(57)【要約】      （修正有）【課題】酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する心血管病予防薬等の提供。【解決手段】下記式（１）：2013136548.tif 000005で示されるエピガロカテキン（３’−Ｏ−メチル）ガレートの使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2013136548.tif 000004
で示されるエピガロカテキン（３’−Ｏ−メチル）ガレートを有効成分とする酸化ＬＤＬ結合阻害剤。
【請求項２】
酸化低密度リポ蛋白質以外のリガンドを介したＬＯＸ−１結合抑制作用を有する請求項１記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する食品組成物。
【請求項４】
請求項１又は２記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する心血管病予防又は治療薬。
【請求項５】
請求項１又は２記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する癌の予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）への酸化ＬＤＬの結合を阻害する薬剤、及び該阻害剤を含有する食品組成物、並びに心血管病又は癌の予防又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本をはじめとする東アジアでは急激な社会の高齢化が進んでいる。さらに、医療技術の向上、国民の長寿化に伴い、医療費の中心は従来の急性疾患より、慢性疾患の治療へとシフトしつつある。
【０００３】
日本国厚生労働省の最近の人口動態統計によると、日本における疾患別死亡者の１位が悪性新生物（腫瘍及び癌）、２位が心疾患、３位が脳血管疾患となっているが、心疾患と脳血管疾患による死亡者の合計は全体の約２７％であり、これは悪性新生物の死亡者割合である約３０％にほぼ匹敵する（平成２０年(２００８年)）。悪性新生物の対処方法に関しては、その発症プロセスから考慮すると早期発見・早期治療が重要であり、臨床学的なアプローチが望ましいとされる。一方、心疾患・脳血管疾患については、生活習慣病に起因する、慢性的な疾患である肥満症・動脈硬化症の下流に位置する疾患であり、その治療も長期間わたるものである。つまり、先に述べたように医療出費の中心が慢性疾患の治療へとシフトしていることが統計的にも現れている。
【０００４】
慢性的な疾患に対しては治療法として、長期投薬による治療と日常生活習慣への指導という形での対処法が一般的であるが、疾患の特性から、日常的に摂取可能な形態を用いる食品からの予防学的なアプローチが可能なプロセスであり、むしろ、このようなプロセスでの対処方法が望ましい。
【０００５】
心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患の危険因子として、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が知られている。元来ＬＤＬは血漿脂質の運搬に必要な脂質蛋白質複合体であるが、酸化を受け易い不飽和脂肪酸を多く含み、容易に酸化的修飾を受ける。この酸化型のＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）が血管内皮細胞の機能変化を引き起こし、病的生理活性を担う重要な因子であることが近年わかりつつある。
【０００６】
酸化ＬＤＬによる血管内皮細胞への作用を媒介する受容体として、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体(ＬＯＸ−１)が本発明者の一人である沢村  達也氏により血管内皮細胞より初めて分離同定された(非特許文献１)。その後の研究により、ＬＯＸ−１は内皮細胞のみならず、マクロファージ、血小板、血管平滑筋細胞などにおいても発現が確認されている(非特許文献２〜４)。
【０００７】
ＬＯＸ−１の発現は、糖尿病、高血圧、高脂血症などで増加しており、また、沢村  達也氏により作成された抗ＬＯＸ−１抗体（抗ヒトＬＯＸ−１マウスモノクローナル抗体ＴＳ９２）は酸化ＬＤＬとＬＯＸ−１との結合を阻害することにより酸化ＬＤＬによる内皮依存性弛緩反応の低下を回復し、さらに、心筋梗塞後の梗塞巣の形成やバルーン傷害後の血管内膜肥厚を抑制する。血栓の形成や、エンドトキシン起因性炎症作用、脳卒中の発症にもＬＯＸ−１の関与が示唆されており、ＬＯＸ−１が心血管病の発症において様々なレベルで関与していることが想定されている (非特許文献２、５〜１０)。
【０００８】
さらに、近年、酸化ＬＤＬ以外にＬＯＸ−１のリガンドとして体内の炎症反応と深い関係のあるＣ反応性タンパク質(Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＲＰ)が報告されている（非特許文献１１）。また、酸化ＬＤＬが関与する炎症性疾患及び代謝性疾患と癌との関連性も指摘されている（非特許文献１２）。疫学的研究としては、コホート研究によりＬＯＸ−１の臨床的応用の可能性が報告されている（非特許文献１０）。すなわち、ＬＯＸ−１を標的とすることは、これら、心血管病や癌などの関連疾患の予防、治療において高い効果を上げることが予想される。
【０００９】
例えば、ＬＯＸ−１へのリガンドの結合を阻害することを目的とした発明は本発明者の一人である沢村  達也氏より酸化ＬＤＬ受容体に対する抗体を利用した医薬組成物が報告されている（特許文献１）。
【００１０】
抗体医薬はその高い作用特異性から大きな期待を寄せられている。だが、抗体医療の問題点として抗体自体の安定性の低さが挙げられる。そのため、医療現場では血管内への直接的な投与しか有効な方法がなく、日常的に使用できない。動脈硬化症は自覚症状の少ない疾患であり、日常的な動脈硬化の予防・対策が重要になってくる。このような現状から日常的に経口摂取でき、吸収効率が良く、かつ安定な化合物が求められている。動脈硬化症に対する効能を主張する化合物はこれまでに報告がされている。例えば、特許文献２ではプロアントシアニジンを含む血栓形成抑制剤又は血小板凝集抑制剤を報告している。プロアントシアニジンには血糖若しくは血圧の上昇を抑制する効果、血中アディポネクチン濃度上昇効果などの報告もなされている（特許文献３，４）。しかし、プロアントシアニジンは複数のフラボノイド単位が重合した縮合型タンニンであり、分子量が比較的大きいものである。これら高分子化合物は効能が見られたとしても特に経口からの摂取では有効成分の吸収面において非常に効率が悪く、事実、確実なに効果を発現するには、実施例のマウスの結果から換算して、成人男性６０ｋｇに対しては一日２４ｇの有効成分を含む血栓形成抑制剤又は血小板凝集抑制剤を摂取し続ける必要がある。また、また、動脈硬化症において発生の見られる線維性肥厚を防ぐ目的で没食子酸エステルの有効量を含む線維化抑制剤の報告も存在する（特許文献５）。しかしながら、特許文献５には没食子酸とフラボノイドとのエステルについて記載されているものの、この化合物とＬＯＸ−１との関連については記載がなく不明である。
【００１１】
近年、緑茶の抽出物と動脈硬化に関する報告がいくつかなされている。しかし、ＬＯＸ−１との関連性については一切の検討がなされていない。緑茶抽出物が血清コレステロール値を低下させることは特許文献６〜９などで報告されているが、いずれも、腸管でのコレステロールの吸収を阻害することを目的としている。しかし、人を含む動物は自身にコレステロール合成経路を持ち合わせる中、腸管でのコレステロールの吸収を阻害することでの動脈硬化効果は非常に限定的であると推測される。
【００１２】
加えて、近年、血中コレステロール値と動脈硬化の因果関係について、日本脂質栄養学会が従来の見解と異なった新たなガイドラインを発表するなど(非特許文献１３)、必ずしも血中コレステロール値の低下が動脈硬化の予防、更には心血管病の根源的な予防の効果があるとは言い切れていないのが現状である。
【００１３】
一方、本発明者らが先に緑茶中のカテキン類であるカテキンガレート及びエピカテキンガレートにＬＯＸ−１アンタゴニスト作用があることを見出している（特許文献１０）。しかし、主要なカテキンであるエピガロカテキンガレートにはＬＯＸ−１アンタゴニスト作用は見出されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２０１０−１８０２１２号公報
【特許文献２】特開２００４−２３８２８９号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２７８３号公報
【特許文献４】特開２００６−１８２７０６号公報
【特許文献５】特開平５−２７１０６７号公報
【特許文献６】特開昭６０−１５６６１４号公報
【特許文献７】特開昭６２−３０７１１号公報
【特許文献８】特許第２８１２６８２号公報
【特許文献９】特開２００４−２６２９２７号公報
【特許文献１０】特願２０１１−２３６４４８
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Sawamura T, et al., Nature, 386:73-77,(1997)
【非特許文献２】Chen M, et al., Biochem Biophys Res Commun, 282:153-158 (2001)
【非特許文献３】Kataoka H, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21:955-960(2  001)
【非特許文献４】Yoshida H, et al., Biochem J, 334:9-13(1998)
【非特許文献５】Mehta JL, et al., Cir Res 100(11)1634-1642(2007)
【非特許文献６】Li et al., J.Pharmacol. Exp. Ther., 302:601-605(2002)
【非特許文献７】Hinagata et al., Cardiovasc Res, 69:263-271(2006)
【非特許文献８】Kakutani M., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 97:360-364(2000)
【非特許文献９】Honjo M., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 100:1274-1279(2003)
【非特許文献１０】Inoue N., et al., Clin Chem. 2010 Apr;56(4):550-558
【非特許文献１１】Fujita R., et al., Clin Chem. 2010 Mar;56(3):478-481
【非特許文献１２】Heather A. Hirsch, et al., Cancer Cell, 17, 348-361(2010)
【非特許文献１３】長寿のためのコレステロールガイドライン２０１０年度版  中日出  版社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記の背景技術を鑑みてなされたものであり、心血管病や癌の根源的な予防、治療を目標とし、血管内皮細胞、マクロファージなどで発現されている酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−1への酸化ＬＤＬ及びその他ＬＯＸ−１へのリガンドの結合を阻害することができる、安全性が高い酸化ＬＤＬ結合阻害剤、該酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する食品組成物、心血管病予防薬又は治療薬、並びに癌の予防薬又は治療薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、様々な天然物よりＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合能を阻害する成分を鋭意探索した。その結果、エピガロカテキンガレートのメチルエステルであるエピガロカテキン（３’−Ｏ−メチル）ガレートに優れた酸化ＬＤＬ結合阻害作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：
【００１９】
【化１】
2013136548.tif 000002
【００２０】
で示されるエピガロカテキン（３’−Ｏ−メチル）ガレートを有効成分とする酸化ＬＤＬ結合阻害剤、
〔２〕酸化低密度リポ蛋白質以外のリガンドを介したＬＯＸ−１結合抑制作用を有する前記〔１〕記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤、
〔３〕〔１〕又は〔２〕記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する食品組成物、
〔４〕〔１〕又は〔２〕記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する心血管病予防又は治療薬、
〔５〕〔１〕又は〔２〕記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤を含有する癌の予防又は治療薬、
に関する。
【００２１】
なお、本発明において、酸化ＬＤＬ結合阻害作用とは、後述の実施例に記載のような方法で評価した場合に、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害する作用を意味する。
【００２２】
また、本発明において、心血管病としては、心臓・血管における疾患を意味しており、例えば、脳卒中、心筋梗塞、血栓症疾患、炎症性疾患が挙げられる。また、癌としては、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫が含まれる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤を用いることで、ＬＯＸ−１を介した酸化ＬＤＬの血管内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞などの細胞内への取り込みや、その他ＬＯＸ−１へのリガンドの結合を阻害することができる。また、酸化ＬＤＬ結合阻害剤の有効成分である式（１）で示されるエピガロカテキン（３’−Ｏ−メチル）ガレートの優れた加工適性から食品組成物や医薬品への応用が容易であり、安価且つ安全にＬＯＸ−１を介した心血管病を治療又は予防するという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、実施例1における、各化合物のｈＬＯＸ−１タンパク質（ヒト由来組換え型ＬＯＸ−１タンパク質）に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の結果を示すグラフである。縦軸は、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬの結合率を表したものであり、未添加のものを１００とした場合の、各化合物を添加した条件でのＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬの結合率を示す。結合率が低いほど、酸化ＬＤＬ結合阻害活性が高いことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤は、有効成分として式（１）：
【００２６】
【化２】
2013136548.tif 000003
【００２７】
で示されるエピガロカテキン（３’−Ｏ−メチル）ガレート（以下ＥＧＣｇ−３’Ｍｅと略す）を含有する。
【００２８】
本発明では、前記式（１）で示されるＥＧＣｇ−３’Ｍｅを有効成分として用いることで、例えば、プロアントシアニンのような重合体に比べると、単量体であるため、投与されたヒトや非ヒト動物の体内に吸収されやすいという利点がある。
【００２９】
前記式（１）で示されるＥＧＣｇ−３’Ｍｅは、そのまま酸化ＬＤＬ結合阻害剤の有効成分として用いることが好ましいが、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤では、前記式（１）で示されるＥＧＣｇ−３’Ｍｅに加えて、必要であれば製剤に使用される公知の成分を混合した組成物としてもよい。前記式（１）で示されるＥＧＣｇ−３’Ｍｅの酸化ＬＤＬ結合阻害剤中における含有量は、有効成分として作用効果が奏される量であればよく、特に限定はない。
【００３０】
前記式（１）で示されるＥＧＣｇ−３’Ｍｅは、市販品を用いてもよいし、「ベニフウキ」などの茶などの天然物から抽出したものでもよいし、公知の手段でＥＧＣｇをメチル化することで製造してもよい。
【００３１】
また、前記ＥＧＣｇ−３’Ｍｅとして、薬学的に許容可能な塩を用いてもよい。
前記薬学的に許容可能な塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アルミニウムヒドロキシド塩等の金属ヒドロキシド塩；アルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、トリアルキルアミン塩、アルキレンジアミン塩、シクロアルキルアミン塩、アリールアミン塩、アラルキルアミン塩、複素環式アミン塩等のアミン塩；α−アミノ酸塩、ω−アミノ酸塩等のアミノ酸塩；ペプチド塩またはそれらから誘導される第１級、第２級、第３級若しくは第４級アミン塩等が挙げられる。これらの薬理的に許容し得る塩は、単独でまたは２種以上を混合して用いることができる。
【００３２】
また、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤は、食品、医薬品などの組成物に、公知の技術を用いて、配合することができる。この場合、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤をそのまま用いてもよいが、各種基材に配合してもよい。基材の種類は特に限定されるものではなく、適時設定すればよいが、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミあるいはドリンクなどの経口投与基材が、食品などに簡易に配合できる観点から好ましい。
【００３３】
食品組成物としては、一般食品として、種々の食品原料に前記酸化ＬＤＬ結合阻害剤の所望量を加え、通常の製造方法により加工することにより、また、健康食品、機能性食品として、食べ易い状態にして使用することができる。
【００３４】
医薬品組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、液剤などが挙げられ、これらは増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤などと共に通常の方法に従って製剤すればよい。これらの医薬品組成物は、心血管病又は癌の予防薬又は治療薬として使用される。
【００３５】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤の１日あたりの投与量は、症状、身長、体重、年齢などにより異なるが、成人１人あたりの摂取量が、１〜２０００ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは1〜１００ｍｇ／ｋｇ・日となるように、１回ないし数回に分けてヒトや非ヒト動物などの被検体に投与するのがよい。
【００３６】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤は、ヒトや非ヒト動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモットなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの鳥類）に投与することで、心血管病又は癌を予防／治療することが期待できる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の主旨はこれらによって制限されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
ＥＧＣｇ−３’Ｍｅの酸化ＬＤＬ結合阻害作用を、組換えｈＬＯＸ−１タンパク質を用いて評価を行った。
【００３９】
試料にはエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、ＥＧＣｇ−３’Ｍｅ（市販品）、ＥＧＣｇ−４’Ｍｅ、ＥＧＣｇ３’’−Ｍｅ、ＥＧＣｇ４’’―Ｍｅ及び酸化ＬＤＬ結合阻害活性が見いだされているプロシアニジンＣ１を使用した。
【００４０】
組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は、ヒト由来ＬＯＸ−１の細胞外ドメインである。ｈｕｍａｎ  ＬＯＸ−１  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＮＭ００２５４３）のうち、細胞外ドメイン（ｅｘ−ｈＬＯＸ−１）をコードする領域（６１〜２７３番目の塩基配列）を、定法に従い発現、精製し得たものを使用した。組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は酸化ＬＤＬに対する結合能力を有していることを確認し、以下のＥＬＩＳＡによる試験用ＬＯＸ−１標品として用いることにした。
【００４１】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）は、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ製）を用いて行った。上記のように精製した組換えｈＬＯＸ−１タンパク質を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）バッファーで調整し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、２０％イムノブロックを含むＰＢＳ（−）バッファー３００μＬを各ウェルにアプライした。２５℃で２時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄した。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーを含むＦ１２−ＨＥＰＥＳ培地（ｐＨ７．４）で１μＭとなるように調整した各精製サンプルを５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、１μｇ／ｍＬとなるように０．１％ＢＳＡを添加したＦ１２−ＨＥＰＥＳ培地で調整した酸化ＬＤＬを各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ａｎｔｉ−ＡｐｏＢ  ＨＵＣ２０抗体を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ抗体を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×５回で洗浄し、  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を５０μＬずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、０．５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を５０μＬずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、酸化ＬＤＬ結合阻害活性（ＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害率）を定量した。図１に結果を示す。
【００４２】
その結果、図１に示すように、ＥＧＣｇ−３’Ｍｅに優れた酸化ＬＤＬ結合阻害活性が見いだされた。これは公知の酸化ＬＤＬ結合阻害剤であるプロシアニジンＣ１よりも優れた活性である。またＥＧＣｇには酸化ＬＤＬ結合阻害活性が見出されなかった。またＥＧＣｇの３’位以外の部分がメチル化されたものに関してはプロシアニジンとほぼ同等の活性しか有していなかった。このことからＥＧＣｇ−３’Ｍｅが新規な酸化ＬＤＬ結合阻害剤として有用であることが示された。
【００４３】
なお、上記の酸化ＬＤＬ結合阻害作用は、鉄イオンが存在していない培地中では生じにくいことも確認している。
【００４４】
また、前記非特許文献２〜１０にはＬＯＸ−１が心血管病の発症に関連していること、前記非特許文献１１、１２にはＬＯＸ−1が癌の発症に関連していることが示されていることから、酸化ＬＤＬのＬＯＸ−１への結合を阻害することでＬＯＸ−１の作用を阻害できる酸化ＬＤＬ結合阻害剤が動物における心血管病や癌の予防・治療薬として使用できることは十分予想される。
したがって、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤も、上記のように、酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害する作用に優れ、かつ安全性が高いことから、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤をヒトや非ヒトの哺乳動物などの被検体に継続的に摂取させることにより、血管内皮細胞などの心血管病又は癌に関連する細胞への酸化ＬＤＬの結合が継続的に阻害されて、ヒト、非ヒト動物における心血管病や癌などの関連疾患の発症を抑える予防薬、又は疾患の症状を緩和したりする治療薬として使用することができる。
【図１】
2013136548.tif 000006