(57)【要約】【課題】レトロウイルス産生用細胞の培養用培地、及び当該培地を使用したレトロウイルスベクターの製造方法を提供すること。高力価のレトロウイルスベクターを製造する方法、及び当該方法に使用可能なレトロウイルス産生細胞の培養用の培地を提供すること。【解決手段】ヘキサメチレンビスアセトアミドを含有する培地を使用してレトロウイルス産生細胞の培養を行うことにより、従来に比べ高力価のレトロウイルスベクターを製造することができる。当該培地を用いて製造されたレトロウイルスベクターや当該ウイルスベクターを有効成分とする組成物は遺伝子治療の基礎研究や臨床応用における遺伝子治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞の培養に使用される培地であって、ヘキサメチレンビスアセトアミドを含有することを特徴とする培地。
【請求項２】
ヘキサメチレンビスアセトアミドの濃度が１〜１５ｍＭである請求項１に記載の培地。
【請求項３】
レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞が、レンチウイルスベクターを産生する能力を有する細胞である請求項１又は２に記載の培地。
【請求項４】
レトロウイルスベクターの製造方法であって、レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、ヘキサメチレンビスアセトアミドを含有する培地で培養する工程を包含することを特徴とするレトロウイルスベクターの製造方法。
【請求項５】
培地が、１〜１５ｍＭのヘキサメチレンビスアセトアミドを含有する培地である請求項４に記載のレトロウイルスベクターの製造方法。
【請求項６】
レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである請求項４に記載のレトロウイルスベクターの製造方法。
【請求項７】
レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞が、（ａ）Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸、（ｂ）Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸、（ｃ）Ｒｅｖタンパク質をコードする核酸、（ｄ）Ｔａｔタンパク質をコードする核酸、及び（ｅ）レトロウイルス粒子に封入されるＲＮＡを転写しうる核酸からなる群より選択される少なくとも１つの核酸を一過性に細胞に導入する工程を含む方法により得られた細胞である請求項４に記載のレトロウイルスベクターの製造方法。
【請求項８】
レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞が、ヒト免疫不全ウイルス１型由来のＵ３プロモーターの制御下にレトロウイルスベクターに封入されるＲＮＡを転写する細胞である請求項４に記載のレトロウイルスベクターの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療の基礎研究や臨床応用における遺伝子治療に有用なレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターの製造に使用される培地、及びその培地を使用したレトロウイルスベクターの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、先天性遺伝子疾患の治療のほか、癌や感染症の治療を目的として、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療が多数試みられている。ウイルスベクターを用いた遺伝子治療としては、従来、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターについて多くの試みがなされているが、最近ではレトロウイルスベクターの中でもレンチウイルスベクターの安全性が向上し、利用例が増加している。
【０００３】
レンチウイルスはレトロウイルス科に属するウイルスであるが、いくつかのアクセサリータンパク質や調節タンパク質を有することから、分裂していない細胞にも感染して宿主ゲノムにウイルス由来のＤＮＡを導入できる。レンチウイルスは、この点で他のレトロウイルス（オンコレトロウイルスなど）と大きく異なり、近年遺伝子導入用のベクターとして開発が進んできた。
遺伝子導入用のレンチウイルスベクターの製造は、他のレトロウイルスベクターと同様である。即ち、レンチウイルスベクターの製造方法は、ウイルス粒子形成に必須なタンパク質をコードする核酸を搭載した複数のプラスミド（タンパク質発現プラスミド）と、ウイルス粒子に封入されるＲＮＡを転写しうる核酸を搭載したプラスミド（レンチウイルスベクタープラスミド）とを細胞に導入することによって、ウイルス産生能力を獲得した細胞を作製し、該細胞の培養上清中に産生された目的のレンチウイルスベクターを採取することが常法とされる。
【０００４】
代表的なレンチウイルスベクターはヒト免疫不全ウイルス１型（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ 1、以下ＨＩＶ−１）を基に開発されたものである。ＨＩＶ−１はＡＩＤＳ（Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を引き起こす高い病原性を有するため、ベクター開発に当たっては安全性の向上、即ち、標的細胞への感染性を損なうことなく標的細胞内での複製・増殖能を排除することへの工夫が最優先でなされてきた。
【０００５】
一方、レトロウイルスベクターの製造においては、高力価のウイルスベクター液の取得への工夫が進んできた。例えば、製造されたウイルスベクター液をウイルス産生細胞に重複して感染させ、該ウイルス産生細胞のウイルス産生能力の向上を図る方法（非特許文献１）や、酪酸ナトリウム又はトリコスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ）を添加する方法（非特許分献２、３）が開示されている。しかしながら、レトロウイルスベクターを遺伝子治療の基礎研究や臨床応用に使用することを目的とした場合には、更に高力価のレトロウイルスベクターの製造方法が求められる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第３巻、第７５６〜７６０頁（１９９６）
【非特許文献２】Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎe  Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、第１１９５〜１２０２頁（１９９５）
【非特許文献３】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２９巻、第８８４〜８９０頁（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、レトロウイルスベクターの製造にあたって、煩雑な操作なく高力価のウイルスベクター液を得るために使用可能な培地、及び当該培地を用いた製造方法の提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のとおり、遺伝子治療の基礎研究や臨床応用に使用することを目的としたレトロウイルスベクターの製造においては、高力価のレトロウイルスベクターを得るための複数の方法が開示され、必要に応じて併用が試みられているが、より高力価なレトロウイルスベクターの製造方法が求められている。本発明者らは鋭意研究の結果、ヘキサメチレンビスアセトアミドを含む培地を使用することにより、高力価のレトロウイルスベクターが得られることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明を概説すれば、本発明は
［１］レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞の培養に使用される培地であって、ヘキサメチレンビスアセトアミドを含有することを特徴とする培地、
［２］ヘキサメチレンビスアセトアミドの濃度が１〜１５ｍＭである［１］に記載の培地、
［３］レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞が、レンチウイルスベクターを産生する能力を有する細胞である［１］又は［２］に記載の培地、
［４］レトロウイルスベクターの製造方法であって、レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞を、ヘキサメチレンビスアセトアミドを含有する培地で培養する工程を包含することを特徴とするレトロウイルスベクターの製造方法、
［５］培地が、１〜１５ｍＭのヘキサメチレンビスアセトアミドを含有する培地である［４］に記載のレトロウイルスベクターの製造方法、
［６］レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである［４］に記載のレトロウイルスベクターの製造方法、
［７］レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞が、（ａ）Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸、（ｂ）Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸、（ｃ）Ｒｅｖタンパク質をコードする核酸、（ｄ）Ｔａｔタンパク質をコードする核酸、及び（ｅ）レトロウイルス粒子に封入されるＲＮＡを転写しうる核酸からなる群より選択される少なくとも１つの核酸を一過性に細胞に導入する工程を含む方法により得られた細胞である［４］に記載のレトロウイルスベクターの製造方法、
［８］レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞が、ヒト免疫不全ウイルス１型由来のＵ３プロモーターの制御下にレトロウイルスベクターに封入されるＲＮＡを転写する細胞である［４］に記載のレトロウイルスベクターの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞の培養に使用される培地であって、ヘキサメチレンビスアセトアミド（以下、ＨＭＢＡ）を含有することを特徴とする培地を提供する。前記の培地はレトロウイルスの製造を目的としたレトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞の培養に使用される。更に、本発明は、当該培地を用いるレトロウイルスベクターの製造方法を提供する。本発明の培地を使用することにより、煩雑な操作なく従来に比べて高力価のレトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターを製造することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のＨＭＢＡを含有する培地（以下、本発明の培地と称することがある）は、ＨＭＢＡ又はその誘導体を含有する脊椎動物細胞用培地、特に哺乳動物細胞用培地であれば特に限定はなく、市販の培地にＨＭＢＡを含有させ、本発明の培地とすることができる。
【００１２】
ＨＭＢＡはＣＡＳ  Ｎｏ．３０７３−５９−４、又は１４６６９６−００−６で指定された公知の物質であり、市販品が入手可能である。好適には水、又は、生理食塩水、後述する培地などの各種溶液に溶解してから培地に添加して使用することができる。当該ＨＭＢＡの本発明の培地に含まれる濃度としては、好ましくは１ｍＭ〜１５ｍＭ、より好ましくは２．５ｍＭ〜１０ｍＭである。
【００１３】
本発明の培地のその他の成分としては、アミノ酸、糖類、有機酸のようなエネルギー源、ビタミン類、ｐＨ調整のための緩衝成分、無機塩類などがあげられる。また、フェノールレッドのようなｐＨ指示薬を含有していてもよい。このような成分を含む培地として、血清を含有しない公知の培地、例えば、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ハムＦ１２、ＲＰＭＩ−１６４０培地などを使用してもよく、これらはＬｏｎｚａ社、ライフテクノロジーズ社、シグマ・アルドリッチ社などから市販品として入手することができる。また、製造されたウイルスベクターの用途に応じて、例えば造血系細胞培養に最適化するなどの目的で、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、上皮細胞成長因子などの精製タンパク質（天然型又は組換え型）、オレイン酸、プロゲステロンなどを含有していてもよい。例えば、本発明にはＧＴ−Ｔ５０２、ＧＴ−Ｔ５０２Ｒ、ＧＴ−Ｔ５０３、ＧＴ−Ｔ５５１、ＧＴ−Ｔ５０７、ＧＴ−Ｔ５０７Ｒ、ＧＴ−Ｔ−ＲｅｔｒｏＩＩＩ（いずれもタカラバイオ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ１０、Ｘ−ＶＩＶＯ１５、Ｘ−ＶＩＶＯ２０、ＰＲ０２９３ａ−ＣＤＭ、ＰＲ０２９３ｓ−ＣＤＭ、ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦ（以上Ｌｏｎｚａ社製）、Ｏｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ、ＶＰ−ＳＦＭ、２９３ＳＦＭＩＩ（以上ライフテクノロジーズ社製）、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＭｅｇａＶｉｒ（ハイクローン社製）などの市販の無血清培地も使用することができる。さらにより高力価のレトロウイルスベクターを調製することを目的として、これらの培地に酪酸ナトリウムやトリコスタチンＡなどの公知のウイルス産生能力の向上作用を有する物質を添加することもできる。
【００１４】
更に、本発明の培地に、血清や血清由来のタンパク質、例えば牛胎児血清（ＦＢＳ）やヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加してもよい。前記ＦＢＳの添加濃度としては、最終０．０５〜２０％、好ましくは５〜１０％である。また前記ＨＳＡの添加濃度としては、最終０．０５〜１％、好ましくは０．１〜０．３％である。
【００１５】
本明細書においてレトロウイルスベクターとは、レトロウイルス科に属するオンコレトロウイルス、レンチウイルスなどを基に遺伝子組換え技術により作製されたウイルス粒子のことを指し、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含む。オンコレトロウイルスベクターとしては、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に基づくベクターなどが挙げられる。また、レンチウイルスベクターとしては、ＨＩＶ−１やＨＩＶ−２に基づくベクターやサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に基づくベクターなどが挙げられる。本明細書におけるオンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターは、それぞれシュードタイプ化されたオンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含む。シュードタイプベクターとは、Ｇａｇタンパク質やＰｏｌタンパク質とは由来が異なるＥｎｖタンパク質を有するレトロウイルスベクターのことを指す。シュードタイプベクターとしては、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ内因性ウイルスＲＤ１１４、マウス白血病ウイルス（Ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ−ｅｎｖ、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ−ｅｎｖ、１０Ａ１−ｅｎｖなど）、球菌ウイルス（Ｃｏｃａｌ）などのＥｎｖタンパク質を有するオンコレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターが例示される。
【００１６】
本発明の培地を用いて製造されるレトロウイルスベクターには特に限定はない。通常、本発明では、無制限な感染、遺伝子導入を防止された複製能欠損レトロウイルスベクターが製造される。該ウイルスベクターは、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのウイルスベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に感染し、その染色体ＤＮＡ中にウイルスベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。本発明では、前記レトロウイルスベクターの中でも、レンチウイルスベクターが好適に製造される。
【００１７】
レトロウイルスベクターを産生する能力を有する細胞（以下、レトロウイルス産生細胞）としては、任意の細胞を選択して作製することができ、特に、レトロウイルスベクター産生に必要なタンパク質やウイルス粒子に封入されるＲＮＡを一過的、恒常的もしくは誘導的に発現するように改変した細胞が使用できる。レトロウイルスベクター産生に必要なタンパク質としては、レトロウイルスベクターの産生に必要なタンパク質、例えば、Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質、Ｅｎｖタンパク質が挙げられる。さらに、所望によりＲｅｖタンパクやＴａｔタンパク質のようなアクセサリータンパク質を発現する細胞も本発明に使用できる。これらタンパク質をコードする核酸、ならびにウイルス粒子に封入されるＲＮＡを転写しうる核酸のそれぞれは、プラスミドベクター等で細胞に導入されていてもよく、細胞の染色体に安定的に組み込まれていてもよい。レトロウイルス産生細胞は、例えば、トランスフェクション効率の高い２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）や２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞（国際公開第０６／０３５８２９号パンフレット）を使用して作製することができる。また、レトロウイルスベクター産生に必要なタンパク質を発現する公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８）］、ＧＰＲＧ細胞［Ｂｌｏｏｄ、第２１巻、第５１０４〜５１１０頁（２００８）］を使用して作製することもできる。本発明の培地を用いて培養されるレトロウイルス産生細胞には特に限定はないが、レンチウイルス産生細胞が好適である。
【００１８】
本発明のレトロウイルスベクターの製造方法の一態様としては、レトロウイルスベクターのウイルス粒子形成に必須な要素を供給する核酸、即ち（ａ）Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質をコードする核酸、（ｂ）Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸、（ｃ）Ｒｅｖタンパク質をコードする核酸、（ｄ）Ｔａｔタンパク質をコードする核酸、及び（ｅ）ウイルス粒子に封入されるＲＮＡを転写しうる核酸からなる群より選択される少なくとも１つの核酸を、細胞に導入する工程を含む方法により得られたレトロウイルス産生細胞を、本発明の培地中で培養することで実施される。レトロウイルス産生細胞の好適な例としては、少なくとも前記（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）の核酸を細胞に導入する工程を含む方法により得られたレトロウイルス産生細胞が例示される。さらにレトロウイルスベクターとしてレンチウイルスベクターを製造する場合は、（ａ）、（ｂ）及び（ｅ）の核酸に加えて、（ｃ）及び／又は（ｄ）の核酸を細胞に導入する工程を含む方法により得られたレトロウイルス産生細胞が例示される。また、レトロウイルス産生細胞としては、レトロウイルスベクターの産生に必要な前記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される１つまたは複数の核酸がすでに導入された細胞株に対し、その他に必要な核酸を導入する工程を含む方法によって得られたレトロウイルス産生細胞も例示される。例えば、少なくとも前記（ａ）及び（ｂ）の核酸が導入されたパッケージング細胞に、前記（ｅ）の核酸を導入して得られたレトロウイルス産生細胞が例示される。そして前記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択される核酸は、それぞれプラスミド等で一過性に導入してもよく、また染色体に安定的に組み込んでもよい。また、本発明の製造方法は、当該核酸を一過性に供給する場合は、レトロウイルス産生細胞を作製する際の核酸を供給する工程の１〜４８時間後、好適には３〜４８時間後から本発明の培地を用いた培養を行うことにより、より高い効果を発揮する。
【００１９】
前記ウイルス粒子に封入されるＲＮＡとしては、少なくともレトロウイルス粒子に封入されるためのパッケージングシグナル及び標的細胞ゲノムに導入されるためのＬＴＲを有するＲＮＡが例示される。好適には、ヒト免疫不全ウイルス１型由来のＵ３プロモーターの制御下に転写されるように改変されているウイルス粒子に封入されるＲＮＡが本発明には使用される。ウイルス粒子に封入されるＲＮＡを供給するプラスミドとしては、公知のプラスミドを用いればよく、例えば、複製能欠損オンコレトロウイルスベクターについては、プラスミドＭＦＧやプラスミドα−ＳＧＣ（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）など、複製能欠損レンチウイルスベクターについては、国際公開第００／６６７５９号パンフレットに開示のプラスミド、ｐＬＶＳＩＮ（タカラバイオ社製）、ｐＬＶＸ（クロンテック社製）など、あるいはこれらを改変したプラスミドが例示される。本発明の製造方法には、好適には、ウイルス粒子に封入されるＲＮＡがヒト免疫不全ウイルス１型由来のＵ３プロモーターの制御下に転写されるように改変されているレンチウイルスベクターが用いられる。
【００２０】
前記ウイルス粒子に封入されるＲＮＡには、任意の外来遺伝子、例えばポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質など）をコードする配列、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡなどを転写しうる配列を搭載させることができる。前記の外来遺伝子の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素が当該ＲＮＡに搭載されていてもよい。
【００２１】
核酸を細胞に一過性に導入する方法には特に限定はなく、公知の一過性導入方法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ポリエチレンイミン法、エレクトロポレーション法などが使用可能である。また市販の試薬、例えばＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２０２０（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＣＤ  Ｒｅａｇｅｎｔ（以上、ライフテクノロジーズ社製）、ＦｕＧｅｎｅ（プロメガ社製）などを用いてもよい。
【００２２】
レトロウイルス産生細胞の培養は、通常の培養条件で行うことができる。例えば温度３０〜３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５〜１０％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。培養は、例えば３０〜３７℃で実施できるが、所望の細胞の増殖、ウイルスベクターの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度で実施してもよい。培養期間は特に限定はないが、例えば１２〜７２時間、好適には２４〜４８時間が好ましい。また、細胞培養上清を回収した後、更に新たな培地を添加して細胞培養を行った後に再度細胞培養液を回収することで、ウイルスベクターを含有する細胞培養液の上清を繰り返し回収することができる。本発明では、こうして得られる細胞培養液の上清を用いてウイルスベクターの製造が実施される。例えばレンチウイルスベクターにおいては、前記の上清をフィルターろ過したろ液のまま、あるいは公知の方法により濃縮もしくは精製したレンチウイルスベクターとして製造され、適切な方法、例えば凍結を用いて所望の用途に使用するまで保存される。
【００２３】
本明細書中の力価とは、実験的に測定される、ウイルスの細胞への感染能力のことである。感染能力の測定には特に限定はなく、所望の標的細胞について公知の方法で行うことができる。例えばウイルスベクターのＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで測定する方法、ウイルスベクターを標的細胞に感染させ、導入遺伝子の発現を検出する方法、細胞の形状が変化する現象（細胞変性）を検出する方法、導入されたプロウイルスコピー数を測定する方法などが使用可能である。
【００２４】
本発明により、本発明の製造方法により取得したレトロウイルスベクターを有効成分として含有する医薬組成物も提供される。当該医薬組成物は、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの製造技術に従って適宜調製することができる。例えば、本発明の製造方法により得られたレトロウイルスベクターを公知の方法で濃縮、精製することにより、精製されたレトロウイルスベクターを取得し、医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物は、患者由来の細胞に体外で使用するか、もしくは患者へ直接投与することもできる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１  Ｔａｔ存在下でのＨＭＢＡによるレンチウイルスベクターの力価向上試験
（１）レンチウイルスベクター液の調製
Ｔ２５フラスコ（ＣＥＬＬＢＩＮＤ、コーニング社製）に２．２５×１０６個の２９３Ｔ細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）にて２４時間培養を行った。培地には１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ社製）を含むＤＭＥＭ（シグマ・アルドリッチ社製）を用いた。Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現プラスミド、Ｒｅｖ発現プラスミド、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド、及びＴａｔ発現プラスミドの混合液に、Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ΔＬＮＧＦＲ）遺伝子［Ｈｕｍｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第９巻、第２２４３〜２２５１頁、（１９９８）］が搭載されたレンチウイルスベクタープラスミドであるｐＬＶ−ＰＬ２を添加してＤＮＡ混合液を調製し、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、キットに添付のプロトコールに従って一過性に導入した。導入操作後の細胞はＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。なお、ｐＬＶ−ＰＬ２はｐＬＶＳＩＮ−ＡｃＧＦＰＮ１（タカラバイオ社製）を基にＡｃＧＦＰ１遺伝子の代わりにΔＬＮＧＦＲ遺伝子を発現するように改変したプラスミドである。一過性導入の翌日、終濃度２．５ｍＭもしくは７．５ｍＭとなるようにＨＭＢＡ（シグマ・アルドリッチ社製）を添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ社製）に培地交換し、培養を継続した。コントロール群はＨＭＢＡを添加しないＸ−ＶＩＶＯ１５培地で培地交換した。一過性導入から２日後、培養上清を採取して０．４５μｍフィルターでろ過し、このろ液をレンチウイルスベクター液として−８０℃で凍結保存した。なお、本願明細書実施例において使用されるＨＭＢＡは、市販の粉末を注射用水に溶解し５００ｍＭに調製したものである。
【００２７】
（２）レンチウイルスベクター液の力価評価
表面未処理２４ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に１ウェルあたり５００μＬの２０μｇ／ｍＬの組換えフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６［商品名：レトロネクチン（登録商標）；タカラバイオ社製］溶液を添加して４℃で一晩放置した。その後、ＣＨ−２９６溶液を除去し、プレートを１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄してＣＨ−２９６コートプレートとした。
【００２８】
１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ・アルドリッチ社製）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁して調製したＳＵＰ−Ｔ１細胞（ＡＴＣ  ＣＣＲＬ−１９４２）懸濁液を、前述のＣＨ−２９６コートプレートに０．２５ｍＬ／ウェル添加した。更に、実施例１−（１）で調製したレンチウイルスベクター液を解凍し、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地にて１５０倍もしくは４５０倍に希釈した。上記ＳＵＰ−Ｔ１細胞を播種した２４ウェルプレートにこの希釈液を０．２５ｍＬ／ウェル添加し、プレートをロッキングしてよく混合した（レンチウイルスベクター液の終濃度：３００倍希釈、９００倍希釈）。この２４ウェルプレートを１０００×ｇ、３２℃で３０分間遠心して遠心感染を実施した後、ＣＯ２インキュベーターにて培養を行った。感染翌日、これらの細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で５倍希釈し、培養を継続した。
感染から３日後、細胞を回収し、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄した。次に、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞を懸濁し、ここにＡＰＣ標識マウス抗ヒトＬＮＧＦＲ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を含む抗体液を添加し、抗体による細胞の標識を行った。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞液をフローサイトメトリーに供し、遺伝子導入効率として、ΔＬＮＧＦＲ陽性率を算出した。その結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
その結果、ＨＭＢＡを添加した培地を使用することにより、レンチウイルスベクター液の明らかな力価向上が認められた。また、力価向上効果は２．５ｍＭよりも７．５ｍＭの方が高かった。
【００３１】
実施例２  Ｔａｔ非存在下でのＨＭＢＡによるレンチウイルスベクターの力価向上試験
（１）レンチウイルスベクター液の調製
実施例１−（１）と同様に、Ｔ２５フラスコに２．２５×１０６個の２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間培養を行った。Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現プラスミド、Ｒｅｖ発現プラスミド、及びＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドの混合液（Ｔａｔ発現プラスミドは含まない）に、ｐＬＶＳＩＮ−ＡｃＧＦＰＮ１（タカラバイオ社製）を添加してＤＮＡ混合液を調製し、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３を用いて添付のプロトコールに従って一過性に導入した。導入操作後の細胞はＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。一過性導入の翌日、終濃度７．５ｍＭとなるようにＨＭＢＡを添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地に培地交換し、培養を継続した。コントロール群はＨＭＢＡを添加しないＸ−ＶＩＶＯ１５培地で培地交換した。一過性導入から２日後、培養上清を採取して０．４５μｍフィルターでろ過し、このろ液をレンチウイルスベクター液として−８０℃で凍結保存した。
【００３２】
（２）レンチウイルスベクター液の力価評価
表面処理された６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に５×１０４個のＨＴ−１０８０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）を播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。培地には１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いた。２４時間後、実施例２−（１）で作製したレンチウイルスベクター液を解凍し、終濃度８μｇ／ｍＬ  ポリブレン（シグマ・アルドリッチ社製）を含む培地で２７０倍希釈したレンチウイルスベクター液を調製した。その後、ＨＴ−１０８０細胞の培地を除き、上記調製したレンチウイルスベクター液を添加して感染を行った。
感染から３日後、トリプシン処理により細胞を回収し、フローサイトメトリーに供してＡｃＧＦＰ１陽性率を測定し遺伝子導入効率を算出した。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
2013208107.tif 000003
【００３４】
その結果、Ｔａｔを使用しない環境下においても、ＨＭＢＡを添加した培地を使用することにより、レンチウイルスベクター液の明らかな力価向上が認められた。
【００３５】
実施例３  動物由来成分を含まないトランスフェクション試薬を用いたＨＭＢＡによるレンチウイルスベクターの力価向上試験
（１）レンチウイルスベクター液の調製
実施例１−（１）と同様に、Ｔ２５フラスコに２．２５×１０６個の２９３Ｔ細胞を播種し、２４時間培養を行った。Ｇａｇ−Ｐｏｌ発現プラスミド、Ｒｅｖ発現プラスミド、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド、及びＴａｔ発現プラスミドの混合液に、ｐＬＶ−ＰＬ２を添加してＤＮＡ混合液を調製し、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２０２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて添付のプロトコールに従って一過性に導入した。なお、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２０２０  Ｒｅａｇｅｎｔは動物由来成分を含まないトランスフェクション試薬である。導入操作後の細胞はＣＯ２インキュベーター（３７℃、ＣＯ２濃度５％）にて培養を行った。一過性導入の翌日、終濃度７．５ｍＭとなるようにＨＭＢＡを添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地に培地交換し、培養を継続した。コントロール群はＨＭＢＡを添加しないＸ−ＶＩＶＯ１５培地で培地交換した。一過性導入から２日後、培養上清を採取して０．４５μｍフィルターでろ過し、このろ液をレンチウイルスベクター液として−８０℃で凍結保存した。
【００３６】
（２）レンチウイルスベクター液の力価評価
実施例３−（１）で取得したレンチウイルスベクター液を実施例１−（２）と同様の方法でＳＵＰ−Ｔ１細胞への感染力価評価を行った。ウイルス液の希釈は、細胞への感染時の終濃度が１００倍および３００倍希釈になるように行った。遺伝子導入効率として算出したΔＬＮＧＦＲ陽性率の結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
2013208107.tif 000004
【００３８】
その結果、動物由来成分を含まないトランスフェクション試薬を用いた場合でも、ＨＭＢＡを添加した培地を使用することにより、レンチウイルスベクター液の明らかな力価向上が認められた。即ち、本発明の方法は医療用途に使用するレンチウイルスベクターの製造においても適していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の培地を用いることにより、レトロウイルス産生細胞の培養を効率よく実施することができ、従来に比べ高力価のレトロウイルスベクターを製造することが可能となる。本発明の培地を用いて製造されたレトロウイルスベクターや当該ウイルスベクターを有効成分とする組成物は、遺伝子組換え技術を用いる研究分野のみならず、遺伝子治療の基礎研究や臨床応用における遺伝子治療に非常に有用である。