(57)【要約】【課題】多分化能幹細胞から所望の細胞タイプに分化させた後、患者の体内に移植する際に、患者の体内で未分化状態の多分化能幹細胞が増殖することを防止する技術であって、前記多分化能幹細胞に突然変異を誘発するおそれのない技術を開発する。【解決手段】本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を提供する。本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物は、ｐ１６及びｐ５３のタンパク質等を含む。本発明は、ｐ１６及びｐ５３のタンパク質の発現を誘導できるポリヌクレオチドを含む多能性幹細胞を提供する。本発明は、本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を多能性幹細胞中に導入するステップを含む、多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物であって、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される、少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物。
【請求項２】
多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物であって、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドは、恒常型又は誘導型プロモーターに発現可能に連結されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記誘導型プロモーターは、テトラサイクリン誘導型プロモーターであることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１つに記載の組成物を含むことを特徴とする、前記多能性幹細胞の生体内での腫瘍化を防止するための医薬品組成物。
【請求項６】
前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法であって、
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたタンパク質を多能性幹細胞中に導入するステップと
を含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法。
【請求項８】
多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法であって、
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列との相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるヌクレオチド配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入するステップと、
（３）
ステップ（２）で導入されたポリヌクレオチドがエンコードするタンパク質を発現するステップと
を含むことを特徴とする、多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、恒常型又は誘導型プロモーターに発現可能に連結されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記誘導型プロモーターは、テトラサイクリン誘導型プロモーターであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であることを特徴とする、請求項７ないし１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれかに連結された融合タンパク質と
からなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を誘導可能に発現するポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、多能性幹細胞。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であることを特徴とする、請求項１２に記載の多能性幹細胞。
【請求項１４】
多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物に混在する未分化多能性幹細胞を除去する方法であって、
（１）
多能性幹細胞を用意するステップと、
（２）
前記多能性幹細胞を分化させて、細胞医薬組成物を製造するステップと、
（３）
請求項１ないし６のいずれか１つに記載の組成物を用意するステップと、
（４）
前記細胞医薬組成物に前記組成物を曝露するステップと
を含むことを特徴とする、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物に混在する未分化多能性幹細胞を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物及び方法に関し、具体的には、ｐ１６及び／又はｐ５３のタンパク質等を含む、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物と、該組成物を用いることを含む、多能性幹細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多分化能幹細胞を用いる再生医療技術の課題のひとつは、多分化能幹細胞から所望の細胞タイプに分化させた後、患者の体内に移植する際に、前記多分化能幹細胞が未分化状態のまま残存し、分化した細胞とともに前記患者の体内に移植され、患者の体内で増殖する危険を如何に防止するかである（非特許文献１）。前記課題の解決策として、安全弁として提唱されている方策（非特許文献２、３）は、ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を前記多分化能幹細胞に安定的に導入しておくことである。すなわち、前記多分化能幹細胞由来の細胞が患者に移植された後望ましくない細胞増殖を起こすときには、ガンシクロビルを投与する。ガンシクロビルは、前記ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ酵素には基質として認識されるが、ヒトのチミジンキナーゼ酵素には基質として認識されない。そこで、前記患者の細胞に影響を与えることなく、前記ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子が導入された移植細胞の増殖だけを阻害することができる。しかし、今度は、前記ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子が前記多分化能幹細胞に導入されることにより、該多分化能幹細胞に挿入突然変異が誘発される危険が生じる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｌｏｗｒｙ，  Ｗ．Ｅ．及びＱｕａｎ，  Ｗ．Ｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、１２３：６４３（２０１０）
【非特許文献２】Ｃｉｃｅｒｉ、Ｆ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．、１０：４８９（２００９）
【非特許文献３】Ｍｅｎｚｅｌ、Ｏ．ら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１７：１７５４（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、患者の体内で未分化状態の多分化能幹細胞が増殖することを防止する技術であって、前記多分化能幹細胞に突然変異を誘発するおそれのない技術を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を提供する。本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物は、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される、少なくとも１種類のタンパク質を含む。
【０００６】
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物は、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に、１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドと、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを含む。
【０００７】
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物において、前記ポリヌクレオチドは、恒常型又は誘導型プロモーターに発現可能に連結される場合がある。
【０００８】
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物において、前記誘導型プロモーターは、テトラサイクリン誘導型プロモーターの場合がある。
【０００９】
本発明は、多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を含む、該多能性幹細胞の生体内での腫瘍化を防止するための医薬品組成物を提供する。
【００１０】
本発明の多能性幹細胞の生体内での腫瘍化を防止するための医薬品組成物において、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の場合がある。
【００１１】
本発明は多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法を提供する。本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法は、
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされ、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたタンパク質を多能性幹細胞中に導入するステップとを含む。
【００１２】
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法は、
（１）
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上か、数個かのアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列との相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるヌクレオチド配列を有し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成し、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（ｆ）特異的結合タグペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドと、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれか１つに連結された融合ポリヌクレオチドとからなるグループから選択される少なくとも１種類のポリヌクレオチドを用意するステップと、
（２）
ステップ（１）で用意されたポリヌクレオチドを多能性幹細胞に導入するステップと、
（３）
ステップ（２）で導入されたポリヌクレオチドがエンコードするタンパク質を発現するステップとを含む。
【００１３】
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法において、前記ポリヌクレオチドは、恒常型又は誘導型プロモーターに発現可能に連結される場合がある。
【００１４】
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法において、前記誘導型プロモーターは、テトラサイクリン誘導型プロモーターの場合がある。
【００１５】
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための方法において、前記幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の場合がある。
【００１６】
本発明は多能性幹細胞を提供する。本発明の多能性幹細胞は、
（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１又は２のアミノ酸配列に１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１又は２のアミノ酸配列との相同性が、８０％、９０％又は９５％か、それ以上かであるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとの相同性が、７０％、８０％、８５％、９０％又は９５％か、それ以上かであるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｅ）配列番号３又は４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有するタンパク質と、
（ｆ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｅ）のいずれかに連結された融合タンパク質と、
（ｇ）細胞膜透過性ペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかに連結された融合タンパク質と
からなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を誘導可能に発現するポリヌクレオチドを含む。
【００１７】
本発明の多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の場合がある。
【００１８】
本発明は、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物に混在する未分化多能性幹細胞を除去するための方法を提供する。前記方法は、
（１）
多能性幹細胞を用意するステップと、
（２）
前記多能性幹細胞を試験管内で分化させて、細胞医薬組成物を製造するステップと、
（３）
本発明の多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を用意するステップと、
（４）
前記細胞医薬組成物に前記多能性幹細胞の増殖を抑制するための組成物を曝露するステップとを含む。
【００１９】
本発明は、多能性幹細胞由来の分化細胞を含む細胞医薬組成物に混在する未分化多能性幹細胞を除去するための方法を提供する。前記方法は、
（１）
本発明の多能性幹細胞を用意するステップと、
（２）
前記多能性幹細胞を試験管内で分化させて、細胞医薬組成物を製造するステップと、
（３）
ステップ（２）の後、本発明の多能性幹細胞に含まれるポリヌクレオチドの発現を誘導するステップとを含む。
【００２０】
本明細書において、ｐ１６とはサイクリン依存性キナーゼ４インヒビター（ｐ１６−ＩＮＫ４又はｐ１６ＩＮＫ４ａ）をいい、ｐ５３とは腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）をいい、ｐ２１とはサイクリン依存性キナーゼ・インヒビター１Ａ（Ｃｉｐ１）をいう。ヒトｐ１６、ｐ５３及びｐ２１タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び５に列挙され、ヒトｐ１６、ｐ５３及びｐ２１タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３、４及び６に列挙される。
【００２１】
本発明において、ヒトｐ１６及びｐ５３のタンパク質は、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号１及び２に列挙されるアミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を含んでもかまわない。あるいは、前記ヒトｐ１６及びｐ５３のタンパク質は、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号１及び２に列挙されるアミノ酸配列との同一性が、８０％又はこれ以上か、９０％又はこれ以上か、９５％又はこれ以上かであってもかまわない。前記ヒトｐ１６及びｐ５３のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列に１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換又は挿入を含むヌクレオチド配列でもかまわない。前記ヒトｐ１６及びｐ５３のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列との同一性が、８０％又はこれ以上か、９０％又はこれ以上か、９５％又はこれ以上のヌクレオチド配列でもかまわない。
【００２２】
本発明のｐ１６及びｐ５３のポリヌクレオチド及びタンパク質は、配列を特定せずに言及される場合には、多能性幹細胞の増殖を抑制する活性を有することを条件として、該多能性幹細胞と同一の生物種であっても、異なる生物種であってもかまわない。前記生物種は、ヒトの他、サル、ブタ、マウス等の実験動物を含むが、これらに限られない。
【００２３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００２４】
本発明において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００２５】
本発明において、ｐ１６及びｐ５３のタンパク質は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ又はＲＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される場合がある。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。
【００２６】
本明細書において、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結された化合物を指す。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。
【００２７】
本明細書において、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」とは、２個以上のヌクレオチドがホスフォジエステル結合で連結された化合物を指す。「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。
【００２８】
本明細書において、特異的結合タグとは、所望の機能を有するポリペプチドを遺伝子組み換えによって調製する際に、前記所望の機能を有するポリペプチドとペプチド結合で連結した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体からの発現タンパク質の分離、精製又は検出をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂、シリコン等と特異的に結合するポリペプチドをいう。前記特異的結合タグは、水溶液中に溶解した物質又は固体支持体と結合する場合がある。前記特異的結合タグには、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。前記特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ又はＧＳＴからなるグループから選択される場合がある。
【００２９】
本明細書において、細胞膜透過ペプチドとは、他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合タンパク質を細胞外に添加すると、細胞膜を透過して前記融合タンパク質を細胞内に移行させることができるペプチドをいい、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のＴａｔタンパク質ＲＮＡ  結合領域（４８−６０位）由来のアルギニンに富む塩基性ペプチド（ＴＡＴペプチド）、アルギニン残基が６ないし１２個連続したオリゴホモペプチド、ショウジョウバエ由来の転写因子Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のＤＮＡ  結合領域由来の塩基性両親媒性ヘリックス構造を有するペプチド（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉及び内胚葉に由来する少なくとも２種類の細胞タイプに分化することができ、かつ、未分化状態で増殖する細胞を指し、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）を含むが、これらに限定されない。ｉＰＳ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）が、患者に移植された細胞が治療に利用できる程度に適合する細胞から作成されることが好ましく、移植される患者本人の細胞から作成されることが最も好ましい。
【００３１】
前記ポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとして細胞に導入されてもかまわない。また、前記ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等を有するベクターに挿入されたコンストラクトとして細胞に導入されてもかまわない。前記ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等の場合がある。前記プロモーターは、構成型プロモーター又は誘導型プロモーターを用いることができる。前記誘導型プロモーターは、プロモーターの活性を促進又は抑制する誘導因子の存在下で、前記プロモーターに連結された所望のポリヌクレオチドの転写を制御できる配列をいう。前記誘導因子は、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ＩＰＴＧ等の化合物等を含むが、これらに限定されない。前記誘導型プロモーターは、前記誘導因子と特異的な相互作用を行うトランスアクチベータータンパク質によって転写が制御される。そこで、本発明のｐ１６又はｐ５３を発現する誘導型プロモーターを含むコンストラクトは、該誘導型プロモーターの転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するベクターが発現する宿主細胞に導入される必要がある。前記誘導型プロモーターの転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するコンストラクトは、前記ｐ１６又はｐ５３を発現する誘導型プロモーターを含むコンストラクトの導入前か、あるいは、導入と同時に、前記宿主細胞に導入される。前記誘導型プロモーターの転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するコンストラクトは、前記トランスアクチベータータンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが、構成型プロモーター又は誘導型プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化部位、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等を有するベクターに挿入されて作出される。
【００３２】
本発明のｐ１６又はｐ５３を発現するコンストラクトは、当業者に周知な方法を用いて多能性幹細胞に導入される。前記コンストラクトが誘導型プロモーターを含む場合、その転写制御に関与するトランスアクチベータータンパク質を発現するコンストラクトも、当業者に周知な方法を用いて前記多能性幹細胞に導入される。前記遺伝子の導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、微量注入法、電気穿孔法、パーティクル・ガン法等を含むが、これらに限定されない。前記コンストラクトが、レトロウイルス、アデノウイルス等の感染性粒子を産生する場合には、ヘルパーウイルス等を用いて培養液中に放出された前記感染性粒子が回収されて、多能性幹細胞に添加される。
【００３３】
本発明において、多能性幹細胞の培養方法は、浮遊凝集培養法、フィーダー細胞を用いた共培養法等を含むが、これらに限定されない。多能性幹細胞から所望の細胞タイプへの分化誘導方法は、当業者に周知のいかなる方法を用いて実施されてもかまわない。本発明の多能性幹細胞に由来する分化細胞を患者に適用する経路は、目的の生体組織に送達されることを条件として特に問わない。前記細胞は、移植、静脈注射、皮下注射及び筋肉注射を含むが、これらに限定されない手段によって患者に適用される場合がある。
【００３４】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞におけるドキシサイクリンによる発現誘導の実験結果を示すウェスタンブロット図。
【図２−１】ｐ１６の継続的な発現誘導が２０１Ｂ７細胞の増殖に与える効果を調べた実験結果を示すグラフ。
【図２−２】ｐ２１の継続的な発現誘導が２０１Ｂ７細胞の増殖に与える効果を調べた実験結果を示すグラフ。
【図２−３】ｐ５３の継続的な発現誘導が２０１Ｂ７細胞の増殖に与える効果を調べた実験結果を示すグラフ。
【図３】ｐ１６の一過性の発現誘導による２０１Ｂ７細胞の増殖への影響を調べた実験結果を示すグラフ。
【図４】マウス脳内に移植された２０１Ｂ７細胞の増殖に対するドキシサイクリン添加飲水によるｐ５３誘導の影響を調べた実験結果を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００３７】
以下の実施例に説明される研究は、「ヘルシンキ宣言（２００２年１０月改定）」、「疫学研究に関する倫理指針（平成１４年６月１７日文部科学省、厚生労働省）」、「臨床研究に関する倫理指針（平成１５年７月３０日厚生労働省）」、「実験動物の適正な実施に向けたガイドライン（平成１８年６月１日日本学術会議）」、「研究機関における動物実験等の実施に関する基本指針（平成１８年６月１日文部科学省）」及び「厚生労働省における動物実験等の実施に関する基本指針（平成１８年６月１日厚生労働省）」の趣旨に則り公立大学法人名古屋市立大学の倫理委員会によって承認された後に実施された。承認番号等は以下のとおりである。
（１）Ｈ２１Ｍ−６５
マウス胎児線維芽細胞初代培養フィーダーの作成
承認日  平成２２年２月１０日
（２）Ｈ２１Ｍ−７２
老化誘導カセット導入ｉＰＳおよびＥ細胞のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおける造腫瘍性の検討
承認日  平成２２年４月６日
【実施例１】
【００３８】
ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３の遺伝子を誘導可能に発現するｉＰＳ細胞の樹立
１．材料及び方法
（１）ｉＰＳ細胞培養用フィーダー細胞の調製
マウス胎仔線維芽細胞（以下、「ＭＥＦ細胞」という。）が、ｉＰＳ細胞培養用フィーダー細胞として用いられた。胎齢１３．５〜１４．５日のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、日本エスエルシー株式会社）の胎仔が、内臓及び頭部以外の胴体をハサミで細かく切断された後、０．２５％のトリプシン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む、カルシウム及びマグネシウムイオン不含生理食塩水（０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ、２５２００、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）中で、３７°Ｃ、１０分間インキュベーションされた。１０％  ウシ胎仔血清、１％  ピルビン酸ナトリウム、１％  非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ、１５１４０、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）の１％）、及び、５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（１２６９９−０１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、以下、「ＭＥＦ細胞用培地」という。）が調製された。前記マウス胎仔線維芽細胞は、培養ディッシュ（１４５．０／２０ｍｍ、６３９１６０、株式会社  グライナー・ジャパン）に１枚あたり２×１０６個播種され、前記ＭＥＦ細胞用培地を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。
【００３９】
（２）ｉＰＳ細胞培養用フィーダー細胞の凍結保存
継代３回までのＭＥＦは、１μｇ／ｍＬ  マイトマイシン−Ｃ（ＭＯ５０３、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を添加したＭＥＦ細胞用培地で２時間培養された後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄され、０．２５％  トリプシン及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む、カルシウム及びマグネシウムイオン不含生理食塩水（０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ、ＧＩＢＣＯ、２５２００、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で処理された。その後、前記ＭＥＦは細胞凍結保存液バンバンカー（ＣＳ−０２−００１、日本ジェネティクス株式会社）に３×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁され、１ｍＬずつ凍結保存用チューブに移され、−１５０°Ｃで凍結保存された。
【００４０】
（３）ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、１３１：８６１（２００７））は、山中伸弥教授（国立大学法人京都大学  ｉＰＳ細胞研究所）から供与された。２０１Ｂ７細胞が培養される前日に、ＭＥＦ細胞は、解凍後、ゼラチンコートされた培養ディッシュ（３５３００３、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に１枚あたり１×１０６個播種され、前記ＭＥＦ細胞用培地を用いて、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で終夜培養された。２０１Ｂ７細胞は、前記ＭＥＦ細胞上にディッシュ１枚あたり約１×１０５個播種された。その後、ヒトｉＰＳ細胞培養用培地を用いて、前記２０１Ｂ７細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。前記ヒトｉＰＳ細胞培養用培地は、２０％  ノックアウト血清代替添加物（ＫＳＲ、１０８２８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と、１％  非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）と、１％  Ｌ−グルタミンと、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ（Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（ＧＩＢＣＯ、１５１４０、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）の０．５％）と、１００μＭ  ２−メルカプトエタノールと、５μｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、東洋紡績（株）ライフサイエンス事業部）とが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄ６４２１、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）である。前記ヒトｉＰＳ細胞培養用培地は、毎日交換された。
【００４１】
（４）ヒトｉＰＳ細胞の継代培養
細胞分離溶液（ＲＣＨＥＴＰ００２、コスモ・バイオ株式会社）を用いて前記ディッシュから解離された２０１Ｂ７細胞が前記ディッシュ１枚あたり約１×１０５個に希釈されて継代培養に用いられた。
【００４２】
（５）レンチウイルスベクターの作成
テトラサイクリン誘導型ｃＤＮＡ発現プラスミド（ＣＳＩＶ−ＴＲＥ−ＲｆＡ−ＵｂＣ−ＫＴ）と、パッケージングプラスミド（ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ）とは、三好浩之氏（理化学研究所バイオリソースセンター細胞運命情報解析技術開発サブチーム）から供与された。Ｍｙｃタグとｐ１６との融合タンパク質（以下、「ｐ１６−ｍｙｃ」という。）と、Ｆｌａｇタグとｐ５３との融合タンパク質（以下、「Ｆｌａｇ−ｐ５３」という。）と、ＨＡタグとｐ２１との融合タンパク質（以下、「ｐ２１−ＨＡ」という。）とをエンコードするポリヌクレオチドが、それぞれ、プラスミド（ｐＥＮＴＲ（商標）１Ａ）にクローニングされた。前記ポリヌクレオチドは、Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（１１７９１−０２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、それぞれ、前記テトラサイクリン誘導型ｃＤＮＡ発現プラスミド（ＣＳＩＶ−ＴＲＥ−ＲｆＡ−ＵｂＣ−ＫＴ）のＲｆＡ（Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ａ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、クロラムフェニコール耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチド）を置換するように挿入された。構築されたプラスミドは、それぞれ、「ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ベクター」、「Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ベクター」及び「ｐ２１−ＨＡ誘導発現ベクター」と命名された。
【００４３】
（６）宿主細胞の培養
前記誘導発現ベクターの挿入配列を含む自己不活性化レンチウイルス粒子を放出させるための宿主細胞として、継代回数の少ない２９３Ｔ細胞が用いられた。前記２９３Ｔ細胞は、０．０１％  ポリ−Ｌ−リジン溶液（Ｐ４８３２、シグマアルドリッチジャパン株式会社）で１０分間コーティングされた培養ディッシュ（３５３００３、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）にディッシュ１枚あたり５×１０６個播種された。前記細胞は、１０％  ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（以下、「２９３Ｔ細胞用培地」という。）を用いて、３７°Ｃ、１０％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で２４時間培養された。
【００４４】
（７）宿主細胞への感染
ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ベクター、Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ベクター又はｐ２１−ＨＡ誘導発現ベクターは、リン酸カルシウム法によって２９３Ｔ細胞に２種類のパッケージングプラスミドｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖと同時にトランスフェクションされた。前記細胞は、３７°Ｃ、３％ＣＯ２で１２〜１８時間培養された。ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ベクター、Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ベクター及びｐ２１−ＨＡ誘導発現ベクターがトランスフェクションされた前記細胞から放出される自己不活性化レンチウイルスは、それぞれ、「ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ウイルス」、「Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ウイルス」及び「ｐ２１−ＨＡ誘導発現ウイルス」という。その後、前記２９３Ｔ細胞用培地から、１０μＭフォルスコリン（Ｄ４５４６、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）と、１０％  ウシ胎仔血清とを添加したダルベッコ変法イーグル培地に切り換えられ、前記細胞は、３７°Ｃ、１０％ＣＯ２で２日間培養された。
【００４５】
（８）レンチウイルスの濃縮
２日間培養後の前記培養液は、０．４５μｍのフィルターでろ過された後、超遠心分離用チューブに回収された。超遠心分離機（ｈｉｍａｃ  ＳＣＰ  ８５Ｇ、日立製作所）を用いて２０°Ｃ、５００００×ｇで２時間の超遠心分離が行われた。沈殿物の懸濁液は限外濾過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔｓ、分画分子量１００，０００、ＵＦＣ５１００９６、日本ミリポア株式会社）を用いて濃縮され、濃縮ウイルス液が調製された。
【００４６】
（９）ヒトｉＰＳ細胞への遺伝子導入
前記細胞分離溶液を用いて解離された２０１Ｂ７細胞は、前記ヒトｉＰＳ細胞培養用培地に懸濁された。この細胞懸濁液に対して体積比０．０５倍量のレンチウイルス液が添加され、３７°Ｃ、３％ＣＯ２で３時間静置された後、前記フィーダー細胞上に播種された。前記２０１Ｂ７細胞は終夜培養された後、培地が交換された。
【００４７】
（１０）遺伝子導入されたヒトｉＰＳ細胞の選択
ｐ１６−ｍｙｃ誘導発現ウイルス、Ｆｌａｇ−ｐ５３誘導発現ウイルス又はｐ２１−ＨＡ誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞は、クサビラ−オレンジ蛍光タンパク質の赤色蛍光を指標として蛍光顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、株式会社キーエンス）により同定され、赤色蛍光陽性の細胞の分離、解離、及びコロニー形成を繰り返して、安定的にクサビラ−オレンジ蛍光タンパク質を発現するクローンが選択された。
【００４８】
（１１）アルカリフォスファターゼ染色
アルカリフォスファターゼ染色は、アルカリフォスファターゼキット（８６Ｌ３Ｒ、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いて製造者の指示書に従って行われた。観察には、顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、株式会社キーエンス）が用いられた。
【００４９】
（１２）ドキシサイクリンによる遺伝子発現誘導
２０１Ｂ７細胞に導入された外来遺伝子の発現誘導は、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン（Ｄ９８９１、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地を用いて行われた。陰性対照には、ドキシサイクリンと同じ体積の水を添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地が用いられた。
【００５０】
（１３）ウェスタンブロット解析
ウェスタンブロット解析は、当業者に周知の標準的な方法に従って行われた。１次抗体には、マウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０  Ｓｃ４０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、コスモ・バイオ株式会社）、マウス抗ＨＡ抗体（１２ＣＡ５  １１５８３８１６００１、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、及び、マウス抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍ２  Ｆ３１６５、シグマアルドリッチジャパン株式会社）が用いられた。２次抗体には、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が用いられた。検出は、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＲＰＮ２２０９、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて行われた。
【００５１】
２．結果
（１）遺伝子導入されたヒトｉＰＳ細胞
ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ及びＦｌａｇ−ｐ５３のそれぞれの誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞から、クサビラ−オレンジ蛍光タンパク質の赤色蛍光陽性、かつ、未分化細胞の形態を示す細胞のクローンが単離された。これらの細胞は、アルカリフォスファターゼ染色で陽性であった（図示されない）ことから、ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ及びＦｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ベクターの挿入配列が安定的にインテグレーションされた２０１Ｂ７細胞は、生化学的なマーカーからも未分化状態を維持していることが示された。
【００５２】
（２）ドキシサイクリンによる遺伝子発現誘導
図１は、前記誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞におけるドキシサイクリンによる発現誘導の実験結果を示すウェスタンブロット図である。ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ又はＦｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞が播種されて２４時間後から４８時間後までの間ドキシサイクリンを含む培地に切り替えられ、その後、細胞は解離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで溶解され、ウェスタンブロッティング法に供された。ｐ１６、ｐ５３及びｐ２１は、それぞれ、連結されたｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦｌａｇタグに特異的な抗体で検出された。その結果、図に示すとおり、１ｐ１６、ｐ５３及びｐ２１は、いずれも、陰性対照（ｃｏｎｔ）では全く発現が認められなかったが、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬのドキシサイクリン存在下の２４時間の培養では発現が十分に認められた。なお、最大限の誘導活性は、ドキシサイクリン濃度１μｇ／ｍＬで得られた。
【実施例２】
【００５３】
継続的に発現が誘導された遺伝子による未分化ｉＰＳ細胞の増殖抑制
１．材料及び方法
ｐ１６−ｍｙｃ、ｐ２１−ＨＡ及びＦｌａｇ−ｐ５３のそれぞれの誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞の培養及び遺伝子発現誘導は、実施例１で説明された方法に従って行われた。遺伝子発現誘導による細胞増殖への影響を調べるためには、１２ウェルの培養プレート（３５３０４８、ファルコン、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に５×１０４個／ウェルのＭＥＦ細胞が播種された。翌日、２０１Ｂ７細胞は、１×１０４個／ウェルとなるように前記培養プレートに播種された。２４時間の培養後、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンか、同体積の水かを添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地に切り換えられ、培地交換は毎日行われた。毎日それぞれの実験条件ごとに２個のウェルの２０１Ｂ７細胞が細胞分離溶液によって解離され、細胞数が算出された。
【００５４】
２．結果
図２−１、図２−２及び図２−３は、それぞれ、ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３の継続的な発現誘導が２０１Ｂ７細胞の増殖に与える効果を調べた実験結果を示すグラフである。図２−１、図２−２及び図２−３において、縦軸は、ウェルあたりの細胞数で、単位は１×１０４個である。横軸は、培養日数で、横軸の下の帯は培養１日目以後ドキシサイクリンによる誘導が継続されたことを示す。実線は培養１日目以後ドキシサイクリンによる誘導が継続された細胞の増殖曲線を示し、破線は全く誘導されなかった細胞の増殖曲線を示す。図２−１、図２−２及び図２−３に示されるとおり、ｐ１６及びｐ５３は２０１Ｂ７細胞の増殖をほぼ完全に抑制したが、ｐ２１は２０１Ｂ７細胞の増殖にはほとんど影響を与えなかった。本実施例の結果から、２０１Ｂ７細胞の増殖は、ｐ１６及びｐ５３によって顕著に抑制されるが、ｐ２１によっては抑制されないことが示された。なお、ｐ１６及びｐ５３の誘導開始から４８時間までの培養では、単離細胞の浮遊が観察された。
【実施例３】
【００５５】
ｐ１６の一過性の発現誘導による未分化ｉＰＳ細胞の増殖抑制
１．材料及び方法
ｐ１６−ｍｙｃの誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞の培養、遺伝子発現誘導及び細胞数測定は、実施例２で説明された方法に従って行われた。２４時間培養後、培地は１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加したヒトｉＰＳ細胞培養用培地に切り換えられた。さらに２４又は４８時間培養後、培地はドキシサイクリンを含まないヒトｉＰＳ細胞培養用培地に切り換えられた。その後、ドキシサイクリンを含まないヒトｉＰＳ細胞培養用培地が毎日交換された。
【００５６】
２．結果
図３は、ｐ１６の一過性の発現誘導による２０１Ｂ７細胞の増殖への影響を調べた実験結果を示すグラフである。図３のグラフはそれぞれ２回の実験結果の平均値がプロットされた。図３において、縦軸は、ウェルあたりの細胞数で、単位は１×１０４個である。横軸は、培養日数で、横軸の下の帯は培養１日目から２４時間だけドキシサイクリンによる誘導が行われたことを示す。実線は培養１日目から２４時間だけドキシサイクリンによるｐ１６発現誘導が行われた細胞の増殖曲線を示し、破線は全く誘導されなかった細胞の増殖曲線を示す。図３に示されるとおり、ｐ１６が２４時間発現誘導されただけで、２０１Ｂ７細胞の増殖は顕著に抑制された。また、発現誘導終了後も少なくとも５日間２０１Ｂ７細胞は増殖しなかった。ｐ１６が４８時間発現誘導された際に、ヒトｉＰＳ細胞の形態は扁平状に肥大化した（図示されない）。
【００５７】
以上の実験結果から、ヒトｉＰＳ細胞は、ｐ１６の一過的発現誘導によって、増殖抑制されること、及び、老化した細胞と同様の形態となることが示された。したがって、ｐ１６は、細胞分化を誘導ことによって幹細胞の増殖を抑制できることが示唆された。
【実施例４】
【００５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける未分化細胞の増殖抑制
１．材料及び方法
（１）ヒトｉＰＳ細胞
Ｆｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞の培養は、実施例１で説明された方法に従って行われた。
【００５９】
（２）マウス
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（６〜１５週齢、チャールズ・リバー）が移植実験に用いられた。
【００６０】
（３）マウスへのヒトｉＰＳ細胞の移植
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは麻酔下で開頭され、Ｆｌａｇ−ｐ５３の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞（２×１０５個／２μＬ）が、ブレグマ（矢状縫合と冠状縫合との交点）から前方１ｍｍ、右側２ｍｍ、及び、深さ３ｍｍの線条体に移植された。
【００６１】
（４）ｐ５３の発現誘導
２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した飲水が、遮光した給水瓶で、実験群のマウスに移植日から３週間投与された。前記給水瓶の飲水は３日毎に交換された。陰性対照群のマウスには、ドキシサイクリンを添加しない飲水が投与された。
【００６２】
（５）組織学的解析
２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加した飲水投与３週間後、マウスは屠殺され、４％パラホルムアルデヒドを添加したリン酸緩衝生理食塩水で潅流固定された脳組織がビブラトームで薄切され、５０μｍ厚の連続切片が作成された。３６０μｍ間隔の切片が共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス株式会社）で観察され、脳内に移植されたｉＰＳ細胞塊の最大径が測定された。
【００６３】
２．結果
図４は、マウス脳内に移植された２０１Ｂ７細胞の増殖に対するドキシサイクリン添加飲水によるｐ５３誘導の影響を調べた実験結果を示す棒グラフである。縦軸はマウス脳内移植後３週間目の細胞塊の最大径の相対値を示す。各実験条件の誤差棒は、陰性対照群及び実験群のマウスそれぞれ３匹の細胞塊の最大径相対値の標準偏差を示す。アステリスク（＊）は、スチューデントのｔ検定においてｐ値が０．２１％であることを示す。なお、陰性対照群の細胞塊の最大断面積の平均値は８．０２４ｍｍ２であったのに対し、実験群の細胞塊の最大断面積の平均値は０．２０７ｍｍ２であった。図４に示されるとおり、陰性対照群では３週間で２０１Ｂ７細胞がマウス脳内で増殖して大きな細胞塊を形成するのに対し、実験群では生体内に移植された２０１Ｂ７細胞でもドキシサイクリンにより細胞増殖が抑制された。
【００６４】
以上の実験結果から、本発明の誘導発現ウイルスが導入された２０１Ｂ７細胞は、生体内に移植されても、体外からの遺伝子発現操作によって腫瘍化を有効に防止できることが示された。
【００６５】
ｐ１６、ｐ２１又はｐ５３は、いずれも、細胞の早期老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）や、活性酸素種等に対するゲノム安定性に関係するタンパク質をエンコードする遺伝子である。ｐ５３遺伝子は多くの悪性腫瘍で突然変異を起こしており、ｐ５３遺伝子に欠失その他の突然変異がある細胞に野生型ｐ５３遺伝子を強制発現させるとアポトーシスによる細胞死が誘発される（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ、Ｍ．Ｖ．及びＥｌ−Ｄｅｉｒｙ、Ｗ．Ｓ．、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、６７：３８６（１９９６））。そこで、野生型ｐ５３遺伝子を発現するウイルスベクターを含む制がん剤が提案されている（ＷＯ０１／０８３７１０）。しかし、ヒトＥＳ細胞（Ｍｉｕｒａ、Ｔ．ら、Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ、３：３３３（２００４））及びｉＰＳ細胞（Ｇｈｏｓｈ、Ｚ．ら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、５：ｅ８９７５）ではｐ５３の発現が知られており、単純にｐ５３遺伝子を強制発現してもアポトーシスを起こすとは考えられてはいなかった。最近、ｐ１６、ｐ２１及びｐ５３は、いずれも、体細胞をｉＰＳ細胞に変換するリプログラミングを阻害する作用があることが報告された（Ｈｏｎｇ，  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，  ４６０：１１３２（２００９），  Ｌｉ，  Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，  ４６０：１１３６（２００９）、Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１４０（２００９）、Ｕｔｉｋａｌ，  Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１４５（２００９）、Ｍａｒｉｏｎ、Ｒ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４６０：１１４９（２００９））。しかし、ｐ５３及びｐ１６だけが本発明のｉＰＳ細胞の増殖抑制効果を奏し、ｐ２１は本発明の効果を奏さない。したがって、本発明は、従来のｐ１６、ｐ２１及びｐ５３に関する知見から当業者が予測することができない異質な作用効果を奏する発明である。
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
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