(57)【要約】【課題】  蛍光サイトメトリー法（蛍光イメージングサイトメトリー法及び蛍光フローサイトメトリー法）による微生物等の検査方法及び検査装置において、食品中の抗酸化成分による蛍光色素の退色を容易に低減することが可能な微生物等の検査方法及び検査装置を提供する。【解決手段】  蛍光サイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置において、微生物等を蛍光色素で染色する前に、食品中の抗酸化成分を酸化する。微生物検査カセットを用いた蛍光フローサイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置においては、例えば、微生物等の染色を行う容器の上流に、食品中の抗酸化成分を酸化する容器を備える。【選択図】  図１
2013215142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体液に酸化剤を添加し、前記酸化剤を添加した前記検体液に蛍光色素を添加し、前記蛍光色素を添加した前記検体液に励起光を照射して蛍光を検出することにより微生物等を計数することを特徴とする微生物等の検査方法。
【請求項２】
前記酸化剤は過酸化水素であることを特徴とする請求項１記載の微生物等の検査方法。
【請求項３】
前記酸化剤の前記検体液に対する濃度が、0.01ｗｔ％〜0.05ｗｔ％であることを特徴とする請求項２記載の微生物等の検査方法。
【請求項４】
前記微生物等の検査方法は、少なくともエシェリキア・コリ（E.coli）、エンテロバクター・アエロゲネス（E.aerogenes）、エンテロバクター・アグロメランズ(E.agglomerans)、エンテロバクター・クロアカ（E.cloacae）の有無を検査するものであることを特徴とする請求項２記載の微生物等の検査方法。
【請求項５】
検体液が保持される検体容器、酸化剤が保持される酸化容器、微生物等を蛍光染色する染色液が保持される染色容器、微生物検出用流路、前記検体容器と前記酸化容器、前記酸化容器と前記染色容器、及び前記染色容器と前記微生物検出用流路をそれぞれ接続する流路を備えた微生物検査カセットと、
前記微生物検査カセットが装着され、前記微生物検査カセットを移動させるステージと、
前記微生物検査カセットと接続され、前記検体液を前記検体容器から前記酸化容器に搬送し、前記酸化容器から混合液を前記染色容器に搬送し、前記染色容器から混合液を検出液として前記微生物検出用流路に搬送する圧力を供給する圧力供給装置と、
前記微生物検出用流路に励起光を照射する光源、前記微生物検出用流路を流れる検出液からの蛍光を検出して電気信号に変換する光検出器を有する検出装置と、を有することを特徴とする微生物等の検査装置。
【請求項６】
前記微生物検査カセットは、前記酸化容器内に酸化剤を保持していることを特徴とする請求項５記載の微生物等の検査装置。
【請求項７】
前記酸化剤が前記酸化容器内の混合液の水位よりも下に位置するように保持されていることを特徴とする請求項５記載の微生物等の検査装置。
【請求項８】
染色液と混合した検体液に励起光を照射して蛍光を検出することにより前記検体液に含まれる微生物等を電気信号として検出する微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットであって、
検体液が保持される検体容器と、
酸化剤を保持している酸化容器と、
前記染色液を保持している染色容器と、
前記励起光が照射される微生物検出用流路と、
前記検体容器と前記酸化容器、前記酸化容器と前記染色容器、及び前記染色容器と前記微生物検出用流路をそれぞれ接続する流路とを備えたことを特徴とする微生物検査カセット。
【請求項９】
前記酸化剤が前記酸化容器内に設けられたガラス管内に保持されていることを特徴とする請求項８記載の微生物等の検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物等の検査方法及び検査装置にかかり、特に、蛍光サイトメトリー法を用いた微生物等の検査方法及び検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生微生物数計測を行う微生物数測定装置には、蛍光サイトメトリー法を用いたものがある。蛍光サイトメトリー法には、蛍光イメージングサイトメトリー法と蛍光フローサイトメトリー法がある。
【０００３】
蛍光イメージングサイトメトリー法は、フィルタ上に固定した検体を蛍光色素によって染色し、蛍光画像を取得して検体を一個ずつ直接計測する粒子計測方法である。また、蛍光フローサイトメトリー法は、蛍光色素によって染色した検体を含む流体が、小さな径の流路を通過するとき、検体を一個ずつ直接計測する粒子計測方法である。蛍光フローサイトメトリー法としては、例えば、特許文献１に記載されたものがある。特許文献１では、グリセリンを微生物への蛍光色素の染色促進剤として使用することにより、微生物の蛍光染色を促進させ、微生物の計測精度を向上させることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−  ９２１０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光サイトメトリー法において、生微生物数計測を正確に行うためには、蛍光色素により食品中の生微生物を漏れなく染色することが重要である。
【０００６】
本発明者等の検討によれば、食品の種類によっては、食品中の生微生物が十分に染色されないことが判明した。食品中の生微生物が十分に染色されない理由は、本発明者等の検討によれば、食品中に含まれる抗酸化成分が蛍光色素を退色させるためである。従って、抗酸化成分が共存した状態では食品中の生微生物が十分に染色されない。
【０００７】
食品中の抗酸化成分による蛍光色素の退色については、特許文献１を含めて従来考慮されていない。特許文献１のように蛍光促進剤を使用したとしても、蛍光色素が食品中の抗酸化成分にさらされたままでは蛍光色素の退色を防ぐことは難しい。
【０００８】
本発明の目的は、食品中の抗酸化成分による蛍光色素の退色を低減することが可能な微生物等の検査方法及び検査装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、蛍光サイトメトリー法（蛍光イメージングサイトメトリー法及び蛍光フローサイトメトリー法）による微生物等の検査方法及び検査装置において、微生物等を蛍光色素で染色する前に、食品中の抗酸化成分を酸化することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
蛍光サイトメトリー法において、食品中の抗酸化成分による蛍光色素の退色を低減することが可能となり、生微生物数計測をより正確に行うことが可能となる。
【００１１】
上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施例である微生物等の検査方法を示すフロー図である。
【図２】酸化剤として過酸化水素を使用したときの菌の染色率を示す図である。
【図３】酸化剤として過酸化水素を使用したときの抗酸化剤の酸化反応を示す図である。
【図４】本発明の一実施例である微生物等の検査装置の概略構成を示す図である。
【図５Ａ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットにおける微生物検出用流路を含む断面例を示す図である。
【図５Ｂ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットにおける微生物検出用流路を含む分解構造例を示す図である。
【図６】本発明の微生物等の検査装置を用いた分析工程の一例を説明する図である。
【図７】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの概略構成の一例を示す図である。
【図８】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの概略構成の他の例を示す図である。
【図９Ａ】本発明の微生物検査装置を用いて菌の測定をした結果を示す図である。
【図９Ｂ】本発明の微生物検査装置を用いて菌の測定をした結果を示す図である。
【図９Ｃ】本発明の微生物検査装置を用いて菌の測定をした結果を示す図である。
【図９Ｄ】本発明の微生物検査装置を用いて菌の測定をした結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、微生物の検査の他に細胞の検査にも同様に適用可能であり、従って、本明細書及び特許請求の範囲において、「微生物等」とは「微生物及び／又は細胞」を意味する。そして、説明を簡単に説明するために、「微生物等」を単に「微生物」と表記する場合がある。また、「食品」には「飲料」も含まれる。
【００１４】
（Ａ）蛍光色素の退色低減の方法  
図１に本発明の一実施例である微生物等の検査方法の手順（蛍光色素の退色低減の手順）を示す。本実施例は、微生物等を蛍光色素で染色する前に、食品中の抗酸化成分を酸化する工程を含むことを特徴とする。酸化する工程としては、好ましくは、酸化剤（過酸化水素等）が用いられる。
【００１５】
まず、食品を滅菌水に懸濁して作製した検体に酸化剤を添加し、食品中の抗酸化成分を酸化する。次に、蛍光色素を添加し、検体中の微生物を蛍光染色する。最後に、検体に励起光を照射して、蛍光色素で染色された微生物の蛍光検出を行う。蛍光検出には、微生物の蛍光発光を画像取得して光点を計数する蛍光イメージングサイトメトリー法や、検体を細い流れにして微生物を載せて光点を計測する蛍光フローサイトメトリー法がある。
【００１６】
図２に蛍光色素の染色率が、酸化剤の濃度に依って変化する様子を示す。図２は、抗酸化成分として最も一般的なアスコルビン酸（ビタミンC）を含有する市販のペットボトル緑茶にE.aerogenes（エンテロバクター・アエロゲネス：大腸菌群の１種）を加え、酸化剤として過酸化水素を添加した後、蛍光色素として全微生物用シアニン系青色蛍光色素を用いてE.aerogenesを染色したときの染色率を示している。
【００１７】
図２より、過酸化水素の濃度範囲（検体液中の過酸化水素の重量濃度）を0.0001〜0.1％と変化させた中で、過酸化水素濃度0.02％付近で染色率のピークが見られた。過酸化水素の無添加時(染色率：2〜3％)と比較して、0.02％添加時の染色率は36〜47％にまで良くなった。このことから、過酸化水素を適正な濃度で染色前に添加することで、抗酸化成分による蛍光色素の退色を抑制し、染色率を上げることが可能であることがわかる。
【００１８】
図３に酸化剤として過酸化水素を使用したときの抗酸化剤の酸化反応を示す。図３に示すように、抗酸化成分であるアスコルビン酸は過酸化水素(H2O2)を添加することにより酸化されてデヒドロアスコルビン酸となる。アスコルビン酸はデヒドロアスコルビン酸となることにより抗酸化作用が失われる。その結果、検体中に蛍光色素を退色させる抗酸化成分が少なくなり、蛍光色素の退色が抑制される。
【００１９】
過酸化水素の濃度は、アスコルビン酸を酸化するのに必要なモル濃度、即ちアスコルビン酸と同じモル濃度が好適といえる（過酸化水素の場合、重量濃度に略等しい）。従って、予め検査対象に含まれる抗酸化剤の濃度を測定し、それに応じて過酸化水素の濃度を調節するのが望ましい。また、アスコルビン酸の濃度を直接測定しなくても、図２に示すような試験を行い、染色率が良くなる範囲を求め、その濃度で酸化剤（過酸化水素）を添加するようにしても良い。
【００２０】
本実施例において使用したペットボトル緑茶に対して、過酸化水素濃度0.01％で染色率が大幅に向上し、0.02％をピークに0.05％までは過酸化水素無添加時よりも10倍の染色率を確保することができる（図２）。また、過酸化水素濃度が0.1％を超えると、菌へのダメージが強く、菌が死ぬことを培養法により確認している。よって、本実施例において使用したペットボトル緑茶に対しては、過酸化水素の濃度は0.01〜0.05％が好ましく、0.02％程度が更に好ましいと言える。本実施例において使用したペットボトル緑茶のアスコルビン酸含有量は0.02％程度であるが、ビタミンＣを多く含有するジュース以外の飲料の多くは、アスコルビン酸含有量は0.02％程度と推測される。従って、多くの場合、過酸化水素の濃度は0.01〜0.05％が好ましく、0.02％程度が更に好ましいと言える。但し、予めアスコルビン酸含有量が分かっていれば、それに対応するように過酸化水素の濃度を調節するのが望ましい。または、図２に示すような試験を予め実施して染色率が良くなる範囲に過酸化水素濃度を調節するのが望ましい。また、上述したように、過酸化水素の濃度によっては菌へのダメージが強くなるので、アスコルビン酸の濃度が高い検体に対しては、減菌水で希釈してアスコルビン酸濃度を下げて（例えば0.02％程度まで下げて）、0.01〜0.05％、より好ましくは0.02％程度の濃度で過酸化水素を添加するのが好ましいと言える。また、本実施例は飲料に限られるものではなく、飲料以外の食品の場合にも同様に適用できる。
【００２１】
なお、酸化剤として過酸化水素を用いたが、酸化作用を有し、かつ蛍光検出を阻害しない無色のものであれば、同様な効果が得られる。例えば、他の酸化剤としては、薄濃度の濃硫酸、希硝酸、濃硝酸があり、過酸化水素と同様の効果があると考えられる。入手のし易さ、使用後の環境負荷を考えると、オートクレーブ滅菌の加熱により水と酸素に分解し無害化する過酸化水素が好適といえる。
【００２２】
本実施例によれば、食品中の抗酸化成分による蛍光色素の退色を容易に低減することができ、光サイトメトリー法において、生微生物数計測をより正確に行うことができる。
【００２３】
（Ｂ）微生物検査装置の全体構成例  
本発明は、上述したように、蛍光イメージングサイトメトリー法と蛍光フローサイトメトリー法の何れにも適用できる。以下に、微生物検査カセットを用いた蛍光フローサイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置に本発明を適用した実施例を詳細に説明する。本実施例では、微生物等の染色を行う容器の上流に、食品中の抗酸化成分を酸化する容器を備えることを特徴とする。
【００２４】
図４に、本発明の一実施例に係る微生物検査装置１の構成図を示す。微生物検査装置１は、基本的には、微生物検査カセット１０と、圧力供給装置１４と、Ｘ−Ｙ可動ステージ（ホルダー）１２５と、検出装置１１と、システム装置１８と、出力装置１９で構成されている。
【００２５】
微生物検査カセット１０は、検体や試薬を内部に保持し、微生物計測に必要な工程を行うための機構を内部に備える。圧力供給装置１４は、微生物計測に必要な工程を行うために、微生物検査カセット１０と連結したチップ連結管１４４１〜１４４４を介して、微生物検査カセット１０内の検体や搬送を制御する。Ｘ−Ｙ可動ステージ（ホルダー）１２５は、微生物検査カセット１０を保持し、微生物検査カセット１０の位置を調整する。検出装置１１は、微生物検査カセット１０内の微生物に励起光を照射し、微生物からの散乱光及び蛍光を電気信号に変換する。これらの詳細については後述する。
【００２６】
微生物検査装置１に連結したシステム装置１８は、圧力供給装置１４に対する制御信号の出力と、検出装置１１から入力される電気信号に対する信号処理を実行する。電気信号の処理により得られた計測結果は、システム装置１８に接続された出力装置１９に表示される。
【００２７】
圧力供給装置１４は、レギュレータ１４１１付のエアポンプ１４１を有する。エアポンプ１４１と微生物検査カセット１０の各通気口１５９１〜１５９４（図７）は、チップ連結管１４４１〜１４４４によって接続されている。チップ連結管１４４１〜１４４４には、バルブ１４２１〜１４２４がそれぞれ設けられている。バルブ１４２１〜１４２４を開閉することにより、微生物検査カセット１０の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査カセット１０の容器を大気開放する。この圧力の制御により、微生物検査カセット１０内における検体や試薬の搬送を実現する。この圧力制御による微生物検査カセット１０内における検体や試薬の搬送は、特開２００８−１５７８２９号公報に詳述されている。
【００２８】
微生物検査カセット１０は、基本的には、検体容器１５１と、酸化容器１５２と、染色容器１５５と、微生物検出部１７と、検出液廃棄容器１５６と、溶液用流路１５７１〜１５７４（図７）と、通気用流路１５８１〜１５８４（図７）とで構成されている。検体容器１５１は検体１５１１を保持する。酸化容器１５２は、検体中の抗酸化成分を酸化するための酸化剤１５２１を保持し、検体と酸化剤を混合して反応させる。染色容器１５５は、検体中の微生物の染色するための染色液（試薬液）１５２２を保持し、検体と染色液を混合して反応させる。微生物検出部１７は、励起光源１１１１、１１１２からの励起光１１３を照射し、微生物を観測するための微生物検出用流路１７３を内部に備えている。検出液廃棄容器１５６には、微生物検出用流路１７３を通過した検出液が廃棄される。溶液用流路１５７１〜１５７４は、検体容器１５１、酸化容器１５２、染色容器１５５、微生物検出用流路１７３を連結し、検体１５１１や混合液、検出液が流動する。通気用流路１５８１〜１５８４は、検体１５１１や混合液、検出液を気圧により流動させるため圧力供給装置１４と各容器を接続する。
【００２９】
検出装置１１は、励起光源１１１１、１１１２と、散乱光検出部と、蛍光検出部１２０１〜１２０３とで構成される。このうち、散乱光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの散乱光１２４を検出するための散乱光検出器１２３と、励起光源１１２からの励起光１１３が散乱光検出器１２３に直接入射することを防ぐための遮光板１２２とから構成される。一方、蛍光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの蛍光１２１を集光し、平行光にする対物レンズ１１４と、励起光１１３を微生物検出部１７の方向に反射する一方で蛍光１２１は透過するダイクロイックミラー１１２と、平行光を集光させるための集光レンズ１１８１、１１８２と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール１１９と、蛍光１２１の一部波長を反射し、残りの波長を透過するダイクロックミラー１１５１、１１５２と、蛍光１２１の一部波長を通過するバンドパスフィルタ１１７１〜１１７３と、バンドパスフィルタ１１７１〜１１７３を通過した光を検出する光検出器１２０１〜１２０３とで構成される。なお、照射部及び検出部は、互いの焦点が重なるように配置され、測定時には微生物検出用流路１７３を焦点の位置に調整できるように構成されている。
【００３０】
検出装置１１は、励起光源１１１２から出力された励起光１１３を微生物検出用流路１７３に照射し、微生物検出用流路１７３から生じる散乱光の光量と微生物検出部１７から生じる蛍光の光量をそれぞれ検出することにより、Ｘ−Ｙステージ１２５の可動位置と各光量との関係をプロファイルとして取得する。また、検出装置１１は、取得されたプロファイルに基づいてＸ−Ｙ可動ステージ１２５を可動制御し、微生物検査カセット１０（具体的には、微生物検出用流路１７３）を検出に適した位置に合わせる。即ち、散乱光検出部で検出される散乱光の光量が最大となる微生物検出用流路の位置を励起光の光軸と一致させ、蛍光検出部で検出される蛍光量が最大となる微生物検出用流路の位置に励起光の焦点を一致させる。この位置合わせについては特開２０１０−２５６２７８号公報に詳述されている。位置合わせについては、他の方法、例えば、特開２００９−２８１７５３号公報に記載の方法を用いても良い。この場合、微生物検査カセットに位置合わせ用試薬等の保持容器や溶液用流路、通気用流路等を設ける。
【００３１】
なお、本実施例では励起光源は２つであるが、蛍光色素の種類に応じて励起光源の数量を変更する場合がある。また、本実施例では蛍光検出部は３つであるが、蛍光色素の種類に応じて蛍光検出部の数量を変更する場合がある。
【００３２】
（Ｃ）微生物検査カセットの微生物検出部の構造例  
図５Ａ及び図５Ｂを用い、微生物検査カセット１０のうち微生物検出部１７の構造を説明する。図５Ａは、微生物検査カセット１０の本体１５と微生物検出部１７の接合部の断面図を示す。図５Ｂは、微生物検出部１７の分解斜視図を示す。
【００３３】
なお、本体１５と微生物検出部１７はそれぞれ別工程で作製され、それぞれを接合する。まず、微生物検出部１７の製造方法を説明する。微生物検出部１７はカバー部材１７１と流路部材１７２からなり、両者は共に薄い平板からなる。流路部材１７２には溝１７３１が形成されており、この溝１７３１の両端には貫通孔１７４１、１７５１が形成されている。溝１７３１が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材１７１と流路部材１７２を張り合わせる。この貼り合わせにより微生物検出部１７が形成される。流路部材１７２の溝１７３１とカバー部材１７１によって微生物検出用流路１７３が構成される。流路部材１７２の貫通孔１７４１、１７５１によって、微生物検出用流路入口１７４と微生物検出用流路出口１７５が構成される。
【００３４】
一方、本体１５に形成された染色容器−微生物検出用流路間流路１５７３は、その下端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。同様に、微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４は、その上端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。染色容器−微生物検出用流路間流路１５７３の開口は、微生物検出用流路入口１７４に接続され、微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４の開口は、微生物検出用流路出口１７５に接続されている。
【００３５】
本体１５には検出用窓枠部１６１が形成されている。検出用窓枠部１６１は、貫通孔、又は、貫通溝である。検出用窓枠部１６１は、染色容器−微生物検出用流路間流路１５７３の開口と微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４の開口の間に形成されている。製造された微生物検出部１７は、前述したように、本体１５に装着される。図５Ａに示すように、本体１５の検出用窓枠部１６１の上に微生物検出用流路１７３が配置されるように、微生物検出部１７を装着する。
【００３６】
本実施例の場合、微生物検出用流路１７３の背後に、本体１５の貫通孔又は貫通溝である検出用窓枠部１６１が設けられる。従って、励起光１１３は、微生物検出部１７のみを照射し、本体１５を照射しない。このため、背景光の増加の原因となる本体１５からの反射光や自家蛍光は発生しない。微生物検出用流路１７３を通過した励起光１１３が、本体１５に照射されないためには、検出用窓枠部１６１を構成する貫通孔の断面は、励起光１１３の放射方向に沿って増加することが好ましい。
【００３７】
カバー部材１７１の厚さは、例えば０．０１μｍ〜１ｍｍとする。流路部材１７２の厚さは、例えば０．０１μｍ〜１ｍｍとする。微生物検出用流路１７３の断面形状は、例えば正方形、長方形、台形に形成する。微生物検出用流路１７３の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。微生物検出用流路１７３の断面の一辺は、例えば１μｍ〜１ｍｍが好ましく、長さは例えば０．０１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましい。微生物検出用流路１７３に照射する励起光１１３の光軸は、微生物検出用流路１７３の方向ベクトルに対して垂直になる。
【００３８】
微生物検出部１７を構成する材料について説明する。微生物検査カセット１０はディスポーザブルである。すなわち、使用後、微生物検出部１７は本体１５と共に廃棄する。そのため、微生物検出部１７に用いる材料は、安価でなければならない。微生物検出部１７に用いる材料は、蛍光計測に好適なように、光学特性に優れている必要がある。すなわち、自家蛍光が低く、光透過性、面精度、屈折率などに優れていることが望ましい。微生物からの蛍光の検出を阻害しないためには、微生物検出部１７自身が発生する自家蛍光量が、微生物からの蛍光量に比べて十分小さいことが好ましい。
【００３９】
微生物検出部１７の表面に、曲面、凹凸等が存在すると、表面における光の屈折、又は、乱反射により微生物計測用流路１７３に照射される励起光１１３の光量が変動する。そのため、検出される蛍光量も変動し、計測精度が低下する。そのため、微生物検出部１７の表面は、所望の平面度を有する必要がある。微生物検出部１７は、凹凸が０．１ｍｍ以下の平面度を有することが好ましい。
【００４０】
このような条件を考慮すると、微生物検出部１７に用いる材料には、ガラス、石英、ポリメタクリル酸メチルエステル（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト等が考えられる。微生物検出部１７は、これらの物質から選択された１種類以上の物質から形成される。
【００４１】
カバー部材１７１は単なる平板であるが、流路部材１７２は平板に溝及び貫通孔を形成したものである。従って、流路部材１７２は、微細加工が容易で、且つ、加工費が安価な材料によって形成される。ガラス、及び、石英は、光学特性が優れているが、微細加工が容易でない。すなわち、微細加工を行うと、加工費が高くなる。
【００４２】
そこで、この形態例の場合、カバー部材１７１をガラス又は石英によって構成し、流路部材１７２をポリメタクリル酸メチルエステル、ポリジメチルシロキサン、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイトによって構成する。なお好ましくは、流路部材１７２をポリジメチルシロキサンによって構成する。この場合、カバー部材１７１と流路部材１７２の接合には、ポリジメチルシロキサンの自己接着性を利用する。
【００４３】
微生物検出部１７の自家蛍光量は、材料ばかりでなく、微生物検出部の厚さ寸法にも依存する。自家蛍光量を少なくするには、微生物検出部の厚さ寸法を小さくすれば良い。微生物検出部１７の厚さが小さいほど、微生物検出部１７から発生する自家蛍光量は少なくなる。しかしながら、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さ寸法を小さくすると、製造が困難になり、平面度が悪化する。必要な平面度を保ち、微生物の蛍光の検出を阻害しないように自家蛍光量を抑制するには、これらの部品の厚さ寸法は、所定の範囲に制限するする必要がある。
【００４４】
ガラス、石英、ポリジメチルシロキサンの自家蛍光量はほぼ同等である。そこで、カバー部材１７１をガラス又は石英によって製造する場合、その厚さは、例えば０．０５ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。流路部材１７２を、ポリジメチルシロキサンによって製造する場合、その厚さは例えば０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。
【００４５】
また、カバー部材１７１及び流路部材１７２を、シクロオレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルエステル、ポリエチレンテレフタラート、又は、ポリカーボネイトによって製造しても良い。この場合、ガラス、又は、石英によってカバー部材１７１を製造し、ポリジメチルシロキサンによって流路部材１７２を製造する場合より、単位体積当たりの自家蛍光量が約３倍以上増加する。そのため、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さは例えば０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下が好ましい。
【００４６】
（Ｄ）計測方法（検査方法）例  
以下、上述の微生物検査装置１を用いて、食品由来の検体中の生微生物数を計測する場合の実施例を説明する。図６に、微生物検査カセット１０を用いた生微生物数計測の工程をフローチャートで示す。また、図７に、微生物検査カセット１０の平面図を示す。
【００４７】
微生物検査カセット１０は、上述したように、検体容器１５１と、酸化容器１５２と、染色容器１５５と、微生物検出用流路１７３を備えた微生物検出部１７と、検出液廃棄容器１５６と、溶液用流路１５７１〜１５７４と、通気用流路１５８１〜１５８４とを備える。また、図７に示すように、検体中に含まれる食品残渣を取り除くためのフィルタである食品残渣除去部１６０を検体容器１５１の下流に備えている。また、圧力供給装置１４と各通気用流路１５８１〜１５８４とを接続する通気口１５９１〜１５９４が設けられている。
【００４８】
溶液用流路１５７１〜１５７４、通気口１５９１〜１５９４及び通気用流路１５８１〜１５８４は連結する容器の名称から、検体容器−酸化容器間流路１５７１、酸化容器−染色容器間流路１５７２、染色−微生物検出用流路間流路１５７３、微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４、検体容器通気口１５９１、酸化容器通気口１５９２、染色容器通気口１５９３、検出液廃棄容器通気口１５９４、検体容器通気流路１５８１、酸化容器通気流路１５８２、染色容器通気流路１５８３、検出液廃棄容器通気流路１５８４とする。
【００４９】
検体容器１５１１と、食品残渣除去部１６０と、酸化容器１５２と、染色容器１５５と、微生物検出用流路１７３と、検出液廃棄容器１５６は、溶液用流路１５７１〜１５７４により直列に連結されている。
【００５０】
酸化剤１５２１は、微生物検査カセット１０内に前もって封入されている。染色液１５２２は、微生物検査カセット１０内に前もって封入されている。検体１５１１は、検査前に通気口１５９１から検体容器１５１に注入する（Ｓ９０１）。
【００５１】
検体容器１５１の体積は、検体１５１１の体積より大きい。酸化容器１５２の体積は、検体１５１１と酸化剤１５２１の合計体積より大きい。染色容器１５５の体積は、検体１５１１と酸化剤１５２１と染色液１５２２の合計体積より大きい。また、検体容器−酸化容器間流路１５７１の最高点は、検体容器１５１中の検体１５１１の水位より高くなるように形成される。これと同様に、酸化容器−染色容器間流路１５７２の最高点は、検体１５１１と酸化剤１５２１の混合液の水位より高くなるように形成される。さらに、染色容器−微生物検出用流路間流路１５７３の最高点は、検体１５１１、酸化剤１５２１、染色液１５２２からなる検出液の水位より高くなるように形成される。
【００５２】
ここで使用した検体１５１１は、検査する食品に対し質量比９倍の滅菌水を加え、ストマッキング処理を行ったものである。
【００５３】
微生物染色液は、死微生物を染色するための死微生物染色液が１種以上と全微生物を染色するための全微生物染色液が１種以上の混合液であり、死微生物染色液には、例えば、死微生物用シアニン系蛍光色素（濃度：０．０１μＭ〜１０μＭ）、ＰＩ（プロピディウムイオダイド）（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＥＢ（エチジウムイオダイド）（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）を使用し、全微生物染色液には、例えば、全微生物用シアニン系蛍光色素（濃度：０．０１μＭ〜１０μＭ）、ＬＤＳ７５１（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＤＡＰＩ（４'、６−ヂアミジン−２'−フェニルインドール）（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＨＯＥＣＨＳＴ３４５８０（濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）などを使用する。ここでは、死微生物染色液として死微生物用シアニン系橙蛍光色素を使用し、全微生物染色液として全微生物用シアニン系青蛍光色素とＬＤＳ７５１を使用する。色素溶媒にはＤＭＳＯ（ジメチルスルオキシド）、エタノール類、水などを使用する。なお、濃度の単位のＭはmol/Lの意味である。
【００５４】
微生物検査カセット１０を用いた生微生物数測定は、図６に示すように、微生物検査カセット１０を微生物検査装置(分析装置)１にセットした状態で開始される（Ｓ９０２）。この測定工程は、微生物検査カセット１０の位置合わせを行う位置あわせ工程（Ｓ９０７）と、検体中の抗酸化物質を酸化した後に検体中の微生物を染色する前処理工程（Ｓ９０３〜Ｓ９０６）と、生微生物数を実際に測定する計測工程（Ｓ９０８）とで構成される。
【００５５】
位置あわせ工程（Ｓ９０７）と前処理工程（Ｓ９０３〜Ｓ９０６）は独立した工程であるため並列して行い、両工程が終了した段階で計測工程（Ｓ９０８）を行う。続いて、各工程における各液体の移動について説明する。
【００５６】
前処理工程では、まず、検体１５１１が酸化容器１５２に移動される（Ｓ９０３）。通気口１５９１を介して検体容器１５１に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。これにより、検体容器１５１内の気圧を上げる。同時に、酸化容器通気口１５９２を介して酸化容器１５２の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、検体１５１１は、酸化容器１５２に入り、酸化剤１５２１と混合される。混合には、バブリングを使用する（Ｓ９０４）。なお
検体１５１１が食品残渣除去部１６０を経て、酸化容器１５２へ流動する際に、検体１５１１中の食品残渣は、食品残渣除去部１６０により検体１５１１から取り除かれる。
【００５７】
検体１５１１と酸化剤１５２１の混合液の水位は、酸化容器１５２と染色容器１５５を連結する酸化容器−染色容器間流路１５７２の最高点を越えず、さらに酸化容器１５２中に入っている空気は、酸化容器通気口１５９２を介して外部に放出される。酸化容器１５２の気圧は大気圧と等しいため、混合液は染色容器１５５に押し出されず、混合液を必要な時間中、酸化容器１５２に保持することができる。保持する時間は、菌へのダメージを小さくするため、例えば１０分程度とする。
【００５８】
このとき、混合液の染色容器１５５への流入を防ぐ目的で、各通気口１５９３〜１５９４に対して圧力供給装置１４からの圧力を加え、検体容器１５１の気圧より低い範囲まで染色容器１５５と検出液廃液容器１５６の気圧を上げても良い。
【００５９】
次に、検体１５１１、酸化剤１５２１から成る混合液を、染色容器１５５に移動させる（Ｓ９０５）。通気口１５９２を介して酸化容器１５２に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。これにより、酸化容器１５２内の気圧を上げる。同時に、通気口１５９３を介して染色容器１５５の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、混合液は、染色容器１５５に入り、染色液１５２２と混合される。混合には、バブリングを使用する（Ｓ９０６）。検体１５１１中の死微生物は、死微生物染色液（ここでは死微生物用シアニン系橙色蛍光色素を使用する。）と全微生物染色液（ここでは全微生物用シアニン系青色蛍光色素とＬＤＳ７５１を使用する。）により染色され、一方、検体１５１１中の生微生物は全微生物染色液のみにより染色される。染色時間は、例えば３〜６０分である。なお、染色中は、微生物検査カセット１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが望ましい。
【００６０】
上記の前処理工程と並行して、微生物検査カセット１０の位置あわせが実行される（Ｓ９０７）。
【００６１】
以上の動作が終了すると、検体１５１１と微生物染色液１５２２から成る検出液が微生物検出用流路１７３に移動され、検体中の生微生物が蛍光フローサイトメトリー法により計測される。（Ｓ９０８）。図４に示す検査装置の場合、紙面垂直方向より、励起光１１３が照射される。このため、微生物を染色した色素からの蛍光と、微生物による散乱光が生じる。検出装置１１は、生微生物については全微生物染色液の２色の蛍光を検出し、死微生物については全微生物染色液の２色と死微生物染色液の１色の蛍光を検出する。このため、生微生物と死微生物とを判別して計数することが可能になる。また、散乱光の光量は微生物の大きさにより変わるため、微生物の大きさの判別も可能になる。
【００６２】
なお、染色液としては、全微生物染色液として１種としても良い。この場合、微生物検査装置は、１励起または２励起光源及び２蛍光検出となる。また、染色液は生菌だけを染める染色液もある。この場合、１励起光源、１蛍光検出となる。
【００６３】
図８は酸化剤と染色液を容器内に図７とは別の方法により保持する微生物検査カセットの図を示す。内部の各容器及び流路の構成は、前述の図７と同等である。酸化容器１５２にはホルダー１５２１Ｈに保持されたガラス管１５２１Ｇを配置し、ガラス管１５２１Ｇ内に酸化剤をガラス管内の毛細管現象で保持している。組み立て順は、ガラス管１５２１Ｇをホルダー１５２１Ｈに保持し、ガラス管１５２１Ｇに酸化剤を充填し、ホルダー１５２１Ｈをカセットの酸化容器１５２に挿入して完成となる。ガラス管１５２１Ｇの上端位置は酸化容器１５２内の検体液の水位以下に配置することにより、検体液が酸化容器１５２内に流入したときにガラス管は検体液の水面下に位置することになり、ガラス管内の毛細管現象が失われ、ガラス管内の酸化剤が検体に染み出る。検体液中に染み出た酸化剤はバブリングにより混合され、検体液中の抗酸化成分を酸化する。このように、ガラス管を検体液の水位以下に配置することにより、ガラス管内の酸化剤を容易に検体内へ染み出すことが出来る。
【００６４】
また、染色容器１５５にはホルダー１５２２Ｈに保持されたガラス管１５２２Ｇを配置し、ガラス管１５２２Ｇ内に染色液をガラス管内の毛細管現象で保持している。組み立て順は、ガラス管１５２２Ｇをホルダー１５２２Ｈに保持し、ガラス管１５２２Ｇに染色液を充填し、ホルダー１５２２Ｈをカセットの染色容器１５５に挿入して完成となる。ガラス管１５２Ｇの上端位置は染色容器１５５内の検体液（混合液）の水位以下に配置することにより、検体液と酸化剤の混合液が染色容器１５５内に流入したときにガラス管は混合液の水面下に位置することになり、ガラス管内の毛細管現象が失われ、ガラス管内の染色液が検体液（混合液）に染み出る。混合液中に染み出た染色液はバブリングにより混合され、検体中の微生物を染色する。このように、ガラス管を混合液の水位以下に配置することにより、ガラス管内の染色液を容易に混合液内へ染み出すことが出来る。
【００６５】
なお、ガラス管は内径０．６ｍｍ、長さ８ｍｍとしたが、内径０．１〜３ｍｍ、長さ１〜３０ｍｍとしても、同様の効果が得られる。
【００６６】
なお、本実施例では微生物検査カセットに染色液と酸化剤を微生物検査カセット組み立て時に内包した例であるが、微生物検査カセットに染色液と酸化剤を内包する場所が設けていれば、微生物検査カセット組み立て時には染色液と酸化剤を内包せず、検査直前に染色液と酸化剤を手作業または自動機にて充填しても本実施例と同様の効果が得られる。
【００６７】
また、本実施例では染色液と酸化剤をガラス管に保持した例であるが、ガラス管の代わりに親水性海綿体構造でも同様の効果が得られる。特に、ガラス焼結体やメラミンスポンジが適している。
【００６８】
また、生微生物の細胞膜内に既に取り込まれた蛍光色素は抗酸化剤により退色しない。このことを利用して、染色容器１５５の下流に抗酸化剤を保持する容器を設置するようにしても良い。この構成によれば、本発明の効果を維持したまま、特許文献１における課題の一つである余剰の蛍光色素による擬陽性を抗酸化剤により退色させて排除できる。
【００６９】
図９Ａ〜図９Ｄに、ペットボトル緑茶に大腸菌（(a)E.coli（エシェリキア・コリ））や大腸菌群（(b)E.aerogenes（エンテロバクター・アエロゲネス）、(c)E.agglomerans(エンテロバクター・アグロメランズ)、(d)E.cloacae（エンテロバクター・クロアカ））を添加して計測した結果を示す。図中の横軸は培養法の計測値で、縦軸は微生物検査装置の計測値である。また軸目盛は対数表示である。
【００７０】
酸化剤として過酸化水素0.02％を用い、酸化容器での保持時間（酸化時間）は１０分とした。また、微生物の染色液として、死微生物染色液（ここでは死微生物用シアニン系橙色蛍光色素を使用する。）と全微生物染色液（ここでは全微生物用シアニン系青色蛍光色素とＬＤＳ７５１を使用する。）を用いた。染色容器内での保持時間（染色時間）は４０分とした。
【００７１】
(a)E.coliと(c)E.agglomeransについては、過酸化水素の添加が無くても元々の検出率（微生物検査装置の値/培養法の値）が高いので（図９Ａ、図９Ｃ）、酸化剤の顕著な効果はみられないが、過酸化水素を薄い濃度（0.02％）で使用することにより、菌にダメージを与えることなく、従来と同様に良好な測定が可能となっている。一方で、(b)E.aerogenesと(d)E.cloacaeについては、酸化剤の添加により微生物検査装置の測定結果（縦軸）がLogで一桁、即ち検出率が10倍向上することがわかる（図９Ｂ、図９Ｄ）。
【００７２】
これらの結果から、過酸化水素を0.02％と薄い濃度で加えることにより、各菌にダメージを与えることなく、食品中の抗酸化成分により検出率の低い微生物の検出率を10倍近く良くすることができることが分かる。これは、過酸化水素による蛍光色素の退色を低減できたことによるものである。
【００７３】
なお、上述の実施例では、蛍光サイトメトリー法として蛍光フローサイトメトリー法を用いているが、蛍光イメージングサイトメトリー法にも本発明は適用可能である。蛍光イメージングサイトメトリー法では、例えば、検体に酸化剤を添加して、所定時間（例えば１０分）保持した後、蛍光色素を添加し、所定時間（例えば４０分）保持して検出液を作成する。この検出液をフィルタに保持して励起光を照射し、微生物の蛍光発光を画像取得して光点を計数することにより微生物を検出する。蛍光イメージングサイトメトリー法においても抗酸化成分による蛍光色素の退色を抑制して生微生物数計測をより正確に行うことが可能となる。
【００７４】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加，削除，置換をすることが可能である。
【００７５】
例えば、微生物検査カセットについては、検体容器１５１に検体を注入する前に、検体と酸化剤を混合しておけば、酸化容器１５２やそれに付随する溶液用流路等を削除できる。
【符号の説明】
【００７６】
１…微生物検査装置、１０…微生物検査カセット、１１…検出装置、１４…圧力供給装置、１７…微生物検出部、１８…システム装置、１９…出力装置、１１１１…短波長励起光源、１１１２…長波長励起光源、１１１３…励起光合成用ダイクロイックミラー、１１２…ダイクロイックミラー、１１３…励起光、１１４…対物レンズ、１１９…ピンホール、１２０…光検出器、１２１…蛍光、１２４…散乱光、１２５…Ｘ−Ｙ可動ステージ、１４１…エアポンプ、１４１１…レギュレータ、１５１…検体容器、１５１１…検体、１５２…酸化容器、１５２１…酸化剤、１５２１Ｈ…ホルダー、１５２１Ｇ…ガラス管、１５５…染色容器、１５２２…染色液、１５２２Ｈ…ホルダー、１５２２Ｇ…ガラス管、１５６…検出液廃棄容器、１５７１〜１５７４…溶液用流路、１５８１〜１５８４…通気用流路、１６１…検出用窓部、１７３…微生物検出用流路、１１５１…短波長蛍光分離用ダイクロイックミラー、１１５２…中波長蛍光分離用ダイクロイックミラー、１１７１…短波長バンドパスフィルタ、１１７２…中波長バンドパスフィルタ、１１７３…長波長バンドパスフィルタ、１１８１、１１８２…集光レンズ、１２０１…短波長用光検出器、１２０２…中波長用光検出器、１２０３…長波長用光検出器
【図１】
2013215142.tif 000003
【図２】
2013215142.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2013215142.tif 000007
【図５Ｂ】
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【図６】
2013215142.tif 000009
【図７】
2013215142.tif 000010
【図８】
2013215142.tif 000011
【図９Ａ】
2013215142.tif 000012
【図９Ｂ】
2013215142.tif 000013
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
2013215142.tif 000015