(57)【要約】【課題】清酒等の酒類におけるDMTSの発生を抑制することができる新規な手段を提供すること。【解決手段】MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、SPE2遺伝子、ARO9遺伝子、MEU1遺伝子、及びUTR4遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は欠失した、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オン（DMTS-P1）の生成能が低い酵母を提供した。本発明の酵母をアルコール発酵に用いて清酒を製造すれば、DMTS-P1の含有量が低く抑えられるので、清酒貯蔵中のDMTSの発生が抑制され、老香が抑制される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、SPE2遺伝子、ARO9遺伝子、MEU1遺伝子、及びUTR4遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は欠失した、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低い酵母。
【請求項２】
MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、及びSPE2遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は欠失した請求項１記載の酵母。
【請求項３】
前記少なくとも１つの遺伝子の発現が欠失した請求項１又は２記載の酵母。
【請求項４】
前記酵母は醸造酵母である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項５】
前記酵母は清酒酵母である請求項４記載の酵母。
【請求項６】
1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの含量が低い酒類の製造用の酵母である請求項４又は５記載の酵母。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の酵母を用いてアルコール発酵を行なうことを含む、ジメチルトリスルフィドの生成が抑制された酒類の製造方法。
【請求項８】
請求項５記載の酵母を用いてアルコール発酵を行ない、清酒を製造することを含む、老香の発生が抑制された清酒の製造方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法により製造された、老香の発生が抑制された清酒。
【請求項１０】
酵母において、MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、SPE2遺伝子、ARO9遺伝子、MEU1遺伝子、及びUTR4遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低下又は欠失させることを含む、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低下した酵母の作出方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの遺伝子が、MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、及びSPE2遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
酵母ゲノム中の前記少なくとも１つの遺伝子を破壊することを含む請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
前記酵母は醸造酵母である請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵母は清酒酵母である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
配列番号３に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号３に示す塩基配列中の1836nt〜2935ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMDE1遺伝子を含まないDNA断片からなる、MDE1遺伝子破壊用DNA断片。
【請求項１６】
配列番号６に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号６に示す塩基配列中の2337nt〜3436ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMRI1遺伝子を含まないDNA断片からなる、MRI1遺伝子破壊用DNA断片。
【請求項１７】
配列番号９に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号９に示す塩基配列中の2292nt〜3391ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なSPE2遺伝子を含まないDNA断片からなる、SPE2遺伝子破壊用DNA断片。
【請求項１８】
配列番号１２に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１２に示す塩基配列中の2643nt〜3742ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なARO9遺伝子を含まないDNA断片からなる、ARO9遺伝子破壊用DNA断片。
【請求項１９】
配列番号１５に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１５に示す塩基配列中の2115nt〜3214ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMEU1遺伝子を含まないDNA断片からなる、MEU1遺伝子破壊用DNA断片。
【請求項２０】
配列番号１８に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１８に示す塩基配列中の1785nt〜2884ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なUTR4遺伝子を含まないDNA断片からなる、UTR4遺伝子破壊用DNA断片。
【請求項２１】
パントテン酸非存在下では生育できないパントテン酸要求性を示し、かつ、スペルミン添加により当該パントテン酸要求性が相補される酵母株を選抜することを含む、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低い酵母の育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、清酒の老香成分ジメチルトリスルフィド（DMTS）の前駆体である1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オン（DMTS-P1）の生成能が低下した酵母の作出方法、該酵母を利用した、DMTSの生成が抑制された酒類の製造方法、特には老香の発生が抑制された清酒の製造方法、及び、特定の栄養要求性を利用した、DMTS-P1生成能が低い酵母の育種方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジメチルトリスルフィド（DMTS）は清酒の貯蔵により生成する物質で、硫黄様、タマネギ様のにおいを呈する。清酒の劣化臭である老香の主要構成成分であり（非特許文献１）、市販清酒中のDMTS含有量は検出限界以下〜2.4μg/L程度、弁別閾値は0.18μg/Lである。
【０００３】
これまでに、清酒のDMTSの主な前駆物質として、新規化合物1,2-dihydroxy-5-(methylsulfinyl) pentan-3-one (DMTS-P1)が同定されている（特許文献１、及び非特許文献２、３）。しかしながら、酵母内でDMTS-P1がどのように生成されているかは未だ明らかにされていない。
【０００４】
老香の制御方法としては、低温貯蔵、溶存酸素濃度の制御（非特許文献４）等が知られている。しかし、これらの手法は冷房設備や窒素置換装置といった設備が必要であり、製造した全ての清酒についてこうした老香制御を均一に行なうこととするとコストがかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2010-203780号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本醸造協会誌, 101, 125-131, 2006
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem., 2009, 57 (1), 189-195
【非特許文献３】J. Agric. Food Chem., 2010, 58 (13), 7756-7761
【非特許文献４】日本醸造協会誌, 94, 827-832, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、清酒等の酒類におけるDMTSの発生を抑制することができる新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、DMTS-P1が発酵中に増加すること、その構造がメチオニン再生経路の代謝中間体の構造と類似していることから、酵母メチオニン再生経路がDMTS-P1生成に関与する可能性があると考えた。そこで、実験室酵母BY4743の非必須遺伝子破壊ライブラリからメチオニン再生経路の遺伝子が破壊された株を選び出し、清酒小仕込み試験を行なった。その結果、Δaro9, Δspe2, Δmeu1, Δmri1, Δmde1, Δutr4破壊株でDMTS-P1およびDMTSの減少がみられ、このうちΔspe2, Δmri1, Δmde1破壊株ではDMTSの閾値以下への減少が確認された。なかでもΔmri1、Δmde1でDMTS-P1の減少が顕著であったため、MRI1遺伝子とMDE1遺伝子について、清酒酵母きょうかい７号（K7）で遺伝子破壊株を構築し確認したところ、いずれもDMTS-P1が顕著に減少し、DMTSも親株と比較して大幅に減少していた。これにより、MRI1遺伝子、MDE1遺伝子、又はSPE2遺伝子の破壊が清酒の老香抑制に有効であることを見出した。さらに、SPE2遺伝子破壊株は、パントテン酸非存在下で生育できず、スペルミン添加によりこのパントテン酸要求性が相補されるという表現型を有するため（White WH, Gunyuzlu PL, Toyn JH. Journal of Biological Chemistry. 2001 Apr 6; 276(14):10794-800.）、この表現型に基づいて酵母株を選抜することでDMTS-P1の生成能が低い酵母株を取得できることを見出し、本願発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、SPE2遺伝子、ARO9遺伝子、MEU1遺伝子、及びUTR4遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は欠失した、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低い酵母を提供する。また、本発明は、上記本発明の酵母を用いてアルコール発酵を行なうことを含む、ジメチルトリスルフィドの生成が抑制された酒類の製造方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の酵母を用いてアルコール発酵を行ない、清酒を製造することを含む、老香の発生が抑制された清酒の製造方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により製造された、老香の発生が抑制された清酒を提供する。さらに、本発明は、酵母において、MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、SPE2遺伝子、ARO9遺伝子、MEU1遺伝子、及びUTR4遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を低下又は欠失させることを含む、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低下した酵母の作出方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号３に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号３に示す塩基配列中の1836nt〜2935ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMDE1遺伝子を含まないDNA断片からなる、MDE1遺伝子破壊用DNA断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号６に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号６に示す塩基配列中の2337nt〜3436ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMRI1遺伝子を含まないDNA断片からなる、MRI1遺伝子破壊用DNA断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号９に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号９に示す塩基配列中の2292nt〜3391ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なSPE2遺伝子を含まないDNA断片からなる、SPE2遺伝子破壊用DNA断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号１２に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１２に示す塩基配列中の2643nt〜3742ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なARO9遺伝子を含まないDNA断片からなる、ARO9遺伝子破壊用DNA断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号１５に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１５に示す塩基配列中の2115nt〜3214ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMEU1遺伝子を含まないDNA断片からなる、MEU1遺伝子破壊用DNA断片を提供する。さらに、本発明は、配列番号１８に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１８に示す塩基配列中の1785nt〜2884ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なUTR4遺伝子を含まないDNA断片からなる、UTR4遺伝子破壊用DNA断片を提供する。さらに、本発明は、パントテン酸非存在下では生育できないパントテン酸要求性を示し、かつ、スペルミン添加により当該パントテン酸要求性が相補さ���る酵母株を選抜することを含む、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低い酵母の育種方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、清酒の老香成分DMTSの発生に関与する酵母遺伝子が初めて同定され、清酒における老香の発生を低コストで抑制できる手段が初めて提供された。本発明の酵母をアルコール発酵に用いて清酒を製造すれば、DMTS-P1の含有量が低く抑えられるので、清酒貯蔵中のDMTSの発生が抑制され、老香が抑制される。従って、本発明によれば、低温貯蔵や溶存酸素濃度の制御のようなコストのかかる手段を講じなくとも、老香の発生を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】メチオニン再生経路の各酵素遺伝子が破壊された１３種の酵母BY4743株を用いて清酒小仕込み試験を行ない、製成酒試料中のDMTS-P1と熟成促進（70℃、7日間）した試料中のDMTSを測定した結果である。
【図２】遺伝子破壊株の構築について説明した図である。
【図３】きょうかい7号で作出した遺伝子破壊株（Δmri1、Δmde1）を用いて清酒小仕込み試験を行ない、製成酒試料中のDMTS-P1と熟成促進（70℃、7日間）した試料中のDMTSを測定した結果である。
【図４】メチオニン再生経路及び該経路とパントテン酸合成の関係を示す図である。
【図５】BY4743メチオニン再生経路遺伝子破壊株をSC/-パントテン酸/-スペルミン培地及びSC/-パントテン酸/+スペルミン培地上に植菌し、生育を観察した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のDMTS-P1低生成酵母は、MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、SPE2遺伝子、ARO9遺伝子、MEU1遺伝子、及びUTR4遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子、好ましくはMDE1遺伝子、MRI1遺伝子、及びSPE2遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が低下又は欠失していることを特徴とする。
【００１３】
上記６遺伝子のうちの少なくともいずれか１つの発現が低下又は欠失した酵母では、DMTS前駆体であるDMTS-P1（1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オン）の生成能が低下する。すなわち、正常な該遺伝子を有する酵母株と比較して、DMTS-P1を生成する能力が有意に低い。とりわけ、MDE1遺伝子、MRI1遺伝子、及びSPE2遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が破壊された酵母株では、DMTS-P1生成能が親株の３０％未満、例えば１５％未満に低下し得る。本発明の酵母を用いてアルコール発酵を行ない製造された酒類は、DMTS-P1の含量が低く、そのためDMTSの生成が抑制される。例えば、本発明の酵母が清酒酵母であれば、本発明の酵母を用いてアルコール発酵を行ない、清酒を製造することにより、清酒貯蔵中のDMTSの生成が抑制されるので、老香の発生を抑制することができる。
【００１４】
本発明の酵母は、好ましくは醸造酵母であり、特に好ましくは清酒酵母である。本発明の酵母は、DMTS-P1の含量が低く、DMTSの生成が抑制された酒類の製造に好ましく用いることができる。とりわけ、本発明の酵母は、DMTSの生成が抑制され、老香の発生が抑制された清酒の製造に好ましく用いることができる。
【００１５】
上記６遺伝子は、メチオニン再生経路で働く酵素をコードする遺伝子であることが知られており（図４）、それらの配列もサッカロミセスゲノムデータベース（SGD、http://www.yeastgenome.org/）及びGenBankに登録され公知である。酵母の各遺伝子のcDNA配列、アミノ酸配列、及び近傍領域を含むゲノム配列を下記表１の通りに配列表に示す（表中「K7」とは清酒酵母「きょうかい７号」である）。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
もっとも、配列表に上記の通り示した配列は野生型配列の一例であり、公知の酵母系統や天然に存在する酵母には、各酵素タンパク質の活性は正常であるが塩基配列ないしアミノ酸配列が一部相違するものも存在し得る。本発明において、例えば「MDE1遺伝子」「MDE1タンパク質」といった場合には、配列表に示した野生型の塩基配列又はアミノ酸配列と完全に同一の配列を有するものだけではなく、酵素活性を損なわない天然の変異を含む配列を有するものも包含される。他の遺伝子についても同様である。そのような天然の変異配列は、通常、配列表に示した各野生型配列と９０％以上、例えば９５％以上、又は９８％以上の同一性を有する。あるいは、そのような天然の変異配列は、野生型配列において１又は数個の塩基又はアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され、及び／又は付加された配列であり得る。
【００１８】
本発明において、上記遺伝子の発現の欠失又は低下は、天然の変異によるものであってもよいし、また、人為的な変異処理により生じた変異によるものであってもよい。上記の通り、各遺伝子の配列は公知であるので、変異により上記遺伝子のいずれかの発現が欠失又は低下しているかどうかは、常法により調べることができる。例えば、ゲノム配列を決定して野生型配列と比較する、ノザンブロットやリアルタイムPCR等によりmRNAの発現量を調べる、ウエスタンブロット等により各酵素タンパク質の発現量を調べる、等の方法で遺伝子発現の欠失や低下を調べることができる。あるいは、後述する通り、上記遺伝子の発現が欠失又は低下した酵母株が有する表現型を指標としてスクリーニングを行なうことで、上記遺伝子の発現の欠失又は低下によりDMTS-P1生成能が低下した酵母株を取得することもできる。あるいはまた、本発明の酵母における上記遺伝子の欠失又は低下は、遺伝子工学的手法によるものであってもよい。
【００１９】
本発明の酵母では、遺伝子破壊等により上記少なくとも１つの遺伝子の発現が欠失していることが好ましい。遺伝子発現の欠失とは、酵母細胞内において、当該遺伝子から転写されるmRNA、又は該mRNAから翻訳されるタンパク質が、検出可能なレベルで産生されないことをいう。また、「遺伝子が破壊された」とは、酵母ゲノムの少なくとも一方のアレルにおいて、好ましくは全てのアレルにおいて、ゲノム上の目的遺伝子のコード領域が欠失していること又は正常な遺伝子産物（mRNA又はタンパク質）が産生されないように変異していることをいい、典型的にはゲノム上の目的遺伝子のコード領域が欠失していることをいう。遺伝子の欠失は、コード領域の全体の欠失でもよく、また一部の欠失でもよい。コード領域全体の欠失の場合には、目的遺伝子に隣接する領域もあわせて広く欠失していてもよい。一部の欠失の場合には、特に限定されないが、目的遺伝子のコード領域の半分以上が欠失していることが好ましい。目的遺伝子の破壊がコード領域の変異による場合の具体例としては、例えば、コード領域の好ましくは中央よりも上流の部位にナンセンス変異又はフレームシフト変異を有する態様が挙げられる。このような態様では、目的遺伝子がコードする酵素の活性が損なわれた短縮型のタンパク質又は全く無関係なタンパク質が産生され得る。目的遺伝子の一部又は全部が他の配列（例えばマーカー遺伝子配列）に置き換わっていてもよい。
【００２０】
人為的な変異処理の方法としては、紫外線照射、放射線照射等の物理的変異処理、及びエチルメタンスルフォン酸等の変異剤で処理する化学的変異処理等が挙げられるが、これらに限定されない。人為的な変異処理によると、少数の塩基の置換・欠失・付加等によりナンセンス変異やフレームシフト変異が生じた変異株や、比較的広いゲノム領域が欠失した変異株等を得ることができる。
【００２１】
遺伝子工学的手法により遺伝子の発現を低下又は欠失させる方法はこの分野で広く知られており、当業者であれば適宜選択して実行できる。DMTS-P1低生成酵母を遺伝子工学的手法により作出する場合、その手法はいずれであってもよい。具体例としては、アンチセンス法、RNAi、遺伝子破壊法等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２２】
酵母の遺伝子破壊方法は公知であり、例えば、相同組換えを利用した手法により目的遺伝子を破壊することができる（特開2009-142161号公報、Amberg D.C., Botstein D., Beasley E.M., Yeast, 11, 1275-1280, 1995等を参照）。具体的には、例えば、目的遺伝子の上流及び下流のゲノム領域を酵母ゲノムからPCRにより増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）及び下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、正常な目的遺伝子を含まない配列の両末端に２つの相同領域をそれぞれ連結して遺伝子破壊用DNA断片（遺伝子破壊カセット）を調製し、これを酵母細胞に導入すればよい。酵母が有する内在の酵素の働きで、相同な領域間で相同組換えが生じ、ゲノム中の目的遺伝子領域が遺伝子破壊用DNA断片と置き換わるので、ゲノムから目的遺伝子を欠失させることができる。
【００２３】
相同領域としては、通常、酵母ゲノム中の対応する領域と同一の塩基配列からなる断片が用いられるが、対応領域と一部が異なる配列であっても、酵母細胞内で相同組換えが生じる程度の配列同一性を有していれば、相同領域として使用することができる。すなわち、相同領域には、配列表にも示した各遺伝子の野生型ゲノム配列（配列番号３、６、９、１２、１５又は１８）中の対応する部分と同一の塩基配列からなるものの他、該塩基配列において相同組換えが起きる程度に少数（好ましくは１個又は数個）の塩基が置換し、欠失し、挿入され又は付加された塩基配列からなる断片も包含される。相同領域と各野生型配列中の対応領域との同一性は９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは１００％である。本発明において、ある領域と「相同な領域」とは、その領域と上記の通りの同一性を有する塩基配列からなる領域をいう。
【００２４】
相同領域のサイズは特に限定されず、一般に鎖長が長い方が相同組換えの効率が高まるが、出芽酵母では相同組換え活性が強いため、数十bp（例えば30〜50bp）程度の相同領域を設ければ十分である（特開2009-142161号公報等を参照）。もっとも、より長い相同領域、例えば300bp程度以上、又は500bp程度以上、又は700bp程度以上の相同領域を用いてもよい。サイズの上限は特に限定されないが、DNA合成の便宜から通常は10000bp以下、好ましくは2500bp以下である。
【００２５】
相同組換え法自体は周知の常法であり、当業者であれば、配列番号３、６、９、１２、１５、１８に示される塩基配列をもとにして、所望の遺伝子破壊カセットを容易に調製することができる。なお、本発明において、「Xnt」という表記は「第X番塩基」の意味である。
【００２６】
例えば、配列番号３の1101nt〜1835ntがMDE1遺伝子コード領域のゲノム配列であるから、MDE1遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、配列番号３の1nt〜1100ntの上流領域のうちの数十bp程度以上の部分領域を増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）を、1836nt〜2935ntの下流領域のうちの数十bp程度以上の部分領域を増幅して下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、これら２つの相同領域を正常なMDE1遺伝子を含まない配列の両末端にそれぞれ連結して調製することができる。このようにして調製されたMDE1遺伝子破壊カセットは、配列番号３に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号３に示す塩基配列中の1836nt〜2935ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMDE1遺伝子を含まないDNA断片からなる。
【００２７】
また、MRI1遺伝子については、配列番号６の1101nt〜2336ntがMRI1遺伝子コード領域のゲノム配列であるから、MRI1遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、配列番号６の1nt〜1100ntの上流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）を、2337nt〜3436ntの下流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、これら２つの相同領域を正常なMRI1遺伝子を含まない配列の両末端にそれぞれ連結して調製することができる。このようにして調製されたMRI1遺伝子破壊カセットは、配列番号６に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号６に示す塩基配列中の2337nt〜3436ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMRI1遺伝子を含まないDNA断片からなる。
【００２８】
SPE2遺伝子については、配列番号９の1101nt〜2291ntがSPE2遺伝子コード領域のゲノム配列であるから、SPE2遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、配列番号９の1nt〜1100ntの上流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）を、2292nt〜3391ntの下流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、これら２つの相同領域を正常なSPE2遺伝子を含まない配列の両末端にそれぞれ連結して調製することができる。このようにして調製されたSPE2遺伝子破壊カセットは、配列番号９に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号９に示す塩基配列中の2292nt〜3391ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なSPE2遺伝子を含まないDNA断片からなる。
【００２９】
ARO9遺伝子については、配列番号１２の1101nt〜2642ntがARO9遺伝子コード領域のゲノム配列であるから、ARO9遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、配列番号１２の1nt〜1100ntの上流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）を、2643nt〜3742ntの下流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、これら２つの相同領域を正常なARO9遺伝子を含まない配列の両末端にそれぞれ連結して調製することができる。このようにして調製されたARO2遺伝子破壊カセットは、配列番号１２に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１２に示す塩基配列中の2643nt〜3742ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なARO9遺伝子を含まないDNA断片からなる。
【００３０】
MEU1遺伝子については、配列番号１５の1101nt〜2114ntがMEU1遺伝子コード領域のゲノム配列であるから、MEU1遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、配列番号１５の1nt〜1100ntの上流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）を、2115nt〜3214ntの下流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、これら２つの相同領域を正常なMEU1遺伝子を含まない配列の両末端にそれぞれ連結して調製することができる。このようにして調製されたMEU1遺伝子破壊カセットは、配列番号１５に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１５に示す塩基配列中の2115nt〜3214ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なMEU1遺伝子を含まないDNA断片からなる。
【００３１】
UTR4遺伝子については、配列番号１８の1101nt〜1784ntがUTR4遺伝子コード領域のゲノム配列であるから、UTR4遺伝子を破壊するための遺伝子破壊カセットは、配列番号１８の1nt〜1100ntの上流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して上流側相同領域（第１の相同領域）を、1785nt〜2884ntの下流領域から数十bp程度以上の部分領域を増幅して下流側相同領域（第２の相同領域）を調製し、これら２つの相同領域を正常なUTR4遺伝子を含まない配列の両末端にそれぞれ連結して調製することができる。このようにして調製されたUTR4遺伝子破壊カセットは、配列番号１８に示す塩基配列中の1nt〜1100ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第１の相同領域と、配列番号１８に示す塩基配列中の1785nt〜2884ntの領域内の部分領域と相同な領域からなる第２の相同領域とを含み、正常なUTR4遺伝子を含まないDNA断片からなる。
【００３２】
なお、配列番号３、６、９、１２、１５、１８の領域のさらに上流及び下流の領域のゲノム塩基配列は、サッカロミセスゲノムデータベースやGenBankから容易に取得することができる。
【００３３】
正常な各遺伝子を含まない配列は、標的遺伝子以外の他の遺伝子配列でもよいし、また、メチオニン再生経路の酵素として正常に機能するタンパク質をコードしない変異mde1、変異mri1、又は変異spe2遺伝子であってもよい。他の遺伝子配列としてマーカー遺伝子を用いることで、形質転換体（遺伝子破壊株）のスクリーニングが容易になる。
【００３４】
マーカー遺伝子としては、導入する酵母株の栄養要求性に適合した栄養要求性相補遺伝子や、各種薬剤耐性遺伝子等を適宜選択して用いることができる。栄養要求性マーカーの場合は、遺伝子破壊の親株として、該当するマーカー遺伝子をもともと欠失している酵母株を用いる必要があるが、酵母遺伝子破壊株を用いて製造された食品に対する消費者の安心を得る観点からは栄養要求性マーカー遺伝子が有利である。一方、薬剤耐性マーカーは、使用する親株の遺伝的背景に制限がなく、より広い範囲の酵母に対し利用することができ有利である。各種のマーカー遺伝子が公知であり、適宜選択して使用することができる。例えば、栄養要求性マーカー遺伝子としては、URA3遺伝子（ウラシル生合成関連遺伝子）等が知られている。これら遺伝子の配列は公知であり、上述のサッカロミセスゲノムデータベースやGenBank等から配列情報を入手できる。薬剤耐性マーカー遺伝子としては、例えば、natMX4（Goldstein, A. L. et. al, Yeast, 15, 1541-1553, 1999）、kanMX4（Wach A., et al., Yeast, 10, 1793-1808, 1994）等を挙げることができる。
【００３５】
２つの相同領域とマーカー遺伝子DNAとの連結はFusion PCR法により行うことができる（図２参照）。上流側相同領域及び下流側相同領域をゲノムから増幅する際、マーカー遺伝子配列の末端領域とハイブリダイズする相補領域をプライマー対の一方（図２ではD及びE）に付加しておき、この相補領域において３つの断片をハイブリダイズさせて１本のDNA断片に融合し、これを鋳型としてPCRを行えば、[上流側相同領域]−[マーカー遺伝子]−[下流側相同領域]が連結した構造の遺伝子破壊用DNA断片を増幅することができる。この工程は、図２に示すように、２段階に分けて順次に行なってもよい。また、マーカー遺伝子の向きは、破壊対象の遺伝子と同じ向きでも逆向きであってもよい。
【００３６】
遺伝子破壊カセットの酵母細胞内への導入は、酢酸リチウム法等の常法により行なうことができる。下記実施例には、酢酸リチウム法による遺伝子破壊カセットの導入の具体例が記載されている。
【００３７】
目的遺伝子を破壊する他の方法としては、例えばAritomiらのBiosci. Biotechnol. Biochem., 68(1), 206-214, 2004に記載されるようなセルフクローニング法を利用することができる。該方法は、遺伝子導入用の薬剤耐性マーカーとカウンターセレクション用の生育抑制マーカーとを含むプラスミドベクターを利用して、ゲノム中の正常遺伝子を変異遺伝子に置き換える方法である。該方法によれば、遺伝子導入のためだけに必要な外来ＤＮＡ配列を変異遺伝子の導入後に除去できるため、食品産業で用いられる醸造酵母の育成に好ましい。以下、MDE1遺伝子を例に用いて、セルフクローニング法にて遺伝子を破壊する方法を具体的に説明する。
【００３８】
用いる上記２種類のマーカーは特に限定されず、例えば、薬剤耐性マーカーとしてはYAP1等、生育抑制マーカーとしてはGIN11等の公知のマーカーを用いることができる。これら２種類のマーカーを含むプラスミドベクター中に、変異を導入したmde1遺伝子（例えば、コード領域の上流側にストップコドンを導入した変異mde1遺伝子）を挿入し、該変異mde1遺伝子配列中の適当な制限酵素部位で切断してリニア化したものを酵母細胞内に導入すれば、相同組換えにより該リニア化プラスミドがゲノム中のMDE1遺伝子座に組み込まれる。その結果、ゲノム中にはプラスミド配列を介して正常MDE1遺伝子と変異mde1遺伝子が縦列して存在するようになる。薬剤耐性マーカーにより、リニア化プラスミドがゲノム中に組み込まれた酵母を容易に選択することができる。
【００３９】
その後、ゲノム中で縦列して存在する正常MDE1遺伝子と変異mde1遺伝子との間で相同組換えが生じると、生育抑制マーカーを含むプラスミド配列が脱落する。そのため、生育抑制マーカーを発現させる条件下で（例えば、生育抑制マーカーがガラクトース誘導性過剰発現プロモーターの制御下にある場合には、ガラクトース培地上で）選択を行なえば、プラスミド配列が残存する酵母は生育抑制マーカーの作用により生育することができず、一方、相同組換えによりプラスミド配列が脱落した酵母は生育することができるので、プラスミド配列が脱落し正常MDE1遺伝子又は変異mde1遺伝子のみがゲノム中に残存する酵母を得ることができる。ゲノム中に残存したMDE1遺伝子が所期の変異を有するか否かは、例えば変異を含む領域をＰＣＲ増幅してシークエンス解析を行なうことにより容易に調べることができる。
【００４０】
二倍体の酵母を親株として遺伝子破壊処理を行なった場合、スクリーニング後に得られる形質転換体は、２つのアレルの目的遺伝子がどちらも破壊されたホモ破壊株か、又は、一方のアレルの遺伝子が破壊され、他方のアレルの遺伝子が破壊されずに残っているヘテロ破壊株であるが、遺伝子破壊カセットが異所的に組み込まれた非破壊株が得られることもある。従って、マーカーによるスクリーニング後、適宜サザン解析やPCR増幅産物サイズの確認、ダイレクトシークエンシング等を行ない、目的通りの位置に遺伝子破壊カセットが挿入され目的遺伝子が破壊されていることを直接確認することが望ましい。
【００４１】
実用される醸造酵母は通常二倍体である。従って、本発明の方法により前駆物質DMTS-P1の生成能が低下した酵母を酒類製造に用いる場合には、特に限定されないが、二倍体で目的遺伝子アレルが共に破壊されたホモ破壊株を用いることが好ましい。
【００４２】
ホモ破壊株を作出する方法としては、下記実施例で行なっているように、二倍体でアレルの一方が破壊された酵母を作製し、次いで、該酵母に対し再度遺伝子破壊処理を行なう方法が挙げられる。上記した遺伝子破壊カセットを用いる方法により目的遺伝子を破壊する場合には、例えば、１回目の遺伝子破壊処理と２回目の遺伝子破壊処理とで異なる薬剤耐性マーカーを用いればよい。上記したセルフクローニング法を用いる場合であれば、アレルの一方が破壊された二倍体酵母は、ゲノム中にマーカー遺伝子を有しないため、２回目でも１回目と同一の遺伝子破壊用プラスミドベクターを用いることができる。なお、取得の頻度は落ちるが、二倍体の酵母に対して上記した遺伝子破壊方法を実施した場合には、２つのアレルが同時に破壊された株も生じ得る。
【００４３】
あるいは、他の方法として、接合型の異なる一倍体（a型及びα型）で遺伝子破壊株を作製し、両者を接合させて二倍体の遺伝子破壊株を得る方法も挙げられる。二倍体の酵母から一倍体を得る方法は、この分野で周知の常法により行なうことができる。例えば、特開2009-142161号公報に記載される通り、酵母を特開平5-317035号公報等に記載されるような公知の胞子形成用培地中にて培養することにより胞子形成させて胞子を得て、該胞子を発芽させて一倍体を得ることができる。
【００４４】
本発明において、酵母は好ましくは醸造酵母であり、より好ましくは清酒酵母である。
【００４５】
Δspe2遺伝子破壊株は、パントテン酸の非存在下では生育できないが、スペルミンを添加するとパントテン酸非存在下でも生育可能になるという特徴的な表現型を示すことが知られている（White WH, Gunyuzlu PL, Toyn JH. Journal of Biological Chemistry. 2001 Apr 6; 276(14):10794-800.）。従って、自然界から分離した酵母、又は該分離酵母若しくは既存の酵母を変異処理したものの中から、上記の表現型を示す株を選抜することで、DMTS-P1の生成能が低い酵母株を取得することができる。すなわち、本発明は、パントテン酸非存在下では生育できないパントテン酸要求性を示し、かつ、スペルミン添加により当該パントテン酸要求性が相補される酵母株を選抜することを含む、1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低下した酵母の育種方法を提供する。
【００４６】
変異処理方法については上述した通りであり、物理的変異処理でも化学的処理でもよく、特に限定されない。
【００４７】
スクリーニングは、パントテン酸を含有しない培地を用いて、次の通りに行なうことができる。パントテン酸非含有培地にスペルミンを添加したものと添加しないものの２種類を準備し、変異処理した又は分離した酵母株のシングルコロニーをこれらの培地に植菌して、酵母の通常の培養条件下（通常25℃〜30℃程度）で1〜5日間程度インキュベートする。パントテン酸(-)／スペルミン(+)の培地では生育しているが、パントテン酸(-)／スペルミン(-)の培地では生育していない株が、spe2変異株候補、すなわち1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの生成能が低下した酵母株の候補である。候補の株が得られたら、これを用いて小スケールで清酒製造試験（小仕込み試験）を行ない、清酒試料中の1,2-ジヒドロキシ-5-メチルスルフィニルペンタン-3-オンの含有量と熟成促進（70℃で7日間保存）した後のDMTS生成量を確認すればよい。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４９】
１．メチオニン再生経路の各遺伝子破壊株（Saccharomyces cerevisiae BY4743）での清酒小仕込試験
[方法]
酵母BY4743で作製された公知の非必須遺伝子破壊ライブラリーのうち、メチオニン再生経路の各酵素遺伝子が破壊された株（Δaro8, Δaro9, Δbat2, Δsam1, Δsam2, Δspe2, Δspe3, Δspe4, Δmeu1, Δmri1, Δmde1, Δutr4, Δadi1）、および野生型親株を用いて、総米83gの小仕込み試験を行った。掛米には精米歩合70％のα化米を60g、麹米は精米歩合70％の乾燥麹を23g（いずれも徳島製麹株式会社製）、汲水にはイオン交換水を200mL使用した。仕込みは１段の酵母仕込み（初期菌体数1×107cells/mL）で行い、乳酸を0.02％となるよう添加した。15℃で19日間発酵を行い、遠心とフィルターろ過（0.20μm）により上槽し、清酒試料を得た。この清酒試料中のDMTS-P1量を下記の手順で測定した。また、各清酒試料を70℃で7日間熟成促進させ、得られた熟成清酒試料中のDMTS量を下記の手順で測定した。
【００５０】
＜DMTS-P1の分析（LC/MS）＞
得られた清酒試料1 mLに、内部標準として20ppmの1,2-dihydroxy-5-(methyl(d3)sulfinyl)pentan-3-one (methyl(d3)DMTS-P1)を25μL添加し、蒸留水で2mLにメスアップした。これを約1mLの陽イオン交換樹脂（Dowex50WX4）に通液し、蒸留水6 mLで洗浄した。通過液を合併して凍結乾燥し、蒸留水1 mLに溶解し、フィルターろ過してLC/MS試料とした。LC/MSの条件は以下のとおり。
装置：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製Surveyor HPLCシステムおよびLCQ Advantageイオントラップ質量分析計
カラム：BDS Hypersil C18 (3.0×150mm)
移動相：超純水、0.3mL/min
インジェクション：10μL
Ion spray voltage：5.0 kV
Capillary temperature：250℃
Sheath gas pressure：30arb
MS/MS条件
collision energy：30%
DMTS-P1：プレカーサーイオン；m/z 181, モニターイオン；m/z 117
Methyl(d3)DMTS-P1：プレカーサーイオン；m/z 184, モニターイオン；m/z 117
【００５１】
＜DMTSの分析（GC/MS）＞
stir bar sorptive extraction (SBSE)により行った。エタノール10％となるように加水した試料10mlに、塩化ナトリウム2g、および内部標準として3-octanolを5 mg/Lとなるように添加し、攪拌子（Twister、Gerstel社製）を入れて700 rpm、30分間攪拌し、香気成分の抽出を行った。香気成分を吸着したTwisterをGerstel社製の加熱脱着装置（TDSA）に装着した。
加熱脱着条件
TDSA：20℃（1min）→60℃/min→230℃（4min）
CIS4：-150℃（0.7min）→12℃/sec→250℃（10min）
GC/MS条件
装置：Agilent社製 GC6890およびMSD5973
カラム：HP-INNOWax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）
オーブン温度：40℃（5min）→5℃/min→120℃→15℃/min→240℃（10min）
キャリアガス：He, 1.0 mL/min
インジェクション：スプリットレス
SIMモード
モニターイオン：DMTS; m/z 126, 3-octanol; m/z 83
【００５２】
[結果]
DMTS-P1及びDMTSの分析結果を図１に示す。野生型親株（WT）と比較して、Δaro9, Δspe2, Δmeu1, Δmri1, Δmde1, Δutr4破壊株でDMTS-P1およびDMTSの有意な減少がみられた。中でも、Δspe2、Δmeu1、Δmri1、Δmde1では、WTと比較してDMTS-P1が大幅に減少しており、特にΔmeu1、Δmri1、Δmde1でDMTS-P1の顕著な減少が見られた。DMTS量は、Δspe2, Δmri1, Δmde1で弁別閾値0.18μg/L以下に減少していた。
【００５３】
なお、各清酒試料の一般成分分析結果は下記の通りである。日本酒度には差異があったが、いずれの変異株も醸造能力は正常であった。
【００５４】
【表２】
2013169191.tif 000004
【００５５】
２．きょうかい７号酵母（K7）のΔmri1、Δmde1遺伝子破壊株構築
DMTS-P1, DMTSともに減少したΔmri1とΔmde1について、清酒酵母でも同様の現象がみられるかを確認するため、きょうかい７号酵母（K7）を用いて遺伝子破壊株Δmri1及びΔmde1を構築した。
【００５６】
(1)  遺伝子破壊用DNA断片の作製
まず、薬剤耐性遺伝子を持つ公知のプラスミドpAG25：natMX4（Goldstein, A. L.. et. al, Yeast, 15, 1541-1553, 1999）およびpFA6：kanMX4（Wach A., et al., Yeast, 10, 1793-1808, 1994）から、通常のPCRにより、薬剤耐性遺伝子natMX4およびkanMX4をそれぞれ増幅した（図２a）。２つのプラスミドは薬剤耐性遺伝子ORFの前後に共通の配列を含んでおり、この共通配列部分を用いて設計したプライマーA及びBを用いてPCRを行なった。また、TaKaRa社製Genとるくん（酵母用）High Recoveryを用いてK7のゲノムDNAを抽出し、標的遺伝子の前後1kbをPCRにより増幅した（図２b）。次に、増幅した３つの断片（すなわち、標的遺伝子の上流側断片、薬剤耐性遺伝子（natMX4またはkanMX4）、および標的遺伝子の下流側断片）をFusion PCR法により融合、増幅し、標的遺伝子を薬剤耐性遺伝子に置き換えるための遺伝子破壊カセット計4種（薬剤耐性遺伝子2種類×標的遺伝子2種類）を作製した（図２d）。これらのPCR用酵素には東洋紡績社製のKOD FXを使用し、各PCR産物の精製、濃縮にはQIAGEN社製のGel Extraction Kitを用いた。各PCRに用いたプライマーA〜Fの配列は下記表３の通りである。
【００５７】
【表３】
2013169191.tif 000005
【００５８】
(2)  K7の形質転換
作製した各遺伝子破壊カセットを酢酸リチウム法によりK7に導入し、相同組換えにより標的遺伝子を破壊した。
【００５９】
親株を2mLのYPD液体培地で30℃、一晩振盪培養し、10mLの2×YPD液体培地に培養液を100μL入れて30℃、4時間振盪培養した。培養液を遠心（1000G・5分間）集菌して5mLのTEに懸濁後、集菌して100μLのSol Aに懸濁、30℃で１時間インキュベートした。１時間後にPCR産物10μL、Carrier DNA (Salmon SPErm由来DNA) 10μL、Sol B 850μLを添加、混合して30℃、3時間インキュベートした。３時間後、室温で10分間静置し、集菌して5mLのYPD液体培地で30℃、2時間振盪培養後、集菌して薬剤入りのYPDプレートで4日間培養した。
Sol A ： 酢酸リチウム0.1M、Tris-HCl 10mM、EDTA 1mM
Sol B ： Polyethylene Glycol 4000 400mg/mL となるようSol Aに溶解
【００６０】
K7は２倍体なので、それぞれのアレルの標的遺伝子をnatMX4、kanMX4で置き換えた。具体的には、まず、natMX4を含む遺伝子破壊カセットをK7に導入して遺伝子破壊株を取得し、その中から、後述のPCRにより、一方のアレルが破壊された株を選択した。続いて、選択された株にkanMX4を含む遺伝子破壊カセットを導入することで、もう一方のアレルを破壊した。あるいは、先にkanMX4で一方のアレルを破壊し、次いでnatMX4で他方のアレルを破壊した。
【００６１】
(3)  遺伝子破壊の確認
形質転換後、薬剤プレートに出てきたコロニーを2mLのYPD液体培地で30℃、一晩振盪培養し、TaKaRa社製Genとるくん（酵母用）High Recoveryを用いてゲノムDNAを抽出した。抽出したDNAを破壊確認用プライマーG〜J（表３、上掲）を用いてPCRし、バンドの長さで標的遺伝子の破壊を確認した（図２e、表４、４）。MRI1遺伝子はnatMX4と鎖長が近く、増幅断片のバンドサイズでの判断が難しいため、PCR増幅断片をBamHIで消化し、消化断片の長さの違いで確認した（表６）。
【００６２】
【表４】
2013169191.tif 000006
【００６３】
【表５】
2013169191.tif 000007
【００６４】
【表６】
2013169191.tif 000008
【００６５】
以上により、Δmri1、Δmde1各２ラインずつ構築した（表７）。なお、構築した遺伝子破壊株のうち、K7-mri1_1、K7-mri1_2、K7-mde1_1の3株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにそれぞれ表７に示した受領番号で寄託されている（受領日：2012年2月2日）。
【００６６】
【表７】
2013169191.tif 000009
【００６７】
３．K7のΔmri1 ,Δmde1破壊株の清酒小仕込試験
[方法]
K7のΔmri1、Δmde1破壊株（表７）および親株（K7 WT）を用いて総米500gの小仕込み試験を行った。掛米には精米歩合70％のα化米を400g、麹米は精米歩合70％の乾燥麹を100g（いずれも徳島製麹株式会社製）、汲水にはイオン交換水を790mL使用した。
【００６８】
仕込みは３段仕込みで行った（表８）。１日目に水こうじ（汲水161mL、乾燥麹25g、初期菌体数1×107cells/mL、乳酸を0.14％、15℃）、２日目に添（α米62.5g、15℃）、４日目に仲（汲水234mL、乾燥麹25g、α米137.5g、9℃）、５日目に留（汲水395mL、乾燥麹50g、α米200g、7℃）を行い、留後7〜15℃で31日間発酵を行い、遠心とフィルターろ過（0.45μm）により上槽した。この清酒試料中のDMTS-P1量を上記と同様の手順で測定した。また、各清酒試料を70℃で7日間熟成促進させ、得られた熟成清酒試料中のDMTS量を上記と同様の手順で測定した。
【００６９】
【表８】
2013169191.tif 000010
【００７０】
[結果]
DMTS-P1及びDMTSの分析結果を図３に示す。Δmri1, Δmde1ともにDMTS-P1の顕著な減少が見られた。K7の仕込ではBY4743に比べてDMTSが全体的に高かったものの、親株と比較してDMTS量は大幅に低下していた。清酒酵母においても、MRI1, MDE1遺伝子はDMTS-P1の生成に大きく寄与し、これらの遺伝子を破壊すると、DMTSの生成も減少することが確認された。なお、各清酒試料の一般成分分析結果は下記の通りであり、いずれの変異株も清酒を製造する能力は正常であった。
【００７１】
【表９】
2013169191.tif 000011
【００７２】
４．Δspe2破壊株の表現型の確認
SPE2遺伝子はスペルミン合成に関与しており、スペルミンはパントテン酸の合成に使われる（図４）。そのため、Δspe2破壊株はパントテン酸要求性を示し、パントテン酸の非存在下では生育できない。この表現型を確認するため、SC（Simmon's Citrate）培地を用いてSC/-パントテン酸/-スペルミン培地とSC/-パントテン酸/+スペルミン培地（スペルミン濃度0.25mM）を調製し、Δspe2破壊株を植菌して30℃、4日間インキュベートし、生育を確認した。
【００７３】
結果を図５に示す。Δspe2破壊株はSC/-パントテン酸/-スペルミン培地では生育できないが、SC/-パントテン酸/+スペルミン培地では生育できることが確認された。Δspe4破壊株もΔspe2破壊株と同様の表現型を示した。パントテン酸要求性とスペルミンによる相補を指標としてスクリーニングを行うことで、SPE2遺伝子の発現の欠失又は低下によりDMTS生産能が低下した酵母株を取得できると考えられる。
【図１】
2013169191.tif 000012
【図３】
2013169191.tif 000013
【図４】
2013169191.tif 000014
【図２】
2013169191.tif 000015
【図５】
2013169191.tif 000016
【配列表】
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