(57)【要約】【課題】トウモロコシの形質転換に変異型ALS遺伝子を利用する際、比較的簡便な方法により形質転換トウモロコシを選抜する。【解決手段】導入目的の内因性遺伝子と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子とを含む発現ベクターを用いて宿主トウモロコシに導入する形質転換トウモロコシの製造方法において、配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドを検出する工程と、上記ポリヌクレオチドが存在する個体を形質転換トウモロコシと判定する工程とを含む形質転換トウモロコシの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入目的の内因性遺伝子と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子とを含む発現ベクターを用いて宿主トウモロコシに導入する形質転換トウモロコシの製造方法において、
以下の（a）〜（c）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを検出する工程と、
（a）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（b）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
上記ポリヌクレオチドが存在する個体を形質転換トウモロコシと判定する工程とを含む形質転換トウモロコシの製造方法。
【請求項２】
上記宿主トウモロコシは、Na65品種以外の品種であることを特徴とする請求項１記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
【請求項３】
上記発現ベクターを宿主トウモロコシに導入する処理の後で、上記ポリヌクレオチドを検出する工程の前に、処理後のトウモロコシ個体を除草剤に接触させ除草剤耐性を有するトウモロコシ個体を選抜する工程を含む請求項１記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
【請求項４】
上記除草剤は、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも１種の除草剤であることを特徴とする請求項３記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチドを検出する工程では、上記ポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅を行うことを特徴とする請求項１記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
【請求項６】
導入目的の内因性遺伝子を挿入する部位と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子とを含む発現ベクターにおいて、当該変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子の3'-非翻訳領域に以下の（a）〜（c）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
（a）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（b）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【請求項７】
上記内因性遺伝子が組み込まれたことを特徴とする請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項６又は７記載の発現ベクターを含む形質転換トウモロコシ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マーカーを利用した形質転換トウモロコシの製造方法、当該マーカーを含む発現ベクター、及び当該発現ベクターを含む形質転換トウモロコシに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物に外部から遺伝子を導入してその形質を変える植物形質転換の手法としては、アグロバクテリウム菌を介するアグロバクテリウム法、遺伝子銃によるパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等が知られている。近年ではアグロバクテリウム法によるプラスミドバイナリーベクターを用いた形質転換が主流となってきており、タバコやシロイヌナズナ等の双子葉植物またはイネやトウモロコシの単子葉植物に対して適応できる。ここに挙げた形質転換手法では、いずれの場合も遺伝子が導入された植物、培養細胞（カルス）、種子等を選抜する必要がある。プラスミドバイナリーベクターを用いた場合、レフトボーダーからライトボーダーの間のT-DNA領域に除草剤抵抗性、抗生物質耐性等の性質を持った選抜マーカー遺伝子を持たせ、特定の除草剤や抗生物質の存在下で生育する個体を選抜する。後代の種子にはメンデル則によって遺伝子が導入された種子と導入されない種子に分離される。
【０００３】
除草剤抵抗性マーカー遺伝子としては、一例として、除草剤の標的酵素であるアセト乳酸合成酵素（acetolactate synthase, ALS）遺伝子に特定の変異が導入された変異型ALS遺伝子が使用されている。ここで、変異型ALS遺伝子としては、形質転換を受ける植物種由来の遺伝子を用いることが好ましい。例えば、トウモロコシの形質転換には、トウモロコシ由来の変異型ALS遺伝子をマーカー遺伝子として利用する。
【０００４】
変異型ALS遺伝子としては、スルホニルウレア系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するもの、イミダゾリノン系除草剤に対して特異的な抵抗性を有するもの、或いはスルホニルウレア系除草剤とイミダゾリノン系除草剤の両方に対して抵抗性を有するものが挙げられる。これら以外にも、アミノ酸置換を伴う変異をALS遺伝子へ導入することで、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも１種の除草剤に対する抵抗性を付与することが明らかとなっている（非特許文献１）。また、特許文献１及び２には、イネ由来のALS遺伝子に特定のアミノ酸置換変異を導入することで、ピリミジニルカルボキシ系除草剤に対する優れた抵抗性を付与できることが示されている。
【０００５】
一方、トウモロコシ由来の変異型ALSとしては、ドメインBのトリプトファンがロイシンに、ドメインEのセリンがイソロイシンに変異した変異型ALSが知られている。この変異型ALSは、ピリミジニルカルボキシ系除草剤に対する優れた抵抗性を有している。この変異型ALS遺伝子を選抜マーカー遺伝子として利用することで、ピリミジニルカルボキシ系除草剤に対する抵抗性を指標として形質転換トウモロコシの後代を選抜できるが、トウモロコシ由来の変異型ALSは、他の植物と比較して抵抗性の程度が十分に高いとは言えない。したがって、この変異型ALSを利用して形質転換トウモロコシの後代を選抜する際には、除草剤抵抗性のみならず他の手段によって判断する必要があった。
【０００６】
例えば、導入された変異型ALS遺伝子をPCRで増幅し、シークエンシングにより配列を決定することで形質転換トウモロコシの後代を選抜できる。また、図８に示すように、変異型ALS遺伝子が導入されたか否かは、変異型ALS遺伝子を含むDNA断片を制限酵素で処理して得られる断片のサイズに基づいて判断することができる。詳細には、野生型ALS遺伝子を含むDNA断片は制限酵素Tsp RI、Bts I、Xsp IもしくはBfa Iで切断されるが、変異型ALS遺伝子を含むDNA断片は切断されない。この差異を利用することで形質転換トウモロコシの後代を選抜できる。
【０００７】
しかしながら、このような変異型ALS遺伝子が導入されたか否かの確認は、多大な労力を要するもので、処理すべきサンプル数が多くなるほどコストも増大するといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開WO 02/44385号公報
【特許文献２】国際公開WO 03/083118号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Modern Crop Protection Compounds, vol. 1, Edited by Wolfgang Kramer and Ulrich Schirmer, WILEY-VCH
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、トウモロコシの形質転換に変異型ALS遺伝子を利用する際、比較的簡便な方法により形質転換トウモロコシを選抜できる、形質転換トウモロコシの製造方法、当該製造方法に使用できる発現ベクター、当該発現ベクターを含む形質転換トウモロコシを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、特定のトウモロコシ自殖品種のターミネーターから3'-非翻訳領域に存在するMITE（Miniature Inverted repeat Transposable Element）様因子を特定し、これを利用することで変異型ALS遺伝子を含む発現ベクターが組み込まれたことを検出できることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）導入目的の内因性遺伝子と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子とを含む発現ベクターを用いて宿主トウモロコシに導入する形質転換トウモロコシの製造方法において、
以下の（a）〜（c）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを検出する工程と、
（a）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（b）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
上記ポリヌクレオチドが存在する個体を形質転換トウモロコシと判定する工程とを含む形質転換トウモロコシの製造方法。
（２）上記宿主トウモロコシは、Na65品種以外の品種であることを特徴とする（１）記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
（３）上記発現ベクターを宿主トウモロコシに導入する処理の後で、上記ポリヌクレオチドを検出する工程の前に、処理後のトウモロコシ個体を除草剤に接触させ除草剤耐性を有するトウモロコシ個体を選抜する工程を含む（１）記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
（４）上記除草剤は、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも１種の除草剤であることを特徴とする（３）記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
（５）上記ポリヌクレオチドを検出する工程では、上記ポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅を行うことを特徴とする（１）記載の形質転換トウモロコシの製造方法。
（６）導入目的の内因性遺伝子を挿入する部位と、選抜マーカー遺伝子である変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子とを含む発現ベクターにおいて、当該変異型アセト乳酸合成酵素（ALS）遺伝子の3'-非翻訳領域に以下の（a）〜（c）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
（a）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（b）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（７）上記内因性遺伝子が組み込まれたことを特徴とする（６）記載の発現ベクター。
（８）上記（６）又は（７）記載の発現ベクターを含む形質転換トウモロコシ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、変異型ALS遺伝子に含まれる特定の領域を使用することで、変異型ALS遺伝子が導入された形質転換トウモロコシを簡易に判定することができる。本発明を適用することによって、非常に簡便かつ低コストに形質転換トウモロコシを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】トウモロコシ自殖系統Na65由来ALS2遺伝子の解析スキームを示す図である。
【図２】トウモロコシ自殖系統Na65由来ALS2遺伝子のクローニングを示す図である。
【図３】クローニングしたALS2遺伝子を基にして、2点変異型ALS(W542L/S621I)を作製するフロー図である。
【図４】2点変異型ALS遺伝子及びGFP遺伝子を挿入したバイナリベクターを作製するフロー図である。
【図５】トウモロコシ自殖系統Na65及びMi29におけるALS2遺伝子とPCRに使用したプライマーとの関係を示す模式図である。
【図６】実施例１０で行ったPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図７】実施例１１で行ったPCRの結果を示す電気泳動写真である。
【図８】変異型ALS遺伝子が導入されたか否を制限酵素断片により判別する際の判別スキームを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．マーカー領域
本発明では、トウモロコシを宿主植物とした形質転換に際して、形質転換トウモロコシを判別するための新規マーカー領域を提供する。この新規マーカー領域は、以下の（a）〜（c）のいずれかに記載されたポリヌクレオチドである。
【００１６】
（a）配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（b）配列番号１の塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（c）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
【００１７】
ここで、配列番号１の塩基配列は、トウモロコシ自殖系統Na65のALS2（ZmALS2）遺伝子の3'-非翻訳領域でトランスポゾン[MITE（miniature inverted-repeat transposable element）]配列（配列番号２）を含む塩基配列である。すなわち、配列番号１の塩基配列は、トウモロコシ自殖系統Na65のALS2（ZmALS2）遺伝子の終止コドンに隣接した塩基からMITE配列を含む540塩基からなる。
【００１８】
また、上記（b）において、「複数の塩基」とは、１〜１０個の塩基、好ましくは１〜５個の塩基を意味する。また、配列番号１の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加され得る領域としては、特に限定されない。
【００１９】
さらに上記（c）において、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual（Third Edition）を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細に、ストリンジェントな条件としては、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC（83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム）、温度42℃である。
【００２０】
従来、ゲノムDNAに２個存在すると考えられるトウモロコシALS遺伝子のターミネーターから3'-非翻訳領域に至る配列はＤＤＢＪ／ＮＣＢＩ／ＥＭＢＬ公開のアクセッション番号BT042814、BT019211、DY398831、AW056264、EC899385、DT947958、DT943695、CF627002、DN215004、DR796514、AW165578、AW054309、DT943694、FM194841、CF044302、AC205154、GP518224、G71374及びI07769により公知である。しかしながら、これら登録された配列情報には、配列番号１の塩基配列は含まれていない。すなわち、ALS2（ZmALS2）遺伝子の3'-非翻訳領域に含まれるMITE配列は新規な塩基配列といえる。
【００２１】
なお、ＤＤＢＪ／ＮＣＢＩ／ＥＭＢＬ公開のアクセッション番号BU050334及びBM736838の配列は、トウモロコシALS遺伝子のターミネーターにMITE配列が隣接して結合しているが、MITE配列より更に3'-非翻訳領域に至る配列については明らかにしておらず、この配列情報を用いてPCR等の手法により遺伝子導入個体を識別することはできない。
【００２２】
２．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種・系統に所望の遺伝子を導入する際に使用される。ここで、導入目的の遺伝子は、トウモロコシに内在する所謂、内因性遺伝子を挙げることができる。例えば、内因性遺伝子を過剰発現するように植物に導入した場合、当該内因性遺伝子が導入されたか否かは、内因性遺伝子を含むDNA断片を増幅する方法によっては判別することができない。内因性遺伝子が導入されていなくても、本来的に内在する遺伝子を含むDNA断片が常に増幅されるからである。
【００２３】
すなわち、本発明の発現ベクターは、上述したマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子と、導入目的の内因性遺伝子と含む。ここで、変異型ALS遺伝子とは、非特許文献１や国際公開WO 02/44385号公報、国際公開WO 03/083118号公報に開示されるように、特定のアミノ酸変異を有することで特定の除草剤に対して耐性を有するALSをコードする遺伝子である。本発明において、変異型ALS遺伝子としては、これら従来公知の変異型ALS遺伝子のいずれも使用することができる。ここで、変異型ALS遺伝子とは、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤から選ばれる少なくとも１種の除草剤に対する抵抗性を示す変異型ALSをコードする遺伝子である。
【００２４】
マーカー領域を含む変異型ALS遺伝子とは、言い換えると、トウモロコシ自殖系統Na65由来であって、3'-非翻訳領域のMITE配列を含む野生型ALS遺伝子に対して、特定のアミノ酸置換変異を伴う変異が導入された遺伝子と同義である。
【００２５】
また、本発明の発現ベクターに含まれる導入目的の内因性遺伝子は、特に限定されず如何なるタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。また、導入目的の内因性遺伝子は、公知のプロモーターと連結したかたちで発現ベクターに組み込まれても良い。かかるプロモーターは、トウモロコシ内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。プロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、トウモロコシ内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。
【００２６】
これらマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子や導入目的の内因性遺伝子をベクターに挿入するには、まず、変異型ALS遺伝子や内因性遺伝子を含む精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２７】
本発明においては、任意遺伝子を発現させるため、上記発現ベクターに、さらに当該任意遺伝子を挿入することができる。任意の遺伝子を挿入する手法は、ベクターに本発明のDNA断片を挿入する方法と同様である。
【００２８】
本発明の発現ベクターは、上述したマーカー領域を含む変異型ALS遺伝子と、導入目的の内因性遺伝子の他に、従来トウモロコシの形質転換に利用されている発現ベクターと同様な構成を有していても良い。従来トウモロコシの形質転換に利用されている発現ベクターとしては、いわゆるアグロバクテリウム法に使用されるバイナリーベクター、パーティクルガン法に使用されているベクターを挙げることができる。マーカー領域を含む変異型ALS遺伝子や導入目的の内因性遺伝子を挿入するベクターとしては、例えばpSTARA（クミアイ化学工業株式会社）、pBI101（Clonetech社）などのベクターを使用することができる。
【００２９】
３．形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主となるトウモロコシに導入することにより得ることができる。ここで、宿主となるトウモロコシとしては、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種・系統である。トウモロコシ自殖系統Na65は、配列番号１の塩基配列に含まれるMITE配列を本来的に有する。したがって、トウモロコシ自殖系統Na65に対しては、本発明の発現ベクターが導入されたか否かを上述したマーカー領域の存在・非存在に基づいて判断できない。言い換えると、トウモロコシ自殖系統Na65以外のトウモロコシ品種・系統であれば、本発明の発現ベクターが導入されたか否かを上述したマーカー領域の存在・非存在に基づいて判断することができる。
【００３０】
本発明において形質転換の対象となるトウモロコシは、トウモロコシの植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
【００３１】
宿主となるトウモロコシ（自殖系統）としては、例えば、Mi29（九州沖縄農業研究センター育成のデント型自殖系統）、Ho102（北海道農業研究センター育成のデント型自殖系統）、Pa91（アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統）、H99（アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統）、A188（アメリカ合衆国で育成されたデント型自殖系統）等を挙げることができる。
【００３２】
上述した本発明の発現ベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、植物ウイルス法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって植物中に導入することができる。
【００３３】
例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
【００３４】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の圧力、5〜6cm程度の距離で行う。
【００３５】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。
【００３６】
アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacteriumu rhizogenes）は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のT-DNA領域（Transferred DNA）と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。
【００３７】
Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。
【００３８】
なお、形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００３９】
導入目的の内因性遺伝子が宿主トウモロコシに組み込まれたか否かの確認は、PCR法により行うことができる。例えば、得られた形質転換トウモロコシから定法に従ってDNAを調製し、上述したマーカー領域を特異的に増幅するように設計された一対のプライマーを用いてPCRを行う。PCRは、ディネーチャーを９４〜９８℃で１０秒〜１分、アニールを５０〜６５℃で３０秒〜２分、エロンゲーションを６５〜７５℃で３０秒〜２分とするサイクルを、例えば２０〜４０サイクル行う条件とすることができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出する。これにより、上述したマーカー領域が形質転換トウモロコシに存在することを確認することができ、導入目的の内因性遺伝子が導入されたと判断することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００４０】
なお、上述したようにPCR法によりマーカー領域の存在・非存在を確認するのに先立って、変異型ALS遺伝子により付与された除草剤抵抗性により形質転換トウモロコシを選抜しても良い。すなわち、上述したように各種方法により形質転換を行った後、得られた個体を除草剤の存在下に培養・生育する。変異型ALS遺伝子を有しない個体や野生型の個体は、除草剤の存在下において死滅したり生育が大幅に抑制される。一方、本発明の発現ベクターを有する個体は、変異型ALS遺伝子が発現することにより除草剤の存在下にて生育できる。この除草剤抵抗性の獲得を指標として形質転換トウモロコシを選抜し、その後、上述したマーカー領域の存在・非存在をPCRによって確認しても良い。
【００４１】
ここで、除草剤としては、発現ベクターに使用した変異型ALS遺伝子により適宜選択して使用することができる。除草剤としては、スルホニルウレア系除草剤、イミダゾリノン系除草剤、トリアゾロピリミジン系除草剤、トリアゾリノン系除草剤及びピリミジニルカルボキシ系除草剤を使用することができる。ピリミジニルカルボキシ系除草剤としては、ビスピリバックナトリウム塩、ピリチオバックナトリウム塩、ピリミノバックを例示することができる。スルホニルウレア系除草剤としては、クロルスルフロンを例示することができる。イミダゾリノン系除草剤としては、イマザキンを例示することができる。トリアゾロピリミジン系除草剤としては、ペノキススラム、ピロクススラムを例示することができる。トリアゾリノン系除草剤としては、フルカルバゾンナトリウム塩、プロポキシカルバゾンナトリウム塩を例示することができる。
【００４２】
４．植物の製造
本発明においては、上記形質転換植物細胞等から形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS培地、MS培地などが例示される。
【００４３】
本発明の「植物体を製造する方法」は、本発明の発現ベクターで形質転換した形質転換トウモロコシ細胞を得て、該形質転換トウモロコシ細胞から形質転換トウモロコシを再生し、得られた形質転換トウモロコシから種子を得て、該種子からトウモロコシを生産する工程を含む。
【００４４】
形質転換トウモロコシから種子を得るには、例えば、形質転換トウモロコシを発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換トウモロコシ上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
〔実施例１〕トウモロコシALS2ターミネーターから3'-非翻訳領域に至る配列の決定（図１）
公知であるトウモロコシALS2遺伝子（accession No. X63554）のシークエンスを基にし、プロモーター領域352bpを含むALS2のDNA断片（807bp）の増幅ができるプライマーセットZmALS-2（センスプライマー、5'-CGAGACTAGTCGATAACTCGATAGC-3'：配列番号３）/ZmALS-3（アンチセンスプライマー、5'-AGCAACGCGTCTGCGAGCGCAGAGACTA-3'：配列番号４）を用いてトウモロコシ自殖系統Na65のゲノムDNAを鋳型にPhusion DNA polymerase （Thermo Fisher Scientific社）を用いPCRを行った。PCRは初期denature:98℃（5min）、denature:98℃（30sec）-annealing:58℃（30sec）-elongation:72℃（1min）を40サイクル、最終elongation:72℃（7min）の条件で行った。GC含量が高いので、PCRの際、DMSOを5%添加した。反応終了後アガロースゲル電気泳動で約800bpのサイズのPCR産物を確認し、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Life Technologies社）を用いてダイレクトシークエンスを行った。その結果、ALS2と相同性の高い配列であることが確認された。
【００４７】
引き続き、トウモロコシNa65系統のゲノムDNAを鋳型とし、プライマーセットZmALS-2（同上）/ZmALS-13（アンチセンスプライマー、5'-GTGCGGGACGATTATATCCAAGAG-3'：配列番号５）でPhusion DNA polymerase （Thermo Fisher Scientific社）を用いPCRを行い、ALS2遺伝子の-352〜1833番目の塩基配列を増幅した。DMSOを5%添加し、初期denature:98℃（5min）、denature:98℃（30sec）-annealing:58℃（30sec）-elongation:72℃（2min）を40サイクル、最終elongation:72℃（7min）の条件で反応した。アガロースゲル電気泳動の結果、約2kbのサイズのバンドが確認できたので、それを回収しBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Life Technologies社）を用いてダイレクトシークエンスを行い、配列を決定した。ターミネーターから3'-非翻訳領域に至る配列は、Seegene社のDNA Walking SpeedUp Kitを用いたゲノムウォーキングによりPCRクローニングし配列を決定した。Phushion DNA polymerase（Thermo Fisher Scientific社）を用い、トウモロコシNa65系統ゲノムDNAを鋳型とし、配列特異的センスプライマー（ZmALS-5:5'-CCAGATTTTGTGGCAATTGCTAAAGGG-3'：配列番号６）とキット添付のDW-ACP1、2、3及び4の組合わせで反応溶液を調製し、98℃（5分）-42℃（1分）-72℃（2分）の条件で反応した後、98℃（40秒）-55℃（40秒）-72℃（1分）のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃で7分間反応を行った。引き続き１回目のPCR反応液1μLを鋳型として用い2回目のPCRを行った。配列特異的プライマー（ZmALS-5:上記）とキット添付のプライマーDW-ACP-Nの組合わせで、98℃（5分）保持し、98℃（30秒）-58℃（30秒）-72℃（1分）のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃で7分間反応を行った。プライマーDW-ACP-1を用いた反応液を鋳型とした２回目のPCR生成物に約800bpのPCR産物が増幅されたのでこれをアガロースゲルから回収した。BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Life Technologies社）を用いたダイレクトシークエンシングによってターミネーター領域から3'-非翻訳領域に至る配列の決定を試みたが、ダイレクトシークエンシングではシグナルが急激に減衰し、解析が困難であった。そこでこれをpUC18プラスミドにサブクローニングした後、シークエンス解析を行った。PCR産物の5'末端をT4 polynucleotide kinase（Takara Bio社）を用いてリン酸化し、これをSma I/BAP処理したpUC18ベクターに平滑末端同士で連結し、pUC18プラスミドへサブクローニングし、大腸菌（JM109株）に導入した。50ppmアンピシリン含有LB培地上でシングルコロニーを選び、４コロニーからプラスミドを抽出し、ターミネーター領域から3'-非翻訳領域に至る配列（540bp）を含むALS2のシークエンスを解析した。これら４個のコロニー由来のシークエンス配列が全て一緒の配列であったことから、PCRで用いたDNA合成酵素に由来する変異導入はないと考え、正しい配列として確定した。
【００４８】
〔実施例２〕トウモロコシＡＬＳ２のプロモーター領域の塩基配列決定（図１）
実施例１でトウモロコシ自殖系統Na65由来ALS2のプロモーター領域の352bpの配列が明らかになったが、更に上流のプロモーター領域の配列解析をゲノムウォーキングにより行った。
【００４９】
DNA Walking SpeedUp Kit（Seegene社）及びPhusion DNA polymerase（Thermo Fisher Scientific社）を用いゲノムウォーキングを行った。PCRは5X Phusion HF buffer 5μL、dNTP（2.5mM each）2μL、DW-ACP primer（2.5μM）2μL、配列特異的アンチセンスプライマーZmALS-22（5'-GGGTAGAAAATTATTGACGGTAGGTCC-3'（配列番号７）、3.2μM）1.5μL、DMSO1.25μL、トウモロコシ自殖系統Na65ゲノムDNA 0.5μL、Phushion DNA polymerase （Thermo Fisher Scientific社）0.25μLを最終量25μLとなるように混和した。98℃（5分）-42℃（1分）-72℃（2分）でインキュベート後、98℃（40秒）-55℃（40秒）-72℃（1分）の反応を40サイクル行い、最後に72℃で7分間インキュベートした。
１回目のPCRに引き続き、配列特異的アンチセンスプライマー（ZmALS-21、5'-GCTTGAGACGCATACACGTGGTCATT-3'：配列番号８）とキットに添付されたプライマーDW-ACP-Nでnested PCRを行った。１回目のPCR生成物をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE Healthcare Science社）を用いてカラム精製し、精製液1μLを鋳型として用い、プライマーDW-ACP-N（10μM）0.5μL及び配列特異的プライマーZmALS-21（3.2μM）2μLを用いた。これら以外は最初のPCRと同様の組成で反応を行った。98℃（5分）保持し、98℃（30秒）-58℃（30秒）-72℃（1分）の反応を40サイクル行い、最後に72℃で7分間インキュベートした。その結果、プライマーDW-ACP-4を用いた反応液を鋳型とした２回目のPCR生成物に約950bpのPCR産物が増幅されたので、これをゲルからGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GE Healthcare Science社）を用いて精製した。ダイレクトシークエンシングによって本PCR産物の配列を解析し、プロモーター領域のシークエンスを決定した。
【００５０】
〔実施例３〕トウモロコシ自殖系統Na65のゲノムDNAを鋳型としたALS2プロモーター領域-ALS2遺伝子-ALS2ターミネーター領域の増幅（図２）
トウモロコシ自殖系統Na65のゲノムDNAを鋳型として以下の2組のプライマーを用いて、DNA断片を増幅させた。ZmALS-pro-3（5'-TTAATTAACGCCAAGCCATTTAACCTCTCTTG-3'：配列番号９、下線部はPac Iサイト）とZmALS-ter-1（5'-AGATCTTGGAACACCTAATGACCTGCTCCAC-3'：配列番号１０、下線部はBgl IIサイト）のプライマーセットを用いて618bp ALS2プロモーター領域::ALS2遺伝子::520bp ALSターミネーター領域の配列を増幅し図２のP1を、ZmALS-pro-1-2（5'-AAAAGAATTCttaattaaGGACTAGTCTGGTGACGATGAAAG-3'：配列番号１１、下線部はEco RIサイト、小文字はPac Iサイト）とZmALS-18（5'-ACAACATACTACACACAGGGTTGG-3'：配列番号１２）のプライマーセットで1013bp ALSプロモーター::ALS ORF::140bp ALS ターミネーターカセット（P2）を増幅し取得した。実施例１〜３により取得したALS2プロモーター領域-ALS2遺伝子-ALS2ターミネーター領域の塩基配列を配列番号１３に示した。また、ALS2遺伝子がコードするALS2タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１４に示した。
【００５１】
〔実施例４〕618bp ALS2プロモーター::ALS2 ORF::520bp ALS2ターミネーターカセット上のALSへの2点変異（W542L/S621I）アミノ酸に対応する遺伝子変異の導入（図３）
トウモロコシALS2上への2点変異（W542L/S621I）の導入は、P1をpUC18プラスミドにサブクローニングした後に行った。T4 polynuleotide kinaseを用いてP1の5'末端をリン酸化し、これをSma Ｉ/BAP処理したpUC18プラスミドに平滑末端で組み込み、Plasmid-1を得た。この精製したプラスミドのALS遺伝子のアミノ酸配列上621番目のセリン（Ser）に対応するコドン（AGT）をイソロイシン（Ile）に対応するコドン（ATT）に変換後、542番目のトリプトファン（Trp）に対応するコドン（TGG）をロイシン（Leu）に対応するコドン（TTG）に変換した。Plasmid-1を鋳型として、プライマーZmALS_mut_S621I（5'-CTATTGGTGGGGCTTTCAAGG-3'：配列番号１５、センス）とZmALS-29（5'-GGATCATAGGCAACACATGC-3'：配列番号１６、アンチセンス）を用いてプラスミド全長を一周してPCRで増幅させた。PCRはPhushion DNA polymerase（Thermo Fisher Scientific社）を用い、98℃で5分間インキュベート後、98℃（30秒）-58℃（30秒）-72℃（1分）の反応を40サイクル行い、最後に72℃で7分間インキュベートした。PCR産物の両末端をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した後、セルフライゲーションさせALS2上にS621Iの変異の入ったプラスミド（Plasmid-2）を作製した。更に本プラスミドを鋳型として、W542Lの変異を導入した。S621I変異導入と同様のPCR条件で、プライマーZmALS_mut_W542L（5'-GTTGGAGGACAGGTTCTATAAG-3'：配列番号１７、センス）/ZmALS-28（5'-TGCACCACCATCCCGAGGTG-3'：配列番号１８、アンチセンス）のセットでプラスミド全長をPCRで増幅させた。PCR産物の両末端をT4 polynucleotide kinaseを用いてリン酸化した後、セルフライゲーションさせW542L/S621Iの2点変異を含むプラスミド（Plasmid-3）を作製した。尚、ライゲーションしたプラスミドは大腸菌（JM109株）に導入後、50ppmアンピシリン含有LB培地でシングルコロニーを形成させ、選抜したコロニーの大腸菌をLB液体培地で培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）で精製し取得した。
【００５２】
〔実施例５〕1013bp ALS2プロモーター::ALS2（W542L/S621I）::520bp ALS2ターミネーターカセットの取得（図３）
実施例４で作製したPlasmid-3をSal Iで処理し、ORFの2点変異型ALS2（W542L/S621I）を含むC末端側領域（1331bp）および520bpターミネーター領域を含むDNA断片（F3）を得た。一方、1013bpプロモーター領域を含むP2をEco RIおよびSal Iで処理し、1013bpプロモーター領域およびORFのN末端領域（586bp）のDNA断片を得た。次にこのDNA断片を同制限酵素で処理したpUC18に導入した。このプラスミドをSal I処理後、セルフライゲーションを防ぐため脱リン酸化BAP処理を行った。これとF3をライゲーションさせ、1013bp ALS2プロモーター::ALS2（W542L/S621I）::520bp ALS2ターミネーターカセットを組み込んだpUC18ベクターを作製した。このプラスミドをPlasmid-4とした。
【００５３】
〔実施例６〕1013bp ALS2プロモーター::ALS2（W542L/S621I）::520bp ALS2ターミネーターカセットのpSTARAバイナリーベクターへの導入（図４）
実施例５で作製したPlasmid-4をPac IおよびBgl IIで処理し、1013bp ALS2プロモーター::ALS2（W542L/S621I）::520bp ALS2ターミネーターカセットを含むDNA断片（F4）を切り出した。一方、同様にイネALSを組み込んだpSTARAベクターであるR-4（クミアイ化学）をPac IおよびBgl IIで処理し、pSTARAベクターのバックボーンを切り出した。F4とpSTARAプラスミドのバックボーンをライゲーションさせ、1013bp ALS2プロモーター::トウモロコシALS2（W542L/S621I）::520bp ALS2ターミネーターカセットを組み込んだpSTARAバイナリーベクタープラスミド（Plasmid-5）を得た。
【００５４】
既に作製してあったシロイヌナズナ2点変異型ALS（W574L/S653I）遺伝子を持つA-3バイナリーベクタープラスミド（クミアイ化学）にLR反応でsGFP（S65T）を導入したプラスミド（Plasmid-6）からCaM35Sプロモーター::sGFP（S65T）::NOSターミネーターカセットを切り出し、Plasmid-5に組込んだ。Plasmid-6をSph I、Eco RIで処理し、約2kbのCaM35S promoter::sGFP（S65T）::NOS terminatorを切り出した。尚、同時にBgl IIでも処理しpSTARAプラスミドの基本骨格部分を消化し、CaM35Sプロモーター::sGFP（S65T）::NOSターミネーターカセット断片とアガロースゲル泳動で重ならないようにした。次にCaM35Sプロモーター::sGFP（S65T）::NOS ターミネーターカセット断片のSph IとEco RI突出末端をT4 DNA polymeraseで平滑化した。一方、Plasmid-5をSwa Iで処理し平滑断片とした後、BAP処理を行い5'末端のリン酸基を除去した。これら2つのDNA断片をライゲーションさせ、大腸菌（HST02株）に導入した。CaM35Sプロモーター::sGFP（S65T）::NOSターミネーターカセットがセンス方向に挿入したプラスミドをPlasmid-7とした。
【００５５】
〔実施例７〕Plasmid-7のアグロバクテリウムへの導入
Plasmid-7をアグロバクテリウム菌（Agrobacterium tumefacience EHA105）にエレクトロポレーション（BIO-RAD社GenePulser X-Cell、2.4KV、25μF、200Ω）により導入し、Yeast Malt寒天培地（12.5ppm リファンピシリン、25ppm クロラムフェニコール、50ppm スペクチノマイシンを含む）に塗布し、27℃で3日間静置培養を行った。得られたシングルコロニーをYM液体培地に植菌し、27℃で3日間振とう培養を行い、その培養液をグリセロールストックとして保存した。
【００５６】
〔実施例８〕トウモロコシ自殖系統Mi29及びNa65の作出
トウモロコシデント種Fl品種「P3352」（パイオニア社）を種子親、（H84 X R2040）XH84を母材とするSI系統「307042」を花粉親として交配し、「NX694」を作成した。その後「NX694」と「P3352」とを交配し、S0世代（母材）として自殖系統の育成を開始した。各種病害抵抗性についての個体選肢と自殖による固定化を進め、S5世代まで育成し、諸特性の評価で有望と認められたのでこれを自殖系統「Na65」とした。
【００５７】
デン卜種自殖系統間の単交雑Fl系統NX220を種子親とし、デント種Fl品種P3358（パイオニア社）を花粉親として交配し、その後P3358が戻し交配された。NX220はPa91（ペンシルパニア大学）x R2040（クライド・ブラック&サン社）の掛け合わせで構成されている。戻し交配系統（NX220X P3358）X P3358をS0世代（母材）として自殖系統の育成を開始し、耐倒伏性と各種病害抵抗性についての有望であった系統の固定化を進め、これを自殖系統「Mi29」とした。
【００５８】
〔実施例９〕アグロバクテリウム菌（KLB-348）を用いたトウモロコシ自殖系統Mi29の形質転換
Mi29の形質転換はIshida et. al.の方法（Nature Protocol 2（7）:1614-1621, 2007）により未熟胚へのアグロバクテリウム感染により行った。自家受粉後約10日のトウモロコシ自殖系統Mi29の未熟胚を摘出し、アグロバクテリウム菌（EHA105株、グリセロールストック番号KLB-348）に浸した後、46℃の高温処置と遠心分離処理を行いLS-AS培地（アセトシリンゴンを含むMS培地）で25℃暗所で約1週間培養した。未熟胚からはカルスが形成されるが、その後ビスピリバックナトリウム塩0.2μMとカルベニシリンを含む培地に移し25℃暗所で2週間〜１ヶ月培養した。ビスピリバックナトリウム塩耐性を示し成長を続けたカルスを28℃連続照明下でゼアチンを含むLSZ培地で2週間〜１ヶ月培養し、シュート形成を促した。シュートが形成されたカルスはさらに棒びん中のLSF培地（0.2mg/lのIBAを含む）に移植し発根を促した。棒びん内で十分発根した組換え体を鉢上げした。
【００５９】
〔実施例１０〕トウモロコシ自殖系統Na65及びMi29のゲノムDNA
トウモロコシ自殖系統Na65及びMi29の葉100mgよりゲノムDNAをDNeasy Plant Mini Kit （Qiagen社）を用い抽出し、濃度100μg/mlの水溶液を50μl得た。引き続きPCRを全量50μlで調製した。反応液組成は鋳型ゲノムDNA 5μl、Phushion DNA polymerase （Thermo Fisher Scientific社）0.5μl、5×Phushion HF Buffer（MgCl2含）10μl、dNTPs（25mM）4μlである。プライマーは50pmol加え、ZmALS-30/ZmALS-18、ZmALS-30/ZmALS-31、ZmALS-14/ZmALS-18、ZmALS-14/ZmALS-31の4通りの組合わせで混合した（図５参照）。反応条件は95℃からのホットスタートで開始し、95℃（30秒）-50℃（1分）-72℃（2分）の増幅サイクルを40回繰り返し、最終サイクルの後、72℃で7分間インキュベートし反応を完結させた。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動に供しPCR生成物のサイズを確認した（図６）。なお、使用したプライマーとPCR生成物のサイズとの関係を表１に示す。
【００６０】
【表１】
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【００６１】
〔実施例１１〕アグロバクテリウム菌（KLB-348）を用いて形質転換したトウモロコシ自殖系統Mi29のゲノムDNA
アグロバクテリウム菌（KLB-348）を用いて形質転換したトウモロコシ自殖系統Mi29の葉100mgよりゲノムDNAをDNeasy Plant Mini Kit（Qiagen社）を用い抽出し、濃度100μg/mlの水溶液を50μl得た。引き続きPCRを全量50μlで調製した。反応液組成は鋳型ゲノムDNA 5μl、Phushion DNA polymerase（Thermo Fisher Scientific社）0.5μl、5×Phushion HF Buffer （MgCl2含）10μl、dNTPs（25mM）4μlである。プライマーは50pmol加え、ZmALS-14/ZmALS-31の組合わせで混合した。反応条件は95℃からのホットスタートで開始し、95℃（30秒）-50℃（1分）-72℃（2分）の増幅サイクルを40回繰り返し、最終サイクルの後、72℃で7分間インキュベートし反応を完結させた。PCR生成物はアガロースゲル電気泳動に供しPCR生成物のサイズを確認した（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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