(57)【要約】【課題】糖転移酵素を用いた糖修飾ポリペプチドの製造方法であって、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】反応溶液（Ｘ’）中で、ポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に糖転移酵素（Ｂ１）を作用させて糖修飾ポリペプチドを製造する方法において、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−１）又は２種以上の酵素を組みあわせてリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換することができるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−２）の存在下で（Ｂ１）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液（Ｘ’）中で、ポリペプチド（Ｃ）及び下記リボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に糖転移酵素（Ｂ１）を作用させて糖修飾ポリペプチドを製造する方法において、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−１）又は２種以上の酵素を組みあわせてリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換することができるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−２）の存在下で（Ｂ１）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法。
リボヌクレオシドリン酸−糖（Ａ１）：トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）、下記単糖（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記一般式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも１つが下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【請求項２】
リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−２）が、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド２リン酸に変換する活性を有する酵素とリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有する酵素との組み合わせであり、反応溶液（Ｘ’）中に、さらにリン酸基含有化合物（Ｆ）を含む請求項１に記載の糖修飾ポリペプチドの製造方法。
【請求項３】
反応溶液（Ｘ）中で、ポリペプチド（Ｃ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に糖転移酵素（Ｂ２）を作用させて糖修飾ポリペプチド質を製造する方法において、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）の存在下で（Ｂ２）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法。
リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）：トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）、下記単糖（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記一般式（６）〜（１０）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも１つが下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【請求項４】
反応溶液（Ｘ）中に、さらにリン酸基含有化合物（Ｆ）を含む請求項３に記載の糖修飾ポリペプチドの製造方法。
【請求項５】
下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である請求項４に記載の糖修飾ポリペプチドの製造方法。
ミカエリス定数Ｋｍ：リボヌクレオシド２リン酸を基質とし、リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）を作用させてリボヌクレオシド３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：糖転移酵素（Ｂ２）をポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、反応溶液（Ｘ）の重量を基準とした（Ｂ２）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｂ２）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖修飾ポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物で発現するポリペプチド（タンパク質を含む）のなかには、糖修飾されたもの（糖修飾ポリペプチド）が存在している。糖修飾ポリペプチドは、糖修飾されたポリペプチドであることで、糖修飾されていないポリペプチドと比較して、生理活性を有するものとなったり、ポリペプチドの活性が向上することが知られており、医薬品等として産業利用されている。
産業利用されている糖修飾ポリペプチドは、真核生物細胞を用いた培養により生産されている。しかしながら、細胞培養で生産した糖修飾ポリペプチドは、修飾する糖の種類や修飾部位などが、培養条件の僅かな違いによって変化してしまう問題がある。
【０００３】
一方、糖修飾されていないポリペプチドを製造する場合、大腸菌や枯草菌、麹菌などの微生物を用いた生産も可能であり、培養細胞を用いた培養系に比べて生産性が高い。そこで、微生物などを用いて生産したポリペプチドを生体外で糖修飾する方法が望まれている。
【０００４】
ポリペプチドを生体外で糖修飾する方法としては、リボヌクレオチド−糖（シチジン１リン酸−シアル酸やウリジン２リン酸−グルクロン酸等）とポリペプチドに糖転移酵素を作用させて、糖転移反応を行うことが知られている（非特許文献１）。しかしながら、酵素が多量に必要である、及び製造効率が低く製造量が少ないという問題があるため、研究レベルに留まっており、工業化の検討はされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｕｒａ  Ｍａｓａｎｏｒｉ  ｅｔ．ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２、Ｖｏｌ．２５７  Ｎｏ．１６、ｐ９５０１−９５０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、糖転移酵素を用いた糖修飾ポリペプチドの製造方法であって、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の糖修飾ポリペプチドの製造方法は、反応溶液（Ｘ’）中で、ポリペプチド（Ｃ）及び下記リボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に糖転移酵素（Ｂ１）を作用させて糖修飾ポリペプチド質を製造する方法において、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−１）又は２種以上の酵素を組みあわせてリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換することができるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−２）の存在下で（Ｂ１）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法である。
リボヌクレオシドリン酸−糖（Ａ１）：トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）、下記単糖（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記一般式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも１つが下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【０００８】
また、本発明の糖修飾ポリペプチドの製造方法は、反応溶液（Ｘ）中で、ポリペプチド（Ｃ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に糖転移酵素（Ｂ２）を作用させて糖修飾ポリペプチド質を製造する方法において、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）の存在下で（Ｂ２）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法である。
リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）：トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）、下記単糖（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記一般式（６）〜（１０）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチド。
【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも１つが下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の糖修飾ポリペプチドの製造方法は、単位酵素あたりの糖修飾ポリペプチドの製造量が多いという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の製造方法は、反応溶液（Ｘ’）中で、ポリペプチド（Ｃ）及び下記リボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に糖転移酵素（Ｂ１）を作用させて糖修飾ポリペプチド質を製造する方法において、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−１）又は２種以上の酵素を組みあわせてリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換することができるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−２）の存在下で（Ｂ１）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法である。
本発明において、糖修飾ポリペプチドとは、ポリペプチド（タンパク質を含む）に糖が付加（グリコシル化）したものである。
ポリペプチド及びリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に糖転移酵素（Ｂ１）を作用させる際、リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−１）又は２種以上の酵素を組みあわせてリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換することができるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−２）の存在下で（Ｂ１）を作用させることにより、副生成物として生成したリボヌクレオシド１リン酸がリボヌクレオシド３リン酸に変換されるので、リボヌクレオシド１リン酸が多糖合成酵素（Ｂ１）に結合するのを防ぐことができ、（Ｂ１）の活性が低下しにくく、従来の方法と比較して、糖転移酵素（Ｂ１）の単位酵素あたりの糖修飾ポリペプチドの製造量が多くなる。したがって、少ない酵素量で大量の糖修飾ポリペプチドを製造することが可能である。
【００１１】
本発明において、リボヌクレオシドリン酸−糖（Ａ１）は、トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）、下記単糖（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記一般式（１）〜（５）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチドである。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも１つが下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
【００１２】
トリオース（ａ−１）は、炭素数３の単糖であり、具体的には、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロース（ａ−２）は、炭素数４の単糖であり、具体的には、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントース（ａ−３）は、炭素数５の単糖であり、具体的には、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソース（ａ−４）は、炭素数６の単糖であり、具体的には、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトース（ａ−５）は、炭素数７の単糖であり、具体的には、セドヘプツロース等が挙げられる。
【００１３】
置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ−６）には、単糖（（ａ−１）〜（ａ−５））分子中のプロトン（−Ｈ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）及びヒドロキシメチル基（−ＣＨ2ＯＨ）の少なくとも１つがカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換された単糖（ａ−６−１）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つがアミノ基（−ＮＨ2）で置換された単糖（ａ−６−２）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つがＮ−アセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ3）で置換された単糖（ａ−６−３）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つがスルファート基（−ＯＳＯ3Ｈ）で置換された単糖（ａ−６−４）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つがメチルエステル基（−ＣＯＯＣＨ3）で置換された単糖（ａ−６−５）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つがＮ−グリコリル基（−ＮＨＣＯＣＨ2ＯＨ）で置換された単糖（ａ−６−６）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つがメチル基で置換された単糖（ａ−６−７）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つが１，２，３−トリヒドロキシプロピル基（−ＣＨＯＨＣＨＯＨＣＨ2ＯＨ）で置換された単糖（ａ−６−８）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つがリン酸基（−ＯＰＯ3Ｈ2）で置換された単糖（ａ−６−９）、単糖分子中のプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも１つが２−カルボキシ−２−ヒドロキシエチル基（−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＯＯＨ）で置換された単糖（ａ−６−１０）並びにプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基の少なくとも２つが複数種類の置換基（Ｅ）で置換された単糖（ａ−６−１１）が含まれる。
【００１４】
（ａ−６−１）として、具体的には、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
（ａ−６−２）として、具体的には、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ムラミン酸等のアミノ糖等が挙げられる。
（ａ−６−３）として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルムラミン酸及び等が挙げられる。
（ａ−６−４）として、具体的には、ガラクトース−３−硫酸等が挙げられる。
（ａ−６−５）として、具体的には、グルコースメチルエステル及び（ａ−６−１）中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
（ａ−６−１１）として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミン−４−硫酸、イズロン酸−２−硫酸、グルクロン酸−２−硫酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−硫酸、シアル酸、ノイラミン酸、Ｎ−グライコリルノイラミン酸及びＮ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。
【００１５】
（ａ−６）が、置換基（Ｅ）としてアニオン基であるリン酸基、カルボキシル基及びスルファート基からなる群より選ばれる１種以上を有する場合、アニオン基のプロトンは、アルカリ金属（Ｎａ及びＫ等）及び／又はアルカリ土類金属（Ｃａ等）で置換されていてもよい。
【００１６】
（ａ−１）〜（ａ−６）の重合体（ａ−７）としては、これらが２個以上結合した糖（二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖及び多糖）が含まれ、具体的には、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、ペクチン、グルコマンナン及びヒアルロン酸等が挙げられる。また、重合体（ａ−７）は直鎖でも分岐していてもいい。
【００１７】
リボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）は、上記糖｛（ａ−１）〜（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）｝の有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが、上記一般式（１）〜（５）で置換された糖ヌクレオチド（Ａ１−１）〜（Ａ１−７）である。
（Ａ１−３）として、具体的には、ウリジン１リン酸（以下、ＵＭＰと記載することがある。）−キシロース等が挙げられる。
（Ａ１−４）として、具体的には、シチジン１リン酸（以下、ＣＭＰと記載することがある。）−グルコース、グアノシン１リン酸−マンノース、グアノシン１リン酸−フコース、アデノシン１リン酸−グルコース、ＵＭＰ−グルコース、ＵＭＰ−ガラクトース及びＵＭＰ−マンノース等が挙げられる。
（Ａ１−６）として、具体的には、ＣＭＰ−シアル酸、ＵＭＰ−グルクロン酸、ＵＭＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＭＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＵＭＰ−イズロン酸等が挙げられる。
【００１８】
本発明の製造方法は、（Ａ１）は１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。
【００１９】
本発明において、ポリペプチド（Ｃ）としては、ポリペプチドであれば制限なく使用できる。ポリペプチドには、タンパク質が含まれる。具体的には、アミノ酸が２〜１０，０００個結合したポリペプチド等が挙げられる。ポリペプチド（Ｃ）としては、糖転移酵素の基質特異性の観点から、Ｓｅｒ残基及び／又はＴｈｒ残基を有するポリペプチドが好ましく、さらに好ましくはポリペプチドの立体構造において表面付近にＳｅｒ残基及び／又はＴｈｒ残基を有するポリペプチドであり、次にさらに好ましくはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒモチーフを有するポリペプチド及びＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒモチーフを有するポリペプチドである。
【００２０】
糖転移酵素（Ｂ１）は、上記（Ａ１）とポリペプチド（Ｃ）の存在下で作用させることにより、（Ａ１）の有する糖をポリペプチド（Ｃ）に転移して糖修飾ポリペプチドを合成する活性を有する酵素である。
糖転移酵素（Ｂ１）には、ポリペプチド（Ｃ）を修飾する糖の種類により種々の酵素が知られており、β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｂ１−１）が含まれる。また、（Ｂ１）には、（Ｂ１−１）以外にも、（Ａ１）とポリペプチド（Ｃ）とから糖修飾ポリペプチドを合成する活性を有する酵素が含まれる。
【００２１】
（Ｂ１−１）は、（Ａ１）としてリボヌクレオシド１リン酸−シアル酸を用いて、ポリペプチド（Ｃ）にシアル酸を転移し、糖修飾ポリペプチドを合成する活性を有する酵素である。（Ｂ１−１）は、例えばヒトのＳＩＡＴ１遺伝子にコードされており、ｃＤＮＡクローニングによって発現大腸菌株を得ることが可能である。
【００２２】
糖転移酵素（Ｂ１）として（Ｂ１−１）を用いる場合、糖修飾ポリペプチドの生産効率の観点から、（Ａ１）としてリボヌクレオシド１リン酸−シアル酸を用いることが好ましく、さらに好ましくはＣＭＰ−シアル酸である。
【００２３】
上記リボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）、ポリペプチド（Ｃ）及び上記糖転移酵素（Ｂ１）は、製造する糖修飾ポリペプチドに応じて適宜選択する。
【００２４】
本発明は、上記ポリペプチド（Ｃ）及び上記リボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に上記糖転移酵素（Ｂ１）を作用させて糖修飾ポリペプチドを製造する方法において、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−１）又は２種以上の酵素を組みあわせてリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換することができるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−２）の存在下で（Ｂ１）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法である。
【００２５】
リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１−１）は、１種の酵素がリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換することができるものである。
【００２６】
（Ｄ１−２）としては、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド２リン酸に変換する酵素とリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する酵素との組み合わせ（Ｄ１−２−１）が含まれる。
【００２７】
（Ｄ１−２−１）において、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド２リン酸に変換する酵素としては、ＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼ及びアデニレートキナーゼ等が挙げられる。
リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する酵素としては、後述するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）等が挙げられる。
（Ｄ１−２−１）として、具体的には、ＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼとポリリン酸キナーゼとの組み合わせ、ＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼとアデノシンキナーゼとの組み合わせ、アデニレートキナーゼとポリリン酸キナーゼとの組み合わせ及びアデニレートキナーゼとアデノシンキナーゼとの組み合わせ等が挙げられる。
（Ｄ１−２−１）において、リボヌクレオシド１リン酸のリボヌクレオシド３リン酸への変換効率の観点から、ＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼとポリリン酸キナーゼとの組み合わせ、ＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼとアデノシンキナーゼとの組み合わせ、アデニレートキナーゼとポリリン酸キナーゼとの組み合わせ及びアデニレートキナーゼとアデノシンキナーゼとの組み合わせが好ましい。
【００２８】
リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１）を作用させる際、必要により、後述するリン酸基含有化合物（Ｆ）を用いてもいい。
リン酸基含有化合物（Ｆ）を用いる場合、（Ｄ１）と（Ｆ）の組み合わせは、基質特異性等の観点から、当業者であれば適宜選択することができる。
また、（Ｄ１）が（Ｄ１−２−１）であり、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する酵素としてリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）を用いる場合、（Ｄ２）と（Ｆ）との好ましい組み合わせは、後述と同様である。
【００２９】
本発明において、リボヌクレオシド１リン酸を効率よくリボヌクレオシド３リン酸に変換する及び糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満である（Ｂ１）及び（Ｄ１）を選択することが好ましい。
ミカエリス定数Ｋｍ：（Ｄ１）として（Ｄ１−１）を用いる場合は、リボヌクレオシド１リン酸を基質とし、（Ｄ１−１）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）を作用させてリボヌクレオシド３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数であり、（Ｄ１）として（Ｄ１−２）を用いる場合は、リボヌクレオシド１リン酸を基質とし、リボヌクレオシド１リン酸に作用する（例えば、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド２リン酸に変換する酵素）酵素を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）を作用させてリボヌクレオシド２リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数である。
阻害濃度ＩＣ50：糖転移酵素（Ｂ１）をポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、反応溶液（Ｘ）の重量を基準とした糖転移酵素（Ｂ１）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｂ１）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
【００３０】
ミカエリス定数Ｋｍは、Ａｇａｒｗａｌらによって報告された方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７８，Ｖｏｌ．５１，Ｐ４８３−４９１に記載の方法）で酵素反応初速度の基質濃度依存性を求めることによって求められる。ミカエリス定数Ｋｍの測定に用いる酵素の形態としては、精製酵素を用いる。
【００３１】
阻害濃度ＩＣ50は、本発明の製造方法において、糖転移酵素（Ｂ１）をポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、（Ｂ１）を作用させる際の濃度と同様の（Ｂ１）の濃度、温度及びｐＨの条件下において、下記測定方法によって求められる。
＜（Ｂ１）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド１リン酸の濃度である阻害濃度ＩＣ50の測定方法＞
一定量の糖転移酵素（Ｂ１）、ポリペプチド（Ｃ）、リボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）、リボヌクレオシド１リン酸、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した液量１ｍＬ以下の酵素反応溶液（Ｙ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｙ’）の温度は、糖転移酵素（Ｂ１）を作用させる温度と同じの温度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｙ’）のｐＨは、糖転移酵素（Ｂ１）を作用させるｐＨと同じのｐＨを選ぶ。
酵素反応溶液（Ｙ’）中の糖転移酵素（Ｂ１）のモル濃度は、本発明の製造方法において、糖転移酵素（Ｂ１）をポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、糖転移酵素（Ｂ１）を作用させる濃度に調整する。
酵素反応溶液（Ｙ’）中のリボヌクレオシド１リン酸の含有量（モル濃度）は、リボヌクレオシド１リン酸が０Ｍの酵素反応溶液と、リボヌクレオシド１リン酸の濃度が０Ｍより大きく糖転移酵素（Ｂ１）の活性が０になる（糖修飾ポリペプチドの生成が観測できなくなる）リボヌクレオシド１リン酸の濃度以下の濃度でリボヌクレオシド１リン酸の濃度が異なる４種類以上の酵素反応溶液とを、すなわち合計５種類以上の酵素反応溶液（Ｙ’）を作成すればいい。また、類似の糖転移酵素（Ｂ１）に対するリボヌクレオシド１リン酸の阻害定数Ｋｉが分かっている場合は、リボヌクレオシド１リン酸の濃度が０Ｍのもの、類似の糖転移酵素（Ｂ１）のＫｉ未満で０Ｍより大きい濃度範囲で２種類以上、Ｋｉ以上及びＫｉの１０倍以下の濃度範囲で２種類以上、合計５種類以上作成すればいい。
酵素反応溶液（Ｙ’）中のポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）の含有量は、経時的なピーク面積変化を観測できる濃度を１点選べばよい。測定に使用する（Ｂ１）と類似の糖転移酵素のミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、Ｋｍ以上及びＫｍの５倍以下の濃度範囲の間で選べばよい。
酵素反応溶液（Ｙ’）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｙ’）中の（Ｋ）の含有量（モル濃度）は、１００〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｙ’）について、（Ｙ’）を作成直後及び一定時間（例えば５分）ごとに溶液の一部（例えば１００μＬ）を取り出し、取り出したものを１００℃で1分間熱処理し、酵素反応を停止する。液体クロマトグラフィーを用いて取り出した反応溶液中の糖修飾ポリペプチドの量を定量する。酵素反応溶液（Ｙ’）を作成直後のピーク面積をＰ0、ｈ時間後のピーク面積をＰhとし、ピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐh−Ｐ0）と糖修飾ポリペプチドのピーク面積に対する検量線を用いて酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
さらに、リボヌクレオシド１リン酸の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｙ’）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
阻害濃度ＩＣ50は、横軸に（ｘ軸）にそれぞれのリボヌクレオシド１リン酸の濃度、縦軸（ｙ軸）にリボヌクレオシド１リン酸の濃度が０の時の酵素反応初速度ｖを１００（％）としたときの相対活性をプロットする。プロットを直線でつなぎ、ｙ＝５０（％）となるときのリボヌクレオシド１リン酸の濃度を阻害濃度ＩＣ50とする。
【００３２】
本発明において、２種以上の（Ｄ１）を用いる場合、ミカエリス定数Ｋｍが阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満とは、それぞれの（Ｄ１）についてミカエリス定数Ｋｍを求め、全ての（Ｄ１）についてミカエリス定数Ｋｍが阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であるとする。
また、２種以上の（Ｂ１）を用いる場合は、それぞれの（Ｂ１）について阻害濃度ＩＣ50を求め、ミカエリス定数Ｋｍが、求めた阻害濃度ＩＣ50の中で最も大きい阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であるとする。
【００３３】
本発明において、リボヌクレオシド１リン酸を効率よくリボヌクレオシド３リン酸に変換する及び糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、ミカエリス定数Ｋｍは、阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満が好ましく、さらに好ましくは１０倍以下である。
【００３４】
本発明の糖修飾ポリペプチドの製造方法としては、ポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）に糖転移酵素（Ｂ１）を作用させる際に、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１）を存在させるものであれば制限はない。
本発明の製造方法の１例は、下記工程（ａ’）〜（ｂ’）を含むものである。
工程（ａ’）：所定のリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）、ポリペプチド（Ｃ）糖転移酵素（Ｂ１）、リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１）及び溶剤（Ｈ）を混合して反応溶液（Ｘ’）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行う。反応溶液（Ｘ’）には、必要により、リン酸基含有化合物（Ｆ）、リボヌクレオシド１リン酸−糖を合成する酵素（Ｇ’）及び糖（ａ−１）〜（ａ−７）を含んでもいい。さらに、必要により、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）等を含んでもいい。
工程（ｂ’）：糖修飾ポリペプチドをカラムクロマトなどを用いることにより精製する。
【００３５】
上記工程（ａ）において、溶剤（Ｈ）としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物が含まれる。
水としては、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｋ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル、環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族または脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット、シクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、タンパク質（酵素及びポリペプチド（Ｃ）等）の安定性の観点からスルホキシドが好ましい。
溶剤としては、酵素の安定性の観点から、スルホキシド及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｋ）を含むバッファー水溶液である。
【００３６】
ｐＨ調整剤（Ｋ）としては、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
【００３７】
上記工程（ａ）において、反応溶液（Ｘ’）中のポリペプチド（Ｃ）の含有量（重量％）は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、０．００１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜３０である。
反応溶液（Ｘ’）中のリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）の含有量（モル濃度）は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、０．０１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭである。
反応溶液（Ｘ’）中の糖転移酵素（Ｂ１）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド１リン酸−糖（Ａ１）の糖をポリペプチド（Ｃ）に転移させる酵素量を１Ｕと定義する。
反応溶液（Ｘ’）中のリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する酵素量を１Ｕと定義する。
（Ｄ１）が（Ｄ１−２−１）である場合、リボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド２リン酸に変換する酵素の反応溶液（Ｘ’）中の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド１リン酸をリボヌクレオシド２リン酸に変換する酵素量を１Ｕと定義する。
（Ｄ１）が（Ｄ１−２−１）である場合、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する酵素の反応溶液（Ｘ’）中の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する酵素量を１Ｕと定義する。
反応溶液（Ｘ’）の温度は、酵素の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは１０℃〜７０℃である。
反応溶液（Ｘ’）のｐＨは、酵素の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（Ｘ’）において、糖転移酵素（Ｂ１）を作用させる時間は、（Ｂ１）の酵素活性の安定性の観点から、１分〜１，０００時間が好ましい。
【００３８】
反応溶液（Ｘ’）には、必要により、リン酸基含有化合物（Ｆ）、リボヌクレオシド１リン酸−糖を合成する酵素（Ｇ’）及び糖（ａ−１）〜（ａ−７）を含んでもいい。糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、リン酸基含有化合物（Ｆ）、リボヌクレオシド１リン酸−糖を合成する酵素（Ｇ’）及び糖｛（ａ−１）〜（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種｝を含んでいることが好ましい。
【００３９】
酵素（Ｇ’）は、リボヌクレオシド３リン酸及び糖から、リボヌクレオシド１リン酸−糖を合成する酵素であり、具体的には、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素等が挙げられる。
【００４０】
反応溶液（Ｘ’）中のリン酸基含有化合物（Ｆ）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、工程（ａ）で用いるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１）とのミカエリス定数Ｋｍの１／１００倍〜１００，０００倍が好ましく、さらに好ましくは１／１０倍〜１０，０００倍である。
反応溶液（Ｘ’）中の酵素（Ｇ’）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド３リン酸をリボヌクレオシド１リン酸−糖に変換する酵素量を１Ｕと定義する。
反応溶液（Ｘ’）中の糖の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、工程（ａ）で用いる酵素（Ｇ’）とのＫｍの１／１００倍〜１００，０００倍が好ましく、さらに好ましくは１／１０倍〜１０，０００倍である。
【００４１】
また、反応溶液（Ｘ’）には、上記以外に、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を用いてもよい。
脂質（Ｍ）としては、例えば、カルディオピン及びオレイン酸等が挙げられる。
糖類（Ｎ）としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
オリゴ糖（Ｏ）としては、例えば、オリゴヒアルロン酸等が挙げられる。
【００４２】
反応溶液（Ｘ’）中の脂質（Ｍ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
反応溶液（Ｘ’）中の糖類（Ｎ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜３０重量％が好ましい。
反応溶液（Ｘ’）中のオリゴ糖（Ｏ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
【００４３】
本発明の糖修飾ポリペプチドの製造方法は、反応溶液（Ｘ）中で、ポリペプチド（Ｃ）及び下記リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に糖転移酵素（Ｂ２）を作用させて糖修飾ポリペプチドを製造する方法において、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）の存在下で（Ｂ２）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法である。
本発明において、糖修飾ポリペプチドとは、ポリペプチド（タンパク質を含む）に糖が付加（グリコシル化）したものである。
ポリペプチド及びリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に糖転移酵素（Ｂ２）を作用させる際、リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）の存在下で（Ｂ２）を作用させることにより、副生成物として生成したリボヌクレオシド２リン酸がリボヌクレオシド３リン酸に変換されるので、リボヌクレオシド２リン酸が多糖合成酵素（Ｂ２）に結合するのを防ぐことができ、（Ｂ２）の活性が低下しにくく、従来の方法と比較して、糖転移酵素（Ｂ２）の単位酵素あたりの糖修飾ポリペプチドの製造量が多くなる。したがって、少ない酵素量で大量の糖修飾ポリペプチドを製造することが可能である。
【００４４】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）は、トリオース（ａ−１）、テトロース（ａ−２）、ペントース（ａ−３）、ヘキソース（ａ−４）、ヘプトース（ａ−５）、下記単糖（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種の糖（ａ）が有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが下記一般式（６）〜（１０）のいずれか１つの官能基で置換された糖ヌクレオチドである。
【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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糖（ａ−６）：（ａ−１）、（ａ−２）、（ａ−３）、（ａ−４）及び（ａ−５）からなる群より選ばれる単糖において、この単糖が有するプロトン、ヒドロキシル基及びヒドロキシメチル基のうち少なくとも１つが下記置換基（Ｅ）で置換された単糖。
置換基（Ｅ）：カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、スルファート基、メチルエステル基、Ｎ−グリコリル基、メチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、リン酸基及び乳酸基からなる群より選ばれる少なくとも１種の置換基。
単糖（ａ−１）〜（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）は、上述の通りである。
【００４５】
リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）は、上記糖｛（ａ−１）〜（ａ−６）及びこれらの重合体（ａ−７）｝の有する少なくとも１つのヒドロキシル基のプロトンが、上記一般式（６）〜（１０）で置換された糖ヌクレオチド（Ａ２−１）〜（Ａ２−７）である。
（Ａ２−３）として、具体的には、ウリジン２リン酸（以下、ＵＤＰと記載することがある）−キシロース等が挙げられる。
（Ａ２−４）として、具体的には、シチジン２リン酸（以下、ＣＤＰと記載することがある）−グルコース、グアノシン２リン酸−マンノース、グアノシン２リン酸−フコース、アデノシン２リン酸−グルコース、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−ガラクトース及びＵＤＰ−マンノース等が挙げられる。
（Ａ２−６）として、具体的には、ＣＤＰ−シアル酸、ＵＤＰ−グルクロン酸、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＵＤＰ−イズロン酸等が挙げられる。
【００４６】
本発明の製造方法は、（Ａ２）は１種を使用してもよく、２種以上を使用してもいい。
【００４７】
本発明において、ポリペプチド（Ｃ）は、上述のポリペプチド（Ｃ）と同じであり、好ましいものも同様である。
【００４８】
糖転移酵素（Ｂ２）は、上記（Ａ２）とポリペプチド（Ｃ）の存在下で作用させることにより、（Ａ２）の有する糖をポリペプチド（Ｃ）に転移して糖修飾ポリペプチドを合成する活性を有する酵素である。
糖転移酵素（Ｂ２）には、ポリペプチド（Ｃ）を修飾する糖の種類により種々の酵素が知られており、ポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（Ｂ２−１）、ＵＤＰ−ガラクトース−グリコプロテイン−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｂ２−２）、β−ガラクトシド−α−２，６−シアルトランスフェラーゼ（Ｂ２−３）、Ｏ−Ｎ−アセチルグルコサミン−トランスフェラーゼ（Ｂ２−４）、グリコプロテイン−フコシルトランスフェラーゼ（Ｂ２−５）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−ヒドロキシプロリンポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（Ｂ２−６）が含まれる。また、（Ｂ２）には、（Ｂ２−１）〜（Ｂ２−６）以外にも、（Ａ２）とポリペプチド（Ｃ）から糖修飾ポリペプチドを合成する活性を有する酵素が含まれる。
【００４９】
（Ｂ２−１）は、（Ａ２）としてリボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いて、ポリペプチド（Ｃ）にＮ−アセチルグルコサミンを転移し、糖修飾ポリペプチドを合成する活性を有する酵素である。（Ｂ２−１）として、具体的には、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩ（ＥＣ２．４．１．１０１）等が挙げられる。ヒトのＭＧＡＴ１遺伝子などにコードされているのでｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成してクローニングするなどの手法で本遺伝子を発現する大腸菌株を作成することが可能である。
【００５０】
（Ｂ２）として（Ｂ２−１）を用いる場合、糖修飾ポリペプチドの生産効率の観点から、リボヌクレオシド２リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンが好ましい。
【００５１】
上記リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）、ポリペプチド（Ｃ）及び上記糖転移酵素（Ｂ２）は、製造する糖修飾ポリペプチドに応じて適宜選択する。
【００５２】
本発明は、上記ポリペプチド（Ｃ）及び上記リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に上記糖転移酵素（Ｂ２）を作用させて糖修飾ポリペプチドを製造する方法において、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）の存在下で（Ｂ２）を作用させる糖修飾ポリペプチドの製造方法である。
【００５３】
リボヌクレオシド２リン酸は、リボヌクレオシドのピロリン酸エステル化物であり、（Ｃ）及び（Ａ２）に（Ｂ２）を作用させた際に副生成物として生成する。例えば、（Ａ２）がＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンである場合、リボヌクレオシド２リン酸としてＵＤＰが生成する。
リボヌクレオシド２リン酸として具体的には、ＵＤＰ（ウリジン５’−二リン酸）、アデノシン２リン酸（アデノシン５’−二リン酸）、リボチミジン−２リン酸（リボチミジン５’−二リン酸）、ＣＤＰ（シチジン５’−二リン酸）及びグアノシン２リン酸（グアノシン５’−二リン酸）等が挙げられる。
【００５４】
リボヌクレオシド３リン酸は、リボヌクレオシドのトリリン酸エステル化物である。リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する際、リボヌクレオシド部分は同じである。例えば、リボヌクレオシド２リン酸がＵＤＰであれば、リボヌクレオシド３リン酸はウリジン３リン酸である。
リボヌクレオシド３リン酸として具体的には、ウリジン３リン酸（ウリジン５’−三リン酸）、アデノシン３リン酸（アデノシン５’−三リン酸）、リボチミジン−３リン酸（リボチミジン５’−三リン酸）、シチジン３リン酸（以下、ＣＴＰと記載することがある。シチジン５’−三リン酸）及びグアノシン３リン酸（グアノシン５’−三リン酸）等が挙げられる。
【００５５】
リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）は、リン酸基を有する化合物から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移させてリボヌクレオシド３リン酸とする反応を触媒する酵素である。（Ｄ２）として、具体的には、アデノシンキナーゼ（２個のヌクレオシド２リン酸分子からヌクレオシド１リン酸及びヌクレオシド３リン酸を合成する酵素）、ヌクレオシド２リン酸キナーゼ（ヌクレオシド３リン酸からヌクレオシド２リン酸にリン酸基を転移する酵素）、ポリリン酸キナーゼ（リボヌクレオシド２リン酸とポリリン酸とから、リボヌクレオシド３リン酸と、重合度の１つ少ないポリリン酸とを生成する活性を有する酵素）、アルギニンキナーゼ（リボヌクレオシド２リン酸とω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンからリボヌクレオシド３リン酸とＬ−アルギニンを生成する活性を有する酵素）、ピルビン酸キナーゼ（リボヌクレオシド２リン酸とホスホエノールピルビン酸からリボヌクレオシド３リン酸とピルビン酸を生成する活性を有する酵素）、カルバミン酸キナーゼ（カルバモイルリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸、二酸化炭素、及びアンモニアを生成する活性を有する酵素）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（３−ホスホグリセロールリン酸とリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及び３−ホスホグリセリン酸を生成する活性を有する酵素）、ホスホクレアチンキナーゼ（ホスホクレアチンとリボヌクレオシド２リン酸からリボヌクレオシド３リン酸及びクレアチンを生成する活性を有する酵素）等が挙げられる。
【００５６】
リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）を作用させる際、必要により、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を与えるリン酸基含有化合物（Ｆ）を用いてもいい。（Ｆ）はリン酸基を有する化合物である。（Ｆ）としては、（Ｄ２）の基質特異性の観点から、リボヌクレオシド２リン酸にリン酸基を供与し得る化合物が好ましい。（Ｆ）としては、例えば、トリアミノホスフィンオキシド、リン酸化したアミノ酸（例えばω−ホスホノ−Ｌ−アルギニン等）、ポリリン酸、ホスホエノールピルビン酸、カルバモイルリン酸、３−ホスホグリセロールリン酸、ホスホクレアチン及びヌクレオシド３リン酸（例えばグアノシン３リン酸、アデノシン３リン酸等のヌクレオシド３リン酸等）等が挙げられる。
【００５７】
リン酸基含有化合物（Ｆ）を用いる場合、（Ｄ２）と（Ｆ）との組み合わせとしては、ヌクレオシド２リン酸キナーゼとヌクレオシド３リン酸との組み合わせ、ポリリン酸キナーゼとポリリン酸との組み合わせ、アルギニンキナーゼとω−ホスホノ−Ｌ−アルギニンとの組み合わせ、ピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸との組み合わせ、カルバミン酸キナーゼとカルバモイルリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ、ホスホグリセリン酸キナーゼと３−ホスホグリセロールリン酸との組み合わせ、ホスホクレアチンキナーゼとホスホクレアチンとの組み合わせが好ましい。
【００５８】
本発明においては、リボヌクレオシド２リン酸を効率よくリボヌクレオシド３リン酸に変換する及び糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、下記ミカエリス定数Ｋｍが下記阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であることが好ましい。
ミカエリス定数Ｋｍ：リボヌクレオシド２リン酸を基質とし、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有する酵素（Ｄ２）を酵素とし、リン酸基含有化合物（Ｆ）を作用させてリボヌクレオシド３リン酸を合成する反応におけるミカエリス定数。
阻害濃度ＩＣ50：糖転移酵素（Ｂ２）をポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、反応溶液（Ｘ）の重量を基準とした糖転移酵素（Ｂ２）の濃度において、基質としてリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）を用いて、阻害剤としてリボヌクレオシド２リン酸を用いて求めた、（Ｂ２）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度。
本発明において、２種以上の（Ｄ２）を用いる場合、ミカエリス定数Ｋｍが阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満とは、それぞれの（Ｄ２）についてミカエリス定数Ｋｍを求め、全ての（Ｄ２）についてミカエリス定数Ｋｍが阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であるとする。
また、２種以上の（Ｂ２）を用いる場合は、それぞれの（Ｂ２）について阻害濃度ＩＣ50を求め、ミカエリス定数Ｋｍが、求めた阻害濃度ＩＣ50の中で最も大きい阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であるとする。
【００５９】
阻害濃度ＩＣ50は、酵素反応初速度の阻害剤濃度依存性を求めることによって求められる。具体的には、下記阻害濃度ＩＣ50の測定法によって求めたものである。阻害濃度ＩＣ50の測定に用いる（Ｂ２）の形態としては、精製酵素を用いる。
【００６０】
阻害濃度ＩＣ50は、本発明の製造方法において、糖転移酵素（Ｂ２）をポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、（Ｂ２）を作用させる際の濃度と同様の（Ｂ２）の濃度、温度及びｐＨの条件下において、下記測定方法によって求められる。
＜（Ｂ２）の酵素活性が半減するときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度である阻害濃度ＩＣ50の測定方法＞
一定量の糖転移酵素（Ｂ２）、ポリペプチド（Ｃ）、リボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）、リボヌクレオシド２リン酸、ｐＨ調整剤（Ｋ）及び水を含む一定の温度及びｐＨに調製した液量１ｍＬ以下の酵素反応溶液（Ｙ）を作成する。
酵素反応溶液（Ｙ）の温度は、糖転移酵素（Ｂ２）を作用させる温度と同じの温度を選ぶ。
酵素反応溶液（Ｙ）のｐＨは、糖転移酵素（Ｂ２）を作用させるｐＨと同じのｐＨを選ぶ。
酵素反応溶液（Ｙ）中の糖転移酵素（Ｂ２）のモル濃度は、本発明の製造方法において、糖転移酵素（Ｂ２）をポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に作用させる工程の開始時から終了時までのいずれかの時点での、糖転移酵素（Ｂ２）を作用させる濃度に調整する。
酵素反応溶液（Ｙ）中のリボヌクレオシド２リン酸の含有量（モル濃度）は、リボヌクレオシド２リン酸が０Ｍの酵素反応溶液（Ｙ）、及びリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍから糖転移酵素（Ｂ２）の活性が０になる（糖修飾ポリペプチドの生成が観測できなくなる）リボヌクレオシド２リン酸の濃度との間で、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる４種類以上の酵素反応溶液（Ｙ）、合計５種類以上の酵素反応溶液（Ｙ）を作成すればいい。また、類似の糖転移酵素（Ｂ２）に対するリボヌクレオシド２リン酸の阻害定数Ｋｉが分かっている場合は、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が０Ｍのもの、類似の糖転移酵素（Ｂ２）のＫｉ未満で０Ｍより大きい濃度範囲で２種類以上、Ｋｉ以上及びＫｉの１０倍以下の濃度範囲で２種類以上、合計５種類以上作成すればいい。
酵素反応溶液（Ｙ）中のポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）の含有量は、経時的なピーク面積変化を観測できる濃度を１点選べばよい。測定に使用する（Ｂ２）と類似の糖転移酵素のミカエリス定数Ｋｍが分かっている場合は、Ｋｍ以上及びＫｍの５倍以下の濃度範囲の間で選べばよい。
酵素反応溶液（Ｙ）に用いるｐＨ調整剤（Ｋ）は、扱いやすさ及び酵素の安定性の観点から、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳバッファー及びＭＥＳバッファー等のＧｏｏｄバッファーが好ましい。酵素反応溶液（Ｙ）中の（Ｋ）の含有量（モル濃度）は、１００〜５００ｍＭである。
酵素反応溶液（Ｙ）について、（Ｙ）を作成直後及び一定時間（例えば５分）ごとに溶液の一部（例えば１００μＬ）を取り出し、取り出したものを１００℃で1分間熱処理し、酵素反応を停止する。液体クロマトグラフィーを用いて取り出した反応溶液中の糖修飾ポリペプチドの量を定量する。酵素反応溶液（Ｙ）を作成直後のピーク面積をＰ0、ｈ時間後のピーク面積をＰhとし、ピーク面積の変化ΔＰ（ΔＰ＝Ｐh−Ｐ0）と糖修飾ポリペプチドのピーク面積に対する検量線を用いて酵素反応初速度ｖ（Ｍ／ｓ）を算出する。
さらに、リボヌクレオシド２リン酸の濃度が異なる酵素反応溶液（Ｙ）を用いて、同様に測定し、酵素反応初速度ｖを算出する。
阻害濃度ＩＣ50は、横軸に（ｘ軸）にそれぞれのリボヌクレオシド２リン酸の濃度、縦軸（ｙ軸）にリボヌクレオシド２リン酸の濃度が０の時の酵素反応初速度ｖを１００（％）としたときの相対活性をプロットする。プロットを直線でつなぎ、ｙ＝５０（％）となるときのリボヌクレオシド２リン酸の濃度を阻害濃度ＩＣ50とする。
【００６１】
本発明において、リボヌクレオシド２リン酸を効率よくリボヌクレオシド３リン酸に変換する及び糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、ミカエリス定数Ｋｍは、阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満が好ましく、さらに好ましくは１０倍以下である。
【００６２】
リボヌクレオシド２リン酸の（Ｄ２）に対するミカエリス定数Ｋｍが、リボヌクレオシド２リン酸の糖転移酵素（Ｂ２）に対する阻害濃度ＩＣ50の１００倍未満であることで、リボヌクレオシド２リン酸がリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有する酵素（Ｄ２）に触媒されてリボヌクレオシド３リン酸を効率よく合成できる。また、反応溶液（Ｘ）中に、リボヌクレオシド３リン酸及び糖から、リボヌクレオシド２リン酸−糖を合成する酵素（Ｇ）を含んでいれば、合成されたリボヌクレオシド３リン酸からリボヌクレオシド２リン酸−糖を合成することができる。さらに、合成されたリボヌクレオシド２リン酸−糖がポリペプチド（Ｃ）と反応し、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造することができる。
例えば、無精製のリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）及びポリペプチド（Ｃ）に糖転移酵素（Ｂ２）を作用させる際に、ミカエリス定数Ｋｍが阻害濃度ＩＣ50の１００倍（Ｋｍ＝１００×ＩＣ50）である（Ｄ２）と糖転移酵素（Ｂ２）とが等モル量存在している場合、（Ｄ２）に触媒されるリボヌクレオシド２リン酸のモル量は、糖転移酵素（Ｂ２）と結合するリボヌクレオシド２リン酸のモル量のおよそ１００分の１程度であると推察される。
【００６３】
本発明の糖修飾ポリペプチドの製造方法は、ポリペプチド（Ｃ）及びリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）に糖転移酵素（Ｂ２）を作用させる際に、リボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する活性を有するリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）を存在させるものであれば、制限なく実施できる。
本発明の製造方法の一例は、下記工程（ａ）〜（ｂ）を含むものである。
工程（ａ）：所定のリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）、ポリペプチド（Ｃ）糖転移酵素（Ｂ２）、リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）及び溶剤（Ｈ）を混合して反応溶液（Ｘ）とし、所定の温度、所定のｐＨに調整し、反応を行う。反応溶液（Ｘ）には、必要により、リン酸基含有化合物（Ｆ）、リボヌクレオシド２リン酸−糖を合成する酵素（Ｇ）及び糖（ａ−１）〜（ａ−７）を含んでもいい。さらに、必要により、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）等を含んでもいい。
工程（ｂ）：糖修飾ポリペプチドをカラムクロマトなどを用いることにより精製する。
【００６４】
上記工程（ａ）において、溶剤（Ｈ）としては、水、有機溶剤及びこれらの混合物が含まれる。
水としては、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。また、水中に、後述するｐＨ調整剤（Ｋ）を含むバッファー水溶液等が挙げられる。
有機溶剤としては、アルコール（炭素数１〜１８のアルコールが挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等）、ケトン（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル（テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールモノアルキルエーテル、プロピレングリコールモノアルキルエーテル、環状エーテル等）、スルホキシド（ジメチルスルホキシド等）、脂肪族または脂環式炭化水素（ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ミネラルスピリット、シクロヘキサン等）及びふっ素含有化合物（テトラフルオロエチレン等）等が挙げられる。これらの有機溶剤のうち、タンパク質の安定性の観点からスルホキシドが好ましい。
溶剤としては、酵素の安定性の観点から、スルホキシド及び水が好ましく、さらに好ましくは水であり、特に好ましくはｐＨ調整剤（Ｋ）を含むバッファー水溶液である。
【００６５】
ｐＨ調整剤（Ｋ）としては、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられる。
【００６６】
上記工程（ａ）において、反応溶液（Ｘ）中のポリペプチド（Ｃ）の含有量（重量％）は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、０．００１〜５０が好ましく、さらに好ましくは０．１〜３０である。
反応溶液（Ｘ）中のリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）の含有量（モル濃度）は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、０．０１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜１０ｍＭである。
反応溶液（Ｘ）中の糖転移酵素（Ｂ２）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸−糖（Ａ２）の糖をポリペプチド（Ｃ）に転移させる酵素量を１Ｕと定義する。
反応溶液（Ｘ）中のリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μｍｏｌのリボヌクレオシド２リン酸をリボヌクレオシド３リン酸に変換する酵素量を１Ｕと定義する。
反応溶液（Ｘ）の温度は、酵素の安定性の観点から、０℃〜１００℃が好ましく、さらに好ましくは１０℃〜７０℃である。
反応溶液（Ｘ）のｐＨは、酵素の安定性の観点から、ｐＨ２〜１２が好ましく、さらに好ましくはｐＨ４〜９である。
反応溶液（Ｘ）において、糖転移酵素（Ｂ２）を作用させる時間は、（Ｂ２）の酵素活性の安定性の観点から、１分〜１，０００時間が好ましい。
【００６７】
反応溶液（Ｘ）には、必要により、リン酸基含有化合物（Ｆ）、リボヌクレオシド２リン酸−糖を合成する酵素（Ｇ）及び糖（ａ−１）〜（ａ−７）を含んでもいい。糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、リン酸基含有化合物（Ｆ）、リボヌクレオシド２リン酸−糖を合成する酵素（Ｇ）及び糖｛（ａ−１）〜（ａ−７）からなる群より選ばれる少なくとも１種｝を含んでいることが好ましい。
【００６８】
酵素（Ｇ）は、リボヌクレオシド３リン酸及び糖から、リボヌクレオシド２リン酸−糖を合成する酵素であり、具体的には、ＵＴＰ−モノサッカリド−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ等が挙げられる。
【００６９】
反応溶液（Ｘ）中のリン酸基含有化合物（Ｆ）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、工程（ａ）で用いるリボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）とのミカエリス定数Ｋｍの１／１００倍〜１００，０００倍が好ましく、さらに好ましくは１／１０倍〜１０，０００倍である。
反応溶液（Ｘ）中の酵素（Ｇ）の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、１〜１０7Ｕ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは１０〜１０4Ｕ／Ｌである。但し、１分間に１μmolのリボヌクレオシド３リン酸をリボヌクレオシド２リン酸−糖に変換する酵素量を１Ｕと定義する。
反応溶液（Ｘ）中の糖の含有量は、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造する観点から、工程（ａ）で用いる酵素（Ｇ）とのミカエリス定数Ｋｍの１／１００倍〜１００，０００倍が好ましく、さらに好ましくは１／１０倍〜１０，０００倍である。
【００７０】
また、反応溶液（Ｘ）には、上記以外に、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、脂質（Ｍ）、糖類（Ｎ）及びオリゴ糖（Ｏ）を用いてもよい。
脂質（Ｍ）としては、例えば、カルディオピン及びオレイン酸等が挙げられる。
糖類（Ｎ）としては、例えば、グリセリン等が挙げられる。
オリゴ糖（Ｏ）としては、例えば、オリゴヒアルロン酸等が挙げられる。
【００７１】
反応溶液（Ｘ）中の脂質（Ｍ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
反応溶液（Ｘ）中の糖類（Ｎ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜３０重量％が好ましい。
反応溶液（Ｘ）中のオリゴ糖（Ｏ）の含有量（重量％）は、酵素の安定化及び酵素の活性化の観点から、０〜１重量％が好ましい。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７３】
＜製造例１＞
糖転移酵素（Ｂ１）であるβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼは、参考文献１［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７７）Ｖｏｌ．２５２，Ｎｏ．７，ｐ２３５６−２３６２］の記載に準じて精製し、β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ溶液（Ｂ１）を得た。
【００７４】
＜製造例２＞
ポリペプチド（Ｃ）であるシアル酸が結合していないポリペプチド（シアル酸未修飾ポリペプチド）は参考文献２［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９６７）Ｖｏｌ．１０４，ｐ３６１−３６８］の記載に準じて精製した。
【００７５】
＜製造例３＞
リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ２）であるシュードモナス属由来のポリリン酸キナーゼ（配列番号１）のアミノ酸配列をコードする遺伝子をｐＥＴ−２２ｂ遺伝子に導入して、参考文献３［国際公開第ＷＯ２０１０／１３７６２４号パンフレット］の記載に準じて発現、培養及び精製した。得られたポリリン酸キナーゼ溶液の精製後の活性は１ｍＵ／ｍｌであった。（１分間に１μｍｏｌのＣＤＰをＣＴＰに変換する活性を１Ｕと定義する。）
【００７６】
＜製造例４＞
アラビドプシス由来のＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼ（配列番号２）のアミノ酸配列をコードする遺伝子をｐＥＴ−２２ｂ遺伝子に導入して参考文献３の記載に準じて発現、培養及び精製した。得られたＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼ溶液の精製後の活性は１ｍＵ／ｍｌであった。（１分間に１μｍｏｌのＣＭＰとＣＴＰとを２μｍｏｌのＣＤＰに変換する活性を１Ｕと定義する。）
【００７７】
＜比較例１＞
溶液Ｉ［｛ＣＭＰ−シアル酸（14Ｃでラベルした放射性同位体を含むＣＭＰ−シアル酸、ＣＭＰ−[14Ｃ]ＮｅｕＡｃ、１０，０００ｃｐｍ）｝５０ｎｍｏｌ、製造例２で得たシアル酸未修飾ポリペプチド０.２ｍｇ（反応点７７ｎｍｏｌ）、リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）５μｍｏｌ及び０．５ｍＭのＣＭＰを含む溶液］４０μｌに、製造例１で製造したβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ溶液（Ｂ１）５μｌを加えて反応溶液（Ｚ’１）とし、３７℃で１５分反応を行った。反応停止液５００μｌ（５重量％リン・タングステン酸、１５重量％トリクロロ酢酸を含む水溶液）で反応停止後、０．４５μｍの精密ろ過フィルムを用いて未反応のＣＭＰ−[14Ｃ]ＮｅｕＡｃからポリペプチドを分離し、１ｍｌの反応停止液で２回洗った後、膜に残った放射性同位体量を液体シンチレーションカクテルを用いて測定して、ポリペプチドに転移したシアル酸の量を算出した。１０ｐｍｏｌ転移していた。
【００７８】
＜実施例１＞
比較例１において、反応溶液（Ｚ’１）中に、製造例４で生産したＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼ溶液２０μｌ、ＣＴＰを０．１ｎｍｏｌ、製造例３で得たポリリン酸キナーゼ溶液（Ｄ２１）を２０μｌ、ポリリン酸（ナカライテスク社製、「テトラポリりん酸ナトリウム」）１０μｍｏｌを加えて反応溶液（Ｘ’−１）としたこと以外は同様に行った。ポリペプチドに転移したシアル酸の量は０．５ｎｍｏｌであった。
【００７９】
リボヌクレオシド３リン酸合成酵素（Ｄ１）（ＵＭＰ／ＣＭＰキナーゼとポリリン酸キナーゼとの組み合わせ）を含む本発明の実施例１は、（Ｄ１）を含まない比較例１と比較して、糖転移酵素（Ｂ）の量が同じであるにもかかわらず、ポリペプチドに転移した糖の量が５０倍であり、単位酵素あたりの糖修飾ポリペプチドの製造量が多いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の製造方法によれば、糖修飾ポリペプチドを効率よく製造することができ、本発明の製造方法により得られた糖修飾ポリペプチドは、化粧品、医薬部外品、医薬品、医療機器及び食品等に用いることができる。
【配列表】
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