(57)【要約】    【課題】概日リズムを調整することができる概日リズム調整用キット等を提供することを課題とする。    【解決手段】本発明の概日リズム調整用キットは、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤と、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤とを備えたことを特徴としている。本発明の概日リズムの調整方法は、脊柱動物に対して、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を昼に投与し、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を夜に投与することを特徴としている。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤と、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤とを備えた概日リズム調整用キット。
【請求項２】
脊柱動物に対して、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を昼に投与し、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を夜に投与する概日リズムの調整方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概日リズム調整用キット及び概日リズムの調整方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞に存在する「時計遺伝子」は、「概日リズム」と称される約２４時間の周期性を生体において維持する機能を有していることが知られている。即ち、時計遺伝子は、地球の自転に伴って起こる明暗などの約２４時間周期の環境サイクルに生体が適応できるように概日リズムを制御している。時計遺伝子としては、複数の種類が知られており、例えば、昼に発現が活性化されるＰｅｒｉｏｄ、Ｃｒｙや、夜に発現が活性化されるＢｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋなどが知られている。
【０００３】
また、時計遺伝子は、概日リズムを刻む生体現象を制御しており、該生体現象としては、睡眠及び覚醒、血圧及び体温の上下、副腎皮質ホルモン、メラトニン、若しくは成長ホルモン等の分泌量の変動等が知られている。
さらに、時計遺伝子は、全身の細胞の概日リズムを統括すべく、中枢組織としての視床下部の視交叉上核（suprachiasmatic nucleus : SCN）を制御するだけでなく、末梢組織の各細胞が概日リズムを刻むように末梢組織細胞をも直接的に制御する。
【０００４】
近年、時計遺伝子が概日リズムを制御する機構が知られるようになり、該機構としては、例えば、上述したＢｍａｌ１及びＣｌｏｃｋの遺伝子産物の２量体（ＢＭＡＬ／ＣＬＯＣＫ複合体）が、Ｅ−ｂｏｘ配列に結合してＰｅｒｉｏｄ及びＣｒｙの転写を活性化し、該活性化によって増加したＰＥＲＩＯＤ及びＣＲＹが複合体を形成して核内に移行し、ＢＭＡＬ／ＣＬＯＣＫ複合体を抑制するため、Ｐｅｒｉｏｄ及びＣｒｙの転写が減少するというフィードバック機構が知られている。そして、該フィードバック機構により、約２４時間周期の概日リズムが生み出されることが知られている。従って、各時計遺伝子の発現を活性化又は抑制させ、各時計遺伝子の発現リズムの振幅をそれぞれ増大させることにより、本来のリズムを刻むように概日リズムを調整できると考えられている。
【０００５】
従来、時計遺伝子の発現を活性化し得る時計遺伝子の発現活性化剤としては、具体的には、例えば、特定のアルキレンジオキシベンゼン誘導体を含むものが知られている（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、斯かる時計遺伝子の発現活性化剤は、光照射によって活性化されたＰｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現を維持するものであり、直接的にＰｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現を活性化又は抑制できるものではない。また、斯かる時計遺伝子の発現活性化剤は、Ｐｅｒｉｏｄ遺伝子に作用するものであり、概日リズムに関わる時計遺伝子のフィードバック機構において最も中心的な役割を担うとされているＢｍａｌ１遺伝子の発現を直接的に活性化させ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現リズムの振幅を増大させるものではない。従って、概日リズムを必ずしも十分に調整できるものではないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３３５６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これに対して、時計遺伝子の発現が活性化されるときに該発現をより活性化させる発現活性化剤だけでは、時計遺伝子の発現リズムの振幅を必ずしも十分に増大させることができないことから、時計遺伝子の発現が抑制されるときに該発現をより抑制する抑制剤によって時計遺伝子の発現リズムの振幅をさらに増大させ、概日リズムを調整することが考えられる。
そこで、時計遺伝子の発現を活性化する活性化剤とその発現を抑制する抑制剤とを備え、概日リズムを十分に調整できる概日リズム調整用キットが要望されている。
【０００９】
本発明は、上記要望点等に鑑み、概日リズムを調整することができる概日リズム調整用キットを提供することを課題とする。また、本発明は、概日リズムを調整することができる概日リズムの調整方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る概日リズム調整用キットは、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤と、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤とを備えたことを特徴としている。
【００１１】
上記構成からなる概日リズム調整用キットによれば、前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤によって、時計遺伝子としてのＢｍａｌ１遺伝子の発現を夜に活性化できる。また、前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤によって、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を昼に抑制できる。従って、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現リズムの振幅を増大させることができる。また、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現リズムの振幅を増大させることにより、Ｂｍａｌ１遺伝子以外の時計遺伝子の発現リズムの振幅が増大し得る。これにより、概日リズムを調整することができる。
【００１２】
本発明に係る概日リズムの調整方法は、脊柱動物に対して、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を昼に投与し、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を夜に投与することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の概日リズム調整用キット及び概日リズムの調整方法は、概日リズムを調整することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１及び２の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図２】実施例３及び４の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図３】実施例５の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図４】実施例６〜８の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図５】実施例９〜１１の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図６】実施例１２〜１４の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図７】実施例１５の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図８】比較例１の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図９】実施例１６の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１０】実施例１７〜２０の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１１】比較例２〜５の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１２】比較例６〜８の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る概日リズム調整用キットの実施形態について以下に説明する。
【００１６】
本実施形態の概日リズム調整用キットは、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤と、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤とを備えたものである。
【００１７】
前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤は、昼に投与することによりＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化するものである。「昼」は、日の出から日の入りまでの時間帯である。
一方、前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤は、夜に投与することによりＢｍａｌ１遺伝子の発現を抑制するものである。「夜」は、日の入りから日の出までの時間帯である。
【００１８】
前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤は、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥのうちの少なくとも１種を含むものである。前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤は、概日リズムをより確実に調整できるという点で、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、及びビタミンＥのうちの少なくとも２種を含むことが好ましく、３種を含むことがより好ましい。
【００１９】
前記ビタミンＢ６は、ピリドキシン、ピリドキサール、若しくはピリドキサミン、又は、これらの塩若しくはリン酸エステルである。
前記塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などが挙げられる。
前記ビタミンＢ６としては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、ピリドキシン又はその塩が好ましく、ピリドキシン塩酸塩がより好ましい。
【００２０】
前記ビタミンＣは、Ｌ−アスコルビン酸又はその誘導体である。Ｌ−アスコルビン酸誘導体は、分子内にＬ−アスコルビン酸構造を有し、生体内においてＬ−アスコルビン酸を生成するものである。
【００２１】
前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、水溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体、又は油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体などが挙げられる。
【００２２】
前記水溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、リン酸Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムやリン酸Ｌ−アスコルビン酸マグネシウムなどのリン酸Ｌ−アスコルビン酸塩、アスコルビン酸グルコシドなどが挙げられる。
前記油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル、ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ステアリン酸Ｌ−アスコルビル、Ｌ−アスコルビン酸−２リン酸−６パルミチン酸などが挙げられる。
【００２３】
前記ビタミンＣとしては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、Ｌ−アスコルビン酸誘導体が好ましく、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体がより好ましく、テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル、又はジパルミチン酸Ｌ−アスコルビルがさらに好ましい。
【００２４】
前記ビタミンＤは、エルゴカルシフェロール、又は、コレカルシフェロールである。
【００２５】
前記ビタミンＤとしては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、エルゴカルシフェロールが好ましい。
【００２６】
前記ビタミンＥは、α−トコフェロール又はその誘導体である。α−トコフェロール誘導体は、分子内にα−トコフェロール構造を有し、生体内においてα−トコフェロールを生成するものである。なお、前記ビタミンＥにおけるα−トコフェロールは、ｄ体であってもｌ体であってもよい。
【００２７】
前記α−トコフェロール誘導体としては、例えば、α−トコフェロール酢酸エステルなどのα−トコフェロールエステル誘導体が挙げられる。
【００２８】
前記ビタミンＥとしては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、α−トコフェロール誘導体が好ましく、α−トコフェロール酢酸エステルがより好ましい。
【００２９】
前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤としては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、少なくともビタミンＣを含むものが好ましい。同様の理由により、上述したビタミンのうち少なくとも２種を含むものが好ましい。また、少なくともビタミンＣを含み且つ上述したビタミンのうち少なくとも２種を含むものがさらに好ましい。
【００３０】
前記少なくとも２種のビタミンを含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤としては、具体的には例えば、ビタミンＢ６とビタミンＣとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものが挙げられる。
また、例えば、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むもの、又は、ビタミンＢ６とビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものなどが挙げられる。
【００３１】
具体的には、前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤としては、ビタミンＢ６とビタミンＣとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものがより好ましく、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、又はビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものがさらに好ましい。
【００３２】
より具体的には、前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤としては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、ピリドキシン又はその塩（ビタミンＢ６）と油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）との混合物を含むもの、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）との混合物を含むもの、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むもの、ピリドキシン又はその塩（ビタミンＢ６）と油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むもの、又は、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むものがより好ましい。
【００３３】
前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤においては、複数種のビタミンが含まれる場合、各ビタミンの含有量の比が、特に限定されず適宜設定されている。
【００３４】
前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤は、少なくともビタミンＡを含むものであり、概日リズムをより確実に調整できるという点で、好ましくは、ビタミンＡと、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、又はビタミンＥとを含むものが好ましい。
なお、前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤に含まれ得る前記ビタミンＢ６、前記ビタミンＣ、前記ビタミンＤ、又は前記ビタミンＥは、上述したものと同様のものである。
【００３５】
前記ビタミンＡは、レチノール、レチナール、レチノイン酸、又は、これらの誘導体である。レチノール、レチナール、又はレチノイン酸の誘導体は、分子内にレチノール、レチナール、又はレチノイン酸の構造を有し、生体内においてレチノール、レチナール、又はレチノイン酸を生成するものである。レチノール誘導体としては、例えば、パルミチン酸レチノール、βカロテン等が挙げられる。
【００３６】
前記ビタミンＡとしては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、レチノール誘導体が好ましく、パルミチン酸レチノールがより好ましい。
【００３７】
前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤としては、概日リズムをより確実に調整できるという点で、ビタミンＡとビタミンＢ６との混合物を含むもの、ビタミンＡとビタミンＣとの混合物を含むもの、ビタミンＡとビタミンＤとの混合物を含むもの、又は、ビタミンＡとビタミンＥとの混合物を含むものが好ましい。
【００３８】
前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤としては、レチノール誘導体（ビタミンＡ）とピリドキシン又はその塩（ビタミンＢ６）との混合物を含むもの、レチノール誘導体（ビタミンＡ）と油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）との混合物を含むもの、レチノール誘導体（ビタミンＡ）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）との混合物を含むもの、又は、レチノール誘導体（ビタミンＡ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むものがより好ましい。
【００３９】
前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤においては、複数種のビタミンが含まれる場合、各ビタミンの含有量の比が、特に限定されず適宜設定されている。
【００４０】
前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤及び前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤は、それぞれ必要に応じて、適宜、溶媒、界面活性剤等を含み得る。
また、前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤及び前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤は、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧料、食品などに配合されて使用され得る。
【００４１】
次に、本発明に係る概日リズムの調整方法の実施形態について説明する。
【００４２】
本実施形態の概日リズムの調整方法は、脊柱動物に対して、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも１種を含む昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を昼に投与し、少なくともビタミンＡを含む夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を夜に投与するものである。
【００４３】
即ち、前記概日リズムの調整方法においては、脊柱動物に対して、日の出から日の入りまでの昼に前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を投与し、日の入りから日の出までの夜に前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を投与する。
前記概日リズムの調整方法においては、昼に前記活性化剤を投与することにより夜にＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化させ、夜に前記抑制剤を投与することにより昼にＢｍａｌ１遺伝子の発現を抑制させることができる。Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を夜に活性化し昼に抑制することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現リズムの振幅を増大させることができる。該振幅が増大することにより、時計遺伝子としてのＰｅｒｉｏｄ遺伝子やＣｒｙ遺伝子の発現リズムの振幅が増大され得ることから、概日リズムを調整することができる。
【００４４】
前記脊柱動物としては、夜にＢｍａｌ１遺伝子の発現が活性化し昼にＢｍａｌ１遺伝子の発現が抑制される動物であれば特に限定されず、例えば、魚類動物、は虫類動物、鳥類動物、哺乳類動物などが挙げられる。
前記哺乳類動物としては、例えば、昼行性哺乳類動物としてのヒト、チンパンジー、ローランドゴリラ、イエネコ、ニホンザル、ウサギ、ヤギ等が挙げられる。また、例えば、夜行性哺乳類動物としてのマウス、ラット等が挙げられる。
【００４５】
前記概日リズムの調整方法においては、前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を日の出から正午の間に投与することが好ましく、例えば、ヒトであれば起床時から４時間までの間に投与することが好ましい。
前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を日の出から正午の間に投与することにより、投与から約１２時間後にＢｍａｌ１遺伝子の発現がより活性化され、日の入りから夜半においてＢｍａｌ１遺伝子の発現がより確実に活性化されることから、概日リズムがより十分に調整されるという利点がある。
なお、正午は、太陽が南中又は北中するときであり、夜半は、正午の１２時間後である。
【００４６】
前記概日リズムの調整方法においては、前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を日の入りから夜半の間に投与することが好ましく、例えば、ヒトであれば日の入りから就寝時までの間に投与することが好ましい。
前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を日の入りから夜半の間に投与することにより、投与から約１２時間後にＢｍａｌ１遺伝子の発現がより抑制され、日の出から正午においてＢｍａｌ１遺伝子の発現がより確実に抑制されることから、概日リズムがより十分に調整されるという利点がある。
【００４７】
前記概日リズムの調整方法においては、例えば、生体外において又は生体において、前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤及び前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤により概日リズムを調整することができる。
【００４８】
具体的には、生体外での概日リズムの調整方法としては、例えば、生体組織の細胞が所定期間培養された培地に対して、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現が抑制されるときに前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を添加し、さらに、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現が活性化されるときに前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を添加する方法を実施することができる。斯かる方法によれば、細胞におけるＢｍａｌ１遺伝子の発現を２４時間の間に交互に活性化及び抑制させることができ、細胞の概日リズムを調整することができる。
細胞におけるＢｍａｌ１遺伝子発現の程度は、例えば、Ｂｍａｌ１遺伝子の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結した遺伝子を含む細胞を用いて、リアルタイムリポーターアッセイ等を採用し、ルシフェラーゼ発光量を測定することにより評価できる。
このような生体外での概日リズムの調整方法は、比較的簡便に実施できることから、例えば、後述する生体での概日リズムの調整方法における、Ｂｍａｌ１遺伝子の活性化剤又は抑制剤の最適濃度を決定する目的で予備実験的に実施することができる。
【００４９】
一方、生体での概日リズムの調整方法においては、例えば、所定の体内組織に対して、昼に前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を含有させる処置を施し、さらに、夜に前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を含有させる処置を施す方法を実施することができる。
より具体的には、該方法においては、例えば、皮膚の表皮組織に前記昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤及び前記夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤をそれぞれ昼及び夜に、塗布などにより含有させる方法を実施することができる。
斯かる方法によれば、表皮組織などの組織の細胞におけるＢｍａｌ１遺伝子の発現を夜に活性化し、昼に抑制して、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現の振幅を増大させることにより、概日リズムを調整することができる。
【００５０】
前記概日リズムの調整方法は、ヒトの生体又はヒト以外の脊柱動物の生体において実施することができる。好ましくは、ヒトの生体において、具体的には例えば美容上の目的で、非治療的に実施する。なお、ヒト以外の脊柱動物は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現が夜に活性化する動物であれば、必ずしも昼行性の動物でなくてもよい。
前記概日リズムの調整方法は、ヒトへの医療行為を除くものであり、具体的には例えば、ヒトの皮膚に塗布して皮膚細胞の概日リズム調整し、皮膚のくすみを抑制したり、皮膚のハリを維持したりする皮膚の美容方法に適用できる。
【００５１】
前記概日リズムの調整方法においては、前記概日リズム調整用キットが備える昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤及び夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を希釈などによって適宜適当な濃度に調整して使用することができる。希釈するための液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、細胞培養用液体培地などを用いることができる。
【００５２】
具体的には、前記発現活性化方法においては、上述したビタミン類の合計量の濃度が好ましくは０．０００１〜１０質量％となるように、より好ましくは０．００１〜１質量％となるように希釈等して使用する。
【００５３】
本発明の概日リズム調整用キット及び概日リズムの調整方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の実施形態に限定されるものではない。また、本発明では、一般の概日リズム調整用キット及び概日リズムの調整方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【実施例】
【００５４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
［事前準備］
まず、下記に示す油溶性のビタミン類のそれぞれを予めエタノールに溶かして３質量％濃度のエタノール溶液を調製しておいた。
ビタミンＣ：ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（Ｌ−アスコルビン酸誘導体）
ビタミンＣ：テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル
（Ｌ−アスコルビン酸誘導体）
ビタミンＤ：エルゴカルシフェロール
ビタミンＥ：酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（α−トコフェロール誘導体）
ビタミンＡ：パルミチン酸レチノール
一方、ビタミンＢ６としてのピリドキシン塩酸塩を純水に溶解させて３質量％の水溶液を調製しておいた。
【００５６】
＜昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤の製造＞
（実施例１）
以下のようにして、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
即ち、１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｇｉｂｃｏ）培地（以下、「１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ」という）を希釈用溶媒として用い、上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液を０．１質量％濃度に希釈し、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００５７】
（実施例２）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００５８】
（実施例３）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のテトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００５９】
（実施例４）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６０】
（実施例５）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６１】
（実施例６）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６２】
（実施例７）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６３】
（実施例８）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６４】
（実施例９）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６５】
（実施例１０）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６６】
（実施例１１）
上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６７】
（実施例１２）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６８】
（実施例１３）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００６９】
（実施例１４）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００７０】
（実施例１５）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を製造した。
【００７１】
（比較例１）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度の比較用の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤を調製した。
【００７２】
＜夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤の製造＞
一方、上述のごとく事前準備したビタミン類の溶液を用いて、それぞれの夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００７３】
（実施例１６）
上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭを希釈用溶媒として用い、上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液を０．１質量％濃度に希釈し、夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００７４】
（実施例１７）
上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液と、上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１６と同様に希釈することにより、夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００７５】
（実施例１８）
上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液と、上記のジパルミチン酸アルコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１６と同様に希釈することにより、夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００７６】
（実施例１９）
上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１６と同様に希釈することにより、夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００７７】
（実施例２０）
上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液と、上記の酢酸α−トコフェロール（ＤＬ混合体  ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１６と同様に希釈することにより、夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００７８】
（比較例２）
パルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液に代えて、上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液を用いた点以外は、実施例１６と同様にして、０．１質量％濃度の比較用の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００７９】
（比較例３）
パルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液に代えて、上記のジパルミチン酸アルコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１６と同様にして、０．１質量％濃度の比較用の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００８０】
（比較例４）
パルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液に代えて、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１６と同様にして、０．１質量％濃度の比較用の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００８１】
（比較例５）
パルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液に代えて、上記の酢酸α−トコフェロール（ＤＬ混合体  ビタミンＥ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１６と同様にして、０．１質量％濃度の比較用の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００８２】
（比較例６）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１６と同様に希釈することにより、比較用の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００８３】
（比較例７）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記の酢酸α−トコフェロール（ＤＬ混合体  ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１６と同様に希釈することにより、比較用の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００８４】
（比較例８）
上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、上記の酢酸α−トコフェロール（ＤＬ混合体  ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の重量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１６と同様に希釈することにより、比較用の夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤を製造した。
【００８５】
＜Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化能又は発現抑制能の評価＞
上記した各実施例及び各比較例の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤及び夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤のそれぞれについて、下記のリアルタイムリポーターアッセイにより、時計遺伝子としてのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能又は発現抑制能を評価した。
【００８６】
リアルタイムリポーターアッセイの詳細
マウスの時計遺伝子Ｂｍａｌ１プロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結した遺伝子を安定的に発現するマウス由来繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３−Ｂｍａｌ−Ｌｕｃ」という）を、３５ｍｍ培養ディシュに約２．５×１０5個  播種した。その後、上述した１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ中にて２日間培養を行った。
そして、時計遺伝子Ｂｍａｌ１を同調させるべく培地中にデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、１００ｎＭ濃度デキサメタゾン／ＤＭＥＭにおいて２時間培養した。その後、培地を、０．１ｍＭ濃度のＤ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を含む１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭに交換し、リアルタイムリポーターアッセイ用発光測定装置（製品名「Ｋｒｏｎｏｓ  Ｄｉｏ  ＡＢ−２５５０」  ＡＴＴＯ社製）により、各発現活性化剤を用いたものについて遺伝子の発現を測定した。測定条件は、測定時間１分、計測間隔１０分とした。
詳しくは、昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤については、計測約２４時間後のルシフェラーゼ発光量が下限ピークをむかえたタイミングで、各発現活性化剤を所定濃度となるように各ディシュに添加し、その後、ルシフェラーゼ発光量の経時変化を測定し、各活性化剤のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能を調べた。
一方、夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤については、計測約３６時間後のルシフェラーゼ発光量が上限ピークをむかえたタイミングで、各発現活性化剤を所定濃度となるように各ディシュに添加し、その後、ルシフェラーゼ発光量の経時変化を測定し、各抑制剤のＢｍａｌ１遺伝子の発現抑制能を調べた。
陰性対照（コントロール）においては、各活性化剤又は抑制剤を添加しない点以外は、上記と同様の操作を行った。
【００８７】
上記測定においては、各実施例及び各比較例において製造した活性化剤又は抑制剤を上述した１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭにより希釈して使用した。また、上記測定における各剤の濃度は、細胞毒性が認められない範囲に設定した。詳しくは、下記の通りに濃度を設定した。
ビタミン類：各０．００５質量％（単独の場合は、０．０１０質量％濃度あり）
なお、実施例２の昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤（ビタミンＣ［ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル］０．０１０％濃度）においては、細胞毒性が認められたため、上記の評価を実施できなかった。
【００８８】
昼用Ｂｍａｌ１遺伝子活性化剤について、実施例１〜１５及び比較例１の評価結果をグラフに表したものを図１〜図８に示す。なお、図１〜図８において、縦軸の値は、陰性対照（コントロール）におけるルシフェラーゼ発光量の最大値を１としたときのルシフェラーゼ発光量の相対値を示している。
【００８９】
さらに、陰性対照（コントロール）のルシフェラーゼ発光量の最大値を１としたとき、各実施例及び比較例におけるルシフェラーゼ発光量の最大値を相対値で表した一覧表を表１に示す。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
また、夜用Ｂｍａｌ１遺伝子抑制剤について、実施例１６〜２０、及び比較例２〜８の評価結果をグラフに表したものを図９〜図１２に示す。なお、図９〜図１２において、縦軸の値は、陰性対照（コントロール）におけるルシフェラーゼ発光量の最小値を１としたときのフェラーゼ発光量の相対値を示している。
【００９２】
さらに、陰性対照（コントロール）のルシフェラーゼ発光量の最小値を１としたとき、各実施例及び比較例におけるルシフェラーゼ発光量の最小値を相対値で表した一覧表を表２に示す。
【００９３】
【表２】
2013056867.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の概日リズム調整用キットは、概日リズムを調整するために好適に使用できる。具体的には、例えば、皮膚表皮細胞などの外胚葉性の細胞、肝臓細胞などの内胚葉性の細胞、心臓細胞などの中胚葉性の細胞における概日リズムを調整するために好適に使用できる。より具体的には、例えば、皮膚外用剤に配合されて皮膚細胞の概日リズムを調整するために使用される。
概日リズムを調製することにより、加齢、時差ぼけ、若しくは交代勤務などによる概日リズムの乱れ、又は、睡眠相後退症候群や非２４時間睡眠覚醒症候群といった睡眠障害を改善できることが期待できる。また、皮膚細胞の概日リズムを調整することにより、具体的には例えば、皮膚のハリを維持する、皮膚のくすみを抑制する、表皮におけるターンオーバーを正常化する、皮膚のシワを抑制する、又は、ニキビや目の下のくまを抑制すること等が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013056867.tif 000012
【図９】
2013056867.tif 000013
【図１０】
2013056867.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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