(57)【要約】【課題】ヒトｉＰＳ細胞から大量の肝前駆細胞を短期間で製造する方法を開発する。【解決手段】本発明は、胎児や成人の肝細胞が保有し、ヒト人工多能性幹細胞が非保有の転写因子の遺伝子を組合せてヒト人工多能性幹細胞へ導入し、増殖、分化させるための増殖促進剤の組合せを含む培地中で基質に接着して単層培養させることにより、ヒト人工多能性幹細胞から肝前駆細胞へ短期間で大量に分化誘導し得る分化誘導法、該方法で製造された肝前駆細胞、該細胞を含む肝臓への移植用細胞組成物を提供する。前記転写因子としてＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαが、前記増殖促進剤としてオンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾン、インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸イオンが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し肝前駆細胞を得る方法であって、
分化用培地中で基質に接着して単層培養される前記ヒト多能性幹細胞に分化誘導用転写因子の組合せを発現させるステップを含む方法。
【請求項２】
前記分化誘導用転写因子がＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαとであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、さらに、前記分化用培地に増殖促進剤の組合せを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖促進剤の組合せは、オンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、インシュリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸イオンからなる群から選択される１または２以上の前記増殖促進剤であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト多能性幹細胞に請求項１に記載された前記分化誘導用遺伝子産物の組合せを発現させるステップにおいて、前記分化誘導用遺伝子産物の組合せは繰り返し前記ヒト多能性幹細胞内で一過性発現をさせられることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法で得られるヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を含むことを特徴とする、肝臓への移植用細胞組成物。
【請求項８】
ヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）から分化を誘導しヒト肝前駆細胞を得る方法であって、ヒトｉＰＳ細胞に転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαの各遺伝子を３日毎にトランスフェクションし、増殖促進剤の組合せとしてオンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾン、インシュリンとトランスフェリンと亜セレン酸イオンとを含む培地中で分化誘導を行い、トランスフェクション後８日目に、ヒトｉＰＳ細胞から分化を誘導しヒト肝前駆細胞を得る方法。
【請求項９】
ヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）から分化を誘導されて得られるヒト肝前駆細胞であって、ヒトｉＰＳ細胞に転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαの各遺伝子を３日毎にトランスフェクションし、増殖促進剤の組合せとしてオンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾンと、インシュリンおよびトランスフェリンを含む培地中で分化誘導を行い、トランスフェクション後８日目に得られることを特徴とするヒト肝前駆細胞。
【請求項１０】
請求項９記載のヒト肝前駆細胞を含むことを特徴とする、肝臓への移植用細胞組成物。
【請求項１１】
ＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαとの遺伝子産物の、ヒト多能性幹細胞に発現させるシステムのヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を調製するための使用。
【請求項１２】
オンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾン、インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸イオンを含む培養液の、ヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を調製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト・人工（誘導）多能性幹（ｉＰＳ）細胞を肝前駆細胞に分化誘導する方法、該方法により誘導された肝前駆細胞、および該肝前駆細胞を含む肝臓への移植用細胞組成物に関する。より詳しくは、本発明は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し肝前駆細胞を得る方法に関する。具体的には、分化用培地中で基質に接着して単層培養される前記ヒト多能性幹細胞に分化誘導用遺伝子産物の組合せを発現させるステップを含む、方法に関する。さらに、該方法にて得られた肝前駆細胞を含む肝臓への移植用途に用いることができる細胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、主に肝実質細胞である肝細胞と、胆管上皮細胞などの肝非実質細胞などにより構成される。肝臓は、胆汁の分泌、吸収栄養分の濾過と解毒、薬物代謝、糖分の貯蔵と血糖の調節を行う他に、フィブリノーゲン、ヘパリンおよび貧血阻止物質などの生成器官であり生命必須のものである。現在、我が国において、肝硬変の死亡者数は年間２万人を超え、肝臓病は、死亡原因の第５位を占める。慢性肝炎例は約１３０万人と推定され、その約半数を占める慢性活動性肝炎は年間約３％の割合で肝硬変に進む。
【０００３】
一方、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）およびｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞から肝臓の細胞へ分化させる技術は、肝臓病の治療、創薬等に応用が期待される。例えば、肝不全は機能する肝細胞が極度に減少する致命的な病態で、肝細胞を移植することができれば根本的な治療法になりうる。肝不全の症例では、極度の凝固因子の不足による出血傾向、肝性昏睡などの大変重篤な状態となるので、一刻も早く治療することが望まれる。
【０００４】
そこで、肝細胞を移植することができれば根本的な治療法になり得る。ヒトにおいて、幹細胞から肝細胞への分化誘導方法を確立し、その分化誘導された肝細胞の移植が期待されている。よって、ヒトｉＰＳ細胞から大量の肝細胞を短期間で調製する方法を開発することが急務である。しかしヒト多能性幹細胞では肝細胞へ分化誘導する方法は確立されていない。
【０００５】
マウスではＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；ＥＳと略す）から肝細胞へ分化誘導させる方法（非特許文献２）や、混在する他の細胞から分離する方法（非特許文献３）も開発されている。しかし、従来の方法による胚性幹細胞から肝細胞へ分化誘導する方法は、ハンギングドロップ法によっており、胚様体を形成する必要があり、このため目的とする分化誘導されて得られる肝細胞はわずかであり、例えば、劇症の肝不全への対応として大量の細胞の供給には向かず、かつ大量の肝細胞の製造は不可能である。さらに、従来の方法ではマウスＥＳ細胞から肝細胞の分化誘導に最低３週間を要し、緊急の場合の治療対応もまた不可能である。例えば、大量の肝細胞を調製するには、肝細胞を培養容器の底面に伸展させて単層培養させる必要がある。
【０００６】
加えるに、ヒトへの適用に関して、ヒト胚性幹細胞の使用は、他人由来の胚性幹細胞を使用するため免疫拒絶や倫理的な問題も存在する。
【０００７】
一方、ヒト線維芽細胞より人工（誘導）多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ、  ｉＰＳ細胞）が開発され、再生医学への応用が期待されている（非特許文献４）。しかし、臓器不全に対する臨床応用には、目的の細胞に分化誘導する方法の確立が必要である。
【０００８】
そこで、自己の細胞から作製可能で免疫拒絶等の問題が少ないｉＰＳ細胞から肝細胞への誘導方法の確立が望まれる。しかし、肝細胞は生体内で多種の細胞と相互作用しつつ分化するので複雑な過程を経ることが推察されるため、培養細胞では多種の細胞との相互作用を再現することは不可能である。
【０００９】
また、マウスＥＳ細胞では胚様体を形成しブドウ糖、アルギニンを欠失した培地で培養するのみで肝細胞への分化誘導が可能であった（非特許文献５）。しかし、ヒトｉＰＳ細胞では胚様体を形成し、マウスＥＳ細胞では内胚葉への分化を誘導するアクチビンを添加したところ、驚くべきことに未分化能は維持される（非特許文献１）。したがって、マウスＥＳ細胞から肝細胞を調製する方法は、ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞を製造しようとする試みには、全く無効である。
【００１０】
さらに、培養ディッシュでｉＰＳ細胞をオンコスタチンＭおよびレチノイン酸の存在下で培養して肝細胞への分化を誘導する試みはある（非特許文献６）が、分化誘導の効率は不十分であり、短期間に大量の細胞を分化誘導して得るには、不十分である。なぜなら、肝細胞で発現しているＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、ＨＮＦ３（ＦｏｘＡ２）の発現がみられないので、この試みでは、肝細胞への分化誘導は不十分と考えられる。発明者は、そのためシート状に培養したｉＰＳ細胞を大量に扱うことはできても、肝細胞への分化誘導は不可能と考えている。
【００１１】
一方、肝前駆細胞（ｈｅｐａｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）と称される細胞は、胎生期にみられる活発に増殖し、肝細胞と胆管上皮に分化する能力を有する細胞とする報告（非特許文献７）と、肝臓が再生する過程で生じる小型で円形の細胞（ｏｖａｌ  ｃｅｌｌ）（非特許文献８）があり、増殖能、肝細胞と胆管上皮細胞に分化する能力を有する。肝前駆細胞は成熟した肝細胞よりも増殖能が高く、胆管上皮も形成するので肝臓に移植した場合速やかに既存の肝構築を形成し、肝細胞のみを移植するよりも効果的に失われた肝臓を再現することが可能と期待される（非特許文献８）。
【００１２】
最近、ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞にＨＨＥＸ（以下、「ＨＥＸ」という。）遺伝子を強制発現させると肝細胞への分化が誘導されるとの報告がされた（非特許文献９）。しかしながら、この方法では、ＨＥＸ遺伝子強制発現の６日前に継代培養用培地から第１の分化培地に換え、さらに１日前に第１の分化培地から第２の分化培地に換える必要がある。分化誘導の指標となるα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の発現は、第１の分化培地に移してから１５日目で、アルブミンの発現は１８日目であった。つまり、この報告方法を行っても分化誘導に要する期間は先に述べたマウスＥＳ細胞から肝細胞を分化誘導させる方法とあまり変わらないこととなる。
【００１３】
肝前駆細胞は肝細胞だけでなく、胆管上皮へ分化する能力をも併せ持つので、肝臓に移植した場合、肝細胞と胆管上皮とが形成されることが期待される（非特許文献１０）。したがって肝細胞のみを移植するよりも効果的に失われた肝臓を再現することが可能と考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｏｍｉｚａｗａら、Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒａｐ  Ｍｅｄ  ２：４０５（２０１１）
【非特許文献２】Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７：９８３（２００３）
【非特許文献３】Ｔｏｍｉｚａｗａら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＲＥＳ  ３３３：１７（２００８）
【非特許文献４】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  １３１：８６１（２００７）
【非特許文献５】Ｚｈｏｎら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０９：６０６  （２０１０）
【非特許文献６】富澤稔ら、肝臓  ５２  （Ｓｕｐｐｌ  ２）：Ａ６８０（２０１１）
【非特許文献７】Ｋａｋｉｎｕｍａら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５１：１２７（２００９）
【非特許文献８】Ｓａｎｇａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ３４２：１３１（２０１０）
【非特許文献９】Ｉｎａｍｕｒａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：４００（２０１１）
【非特許文献１０】Ｔｏｍｉｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４９：１（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ヒト多能性幹細胞を分化誘導し、大量の肝前駆細胞を短期間で製造する方法を開発する必要が、急務である。しかし、これに応える方法、つまり効率よく大量にヒト肝前駆細胞へヒトｉＰＳ細胞から分化誘導する方法は確立されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、胎児や成人の肝細胞において発現が認められ、ヒトｉＰＳ細胞においては発現が認められない転写因子に係る遺伝子発現を検討し、その遺伝子を決めた。該転写因子遺伝子を組合せてヒト人工多能性幹細胞へ導入し、さらに、該遺伝子導入幹細胞を増殖、分化させるための増殖促進剤の組合せを検討し、分化用培地中で基質に接着して単層培養することにより、ヒトｉＰＳ細胞から肝前駆細胞への分化誘導法を確立し、本発明を完成させた。
【００１７】
本発明は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し肝前駆細胞を得る方法であって、分化用培地中で基質に接着して単層培養される前記ヒト多能性幹細胞に分化誘導用転写因子の組合せを発現させるステップを含む方法に関わる。
【００１８】
また、本発明は、前記分化誘導用転写因子がＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαとであることを特徴とする前記の方法に関わる。
【００１９】
さらに本発明は、前記方法に関わり、さらに、前記分化用培地に増殖促進剤の組合せを含むことを特徴とする、前記の方法に関わる。
【００２０】
また、本発明における、前記増殖促進剤の組合せは、オンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、インシュリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸イオンからなる群から選択される１または２以上の前記増殖促進剤であることを特徴とする前記の方法に関わる。
【００２１】
さらに本発明は、前記ヒト多能性幹細胞に先に記載された前記分化誘導用遺伝子産物の組合せを発現させるステップにおいて、前記分化誘導用遺伝子産物の組合せは繰り返し前記ヒト多能性幹細胞内で一過性発現をさせられることを特徴とする、前記の方法に関わる。
【００２２】
さらに本発明は、前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞であることを特徴とする、前記のいずれかの方法に関わる。
【００２３】
また、本発明は、先に記載されたいずれかに記載の方法で得られるヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を含むことを特徴とする、肝臓への移植用細胞組成物に関わる。
【００２４】
さらにまた、本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）から分化を誘導しヒト肝前駆細胞を得る方法であって、ヒトｉＰＳ細胞に転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαの各遺伝子を３日毎にトランスフェクションし、増殖促進剤の組合せとしてオンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾン、インシュリンとトランスフェリンと亜セレン酸イオンとを含む培地中で分化誘導を行い、トランスフェクション後８日目に、ヒトｉＰＳ細胞から分化を誘導しヒト肝前駆細胞を得る方法に関わる。
【００２５】
また、本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）から分化を誘導されて得られるヒト肝前駆細胞であって、ヒトｉＰＳ細胞に転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαの各遺伝子を３日毎にトランスフェクションし、増殖促進剤の組合せとしてオンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾン、インシュリンおよびトランスフェリンを含む培地中で分化誘導を行い、トランスフェクション後８日目に得られることを特徴とするヒト肝前駆細胞に関わる。
【００２６】
さらに本発明は、前記のヒト肝前駆細胞を含むことを特徴とする、肝臓への移植用細胞組成物に関わる。
【００２７】
また、本発明は、ＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαとの遺伝子産物の、ヒト多能性幹細胞に発現させるシステムのヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を調製するための使用に関わる。
【００２８】
さらに本発明は、オンコスタチンＭ、上皮成長因子、レチノイン酸、デキサメタゾン、インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸イオンを含む培養液の、ヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を調製するための使用に関わる。
【００２９】
具体的には、本発明は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し肝前駆細胞を得る方法であって、分化用培地中で基質に接着して単層培養される前記ヒトｉＰＳ細胞に分化誘導用転写因子の組合せを発現させるステップを含む方法を提供する。
【００３０】
前記方法において、分化誘導用転写因子の組合せがＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαとである場合がある。
【００３１】
前記方法において、さらに、分化用培地として、増殖促進剤の組合せを含む培地である場合がある。
【００３２】
本発明の前記方法において、前記増殖促進剤はオンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、インシュリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸イオンからなる群より選択される１または２以上の増殖促進剤である場合がある。
【００３３】
また、本発明は、ヒト多能性幹細胞から分化を誘導し肝前駆細胞を得る方法であって、分化用培地中で基質に接着して単層培養される前記ヒト多能性幹細胞に以下に示される分化誘導用遺伝子産物の組合せを発現させるステップを含み、前記分化用培地は、オンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、インシュリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸イオンとを含み、前記分化誘導用遺伝子産物の組合せは、ＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαとを含むことを特徴とする、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し肝前駆細胞を得る方法を提供する。
【００３４】
本発明の前記ヒト多能性幹細胞に前記分化誘導用遺伝子産物の組合せを発現させるステップにおいて、前記分化誘導用遺伝子産物の組合せは繰り返し前記ヒト多能性幹細胞内で一過性発現をさせることを特徴とする場合がある。
【００３５】
本発明は、前記ヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞または胚性多能性幹細胞の場合がある。
【００３６】
本発明は、前記本方法で得られるヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を含むことを特徴とする、肝臓への移植用細胞組成物の場合がある。
【００３７】
さらに、本発明は、ヒト人工多能性肝細胞（ヒトｉＰＳ細胞）から分化を誘導しヒト肝前駆細胞を得る方法であって、ヒトｉＰＳ細胞に転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαの各遺伝子を３日毎にトランスフェクションし、さらに増殖促進剤の組合せとして、オンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、インシュリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸イオンとを含む培地中で分化誘導を行い、トランスフェクション後８日目に、ヒトｉＰＳ細胞から分化を誘導しヒト肝前駆細胞を得る方法を提供する。
【００３８】
また、本発明は、ヒト人工多能性肝細胞（ヒトｉＰＳ細胞）から分化を誘導されて得られるヒト肝前駆細胞であって、ヒトｉＰＳ細胞に転写因子であるＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαの各遺伝子を３日毎にトランスフェクションし、増殖促進剤の組合せとしてオンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、インシュリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸イオンとを含む培地中で分化誘導を行い、トランスフェクション後８日目に得られることを特徴とする、ヒト肝前駆細胞を提供する。
【００３９】
本発明は、前記ヒト肝前駆細胞を含むことを特徴とする、肝臓への移植用組成物を提供する。
【００４０】
本発明は、ＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、Ｃ／ＥＢＰαとの遺伝子産物をヒト多能性幹細胞に発現させるシステムのヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を調製するための使用をも提供する。
【００４１】
本発明は、オンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、インシュリンと、トランスフェリンと、亜セレン酸イオンとを含む培養液のヒト多能性幹細胞由来肝前駆細胞を調製するための使用をも提供する。
【００４２】
多能性幹細胞は、所定の培養条件下において長期に自己複製能を有し、所定の分化誘導条件下において多種の細胞への多分化能を有する幹細胞であり、これに限定されない、公知の方法により製造できる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ  １３１：８６１（２００７））。
【００４３】
本発明の多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導において、胎児または成人肝の細胞において遺伝子の発現が認められ、多能性幹細胞においては発現が認められない転写因子の遺伝子を多能性幹細胞へ導入するステップが含まれる。
【００４４】
本発明において、転写因子とはＤＮＡに特異的に結合するタンパク質の一群をいう。ＤＮＡ上のプロモーターやエンハンサーと呼ばれる転写を制御する領域に結合し、ＤＮＡの遺伝情報をＲＮＡに転写する過程を促進、あるいは逆に抑制する。転写因子はこの機能を単独で、または他のタンパク質と複合体を形成することによって発揮する。
【００４５】
前記胎児または成人肝の細胞において遺伝子が発現し、多能性幹細胞においては発現していない転写因子として、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸおよびＣ／ＥＢＰαが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書において、ＦＯＸＡ２とはヒトＦＯＲＫＨＥＡＤボックスＡ２遺伝子をいう。ＦＯＸＡ２タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２７に示される。
【００４７】
本発明において、ＦＯＸＡ２タンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２７に示されるアミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含んでもかまわない。あるいは、前記ＦＯＸＡ２タンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２７に示されるアミノ酸配列との同一性が、８０％またはこれ以上か、９０％またはこれ以上か、９５％またはこれ以上かであってもかまわない。前記ＦＯＸＡ２のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２７に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含むヌクレオチド配列でもかまわない。前記ＦＯＸＡ２のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２７に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列でもかまわない。
【００４８】
本明細書において、ＧＡＴＡ４とはヒトＧＡＴＡ結合タンパク４遺伝子をいう。ＧＡＴＡ４タンパク質のアミノ酸配列は配列番号２８に示される。
【００４９】
本発明において、ＧＡＴＡ４タンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２８に示されるアミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含んでもかまわない。あるいは、前記ＧＡＴＡ４タンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２８に示されるアミノ酸配列との同一性が、８０％またはこれ以上か、９０％またはこれ以上か、９５％またはこれ以上かであってもかまわない。前記ＧＡＴＡ４のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含むヌクレオチド配列でもかまわない。前記ＧＡＴＡ４のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２８に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列でもかまわない。
【００５０】
本明細書において、ＨＥＸとは、ＨＨＥＸすなわちヒト造血系で発現するホメオボックス（ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣＡＬＬＹ  ＥＸＰＲＥＳＳＥＤ  ＨＯＭＥＯＢＯＸ）遺伝子をいう。ＨＥＸタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２９に示される。
【００５１】
本発明において、ＨＥＸタンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２９に示されるアミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含んでもかまわない。あるいは、前記ＨＥＸタンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２９に示されるアミノ酸配列との同一性が、８０％またはこれ以上か、９０％またはこれ以上か、９５％またはこれ以上かであってもかまわない。前記ＨＥＸのポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含むヌクレオチド配列でもかまわない。前記ＨＥＸのポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号２９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列でもかまわない。
【００５２】
本明細書において、ＣＥＢＰＡとはヒトＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ遺伝子をいう。ＣＥＢＰＡタンパク質のアミノ酸配列は配列番号３０に示される。
【００５３】
本発明において、ＣＥＢＰＡタンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号３０に示されるアミノ酸配列に１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入を含んでもかまわない。あるいは、前記ＣＥＢＰＡタンパク質は、未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号３０に示されるアミノ酸配列との同一性が、８０％またはこれ以上か、９０％またはこれ以上か、９５％またはこれ以上かであってもかまわない。前記ＣＥＢＰＡのポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号３０に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に１個ないし数個のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含むヌクレオチド配列でもかまわない。前記ＣＥＢＰＡのポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質が未分化のヒト多能性幹細胞から分化を誘導し、肝前駆細胞を得られることを条件として、配列番号３０に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションできるヌクレオチド配列でもかまわない。
【００５４】
本発明において、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００５５】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒＥＳｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象または電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×  ＳＳＣおよび０．２％  ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×  ＳＳＣおよび０．２％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃで、終夜行う。その後前記固相を１×  ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃで、各３０分間ずつ２回洗浄し、０．２×  ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃで、各３０分間ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００５６】
本明細書において、ＦＯＸＡ２と、ＧＡＴＡ４と、ＨＥＸと、ＣＥＢＰＡとの遺伝子産物をヒト多能性幹細胞に発現させるシステムとは、前記遺伝子産物をヒト多能性幹細胞に発現させるいずれかのシステムをいう。前記システムには、前記遺伝子産物をヒト多能性幹細胞に発現させる発現ベクターであってもかまわない。前記発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、その他の周知のベクターであってもかまわない。前記発現ベクターには、未分化ヒト多能性幹細胞から肝前駆細胞に至る細胞系譜の細胞タイプで前記遺伝子産物を発現させる遺伝子発現制御配列、すなわち、プロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれることが好ましい。前記システムにはかかる発現ベクターをヒト多能性幹細胞にトランスフェクションするための試薬、例えばリポフェクションのための試薬またはエレクトロポレーション用の装置が含まれる場合がある。あるいは、ヒト多能性幹細胞の細胞内に取り込まれて細胞内で機能できるタンパク質、例えば細胞膜透過ペプチドと連結した融合タンパク質、が前記システムに含まれてもかまわない。かかるタンパク質は培地に添加するだけでヒト多能性幹細胞の細胞内に取り込まれるため、分化した肝前駆細胞に恒久的に残存することがない点で、発現ベクターより好ましい。
【００５７】
本明細書において、細胞膜透過ペプチドとは、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合タンパク質を細胞外に添加すると、細胞膜を透過して前記融合タンパク質を細胞内に移行させることができるペプチドをいい、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のＴａｔタンパク質ＲＮＡ  結合領域（４８−６０位）由来のアルギニンに富む塩基性ペプチド（ＴＡＴペプチド）、アルギニン残基が６ないし１２個連続したオリゴホモペプチド、ショウジョウバエ由来の転写因子Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のＤＮＡ  結合領域由来の塩基性両親媒性ヘリックス構造を有するペプチド（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明において、前記胎児または成人肝の細胞においては発現し多能性幹細胞においては発現しない転写因子の遺伝子の多能性幹細胞への導入は、公知の方法で発現ベクターを調製し、リポフェクション法または電気穿孔法等の当該技術分野において公知の方法により多能性幹細胞へトランスフェクション可能である。
【００５９】
本発明において、哺乳動物体内における特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性タンパク質を増殖因子と呼び、なお限定されないが、オンコスタチンＭと上皮成長因子、および、細胞増殖促進作用を有する増殖因子補助剤としてデキサメタゾンや、インシュリンとトランスフェリンと亜セレン酸イオンとを含み、これら増殖因子と増殖因子補助剤とを総称して増殖促進剤という。本発明においては、前期増殖促進剤含む培地中で培養することによりヒト多能性幹細胞を肝前駆細胞へ分化誘導できた。
【００６０】
マウスＥＳ細胞では胚様体を形成すると胎生期の内胚葉に類似の構造が形成される（Ａｂｅら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２２９：２７（１９９６））。しかし、三次元の環境で各細胞が互いに影響しあうため様々な細胞に分化してしまい、目的の細胞以外の細胞が混在するという問題がある。そこで、本発明においては、ヒト多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導は細胞の胚様体形成を行わない若しくは回避し、基質に接着した単層形成により分化誘導を行った。
【００６１】
基質に接着して単層培養する方が、より簡便な操作で大量の細胞を同一の環境で扱うことができる。また、実験系が二次元的で単純なため増殖促進剤添加や転写因子遺伝子導入などを簡単に行うことが可能となり、目的の細胞を大量に、他の細胞の混在がより少ない状態で得ることが可能となった。
【００６２】
また、他の分化誘導法が全て多工程を必要とするのに対して本発明の方法は単工程であり、本発明の方法におけるｉＰＳ細胞からの誘導方法への単工程の適用は新規である。
【００６３】
多能性幹細胞から肝前駆細胞への分化誘導の確認は、分化誘導細胞での、未分化な肝細胞のマーカーであるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）の産生亢進、幹細胞や前駆細胞など未熟な細胞の増殖・分化を制御し肝細胞への分化を示唆するＤｅｌｔａ  ｌｉｋｅ−１  （ＤＬＫ−１）の発現亢進、および／または、胆管上皮のマーカーであるγ−ＧＴＰの発現の亢進、並びに、肝細胞としての薬物代謝の反映するインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込みを指標として行うことができる（Ｔｏｍｉｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４９：１（１９９８）、Ｉｎａｍｕｒａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：４００（２０１１））。しかし、これらに限定されない。
【００６４】
ＤＬＫ−１は胎児肝の肝細胞に発現がみられ、成人肝では発現が消失し（Ｔａｎｉｍｉｚｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１６：１７７５−１７８６，  ２００３）、肝前駆細胞のマーカーとして用いられる（Ｔａｎｉｍｉｚｕら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅ．  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ５：２０９−２１８，  ２００４）。
【００６５】
ｉＰＳ細胞における未分化能の最も正確な指標として、細胞の形態、アルカリホスファターゼ染色陽性、およびＮＡＮＯＧの発現保持が含まれる。ＮＡＮＯＧの発現低下を測定することにより細胞の分化を評価できる。ＮＡＮＯＧの発現はＰＣＲ等の公知の方法で測定し、評価することができる。これらに限定されない。
【００６６】
前記、分化誘導された肝前駆細胞、および分化誘導のマーカーであるＮＡＮＯＧは、細胞内の対象タンパク質のｍＲＮＡを逆転写後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリアルタイム−ポリメラーゼ連鎖反応などの公知の方法によって測定するか、さらに、被験タンパク質に対する抗体を用いるＥＬＩＳＡ法や免疫染色法によっても確認できる。これらの方法に限定されない。
【００６７】
本発明の肝前駆細胞は成熟した肝細胞よりも増殖能が高く、胆管上皮も形成するので肝臓に移植した場合、速やかに既存の肝構築を形成すると考えられている。本発明の多能性幹細胞から分化誘導された肝前駆細胞は、肝不全症の患者へ投与または移植できる。
【００６８】
肝不全症としては、急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎、肝硬変、または肝臓がんなどが含まれるが、これらに限定されない。特に、劇症肝炎は入院時より重症感があり、１−２週間程度で肝不全に至り、多臓器不全を発症すると救命が極めて困難であり、可及的速やかな移植等の治療を必要とする。現在、生体肝移植が一部の医療機関で実施されている。この場合、一般的にドナーは家族である。ドナーへの大きな侵襲を伴う等の問題があり、細胞治療、人工臓器等の開発が必要である。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、本発明の肝前駆細胞に加えて、薬学的に許容可能な医薬品添加物を含んでいてもよい。前記医薬品添加物は、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、キレート剤、防腐剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、およびそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等が例示できる。ｐＨ調整剤は、塩酸、硫酸、リン酸、ポリリン酸、ホウ酸、またはホウ砂などの無機酸類；酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、グルコン酸、フマル酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸などの有機酸類；水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなどの無機塩基；モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、またはトリイソプロパノールアミンなどの有機塩基；酢酸アンモニウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、乳酸カルシウムなどが例示できる。安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組み合せて使用できる。上記Ｌ−アミノ酸は、グリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよいが、これらに限定されない。糖類は、グルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等、およびそれらの誘導体等のいずれでもよく、これらに限定されるものではない。セルロース誘導体は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよいが、これらに限定されない。キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示できる。
【００７１】
前記等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、溶解剤、安定化剤、防腐剤などの医薬品添加物は、上記例示された医薬品添加物以外の公知の化合物を、公知の用法および用量（例えば、医薬品添加物辞典２００７（日本医薬品添加剤協会編、薬事日報社、東京、２００７）に記載）で使用できるが、これらに限定されない。
【００７２】
また、本発明における多能性幹細胞から分化誘導された肝前駆細胞は、ヒトの体外で培養、維持されることにより人工肝臓としても使用できる。
【発明の効果】
【００７３】
本発明により、ヒト多能性幹細胞より胚様体を形成せず基質に接着して単層培養することにより培養皿で８日間で、肝前駆細胞へ分化誘導が可能となり、肝前駆細胞を短期間で大量培養が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、胎児肝および成人肝で発現を認め、ｉＰＳ細胞で発現を認めない転写因子を調べるため、各転写因子ｍＲＮＡをＰＣＲ法で増幅後、電気泳動法で検討した結果を表す。各レーンは、１：水、２：ｉＰＳ細胞、３：胎児肝、４：成人肝を示す。
【図２】図２は、各種増殖促進剤を添加した培地で、ｉＰＳ細胞を培養した場合のｉＰＳ細胞の転写因子の発現に及ぼす影響をＰＣＲ法および電気泳動法で検討した結果を表す。転写因子としてＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ６、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、ＴＴＲ、Ｃ／ＥＢＰαの発現を検討、評価した。各レーンの増殖促進剤は、レーン１：水（ブランク）、２：ＲｅｐｒｏＦＦ培地、３：ｉＰＳｍ（−）培地、４：ｂＦＧＦ、５：ＢＭＰ４、６：オンコスタチンＭ、７：ＥＧＦ、８：ＮＧＦ、９：ＴＧＦ−β１、１０：レチノイン酸、１１：ＨＧＦを示す。
【図３−１】図３−１は、増殖促進剤の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析結果を表す。肝前駆細胞の指標タンパク質であるαフェトプトテインのｍＲＮＡの発現亢進に及ぼす増殖促進剤との組合せの影響を解析した。内部標準としてＲＰＬ１９を合わせて測定し、αフェトプロテイン／ＲＰＬ１９の比を求めた。各レーンの増殖促進剤は、それぞれ、１：ＲｅｐｒｏＦＦ培地、２：オンコスタチンＭ、３：上皮成長因子、４：レチノイン酸、５：デキサメタゾン、６：ＩＴＳ、７：オンコスタチンＭと上皮成長因子とレチノイン酸とを共添加した試料、８：オンコスタチンＭと上皮成長因子とレチノイン酸とデキサメタゾンとＩＴＳとを共添加した試料を示す。
【図３−２】図３−２は、増殖促進剤の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析結果を表す。肝前駆細胞の指標タンパク質であるＤＬＫ−１のｍＲＮＡの発現亢進に及ぼす増殖促進剤との組合せの影響を解析した。内部標準としてＲＰＬ１９を合わせて測定し、ＤＬＫ−１／ＲＰＬ１９の比を求めた。各レーンの増殖促進剤は、それぞれ、１：ＲｅｐｒｏＦＦ培地、２：オンコスタチンＭ、３：上皮成長因子、４：レチノイン酸、５：デキサメタゾン、６：ＩＴＳ、７：オンコスタチンＭと上皮成長因子とレチノイン酸とを共添加した試料、８：オンコスタチンＭと上皮成長因子とレチノイン酸とデキサメタゾンとＩＴＳとを共添加した試料を示す。
【図４−１】図４−１は、ＡＦＰの発現量をＲＰＬ１９の発現量に対する比を求め、転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰαをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞に対して各種の増殖促進剤の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析結果を示す。横軸の各実験群の数値は、１：ＲｅｐｒｏＦＦ培地、２：ＧＨＡ、３：ＦＨＡ、４：ＦＧＡ、５：ＦＧＨ、６：ＦＧＨＡ、７：胎児肝を表し、Ｆは、ＦＯＸＡ２、ＧはＧＡＴＡ４、ＨはＨＥＸ、ＡはＣ／ＥＢＰαを示す。
【図４−２】図４−２は、ＤＬＫ−１の発現量をＲＰＬ１９の発現量に対する比を求め、転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰαをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞に対して各種の増殖促進剤の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析結果を示す。横軸の各実験群の数値は、１：ＲｅｐｒｏＦＦ培地、２：ＧＨＡ、３：ＦＨＡ、４：ＦＧＡ、５：ＦＧＨ、６：ＦＧＨＡ、７：胎児肝を表し、ＦはＦＯＸＡ２、ＧはＧＡＴＡ４、ＨはＨＥＸ、ＡはＣ／ＥＢＰαを示す。
【図４−３】図４−３は、Ｇ−ＧＴＰの発現量をＲＰＬ１９の発現量に対する比を求め、転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰαをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞に対して各種の増殖促進剤の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析結果を示す。横軸の各実験群の数値は、１：ＲｅｐｒｏＦＦ培地、２：ＧＨＡ、３：ＦＨＡ、４：ＦＧＡ、５：ＦＧＨ、６：ＦＧＨＡ、７：胎児肝を表し、Ｆは、ＦＯＸＡ２、ＧはＧＡＴＡ４、ＨはＨＥＸ、ＡはＣ／ＥＢＰαを示す。
【図４−４】図４−４は、ＮＡＮＯＧの発現量をＲＰＬ１９の発現量に対する比を求め、転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰαをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞に対して各種の増殖促進剤の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析結果を示す。横軸の各実験群の数値は、１：ＲｅｐｒｏＦＦ培地、２：ＧＨＡ、３  ＦＨＡ、４：ＦＧＡ、  ５：ＦＧＨ、６：ＦＧＨＡ、７：胎児肝を表し、Ｆは、ＦＯＸＡ２、ＧはＧＡＴＡ４、ＨはＨＥＸ、ＡはＣ／ＥＢＰαを示す。
【図５−１】図５−１は、本発明により人工多能性幹細胞より肝前駆細胞へ分化誘導された細胞のインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込みを検討した顕微鏡写真を示す。図５−１は、本発明の方法によって未分化のヒトｉＰＳ細胞から分化が誘導された肝前駆細胞の培養の位相差顕微鏡写真からの作図である。図５−１の写真は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２５μｍを表す。
【図５−２】図５−２は、本発明により人工多能性幹細胞より肝前駆細胞へ分化誘導された細胞のインドシアニングリーンの取り込みを検討した顕微鏡写真を示す。図５−２は、本発明の方法によって未分化のヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された肝前駆細胞にインドシアニングリーンが添加された培養の位相差顕微鏡写真からの作図である。図５−２の写真は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２５μｍを表す。
【図５−３】図５−３は、本発明により人工多能性幹細胞より肝前駆細胞へ分化誘導された細胞のインドシアニングリーンの取り込みを検討した顕微鏡写真を示す。図５−３は、図５−１の原図（カラー）でインドシアニンの蛍光色である緑色部分を白色として変換強調された写真からの作図である。矢印は原図で緑色の部分を指し示す。図５−３の写真は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２５μｍを表す。
【図５−４】図５−４は、本発明により人工多能性幹細胞より肝前駆細胞へ分化誘導された細胞のインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込みを検討した顕微鏡写真を示す。図５−４は、図５−２の原図（カラー）でインドシアニンの蛍光色である緑色の部分を白色に変換強調された写真からの作図である。矢印は原図で緑色の部分を指し示す。図５−４の写真は２００倍の倍率で撮影し、スケールバーは２５μｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。
【実施例１】
【００７６】
胎児および成人肝細胞で発現し、ｉＰＳ細胞で未発現の転写因子の検索
１．１  実験材料および方法
３μｇのＲＮＡより逆転写酵素（ライフテクノロジージャパン株式会社）を用いてｉＰＳ細胞、胎児肝細胞、および成人肝細胞のｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを用いて、それぞれ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβに対する下記プライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、２％低融点アガロース（Ｌｏｎｚａ社）、１×ＴＡＥにて電気泳動を行うことにより、ｉＰＳ細胞、胎児肝細胞、および成人肝細胞におけるＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰα、およびＣ／ＥＢＰβの発現を検討した
電気泳動後２％低融点アガロースをＵＶトランスイルミネーター（ＵＶＰ社、  ＮＬＭＳ−２０Ｅ）より２５４ｎｍの紫外線を照射してゲルカメラ（フナコシＤＳ−３００）を用いてポラロイド写真（富士フイルム株式会社、ＦＰ−３０００Ｂ）を撮影して電気泳動パターンを解析した。
【００７７】
ＰＣＲサイクルは、熱変性：９４°Ｃ、１分、アニーリング１分、伸長反応：７２°Ｃで１分、３０サイクルで実施した。
【００７８】
ＧＡＴＡ４のプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣ−３’（配列番号１）
リバース；５’−ＡＧＡＣＡＴＣＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＡＣＧ−３’（配列番号２）
アニーリング温度は、５５．９°Ｃで実施した。
【００７９】
ＦＯＸＡ２のプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号３）
リバース；５’−ＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴ−３’（配列番号４）
アニーリング温度は、６０°Ｃで実施した。
【００８０】
ＨＥＸのプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＴＴＣＴＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＣＣＡＴＣＧ−３’（配列番号５）
リバース；５’−ＴＴＴＴＡＴＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＣＡＣ−３’（配列番号６）
アニーリング温度は、５６．２°Ｃで実施した。
【００８１】
Ｃ／ＥＢＰαのプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＴＧＧＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号７）
リバース；５’−ＴＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＣ−３’（配列番号８）
アニーリング温度は、６９．１°Ｃで実施した。
【００８２】
Ｃ／ＥＢＰβのプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＣ−３’（配列番号９）
リバース；５’−ＡＡＧＴＴＣＣＧＣＡＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧ−３’（配列番号１０）
アニーリング温度は、５９．５°Ｃで実施した。
【００８３】
１．２  実験結果
電気泳動の結果を図１に示した。各レーンは、レーン１：水、２：ｉＰＳ細胞、３：胎児肝、４：成人肝を表す。
【００８４】
本実験において、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＨＥＸ、およびＣ／ＥＢＰαは胎児、成人肝に発現がみられたがｉＰＳ細胞には発現が認められなかった。また、Ｃ／ＥＢＰβはｉＰＳ細胞、胎児肝、成人肝ともに発現が認められた。
【実施例２】
【００８５】
増殖促進剤のみによっては非発現の転写因子の検討
２．１  実験材料および方法
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７、理研細胞バンク）をマトリゲルコーティングした６孔プレートに播種し、フィーダー細胞を用いることなく幹細胞の未分化維持培養のためのフィーダーレス培地ＲｅｐｒｏＦＦ（商標、株式会社リプロセル）を培地とし３７°Ｃ、５％炭酸ガスの定法の条件下培養した。
【００８６】
Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）に２０％のノックアウト血清代替物（ライフテクノロジージャパン株式会社）、１０％Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（ライフテクノロジージャパン株式会社）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ライフテクノロジージャパン株式会社）、および、１ｍＭの２−メルカプトエタノールを添加した培地をｉＰＳｍ（−）培地とした。
【００８７】
ｉＰＳｍ（−）培地に、下記の増殖促進剤を添加し、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ６、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、ＴＴＲ、およびＣ／ＥＢＰαの発現を実験１と同様の方法で行った。
【００８８】
添加した増殖促進剤は、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子、和光純薬工業株式会社）、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−４  （和光純薬工業株式会社）、オンコスタチンＭ（和光純薬工業株式会社）、上皮成長因子（ＥＧＦ、和光純薬工業株式会社）、神経成長因子（ＮＧＦ、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社）、ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社）、レチノイン酸（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を使用した。
【００８９】
なお、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ６、およびＴＴＲに対するＲＴ−ＰＣＲは下記の条件で実施した。
【００９０】
ＳＯＸ−１７のプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＣＧＣＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＴＧＧＧＣＴＡＡＧＧＡＣＧ−３’（配列番号１１）
リバース；５’−ＴＡＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１２）
アニーリング温度は、６３°Ｃで実施した。
【００９１】
ＧＡＴＡ６のプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＴＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴＴＧＧＡＴＴＧＴＣ−３’（配列番号１３）
リバース；５’−ＧＴＧＴＴＧＴＧＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１４）
アニーリング温度は、５５．９°Ｃで実施した。
【００９２】
ＴＴＲのプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＧＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＧＴＧＴＣＣＴＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１５）
リバース；５’−ＧＴＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＡＡ−３’
（配列番号１６）
アニーリング温度は、６１°Ｃで実施した。
【００９３】
２．２  実験結果
電気泳動の結果を図２に示した。各レーンは、レーン１：水、２：ＲｅｐｒｏＦＦ、３：ｉＰＳｍ（−）、４：ｂＦＧＦ、５：ＢＭＰ−４、６：オンコスタチンＭ、７：ＥＧＦ、８：ＮＧＦ、９：ＴＧＦ−β１、１０：レチノイン酸、１１：ＨＧＦを表す。
【００９４】
ＳＯＸ−１７はオンコスタチンＭ、ＧＡＴＡ６はＥＧＦ、ＴＧＦ−β、レチノイン酸によってそれぞれ発現が認められた。Ｃ／ＥＢＰαはオンコスタチンＭでわずかに発現がみられた。しかし、これらの増殖促進剤によって、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、およびＣ／ＥＢＰαの発現は認められなかった。
【実施例３】
【００９５】
増殖促進剤の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析
実施例２の結果に基づき、増殖促進剤の添加で発現が認められない転写因子ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、およびＣ／ＥＢＰαについて、各発現ベクターをヒト人工多能性幹細胞へ導入して肝前駆細胞への分化誘導を試みた。
【００９６】
３．１  実験材料および方法
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７、理研細胞バンク）をマトリゲルコーティングした６孔プレートに播種し、ＲｅｐｒｏＦＦを培地として３７°Ｃ、５％炭酸ガスの条件下、定法により培養した。リポフェクション用試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（登録商標、ライフテクノロジージャパン株式会社）を用いてＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、およびＣ／ＥＢＰαの発現プラスミドを各０．５μｇづつトランスフェクションした。
【００９７】
転写因子の発現ベクターは、ヒトＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、およびＣＥＢＰＡの完全長ｃＤＮＡがそれぞれサイトメガロウイルス由来の強力なプロモーターの下流に組み込まれた発現ベクター（ヒトＴｒｕｅＣｌｏｎｅ、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、コスモ・バイオ株式会社）が用いられた。ヒトＦＯＸＡ２発現ベクター（カタログ番号ｓｃ１２２９１３）はヒトＦｏｘＡ２タンパク質をコード化する完全長ｃＤＮＡがｐＣＭＶ６−ＸＬ５のＥｃｏＲ１およびＳａｌ１切断部位の間に挿入された。ヒトＧＡＴＡ４発現ベクター（カタログ番号ｓｃ１２４０３７）はヒトＧＡＴＡ４タンパク質をコード化する完全長ｃＤＮＡがｐＣＭＶ６−ＸＬ４のＥｃｏＲ１およびＳａｌ１切断部位の間に挿入された。ヒトＨＥＸ発現ベクター（カタログ番号ｓｃ３２１６２６）はヒトＨＨＥＸタンパク質をコード化する完全長ｃＤＮＡがｐＣＭＶ６−ＡＣのＳｇｆ１およびＭｌｕ１切断部位の間に挿入された。ヒトＣＥＢＰＡ発現ベクター（カタログ番号ｓｃ３０３４７２）はヒトＣＥＢＰＡタンパク質をコード化する完全長ｃＤＮＡがｐＣＭＶ６−ＸＬ５のＥｃｏＲ１およびＳａｌ１切断部位の間に挿入された。
【００９８】
トランスフェクション直前に前記ｉＰＳｍ（−）培地にオンコスタチンＭ（和光純薬工業株株式会社）、ＥＧＦ（和光純薬工業株株式会社）、レチノイン酸（和光純薬工業株株式会社）を添加した培地に変更した。ここでｉＰＳｍ（−）培地とは京都大学ＣｉＲＡが推奨するヒトｉＰＳ細胞のフィーダー細胞用の培地から塩基性線維芽細胞成長因子を除いたものである。具体的には、２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、ライフテクノロジージャパン株式会社）、１０％Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（ライフテクノロジージャパン株式会社）、２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジージャパン株式会社）および０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を添加したＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ−Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を使用した。
【００９９】
転写因子は３日ごとにトランスフェクションを３回繰り返し８日目にＩｓｏｇｅｎ  （株式会社ニッポンジーン）を用いてＲＮＡを抽出した。このＲＮＡよりスーパースクリプト  ＩＩＩ  ファーストストランドシステム（ライフテクノロジージャパン株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを２０倍希釈し、リアルタイムＰＣＲ解析試薬Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（登録商標、ライフテクノロジージャパン株式会社）を用いてリアルタイム定量ＰＣＲ法にて肝前駆細胞の指標であるαフェトプテイン（ＡＦＰ）の発現量を解析した。なお、解析にはリアルタイムＰＣＲ検出装置ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。肝前駆細胞の指標としてαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、  Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  （ＤＬＫ）−１の発現量をリボゾーム関連タンパク質（ＲＬＰ１９）を内部標準として定量した（各群  ｎ＝３）。
【０１００】
リアルタイム定量ＰＣＲは、下記のプライマーを用い、ＰＣＲサイクルは９５°Ｃで５秒、６０°Ｃで２０秒、３０サイクルで実施した。
【０１０１】
ＡＦＰのプライマーの塩基配列：（１４７ｂｐ）
フォワード；５’−ＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＣＣＣＡＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１７）
リバース；５’−ＧＧＴＧＣＡＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＧＡＴＧ−３’（配列番号１８）
ＤＬＫ−１のプライマー塩基配列：（１２１ｂｐ）
フォワード；５’−ＧＧＡＴＧＡＧＴＧＣＧＴＣＡＴＡＧＣＡＡ−３’（配列番号１９）
リバース；５’−ＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣ−３’（配列番号２０）
ＲＬＰ１９のプライマー塩基配列：（１５７ｂｐ）
フォワード；５’−ＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号２１）
リバース；５’−ＣＣＡＴＧＡＧＡＡＴＣＣＧＣＴＴＧＴＴＴ−３’（配列番号２２）
３．２  実験結果
各増殖促進剤の添加によるαフェトプロテインの発現の亢進を検討した結果を図３−１及び図３−２に示した。図３−１及び図３−２の棒グラフの横軸の数値は、以下の増殖促進剤を培地に添加した場合を表す。誤差棒は、標準誤差を表す。１：ＲｅｐｒｏＦＦ、２：オンコスタチンＭ、３：上皮成長因子、４：レチノイン酸、５：デキサメタゾン、６：ＩＴＳ、７：オンコスタチンＭと上皮成長因子とレチノイン酸との共添加、８：オンコスタチンＭと上皮成長因子とレチノイン酸とデキサメタゾンと（インシュリン、トランスフェリンおよび亜セレン酸イオン、以下ＩＴＳと記載）との共添加群を表す。
【０１０２】
図３−１に示すとおり、αフェトプロテインの発現は、オンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、ＩＴＳとを共添加した培地で培養した群で最も亢進し、次に、オンコスタチンＭ添加群であった。
【０１０３】
図３−２に示すとおり、一方、ＤＬＫ−１に対しては、オンコスタチンＭ添加群が最も発現亢進し、次に、オコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、ＩＴＳとを共添加した群の順序であった。
【０１０４】
図３−１に示した各レーンの数値は、  レーン  １：  １００±１１，  ２
：  １７２±１１．  ３：  １３９±１３，４：  １３３±５８，  ５：  ５
０．１±５，  ６：  ４９±７，  ７：  １２５±１３，  ８：  ３５９±２
６、である。また図３−２に示した各レーンの数値は、  レーン  １：  １００±２５，  ２：  ６２３±８６，  ３：  ５９±７，  ４：  ７９±４０，
５：  ２０８±５４，  ６：  １０６±１９，  ７：  ３４６±３１，  ８
：  ４４９±６６、である。
【０１０５】
以上の結果より、オンコスタチンＭと、上皮成長因子と、レチノイン酸と、デキサメタゾンと、ＩＴＳとを共添加した群がαフェトプロテインおよびＤＬＫ−１の両方の発現の亢進に対して最も効果的であることが示された。
【実施例４】
【０１０６】
転写因子の組合せによる肝前駆細胞への分化誘導の解析
４．１  実験材料および方法
転写因子ＦＯＸＡ２（以下Ｆと記載）、ＧＡＴＡ４（以下Ｇと記載）、ＨＥＸ（以下Ｈと記載）、およびＣ／ＥＢＰα（以下Ａと記載）を３日毎に３回、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸを用いてトランスフェクションした。増殖促進剤は、ＥＧＦと、レチノイン酸と、オンコスタチンＭと、デキサメタゾンと、ＩＴＳとを添加した。８日目に実施例３と同様の方法で、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。
【０１０７】
ＡＦＰ、ＤＬＫ−１は肝前駆細胞の指標、Ｇ−ＧＴＰは胆管上皮細胞への分化能の指標として、ＮＡＮＯＧを未分化能の指標として解析した。
【０１０８】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲは、下記の条件で実施した。ＰＣＲサイクル：９５°Ｃで５秒、６０°Ｃで２０秒、３０サイクルで実施した。
【０１０９】
Ｇ−ＧＴＰのプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＡＡＡＧＧ−３’（配列番号２３）
リバース；５’−ＣＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧ−３’（配列番号２４）
ＮＡＮＯＧのプライマー塩基配列：
フォワード；５’−ＣＣＧＴＴＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＴＴＴＧ−３’
（配列番号２５）
リバース；５’−ＴＣＡＴＣＧＡＡＡＣＡＣＴＣＧＧＴＧＡＡ−３’
（配列番号２６）
４．２  実験結果
結果を図４−１、図４−２、図４−３及び図４−４に示した。各レーンは、レーン１：ＲｅｐｒｏＦＦ、２：ＧＨＣ（ＧＡＴＡ４とＨＥＸとＣ／ＥＢＰα）の組合せ、３：ＦＨＡ（ＦＯＸＡ２とＨＥＸとＣ／ＥＢＰα）の組合せ、４：ＦＧＡ（ＦＯＸＡ２とＧＡＴＡ４とＣ／ＥＢＰα）の組合せ、５：ＦＧＨ（ＦＯＸＡ２とＧＡＴＡ４とＨＥＸ）の組合せ、６：ＦＧＨＡ（ＦＯＸＡ２とＧＡＴＡ４とＨＥＸとＣ／ＥＢＰα）の組合せ、７：胎児肝を表す。
【０１１０】
ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、およびＣ／ＥＢＰαの４種の発現ベクターを同時にトランスフェクションした実験群は、ＡＦＰ（図４−１）、ＤＬＫ−１（図４−２）、およびＧ−ＧＴＰ（図４−３）を発現し、ＮＡＮＯＧ（図４−４）の発現が低下した。特に、ＦＯＸＡ２とＧＡＴＡ４とＨＥＸとＣ／ＥＢＰαとの４種の発現ベクターをトランスフェクションしたレーンは、このうちの３種の発現ベクターをトランスフェクションするよりもＧ−ＧＴＰの発現がもっとも強いとの結果を得た。
【０１１１】
本結果より、ＦＯＸＡ２とＧＡＴＡ４とＨＥＸとＣ／ＥＢＰαの転写因子の組合せ、およびＥＧＦと、レチノイン酸と、オンコスタチンＭと、デキサメタゾンと、ＩＴＳとの増殖促進剤の組合せはｉＰＳ細胞から肝前駆細胞へ最も効率よく分化誘導することが明らかになった。
【０１１２】
図４−１に示した各レーンの数値は、  レーン  １：  １００±１８，  ２：  ７５±９３，  ３：  ９８±１３，  ４：  ３５９±２９，  ５：  ５４４±２０，  ６：  ３７８±４５，  ７：  ６２９±５４である。図４−２に示した各レーンの数値は、  レーン  １：  １００±１７，  ２：  ３３９±４８，  ３：  ２２６±１４，  ４：  １５３±１０，  ５：  ３９±３，  ６：  ２１５±４１，  ７：  １７５±２２である。図４−３  に示した各レーンの数値は、レーン  １：  １００±１５，  ２：  ２０±３，  ３：  ３１±６，  ４：  ４７±６，  ５：  ７５±７，  ６：  ８３±４，  ７：  ４０８±３６である。図４−４  に示した各レーンの数値は、  レーン  １：  １００±１４，  ２：  ０．５５±０．３，  ３：  １．１６±０．４，  ４：  １．０±０．２，  ５：  １．２±０．４，  ６：  ０．４５±０．０５，  ７：  ０．１７±０．０５である。
【実施例５】
【０１１３】
肝前駆細胞へ分化誘導された細胞のインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の取り込み機能の解析
５．１  実験材料および方法
実施例３および４の結果に基づき、同様の方法で、人工多能性幹細胞に対してＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ、Ｃ／ＥＢＰαを３日毎に３回、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸを用いてトランスフェクションを繰り返し、増殖促進剤としてＥＧＦと、レチノイン酸と、オンコスタチンＭと、デキサメタゾンと、ＩＴＳとを添加した培地で培養した。成人では肝細胞のみが能動的に取り込むＩＣＧを実施例３に基づいて分化誘導８日目に、培地にＩＣＧ（参天製薬株式会社）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。添加１５分後に光学顕微鏡ＣＫＸ４１Ｎ−３１ＰＨＰ（オリンパス株式会社）にて、ＩＣＧの細胞への取り込みを観察した。
【０１１４】
５．２  実験結果
図５−１及び図５−２は、前記５種類の分化誘導剤の存在下で前記４種類の転写因子が３回リポフェクションされた第８日の２０１Ｂ７細胞の２００倍の位相差顕微鏡写真である。スケールバーは２５μｍを表す。図５−１はインドシアニングリーン処理が施されない細胞の写真で、図５−２はインドシアニングリーン処理が施された細胞の写真である。図５−３及び図５−４は、それぞれ図５−１及び図５−２の原図（カラー）で緑色の部分が白色に変換されて強調された写真である。図５−４では、矢印は原図で緑色の部分を指し示す。図５−４に示されるとおり、前記５種類の分化誘導剤の存在下で前記４種類の転写因子が３回リポフェクションされた第８日の２０１Ｂ７細胞の培養には、インドシアニングリーンが取り込まれて緑色に染色された細胞が観察された。インドシアニングリーンは肝細胞でのみ血液循環から細胞内に取り込まれることが知られている。そこで本発明の方法によって未分化のヒトｉＰＳ細胞から８日間で分化が誘導された肝前駆細胞は肝細胞の機能を発現していることが示された。
【図３−１】
2013226127.tif 000002
【図３−２】
2013226127.tif 000003
【図４−１】
2013226127.tif 000004
【図４−２】
2013226127.tif 000005
【図４−３】
2013226127.tif 000006
【図４−４】
2013226127.tif 000007
【図１】
2013226127.tif 000008
【図２】
2013226127.tif 000009
【図５−１】
2013226127.tif 000010
【図５−２】
2013226127.tif 000011
【図５−３】
2013226127.tif 000012
【図５−４】
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【配列表】
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