(57)【要約】【課題】免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質を含有する試料液中から効率よく優れた精度で精製タンパク質を精製することができる精製方法を提供する。【解決手段】免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質と、精製タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、精製タンパク質を精製する精製方法であり、リン酸を含む平衡化液を用いて平衡化された、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に試料液を接触させ、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に精製タンパク質を吸着させる第１の工程と、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、精製タンパク質を精製する第２の工程とを有し、第２の工程において、溶出液にリン酸を含まない添加液を添加して、溶出液のイオン強度を高くすることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質と、該精製タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、前記精製タンパク質を精製する精製方法であって、
リン酸を含む平衡化液を用いて平衡化された、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記試料液を接触させ、前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記精製タンパク質を吸着させる第１の工程と、
前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記精製タンパク質を精製する第２の工程とを有し、
前記第２の工程において、前記溶出液に、リン酸を含まない添加液を添加して、前記溶出液のイオン強度を高くすることを特徴とする精製方法。
【請求項２】
前記平衡化液は、濃度が２０ｍＭ以下のリン酸緩衝液である請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記溶出液は、濃度が２０ｍＭ以下のリン酸緩衝液である請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記溶出液は、ｐＨが４〜１２のリン酸緩衝液である請求項１ないし３のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
前記添加液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＮＨ４Ｃｌのうちの少なくとも１種を含む請求項１ないし４のいずれかに記載の精製方法。
【請求項６】
前記添加液は、ヘペス、メスおよびトリスのうちの少なくとも１種を含む請求項１ないし５のいずれかに記載の精製方法。
【請求項７】
前記混入物として、前記精製タンパク質を含む凝集体を含有する請求項１ないし６のいずれかに記載の精製方法。
【請求項８】
前記精製タンパク質は、天然の抗体、または組換え融合タンパク質である請求項１ないし７のいずれかに記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中から精製タンパク質を精製する精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、血漿中に含まれる抗体（天然の抗体）や、遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される組換え融合タンパク質（人工の抗体）を精製する方法として、アフィニティークロマトグラフィー法や、イオン交換クロマトグラフィー法が用いられている。
【０００３】
特に、アフィニティークロマトグラフィー法は、プロテインＡ、プロテインＧのような結合性タンパク質を個体支持体に固定化したものを吸着剤として用い、この結合性タンパク質に対して、抗体および組換え融合タンパク質が有する定常（Ｆｃ）部が優れた可逆的相互作用を有することから、かかる相互作用を利用して、抗体および組換え融合タンパク質を容易に精製することができるため広く利用されている（例えば、非特許文献１、２参照。）。
【０００４】
また、このような抗体および組換え融合タンパク質を薬理学的用途で使用する場合、抗体および組換え融合タンパク質とともに含まれる混入物を高い精度で除去する必要がある。
【０００５】
なお、この混入物としては、組換え融合タンパク質である場合には、宿主細胞に由来する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質等が挙げられ、また、抗体である場合には、血漿中に含まれるアルブミン、βグロブリン、γグロブリンのようなタンパク質等が挙げられる。また、組換え融合タンパク質および抗体は、単量体であればよいが、これらが凝集した凝集体を形成した場合、この凝集体も混入物に含まれる。さらに、精製にアフィニティークロマトグラフィー法を用いた場合には、個体支持体から離脱したプロテインＡ、プロテインＧのような結合性タンパク質も含まれる。
【０００６】
特に、凝集体は、補体の活性化や、アナフィラキシーに関与するおそれがあるため、より高精度に除去しておく必要がある。
【０００７】
しかしながら、このような混入物を、効率よく優れた精度で除去して、精製タンパク質を精製することができる精製方法については知られていないのが実状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒ．Ｖｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２７−３６
【非特許文献２】Ａｙｂａｙ ａｎｄ Ｉｍｉｒ（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３（１−２）：７７−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質を含有する試料液中から効率よく優れた精度で精製タンパク質を精製することができる精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような目的は、下記（１）〜（８）の本発明により達成される。
（１）  免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質と、該精製タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、前記精製タンパク質を精製する精製方法であって、
リン酸を含む平衡化液を用いて平衡化された、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記試料液を接触させ、前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記精製タンパク質を吸着させる第１の工程と、
前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記精製タンパク質を精製する第２の工程とを有し、
前記第２の工程において、前記溶出液に、リン酸を含まない添加液を添加して、前記溶出液のイオン強度を高くすることを特徴とする精製方法。
【００１１】
これにより、免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質を含有する試料液中から効率よく優れた精度で精製タンパク質を精製することができる。
【００１２】
（２）  前記平衡化液は、濃度が２０ｍＭ以下のリン酸緩衝液である上記（１）に記載の精製方法。
【００１３】
これにより、試料液を、吸着剤に供給した際に、試料液中に含まれる精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体との双方を確実に吸着剤に吸着させることができる。
【００１４】
（３）  前記溶出液は、濃度が２０ｍＭ以下のリン酸緩衝液である上記（１）または（２）に記載の精製方法。
【００１５】
これにより、添加液の添加にともなうイオン強度の上昇に起因して、精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体とをより確実に分離することができる。
【００１６】
（４）  前記溶出液は、ｐＨが４〜１２のリン酸緩衝液である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の精製方法。
【００１７】
かかるｐＨの範囲のリン酸系緩衝液を用いたとしても、吸着剤の変質を好適に防止することができる。
【００１８】
（５）  前記添加液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＮＨ４Ｃｌのうちの少なくとも１種を含む上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の精製方法。
【００１９】
これらのものを添加液として用いることで、溶出液に対する添加液の添加により、溶出液のイオン強度を確実に高くすることができる。
【００２０】
（６）  前記添加液は、ヘペス、メスおよびトリスのうちの少なくとも１種を含む上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の精製方法。
【００２１】
これらのものを添加液として用いることで、溶出液に対する添加液の添加により、溶出液のイオン強度を確実に高くすることができる。
【００２２】
（７）  前記混入物として、前記精製タンパク質を含む凝集体を含有する上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の精製方法。
【００２３】
このように混入物として、精製タンパク質を含む凝集体が含まれるものから、精製タンパク質を優れた精度で精製することができる。
【００２４】
（８）  前記精製タンパク質は、天然の抗体、または組換え融合タンパク質である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の精製方法。
【００２５】
本発明の精製方法は、天然の抗体、または組換え融合タンパク質の精製に好適に適用される。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の精製方法によれば、免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質と、この精製タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から効率よく優れた精度で精製タンパク質を精製することができる。
【００２７】
また、吸着剤としてフッ素アパタイトで構成されるものを用いるので、吸着剤から精製タンパク質を溶出させる際に用いる溶出液の選択の幅が広がり、溶出液のｐＨ値を広範囲に設定することができるため、分画された各画分の流出液中に高精度で精製タンパク質が精製される条件により確実に設定することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の精製方法に用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の精製方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
なお、本発明の精製方法を説明するのに先立って、好適な実施形態を説明するにあたり、説明に使用する用語を以下に定義する。
【００３０】
「吸着剤」とは、固体支持体に固定した少なくとも１種類の分子、またはそれ自体が固体である少なくとも１種類の分子で構成され、各種クロマトグラフィーを実施するために用いられるものである。
【００３１】
「アフィニティークロマトグラフィー」とは、クロマトグラフィー分離を行うために、分子の一般的な特性（例えば、等電点、疎水性またはサイズ）ではなく、生体分子間の特異的な可逆的相互作用（例えば、プロテインＡがＩｇＧ抗体のＦｃ部に結合する能力）を利用するクロマトグラフィーである。具体的には、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、固体支持体にプロテインＡ等の結合性タンパク質が固定化されたものを吸着剤として用いて、吸着剤に対する分子の吸着力（結合力）の差に基づいて分子をクロマトグラフィー分離することをいう（Ｏｓｔｒｏｖｅ（１９９０）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：３５７−３７９参照。）。
【００３２】
「陰イオン交換クロマトグラフィー」とは、第三級または第四級アミノ基などの共有結合した正に帯電した基を有するイオン交換樹脂を用いて、試料液中に含まれる陰イオンと交換することを利用するクロマトグラフィーである。
【００３３】
「抗体」とは、タンパク質またはタンパク質複合体であり、それぞれが、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン、および少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインを含むものをいう。また、「抗体」は、一本鎖抗体、二量体抗体、またはいずれかの高次タンパク質複合体であってよく、これにはヘテロ二量体抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
「免疫グロブリン定常ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＣL、ＣH１、ＣH２、ＣH３またはＣH４ドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言い、抗体のＦｃ部もこれに含まれる。（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｊ．Ｄｏｎａｌｄ Ｃａｐｒａ，免疫グロブリン：構造と機能，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，２０９，２１０−２１８（１９８９）参照。）。
【００３５】
「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＶLまたはＶHドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言う。なお、本発明では、実質的類似性を判定するための免疫グロブリン可変ドメインの生物学的活性は、抗原結合性である。
【００３６】
「プロテインＡ」とは、最初にブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合する特性を有するものである。本発明では、「プロテインＡ」は、ブドウ球菌由来のプロテインＡと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＡも含まれる。なお、本発明では、実質的類似性を判定するためのプロテインＡの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。
【００３７】
「プロテインＧ」とは、最初に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合する特性を有するものである。本発明では、「プロテインＧ」は、連鎖球菌由来のプロテインＧと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＧも含まれる。なお、本発明では、実質的類似性を判定するためのプロテインＧの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。
【００３８】
「プロテインＬＧ」とは、ＩｇＧ抗体に結合する組換え融合タンパク質のことを言い、前記プロテインＧとプロテインＬの両方の一部を含む。また、「プロテインＬ」とは、最初にペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁から単離されたタンパク質である。プロテインＬＧは、プロテインＬとＧの両方に由来するＩｇＧ結合ドメインを含む（例えば、Ｖｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２７−３６参照。）。本発明では、「プロテインＬＧ」は、プロテインＬＧと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＬＧも含まれる。本発明の目的に関して、実質的類似性を判定するためのプロテインＬＧの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。
【００３９】
「組換え融合タンパク質」とは、それらの天然状態では融合していない２以上のタンパク質の一部または全体を含むいずれかのタンパク質のことを言い、そのようなタンパク質としては、例えば、抗体のＦｃ部に融合したＮＦ−κＢのヒト受容体アクチベーター（ｈｕＲＡＮＫ：Ｆｃ）、抗体のＦｃ部に融合した内膜内皮細胞キナーゼ−δ（ＴＥＫδ：Ｆｃ）、および抗体のＦｃ部に融合した腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「精製タンパク質を精製する」とは、精製タンパク質を含む試料液中に存在する可能性のある異質または不都合な要素、特に精製すべき精製タンパク質と異なるタンパク質、精製タンパク質を含む凝集体およびＤＮＡのような生体高分子の量を減らすことを意味する。また、精製タンパク質とは異なるタンパク質の存在は、ゲル電気泳動と染色および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含めた、いずれかの適切な方法で特定できる。さらに、ＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動と染色および／またはポリメラーゼ連鎖反応を用いるアッセイを含めた、いずれか適切な方法で特定できる。
【００４１】
「実質的に類似」とは、タンパク質のアミノ酸配列が互いに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、かつ変化していないタンパク質の生物学的活性を保持するか、または望ましい様式で活性が変化している場合、それらのタンパク質は実質的に類似すると言う。タンパク質が実質的に類似するかを判定する目的について同一とみなされるアミノ酸に含まれるのは、生物学的活性に影響を与える可能性がない保存的置換であり、下記のものが含まれる。すなわち、ＡｌａがＳｅｒを、ＶａｌがＩｌｅを、ＡｓｐがＧｌｕを、ＴｈｒがＳｅｒを、ＡｌａがＧｌｙを、ＡｌａがＴｈｒを、ＳｅｒがＡｓｎを、ＡｌａがＶａｌを、ＳｅｒがＧｌｙを、ＴｙｒがＰｈｅを、ＡｌａがＰｒｏを、ＬｙｓがＡｒｇを、ＡｓｐがＡｓｎを、ＬｅｕがＩｌｅを、ＬｅｕがＶａｌを、ＡｌａがＧｌｕを、ＡｓｐがＧｌｙを置換、およびこれらの逆の交換の場合が含まれる（例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７９）参照。）。
【００４２】
「ＴＮＦＲ」とは、天然の哺乳動物の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の配列と同一または実質的に類似するアミノ酸配列を含むタンパク質のこと言う。実質的類似性を判定するための生物学的活性とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合する、ＴＮＦの結合によって開始する生物学的信号を細胞へ伝達する、または天然（すなわち非組換え）源由来ＴＮＦＲに対して産生された抗−ＴＮＦＲ抗体と交差反応する能力を意味する。ＴＮＦＲはいずれの哺乳動物ＴＮＦＲであってもよく、ネズミまたはヒトＴＮＦＲがこれに含まれる。そのようなＴＮＦＲは、米国特許第５，３９５，７６０号および米国特許第５，６１０，２７９号に記載されている。なお、特に好ましいＴＮＦＲは、米国特許第５，３９５，７６０号に記載のものであり、グリコシル化型でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見掛け分子量は約８０キロダルトンである。
【００４３】
「ＴＮＦＲ：Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に融合したＴＮＦＲの細胞外ドメインの全体または部分を含む組換え融合タンパク質のことを言う。そのような細胞外ドメインには、米国特許第５，３９５，７６０号の図２Ａのアミノ酸配列１〜１６３、１〜１８５または１〜２３５に実質的に類似するアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
「精製タンパク質を含む凝集体」とは、免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質と、この精製タンパク質と同一または異なるタンパク質とを含む少なくとも２つのタンパク質の結合物（凝集物）のことを言い、この結合物の結合様式は、特に限定されず、共有結合、非共有結合、ジスルフィド結合、および非還元性架橋結合等のうちのいずれであってもよい。
【００４５】
次に、本発明の精製方法に用いられる吸着装置（分離装置）の一例について説明する。
なお、以下では、吸着装置として、このものが備える吸着剤の種類が異なるもの、すなわち、固体支持体にプロテインＡ等の結合性タンパク質が固定化された固定化部材と、陰イオン交換樹脂と、フッ素アパタイトとで吸着剤がそれぞれ構成されるものを、３つ用意する。そして、これらの吸着装置を用いて、精製タンパク質を含む試料液中に対して、アフィニティークロマトグラフィー処理、陰イオン交換クロマトグラフィー処理およびフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理をこの順で施すことにより、試料液中から精製タンパク質を精製する場合を代表に説明する。
【００４６】
＜吸着装置＞
図１は、本発明の精製方法に用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００４７】
ここで、流入側とは、精製すべき精製タンパク質を精製（分離）する際に、例えば、試料液（精製タンパク質を含む液体）、溶出液等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記試料液が流出液として吸着装置内から流出する側のことを言う。
【００４８】
なお、以下では、吸着装置１の吸着剤３以外の構成について説明した後、吸着剤３について説明する。
【００４９】
図１に示す吸着装置１は、カラム２と、吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００５０】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００５１】
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
【００５２】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００５３】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
【００５４】
吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液１ｍＬに対して、０．０５〜１００ｍＬ程度が好ましく、０．１〜１００ｍＬ程度がより好ましく、０．５〜５０ｍＬ程度がさらに好ましい。
【００５５】
また、カラム２では、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００５６】
これらキャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、試料液（液体）が供給される。また、吸着剤３に供給された試料液は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。
【００５７】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ガラス焼結体、金属あるいはポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
【００５８】
また、３つの吸着装置のうち、１の吸着装置１（第１の吸着装置１Ａ）は、後述するアフィニティークロマトグラフィー処理において用いられ、吸着剤３として、固体支持体にプロテインＡ等の結合性タンパク質が固定化された固定化部材を備え、また、２の吸着装置１（第２の吸着装置１Ｂ）は、後述する陰イオン交換クロマトグラフィー処理において用いられ、吸着剤３として、陰イオン交換樹脂で構成され、さらに、３の吸着装置１（第３の吸着装置１Ｃ）は、後述するフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において用いられ、吸着剤３としてフッ素アパタイトで構成されている。
【００５９】
固定化部材は、結合性タンパク質が固体支持体に固定化されたものである。
この固定化部材は、結合性タンパク質と可逆的相互作用（親和性）を有する各種物質（例えば、免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質）に対して優れた吸着特性を発揮するため、結合性タンパク質と可逆的相互作用を有する各種物質を吸着させる吸着剤として好適に使用されるものである。
【００６０】
結合性タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、免疫グロブリン定常ドメインに結合する特性を備えるタンパク質であり、具体的には、例えば、プロテインＧ、プロテインＬＧおよびプロテインＡ等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６１】
また、固体支持体の構成材料としては、例えば、アガロース、セファロース、シリカ、コロジオン木炭および砂等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６２】
陰イオン交換樹脂は、ポリエチレンまたはポリスチレン主鎖に、第三級または第四級アミノ基等の共有結合した正に帯電した基が導入されたものである。
【００６３】
かかる構成の陰イオン交換樹脂は、正に帯電した基を有することから、陰イオン交換体として静電相互作用に基づく吸着能を発揮する。このため、陰イオン交換樹脂は、負電荷を有する（負に帯電する）各種物質に対して優れた吸着能を発揮する。
【００６４】
ここで、精製タンパク質も、免疫グロブリン定常ドメインを備えるため、負電荷を有する物質ではあるが、試料液の条件を、精製タンパク質は陰イオン交換樹脂に結合しないが、試料液中に含まれる精製タンパク質以外の物質のうち精製タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質（例えば、ＤＮＡ等）が結合する条件に設定する。そして、この条件で、試料液を陰イオン交換樹脂に接触させると、精製タンパク質が陰イオン交換樹脂に結合することなく、精製タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質が陰イオン交換樹脂に結合する。したがって、後述する陰イオン交換クロマトグラフィー処理において、フロースルー液および洗浄液を、陰イオン交換クロマトグラフィー処理が施された試料液として採集することで、この試料液中には、精製タンパク質が含まれ、試料液中に含まれる精製タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質が陰イオン交換樹脂に吸着して除去される。
【００６５】
また、フッ素アパタイトは、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２−２ｘＦ２Ｘ［式中、ｘは０＜ｘ≦１である。］で表され、ハイドロキシアパタイトが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたものである。
【００６６】
かかる構成のフッ素アパタイトは、そのＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のものが用いられ、Ｃａイオン（カルシウムサイト）とリン酸基（リン酸サイト）とが高密度に規則的に配列した構造を有し、通常、両性イオン交換体として静電相互作用に基づく吸着能を有する。このため、フッ素アパタイトで構成された粒子は、正または負電荷を有する各種物質に対して優れた吸着能を発揮する。
【００６７】
このような吸着特性を有するフッ素アパタイトで構成される吸着剤３に対して、リン酸の存在下で、精製タンパク質と、混入物として含まれる精製タンパク質を含む凝集体とを含有する試料液を接触させると、精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体との双方が、吸着剤３が備えるカルシウムサイトに吸着する。
【００６８】
このカルシウムサイトに対する、精製タンパク質および精製タンパク質を含む凝集体の吸着力は、リン酸の存在下であるため、それほど強固なものでないことから、この状態で、リン酸を含まない溶液によりイオン強度が高くなると、カルシウムサイトとイオンとの間で相互作用が生じる。その結果、精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体とのうち、カルシウムサイトに対する吸着力がより小さい精製タンパク質が優先的に吸着剤３から離脱することとなる。
【００６９】
このような吸着剤３の吸着特性を利用して、試料液中に含まれる精製タンパク質がフッ素アパタイトに結合する条件で、試料液をフッ素アパタイトと接触させる。これにより、試料液中に含まれる各種物質のうち、精製タンパク質と、この精製タンパク質よりもフッ素アパタイトに対する吸着力が大きい精製タンパク質を含む凝集体とがフッ素アパタイトに結合する。したがって、後述するフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において、試料液中に含まれる精製タンパク質を吸着剤３に吸着させた後、この吸着剤３に溶出液を供給して、得られる流出液を、所定量ずつ分画する際に、この溶出液に添加液を添加して、溶出液のイオン強度を高くすることで、精製タンパク質が優先的に溶出する。そのため、この分画により得られる各画分の流出液中には、精製タンパク質が含まれ、精製タンパク質を含む凝集体等がフッ素アパタイトに吸着して除去されていることから、精製タンパク質が精製される。
【００７０】
また、フッ素アパタイトは、ハイドロキシアパタイトと比較して、耐酸性および耐アルカリ性に優れることから、フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において、各画分の流出液を得る際に用いる溶出液の選択の幅が広がる。すなわち、溶出液のｐＨ値を広範囲に設定することができる。そのため、目的とする画分の流出液中に高精度で精製タンパク質が精製される条件により確実に設定することができるようになる。
【００７１】
なお、これらのフッ素アパタイトは、公知の湿式合成法、乾式合成法等によって合成することができる。この場合、フッ素アパタイト中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００７２】
以上のような３つの吸着装置１（第１の吸着装置１Ａ、第２の吸着装置１Ｂおよび第３の吸着装置１Ｃ）に、それぞれ充填される吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒子状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状、モノリス）等とすることもできる。なお、吸着剤３を粒子状とすることにより、その表面積を増大させることができ、精製タンパク質と混入物との分離特性の向上を図ることができる。
【００７３】
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１５０μｍ程度であるのが好ましく、１０〜８０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００７４】
次に、このような吸着装置（分離装置）１（第１の吸着装置１Ａ、第２の吸着装置１Ｂおよび第３の吸着装置１Ｃ）を用いて、精製タンパク質と、この精製タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、精製タンパク質を精製する精製方法について説明する。
【００７５】
＜精製方法＞
本実施形態の精製方法は、試料液にアフィニティークロマトグラフィー処理を施すことにより、混入物の少なくとも一部を試料液中から除去するアフィニティー工程と、アフィニティー工程が施された試料液に陰イオン交換クロマトグラフィー処理を施すことにより、混入物の少なくとも一部をアフィニティー工程が施された試料液中から除去する陰イオン交換工程と、陰イオン交換工程が施された試料液に、フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理を施すことにより、陰イオン交換工程が施された試料液中から精製タンパク質を精製するフッ素アパタイト工程とを有する。
【００７６】
以下、この精製方法について詳述する。
［１］  調製工程
まず、精製すべき精製タンパク質と、精製タンパク質以外の物質である混入物とを含有する試料液を用意する。
【００７７】
精製タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）を有するタンパク質またはタンパク質複合体である。このような精製タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー処理［２］において、免疫グロブリン定常ドメインの結合性タンパク質に対する可逆的相互作用（親和性）に基づいて、固定化部材に吸着する特性を発揮する。また、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）を有することから、中性のｐＨ領域で負電荷を帯びる酸性タンパクである。
【００７８】
この精製タンパク質は、例えば、かかる精製タンパク質が産生されるように遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される。
【００７９】
この場合、この精製タンパク質が産生されるように細胞を遺伝子工学的に処理する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｅｙ，ニューヨーク）参照。）。
【００８０】
なお、この精製タンパク質は、１以上の免疫グロブリン定常ドメインを有するものであればよく、１個または２個以上の免疫グロブリン可変ドメインを有するものであってもよく、免疫グロブリン可変ドメインを有しないものであってもよい。
【００８１】
さらに、精製タンパク質は、天然タンパク質（天然の抗体）または組換え融合タンパク質であってもよく、組換え融合タンパク質としては、例えば、抗体のＦｃ部を有するものが挙げられ、非抗体タンパク質であってもよい。
【００８２】
組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、下記のタンパク質のいずれかと同一または実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００８３】
前記タンパク質としては、例えば、ｆｌｔ３リガンド（国際特許出願ＷＯ９４／２８３９１参照。）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９号参照。）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーターに対するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際特許出願ＷＯ９７／０１６３３参照。）、胸腺ストローマ由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許Ｎｏ．５８８８１９参照。）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋに対する種々のリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳに対するリガンド）等が挙げられる。
【００８４】
また、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、前記タンパク質のいずれかに対する受容体またはそのような受容体と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００８５】
前記受容体としては、両形態のＴＮＦＲ（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、Ｉ型およびＩＩ型インターロイキン−１受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ４６０ ８４６、米国特許第４，９６８，６０７号および米国特許第５，７６７，０６４号参照。）、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−４受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ３６７ ５６６および米国特許第５，８５６，２９６号参照。）、インターロイキン−１５受容体、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１８受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ、米国特許第６，２７１，３４９号参照。）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４を含む）、ならびにデスドメインを含む受容体、例えば、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）等が挙げられる。
【００８６】
さらに、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、分化抗原（ＣＤタンパク質と呼ばれる）もしくは分化抗原または分化抗原と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００８７】
前記分化抗原としては、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．編，日本，神戸，１９９６）に示されており、具体的には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、など）が挙げられる。
【００８８】
なお、幾つかのＣＤ抗原は、ＴＮＦ受容体ファミリーの１種であり、これには４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０も含まれる。上記リガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドと同様にＴＮＦファミリーの１種である。
【００８９】
その例には、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインと、下記のタンパク質のいずれかもしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似するタンパク質の全体または一部とを含む組換え融合タンパク質が挙げられ、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素、前記酵素のいずれかに対するリガンド、ならびに他の多数の酵素およびそれらのリガンドが挙げられる。
【００９０】
さらに、精製タンパク質としては、抗体（天然の抗体）またはその一部、およびキメラ抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン定常ドメインが１以上のネズミ免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントであってもよいし、抗体と細胞傷害性物質または発光物質とを含む結合体であってもよい。細胞傷害性物質または発光物質としては、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）誘導体（例えば、ＤＭ１）；エンテロトキシン（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン）；ヨウ素同位体（例えば、Ｉ−１２５）；テクニウム同位体（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）；シアニン蛍光色素（例えば、Ｃｙ５．５．１８）；およびリボソーム不活性化タンパク質（例えば、ボーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、またはサポリン−Ｓ６（ｓａｐｏｒｉｎ−Ｓ６））等が挙げられる。
【００９１】
なお、抗体、抗体／細胞毒素結合体、または抗体／発光団結合体としては、例えば、前記タンパク質および／または下記抗原のうちいずれか１種類またはその組合わせを認識するものが挙げられ、抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣＩ、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌および／または膵臓癌の患者血清中に高濃度で存在する腫瘍関連エピトープ、胸部、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺および／または腎臓癌細胞、および／または黒色腫、グリオーマもしくは神経芽細胞に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍壊死コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシンＨ鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害薬）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＩＦＮ−γ、呼吸系発疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｓ）等が挙げられる。
【００９２】
また、混入物は、試料液中に含まれる精製すべき精製タンパク質以外の異質または不都合な分子のことを総称して言い、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質（精製タンパク質とは異なる塩基性タンパク質）、精製タンパク質を含む凝集体のような生体高分子が挙げられる。
【００９３】
具体的には、混入物としては、精製タンパク質が遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される場合、宿主細胞に由来する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の他、培地成分、および精製タンパク質を含む凝集体等が挙げられ、また、精製タンパク質が天然の抗体である場合、血漿中に含まれるアルブミン、βグロブリン、αグロブリンのようなタンパク質、および精製タンパク質を含む凝集体等が挙げられる。さらに、アフィニティークロマトグラフィー処理［２］において用いる第１の吸着装置１Ａが備える吸着剤（固定化部材）３から離脱して試料液中に浸出したプロテインＡ等の結合性タンパク質、および結合性タンパク質と精製タンパク質との凝集体（複合体）も含まれる。
【００９４】
［２］  アフィニティークロマトグラフィー処理（アフィニティー工程）
［２−１］  第１の吸着装置への供給工程
次に、得られた試料液を、まず、３つの吸着装置１のうち第１の吸着装置１Ａに供給する。すなわち、第１の吸着装置１Ａの流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給する。
【００９５】
これにより、カラム２（第１の吸着装置１Ａ）内を、試料液が通過して、固体支持体に結合性タンパク質が固定化された固定化部材で構成される吸着剤３に試料液が接触する。
【００９６】
この際、試料液中に含まれる物質のうち、固体支持体（特に、結合性タンパク質）に対する可逆的相互作用（親和性）が高いものが、カラム２内に吸着（保持）され、固体支持体（特に、結合性タンパク質）に対する可逆的相互作用（親和性）が低いものが、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出液として流出する。
【００９７】
すなわち、免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質と、混入物のうち固体支持体に対して親和性が高いものがカラム２内に吸着され、混入物のうち固体支持体に対して親和性が低いものがカラム２内から流出する。
【００９８】
なお、第１の吸着装置１Ａへの試料液の供給の前後において、精製タンパク質の免疫グロブリン定常ドメインが、結合性タンパク質に結合するのを妨害しない溶液を、第１の吸着装置１Ａに供給することで、吸着剤３を洗浄するようにしてもよい。
【００９９】
また、吸着剤３を洗浄する洗浄液としては、緩衝液および／または塩類を含むものを用いることができる。
【０１００】
緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１０１】
また、塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、カルシウム塩およびマグネシウム塩等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることできる。
【０１０２】
なお、この溶液としては、具体的には、例えば、トリスを約５〜１００ｍＭの濃度とし、塩化ナトリウムを約５０〜２５０ｍＭの濃度で添加したものが挙げられる。
【０１０３】
［２−２］  第１の吸着装置による分画工程
次に、第１の吸着装置１Ａの流入管２４からカラム２内に、吸着剤３に対して精製タンパク質を溶出させるための溶出液（第１溶出液）を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する試料液（流出液）を回収する。
【０１０４】
これにより、溶出液の作用により、吸着剤３に吸着している精製タンパク質が吸着剤３から離脱することから、試料液（アフィニティー工程が施された試料液）に溶出した状態で回収される。
【０１０５】
溶出液としては、結合性タンパク質による、精製タンパク質が備える免疫グロブリン定常ドメインに対する結合を阻害する機能を有するものが用いられ、例えば、ｐＨを上昇または低下させる物質であるカオトロピック剤、例えば、グアニジニウム、および塩類のうちの少なくとも１種を含有するものが挙げられる。
なお、この溶出液は、酢酸、グリシンまたはクエン酸を含有するものであってもよい。
【０１０６】
また、精製タンパク質の離脱（溶離）は、例えば、前記溶出液のｐＨを低下させることで、より確実に実施することができる。
【０１０７】
具体的には、例えば、クエン酸塩または酢酸塩を含む溶液を用いてｐＨを好ましくは４．５程度以下、より好ましくは２．５程度〜３．５程度に低下させることにより、精製タンパク質を吸着剤３から離脱させることができる。
【０１０８】
なお、ｐＨの上昇により精製タンパク質を吸着剤３から離脱させる場合には、前記溶液のｐＨを好ましくは８．５程度以上に設定すればよい。
【０１０９】
なお、溶出液の流速は、５０〜４００ｃｍ／時程度であるのが好ましく、１００〜３６０ｃｍ／時程度であるのがより好ましい。
【０１１０】
以上のような操作により、アフィニティークロマトグラフィー処理が施された試料液は、精製タンパク質が第１精製（混入物の少なくとも一部が除去）された状態で回収される。
【０１１１】
なお、本工程を施すことにより、回収された試料液中には、精製タンパク質と、精製タンパク質以外の物質との他、固体支持体から乖離した結合性タンパク質や、この結合性タンパク質と精製タンパク質との凝集体（複合体）が混入物として含まれる。
【０１１２】
なお、回収した試料液（流出液）に対して、必要に応じて、そのｐＨを２．５〜４．５程度に調整するｐＨ調整を行うようにしてもよい。これにより、混入物中にベクターウイルスのようなウイルスが混入する場合であっても、このウイルスを確実に不活化することができる。
【０１１３】
さらに、回収した試料液に対して、ろ過を行うようにしてもよい。このろ過に用いるフィルタ（ろ膜）としては、特に限定されないが、０．１〜０．３μｍ程度であるのが好ましく、０．２μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、試料液中に含まれる精製タンパク質をフィルタで捕捉することなく、精製タンパク質よりもサイズの大きい混入物（具体的にはＤＮＡ等）を確実に試料液中からフィルタで捕捉することで除去することができる。
【０１１４】
［３］  陰イオン交換クロマトグラフィー処理（陰イオン交換工程）
［３−１］  第２の吸着装置への供給工程
次に、第１の吸着装置１Ａから回収された試料液（アフィニティー工程が施された試料液）を、第２の吸着装置１Ｂに供給する。すなわち、第１の吸着装置１Ａから回収された試料液を、第２の吸着装置１Ｂの流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給する。
【０１１５】
これにより、カラム２（第２の吸着装置１Ｂ）内を試料液が通過して、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に試料液が接触する。
【０１１６】
この際、第１の吸着装置１Ａから回収された試料液中に含まれる緩衝液のｐＨおよび塩類の濃度が以下のようになるように設定されている。
【０１１７】
すなわち、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に対する吸着能が、免疫グロブリン定常ドメインを備えるため、負電荷を有している精製タンパク質に対しては発揮されないが、混入物のうち精製タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質（例えば、ＤＮＡ等）に対して発揮されるように設定されている。
【０１１８】
換言すれば、陰イオン交換クロマトグラフィー処理［３］は、精製タンパク質は、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に吸着（結合）しないが、試料液中に含まれる精製タンパク質以外の物質（混入物）のうち精製タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質（例えば、ＤＮＡ等）は、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に吸着（結合）する条件下で実施される。
【０１１９】
緩衝液または塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、フッ化物、酢酸塩、リン酸塩および／またはクエン酸塩、ならびに／あるいはトリス緩衝液が挙げられ、中でも、トリス緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であるのが好ましい。
【０１２０】
また、リン酸ナトリウム緩衝液を用いる場合、その濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜６００ｍＭ、より好ましくは５〜４００ｍＭ程度に設定される。
【０１２１】
さらに、リン酸緩衝液（リン酸ナトリウ緩衝液）のｐＨは、４〜１２程度であるのが好ましく、５．５〜８．５程度であるのがより好ましい。
【０１２２】
［３−２］  第２の吸着装置による分画工程
次に、第２の吸着装置１Ｂの流入管２４からカラム２内に、精製タンパク質を流出させるための供給液（洗浄液）を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、陰イオン交換工程が施された試料液として回収する。
【０１２３】
この際、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に混入物のうちの少なくとも一部（精製タンパク質よりも大きい負電荷を有する混入物）が吸着し、精製タンパク質が吸着されていないことから、流出液中に精製タンパク質が含まれ、少なくとも一部の混入物が流出液中から除去される。
【０１２４】
かかる構成とすることで、負電荷を有する精製タンパク質がフロースルー液および洗浄液中に回収され、試料液中で精製タンパク質よりも大きい負電荷を有する混入物が陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に保持される。そのため、吸着剤３に吸着した精製タンパク質を、溶出させるための溶出工程が省略されることから、精製タンパク質を精製するための本実施形態の精製方法の簡略化を図ることができる。
【０１２５】
ここで、カラム２内に供給する供給液は、前記工程［３−１］で供給した試料液と同様に、精製タンパク質が、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に結合しないが、混入物のうち精製タンパク質よりも大きい負電荷を有するものが、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に結合するようなものが用いられる。
【０１２６】
このような供給液は、前記工程［３−１］で説明した、緩衝液または塩類と、同一の濃度およびｐＨであるものが用いられる。
【０１２７】
以上のような操作、すなわち、カラム２内から流出する流出液すなわちフロースルー液および洗浄液を、陰イオン交換工程が施された試料液として採集することにより、陰イオン交換クロマトグラフィー処理が施された試料液は、精製タンパク質が第２精製（さらに混入物の少なくとも一部が除去）された状態で回収される。
【０１２８】
［４］  フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理（フッ素アパタイト工程）
このフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において、本発明の精製方法が適用される。
【０１２９】
すなわち、フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理は、リン酸を含む平衡化液を用いて平衡化された、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を接触させ、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に精製タンパク質を吸着させる第１の工程と、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、精製タンパク質を精製する第２の工程とを有しており、前記第２の工程において、前記溶出液に、リン酸を含まない添加液を添加して、前記溶出液のイオン強度を高くするよう構成されている。
【０１３０】
以下、このフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理について説明する。
［４−１］  吸着剤の平衡化工程
まず、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を、吸着剤３に接触させるのに先立って、吸着剤３をリン酸を含む平衡化液を用いて平衡化する。
【０１３１】
すなわち、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を、第３の吸着装置１Ｃに供給するのに先立って、リン酸を含む平衡化液を第３の吸着装置１Ｃに供給する。これにより、カラム２（第３の吸着装置１Ｃ）内を試料液が通過して、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に平衡化液が接触することから、吸着剤３がリン酸により平衡化される。
【０１３２】
このように、吸着剤３がリン酸により平衡化されると、フッ素アパタイトが有するＣａイオン（カルシウムサイト）およびリン酸基（リン酸サイト）のうち、カルシウムサイトとリン酸との間で相互作用が生じた状態とすることができる。
【０１３３】
平衡化液としては、リン酸を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸リチウム緩衝液のようなリン酸緩衝液が挙げられる。
【０１３４】
また、この場合、リン酸緩衝液の濃度は、２０ｍＭ以下であるのが好ましく、２ｍＭ以上、１０ｍＭ以下程度であるのがより好ましい。リン酸緩衝液の濃度をかかる範囲内に設定することにより、次工程［４−２］において、試料液を、第３の吸着装置１Ｃに供給した際に、試料液中に含まれる精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体との双方を確実に吸着剤３に吸着させることができる。
【０１３５】
また、平衡化液のｐＨは、６．１〜８．１程度であるのが好ましく、７．２程度であるのがより好ましい。
【０１３６】
［４−２］  第３の吸着装置への供給工程（第１の工程）
次に、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を、リン酸を含む平衡化液を用いて平衡化された吸着剤３を備える第３の吸着装置１Ｃに供給する。すなわち、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液を、第３の吸着装置１Ｃの流入管２４およびフィルタ部材４を介して、リン酸を含む平衡化液を用いて平衡化された、吸着剤３に供給する。
【０１３７】
ここで、カラム２（第３の吸着装置１Ｃ）内を試料液が通過して、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に試料液が接触する際に、吸着剤３がリン酸を含む平衡化液を用いて平衡化されているため、試料液中に含まれる精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体との双方が吸着剤３に吸着する。
【０１３８】
なお、この精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体との吸着剤３に対する吸着の際には、試料液中に含まれる各種物質のうち、精製タンパク質よりも低い吸着能を有する各種物質は、吸着剤３に結合しない。これに対して、精製タンパク質および精製タンパク質を含む凝集体の他、精製タンパク質と同等および精製タンパク質よりも高い吸着能を有する各種物質は、吸着剤３に結合する。
【０１３９】
よって、吸着剤３に結合しなかった各種物質（混入物）等は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。これに対して、吸着剤３に結合した各種物質は、カラム２内に保持される。
【０１４０】
［４−３］  吸着剤の洗浄工程
次に、精製タンパク質等が結合（吸着）した吸着剤３を、リン酸を含有する洗浄液を第３の吸着装置１Ｃに供給することにより洗浄する。
【０１４１】
これにより、吸着剤３には吸着していないが、カラム２内に残存している各種物質（混入物）等を、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から確実に流出させることができる。
【０１４２】
この洗浄液としては、前記工程［４−１］で説明した平衡化液と同様のものを用いることができる。すなわち、洗浄液としては、例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸リチウム緩衝液のようなリン酸緩衝液を用いることができる。これにより、吸着剤３に結合した精製タンパク質等を吸着剤３から解離（溶出）させることなく、カラム２内に残存している各種物質（混入物）等を、カラム２内から確実に流出させることができる。
【０１４３】
なお、本工程［４−３］は、次工程［４−４］において用いる溶出液の種類等によっては省略することができる。
【０１４４】
［４−４］  第３の吸着装置による分画工程（第２の工程）
次に、第３の吸着装置１Ｃの流入管２４からカラム２内に、精製タンパク質を流出させるための溶出液を供給して、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。
【０１４５】
この際、本発明では、溶出液に、リン酸を含まない添加液を添加して、溶出液のイオン強度を高くする。
【０１４６】
これにより、吸着剤３に吸着している精製タンパク質および混入物は、それぞれが有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて、各分画内に溶出した状態で回収（分離）されるが、本発明では、上記の通り、溶出液のイオン強度が高くなるため、フッ素アパタイトが備えるカルシウムサイトとイオンとの間で相互作用が生じる。そのため、前記工程［４−２］において、吸着剤３に吸着している精製タンパク質および精製タンパク質を含む凝集体のうち、カルシウムサイトに対する吸着力がより小さい精製タンパク質が優先的に吸着剤３から離脱することとなる。
【０１４７】
すなわち、吸着剤３には、精製タンパク質や、精製タンパク質を含む凝集体等の混入物が、それぞれに固有の吸着（担持）力で特異的に吸着しているが、精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体とでは、カルシウムサイトに対する吸着力が精製タンパク質のほうが小さいため、この吸着力の差に応じて、所定の分画内に溶出した状態で精製タンパク質が精製される。
【０１４８】
カラム２内に供給する溶出液は、特に限定されないが、前述した平衡化液と同様に、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸リチウム緩衝液のようなリン酸系緩衝液が好ましく用いられる。これにより、添加液の添加にともなうイオン強度の上昇に起因して、精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体とを確実に分離することができる。
【０１４９】
また、リン酸緩衝液の濃度は、２０ｍＭ以下であるのが好ましく、２ｍＭ以上、１０ｍＭ以下程度であるのがより好ましい。リン酸緩衝液の濃度をかかる範囲内に設定することにより、添加液の添加にともなうイオン強度の上昇に起因して、精製タンパク質と、精製タンパク質を含む凝集体とをより確実に分離することができる。
【０１５０】
リン酸系緩衝液のｐＨは、特に限定されないが、好ましくは４〜１２程度、より好ましくは５．５〜８．５程度に設定される。これにより、精製タンパク質を確実に溶出させることができ、その精製率の向上を図ることができる。また、吸着剤３がＣａイオンを接触させたフッ素アパタイトで構成されることで吸着剤３は優れた耐酸性を有しているため、かかるｐＨの範囲のリン酸系緩衝液を用いたとしても、吸着剤３の変質（溶解等）を好適に防止することができ、第３の吸着装置１Ｃにおける分離能の変化を確実に防止することもできる。
【０１５１】
このリン酸系緩衝液の温度も、特に限定されないが、３０〜５０℃程度であるのが好ましく、３５〜４５℃程度であるのがより好ましい。これにより、分離する精製タンパク質の変質（変成）を防止することができる。
【０１５２】
したがって、溶出液として、かかるｐＨ範囲および温度範囲のリン酸系緩衝液を用いることにより、目的とする精製タンパク質の収率（回収率）の向上を図ることができる。
【０１５３】
また、リン酸を含まない添加液としては、特に限定されないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＮＨ４Ｃｌのうちの少なくとも１種の塩を含む溶液であっても良いし、ヘペス（4−（2−hydroxyethyl）−1−piperazineethanesulfonic acid）、メス（2−モルホリノエタンスルホン酸）およびトリス（Tris−hydroxymethylammonium）のうちの少なくとも１種を含む緩衝液であっても良い。これらのものを添加液として用いることで、溶出液に対する添加液の添加により、溶出液のイオン強度を確実に高くすることができる。
【０１５４】
添加液として、上述したような塩を含む溶液を用いた場合、添加液を添加した後の溶出液における塩の濃度は、好ましくは０．０１Ｍ以上、２．５Ｍ以下程度、より好ましくは０．２Ｍ以上、２．０Ｍ以下程度に設定される。溶出液における塩の濃度をかかる範囲内に設定することにより、精製タンパク質をより高精度に精製することができる。
【０１５５】
さらに、添加液として、上述したような緩衝液を用いた場合、添加液を添加した後の溶出液における緩衝液の濃度は、好ましくは０．１Ｍ以上、５．０Ｍ以下程度、より好ましくは０．５Ｍ以上、２．５Ｍ以下程度に設定される。溶出液における緩衝液の濃度をかかる範囲内に設定することにより、精製タンパク質をより高精度に精製することができる。
【０１５６】
なお、溶出液は、そのイオン強度が、添加液を添加することで、経時的に変化しない一定のものであっても良いし、経時的に高くなるように変化するものであっても良い。ただし、経時的に変化するものとすることで、所定の分画内に、より優れた精度で精製タンパク質を溶出させることができる。
【０１５７】
また、溶出液の流速は、０．１〜１０ｍＬ／分程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／分程度であるのがより好ましい。このような流速で、精製タンパク質の分離を行うことにより、分離操作に長時間を要することなく、目的とする精製タンパク質を確実に分離すること、すなわち、高純度な精製タンパク質を得ることができる。
【０１５８】
以上のような操作により、所定の画分に、精製タンパク質が回収される。
なお、本実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインを有する精製タンパク質を、より高精度に精製することを目的に、アフィニティークロマトグラフィー処理、陰イオン交換クロマトグラフィー処理およびフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理をこの順で施す３ステップで試料液を処理する場合について説明したが、精製する精製タンパク質の種類等によっては、アフィニティークロマトグラフィー処理および陰イオン交換クロマトグラフィー処理のうちの少なくとも一方を省略することができる。
【０１５９】
また、上記のような３ステップの処理の他に、疎水性相互作用クロマトグラフィー処理、金属親和性クロマトグラフィー処理、体積排除クロマトグラフィー処理、限外濾過処理等の他の処理を、試料液に施すようにしてもよい。
【０１６０】
以上、本発明の精製方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１６１】
例えば、本発明では、任意の目的で、工程［４−１］の前工程、各工程［４−１］〜［４−４］同士の間に存在する中間工程、または工程［４−４］の後工程を追加するようにしてもよい。
【実施例】
【０１６２】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
・精製タンパク質（モノクローナル抗体）の吸着量の測定
【０１６３】
（実施例）
−１−  まず、セラミックフルオロアパタイト Type II、４０μｍ（Bio−rad Laboratories, Inc.）を吸着剤として詰めたφ４．０ｘ１００ｍｍのステンレス製カラム（吸着装置）を用意した。
【０１６４】
−２−  次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を吸着装置に供給することで、吸着剤をこの緩衝液で平衡化した。
【０１６５】
−３−  次に、アフィニティークロマトグラフィー処理を施すことで精製されたモノクローナル抗体を、吸着装置に供給した。
【０１６６】
−４−  次に、溶出液を吸着装置に１ｍＬ／ｍｉｎの流速で５分間供給して、カラム内から流出する流出液を回収した。
【０１６７】
なお、溶出液には、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、１ＭのＮａＣｌを添加したものを用いた。
【０１６８】
−５−  次に、４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を吸着装置に供給することで、吸着剤を洗浄した。
【０１６９】
（比較例）
吸着装置が備える吸着剤として、セラミックフルオロアパタイトに代えて、セラミックハイドロキシアパタイトType II、４０μｍ（Bio−rad Laboratories, Inc.）を用いたこと以外は、前記実施例と同様にして、前記−１−〜−５−の工程を行うことでモノクローナル抗体の精製を行なった。
【０１７０】
以上のような実施例および比較例でそれぞれ得られた流出液について、流出液に含まれる単量体（モノマー）と、凝集体とを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析装置（Bio−rad Laboratories, Inc.）を用いて、それぞれ測定し、得られた測定値から、流出液中に含まれる単量体の含有率（すなわち、単量体／抗体の総量（単量体＋凝集体））を求めた。
【０１７１】
その結果、実施例で得られた流出液中に含まれる単量体の含有率は９０％であったのに対して、比較例で得られた流出液中に含まれる単量体の含有率は８０％であった。
以上のことから、吸着装置が備える吸着剤として、セラミックフルオロアパタイトを用いた場合では、セラミックハイドロキシアパタイトを用いた場合と比較して、凝集体の混入を防止して、高精度にモノクローナル抗体（単量体）を精製し得ることが判った。
【符号の説明】
【０１７２】
１            吸着装置
１Ａ          第１の吸着装置
１Ｂ          第２の吸着装置
１Ｃ          第３の吸着装置
２            カラム
２０          吸着剤充填空間
２１          カラム本体
２２、２３    キャップ
２４          流入管
２５          流出管
３            吸着剤
４、５        フィルタ部材
【図１】
2013234154.tif 000002