製）５００μｌ
１ｍｇ／ｍｌ ヘパリン（シグマ−アルドリッチ社製） ２００μｌ
１０μｇ／ｍｌＬＩＦ（ケミコン社製） １００μｌ
ＮＳＦ−１（５０倍濃度）（カンブレックス社製） ２ｍｌ（最終濃度；２％［w/v］）
６０ｍｇ／ｍｌＮ−アセチルシステイン（N-acetylcysteine）（シグマ−アルドリッチ社製） １００μｌ
【００４４】
なお、ここでは約１００ｍｌの無血清培地を作製する場合の組成を記載している。また、無血清培地は、成分Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ個別に作製した後、混合して作製した。
【００４５】
１−２  オルニチン及びラミニンでコーティングしたシャーレの作製
０．０１％ Poly-L-ornithine溶液をシャーレに表面が覆われる程度入れて、約３０分間、室温で置いておく。その後その溶液は吸引して除き、ＰＢＳで１回洗浄し、１％ラミニン／ＰＢＳ溶液で１晩（１５〜１８時間）、３７℃のインキュベーターで保存した後、かかる溶液を捨てて、クリーンベンチ内にて室温で乾燥させる。その後使用までは４℃で保存した。使用直前にＰＢＳを用いて一度洗浄した。
【実施例２】
【００４６】
２．本発明の無血清培地を用いた、膵臓がん幹細胞の単離
本発明の無血清培地を用いて、膵臓がん細胞株から膵臓がん幹細胞を単離し、長期培養できるかどうかを解析した。上記実施例１で作製した無血清培地を用いて、インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）で膵臓がん細胞株（ＹＰＫ１〜５）をがん細胞が死滅しがん幹細胞が生存できる条件下、すなわち浮遊条件下で約１〜２週間培養を行った。なお、コントロールとして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；fetal bovine serum）を含むＤＭＥＭ（以下、単に血清含有培地という）や３種類の無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２［シグマ−アルドリッチ社製］、ＲＰＭＩ１６４０［日研生物医学研究所社製］、ＳＴＫ２  ヒト間葉系幹細胞用無血清倍地［ＤＳファーマバイオメディカル社製］）を用いた。その結果、本発明の無血清培地を用いると、ＹＰＫ１〜５いずれの膵臓がん細胞株においても、膵臓がん幹細胞からなる細胞塊（Sphere）の形成が認められた。図１には、ＹＰＫ２細胞株で形成された細胞塊の例を示す。他方、血清含有培地を用いた場合、膵臓がん細胞は接着し、細胞塊は形成されなかった。また、上記３種類の無血清培地を用いて形成された細胞塊は、本発明の無血清を用いた場合と比べ形成効率が悪く、また大きさも小さい上に、かかる細胞塊を形成する細胞は約１週間の培養後死滅し始めた。これらの結果は、市販品等の従来知られている無血清培地では、膵臓がん細胞株から膵臓がん幹細胞の単離はできないが、本発明の無血清培地を用いると、膵臓がん細胞株から膵臓がん幹細胞を単離できることを示している。
【実施例３】
【００４７】
３．本発明の無血清培地を用いた、膵臓がん幹細胞の長期増殖培養
次に上記実施例２の方法で単離した膵臓がん幹細胞が、長期培養した場合に安定に増殖できるかどうかを解析した。上記実施例２に示される方法で細胞塊を含む無血清培地を分離し、ラミニンをコートした培養シャーレに移した後、同体積量の上記実施例１で作製した新鮮な無血清培地を添加した。シャーレの底に少しずつ、膵臓がん幹細胞が付着し増加するのを顕微鏡で確認しながら１週間に一度無血清培地を半分吸引・破棄し、同体積量の上記実施例１で作製した新鮮な無血清培地を添加する操作を繰り返し行い、接着培養したところ、少なくとも三月間増殖培養できることが明らかとなった。一方、上記実施例１で作製した新鮮な無血清培地を添加する操作を行わなかった場合は、２週間程度しか膵臓がん幹細胞を培養することができなく、また、本発明の無血清培地を上記実施例１で作製した新鮮な無血清培地にすべて置換した場合は、１週間程度しか膵臓がん幹細胞を培養することができなかった。これらの結果は、膵臓がん幹細胞などのがん幹細胞が産生するサイトカインががん幹細胞の細胞増殖をサポートすることを示唆している。
【００４８】
そこで、がん幹細胞が産生するサイトカインを探索するために、２種類の膵臓がん細胞株（ＹＰＫ１及び２）を用いて上記実施例２の方法により膵臓がん幹細胞を単離した後、接着培養を行い、接着培養開始２週間後にBio-plex（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により培地中の２７種類のサイトカイン（ＩＬ−１ｂｅｔａ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２［ｐ７０］、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、Basic ＦＧＦ、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンガンマ［Interferon-gamma；IFN-gamma］、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１［ＭＣＡＦ］、マクロファージ炎症性タンパク質１アルファ［Macrophage inflammatory protein 1alpha；MIP-1alpha］、マクロファージ炎症性タンパク質１ベータ［Macrophage inflammatory protein 1beta；MIP-1beta］、血小板由来増殖因子BB［becaplermin, platelet-derived growth factor BB；PDGF-BB］、ＲＡＮＴＥＳ、TNF-alpha、及びＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの発現量を測定した。なお、コントロールとして膵臓がん細胞株（ＹＰＫ１又は２）を血清含有培地で２週間接着培養した後の培地を用いた。その結果、膵臓がん幹細胞を培養した培地は、コントロールの培地と比べ、１４種類のサイトカイン（ＩＬ−１ｂｅｔａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Basic ＦＧＦ、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＰ−１０、TNF-alpha、及びＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの発現量が増加していた（ＩＬ−１ｂｅｔａ；１７〜３８倍、ＩＬ−２；５〜１０００倍以上、ＩＬ−４；１．６〜６．０倍、ＩＬ−９；１．５〜１０００倍以上、ＩＬ−１０；３〜５倍、ＩＬ−１２；３．２〜５倍、ＩＬ−１３；３．８〜１３倍、Basic ＦＧＦ；１０００倍以上、エオタキシン；１４〜１０００倍以上、Ｇ−ＣＳＦ；２〜４０倍、ＧＭ−ＣＳＦ；１．７〜１０００倍以上、ＩＰ−１０；１．１〜２７倍、TNF-alpha；１０００倍以上、ＶＥＧＦ；１．５〜１１倍）ことが明らかとなった。この結果は、１４種類のサイトカイン（ＩＬ−１ｂｅｔａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Basic ＦＧＦ、エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＰ−１０、TNF-alpha、及びＶＥＧＦ）が膵臓がん幹細胞などのがん幹細胞の増殖をサポートすることを示唆している。
【００４９】
また、胃がん組織からの培養、胃がん患者腹水（癌を含んでいる）からの培養、大腸がん肝転移組織から単離して、上記実施例２で示した方法により培養を行ってもがん幹細胞からなる細胞塊の形成が認められ、またかかる細胞塊を上記実施例３で示した方法により増殖培養を行ったところ、少なくとも二月間がん幹細胞が細胞増殖することが確認された。
【実施例４】
【００５０】
４．フローサイトメトリーを用いた、単離した膵臓がん幹細胞のがん幹細胞マーカー因子の解析
次に、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞について、がん幹細胞マーカー因子として知られている３種類の因子（ＣＤ２４、ＣＤ４４、及びＥＳＡ）の蛋白質の発現レベルが亢進しているかどうかをフローサイトメトリーにより解析した。上記実施例２で示した方法によりＹＰＫ２細胞株を用いて膵臓がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、抗ヒトＣＤ２４抗体、抗ヒトＣＤ４４抗体及び抗ヒトＥＳＡ抗体を用いて免疫蛍光染色法を行い、BD Biosciences社製のFACS Aria IIIを用いて解析を行った（図２）。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したＹＰＫ２細胞株を用いた。その結果、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞は、血清含有培地を用いて培養した膵臓がん細胞と比べ、ＣＤ２４陰性及びＣＤ４４陰性細胞の細胞数が減少するとともに(図２の中央図、Ｑ４領域［３７．４％］ｖｓ．図２の左図、Ｑ４領域［８７．１％］)、ＣＤ２４陽性及び／又はＣＤ４４陽性細胞の細胞数は増加していることが明らかとなった（図２の中央図、Ｑ１〜３領域［３６．３＋２．７６＋２３．６≒６２．７％］vs.図２の左図、Ｑ１〜３領域［０．５８５＋０．７９３＋１１．５≒１２．９％］)。さらに本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞のＣＤ２４陽性及びＣＤ４４陽性細胞（図２の中央図、Ｑ２領域の細胞）におけるＥＳＡの発現量は、血清含有培地を用いて培養した膵臓がん細胞のＣＤ２４陰性及びＣＤ４４陰性細胞（図２の左図、Ｑ４領域の細胞）おけるＥＳＡの発現量と比べ、高いことが明らかとなった（図２の右図）。これらの結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞には、がん幹細胞マーカー因子であるＣＤ２４、ＣＤ４４、又はＥＳＡ陽性を示す細胞が多く含まれていることを示している。
【実施例５】
【００５１】
５．超免疫不全マウス（ＮＲＧマウス）を用いた、単離した膵臓がん幹細胞による腫瘍形成の解析
次に、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞について、腫瘍形成能を解析した。上記実施例２で示した方法によりＹＰＫ２細胞株を用いて膵臓がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、１０００個を超免疫不全マウス（ＮＲＧマウス）（ジャクソン研究所）へ皮下移植した。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したＹＰＫ２細胞株を用いた。その結果、コントロールでは腫瘍形成はされなかったのに対し、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞を用いた場合、腫瘍形成が確認された（図３）。この結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した膵臓がん幹細胞などのがん幹細胞は、がん幹細胞の機能の１つである腫瘍形成能を有することが明らかとなった。
【実施例６】
【００５２】
６．本発明の無血清培地を用いた、肝がん幹細胞の単離
従来の肝がん細胞株を用いたがん幹細胞の単離は、がん幹細胞がある程度含まれている、ＨｕＨ−７等の高分化型肝がん由来の細胞株を用いて行われている。他方、ＳＫ−ＨＥＰ−１等の低分化型肝がん由来の細胞株には、がん幹細胞がほとんど含まれていないため(<0.5%, Chen, X. et al., J Hepatol., 2011, 55: 838-845)、がん幹細胞を単離することは困難とされていた。そこで、本発明の無血清培地を用いてＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株から肝がん幹細胞を単離できるかどうかを解析した。
【００５３】
ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株の生細胞数をトリパンブルー染色より計測し、１．０ｘ１０５個／ｍｌとなるように上記実施例１で作製した無血清培地に懸濁した後、培養シャーレに播種し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養した。なお、コントロールとして血清含有培地を用いた。上記実施例１で作製した無血清培地を用いた場合、培養後３日目には、肝がん幹細胞からなる細胞塊が形成されることが明らかとなった（図４の右図）。他方、血清含有培地を用いた場合、ＳＫ−ＨＥＰ−１肝がん細胞は接着し、細胞塊は形成されなかった（図４の左図）。この結果は、本発明の無血清培地を用いると、がん幹細胞がほとんど含まれていない、ＳＫ−ＨＥＰ−１などの低分化型肝がん由来の細胞株からもがん幹細胞を単離できることを示している。
【実施例７】
【００５４】
７．単離した肝がん幹細胞の抗がん剤耐性能の解析
がん幹細胞は、がん細胞と比較して、抗がん剤などの薬剤に対して高い耐性能を有することが知られている。そこで、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞が高い抗がん剤耐性能を有するかどうかを解析した。実施例６で示した方法によりＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いて肝がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、１．０ｘ１０３個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、３日後に抗がん剤（５−ＦＵ、ＣＤＤＰ、又はＮａＢ）を添加した。抗がん剤添加から２４時間後にＭＴＳ試薬（CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega社製)を添加し、さらに２時間後に４９０ ｎｍでの吸光度を測定し、生存率を評価した。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いた。その結果、上記３種類の抗がん剤（５−ＦＵ、ＣＤＤＰ、及びＮａＢ）いずれを用いた場合においても、肝がん幹細胞からなる細胞塊は、コントロールのＳＫ−ＨＥＰ−１肝がん細胞よりも生存率が高かった（図５）この結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞は、がん幹細胞に特徴的な抗がん剤などの薬剤に対して高い耐性能を有することを示している。
【実施例８】
【００５５】
８．単離した肝がん幹細胞のがん幹細胞マーカー因子及びＥＭＴに関与する因子のｍＲＮＡの発現の解析
次に、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞について、がん幹細胞マーカー因子として知られている４種類の因子（３種類のＡＢＣトランスポーター［ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、及びＡＢＣＧ２］とＡＬＤＨ１Ａ１）のｍＲＮＡの発現レベルが亢進しているかどうかを定量ＰＣＲにより解析した。また、がん細胞が浸潤や転移するときに、上皮細胞から間葉系の細胞に形質転換する現象（ＥＭＴ）が知られているが、かかるＥＭＴに関与する因子（ＴＧＦβ１）の発現レベルについてもあわせて解析した。実施例２で示した方法でＳＫ−ＨＥＰ−１肝がん細胞由来の肝がん幹細胞からなる細胞塊を単離した後、TRIzol Reagent（Life Technologies社製）とPureLink Micro-to-Midi Total RNA Purification Kit（Life Technologies社製）を用いて全ＲＮＡを精製し、さらにPrimeScript RT reagent Kit（TaKaRa Bio社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型として、LightCycler 480 Probe Master（Roche社製）及びLightCycler480 System II（Roche社製）を用いて定量ＰＣＲを行った。なお、コントロールとして血清含有培地を用いて培養したＳＫ−ＨＥＰ−１肝がん細胞株由来のＲＮＡを用いて解析を行った。その結果、肝がん幹細胞からなる細胞塊は、ＳＫ−ＨＥＰ−１肝がん細胞と比べ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２、ＡＬＤＨ１Ａ１、及びＴＧＦβ１のｍＲＮＡの発現量が亢進していることが明らかとなった（ＡＢＣＢ１；５．７倍、ＡＢＣＣ１；１．８倍、ＡＢＣＧ２；５．０倍、ＡＬＤＨ１Ａ１；４．６倍、ＴＧＦβ１；３．０倍）（図６）。さらに、がん幹細胞マーカー因子として知られている２種類の因子（ＰＲＯＭ１及びＮＡＮＯＧ）やＥＭＴに関与する４種類の因子（ＦＮ１、ＶＩＭ、ＴＷＩＳＴ２、及びＳＮＡＩ３）についても同様に解析したところ、肝がん幹細胞からなる細胞塊は、ＳＫ−ＨＥＰ−１肝がん細胞と比べ、かかる６種類の因子全てのｍＲＮＡの発現量が亢進していることが明らかとなった（ＰＲＯＭ１；６．６倍、ＮＡＮＯＧ；５．０倍、ＦＮ１；２．８倍、ＶＩＭ；２．３倍、ＴＷＩＳＴ２；２．２倍、ＳＮＡＩ３；３．１倍）（図７）。これらの結果は、本発明の無血清培地を用いて単離した肝がん幹細胞は、がん幹細胞に特徴的ながん幹細胞マーカー因子が高発現していることを示しているとともに、ＥＭＴ関連因子の発現レベルについても亢進が認められたことから、がん幹細胞はＥＭＴにより形成された可能性も示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、消化器がんの治療薬の開発に資するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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