(57)【要約】【課題】投与時関連反応の発生を抑制して、小粒子酸素運搬体の虚血性脳卒中の患者への投与を可能にする。【解決手段】赤血球よりも小さい平均粒子径の粒子状担体に有効成分のヘムタンパク質が内封された液状製剤を、投与開始から１５分間は２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ未満の速度で、その後２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ以上の速度で静脈内投与する虚血性脳卒中治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球よりも小さい平均粒子径の粒子状担体に内封されたヘムタンパク質を含む液状製剤であって、投与開始から１５分間の２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ未満の速度での初期投与と、その後の２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ以上の速度での投与とにより、静脈内投与されることを特徴とする、前記ヘムタンパク質を有効成分とする虚血性脳卒中治療薬。
【請求項２】
前記粒子状担体の平均粒子径が、１μｍ以下である請求項１に記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項３】
前記製剤のヘムタンパク質濃度が、０.５ｗ/ｖ％以上である請求項１または２に記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項４】
前記投与速度が、段階的あるいは一気に速められる請求項１〜３のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項５】
前記１５分間経過後の速度が、初期投与速度の１.２倍以上である請求項１〜４のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項６】
１回の用量が１２ｍｇ／ｋｇ以上である請求項１〜５のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項７】
前記用量が１２〜２４００ｍｇ／ｋｇである請求項６に記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項８】
投与回数が１回である請求項１〜７のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項９】
全投与時間が９０分以内である請求項１〜８のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項１０】
前記ヘムタンパク質が人工および／または天然由来のヘモグロビンである請求項１〜９のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項１１】
前記粒子状担体がリポソームである請求項１〜１０のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【請求項１２】
前記液状製剤が、ヘモグロビン含有リポソーム製剤である請求項１〜１１のいずれかに記載の虚血性脳卒中治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性脳卒中治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞は、アテローム血栓性梗塞、心原性寒栓症、ラクナ梗塞およびその他の脳梗塞に分類されているが、共通の病態は脳血管局所での血流遮断や低下が原因で虚血あるいは低酸素状態に陥った脳組織が、時間と共に様々な過程を経て、最終的に死に至ることである。梗塞部位には、ほぼ完全に血流が途絶えた虚血中心領域とその周辺のペナンブラ領域が存在する。虚血中心領域は、残存血流が極めて不十分であるため、非常に早い段階で不可逆的変化を起こすが、ペナンブラ領域では残存血流がある程度保たれているため、脳組織機能は低下しても直ちに不可逆的な障害に至らず、適切な処置により障害を最小限に止めることが可能である（非特許文献１参照）。
【０００３】
このようなペナンブラ領域の保護のために、高圧酸素療法や酸素運搬体の投与により当該部位に酸素を供給して低酸素状態を改善することによる治療の試みがなされており（たとえば、非特許文献２および３参照）、広くは虚血性脳卒中治療薬としての可能性が示されている（たとえば、特許文献１参照）。さらに、脳卒中および外傷性脳損傷などの脳障害の従来から行われている脳低温療法（脳を選択的に冷却）に、酸素運搬体としての酸素ナノバブルの使用を組み合わせて、ペナンブラ領域を保護する提案もある（たとえば、特許文献２参照）。
【０００４】
酸素運搬体としては、フッ化炭素エマルジョンの酸素溶解能力（水の２０倍）を利用した化学合成品が検討されたが、酸素運搬量が不足すること、さらに体内蓄積性が危惧されている。
酸素運搬体として、天然赤血球由来ヘモグロビンを利用する試みも行われているが、遊離ヘモグロビンの生体内半減期は極端に短く、血管外への遊出が起こりやすい。血管外に遊出したヘモグロビンが一酸化窒素をトラップした結果として、血管収縮が起こり、末梢循環の不良状態を来たして、末梢の病巣へ十分な酸素供給が行なえないこと、さらに臓器障害性を示すことなどが問題点として指摘されている。このような遊離ヘモグロビン溶液の問題点を改善すべくヘモグロビンの蛋白分子自体を化学的に改変した修飾ヘモグロビン（安定化ヘモグロビン、重合ヘモグロビン等）の検討も行われてきたが、ヘモグロビンの持つ、本質的な問題を解決するには至っていない。
【０００５】
一方、ヘモグロビンを脂質小胞体のリポソーム内に封入したヘモグロビン含有リポソームは、赤血球に疑似化した構造的な特徴を有しており、上記のようなヘモグロビンの抱える問題点を解決し得る可能性を持つ手段として期待されている。特に、輸血における血液型の問題がなく、ウィルス感染等も回避できる安全性の高さに加え、粒子径が小さく、粘度も小さいことから、赤血球では十分に酸素運搬できていないような微小循環系においても必要とされる酸素量を供給することが可能である。
【０００６】
ここで、虚血性脳卒中の治療においては、脳虚血発症後、ある治療が脳損傷の程度を軽減し、機能回復を促進し、長期的な予後を改善しうるある一定の期間「Therapeutic time window」（非特許文献４参照）が存在し、発症後できるだけ早く治療を行う（薬物の場合は必要量の投与を終える）必要がある。
【０００７】
一方、リポソーム等の粒子状の担体の経血管的な投与においては、投与開始時に顔面紅潮、息切れ、背痛・頭痛、悪寒、腰や食道の緊張、血圧変動等の投与時関連反応（infusion-related reactions；ＩＲＲｓ)が起こることが多数報告されている（非特許文献５〜７参照）。これは、通常の輸血（適合血液）では問題とならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３７４６２９３号公報
【特許文献２】特開２０１１−００１２７１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Stroke，1981，12：723-725
【非特許文献２】Stroke，2007，38：1626-1632
【非特許文献３】J Pharmacol Exp Ther，2010，332：429-436
【非特許文献４】Ann NY Acad Sci,1997，835：187-193
【非特許文献５】Radiology，1987，163：339-343
【非特許文献６】Lancet，1994，344：1156-1157
【非特許文献７】J Clin Oncol，1995，13：1777-1785
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のとおり、虚血性脳卒中の治療では酸素運搬体の投与を早く完了することが重要である一方、副作用（ＩＲＲｓ）を誘発する粒子状製剤の酸素運搬体には早い投与は避けるべきという背反する現実が存在している。なお、通常の輸血（赤血球）には、血液型適合性等の問題があるが、ＩＲＲｓに関連する問題は格別認識されない。
本発明は、特に、非血球性の粒子状製剤の酸素運搬体に特有のＩＲＲｓの課題を解決し、該酸素運搬体の虚血性脳卒中の患者への投与を可能にした虚血性脳卒中治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、虚血性脳卒中の治療を目的として、より具体的には急性期脳梗塞に伴う神経症状、日常生活運動障害および／または機能障害の改善を目的として鋭意検討したところ、上記粒子状製剤の酸素運搬体であっても、投与初期の１５分間を２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ（（ヘモグロビン量／体重）／時間）未満の緩和速度で投与を実施すれば、予想外にも、その後高速投与してもＩＲＲｓの発生がほぼ観察されないという知見を得た。このＩＲＲｓ観察結果は、血圧および肺動脈圧観察として後述の実施例に示すが、上記態様により、結果として、必要量（用量全量）の酸素運搬体の投与（以下、本投与ともいう）を短時間で終えることができる。この知見に基づいてさらに詳細に研究し、以下のような本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、赤血球よりも小さい平均粒子径の粒子状担体に内封されたヘムタンパク質を含む液状製剤であって、投与開始から１５分間の２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ未満の速度での初期投与と、その後の２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ以上の速度での投与とにより、静脈内投与されることを特徴とする、前記ヘムタンパク質を有効成分とする虚血性脳卒中治療薬である。
上記において、初期投与の緩和速度が２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎでも肺動脈圧の変動が見られるものの血圧の変動は見られず、極端なＩＲＲｓは起きないことが確かめられており、これ未満はＩＲＲｓを誘発しない安全な速度といえる。なお、初期投与は緩和された速度である程度の投与が実施できればよいことから、０.０５（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ以上であればよい。
【００１３】
上記粒子状担体の平均粒子径は、通常１μｍ以下である。
なお、赤血球の粒子径（直径）は約７〜８μｍである。
【００１４】
上記製剤のヘムタンパク質濃度は、０.５ｗ/ｖ％以上である。
【００１５】
上記投与速度は、段階的あるいは一気に速めることができる。
本発明において、本投与の速度は、ＩＲＲｓを考慮せずに設定でき、初期投与速度の１.２倍以上に速めることができ、初期投与速度に対して１００倍程度に速めても構わない。本投与の速度は、用量、初期投与を含む全投与時間等によっても特に制限なく設定でき、具体的に、上記２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ以上の速度であっても構わない。通常の緊急時最大輸血量に相当する１２０（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎでも構わない。
【００１６】
全投与時間は、９０分以内が好ましい。
【００１７】
１回の用量は、１２ｍｇ／ｋｇ以上が望ましく、通常、１２〜２４００ｍｇ／ｋｇである。
また、投与回数は、通常１回である。
【００１８】
有効成分のヘムタンパク質は、好ましくは人工および／または天然由来のヘモグロビンである。
【００１９】
また、粒子状担体はリポソームが好ましい。
本発明の好ましい態様における液状製剤は、ヘモグロビン含有リポソーム製剤である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、特定の投与形態で投与されることによってＩＲＲｓの発生が抑制され、迅速投与による虚血性脳卒中治療に有用性を発揮しうる、粒子状ヘムタンパク質製剤の酸素運搬体からなる虚血性脳卒中の治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】麻酔下イヌに対して酸素運搬体Ａを投与した際の循環動態（血圧および肺動脈圧）の変化を示す図である。上段のカラムが血圧の変化を、下段のカラムが肺動脈圧の変化を示す。（Ａ）は１２００ｍｇ／ｋｇを１０分間で投与（１２０（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ）、（Ｂ）は１２００ｍｇ／ｋｇを５０分間で投与（２４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ）、（Ｃ）は１２００ｍｇ／ｋｇを２００分間で投与（６（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ）、（Ｄ）は３００ｍｇ／ｋｇを２５０分間で投与（１.２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ）した際の循環動態の変化を示す。
【図２】麻酔下イヌに対して酸素運搬体Ｂを投与した際の循環動態（Ａ，血圧；Ｂ，肺動脈圧）の変化を示す図である。図中の矢印で示した時間幅が投与を行っている期間を示す。
【図３】麻酔下イヌに対して酸素運搬体Ｂを０.１８（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎで投与を開始して、１５分後に６（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎに変更して投与した際の循環動態（Ａ，血圧；Ｂ，肺動脈圧）の変化を示す図である。図中の矢印で示した時間幅が投与を行っている期間を示す。
【図４】麻酔下イヌに対して酸素運搬体Ｂを０.１２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎで投与を開始して、段階的に投与速度を早くした際の循環動態（Ａ，血圧；Ｂ，肺動脈圧）の変化を示す図である。図中数字は投与速度（（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ）を示し、矢印で示した時間幅がその投与速度にて投与を行っている期間を示す。図中の結果は、◇，３０１；□，３０２；△，３０３の各個体のデータを示す。
【図５】ラット中大脳脈閉塞−再開通モデルにおける酸素運搬体Ｂの脳梗塞巣進展抑制効果を示す図である。「生食」は対照として生理食塩液を投与した群を、「酸素運搬体Ｂ」は酸素運搬体Ｂを投与した群を示す。
【図６】ラット中大脳動脈永久閉塞モデルにおける酸素運搬体Ｂの脳梗塞巣進展抑制効果に対する投与時間が与える影響を示す図である。「生食」は対照として生理食塩液を投与した群を、それ以外のカラムは酸素運搬体Ｂを投与した群を示す。また、図中の時間は屈曲確認後から酸素運搬体Ｂが投与されるまでの時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明に係る虚血性脳卒中治療薬は、粒子状担体に内封されたヘムタンパク質を有効成分として含む液状製剤（以下、酸素運搬体とも称す）である。
ヘムタンパク質としては、たとえばヘモグロビン、ミオグロビン、アルブミン−ヘムなどが挙げられる。
【００２３】
また、液状製剤は、ヘムタンパク質を内封することのできる閉鎖小胞構造で、平均粒子径が赤血球よりも小さい粒子状担体を含むものであればよく、リポソーム、リピッドマイクロスフェアおよびナノパーテイクルなどの様々な形態をとることができる。通常、Ｗ（水相）／Ｏ（油相）型およびＷ／Ｏ／Ｗ型が存在し、Ｗ／Ｏ型担体としては、たとえば、ミセル、マイクロスフェア等が挙げられる。また、Ｗ／Ｏ／Ｗ型担体としては、たとえば、膜状に集合した脂質および内部に水相から構成されるリポソームなどが挙げられる。
これらのうちでも、ヘムタンパク質を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する閉鎖小胞、特にリポソームが好ましい。
【００２４】
以下には、液状製剤の代表例として、粒子状担体がリポソームであり、ヘムタンパク質がヘモグロビンであるヘモグロビン含有リポソームについて具体的に説明する。
リポソームの構造も特に限定されず、多重層であってもよいし、一枚膜であってもよい。リポソームの大きさは特に限定されないが、平均粒子径は１μｍ以下、通常１０〜１０００ｎｍ程度、好ましくは３０〜５００ｎｍ程度、より好ましくは１００〜３００ｎｍ程度である。また、リポソームを構成する脂質も特に限定されず、生体内において安全かつ安定な酸素運搬体を提供するという観点から、天然または合成のリン脂質、他の脂質、それらの誘導体、安定化剤、酸化防止剤、荷電物質等を好適に組み合わせて用いることができる。
【００２５】
リン脂質およびその誘導体としては、たとえば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ガングリオシド、カルジオリピン、およびこれらの不飽和結合について一部または完全に水素添加した水素添加リン脂質などが挙げられる。リポソームの膜成分としては水素添加リン脂質が好ましい。水素添加リン脂質は、部分水素添加物であってもよい。たとえば水素添加率５０％以上の卵黄または大豆由来の水素添加リン脂質が好ましい。
【００２６】
安定化剤は、たとえば、コレステロール、コレスタノール等のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類が挙げられる。酸化防止剤は、たとえば、トコフェロール同族体、即ち、ビタミンＥが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γおよびδの４個の異性体が存在するが、本発明にはいずれも用いることができる。荷電物質は、たとえば、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ジセチルホスフェート、脂肪酸が挙げられる。脂肪酸としては、他の脂質類と共に、リポソームを形成し得るものであれば特に限定はないが炭素数１２〜２２の飽和および不飽和脂肪酸が用いられる。たとえば、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸などが挙げられる。
【００２７】
また、上記膜成分の脂質が、たとえば、親水性高分子で修飾されている態様も好適である。特に、リポソームの外表面に親水性高分子を配置した形態がより好ましい。
修飾に用いられる親水性高分子は、酸素運搬体の構造安定を損なうものでなければ特に限定されないが、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナン、およびこれらの誘導体、さらにグルクロン酸、シアル酸等の水溶性多糖類が挙げられる。これらのうちでもＰＥＧが好ましい。
本発明では、リポソームが血液中においてタンパク等と結合し凝集したり、細網内皮系への取り込みにより血流中から早期に排除されたりするのは好ましくないため、これを避けるために、平均重合度で１０〜２００（平均分子量として５００〜１００００）より好ましくは４０〜１００の鎖長のＰＥＧが好ましい。
【００２８】
リポソーム表面をＰＥＧ等により修飾するには、様々な手法が挙げられ特に限定されないが、ＰＥＧ等をリン脂質、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物と結合させて、その疎水性化合物の部分をリポソーム表面に挿入する方法が好ましい。
具体的に、ＰＥＧ結合リン脂質は、リン脂質の親水部（極性頭部）に、ＰＥＧを結合させた構造の分子であり、一分子中に１または２以上のＰＥＧ鎖を含有する。特に、ＰＥＧ結合リン脂質、たとえばＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）などが好ましい。
【００２９】
ヘモグロビン含有リポソームおよび内封するヘモグロビンの好ましい調製方法については、たとえば特開２００７−２６９６４６、特開２００９−３５５１７などにより公知であり、その記載に準じて適宜調製することができる。また、好ましい組成および構造などとともに、そこに開示される記載を引用することにより、本明細書に記載されているものとすることができる。
本発明におけるヘモグロビン含有リポソームのヘモグロビン濃度は、上記したとおり、通常、０.５ｗ/ｖ％以上であるが、好ましくは１〜１２ｗ/ｖ％である。
【００３０】
上記酸素運搬体の初期投与は、ＩＲＲｓが起こらない、あるいはほとんど起こらない２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ未満の投与速度で行われ、通常、０.０５〜２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎにて、好ましくは０.１〜１.２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎにて実施される。この範囲での投与速度で１５分間実施した後、投与開始１５分以降の本投与を１.２〜１００倍、好ましくは２〜６０倍に速度を上げることが好ましい。
【００３１】
本発明では、投与開始１５分経過時に投与速度を一気に所定速度上げることができる。また投与速度を段階的に上げてもよく、その場合、前記２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎ未満の範囲内であれば、初期投与時から変化させても構わないが、初期投与の完了時以降に速度を変化させることが好ましい。
【００３２】
また投与量（１回用量）は、患者の症状、体重、年令などにより変わりうるが、１２〜２４００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは３０〜１２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは６０〜６００ｍｇ／ｋｇである。
また、上記用量で、通常１回だけ投与する。
【００３３】
上記のような本発明における虚血性脳卒中治療薬は、虚血性脳卒中に起因する脳梗塞巣の拡大、運動機能障害や各種神経機能障害などを予防または軽減することができる。虚血性脳卒中としては、たとえば、脳梗塞（アテローム血栓性梗塞、ラクナ梗塞、心原性脳塞栓症など）や一過性脳虚血発作、さらに脳出血またはくも膜下出血後に発症する二次的な虚血性脳卒中などが挙げられる。虚血性脳卒中に起因する症状としては運動機能傷害、意識障害、感覚障害、言語障害、記憶障害、感情の障害、思考能力の障害、めまい、頭痛、吐き気、嘔吐等が挙げられる。
本発明における虚血性脳卒中治療薬は、現行の治療法を併せて使用可能である。現行の治療法とは、たとえば、急性期脳梗塞の治療に用いられる血栓溶解療法、局所線溶療法、血栓除去術、抗凝固療法、抗血小板療法、脳浮腫治療薬、脳保護薬、血液希釈療法、高圧酸素療法、低体温療法、開頭外減圧術などが挙げられる。
【実施例】
【００３４】
次に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
イヌ循環動態に対する酸素運搬体Ａの投与速度が与える影響
（１）酸素運搬体Ａの調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン１８１.７ｇ、コレステロール８９.０ｇ、ステアリン酸６５.３ｇからなる均一混合脂質に水３３６.０ｇを加えて、８５℃で３０分間加温して水和膨潤均一混合脂質を調整した。
期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製・濃縮し、イノシトールヘキサリン酸をヘモグロビンに対して等モル添加したヘモグロビン濃度４２.６ｗ／ｗ％の濃厚高純度ヘモグロビン溶液を調整した。
【００３６】
前記水和膨潤均一混合脂質６７２ｇに、前記濃厚高純度ヘモグロビン溶液２，４００ｇを添加した後に、ｐＨ調整剤として１.６Ｍ−ＮａＯＨ  ８３.６３ｇを混合滴下してプレ乳化物とした後に、高速攪拌法により乳化して、ヘモグロビン含有リポソーム混合乳化液を得た。
粒子径の制御を行った後、リポソームに封入されなかったヘモグロビンおよびイノシトールヘキサリン酸を除去・濃縮して、ヘモグロビン含有リポソームの生理食塩液による懸濁液を得た。
【００３７】
このヘモグロビン含有リポソームの生理食塩液による懸濁液に、ＰＥＧ結合リン脂質としてＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ（日油株式会社）を生理食塩液に溶解させたＰＥＧ結合リン脂質水溶液を添加して、ヘモグロビン含有リポソームおよびＰＥＧ結合リン脂質を含有し、生理食塩液による懸濁液中のヘモグロビン濃度が６.０ｗ／ｖ％であり、ＰＥＧ結合リン脂質濃度が０.１５ｗ／ｖ％である様に調製した後に、ＰＥＧ結合リン脂質を表面固定化処理したものを酸素運搬体Ａとした。
【００３８】
（２）麻酔管理
イヌ（ビーグル、株式会社日本医科学動物資材研究所、雄性）に、チオペンタールナトリウム（田辺三菱製薬株式会社）２５ｍｇ／ｋｇを静脈内投与し、人工呼吸のための気管カテーテル（テルモ株式会社）を挿入した。臭化パンクロニウム（第一三共株式会社）０.１ｍｇ／ｋｇを右橈側皮静脈に留置した２１Ｇ翼付静注針（テルモ株式会社）を介してシリンジポンプを用いて静脈内投与し、自発呼吸が消失したのを確認した後、１〜２％イソフルランの吸入麻酔薬を混合したガス（酸素：笑気＝３：７）を用いた人工呼吸（１回換気量およそ１５ｍＬ／ｋｇ／回、分時換気数およそ１０回／分）による維持麻酔を開始した。その後、術中の不感蒸泄分の水分の補充を目的とした乳酸リンゲル液（１０ｍＬ／ｋｇ／ｈ）の持続投与を開始した。乳酸リンゲル液の投与は左橈側皮静脈に留置した２１Ｇ翼付静注針（テルモ株式会社）を介して輸液ポンプを用いて静脈内投与した。
【００３９】
（３）カテーテルの留置
動脈圧測定のため、右大腿動脈に７Ｆｒ．イントロデューサーを留置し、このイントロデューサーを介し、マイクロチップ圧トランスデューサー（MILLAR INSTRUMENTS社）を大腿動脈に留置した。検体投与のため、右大腿静脈に７Ｆｒ．イントロデューサーを留置し、このイントロデューサーを介し、５Ｆｒ．フィーディングチューブを大腿静脈に留置した。
肺動脈圧測定のため、右総頚静脈に７Ｆｒ．イントロデューサーを留置し、このイントロデューサーを介して５Ｆｒ．サーモダイリューションカテーテル（エドワーズライフサイエンス社）を肺動脈内に留置した。
また、イントロデューサーおよびサーモダイリューションカテーテルは、血栓予防の為カテーテル内をヘパリンロックした（ヘパリンは１００Ｕ／ｍＬに生理食塩液で希釈したものを用いた）。
【００４０】
（４）循環動態の測定
動脈圧は大腿動脈に留置したマイクロチップ圧トランスデューサーを、ひずみ圧力用アンプ（日本光電工業株式会社）もしくは張力用アンプ（日本光電工業株式会社）にそれぞれ接続し測定した。また、肺動脈圧はサーモダイリューションカテーテルの圧力測定ハブ（黄色チューブ）を、圧力トランスデューサー（日本光電工業株式会社）をひずみ圧力用アンプもしくは張力用アンプにそれぞれ接続し測定した。動脈圧および肺動脈圧のデータは熱書記録器（日本光電工業株式会社）にて記録した。また、これらのデータは、データ解析システムPowerLab System（ADInstruments社）を用いてパソコンに取り込んだ。この際、平均血圧および肺動脈圧は、収縮期圧から拡張期圧を減じたものを３で除したものに拡張期圧を加え算出した。
【００４１】
（５）酸素運搬体Ａの投与速度が与える影響
酸素運搬体Ａ（１２００ｍｇ／ｋｇ）を１２０、２４、６、１.２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎの各投与速度における循環動態（血圧および肺動脈圧）の変動を観察した。
１２０（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎにて投与した際には、血圧が投与前の１１６ｍｍＨｇに対して６２ｍｍＨｇまで低下した（投与８分後）。また、肺動脈圧は、投与前の１５ｍｍＨｇに対して２３ｍｍＨｇまで上昇した（投与４分後）（図１（Ａ））。
２４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎにて投与した際には、血圧が投与前の７０ｍｍＨｇに対して５０ｍｍＨｇまで低下した（投与７分後）。また、肺動脈圧は、投与前の１３ｍｍＨｇに対して投与７分後には１５ｍｍＨｇを示し、投与中に２０ｍｍＨｇまで上昇した（図１（Ｂ））。
６（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎにて投与した際には、血圧が投与前の７０ｍｍＨｇに対して４０ｍｍＨｇまで低下した（投与８分後）。また、肺動脈圧は投与前の１５ｍｍＨｇに対して投与中に１９ｍｍＨｇまで上昇した（図１（Ｃ））。
一方、１.２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎにて投与した際には、３００ｍｇ／ｋｇを投与する間中、血圧および肺動脈圧の変動は認められなかった（図１（Ｄ））。
これらの結果は、酸素運搬体による麻酔下イヌの一過的な循環動態の変動を起こす投与速度の閾値が１.２〜６（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎの範囲にあることを示す。
【００４２】
（実施例２）
イヌ循環動態に対する酸素運搬体Ｂの投与速度が与える影響
（１）酸素運搬体Ｂの調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン１９２.４ｇ、コレステロール９４.２ｇ、ステアリン酸４９.４ｇからなる均一混合脂質に水３３６.０ｇを加えて、８５℃で３０分間加温して水和膨潤均一混合脂質を調整した。
期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製・濃縮し、イノシトールヘキサリン酸をヘモグロビンに対して等モル添加したヘモグロビン濃度４１.６ｗ／ｗ％の濃厚高純度ヘモグロビン溶液を調整した。
【００４３】
前記水和膨潤均一混合脂質６７２ｇに、前記濃厚高純度ヘモグロビン溶液２，４００ｇを添加して減圧処理を行った後に、プレ乳化物とした。このプレ乳化物を４５℃以下の温度で、高速攪拌法により乳化して、ヘモグロビン含有リポソーム混合乳化液を得た。
前記乳化液の粒子径の制御を行った後に、リポソームに内封されなかったヘモグロビンおよびイノシトールヘキサリン酸を除去・濃縮し、ヘモグロビン含有リポソームの生理食塩液による懸濁液を得た。
【００４４】
このヘモグロビン含有リポソームの生理食塩液による懸濁液に、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥを生理食塩水に溶解させたＰＥＧ結合リン脂質水溶液を添加して、ヘモグロビン含有リポソームおよびＰＥＧ結合リン脂質を含有し、生理食塩液による懸濁液中のヘモグロビン濃度が６.０ｗ／ｖ％であり、ＰＥＧ結合リン脂質濃度がリポソ−ム構成膜成分の０.４ｗ／ｖ％である様に調製した後に、ＰＥＧ結合リン脂質の表面固定化処理したものを酸素運搬体Ｂとした。
【００４５】
（２）酸素運搬体Ｂの投与速度が与える影響
実施例１に記載した方法にて、イヌにおける麻酔管理、カテーテル留置および循環動態の測定を行った。
酸素運搬体Ｂ（６０ｍｇ／ｋｇ）を２.４あるいは１.２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎの投与速度にて投与した際には、両条件共に血圧の変化は見られなかった。一方、２.４（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎにて投与した際には、一過性の肺動脈圧の上昇が認められた（図２）。これらの結果は、酸素運搬体による麻酔下イヌの一過的な循環動態の変動を起こす閾値は約２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎであることを示す。
【００４６】
（実施例３）
イヌ循環動態に対する酸素運搬体Ｂの低速から高速へと切り替えた際の影響
実施例１に記載した方法にて、イヌにおける麻酔管理、カテーテル留置および循環動態の測定を行った。
酸素運搬体Ｂ（３０ｍｇ／ｋｇ）を０.１８（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎの投与速度で１５分間投与した後に、６（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎに速度を一気に速くして投与した際には、循環動態の変動は認められなかった（図３）。
【００４７】
（実施例４）
イヌ循環動態に対する酸素運搬体Ｂの段階的速度切り替えが与える影響
実施例１に記載した方法にて、イヌにおける麻酔管理、カテーテル留置および循環動態の測定を行った。
酸素運搬体Ｂ（６０ｍｇ／ｋｇ）を０.１２（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎの投与速度にて投与を開始し、その後１５分間隔で０.２４、１.２および６（ｍｇ／ｋｇ）／ｍｉｎの順に投与速度を速めて投与した際には、循環動態の変動は認められなかった（図４）。
【００４８】
（実施例５）
ラット中大脳動脈閉塞−再開通モデルに対する脳梗塞巣進展抑制作用
（１）ラット中大脳動脈閉塞−再開通モデルの作製
ラット（Ｃｒｌ：ＣＤ (ＳＤ)、日本チャールス・リバー株式会社、雄性）を２％イソフルラン（麻酔背景：空気）吸入麻酔下にて、仰臥位に固定した。右総頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を露出し、中大脳動脈（ＭＣＡ）を閉塞するため総頸動脈および外頸動脈を縫合糸で結紮した。予めシリコン（ヘレウスクルツァージャパン株式会社）コーティングし、１９ｍｍの長さに切断した４号のナイロン糸（栓子）を外頸動脈と内頸動脈の分岐部より挿入し、ＭＣＡを閉塞した。ＭＣＡ閉塞３０分後に閉塞側と対側前肢の屈曲を確認した。上述の麻酔条件下でＭＣＡ閉塞２時間後に栓子を抜き、ＭＣＡの血流を再開させた。
【００４９】
（２）酸素運搬体の有効性評価
ＭＣＡ閉塞３０分後に閉塞側と対側前肢の屈曲を確認後、屈曲が認められた動物に上述の酸素運搬体Ａ（１２、６０、３００あるいは６００ｍｇ／ｋｇ）あるいは生理食塩液を静脈内投与した。
ＭＣＡ閉塞２４時間後に動物を断頭し、全脳を素早く摘出して厚さ２ｍｍの脳切片を作製した。脳切片はＢｒｅｇｍａ前方４ｍｍ、Ｂｒｅｇｍａ前方２ｍｍ、Ｂｒｅｇｍａ上、Ｂｒｅｇｍａ後方２ｍｍ、Ｂｒｅｇｍａ後方４ｍｍおよびＢｒｅｇｍａ後方６ｍｍの冠状面が得られる位置とした。
脳切片は、１ｗ／ｖ％  2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride（ナカライテスク株式会社）溶液に室温で浸漬・染色し写真撮影を行った。得られた写真に画像解析（Adobe PhotoshopTM 3.0J,Adobe Systems Incorporated;Color Count 0.3b,K&M Software Corporation）を施し、梗塞巣面積を実測値で求め、その値よりＢｒｅｇｍａ前方４ｍｍ〜Ｂｒｅｇｍａ後方６ｍｍの体積を次式より算出した。
【００５０】
【数１】
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Ｖ：梗塞巣体積（ｍｍ３）
ａ：Ｂｒｅｇｍａ前方４ｍｍ断面上の梗塞巣面積（ｍｍ２）
ｂ：Ｂｒｅｇｍａ前方２ｍｍ断面上の梗塞巣面積（ｍｍ２）
ｃ：Ｂｒｅｇｍａ断面上の梗塞巣面積（ｍｍ２）
ｄ：Ｂｒｅｇｍａ後方２ｍｍ断面上の梗塞巣面積（ｍｍ２）
ｅ：Ｂｒｅｇｍａ後方４ｍｍ断面上の梗塞巣面積（ｍｍ２）
ｆ：Ｂｒｅｇｍａ後方６ｍｍ断面上の梗塞巣面積（ｍｍ２）
【００５１】
酸素運搬体Ｂが投与されたラットでは梗塞巣体積は、対照となる生理食塩液を投与したラットと比較して１２ｍｇ／ｋｇから用量依存的に小さい値を示し、６０ｍｇ／ｋｇ以上の投与によって統計学的に有意に低値を示した（図５）。
【００５２】
（実施例６）
ラット中大脳動脈永久閉塞モデルに対する脳梗塞巣進展抑制作用の対する投与時間の影響
実施例５と同様の方法でラットのＭＣＡを閉塞させた。ＭＣＡ閉塞３０分後に閉塞側と対側前肢の屈曲を確認後、屈曲が認められた動物に実施例１に記載した酸素運搬体Ｂ（３００ｍｇ／ｋｇ）あるいは生理食塩液を静脈内投与した。
一方、投与完了時間による効果の違いを確認するために、屈曲を確認してから１.５、３.５あるいは５.５時間後（それぞれＭＣＡ閉塞２、４、あるいは６時間後）に酸素運搬体Ｂを投与した。ＭＣＡ閉塞２４時間後に動物を断頭し、全脳を素早く摘出して実施例５と同様の方法にて梗塞巣体積を計測した。
【００５３】
まず、酸素運搬体ＡはＭＣＡの永久閉塞モデルに対しても脳梗塞巣進展抑制作用を示した。また、その効果は時間依存的に弱くなったが、屈曲確認５.５時間後（ＭＣＡ閉塞６時間後）でも抑制効果を示した（図６）。これらの結果は、酸素運搬体Ｂは遅くとも５.５時間以内に投与を完了すれば効果を発揮し、より早く投与を完了するほどその効果が強まることを示すものである。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図４】
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