(57)【要約】【課題】  ＳＨＣを用い、より効率良く、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを製造する方法の提供。【解決手段】  ホモファルネソールに、下記式（１）：  Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）  〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕で表されるアミノ酸モチーフ配列を含むタンパク質であって、スクアレン−ホペン環化活性を有するタンパク質を作用させることを特徴とする（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモファルネソールに、ホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素であって、下記式（１）：
Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）
〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸モチーフ配列を含むタンパク質を作用させることを特徴とする（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造方法。
【請求項２】
Ｘ3が（Ｑ、Ｅ又はＲ）−（Ｔ又はＲ）−（Ｉ、Ｔ又はＥ）−（Ｋ、Ｒ、Ｎ又はＩ）−（Ｌ又はＫ）−（Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｒ又はＫ）−（Ｄ、Ｅ又はＱ）−（Ｐ、Ｍ、Ａ又はＲ）−（Ａ、Ｌ、Ｓ又はＧ）−（Ｉ、Ｌ、Ａ又はｎ）−（Ｓ、Ｑ、Ｔ又はｎ）−（Ｋ、Ｅ、Ｑ又はｎ）−（Ｒ又はｎ）〔ここで、ｎは欠失を示す。〕である請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｘ3がＱ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−（Ｄ又はＮ）−Ｄ−Ｐ−（Ａ又はＬ）−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒである請求項１記載の方法。
【請求項４】
Ｘ4がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｄ又はＱであり、Ｘ5がＧ又はＨであり、Ｘ6がＡ、Ｐ、Ｔ又はＣであり、Ｘ7がＳ、Ｑ又はＡである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
Ｘ1がＧであり、Ｘ4がＭ又はＬであり、Ｘ5がＧであり、Ｘ6がＡ又はＰであり、Ｘ7がＳである請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｘ1がＧであり、Ｘ2がＶであり、Ｘ3がＱ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−（Ｄ又はＮ）−Ｄ−Ｐ−（Ａ又はＬ）−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒであり、Ｘ4がＭ又はＬであり、Ｘ5がＧであり、Ｘ6がＡ又はＰであり、Ｘ7がＳである請求項５記載の方法。
【請求項７】
式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列が、下記の（１−ａ）〜（１−ｃ）から選ばれる請求項１記載の方法。
（１−ａ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
（１−ｂ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｍ−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
（１−ｃ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｍ−Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
【請求項８】
前記ホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素であって、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を含むタンパク質が、下記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のタンパク質である、請求項１記載の方法。
（ａ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性環化活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列と６７％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列において、少なくとも下記表１に示す配列番号８の各位置に相当する位置のアミノ酸がそれぞれ対応する当該表１記載のアミノ酸である前記（ｂ）〜（ｄ）のタンパク質、
【表１】
2013132226.tif 000014
（ｆ）式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列に式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｇ）アミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質である前記（ｆ）のタンパク質、
（ｈ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が、下記表２に示す配列番号８の各位置のアミノ酸を有する前記（ｇ）のタンパク質。
【表２】
2013132226.tif 000015
【請求項９】
式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列のＣ末端から１００アミノ酸残基以内に存在する保存配列「ＧＦＰ」のＮ末端側に、下記式（１）：
Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）
〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸モチーフ配列を挿入することを特徴とする、当該ホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素のホモファルネソール環化活性の向上方法。
【請求項１０】
式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が、下記表３に示す配列番号８の各位置のアミノ酸を有する請求項１０記載の方法。
【表３】
2013132226.tif 000016
【請求項１２】
請求項９乃至１１記載の方法によりホモファルネソール環化活性が向上されたスクアレン−ホペン環化酵素。
【請求項１３】
下記式（１）：
Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）
〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸モチーフ配列からなる、ホモファルネソール環化活性付与又は向上能を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン)は、香気特性と残香性に優れたアンバー系調合香料に欠かせない化含物である。
【０００３】
３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランには、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランと（＋）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの光学異性体が存任し、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランは典型的なアンバー香気を有し、（＋）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランは弱い木様香気を有する。このうち、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランは、香料として有用性が高いことから、高い光学純度でこれを得るべく、不斉合成法について、研究開発が盛んに行われている。
【０００４】
例えば、下記に示すように、天然植物クラリーセージの抽出物である(−)−スクラレオールを出発原料とし、(＋)−スクラレオライドを経由し、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを工業的に製造する方法が知られている（非特許文献１）。
【０００５】
【化１】
2013132226.tif 000002
【０００６】
しかしながら、この方法は、多段階反応であり操作が迂遠であり、天然原料を用いるために、供給量と供給安定性が満足のいくものではない。さらに、(−)−スクラレオールの酸化分解工程においてクロム酸や過マンガン塩などの酸化剤を用いており環境負荷が大きい、等の問題がある。
【０００７】
一方、Alicyclobacillus属、Zymomonas属、Bradyrhizobium属、Methylococcus属等の細菌には、下記に示すように、スクアレンを基質とし、ホペン、ホパノールといった環状化合物を生成する環化酵素であるスクアレン−ホペン環化酵素(Squalcne-Hopen cyclase ：以下「ＳＨＣ」ともいう）が存在することが報告されている（非特許文献２）。
【０００８】
【化２】
2013132226.tif 000003
【０００９】
近年、このＳＨＣを用いて、種々の基質に対する反応性が検討され、例えば、ファルネソールを基質とした場合、変換率６４％で下記の化含物（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）が７：３：４５：９の割合で生成することが報告されている（非特許文献３及び４）。
【００１０】
【化３】
2013132226.tif 000004
【００１１】
また、本出願人は、ホモファルネソールを基質とし、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のＳＨＣ（ホモファルネソール環化活性をもつＳＨＣ）を用いることにより、（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを合成できることを報告している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００９−６０７９９８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】島田明美，香料最新技術の特許分析，p.114(1988),シーエムシー出版
【非特許文献２】Sato T. et al., Biosci. Biotechnol. Biochern.,62(2),407-411 ,1998
【非特許文献３】Hoshino T. et al., Org. Biomol. Chem.,2,2650-2657,2004
【非特許文献４】米村ら,TEAC要旨集,238-240,2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＳＨＣを用い、より効率良く、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを製造する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＳＨＣに関して種々検討したところ、スクアレンを基質とするＳＨＣであっても、ホモファルネソールを基質として（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを生成する活性を有するＳＨＣ（ホモファルネソール環化活性を有するＳＨＣ）は極めて限られており、そのなかでも特に有効なホモファルネソール環化活性を有するＳＨＣには、そのアミノ酸配列に固有のモチーフ配列が存在することを見出した。すなわち、当該固有のモチーフ配列を有し且つホモファルネソール環化活性を有するＳＨＣを用いることにより、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランをより効率良く製造できることを見出した。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の１）〜１３）に係るものである。
１）ホモファルネソールに、ホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素であって、下記式（１）：
Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）
〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸モチーフ配列を含むタンパク質を作用させることを特徴とする（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造方法。
２）Ｘ3が（Ｑ、Ｅ又はＲ）−（Ｔ又はＲ）−（Ｉ、Ｔ又はＥ）−（Ｋ、Ｒ、Ｎ又はＩ）−（Ｌ又はＫ）−（Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｒ又はＫ）−（Ｄ、Ｅ又はＱ）−（Ｐ、Ｍ、Ａ又はＲ）−（Ａ、Ｌ、Ｓ又はＧ）−（Ｉ、Ｌ、Ａ又はｎ）−（Ｓ、Ｑ、Ｔ又はｎ）−（Ｋ、Ｅ、Ｑ又はｎ）−（Ｒ又はｎ）〔ここで、ｎは欠失を示す。〕である上記１）の方法。
３）Ｘ3がＱ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−（Ｄ又はＮ）−Ｄ−Ｐ−（Ａ又はＬ）−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒである上記１）の方法。
４）Ｘ4がＭ、Ｌ、Ｋ、Ｄ又はＱであり、Ｘ5がＧ又はＨであり、Ｘ6がＡ、Ｐ、Ｔ又はＣであり、Ｘ7がＳ、Ｑ又はＡである上記１）〜３）のいずれかの方法。
５）Ｘ1がＧであり、Ｘ4がＭ又はＬであり、Ｘ5がＧであり、Ｘ6がＡ又はＰであり、Ｘ7がＳである上記４）の方法。
６）Ｘ1がＧであり、Ｘ2がＶであり、Ｘ3がＱ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−（Ｄ又はＮ）−Ｄ−Ｐ−（Ａ又はＬ）−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒであり、Ｘ4がＭ又はＬであり、Ｘ5がＧであり、Ｘ6がＡ又はＰであり、Ｘ7がＳである上記５）の方法。
７）式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列が、下記の（１−ａ）〜（１−ｃ）から選ばれる上記１）の方法。
（１−ａ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
（１−ｂ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｍ−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
（１−ｃ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｍ−Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
８）前記ホモファルネソール環化活性をもつスクアレン−ホペン環化酵素であって、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を含むタンパク質が、下記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のタンパク質である、上記１）の方法。
（ａ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と６７％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列において、少なくとも下記表１に示す配列番号８の各位置に相当する位置のアミノ酸がそれぞれ対応する当該表１記載のアミノ酸である前記（ｂ）〜（ｄ）のタンパク質、
【００１７】
【表１】
2013132226.tif 000005
【００１８】
（ｆ）式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列に式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｇ）アミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質である前記（ｆ）のタンパク質。
（ｈ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が、下記表２に示す配列番号８の各位置のアミノ酸を有する前記（ｇ）のタンパク質。
【００１９】
【表２】
2013132226.tif 000006
【００２０】
９）式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列のＣ末端から１００アミノ酸残基以内に存在する保存配列「ＧＦＰ」のＮ末端側に、下記式（１）：
Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）
〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸モチーフ配列を挿入することを特徴とする、当該スクアレン−ホペン環化酵素のホモファルネソール環化活性の向上方法。
１０）式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質である上記９）の方法。
１１）配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が、前記表２に示す配列番号８の各位置のアミノ酸を有する上記１０）の方法。
１２）上記９）〜１１）の方法によりホモファルネソール環化活性が向上されたスクアレン−ホペン環化酵素。
１３）下記式（１）：
Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）
〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸モチーフ配列からなる、ホモファルネソール環化活性付与又は向上能を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の製造方法によれば、安価な出発原料から、従来法に比べて、より短時間で、より緩和な条件で、より効率良く（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを製造することができ、生産性及び経済性の両面で工業的に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】アミノ酸モチーフ配列の導入方法を示した模式図。
【図２】各SHCの反応至適pHを示すグラフ。
【図３】各SHCの反応至適温度を示すグラフ。
【図４】各種SHCにおけるアミノ酸モチーフ配列付近のアミノ酸配列の比較図。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、アミノ酸モチーフ配列を示す式中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はＮ末からＣ末方向の順に記載する。
また、本明細書において、アミノ配列及び塩基配列の同一性は、例えば、リップマン−パーソン法 (Lipman-Pearson法:Science,227,1435(1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェア(Genetyx-Win(Ver.5.1.1:ソフトウェア開発)のホモロジー解析 (Scarch Homology)プログラムを用いて、Unit size to compare (ktup)を２として解析を行うことにより算出される。
【００２４】
本発明の（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造方法は、下記式で示される如く、ホモファルネソール（Ａ）に、スクアレン−ホペン環化活性を有するタンパク質であって、下記式（１）：
Ｇ−Ｙ−Ｘ1−Ｘ2−Ｇ−Ｘ3−Ｌ−Ｘ4−Ｑ−Ｘ5−Ｘ6−Ｅ−Ｌ−Ｘ7  ・・・（１）
〔式中、Ｘ1はＧ又はＳを示し、Ｘ2はＶ又はＩを示し、Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示し、Ｘ4は任意のアミノ酸を示し、Ｘ5はＧ又はＨを示し、Ｘ6及びＸ7はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を示す。〕
で表されるアミノ酸モチーフ配列を含むタンパク質を作用させて、（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（Ｂ）を製造する方法である。
【００２５】
【化４】
2013132226.tif 000007
【００２６】
アミノ酸モチーフ配列を示す上記式（１）において、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｌはロイシン、Ｒはアルギニンを示す。
【００２７】
Ｘ1はＧ（グリシン）又はＳ（セリン）を示すが、Ｇであるのが好ましい。
【００２８】
Ｘ2はＶ（バリン）又はＩ（イソロイシン）を示すが、Ｖであるのが好ましい。
【００２９】
Ｘ3は９〜１３個の任意のアミノ酸を示すが、ここで、任意のアミノ酸としては、Ｍ（メチオニン）、Ｓ（セリン）、Ａ（アラニン）、Ｔ（トレオニン）、Ｖ（バリン）、Ｙ（チロシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｑ（グルタミン）、Ｐ（プロリン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｗ（トリプトファン）、Ｋ（リシン）、Ｃ（システイン）、Ｒ（アルギニン）、Ｇ（グリシン）及びＨ（ヒスチジン）から、同種又は異種のアミノ酸を任意に９〜１３個選択されることを意味する。アミノ酸の個数は、９〜１３個が好ましく、１２〜１３個が更に好ましい。
【００３０】
斯かるＸ3はとしては、具体的には、例えば、Ｘ3-1−Ｘ3-2−Ｘ3-3−Ｘ3-4−Ｘ3-5−Ｘ3-6−Ｘ3-7−Ｘ3-8−Ｘ3-9−Ｘ3-10−Ｘ3-11−Ｘ3-12−Ｘ3-13〔ここで、Ｘ3-1はＱ、Ｅ又はＲ、Ｘ3-2はＴ又はＲ、Ｘ3-3はＩ、Ｔ又はＥ、Ｘ3-4はＫ、Ｌ、Ｒ、Ｎ又はＩ、Ｘ3-5はＬ又はＫ、Ｘ3-6はＤ、Ｎ、Ｔ、Ｒ又はＫ、Ｘ3-7はＤ、Ｅ又はＱ、Ｘ3-8はＰ、Ｍ、Ａ又はＲ、Ｘ3-9はＡ、Ｌ、Ｓ又はＧ、Ｘ3-10はＩ、Ｌ、Ａ又はｎ、Ｘ3-11はＳ、Ｑ、Ｔ又はｎ、Ｘ3-12はＫ、Ｅ、Ｑ又はｎ、Ｘ3-13はＲ又はｎを示す（ここで、ｎは欠失を示す。）。〕
【００３１】
より好ましいＸ3としては、Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−（Ｄ又はＮ）−Ｄ−Ｐ−（Ａ又はＬ）−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒが挙げられる。
【００３２】
Ｘ4は任意のアミノ酸を示すが、Ｘ4はＭ（メチオニン）、Ｌ（ロイシン）、Ｋ（リシン）、Ｄ（アスパラギン酸）又はＱ（グルタミン）であるのが好ましく、Ｍ又はＬであるのがより好ましい。
【００３３】
Ｘ5はＧ（グリシン）又はＨ（ヒスチジン）を示すが、Ｇであるのが好ましい。
【００３４】
Ｘ6及びＸ7は任意のアミノ酸を示すが、Ｘ6はＡ（アラニン）、Ｐ（プロリン）、Ｔ（トレオニン）又はＣ（システイン）であるのが好ましく、Ａ又はＰであるのがより好ましい。また、Ｘ7はＳ（セリン）、Ｑ（グルタミン）又はＡ（アラニン）であるのが好ましく、Ｓであるのがより好ましい。
【００３５】
式（１）で示される好適なアミノ酸モチーフ配列としては、Ｘ1がＧであり、Ｘ2がＶであり、Ｘ3がＱ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−（Ｄ又はＮ）−Ｄ−Ｐ−（Ａ又はＬ）−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒであり、Ｘ4がＭ又はＬであり、Ｘ5がＧであり、Ｘ6がＡ又はＰであり、Ｘ7がＳであるものが挙げられ、
より好適には、以下の式（１−ａ）、（１−ｂ）、及び（１−ｃ）が挙げられる。
（１−ａ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｌ−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
（１−ｂ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｄ−Ｄ−Ｐ−Ａ−Ｉ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｍ−Ｑ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
（１−ｃ）：Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｑ−Ｔ−Ｉ−Ｋ−Ｌ−Ｎ−Ｄ−Ｐ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ｒ−Ｌ−Ｍ−Ｑ−Ｇ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｓ
（１−ａ）は、Zymomonas mobilis NBRC 13756株由来ＳＣＨのアミノ酸モチーフ配列、（１−ｂ）は、Acetobacter pasteurianum NBRC 3283株由来ＳＨＣのアミノ酸モチーフ配列、（１−ｃ）は、Rhodopseudomonas palstris BisA53株由来ＳＨＣのアミノ酸モチーフ配列である。
【００３６】
本発明の、（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（Ｂ）の製造に用いられるタンパク質は、ホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素であって、上記式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を含むタンパク質であれば特に高いホモファルネソール環化活性能を有することから何れも用いることができる。また、その由来も限定されるものではないが、例えば、Zymomonas属、Acetobacter属、Rhodopseudomonas属、Teredinibacter属、Pelobacter属、Syntrophobacter属、Bradyrhizobium属等の細菌、好ましくは、Zymomonas mobilis、Acetobacter pasteurianum、Rhodopseudomonas palstris 、Teredinibacter turnerae、Pelobacter carbinolicus、Syntrophobacter fumaroxidans 、Bradyrhizobium sp等が挙げられる。尚、図４に、各種SHCにおけるアミノ酸モチーフ配列付近のアミノ酸配列の比較図を示す。
【００３７】
当該タンパク質としては、好適には、例えば、下記（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のものが挙げられる。
（ａ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と６７％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｄ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、
（ｅ）配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列において、少なくとも前記表１に示す配列番号８の各位置に相当する位置のアミノ酸がそれぞれ対応する当該表１記載のアミノ酸である前記（ｂ）〜（ｄ）のタンパク質、
（ｆ）式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列に式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列が挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｇ）アミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質である前記（ｆ）のタンパク質。
（ｈ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が、前記表２に示す配列番号８の各位置のアミノ酸を有する前記（ｇ）のタンパク質。
【００３８】
ここで、スクアレン−ホペン環化活性を有するタンパク質とは、広義には、スクアレンを基質とし、ホペン、ホパノールといった環状化合物を生成する活性を持つタンパク質、すなわちスクアレン−ホペン環化酵素（ＳＨＣ）を意味する。
また、「ホモファルネソール環化活性」とは、ホモファルネソール（Ａ）を基質とし、（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（Ｂ）を生成する活性をいう。
【００３９】
ＳＨＣは、Ｃ末端から１００アミノ酸残基以内に、アミノ酸が高度に保存された領域（保存配列「ＧＦＰ」）が存在するが、本発明のタンパク質は、当該ＧＦＰのＮ末端側に、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を有するものであるのが好ましい。
【００４０】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Zymomonas mobilis NBRC13756株から見出されたＳＨＣであり、1995年に、クローニング、塩基配列の決定及び大腸菌での発現が行われている(Microbiology l41(1995),155-161)。当該タンパク質は、スクアレンから、ホペン及びホパノールの生成活性を有することが確認されているが、酵素学的な解析は為されておらず、（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン生成能を有することについては全く知られていない。尚、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、前記特許文献1において使用された、Alicyclobacillus acidocaldarius NBRC 15652株より単離されたＳＨＣ（配列番号８、前記非特許文献２）とのアミノ酸配列の同一性は４３％である。
なお、Alicyclobacillus acidocaldarius由来のＳＨＣでは環化反応に必要な構造が特定されており（CHEM. COMMUN.,2002,291-301）、前記表２にその位置及びアミノ酸を示している。
【００４１】
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Acetobacter pasteurianum NBRC 3283株由来から見出されたＳＨＣであり、1980年に精製酵素を用いてスクアレン環化活性の評価が行われている(Eur. J. Biochem. 112(3), 541-547, 1980)のみでクローニング及び大腸菌での発現は検討されていない。
【００４２】
配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Rhodopseudomonas palustris BisA53株由来から見出されたＳＨＣであり、2006年にゲノム配列が公開されたのみで、大腸菌での発現ならびに機能解析は行われていない。
【００４３】
尚、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Acetobacter pasteurianum NBRC 3283株由来のＳＨＣ）と、配列番号２のアミノ酸配列との配列同一性は７９%であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Rhodopseudomonas palstris BisA53株由来のＳＨＣ）と配列番号２のアミノ酸配列との配列同一性は６７%である。
【００４４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質においては、保存配列「ＧＦＰ」はアミノ酸番号６６７番目〜６６９番目に相当し、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列は、アミノ酸番号６７０番目〜６９５番目に相当する。
配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質においては、保存配列「ＧＦＰ」はアミノ酸番号６６２番目〜６６４番目に相当し、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列は、アミノ酸番号６６５番目〜６９０番目に相当する。
配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質においては、保存配列「ＧＦＰ」はアミノ酸番号６２６番目〜６２８番目に相当し、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列は、アミノ酸番号６２９番目〜６５４番目に相当する。
尚、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質においては、保存配列「ＧＦＰ」はアミノ酸番号６００番目〜６０２番目に相当するが、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列は有しない。
【００４５】
配列番号２、４、６又は８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、其々Zymomonas mobilis、Acetobacter pasteurianum及びRhodopseudomonas palstris、Alicyclobacillus acidocaldariusから単離し得るが、配列番号１、３、５又は９で示される塩基配列を挿入した発現ベクターを導入した組換え宿主より製造することもできる（後記実施例１参照）。
【００４６】
配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一なタンパク質もまた、本発明の（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造に使用できる。
ここで、「実質的に同一なタンパク質」とは、ホモファルネソール環化活性を有する限りにおいて、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列において１又は数個、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
【００４７】
「実質的に同一なタンパク質」としてはまた、ホモファルネソール環化活性を有する限りにおいて、配列番号２のアミノ酸配列と６７％以上の配列同一性、より好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
「実質的に同一なタンパク質」としてはさらに、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性、より好ましくは８５％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
上記記載の「実質的に同一なタンパク質」において、より好ましいタンパク質としては、配列番号２、４又は６で示されるアミノ酸配列において、少なくとも前記表１に示す配列番号８の各位置に相当する位置のアミノ酸がそれぞれ対応する当該表１記載のアミノ酸であり且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００４８】
所与のタンパク質と実質的に同一なタンパク質は、公知の技術によって取得される。例えば、実質的に同一なタンパク質は、部位特異的変異法によって、所与のタンパク質のアミノ酸配列から特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加等されるようにそのタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を改変することによって得られる。また、改変された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、従未知られている他の突然変異処理によっても取得できる。他の突然変異処理としては、配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ(例えば、配列番号1で示される塩基配列からなるＤＮＡ)をヒドロキシアミン等でインビトロ処理する方法、及び配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持する微生物等を紫外線照射もしくはニトロソグアニジン等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００４９】
また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、若しくは付加等の改変には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる改変も含まれる。上記のような改変を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の酵素活性を調べることにより、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンバク質と実質的に同一のタンパク質及びそれをコードするＤＮＡが得られる。
【００５０】
本発明の製造方法に用いられるタンパク質は、上記（ａ）〜（ｅ）の他に、（ｆ）式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列に式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列が挿入されたアミノ配列からなるタンパク質も包含される。式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列が挿入されたスクアレン−ホペン環化酵素は、ホモファルネソール環化活性が向上される。
【００５１】
式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素としては、例えば配列番号８（Alicyclobacillus acidocaldarius NBRC 15652株由来のSHC）で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が挙げられる。なお、１若しくは数個とは、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個をいう。
さらに式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を持たないホモファルネソール環化活性を有するスクアレン−ホペン環化酵素としては、例えば配列番号８（Alicyclobacillus acidocaldarius NBRC 15652株由来のSHC）で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質が挙げられ、好ましくは８５％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
【００５２】
ここで、配列番号８で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質、及び配列番号８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つホモファルネソール環化活性を有するタンパク質としては、更に、前記表２に示す配列番号８の各位置（１７−３２位，４５位等）のアミノ酸を有するもの（当該アミノ酸が保存されているもの）が好ましい。
【００５３】
尚、式（１）で表されるアミノ酸モチーフ配列を挿入される位置は、上述したとおり、当該ＳＨＣのＣ末端から１００アミノ酸残基以内に存在する保存配列「ＧＦＰ」のＮ末端側が好ましい。例えば、配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であれば、アミノ酸番号６０２番目と６０３番目の間に挿入するのが好ましい。
【００５４】
斯かるアミノ酸モチーフ配列が挿入されたＳＨＣ（「改変ＳＨＣ」とも云う）は、モチーフ配列を持たないＳＨＣのＣ末端から１００アミノ酸以内に存在する保存配列「ＧＦＰ」のＮ末端側にモチーフ配列が挿入されるようにプライマーを設計し、当該モチーフ配列を持たないＳＨＣの発現ベクターを鋳型に変異導入ＰＣＲを行うことで当該モチーフ配列を有するＳＨＣに改変することによって得ることができる（図１参照）。
【００５５】
ホモファルネソール(Ａ)に、本発明のタンパク質を作用させるに当たっては、当該タンパク質を基質に直接的に作用させてもよいし、当該タンパク質を含有する微生物又は当該微生物の処理物、例えば、死菌化細胞、抽出物、粗精製物等の形態で当該基質に作用させてもよい。タンパク質の基質への接触は、タンパク質を適当な溶媒、例えば水性溶媒や緩衝液に溶解又は分散させて行うのが好ましく、円滑な反応、操作の容易性などの点から、緩衝液を用いて行うのがさらに好ましい。また、これに有機溶媒を共存させて接触させることもできる。
【００５６】
本発明の反応は、反応収率の点から、溶媒のpHは、使用するタンパク質の至適ｐＨ付近、例えば４．０〜７．０で行うのが好ましい。より詳細には、例えばZymomonas属細菌由来のタンパク質を用いる場含、ｐＨを４．０〜７．０、好ましくは４．５〜６．０として行うのがよく、Acetobacter属細菌由来のタンパク質を用いる場合、ｐＨを４．０〜７．０、好ましくは４．５〜６．５として行うのがよく、Rhodopseudomonas属細菌由来のタンパク質を用いる場含、ｐＨを４．５〜７．０、好ましくは５．０〜６．５として行うのがよい。また、式（１）のモチーフ配列を導入したAlicyclobacillus属細菌由来のタンパク質を用いる場合は、ｐＨを４．０〜７．０、好ましくは４．５〜６．５として行うのがよいが、モチーフ配列導入により至適ｐＨが変化する可能性があるので、モチーフ配列導入後に至適ｐＨ等の酵素学的特徴を確認した後、適した条件にて反応を行うことが望ましい。
好適な溶媒としては、pH調整の点から、例えば、硫酸、塩酸、リン酸等の鉱酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム等の無機塩基、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩を添加した水溶液や、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、燐酸緩衝液等の緩衝液が挙げられ、クエン酸緩衝液がより好ましい。
【００５７】
また、有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、t一ブチルメチルエーテル、イソブロヒルエーテル等のエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘブタン、イソオクタン、デカン等の庚化水素類、t一ブタノール、メタノール、エタノール、イソフロハノール、n一ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
【００５８】
当該基質の濃度は特に限定されないが、０．０１〜３％が好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。また、ホモファルネソールは、反応系に一括又は連続的に加えることができる。尚、ホモファルネソール（Ａ）は、ネロリドールを臭未化し、シアノ化し、加水分解することによりホモファルネシル酸とし、さらに還元することにより得ることができる。
【００５９】
反応温度は、使用するタンパク質の至適温度付近、例えば１５〜６０℃で行うのが好ましい。より許細には、例えばZymomonas属細菌由来のタンパク質を用いる場合、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃で、Acetobacter属細菌由来のタンパク質を用いる場含、１５〜６０℃、好ましくは２０〜４５℃で、Rhodopseudomonas属細菌由来のタンパク質を用いる場含、１５〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃で、通常０．５〜１００時間程度、好ましくは８〜４８時間程度、振とう、撹拌することにより行うことができる。
式（１）のモチーフ配列を導入したAlicyclobacillus属細菌由来のタンパク質を用いる場合は、温度１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃で行うのがよいが、モチーフ配列導入により至適温度が変化する可能性があるので、モチーフ配列導入後に至適温度等の酵素学的特徴を確認した後、適した条件にて反応を行うことが望ましい。
【００６０】
反応系からの（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン(Ｂ)の分離回収は、例えば、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを含有する反応系に有機溶剤(例えば、ｎ−ヘキサンなど脂肪族炭化水素系溶剤、酢酸エチル、クロロホルムなど非水溶性の有機溶剤、２−プロパノールなどアルコール類等)を一種もしくは複数種添加して十分に撹拌した後、水層と有機層に分液し、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを有機層に移行させ、有機層を水層から分離した後に、有機層の溶剤を留去するか、または蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより処理して、（−)−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランを単離精製する方法等が挙げられる。
【実施例】
【００６１】
参考例１  SHC蛋白質の大腸菌での発現
（１）SHC発現ベクターの作製
【００６２】
Alicyclobacillus acidocaldarius NBRC 15652株（以下A.a.）、Zymomonas mobilis NBRC 13756株(以下Z.m.)、Acetobacter pasteurianus NBRC 3283株(以下A.p.)をそれぞれの復元培地にて培養し、MO  BIO Laboratories, Inc製UltraCleanTM Microbial DNA Isolation KitにてゲノムDNAを回収した(A.a.:NBRC 864培地、Z.m.:NBRC 226培地、A.p.:NBRC 804培地)。また、Rhodopseudomonas palstris BisA53株（以下R.p.）はSHC配列を人工合成した。
【００６３】
回収したゲノムDNAまたは人工合成DNAを鋳型とし、Takara Bio社製PrimeSTAR ポリメラーゼおよび表１記載のプライマーを用いてPCR反応（98℃10秒〜55℃30秒〜72℃2分30秒  30サイクル）によってSHC遺伝子断片（A.a.-SHC（配列番号９、前記非特許文献２:1.9kb）、Z.m.-SHC（配列番号１:2.1kb）、A.p.-SHC1（配列番号３:2.1kb）、R.p.-SHC（配列番号５:2.1kb）、）を増幅した。
【００６４】
【表３】
2013132226.tif 000008
【００６５】
それぞれのSHC遺伝子断片及びpET21aベクターをそれぞれTakara Bio社製制限酵素でよって切断し（A.a.-SHC:NdeI, BamHI、Z.m.-SHC:NdeI, HindIII、A.p.-SHC1:NdeI, EcoRI、R.p.-SHC:EcoRI, SalI）、両者をTOYOBO社製Ligation Highキットを用いて連結させ、プラスミドpET21a-A.a.SHC、pET21a-Z.m.SHC、pET21a-A.p.SHC1、pET21a-R.p.-SHCを作製した。
【００６６】
連結させたサンプルを大腸菌HB101株に形質転換し、その形質転換体からRoche社製High Pure PCR Product Purification Kitにて各種SHC発現ベクターを抽出、精製した。
【００６７】
＊864培地：  Solution  A(Yeast Extract 1g, (NH4)2SO4・7H2O 0.5g, CaCl2・2H2O 0.25g, KH2PO4 0.6g, Distilled water 500mL, pH2.5-3.0), Solution B(Glucose 1g, Agar(if need) 20g, Distilled water 500mL, pH5.5-6.0)、Solution AとSolution Bは個々に滅菌処理した後混合した。
【００６８】
＊226培地： Yeast Extract 5g/L, Glucose 20g/L, Agar(if need) 15g/L, pH6.8-7.0
【００６９】
＊804培地：Polypeptone 5g/L、Yeast Extract 3g/L、Glucose 5g/L、MgSO4・7H2O 1g/L、Agar(if need) 15g/L、pH6.6-7.0
【００７０】
（２）モチーフ配列欠損SHCの発現ベクター作製
構築したpET21a-Z.m.SHC、pET21a-A.p.SHC1、pET21a-R.p.-SHC を鋳型とし、Takara Bio社製PrimeSTAR Maxポリメラーゼ及び表３記載のプライマーを用いてPCR反応（98℃10秒〜55℃30秒〜72℃2分30秒  30サイクル）によって各ベクター（約7kb）を増幅した。増幅させたサンプルをToyobo社製制限酵素DpnIで処理した後大腸菌HB101株に形質転換し、その形質転換体からRoche社製High Pure PCR Product Purification Kitにて各種SHC発現ベクターを抽出、精製した。
【００７１】
【表４】
2013132226.tif 000009
【００７２】
（３）モチーフ配列導入SHCの発現ベクター作製
構築したpET21a-A.a.SHC、を鋳型とし、Takara Bio社製PrimeSTAR Maxポリメラーゼ及び表５記載のプライマーを用いてPCR反応（98℃10秒〜55℃30秒〜72℃2分30秒  30サイクル）によって各ベクター（約7kb）を増幅した。増幅させたサンプルをToyobo社製制限酵素DpnIで処理した後大腸菌HB101株に形質転換し、その形質転換体からRoche社製High Pure PCR Product Purification Kitにて各種SHC発現ベクターを抽出、精製した。
【００７３】
【表５】
2013132226.tif 000010
【００７４】
（４）大腸菌におけるSHCの発現およびSHCの抽出
構築したSHC発現ベクターを大腸菌BL21StarTM(DE3)株に形質転換し、その形質転換体をLB-Amp培地(Bacto Trypton 1%, Bacto Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, Agar(if need) 1.5%, アンピシリン100μg/mL（滅菌処理後添加）)にて30℃で振とう培養した。菌体濁度(OD600)が0.4程度まで増加したところで終濃度100μg/mLになるようにイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、SHCの発現を誘導した。IPTG添加後6〜8時間培養した後、培養液から菌体を遠心分離し、0.2％ Triton X-100を添加した60mMクエン酸緩衝液（pH6.0）に再懸濁して超音波処理にて細胞破砕液を調製した。得られた細胞破砕液は遠心分離によって不溶性画分を除去しSHC抽出液を得た（A.a.-SHC（配列番号８）、Z.m.-SHC（配列番号２）、A.p.-SHC1（配列番号４）、R.p.-SHC（配列番号６））。
【００７５】
参考例２  各SHCの反応至適pH
pH4.4〜8.0になるように100mM各種緩衝液、0.2％TritonX-100、0.05％スクアレン又は0.1％ホモファルネソール、及び参考例１で得られた各種SHC抽出液を混合し、A.a.-SHCは60℃、Z.m.-SHCは25℃、A.p.-SHC1は45℃、R.p.-SHCは37℃にて24時間反応させた。ホモファルネソールは、3Z,7Z-体、3E,7Z-体、3Z,7E-体、3E,7E-体の４つの異性体混合物である。反応液は5分間氷上に静置して反応を停止させ、ヘキサン：2-プロパノール＝3：2の抽出溶媒を用いて反応物を抽出し、ガスクロマトグラフィーによって分析した。その結果、生成物としてスクアレンを基質とした場合にはホペン及びホパノール、ホモファルネソールを基質とした場合には（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランが検出された。（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランは3E,7E-ホモファルネソールから生成したものである。結果を図２に示す。
【００７６】
図２よりスクアレン環化反応における至適pHは、A.a.-SHC : pH5.0〜6.0、Z.m.-SHC : pH7.0、A.p.-SHC1 : pH7.0、R.p.-SHC : pH7.0であり、ホモファルネソール環化反応における至適pHは、A.a.-SHC : pH5.0〜6.0、Z.m.-SHC : pH5.0、A.p.-SHC1 : pH5.0、R.p.-SHC : pH6.0あることが分かった。
【００７７】
参考例３  各SHCの反応至適温度
参考例２で判明した至適pHの各種緩衝液、0.2％TritonX-100、0.05％スクアレン又は0.1％ホモファルネソール、及び参考例１で得られた各種SHC抽出液を混合し、20〜70℃にて24時間反応させた。参考例１（１）と同様に反応物を分析したところ、スクアレンを基質とした場合にはホペン及びホパノール、ホモファルネソールを基質とした場合には（−）−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］が検出された。結果を図３に示す。
【００７８】
図３よりスクアレン環化反応における至適温度は、A.a.-SHC : 60℃、Z.m.-SHC : 45℃、A.p.-SHC1 : 45℃、R.p.-SHC : 45℃あり、ホモファルネソール環化反応における至適温度は、A.a.-SHC : 60℃、Z.m.-SHC : 25℃、A.p.-SHC1 : 25-37℃、R.p.-SHC : 45℃あることが分かった。
【００７９】
実施例１  各種SHCによるホモファルネソール環化反応
参考例１，２で確認した反応至適条件において各種SHCをホモファルネソールと反応させ、環化活性を評価した。結果を表６に示す。
【００８０】
【表６】
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【００８１】
表６より、モチーフ配列を有するZ.m.-SHC、A.p.-SHC1、R.p.-SHCはモチーフ配列を持たないA.a.-SHCよりもホモファルネソールに対する反応性が大幅に高い酵素であることが示された。
【００８２】
実施例２  モチーフ配列欠損SHCにおける環化活性
参考例１で確認した反応至適pH、反応至適温度においてZ.m.-SHC、A.p.-SHC、R.p.-SHCとそれぞれのモチーフ配列欠損酵素をホモファルネソールと反応させ、環化活性を評価した。結果を表７に示す。
【００８３】
【表７】
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【００８４】
表７よりモチーフ配列欠損酵素においてホモファルネソールに対する反応性が大幅に低下し、モチーフ配列がホモファルネソール環化活性に重要な役割を果たすことが示唆された。
【００８５】
実施例３  モチーフ配列挿入SHCにおけるホモファルネソール環化反応
参考例１で確認した反応至適pH、20〜70℃の条件においてA.a.-SHCとA.a.-SHCモチーフ配列挿入酵素をホモファルネソールと反応させ、環化活性を評価した。結果を表８に示す。
【００８６】
【表８】
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【００８７】
高温ではモチーフ配列挿入酵素において活性が低下したが、低温ではモチーフ配列挿入酵素の方が野生型酵素より活性が向上した。このことから、モチーフ配列の挿入により条件によって、ホモファルネソール環化活性が向上することが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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