(57)【要約】【課題】シヌクレイノパチーに対する効果的な医薬組成物、及び、その有効成分のスクリーニング方法を開発する。【解決手段】本発明は、アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物を有効成分として含む、神経変性疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。前記アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物として、アディポネクチンタンパク質と、球状アディポネクチンタンパク質と、アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物と、球状アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物とからなるグループから少なくとも１つが選択される。本発明は、アディポネクチンが関与するα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はリン酸化タウの凝集及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制することに基づく神経変性の抑制及び／又は改善する化合物のスクリーニング方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物を有効成分として含むことを特徴とする、神経変性疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
前記アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物として、アディポネクチンタンパク質と、球状アディポネクチンタンパク質と、アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物と、球状アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物とからなるグループから少なくとも１つが選択されることを特徴とする、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するために用いられることを特徴とする、請求項１又は２の医薬組成物。
【請求項４】
前記アディポネクチン受容体アゴニストの発現を誘導する化合物はペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（ＰＰＡＲ）−γ（ｇａｍｍａ）のアゴニストであることを特徴とする、請求項１ないし３の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（ＰＰＡＲ）−γ（ｇａｍｍａ）のアゴニストはピオグリタゾン塩酸塩であることを特徴とする、請求項４の医薬組成物。
【請求項６】
アディポネクチンが関与するα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はリン酸化タウの凝集及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制することに基づく神経変性の抑制及び／又は改善する化合物のスクリーニング方法。
【請求項７】
ａ）α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現する生物学的材料を用意するステップと、
ｂ）前記生物学的材料と被験化合物とを接触させるステップと、
ｃ）前記生物学的材料由来のアディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、アディポネクチン受容体のタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化タウの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、アディポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、プロテアソーム活性とからなる群から選択される少なくとも１つの測定値を決定するステップと、
ｄ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップと
を含むことを特徴とする、請求項６のスクリーニング方法。
【請求項８】
ａ）α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン発現細胞を用意するステップと、
ｂ）前記細胞に被験化合物を添加し、インキュベーションするステップと、
ｃ）アディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、αシヌクレインの凝集体の量と、アディポネクチン及びαシヌクレインの凝集体の量と、プロテアソーム活性とからなる群から選択される少なくとも１つの測定値を決定するステップと、
ｄ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップと
を含むことを特徴とする、請求項６のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記ステップａ）は、プロテアソーム阻害剤存在下、α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン発現細胞を培養するステップであることを特徴とする、請求項８のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記ステップａ）における前記細胞に、さらに、アディポネクチン及び／又はアディポネクチン受容体のｓｉＲＮＡを導入するステップを含むことを特徴とする、請求項８のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記ステップａ）における前記細胞に、さらに、アディポネクチン及び／又はアディポネクチン受容体のｓｉＲＮＡを導入するステップを含むことを特徴とする、請求項９のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記ステップｃ）の前記リン酸化酵素として、ＡＭＰＫと、リン酸化ＡＭＰＫと、ｐ３８  ＭＡＰＫと、リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫと、ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）と、リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）とからなる群から少なくとも１つが選択されることを特徴とする、請求項８ないし１１のスクリーニング方法。
【請求項１３】
ａ）神経細胞特異的にヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現するトランスジェニック動物より摘出した脳組織と、被験化合物とをインキュベーションするステップと、
ｂ）アディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、アディポネクチン受容体のタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化タウの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、アディポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、プロテアソーム活性とからなる群から選択される少なくとも１つの測定値を決定するステップと、
ｃ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップと
を含むことを特徴とする、請求項６のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ａ）神経細胞特異的にヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現するトランスジェニック動物に被験化合物を投与するステップと、
ｂ）前記トランスジェニック動物の脳組織の、アディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、アディポネクチン受容体のタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化タウの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、アティポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、プロテアソームの活性とからなる群からなる少なくとも１つの測定値を決定するステップと、
ｃ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップと
を含むことを特徴とする、請求項６のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物を有効成分として含む、神経変性疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。また、本発明は、神経変性の抑制及び／又は改善する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患とは、中枢神経系の神経細胞が徐々に変性して細胞死に陥る進行性疾患をいう。神経変性疾患のうち、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症等を含むシヌクレイノパチーではα（ａｌｐｈａ）シヌクレインが異常蓄積し、アルツハイマー病（ＡＤ）ではアミロイドβ（ｂｅｔａ）タンパク質及びタウが異常蓄積し、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症及びピック病ではタウが異常蓄積することが知られている。そしてこれらのタンパク質の遺伝子異常も家族性神経変性疾患を引き起こすことから、これらのタンパク質が中枢神経系の神経細胞に異常凝集・蓄積することにより神経毒性を獲得し、神経細胞死等をきたすような機序が神経変性疾患の病態の中心を占めることが明らかにされている。
【０００３】
また、アルツハイマー病やタウ病を含む神経変性疾患はリン酸化タウによっても惹起される。タウタンパク質は、神経細胞の構造タンパク質である微小管に結合してチューブリンとチューブリンとの間のヒンジとしての役目をもち、チューブリンから微小管への重合促進能を有している。タウタンパク質はリン酸化されると、微小管結合能を失い、正常な細胞骨格が崩壊する。さらにリン酸化タウタンパク質はＰａｉｒｅｄ  Ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（ＰＨＦ）を形成し、神経原線維変化を伴う神経変性を惹起する。ＡＤでは、主にアミロイドβ（ｂｅｔａ）タンパク質及びタウの異常蓄積が認められる。また、多くのＡＤ患者の脳ではα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの蓄積も認められ、ＡＤの青斑核や扁桃体では、同一神経細胞内にα（ａｌｐｈａ）シヌクレイン等から構成されるレビー小体とタウタンパク質による神経原線維変化が共局在することが知られている。また、脳幹型レビー小体の明暈（ハロー）部分では、リン酸化タウ及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインが同じ部位に存在し、タウとα（ａｌｐｈａ）シヌクレインとは互いに線維化を促進するものと考えられている。実際に、ＡＤはＰＤを合併しやすく、ＰＤはＡＤを合併しやすいことから、分子レベルでのこれらの相互作用の関与が推察される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ．  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ９（４）：７０７−２０．  （１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
神経変性疾患のうちα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの異常蓄積を伴うものをシヌクレイノパチーという。パーキンソン病はアルツハイマー病に次いで頻度の高い神経変性疾患である。レビー小体型認知症は、アルツハイマー病、脳血管障害に次いで３番目に頻度の高い認知症の原因である。現時点ではシヌクレイノパチーに対する原因療法は存在せず、介護に関わる家族及び介護施設の重い負担と、莫大な医療費とを含めて深刻な社会問題となっている。そこでシヌクレイノパチーに対する効果的な医薬組成物、及び、その有効成分のスクリーニング方法を開発する必要がある。
【０００６】
神経変性疾患は加齢性疾患という側面があり、糖尿病や動脈硬化のような他の加齢性疾患と同様、運動やカロリー制限に予防効果があることが知られている。そこで本発明者らは、抗糖尿病因子及び抗動脈硬化因子として知られているアディポネクチンに注目して、神経変性疾患におけるアディポネクチンの関与について研究している。そして本発明者らは、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集、タウのリン酸化及びプロテアソーム活性低下をアディポネクチンが抑制することを発見した。本発明はかかる発見に基づいて想到された。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物を有効成分として含む、神経変性疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。
【０００８】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物における前記アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物として、アディポネクチンタンパク質と、球状アディポネクチンタンパク質と、アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物と、球状アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物とからなるグループから少なくとも１つが選択される。
【０００９】
本発明は、前記アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物を含む、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物を提供する。
【００１０】
本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物として、アディポネクチンタンパク質と、球状アディポネクチンタンパク質と、アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物と、球状アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物とからなるグループから少なくとも１つが選択される。
【００１１】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物は、ヒトアディポネクチンタンパク質を含む場合があり、前記球状アディポネクチンタンパク質は、ヒト球状アディポネクチンタンパク質の場合がある。
【００１２】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記ヒトアディポネクチンタンパク質として、（１）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むヒトアディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とを含むグループから少なくとも１つが選択される。
【００１３】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記ヒト球状アディポネクチンタンパク質として、（１）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むヒト球状アディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２４のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから少なくとも１つが選択される。
【００１４】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むヒトアディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００１５】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むヒト球状アディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２４のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００１６】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むヒトアディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの場合がある。
【００１７】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むヒト球状アディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２４のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの場合がある。
【００１８】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための医薬組成物における前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（ＰＰＡＲ）−γ（ｇａｍｍａ）のアゴニストの場合がある。
【００１９】
本発明は神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法を提供する。本発明の方法は、アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物の有効量を投与するステップを含む。
【００２０】
本発明の方法における前記アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物として、アディポネクチンタンパク質と、球状アディポネクチンタンパク質と、アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物と、球状アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物とからなるグループから少なくとも１つが選択される。
【００２１】
本発明はα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法を提供する。本発明の方法は、アディポネクチン受容体アゴニスト及び／又は該アゴニストを誘導する化合物が、アディポネクチンタンパク質と、球状アディポネクチンタンパク質と、アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物と、球状アディポネクチンタンパク質の発現を誘導する化合物とからなるグループから選択される少なくとも１つの有効量を投与するステップを含む。
【００２２】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法において、前記アディポネクチンはヒトアディポネクチンタンパク質の場合があり、前記球状アディポネクチンタンパク質は、ヒト球状アディポネクチンタンパク質の場合がある。
【００２３】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法における前記ヒトアディポネクチンタンパク質として、（１）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むヒトアディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから少なくとも１つが選択される。
【００２４】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法における前記ヒト球状アディポネクチンタンパク質として、（１）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むヒト球状アディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２４のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから少なくとも１つが選択される。
【００２５】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法における前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むヒトアディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００２６】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法における前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むヒト球状アディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２４のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む場合がある。
【００２７】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法における前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むヒトアディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの場合がある。
【００２８】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法における前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、（１）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質と、（２）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（３）配列番号２３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（４）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むヒト球状アディポネクチンタンパク質と、（５）配列番号２４のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターの場合がある。
【００２９】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下を抑制するための方法における前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物はペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（ＰＰＡＲ）−γ（ｇａｍｍａ）のアゴニストの場合がある。
【００３０】
本発明の神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法、及び／又は、本発明のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制するための方法におけるペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター（ＰＰＡＲ）−γ（ｇａｍｍａ）のアゴニストはピオグリタゾン塩酸塩の場合がある。
【００３１】
本発明は、アディポネクチンが関与するα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はリン酸化タウの凝集及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制することに基づく神経変性の抑制及び／又は改善する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法は、ａ）α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現する生物学的材料を用意するステップと、ｂ）前記生物学的材料と被験化合物とを接触させるステップと、ｃ）前記生物学的材料由来のアディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、アディポネクチン受容体のタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化タウの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、アディポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、プロテアソーム活性とからなる群から選択される少なくとも１つの測定値を決定するステップと、ｄ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップとを含む場合がある。
【００３３】
本発明は、ａ）α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン発現細胞を用意するステップと、ｂ）前記細胞に被験化合物を添加し、インキュベーションするステップと、ｃ）アディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、αシヌクレインの凝集体の量と、アディポネクチン及びαシヌクレインの凝集体の量と、プロテアソーム活性とからなる群から選択される少なくとも１つの測定値を決定するステップと、ｄ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップとを含む場合がある。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法において、前記ステップａ）は、プロテアソーム阻害剤存在下、α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン発現細胞を培養するステップの場合がある。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法において、前記ステップａ）における前記細胞に、さらに、アディポネクチン及び／又はアディポネクチン受容体のｓｉＲＮＡを導入するステップを含む場合がある。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法における前記ステップｃ）の前記リン酸化酵素として、ＡＭＰＫと、リン酸化ＡＭＰＫと、ｐ３８  ＭＡＰＫと、リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫと、ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）と、リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）とからなる群から少なくとも１つが選択される。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法は、ａ）神経細胞特異的にヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現するトランスジェニック動物より摘出した脳組織と、被験化合物とをインキュベーションするステップと、ｂ）アディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、アディポネクチン受容体のタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化タウの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、アディポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、プロテアソーム活性とからなる群から選択される少なくとも１つの測定値を決定するステップと、ｃ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップとを含む場合がある。
【００３８】
本発明のスクリーニング方法は、ａ）神経細胞特異的にヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現するトランスジェニック動物に被験化合物を投与するステップと、ｂ）前記トランスジェニック動物の脳組織の、アディポネクチンのタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、アディポネクチン受容体のタンパク質及び／又はｍＲＮＡの量と、リン酸化タウの量と、リン酸化酵素の量及び／又は活性と、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、アティポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体の量と、プロテアソームの活性とからなる群からなる少なくとも１つの測定値を決定するステップと、ｃ）決定された測定値に基づいて被験化合物の効果を比較するステップとを含む場合がある。
【００３９】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００４０】
アディポネクチンは、Ｍａｅｄａ，Ｋ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２２１：  ２８６（１９９６））によってクローニングされた脂肪細胞で大量に発現する遺伝子産物で、脂肪細胞の分化を抑制又は阻害する。アディポネクチンのｍＲＮＡはノザンブロットでは正常な脳で検出されない。脳室内に投与されると、主にエネルギー消費を刺激して体重を減少させる作用がある。アディポネクチンは、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化を抑制又は軽減する特性及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する特性に基づいて、神経変性疾患の治療及び／又は予防という本発明の作用効果を奏する。ヒトアディポネクチンのコーディング領域のヌクレオチド配列は本明細書に添付する配列表の配列番号２１に示され、ヒトアディポネクチンのコーディング領域のアミノ酸配列は本明細書に添付する配列表の配列番号２２に示される。本発明においてヒトアディポネクチンにはヒトアディポネクチンの均等物、すなわち、ヒトアディポネクチンと非常に類似したアミノ酸配列のタンパク質であって、本発明のアディポネクチンの作用である、神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する活性を備えるタンパク質も含まれる。
【００４１】
球状アディポネクチンは、アディポネクチンのＮ末端のコラーゲン様ドメインがプロテアーゼにより切断されたアディポネクチンのアイソフォームの一種であり、アディポネクチン受容体に対してアゴニストとしての機能を有する。
【００４２】
本発明において、アディポネクチン受容体アゴニストとは、アディポネクチン受容体に働いて、アディポネクチンと同様の機能を示す化合物をいい、前記アディポネクチン、組換えアディポネクチン、前記球状アディポネクチン、及び、組換え球状アディポネクチンを含む。
【００４３】
アディポネクチン受容体（ＡｄｉｐｏＲ）には、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の２種類が存在し、球状アディポネクチン及び完全長アディポネクチンの受容体として機能する。前記受容体は、ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−α（ａｌｐｈａ）及びｐ３８  ＭＡＰＫを含むシグナル伝達分子群の活性化や、脂肪酸の酸化及びグルコースの摂取の増大を仲介することが知られている。
【００４４】
本発明において、アディポネクチン受容体アゴニストは、アディポネクチン受容体に働いて、細胞内シグナル伝達系を構成するＡＭＰＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）などのリン酸化酵素を誘導及び／又は活性化し、リン酸化ＡＭＰＫ、リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ、リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）を増加し、さらに、タウのリン酸化、リン酸化タウの凝集、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集、及び／又は、タウとα（ａｌｐｈａ）シヌクレインとの凝集形成を抑制する。
【００４５】
本発明において、アディポネクチンの発現を誘導する化合物とは、培養細胞か、ヒト又は実験動物の個体に経口的又は非経口的に投与すると、アディポネクチンの発現が誘導される化合物をいう。アディポネクチンの発現の誘導とは、アディポネクチンを産生する細胞内でアディポネクチンの量が増大すること、及び／又は、アディポネクチンを産生する細胞からアディポネクチンが分泌されることをいう。前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、アディポネクチン又はその均等物をエンコードするｃＤＮＡの場合がある。また、前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、アディポネクチン又はその均等物をエンコードするｃＤＮＡを含む組換えベクターの場合がある。前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、ＷＯ２００５／０９４８６６に記載のＫＬＦ９と、特開２００８−１０５９４に記載のアシルアミド化合物と、特開２００８−１９５６３０に記載のＰＰＡＲ−γ（ｇａｍｍａ）アゴニスト、例えばピオグリタゾン塩酸塩と、特開２０１１−１４８７４８に記載のポルフィラン又はその塩類と、特開２０１１−２３６２３６に記載のシメジから抽出された抽出物とを含むが、これらに限定されない、アディポネクチンの発現を誘導することが本発明の出願前に公知の全ての化合物をいう。さらに、前記アディポネクチンの発現を誘導する化合物が脳血液関門を通過するのを促進する全ての化合物も本発明のシヌクレイノパチーの治療及び／又は予防用医薬組成物に含まれる。
【００４６】
本発明において、球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物とは、培養細胞か、ヒト又は実験動物の個体に経口的又は非経口的に投与すると、球状アディポネクチンの発現が誘導される化合物をいう。球状アディポネクチンの発現の誘導とは、球状アディポネクチンを産生する細胞内で球状アディポネクチンの量が増大すること、及び／又は、球状アディポネクチンを産生する細胞から球状アディポネクチンが分泌されることをいう。前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、球状アディポネクチン又はその均等物をエンコードするｃＤＮＡの場合がある。また、前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、球状アディポネクチン又はその均等物をエンコードするｃＤＮＡを含む組換えベクターの場合がある。前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物は、ＷＯ２００５／０９４８６６に記載のＫＬＦ９と、特開２００８−１０５９４に記載のアシルアミド化合物と、特開２００８−１９５６３０に記載のＰＰＡＲ−γ（ｇａｍｍａ）アゴニスト、例えばピオグリタゾン塩酸塩と、特開２０１１−１４８７４８に記載のポルフィラン又はその塩類と、特開２０１１−２３６２３６に記載のシメジから抽出された抽出物とを含むが、これらに限定されない。さらに、前記球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物が脳血液関門を通過するのを促進する全ての化合物も本発明のシヌクレイノパチーの治療及び／又は予防用医薬組成物に含まれる。
【００４７】
本発明の組成物は、アディポネクチン、アディポネクチンの発現を誘導する化合物、球状アディポネクチン、及び／又は、球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物が、神経細胞におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する効果を損なわないことを条件として、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含む場合がある。前記添加物は、結合剤、滑剤、崩壊剤、溶解剤、緩衝剤、着色剤、香料、甘味料、防腐剤、安定化剤、及び、当業者に知られたその他の医薬品添加剤を含むが、これらに限られない。
【００４８】
本発明における有効量とは、本発明の組成物を投与された被験者が健康を害さず、かつ、該被験者で本発明の効果を有する投与量をいう。前記有効量は、被験者の体重、年齢、性別、遺伝子型、病状等を考慮して設定されることが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物の剤型は、アディポネクチン、アディポネクチンの発現を誘導する化合物、球状アディポネクチン、及び／又は、球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物が、神経細胞におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化及び／又はプロテアソーム活性低下、を抑制する効果を損なわないことを条件として、特に限定されない。本発明の組成物の剤型は、例えば経鼻スプレー等の経鼻剤の場合がある。
【００５０】
本発明の組成物の製造は、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規範に適合した条件（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ）で実施されることが好ましい。
【００５１】
本発明の化合物の送達には、アディポネクチン、アディポネクチンの発現を誘導する化合物、球状アディポネクチン、及び／又は、球状アディポネクチンの発現を誘導する化合物の体内分布を、量的、空間的及び時間的に制御できる当業者に周知の送達システムを用いることができる。
【００５２】
本発明において、神経変性疾患とは、中枢神経系の神経細胞が異常タンパク質の蓄積により、徐々に変性していき、機能不全や細胞死に陥る進行性疾患をいう。前記神経変性疾患は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病、及び、多系統萎縮症を含むが、これらに限定されない。本発明の神経変性疾患はα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの異常蓄積を伴う、いわゆるシヌクレイノパチーの場合がある。
【００５３】
本発明において、アディポネクチンは神経細胞内でα（ａｌｐｈａ）シヌクレインと相互作用して、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化を抑制又は軽減し、あるいは、プロテアソーム活性低下を改善して、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又は蓄積を抑制する。しかし、本明細書の実施例に示すとおり、アディポネクチンはα（ａｌｐｈａ）シヌクレインと直接タンパク質間相互作用を行うことが示されるので、細胞外でのα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集物の形成を抑制又は軽減することによりシヌクレイノパチーの治療及び／又は予防という作用効果を奏することも本発明に含まれる。
【００５４】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００５５】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、当業者に周知のサザンブロットで以下の実験条件で行うことをいう。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることをいう。
【００５６】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００５７】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質が神経細胞におけるヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及び／又はタウのリン酸化を抑制する活性を保持することを条件として、いかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００５８】
本明細書において「組換えベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、該所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。
【００５９】
本明細書において「ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるためのプラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記ベクターはプラスミドの場合がある。
【００６０】
本発明の組換えベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。
【００６１】
前記生物学的試料は、ヒト、実験動物の生体内から採取された細胞、組織及び器官と、培養細胞とを含むが、これらに限定されない。前記培養細胞は、生体内から採取した細胞の初代培養と、継代培養された細胞と、ｉＰＳ細胞、外胚葉系幹細胞その他の多分化能を有する幹細胞から分化された細胞と、細胞株とを含むが、これらに限定されない。前記細胞株はＢ１０３神経芽細胞の場合がある。前記実験動物は、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物を含む。前記トランスジェニック動物は、Ｔｈｙ−１−α（ａｌｐｈａ）Ｓトランスジェニックマウス（α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス）の場合がある。前記生物学的試料は、当業者に標準的な方法で調製することができる。前記生物学的試料の生物種は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ及びブタを含むが、これらに限定されない。前記ヒトは、健常者と、神経変性疾患患者（例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、皮質基底核変性症、ピック病等）とを含むが、これらに限定されない。本発明において、前記生物学的材料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又は、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法において、被験化合物は、微生物、菌類、植物及び動物から調製される化合物と、化学的に合成される化合物とを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明において、ｍＲＮＡの量は、細胞内に存在する所望のｍＲＮＡの量の他、前記細胞における所望の遺伝子の転写活性を含む。前記細胞内に存在する所望のｍＲＮＡの量は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロットその他の固相雑種形成を含むがこれらに限定されない方法によって測定される。前記転写活性は、核酸コンストラクトを培養細胞に一時的又は永続的に導入することによって測定されるのが典型的である。前記核酸コンストラクトは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β（ｂｅｔａ）−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むレポータータンパク質遺伝子の発現を調節可能な場合がある。前記核酸コンストラクトはベクターの場合がある。前記細胞内に存在する所望のｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲによって測定するためには、配列表に示されたヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが、プライマーの対として用いられる場合がある。
【００６４】
本発明において、ｍＲＮＡの量は、測定するときの細胞の数又は全ｍＲＮＡの量によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望のｍＲＮＡの量は、被験化合物を添加する前の前記細胞の所望のｍＲＮＡの量を基準とする測定値で表される場合がある。さらに、本発明において、所望のｍＲＮＡの量は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照遺伝子のｍＲＮＡの量で標準化される場合がある。前記対照遺伝子は、いわゆるハウスキーピング遺伝子を含むが、これらに限定されず、例えば遺伝子発現アレイチップ等の手段で見つけることができる。本発明において、ハウスキーピング遺伝子は、２８ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β（ｂｅｔａ）−アクチン、シクロフィリンＡ等を含むが、これらに限定されない。前記細胞内に存在するシクロフィリンＡのｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲによって測定するためには、配列番号１３及び１４に示されたヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドが、プライマーの対として用いられる場合がある。本発明のスクリーニング方法において、被験化合物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００６５】
前記所望のｍＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡ、スプライシング・バリアント及び未成熟ｍＲＮＡを含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明における固相雑種形成には、いわゆるノザンブロット法の他、遺伝子発現アレイチップへの雑種形成を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明において、タンパク質の量は、細胞により産生されたタンパク質の量の他、採取された生物学的試料中に存在するタンパク質の量を含む。所望のタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法及び免疫比濁法を含むが、これらに限定されない方法によって測定される。前記方法において、所望のタンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。前記抗体は、当業者に標準的な方法で調製されてもよく、商業的に入手可能な抗体であってもかまわない。
【００６８】
本発明において、タンパク質の量は、測定するときの細胞の数又は全タンパク質の量によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望のタンパク質の量は、被験化合物を添加する前の前記細胞の所望のタンパク質の量を基準とする測定値で表される場合がある。さらに、本発明において、所望のタンパク質の量は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照タンパク質の量で標準化される場合がある。前記対照タンパク質は、いわゆるハウスキーピング遺伝子のタンパク質、例えば、β（ｂｅｔａ）−アクチン、γ（ｇａｍｍａ）−チューブリン等を含むが、これらに限定されない。ハウスキーピング遺伝子のタンパク質の量をＥＬＩＳＡ等によって測定するためには、前記タンパク質を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。本発明のスクリーニング方法において、被験化合物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００６９】
本発明において、リン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量は、細胞により産生されたリン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量の他、採取された生物学的試料中に存在するリン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量を含む。所望のリン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法及び免疫比濁法を含むが、これらに限定されない方法によって測定される。前記方法において、所望のリン酸化タウ又はリン酸化酵素を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。前記抗体は、当業者に標準的な方法で調製されてもよく、商業的に入手可能な抗体であってもかまわない。
【００７０】
本発明において、リン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量は、測定するときの細胞の数又は全タンパク質の量によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望のリン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量は、被験化合物を添加する前の前記細胞の所望のリン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量を基準とする測定値で表される場合がある。さらに、本発明において所望のリン酸化タウ及び／又はリン酸化酵素の量は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照のリン酸化タンパク質の量で標準化される場合がある。前記リン酸化酵素は、ＡＭＰＫ、ｐ３８  ＭＡＰＫ、及び／又は、ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）を含むが、これらに限定されない。本発明のスクリーニング方法において、被験化合物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００７１】
本発明において、リン酸化酵素の活性は、細胞により産生されたリン酸化酵素の活性の他、採取された生物学的試料中に存在するリン酸化酵素の活性を含む。所望のリン酸化酵素の活性は、ＥＬＩＳＡを含むが、これらに限定されない方法によって測定される。
【００７２】
本発明において、リン酸化酵素の活性は、測定するときの細胞の数又は全リン酸化酵素の活性によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望のリン酸化酵素の活性は、被験化合物を添加する前の前記細胞の所望のリン酸化酵素の活性を基準とする測定値で表される場合がある。さらに、本発明において所望のリン酸化酵素の活性は、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、同一条件で処理された容器１つあたりの対照のリン酸化酵素の活性で標準化される場合がある。本発明のスクリーニング方法において、被験化合物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００７３】
本発明において、凝集体の量は、細胞により産生された凝集体の量の他、採取された生物学的試料中に存在する凝集体の量を含む。所望の凝集体の量は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法及び免疫比濁法を含むが、これらに限定されない方法によって測定される。前記方法において、所望の凝集体を特異的に認識する抗体が用いられる場合がある。前記抗体は、当業者に標準的な方法で調製されてもよく、商業的に入手可能な抗体であってもかまわない。
【００７４】
本発明において、凝集体の量は、測定するときの細胞の数又は全凝集体の量によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望の凝集体の量は、被験化合物を添加する前の前記細胞の所望の凝集体の量を基準とする測定値で表される場合がある。前記凝集体は、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体、アティポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体を含むが、これらに限定されない。本発明のスクリーニング方法において、被験化合物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００７５】
本発明において、プロテアソームの活性は、培養細胞の他、採取された生物学的試料のプロテアソームの活性を含む。前記プロテアソームの活性は、商業的に入手可能なキットを用いて測定することができる。前記プロテアソームは、２０Ｓ、２６Ｓ等のプロテアソームの場合がある。
【００７６】
本発明において、プロテアソームの活性は、測定するときの細胞の数又は全プロテアソームの活性によって標準化された測定値として決定される場合がある。あるいは、同じ数の細胞が複数の同一容器、例えば、ウェル、ディッシュ、フラスコ等に播種される場合には、培養後の容器１つあたりの所望のプロテアソームの活性は、被験化合物を添加する前の前記細胞のプロテアソームの活性を基準とする測定値で表される場合がある。本発明のスクリーニング方法において、被験化合物の効果は前記測定値を用いて比較される場合がある。
【００７７】
本発明のスクリーニング方法において、アディポネクチンのｓｉＲＮＡ、アディポネクチン受容体のｓｉＲＮＡ及びアディポネクチン受容体阻害剤が用いられる場合がある。また、本発明のスクリーニング方法において、被験化合物以外の化合物の投与や、細胞培養の温度、ガス組成、ガス分圧や、飼育時の温度、給餌、明暗時間の変更等のスクリーニング条件が変更される場合がある。
【００７８】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】免疫細胞化学染色したＰＤ及びＤＬＢ患者由来の脳サンプルの共焦点顕微鏡写真。
【図１Ｂ】健常者及びＤＬＢ患者の脳サンプルから調製したさまざまな抽出画分を、抗アディポネクチン抗体、抗リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体、抗アディポネクチン受容体１抗体、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１Ｃ】図１Ｂの実験結果をまとめたグラフ。
【図２Ａ】α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスおけるアディポネクチンのｍＲＮＡ量を調べた実験の電気泳動図。
【図２Ｂ】図２Ａの実験のｍＲＮＡ量をまとめたグラフ。
【図２Ｃ】α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスにおけるアディポネクチンタンパク質の量を調べた実験結果を示すウェスタンブロット図。
【図２Ｄ】図２Ｃの実験結果をまとめたグラフ。
【図３Ａ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるアディポネクチンのｍＲＮＡ量を調べた実験の電気泳動図。
【図３Ｂ】図３ＡのｍＲＮＡ量をまとめたグラフ。
【図３Ｃ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）における界面活性剤可溶分画を抗アディポネクチン抗体、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体、抗アディポネクチン受容体１抗体、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図３Ｄ】図３Ｃのアディポネクチンタンパク質の定量結果をまとめたグラフ。
【図３Ｅ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）の共焦点顕微鏡写真。
【図４Ａ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質の凝集状態に対するアディポネクチンｓｉＲＮＡの影響を調べた実験の結果を示すウェスタンブロット図。
【図４Ｂ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質の凝集状態に対するアディポネクチンｓｉＲＮＡの影響を調べた実験の結果を示すチオフラビンＴ染色細胞の共焦点顕微鏡写真。
【図４Ｃ】図４Ａの実験結果をまとめたグラフ。
【図５Ａ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）に１０μＭのＭＧ１３２を添加した場合（＋）又は添加しなかった場合（−）のアディポネクチンのｍＲＮＡ量への影響を調べた実験の電気泳動図。
【図５Ｂ】図５Ａの実験結果をまとめたグラフ。
【図６Ａ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるアディポネクチンの一過的発現の影響を調べた実験の結果を示すウェスタンブロット図。
【図６Ｂ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質によるプロテアソーム活性低下に対するアディポネクチンの一過的発現の影響を調べた実験の結果を示すグラフ。
【図７】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質によるプロテアソーム活性低下に対するアディポネクチンの影響を調べた実験の結果を示すグラフ。
【図８Ａ】アディポネクチン組換えタンパク質の試験管内での凝集と、これに対するα（ａｌｐｈａ）シヌクレイン組換えタンパク質の影響とを調べた実験結果のウェスタンブロット図。
【図８Ｂ】図７Ａの実験結果をまとめたグラフ。
【図９】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）から調製したさまざまな抽出画分を、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１０Ａ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）から調製した界面活性剤可溶分画を、抗リン酸化ＡＭＰＫα（ａｌｐｈａ）抗体、抗ＡＭＰＫα（ａｌｐｈａ）抗体、抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体、抗ｐ３８α（ａｌｐｈａ）／ＳＡＰＫ２ａ抗体、抗リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）（Ｓｅｒ９）抗体、抗ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）抗体、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチンマウスモノクローナル抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１０Ｂ】アディポネクチンと、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤又はＡＭＰＫ阻害剤とで処理したＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したＴＢＳ可溶分画、ＳＤＳ可溶分画及びギ酸可溶分画を、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１０Ｃ】アディポネクチンと、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤又はＡＭＰＫ阻害剤とで処理したＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製した界面活性剤可溶分画を、抗リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１１Ａ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製した界面活性剤可溶分画を、抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）抗体及び抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ３９６）抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１１Ｂ】Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したＮＰ４０可溶分画を用いて、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて免疫共沈降したリン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）を抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１２】ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したギ酸可溶画分を、抗リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１３】蛍光免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（嗅脳、大脳皮質及び脳幹）の共焦点顕微鏡写真。
【図１４Ａ】免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（視床）の顕微鏡写真。
【図１４Ｂ】免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（嗅脳）の顕微鏡写真。
【図１４Ｃ】免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（大脳皮質）の顕微鏡写真。
【図１５Ａ】α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスから調製した界面活性剤不溶分画を、抗ＧＦＡＰ抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【図１５Ｂ】α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスから調製したさまざまな抽出画分を、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【００８１】
以下の実験は公益財団法人東京都医学総合研究所（旧東京都神経科学総合研究所）の研究倫理委員会の承認（承認番号：２３０２、承認日：２０１１年４月１日）を得て実施された。
【００８２】
以下の実験は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ））のガイドラインに従って実施された。
【実施例１】
【００８３】
ヒト脳におけるアディポネクチンの発現及び局在
１．材料及び方法
１．１  抗体
抗アディポネクチンＣ末端認識ウサギポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  ＬＬＣ）、抗アディポネクチンＮ末端認識ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ．）、抗アディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ）、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（ｓｙｎ−１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）、抗リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（和光純薬工業株式会社）、抗β（ｂｅｔａ）−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｃ−１５、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。
【００８４】
蛍光免疫組織化学染色には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  標識抗ウサギ抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。ウェスタンブロットには、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【００８５】
１．２  剖検脳
弧発性パーキンソン病（以下、「ＰＤ」という。）及び弧発性レビー小体型認知症（以下、「ＤＬＢ」という。）の患者の脳サンプルと、健常者の脳サンプルとは福祉村病院ブレインバンクの赤津裕康先生から提供された。ＰＤ及びＤＬＢの診断はＣａｌｎｅらの診断基準（Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ３２（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１２５（１９９２））と、ＤＬＢコンソーシアム（Ｍｃｋｅｉｔｈら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６５：１８６３（２００５））の報告とに基づいて行われた。前記脳サンプルは死後２時間で剖検され、ウェスタンブロット用のサンプルは−８０°Ｃで凍結保存された。蛍光免疫組織化学染色用のサンプルは、ＰＤ患者の脳サンプル（中脳黒質）については４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、ＤＬＢ患者の脳サンプル（大脳皮質帯状回）についてはメタカン固定液（メタノール／クロロホルム／氷酢酸）で、それぞれ浸漬固定され、パラフィン包埋に供された。
【００８６】
１．３  蛍光免疫組織化学染色
蛍光免疫組織化学染色は当業者に周知な標準的な手順で行われた。簡潔には、前記脳サンプルはパラフィンで包埋され、薄切切片が４μｍの厚さで作製された。脱パラフィン後、薄切切片は１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に入れられ、マイクロウエーブ（ＭＷ）を用いる抗原賦活処理（９５°Ｃ、１０分間）が施された。前記抗原賦活処理の後、前記薄切切片は１０％ヤギ正常血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）／０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で３０分間ブッロキングされた。その後、前記薄切切片は０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳで希釈された１次抗体と４°Ｃで終夜インキュベーションされた。洗浄後、前記薄切切片は０．１％  ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識２次抗体と室温で１時間インキュベーションされた。封入後、前記薄切切片は共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス株式会社）を用いて観察された。
【００８７】
１．４  さまざまな可溶分画の抽出及びウェスタンブロットによる検出
ウェスタンブロットは藤田らの方法に従って実施された（Ｆｕｊｉｔａら、Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １：１１０（２０１０））。脳サンプルはＴＢＳでホモジネート後、１００，０００×ｇ、４°Ｃで３０分間遠心分離され、上清がＴＢＳ可溶分画として回収された。ＴＢＳ不溶性の沈殿物は１％  ＳＤＳに溶かされ、１００，０００×ｇで遠心分離され、上清がＳＤＳ可溶分画として回収された。ＳＤＳ不溶性の沈殿物は７０％ギ酸（ＦＡ）に溶解され、２０，０００×ｇで遠心分離された。上清がギ酸可溶分画として回収され、遠心濃縮機（株式会社トミー精工）による減圧乾燥後、１×ＳＤＳサンプルバッファーに溶解された。それぞれの分画のタンパク質濃度がＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）を使用して測定され、１つのレーンあたり１０μｇが２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）を含む１×ＳＤＳサンプルバッファーに溶かされた。アディポネクチンを検出する場合には、サンプルは３０分間震盪後、９５°Ｃで１０分間加熱された。その他の場合には、サンプルは震盪せずに９５°Ｃ１０分間加熱された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜１６％）後、ニトロセルロース膜（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）にタンパク質が転写された。前記ニトロセルロース膜は、３％  ＢＳＡ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０が添加されたＴＢＳで３０分間ブロッキングされた後、３％  ＢＳＡ／０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０が添加されたＴＢＳで希釈した１次抗体と４°Ｃで終夜インキュベーションされた。その後、前記ニトロセルロース膜は、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０が添加されたＴＢＳで洗浄後、２次抗体とインキュベーションされ、抗原抗体複合体がＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）により検出された。
【００８８】
２  結果
２．１  免疫組織化学染色
図１Ａは、免疫細胞化学染色したＰＤ及びＤＬＢ患者由来の脳サンプルの共焦点顕微鏡写真である。図１Ａの写真のそれぞれの上部に用いた１次抗体が示される。図１Ａの上段ではＰＤ患者由来の黒質サンプルが用いられ、図１Ａの下段ではＤＬＢ患者由来の大脳皮質サンプルが用いられた。「重ね合わせ」は、２枚の写真の画像を合成したことを意味する。抗アディポネクチン抗体及び抗リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体はそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  標識抗ウサギ抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識抗マウス抗体で検出されるため、アディポネクチン及びリン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレインはそれぞれ緑色及び赤色に染色される。そして両方の抗原が共局在する場合には、合成された画像では黄色になる。図１Ａに示されるとおり、アディポネクチン（ＡＰＮ）及びリン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン（リン酸化α（ａｌｐｈａ）Ｓ）はレビー小体の明暈（ハロー）で共局在することが観察された。
【００８９】
２．２  各可溶分画ごとのタンパク質の定量
図１Ｂは、健常者及びＤＬＢ患者の脳サンプルから調製したさまざまな抽出画分を、抗アディポネクチン抗体、抗リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体、抗アディポネクチン受容体１抗体、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１Ｃは、図１Ｂの実験結果をまとめたグラフである。各実験条件の誤差棒は同一条件で４回繰り返した実験結果の測定値の標準誤差を示す。統計学的検定には、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストが用いられた（Ｐｒｉｓｍ４、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｉｎｃ．）。アステリスク（＊＊）はｐ値が１％未満であることを示す。図１Ｂ及び１Ｃに示されるとおり、ＳＤＳ可溶画分中のＡＰＮ及びリン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレインは健常者よりもＤＬＢ患者で多かった。ＳＤＳ画分中のアディポネクチン量は健常者よりもＤＬＢ患者で統計学的に有意に多かった。ギ酸可溶画分中のリン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレインは健常者よりもＤＬＢ患者で多かった。しかし、アディポネクチンはギ酸可溶画分では検出されなかった。したがって、ＳＤＳで溶解できる程度のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体にアディポネクチンが結合していることが示された。
【００９０】
従来の知見では、アディポネクチンは成人の脳では発現しないとされてきた。しかし本実施例の実験結果から、レビー小体の明暈におけるアディポネクチン及びリン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの共局在が示された。また、アディポネクチンはＤＬＢ患者で不溶化していることが示された。したがって、アディポネクチンは、リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレインとともにレビー小体の形成に関与する可能性が示された。
【実施例２】
【００９１】
脳特異的にα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現するＴｈｙ−１−α（ａｌｐｈａ）Ｓトランスジェニックマウスでのアディポネクチン発現
１．材料及び方法
１．１  トランスジェニック動物
Ｔｈｙ−１−α（ａｌｐｈａ）Ｓトランスジェニックマウス（以下、α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスという。）は、Ｔｈｙ−１プロモーターにより神経細胞特異的にヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレイン遺伝子を発現する（カリフォルニア大学サンジエゴ校、Ｅｌｉｅｚｅｒ  Ｍａｓｌｉａｈ教授より寄贈、Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．６６：５７３（２００２））。α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスは東京都医学総合研究所内のＳＰＦ動物室において飼育、繁殖された。Ｃ５７ＢＬ／６（日本クレア株式会社）と交配され、ＰＣＲにより遺伝子診断を行って、トランスジーンを有するマウスを実験群とし、同腹仔の野生型マウス（以下、ｎｏｎ  ｔｇマウスという。）を対照群とした。７ヶ月齢のオスα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスは麻酔後、０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を灌流して脱血され、頸椎脱臼により安楽死された。脳サンプルは液体窒素により凍結され、−８０°Ｃで保存された。
【００９２】
１．２  アディポネクチンｍＲＮＡの定量
ＲＴ−ＰＣＲは藤田らの方法を用いて実施された（Ｆｕｊｉｔａら、Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １：１１０（２０１０））。α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳凍結サンプルからＩＳＯＧＥＮ（株式会社  ニッポンジーン）により全ＲＮＡが抽出され、３７°Ｃで３０分間のＤＮａｓｅ（ＤＮａｓｅ  １、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）処理が施された。ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｓｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて２．５μｇの全ＲＮＡから合成された。
【００９３】
逆転写産物は以下のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅された。
マウスアディポネクチンフォワードプライマー：５’−ＣＴＡＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＧＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号１）
マウスアディポネクチンリバースプライマー：５’−ＣＡＣＡＣＴＧＡＡＣＧＣＴＧＡＧＣＧＡＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２）
ラットアディポネクチンフォワードプライマー：５’−ＧＧＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＣＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡ−３’（配列番号３）
ラットアディポネクチンリバースプライマー：５’−ＣＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＧＴＧ−３’（配列番号４）
マウスアディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）フォワードプライマー：５’−ＣＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＧ−３’（配列番号５）
マウスアディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）リバースプライマー：５’−ＧＴＡＧＡＧＣＡＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号６）
ラットアディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）フォワードプライマー：５’−ＡＴＣＴＴＣＣＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡ−３’（配列番号７）
ラットアディポネクチン受容体１（ＡｄｉｐｏＲ１）リバースプライマー：５’−ＡＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧ−３’（配列番号８）
マウスアディポネクチン受容体２（ＡｄｉｐｏＲ２）フォワードプライマー：５’−ＴＴＧＧＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＧＧＴＴＧＴＧＴＡ−３’（配列番号９）
マウスアディポネクチン受容体２（ＡｄｉｐｏＲ２）リバースプライマー：５’−ＣＡＣＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１０）
ラットアディポネクチン受容体２（ＡｄｉｐｏＲ２）フォワードプライマー：５’−ＡＧＡＴＡＧＧＣＴＧＧＣＴＡＡＴＧＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号１１）
ラットアディポネクチン受容体２（ＡｄｉｐｏＲ２）リバースプライマー：５’−ＧＡＴＧＴＣＡＣＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１２）
マウス及びラットのシクロフィリンＡフォワードプライマー：５’−ＴＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１３）
マウス及びラットのシクロフィリンＡリバースプライマー：５’−ＧＴＣＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１４）
【００９４】
ＰＣＲの反応条件は、９４°Ｃ、５分間の後、９５°Ｃ、３０秒間と、５５°Ｃ、３０秒間と、７２°Ｃ、６０秒間とを３５回繰り返した後、７２°Ｃ、１０分間の後４°Ｃで静置する条件であった。ＰＣＲ産物は１．２％アガロースゲルで電気泳動された。各遺伝子のｍＲＮＡの量は、臭化エチジウム染色されたＰＣＲ産物のバンドの濃度がデンシトメーター（ＡＴＴＯ）によって定量化された。アディポネクチンのｍＲＮＡ量はシクロフィリンＡのｍＲＮＡ量で標準化された。
【００９５】
１．３  各可溶分画ごとのタンパク質の定量
さまざまな可溶分画の抽出及びウェスタンブロットによる検出は実施例１で説明された手順に従って実施された。タンパク質サンプルが前記α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの大脳皮質から当業者に周知な標準的な方法で調製された。抗アディポネクチン抗体、抗アディポネクチン受容体１抗体、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチン抗体が１次抗体として用いられた。ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体、ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として用いられた。各タンパク質の量は、発光反応で検出されたバンドの濃度がＩｍａｇｅ  Ｊ  （ＮＩＨ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって定量化された。アディポネクチンタンパク質の量はβ（ｂｅｔａ）−アクチンタンパク質の量で標準化された。
【００９６】
２．結果
２．１  アディポネクチンｍＲＮＡの定量
図２Ａは、α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳におけるアディポネクチンのｍＲＮＡ量を調べた実験の電気泳動図である。図２Ｂは図２Ａの実験のｍＲＮＡ量をまとめたグラフである。各誤差棒は、α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス又はｎｏｎ  ｔｇマウス（各８ないし９匹）のシクロフィリンＡで標準化されたアディポネクチンのｍＲＮＡ量の標準誤差を示す。アステリスク（＊＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が１％未満であることを示す。アディポネクチンのｍＲＮＡ量は、ｎｏｎ  ｔｇマウスよりもα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスで統計学的に有意に多かった。
【００９７】
２．２  各可溶分画ごとのタンパク質の定量
図２Ｃは、α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスにおけるアディポネクチンタンパク質の量を調べた実験結果を示すウェスタンブロット図である。図２Ｄは図２Ｃの実験結果をまとめたグラフである。各誤差棒は、α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス又はｎｏｎ  ｔｇマウス（各８−９匹）のβ（ｂｅｔａ）−アクチンで標準化されたアディポネクチンタンパク質の量の標準誤差を示す。アステリスク（＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が５％未満であることを示す。アディポネクチンタンパク質の量は、ｎｏｎ  ｔｇマウスよりもα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスで統計学的に有意に多かった。本実施例の実験結果から、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現する脳ではアディポネクチンの遺伝子発現が誘導されることが示された。
【実施例３】
【００９８】
α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現する培養神経細胞でのアディポネクチン発現
１．材料及び方法
１．１  細胞培養
ラットＢ１０３神経芽細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＢｉｏＷｅｓｔ、フナコシ株式会社）と、１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン（カタログ番号：１５０７０−０６３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）とを添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」という。ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で３７°Ｃ、５％  ＣＯ2条件下で培養・継代された。
【００９９】
１．２  α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを強制発現するラットＢ１０３神経芽細胞の調製
竹之内らにより作製されたｐＣＥＰ４−α（ａｌｐｈａ）シヌクレインコンストラクト（Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：１４１（２００１））がα（ａｌｐｈａ）シヌクレインのｃＤＮＡを恒常的に発現するために用いられた。前記ｐＣＥＰ４−α（ａｌｐｈａ）シヌクレインコンストラクトをトランスフェクションしたＢ１０３神経芽細胞（以下、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）という。）はＴａｋｅｎｏｕｃｈｉら（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：１４１（２００１））によって説明された手順に従って調製された。対照群として、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインｃＤＮＡが挿入されない空のｐＣＥＰ４発現ベクターをトランスフェクションしたＢ１０３神経芽細胞（以下、Ｂ１０３神経芽細胞（ベクター）という。）が用いられた。前記コンストラクトがトランスフェクションされたＢ１０３細胞をハイグロマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、メルク株式会社）存在下で選択し、得られたハイグロマイシン耐性Ｂ１０３細胞クローンのうち、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを安定的に発現するクローンがα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現する神経芽細胞として本実施例の実験に用いられた。
【０１００】
１．３  アディポネクチンのｍＲＮＡ及びタンパク質の定量
Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるアディポネクチンのｍＲＮＡ及びタンパク質の定量は実施例１及び２で説明された手順に従って実施された。
【０１０１】
１．４  免疫細胞化学染色
各細胞はポリリジンでコーティングしたカバーガラス上に増殖され、７０％コンフルエント程度の状態において４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定され、さらに０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）で１５分間処理されて、細胞膜の透過性が亢進された。前記各細胞は、ＰＢＳで洗浄後、１０％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ、フナコシ株式会社）／０．１％  ＢＳＡ／ＴＢＳで３０分間固定された。前記各細胞は、ＰＢＳで洗浄後、０．１％  ＢＳＡ／ＴＢＳに希釈された１次抗体と４°Ｃで終夜インキュベーションされた。洗浄後、前記各細胞は、０．１％  ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識２次抗体と室温で１時間インキュベーションされた。封入後、前記各細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス株式会社）を用いて観察された。
【０１０２】
２．結果
２．１  アディポネクチンｍＲＮＡの定量
図３Ａは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるアディポネクチンのｍＲＮＡ量を調べた実験の電気泳動図である。図３Ｂは図３ＡのｍＲＮＡ量をまとめたグラフである。各誤差棒は、６個の同一条件のサンプルのシクロフィリンＡで標準化されたアディポネクチンタンパク質の量の標準誤差を示す。アステリスク（＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が５％未満であることを示す。図３Ａ及び３Ｂから示されるとおり、アディポネクチンのｍＲＮＡ量は、空ベクターがトランスフェクションされた神経芽細胞の対照群と比較して、ｐＣＥＰ４−α（ａｌｐｈａ）シヌクレインコンストラクトがトランスフェクションされ、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現する神経芽細胞で統計学的に有意に多かった。
【０１０３】
２．２  各可溶分画ごとのタンパク質の定量
図３Ｃは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）における界面活性剤可溶分画を抗アディポネクチン抗体、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体、抗アディポネクチン受容体１抗体、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図３Ｄは、図３Ｃのアディポネクチンタンパク質の定量結果をまとめたグラフである。各誤差棒は、６個の同一条件のサンプルのβ（ｂｅｔａ）−アクチンで標準化されたアディポネクチンタンパク質の量の標準誤差を示す。アステリスク（＊＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が１％未満であることを示す。アディポネクチンタンパク質の量は、空ベクターがトランスフェクションされたＢ１０３神経芽細胞の対照群と比較して、ｐＣＥＰ４−α（ａｌｐｈａ）シヌクレインコンストラクトがトランスフェクションされ、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現するＢ１０３神経芽細胞で統計学的に有意に多かった。
【０１０４】
２．３  免疫細胞化学染色
図３Ｅは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）の共焦点顕微鏡写真である。用いられた１次抗体は図３Ｅの写真のそれぞれの左上に示される。図３Ｅの上段はＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）であり、下段はＢ１０３神経芽細胞（ベクター）である。「重ね合わせ」は、２枚の写真の画像を合成したことを意味する。抗アディポネクチン抗体及び抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体はそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  標識抗ウサギ抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識抗マウス抗体で検出されるため、アディポネクチン及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインはそれぞれ緑色及び赤色に染色される。そして両方の抗原が共局在する場合には、合成された画像では黄色になる。図３Ｅに示されるとおり、アディポネクチン（ＡＰＮ）及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレイン（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）はＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）の周辺部で共局在することが観察された。本実施例の実験結果から、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）では、アディポネクチンも発現しα（ａｌｐｈａ）シヌクレインと共局在することが示された。そこで、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの発現によってアディポネクチンの発現が誘導されることが示された。
【実施例４】
【０１０５】
ｓｉＲＮＡを用いたアディポネクチンの発現抑制
１．材料及び方法
１．１  ｓｉＲＮＡの導入
ラットアディポネクチンのセンス鎖ＲＮＡ：５’−ＣＡＡＵＧＡＣＵＣＵＡＣＡＵＵＵＡＣＡｔｔ−３’（配列番号１５）と、アンチセンス鎖ＲＮＡ：５’−ＵＧＵＡＡＡＵＧＵＡＧＡＧＵＣＡＵＵＧｔｔ−３’（配列番号１６）と、対照実験のランダム配列のセンス鎖ＲＮＡ：５’−ＵＣＵＵＡＡＵＣＧＣＧＵＡＵＡＡＧＧＣｔｔ−３’（配列番号１７）と、アンチセンス鎖ＲＮＡ：５’−ＧＣＣＵＵＡＵＡＣＧＣＧＡＵＵＡＡＧＡｔｔ−３’（配列番号１８）とはＴａｋａｒａ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｒｎａｉ／）（タカラバイオ株式会社）を利用して調製された。Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）と、対照実験のＢ１０３神経芽細胞（ベクター）とが市販の６穴プレートで培養され、３０〜５０％コンフルエント程度の状態でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてトランスフェクションされた。トランスフェクション６時間後に培地が１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換された。２４時間培養後、培地は、ＦＢＳ中のアディポネクチンによる影響を避けるため無血清ＤＭＥＭ培地に置換された。さらに３日間培養された後、トランスフェクションしたＢ１０３神経芽細胞が回収され、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集状態の検出と、プロテアソーム活性の測定とに供された。また、チオフラビンＴ染色用のＢ１０３細胞はポリリジンコートをしたカバーガラスの上でトランスフェクションが行われた。前記Ｂ１０３神経芽細胞は無血清培地で培養された後、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定された。前記Ｂ１０３神経芽細胞はＰＢＳで洗浄された後、０．１％チオフラビンＴ（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）で７分間染色された。
【０１０６】
１．２  各可溶分画の抽出及びウェスタンブロットによる検出
各可溶分画の抽出と、ウェスタンブロットによる各可溶分画ごとのタンパク質の定量は実施例１ないし３と同様の手順で実施された。
【０１０７】
１．３  プロテアソーム活性の測定
ｓｉＲＮＡが導入されたＢ１０３神経芽細胞は、ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ）にて回収された。その後、凍結融解を繰り返すことで細胞膜が破壊され、２０，０００×ｇ、４°Ｃで１０分間遠心分離することによって上清が回収された。タンパク質濃度が測定され、１０μｇが４０μＭのｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ蛍光プロテアソーム基質（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、日本ミリポア株式会社）を含むＨＥＰＥＳバッファーに溶解された。プロテアソームの活性は、基質の分解量をＢｅｒｔｈｏｌｄ  Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０  マイクロプレートリーダー（ベルトールドジャパン株式会社）により１時間、３７°Ｃ（励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）の条件で経時的に測定することで算出された。
【０１０８】
２．結果
図４Ａは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質の凝集状態に対するアディポネクチンｓｉＲＮＡの影響を調べた実験の結果を示すウェスタンブロット図である。Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）と、対照実験のＢ１０３神経芽細胞（ベクター）とに、アディポネクチンのアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡ（ＡＰＮ  ｓｉＲＮＡ）又は対照実験のランダム配列のｓｉＲＮＡ（ランダム配列）が導入され、７２時間培養後に、培養上清と、ＴＢＳ、ＳＤＳ及びギ酸で順次抽出されて得られた可溶分画とがウェスタンブロットにより解析された結果である。図４Ａに示されるとおり、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）におけるアディポネクチンの発現がｓｉＲＮＡで抑制されない場合には、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインは培養上清、ＴＢＳ及びＳＤＳ可溶分画で検出されるが、ギ酸可溶分画では検出されなかった。しかし、アディポネクチンの発現がｓｉＲＮＡで抑制される場合には、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインはギ酸可溶分画でも検出された。
【０１０９】
図４Ｂは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質の凝集状態に対するアディポネクチンｓｉＲＮＡの影響を調べた実験の結果を示すチオフラビンＴ染色細胞の共焦点顕微鏡写真である。アディポネクチンのアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡが導入されたα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを発現するＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）と、対照実験の空の発現ベクターがトランスフェクションされたＢ１０３神経芽細胞（ベクター／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）とをそれぞれチオフラビンＴ染色によりタンパク質の凝集を確認したところ、アディポネクチンの発現が抑制されたα（ａｌｐｈａ）シヌクレイン発現神経芽細胞ではチオフラビンＴ陽性像が観察され、タンパク質の凝集が示された。
【０１１０】
図４Ｃは図４Ａの実験結果をまとめたグラフである。各誤差棒は、４ないし５個の同一条件のサンプルのプロテアソーム活性の測定値の標準誤差を示す。アステリスク（＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が５％未満であることを示す。アステリスク（＊＊＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が０．１％未満であることを示す。図４Ｃに示すとおり、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）では、対照実験のＢ１０３神経芽細胞（ベクター／Ａｄ  ｓｉＲＮＡ）と比較してプロテアソーム活性が低下した。さらに、アディポネクチンのｓｉＲＮＡが導入されたＢ１０３神経芽細胞では、ランダム配列のｓｉＲＮＡが導入されたＢ１０３細胞と比較してプロテアソーム活性が低下した。本実施例の結果から、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの発現はプロテアソーム活性を低下させ、アディポネクチンはプロテアソーム活性低下を部分的に阻害することが示された。
【実施例５】
【０１１１】
プロテアソーム機能阻害によるアディポネクチン発現誘導
１．材料及び方法
ＭＧ１３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、メルク株式会社）がプロテアソーム阻害剤として用いられた。ＤＭＳＯ中に１０ｍＭのＭＧ１３２を溶解したストック溶液が調製され、１０μＭのＭＧ１３２を含む１０％  ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地が用時調製された。８０−９０％コンフルエント程度のＢ１０３神経芽細胞の培地がＭＧ１３２を含む１０％  ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換された。６時間後、前記細胞は回収され、アディポネクチンｍＲＮＡの発現がＲＴ−ＰＣＲにより測定された。
【０１１２】
２．結果
図５Ａは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）に１０μＭのＭＧ１３２を添加した場合（＋）又は添加しなかった場合（−）のアディポネクチンのｍＲＮＡ量への影響を調べた実験の電気泳動図である。図５Ｂは図５Ａの実験結果をまとめたグラフである。各誤差棒は、５ないし６個の同一条件のサンプルのシクロフィリンＡで標準化されたアディポネクチンのｍＲＮＡ量の標準誤差を示す。アステリスク（＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が５％未満であることを示す。アステリスク（＊＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が１％未満であることを示す。図５Ｂに示されるとおり、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインが強制的に発現されたＢ１０３神経芽細胞ではアディポネクチンの発現が誘導されたが、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの発現の有無にかかわらず、ＭＧ１３２によりプロテアソーム活性が低下するとアディポネクチンの発現誘導が増大した。
【実施例６】
【０１１３】
アディポネクチンの過剰発現によるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集及びプロテアソーム活性への影響
１．材料及び方法
１．１  アディポネクチンの発現ベクターコンストラクトの作製
マウスのｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーからアディポネクチンに特異的な配列を含むプライマーが設計された。アディポネクチンのＮ−末端の塩基配列を含むフォワードプライマー（Ｎ−ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）５’−ＧＧＧＡＴＧＣＴＡＣＴＧＴＴＧＣＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１９）と、アディポネクチンのＣ−末の塩基配列を含むリバースプライマー（Ｃ−ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）５’−ＧＡＧＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＣＡＧＴＴＧＧＴＡＴＣＡＴＧ−３’（配列番号２０）とのプライマーが調製され、マウスアディポネクチンのｃＤＮＡがマウス脂肪組織から得られたｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応により増幅された。得られたＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで分離し、アディポネクチンｃＤＮＡのバンドをゲルから切り出して、ＤＮＡが精製された。その後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社）により前記アディポネクチンｃＤＮＡ断片の５’末端にリン酸基が付加された。制限酵素ＰｖｕＩＩであらかじめ消化されたｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）がアルカリフォスファターゼで脱リン酸化された。脱リン酸化ｐＣＥＰ４のＰｙｕＩＩ部位にリン酸化アディポネクチン断片がＴ４リガーゼ（タカラバイオ株式会社）により挿入された。その結果、アディポネクチンの全長を含む発現ベクターコンストラクトｐＣＥＰ４−ＡＰＮが得られた。その後、塩基配列の決定によりｐＣＥＰ４−ＡＰＮの構造が確認された。
【０１１４】
１．２  アディポネクチンを過剰発現するＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）の作製
アディポネクチンを安定的に発現するラットＢ１０３神経芽細胞は前記ｐＣＥＰ４−ＡＰＮ発現ベクターコンストラクトをラットＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）にトランスフェクションして作製された。簡潔には、約８０％コンフルエント程度のＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてｐＣＥＰ４−ＡＰＮが導入された。対照として、空のｐＣＥＰ４発現ベクターがＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）に導入された。前記導入後、培養培地はＤＭＥＭ培地に置換され、４８時間後に前記細胞は回収された。
【０１１５】
α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの可溶性
その後、ＴＢＳ可溶分画、ＳＤＳ可溶分画及びギ酸可溶分画が、実施例１で説明された方法に従って調製された。アディポネクチンの発現及びα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの可溶性はウェスタンブロットにより確認された。前記ウェスタンブロットは実施例１で説明された方法に従って行われた。
【０１１６】
プロテアソーム活性の測定
０、０．５又は１μｇ／ウェルのｐＣＥＰ４−ＡＰＮが、６穴プレートに培養したＢ１０３細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）にトランスフェクションされた（黒塗り）。対照として、空のｐＣＥＰ４発現ベクターが、培養したＢ１０３細胞（ベクター）にトランスフェクションされた（白抜き）。４８時間後、トランスフェクションした細胞はＨＥＰＥＳバッファーで回収された、プロテアソーム活性が測定された。前記プロテアソーム活性の測定は、実施例４で説明された方法に従って行われた。
【０１１７】
２．結果
図６Ａは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるアディポネクチンの一過的発現の影響を調べた実験の結果を示すウェスタンブロット図である。図６Ａに示されるとおり、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）においてアディポネクチンの一過性発現を行わなかった場合には、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインはＴＢＳ、ＳＤＳ及びギ酸の可溶分画全てで検出された。しかしＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）においてアディポネクチンの一過性発現を行った場合には、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインはＴＢＳ及びＳＤＳの可溶分画では検出されたが、ギ酸可溶分画では検出されなかった。これは、アディポネクチンが過剰に発現された場合には、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインはＳＤＳに不溶性の凝集体は形成しなかったことを意味する。すなわち、アディポネクチンの過剰発現によりα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集が抑制された。
【０１１８】
図６Ｂは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質によるプロテアソーム活性低下に対するアディポネクチンの一過的発現の影響を調べた実験の結果を示すグラフである。各誤差棒は、５ないし７個の同一条件のサンプルのプロテアソーム活性の測定値の標準誤差を示す。アステリスク（＊＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が１％未満であることを示す。図６Ｂに示すとおり、アディポネクチンを一過的に発現したＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）では、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインによるプロテアソーム活性低下を実質的に回復できた。これは、アディポネクチンの過剰発現にはα（ａｌｐｈａ）シヌクレインによる神経変性疾患を治療及び／又は改善できる効果があることを示す。
【実施例７】
【０１１９】
アディポネクチン添加によるプロテアソーム活性低下に対する影響
１．材料及び方法
細胞培養は実施例１で説明された方法に従って行われた。前記細胞培養では、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）が、８０〜９０％コンフルエント程度の状態まで市販の６穴プレートで培養された。その後、前記細胞は洗浄され、１μｇ／ｍＬの組換えヒトアディポネクチン（ＰｒｏＳｐｅｃ、岩井化学薬品株式会社）含有培地で培養された（ＡＰＮ）。ＰＢＳが対照として用いられた（ｃｏｎｔｒｏｌ）。２４時間後、前記Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）はＨＥＰＥＳバッファーで回収され、プロテアソーム活性が測定された。前記プロテアソーム活性の測定は、実施例４で説明された方法に従って行われた。
【０１２０】
２．結果
図７は、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）におけるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインタンパク質によるプロテアソーム活性低下に対するアディポネクチンの影響を調べた実験の結果を示すグラフである。各誤差棒は、６個の同一条件のサンプルのプロテアソーム活性の測定値の標準誤差を示す。アステリスク（＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が５％未満であることを示す。図７に示すとおり、アディポネクチンを添加したＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）では、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインによるプロテアソーム活性低下が統計学的に有意に改善された。これは、アディポネクチンにはα（ａｌｐｈａ）シヌクレインによる神経変性疾患を治療及び／又は改善できる効果があることを示す。
【実施例８】
【０１２１】
α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン及びアディポネクチンのタンパク質間相互作用
１．材料及び方法
ヒトアディポネクチンの組換えタンパク質（ＰｒｏＳｐｅｃ、岩井化学薬品株式会社）０．５μｇと、ヒトα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの組換えタンパク質（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ７９９：３０１（１９９８））１．０μｇとが１００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液中で３７°Ｃ、５００ｒｐｍ（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、エッペンドルフ株式会社）で４８時間インキュベーションされた。その後、実施例１ないし６と同様の手順でウェスタンブロットにより解析された。各サンプルは２ＭＥを含まない１×サンプルバッファーに溶解され、９５°Ｃで１０分間加熱された。対照実験では、室温でインキュベーションが行われた。また、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの代わりにＢＳＡ（１．０μｇ）がアディポネクチンとインキュベーションされた。
【０１２２】
２．結果
図８Ａは、アディポネクチン組換えタンパク質の試験管内での凝集と、これに対するα（ａｌｐｈａ）シヌクレイン組換えタンパク質の影響とを調べた実験結果のウェスタンブロット図である。各実験条件ごとに異なる２個のサンプルが調製され、隣接したレーンで電気泳動が行われた。図８Ａに示されるとおり、アディポネクチンは室温でも２量体及び３量体が検出されたが、３７°Ｃでのインキュベーションでは２量体が増大した。アディポネクチンにα（ａｌｐｈａ）シヌクレインを添加してインキュベーションを行うとき、アディポネクチンの２量体がさらに増大するとともに、ほとんど分離されないアディポネクチンの凝集体がゲルの上端に検出された。α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの代わりにＢＳＡを添加してアディポネクチンとともにインキュベーションを行うときには、アディポネクチンの凝集状態はアディポネクチン単独でインキュベーションされたときとほぼ同様であった。
【０１２３】
図８Ｂは、図８Ａの実験結果をまとめたグラフである。各誤差棒は、４５個の同一条件のサンプルについて、図８Ａのウェスタンブロット図の左に「ａｇｇｒｅｇａｔｅ」と示された範囲のデンシトメーターの測定値の標準誤差を示す。アステリスク（＊＊＊）はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ’ｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  テストによる検定でｐ値が０．５％未満であることを示す。「ｎ．ｓ．」は前記検定で有意差が認められなかったことを示す。図８Ｂから明らかなとおり、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの存在下ではアディポネクチンの凝集が有意に促進された。
【０１２４】
本実施例の結果から、アディポネクチンとα（ａｌｐｈａ）シヌクレインとの間には直接的なタンパク質間相互作用が生じていることが示された。そこで、アディポネクチンは、神経細胞内でのα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集の阻害又は抑制に関与するだけでなく、細胞外でのα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集物の形成の抑制又は軽減に関与することが想定される。
【実施例９】
【０１２５】
アディポネクチンによるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集、シグナル伝達及びタウのリン酸化への影響
１．材料及び方法
１．１  アディポネクチンの添加実験（１）（α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集）
Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）と、Ｂ１０３神経芽細胞（ベクター）とは、実施例３で説明された方法に従って調製され、培養された。前記Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）は６穴プレートに播種され、８０〜９０％コンフルエント程度に培養された。ＰＢＳ洗浄後、前記細胞は、組換えヒトアディポネクチン（１μｇ／ｍＬ、３量体、ＰＲＯＳＰＥＣ）を無血清培地に添加した試験培地で２４時間培養された。対照として、前記組換えヒトアディポネクチンの代わりにＰＢＳを添加した対照培地が用いられた。培養後、ＴＢＳ可溶分画、ＳＤＳ可溶分画及びギ酸可溶分画が実施例１で説明された方法に従って調製された。また、ウェスタンブロットが実施例１で説明された方法に従って行われた。α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集を評価するために、前記ウェスタンブロットでは、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（ｓｙｎ−１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１２６】
１．２  アディポネクチンの添加実験（２）（シグナル伝達及びタウのリン酸化）
前記Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）は５ｃｍディッシュに播種され、８０〜９０％コンフルエント程度に培養された。その後、前記細胞はＰＢＳで洗浄され、無血清培地で４時間培養された。ＰＢＳ洗浄後、前記細胞は、組換えヒトアディポネクチン（１μｇ／ｍＬ、３量体、ＰＲＯＳＰＥＣ）を無血清培地に添加した試験培地（アディポネクチン添加群）で培養された。対照として、前記組換えヒトアディポネクチンの代わりにＰＢＳを添加した対照培地（アディポネクチン非添加群）が用いられた。培養時間は、シグナル伝達を評価する際には０、１０及び３０分間であり、タウのリン酸化を評価する際には０、１及び２時間であった。回収した前記細胞それぞれは、細胞溶解液（１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１  ｍＭ  ＥＧＴＡ、１００  ｍＭ  フッ化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤（ナカライテスク株式会社））で溶解された。上清が１００，０００×ｇ、３０分間の遠心分離後に回収され、界面活性剤可溶分画としてウェスタンブロットで用いられた。前記ウェスタンブロットは実施例１で説明された方法に従って行われた。
【０１２７】
シグナル伝達を評価するために、前記ウェスタンブロットでは、抗リン酸化ＡＭＰＫα（ａｌｐｈａ）（Ｔｈｒ１７２）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＡＭＰＫα（ａｌｐｈａ）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｈｒ１８２）抗体（Ｄ３Ｆ９、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｐ３８α（ａｌｐｈａ）／ＳＡＰＫ２ａ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）（Ｓｅｒ９）抗体（Ｄ８５Ｅ１２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗β（ｂｅｔａ）−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｃ−１５、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１２８】
タウのリン酸化を評価するために、前記ウェスタンブロットでは、抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）抗体（ＡＮＡＳＰＥＣ）、抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ３９６）抗体（ＡＮＡＳＰＥＣ）、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｃ−１５、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１２９】
１．３  ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の添加実験（α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成抑制効果、及び、タウのリン酸化におけるシグナル伝達経路の検討）
前記Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）は６穴プレートに播種され、８０〜９０％コンフルエント程度に培養された。ＰＢＳ洗浄後、前記細胞は、５μＭ  ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０３５８０、Ｐｒｏｍｅｇａ）又は５μＭ  ＡＭＰＫ阻害剤（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を無血清培地に添加した阻害試験培地で１０分間培養された。対照として、前記阻害剤の代わりにＤＭＳＯが無血清培地に添加された。その後、組換えヒトアディポネクチン（１μｇ／ｍＬ、３量体、ＰＲＯＳＰＥＣ）又はＰＢＳが添加され、前記細胞は３０分間培養された。回収した前記細胞それぞれは、前記細胞溶解液で溶解された。実施例１で説明された方法に従って、ＴＢＳ可溶分画、ＳＤＳ可溶分画及びギ酸可溶分画が調製され、ウェスタンブロットに供された。
【０１３０】
シグナル伝達経路を検討するために、前記ウェスタンブロットでは、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（ｓｙｎ−１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）、抗リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）（Ｓｅｒ９）抗体（Ｄ８５Ｅ１２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｃ−１５、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１３１】
１．４  免疫沈降
免疫沈降は当業者に周知な標準的な手順で行われた。簡潔には、前記Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）は１０ｃｍディッシュに播種され、８０〜９０％コンフルエント程度に培養された。その後、前記細胞はＰＢＳで洗浄され、組換えヒトアディポネクチン（１μｇ／ｍＬ、３量体、ＰＲＯＳＰＥＣ）を無血清培地に添加した試験培地（アディポネクチン添加群）で培養された。対照として、前記組換えヒトアディポネクチンの代わりにＰＢＳを添加した対照培地（アディポネクチン非添加群）が用いられた。２４時間培養後、前記細胞はＮＰ４０溶解液（１％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ６３０  （シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、プロテアーゼ阻害剤（ナカライテスク株式会社））で溶解された。上清が１００，０００×ｇ、３０分間の遠心分離後に回収され、ＮＰ４０可溶分画として免疫沈降に用いられた。免疫沈降はＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｐａｃｋ  （ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて製造・販売者の指示書に従って行われた。アディポネクチンで処理したか、若しくは処理していないＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）のＮＰ４０可溶分画に抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（ｓｙｎ−１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）が、アディポネクチンで処理したか、若しくは処理していないＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）のＮＰ４０可溶分画（２００μｇ）に添加され、４°Ｃで終夜インキュベーションされた。また、対照には、マウスＩｇＧ１抗体（ＤＡＫＯ）が添加された。前記インキュベーション後、５０％スラリーアガロース結合体懸濁液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）が添加され、４℃で６０分間インキュベーションされた。その後、免疫沈降した複合体が遠心分離によって回収された。前記複合体はＰＢＳに再懸濁され、４℃で遠沈された。３回の洗浄後、回収した複合体は１×ＳＤＳサンプルバッファーに溶解され、ウェスタンブロットに供された。前記ウェスタンブロットは実施例１で説明された方法に従って行われた。前記ウェスタンブロットでは、抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）抗体（ＡＮＡＳＰＥＣ）、及び、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（ｓｙｎ−１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）及びＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１３２】
１．５  ｓｉＲＮＡを用いたアディポネクチン受容体の発現抑制実験
前記Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）は６穴プレートに播種され、３０〜５０％コンフルエント程度に培養された。その後、ラットのアディポネクチン受容体１（Ａｄｉｐｏ  Ｒ１）のｓｉＲＮＡ（ｓｃ−１５６０２４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）、及び、ラットのアディポネクチン受容体２（Ａｄｉｐｏ  Ｒ２）のｓｉＲＮＡ（ｓｃ−１５６０２５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．）と、ランダム配列のｓｉＲＮＡ（配列番号１７及び１８、センスｓｉＲＮＡ及びアンチセンスｓｉＲＮＡの混合物）とは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてトランスフェクションされた。６時間後、培地が１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに切り換えられ、前記細胞は４８時間培養された。その後、組換えヒトアディポネクチン（１μｇ／ｍＬ、３量体、ＰＲＯＳＰＥＣ）を無血清ＤＭＥＭ培地に添加した培地で２４時間培養された。対照として、前記組換えヒトアディポネクチンの代わりにＰＢＳが無血清ＤＭＥＭ培地に添加された。前記細胞は培養後にＰＢＳで洗浄され、ＴＢＳ可溶分画、ＳＤＳ可溶分画及びギ酸可溶分画が実施例１で説明された方法に従って調製された。また、ウェスタンブロットは実施例１で説明された方法に従って行われた。前記ウェスタンブロットでは、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（ｓｙｎ−１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１３３】
２  結果
２．１  アディポネクチンの添加実験（１）（α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集）
図９は、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）から調製したさまざまな抽出画分を、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図９に示されるとおり、ギ酸可溶画分及び培養上清中のα（ａｌｐｈａ）シヌクレインは、アディポネクチンの添加によって減少した。したがって、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成はアディポネクチンの存在下で抑制されることが示された。なお、アディポネクチン添加による細胞毒性は、特に観察されなかった。
【０１３４】
２．２  アディポネクチンの添加実験（２）（シグナル伝達）
図１０Ａは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）及びＢ１０３神経芽細胞（ベクター）から調製した界面活性剤可溶分画を、抗リン酸化ＡＭＰＫα（ａｌｐｈａ）抗体、抗ＡＭＰＫα（ａｌｐｈａ）抗体、抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体、抗ｐ３８α（ａｌｐｈａ）／ＳＡＰＫ２ａ抗体、抗リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）（Ｓｅｒ９）抗体、抗ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）抗体、及び、抗β（ｂｅｔａ）−アクチンマウスモノクローナル抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１０Ａに示されるとおり、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＡＭＰＫ及びＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）のリン酸化は、アディポネクチンの添加によって増大した。したがって、アディポネクチンは、ｐ３８  ＭＡＰＫ、ＡＭＰＫ及びＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）によるシグナル伝達を亢進することが示された。なお、アディポネクチン添加による細胞毒性は、特に観察されなかった。
【０１３５】
２．３  ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の添加実験（α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成抑制効果におけるシグナル伝達経路の検討）
図１０Ｂは、アディポネクチンと、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤又はＡＭＰＫ阻害剤とで処理したＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したＴＢＳ可溶分画、ＳＤＳ可溶分画及びギ酸可溶分画を、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１０Ｂに記載の「ＩＢ」はイムノブロットを示す。図１０Ｂに示されるとおり、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体は、アディポネクチン非添加群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、阻害剤非添加群（ＡＰＮ）、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤処理群（ＡＰＮ＋ＳＢ２０３５８０）及びＡＭＰＫ阻害剤処理群（ＡＰＮ＋Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃ）のＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したＴＢＳ可溶分画及びＳＤＳ可溶分画では検出された。また、前記α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体は、アディポネクチン非添加群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、阻害剤非添加群（ＡＰＮ）及びＡＭＰＫ阻害剤処理群（ＡＰＮ＋Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃ）のＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したギ酸可溶分画でも検出された。しかし、前記α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体は、阻害剤非添加群（ＡＰＮ）及びｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤処理群（ＡＰＮ＋ＳＢ２０３５８０）のＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したギ酸可溶分画では検出されなかった。したがって、アディポネクチンによるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成抑制効果は、ＡＭＰＫを介するシグナル伝達経路に依存していることが示された。
【０１３６】
２．４  ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤の添加実験（タウのリン酸化におけるシグナル伝達経路の検討）
図１０Ｃは、アディポネクチンと、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤又はＡＭＰＫ阻害剤とで処理したＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製した界面活性剤可溶分画を、抗リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１０Ｃに示されるとおり、リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）は、アディポネクチン非添加群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、阻害剤非添加群（ＡＰＮ）及びＡＭＰＫ阻害剤処理群（ＡＰＮ＋Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃ）のＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製した界面活性剤可溶分画では検出された。しかし、前記リン酸化ＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）は、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤処理群（ＡＰＮ＋ＳＢ２０３５８０）のＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製した界面活性剤可溶分画では検出されなかった。したがって、アディポネクチンによるＧＳＫ−３β（ｂｅｔａ）のリン酸化の亢進は、ｐ３８  ＭＡＰＫに依存していることが示された。
【０１３７】
２．５  アディポネクチンの添加実験（３）（タウのリン酸化）
図１１Ａは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製した界面活性剤可溶分画を、抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）抗体及び抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ３９６）抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１１Ａに示されるとおり、リン酸化タウはアディポネクチンの添加によって減少した。したがって、アディポネクチンは、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成を抑制するだけでなく、タウのリン酸化も抑制することが示された。また、タウのリン酸化抑制にはｐ３８  ＭＡＰＫを介するシグナル伝達経路が関係しており、ｐ３８  ＭＡＰＫを介するシグナル伝達を阻害することによってタウのリン酸化（タウの蓄積）も抑制できることが示された。なお、アディポネクチン添加による細胞毒性は、特に観察されなかった。
【０１３８】
２．６  免疫沈降
図１１Ｂは、Ｂ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したＮＰ４０可溶分画を用いて、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて免疫共沈降したリン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）を抗リン酸化タウ（Ｓｅｒ２０２）抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１１Ｂに記載の「Ｉｎｐｕｔ」は免疫沈降していないサンプルを示し、「ＩＰ」は免疫沈降を示し、「ＩＢ」はイムノブロットを示す。図１１Ｂに示されるとおり、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体で免疫沈降したアディポネクチン非添加群では、リン酸化タウはα（ａｌｐｈａ）シヌクレインと共沈降した。また、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体で免疫沈降したアディポネクチン添加群では、リン酸化タウはα（ａｌｐｈａ）シヌクレインと共沈降しなかった。したがって、タウの凝集体形成抑制にもアディポネクチンが効果的であると示された。
【０１３９】
２．７  ｓｉＲＮＡを用いたアディポネクチン受容体の発現抑制実験
図１２は、ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＢ１０３神経芽細胞（α（ａｌｐｈａ）Ｓ）から調製したギ酸可溶画分を、抗リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１２に示されるとおり、リン酸化α（ａｌｐｈａ）シヌクレインは、ランダム配列のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした実験群と比較して、アディポネクチン受容体１及び２のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした実験群で増大した。したがって、アディポネクチンによるα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成は、アディポネクチン受容体の下流のシグナル伝達経路を介して抑制されることが示された。
【実施例１０】
【０１４０】
α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスへの球状アディポネクチンの単回投与実験（鼻腔内投与によるｇＡＰＮの浸透評価）
１．材料及び方法
１．１  球状アディポネクチンの単回投与
α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスは実施例２で説明された方法に従って鑑別された。Ｎ末端にＦＬＡＧでタグ化した球状アディポネクチン（ＦＬＡＧ−ｇＡＰＮ）又はＰＢＳが、０、３、６、９、１２、１５、１８及び２１日目にα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスに鼻腔内投与された。鼻腔内投与では、粘膜吸収促進剤（５ｍｇ／ｍＬ  ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩（分子量  ＞７０，０００）（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を含むＰＢＳ）  １０μＬが鼻孔内に投与された。３０分後、前記球状アディポネクチン（１ｍｇ／ｍｌ  ＦＬＡＧ−ｇＡＰＮ（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）を含むＰＢＳ）１０μＬ又はＰＢＳ  １０μＬが鼻孔内に投与された。３０分後、前記マウスは実施例２で説明された方法に従って安楽死され、脳サンプルが採取された。
【０１４１】
１．２  蛍光免疫組織化学染色
蛍光免疫組織化学染色は当業者に周知な標準的な手順で行われた。簡潔には、前記脳サンプルの半球は、２０％スクロース／０．０１ＭＰＢＳ液での置換後、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４５８３（サクラ精機株式会社）に包埋され、液体窒素で凍結された。前記脳サンプルの薄切切片が７μｍの厚さで作製され、スライドガラス上に載置された。風乾後、前記薄切切片は０．０１Ｍ  ＰＢＳで水和され、１０％ヤギ正常血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）／ＴＢＳ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で３０分間ブッロキングされた。その後、前記薄切切片は０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳで希釈された１次抗体（抗ＤＤＤＤＫ−ｔａｇ抗体、株式会社  医学生物学研究所）と４°Ｃで終夜インキュベーションされた。洗浄後、前記薄切切片は０．１％  ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈された２次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と室温で１時間インキュベーションされた。封入後、前記薄切切片は共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス株式会社）を用いて観察された。
【０１４２】
２  結果
蛍光免疫組織化学染色
図１３は、蛍光免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（嗅脳、大脳皮質及び脳幹）の共焦点顕微鏡写真である。図１３に示されるとおり、ＦＬＡＧ−ｇＡＰＮが、嗅脳、大脳皮質及び脳幹で検出された。また、ＦＬＡＧ−ｇＡＰＮが他の脳組織でも検出された（図示されない）。したがって、ＦＬＡＧ−ｇＡＰＮは、鼻腔内投与によってマウスの脳内に浸透することが明らかとなった。なお、球状アディポネクチンの単回投与による副作用は、特に観察されなかった。
【実施例１１】
【０１４３】
α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスへの球状アディポネクチンの連続投与実験
１．材料及び方法
１．１  球状アディポネクチンの連続投与
α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスは実施例２で説明された方法に従って鑑別された。球状アディポネクチン（ｇＡＰＮ）が、０、３、６、９、１２、１５、１８及び２１日目にα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスに鼻腔内投与された。また、対照として、ＰＢＳが、０、３、６、９、１２、１５、１８及び２１日目にα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスに鼻腔内投与された。鼻腔内投与では、粘膜吸収促進剤（５ｍｇ／ｍＬポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩（分子量  ＞７０，０００）（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）を含むＰＢＳ）１０μＬが鼻孔内に投与され、３０分後に、球状アディポネクチン（１ｍｇ／ｍＬ  ｇＡＰＮ（Ｐｒｏｓｐｅｃ）を含むＰＢＳ）１０μＬ又はＰＢＳ  １０μＬが鼻孔内に投与された。鼻腔内投与２２日目に、前記マウスは実施例２で説明された方法に従って安楽死され、脳サンプルが採取された。病理学的解析用の半球は４％パラホムアルデヒドで浸漬固定され、パラフィン包埋された。ウェスタンブロット用の他の半球は液体窒素により凍結され、−８０°Ｃで保存された。
【０１４４】
１．２  免疫組織化学染色
免疫組織化学染色は当業者に周知な標準的な手順で行われた。簡潔には、パラフィンで包埋した前記脳サンプルを用いて、薄切切片が４μｍの厚さで作製された。脱パラフィン後、前記薄切切片は１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に入れられ、マイクロウエーブ（ＭＷ）を用いる抗原賦活処理（９５°Ｃ、１０分間）が施された。前記抗原賦活処理の後、前記薄切切片は３％過酸化水素を含むメタノールで１５分間処理された。洗浄後、前記薄切切片は１０％ヤギ正常血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）／ＴＢＳ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で３０分間ブッロキングされた。その後、前記薄切切片は０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＴＢＳで希釈された１次抗体（抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体又は抗ＧＦＡＰ抗体）と４°Ｃで終夜インキュベーションされた。洗浄後、前記薄切切片は０．１％  ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈された２次抗体（ビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．））と室温で２０分間インキュベーションされた。染色では、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）及び３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｔ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＤＡＢ）が用いられた。前記染色後、前記薄切切片は顕微鏡を用いて観察された。
【０１４５】
１．３  界面活性剤不溶分画でのＧＦＡＰの検出
脳サンプルは、細胞溶解液（１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１  ｍＭ  ＥＧＴＡ、１００  ｍＭ  フッ化ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤（ナカライテスク株式会社））でホモジネート後、１００，０００×ｇ、４°Ｃで３０分間遠心された。沈殿物が界面活性剤不溶分画としてウェスタンブロットで用いられた。ウェスタンブロットは実施例１で説明された方法に従って行われた。前記ウェスタンブロットでは、抗ＧＦＡＰ抗体（Ｐｒｏｇｅｎ）及び抗β（ｂｅｔａ）−アクチンマウスモノクローナル抗体（Ｃ−１５、シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１４６】
１．４  さまざまな分画でのα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集の評価
ＴＢＳ可溶分画、ＳＤＳ可溶分画及びギ酸可溶分画は、実施例１で説明された方法に従って前記脳サンプルの大脳皮質から調製された。ウェスタンブロットは実施例１で説明された方法に従って行われた。前記ウェスタンブロットでは、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレインマウスモノクローナル抗体（ｓｙｎ−１、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）が１次抗体として適宜希釈して用いられた。また、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ）が２次抗体として適宜希釈して用いられた。
【０１４７】
２  結果
２．１  免疫組織化学染色
図１４Ａは、免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（視床）の顕微鏡写真である。図１４Ａに示されるとおり、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体が、ｇＡＰＮ非投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスで検出された。しかし、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体は、ｇＡＰＮ投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスではほとんど検出されなかった。図１４Ｂは、免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（嗅脳）の顕微鏡写真である。図１４Ｂに示されるとおり、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体が、ｇＡＰＮ非投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスで検出された。しかし、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体は、ｇＡＰＮ投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスではほとんど検出されなかった。図１４Ｃは、免疫組織化学染色したα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスの脳サンプル（大脳皮質）の顕微鏡写真である。図１４Ｃに示されるとおり、アストロサイトの増生が、ｇＡＰＮ非投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスで検出された。しかし、アストロサイトの増生は、ｇＡＰＮ投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスではほとんど検出されなかった。したがって、ｇＡＰＮは、脳内でのα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成及びアストロサイトの増生を抑制できることが示された。これらの結果から、ｇＡＰＮは、アディポネクチンと同様にα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成を抑制できることが明らかとなった。また、ｇＡＰＮは、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成及び／又はプロテアソーム活性低下を抑制することによって、凝集体形成を伴う神経変性疾患を治療、予防及び／又は緩和できることが示された。なお、球状アディポネクチンの連続投与による副作用は、特に観察されなかった。
【０１４８】
２．２  界面活性剤不溶分画でのＧＦＡＰの検出
図１５Ａは、α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスから調製した界面活性剤不溶分画を、抗ＧＦＡＰ抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１５Ａに示されるとおり、ＧＦＡＰは、ｇＡＰＮ投与群及びｇＡＰＮ非投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスで検出された。しかし、前記α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスにおいて、ＧＦＡＰは、ｇＡＰＮ非投与群と比較してｇＡＰＮ投与群で少なかった。したがって、アストロサイトの異常活性が、ｇＡＰＮ投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスでは抑制されていることが明らかとなった。蓄積したα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの神経毒性により誘発したアストロサイトの活性化をｇＡＰＮが抑制することが示された。
【０１４９】
２．３  さまざまな分画でのα（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集の評価
図１５Ｂは、α（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウス及びｎｏｎ  ｔｇマウスから調製したさまざまな抽出画分を、抗α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン抗体を用いて検出したウェスタンブロット図である。図１５Ｂに示されるとおり、α（ａｌｐｈａ）シヌクレイン凝集体は、ｇＡＰＮ投与群のα（ａｌｐｈａ）Ｓ  ｔｇマウスから調製したＳＤＳ可溶画分では顕著に減少した。したがって、α（ａｌｐｈａ）シヌクレインの凝集体形成はアディポネクチンの存在下で抑制されることが示された。
【図１Ｃ】
2013234167.tif 000002
【図２Ｂ】
2013234167.tif 000003
【図２Ｄ】
2013234167.tif 000004
【図３Ｂ】
2013234167.tif 000005
【図３Ｄ】
2013234167.tif 000006
【図４Ｃ】
2013234167.tif 000007
【図５Ｂ】
2013234167.tif 000008
【図６Ｂ】
2013234167.tif 000009
【図７】
2013234167.tif 000010
【図８Ｂ】
2013234167.tif 000011
【図１Ａ】
2013234167.tif 000012
【図１Ｂ】
2013234167.tif 000013
【図２Ａ】
2013234167.tif 000014
【図２Ｃ】
2013234167.tif 000015
【図３Ａ】
2013234167.tif 000016
【図３Ｃ】
2013234167.tif 000017
【図３Ｅ】
2013234167.tif 000018
【図４Ａ】
2013234167.tif 000019
【図４Ｂ】
2013234167.tif 000020
【図５Ａ】
2013234167.tif 000021
【図６Ａ】
2013234167.tif 000022
【図８Ａ】
2013234167.tif 000023
【図９】
2013234167.tif 000024
【図１０Ａ】
2013234167.tif 000025
【図１０Ｂ】
2013234167.tif 000026
【図１０Ｃ】
2013234167.tif 000027
【図１１Ａ】
2013234167.tif 000028
【図１１Ｂ】
2013234167.tif 000029
【図１２】
2013234167.tif 000030
【図１３】
2013234167.tif 000031
【図１４Ａ】
2013234167.tif 000032
【図１４Ｂ】
2013234167.tif 000033
【図１４Ｃ】
2013234167.tif 000034
【図１５Ａ】
2013234167.tif 000035
【図１５Ｂ】
2013234167.tif 000036
【配列表】
2013234167000001.app