(57)【要約】【課題】アミロイドβとの特異的結合性に優れたアミロイドβ結合性材料、および、該結合性材料を用いたセンサ素子を提供すること。【解決手段】本発明は、糖、または、該糖に由来する糖残基を含むアミロイドβ結合性材料であって、前記糖または前記糖残基は、アミロイドβの１３番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１３）または１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１４）と特異的に結合することを特徴とするアミロイドβ結合性材料である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖、または、該糖に由来する糖残基を含むアミロイドβ結合性材料であって、
前記糖または前記糖残基は、アミロイドβの１３番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１３）または１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１４）と特異的に結合することを特徴とするアミロイドβ結合性材料。
【請求項２】
前記糖のヒドロキシ基のうち、少なくとも１つがヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基で置換されている、請求項１に記載のアミロイドβ結合性材料。
【請求項３】
前記糖のヒドロキシ基のうち、２以上がヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基で置換されている、請求項２に記載のアミロイドβ結合性材料。
【請求項４】
前記官能基は、スルホ基、スルホ基の塩、または、カルボキシル基である、請求項２または３に記載のアミロイドβ結合性材料。
【請求項５】
前記糖は六員環構造を有する、請求項１〜４のいずれかに記載のアミロイドβ結合性材料。
【請求項６】
前記糖または前記糖残基は、水素結合または静電的相互作用によってＨｉｓ１３またはＨｉｓ１４の側鎖に結合する、請求項１〜５のいずれかに記載のアミロイドβ結合性材料。
【請求項７】
センサ素子に固定化するためのリンカー部を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のアミロイドβ結合性材料。
【請求項８】
金属からなる空隙配置構造体を備えるセンサ素子であって、前記空隙配置構造体の表面に請求項１に記載のアミロイドβ結合性材料が固定化されていることを特徴とするセンサ素子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβ結合性材料およびそれを用いたセンサ素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドβは、アルツハイマー病の発症メカニズムに関連するタンパク質として知られている。このため、アルツハイマー病のスクリーニング検査において、アミロイドβを検出することのできる方法の確立が望まれている。
【０００３】
すでに、アミロイドβの検出法として、各種のアミロイドβとの結合性を有する材料を用いる方法が検討されている。例えば、特許文献１（特開２００８−１０１９４９号公報）には、アミロイドβと親和性の高い糖残基の種類が開示されており、このような糖残基が固定化された電極を用いた電気化学的測定方法により、アミロイドβを測定する方法が開示されている。
【０００４】
しかし、特許文献１に記載された糖残基は、レクチンやウィルス検出用の糖鎖高分子等と比べれば、結合性が必ずしも十分ではない。このため、アミロイドβの検出感度を実用的なレベルに高めるためには、より優れたアミロイドβとの特異的結合性を有する結合性材料の提供が望まれていた。
【０００５】
なお、上述の糖残基がアミロイドβのどのアミノ酸残基と結合するのか、糖残基の中でどの構造がアミロイドβと結び付きやすいのか、といった傾向はこれまで分かっていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１０１９４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アミロイドβとの特異的結合性に優れたアミロイドβ結合性材料、および、該結合性材料を用いたセンサ素子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、糖、または、該糖に由来する糖残基を含むアミロイドβ結合性材料であって、
前記糖または前記糖残基は、アミロイドβの１３番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１３）または１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１４）と特異的に結合することを特徴とするアミロイドβ結合性材料である。
【０００９】
前記糖のヒドロキシ基のうち、少なくとも１つがヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基で置換されていることが好ましい。前記糖のヒドロキシ基のうち、２以上がヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基で置換されていることがより好ましい。
【００１０】
前記官能基は、スルホ基、スルホ基の塩、または、カルボキシル基である、ことが好ましい。また、前記糖は六員環構造を有することが好ましい。
【００１１】
前記糖または前記糖残基は、水素結合または静電的相互作用によってＨｉｓ１３またはＨｉｓ１４の側鎖に結合することが好ましい。
【００１２】
上記アミロイドβ結合性材料は、センサ素子に固定化するためのリンカー部を有することが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、金属からなる空隙配置構造体を備えるセンサ素子であって、前記空隙配置構造体の表面に上記のアミロイドβ結合性材料が固定化されていることを特徴とするセンサ素子にも関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、アミロイドβとの特異的結合性に優れたアミロイドβ結合性材料、および、該結合性材料を用いたセンサ素子を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のセンサ素子を用いた測定装置の一例の全体構造を模式的に示す図である。
【図２】実施例１の計算結果を示すグラフである。
【図３】空隙配置構造体の構造を示す図である。
【図４】空隙配置構造体に電磁波を照射した場合の周波数−透過率特性を示すグラフである。
【図５】αヘリックスＡβと糖Ｉとの結合状態を示す構造図である。
【図６】αヘリックスＡβと糖ＩＩとの結合状態を示す構造図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、アミロイドβ（Ａβ）は、４２アミノ酸残基からなるＡβ４２あるいは４０アミノ酸残基からなるＡβ４０であり、そのアミノ酸配列は：
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ
あるいは
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ
である。
【００１７】
本発明者らの研究により、特許文献１に記載されたアミロイドβと親和性の高い糖残基は、アミロイドβの１３番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１３）または１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン残基（Ｈｉｓ１４）に対して強く結合する傾向があることが判明した。かかる知見に基づいて、アミロイドβのＨｉｓ１３またはＨｉｓ１４と特異的に結合する糖または該糖に由来する糖残基を含む結合性材料である本発明に到達した。
【００１８】
ヒスチジンは側鎖にイミダゾイル基を有することから、塩基性アミノ酸に分類される。このため、アミロイドβのＨｉｓ１３またはＨｉｓ１４と特異的に結合する糖としては、酸性基を増加させた糖が挙げられる。具体的には、ヒドロキシ基のうち、少なくとも１つがヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基で置換されている糖が挙げられる。糖のヒドロキシ基のうち、２以上がヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基で置換されていることが好ましい。
【００１９】
ヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基としては、例えば、スルホ基、スルホ基の塩、または、カルボキシル基が挙げられ、好ましくはスルホ基の塩である。糖の骨格は特に限定されないが、六員環構造を有することが好ましい。
【００２０】
糖のヒドロキシ基の一部は、ヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基以外の官能基で置換されていてもよい。ヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基以外の官能基としては、例えば、アセチルアミノ基が挙げられる。例えば、グルコースの２位のヒドロキシル基がアセチルアミノ基に置換されたにＮ−アセチルグルコサミンを用いる場合は、ヒドロキシ基をヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基で置換してもよく、アセチルアミノ基のアセチル基をヒドロキシ基より強い酸性を示す官能基に置換してもよい。
【００２１】
このようなアミロイドβのＨｉｓ１３またはＨｉｓ１４と特異的に結合する糖に由来する糖残基の具体例としては、以下の化学式で示される糖残基が挙げられる。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
【化２】
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【００２４】
【化３】
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【００２５】
【化４】
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【００２６】
【化５】
2013116856.tif 000007
【００２７】
【化６】
2013116856.tif 000008
【００２８】
【化７】
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【００２９】
【化８】
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【００３０】
上記の糖または糖残基は、水素結合または静電的相互作用によってアミロイドβのＨｉｓ１３またはＨｉｓ１４の側鎖に結合することが好ましい。水素結合は、水溶液中の水分子を介した水素結合であってもよい。また、静電的相互作用は、水溶液中のイオンを介して生じるものであってもよい。
【００３１】
本発明の結合性材料は、上記糖および該糖に由来する糖残基以外に、必要に応じて種々の構成材料を含んでいてもよく、例えば、アミロイドβ結合性材料をセンサ素子を構成する空隙配置構造体等に固定化するためのリンカー部を有することができる。例えば、リンカー部が末端にチオール基を有している場合、金から構成される空隙配置構造体等の表面にアミロイドβ結合性材料を結合させることができる。また、リンカー部が末端にヒドロキシ基（−ＯＨ）やカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有している場合、ニッケルから構成される空隙配置構造体等の表面にアミロイドβ結合性材料を結合させることができる。
【００３２】
（センサ素子）
上記アミロイドβ結合性材料は、例えば、アミロイドβの検出に使用可能な各種のセンシング技術に用いられるセンサ素子等に固定化される。そして、例えば、該センサ素子に固定化されたアミロイドβ結合性材料を介してアミロイドβを付着させた状態でセンシングが行われる。センサ素子の具体例としては、例えば、金属からなる空隙配置構造体を備えるセンサ素子であって、該空隙配置構造体の表面にアミロイドβ結合性材料が固定化されているセンサ素子が挙げられる。
【００３３】
図１は、本発明のセンサ素子を用いた測定装置の一例の全体構造を模式的に示す図である。この測定装置は、レーザ２（例えば、短光パルスレーザ）から照射されるレーザ光を半導体材料に照射することで発生する電磁波（例えば、２０ＧＨｚ〜１２０ＴＨｚの周波数を有するテラヘルツ波）パルスを利用するものである。
【００３４】
図１の構成において、レーザ２から出射したレーザ光を、ハーフミラー２０で２つの経路に分岐する。一方は、電磁波発生側の光伝導素子７１に照射され、もう一方は、複数のミラー２１（同様の機能のものは付番を省略）を用いることで、時間遅延ステージ２６を経て受信側の光伝導素子７２に照射される。光伝導素子７１、７２としては、ＬＴ−ＧａＡｓ（低温成長ＧａＡｓ）にギャップ部をもつダイポールアンテナを形成した一般的なものを用いることができる。また、レーザ２としては、ファイバー型レーザやチタンサファイアなどの固体を用いたレーザなどを使用できる。さらに、電磁波の発生、検出には、半導体表面をアンテナなしで用いたり、ＺｎＴｅ結晶の様な電気光学結晶を用いたりしてもよい。ここで、発生側となる光伝導素子７１のギャップ部には、電源３により適切なバイアス電圧が印加されている。
【００３５】
発生した電磁波は放物面ミラー２２で平行ビームにされ、放物面ミラー２３によって、空隙配置構造体１に照射される。空隙配置構造体１を透過したテラヘルツ波は、放物面ミラー２４，２５によって光伝導素子７２で受信される。光伝導素子７２で受信された電磁波信号は、アンプ６で増幅されたのちロックインアンプ４で時間波形として取得される。そして、算出手段を含むＰＣ（パーソナルコンピュータ）５でフーリエ変換などの信号処理された後に、空隙配置構造体１の透過率スペクトルなどが算出される。ロックインアンプ４で取得するために、発振器８の信号で発生側の光伝導素子７１のギャップに印加する電源３からのバイアス電圧を変調（振幅５Ｖ〜３０Ｖ）している。これにより同期検波を行うことでＳ／Ｎ比を向上させることができる。
【００３６】
なお、以上に説明した測定方法は、一般にテラヘルツ時間領域分光法（ＴＨｚ−ＴＤＳ）と呼ばれる方法であるが、その他、フーリエ変換型赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）等の計測方法を用いることも可能である。
【００３７】
空隙配置構造体にアミロイドβ結合性材料を直接固定化する場合、空隙配置構造体を構成する金属としては、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシル基などの官能基を有する化合物の官能基と結合することのできる金属や、ヒドロキシ基、アミノ基などの官能基を表面にコーティングできる金属、ならびに、これらの金属の合金を挙げることができる。具体的には、金、白金、パラジウム、ニッケル、チタン、クロム、シリコン、ゲルマニウムなどが挙げられ、好ましくは金、パラジウム、ニッケル、チタンである。金、パラジウムを用いた場合、特にアミロイドβ結合性材料がチオール基（−ＳＨ基）を有する場合に該チオール基を空隙配置構造体の表面に結合させることができるため有利である。また、ニッケル、チタンを用いた場合、特にアミロイドβ結合性材料がヒドロキシ基（−ＯＨ）やカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する場合に該官能基を空隙配置構造体の表面に結合させることができるため有利である。
【００３８】
本発明のセンサ素子を用いることにより、例えば、金属からなる空隙配置構造体において前方分散（透過）した電磁波の周波数特性に生じたディップ波形や、後方分散（反射）した電磁波の周波数特性に生じたピーク波形などが、被測定物（アミロイドβ）の存在により変化することに基づいて、アミロイドβを検出することができる。
【００３９】
ここで、ディップ波形とは、照射した電磁波に対する検出した電磁波の比率（例えば、電磁波の透過率）が相対的に大きくなる周波数範囲において、空隙配置構造体の周波数特性（例えば、透過率スペクトル）に部分的に見られる谷型（下に凸）の部分の波形である。また、ピーク波形とは、照射した電磁波に対する検出した電磁波の比率（例えば、電磁波の反射率）が相対的に小さくなる周波数範囲において、空隙配置構造体の周波数特性（例えば、反射率スペクトル）に部分的に見られる山型（上に凸）の波形である。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１）
アミロイドβのどのアミノ酸残基が糖との結合に重要であるかを明らかにするため、アミロイドβを構成する各アミノ酸残基と糖との間の相互作用エネルギーを、第一原理フラグメント分子軌道（ＦＭＯ）法により高精度に解析した。
【００４２】
本実施例では、アミロイドβ（Ａβ）としてはαヘリックス構造を有するもの（以下、「αヘリックスＡβ」と略す。）を用いた。また、糖として、上記化学式（７）、（８）で示される糖残基に相当する２種類の単糖（以下、それぞれ糖Ｉ、糖IIと呼ぶ）を用いた。
【００４３】
αヘリックスＡβと糖Ｉ、αヘリックスＡβと糖IIの複合体のそれぞれにおける最安定構造に対し、ＦＭＯ計算により、Ａβの各アミノ酸残基と糖間のInteraction energy（I.E.）を計算した。計算結果をまとめたグラフを図２に示す。
【００４４】
図２上段に示されるように、αヘリックスＡβと糖Ｉの組み合わせにおいては、Ｈｉｓ１３（１３番目のアミノ酸残基であるヒスチジン）、Ｌｅｕ３４（３４番目のアミノ酸残基であるロイシン）と糖Ｉの間でI.E.が大きいことが分かる。（Ｉ．Ｅ．が負の場合は引力的、正の場合は斥力的。）なお、糖Ｉ周囲の構造を解析したところ、糖ＩとＨｉｓ１３の間、および、糖ＩとＬｅｕ３４とＧｌｙ３３の間のバックボーンの酸素原子との間にそれぞれ１本の水素結合が形成されていることが確認された（図５参照）。
【００４５】
一方、図２下段に示されるように、αヘリックスＡβと糖IIの組み合わせにおいては、Ｈｉｓ１４（１４番目のアミノ酸残基であるヒスチジン）、Ａｌａ４２（４２番目のアミノ酸残基であるアラニン）と糖II間のI.E.が大きいことが分かる。なお、糖II周辺の構造を解析したところ、糖IIとＨｉｓ１４の間で３箇所、糖IIとＡｌａ４２の間で２箇所の水素結合が形成されていることが確認された（図６参照）。
【００４６】
図２の結果から、糖Ｉと糖IIに共通する傾向として、アミノ酸残基の１３番目と１４番目の付近が糖との結合において重要であり、この位置のヒスチジン残基と糖の結合性が重要であると考えられる。なお、糖Ｉと糖IIで、αヘリックスＡβとのＩ．Ｅ．が変化する原因は、糖Ｉとアミロイドβの末端のＡｌａ４２は反発するが（図２上段）、糖IIはＡｌａ４２と引力相互作用が働いている（図２下段）ことなど、結合性が異なる為であると考えられる。
【００４７】
（実施例２）
実施例１では、糖のヒドロキシ基の１つ乃至２つがスルホ基の塩に置換された糖Ｉ、糖IIについて検討を行った。一方、本実施例では、上記化学式（１）〜（８）で表される６つの糖残基に相当する単糖（それぞれを順に糖Ａ〜Ｈと呼ぶ）について、末端にチオール基を有するリンカー部を用いて、Ａｕ表面を有する空隙配置構造体の表面上に固定化し、Ａβ４２との結合による空隙配置構造体に特性変化をセンシングすることで、Ａ〜ＨのＡβ４２との特異吸着性能を調べる実験を行なった。
【００４８】
図３に、空間配置構造体１の外形を示す。１０ａは空隙配置構造体１の主面を表し、１１が空隙部である。空間配置構造体としては、ピッチｓ＝６．５μｍ、開口ｄ＝４．０μｍ、厚み１．５μｍのＮｉ製の構造体の表面にＡｕによるコーティングを施したものを使用した。
【００４９】
図４に、上記空間配置構造体の透過率の周波数特性例を示す。本実施例では、透過率のピーク周波数が約４０ＴＨｚになるものを使用した。空間配置構造体表面に物質が吸着した場合、その周波数特性は低周波側にシフトする。本実施例では、化合物１〜８によるＡβ４２の吸着時のピーク周波数シフトを観測・比較した。
【００５０】
末端にチオール基を有するリンカー部を修飾した化合物１〜８を用意し、各々、空間配置構造体表面にチオール＝金属結合を利用して固定化した。固定化が終わった空間配置構造体の透過率の周波数特性をＦＴ−ＩＲを用いて測定し、透過率のピーク周波数を求め、これを反応前特性とした。
【００５１】
反応前特性測定後の空間配置構造体を濃度１００［μｇ／ｍＬ］のＡβ４２溶液中に約８時間放置することで、Ａβ４２と化合物１〜８の特異吸着反応を行った。特異吸着反応後の空間配置構造体を洗浄・乾燥を行い、前述と同様に反応後特性を測定した。化合物１〜８について、周波数シフト量＝反応後特性−反応前特性を下表に示す。
【００５２】
【表１】
2013116856.tif 000011
【００５３】
この結果から、スルホ基の数が増えるに従って、周波数シフト量が増加、すなわちＡβ４２の特異吸着量が増加していることがわかる。
【００５４】
今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【００５５】
１  空隙配置構造体（センサ素子）、１０ａ  主面、１００  基本格子、１０１  突起部、１１  空隙部、２  レーザ、２０  ハーフミラー、２１  ミラー、２２，２３，２４，２５  放物面ミラー、２６  時間遅延ステージ、２７  波源、２８  観測面、３  電源、４  ロックインアンプ、５  ＰＣ（パーソナルコンピュータ）、６  アンプ、７１，７２  光電導素子、８  発振器。
【図１】
2013116856.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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