(57)【要約】【課題】被験体より容易に入手し得る生体試料を用い、被験体の疲労の程度を判定する方法、疲労を回復、改善又は予防し得る物質（被験物質）の疲労に対する有効性を判定する方法、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法、これら方法に使用するバイオマーカーを提供する。【解決手段】生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼを指標とした疲労の判定方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標とした疲労の判定方法。
【請求項２】
生体試料が、血液又は肝臓又は筋肉である請求項１に記載の疲労の判定方法。
【請求項３】
疲労が、肉体疲労である請求項１又は２に記載の疲労の判定方法。
【請求項４】
好酸球由来リボヌクレアーゼが、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）又は好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
【請求項５】
好酸球由来リボヌクレアーゼが、ＲＮＡＳＥ２又はＲＮＡＳＥ３又はそれらのホモログである請求項１〜４のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標とした疲労の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疲労は日常生活の中で、誰もが感じる一般的な感覚である。多忙を極める現代社会において、疲労の蓄積を事前に回避するような環境下で生活することは、困難な状況にある。このような生活環境を考慮すると、回復困難な疲労状態に陥る前に適切な疲労対策を講じるということが、ＱＯＬを維持する上で、重要なポイントとなる。
【０００３】
個人の疲労状態に合わせた適切な疲労対策を講じるためには、疲労の程度を客観的に把握することが重要である。疲労の程度を判定する方法については公的な対策も推進されており、広く知られている公的対策の一つとしては、睡眠の時間や質、労働時間、疲労感や抑うつ感などの項目からなる簡易な自己判断方法（労働者の疲労蓄積度チェックリストなど）が挙げられる（非特許文献１）。また、栄養素、サイトカインやその受容体、さらには細胞内シグナル伝達機構などの研究成果を活用し、疲労の程度を客観的に判定するための方法の開発が試みられている（非特許文献２）。例えば、血液中の複数のアミノ酸（特許文献１）、ＴＧＦ-β（特許文献２）、唾液中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）の遺伝子の発現量（特許文献３）、コルチゾール、副腎性ホルモン又はそれらの代謝物、クロモグラニンＡ、モノアミン類、尿中のイソプラスタン、８-ハイドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の測定が挙げられる。しかしながら上記の疲労判定方法で用いられる物質、例えばイソプラスタンや８−ＯＨｄＧは、疲労だけでなく糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病とも密接に関係しており、疲労特異的に相関性を示す物質とは言い難い。そのため、日常生活における疲労のバイオマーカーとして使用するには課題が残されている。疲労の回復を促進するような医薬品等を簡便かつ適正に評価するためにも、客観的かつ疲労特異的に疲労の程度を評価できるバイオマーカーを見出すことが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７８４４８号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／０９４４７２号公報
【特許文献３】特開２００７−３３０２６３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】厚生労働省  労働者の疲労蓄積度チェックリスト
【非特許文献２】疲労の生化学バイオマーカー（血液、尿）、Ｐ７１−７５、最新・疲労の科学、別冊・医学のあゆみ、医歯薬出版株式会社、２０１０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
疲労の状態、あるいは疲労の回復度合いを簡便かつ適正に評価できなければ、疲労の回復促進に有効な医薬品等の評価が的確になし得ず、疲労の回復に有効な医薬品等の開発にも支障を生じることとなる。
【０００７】
そこで、本発明の課題は、客観的に疲労を測定できる評価方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼを指標として疲労を客観的に測定しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
かかる本発明の態様は、次のとおりである。
（１）生体試料中の好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標とした疲労の判定方法。
（２）生体試料が、血液又は肝臓又は筋肉である前記（１）に記載の疲労の判定方法。
（３）疲労が、肉体疲労である前記（１）から（２）のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
（４）好酸球由来リボヌクレアーゼが、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）又は好酸球由来ニューロトキシン（ＥＤＮ）である前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
（５）好酸球由来リボヌクレアーゼが、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３又はそれらのホモログである前記（１）から（４）のいずれか１項に記載の疲労の判定方法。
【発明の効果】
【００１０】
走行運動負荷により疲労状態にさせたマウスの生体試料において、非疲労状態と比較して発現増加が認められる遺伝子としてＥａｒ（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）遺伝子群を見出した。これら遺伝子群のうち、顕著な発現上昇が認められたＥａｒ１１と近縁のＥａｒ５に焦点をあて検討したところ、被験物質（抗疲労物質）を投与したマウスでは、走行運動負荷を行っても上記のようなＥａｒ１１、Ｅａｒ５遺伝子の発現量の上昇は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】マウス筋肉におけるＥａｒ１１の発現量変化の結果を示すグラフである。
【図２】マウス筋肉におけるＥａｒ５の発現量変化の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の疲労の判定方法としては，疲労の程度を判定する方法のみならず、本発明を用いた被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索する方法、あるいは本方法を用いた疲労判定試薬又は疲労判定キットも含むが、これらに限ったものではない。
【００１３】
本発明で用いる生体試料の起源（被験体）としては、好ましくは哺乳動物であり、ヒトである事が特に好ましい。生体試料としては、血液、唾液、精液などの体液、肝臓、心筋、骨格筋などの組織や細胞が挙げられる。これらの試料は、倫理的な問題が生じないように採血、採取又はバイオプシーなどにより、被験体から分離されることが望ましい。好ましくは、生体試料が血液又は肝臓又は筋肉であり、特に好ましくは血液である。
【００１４】
本発明における「疲労」とは、肉体疲労、身体疲労、筋肉疲労、運動疲労、精神疲労などであり、身体に負荷を与える作業（身体作業）により末梢組織（肝臓、心筋、骨格筋など）が疲労することに起因する肉体疲労（身体作業による肉体疲労）などが特に好ましい。ここで言う「身体作業」には、産業活動における労働作業のみでなく、日常生活における作業や運動、走行、自転車こぎ、階段の昇降などの動作も含む。疲労した状態とは、例えば、身体作業あるいは精神作業などにより、身体あるいは精神に負荷を与えた際に生じる作業効率（パフォーマンス）が低下した状態を示す。疲労の程度（疲労度）とは、上記疲労した状態の程度（度合い）を意味し、パフォーマンスの低下等の指標で表すことも可能である。
【００１５】
本発明における「好酸球由来リボヌクレアーゼ」とは、ウイルスや細菌に感染した際に好酸球から脱顆粒される好酸球顆粒タンパク質のうち、リボヌクレアーゼ活性を示すタンパク質で、ヒトではＥＣＰとＥＤＮを示す。
【００１６】
本発明の好酸球由来リボヌクレアーゼは、タンパク質そのものばかりでなく、好酸球由来リボヌクレアーゼをコードする遺伝子も含まれる。
【００１７】
本発明におけるＥＣＰはＲＮＡＳＥ３遺伝子によりコードされる。一方、ＥＤＮはＲＮＡＳＥ２遺伝子によりコードされる。
【００１８】
本発明における好酸球由来リボヌクレアーゼは、ヒト、ゴリラ、チンパンジーなどの霊長類ばかりでなく、マウス、ラットなどのげっ歯類からも同定されており、マウスではＥａｒ遺伝子群によってコードされる。ここでＥａｒ遺伝子群とは、Ｅａｒ１１、Ｅａｒ５、Ｅａｒ６、Ｅａｒ７、Ｅａｒ１、Ｅａｒ８、Ｅａｒ１０、Ｅａｒ９、Ｅａｒ２、Ｅａｒ３、Ｅａｒ４、Ｅａｒ１４を示し、中でもＥａｒ１１はＲＮＡＳＥ２と、Ｅａｒ５はＲＮＡＳＥ３と相同性が高い。
【００１９】
本発明における「遺伝子」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれもでもよく、ゲノムＤＮＡのみならず、ｍＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｃＲＮＡ及びｃＤＮＡなども含むものであり、全長遺伝子のみでなく、その一部を含む遺伝子（ＥＳＴ）でもよい。
【００２０】
ここで言う「その一部を含む遺伝子」とは、ハイブリダイズする際に十分な配列長を有するものであれば、その長さは特に限定されないが、好ましくは少なくとも１０塩基以上である。また、遺伝子には、塩基配列又はアミノ酸配列などによって特定される遺伝子、例えば、塩基配列と相補的な塩基配列からなる遺伝子とハイブリダイズする遺伝子が含まれる。
【００２１】
本発明における「ホモログ」とは、対象となる遺伝子又はタンパク質と、塩基配列又はアミノ酸配列において、高い相同性を有しており、その相同性は、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。「ホモログ」がタンパク質として存在する場合には、上記塩基配列又はアミノ酸配列の相同性に加えて、対象となるタンパク質と同様の生物学的機能を有することが好ましい。本発明における生物学的機能としては、例えば「リボヌクレアーゼ活性」が挙げられる。
【００２２】
本発明で用いる遺伝子又はタンパク質は、少なくともヒト、マウス又はラットにて公知の遺伝子又はタンパク質であり、その塩基配列又はアミノ酸配列は公知であり、当業者に利用可能なものである。これら遺伝子又はタンパク質は、Ｔｈｅ ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ （ＨＧＮＣ）、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースに登録されており、これらのデータベースにおいて遺伝子シンボル、Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ（ＥＧＩＤ）、ＨＧＮＣ ＩＤ、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＭＧＩ）又はアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｏｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）などによって容易に塩基配列又はアミノ酸配列などの情報を入手する事ができる。これら遺伝子又はタンパク質のいくつかは、ＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）、ＢｉｏＣａｒｔａ、ＧｅｎＭＡＰＰなどのパスウェイデータベースや遺伝子オントコロジー（ＧＯ）データベースにも登録されており、機能的情報を容易に得ることもできる。
【００２３】
本発明の方法においては、好ましくは以下に記載した１個以上の遺伝子又はそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子の発現量の変動を分析及び／又は比較する。
【００２４】
本発明における、好ましい特定の遺伝子としては、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３、Ｅａｒ１１、Ｅａｒ５、Ｅａｒ６、Ｅａｒ７、Ｅａｒ１、Ｅａｒ８、Ｅａｒ１０、Ｅａｒ９、Ｅａｒ２、Ｅａｒ３、Ｅａｒ４、Ｅａｒ１４及びそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子である。
より好ましくは、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３、Ｅａｒ１１、Ｅａｒ５、及びそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子である。
さらに好ましい特定の遺伝子としては、ＲＮＡＳＥ２、ＲＮＡＳＥ３、及びそれらホモログ遺伝子より選ばれる少なくとも１個以上の遺伝子である。
【００２５】
以下の遺伝子（括弧内にはアクセッション番号を併記する）の塩基配列をそれぞれ、配列表の配列番号１から１４に記載する。
RNASE2（NM_002934.2）配列番号１
RNASE3（NM_002935.2）配列番号２
Ear11（NM_053113.2）配列番号３
Ear5（NM_019398.2）配列番号４
Ear6（NM_053111.2）配列番号５
Ear7（NM_017385.1）配列番号６
Ear１（NM_007894.2）配列番号７
Ear8（AF238404.1）配列番号８
Ear10（AF512014.1）配列番号９
Ear9（AF238426.1）配列番号１０
Ear2（NM_007895.2）配列番号１１
Ear3（NM_017388.1）配列番号１２
Ear4（NM_001017422.1）配列番号１３
Ear14（NM_017389.2）配列番号１４
【００２６】
本発明における「好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量」とは、遺伝子の発現量又はタンパク質の発現量のいずれでもよい。
【００２７】
遺伝子の発現量を測定する方法としては、例えば、当該遺伝子を認識するプライマーを用いた遺伝子の増幅手法が挙げられる。ここで使用する遺伝子にはｍＲＮＡのみでなく、ＲＮＡから調整されたｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はａＲＮＡも含まれる。測定のためには先ずｍＲＮＡを抽出するが、ＲＮＡは、当該分野で公知の方法によって抽出してもよいし、市販のキットを用いて行ってもよい。「プライマーを用いた遺伝子の増幅手法」としては、特に限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した方法（ＰＣＲ法、Ｑ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法など）、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などを挙げることができる。これらの増幅手法の条件や方法は、当業者に公知であり、当業者であれば適宜設定することができる。
【００２８】
遺伝子の発現量を測定する他の方法としては、当該遺伝子を認識するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション法やノーザンハイブリダイゼーション法などを挙げることができる。これらのハイブリダイゼーション手法の条件や方法は、当業者に公知であり、当業者であれば適宜設定することができる。
【００２９】
タンパク質の発現量を測定する方法としては、当該タンパク質を認識する抗体等を利用する方法などがある（ウェスタンブロッティング法など）。ここで使用する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらでもよく、市販の抗体を用いてもよい。また、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によって作製することができる。これらの抗体は修飾されていてもよい。
【００３０】
タンパク質の発現量を測定する他の方法としては、タンパク質の活性を測定してもよい。本発明では、「好酸球由来リボヌクレアーゼ活性」を当業者に公知の方法に基づき測定することが可能である。
【００３１】
タンパク質の発現量を測定する他の方法として、二次元電気泳動、ＬＣ／ＭＳ質量分析法、クロマトグラフィー、核磁気共鳴分光法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡなどの方法も使用可能であり、特に限定されない。
【００３２】
遺伝子やタンパク質の発現量は、必要に応じて、疲労の状態の有無において発現量がほとんど変動しない遺伝子又はタンパク質（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現量に基づいて補正することができる。「ハウスキーピング遺伝子」としては、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）やβ−アクチン（ＡＣＴＢ）などを挙げることができる。
【００３３】
本発明においては、疲労の程度が未知である被験体由来の生体試料における、好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標とすることによって”疲労の程度”を判定する。具体的には、疲労の程度が未知である被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量が非疲労の状態の被験体由来の生体試料（健常対照体）における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量と比較して増加している場合に、当該被験体が疲労の状態であると判定することができる。
【００３４】
好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量の“増加”又は“減少”の判断をする際には、例えば、一定の倍率をもって“増加”又は“減少”と判断するＦｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ比較の方法により判断する方法が好ましい。例えば、一定の倍率を「１．５倍」とした場合には、ある被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量が非疲労の状態の被験体由来の生体試料（健常対照体）における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量と比較して１．５倍以上増加（５０％以上増加）又は減少（５０％以上減少）している場合に、“増加”又は“減少”と判断し、当該被験体は疲労の状態であると判定することができる。一定の倍率は１．５倍以上が好ましいが、特には限定されない。
【００３５】
また、統計的処理によって好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量の“増加”又は“減少”の判断をすることも可能である。例えば、ｔ−検定（２群の場合）、分散分析（３群以上の場合）、多変量解析、クラスタリング、判別分析などの方法、回帰直線を求める方法、相関係数を求める方法など、公知の方法が広く知られている。これらの統計的処理における基準の設定は、当業者であれば、適宜行うことができる。
【００３６】
本発明によれば、被験体に被験物質を投与し、当該被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量の変動を測定することによって、当該被験物質の疲労に対する有効性（効果）を判定することができる。被験物質の疲労に対する有効性を判定する方法としては、例えば、疲労の状態である被験体において、被験物質の投与前と投与後に好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を比較し、薬物投与により発現量が減少している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することができる。また、被験物質を投与する前に、疲労の状態である被験体を被験物質投与群と被験物質非投与群に分け、これらの群における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を比較し、被験物質を投与した群の発現量が、被験物質を投与しなかった群の発現量より減少している場合に、被験物質は疲労に対して有効であると判定することができる。被験体への被験物質の投与は、経口投与又は非経口投与のいずれでもよく、身体作業による身体への負荷と組み合わせる場合は、被験物質の特性に応じて、身体作業の前でも後でもよく、前後でもよく、投与の時期は特に限定されない。細胞培養培地への被験物質の添加においても、好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を変動させる処置の前でも後でもよく、前後に添加してもよい。
【００３７】
本発明においては、疲労状態の被験体に被験物質を投与し、被験体由来の生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を減少させる物質を、疲労を回復、改善又は予防し得る候補物質として選択することによって、疲労を回復、改善又は予防し得る物質を探索することができる。
【００３８】
本発明によれば、好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を測定し疲労の程度を判定するための疲労判定試薬又は疲労判定キットが提供される。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、好酸球由来リボヌクレアーゼに特異的な抗体などが含まれている。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットには、更に所望により、標識、標識二次抗体、担体、サンプル希釈液、酵素基質、反応停止液、標準物質、リン脂質酸化体及び／又はその代謝物の発現量や特徴などから疲労の程度を判定するための資料などを含めてもよい。さらに必要に応じて、洗浄バッファー、保存剤、防腐剤などを加えることもできる。本発明の疲労判定試薬又は疲労判定キットに含まれる抗体などは、１種のみでもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。これらは、固体でも液体でもよく、単一又複数の固相上に固定されているもの、例えば、マイクロタイタープレートのようなプレートに個別に分注された状態となっていてもよい。本発明にかかる疲労判定キットは、被験体の血液などの生体試料を採取するための手段を含んでいてもよい。また、疲労判定キットの包装材に付されたラベル又は添付された文書に、生体試料における好酸球由来リボヌクレアーゼの発現量を指標として被験体の疲労の程度を判定するために使用できることを表示していてもよい。さらに、本発明にかかる疲労判定キットは、コンピューターなどの従来公知の演算装置を用いてなるキットとなっていてもよい。
【００３９】
本発明においては、好酸球由来リボヌクレアーゼを疲労のバイオマーカー（生物学的指標）として用いることができる。「バイオマーカー」とは、例えば、通常の生物学的過程、病理学的過程、もしくは治療介入に対する薬理学的応答の指標として、客観的に測定され評価される特性である。即ち、正常なプロセスや病的プロセス、あるいは治療に対する薬理学的な反応の指標として客観的に測定・評価される項目であり、治癒の程度を特徴づけるバイオマーカーは新薬の臨床試験での有効性を確認するためのサロゲートマーカーとして使われる項目である。バイオマーカーは、疾患にかかった後の治療効果の判定だけでなく、疾患を未然に防ぐための日常的な指標として疾患の予防にも用いることができる。
【実施例】
【００４０】
以下に試験例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明する。
試験例１  抗疲労物質の作用評価
＜方法＞
トレッドミル装置（Ｐａｎｌａｂ社製）の傾斜角を１０°に設定し、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（日本エスエルシー（株）、１群８匹）に、漸増式（１５ｃｍ／ｓから４分毎に５ｃｍ／ｓずつ速度を増加）に走行運動を負荷し、走行不能となる第１限界走行速度を算出した。その後、休憩時間を４時間挟み、再度、同じ条件にて、走行運動を負荷し、走行不能となる第２限界走行速度を算出した。
被験物質（タウリン）は走行運動試験の前日まで１日１回で２１日間の連続投与を行った（３００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ）。走行運動試験当日は、１度目の走行運動試験終了直後に投与した。
＜結果＞
第１限界走行速度に対する第２限界走行速度の低下率を算出した結果、対照群（タウリン非投与群）では休憩時間４時間のときの第２限界走行速度の低下率は１６．４％であった。一方、タウリン投与群では第２限界走行速度の低下率は６．３％であり、有意な低下率の抑制、すなわちパフォーマンスの低下の改善が認められ、抗疲労効果が確認された。
【００４１】
試験例２  遺伝子発現量の変化（ＤＮＡマイクロアレイ）
＜方法＞
行った試験は、（１）走行運動の負荷、（２）組織の採取、（３）ＲＮＡの抽出、（４）遺伝子の発現量の分析及び比較、の工程よりなる。
（１）走行運動の負荷
トレッドミル装置（Ｐａｎｌａｂ社製）の傾斜角を１０°に設定し、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（日本エスエルシー（株）、１群４匹）に、漸増式（１５ｃｍ／ｓから４分毎に５ｃｍ／ｓずつ速度を増加）に走行運動をさせ、疲労を負荷した。
（２）組織の採取
走行運動負荷群は、走行４時間後に深麻酔条件下で腹部大静脈から血液を１ｍＬ採取した。採取した血液には、ヌクレアーゼ不含水１ｍＬを添加し、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ(ニッポンジーン)２ｍＬを添加し、血液を溶解した。血液を採取したマウスを安楽死処置後、肝臓及び腓腹筋を採取した。溶解した血液、肝臓及び腓腹筋は液体窒素中で急速凍結後、−８０℃で一時保管し、後日ＲＮＡ抽出に供した。非走行群に対しても、同様の方法で採取した。
【００４２】
（３）ＲＮＡの抽出
血液サンプルのＲＮＡ抽出は、Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ(ニッポンジーン社)に溶解されている血液サンプル４ｍＬの半量を用いて精製を行った。Ｉｓｏｇｅｎ−ＬＳ溶解サンプル２ｍＬに対し、クロロホルム４００μＬを加えて、十分ボルテックスし遠心の後、水層８００から１０００μＬをＲＮＡ粗抽出液として回収した。得られたＲＮＡ粗抽出液をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ中のＣｏｌｕｍｎに流し入れ、ＲＮＡを吸着させた。洗浄後６０μＬのヌクレアーゼ不含水に溶解させた。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μＬを、ＮａｎｏＤｒｏｐＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。
ヌクレアーゼ不含水１μＬ中のＲＮＡを、常法により変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。その後、５μｇの抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡから、ＧＬＯＢＩＮｃｌｅａｒＴＭ−Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、同キットの規定プロトコールに従って、血液中に大量に含まれるグロビンｍＲＮＡの除去処理を行い、３０μＬのＫｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。ＲＮＡを含むＫｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬを、ＮａｎｏＤｒｏｐＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。Ｋｉｔ付属Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ中のＲＮＡを、常法により変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。
肝臓及び腓腹筋サンプルのＲＮＡ抽出は、−８０℃で一時保管された組織１００ｍｇをＲＮＡｉｓｏ４ｍＬ中でホモジェナイズし、筋組織のＲＮＡｉｓｏ溶液とした。筋組織のＲＮＡｉｓｏ溶液１ｍＬクロロホルム０．２ｍＬを加えて、十分ボルテックスし遠心の後、水層５００から７００μＬをＲＮＡ粗抽出液として回収した。得られたＲＮＡ粗抽出液をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）中のＣｏｌｕｍｎに流し入れ、ＲＮＡを吸着させた。洗浄後６０μＬのヌクレアーゼ不含水に溶解させた。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μＬを、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ社）を用いてＲＮＡの定量及び純度指標による品質確認を行った。ＲＮＡを含むヌクレアーゼ不含水１μＬを常法によりＲＮＡを変性後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００ （Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて電気泳動し、分解度指標による品質確認を行った。
【００４３】
（４）遺伝子の発現量の分析及び比較
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社において作製されたゲノム上の既知、及び想定される２８８５３個の遺伝子について２５ｍｅｒ×７７０３１７個の対象と完全一致するオリゴヌクレオチド・プローブ（パーフェクトマッチプローブ）が搭載されたＤＮＡマイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ １．０ ＳＴ Ａｒｒａｙ）を用い、遺伝子発現量の解析を行った。具体的には、次の手順で行った。
ＷＴ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用い、プロトコールに従って、２５０ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡより、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ鎖ｃＲＮＡの合成を介して、ｓｅｎｓｅ 鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、ＷＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて、合成したｃＤＮＡを断片化し、その５’末端にビオチンラベルを行った。中途産物であるｃＲＮＡを常法により変性後、断片化前のｃＤＮＡ及び断片化後のｃＤＮＡ（１００から３７５ｎｇ）をＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて電気泳動し、品質確認を行った。
５μｇの断片化ビオチンラベルｃＤＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙへハイブリダイズさせるハイブリカクテルを調製した。ハイブリカクテルを、まず９９℃で５分間ヒートブロックを用いてインキュベーションし、続けて４５℃で５分間ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｙｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ  ６４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いてインキュベーションし、微量高速遠心機で室温、２０，４００×ｇ、１分間遠心した。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙへハイブリカクテル８０μｌを注入し、４５℃で１７時間、毎分６０回転で、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｙｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｖｅｎ  ６４０内で、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション完了後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  ＫｉｔとＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓａｔａｔｉｏｎ  ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、システム制御ソフトウェア・Ａｆｆｙｍｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  （ＡＧＣＣ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）上の規定プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙの染色及び洗浄を行った。同じくＣｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ 上の規定プロトコールに従って、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によりＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙをスキャンし、各遺伝子プローブの蛍光強度を遺伝子発現データのアレイ毎の画像ファイル（ＤＡＴファイル）として取得した。更に Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅを用いて、ＤＡＴファイルを数値化可能なＣＥＬファイルへ変換した。
解析ソフトウェア・Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用い、ＣＥＬファイルから標準化された発現シグナル値の数値データをテキストファイルとして出力した。発現シグナル値の標準化には、本アレイにおけるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社標準のＲＭＡ−ｓｋｅｃｈ法を用いた。
【００４４】
＜結果＞
走行運動負荷群と非走行群の各アレイの遺伝子発現データについて、非走行群の発現シグナル値を分母とし、走行運動負荷群の発現シグナル値を分子として発現比を求めた。その結果、非走行状態と比較して発現増加が認められる遺伝子として表１で示されるＥａｒ遺伝子群を見出した。また血液、肝臓及び腓腹筋いずれにおいても顕著に発現増加が認められる遺伝子としてＥａｒ１１を見出した。
【００４５】
【表１】
2013076691.tif 000003
【００４６】
試験例３  遺伝子発現量の変化（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
＜方法＞
行った試験は、（１）走行運動の負荷、（２）組織の採取、（３）遺伝子発現量の測定の工程よりなる。
（１）走行運動の負荷
トレッドミル装置（Ｐａｎｌａｂ社製）の傾斜角を１０°に設定し、ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（日本エスエルシー（株）、１群４匹）に、漸増式（１５ｃｍ／ｓから４分毎に５ｃｍ／ｓずつ速度を増加）に走行運動をさせ、疲労を負荷した。被験物質（タウリン）は走行運動試験の前日まで１日１回で１４日間の連続投与を行った（３００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ）。
（２）組織の採取
走行運動負荷を行ったマウスは、走行２または２４時間後に深麻酔条件下で腹部大静脈から脱血処置を行い、マウスを安楽死処置後、腓腹筋を採取した。採取した腓腹筋は液体窒素中で急速凍結後、−８０℃で一時保管し、後日遺伝子発現量の測定に供した。非走行マウスに対しても、同様の方法で採取した。
（３）遺伝子発現量の測定
得られた腓腹筋から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を用い、付属のプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用い、付属の使用説明書に従いＶｅｒｉｔｉサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社）を使用して逆転写を行い、ｃＤＮＡサンプルを作成した。
得られたｃＤＮＡサンプルに対し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用い、その使用説明書に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。使用したプライマーとして、Ｅａｒ１１はＭＡ０６６９２７−Ｆ（ターゲットポイント：２７３、シークエンス：ＣＣＧＴＧＴＧＴＧＴＣＡＴＡＡＴＣＣＡＣＧＴＡＡＧ、タカラバイオ株式会社）とＭＡ０６６９２７−Ｒ（ターゲットポイント：３８７、シークエンス：ＡＴＧＡＣＴＧＧＣＣＧＧＡＧＴＴＧＴＧＡＧ、タカラバイオ株式会社）を用い、Ｅａｒ５はＭＡ０８６０８２−Ｆ（ターゲットポイント：１２、シークエンス：ＧＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＣ、タカラバイオ株式会社）とＭＡ０８６０８２−Ｒ（ターゲットポイント：１５９、シークエンス：ＧＡＣＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣ、タカラバイオ株式会社）を用いた。内部標準として３６Ｂ４を使用し、相対定量法によりＥａｒ１１、Ｅａｒ５の発現レベルを比較した。結果を図１、２に示す。
【００４７】
＜結果＞
図１、２によるとマウス腓腹筋において、走行運動負荷を行った対照群にＥａｒ１１、Ｅａｒ５の発現レベルの上昇が認められた。一方、タウリン投与群のマウス腓腹筋においては、走行運動負荷後においても、Ｅａｒ１１及びＥａｒ５の発現の上昇は認められなかった。
本発明の評価方法を用いることにより、疲労の程度を評価できること、疲労の回復に有効な物質の評価が可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、疲労の研究や判定などの分野、疲労を改善するための医薬や食品の評価などの分野、そのためのキットの製造の分野などにおいて利用可能である。例えば、本発明を利用することにより、日常生活における生理的疲労、末梢性疲労、特に肉体疲労の程度を客観的に判定することが可能になる。また、医薬品や食品等による疲労の回復、改善及び予防の予測が容易になる。さらには、本発明により、疲労の程度の判定するために使用するバイオマーカーやサロゲートマーカーの提供が可能となる。
【図１】
2013076691.tif 000004
【図２】
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【配列表】
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