(57)【要約】【課題】本発明は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド、並びにそれらの利用方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、一態様において、前記塩基の５位に、５−ＦＡＭ、６−ＦＡＭ、５−ＴＡＭＲＡ、６−ＴＡＭＲＡ、ＤＡＮＳＹＬ、５−ＨＥＸ、６−ＨＥＸ、５−ＴＥＴ、６−ＴＥＴ、５−ＲＯＸ、及び６−ＲＯＸからなるグループから選択される蛍光色素、あるいは、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ１及びＢＨＱ２からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、  ５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項２】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドであって、前記塩基の５位が、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、Ｎ−メチル−Ｎ−[４−[２−メトキシ−５−メチル−４−（２−ニトロ−４−メチルフェニルアゾ）フェニルアゾ]フェニル]−４−アミノ酪酸（ＢＨＱ１）及びＮ−メチル−Ｎ−[４−[２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニルアゾ]フェニル]−４−アミノ酪酸（ＢＨＱ２）からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している、前記ヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項３】
前記塩基の５位の蛍光色素又は消光色素が、下記の化学式Ｉ−ＩＩＩ：
【化１】
2013067622.tif 000012
［式Ｉ中、ｎは１ないし５の整数から選択される］
【化２】
2013067622.tif 000013
［式ＩＩ中、ｍ及びｌは、１ないし５の整数から各々独立に選択される］
及び
【化３】
2013067622.tif 000014
からなるグループから選択されるリンカーを介して、塩基の５位に結合している、請求項１又は２に記載のヌクレオシド又はヌクレオチド。
【請求項４】
前記請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた、核酸。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオチドと、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記６位置換された２−アミノプリン−９−イル基が２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基である、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオチドと、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本鎖核酸上に存在する、請求項４ないし６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとして使用される、請求項４ないし７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
１）前記請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し；
２）前記核酸を標的タンパク質と結合させ；
３）標的タンパク質を支持体に付着させ；そして
４）支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。
【請求項１０】
１）前記請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し；
２）前記核酸を標的タンパク質と結合させ；
３’）標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
；そして
４’）溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む、標的タンパク質の検出方法。
【請求項１１】
Ｉ−１）請求項１に記載のヌクレオチドを含む核酸と、請求項２に記載のヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
Ｉ−２）蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【請求項１２】
ＩＩ−１）各々異なる蛍光色素であって、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示す２種類の蛍光色素を各々含む、２種の請求項１に記載の核酸をハイブリダイズさせ、そして
ＩＩ−２）蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【請求項１３】
１）前記請求項１ないし３のいずれか１項に記載のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し；
２）前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ；そして
３）前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、低分子化合物の検出方法。
【請求項１４】
前記試料が溶液であり、工程２）において核酸と試料との接触を溶液中で行うことを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
低分子化合物が、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド及びアミノ酸からなるグループから選択される、請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な非天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチド及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子である核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）は、生命活動に必要となる膨大な量の遺伝情報を、僅か４種類の塩基の組合せからなる配列として記録している。また、核酸は自分自身を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼにより自己複製し、さらにＲＮＡポリメラーゼによる転写、リボソームによる翻訳というプロセスを介して、ＤＮＡからＤＮＡへ、ＤＮＡからＲＮＡへ、ＲＮＡからタンパク質へと遺伝情報を伝達する。この遺伝情報の複製と伝達を可能としているのは排他的な塩基対形成（Ａ−Ｔ／Ｕ、Ｇ−Ｃ）のルールである。また、核酸は、多様な高次構造を形成して様々な機能を発揮する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によって、アプタマーやリボザイムの機能を有する新規核酸がこれまでに多数見つかってきたこともその一つである。
【０００３】
しかし、２０種類のアミノ酸からなるタンパク質に比べて、天然の核酸には４種類の塩基（２種類の塩基対）しかないという事実は、核酸の化学的・物理的多様性に限界を与えている。たとえば、生体中のｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ等の機能性ＲＮＡは自分自身の構造を安定化したり、ＲＮＡ−ＲＮＡ間、ＲＮＡ−タンパク質間相互作用を安定化するために、様々な修飾塩基を利用している。したがって、新規機能性核酸の開発において、新たな塩基（対）のレパートリーを増やすことは大変有益であると考えられる。
【０００４】
核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製への取り組みが行われている。核酸に修飾塩基（もしくは非天然型塩基）を導入する手法として、１）化学合成により直接導入する方法、２）核酸合成酵素により導入する方法が考えられる。１）の場合は、アミダイトユニットの安定性や塩基部分の適当な保護基が存在すること等化学合成上の問題の解決が必要である。また、これらの問題が解決されれば様々な非天然型塩基を位置選択的に導入できるが、その核酸の増幅は困難であり、長鎖長の核酸の合成も難しくなる。２）の場合は、もし、基質が酵素に認識され、人工塩基対間で相補的に複製、転写されれば、その核酸の増幅・調製が可能となるが、そのような基質や塩基対（非天然型ヌクレオチド）も開発途中である。
【０００５】
人工塩基対の背景
天然の二本鎖ＤＮＡ中のＡとＴ及びＧとＣは、それぞれ特異的な水素結合を介して互いに「排他的」な塩基対を形成している。近年、天然型塩基対と異なる水素結合様式をもち、かつ立体障害によって天然型塩基との対合を排除できるような塩基対を創出の研究が行われている。例えば、Ｏｈｔｓｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＨｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２では、プリンの６位にかさ高い置換基を導入した２−アミノ−６−ジメチルアミノプリン（ｘ）と２−アミノ−６−チエニルプリン（ｓ）、そしてそのかさ高い置換基に相補する部位に水素原子をもった２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（ｙ）をデザインし、このｘ−ｙ、ｓ−ｙ塩基対形成をＫｌｅｎｏｗフラグメントによるＤＮＡ中への取り込み効率により調べた。その結果、鋳型中のｘに対するｙの取り込みは低い選択性しか示さなかったが、ｓに対するｙの取り込みは、比較的選択性も効率も良いことが示されていた（図１）。
【０００６】
上記ｓ−ｙ塩基対の開発によって、ＲＮＡ中に選択的にｙを導入することが可能になった。本発明者らはさらに、ｙに機能性の置換基が結合した物質が得られれば、アプタマーやリボザイム等の新規機能性分子が創製可能にある、と考えた。そこで、５位がヨウ素等で置換されている５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを有する核酸を開発した。人工塩基対の開発の経緯、並びに５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオシド及びヌクレオチドについては、ＷＯ２００４／００７７１３（２００４年１月２２日公開）に詳述されている。
【０００７】
核酸の標識及び検出
従来より、放射性元素、蛍光色素等を用い核酸を標識することが行われている。しかし、天然型の塩基を含む核酸の場合は、核酸の末端のみが標識されるか、あるいは天然型塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）のいずれか標識されたものを核酸内部に取り込む場合は、標識核酸が多数ランダムに取り込まれる、という本質的な問題がある。核酸の内部を、例えば蛍光色素を用いて、部位特異的に標識する方法が希求される。
【０００８】
以下の文献は、参考文献としてその内容が本明細書中に援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００４／００７７１３
【非特許文献】
【００１０】
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、一態様において、前記塩基の５位に、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される蛍光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。本明細書においては、５−ＦＡＭ及び６−ＦＡＭ、５−ＴＡＭＲＡ及び６−ＴＡＭＲＡ、５−ＨＥＸ及び６−ＨＥＸ、５−ＴＥＴ及び６−ＴＥＴ、ならびに、５−ＲＯＸ及び６−ＲＯＸ、の各々を特に区別する必要のない場合は単に、それぞれ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、及びＲＯＸと記載することがある。
【００１２】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、別の態様において、前記塩基の５位が、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、Ｎ−メチル−Ｎ−[４−[２−メトキシ−５−メチル−４−（２−ニトロ−４−メチルフェニルアゾ）フェニルアゾ]フェニル]−４−アミノ酪酸（ＢＨＱ１）及びＮ−メチル−Ｎ−[４−[２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニルアゾ]フェニル]−４−アミノ酪酸（ＢＨＱ２）からなるグループから選択される消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の前記５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた、核酸を提供する。本発明の核酸中のヌクレオチドは、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドと塩基対を形成しうる。本発明の核酸は、一態様において、前記５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、同一の一本鎖核酸上に存在する。
【００１４】
本発明はさらにまた、標的タンパク質の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、一態様において
１）本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し；
２）前記核酸を標的タンパク質と結合させ；
３）標的タンパク質を支持体に付着させ；そして
４）支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
【００１５】
本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程３）及び４）に代えて
３’）標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
；そして
４’）溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
【００１６】
本発明はまた、本発明のヌクレオチドを利用して核酸の二本鎖形成を検出する方法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法Ｉ又はＩＩの方法を用いて行うことができる。
【００１７】
方法Ｉ
Ｉ−１）本発明の、５位が蛍光色素で置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、５位が消光色素で置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
Ｉ−２）蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【００１８】
方法ＩＩ
ＩＩ−１）本発明の、５位が蛍光色素で置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、２種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示す２種類の蛍光色素を各々含む、前記２種類の核酸をハイブリダイズさせ、
ＩＩ−２）蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは上記問題の解決のために、鋭意研究に努めた結果、転写で選択的に機能する人工塩基対の開発に成功し、これを用いてＲＮＡ中に部位特異的に修飾ヌクレオチドを導入することを可能にした。本発明の修飾ヌクレオチドは、転写によりＲＮＡ中に取り込まれ、核酸の部位特異的な蛍光標識を可能にした。本発明者はさらに、標識核酸と相互作用する分子（核酸、タンパク質）などを検出するシステムを作り出すことに成功した。
【００２０】
５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチド
本発明は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを提供する。本発明の５位置換ピリジン塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドは、５位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカーを介して結合していることを特徴とする。
【００２１】
本発明における「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。なお、前記「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、及びこれら塩基の誘導体も含む概念である。前記「誘導体」の種類は特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基に相当する塩基や、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基に相当する塩基、などが挙げられる。「ヌクレオチド」は、前記ヌクレオシドの糖部分が、リン酸とエステルをつくっている化合物をいう。より好ましくは、一、二、又は三リン酸エステルである。ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖部分はリボフラノシル、２’−デオキシリボフラノシル、あるいはハロゲンなどの置換基を２’位に有する２’−置換リボフラノシルであってもよく、また、リン酸部分は、チオリン酸であってもよい。つまり、糖部分及びリン酸部分は、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド、あるいはこれらの誘導体にみられる構成をとっていればよい。糖部分がリボフラノシルであるリボヌクレオチドはＲＮＡの構成成分となり、デオキシリボフラノシルであるデオキシリボヌクレオチドはＤＮＡの構成成分となる。
【００２２】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基に相当する塩基の５位に蛍光色素又は消光色素が、直接又はリンカーを介して結合している。
【００２３】
蛍光色素は、公知の蛍光色素を利用可能であるが、好ましくは、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（ＤＡＮＳＹＬ）、５−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（５−ＨＥＸ）、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（６−ＨＥＸ）、５−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（５−ＴＥＴ）、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン（６−ＴＥＴ）、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（６−ＲＯＸ）からなるグループから選択される。フルオレセイン及びローダミンは、一般的に開環型及びスピロ型の二通りで表記される。例えば、５−カルボキシフルオレセインを開環型で表記すると、
【００２４】
【化１】
2013067622.tif 000002
【００２５】
となり、そしてスピロ型で表記すると、
【００２６】
【化２】
2013067622.tif 000003
【００２７】
となる。図１及び図３ではこれらの蛍光色素は開環型で示しているが、スピロ型で表記したものも本発明に含まれる。これらの蛍光色素については、例えば Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｉｓｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６及び、Ｃｈｅｈａｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９に詳述されている。
【００２８】
例えば、ＦＡＭの吸収極大波長は４９３ｎｍ、蛍光極大波長は５２２ｎｍである。また、ＴＡＭＲＡの吸収極大波長は５５３ｎｍ、蛍光極大波長は５７８ｎｍである。ＤＡＮＳＹＬの吸収極大波長は３３５ｎｍ、蛍光極大波長は５１８ｎｍである。ＨＥＸの吸収極大波長は５３５ｎｍ、蛍光極大波長は５５６ｎｍである。ＴＥＴの吸収極大波長は５２１ｎｍ、蛍光極大波長は５３６ｎｍである。５−ＲＯＸの吸収極大波長は５６７ｎｍ、蛍光極大波長は５９１ｎｍである。６−ＲＯＸの吸収極大波長は５７０ｎｍ、蛍光極大波長は５９０ｎｍである。
【００２９】
本発明のヌクレオチドは５位置換基として蛍光分子を有するため、蛍光分子の種類に応じて、本発明のヌクレオチドを含む核酸の検出を行うことが可能である。よって、本発明のヌクレオチドを含む核酸は、標識核酸として当該核酸と相互作用する物質検出のプローブとして使用されうる。また、各蛍光色素によって蛍光色が異なるため、多重染色に使用することも可能である。
【００３０】
消光色素は、公知の消光色素を利用可能であるが、好ましくは、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、Ｎ−メチル−Ｎ−[４−[２−メトキシ−５−メチル−４−（２−ニトロ−４−メチルフェニルアゾ）フェニルアゾ]フェニル]−４−アミノ酪酸（ＢＨＱ１）及びＮ−メチル−Ｎ−[４−[２，５−ジメトキシ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）フェニルアゾ]フェニル]−４−アミノ酪酸（ＢＨＱ２）からなるグループから選択される。これらの消光色素の存在により、蛍光色素の蛍光放出が消光色素へのエネルギー転移により抑制され、蛍光色素の蛍光が検出できなくなる。具体的には、ＤＡＢＣＹＬは、 ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＨＥＸ、Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３．５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し；ＢＨＱ１は、ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、ＴＥＴ、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｒ６Ｇ−Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、ＪＯＥ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ＴＡＭＲＡなどの蛍光色素の蛍光放出を消光し；そして、ＢＨＱ２は、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３．５、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ−Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ６４０（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｂｏｉｄｉｐｙ  ６３０／６５０−Ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）、Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）などの蛍光色素の蛍光放出を消光する。
【００３１】
これらの消光色素については、例えばＴｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６及びＢｏｇｕｓｚｅｗｓｋａ−Ｃｈａｃｈｕｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、に詳述されている。
【００３２】
本明細書中、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基の５位に直接又はリンカーを介して結合している、蛍光色素及び／又は消光色素を、便宜上必要に応じ５位の「置換基」と呼称することがある。また、上記蛍光色素及び消光色素は、例えば、プロリゴ・ジャパン株式会社、Ｉｎｓｉｔｅｃｈ  ＩＮＣ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ等から購入することが可能である。
【００３３】
本発明の蛍光色素又は消光色素は、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基の５位に直接結合させても、あるいはリンカーを介して結合させてもよい。リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、下記の化学式Ｉ−ＩＩＩ
【００３４】
【化３】
2013067622.tif 000004
【００３５】
［式Ｉ中、ｎは１ないし５の整数から選択される］
【００３６】
【化４】
2013067622.tif 000005
【００３７】
［式ＩＩ中、ｍ及びｌは、１ないし５の整数から各々独立に選択される］
及び
【００３８】
【化５】
2013067622.tif 000006
【００３９】
からなるグループから選択される。
上記ｎ、ｍ及びｌは独立に選択され、好ましくは１ないし５、最も好ましくは、５である。リンカーが短いものは、転写反応において取り込まれる効率が僅かに落ちる。よって、長いリンカーである化学式Ｉ又はＩＩのリンカーが好ましい。また、化学式Ｉ−ＩＩＩのアミノアルキニル基部分は、三重結合部分が、単結合又は二重結合の対応するアミノアルキル基、又はアミノアルケニル基であってもよい。
【００４０】
その他、リンカーとしては、例えば、ジアミノエトキシエーテル型の
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＮＨ−
（Ｂａｒｎａｃｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１参照）、又は、
−［ＰＯ３］−（ＣＨ２）６−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−、もしくは
−［ＰＯ３］−（ＣＨ２）７−ＮＨ−
（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６参照）、のような構造のものが利用できる。
【００４１】
本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドの合成法は、特に限定されることはない。３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オンに、先ず５位に置換基を導入し、次いで、三リン酸を導入してもよい。あるいは、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２（１Ｈ）−オンに、先ず三リン酸を導入し、次いで、置換基を導入してもよい。特に、リンカー等の大きな基を導入する場合、先ず、ヨード等の光反応性基を導入して活性化してから、置換してもよい。好ましくは、反応基による活性化、リンカーの導入、三リン酸の導入、最後に置換基を導入する、また、置換基を導入する際の反応条件などは、ピリジンにこれら置換基を導入する反応の場合を参照して行うことができる。
【００４２】
本発明の一態様として、蛍光色素又はアミノ基を化学式Ｉの長いリンカーを介して５位に導入したｙＴＰの合成を図２に示した。さらに、化学式ＩＩＩの短いリンカーでＦＡＭを結合したｙＴＰ（ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙＴＰ）の合成を図３に示した。まず、ｙのヌクレオシドの５位をヨウ素化し、これにリンカーを結合し、三リン酸化、保護基の除去を行いアミノ基を導入したｙＴＰ（ＮＨ２−ｙＴＰ）を合成した。このＮＨ２−ｙＴＰを、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、あるいは、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）のコハク酸イミドエステル体で処理することにより、これらの色素を導入したＦＡＭ−ｙＴＰとＴＡＭＲＡ−ｙＴＰが得られた（実施例１−９）。
【００４３】
あるいは、本発明における蛍光色素又は消光色素による、２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドの修飾は、単独のヌクレオチド合成時ではなく、当該ヌクレオチドを含む核酸を転写等によって合成した後に行うことも可能である。実際、本願明細書の実施例１３では、転写によるＲＮＡ分子の合成後、蛍光基を導入することに成功した（図７）。好ましくは、大過剰量の蛍光分子のコハク酸イミドエステル誘導体を使用する。５位にリンカーを結合させた２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが、核酸分子の内側（中央側）に位置するより、末端に存在する方が導入効率が高いと期待される。
【００４４】
あるいは、単独のヌクレオチド合成時、又は、転写もしくは複製等によって核酸合成された後の蛍光分子又は消光分子による修飾には、上述の蛍光分子又は消光分子のコハク酸イミドエステル誘導体の他に、蛍光分子又は消光分子のイソチオシアナート誘導体（例えば、ＦＡＭのイソチオシアナート誘導体）又はスルホニルクロリド誘導体（例えば、ＤＡＮＳＹＬ−クロリド）を用いることによって行うことも可能である。
【００４５】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸
本発明は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を提供する。本明細書において「核酸」とは、１より多くのヌクレオチドが、５’→３’の方向に結合した核酸鎖の分子を意味する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡを含む。二本鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡであってもよい。また、ＤＮＡには、ＲＮＡを鋳型として逆転写してなるｃＤＮＡも含まれる。あるいは、核酸は３本鎖、４本鎖等も形成しうる。
【００４６】
本発明者らは、核酸のさらなる機能拡張をめざして、非天然型塩基をもつヌクレオシド又はヌクレオチドの創製へ取り組んでいる。新たに開発された人工塩基対の態様として、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（ｓと命名）と２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（ｙと命名）との塩基対、並びに２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン（ｖと命名）とｙとの塩基対が含まれる。（図１）。従来技術に対して、蛍光色素（及び消光色素）を結合した第５番目の塩基を人工塩基対を介して、転写により核酸中の特定部位に導入できれば、核酸の標識、そして、それによる核酸の検出が非常に簡便になる。本発明ではｓ−ｙという人工塩基対を用いて、これを可能にした。
【００４７】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドは、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドとが塩基対を形成することが可能である。図１にｙとｓ（２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基）、あるいは、ｙとｖ（２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基）と例示されているように、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基は、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基と、２箇所で水素結合を生じる。本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基は、立体構造上、天然型プリン塩基Ａ（アデニン）及びＧ（グアニン）とは塩基対を形成できない。そして、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基は立体障害のため、天然型Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル）及びＣ（シトシン）とは塩基対を形成できない。よって、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基は、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基と特異的に塩基対を形成することが可能である。
【００４８】
よって、本発明の核酸は、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとが塩基対を形成している、態様を含む。６位置換された２−アミノプリン−９−イル基は、好ましくは２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン−９−イル基（ｓ）又は２−アミノ−６−（２−チアゾリル）プリン−９−イル基（ｖ）である。後述の実施例で示されたようにｖの方がｓよりも転写によるｙの取り込む効率がよいため、より好ましくは、ｖである。
【００４９】
本発明において、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとは、異なる２本の核酸上に存在して塩基対により二本鎖を形成しうる。あるいは、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドと、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドとは同一の一本の核酸上に存在してもよい。この場合、塩基対により、一本鎖はループ構造を形成してもよい。
【００５０】
後述するように、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム、アプタマー又はＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）に用いられるＲＮＡとして使用されうる。あるいは、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれたＤＮＡ又はＲＮＡは、タンパク質、ペプチドの全体又は一部をコードするものであってもよい。
【００５１】
本発明のヌクレオシド又はヌクレオチドが組み込まれた核酸の合成
本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、転写、複製又は逆転写反応により、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸に取り込むことが可能である。具体的には、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸、例えば、ｓあるいはｖを含む鋳型ＤＮＡを用いてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を行うと、ｙの基質（ｙＴＰ）が部位特異的に、ｓあるいはｖに相補して、ＲＮＡ中に取り込まれる。ｙは、その５位を化学的に修飾することができるので、種々の機能性のｙ誘導体をＲＮＡ中の特定の部位に取り込ませることが出来る。
【００５２】
よって、限定されるわけではないが、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸は、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸を鋳型として転写、複製又は逆転写を行い、前記６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドの相補的な位置に、本発明の核酸を組み込む、ことを含む、方法によって調製することが可能である。あるいは、天然型塩基を有するヌクレオシド又はヌクレオチドと同様に、化学合成によってＤＮＡ又はＲＮＡに取り込んでもよい。
【００５３】
例えば、５位に蛍光色素をもつ標識ウリジン(Ｕ）を転写反応によりＲＮＡ中に導入する場合には、ＵＴＰと標識ＵＴＰの存在比を変えて転写反応を行い、Ｕの位置をランダムに標識Ｕで置換するか、あるいはＵＴＰの代わりに標識ＵＴＰだけを転写反応に用いてＵの位置を全て標識Ｕに置換するしかない。この場合、標識Ｕの導入によってＲＮＡの高次構造が変化してしまったり、ＲＮＡの機能に支障をきたすこともある［Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５］。
【００５４】
これに対し、本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基は、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基と特異的に塩基対を形成する。よって、所望の位置に６位置換−２−アミノプリン−９−イル基が導入されているＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、転写、複製又は逆転写反応を行うことにより、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを位置選択的（部位特異的）に導入することが可能となった。
【００５５】
転写、複製又は逆転写反応は公知の方法に従って行うことが可能である。限定されるわけではないが、例えば、転写反応はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ等）、複製反応は、クレノウフラグメント（ＫＦ）、逆転写反応はＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ  （ＡＭＶ−ＲＴ）（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用することが可能である。複製反応は、反応中に６位置換された２−アミノプリン−９−イル基が除去されてしまうのを防ぐために、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ  ＴａｑＴＭ）を用いてｓ又はｖを含むプライマーによる鋳型ＤＮＡのＰＣＲ増幅も可能である。
【００５６】
なお、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基を塩基として有するヌクレオチドは、公知の方法、例えば、［Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１］に記載の方法で合成可能である。
【００５７】
本発明では、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基の、６位置換された２−アミノプリン−９−イル基との特異的な塩基対を利用して、転写反応の１段階で位置選択的に本発明のヌクレオチドをＲＮＡに取り込むことが可能になった。本発明の非天然型の塩基を含む５種類の塩基からなるＲＮＡを任意に調製出来れば、核酸の特異的な標識が可能になり、その有用性・汎用性は非常に高い。
【００５８】
本発明の核酸のアンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム又はアプタマーとしての利用
本発明の一態様において、本発明の、ヌクレオチドが組み込まれた核酸は、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、リボザイム、アプタマー又はＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）に用いられるＲＮＡとして使用されうる。アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡとは、ある特定の遺伝子の発現を抑えるＤＮＡ又はＲＮＡである。標的とする遺伝子配列（センス鎖）の全長又は部分配列に対して相補的という意味で名付けられた。人為的に遺伝子発現を調節する手法として使用されうる。本発明のヌクレオチドが組み込まれたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは、非天然型塩基を含むため標的に対する相補性が天然型塩基のみを使用した場合と比較して異なるものを創製しうる。リボザイムは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称である。アプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクション法によって得られた、特定の分子に結合する機能を有する核酸である。ＲＮＡｉとは、細胞内で見つかったシステムで、短いＲＮＡ断片が翻訳を制御するシステムであり、外部から標的遺伝子に対応した短いＲＮＡ断片を細胞内に加えたり、発現させたりすることで、標的遺伝子の発現を抑える手法である。
【００５９】
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクションによって得られる、５位置換２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を含むアプタマーは、標的タンパク質と架橋反応する等の新機能を持つＲＮＡ分子を創製することも可能となる［Ｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４］。
【００６０】
さらに、蛍光分子をＲＮＡアプタマー中に導入してアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）として活用する例も報告されている［Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１］。
【００６１】
これまでに、修飾塩基として、フルオレセイン−１２−ウラシル（Ｆ−１２−Ｕ）［Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００］、５−（１−ペンチニル）ウラシル［Ｌａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４］、５−（３’’−アミノプロピニル）ウラシル［Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９］、５−ヨードウラシル（５ＩＵ）［Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５］、５−ブロモウラシル（５ＢｒＵ）［Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００］をｉｎ  ｖｉｔｒｏセレクションで利用した例が報告されている。しかしながら、これらの例では全て、ＤＮＡもしくはＲＮＡプールの調製の段階から修飾塩基を天然型塩基（ＴもしくはＵ）と置換している。
【００６２】
蛍光分子を含む本発明の核酸（アプタマー）は標的タンパク質を検出するためアナライトとして利用することが可能である。本発明は、本発明の核酸を利用した標的タンパク質の検出方法を含む。本発明の検出方法は、一態様において
１）本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し；
２）前記核酸を標的タンパク質と結合させ；
３）標的タンパク質を支持体に付着させ；そして
４）支持体に付着した標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含む。
【００６３】
本発明の検出方法は、別の態様において、前記工程３）及び４）に代えて
３’）標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
；そして
４’）溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでもよい。
【００６４】
本発明において、標的タンパク質は特に限定されず任意のものを対照とすることができる。結合する核酸分子（アプタマー）の塩基配列が解明されているものは容易に利用可能である。そのような標的タンパク質とアプタマーの組み合わせの例は、本明細書中に参考文献として援用されるＷＯ２００４／００７７１３の参考例１に記載のＲａｆ−１タンパク質とＲＮＡ  ９Ａ（ＷＯ２００４／００７７１３  図１３）及びＲＮＡ  ９Ｂである。
【００６５】
支持体としては、例えば、ニトロセルロースフィルター等が利用可能である。これらの支持体は標的タンパク質は付着するが、核酸分子は単独では結合しない。核酸はタンパク質に結合した場合のみ、タンパク質を介して支持体に付着する。支持体に付着したタンパク質−核酸の複合体は、核酸に結合した蛍光を測定にすることにより検出することができる。
【００６６】
本明細書の実施例１４では、ＦＡＭ−ｙをＲａｆ−１タンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマー（抗−Ｒａｆ−１アプタマー）ＲＮＡ  ９Ａの９０番目（全長１００ヌクレオチド）に導入し、この蛍光色素を導入したＲＮＡアプタマーと種々の濃度のＲａｆ−１タンパク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク質をニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合したＲＮＡアプタマーの蛍光を測定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた（図８）。これは、従来のラジオアイソトープでＲＮＡを標識する方法に代わる簡便な方法である
本発明の方法は、標的タンパク質の濃度を好ましくは０ｐｍｏｌ−１０００ｐｍｏｌ、より好ましくは０ｐｍｏｌ−５００ｐｍｏｌ、最も好ましくは１ｐｍｏｌ−１００ｐｍｏｌの範囲で、定量的に検出することが可能である。
【００６７】
支持体を利用する代わりに、限外濾過膜を用いて標的タンパク質を溶液中に選択的に留めてもよい。限外濾過膜を用いた標的タンパク質の検出方法は、前記工程３）及び４）に代えて
３’）標的タンパク質を限外濾過膜を用いて溶液中に選択的に留め
；そして
４’）溶液中に留まった標的タンパク質に結合した前記核酸の蛍光を測定する
ことを含んでよい。限外濾過膜は標的タンパク質のサイズに応じて適宜公知のものを使用することが可能である。
【００６８】
核酸の二本鎖の検出方法
本発明はさらに、本発明の核酸を利用した核酸の二本鎖の検出方法を提供する。本発明の検出方法は、より具体的には下記の方法Ｉ又はＩＩの方法を用いて行うことができる。
【００６９】
方法Ｉ
Ｉ−１）本発明の、５位が蛍光色素で置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸と、５位が消光色素で置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む核酸とをハイブリダイズさせ、そして
Ｉ−２）蛍光スペクトルの変化を測定する、
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【００７０】
方法ＩＩ
ＩＩ−１）本発明の、５位が蛍光色素で置換された、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオチドを含む、２種類の核酸であって、各々異なる蛍光色素であって、互いに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を示す２種類の蛍光色素を各々含む、前記２種類の核酸をハイブリダイズさせ、
ＩＩ−２）蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む、核酸の二本鎖形成の検出方法。
【００７１】
本発明の方法は、蛍光色素と消光色素、あるいは２種の蛍光色素が各核酸分子に存在する場合に、核酸の二本鎖が形成され色素同士が物理的に近傍に存在すると、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）が生じて蛍光スペクトルが変化する。本発明の方法は、核酸の二本鎖の形成をＦＲＥＴによる蛍光スペクトルの変化の測定によって検出するものである。
【００７２】
「蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）」は、ある蛍光分子から他の分子へ、共鳴により励起エネルギーが移動する現象を意味する。エネルギーを与える分子はドナー（供与体）、受け取る分子はアクセプター（受容体）と呼ばれる。ＦＲＥＴが生じると、エネルギーを失ったドナーは基底状態に戻り、同時にエネルギーを受け取ったアクセプターは励起状態となる。従って、ドナーの蛍光は弱まり、アクセプターが蛍光分子であればその蛍光が観察される。アクセプターが消光分子であれば、ドナーが単独の場合には観察されていた蛍光がＦＲＥＴにより観察されなくなる。ＦＲＥＴによるタンパク質の検出、核酸の検出の一般的な方法は公知であり、例えば、ＲＮＡアプタマーに２種類のＦＲＥＴを起こす色素を導入して、標的タンパク質を検出する方法（Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）や、ヘアピン型核酸を利用した相補鎖核酸の検出法（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６)が知られている。その他、ＦＲＥＴに関しては、Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１及びＫｌｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に概説されている。
【００７３】
ＦＲＥＴが生じるためには、以下の３条件を満たす必要がある。ｉ）ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルの重なりがあること。スペクトルの重なり範囲は大きい方が望ましいが、必ずしも完全に重なっている必要はない。ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルが３０％以上重なっていることが好ましく、５０％重なっていることがより好ましい。ｉｉ）ドナーとアクセプターが物理的に近距離に存在すること。ＦＲＥＴが５０％の確率で生じる距離は１ｎｍないし１０ｎｍと考えられており、ＦＲＥＴの効率はこの距離の変化に対して敏感に変化する。例えば、方法Ｉの場合、核酸が二本鎖を形成した場合に、蛍光色素で置換された５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基（ｙ）を塩基として有するヌクレオチドに対し、消光色素で置換されたｙを有するヌクレオチドが近接し、蛍光色素と消光色素の色素間の距離が好ましくは３０ｎｍ以内、より好ましくは１０ｎｍ以内、最も好ましくは５ｎｍ以内である場合に蛍光スペクトルの変化が検出可能である。ｉｉｉ）ドナーとアクセプターの相対的な向きが適切であること。
【００７４】
本発明で使用される蛍光色素の最大吸収スペクトルと蛍光スペクトルを以下にまとめた。
【００７５】
【表１】
2013067622.tif 000007
【００７６】
よって、方法ＩＩにおいて、アクセプター及びドナーの組み合わせとして使用できる態様は下記の通りである。
【００７７】
【表２】
2013067622.tif 000008
【００７８】
一方、方法Ｉにおいて、消光色素はドナーの種類に限定されず、アクセプターとして一般的に使用することができる。
本発明の方法は、核酸を合成する際、例えば鋳型ＤＮＡからＲＮＡを調製する際に、同時にＲＮＡを部位特異的に蛍光標識化することが出来るという利点があり、種々の検出方法、同定方法、診断方法等に応用できるものである。
【００７９】
低分子化合物の検出方法
本発明はさらにまた、低分子化合物を検出する方法を提供する。
本発明の検出方法は、
１）本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を合成し；
２）前記核酸を低分子化合物を含むと考えられる試料と接触させ；そして
３）前記核酸の蛍光スペクトルの変化を測定する
ことを含む。
【００８０】
本発明において、好ましくは前記試料は溶液であり、工程２）において核酸と試料との接触を溶液中で行うことを含む。本発明において試料が液体試料の場合、例えば、本発明のヌクレオチドが組み込まれた核酸を含む溶液を、セルに入れて、蛍光スペクトルの装置に装着し、そこに低分子化合物を含むと考えられる液体試料を加えて、そのまま蛍光強度の変化を測定することが可能である。蛍光強度が変化した場合、標的となる低分子化合物の検出と定量が可能である。定量は、例えば、既知の濃度の標的低分子化合物を含む試料を用いて予め作成した蛍光スペクトル、測定試料の蛍光スペクトルを比較することによって行うことが可能である。
【００８１】
本発明の方法によって測定される低分子化合物は特に限定されないが、好ましくは１）核酸へ結合する性質を有する、そして、２）核酸が本発明の５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル−基を塩基として有するヌクレオシド又はヌクレオチドを含むものであっても、核酸への結合が影響を受けない、という性質を有する。限定されるものではないが、低分子化合物の分子量は、約５００ないし１０００である。
【００８２】
本発明において、非限定的に、テオフィリン、塩基、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド、アミノ酸からなるグループから選択される（非特許文献４９）。
限定されるわけではないが、本発明の検出方法によって、好ましくは約１０ｎＭないし約１０ｍＭ、より好ましくは約１００ｎＭないし約１ｍＭ、さらにより好ましくは約１μＭないし約２０μＭの低分子化合物を検出することができる。
【００８３】
本明細書中、５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン−３−イル基を塩基として有するヌクレオシドを「５位置換−ｙ」もしくはもしくは「５−修飾ｙ」、特に置換基が蛍光色素の場合には、「蛍光色素−結合ｙ」と記載することがある。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、ｓ−ｙとｖ−ｙの人工塩基対と５位を修飾したｙの誘導体を示す。
【図２】図２は、蛍光色素又はアミノ基を長いリンカーで結合したｙＴＰの合成スキームを示す。各工程の条件及び収率は下記の通りである。
【００８５】
（ａ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、室温、８２％；
（ｂ）ｉ）（ＣＨ３ＣＯ）２Ｏ、ピリジン、室温、ｉｉ）Ｃ２Ｈ５ＯＨ、還流、８４％；
（ｃ）ＣｕＩ、Ｐｄ［Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３］４、ＤＭＦ、（Ｃ２Ｈ５）３Ｎ、室温、次いで、６−（トリフルオロアセタミド）カプロン酸  プロプ−２−イニルアミド、８８％；
（ｄ）ＣＨＣｌ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、０℃、７４％；
（ｅ）２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オン／ジオキサン、トリ−ｎ−ブチルアミン、ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェート、Ｉ２／Ｈ２Ｏ／ピリジン、ジオキサン、ピリジン、室温、次いでＮＨ４ＯＨ；
（ｆ）Ｒ−Ｎ−スクシンイミジルエステル／ＤＭＦ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ａｑ．、室温、次いでＮＨ４ＯＨ。
【図３】図３は、蛍光色素（ＦＡＭ）を短いリンカーで結合したｙＴＰの合成スキームを示す。
【図４】図４は、ＦＡＭ−ｙＴＰとＴＡＭＲＡ−ｙＴＰの蛍光特性を示す。図４ａはＦＡＭ−ｙＴＰ及びＴＡＭＲＡ−ｙＴＰの吸収スペクトルを示し、図４ｂはＦＡＭ−ｙＴＰ及びＴＡＭＲＡ−ｙＴＰの蛍光スペクトルを示す。ダイヤモンド形は、ＦＡＭ−ｙＴＰの結果を、正方形は、ＴＡＭＲＡ−ｙＴＰの結果を示す。
【図５ａ】図５ａは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるＦＡＭ−ｙＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｙＴＰのＲＮＡへの導入を示す。鋳型がＡの場合を１００とする相対収率は、レーン１−９の順に、１０３、４９、１００，７６、２６、１００、６１、２１、１００であった。
【図５ｂ】図５ｂは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙＴＰ、ＦＡＭ−ｙＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｙＴＰ、Ｄａｎｓｙｌ−ｘ−ｙＴＰのＲＮＡへの導入を示す。鋳型がＡで天然型塩基のみの場合を１００とする相対収率は、レーン１−９の順に、７２、１０８、８０、９６、６２、１１０、４８、９４、１００であった。
【図６】図６は、２次元ＴＬＣによるＲＮＡリガンド中に取り込まれたＮＨ２−ｙと天然型ヌクレオチドの組成分析を示す。
【図７】図７は、ＮＨ２−ｙを導入したＲＮＡの転写後の蛍光標識化を示す。標識化の収率は、ＦＡＭ−ＳＥを×１００、×１０００使用した場合に各々６％、４０％、ＴＡＭＲＡ−ＳＥを×１０、×１００、×１０００使用した場合に各々１３％、６６％、９９％であった。
【図８】図８は、ＦＡＭ−ｙＴＰのＲＮＡへの導入のアンチ−（Ｒａｆ−１）アプタマーへの部位特異的導入とその応用例（Ｋｄ測定）を示す。最終のＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦｘＰｒｏの測定において、レーザーは４８８ｎｍ、５３０ｎｍ  ＢａｎｄＰａｔｈｆｉｌｔｅｒを使用した。
【図９】図９は、テオフィリン結合性ＲＮＡアプタマーの構造を示す。（ａ）２次構造；（ｂ）テオフィリン結合部位に関与するヌクレオチド間の相互作用（点線は塩基間での水素結合を示す）；（ｃ）Ｕ６−Ｕ２３−Ａ２８からなる塩基トリプレット構造；（ｄ）Ｕ６を５位置換−２−オキソ（１Ｈ）ピリジンに置き換えた場合でのトリプレット構造。
【図１０】図１０は、Ｔ７転写による、ｙまたは５位置換ｙ（５−修飾塩基）のテオフィリン結合性アプタマーの部位特異的導入を示す。
【００８６】
（Ａ）Ｕ６の部位にｙまたは５−修飾塩基を特異的に導入するための転写スキーム
５−修飾塩基の導入部位に対して相補的な位置にｓを含む２本鎖鋳型ＤＮＡを用いて、ｙＴＰまたは５位置換ｙＴＰ（Ｐｈ−ｙＴＰおよびＩ−ｙＴＰ）存在下で転写を行った。テオフィリン結合性アプタマー（４１ヌクレオチド）中の番号付けは、非特許文献４３に記載された３３ヌクレオチドからなるアプタマーでの番号付けと対応させた。転写は２０μｌスケールで行い、反応組成は、４０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  天然型ヌクレオチド（ＮＴＰ）および１ｍＭ  ｙＴＰ若しくは１ｍＭ  Ｐｈ−ｙＴＰ若しくは０．２５ｍＭ  Ｉ−ｙＴＰ、２μＣｉ［α−３２Ｐ］ＡＴＰ、２μＭ  鋳型ＤＮＡおよび２．５単位／μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【００８７】
（Ｂ）Ｕ６の箇所にＩ−ｙ若しくはｙ若しくはＰｈ−ｙを導入したアプタマー（Ｉ−ｙ６−４１、ｙ６−４１、Ｐｈ−ｙ６−４１に相当）のゲル電気泳動図。
ｓを含む鋳型（レーン１−３：ｔｅｍｐ５９ｓ）又はｓの代わりにＡを含む鋳型（レーン４：ｔｅｍｐ５９）を用いて、上記濃度のｙＴＰもしくは５位置換ｙＴＰ存在下で転写を行い、その産物をゲル電気泳動で解析した。
【００８８】
（Ｃ）転写産物のヌクレオチド組成分析。
転写産物を０．７５単位のＲＮａｓｅＴ２存在下で、１５ｍＭ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）中、３７℃で９０分間消化し、その消化産物をＭｅｒｃｋ  ＨＰＴＬＣプレート（１００ｘ１００ｍｍ）上で２次元に展開して解析した。１次元目、２次元目の展開溶媒はそれぞれ、イソ酪酸−アンモニア−水（体積比６６：１：３３）、イソプロピルアルコール−塩酸−水（体積比７０：１５：１５）である。ＴＬＣプレート上のスポット（各ヌクレオチドに対応）の放射活性をバイオイメージングアナライザーで定量し、その結果をＴＬＣパネルの下に示した。
【００８９】
値は以下の式を用いて決定した。
【００９０】
【化６】
2013067622.tif 000009
【００９１】
各ヌクレオチドの理論値を括弧内に記載してある。
【図１１】図１１は、特異的な位置にｙ又は修飾−ｙを有するＲＮＡアプタマーの３Ｈ−標識テオフィリンとの結合曲線を示す。ｙ又は修飾−ｙを導入した箇所を括弧内に記載した。
【００９２】
緑線：ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ（６）；  黄線：ＦＡＭ−ｙ（６）
ピンク線：ＴＡＭＲＡ−ｙ（６）；  水色線：Ｐｈ−ｙ（６）
うす茶色：Ｉ−ｙ（６）；  黒色線：ｙ（６）
点線白丸：ｙ（２３）；  波線×：ｙ（２４）
オレンジ線：非修飾
【図１２】図１２は、本発明の各種非天然型塩基を有するヌクレオチドで部位特異的に標識されたテオフィリン結合性ＲＮＡアプタマーの、蛍光スペクトルを示す。
【００９３】
ＲＮＡアプタマーは、ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ(ａ）、ＦＡＭ−ｙ（ｃ）またはＴＡＭＲＡ−ｙ（ｄ）のいずれかで標識し、様々な濃度のテオフィリン（０−２０μＭ）又はカフェイン（２０μＭ）の存在下での蛍光スペクトルを測定した。黒線、青線、水色線、緑線、オレンジ線、赤線は、各々０μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ及び２０μＭのテオフィリンの結果を示す。赤線点線は、２０μＭのカフェインの結果を示す。図１２ｂは、ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ標識ＲＮＡアプタマーのテオフィリン存在下での蛍光強度変化において、５２２ｎｍにおける蛍光強度をテオフィリン濃度に対してプロットした曲線である。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９５】
以下、実施例１−９は合成実施例を記載する。
実施例１  ３−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨード−２−オキソ（１Ｈ）ピリジンの合成
３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨード−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（１７８ｍｇ，５０５μｍｏｌ）を１０ｍｌナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行った。これを無水ピリジン（５ｍｌ，０．１μＭ）に溶解させ、塩化ジメトキシトリチル（１８３ｍｇ，５４０μｍｏｌ）を加え、室温で１時間半攪拌した。反応溶液を酢酸エチル／水中に加え、水層を除去した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝１００：０→１００：２）で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質（２７２ｍｇ，４１６μｍｏｌ，収率８２％）として得た。
【００９６】
１Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ３．０９−３．２０（ｍ，２Ｈ），  ３．７０−３．８６（ｍ，８Ｈ），  ３．９２−３．９４（ｍ，１Ｈ），  ４．７３−４．７６（ｍ，２Ｈ），  ５．２７（ｂｓ，１Ｈ），  ６．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），  ７．１８−７．４３（ｍ，９Ｈ），  ７．５９−７．６１（ｍ，２Ｈ），  １１．９（ｂｓ，１Ｈ）．
実施例２  ３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨード−２−オキソ（１Ｈ）ピリジンの合成
実施例１で合成した３−（５−Ｏ−ジメトキシトリチルｌ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨード−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（２６６ｍｇ，４０６μｍｏｌ）を１０ｍｌナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行った。これを無水ピリジン（４ｍｌ，０．１μＭ）に溶解させ、酢酸無水物  （１１０μｌ，１．１７ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をエタノール（５０ｍｌ）に溶解させ、１時間半還流させた。濃縮後、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝１００：１→１００：４）で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質（２５３ｍｇ，３４２μｍｏｌ，収率８４％）として得た。
【００９７】
１Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）・δ  １．９６（ｓ，３Ｈ），  ２．０４（ｓ，３Ｈ），  ３．１４（ｍ，１Ｈ），  ３．２９−３．３１（ｍ，１Ｈ），  ３．７３（ｓ，６Ｈ），  ４．１０−４．１５（ｍ，１Ｈ），  ４．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），  ５．２５−５．３３（ｍ，２Ｈ），  ６．８８（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），  ７．２１−７．３９（ｍ，９Ｈ），  ７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），  ７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ）．
実施例３  ３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジンの合成
実施例２で合成した３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨード−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（２４４ｍｇ，３３０μｍｏｌ）を１０ｍｌナス型フラスコ中、無水アセトニトリルで共沸を２回行った。ヨウ化銅（１３．３ｍｇ，６９．８μｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（３６．４ｍｇ，３１．５μｍｏｌ）を加え、これらを無水ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、室温で攪拌させながらトリエチルアミン（８５μｌ，６１０μｍｏｌ）を加え、遮光下室温で攪拌した。これにＮ−（２−プロピニル）−６−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド（２４０ｍｇ，９０８μｍｏｌ）のＤＭＦ（１．５ｍｌ）溶液を滴下し、室温で３．５時間攪拌した。反応溶液を酢酸エチル／ヘキサン（１：１）で希釈し、有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝１００：０．５→１００：３）で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質（２５５ｍｇ，２９１μｍｏｌ，収率８８％）として得た。
【００９８】
１Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １．１６（ｍ，２Ｈ），  １．４１−１．４９（ｍ，４Ｈ），  １．８９−２．０７（ｍ，８Ｈ），  ３．１３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．６  ａｎｄ  １２．９Ｈｚ），  ３．２３−３．２４（ｍ，２Ｈ），  ３．７３（ｓ，６Ｈ），  ３．９０−３．９２（ｍ，２Ｈ），  ４．１０−４．１３（ｍ，１Ｈ），  ４．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），  ５．２５−５．３３（ｍ，２Ｈ），  ６．８７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），  ７．２１−７．３８（ｍ，９Ｈ），  ７．５６−７．５８（ｍ，２Ｈ），  ８．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），  ９．３８（ｂｓ，１Ｈ），  １２．０（ｂｓ，１Ｈ）．
ＨＲＭＳ  （ＦＡＢ，  ３−ＮＢＡ  ｍａｔｒｉｘ）  ｆｏｒ  Ｃ４６Ｈ４９Ｆ３Ｎ３Ｏ１１  ［Ｍ＋１］＋：  ｃａｌｃｄ，８７６．３３１９；  ｆｏｕｎｄ，８７６．３３６９．
実施例４  ３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジンの合成
実施例３で合成した３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（２４５ｍｇ，２７９μｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（４６ｍｌ）に溶解させ、０℃で攪拌させながらジクロロ酢酸（４７０μｌ，５．６９ｍｍｏｌ）を加え、１５分間攪拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に室温で滴下し、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで２０回以上抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた後、溶媒を留去した。得られた油状物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；ジクロロメタン：メタノール＝１００：０．５→１００：４）で精製し、目的物を淡黄色アモルファス状物質（１１９ｍｇ，２０７μｍｏｌ，収率７４％）として得た。
【００９９】
１Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １．１９−１．２７（ｍ，２Ｈ），  １．４１−１．５５（ｍ，４Ｈ），  ２．００（ｓ，３Ｈ），  ２．０２（ｓ，３Ｈ），  ２．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ３．１４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８  ａｎｄ  １２．９Ｈｚ），  ３．４９−３．６８（ｍ，２Ｈ），  ４．０１−４．０５（ｍ，３Ｈ），  ４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ），  ５．１５−５．１９（ｍ，２Ｈ），  ５．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），  ７．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），  ７．６６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），  ８．２６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），  ９．３８（ｂｓ，１Ｈ），  １２．１（ｂｓ，１Ｈ）．
ＨＲＭＳ  （ＦＡＢ，  ３−ＮＢＡ  ｍａｔｒｉｘ）  ｆｏｒ  Ｃ２５Ｈ３１Ｆ３Ｎ３Ｏ９  ［Ｍ＋１］＋：  ｃａｌｃｄ，５７４．２０１２；  ｆｏｕｎｄ，５７４．２０６１．
実施例５  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸  （ＮＨ２−ｙＴＰ）の合成
実施例４で合成した、３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−トリフルオロアセタミドヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（５８．３ｍｇ，１０２μｍｏｌ）を５０ｍｌナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン（１００μｌ）及び無水ジオキサン（３００μｌ）を加えて溶解させ、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オンの１Ｍ  ジオキサン溶液（１１０μｌ，１１０μｍｏｌ）を加えて室温で１０分間攪拌したのちに、トリ−ｎ−ブチルアミン（１００μｌ）及びビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェートの０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液（３００μｌ）を加えて１０分間攪拌した。１％  ヨウ素／水／ピリジン溶液（２ｍｌ）を加え、室温で１５分間攪拌し、５％  亜硫酸水素ナトリウム水溶液（１５０μｌ）を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水（１０ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後に濃アンモニア水（１２ｍｌ）を加えて３時間攪拌した。これを減圧濃縮後、５０ｍｌチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水に溶解させて室温で３時間攪拌した後に、凍結乾燥させた。これをＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）及びＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％―１５％  アセトニトリルの０．１Ｍ  酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物を得た。
【０１００】
１Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  １．１３（ｔ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  １．２１−１．３２（ｍ，２Ｈ），  １．４８−１．６１（ｍ，４Ｈ），  ２．１９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ２．８３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ３．０５（ｑ，１２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ３．９５−４．２０（ｍ，７Ｈ），  ４．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），  ７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），  ７．８３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  −２２．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），  −１０．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ），  −８．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２０．１Ｈｚ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｆｏｒ  Ｃ１９Ｈ２９Ｎ３Ｏ１５Ｐ３  ［Ｍ−１］−：  ｃａｌｃｄ，６３２．０８  ；  ｆｏｕｎｄ，６３１．８４．
実施例６  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−［６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸  （ＦＡＭ−ｙＴＰ）  の合成
実施例５で合成した３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸（１０μｍｏｌ）を５ｍｌの滅菌済みチューブに移し、これを０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．６，１．５ｍｌ）に溶解させ、５−カルボキシフルオレセイン  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド  エステル（５．５ｍｇ，１１．６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２００μｌ）を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で３．５時間反応させた。これに濃アンモニア水（１ｍｌ）を加え、時々振盪させながら２時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，  濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）及びＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％―５０％  アセトニトリルの０．１Ｍ  酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物（３．０μｍｏｌ，３０％）を得た。
【０１０１】
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  １．１４（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），    １．２０−１．４０（ｍ，２Ｈ），  １．４５−１．６５（ｍ，４Ｈ），  ２．１０−２．３５（ｍ，２Ｈ），  ２．９０−３．６０（ｍ，２２Ｈ），  ３．７０−４．２０（ｍ，５Ｈ），  ６．５５−６．８５（ｍ，４Ｈ），  ７．００−７．４０（ｍ，４Ｈ），  ７．５０−７．７０（ｍ，１Ｈ），  ７．９０−８．０５（ｍ，１Ｈ），  ８．１０−８．２０（ｍ，１Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ  （１０９ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  −２１．７５，  −１０．４０，  −９．３８．
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｆｏｒ  Ｃ４０Ｈ３９Ｎ３Ｏ２１Ｐ３  ［Ｍ−１］−：  ｃａｌｃｄ，９９０．１３；  ｆｏｕｎｄ，９８９．９８．
実施例７  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−［６−（テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸  （ＴＡＭＲＡ−ｙＴＰ）  の合成
実施例５で合成した３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸（８μｍｏｌ）を５ｍｌの滅菌済みチューブに移し、これを０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．６，１．２ｍｌ）に溶解させ、５−カルボキシテトラメチルローダミン  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド  エステル（５ｍｇ，９．５μｍｏｌ）のＤＭＦ／水混合溶液（１５０／１５０μｌ）を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で３．５時間反応させた。これに濃アンモニア水（１ｍｌ）を加え、時々振盪させながら２時間反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，  濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）  及びＣ１８−ＨＰＬＣ  （濃度勾配；０％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物（４．０μｍｏｌ，５０％）を得た。
【０１０２】
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  １．１３（ｔ，２７Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  １．２５−１．４０（ｍ，２Ｈ），  １．５０−１．６５（ｍ，４Ｈ），  ２．１０−２．３５（ｍ，２Ｈ），  ３．００−３．２２（ｍ，３２Ｈ），  ３．４０−４．００（ｍ，７Ｈ），  ４．８０−４．８５（ｍ，１Ｈ），  ６．５５−６．６０（ｍ，１Ｈ），  ６．６５−６．７５（ｍ，２Ｈ），  ６．８０−６．９０（ｍ，１Ｈ），  ６．９８−７．０５（ｍ，１Ｈ），  ７．０５−７．２０（ｍ，２Ｈ），  ７．４０−７．５０（ｍ，２Ｈ），  ７．９５−８．０５（ｍ，１Ｈ），  ８．０８−８．１５（ｍ，１Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ  （１０９ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）  δ  −２３．００−  −２２．００（ｍ，１Ｈ），  −１１．５０−  −１０．５０（ｍ，１Ｈ），  −１０．５０−  −９．５０（ｍ，１Ｈ）．
ＭＳ（ＥＳＩ）  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｈ４９Ｎ５Ｏ１９Ｐ３  ［Ｍ−１］−：  ｃａｌｃｄ，１０４４．２２；  ｆｏｕｎｄ，１０４３．９０．
実施例８  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−［６−［６−［（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォニル）アミノ］ヘキサンアミド］ヘキサンアミド］−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸  （Ｄａｎｓｙｌ−ｘ−ｙＴＰ）  の合成
実施例５で合成した３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（６−アミノヘキサンアミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸（９μｍｏｌ）を５０ｍｌの滅菌済みチューブに移し、これを０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．５，  １．８ｍｌ）に溶解させ、６−［（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォニル）アミノ］ヘキサン酸  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド  エステル（２０ｍｇ，４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１．８ｍｌ）を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で４８時間反応させた。これに濃アンモニア水（１ｍｌ）を加え、時々振盪させながら１時間反応させた。これを減圧濃縮させた後、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，  濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）及びＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物（６．２μｍｏｌ，６８％）を得た。
【０１０３】
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  ０．７５−０．９０（ｍ，２Ｈ），  ０．９２−１．１０（ｍ，４Ｈ），  １．０８−１．２６（ｍ，２９Ｈ），  １．２６−１．４０（ｍ，２Ｈ），  １．４０−１．５２（ｍ，２Ｈ），  １．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ２．１４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ２．７２−２．８６（ｍ，８Ｈ），  ２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），  ３．０６（ｑ，１８Ｈ，Ｊ＝７．３  Ｈｚ），  ３．８５−４．２０（ｍ，７Ｈ），  ４．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），７．２５−７．３２（ｍ，２Ｈ），  ７．５２−７．６５（ｍ，３Ｈ），  ８．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ８．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），  ８．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ（１０９ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  −２２．５６，  −１０．５４，  −１０．０９．  ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｆｏｒ  Ｃ３７Ｈ５１Ｎ５Ｏ１８Ｐ３Ｓ１  ［Ｍ−１］−：  ｃａｌｃｄ，９７８．２２；  ｆｏｕｎｄ，９７８．３４．
実施例９  ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸  （ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙＴＰ）  の合成
１）３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（２，２−ジクロロアセタミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン
実施例２で合成した、３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ヨード−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（２６８ｍｇ、３６２μｍｏｌ）を、ＣＨ３ＣＮ中に溶解し、乾燥するまで真空内で２回蒸発させた。残渣をＤＭＦ（２ｍｌ中）に、Ｃｕ（Ｉ）Ｉ（１２．４ｍｇ、６５．２μｍｏｌ）及びＰｄ［Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３］４（３７．７ｍｇ、３２．６μｍｏｌ）と共に溶解した。トリエチルアミン（９１μｌ、６５２μｍｏｌ）を加えた後、暗がりで、室温で攪拌した。溶液に、ＤＭＦ（１，５ｍｌ）中の２，２−ジクロロ−Ｎ−プロプ−２−イニル−アセタミド（１６２ｍｇ、９７８μｍｏｌ）を滴下して加え、溶液を室温で３．５時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈した。溶液をＨ２Ｏ及び食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中の０．５−３％ＣＨ３ＯＨ）によって、３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（２，２−ジクロロアセタミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（２５１ｍｇ、８９％）を精製した。ジクロロメタン（３２ｍｌ）中の３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（２，２−ジクロロアセタミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（２５１ｍｇ、３２３μｍｏｌ）に、ジクロロ酢酸（３２３μｌ、３．９２ｍｍｏｌ）を加え、そして、０℃で１５分間攪拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液に注ぎ、激しく攪拌した。水層をジクロロメタンで５回抽出した。混合した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、そして真空内で蒸発させた。残渣からシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中の２−１０％ＣＨ３ＯＨ）によって、産物（１３６ｍｇ、８８％）を精製した。
【０１０４】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ２．０１（ｓ，３Ｈ），  ２．０４（ｓ，３Ｈ），  ３．５０−３．７０（ｍ，２Ｈ），  ４．００−４．０５（ｍ，１Ｈ），  ４．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），  ４．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），  ５．１０−５．３０（ｍ，３Ｈ），  ６．４８（ｓ，１Ｈ），  ７．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．３Ｈｚ），  ７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），  ９．１０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），  １２．０８（ｂｒｓ，１Ｈ）．
ＨＲＭＳ  （ＦＡＢ，  ３−ＮＢＡ  ｍａｔｒｉｘ）  ｆｏｒ  Ｃ１９Ｈ２１Ｃｌ２Ｎ２Ｏ８  （Ｍ＋１）：  ｃａｌｃｄ，  ４７５．０６７５；  ｆｏｕｎｄ，  ４７５．０６８９．
２）３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸  （ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙＴＰ）
３−（２，３−ジ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−（２，２−ジクロロアセタミド）−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（４７．５ｍｇ，１００μｍｏｌ）を５０ｍｌ  ナス型フラスコ中、無水ピリジンで共沸を３回行ったのち、反応容器をアルゴンガスで満たした。これに無水ピリジン（１００μｌ）及び無水ジオキサン（３００μｌ）を加えて溶解させ、２−クロロ−４Ｈ−１，３，２−ベンゾジオキサホスフォリン−４−オンの１Ｍ  ジオキサン溶液（１１０μｌ，１１０μｍｏｌ）を加えて室温で１０分間攪拌したのちに、トリ−ｎ−ブチルアミン（１００μｌ）及びビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェートの０．５Ｍ  ＤＭＦ溶液（３００μｌ）を加えて１０分間攪拌した。１％  ヨウ素／水／ピリジン溶液（２ｍｌ）を加え、室温で１５分間攪拌し、５％  亜硫酸水素ナトリウム水溶液（１５０μｌ）を加えた後に反応溶液を減圧濃縮した。得られた油状物質に水（１０ｍｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した後に濃アンモニア水（１２ｍｌ）を加えて３時間攪拌した。これを減圧濃縮後、５０ｍｌチューブに移し、凍結乾燥させた。これを濃アンモニア水（３ｍｌ）に溶解させて５５℃で３時間攪拌した後に、減圧濃縮した。これをＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，  濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）にて精製し、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−５−［３−アミノ−１−プロピニル］−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン  ５’−三リン酸を得た。これを５０ｍｌの滅菌済みチューブに移し、０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．６，４ｍｌ）に溶解させ、５−カルボキシフルオレセイン  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド  エステル（１４．５ｍｇ，３０．６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍｌ）を加えて、時々振盪させながら遮光下室温で１２時間反応させた。これに濃アンモニア水（１ｍｌ）を加え、時々振盪させながら３０分反応させた。これを減圧濃縮、凍結乾燥させた後、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５カラムクロマトグラフィー（１．５ｘ３０ｃｍ，  濃度直線勾配；ＴＥＡＢの５０ｍＭ―１Ｍ溶液）及びＣ１８−ＨＰＬＣ（濃度勾配；０％―５０％アセトニトリルの０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液，ｐＨ７．０）にて精製し、目的物（１０．１μｍｏｌ，１０％）を得た。
【０１０５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （２７０ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）  δ  １．１４（ｔ，３２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ３．０６（ｑ，２１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），  ４．００−４．３５（ｍ，７Ｈ），  ４．８０−４．９０（ｍ，１Ｈ），  ６．６５−６．８８（ｍ，４Ｈ），  ６．９２−７．０６（ｍ，２Ｈ），  ７．２５−７．３８（ｍ，１Ｈ），  ７．４８−７．５８（ｍ，１Ｈ），  ７．７３−７．８５（ｍ，１Ｈ），  ７．９５−８．１０（ｍ，１Ｈ），  ８．２４−８．３２（ｍ，１Ｈ）．
３１Ｐ  ＮＭＲ  （１０９ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）  δ  −２２．４０，  −１０．３８，  −１０．３８．
ＭＳ  （ＥＳＩ）  ｆｏｒ  Ｃ３４Ｈ２８Ｎ２Ｏ２０Ｐ３  ［Ｍ−１］−：  ｃａｌｃｄ，８７７．０４；  ｆｏｕｎｄ，８７７．０７．
実施例１０  ｙＴＰ誘導体の量子収率測定
蛍光スペクトルは、ＦＡＭ−ｙＴＰ（１．０μＭ）、ＴＡＭＲＡ−ｙＴＰ（１．０μＭ）、ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙＴＰ（１．０μＭ）及びＤａｎｓｙｌ−ｘ−ｙＴＰ（１．０μＭ）の１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の溶液を２５℃で、ＦＰ−６５００蛍光測定装置（日本分光）により測定した。測定には３ｘ３ｍｍセルを用い、レスポンス  １．０ｓ、感度ｌｏｗ、スリットは励起側・蛍光側ともに３ｎｍに固定してスペクトル測定を行った。結果を図４に示す。
【０１０６】
量子収率（φ）は以下に示す式から算出し、標準物質としてはフルオレセイン（１．０μＭ  ｉｎ  ０．１Ｎ  ＮａＯＨ，  φｓ＝０．９０）を用いた。
φ  ＝  （Ｆ・Ａｓ・η２・φｓ）／（Ａ・Ｆｓ・η０２）
Ｆ；  蛍光スペクトルの面積
Ａ；  励起波長での吸光度
η；  屈折率（水：  １．３３）
ｓ；  標準物質
【０１０７】
【表３】
2013067622.tif 000010
【０１０８】
図４及び表３に示されたように、ＦＡＭ−ｙＴＰの定常光励起発光スペクトルは、吸収極大波長の４９３ｎｍで励起すると、５２２ｎｍに極大を有する蛍光スペクトルを示し、その量子収率（φ）は、０．５５（ｐＨ７．０水溶液中）であった。また、ＴＡＭＲＡ−ｙＴＰの定常光励起発光スペクトルは、吸収極大波長の５５３ｎｍで励起すると、５７８ｎｍに極大を有する蛍光スペクトルを示し、その量子収率（φ）は、０．５０（ｐＨ７．０水溶液中）であった。
【０１０９】
以下、実施例１１−１３は転写反応実施例を示す。
実施例１１  Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによる転写反応
ＮＨ２−ｙＴＰ、ＦＡＭ−ｙＴＰ、ＴＡＭＲＡ−ｙＴＰのそれぞれを用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を行った。
【０１１０】
具体的には、二本鎖の鋳型ＤＮＡ（１０μＭ）のアニーリングを１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）中で、９５℃、３分→５０℃、３分→４℃の徐冷操作で行った。Ｔ７転写反応は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＧＴＰ、１ｍＭ  ＮＴＰｓ、１ｍＭ  修飾ｙＴＰ、２μＭ  鋳型ＤＮＡ、及び５０単位  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）の反応溶液（２０μｌ）で行った。
【０１１１】
鋳型ＤＮＡには、Ｔ７プロモーターを含む３５量体（３５−ｍｅｒ）の鋳型鎖とＴ７プロモーターの非鋳型鎖２１−ｍｅｒとを二本鎖化したものを用いた。そして、鋳型中の一箇所には、ｓ、あるいは、ｖを導入してある。
【０１１２】
Ｔ７プロモーターを含む３５量体（３５−ｍｅｒ）（配列番号１）
５’−ＣＡＣＴＮＣＴＣＧＧＧＡＴＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴ−３’
Ｎ（５）＝ｖ（本発明）、ｓ（本発明）又はＡ（対照）
Ｔ７プロモーターの非鋳型鎖２１−ｍｅｒ（配列番号２）
５’−ＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’
転写物（配列番号３）
５’−ＧＧＧＡＡＵＣＣＣＧＡＧＮ’ＡＧＵＧ−３’
Ｎ’（１３）＝ＮＨ２−ｙ、ＦＡＭ−ｙ又はＴＡＭＲＡ−ｙ
天然型の基質と等量の修飾基質を加え、３７℃、３時間反応を行った後、１０Ｍ  尿素を含む電気泳動用色素溶液（２０μｌ）を加えて反応を停止させた。反応溶液を７５℃で３分間加熱後、２０％  ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動を行い、転写物をバイオイメージアナライザーで解析した。
【０１１３】
結果を図５に示す。図５に示されたように、それぞれの修飾基質がＲＮＡ中に取り込まれることがわかった。それぞれの修飾基質が取り込まれるとＲＮＡ断片１７−ｍｅｒのゲル中での移動度が遅くなることから、それらの取り込みが確認された。さらに、それぞれのレーンに天然型の１７−ｍｅｒのバンドがほとんど見えないこと、さらに、天然型の鋳型を用いた場合には、移動度の遅いバンドが認められないことから、それぞれの修飾基質が効率よく部位特異的に取り込まれたことがわかった。また、鋳型塩基にｓを用いるよりも、ｖを用いたほうが、転写効率が良かった。天然型の鋳型・基質のみの転写反応と比較すると、ＮＨ２−ｙが取り込まれたＲＮＡは、同程度の収率で得られ、ＦＡＭ−ｙ、あるいは、ＴＡＭＲＡ−ｙが取り込まれたＲＮＡの収率は、それぞれ、７６％、６１％であり、非常に効率がよいことが判明した。
【０１１４】
実施例１２  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応生成物の塩基組成分析
実施例１１に次いで、ＮＨ２−ｙが取り込まれたＲＮＡについて、ヌクレオチドの組成分析を行った。
【０１１５】
実施例１１と同様のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、１ｍＭ  ＮＴＰｓ、１ｍＭ  修飾−ｙＴＰ、２μＭ  鋳型ＤＮＡ、及び５０単位  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）の反応溶液で行った。転写物を、１５％  ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルによる電気泳動後、ゲルからの溶出を行った後、ｔＲＮＡ（０．２５ＯＤ）を加えてエタノール沈殿を行い回収した。
【０１１６】
このｔＲＮＡを含む溶液（８．５μｌ）に、ＲＮａｓｅ  Ｔ２（１．５μｌ，１単位／μｌ）を加えて、３７℃で一晩反応を行った。この溶液の０．３μｌをＴＬＣ  （Ｍｅｒｃｋ，１０ｃｍｘ１０ｃｍ）にスポットし、二次元展開を行った。展開液として、一次元目はイソ酪酸：濃アンモニア水：水＝６６：１：３３（ｖ／ｖ／ｖ）、二次元目は２−プロパノール：塩酸：水＝６５：１０：２５（ｖ／ｖ／ｖ）を用いた。展開後のスポットをバイオイメージアナライザーで検出し、解析を行った。
【０１１７】
結果を図６に示す。図６のイメージアナライザーの図には、３２Ｐで標識されたＧｐ×２、Ａｐ×１と、Ｎ’ｐ×１が検出される。鋳型のＮの位置にｖが存在する場合には、対応するＮ’としてＮＨ２−ｙが検出され、Ｕｐが見出されない。一方、鋳型のＮの位置にＡが存在する場合には、対応するＮ’としてＵｐが検出され、ＮＨ２−ｙが見出されない。ヌクレオチドの組成分析の結果、ｖに対するＮＨ２−ｙの特異的な取り込みが確認された。
【０１１８】
実施例１３  ＮＨ２−ｙを含むＲＮＡ  １７−ｍｅｒの転写後修飾による蛍光基の導入
ＮＨ２−ｙが取り込まれたＲＮＡを用いて、ＲＮＡ転写後にＦＡＭ、あるいは、ＴＡＭＲＡによる修飾も行った。
【０１１９】
具体的には、実施例１１と同様のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写反応で生成したＮＨ２−ｙを含むＲＮＡ１７−ｍｅｒ（配列番号３）を、電気泳動（１５％  ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲル）で精製した後、ゲルからの溶出、及び、エタノール沈殿により回収した。修飾反応は、ＲＮＡ１７−ｍｅｒ（２０μＭ，２．５μｌ）を、ＦＡＭ、又は、ＴＡＭＲＡのコハク酸イミドのエステル体（ＦＡＭ−ＳＥ又はＴＡＭＲＡ−ＳＥ）のＤＭＳＯ溶液（０もしくは０．２-２０ｍＭ，２．５μｌ）、０．１Ｍ  テトラホウ酸ナトリウム−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）（１５μｌ）と混ぜて、３７℃、１２時間行った。
【０１２０】
１０Ｍ尿素を含む電気泳動用色素溶液（２０μｌ）を加えて反応を停止させ、７５℃で３分間加熱後、２０％  ポリアクリルアミド−７Ｍ  尿素ゲルで電気泳動を行った後、生成物をバイオイメージアナライザーで解析した。
【０１２１】
結果を図７に示す。図７に示されたように、大過剰のそれぞれのコハク酸イミドエステル誘導体を用いることにより、それぞれのＲＮＡ断片を蛍光標識できることがわかった。このＲＮＡ断片では、ＮＨ２−ｙが配列の中央に位置しているが、末端に導入すれば、修飾効率はさらに高くなると期待される。また、ＮＨ２−ｙを導入したＲＮＡは、蛍光色素以外にもいろいろな修飾が可能である。
【０１２２】
実施例１４  フィルター結合法によるタンパク質と部位特異的に蛍光標識したＲＮＡの結合実験
Ａ）転写反応用鋳型の調製
本実施例に使用するＲａｆ−１タンパク質及びＲＮＡアプタマーについては、本明細書中に参考文献として援用されるＷＯ２００４／００７７１３の参考例１を参照されたい。
【０１２３】
転写反応用の鋳型は、以下のＰＣＲ反応により調製された。ＰＣＲ反応の鋳型にはａｎｔｉ−（Ｒａｆ−１）  アプタマー９Ａの遺伝子（配列番号４）がサブクローニングされたベクター（ＴＯＰＯ  ９Ａ）を用い、また、ＰＣＲ反応の酵素には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がないＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いた。
【０１２４】
反応組成は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭ  プライマー対［３９．４５  （３９−ｍｅｒ）；５’−ＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＧ（配列番号５）、２９．４５ｖ９０  （２９−ｍｅｒ）；５’−ＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴｖＣＴＧＴＣＧＣＴＡＡＧＧＣＡＴＡＴＧ（配列番号６）］、１ｎｇ／μｌ  ＴＯＰＯ  ９Ａ、０．０２５単位／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１２５】
反応はＰＴＣ−１００ＴＭ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、［９４℃  １５秒−５０℃  ３０秒−７２℃  １分］×１５サイクル  −  ７２℃  ５分、の条件で行われた。反応溶液をマイクロピュア−ＥＺ（ミリポア）に通して酵素を除去した後、溶液をエタノール沈澱してＰＣＲ産物を回収した。サンプルは、滅菌水に溶かして保存し、Ｔ７転写反応の鋳型とした。
【０１２６】
Ｂ）Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによる転写反応（ＦＡＭ−ｙを９０残基目に含むＲＮＡ  ９Ａの調製）
Ｔ７転写反応は、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液（ｐＨ８．０）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ｎａｔｕｒａｌ  ＮＴＰｓ、１ｍＭ  ＦＡＭ−ｙＴＰ、２５ｎｇ／μｌ  鋳型ＤＮＡ、及び２．５Ｕ／μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を含む溶液で行った。３７℃、６時間反応を行った後、１０Ｍ  尿素を含む電気泳動用色素溶液を反応溶液と等量加えて反応を停止させた。反応溶液を７５℃で３分間加熱後、１０％  ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素ゲルで電気泳動を行い、目的の転写反応産物（９Ａ９０Ｆ；１００−ｍｅｒ）が含まれるゲルを切り出した。目的産物を滅菌水でゲルから溶出した後、エタノール沈殿を行い、ＲＮＡ  ９Ａ９０Ｆを回収した。
【０１２７】
Ｃ）フィルター結合法によるタンパク質とＲＮＡの結合実験
結合実験には、ｈｕｍａｎ  Ｒａｆ−１のＲＢＤ（アミノ酸残基５１−１３１番）のＧＳＴ融合タンパク質（Ｒａｆ−１タンパク質）を用いた。本手法では、ニトロセルロースフィルターがタンパク質を吸着する一方、ＦＡＭ標識されたＲＮＡ  ９Ａは吸着しない性質を利用し、タンパク質−ＲＮＡ複合体をニトロセルロースフィルターにより単離した。
【０１２８】
ＲＮＡ  ９Ａ９０Ｆ、６０μｌ（最終濃度  １０ｎＭ）を、さまざまな濃度のＲａｆ−１タンパク質、２μｌ（最終濃度５０−８００ｎＭ）と緩衝液Ｐ（ＰＢＳ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で混合し、室温（２２℃）で３０分間インキュベートした。その反応溶液５０μｌをニトロセルロースフィルター（ミリポア，ｃａｔａｌｏｇ＃  ＨＡＷＰ０１３００）に通し、２００μｌの緩衝液Ｐで洗浄した後、フィルター上に吸着したＲＮＡの蛍光量を蛍光スキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ  Ｐｒｏ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）により測定した。測定条件は、フィルターが５３０ｎｍ  ＢＰ（ＢａｎｄＰａｔｈ）、レーザー波長が４８８ｎｍ、ＰＭＴセッティングが８０％である。カレイダグラフ（Ａｌｂｅｌｂｅｃｋ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、測定した蛍光量をｙ、タンパク質濃度をＭ０として、計算式ｙ＝Ｍ０×Ｍ１／（Ｍ０＋Ｍ２）にあてはめ、最小二乗法によるデータフィッテングを行って解離定数Ｋｄ（Ｍ２に相当）を求めた。同時に求まるＭ０は、ＲＮＡとタンパク質の結合が飽和した場合（タンパク質量が無限大）でのフィルター上に吸着されるＲＮＡの蛍光量に相当する。結果を図８に示す。
【０１２９】
本実施例では、本研究の応用例として、ＦＡＭ−ｙＴＰをＲａｆ−１タンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマー（抗−Ｒａｆ−１アプタマー）の９０番目（全長１００ヌクレオチド）に導入し、この蛍光色素を導入したＲＮＡアプタマーと種々の濃度のＲａｆ−１タンパク質を混ぜ、この溶液をニトロセルロースフィルターに通すことにより、タンパク質をニトロセルロースに吸着させ、そのタンパク質に結合したＲＮＡアプタマーの蛍光を測定することにより、タンパク質の量を測定し、解離定数を求めることができた。これは、従来のラジオアイソトープでＲＮＡを標識する方法に代わる簡便な方法である。
【０１３０】
実施例１５  テオフィリンに特異的に結合するアプタマーへの蛍光色素−結合ｙの導入
１）本実施例では、本発明の部位特異的な蛍光標識の可能性を調べるために、気管支拡張剤テオフィリン（非特許文献３７、４１−４６）に特異的に結合する別のアプタマーに、蛍光色素−結合ｙを導入した（図９ａ）。ＲＮＡ分子中の特異的な位置の蛍光色素は、蛍光強度における変化を測定することによって立体構造の変化を検出するために、あるいは、標的分子を検出するために有用である。
【０１３１】
テオフィリンの結合により、ＲＮＡアプタマー中に特有の構造モチーフが生じる（図９ｂ）。複合体では、２組のトリプレット、即ち、Ｕ６−Ｕ２３−Ａ２８（図９ｃ）及びＡ７−Ｃ８−Ｇ２６、並びに２組の独立した塩基、即ち、Ｃ２２及びＵ２４が、テオフィリンを囲み、高度に特異的なリガンド結合部位を形成する。しかしながら、この部位は、リガンドが存在しない場合、安定しては形成されない（非特許文献３７、４１−４６）。非特許文献３７は、蛍光アデニン類似体、２−アミノプリンをアプタマーのＣ２７に導入し、アプタマーとテオフィリンとの結合様式について、ストップトフロー蛍光スペクトルによる解析を報告している。
【０１３２】
本発明者らは、アプタマー配列内の適当な部位を蛍光色素−結合ｙで置換し、蛍光強度における変化をモニターすることで、テオフィリンとの結合を検出した。以下、具体的に説明する。
【０１３３】
２）先ず、蛍光色素−結合ｙの導入のための、テオフィリン結合性アプタマー内の適当な部位を決定するために、アプタマーの結合モチーフ内のＵ６、Ｕ２３又はＵ２４をそれぞれ、非修飾ｙで置換した場合の効果を調べた。ｙを有する各アプタマー（４１ヌクレオチド）は、ｓを含む鋳型ＤＮＡを用いて、ｙＴＰ存在下でＴ７転写を行い、調製された。（図１０ａ）。アプタマーへのｙの部位特異的な導入は、２次元ＴＬＣを用いたヌクレオチド組成分析により確認された（図１０ｃ）。
【０１３４】
アプタマーのテオフィリン結合に関する解離定数（Ｋｄ）を、公知の平衡濾過アッセイ法（非特許文献４１）によって、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む溶液中で、３Ｈ−標識テオフィリンを用いて測定した。Ｕ２３及びＵ２４でのｙによる置換は、元のアプタマーの結合能力（Ｋｄ＝３３１±１６ｎＭ）と比較して、アプタマーの結合能力を有意に減少させた（Ｋｄ＞１５００ｎＭ）。Ｕ２３の置換については、Ｕ２３の４−ケト基が、塩基のトリプレットにおいてＵ６とＡ２８の双方と水素結合を形成する。非天然型塩基ｙはＵの４−ケト基を欠くため、Ｕ２３をｙで置換すると、結合に好ましくない影響を与えうると考えられる。一方、Ｕ２４の４−ケト基が他の塩基やテオフィリンと直接相互作用していることはＮＭＲによる解析では観察されなかったが、Ｕ２４の３位の窒素原子は、テオフィリンと水素結合を形成している。したがって、Ｕ２４の４−ケト基が結合モチーフの形成に重要な役割を果たしており、そして、Ｕ２４が実際に、アプタマー構造における金属結合及びＵ−ターン形成（非特許文献４２、４４）に関与していることが、Ｕ２４をｙに置換することにより、示唆された。
【０１３５】
一方、Ｕ６をｙで置換したアプタマーは、解離定数２１７±１３ｎＭで、元のアプタマーに遜色なく、テオフィリンに結合した。このことは、Ｕ６の４−ケト基を除いても、アプタマーの結合能力には悪い影響を与えないことを示唆する。実際、この４−ケト基はアプタマー中のＵ６−Ｕ２３−Ａ２８塩基のトリプレットに関与していない（非特許文献４２，４３）。さらに、５−フェニルエチニル−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（Ｐｈ−ｙ）（非特許文献３８）及び５−ヨード−２−オキソ（１Ｈ）ピリジン（Ｉ−ｙ）（非特許文献２２）などの、５−修飾ｙを、Ｕ６の代わりに導入しても、アプタマーは結合能力を維持した（Ｐｈ−ｙ置換について、Ｋｄ＝５３６±４２ｎＭ、そして、Ｉ−ｙ置換について、Ｋｄ＝５５１±６８ｎＭ、表４及び図１１）。
【０１３６】
表４  修飾−ｙを有するＲＮＡアプタマーのテオフィリン結合能
【０１３７】
【表４】
2013067622.tif 000011
【０１３８】
ａ：  テオフィリン結合の解離定数は、３Ｈ−標識テオフィリン（２０ｎＭ）及び種々のＲＮＡ濃度（２５−１５００ｎＭ）を用いた平衡濾過アッセイで測定した。
ｂ：  蛍光強度変化から求めたテオフィリン結合の平衡定数は、種々のテオフィリン濃度（０−２０μＭ）での、蛍光色素−結合ｙを有するＲＮＡアプタマー（１００ｎＭ）の蛍光測定により決定された。
【０１３９】
Ｕ６をｙで置換したアプタマーのＫｄ値（Ｋｄ＝２１７±１３ｎＭ）は、非修飾アプタマーのＫｄ値（Ｋｄ＝３３１±１６ｎＭ）よりも若干低かった。従って、Ｕ６をｙで置換してもテオフィリンを結合するために必須な塩基トリプレットの形成が可能であり、Ｕ６は、蛍光色素−結合ｙの導入のために適した部位である。
【０１４０】
３）本発明者は、ｓを有する鋳型ＤＮＡを用いＴ７転写によって、Ｕ６の部位にｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ、ＦＡＭ−ｙ、又はＴＡＭＲＡ−ｙを有するアプタマーを調製し、テオフィリンの結合を調べた。ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ及びＦＡＭ−ｙを有するアプタマーの３Ｈ−標識テオフィリンへの結合のＫｄ値は、約２００ｎＭ（表４）であり、これは、元のアプタマーやＵ６をｙで置換したアプタマーのそれと同一である。
【０１４１】
本発明者らは次いで、ＦＰ−６５００蛍光測定装置を用いて、テオフィリンの存在下又は非存在下でのアプタマーの蛍光強度を測定した。ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ、ＦＡＭ−ｙ又はＴＡＭＲＡ−ｙを有するアプタマーの蛍光強度は、テオフィリンの量に依存して増加し、そして、テオフィリンの飽和濃度（５−２０μＭ）の添加によって倍増した（図１２）。
【０１４２】
ＴＡＭＲＡ−ｙを有するアプタマーの３Ｈ−標識テオフィリンへの結合のＫｄ値は非常に高く、テオフィリンとの結合が弱いことが示唆されたが、テオフィリンの濃度を増加させるにつれて、アプタマーの蛍光強度は増加した（図１２ｄ）。これらの蛍光強度の変化は、標的物質であるテオフィリンとの結合により、アプタマーの構造変化が生じたためと考えられる。テオフィリンの非存在下において、蛍光残基はアプタマーの構造の内部に存在して、近傍の塩基との重なりなどにより、蛍光強度が減少していると考えられる。テオフィリン存在下では、アプタマーがテオフィリンと結合することにより、蛍光残基が外部に押し出され、溶媒にさらされて塩基による消光作用が減少し、蛍光強度が増加したと考えられる。
【０１４３】
アプタマーの蛍光強度変化から得られる平衡定数（「Ｋｆ」によって表す）(図１２及び表４）は、３Ｈ−標識テオフィリンを用いて得られる解離定数（Ｋｄ）と若干相違した。ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ及びＦＡＭ−ｙを有するアプタマーの場合、Ｋｆ値は、対応するＫｄ値よりも大きかった。このことは、約０．２−０．５μＭの濃度でテオフィリンが結合した場合、蛍光色素はまだ構造の内部で近傍の塩基と重なっていることを示唆する。対照的に、ＴＡＭＲＡ−ｙを有するアプタマーのＫｆ値はＫｄ値の２分の１であった。理論に束縛されるわけではないが、これは、ＴＡＭＲＡのジメチルアミノ基が立体障害となり、テオフィリンとの弱い相互作用によってもＴＡＭＲＡ残基がアプタマーの構造の内部から外部へ押し出されやすくなり、また同時にテオフィリン結合能力の低下を引き起こしたことによると考えられる。いずれの場合も、アプタマーのＫｆ値は、テオフィリンの特定の濃度によって誘導される蛍光残基の環境変化に依存する。よって、Ｋｆ値もアプタマーのセンサーとしての検出感度を評価するに、実際に有用である。
【０１４４】
蛍光標識アプタマーは、テオフィリンに対するその高い特異性を保持している。アプタマーの蛍光強度は、構造的にテオフィリンと類似するカフェイン（２０μＭ）の存在下でも増加されない（図１２ａ、ｃ及びｄ）。特に、ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙで標識したアプタマーは、２０μＭカフェインの添加によっても蛍光強度の有意な変化は観察されなかった（図１２ａ）。
【０１４５】
本発明の方法の感度は、従来のモジュラーアプタマーセンサー及び蛍光分子スイッチ（非特許文献４７−４８）よりも、非常に高いものである。従来技術において、テオフィリン結合性アプタマーのＣ２７の部位へ、別の蛍光色素、２−アミノプリンを導入した場合も、プローブとして有用であった（非特許文献３７）が、２−アミノプリンを有するアプタマーの調製は、化学合成を必要とする。本発明の、非天然型塩基対を利用した転写系は、所望の位置に蛍光プローブを有するＲＮＡ分子を調製するための簡便な方法である。そして、本発明によって提供される、部位特異的に標識された蛍光色素−結合ｙ塩基は、その標的分子の選択的かつ効率的な検出を可能にするものである。
【０１４６】
本実施例において、「Ｔ７転写による、ｙまたはその５−修飾塩基（類）のテオフィリン結合性アプタマーへの部位特異的導入」、「平衡濾過アッセイ」及び「蛍光測定」は、具体的には以下のように行った。
【０１４７】
Ｔ７転写による、ｙまたはその５−修飾塩基（類）のテオフィリン結合性アプタマーへの部位特異的導入
ｓを有する化学的に合成された二本鎖鋳型ＤＮＡを用いて、ｙ又はその修飾塩基（Ｐｈ−ｙ、Ｉ−ｙ及び蛍光色素−結合ｙ）を、６Ｕ、２３Ｕ又は２４Ｕの代わりに導入した。
【０１４８】
ｓを含む鋳型の配列は、図１０Ａ及び配列番号７に記載した通りである。
図１０ＡにおけるＲＮＡアプタマー（４１ヌクレオチド）（配列番号８）中の番号付けは、非特許文献４３に記載された３３ヌクレオチドからなるアプタマーの番号付けと対応させた。鋳型（５９ヌクレオチド  コードＤＮＡ及び５９ヌクレオチド非コードＤＮＡの１０μＭ）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）及び１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液中で、９５℃で加熱し、そしてゆっくりと４℃まで冷却することによってアニールさせた。
【０１４９】
転写は２０μｌスケールで行い、反応組成は、４０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  天然型ヌクレオチド（ＮＴＰ）および１ｍＭ  ｙＴＰ若しくは１ｍＭ  Ｐｈ−ｙＴＰ若しくは０．２５ｍＭ  Ｉ−ｙＴＰ、２μＣｉ［α−３２Ｐ］ＡＴＰ、２μＭ  鋳型ＤＮＡおよび２．５単位／μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｋｙｏｔｏ）である。
【０１５０】
３７℃で６時間インキュベーションの後、等量の染色溶液の添加によって反応を終了させた。反応混合物を７５℃で３分加熱し、そして、４１ヌクレオチドの転写産物をゲル電気泳動によって精製した。
【０１５１】
平衡濾過アッセイ
特定部位にｙ又はその５−修飾塩基を有するＲＮＡアプタマーによるテオフィリンとの結合を、平衡濾過アッセイ（非特許文献４１）によって分析した。種々の濃度のアプタマーを含む溶液（５４μｌ、１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、２５−１５００ｎＭ）を、６μｌの２００ｎＭ  ３Ｈ−標識テオフィリン溶液（Ｍｏｒａｖｅｋ）と混合し、そして混合物を２５℃で５分間インキュベートした。次いで、混合物をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０濾過装置（Ａｍｉｃｏｎ）に装填し、そして濃縮した。濾液の１０μｌ試料を回収し、そして、シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。各ＲＮＡアプタマーに対するテオフィリン結合の比率は、ＲＮＡの存在下及び非存在下で得られた濾液中のテオフィリンの濃度の差から決定された。テオフィリン結合に関する解離定数（Ｋｄ）は、以下の式を用いたＫＡＬＥＩＤＡＧＲＡＰＨプログラムによって決定した。
【０１５２】
式：  ｙ＝Ｍ０×Ｍ１／（Ｍ０＋Ｍ２）
［ここにおいて、
ｙは、テオフィリン結合の比率であり；
Ｍ０は、ＲＮＡ濃度であり；
Ｍ１は、テオフィリンの結合容量であり；そして、
Ｍ２は、Ｋｄである］。
【０１５３】
蛍光測定
Ｕ６の代わりにｓｈｏｒｔ  ＦＭＡ−ｙ、ＦＡＭ−ｙ又はＴＡＭＲＡ−ｙを有する各テオフィリン結合性アプタマーの蛍光プロフィールは、テオフィリン（０−２０μＭ）又はカフェイン（２０μＭ）の存在下で、ＦＰ−６５００蛍光測定装置（ＪＡＳＣＯ）を用いて２５℃で測定された。蛍光スペクトル測定では、１００ｎＭの濃度のアプタマーも用い、励起波長は５ｎｍスペクトルバンド幅で４３４ｎｍ（ｓｈｏｒｔ  ＦＡＭ−ｙ若しくはＦＡＭ−ｙを有するアプタマー）、又は５００ｎｍ（ＴＡＭＲＡ−ｙを有するアプタマー）に設定した。
【０１５４】
各修飾アプタマーの平衡蛍光強度から決定される、Ｋｆ値は、以下の式を用いたＫＡＬＥＩＤＡＧＲＡＰＨプログラムによって得られた。
式：  ｙ＝１＋Ｃ０×Ｃ１／（Ｃ０＋Ｃ２）
［ここにおいて、
ｙは、ＦＡＭについては５２２ｎｍであり、そしてＴＡＭＲＡについては５７８ｎｍにおける相対蛍光強度（テオフィリン非存在下での蛍光強度を「１」と設定する）であり；
Ｃ０は、テオフィリン濃度であり；
Ｃ１は、テオフィリンの飽和濃度における相対的増加値に該当し；そして、
Ｃ２は、Ｋｆである］。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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