(57)【要約】【課題】安価で毒性がなく、細胞の自家蛍光の影響を受けない、近赤外蛍光プローブを提供すること。【解決手段】ポルフィリン含有複合体であって、（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び（Ｃ）非カチオン性シランが結合してなり、当該複合体の蛍光波長が、当該複合体化前のアニオン性ポルフィリンの蛍光波長より長波長である、ポルフィリン含有複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポルフィリン含有複合体であって、少なくとも
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、
（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
が結合してなり、
当該複合体の蛍光波長が、当該複合体化前のアニオン性ポルフィリンの蛍光波長より長波長である、
ポルフィリン含有複合体。
【請求項２】
（Ｂ）アニオン性ポルフィリンの含有量が、当該（Ａ）〜（Ｃ）合計量を１００重量部としたときに３０重量部以上である、請求項１に記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項３】
７００〜８００ｎｍの蛍光ピーク波長を示す、請求項１又は２に記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項４】
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、
（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
が共有結合又は静電相互作用による結合により結合してなる、
請求項１〜３のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項５】
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシランが、式（Ｉ）：
Ｘｉ−Ｓｉ（Ｒ２ａ）ｊ（ＯＲ１ａ）（４−ｉ―ｊ）    （Ｉ）
（式中、ＸはＨ２ＮＣｍＨ２ｍ−、Ｈ２ＮＣｎＨ２ｎ−ＨＮＣｍＨ２ｍ−、Ｎ＋（ＣＨ３）３−ＣｍＨ２ｍ−、又はＰｈ−ＣｍＨ２ｍ−〔ここでＰｈはフェニル基を示す〕で示される基を示し、
Ｒ１ａ及びＲ２ａは、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｉは１又は２、ｊは０又は１、〔但し（４−ｉ−ｊ）≧２〕を示し、
ｍ及びｎは、同一又は異なって、１〜６の整数を示す）
で表される化合物である、請求項１〜４のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項６】
（Ｂ）アニオン性ポルフィリンが、式（ＩＩ）：
【化１】
2013136555.tif 000088
（式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂは、同一又は異なって、カルボキシル基、スルホ基又は水素原子を示す（但し全て水素原子である場合は除く））で表される化合物、ビリルビン、ヘミン、及びプロトポルフィリンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項７】
（Ｃ）非カチオン性シランが、式（ＩＩＩ）：
Ｙｐ−Ｓｉ（Ｒ２ｃ）ｑ（ＯＲ１ｃ）（４−ｐ―ｑ）      （ＩＩＩ）
（式中、ＹはＣＨ２＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−で示される基、ＯＣＮＣＨ２ＣＨ２−で示される基、ＣｌＣαＨ２α−で示される基、ＨＳＣβＨ２β−で示される基、ＣＦ３ＣγＦ２γ−ＣδＨ２δ−で示される基、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣεＨ２ε−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＯＯＣζＨ２ζ−で示される基、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ２η−で示される基、
下式：
【化２】
2013136555.tif 000089
で示される基、
下式：
【化３】
2013136555.tif 000090
で示される基、
炭素数１〜１８のアルキル基、又はフェニル基を示し、
Ｒ１ｃは、炭素数１〜６のアルキル基、又は−（ＣＨ２）τ−ＯＣＨ３を示し、
Ｒ２ｃは、炭素数１〜６のアルキル基、又はフェニル基を示し、
α、β、δ、ε、ζ、η、θ及びιは、それぞれ独立して１〜６の整数を示し、γは０〜８の整数を示し、τは１〜４の整数を示し、
ｐは０、１又は２、ｑは０又は１、〔但し（４−ｐ−ｑ）≧２〕を示す）で表される化合物、
式（ＩＶ）：
Ｚ−ＳｉＣｌ３    （ＩＶ）
（式中、ＺはＣＨ２＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−で示される基、ＣｌＣκＨ２κ−で示される基、ＣＦ３ＣλＦ２λ−ＣξＨ２ξ−で示される基、炭素数１〜１８のアルキル基、フェニル基、又はシクロヘキシル基を示し、
κ及びξは、それぞれ独立して１〜６の整数を示し、λは０〜８の整数を示す）で表される化合物、及びN-[2-(N-ビニルベンジルアミノ)エチル]-3-アミノプロピルトリメトキシシラン塩酸塩
からなる群より選択される少なくとも１種である、
請求項１〜６のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項８】
ＰＥＧ化された、請求項１〜７のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項９】
リング状である、請求項１〜８のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
【請求項１０】
請求項９に記載のポルフィリン含有複合体に造影剤が内包されてなる、造影剤内包ポルフィリン含有複合体。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体を含む、蛍光プローブ又は光線力学療法用光増感剤。
【請求項１２】
請求項１０に記載の造影剤内包ポルフィリン含有複合体を含む、蛍光プローブ、光線力学療法用光増感剤又はデュアルモーダルイメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポルフィリン含有複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光イメージングは他のイメージング（MRIやX-ray CTなど）に比べて安価且つ迅速に生体のイメージングを行うことが可能であるため、癌診断や細胞又は薬剤の体内分布を調べる有用な方法として注目されている。従来の蛍光イメージングでは、励起のためにUVまたは可視光といった光を用いているが、これらの光は、メラニン・ヘモグロビン・水等により吸収されたり、あるいは散乱されたりするため、光がほとんど生体内へ浸透せず、生体深部のイメージングができない（即ち、組織透過性が悪い）という問題があった。またさらに、紫外領域又は可視領域でのイメージングでは、細胞の自家蛍光が強く、蛍光プローブからの光の検出を妨げるため、SN比が悪いという問題があった。一方、近赤外領域（波長650 nm〜900 nm）の光を用いることで、光の散乱及び吸収、並びに細胞の自家蛍光を弱めることができるため、より深く、明瞭なイメージングを行うことができる。特に、近赤外領域では波長が長くなるにつれて細胞の自家蛍光は弱くなり、蛍光波長７４０ｎｍ付近では自家蛍光の影響をほぼ無視できる。しかしながら、従来用いられている近赤外蛍光プローブは、有機色素分子やカドミウムを含むものが多く（例えば半導体量子ドット）、コストや毒性の問題があった。このため、安価で毒性のない近赤外蛍光プローブが求められている。
【０００３】
ポルフィリンは近赤外領域に蛍光波長をもつ蛍光色素であり、比較的安価に入手可能である。また、ポルフィリンは、光照射により活性酸素（1O2）を生成するため、この1O2を利用した治療である光線力学療法への応用も期待されている。しかし、一般に、ポルフィリンの励起波長は近赤外領域よりも短く、また、蛍光波長も近赤外領域に有るとはいっても細胞の自家蛍光が無視できる領域にはない。また、ポルフィリンは、水に溶解しにくく、毒性を示す。また、ポルフィリンは、π-πスタッキングによりJ会合体を形成した場合、吸収波長が長波長側にシフトする（レッドシフトする）ことが知られているが、J会合体は塩濃度やpHの影響を受けやすく、また、J会合体の形成は様々な分子との相互作用に大きく依存するため、生理活性条件化では、J会合体は形成されにくい。以上のことから、ポルフィリンを単独で、近赤外蛍光プローブとして用いることは（特に生体観察のための近赤外蛍光プローブとして用いることは）困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Materials Research Bulletin 45 (2010) 1150-1156
【非特許文献２】J Sol-Gel Sci Technol (2011) 59:276-282
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安価で毒性がなく、細胞の自家蛍光の影響を受けない、近赤外蛍光プローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべき事に、（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び（Ｃ）非カチオン性シランが結合してなるポルフィリン含有複合体であれば、当該複合体の蛍光波長が、当該複合体化前のアニオン性ポルフィリンの蛍光波長より長波長となる蓋然性が高いこと、並びに、当該複合体を細胞の自家蛍光の影響を受けない近赤外蛍光プローブとして好ましく用い得ること、を見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の複合体等を包含する。
項１．
ポルフィリン含有複合体であって、少なくとも
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、
（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
が結合してなり、
当該複合体の蛍光波長が、当該複合体化前のアニオン性ポルフィリンの蛍光波長より長波長である、
ポルフィリン含有複合体。
項２．
（Ｂ）アニオン性ポルフィリンの含有量が、当該（Ａ）〜（Ｃ）合計量を１００重量部としたときに３０重量部以上である、項１に記載のポルフィリン含有複合体。
項３．
７００〜８００ｎｍの蛍光ピーク波長を示す、項１又は２に記載のポルフィリン含有複合体。
（蛍光ピーク波長は、励起波長に依存して変化するが、励起波長６５０〜７００ｎｍ間のいずれか１点の励起波長において、上記波長範囲（７００〜８００ｎｍ、より好ましくは７２０〜７８０ｎｍ）に含まれる蛍光ピーク波長を示す項１又は２に記載のポルフィリン含有複合体をいう。特に、励起波長６７０ｎｍにおいて上記蛍光ピーク波長を示すものが好ましい。なお、蛍光測定は、水溶液中にポルフィリン含有複合体を溶解させて行う。）
項４．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、
（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
が共有結合又は静電相互作用による結合により結合してなる、
項１〜３のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
項５−１．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシランが、式（Ｉ）：
Ｘｉ−Ｓｉ（Ｒ２ａ）ｊ（ＯＲ１ａ）（４−ｉ―ｊ）    （Ｉ）
（式中、ＸはＨ２ＮＣｍＨ２ｍ−、Ｈ２ＮＣｎＨ２ｎ−ＨＮＣｍＨ２ｍ−、Ｎ＋（ＣＨ３）３−ＣｍＨ２ｍ−、又はＰｈ−ＣｍＨ２ｍ−〔ここでＰｈはフェニル基を示す〕で示される基を示し、
Ｒ１ａ及びＲ２ａは、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基を示し、
ｉは１又は２、ｊは０又は１、〔但し（４−ｉ−ｊ）≧２〕を示し、
ｍ及びｎは、同一又は異なって、１〜６の整数を示す）
で表される化合物である、請求項１〜４のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
項５−２．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシランが、トリメチル[3-(トリメトキシシリル)プロピル]アンモニウムクロリド、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、3-(2-アミノエチルアミノ)プロピルジメトキシメチルシラン、3-(2-アミノエチルアミノ)プロピルトリエトキシシラン、3-(2-アミノエチルアミノ)プロピルトリメトキシシラン、3-アミノプロピルジエトキシメチルシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン、及びトリメトキシ[3-(フェニルアミノ)プロピル]シランからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項５−１に記載のポルフィリン含有複合体。
項５−３．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシランが、トリメチル[3-(トリメトキシシリル)プロピル]アンモニウムクロリド（ＴＭＡＰＳ）及び／又は3-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）である、項５−２に記載のポルフィリン含有複合体。
項６−１．
（Ｂ）アニオン性ポルフィリンが、式（ＩＩ）：
【０００８】
【化１】
2013136555.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂは、同一又は異なって、カルボキシル基、スルホ基又は水素原子を示す（但し全て水素原子である場合は除く））で表される化合物、ビリルビン、ヘミン、及びプロトポルフィリンからなる群より選択される少なくとも１種である、項１〜５−３のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
項６−２．
（Ｂ）アニオン性ポルフィリンが、式（ＩＩ）：
【００１０】
【化２】
2013136555.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂが、全てカルボキシル基又は全てスルホ基を示す）で表される化合物である、項６−１に記載のポルフィリン含有複合体。
項７−１．
（Ｃ）非カチオン性シランが、式（ＩＩＩ）：
Ｙｐ−Ｓｉ（Ｒ２ｃ）ｑ（ＯＲ１ｃ）（４−ｐ―ｑ）      （ＩＩＩ）
（式中、ＹはＣＨ２＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−で示される基、ＯＣＮＣＨ２ＣＨ２−で示される基、ＣｌＣαＨ２α−で示される基、ＨＳＣβＨ２β−で示される基、ＣＦ３ＣγＦ２γ−ＣδＨ２δ−で示される基、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣεＨ２ε−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＯＯＣζＨ２ζ−で示される基、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ２η−で示される基、
下式：
【００１２】
【化３】
2013136555.tif 000004
【００１３】
で示される基、
下式：
【００１４】
【化４】
2013136555.tif 000005
【００１５】
で示される基、
炭素数１〜１８のアルキル基、又はフェニル基を示し、
Ｒ１ｃは、炭素数１〜６のアルキル基、又は−（ＣＨ２）τ−ＯＣＨ３を示し、
Ｒ２ｃは、炭素数１〜６のアルキル基、又はフェニル基を示し、
α、β、δ、ε、ζ、η、θ及びιは、それぞれ独立して１〜６の整数を示し、γは０〜８の整数を示し、τは１〜４の整数を示し、
ｐは０、１又は２、ｑは０又は１、〔但し（４−ｐ−ｑ）≧２〕を示す）で表される化合物、
式（ＩＶ）：
Ｚ−ＳｉＣｌ３    （ＩＶ）
（式中、ＺはＣＨ２＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−で示される基、ＣｌＣκＨ２κ−で示される基、ＣＦ３ＣλＦ２λ−ＣξＨ２ξ−で示される基、炭素数１〜１８のアルキル基、フェニル基、又はシクロヘキシル基を示し、
κ及びξは、それぞれ独立して１〜６の整数を示し、λは０〜８の整数を示す）で表される化合物、及びN-[2-(N-ビニルベンジルアミノ)エチル]-3-アミノプロピルトリメトキシシラン塩酸塩
からなる群より選択される少なくとも１種である、
請求項１〜６−２のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
項７−２．
（Ｃ）非カチオン性シランが、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、アリルトリエトキシシラン、アリルトリメトキシシラン、ジエトキシメチルビニルシラン、ジメトキシメチルビニルシラン、トリエトキシビニルシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス(2-メトキシエトキシ)シラン、(クロロメチル)トリエトキシシラン、3-クロロプロピルジメトキシメチルシラン、3-クロロプロピルトリエトキシシラン、2-(3,4-エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン、3-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、イソシアン酸3-(トリエトキシシリル)プロピル、メタクリル酸3-(トリメトキシシリル)プロピル、トリエトキシ-1H,1H,2H,2H-トリデカフルオロ-n-オクチルシラン、アクリル酸3-(トリメトキシシリル)プロピル、3-トリメトキシシリルプロピルクロリド、1-[3-(トリメトキシシリル)プロピル]尿素、トリメトキシ(3,3,3-トリフルオロプロピル)シラン、3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン、ジエトキシ(3-グリシジルオキシプロピル)メチルシラン、3-グリシジルオキシプロピル(ジメトキシ)メチルシラン、3-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン、2-シアノエチルトリエトキシシラン、ジアセトキシジメチルシラン、ジエトキシジメチルシラン、ジメトキシジメチルシラン、ジメトキシジフェニルシラン、ジメトキシメチルフェニルシラン、ドデシルトリエトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、オクタデシルトリエトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、n-オクチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、トリアセトキシメチルシラン、トリエトキシエチルシラン、トリエトキシメチルシラン、トリメトキシ(メチル)シラン、トリメトキシフェニルシラン、トリメトキシ(プロピル)シラン、アリルトリクロロシラン、トリクロロビニルシラン、3-クロロプロピルトリクロロシラン、トリクロロ(1H,1H,2H,2H-ヘプタデカフルオロデシル)シラン、トリクロロ(1H,1H,2H,2H-トリデカフルオロ-n-オクチル)シラン、ブチルトリクロロシラン、シクロヘキシルトリクロロシラン、デシルトリクロロシラン、ドデシルトリクロロシラン、エチルトリクロロシラン、n-オクチルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシラン、トリクロロ-2-シアノエチルシラン、トリクロロヘキシルシラン、トリクロロ(メチル)シラン、トリクロロオクタデシルシラン、トリクロロ(プロピル)シラン、トリクロロテトラデシルシラン、及びN-[2-(N-ビニルベンジルアミノ)エチル]-3-アミノプロピルトリメトキシシラン塩酸塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項７−１に記載のポルフィリン含有複合体。
項７−３．
（Ｃ）非カチオン性シランが、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、及びテトライソプロポキシシランからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項７−２に記載のポルフィリン含有複合体。
項８．
ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールにより修飾）された、項１〜７−３のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
項９．
リング状である、項１〜８のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体。
項１０．
項９に記載のポルフィリン含有複合体に造影剤（好ましくはＸ線造影剤、より好ましくは金粒子）が内包されてなる、Ｘ線造影剤内包ポルフィリン含有複合体。
項１１．
項１〜９のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体を含む、蛍光プローブ又は光線力学療法用光増感剤。
項１２．
項１０に記載のＸ線造影剤内包ポルフィリン含有複合体を含む、蛍光プローブ、光線力学療法用光増感剤又はデュアルモーダルイメージング用造影剤。
【００１６】
項Ａ−１．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン
（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
を０℃〜６０℃にて反応させる工程を含む、（Ａ）〜（Ｃ）が結合してなるリング状ポルフィリン含有複合体の製造方法。
項Ａ−２．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン
（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
を０℃〜６０℃にて反応させる工程を含む、項９に記載のリング状ポルフィリン含有複合体の製造方法。
項Ａ−３．
項Ａ−１又はＡ−２に記載の製造方法で得られるリング状ポルフィリン含有複合体。
【００１７】
項Ｂ−１．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン及び（Ｂ）アニオン性ポルフィリンが共有結合した（Ａ）−（Ｂ）結合体、
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
を加水分解及び縮合する工程を含む、（Ａ）〜（Ｃ）が結合してなるポルフィリン含有複合体の製造方法。
項Ｂ−２．
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン及び（Ｂ）アニオン性ポルフィリンが共有結合した（Ａ）−（Ｂ）結合体、
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、及び
（Ｃ）非カチオン性シラン
を加水分解及び縮合する工程を含む、項１〜９のいずれかに記載のポルフィリン含有複合体の製造方法。
項Ｂ−３．
項Ｂ−１又は項Ｂ−２に記載の製造方法で得られるポルフィリン含有複合体。
項Ｂ−４．
項Ｂ−３に記載のポルフィリン含有複合体にＸ線造影剤（好ましくは金粒子）が内包されてなる、Ｘ線造影剤内包ポルフィリン含有複合体。
項Ｂ−５．
項Ｂ−３に記載のポルフィリン含有複合体を含む、蛍光プローブ又は光線力学療法用光増感剤。
項Ｂ−６．
項Ｂ−４に記載のＸ線造影剤内包ポルフィリン含有複合体を含む、蛍光プローブ、光線力学療法用光増感剤又はデュアルモーダルイメージング用造影剤。 
【発明の効果】
【００１８】
本発明の複合体は、特に、高感度かつ生体深部の蛍光イメージングを達成するためのプローブとして有用である。また、当該複合体は、細胞毒性が低い一方で、光照射により活性酸素を産生するため、光線力学療法用光増感剤としても有用である。さらに、当該複合体は、特に癌組織において長期間滞在する性質（長期滞在性）を示すため、蛍光プローブとしても光線力学療法用光増感剤としても、癌組織に対して適用する際に特に有用である。またさらに、当該複合体は、さらに化学修飾することも可能であり、例えばＰＥＧ修飾を行うことにより血中滞留時間を大きく延長することもできる。また、癌組織は血管壁のできが雑であり、正常組織の血管よりも１オーダー以上広い５０ｎｍ〜２００ｎｍの隙間が空いているため、この範囲の大きさのナノ粒子は癌組織特異的に進入することが知られている。これをEnhanced Permeation and Retention Effect（ＥＰＲ効果）という。本発明の複合体は、当該効果も期待することができる。また、本発明の複合体のうち、特にリング状のものについては、内部に有用成分を内包することができる。よって、例えば、Ｘ線造影剤（好ましくは金粒子）を内包させることにより、蛍光イメージングとＸ線ＣＴを組み合わせたデュアルモーダルイメージング用造影剤として使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】trimethyl[3-(trimethoxysilyl)-propyl]ammonium chloride（ＴＭＡＰＳ）、tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin（ＴＣＰＰ）及びtetraethyl orthosilicate（ＴＥＯＳ）を２２℃で反応させて得た複合体（実施例１）を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察した結果をａ）〜ｃ）に示す。また、ＴＭＡＰＳ、ＴＣＰＰ及びＴＥＯＳを８０℃で反応させて得た粒状物（比較例１）をＴＥＭにより観察した結果をｄ）に示す。
【図２】ＴＭＡＰＳの代わりに３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いた以外は、実施例１と同様に操作して得た複合体（実施例２）のＴＥＭ撮影画像をａ）に示す。また、８０℃で反応させた以外は同様に操作して得た粒状物（比較例２）のＴＥＭ撮影画像をｂ）に示す。
【図３】実施例１で得たチューブ状複合体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解させた写真をａ）に示し、これを動的光散乱測定装置により測定を行った結果をｂ）に示す。
【図４】実施例１で得たチューブ状複合体（粉末状）をフーリエ変換赤外分光光度計により測定した結果を示す。併せて、ＴＥＯＳ、ＴＭＡＰＳ、及びＴＣＰＰを同様に測定した結果を示す。ａ）がＴＥＯＳ、ｂ）がＴＭＡＰＳ、ｃ）がＴＣＰＰ、ｄ）がチューブ状複合体のスペクトルを示す。
【図５ａ】ポルフィリン（ＴＣＰＰ）を４頂点部分にそれぞれカルボン酸由来負電荷を有する正方形平板にたとえた図である。
【図５ｂ】正方形平板（ＴＣＰＰ）がπ−πスタッキングにより重複したもの（Ｊ会合体）が、さらに負電荷によりカチオン性オルガノアルコキシシランの正電荷と相互作用しており、これらがチューブ状複合体の側面を構成しているであろうことを表した推定図である
【図６】実施例１で得たチューブ状複合体をＰＢＳに溶解させて得た溶液（チューブ状複合体ＰＢＳ溶液）について、紫外可視吸収スペクトルを測定した結果を示す。また、併せて、比較例２で得た生成物（球状粒子）、及びTCPPについて同様に測定を行った結果を示す。
【図７】チューブ状複合体ＰＢＳ溶液について、蛍光スペクトル（励起波長670 nm）を測定した結果を示す。また、比較例２で得た生成物（球状粒子）、及びTCPPについて同様に測定を行った結果を併せて示す。
【図８】チューブ状複合体ＰＢＳ溶液について波長660〜690nmの光励起時の蛍光像を示す。
【図９】ＤＰＩＢＦ（1,3-diphenylisobenzofuran）とチューブ状複合体を含む溶液に、波長635〜675nm（光源；水銀ランプ）の光を照射した際の、ＤＰＩＢＦの吸収スペクトルの変化を測定した結果を示す。
【図１０】チューブ状複合体の毒性をWST-1アッセイにより調べた結果を示す。
【図１１】チューブ状複合体に光照射した際の細胞毒性を、WST-1アッセイにより調べた結果を示す。
【図１２】チューブ状複合体によりマクロファージを蛍光染色した結果を示す。
【図１３】マウスの自家蛍光を測定した結果を示す。
【図１４】チューブ状複合体で標識されたマクロファージをマウスの皮下に投与し、蛍光を測定した結果を示す。
【図１５】チューブ状複合体で標識されたマクロファージをマウスに静脈投与し、蛍光を測定した結果を示す。ａ〜ｄはin vivoイメージング結果、ｅ〜ｈはex vivoイメージング結果である。
【図１６ａ】担癌マウスに対して、チューブ状複合体又はＴＣＰＰを癌部に直接投与（intratumor投与）し、蛍光を観察した結果を示す。
【図１６ｂ】図１６ａに示す傾向イメージングのradiant efficiency （ＲＥ）の変化を示す。
【図１７】ＴＣＰＰに３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を共有結合させ、ＴＣＰＰ−ＡＰＴＥＳ結合体を作製し、さらに当該結合体にさらにＴＥＯＳ及びＡＰＴＥＳを共有結合させて、ポルフィリン含有複合体を製造したときの、概要を示す。
【図１８】実施例３複合体及び比較例４集合物の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察画像を示す。
【図１９】ＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）により得られた、ＴＥＯＳ、ＡＰＴＥＳ、ＴＣＰＰ及び実施例３複合体のスペクトルを示す。
【図２０】実施例３複合体の２９Ｓｉ  ＮＭＲ測定結果を示す。
【図２１】実施例３複合体の１３Ｃ  ＮＭＲ測定結果を示す。
【図２２】実施例３複合体および比較例４集合物の熱重量分析結果を示す。
【図２３】生理食塩水に分散させた実施例３複合体および比較例４集合物を示す。
【図２４】生理食塩水に分散させた実施例３複合体および比較例４集合物の吸収スペクトルを示す。
【図２５】生理食塩水に分散させた実施例３複合体および比較例４集合物の蛍光イメージ（励起波長６７５ｎｍ）を示す。
【図２６】実施例３複合体および比較例４集合物の平均蛍光強度（左側）および最大蛍光強度（右側）の波長依存性を示す。
【図２７】実施例３複合体のＰＥＧ化の概要を示す。
【図２８】ＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）により得られた、ＰＥＧ修飾された実施例３複合体のスペクトルを示す。
【図２９】ＰＥＧ化実施例３複合体を静脈投与し、IVIS Spectrumを用いて蛍光を観察した結果を示す。
【図３０】金粒子内包実施例３複合体の調製の概要を示す。
【図３１】金粒子内包実施例３複合体のＴＥＭ観察画像を示す。
【図３２】動的光散乱（ＤＬＳ）により、水溶液中での金粒子内包実施例３複合体の粒径を測定した結果を示す。
【図３３】金粒子、ＴＣＰＰ、及び金粒子内包実施例３複合体の紫外可視吸収スペクトルを測定した結果を示す。
【図３４】左側に金粒子内包実施例３複合体の蛍光画像を、右側に蛍光波長と蛍光強度の関係を示したグラフを、それぞれ示す。
【図３５】左側に、金粒子内包実施例３複合体２００ｍＭ（Ａｕとして）、イオパミロン２００ｍＭ（Ｉとして）、及び水のＸ線ＣＴ画像を示す。右側に、金粒子内包実施例３複合体及びイオパミロンの濃度（それぞれＡｕ濃度、Ｉ濃度）とＣＴ値との関係を表すグラフを示す。
【図３６】金粒子内包実施例３複合体をマウスに投与した際の蛍光観察結果を示す。
【図３７】図３６で観察された蛍光強度をグラフ化した図を示す。
【図３８】金粒子内包実施例３複合体投与前と投与後２４時間に取得した、マウスのＸ線ＣＴ画像（側面）を示す。
【図３９】金粒子内包実施例３複合体投与前と投与後２４時間に取得した、マウスのＸ線ＣＴ画像（正面）を示す。
【図４０】図３８及び図３９で観察されたＣＴ値をグラフ化した図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、ポルフィリン含有複合体であって、少なくとも（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、及び（Ｃ）非カチオン性シランが結合してなり、当該複合体の蛍光波長が、当該複合体化前のアニオン性ポルフィリンの蛍光波長より長波長である、ポルフィリン含有複合体に係る。以下これら（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、（Ｂ）アニオン性ポルフィリン、（Ｃ）非カチオン性シランを、それぞれ（Ａ）成分、（Ｂ）成分、（Ｃ）成分ということがある。
【００２２】
なお、本明細書において、カチオン性とは、ｐＨ７以上の水溶液に溶解させた際に、陽イオンとなるという意味であり、アニオン性とは、ｐＨ７以上の水溶液に溶解させた際に、陰イオンとなるという意味である。ｐＨ７以上の水溶液に溶解させた際に、陽イオン又は陰イオンとなるか否かは、ゼータ電位を測定することで確認できる。ｐＨ７以上の水溶液に溶解させた際のゼータ電位が、マイナスであれば陰イオンであり、プラスであれば陽イオンである。また、本明細書におけるｐＨは２５℃でｐＨメーターを用いて測定した値である。
【００２３】
本発明のポルフィリン含有複合体は、少なくとも（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が結合してなる。特に（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が結合してなるものが好ましい。結合様式は特に制限されないが、共有結合又は静電相互作用による結合であることが好ましい。また、結合様式によっては、特に結合部分において化学構造が若干変化することにより、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分がそのまま複合体中に含まれない場合もあり得るが、そのような複合体も本発明における（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が「結合してなる」複合体に含まれる。例えば、各成分間で脱水縮合反応（分子間脱水反応）が起こった結果、各成分同士が共有結合により結合する場合がある。より具体的には、例えば各成分間で−ＣＯＯＨ基と−ＮＨ２基又は−ＯＨ基が反応して脱水縮合し、−ＣＯＮＨ−又は−ＣＯＯ−により各成分が共有結合する場合が例示できる。このような結合様式により結合してなる複合体には、もはや（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分がそのまま含まれるわけではないが、このような複合体も本発明における“（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が「結合してなる」複合体”に包含されるということである。
【００２４】
なお、１の複合体において、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分は、全て同様の結合様式で結合される必要はなく、各成分間の結合様式は異なっていても同一であってもよい。また、これら３種の成分は、３種成分が全て結合しているのであれば、全ての成分が他の２種の成分の両方と結合している（すなわち（Ａ）成分が（Ｂ）（Ｃ）成分と結合し、（Ｂ）成分が（Ａ）（Ｃ）成分と結合し、（Ｃ）成分が（Ａ）（Ｂ）成分と結合する）必要はなく、例えば３種成分のうち１種のみが残り２種と結合しているだけであってもよい。
【００２５】
本発明のポルフィリン含有複合体は、当該複合体化前のアニオン性ポルフィリンの蛍光波長より長波長の蛍光波長を有する。つまり、（Ｂ）アニオン性ポルフィリン含有複合体そのものが有する蛍光波長に比べ、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が結合してなる本発明のポルフィリン含有複合体が有する蛍光波長の方が長い。上述のように、一般に、ポルフィリンの蛍光波長は近赤外領域に有るとはいっても、細胞の自家蛍光が無視できる領域にはないが、本発明のポルフィリン含有複合体の有する蛍光波長は、これよりも長波長であるため、細胞の自家蛍光がほぼ無視できる領域に存在する。本発明のポルフィリン含有複合体の蛍光ピーク波長は、好ましくは７００〜８００ｎｍ、より好ましくは７００〜７８０ｎｍ、さらに好ましくは７２０〜７８０ｎｍである。なお、蛍光ピーク波長は、励起波長に依存して変化するが、励起波長６５０〜７００ｎｍ間のいずれか１点の励起波長において、上記波長範囲（好ましくは７００〜８００ｎｍ、より好ましくは７２０〜７８０ｎｍ）に含まれる蛍光ピーク波長を示せばよい。特に、励起波長６７０ｎｍにおいて上記蛍光ピーク波長を示すものが好ましい。なお、蛍光測定は、水溶液中にポルフィリン含有複合体を溶解させて行う。当該水溶液としては、例えば生理食塩水やＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）が挙げられる。
【００２６】
本発明のポルフィリン含有複合体においては、（Ｂ）アニオン性ポルフィリンの含有量が多いほど蛍光強度が強まるので好ましい。また特に、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が結合してなるポルフィリン含有複合体でなければ、（Ｂ）アニオン性ポルフィリンを多く含有させることが難しいため、アニオン性ポルフィリンを多く含有できるという点でも本願発明のポルフィリン含有複合体は優れている。特に限定はされないが、（Ｂ）アニオン性ポルフィリンの含有量が、（Ａ）〜（Ｃ）成分合計量を１００重量部としたときに３０重量部以上であることが好ましく、３５重量部以上であることがより好ましく、４０重量部以上であることがさらに好ましい。なお、当該（Ｂ）成分の含有重量部比値は、ポルフィリン含有複合体を熱重量分析した際の有機物の重量減少割合（但し水の重量減少の影響は差し引く）から求めた値である。
【００２７】
（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシランとしては、カチオン性を示すオルガノアルコキシシランであれば、特に制限されない。例えば、式（Ｉ）：
Ｘｉ−Ｓｉ（Ｒ２ａ）ｊ（ＯＲ１ａ）（４−ｉ―ｊ）    （Ｉ）
で表される化合物が好適である。
【００２８】
式（Ｉ）において、ＸはＨ２ＮＣｍＨ２ｍ−、Ｈ２ＮＣｎＨ２ｎ−ＨＮＣｍＨ２ｍ−、Ｎ＋（ＣＨ３）３−ＣｍＨ２ｍ−、又はＰｈ−ＣｍＨ２ｍ−〔ここでＰｈはフェニル基を示す〕で示される基を示し、中でもＨ２ＮＣｍＨ２ｍ−、Ｈ２ＮＣｎＨ２ｎ−ＨＮＣｍＨ２ｍ−、又はＮ＋（ＣＨ３）３−ＣｍＨ２ｍ−で示される基が好適である。ｍ及びｎは、同一又は異なって、１〜６の整数を示す。ｍは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。ｎは１、２、３又は４が好ましく、１、２、又は３がより好ましい。また、上記どの基におけるＣｍＨ２ｍも（ＣＨ２）ｍが好適であり、ＣｎＨ２ｎも（ＣＨ２）ｎが好適である。つまり、上記のＨ２ＮＣｍＨ２ｍ−、Ｈ２ＮＣｎＨ２ｎ−ＨＮＣｍＨ２ｍ−、Ｎ＋（ＣＨ３）３−ＣｍＨ２ｍ−、Ｐｈ−ＣｍＨ２ｍ−は、それぞれ、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｍ−、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）ｎ−ＨＮ（ＣＨ２）ｍ−、Ｎ＋（ＣＨ３）３−（ＣＨ２）ｍ−、Ｐｈ−（ＣＨ２）ｍ−であることが好ましい。
【００２９】
また、Ｒ１ａ及びＲ２ａは、同一又は異なって、炭素数１〜６のアルキル基を示す。当該アルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、イソヘキシル、３−メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルが好ましい。
【００３０】
また、ｉは１又は２、ｊは０又は１、〔但し（４−ｉ−ｊ）≧２〕を示す。すなわち、（ｉ、ｊ）は（１、０）、（１、１）、又は（２、０）を示す。
【００３１】
式（Ｉ）で表される化合物としては、具体的には例えば以下に記載する化合物が例示される。なお、以下の例示では、化合物の英語表記及び日本語表記を挙げ、さらに構造式を示す。
【００３２】
Trimethyl[3-(trimethoxysilyl)propyl]ammonium Chloride  トリメチル[3-(トリメトキシシリル)プロピル]アンモニウムクロリド（ＴＭＡＰＳ）
【００３３】
【化５】
2013136555.tif 000006
【００３４】
Trimethyl[3-(triethoxysilyl)propyl]ammonium Chloride    トリメチル[3-(トリエトキシシリル)プロピル]アンモニウムクロリド
【００３５】
【化６】
2013136555.tif 000007
【００３６】
3-Aminopropyltriethoxysilane  3-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）
【００３７】
【化７】
2013136555.tif 000008
【００３８】
3-(2-Aminoethylamino)propyldimethoxymethylsilane  3-(2-アミノエチルアミノ)プロピルジメトキシメチルシラン
【００３９】
【化８】
2013136555.tif 000009
【００４０】
3-(2-Aminoethylamino)propyltriethoxysilane  3-(2-アミノエチルアミノ)プロピルトリエトキシシラン
【００４１】
【化９】
2013136555.tif 000010
【００４２】
3-(2-Aminoethylamino)propyltrimethoxysilane  3-(2-アミノエチルアミノ)プロピルトリメトキシシラン
【００４３】
【化１０】
2013136555.tif 000011
【００４４】
3-Aminopropyldiethoxymethylsilane  3-アミノプロピルジエトキシメチルシラン
【００４５】
【化１１】
2013136555.tif 000012
【００４６】
3-Aminopropyltrimethoxysilane  3-アミノプロピルトリメトキシシラン
【００４７】
【化１２】
2013136555.tif 000013
【００４８】
Trimethoxy[3-(phenylamino)propyl]silane  トリメトキシ[3-(フェニルアミノ)プロピル]シラン
【００４９】
【化１３】
2013136555.tif 000014
【００５０】
以上のような化合物が、式（Ｉ）で表される化合物として例示される。中でも、トリメチル[3-(トリメトキシシリル)プロピル]アンモニウムクロリド（ＴＭＡＰＳ）又は3-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）が好ましい。
【００５１】
本発明に用いるカチオン性オルガノアルコキシシランは、公知の化合物であるか、又は公知の方法により容易に製造できる。例えば、上記例示のカチオン性オルガノアルコキシシランは、全て市販されており、例えば東京化成工業株式会社等から購入できる。また、カチオン性オルガノアルコキシシランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 
【００５２】
（Ｂ）アニオン性ポルフィリンとしては、アニオン性を示すポルフィリンを用いることができる。なお、“ポルフィリン”は、4つのピロール環がα位置で4つのメチン基と交互に結合した環状化合物とその誘導体の総称の意味で用いている。
【００５３】
アニオン性ポルフィリンとしては、例えば、式（ＩＩ）：
【００５４】
【化１４】
2013136555.tif 000015
【００５５】
で表される化合物を用いることができる。式（ＩＩ）中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂは、同一又は異なって、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、スルホ基（ＳＯ３Ｈ）又は水素原子（Ｈ）を示す（ただし、全て水素原子である場合は除く）。好ましくは、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂの組み合わせは、全てカルボキシル基、全てスルホ基、Ｒ１ｂはカルボキシル基でＲ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂは水素原子、又はＲ１ｂはスルホ基でＲ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂは水素原子、であり、全てカルボキシル基であることが中でも好ましい。なお、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂが全てカルボキシル基である化合物は、Tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin（ＴＣＰＰ）と呼ばれる。
【００５６】
また、例えばビリルビン、ヘミン、プロトポルフィリン等も、アニオン性ポルフィリンとして用いることができる。なお、プロトポルフィリン含有複合体を製造する場合には、プロトポルフィリン二ナトリウムを用いるのが好適である。
【００５７】
本発明に用いるアニオン性ポルフィリンは、公知の化合物であるか、又は公知の方法により容易に製造できる。例えば東京化成工業株式会社等から購入することができる。なお、アニオン性ポルフィリンは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。 
【００５８】
（Ｃ）非カチオン性シランは、言い換えれば中性又はアニオン性シランであり、中性又はアニオン性を示すシランを用いることができる。例えば、シランカップリング剤として知られる中性又はアニオン性シランを用いることができる。具体的には、非カチオン性シランとしては、例えば式（ＩＩＩ）：
Ｙｐ−Ｓｉ（Ｒ２ｃ）ｑ（ＯＲ１ｃ）（４−ｐ―ｑ）      （ＩＩＩ）
で表される化合物を好適に用いることができる。
【００５９】
式（ＩＩＩ）において、ＹはＣＨ２＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−で示される基、ＯＣＮＣＨ２ＣＨ２−で示される基、ＣｌＣαＨ２α−で示される基、ＨＳＣβＨ２β−で示される基、ＣＦ３ＣγＦ２γ−ＣδＨ２δ−で示される基、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣεＨ２ε−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＯＯＣζＨ２ζ−で示される基、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ２η−で示される基、
下式：
【００６０】
【化１５】
2013136555.tif 000016
【００６１】
で示される基、
下式：
【００６２】
【化１６】
2013136555.tif 000017
【００６３】
で示される基、
炭素数１〜１８のアルキル基、又はフェニル基を示す。
ここで、α、β、δ、ε、ζ、η、θ及びιは、それぞれ独立して１〜６（好ましくは１、２、３又は４）の整数を示し、γは０〜８（好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７）の整数を示す。また、炭素数１〜１８のアルキル基は、炭素数１〜１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣαＨ２α−、ＨＳＣβＨ２β−、ＣＦ３ＣγＦ２γ−ＣδＨ２δ−、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣεＨ２ε−、ＣＨ２＝ＣＨＣＯＯＣζＨ２ζ−、ＨＮ−ＣＯＮＨ−ＣηＨ２η−は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ２）α−、ＨＳ（ＣＨ２）β−、ＣＦ３（ＣＦ２）γ−（ＣＨ２）δ−、ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２）ε−、ＣＨ２＝ＣＨＣＯＯ（ＣＨ２）ζ−、ＨＮ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）η−であることが好ましい。
【００６４】
また、Ｒ１ｃは、炭素数１〜６のアルキル基、又は−（ＣＨ２）τ−ＯＣＨ３を示し、Ｒ２ｃは、炭素数１〜６のアルキル基、又はフェニル基を示す。Ｒ１ｃ及びＲ２ｃは同一であっても異なってもよい。Ｒ１ｃ及びＲ２ｃのいずれにおいても、炭素数１〜６のアルキル基は、直鎖状又は分岐状であってよく、直鎖状が好ましい。また、炭素数１、２、３又は４のアルキル基が好ましい。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−エチルプロピル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、イソヘキシル、３−メチルペンチル基等が例示される。中でも、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチルが好ましい。また、τは１〜４の整数（好ましくは１、２又は３）を示す。
【００６５】
また、ｐは０、１又は２、ｑは０又は１、〔但し（４−ｐ−ｑ）≧２〕を示す。すなわち、（ｐ、ｑ）は（０、０）、（０、１）、（１、０）、（１、１）、又は（２、０）を示す。なお、ｐが０を示すとき、式（ＩＩＩ）は、Ｙが存在せず、Ｓｉ原子に結合するのがＲ２ｃ及びＯＲ１ｃ、又はＯＲ１ｃのみ、という化合物を示す。 
【００６６】
また、非カチオン性シランとしては、例えば式（ＩＶ）：
Ｚ−ＳｉＣｌ３    （ＩＶ）
で表される化合物も好適に用いることができる。
【００６７】
式（ＩＶ）において、ＺはＣＨ２＝ＣＨ−で示される基、ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−で示される基、ＣｌＣκＨ２κ−で示される基、ＣＦ３ＣλＦ２λ−ＣξＨ２ξ−で示される基、炭素数１〜１８のアルキル基、フェニル基、又はシクロヘキシル基を示す。κ及びξは、それぞれ独立して１〜６（好ましくは１、２、３又は４）の整数を示し、λは０〜８（好ましくは０、１、２、３、４、５、６又は７）の整数を示す。また、炭素数１〜１８のアルキル基は、炭素数１〜１２が好ましく、炭素数１、２、３、４、５、６、７又は８がより好ましい。また、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、直鎖状であることが好ましい。また、上記のＣｌＣκＨ２κ−、ＣＦ３ＣλＦ２λ−ＣξＨ２ξ−は、それぞれ、Ｃｌ（ＣＨ２）κ−、ＣＦ３（ＣＦ２）λ−（ＣＨ２）ξ−であることが好ましい。
【００６８】
また、非カチオン性シランとして、N-[2-(N-ビニルベンジルアミノ)エチル]-3-アミノプロピルトリメトキシシラン塩酸塩を用いてもよい。
【００６９】
式（ＩＩＩ）で表される化合物としては、具体的には例えば以下に記載する化合物が例示される。なお、以下の例示では、化合物の英語表記及び日本語表記を挙げ、さらに構造式を示す。
【００７０】
Tetramethoxysilane  テトラメトキシシラン
【００７１】
【化１７】
2013136555.tif 000018
【００７２】
Tetraethoxysilane  テトラエトキシシラン
【００７３】
【化１８】
2013136555.tif 000019
【００７４】
Tetrapropoxysilane  テトラプロポキシシラン
【００７５】
【化１９】
2013136555.tif 000020
【００７６】
Tetrabutoxysilane  テトラブトキシシラン
【００７７】
【化２０】
2013136555.tif 000021
【００７８】
Tetraisopropoxysilane  テトライソプロポキシシラン
【００７９】
【化２１】
2013136555.tif 000022
【００８０】
Allyltriethoxysilane  アリルトリエトキシシラン
【００８１】
【化２２】
2013136555.tif 000023
【００８２】
Allyltrimethoxysilane  アリルトリメトキシシラン
【００８３】
【化２３】
2013136555.tif 000024
【００８４】
Diethoxymethylvinylsilane  ジエトキシメチルビニルシラン
【００８５】
【化２４】
2013136555.tif 000025
【００８６】
Dimethoxymethylvinylsilane  ジメトキシメチルビニルシラン
【００８７】
【化２５】
2013136555.tif 000026
【００８８】
Triethoxyvinylsilane  トリエトキシビニルシラン
【００８９】
【化２６】
2013136555.tif 000027
【００９０】
Vinyltrimethoxysilane  ビニルトリメトキシシラン
【００９１】
【化２７】
2013136555.tif 000028
【００９２】
Vinyltris(2-methoxyethoxy)silane  ビニルトリス(2-メトキシエトキシ)シラン
【００９３】
【化２８】
2013136555.tif 000029
【００９４】
(Chloromethyl)triethoxysilane  (クロロメチル)トリエトキシシラン
【００９５】
【化２９】
2013136555.tif 000030
【００９６】
3-Chloropropyldimethoxymethylsilane  3-クロロプロピルジメトキシメチルシラン
【００９７】
【化３０】
2013136555.tif 000031
【００９８】
3-Chloropropyltriethoxysilane  3-クロロプロピルトリエトキシシラン
【００９９】
【化３１】
2013136555.tif 000032
【０１００】
2-(3,4-Epoxycyclohexyl)ethyltrimethoxysilane  2-(3,4-エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシラン
【０１０１】
【化３２】
2013136555.tif 000033
【０１０２】
3-Mercaptopropyl(dimethoxy)methylsilane  3-メルカプトプロピル(ジメトキシ)メチルシラン
【０１０３】
【化３３】
2013136555.tif 000034
【０１０４】
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane  (3-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン
【０１０５】
【化３４】
2013136555.tif 000035
【０１０６】
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane  (3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン
【０１０７】
【化３５】
2013136555.tif 000036
【０１０８】
3-(Triethoxysilyl)propyl Isocyanate  イソシアン酸3-(トリエトキシシリル)プロピル
【０１０９】
【化３６】
2013136555.tif 000037
【０１１０】
3-(Trimethoxysilyl)propyl Methacrylate  メタクリル酸3-(トリメトキシシリル)プロピル
【０１１１】
【化３７】
2013136555.tif 000038
【０１１２】
Triethoxy-1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octylsilane  トリエトキシ-1H,1H,2H,2H-トリデカフルオロ-n-オクチルシラン
【０１１３】
【化３８】
2013136555.tif 000039
【０１１４】
3-(Trimethoxysilyl)propyl Acrylate  アクリル酸3-(トリメトキシシリル)プロピル
【０１１５】
【化３９】
2013136555.tif 000040
【０１１６】
3-Trimethoxysilylpropyl Chloride  3-トリメトキシシリルプロピルクロリド
【０１１７】
【化４０】
2013136555.tif 000041
【０１１８】
1-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]urea  1-[3-(トリメトキシシリル)プロピル]尿素
【０１１９】
【化４１】
2013136555.tif 000042
【０１２０】
Trimethoxy(3,3,3-trifluoropropyl)silane  トリメトキシ(3,3,3-トリフルオロプロピル)シラン
【０１２１】
【化４２】
2013136555.tif 000043
【０１２２】
3-Ureidopropyltriethoxysilane 3-ウレイドプロピルトリエトキシシラン
【０１２３】
【化４３】
2013136555.tif 000044
【０１２４】
Diethoxy(3-glycidyloxypropyl)methylsilane  ジエトキシ(3-グリシジルオキシプロピル)メチルシラン
【０１２５】
【化４４】
2013136555.tif 000045
【０１２６】
3-Glycidyloxypropyl(dimethoxy)methylsilane  3-グリシジルオキシプロピル(ジメトキシ)メチルシラン
【０１２７】
【化４５】
2013136555.tif 000046
【０１２８】
3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane  3-グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン
【０１２９】
【化４６】
2013136555.tif 000047
【０１３０】
2-Cyanoethyltriethoxysilane  2-シアノエチルトリエトキシシラン
【０１３１】
【化４７】
2013136555.tif 000048
【０１３２】
Diacetoxydimethylsilane  ジアセトキシジメチルシラン
【０１３３】
【化４８】
2013136555.tif 000049
【０１３４】
Diethoxydimethylsilane  ジエトキシジメチルシラン
【０１３５】
【化４９】
2013136555.tif 000050
【０１３６】
Dimethoxydimethylsilane  ジメトキシジメチルシラン
【０１３７】
【化５０】
2013136555.tif 000051
【０１３８】
Dimethoxydiphenylsilane  ジメトキシジフェニルシラン
【０１３９】
【化５１】
2013136555.tif 000052
【０１４０】
Dimethoxymethylphenylsilane  ジメトキシメチルフェニルシラン
【０１４１】
【化５２】
2013136555.tif 000053
【０１４２】
Dodecyltriethoxysilane  ドデシルトリエトキシシラン
【０１４３】
【化５３】
2013136555.tif 000054
【０１４４】
Hexyltrimethoxysilane  ヘキシルトリメトキシシラン
【０１４５】
【化５４】
2013136555.tif 000055
【０１４６】
Octadecyltriethoxysilane  オクタデシルトリエトキシシラン
【０１４７】
【化５５】
2013136555.tif 000056
【０１４８】
Octadecyltrimethoxysilane  オクタデシルトリメトキシシラン
【０１４９】
【化５６】
2013136555.tif 000057
【０１５０】
n-Octyltriethoxysilane   n-オクチルトリエトキシシラン
【０１５１】
【化５７】
2013136555.tif 000058
【０１５２】
Pentyltriethoxysilane  ペンチルトリエトキシシラン
【０１５３】
【化５８】
2013136555.tif 000059
【０１５４】
Triacetoxymethylsilane  トリアセトキシメチルシラン
【０１５５】
【化５９】
2013136555.tif 000060
【０１５６】
Triethoxyethylsilane  トリエトキシエチルシラン
【０１５７】
【化６０】
2013136555.tif 000061
【０１５８】
【化６１】
2013136555.tif 000062
【０１５９】
Trimethoxy(methyl)silane  トリメトキシ(メチル)シラン
【０１６０】
【化６２】
2013136555.tif 000063
【０１６１】
Trimethoxyphenylsilane  トリメトキシフェニルシラン
【０１６２】
【化６３】
2013136555.tif 000064
【０１６３】
Trimethoxy(propyl)silane  トリメトキシ(プロピル)シラン
【０１６４】
【化６４】
2013136555.tif 000065
【０１６５】
以上のような化合物が、式（ＩＩＩ）で表される化合物として例示される。中でも、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトライソプロポキシシランが好ましい。
【０１６６】
また、式（ＩＶ）で表される化合物としては、具体的には例えば以下に記載する化合物が例示される。なお、以下の例示でも、化合物の英語表記及び日本語表記を挙げ、さらに構造式を示す。 
Allyltrichlorosilane  アリルトリクロロシラン
【０１６７】
【化６５】
2013136555.tif 000066
【０１６８】
Trichlorovinylsilane  トリクロロビニルシラン
【０１６９】
【化６６】
2013136555.tif 000067
【０１７０】
3-Chloropropyltrichlorosilane  3-クロロプロピルトリクロロシラン
【０１７１】
【化６７】
2013136555.tif 000068
【０１７２】
Trichloro(1H,1H,2H,2H-heptadecafluorodecyl)silane  トリクロロ(1H,1H,2H,2H-ヘプタデカフルオロデシル)シラン
【０１７３】
【化６８】
2013136555.tif 000069
【０１７４】
Trichloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octyl)silane  トリクロロ(1H,1H,2H,2H-トリデカフルオロ-n-オクチル)シラン
【０１７５】
【化６９】
2013136555.tif 000070
【０１７６】
Butyltrichlorosilane  ブチルトリクロロシラン
【０１７７】
【化７０】
2013136555.tif 000071
【０１７８】
Cyclohexyltrichlorosilane  シクロヘキシルトリクロロシラン
【０１７９】
【化７１】
2013136555.tif 000072
【０１８０】
Decyltrichlorosilane  デシルトリクロロシラン
【０１８１】
【化７２】
2013136555.tif 000073
【０１８２】
Dodecyltrichlorosilane  ドデシルトリクロロシラン
【０１８３】
【化７３】
2013136555.tif 000074
【０１８４】
Ethyltrichlorosilane  エチルトリクロロシラン
【０１８５】
【化７４】
2013136555.tif 000075
【０１８６】
n-Octyltrichlorosilane   n-オクチルトリクロロシラン
【０１８７】
【化７５】
2013136555.tif 000076
【０１８８】
Phenyltrichlorosilane  フェニルトリクロロシラン
【０１８９】
【化７６】
2013136555.tif 000077
【０１９０】
Trichloro-2-cyanoethylsilane  トリクロロ-2-シアノエチルシラン
【０１９１】
【化７７】
2013136555.tif 000078
【０１９２】
Trichlorohexylsilane  トリクロロヘキシルシラン
【０１９３】
【化７８】
2013136555.tif 000079
【０１９４】
Trichloro(methyl)silane  トリクロロ(メチル)シラン
【０１９５】
【化７９】
2013136555.tif 000080
【０１９６】
Trichlorooctadecylsilane  トリクロロオクタデシルシラン
【０１９７】
【化８０】
2013136555.tif 000081
【０１９８】
Trichloro(propyl)silane  トリクロロ(プロピル)シラン
【０１９９】
【化８１】
2013136555.tif 000082
【０２００】
Trichlorotetradecylsilane  トリクロロテトラデシルシラン
【０２０１】
【化８２】
2013136555.tif 000083
【０２０２】
以上のような化合物が、式（ＩＶ）で表される化合物として例示される。
【０２０３】
本発明に用いる非カチオン性シランは、公知の化合物であるか、又は公知の方法により容易に製造できる。例えば東京化成工業株式会社等から購入することができる。なお、非カチオン性シランは１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０２０４】
本発明のポルフィリン含有複合体（特に、（Ａ）〜（Ｃ）成分が共有結合してなるポルフィリン含有複合体）は、（Ａ）成分として、特に、上記式（Ｉ）において、ＸがＨ２ＮＣｍＨ２ｍ−、又はＨ２ＮＣｎＨ２ｎ−ＨＮＣｍＨ２ｍ−で示される基を示すものが好ましく、また、ｊが０であるものが好ましく、当該Ｘ及びｊの条件をともに満たすものがさらに好ましい。また、（Ａ）〜（Ｃ）成分が共有結合してなるポルフィリン含有複合体においては、（Ｂ）成分として、特に、上記式（ＩＩ）において、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂ、及びＲ４ｂの少なくとも１つがカルボキシル基であるものが好ましく、少なくとも２つがカルボキシル基であるものがより好ましく、少なくとも３つがカルボキシル基であるものがさらに好ましく、全てがカルボキシル基であるものが最も好ましい。また、（Ａ）〜（Ｃ）成分が共有結合してなるポルフィリン含有複合体においては、（Ｃ）成分として、特に、上記式（ＩＩＩ）において、ｐが０のものが好ましく、ｐ及びｑがともに０のものがより好ましい。
【０２０５】
本発明の複合体は、その形状がリング状であることが好ましい。リングが細長い形状を有するとチューブ状ということもできる。よって本明細書ではリング状はチューブ状を包含する概念として用いる。リング（チューブ）の直径や長さは特に限定はされないが、例えば、リング（チューブ）の直径５０〜２００ｎｍ程度、長さ４００〜６００ｎｍ程度が例示される。
【０２０６】
本発明のポルフィリン含有複合体は、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が結合してなり、当該複合体の蛍光波長が、当該複合体化前のアニオン性ポルフィリンの蛍光波長より長波長であるものであれば、その製造方法は特に制限されない。以下に好ましい製造方法を例示する。
【０２０７】
本発明のポルフィリン含有複合体の製造方法例１として、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分を０℃〜６０℃で反応させて製造する方法が挙げられる。よって、本発明は、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分を０℃〜６０℃で反応させて得られる複合体を包含する。また、本発明は、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分を０℃〜６０℃にて反応させる工程を含む、（Ａ）〜（Ｃ）が結合してなるポルフィリン含有複合体（好ましくはリング状ポルフィリン含有複合体）の製造方法も包含する。反応温度は、好ましくは４℃〜５０℃であり、より好ましくは５℃〜４０℃であり、さらに好ましくは１０℃〜３５℃である。特に、反応温度が高すぎると（特に８０℃以上である場合は）、蛍光プローブとして有用な特性を備えた複合体は得られないおそれがある。（本発明の複合体は、蛍光ピーク波長が長波長へシフトするという有利な性質を示すが、反応温度が高すぎると、このような性質を有する複合体が得られないおそれがある。）
より具体的には、例えば、これら（Ａ）〜（Ｃ）の各成分を溶媒に溶解させ、同一容器内に入れ、０℃〜６０℃にて撹拌することで、これらの成分を反応させ、本発明の複合体を生成させることができる。撹拌時間（反応時間）は、例えば１〜４８時間程度、好ましくは２〜３６時間程度である。また、溶媒としては、アルコール（例えばエタノール）又は含水エタノールが例示される。
【０２０８】
好ましくは、まず溶媒に（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を溶解させ、さらにアルカリ溶液（例えば水酸化ナトリウム水溶液）を加え、室温にて１時間程度撹拌した後、さらに（Ｃ）成分を加えて１〜４８時間（好ましくは２〜３６時間）程度撹拌することが好ましい。
【０２０９】
反応後、遠心分離（例えば15000 rpm）により生成物を回収することにより、複合体を得ることができる。
【０２１０】
当該製造方法例１に用いる（Ａ）成分、（Ｂ）成分、及び（Ｃ）成分の量比は、上記（Ａ）〜（Ｃ）合計量を１００重量部としたときの好ましい（Ｂ）の重量部を満たすことが好ましい他、特に限定はされないが、例えば、モル比で、（Ａ）／（Ｂ）は１／３〜７０／１が好ましく、１／１〜１０／１がより好ましく、１／１〜５／１がさらに好ましく、２／１が最も好ましい。また、モル比で、（Ｂ）／（Ｃ）は１／１４０〜３／４が好ましく、１／１００〜１／２がより好ましく、１／５０〜１／５がさらに好ましく、３／４０が最も好ましい。また、モル比で、（Ａ）／（Ｃ）は１／４３〜５／１が好ましく、１／３０〜１／１がより好ましく、１／２０〜１／２がさらに好ましく、３／２０が最も好ましい。
【０２１１】
本発明のポルフィリン含有複合体の製造方法例２として、まず（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン及び（Ｂ）アニオン性ポルフィリンを共有結合させて（Ａ）−（Ｂ）結合体を製造し、当該（Ａ）−（Ｂ）結合体、（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、及び（Ｃ）非カチオン性シランを加水分解及び縮合させて、（Ａ）〜（Ｃ）が共有結合したポルフィリン含有複合体を製造する方法が挙げられる。よって、本発明は、（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン及び（Ｂ）アニオン性ポルフィリンが共有結合した（Ａ）−（Ｂ）結合体、（Ａ）カチオン性オルガノアルコキシシラン、及び（Ｃ）非カチオン性シランを加水分解及び縮合する工程を含む、（Ａ）〜（Ｃ）が結合してなるポルフィリン含有複合体の製造方法を包含する。また、本発明は、当該製造方法で得られる複合体も包含する。
【０２１２】
より具体的には、例えば、（i）（Ａ）成分のアミノ基と（Ｂ）成分のカルボキシル基を縮合させ、アミド結合を形成させて（Ａ）−（Ｂ）結合体を調製し、（ii）さらに当該（Ａ）−（Ｂ）結合体、（Ａ）成分、及び（C）成分を加水分解及び縮合させて、ポルフィリン含有複合体を調製する方法が例示できる。なお、当該（ii）において用いる（Ａ）成分は、（Ａ）−（Ｂ）結合体調製に用いた（Ａ）成分と同じであっても異なってもよく、同じであることがより好ましい。
【０２１３】
本発明の複合体は、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）成分が「結合して」なるため、これらの成分が個々に含まれる組成物（換言すれば、これらの成分が寄せ集められただけの組成物）とは全く異なる物性を有している。この点から、本発明の複合体は、（Ａ）〜（Ｃ）成分がハイブリッド化された新素材ということができる。
【０２１４】
当該製造方法例１において、例えば、（Ｂ）成分としてＴＣＰＰを用いた場合は、当該ＴＣＰＰは複合体中でアニオンとして存在することが好ましい。また、当該製造方法例２において、例えば、（Ｂ）成分としてＴＣＰＰを用いた場合は、ＴＣＰＰのカルボキシル基はアミド結合を形成するなどして存在することが好ましい。このような複合体中の状態は、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）により確認できる。すなわち、ＴＣＰＰが複合体中でアニオンとして存在する場合、ＴＣＰＰそのもののＦＴＩＲスペクトルでは1710 cm-1あたりにカルボン酸（COOH）由来の吸収が見られるが、複合体のＦＴＩＲスペクトルではカルボン酸ではなくカルボン酸アニオン（COO-）による吸収として現れる(1600 cm-1あたり、及び1390 cm-1あたり）。また、ＴＣＰＰが複合体中でアミド結合形成している場合、ＴＣＰＰそのもののＦＴＩＲスペクトルでは1710 cm-1あたりにカルボン酸（COOH）由来の吸収が見られるが、複合体のＦＴＩＲスペクトルではカルボン酸ではなくアミド結合（CONH）による吸収として現れる(1650 cm-1あたり）。
【０２１５】
本発明の複合体の中には、細胞毒性は低い一方で、光照射（好ましくは波長635〜675nm程度の光照射）により、活性酸素（１Ｏ２）を発生するものがある。従って、このような本発明の複合体は、光線力学療法用光増感剤として好ましく利用できる。また、本発明の複合体は、特に癌組織のイメージングや光線力学療法用光増感剤として好ましく利用することができる。
【０２１６】
さらに、本発明の複合体には、ＤＤＳ（Drug Delivery System）に用いられる公知の各種化学修飾を施してもよい。例えば、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコール修飾）、デキストリン修飾、キトサン修飾、等が挙げられる。特に、ＰＥＧ化は、被ＰＥＧ化物の血中滞留時間を大きく延長できることが知られており、有利である。よって、本発明は化学修飾された（好ましくはＰＥＧ化）上記ポルフィリン含有複合体も包含する。ポルフィリン含有複合体のＰＥＧ化は、複合体中に残存する官能基を適宜選択して利用することで行うことができる。各種官能基に対してＰＥＧを結合させる試薬は公知のものを利用できる。例えば、複合体中にアミノ基が残存している場合、当該アミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ（構造は図２７を参照）とを反応させて、ＰＥＧ化を行うことができる。
【０２１７】
また、上述のように、本発明のポルフィリン含有複合体は、リング状（チューブ状）であることが好ましい。リング状であれば、その内部に物質を内包し得る。従って、本発明のポルフィリン含有複合体は、有用成分を内包させた上で生体に適用するという用い方もできる。例えば、ポルフィリン含有複合体で薬物を内包した薬物内包ポルフィリン含有複合体は、ＤＤＳとして用いることができる。特に薬物として造影剤（例えばＸ線造影剤やＭＲＩ造影剤）を用いた場合、生体に投与した際に蛍光だけでは得ることのできない生体内の情報を得ることができるので有利である。つまり、造影剤内包ポルフィリン含有複合体は、デュアルモーダルイメージング用造影剤として用いることができる。造影剤としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限されず、公知の造影剤を用いることができる。なかでもＸ線造影剤を用いることが好ましく、Ｘ線造影剤の中でも金粒子を用いることがより好ましい。
【０２１８】
薬物を内包させる方法としては、例えば複合体製造時に原料と緒に薬物も混ぜておく方法が挙げられる。特に、上記製造方法例２の製造方法を用いる場合は、（Ａ）−（Ｂ）結合体、（Ａ）成分、及び（C）成分を加水分解及び縮合させる際に、一緒に薬物（例えばＸ線造影剤である金粒子）を混ぜておくことで、複合体に薬物を内包させ得る。
【実施例】
【０２１９】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
＜複合体の調製＞
実施例１
カチオン性オルガノアルコキシシランとして、trimethyl[3-(trimethoxysilyl)-propyl]ammonium chloride（ＴＭＡＰＳ）を、アニオン性ポルフィリンとして、tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin（ＴＣＰＰ）を用いた。また、非カチオン性シランとして、tetraethyl orthosilicate（ＴＥＯＳ）を用いた。また、ＴＭＡＰＳ、ＴＣＰＰ、及びＴＥＯＳはいずれも東京化成工業株式会社から購入して用いた。以下に、ＴＭＡＰＳ、ＴＣＰＰ、及びＴＥＯＳの構造式を示す。
【０２２０】
【化８３】
2013136555.tif 000084
【０２２１】
【化８４】
2013136555.tif 000085
【０２２２】
【化８５】
2013136555.tif 000086
【０２２３】
ＴＭＡＰＳ １８ｍｇ及びＴＣＰＰ ２３．７ｍｇを、エタノール／水（２９／１）混合溶媒２７ｍＬに溶解させ、これにさらに水酸化ナトリウム水溶液０．３７５ｍＬを加えた。１時間２２℃で攪拌した後、ＴＥＯＳを８９μＬ加えて、２４時間室温で攪拌した。なお、このとき、ＴＭＡＰＳ：ＴＣＰＰ：ＴＥＯＳ（モル比）は、約２：１：１３である。生成物は遠心分離（15000 rpm）により、回収した。また、生成物はエタノールおよび水への再分散、遠心分離を繰り返すことで、洗浄した。さらに、１００℃で１２時間乾燥させて、粉末状の生成物を得た。
【０２２４】
得られた生成物（すなわち、ＴＭＡＰＳ、ＴＣＰＰ及びＴＥＯＳの複合体）を、走査型電子顕微鏡(SEM)(JEOL, JSM-6700F)及び透過型電子顕微鏡(TEM)(H-7650, Hitachi, Tokyo, Japan)により観察した。結果を図１ａ）〜ｃ）に示す。図１ａ）はSEM観察画像を示し、図１ｂ）及びｃ）はTEM観察画像を示す。これらの観察画像から、得られた複合体はチューブ状の形状を有することがわかった。図１中のスケールバーからわかるように、当該チューブ状の複合体は、チューブ長さ約２５０〜６５０ｎｍ、チューブ直径約１００ｎｍ、チューブ膜厚約１０ｎｍ程度であった。
【０２２５】
比較例１
反応温度を室温ではなく８０℃とした以外は、実施例１と同様に操作して、生成物を得、当該生成物をＴＥＭにより観察した。結果（観察画像）を図１ｄ）に示す。図１ｄ）右上に、観察された粒子１粒の拡大画像を示す。スケールバーは、２μｍ（右上拡大画像のスケールバーは１００ｎｍ）を示す。当該観察画像から、得られた複合体は粒状（球状）の形状を有することがわかった。なお、当該粒状の複合体の直径は約２００〜３００ｎｍであった。
【０２２６】
実施例２
カチオン性オルガノアルコキシシランとして３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いた以外は、実施例１と同様に操作して（カチオン性オルガノアルコキシシラン使用量は、実施例１のモル比と同様になるようにした）、生成物を得、当該生成物をＴＥＭにより観察したところ、チューブ状複合体が得られていることが確認できた（図２ａ）。なお、図２ａ右上にチューブ状複合体１個の拡大画像を示す。
【０２２７】
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の構造式を以下に示す。
【０２２８】
【化８６】
2013136555.tif 000087
【０２２９】
比較例２
反応温度を室温ではなく８０℃とした以外は、実施例２と同様に操作して、生成物を得、当該生成物をＴＥＭにより観察した。結果（観察画像）を図２ｂ）に示す。当該観察画像から、得られた複合体は粒状（球状）の形状を有することがわかった。
【０２３０】
比較例３
ＴＥＯＳを加えない以外は実施例１と同様に操作したところ、生成物は得られなかった。すなわち、複合体は形性されなかった
【０２３１】
次に、得られたチューブ状複合体の性質の検討を行った。なお、以下の検討において用いたチューブ状複合体は、特に断らない限り、全て、実施例１で得たチューブ状複合体である。
＜複合体の蛍光プローブとしての応用可能性の検討＞
ＤＬＳ（動的光散乱法）による検討
実施例１で得たチューブ状複合体をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解させ、動的光散乱測定装置（NICOMP 380 ZLS, Showa Denko, Tokyo, Japan）により測定を行った。結果を図３に示す。図３ａ）に当該複合体を溶解したＰＢＳを示す。チューブ状複合体は凝集無く溶解しており、高い溶解性を示すことがわかった。図３ｂ）にＤＬＳ測定結果を示す。図３ｂ）に示される２つピークは、左側のピークが当該チューブ状複合体の直径を表し（約１００ｎｍ）、右側のピークが当該チューブ状複合体の長さを表す（約４００弱〜６００強ｎｍ）と考えられた。これらのＤＬＳ測定から得られた数値は、上記ＴＥＭ観察結果から求められた直径及び長さとよく合致していた。
【０２３２】
なお、当該溶液のゼータ電位は-3.1mVであった。
【０２３３】
ＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）による検討
実施例１で得たチューブ状複合体（粉末状）をフーリエ変換赤外分光光度計（FTIR-6200, JASCO, Tokyo, Japan）により測定した。また、ＴＥＯＳ、ＴＭＡＰＳ、及びＴＣＰＰも同様に測定を行った。結果を図４に示す。図４のａ）がＴＥＯＳ、ｂ）がＴＭＡＰＳ、ｃ）がＴＣＰＰ、ｄ）が当該チューブ状複合体のスペクトルを示す。
【０２３４】
当該チューブ状複合体が示すスペクトルでは、シロキサン骨格(Si-O-Si)（1070cm-1）、ポルフィリン環（1550〜1490cm-1及び970cm-1）による吸収が観察された。
【０２３５】
また、ＴＣＰＰのスペクトルには1710 cm-1にカルボン酸（COOH）由来の吸収が見られたが、チューブ状複合体のスペクトルではカルボン酸ではなくカルボン酸アニオン（COO-）による吸収として現れていた(1600 cm-1及び1390 cm-1)。この結果は、チューブ状複合体中では、ＴＣＰＰがアニオンとして存在していることを示している。
【０２３６】
また、ＴＭＡＰＳの４級アンモニウム塩によるＣ−Ｎ結合（1170cm-1）とＴＣＰＰのポルフィリン環（1185cm-1）が重なり、チューブ状複合体のスペクトルにはブロードな吸収（1250cm-1〜1120cm-1）が観察された。
【０２３７】
以上の結果は、実施例１において、ポルフィリンとシリカが個々に含まれる組成物を得たのではなく、ポルフィリンとシリカから新素材を製造することに成功したことを示している。すなわち、当該チューブ状複合体は、ポルフィリンとシリカを含んでなる新素材ということができる。ポルフィリンとシリカのハイブリッド化に成功したとも換言できる。
【０２３８】
当該ハイブリッド化は、カルボン酸アニオン及びアンモニウム塩の静電的相互作用、並びにポルフィリン環のπ−πスタッキング、の寄与により、成されたものと推定される。当該推定の概念図を図５に示す。図５ａは、ポルフィリン（ＴＣＰＰ）を４頂点部分にそれぞれカルボン酸由来負電荷を有する正方形平板にたとえた図であり、図５ｂは、当該正方形平板（ＴＰＣＣ）がπ−πスタッキングにより重複したもの（Ｊ会合体）が、さらに負電荷によりカチオン性オルガノアルコキシシランの正電荷と相互作用しており、これらがチューブの側面を構成しているであろうことを表した推定図である。
【０２３９】
なお、上記比較例１において、生成物がチューブ状ではなく球状になったのは、80℃で加熱したために、静電相互作用およびπ-πスタッキングが弱くなったことが原因であると考えられる。
【０２４０】
吸収波長の検討
実施例１で得たチューブ状複合体をＰＢＳに溶解させて得た溶液（以下、チューブ状複合体ＰＢＳ溶液ともいう）について、紫外可視吸収スペクトルを測定した。また、比較例２で得た生成物（球状粒子）、及びTCPPについても同様に測定を行った。結果を図６に示す。チューブ状複合体のピークはＴＣＰＰに比べて約35 nm長波長側にシフト（レッドシフト）していることが分かる（約635nm→約670nm）。このレッドシフトはＴＣＰＰのＪ会合体が形成されていることを証明している。つまり、（i）π-πスタッキング及び（ii）静電相互作用を利用したシリカとのハイブリッド化により、ＴＣＰＰはJ会合体状態を保ちながらシリカマトリックス中に存在することを示している。さらに、非カチオン性シラン（シリカマトリックス）により、生理活性条件化でもTCPPの会合状態を維持するよう保護されるものと考えられた。一方、80℃で加熱して合成したTCPP含有球状粒子（比較例２）において、吸収スペクトルのシフトは確認されなかった。これは、加熱により、π-πスタッキングと静電相互作用が弱くなり、TCPPのJ会合体状態が維持されなかったことを示していると考えられ、TEMによる観察結果とも一致していると考えられる。
【０２４１】
蛍光波長の検討
チューブ状複合体ＰＢＳ溶液について、蛍光スペクトル（励起波長670 nm）を測定した。また、比較例２で得た生成物（球状粒子）、及びTCPPについても同様に測定を行った。結果を図７に示す。チューブ状複合体は、PBS中で、670 nmの光励起により、近赤外領域全般にわたって蛍光を発することが分かった。蛍光ピーク波長は730 nmであり、これはTCPPや比較例２で得た球状粒子に比べてかなり長い波長である。このため、当該チューブ状複合体を生体イメージング用蛍光プローブとして用いれば、従来の生体イメージング用蛍光プローブに比べて、細胞の自家蛍光の影響を弱め、SN比を向上させ得ることがわかった。また、図８にチューブ状複合体ＰＢＳ溶液について波長660〜690nmの光励起時の蛍光像を示す。図８の各画像（Ｉ〜Ｖ）において、エミッション（λem）は、Ｉが710〜730nm、ＩＩが730〜750 nm、ＩＩＩが750〜770 nm、ＩＶが770〜790 nm、Ｖが790〜810 nmである。チューブ状複合体は、710〜810nmという幅広い波長領域の蛍光を発することがわかった。
【０２４２】
＜複合体の光線力学療法用光増感剤としての応用可能性の検討＞
光線力学療法とは、細胞毒性を持たないが光照射下では毒性を示す光感受性化合物を利用して癌などの患部を選択的に治療する方法である。ポルフィリンは光が照射されると１Ｏ２を発生させる特性を有しており、１Ｏ２は腫瘍細胞を死滅させ得る。このため、ポルフィリンは光線力学療法用光増感剤として用いられている。
【０２４３】
実施例１で得られたチューブ状複合体はポルフィリンを含むことから、光線力学療法用光増感剤としての応用可能性が考えられたため、その可能性を検討した。
【０２４４】
光照射による１Ｏ２発生の検討
当該チューブ状複合体に光を照射した時に発生する活性酸素（１Ｏ２）量を測定した。当該測定においては、1,3-diphenylisobenzofuran（ＤＰＩＢＦ）を１Ｏ２補足剤として用いた。ＤＰＩＢＦは、１Ｏ２により分解される性質を有する。分解したＤＰＩＢＦの量を吸光度計により測定することで、発生した１Ｏ２量を見積もることができる。具体的には、ＤＰＩＢＦと当該チューブ状複合体を含む溶液（溶媒；ＰＢＳ）に、波長635〜675nm（光源；水銀ランプ）の光を照射した際の、ＤＰＩＢＦの吸収スペクトルの変化を測定した。結果を図９に示す。図９ａ）は、チューブ状複合体の濃度を変えて（０、１０又は１００μｇ／ｍＬ）、６０分間光を照射したときの、ＤＰＩＢＦの吸収スペクトルの変化を示す。図９ｂ）は、光照射時間経過につれ、ＤＰＩＢＦ分解がどの程度起こるかを示す（吸光波長４１５ｎｍでの測定結果）。これらの結果から、チューブ状複合体の濃度が高いほど、また光照射時間が長いほど、ＤＰＩＢＦの分解が進行することがわかった。
【０２４５】
以上のことから、チューブ状複合体は、光照射により１Ｏ２を発生することが確認できた。
【０２４６】
細胞毒性検討１（光照射無し）
マウス（C57BL/6 Alb Hr）の腹腔からマクロファージを取り出し、10%ウシ胎仔血清含有RPMI培地中で5% CO2, 37℃で培養した。1ウェルあたり2×105個のマクロファージを96ウェルプレートに播き、チューブ状複合体ＰＢＳ溶液（0〜0.5 mg/mL）を加え、24時間培養した。そして、細胞生存率をWST-1アッセイにより調べた。結果を図１０に示す。チューブ状複合体濃度が0.5 mg/mLまでは、細胞死は確認されなかった。通常、医療用途では、0.1 mg/mL以下の濃度で使用するが、チューブ状複合体は0.5 mg/mLという高濃度まで毒性を示さないため、医療・バイオ用途に応用可能（特に光線力学療法用光増感剤として応用可能）であると考えられた。
【０２４７】
なお、WST-1アッセイは周知の細胞毒性検討アッセイであり、次のような原理に基づく。WST-1（4-[3-（4-ヨードフェニル）-2-（4-ニトロフェニル）-2H-5-テトラゾリオ]-1,3-ベンゼン、ジスルフォネート）は安定なテトラゾリウム塩であり、ミトコンドリア内脱水素酵素によりイエローオレンジの水溶性フォルマザンへ分解するという特徴を有しているので、細胞培養液中にWST-1を添加し、吸光度を測定してフォルマザンの生成量を測定することにより、細胞の生存率を求めることができる。
【０２４８】
細胞毒性検討２（光照射有り）
細胞培養時に波長635〜675nm（光源；水銀ランプ）の光を照射した点、及びチューブ状複合体ＰＢＳ溶液の濃度を０、１０又は１００μｇ／ｍＬとした点、以外は、上記「細胞毒性検討１」と同様にして、光照射により細胞生存率が変化するかを検討した。結果を図１１に示す。チューブ状複合体の濃度が高いほど、また光照射時間が長いほど、細胞生存率が低下することがわかった。この結果は、上記「光照射による１Ｏ２発生の検討」において確認された１Ｏ２発生量の結果と合致する。
【０２４９】
以上のことから、チューブ状複合体は、それ単独では細胞毒性が低く、かつ光照射時には１Ｏ２を発生して細胞を死滅させることができることがわかった。従って、当該チューブ複合体は、光線力学療法用光増感剤として好ましく利用できると考えられた。
【０２５０】
＜複合体の蛍光プローブとしての応用＞
細胞のラベリング
マウス腹部を消毒後、皮膚を切開して腹膜を露出させ、下腹部からＰＢＳを５〜１０ｍＬ注射筒で勢いよく注入し、腹部を指で揉み、注入に用いた注射筒でＰＢＳを回収することで、マウスのマクロファージを採取した。
【０２５１】
マクロファージ（5×105 cells）をディッシュに播き、このディッシュに0.1 mg/mLのチューブ状複合体ＰＢＳ溶液を加え、1時間培養した。1時間後、細胞外のチューブ状複合体をＰＢＳで洗浄し、除去した。チューブ状複合体の細胞内への取り込みは蛍光顕微鏡で確認した。マクロファージの核は紫外励起で青色蛍光を発する4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI)で染色した。チューブ状複合体由来の蛍光は635-675 nm励起、696-736 nm蛍光フィルターを用いて観察した。なお、観察には蛍光顕微鏡（TE2000 fluorescent microscope Nikon, Kanagawa, Japan）を用いた。
【０２５２】
結果を図１２に示す。図１２ａ）〜ｄ）は、無処理のマクロファージの明視野像（ａ）および蛍光像（ｂ〜ｄ）であり、ｅ）〜ｈ）はチューブ状複合体でラベリングしたマクロファージの明視野像（ｅ）および蛍光像（ｆ〜ｈ）である。明視野像において、無処理のマクロファージは透明であるが（ａ）、チューブ状複合体でラベリングされたマクロファージは色づいていた（ｅ）。（ｂ）及び（ｆ）は紫外励起の蛍光像であり、これらの像から、DAPI染色により、マクロファージの核が青色蛍光を発していることがわかった。（ｃ）及び（ｇ）は、635-675 nm励起、696-736 nm蛍光フィルターを用いて観察した像であり、チューブ状複合体で処理したマクロファージから赤色蛍光が発せられることが確認できた。（ｄ）及び（ｈ）は、紫外励起の蛍光像と635-675 nm励起の蛍光像を重ね合わせた（マージ(merge)させた）像である。（ｈ）において、赤色蛍光の位置と核による青色蛍光の位置が一致していることから、チューブ状複合体はマクロファージ内に取り込まれており、マクロファージのラベリングに成功したことが確認できた。
【０２５３】
生体イメージング用蛍光プローブとしての使用
〔自家蛍光の影響の検討〕
発光・蛍光 in vivo イメージングシステムIVIS Spectrum (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)を用いて、何ら蛍光プローブ処理を行っていないマウスを観察し、自家蛍光の影響を検討した。結果を図１３（ａ〜ｈ）に示す。なお、観察対象マウスは、自家蛍光を弱めるために、観察前の２週間はアルファルファフリーの飼料を用いて飼育した。
【０２５４】
腹側（Ventral side）、背側（Dorsal side）ともに、蛍光波長660〜690 nmでは強い自家蛍光が検出されたが（ａ、ｃ）、蛍光波長730〜750 nmでは自家蛍光の影響をほとんど無視できることが分かった（ｂ、ｄ）。なお、腹側、背側の最小radiant efficiency (RE)値はそれぞれ5.0×107 (p/sec/cm2/sr)/(iＷ/cm2)、4.0×107(p/sec/cm2/sr)/(μＷ/cm2)に設定している。また、ｇ及びｈは、ａ〜ｄの青色で囲んだ領域の、波長と自家蛍光の強度（REの合計値と平均値）の関係を示している。
【０２５５】
蛍光波長660〜690 nmにおいて自家蛍光の悪影響を打ち消すためには、最小RE値を1.0×108 (p/sec/cm2/sr)/(μＷ/cm2)程度にする必要があるため（ｅ、ｆ）、蛍光プローブからの微弱な蛍光は検出することができず、高感度検出は困難であった。また、波長が長くなるにつれて、合計RE値、平均RE値ともに劇的に減少することが分かる（ｇ、ｈ）。つまり、波長が長いほど、自家蛍光が弱くなり、蛍光プローブからの蛍光をより明瞭に検出できることがわかった。
【０２５６】
〔複合体の生体イメージング用蛍光プローブとしての性能検討〕
〈検討１〉
チューブ状複合体で標識したマクロファージを、細胞剥離溶液（Sigma-Aldrich）を用いてディッシュから剥がし、遠心分離で回収した。この回収したマクロファージをＰＢＳで希釈し、2×105個, 2×104個, 2×103個, 2×102個の細胞を含む懸濁液をそれぞれ調製した。これらの懸濁液をマウスの皮下に投与し、IVIS Spectrumにより、細胞を検出した(励起波長660-690 nm、蛍光波長730-750 nm)。結果を図１４に示す。チューブ状複合体で標識されたマクロファージをマウスの皮下に投与した場合、2×102個という低濃度であっても検出できることがわかった。
〈検討２〉
チューブ状複合体で標識したマクロファージ（1×106個）を含むＰＢＳ懸濁液を、当該マクロファージを取り出した元のマウスに静脈投与した。このマクロファージの体内分布を、IVIS Spectrumを用いて、in vivoおよびex vivo蛍光イメージングにより観察した(励起波長660-690 nm、蛍光波長730-750 nm)。結果を図１５（ａ〜ｄ：in vivoイメージング、ｅ〜ｈ：ex vivoイメージング）に示す。ａ及びｅは投与前、ｂ及びｃは投与後６時間、ｃ及びｇは投与後２４時間、ｄ及びｈは投与後４８時間で観察した像である。なお、ex vivoイメージングは、生体内から摘出した各種臓器の蛍光観察することで行った。図１５ｅにおいて、Hは心臓、Luは肺、Liは肝臓、Kは腎臓、Sは脾臓、Fは脂肪、UBは膀胱、Tは精巣を、それぞれ示す。
【０２５７】
チューブ状複合体で標識したマクロファージを元のマウスに静脈注射をして、蛍光イメージングにより追跡することにより、マクロファージの体内分布を調べた（励起波長660〜690 nm, 蛍光波長730〜750 nm)。投与してから6時間後、 チューブ状複合体で標識したマクロファージは肝臓に蓄積し、他の臓器には存在しないことがex vivoイメージングから明らかになった(ｆ)。さらに、肝臓に集積した、チューブ状複合体で標識されたマクロファージからの蛍光は、in vivoイメージングにより体外でも検出することができた (ｂ)。チューブ状複合体で標識されたマクロファージは48時間後も肝臓に存在しており、ex vivo（ｈ）だけではなくin vivo（ｄ）においても、明瞭に検出された。これらの結果から、チューブ状複合体が高感度かつ生体深部の蛍光イメージングを達成するためのプローブとして有用であることがわかった。
〈検討３〉
担癌マウスに対して、チューブ状複合体又はＴＣＰＰを癌部に直接投与（intratumor投与）し、IVIS Spectrumを用いて蛍光を観察した。結果を図１６ａに示す。投与前のマウスの写真において黄色円で囲った部分に癌が存在している。図１６ａ上側は、チューブ状複合体を投与したマウスの観察結果であり、図１６ａ下側に、ＴＣＰＰを投与したマウスの観察結果である。チューブ状複合体は投与して ６時間までは癌組織に濃縮されていき、その後も癌組織に留まることがわかった。一方、ＴＣＰＰは投与後すぐに癌組織から漏れ出し、１６時間後には蛍光が検出できなくなった。このことから、チューブ状複合体は、ポルフィリン（ＴＣＰＰ）を用いるよりも、癌組織滞在性が高められていることがわかった。チューブ状複合体の癌組織での長期滞在性は光線力学療法による治療効果を高めるために有効であると考えられた。
【０２５８】
なお、図１６ａに示す傾向イメージングのradiant efficiency （ＲＥ）の変化を図１６ｂに示す。図１６ｂ左は合計ＲＥを、同中は平均ＲＥを、同右は最大ＲＥを、それぞれ示す。チューブ状複合体（赤四角）は合計ＲＥ、平均ＲＥ、 最大ＲＥの、全てが６時間までは増加したが、ＴＣＰＰ（黒四角）は投与後直後からＲＥ値が減少し、１６時間では投与前とほぼ同じ値になった。これらの結果からも、チューブ状複合体の癌組織における長期滞在性を確認することができた。
【０２５９】
実施例３
ＴＣＰＰに３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を共有結合させ、ＴＣＰＰ−ＡＰＴＥＳ結合体を作製し、さらに当該結合体にさらにＴＥＯＳ及びＡＰＴＥＳを共有結合させて、ポルフィリン含有複合体を製造した。当該製造工程の概要を図１７に示す。
【０２６０】
具体的には、次のようにして製造した。３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）  （１２０μｍｏｌ）とＴＣＰＰ（３０μｍｏｌ）をN,N-dimethylformamide（ＤＭＦ）（８ｍＬ）に溶解し、1-(3-dimethyl aminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride（１２０μｍｏｌ）とN-hydroxy succinimide（１２０μｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌することにより、ＡＰＴＥＳのアミノ基とＴＣＰＰのカルボキシル基を縮合させ、アミド結合を形成させて、ＴＣＰＰ−ＡＰＴＥＳ結合体を製造した（図１７Ａ）。次に、当該ＴＣＰＰ−ＡＰＴＥＳ結合体の溶液にオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）（２００μｍｏｌ）とＡＰＴＥＳ（２００μｍｏｌ）を加え、攪拌し、さらにアンモニア水（２８％）を加え、攪拌し、４０℃で２時間放置することにより（すなわち加水分解して脱水縮合することにより）、ポルフィリン含有複合体を合成した（図１７Ｂ）。生成物は遠心分離（15000 rpm）により、回収した。また、生成物はエタノールおよび水への再分散、遠心分離を繰り返すことで、洗浄した。さらに、１００℃で１２時間乾燥させて、粉末状の生成物を得た。以下、このようにして得たポルフィリン含有複合体を実施例３複合体と標記する。
【０２６１】
比較例４
実施例３複合体との比較のため、実施例３で用いたのと同様の原料から、ＴＣＰＰが結合していない集合物を製造した。具体的には、次のようにして製造した。ＴＣＰＰ（３０μｍｏｌ）、ＴＥＯＳ（２００μｍｏｌ）、ＡＰＴＥＳ（３２０μｍｏｌ）をＤＭＦ  （８ｍＬ）に溶解し、アンモニア水（２８％）を２ｍＬ加え、攪拌し、４０℃で２時間放置することにより、これらの集合物を得た。当該集合物では、ＴＥＯＳ及びＡＰＴＥＳは共有結合してＴＥＯＳ−ＡＰＴＥＳ結合物となっているが、ＴＣＰＰはこれらとは結合しておらず、ＴＣＰＰはＴＥＯＳ−ＡＰＴＥＳ結合物に物理的に補足されているだけと考えられる（限定的な解釈を望むものではないが、ＴＥＯＳ−ＡＰＴＥＳ結合物のシリカネットワークが“網”のような役割をし、ＴＣＰＰを物理的に補足しているものと考えられる）。以下、このようにして得た集合物を比較例４集合物と標記する。
【０２６２】
電子顕微鏡観察
次に、実施例３複合体と比較例４集合物の性質の検討を行った。まず、透過型電子顕微鏡(TEM)(H-7650, Hitachi, Tokyo, Japan)により観察した。結果を図１８Ａ〜Ｄに示す。図１８Ａ及びＢが実施例３複合体の観察結果を、図１８Ｃ及びＤが比較例４集合物の観察結果を、それぞれ示す。当該結果から、実施例３複合体がリング状である一方、比較例４集合物は球状であることがわかった。また、実施例３複合体の直径は５６±９ｎｍであり、ＥＰＲ効果が利用できるサイズであった。比較例４集合物は直径訳２４３ｍｍであり、ＥＰＲ効果が期待できるサイズではなかった。
【０２６３】
ＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）による検討２
実施例１で得たチューブ状複合体を検討したのと同様にして、実施例３複合体をＦＴＩＲにより測定した。結果を図１９に示す。図１９では、上からＴＥＯＳ、ＡＰＴＥＳ、ＴＣＰＰ及び実施例３複合体のスペクトルが示される。
【０２６４】
当該スペクトルから、次のことが読み取れた。すなわち、ＴＥＯＳとＡＰＴＥＳのスペクトルの１１６０〜１０５０ｃｍ-１の吸収はνＳｉ−ＯＲによるものである。ＡＰＴＥＳのスペクトルの１５８４ｃｍ-１の吸収はアミンのδＮ−Ｈによるものである。ＴＣＰＰのスペクトルの１４１０ｃｍ-１の吸収はνＣαＮ、νＣαＣβによるものであり、１７８０〜１６５０ｃｍ-１の吸収はカルボン酸のνＣ＝Ｏによるものである。ＨＮＲｓのスペクトルの１０６９ｃｍ-１、８０６ｃｍ-１及び４７３ｃｍ-１の吸収はそれぞれνａｓＳｉ−Ｏ−Ｓｉ、νｓＳｉ−Ｏ−Ｓｉ、ρＳｉ−Ｏ−Ｓｉによるものである。１６５０ｃｍ-１の吸収はアミドのνＣ＝Ｏによるものである（カルボン酸のνＣ＝Ｏは見られなかった）。１５５４ｃｍ-１の吸収はアミドとアミンのδＮ−Ｈに由来するものである。１３９５ｃｍ-１の吸収はＴＣＰＰのνＣαＮとνＣαＣβによるものである。
【０２６５】
以上のことから、実施例３複合体では、シロキサンネットワークが形成されていること、そして、アミド結合を介して、ＴＣＰＰがシロキサンネットワーク中に組み込まれていること、が明らかになった。
【０２６６】
２９Ｓｉ  ＮＭＲ測定による検討
Ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ  ２９Ｓｉ  ＮＭＲ測定により、実施例３複合体のシリカネットワークに関するより詳細な情報を得た。図２０に結果を示す。実施例３複合体のシリカネットワークはＱ４、Ｑ３、Ｔ３、Ｔ２からなることが分かった（−１０８．０ｐｐｍ、−１００．４ｐｐｍ、−６６．７ｐｐｍのピークがそれぞれＱ４、Ｑ３、Ｔ３であり、−６６．７ｐｐｍのピークの肩がＴ２である。なお、Ｑ４、Ｑ３、Ｔ３、Ｔ２は図２０中に示す各シロキサン結合である。）。つまり、ＴＥＯＳのシラノール基のうち３つ又は４つが加水分解及び縮合を受け、ＴＣＰＰ−ＡＰＴＥＳ結合体及びＡＰＴＥＳのシラノール基のうち２つ又は３つが加水分解及び縮合を受けていることがわかった。
【０２６７】
１３Ｃ  ＮＭＲ測定による検討
Ｓｏｌｉｄ  ｓｔａｔｅ  １３Ｃ  ＮＭＲ測定により、実施例３複合体の構造解析を行った。結果を図２１に示す。図２１中の炭素についている１〜１１の番号が、ピークについている番号と対応しており、ピーク１２はＴＣＰＰのカルボン酸に起因するものである（ｐｅａｋ１：１０．４ｐｐｍ、ｐｅａｋ２：２２．３ｐｐｍ、ｐｅａｋ３：３５．４ｐｐｍ、ｐｅａｋ４：１６３．４ｐｐｍ、ｐｅａｋ５：１５０．１ｐｐｍ、ｐｅａｋ６及び７：１３２．４ｐｐｍ、ｐｅａｋ８：１４２．７ｐｐｍ、ｐｅａｋ９：１２６．６ｐｐｍ、ｐｅａｋ１０：１１８．２ｐｐｍ、ｐｅａｋ１１：４２．７ｐｐｍ、ｐｅａｋ１２：１７１．９ｐｐｍ）。以上の結果から、実施例３複合体において、ＴＣＰＰはアミド結合を介してシロキサンネットワーク中に組み込まれていることがわかった。さらに、実施例３複合体にはＡＰＴＥＳ由来のアミノ基が残存していることもわかった。当該アミノ基は、実施例３複合体にさらに化学修飾を行う場合に有用である。
【０２６８】
熱重量分析（ＴＧ）による検討
ＴＧによる解析では、実施例３複合体は５８％の重量減少が見られ、比較例４集合物は１３％の重量減少が見られた（図２２）。この内、水による重量減少は実施例３複合体で約１３％、比較例４集合物で約８％であった（図２２）。つまり、ＴＣＰＰ含有量は実施例３複合体が約４５重量％、比較例４集合物が約５重量％であり、実施例３複合体は比較例４集合物に比べ、ＴＣＰＰを非常に多く含有していることがわかった。
【０２６９】
なお、水の重量減少は２００℃において、実施例３複合体及び比較例４集合物の重量減少は８００℃において、それぞれ読み取った（図２２）。これは、２００℃で脱水が完全に行われ、また、８００℃で有機物が完全に燃焼していると考えられるためである。
【０２７０】
肉眼観察
実施例３複合体および比較例４集合物を生理食塩水に分散させ、肉眼観察した。それぞれの写真を図２３に示す。図２３Ａが実施例３複合体を、Ｂが比較例４集合物を示す。実施例３複合体はＴＣＰＰを多く含有しているため赤褐色に見えるが、比較例４集合物はほとんどＴＣＰＰを含有できていないため白く見える（シリカの色）。
【０２７１】
吸収波長の検討２
図２３に示した、生理食塩水に分散させた実施例３複合体および比較例４集合物について、紫外可視吸収スペクトルを測定した（図２４）。実施例３複合体はＴＣＰＰに比べて吸収波長が長波長側にシフトしており、最大吸収波長（６５６ｎｍ）が近赤外領域に入っていた。つまり、生体のイメージング（特に医療用途）に適した波長領域に励起波長を有していた。一方、比較例４集合物はＴＣＰＰの含有量が少ないため、吸収バンドが確認できなかった。
【０２７２】
蛍光イメージ及び蛍光強度の検討
図２３に示した、生理食塩水に分散させた実施例３複合体および比較例４集合物の蛍光イメージ（励起波長６７５ｎｍ）を、図２５（上側が実施例３複合体、下側が比較例４集合物）を示す。また、図２６に、実施例３複合体および比較例４集合物の平均蛍光強度（図２６左側）および最大蛍光強度（図２６右側）の波長依存性をそれぞれ示す。実施例３複合体は波長７４０ｎｍで最も強く蛍光を発することが分かった。実施例３複合体は励起波長、蛍光波長ともに近赤外領域に入っているので、生体のイメージング（特に医療用途）に適していると考えられた。一方、比較例４集合物は全く蛍光を発しなかった。これは、ＴＣＰＰ含有量が少ないためと考えられた。
【０２７３】
実施例３複合体の化学修飾（ＰＥＧ化）の検討
上述のように、実施例３複合体にはＡＰＴＥＳ由来のアミノ基が残存しているので、これを利用して化学修飾を施すことを検討した。具体的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）による修飾（ＰＥＧ化）の検討を行った。
【０２７４】
ＰＥＧ化の概要を図２７に示す。具体的には、実施例３複合体を水に分散させ（４ｍｇ／ｍＬ）、ＮＨＳ−ＰＥＧ（１０μｍｏｌ）を加え、攪拌し、２５℃で２４時間静置することにより、実施例３複合体をＰＥＧ修飾した（以下、ＰＥＧ修飾された実施例３複合体を「ＰＥＧ化実施例３複合体」と標記する）。
【０２７５】
さらに、ＰＥＧ化実施例３複合体及びＮＨＳ−ＰＥＧを、ＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）により解析してスペクトルを得た。結果を図２８に示す。当該結果から次のことが読み取れる。すなわち、ＮＨＳ−ＰＥＧにはＮＨＳ活性エステル由来のνＣ＝Ｏによる吸収が１７４３ｃｍ−１に見られるが、ＰＥＧ化実施例３複合体には見られず、アミド由来のνＣ＝Ｏによる吸収が１６７０ｃｍ−１に見られる。また、１５５６ｃｍ−１にもアミドのδＮ−Ｈによる吸収が見られる。ＰＥＧ由来の吸収が９６７ｃｍ−１と５５８ｃｍ−１に見られる。ＴＣＰＰに由来する吸収が１３９０ｃｍ−１に見られる。１０７７ｃｍ−１、８０２ｃｍ−１、４５５ｃｍ−１にそれぞれνａｓＳｉ−Ｏ−Ｓｉ、νｓＳｉ−Ｏ−Ｓｉ、ρＳｉ−Ｏ−Ｓｉによる吸収が見られる。以上のことから、ＮＨＳ−ＰＥＧのＮＨＳエステルと実施例３複合体のアミンが反応し、アミド結合を介して実施例３複合体がＰＥＧにより修飾されたことが明らかになった。
【０２７６】
なお、ＰＥＧ化には、タンパク質や細胞の非特異的吸着を抑制できる、細網内皮系による貧食を回避できる、腎臓からの排泄を遅延させることができる、等の効果があることが知られており、従ってＰＥＧ化によって血中滞留時間を大きく延長させることができると考えられる。
【０２７７】
担癌マウスへのＰＥＧ化実施例３複合体の投与
担癌マウスに対して、ＰＥＧ化実施例３複合体を静脈投与し、IVIS Spectrumを用いて蛍光を観察した。静脈投与は、ＰＥＧ化実施例３複合体１ｍｇを生理食塩水１ｍLに溶解させて投与液とし、これを１００μｌ投与することで行った。結果を図２９に示す。投与前のマウスの写真（図２９左側）においてオレンジ色円で囲った部分に癌が存在している。静脈投与したにもかかわらず、ＰＥＧ化実施例３複合体は癌部分に特異的に集積したことがわかった（図２９右側）。これは、ＰＥＧ化により血中滞留時間を大きく延長された結果、ＥＰＲ効果が高められた結果であると考えられた。
【０２７８】
ポルフィリン含有複合体への金粒子の内包の検討
上述のように、本発明のポルフィリン含有複合体は、リング状（チューブ状）であることが好ましい。また、リング状であれば、その内部に物質を内包できる可能性が考えられる。そこで、本発明のリング状ポルフィリン含有複合体に有用成分を内包させ、さらに優れた効果を奏する複合体を製造できないか検討を行った。
【０２７９】
蛍光イメージングは特殊な設備や環境が不要で、測定時間が短く高スループットで手軽に観察することが出来るが、空間分解能は劣っている。そこで、蛍光イメージングとＸ線ＣＴを組み合わせることにより蛍光イメージングの欠点を補うことを目的とし、蛍光イメージング及びＸ線ＣＴの両方の造影剤として働く粒子の創製を試みた。
【０２８０】
そこで、本発明のポルフィリン含有複合体に、Ｘ線造影剤として金粒子を内包させた複合体の製造を試みた。金はヨウ素に比べＸ線吸収率が高いうえ、ナノ粒子でありポルフィリン含有複合体に内包させやすいと考えられたためである。
【０２８１】
具体的には、次のようにして金粒子を内包した実施例３複合体（以下「金粒子内包実施例３複合体」と標記する）を調製した。
【０２８２】
すなわち、まずＨＡｕＣｌ４とｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅを水に溶かした（それぞれ２５０μＭになるようにした）。これに、氷で冷やしたＮａＢＨ４を３ｍＭになるように加え、２５℃で３時間攪拌した。このようにして、金粒子を得た。以下、検討には当該金粒子を用いた。
【０２８３】
さらに、ＴＣＰＰ−ＡＰＴＥＳ結合体、金粒子、ＴＥＯＳ、ＡＰＴＥＳ、及び２８％ＮＨ３（ａｑ）を混合した（それぞれ、５６０μＭ、１８５μＭ、３７０μＭ、３７０μＭ、３．３Ｍ）。この溶液を室温で一晩攪拌した。
【０２８４】
以上の工程により、金粒子内包実施例３複合体を得た。当該調製の概要を図３０に示す。なお、図３０に示す工程のうち、ＰＥＧ化工程は上記の調製では行っていないが、上記実施例３複合体のＰＥＧ化と同様に操作することで、金粒子内包実施例３複合体も容易にＰＥＧ化することができる。現在使用されているＸ線造影剤（例えばイオパミロンなどのヨウ素化合物）は低分子であり、体内に投与した瞬間に拡散するため、血管や尿路などの造影にしか使用できなかった。一方、上記の通り本発明のポルフィリン含有複合体はＰＥＧ化により血中滞留時間を大きく延長できることが確認できているため、ＰＥＧ化ポルフィリン含有複合体にＸ線造影剤を内包できれば、これまで難しかった、Ｘ線造影剤の血中滞留時間の延長も可能になると考えられる。 
【０２８５】
金粒子内包実施例３複合体のＴＥＭ観察画像を図３１に示す。金粒子のクラスターがコアになっており、この周りをシリカシェルが覆っている（すなわち、実施例３複合体に金粒子が内包されている）ことが分かった。ＴＥＭから見積もった金粒子内包実施例３複合体の平均サイズは１４８±２２ｎｍであった。また、動的光散乱（ＤＬＳ）により、水溶液中での金粒子内包実施例３複合体の粒径を測定したところ、平均サイズは１５５ｎｍ±１５ｎｍであった（図３２）。これは、ＴＥＭから見積もった粒径とほぼ一致していた。
【０２８６】
また、金粒子、ＴＣＰＰ、及び金粒子内包実施例３複合体の紫外可視吸収スペクトルを測定した（図３３）。金粒子内包実施例３複合体は金粒子とＴＣＰＰが混合したスペクトルパターンを示しており、ＴＣＰＰに比べ約１０ｎｍレッドシフトしていた。このことから、金粒子内包実施例３複合体の吸収最大波長ピークは約６５０ｎｍとなり、近赤外領域内となっていることがわかった。
【０２８７】
図３４左に金粒子内包実施例３複合体の蛍光画像を示す。画像上の数字は蛍光波長を示しており、励起波長は全て６７５ｎｍである。蛍光波長７２０ｎｍ〜８２０ｎｍという近赤外領域内でブロードな蛍光を発し、特に７４０ｎｍで強い蛍光を発することが分かった。図３４右には蛍光波長と蛍光強度の関係を示したグラフを示す。当該グラフからも、金粒子内包実施例３複合体が７２０ｎｍで最も強い蛍光を発することが分かった。
【０２８８】
図３５左に、金粒子内包実施例３複合体２００ｍＭ（Ａｕとして）、イオパミロン２００ｍＭ（Ｉとして）、及び水のＸ線ＣＴ画像を示す。金粒子内包実施例３複合体は市販のヨウ素系Ｘ線ＣＴ用造影剤イオパミロンよりもコントラストを増強させており、造影効果が強いことが分かった。図３５右に、金粒子内包実施例３複合体及びイオパミロンの濃度（それぞれＡｕ濃度、Ｉ濃度）とＣＴ値との関係を示す。金粒子内包実施例３複合体、イオパミロンともに、ＣＴ値は濃度に対して線形に増加した。また、金粒子内包実施例３複合体の方がイオパミロンよりもＣＴ値が大きく、これらのＣＴ値の差は濃度が高くなるにつれて大きくなることがわかった。以上より、金粒子を内包させたリング状のポルフィリン含有複合体（金粒子内包実施例３複合体）は、蛍光イメージングとＸ線ＣＴを組み合わせたデュアルモーダルイメージング用造影剤として使用できることが明らかになった。
【０２８９】
金粒子内包実施例３複合体を用いたデュアルモーダルイメージング
健常マウスに対して、金粒子内包実施例３複合体を左手から皮内投与し、IVIS Spectrumを用いて蛍光を観察するとともに、ＣＴスキャナ（Aloka Latheta LCT-200）によりＸ線ＣＴ画像を取得した。なお、皮内投与は、金粒子内包実施例３複合体１ｍｇを生理食塩水１ｍＬに溶解させ、投与液とし、これを５０μｌ投与することで行った。
【０２９０】
蛍光観察結果を図３６に示す。投与前のマウスの写真（図３６：Ｐｒｅ）では蛍光は観察されないが、投与後1時間で頸リンパ節（緑矢印）と左腋窩リンパ節（青矢印）が造影された（図３６：１ｈ）。時間が経つにつれて、頸リンパ節と左腋窩リンパ節の蛍光強度は強くなった（図３６：５ｈ）。２４時間後、右腋窩リンパ節（紫矢印）も造影された（図３６：２４ｈ）。４８時間後、左右腋窩リンパ節からの蛍光は消滅し、頸リンパ節の蛍光も弱くなった（図３６：４８ｈ）。また、同様に金粒子内包実施例３複合体を左手から皮内投与した別のマウスを、投与24時間後に解剖して、蛍光観察（Ex vivoイメージング）を行った。Ex vivoイメージングにより、左右腋窩リンパ節と頸リンパ節の位置をより明確に把握できた（解剖したため頸リンパ節は左右に分かれている）（図３６：Ex vivo）。挿入図は摘出した頸リンパ節である（図３６：Ex vivoの挿入図）。肉眼ではリンパ節を特定することは困難であったが、蛍光イメージングにより容易に特定できるようになったため、摘出することに成功した。
【０２９１】
また、図３６の結果（in vivo蛍光イメージング結果）から、各リンパ節の蛍光強度の変化をグラフにしたものを図３７に示す。具体的には、頸リンパ節（■）、左腋窩リンパ節（●）、右腋窩リンパ節（◆）の蛍光強度を示す。どのリンパ節でも、投与後２４時間までは蛍光強度が増大し、４８時間では減少していることがわかる。
【０２９２】
なお、リンパ節にはマクロファージが多く存在しており、このマクロファージの貧食作用によってナノ粒子が集積し易くなっているため、投与した金粒子内包実施例３複合体はリンパ節に集積する。４８時間後に蛍光強度が弱まるのは、投与した金粒子内包実施例３複合体が拡散したためと考えられる。
【０２９３】
取得したＸ線ＣＴ画像を図３８及び図３９に示す。金粒子内包実施例３複合体投与前と投与後２４時間に取得したＣＴ画像である。図３８で点線の円で囲った部分が頸リンパ節部分であり、投与後２４時間後の画像において頸リンパ節が造影されていることが確認できた。また、図３９で緑点線の円で囲った部分が左腋窩リンパ節部分であり、黄点線の円で囲った部分が右腋窩リンパ節部分である。投与後２４時間後の画像において左右腋窩リンパ節が造影されていることが確認できた。なお、図３８及び３９の「MIP image」は、「Maximum Intensity Projections image」のことである。
【０２９４】
頸リンパ節、左右腋窩リンパ節（図３８および図３９で点線で囲んだ部分）のＣＴ値をグラフ化したものを図４０に示す。金粒子内包実施例３複合体の投与により、リンパ節のＣＴ値が著しく向上していることが分かった。なお、＊はｐ＜0.0005を、＊＊はｐ＜0.0001を、＊＊＊はｐ＜0.00005を、それぞれ示す。 
【０２９５】
以上の結果から、金粒子内包実施例３複合体を、蛍光イメージングとＸ線ＣＴを組み合わせたデュアルモーダルイメージング用造影剤として用い得ることが確認できた。
【０２９６】
リンパ節は肉眼で確認することが難しい部位であるとともに、癌が初めに転移する場所であり、また肺癌や結核の診断に重要であることから、リンパ節造影は非常に注目される研究分野である。この観点から、本発明のポルフィリン含有複合体は非常に有用であると考えられる。またさらに、癌を標的とする分子を本発明のポルフィリン含有複合体に修飾させると、この修飾粒子が修飾されていない粒子よりも長くリンパ節に滞在する（蛍光が発せられる）ということであればリンパ節に癌の転移があると解釈でき、逆に修飾なしの粒子と同様の時間で蛍光が見られなくなればリンパ節に癌の転移は無いと解釈できることから、癌転移の診断に好ましく用い得る可能性も考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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