(57)【要約】      （修正有）【課題】所望する粘着末端（突出末端）を有する二本鎖ＤＮＡを容易に調製する方法、さらに当該方法によって調製したＤＮＡ断片を用いた簡便で汎用性の高い組換えＤＮＡならびにベクターの作製方法を提供する。【解決手段】傷害バイパス活性欠損（傷害塩基不耐性）のＤＮＡポリメラーゼと、傷害塩基を含むプライマーを用いてＤＮＡ鎖を合成し、ＤＮＡポリメラーゼの停止によって粘着末端（突出末端）を作製する。【選択図】図１
2013051940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製する方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程；
（ａ）鋳型ＤＮＡと、該鋳型ＤＮＡにアニーリング可能な第１のプライマーとを接触させる工程
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第１のプライマーを伸長させ、該鋳型ＤＮＡに対して相補的な第１の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
（ｃ）該第１の相補ＤＮＡ鎖と、該相補ＤＮＡ鎖にアニーリング可能な第２のプライマーとを接触させる工程
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第２のプライマーを伸長させ、第１の相補ＤＮＡ鎖に対して相補的な第２の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
を含み、
前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの少なくとも一方が、その５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むプライマーであり、
前記ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、有意な傷害バイパス活性を示さないＤＮＡポリメラーゼである方法。
【請求項２】
（ａ）〜（ｄ）の工程が繰り返し行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）〜（ｄ）の工程がポリメラーゼ連鎖反応中に行われる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
傷害塩基が、ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチンおよびオキサニンからなる群より選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
傷害塩基が、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
有意な傷害バイパス活性を示さないＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼおよびその誘導体から選択される請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
有意な傷害バイパス活性を示さないＤＮＡポリメラーゼが、古細菌由来のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼおよびその誘導体から選択される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって作製した二本鎖ＤＮＡの粘着末端と、該粘着末端と相補的な粘着末端を有するＤＮＡとをライゲーションする組換えＤＮＡの作製方法。
【請求項９】
得られる組換えＤＮＡがベクターである請求項８に記載の組換えＤＮＡの作製方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の作製方法により得られる組換えＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘着末端（突出末端）を有する二本鎖ＤＮＡを調製する方法に関する。さらに当該方法によって調製したＤＮＡ断片を用いた組換えＤＮＡの作製方法、および該組換えＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．組換えＤＮＡの作製における粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製
ＤＮＡまたはタンパク質の機能を研究するため、また産業上有用な遺伝子またはタンパク質を開発するために、遺伝子のクローニングまたはエンジニアリングの技術が広く使用されている。遺伝子のクローニング、複数のＤＮＡ配列間のドメイン交換、または複数のＤＮＡ断片からの配列アセンブリなどのＤＮＡエンジニアリングは、最も一般的には、制限酵素によりＤＮＡを切断する工程とリガーゼによりＤＮＡを結合する工程とを含む手法によって行われている。その多くの場合は、制限酵素による消化によって粘着末端を有するＤＮＡ断片が調製される。
【０００３】
一方で、制限酵素を使用せずに粘着末端を有するＤＮＡ断片を調製する方法として、ＤＮＡポリメラーゼのＴｄＴ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を利用するＴＡクローニング法が知られている。ＴＡクローニング法は簡便な方法であるが、効率が低い、古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼなどの高忠実性ポリメラーゼを使用できない、または方向性を保った断片挿入ができない等の欠点もある。
【０００４】
また別の方法として、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して粘着末端を調製するＬＩＣ（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法が知られている（非特許文献１）。
【０００５】
またＦＡＳＴＲ（ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）法では、タイプＩＩＳ制限酵素とＤＮＡリガーゼとを利用して、制限酵素の認識配列とは別の任意の配列を有する粘着末端の調製、およびそのライゲーションを遂行できる（特許文献１、非特許文献２）。
【０００６】
また別の粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製法として、化学修飾塩基を含むケージドプライマーの使用、およびＵＶ照射による修飾部位の分解を利用したＬＡＣＥ−ＰＣＲ（ｌｉｇｈｔ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｏｈｅｓｉｖｅ−ｅｎｄｉｎｇ  ＰＣＲ）法がある（特許文献２、非特許文献３）。
【０００７】
このように最も古典的な制限酵素消化による粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製法が、今も根強く使用されている一方で、新しい様々な粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製法が開発されてきている。しかし、引き続き、より簡便で汎用性の高い粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製法およびそれを利用する組換えＤＮＡの作製法が求められていた。
【０００８】
２．高忠実性ＤＮＡポリメラーゼの傷害塩基不耐性
ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）において一般的に使用されているＤＮＡ合成酵素は、主にＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）またはその誘導体である。一方で、一般的なＴａｑポリメラーゼよりも合成エラー率の低い、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼが知られており、それらはＤＮＡのクローニングなどで重宝されている。
【０００９】
高忠実性ＤＮＡポリメラーゼとして、ファミリーＢ（またはタイプＢと呼ばれる）のＤＮＡポリメラーゼおよびその誘導体が知られており、また古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼおよびその誘導体が知られている。
【００１０】
例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来の酵素またはその誘導体としてＰｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などがあり、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＧＢ−Ｄ由来の酵素またはその誘導体としてＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）などがあり、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ由来の酵素またはその誘導体としてＰｒｏｏｆＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）などがある。
【００１１】
また、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来の酵素またはその誘導体としてＶｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）などがあり、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来の酵素またはその誘導体としてＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＫＯＤ（ＨｉＦｉ）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ／Ｎｏｖａｇｅｎ）などがあり、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ由来の酵素またはその誘導体としてＴｇｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）などがある。
【００１２】
しかしながら、これらの高忠実性ＤＮＡポリメラーゼは、一般に傷害バイパス活性（ｌｅｓｉｏｎ  ｂｙｐａｓｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示さないポリメラーゼ（以下、傷害バイパス活性欠損ＤＮＡポリメラーゼ、または傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼともいう）であるため、鋳型ＤＮＡ鎖の中にｄＵまたはｄＩなどの傷害が存在すると、ＤＮＡ合成反応が停止してしまうことが知られている（非特許文献４）。
【００１３】
前記ＤＮＡ合成反応の停止は、ＤＮＡポリメラーゼの“ｒｅａｄ−ａｈｅａｄ”機能によることが分かっている。ＤＮＡポリメラーゼは、進行方向の４塩基前方にある鋳型鎖中の傷害塩基を特異的に認識して、強固に結合する。その結果、ＤＮＡ合成反応は停止してしまう。様々なＤＮＡポリメラーゼについて、このような合成阻害効果の詳細が報告されている（非特許文献５〜１０）。
【００１４】
また、プライマー鎖中に傷害塩基が含まれている場合も、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応は阻害されるとの報告がある（非特許文献１１〜１３）。
【００１５】
さらに、ＤＮＡ合成基質であるｄＮＴＰｓの中に傷害塩基が存在している場合も、結果的に高忠実性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成反応は阻害される（非特許文献１４および１５）。
【００１６】
このように、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成反応において、傷害塩基が、鋳型鎖、プライマー鎖およびｄＮＴＰのいずれの中に存在しても、ＤＮＡ合成反応を阻害する原因となる。このような高忠実性ＤＮＡポリメラーゼの傷害塩基不耐性（ｌｅｓｉｏｎ  ｂａｓｅ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｔ）のため、当業者の間では、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲでは、反応系に傷害塩基を含むことは避けるべきであると考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２５２０９号
【特許文献２】国際公開第２００９／１１３７０９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Aslanidis C, de Jong PJ. Ligation-independent cloning of PCR products（LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 1990 Oct 25;18(20):6069-74.
【非特許文献２】Kotera I, Nagai T. A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS restriction enzyme. J Biotechnol. 2008 Oct 10;137(1-4):1-7. Epub 2008 Jul 23.
【非特許文献３】Tanaka K, Katada H, Shigi N, Kuzuya A, Komiyama M. Direct preparation of sticky-ended duplexes within PCR by using caged primers. Nucleic Acids Symp Ser（Oxf). 2008;(52):467-8.
【非特許文献４】Hogrefe HH, Borns MC, Highｆidelity PCR Enzymes, Stratagene Newsletter Volume 17 Number 2.（Reproduced with permissionｆrom C.W. Dieffenbach, G.S. Dveksler（eds.）PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003).
【非特許文献５】Lasken RS, Schuster DM, Rashtchian A. Archaebacterial DNA polymerases tightly bind uracil-containing DNA. J Biol Chem. 1996 Jul 26;271(30):17692-6.
【非特許文献６】Greagg MA, Fogg MJ, Panayotou G, Evans SJ, Connolly BA, Pearl LH. A read-aheadｆunction in archaeal DNA polymerases detects promutagenic template-strand uracil. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Aug 3;96(16):9045-50.
【非特許文献７】Gruz P, Shimizu M, Pisani FM, Deｆelice M, Kanke Y, Nohmi T. Processing of DNA lesions by archaeal DNA polymerasesｆrom Sulfolobus solfataricus. Nucleic Acids Res. 2003 Jul 15;31(14):4024-30.
【非特許文献８】Shuttleworth G, Fogg MJ, Kurpiewski MR, Jen-Jacobson L, Connolly BA. Recognition of the pro-mutagenic base uracil byfamily B DNA polymerases from archaea. J Mol Biol. 2004 Mar 26;337(3):621-34.
【非特許文献９】Gill S, O'Neill R, Lewis RJ, Connolly BA. Interaction of the family-B DNA polymeraseｆrom the archaeon Pyrococcus furiosus with deaminated bases. J Mol Biol. 2007 Sep 28;372(4):855-63.
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【非特許文献１１】Knittel T, Picard D. PCR with degenerate primers containing deoxyinosineｆails with Pfu DNA polymerase. PCR Methods Appl. 1993 May;2(4):346-7.
【非特許文献１２】Fujiwara H,ｆujiwara K, Hashimoto K. PCR with deoxyinosine-containing primers using DNA polymerases with proofreading activity. PCR Methods Appl. 1995 Feb;4(4):239-40.
【非特許文献１３】Sakaguchi AY, Sedlak M, Harris JM, Sarosdy MF. Cautionary note on the use of dUMP-containing PCR primers with Pfu and VentR DNA polymerases. Biotechniques. 1996 Sep;21(3):368-70.
【非特許文献１４】Slupphaug G, Alseth I, Eftedal I, Volden G, Krokan HE. Low incorporation of dUMP by some thermostable DNA polymerases may limit their use in PCR amplifications. Anal Biochem. 1993 May 15;211(1):164-9.
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼの能力を利用し、所望する粘着末端（突出末端）を有する二本鎖ＤＮＡを容易に調製する方法を提供することである。さらに当該方法によって調製したＤＮＡ断片を用いた簡便で汎用性の高い組換えＤＮＡおよびベクターの作製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。前述のごとく、所望するＤＮＡの複製において有用な高忠実性ＤＮＡポリメラーゼは、傷害バイパス活性欠損（傷害塩基不耐性）であるために、反応系中に傷害塩基が存在するとＤＮＡ合成反応が阻害されてしまう、というのが当業者の常識であった。
【００２１】
しかしながら、本発明者らは、プライマーの塩基配列において、ある特定の位置に傷害塩基が存在する場合は、例外的に高忠実性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成反応が阻害されないことを見出した。
【００２２】
本発明者らはさらに鋭意検討を重ね、その結果、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼの能力と、傷害塩基を含むプライマーを使用することによって、所望する粘着末端（突出末端）を有する二本鎖ＤＮＡを容易に調製し得ることを見出し、本発明を完成した。
【００２３】
すなわち本発明は以下の通りである。
１．少なくとも１つの粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製する方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程；
（ａ）鋳型ＤＮＡと、該鋳型ＤＮＡにアニーリング可能な第１のプライマーとを接触させる工程
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第１のプライマーを伸長させ、該鋳型ＤＮＡに対して相補的な第１の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
（ｃ）該第１の相補ＤＮＡ鎖と、該相補ＤＮＡ鎖にアニーリング可能な第２のプライマーとを接触させる工程
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第２のプライマーを伸長させ、第１の相補ＤＮＡ鎖に対して相補的な第２の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
を含み、
前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの少なくとも一方が、その５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むプライマーであり、
前記ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が、有意な傷害バイパス活性を示さないＤＮＡポリメラーゼである方法。
２．（ａ）〜（ｄ）の工程が繰り返し行われる前項１に記載の方法。
３．（ａ）〜（ｄ）の工程がポリメラーゼ連鎖反応中に行われる前項１または２に記載の方法。
４．傷害塩基が、ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチンおよびオキサニンからなる群より選択される前項１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．傷害塩基が、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される前項４に記載の方法。
６．有意な傷害バイパス活性を示さないＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼおよびその誘導体から選択される前項１〜５のいずれか１に記載の方法。
７．有意な傷害バイパス活性を示さないＤＮＡポリメラーゼが、古細菌由来のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼおよびその誘導体から選択される前項１〜６のいずれか１に記載の方法。
８．前項１〜７のいずれか１に記載の方法によって作製した二本鎖ＤＮＡの粘着末端と、該粘着末端と相補的な粘着末端を有するＤＮＡとをライゲーションする組換えＤＮＡの作製方法。
９．得られる組換えＤＮＡがベクターである前項８に記載の組換えＤＮＡの作製方法。
１０．前項８または９に記載の作製方法により得られる組換えＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体。
【発明の効果】
【００２４】
上述したように、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼ等の傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応において、鋳型鎖、プライマー鎖およびｄＮＴＰｓのいずれの中に傷害塩基が存在しても、ＤＮＡ合成反応が阻害される原因になると考えられていた。
【００２５】
しかしながら、本発明の方法によれば、５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むプライマーを使用することにより、傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼであっても例外的にプライマーを伸長させることができる。
【００２６】
したがって、本発明の方法によれば、一般的なＴａｑポリメラーゼよりも合成エラー率の低い、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、所望する粘着末端（突出末端）を有する二本鎖ＤＮＡを容易に調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製する方法（ＳＥＥＰＳ法；Ｓｔｉｃｋｙ  Ｅｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｓｔｏｐ）の原理を模式的に表す図である。
【図２】ＳＥＥＰＳ法を利用した組換えＤＮＡの作製法の一例（粘着末端を有するＤＮＡ断片の増幅と、そのベクターへの挿入）を模式的に表す図である。
【図３】５’領域に付加配列を有するＳＥＥＰＳプライマーの例を模式的に表す図である。
【図４Ａ】正常塩基とその様々な傷害塩基の例について、それらの化学構造を示す図である。
【図４Ｂ】正常塩基とその様々な傷害塩基の例について、それらの化学構造を示す図である。
【図４Ｃ】正常塩基とその様々な傷害塩基の例について、それらの化学構造を示す図である。
【図４Ｄ】正常塩基とその様々な傷害塩基の例について、それらの化学構造を示す図である。
【図５】鋳型ＤＮＡとＳＥＥＰＳプライマーとのアニーリングの様子を示す模式図である。
【図６】様々なｄＩ含有プライマーと傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図７】付加配列にｄＩを含む様々なプライマーと傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図８】様々なｄＵ含有プライマーと傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図９】付加配列にｄＵを含む様々なプライマーと傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図１０】ＳＥＥＰＳ法を利用して作製した組換えＤＮＡのインサートＤＮＡとベクターＤＮＡとの結合様式および接合部の塩基配列を示す図である。
【図１１】ＳＥＥＰＳ法を利用して作製した組換えＤＮＡを制限酵素で消化した結果を示す電気泳動像の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００２９】
なお本明細書中では、本発明の粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製する方法を「ＳＥＥＰＳ法」（Ｓｔｉｃｋｙ  Ｅｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｓｔｏｐ）と呼ぶ場合がある。
【００３０】
また、ＳＥＥＰＳ法で使用する５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むプライマーを「ＳＥＥＰＳプライマー」と呼ぶ場合がある。
【００３１】
またＳＥＥＰＳ法に適合する酵素、すなわちＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素であって、有意な傷害バイパス活性を示さない［傷害バイパス活性欠損（傷害塩基不耐性）］酵素を、「ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼ」と呼ぶ場合がある。
【００３２】
１．本発明の粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製する方法の概要
本発明の粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製する方法（ＳＥＥＰＳ法）は、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）鋳型ＤＮＡと、該鋳型ＤＮＡにアニーリング可能な第１のプライマーとを接触させる工程、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第１のプライマーを伸長させ、該鋳型ＤＮＡに対して相補的な第１の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
（ｃ）該第１の相補ＤＮＡ鎖と、該相補ＤＮＡ鎖にアニーリング可能な第２のプライマーとを接触させる工程
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第２のプライマーを伸長させ、第１の相補ＤＮＡ鎖に対して相補的な第２の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
【００３３】
前記第１のプライマーおよび第２のプライマーの少なくとも一方は、その５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むプライマー（ＳＥＥＰＳプライマー）である。また、前記ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、有意な傷害バイパス活性を示さないポリメラーゼ（ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼ）である。
【００３４】
工程（ａ）〜（ｄ）の反応は、当業者に公知の条件（例えば、「バイオ実験イラストレイテッド２  遺伝子解析の基礎」中山広樹・西方敬人著、１９９５年、秀潤社発行、および「バイオ実験イラストレイテッド３  本当にふえるＰＣＲ」中山広樹著、１９９６年、秀潤社発行）で行うことができる。また、工程（ａ）〜（ｄ）は繰り返し行われることが好ましい。工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返すサイクル数は、鋳型ＤＮＡの種類、第１のプライマーおよび第２のプライマーの長さおよび反応条件等により適宜設定することが好ましく、特に限定されないが、通常１０〜５０サイクルが好ましく、２０〜３０サイクルがより好ましい。
【００３５】
鋳型ＤＮＡの長さは特に限定されず、２０塩基〜ゲノムサイズのＤＮＡまで広く適用可能である。鋳型から合成するＤＮＡの長さは特に限定されないが、通常２０〜５００，０００塩基であることが好ましく、５０〜５０，０００塩基であることがより好ましく、８０〜１０，０００塩基であることが更に好ましい。
【００３６】
第１のプライマーおよび第２のプライマーの長さは、特に限定されないが、通常７〜１００塩基であることが好ましく、１０〜８０塩基であることがより好ましく、１６〜６０塩基であることが更に好ましい。
【００３７】
第１のプライマーの塩基配列は使用される反応条件において鋳型ＤＮＡにアニーリングするように、実質的に鋳型ＤＮＡに相補的な塩基配列であることが好ましい。また、第２のプライマーの塩基配列は使用される反応条件において第１の相補ＤＮＡ鎖にアニーリングするように、実質的に第１の相補ＤＮＡ鎖に相補的な塩基配列であることが好ましい。
【００３８】
第１のプライマーおよび第２のプライマーがＳＥＥＰＳプライマーである場合、後述する「４．ＳＥＥＰＳプライマーの設計」に従って設計する。
【００３９】
以下、工程毎に説明する。ＳＥＥＰＳ法の中心的な機構を、図１に模式的に示す。なお、図１においては、第１のプライマーがＳＥＥＰＳプライマー（傷害塩基含有プライマー）である場合を説明する。
【００４０】
（ａ）鋳型ＤＮＡと、該鋳型ＤＮＡにアニーリング可能な第１のプライマーとを接触させる工程
工程（ａ）は、鋳型ＤＮＡと、該鋳型ＤＮＡにアニーリング可能な第１のプライマーとを接触させることにより、鋳型ＤＮＡと第１のプライマー［図１（ａ）においては、傷害塩基含有プライマー］とをアニールさせる工程である［図１（ａ）］。
【００４１】
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第１のプライマーを伸長させ、鋳型ＤＮＡに対して相補的な第１の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
工程（ｂ）は、ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼの作用によって、鋳型ＤＮＡにアニールした第１のプライマーを伸長させて、鋳型ＤＮＡに対して相補的な第１の相補鎖を合成する工程である［図１（ｂ）］。
【００４２】
（ｃ）第１の相補ＤＮＡ鎖と、該相補ＤＮＡ鎖にアニーリング可能な第２のプライマーとを接触させる工程
工程（ｃ）は、第１の相補ＤＮＡ鎖と、該相補ＤＮＡ鎖にアニーリング可能な第２のプライマーとを接触させることにより、第１の相補鎖に第２のプライマーをアニールさせる工程である。
【００４３】
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の作用によって第２のプライマーを伸長させ、第１の相補ＤＮＡ鎖に対して相補的な第２の相補ＤＮＡ鎖を合成する工程
工程（ｄ）は、ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼの作用によって、第１の相補ＤＮＡ鎖にアニールした第２のプライマーを伸長させて、第１の相補鎖を鋳型とした第２の相補鎖の合成（すなわち元の鋳型と同じ配列を有するＤＮＡ鎖の合成）を進行させる工程である［図１（ｃ）］。
【００４４】
しかしながら、傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼである第１のＤＮＡポリメラーゼが持つ‘ｒｅａｄ−ａｈｅａｄ’機能のため、進行方向の４塩基前方の鋳型鎖（第１の相補鎖）に傷害塩基が存在する位置で、第２の相補鎖の合成は停止する。従って、ＤＮＡ合成は、第１のプライマーに含まれる５’端の傷害塩基を認識し、その４塩基前方で停止する［図１（ｄ）］。
【００４５】
この結果、合成された二本鎖ＤＮＡ上に、第１の相補鎖の５’端が４塩基突出した粘着末端が作製される［図１（ｅ）］。
【００４６】
傷害バイパス活性欠損（傷害塩基不耐性）のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成反応において、傷害塩基が、鋳型鎖、プライマー鎖およびｄＮＴＰｓのいずれの中に存在しても、反応阻害の原因となると考えられていた。しかしながら、本発明のＳＥＥＰＳ法においては、５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むプライマーを使用する。本発明者らの検討の結果によれば、傷害塩基がプライマーの５’末端に位置する場合は、傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼであっても例外的にプライマーを伸長させることができるのである。
【００４７】
２．核酸増幅反応の中で粘着末端を作製する方法
ＳＥＥＰＳ法は、核酸増幅反応の中で実施することが好ましく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中で実施することがより好ましい。
【００４８】
ＰＣＲ中でＳＥＥＰＳ法を行う実施形態について、図２に模式図を示して説明する。図２に示すように、ＰＣＲにおいて、ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼを用い、上流側および下流側プライマーとして５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むＳＥＥＰＳプライマーを用いると、得られる標的ＤＮＡの増幅産物は、両末端に粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡとなる。従って、各粘着末端とライゲーション可能な末端を有するベクターＤＮＡを用意すれば、該増幅産物は制限酵素処理することなく、容易にベクターに連結可能である。
【００４９】
プライマー配列を目的に応じて任意に設計してもよく、上流側のＳＥＥＰＳプライマーと下流側のＳＥＥＰＳプライマーを適切に設計し、標的ＤＮＡの各末端に異なる配列の粘着末端を作製することができる。そうすることで、ベクター中に標的ＤＮＡが所望する方向で挿入されるようにすることができる。また、目的に応じて、両末端に同じ配列の粘着末端を作製するようにＳＥＥＰＳプライマーを設計することも可能である。
【００５０】
本実施形態では、ＰＣＲ反応中に粘着末端を有するＤＮＡが蓄積されることから、まれに反応中の粘着末端どうしのアニーリングが（それが可能な配列の場合は）起こり、それによって標的ＤＮＡが２コピー以上連結された長い増幅産物が、副産物または主産物として生成することがある。該長い増幅産物の生成を所望しない場合は、通常のＰＣＲよりもアニーリング温度を若干高めに設定したサーマルサイクリングを行うことで、該長い増幅産物の生成を完全に抑えられる。
【００５１】
また、目的に応じて、上流側または下流側プライマーのいずれか一方のみにＳＥＥＰＳプライマーを使用し、増幅産物の片方の末端だけに粘着末端を作製してもよい。
【００５２】
本実施形態において、ＳＥＥＰＳプライマーは、図１に例示したようなプライマー全体が標的配列にアニールする配列である必要はない。ポリメラーゼによるプライマー伸長が可能な範囲で、ミスマッチ、挿入または欠損等を含んでいてもよい。ミスマッチ、挿入または欠損等を含むプライマーを用いることで、標的ＤＮＡに部位特異的変異導入が可能である。
【００５３】
また本実施形態において、ＳＥＥＰＳプライマーは、図３（ａ）に示すように５’端領域が標的ＤＮＡに直接アニールしない付加配列であってもよい。図３（ｂ）に示すように、５’端領域が標的ＤＮＡに直接アニールしない付加配列のＳＥＥＰＳプライマーを用いた場合には、粘着末端に付加配列を含む増幅産物が得られる。ＳＥＥＰＳ法によれば粘着末端の配列を相当自由な範囲で作製することができる。
【００５４】
また本実施形態において、ＳＥＥＰＳプライマーは縮重プライマーであってもよい。また、ＳＥＥＰＳプライマーはその機能を失わない範囲であれば、公知の様々な修飾、例えば、蛍光標識、放射性標識または化学修飾などを有していてもよい。
【００５５】
２．ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼ
本発明のＳＥＥＰＳ法に用いるＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素であって、有意な傷害バイパス活性を示さない（傷害塩基不耐性）酵素である。ここで、傷害バイパス活性（ｌｅｓｉｏｎ  ｂｙｐａｓｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）とは、酵素が鋳型鎖中の傷害塩基を通過してＤＮＡを合成する活性である（Ｓｔｅｉｔｚ  ＴＡ，Ｙｉｎ  ＹＷ．Ａｃｃｕｒａｃｙ，ｌｅｓｉｏｎ  ｂｙｐａｓｓ，ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．２００４  Ｊａｎ  ２９；３５９（１４４１）：１７−２３）。また、「有意な傷害バイパス活性を示さない」とは、酵素が鋳型鎖中の障害塩基を通過してＤＮＡを合成する能力が無い、または正常塩基を通過してＤＮＡを合成する速度と比較して遅い（例えば１／１０００以下）ために、ＤＮＡ合成反応が実質的に停止しＤＮＡ合成産物を観測できないことをいう。
【００５６】
ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、高忠実性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。高忠実性ポリメラーゼの中でも、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが好ましく、古細菌由来のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼがより好ましい。
【００５７】
なお、ＰＣＲなどの核酸増幅反応においてＳＥＥＰＳ法を実施する場合は、前記ＤＮＡポリメラーゼの中でも、サーマルサイクリングに耐え得る耐熱性を有するＤＮＡポリメラーゼであることが更に好ましい。
【００５８】
また、ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼには、前述の様々な酵素の誘導体、すなわちクローニングによって作製した組換え酵素、および一部のアミノ酸またはドメイン等に改変を加えて酵素学的性質を改善したものなども含まれる。そのようなＤＮＡポリメラーゼおよびその誘導体は、その多くが酵素試薬として市販されており、容易に入手可能である。
【００５９】
ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、次のような酵素が挙げられる；
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｖｅｎｔ）；  
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）；  
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｆｕ）；  
ＪＤＦ−３  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｓｏ）；  
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｇｏ）；  
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ＴＹ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＫＯＤＩ（ＫＯＤ）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｕｍ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ９°Ｎ−７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｏｌｔａｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＴＯＫ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｄ．Ｔｏｋ  Ｐｏｌ）；  
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  
Ｔｈｅｎｎｏｃｏｃｃｕｓｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；および
Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．
【００６０】
３．傷害塩基
ＳＥＥＰＳ法に用いる第１のプライマーおよび第２のプライマーの少なくとも一方は、その５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含む。傷害塩基（ｌｅｓｉｏｎ  ｂａｓｅ）とは、正常な塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン）が、化学修飾を受けて、本来の化学構造とは異なる構造となったものである。
【００６１】
化学修飾としては、例えば、脱アミノ化、酸化若しくはアルキル化またはそれらの組合せなどが挙げられるが、これらに限られない。一般的な傷害塩基の例とその化学構造を図４Ａ〜Ｄに示す。
【００６２】
アデニン由来の傷害塩基としては、例えば、ヒポキサンチン（Ｈｘ）、８−オキソアデニン（８−ｏｘｏＡ）、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＡ）、１−メチルアデニン（ｍ１Ａ）、７−メチルアデニン（ｍ７Ａ）、Ｎ６−メチルアデニン（ｍ６Ａ）、３−メチルアデニン（ｍ３Ａ）および１，Ｎ６−エテノアデニン（εＡ）などが挙げられる（図４Ａ）。
【００６３】
グアニン由来の傷害塩基としては、例えば、キサンチン（Ｘａｎ）、オキサニン（Ｏｘａ）、８−オキソグアニン（８−ｏｘｏＧ）、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン（ＦａｐｙＧ）、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−Ｎ−メチルホルムアミドピリミジン（Ｍｅ−ＦａｐｙＧ）、Ｎ２−メチルグアニン（ｍ２Ｇ）、３−メチルグアニン（ｍ３Ｇ）、１−メチルグアニン（ｍ１Ｇ）、Ｏ６−メチルグアニン（ｍ６Ｇ）、１，Ｎ２−エテノグアニン（１，Ｎ２−εＧ）および７−メチルグアニン（ｍ７Ｇ）などが挙げられる（図４Ｂ）。
【００６４】
シトシン由来の傷害塩基としては、例えば、ウラシル（Ｕ）、５−ヒドロキシシトシン（ｈｏＣ）、ウラシルグリコール（Ｕｇ）、５，６−ジヒドロウラシル（ｈＵ）、５−ヒドロキシウラシル（ｈｏＵ）、アロキサン、Ｏ２−メチルシトシン（ｍ２Ｃ）、３−メチルシトシン（ｍ３Ｃ）および３，Ｎ４−エテノシトシン（εＧ）などが挙げられる（図４Ｃ）。
【００６５】
チミン由来の傷害塩基としては、例えば、５−ヒドロキシメチルウラシル（ｈｍＵ）、５，６−ジヒドロチミン（ｈＴ）、β−ウレイドイソ酪酸、チミングリコール（Ｔｇ）、５−ホルミルウラシル（ｆＵ）、尿素、Ｏ４−メチルチミン（ｍ４Ｔ）、３−メチルチミン（ｍ３Ｔ）およびＯ２−メチルチミン（ｍ２Ｔ）などが挙げられる（図４ｄ）。
【００６６】
またこの他にも、化学合成または化学修飾によって正常塩基とは異なる構造を与えられたヌクレオチド類縁体、類似体、誘導体または構造異性体などであって、ＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖伸長反応を停止させ得るものも、傷害塩基に含まれる。
【００６７】
ＳＥＥＰＳプライマーに含有させる傷害塩基は、使用するＳＥＥＰＳ適合ＤＮＡポリメラーゼに応じて適当なものを選択すればよい。傷害塩基は、自然発生的に正常塩基が傷害を受けて生じたものでもよいが、人為的処理によって正常塩基を傷害塩基に変換したものでもよい。また化学合成的手法若しくは酵素学的手法、またはそれらの組合せによって作製したものでもよく、出発物質は必ずしも正常塩基である必要はない。
【００６８】
ＳＥＥＰＳ法において、特に好ましいＳＥＥＰＳプライマーの傷害塩基は、ＤＮＡポリメラーゼの傷害塩基不耐性についてよく知られている脱アミノ化傷害を受けた塩基である。例えば、ウラシル（Ｕ）、ヒポキサンチン（Ｈｘ）、キサンチン（Ｘａｎ）およびオキサニン（Ｏｘａ）などが挙げられる。
【００６９】
ＳＥＥＰＳ法において、最も好ましいＳＥＥＰＳプライマーの傷害塩基は、一般的なプライマーの化学合成技術によって容易に５’端に導入できるウラシルおよびヒポキサンチンである。なお、ヒポキサンチン（Ｈｘ）は、デオキシイノシン（ｄＩ）の塩基であり、ＤＮＡの配列表記においてはＩと記載されることも多い。
【００７０】
４．ＳＥＥＰＳプライマーの設計
ＳＥＥＰＳ法に用いる第１のプライマーおよび第２のプライマーの少なくとも一方は、その５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むＳＥＥＰＳプライマーである。ＳＥＥＰＳプライマーの設計は、５’末端のヌクレオチドに傷害塩基を含むヌクレオチドとする以外には特に制約が無く、一般的なプライマーの設計と何ら変わりがない。従って、当業者は相当な自由度をもってＳＥＰＰＳ法により得られる二本鎖ＤＮＡにおける粘着末端の配列を設計することができる。
【００７１】
また、ＳＥＥＰＳ法で作製したＤＮＡの粘着末端を、後に他のＤＮＡの末端とライゲーションすることまでを考慮すると、粘着末端配列の相補的ペアの間で、例えば、傷害塩基ウラシルはアデニンと塩基対を、また傷害塩基ヒポキサンチンはシトシンと塩基対を形成するように粘着末端の配列を設計することが好ましい。
【００７２】
このように、ＳＥＥＰＳ法は、通常のＰＣＲを行うのとほぼ同様に、目的ＤＮＡを増幅するだけで、同時に粘着末端が作製できる、極めて簡便な方法である。
【００７３】
５．末端のリン酸化
ＳＥＥＰＳ法により得られる二本鎖ＤＮＡをリガーゼによって連結するためには、その５’末端を必要に応じてリン酸化することが好ましい。ＳＥＥＰＳ法で得られる二本鎖ＤＮＡの５’末端をリン酸化された粘着末端とするには、第１のプライマーおよび第２のプライマーの少なくとも一方に、５’末端がリン酸化されたＳＥＥＰＳプライマーを使用すればよい。
【００７４】
ポリヌクレオチドキナーゼなどの酵素を用いて、５’末端がリン酸化されていないプライマーの５’端をリン酸化する方法は、公知の方法である。また通常のＤＮＡの化学合成法によって、あらかじめ５’末端がリン酸化されたプライマーを調製することもできる。
【００７５】
また別の方法として、５’末端がリン酸化されていない第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いたＳＥＥＰＳ法により粘着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製した後、該二本鎖ＤＮＡの粘着末端に対して、ポリヌクレオチドキナーゼなどの酵素を用いて５’末端をリン酸化してもよい。
【００７６】
ＳＥＥＰＳ法により得られる二本鎖ＤＮＡの粘着末端と、該末端と相補的な粘着末端を有するＤＮＡをライゲーションすることにより、組換えＤＮＡを作製することができる。このようにして得られる組換えＤＮＡとしては、例えば、ベクターが挙げられる。
【００７７】
また、得られる組換えＤＮＡを適当な宿主に形質転換または形質導入して形質転換体または形質導入体を得ることができる。該形質転換体または形質導入体を培養して、該培養破砕液より組換えＤＮＡを調製することができる。
【実施例】
【００７８】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００７９】
＜実施例１＞  ｄＩ含有プライマーと傷害塩基不耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ
（１）プライマー中のｄＩ含有位置の違いによる増幅の有無
デオキシイノシン（ｄＩ）の塩基であるヒポキサンチンを含むプライマーを用いてＰＣＲを実施した。まず５０μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
【００８０】
その組成は次の通りである；１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡製、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ付属品）、各終濃度２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、終濃度１ｍＭ  硫酸マグネシウム、各終濃度３００ｎＭのｄＩ含有上流および下流プライマー、９９ｎｇの大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株由来ゲノムＤＮＡ、および古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（東洋紡製）１ユニット。
【００８１】
ここで使用した上流および下流プライマーの配列を表１に示す。各プライマーはｄＩの位置が異なる。配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と１０をそれぞれペアとして用い、各ペアをプライマーセット１〜５と名付けた。各プライマーセットは、大腸菌のｎｆｉ遺伝子配列（６７２ｂｐ）内のそれぞれ異なる領域をターゲットとするものである［図５（ａ）］。
【００８２】
コントロール実験として、傷害バイパス活性（傷害塩基耐性）を持つＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはヒポキサンチンによるＰＣＲの阻害を受けないことが知られているＤＮＡポリメラーゼである。
【００８３】
コントロールＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ付属品）、終濃度２００μＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、終濃度３００ｎＭ  ｄＩ含有上流および下流プライマー（配列番号９および１０）、９９ｎｇの大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株由来ゲノムＤＮＡ、１．３ユニットのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ製）を含むよう調製した。
【００８４】
サーマルサイクラーはＶｅｒｉｔｉ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用し、９４℃で２分間を１回、９４℃で１５秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で３０秒間の温度サイクルを３０回繰り返した。
【００８５】
反応終了後、各反応液から５μｌを分取して、２質量％  アガロース電気泳動で増幅産物を分離した。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色した後、イメージアナライザーＦＬＡ−９０００（富士フイルム製）を用いてバンドを可視化し、増幅産物の有無を確認した。
【００８６】
その電気泳動結果を図６に示す。図６中、レーン１はＤＮＡサイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡製）、レーン２〜６はそれぞれプライマーセット１〜５を用いたＰＣＲ反応液、レーン７はコントロールＰＣＲ反応液、レーン８はプライマーを含まない反応結果である。
【００８７】
図６に示すように、レーン３〜６において、増幅産物は検出されなかった。レーン２においては、予期される増幅産物のサイズ（約３２３ｂｐ）に一致する約３２０ｂｐの位置に単一なバンドが検出された。
【００８８】
これらの結果は、５’末端から２番目以降の位置にヒポキサンチンが含まれるプライマーを用いた場合、当業者の従来の知見どおり、ＰＣＲが阻害されることを示す。一方、驚くべきことに、ヒポキサンチンが５’末端に位置するプライマーを用いた場合だけは、例外的にＰＣＲが阻害されず、目的とするサイズの増幅産物が得られた。
【００８９】
（２）付加配列を有するプライマー中のｄＩ含有位置の違いによる増幅の有無
５’末端に鋳型ＤＮＡと相補的でない５ヌクレオチドの付加配列を有するプライマー［図５（ｂ）］を用い、上記（１）と同様の方法でＰＣＲを行った。使用した上流および下流プライマーの配列と使用した組み合わせを表２に示す。
【００９０】
各プライマーセットは、大腸菌ｎｆｉ遺伝子配列内の同じ領域をターゲットとしており、予期される増幅産物のサイズは約３６７ｂｐである。コントロール実験として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーセット１０を用いてＰＣＲを実施した。
【００９１】
サーマルサイクラーはＶｅｒｉｔｉ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用し、９４℃で２分間を１回、９４℃で１５秒間、５８．８℃で３０秒間、６８℃で３０秒間の温度サイクルを３０回繰り返した。増幅産物の電気泳動および検出は上記（１）の手順と同様に行った。
【００９２】
その電気泳動結果を図７に示す。図７中、レーン１はＤＮＡサイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡製）、レーン２〜６はそれぞれプライマーセット６〜１０を用いたＰＣＲ反応液、レーン７はコントロールＰＣＲ反応液、レーン８はプライマーを含まない反応結果である。
【００９３】
図７に示すように、レーン３〜６において、増幅産物は検出されなかった。レーン２においては、予期される増幅産物のサイズ（約３６７ｂｐ）に一致する約３７０ｂｐの位置に単一なバンドが検出された。
【００９４】
これらの結果は、上記（１）の結果と同様、ヒポキサンチンが５’末端に含まれるプライマーを用いた場合のみ、例外的にＰＣＲが阻害されることなく反応が進み、目的とするサイズの増幅産物が得られることを示す。
【００９５】
【表１】
2013051940.tif 000003
【００９６】
【表２】
2013051940.tif 000004
【００９７】
＜実施例２＞  ｄＵ含有プライマーを用いたＰＣＲ  
（１）プライマー中のｄＵ含有位置の違いによる増幅の有無
デオキシウリジン（ｄＵ）の塩基であるウラシルを含むプライマーを用いてＰＣＲを実施した。調製した５０μｌのＰＣＲ反応液の組成は、使用したプライマーが異なる以外は、実施例１（１）と同じである。使用した上流および下流プライマーの配列と使用した組み合わせ表３に示す。
【００９８】
各プライマーセットは、大腸菌のｎｆｉ遺伝子配列（６７２ｂｐ）内のそれぞれ異なる領域をターゲットとするものである［図５（ａ）］。コントロール実験として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーセット１５を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲの温度サイクルは実施例１（１）と同様である。
【００９９】
その電気泳動結果を図８に示す。図８中、レーン１はＤＮＡサイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡製）、レーン２〜６はそれぞれプライマーセット１１〜１５を用いたＰＣＲ反応液、レーン７はコントロールＰＣＲ反応液、レーン８はプライマーを含まない反応結果である。
【０１００】
図８に示すように、レーン３〜６において、増幅産物は検出されなかった。レーン２においては、予期される増幅産物のサイズ（約３６７ｂｐ）に一致する約３７０ｂｐの位置に単一なバンドが検出された。
【０１０１】
これらの結果は、５’末端から２番目以降の位置にウラシルが含まれるプライマーを用いた場合、当業者の従来の知見どおり、ＰＣＲが阻害されることを示す。一方、驚くべきことに、ウラシルが５’末端に位置するプライマーを用いた場合だけは、例外的にＰＣＲが阻害されず、目的とするサイズの増幅産物が得られた。
【０１０２】
（２）付加配列を有するプライマー中のｄＵ含有位置の違いによる増幅の有無
５’末端に鋳型ＤＮＡと相補的でない５ヌクレオチドの付加配列を有するプライマー（図５ｂ）を用い、実施例１（２）と同じの反応組成および条件でＰＣＲを行った。使用した上流および下流プライマーの配列と使用した組み合わせ表４に示す。
【０１０３】
各プライマーセットは、大腸菌ｎｆｉ遺伝子配列内の同じ領域をターゲットとしており、予期される増幅産物のサイズは約３６７ｂｐである。コントロール実験として、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと、プライマーセット２０を用いてＰＣＲを実施した。
【０１０４】
その電気泳動結果を図９に示す。図９中、レーン１はＤＮＡサイズマーカー１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡製）、レーン２〜６はそれぞれプライマーセット１６〜２０を用いたＰＣＲ反応液、レーン７はコントロールＰＣＲ反応液、レーン８はプライマーを含まない反応結果である。
【０１０５】
図９に示すように、レーン３〜６において、増幅産物は検出されなかった。レーン２においては、予期される増幅産物のサイズ（約３６７ｂｐ）に一致する約３７０ｂｐの位置に単一なバンドが検出された。
【０１０６】
これらの結果は、上記（１）の結果と同様、ウラシルが５’末端に位置するプライマーを用いた場合のみ、例外的にＰＣＲは阻害されることなく反応が進み、目的とするサイズの増幅産物が得られることを示す。
【０１０７】
【表３】
2013051940.tif 000005
【０１０８】
【表４】
2013051940.tif 000006
【０１０９】
＜実施例３＞  ＳＥＥＰＳ法によって作製したＤＮＡ断片の組換え
（１）ｄＩ含有プライマーを使用した粘着末端の作製と、それを利用した組換えＤＮＡの作製
粘着末端を有するインサートＤＮＡを作製するために、まず３００μｌのＰＣＲ反応液を調製した。
【０１１０】
前記ＰＣＲ反応液の組成は、１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡製、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ付属品）、終濃度各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、終濃度１ｍＭ  硫酸マグネシウム、終濃度各３００ｎＭの上流および下流プライマー、５９１ｎｇの大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株由来ゲノムＤＮＡ、６ユニットの古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（東洋紡製）とした。
【０１１１】
使用した上流および下流プライマーの塩基配列を表５に示す（配列番号４１および４２）。これらは、ヒポキサンチンを５’末端に１ヶ所含み、増幅産物の両末端がＢａｍ  ＨＩサイトと接続するように、５’側に５塩基の付加配列を持つ。このプライマーセットは、大腸菌ｎｆｉ遺伝子配列内の領域をターゲットとしており、予期される増幅断片のサイズは約３６７ｂｐである。
【０１１２】
調製した反応液に対して、次の温度条件でＰＣＲを行った；９４℃で２分間を１回、９４℃で１５秒間、６８℃で３０秒間の温度サイクルを３０回。
【０１１３】
反応終了後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて増幅産物を精製し、３０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ８．５）を用いて溶出した。溶出液から２μｌを分取して２％  アガロース電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色した後、イメージアナライザーＦＬＡ−９０００（富士フイルム製）を用いてバンドを可視化した。その結果、予期されるインサートＤＮＡのサイズと同等な単一のバンドが確認された。
【０１１４】
続いてＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いて、前記インサートＤＮＡの５’−リン酸化を行った。１００μｌのリン酸化反応液を調製した。リン酸化反応液の組成は、１×Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ付属品）、終濃度１ｍＭ  ＡＴＰ、２μｇのインサートＤＮＡ、２０ユニットのＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ製）とした。
【０１１５】
前記リン酸化反応液を３７℃で、３０分間静置した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてインサートＤＮＡを精製し、２２μｌの１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ  ８．５）を用いて溶出した。
【０１１６】
ベクターＤＮＡとしてプラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ製）を使用した。ベクターＤＮＡをＢａｍ  ＨＩ（タカラバイオ製）で、１×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）存在下、３０℃、１時間静置した後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製した。
【０１１７】
精製した４．７μｇのベクターＤＮＡを、１２０ユニットのＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ、タカラバイオ製）を用いて３７℃、３０分間静置することで脱リン酸化を行った。その後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製した。
【０１１８】
ライゲーション反応を行うため、脱リン酸化したベクターＤＮＡ（２５ｆｍｏｌ）とリン酸化したインサートＤＮＡ（２５０ｆｍｏｌ）とを加えたＤＮＡ溶液  ５μｌに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ製、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ）を５μｌ加え、１６℃、３０分間静置した。
【０１１９】
前記のライゲーション反応の終了後、その反応液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  コンピテントセル（タカラバイオ製）を形質転換し、ＬＢ寒天培地（終濃度５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、１００μＭ  ＩＰＴＧ、および４０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含む）上でコロニーを形成させた。出現した白コロニーのうち１２クローンを拾いプラスミドを抽出した。
【０１２０】
表６に示したシーケンシングプライマー（配列番号４３および４４）を用いて、インサートＤＮＡ全長およびベクターＤＮＡとの接続部の両鎖の塩基配列を解読した。１２クローン中、７クローンが目的のインサートＤＮＡが１コピー挿入されており、かつインサートＤＮＡ全長およびベクターＤＮＡとの接続部の塩基配列が企図した配列と完全に一致した。
【０１２１】
すなわち、接合部の配列は図１０（ａ）に示すように、インサートＤＮＡの両側の５’末端に存在していたヒポキサンチンが、グアニンに置換されたことを確認した。このように、ｄＩ含有プライマーを用いたＳＥＥＰＳ法で作製されたインサートＤＮＡが、制限酵素消化などの末端の加工を行うことなく、ベクターＤＮＡの制限酵素サイト中に挿入された。
【０１２２】
（２）ｄＵ含有プライマーを使用した粘着末端の作製と、それを利用した組換えＤＮＡの作製
ウリジンを５’末端に１つ含むプライマーセットを用いて上記（１）と同様な方法でインサートＤＮＡを作製した。使用した上流および下流プライマーの塩基配列を表７に示す（配列番号４５および４６）。
【０１２３】
これらのプライマーは、増幅産物の両末端がＳａｌ  Ｉサイトと接続するように、５’側に５塩基の付加配列を持つ。このプライマーセットは、大腸菌ｎｆｉ遺伝子配列内の領域をターゲットとしており、予期される増幅断片のサイズは約３６７ｂｐである。
【０１２４】
ＰＣＲ終了後に精製した増幅産物の電気泳動結果より、予期したサイズ付近に単一のバンドとしてインサートＤＮＡの存在が確認された。その後、上記（１）と同様な方法でＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを用いてインサートＤＮＡのリン酸化処理を行った。
【０１２５】
次にベクターＤＮＡであるプラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ製）をＳａｌＩ（タカラバイオ製）で、１×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ製）存在下、３７℃、１７時間静置した。その後、上記（１）と同様の手順でベクターＤＮＡを調製した。
【０１２６】
続いて、インサートＤＮＡとベクターＤＮＡとのライゲーションおよび大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を、上記（１）の方法と同様に実施した。出現した白コロニーのうち１２クローンを拾いプラスミドを抽出した。
【０１２７】
これらのプラスミド中の挿入断片の有無およびサイズを確認するために、抽出したプラスミドをＳａｌＩで消化し、その反応液を１．５％  アガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色した後、イメージアナライザーＦＬＡ−９０００（富士フイルム製）を用いてバンドを可視化した。
【０１２８】
その電気泳動結果を図１１に示す。レーンＭ１はλ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡製）、レーンＭ２はＬｏｗＲａｎｇｅｒ  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ製）、レーンＣはｐＵＣ１８のＳａｌＩ消化物、レーン１〜１２は１２のクローンから抽出した各プラスミドのＳａｌＩ消化物である。
【０１２９】
図１１に示すように、これら１２クローンのうち、１０のクローンにおいてインサートＤＮＡのサイズ（約３６７ｂｐ）とほぼ一致する位置に明瞭なバンドが検出された。
【０１３０】
次にプラスミド中のインサートＤＮＡ全長およびベクターＤＮＡとの接続部の塩基配列を上記（１）と同様の方法で解読した。その結果、１２クローン中、９クローンにおいて、目的のインサートＤＮＡが１コピー挿入されており、かつインサートＤＮＡ全長およびベクターＤＮＡとの接続部の塩基配列が企図した配列と完全に一致した。
【０１３１】
すなわち、接合部の配列は図１０（ｂ）に示すように、インサートＤＮＡの両側の５’末端に存在していたウラシルが、チミンに置換されたことを確認した。このように、ｄＵ含有プライマーを用いたＳＥＥＰＳ法で作製されたインサートＤＮＡも、制限酵素消化などの末端の加工を行うことなく、ベクターＤＮＡの制限酵素サイト中に挿入された。
【０１３２】
【表５】
2013051940.tif 000007
【０１３３】
【表６】
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【０１３４】
【表７】
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【０１３５】
＜実施例４＞  ＳＥＥＰＳ法によって作製したＤＮＡ断片の方向性を持った組換え（Ｉ）
ヒポキサンチンを５’末端に含む上流プライマー（配列番号４１）と、ウラシルを５’末端に含む下流プライマー（配列番号４６）を用いて、実施例３（１）と同様の手順でインサートＤＮＡを作製し、リン酸化反応を行った。
【０１３６】
ｐＵＣ１８をＳａｌＩで３７℃、１７時間処理した後、ＢａｍＨＩで３０℃、１時間処理した。以降、実施例３（１）と同様にベクターＤＮＡを脱リン酸化し、インサートＤＮＡとライゲーションを行い、形質転換後に出現した白コロニー１２クローンからプラスミドを抽出した。
【０１３７】
これらのクローンの塩基配列を解読したところ、１２クローン中、７クローンにおいて、図１０ｃのように、インサートＤＮＡが方向性を持って１コピー挿入されており、かつインサートＤＮＡおよび接続部の塩基配列が企図した配列と完全に一致した。  
【０１３８】
これとは別に、ウラシルを５’末端に含む上流プライマー（配列番号４５）と、ヒポキサンチンを５’末端に含む下流プライマー（配列番号４２）を用いて、上記と同様な方法で、１２プラスミドを取得し、それらの塩基配列を解読した結果、４つのクローンにおいて、図１０（ｄ）に示すように、インサートＤＮＡが方向性を持って１コピー挿入されており、かつインサートＤＮＡおよび接続部の塩基配列が企図した配列と完全に一致した。すなわち、ＳＥＥＰＳ法で調製したインサートＤＮＡを使用し、方向性を持った組換えＤＮＡの作製が可能であることが示された。
【０１３９】
＜実施例５＞  ＳＥＥＰＳ法によって作製したＤＮＡ断片の方向性を持った組換え（ＩＩ）
ベクターＤＮＡの脱リン酸化は行わず、それ以外は実施例４と同様な手順でインサートＤＮＡおよびベクターＤＮＡを調製した。プライマーセットは、ヒポキサンチンを５’末端に含む上流プライマー（配列番号４１）と、ウラシルを５’末端に含む下流プライマー（配列番号４６）を用いた。
【０１４０】
ここで、実施例３（１）と同様Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行ったサンプルＡと、大腸菌ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行ったサンプルＢとを作製した。
【０１４１】
サンプルＢについては、６０ユニットの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ製）を用い１×Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）存在下、１６℃、１時間で、ベクターＤＮＡ（２５ｆｍｏｌ）とインサートＤＮＡ（２５０ｆｍｏｌ）のライゲーション反応を行った。
【０１４２】
その後、サンプルＡおよびＢそれぞれについて、形質転換後に出現した白コロニー１２クローンからプラスミドを抽出し、それらの塩基配列を解読した。サンプルＡ（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ使用）においてもサンプルＢ（大腸菌ＤＮＡリガーゼ使用）においても、それぞれ１２クローン中、６クローンにおいて、図１０（ｃ）に示すように、インサートＤＮＡが方向性を持って１コピー挿入されており、かつインサートＤＮＡおよび接続部の塩基配列が企図した配列と完全に一致した。
【０１４３】
またＳＥＥＰＳ法によって作製したＤＮＡ断片の組換えを行う際に、ベクターＤＮＡの脱リン酸化処理を行わなくても目的の組換えＤＮＡの作製が可能であることも示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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