(57)【要約】      （修正有）【課題】アデノウイルスベクターをがん細胞に対して選択的に導入可能なポリペプチドおよび当該ポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを提供する。【解決手段】（１）がん細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、及び、（２）コクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の細胞外ドメイン又はその類縁体の一部又は全部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分を含む、がん細胞に対して選択的に導入可能なポリペプチドおよび当該ポリペプチドを備えるアデノウイルスベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）がん細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、及び、
（２）コクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の細胞外ドメイン又はその類縁体の一部又は全部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分
を含む
ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、
前記「ＣＰＰに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分」が、
（ａ）５〜２０個の連続したポリアルギニン配列と、１または複数のインテグリン結合モチーフ（ＲＧＤ）の配列とを有するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、
（ｂ）配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、又は、
（ｃ）配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、がん細胞に対する選択的な細胞膜透過性を有するポリペプチド部分
であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドであって、
前記「ＣＡＲの細胞外ドメイン又はその類縁体の一部又は全部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分」が、
（ｉ）配列番号７〜１１で表わされるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、又は、
（ｉｉ）配列番号７〜１１で表わされるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アデノウイルスに対する親和性を有するポリペプチド部分、
であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドを備える
がん細胞に選択的に導入可能なアデノウイルスベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のアデノウイルスベクターであって、
前記ポリペプチドが、前記アデノウイルスベクターのファイバータンパクと結合していることを特徴とするアデノウイルスベクター。
【請求項７】
請求項５または６に記載のアデノウイルスベクターであって、前記がん細胞が、胃がん細胞、乳がん細胞、大腸がん細胞、肺がん細胞、肝がん細胞、腎がん細胞、前立腺がん細胞、骨肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、コーイング肉腫細胞、脳腫瘍細胞、中皮腫細胞、血液腫瘍細胞、および、リンパ腫細胞からなる群より選択されるがん細胞であることを特徴とするがん細胞であるアデノウイルスベクター。
【請求項８】
がん細胞に選択的に導入可能なアデノウイルスベクターの製造方法であって、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドとアデノウイルスベクターとを溶媒中で混和する工程を含む、
アデノウイルスベクターの製造方法。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１０】
がん疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、請求項５〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含み、
前記アデノウイルスベクターが、抗がん遺伝子の発現カセットを有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物であって、
前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の医薬組成物の治療的有効量を、対象に投与することを特徴とするがん疾患の治療方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載のがん疾患の治療方法であって、
前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする治療方法。
【請求項１４】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含むがん疾患の診断薬。
【請求項１５】
請求項１４に記載の診断薬であって、
前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする診断薬。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の診断薬を、対象に投与することを特徴とするがん細胞の検出方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の検出方法であって、
前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノウイルスベクターをがん細胞に対して選択的に導入可能なポリペプチドおよび当該ポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
革新的ながん治療薬の開発の１つとして、組み換えアデノウイルスベクター技術の利用が進められてきた。この技術は、アデノウイルスベクターを介して、対象とするがん細胞へ抗腫瘍遺伝子を「抗がん薬」として投与する遺伝子治療法である。そして、現行のアデノウイルスベクターを利用した遺伝子治療技術においては、非増殖型アデノウイルスベクター、または、がんのみで特異的に増殖する制限増殖型アデノウイルスベクターが用いられてきた。しかしながら、そのいずれのアデノウイルスベクターを用いた場合であっても、がんの治療効果自体は十分なものではなかった。非増殖型アデノウイルスベクターの場合には、がん以外の正常組織でも発現するリスクを有する。一方、がん特異的に増殖する制限増殖型アデノウイルスベクターの場合には、腫瘍指向性に増幅されると考えられてきたが、最近の研究から正常幹細胞や生殖細胞でも遺伝子発現することが明らかとなっており副作用を発現するリスクを有する。このように、がんに対する特異性（安全性）についても、一長一短がある。結果として、アデノウイルスベクターは、抗がん薬の導入ベクターとして、いまだその潜在能力を引き出すに至っていない。従来法における問題点の主な原因として、治療用ウイルスのがん細胞への導入が、ウイルス本来の感染機構に頼っている点があげられる。即ち、ウイルス本体の感染機構に基づく受容体を介した感染性導入では、制がんに十分な遺伝子効果が得られないと考えられる。
【０００３】
アデノウイルスの感染は、ウイルス表面にあるファイバー先端部（ｋｎｏｂ）が宿主細胞上に発現する受容体（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ））に結合することにより始まる。ＣＡＲに結合したウイルスは、その後ファイバー根元のｐｅｎｔｏｎ  ｂａｓｅにおけるＲＧＤモチーフを利用し、宿主細胞上の第２の受容体αＶβインテグリンと結合し、細胞内への侵入を開始する。このようにアデノウイルスベクターの導入は標的細胞上の受容体ＣＡＲの発現に依存するため、ＣＡＲの発現レベルが低い細胞（内皮細胞、肺上皮細胞、平滑筋細胞、神経細胞、血球系の細胞、一部の腫瘍細胞）への遺伝子導入効率は極めて低い。さらに、アデノウイルスベクターの利用は、ＣＡＲを発現する正常細胞（非標的細胞）に対する遺伝子導入が非選択的に行われてしまう問題点を有する。
【０００４】
この問題に対処するため、ＣＡＲやαＶβインテグリンに依存しないアデノウイルスベクター導入法の研究・開発が行われてきた。（１）ファイバーやｐｅｎｔｏｎ  ｂａｓｅの改変によるＣＡＲ／αＶβインテグリン非結合型アデノウイルスベクターの開発や、（２）アデノウイルス−ＣＡＲ結合阻害抗体と標的細胞特異的に発現する受容体に対する抗体とを融合したバイファンクショナル抗体を、アデノウイルスベクターと組み合わせたものの開発、（３）ＣＡＲの細胞外ドメインと標的細胞特異的受容体に結合する分子（抗受容体抗体や受容体のリガンド分子）とを融合したアダプタータンパクを、アデノウイルスベクターへ組み合わせたものの開発、などが挙げられる。
【０００５】
これまでにアダプタータンパクとして、ＣＡＲ細胞外領域と、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）（非特許文献１）、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）（特許文献１）、ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）（特許文献２）、１本鎖抗ＣＤ３４抗体（特許文献２）との融合タンパク質が開発されている。そして、これらのアダプタータンパクとアデノウイルスベクターとを組み合わせることにより、標的細胞へのアデノウイルスベクター導入の促進が報告されている。
【０００６】
しかしながら、上記改良法においても、標的細胞に対するアデノウイルスベクターの導入効率は、標的細胞上の受容体の発現量に依存する。そのため、がん種や悪性度により標的細胞上の受容体の発現量が変動してしまう場合には、アデノウイルスベクターの導入効率は制限されてしまう。したがって、上記改良法によっても、すべてのがん細胞の完全な死滅を目的とした場合には、効果が十分であるとは言い難い。さらに、ＣＡＲやＥＧＦ受容体は、腫瘍組織に特異的に発現しているわけではなく、正常細胞の細胞表面にも存在する。よって、標的とするがん細胞のみならず、正常細胞へのアデノウイルスベクターの導入も生じていた。
【０００７】
このように、従来の組み換えアデノウイルスベクター技術を利用した遺伝子治療法は、アデノウイルスベクターの導入による遺伝子導入が標的細胞上の受容体の発現量に影響され、また、がん細胞選択的にアデノウイルスベクターを導入できないという問題を有していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報第２０１１／１５４３０８号
【特許文献２】特開２００３−１９２７００
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒ．  Ａｌｅｍａｎｙ  ａｎｄ  Ｄ  Ｔ  Ｃｕｒｉｅｌ，  Ｊ．Ｖｉｏｌ．２０００，  ７４，  ６８７５−６８８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、組み換えアデノウイルスベクター技術を利用した遺伝子治療法において、アデノウイルスベクターの導入による遺伝子導入を、がん細胞に対して選択的に行うことを可能とするポリペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは従来法の発想を転換することで、上記課題に大きなブレークスルーをもたらした。すなわち、本発明者らは、アデノウイルスベクターをがん細胞に選択的に導入させるためのポリペプチドであって、がん細胞に対して選択的に細胞膜透過性を有するペプチド部分とアデノウイルスレセプター細胞外ドメインを有するポリペプチドを開発した。
【００１２】
すなわち、本発明のポリペプチド（ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ）は、がん細胞膜透過性ペプチド（ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ；ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ  ＣＰＰ）とＣＡＲの細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＣＡＲ；ｅｘＣＡＲ）を融合した組み換えタンパク質である。このように、本発明のポリペプチドは、アデノウイルスレセプターの細胞外ドメインを有している。そのため、本発明のポリペプチドとヒト遺伝子などの発現カセットを組み込んだアデノウイルスベクターとを一定量比で混和することで、ポリペプチドとアデノウイルスベクターとを結合させることができる。そして、本発明のポリペプチドは、がん細胞に対して選択的に細胞膜透過性を有するペプチド部分を有している。これにより、本発明のポリペプチドと結合したアデノウイルスベクターは、対象とするがん細胞に対して選択的に導入させることができる。
【００１３】
さらに、がん細胞膜透過性ペプチドは、ヒト悪性腫瘍系統別に対応させることが可能である。例えば、がん細胞膜透過性ペプチドには、大腸がんのがん細胞に選択的なＣＰＰ２、固形がん全般のがん細胞に選択的なＣＰＰ１０、肝がんのがん細胞や白血病に関連するがん細胞に対して選択的なＣＰＰ４４などが存在する。したがって、目的に応じたがん細胞膜透過性ペプチドを選択することにより、がん細胞に高い選択性を有するポリペプチドおよび当該ポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを構築することができる。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）がん細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、及び、
（２）コクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の細胞外ドメイン又はその類縁体の一部又は全部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分
を含む
ことを特徴とするポリペプチドに関する。
【００１５】
ここで、本発明のポリペプチドの一実施の形態においては、
前記「ＣＰＰに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分」が、
（ａ）５〜２０個の連続したポリアルギニン配列と、１または複数のインテグリン結合モチーフ（ＲＧＤ）の配列とを有するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、
（ｂ）１〜６で表わされるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、又は、
（ｃ）配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、がん細胞に対する選択的な細胞膜透過性を有するポリペプチド部分
であることを特徴とする。
また、本発明のポリペプチドの一実施の形態においては、前記「ＣＡＲの細胞外ドメイン又はその類縁体の一部又は全部に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド部分」が、
（ｉ）配列番号７〜１１で表わされるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列を有するポリペプチド部分、又は、
（ｉｉ）配列番号７〜１１で表わされるアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アデノウイルスに対する親和性を有するポリペプチド部分、
であることを特徴とする。
また、本発明の別の態様によれば、前記ポリペプチドを含む組成物に関する。
【００１６】
また、本発明の別の態様によれば、前記ポリペプチドを備える、がん細胞に選択的に導入可能なアデノウイルスベクターに関する。
なお、本発明のアデノウイルスベクターの一実施の形態においては、前記ポリペプチドが、前記アデノウイルスベクターのファイバータンパクと結合していることを特徴とする。
また、本発明のアデノウイルスベクターの一実施の形態においては、前記がん細胞が、胃がん細胞、乳がん細胞、大腸がん細胞、肺がん細胞、肝がん細胞、腎がん細胞、前立腺がん細胞、骨肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、コーイング肉腫細胞、脳腫瘍細胞、中皮腫細胞、血液腫瘍細胞、および、リンパ腫細胞からなる群より選択されるがん細胞であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の別の態様によれば、がん細胞に選択的に導入可能なアデノウイルスベクターの製造方法であって、前記ポリペプチドとアデノウイルスベクターとを溶媒中で混和する工程を含むアデノウイルスベクターの製造方法に関する。
なお、本発明の別の態様によれば、前記アデノウイルスベクターを含む組成物に関する。
【００１８】
また、本発明の別の態様によれば、前記アデノウイルスベクターを含む、がん疾患を治療するための医薬組成物であって、前記アデノウイルスベクターが、抗がん遺伝子の発現カセットを有することを特徴とする医薬組成物に関する。
なお、本発明の医薬組成物の一実施の形態においては、前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の別の態様によれば、前記医薬組成物の治療的有効量を、対象に投与することを特徴とするがん疾患の治療方法に関する。
なお、本発明の治療方法の一実施の形態においては、前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の別の態様によれば、前記アデノウイルスベクターを含むがん疾患の診断薬に関する。
なお、本発明の診断薬の一実施の形態においては、前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の別の態様によれば、前記診断薬を、対象に投与することを特徴とするがん細胞の検出方法に関する。
なお、本発明の検出方法の一実施の形態においては、前記がん疾患が、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫、脳腫瘍、中皮腫、血液腫瘍、および、リンパ腫からなる群より選択されるがんであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
上述のように、本発明のポリペプチドは、がん細胞膜透過性ペプチドとＣＡＲ細胞外ドメインとを融合させたアデノウイルスベクターデリバリー用のポリペプチドである。したがって、がん細胞における受容体の発現量に依存することなく、本発明のポリペプチドを結合させたアデノウイルスベクターを対象とするがん細胞に対して選択的に導入させることができる。これは、従来技術においてアデノウイルスベクターを導入させることができなかった、ウイルスレセプター発現の無い細胞に対しても、高効率で抗腫瘍遺伝子を導入することを可能とする。
【００２３】
また、上述のように、本発明のポリペプチド内のがん細胞透過性ペプチド部分は、対象とするがん細胞ごとに選択的に変更することも可能である。よって、目的とするがん細胞の種類ごとによっても、選択的にアデノウイルスベクターを導入させることができる。
【００２４】
これにより、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターは、従来のアデノウイルスベクター導入法、例えば、既存のアダプター分子（ＣＡＲ−ＥＧＦ）を用いた導入法による場合に比較して、数十倍〜数百倍に達する高い目的遺伝子発現効果を有するアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入システムを提供することができる。
【００２５】
また、従来の組み換えアデノウイルスベクター技術を利用した遺伝子治療法においては、ファイバーと呼ばれるウイルス表面成分（ウイルス表面の突起部分）の抗原性もアデノウイルスベクターを利用した遺伝子治療の実効性を阻む大きな障害となっていた。すなわち、ウイルスベクターのファイバータンパクの抗原性が、ウイルスベクターを投与した対象内での中和抗体産生を惹起し、ウイルスベクターの不活化を招いてしまっていた（平成２２年度国立医薬品食品衛生研究所報告書、日本薬理学雑誌１３７、７０−７４頁、２０１１）。しかし、本発明のポリペプチドは、アデノウイルスベクター粒子表面上のファイバーに結合し、被包する。これにより、ファイバーの抗原性によるウイルス投与対象内での中和抗体産生の惹起を低減させることができる。
なお、アデノウイルスは、細胞表面上のＣＡＲに結合することにより、細胞へ感染することが知られている。よって、本発明のポリペプチドによるファイバー先端の被包は、アデノウイルスベクターのＣＡＲを介した感染能力を消失させる。しかしながら、その代わりに、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターは、対象とするがん細胞内へ、がん細胞膜透過性ペプチドの持つ細胞高親和性浸透能に依存して導入することが可能である。
【００２６】
また、従来の組み換えアデノウイルスベクター技術を利用した遺伝子治療法においては、アデノウイルスベクター導入に起因する生殖毒性や肝障害などの組織毒性が生じる事についても問題点として指摘されている。
これに対して、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターは、高い導入効率と高い選択性によりウイルス投与量の減量が可能となる。これにより、上記に挙げるような組織毒性を最小限に抑えた、生体低侵襲性の遺伝子導入を可能とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本発明の一実施の形態であるポリペプチドの概略図を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施の形態である、動物細胞により発現されるポリペプチド（ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ）のイメージ図を示す。
【図３】図３は、本発明の一実施の形態であるポリペプチドとアデノウイルスベクターとを結合させることにより、本発明のポリペプチドを備えたアデノウイルスベクターの概略図を示す。
【図４】図４は、本発明の一実施の形態である、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列（１１Ｒ）とを融合させたペプチドのアミノ酸配列を示す。太字はシグナル配列を示し、アンダーラインはＣＡＲ細胞外ドメインを示し、太字及び斜体はアルギニン１１回繰り返し配列（１１Ｒ）からなるＣＰＰ配列を示し、太字及び波線はｍｙｃ−ｔａｇを示し、太字及び太いアンダーラインは、６Ｈｉｓ−ｔａｇを示す。
【図５】図５は、本発明の一実施の形態である、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列（７ＲＧＤ−７Ｒ）とを融合させたペプチドのアミノ酸配列を示す。太字はシグナル配列を示し、アンダーラインはＣＡＲ細胞外ドメインを示し、枠による囲みは、インテグリン結合配列を示し、太字及び斜体はアルギニン７回繰り返し配列（７Ｒ）からなるＣＰＰ配列を示し、太字及び波線はＨＡ−ｔａｇを示し、太字及び太いアンダーラインは、６Ｈｉｓ−ｔａｇを示す。
【図６】図６は、本発明の一実施の形態である、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列（ＣＰＰ２）とを融合させたペプチドのアミノ酸配列を示す。太字はシグナル配列を示し、アンダーラインはＣＡＲ細胞外ドメインを示し、太字及び斜体は大腸がん選択的ＣＰＰ配列（ＣＰＰ２）を示し、太字及び波線はｍｙｃ−ｔａｇを示し、太字及び太いアンダーラインは、６Ｈｉｓ−ｔａｇを示す。
【図７】図７は、本発明の一実施の形態である、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列（ＣＰＰ１０）とを融合させたペプチドのアミノ酸配列を示す。太字はシグナル配列を示し、アンダーラインはＣＡＲ細胞外ドメインを示し、太字及び斜体は固形がん選択的ＣＰＰ（ＣＰＰ１０）を示し、太字及び波線はｍｙｃ−ｔａｇを示し、太字及び太いアンダーラインは、６Ｈｉｓ−ｔａｇを示す。
【図８】図８は、本発明の一実施の形態である、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列（ＣＰＰ４４）とを融合させたペプチドのアミノ酸配列を示す。太字はシグナル配列を示し、アンダーラインはＣＡＲ細胞外ドメインを示し、太字及び斜体は白血病／肝臓がん選択的ＣＰＰ配列（ＣＰＰ４４）を示し、太字及び波線はｍｙｃ−ｔａｇを示し、太字及び太いアンダーラインは、６Ｈｉｓ−ｔａｇを示す。
【図９】図９は、本発明の一実施の形態である、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列（１１Ｒ）とを融合させたペプチド（ｅｘＣＡＲ−１１Ｒ）をコードするｃＤＮＡを製造するための、ＣＰＰ配列（１１Ｒ）を含むｃＤＮＡ配列を示す。枠による囲みは、Ｎ末端側よりそれぞれ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎdＩＩＩ、および、Ｘｂａｌの制限酵素部位を示し、下線は、１１Ｒを示す。
【図１０】図１０は、本発明の一実施の形態である、ＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列（７ＲＧＤ−７Ｒ）とを融合させたペプチド（ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ）をコードするｃＤＮＡを製造するための、ＣＰＰ配列（７ＲＧＤ−７Ｒ）を含むｃＤＮＡ配列を示す。枠による囲みは、５‘末端側よりそれぞれ、Ｘｈｏｌ、および、Ｘｂａｌの制限酵素部位を示し、下線は、７ＲＧＤ−７Ｒを示す。
【図１１】図１１は、Ｌｅｎｔｉ−ＸＴＭ  ２９３Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅより発現・回収した本発明の一実施の形態であるポリペプチドの精製度を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて確認した際のＣＢＢ染色像を示す。
【図１２】図１２は、様々な細胞におけるＣＡＲの発現量をウェスタンブロッティングにより測定した際の画像データを示す。
【図１３】図１３は、胃がん細胞株ＭＫＮ２８、乳癌細胞株ＭＣＦ−７、および、高悪性度脳腫瘍細胞株Ｔ９８に対して、本発明の一実施の形態であるｅｘＣＡＲ−１１ＲまたはｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えたＧＦＰアデノウイルスベクターを導入させた際の、ＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した際の画像データを示す。
【図１４】図１４は、胃がん細胞株ＭＫＮ２８、乳癌細胞株ＭＣＦ−７、および、高悪性度脳腫瘍細胞株Ｔ９８に対して、本発明の一実施の形態であるｅｘＣＡＲ−１１ＲまたはｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えたＧＦＰアデノウイルスベクターを導入させた際の、ＧＦＰ蛍光強度を示すグラフを示す。
【図１５】図１５Ａは、アデノウイルス低感受性ヒト胃癌腹腔播種モデルに対してｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えたＧＦＰアデノウイルスベクターを導入し、アデノウイルスベクター投与後２４時間目に摘出した臓器の写真図を示す。図１５Ｂは、図１５Ａに示す臓器におけるＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した際の画像データを示す。
【図１６】図１６は、アデノウイルス低感受性ヒト胃癌腹腔播種モデルに対して、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０を備えたＧＦＰアデノウイルスベクターを導入し、アデノウイルスベクター投与後４８時間目に摘出した臓器の写真図および蛍光顕微鏡下の画像データを示す。
【図１７】図１７は、アデノウイルス低感受性ヒト胃癌腹腔播種モデルに対して、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えたＧＦＰアデノウイルスベクターを導入し、導入後に摘出した各臓器および腫瘍組織におけるＧＦＰタンパク発現を、ウサギ抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。
【図１８】図１８は、アデノウイルス低感受性ヒト胃癌腹腔播種モデルに対して、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０を備えたＧＦＰアデノウイルスベクターを導入し、導入後に摘出した各臓器および腫瘍組織におけるＧＦＰタンパク発現を、ウサギ抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット法により測定した結果を示す図である。
【図１９】図１９は、胃がん細胞株ＭＫＮ２８細胞に対して、アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクター（Ａ）、既存技術であるｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを備えるアデノウイルスベクター（Ｂ）、または本発明の一実施の形態であるｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えるアデノウイルスベクター（Ｃ）を導入し、導入後４８時間後のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡により観察した画像データを示す。
【図２０】図２０は、胃がん細胞株ＭＫＮ２８細胞に対して、アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクター（Ａ）、既存技術であるｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを備えるアデノウイルスベクター（Ｂ）、または本発明の一実施の形態であるｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えるアデノウイルスベクター（Ｃ）を導入し、導入後４８時間後のＧＦＰの平均蛍光強度をフローサイトメトリーにより解析した結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、ヒト正常線維芽細胞ＮＨＤＦに対して、アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクター（Ａ）、既存技術であるｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを備えるアデノウイルスベクター（Ｂ）、または本発明の一実施の形態であるｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えるアデノウイルスベクター（Ｃ）を導入し、導入後４８時間後のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡により観察した画像データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書において、がん細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）とは、がん細胞に対して選択的な膜透過性の機能を有するペプチドである。ここで、がん細胞に対する選択的な膜透過性とは、特定の種類（例えば、病理学的組織型分類）のがん細胞に対する選択的な膜透過性を意味する。目的とする特定の種類のがん細胞に対する膜透過性が、特定のがん細胞以外のがん細胞および正常細胞に対する膜透過性に比べて高いことが好ましい。ここで、目的とする特定の種類のがん細胞とは、一種類のがん細胞であってもよいし、二種類以上のがん細胞であってもよい。
【００２９】
本発明に使用し得るがん細胞膜透過性ペプチドとしては、（ｉ）上記機能を有するペプチドであり、かつ、（ｉｉ）ＣＡＲ細胞外ドメインとともにアダプターペプチドを構成し、アデノウイルスベクターと結合した際に、当該アデノウイルスベクターをがん細胞選択的に導入可能なペプチドであれば特に限定されない。このようながん細胞膜透過性ペプチドとしては、例えば、正常細胞に比して悪性腫瘍細胞に対してより指向性が高い、５個〜２０個のアルギニンが連続したポリアルギニン配列とインテグリン結合モチーフ（ＲＧＤ）を数回繰り返した配列とを組み合わせたアミノ酸配列からなるペプチド、大腸がんに対して選択的であるＣＰＰ２（配列番号１）、固形がんに対して選択的であるＣＰＰ１０（配列番号２）、白血病／肝臓がんに対して選択的であるＣＰＰ４４（配列番号３）、乳がんに対して選択的であるＣＰＰ（配列番号４）、肺がんに対して選択的であるＣＰＰ（配列番号５）、骨肉腫に対して選択的であるＣＰＰ（配列番号６）を挙げることができる。なお、インテグリン結合モチーフ（ＲＧＤ）を数回繰り返した配列とは、当該配列中に、１または複数のインテグリン結合モチーフを有する配列であり、例えば、１〜２０のインテグリン結合モチーフを含むことができる。また、当該配列中のインテグリン結合モチーフは、それぞれが連続して配置されてもよいし、非連続的に配置されていてもよい。
【００３０】
また、本発明に使用し得るがん細胞膜透過性ペプチドとしては、がん細胞膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、がん細胞に対する選択的な細胞膜透過性を有するペプチドも含まれる。また、本発明に使用し得るがん細胞膜透過性ペプチドとしては、がん細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）の類縁体も含まれる。がん細胞膜透過性ペプチドの類縁体とは、がん細胞膜透過性ペプチドを構成するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％の相同性を有する変異体、がん細胞膜透過性ペプチドのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド、がん細胞膜透過性ペプチドの活性を有する伸長されたがん細胞膜透過性ペプチドを含む。また、本発明に使用し得るがん細胞膜透過性ペプチドの類縁体としては、がん細胞に対する選択的な細胞膜透過性を有しているものが好適に使用される。
【００３１】
なお、ペプチドのがん細胞膜透過性は、例えば、当該ペプチドに適当な標識物質（例えば蛍光物質）でラベルし、特定のがん細胞を共培養することで、がん細胞内へ透過したペプチドの蛍光を検出することにより確認することができる。
【００３２】
本明細書において、コクサッキーウイルス・アデノウイルイスレセプター（ＣＡＲ）とは、アデノウイルスのカプシド外表に存在するファイバーと相互作用する細胞表面レセプターをいう。本明細書において、ＣＡＲ細胞外ドメイン（ｅｘＣＡＲ）とは、この細胞表面に存在するＣＡＲ受容体のうち細胞外に存在する領域であって、アデノウイルスに対する受容体活性を有する領域をいう。なお、ヒトにおけるＣＡＲ細胞外ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列で示すことができる。また、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ由来のＣＡＲのアミノ酸配列は、よく保存されていることが知られている。よって、本発明に使用し得るＣＡＲ細胞外ドメインとしては、ヒトに限らず、マウス、ラット、ブタ、イヌ、チンパンジー、ウシ等の哺乳動物由来のＣＡＲ細胞外ドメインを好適に使用することができる。特に好ましくは、ヒト由来またはマウス由来のＣＡＲ細胞外ドメインである。なお、例えば、マウスのＣＡＲ細胞外ドメインは配列番号８のアミノ酸配列を有しており、ラットのＣＡＲ細胞外ドメインは配列番号９のアミノ酸配列を有しており、チンパンジーのＣＡＲ細胞外ドメインは配列番号１０のアミノ酸配列を有しており、ウシのＣＡＲ細胞外ドメインは配列番号１１のアミノ酸配列を有している。
【００３３】
また、本発明に使用し得るＣＡＲ細胞外ドメインとしては、ＣＡＲ細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アデノウイルスに対する親和性を有するペプチドも含まれる。また、本発明に使用し得るＣＡＲ細胞外ドメインとしては、ＣＡＲ細胞外ドメインの類縁体も含まれる。ＣＡＲ細胞外ドメインの類縁体とは、ＣＡＲ細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または、９９％の相同性を有する変異体、ＣＡＲ細胞外ドメインのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド、ＣＡＲ細胞外ドメインの活性を有する伸長されたＣＡＲ細胞外ドメインを含む。また、本発明に使用し得るＣＡＲ細胞外ドメインの類縁体として、アデノウイルスのファイバーに対する親和性を有するものを好適に使用し得る。
【００３４】
本発明のポリペプチド（ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ）は、ＣＡＲ細胞外ドメイン（ｅｘＣＡＲ）と、がん細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）との融合により構築されるタンパクである。なお、図１に、本発明のポリペプチドの概要図を示す。本発明のポリペプチド内におけるＣＡＲ細胞外ドメインとがん細胞膜透過性ペプチドとの位置関係は、ＣＡＲ細胞外ドメインがＮ末端側にあっても、がん細胞膜透過性ペプチドがＮ末端側にあってもよい。ただし、がん細胞膜透過性ペプチドがＮ末端側にある場合ＣＡＲのシグナルペプチド配列と細胞外ドメイン配列の間に位置するものとする。好ましくは、ＣＡＲ細胞外ドメインがＮ末端側に存在し、がん細胞膜透過性ペプチドがＣ末端側に存在する。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、ＣＡＲ細胞外ドメインとがん細胞膜透過性ペプチドの他に、タグを含むことができる。本発明に使用し得るタグは、ＣＡＲ細胞外ドメインとがん細胞膜透過性ペプチドの機能を害さない限り、精製用のタグ等、ペプチド合成において当業者に周知のタグを使用することができる。このようなタグとしては、例えば、６個〜１２個からなるＨｉｓタグや、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ等を挙げることができる。本発明のポリペプチド内におけるタグの位置は、ＣＡＲ細胞外ドメインとがん細胞膜透過性ペプチドの機能を害さない限り限定されない。好ましくは、タグは、ＣＡＲ細胞外ドメインおよびがん細胞膜透過性ペプチドよりもポリペプチドのＣ末端側に存在する。
【００３６】
また、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列内にリンカー配列を含むことができる。リンカー配列としては、ＣＡＲ細胞外ドメインとがん細胞膜透過性ペプチドの機能を害さず、ポリペプチドの産生・分泌に影響を与えない配列であれば限定されない。アミノ酸の種類、長さも特に制限されないが、好ましくは２から２０残基であって、既知のペプチドモチーフを含まない配列が好ましい。
また、本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列内にスペーサー配列を含んでいてもよい。本発明のポリペプチド内に使用し得るスペーサー配列としては、例えば、ＧｎＳｎＡｎＰｎＱｎＧｎ（ＰＥＧ）ｎ（ｎ＝０〜３０；ＰＥＧ＝ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）のような配列を挙げることができる。なお、前記のスペーサー配列内において、（ＰＥＧ）ｎは、アミノ酸配列（ＧｎＳｎＡｎＰｎＱｎＧｎ）のＣ末端側とすることもできるし、Ｎ末端側とすることもできる。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、遺伝子組換えポリペプチドとして、動物細胞での発現のほか、大腸菌を代表とする細菌類、酵母、昆虫細胞で発現させたものを使用することができる。また無細胞タンパク合成系や蚕体内、動物の乳汁中での生産も可能である。
なお、図２に、本発明に係るポリペプチドの一態様である、動物細胞により発現されたポリペプチド（ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ）のイメージ図を示す。このポリペプチドは、分泌型タンパク誘導用のシグナル配列をＮ末端に有している。
【００３８】
動物細胞により発現・分泌されたポリペプチドは、タグにより精製・回収することができる。また、回収後のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の手段により目的タンパクとして得られていることを同定することができる。
なお、上記のようなポリペプチド中のシグナル配列は、動物細胞内に存在するシグナルぺプチダーゼにより除去された形で分泌される。
【００３９】
本発明のポリペプチドの一実施の形態としては、例えば下記のようなポリペプチドを挙げることができる。
配列番号１２、１４、１６、１８、または、２０のアミノ酸配列で示されるヒトＣＡＲ＋ＣＰＰｓ（なお、配列番号１３、１５、１７、１９、および、２１は、前述のヒトＣＡＲ＋ＣＰＰｓに対応するｃＤＮＡ配列を示す）、配列番号２２、２４、２６、２８、または、３０のアミノ酸配列で示されるマウスＣＡＲ＋ＣＰＰｓ（なお、配列番号２３、２５、２７、２９、および、３１は、前述のマウスＣＡＲ＋ＣＰＰｓに対応するｃＤＮＡ配列を示す）、配列番号３２、３４、３６、３８、または、４０のアミノ酸配列で示されるラットＣＡＲ＋ＣＰＰｓ（なお、配列番号３３、３５、３７、３９、および、４１は、前述のラットＣＡＲ＋ＣＰＰｓに対応するｃＤＮＡ配列を示す）、配列番号４２、４４、４６、４８、または、５０のアミノ酸配列で示されるチンパンジーＣＡＲ＋ＣＰＰｓ（なお、配列番号４３、４５、４７、４９、および、５１は、前述のチンパンジーＣＡＲ＋ＣＰＰｓに対応するｃＤＮＡ配列を示す）、配列番号５２、５４、５６、５８、または、６０のアミノ酸配列で示されるウシＣＡＲ＋ＣＰＰｓ（なお、配列番号５３、５５、５７、５９、および、６１は、前述のウシＣＡＲ＋ＣＰＰｓに対応するｃＤＮＡ配列を示す）。
なお、上記のポリペプチドは、シグナル配列をＮ末端側に有した状態のものを示す。また、上記のポリペプチドは、精製用のタグをＣ末端側に有している。なお、上記のポリペプチドは、本発明の一実施の形態についての例示に過ぎず、これ以外のＣＡＲ細胞外ドメインとＣＰＰ配列との組み合わせを排除するものではない。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、アデノウイルスベクターと結合することにより、アデノウイルスベクターをがん細胞選択的に導入させることができる。本発明のポリペプチドは、ＣＡＲ細胞外ドメインの部分が、アデノウイルスベクターのカプチド外表に存在するファイバーと結合することにより連結される。そして、ポリペプチドと結合したアデノウイルスベクターは、ポリペプチド内のがん細胞膜透過性ペプチドの選択的な細胞膜の透過機能により、がん細胞に対して選択的に導入させることが可能となる。図３として、本発明のポリペプチドとアデノウイルスベクターとを結合させたイメージ図を示す。
【００４１】
ここで、がん細胞に対して選択的に導入できるとは、正常細胞に対する導入と比較して、がん細胞に対して選択的に導入できることをいう。なお、がん細胞に対して選択的に導入できるとは、さらに、異なるがん細胞の種間によっても特定のがん細胞に対して選択的に導入できることも含まれる。
【００４２】
本発明のポリペプチドとアデノウイルスベクターの結合は、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳバッファー、生理食塩水等の溶媒（ｐＨ７．０〜７．８）中において、ポリペプチドと、アデノウイルスベクターとを混和させることで結合させることができる。反応条件は、例えば、室温で１０分〜６０分とすることができる。
【００４３】
遺伝子治療に使用されるアデノウイルスベクターは、抗がん遺伝子をがん細胞中において発現するための発現カセットを有する。本発明に使用し得るアデノウイルスベクターとしては、ポリペプチドとの結合によりがん細胞に対して選択的に導入できるアデノウイルスベクターであって、導入後に抗がん遺伝子を発現可能なアデノウイルスベクターであれば制限されない。アデノウイルスベクターにより導入する抗がん遺伝子は、遺伝子治療分野において使用される抗がん遺伝子であれば特に制限されない。
【００４４】
本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを、特定のがん細胞に対して選択的に導入できるという場合、アデノウイルスベクターの細胞に対する導入頻度によって評価することができる。なお、本明細書において導入頻度とは、アデノウイルスベクターを投与した全細胞数に対する、アデノウイルスベクターにより遺伝子が導入された細胞の割合とする。アデノウイルスベクターの導入頻度は、例えば、蛍光タンパクであるＧＦＰ遺伝子の発現カセットを有するアデノウイルスベクターを細胞へ導入させ、導入後に、ＧＦＰの蛍光を有する細胞をカウントすることで、アデノウイルスベクターの導入効率を測定することができる。本発明のアデノウイルスベクターの目標とする特定のがん細胞に対する導入頻度は、従来のアダプタータンパクを有していないアデノウイルスベクターの導入頻度に対して２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、または、５０倍以上の導入頻度を有し、好ましくは、１０倍以上の導入頻度を有する。
また、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを、特定のがん細胞に対して導入させた場合、その導入頻度は、好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または、９９％以上である。より好ましくは、９０％以上の導入頻度を有しており、さらに好ましくは９５％以上の導入頻度を有しており、最も好ましくは９９％以上の導入頻度を有する。
【００４５】
また、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを、特定のがん細胞に対して選択的に導入できるという場合、蛍光イメージングによる解析における単一細胞あたりの蛍光強度によっても評価することができる。ここで、蛍光イメージングによる解析とは、例えばＧＦＰ発現カセットを有するアデノウイルスを細胞に導入し、導入した細胞のＧＦＰ蛍光強度をフローサイトメトリーにより解析することで測定できる。また、単一細胞あたりの蛍光強度とは、アデノウイルスベクターを導入した単一の細胞内における蛍光強度をいう。このような評価に基づいた場合、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを導入した特定のがん細胞の蛍光強度は、正常細胞における蛍光強度に対して少なくとも１０倍以上となり、好ましくは、２０倍以上、５０倍以上、１００倍以上となる。
【００４６】
また、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを、特定のがん細胞に対して選択的に導入できるという場合、アデノウイルスベクターを導入した単一細胞あたりの導入遺伝子の発現量によっても評価することができる。本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターが、優れた導入遺伝子の遺伝子発現を可能とするという場合、例えば、導入した細胞内において優れた導入遺伝子の遺伝子発現量を示すことをいう。なお、導入遺伝子の遺伝子発現量は、当業者に周知の方法により測定することができる。
本発明のアデノウイルスベクターを導入した単一細胞あたりの遺伝子発現量は、従来のアダプタータンパクを有していないアデノウイルスベクターを導入した単一細胞あたりの遺伝子発現量に対して１０倍以上、１００倍以上、または、１０００倍以上の遺伝子発現量を有し、好ましくは１００倍以上の遺伝子発現量を有する。
また、本発明のアデノウイルスベクターを用いた場合の導入遺伝子の遺伝子発現量は、従来の細胞表面受容体を標的としたアデノウイルスベクターによる遺伝子導入システムによる遺伝子発現量に対して、２倍以上、５倍以上、または、１０倍以上の遺伝子発現量を有する。また、本発明のアデノウイルスベクターを用いた場合の導入遺伝子の遺伝子発現量は、ポリペプチドを有さないアデノウイルスベクター単独の投与による遺伝子導入システムに対して、４倍以上、１０倍以上、または、２０倍以上の遺伝子発現量を有し、好ましくは、１０倍以上の遺伝子発現量を有する。
【００４７】
また、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターが、従来法と比較して優れた導入遺伝子の遺伝子発現効率を有するという場合、例えば、下記式で示すような遺伝子導入効率の増幅率としても示すことができる。
（本発明のアデノウイルスベクターの導入によるＧＦＰ遺伝子導入頻度／従来のアデノウイルスベクターの導入によるＧＦＰ遺伝子導入頻度）×（本発明のアデノウイルスベクターの導入による各がん細胞株の個細胞あたりのＧＦＰ蛍光強度／従来のアデノウイルスベクターの導入による個細胞あたりの蛍光強度）＝従来法に対する増幅効率
本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを用いた際の、従来の細胞表面受容体を標的としたアデノウイルスベクターによる遺伝子導入システムに対する遺伝子発現効率の増幅率は、１０倍以上、１００倍以上、または、１０００倍以上であり、好ましくは、１００倍以上である。また、本発明のポリペプチドを備えるアデノウイルスベクターを用いた際の、アダプタータンパクを有さないアデノウイルスベクター単独の投与に対する遺伝子発現効率の増幅率は、２倍以上、１０倍以上、２０倍以上、または、５０倍以上であり、好ましくは、１０倍以上である。
【００４８】
本発明の一態様によれば、本発明のポリペプチドを備えたアデノウイルスベクターを有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、がんの治療に大変有効である。上述の通り、本発明のポリペプチドを備えたアデノウイルスベクターは特定のがん細胞に対して選択的に導入させることができるため、本発明の医薬組成物は、特定のがん細胞に対して選択的な治療効果を有する。また、従来のアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入技術に比べて、正常細胞への悪影響を抑えることができる。
【００４９】
例えば、本発明のアデノウイルスベクターにより選択的に治療可能ながん疾患（悪性腫瘍）としては、例えば、胃がん、乳がん、大腸がん、肺がん、肝がん、腎がん、前立腺がん等の癌腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、コーイング肉腫等の肉腫、脳腫瘍、中皮腫、骨髄性白血病、リンパ腫等の血液腫瘍等の悪性腫瘍すべてが含まれる。なお、本明細書において、固形がんとは、胃がん、子宮頸がん、大腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、腎がん、肝がん、骨肉腫、横紋筋肉腫、グリオーマをいう。また、白血病とは、例えば、急性骨髄性白血病等を挙げることができる。白血病に関連するがん細胞とは、白血病に関連してがん化している造血細胞等をいう。
また、本発明のアデノウイルスベクターを有効成分として含有する医薬組成物の投与対象は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。
【００５０】
本発明のアデノウイルスベクターを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、当業者に周知のアデノウイルスベクターと併用して投与される中和抗体とともに組み合わせて用いることもできる。
【００５１】
本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、対象の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。対象に対して直接投与するのであれば、例えば、注射剤として、静脈内、筋肉内、臓器内、皮内、皮下、動脈内、静脈内、腹腔内または、直接腫瘍組織内に投与することができる。または、間接的に投与する方法としては、治療対象より採血、骨髄穿刺、生検等により採取した器官や組織の細胞を利用する方法も挙げることができる。対象より摘出した細胞を培養し、当該細胞に対して体外で本発明のアデノウイルスベクターを作用させ、遺伝子導入後の細胞を治療対象へ投与することもできる。
【００５２】
上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、がんのサイズ、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、１×１０８個のがん細胞に相当するがん組織に対して本発明のアデノウイルスベクターが１×１０６〜１×１０１０個、好ましくは１×１０８〜１×１０１０個となる投与量とすることができる。
【００５３】
上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。
【００５４】
また、本発明の別の態様によれば、がんの診断薬を提供することができる。
本発明のポリペプチドを備えたアデノウイルスベクターを有効成分として含有するがんの診断薬は、がん細胞を選択的に検出することを可能とする。がんの診断薬に使用されるアデノウイルスベクターは、がん細胞検出用の発現カセットを有する。がん細胞検出用の発現カセットは、対象となる細胞内での遺伝子発現により当該細胞を検出可能な当業者に周知の導入遺伝子であれば限定されない。がん細胞検出用の遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ遺伝子、ＤｓＲＥＤ、ＲＦＰ等の発現カセットを挙げることができる。これにより、アデノウイルスベクターが選択的に導入されたがん細胞内で検出用の導入遺伝子が発現し、がん細胞を選択的に検出することが可能となる。
がんの診断薬の投与量等の方法については、投与対象に応じて当業者が適宜設定することができる。
【００５５】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００５６】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００５７】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００５８】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００５９】
（実施例１：ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓの合成）
Ｉ．ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓ  ｃＤＮＡの合成
Ｎ末端側よりＣＡＲ細胞外ドメイン（ｅｘＣＡＲ）と、がん細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）と、タンパク質精製のための配列（ＨＡ−６Ｈｉｓ  ｔａｇあるいはＭｙｃ−６Ｈｉｓ  ｔａｇ）とを有するアダプターペプチドのｃＤＮＡ配列を合成した。
なお、がん細胞膜透過性ペプチドとして、ポリアルギニン（１１Ｒ）、ポリアルギニン（７Ｒ）とインテグリン結合モチーフ（ＲＧＤ）７回繰り返し配列の下流に７残基のアルギニンとを組み合わせた７ＲＧＤ−７Ｒ、大腸がん細胞膜選択的細胞透過性ペプチドＣＰＰ２、固形癌細胞膜選択的細胞透過性ペプチドＣＰＰ１０、あるいは白血病／肝臓がん細胞膜選択的細胞透過性ペプチドＣＰＰ４４を用いた。各がん細胞膜透過性ペプチドを有するポリペプチド（ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓ）を、それぞれ、ｅｘＣＡＲ−１１Ｒ（図４、配列番号１２）、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ（図５、配列番号１４）、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ２（図６、配列番号１６）、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０（図７、配列番号１８）、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ４４（図８、配列番号２０）と表記する。また、これらのポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１に相当する。
【００６０】
まず、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡを以下のようにして作製した。
ヒトｅｘＣＡＲ−１１Ｒに用いるＣＡＲ細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡは、ヒト表皮角化細胞のｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応により獲得した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーペアは以下の通りである。
【００６１】
<ｅｘＣＡＲ−１１Ｒ用ｅｘＣＡＲ増幅プライマー>
・フォワードプライマー（配列番号６２）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣ  −３’
・リバースプライマー（配列番号６３）
３’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＴＴＴ−５’
【００６２】
次に、ＣＰＰ配列を含むｃＤＮＡ（１１Ｒ用人工合成ｃＤＮＡ）（図９、配列番号６４）を人工的に合成した。そして、ＰＣＲにより得られたＣＡＲ細胞外ドメインのｃＤＮＡを、ＣＰＰ配列を含むｃＤＮＡ（１１Ｒ用人工合成ｃＤＮＡ）と同一の制限酵素部位（ＢａｍＨＩ）を利用して結合させることで、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡ配列（配列番号１３）を構築した。
【００６３】
また、ヒトｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７ＲのｃＤＮＡ配列は以下のようにして作製した。
ヒトｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒに用いるＣＡＲ細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡは、ヒト表皮角化細胞のｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応により獲得した。ＰＣＲ反応に用いたプライマーペアは以下の通りである。
【００６４】
<ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ用ｅｘＣＡＲ増幅プライマー>
・フォワードプライマー
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＣＧＴＧＣ  （配列番号６５）−３’
・リバースプライマー
３’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＴＴＴ  （配列番号６６）−５’
【００６５】
次に、ＣＰＰ配列を含むｃＤＮＡ（７ＲＧＤ−７Ｒ用人工合成ｃＤＮＡ）（図１０、配列番号６７）を人工的に合成した。そして、ＰＣＲにより得られたｅｘＣＡＲ  ｃＤＮＡを、ＣＰＰ配列を含むｃＤＮＡ（７ＲＧＤ−７Ｒ用人工合成ｃＤＮＡ）と同一の制限酵素部位（ＸｈｏＩ）を利用して結合させることで、ヒトｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７ＲのｃＤＮＡ配列（配列番号１５）を構築した。
【００６６】
また、ヒトｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ２のｃＤＮＡは、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡを基に作製した。すなわち、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡが挿入されたベクターから１１Ｒ配列を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化することにより切り出し、代わりにＣＰＰ２に対応するオリゴＤＮＡ（配列番号６８）を挿入することにより取得した。なお、ＣＰＰ２に対応するオリゴＤＮＡは、フォワード鎖オリゴＤＮＡ１００  μＭ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解）とリバース鎖オリゴＤＮＡ１００  μＭ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解）を等量混合し（最終濃度５０  μＭ）、両オリゴＤＮＡのアニーリング（９５℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  ２ｍｉｎ、３７℃  ２ｍｉｎ、２５℃  ２ｍｉｎ）を行うことにより調製した。オリゴＤＮＡペアは以下の通りである。
【００６７】
<ＣＰＰ２用オリゴＤＮＡ>
・フォワード鎖オリゴＤＮＡ
５’−ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＡＧＴＴＣＴＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＧＣ  −３’（配列番号６９）
・リバース鎖オリゴＤＮＡ
３’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＴＣＴＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＣＧ  −５’  （配列番号７０）
【００６８】
また、ヒトｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０のｃＤＮＡも、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡが挿入されたベクターから作製した。すなわち、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡが挿入されたベクターから、１１Ｒ配列を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化することにより切り出し、代わりにＣＰＰ１０に対応するオリゴＤＮＡ（配列番号７１を挿入することにより取得した。なお、ＣＰＰ１０に対応するオリゴＤＮＡはフォワード鎖オリゴＤＮＡ１００  μＭ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解）とリバースプライマー１００  μＭ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解）を等量混合し（最終濃度５０  μＭ）、両プライマーのアニーリング（９５℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  ２ｍｉｎ、３７℃  ２ｍｉｎ、２５℃  ２ｍｉｎ）を行うことにより調製した。オリゴＤＮＡペアは以下の通りである。
【００６９】
<ＣＰＰ１０用オリゴＤＮＡ>
・フォワード鎖オリゴＤＮＡ
５’−ＧＡＴＣＣＧＣＧＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＧＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣ  −３’  （配列番号７２）
・リバース鎖オリゴＤＮＡ
３’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＣＧＣＧ  −５’  （配列番号７３）
【００７０】
また、ヒトｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ４４のｃＤＮＡも、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡが挿入されたベクターから作製した。すなわち、ヒトｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡが挿入されたベクターから１１Ｒ配列を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化することにより切り出し、代わりにＣＰＰ４４に対応するオリゴＤＮＡ（配列番号７４）を挿入することにより取得した。なお、ＣＰＰ４４に対応するオリゴＤＮＡはフォワード鎖オリゴＤＮＡ１００μＭ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解）とリバース鎖オリゴＤＮＡ１００μＭ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解）を等量混合し（最終濃度５０μＭ）、両プライマーのアニーリング（９５℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  ２ｍｉｎ、３７℃  ２ｍｉｎ、２５℃  ２ｍｉｎ）を行うことにより調製した。オリゴＤＮＡペアは以下の通りである。
【００７１】
<ＣＰＰ４４用オリゴＤＮＡ>
・フォワード鎖オリゴＤＮＡ
５’−ＧＡＴＣＣＧＣＧＡＡＡＣＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＣＧＡＴＴＣＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＡＡＴＧＡＡＧＣＣＧＣ  −３’  （配列番号７５）
・リバース鎖オリゴＤＮＡ
３’−ＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＴＴＧＧＧＴＴＣＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＧＡＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＣＧＴＴＴＣＧＣＧ  −５’  （配列番号７６）
【００７２】
ＩＩ．ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓ発現コンストラクト
ＣＭＶイントロンプロモーター（ＣＭＶｉ）を導入したＰＤＮＲ１ｒベクター（プロモーターレスドナーベクター；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を構築した。ＣＭＶｉの下流に、上記で合成した５つのヒトｅｘＣＡＲ−ＣＰＰのｃＤＮＡ配列を挿入した。なお、ｅｘＣＡＲ−１１ＲのｃＤＮＡ配列（配列番号１３）をそれぞれ挿入したベクターを、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−１１Ｒとする。その他、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ２、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０、または、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ４４をコードするｃＤＮＡ（配列番号１５、１７、１９、および、２１）を挿入したベクターを、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ２、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ４４とする。
また、対照として、ＣＰＰ細胞外ドメインの代わりに、ＥＧＦをｅｘＣＡＲと融合したｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを使用した。そのため、このｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ（配列番号７７）をコードするｃＤＮＡ（配列番号７８）を構築し、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを発現させるためのｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを構築した。なお、各挿入ｃＤＮＡの塩基配列は、ＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。
【００７３】
ＩＩＩ．ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓの精製
ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−１１Ｒ、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ２、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０、または、ｐＣＭＶｉ−ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを、ＦｕＧＥＮＥ−ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）トランスフェクション試薬を用いてＬｅｎｔｉ−ＸＴＭ  ２９３Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社  ｃａｔ  ｎｏ．６３２１８０）に導入した。遺伝子を導入後、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて２４時間培養した。その後、細胞を培養する培地を無血清培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２（フェノールレッドを含まない）に置換し、３日後に全培養上清を回収した。培養上清中の目的の組み換えタンパク質は、それぞれＨｉｓ  ｔａｇｇｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（ＭＢＬ社）を用い、製品添付のプロトコルに従って回収、精製した。
【００７４】
ＩＶ．精製したｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析
上記操作により精製されたｅｘＣＡＲ−１１Ｒ、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ２、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦの精製度を確認した。具体的には、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１０％）を行い、泳動後のゲルをＣＢＢ染色した。その結果を図１１に示す。図１１に示す通り、精製タンパク質はいずれも単一バンドとして確認された。
【００７５】
（実施例２：ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターの構築）
ＧＦＰ発現組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ：Ｔｙｐｅ５  Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ、ＶＥＣＴＯＲ  ＢＩＯＬＡＢＳ社）の２ｘ１０５ＰＦＵと実施例１にて合成したｅｘＣＡＲ−１１Ｒ、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ、または、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０の０．１ｕｇをＰＢＳ１００ｕｌ内で混合した。混合液を室温で１５分放置することで、結合反応を終了させた。これにより、ＰＢＳ溶液内に、アデノウイルスベクターとｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓとの複合体（ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰｓ／Ａｄ−ＧＦＰ）を得た。
【００７６】
（実施例３：ＣＡＲ低発現の細胞に対するｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける導入効率について）
本発明のｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターが、ＣＡＲ低発現の細胞に対しても高い効率で導入できるかどうかを確かめた。ＣＡＲ低発現細胞として、３種類の悪性腫瘍（胃がん細胞株ＭＫＮ２８、乳癌細胞株ＭＣＦ−７、および、高悪性度脳腫瘍細胞株Ｔ９８）を比較検定のモデルとして用いた。そして、これらの細胞にｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターを導入させた。これらの悪性腫瘍を構成する細胞は、図１２に示すように、アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現が低い（アデノウイルス低感受性腫瘍細胞）。よって、従来のアデノウイルスベクターの導入方法では、これらの悪性腫瘍に対するがん治療用アデノウイルスベクターの導入は困難であった。
【００７７】
実施例１により作成したｅｘＣＡＲ−１１ＲあるいはｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒの１ｎｇとＧＦＰアデノウイルスベクター（４×１０５ＰＦＵ）を１５分間ＰＢＳ溶液内で混和した。混和後、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるＧＦＰアデノウイルスベクター（ｅｘＣＡＲ−１１Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰまたはｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰ）（用量１Ｍ．Ｏ．Ｉ）を、上記の各アデノルイス低感受性腫瘍細胞（４×１０５個）に感作させた。また、対照として、アダプタータンパクを有さないアデノウイルスベクターを単独で投与した。ウイルス感作より２４時間後、デリバリーされた目的遺伝子（緑色蛍光タンパク質：ＧＦＰ）の各細胞内における発現を蛍光顕微鏡により観察し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて解析した（図１３）。その結果、ｅｘＣＡＲ−１１ＲまたはｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを有するアデノウイルスベクターを感作させた場合では、ほぼ全腫瘍細胞（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙによる解析では９９％以上の腫瘍細胞）でＧＦＰの均一な蛍光を観察できた（図１３）。すなわち、導入遺伝子の導入頻度が９９％以上であった。さらに、ｅｘＣＡＲ−１１Ｒを備えるアデノウイルスベクターは、アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクターと比較して、蛍光を有する細胞における蛍光強度が約４〜１１倍の増強効果を示した。また、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えるアデノウイルスベクターは、アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクターと比較して、約７〜１８倍の発現増強効果を示した（図１４）。
【００７８】
また、ｅｘＣＡＲ−１１Ｒを備えたアデノウイルスベクター（ｅｘＣＡＲ−１１Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰ）の導入による遺伝子導入効率についての増幅率は、アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクターの導入と比較した場合に、下記のような値を示した。
胃がん細胞株ＭＫＮ２８：（９９．９／４）×（１６９．４２／４１．０）＝１０３倍
乳がん細胞株ＭＣＦ−７：（９９．９／３）×（８７４．８２／７９．３１）＝３６７倍
高悪性度嚢腫瘍細胞株Ｔ９８：（９９．９／３７）×（１１３４．７５／２４３．７６）＝１３倍
なお、上記の増幅率の計算は、下記のようにして行った。
（ｅｘＣＡＲ−１１Ｒを備えたアデノウイルスベクター導入によるＧＦＰ遺伝子導入頻度／アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクター導入によるＧＦＰ遺伝子導入頻度）×（ｅｘＣＡＲ−１１Ｒを備えたアデノウイルスベクター導入による各がん細胞株の個細胞あたりの蛍光強度／アダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクター導入による個細胞あたりの蛍光強度）＝従来法に対する増幅率
【００７９】
同様に、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えたアデノウイルスベクター（ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰ）の遺伝子導入効率についての増幅率は、従来のアダプタータンパクを備えていないアデノウイルスベクターの導入法と比較した場合に、下記のような値を示した。
胃がん細胞株ＭＫＮ２８：（９９．９／４）×（２９６．５９／４１．０）＝１８１倍
乳がん細胞株ＭＣＦ−７：（９９．９／３）×（１３９３．０８／７９．３１）＝５８５倍
高悪性度嚢腫瘍細胞株Ｔ９８：（９９．９／３７）×（１８６７．６４／２４３．７６）＝２１倍
【００８０】
（実施例４：マウス癌性腹膜炎モデルにおけるｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターのがん細胞に対する選択的な導入について）
マウス癌性腹膜炎モデルにおいて、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターが、実際にがん細胞に対して選択的に導入されるのか、検証した。
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに対して胃がん細胞株ＭＫＮ２８（１ｘ１０６個）を腹腔内に移植し、アデノウイルス低感受性であるヒト胃癌腹腔播種モデルマウスを作成した。胃がん細胞播種後３０日目に、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えるＧＦＰアデノウイルスベクター（１×１０６  ｖｉｒｉｏｎ）をヒト胃癌腹腔播種モデルマウスの腹腔内へ注射した。なお、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えるＧＦＰアデノウイルスベクターは、実施例１と同様に、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ（３ｕｇ）とＧＦＰアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）（１×１０６  ＰＦＵとを１５分間ＰＢＳ溶液内で混和することにより作製した。また、対照として、アダプターペプチドを備えていないＧＦＰアデノウイルスベクター（１×１０６  ｖｉｒｉｏｎ）をヒト胃癌腹腔播種モデルマウスの腹腔内へ注射した。腹腔内投与から２４時間後に開腹し、各臓器を摘出した。摘出した各臓器におけるＧＦＰ遺伝子の発現を蛍光実体顕微鏡下で観察し、写真撮影を行った。また、各臓器におけるＧＦＰ遺伝子発現について、アダプタータンパクを有さないＧＦＰアデノウイルスベクターを投与した場合と比較した。
【００８１】
その結果、アダプタータンパクを備えていないＧＦＰウイルスの導入では、がんの転移巣におけるＧＦＰの緑色蛍光は検出されなかった（図１５Ｂの左図）。しかしながら、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えたＧＦＰアデノウイルスベクター（ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＦ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰ）を投与したモデルマウス個体では、網羅的かつ明瞭に多発性転位がん病巣が緑色蛍光を発しているのが認められた（図１５Ｂの右図）。なお、図１５中の矢印は、胃周囲におけるがん組織の多発転位巣を示す。また、背景の正常組織（脾臓・大網・胃）においては、緑色蛍光は観察されなかった。このように、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えたＧＦＰアデノウイルスベクターを投与したモデルマウス個体では、がん細胞において有意な蛍光の分布が限局的に観察された。すなわち、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えたＧＦＰアデノウイルスベクターが、がん細胞に対して選択的に導入され、導入遺伝子を発現できたことが示された。
【００８２】
（実施例５：ヒト胃癌腹腔播種モデルマウスにおける生体内におけるｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターの胃がん細胞の選択的な導入について）
がん細胞膜透過性ペプチドとして、胃がん細胞に選択的に高効率で透過性を示すＣＰＰ１０を用いてｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０を作成した。ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０を備えるＧＦＰアデノウイルスベクター（ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０／Ａｄ−ＧＦＰ）の作製は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。また、投与対象として、実施例４と同様にして作成したヒト胃癌腹腔播種モデルマウスを用いた。モデルマウスの腹腔内に、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０を備えるＧＦＰアデノウイルスベクターを含むＰＢＳ溶液を、投与した。投与後４８時間目にモデルマウスを解剖した。モデルマウスより腫瘍組織及び各臓器を摘出し、腫瘍組織及び各臓器におけるＧＦＰの発現の有無について、蛍光実体顕微鏡を用いて観察し写真撮影を行った。その結果、モデルマウス体内で発育したヒト胃がん腫瘍組織に対してのみ、ＧＦＰ蛍光の集積が認められた（図１６）。一方で、モデルマウス体内の正常臓器においては、腫瘍組織と比較してＧＦＰの蛍光が極端に低かった（図１６）。
【００８３】
（実施例６：腫瘍組織および腫瘍外正常組織における導入目的遺伝子の発現の定量的比較）
本発明のｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えるアデノウイルスベクターによる導入遺伝子の標的組織選択的な発現効率をウイエスタンブロット法により解析した。解析に用いる試料として、実施例４および実施例５におけるヒト胃癌腹腔播種モデルマウスより採取した各臓器および腫瘍組織を用いた。発現解析は、摘出した臓器および腫瘍組織をＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒで溶解し、ウサギ抗ＧＦＰ抗体でイムノブロットを実施することで、各組織におけるＧＦＰタンパク発現量を検出した。なお、ブロットしたタンパク量の基準として抗アクチン抗体を使用した結果を対照とした。
その結果、図１７および図１８に示すように、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７ＲおよびｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０のいずれのポリペプチドを用いた場合もＧＦＰタンパク発現は腫瘍に強く認められた。一方で、他の正常臓器（心、肺、肝、腎、胃、小腸、卵巣）での発現量は有意に低かった。
【００８４】
（実施例７：ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ２８に対するアデノウイルスベクター導入におけるｅｘＣＡＲ−ＣＰＰ１０の導入効率の比較）
ｅｘＣＡＲを用いた既存のアデノウイルスベクターデリバリー技術のアダプタータンパクとして使用されるｅｘＣＡＲ−ＥＧＦと、本発明に係るポリペプチドの一態様であるｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒとのアデノウイルスベクター導入効率に関する性能比較を行った。なお、ＥＧＦ受容体は、がん細胞において発現上昇することが知られている。そして、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦは、増加したＥＧＦ受容体へ結合することによりアデノウイルスベクターをがん細胞へデリバリーさせる既存技術のアダプタータンパクである。既存のアデノウイルスベクターデリバリー技術にならい、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦとＡｄ−ＧＦＰ（４ｘ１０５ＰＦＵ）とを混和させることにより、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦを備えたアデノウイルスベクター（ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ／Ａｄ−ＧＦＰ）を作製した。また、本発明に係るポリペプチドの一態様であるｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７ＲとＡｄ−ＧＦＰ（４ｘ１０５ＰＦＵ）とを混和させることにより、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えたアデノウイルスベクター（ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰ）を作製した。アデノウイルス低感受性の胃がん細胞株ＭＫＮ２８細胞（２ｘ１０５個）に対して、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ／Ａｄ−ＧＦＰまたはｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰを添加し、４８時間培養を継続した。４８時間後にｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ用蛍光顕微鏡でＧＦＰの発現を観察し、導入遺伝子の導入頻度を比較した（図１９Ａ、Ｂ、Ｃ）。さらに導入細胞についてフローサイトメトリー解析を行い、細胞１個あたりのＧＦＰの平均蛍光強度を算出することで、タンパク発現量についても比較を行った（図２０）。
【００８５】
ＧＦＰが検出された胃がん細胞の数を算出したところ、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを備えたウイルスを反応させた場合（図１９Ｃ）では、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦとウイルスを同条件下で反応させた場合（図１９Ｂ）と比べて導入頻度が約５倍多かった。次に、ウイルス導入のない細胞の蛍光強度を１．０として単一細胞における蛍光強度（遺伝子発現量）を比較したところ、ウイルスのみ導入した細胞では蛍光強度は２．１倍であった。また、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ／Ａｄ−ＧＦＰを導入した場合では２．５９倍であり、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰを導入した場合は６．６倍となった。ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ／Ａｄ−ＧＦＰとｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰとを比較した場合、単一細胞当たりでｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰはｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ／Ａｄ−ＧＦＰの約２．５倍の遺伝子発現量の増強が見られた。
【００８６】
遺伝子導入効率の増幅率を、実施例３に記載の計算式と同様にして評価した場合、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰは、ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ／Ａｄ−ＧＦＰの約５×２．５＝１２．５倍の効率向上が認められた。このように、ｅｘＣＡＲ−ＣＰＰを備えたアデノウイルスベクターは、先行技術よりも高い目的とする効果を達成できることが明らかとなった。
【００８７】
（実施例８：ヒト高増殖性繊維芽細胞に対するアデノウイルスベクターデリバリーにおけるアダプタータンパクによる導入効率の比較）
ｂａｓｉｃＦＧＦ＋ＥＧＦ添加培地で増殖刺激をしたヒト正常線維芽細胞ＮＨＤＦに対してアデノウイルスベクターを導入させた際の、アダプタータンパク（ｅｘＣＡＲ−ＥＧＦまたはｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒ）の違いによる導入頻度の比較をした。実験手法および解析方法は、実施例７と同様の方法により行った。
【００８８】
アダプタータンパクを備えていないＧＦＰアデノウイルスベクター（図２１Ａ）および既存のアダプタータンパクを備えたｅｘＣＡＲ−ＥＧＦ／Ａｄ−ＧＦＰ（図２１Ｂ）に比較して、ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−Ｒ／Ａｄ−ＧＦＰ（図２１Ｃ）は、ＧＦＰ遺伝子導入頻度（ＧＦＰ陽性細胞数）および個細胞あたりの目的遺伝子発現量（ＧＦＰ蛍光強度）が顕著に増強されていた。ｅｘＣＡＲ−７ＲＧＤ−７Ｒを用いたウイルスデリバリーシステムは、高増殖活性を示す線維芽細胞の増殖制御を目的とする場合、従来法に大きく優る有用性が示唆された。
【図９】
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【図１０】
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【図２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【配列表】
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