(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体を用いてリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３濃度を測定することを含む、癌の予測方法を提供する。【解決手段】リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体。抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定キット。被験者由来の検体を抗体と接触させるステップ；及び、該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の結合を検出又は定量するステップ、を備える、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ｓｍａｄ３がヒト、マウス又はラット由来である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
Ｓｍａｄ３のリンカー領域のセリン又はスレオニンがリン酸化されていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１３３〜２２３番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、１７９番目のスレオニン、２０４番目のセリン、２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１３３〜２２３番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３２）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３３）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３４）、又はＧｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号３５）である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識し、かつ、リン酸化されたＳｍａｄ３のＣ末端を認識しない請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するが、リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域を認識しない、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
以下の、（ｉ）又は（ｉｉ）から選択されるいずれか１つのモノクローナル抗体又はその断片：
（ｉ）重鎖が配列番号５に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片；
（ｉｉ）重鎖が配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１０】
配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１１】
配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１に記載のアミノ酸配列をＣＤＲとして有する、請求項９に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
【請求項１２】
重鎖のＣＤＲ１が配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１３に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号１４に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１５に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号１６に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１７に記載されたアミノ酸配列を有する抗体、あるいは、重鎖のＣＤＲ１が配列番号２６に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２８に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号２９に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号３０に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項１３】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるいずれか１つのモノクローナル抗体：
（ｉ）（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号９のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号９のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号９のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１１のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体；
（ｉｉ）（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号２３のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号２３のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号２３のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号２５のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号２５のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号２５のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体；
（ｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号９のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体；
（ｉｖ）重鎖の可変領域が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号２５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の抗体を含有する薬剤。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定キット。
【請求項１６】
被験者由来の検体を請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の抗体と接触させるステップ；及び、
該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の結合を検出又は定量するステップ、
を備える、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定方法。
【請求項１７】
被験者由来の検体が、血液、血漿、血清、尿、又は肝臓組織である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３に特異的に反応するモノクローナル抗体に関するものである。また、本発明は前記抗体を用いた、組織上のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を特異的に検出可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｓｍａｄは哺乳類では８種類の存在が知られており、Ｓｍａｄはファミリー間で保存されているＮ末端Ｍａｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ１ドメイン（ＭＨ１ドメイン）とＣ末端Ｍａｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ２ドメイン（ＭＨ２ドメイン）、これらの領域間に存在するリンカー部から構成されている。
【０００３】
癌において、癌化のシグナル伝達には多くの経路があることが知られているが、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（以下、「ＴＧＦ−β」という）シグナル伝達の詳細な解析により、リン酸化Ｓｍａｄシグナル伝達の変遷により発がんリスクの強弱が判定できる事がわかってきた。ＴＧＦ−βシグナルは、Ｉ型ＴＧＦ−β受容体を介して、細胞増殖抑制、アポトーシス誘導などの癌抑制シグナルに関わる。活性化したＩ型ＴＧＦ−β受容体は、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のＣ末端（ＳＸＳモチーフ）をリン酸化して、Ｃ末端がリン酸化されたＳｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２Ｃ）及びＳｍａｄ３（ｐＳｍａｄ３Ｃ）を形成する。ｐＳｍａｄ３Ｃは核移行した後、ｐ２１ＷＡＦ１遺伝子のプロモーター領域に結合し転写を活性化させることで幹細胞増殖を停止させ、Ｂｃｌ−２の発現を抑制することでアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
一方で、ＨＢｘタンパクなどの肝炎ウイルスを構成する発癌関連分子、慢性炎症において分泌される炎症性サイトカイン、及びがん関連遺伝子Ｒａｓ等は、細胞質に存在するｃ−Ｊｕｎ  Ｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ（以下、「ＪＮＫ」という）を活性化してリンカー部をリン酸化して、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３（ｐＳｍａｄ３Ｌ）を形成する。核移行したｐＳｍａｄ３Ｌは、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子の発現を刺激して細胞増殖を促進させる（非特許文献２）。また、ｐＳｍａｄ３Ｌは、ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ（ＰＡＩ−１）転写を活性化して細胞外マトリックスタンパクの蓄積を促すことから、線維化にも関与している（非特許文献３）。
【０００５】
このようにＩ型ＴＧＦ−β受容体あるいはＪＮＫは、ｐＳｍａｄ３ＣあるいはｐＳｍａｄ３Ｌを形成するが、ｐＳｍａｄ３Ｌが形成されると構造が変化し、ｐＳｍａｄ３Ｃが形成されなくなる（非特許文献４）ことから、ｐＳｍａｄ３Ｌを介する癌化シグナルとｐＳｍａｄ３Ｃを介する癌抑制シグナルは相反する関係にあると考えられている。また、リンカー部のリン酸化を抑制することにより、ｐＳｍａｄ３ＬからｐＳｍａｄ３Ｃへとシグナルが回帰することから、ｐＳｍａｄ３ＬからｐＳｍａｄ３Ｃへの経路の可逆性があると考えられている（非特許文献５）。
【０００６】
Ｃ型慢性肝炎が肝硬変から肝がんに進展するにつれて、ｐＳｍａｄ３Ｌはほぼ全ての肝細胞に見られるようになるが、ｐＳｍａｄ３Ｃは減少する。また、Ｂ型慢性肝炎患者においては、ｐＳｍａｄ３Ｌが多い患者は発がん率が高い一方、ｐＳｍａｄ３Ｌが少ない患者は発がん率が低く、ｐＳｍａｄ３Ｃが多い群では肝がんを発症していない。
【０００７】
また、ウイルス性慢性肝炎患者に抗ウイルス療法を行うと、肝線維化の改善及び発がん抑制効果をもたらすが、この際、ウイルスと炎症が終息するとｐＳｍａｄ３Ｌを介する線維化・がん化シグナルがｐＳｍａｄ３Ｃを介するがん抑制シグナルに回帰する。一方で、病態が進行した肝硬変患者においては遺伝子変異又はエピジェネティックな変化がｐＳｍａｄ３Ｌ経路を恒常的に活性化し、抗ウイルス療法を適用してウイルスと炎症が終息しても肝線維化は改善せず、発癌リスクも高いままである。
【０００８】
このように、ウイルス性慢性肝組織の肝細胞におけるリン酸化Ｓｍａｄ３シグナルは、ｐＳｍａｄ３Ｃを介するがん抑制経路から、間質細胞に特徴的なｐＳｍａｄ３Ｌを介する細胞増殖促進（がん化）・線維化経路に、病態の進行と共に次第に移り代わっており、ｐＳｍａｄ３Ｌは、がん化、線維化等の病態の進行の予測や、抗癌治療の効果を評価するための指標として非常に重要であると考えられる。
【０００９】
ｐＳｍａｄ３Ｌを認識するポリクローナル抗体が作製され、Ｓｍａｄ３のリン酸化部位の検出等に使用されている（非特許文献６、特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｙａｎｇ  ＹＡら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００６；９：４４５−４５７
【非特許文献２】Ｍｕｒａｔａ  Ｍら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００９；４９：１２０３−１２１７
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ２００５；１６６：１０２９−１０３９
【非特許文献４】Ｓｅｋｉｍｏｔｏ  Ｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：５０９０−５０９６
【非特許文献５】Ｎａｇａｔａ  Ｈら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００９；４９：１９４４−１９５３
【非特許文献６】Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：５３２１−３０
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００５−１１２８１２号公報
【発明の概要】
【００１２】
従来使用されていたポリクローナル抗体には、特異性が低く、ｐＳｍａｄ３Ｌを正確に検出することができないという問題があった。よって、本発明者らは、ｐＳｍａｄ３Ｌを正確に検出することががん化及び線維化の評価に有効であると考えて各種検討を行った結果、ｐＳｍａｄ３Ｌを特異的に認識するモノクローナル抗体を作製することに成功し、また、当該抗体がｐＳｍａｄ３Ｌをより正確に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
具体的には、一態様において本発明は、以下の（１）〜（１５）に記載の発明に関する。
（１）  リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体。
（２）  Ｓｍａｄ３がヒト、マウス又はラット由来である、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）  Ｓｍａｄ３のリンカー領域のセリン又はスレオニンがリン酸化されていることを特徴とする（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体。
（４）  リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１３３〜２２３番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、１７９番目のスレオニン、２０４番目のセリン、２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（５）  リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域が、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１３３〜２２３番目のアミノ酸からなる部分又はその一部であって、２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化されていることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（６）  リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域が、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３２）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３３）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３４）、又はＧｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号３５）である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（７）  リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識し、かつ、リン酸化されたＳｍａｄ３のＣ末端を認識しない（１）〜（６）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（８）  リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するが、リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域を認識しない、（１）〜（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（９）  以下の、（ｉ）又は（ｉｉ）から選択されるいずれか１つのモノクローナル抗体又はその断片：
（ｉ）重鎖が配列番号５に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片。
（ｉｉ）重鎖が配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体、又は、前記モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片。
（１０）  配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１に記載のアミノ酸配列を有する、（９）に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（１１）  配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１に記載のアミノ酸配列をＣＤＲとして有する、（９）に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（１２）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１３に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号１４に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１５に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号１６に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１７に記載されたアミノ酸配列を有する抗体、あるいは、重鎖のＣＤＲ１が配列番号２６に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２８に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号２９に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号３０に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を有する抗体。
（１３）  以下の（ｉ）〜（ｉｖ）から選択されるいずれか１つのモノクローナル抗体：
（ｉ）（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号９のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号９のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号９のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１１のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体；
（ｉｉ）（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号２３のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号２３のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号２３のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号２５のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号２５のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号２５のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体；
（ｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号９のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体；
（ｉｖ）重鎖の可変領域が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号２５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体。
（１４）  （１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体を含有する薬剤。
（１５）  （１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定キット。
（１６）  被験者由来の検体を（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体と接触させるステップ；及び、
該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の結合を検出又は定量するステップ、
を備える、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定方法。
（１７）  癌の発症を予測するための情報を得る方法、又は癌の発症を予測する方法であって：
（ａ）被験者由来の検体中と少なくとも１つの（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体とを接触させるステップ；
（ｂ）リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の該抗体への結合を検出して試料中のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を検出又は定量するステップ；及び、
（ｂ）リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルから癌の発症を予測するステップ、ここで、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルが高いことが、被検者が癌を発症しやすいことを示す。
（１８）  被験者が慢性肝炎患者であり、癌が肝臓癌である、（１７）に記載の方法。
（１９）  被験者由来の検体が、血液、血漿、血清、尿、又は肝臓組織である、（１７）又は（１８）に記載の方法。
【００１４】
本明細書において、「Ｓｍａｄ３」とは、ショウジョウバエのｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ遺伝子及びシノラブディス・エレガンスのＳｍａ遺伝子に類似するＳｍａｄタンパク質ファミリーに属するタンパク質である。Ｓｍａｄ３はヒト以外の哺乳動物でも存在し、例えば、マウスＳｍａｄ３は、アミノ酸配列において、ヒトＳｍａｄ３と９９．３％の相同性を有する等、異なる種でも配列の保存性は高いと考えられていることから（Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ６１（３），  ２１３−２１９，１９９９）、本明細書におけるＳｍａｄ３は哺乳動物由来であれば特に限定されない。例えば、本明細書におけるＳｍａｄ３は、ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、アフリカツメガエル、又はゼブラフィッシュ由来等であってもよいが、好ましくは、ヒト、マウス、又は由来であり、より好ましくはヒト由来である。
【００１５】
本明細書において、「Ｓｍａｄ３のリンカー領域」とは、Ｓｍａｄ３のＭＨ１ドメイン及びＭＨ２ドメインに挟まれたリンカー部に含まれる領域を意味する（なお、本明細書において、「リンカー部」とは、Ｓｍａｄ３のＭＨ１ドメイン及びＭＨ２ドメインに挟まれたアミノ酸配列からなる部分の全体を意味し、「リンカー領域」とは、当該リンカー部に含まれる全部又は一部を意味する）。リンカー部に含まれるリン酸化されたアミノ酸を含む限り、本明細書におけるＳｍａｄ３のリンカー領域は、リンカー部の全体である必要はなく、その一部であってもよい。例えば、ヒトの場合、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｓｍａｄ３）の８〜１３２番目のアミノ酸からなる部分（ＭＨ１ドメイン）及び２２４〜４１４番目のアミノ酸からなる部分（ＭＨ２ドメイン）に挟まれた１３３〜２２３番目のアミノ酸からなる部分（リンカー部）又はその一部を意味する。また、マウスの場合、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｓｍａｄ３）の１３３〜２２３番目のアミノ酸からなる部分又はその一部を意味する。また、ラットの場合、配列番号３で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質（Ｓｍａｄ３）の１３３〜２２３番目のアミノ酸からなる部分又はその一部を意味する。
【００１６】
よって、本明細書において、「リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域」とは、前記リンカー部又はその一部であって、リン酸化されたセリン及び／又はスレオニンを少なくとも１つ含有している部分を意味する。具体的には、ヒトＳｍａｄ３の場合、配列番号１で表わされるアミノ酸配列の１７９番目のスレオニン、２０４番目のセリン、２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化されたリンカー部又はその一部であって、少なくとも１つのリン酸化されたアミノ酸を含有する部分を意味し、好ましくは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するの２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化されたリンカー部又はその一部であって、少なくとも１つのリン酸化されたアミノ酸を含有する部分である。
【００１７】
例えば、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域は、リン酸化されたセリン及び／又はスレオニンを少なくとも１つ含有する、リンカー部由来の少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、又は少なくとも５０アミノ酸からなる部分を含んでいてもよい。
【００１８】
具体的には、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域としては、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３２）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３３）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｐＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（配列番号３４）、又はＧｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号３５）を挙げることができる。本明細書において、アミノ酸表記の前に記載された「ｐ」はリン酸化されていることを意味する。よって、「ｐＳｅｒ」はリン酸化されたセリンを意味し、「ｐＴｈｒ」はリン酸化されたスレオニンを意味する。
【００１９】
また、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を有するＳｍａｄ３タンパク質のリンカー部であってもよい。例えば、１７９番目のスレオニン、２０４番目のセリン、２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化された配列番号１の１３３〜２２３番目のアミノ酸配列からなる部分であり、より好ましくは、２０８番目のセリン、及び／又は２１３番目のセリンがリン酸化された配列番号１の１３３〜２２３番目のアミノ酸配列からなる部分である。
【００２０】
本明細書において、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域のアミノ酸配列、特にはそのリン酸化されたアミノ酸を認識する限り特に限定されるものではない。例えば、本発明のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を有するＳｍａｄ３タンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識し、かつ、リン酸化されたＳｍａｄ３のＣ末端を認識しないモノクローナル抗体である。
【００２１】
モノクローナル抗体がリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するか否かは、モノクローナル抗体とリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域及びリン酸化されていないＳｍａｄ３のリンカー領域との結合を測定することにより判定することができる。よって、本明細書において、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体の語は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域と特異的に結合するモノクローナル抗体と読み替えてもよい。リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域及びリン酸化されていないＳｍａｄ３のリンカー領域とモノクローナル抗体との結合は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡのいずれの方法により確認されるものであってもよいが、好ましくは、免疫組織化学染色又はＥＬＩＳＡである。よって、本発明のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体として、好ましくは、免疫組織化学染色又はＥＬＩＳＡによりリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域と結合可能な抗体である。より、好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、がん組織又はその調製物中における、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を有するＳｍａｄ３タンパク質と免疫組織化学染色又はＥＬＩＳＡにより結合可能な抗体である。
【００２２】
モノクローナル抗体がＳｍａｄ３のリンカー領域と結合するか否かをウェスタンブロッティングにより確認する場合、組換タンパク質として発現させた、リン酸化されたリンカー領域を有するＳｍａｄ３タンパク質又はペプチド（以下、「「ｐＳｍａｄ３Ｌ」という）、ｐＳｍａｄ３ＬのｃＤＮＡが導入されたＣＨＯ細胞、及びその培養液を、２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ジチオスレイトール溶液中に溶解し、煮沸して被検抗体によりウェスタンブロット分析を行うことにより確認することができる。
【００２３】
モノクローナル抗体とｐＳｍａｄ３Ｌが結合するか否かを免疫沈降により確認する場合（免疫沈降によりｐＳｍａｄ３Ｌを検出可能であるか否かを確認する場合を含む）、免疫沈降ウェスタンブロッティング分析により確認することができる。具体的には、ｐＳｍａｄ３Ｌトランスフェクタントの上清を被検抗体と共にインキュベートし、共にプロテインＧ  セファロース（ＧＥヘルスケアジャパン）を添加する、更にインキュベートした後、遠心分離を行い、得られたペレットを三回洗浄した。次いでペレットを溶解し、別の抗ｐＳｍａｄ３Ｌ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行うことにより、確認することができる。
【００２４】
モノクローナル抗体とｐＳｍａｄ３Ｌが結合するか否かを免疫組織化学染色により確認する場合、血管を含む組織を４％パラホルムアルデヒド中で３〜５日間固定化し、パラフィンに包埋し、常法に従ってミクロトーム上で５μｍ厚に切断する。組織切片からパラフィンを定法により除去、水和させ、トリス塩酸緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で洗浄後、内因性の過酸化を防ぐため、３％過酸化水素含有メタノール中で１０分間静置処理する。水で洗浄後、前処理として、切片を市販の抗原賦活溶液に浸したまま、圧力鍋に入れて電子レンジで、予熱１０分した後、１５分加熱し、３０分室温で放置する。ＴＢＳＴで洗浄後、１％ＢＳＡで切片をブロッキング操作を１０分間行う。ＴＢＳＴで軽く洗浄後、被検抗体と共に４℃で一晩静置反応する。ＴＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、ＥＮＶＩＳＩＯＮキット/ＨＲＰ(ＤＡＢ) Ｒａｂｂｉｔ/Ｍｏｕｓｅ (ＤＡＫＯ ＃Ｋ５０２７)などと共に室温で６０分間静置反応する。ＴＢＳＴで洗浄後、免疫反応性は、３，３’−ジアミノベンジジン（シグマ社）を色原体として使用し可視化する。またヘマトキシリンで対比核染色し、最終的に脱水、透徹、封入を行い顕鏡できる。
【００２５】
モノクローナル抗体とｐＳｍａｄ３Ｌが結合するか否かをＥＬＩＳＡにより確認する場合（ＥＬＩＳＡによりｐＳｍａｄ３Ｌを検出可能であるか否かを確認する場合を含む）、被検モノクローナル抗体を用いて後述のＥＬＩＳＡ系を構築し、後述のＥＬＩＳＡ法を実施して、ｐＳｍａｄ３Ｌを検出できるか否かを測定することにより行うことができる。
【００２６】
本明細書において、「モノクローナル抗体」の語は、単一クローンに由来することを意味し、完全抗体の他、抗原との結合活性を保持する限り抗体断片をも含む。完全抗体としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体等の哺乳動物の抗体の他、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列とヒト抗体のアミノ酸配列を有する抗体を含む。非ヒト動物抗体のアミノ酸配列とヒト抗体のアミノ酸配列を有する抗体は、ヒト抗体の抗原結合ドメインＦｖを非ヒト動物モノクローナル抗体の抗原結合ドメインＦｖと入れ替えたヒト型キメラ抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体の相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」という）をヒト抗体のフレーム領域（以下、「ＦＲ」という）に組み込んだヒト化抗体を含む。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよい。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。また、抗体断片には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、及び、ＣＤＲを含むペプチドを含む。
【００２７】
本明細書において、「特異的に認識する」又は「特異的に結合する」とは、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域に結合することができるが、リン酸化されていないＳｍａｄ３のリンカー領域とは結合しないか又は結合が弱いことを意味する。ここで、結合が弱いとは、被検抗体のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域への結合力に比較して、リン酸化されていないＳｍａｄ３のリンカー領域への結合が十分区別可能な程度に弱い場合を含む。なお、本明細書において、「特異的に認識する」の語は、リン酸化されていないＳｍａｄ３のリンカー領域の他、Ｓｍａｄ３以外のタンパク質とも結合しないか又は結合が弱いことを意味する。ここで、結合が弱いとは、被検抗体のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域への結合力に比較して、Ｓｍａｄ３以外のタンパク質への結合が十分区別可能な程度に弱い場合を含む。
【００２８】
本明細書において、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識する抗体は、リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域を認識してもよい。ヒトＳｍａｄ３とヒトＳｍａｄ２のアミノ酸配列のアラインメントを示す図１からもわかる通り、Ｓｍａｄ３とＳｍａｄ２はその構造が類似し、また、機能面においても類似することが知られていることから、本発明の目的においては本発明の抗体がリン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域を認識することが妨げられるものではない。しかし、好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するが、リン酸化されたＳｍａｄ２のリンカー領域を認識しない抗体である。
【００２９】
一例において、本発明の抗体は、重鎖が配列番号５に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体（５Ａ１１モノクローナル抗体）である。また、別の例において、本発明の抗体は、重鎖が配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体（１Ａ１モノクローナル抗体）である。
【００３０】
また、本発明のモノクローナル抗体は、５Ａ１１モノクローナル抗体又は１Ａ１モノクローナル抗体と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ実質的に同一の機能を保持するモノクローナル抗体又はその断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、又はＣＤＲを含むペプチド）であってもよい。例えば、本発明の抗体は、その可変領域が、５Ａ１１モノクローナル抗体又は１Ａ１モノクローナル抗体の可変領域と実質的に同一のアミノ酸配列を有する抗体、あるいは５Ａ１１モノクローナル抗体又は１Ａ１モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＣＤＲを有する抗体（好ましくは、ヒト化抗体）であってもよい。
【００３１】
本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」とは、対象となるアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有するか、又は、対象となるアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
また、本明細書において、「実質的に同一の機能を保持する」とは、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識することを意味し、好ましくは、前述のウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡのいずれかの方法により確認される、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域へのモノクローナル抗体又はその断片の結合力が、リン酸化されていないＳｍａｄ３のリンカー領域へのモノクローナル抗体又はその断片の結合力と比較して十分区別可能な程度（例えば、目視で判別できる程度、又は、結合定数が一桁又は二桁異なる程度）に強いことを意味する。
【００３３】
具体的には、本発明のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体は、配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１に記載のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体）であり、好ましくは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６及び１７に記載のアミノ酸配列、又は、配列番号２６、２７、２８、２９、３０及び３１に記載のアミノ酸配列をＣＤＲとして有するモノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体）である。これらのモノクローナル抗体は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体である。
【００３４】
より好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、重鎖のＣＤＲ１が配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１３に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号１４に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１５に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号１６に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１７に記載されたアミノ酸配列を有する抗体、あるいは、
重鎖のＣＤＲ１が配列番号２６に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２７に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２８に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号２９に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号３０に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号３１に記載されたアミノ酸配列を有する抗体（例えば、ヒト化抗体）である。
【００３５】
また、別の態様において、本発明のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載のモノクローナル抗体である。
（ｉ）（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号９のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号９のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号９のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１１のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体；
（ｉｉ）（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号２３のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号２３のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号２３のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号２５のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号２５のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号２５のアミノ酸配列、かつ
リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体；
（ｉｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号９のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体；
（ｉｖ）重鎖の可変領域が配列番号２３のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号２５のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体。
【００３６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」するとは、当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば、ハイブリダイズの条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。また、アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。
【００３７】
また、別の態様において、本発明は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を含有する薬剤に関する。本薬剤に含まれる抗体は、目的のタンパク質と結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。本発明の薬剤が含有する抗体又は抗体の断片は、必要に応じて適宜標識されていてもよい。本発明の薬剤は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体に代えて、当該抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞を包含していてもよい。本発明の薬剤が備えるリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片として、好ましくは、前述のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体として好ましいモノクローナル抗体と同様であり、例えば、５Ａ１１モノクローナル抗体又は１Ａ１モノクローナル抗体である。
【００３８】
また、本発明によれば癌（特に肝臓癌）患者の組織中のリンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３濃度は癌の病態進行又は線維化促進の指標となることから、癌の予後予測に利用することができる。よって、本発明の薬剤は、癌（特に肝臓癌）の予後予測のための薬剤とすることができる。具体的には、免疫染色用、画像診断用の薬剤として使用することができる。本発明の薬剤を画像診断用として用いる場合、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体は、標識物質を含有し又は標識物質と結合している。標識物質としては、例えば、放射性同位元素等の当業者周知の物質を用いることができ、好ましくは陽電子放出放射性同位元素又はγ線放射性同位元素であり、これに限定されるものではないが、例えば１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ及び７５Ｂｒを挙げることができる。画像診断用として用いる場合、本発明の薬剤が含有するリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体として、好ましくは、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。画像診断用として用いる場合、本発明の薬剤は、ヒトへの投与に適した医薬上許容される形態であって、生理学的に許容し得る添加剤、例えば、薬学的に許容し得る希釈剤、緩衝剤、可溶化剤、無痛化剤、溶剤、安定化剤又は酸化防止剤を含んでいてもよい。本発明の診断薬の投与量は、対象部位、用いる画像診断方法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度により適宜選択することができる。
【００３９】
更に、別の態様において、本発明は、本発明のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定キットに関する。本発明のキットは、好ましくは、ヒト体液又は組織中のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を測定可能な（又は測定するための）キットである。一の態様において、本発明のキットは、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその断片を備える。当該抗体は、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明のキットは、本発明のモノクローナル抗体に加えて、ポリクローナル抗体を備えていてもよい。また、本発明のキットが含有する抗体又は抗体の断片は、適宜標識されていてもよい。また、本発明のキットは、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体に代えて、当該抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞も包含していてもよい。本発明のキットが備える抗体又はその断片として、好ましくは、前述のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体として好ましいモノクローナル抗体と同様であり、例えば、５Ａ１１モノクローナル抗体又は１Ａ１モノクローナル抗体である。
【００４０】
本発明のキットは、好ましくは、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含む。本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。本発明のキットが、所望の測定を実施することが可能であるか否かは、当該サンプル又は当該濃度のサンプルを用いて、各測定法を当業者周知の方法により実施することにより、検出可能であるか否かを測定することにより確認することができる。
【００４１】
例えば、本発明のキットは、（ｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体である第一抗体が固定化した固相又はハプテン、及び（ｉｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３と結合可能な標識化された第二抗体（該、第二抗体は、リン酸化されていないＳｍａｄ３と結合してもよく、また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、リン酸化されたＳｍａｄ３と特異的に結合するモノクローナル抗体である）を含む免疫化学測定のキットとすることができる。あるいは、本発明のキットは、（ｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３と結合可能な第一抗体（該、第一抗体は、リン酸化されていないＳｍａｄ３と結合してもよく、また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、リン酸化されたＳｍａｄ３と特異的に結合するモノクローナル抗体である）が固定化した固相又はハプテン、及び（ｉｉ）標識化されたリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体である第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。好ましくは、前記第一抗体と前記第二抗体はリン酸化されたＳｍａｄ３の異なる部位を認識する。
【００４２】
又は、本発明のキットは、（ｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体である第一抗体が固定化した固相、及び、（ｉｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３と結合可能な第二抗体（該、第二抗体は、リン酸化されていないＳｍａｄ３と結合してもよく、また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、リン酸化されたＳｍａｄ３と特異的に結合するモノクローナル抗体である）が固定化したハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。あるいは、本発明のキットは、（ｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３と結合可能な第一抗体（該、第一抗体は、リン酸化されていないＳｍａｄ３と結合してもよく、また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、リン酸化されたＳｍａｄ３と特異的に結合するモノクローナル抗体である）が固定化した固相、及び、（ｉｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体である第二抗体が固定化したハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。
【００４３】
あるいは、本発明のキットは、（ｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体である第一抗体が固定化した不溶性担体、及び、（ｉｉ）リン酸化されたＳｍａｄ３と結合可能な第二抗体（該、第二抗体は、リン酸化されていないＳｍａｄ３と結合してもよく、また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、リン酸化されたＳｍａｄ３と特異的に結合するモノクローナル抗体である）が固定化した不溶性担体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。
【００４４】
本発明のキットにおいて、固相は免疫化学測定に使用できる固相であれば特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を挙げることができ、好ましくは、プレート及び磁気ビーズである。本明細書において不溶性担体とは、ビーズ等の懸濁可能な不溶性の固相を意味し、例えば、ラテックスビーズや磁気ビーズを挙げることができる。
【００４５】
本発明の薬剤又はキットが標識化された抗体を含む場合、当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
【００４６】
本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬、使用方法等が記載されたマニュアル、パッケージ等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の薬剤又はキットに用いる検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料又は液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織切片、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液又はそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明のキットによる分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。
【００４８】
また、本発明によれば癌（特に肝臓癌）患者の組織中のリンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３濃度は癌の病態進行又は線維化促進の指標となることから、癌の予後予測に利用することができる。よって、本発明のキットは、癌（特に肝臓癌）の予後予測のためのキットとすることができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明のモノクローナル抗体、当該抗体を含有する薬剤、及び当該抗体を含有する測定キットは、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定が可能であることから、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３と疾患との関係を解明する重要な測定手段を提供するものである。特に、癌（特に肝臓癌）患者の組織中のリンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３濃度は癌の病態進行又は線維化促進と関連することから、癌（特に肝臓癌）の予後予測に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヒトＳｍａｄ３のアミノ酸配列（配列番号１）とヒトＳｍａｄ２のアミノ酸配列（配列番号４２）を比較した図である。
【図２】５Ａ１１モノクローナル抗体の各ペプチドとの反応性を各ペプチド固相Ｐｌａｔｅ  ＥＬＩＳＡにて確認した図である。縦軸は吸光度、横軸は抗体濃度を示す。
【図３】５Ａ１１モノクローナル抗体の反応特異性をウエスタンブロット解析にて確認した図である。レーン１は、Ｓｍａｄ３ 非リン酸化（ＥＰＳＭ）／ＣＯＳ１細胞ペレット、レーン２は、Ｓｍａｄ３ワイルドタイプ（Ｗ.Ｔ）／ＣＯＳ１細胞ペレット、レーン３は、Ｍｏｃｋ／ＣＯＳ１細胞ペレットを電気泳動し５Ａ１１モノクローナル抗体を反応させた結果をそれぞれ示す。矢印はＳｍａｄ３タンパクの分子量に該当する位置を示す。
【図４】１Ａ１モノクローナル抗体の各ペプチドとの反応性を各ペプチド固相Ｐｌａｔｅ  ＥＬＩＳＡにて確認した図である。縦軸は吸光度、横軸は抗体濃度を示す。
【図５】１Ａ１モノクローナル抗体の反応特異性をウエスタンブロット解析にて確認した図である。レーン１は、Ｓｍａｄ３非リン酸化（ＥＰＳＭ）／ＣＯＳ１細胞ペレット、レーン２は、Ｓｍａｄ３ ワイルドタイプ（Ｗ.Ｔ）／ＣＯＳ１細胞ペレット、レーン３は、Ｍｏｃｋ／ＣＯＳ１細胞ペレットを電気泳動し、１Ａ１モノクローナル抗体を反応させた結果を示す。矢印はＳｍａｄ３タンパクの分子量に該当する位置を示す。
【図６】クローニングしたモノクローナル抗体５Ａ１１及び１Ａ１の重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）の発現をウェスタンブロッティングにより確認した写真である。左の写真は、5Ａ１１の結果を示し、右の写真は１Ａ１の結果を示す。写真最上部の「Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ」は、細胞ペレットサンプルを指し、「Ｓｕｐ（×１０）」は、細胞培養上清を十倍に濃縮したサンプルを指す。Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ及びＳｕｐ（×１０）の各レーンは、左から、Ｖｅｃｔｏｒ：ｐｃＤＮＡベクター単独（ネガティブコントロール）、Ｌｃ：各抗体のＬｃ、Ｈｃ＋Ｌｃ：各抗体のＨｃ及びＬｃ、Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｈｃ＋Ｌｃ）：Ｈｃ及びＬｃ（ポジティブコントロール）を示す。写真の左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。写真右の矢印ヘッドは、Ｈｃ及びＬｃのタンパク質の分子量に該当する位置を示す。
【図７】５Ａ１１抗体および１Ａ１抗体の肝臓癌患者組織における免疫組織化学染色の結果を示す。本視野中には、上部に肝臓癌組織部分、下部に正常組織が混在した切片であるが、いずれの抗体も癌組織部分に特異的に染色され、正常組織部分には陽性像はほとんど認められない。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
（抗体）
本発明の抗体は、以下の方法により得ることができる。まず、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、リンカー部がリン酸化されたＳｍａｄ３の全部、又はその一部を有するポリペプチド（例えば、配列番号３６〜４１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるペプチド）をコードするＤＮＡを含む発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ（大腸菌用）、ｐｃＤＮＡ３．１（動物細胞発現用）等）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等（好ましくは、カイコ細胞）に形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を適切な培地（例えば、ＬＢ培地等）で培養して発現させることにより得ることができる。また、当該配列を有するペプチドを化学合成したものを用いることも可能である。
【００５２】
上記抗原を用いた動物の免疫は、上記抗原をリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）と共に、非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス等）又は鳥類に免疫することにより行われる。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができる。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を複数回（好ましくは、合計２〜５回）行うことができる。
【００５３】
モノクローナル抗体の作製は、上記方法により免疫した免疫感作動物の脾臓等から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。
【００５４】
（ヒト型キメラ抗体作製）
本発明の抗体がヒト型キメラ抗体の場合、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識する非ヒトモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号８及び配列番号１０に記載の核酸配列からなるＤＮＡ、又は、配列番号２２及び配列番号２４に記載の核酸配列からなるＤＮＡ）を調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）。
【００５５】
（ヒト化抗体の作製）
本発明の抗体がヒト化抗体の場合は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識する非ヒトモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３，１９９１；Ｃｌａｒｋ  Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７−４０２，２０００参照）。非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。また、ヒト化抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域（以下、「Ｖ領域」という）のＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。
【００５６】
（ヒト抗体）
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を有するペプチドを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。
【００５７】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述のリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体の作製方法に準じて抗原（好ましくは、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を有するペプチド）を免疫することにより、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するヒトモノクローナル抗体を得ることができる。
【００５８】
（抗体断片の作製）
Ｆ（ａｂ’）２断片（分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明のＩｇＧ抗体（例えば、５Ａ１１あるいは１Ａ１モノクローナル抗体）をペプシンで処理することにより得ることができる。Ｆａｂ’断片は、上述の方法により得られたＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明の抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡから得ることができる。Ｆａｂ断片（Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明の抗体をパパインで処理することにより得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明の抗体のＦａｂをコードするＤＮＡから得ることができる。ｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築することにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）又はその繰り返し配列である。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換し、当該システイン残基間をジスルフィド結合により結合させることにより得ることができる。Ｄｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築することにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を有するペプチドとして設計することにより得ることができる。
【００５９】
（標識）
抗体又はその断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５５５  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００６０】
（キット）
また、本発明は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識する抗体を含有するリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定キットに関する。具体的には、本発明は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識する第一抗体が固定化した、固相、ハプテン、磁気ビーズ及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含むことを特徴とする免疫化学測定のキットに関する。本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体（又は標識化した抗体）を用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法用のキットとして当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。
【００６１】
例えば、本発明のキットは、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体固相化プレート、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合するビオチン標識抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）溶液、ストレプトアビジンＰＯＤ溶液、洗浄液、ＴＭＢ試薬、２Ｍ  ＨＣｌ、標準物質（リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域ペプチド）を備えるキットとして製造することができる。また、別の例として、本発明のキットは、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）結合金コロイド、ウサギ免疫グロブリン結合金コロイド、及び、テストプレートを備えるキットとして製造することができる。当該キットにおいて、テストプレートは、検体を挿入する検体採取部、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合する抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）結合金コロイドを含む感作金コロイド塗布部、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を含む判定部（テストライン）、抗ウサギ免疫グロブリンポリクローナル抗体を含む判定部（リファレンスライン）、吸収剤、及び、メンブレンフィルターを備えていてもよい。なお、上述のキットにおいて、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体とリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合するモノクローナル抗体とリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）が互いに交換されていてもよい。
【００６２】
（リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定方法）
一の態様において、本発明は、リン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の測定方法に関する。具体的には、本発明の測定方法は、以下のステップを含んでいてもよい：被験者由来の検体をリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させるステップ；及び、該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の結合を検出又は定量するステップ。
【００６３】
本発明の方法において、「リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を検出又は定量」は、抗体分子を用いた公知の方法に基づき行うことができる。このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。
【００６４】
本明細書において、「被験者由来の検体をリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させるステップ」及び「該抗体へのリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の結合を検出又は定量するステップ」は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより実施する場合には、固相に固定化されたリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識する抗体に被験試料を接触させ、洗浄後、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合する標識抗体を添加して非結合抗体を洗浄により除去した後、当該抗体の標識を検出又は定量することにより行うことができる。また、イムノクロマトにより行う場合には、固定化されていないリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識する標識抗体に被験試料を接触させた後、当該混合物をリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と結合する別の抗体が特定部位に固定化された担体と接触させ、当該部位における標識抗体の集積を検出又は定量することにより行うことができる。
【００６５】
これらの方法においては、予め適宜既知の濃度に段階希釈されたリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３又はその一部を有するペプチドを標準物質として用いて検量線を作成し、検体中の測定値から当該検量線を基にリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の濃度を計算して求めてもよい。検出か定量かは、測定の目的が、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の存在により行われるのか又はレベルにより行われるのかに応じて決定される。例えば、測定がリン酸化されたＳｍａｄ３の存在／不存在を決定する目的で行われる場合には、（存在／不存在を）検出することが望ましい。また、測定がリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルを決定することを目的として行われる場合には、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルを定量することが望ましい。また、測定がリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の閾値レベルを超えるか否かを判定することを目的として行われる場合には、閾値レベルを超えるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３濃度を検出してもよいし、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルを定量した上で閾値レベルを超えるか否かを判定してもよい。なお、本明細書において、レベルとは、数値化される指標を意味し、例えば、濃度あるいはその代わりとして用いることができる指標を意味する。よって、レベルは蛍光等の測定値そのものであってもよいし、濃度に換算された値であってもよい。
【００６６】
前述の通り、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３はがん化・線維化の病態の進行と相関することが知られていることから、本発明の測定方法は、癌の発症を予測するための情報を得る方法、又は癌の発症を予測する方法として用いることができる。例えば、そのような方法は、以下のステップを含むことができる：
（ａ）被験者由来の検体をリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させるステップ；
（ｂ）リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の該抗体への結合を検出して検体中のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を検出又は定量するステップ；及び、
（ｂ）リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルから癌の発症を予測するステップ（又は、癌の発症を予測するための情報を得るステップ）、ここで、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３が存在する又はリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルが高いことが、被検者が癌を発症しやすいことを示す。
【００６７】
必要に応じて、本発明の方法は、被験者由来の検体に加えて、健常者由来の体液又は癌を発症しないと信じられている患者由来の検体をネガティブコントロールとして、同様にリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の濃度を測定してもよいし、かつ／あるいは、罹患した患者（特には、癌患者）又は癌を発症することが知られている患者由来の検体をポジティブコントロールとして、同様にリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の濃度を測定してもよい。
【００６８】
本明細書において、「リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルが高い」とは、被験者におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の存在又はレベルが、癌を発症した患者又は発症することが知られている患者（ポジティブコントロール）して低いこと、あるいは、癌を発症しなかった患者又は発症しないと信じられている患者（ネガティブコントロール）におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルと比較して高いことを意味する。比較対象におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既に発症の有無が判明している患者由来の試料におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルを測定することにより、あるいは、他の指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３と発症との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮｅｗＹｏｒｄ，  １９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００６９】
例えば、本発明の方法により検出されたリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３は、その存在／不存在により被験者の癌の発症と関連付けることができる。また、別の例として、本発明のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３について発症指標としての閾値レベルを設定し、被験者由来の検体におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルを、閾値レベルと比較することにより発症を予測してもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００７０】
あるいは、本発明の測定方法は、発症の可能性の高さに関するいくつかのグループ群（クラス）を設定し、患者由来の検体におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルから、当該クラスのうち一つのクラスに分類し、分類されたクラスに属する患者に特異的な癌に関する既知の性質（癌の発症率等）から当該患者の癌の発症を予測するための情報を得る方法、又は癌の発症を予測する方法として利用することもできる。よって、一例として、本発明は以下の方法であってもよい：癌の発症を予測するための情報を得る方法又は癌の発症を予測する方法であって：
（ａ）被験者由来の検体のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を定量すること；及び、
（ｂ）測定されたリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルと該患者の癌発症との関連付けをすることを含む方法、
ここで、前記関連付けは、以下の方法を含む：
（ｃ）定量されたリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルから、癌の発症クラスのうち一つのクラスに分類すること、ここで、当該分類結果は定量されたリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルに依存している；及び
（ｄ）分類された当該一つの反応クラスに属する癌の発症に特異的な既知の性質から当該患者の癌の発症を予測すること。
【００７１】
本明細書において、「癌の発症クラスのうち一つのクラスに分類する」とは、被験者由来の試料におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルに応じて当該被験者をグループ分けすることを意味する。当該グループ分けは、絶対的又は相対的な指標により振り分けることができる。例えば、対象患者のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の定量値から、当該患者を予め決められたリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の定量値を示すグループに振り分けることにより行ってもよいし、又は、被験者を含む不特定の患者群におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルを定量した上で、相対的な定量レベルの差から、患者を２以上のグループに分けてもよい。また、クラス分けは、健常者におけるリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルとの差の大小を指標として行ってもよい。好ましくは、比較した場合にリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の定量値が多い（レベルが高い）ほど癌の発症の可能性が高いクラスに分類される。
【００７２】
発症予測の判定結果は、予測される患者の状態の経過又は転帰を意味し、状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。発症予測の判定は、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、発症予測の判定結果は、本発明のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３レベルが上昇又は減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ある特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００７３】
本発明の予測方法は、癌の発症を予測するものであり、発症の予測は癌に罹患するする危険性を判断するものである。本発明の予測方法において、発症を予測可能な癌としては、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、グリオーマ、肝臓癌、前立腺癌、子宮内膜癌、腎臓癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆管癌、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、扁平上皮癌、消化管間質腫瘍、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫（ニューロブラストーマ）、神経膠芽腫（グリオブラストーマ）、子宮癌、卵巣癌、ウイルムス腫瘍、慢性骨髄性白血病、フィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病を挙げることができ、好ましくは、肝臓癌である。また、本発明の予測方法における被験者は、癌の発症を予測することが必要な対象であれば特に限定されないが、好ましくはヒトであり、より好ましくは、慢性肝炎患者である。
【００７４】
また、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３は、患者の癌発症の指標となることから、癌治療薬のスクリーニングにおいて、患者の発症の改善の指標として用いることができる。例えば、本発明の癌治療薬のスクリーニング方法は、被験者に被験薬を投与し、又は、癌モデル動物に被験薬を投与するステップ；モデル動物由来の検体をリン酸化されたＳｍａｄ３のリンカー領域を特異的に認識するモノクローナル抗体と接触させるステップ；リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３の該抗体への結合を検出して検体中のリンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を検出又は定量するステップ；リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３のレベルから当該被験薬が癌の発症を改善するものであるか否かを判定するステップ；被験薬の添加又は投与により、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３レベルが減少する被験薬を、癌を改善し又は発症を抑制する治療薬として選別するステップ、を備えることができる。本発明のスクリーニング方法の各ステップは、前述の測定方法及び予測方法に準じて実施することができる。
【００７５】
本発明の測定方法、予測方法及びスクリーニング方法において使用する患者由来の試料としては、リンカー領域がリン酸化されたＳｍａｄ３を検出することができる検体を使用することができ、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液、組織（好ましくは、肝臓組織）又はそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは、血液、血漿、血清、尿、又は肝臓組織又はそれらの分画物若しくは処理物（例えば、肝臓組織切片）である。本発明の測定方法、予測方法及びスクリーニング方法における分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。
【００７６】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００７７】
（実施例１）抗リンカー部リン酸化Ｓｍａｄ３抗体の調製
（１）抗原の調製
Ｓｍａｄ３のリンカー部におけるリン酸化部位のうち、１７９番目のスレオニン、２０４番目のセリン、２０８番目のセリン、及び、２１３番目のセリンに着目し、これらの部位を含むペプチドを抗原として設計し、リン酸化させて抗原として使用した。具体的には、ＣＱＳＮＩＰＥＴＰＰＰＧＹＬ（配列番号３６）、ＩＰＥＴＰＰＰＧＹＬＳＥＤＧＥＴＳ（配列番号３７）、ＳＰＮＰＭＳＰＡＨＮＮＬＤＬ（配列番号３８）、ＡＧＳＰＮＬＳＰＮＰＭＳＰＡ（配列番号３９）、ＮＨＳＭＤＡＧＳ−ＰＮＬＳＰＮＰ（配列番号４０）、又は、ＡＧＳＰＮＬＳＰＮＰＭＳＰＡ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなるペプチドを設計し、抗原として使用した。
抗原ペプチドは、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ社（杭州市、中国)に合成を依頼し取得した。
【００７８】
（２）抗リンカー部リン酸化Ｓｍａｄ３抗体の産生
得られた抗原ペプチドをマウスに注射した。免疫マウスから得られた脾細胞、及びリンパ節細胞をミエローマ細胞株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させた。
【００７９】
（３）抗リンカー部セリンリン酸化Ｓｍａｄ３抗体の選択
抗リンカー部セリンリン酸化Ｓｍａｄ３ペプチドを固相しハイブリドーマ細胞の上清の抗体とリンカー部のセリンがリン酸化されたＳｍａｄ３との反応性をＥＩＡにより測定した。結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2013234156.tif 000002
【００８１】
得られたクローンのうち、クローン番号１、４、５、８、１０、及び１７が、２０８番目及び２１３番目のセリンがリン酸化されたＳｍａｄ３を認識し、かつ、２０８番目及び２１３番目のセリンがリン酸化されていないＳｍａｄ３を認識しなかった。このような抗体は、いずれも２０８番目のみ又は２１３番目のみがリン酸化されたＳｍａｄ３のいずれかを認識していた。
【００８２】
（４）抗リンカー部セリンリン酸化Ｓｍａｄ３抗体産生クローンの樹立
さらにリン酸化部位特異的なクローンの樹立を行うため開発を鋭意進め、最終的に１つのクローンを樹立し、５Ａ１１と名づけた。この得られたクローンの反応特異性の検討を行った。
【００８３】
（５）抗リンカー部セリンリン酸化Ｓｍａｄ３抗体産生クローン（５Ａ１１抗体）のＥＬＩＳＡ分析及びウエスタンブロット分析
得られた５Ａ１１抗体の結合特性を評価するため、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットによる分析を行った。各種Ｓｍａｄ３ペプチドを固相し、５Ａ１１抗体を反応させた。ＥＬＩＳＡの結果を図２に示す。本図に示す通り、５Ａ１１抗体は２１３番目のセリンを特異的に認識する抗体であることが確認された。また、Ｓｍａｄ３非リン酸化（ＥＰＳＭ）、Ｓｍａｄ３ リン酸化（Ｗ.Ｔ.）をＣＯＳ細胞に発現させた細胞を用いてウエスタンブロット解析を行った。ウエスタンブロットの結果を図３に示す。その結果、５Ａ１１はＣＯＳ細胞発現系での発現をウエスタンブロットで確認できる程度に結合力が強いことが確認された。またリンカー部のリン酸化がおこらないＳｍａｄ３非リン酸化（ＥＰＳＭ）を発現させた細胞には反応しないことが確認された。
【００８４】
（６）抗リンカー部スレオニンリン酸化Ｓｍａｄ３抗体産生クローンの樹立
上記（３）および（４）で示した抗リンカー部セリンリン酸化Ｓｍａｄ３抗体産生の作製及びクローンの樹立と同様の方法を用いて、リンカー部スレオニンリン酸化部位特異的なクローンの樹立を行うため開発を鋭意進め、最終的に１つのクローンを樹立し、１Ａ１と名づけた。この得られたクローンの反応特異性の検討を行った。
（７）クローン１Ａ１抗体のＥＬＩＳＡ分析及びウエスタンブロット分析
抗原固相ＥＬＩＳＡにより１Ａ１抗体とリン酸化された各ペプチドＳｍａｄ３との反応性を測定した。結果を図４に示す。１Ａ１は１７９番目のスレオニンがリン酸化されたＳｍａｄ３を認識し、かつ、１７９番目のスレオニンがリン酸化されていないＳｍａｄ３を認識しなかった。
また、得られたクローンの結合特性を評価するため、ウエスタンブロットによる分析を行った。Ｓｍａｄ３非リン酸化（ＥＰＳＭ）、Ｓｍａｄ３ リン酸化（Ｗ.Ｔ.）をＣＯＳ細胞に発現させた細胞を用いてウエスタンブロット解析を行った。ウエスタンブロットの結果を図５に示す。その結果、１Ａ１はＣＯＳ細胞発現系での発現をウエスタンブロットで確認できる程度に結合力が強いことが確認された。またリンカー部のりん酸化がおこらないＳｍａｄ３（ＥＰＳＭ）を発現させた細胞には反応しないことが確認された。
【００８５】
（実施例２）抗リンカー部リン酸化Ｓｍａｄ３抗体の特異性解析
抗原として、リン酸化された種々の各Ｓｍａｄ３ペプチドを固相した後、上記で得られた５Ａ１１抗体および１Ａ１抗体を反応させ、洗浄後、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧを反応させ、洗浄後基質液を加えて得られる発色強度の確認により、リン酸化された各Ｓｍａｄ３ペプチドとの反応特異性を判定した。結果を表２に示す。＋が反応している事を示す。
【００８６】
【表２】
2013234156.tif 000003
【００８７】
（実施例３）抗体配列決定
５Ａ１１抗体及び１Ａ１抗体の遺伝子配列を決定するため、重鎖（以下、「Ｈｃ」という）及び軽鎖（以下、「Ｌｃ」という）のクローニングを行った。各抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製した。常法に従って、５’−Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ（５’−ＲＡＣＥ）を行い、Ｈｃ及びＬｃ遺伝子の５’末端の塩基配列を決定した。Ｈｃ、Ｌｃに特異的なプライマーを使用して、それぞれの全長ｃＤＮＡをクローニングした。決定された５Ａ１１のＨｃ及びＬｃの遺伝子配列は、配列番号４及び配列番号６、アミノ酸配列は、配列番号５及び配列番号７にそれぞれ記載の通りであった。また、決定された１Ａ１のＨｃ及びＬｃの遺伝子配列は、配列番号１８及び配列番号２０、アミノ酸配列は、配列番号１９及び配列番号２１にそれぞれ記載の通りであった。
【００８８】
クローニングした抗体のＨｃ及びＬｃ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｖ７９０−２０）に組み込むことにより発現ベクターを作製し、一過性発現試験により発現を確認した。Ｌｃ発現ベクターのみ、又は、Ｈｃ発現ベクター及びＬｃ発現ベクターの両方をＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１５７３）にトランスフェクションした。無血清のＭｅｄｉａ培地（株式会社免疫生物研究所）中で２日間培養後、培養上清及び細胞を回収した。培養上清は１０倍濃度に限外濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行った。ゲルをＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア，ＩＰＶＨ０００１０）に転写後、５Ａ１１抗体は、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７５０４）, 1Ａ１抗体は、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７５０４）と抗マウス・ラムダ  標識抗体  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ，  ７３１８９１）にて検出した。
【００８９】
結果を図６Ａ，Ｂに示す。細胞ペレット  （Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ）及び培養上清（Ｓｕｐ（ｘ１０））においてＨｃ及びＬｃの発現が確認された。
【００９０】
（実施例４）免疫染色
（１）ヒト肝臓組織の調製
インフォームドコンセントの下、大腸癌が肝臓に転移した患者の手術後の肝臓組織を実験に使用した。
【００９１】
（２）免疫染色の実施
大腸癌が肝臓に転移した患者から得たホルマリン固定パラフィン包埋切片を、常法に従ってミクロトーム上で５μｍ厚に切断した。
切片からパラフィンを定法により除去、水和させ、トリス塩酸緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で洗浄後、内因性の過酸化を防ぐため、３％過酸化水素含有メタノール中で１０分間静置処理した。水で洗浄後、切片を市販の抗原賦活溶液（ＤＡＫＯ社）に浸したまま、圧力鍋に入れて電子レンジで、予熱１０分した後、１５分加熱し、３０分室温で放置した。ＴＢＳＴで洗浄後、１％ＢＳＡで切片をブロッキング操作を１０分間行った。ＴＢＳＴで軽く洗浄後、第一抗体として、５Ａ１１抗体（２〜５μｇ／ｍＬ濃度）および１Ａ１抗体（１〜２μｇ／ｍＬ濃度）と共に４℃で一晩静置反応した。ＴＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、ＥＮＶＩＳＩＯＮキット/ＨＲＰ(ＤＡＢ) Ｒａｂｂｉｔ/Ｍｏｕｓｅ (ＤＡＫＯ ＃Ｋ５０２７)と共に室温で６０分間静置反応した。ＴＢＳＴで洗浄後、免疫反応性は、３，３’−ジアミノベンジジン（シグマ社）を色原体として使用し可視化した。またヘマトキシリンで対比核染色した。最終的に脱水、透徹、封入を行い顕鏡に供した。
【００９２】
（３）結果
結果を図７に示す。
【図１】
2013234156.tif 000004
【図２】
2013234156.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
2013234156.tif 000008
【図６】
2013234156.tif 000009
【図７】
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【配列表】
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