(57)【要約】      （修正有）【課題】同一装置により、ＣＡＲＳ光の発生効率および空間分解能の低下を抑え、ＣＡＲＳ光観察と微分干渉観察の同時観察に好適なレーザ顕微鏡装置を提供する。【解決手段】波長が異なる第１および第２の光束Ｌ１,Ｌ２を発生させる光源部１００と、２光束Ｌ１’,Ｌ２’を合波するレーザコンバイナー１０５と、２つの光路の少なくとも一方に設けられ、直線偏光の光束を作り出すポラライザー１０４と、二次元走査部２０１と、光束を２分割する複屈折プリズム２０２と、合波光束を集光する対物レンズ２０３と、標本からの２光束を合成する複屈折プリズム２０９と、アナライザー２１０と、光束分離部２０７と、ＣＡＲＳ信号およびＤＩＣ信号を検出するための第１の検出部３０１、第２の検出部３０２と、第１、第２の検出部による情報と二次元走査部２０１による光スポットの位置情報とに基づいて、標本内の観察面の画像を形成する画像処理部４０１とを備える。【選択図】図１
2013003204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＲＳ信号とＤＩＣ信号を同時に検出するレーザ顕微鏡装置であって、
互いに波長が異なる第１の光束および第２の光束を発生させる光源部と、
前記２つの光束を合波する合波部と、
前記２つの光束を合波部に導光する２つの光路の少なくとも一方に設けられ、直線偏光の光束を作り出す直線偏光調整部と、
標本に形成される光スポットを走査する二次元走査部と、
光束を偏光成分に従って２つの光束に分割する光束分割部と、
合波された光束を標本に集光する集光部と、
標本から得られる光束のうち、前記光束分割部によって２つの光束に分割された光束を合成する光束合成部と、
合成された光束から特定の直線偏光の光束を取り出す直線偏光抽出部と、
第１の光束と第２の光束の少なくとも一方を分離する光束分離部と、
ＣＡＲＳ信号を検出するための第１の検出部と、
ＤＩＣ信号を検出するための第２の検出部と、
該第１の検出部および第２の検出部によって検出された情報と前記二次元走査部から得られる光スポットの位置情報とに基づいて、標本内の観察面の画像を形成する画像処理部と
を備えるレーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
請求項１であって、前記光束分割部と前記光束合成部の代わりに、光束を偏光成分に従って２つの光束に分割するとともに標本から戻ってくる光束を合成する光束分割合成部と、標本から戻って該光束分割合成部で合成された光束を分離する光束分離部とを備えており、前記第２の検出部が落射型に配置されているレーザ顕微鏡装置。
【請求項３】
請求項１〜２のいずれかひとつにおいて、前記光束分離部が、分離比が入射光の偏光に依存しない光束分離部である、レーザ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標本中の分子の特定の振動を利用し、分子からのコヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）光（ＣＡＲＳ信号）を発生させ、このＣＡＲＳ光を検出することで標本の観察を行うＣＡＲＳ顕微鏡が知られている（特許文献１参照）。このＣＡＲＳ顕微鏡は、標本の分子の特定の振動を利用しているため、蛍光顕微鏡のように、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がない。また、利用する振動を変更することで観察する分子を変更することができる。
【０００３】
従来、このＣＡＲＳ顕微鏡の光源には、２つの異なる周波数を有するパルスレーザが用いられている。このような顕微鏡によれば、これら２つのパルスレーザ光（ポンプ光とストークス光）の周波数差が、標本の分子の特定の振動周波数に一致するように調節した状態で標本面に集光する。このとき、焦点面近傍に広がる光子密度が高い極めて狭い空間において、ポンプ光とストークス光の周波数差が分子の特定の振動周波数に共鳴し、強いＣＡＲＳ光が発生する。このＣＡＲＳ光は、照射したポンプ光とストークス光の周波数よりも高い周波数を有する（つまり短い波長を有する）。したがって、このＣＡＲＳ光だけを分光的に選択して検出することで標本の分子の観察を行うことができる。
【０００４】
現在では、フェムト秒パルスレーザ光もしくはピコ秒パルスレーザ光を光源に用いて、ＣＡＲＳ光観察、多光子励起（ＭＰＥ）の蛍光観察および第２次高調波発生（ＳＨＧ）光観察を切り替えて行うことができるレーザ顕微鏡が知られている（特許文献２参照）。
【０００５】
一方、数十ｎｍ〜数μｍに分離した二つの光束を標本に照射し、標本通過後、この二つの光束を合成干渉させて得られる光束（ＤＩＣ信号）を検出することで標本の観察を行う微分干渉（ＤＩＣ）顕微鏡が知られている。このＤＩＣ顕微鏡は、位相差顕微鏡と同様に透明な標本の微細構造を明暗として可視化する観察方法である。
【０００６】
通常、ＤＩＣ顕微鏡は、偏光した光を複屈折プリズム（ノマルスキープリズム）に入射させ、照明用コンデンサーレンズと合わせて、標本をわずかに分離させた二つの光束で照明し、対物レンズと観察光路に置かれた複屈折プリズムで光束を再び一本にし、最後に偏光子を通過させて干渉させることによって、標本の微細構造を可視化している。この手法では、二本の光束が通る光路中の標本の位相差（例えば段差や屈折率差）を明暗として観察でき、位相差顕微鏡と同様に光軸方向の１０ｎｍ程度の微小段差などを検出できる。また、位相差顕微鏡と異なり照明ＮＡに制約がないので、光軸と垂直方向の解像力を顕微鏡対物レンズの限界まで発揮することができる。さらに、位相差法と比べて輪郭が光ることがなく、解像度の高い像を得ることができる。
【０００７】
ＤＩＣ顕微鏡においては、直線偏光の光束を偏光成分に従って空間的に分離している二つの光束に分割して標本に照射し、標本に形成される光スポットを二次元的に走査し、標本で反射された二つの光束を合成し、合成された光束のうち観察面近傍からの光束だけを選択的に取り出し、観察面近傍からの光束から特定の直線偏光の光束を検出し、検出された情報と光スポットの位置情報とに基づいて標本の観察面の画像を形成することもできる。これによって、透明な標本の数ｎｍの段差をリアルタイムで観察することが可能となる（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５２０６１２号公報
【特許文献２】特開２０１０−９６６６７号公報
【特許文献３】特開２００５−３０９４１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＡＲＳ顕微鏡は標本の分子の特定の振動を利用しているため、観察対象を蛍光プローブであらかじめ標識する必要がないことが特徴の１つである。一方、蛍光プローブで標識していない透明な標本（例えば、細胞）の微細構造の観察には、ＤＩＣ顕微鏡が適している。しかし、ＣＡＲＳ顕微鏡に複屈折プリズムやポラライザー、アナライザーを組み入れるだけでは、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察とを同時に行う際に次に示すような不具合が生じる。
【００１０】
１つ目の不具合は、標本から発生するＣＡＲＳ光強度の低下である。ＣＡＲＳ光観察においては通常、ポンプ光とストークス光の偏光は直線偏光とし、ポンプ光とストークス光の偏光方向が平行となるように調整し標本に集光する。こうすることで、標本中の特定の分子から最も効率よくＣＡＲＳ光を発生させることが出来る。一方、ＤＩＣ観察においては、直線偏光の光束を、偏光方向が互いに直交した２つの光束に分割した後、２つの光束を標本に集光する。このために、直線偏光の光束を複屈折プリズムに入射させ、偏光方向が互いに直交する２つの光束に分割されるように、複屈折プリズムの向き、かつ/または入射させる直線偏光の光束の偏光方向を調整する。つまり、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行うためにＣＡＲＳ顕微鏡に複屈折プリズムを組み合わせた場合、偏光方向が互いに平行であるポンプ光とストークス光の両方が、複屈折プリズムによりそれぞれ互いに偏光方向が直交した２つの光束に分割されてしまう。この場合、以下に説明するように標本から発生するＣＡＲＳ光強度が低下する。
【００１１】
直線偏光のポンプ光とストークス光を用いて、ポンプ光とストークス光の偏光方向を平行に調節して標本に集光した場合に発生するＣＡＲＳ光の強度ＩCARSは、ポンプ光の強度をＩP、ストークス光の強度をＩSとおくと以下のようになる。
【００１２】
2013003204.tif 000003
【００１３】
図２（ａ）は、複屈折プリズムに入射した直線偏光の光束が、複屈折プリズムによって２つの光束に分割された様子を表した模式図である。複屈折プリズムによって分割された２つの光束の偏光方向は互いに直交する。ここで、複屈折プリズムによって分割された２つの光束を両方含む面をＲ面と定義する。また、複屈折プリズムに入射した光束の光軸に平行な軸をｚ軸、Ｒ面に平行でｚ軸に垂直な軸をｘ軸、Ｒ面に垂直でｚ軸に垂直な軸をｙ軸と定義する。
【００１４】
図２（ｂ）のように、例えば、複屈折プリズムに入射したポンプ光およびストークス光の偏光方向がｘ軸から互いに４５度傾いている場合、図２（ａ）のように複屈折プリズムによってそれぞれ２つの光束に分割される。つまり、複屈折プリズムに入射したポンプ光は、ｘ軸に平行な偏光方向の成分とｙ軸に平行な偏光方向の成分とに分割される。同様に、複屈折プリズムに入射したストークス光も、ｘ軸に平行な偏光方向の成分とｙ軸に平行な偏光方向の成分とに分割される。ここで、複屈折プリズムに入射したポンプ光とストークス光の強度をそれぞれＩP, ＩS, 複屈折プリズムによって分離された２つの光束のうち、偏光方向がｘ軸に平行なポンプ光およびストークス光の強度をそれぞれＩ’Px, Ｉ’Sx, 偏光方向がｙ軸に平行なポンプ光およびストークス光の強度をそれぞれＩ’Py, Ｉ’Syと定義すると、以下の関係が成り立つ。
【００１５】
Ｉ’Px＝ＩP／２                                                       （式２）
【００１６】
Ｉ’Sx＝ＩS／２                                                       （式３）
【００１７】
Ｉ’Py＝ＩP／２                                                       （式４）
【００１８】
Ｉ’Sy＝ＩS／２                                                       （式５）
【００１９】
よって、複屈折プリズムを通過したポンプ光とストークス光を標本に集光した場合に発生するＣＡＲＳ光の、ｘ軸に平行な偏光方向の成分の強度Ｉ’CARSxとｙ軸に平行な偏光方向の成分の強度Ｉ’CARSyは、式１〜５より以下のようになる。
【００２０】
2013003204.tif 000004
【００２１】
2013003204.tif 000005
【００２２】
したがって、図２（ｂ）のように、ｘ軸から４５度傾いたポンプ光およびストークス光を複屈折プリズムによってそれぞれ２つの光束に分割して標本に集光したときに発生するＣＡＲＳ光の強度Ｉ’CARSは、式７と式８より以下のようになる。
【００２３】
2013003204.tif 000006
【００２４】
式１と式９より、直線偏光のポンプ光とストークス光を用いて、ポンプ光とストークス光の偏光方向を平行に調節して標本に集光した場合に発生するＣＡＲＳ光の強度ＩCARSと比較して、図２（ｂ）のように、偏光方向がｘ軸から４５度傾いたポンプ光およびストークス光を、複屈折プリズムによってそれぞれ２つの光束に分割して標本に集光したときに発生するＣＡＲＳ光の強度Ｉ’CARSは、４分の１に低下することがわかる。
【００２５】
２つ目の不具合は、ＣＡＲＳ光観察の空間分解能の低下である。ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行うために、ＣＡＲＳ顕微鏡に複屈折プリズムを組み合わせた場合、上述のようにポンプ光とストークス光の両方が、互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割される。これら２つの直線偏光を標本上に集光した場合、それぞれの光スポットは標本上のわずかにずれた位置に形成され、２つの光スポットから発生するＣＡＲＳ光を同時に検出することになる。２つの光スポットずれ量（シアー量）は、対物レンズの種類等により変わる量であり、シアー量が大きくなるほどＣＡＲＳ光観察の空間分解能が低下する。これにより、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察の両方を行う際には、同一の場所を同時に検出することが極めて困難であるという技術的課題を有している。
【００２６】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光源が１台の同一装置を用いて、ＣＡＲＳ光の発生効率の低下を抑えた状態でＤＩＣ観察およびＣＡＲＳ光観察を同時に行うのに好適な新しい技術を捉供し、ＣＡＲＳ光観察による分子情報とＤＩＣ観察による微細構造情報を同時に取得することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、ＤＩＣ信号とＣＡＲＳ信号を同時に検出するレーザ顕微鏡装置であって、互いに波長が異なる第１の光束および第２の光束を発生させる光源部（例えば、パルス光源などの１台の光源と、光源から発生する光束を２つに分岐する手段と、該２つの光束のうち、少なくとも一方の光束の周波数を変換する周波数変換手段とから成る。）と、前記２つの光束を合波する合波部と、前記２つの光束を合波部に導光する２つの光路の少なくとも一方に設けられ、直線偏光の光束を作り出す直線偏光調整部と、標本に形成される光スポットを走査する二次元走査部と、光束を偏光成分に従って２つの光束に分割する光束分割部と、合波された光束を標本に集光する集光部と、標本から得られる光束のうち、前記光束分割部によって２つの光束に分割された光束を合成する光束合成部と、合成された光束から特定の直線偏光の光束を取り出す直線偏光抽出部と、第１の光束と第２の光束の少なくとも一方を分離する光束分離部と、ＣＡＲＳ信号を検出するための第１の検出部と、ＤＩＣ信号を検出するための第２の検出部と、該第１の検出部および第２の検出部によって検出された情報と前記二次元走査部から得られる光スポットの位置情報とに基づいて、標本内の観察面の画像を形成する画像処理部と、形成された画像を表示する表示部とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
【００２８】
本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、光源部（例えば、パルス光源などの１台の光源と、光源から発生する光束を２つに分岐する手段と、該２つの光束のうち、少なくとも一方の光束の周波数を変換する周波数変換手段とから成る。）から発生する互いに波長が異なる２つの光束（ポンプ光とストークス光）を合波部によって合波する。合波された光束を標本に集光し、標本に形成される光スポットを二次元走査部によって走査することで、標本から発生するＣＡＲＳ光を観察することができる。また、ポンプ光とストークス光の少なくともどちらか一方が、光束分割部によって２つの光束に分割されないように、光束分割部の向きを調節する。次に、ポンプ光とストークス光のどちらか一方だけが光束分割部によって２つの光束に分割されるように、直線偏光調整部を調整する。光束分割部によって２つの光束に分割されたポンプ光もしくはストークス光を標本に集光し、標本に形成される光スポットを二次元走査部によって走査する。標本から得られる光束を光束合成部によって合成し、合成された光束から特定の直線偏光の光束を検出することで、標本のＤＩＣ像を観察することができる。
【００２９】
このようにすることで、ポンプ光とストークス光のいずれか一方の光はＤＩＣ観察のために互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割され、他方は分割されないため、同時に観察するＣＡＲＳ光強度の低下を抑えることができる。また、ポンプ光とストークス光のいずれか一方の光が、標本上で２つの光スポットを形成し、他方は１つの光スポットを形成する。標本から発生するＣＡＲＳ光は（式１）の関係にあるため、ポンプ光とストークス光の光スポットが重なり合った部分からのみＣＡＲＳ光が発生する。つまり、上述したポンプ光とストークス光のそれぞれが互いに直交した２つの直線偏光に分割されることによるＣＡＲＳ光観察の空間分解能の低下を回避することができる。
【００３０】
ここで、ＣＡＲＳ光観察時には、光源部から発生する２つの光束の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、周波数変換部によって少なくとも一方の光束の周波数が変換される。これにより、２つの光束のうち、周波数の高い方の光束をポンプ光、周波数の低い方の光束をストークス光として、ＣＡＲＳ光を発生させることができる。
【００３１】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記光束分割部と前記光束合成部の代わりに、光束を偏光成分に従って２つの光束に分割するとともに標本から戻ってくる光束を合成する光束分割合成部と、標本から戻って該光束分割合成部で合成された光束を分離する光束分離部とを備えており、前記第２の検出部が落射型に配置されていることとしてもよい。
このような構成をとることで、落射型で標本のＤＩＣ像を取得することが可能となる。落射型の場合、標本内の光路長は透過型と比較して２倍である。このため、観察面の位相変化を透過型と比較して２倍の感度で検出することができる。
【００３２】
上記のレーザ顕微鏡装置において、前記光束分離部が、分離比が入射光の偏光に依存しない光束分離部であることとしてもよい。
このような光束分離部を用いることで、光束分離部に入射した光束が光束分離部の入射面に対してＰ偏光やＳ偏光以外の光束であっても、偏光に依らず一定の分離比で、透過される光束と反射される光束とに分離することができる。したがって、直線偏光調整部によって作り出された直線偏光の偏光方向を維持したまま光束分離部に導光することができる。さらに、標本から戻ってきて光束分割合成部によって合成された光束の偏光方向を維持したまま直線偏光抽出部へ導光することができる。これにより、標本の微細構造によって生じた位相差を利用してＤＩＣ像を観察することができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、同一装置を用いてＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行うのに好適な新しい技術が捉供される。これにより、ＣＡＲＳ観察におけるＣＡＲＳ光の発生効率の低下を抑え、空間分解能を低下させることなくＣＡＲＳ光観察による分子情報とＤＩＣ観察による微細構造情報を同時に取得できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【図２】（ａ）複屈折プリズムに入射した直線偏光の光束が、複屈折プリズムによって２つの光束に分割される様子を表した模式図である。（ｂ）ｘ軸から４５度傾いて複屈折プリズムに入射するポンプ光およびストークス光を表した模式図である。
【図３】本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置の全体構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について、図１を参照して以下に説明する。
【００３６】
レーザ顕微鏡装置１は、互いに波長が異なる第１の光束および第２の光束を発生させる光源部１００を備えている。光源部１００は、波長が９００ｎｍから１１００ｎｍの光束Ｌ１およびその第２次高調波の光束Ｌ２を射出することができる１台のパルス光源１０１と、光束Ｌ１, Ｌ２をそれぞれ通過させる２つの光路００１, ００２と、２つの光路００１, ００２を通過してきた２つの光束Ｌ１’, Ｌ２’を合波するレーザコンバイナー（合波部）１０５とを備えている。
【００３７】
第１の光路００１には、光束Ｌ１のパルスタイミングを調節するための遅延光路１０２と、光束Ｌ１から直線偏光の光束Ｌ１’を作り出すためのポラライザー（直線偏光調整部）１０４とが設けられている。
【００３８】
遅延光路１０２は、例えば、ミラー（リフレクター）により構成される（図示略）。少なくとも２組以上のリフレクターを用いて光束Ｌ１の光路を折り返し、少なくとも２組以上のリフレクターの間隔を調節することで光束Ｌ１の光路長を変化させることができる。これによって、光束Ｌ１のパルスの時間的タイミングを調整することができる。
【００３９】
ポラライザー１０４は偏光板であり、入射する光束のうち特定の偏光成分の光束だけを選択的に透過し、また、その直線偏光の方向を任意に変えることができる。このため、ポラライザー１０４は光束Ｌ１から所望の直線偏光の光束Ｌ１’を作り出すことができる。ポラライザー１０４は、ＤＩＣ像の観察時のみ必要な素子であるため、ＤＩＣ像観察時のみ光路００１上に組み入れることができるようにしてもよい。
【００４０】
第２の光路００２には、光束Ｌ２を通過させる光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）１０３が周波数変換手段として設けられている。
【００４１】
ＯＰＯ１０３は、通過させる光束Ｌ２を励起光源として可視から近赤外で高出力かつ狭線幅の光束Ｌ２’を生成し、光路００１, ００２を導光される光束Ｌ１’, Ｌ２’に標本２０５中の分子の特定の振動数に略等しい周波数差を与えられるようになっている。
【００４２】
また、レーザ顕微鏡装置１は、レーザコンバイナー１０５で合波された光束Ｌ３を二次元的に走査する二次元走査部２０１と、二次元走査部２０１を通過した光束Ｌ３を偏光成分に従って２つの光束に分離する複屈折プリズム（光束分割部）２０２と、複屈折プリズム２０２を通過した光束を標本２０５面上に集光する対物レンズ（集光部）２０３とを備えている。図中、符号２０４はステージである。
【００４３】
複屈折プリズム２０２は、二次元走査部２０１を通過した光束Ｌ３のうち、光束Ｌ１’か光束Ｌ２’のどちらか一方のみを２つの光束に分割する。分割された２つの光束は空間的に分離しており、それらの偏光成分は互いに直交する。
複屈折プリズム２０２の向きは、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’の少なくともどちらか一方が、２つの光束に分割されないように調節される。ポラライザー１０４は、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’のどちらか一方だけが複屈折プリズム２０２によって２つの光束に分割されるように調整される。複屈折プリズム２０２を通過した光束は、それぞれ対物レンズ（集光部）２０３を通って標本２０５に集光されて光スポットを形成する。複屈折プリズム２０２は、ポラライザー１０４と同様にＤＩＣ像の観察時のみ必要な素子であるため、ＤＩＣ像観察時のみ光路上に組み入れることができるようにしてもよい。
【００４４】
二次元走査部２０１は、標本２０５に形成される光スポットを二次元的に走査する。二次元走査部２０１は、例えば、ガルバノミラーを利用したものであってもよい。二次元走査部２０１は、また、音響光学素子を利用したものであってもよい。
【００４５】
また、レーザ顕微鏡装置１は、標本２０５から発生し集光レンズ２０６によって集光されたＣＡＲＳ光を検出するための第１の検出部３０１を備えている。図中、符号２０７はダイクロイックミラー（光束分離部）、符号２０８は標本２０５から発生したＣＡＲＳ光を選択的に通過させるためのバンドパスフィルターである。
【００４６】
また、レーザ顕微鏡装置１は、複屈折プリズム２０２によって２つの光束に分割され、対物レンズ２０３を介して標本２０５に集光され、標本２０５から得られた２つの光束を合成するための複屈折プリズム（光束合成部）２０９と、複屈折プリズム２０９によって合成された光束のうち、特定の直線偏光の光束を取り出すためのアナライザー（直線偏光抽出部）２１０と、アナライザー２１０を通過した光束を検出するための第２の検出部３０２とを備えている。図中、符号２１１は、複屈折プリズム２０２によって互いに直交した２つの直線偏光に分割された光束の波長を選択的に通過させることができるバンドパスフィルターである。
【００４７】
アナライザー２１０は、ポラライザー１０４と同様に偏光板であり、入射する光束のうち特定の偏光成分の光束だけを選択的に透過する。アナライザー２１０はポラライザー１０４に対してクロスニコルの関係に配置されている。従って、アナライザー２１０は、ポラライザー１０４を透過する直線偏光に直交する直線偏光の光束を選択的に透過する。
【００４８】
第１の検出部３０１、第２の検出部３０２は例えば光電子増倍管で構成される。
【００４９】
また、レーザ顕微鏡装置１は、第１の検出部３０１と第２の検出部３０２とによって検出された情報と、二次元走査部２０１から得られる光スポットの位置情報（走査情報）とに基づいて標本２０５の観察面の画像を形成する画像処理部４０１と、形成された画像を表示する表示部４０２とを備えている。
【００５０】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、ＣＡＲＳ光による標本２０５の観察を行う場合について以下に説明する。
【００５１】
１台のパルス光源１０１から発生した光束Ｌ１は、第１の光路００１上に設けられた遅延光路１０２を通過することによってパルスの時間的タイミングを調節される。一方、１台のパルス光源１０１から発生した光束Ｌ１の第２次高調波である光束Ｌ２は、第２の光路００２上に設けられたＯＰＯ１０３によって周波数が高周波数側に変換され、光束Ｌ２’となる。これにより、光路００１, ００２を導光される２つの光束Ｌ１,Ｌ２’に標本２０５中の分子の特定の振動数に略等しい周波数差を与えることができる。
【００５２】
その後、２つの光束Ｌ１,Ｌ２’はレーザコンバイナー１０５によって合波され、光束Ｌ３となる。
【００５３】
このように合波されたパルスレーザ光Ｌ３は、二次元走査部２０１で走査された後対物レンズ２０３を介して標本２０５面上に集光される。これにより、光束Ｌ３が集光された各位置において、標本２０５中の分子の特定の振動周波数からＣＡＲＳ光を発生させることができる。
【００５４】
標本２０５において発生したＣＡＲＳ光は、標本２０５を挟んで対物レンズ２０３とは反対側に配置された集光レンズ２０６によって集光され、第１の検出部３０１により検出される。そして、第１の検出部３０１によって検出された情報と二次元走査部２０３から得られる光スポットの位置情報（走査情報）とに基づいて、標本２０５の観察面の画像を画像処理部４０１で形成し、表示部４０２により形成された画像を表示することができる。
【００５５】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、パルス光源１０１を用いて、ＯＰＯ１０３により周波数が高周波数側に変換された光束Ｌ２’をポンプ光、周波数が変換されていない光束Ｌ１をストークス光として、ＣＡＲＳ光を発生させることができる。
【００５６】
次に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１を使用して、標本２０５から発生するＣＡＲＳ光の観察と標本２０５のＤＩＣ像の観察を同時に行う場合の、ＤＩＣ像の観察について以下に説明する。ＣＡＲＳ光の観察については、上述のとおりである。
【００５７】
標本２０５から発生するＣＡＲＳ光の観察と同時に、標本２０５のＤＩＣ像を観察する場合には、レーザ顕微鏡装置１にポラライザー１０４と複屈折プリズム（光束分割部）２０２と、複屈折プリズム（光束合成部）２０９と、アナライザー２１０とが配置された状態で使用する。
【００５８】
複屈折プリズム２０２の向きは、二次元走査部２０１を通過した光束Ｌ３のうち、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’の少なくともどちらか一方が、２つの光束に分割されないように調節される。ポラライザー１０４は、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’のどちらか一方だけが複屈折プリズム２０２によって２つの光束に分割されるように調整される。分割された２つの光束は空間的に分離しており、それらの偏光成分は互いに直交する。分割された２つの光束は対物レンズ２０３によって収束されて標本２０５面上に集光され、二次元走査部２０１によって走査される。
【００５９】
標本２０５を通過した２つの光束は、集光レンズ２０６を通ってダイクロイックミラー２０７で部分的に反射され複屈折プリズム２０９に入射し、複屈折プリズム２０９によって１つの光束に結合される。複屈折プリズム２０９によって結合された光束は、アナライザー２１０に入射させられる。アナライザー２１０はポラライザー１０４を透過する直線偏光に直交する直線偏光を選択的に透過する。アナライザー２１０を透過した光束は、第２の検出部３０２により検出される。そして、第２の検出部３０２によって検出された情報と二次元走査部２０１から得られる光スポットの位置情報（走査情報）とに基づいて、標本２０５の観察面の画像を画像処理部４０１で形成し、表示部４０２により形成された画像を表示することができる。画像処理部４０１は、二次元走査部２０１の連続駆動により、繰り返し同じ観察領域から二次元的な画像情報を得て、時系列な動画情報を形成して表示部４０２に表示（上映）させることもできる。
【００６０】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、複屈折プリズム２０２によって分割された互いに直交する２つの直線偏光の光束を用いて、標本２０５のＤＩＣ像を観察することができる。
【００６１】
複屈折プリズム２０２によって２つに分割された光束は、空間的に離れているため標本内の異なる２点に照射される。２つの光束がそれぞれ標本内を通過する部分の光路長の差に対応する位相差（リタデーション）が２つの光束の間に生じる。つまり、２つの光束が通過する部分の光学的な厚さの違いによって２つの光束の間に位相差が発生する。２つの光束の間の位相差は、ポラライザー１０４を透過する直線偏光に直交する直線偏光の成分を発生させる。従って、２つの光束の間の位相差はアナライザー２１０を通過した光束の強度として検出される。
【００６２】
つまり、２つの光束が通過する標本２０５内の部分の光学的な厚さが等しい場合には第２の検出部３０２から信号が出力されないが、２つの光束が通過する標本２０５内の部分の光学的な厚さが異なる場合にはその光学的な厚さの違いに対応した信号が出力される。これによって、標本２０５内の観察対象物が光学的に透明であっても表面の段差や傾斜の情報を取得することができる。
【００６３】
ここで、標本から発生するＣＡＲＳ光について、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行った場合に起こり得るＣＡＲＳ光強度の低下と、本実施形態におけるＣＡＲＳ光強度の低下防止の作用効果について説明する。
【００６４】
先に述べたとおり、ＣＡＲＳ顕微鏡に複屈折プリズムを組み合わせただけでは、ポンプ光とストークス光の両方が互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割されてしまい、その結果、標本から発生するＣＡＲＳ光の強度が低下する。例えば、図２（ｂ）のようにｘ軸から４５度傾いたポンプ光およびストークス光を、複屈折プリズムによってそれぞれ２つの光束に分割して標本に集光したときに発生するＣＡＲＳ光の強度Ｉ’CARSは、ポンプ光とストークス光の偏光方向を平行に調節して標本に集光した場合に発生するＣＡＲＳ光の強度ＩCARSと比較して、４分の１に低下する。
【００６５】
これに対して、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、ストークス光のみが互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割されるように調節することが可能である。図２（ｂ）のようにｘ軸から４５度傾いたストークス光を、複屈折プリズムによってそれぞれ２つの光束に分割して標本に集光した場合に発生するＣＡＲＳ光の強度を計算すると、Ｉ’CARSの２倍になる。すなわち、ＩCARSと比較した時のＣＡＲＳ光強度の低下を２分の１に抑えることができる。
【００６６】
次に、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行った場合に起こり得る、ＣＡＲＳ光観察の空間分解能の低下と、本実施形態における空間分解能の低下防止の作用効果について説明する。
【００６７】
先に述べたとおり、ＣＡＲＳ顕微鏡に複屈折プリズムを組み合わせただけでは、ポンプ光とストークス光の両方が互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割されてしまう。その結果、標本上のわずかにずれた位置に形成された２つの光スポットから発生するＣＡＲＳ光を同時に検出することになり、ＣＡＲＳ光観察の空間分解能が低下する。
【００６８】
これに対して、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、ストークス光のみが互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割されるように調節することが可能である。よって、ストークス光のみが標本上で２つの光スポットを形成し、ポンプ光は１つの光スポットしか形成しない。これにより、ポンプ光とストークス光のそれぞれが互いに直交した２つの直線偏光に分割されることによるＣＡＲＳ光観察の空間分解能の低下を回避することができる。これにより、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察の両方を行う際に、同一の場所を同時に検出することが可能になるという利点を有する。同一の場所を同時に検出できるということは、とくに生体のように多様な動きを示す試料を画像化する場合や光走査の過程で走査速度が変化するような場合であっても、ＣＡＲＳ光観察像とＤＩＣ観察像とを時間的且つ空間的に完全に一致することから、観察領域全体について鮮明な重ね表示が可能になるという格段の効果も奏する。
【００６９】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１によれば、ＣＡＲＳ光の発生効率の低下を抑え、空間分解能を低下させることなく、同じ場所についてＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行うことができる。
【００７０】
〔第２の実施形態〕
本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２について、図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２が第１の実施形態と異なる点は、ＤＩＣ観察を落射型で行う点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置２について、第１の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について説明する。
【００７１】
レーザ顕微鏡装置２は、レーザコンバイナー（合波部）１０５で合波された光束Ｌ３を標本２０５に方向付ける光束分離部５０１と、光束分離部５０１を通過した光束Ｌ３を二次元的に走査する二次元走査部２０１と、二次元走査部２０１を通過した光束Ｌ３を偏光成分に従って２つの光束に分離する複屈折プリズム（光束分割合成部）５０３と、複屈折プリズム５０３を通過した光束を標本２０５面上に集光する対物レンズ（集光部）２０３とを備えている。図中、符号５０２は偏向ミラー、符号２０４はステージである。
【００７２】
光束分離部５０１はレーザコンバイナー１０５で合波された光束Ｌ３を対物レンズ２０３に方向付けるとともに、対物レンズ２０３を通って標本２０５から戻ってくる光束を対物レンズ２０３に方向付けられた光束から分離する。光束分離部５０１は、例えば、光を部分的に反射し部分的に透過するミラーで構成される。光束分離部５０１は、例えば、入射光の反射と透過の分割比が入射光の偏光に依存しない無偏光ビームスプリッターで構成される。
【００７３】
複屈折プリズム５０３は、二次元走査部２０１を通過した光束Ｌ３のうち、光束Ｌ１’か光束Ｌ２’のどちらか一方のみを偏光成分に従って２つの光束に分割する。分割された２つの光束は空間的に分離しており、それらの偏光成分は互いに直交する。
複屈折プリズム５０３の向きは、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’の少なくともどちらか一方が、２つの光束に分割されないように調節される。ポラライザー（直線偏光調整部）１０４は、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’のどちらか一方だけが複屈折プリズム５０３によって２つの光束に分割されるように調整される。複屈折プリズム５０３を通過した光束は、それぞれ対物レンズ（集光部）２０３を通って標本２０５に集光されて光スポットを形成する。さらに複屈折プリズム５０３は、対物レンズ２０３を通って標本２０５から戻ってくる、複屈折プリズム５０３によって分割されていた２つの光束を合成する。複屈折プリズム５０３は、ポラライザー１０４と同様にＤＩＣ像の観察時のみ必要な素子であるため、ＤＩＣ像観察時のみ光路上に組み入れることができるようにしてもよい。
【００７４】
また、レーザ顕微鏡装置２は、標本２０５から発生し集光レンズ２０６によって集光されたＣＡＲＳ光を検出するための第１の検出部３０１を備えている。図中、符号５０４は、標本２０５を透過してきた光束から、標本２０５から発生したＣＡＲＳ光を選択的に通過させるためのショートパスフィルター、符号５０５はバンドパスフィルターである。
【００７５】
また、レーザ顕微鏡装置２は、光束分離部５０１によって分離された標本２０５から戻ってくる光束から特定の直線偏光の光束を取り出すためのアナライザー（直線偏光抽出部）２１０と、アナライザー２１０を通過した光束から、複屈折プリズム５０３によって互いに直交した２つの直線偏光に分割された光束の波長を選択的に取り出すためのバンドパスフィルター５０６と、バンドパスフィルター５０６を通過した光束を検出するための第２の検出部３０２とを備えている。
【００７６】
また、レーザ顕微鏡装置２は、アナライザー２１０を通過した光束から観察面以外からの不所望な光を排除するための共焦点ピンホールを備えていてもよい。共焦点光学系を採用することで、観察面近傍を外れた部位からの反射光と散乱光や、光学系中の光学素子からの反射光など、観察面以外からの不所望な光は共焦点ピンホールで遮断される。これによってノイズを抑えて標本の微細構造を観察することができる。
【００７７】
また、レーザ顕微鏡装置２は、第１の検出部３０１と第２の検出部３０２とによって検出された情報と、二次元走査部２０１から得られる光スポットの位置情報（走査情報）とに基づいて標本２０５の観察面の画像を形成する画像処理部４０１と、形成された画像を表示する表示部４０２とを備えている。
【００７８】
上記のように構成されたレーザ顕微鏡装置２の作用について以下に説明する。
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２を使用して、ＣＡＲＳ光による標本２０５の観察を行う場合については、第１の実施形態で説明した通りである。
【００７９】
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２を使用して、標本２０５から発生するＣＡＲＳ光の観察と標本２０５のＤＩＣ像の観察を同時に行う場合の、ＤＩＣ像の観察について以下に説明する。ＣＡＲＳ光の観察については、上述のとおりである。
【００８０】
標本２０５から発生するＣＡＲＳ光の観察と同時に、標本２０５のＤＩＣ像を観察する場合には、レーザ顕微鏡装置２にポラライザー１０４と複屈折プリズム５０３とが配置された状態で使用する。
【００８１】
複屈折プリズム５０３の向きは、二次元走査部２０１を通過した光束Ｌ３のうち、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’の少なくともどちらか一方が、２つの光束に分割されないように調節される。ポラライザー１０４は、光束Ｌ１’と光束Ｌ２’のどちらか一方だけが複屈折プリズム５０３によって２つの光束に分割されるように調整される。分割された２つの光束は空間的に分離しており、それらの偏光成分は互いに直交する。分割された２つの光束は対物レンズ２０３によって収束されて標本２０５面上に集光され、二次元走査部２０１によって走査される。
【００８２】
標本２０５で反射された２つの光束は対物レンズ２０３を通って複屈折プリズム５０３に戻り、複屈折プリズム５０３によって１つの光束に結合される。複屈折プリズム５０３からの光束は偏向ミラー５０２で反射されて二次元走査部２０１を通過し、光束分離部５０１を部分的に透過する。光束分離部５０１を透過した光束はアナライザー２１０に入射する。アナライザー２１０はポラライザー１０４を透過する直線偏光に直交する直線偏光を選択的に透過する。アナライザー２１０を透過した光束は、第２の検出部３０２により検出される。そして、第２の検出部３０２によって検出された情報と二次元走査部２０１から得られる光スポットの位置情報（走査情報）とに基づいて、標本２０５の観察面の画像を画像処理部４０１で形成し、表示部４０２により形成された画像を表示することができる。画像処理部４０１は、二次元走査部２０１の連続駆動により、繰り返し同じ観察領域から二次元的な画像情報を得て、時系列な動画情報を形成して表示部４０２に表示（上映）させることもできる。
【００８３】
上述のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２によれば、複屈折プリズム５０３によって分割された互いに直交する２つの直線偏光の光束を用いて、標本２０５のＤＩＣ像を観察することができる。
【００８４】
また、アナライザー２１０を通過した光束から観察面以外からの不所望な光を排除するための共焦点ピンホールを備えた場合には、標本面と共役な位置に配置された共焦点ピンホールを持つ共焦点光学系であるため、観察面近傍を外れた部位からの反射光と散乱光や、光学系中の光学素子からの反射光など、観察面以外からの不所望な光が遮断される。これによって、明視野観察のような通常の顕微鏡観察ではノイズに埋もれてしまっていた標本の微細構造の情報を取得できるようになる。また、点光源としてのレーザ光を対物レンズによって絞り標本に照射し、発生した光を同じ対物レンズによって結像し、共焦点ピンホールを通して焦点面からの光だけを検出する。従って、光束を二回絞って像を得るので、通常の顕微鏡観察より平面空間分解能は約１．４倍優れている。
【００８５】
ここで、標本から発生するＣＡＲＳ光について、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行った場合に起こり得るＣＡＲＳ光強度の低下と、本実施形態におけるＣＡＲＳ光強度の低下防止の作用効果について説明する。
【００８６】
第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１と同様に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２によれば、ストークス光のみが互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割されるように調節することが可能である。図２（ｂ）のようにｘ軸から４５度傾いたストークス光を、複屈折プリズムによってそれぞれ２つの光束に分割して標本に集光した場合に発生するＣＡＲＳ光の強度を計算すると、Ｉ’CARSの２倍になる。すなわち、ＩCARSと比較した時のＣＡＲＳ光強度の低下を２分の１に抑えることができる。
【００８７】
次に、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行った場合に生じる、ＣＡＲＳ光観察の空間分解能の低下について説明する。
【００８８】
第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１と同様に、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２によれば、ストークス光のみが互いに直交した２つの直線偏光の光束に分割されるように調節することが可能である。よって、ストークス光のみが標本上で２つの光スポットを形成し、ポンプ光は１つの光スポットしか形成しない。これにより、ポンプ光とストークス光のそれぞれが互いに直交した２つの直線偏光に分割されることによるＣＡＲＳ光観察の空間分解能の低下を回避することができる。これにより、ＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察の両方を行う際に、同一の場所を同時に検出することが可能になるという利点を有する。同一の場所を同時に検出できるということは、とくに生体のように多様な動きを示す試料を画像化する場合や光走査の過程で走査速度が変化するような場合であっても、ＣＡＲＳ光観察像とＤＩＣ観察像とを時間的且つ空間的に完全に一致することから、観察領域全体について鮮明な重ね表示が可能になるという格段の効果も奏する。
【００８９】
以上のように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２によれば、ＣＡＲＳ光の発生効率の低下を抑え、空間分解能を低下させることなく、同じ場所についてＣＡＲＳ光観察とＤＩＣ観察を同時に行うことができる。さらに、ＤＩＣ観察を落射型で行うことによって、ＤＩＣ観察の空間分解能を高めることができる。
【００９０】
以上、本発明の各実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【００９１】
例えば、特開２０１０−９６６６７に開示されているように、パルス光源１０１にフェムト秒パルスレーザ光源を用い、第１の光路００１にフェムト秒パルスレーザ光源から射出された光束の周波数分散量を調節する周波数分散調節手段を設け、第２の光路００２に周波数変換手段と遅延光路とを設けてもよい。ここで、周波数分散調節手段は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズムと、ミラーとを備えているのが好ましく、さらに一対のプリズムを通過した光束は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路上に戻されるようになっているのが好ましい。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散調節手段を通過する光束に与える周波数分散量を調節することができるようになっている。また、上記一対のプリズムの代わりに一対の回折格子を用いてもよい。
【００９２】
また、周波数分散調節手段によって周波数分散量を調節する代わりに、バンドパスフィルターを用いてフェムト秒パルスレーザ光源から射出される光束の帯域を制限してもよい。この場合、周波数変換手段は、例えば、フォトニッククリスタルファイバーで構成される。フォトニッククリスタルファイバーは、通過させる光束の周波数帯域を変更または拡大し、光路００１，００２を導光されるパルスレーザ光Ｌ１，Ｌ２’に標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を与えるようになっていることが好ましい。
【００９３】
また、二次元走査部は、それ自身の構成として、または別の走査部をさらに追加することにより、、試料の深さ方向の異なる位置に照射光の焦点を移動させる構成を有していてもよく、それにより三三次元の画像も得るようにしてもよい。
【符号の説明】
【００９４】
Ｌ１,Ｌ２,Ｌ３,Ｌ４,Ｌ１’,Ｌ２’,Ｌ４’  光束
１００  光源部
１０１  パルス光源
１０２  遅延光路
１０３  光パラメトリック発振器（ＯＰＯ）
１０４  ポラライザー（直線偏光調整部）
１０５  レーザコンバイナー（合波部）
２０１  二次元走査部
２０２  複屈折プリズム（光束分割部）
２０３  対物レンズ（集光部）
２０４  ステージ
２０５  標本
２０６  集光レンズ
２０７  ダイクロイックミラー（光束分離部）
２０８, ２１１, ５０５, ５０６  バンドパスフィルター
２０９  複屈折プリズム（光束合成部）
２１０  アナライザー（直線偏光抽出部）
３０１  第１の検出部
３０２  第２の検出部
４０１  画像処理部
４０２  表示部
５０１  光束分離部
５０２  偏向ミラー
５０３  複屈折プリズム（光束分割合成部）
５０４  ショートパスフィルター
【図１】
2013003204.tif 000007
【図２】
2013003204.tif 000008
【図３】
2013003204.tif 000009