(57)【要約】【課題】血清型によらず、腸管出血性大腸菌全般を選択的に検出できる培地を提供することにある。【解決手段】（ａ）セフィキシム、（ｂ）亜テルル酸塩、（ｃ）胆汁酸又はその塩、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）乳糖、及び（ｆ）ニュートラルレッド０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ（検出時の濃度）を含有する腸管出血性大腸菌検出用培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）セフィキシム、（ｂ）亜テルル酸塩、（ｃ）胆汁酸又はその塩、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）乳糖、及び（ｆ）ニュートラルレッド０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ（検出時の濃度）を含有する腸管出血性大腸菌検出用培地。
【請求項２】
（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質が、青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルピラノシド又はβ−セロビオシドである請求項１記載の腸管出血性大腸菌検出用培地。
【請求項３】
請求項１又は２記載の培地に検体を接種し、培養後ピンク色のコロニーを検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌を他の大腸菌と区別して検出し得る培地及び腸管出血性大腸菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌Ｏ１５７をはじめとする腸管出血性大腸菌はベロ毒素を産生する大腸菌の血清型の一種であり、一般的に食中毒の原因となる細菌として知られており、また本食中毒は重篤化することがあることから、本細菌の制御は食品衛生及び安全の点からも重要である（非特許文献１）。
【０００３】
腸管出血性大腸菌の選択分離培地としてはセフィキシム及び亜テルル酸カリウムを添加したマッコンキー基礎寒天培地に特定の糖を加えた培地、すなわちＯ１５７の場合にはソルビトールを利用できないのでソルビトールを添加し、発育してきたコロニーのうち糖利用反応を認めない無色のコロニーを腸管出血性大腸菌Ｏ１５７として分離する、同様にＯ１１１及びＯ２６の場合にはソルボース、ラムノースをそれぞれ添加し同様に糖利用反応を認めないコロニーを分離するといったものが古くから用いられてきた。この場合には目的とする細菌のコロニーに検出可能な反応が見られず、目的以外のコロニーに検出可能な反応が発生するため目的菌のコロニーが見難くなる。
【０００４】
一方で近年では検出可能な色原体化合物を有する酵素基質により腸管出血性大腸菌に特異的な酵素を指標とし、腸管出血性大腸菌を検出できる培地が種々開発されている（非特許文献２、３及び特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０００−５０８１７６号公報
【特許文献２】特開２０１０−２３３５６５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】食品衛生検査指針  微生物編  厚生労働省監修  社団法人  日本食品衛生協会  １６８−１７９頁、２００４年６月３０日。
【非特許文献２】Ｄｉｆｃｏ  ＆  ＢＢＬ  Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ  ２００３，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ３４０−３４２頁。
【非特許文献３】極東製薬株式会社  ＣＩＸ寒天培地パンフレット。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの検出可能な色原体化合物を有する酵素基質の添加による腸管出血性大腸菌の培地ではＯ１５７、Ｏ１１１、Ｏ２６といった主要な腸管出血性大腸菌の血清型を推定的に鑑別することが出来る培地であるが、複数の色原体化合物を有する酵素基質を使用する必要があり、非常に高価である。更にこれらの培地において３種の菌の性状のうち２種は同系色のコロニーを形成するため一概にして３種を鑑別できるとは言い難い。また、食品を検体とする検出培地としては、血清型の鑑別は重要ではなく、検体食品中に食中毒を生じる可能性のある腸管出血性大腸菌が存在するか否かが最重要である。
従って、本発明の課題は、血清型によらず、腸管出血性大腸菌全般を選択的に検出できる培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、高価な色原体化合物を有する酵素基質を１種のみ使用して、腸管出血性大腸菌全般を他の大腸菌群と区別して検出可能な培地を開発すべく種々検討した結果、セフィキシム及び亜テルル酸塩を添加した栄養培地に、胆汁酸又はその塩、青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、乳糖、及び特定濃度のニュートラルレッドを添加した培地を用いれば、血清型にかかわらず腸管出血性大腸菌を明瞭なピンク色のコロニーとして検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、（ａ）セフィキシム、（ｂ）亜テルル酸塩、（ｃ）胆汁酸又はその塩、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）乳糖、及び（ｆ）ニュートラルレッド０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ（検出時の濃度）を含有する腸管出血性大腸菌検出用培地を提供するものである。
また、本発明は、上記の培地に検体を接種し、培養後ピンク色のコロニーを検出することを特徴とする腸管出血性大腸菌の検出方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地を用いれば、食中毒の原因となる腸管出血性大腸菌が、血清型にかかわらず、他の大腸菌群と区別して、ピンク色のコロニーとして明確に検出できる。従って、広範囲な飲食品中の腸管出血性大腸菌が簡便かつ速やかに検出可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の腸管出血性大腸菌検出用培地は、（ａ）セフィキシム、（ｂ）亜テルル酸塩、（ｃ）胆汁酸又はその塩、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）乳糖、及び（ｆ）ニュートラルレッド０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ（検出時の濃度）を含有する。
【００１２】
（ａ）セフィキシムはプロテウスやモルガネラ等の発育を抑制し、（ｂ）亜テルル酸塩は腸管出血性大腸菌以外の大腸菌やアエロモナス等の発育を抑制するため、腸管出血性大腸菌の分離に重要である。亜テルル酸塩としては、亜テルル酸ナトリウム、亜テルル酸カリウム等の亜テルル酸アルカリ金属塩が好ましい。セフィキシムは本発明培地中の検出時の濃度として０．０１〜０．５ｍｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．０１〜０．１ｍｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。亜テルル酸塩は本発明培地中の検出時の濃度として０．１〜１０ｍｇ／Ｌ含有するのが好ましく、１〜８ｍｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１３】
（ｃ）胆汁酸又はその塩は、グラム陽性菌を抑制し、また形成したコロニーを赤色系にすることにより、腸管出血性大腸菌のピンク色のコロニーを検出しやすくする作用を有する。胆汁酸としては、コール酸、デオキシコール酸が挙げられる。胆汁酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。（ｃ）胆汁酸又はその塩は、グラム陽性菌の抑制及び腸管出血性大腸菌のコロニーの呈色性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．５〜１０ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、１〜５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１４】
（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質は、腸管出血性大腸菌以外の細菌を色原体化合物に依存する青色のコロニーを形成させて排除するために必要である。大腸菌以外の大腸菌群はβ−グルコシダーゼを産生するので、検体中に大腸菌以外の大腸菌群が含まれれば基質が分解され、青色の色原体化合物が遊離する。これらの基質に含まれる青色の色原体化合物としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール、５−ブロモ−３−インドール、６−ブロモ−２−ナフトール、２−メチル−３−インドール、６−クロロ−３−インドール等が挙げられる。また、β−グルコシダーゼ基質としては、β−グルコピラノシド又はβ−セロビオシドが好ましい。（Ｂ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質の具体例として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、１−メチル−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−セロビオシド、１−メチル−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシドなどが挙げられる。
（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質は腸管出血性大腸菌以外の細菌のコロニーの呈色性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．０１〜１ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１５】
（ｅ）乳糖は、腸管出血性大腸菌を含む大腸菌群が資化しうる糖であり、腸管出血性大腸菌を含む大腸菌群を選択的に増殖させ、コロニーの呈色を良好にする上で重要である。本発明培地の検出時の濃度として５〜２０ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、７．５〜１５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１６】
（ｆ）ニュートラルレッドは胆汁酸又はその塩とともに形成したコロニーの色を赤色系にすることにより、腸管出血性大腸菌のコロニーを検出しやすくする作用を有する。（ｆ）ニュートラルレッドは腸管出血性大腸菌のコロニーの呈色性の点から、本発明培地の検出時の濃度として０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。一般的に培地に使用されている含有量である０．０２〜０．０３ｇ／Ｌの場合には培地全体が赤色系になってしまうため、コロニーの検出性が悪化する。
【００１７】
本発明においては、青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を検出対象である腸管出血性大腸菌のコロニーを呈色させる目的でなく、検出対象である腸管出血性大腸菌以外の菌を呈色させる目的で用い、これに乳糖、胆汁酸又はその塩及びニュートラルレッドを併用することにより、検出対象である腸管出血性大腸菌をピンク色のコロニーとして検出できる。すなわち、セフィキシム及び亜テルル酸カリウムを添加した栄養培地に腸管出血性大腸菌を含む大腸菌群に特異的である乳糖を加える事により発育した腸管出血性大腸菌及びセフィキシム及び亜テルル酸カリウムに耐性の腸管出血性大腸菌以外の大腸菌群は胆汁酸及びニュートラルレッドとの反応により全てピンク色のコロニーを形成する。これを回避するために大腸菌が利用できずその他の大腸菌群が利用できる青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を加えることにより、腸管出血性大腸菌はピンク色集落を形成するが、セフィキシム及び亜テルル酸カリウムに耐性の腸管出血性大腸菌以外で発育しうる菌において、ピンク色の集落の着色が消失し、且つ加えたβ−グルコシダーゼ基質由来の色原体に起因する発色も消失することを認めた。その結果目的菌である腸管出血性大腸菌のコロニーのみピンク色となり、それ以外の菌について発育するものにおいてはほぼ無色のコロニーを形成することを認めた。このとき本培地自体はニュートラルレッドを含んでいるが無色透明であるため腸管出血性大腸菌のコロニーの鑑別が容易である。
【００１８】
本発明培地には上記成分の他、栄養成分、無機塩、ｐＨ調整剤等を配合することが出来る。
【００１９】
栄養成分としては、ペプトン、獣肉エキス、酵母エキス、魚肉エキス等が好ましい。無機塩類としては塩化ナトリウム等の無機酸金属塩、クエン酸ナトリウムなどの有機酸金属塩などが挙げられる。
【００２０】
また、本発明培地は、ニュートラルレッドの呈色性とピンク色のコロニーの検出性の点から、検出時のｐＨが７．０以上であるのが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０であるのがより好ましい。
【００２１】
また、本発明培地には、検出可能なβ−グルクロニダーゼ基質を加える事により、腸管出血性大腸菌の中で最も検出頻度が高いＯ１５７を推定的に検出することも可能である。
【００２２】
本発明培地を用いて、被検体中の腸管出血性大腸菌を検出するには、当該培地に検体を接種して２５〜４０℃、２４〜４８時間培養した後に、コロニーの呈色を観察すればよい。
【００２３】
本発明培地に適用される検体としては、肉類、魚介類などの生鮮食料品、便などの臨床検体、海水、調理場、病院などのふき取り検体等が挙げられるが、これらの検体を予めトリプトソーヤブイヨン培地で培養した培養液や更にこれを増菌用培地で培養した培養液も用いることができる。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）培地の作製
各培地組成を表１に示した。
本発明培地は１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１００℃、２０分間加温溶解し、約５０℃になるまで冷却後、セフィキシム及び亜テルル酸カリウムを加えよく混合した後プラスチックシャーレ（９０φｍｍ）に２０ｍｌずつ分注して培地が固まるまで静置し本発明の腸管出血性大腸菌検出用培地を作製した。
陽性コントロールとしてトリプトソイ寒天培地（ＴＳＡ）は１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌し良く撹拌後、プラスチックシャーレ（９０φｍｍ）に２０ｍｌずつ分注して培地が固まるまで静置した。
【００２５】
【表１】
2013116087.tif 000002
【００２６】
（２）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイ寒天培地で２４時間前培養したものを供試菌として用い、これを白金線を用いて画線塗抹により接種し、３５℃、２４時間培養後のコロニー色調を確認した。
結果を表２及び表３に示す。表中、ＴＳＡはトリプケース・ソイブイヨン培地を示す。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
本発明培地において腸管出血性大腸菌を含む各供試菌株の発育を確認したところ、本発明培地は腸管出血性大腸菌のみをピンク色の有色コロニーとして検出でき、それ以外の発育した菌については黄緑色のコロニーとして排除できることを認めた。またβ−グルコシダーゼ基質としてβ−グルコピラノシド、β−セロビオシドのいずれを用いても腸管出血性大腸菌とそれ以外の菌を明瞭に鑑別できることを認めた。
【００２９】
【表３】
2013116087.tif 000004
【００３０】
本発明培地のニュートラルレッド濃度を検討したところ、ニュートラルレッドを加えない場合には腸管出血性大腸菌のコロニーの発色が認められないため鑑別しにくくなる。また通常一般的に使用される濃度である０．０２ｇ／Ｌでは各発育菌株のコロニー性状は変わらないが、培地色調が赤色であるため、発育した菌のコロニー色調が見づらくなる。一方、その約１０分の１量である０．００２５ｇ／Ｌまで低下させると培地色が透明であるにも拘らず、腸管出血性大腸菌の明瞭な集落の着色が認められた。０．００１ｇ／Ｌまで濃度を低下させると腸管出血性大腸菌のコロニーの着色が薄くなりすぎることが認められた。従って、本発明培地にニュートラルレッドを加える場合には、ニュートラルレッド濃度を０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ、特に０．００２〜０．００６ｇ／Ｌにすることで培地が無色透明となり同時に着色集落が明瞭に確認できることを見出した。またニュートラルレッドは酸性ｐＨでは赤色を呈する性質があり、本培地における現象は培地ｐＨが７．０以上であることが重要であり、これを下回ると培地色が赤色を呈するようになってしまう。