(57)【要約】【課題】エタノールを原料として、腸内細菌科に属する細菌を用いて効率よくＬ−アミノ酸を製造する方法、及び該方法に用いる細菌を提供すること。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、エタノールを含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、AldBタンパク質の活性が低下するように改変されている細菌、好ましくは、さらにAdhEタンパク質の活性が増強するように改変されている細菌を用いる。【選択図】図１
2013176301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、エタノールを含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌は、ＡｌｄＢタンパク質の活性が低下するように改変されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
ａｌｄＢ遺伝子のコード領域及び／又は同遺伝子の発現制御領域に変異が導入されたことにより、前記ＡｌｄＢタンパク質の活性が低下した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌は染色体上のａｌｄＢ遺伝子が破壊されたことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡｌｄＢタンパク質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかのタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
前記ａｌｄＢ遺伝子は、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ、又は、
（ｂ）配列番号１の塩基配列に相補的な配列、又は同配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
前記細菌がエシェリヒア属、エンテロバクター属、又はパントエア属に属する細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌は、さらにＡｄｈＥタンパク質の活性が増強された、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌は、好気的にエタノールを資化できるように改変された、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法に関し、特にエタノールを原料とするＬ−アミノ酸の製造法、及び該方法に用いる細菌に関する。Ｌ−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術により塩基性Ｌ−アミノ酸生合成酵素の活性が増大するように改変された微生物などが用いられている。(特許文献１〜９）
【０００３】
一般的に、微生物を用いてアミノ酸生産を行う際には、炭素源に糖質を主成分として用いているが、エタノールも糖質と同様に炭素源として用いることが可能である（特許文献１０）。細胞に取り込まれたエタノールはアルコールデヒドロゲナーゼにより、まずアセトアルデヒドに変換される。生じたアセトアルデヒドは、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼにより酢酸に、または、アセトアルデヒドCoAデヒドロゲナーゼによりアセチル-CoAへと変換されると考えられる。
【０００４】
エシェリヒア・コリにおいて見いだされたAldBは、NADP依存型のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有することが知られており、MgCl2存在時にはさまざまな基質に対する活性が向上するなど、ヒトミトコンドリアのアルデヒドデヒドロゲナーゼと似た性質を持つ（非特許文献１）。
【０００５】
また、エタノールが存在すると培養定常期にAldBの発現が上昇することから、アルコールやアルデヒドによるストレスを低減する機能を持つと考えられている（非特許文献２）。
しかしながら、実際にエタノールを資化する際にAldBによりアセトアルデヒドが酢酸に変換されるかは不明であった。また、AldBの活性と、エタノールからのＬ−アミノ酸生産との関係は、全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許公開EP0643135B
【特許文献２】欧州特許公開EP0733712B
【特許文献３】欧州特許公開EP1477565A
【特許文献４】欧州特許公開EP0796912A
【特許文献５】欧州特許公開EP0837134A
【特許文献６】国際公開WO01/53459
【特許文献７】欧州特許公開EP1170376A
【特許文献８】国際公開WO2005/010175
【特許文献９】国際公開WO96/17930
【特許文献１０】WO2008/010565
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Bacteriol., 187 (2005) 1067-1073
【非特許文献２】J. Bacteriol., 177 (1995) 3166-3175
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、エタノールを原料として、腸内細菌科に属する細菌を用いて効率よくＬ−アミノ酸を製造する方法、及び該方法に用いる細菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
エタノールの資化にAldBが関与しているとすると、AldBのアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性によってアセトアルデヒドから酢酸が生じると考えられる。次いで、酢酸はアセチルCoA合成酵素（ACS）、又は、ホスホトランスアセチラーゼ（PTA）及びアセテートキナーゼ（ACK）により触媒される反応によってアセチル-CoAに変換されるが、いずれもATPからAMP又はADPへの変換を伴う。それに対し、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を持つ他のタンパク質であるAdhEは、アルコールデヒドロゲナーゼ活性も有しており、アセトアルデヒドを直接アセチル-CoAに変換する反応を触媒するため、ATPの損失がなく、エネルギー的には有利と考えた。一方、J. Bacteriol., 177 (1995) 3166-3175には、エタノールが存在すると培養定常期にAldBの発現が上昇することが示されており、AldBがエタノール代謝に関わるとすると、aldB欠損株ではエタノールの資化性が低下する可能性も考えられた。ところが、予想に反し、Ｌ−アミノ酸生産菌のAldBの活性を低下させたところ、エタノールを炭素源としたときにＬ−アミノ酸生産能が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を、エタノールを含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法であって、
前記細菌は、ＡｌｄＢタンパク質の活性が低下するように改変されていることを特徴とする方法。
（２）ａｌｄＢ遺伝子のコード領域及び／又は同遺伝子の発現制御領域に変異が導入されたことにより、前記ＡｌｄＢタンパク質の活性が低下した、前記方法。
（３）前記細菌は染色体上のａｌｄＢ遺伝子が破壊されたことを特徴とする、前記方法。（４）前記ＡｌｄＢタンパク質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかのタンパク質である、前記方法。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（５）前記ａｌｄＢ遺伝子は、下記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである前記方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ、又は、
（ｂ）配列番号１の塩基配列に相補的な配列、又は同配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）前記細菌がエシェリヒア属、エンテロバクター属、又はパントエア属に属する細菌である、前記方法。
（７）前記細菌がエシェリヒア・コリである、前記方法。
（８）前記細菌は、さらにＡｄｈＥタンパク質の活性が増強された、前記方法。
（９）前記細菌は、好気的にエタノールを資化できるように改変された、前記方法。
（１０）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンである、前記方法。
（１１）前記細菌は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スク
シニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、及び／または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、前記方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、エタノールを炭素源として、Ｌ−アミノ酸を効率よく発酵生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各種AldBのアミノ酸配列のアラインメントを示す図。
【図２】各種AldBのアミノ酸配列のアラインメントを示す図（続き）。
【図３】各種AdhEのアミノ酸配列のアラインメントを示す図。
【図４】各種AdhEのアミノ酸配列のアラインメントを示す図（続き）。
【図５】各種AdhEのアミノ酸配列のアラインメントを示す図（続き）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明に用いる細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、かつ、AldBタンパク質の活性が低下するように改変されている細菌である。
【００１４】
Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明に用いる細菌（以下、「本発明の細菌」ともいう）を培地中で培養したときに、Ｌ−アミノ酸を生成し、培地中または菌体内に蓄積する能力をいう。好ましくは、目的とするＬ−アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる能力をいう。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細菌としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、後述の細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１５】
Ｌ−アミノ酸の種類は特に制限されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。本発明の細菌は２種類以上のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１６】
本発明においてＬ−アミノ酸とは、フリー体のＬ−アミノ酸とＬ−アミノ酸塩、たとえば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩を含む。
【００１７】
本発明の細菌を得るために用いる腸内細菌科に属する細菌としては、特に限定されないが、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、ペクトバクテリウム、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
【００１８】
エシェリヒア属に属する細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されていることを意味する。例えば、ナイトハルトらの著書（Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483. Table 1. American
Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110
（ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００１９】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。以下に記載する他のATCC菌株も同様である。
【００２０】
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）のある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・ステワルティイ（Pantoea stewartii）その他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２１】
パントエア・アナナティスとしては、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００２２】
エンテロバクター属細菌とは、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エンテロバクター属に分類されていることを意味する。例えば、エンテロバクター・アグロメランス、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等が挙げられる。具体的には欧州特許出願公開EP952221号に例示された菌株を使用することが出来る。エンテロバクター属の代表的な株としては、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株やエンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、エンテロバクター・アエロゲネスNBRC12010株（Biotechonol Bioeng.2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637(FERM BP-10955)株が挙げられる。
【００２３】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）等が挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）等が挙げられ、ペクトバクテリウム属細菌としては、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）（旧名、エルビニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)）等が挙げられる。
【００２４】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産菌、及びＬ−アミノ酸生産能の付与又は増強
以下、腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生菌、並びに細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、又は細菌のＬ−アミノ酸生産能を増強する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法
を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００２５】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株を取得するには、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００２６】
また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与又は増強は、遺伝子組換えによって、酵素活性を増強することによっても行うことが出来る。酵素活性の増強は、例えば、Ｌ−アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように細菌を改変する方法を挙げることができる。遺伝子の発現を増強するための方法としては、遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適当なプラスミド、例えば微生物内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入した増幅プラスミドを導入すること、または、これらの遺伝子を染色体上で接合、転移等により多コピー化すること、またこれらの遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することにより達成することもできる（国際公開パンフレットWO95/34672号参照）。
【００２７】
上記増幅プラスミドまたは染色体上に目的遺伝子を導入する場合、これらの遺伝子を発現させるためのプロモーターは腸内細菌科において機能するものであればいかなるプロモーターであっても良く、用いる遺伝子自身のプロモーターであってもよいし、改変したものでもよい。腸内細菌科で強力に機能するプロモーターを適宜選択することや、プロモーターの−35、−10領域をコンセンサス配列に近づけることによっても遺伝子の発現量の調節が可能である。以上のような、酵素遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。
【００２８】
以下、細菌にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法、及びＬ−アミノ酸生産能が付与された細菌について例示する。
【００２９】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア・コリの生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア・コリを通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びE. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００３０】
WC196株は、E. coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、E. coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352位のスレオニンをイソロイシンに置換することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコ
ードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。同株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。
【００３１】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。なお、カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。
【００３２】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型アスパルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【００３３】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００３４】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受
託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００３５】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。ここで、リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい（国際公開第WO2006/038695号パンフレット）。
【００３６】
cadA遺伝子とldcC遺伝子が破壊された菌株としては、エシェリヒア・コリWC196LC（WC196ΔcadAΔldcC）（US5,827,698、US20060160191）が挙げられる。WC196LC株は、AJ110692と命名され、2008年10月7日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【００３７】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００３９】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【００４０】
好ましくは、本発明に用いる細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
−スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
−ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
−スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
−推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
−アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
−アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００４１】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００４２】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００４３】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００４４】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T. J., Arnheim, N., and Erlich, H. A. 1989. Trends Genet. 5: 185-189参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００４５】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００４６】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒
性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)など株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００４９】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)など株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００５１】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００５２】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン
、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE.
coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などの菌株が挙げられる。
【００５３】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００５４】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(gltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。
【００５５】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【００５６】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)、γ-グルタミル転移酵素(ggt)、γ-グルタミルシステイン合成酵素(gshA)、γ-グルタミン酸プトレシン合成酵素(ycjK)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００５７】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００５８】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ
遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００５９】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するエシェリヒア・コリが挙げられる。このような株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などの菌株が挙げられる。
【００６０】
パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００６１】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００６２】
さらに、パントエア・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００６３】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli AJ
12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア・コリのＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６４】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア・コリのＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６５】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００６６】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６７】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００６９】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア・コリの例としては、NRRL B-12403及びNRRL
B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００７０】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などの菌株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００７２】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００７３】
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００７４】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオ
ニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００７５】
Ｌ−アスパラギン酸生産菌
Ｌ−アスパラギンは、アスパラギン酸へアミノ基を付与することにより生産される（Boehlein, S. K., Richards, N. G. J., & Schuster, S. M. (1994a) J. Biol. Chem. 269,
7450-7457.）。したがって、エシェリヒア・コリのＬ−アスパラギン生産菌として、Ｌ−アスパラギン酸生産菌のアスパラギンシンテターゼが増強されたエシェリヒア・コリ菌株が挙げられる。
【００７６】
本発明の細菌は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増大するように改変された菌株であってもよい。ピルビン酸シンターゼの、あるいは、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が増大するように改変するには、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することが好ましい。尚、微生物が元来ピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合、同酵素活性を有するように改変された微生物は、ピルビン酸シンターゼ、または、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性が、非改変株に比べて増大している。
【００７７】
本発明における「ピルビン酸シンターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばフェレドキシンあるいはフラボドキシン存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.7.1）を意味する。ピルビン酸シンターゼは、ＰＳと略称されることもあり、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、または、ピルビン酸オキシドレダクターゼと命名されている場合もある。電子供与体としては、フェレドキシンまたはフラボドキシンを用いることが出来る。
【００７８】
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸 +
ＣｏＡ
【００７９】
ピルビン酸シンターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとＣｏＡと粗酵素液を含む反応液にピルビン酸を添加した際に、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸シンターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Buckel, W.and Golding, B. T. 2006. Ann. Rev. of Microbiol. 60: 27-49）。したがって、酵素活性の測定に際しては、反応容器中の酸素濃度を低下させて酵素反応を行うことが好ましい。
【００８０】
ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。また、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をはじめとする、腸内細菌群に属する細菌由来のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することも可能である。さらに、ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子は、メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）などの独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のピルビン酸シンターゼ遺伝子を利用することが可能である。
【００８１】
具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ遺伝子として、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1534432〜1537989に位置する塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. AAC76906に開示されている。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（GenBank Accession No. BAA95604）、αサブユニット（GenBank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（GenBank Accession No. BAA95606）、γサブユニット（GenBank Accession No. BAA95607）の４つのサブユニットによる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T. et al. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。さらに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子からなるピルビン酸シンターゼ遺伝子、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession
No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子でコードされるピルビン酸シンターゼ遺伝子を例示することができる。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【００８２】
エシェリヒア・コリにおいては、K-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号1435284〜1438808に位置する塩基配列を有するydbK遺伝子（b1378）が、配列上の相同性からピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、すなわちピルビン酸シンターゼをコードしていると予想されている。同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. AAC76906に開示されている。さらに、ピルビン酸シンターゼ遺伝子は、エシェリヒア・コリのピルビン酸シンターゼ遺伝子（ydbK）と高い相同性を有する、エシェリヒア属、サルモネラ属（Salmonella）、セラチア属（Serratia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シゲラ属（Shigella）、サイトロバクター属（Citrobacter）などの腸内細菌群に属するピルビン酸シンターゼ遺伝子であってもよい。
【００８３】
メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）のピルビン酸シンターゼは、メタノコッカス・マリパルディスのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_005791）（Hendrickson, E. L. et al. 2004. J. Bacteriol. 186: 6956-6969）の塩基番号1462535〜1466397に位置するporCDABEFオペロンにコードされている（Lin, W. C. et al. 2003. Arch. Microbiol. 179: 444-456）。このピルビン酸シンターゼは、γ、α、β、及びδの４つのサブユニットを含んでおり、これらのサブユニットに加えて、PorE及びPorFもピルビン酸シンターゼの活性に重要であることが知られている（Lin, W. and Whitma
n, W. B. 2004. Arch. Microbiol. 181: 68-73）。γサブユニットは、前記ゲノム配列の塩基番号1465867〜1466397（相補鎖）のporA遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988626に開示されている。δサブユニットは、前記ゲノム配列の塩基番号1465595〜1465852（相補鎖）porB遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988627に開示されている。αサブユニットは、前記ゲノム配列の塩基番号1464410〜1465573（相補鎖）のporC遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988625に開示されている。βサブユニットは、ゲノム配列の塩基番号1463497〜1464393（相補鎖）のporD遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988624に開示されている。PorEは、ゲノム配列の塩基番号1462970〜1463473（相補鎖）のporE遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988623に開示されている。PorFは、ゲノム配列の塩基番号1462535〜1462951（相補鎖）のporF遺伝子にコードされており、同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. NP_988622に開示されている。
【００８４】
独立栄養性のメタン生成古細菌のメタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーマトトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）なども同じ遺伝子構造のピルビン酸シンターゼ遺伝子を有していることが知られており、これらを利用することが可能である。
【００８５】
本発明における「ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ」とは、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記の反応を、電子供与体存在下、例えばＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨ存在下で可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.1.15）を意味する。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、ＰＮＯと略称されることもあり、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと命名されている場合もある。しかしながら、本発明において「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性」というときは、後述するように、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性であり、この反応を触媒するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼとは別の酵素である。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、電子供与体としては、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを用いることが出来る。
【００８６】
ＮＡＤＰＨ + アセチル-CoA + CO2 → ＮＡＤＰ+ + ピルビン酸 + CoA
【００８７】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、増強後の微生物より粗酵素液を調製し、そのピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を比較することにより達成される。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性は、例えば、Inuiらの方法（Inui, H. et al. 1987. J. Biol. Chem. 262: 9130-9135）に従って測定できる。例えば、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含む反応液に、ピルビン酸を添加した際にピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンの還元量で表される。親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有している場合、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。また親株がピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することにより、ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼが生成されていればよいが、酵素活性が測定できる程度に強化されていることが好ましく、好ましくは0.001U/mg（菌体タンパク質）以上、より好ましくは0.005U/mg以上、さらに好ましくは0.01U/mg以上が望ましい。ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼは、酸素に対して感受性であり、一般的に活性発現や測定は困難であることも多い（Inui, H. et al. 1987. J. B
iol. Chem. 262: 9130-9135; Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol. Evol. 18: 710-720）。
【００８８】
ピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、光合成真核微生物で原生動物にも分類されるユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Nakazawa, M. et al. 2000. FEBS Lett. 479:
155-156）、原生生物クリプトスポルジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子（Rotte, C. et al. 2001. Mol. Biol.
Evol. 18: 710-720）の他、珪藻タラシオシラ・スードナナ（Tharassiosira pseudonana）にも相同な遺伝子が存在することが知られている（Ctrnacta, V. et al. 2006. J. Eukaryot. Microbiol. 53: 225-231）。
【００８９】
具体的には、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）のピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ遺伝子として、GenBank Accession No. AB021127に示す塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。同遺伝子がコードするアミノ酸配列はGenBank Accession No. BAB12024に開示されている。
【００９０】
本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼの活性に必要な電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性が、親株、例えば野生株や非改変株と比べて増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を挙げることができる。また、電子供与体のリサイクル活性の増強に加えて、ピルビン酸シンターゼ活性が増大するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物でもよい。なお、上記親株は、本来内在的に電子供与体のリサイクル活性をコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来は電子供与体のリサイクル活性を有さないが、当該活性をコードする遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【００９１】
「フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
【００９２】
還元型フェレドキシン + NADP+ → 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【００９３】
本反応は、可逆反応であり、ＮＡＤＰＨと酸化型フェレドキシン存在下で、還元型フェレドキシンを産生することが可能である。フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能でありフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼと命名されているものも同等の機能を有する。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されており（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A. 2003. Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915; Ceccarelli, E. A. et al. 2004. Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165参照）、フェレドキシン-ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ-フェレドキシンオキシドレダクターゼと命名されているものもある。
【００９４】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増強されたことの確認は、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより達成される。フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982. Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。例えば、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって測定可能である。酵素活性１ユニット（U）は１分間あたり１μmolのNADPHの酸化量で表される。親株がフェレドキシン-ＮＡ
ＤＰ+レダクターゼ活性を有している場合、親株の活性が十分高ければ、増強する必要はないが、親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上酵素活性が上昇していることが望ましい。
【００９５】
フェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子は、多くの生物種で見出されており、目的のＬ-アミノ酸生産株中で活性を有するものであれば使用することが可能である。エシェリヒア・コリではフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしてfpr遺伝子が同定されている（Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）。また、シュードモナス・プチダ(Psuedomonas putida)には、ＮＡＤＰＨ-プチダレドキシンレダクターゼ（Putidaredoxin reductase）遺伝子とプチダレドキシン（Putidaredoxin）遺伝子がオペロンとして存在することが知られている(Koga, H. et al. 1989. J. Biochem.
(Tokyo) 106: 831-836）。
【００９６】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼとしては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する塩基配列を有するfpr遺伝子を例示することができる。Fprのアミノ酸配列は、GenBank Accession No. AAC76906に開示されている。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）の塩基番号2526234〜2527211にフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子が見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
【００９７】
ピルビン酸シンターゼの活性には、フェレドキシン又はフラボドキシンが電子供与体として存在することが必要である。従って、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変することによって、ピルビン酸シンターゼの活性が増大するように改変された微生物であってもよい。
また、ピルビン酸シンターゼ活性、又は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼ及びピルビン酸シンターゼ活性が増強するように改変することに加えて、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が向上するように改変してもよい。
【００９８】
本発明における「フェレドキシン」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と、硫黄原子を含み、4Fe-4S、3Fe-4S、あるいは、2Fe-2Sクラスターと呼ばれる鉄-硫黄クラスターを結合したタンパク質で1電子の伝達体として機能するものを指す。「フラボドキシン」とはFMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む1あるいは2電子の伝達体として機能するものタンパク質を指す。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【００９９】
なお、改変に用いる親株は、本来内在的にフェレドキシン又はフラボドキシンをコードする遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はフェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を有さないが、フェレドキシン又はフラボドキシン遺伝子を導入することにより活性が付与され、Ｌ-アミノ酸生産能が向上するものであってもよい。
【０１００】
フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、フェレドキシン又はフラボドキシンのmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認できる。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular CloningA Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【０１０１】
また、フェレドキシン又はフラボドキシンの産生能が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、SDS-PAGEや二次元電気泳動あるいは、抗体を用いたウェスタンブロットによって検出することが出来る（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。生産量については、野生株あるいは非改変株と比較して、向上していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上上昇していることが望ましい。
【０１０２】
フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系に加えることで測定することが可能である。例えば、Boyerらにより、産生されたフェレドキシンをフェレドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量する方法が開示されている（Boyer, M. E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性は、フラボドキシン-ＮＡＤＰ+レダクターゼを用いることで、同じ方法で測定が可能である。
【０１０３】
フェレドキシン、又はフラボドキシンをコードする遺伝子は、広く分布しており、コードされるフェレドキシン又はフラボドキシンがピルビン酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシン遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol. 173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番に複数のフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276:
44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラス等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。
【０１０４】
具体的には、エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置するfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置するyfhL遺伝子を例示することができる。Fdx及びYfhLのアミノ酸配列は、それぞれ、GenBank Accession
No. AAC75578及びAAC75615に開示されている。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子としては、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置するfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置するfldB遺伝子を例示することができる。fldA遺伝子及びfldB遺伝子がコードするアミノ酸配列は、それぞれ、GenBank Accession No. AAC73778及びAAC75933に開示されている。
【０１０５】
クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子としては、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078〜1184266番に位置するフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置するフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。フェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIのアミノ酸配列は、それぞれ、GenBank Accession No. AAM72491及びAAM72490
に開示されている。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるスルフォロバス・ソルファタリカスのフェレドキシン遺伝子を例示することができる。さらに、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものであってもよく、さらにはエンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ-プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよい。
【０１０６】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、マリックエンザイムの活性が低下していてもよい。本発明の微生物がエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である場合は、特にマリックエンザイムの活性を低下させてもよい。
【０１０７】
本発明において、マリックエンザイムの活性とは、リンゴ酸を酸化的に脱炭酸し、ピルビン酸を生成する反応を可逆的触媒する活性を意味する。上記反応は、ＮＡＤＰを電子受容体とするＮＡＤＰ型マリックエンザイム（malate dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NADP+)とも表記される）（EC:1.1.1.40 b2463遺伝子（maeB遺伝子とも表記される））、あるいは、ＮＡＤを電子受容体とするＮＡＤ型マリックエンザイム（malate
dehydrogenase (oxaloacetate-decarboxylating) (NAD+) とも表記される）（EC:1.1.1.38 sfcA遺伝子（maeA遺伝子とも表記される））の２種の酵素によって触媒される。マリックエンザイム活性の確認は、Bolognaらの方法（Bologna, F. P. et al. 2007. J. Bacteriol. 2007 189: 5937-5946）に従って測定することができる。
【０１０８】
NADP-dependent malic enzyme : NADP+ + malate → NADPH + CO2 + pyruvate
NAD-dependent malic enzyme：NAD+ + malate → NADH + CO2 + pyruvate
【０１０９】
本発明においては、ＮＡＤＰ型マリックエンザイムとＮＡＤ型マリックエンザイムの両方の活性を低下させることがより好ましく、特に、本発明の微生物がエシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、クレブシエラ属、又はセラチア属に属する細菌である場合に、両方の型のマリックエンザイムの活性を低下させることが好ましい。
【０１１０】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸シンターゼ、又はピルビン酸：ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼの活性の増強に加えて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることが好ましい。
【０１１１】
本発明において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＤＨ」ということがある）活性とは、ピルビン酸を酸化的に脱炭酸し、アセチル-CoA(acetyl-CoA)を生成する反応を触媒する活性を意味する。上記反応は、PDH（E1p：pyruvate dehydrogenase, EC:1.2.4.1、aceE遺伝子によってコードされる）、ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ（E2p：dihydrolipoyltransacetylase, EC:2.3.1.12、aceF遺伝子によってコードされる）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（E3：dihydrolipoamide dehydrogenase; EC:1.8.1.4、lpdA遺伝子によってコードされる）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類のサブユニットはそれぞれ以下の反応を触媒し、これら３つの反応を合わせた反
応を触媒する活性をPDH活性という。PDH活性の確認は、VisserとStratingの方法（Visser, J. and Strating, M. 1982. Methods Enzymol. 89: 391-399）に従って測定することができる。
【０１１２】
E1p: pyruvate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine
→ [dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase] S-acetyldihydrolipoyllysine + CO2
E2p：CoA + enzyme N6-(S-acetyldihydrolipoyl)lysine → acetyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ → protein N6-(lipoyl)lysine + NADH + H+
【０１１３】
また、本発明の細菌は、マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するか、又は同オペロンの発現が強化されるように改変された菌株であってもよい。マレートシンターゼ・イソシトレートリアーゼ・イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼオペロン（aceオペロン）が構成的に発現するとは、aceオペロンのプロモーターが、リプレッサータンパク質であるiclRにより抑制を受けないこと、抑制が解除されていることを意味する。
【０１１４】
aceオペロンを構成的に発現していること、また同オペロンの発現が強化していることは、aceオペロンがコードするタンパク質であるマレートシンターゼ(aceB)、イソシトレートリアーゼ(aceA)、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼ／フォスファターゼ（aceK）の酵素活性が非改変株、あるいは野生株と比べて増大していることによって確認出来る。
【０１１５】
酵素活性の測定は、マレートシンターゼに関してはグリオキシル酸に依存するアセチルCoAのチオエステル結合の分解をA232の減少で測定する方法(Dixon,G.H.,Kornberg,H.L., 1960, Biochem.J, 1;41:p217-233）、イソシトレートリアーゼに関してはイソシトレートから生じるグリオキシル酸を２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン誘導体として測定する方法(Roche,T.E..Williams J.O., 1970, Biochim.Biophys.Acta, 22;206(1):p193-195)、イソシトレートデヒドロゲナーゼキナーゼに関してはイソシトレートデヒドロゲナーゼに対するリン酸の脱着を32Pを使用して測定する方法（Wang, J.Y.J. and Koshland, D.E., Jr., 1982, Arch  Biochem. Biophys., 218, p59-67）などで確認出来る。
【０１１６】
抑制を解除するためには、例えば、aceオペロン上のリプレッサー（iclR）の結合部位を、iclRが結合できないように改変すればよい。また、同オペロンのプロモーターを、iclRによって発現抑制を受けない強力なプロモーター（lacプロモーターなど）に置換することによって、抑制を解除することもできる。
【０１１７】
また、iclR遺伝子の発現が低下又は欠失するように細菌を改変することによって、aceオペロンの発現を構成的にすることもできる。具体的には、iclRをコードする遺伝子の発現調節配列を同遺伝子が発現しないように改変するか、同リプレッサーの機能が失われるようにコード領域を改変することによって、aceオペロンの発現の抑制を解除することができる。
【０１１８】
＜１−２＞AldBタンパク質の活性を低下させる改変
本発明の細菌は、上述したようなＬ−アミノ酸生産能を有する腸内細菌を、AldBタンパク質の活性が低下するように改変することによって得できる。また、本発明の細菌は、AldBタンパク質の活性が低下するように改変された細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する
ことによっても、取得できる。
「AldBタンパク質」とは、エシェリヒア・コリK-12株のaldB遺伝子によってコードされるタンパク質、並びにそのホモログ及び人為的改変体等、保存的変異を有するタンパク質をいう。このような保存的変異を有するタンパク質を、保存的バリアントと記載する。保存的バリアントについては後述する。
「AldBタンパク質の活性」とは、AldBタンパク質の持つアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、すなわちアセトアルデヒドを酢酸に変換する反応を触媒する活性を意味し、特にNADP依存型又はNAD依存型のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を意味する。このような活性を有するタンパク質は、その名称は問わず、AldBタンパク質に包含される。例えば、パントエア・アナナティスのaldA遺伝子によってコードされるタンパク質は、NAD依存型のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有しており、「AldBタンパク質」に包含される。AldBタンパク質は、Co-A非依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Co-A independent aldehyde dehydrogenase）とも呼ばれる。
【０１１９】
尚、「AldBタンパク質の活性が低下する」とは、親株又は野生株等の非改変株に比べてAldBタンパク質の活性が相対的に低下している場合、及び、AldBタンパク質の活性を完全に欠損している場合の両方が含まれる。
【０１２０】
細菌を、AldBタンパク質の活性が低下するように改変するには、例えば、AldBタンパク質をコードするaldB遺伝子の発現を低下させればよい。
【０１２１】
aldB遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリK-12株のaldB遺伝子（GenBank Accession NC_000913.2 GI:49175990 complement(3752996..3754534)）が挙げられる。同遺伝子の塩基配列を配列番号１に示した。配列番号２には、同遺伝子がコードするAldBタンパク質のアミノ酸配列を示した。また、パントエア・アナナティスLMG 20103株（GenBank Accession NC_013956.1 GI:291617493 complement(2166733..2168205)）、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）（旧名、エルビニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)）SCRI1043株（GenBank Accession NC_004547.2 GI:50119055 111626..113161）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）CT18株（NC_003198.1 GI:16762629 3978586..3980124）のaldB遺伝子がコードするAldBタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号９〜１１に、各々示した。尚、パントエア・アナナティスでは、AldBタンパク質ホモログをコードする遺伝子はaldA遺伝子と呼ばれているが、この遺伝子はaldB遺伝子、及び同遺伝子がコードするタンパク質はAldBタンパク質として記載する。。これらのAldBタンパク質のアラインメントを図１、２に示す。パントエア・アナナティス、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム、及び、サルモネラ・エンテリカのAldBは、エシェリヒア・コリのAldBと各々64.7%、81.4%、95.8%の相同性を有している。
【０１２２】
AldBタンパク質は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、それらのホモログや人為的改変体等、保存的変異を有するタンパク質であってもよい。このような保存的変異を有するタンパク質を、保存的バリアントと記載する。
【０１２３】
AldBタンパク質の保存的バリアントとしては、例えば配列番号２、又は９〜１１のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質であってもよい。
【０１２４】
「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個を意味する。また、保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸で
ある場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。このようなタンパク質は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように野生型aldB遺伝子の塩基配列を改変することによって取得することができる。
【０１２５】
さらに、上記のような保存的変異を有するタンパク質は、アミノ酸配列全体に対して、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、野生型タンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【０１２６】
野生型aldB遺伝子は、上記のようなアミノ酸配列をコードするものであれば、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、及びエンテロバクター・アエロゲネス等の遺伝子に限らず、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。
【０１２７】
また、野生型aldB遺伝子は、配列番号１の塩基配列と相補的な配列、又はその相補的な配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【０１２８】
プローブとしては、aldB遺伝子の相補配列の一部を用いることもできる。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０１２９】
上記のようなタンパク質の保存的バリアントをコードする遺伝子は、野生型遺伝子の「保存的バリアント」である。
【０１３０】
上記した保存的バリアント及びそれをコードする遺伝子に関する記載は、前記のＬ−ア
ミノ酸生産菌について記載した他の遺伝子、及び後述のadhE遺伝子についても同様に適用される。
【０１３１】
以下、AldBタンパク質の活性を低下させる改変について、具体的に説明する。
AldBタンパク質の活性を低下させるような改変は、例えば、aldB遺伝子の発現を低下させることによって達成される。具体的には例えば、染色体上のaldB遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることによって、AldBタンパク質の細胞内の活性を低下させることができる。
【０１３２】
またAldBタンパク質活性の低下は、aldB遺伝子のプロモーターやシャインダルガノ（SD）配列等の発現調節配列を改変することなどによって、同遺伝子の発現を低下させることによっても、達成することができる。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上のaldB遺伝子の前後の配列を含めて、同遺伝子全体を欠失させてもよい。また、染色体上のaldB遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても、遺伝子の発現を低下させることが出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:5511-5515 (1998), J. Biol. Chem. 266:20833-20839 (1991)）。
【０１３３】
また、AldBタンパク質の活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線照射、またはＮ-メチル-Ｎ'-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。
【０１３４】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、AldBタンパク質の活性が低下するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【０１３５】
aldB遺伝子のコード領域に他の配列を挿入する場合も、挿入の箇所は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるAldBタンパク質の機能を低下させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ-アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【０１３６】
例えば、aldBタンパク質の活性を低下させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。aldB遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能するAldBタンパク質を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する微生物に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上のaldB遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven
integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、及び、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖上ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（Datsenko, K.A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645(20
00); 米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【０１３７】
上記したAldBタンパク質の活性を低下させる方法は、前記のＬ−アミノ酸生産能の付与又は増強における酵素活性の低下においても、同様に適用することができる。
【０１３８】
＜１−３＞adhEタンパク質の活性を増強する改変
本発明の細菌は、AdhEタンパク質の活性が増強されていることが好ましい。
エシェリヒア・コリに関しては、嫌気条件でエタノールを生成する酵素として、以下の反応を可逆的に触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するAdhEの存在が知られている。AdhEタンパク質の活性とは、これらの反応を触媒する活性を意味し、「AdhEタンパク質の活性が増強されている」とは、特にアセトアルデヒドから直接アセチル-CoAを生成する反応を触媒する活性が増強されていることを意味する。AdhEタンパク質は、Co-A依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼ（Co-A dependent aldehyde dehydrogenase）とも呼ばれる。
エシェリヒア・コリのAdhEをコードするadhE遺伝子の配列は、WO2009/031565、米国特許出願公開第2009068712号に開示されている。また、エシェリヒア・コリK-12株のadhE遺伝子（NC_000913.2 GI:49175990 1294669..1297344）の塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。また、パントエア・アナナティスLMG 20103株（GenBank Accession NC_013956.1 GI:291617642 complement(4631008..4632396) ）、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム（Pectobacterium atrosepticum）（旧名、エルビニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)）SCRI1043株（GenBank Accession NC_004547.2 GI:50121254 2634501..2637176）、及び、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）CT18株（NC_003198.1 GI:16760134 complement(1259893..1262571)）のadhE遺伝子がコードするAdhEタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１２〜１４に、各々示した。これらのAdhEタンパク質のアラインメントを図３〜５に示す。
【０１３９】
アセチル-CoA + NADH + H+ → アセトアルデヒド + NAD+ + CoA
アセトアルデヒド + NADH + H+ → エタノール + NAD+
【０１４０】
AdhEタンパク質の活性は、例えば、adhE遺伝子の発現を増強することによって、増強することができる。
以下に、adhE遺伝子の発現を増強する方法について説明する。これらの方法は、前記のＬ−アミノ酸生産菌について記載した遺伝子についても、適用することができる。
【０１４１】
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。
【０１４２】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、及び、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等が挙げられる。
【０１４３】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。染色体上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【０１４４】
尚、遺伝子のコピー数を高める場合、目的遺伝子の産物の活性を増強できれば、コピー数は特に制限されないが、微生物がもともと目的遺伝子を有している場合は、２以上であることが好ましい。また、微生物が本発明の遺伝子をもともと有していない場合は、導入される遺伝子のコピー数は１であってもよいが、２以上であってもよい。
【０１４５】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
【０１４６】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H. et al. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【０１４７】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【０１４８】
adhE遺伝子の発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、同遺伝子のmRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればい
ずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。
【０１４９】
また、本発明の細菌は、好気的にエタノールを資化できることが好ましい。エシェリヒア・コリは、好気条件ではエタノールは資化できないが、好気的にエタノールを資化できるように改変された株を用いてもよい。元来好気的にエタノールを資化できない細菌を、好気的にエタノールを資化できるように改変するには、例えば、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するように改変されたadh遺伝子を保持させること、又は、好気的にエタノールを資化できることを可能にする変異をコード領域内に有する変異型adhE遺伝子を保持させることが挙げられる（Clark, D. P., and Cronan, J. E. Jr. 1980. J. Bacteriol. 144: 179-184; Membrillo-Hernandez, J. et al. 2000. J. Biol. Chem. 275: 33869-33875）。さらに、この変異型adhE遺伝子は、好気条件で機能する非天然型プロモーターの制御下で発現するものであってもよい。
【０１５０】
エシェリヒア・コリは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の上流のプロモーターを好気的に機能するプロモーターに置換することによって、好気条件でアルコールデヒドロゲナーゼが発現し、好気的にエタノールを資化できるようになる（WO2008/010565号パンフレット）。好気条件で機能する非天然型プロモーターとして、好気条件で或る特定レベルを超えてadhE遺伝子を発現することができる任意のプロモーターを用いることができる。好気条件は、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。具体的には、好気条件で遺伝子を発現することが知られている任意のプロモーターを用いることができる。例えば、解糖、ペントースリン酸経路、ＴＣＡサイクル、アミノ酸生合成経路等に関与する遺伝子のプロモーターを用いることができる。さらに、λファージのPtacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、PRプロモーター、又はPLプロモーターは全て、好気条件で機能する強いプロモーターであることが知られており、これらを用いることが好ましい。
【０１５１】
前記のような変異を有するAdhE変異体として具体的には、エシェリヒア・コリのAdhEの568位のグルタミン酸残基がグルタミン酸及びアスパラギン酸以外のアミノ酸残基、例えばリジンで置換された変異体（Glu568Lys、E568K）がある（国際公開パンフレットWO2008/010565号公報）。
【０１５２】
さらに、前記AdhE変異体は、以下の追加的変異を含んでいてもよい。
Ａ）560位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基、例えばリジン残基への置換
Ｂ）566位のフェニルアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばバリン残基への置換、
Ｃ）22位のグルタミン酸残基、236位のメチオニン残基、461位のチロシン残基、554位のイソロイシン残基、及び786位のアラニン残基の他のアミノ酸残基、例えばそれぞれグリシン残基、バリン残基、システイン残基、セリン残基、及びバリン残基への置換、又は
Ｄ）上記変異の組合わせ。
【０１５３】
他の微生物のAdhEについても、上記と同様の変異を持つ変異体を用いることができる。パントエア・アナナティス、ペクトバクテリウム・アトロセプティカム、及び、サルモネラ・エンテリカのAdhEは、エシェリヒア・コリのAdhEと各々89.0%、89.1%、97.2%の相同性を有している。各々のAdhEにおいて、上記の変異の位置に相当するアミノ酸残基は、図２に示したアラインメントにしたがって特定することできる。他の微生物のadhE遺伝子を用いる場合も、コードされるAdhEのアミノ酸配列と公知のAdhEのアミノ酸配列とのアラインメントを作成することにより、変異を導入する位置を特定することができる。
【０１５４】
「好気的にエタノールを資化できる」とは、エタノールを単一炭素源とする最少液体培地もしくは固体培地にて、好気条件で生育可能であることを意味する。「好気条件」は前
記と同様に、振盪、通気及び撹拌等の方法によって酸素が供給される細菌の培養に通常用いられるものであり得る。また、「好気的にエタノールを資化できる」とは、ＡｄｈＥタンパク質のレベルに関して、Clark及びCronan（J. Bacteriol., 141, 177-183 (1980））の方法によって測定された無細胞抽出物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１．５ユニット以上、好ましくは５ユニット以上、及びより好ましくは１０ユニット以上であることを意味する。
【０１５５】
また、本発明の細菌は、リボヌクレアーゼＧの活性が低下するように改変されていてもよい。
【０１５６】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明の細菌を、エタノールを炭素源として含む培地で培養し、該培地からＬ−アミノ酸を採取することにより、Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
【０１５７】
本発明の方法で使用する培地に含まれるエタノールの量は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含まれることが好ましい。また、培地中に単独の炭素源として添加する場合、０．２w/v%以上、好ましくは０．５w/v%以上、さらに好ましくは１．０w/v%以上含まれていることが望ましい。
【０１５８】
さらに、本発明の方法に使用する培地には、エタノールに加え、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。なお他の炭素源を用いる場合には、炭素源中のエタノールの比率が１０重量％以上、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上であることが好ましい。
【０１５９】
また、流加培地として使用する場合は、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、流加後の培地中の濃度が５w/v%以下、好ましくは２w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下で含まれることが好ましい。また、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、０．０１w/v%以上、好ましくは０．０２w/v%以上、さらに好ましくは０．０５w/v%以上の量にて制御することが好ましい。
【０１６０】
なお、本発明において、エタノールは、培養の全工程において一定濃度含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよく、その他の炭素源が充足していれば、一定時間エタルールが不足している期間があってもよい。一定時間とは、例えば発酵全体の時間のうち１０％、２０％、最大で３０％の時間でエタノールが不足していてもよい。このように一時的にエタノールの濃度が０になることがあっても、エタノールを含む培地での培養期間が存在する場合は、本発明の「エタノールを含む培地で培養する」との文言に含まれる。
【０１６１】
培地中に添加する炭素源以外の成分としては、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源が１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含まれてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地の
窒素源と変更してもよい。
【０１６２】
本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【０１６３】
また、培地には、上記成分の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよい。
【０１６４】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。Ｌ-リジン生産菌は、後述のようにＬ-リジン生合成経路が強化されており、Ｌ-リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ-スレオニン、Ｌ-ホモセリン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１６５】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ-アミノ酸が蓄積される。
【０１６６】
本発明においては、Ｌ-アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、細菌の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【０１６７】
本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的にエタノールまたはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【０１６８】
流加培養に用いられる流加培地は、エタノールとその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中のエタノール濃度が一定以下になるように制御してもよい。
流加培地に加えるその他の炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトースが
好ましく、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等を使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。
【０１６９】
本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ-アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。
【０１７０】
菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ-アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。
【０１７１】
ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ-アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ-アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行うとよい。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように設定することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。
【０１７２】
培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させたあとに引き抜きを開始することが望ましく、例えば引き抜き開始時間としては流加を始めてから5時間以内、望ましくは3時間以内、さらに望ましくは1時間以内である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。
【０１７３】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも２０ｍＭ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸のカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP 1813677A）。
【０１７４】
塩基性アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地中で好気培養するに際して、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又はこれらの両方を、塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用することができる。塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させる方法としては、培養中の培地のｐＨが６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、さらに、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することが知られている（特開2002-65287、米国特許出願公開第20020025564号、EP1813677A）。
【０１７５】
本発明においては、発酵中の発酵槽内の圧力が正となるように制御すること、及び、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することの両方を行ってもよい。いずれの場合も、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが、好ましくは20mM以上、よ
り好ましくは30mM以上、特に好ましくは40mM以上存在する培養期があるようにすることが好ましい。発酵槽内圧力、炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスの供給量、又は制限された給気量は、例えば培地中の重炭酸イオン又は炭酸イオンを測定することや、pHやアンモニア濃度を測定することによって、決定することができる。
【０１７６】
上記態様においては、培養中の培地のｐＨが６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御する。上記態様によれば、従来の方法に比べて、カウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるための培地のpHを低く抑えることが可能となる。アンモニアでｐＨを制御する場合、ｐＨを高めるためにアンモニアが供給され、塩基性アミノ酸のＮ源となり得る。培地に含まれる塩基性アミノ酸以外のカチオンとしては、培地成分由来のＫ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａ等が挙げられる。これらは、好ましくは総カチオンの５０％以下であることが好ましい。
【０１７７】
また、発酵中の発酵槽内圧力が正となるようにするには、例えば、給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力を正にすることによって、発酵により生成する炭酸ガスが培養液に溶解し、重炭酸イオン又は炭酸イオンを生じ、これらは塩基性アミノ酸のカウンタイオンとなり得る。発酵槽内圧力として具体的には、ゲージ圧（大気圧に対する差圧）で、０．０３〜０．２ＭＰａ、好ましくは０．０５〜０．１５ＭＰａ、さらに好ましくは０．１〜０．３ＭＰａが挙げられる。また、培養液に炭酸ガス、又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給することによって、培養液に炭酸ガスを溶解させてもよい。さらには、培養液に炭酸ガス又は炭酸ガスを含む混合ガスを供給しつつ、発酵槽内圧力が正となるように調節してもよい。
【０１７８】
発酵槽内圧力を正に調節するには、例えば、給気圧を排気圧よりも高くするように設定すればよい。また、培養液に炭酸ガスを供給する場合は、例えば、純炭酸ガス、又は炭酸ガスを５体積％以上含む混合ガスを吹き込めばよい。
【０１７９】
尚、培地に重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを溶解させる上記の方法は、単独でもよいし、複数を組み合わせてもよい。
【０１８０】
従来法では、通常、生成する塩基牲アミノ酸のカウンタアニオンとすべく、十分量の硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムが、又、栄養成分として蛋白等の硫酸分解物もしくは塩酸分解物が培地に添加され、これらから与えられる硫酸イオン、塩化物イオンが培地に含まれる。従って、弱酸性である炭酸イオン濃度は培養中極めて低く、ppm単位である。上記態様では、これら硫酸イオン、塩化物イオンを減じ、微生物が発酵中に放出する炭酸ガスを上記発酵環境にて培地中に溶解せしめ、カウンタイオンとすることに特徴がある。したがって、上記態様においては、硫酸イオンや塩化物イオンを生育に必要な量以上培地に添加する必要はない。好ましくは、培養当初は硫酸アンモニウム等を培地に適当量フィードし、培養途中でフィードを止める。あるいは、培地中の炭酸イオン又は重炭酸イオンの溶存量とのバランスを保ちつつ、硫酸アンモニウム等をフィードしてもよい。また、塩基性アミノ酸の窒素源として、アンモニアを培地にフィードしてもよい。アンモニアは、単独で、又は他の気体とともに培地に供給することができる。
【０１８１】
培地に含まれる重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン以外の他のアニオンの濃度は、微生物の生育に必要な量であれば、低いことが好ましい。このようなアニオンには、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、イオン化した有機酸、及び水酸化物イオン等が挙げられる。これらの他のイオンのモル濃度の合計は、好ましくは通常は９００ｍＭ以下、より好ましくは７００ｍＭ以下、特により好ましくは５００ｍＭ以下、さらに好ましくは３００ｍＭ以下、特に好ましくは２００ｍＭ以下である。
【０１８２】
上記態様においては、硫酸イオン、及び／又は、塩化物イオンの使用量を削減することが目的の一つであり、培地に含まれる硫酸イオンもしくは塩化物イオン、又はこれらの合計は、通常、７００ｍＭ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、より好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは１００ｍＭ以下である。
【０１８３】
通常は、塩基性アミノ酸のカウンタイオン源として培地に硫酸アンモニウムを添加すると、硫酸イオンによって培養液中の炭酸ガスが放出してしまう。それに対して、上記態様においては、過剰量の硫酸アンモニウムを培地に添加する必要がないので、炭酸ガスを発酵液中に容易に溶解させることができる。
【０１８４】
また、上記態様においては、「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」程度に培地中の総アンモニア濃度を制御することが好ましい。そのような条件としては、例えば、最適な条件において塩基性アミノ酸を生産する場合の収率及び／又は生産性に比べて、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の収率及び／又は生産性が得られる条件が含まれる。具体的には、培地中の総アンモニア濃度としては、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは２５０ｍＭ、特に好ましくは２００ｍＭ以下の濃度が挙げられる。アンモニアの解離度はｐＨが高くなると低下する。解離していないアンモニアは、アンモニウムイオンよりも菌に対して毒性が強い。そのため、総アンモニア濃度の上限は、培養液のｐＨにも依存する。すなわち、培養液のｐＨが高いほど、許容される総アンモニア濃度は低くなる。したがって、前記「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度は、ｐＨ毎に設定することが好ましい。しかし、培養中の最も高いｐＨにおいて許容される総アンモニア濃度範囲を、培養期間を通じての総アンモニア濃度の上限値範囲としてもよい。
【０１８５】
一方、微生物の生育及び塩基性物質の生産に必要な窒素源としての総アンモニア濃度としては、培養中にアンモニアが継続して枯渇しない窒素源が不足することにより微生物による目的物質の生産性を低下させない限り特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、培養中にアンモニア濃度を経時的に測定し、培地中のアンモニアが枯渇したら少量のアンモニアを培地に添加してもよい。アンモニアを添加したときの濃度としては、特に制限されないが、例えば、総アンモニア濃度として好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上の濃度が挙げられる。
【０１８６】
発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法（Nagai,H.et al., Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【０１８７】
尚、回収されるＬ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸以外に細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたＬ−アミノ酸の純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
【０１８８】
また、Ｌ−アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ−アミノ酸は、培地中に溶解しているＬ−アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【実施例】
【０１８９】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【０１９０】
〔実施例１〕AldB活性が低下したＬ−リジン生産菌の構築
＜１−１＞エタノール資化性が付与されたＬ−リジン生産菌の構築
L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhE*）の導入を行った。変異型アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子として、MG1655::PL-tacadhE*（WO2008/010565）由来の遺伝子を用いた。MG1655::PL-tacadhE*株は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）と、PL-tacプロモーターにより制御される変異型adhE遺伝子が連結したＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムに挿入して得た株である。前記変異型adhE遺伝子は、568位のグルタミン酸残基がリジンで置換された変異体をコードしている。この変異型アルコールデヒドロゲナーゼを保持するエシェリヒア・コリは、好気条件でエタノールを資化することができる。
【０１９１】
cat遺伝子をMG1655::PL-tacadhE*株のゲノムから除去できるようにするため、cat遺伝子を、ラムダファージのアタッチメントサイトとテトラサイクリン耐性遺伝子を連結したＤＮＡ断片（att-tet）へ置き換えた。
【０１９２】
cat遺伝子のatt-tet遺伝子への置き換えは、WO2005/010175に記載の、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E.H. et al., J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-5203）を組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマーとして、配列番号５及び６のプライマーを使用して行った。こうして、MG1655::PL-tacadhE*のcat遺伝子がatt-tet遺伝子に置き換えられたMG1655-att-tet-PL-tacadhE*株を得た。
L-リジン生産菌にエタノール資化性を付与するため、MG1655-att-tet-PL-tacadhE*をドナーとして、L-リジン生産菌WC196ΔcadAΔldcC株（「WC196LC」とも記載する）にP1トランスダクションを行い、WC196LC-att-tet-PL-tacadhE*株を得た。
【０１９３】
次に、PL-tacプロモーター上流に導入されたatt-tet遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドpMW-intxis-ts（米国特許出願公開20060141586）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。
【０１９４】
上記で得られたWC196LC-att-tet-PL-tacadhE*株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地上、42℃で培養し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びテトラサイクリン耐性を試験し、att-tet及びpMW-intxis-tsが脱落しているPL-tacadhE*導入株であるテトラサイクリン、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196LC PL-tacadhE*株と名づけた。
【０１９５】
WC196LC PL-tacadhE*株を、dapA、dapB及びlysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2株を得た。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するE. coli由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型d
apA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するE. coli由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、E. coli由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。
【０１９６】
＜１−２＞WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2株からのAldB非産生株の構築
MG1655株に対して、「Red-driven integration」方法により、aldB遺伝子の欠失を行った。aldB遺伝子の欠失用プライマーとして、配列番号７及び８のプライマーを使用した。これによって、MG1655ΔaldB::Tet株を得た。MG1655ΔaldB::Tet株をドナーとして、L-リジン生産菌WC196LC PL-tacadhE*株にP1トランスダクションを行い、AldB非産生株WC196LC
PL-tacadhE*ΔaldB::Tet/pCABD2株を得た。これらの株を20mg/Lのストレプトマイシンを含むＬ培地にて終ＯＤ600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40％グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
【０１９７】
〔実施例２〕AldB非産生株のＬ−リジン生産能の評価
前記の株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて15時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8の菌体を、太試験管(内径18 mm)の、20mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地の5 mLに接種し、往復振とう培養装置で、攪拌120rpmの条件下、37℃において培養した。
AldB非改変株WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2株についても、同様の培養を行った。
エタノールを炭素源とする発酵培地の組成を以下に示す。
【０１９８】
［Ｌ−リジン発酵培地組成］
エタノール                            10 ml/L
(NH4)2SO4                             24 g/L
K２HPO４                              1.0 g/L
MgSO4・7H2O                           1.0 g/L
FeSO4・7H2O                           0.01 g/L
MnSO4・5H2O                           0.082 g/L
イーストエキストラクト                2.0 g/L
CaCO3（日本薬局方）                   30 g/L
蒸留水                                最終量1L
KOHでpH5.7に調整し、115℃で10分オートクレーブを行った。但しMgSO4・7H2Oは別に殺菌し、エタノールはフィルターろ過により滅菌した。CaCO3は、180℃で２時間乾熱滅菌したものを入れた。
【０１９９】
16時間培養後20μLのエタノールを添加し、24時間培養後40μLのエタノールを添加した。41時間培養後、培地中に蓄積したL-リジンの量を公知の方法（サクラ精機  バイオテックアナライザーAS210）により測定し、培養液中のエタノール濃度を公知の方法（王子計測機器バイオセンサBF-5）により測定した。結果を表１に示す。AldB非産生株（WC196LC PL-tacadhE*ΔaldB::Tet/pCABD2株）は、対照株（WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2株）と比較して、有意に高いＬ-リジン生産を示した。
【０２００】
【表１】
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【０２０１】
〔配列表の説明〕
配列番号１：E. coliのaldB遺伝子の塩基配列
配列番号２：E. coliのAldBアミノ酸配列
配列番号３：E. coliのadhE遺伝子の塩基配列
配列番号４：E. coliのAdhEアミノ酸配列
配列番号５：cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマー
配列番号６：cat遺伝子をatt-tet遺伝子で置換えるためのプライマー
配列番号７：aldB遺伝子の欠失用プライマー
配列番号８：aldB遺伝子の欠失用プライマー
配列番号９：P. ananatisのAldBアミノ酸配列
配列番号10：P. atrosepticumのAldBのアミノ酸配列
配列番号11：S. entericaのAldBのアミノ酸配列
配列番号12：P. ananatisのAdhEのアミノ酸配列
配列番号13：P. atrosepticumのAdhEのアミノ酸配列
配列番号14：S. entericaのAdhEのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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