(57)【要約】【課題】ヘリコバクター・ピロリの除菌率が高く、使用形態が制約されにくい抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有する乳酸菌、その乳酸菌を含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤、及びその乳酸菌を含む飲食品を提供すること。【解決手段】本発明の新規な菌株である、ラクトコッカス・ラクティスＨＡ−７菌株、ロイコノストック・シトレウムＨＡ−１２菌株、ワイセラ・パラメセンテロイデスＨＡ−８１９菌株、ロイコノストック・メセンテロイデスＨＡ−８６３菌株、ワイセラ・コンフサＨＡ−１３１５菌株は、それぞれの菌株の標準株と比較して高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果を奏する。本発明の抗ヘリコバクター・ピロリ剤は、上記の菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株を含むことを特徴とする。本発明の飲食品は、上記の菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株又は上記の抗ヘリコバクター・ピロリ剤を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス・ラクティスＨＡ−７（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＨＡ−７）ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５７菌株。
【請求項２】
ロイコノストック・シトレウムＨＡ−１２（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＨＡ−１２）ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５８菌株。
【請求項３】
ワイセラ・パラメセンテロイデスＨＡ−８１９（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＨＡ−８１９）ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５９菌株。
【請求項４】
ロイコノストック・メセンテロイデスＨＡ−８６３（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＨＡ−８６３）ＮＩＴＥ  Ｐ−１１６０菌株。
【請求項５】
ワイセラ・コンフサＨＡ−１３１５（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ  ＨＡ−１３１５）ＮＩＴＥ  Ｐ−１１６１菌株。
【請求項６】
ニンニクより単離されることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の菌株。
【請求項７】
請求項１〜請求項６に記載の菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株を含むことを特徴とする、抗ヘリコバクター・ピロリ剤。
【請求項８】
前記菌株は死菌であることを特徴とする、請求項７に記載の抗ヘリコバクター・ビロリ剤。
【請求項９】
請求項１〜請求項６に記載の菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株による発酵によって得られる発酵成分を有効成分とすることを特徴とする、抗ヘリコバクター・ピロリ剤。
【請求項１０】
ニンニクから抽出されるニンニク成分を含むことを特徴とする、請求項７〜請求項９のいずれか一項に記載の抗ヘリコバクター・ピロリ剤。
【請求項１１】
請求項１〜請求項６に記載の菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株を含むことを特徴とする、飲食品。
【請求項１２】
請求項７〜請求項１０のいずれか一項に記載の抗ヘリコバクター・ピロリ剤を含むことを特徴とする、飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有する乳酸菌株、その乳酸菌株を含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤、及びその乳酸菌株を含む飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）は、１９８３年にウォーレン（Ｗａｒｒｅｎ）及びマーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）によって発見された胃幽門前庭部に特異的に見出されるグラム陰性螺旋状桿菌である[ランセット（Ｌａｎｃｅｔ，Ｉ．）１２７３−１２７５（１９８３）]。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリは、胃炎、消化性潰瘍などの患者の胃粘膜から高率に検出されることから、それら病気の発症に強く関わっていると考えられている。近年、胃癌への関与が注目されており、ある種の胃癌の発症には、ヘリコバクター・ピロリが原因となっていることが知られている。また、日本人の中高年者の７０％以上がヘリコバクター・ピロリの保菌者といわれている。
【０００４】
このような背景からヘリコバクター・ピロリの除菌及び増殖抑制について社会的関心が高まっている。ヘリコバクター・ピロリの除菌及び増殖抑制には例えば薬剤が使用される。ヘリコバクター・ピロリの除菌及び増殖抑制に一般的に用いられる薬剤は、プロトンインヒビターと抗生物質（β―ラクタム系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質及びニューキノロン系抗菌剤など）を組み合わせた３種類程度の薬剤である。薬剤によるヘリコバクター・ピロリの除菌及び増殖抑制は、胃癌の抑止に一定の効果を上げることが知られている。
【０００５】
また、特開２００１−１４３号公報には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉに属する乳酸菌がヘリコバクター・ピロリの生育を阻害し、ヘリコバクター・ピロリの除菌、感染予防を目的とした食品に応用されることが報告されている（特許文献１）。乳酸菌は、世界中で様々な発酵食品に用いられており、非常に安全性の高い菌である。乳酸菌は、生菌や死菌の形態で医薬品や食品に含まれる。また、乳酸菌の有無は関係なく乳酸菌による発酵によって得られる発酵生産物という形態でも医薬品や食品に含まれる。生菌でなければ抗ヘリコバクター・ピロリ効果がないもの、死菌でも抗ヘリコバクター・ピロリ効果があるもの、菌の有無は関係なく乳酸菌による発酵によって得られる発酵生産物でも抗ヘリコバクター・ピロリ効果があるものなどがあり、個々の乳酸菌によって、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有する乳酸菌の形態は異なる。乳酸菌による抗ヘリコバクター・ピロリ効果は、例えば、乳酸菌が生産する乳酸や抗菌物質のバクテリオシン等によって引き起こされることが知られている。ヘリコバクター・ピロリを除菌するために、乳酸菌を単独で使用する（非特許文献１）場合や、乳酸菌と薬剤とを併用する（非特許文献２）場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１４３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boonyaritichaikij S., Kuwabara K., Nagano J., Kobayashi K., Koga Y., Long-term administration of probiotics to asymptomatic pre-school children for either the eradication or the prevention of Helicobacter pylori infection, Helicobacter, 14(3), 202-207, June 2009
【非特許文献２】神谷  茂，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ感染症に対するプロバイオティクスの効果，腸内細菌学雑誌，２４，１−１２，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、薬剤によるヘリコバクター・ピロリの除菌は完全ではなく、１回目の薬剤投与で完全に除菌されない場合、２回目以降の薬剤投与を行っても、ヘリコバクター・ピロリの除菌率は大幅に低下するので、多量の薬剤を長期間にわたって使用しなければならないという問題がある。また、複数回薬剤投与を行うことは、薬剤を大量且つ長期間にわたって服用することになるので、患者へもストレスがかかり、耐性菌が出現するなどの副作用を伴う恐れがある。
【０００９】
また、非特許文献１に記載の乳酸菌を単独で使用する場合では、ヘリコバクター・ピロリの除菌率は３０％以下であり除菌率が低いという問題がある。さらに、乳酸菌を生菌で使用しなければ効果が得られないということもあり、乳酸菌の使用形態が制約されるという問題もある。
【００１０】
さらに、生菌でなければ抗ヘリコバクター・ピロリ効果がない乳酸菌は、薬剤との混合又は併用して使用した場合には、薬剤の影響を受けるために使用することができない。したがって、生菌以外の形態で使用することが必要となるなど乳酸菌の使用形態が制約されるという問題がある。
【００１１】
本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、ヘリコバクター・ピロリの除菌率が高く、使用形態が制約されにくい抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有する乳酸菌、その乳酸菌を含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤、及びその乳酸菌を含む飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の菌株は、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１５７であるラクトコッカス・ラクティスＨＡ−７（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＨＡ−７）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１５８であるロイコノストック・シトレウムＨＡ−１２（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＨＡ−１２）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１５９であるワイセラ・パラメセンテロイデスＨＡ−８１９（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＨＡ−８１９）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１６０であるロイコノストック・メセンテロイデスＨＡ−８６３（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＨＡ−８６３）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１６１であるワイセラ・コンフサＨＡ−１３１５（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ  ＨＡ−１３１５）菌株である。
【００１３】
本発明の菌株は、それぞれの菌株の標準株と比較して高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果を奏する。よって、上記菌株を用いれば、それぞれの菌株の標準株を使用した場合と比較して、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を向上させることができる。なお、抗ヘリコバクター・ピロリ効果とは、ヘリコバクター・ピロリを除菌する効果及び増殖を抑制する効果の少なくとも一方の効果のことである。
【００１４】
本発明の菌株は、菌株培養の常法に従って任意の条件で培養することができる。培養方法については特に限定されず、従来公知の方法を適宜選択して使用することができる。
本発明の菌株は、それぞれニンニクより単離されることが好ましい。
【００１５】
ニンニクより単離された本発明の菌株は、他の野菜から単離された乳酸菌株と比較して抗ヘリコバクター・ピロリ効果が高い。
ニンニクからの単離は、一般的な手法で行うことができる。例えば、ニンニクを、滅菌した生理食塩水で洗浄した後、洗浄液からニンニクに付着している菌を単離することもできる。また、ニンニクを粉砕後、粉砕物から得た試料を、ブロムクレゾールパープルを含む乳酸菌分離用培地に加え、それぞれの菌株を培養後に、菌株のコロニーの周囲が黄変している菌株を回収することによって単離することもできる。
【００１６】
ニンニクの粉砕物から単離された本発明の菌株は、ニンニクを粉砕せずに単離された乳酸菌株と比較して抗ヘリコバクター・ピロリ効果が高い。
また、ニンニクの粉砕物から単離された本発明の菌株は、その菌株の標準株と比較して、抗ヘリコバクター・ピロリ効果が高い。
【００１７】
また、ニンニクより単離されることによって、ニンニクから抽出されるニンニク成分に耐性を有する菌株を得ることができるので、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有するニンニク成分と併用して使用することも可能である。
【００１８】
使用されるニンニクの品種や産地は特に限定されない。
本発明の第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤は、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１５７であるラクトコッカス・ラクティスＨＡ−７（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＨＡ−７）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１５８であるロイコノストック・シトレウムＨＡ−１２（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＨＡ−１２）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１５９であるワイセラ・パラメセンテロイデスＨＡ−８１９（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＨＡ−８１９）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１６０であるロイコノストック・メセンテロイデスＨＡ−８６３（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＨＡ−８６３）菌株、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１１６１であるワイセラ・コンフサＨＡ−１３１５（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ  ＨＡ−１３１５）菌株及びニンニクより単離される該菌株それぞれからなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株を含むことを特徴とする。
【００１９】
このような第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤によれば、それぞれの菌株の標準株を使用した抗ヘリコバクター・ピロリ剤と比較して抗ヘリコバクター効果を向上させることができる。
【００２０】
本発明の第１のヘリコバクター・ピロリ剤は、ニンニクより単離される菌株が使用されると好ましい。ニンニクより単離される菌株は、他の野菜から単離された乳酸菌株と比較して抗ヘリコバクター・ピロリ効果が高く、ニンニクから抽出されるニンニク成分に耐性を有するので、ニンニクから抽出されるニンニク成分と併用することが可能になる。
【００２１】
抗ヘリコバクター・ピロリ剤とは、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を備える薬剤である。
また、本発明の第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤において、使用される菌株は、死菌であると好ましい。
【００２２】
このように生菌以外の形態でも抗ヘリコバクター・ピロリ剤に使用することができるので、生菌でないと抗ヘリコバクター・ピロリ効果がない菌株を使用する場合と比較して、菌株の使用形態の制約を受けにくくすることができる。
【００２３】
死菌とは、生菌を例えば加熱処理などして得られる菌株である。
本発明の第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤において、菌株の培養液を抗ヘリコバクター・ピロリ剤の構成物質として使用しても良いし、菌株を培養後に殺菌処理をした培養液を第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤の構成物質として使用しても良い。また、培養液の殺菌の有無に関わらず、培養液を乾燥させて、粉末などの固形物を第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤の構成物質として使用しても良い。培養液には菌株が含まれているので、培養液や培養液を乾燥した固形物を使用すると、菌株は第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤に含まれることになる。また、培養液の殺菌の有無に関わらず、培養液を遠心分離等で分離し、菌株等が含まれる固形分を第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤の構成物質として使用しても良い。
【００２４】
本発明の第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤は、上記記載の菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株による発酵によって得られる発酵成分を有効成分とする。
発酵成分とは、それぞれの菌株の発酵によって得られる成分である。この成分は、例えば菌株の培養液の上清に含まれる。上清とは、菌株を培養後、培養後の培養液を遠心分離等で分離し、菌等の固形分を沈殿させて得られる液体部分である。
【００２５】
本発明の第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤において、菌株の培養液を第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤の構成物質として使用しても良い。
培養液には菌株の発酵によって得られる発酵成分が含まれているので、培養液を使用しても、菌株による発酵によって得られる発酵成分は第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤に含まれることになる。
【００２６】
本発明の第１及び第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤には、それぞれ賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、コーティング剤等を含有させてもよい。他にも、希釈剤、緩衝剤、懸濁剤、乳化剤等、医薬品の製造技術分野において通常使用しうる添加剤を含有させてもよい。また、必要に応じて他の薬剤を調合してもよい。
【００２７】
賦形剤としては、特に限定されないが、例えば、白糖、乳糖、マンニトール、グルコース等の糖類、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コメデンプン等のデンプン類、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油等を挙げることができる。
【００２８】
結合剤としては、特に限定されないが、例えば、キトサン、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、寒天等の多糖類、トラガント、ゼラチン、グルテン等の天然高分子類、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、酢酸ビニル樹脂等の合成高分子等を挙げることができる。
【００２９】
崩壊剤としては、特に限定されないが、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体、カルボキシメチルスターチナトリウム、ヒドロキシプロピルスターチ、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コメデンプン、部分α化デンプン等のデンプン類等を挙げることができる。
【００３０】
潤沢剤としては、特に限定されないが、例えば、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、コロイダルシリカ、含水二酸化ケイ素、ワックス類、硬化油等を挙げることができる。
【００３１】
コーティング剤としては、特に限定されないが、例えば、ジメチルアミノエチルメタアクリレート・メタアクリル酸共重合体、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アクリル酸エチル・メタアクリル酸共重合体、アクリル酸エチル・メタアクリル酸メチル・メタアクリル酸塩化トリメチルアンモニウムエチル共重合体、エチルセルロース等の水不溶性高分子、メタアクリル酸・アクリル酸エチル共重合体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート等の腸溶性高分子、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等の水溶性高分子等を挙げることができる。
【００３２】
また、投与形態は限定されることはなく、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤などの形態で経口投与されるものであってもよいし、注射剤等の非経口投与されるものであってもよい。
【００３３】
本発明の第１及び第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤それぞれは、ニンニクから抽出されるニンニク成分を含むと好ましい。
ニンニクから抽出されるニンニク成分には抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有する物がある。したがって、第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤においては、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有するニンニク成分を含むことにより、菌株を単独で使用した場合と比較して、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を高めることができる。また、第の２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤においては、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有するニンニク成分を含むことにより、菌株による発酵によって得られる発酵成分を有効成分として単独で使用した場合と比較して、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を高めることができる。
【００３４】
また、ニンニクから抽出されるニンニク成分は天然成分であるため、化学薬剤等の天然成分ではない薬剤の使用に起因する副作用を防止することができるので、第１及び第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤それぞれの安全性を高めることができる。
【００３５】
第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤において、ニンニク成分を含む場合に使用される菌株としては、ニンニクより単離された菌株等が挙げられる。
第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤において、ニンニク成分を含む場合、ニンニクから単離された菌株による発酵によって得られる発酵成分等を用いることができる。
【００３６】
また、ニンニクから抽出されるニンニク成分としては、抗菌物質であるアリシンやアホエン等が挙げられる。
本発明の第１の飲食品は、上記記載の菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株を含むことを特徴とする。
【００３７】
このような飲食品には、上記記載の高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有する菌株が含まれている。したがって、このような飲食品によれば、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を向上させることができる。
【００３８】
第１の飲食品としては、上記記載の菌株を直接任意の食品に加えた物や、香料等の添加剤と混合させて、粉末状、顆粒状、塊状等の任意の形態の固形食品や飲料食品とした物等が挙げられる。例えば、乳製品や野菜等に上記記載の菌株を加えて発酵食品にしたもの等がある。
【００３９】
また、任意の賦形剤、結合剤、希釈剤等を混合して、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、飲料等の任意の形態の健康食品とした物等もある。
本発明の第２の飲食品は、上記記載の抗ヘリコバクター・ピロリ剤を含むことを特徴とする。
【００４０】
このような飲食品によれば、上記記載の抗ヘリコバクター・ピロリ剤が含まれているので、抗ヘリコバクター・ピロリ効果を向上させることができる。
第２の飲食品としては、第１の飲食品と同様な固形食品や飲料食品等が挙げられる。
【００４１】
また、第１の飲食品と同様に任意の賦形剤、結合剤、希釈剤等を混合して、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、飲料等の任意の形態の健康食品とした物等もある。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
次に、本発明の実施形態について一例を挙げて説明する。但し、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
１．抗ヘリコバクター・ピロリ効果を奏するＨＡ−７、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５菌株の単離
（１）ニンニク（ホワイト種）はスーパーマーケットで市販されている物を使用した。ニンニクの外皮を除いた後フードプロセッサーにて粉砕した。１時間保持した後、この粉砕物を１ｇ採取し、滅菌した生理食塩水１０ｍｌに懸濁し、０．１ｍｌをＢＣＰ加プレートカウントアガール（日水製薬製）に接種した。これを寒天培地１とした。
（２）上記（１）を繰り返し、寒天培地１からコロニーの周囲が黄変しているコロニーを２０００菌株採取した。ニンニク成分に耐性のある乳酸菌株のコロニーの周囲は、黄変しているので、このコロニーを回収することによって、ニンニク成分に耐性のある乳酸菌株を得ることができる。採取した２０００菌株それぞれをＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した。
（３）各菌株についてヘリコバクター・ピロリ抑制試験を行った。ヘリコバクター・ピロリ抑制試験の方法について、以下に説明する。各菌株それぞれについて、培養液の濁度が１．０になるまで培養した後、培養液を０．２５ｍＬ採取し、ヘリコバクター・ピロリ  ＡＴＣＣ４３５０４菌株を１０7コロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ：ｃｆｕ）含む培養液０．２５ｍＬと混合した。３７℃で１時間保持後、適宜希釈し、ヘリコバクター寒天培地（日水製薬製）で３７℃、７日間微好気条件下培養し、ヘリコバクター・ピロリの生菌数を測定した。ヘリコバクター・ピロリ  ＡＴＣＣ４３５０４菌株は、１０％馬血清を含むブルセラブロス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養したものを使用した。
【００４３】
その結果、採取した２０００菌株のうち、特定の５つの菌株を使用した場合には、ヘリコバクター・ピロリの生菌数が、菌株の培養液を含まないブランクと比較して著しく低下することが示され、高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果があることが明らかとなった。この５つの菌株を、以下では、ＨＡ−７、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５とする。
【００４４】
ＨＡ−７、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５のヘリコバクター・ピロリ抑制試験の結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2013116089.tif 000002
【００４６】
なお、ＨＡ−７、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５は、それぞれ独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。ＨＡ−７は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５７として、ＨＡ−１２は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５８として、ＨＡ−８１９は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１５９として、ＨＡ−８６３は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１６０として、ＨＡ−１３１５は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１１６１として寄託されている。
（４）ニンニク粉砕物から単離された乳酸菌株、ニンニク浸漬物から単離された乳酸菌株、キャベツから単離された乳酸菌株、それぞれについてのヘリコバクター・ピロリ抑制試験
上記（１）では、ニンニク粉砕物を使用した。上記記載のようにニンニク粉砕物から単離された乳酸菌株に高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果があることを、下記に記載のサンプル１ａ〜１０ａ、１ｂ〜１０ｂ、１ｃ〜１０ｃについて、ヘリコバクター・ピロリ抑制試験をすることによって明らかにした。
【００４７】
サンプル１ａ〜１０ａは、ニンニク粉砕物から単離された乳酸菌株である。サンプル１ａ〜１０ａを、次に記載の方法を使用して得た。上記（１）に記載の寒天培地１からコロニーの周囲が黄変しているコロニーを１００菌株採取した。採取した１００菌株のコロニーを、それぞれについて１０菌株ずつ１０個のグループに分けた。１０個のグループそれぞれをＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した。培養液の濁度が１．０になった培養液を各グループからそれぞれ０．１ｍＬずつ採取し一つにまとめた。これを、ヘリコバクター・ピロリ抑制試験用のサンプルとした。サンプルは１０個作成し、１ａ〜１０ａとした。
【００４８】
サンプル１ｂ〜１０ｂは、ニンニク浸漬物から単離された乳酸菌株である。サンプル１ｂ〜１０ｂを次に記載の方法を使用して得た。ニンニク（ホワイト種）の外皮を除き、ニンニクの鱗茎１かけら（約４ｇ）をそのまま滅菌した生理食塩水５０ｍｌに浸漬した。1時間保持した後、生理食塩水０．１ｍｌを採取、ＢＣＰ加プレートカウントアガールに接種した。これを寒天培地２とし、上記のサンプル１ａ〜１０ａを得た方法と同じ方法を使用してサンプル１ｂ〜１０ｂを得た。
【００４９】
サンプル１ｂ〜１０ｂは、キャベツから単離された乳酸菌株である。サンプル１ｃ〜１０ｃを次に記載の方法を使用して得た。キャベツはスーパーマーケットで市販されている物を使用した。キャベツの外皮を２、３枚取り除いた後、キャベツ４〜１０ｇを５０ｍｌの滅菌した生理食塩水に浸漬し、フードプロセッサーで粉砕して１時間保持後０．１ｍｌを採取してＢＣＰ加プレートカウントアガールに接種した。これを寒天培地３とし、上記のサンプル１ａ〜１０ａを得た方法と同じ方法を使用してサンプル１ｃ〜１０ｃを得た。
【００５０】
各サンプルについてヘリコバクター・ピロリ抑制試験を上記１．（３）に記載の方法を使用して行った。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2013116089.tif 000003
【００５２】
表２に示すように、１ａ〜１０ａのサンプルは、１ｂ〜１０ｂ、１ｃ〜１０ｃのサンプルと比較して高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果を示した。また、ニンニクから単離された乳酸菌株１ａ〜１０ａ、１ｂ〜１０ｂの結果から、ニンニクを粉砕せずに使用した場合と比較して、ニンニクを粉砕して使用した方が、乳酸菌株の抗ヘリコバクター・ピロリ効果が高いことが明らかとなった。
２．単離された菌株の同定
（１）ＨＡ−７について、公知の方法を用いて、１６ＳｒＤＮＡ（１６Ｓリボソ−ムＤＮＡ）解析を行った。その結果、ＨＡ−７は、既にデータベースに登録されているラクトコッカス・ラクティスの株との間で、１６ＳｒＤＮＡの部分配列において高い相同性を示した。このことから、ＨＡ−７は、ラクトコッカス・ラクティスであることが分かった。同様にして、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５についても１６ＳｒＤＮＡ解析を行った。その結果、ＨＡ−１２は、ロイコノストック・シトレウムであり、ＨＡ−８１９は、ワイセラ・パラメセンテロイデスであり、ＨＡ−８６３は、ロイコノストック・メセンテロイデスであり、ＨＡ−１３１５は、ワイセラ・コンフサであることが分かった。また、これら菌株は、基準株との相同性が１００％ではないことから、公知の菌株とは異なる、新規な菌株であることが分かった。
（２）ＨＡ−７、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５の菌学的性質（形態的性状、生殖様式、生理・化学的性状等）を分析した。糖の資化性はＡＰＩ（アピ）  ＣＨキット（シスメックス・ビオメリュー社製）を用いて分析した。分析結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
2013116089.tif 000004
【００５４】
ＨＡ−７、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５の菌学的性質は、それぞれの基準株と比較して以下に記載のように糖の資化性に違いがあることが示された。ＨＡ−７株の基準株では、Ｄマンニトールの資化性は示さなかったが、ＨＡ−７では、Ｄマンニトールに対して資化性を示した。ＨＡ−１２の基準株では、Ｄキシロースの資化性は示さなかったが、ＨＡ−１２では、Ｄキシロースに対して資化性を示した。ＨＡ−８１９の基準株では、Ｄキシロースの資化性は示さなかったが、ＨＡ−８１９では、Ｄキシロースに対して資化性を示した。ＨＡ−８６３は、その基準株と比較してゲンチオビオースに対して弱い資化性を示した。ＨＡ−１３１５は、その基準株と比較してＤガラクトースに対して弱い資化性を示した。以上のことからも、これら菌株は、公知の菌株とは異なる、新規な菌株であることがわかった。
【００５５】
以下、上記１．に記載のニンニクから単離されたＨＡ−７、ＨＡ−１２、ＨＡ−８１９、ＨＡ−８６３、ＨＡ−１３１５をまとめて、ニンニクより単離された菌株と称する。
また、表４、表６〜表８のブランクとは、各菌株を１０5ｃｆｕ／ｍｌ含む培養液と生理食塩水とを１：１の割合で混合して３７℃で１時間保持後、混合液をＢＣＰ加プレートカウントアガールに接種し、各菌株のコロニー数を計測した結果を示す。
３．ヘリコバクター・ピロリ抑制試験
ニンニクより単離された菌株それぞれとそれぞれの基準株について、ヘリコバクター・ピロリ抑制試験を行った。試験は、１．（３）に記載と同様の方法で行った。その結果を表４に示す。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
ニンニクより単離された菌株は、基準株と比較して、ヘリコバクター・ピロリの生菌数が減少し高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果があることが明らかとなった。
４．ニンニク成分に対する耐性試験
ニンニクより単離された菌株それぞれとそれぞれの基準株について、ニンニク成分に対する耐性試験を行った。耐性試験には、ニンニク搾汁とアホエンを使用した。アホエンは、ニンニク由来の抗菌性を有する物質である。アホエンの製造と分析は、特許第２６０８２５２号公報に開示されている方法に従って行った。
【００５８】
ニンニク搾汁に対する耐性試験を以下に記載の通りに行った。外皮を除去したニンニク１００ｇを７０％エタノールに浸した後、２０ｍｌの滅菌水を加え、フードプロセッサーで処理してニンニクの搾汁を得た。各菌株を１０5ｃｆｕ／ｍｌ含む培養液とニンニクの搾汁とを１：１の割合で含むように混合して３７℃で１時間保持後、混合液をＢＣＰ加プレートカウントアガールに接種し、各菌株のコロニー数を計測した。
【００５９】
アホエンに対する耐性試験を以下に記載の通りに行った。各菌株を１０5ｃｆｕ／ｍｌ含む培養液にアホエンを１５０μｇ／ｍｌ含むように添加し、１時間保持した後、培養液をＢＣＰ加プレートカウントアガールに接種し、各菌株のコロニー数を計測した。この結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
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【００６１】
表５に示されるように、基準株を使用した場合には、各菌株の生菌数は大きく減少したが、ニンニクより単離された菌株は、培養液中にニンニク搾汁やアホエンを含む場合でも、各菌株の生菌数は低下しなかった。したがって、ニンニクより単離された菌株はニンニク成分に対し、耐性を有することが明らかとなった。
５．第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤
ニンニクより単離された菌株それぞれについて、それぞれの菌株の死菌を含む第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤を次に記載のように製造した。
【００６２】
ニンニクより単離された菌株それぞれの培養液について、濁度が１．０になるまで培養し、培養液を１２１℃、１５分の条件で加熱処理を行った。この培養液を第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤とした。
【００６３】
第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤について、ヘリコバクター・ピロリ抑制試験を行った。
ヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ４３５０４株の培養液は、１０％馬血清を含むブルセラブロスで１０7ｃｆｕ／ｍｌになるように培養したものを使用した。
【００６４】
第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤と上記のヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ４３５０４株の培養液とを混合し、３７℃で１時間保温後、適宜希釈し、ヘリコバクター寒天培地（日水製薬製）に塗布して微好気条件下、３７℃で７日間培養した後、ヘリコバクター・ピロリのコロニー数を計測した。その結果を表６に示す。
【００６５】
【表６】
2013116089.tif 000007
【００６６】
第１の抗ヘリコバクター・ピロリ剤を使用した場合は、ブランクと比較してヘリコバクター・ピロリ菌数は減少していることから、高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果があることが認められた。したがって、生菌ではなく、菌株を加熱処理して死菌の形態にしても使用することができるので、菌株の使用形態の制約を受けにくくすることができる。
６．第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤
ニンニクより単離された菌株それぞれについて、それぞれの菌株による発酵によって得られる発酵成分を有効成分とする第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤を次に記載のように製造した。
【００６７】
ニンニクより単離された菌株それぞれの培養液について、濁度が１．０になるまで培養し、培養液を遠心分離後、その上清を０．４５μｍの滅菌済みフィルターでろ過して菌株培養上清を得た。この上清みを第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤とした。
【００６８】
第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤について、ヘリコバクター・ピロリ抑制試験を行った。
ヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ４３５０４株の培養液は、上記５に記載と同様に培養したものを使用した。
【００６９】
第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤とヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ４３５０４株の培養液とを２５０μｌずつ混合し、３７℃で１時間保温後、適宜希釈し、ヘリコバクター寒天培地に塗布して微好気条件下、３７℃で７日間培養した後、ヘリコバクター・ピロリのコロニー数を計測した。その結果を表７に示す。
【００７０】
【表７】
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【００７１】
第２の抗ヘリコバクター・ピロリ剤を使用した場合は、ブランクと比較してヘリコバクター・ピロリのコロニー数は減少していることから、高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果があることが認められた。
７．ニンニク成分を含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤
ニンニクより単離された菌株それぞれとニンニク成分として抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有するアホエンとを含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤を次に記載のように製造した。
【００７２】
ニンニクより単離された菌株それぞれについて、濁度が１．０になるまで培養した。その培養液にアホエンを添加しニンニク成分を含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤とした。
ニンニク成分を含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤について、ヘリコバクター・ピロリ抑制試験を行った。
【００７３】
ヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ４３５０４株の培養液は、上記５に記載と同様に培養したものを使用した。
ニンニク成分を含む抗ヘリコバクター・ピロリ剤にヘリコバクター・ピロリＡＴＣＣ４３５０４株の培養液を２５０μｌずつ混合した。（アホエンは１５μｇ／ｍｌになるように添加した。）３７℃で１時間保温後、ヘリコバクター寒天培地で微好気条件下、３７℃で７日間培養し、ヘリコバクター・ピロリのコロニー数を計測した。アホエン未添加の場合のヘリコバクター・ピロリ抑制試験も行った。その結果を表８に示す。
【００７４】
【表８】
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【００７５】
本発明の抗ヘリコバクター・ピロリ剤は、ニンニクより単離された菌株を、アホエンと併用して使用することにより、菌株それぞれを単独で使用した場合と比較して、ヘリコバクター・ピロリのコロニー数は減少していることから、抗ヘリコバクター・ピロリ効果が増大することが明らかとなった。また、アホエン存在下においてニンニクより単離された菌株は生存していることが確認された。
８．本発明の菌株や抗ヘリコバクター・ピロリ剤を含む飲食品
本発明の菌株や抗ヘリコバクター・ピロリ剤を、牛などの家畜の生乳に加えることによって、発酵乳やヨーグルトを生成することもできる。また、野菜や果物の搾汁やペースト状のものに加えることによって発酵食品にすることもできる。さらに、任意の賦形剤、結合剤、希釈剤等を混合して、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、飲料の形態の健康食品に加工することもできる。
【００７６】
本発明の飲食品は、本発明の菌株や抗ヘリコバクター・ピロリ剤を含むので、これらを含まない飲食品と比較して、高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果を奏する。
以上のように、ニンニクから単離された上記菌株は、高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果を有する。また、ニンニク由来の抗菌成分に対して耐性を持つため、これら抗菌成分と併用して使用することもできる。さらに、上記菌株の使用形態は制約されにくく、生菌、死菌、及び菌株の発酵によって得られる発酵成分を使用して、高い抗ヘリコバクター・ピロリ効果を奏することができる。
【００７７】
尚、本発明は前記実施の形態になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。