(57)【要約】【課題】従来よりも高温でアルコール発酵が可能な耐熱性セルラーゼ発現形質転換耐熱性酵母の提供を目的とする。【解決手段】耐熱性酵母に耐熱性セルラーゼ発現遺伝子を導入した形質転換酵母。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性酵母に耐熱性セルラーゼ発現遺伝子を導入した形質転換酵母。
【請求項２】
前記耐熱性酵母は、Kluyveromyces marxianusである形質転換酵母。
【請求項３】
セルラーゼ発現プロモーターはタンパク質イヌリナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーター配列遺伝子である請求項１又は２記載の形質転換酵母。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換酵母を用いたエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセルロースを分解し、アルコール発酵を行うことのできる形質転換酵母に関し、特に耐熱性のセルラーゼと耐熱性の酵母を用いることでセルロースの糖化と発酵を高温で同時並行的に行うことができる形質転換酵母に係る。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスを用いたエタノールの生産方法が検討され、一部実用化されている。
代表的なバイオエタノールの製造方法には硫酸処理法と酵素法がある。
硫酸処理法はセルロース系のバイオマスを原料に用いることができ、粉砕し、硫酸にて加水分解をした後に、中和し、酵母を用いて発酵する方法であり、酸を使用するので装置の腐食対策が必要であるのみならず、糖の回収率が低く、処理速度も遅い問題があった。
酵素法は、デンプンを原材料とするものであり、α−アミラーゼでオリゴ糖にした後にグルコアミラーゼと酵母を用いて、糖化・発酵を行う方法であり、酵素活性が弱いため高価な酵素が大量に必要であるのみならず、糖化・発酵に時間がかかり雑菌で汚染されやすく、また、α−アミラーゼ活性は約４０℃前後が高い酵素活性を示すのに対して従来の酵母Saccharomyces属は耐熱性に劣り、約３０℃まで冷却しないと発酵が行えない問題があり、エネルギー的に多くの消費が必要であった。
【０００３】
また、通常、酵母の発酵には炭素源として直接セルロースを用いることができないことから、商業的にはトウモロコシ，サトウキビ等のデンプンが原料として用いられ、食糧との競合が懸念されているので特許文献１にはシロアリ等の木質分解性昆虫由来のセルラーゼを導入した酵母が提案され、非特許文献１には糸状菌のセルラーゼを酵母の細胞表層に付着発現させる技術を開示する。
しかし、これらの文献に開示する方法は、いずれも３０℃の低温で発酵しなければならないものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１７８６７７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】都築  正男他，「セルラーゼ表層提示型発現酵母を用いたセルロース系素材のアルコール発酵」，奈良県工業技術センター研究報告Ｎｏ．３７  ２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来よりも高温でアルコール発酵が可能な耐熱性セルラーゼ発現形質転換耐熱性酵母の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る形質転換酵母は、耐熱性酵母に耐熱性セルラーゼ発現遺伝子を導入したものである。
ここで耐熱性酵母とは、従来の酵母Saccharomyces属が約３０℃の相対的低温でアルコール発酵を行うのに対して少なくとも３２℃以上、好ましくは３５℃以上でアルコール発酵を行うことができる酵母をいう。
このような耐熱性酵母にはKluyveromyces marxianus DMKU3-1042株がある。
これは土壌から分離された耐熱性酵母であり、約４８℃の高温でもアルコール発酵が行われる。
【０００８】
本発明で特徴的なのは、セルラーゼ発現プラスミドの構築に際し、K.marxianusが培養上清に分泌発現するタンパク質イヌリナーゼのプロモーター部分をコードする遺伝子をプロモーターに用いた点にある。
このようなプロモーター及びそのシグナルのＤＮＡはK.marxianusの染色体のＤＮＡをテンプレートにし、ＰＣＲ法によりクローニングすることで得られる。
用いたプライマー及びその塩基配列は次のとおりである。
＜配列番号１＞
INU1p-Hind111-f:
5'-ccaagcttagtagcgttggttttcactgtgccgc-3'
＜配列番号２＞
INU1p-sig-site-BamH1-r:
5'-cccggatccagcactgactcctgccaatg-3'
また、得られたＤＮＡの塩基配列を下記表１に示す。
なお、下記表１は塩基を大文字で示し、シグナル部分を示すタンパク質のアミノ酸を一文字表示し、これをコードする塩基配列を合せて表示した。
なお、詳細については添付配列表に示した。
＜配列番号３＞
【表１】
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【０００９】
このような耐熱性酵母に耐熱性セルラーゼ発現遺伝子を導入することで３２〜４８℃の高温にて、セルロース系バイオマスの糖化とエタノール発酵を同時並行的に行うことができる。
セルラーゼはセルロースをグルコースに分解する酵素をいい、β−グルコシターゼ，エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが協働してセルロースを分解する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る耐熱性セルラーゼ発現遺伝子を耐熱性酵母に導入した形質転換酵母を用いると、木質のセルロース系の原料を炭素源としてアルコール発酵が可能になるために、セルロースの糖化とグルコースのアルコール発酵を高温で同時並行的に行うことができる。
これにより従来に比較して短時間にアルコール発酵が可能になり、その分、コンタミネーション汚染の軽減ができ、従来の糖化工程から発酵工程に至るステップでの冷却工程が不要になるとともに発酵後の蒸留ステップにおける加熱エネルギーの省エネ化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係る形質転換酵母（セルラーゼ発現株）と野性株とのエタノール発生比較を示す。（ａ）膨潤セルロースを炭素源にした３７℃におけるエタノール発生量を示し、（ｂ）は４５℃におけるエタノール発生量を示す。
【図２】イヌリナーゼプロモーター及びそのシグナル配列を組換えたプラスミドの構築図を示す。
【図３】セルロース発現遺伝子として（ａ）β−グルコシターゼ発現遺伝子，（ｂ）セロビオヒドロラーゼ発現遺伝子，（ｃ）エンドグルカナーゼ発現遺伝子を組み込んだプラスミドの構築図を示す。
【図４】セルラーゼ発現ベクターの酵母への導入図を示す。
【図５】本発明に係る形質転換酵母の（ａ）β−グルコシターゼ活性測定結果，（ｂ）エンドグルカナーゼ活性測定結果，（ｃ）セロビオヒドロラーゼ活性測定結果を示す。
【図６】本発明に係る形質転換酵母の膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）の分解活性測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、セルラーゼ発現酵母の作製手順について説明する。
K.marxianusを培養した上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析した結果、イヌリナーゼを多量産生していることが明らかになった。
そこで、K.marxianusの染色体ＤＮＡをテンプレートにして、タンパク質イヌリナーゼを発現する遺伝子をＰＣＲにてクローニングした。
用いたプライマーは下記のとおりである。
＜配列番号１＞
INU1p-Hind111-f:
5'-ccaagcttagtagcgttggttttcactgtgccgc-3'
＜配列番号２＞
INU1p-sig-site-BamH1-r:
5'-cccggatccagcactgactcctgccaatg-3'
このときのプラスミド構築図を図２に示す。
【００１３】
次にセルラーゼ発現遺伝子として、タンパク質，β−グルコシターゼ，エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子を組換えたプラスミドを構築した。
イヌリナーゼプロモーターおよびターミネーター制御下のβ-グルコシダーゼ発現プラスミドpINU1p-BGL1は、プライマーBGL1-BamHI-f およびBGL1-BanII-r を用い、プラスミドpUC19-BGL1を鋳型として増幅させた糸状菌 Thermoascus aurantiacus由来耐熱性β-グルコシダーゼ遺伝子BGL1を制限酵素BamHIとBanIIで処理し同制限酵素で処理したpINU1pへ導入した後、C末端に、プラスミドYEGAp/eng1よりGAPt-BanII-fおよびGAPt-SphI-rにて増幅しBanIIとSphIで処理したDNA断片（GAPt）を導入することによって構築した。
イヌリナーゼプロモーターおよびターミネーター制御下のセロビオヒドロラーゼ発現プラスミドpINU1p-s-CBH1の構築のために、まず糸状菌 Thermoascus aurantiacus由来耐熱性セロビオヒドロラーゼ遺伝子を酵母Kluyveromyces 属発現コドンに最適化した合成遺伝子s-CBH1の作製をタカラバイオ（株）ドラゴンジェノミクスセンターに依頼し取得した。
そのDNA断片s-CBH1をBamHIとBanIIで処理したプラスミドpINU1p-BGL1へ導入することによってpINU1p-s-CBH1を構築した。
イヌリナーゼプロモーターおよびターミネーター制御下のエンドグルカナーゼ発現プラスミドpINU1p-ENG1は、プライマーENG1-BamHI-fおよびGAPt-SphI-rを用い、プラスミドYEGAp/eng1 を鋳型として増幅させた糸状菌 Aspergillus niger 由来エンドグルカナーゼ遺伝子ENG1とGAPtを制限酵素BamHIとSphIで処理し同制限酵素で処理したpINU1p へ導入することによって構築した。
【００１４】
次に上記ベクターを酵母に導入する手順を説明する。
プラスミドpINU1p-BGL1のSphI部位に、pKmURA3Tより制限酵素EcoRIによって切り出したDNA断片URA3を、さらにNarI 部位に、pINU1p-ENG1 よりHindIII とSphI によって切り出したENG1発現カセットを導入し、pINU1p-BGL1-INU1p-ENG1-URA3を構築した。
プラスミドpINU1p-s-CBH1を制限酵素ScaIとBstAPIで処理しENG1発現カセットを導入した後、SphI 部位に、プラスミドpKmTRP1を制限酵素KpnIで処理して得られたDNA断片TRP1を導入し、pINU1p-s-CBH1-INU1p-ENG1-TRP1 を構築した。
プラスミドpINU1p-ENG1のBstAPI部位に、プラスミドpKmLEU2を制限酵素EcoRIで処理して得られたDNA断片LEU2を導入し、pINU1p -ENG1-LEU2を構築した。
以上３つの発現プラスミドを用い、セルラーゼ遺伝子をK. marxianus YHJ010株（ura3 leu2 trp1 derived from K.  marxianus NBRC1777、ウラシル、ロイシン、トリプトファン栄養要求性株）のゲノムへ相同組み換えによって導入した。
形質転換にはエレクトロポレーション法を用い、Gene Pulser Xcell (BioRad)によって0.2-cm cuvette、1.5 kV、25 μF、200 Ωの条件で行った。
まず、pINU1p-BGL1-INU1p-ENG1-URA3を制限酵素SphIで断片化しYHJ010株へ導入、ウラシル要求性によって選抜し、形質転換株CM1を得た。
次にpINU1p-s-CBH1-INU1p-ENG1-TRP1を制限酵素NheIで断片化しCM1株へ導入、トリプトファン要求性によって選抜し、形質転換株CM2を得た。
最後にpINU1p-ENG1-LEU2を制限酵素BstAPIで断片化しCM2株へ導入、ロイシン要求性によって選抜し、形質転換株CM3（セルラーゼ発現酵母）を得た。
【００１５】
上記にて得られたセルラーゼ発現酵母を用いて酵素活性を評価した。
培地としては液体培地ＹＰＤ２を用いた。
３００ｍｌフラスコにＹＰＤ２，３０ｍｌを入れ、酵母培養液３００μｌ加え、１６０ｒｐｍで撹拌しつつ、３７℃で４８時間培養を行った。
培養液を６０℃で１５分間熱処理後に酸素活性を測定した。
酵素活性は、図５に示した各基質に対してｐＨ４．５（１００ｍＭ  citrate phosphate buffer）に調整し、４０℃の温度条件で反応させ測定した。
その結果を図５に示す。
これにより各酵素が発現し、活性を示すことが確認できた。
【００１６】
次にセルロース分解酵素活性を測定した。
上記段落（００１５）と同様に培養した培養液から遠心分離機にて上清を取得し、６０℃×１５分の熱処理後にｐＨ４．５（３０ｍＭ  citrate phosphate buffer）に調整し、膨潤セルロース（ＰＡＳＣ：グルコース当量１４ｍＭ）を加え４０℃で反応させた。
ＤＮＳ法によって還元糖量を測定した結果を図６に示す。
これにより、本発明に係る形質転換酵母は膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）の分解能が高いことが分かる。
【００１７】
＜エタノールの生産＞
上記段落（００１５）と同様の培養液１．５ｍｌ，膨潤セルロース１．５ｍｌ（グルコース当量５０ｍＭ）を合せ全容３．０ｍｌとし、これをＫ２Ｓ  ０．０５％，Tween80  ０．０４２％,Ergosterol  ０．００１％になるように調整した後に、エタノール生産発酵を行った。
そのうち、ｐＨ５．０，３７℃にて反応させた結果を図１（ａ）に示し、ｐＨ５．０，４５℃にて反応させた結果を図１（ｂ）に示す。
この結果、従来よりも高い３７℃及び４５℃にてセルロースを炭素源にしたアルコール発酵が可能になることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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