(57)【要約】【課題】アマドリアーゼを用いた、より簡便で、迅速に、精度の高い測定値が得られる糖化ヘモグロビン測定方法を提供する。また、そのために用いる、使用条件の制約がより少なく、処方される酵素の性能を十分に発揮できる糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を提供する。【解決手段】弱酸性領域から弱アルカリ性領域に及ぶ広範なｐＨ範囲においてα−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性に対するε−フルクトシルリジンへの反応性が顕著に低減したアマドリアーゼを処方した、糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物およびそれを用いた糖化ヘモグロビン測定方法。【効果】アマドリアーゼの反応に最も適したｐＨを含む広範なｐＨ範囲で、前処理による影響物質の消去等の工程を行うことなく、精度の高い測定値が得られる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ、アマドリアーゼを含む糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物において、アマドリアーゼが下記の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有する糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
（ａ）ｐＨ５．５から８．０に及ぶ範囲において、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性を１とした場合のε−フルクトシルリジンへの反応性の割合が０．０５以下である。
（ｂ）ｐＨ５．５から８．０に及ぶ範囲において、試料中に共存するε−フルクトシルリジンがα−フルクトシルバリルヒスチジンの測定値に与える影響が１５％以下である。
【請求項２】
アマドリアーゼによる測定反応を、ｐＨ５．５〜８．０で行うように処方がなされた、請求項１記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
【請求項３】
アマドリアーゼが、配列番号１に示すアミノ酸配列において以下の（ｃ）又は（ｄ）に示したアミノ酸残基の置換および／または欠失を有するアマドリアーゼである請求項１または２に記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
（ｃ）９８位のグルタミン酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンのアスパラギンへの置換、２５９位のバリンのシステインへの置換
（ｄ）９８位のグルタミン酸のアラニンへの置換、１０３位のグリシンのヒスチジンへの置換、１５４位のセリンのアスパラギンへの置換、２６３位のグリシンのメチオニンへの置換、２６５位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、４３５位のプロリン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンの欠失
【請求項４】
アマドリアーゼが、配列番号１に示すアミノ酸配列において上記（ｃ）又は（ｄ）に示したアミノ酸残基の置換および／または欠失を有し、（ｃ）又は（ｄ）に示した位置以外の位置で１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである請求項１または２に記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を用いる糖化ヘモグロビン測定方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の測定に有効な試薬組成物、より具体的には、共存するε−フルクトシルリジンの影響を受け難い糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物およびそれを用いる糖化ヘモグロビン測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化蛋白質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、蛋白質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。蛋白質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、蛋白質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化蛋白質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
【０００３】
これら生体内で生じる糖化蛋白質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ヘモグロビンはαサブユニット（以降α鎖と表記）２分子とβサブユニット（以降β鎖と表記）２分子の計４分子のサブユニットから構成される蛋白質であり、ＨｂＡ１ｃはβ鎖のアミノ末端が糖化されたヘモグロビンと定義されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）、若しくはα−フルクトシルバリン（以降αＦＶと表す）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１〜７参照）。
実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きいと考えられている。そのため、現在では特定のプロテアーゼを用いてＨｂＡ１ｃのβ鎖からαＦＶＨを遊離させ、それを定量することによりＨｂＡ１ｃを測定する方法が主流となっている。
【０００５】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する。
アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜９参照）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
【０００６】
酵素的方法によるＨｂＡ１ｃの測定においては、アマドリアーゼの性質として厳密な基質特異性が要求される。例えば、先述の様に、特定のプロテアーゼにより遊離されたαＦＶＨを定量することによりＨｂＡ１ｃの測定を実施する場合には、検体中に遊離状態で存在する、および／または、プロテアーゼ等を用いたＨｂＡ１ｃの処理工程において遊離される、αＦＶＨ以外の糖化アミノ酸や糖化ペプチドには作用し難いアマドリアーゼを用いることが望ましい。特に、ヘモグロビン分子中に含まれるリジン残基側鎖のε位のアミノ基は糖化を受けることが知られており、この糖化を受けたリジン残基に由来する、ε位のアミノ基が糖化されたε−フルクトシルリジン（以降εＦＫと表す）が、プロテアーゼ処理等によって遊離されることが示唆されている（非特許文献１０参照）。そのため、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫに対し作用し難い、基質特異性の高いアマドリアーゼが強く望まれている。
【０００７】
なお、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端よりαＦＶＨを遊離させるプロテアーゼにより、ＨｂＡ１ｃのα鎖アミノ末端より遊離されるペプチド断片はこれまでに同定されておらず、また、ヘモグロビンのα鎖アミノ末端のバリンはβ鎖アミノ末端のバリンと比較して極めて糖化され難いことが示されている（非特許文献１０参照）。従って、α鎖アミノ末端由来の糖化アミノ酸／糖化ペプチドについては測定誤差の原因物質となり得る可能性はほぼ皆無である。
【０００８】
一般的な技術として、酵素の基質特異性を改変するためには、酵素をコードするＤＮＡに変異を加え、酵素のアミノ酸に置換を導入し、目的とする基質特異性を備えた酵素を選抜する方法が知られている。また、相同性の高い酵素において、アミノ酸置換によって基質特異性を高めたという例が既に知られている場合には、その情報をもとに基質特異性の向上を予想することが可能である。
【０００９】
実際、カーブラリア・クラベータ(Curvularia clavata)ＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼおよびネオコスモスポラ・ヴァシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)４７４由来のケトアミンオキシダーゼについては、数個のアミノ酸を置換することによって、αＦＶＨに対する基質特異性が向上した改変型ケトアミンオキシダーゼが示されている（特許文献１参照）。例えば、カーブラリア・クラベータＹＨ９２３由来のケトアミンオキシダーゼにおいては、５８位のイソロイシンをバリンに、６２位のアルギニンをヒスチジンに、３３０位のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより、ε−フルクトシル−（α−ベンジルオキシカルボニルリジン）（以降εＦＺＫと表す）に対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるεＦＺＫ／αＦＶＨが０．９５から０．０２５へと低減することが示されている。
【００１０】
しかし、上記文献において改変型ケトアミンオキシダーゼの基質特異性の評価に用いられているεＦＺＫは、糖化ヘモグロビンをプロテアーゼで処理する工程において実際に生じるεＦＫとは、分子量や構造の点でも相当に異なる化合物である。そのため、εＦＺＫに対する反応性が低減していることをもって、実際の測定誤差の原因物質となり得るεＦＫに対する反応性が低減したとはいい難い。また、上記文献中の改変型ケトアミンオキシダーゼを用いてεＦＫに対する反応性の低減を確認している旨の記載もない。
【００１１】
その他にも、アスペルギルス・ニードランス(Aspergillus nidulans)Ａ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼにアミノ酸置換を導入し、基質特異性を改変することにより、αＦＶＨに対する反応性を新たに付与した改変型フルクトシルアミノ酸オキシダーゼが報告されている（特許文献１１参照）。例えば、アスペルギルス・ニードランスＡ８９由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの、５９位のセリンをグリシンに、かつ６５位のリジンをグリシンに置換することにより、または１０９位のリジンをグルタミンに置換することにより、新たにαＦＶＨに対する酵素活性が付与されることが示されている。しかしながら、当該アミノ酸置換がεＦＫに対する反応性の低減に寄与するとの記載はない。
【００１２】
すなわち、天然型若しくは変異型アマドリアーゼを含め、εＦＫに対する酵素活性をαＦＶＨに対する酵素活性で割って導いた活性比であるεＦＫ／αＦＶＨが低い、および／またはεＦＫ／αＦＶが低いアマドリアーゼの例は、これまでになく、精度の高いＨｂＡ１ｃの測定を実現し得る、εＦＫに対する反応性が十分に低いアマドリアーゼが依然として求められている。
【００１３】
なお、各種アマドリアーゼを利用して、実際に血液試料中のＨｂＡ１ｃを測定するためには、アマドリアーゼおよび各種の必要とされる成分が処方された測定用試薬組成物を調製し、これを所定の方法で使用して測定を行う。そして、精度の高い測定値を得るという目的のためには、酵素自体の性質を向上させる取り組みに加え、例えば、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫ等の影響をできる限り受け難い測定用試薬組成物や、εＦＫ等の影響をできる限り受け難い測定方法の開発も重要である。
【００１４】
例えば、εＦＫ等の影響を低減するための試みとして、アマドリアーゼによってαＦＶＨを測定するのに先立ち、εＦＫ等の影響物質を別の酵素を用いて消去する方法が開示されている（例えば、特許文献１７参照）。この方法により影響物質の量を予め減らすことによって、測定値の精度向上が期待できる。しかし、この方法は、消去操作という付随的な前処理が必要となり、測定操作が複雑化するという課題を有する。消去に要する時間、消去反応を停止させる時間など、消去工程に伴う作業に要する時間の分だけ測定時間が長くなる点も課題である。さらに、消去酵素の反応性や安定性まで考慮に入れて、消去にも、測定にも、そして保存にも適した試薬処方を組まねばならないという点は、処方の検討上、大きな制約となり得る。
【００１５】
εＦＫ等の影響を低減するための別の試みとしては、ｐＨ５．５、ｐＨ６．５等の弱酸性ｐＨ条件下でアマドリアーゼを作用させてαＦＶＨの測定を行う方法が報告されている（特許文献２参照）。このような弱酸性域のｐＨで測定反応を行わせることにより、ｐＨ７〜８という中性〜弱アルカリ性ｐＨ領域で測定反応を行わせた場合と比較して、εＦＫが測定値に与える影響が低減されることが開示されている。しかしながら、本文献中に開示されているアマドリアーゼの反応至適ｐＨは８．０であり（非特許文献１参照）、ｐＨ５．５、ｐＨ６．５等の弱酸性ｐＨ領域では、この酵素の反応性は十分ではない。すなわち、この方法においては、εＦＫが測定値に与える影響を回避するために、酵素の性能を十分に発揮できない条件下で使用するように試薬組成を組まざるを得ないという問題を有する。このように酵素の反応至適ｐＨから逸脱したｐＨで試薬組成を組むことにより、使用する酵素量を増やさざるを得ないという問題も生じる。
【００１６】
すなわち、アマドリアーゼを用いた糖化ヘモグロビン測定方法においては、より簡便で、迅速に、精度の高い測定値が得られる、さらなる改善が求められている。また、糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物においては、使用条件の制約がより少なく、処方される酵素の性能を最大限に発揮することが可能となる、さらなる改善が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】特開２０１０−２３３５０２号公報
【特許文献１７】国際公開第２００７／１０９５０号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１１，  １０４−１１，  ２００３
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６，  ３５８−６６，  ２０１０
【非特許文献３】Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０２，  ２４１−３，  ２００６
【非特許文献４】Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７４，  ８１３−９，  ２００７
【非特許文献５】Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４２，  ４９９−５０５，  １９９６
【非特許文献６】Ｍａｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６，  ６２５−３２，  ２００４
【非特許文献７】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  １２５６−６１，  ２００２
【非特許文献８】Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６６，  ２３２３−２９，  ２００２
【非特許文献９】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７，  ２７−３２，  ２００５
【非特許文献１０】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ２７６１３−２０，  ２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明が解決しようとする課題は、アマドリアーゼを用いた、より簡便で、迅速に、精度の高い測定値が得られる糖化ヘモグロビン測定方法を提供すること、および、そのために用いる、使用条件の制約がより少なく、処方される酵素の性能を十分に発揮できる糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記の問題点を解決するために鋭意検討を重ねた結果、弱酸性領域から弱アルカリ性領域に及ぶ広範なｐＨ範囲において、αＦＶＨへの反応性に対するεＦＫへの反応性が顕著に低減したアマドリアーゼを創出し、これを処方した糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を用いた時には、前記アマドリアーゼの反応に最も適したｐＨを含む広範なｐＨ範囲で、前処理による影響物質の消去等の工程を行うことなく精度の高い測定値が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００２１】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）プロテアーゼ、アマドリアーゼを含む糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物において、アマドリアーゼが下記の（ａ）および／または（ｂ）の性質を有する糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
（ａ）ｐＨ５．５から８．０に及ぶ範囲において、α−フルクトシルバリルヒスチジンへの反応性を１とした場合のε−フルクトシルリジンへの反応性の割合が０．０５以下である。
（ｂ）ｐＨ５．５から８．０に及ぶ範囲において、試料中に共存するε−フルクトシルリジンがα−フルクトシルバリルヒスチジンの測定値に与える影響が１５％以下である。
（２）アマドリアーゼによる測定反応を、ｐＨ５．５〜８．０で行うように処方がなされた、上記（１）記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
（３）アマドリアーゼが、配列番号１に示すアミノ酸配列において以下の（ｃ）又は（ｄ）に示したアミノ酸残基の置換および／または欠失を有するアマドリアーゼである上記（１）または（２）に記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
（ｃ）９８位のグルタミン酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンのアスパラギンへの置換、２５９位のバリンのシステインへの置換
（ｄ）９８位のグルタミン酸のアラニンへの置換、１０３位のグリシンのヒスチジンへの置換、１５４位のセリンのアスパラギンへの置換、２６３位のグリシンのメチオニンへの置換、２６５位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、４３５位のプロリン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンの欠失
（４）アマドリアーゼが、配列番号１に示すアミノ酸配列において上記（ｃ）又は（ｄ）に示したアミノ酸残基の置換および／または欠失を有し、（ｃ）又は（ｄ）に示した位置以外の位置で１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである上記（１）または（２）に記載に記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を用いる糖化ヘモグロビン測定方法。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を含む糖化ヘモグロビン測定用キット。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、弱酸性領域から弱アルカリ性領域に及ぶ広範なｐＨ範囲において、εＦＫによる測定への影響が低減された糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物を提供できる。本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物は、アマドリアーゼの反応に最も適したｐＨを含む広範なｐＨ範囲で好適に使用可能であるため、酵素の性能を最大限に発揮した処方が可能となる。また、処方においてｐＨの制約が少ないため、用途や配合成分の種類に応じて柔軟な処方を行うことが容易である。特に、従来は、測定反応に適したｐＨ付近ではεＦＫによる測定への影響回避のために前処理の消去工程が必要であったのに対し、本発明によれば、測定反応に最適なｐＨで使用した場合でも、影響物質の消去等の工程を行う必要なく精度の高い測定値が得られるという点で、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物およびそれを用いた糖化ヘモグロビン測定方法は産業上非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】アマドリアーゼＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃの反応至適ｐＨを示す図である。
【図２】アマドリアーゼＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の反応至適ｐＨを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
（糖化蛋白質）
本発明における糖化蛋白質とは、非酵素的に糖化された蛋白質を指す。糖化蛋白質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にＨｂＡ１ｃという。生体外に存在する例としては、蛋白質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
【００２６】
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
【００２７】
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、基質特異性が改変されたアマドリアーゼの改変体である。このような変異体の例としては、配列番号１と高い配列同一性（例えば、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、および、配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。なお、請求の範囲に記載されたアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、ピレノケータ属、アルスリニウム属、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、アスペルギルス属、エメリセラ属、ウロクラディウム属、ペニシリウム属、フザリウム属、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、レプトスフェリア属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、コニオケチジウム属、ピチア属、コリネバクテリウム属、アグロバクテリウム属、アルスロバクター属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
【００２８】
本出願に先立ち、出願人は、ｐＨ７．０における基質特異性の改変に効果がある複数のアミノ酸変異箇所を単独変異として見出し、この知見は本出願の優先日以後に国際公開第２０１２／１８０９４号として公開されている。しかしながら、上記文献に記載されているアミノ酸置換による基質特異性の改変効果はｐＨ７．０においてのみ確認されており、このようなアミノ酸置換をどのように蓄積させた場合に、アマドリアーゼの反応に最適なｐＨを含む広範なｐＨ範囲で、前処理によって影響物質を別途消去する等の工程を行うことなく精度の高い測定値が得られるアマドリアーゼの作製を実現できるかは定かではなかった。そこで発明者らはさらなる試行錯誤を重ねた結果、配列番号１に示すアミノ酸配列において下記（ｃ）又は（ｄ）に示したアミノ酸残基の置換および／または欠失を有するアマドリアーゼ改変体が、反応に最適なｐＨを含む広範なｐＨ範囲で、前処理による影響物質の消去等の工程を行うことなく精度の高い測定値を得ることができるアマドリアーゼであることを見出すに至った。
（ｃ）９８位のグルタミン酸のアラニンへの置換、１５４位のセリンのアスパラギンへの置換、２５９位のバリンのシステインへの置換
（ｄ）９８位のグルタミン酸のアラニンへの置換、１０３位のグリシンのヒスチジンへの置換、１５４位のセリンのアスパラギンへの置換、２６３位のグリシンのメチオニンへの置換、２６５位のロイシンのフェニルアラニンへの置換、４３５位のプロリン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンの欠失
さらに、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼは、上記のアミノ酸の置換および／または欠失を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列の該置換および／または欠失したアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、基質特異性が改変されたアマドリアーゼ変異体を包含する。
さらに、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列において上記（ｃ）又は（ｄ）に示したアミノ酸残基の置換および／または欠失を有し、（ｃ）又は（ｄ）に示した位置以外の位置で１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ変異体を包含する。
【００２９】
上記のアミノ酸置換において、アミノ酸の位置は配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を表しているが、他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列においては、配列番号１に示されるアミノ酸配列における位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている。「対応する位置」の意味については後述する。
【００３０】
（アミノ酸配列の相同性）
アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ  （Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
【００３１】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００３２】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報参照）が挙げられる。
【００３３】
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ（特開２００３−２３５５８５号公報参照）から、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Alcrich社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、抽出、精製して得ることができる。
【００３４】
（ベクター）
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼを生産するために用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（Stratagene社製）等が好ましい。
【００３５】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００３６】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２，  ９４４１  （１９８４）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５４，  ３５０  （１９８７）：  Ｇｅｎｅ，  ３７，  ７３  （１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ８７４９  （１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １３，  ８７６５  （１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １４，  ９６７９  （１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２，  ４８８  （１９８５）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １５４，  ３６７  （１９８７））等が挙げられる。
【００３７】
また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  １，  １１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
【００３８】
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等を用いることにより行うことができる。
【００３９】
（形質転換・形質導入）
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
【００４０】
（アミノ酸に対応する位置の特定）
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００４１】
なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの９８位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９８位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは９８位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは９７位のセリンである。
【００４２】
また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０３位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０３位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、E. terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、C. clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、N. vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、P. janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０３位のグリシン、C. neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０３位のセリン、P. nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０３位のアスパラギン酸、A. nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、E. nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０２位のグリシンである。
【００４３】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１５４位のセリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１５４位のセリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
すなわち、E. terrenum由来のアマドリアーゼ、P. janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５４位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、C. clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、N. vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、C. neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１５４位のセリン、P. nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１５２位のセリン、A. nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、E. nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１５３位のシステインである。
【００４４】
さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５９位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５９位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させることにより特定することができる。
すなわち、E. terrenum由来のアマドリアーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、N. vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、C. neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、A. nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、E. nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、P. janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５９位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、C. clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のバリン、P. nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５５位のバリンである。
【００４５】
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６３位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６３位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、E. terrenum由来のアマドリアーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、N. vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、A. nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、E. nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、P. janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、C. clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６１位のグリシン、C. neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のセリン、P. nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５９位のグリシンである。
【００４６】
さらに、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６５位のロイシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６５位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
すなわち、E. terrenum由来のアマドリアーゼ、A. nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、E. nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、P. janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６５位のチロシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６３位のロイシン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、C. neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６５位のロイシン、C. clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６３位のバリン、N. vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６５位のバリン、P. nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６１位のバリンである。
【００４７】
（カルボキシル末端の欠失箇所に対応する位置）
「配列番号１記載のアミノ酸配列の４３５位のプロリン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンに対応する位置」とは配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基のペルオキシソーム移行シグナル（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ１；ＰＴＳ１）配列を意味するものである。アミノ酸配列を確定した任意のアマドリアーゼにおいて、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４３５位のプロリン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンに対応する位置」とは、ＰＴＳ１配列として推定され得るカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を指す。
【００４８】
すなわちE. terrenum由来のアマドリアーゼでは４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジンおよび４３７位のロイシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４３８位のアラニン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４５０位のヒスチジン、４５１位のリジンおよび４５２位のロイシン、C. clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは４３８位のセリン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、P. nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギンおよび４３７位のロイシンからなり、A. nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、E. nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３９位のアラニン、４４０位のリジンおよび４４１位のロイシンからなり、P. janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンである。
【００４９】
なお、真核生物においては、タンパク質をペルオキシソームへ輸送するためのシグナル配列であり、カルボキシル末端の３アミノ酸から構成されるモチーフであるＰＴＳ１配列が知られている。よく知られた公知のＰＴＳ１モチーフとしては、（プロリン／セリン／アラニン／システイン）−（リジン／ヒスチジン／アルギニン／アスパラギン）−（ロイシン／メチオニン）配列からなるモチーフがある（例えば、ＦＥＢＳ Ｊ., ２７２， ２３６２（２００５）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ.， ３８， ７５９ （１９９７）， Ｅｕｒ． ｊ． Ｃｅｌl Ｂｉｏｌ．，７１， ２４８ （１９９６）参照。）。
【００５０】
（本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られた基質特異性が改善されたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【００５１】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００５２】
また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化蛋白質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化蛋白質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
【００５３】
培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは３７℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【００５４】
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
【００５５】
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のεＦＫに対する反応性が低減したアマドリアーゼを得ることができる。
【００５６】
（本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼにおけるεＦＫに対する反応性の低下）
上記のような手段で得られる本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して基質特異性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のものと比較して、「αＦＶＨに対する反応性を１とした場合のεＦＫに対する反応性の割合」、あるいは、「αＦＶに対する反応性を１とした場合のεＦＫに対する反応性の割合」が低減していることを特徴とする。または、改変前のものと比較して、「αＦＶＨに対する反応性を１とした場合のεＦＫに対する反応性の割合」、および、「αＦＶに対する反応性を１とした場合のεＦＫに対する反応性の割合」がいずれも低減していることを特徴とする。
【００５７】
糖化ヘモグロビンの測定において、εＦＫに対して反応性が高いことは測定誤差の原因となり得るため、εＦＫに対する反応性の割合は低ければ低いほど好ましい。具体的には、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を示すεＦＫ／αＦＶＨは、αＦＶＨに対する反応性を１とした場合のεＦＫに対する反応性の割合が、好ましくは０．０５以下、より好ましくは０．０４以下、さらに好ましくは０．０３以下、最も好ましくは０．０１以下を示すことが望ましい。
【００５８】
また、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼにおける、αＦＶに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を示すεＦＫ／αＦＶは、αＦＶに対する反応性を１とした場合のεＦＫに対する反応性の割合が、好ましくは０．０３以下、より好ましくは０．０１以下、最も好ましくは０を示すことが望ましい。
【００５９】
αＦＶＨに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合、あるいは、αＦＶに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合は、公知のアマドリアーゼの測定法を用いて、任意の条件下で測定し、改変前のものと比較することができる。例えば、任意のｐＨにおいて、１ｍＭのεＦＫを添加して測定した活性を、１ｍＭのαＦＶＨを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶＨに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。また、例えば、任意のｐＨにおいて、１ｍＭのεＦＫを添加して測定した活性を、１ｍＭのαＦＶを添加して測定した活性で割った比率として求めることにより、αＦＶに対する反応性に対するεＦＫに対する反応性の割合を算出し、これを改変前のものと改変後のもので比較することができる。
【００６０】
改変前のものと比較して基質特異性が向上している本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼの一例としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ）株や大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。このような基質特異性が改善されたアマドリアーゼは、εＦＫをノイズとして測り込む度合が良好に低減され、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端由来の糖化アミノ酸であるαＦＶＨ、若しくはＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端由来の糖化アミノ酸であるαＦＶのみを測定することが可能となるため、精度の高い測定を行うことができ、産業利用上非常に有利である。
【００６１】
（本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼにおける、εＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響の低下）
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼは、そのアミノ酸配列に変異を生じ改変前のものと比較して基質特異性が向上した結果、本発明のアマドリアーゼを使用してαＦＶＨを測定した場合に、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫが共存した場合のαＦＶＨの測定値に与える影響を低下できることを特徴とする。具体的には、試料中に共存するεＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響は、例えば、αＦＶＨのみを含む試料を測定した場合の吸光度変化量を１００％とした場合の（αＦＶＨ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合が、好ましくは８５％以上１１５％以下、より好ましくは９５％以上１０５％以下、更に好ましくは９７％以上１０３％以下、最も好ましくは９８％以上１０２％以下に収まることが好ましい。
【００６２】
なお、αＦＶＨのみを含む試料を測定した場合の吸光度変化量を１００％とした場合の（αＦＶＨ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合が、８５％以上１１５％以下に収まる場合、εＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響が１５％以下であると表現し、９５％以上１０５％以下に収まる場合、εＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響が５％以下であると表現し、また、９７％以上１０３％以下に収まる場合、εＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響が３％以下であると表現する。また、９８％以上１０２％以下に収まる場合、εＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響が２％以下であると表現する。
【００６３】
（本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼにおける、εＦＫがαＦＶの測定値に与える影響の低下）
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼは、そのアミノ酸配列に変異を生じ改変前のものと比較して基質特異性が向上した結果、本発明のアマドリアーゼを使用してαＦＶを測定した場合に、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫが共存した場合のαＦＶの測定値に与える影響を低下できることを特徴とする。具体的には、試料中に共存するεＦＫがαＦＶの測定値に与える影響は、例えば、αＦＶのみを含む試料を測定した場合の吸光度変化量を１００％とした場合の（αＦＶ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合が、好ましくは９５％以上１０５％以下、より好ましくは９７％以上１０３％以下、さらに好ましくは９８％以上１０２％以下に収まることが好ましい。
【００６４】
なお、αＦＶのみを含む試料を測定した場合の吸光度変化量を１００％とした場合の（αＦＶ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合が、９５％以上１０５％以下に収まる場合、εＦＫがαＦＶの測定値に与える影響が５％以下であると表現し、また、９７％以上１０３％以下に収まる場合、εＦＫがαＦＶの測定値に与える影響が３％以下であると表現する。また、９８％以上１０２％以下に収まる場合、εＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響が２％以下であると表現する。
【００６５】
（本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼにおける基質特異性向上の効果が発揮されるｐＨ領域）
本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼは、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して基質特異性が向上するとともに、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼを使用してαＦＶＨを測定した場合に、測定誤差の原因物質となり得るεＦＫが共存した場合のαＦＶＨの測定値に与える影響を低下できることを特徴とする。そして、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼにおける前記の効果は広範なｐＨ領域において発揮されることも本発明の特徴である。具体的には、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物に用い得るアマドリアーゼにおける基質特異性向上効果および、εＦＫが共存した場合のαＦＶＨの測定値に与える影響を低下する効果は、ｐＨ５．５から８．０の幅広い領域に渡り発揮される。このことは実用上非常に優位性を有する。従来のアマドリアーゼでは、前記のような効果を得るために、その酵素の本来の反応至適ｐＨからかなり離れたｐＨ領域で使用しなければならない等の制約があった。例えば、反応至適ｐＨはアルカリ性であるにも関わらず、酸性側で反応を行わせねばならないことがあった。しかし、本発明の糖化ヘモグロビン測定用試薬においては、その反応至適ｐＨにより近いｐＨ条件や、その反応至適ｐＨと同じｐＨ条件で反応を行わせることもでき、酵素の性能を十分に発揮した状態で測定を行うことができるようになる。あるいは、酵素以外の測定試薬成分や測定機器の各種条件に合致させる目的で反応ｐＨを意図的に変動させねばならない等の場合にも、ｐＨ範囲に制約を受けることが少なく、各種の反応条件下で本発明の効果を発揮することが可能である。
【００６６】
本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物における液組成については、プロテアーゼを含む糖化ヘモグロビン分解試薬、生成した糖化ペプチド若しくは糖化アミノ酸を酸化的に脱糖化するためのアマドリアーゼを含む糖化ペプチド／アミノ酸測定試薬、前述の酸化的脱糖化反応により生じる過酸化水素を利用した酸化還元反応により還元剤を発色させ、この発色強度を測定することにより過酸化水素量を測定するためのパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、および酸化により発色する還元剤を含む過酸化水素量測定用試薬を適宜組み合わせればよい。またこれらの試薬は液状品および液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００６７】
本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物に配合される糖化ヘモグロビンを分解するためのプロテアーゼとしては、糖化ヘモグロビンから糖化ペプチド／アミノ酸を、最も好ましくは糖化ヘモグロビンのβ鎖アミノ末端からαＦＶＨを遊離させるプロテアーゼを選択することができる。例えば、Bacillus属由来の中性プロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼを反応させる際の具体的な条件は、所望の糖化ペプチド／アミノ酸が調製され得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度および種類、ならびにプロテアーゼの種類に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
【００６８】
本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物のｐＨ域については、使用するアマドリアーゼの至適ｐＨを考慮して反応が効率よく進行するようにｐＨを選択し、次に糖化アミノ酸に作用する酵素量を決定すればよい。例えば、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃを使用する場合、ｐＨ５．５〜８．０、好ましくは、最大活性の９０％以上の活性を示すｐＨ領域であるｐＨ６．５〜８．０、より好ましくは、最大活性の９５％以上の活性を示すｐＨ領域であるｐＨ７．０〜７．５を選択できる。
本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物の大きな特徴は、これまでは実現されていなかった広範なｐＨ範囲に渡って使用した時に、εＦＫの影響を良好に回避できることであるから、使用するアマドリアーゼの最大活性を示す領域を外れた弱酸性の領域においても勿論εＦＫの影響を良好に回避できるが、他に処方される成分や測定機器の種類による制約条件がない限り、アマドリアーゼの反応に好適なｐＨ範囲付近で処方が行えることはより望ましい。
【００６９】
また、アマドリアーゼの添加濃度は、使用される反応液中で糖化ペプチド／アミノ酸を十分に検出し得る濃度であればよく、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃを添加する場合、例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌであり、好ましくは０．５〜２００Ｕ／ｍｌであり、最も好ましくは１．０〜１００Ｕ／ｍｌである。ただし上記の濃度は、特に限定されるものではなく、反応条件、試料の種類および状態、実験者の手技ならびに使用する試薬の種類などに応じて、適宜、決定され得る。
【００７０】
また、試薬ｐＨを目的の範囲に調整するために用いる緩衝液については、所望のｐＨ範囲において緩衝能を示す緩衝液であればその種類、濃度は特に限定されるものではなく、例えば、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．０の範囲で緩衝能を示す緩衝液としては、リン酸水素二カリウム／二ナトリウムーリン酸二水素カリウム／ナトリウム緩衝液、ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、トリス−ＨＣｌ緩衝液等が挙げられる。
【００７１】
本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物に配合されるパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）としては、過酸化水素を利用した酸化還元反応により還元剤を発色させることができるＰＯＤであれば、特に限定されるものではなく、例えば、西洋ワサビ、微生物由来のＰＯＤが選択でき、試料の濃度および種類、ならびにプロテアーゼの濃度および種類に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
αＦＶＨを遊離させるプロテアーゼは、任意のものを選択することができる。例えば、Bacillus属由来の中性プロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼを反応させる際の具体的な条件は、所望の糖化アミンが調製され得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度および種類、ならびにＰＯＤの種類に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。
【００７２】
本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物に配合される過酸化水素を検出するための還元剤としては、過酸化水素が存在する条件下においてＰＯＤの触媒作用により、発色するものであれば、特に限定されるものではなく、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）等のカップラーに対してフェノール系、アニリン系またはトルイジン系の色原体を酸化縮合反応させることにより色素を生成するトリンダー試薬類、およびＰＯＤの存在下で直接酸化呈色するロイコ色素が使用され得る。カップラーとしては、４−アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）およびスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）などが挙げられる。トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）の様なフェノールおよびその誘導体を用いることができる。ロイコ色素としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体およびジフェニルアミン誘導体などが使用できる。
【００７３】
（糖化ヘモグロビン測定方法、測定キット、前処理、後処理工程）
本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物を、従来の糖化ヘモグロビン測定用組成物と置き換える形で、糖化ヘモグロビン測定を実施することができる。また、従来の糖化ヘモグロビン測定キットにおける糖化ヘモグロビン測定用組成物を本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物に置き換えることで、本発明の糖化ヘモグロビン測定用キットを製造することができる。本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物は、より広範なｐＨでの使用に好適に用いることができるので、例えば、これまではεＦＫの影響を回避することを優先して使用できなかった領域のｐＨにおいて、キットの処方を組むことも可能になる。
測定方法および測定キットにおいて、従来用いていた任意の前処理および後処理を含むことができる。本発明の糖化ヘモグロビン測定用組成物を用いた場合、条件を調整することにより、従来は必要であった影響物質の消去工程等が不要となることが期待される。特に、中性〜弱アルカリ性ｐＨ領域において、精度の高い測定値を得るためには不可欠であった消去工程が不要となる場合には、試薬製造コスト、測定作業、測定時間の全てにおいて大幅な改善がなされ、効率的な測定および、キットの生産が実現されるという点で極めて有用である。
【００７４】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
【００７５】
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
【００７６】
本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、若しくはεＦＫを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、若しくはεＦＫを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
αＦＶ等の糖化アミノ酸、およびαＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報参照）。
【００７７】
Ａ．：試薬製
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ、０．４９ｍＭ  ４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、若しくは８．０）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
（試薬２）：１５ｍＭ  ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（試薬３）：αＦＶＨ溶液（３００ｍＭ；  終濃度１０ｍＭ）
αＦＶＨ  １２５０ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
（試薬４）：基質溶液（３０ｍＭ；  終濃度１ｍＭ）
αＦＶＨ  １２５ｍｇ、若しくはεＦＫ  ９２ｍｇまたはαＦＶ  ８４ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
【００７８】
Ｂ：反応至適ｐＨ測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定した。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定した。３７℃で１分間あたりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出した。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ {(ΔAs−ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の１分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数（mM-1・cm-1）
0.5：１ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
df：希釈係数
【００７９】
Ｃ：基質特異性測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬４を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定した。なお、対照液は、１００μｌの試薬４の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定した。３７℃で１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位（Ｕ）とし、下記の式に従って算出した。
活性（Ｕ／ｍｌ）＝ {(ΔAs−ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の１分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の１分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数（mM-1・cm-1）
0.5：１ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
df：希釈係数
【００８０】
（アマドリアーゼの反応至適ｐＨ）
アマドリアーゼの反応至適ｐＨは、上記Ｂ：反応至適ｐＨ測定法に従い各ｐＨにおいてアマドリアーゼ活性を測定した結果、最大活性を示すｐＨにおける活性を１００％とした場合の各ｐＨにおける相対活性から判断する。本発明における反応至適ｐＨとは、相対活性が９５％以上、より好ましくは１００％となるｐＨ範囲を示す。
【００８１】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
なお、実施例中に記載のあるＣＦＰ、ＣＦＰ−Ｔ７ およびＣＦＰ−Ｔ９の関連性を表１に示した。
【００８２】
【表１】
2013176351.tif 000003
【実施例１】
【００８３】
Coniochaeta属由来アマドリアーゼの調製
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの調製
配列番号１は熱安定性向上型変異（Ｇ１８４Ｄ、Ｆ２６５Ｌ、Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙ）を導入したConiochaeta属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号２の遺伝子にコードされている（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）。
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡを得た。
【００８４】
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡの部位特異的改変操作
配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をアラニンに、１５４位のセリンをアスパラギンに、２５９位のバリンをシステインに置換するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡを鋳型として、配列番号６、７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９  ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
【００８５】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BIOLABS社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ）を得た。
【００８６】
上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号８、９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ）を得た。
【００８７】
さらに上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１０、１１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、９８位のグルタミン酸がアラニンに、１５４位のセリンがアスパラギンに、２５９位のバリンがシステインに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ）を得た。
【００８８】
（３）ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃの生産
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃを用いて大腸菌を形質転換することにより得られた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ）株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地４０ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液８ｍｌを調製した。
（４）ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃの精製
【００８９】
調製した粗酵素液を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した４ｍｌのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に８０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【００９０】
得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３０Ｋ  ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で濃縮した。その後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収し、野生型および改変型アマドリアーゼの精製標品を得た。得られた精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、単一なバンドまで精製されていることを確認した。
【００９１】
（５）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの調製
配列番号３は熱安定性向上型変異（Ｎ２７２Ｄ、Ｈ３０２Ｒ、Ｈ３８８Ｙ）を導入したConiochaeta属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列であり、配列番号４の遺伝子にコードされている（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）。
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号４）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、上記（１）と同様の方法で培養、集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを得た。
【００９２】
（６）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡの部位特異的改変操作
配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸をアラニンに、１０３位のグリシンをヒスチジンに、１５４位のセリンをアスパラギンに、２５９位のバリンをシステインに、２６３位のグリシンをメチオニンに、２６５位のロイシンをフェニルアラニンに置換し、かつ４３５位のプロリン、４３６位のリジン、４３７位のロイシンを欠失した改変型アマドリアーゼを作製するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７  ＤＮＡを鋳型として、配列番号１２、１３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９株の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１８４Ｄ）を得た。
【００９３】
上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１８４Ｄ  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１４、１５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３記載のアミノ酸配列の１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、かつ４３５位のプロリン、４３６位のリジン、４３７位のロイシンを欠失した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１）を得た。
【００９４】
続いて、上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号６、７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がアラニンに、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、かつ４３５位のプロリン、４３６位のリジン、４３７位のロイシンを欠失した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−９８Ａ／１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１）を得た。
【００９５】
続いて、上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−９８Ａ／１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１６、１７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がアラニンに、１０３位のグリシンがヒスチジンに、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、かつ４３５位のプロリン、４３６位のリジン、４３７位のロイシンを欠失した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−９８Ａ／１０３Ｈ／１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１）を得た。
【００９６】
続いて、上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−９８Ａ／１０３Ｈ／１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号８、９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がアラニンに、１０３位のグリシンがヒスチジンに、１５４位のセリンがアスパラギンに、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に置換され、かつ４３５位のプロリン、４３６位のリジン、４３７位のロイシンを欠失した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１）を得た。
【００９７】
さらに、上記と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／１８４Ｄ／ΔＰＴＳ１  ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８、１９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がアラニンに、１０３位のグリシンがヒスチジンに、１５４位のセリンがアスパラギンに、１８４位のグリシンがアスパラギン酸に、２６３位のグリシンがメチオニンに置換され、かつ４３５位のプロリン、４３６位のリジン、４３７位のロイシンを欠失した改変型アマドリアーゼ、すなわち配列番号１記載のアミノ酸配列の９８位のグルタミン酸がアラニンに、１０３位のグリシンがヒスチジンに、１５４位のセリンがアスパラギンに、２６３位のグリシンがメチオニンに、２６５位のロイシンがフェニルアラニンに置換され、かつ４３５位のプロリン、４３６位のリジン、４３７位のロイシンを欠失した改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）を得た。
【００９８】
（７）ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の生産
ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を用いて大腸菌を形質転換することにより得られた大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１）株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地４０ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液８ｍｌを調製した。
【００９９】
（８）ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の精製
調製したＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を含む粗酵素液を、上記（４）記載の方法に従って精製し、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の精製標品を得た。得られた精製標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により、単一なバンドまで精製されていることを確認した。
【０１００】
（９）ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の反応至適ｐＨの測定
ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の精製標品を用いて、上記のＢ：反応至適ｐＨ測定法に示した方法により、反応至適ｐＨを測定した。図１、２に示した様にＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の反応至適ｐＨは共に７．５であった。
【０１０１】
（１０）εＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶの測定
上述のＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の精製標品を用いて、上記のＣ：基質特異性測定法に示した方法により、αＦＶＨ、αＦＶおよびεＦＫに対する酵素活性を測定した。続いて、各ｐＨにおけるεＦＫへの反応性に対するαＦＶＨへの反応性の割合（εＦＫ／αＦＶＨ）、およびεＦＫへの反応性に対するαＦＶへの反応性の割合（εＦＫ／αＦＶ）を算出した。また、比較例として、ＣＦＰ（配列番号５）の精製標品（キッコーマンバイオケミファ社製）を用いて同様の測定を行った。εＦＫ／αＦＶＨの算出結果を表２に、εＦＫ／αＦＶの算出結果を表３に示した。
【０１０２】
【表２】
2013176351.tif 000004
【０１０３】
【表３】
2013176351.tif 000005
【０１０４】
ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１では、比較例であるＣＦＰに比べて、εＦＫ／αＦＶＨ、εＦＫ／αＦＶのいずれにおいても極めて低い値となった。比較例においては、弱酸性ｐＨ領域では比較的低値であったが、中性域から弱アルカリ性域になるにつれて、顕著に値が大きくなり、εＦＫの影響を受けやすいことが確認できた。これに対し、本発明の変異体においては、ｐＨ５．５〜８．０に渡る広範なｐＨ範囲で、εＦＫ／αＦＶＨは０〜０．０３、εＦＫ／αＦＶは０〜０．０１と、極めてεＦＫの影響を受け難いことが確認できた。
【実施例２】
【０１０５】
フルクトシルアミノ酸試料およびフルクトシルペプチド試料の測定
【０１０６】
上記のようにして得たＣＦＰ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃの精製標品を用いて、下記に示した試料の測定を実施した。なお、ＣＦＰ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃの活性値は前述の「Ｃ：基質特異性測定法」に記載の方法に従い、終濃度５ｍＭのαＦＶを基質として、ｐＨ８．０に調整した（試薬１）を用いて決定した。
【０１０７】
（１１）フルクトシルアミノ酸試料およびフルクトシルペプチド試料の調製
上記（試薬４）に記載したαＦＶＨ、εＦＫまたはαＦＶの溶液をそれぞれイオン交換水で６０倍希釈することにより基質溶液０．５ｍＭの各種フルクトシルアミノ酸、若しくはフルクトシルペプチドの試料を調製した。
【０１０８】
（１２）フルクトシルアミノ酸試料およびフルクトシルペプチド試料の測定
（試薬５）
０．８６Ｕ／ｍｌ  ＣＦＰ、あるいはＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃ
０．９３Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン社製）
０．４６ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
０．５２ｍＭ  ＴＯＯＳ（同仁化学研究所社製）
９３ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０、７．０、７．５、または８．０）
【０１０９】
上記（１１）で調製した３４μｌの試料に対し、予め３７℃で５分間加温しておいた９８６μｌの（試薬５）を添加して反応を開始し、３７℃で５分間反応後の波長５５５ｎｍにおける吸光度を分光光度計Ｕ−３０１０Ａで測定した。試料の代わりにイオン交換水を用いて同様に操作して測定した波長５５５ｎｍにおける吸光度（試薬ブランク）を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量を算出した。
吸光度変化量＝ΔＡｅｓ−Ａｅ０
ΔＡｅｓ：反応開始から５分経過後の吸光度
ΔＡｅ０：対照液を添加した場合の反応開始から５分経過後の吸光度
得られた各吸光度変化量を用いて、αＦＶＨの吸光度変化量を１とした場合のεＦＫの吸光度変化量の割合に相当するΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨを算出した。結果を表４に示す。また、同様にして算出したαＦＶの吸光度変化量を１とした場合のεＦＫの吸光度変化量の割合に相当するΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶを表５に示す。
【０１１０】
【表４】
2013176351.tif 000006
【０１１１】
【表５】
2013176351.tif 000007
【０１１２】
表４、５から明らかなように、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃを含む試薬を用いて測定したΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶは全てのｐＨにおいて低値であった。特に、本酵素の至適ｐＨであるｐＨ７．５においても、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９ＣのΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶは、いずれも、比較例であるＣＦＰの場合に最も低い値が得られたｐＨである６．０におけるΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶと比べても低い値を示し、広範なｐＨ範囲に渡ってεＦＫの影響が大きく低減できていることが分かった。
【０１１３】
また、前述のようにして得たＣＦＰ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の精製標品を用いて、下記に示した試料の測定を実施した。なお、ＣＦＰ、およびＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１の活性値はＣ：基質特異性測定法に記載の方法に従い、終濃度５ｍＭのαＦＶＨを基質として、ｐＨ７．０に調整した（試薬１）を用いて決定した。
【０１１４】
（１３）フルクトシルアミノ酸試料およびフルクトシルペプチド試料の調製
上記（試薬４）に記載したαＦＶＨ、εＦＫまたはαＦＶの溶液をそれぞれイオン交換水で１００倍希釈することにより基質溶液０．３ｍＭの各種フルクトシルアミノ酸、若しくはフルクトシルペプチドの試料を調製した。
【０１１５】
（１４）フルクトシルアミノ酸試料およびフルクトシルペプチド試料の測定
（試薬６）
０．７２Ｕ／ｍｌ  ＣＦＰ、あるいは
０．９６Ｕ／ｍｌ  ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１
５．４Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン社製）
０．５３ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）
０．６ｍＭ  ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）
１０８ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、または８．０）
【０１１６】
予め３７℃で５分間加温しておいた１７５μｌの（試薬６）に対し、上記（１３）で調製した試料３５μｌを添加して反応を開始し、３７℃で５分間反応後の波長５４５ｎｍにおける吸光度を自動分析装置Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ‐ＢＭ１６５０（日本電子）で測定した。試料の代わりにイオン交換水を用いて同様に操作して測定した波長５４５ｎｍにおける吸光度（試薬ブランク）を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量を算出した。
吸光度変化量＝ΔＡｅｓ−Ａｅ０
ΔＡｅｓ：反応開始から５分経過後の吸光度
ΔＡｅ０：対照液を添加した場合の反応開始から５分経過後の吸光度
得られた各吸光度変化量を用いて、αＦＶＨの吸光度変化量を１とした場合のεＦＫの吸光度変化量の割合に相当するΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨを算出した。結果を表６に示す。また、同様にして算出したαＦＶの吸光度変化量を１とした場合のεＦＫの吸光度変化量の割合に相当するΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶを表７に示す。
【０１１７】
【表６】
2013176351.tif 000008
【０１１８】
【表７】
2013176351.tif 000009
【０１１９】
表６、７から明らかなように、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を含む試薬を用いて測定したΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶは全てのｐＨにおいて低値であった。特に、本酵素の至適ｐＨであるｐＨ７．５においても、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１のΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶは、いずれも、比較例であるＣＦＰの場合に最も低い値が得られたｐＨである６．０におけるΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡεＦＫ／ΔＡαＦＶと比べても低い値を示し、広範なｐＨ範囲に渡ってεＦＫの影響が大きく低減できていることが分かった。
【実施例３】
【０１２０】
εＦＫが共存するフルクトシルアミノ酸／フルクトシルペプチド試料の測定
【０１２１】
（１５）εＦＫを含むフルクトシルアミノ酸、フルクトシルペプチド試料の調製
（試薬４）に記載したαＦＶ、若しくはεＦＫの溶液を混合し、イオン交換水で希釈することで、αＦＶ、εＦＫをそれぞれ０．５ｍＭずつ含む（αＦＶ＋εＦＫ）混合試料を作製した。また、同様に（試薬４）に記載したαＦＶＨ、若しくはεＦＫの溶液を混合し、イオン交換水で希釈することで、αＦＶＨ、εＦＫをそれぞれ０．５ｍＭずつ含む（αＦＶＨ＋εＦＫ）混合試料を作製した。
【０１２２】
（１６）εＦＫを含むフルクトシルアミノ酸、フルクトシルペプチド試料の測定
上記（１５）で調製した３４μｌの試料に対し、予め３７℃で５分間加温しておいた９８６μｌの（試薬４）を添加して反応を開始し、３７℃で５分間反応後の波長５５５ｎｍにおける吸光度を分光光度計Ｕ−３０１０Ａを用いて測定した。試料の代わりにイオン交換水を用いて同様に操作して測定した波長５５５ｎｍにおける吸光度（試薬ブランク）を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量を算出した。
吸光度変化量＝ΔＡｅｓ−Ａｅ０
ΔＡｅｓ：反応開始から５分経過後の吸光度
ΔＡｅ０：対照液を添加した場合の反応開始から５分経過後の吸光度
得られた各吸光度変化量を用いて、αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の（αＦＶＨ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合ΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨを算出した。結果を表８に示した。また、同様にして算出したαＦＶのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の（αＦＶ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合ΔＡ（αＦＶ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶを表９に示した。
【０１２３】
【表８】
2013176351.tif 000010
【０１２４】
【表９】
2013176351.tif 000011
【０１２５】
表８、９から明らかなように、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃを含む試薬を用いて測定したΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡ（αＦＶ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶは全てのｐＨにおいて低値であった。特に、本酵素の至適ｐＨであるｐＨ７．５においても、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１５４Ｎ／２５９Ｃを用いた場合は、共存しているεＦＫの影響を受けることなくαＦＶＨおよびαＦＶを精度よく定量できることが分かった。なお、ｐＨ５．５よりも酸性側の条件においても、同様に測定を試みたが、ｐＨ５．０は、ＴＯＯＳと４-ＡＡの酸化的縮合反応により生じるキノンイミン色素が呈色を示すｐＨ範囲外であり、実施例記載の処方においては、吸光度変化量による正確な定量は不可能であった。以上より、本発明の試薬組成物は、ｐＨ５．５〜８．０という広範な範囲での測定に好適に使用できることが確認され、このｐＨ範囲にわたりεＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響は１５％以下であった。特に、ｐＨ５．５〜７．５にわたりεＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響は５％以下であり、このような広範な範囲測定において好適に使用できることが確認された。  
【０１２６】
（１７）εＦＫを含むフルクトシルアミノ酸、フルクトシルペプチド試料の調製
（試薬４）に記載したαＦＶ、若しくはεＦＫの溶液を混合し、イオン交換水で希釈することで、αＦＶ、εＦＫをそれぞれ０．３ｍＭずつ含む（αＦＶ＋εＦＫ）混合試料を作製した。また、同様に（試薬４）に記載したαＦＶＨ、若しくはεＦＫの溶液を混合し、イオン交換水で希釈することで、αＦＶＨ、εＦＫをそれぞれ０．３ｍＭずつ含む（αＦＶＨ＋εＦＫ）混合試料を作製した。
【０１２７】
（１８）εＦＫを含むフルクトシルアミノ酸、フルクトシルペプチド試料の測定
予め３７℃で５分間加温しておいた１７５μｌの（試薬６）に対し、上記（１８）で調製した試料３５μｌを添加して反応を開始し、３７℃で５分間反応後の波長５４５ｎｍにおける吸光度を自動分析装置Ｂｉｏ Ｍａｊｅｓｔｙ ＪＣＡ‐ＢＭ１６５０を用いて測定した。試料の代わりにイオン交換水を用いて同様に操作して測定した波長５４５ｎｍにおける吸光度（試薬ブランク）を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量を算出した。
吸光度変化量＝ΔＡｅｓ−Ａｅ０
ΔＡｅｓ：反応開始から５分経過後の吸光度
ΔＡｅ０：対照液を添加した場合の反応開始から５分経過後の吸光度
得られた各吸光度変化量を用いて、αＦＶＨのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の（αＦＶＨ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合ΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨを算出した。結果を表１０に示した。また、同様にして算出したαＦＶのみを含む試料を測定した時の吸光度変化量を１とした場合の（αＦＶ＋εＦＫ）混合試料を測定した時の吸光度変化量の割合ΔＡ（αＦＶ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶを表１１に示した。
【０１２８】
【表１０】
2013176351.tif 000012
【０１２９】
【表１１】
2013176351.tif 000013
【０１３０】
表９、１０から明らかなように、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を含む試薬を用いて測定したΔＡ（αＦＶＨ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶＨ、ΔＡ（αＦＶ＋εＦＫ）／ΔＡαＦＶは全てのｐＨにおいて低値であった。特に、本酵素の至適ｐＨであるｐＨ７．５においても、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１を用いた場合は、共存しているεＦＫの影響を受けることなくαＦＶＨおよびαＦＶを精度よく定量できることが分かった。以上より、本発明の試薬組成物は、ｐＨ５．５〜８．０という広範な範囲での測定に好適に使用できることが確認され、このｐＨ範囲にわたりεＦＫがαＦＶＨの測定値に与える影響は２％以下、εＦＫがαＦＶの測定値に与える影響は３％以下であった。また、ｐＨ５．５〜７．５にわたりεＦＫがαＦＶの測定値に与える影響は２％以下であり、このような広範な範囲測定において好適に使用できることが確認された。また、ＣＦＰ−Ｔ９−９８Ａ／１０３Ｈ／１５４Ｎ／２６３Ｍ／２６５Ｆ／ΔＰＴＳ１は、ＣＦＰ−Ｔ９よりも熱安定性が向上しており、安定性の点でも優れたアマドリアーゼに改変されていた。
【図１】
2013176351.tif 000014
【図２】
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【配列表】
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