(57)【要約】      （修正有）【課題】心疾患に対する治療剤として有効な候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】刺激によって発する蛍光の波長が変化するイシサンゴ由来のＫａｅｄｅ蛋白質を、心筋細胞特異的に発現させた魚類を用い、該魚類の心臓に再生可能な損傷を加えた後に、心疾患治療剤候補化合物を与えて、再生した損傷部位を可視化し再生の程度を定量化する事により、該治療薬をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激によって発光波長が変化する蛋白質を心筋細胞特異的に発現させた魚類を用いた、心疾患治療薬のスクリーニング方法
【請求項２】
前記蛋白質がＫａｅｄｅである、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法
【請求項３】
前記魚類が、ゼブラフィッシュ又はメダカである、請求項１または２に記載のスクリーニング方法
【請求項４】
前記心疾患が虚血性心疾患又は心筋症である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心疾患治療薬のスクリーニング方法に関する
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞など虚血性の心疾患は社会的にも多くの関心を集めている。ヒトを初め、哺乳動物の心筋は損傷を受けた後に再生しない為、一般に虚血性心疾患の予後は悪く、生活の質も低下しがちである。
【０００３】
いわゆる再生医療的技術がこの問題の解決に寄与すると期待されている。主なものには壊死した心筋を他の細胞（例えば間葉系幹細胞や骨格筋細胞など）で置換し心筋に分化させようとするものがある。
心筋再生医療には今後心筋の再生過程を制御する上で心筋細胞の再生を促進したり抑制したりする薬剤の開発がなされると考えられており、実際いくつかの薬剤が候補として報告されている。これらの薬剤の効果を判定する上でげっ歯類などのモデル動物が用いられている。例えば非特許文献1においては冠動脈を結紮したラット心臓に培養心筋細胞を移植
する際に、ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞増殖因子）を加えることによって心臓機能の改善や瘢痕(ｓｃａｒ)部への培養心筋細胞の生着を促すことに成功している。
【０００４】
また、非特許文献５において、ＭＡＰＫファミリーに属するp38蛋白質の阻害剤が、Ｆ
ＧＦ−１と協調的に心筋梗塞モデルラットに対して有効に働くことが示唆されているが、これらの蛋白質群は様々な生体現象に関与するシグナル分子であり、薬剤の候補化合物として使用しても、副作用が生じる可能性も高いことは否めない。従って、心疾患に対して効果的な薬剤の開発のために、より確実性の高いスクリーニング系の開発が求められている。
【０００５】
しかしながら、哺乳動物は天然でほとんどあるいは全く心筋再生せず、げっ歯類でしばしば行われる冠動脈結紮実験などを用いても心筋再生の定量的解析は達成されていない。心筋再生の評価は結紮後の心臓機能の回復や心筋細胞における細胞周期やDNA複製の観察
といった間接的な評価法に留まり、高感度の心筋再生評価は著しく困難である。また、げっ歯類の冠動脈結紮実験は熟練した技術を必要とし、実験者の技量によって実験結果が容易に異なり得る為、異なる実験者による実験結果の単純な比較が行ないにくく、信頼性や再現性に問題がある。加えて、半定量的な心筋再生実験も、統計上の有意差を出す為には多くの動物を必要とするなど心筋再生の研究には様々な困難が伴っている。
【０００６】
生物学的実験におけるモデル動物として多用されるゼブラフィッシュは、哺乳動物とは異なり、損傷した心臓が再生することが知られている（非特許文献２）。一方で近年のバイオテクノロジー技術の進歩により、ある一定のエネルギーを吸収することで、自らが発光する光の波長を変化させることのできる分枝の開発が進んでいる。例えばＫａｅｄｅ蛋白質は、特定の紫外線をエネルギーにして、通常自らが発光する緑色帯の蛍光を、赤色帯の蛍光に変化させることができる。このような蛋白質を用いることによって、様々な生体現象を解析することに成功している。
【０００７】
さらに、上記のＫａｅｄｅ蛋白質を非特許文献３に記載の心筋細胞において特異的に作動するプロモーターの下で発現させたトランスジェニックゼブラフィッシュが作製されているが（非特許文献４）、本文献においては心筋細胞のゼブラフィッシュの発生初期の心臓の形態形成の研究に用いられているのみであり、心疾患に対する薬剤の、有効成分となりえる候補化合物のスクリーニングについて、何ら示唆されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Prevascularization with gelatin microspheres containing basic fibroblast growth factor enhances the benefits of cardiomyocyte transplantation.Sakakibara Y, Nishimura K, Tambara K, Yamamoto M, Lu F, Tabata Y, Komeda M.J Thorac Cardiovasc Surg. 2002 Jul;124(1):50-6.PMID: 12091808
【非特許文献２】A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.Lepilina A, Coon AN, Kikuchi K, Holdway JE, Roberts RW, Burns CG, Poss KD.Cell. 2006 Nov 3;127(3):607-19.PMID: 17081981
【非特許文献３】Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.Huang CJ, Tu CT, Hsiao CD, Hsieh FJ, Tsai HJ.Dev Dyn. 2003 Sep;228(1):30-40.PMID: 12950077
【非特許文献４】Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.de Pater E, Clijsters L, Marques SR, Lin YF, Garavito-Aguilar ZV, Yelon D, Bakkers J.Development. 2009 May;136(10):1633-41.PMID: 19395641
【非特許文献５】FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction.Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct 17;103(42):15546-51. Epub 2006 Oct 10.Engel FB, Hsieh PC, Lee RT, Keating MT.PMID: 17032753
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主な目的は、心疾患に対する治療剤として有効な候補化合物をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、上述の課題に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定のエネルギーを吸収することによって、発する光の波長が変化する蛋白質を、心筋細胞特異的に発現させた魚類を用いることで、該魚類の心臓に対して致死に至らしめることのない、再生可能な損傷を加えた後に、再生した損傷部位を可視化することに成功し、さらに再生の程度を定量化することに成功した。
【００１１】
本発明は、係る知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様の発明を包含する。
【００１２】
項１  刺激によって発光波長が変化する蛋白質を心筋細胞特異的に発現させた魚類を用いた、心疾患治療薬のスクリーニング方法
項２  前記蛋白質がＫａｅｄｅである、上記項１又は２に記載のスクリーニング方法
項３  前記魚類が、ゼブラフィッシュ又はメダカである、請求項１または２に記載のスクリーニング方法
項４  前記心疾患が虚血性心疾患又は心筋症である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のスクリーニング方法
【発明の効果】
【００１３】
心疾患に対する薬剤の有効成分となる候補化合物を、予め心臓に損傷を与えた、本発明のゼブラフィッシュ個体に用いることによって、該損傷部位にあって緑色蛍光のみを発現する細胞数を計測することにより心筋の再生度合いを再現性良く定量化できる。これを利
用することで、下記実施例のｂＦＧＦで例示したように、哺乳動物においても心筋再生を促進可能する候補薬剤は、本発明におけるゼブラフィッシュの赤色変色、損傷処理後に候補薬剤を飼育水に加えたり個体の胸腔内に注射し一定時間後に緑色蛍光のみを有する細胞が対照群に対して優位に増加する性質をもつものとしてスクリーニング可能となる。
【００１４】
ヒトに対して有用な薬剤が、ゼブラフィッシュ、メダカ等の小型魚類においても機能する例は多く報告されており、既に小型魚類を用いてヒト薬剤の薬理特性や副作用を検討する製薬会社も存在している。従って本発明の方法を用いることにより、単に小型魚類に限らず、ヒトを初めとする哺乳動物の心筋再生制御に関わる薬剤のスクリーニングすることが可能となる。
【００１５】
さらに、既に候補化合物として挙げられる化合物の、様々な有用性を確認することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】トランスジーンの模式図
【図２】トランスジーンの挿入された、ｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュ稚魚
【図３】ｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュ稚魚心臓のＵＶ照射による変色
【図４】ｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュ成魚の開胸手術とＵＶ照射による心臓の変色
【図５】変色後の心筋損傷の再生像
【図６】心筋再生時の新生心筋細胞数の定量
【図７】心筋再生阻害剤処理による心筋再生への影響
【図８】心筋再生促進剤処理による心筋再生への影響
【発明を実施するための形態】
【００１７】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis，” Molecular Cloning A Laboratory Manual ”， Cold Spring Harbor Laboratory Press， New
York， 2001; Ausubel, F. M. et al. ” Current Protocols in Molecular Biology ”, John Wiley & Sons, New   York, N. Y, 2007等に記載されている。
〔本発明の魚類について〕
本発明の魚類は心臓の再生能を有する魚類であれば、特に限定されることは無いが、一般的に生物実験におけるモデル動物として扱い易い魚類が好ましく、例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ等を挙げることができる。好ましくはゼブラフィッシュである。
【００１８】
本発明の蛋白質とは、刺激によって自らが発する光が変化するものである。刺激とは、魚類内部にて発現する蛋白質に対して、刺激効果を与えうるものであれば得に限定はされないが、例えば、光、熱、力学的、超音波、電気、磁気、化学物質による刺激などが挙げられ、魚類の心臓における従来の働きなど、生体そのものに影響を与えないことを勘案して、光による外部刺激が好ましい。特に、紫外光による刺激が好ましく、３５０〜４１０ｎｍの紫外光が最も好ましい。
【００１９】
本発明の蛋白質は、上記の刺激に応答して自らが発光する蛍光波長を変化させ得るものであれば特に限定はされない。具体的にはイシサンゴ（Ｔｒａｃｈｙｐｈｙｌｌｉａ  ｇ
ｅｏｆｆｒｏｙｉ）由来のＫａｅｄｅが好ましい。上記のＫａｅｄｅは、（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．  ＡＢ０８５６４１）に示す遺伝子配列によってコードされるアミノ酸を含む蛋白質である。
【００２０】
上述のＫａｅｄｅは、未処理の場合は、通常５１８ｎｍ付近の励起光を発し、ここで３５０〜４１０ｎｍ程度の紫外光を照射することによって、５８２ｎｍ付近の励起光を発する。すなわち、紫外光という外部刺激を受けることによって、励起光の波長を変化させる蛋白質である。
【００２１】
上述の魚類に対して、上述の蛋白質を心筋細胞特異的に発現させる方法としては、公知のトランスジェニック動物の作製法に従えば、当業者であれば容易に作製することが可能である。具体的には、心筋細胞特異的にタンパク質を発現させるために、心筋細胞において特異的に働くプロモーター配列の下流に、上述のタンパク質をコードする遺伝子配列を繋いで作成した遺伝子カセットを、魚類個体の１−２細胞期の細胞に顕微注射することによって作成されるキメラ個体を育種し、安定的に前記の遺伝子カセットを発現する魚類個体を選抜することによって作製することができる。
【００２２】
上述の心筋細胞にて特異的に働くプロモーターの例としては、ｍｌｃ２ａ、CARP (cardiac ankyrin repeat protein)、ｃTnT(Cardiac troponin T)等を挙げることができるが、特に、ｍｌｃ２ａが好ましい。
〔本発明のスクリーニング方法〕
本発明のスクリーニング方法は、上述した魚類を用いて行うことができ、上述した本発明の魚類は、正常時に心筋細胞内にて特異的に発現している蛋白質が発する蛍光の波長を、刺激を与えることによって変化させることができる。その後、変化をさせた蛋白質を含む心臓の部位に損傷を与えることによって、心臓組織の一部分を欠損させる。本発明の魚類は、心臓組織が欠損したとしても、一定期間経過後には再生されるので、心臓の欠損部位は上述の蛋白質と共に再生される。
【００２３】
再生した心臓組織は、刺激を与えていない状態の蛋白質を含む心筋細胞が大部分に含まれるので、損傷を与えていない心臓組織の部位と比較して発する蛍光の波長が異なる。従って、上記魚類の心臓に予め刺激を与えて、心臓部位にて発現する蛋白質が発する蛍光を変化させておき、次に心臓の一部に損傷を与え、心疾患治療薬の有効成分となる候補化合物を投与すれば、一定期間経過後に再生する心臓組織の程度を、刺激を与える前の蛋白質が発する蛍光領域を再生して判断することができ、その領域を定量化すれば、各候補化合物の効果を定量的に示すことが可能となる。
【００２４】
本発明における心疾患とは、特には限定されるものではないが、心臓組織が欠落する症状を示し、治療するにあたって心臓組織そのものの再生が求められる疾患が好ましい。具体的には、虚血性心疾患、心筋症、心筋外傷等を挙げることができるが、特に、虚血性心疾患又は心筋症が好ましい。
【００２５】
スクリーニング方法の具体例としては、
（１）上述の魚類の心臓に対して刺激を与え、心筋細胞にて特異的に発現している蛋白質が発する蛍光の波長を変化させる処理を行う工程１、
（２）魚類の心臓に対して、損傷を与える処理を行う工程２、
（３）魚類に対して、候補化合物を投与する工程３、
（４）上記工程１〜３の処理を施した後、一定期間飼育し、魚類の損傷部位を蛍光顕微鏡によって観察する工程４、及び
（５）上記工程４の観察によって得られる顕微鏡写真像を解析し、再生した心臓組織を定量化する工程５、
を含む方法を挙げることができる。
【００２６】
（工程１について）
工程１において与える刺激は、上述したそれぞれの蛋白質が発する蛍光の波長を変化させることができるものであれば、適宜選択することが可能であり、特には限定されないが、特に紫外線などの光による刺激が好ましい。また、刺激を与える時間についても、魚類の生存等に悪影響を与えず、上述の蛋白質が発する蛍光の波長を変化させ得る範囲において適宜設定することができる。例えば、紫外線などの光による刺激の場合、通常１０〜１２０秒程度の刺激を与えることができ、好ましくは３０〜６０秒である。
【００２７】
上記の刺激は、刺激の種類によってそれぞれ適当な方法によって与えることができ、魚類個体に対して外部から与えてもよく、麻酔等の処理の後に開胸して、直接心臓に与えても良い。例えば、透明な体を有する魚類の場合は、光等の刺激を外部から与えることが可能となる。
【００２８】
また、工程１は、下記に詳述する工程２の後に行っても良い。その場合、工程２にて心臓に損傷を与えた部位に上述の刺激を与えることが好ましく、損傷を与えた後は一定期間の飼育をすることなく、連続的に行うことが好ましい。
【００２９】
（工程２について）
工程２において魚類の心臓に損傷を与える方法は、心臓の組織が欠損し、再生を要する状態にすればよい。また、定量的評価の為に再現性良くほぼ同一の損傷が与えられる方法が好ましい。さらに、魚類に対して致死的な損傷を与えることなく、再生可能な程度の損傷であり、再生の程度が容易に観察される方法が好ましい。これらの条件を満たすような損傷を与える方法については特には限定されないが、スクリーニング系の再現性、後に得られる定量データに統計学上の有意差を示せる程度に信頼度の高いデータを採取することに鑑みて、特段熟練した技術を要しない方法が好ましい。
【００３０】
例えば、同一の径を有する針を用いて上記工程１の処理にて変色させた心臓の部位を穿刺する処理を挙げることができる。また、穿刺する部位は、損傷処理によって魚類の生命活動に悪影響を与えない部位が好ましく、例えば心室腹面遠位部に損傷を与えることが好ましい。
【００３１】
工程２は、上記の工程１の後に適当な期間飼育した後に行ってもよく、上記の工程１の後、飼育することなく連続的に行ってもよい。また上述の蛋白質が、上述の工程１と同様の方法によって処理され、既に発する蛍光の波長が変化しているものを別途入手して用いることも可能である。
【００３２】
さらに、工程２は上述のように工程１の後に行ってもよく、下記に詳述する工程３の後に行ってもよい。
【００３３】
（工程３について）
工程３において用いる候補化合物は、特に限定されることは無く、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、または無機化合物等を挙げることができ、それぞれ公知の方法によって作製することが出来る。
【００３４】
上述の候補化合物の投与方法は、特には限定されないが、例えば微小細管等の器具を用いて、直接魚類の胸腔又は腹腔内に投与する方法、魚類を飼育する飼育槽、又は飼育する際に与える餌に上述の候補化合物を含有させて、エラや消化器官を介して投与する方法、物理的な拡散による投与方法等を挙げることができる。上述の候補化合物を使用するにあ
たり、経済的な点を勘案すると、胸腔、又は腹腔内に直接投与する方法が好ましい。
【００３５】
工程３は、上記工程１又は工程２に先だって処理することも可能である。この場合、工程３による処理の後、連続的に工程１及び工程２の処理を行ってもよく、一定期間の飼育の後に行ってもよい。
【００３６】
（工程４について）
工程４では、上記工程１〜３の処理後、一定期間飼育し、例えば、魚類を開胸して心臓を摘出し、蛍光顕微鏡を用いることによって得られる像を解析して、上述の候補化合物の心臓再生に係る効果の有無を判断することができる。
【００３７】
上述の一定期間の飼育とは、心臓の再生効果の有無がより明確となり、且つ有意差を持った信頼度の高い定量的なデータが取得される範囲において、適当な期間であり、通常１０日以上程度であり、好ましくは１４〜３０日程度である。
【００３８】
また、上述の顕微鏡観察については、一定期間の飼育後の魚類に対して開胸処理のみを施し、心臓を摘出することなく蛍光顕微鏡下にて像を取得することも可能である。さらに、上記の魚類が透明な体を有する魚類であれば、開胸処理すら行うことなく、心臓再生効果の有無を蛍光顕微鏡による像から判断することもできる。心臓を摘出しない方法によって蛍光顕微鏡像を取得した場合は、経時的に候補化合物による心臓再生効果を評価することができ、さらに好ましいスクリーニング方法となる。
【００３９】
工程４において用いる蛍光顕微鏡は、通常は生物化学分野にて用いられる蛍光顕微鏡が利用可能であり、上述の蛋白質が発する変化前の蛍光波長と変化後の蛍光波長をそれぞれ検出し得るものであればよい。
【００４０】
（工程５について）
工程５では、上記工程４にて得られた蛍光顕微鏡像を解析することによって、候補化合物の心臓再生効果について定量することができる。具体的には候補化合物の投与後に再生した心筋細胞の数を、上記工程４によって得られた蛍光顕微鏡像から計数することによって、定量化することができる。すなわち、再生した心筋細胞の数が多いほど、候補化合物による効果が高いと判断することができる。なお、上述した細胞数を計数するためには、公知の画像解析ソフトを用いることによって実施できる。
【００４１】
上述の工程１〜５に記載の方法を用いることで、心疾患に対する新規薬剤の有効成分となり得る候補化合物をスクリーニングすることが可能となる。また、既に候補化合物として挙がる化合物の、有用性の検討、投与間隔・期間の検討、他の候補薬剤との併用による効果の検討等を行うことも可能である。
【００４２】
以下に本発明をより詳細に説明する。但し、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでも無い。
【実施例】
【００４３】
トランスジェニックゼブラフィッシュを用いた心筋細胞の再生
ゼブラフィッシュｍｌｃ２ａ蛋白質の上流領域１．６ｋｂ（配列番号１：非特許文献３）の下流に、紫外線照射で変色する蛍光分子Ｋａｅｄｅ（ＭＢＬ， 日本）をコードする
遺伝子を配置した遺伝子カセット（図１）を、ゼブラフィッシュ1-2細胞期の細胞に顕微
注射した。その後、顕微注射したこのキメラゼブラフィッシュ個体から、ゲノムDNAに外
来遺伝子を安定的に取り込んだ子孫を単離した。これを、心臓再生を可視化できるｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュとした。このトランスジェニック
ゼブラフィッシュ個体は心筋細胞のみが緑色の蛍光を呈し、図２に示すように、幼魚期には外部から緑色蛍光を観察できる。
【００４４】
このｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュの幼魚期の心臓に、紫外光（330-385ｎｍ）を照射すると、図３に示すように心筋細胞が緑から赤色に変色す
る。緑色と赤色の蛍光は適当なフィルターを使うことによりそれぞれの蛍光のみを抽出可能であると共に、いわゆるロングパスフィルターを使うことで例えば緑色の蛍光と橙色の蛍光として同時に観察することも可能である。
【００４５】
また、図４に示すようにｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュは成魚においても麻酔後に開胸し紫外線を照射することで照射面を再現性良く緑から赤色に変色可能であるため、ｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュの成魚を用いて心筋再生の定量化実験ならびに、薬剤が及ぼす影響の評価を行なった。０．３２ｍｇ／ｍｌのＴｒｉｃａｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を用いてｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュの成魚を麻酔後、腹部を上にしてスリットを入れたスポンジ内で固定し、ピンセットを用いて開胸した。落射蛍光顕微鏡（ＢＸ６０−ＢＨ２−ＲＦＬ−Ｔ：オリンパス，日本）を用いて心室腹側面の緑色蛍光を発する心筋細胞を赤色蛍光に変色後、蛍光実体顕微鏡下で０．２ｍｍ径のタングステン針（ニラコ，日本）で変色部分に穿刺により損傷を加える。この方法により再現性良く同一の損傷を加えることができる。
【００４６】
損傷後７日後、１４日後、３０日後のｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュ個体をそれぞれ解剖し、心臓を摘出して蛍光顕微鏡（ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００：キーエンス，日本）により蛍光像を観察した。結果を図５に示す。損傷後７日目までは緑色蛍光のみを有する細胞は損傷部位に認められないが、損傷後１４、３０日目では緑色蛍光のみを有する細胞群が損傷部位において明瞭に認められた。これにより、ｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュ個体を用いることによって、心筋再生を可視化することが可能となった。
【００４７】
図６（Ａ）に示すように、再生心筋の緑色蛍光像および赤色蛍光像をそれぞれバンドパスフィルターで別々に撮影し、ＢＺ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（キーエンス日本）を用いて緑色蛍光像を白黒像とし、赤色蛍光像を白黒像にした後明暗を反転させ、両画像を重ね合わせることにより緑色蛍光のみを有する細胞を明瞭な白色像として判別することが出来る。この方法を用いて、図６（Ｂ）に示すように、再生した心筋細胞数を再現性良く計測することが可能となった。
【００４８】
トランスジェニックゼブラフィッシュを用いた心臓再生薬剤のスクリーニング
ゼブラフィッシュの心臓の再生プロセスにおいて必須の役割を担っているＦＧＦＲの阻害剤を用いることで、ｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュの心臓再生効果にどのような影響を与えるか検討した。上記方法によりｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュの心臓を赤色蛍光に変色させた後、タングステン針で損傷後７日目から１４日目の間、１７μＭのＦＧＦＲ阻害剤（ＳＵ５４０２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，米国）を存在下および非存在下でゼブラフィッシュ個体を飼育した。損傷後１４日後、ゼブラフィッシュ個体より心臓を切除、回収し、蛍光顕微鏡下で再生心筋細胞の観察を行なった結果を、図7（Ａ）に示す。
【００４９】
ＦＧＦＲ阻害剤で処理した個体において、損傷領域における緑色蛍光のみを有する細胞群は、対照個体における緑色蛍光のみを有する細胞群に比べて有意に少なく、それぞれ３個体ずつを処理して認められた緑色蛍光のみを有する細胞数は平均で６個（ＦＧＦＲ阻害剤処理）と２１個（対照）であり、心筋再生に及ぼす薬剤の阻害効果を定量的に評価する
ことが可能となった。
【００５０】
また、哺乳動物である心筋梗塞モデルラットで心筋再生課程を促進し得ることが示されているＦＧＦ（特にｂＦＧＦあるいはＦＧＦ−１）が、トランスジェニックゼブラフィッシュを用いることで心筋再生を定量的に解析できるかどうかについて検討した。
【００５１】
上記方法によりｍｌｃ２ａ−ｋａｅｄｅトランスジェニックゼブラフィッシュ心臓を赤色蛍光に変色、タングステン針で損傷後、２日後及び４日後に３０μＭのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ:米国）１μｌをゼブラフィッシュ胸腔内に先端を尖らせた微小ガラス
管（ナリシゲ，日本）を用いて注入した。１４日後、ゼブラフィッシュ個体より心臓を切除、回収し、蛍光顕微鏡下で再生心筋細胞の観察を行なった。結果を図８（Ａ）に示す。
【００５２】
同一の損傷を加えたにも関わらず、ｂＦＧＦを加えた個体においては対照の個体に比べて緑色蛍光のみを有する再生心筋の有意な増加が認められた。顕微鏡観察像から、再生した心筋細胞の数を解析した結果、図８（Ｂ）に示すように。対照群の平均２２個に対し、ｂＦＧＦ投与群の平均は34個であることが判明した。従って、トランスジェニックゼブラフィッシュは、心疾患に対する薬剤の有効成分となる候補化合物を、再現性良く、さらに簡便な方法によってスクリーニングすることが可能となる。また、検定することも可能である。
【００５３】
上記の実施例の結果から、本発明の方法を用いることにより、心疾患に対する薬剤の有効成分となる候補化合物のスクリーニングが可能となる。また、既に候補化合物として挙がる化合物が、心疾患に対して有効な効果を奏するかどうかの確認、化合物の指摘濃度の検討、投与間隔・期間の検討、他の候補化合物と併用可能性の検討等に用いることも可能となる。
【図１】
2013116046.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2013116046.tif 000006
【図６】
2013116046.tif 000007
【図７】
2013116046.tif 000008
【図８】
2013116046.tif 000009
【配列表】
2013116046000001.app