(57)【要約】【課題】  亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなくウイルスの感染を抑制することができる、ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤を提供する。【解決手段】  カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質を有効成分とする。本発明に係るウイルス感染抑制および感染症治療剤によれば、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなく、広範囲のウイルス株に対して長期的に、感染を抑制することまたはウイルス感染症を治療することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質を有効成分とするウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【請求項２】
カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質がグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、アムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムからなる群から選択される１または２以上の物質である、請求項１に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【請求項３】
ウイルスがエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、請求項１または請求項２のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【請求項４】
エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスからなる群から選択される１または２以上のエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、請求項３に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【請求項５】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１から請求項４のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤に関し、特に、カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質を有効成分とするウイルス感染抑制および感染症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスとは、細胞を構成単位とせずにＤＮＡかＲＮＡのいずれかをゲノムとして有し、宿主細胞内だけで増殖する微小構造体であり、宿主細胞内の代謝系を利用して増殖する。その際、病原体としてふるまうことがあり、ウイルスが増殖した結果として宿主に惹起される疾病をウイルス感染症という。ウイルス感染症には、例えば、ライノウイルスによる感冒、インフルエンザウイルスによるインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルスによる後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）、単純ヘルペスウイルスによる単純ヘルペス、腫瘍ウイルスによる癌など、さまざまなものがある。
【０００３】
ウイルスの感染には、I「細胞表面への吸着」、II「細胞内への侵入」、III「脱殻」、IV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」、V「ウイルス部品の集合」、VI「細胞からの放出」の、I〜VIのステップがある。従って、従来、これらのステップを攻撃対象として、種々のウイルス感染症の治療剤やウイルス感染予防・阻害剤の研究開発がされている。
【０００４】
例えば、ウイルス感染予防・阻害剤やウイルス感染症治療剤として代表的であるワクチンは、弱毒化または不活化したウイルスを宿主に取り込ませて免疫を獲得させ、これを利用することで、上記ステップのうち、I「細胞表面の吸着」、II「細胞内への侵入」、あるいはVI「感染細胞からの放出」ステップを対象としている。また、特開２００８−２５３１８８号公報に開示されているＤＮａｓｅＸタンパク質は、ウイルス遺伝子の宿主への取り込みを抑制することで、特開２００７−１６０４４号公報に開示されているペプチドは、レトロウイルスのインテグラーゼを阻害することで、それぞれIV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」ステップを攻撃する（特許文献１および特許文献２）。
【０００５】
一方、インフルエンザは、代表的なウイルス感染症として知られている。インフルエンザの治療剤、インフルエンザウイルス感染予防・阻害剤としては、例えば、インフルエンザ表面に存在する酵素ノイラミターゼの働きを阻害することによりVI「感染細胞からの放出」ステップを攻撃するオセルタミビル（商品名タミフル；ロシュ社）やザナミビル（商品名リレンザ；グラクソ・スミスクライン社）の他、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を阻害することによりIII「脱殻」ステップを攻撃するアマンタジン（商品名シンメトレル；ノバルティスファーマ社）を挙げることができる。また、国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレットには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに親和性の高いペプチドが開示されており、I「細胞表面への吸着」およびII「細胞内への侵入」ステップを対象としている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２５３１８８号公報
【特許文献２】特開２００７−１６０４４号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示されたウイルス感染予防・阻害剤は、外来遺伝子の分解を促進することが示されているものの、実際のウイルス感染を阻害するか否かは確かめられておらず、ウイルス感染阻害効果は不明である。また、ワクチン、レトロウイルス感染阻害剤（特許文献２）、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、インフルエンザ予防・治療剤（特許文献３）は、いずれもウイルス本体に由来するタンパク質を標的としているため、亜型への効果が期待できず、また、変異体の出現により耐性獲得が生じやすいという問題点を抱えている。例えば、現在日本で使用されている季節性インフルエンザに対するワクチンは、先行するオーストラリアでの流行株の情報に基づき、日本で流行すると予想された株に対するワクチンが作製されるため、毎年不安定であるうえ、この予測が外れた場合や変異体が生じた場合には、対応が困難となる。
【０００８】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなくウイルスの感染を抑制することができる、ウイルス感染抑制および／または感染症治療剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、宿主細胞におけるカルシウムイオンを標的として、カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質を用いることでウイルスの感染を抑制できることを見出し、下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質を有効成分とするウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【００１１】
（２）カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質がグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ、アムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムからなる群から選択される１または２以上の物質である、（１）に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【００１２】
（３）ウイルスがエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、（１）または（２）のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【００１３】
（４）エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスからなる群から選択される１または２以上のエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスである、（３）に記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【００１４】
（５）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１）から（４）のいずれかに記載のウイルス感染抑制および／または感染症治療剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤によれば、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなく、広範囲のウイルス株に対して長期的に、感染を抑制することまたはウイルス感染症を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、ＬＹ２９４００２を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ２９４００２群）、ＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）およびオセルタミビルを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（オセルタミビル群）の、それぞれのウイルス感染率を示すグラフである。
【図２】ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、アムロジピンを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（アムロジピン群）、ベラパミルを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ベラパミル群）、ジルチアゼムを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ジルチアゼム群）およびＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）の、それぞれのウイルス感染率を示すグラフである。コントロール群に対して有意差検定を行って得られたｐ値をグラフ上部に示す。
【図３】ＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加した培地でＭＤＣＫ細胞群を培養した時間とＰＲ８ウイルスの接種時間との関係を示す模式図（左図）およびその場合のウイルス感染率を示すグラフ（右図）である。図中、白色帯はＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加していない培地にてＭＤＣＫ細胞群を培養した時間帯を、黒色帯はＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加した培地にてＭＤＣＫ細胞群を培養した時間帯を、それぞれ示す。
【図４】ＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＣｏｓ１細胞における、インフルエンザウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光により、Ｒａｂ７タンパク質をＥＣＦＰの蛍光によりそれぞれ検出した結果を示す図（左図）およびＣｏｓ１細胞１細胞あたりの「ＥＣＦＰの蛍光とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光との重複を示す顆粒数」を示すグラフ（右図）である。
【図５】ＢＡＰＴＡ−ＡＭおよびジルチアゼムをそれぞれ添加してデキストランまたはトランスフェリンを取り込ませたＭＤＣＫ細胞群における、ＭＤＣＫ細胞１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度をデキストランまたはトランスフェリンの取り込み量に換算して表したグラフである。各グラフ中の横線は中央値を示す。
【図６】「ＹＦＰの蛍光／ＥＣＦＰの蛍光」の割合を測定することにより、ＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（コントロール群）、ＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）およびＥＧＴＡを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＥＧＴＡ群）における活性化Ｒａｓタンパク質濃度を測定した結果を示す図である。図中、ＰＲ８ウイルス含有培地を細胞に添加した時間を０分として示す。
【図７】野生型ＭＥＦ細胞群（陰性コントロール群）、ＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（陽性コントロール群）、ＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＢＡＰＴＡ群）およびＥＧＴＡを添加してＰＲ８ウイルスを接種した野生型ＭＥＦ細胞群（ＥＧＴＡ群）について、ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤタンパク質を用いてプルダウンアッセイを行って得られた溶出液中の、それぞれのＲａｓタンパク質をイムノブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤について詳細に説明する。本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤は、カルシウムイオンとキレートを形成する物質および／または細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質を有効成分とする。
【００１８】
本発明においてカルシウムイオンとキレートを形成する物質は、キレート剤として機能する物質であれば、細胞膜透過性の有無を問わず用いることができる。また、カルシウムイオンに対する選択性が高くて専らカルシウムイオンとキレートを形成する物質でもよく、カルシウムイオンに対する選択性が低く、カルシウムイオンの他、カルシウムイオン以外の物質ともキレートを形成する物質でもよい。そのような物質としては、例えば、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ｛Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ｔｅｔｒａａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ｝、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１，３−ジアミノ２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、トランス−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、カルボキシメチルポリエチレンイミン、クラウンエーテルなどのポリマーキレート剤、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、エチレンジアミンコハク酸（ＥＤＤＳ）およびこれらの塩などのアミノカルボン酸系キレート剤、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、ホスホノブタントリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）などのホスホン酸系キレート剤、グルコン酸、ヘプトグルコン酸、クエン酸やシュウ酸およびこれらの塩などのカルボン酸系キレート剤、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメル、エデト酸トリエンチンなどを挙げることができ、これらから選択される１種または２種以上を用いることができ、ＢＡＰＴＡ−ＡＭやＥＧＴＡを好適に用いることができる。
【００１９】
本発明において、細胞内とは生体膜によって仕切られた内部のことをいう。一般に、細胞内へのカルシウムイオンの流入は種々の経路を介しておこる。例えば、Ｌ型カルシウムチャネル、Ｐ型／Ｑ型カルシウムチャネル、Ｎ型カルシウムチャネル、Ｒ型カルシウムチャネル、Ｔ型カルシウムチャネルなどの細胞膜に存在する電位依存性カルシウムチャネルを含む電位依存性陽イオンチャネルや、イノシトール三リン酸受容体、リアノジン受容体、容量依存性カルシウムチャネルなどのリガンド依存性カルシウムチャネルの他、５−ＨＴ３受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体やα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メソオキサゾール−４−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体などを含むリガンド依存性陽イオンチャネルが開口して、細胞外から細胞内へカルシウムイオンが流入する経路を挙げることができる。カルシウムチャネルにおけるサブユニットとしては、例えば、α１サブユニット、α２サブユニット、βサブユニット、γサブユニット、δサブユニットなどを挙げることができる。また、細胞内が細胞質をいう場合は、上述の経路の他、小胞体や筋小胞体など、カルシウム貯蔵部位として機能する細胞小器官の生体膜上に存在する電位依存性カルシウムチャネルやリガンド依存性カルシウムチャネルが開口して、細胞小器官の内部から細胞質へカルシウムイオンが流入する経路を挙げることができる。その他、カルシウムナトリウム交換体による流入経路、一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネルからの流入経路などを挙げることができる。
【００２０】
本発明に係る細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制する物質は、上述の流入経路からのカルシウムイオンの流入を阻害する物質を含め、その作用機構にかかわらず、結果として細胞内へのカルシウムイオンの流入を抑制するものであれば特に限定されない。そのような物質としては、例えば、カルシウムイオン特異的結合タンパク質、カルシウムチャネルの開口を阻害する物質（カルシウムチャネル阻害剤、カルシウム拮抗剤、カルシウムチャネル遮断剤）、ＫＢ−Ｒ７９４３などのカルシウムナトリウム交換体のカルシウムイオン流入作用を阻害する物質などを挙げることができ、カルシウムチャネル阻害剤を好適に用いることができる。
【００２１】
本発明において、カルシウムチャネル阻害剤としては、例えば、ジヒドロピリジン誘導体、フェニルアルキルアミン誘導体、ベンゾチアゼピン誘導体、ジフェニルピペラジン誘導体などを挙げることができ、より詳細には、例えば、アムロジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニカルジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、ベプリジル、バルプロ酸、ガバペンチン、シルニジピン、アラニゾピン、エホニジピン、ニソルジピン、ニソルニジピン、ニトレンジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、バルニジピン、フェロジピン、ベニジピン、マニジピン、カルシセプチン、コノトキシン、アガトキシン、ＦＴＸ、フルナリジン、オクタノール、カルシクルジン、タイカトキシン、２，３−Ｄｉｏｘｏ−６−ｎｉｔｒｏ−１，２，３，４−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｆ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−７−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＮＢＱＸ）、６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ）、６，７−Ｄｉｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ−２，３−ｄｉｏｎｅ（ＤＮＱＸ）、ジゾシルピン、Ｄ−（−）−２−Ａｍｉｎｏ−５−ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（Ｄ−ＡＰ５）などを挙げることができ、アムロジピンやベラパミル、ジルチアゼムを好適に用いることができる。
【００２２】
感染を抑制するか否かは、ＪＢＣ、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年や、ＮＣＢ、第３巻、第３０１頁、２００１年、あるいはＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年などに従い、感染率を算出することにより評価することができる他、例えば、ウイルス株の感染価を指標として評価することができる。感染価とは、一般的に感染性の微生物を含む検体を培養細胞に等量ずつ接種した時、感染率５０％を与えるようなその検体の量をいい、「ＴＣＩＤ５０（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」で表される。
【００２３】
なお、本発明において「感染を抑制する」は、「感染を予防する」、「感染を阻止する」、「感染を阻害する」と交換可能に用いられる。
【００２４】
本発明に係るウイルス感染抑制および／または感染症治療剤は、個体または細胞とウイルスとが接触する以前、接触中または接触直後のみならず、個体または細胞とウイルスとが接触して長時間経過した後に投与することにより、ウイルス感染を抑制し、あるいは感染症を治療することができる。
【００２５】
対象となるウイルスとしては、例えば、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、パラミクソウイルスなどの膜融合により感染可能なウイルス、バクテリオファージなどの核酸注入により感染可能なウイルス、インフルエンザウイルスなどのエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスを挙げることができるが、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスが好ましい。また、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのうち、クラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスからなる群から選択される１または２以上のエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスがより好ましい。そのようなウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、シミアン−ウイルス４０、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヘルペスウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｂ（ＣＶＢ）、イネ萎縮ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどを挙げることができる。
【００２６】
ここで、エンドサイトーシスとは、一般に、細胞が外界からの物質を細胞膜の小胞化と融合により内部に取り込む方式の総称である。エンドサイトーシスは、取り込む物質の種類や大きさ、関与する細胞装置の違いにより、クラスリン非依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、カベオラ依存性エンドサイトーシス、コレステロール依存性エンドサイトーシス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシスなどに分類されている。
【００２７】
また、エンドサイトーシスは、細胞膜に存在する受容体タンパク質への刺激により生じるか否かにより、受容体依存性エンドサイトーシスおよび受容体非依存性エンドサイトーシスにも分類可能である。この場合、前者には上述の分類でいうクラスリン依存性エンドサイトーシスやカベオラ依存性エンドサイトーシスなどに相当するエンドサイトーシスが含まれ、後者には上述の分類でいうクラスリン非依存性エンドサイトーシスやマクロピノサイトーシスに相当する、食作用（ファゴサイトーシス）や飲作用（ピノサイトーシス）などが含まれる。
【００２８】
すなわち、本発明において「エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、クラスリン非依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、クラスリン依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、マクロピノサイトーシスにより感染可能なウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスが包含される。
【００２９】
なお、本発明者らは以前に、宿主細胞におけるｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質とＰｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とが複合体を形成し、エンドソーム上に存在することで、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによってウイルスが感染することを見出している（特願２００９−２３６７５８）が、本発明に係るウイルスの感染抑制および／または感染症治療剤は、ウイルス接種に伴うＲａｓタンパク質の活性化をも抑制することができることから、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが複合体を形成することによるウイルス感染メカニズムよりも上流にあるメカニズムを阻害するものである。なお、特願２００９−２３６７５８の内容は、本明細書に包含される。
【００３０】
本発明に係るウイルスの感染抑制および／または感染症治療剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００３１】
以下、本発明に係るウイルスの感染抑制および／または感染症治療剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３２】
＜実施例１＞カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞におけるインフルエンザウイルス感染率の検討
Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤であるＬＹ２９４００２、カルシウムイオンキレート剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭおよび市販のインフルエンザ薬であるオセルタミビルをそれぞれ添加してインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
【００３３】
（１）カルシウムイオンキレート剤による前処理
Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞群を４群に分け、それぞれコントロール群、ＬＹ２９４００２群、ＢＡＰＴＡ群およびオセルタミビル群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群について、ＰＢＳで洗浄した後、ＢＡＰＴＡ群には細胞膜透過性のカルシウムイオンキレート剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地；シグマ社）を、オセルタミビル群には細胞膜非透過性のカルシウムイオンキレート剤であるオセルタミビル（Ｒｏｃｈｅ社）１００μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を添加して、それぞれ３７℃で３０分間培養した。
【００３４】
（２）ウイルスの調製
北海道大学の高田礼人氏より供与されたインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）を、ニワトリ卵１０日胚（ホクレン中央種鶏場）の漿尿膜へ接種して、３７℃にて４８時間培養して増殖させた。
【００３５】
（３）ＭＤＣＫ細胞群へのウイルス接種
本実施例（２）のＰＲ８ウイルスを、重複感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）=１となるようｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ培地）（インビトロジェン社）に加えてＰＲ８ウイルス含有培地を調製した。さらに、各群に添加するＰＲ８ウイルス含有培地に、下記に示す試薬をそれぞれ添加した。
【００３６】
コントロール群：無添加
ＬＹ２９４００２群：ＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）
５０μｍｏｌ／Ｌ（培地中濃度）
ＢＡＰＴＡ群：ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）      ２５μｍｏｌ／Ｌ（培地中濃度）
オセルタミビル群：オセルタミビル（Ｒｏｃｈｅ社）１００μｍｏｌ／Ｌ（培地中濃度）
【００３７】
続いて、本実施例（１）の各群をＰＢＳで洗浄した後、上記の試薬を含むＰＲ８ウイルス含有培地を添加し、３５℃にて１時間培養することによりインフルエンザウイルス接種を行った。
【００３８】
（４）ウイルス接種後の培養
本実施例（３）の各群をＰＢＳで洗浄した後、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加し、３５℃にて２日間培養した。ただし、ＬＹ２９４００２群、ＢＡＰＴＡ群およびオセルタミビル群について、本実施例（３）のウイルス接種時と同じ試薬を同じ濃度となるようそれぞれ添加した。
【００３９】
（５）プラークアッセイによる感染率の検定
本実施例（４）の培養上清を、新たなＭＤＣＫ細胞群にそれぞれ添加した後、１時間培養した。続いて、培養上清を除去し、Ｂａｃｔ−ａｇａｒ１％（ｖ／ｖ）およびトリプシン５μｇ／ｍＬを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加して３５℃にて２日間培養した後、出現したプラークを数えた。この結果をもとに、ＰＲ８ウイルスの各群における感染率を求めた｛ＪＢＣ、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年；ＮＣＢ、第３巻、第３０１頁、２００１年；ＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年｝。その結果を図１に示す。
【００４０】
図１に示すように、ＬＹ２９４００２群、ＢＡＰＴＡ群およびオセルタミビル群の感染率は、コントロール群に比較して、それぞれ約１／５、約１／１００および約１／１０であり、ＢＡＰＴＡ群が最も顕著に感染率が低下した。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理すると、ウイルス感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
【００４１】
＜実施例２＞カルシウムチャネル阻害剤により処理した細胞におけるウイルス感染率の検討
カルシウムチャネルを阻害することにより細胞内へのカルシウムイオン流入を抑制する試薬であるアムロジピン、ベラパミルおよびジルチアゼムをそれぞれ添加してインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
【００４２】
まず、ＭＤＣＫ細胞群を５群に分け、それぞれコントロール群、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群とした。続いてアムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群について、アムロジピン（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）、ベラパミル（シグマ社）５０μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）、ジルチアゼム（シグマ社）１００μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）およびＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を用いて、実施例１（１）に記載の方法によりそれぞれ前処理を行った。
【００４３】
続いて、コントロール群、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した後、実施例１（４）に記載の方法により培養した。ただし、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群について、ＰＲ８ウイルス含有培地および接種後の培養に用いた培地には、前処理時と同じ試薬を同じ濃度となるよう添加し、接種後の培養時間は２日間に代えて２３時間とした。
【００４４】
続いて、実施例１（５）に記載の方法によりプラークアッセイを行い、ウイルス感染率を求めた。その結果を図２に示す。
【００４５】
図２に示すように、アムロジピン群、ベラパミル群、ジルチアゼム群およびＢＡＰＴＡ群のウイルス感染率は、いずれもコントロール群に比較して顕著に低下した。以上より、カルシウムチャネル阻害剤で処理することにより、ウイルス感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
【００４６】
＜実施例３＞カルシウムイオンキレート剤による処理時間とウイルス接種時間との関係の検討
カルシウムイオンキレート剤を添加した培地で培養した時間が異なる細胞におけるウイルス感染率を求め、カルシウムイオンキレート剤による処理時間とウイルス接種時間との関係を調べた。
【００４７】
まず、ＭＤＣＫ細胞群を４群に分け、それぞれコントロール群、Ｂ−Ｂ群、Ｎ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群とした。続いて、Ｂ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群について、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を用いて、実施例１（１）に記載の方法により前処理を行った。
【００４８】
次に、コントロール群、Ｂ−Ｂ群、Ｎ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、Ｂ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群については、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）を２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加したＰＲ８ウイルス含有培地を用いた。
【００４９】
その後、実施例１（４）に記載の方法により培養した。ただし、培養時間は２日間に代えて２３時間とし、培養時間が３時間を経過した時点で培地を同じ組成の新しいものに交換した。また、Ｂ−Ｂ群、Ｎ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群の培地に、下記のとおりＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）を２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加した。
【００５０】
Ｂ−Ｂ群：０時間〜３時間    添加
３時間〜２３時間  添加
Ｎ−Ｂ群：０時間〜３時間    添加せず
３時間〜２３時間  添加
Ｂ−Ｎ群：０時間〜３時間    添加
３時間〜２３時間  添加せず
【００５１】
ＢＡＰＴＡ−ＡＭを培地に添加した時間についての模式図を図３左図に示す。また、実施例１（５）に記載の方法によりプラークアッセイを行い、ウイルス感染率を求めた結果を図３右図に示す。
【００５２】
図３右図に示すように、Ｂ−Ｂ群、Ｎ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群のウイルス感染率は、いずれもコントロール群に比べて低下した。また、ウイルス感染率の低下はＢ−Ｂ群が最も顕著であり、Ｎ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群は同程度であった。
【００５３】
以上より、Ｂ−Ｎ群でウイルス感染率が低下したことから、ウイルス接種と同時およびウイルス接種前後数時間の間にカルシウムイオンキレート剤により処理すると、ウイルス感染を抑制できることが明らかになった。また、Ｎ−Ｂ群でウイルス感染率が低下することから、ウイルス接種後数時間から数十時間の間にカルシウムイオンキレート剤により処理すると、ウイルス感染を抑制できることが明らかになった。さらに、Ｂ−Ｂ群において、Ｎ−Ｂ群およびＢ−Ｎ群に比較してウイルス感染率の低下が大きいことから、ウイルス接種前からウイルス接種後数十時間の間に継続してカルシウムイオンキレート剤により処理すると、ウイルス感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
【００５４】
＜実施例４＞カルシウムイオンキレート剤により処理した細胞におけるインフルエンザウイルス核タンパク質の存在箇所の観察
インフルエンザウイルス核タンパク質および後期エンドソームマーカータンパク質を免疫抗体染色および蛍光標識により可視化し、ＢＡＰＴＡ−ＡＭを添加してＰＲ８ウイルスを接種した細胞において、これらのタンパク質が存在する箇所を調べた。
【００５５】
（１）発現ベクターの調製
後期エンドソームに局在することが知られているＲａｂ７タンパク質のコード領域（配列番号１）が挿入された発現ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ７は東京大学の坪井貴司氏から供与された。また、強化青緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）のコード領域（配列番号２）が挿入された発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰは、京都大学の松田道行氏から供与された。
【００５６】
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ７を鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社）を用いてＰＣＲを行い、Ｒａｂ７のコード領域を増幅して単離した。ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
【００５７】
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧ−３’（配列番号３）
リバースプライマー  ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ反応溶液組成；ｄＮＴＰ  ２００μｍｏｌ／Ｌ、フォワードプライマー  ３００ｎｍｏｌ／Ｌ、リバースプライマー  ３００ｎｍｏｌ／Ｌ、鋳型ＤＮＡ  １００ｎｇ、ＭｇＣｌ２  １．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１×Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｒｅａｃｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ  ５２Ｕ／ｍＬ
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
【００５８】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した後、制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、前記発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ７を得た。
【００５９】
（２）一次抗体の調製
インフルエンザ核タンパク質（インフルエンザＮＰ）に対する抗体である抗インフルエンザＮＰマウスモノクローナル抗体は北海道大学の高田礼人氏より供与された。
【００６０】
（３）Ｃｏｓ１細胞への発現ベクターの導入
アフリカミドリザル腎由来のＣｏｓ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）に、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（１）の発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ７を導入し、胎児牛血清（ＦＢＳ；Ｃａｎｓｅｒａ社）１０ｖ／ｖ％を含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）で、３７℃、ＣＯ２５％を含む加湿環境下にて２４時間培養した。
【００６１】
（４）カルシウムイオンキレート剤による前処理およびウイルス接種
本実施例（３）のＣｏｓ１細胞群を２群に分け、それぞれコントロール群およびＢＡＰＴＡ群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群について、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）を用いて、実施例１（１）に記載の方法により前処理を行った。
【００６２】
次に、コントロール群およびＢＡＰＴＡ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、接種時間は１時間に代えて２時間とした。また、ＢＡＰＴＡ群については、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）を２５μｍｏｌ／Ｌとなるように添加したＰＲ８ウイルス含有培地を用いた。
【００６３】
（５）免疫蛍光染色
本実施例（４）のコントロール群およびＢＡＰＴＡ群をＰＢＳで洗浄後、パラホルムアルデヒドを３％含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温で１５分間固定した後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．１％含むＰＢＳを用いて室温で４分間透過処理した後、ＰＢＳで洗浄した。次に、抗体の非特異的結合を抑えるために、ウシ血清アルブミンを１％含むＰＢＳを用いて３０分間ブロッキングを行った後、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびウシ血清アルブミンをそれぞれ０．０５％および０．１％含むＰＢＳで洗浄した。その後、本実施例（２）の抗インフルエンザＮＰ抗体をＰＢＳで５００倍希釈した溶液に４℃にて一晩曝し、一次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）をＰＢＳで２５０倍希釈した溶液に室温にて１時間曝して、二次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。
【００６４】
（６）蛍光顕微鏡による観察
共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ‐１０００（オリンパス社）を用いて、本実施例（３）のコントロール群およびＢＡＰＴＡ群におけるＥＣＦＰの蛍光およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光を検出した。その結果を図４左図に示す。また、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて各群の１０個から２０個の細胞について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光とＥＣＦＰの蛍光との重複を示す顆粒数を測定し、１細胞あたりの平均値を求めてグラフに表した。その結果を図４右図に示す。
【００６５】
図４左図および右図に示すように、ＢＡＰＴＡ群では、コントロール群に比較してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光とＥＣＦＰの蛍光との重複を示す顆粒が顕著に少なかった。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理すると、ウイルスＮＰの後期エンドソームへの取り込みが抑制されることが明らかになった。
【００６６】
＜実施例５＞カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞およびカルシウムチャネル阻害剤で処理した細胞におけるエンドサイトーシス機能の検討
トランスフェリンおよびデキストランを、カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞およびカルシウムチャネル阻害剤で処理した細胞に取り込ませ、それらの取り込み量を調べた。
【００６７】
（１）カルシウムイオンキレート剤およびカルシウムチャネル阻害剤による前処理
ＭＤＣＫ細胞群を３群に分け、それぞれコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群について、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）およびジルチアゼム（シグマ社）１００μｍｏｌ／Ｌμｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地（シグマ社）をそれぞれ用いて、実施例１（２）に記載の方法により前処理を行った。
【００６８】
（２）エンドサイトーシス機能の評価
本実施例（１）のコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群をそれぞれ２つに分け、そのうち一方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を結合した分子量１００００のデキストランを、他方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を結合したトランスフェリン（インビトロジェン社）を、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう培地に添加して、３７℃、ＣＯ２５％を含む加湿環境下で３０分間培養した。続いて、ＰＢＳを用いて各群の細胞を洗浄し、３％ＰＦＡを用いて室温で１５分間固定した後、再度ＰＢＳを用いて各群の細胞を洗浄した。その後、実施例４（６）に記載の方法により蛍光観察を行い、各群における２０個から３０個の細胞について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度を測定し、デキストランの取り込み量およびトランスフェリンの取り込み量に換算して、グラフに表した。その結果を図５に示す。
【００６９】
図５に示すように、ＢＡＰＴＡ群およびジルチアゼム群では、デキストランおよびトランスフェリンのいずれについても、コントロール群に比較して取り込み量が低下した。分子量１００００のデキストランは、主にマクロピノサイトーシスおよびクラスリン非依存性エンドサイトーシスにより、またトランスフェリンは主にクラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれると考えられることから、カルシウムイオンキレート剤またはカルシウムチャネル阻害剤で処理すると、クラスリン非依存性のエンドサイトーシス、クラスリン依存性のエンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスが抑制されることが明らかになった。
【００７０】
＜実施例６＞カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞における、Ｒａｓタンパク質活性化の検討
カルシウムイオンキレート剤で処理した細胞における、ウイルス接種に伴う活性化Ｒａｓタンパク質の濃度変化を、ＦＲＥＴの原理に基づく蛍光観察およびプルダウンアッセイにより調べた。
【００７１】
（１）ＦＲＥＴによる活性化Ｒａｓタンパク質の検出
［１−１］野生型ＭＥＦ細胞群の調製
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Ｊｃｌ；日本クレア）からマウス胎児繊維芽（Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）細胞群を既報に従って調製し｛Ｓａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８７巻、第５４５５号、第１０４０−１０４６頁、２０００年｝、実施例４（２）に記載の環境下で培養した。
【００７２】
［１−２］発現ベクターの調製
ＦＲＥＴの原理に基づいて設計されたＲａｉｃｈｕ−Ｒａｓタンパク質のコード領域（配列番号５）が挿入された発現ベクターｐＲａｉｃｈｕ−１４６Ｘは、京都大学の松田道行氏から供与された。Ｒａｉｃｈｕ−Ｒａｓタンパク質は、Ｒａｓタンパク質とＲａｓタンパク質に結合することが知られている因子であるＲａｆタンパク質のＲＢＤとが連結され、さらに、Ｒａｓタンパク質とＲＢＤとがＹＦＰとＣＦＰとで挟まれた構造を持つ。よって、波長４４０ｎｍで励起すると、Ｒａｓタンパク質がＧＤＰ結合型の場合はＣＦＰの蛍光を発し、Ｒａｓタンパク質がＧＴＰ結合型の場合はＹＦＰの蛍光を発する。
【００７３】
［１−３］野生型ＭＥＦ細胞への発現ベクターの導入
本実施例（１）の野生型ＭＥＦ細胞に、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（１）［１−２］の発現ベクターｐＲａｉｃｈｕ−１４６Ｘを導入した。その後、実施例４（２）に記載の環境下で培養した。
【００７４】
［１−４］カルシウムイオンキレート剤による前処理
本実施例（１）［１−３］の野生型ＭＥＦ細胞群を３群に分け、それぞれコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群には細胞膜透過性のカルシウムイオンキレート剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地を、ＥＧＴＡ群には細胞膜非透過性のカルシウムイオンキレート剤であるＥＧＴＡ（シグマ社）２５μｍｏｌ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地をそれぞれ用いて、実施例１（１）に記載の方法により前処理を行った。
【００７５】
［１−５］インフルエンザウイルス接種および蛍光観察
既報（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ 第４１１巻、第１０６５−１０６８頁、２００１年／Ｏｈｂａ Ｙ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２２巻、第４号、第８５９−８６９頁、２００３年）に従い、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いて観察しながら、本実施例（１）［１−４］のコントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群に、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種して、約５０分間蛍光観察した。代表的な１細胞の結果を図６に示す。
【００７６】
図６に示すように、コントロール群ではＰＲ８ウイルス接種後にＹＦＰの蛍光強度が経時的に増加した。一方、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群では、ＹＦＰの蛍光強度はほとんど増加しなかった。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理することにより、ウイルス接種に伴うＲａｓタンパク質の活性化が抑制されることが明らかになった。
【００７７】
（２）プルダウンアッセイによる活性化Ｒａｓタンパク質の検出
【００７８】
［２−１］ＧＳＴ融合タンパク質およびｌｙｓｉｓ緩衝液の調製
北里大学の服部成介氏から供与された、ＧＳＴ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とｃ−Ｒａｆ１のＲＢＤとの融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤタンパク質）のコード領域が挿入された発現ベクターｐＧＥＸ−Ｒａｆ−ＲＢＤを、常法に従い大腸菌で発現させて精製ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤタンパク質を得た。また、以下の組成からなるｌｙｓｉｓ緩衝液を調製した。
【００７９】
ｌｙｓｉｓ緩衝液の組成
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）          ５０ｍＭ
ＮａＣｌ                              １５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                                 ５ｍＭ
Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０                       １％
ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ   ０．５％
ＳＤＳ                                  ０．１％
Ｎａ３ＶＯ４                                １ｍＭ
【００８０】
［２−２］野生型ＭＥＦ細胞群の調製、カルシウムイオンキレート剤による前処理およびウイルス接種
本実施例（１）［１−１］に記載の方法により調製した野生型ＭＥＦ細胞群を４群に分け、それぞれ陰性コントロール群、陽性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群とした。続いて、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群について、本実施例（１）［１−４］に記載の方法により前処理を行った。次に、陽性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群について、実施例１（３）に記載の方法によりＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、ＰＲ８ウイルス含有培地における培養時間を１時間に代えて０．５時間とした。
【００８１】
［２−３］プルダウンアッセイ
プルダウンアッセイは、既報｛Ｆｒａｎｋｅ Ｂ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ． 第１６巻、第２５２−２５９頁、１９９７年；Ｉｎｕｚｕｋａ Ｔ．ら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ． 第３７９巻、第５１０−５１３頁、２００９年；Ｏｈｂａ、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２０巻、第１３号、第３３３３−３３４１頁、２００１年｝に従い行った。具体的には、本実施例（２）［２−２］の陰性コントロール群、陽性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群に、本実施例（２）［２−１］のｌｙｓｉｓ緩衝液を添加して細胞を溶解した。続いて、遠心分離を行って上清を回収した。各群の上清を２つに分け、そのうち一方は細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液として取り置いた。他方に、本実施例（２）［２−１］の精製ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤタンパク質を添加して３０分間反応させた後、グルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ；ＧＥヘルスケア社）を添加して反応させた。続いて、遠心分離を行って上清を除去し、本実施例（２）［２−１］のｌｙｓｉｓ緩衝液を用いて沈殿物を２回洗浄した後、溶出液を加えてビーズに結合したタンパク質を溶出させ、各群のプルダウンアッセイ液を得た。
【００８２】
［２−４］イムノブロッティングによるＲａｓタンパク質の検出
本実施例（２）［２−３］の各群の細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液およびプルダウンアッセイ液について、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。続いて、分離したタンパク質を、イミュン−ブロットＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に吸着させた。
【００８３】
次に、一次抗体として抗Ｒａｓマウスモノクローナル抗体｛Ａｎｔｉ−Ｐａｎ−Ｒａｓ（Ａｂ−３）；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社｝とＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）とを用いて、付属の使用書に従い抗原抗体反応を行った後、ＬＡＳ−１０００ＵＶ ｍｉｎｉ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（富士フィルム社）を用いてシグナルを検出した。その結果を図７に示す。
【００８４】
図７に示すように、陽性コントロール群では、プルダウンアッセイ液において細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液と同程度の強いシグナルが検出された一方で、陰性コントロール群、ＢＡＰＴＡ群およびＥＧＴＡ群ではいずれも、各群の細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液に比べて弱いシグナルが検出された。また、細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液におけるシグナル強度に各群間の差はほとんど見られなかった。
【００８５】
抗Ｒａｓ抗体はＧＴＰ結合型Ｒａｓタンパク質およびＧＤＰ結合型Ｒａｓタンパク質のいずれにも結合することから、細胞内総Ｒａｓタンパク質検出用液におけるシグナルは細胞中の総Ｒａｓタンパク質の存在量を表す。一方、Ｒａｆ−ＲＢＤに結合するのはＧＴＰ結合型Ｒａｓタンパク質であり、ＧＤＰ結合型Ｒａｓタンパク質は結合しないことから、プルダウンアッセイ液におけるシグナルは、活性化Ｒａｓタンパク質の存在量を表す。以上より、カルシウムイオンキレート剤で処理することにより、ウイルス接種に伴うＲａｓタンパク質の活性化が抑制されることが明らかになった。また、カルシウムイオンキレート剤は、細胞膜透過性の有無にかかわらず、細胞内におけるＲａｓタンパク質活性化の抑制効果を有することが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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