(57)【要約】【課題】高温環境下で栽培した場合であっても胚乳の白濁等の高温障害が抑制できるなどの高温耐性に優れ、品質上実用性が高い形質転換植物体及びその製造方法、前記形質転換植物体の製造方法に用いることが可能なＲＮＡ又はＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを有するベクターの提供。【解決手段】植物体のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを有するベクター、前記ＤＮＡを植物体に導入した形質転換植物体及びその製造方法などである。【選択図】図５Ａ
2013208076.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物体のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することを特徴とするＲＮＡ。
【請求項２】
下記（ｉ）から（ｉｖ）から選択される少なくとも１種である請求項１に記載のＲＮＡ；
（ｉ）α−アミラーゼ遺伝子のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ、
（ｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ、
（ｉｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を共抑制作用により阻害するＲＮＡ、
（ｉｖ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物と相補的なＲＮＡ。
【請求項３】
植物体が、イネ科植物である請求項１から２のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項４】
α−アミラーゼ遺伝子が、Ａｍｙ１Ａ遺伝子、Ａｍｙ１Ｃ遺伝子、Ａｍｙ２Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ｂ遺伝子、Ａｍｙ３Ｃ遺伝子、Ａｍｙ３Ｄ遺伝子、及びＡｍｙ３Ｅ遺伝子の少なくともいずれかである請求項１から３のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＲＮＡをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５から６のいずれかに記載のＤＮＡを有することを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項５から６のいずれかに記載のＤＮＡを植物体に導入し形質転換植物体を得るＤＮＡ導入工程を含むことを特徴とする形質転換植物体の製造方法。
【請求項９】
ＤＮＡ導入工程が、植物体をカルス誘導し、前記カルスにＤＮＡを導入することにより行われる請求項８に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１０】
ＤＮＡを導入したカルスを増殖させるカルス増殖工程と、
増殖させた前記カルスから植物体を再分化させる再分化工程と、
を更に含む請求項９に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法により製造されてなることを特徴とする形質転換植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ又はＤＮＡ、並びに、前記ＤＮＡを有するベクター、前記ＤＮＡを導入した形質転換植物体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＣＯ２の排出量の増加やオゾン層の破壊などによる地球温暖化の影響が懸念されている。特に、植物は、至適温度の環境下において最も良好に生育することから、温度上昇に伴って種々の障害が確認されている。例えば、イネ科植物の場合、イネ登熟期の高温は、胚乳の白濁化と収量の減少を引き起こすことが知られている。
【０００３】
このような問題に対して、高温環境下でも適応可能な植物の開発が種々行われている。例えば、イネ細胞を培養して突然変異を生じさせ、イネの品質を改良する方法（例えば、非特許文献１及び２参照）、熱ショックタンパク質ｓＨＳ１７．７遺伝子をイネ科植物細胞中に導入して恒常的に高発現させることによって、イネ科植物の環境ストレス、例えば、高温耐性、紫外線耐性、乾燥耐性などの複合環境ストレス下でも栽培可能な植物を得る方法（特許文献１参照）、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を抑制し不飽和脂肪酸含量を低下させることによって、タバコ等の植物に高温耐性が付与された植物を得る方法（特許文献２参照）、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）大サブユニットにアミノ酸変異を導入することによって、高温ストレス条件下で生育させると収量の増加をもたらすトウモロコシなどの植物を得る方法（特許文献３参照）などが提案されている。
【０００４】
しかし、作物においては、高温環境下で単に生育できるだけでは十分でなく、作物の収量面や品質においても通常栽培環境下と同程度であることが要求される。特に、果実を可食部とする作物では、登熟発生過程で高温に晒されると品質が低下し、商品価値が著しく低下する。例えば、イネ科植物の場合、高温環境下で栽培した場合であっても、胚乳の白濁化が生じないことが、高温耐性の特性として必要である。
【０００５】
したがって、高温環境下で栽培した場合であっても胚乳の白濁等の高温障害が抑制できるなどの高温耐性に優れ、品質上実用性が高い植物体及びその製造方法の提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３４２５２号公報
【特許文献２】国際公開第００／１９８０６号パンフレット
【特許文献３】特開２０１０−８４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｇｅｍｕｎｅ  Ａ．ら，  Ｈｏｋｕｒｉｋｕ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．，  ２００３，  ３８，  ５０−５２
【非特許文献２】Ｔａｔｅｙａｍａ  Ｍ．ら，  Ｔｏｈｏｋｕ  Ａｇｒｉｃ．  Ｒｅｓ．，  １９９８，  ５１，  ７−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、高温環境下で栽培した場合であっても胚乳の白濁等の高温障害が抑制できるなどの高温耐性に優れ、品質上実用性が高い形質転換植物体及びその製造方法、前記形質転換植物体の製造方法に用いることが可能なＲＮＡ又はＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを有するベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、植物体におけるα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することで、高温環境下における前記植物体の胚乳の白濁化を抑制できること、前記α−アミラーゼ遺伝子発現抑制がＲＮＡにより行われることを知見し、本発明の完成に至った。α−アミラーゼのようなデンプン分解酵素の遺伝子の発現を抑制することにより植物体の高温障害を大幅に低減できることは、これまでに全く報告がなく、本発明者らの新たな知見である。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  植物体のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することを特徴とするＲＮＡである。
＜２＞  下記（ｉ）から（ｉｖ）から選択される少なくとも１種である前記＜１＞に記載のＲＮＡである；
（ｉ）α−アミラーゼ遺伝子のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ、
（ｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ、
（ｉｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を共抑制作用により阻害するＲＮＡ、
（ｉｖ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物と相補的なＲＮＡ。
＜３＞  植物体が、イネ科植物である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のＲＮＡである。
＜４＞  α−アミラーゼ遺伝子が、Ａｍｙ１Ａ遺伝子、Ａｍｙ１Ｃ遺伝子、Ａｍｙ２Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ｂ遺伝子、Ａｍｙ３Ｃ遺伝子、Ａｍｙ３Ｄ遺伝子、及びＡｍｙ３Ｅ遺伝子の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のＲＮＡである。
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＲＮＡをコードすることを特徴とするＤＮＡである。
＜６＞  配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表される塩基配列の少なくともいずれかを有する前記＜５＞に記載のＤＮＡである。
＜７＞  前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載のＤＮＡを有することを特徴とするベクターである。
＜８＞  前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載のＤＮＡを植物体に導入し形質転換植物体を得るＤＮＡ導入工程を含むことを特徴とする形質転換植物体の製造方法である。
＜９＞  ＤＮＡ導入工程が、植物体をカルス誘導し、前記カルスにＤＮＡを導入することにより行われる前記＜８＞に記載の形質転換植物体の製造方法である。
＜１０＞  ＤＮＡを導入したカルスを増殖させるカルス増殖工程と、増殖させた前記カルスから植物体を再分化させる再分化工程と、を更に含む前記＜９＞に記載の形質転換植物体の製造方法である。
＜１１＞  前記＜８＞から＜１０＞のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法により製造されてなることを特徴とする形質転換植物体である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、高温環境下で栽培した場合であっても胚乳の白濁等の高温障害が抑制できるなどの高温耐性に優れ、品質上実用性が高い形質転換植物体及びその製造方法、前記形質転換植物体の製造方法に用いることが可能なＲＮＡ又はＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを有するベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、各種α−アミラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の遺伝子領域を示す概略模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、各種α−アミラーゼ遺伝子が転写された後のｍＲＮＡ領域を示す概略模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、前記各種α−アミラーゼ遺伝子の保存領域の塩基配列を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、α−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターの作製方法の説明図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、α−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターの概略模式図である。
【図３】図３は、試験例１における各種α−アミラーゼ遺伝子の増幅領域の概略模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例１におけるＡｍｙ１Ａ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例１におけるＡｍｙ１Ｃ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、試験例１におけるＡｍｙ２Ａ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、試験例１におけるＡｍｙ３Ａ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、試験例１におけるＡｍｙ３Ｂ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、試験例１におけるＡｍｙ３Ｃ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図４Ｇ】図４Ｇは、試験例１におけるＡｍｙ３Ｄ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図４Ｈ】図４Ｈは、試験例１におけるＡｍｙ３Ｅ遺伝子の発現量の結果を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例２における正常粒率の結果を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例２における種子の外観を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（ＲＮＡ、ＤＮＡ）
本発明のＲＮＡは、植物体のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡであり、下記（ｉ）から（ｉｖ）から選択される少なくとも１種のＲＮＡであることが好ましい。
（ｉ）α−アミラーゼ遺伝子のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ（以下、「（ｉ）の態様のＲＮＡ」と略記することがある）、
（ｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ（以下、「（ｉｉ）の態様のＲＮＡ」と略記することがある）、
（ｉｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を共抑制作用により阻害するＲＮＡ（以下、「（ｉｉｉ）の態様のＲＮＡ」と略記することがある）、
（ｉｖ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物と相補的なＲＮＡ（以下、「（ｉｖ）の態様のＲＮＡ」と略記することがある）。
また、本発明のＤＮＡは、本発明の前記ＲＮＡをコードするＤＮＡである。
以下に、本発明の前記ＲＮＡの説明と併せて、本発明の前記ＤＮＡについて説明する。
【００１４】
＜植物体＞
前記植物体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、作物が好ましい。
前記作物としては、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ等のイネ科植物；タバコ等のナス科植物などが挙げられる。これらの中でも、イネ科植物が好ましく、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）が特に好ましい。
【００１５】
前記イネの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インディカ種、ジャポニカ種、前記インディカ種と前記ジャポニカ種との交配品種、これらの系統、野生イネ、栽培品種と前記野生イネの交配又は交雑品種などが挙げられる。
前記イネの品種としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、日本晴、コシヒカリ、ひとめぼれ、あきたこまち、きらら３９７、はえぬき、ほしのゆめ、つがるロマン、ななつぼしなどが好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００１６】
＜α−アミラーゼ遺伝子＞
前記ＲＮＡ及び該ＲＮＡによりコードされるＤＮＡが抑制し得るα−アミラーゼ遺伝子としては、植物体の内因性のα−アミラーゼ遺伝子であることが好ましい。即ち、前記ＲＮＡ及び該ＲＮＡによりコードされるＤＮＡは、植物体の内因性のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制できるものであることが好ましい。
なお、本明細書において、「α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制する」とは、前記α−アミラーゼ遺伝子の転写の抑制及びタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、前記α−アミラーゼ遺伝子発現の完全な停止だけでなく、発現の減少も含まれる。
【００１７】
前記α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）は、デンプン分解酵素であり、発芽穀類種子においては、胚盤組織及びアリューロン層からデンプン貯蔵組織である胚乳に分泌され、そしてデンプン顆粒を分解し、発芽及び伸長生長に必要な炭素源並びにエネルギー源を供給するという働きを有することが知られている（Ｆｉｎｃｈｅｒ，  Ｇ．Ｂ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９８９，  ４０，  ３０５−３４６及びＭｉｔｓｕｉ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｉｔｏｈ，  Ｋ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．，  １９９７，  ２，  ２５５−２６１．参照）。また、緑葉や登熟種子等の生細胞でも発現が見られ、葉緑体やアミロプラストにおける澱粉分解にも関与していることが見出されている（Ａｓａｔｓｕｍａ，Ｓ．ら，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２００５，  ４６，  ８５８−８６９、Ａｓａｔｓｕｍａ，Ｓ．ら，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，  ２００６，  ５３，１８７−１９２、Ｋｉｔａｊｉｍａ，Ａ．ら，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ２００９，  ２１，２８４４−２８５８、Ｙａｍａｋａｗａ，Ｈ．ら，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２００７，  １４４，  ２５８−２７７など参照）。
【００１８】
前記α−アミラーゼ遺伝子は、α−Ａｍｙ１遺伝子群、α−Ａｍｙ２遺伝子群、α−Ａｍｙ３遺伝子群に分類される。これらの遺伝子群は、複数の遺伝子を含んでいる。
前記α−Ａｍｙ１遺伝子群には、Ａｍｙ１Ａ遺伝子（別名：Ｏｓ０２ｇ０７６５６００）、Ａｍｙ１Ｂ遺伝子（別名：Ｏｓ０１ｇ０３５７４００）、Ａｍｙ１Ｃ遺伝子（別名：Ｏｓ０２ｇ０７６５３００）が存在する。
前記α−Ａｍｙ２遺伝子群には、Ａｍｙ２Ａ遺伝子（別名：Ｏｓ０６ｇ０７１３８００）が存在する。
前記α−Ａｍｙ３遺伝子群には、Ａｍｙ３Ａ遺伝子（別名：Ｏｓ０９ｇ０４５７４００）、Ａｍｙ３Ｂ遺伝子（別名：Ｏｓ０９ｇ０４５７６００）、Ａｍｙ３Ｃ遺伝子（別名：Ｏｓ０９ｇ０４５７８００）、Ａｍｙ３Ｄ遺伝子（別名：Ｏｓ０８ｇ０４７３９００）、Ａｍｙ３Ｅ遺伝子（別名：Ｏｓ０８ｇ０４７３６００）が存在する。
これらの遺伝子情報は、“Ｔｈｅ  Ｒｉｃｅ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲＡＰ−ＤＢ）”〔ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂｌｅｇａｃｙ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〕、“Ｏｒｙｚａｂａｓｅ”〔ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｇｅｎ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｒｉｃｅ／ｏｒｙｚａｂａｓｅ／ｔｏｐ／ｔｏｐ．ｊｓｐ〕などに掲載されている。
【００１９】
本発明の前記ＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡは、前記各種α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができるが、Ａｍｙ１Ａ遺伝子、Ａｍｙ１Ｃ遺伝子、Ａｍｙ２Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ｂ遺伝子、Ａｍｙ３Ｃ遺伝子、Ａｍｙ３Ｄ遺伝子、Ａｍｙ３Ｅ遺伝子などの発現を好適に抑制できる。これらの中でも、前記ＲＮＡ又は該ＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ａｍｙ１Ａ遺伝子、Ａｍｙ１Ｃ遺伝子、Ａｍｙ３Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ｂ遺伝子、Ａｍｙ３Ｄ遺伝子などの発現を特に好適に抑制でき、その遺伝子発現率は２０％未満である。
【００２０】
図１Ａは、前記各種α−アミラーゼ遺伝子（ＤＮＡ）の遺伝子領域（黒色又は灰色の四角形で示す箇所）を示す概略模式図であり、図１Ｂは、前記各種α−アミラーゼ遺伝子が転写された後のｍＲＮＡ領域（黒色又は灰色の四角形で示す箇所）を示す概略模式図であり、図１Ｃは、前記各種α−アミラーゼ遺伝子の保存領域（黒地に白字で示す箇所）の塩基配列を示す図である。
図１Ａ〜Ｃより、前記各種α−アミラーゼ遺伝子は、遺伝子間で保存されていることがわかる。
【００２１】
＜（ｉ）α−アミラーゼ遺伝子のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡ干渉作用を有するＲＮＡ又は前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ＞
前記ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）とは、標的遺伝子（α−アミラーゼ遺伝子）の塩基配列の少なくとも一部と同一若しくは類似した塩基配列を有する１本鎖ＲＮＡ又は２本鎖ＲＮＡ、好ましくは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子及び標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象をいう。
【００２２】
例えば、細胞に約４０塩基対〜数百塩基対のｄｓＲＮＡが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、ｄｓＲＮＡを３’末端から約２１塩基〜２３塩基対ずつ切り出し、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）を生じる。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部で標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）を切断する。また、この経路とは別にｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｓＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成される。このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となって、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅する経路もある。
【００２３】
前記（ｉ）の態様のＲＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と同一若しくは類似した（相同性を有する）塩基配列を有するｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ｓｉＲＮＡは、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる２重鎖ＲＮＡであることが好ましい。
【００２４】
前記（ｉ）の態様のＲＮＡと前記内因性のα−アミラーゼ遺伝子の転写産物との相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、１００％が特に好ましい。
【００２５】
前記塩基配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １９９０，  ２１５，  ４０３−４１０）を利用して決定することができる。前記プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９０，  ８７，  ２２６４−２２６８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９３，  ９０，  ５８７３−５８７７など参照）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合、パラメーターとしては、例えば、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２などが挙げられる。この解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２６】
前記（ｉ）の態様のＲＮＡの長さとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５ｂｐ〜４９ｂｐが好ましく、１５ｂｐ〜３５ｂｐがより好ましく、２１ｂｐ〜３０ｂｐが特に好ましい。また、前記（ｉ）の態様のＲＮＡは、発現されるｓｉＲＮＡが更に転写され、最終的な２重鎖ＲＮＡの長さが前記好ましい長さを満たすものであってもよい。
【００２７】
前記ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した２重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。また、前記ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する２重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジ及びミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００２８】
前記（ｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と同一若しくは類似した配列を有するｄｓＲＮＡを発現し得るＤＮＡであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
前記（ｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡと前記内因性のα−アミラーゼ遺伝子との相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、１００％が特に好ましい。前記相同性は、前記（ｉ）の態様のＲＮＡで説明した方法と同様の方法で確認することができる。
【００３０】
前記（ｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡの長さとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５ｂｐ〜４９ｂｐが好ましく、１５ｂｐ〜３５ｂｐがより好ましく、２１ｂｐ〜３０ｂｐが特に好ましい。
【００３１】
＜（ｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡ又は前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ＞
リボザイムとは、触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。前記リボザイムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グループＩイントロン型（制限酵素をコードする領域を有する自己スプライシング型）、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮａｓｅＰ）に含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのもの、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものなどが挙げられる。これらの中でも、前記（ｉｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、ＲＮＡの部位特異的な切断を行うリボザイム活性を有するものが好ましい。
したがって、前記（ｉｉ）の態様のＲＮＡとしては、前記リボザイム活性を有するＲＮＡ分子を意味する。
【００３２】
前記ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’末端側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡ又はＵでも切断されることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９８８，  ２２８，  ２２５）。リボザイムの基質結合部を標的配列近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、前記α−アミラーゼ遺伝子の転写産物（ＲＮＡ）中のＵＣ、ＵＵ、又はＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｋｏｉｚｕｍｉら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２３９，  １９８８，  ２８５、小泉誠及び大塚栄子，  蛋白質核酸酵素，  １９９０，  ３５，  ２１９１、Ｋｏｉｚｕｍｉら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  １９８９，  １７，  ７０５９など参照）。
【００３３】
前記ヘアピン型リボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９８６，  ３２３，  ３４９）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ及びＳａｓａｋｉ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９２，  １９，  ６７５１、菊池洋，  化学と生物，  １９９２，  ３０，  １１２など参照）。
【００３４】
また、前記（ｉｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡを発現し得るＤＮＡであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
前記（ｉｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター等のプロモーター及び転写終結配列に連結されることが好ましい。しかし、その際、転写されたＲＮＡの５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’末端側や３’末端側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である。
【００３６】
また、前記プロモーター、前記（ｉｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び前記転写終結配列からなる構成単位をタンデムに並べ、前記α−アミラーゼの転写産物内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めてもよい。
【００３７】
前記（ｉｉ）の態様のＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡの長さとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記（ｉ）の態様のＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡの長さと同程度であることが好ましい。
【００３８】
＜（ｉｉｉ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を共抑制作用により阻害するＲＮＡ又は前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ＞
前記共抑制作用とは、植物に、標的遺伝子の塩基配列の少なくとも一部と同一若しくは類似した塩基配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入した外来遺伝子及び内在性標的遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は、明らかではないが、植物においてはしばしば観察される（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，  ７，  Ｒ７９３及びＣｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ６，８１０参照）。
なお、ここで「導入した外来遺伝子及び内在性標的遺伝子の両方の発現が抑制される」とは、外来性及び内在性の前記α−アミラーゼ遺伝子の転写の抑制及びタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、外来性及び内在性の前記α−アミラーゼ遺伝子発現の完全な停止だけでなく、発現の減少も含まれる。
【００３９】
したがって、前記（ｉｉｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の転写産物を共抑制作用により阻害するＲＮＡを発現し得るＤＮＡであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
前記（ｉｉｉ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡと前記内因性のα−アミラーゼ遺伝子との相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、１００％が特に好ましい。前記相同性は、前記（ｉ）の態様のＲＮＡで説明した方法と同様の方法で確認することができる。
【００４１】
また、前記（ｉｉｉ）の態様のＲＮＡとしては、導入した前記α−アミラーゼ遺伝子（外来遺伝子）及び内在性の前記α−アミラーゼ遺伝子の両方の発現を抑制できるＲＮＡであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
前記（ｉｉｉ）の態様のＲＮＡと前記内因性のα−アミラーゼ遺伝子の転写産物との相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、１００％が特に好ましい。前記相同性は、前記（ｉ）の態様のＲＮＡで説明した方法と同様の方法で確認することができる。
【００４３】
前記（ｉｉｉ）の態様のＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡの長さとしては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記（ｉ）の態様のＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡの長さと同程度であることが好ましい。
【００４４】
＜（ｉｖ）α−アミラーゼ遺伝子の転写産物と相補的なＲＮＡ又は前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ＞
前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡとしては、例えば、前記α−アミラーゼ遺伝子と相補的なアンチセンスＲＮＡなどが挙げられ、前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡなどが挙げられる。
【００４５】
前記アンチセンスＲＮＡが標的遺伝子（α−アミラーゼ遺伝子）の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、３重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などが挙げられる。これらは、転写、スプライシング、又は翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島及び井上，  「新生化学実験講座２  核酸ＩＶ  遺伝子の複製と発現」，  １９９３，  日本生化学会編，  東京化学同人，  ｐｐ．３１９−３４７参照）。
【００４６】
前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡは、上記のいずれの作用で標的遺伝子（α−アミラーゼ遺伝子）の発現を抑制してもよい。
前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡの塩基配列としては、例えば、前記α−アミラーゼ遺伝子のｍＲＮＡの５’末端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を有するＲＮＡ、コード領域若しくは３’末端側の非翻訳領域に相補的な配列を有するＲＮＡなどが挙げられる。前記α−アミラーゼ遺伝子のｍＲＮＡの５’末端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を有するＲＮＡは、α−アミラーゼ遺伝子の翻訳を阻害できる。
【００４７】
前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡと前記内因性のα−アミラーゼ遺伝子の転写産物との相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、１００％が特に好ましい。前記相同性は、前記（ｉ）の態様のＲＮＡで説明した方法と同様の方法で確認することができる。
【００４８】
したがって、前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡは、前記α−アミラーゼ遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも含まれる。前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結されることが好ましく、更に３’末端側に転写終結シグナルを含む配列が連結されることがより好ましい。
【００４９】
前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡの長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、効果的に前記α−アミラーゼの遺伝子発現を抑制するには、１５ｂｐ以上が好ましく、１００ｂｐ以上がより好ましい。また、その上限値としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５ｋｂｐ未満が好ましく、２．５ｋｂｐ未満がより好ましい。
【００５０】
前記（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡと前記内因性のα−アミラーゼ遺伝子との相同性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、１００％が特に好ましい。前記相同性は、前記（ｉ）の態様のＲＮＡで説明した方法と同様の方法で確認することができる。
【００５１】
前記（ｉ）〜（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡの特に好ましい態様としては、各種α−アミラーゼ遺伝子の中で相同性の高い、配列番号１で表される塩基配列及び配列番号２で表される塩基配列の少なくともいずれかである。なお、前記配列番号２で表される塩基配列は、前記配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列である。
また、前記（ｉ）〜（ｉｖ）の態様のＲＮＡの特に好ましい態様としては、前記配列番号１で表される塩基配列の転写産物及び前記配列番号２で表される塩基配列の転写産物の少なくともいずれかである。
前記「相補的な塩基配列」とは、ＡとＴ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、ＧとＣの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を意味する。
【００５２】
前記配列番号１で表される塩基配列又は前記配列番号２で表される塩基配列は、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができれば、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたものであってもよい。
また、前記配列番号２で表される塩基配列は、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができれば、前記配列番号１で表される塩基配列に完全に相補的な塩基配列だけでなく、１若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたものであってもよい。
【００５３】
前記ＤＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができれば、前記配列番号１で表される塩基配列及び前記配列番号２で表される塩基配列に相同的な配列であってもよい。また、前記ＲＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができれば、前記配列番号１で表される塩基配列の転写産物及び前記配列番号２で表される塩基配列の転写産物に相同的な配列であってもよい。
【００５４】
前記「相同的な配列」とは、α−アミラーゼ活性を有しているものの、塩基配列が異なるものをいい、その相同性としては、５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上が更に好ましく、９０％以上が特に好ましい。前記相同性は、前記（ｉ）の態様のＲＮＡで説明した方法と同様の方法で確認することができる。
【００５５】
また、前記ＤＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができれば、前記配列番号１で表される塩基配列や前記配列番号２で表される塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダーゼーリョン可能な塩基配列であってもよく、このような塩基配列は、前記配列番号１で表される塩基配列や前記配列番号２で表される塩基配列と、前記ハイブリダーゼーリョン可能な塩基配列との融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる（Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  １９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ参照）。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ（ＮａＣｌ，ｔｒｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）、０．１質量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３７℃」程度の条件を挙げることができる。前記条件で洗浄しても、前記配列番号１で表される塩基配列や前記配列番号２で表される塩基配列と、該配列番号１で表される塩基配列や該配列番号２で表される塩基配列とハイブリダーゼーリョン可能な塩基配列とがハイブリダイズ状態を維持するものをいう。
【００５６】
＜＜ＤＮＡの製造方法＞＞
前記（ｉ）〜（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記植物体より抽出した全ＲＮＡに基づき公知の方法でｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型として、前記α−アミラーゼ遺伝子の遺伝情報に基づき設計したプライマーを用いてＰＣＲ法により製造する方法、化学合成する方法などが挙げられる。前記化学合成は、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機などを用いて行うことができる。
【００５７】
前記ＤＮＡを製造する際に使用する植物体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現量が高い点で、登熟期に高温処理（昼温３１℃、夜温２６℃程度）を施しながら栽培したものであることが好ましい。
前記ＰＣＲ法により増幅させる領域としては、前記α−アミラーゼ遺伝子の全領域であってもよく、その一部の領域であってもよいが、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現抑制効率の点で、前記α−アミラーゼ遺伝子の一部の領域であることが好ましい。
【００５８】
前記プライマーは、前記例示したいずれの遺伝子群のα−アミラーゼ遺伝子を増幅させるように設計されてもよいが、Ａｍｙ１Ａ遺伝子の全部又は一部、好ましくは一部を増幅させるように設計されることが好ましい。前記プライマーは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機などを用いて合成することができる。
【００５９】
前記Ａｍｙ１Ａ遺伝子の一部を増幅させるプライマーの具体例としては、下記配列番号３で表されるプライマー（Ａｍｙ１Ａ−Ｆ）と下記配列番号４で表されるプライマー（Ａｍｙ１Ａ−Ｒ）とのプライマーセットなどが挙げられる。
Ａｍｙ１Ａ−Ｆ：ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＴＣＧＡＣ（配列番号３）
Ａｍｙ１Ａ−Ｒ：ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＣＧＴＡＧＡＡＧ  （配列番号４）
【００６０】
＜＜ＲＮＡの製造方法＞＞
前記（ｉ）〜（ｉｖ）の態様のＲＮＡの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記（ｉ）〜（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡを所望の条件で転写させる方法、化学合成する方法、前記植物体から抽出した全ＲＮＡをＲＮＡａｓｅ等のＲＮＡ分解酵素により所望の大きさに切断する方法などが挙げられる。
【００６１】
＜用途＞
本発明のＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡは、植物体のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制するものであるが、該植物体の登熟期に高温環境下で栽培された場合に生じる胚乳の白濁化の抑制にも好適に利用される。即ち、高温環境下で登熟させる植物体の胚乳の白濁化を抑制するＲＮＡ及び該ＲＮＡをコードするＤＮＡも本発明の範囲に含まれる。
したがって、後述する本発明のベクター、形質転換植物体及びその製造方法に好適に利用される。
【００６２】
（ベクター）
本発明のベクターは、本発明の前記ＤＮＡを有し、更に必要に応じて、その他の塩基配列を有する。
【００６３】
＜ＤＮＡ＞
前記ベクターは、植物体のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制する本発明の前記ＲＮＡをコードするＤＮＡを有していればよく、前記（ｉ）〜（ｉｖ）の態様のＲＮＡをコードするＤＮＡの少なくともいずれかを有していることが好ましい。
前記ｓｉＲＮＡの発現システムをベクターに保持させる場合、同一のベクターから前記α−アミラーゼ遺伝子の少なくとも一部の配列を有するセンスＲＮＡ及び／又はアンチセンスＲＮＡを発現させる態様であってもよく、異なるベクターからそれぞれ前記センスＲＮＡ及び／又は前記アンチセンスＲＮＡを発現させる態様であってもよい。
センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを、同一又は異なるベクターから同時に発現させることで、ｄｓＲＮＡを好適に発現させることができる。
【００６４】
前記同一のベクターから前記センスＲＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡを発現させる態様としては、前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの両方を有するベクターであることが好ましい。
この場合、前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの上流に、それぞれｐｏｌＩＩＩ系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたセンスＲＮＡ発現カセット及びアンチセンスＲＮＡ発現カセットをそれぞれ構築し、これらのカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに導入することが好ましい。
【００６５】
また、異なる鎖上に対向するように、前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡと前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡとを逆向きに配置した発現システムを構築することもできる。この構造では、前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖と前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖とが対となった一つの２本鎖ＤＮＡ（ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ）が設けられ、その両側にそれぞれの鎖からセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを発現し得るようにプロモーターを対向して構築されることが好ましい。
この場合には、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖及び前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ鎖）の３’末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ａ（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、２つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。
【００６６】
前記異なるベクターからそれぞれ前記センスＲＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡを発現させる態様としては、例えば、前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡを有するベクターと、前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを有するベクターとを用いることが好ましい。
前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡを有するベクターは、前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡの上流にｐｏｌＩＩＩ系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたセンスＲＮＡ発現カセットを構築し、このカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに導入することが好ましい。
前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを有するベクターは、前記アンチンスＲＮＡをコードするＤＮＡの上流にｐｏｌＩＩＩ系のような短いＲＮＡを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスＲＮＡ発現カセットを構築し、このカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに導入することが好ましい。
【００６７】
前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列番号１で表される塩基配列を有することが好ましく、前記配列番号１で表される塩基配列からなることがより好ましい。
また、前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列番号２で表される塩基配列を有することが好ましく、前記配列番号２で表される塩基配列からなることがより好ましい。
【００６８】
これらの中でも、前記ベクターは、同一のベクターから前記センスＲＮＡ及び前記アンチセンスＲＮＡを発現させる態様が好ましく、前記センスＲＮＡをコードするＤＮＡとして配列番号１で表される塩基配列を、前記アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡとして配列番号２で表される塩基配列を有するベクターが特に好ましい。
【００６９】
＜その他の塩基配列＞
前記その他の塩基配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、複製開始点（オリジン：ｏｒｉ）、プロモーター配列、マーカー遺伝子配列、ターミネーター配列、シグナル配列、所望の植物体中で前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制するＤＮＡの発現促進に寄与する配列などが挙げられる。
【００７０】
前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平２−７９９８３号公報）、登熟期の種子に特異的に発現する種子貯蔵タンパク質プロモーター（Ｋｕｒｏｄａら，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２０１０，  ７４，  ２３４８−２３５１参照）などが挙げられる。
前記ベクターがプロモーター配列を有すると、前記植物体に導入した後、前記α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制するＲＮＡが該植物体内で効率よく発現できる点で有利である。
【００７１】
前記マーカー遺伝子配列としては、例えば、薬剤耐性遺伝子からなる配列、レポーター遺伝子からなる配列などが挙げられる。
前記薬剤耐性遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシン又はゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
前記レポーター遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子などが挙げられる。
前記ベクターがマーカー遺伝子配列を有すると、前記植物体に導入した後、形質転換した植物体を効率よく選別できる点で有利である。
【００７２】
これらの中でも、前記ベクターは、発現プロモーターと、該発現プロモーターの下流に本発明の前記ＲＮＡをコードするＤＮＡとが配置され、更に該ＤＮＡの下流にターミネーター配列が配置されることが好ましい。
【００７３】
＜ベクターの種類＞
前記ＤＮＡを導入するベクターの種類としては、該ベクターを導入する宿主の種類、使用目的等に応じて適宜選択することができ、例えば、クローニングベクター、発現ベクターなどが挙げられる。これらの中でも、前記宿主内で前記α−アミラーゼ遺伝子の発現抑制作用を奏するためには、発現ベクターが好ましく、バイナリーベクターが特に好ましい。
【００７４】
前記クローニングベクターとしては、例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
【００７５】
前記発現ベクターとしては、例えば、ｐＭＨ１、ｐＭＨ２等の植物由来の発現ベクター；ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １９９０，  １８（１７），  ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８等の哺乳動物由来の発現ベクター；商品名「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８等の昆虫細胞由来の発現ベクター；ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ等の動物ウィルス由来の発現ベクター；ｐＺＩＰｎｅｏ等のレトロウィルス由来の発現ベクター；商品名「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロジェン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１等の酵母由来の発現ベクター；ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０等の枯草菌由来の発現ベクターなどが挙げられる。
【００７６】
前記バイナリーベクターとしては、例えば、ｐＺＨ２Ｂｉｋベクター（Ｋｕｒｏｄａ  Ｍら，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，  ７４（１１），  ２３４８−２３５１）などが挙げられる。
【００７７】
＜＜ベクターの製造方法＞＞
前記ベクターを製造する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記所望のベクターと、前記導入するＤＮＡとを、それぞれライゲーション可能な制限酵素で消化し、これらをライゲーションする方法などが挙げられる。
【００７８】
＜用途＞
本発明のベクターは、本発明の前記ＤＮＡを有するため、植物体のα−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制することに利用でき、また該植物体の登熟期に高温環境下で栽培された場合に生じる胚乳の白濁化の抑制にも好適に利用される。
したがって、後述する本発明の形質転換植物体及びその製造方法に好適に利用される。
【００７９】
（形質転換植物体及びその製造方法）
本発明の形質転換植物体の製造方法は、ＤＮＡ導入工程を少なくとも含み、更にカルス増殖工程と、再分化工程とを含むことが好ましく、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
本発明の形質転換植物体は、本発明の前記形質転換植物体の製造方法により製造されてなる。
以下、本発明の形質転換植物体の製造方法の説明と併せて、本発明の前記形質転換植物体について説明する。
【００８０】
＜ＤＮＡ導入工程＞
前記ＤＮＡ導入工程は、本発明の前記ＤＮＡを植物体に導入し形質転換植物体を得る工程である。
【００８１】
＜＜植物体＞＞
前記植物体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、作物が好ましい。
前記作物としては、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ等のイネ科植物；タバコ等のナス科植物などが挙げられる。これらの中でも、イネ科植物が好ましく、イネが特に好ましい。
【００８２】
前記イネの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インディカ種、ジャポニカ種、前記インディカ種と前記ジャポニカ種との交配品種、これらの系統、野生イネ、栽培品種と前記野生イネの交配又は交雑品種などが挙げられる。
前記イネの品種としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、日本晴、コシヒカリ、ひとめぼれ、あきたこまち、きらら３９７、はえぬき、ほしのゆめ、つがるロマン、ななつぼしなどが好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００８３】
前記植物体は、例えば、ＪＡ等の市販品を用いてもよく、独立行政法人農業生物資源研究所ゲノムリソースセンター等から入手してもよい。また、これらの植物体は、前記入手したものを更に育成して得られた次世代移行のものであってもよい。
【００８４】
前記形質転換植物体の製造方法に用いられる植物体の部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葉、根、茎、花、種子、カルス、これらに由来する細胞などが挙げられる。前記細胞は、懸濁培養細胞であってもよい。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞、カルスが好ましく、カルスが特に好ましい。
【００８５】
−カルス−
以下にカルスを誘導する方法について、前記植物体がイネの場合を一例として説明する。前記イネからカルスを誘導する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イネ種子（玄米）を培地上でカルス培養する方法などが挙げられ、具体的には、殺菌したイネ種子（玄米）をカルス誘導培地（固体培地）に置床して暗所で培養してカルス誘導を行う方法などが挙げられ、“Ｄａｉｇｅｎ  Ｍ．ら，  Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．，  ２０００，  ５０，  １９７−２０２”及び“Ｏｇａｗａ  Ｔ．ら，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，  １９９９，  １８，  ５７６−５８１”等の文献を参照して培養することができる。
【００８６】
前記カルス誘導する際の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、α−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物体の育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、２５℃〜３０℃が好ましい。
【００８７】
前記カルス誘導する際の光量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、α−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物体の育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、１５，０００ルクス〜３０，０００ルクスが好ましい。
【００８８】
前記カルス誘導する際の培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ６Ｄ培地（Ｔｏｋｉ，Ｓ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．，  １９９７，  １５，  １６−２１参照）、ＫＳＰ培地（津川ら，  育種学雑誌，  １９９３，  ４３巻（別２），  １２１参照）、ＤＫＮ培地（Ｄａｉｇｅｎ，Ｍ．ら，  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉ．，  ２０００，  ５０，  １９７−２０２参照）などが挙げられる。
【００８９】
前記カルス誘導する際の培地のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、α−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物体の育種に好適な点で、ｐＨ５〜ｐＨ６が好ましい。
【００９０】
前記カルス誘導する際の前記培地に対するイネ種子の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、α−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物体の育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、固体培地プレート１枚（直径９０ｍｍ×２０ｍｍ）あたり、１５個〜２０個が好ましい。
【００９１】
前記カルス誘導する際の培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、α−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物体の育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、５日間〜１０日間が好ましい。
【００９２】
前記カルス誘導に用いられる培養装置としては、培養温度及び光量を調節することができる装置であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グロースチャンバー（ＭＬＲ−３５０Ｔ、ＳＡＮＹＯ社製）などが挙げられ、培養容器としては、固体培地を形成することができる培養容器であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シャーレ、三角フラスコなどが挙げられる。
【００９３】
＜＜ベクターの導入＞＞
前記植物体への前記ＤＮＡの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記ＤＮＡを直接導入してもよいが、本発明の前記ベクターを用いて行われることが好ましい。
【００９４】
前記導入方法としては、例えば、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法、電気パルス法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などが挙げられる。これらの中でも、アグロバクテリウム法が好ましい。
前記アグロバクテリウム法は、例えば、Ｈｏｏｄら，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８６，  １６８，  １２９１−１３０１に記載の方法などを参照できる。
【００９５】
前記アグロバクテリウムの系統としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＨＡ１０１系統（カナマイシン耐性遺伝子を有する系統）、ＥＨＡ１０５系統（ＥＨＡ１０１からカナマイシン耐性遺伝子を除いた系統）などが挙げられる。
【００９６】
＜カルス増殖工程＞
前記カルス増殖工程は、前記ＤＮＡを導入したカルスを増殖させる工程である。
カルスを増殖させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＤＮＡ導入工程におけるカルス誘導の際の温度、光量、培地、培地のｐＨ、培養装置などと同様の条件で一定期間培養する方法などが挙げられる。
この際、途中で継代培養してもよく、この場合、カルスから芽と根を除去してから継代培養することが好ましい。
前記カルス増殖工程における培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０日間〜６５日間が好ましい。
【００９７】
＜再分化工程＞
前記再分化工程は、前記カルス増殖工程で増殖させた前記カルスから植物体を再分化させる工程である。
前記再分化する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記カルス増殖工程で増殖したカルスを再分化個体形成培地（固体培地）に置床して明所で培養する方法などが挙げられ、“Ｄａｉｇｅｎ  Ｍ．ら，  Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．，  ２０００，  ５０，  １９７−２０２”、“Ｏｇａｗａ  Ｔ．ら，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，  １９９９，  １８，  ５７６−５８１”、“Ｔｏｋｉ  Ｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ，１９９７，  １５，  １６−２１”等の文献を参照して培養することができる。
【００９８】
前記再分化する際の温度、光量、培地のｐＨ、培養装置などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＤＮＡ導入工程におけるカルス誘導の際の温度、光量、培地のｐＨ、培養装置などと同様の条件などが挙げられる。
【００９９】
前記再分化個体形成培地としては、特に制限はなく、ＭＳ培地、ＫＳＰ培地、ＤＫＮ培地等を目的に応じて適宜選択することができる。
【０１００】
前記再分化する際の前記再分化個体形成培地（固体培地）に対する前記カルス添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、α−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物体の育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、固体培地プレート１枚（直径９０ｍｍ×２０ｍｍ）あたり、９個〜１６個が好ましい。
【０１０１】
前記再分化する際の培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、α−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制された形質転換植物体の育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、３０日間〜５０日間が好ましい。
【０１０２】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、除菌工程、選抜工程、順化工程、鉢上げ工程などが挙げられる。
【０１０３】
−除菌工程−
前記除菌工程は、前記ＤＮＡ導入工程でアグロバクテリウムが使用された場合に該アグロバクテリウムを除菌する工程であり、前記再分化工程の前に行われることが好ましい。
前記除菌の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カルベニシリンを含有する培地を用いて、カルスからアグロバクテリウムを洗い流す方法などが挙げられる。
前記除菌は、少なくとも１回行われることが好ましく、２回以上行われることがより好ましい。
【０１０４】
−選抜工程−
前記選抜工程は、前記ＤＮＡ導入工程でＤＮＡが導入され、形質転換されたカルスを選抜する工程であり、前記再分化工程の前に行われることが好ましい。
【０１０５】
前記選抜の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記カルスに導入したベクターなどが有するマーカー遺伝子に対応するマーカーを指標として選抜する方法などが挙げられる。
前記マーカー遺伝子が前記薬剤耐性遺伝子である場合は、該薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を培地に添加し、該培地上にカルスを置き、生育したカルスを形質転換されたカルスとして選抜する方法などが挙げられる。
前記選抜は、少なくとも１回行われることが好ましく、２回以上行われることがより好ましい。
【０１０６】
前記選抜工程における培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＤＮＡ導入工程におけるカルス誘導の際の温度、光量、培地、培地のｐＨ、培養期間、培養装置などと同様の条件で一定期間培養する方法などが挙げられる。
【０１０７】
−順化工程−
前記順化工程は、前記再分化工程後の植物体を順化培養する工程である。これにより好適に形質転換植物体を育成することができる。
前記順化工程おける培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記形質転換植物体の栽培に好適な条件などが挙げられる。
【０１０８】
−鉢上げ工程−
前記鉢上げ工程は、再分化した形質転換カルスを、発根培地上に移して、根の発育を確認し、鉢上げする工程である。前記鉢上げは、前記再分化工程の後に行われる。
前記発根させたカルスを育成することにより、形質転換植物体を得ることができる。
【０１０９】
＜形質転換植物体＞
このようにして製造された形質転換植物体は、前記ＤＮＡが導入された世代のものであってもよく、更に世代促進させたものであってもよいが、世代促進させたものが、前記ＤＮＡが前記形質転換植物体（植物体）のゲノム中に固定され、安定に本発明の前記ＲＮＡを発現できる点で好ましい。
【０１１０】
本発明の形質転換植物体は、内在性、若しくは、内在性及び外来性のα−アミラーゼ遺伝子発現が抑制されたものであり、前記植物体の胚乳は、高温条件で登熟されたものであっても白濁化が発生しない点で有利である。
前記高温条件としては、例えば、登熟期平均気温２８℃以上３５℃以下などが挙げられる。
【０１１１】
前記形質転換植物体における前記ＤＮＡ（導入された外来性ＤＮＡ）の存在を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知のＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、前記形質転換植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析する方法などが挙げられる。
【０１１２】
前記形質転換植物体において、内在性、若しくは、内在性及び外来性のα−アミラーゼ遺伝子の発現が抑制されていることは、前記形質転換植物体の全ＲＮＡを抽出し、これに基づきＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを鋳型としてα−アミラーゼ遺伝子を所望のプライマーを用いて増幅させる定量ＰＣＲを行うことで確認することができる。
【０１１３】
また、前記胚乳の白濁化の判定は、目視あるいは穀粒判別器（例えば、Ｖｉｒｇｏ  ＥＳ−１０００、静岡精機株式会社製）を用いて行うことができる。例えば、イネの場合は、穂から複数粒の種子（玄米）を採取して白濁化を判定し、玄米の正常粒率を次式より算出することができる。下記正常粒率は、その値が高いほど、高品質の種子（白濁化していない種子）であることを示す。
なお、前記穂は、複数個体から採取することが、信頼度の高い正常粒率を算出できる点で好ましい。この場合、１個体毎に正常粒率を算出した後、全個体の正常粒率平均値を算出することが好ましい。
正常粒率（％）＝（全種子数−白濁化した粒数）／全種子数×１００
【０１１４】
前記正常粒率としては、３０％以上が好ましく、４０％以上がより好ましく、５５％以上が特に好ましい。換言すれば、高温でも良好に生育可能な高温耐熱性イネである。前記高温耐熱性イネの性質としては、通常知られているイネと同様、日本では、花期が７〜８月、結実期は９月〜１０月であり、花の大きさが６ｍｍ程度、丈が５０ｃｍ〜９０ｃｍ程度である。
【０１１５】
前記高温耐熱性イネの生育期は、通常知られているイネの生育期と同様、栄養生長期（発芽から穂の基となるもの（穂の原基）ができるまでの期間）、生殖生長期（穂の原基ができてから出穂乃至開花までの期間）、登熟期（出穂乃至開花から成熟までの期間）に分類される。高温登熟性能を有さないイネでは、前記登熟期にイネを高温にさらすと、籾（イネの果実）のデンプン合成能力等が低下することが報告されている。これは、デンプン合成系酵素の発現が高温によって低下し、デンプン分解酵素（α−アミラーゼ）の活性が高温によって上昇するためである。一方、本発明の形質転換植物体は、登熟期に高温にさらされても、デンプン合成能力が低下せず、前記デンプンの分解酵素の活性が抑制される性質を有する。
【０１１６】
前記形質転換植物体は、本発明の前記ＲＮＡをコードするＤＮＡが導入されているため、前記形質転換植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができる。また、前記形質転換植物体やその子孫あるいはそのクローンから、繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に前記形質転換植物体を量産することもできる。
これらの、本発明の前記ＲＮＡをコードするＤＮＡが導入された植物細胞、該植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫又はクローン等の繁殖材料も、本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１７】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【０１１８】
（実施例１）
＜α−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターの作製＞
−ＰＣＲ法によるＡｍｙ１Ａ遺伝子の増幅−
ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＫ１０１７４４、農業生物資源研究所イネゲノムリソースセンターより入手）を鋳型とし、配列番号３で表されるプライマー（Ａｍｙ１Ａ−Ｆ）及び配列番号４で表されるプライマー（Ａｍｙ１Ａ−Ｒ）（以下、「Ａｍｙ１Ａプライマーセット１」と称することがある）と、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、タカラバイオ株式会社製）とを用いてＰＣＲを行い、配列番号５で表されるＡｍｙ１Ａ遺伝子（Ｏｓ０２ｇ０７６５６００）のＤＮＡ断片を増幅した。前記ＰＣＲの条件は、９４℃１分間を１サイクル、９８℃１０秒間及び６８℃１分間を３３サイクル行った。
なお、前記配列番号５で表されるＡｍｙ１Ａ遺伝子のＤＮＡ断片は、配列番号１で表されるＡｍｙ１Ａ遺伝子のＤＮＡ断片（１２９ｂｐ）の５’末端にＳａｃＩ及びＸｂａＩ制限酵素サイトをこの順で有し、３’末端にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを有するものである。
［Ａｍｙ１Ａプライマーセット１］
Ａｍｙ１Ａ−Ｆ：ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＴＣＧＡＣ  （配列番号３）
Ａｍｙ１Ａ−Ｒ：ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＴＣＧＴＡＧＡＡＧ  （配列番号４）
なお、前記配列番号３において、下線で示す箇所は、ＳａｃＩ制限酵素サイト（ＧＡＧＣＴＣ）及びＸｂａＩ制限酵素サイト（ＴＣＴＡＧＡ）であり、前記配列番号４において、下線で示す箇所は、ＢａｍＨＩ制限酵素サイト（ＧＧＡＴＣＣ）である。
【０１１９】
−ｐＺＨ２ＢｉｋベクターへのＡｍｙ１Ａ遺伝子の導入−
以下に示す方法で、ｐＺＨ２Ｂｉｋベクターにおけるイネアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子のイントロンを挟んだ２箇所に、Ａｍｙ１Ａ遺伝子のセンス配列及びアンチセンス配列を導入することにより、α−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターを作製した。
図２Ａに、α−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターの作製方法の説明図を、図２Ｂに、α−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターの概略模式図を示す。なお、図２Ａ及びＢにおいて、矢印は、導入したＡｍｙ１Ａ遺伝子を示し、「ＬＢ」及び「ＲＢ」は、Ｔ−ＤＮＡ左右境界領域（約０．７ｋｂｐ）を示し、「Ｐ−ＣＡＭＶ３５Ｓ」は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター領域（約０．８ｋｂｐ）を示し、「ＨＰＨ」は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（約１．０ｋｂｐ）を示し、「ＮｏｓＴ」は、Ｎｏｓターミネーター領域（約０．３ｋｂｐ）を示し、「Ｐ１０Ｐ」は、イネ種子貯蔵タンパク質プロラミンプロモーター領域（約０．９ｋｂｐ）を示し、「ＲＡＰ  Ｉｎｔｒｏｎ」は、イネアスパラギン酸プロテアーゼ（Ｏｒｙｚａｓｉｎ１）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｔｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ３２１６５）のイントロン（約１．０ｋｂｐ）を示し、「Ｐ１０Ｔ」は、イネ種子貯蔵タンパク質プロラミンターミネーター（約０．３ｋｂｐ）を示す。導入したα−アミラーゼ遺伝子以外の領域又は遺伝子は、ｐＺＨ２Ｂｉｋベクターに含まれている領域又は遺伝子である。
【０１２０】
−−ｐＺＨ２ＢｉｋベクターへのＡｍｙ１Ａ遺伝子（センス配列）の導入−−
前記増幅したＡｍｙ１Ａ遺伝子のＤＮＡ断片（配列番号５）は、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（いずれもタカラバイオ株式会社製）で消化した。また、バイナリーベクターであるｐＺＨ２Ｂｉｋベクター（Ｋｕｒｏｄａ  Ｍ．ら，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，  ７４（１１），  ２３４８−２３５１）は、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ（いずれもタカラバイオ株式会社製）で消化した。次いで、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化したＡｍｙ１Ａ遺伝子のＤＮＡ断片と、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩで消化したｐＺＨ２ＢｉｋベクターとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてライゲーションし、ｐＺＨ２Ｂｉｋベクターに、Ａｍｙ１Ａ遺伝子のセンス配列を導入した。
【０１２１】
−−ｐＺＨ２ＢｉｋベクターへのＡｍｙ１Ａ遺伝子（アンチセンス配列）の導入−−
次に、前記Ａｍｙ１Ａ遺伝子のセンス配列を導入したベクターを、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ（いずれもタカラバイオ株式会社製）で更に消化した。一方、前記増幅したＡｍｙ１Ａ遺伝子のＤＮＡ断片（配列番号５）を、別途ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ（いずれもタカラバイオ株式会社製）で消化した。次いで、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化したＡｍｙ１Ａ遺伝子のＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化したＡｍｙ１Ａ遺伝子のセンス配列を有するベクターとをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いてライゲーションし、最初に導入したＡｍｙ１Ａ遺伝子のセンス配列と同一鎖上に、Ａｍｙ１Ａ遺伝子のアンチセンス配列を導入した。
【０１２２】
（実施例２）
＜形質転換カルス及び形質転換植物体の作製＞
−イネのカルス培養−
イネ（品種：日本晴、ＪＡ滋賀より入手）の籾殻を、籾摺り器を用いて除去後、１本の５０ｍＬファルコンチューブに、イネ種子（玄米）２００粒を入れた。このチューブに、７０質量％エタノールを１０ｍＬ入れ、１分間表面を殺菌し、その後滅菌蒸留水で洗浄した。更に、このチューブに１質量％の次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、振盪器を用いて１０分間穏やかに振盪した後、溶液を捨て、この操作を３回繰り返した。次いで、約３０ｍＬの滅菌蒸留水で１０分間振盪して洗浄し、この洗浄を３回繰り返した。洗浄後の玄米を、カルス誘導培地〔Ｎ６Ｄ培地（３０ｇ／Ｌスクロース、０．３ｇ／Ｌカザミノ酸、２．８ｇ／Ｌプロリン、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、４ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）、固体培地〕に埋めた。このとき、玄米の胚は上向きにし、カルス誘導培地から胚が３ｍｍ程度はみ出るように埋めた。また、前記カルス誘導培地を収容した培地プレート（９０ｍｍ×２０ｍｍシャーレ使用）１枚あたり、玄米が２０個となるように埋めた。これを２９℃、明所（２０，０００ルクス）で１週間培養してカルスを誘導させた。この胚盤由来の増殖したカルスを、以下の形質転換に使用した。
【０１２３】
−カルスの形質転換−
国際出願第２００１／００６８４４号パンフレットに記載の方法に従い、アグロバクテリウム法により日本晴カルス（以下、「カルス」と略記することがある）に実施例１で作製したα−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターを導入した。
【０１２４】
具体的には、まず、Ｈｏｏｄら，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８６，  １６８，  １２９１−１３０１に記載の方法に従い、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１系統（Ｈｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９８６，  １６８，  １２９１−１３０１参照）に実施例１で作製したα−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターを導入した。なお、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１系統は、ヘルパープラスミドのｖｉｒ領域が強病原性アグロバクテリウムＡ２８１由来の菌である。バイナリーベクターｐＩＧ１２Ｈｍを有し、レポーター遺伝子となるＧＵＳ遺伝子のほか、選抜マーカー遺伝子となるカナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）及びハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇＲ）を有する。
【０１２５】
次に、前記カルスに、前記形質転換されたアグロバクテリウムＥＨＡ１０１系統を感染させ、２Ｎ６−ＡＳ培地（３０ｇ／Ｌスクロース、１０ｇ／Ｌグルコース、０．３ｇ／Ｌカザミノ酸、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、４ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．２）上で、暗黒下で３日間、２８℃で保温して共存培養した。
【０１２６】
−除菌−
５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するＮ６Ｄ培地（３０ｇ／Ｌスクロース、０．３ｇ／Ｌカザミノ酸、２．８ｇ／Ｌプロリン、２ｍｇ／Ｌ  ２，４−Ｄ、４ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）を用いて、カルスからアグロバクテリウムを洗い流した。
【０１２７】
−選抜−
アグロバクテリウムを洗い流したカルスにおいて、形質転換されたカルス（形質転換かルス）の選抜を、以下の条件で行った。
［第１回目の選抜］
カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）及びハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充した２ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上にカルスを置き、２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
［第２回目の選抜］
カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）及びハイグロマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を補充した２ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含むＮ６Ｄ培地上にカルスを置き、更に２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
【０１２８】
−再分化−
選抜された形質転換カルスを、以下の条件で再分化させた。
［第１回目の再分化］
分化培地〔カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ）及びハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充したＭＳ培地（３０ｇ／Ｌスクロース、３０ｇ／Ｌソルビトール、２ｇ／Ｌカザミノ酸、２ｍｇ／Ｌカイネチン、０．００２ｍｇ／Ｌ  ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、４ｇ／Ｌゲルライト、ｐＨ５．８）〕上に、選抜した形質転換カルスを置き、２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
［第２回目の再分化］
第１回目の再分化において使用したものと同じ再分化培地を使用して、更に２週間、２７℃〜３２℃で保温した。
【０１２９】
−鉢上げ−
再分化した形質転換カルスを、発根培地〔ハイグロマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した、ホルモンを含まないＭＳ培地〕上に移して、根の発育を確認した後に、鉢上げした。これにより、形質転換植物体を得た。次に、この形質転換植物体を、温室で昼温２７℃、夜温２２℃にて栽培し、Ｔ０世代の種子を取得し、更に世代促進により導入したα−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクター由来の遺伝子を固定した。これにより、α−アミラーゼ遺伝子発現を抑制するイネ系統（以下、「ＲＮＡｉ系統」と称することがある）を確立した。
【０１３０】
（比較例１）
実施例２において、カルスの形質転換工程でα−アミラーゼ遺伝子発現抑制用ベクターを使用したことに変えて、ｐＺＨ２Ｂｉｋベクター（Ｋｕｒｏｄａ  Ｍ．ら，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，  ７４（１１），  ２３４８−２３５１）を使用したこと以外は、実施例２と同様の方法で形質転換植物体（以下、「対照系統」と称することがある）を得た。
【０１３１】
（試験例１）
＜ＲＮＡｉ系統の登熟途中種子におけるα−アミラーゼ遺伝子発現＞
ＲＮＡｉ系統（実施例２）と、対照系統（比較例１）のイネを温室で昼温２７℃、夜温２２℃にて栽培し、更に登熟期に高温処理（昼温３１℃、夜温２６℃）を施しながら栽培し、穂出後１２日目の穂を収穫した。
収穫した穂から得た種子（３粒）を用い、実施例１のＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成工程と同様の方法で全ＲＮＡを抽出し、１本鎖のｃＤＮＡを合成した。
【０１３２】
調製したｃＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号６〜２１で表される塩基配列からなるプライマーを有する、Ａｍｙ１Ａプライマーセット２、Ａｍｙ１Ｃプライマーセット、Ａｍｙ２Ａプライマーセット、Ａｍｙ３Ａプライマーセット、Ａｍｙ３Ｂプライマーセット、Ａｍｙ３Ｃプライマーセット、Ａｍｙ３Ｄプライマーセット、及びＡｍｙ３Ｅプライマーセットを用いて、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）により定量ＰＣＲを行い、配列番号２４で表されるＡｍｙ１Ａ遺伝子、配列番号２５で表されるＡｍｙ１Ｃ遺伝子、配列番号２６で表されるＡｍｙ２Ａ遺伝子、配列番号２７で表されるＡｍｙ３Ａ遺伝子、配列番号２８で表されるＡｍｙ３Ｂ遺伝子、配列番号２９で表されるＡｍｙ３Ｃ遺伝子、配列番号３０で表されるＡｍｙ３Ｄ遺伝子、及び配列番号３１で表されるＡｍｙ３Ｅ遺伝子のＤＮＡ断片をそれぞれ増幅し、ＲＮＡｉ系統及び対照系統における、各α−アミラーゼ遺伝子〔Ａｍｙ１Ａ（Ｏｓ０２ｇ０７６５６００）、Ａｍｙ１Ｃ（Ｏｓ０２ｇ０７６５３００）、Ａｍｙ２Ａ（Ｏｓ０６ｇ０７１３８００）、Ａｍｙ３Ａ（Ｏｓ０９ｇ０４５７４００）、Ａｍｙ３Ｂ（Ｏｓ０９ｇ０４５７６００）、Ａｍｙ３Ｃ（Ｏｓ０９ｇ０４５７８００）、Ａｍｙ３Ｄ（Ｏｓ０８ｇ０４７３９００）、及びＡｍｙ３Ｅ（Ｏｓ０８ｇ０４７３６００）〕の発現量を比較した。図３に、下記各種α−アミラーゼ遺伝子の増幅領域の概略模式図を示す。
なお、各種α−アミラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ量は、下記配列番号２２及び２３で表される塩基配列からなるプライマーを有するプライマーセットＵＢＩＱ５を用いて同様の条件で増幅させた配列番号３２で表される稲ポリユビキチン遺伝子（ＵＢＩＱ５；Ｏｓ０１ｇ０３２８４００）の発現量で標準化し、対照系統の発現量を１００％として示した。
ＰＣＲの条件は、９５℃１０秒間を１サイクル、９５℃５秒間及び６０℃３０秒間を５０サイクル行った。
［Ａｍｙ１Ａプライマーセット２］
ＡＭＹ１Ａ２−Ｆ：ＧＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＣ  （配列番号６）
ＡＭＹ１Ａ２−Ｒ：ＣＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＴＧ  （配列番号７）
［Ａｍｙ１Ｃプライマーセット］
ＡＭＹ１Ｃ−Ｆ：ＧＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＧＡＡＣＡＣＣＴＣ  （配列番号８）
ＡＭＹ１Ｃ−Ｒ：ＣＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＴＧ  （配列番号９）
［ＡＭＹ２Ａプライマーセット］
ＡＭＹ２Ａ−Ｆ：ＴＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＣＧ  （配列番号１０）
ＡＭＹ２Ａ−Ｒ：ＧＣＴＡＡＴＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣ  （配列番号１１）
［ＡＭＹ３Ａプライマーセット］
ＡＭＹ３Ａ−Ｆ：ＧＣＣＧＡＴＣＡＴＣＧＣＡＣＣＴＣＴＴＣ  （配列番号１２）
ＡＭＹ３Ａ−Ｒ：ＣＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＴＧＡＣＧ  （配列番号１３）
［ＡＭＹ３Ｂプライマーセット］
ＡＭＹ３Ｂ−Ｆ：ＧＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣＧ  （配列番号１４）
ＡＭＹ３Ｂ−Ｒ：ＴＧＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴＧＣＧＡＧＣ  （配列番号１５）
［ＡＭＹ３Ｃプライマーセット］
ＡＭＹ３Ｃ−Ｆ：ＧＡＴＴＧＧＧＡＣＡＣＧＧＴＡＴＧＡＣＧ  （配列番号１６）
ＡＭＹ３Ｃ−Ｒ：ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＡＣＣＧ  （配列番号１７）
［ＡＭＹ３Ｄプライマーセット］
ＡＭＹ３Ｄ−Ｆ：ＡＧＡＣＴＴＣＣＡＴＧＴＣＧＴＴＧＣＴＣ  （配列番号１８）
ＡＭＹ３Ｄ−Ｒ：ＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＴＡＧＴＣＣＴＧ  （配列番号１９）
［ＡＭＹ３Ｅプライマーセット］
ＡＭＹ３Ｅ−Ｆ：ＧＴＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＴＣＴＡＧＣＣＴ  （配列番号２０）
ＡＭＹ３Ｅ−Ｒ：ＣＣＡＡＣＧＧＴＴＡＣＡＡＡＣＴＧＣＧＴＧＡ  （配列番号２１）
［ＵＢＩＱ５プライマーセット］
ＵＢＩＱ５−Ｆ：ＧＡＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＡＧＧＧＴＴＣ  （配列番号２２）
ＵＢＩＱ５−Ｒ：ＧＣＴＣＧＴＡＣＡＣＡＴＣＴＣＧＣＡＧＣＡ  （配列番号２３）
【０１３３】
結果を図４Ａ〜Ｈに示す。これらの結果より、ＲＮＡｉ系統は、対照系統と比較して、Ａｍｙ１Ａ遺伝子（図４Ａ）だけでなく、Ａｍｙ１Ｃ遺伝子（図４Ｂ）、Ａｍｙ２Ａ遺伝子（図４Ｃ）、Ａｍｙ３Ａ遺伝子（図４Ｄ）、Ａｍｙ３Ｂ遺伝子（図４Ｅ）、Ａｍｙ３Ｃ遺伝子（図４Ｆ）、Ａｍｙ３Ｄ遺伝子（図４Ｇ）、Ａｍｙ３Ｅ遺伝子（図４Ｈ）についても遺伝子発現の低下が認められた。特に、Ａｍｙ１Ａ遺伝子、Ａｍｙ１Ｃ遺伝子、Ａｍｙ３Ａ遺伝子、Ａｍｙ３Ｂ遺伝子、Ａｍｙ３Ｄ遺伝子については、ＲＮＡｉ系統における遺伝子発現が２０％未満であり、対照系統と比較して大幅に低下していることが確認された。
【０１３４】
（試験例２）
＜ＲＮＡｉ系統の高温処理による白未熟粒の低減＞
ＲＮＡｉ系統（実施例２）と、対照系統（比較例１）のイネ（それぞれｎ＝５）をインキュベーターで昼温２７℃、夜温２２℃にて栽培し、更に穂出時からインキュベーターで高温処理（昼温３１℃、夜温２６℃）を施しながら栽培し、穂出後４０日目の穂を収穫した。収穫した穂から得た種子を採取し、玄米の外観を観察し、１個体毎の玄米の正常粒率を次式より算出し、更に５個体の正常粒率の平均値を算出した。
正常粒率（％）＝（全種子数−白濁化した粒数）／全種子数×１００
【０１３５】
正常粒率の平均値の結果を図５Ａに、種子の外観を図５Ｂに示す。これらの結果より、ＲＮＡｉ系統は、対照系統と比較して大幅に乳白粒が低減しており、高い正常粒率を示した。これより、α−アミラーゼ遺伝子の発現を抑制するにより、コメの品質障害を低減できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明のＲＮＡ又はＤＮＡは、高温環境下で栽培した場合であっても胚乳の白濁等の高温障害が抑制できるなどの高温耐性に優れ、品質上実用性が高い形質転換植物体の製造方法に好適に利用可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2013208076.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2013208076.tif 000006
【図２Ｂ】
2013208076.tif 000007
【図３】
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【図４Ａ】
2013208076.tif 000009
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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