(57)【要約】      （修正有）【課題】現行の抗生物質による処置が長期のものとなり、合併症には役に立たず、また長期療法後ですら感染が持続する可能性があるため、ライム病および／またはボレリア感染症の新たな処置方策を提供する。【解決手段】その必要がある動物（ヒトまたはヒト以外の動物）に療法有効量のセフォベシンの少なくとも１回、好ましくは２回の投与。さらに他の側面において、セフォベシンを第２抗生物質（好ましくはアモキシシリンまたはドキシサイクリン）と共に投与。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物においてボレリア感染症および／またはライム病を処置するための方法であって、その必要がある動物に療法有効量のセフォベシンを投与することを含む方法。
【請求項２】
セフォベシンがセフォベシンナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
セフォベシンを、その必要がある動物に少なくとも２回投与する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
２回目のセフォベシンを、１回目のセフォベシンの約１０〜１３日後に投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
セフォベシンを皮下注射により投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
療法有効量のセフォベシンが約８ｍｇ／ｋｇのセフォベシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
動物がヒト以外の動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヒト以外の動物がイヌ類、ネコ類、ウシ類、ウマ類、または鳥類である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
動物がイヌ類である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
動物がネコ類である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
動物がウマ類である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
動物がウシ類である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、少なくとも１種類の他の抗生物質を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１種類の他の抗生物質の投与が同時または連続的である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
他の抗生物質が、ドキシサイクリン、アモキシシリン、アジスロマイシン、オキシテトラサイクリン、ミノサイクリン、およびセフトリアキソンから選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物においてボレリア(Borrelia)感染症および／またはライム病(ボレリア症、Borreliosis)を処置するための方法であって、その必要がある動物に療法有効量のセフォベシン(cefovecin)を投与することを含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ライム病（ボレリア症）は、動物（たとえば、ヒト、イヌ類、ネコ類、ウシ類、ウマ類、および鳥類）に感染するスピロヘータであるボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、すなわちダニ媒介細菌により引き起こされる感染性疾患である。臨床徴候はイヌ類において十分に特性づけられており、発熱、関節炎、食欲低下、リンパ節腫脹、および若干症例での腎炎を含む。しかし、被曝したネコ類の大部分は無症候性であり、ライム病と呼ばれる臨床症状を発症するのは推定で５％にすぎない。ウマ類では、臨床徴候には軽度の発熱、慢性的な体重減少、散発性跛行、筋圧痛、慢性的な動作不良、関節炎、および多様な整形外科的問題を含めることができる。ライム病は伝統的に抗生物質で処置されてきた。現在の薬物処置計画は、高用量の抗生物質を長期間必要とする可能性がある。推奨される処置は長期のものであり、合併症には役に立たず、また長期療法後ですら感染が持続する可能性があるので、動物、特にイヌ類およびウマ類、殊にイヌ類のための新たな処置方策が求められている。本発明は既存の抗生物質処置のさまざまな欠点のうち１以上を克服し、またはその特性を改善する。特に、本発明はライム病に対する遵守性のある有効な処置選択肢を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、その必要がある動物に療法有効量のセフォベシンナトリウム（すなわち、Ｃｏｎｖｅｎｉａ（登録商標））を投与することにより、ボレリア感染症および／またはライム病を伴う動物を処置する方法を提供する。
【０００４】
本発明の他の側面において、動物はヒトである。本発明のさらに他の側面において、動物はヒト以外の動物である。ヒト以外の動物には、イヌ類、ネコ類、ウマ類、ウシ類、および鳥類が含まれるが、これらに限定されない。ヒト以外の好ましい動物はイヌ類およびウマ類であり、ヒト以外のより好ましい動物はイヌ類である。鳥類にはアヒル、ガチョウおよびニワトリが含まれるが、これらに限定されない。
【０００５】
本発明の他の側面において、セフォベシンナトリウムを、その必要がある動物に少なくとも１回、好ましくは２回投与する。２回目のセフォベシンナトリウムは、１回目の投与の約１０〜１３日後に、または担当医が適用可能と考えるものに従って投与することができる。
【０００６】
本発明の他の側面において、セフォベシンナトリウムを注射により投与する。好ましい投与経路は皮下注射である。本発明のさらに他の側面において、セフォベシン約８ｍｇ／ｋｇの療法有効量が得られるようにセフォベシンナトリウムを投与する。本発明のさらに他の側面において、セフォベシンを第２抗生物質と共に投与することができる。好ましい第２抗生物質はアモキシシリンまたはドキシサイクリンである。１回目または２回目のセフォベシンは、第２抗生物質に続いて、またはそれと同時に投与できる。セフォベシンを第２抗生物質の投与前に投与することもできる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
意外にも、セフォベシンは感染したダニによる刺咬後の動物におけるボレリア感染症および／またはライム病を処置できることが今回見出された。本発明の基礎となる研究により、感染動物のセフォベシンによる後処置は、１回または２回の単回注射量のセフォベシンナトリウムで効果的かつ予想外にボレリア感染症およびライム病を処置することが立証される。この知見は、感染および疾患進行を阻止し、遵守のきっかけを提供するために、医療（たとえば獣医学）専門家にとって特に重要である。
【０００８】
セフォベシンナトリウム（商品名Ｃｏｎｖｅｎｉａ（登録商標））は、セファロスポリンクラスの半合成広域抗細菌薬である。Ｃｏｎｖｅｎｉａは、（６Ｒ，７Ｒ）−７−［［（２Ｚ）−（２−アミノ−４−チアゾリル）（メトキシイミノ）アセチル］−アミノ］−８−オキソ−３−［（２Ｓ）−テトラヒドロ−２−フラニル］−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸一ナトリウム塩と表記される。セフォベシンナトリウム、セフォベシン、Ｃｏｎｖｅｎｉａ、およびＣｏｎｖｅｎｉａ（登録商標）は、本明細書中で互換性をもって用いられる。イヌ類およびネコ類において、セフォベシンは、多数の細菌株に関連する皮膚感染症（たとえば、表在性膿皮症、創傷、および膿瘍）および尿路感染症に適用される。投与すると、皮下注射後にセフォベシンは迅速かつ完全に吸収される。排出半減期は、イヌ類およびネコ類においてそれぞれ約１３３時間および１６６時間である。この長い半減期は、特定の細菌株に対して７および１４日間に及ぶ長期間の抗細菌活性をもたらす。Ｃｏｎｖｅｎｉａは凍結乾燥ペレットとして提供され、これは１０ｍＬの無菌注射用水で再構成した後に８０ｍｇ／ｍＬのセフォベシンを含有する。前記の皮膚および尿路感染症に対して、Ｃｏｎｖｅｎｉａは０．１ｍＬ／ｋｇ（８ｍｇ／ｋｇ）皮下注射として投与される。
【０００９】
前記方法に関して、また本明細書および特許請求の範囲の全体において、以下の用語は本明細書に定義する意味をもつ。
【００１０】
本発明に関して、“ボレリア・ブルグドルフェリ”は、遺伝種コンプレックスである広義ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi sensu lato)を包含し、特にたとえばボレリア・アフゼリイ(B. afzelii)、ボレリア・ガリニイ(B. garinii)、狭義ボレリア・ブルグドルフェリ(B. burgdorferi sensu stricto)、ボレリア・バレイシアナ(B. valaisiana)、ボレリア・スピールマニイ(B. spielmanii)、ボレリア・ルスタニエ(B. lusitaniae)である。本発明は特に狭義ボレリア・ブルグドルフェリに関する。
【００１１】
本発明に関して、“ライム病”は、ライム病、ボレリア症、およびライムボレリア症を包含する。
【００１２】
本発明に関して、本明細書中で用いる“動物（単数または複数）”は、哺乳動物または鳥類である個々の動物を包含する。詳細には、哺乳動物は分類体系の哺乳類のメンバーであるヒトおよびヒト以外の脊椎動物を表わす。限定ではないヒト以外の動物の例には、イヌ類、ネコ類、ウマ類、およびウシ類が含まれる。詳細には、鳥類は分類体系の鳥類(Aves)の脊椎動物を表わす。鳥類は羽毛があり、翼をもち、二足性、内温性(endothermic)、および産卵性である。限定ではない鳥類の例には家禽(poultry)（たとえば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウ）が含まれ、それらすべてを鳥類(fowl)と呼ぶこともできる。
【００１３】
本発明に関して、“処置(treatment, treating)”などは、細菌感染症または状態の回復、軽減または阻止を包含する。本明細書中で用いるこれらの用語は、動物の状態に応じて、障害もしくは状態、または障害もしくは状態に関連する症状の発生を阻止することをも包含し、これには、それらの感染症に冒される前に、障害もしくは状態またはそれらに関連する症状の重症度を低下させることが含まれる。したがって処置は、動物へのＣｏｎｖｅｎｉａの投与であって、感染症の臨床徴候を示している時点での投与ではないものを表わすことができる。本発明に関して、薬物（たとえば、セフォベシンナトリウム）に関連する“療法有効量”などは、そのために薬物を送達しようとしている状態の処置に際して、何らかの認識できるレベルの療法結果を達成するのに十分な薬物量または送達速度を表わす。“認識できるレベルの療法結果”は、製品販売の承認に関するいずれかの政府当局の有効性基準を満たす場合または満たさない場合があると理解される。ある物質がそれの目的作用を遂行する能力にはさまざまな生物学的要因が影響を及ぼす可能性があることは理解される。したがって“療法有効量”は、ある場合はそのような生物学的要因にある程度依存する可能性がある。しかし、各薬物につき、大部分の対象に十分な用量の範囲に関して通常は当業者間に合意がある。さらに、療法効果の達成は臨床医または資格をもつ他の医療担当者が当技術分野で既知の評価法を用いて測定できるが、処置に対する個体の変動および応答によって療法効果の達成が主観的判定になる可能性があることは認識される。療法有効量または送達速度の決定は、医薬科学および医療の当業者が十分になしうる範囲にある。
【００１４】
セフォベシンは、ライム病を効果的に処置するいずれの経路でも投与できる。適切な投与方法には、非経口法、たとえば゛静脈内、皮下および筋肉内注射が含まれるが、これらに限定されない。皮下注射は好ましい投与経路である。
【００１５】
経口用抗生物質が通常はライム病および／またはボレリア感染症の標準処置コースである。たとえば、標準処置コースには下記の推奨用量が含まれる：ドキシサイクリン１０ｍｇ／ｋｇを１日２回；アモキシシリン２０ｇ／ｋｇを１日４回；アジスロマイシン２５ｍｇ／ｋｇを１日１回；オキシテトラサイクリン６．６〜１１ｍｇ／ｋｇを１日１回で１０日間；およびミノサイクリン４ｍｇ／ｋｇを１日１回。一般に、これらの抗生物質を３０日〜約６０日の期間投与する。静脈内抗生物質には１日１回のセフトリアキソン(ceftriaxone)２５ｍｇ／ｋｇが含まれるが、これに限定されない。抗生物質はその必要がある動物に同時に(concomitantly)、または連続して(sequentially)投与できる。同時投与は、１種類の薬剤（たとえば、セフォベシン）を第２抗生物質とほぼ同一時点で投与することを表わす。連続投与は、１種類の薬剤（たとえば、アモキシシリン）を投与し、次いで数時間または数日後に第２抗生物質、たとえば、セフォベシンを投与することを表わす。別の投与順序、たとえばセフォベシンを最初に投与するものも考慮される。
【実施例】
【００１６】
ボレリア・ブルグドルフェリの３種類の外面タンパク質(outer surface protein)（Ｏｓｐ）が診断および予防に重要であり、これらはその生物がそれの局所環境に応答して発現する。ＯｓｐＡはダニの腸管およびインビトロ組織培養におけるボレリア・ブルグドルフェリに広く存在する外面タンパク質である；したがって、インビボでのそれの存在はワクチン接種に伴う免疫応答に起因する。ＯｓｐＣはダニから動物へのボレリア・ブルグドルフェリの媒介に伴う主要Ｏｓｐであり、ボレリアスピロヘータにより産生されるのに伴って感染初期に提示される。ＯｓｐＦは一般に疾患後期にみられるもうひとつの外面タンパク質である。ＯｓｐＣのＣは、外膜リポタンパク質（ＶｌｓＥ）の第６非変異領域にある２５アミノ酸のＣ６ペプチドを表わす。Ｃ６に対する抗体は、対象（たとえば、イヌ類）のワクチン接種状態と無関係なライム病の血清学的診断としての精度が高い。さらに、Ｃ６抗体の産生は生存可能なスピロヘータによる能動感染を意味する。ボレリア・ブルグドルフェリ／ライム病を検出するための血清学的方法は、ＩＤＥＸＸ定性ＳＮＡＰ−４Ｄｘ  ＥＬＩＳＡおよび定量Ｃ６（Ｑｕａｎｔ  Ｃ６またはＱＣ６）診断キットを用いて実施された；これらは、前記の２５アミノ酸のＣ６ペプチドに対する酵素結合イムノソルベントアッセイである。ＱＣ６  ＥＬＩＳＡデータ（単位／ｍＬ）は、療法に対する応答の開始および評価に際しての指針として有用である(参照：Levy SA, O’Connor TP, Hanscom JL, Shields P, et al. Quantitative measurement of a C6 antibody following antibiotic treatment of Borrelia burgdorferi antibody-positive, nonclinical dogs. Clin Vacc Immunol 2008; 15(1):115-119、およびLittman MP, Goldstein RE, Labato MA, et al. ACVIM Small Animal Concensus Statement on Lyme Disease in Dogs: Diagnosis, Treatment and Prevention. J Vet Intern Med 2006; 20: 422-434)。
【００１７】
イヌ類のライム病の診断は、一般に、ボレリアを保有する可能性のあるダニへの曝露（たとえば、ライム病の流行地域での被曝）、臨床徴候、診断における他の識別疾患の除外、および抗微生物療法に対する応答に基づく、four-prongedアルゴリズムを伴う。
【００１８】
セフォベシンの有効性のインビトロ評価
狭義ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ３１株）を培養した。実験（３重）グループには、対照、セフォベシン０．０２μｇ／ｍＬ、およびセフォベシン２μｇ／ｍＬが含まれていた。接種後０、６、２４、３０、４８および５４時間目に培養物を光学顕微鏡検査により観察して、生存スピロヘータ数を評価した（表１）。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
濃度２μｇ／ｍＬのセフォベシンは、約２４時間後に培養物中のボレリア・ブルグドルフェリを排除する。さらに、濃度０．０２μｇ／ｍＬのセフォベシンは、ボレリア・ブルグドルフェリの増殖を５４時間で少なくとも３０％抑制する。インビトロ試験後に、２つのインビボ試験（試験ＡおよびＢ）をイヌにおいて実施した。
【００２１】
試験Ａ
２３匹の成体雌ビーグル犬をこの試験に用いた；すべてがボレリアについて血清陰性であり、いずれのボレリア属種ワクチンも接種されておらず、いずれの試験活動前にも７日間、試験施設に順化された。試験はNational Research Council guidelines (1996)下で実施された。イヌを、非感染対照（ｎ＝７匹のイヌ）グループ、または米国の２地域、地域Ａ（ニューイングランド（ＮＥ）、すなわちロードアイランド）および地域Ｂ（中西部（ＭＷ）、すなわちウィスコンシン）からのダニを用いた感染グループ（ｎ＝８匹のイヌ／地域）にランダム化した。イヌに０日目に１匹当たり最高３０匹のクロアシマダニ(Ixodes scapularis)を感染させた。ダニの付着を毎日モニターし、９日後に残りのダニを採取し、すべてのイヌを承認済み殺ダニ剤の２回局所適用で処置し、３０日の適用間隔で観察した。イヌを攻撃後２１日間、発熱につきモニターし、攻撃後の全期間にわたってライム病の臨床徴候（跛行、運動失調、食欲低下、リンパ節腫脹および抑うつ）につきモニターした。
【００２２】
アッセイ法：ＳＮＡＰ−４Ｄｘ、定量Ｃ６（ＱＣ６）ＥＬＩＳＡおよび皮膚生検
各イヌから、２８日目まで週１回、次いで試験期間（１６６日間）の残りについては２週毎に、血液を採集した。ボレリアに対する血清抗体を、ＳＮＡＰ−４ＤｘおよびＱＣ６  ＥＬＩＳＡによりアッセイした。細菌培養のために、攻撃後２８日毎に各イヌからダニ付着部位付近の皮膚パンチ生検体２つを採集した。
【００２３】
攻撃後
ダニの外寄生後４１日目に１６匹中８匹のイヌがＳＮＡＰ−４Ｄｘによりボレリア・ブルグドルフェリについて陽性であり、８３日目までには１６匹全部のイヌがＳＮＡＰ−４Ｄｘ陽性となった。ＱＣ６  ＥＬＩＳＡは検出感度を増大させ、ダニの外寄生後２０日目に、すなわちＳＮＡＰ−４Ｄｘより３週間早く、全般的な抗体レベル（感染）上昇を示した。平均ＱＣ６（表２）レベルは５４日目から６９日目まで上昇し、次いで８３日目まで水平レベル維持または漸減した（図１）。８３および９７日目にＣｏｎｖｅｎｉａを投与した（８ｍｇ／ｋｇ体重；皮下注射）。処置したイヌ、すなわち８匹のボレリア・ブルグドルフェリ陽性および４匹の対照を、非処置コホート（ボレリア・ブルグドルフェリ陽性の８匹および３匹の対照）と比較した。比較には、血清学的検査、皮膚培養結果、および関節病理検査が含まれていた。
【００２４】
結果
散発性一過性片足跛行のほかに、イヌはライム病の臨床徴候、たとえば発熱、抑うつ、跛行（持続的な足のシフト）または運動失調を示さなかった。遊走性紅斑はみられなかった。
【００２５】
感染したイヌからの皮膚生検試料の細菌培養物（ｎ＝１６；１００．０％）から、攻撃後２８日目にスピロヘータが得られた。１５匹および１１匹は、攻撃後それぞれ５４および８３日目に依然として培養陽性であった。非感染対照からの皮膚試料は、一貫してボレリア・ブルグドルフェリ陰性であった。
【００２６】
８３日目のＣｏｎｖｅｎｉａ投与の前は、そのグループのすべてのイヌ（Ｎ＝８；１００％）がボレリア・ブルグドルフェリについてＳＮＡＰ−４Ｄｘ陽性であり、５〜７匹は試験期間全体（１６６日）を通して陽性のままであった。感染した非処置イヌ（Ｎ＝８；１００％）は、８３日目から１１１日目までＳＮＡＰ−４Ｄｘ陽性であった；７匹（８８％）は１６６日目まで陽性のままであった；１匹のイヌが１２５日目にＳＮＡＰ−４Ｄｘ陰性状態に戻った。すべての非感染対照がボレリア・ブルグドルフェリについてＳＮＡＰ陰性であった。Ｃｏｎｖｅｎｉａ投与中または投与後に有害または予想外の事象は起きなかった。Ｃｏｎｖｅｎｉａ処置イヌにおける平均ＱＣ６抗体ＥＬＩＳＡレベルは、処置前の９４〜１２２Ｕ／ｍＬの範囲から出発して試験終了時の３〜６．５Ｕ／ｍＬまで低下する顕著な衰退を示した。感染した非処置イヌは、同じ時間枠で１１０から１１５Ｕ／ｍＬまでの範囲のＱＣ６抗体レベルをもち、これは試験の進行に伴って増大し、２０６から２１５Ｕ／ｍＬまでのレベルで終了した（図１）。Ｃｏｎｖｅｎｉａグループの８匹中７匹（８８％）のイヌが、処置前の皮膚からのスピロヘータについて培養陽性であり；処置後の細菌培養についてはすべてが陰性であった（１１１〜１６６日目）。感染した非処置イヌ８匹中の４、７および２匹からの皮膚試料が、８３日目以後、スピロヘータについて培養陽性であった（図２）。
【００２７】
各イヌからの１０の関節をスピロヘータについて培養し、変化を顕微鏡検査した。関節には、手首(carpus)、肘(elbow)、肩(shoulder)、膝(stifle)および足首(tarsus)（右と左の両方の前足と後足）が含まれていた。皮膚切片を同様にライム病関連の変化について検査した（病理検査）。スピロヘータについて培養陽性の関節が非処置イヌからは６つあった；Ｃｏｎｖｅｎｉａで処置したイヌからのものにはなかったのと比較。顕微鏡検査では、すべての非処置感染イヌの皮膚切片が炎症およびライム病について記載されている他の変化を伴い、これに対し、処置したイヌ８匹のうち同様な所見を伴ったのは６匹（７５％）であった。すべての関節が病理変化なしであった１匹の処置イヌを除いて、他のすべてのイヌがライム病の変化を示す少なくとも２つの関節をもっていた。これらの顕微鏡所見にもかかわらず、決定的に感染に起因する関節の病理学的状態、またはＣｏｎｖｅｎｉａ療法の結果としての病理学的状態の改善は不確実であった。この試験のイヌは高齢であり（１．２〜４．６歳）、すべてがある程度の加齢性変化をバックグラウンド“ノイズ”として示していた。一般に炎症に関して、炎症性変化が無ないし軽度と等級づけられた処置イヌからの関節と比較して、非処置イヌからの関節は中等度ないし顕著と特徴づけられた。
【００２８】
これらのデータを合わせると、ライム病の炎症性要素の軽減、ボレリアに対する循環ＱＣ６抗体の顕著な減少、およびダニの付着部位付近で採取した皮膚の生存スピロヘータの排除において、Ｃｏｎｖｅｎｉａ療法が支持される。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
【数１】
2013139443.tif 000004
【００３１】
【数２】
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【００３２】
試験Ｂ
３２匹（１８匹の雄および１４匹の雌）ビーグル犬はボレリア・ブルグドルフェリについて血清陰性であり、いずれのボレリア属種ワクチンも接種されておらず、７日間、試験施設に順化された。試験はNational Research Council guidelines (1996)下で実施された。イヌを、各８匹の４グループにランダムに配属した：非処置対照（Ｔ０１）、ならびに抗生物質を投与した３グループ：ドキシサイクリン（Ｔ０２）、アモキシシリン（Ｔ０３）およびＣｏｎｖｅｎｉａ（Ｔ０４）。米国北西部からの野生捕獲ダニを封じ込めチャンバーなしで１０日間、イヌに付与した；満腹するまでダニに給餌した後、承認済みの局所用殺ダニ剤を３０日の適用間隔で２回適用することによりイヌを処置した。
【００３３】
アッセイ法：血清学的検査および皮膚生検（培養およびＰＣＲ）
攻撃後４０日目、および抗生物質処置前に、各イヌから血液を採集し、ダニ付着部位付近の皮膚生検パンチ試料２つも採取した。血液は、処置後ほぼ月１回採集された。皮膚生検体は、ダニ付着部位付近で４８／４９、１１８、１４６、１８０および３１５日目に採取された。ボレリアに対する血清抗体をＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ−４ＤｘおよびＱＣ６  ＥＬＩＳＡによりアッセイした。コーネル大学と共同で、ボレリア・ブルグドルフェリ外面タンパク質ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣおよびＯｓｐＦに対する抗体を検出する蛍光ビーズに基づく多重アッセイ法により血清試料を分析した。データは中央蛍光強度(median fluorescent intensities)（ＭＦＩ）として表わされ、感染に関する解釈指針を得るために特異的かつ高感度であることが示された。皮膚生検体をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ＦｌａＢ）アッセイ用に採集し、スピロヘータ検出のために培養した。試験の終了時に、剖検に際して血液および皮膚生検体を採集し、関節からの滑液膜組織を採取した。
【００３４】
抗生物質計画
７５および８９日目にＣｏｎｖｅｎｉａをＴ０４の８匹のイヌに投与した（８ｍｇ／ｋｇ体重；皮下注射）。他の処置グループにはそれらの各計画を１日１回、経口により、７５日目から１０４日目まで３０日間施した。Ｔ０２のイヌにはドキシサイクリンを投与し（１０ｍｇ／ｋｇ；１日１回（ＳＩＤ））、Ｔ０３のイヌにはアモキシシリンを投与した（２０ｍｇ／ｋｇ；１日３回（ＴＩＤ））。Ｔ０１のイヌは感染した非処置対照として用いられた。抗生物質の有効性を評価するための処置間比較には、臨床徴候、血清学的検査、培養結果および病理検査が含まれていた。
【００３５】
結果
３２匹中３０匹のイヌが、連続ＳＮＡＰ−４ＤｘおよびＰＣＲならびに皮膚生検培養結果に基づいてボレリア・ブルグドルフェリ感染につき陽性であった：対照およびＣｏｎｖｅｎｉａグループそれぞれの８匹のイヌ、ならびにアモキシシリンおよびドキシサイクリングループそれぞれの７匹のイヌ。１１１、１４５、１７９、２２１、２５１、２８１および３１４日目に感染モニタリングを実施した。抗生物質を投与するように割り当てたすべてのイヌをプロトコルに従って処置した；ただし、全試験についてＳＮＡＰ−４ＤｘおよびＰＣＲの両方が陰性であった２匹のイヌがいた：ドキシサイクリンおよびアモキシシリングループそれぞれに１匹。非処置対照では、６２％〜１００％のイヌが４８日目から３１４日目までＳＮＡＰ−４Ｄｘ陽性であった；これに対し、ドキシサイクリン、アモキシシリンおよびＣｏｎｖｅｎｉａで処置したグループのＳＮＡＰ−４Ｄｘ陽性のイヌの数は１７９日目にそれぞれ１、２および２匹であり、１７９日目より後の残りの試験期間について陽性はいなかった（表３）。
【００３６】
感染前には、すべてのグループがＱＣ６  ＥＬＩＳＡにおける平均値＜１０Ｕ／ｍＬを示した；このアッセイにおいて≧３０Ｕ／ｍＬのレベルは、ライム病に対する処置の根拠がある陽性とみなされる。処置グループのいずれにも１１１日より後は閾値を超えたものがなかったのと比較して、対照グループの半数ないし７５％が３１４日目まで閾値を超えていた（表４）。
【００３７】
多重アッセイ結果はボレリア・ブルグドルフェリ感染を陰性、不確定または陽性と分類するために用いた解釈指針と一致した（表５）。ボレリア・ブルグドルフェリに対するワクチンを接種していないすべてのイヌが、ワクチン接種していないイヌについて公表されている結果と一致する抗体−ＯｓｐＡ価をもっていた。各グループに、感染後、処置前（４８日目）に、抗体−ＯｓｐＣについて閾値を超えた４匹のイヌがいた。非処置グループの１〜２匹のイヌが全試験期間を通して感染閾値を超えたままであった（抗体−ＯｓｐＣ）；下記と比較：Ｔ０２では２２１日目に１匹；Ｔ０３では２８１日目に１匹；Ｔ０４では１１１日目に１匹。６匹の対照（７５％）は１１１日目から３１４日目まで閾値を超える抗体−ＯｓｐＦレベルをもっていた（表６）。これに対し、ドキシサイクリンで処置した２匹のイヌが感染閾値を超えていた：４８日目に１匹および１１１日目に１匹；アモキシシリンで処置した３匹のイヌが１１１日目に感染閾値を超えていた（その後はすべてのイヌが陰性）；４８日目に感染閾値を超えた２匹のＣｏｎｖｅｎｉａ処置イヌがいた（その後はすべてのイヌが陰性）。
【００３８】
剖検に際して各イヌにつき１０の関節を採取し、ホルマリン固定、染色、および顕微鏡検査した。関節には、手首、肘、肩、膝および足首（右と左の両足）が含まれていた。さらに、各イヌからのダニ付着部位付近の皮膚切片を評価した。Ｃｏｎｖｅｎｉａグループでは、ライム病について記載されている変化を示す組織を伴うイヌが２匹いた（２５％）；対照の７匹（８７．５％）および他の抗生物質で処置したグループの３匹（３７．５％）〜４匹（５０．０％）イヌと比較（表７）。グループ当たり評価した８０の関節のうち、対照の３６は特徴的なライム病の変化を伴っていた；抗生物質処置グループの６、１１および１２の患部関節（それぞれ、Ｃｏｎｖｅｎｉａ、ドキシサイクリンおよびアモキシシリン；表８）と比較。Ｃｏｎｖｅｎｉａグループは関節変化の発生率が最低であり、８０のうち罹患したのは６つであった。
【００３９】
【表３】
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【００４０】
【表４】
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【００４１】
【表５】
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【００４２】
【表６】
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【００４３】
【表７】
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【００４４】
【表８】
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【００４５】
結論
管理された環境で自然媒介経路を用いた野生捕獲ダニからのボレリアの媒介に成功した。一般的な血清学的アッセイ法および細菌回収またはＰＣＲ法を用いて、スピロヘータの媒介を確認した。全般的に、ボレリア・ブルグドルフェリに感染させ、次いでＣｏｎｖｅｎｉａで処置したイヌは、その生物のＯｓｐに対する循環抗体の臨床関連減少を示し、皮膚切片から回収できるスピロヘータはなく、かつ非処置イヌと比較して全般的に皮膚および関節の炎症がより軽度であることを示した。初期試験結果の確認では、Ｃｏｎｖｅｎｉａを２種類の３０日間経口抗生物質計画と比較して、ラベルの用量および間隔で投与したＣｏｎｖｅｎｉａはドキシサイクリンまたはアモキシシリンのいずれとも差がなかった。感染および効力を、ＳＮＡＰ−４Ｄｘ、ＱＣ６  ＥＬＩＳＡ、および最近公表された感度が高くかつ特異的であることが示された多重アッセイ法によりモニターした。さらにライム病感染を決定的に確認するために用いた関節の顕微鏡評価は、抗生物質療法（経口、注射）が病変の発生率を低下させることを支持し、Ｃｏｎｖｅｎｉａを投与したイヌではドキシサイクリンまたはアモキシシリンを３０日間経口投与したイヌより２倍低く低下させた。
【外国語明細書】
2013139443000001.pdf