(57)【要約】      （修正有）【課題】ＮＣ１又はその抗体投与により作製した腎疾患モデルによりスクリ−ニングした腎疾患治療剤を提供する。【解決手段】次の通り構成する。イ、タイプ４コラ−ゲンのＮＣ１分画（又はその部分や構成ペプタイド）又はその抗体を動物に投与して作製した「腎疾患」モデルを用いて開発する腎疾患治療剤、及び同モデルを用いて開発する免疫抑制効果や抗アレルギ−効果を持つ腎疾患治療剤。ロ、タイプ４コラ−ゲンのＮＣ１分画（又はその部分や構成ペプタイド）より成るか、これらを抗原として作製した抗体より成る腎疾患治療剤。ハ、抗ＮＣ１抗体の測定による、腎炎の初期を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の腎臓由来タイプ４コラーゲンＮＣ１分画を、下記の動物に下記の条件で投与した時、腎炎の発症率が１００％で、投与６週後の生存率９５％以上となる腎炎惹起方法。
１．投与物質は、以下の全条件を満足するウシ腎臓由来タイプ４コラーゲンＮＣ１分画
１）投与物質の抽出工程の特徴；
４７〜５０℃で１日間の熱処理をする
２）投与物質の特定域の採取；
電気泳動像が特定バンド（４９〜３３ｋＤａ及び２８〜２０ｋＤａ）であり、カラム抽出する時は吸光度が７Ｓのピークの９０％以上で４倍以内のものを採取する
３）投与物質の免疫的特性；
（１）作製したウサギ由来（ポリクロ）、ラット由来（ポリクロ）、マウス由来（モノクロ）のいずれの抗ＮＣ１抗体とも反応する
（２）抗タイプ４コラーゲン（三本鎖領域）抗体と反応しない
（３）前述のウサギ由来（ポリクロ）、ラット由来（ポリクロ）、マウス由来（モノクロ）のいずれの抗ＮＣ１抗体もヒト胎盤由来タイプ４コラーゲンと反応しない
２．腎炎モデル；カニクイサル（個体あたり２〜３．５ｋｇ）
投与量；同量のＦＣＡと共に１回当たり３ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ×１回
投与部位；フットパット又は背部皮内
結果の判定；
投与２〜３週後に蛋白尿を示し、
６週後には強蛋白尿となり、腎糸球体組織に破壊が生じる」
【請求項２】
請求項１の腎炎惹起方法によるカニクイサル腎炎モデル。
【発明の詳細な説明】
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月20日(2012.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】追加
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、腎疾患モデル動物及び腎疾患モデルによりスクリ−ニングした腎疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】従来、動物に腎炎モデルを作製するには、１）腎臓の５／６切除（発症までに２−３ヵ月と長期間を要する）、２）抗サイ１の静注（腎炎の期間は１週間と短くその後自然回復する）、３）片側腎の切除と「２）」との併用（再現性が難しく、しかも発症までに２−３ヵ月を要する）、４）アドリアマイシンなどの薬剤静注（発症までに２−３ヵ月と長期間を要する）などの方法がある。
従来の方法はいずれも一長一短があり、薬物のスクリ−ニングや副作用検出にふさわしいものではなかった。
一方、腎炎モデルとして、腎臓の糸球体基底膜からのタイプ４コラ−ゲンのＮＣ１分画を用いる方法も文献（ラット投与による実験）に記載されているが、投与６週間後には半数が腎不全で死ぬとも、記載されており、余りにも激症であり、薬物のスクリ−ニングや副作用検出にふさわしいものではなかった。又抗原としてのＮＣ１の抽出精製の困難さもあり、薬効評価に用いられていなかった。
【発明が解決しょうとする課題】
【０００３】従来の方法は、１）発症まで長時間を要するので、実験に直ぐ掛かれず動物飼育費も重む、２）実験途中で自然回復するので、薬効の判定がし難い、３）再現性がなく、追試で薬効を比較し難い、４）激症のため、実験途中で死ぬなどの欠点があった。以上の欠点を解消した腎炎モデルが作製できれば、腎疾患治療薬の開発や他薬剤の副作用検出（腎疾患への影響）に利用できる。
【課題を解決するための手段】
【０００４】本発明者は、長い間腎疾患や他疾患に伴う二次性腎疾患の治療薬開発と早期検出方法に努めてきた。
先ず、抽出精製方法を工夫し、ウシ腎臓の糸球体基底膜から、安定的に品質維持された「タイプ４コラーゲンのＮＣ１分画（以降ＮＣ１と言う）」を得た。
（本発明に於いてタイプ４コラ−ゲンはタイプＩＶコラ−ゲンと、ＮＣ１分画はＮＣ１領域と同義に用いる。）
つまり、１）抽出過程で蛋白分解酵素阻害剤を適量加える（ＮＥＭ及びＰＭＳＦを抽出溶液中にそれぞれ最終濃度０．１Ｍから０．０１ｍＭになるように、望ましくは、１０ｍＭから０．１ｍＭになるように加える）、２）精製途中で加熱（４０度以上５０度以下で５分以上）する、３）電気泳動で特定バンド（４９〜３３ｋＤａの間及び２８〜２０ｋＤａ）を示すものをカラム抽出（吸光度が７Ｓのピ−クの９０％以上で、４倍以内のもの）する−である。このＮＣ１は常に一定の生化学的特性と保存性を示す。
【０００５】さらに腎炎モデルを作製する時、ＮＣ１の投与方法は、ＮＣ１と同容量のＦＣＡとを混和し、両後足のフットパット（又は、尾根部や背部の皮内）に投与する。サルでは、例えばカニクイザル（投与時体重２ｋｇから３．５ｋｇが望ましい）は、３ｍｇ／ｋｇから０．１ｍｇ／ｋｇまでの量を投与し、望ましくは、１ｍｇ／ｋｇである。ラット（投与時４週令から２０週令）やマウス（投与時４週令から２０週令）では、２ｍｇ／匹から５μｇ／匹までの量を投与し、望ましくは、５μｇ／匹から２００μｇ／匹であり、より望ましくは、１０μｇ／匹から１００μｇ／匹である。
抗体投与の場合は、抗体を動物の静脈や腹腔に単独投与する。抗体は、ポリクロでも、モノクロでも良い。モノクロは、ＩｇＧ１でもＩｇＧ２でも良いが、ＩｇＧ１の方が弱い腎炎を惹起する。ポリクロはポリクロを作製する時、動物種間、個体間で抗体価がばらつくので、使用時に留意する必要があるが、モノクロはいつも一定の抗体価を示すものが得られるので、作製の手間は要するが使用は楽である。サルでのモノクロ投与は、例えばカニクイザル（投与時体重２ｋｇから３．５ｋｇが望ましい）は、２ｍｇ／ｋｇから１０μｇ／ｋｇまでの量を投与し、望ましくは、１ｍｇ／ｋｇから５０μｇ／ｋｇである。ラット（投与時４週令から１５週令）やマウス（投与時４週令から１５週令）では、１ｍｇ／匹から５μｇ／匹までの量を投与し、望ましくは、２００μｇ／匹から５μｇ／匹である。
その結果、提示の投与法と量でラットやマウス等のげっ歯類及びサルなどの哺乳動物に感作した時に、確実に腎炎を発症させながら、実験途中で死亡などの激症を生じさせない特徴を持つ。
【０００６】本発明に用いるＮＣ１は、ウシ以外の動物でも良く、例えば、ヒト、サル、ブタ、羊、ヤギ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類、ラット、マウス等のげっし類、鮭、鮫などの魚類、昆虫類、その他の動物や、細菌、微生物でも良い。
又、ＮＣ１の由来臓器は、腎臓に限らず、胎盤、眼その他いずれの臓器でも良いが、腎臓又は胎盤が望ましい。他の臓器に比較し、大量に入手しやすく精製の費用も安くなる。
更に、ＮＣ１は、抽出精製のみでなく合成しても良く、遺伝子操作で、その全体又は、部分を合成させて使用しても良い。しかし、ＮＣ１全体を用いることは、特定α鎖（α３やα４）のＮＣ１を用いるより発症を緩やかにする。
【０００７】次に、この疾患モデルを用いて、薬物のスクリーニングを行い腎炎治療薬を見出だした。
サイクロスポリンを始めとする免疫抑制剤は、腎炎治療薬と成り得るし、従来、抗炎症剤、抗アレルギ−剤、アトピ−治療剤として用いられていた薬剤も、腎炎治療薬として効能が拡大できる。
同時に、本発明のスクリーニング方法の有効性も確認できた。
更に腎炎に伴う二次性疾患の治療剤、例えば透析剤、腎性貧血剤、降圧剤、骨疾患治療剤のスクリーニングや評価にも使える。
一方、長期に薬剤を服用する糖尿病、高血圧、骨粗鬆症、高脂血症、その他の慢性疾患では、長期の服用による腎臓への影響が懸念される。特に、これらの薬を利用する機会の多い中高年は、若年者にくらべ腎臓の代謝能力が著しく劣っているので、より留意する必要がある。
その点、本発明の腎炎モデルを、一般薬剤の長期連用による腎機能の劣化している中高年者への影響を検討するのにもふさわしい。
もちろん、短期間投与の薬剤、例えば抗生物質などの腎疾患患者への影響を確認するにも適している。
【０００８】又、ＮＣ１や、抗ＮＣ１抗体は、腎炎治療薬となり得る。ＮＣ１や、抗ＮＣ１抗体の事前投与で腎炎発症を抑制する。この場合は、感作に先立つ薬物の事前投与によるスクリ−ニングである。本方法もスクリ−ニング方法として有効である。更に、血清中の抗ＮＣ１抗体の検出は、蛋白尿に先立つので、腎疾患の早期検出に有用である。
【０００９】血液中の抗ＮＣ１抗体を免疫反応を用いて測定する方法とその試薬。
ラット血清中の抗ＮＣ１抗体を、酵素免疫反応（ＥＬＩＳＡ）で測定する時、試薬として、１）ＮＣ１をコ−トしたプレ−ト、２）酵素標識抗ラットＩｇＧ抗体、３）発色基質（ＴＭＢ，過酸化水素）、４）反応停止液（硫酸）を用いて測定する。
もちろん、免疫反応として、酵素免疫反応に限定されず、ＡＢ法、ＲＩＡ，免疫発光法、沈降反応、凝集反応他を含み、酵素標識の抗体としては、ポリクロ−ナル又はモノクロ−ナル抗体を問わず、又それを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でも良い。
反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法等でも良い。
プレ−トに替え、ガラス、磁性物質、ラテックスにしても良く、無しにして固相法を用いないことでも良い。
プレ−トにＮＣ１をコ−トする時、コ−ト物質をアビジン、ビオチン、又はこれらの結合した成分を介しても良い。
コ−ト時に用いるＮＣ１の動物種としては、検体と同一の種が望ましく（ここではラット）又、ウシ、ヒト、サル、ブタ、羊、ヤギ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類、マウス等のげっし類、魚類、その他の動物でも良い。ＮＣ１の由来臓器は、腎臓が望ましいが、これに限定されない。
プレ−トにコ−トするＮＣ１は、複数種を混合したものでも良い。又、ＮＣ１は、生体抽出物やリコンビナントのみでなく、構成ペプタイド（特定分画、合成品を含む）でも良い。
更に第二抗体は、抗検体ＩｇＧ抗体に限定されず、抗検体ＩｇＭ抗体、抗検体ＩｇＡ抗体、抗検体イムノグロブリン抗体でも良いが、抗検体ＩｇＧ抗体が望ましい。
測定する検体がヒト，サル、マウスなどラット以外の時は、前述のラット用試薬成分を検体に合わせる。
【実施例１】
【００１０】１．ＮＣ１の特性；
ウシ腎臓の糸球体基底膜よりタイプ４コラ−ゲンのＮＣ１を精製し、その特徴は下記の通りである。
・ＮＣ１の電気泳動像は一定（４９〜３３ｋＤａの間及び２８〜２０ｋＤａ）
・抗タイプ４コラーゲン（三本鎖領域）抗体と反応しないが、作製した各種の抗ＮＣ１抗体（ポリクロ／ウサギ、ラット、モノクロ／マウス）と反応する。
・同上の抗ＮＣ１抗体は別途用意したタイプ４コラーゲン（Ｋ３４  ヒト胎盤由来タイプ４コラ−ゲン  コラ−ゲン技術研修会製）と反応しない。
・提示方法で、動物に投与した時、腎炎の発症率１００％で、投与６週後の生存率９５％以上となるタイプ４コラ−ゲンのＮＣ１。
【実施例２】
【００１１】２．ＮＣ１感作によるラット腎炎モデル
（以降実施例で用いるＮＣ１は、上記「実施例１」で得たものである）
１）発症試験１
ラット；ウイスタ−系・雌・５週令・３匹×２群（チャ−ルスリバ−社）
投与部位；尾根部皮内
投与量；ＦＣＡと共に初回ＮＣ１を０．０５ｍｇ／匹、以降２週間毎に０．１ｍｇ×４回
結果；投与個体は全て強蛋白尿を示した。
実験終了後は全て生存した。
実験中の挙動（投与部位の足腫れ有り）・体重には健常群と投与群とに大差がなかった。し
初回投与後３５日で抗体ＯＤ値は８０００倍稀釈も原血清も同じだった。
初回投与後４２日の測定で随時尿の蛋白は最高濃度を示した。
結論；追加免疫の繰り返しで、抗体価が上昇し、全て発症、全て生存し、腎炎モデルとして、使用可能である。
２）発症試験２
ラット；ＷＫＹ／ＮＣｒｊ・雌・７週令・投与１０匹非投与５匹
投与部位；両後足フットパット
投与量；ＦＣＡ（１対１）と共にＮＣ１として０．１ｍｇ（片足０．０５ｍｇ）×１回
結果；投与個体は３週間後に全て強蛋白尿を示した。
実験終了の６週間まで全て生存した。剖検で糸球体の破壊が認められた。
実験中の挙動・体重には非投与群とに差が無かった。
（投与部位の腫れで４−５日足を引きずる）
蛋白尿は、投与後２週間で２匹が、３週間後で全１０匹が陽性を示した。
血清中抗体価は投与後２週間で全１０匹が２０００以上、４週間で４４００より１００００以上まで上昇した（抗体価は吸光度１．００になる稀釈倍率で示す）。
尿中抗体価は投与後２週間で２匹の蛋白尿陽性検体のみで１０と２０、４週間で全１０匹が５０〜１０００を示した。（添付３、添付４）
結論；血清中の抗体は、尿中蛋白や尿中抗体に先行して検出されるので、腎疾患の早期検出に有用である。
抗体価は、血清中が尿中の１０倍以上であったので、血清測定が望ましい。
３）発症試験３
ラット；ウイスタ−・雌・８週令・３匹
投与部位；背部皮内
投与量；ＦＣＡ（１対１）と共にＮＣ１として０．１ｍｇ、追加免疫２週後同量
測定；尿試験紙（テルモウリエ−ス；蛋白陽性は＋１〜＋４）
結果；投与１週後より５週まで、±から＋１で、６週以降３か月間、＋１又は＋２で弱い蛋白尿を継続し、同時に潜血反応も示した。
結論；軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
【実施例３】
【００１２】３．ＮＣ１感作によるサル腎炎モデル    発症試験４
サル；カニクイザル・雌・２匹（３．０ｋｇ，２．６ｋｇ、共に４歳）
投与部位；両後足フットパット
投与量；ＦＣＡ（１対１）と共にＮＣ１として４ｍｇ（片足２ｍｇ）×１回
結果；中蛋白尿を示した。１匹は２週後（１５４ｍｇ／２４ｈｒ）、１匹は３週間後（８１ｍｇ／２４ｈｒ）である。
実験終了時（６週間）は強蛋白尿（３３９ｍｇ／２４ｈｒ，２４９ｍｇ／２４ｈｒ）で、臓器の変化は、肺臓、肝臓にはなく腎臓のみで、糸球体に破壊があった。
結論；哺乳類であるサルで、１００％発症し、実験中１００％生存する安定した腎炎モデルを作製できる。
【実施例４】
【００１３】４．ＮＣ１感作によるマウス腎炎モデル    発症試験５
マウス；ＢＡＬＢ／ｃ・雌・５週令・３匹（チャ−ルズリバ−社）
投与部位；背部皮内
投与量；ＦＣＡ（１対１）と共にＮＣ１として０．１ｍｇ、追加免疫２週後同量
測定；尿試験紙（テルモウリエ−ス；蛋白陽性は＋１〜＋４）
結果；投与１週後より７週まで＋１又は＋２で、弱い蛋白尿を継続した。
【実施例５】
【００１４】５．抗ＮＣ１抗体投与によるマウス腎炎モデル    発症試験６
マウス；ＢＡＬＢ／ｃ・雌・５週令・９匹（チャ−ルズリバ−社）
投与部位；腹腔内
投与量；抗ＮＣ１抗体（マウスモノクロ抗体、ＩｇＧ１、１２Ｄ）を、１０，２０，５０μｇを各３匹に投与し、２週後同量追加投与した。
測定；尿試験紙（テルモウリエ−ス；蛋白陽性は＋１〜＋４）
結果；投与１週後より７週まで＋１又は＋２で、弱い蛋白尿を継続した。
結論；軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
６．抗ＮＣ１抗体投与によるラット腎炎モデル    発症試験７
ラット；ウイスタ−・雌・８週令・３匹（チャ−ルズリバ−社）
投与部位；腹腔内
投与量；抗ＮＣ１抗体（マウスモノクロ抗体、ＩｇＧ１、１２Ｄ）を、５０μｇを各３匹に投与、２週後同量追加投与した。
測定；尿試験紙（テルモウリエ−ス；蛋白陽性は＋１〜＋４）
結果；投与１週後より４か月間、＋１、±又は＋２で、弱い蛋白尿を継続した。
−はなかった。
結論；軽微で長期の蛋白尿出現は、軽症の腎炎モデルとして有用である。
【実施例６】
【００１５】７．薬効試験１
ラット；ＷＫＹ／ＮＣｒｊ・雌・８週令・３匹
試験法；「発症試験２」を用いた。
投与薬剤；免疫抑制剤の例として、サイクロスポリンＡを使用
投与量；感作翌々日より５０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与で連日投与
結果；感作４週間後で、２匹には微弱な（尿試験紙）蛋白尿、１匹は陰性しか認められなかった。
結論；本発明のスクリーニング方法は、薬効評価に有用である。
８．薬効試験２
ラット；ＷＫＹ／ＮＣｒｊ・雌・５週令・６匹（１薬剤２匹）対照２匹計８匹
試験法；「発症試験２」を用いた。
投与薬剤；ＮＣ１、
抗ＮＣ１ポリクロ抗体（ウサギ由来）、
抗ＮＣ１モノクロ抗体（マウス由来）
投与量；各薬剤（蛋白量として）０．４ｍｇ／匹を連日４週間の経口投与後、感作した。
結果；感作４週間後で、対照は強呈色であったが、投与群はいずれも微弱から中の蛋白呈色であった。
結論；本発明のスクリーニング方法が、薬効評価に有用であるのみならず、ＮＣ１及びその抗体は、腎炎治療剤となり得る。
【実施例７】
【００１６】９．抗ＮＣ１抗体の測定
検体；ＮＣ１感作後１０日目のラット血清（５匹）及び未処理ラット（５匹）
測定法；ＥＬＩＳＡ法とラテックス凝集法
ＥＬＩＳＡ法の概要；
試薬１、ＮＣ１（ウシ腎糸球体基底膜由来タイプ４コラ−ゲンのＮＣ１）を０．５μｇ／穴をコ−トしたマイクロプレ−ト
試薬２、ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ抗体（ウサギ由来ポリクロ−ナル）
試薬３、ＴＭＢ試薬（ＴＭＢ０．１％，過酸化水素０．０２％、０．１Ｍクエン酸緩衝液）
試薬４、反応停止液（０．５Ｍ硫酸）
検体は、リン酸緩衝液で２０００倍に希釈し、１００μｌ／穴を用いた。
測定方法：試薬１に検体１００μｌ／穴→２時間インキュベ−ション及び洗浄→試薬２、１００μｌ／穴→１時間インキュベ−ションおよび洗浄→試薬３、１００μｌ→３０分インキュベ−ション→試薬４、５０μｌ→測定（吸光度４５０ｎｍ）
結果：感作５検体中、抗ＮＣ１抗体は、全てに認められた。未投与検体５例ではまったく認められなかった。  （付表４）
よって、本法は、腎疾患で蛋白尿が出現する前の早期血清中の抗ＮＣ１抗体の存在を検出でき、腎疾患発症を予知できる。
なおラテックス凝集法を用いた時は、検体の稀釈が１００倍で同じ結果を得た。
結論；本発明の抗ＮＣ１抗体測定法は、実験動物の評価及び、腎炎の早期検出に有用である。
【発明の効果】
【００１７】腎疾患の治療と早期検出とに役立つ。
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