(57)【要約】【課題】顕微鏡のＡＦ制御において、安定した合焦の追従性を実現させることが可能な顕微鏡装置を提供すること。【解決手段】２つの領域で受光した光強度信号に基づいて評価関数を算出し、評価関数の傾きが一定となるように調整する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光路に交換可能に設置される複数の対物レンズと、前記複数の対物レンズのうち前記光路に設置された１つの対物レンズを介して、照明用光源から出射された可視光を移動ステージ上に載置された試料に投光し、前記試料で反射した前記観察光を観察する観察光学系と、前記１つの対物レンズを介して、オートフォーカス用光源から出射された赤外光を前記試料に投光し、前記試料で反射した前記赤外光を検出する合焦光学系と、を備えた顕微鏡装置であって、
前記反射した前記赤外光を２つの領域でそれぞれ受光する受光手段と、
前記受光手段によって受光した前記赤外光の光強度信号に基づいて、前記試料の合焦位置を調整する合焦位置調整手段と、
前記受光手段によって受光した前記赤外光の光強度信号を用いて評価関数を算出する評価関数算出手段と、
前記合焦光学系の光路上に配置された補正レンズ群の位置に基づき、前記評価関数算出手段によって算出される評価関数の傾きが一定となるように調整する調整手段と、
を備えることを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記調整手段は、前記合焦光学系の光路上に配置された補正レンズ群の位置に対応付けられた傾き補正係数に基づき調整することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記傾き補正係数を格納するメモリ手段を更に有し、
前記傾き補正係数は、前記補正レンズ群の位置に応じて定めされ、前記メモリ手段に格納されることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記傾き補正係数は、前記複数の対物レンズ毎の倍率または開口数に応じて定められることを特徴とする請求項２または３に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記補正レンズ群の少なくとも異なる２つの位置における前記評価関数に基づき、前記傾き補正係数を算出する傾き補正係数算出手段、を備え、
前記調整手段は、前記傾き補正係数算出手段によって算出された前記傾き補正係数に基づき調整することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記オートフォーカス用光源から出射された赤外光の開口径を変動させる開口絞りを備え、
前記調整手段は、前記開口絞りの開口径を変動させることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記評価関数算出手段は、前記受光手段の第１の領域で受光した前記赤外光の第１の光強度信号と前記受光手段の第２の領域で受光した前記赤外光の第２の光強度信号との差を、前記第１の強度信号と前記第２の強度信号との和で除算して算出することを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対物レンズを用いて試料移動ステージ上の観察試料を光学的に観察する光学顕微鏡等の顕微鏡装置に関し、特に、観察試料のピント位置の調整を自動的に行うことのできる自動焦点（オートフォーカス（ＡＦ：Auto Focus））機能を有する顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微細な試料を観察したり、観察した観察像をビデオ画像として記録したりすることのできる顕微鏡は、生物分野の研究をはじめ、工業分野の検査工程まで幅広く利用されている。このような顕微鏡は、観察試料のピント位置の調整を自動的に行うことのできるＡＦ機能を有している。
【０００３】
通常、ＡＦを行なうためには赤外光（ＡＦ光）を用い、試料を観察するためには可視光（観察光）を用いている。そのため、両光の波長差や、複数の対物レンズを使用した場合の対物レンズ毎の色収差により、自動焦点検出位置がバラついてしまう。このようなバラつきを補償するための手段として、色収差補正用オフセットレンズを合焦検出光学系に配置し、対物レンズ毎に設けた調整部で、対物レンズ毎に合焦位置からのオフセット値を設定し、色収差補正用オフセットレンズの位置を調整する事で、観察光と、ＡＦ光の色収差をキャンセルする技術が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
また、ＡＦ光は、反射率が比較的高いカバーガラスと観察試料との界面、またはカバーガラスの表面での反射光を検出しており、他方、観察光は、観察試料そのもの、例えば液体中の標本に照射される必要があり、両光の光路長が異なっている。これを補正するために、ＡＦ光の光学系と照明光の光学系の共通の光路、またはいずれか一方の光路上に焦点調節用オフセットレンズを配設し、この焦点調節用オフセットレンズでＡＦ光の結像位置を調節することにより、対物レンズの焦点に観察試料の位置を合わせる技術が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
このようなＡＦ機能は、例えば、光を検出するフォトダイオードの領域を反射光の光軸を中心にして２つの領域（Ａ領域、Ｂ領域）に分け、２個のセンサ（センサＡ、Ｂ）がそれぞれの領域の光強度を検出信号として検出する。そして、これらの差（Ａ−Ｂ）をこれらの和（Ａ＋Ｂ）で除算した値（（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ））を評価関数値（ＥＦ値）として算出し、そのＥＦ値を用いて合焦判定を行なっている。すなわち、対物レンズと観察試料の距離を相対的に変化させ、ＥＦ値が０となる箇所を合焦位置と判定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４０９７７６１号公報
【特許文献２】特開２００４-７０２７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述のような光強度の検出信号は、色収差補正オフセットレンズ、あるいは焦点調節用オフセットレンズの位置により、対物レンズの瞳位置におけるＡＦ光のビーム径が異なり、これにより対物レンズからの出射光のＮＡが異なるため、合焦近傍でのＥＦ値の傾きにバラツキが発生してしまう。ＥＦ値の傾きが急峻なもの程、合焦判定を行う際の合焦閾値の範囲が狭くなるため、色収差補正オフセットレンズ、あるいは焦点調節用オフセットレンズの位置により、ＥＦ値の傾きが急峻になる場合には、環境温度や振動の影響により合焦の追従が収束しにくくなる、という問題点があった。
【０００８】
本発明は、上述のような実状に鑑みたものであり、顕微鏡のＡＦ制御において、安定した合焦の追従性を実現させることが可能な顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記課題を解決するため、下記のような構成を採用した。
すなわち、本発明の一態様によれば、本発明の顕微鏡装置は、光路に交換可能に設置される複数の対物レンズと、前記複数の対物レンズのうち前記光路に設置された１つの対物レンズを介して、照明用光源から出射された可視光を移動ステージ上に載置された試料に投光し、前記試料で反射した前記観察光を観察する観察光学系と、前記１つの対物レンズを介して、オートフォーカス用光源から出射された赤外光を前記試料に投光し、前記試料で反射した前記赤外光を検出する合焦光学系とを備えた顕微鏡装置であって、前記反射した前記赤外光を２つの領域でそれぞれ受光する受光手段と、前記受光手段によって受光した前記赤外光の光強度信号に基づいて、前記試料の合焦位置を調整する合焦位置調整手段と、前記受光手段によって受光した前記赤外光の光強度信号を用いて評価関数を算出する評価関数算出手段と、前記合焦光学系の光路上に配置された補正レンズ群の位置に基づき、前記評価関数算出手段によって算出される評価関数の傾きが一定となるように調整する調整手段とを備えることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の顕微鏡装置は、前記調整手段が、前記合焦光学系の光路上に配置された補正レンズ群の位置に対応付けられた傾き補正係数に基づき調整することが望ましい。
また、本発明の顕微鏡装置は、前記傾き補正係数を格納するメモリ手段を更に有し、前記傾き補正係数が、前記補正レンズ群の位置に応じて定めされ、前記メモリ手段に格納されることが望ましい。
【００１１】
また、本発明の顕微鏡装置は、前記傾き補正係数が、前記複数の対物レンズ毎の倍率または開口数に応じて定められることが望ましい。
また、本発明の顕微鏡装置は、前記補正レンズ群の少なくとも異なる２つの位置における前記評価関数に基づき、前記傾き補正係数を算出する傾き補正係数算出手段を更に備え、前記調整手段が、前記傾き補正係数算出手段によって算出された前記傾き補正係数に基づき調整することが望ましい。
【００１２】
また、本発明の顕微鏡装置は、前記オートフォーカス用光源から出射された赤外光の開口径を変動させる開口絞りを更に備え、前記調整手段が、前記開口絞りの開口径を変動させることが望ましい。
【００１３】
また、本発明の顕微鏡装置は、前記評価関数算出手段が、前記受光手段の第１の領域で受光した前記赤外光の第１の光強度信号と前記受光手段の第２の領域で受光した前記赤外光の第２の光強度信号との差を、前記第１の強度信号と前記第２の強度信号との和で除算して算出することが望ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、色収差補正オフセットレンズ、あるいは焦点調節用オフセットレンズの位置に関わらず、合焦近傍のＥＦ値の傾きが一定となるため、合焦判定の際の合焦閾値の範囲が安定し、結果として合焦の追従が安定する、という効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明を適用した顕微鏡装置の全体構成を示す図である。
【図２】２分割ＰＤ１４への結像の様子を説明するための図である。
【図３】２分割ＰＤ１４の検出信号の強度をおよびＥＦ値をグラフにして示した図である。
【図４】低ＮＡ、中ＮＡ、高ＮＡの対物レンズの合焦近傍でのＥＦ値を示す図である。
【図５】第１の実施の形態におけるコントロール部２４の内部構成を示す図である。
【図６】第１の実施の形態におけるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。
【図７】ＥＦ傾き補正係数記憶部２０９に格納された対物レンズ毎のＥＦ値と傾き補正係数との対応例を示す図である。
【図８】焦準位置とＥＦ値との関係を示す図である。
【図９】第２の実施の形態におけるコントロール部２４Ｂの内部構成を示す図である。
【図１０】第２の実施の形態におけるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。
【図１１】第３の実施の形態における顕微鏡装置の全体構成を示す図である。
【図１２】第３の実施の形態におけるコントロール部２４Ｃの内部構成を示す図である。
【図１３】第３の実施の形態におけるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。
【図１４】ＡＳ開口径記憶部２１２に格納されたオフセットレンズ位置毎の開口径データの対応例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
（第１の実施の形態）
図１は、本発明を適用した顕微鏡装置の全体構成を示す図である。
【００１７】
図１において、顕微鏡装置１００は、複数の対物レンズ３ａおよび３ｂを取付可能なレボルバ本体２、レボルバ本体２を回転させて任意の対物レンズ３ａまたは３ｂを光路中に挿入させるために電気的な駆動を行なうレボルバ用モーター１５、並びにレボルバ本体２のどの対物レンズ取付け位置が現在光路中に挿入されているかを検出するためのレボ穴位置検出部２１から構成される電動レボルバを備える。
【００１８】
このような電動レボルバにおいて、コントロール部２４からの信号を受けるレボルバ用モーター駆動部１８の駆動制御により前記レボルバ用モーター１５が回転駆動され、レボルバ本体２のどの穴位置に対物レンズ３ａまたは３ｂが装着されているかを検出するレボ穴位置検出部２１で検出された情報がコントロール部２４へ送られる。
【００１９】
コントロール部２４は、周知のＣＰＵ回路であり、ＣＰＵ本体、制御プログラムを格納したＲＯＭ、制御に必要なデータを随時格納する揮発性メモリであるＲＡＭ、制御信号の入出力を行なうＩ／Ｏポート、およびこれらの各部を接続するデータバス、発振器、アドレスデコーダ等の周知の周辺回路から構成され、データバスおよびＩ／Ｏポートを介して周辺装置の制御を行なう。
【００２０】
観察対象となる観察試料Ｓを載置する試料移動ステージ１は、焦準用モーター１６によって電気的に、光軸方向に移動することが可能である。この焦準用モーター１６は、コントロール部２４によって焦準用モーター駆動部１９が制御されることにより駆動する。
【００２１】
ＡＦに用いられる基準光源４としては、赤外線等の可視外光波長領域の光源が使用される。この基準光源４は、光源のパルス点灯等を行ない、光源の強弱をコントロールするレーザー駆動部２２より制御される。基準光源４から発せられたＡＦ光としての赤外レーザー光は、平行光を保つためのコリメートレンズ５を通り、光束の半分をカットする投光側ストッパー６を介して観察試料Ｓ側に導かれる。すなわち、集光レンズ群８により一旦集光された光束は、オフセットレンズ群９を通り、λ／４板１０を通過する時に４５度偏光され、ダイクロックミラー１１により反射される。
【００２２】
前記オフセットレンズ群９は、オフセットレンズ用モーター１７により焦点距離を変更するズーム機構と、光軸方向への移動を行なう機構の両方を兼ね備えた構成になっており、オフセットレンズ用モーター駆動部２０によって駆動される。また、オフセットレンズ群９の光軸方向における所定の範囲の両端には、リミット検出部２７が設けられており、前記オフセットレンズ群９の光軸方向の移動範囲を制限している。
【００２３】
前記ダイクロックミラー１１は、赤外域のみが反射され、可視域は通過する性質をもっている。これにより、ＡＦ光は、ダイクロックミラー１１で反射されるが、観察試料Ｓを視察するための可視光、すなわち観察光および照明光は、光路中に挿入された対物レンズ３ａまたは３ｂを介して、不図示の接眼レンズに至り、観察試料Ｓを観察することが可能になる。
【００２４】
ダイクロックミラー１１により反射されたＡＦ光は、対物レンズ３ａまたは３ｂにより観察試料Ｓにスポット状の像を形成する。そして、観察試料Ｓにより反射されたＡＦ光は、今度は逆に対物レンズ３ａまたは３ｂ、ダイクロックミラー１１を介し、λ／４板１０を再び通過する時に４５度偏光される。その後、オフセットレンズ群９、集光レンズ群８を戻り、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ：Polarization Beam Splitter）７へ入射する。ＰＢＳ７で反射されたＡＦ光の偏光成分は、受光側ストッパー１２、集光レンズ群１３を通過した後に２分割フォトダイオード（ＰＤ）１４に結像される。
【００２５】
２分割ＰＤ１４は、光軸を中心に２個のフォトダイオード（センサＡおよびＢ）が並ぶ光検出器である。２分割ＰＤ１４で結像されたスポットの光強度に応じた電流信号は、電流／電圧変換された後に所定の増幅率をもって増幅され、その後Ａ／Ｄ変換器２３にてデジタル値に変換されてからコントロール部２４で演算処理される。
【００２６】
フォトダイオードの領域は、反射光の光軸を中心にして２つの領域（Ａ領域、Ｂ領域）に分けられ、２個のセンサ（センサＡ、Ｂ）がそれぞれの領域の光強度を検出信号として検出する。そして、これらの差（Ａ−Ｂ）をこれらの和（Ａ＋Ｂ）で除算した値（（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ））をＥＦ値として算出し、そのＥＦ値を用いて合焦判定を行なう。すなわち、対物レンズ３ａまたは３ｂと観察試料Ｓとの距離を相対的に変化させ、ＥＦ値が０となる箇所を合焦位置と判定している。
【００２７】
また、観察者が直接操作する不図示操作部として、レボルバ本体２を回転させて対物レンズ３ａまたは３ｂを変更するための対物レンズ変換ＳＷ、ＡＦ動作の設定／解除を行なうＡＦスイッチ、並びに試料移動ステージ１の上下動およびオフセットレンズ群９の移動を指示するためのＪＯＧエンコーダ２６が設けられている。ＪＯＧエンコーダ２６からのエンコーダ信号は、パルスカウンタ２５にてパルス数に変換されてコントロール部２４に送られる。コントロール部２４は、このパルスカウンタ２５からのパルス数を読込むことで前記ＪＯＧエンコーダ２６がどちらの方向にどれだけ回転されたかを判断し、ＪＯＧエンコーダ２６の回転量に応じて各々の駆動部を動かすようになっている。
【００２８】
次に、顕微鏡装置１００によって実行されるＡＦ処理について説明する。
ＡＦ動作の設定／解除を行なうＡＦスイッチが押下されると、コントロール部２４は、ＡＦ用の赤外光のスポットを観察試料Ｓに照射させるためにレーザー駆動部２２に信号を与え、基準光源４の発振を開始する。
【００２９】
基準光源４からの光束により観察試料Ｓにスポットが照射され、その反射光が２分割ＰＤ１４に投影される。そして、この投影されたスポットの位置によりＡＦ制御が行なわれる。
【００３０】
図２は、２分割ＰＤ１４への結像の様子を説明するための図であり、（ａ）が中ＮＡの対物レンズ３ａを用いた場合、（ｂ）が高ＮＡの対物レンズ３ｂを用いた場合、（ｃ）が低ＮＡの対物レンズを用いた場合である。
【００３１】
まず、カバーガラス２８の位置が合焦位置より上の場合、すなわちカバーガラス２８が対物レンズ３ａから近い位置の場合を考える。この場合、ＡＦ光は、カバーガラス２８から早く反射されるので、図２（ａ）に示したように、２分割ＰＤ１４に結像されるスポット像２０１（ａ）は、中心位置からセンサＢ寄りに結像される。他方、カバーガラス２８が合焦位置より下にある場合、すなわちカバーガラス２８が対物レンズ３ａから遠い位置の場合には、２分割ＰＤ１４に結像されるスポット像２０２（ａ）は、センサＡ寄りに結像される。
【００３２】
また、カバーガラス２８が正確に合焦位置にある場合のスポット像２０３（ａ）は、センサＡ、Ｂが共に均等な範囲でほぼ光軸の中心に結像する。さらに、この場合は焦点位置にあるために中心の光強度は最も高くなっている。
【００３３】
焦点深度が小さい高ＮＡの対物レンズの場合は、図２（ｂ）に示したように、合焦位置より上、下のスポットの形状２０１（ｂ）、２０２（ｂ）は、中ＮＡの対物レンズのスポット像２０１（ａ）、２０２（ａ）に比べて大きくなる。焦点深度が大きい低倍対物レンズの場合は、図２（ｃ）に示したように、合焦位置より上、下のスポットの形状２０１（ｃ）、２０２（ｃ）は、中ＮＡの対物レンズのスポット像２０１（ａ）、２０２（ａ）に比べて小さくなる。
【００３４】
このように、２分割ＰＤ１４のフォトダイオードに形成されるスポットは、中ＮＡ、高ＮＡ、低ＮＡの対物レンズによって異なる。
上述したように２分割ＰＤ１４は、フォトダイオードの領域を反射光の光軸を中心にして２つの領域（Ａ領域、Ｂ領域）に分け、２個のセンサ（センサＡ、Ｂ）でそれぞれの領域の光強度を検出信号として検出する。コントロール部２４は、ＥＦ値を算出して合焦判定を行なう。
【００３５】
具体的には、対物レンズ３ａまたは３ｂと観察試料Ｓとの距離を相対的に変化させ、ＥＦ値が０となるように試料移動ステージ１を移動することによりＡＦ動作を行なう。すなわち、センサＡの出力が大きい場合は試料移動ステージ１を上に駆動し、センサＢの出力が大きい場合は下に移動する。これにより、観察試料Ｓに正確に合焦できることになる。
【００３６】
このような補正移動量は、対物レンズ３ａまたは３ｂの特性、基準光源４の使用波長により異なることから、予め対物レンズ３ａおよび３ｂ毎の補正移動値をＲＯＭあるいはその他の記憶媒体、例えば不揮発性メモリであるＥＥＰＲＯＭ等に格納しておく。
【００３７】
コントロール部２４が上述のようにして合焦したと判断しても、ＡＦ動作を行なう基準光源４が出射するのは赤外光であり、可視光とは波長が異なるため、色収差により可視光領域ではピントがずれるという事態も生ずる。これを補正するのがオフセットレンズ群９である。
【００３８】
コントロール部２４は、オフセットレンズ用モーター駆動部２０に駆動指示を与え、オフセットレンズ用モーター１７を駆動してオフセットレンズ群９の光軸方向に対する移動量を調整し、２分割ＰＤ１４の結像位置の補正を行なう。
【００３９】
図３は、２分割ＰＤ１４の検出信号の強度をおよびＥＦ値をグラフにして示した図であり、（ａ）が低ＮＡ、中ＮＡ、高ＮＡの対物レンズを用いて検出した場合のＡ、Ｂ信号を示し、（ｂ）がこれらのＡ、Ｂ信号から算出したＥＦ値（（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ））を示す。
【００４０】
コントローラ２４は、Ａ、Ｂ信号の和（Ａ＋Ｂ）、およびＥＦ値（（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ））を用いて以下のように合焦位置の判定を行う。
まず、対物レンズ３ａおよび３ｂ毎に設定されているノイズ判定閾値（ＮＴＨ）を不図示の不揮発性メモリから読み出し、（Ａ＋Ｂ）の値と比較する。その結果、（Ａ＋Ｂ）の値が所定のノイズ判定閾値ＮＴＨより小さければ、すなわち、（Ａ＋Ｂ）＜ＮＴＨであれば、コントロール部２４は、カバーガラス２８を補足していないと判定し、（Ａ＋Ｂ）の値がノイズ判定閾値ＮＴＨ以上になるように、すなわち（Ａ＋Ｂ）≧ＮＴＨが成立するように、試料移動ステージ１を駆動する。
【００４１】
カバーガラス２８を補足する範囲は、図３（ａ）に示す通り、低ＮＡの対物レンズの場合が範囲３０１であり、同様に中ＮＡの対物レンズ３ａが範囲３０２、高ＮＡの対物レンズ３ｂが範囲３０３であり、高ＮＡ対物レンズ３ｂが最も狭く、対物レンズの倍率が小さくなるほどこの範囲は広くなる。
【００４２】
そして、（Ａ＋Ｂ）≧ＮＴＨが成立すると、コントロール部２４は、ＥＦ値が所定の合焦範囲内に入るように、試料移動ステージ１を駆動する。すなわち、下記の不等式（１）が成立するように、コントロール部２４は試料移動ステージ１を移動させ、成立したところで試料移動ステージ１の動作を止める。
【００４３】
−ＦＴＨ＜（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）＜＋ＦＴＨ    ・・・（１）
ここで、ＦＴＨは合焦判定閾値であり、試料移動ステージ１の位置が各対物レンズ３ａまたは３ｂの焦点深度の範囲内に必ず移動されるように決められており、対物レンズレンズ３ａまたは３ｂ毎に設定されている値である。
【００４４】
上記不等式（１）が成立する位置が合焦位置となり、合焦判定閾値ＦＴＨは各対物レンズ３ａまたは３ｂの焦点深度以下になる値に決められている。
図３（ｂ）に示したように、色収差補正オフセットレンズ、あるいは焦点調節用オフセットレンズの位置に起因して、また、対物レンズの倍率に起因して、低ＮＡ、中ＮＡ、高ＮＡの対物レンズ毎に合焦近傍でのＥＦ値の傾きが異なってしまう。
【００４５】
図４は、低ＮＡ、中ＮＡ、高ＮＡの対物レンズの合焦近傍でのＥＦ値を示す図である。
図４に示したように、ＥＦ値の傾きが急峻なもの程、合焦判定を行う際の合焦判定閾値ＦＴＨの範囲が狭くなり、環境温度や振動の影響により合焦の追従が収束し難くなる。
【００４６】
そこで、本発明を適用した顕微鏡装置１００は、対物レンズ３ａおよび３ｂ毎にオフセットレンズ群９の位置に対応付けした傾き補正係数を設定し、常に、合焦近傍でのＥＦ値の傾きが一定となるようにする。
【００４７】
図５は、第１の実施の形態におけるコントロール部２４の内部構成を示す図である。
図５において、コントロール部２４は、入出力部２００、検出信号記憶部２０１、ＥＦ値演算部２０２、ＡＦ処理部２０３、ＥＦ値補正部２０４、オフセットレンズ駆動指示部２０５、焦準部駆動指示部２０６、レボルバ駆動指示部２０７、レーザー駆動指示部２０８、およびＥＦ傾き補正係数記憶部２０９を備える。
【００４８】
入出力部２００は、Ａ／Ｄ変換器２３にてデジタル値に変換された２分割ＰＤ１４の検出値、パルスカウンタ２５にてパルス数に変換されたＪＯＧエンコーダ２６からのエンコーダ信号、または現在光路中に挿入されているレボルバ本体２の対物レンズ取付け位置を入力したり、レボルバ用モーター駆動部１８、焦準用モーター駆動部１９、オフセットレンズ用モーター駆動部２０、およびレーザー駆動部２２を駆動するための駆動信号を各駆動部に対して出力したりする。
【００４９】
検出信号記憶部２０１は、Ａ／Ｄ変換器２３にてデジタル値に変換された２分割ＰＤ１４の検出値を格納し、ＥＦ値演算部２０２は、検出信号記憶部２０に格納された２分割ＰＤ１４の検出値に基づいて、ＥＦ値を算出する。
【００５０】
ＡＦ処理部２０３は、ＥＦ値演算部２０２で算出したＥＦ値を用いて、上述のＡＦ処理を実行する。
ＥＦ値補正部２０４は、対物レンズ３ａおよび３ｂ毎にオフセットレンズ群９の位置に対応付けた傾き補正係数に基づき、ＥＦ値の傾きが一定となるようにする。
【００５１】
オフセットレンズ駆動指示部２０５は、オフセットレンズ群９の駆動を指示し、焦準部駆動指示部２０６は、焦準用モーター駆動部１９の駆動を指示し、レボルバ駆動指示部２０７は、電動レボルバの駆動を指示し、レーザー駆動指示部２０８は、レーザー駆動部２２の駆動を指示する。
【００５２】
そして、ＥＦ傾き補正係数記憶部２０９は、対物レンズ３ａおよび３ｂ毎にオフセットレンズ群９の位置に対応した傾き補正係数を格納する。
図６は、第１の実施の形態におけるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。
【００５３】
まず、ステップＳ６０１において、コントロール部２４が、ＡＦ用の赤外光のスポットを観察試料Ｓに照射させるためにレーザー駆動部２２に信号を与え、基準光源４の発振を開始すると、ステップＳ６０２において、２分割ＰＤ１４が、反射光の光軸を中心に分けたフォトダイオードの２つの領域（Ａ領域、Ｂ領域）それぞれの光強度を検出信号として検出する。
【００５４】
そして、ステップＳ６０３において、２分割ＰＤ１４の検出値に基づいて、ＥＦ値を算出する。
次に、ステップＳ６０４において、合焦近傍であるか否かを判断し、未だ合焦近傍でない場合（ステップＳ６０４：Ｎｏ）は、ステップＳ６０５において、焦準用モーター１６を駆動することにより、合焦するように試料移動ステージ１が光軸方向に上下動する。
【００５５】
他方、ステップＳ６０４で合焦近傍であると判断した場合（ステップＳ６０４：Ｙｅｓ）、ステップＳ６０６において、ＥＦ傾き補正係数記憶部２０９に格納された傾き補正係数を読み出す。なお、このステップＳ６０６は、例えば、同一の対物レンズを用いている場合には、１度実行すれば２度目以降は１度目に読み出したデータを用いることができるので、スキップすることもできる。
【００５６】
図７は、ＥＦ傾き補正係数記憶部２０９に格納された対物レンズ毎のＥＦ値と傾き補正係数との対応例を示す図である。
図７に示した例では、オフセットレンズ群９の光軸方向の位置が「−４ｍｍ以上０ｍｍ未満」を基準にして、「０ｍｍ以上５ｍｍ未満」「５ｍｍ以上１０ｍｍ未満」「１０ｍｍ以上１５ｍｍ未満」「１５ｍｍ以上２０ｍｍ未満」「２０ｍｍ以上２２ｍｍ以下」の場合に、それぞれの傾き補正係数が「１．０」「１．１」「１．２」「１．３」「１．４」「１．５」となっている。
【００５７】
これらの傾き補正係数は、次にようにして決定する。
図８は、焦準位置とＥＦ値との関係を示す図である。
図８に示す実線および破線は、計測値から求めた近似式である。図８中の実線は、６０倍の対物レンズにおける、オフセットレンズ群９の位置が光軸方向に−４ｍｍの場合の、焦準位置とＥＦ値との関係を示し、破線は、オフセットレンズ群９の位置が２２ｍｍの場合を示す。
【００５８】
図８に示したように、６０倍の対物レンズにおいて、オフセットレンズ群９の位置が−４ｍｍと２２ｍｍとのＥＦ値の傾きを比較すると、対物レンズから遠い方向にある−４ｍｍの位置の傾きの方が急である。なお、−４ｍｍの時の傾きは、２２ｍｍの時の傾きに対して１．５倍である。
【００５９】
この時のＥＦ値が−１０００から１０００までにおける閾値範囲は、−４ｍｍの時で１７４ｎｍであり、２２ｍｍの位置では、２６１ｎｍとなっており、その差は約１００マイクロメートルとなる。すなわち、−４ｍｍの位置の方が、振動の影響を受け易い事が分る。ここで、−４ｍｍ時のＥＦ値に対して１．５の逆数を掛けるとこの差は無くなる。
【００６０】
そこで、図６のステップＳ６０７において、ＥＦ値に傾き補正係数を乗算した値に算出する。これにより、オフセットレンズ群９に位置に関係なく、合焦近傍のＥＦ値の傾きは一定となる。
【００６１】
そして、ステップＳ６０８において、ステップＳ６０７で算出した値と、対物レンズ３ａおよび３ｂ毎に設定されているノイズ判定閾値ＮＴＨとを用いて焦点深度内か否かを判断し、焦点深度内であれば（ステップＳ６０８：Ｙｅｓ）、ステップＳ６０２に戻る。他方、環境温度の変化や振動等により焦点深度内でなくなるような場合は（ステップＳ６０８：Ｎｏ）、ステップＳ６０５に進む。
【００６２】
以上により、対物レンズ３ａおよび３ｂ毎にオフセットレンズ群９の位置に対応した傾き補正係数によりＥＦ値を補正することで、オフセットレンズ群９の位置に関係なく、合焦近傍のＥＦ値の傾きは一定になり、振動等の外乱による影響が軽減される。
【００６３】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。
本発明の第２の実施の形態は、上述の第１の実施の形態がＥＦ値を補正するための傾き補正係数を予め格納しているのに対して、ＡＦ処理の中で傾き補正係数を求めることを特徴としている。
【００６４】
顕微鏡装置の全体構成は、コントロール部２４の代わりにコントロール部２４Ｂを備えることを除き、図１に示した第１の実施の形態と同様であるので、その説明を省略する。
図９は、第２の実施の形態におけるコントロール部２４Ｂの内部構成を示す図である。
【００６５】
図９において、コントロール部２４Ｂは、入出力部２００、検出信号記憶部２０１、ＥＦ値演算部２０２、ＡＦ処理部２０３、ＥＦ値補正部２０４、オフセットレンズ駆動指示部２０５、焦準部駆動指示部２０６、レボルバ駆動指示部２０７、レーザー駆動指示部２０８、およびＥＦ傾き補正係数演算部２１０を備える。
【００６６】
ＥＦ傾き補正係数演算部２１０は、予め決められた間隔でＥＦ値をサンプリングし、傾きが一定となるようにＥＦ値の傾き補正係数を算出する。例えば、上述したように、６０倍の対物レンズにおいて、オフセットレンズ群９の位置が−４ｍｍと２２ｍｍとのＥＦ値をそれぞれ算出し、それらのＥＦ値の傾きを求める。
【００６７】
なお、コントロール部２４Ｂにおいて、コントロール部２４と同様の構成については、その説明を省略する。
図１０は、第２の実施の形態におけるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。
【００６８】
図１０のフローチャートは、図６のフローチャートのステップＳ６０６の代わりに、ステップＳ１００１乃至Ｓ１００５を実行する。
すなわち、図１０のステップＳ６０４で合焦近傍であると判断した場合（ステップＳ６０４：Ｙｅｓ）、ステップＳ１００１およびＳ１００２において、サンプリングの回数ｎが規定の回数に達するまで、ステップＳ６０３のＥＦ値を算出する。
【００６９】
ステップＳ１００１で所定回数に達したら（ステップＳ１００１：Ｙｅｓ）、ステップＳ１００３において、現在のＥＦ値を一時的にメモリに保持した後、ステップＳ１００４でｎを０にする。
【００７０】
そして、ステップＳ１００５において、目標とする傾きになるようなＥＦ値の傾き補正係数を算出し、ステップＳ６０７に進む。
これにより、第１の実施の形態では必要であった、図７に例示したようなテーブルを格納しておくメモリが不要となるとともに、合焦近傍のＥＦ値の傾きは一定になり、振動等の外乱による影響も軽減される。
【００７１】
なお、コントロール部２４Ｂが第１の実施の形態と同様のＥＦ傾き補正係数記憶部２０９を備え、ステップＳ１００５で傾き補正係数を算出後、算出した傾き補正係数をＥＦ傾き補正係数記憶部２０９に格納するようにすれば、ステップＳ１００５での算出を毎回実行する必要がなくなり、その後はその格納した傾き補正係数を用いるようにしてもよい。
【００７２】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態について説明する。
図１１は、第３の実施の形態における顕微鏡装置の全体構成を示す図である。
【００７３】
本発明の第３の実施の形態の顕微鏡装置１００Ｃは、上述した第１の実施の形態の顕微鏡装置１００の構成に加え、開口絞り（ＡＳ：Aperture Stop）２９、ＡＳ用モーター３０およびＡＳ用モーター駆動部３１を備えることを特徴とする。図１に示した顕微鏡装置１００と同様の構成に関しては、その説明を省略する。
【００７４】
開口絞り２９は、対物レンズ３ａまたは３ｂの瞳位置におけるＡＦ光のビーム径を調整するために、基準光源４とコリメートレンズ５の間に設ける。そして、コントロール部２４Ｃの制御の元、ＡＳ用モーター駆動部３１によってＡＳ用モーター３０が駆動され、開口絞り２９の開口径を変動させる。
【００７５】
基準光源４から発せされたＡＦ光は、開口絞り２９で絞られるので、開口絞り２９の開口径に応じて２分割ＰＤ１４の検出信号の電位が変化する。したがって、その電位を調整する必要がある。例えば、２分割ＰＤ１４で結像されたスポットの光強度に応じた電流信号を、Ａ／Ｄ変換器２３Ｃで所定の増幅率をもって増幅させることにより調整する。あるいは、コントロール部２４で、光源の強弱をコントロールするレーザー駆動部２２を制御して調整する。
【００７６】
図１２は、第３の実施の形態におけるコントロール部２４Ｃの内部構成を示す図である。
図１２において、コントロール部２４Ｃは、入出力部２００、検出信号記憶部２０１、ＥＦ値演算部２０２、ＡＦ処理部２０３、オフセットレンズ駆動指示部２０５、焦準部駆動指示部２０６、レボルバ駆動指示部２０７、レーザー駆動指示部２０８、ＡＳ駆動指示部２１１、およびＡＳ開口径記憶部２１２を備える。
【００７７】
ＡＳ開口径記憶部２１２は、レボルバ駆動指示部２０７によって光路内へ移動される対物レンズ３ａまたは３ｂの種類情報と、オフセットレンズ駆動指示部２０５によって移動されるオフセットレンズ群９の位置情報に従って、予め定められた開口絞り２９の開口径を格納する。
【００７８】
ＡＳ駆動指示部２１１は、ＡＳ開口径記憶部２１２に格納された開口径になるように、開口絞り２９を変動させる。なお、ＡＦの追従動作中にオフセットレンズ群９の位置が移動された場合であっても、ＡＳ駆動指示部２１１は、それに追従して開口絞り２９を変動させてもよい。
【００７９】
なお、コントロール部２４Ｃにおいて、コントロール部２４と同様の構成については、その説明を省略する。
図１３は、第３の実施の形態におけるＡＦ処理の流れを示すフローチャートである。
【００８０】
まず、ステップＳ１３０１において、ＡＳ開口径記憶部２１２に格納された開口径データを読み出す。
図１４は、ＡＳ開口径記憶部２１２に格納されたオフセットレンズ位置毎の開口径データの対応例を示す図である。
【００８１】
図１４に示した例では、オフセットレンズ群９の光軸方向の位置が「−４ｍｍ以上０ｍｍ未満」を基準にして、「０ｍｍ以上５ｍｍ未満」「５ｍｍ以上１０ｍｍ未満」「１０ｍｍ以上１５ｍｍ未満」「１５ｍｍ以上２０ｍｍ未満」「２０ｍｍ以上２２ｍｍ以下」の場合に、それぞれの開口径が「３．４ｍｍ」「３．５ｍｍ」「３．６ｍｍ」「３．７ｍｍ」「３．８ｍｍ」「３．９ｍｍ」となっている。
【００８２】
そして、ステップＳ１３０２において、対物レンズ３ａまたは３ｂの種類情報とオフセットレンズ群９の位置情報に対応した開口絞り２９の開口径になるように、ＡＳ用モーター３０を駆動して開口絞り２９を変動させる。
【００８３】
次に、ステップＳ６０１において、コントロール部２４Ｃが、ＡＦ用の赤外光のスポットを観察試料Ｓに照射させるためにレーザー駆動部２２に信号を与え、基準光源４の発振を開始すると、ステップＳ６０２において、２分割ＰＤ１４が、反射光の光軸を中心に分けたフォトダイオードの２つの領域（Ａ領域、Ｂ領域）それぞれの光強度を検出信号として検出する。
【００８４】
そして、ステップＳ６０３において、２分割ＰＤ１４の検出値に基づいて、ＥＦ値を算出する。
そして、ステップＳ６０８において、対物レンズ３ａおよび３ｂ毎に設定されているノイズ判定閾値ＮＴＨを用いて焦点深度内か否かを判断し、焦点深度内であれば（ステップＳ６０８：Ｙｅｓ）、ステップＳ６０２に戻る。
【００８５】
他方、環境温度の変化や振動等により焦点深度内でなくなるような場合は（ステップＳ６０８：Ｎｏ）、ステップＳ６０５に進み、焦準用モーター１６を駆動することにより、合焦するように試料移動ステージ１が光軸方向に上下動する。
【００８６】
このように、オフセットレンズ群９の位置毎に、開口絞り２９の開口径を可変にすることで、対物レンズ３ａまたは３ｂの瞳位置におけるＡＦ光のビーム径が可変となり、合焦付近でのＥＦ値が常に一定となるため、振動等の外乱による影響が軽減される。
【００８７】
以上本発明を適用した各実施の形態を説明してきたが、本発明は、以上に述べた各実施の形態等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の構成または形状を取ることができる。
【符号の説明】
【００８８】
１        試料移動ステージ
２        レボルバ本体
３ａ、３ｂ    対物レンズ
４        基準光源
５        コリメートレンズ
６        投光側ストッパー
７        偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）
８        集光レンズ群
９        オフセットレンズ群
１０      λ／４板
１１      ダイクロックミラー
１２      受光側ストッパー
１３      集光レンズ群
１４      ２分割フォトダイオード（ＰＤ）
１５      レボルバ用モーター
１６      焦準用モーター
１７      オフセットレンズ用モーター
１８      レボルバ用モーター駆動部
１９      焦準用モーター駆動部
２０      オフセットレンズ用モーター駆動部
２１      レボ穴位置検出部
２２      レーザー駆動部
２３、２３Ｃ  Ａ／Ｄ変換器
２４、２４Ｂ、２４Ｃ  コントロール部
２５      パルスカウンタ
２６      ＪＯＧエンコーダ
２７      リミット検出部
２８      カバーガラス
２９      開口絞り
３０      ＡＳ用モーター
３１      ＡＳ用モーター駆動部
１００、１００Ｃ  顕微鏡装置
２００    入出力部
２０１    検出信号記憶部
２０２    ＥＦ値演算部
２０３    ＡＦ処理部
２０４    ＥＦ値補正部
２０５    オフセットレンズ駆動指示部
２０６    焦準部駆動指示部
２０７    レボルバ駆動指示部
２０８    レーザー駆動指示部
２０９    ＥＦ傾き補正係数記憶部
２１０    ＥＦ傾き補正係数演算部
２１１    ＡＳ駆動指示部
２１２    ＡＳ開口径記憶部
Ｓ        観察試料
【図１】
2013003333.tif 000003
【図２】
2013003333.tif 000004
【図３】
2013003333.tif 000005
【図４】
2013003333.tif 000006
【図５】
2013003333.tif 000007
【図６】
2013003333.tif 000008
【図７】
2013003333.tif 000009
【図８】
2013003333.tif 000010
【図９】
2013003333.tif 000011
【図１０】
2013003333.tif 000012
【図１１】
2013003333.tif 000013
【図１２】
2013003333.tif 000014
【図１３】
2013003333.tif 000015
【図１４】
2013003333.tif 000016