(57)【要約】【課題】タンパク質等の生体高分子の吸着量が大きく、且つ、分離能に優れたアニオン交換体を提供すること。【解決手段】  クロマトグラフィー用担体にジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合することによる。【選択図】図１
2013136025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材にジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合したアニオン交換体。
【請求項２】
基材が、無機材料、多糖類及び合成高分子からなる群よりえらばれることを特徴とする請求項１に記載のアニオン交換体。
【請求項３】
基材の形状が、球状粒子、非球状粒子、膜、又はモノリス（連続体）であることを特徴とする請求項１乃至請求項２に記載のアニオン交換体。
【請求項４】
エポキシ基及び／又はハロゲン基を有する基材にジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合することにより得られることを特徴とするアニオン交換体の製造方法。
【請求項５】
基材にジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合したアニオン交換体を充填してなる液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質等の生体高分子分離、精製用のアニオン交換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アニオン交換体は、微粒子表面の官能基にアニオン交換基を直接結合させて製造するのが一般的である。例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類の架橋微粒子、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト等の無機系微粒子、又は、アクリルポリマー、スチレンポリマー等のポリマー系微粒子の表面に、水酸基、エポキシ基又はアルキルハロゲン基等を導入しておき、これにアニオン交換性を有する窒素化合物を導入する方法が知られている。
【０００３】
アニオン交換体におる工業スケールでの生体高分子（タンパク質）の分離や精製では、アニオン交換体をカラムに充填し、液体クロマトグラフィーの方法が使用されることが多いが、この場合には大容量の培養液を可能な限り小さいカラムで処理すべく、吸着量の大きいイオン交換体が望まれる。しかし、前記したような従来方法で製造されたアニオン交換体はたんぱく質の吸着量が少ない。そこで特許文献１では、アニオン交換基を有するポリマー鎖を粒子表面に導入し、粒子表面で多層にわたってタンパク質を吸着するアニオン交換体とその製造方法を提案している。ここで、ポリマー鎖を粒子等の表面に導入する方法としては特許文献２から特許文献６に記載された方法等が知られている。これらは具体的には、導入するポリマー鎖に架橋性の官能基を有する単量体を共重合させておく方法、放射線を照射したり、粒子表面の水酸基をラジカル開始点としてセリウム塩やマンガン塩等を用いて該表面にポリマー鎖を成長させる方法（グラフト重合法）、粒子表面に不飽和基を導入しモノマー溶液中で重合してポリマー鎖を導入する方法、ポリマー鎖の重合末端に官能基を導入し粒子表面の官能基と結合させる方法等である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】アメリカ特許第５４５３１８６号公報
【特許文献２】アメリカ特許第３７２３３０６号公報
【特許文献３】アメリカ特許第４１３７１３７号公報
【特許文献４】アメリカ特許第４２９８６９８号公報
【特許文献５】アメリカ特許第４６０５６８５号公報
【特許文献６】アメリカ特許第４７２８６７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質の吸着量が大きなイオン交換体を製造する方法として、前記のようなグラフト重合法をはじめとして、アニオン交換基を有するポリマー鎖を粒子表面に導入する方法が知られているが、これら従来の方法で製造したアニオン交換体は、その表面に直鎖状のポリマー鎖を有しているために、カラム充填して液体クロマトグラフィーで用いた場合には操作圧力が高くなり、高流速での使用が困難となるという課題がある。
そこで本発明の目的は、上記のような従来のアニオン交換体に見られる課題を解決した、タンパク質等の生体高分子の吸着量が大きく、且つ、カラムに充填して用いた場合にも操作圧力の上昇がおこらず、高流速での使用が可能なアニオン交換体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行った結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、基材にジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合したアニオン交換体である。また本発明は、エポキシ基及び／又はハロゲン基を有する基材にジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合することにより得られることを特徴とするアニオン交換体の製造方法である。そして本発明は、基材にジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合したアニオン交換体を充填してなる液体クロマトグラフィー用カラムである。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明のアニオン交換体を構成する基材としては、有機系のものやや無機系のものを用いることができ、多孔質でも非多孔質でも良い。また、基材の形状としては球状粒子、非球状粒子、膜、モノリス（連続体）等を例示できる。基材の形状を粒子状とする場合、その大きさは、アニオン交換体の使用条件によって適宜決定することが好ましい。例えば、液体クロマトグラフィー用の充填剤として用いる場合は、平均粒子径が通常５〜１５μｍ、少量分取を目的とする場合には１５〜５０μｍ、工業プロセスで使用する目的では５０〜３００μｍ程度とすることが例示できる。
【０００８】
有機系基材としては、例えば単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーを共重合したものや、架橋多糖類微粒子を挙げることができる。単官能ビニルモノマーとしては２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキルエステル、グリシジル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸グリシジルエステル、３−クロロ−２−ヒドロキシ（メタ）アクリレート、３−ブロモプロピル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸ハロゲン化アルキルエステル、アクリル酸、メタクリル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸エステル、クロロメチルスチレン、ビニルベンジルアルコール、ビニルベンジルグリシジルエーテル、ヒドロキシスチレンなどのスチレン誘導体、酢酸ビニル等を具体的に例示できる。また、多官能ビニルモノマーとしてはエチレングリコールジ（メタ）アクリル酸エステル、グリセロールジ（メタ）アクリル酸エステル等のポリオール（メタ）アクリル酸エステル、ジビニルベンゼン、トリアリルイソシアヌレート等を具体的に例示できるが、これらに限定されない。また、架橋多糖微粒子の多糖としては、セルロース、アガロース、デキストラン、マンノース等を例示でき、無機系基材としては、シリカ、ゼオライト、チタニア、アルミナ等を例示できるが、これらに限定されない。
【０００９】
本発明で使用するジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマーとしては、市販の製品を使用することができ、例えばカチオマスター  ＰＤ−３０（商品名、四日市合成(株)製）、カチオマスター  ＰＤＴ−２（商品名、四日市合成(株)製）を例示することができるが、これらに限定されない。また本発明で使用するジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーとしては、市販の製品を使用することができ、例えば、カチオマスター  ＰＥ−３０（商品名、四日市合成(株)製）、カチオマスター  ＰＥ−１０（商品名、四日市合成(株)製）およびポリ（ジメチルアミン−ｃｏ−エピクロロヒドリン−ｃｏ−エチレンジアミン）溶液（アルドリッチ製）を例示することができるが、これらに限定されない。
【００１０】
基材に結合するジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及びジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーは、それらポリマー中の水酸基及び／又はアミノ基を利用して基材に結合させる。例えば水酸基を持つ基材であればエピクロロヒドリンや多官能エポキシ化合物等でエポキシ基を導入したり、ハロゲン基を導入することにより、上記ポリマーと結合することができるが、これらに限定されない。
【００１１】
多官能エポキシ化合物の具体例としては、（ポリ）グリセロールポリグリシジルエーテル、（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル等を例示できるが、これらに限定されない。エピクロロヒドリンを水酸基を持つ基材と反応させ、エポキシ基を生成させるための反応剤としては、アルカリ金属水酸化物を例示できる。具体的には、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を例示できる。また、多官能エポキシ化合物を水酸基を持つ基材と反応させる触媒としてはアルカリ金属水酸化物を例示できる。具体的には、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を例示できるが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明のアニオン交換体は、エポキシ基またはハロゲン基を導入した基材を水溶液中に分散させておき、ここにジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマー溶液を添加し、触媒としてアルカリ金属水酸化物を添加することで調製することができる。なお、ジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合させた基材を未反応のポリマーや触媒から分離するために、例えば塩酸水溶液や純水で洗浄することが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、このアニオン交換体をカラムに充填して溶離液のＮａＣｌ濃度リニアーグラジエントでタンパク質を溶出させると、従来の四級アンモニウム基や三級アンモニウム基を導入したイオン交換体に比べて、タンパク質等の吸着量が大きく、且つ、タンパク質の溶出領域が広がり、不純物を容易に分離することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明のアニオン交換体の製造方法等について、その一形態を説明する。
【００１５】
本発明のアニオン交換体の製造においては、エポキシ基を導入した担体を純水とジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーに分散させる。触媒としてアルカリ金属水酸化物を添加して、３０〜１００℃に加熱する。ジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー及び／又はジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマーを結合させた担体は未反応のポリマーや触媒を除くために塩酸水溶液や純水で洗浄する。
【００１６】
以下、実施例に基づいて本発明のアニオン交換体をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
BSAの吸着量の測定法（参考例１）
本発明の実施例及び比較例のアルブミン、ウシ血清由来（和光純薬工業製、一級）、（以降ＢＳＡと略記する。）吸着量を測定するための操作について説明する。
【００１７】
１１Ｇ４グラスフィルターに５ｍＬ程度のアニオン交換体を測りとり、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．５で分散、ろ過を３回繰り返す。次に上部にシリコンチューブを取り付けた１ｍＬファンネル管に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．５でスラリー状態のアニオン交換体を吸引しながらシリコンチューブに充填する。ファンネル管からシリコンチューブを取り外し、ファンネル管上部のアニオン交換体をミクロスパーティルですり切り、アニオン交換体１ｍＬの重量を求める。量り取ったアニオン交換体を１５ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．５で２００ｍＬ共栓付三角フラスコに流し入れる。ＢＳＡを２５ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．５に溶解した溶液７．５ｍＬを加え、２５℃水浴中で３時間振盪する。また、ファンネル管上部のシリコンチューブ内に残ったアニオン交換体からアニオン交換体中の含液率を加熱乾燥式水分計で求め、秤量したアニオン交換体１ｍＬ中の水溶液量を求める。
【００１８】
３時間振盪吸着した液の上清を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．５で１０ｍＬメスフラスコに希釈して赤外分光光度計で２８０ｎｍの吸光度を求める。また、２５ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．５に溶解したＢＳＡ溶液１．５ｍＬを２５ｍＬメスフラスコに５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．５で希釈し、１．５ｍｇ／ｍＬとして２８０ｎｍの吸光度からＢＳＡの吸光度係数を求める。ＢＳＡ吸着測定時の液量、吸着後上清の希釈率、２８０ｎｍの吸光度及び吸光度係数から上清中のＢＳＡ量を定量し、添加したＢＳＡ量から差し引いて吸着量を求める。
【００１９】
実施例１  
パドル型４枚羽根（６ｃｍ長）と温度計測用熱電対を備えた０．３Ｌセパラブルフラスコにビニルポリマーを基材としたＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−６５Ｍ（４０−９０μｍ）（東ソー(株)製）を水サクションドライ状態で６０．０ｇ秤量し、純水３２．０ｇ、エピクロロヒドリン３４．３ｇを添加した。４５℃に加熱しながら攪拌し、４８％ＮａＯＨ２９．２ｇをチューブポンプを用いて２時間で滴下し、滴下終了後４５℃で、さらに２時間保持した。グラスフィルターを用いて純水で洗浄後、サクションドライゲル２０．０ｇを１００ｍＬセパラブルフラスコに秤量し、ジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマー（四日市合成(株)製  製品名ＰＤ−３０）２０．０ｇを添加して、４０℃で攪拌した。１５分後、４８％ＮａＯＨ３．２ｇを添加し、１６時間攪拌した。グラスフィルターを用いて純水で未反応ジメチルアミン・エピクロロヒドリン系ポリマーとＮａＯＨを除去し、次いで０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、さらにろ液のｐＨが中性になるまで純水で洗浄した。このアニオン交換体のイオン交換容量は０．０７ｍｅｑ／ｍＬであった。参考例１に示した方法で測定したＢＳＡの吸着量は１３６ｍｇ/ｍＬであった。
【００２０】
以上のようにして得られたアニオン交換体を６ｍｍＩ．Ｄ．×３．５ｃｍＬカラムに充填し、クロマトグラフィーシステム（製品名、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））を使用して、測定波長２８０ｎｍ、サンプル１０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（和光純薬製）、サンプル注入量１００マイクロリットル、流速＝１ｍＬ／分、溶離液Ａ＝２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．５、溶離液Ｂ＝２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．０Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ＝７．５，グラジエント＝６０分かけて溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアーグラジエントでＢＳＡを溶出させた。図１にＢＳＡの溶出クロマトグラムを示す。ＢＳＡ中の不純物（凝集体）が分離されている。
【００２１】
実施例２  
実施例１で用いたジメチルアミン・エピクロロヒドリンポリマーをジメチルアミン・エチレンジアミン・エピクロロヒドリンポリマー（四日市合成（株）製  製品名ＰＥ−３０）に代えた以外は実施例１と同様の方法で行った。このアニオン交換体のイオン交換容量は０．１２ｍｅｑ／ｍＬであった。参考例１に示した方法で測定したＢＳＡの吸着量は１４６ｍｇ/ｍＬであった。
以上のようにして得られたアニオン交換体を実施例１と同様に６ｍｍＩ．Ｄ．×３．５ｃｍＬカラムに充填し、タンパク質をＮａＣｌの濃度リニアーグラジエントで溶出させた。図２にＢＳＡの溶出クロマトグラムを示す。ＢＳＡ中の不純物（凝集体）が分離されている。
【００２２】
比較例１
第四級アンモニウム基を導入したイオン交換体ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＱＡＥ−５５０Ｃ（５０−１５０μｍ）（東ソー(株)製）を実施例１と同様のカラムに充填し、ＢＳＡの溶出を行った。図３に溶出クロマトグラムを示す。ＢＳＡ中の不純物（凝集体）が分離できていない。参考例１に示した方法で測定したＢＳＡの吸着量は７２ｍｇ/ｍＬであった。
【００２３】
比較例２
第四級アンモニウム基を導入したイオン交換体ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ（４０−９０μｍ）（東ソー(株)製）を実施例１と同様のカラムに充填し、ＢＳＡの溶出を行った。ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍは保持力が弱かったためグラジエント時間を１２０分にて実施した。図４に溶出クロマトグラムを示す。ＢＳＡ中の不純物（凝集体）が分離できていない。参考例１に示した方法で測定したＢＳＡの吸着量は１５５ｍｇ/ｍＬであった。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１にて得られたクロマトグラムである。
【図２】実施例２にて得られたクロマトグラムである。
【図３】比較例１にて得られたクロマトグラムである。
【図４】比較例２にて得られたクロマトグラムである。
【図１】
2013136025.tif 000003
【図２】
2013136025.tif 000004
【図３】
2013136025.tif 000005
【図４】
2013136025.tif 000006