(57)【要約】【課題】検体中に含まれる肌診断用の複数の抗原を、抗原抗体反応を利用して、高感度にかつ迅速に検出することができる検出キット、および、およびかかる検出キットを用いて、肌診断用のための複数の項目を検査することができる検査方法を提供すること。【解決手段】本発明の検出キットは、検体５０中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出するために用いられ、検体５０を貯留するための複数の穴部を備える基材と、抗原を特異的に認識する特異抗体と、穴部の内面に吸着したポリマーとを有し、第１の穴部１１の内面には第１のポリマー３１を介して第１の特異抗体４１が担持され、第２の穴部の内面には第２のポリマーを介して第２の特異抗体が担持されており、第１の穴部１１において検体５０中に含まれる第１の抗原５１が第１の抗体４１に認識され、第２の穴部において検体５０中に含まれる第２の抗原が第２の抗体に認識されることにより検出される。【選択図】図２
2013228383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出するために用いられ、
前記検体を貯留するための複数の穴部を備える基材と、前記抗原を特異的に認識する特異抗体と、前記穴部の内面に吸着したポリマーとを有する検出キットであって、
複数の前記穴部のうち第１の穴部の内面には、第１のポリマーを介して、第１の特異抗体が担持され、第２の穴部の内面には、第２のポリマーを介して、第２の特異抗体が担持されており、
前記第１の穴部において、前記検体中に含まれる第１の抗原が、前記第１の抗体に認識されることにより検出され、前記第２の穴部において、前記検体中に含まれる第２の抗原が、前記第２の抗体に認識されることにより検出されることを特徴とする検出キット。
【請求項２】
前記第１の抗原は、ヒートショックプロテイン２７、アルギナーゼ１、マクロファージ遊走阻止因子またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子であり、前記第１のポリマーは、下記一般式（２Ｂ）で表される共重合体である請求項１に記載の検出キット。
【化１】
2013228383.tif 000014
（ただし、上記一般式（２Ｂ）において、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｎは、１〜１００の整数を示す。）
【請求項３】
前記第２の抗原は、ヒートショックプロテイン２７またはプロフィリン１であり、前記第２のポリマーは、下記一般式（５Ａ）で表される共重合体である請求項１または２に記載の検出キット。
【化２】
2013228383.tif 000015
（ただし、上記一般式［５Ａ］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１つはアルコキシシリル基であり、その他はアルキル基を示す。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、１〜１００の整数を示す。）
【請求項４】
前記基材は、第３の穴部を有し、該第３の穴部の内面には、前記第１のポリマーを介して、第３の特異抗体が担持されている請求項１ないし３のいずれかに記載の検出キット。
【請求項５】
前記基材は、第４の穴部を有し、該第４の穴部の内面には、前記第２のポリマーを介して、第４の特異抗体が担持されている請求項１ないし４のいずれかに記載の検出キット。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれかに記載の検出キットを用意し、
前記第１の穴部および前記第２の穴部に、前記検体を、ほぼ同時に供給することにより、
前記第１の穴部における前記第１の抗原の検出と、前記第２の穴部における前記第２の抗原の検出とをほぼ同時に行い、
その結果に基づいて、肌診断用のための複数の項目を検査することを特徴とする検査方法。
【請求項７】
前記複数の項目は、シワ、肌ストレス、紫外線ストレスおよび弾力性のうちの少なくとも２つの項目である請求項６に記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中に含まれる肌診断用の抗原を検出する検出キットおよび検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
検体中に含まれる、肌診断用の抗原を検出して、検出された抗原の種類やその組み合わせに応じて、肌の状態を診断することが行われている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
従来、この肌診断用の抗原の検出には、通常、ウェスタンブロット法、免疫組織化学分析法、蛍光共鳴エネルギー遷移測定法等が用いられている。
【０００４】
しかしながら、これらの方法では、検体の採取から抗原の検出までに長時間を要し、迅速な肌診断を検体採取者に対して行うことができず、検体採取時における肌状態に応じた処置を施すことができないという問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２００７／０４６４６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、検体中に含まれる肌診断用の複数の抗原を、抗原抗体反応を利用して、高感度にかつ迅速に検出することができる検出キット、および、かかる検出キットを用いて、肌診断用のための複数の項目を検査することができる検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような目的は、下記（１）〜（７）に記載の本発明により達成される。
（１）  検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出するために用いられ、
前記検体を貯留するための複数の穴部を備える基材と、前記抗原を特異的に認識する特異抗体と、前記穴部の内面に吸着したポリマーとを有する検出キットであって、
複数の前記穴部のうち第１の穴部の内面には、第１のポリマーを介して、第１の特異抗体が担持され、第２の穴部の内面には、第２のポリマーを介して、第２の特異抗体が担持されており、
前記第１の穴部において、前記検体中に含まれる第１の抗原が、前記第１の抗体に認識されることにより検出され、前記第２の穴部において、前記検体中に含まれる第２の抗原が、前記第２の抗体に認識されることにより検出されることを特徴とする検出キット。
【０００８】
（２）  前記第１の抗原は、ヒートショックプロテイン２７、アルギナーゼ１、マクロファージ遊走阻止因子またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子であり、前記第１のポリマーは、下記一般式（２Ｂ）で表される共重合体である上記（１）に記載の検出キット。
【化１】
2013228383.tif 000003
（ただし、上記一般式（２Ｂ）において、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｎは、１〜１００の整数を示す。）
【０００９】
（３）  前記第２の抗原は、ヒートショックプロテイン２７またはプロフィリン１であり、前記第２のポリマーは、下記一般式（５Ａ）で表される共重合体である上記（１）または（２）に記載の検出キット。
【化２】
2013228383.tif 000004
（ただし、上記一般式［５Ａ］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１つはアルコキシシリル基であり、その他はアルキル基を示す。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｐ、ｑおよびｒは、それぞれ独立して、１〜１００の整数を示す。）
【００１０】
（４）  前記基材は、第３の穴部を有し、該第３の穴部の内面には、前記第１のポリマーを介して、第３の特異抗体が担持されている上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の検出キット。
【００１１】
（５）  前記基材は、第４の穴部を有し、該第４の穴部の内面には、前記第２のポリマーを介して、第４の特異抗体が担持されている上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の検出キット。
【００１２】
（６）  上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の検出キットを用意し、
前記第１の穴部および前記第２の穴部に、前記検体を、ほぼ同時に供給することにより、
前記第１の穴部における前記第１の抗原の検出と、前記第２の穴部における前記第２の抗原の検出とをほぼ同時に行い、
その結果に基づいて、肌診断用のための複数の項目を検査することを特徴とする検査方法。
【００１３】
（７）  前記複数の項目は、シワ、肌ストレス、紫外線ストレスおよび弾力性のうちの少なくとも２つの項目である上記（６）に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、検体中に含まれる肌診断用の複数の抗原を、抗原抗体反応を利用して、高感度にかつ迅速に検出することができる検出キットとすることができる。
【００１５】
さらに、本発明の検出キットを用いて、検体中に含まれる肌診断用の複数の抗原を検出することで、その検出結果に基づいて、肌診断用のための複数の項目を検査することができるため、適切な肌診断を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の検出キットに用いられる検出容器の好適実施形態を模式的に示す部分縦断面図である。
【図２】本発明の検査方法の好適実施形態を説明するための縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の検出キットおよび検査方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００１８】
＜検出容器＞
まず、本発明の検出キットの検出容器１について説明する。
【００１９】
図１は、本発明の検出キットに用いられる検出容器の好適実施形態を模式的に示す部分縦断面図である。
【００２０】
検出容器１は、検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出するために用いられるものであり、検体を貯留するための複数の穴部を備える基材と、抗原を特異的に認識する特異抗体と、穴部の内面に吸着したポリマーとを有するものである。
【００２１】
本実施形態では、基材１０に４つの穴部（ウェル）１１〜１４が設けられている。
この基材１０の構成材料としては、特に限定されず、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンのような直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィンおよび含フッ素樹脂等の樹脂材料が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
そして、これら穴部１１〜１４のうち、第１の穴部１１の底面（内面）２１には第１のポリマー３１が吸着し（担持され）ており、さらに、この第１のポリマー３１を介して、第１の特異抗体４１が担持されている。
【００２３】
また、第２の穴部１２の底面には第２のポリマーが吸着しており、さらに、この第２のポリマーを介して、第２の特異抗体が担持されている。
【００２４】
第３の穴部１３の底面には、図示しない、第１のポリマーが吸着しており、さらに、この第１のポリマーを介して、第３の特異抗体が担持されている。
【００２５】
さらに、第４の穴部１４の底面には、図示しない、第２のポリマーが吸着しており、さらに、この第２のポリマーを介して、第４の特異抗体が担持されている。
【００２６】
これにより、第１〜第４の穴部１１〜１４には、ポリマーを介して、それぞれ、第１〜第４の特異抗体が担持されることとなる。そのため、第１〜第４の穴部１１〜１４に検体を供給することにより、各特異抗体が特異的に認識する抗原が、特異抗体およびポリマーを介して、第１〜第４の穴部１１〜１４の底面に担持される。
【００２７】
したがって、第１の穴部１１において、検体中に含まれる第１の抗原が、第１の特異抗体４１に認識されることにより検出される。また、第２の穴部１２において、検体中に含まれる第２の抗原が、第２の特異抗体に認識されることにより検出される。第３の穴部１３において、検体中に含まれる第３の抗原が、第３の特異抗体に認識されることにより検出される。さらに、第４の穴部１４において、検体中に含まれる第４の抗原が、第４の特異抗体に認識されることにより検出される。
【００２８】
ここで、第１〜第４の穴部１１〜１４において、第１〜第４の特異抗体に、それぞれ、第１〜第４の抗原を確実に認識させるには、すなわち、各抗原の検出率を向上させるには、抗原認識部位の認識能を低減させることなく、ポリマーを介して、第１〜第４の特異抗体を、第１〜第４の穴部１１〜１４の底面に担持させる必要がある。
【００２９】
本発明者は、かかる点に着目し、鋭意検討を行なった結果、第１〜第４の抗原を認識する第１〜第４の特異抗体の種類に応じて、ポリマーの種類を選択することで、抗原認識部位の認識能を低減させることなく、第１〜第４の特異抗体を担持させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３０】
具体的には、第１の穴部１１において検出すべき抗原（第１の抗原）として、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）２７、アルギナーゼ１、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、インターロイキン１ａ（ＩＬ−１ａ）、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ガレクチン−７またはＰＡＲＫ７（ＤＪ−１）を選択した場合、第１のポリマーとしては、以下に示すようなものが選択される。
【００３１】
第１のポリマーは、ホスホリルコリン基を含む第１の単位とカルボン酸誘導基を含む第２の単位とを有する高分子物質であり、抗体や抗原の非特異的吸着を抑制する性質と、抗体を固定化する性質とを併せ持つものである。
【００３２】
より具体的には、第１の単位に含まれるホスホリルコリン基は抗体や抗原の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第２の単位に含まれるカルボン酸誘導基は捕捉分子を化学的に固定化する役割を果たす。
【００３３】
第１の単位は、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
【００３４】
また、これら第１の単位として用いられる基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第１単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、基材１０の表面における非特異的吸着をより確実に抑制することができる。
【００３５】
第１のポリマーにおいて、第１の単位の割合は、特に限定されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、５〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜４０ｍｏｌ％、さらに好ましくは１５〜３０ｍｏｌ％である。
【００３６】
また、第２単位において、活性化されたカルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性化されたカルボン酸誘導体としては、例えば、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸等のカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。
【００３７】
カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、例えば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；−Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン等の基を有することができる。
また、カルボン酸誘導基は、下記式（１Ｂ）に示される基とすることができる。
【００３８】
【化３】
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（ただし、上記式（１Ｂ）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
【００３９】
また、上記式（１Ｂ）に示される一価の基は、例えば、下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。
【００４０】
【化４】
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（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ１はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ２はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）
【００４１】
具体的には、上記式（ｐ）に示される基として、例えば、下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。
【００４２】
また、上記式（ｑ）に示される基として、例えば下記式（ｕ）、（ｖ）に示される基が挙げられる。
【００４３】
したがって、上記式（１Ｂ）に示される基は、例えば、下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
【００４４】
【化５】
2013228383.tif 000007
【００４５】
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、例えば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００４６】
なお、活性エステル基としては、後述する第２のポリマーで説明するのと同様のものが挙げられる。
【００４７】
また、第１のポリマーにおいて、第２の単位の割合は、特に限定されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜３０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜２０ｍｏｌ％、さらに好ましくは２〜１５ｍｏｌ％である。
【００４８】
基材１０の表面に抗体が固定化される検出容器１において、第１単位と第２単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、例えば、ホスホリルコリン基を含む第１単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
【００４９】
また、第１のポリマーは、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、この第１のポリマーは、共重合体とすることができる。
【００５０】
具体的には、第１のポリマーがブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。かかる構成とすることで、第１のポリマーが適度に疎水化し、基材１０の表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
【００５１】
また、第１のポリマーにおいて、ブチルメタクリレート基を含む構成とする場合、このブチルメタクリレート基を含む繰り返し単位の割合は、特に限定されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、４０〜９５ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは５０〜９０ｍｏｌ％、さらに好ましくは６０〜８０ｍｏｌ％である。
【００５２】
なお、ブチルメタクリレート基を含む第１のポリマーを、具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第１単量体と、ｐ−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第２単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第３単量体との共重合体とすることができる。
【００５３】
すなわち、これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２Ｂ）で表される。
【００５４】
【化６】
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（ただし、上記一般式（２Ｂ）において、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。ｎは、１〜１００の整数を示す。）
【００５５】
また、上記一般式（２Ｂ）において、第１〜第３単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００５６】
ここで、上記一般式（２Ｂ）で示される共重合体は、第１のポリマーの適度な疎水化と、抗体の非特異吸着を抑制する性質と、抗体を固定化する性質とのバランスにより一層優れた構成である。このため、これを用いることにより、基材１０の表面をより確実に第１のポリマーで被覆するとともに、第１のポリマーが吸着した基材１０上への非特異的吸着を抑制しつつ、抗体をさらに確実に共有結合により固定化して基材１０上に導入することができる。
【００５７】
なお、上記一般式（２Ｂ）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。より具体的には、上記一般式（２Ｂ）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、例えば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【００５８】
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。
【００５９】
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。例えば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物等が用いられる。
【００６０】
より具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。
【００６１】
なお、第１のポリマーの基材１０（穴部）の表面への被覆は、例えば、有機溶剤に第１のポリマーを０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解した第１のポリマー溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材の表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００６２】
有機溶剤としては、特に限定されないが、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００６３】
また、第２の穴部１２において検出すべき抗原（第２の抗原）として、例えば、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）２７またはプロフィリン（ＰＦＮ）１を選択した場合、第２のポリマーとしては、以下に示すようなものが選択される。
【００６４】
第２のポリマーは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を第１の単位とし、少なくとも特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位を第２の単位とし、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される繰り返し単位を第３の単位として有する高分子物質であり、抗体や抗原の非特異的吸着を抑制する性質と、抗体を固定化する性質と、高分子物質同士を架橋する性質とを併せ持つものである。
【００６５】
より具体的には、第１の単位に含まれるアルキレングリコール残基は抗体や抗原の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第２の単位に含まれる特異抗体を固定化する官能基は捕捉分子としての特異抗体を化学的に固定化する役割を果たし、第３の単位に含まれる架橋可能な官能基は隣接する高分子物質同士を架橋する役割を果たす。
【００６６】
第１の単位を形成し得る、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）は、特に限定されないが、一般式［２Ａ］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物が好適に用いられる。
【００６７】
【化７】
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（式中Ｒ２は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）
【００６８】
式中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、さらに好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。各種ｑの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｑは平均値として特定される。繰り返し数ｑが２以上の場合は、Ｙは同一であっても、異なっていてもよい。
【００６９】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）としては、例えば、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００７０】
これらのなかでも、特異抗体および抗原の非特異的吸着の少なさおよび入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。特に、エチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００であるメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが、合成時の操作性（ハンドリング）の良さの点からより好ましく用いられる。
【００７１】
第２のポリマーにおいて、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される第１の単位の割合は、特に限定されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０〜９５ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、さらに好ましくは５０〜９０ｍｏｌ％である。
【００７２】
第２の単位を形成し得る、特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基等があるが、これらに限定されない。
【００７３】
具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、ストレプトアビジン、金属キレート等があるがこれらに限定されない。これらの中でも特異抗体に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また特異抗体と結合定数が高いビオチンが好ましい。なかでもモノマーの保存安定性の点から活性エステル基がさらに好ましい。
【００７４】
具体的には、特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に限定されないが、下記の一般式［１Ａ］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキル基を介して結合した化合物であることが好ましい。
【００７５】
特に、アルキレングリコール残基の連鎖は、それ自体がタンパク質の非特異吸着を抑制する性質を有している。このため、（メタ）アクリル基と活性エステル基がアルキレングリコール残基の連鎖を介して結合したモノマーは、特異抗体を固定化する性質と、特異抗体や抗原の非特異吸着を抑制する性質とを併せ持つ。なお、本明細書中において（メタ）アクリルは、アクリルおよび／またはメタクリルを示し、（メタ）アクリレートは、アクリレートおよび／またはメタクリレートを示す。
【００７６】
【化８】
2013228383.tif 000010
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
【００７７】
式［１Ａ］で、Ｘがアルキレングリコール残基の場合、Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。
【００７８】
なおここで、アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側末端または両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）をいう。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）である。
【００７９】
Ｘの繰り返し数ｐは１〜１００の整数であり、Ｘがアルキレングリコール残基の場合、より好ましくは２〜５０の整数であり、さらに好ましくは２〜３０の整数であり、最も好ましくは２〜２０の整数である。各種ｐの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｐは平均値として特定される。繰り返し数ｐが２以上の場合は、繰り返されるＸは同一であっても、異なっていてもよい。
【００８０】
式［１］で、Ｘがアルキル基の場合、ｐ個分のアルキル基の炭素数の合計（（Ｘ）ｐ）が１〜１００であることが好ましく、１〜２０であることがより好ましい。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。
【００８１】
なお、本明細書中において、「活性エステル基」とは、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものを言う。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００８２】
このような活性エステル基としては、−ＣＯＯＲ”で表されるＲ”に上記酸性度が高い電子吸引性基を有するものが挙げられる。例えば上記Ｒ”がｐ−ニトロフェニルである、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基；上記Ｒ”がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基；上記Ｒ”がフタル酸イミドである、フタル酸イミド活性エステル基；上記Ｒ”が５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドである、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でも保存安定性と反応性の高さとのバランスの点からｐ−ニトロフェニル活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。
【００８３】
特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）としては、例えば、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートやスクシンイミドオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートを挙げることができるが、中でも、下記式で表されるｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）メタクリレートが好ましい。なお、エチレングリコールの繰り返し数ｐおよび／またはｐの平均値は２〜２０が好ましい。
【００８４】
【化９】
2013228383.tif 000011
【００８５】
第２のポリマーにおいて、特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される第２の単位の割合は、特に制限されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜９９．７ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜７０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜５０ｍｏｌ％である。
【００８６】
第３の単位を形成し得る、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）は、架橋可能な官能基の反応が高分子化合物合成中に進行しないものであれば特に制限されるものではない。
【００８７】
架橋可能な官能基としては、例えば、加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、（メタ）アクリル基、グリシジル基などが用いられるが、架橋処理が容易なことから加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、グリシジル基が好ましく、より低温で架橋できることから加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。
【００８８】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。中でも、ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、中でもシラノール基を生成し易い点からアルコキシシリル基が最も好ましい。
【００８９】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が直接または炭素数１〜２０のアルキル鎖を介して結合した一般式［３Ａ］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。
【００９０】
【化１０】
2013228383.tif 000012
【００９１】
アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。中でも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００９２】
第２のポリマーにおいて、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される第３の単位の割合は、特に制限されないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、好ましくは１〜２０ｍｏｌ％であり、より好ましくは２〜１５ｍｏｌ％、さらに好ましくは２〜１０ｍｏｌ％である。
【００９３】
以上のことから、基材１０の表面に抗体が固定化される検出容器１において、好ましい第１単位と第２単位と第３の単位との組み合わせとして、例えば、模式的に下記一般式［５Ａ］で表されるものが挙げられる。
【００９４】
【化１１】
2013228383.tif 000013
（ただし、上記一般式［５Ａ］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１つはアルコキシシリル基であり、その他はアルキル基を示す。ａおよびｂは、それぞれ独立して、正の整数である。ｐおよびｑは、それぞれ独立して、１〜１００の整数を示す。）
【００９５】
なお、第２ポリマーは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される第１の単位、特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される第２単位、および架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される第３単位以外に他の基を含んでもよい。具体的には、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）を共重合させてもよく、アルキル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｄ）としては、例えば、ｎ−ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレートおよびｎ−オクチルメタクリレート等が挙げられる。
【００９６】
第２ポリマーの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、少なくとも特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）および架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
【００９７】
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００９８】
重合開始剤としては、通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００９９】
第２のポリマーの化学構造は、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位である第１の単位と、少なくとも特異抗体を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位である第２の単位と、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される繰り返し単位を第３の単位とを含む重合体であれば、当該重合体が共重合体の場合の結合方式はランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【０１００】
また、第２のポリマーの分子量は、高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【０１０１】
第２のポリマーは、基材１０の表面を該高分子化合物で被覆することにより、第２の抗原以外の非特異的吸着を抑制する性質、第２の抗原を特異的に固定化する性質を容易に付与することが可能である。さらに、高分子主鎖同士を架橋させる性質を併せ持つことから、基材１０の表面を被覆した後に、架橋させることが可能である。これにより、基材１０上の高分子に不溶性を付与することができ、基材１０の洗浄による信号低下を低減することができる。
【０１０２】
なお、第２のポリマーの基材１０の表面への被覆は、第１のポリマーの基材１０の表面への被覆で説明したのと同様の方法を用いることができる。
【０１０３】
また、第３の穴部１３において検出すべき抗原（第３の抗原）として、ヒートショックプロテイン２７、アルギナーゼ１、マクロファージ遊走阻止因子およびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のうち第１の抗原で選択したものと異なるものを選択した場合、第１のポリマーとしては、第１の穴部１１に吸着させる第１のポリマーで説明したのと同様のものが選択される。
【０１０４】
さらに、第４の穴部１４において検出すべき抗原（第４の抗原）として、ヒートショックプロテイン２７およびプロフィリン１のうち第２の抗原で選択したものと異なるものを選択した場合、第２のポリマーとしては、第３の穴部１３に吸着させる第２のポリマーで説明したのと同様のものが選択される。
【０１０５】
なお、第１〜第４の穴部１１〜１４において検出すべき第１〜第４の抗原として挙げた各種抗原は、具体的には、それぞれ、以下に示すようなものである。
【０１０６】
すなわち、プロフィリン１（ＰＦＮ１：Ｇｅｎｅ ＩＤ ５２１６）は、生体内において広範囲に発現しているタンパク質であり、細胞内の細胞骨格構成タンパク質であるアクチンの重合・脱重合を調節するタンパク質として知られている。このようなプロフィリン１は、皮膚老化リスク評価の指標となり、特に、老化現象の対象として、シワ形成の指標（マーカー）として有効である。すなわち、検体中のプロフィリン１を検出してその発現量を測定することにより、シワ形成等の将来予測をすることができる。
【０１０７】
また、ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）は、熱等のストレス条件下にさらされた際に発現が上昇して細胞を保護するタンパク質であり分子シャペロンとしての機能を有し、細胞内タンパク質輸送に関与するタンパク質でることが知られており、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。
【０１０８】
アルギナーゼ１は分子質量３４，７３５Ｄａの細胞内タンパク質で、アルギニンをオルニチンと尿素に変換する酵素である。哺乳類《アルギナーゼ》の少なくとも2つの《アイソフォーム》（I型とII型）が存在し、それらは組織分布、細胞内局在性、免疫学的交差反応性、生理学的機能において異なる。この遺伝子が指令するアイソフォームI型は細胞質ゾル酵素であり、尿素循環の構成因子として肝臓で優先的に発現される。この酵素の遺伝的《欠損》は、《高アンモニア血症》を特徴とする《常染色体劣性遺伝疾患》である《アルギニン血症》をもたらす。このような、アルギナーゼ１は、紫外線リスクの指標（マーカー）として有効である。遺伝子塩基配列情報（ＡＲＧ１，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．：１６：８７８９−８８０２（１９８８），Ｘ１２６６２）。アミノ酸配列情報（Ａｒｇｉｎａｓｅ−１，ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆｆｅｒ．２０００Ｆｅｂ；７（２）：１３７−４４，Ｐ０５０８９）。
【０１０９】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）は、分枝質量４８，５２５Ｄａの分泌タンパク質である。ｕＰＡはプラスミノーゲンをプラスミンに変換するセリンプロテアーゼの一種。前駆体タンパク質（５５ｋＤａ）として細胞外へ分泌され、切断型（３５ｋＤａ）となってプロテアーゼ活性を示す。乳がんで多くの発現が見られるが、本発明では、皮膚老化マーカーの指標（マーカー）として有効である。遺伝子配列情報（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２７５９−２７７１，１９８５，ＢＣ０１３５７５）。アミノ酸配列情報（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ'ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６３：１０４３−１０５８，１９８２，Ｐ００７４９）。
【０１１０】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、通常は血管中を血液とともに流動しており、能動的に適所にとどまることはできないマクロファージを、異物侵入場所に的確にとどめるための因子であり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。
さらに、インターロイキン１ａ（ＩＬ−１ａ）は、炎症時における発熱や急性期タンパク質の産生誘導に関与する炎症性サイトカインであり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。
インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、ＩＬ−１レセプターにＩＬ−１と同等の結合親和性を有するのに対して、何ら生物活性を発現しないことから、ＩＬ−１の作用を拮抗的に阻害する一種の生体内インヒビターと考えられるものであり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。
ガレクチン−７は、重層上皮に分布する糖鎖との結合に関与するタンパク質であり、肌ストレスの指標（マーカー）として有効である。
ＰＡＲＫ７（ＤＪ−１）は、パーキンソン病等に関与するタンパク質であり、皮膚老化マーカーの指標（マーカー）として有効である。
【０１１１】
なお、このような第１〜第４の抗原を認識する各特異抗体の第１または第２のポリマーへの固定化は、例えば、各特異抗体を溶解または分散させた液体を、第１または第２のポリマーが吸着した基材１０（穴部）の表面に、点着し、その後、静置することにより行うことができる。
【０１１２】
また、基材１０の洗浄後には、特異抗体を固定化した以外の基材表面に残存する官能基を不活性化処理するのが好ましい。特異抗体を固定化する官能基が活性エステル基やアルデヒド基の場合は、アルカリ化合物、または一級アミノ基を有する化合物で不活化処理することができる。
【０１１３】
アルカリ化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウム等を好ましく用いることができる。
【０１１４】
一級アミノ基を有する化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等を好ましく用いることができ、アミノエタノール、グリシンが最も好ましい。
【０１１５】
以上説明したような検出容器１を用いた本発明の検出キットによれば、第１〜第４の穴部１１〜１４において、それぞれ、上述したような抗原を検出することができる。そのため、得られた検出結果に基づいて、シワ、肌ストレス、紫外線ストレスおよび弾力性等の肌診断のための項目をほぼ同時に検査することができる。
【０１１６】
なお、本実施形態では、基材１０が４つの穴部１１〜１４を備える場合について説明したが、かかる場合に限定されず、基材は、少なくとも２つの穴部を備えていればよい。このように基材が少なくとも２つの穴部を備える構成とすれば、２つ以上の肌診断のための項目をほぼ同時に検査することができる。
【０１１７】
以下、この検出容器１を用いた検査方法（本発明の検査方法）について説明する。
＜検査方法＞
図２は、本発明の検査方法の好適実施形態を説明するための縦断面図である。
【０１１８】
本実施形態の検査方法は、検体中に含まれる特定の抗原を検出する検査方法であって、［１］検出容器と、検出すべき抗原を含有する検体とを用意する工程と、［２］前記検体を穴部内に供給する工程と、［３］穴部内を洗浄する工程と、［４］前記抗原を特異的に認識し、かつ標識化された標識化特異抗体を含有する第１の処理液を穴部内に供給する工程と、［５］穴部内を洗浄する工程と、［６］標識化特異抗体が備える標識部位を観察する工程とを有する。
【０１１９】
以下、各工程について、検出容器１が備える第１の穴部１１において、検体中に含まれる第１の抗原を検出する場合を一例にして、順次説明する。
【０１２０】
［１］  まず、図２（ａ）に示す検出容器１と、検出すべき第１の抗原５１を含有する検体５０を用意する（第１の工程）。
【０１２１】
ここで、検体５０には、例えば、皮膚（肌）に粘着テープを貼り付けて、この粘着テープに角層を粘着させ、その後、溶媒または分散媒中に、この角層を溶解または分散させたものを用いることができる。
【０１２２】
溶媒または分散媒としては、特に限定されないが、例えば、等張液を用いることができる。なお、本明細書中において、「等張液」とは、細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体のことを言うこととする。これにより、溶媒または分散媒が抗原に接触した際に、細胞内に存在するのと同様の浸透圧を維持することができるため、抗原の破壊を防止することができる。
【０１２３】
この等張液には、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水等を用いることができる。
また、この等張液には、必要に応じて、各種界面活性剤が添加されていても良い。
【０１２４】
界面活性剤としては、例えば、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなアルキルグルコシド系非イオン界面活性剤、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（Ｔｗｅｅｎ２０）のようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１２５】
［２］次に、図２（ｂ）に示すように、検体５０を、第１の穴部１１内に供給する（第２の工程）。
【０１２６】
これにより、第１の特異抗体４１に検体５０が接触する。このとき、検体５０中に、第１の抗原５１が含まれていると、第１の特異抗体（一次抗体）４１に第１の抗原５１が特異的に認識される。
【０１２７】
なお、検体５０中には、この第１の抗原５１以外の抗原（図２（ｂ）中の●や★）が含まれているが、第１の特異抗体４１は、第１の抗原５１を特異的に認識する。そのため、この第１の抗原５１以外の抗原が検体５０中に含まれていたとしても、第１の特異抗体４１は、他の抗原を認識することなく、第１の抗原５１を選択的に認識する。
【０１２８】
その結果、第１の穴部１１の底面２１に、検体５０中に含まれる第１の抗原５１が、第１のポリマー３１および第１の特異抗体４１を介して選択的に担持（吸着）される。
【０１２９】
なお、この検体５０を第１の穴部１１内に留置しておく時間は、１〜３０分程度であるのが好ましく、５〜１５分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、第１の特異抗体４１が認識する第１の抗原５１の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【０１３０】
また、処理時における検体５０の温度は、０〜４０℃程度であるのが好ましく、１０〜３７℃程度であるのがより好ましい。
【０１３１】
また、検体５０のｐＨは、特に限定されないが、５〜１０程度とするのが好ましく、６〜８程度とするのがより好ましい。
【０１３２】
検体５０の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、検体５０中に含まれる第１の抗原５１がより迅速かつ選択的に認識されるようになる。
【０１３３】
［３］次に、第１の穴部１１内を洗浄する（第３の工程）。
具体的には、第１の穴部１１内に洗浄液を供給した後、この洗浄液を除去して廃棄することで、第１の穴部１１内を洗浄する。なお、洗浄液の供給の後、洗浄液を穏やかに攪拌するのが好ましい。これにより、洗浄液中に、第１の穴部１１に担持されなかった第１の抗原５１や、検体５０中に含まれる第１の抗原５１以外の抗原をより確実に分散させることができるため、第１の穴部１１内の洗浄効率を向上させることができる。
【０１３４】
本工程で用いる洗浄液としては、特に限定されないが、第１の特異抗体４１および第１の抗原５１に変性・変質が生じるのを防止するために、等張液が好ましく用いられる。この等張液には、前記工程［１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１３５】
また、本工程は、必要に応じて、複数回繰り返して行うようにしてもよい。これにより、第１の穴部１１に担持されなかった第１の抗原５１をより確実に除去することができる。
【０１３６】
この場合、用いる洗浄液は、各回において、同一のものを用いてもよく、異なる種類（条件）のものを用いるようにしてもよい。
【０１３７】
［４］次に、第１の標識化特異抗体６１を含有する処理液６０を第１の穴部１１内に供給する（第４の工程）。
【０１３８】
この第１の標識化特異抗体６１は、第１の特異抗体４１と同様に、第１の抗原５１を特異的（選択的）に認識するとともに、標識部位により標識化された二次抗体として機能するものである。
【０１３９】
かかる第１の標識化特異抗体６１を含む処理液６０を第１の穴部１１内に供給することにより、第１の標識化特異抗体６１は、図２（ｃ）に示すように、第１の抗原５１を認識する。
【０１４０】
その結果、第１のポリマー３１と、第１の特異抗体４１と第１の抗原５１とを介して、第１の穴部１１の底面に第１の標識化特異抗体６１が担持（吸着）される。
【０１４１】
なお、第１の抗原５１が認識（吸着）されていない第１の特異抗体４１には、当然、第１の標識化特異抗体６１が第１の特異抗体４１を認識することができないため、第１の標識化特異抗体６１が担持されることはない。
【０１４２】
また、第１の標識化特異抗体６１を標識化するための標識部位としては、特に限定されないが、酵素、蛍光物質および吸光物質等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１４３】
このように第１の標識化特異抗体６１を用いて、第１の抗原５１を標識化すれば、後工程［６］において、第１の標識化特異抗体６１が有する標識部位を観察することにより、第１の特異抗体４１に担持された第１の抗原（マーカー）５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の第１の抗原５１の量を定量することが可能となる。
【０１４４】
なお、処理液６０を第１の穴部１１内に留置しておく時間は、１〜３０分程度であるのが好ましく、５〜１５分程度であるのがより好ましい。この時間が短過ぎると、第１の標識化特異抗体６１が認識する第１の抗原５１の数が少なくなるおそれがあり、一方、この時間を前記上限値を超えて長くしても、それ以上の効果の増大が見込めない。
【０１４５】
また、処理時における処理液６０の温度は、０〜４０℃程度であるのが好ましく、１０〜３７℃程度であるのがより好ましい。
【０１４６】
また、処理液６０のｐＨは、特に限定されないが、５〜１０程度とするのが好ましく、６〜８程度とするのがより好ましい。
【０１４７】
処理液６０の温度およびｐＨをかかる範囲内に設定することにより、処理液６０中に含まれる第１の標識化特異抗体６１がより迅速かつ選択的に認識するようになる。
【０１４８】
また、処理液６０としては、第１の標識化特異抗体６１を含有すればよく、特に限定されるものではないが、第１の標識化特異抗体６１を等張液中に溶解したものが好適に用いられる。
さらに、等張液としては、前記工程［１］で説明したのと同様のものが挙げられる。
【０１４９】
［５］次に、第１の穴部１１内を洗浄する（第５の工程）。
これにより、処理液６０中に含まれる第１の標識化特異抗体６１のうち、第１の抗原５１を認識しなかった第１の標識化特異抗体６１が、第１の穴部１１外に廃棄される。
【０１５０】
第１の穴部１１内を洗浄する方法としては、前記工程［３］で説明したのと同様の方法が用いられる。
【０１５１】
［６］次に、第１の穴部１１内に担持された第１の標識化特異抗体６１が備える標識部位を観察する。
【０１５２】
例えば、標識部位が酵素である場合、この酵素との反応により、発色または吸光する基質７１を第１の穴部１１内に供給し、その反応に伴う発色または吸光を観察することにより、第１の抗原５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の第１の抗原５１の定量を間接的に行うことが可能となる（図２（ｄ）参照。）。
【０１５３】
また、標識部位が蛍光物質または吸光物質である場合、第１の穴部１１に光を照射し、この光照射に伴う認識部位の発色または吸光を観察することにより、第１の抗原５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の第１の抗原５１の定量を間接的に行うことが可能となる。
【０１５４】
以上のようにして、第１の穴部１１において、検体５０中における第１の抗原５１を観察すること、すなわち、第１の抗原５１の有無の判定（陽性、陰性の判定）、さらには検体５０中の第１の抗原５１の定量を行うことができる。
【０１５５】
したがって、第１の穴部１１と同様に、第２の穴部１２〜第４の穴部１４についても、検体５０を供給し、その後、第２の標識化特異抗体〜第４の標識化特異抗体を含有する処理液を供給する構成とすることで、第２の穴部１２〜第４の穴部１４において、それぞれ、検体５０中における第２の抗原〜第４の抗原を観察することができる。
【０１５６】
よって、検出容器１を用い検査方法によれば、検体５０中に含まれる肌診断用の第１〜第４の抗原を、抗原抗体反応を利用して高感度に検出することができるとともに、さらに、第１〜第４の穴部１１〜１４において、ほぼ同時に第１〜第４の抗原を観察することができるため、第１〜第４の抗原の検出を迅速に行うことができる。
【０１５７】
そして、第１〜第４の抗原の検出結果に基づいて、シワ、肌ストレス、紫外線ストレスおよび弾力性の項目の検査を行えるため、検体採取者に対して、検体採取時における肌状態に応じた処置を施すことができる。
【０１５８】
以上、本発明の検査キットおよび検出方法を、図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１５９】
例えば、本発明の検査キットは、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成のものを付加することができる。
【０１６０】
また、本発明の検出方法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。
【実施例】
【０１６１】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．第１および第２のポリマーの調製
（１）第１のポリマーの合成
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と記載）、ｎ−ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」と記載）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載。）を脱水エタノールに溶解させた。
【０１６２】
そこに、さらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載、和光純薬工業社製）を添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。
【０１６３】
なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に７０：２７：３である。
【０１６４】
その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集することにより第１のポリマーを得た。
なお、上述したＭＥＯＮＰについては、以下の（３）に示すようにして合成した。
【０１６５】
（２）第２のポリマーの合成
数平均分子量Ｍｎ＝約１８８のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下、「ＰＥＧＭＡ」と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製。）と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載。）と、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（以下、「ＭＰＤＥＳ」と記載、ＧＥＬＥＳＴ，ＩＮＣ．製。）とを脱水エタノールに溶解させた。
【０１６６】
そこに、さらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載、和光純薬工業社製）をそれぞれ添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。
【０１６７】
なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、ＰＥＧＭＡ、ＭＥＯＮＰ、ＭＰＤＥＳの順に９０：５：５である。
【０１６８】
その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集することにより第２のポリマーを得た。
なお、上述したＭＥＯＮＰについては、以下の（３）に示すようにして合成した。
【０１６９】
（３）ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂製、「Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００」）を２０ｍＬのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。
【０１７０】
−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業社製）およびクロロホルム２０ｍＬの均一溶液をゆっくりと滴下した。
【０１７１】
−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してＭＥＯＮＰを得た。
【０１７２】
２．各種抗原の検出
［実施例１］（プロフィリン１（ＰＦＮ１）の検出）
（１）まず、ＰＦＮ１の検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
＜１＞  基材：２つの穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
＜２＞  特異抗体（一次抗体）：rabit polyclonarl PFN1 antibody（abcam社製、「ab50668」）を用意した。
＜３＞  標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識  rabit polyclonarl PFN1 antibody（abcam社製、「ab50667」）を用意した。
＜４＞  抗原：プロフィリン１（ＰＦＮ１；abcam社製）を用意した。
＜５＞  洗浄液：０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用意した。
【０１７３】
（２）次に、第１のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第１の穴部に点着したのち乾燥させることで、第１の穴部の底面に、第１のポリマーを導入した。また、第２のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第２の穴部に点着したのち乾燥させることで、第２の穴部の底面に、第２のポリマーを導入した。
【０１７４】
（３）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（４）次に、特異抗体の１μｇ／ｍＬ  リン酸バッファー溶液を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、室温下で一晩静置した。
【０１７５】
（５）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（６）次に、抗原の１μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０１７６】
（７）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（８）次に、標識化特異抗体の０．４μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；処理液）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０１７７】
（９）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１０）次に、Ｃｙ３標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。
【０１７８】
（１１）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１２）その後、第１の穴部および第２の穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【０１７９】
その結果、第２のポリマーが吸着された第１の穴部では、蛍光の変化が認められなかったのに対して、第１のポリマーが吸着された第２の穴部では、蛍光の変化が認められた。
【０１８０】
これにより、第２の穴部では、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下することなく、第２の穴部の底面に、特異抗体が第２のポリマーを介して担持（固定化）されていると推測された。
【０１８１】
これに対して、第１の穴部では、第１のポリマーを介した特異抗体の固定化により、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下しているものと推測された。
【０１８２】
［実施例２］（ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７）の検出）
（１）まず、ＨＳＰ２７の検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
＜１＞  基材：２つの穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
＜２＞  特異抗体（一次抗体）：HSP27 antibody（R&D Systems社製、「Human TotalHSP27 ELISAキット」の抗体セット）を用意した。
＜３＞  標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識  HSP27 antibody（R&D Systems社製、「Human TotalHSP27 ELISAキット」の抗体セット）を用意した。
＜４＞  抗原：ヒートショックプロテイン２７（ＨＳＰ２７；R&D Systems社製、「Human Total HSP27 ELISAキット」の抗原）を用意した。
＜５＞  洗浄液：０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用意した。
【０１８３】
（２）次に、第１のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第１の穴部に点着したのち乾燥させることで、第１の穴部の底面に、第１のポリマーを導入した。また、第２のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第２の穴部に点着したのち乾燥させることで、第２の穴部の底面に、第２のポリマーを導入した。
【０１８４】
（３）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（４）次に、特異抗体の１８０μｇ／ｍＬ  リン酸バッファー溶液を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、室温下で一晩静置した。
【０１８５】
（５）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（６）次に、抗原の２ｎｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０１８６】
（７）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（８）次に、標識化特異抗体の０．５μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；処理液）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０１８７】
（９）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１０）次に、Ｃｙ３標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。
【０１８８】
（１１）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１２）その後、第１の穴部および第２の穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【０１８９】
その結果、第１のポリマーが吸着された第１の穴部および第２のポリマーが吸着された第２の穴部の双方において、蛍光の変化が認められた。
【０１９０】
これにより、第１の穴部では、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下することなく、第１の穴部の底面に、特異抗体が第１のポリマーを介して担持（固定化）され、さらに、第２の穴部では、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下することなく、第２の穴部の底面に、特異抗体が第２のポリマーを介して担持（固定化）されていると推測された。
【０１９１】
［実施例３］（アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）の検出）
（１）まず、ＡＲＧ１の検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
＜１＞  基材：２つの穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
＜２＞  特異抗体（一次抗体）：ARG1 antibody（Sigma社製、「rabbit paAb」）を用意した。
＜３＞  標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識  ARG1 antibody（Sigma社製、「rabbit paAb」）を用意した。
＜４＞  抗原：アルギナーゼ１（ＡＲＧ１；Abnova社製）を用意した。
＜５＞  洗浄液：０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用意した。
【０１９２】
（２）次に、第１のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第１の穴部に点着したのち乾燥させることで、第１の穴部の底面に、第１のポリマーを導入した。また、第２のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第２の穴部に点着したのち乾燥させることで、第２の穴部の底面に、第２のポリマーを導入した。
【０１９３】
（３）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（４）次に、特異抗体の０．０５ｍｇ／ｍＬ  リン酸バッファー溶液を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、室温下で一晩静置した。
【０１９４】
（５）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（６）次に、抗原の２μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０１９５】
（７）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（８）次に、標識化特異抗体の１ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；処理液）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０１９６】
（９）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１０）次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。
【０１９７】
（１１）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１２）その後、第１の穴部および第２の穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【０１９８】
その結果、第１のポリマーが吸着された第１の穴部では、蛍光の変化が認められたものの、第２のポリマーが吸着された第２の穴部では、蛍光の変化が認められなかった。
【０１９９】
これにより、第１の穴部では、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下することなく、第１の穴部の底面に、特異抗体が第１のポリマーを介して担持（固定化）されていると推測された。
【０２００】
これに対して、第２の穴部では、第２のポリマーを介した特異抗体の固定化により、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下しているものと推測された。
【０２０１】
［実施例４］（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）の検出）
（１）まず、ｕＰＡの検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
＜１＞  基材：２つの穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
＜２＞  特異抗体（一次抗体）：uPA antibody（Millipore社製、mouse moAb「MAB7776」）を用意した。
＜３＞  標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識  uPA antibody（R&D社製、goat poAb「BAF1310」）を用意した。
＜４＞  抗原：ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ；Millipore社製）を用意した。
＜５＞  洗浄液：０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用意した。
【０２０２】
（２）次に、第１のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第１の穴部に点着したのち乾燥させることで、第１の穴部の底面に、第１のポリマーを導入した。また、第２のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第２の穴部に点着したのち乾燥させることで、第２の穴部の底面に、第２のポリマーを導入した。
【０２０３】
（３）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（４）次に、特異抗体の０．５ｍｇ／ｍＬ  リン酸バッファー溶液を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に２時間静置した。
【０２０４】
（５）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（６）次に、抗原の０．５μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０２０５】
（７）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（８）次に、標識化特異抗体の０．２ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；処理液）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０２０６】
（９）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１０）次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。
【０２０７】
（１１）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１２）その後、第１の穴部および第２の穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【０２０８】
その結果、第１のポリマーが吸着された第１の穴部では、蛍光の変化が認められたものの、第２のポリマーが吸着された第２の穴部では、蛍光の変化が認められなかった。
【０２０９】
これにより、第１の穴部では、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下することなく、第１の穴部の底面に、特異抗体が第１のポリマーを介して担持（固定化）されていると推測された。
【０２１０】
これに対して、第２の穴部では、第２のポリマーを介した特異抗体の固定化により、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下しているものと推測された。
【０２１１】
［実施例５］（マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の検出）
（１）まず、ＭＩＦの検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
＜１＞  基材：２つの穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
＜２＞  特異抗体（一次抗体）：MIF antibody（R&D Systems、「Ｈｕｍａｎ  ＭＩＦ ELISAキット」の抗体セット」）を用意した。
＜３＞  標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識  MIF antibody（R&D Systems、「「Ｈｕｍａｎ  ＭＩＦ ELISAキット」の抗体セット」）を用意した。
＜４＞  抗原：マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ；R&D Systems社製）「Ｈｕｍａｎ  ＭＩＦ ELISAキット」の抗原」を用意した。
＜５＞  洗浄液：０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを用意した。
【０２１２】
（２）次に、第１のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第１の穴部に点着したのち乾燥させることで、第１の穴部の底面に、第１のポリマーを導入した。また、第２のポリマーの０．３ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを第２の穴部に点着したのち乾燥させることで、第２の穴部の底面に、第２のポリマーを導入した。
【０２１３】
（３）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（４）次に、特異抗体の０．１８ｍｇ／ｍＬ  リン酸バッファー溶液を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に２時間静置した。
【０２１４】
（５）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（６）次に、抗原の２ｎｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０２１５】
（７）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（８）次に、標識化特異抗体の０．２ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０；処理液）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
【０２１６】
（９）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１０）次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）を調製し、これを第１の穴部および第２の穴部の双方に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。
【０２１７】
（１１）次に、洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（１２）その後、第１の穴部および第２の穴部について、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
【０２１８】
その結果、第１のポリマーが吸着された第１の穴部では、蛍光の変化が認められたものの、第２のポリマーが吸着された第２の穴部では、蛍光の変化が認められなかった。
【０２１９】
これにより、第１の穴部では、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下することなく、第１の穴部の底面に、特異抗体が第１のポリマーを介して担持（固定化）されていると推測された。
【０２２０】
これに対して、第２の穴部では、第２のポリマーを介した特異抗体の固定化により、特異抗体の抗原認識部位の認識能が低下しているものと推測された。
【符号の説明】
【０２２１】
１            検出容器
１０          基材
１１          第１の穴部
１２          第２の穴部
１３          第３の穴部
１４          第４の穴部
２１          底面
３１          第１のポリマー
４１          第１の特異抗体
５０          検体
５１          第１の抗原
６０          処理液
６１          第１の標識化特異抗体
７１          基質
【図１】
2013228383.tif 000016
【図２】
2013228383.tif 000017