(57)【要約】      （修正有）【課題】従来のエクシジョナーゼとは異なる塩基配列を認識し、当該塩基配列間にある領域を切り出すことができる新規エクシジョナーゼを提供する。【解決手段】特定の配列ａｔｔＬ及び第２の特定配列ａｔｔＲを認識して、組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰを生じ、かつ分子量が２５〜３０Ｋｄである、エクシジョナーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じ、かつ
分子量が２５〜３０Ｋｄである、エクシジョナーゼ。
【請求項２】
下記（ｉ）又は（ｉｉ）に示すタンパク質からなる、エクシジョナーゼ
（ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じるエクシジョナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
アクチノファージＴＧ１に由来するものである、請求項１又は２に記載のエクシジョナーゼ。
【請求項４】
下記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）に示すＤＮＡからなる、エクシジョナーゼ遺伝子
（ｉｉｉ）請求項２に記載のエクシジョナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉｖ）請求項２に記載のエクシジョナーゼタンパク質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じるエクシジョナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
下記（ｖ）又は（ｖｉ）に示すＤＮＡからなる、エクシジョナーゼ遺伝子
（ｖ）配列番号６に示す塩基配列を有するＤＮＡ
（ｖｉ）配列番号６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されてなる塩基配列を有するＤＮＡであって、配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じるエクシジョナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
アクチノファージＴＧ１に由来するものである、請求項４又は５に記載のエクシジョナーゼ遺伝子。
【請求項７】
配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲに、請求項１〜３のいずれか１項に記載のエクシジョナーゼを作用させ、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生させる工程を含む、細胞内における部位特異的遺伝子組換えを誘導する方法。
【請求項８】
（１）請求項４〜６のいずれか１項に記載のエクシジョナーゼ遺伝子を用いてエクシジョナーゼを調製する工程、及び
（２）配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲに、上記工程（１）で得られたエクシジョナーゼを作用させ、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生させる工程を含む、細胞内における部位特異的遺伝子組換えを誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のエクシジョナーゼ及びこれを用いた部位特異的遺伝子組換えの誘導方法に関する
【背景技術】
【０００２】
真核生物のゲノム構造を改変し、その遺伝子発現制御を操作する、いわゆるゲノム工学技術は、遺伝子治療のみならず、様々な真核生物の育種において重要な方法である。中でも外来遺伝子の真核生物ゲノム中の標的組み込みが重要であるが、これと同様に、当該組み込み反応の逆反応である、特定の遺伝子をゲノム配列から切り出す反応も、ゲノム工学上、非常に重要な反応である。
【０００３】
ここで、上記組み込み反応を触媒する酵素（インテグラーゼ）は、種々の溶原性ファージが保持していることが知られている。溶原性ファージは、かかるインテグラーゼによって、自身のゲノムを宿主染色体へと組込ませる。そして、溶原性ファージは、別の菌体に感染する際に宿主染色体に組み込ませた自身のゲノムを切り出すために、エクシジョナーゼ活性を有することも知られている。そして、いくつかの溶原性ファージについては、この切り出し反応を触媒するエクシジョナーゼが同定されている（非特許文献１〜４）。
【０００４】
しかし、インテグラーゼは異なる種類のファージ間で遺伝子配列に類似性があり、保存領域を有するのに対し、エクシジョナーゼはファージ間での遺伝子配列の種差が非常に大きく、保存領域は見つかっていない。
【０００５】
従って、エクシジョナーゼ遺伝子の配列情報が未知の溶原性ファージについて、その塩基配列を同定することは非常に困難である。さらに、溶原性ファージの全塩基配列が不明の場合には、エクシジョナーゼ遺伝子を同定することの困難性は格段に高まる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mol Mivrobiol 2011 80(6), 1450-1463
【非特許文献２】J Bacteriol 1999, p7291-7297
【非特許文献３】Mol Microbiol 2005 55(6), 1896-1910
【非特許文献４】PLoS Biol 2006 Vol. 4 Issue 6 p0964-0974
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決すべき課題は、遺伝子工学上  有用な新規エクシジョナーゼ遺伝子を同定、単離することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる状況の下、本発明者らは、新規エクシジョナーゼ遺伝子の同定及び単離をすべく鋭意検討した結果、無数にある溶原性ファージのうち、ＴＧ−１ファージの遺伝子上に前述の公知のエクシジョナーゼと類似する領域があることを見出した。さらに、分子量等の条件を検討した結果、一定の分子量を有する領域がエクシジョナーゼ活性を有することを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明は、以下の項に記載の新規エクシジョナーゼ及びこれを利用する方法を提供する：
項１．配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じ、かつ
分子量が２５〜３０Ｋｄである、エクシジョナーゼ。
【００１０】
項２．下記（ｉ）又は（ｉｉ）に示すタンパク質からなる、エクシジョナーゼ
（ｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じるエクシジョナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】
項３．アクチノファージＴＧ１に由来するものである、項１又は２に記載のエクシジョナーゼ。
【００１２】
項４．下記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）に示すＤＮＡからなる、エクシジョナーゼ遺伝子
（ｉｉｉ）項２に記載のエクシジョナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｉｖ）項２に記載のエクシジョナーゼタンパク質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じるエクシジョナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１３】
項５．下記（ｖ）又は（ｖｉ）に示すＤＮＡからなる、エクシジョナーゼ遺伝子
（ｖ）配列番号６に示す塩基配列を有するＤＮＡ
（ｖｉ）配列番号６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されてなる塩基配列を有するＤＮＡであって、配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲを認識して、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生じるエクシジョナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
項６．アクチノファージＴＧ１に由来するものである、項４又は５に記載のエクシジョナーゼ遺伝子。
【００１５】
項７．配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲに、項１〜３のいずれか１項に記載のエクシジョナーゼを作用させ、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生させる工程を含む、細胞内における部位特異的遺伝子組換えを誘導する方法。
【００１６】
項８．（１）項４〜６のいずれか１項に記載のエクシジョナーゼ遺伝子を用いてエクシジョナーゼを調製する工程、及び
（２）配列番号１に示す配列ａｔｔＬ及び配列番号２に示す配列ａｔｔＲに、上記工程（１）で得られたエクシジョナーゼを作用させ、配列番号３に示す組換え配列ａｔｔＢ及び配列番号４に示す組換え配列ａｔｔＰを生させる工程を含む、細胞内における部位特異的遺伝子組換えを誘導する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来のエクシジョナーゼとは異なる塩基配列を認識し、当該塩基配列間にある領域を切り出すことができる新規エクシジョナーゼを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例２における組換え反応の模式図を示す。
【図２】実施例２の方法における組換え効率のグラフを示す。
【図３】実施例２におけるＰＣＲ法による組換え産物の解析の結果を示す。
【図４】実施例５における組換え反応の模式図を示す。
【図５】実施例５におけるＰＣＲ法による組換え産物の解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明のエクシジョナーゼ
本発明は、下記認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲを認識して： 
ａｔｔＬ：5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’    配列番号１
ａｔｔＲ：5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’    配列番号２
下記組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰ：
ａｔｔＢ：5’-TCGATCAGCTCCGCGGGCAAGACCTTCTCCTTCACGGGGTGGAAGGTCGG-3’    配列番号３
ａｔｔＰ：5’-GTTCCAGCCCAACAGTGTTAGTCTTTGCTCTTACCCAGTTGGGCGGGATA-3’    配列番号４
を生じ、
分子量が２５〜３０Ｋｄである、エクシジョナーゼを提供する。以下、本明細書中に置いて、配列番号１に示す配列を単に「配列ａｔｔＬ」又は「認識配列ａｔｔＬ」と示すことがある。同様に、配列番号２に示す配列、配列番号３に示す配列、及び配列番号４に示す配列を、それぞれ、単に「配列ａｔｔＲ」又は「認識配列ａｔｔＲ」、「配列ａｔｔＢ」又は「組換え配列ａｔｔＢ」及び「配列ａｔｔＰ」又は「組換え配列ａｔｔＰ」と示すことがある。
【００２０】
本発明に係るエクシジョナーゼの分子量は上記の範囲であれば特に限定されないが、２５〜３０Ｋｄ、好ましくは２５〜２８Ｋｄ、より好ましくは２６〜２７Ｋｄである。
【００２１】
本発明に係るエクシジョナーゼは、上記認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲを認識し、組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰを生成する酵素であり、かつ分子量が上記範囲内に含まれるものであれば特に限定されず、エクシジョナーゼ単独で上記組換え反応を触媒する酵素だけでなく、単独では当該反応を触媒しないが、インテグラーゼの存在下で当該反応を触媒する酵素も含まれる。尚、以下、本発明において、認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲを認識し、組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰを生成する反応を単に組換え反応Ｉと示すことがある。
【００２２】
ここで、本発明に係るエクシジョナーゼとしては、下記配列番号５：
MAGFNLWATDPENKPKPRQTFSDDAVGRLHGGYMDTTGRKPKPVALSEWRFSTGDKVVADALAQLFGGTPAENDDTDSEHFIDVFTEAKRVPVIVEPDGIEADMKQWVNGKLIHHCDGVKFLSPDDKRGDLCGCPSLFAERKAAAKDYQGPNPSIKVTFRLADDPELGKFTYSTGSWTLAAVLHEALNDLDRIGETAYGYVELEYVEFIPSRGPMRGKTVSYTKPVLKFVKPYNDAIAD
に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられ、またその機能的等価物も挙げられる。機能的等価物としては、上記組換え反応Ｉを触媒するものであれば、特に限定されず、天然に存在する機能的等価物、天然に存在しない機能的等価物のいずれもが含まれる。また、これら機能的等価物の中には配列番号５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を人為的な方法（例えばProc.Natl.Acad.Sci.USA,81,4662-5666(1984)、Nucleic Acid Res.10,6487-6500(1982);Nature 316,601-605(1985)等に記載の部位特異的突然変異誘発法）で改変させたものも含まれ得る。
【００２３】
当該機能的等価物には、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と、アミノ酸配列において、例えば、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましく８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上が同一であるものが挙げられる。好ましい実施形態として、当該機能的等価物には、配列番号５に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、上記組換え反応Ｉを触媒するタンパク質も含まれる。
【００２４】
本発明に係るエクシジョナーゼは、ＴＧ−１ファージ由来のものが好ましい。ＴＧ−１ファージとは、アクチノファージの一種であり（Foor, F., et al., Gene, 39, 11-16 (1985)）、本発明者らは、先に、当該ＴＧ−１ファージ由来のインテグラ−ゼ遺伝子の構造及び機能を明らかにしている。ＴＧ−１ファージ由来のインテグラーゼは、上記認識配列ａｔｔＢ及び認識配列ａｔｔＰを認識して組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰを生じることが知られている。しかし、ＴＧ−１ファージの全塩基配列はいまだ分かっていない。
【００２５】
本発明に係るエクシジョナーゼがインテグラーゼの存在下で上記組換え反応Ｉを触媒するものである場合、インテグラーゼとは、配列ａｔｔＢ及び配列ａｔｔＰを認識し、配列ａｔｔＬ及び配列ａｔｔＲを生成するインテグラーゼ活性を有する酵素を示す。以下、本明細書中において、配列ａｔｔＢ及び配列ａｔｔＰを認識し、配列ａｔｔＬ及び配列ａｔｔＲを生成する反応を組換え反応ＩＩと示すこともある。当該実施形態においては、インテグラーゼは、単独では組換え反応ＩＩを触媒し、一方で本発明に係るエクシジョナーゼが存在する場合、この逆反応である、組換え反応Ｉの活性を示すこととなる。より具体的には、インテグラーゼとしては、Accession No. AB251920でデータベースに登録されているＴＧ−１インテグラーゼ、またはその機能的等価物が挙げられる。かかるインテグラーゼとしては、例えば、配列番号７：
MVILAGGYDRQSAERENSSTASPATQRAANRGKAEALAKEYARDGVEVKWLGHFSEAPGTSAFTGVDRPEFNRILDMCRNREMNMIIVHYISRLSREEPLDIIPVVTELLRLGVTIVSVNEGTFRPGEMMDLIHLIMRLQASHDESKNKSVAVSNAKELAKRLGGHTGSTPYGFDTVEEMVPNPEDGGKLVAIRRLVPSAHTWEGAHGSEGAVIRWAWQEIKTHRDTPFKGGGAGSFHPGSLNGLCERLYRDKVPTRGTLVGKKRAGSDWDPGVLKRVLSDPRIAGYQADIAYKVHADGSRGGFSHYKIRRDPVTMEPLTLPGFEPYIPPAEWWELQEWLQGRGRGKGQYRGQSLLSAMDVLYCYGSGQLDPETGYSNGSTMAGNVREGDQAHKSSYACKCPRRVHDGSSCSITMHNLDPYIVGAIFARITAFDPADPDDLEGDTAALMYEAARRWGATHERPELKGQRSELMAQRADAVKALEELYEDKRNGGYRSAMGRRAFLEEEAALTLRMEGAEERLRQLDAADSPVLPIGEWLGDRGSDPTGPGSWWALAPLEDRRAFVRLFVDRIEVIKLPKGVQRPGRVPPIADRVRIHWAKPKVEEETEPETLNGFTAAA
に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号７に示すアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、かつ上記組換え反応ＩＩを触媒するタンパク質等が挙げられる。
【００２６】
上記ＴＧ−１インテグラーゼは、セリン型インテグラーゼ及びチロシン型インテグラーゼのうち、セリン型インテグラーゼに属する。セリン型インテグラーゼは、チロシン型と異なり、宿主因子の存在を必要とせず、attB、attPともに40 bpほどの比較的短い配列の間で部位特異的な組換えを起すため、遺伝子工学上有用である。従って、上記インテグラーゼの存在下で組換え反応Ｉを触媒する実施形態においては、本発明に係るエクシジョナーゼも、宿主因子の存在を必要としない点及びａｔｔＬ及びａｔｔＲといった比較的短い配列の間での部位特異的な組換えを生じさせるという利点を有する。
【００２７】
エクシジョナーゼ遺伝子
本発明は、上記組換え反応Ｉを触媒するエクシジョナーゼをコードするエクシジョナーゼ遺伝子を提供する。本発明に係るエクシジョナーゼ遺伝子としては、上記エクシジョナーゼタンパク質をコードするＤＮＡだけでなく、上記エクシジョナーゼタンパク質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、上記組換え反応Ｉを起すタンパク質をコードするＤＮＡも挙げられる。
【００２８】
ここで、ストリンジェントな条件とは、５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度反応温度条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことを意味する。
【００２９】
より具体的には、本発明に係るエクシジョナーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号６に示す塩基配列を有するＤＮＡ：
ATGGCCGGATTCAACCTTTGGGCGACCGACCCGGAGAACAAGCCGAAGCCCCGTCAGACCTTCAGCGACGACGCCGTTGGTCGGCTGCACGGCGGCTACATGGACACGACCGGCAGGAAGCCGAAGCCTGTTGCCCTGTCTGAGTGGCGTTTCTCGACCGGCGACAAGGTCGTTGCCGACGCGCTGGCCCAGCTCTTCGGCGGCACCCCGGCGGAGAACGACGACACTGACTCTGAGCACTTCATAGACGTGTTCACTGAGGCGAAGCGCGTGCCGGTCATTGTCGAGCCGGACGGCATCGAAGCCGACATGAAGCAGTGGGTAAACGGGAAGCTGATTCACCACTGTGACGGCGTCAAGTTCCTGTCGCCCGACGACAAGCGGGGCGACCTGTGCGGGTGCCCGTCGCTCTTCGCTGAGCGGAAGGCGGCGGCGAAGGACTACCAGGGGCCGAACCCGTCGATCAAGGTCACGTTCCGTCTGGCCGACGACCCGGAGCTTGGCAAGTTCACCTATTCCACGGGCTCTTGGACGCTGGCCGCTGTGCTTCACGAAGCGCTGAACGACCTCGACCGTATCGGCGAGACGGCTTACGGGTACGTCGAGCTTGAGTACGTCGAGTTCATTCCGTCGCGCGGCCCCATGCGCGGTAAGACCGTGTCTTACACGAAGCCCGTGCTGAAGTTCGTGAAGCCCTACAACGACGCGATCGCCGACTAA
、及び配列番号６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されてなる塩基配列を有するＤＮＡであって、認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲを認識して、組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰを生じるエクシジョナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。これらのエクシジョナーゼ遺伝子は、アクチノファージＴＧ１に由来するものであってもよい。
【００３０】
さらに、本発明には、エクシジョナーゼをコードする遺伝子の上流にさらにＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでなる遺伝子も含まれ、このような遺伝子を利用することで、酵素の生産量を著しく増加させることができるため好ましい。かかるＳＤ配列としては、例えば、ＬａｃプロモーターやＴ７プロモーターのＳＤ配列が挙げられる。
【００３１】
部位特異的遺伝子組換えを誘導する方法
本発明は、認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲに、上記エクシジョナーゼを作用させて、組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰを生させる工程を含む、細胞内における部位特異的遺伝子組換えを誘導する方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、
（１）前記エクシジョナーゼ遺伝子を用いてエクシジョナーゼを調製する工程、及び
（２）認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲに、上記工程（１）で得られたエクシジョナーゼを作用させ、組換え配列ａｔｔＢ及び組換え配列ａｔｔＰを生させる工程を含む、細胞内における部位特異的遺伝子組換えを誘導する方法を提供する。
【００３３】
本発明の部位特異的遺伝子組換えの誘導方法においては、認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲを有するＤＮＡを反応基質として用いる。ここで、図１の下段（ｐＵＣＬＺＲの反応）に示すように、１つのＤＮＡ上に、認識配列ａｔｔＬ及び認識配列ａｔｔＲを挿入したものを反応基質として用いることによって、両認識配列の間に挟まれた領域を切り出すことができる。
【００３４】
また、反応基質として２つのＤＮＡを用い、一方のＤＮＡに認識配列ａｔｔＬを、他方のＤＮＡに認識配列ａｔｔＲを挿入しておくことにより、２つのＤＮＡを交叉させる組換えが可能になる。さらに、反応基質として２つのＤＮＡを用い、少なくとも一方のＤＮＡに認識配列を２つ挿入しておくこと（例えば、一方のＤＮＡに認識配列ａｔｔＬを２つ挿入しておく、他方のＤＮＡに認識配列ａｔｔＲを２つ挿入しておく、またはその両方を行う）ことによっても、それらの認識配列に挟まれた配列を切り出すことができる。
【００３５】
本発明の方法において上記組換え反応に供する認識配列ａｔｔＬを有するＤＮＡ及び認識配列ａｔｔＲを有するＤＮＡの調製は、通常の遺伝子のクローン技術を用いて行うことができる。このような遺伝子のクローニング、クローン化したＤＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製等は、分子生物学の分野に属する技術者にとっては周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecular Cloning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor、New York(1982)）に記載の方法に従って行うことができる。
【００３６】
本発明に係る部位特異的遺伝子組換えの誘導方法において、上記反応基質の添加量としては、例えば、反応溶液中の最終濃度として、１０μＬの反応溶液中に、０．０１〜１ｐｍｏｌ、より好ましくは、０．０３〜０．３ｐｍｏｌの反応基質が含まれるよう設定することができる。
【００３７】
また、本発明に係るエクシジョナーゼ遺伝子及びエクシジョナーゼタンパク質は、例えば、後述する実施例に記載の方法に従い調製することができる。より具体的には、例えば、実施例１にて配列番号８に示すプライマー（Ａ）及び配列番号９に示すプライマー（Ｂ）に相当するオリゴヌクレオチドを合成する。合成したオリゴヌクレオチドを用い、エクシジョナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすることにより調製することができる。クローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及び簡便性から大腸菌など微生物を宿主とするのが適当である。
【００３８】
クローン化したエクシジョナーゼ遺伝子の高発現系を構築することが好ましい。たとえばマキザム−ギルバートの方法（Methods in Enzymology,65,499(1980)）もしくはダイデオキシチェーンターミネーター法（Methods in Enzymology,101,20(1983)）などを応用してクローン化したＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が微生物菌体中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え発現ベクターを作製する。
【００３９】
エクシジョナーゼを異種微生物内で大量に産生させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、エクシジョナーゼの生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,80,21(1983)、Gene,20,231(1982)）、ｔｒｃプロモーター（J.Biol.Chem.,260,3539(1985)）などを例示することができる。 
【００４０】
ベクターとしては、種々のプラスミドべクター、ファージベクターなどが使用可能であるが、微生物菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的に大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２（Gene,2,95(1975)）、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（Gene，33,103(1985)）などを例示することができる。
【００４１】
作製した組換えべクターを用いて微生物を形質転換する。宿主となる微生物としては安全性が高く取扱いやすいものであれば特に限定されない。例えば、大腸菌、酵母など遺伝子組換えに常用されている微生物を使用することができる。その中でも、大腸菌が有利であり、例えば組換えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ１０５菌、ＪＭ１０９菌（Gene, 33, 103-119(1985)）などが使用可能である。
【００４２】
微生物を形質転換する方法はすでに多くの方法が報告されており、宿主として使用する微生物に応じて適宜選択すればよい。例えば大腸菌を宿主として使用する場合、低温下、塩化カルシウム処理して菌体内にプラスミドを導入する方法（J.Mol.Biol., 53,159(1970)）により大腸菌を形質転換することができる。
【００４３】
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したエクシジョナーゼ遺伝子の発現を誘導して菌体内に当該酵素が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Methods in Enzymology,100,20(1983)）、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Molecular Cloning、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【００４４】
培養中にエクシジョナーゼ遺伝子の発現を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。
【００４５】
このようにして調製した培養物から膜分離あるいは遠心分離処理などにより菌体を回収する。回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離または膜処理により除去して無細胞抽出液を調製する。さらに、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせてエクシジョナーゼを調製する。 
【００４６】
調製されたエクシジョナーゼを用いて、その活性および特性の解析や確認を文献（Khaleel,T., Younger,E., McEwan,A.R., Varghese,A.S. and Smith,M.C.M., Mol Microbiol, 10.1111/j.1365-2958.2011.07696.x. (2011)
Ghosh,P., Wasil,L.R. and Hatfull,G.F., PLoS Biol, 4, e186, 10.1371/journal.pbio.0040186. (2006)）の方法に従い、実施することができる。
【００４７】
さらに、本発明においては、本願実施例に記載の方法に自体公知の方法を組み合わせることによって、エクシジョナーゼ活性を維持しつつ、当該実施例に記載のエクシジョナーゼ遺伝子及びエクシジョナーゼタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列を適宜改変したエクシジョナーゼを調製することもできる。
【００４８】
本発明において、エクシジョナーゼの添加量は、例えば、最終濃度として、反応溶液１０μＬ中に０．１〜１０ｐｍｏｌ、より好ましくは、０．３〜３ｐｍｏｌのエクシジョナーゼが含まれるようで設定することができる。また、好ましい実施形態において、当該反応系は、前述のインテグラーゼの存在下で行ってもよい。当該実施形態において、インテグラーゼの添加量は、例えば、最終濃度として、反応溶液１０μＬ中に０．１〜１０ｐｍｏｌ、より好ましくは、０．３〜３ｐｍｏｌのインテグラーゼが含まれるよう設定することができる。
【００４９】
本発明に係る部位特異的遺伝子組換えの誘導方法は、上記反応基質及びエクシジョナーゼ、ならびに必要に応じてインテグラーゼを反応系に添加し、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃の温度に維持することにより行うことができる。反応時間は上記反応が完了するのに必要な時間を適宜設定可能であるが、例えば、０．５〜１６時間、好ましくは１〜２時間の範囲内で設定することができる。
【００５０】
本発明の方法には、反応系にエクシジョナーゼタンパク質を添加する方法だけでなく、前述したエクシジョナーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクターを反応系に添加し、反応系の中で発現したエクシジョナーゼにより組換え反応を生じさせてもよい。また上記反応をインテグラーゼの存在下に行う実施形態においても、本発明には、インテグラーゼタンパク質を添加する方法だけでなく、インテグラーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクターを構築し、これを反応系にて発現させる方法も含まれる。インテグラーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクターの構築は、前述したエクシジョナーゼ遺伝子を含む組換え発現ベクターの構築手法と同様の方法により行うことができる。また、一つのベクターにインテグラーゼ遺伝子及びエクシジョナーゼ遺伝子の両方を挿入してもよい。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、大腸菌の形質転換法、ＤＮＡ塩基配列の決定などは全て「Molecular cloning II」（Sambrookら編、Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、及びＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼなどのＤＮＡ関連酵素は宝バイオ（株）より入手した。
【００５２】
実施例１；アクチノファージＴＧ１エクシジョナーゼ遺伝子のクローニング
実施例１−１
ＴＧ１ファージが溶原化している放線菌ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（北里大学より入手）のゲノムを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりエクシジョナーゼ遺伝子を増幅した。
【００５３】
プライマー（Ａ）5'-CAGGAAACAGCATATGGCCGGATTCAACCTTTGGGC-3'    配列番号８
プライマー（Ｂ）5'-GAACGCCGGAGGATCCTTAGTCGGCGATCGCGTCGT-3'    配列番号９
ＰＣＲによるエクシジョナーゼ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンプレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリングとポリメライゼーション（６８℃、１分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００５４】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning II、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、０．７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＬａｃ（FEMS Microbiol.Lett,297,234-240(2009)）とIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＬａｃ−ｘｉｓを単離した。ｐＬａｃ−ｘｉｓは、ｐＬａｃのＬａｃプロモーター下流のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ切断部位に０．７ｋｂのエクシジョナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００５５】
実施例１−２
ＴＧ１ファージが溶原化している放線菌ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（北里大学より入手）のゲノムを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりエクシジョナーゼ遺伝子を増幅した。
【００５６】
プライマー（Ｃ）5'-ACAGCATATGGCCGGATTCAACCTTTGGGC−３'    配列番号１０
プライマー（Ｄ）5'-AAGGTGATGTCATTCTTAGTCGGCGATCGCGTCGT−３’    配列番号１１
ＰＣＲによるエクシジョナーゼ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンプレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリングとポリメライゼーション（６８℃、１分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００５７】
プラスミドｐＬａｃ（FEMS Microbiol.Lett,297,234-240(2009)）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＬａｃプロモーターを増幅した。
【００５８】
プライマー（Ｅ）5'-CGAGCTTCTTCACCACTGGCACGACAGGTTTCCCG−３'    配列番号１２
プライマー（Ｆ）5'-CGGCCATATGCTGTTTCCTGTGTGAAAT−３’        配列番号１３
ＰＣＲによるＬａｃプロモーターの増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンプレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２μＭ、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９８℃、２０秒）、アニーリング（５０℃、３５秒）、ポリメライゼーション（６８℃、３５秒）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００５９】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning II、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、０．７ｋｂ相当の０．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＭｓｌＩで消化したプラスミドｐＬａｃ−ｉｎｔ（FEMS Microbiol.Lett,297,234-240(2009)、当該ｐＬａｃ−ｉｎｔは、ＴＧ−１由来のインテグラーゼ遺伝子を含有する）とIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐＬａｃ−ｉｎｔ−ｘｉｓを単離した。ｐＬａｃ−ｉｎｔ−ｘｉｓは、ｐＬａｃ−ｉｎｔのＭｓｌＩ切断部位に０．２ｋｂのＬａｃプロモーターと０．７ｋｂのエクシジョナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００６０】
実施例２：アクチノファージＴＧ１エクシジョナーゼの活性解析
プラスミドｐＬａｃ、ｐＬａｃ−ｉｎｔ、ｐＬａｃ−ｘｉｓ、ｐＬａｃｉｎｔ−ｘｉｓを保持する大腸菌ＤＨ５α菌をカナマイシンを３０μｇ／ｍｌ含有するＬＢ培地で３７℃で３時間培養後、１００ｍＭ ＣａＣｌ２で懸濁した。この細胞懸濁液に５０ｎｇの基質プラスミドｐＵＣＢＺＰまたはｐＵＣＬＺＲ（FEMS Microbiol.Lett,297,234-240(2009)）を添加し、４２℃で３０秒放置した。その後、ＬＢ培地を添加し３７℃で１時間放置した。この混合液をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ、カナマイシンを３０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧを０．０１ｍＭ、Ｘ−ｇａｌを４０μｇ／ｍｌ含有するＬＢ寒天培地に塗抹し、３７℃で一晩放置した。生育したコロニーを計測し、全コロニー数中の白コロニー数の割合を組換え効率として算出し、酵素活性を解析した。
【００６１】
アクチノファージＴＧ１エクシジョナーゼの組換え産物の確認のため、上記のコロニーを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。反応液を１．０％アガロースゲル電気永動に供し、組換え産物を解析した。
【００６２】
図１は、本実施例２における、基質プラスミドにおける組換え反応の模式図である。ｐＵＣＢＺＰにおけるａｔｔＢ−ａｔｔＰ間での組換え反応（当該配列で挟まれた領域の切り出し反応）またｐＵＣＬＺＲにおけるａｔｔＬ−ａｔｔＲ間で組換え反応（当該配列で挟まれた領域の切り出し反応）が生じると、間に存在するＬａｃＺα遺伝子が切り出される。組換え反応前の基質プラスミド（ＬａｃＺα遺伝子を含む）を保持する大腸菌は青色を、 組換え反応後の基質プラスミド（ＬａｃＺα遺伝子を含まない）を保持する大腸菌は白色を呈する。矢印はＰＣＲ法による組換え産物の解析に用いたプライマーの位置を示す。
【００６３】
コロニー数から算出された組換え効率のグラフを図２に示す。図２において、縦軸は全コロニー数中の白コロニー数の割合をパーセントで示す。横軸は使用した遺伝子発現プラスミドの名称を示す。黒いバーは基質プラスミドとしてｐＵＣＢＺＰを用いた場合、灰色のバーは基質プラスミドとしてｐＵＣＬＺＲを用いた場合の組換え効率を示す。図２の結果から明らかなように、インテグラーゼ単体では行う事が出来なかったａｔｔＬ−ａｔｔＲ間の組換え反応が、インテグラーゼとエクシジョナーゼが共発現することで反応が行われることが確認され、インビボにおいてＴＧ１エクシジョナーゼが当該活性を有していることが確認された。
【００６４】
さらにＰＣＲ法による組換え産物の解析の結果を図３に示す。具体的には、図３は、ＰＣＲ法による組換え産物の解析のアガロースゲル電気泳動写真である。遺伝子発現プラスミドとして、レーン１とレーン５はｐＬａｃを用いたもの、レーン２とレーン６はｐＬａｃーｉｎｔを用いたもの、レーン３とレーン７はｐＬａｃーｘｉｓを用いたもの、レーン４とレーン８はｐＬａｃーｉｎｔーｘｉｓを用いたものである。基質プラスミドとして、レーン１からレーン４はｐＵＣＢＺＰを、レーン５からレーン８はｐＵＣＬＺＲを用いたものである。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーを示す。Ｓは組換え反応前の基質プラスミドのＰＣＲ産物を示す。Ｐは組換え反応後の基質プラスミドのＰＣＲ産物を示す。図３から明らかなように、インテグラーゼとエクシジョナーゼによる組換え反応は目的の部位で生じていることが確認された。
【００６５】
実施例３；アクチノファージＴＧ１エクシジョナーゼ遺伝子のクローニング
プラスミドｐＥＴ−ＧＳＴ(Mol.Genet.Genomics,282,607-616(2009)) を単離した。ｐＥＴ−ＧＳＴは、ｐＥＴ−２１ａのＴ７プロモーター下流のＮｄｅＩとＢａｍＨＩ切断部位に０．７ｋｂのＧＳＴ遺伝子 を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。次に、ＴＧ１ファージが溶原化している放線菌ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（北里大学より入手）のゲノムを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりエクシジョナーゼ遺伝子を増幅した。
【００６６】
プライマー（Ａ）5'-TCCAGGGGCCCCTGGGATCCATGGCCGGATTCAACCTTTG-3'    配列番号８
プライマー（Ｂ）5'-GCTCGAATTCGGATCCTTAGTCGGCGATCGCGTCGT-3'    配列番号９
ＰＣＲによるエクシジョナーゼ遺伝子の増幅は、反応液１００μＬ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、テンプレートＤＮＡ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２μＭ、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）２．５ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９８℃、１０秒）、アニーリングとポリメライゼーション（６８℃、１分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
【００６７】
遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning II、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、０．７ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＥＴ−ＧＳＴとIn-Fusion（登録商標） HD Cloning Kit（タカラバイオ）を用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株(Novagen社より入 手)を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＥＴＧＳＴ−ｘｉｓを単離した。ｐＥＴＧＳＴ−ｘｉｓは、ｐＥＴ−ＧＳＴのＧＳＴ遺伝子下流のＢａｍＨＩ切断部位に０．７ｋｂのアクチノファージＴＧ１のエクシジョナーゼ遺伝子がＧＳＴ遺伝子とインフレームで挿入されたものである。
【００６８】
実施例４；アクチノファージＴＧ１エクシジョナーゼの発現と調製  
プラスミドｐＥＴＧＳＴ−ｘｉｓを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含有するＬＢ培地で３０oCで２時間培養後、終濃度１ｍMとなるようにＩＰＴＧを添加し、２５oCで３時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、１ｘＰＢＳ緩衝液((140mM NaCl、2.7mM KCl、10.1mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、pH7.3)で再懸濁した。超音波破砕を３０秒間、 ２回行い、遠心分離によって上清を得た。この上清からBulk GST Purification Module(GE Healthcare Biosciences社製)を用いてＧＳＴ−ＴＧ１エクシジョナーゼ融合蛋白質を精製した。
【００６９】
１ｘＰＢＳで平衡化したGlutathione Sepharose 4Bを上清に添加し、１ｘＰＢＳで洗浄後、1×PreScission buffer(5mM Tris-HCl pH7.5、15mM NaCl、0.1mM EDTA、0.1mM DTT)を添加し室温で１時間放置した。その後、0.05UnitのPreScission protease(GE Healthcare Biosciences社製)を含んだ1×PreScission bufferを添加し、４oCで４時間放置し、ＧＳＴとエクシジョナーゼの間に存在するPreScission proteaseサイトで切断を行った。遠心分離によりＴＧ１エクシジョナーゼを回収し、酵素標品とした。得られたエクシジョナーゼの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認したところ、２６．６ｋＤａであった。
【００７０】
実施例５；アクチノファージＴＧ１エクシジョナーゼの活性解析
Reaction buffer(20mM Tris-HCl pH7.5、10mM EDTA、25mM 20  NaCl、10mM Spermidine、1mM DTT、0.1mg/ml B SA)に、３ｐｍｏｌのＴＧ１インテグラーゼ及び３ｐｍｏｌのＴＧ１エクシジョナーゼ、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列をそれぞれプラスミドｐＵＣ１９に挿入したプラスミドｐＵＣａｔｔＰ、ｐＵＣａｔｔＢ、ｐＵＣａｔｔＬ、ｐＵＣａｔｔＲＤＮＡ０．０３ｐｍｏｌならびにそれぞれ対応するＤＮＡ断片である、ａｔｔＢ−ＤＮＡ、ａｔｔＰ−ＤＮＡ、ａｔｔＲ−ＤＮＡ及びａｔｔＬ−ＤＮＡ０．３ｐｍｏｌを下記表１に示す組合わせで加えて、全量１０μＬの反応溶液を調製し、３０oＣで２時間保温した：
【００７１】
【表１】
2013176302.tif 000002
【００７２】
反応後、６５oＣで１０分間保温し、反応を停止させた。反応液を１．０％アガロースゲル電気永動に供し、酵素活性を解析した。
【００７３】
ここで、上記各反応の一例として、ｐＵＣａｔｔＬ及びａｔｔＲを基質として用いた場合のインビトロにおける組換え反応の模式図を図４に示す。
当該反応系にてインテグラーゼが作用すると、プラスミドｐＵＣａｔｔＬ上のａｔｔＬとａｔｔＲＤＮＡとの間で組換え反応が生じる。この反応における組換え産物はａｔｔＰとａｔｔＢを含んだ直鎖状ＤＮＡとなる。
【００７４】
結果を図５に示す。より具体的には、図５は、インビトロにおける組換え反応の解析のアガロースゲル電気泳動写真である。レーン１〜レーン１２は、それぞれ、上記試験１〜１２に対応する。レーンＭはＤＮＡサイズマーカーを示す。Ｓは組換え反応前の基質プラスミドＤＮＡを示す。Ｐは組換え産物のＤＮＡを示す。
【００７５】
図５の結果、特にレーン９及び１２に示されるように、ａｔｔＬを含むＤＮＡ及びａｔｔＲを含むＤＮＡを基質として、エクシジョナーゼを作用させることによって、組換え産物Ｐが生成された。このことから明らかなように、インテグラーゼ単体では行う事が出来なかった配列ａｔｔＬ及び配列ａｔｔＲを認識してａｔｔＢ及びａｔｔＰを生じさせる組換え反応が、インテグラーゼとエクシジョナーゼが存在することで反応が行われることが確認され、インビトロにおいてＴＧ１エクシジョナーゼが当該活性を有していることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明のエクシジョナーゼは、従来公知のエクシジョナーゼと異なる核酸配列を認識する。従って、従来の公知のエクシジョナーゼ、インテグラーゼと組み合わせることにより、より複雑な遺伝子操作（例えば、染色体上に核酸分子を組み込み、その後、その一部を本発明のエクシジョナーゼを用いて切り出す等）を行うことが可能となる。また、本発明のエクシジョナーゼは、宿主因子を必要とせず組換え反応を生じさせることができる。従って、本発明は、遺伝子工学を用いる種々の分野（遺伝子治療、遺伝子組換え作物の作成、その他遺伝子工学を用いた研究）に応用可能であり、産業上、非常に有用な発明である。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号８はプライマーである。
【００７８】
配列番号９はプライマーである。
【００７９】
配列番号１０はプライマーである。
【００８０】
配列番号１１はプライマーである。
【００８１】
配列番号１２はプライマーである。
【００８２】
配列番号１３はプライマーである。
【図３】
2013176302.tif 000003
【図５】
2013176302.tif 000004
【図１】
2013176302.tif 000005
【図２】
2013176302.tif 000006
【図４】
2013176302.tif 000007
【配列表】
2013176302000001.app