(57)【要約】【課題】髄膜腫の治療において有用な髄膜腫治療用医薬組成物を提供すること。【解決手段】ＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害性を発揮する物質、又はＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性を誘導する活性を有する物質を有効成分として含有する髄膜腫治療用医薬組成物が提供される。ＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害性を発揮する物質は、例えば「ＷＴ１発現細胞特異的細胞傷害活性を有する細胞」及び「ＷＴ１発現細胞を特異的に認識する抗体」からなる群より選択される物質である。ＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性を誘導する活性を有する物質は、例えば、「ＷＴ１」、「ＷＴ１由来ペプチド」、「ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞」、「ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプター」及び「ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプターをコードする核酸」からなる群より選択される物質である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害性を発揮する物質、又はＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性を誘導する活性を有する物質を有効成分として含有する髄膜腫治療用医薬組成物。
【請求項２】
ＷＴ１発現細胞特異的細胞傷害性を有する細胞を有効成分として含有する請求項１記載の髄膜腫治療用医薬組成物。
【請求項３】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）又はキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する細胞を含有する請求項２記載の髄膜腫治療用医薬組成物。
【請求項４】
ＷＴ１、ＷＴ１由来ペプチド、ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞から選択される有効成分を含有する請求項１記載の髄膜腫治療用医薬組成物。
【請求項５】
ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞が抗原提示細胞である請求項４記載の髄膜腫治療用医薬組成物。
【請求項６】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプター又は前記レセプターをコードする核酸から選択される有効成分を含有する請求項１記載の髄膜腫治療用医薬組成物。
【請求項７】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸を含有する請求項６記載の髄膜腫治療用医薬組成物。
【請求項８】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸がウイルスベクター粒子に含有される請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識する抗体又はその抗体の抗原認識部位を含むポリペプチドを有効成分として含有する請求項１記載の髄膜腫治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は髄膜腫の治療において有用な、ＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害活性を発揮する物質、又はＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害活性を誘導する活性を有する物質を有効成分として含有する髄膜腫治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍は脳を構成する神経細胞、グリア細胞等が個々に変異して生じたとされており、起源となる細胞によって形態学的に非常に多彩な像を示し、そのため病理学的分類も非常に複雑になっている。国際的にはＷＨＯ分類が広く用いられている。ＷＨＯ分類による組織分類と、その発生頻度は、神経膠腫２８％、髄膜腫２６％、下垂体腺腫１７％、神経鞘腫１１％、胚細胞腫瘍２．１％、リンパ腫造血器腫瘍（頻度不明）である。神経膠腫の中で最も頻度が高いのが星細胞腫であり、神経膠腫の約８０％を占める。
【０００３】
ＷＴ１遺伝子は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子の１つとして単離された遺伝子（非特許文献１）に由来し、成長因子遺伝子（ＰＤＧＦα鎖、ＣＳＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ）、成長因子レセプター遺伝子（ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ）や、その他の遺伝子（ＲＡＲ−α、Ｃ−ｍｙｂ、Ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｌ−２、オルニチン脱炭酸酵素、Ｎ−ｍｙｃ）の転写を抑制する。一方、ＷＴ１遺伝子は、ＲｂＡｐ４６、Ｄａｘ−１、ｂｃｌ−２遺伝子の転写を促進することが知られている。ＷＴ１遺伝子は、白血病や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌においても高発現していると言われている（特許文献１）。これらの疾患においては腫瘍発生に関与し、固形癌や造血器腫瘍の発症や進展に重要な役割を果たしているとされている。
【０００４】
造血器腫瘍等を有する患者において、ＷＴ１由来のタンパク質に対する液性免疫反応及びＣＤ８陽性Ｔ細胞による細胞性免疫反応が自然に誘導されることが知られている。また、ＷＴ１からＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識する複数の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープペプチドが同定されている。例えば、ヒト白血球型抗原ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性の１２６−１３４ペプチド、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性の２３５−２４３ペプチドなどが報告されている。これらペプチドを認識するＣＴＬは、ＷＴ１抗原を発現する腫瘍細胞をＨＬＡ拘束性に傷害することが報告されている。ＷＴ１遺伝子は正常造血幹細胞を除く正常細胞での発現は極めて低レベルであるが、正常造血幹細胞には腫瘍細胞と同等の発現があるとされている。しかし、ＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬを用いたヒトｉｎ  ｖｉｔｒｏコロニー形成能阻害実験や、マウスにおけるＷＴ１ペプチドワクチンによるｉｎ  ｖｉｖｏ実験においては、正常造血幹細胞への傷害性はみられていない（非特許文献２）。
【０００５】
現在、様々な腫瘍細胞の表面に発現している腫瘍抗原が多数見出され、それぞれの腫瘍細胞や正常組織での発現強度が報告されている。これらの腫瘍抗原を標的とする細胞性免疫又は液性免疫に基づく治療が研究されているが、腫瘍と腫瘍抗原は多種多様であり、それぞれの腫瘍の治療に適切な腫瘍抗原の選択と選択した腫瘍抗原に基づく治療戦略を見出すべく試行錯誤が続けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７６９６１８０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】モレキュラー  セル  バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１１巻、第１７０７頁（１９９１）
【非特許文献２】ジャパニーズ  ジャーナル  オブ  クリニカル  オンコロジー（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）、第４０巻、第３７７−３８７頁（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、髄膜腫の治療において有用な髄膜腫治療用医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害性を発揮する物質、又はＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性を誘導する活性を有する物質を有効成分として含有する髄膜腫治療用医薬組成物を見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち本発明を概説すれば、
［１］  ＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害性を発揮する物質、又はＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性を誘導する活性を有する物質を有効成分として含有する髄膜腫治療用医薬組成物、
［２］  ＷＴ１発現細胞特異的細胞傷害性を有する細胞を有効成分として含有する［１］記載の髄膜腫治療用医薬組成物、
［３］  ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）又はキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する細胞を含有する［２］記載の髄膜腫治療用医薬組成物、
［４］  ＷＴ１、ＷＴ１由来ペプチド、ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞から選択される有効成分を含有する［１］記載の髄膜腫治療用医薬組成物、
［５］  ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞が抗原提示細胞である［４］記載の髄膜腫治療用医薬組成物、
［６］  ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプター又は前記レセプターをコードする核酸から選択される有効成分を含有する［１］記載の髄膜腫治療用医薬組成物、
［７］  ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸を含有する［６］記載の髄膜腫治療用医薬組成物、
［８］  ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸がウイルスベクター粒子に含有される［７］記載の医薬組成物、
［９］  ＷＴ１発現細胞を特異的に認識する抗体又はその抗体の抗原認識部位を含むポリペプチドを有効成分として含有する［１］記載の髄膜腫治療用医薬組成物、に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、髄膜腫の治療において有用な髄膜腫治療用医薬組成物が提供される。本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は髄膜腫に対する高い細胞傷害性又は細胞傷害性を誘導する高い活性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】髄膜腫でのＷＴ１遺伝子の発現を示す図である。
【図２】実施例で使用するＷＴ１−ＴＣＲ発現ベクターの構造を示す図である。
【図３】ＷＴ１−ＴＣＲを発現する細胞の細胞内サイトカイン量を示す図である。
【図４】ＷＴ１−ＴＣＲを発現する細胞の細胞傷害活性を示す図である。
【図５】悪性頭蓋底髄膜腫マウスモデルの腫瘍サイズを示す図である。
【図６】正常組織及び腫瘍に浸潤したＣＤ８陽性細胞数を示す図である。
【図７】悪性頭蓋底髄膜腫マウスモデルの生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「髄膜腫」とは、脳を包む髄膜（軟膜、くも膜、硬膜）から発生した腫瘍の総称を示し、良性髄膜腫、異形性髄膜腫及び退形成髄膜腫を含む。腫瘍が巨大になった場合には、頭蓋内腔全体の圧力が上昇して頭痛、吐き気などが見られる。樹立化された髄膜腫細胞株が複数報告されており、ＩＯＭＭ−Ｌｅｅ［ニューロサージェリー（Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ）、第２７（３）巻、第３８９−３９５頁（１９９０）］、ＨＫＢＭＭ［ヒューマンセル（Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ）、第１７（４）号、第２１１−２１７頁（２００４）］が例示される。
【００１４】
本明細書において「ＷＴ１」とは、前記の通りＷｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子の１つとして単離された遺伝子がコードするタンパク質である。アミノ酸配列はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００３６９．３に、塩基配列はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿０００３７８．４に記載される。ＷＴ１のアミノ酸配列を配列番号１４に示す。細胞におけるＷＴ１の発現は、例えば特許文献１に記載される方法で定量することができる。
【００１５】
本明細書において「Ｔ細胞」とは、Ｔリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球のうち胸腺に由来する細胞を意味する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、α鎖とβ鎖のＴＣＲを発現するαβＴ細胞、γ鎖とδ鎖のＴＣＲを発現するγδＴ細胞が含まれる。「Ｔ細胞を含有する細胞集団」としては、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄液の他、これらより採取、単離、精製、誘導された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、血球系細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球などを含む細胞集団が例示される。また、Ｔ細胞を含有する血球系細胞由来の種々の細胞集団を本発明に使用できる。これらの細胞は抗ＣＤ３抗体やＩＬ−２などのサイトカインにより生体内（イン・ビボ）や生体外（エクス・ビボ）で活性化されていても良い。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたものをそのまま又は凍結保存したもののいずれも使用することができる。
【００１６】
本明細書において「ＴＣＲ」とは、細胞表面に提示された抗原−ＭＨＣ分子（主要組織適合遺伝子複合体）を認識するＴ細胞の細胞表面に存在するレセプターである。ＴＣＲは、α鎖とβ鎖からなるヘテロダイマー、γ鎖とδ鎖からなるヘテロダイマーが知られているが、本発明においていずれも好適に使用できる。
【００１７】
本明細書において「キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）」とは、抗原に結合する細胞外ドメイン、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質をいう。「キメラ受容体」、「Ｔ−ｂｏｄｙ」、「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることがある。「抗原に結合する細胞外ドメイン」は、ある抗原に結合することができる任意のオリゴ又はポリペプチドを示し、「細胞内ドメイン」は細胞内で生物学的プロセスの活性化又は阻害をもたらすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴ又はポリペプチドを意味する。
【００１８】
本発明の髄膜腫治療用医薬組成物はＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害性を発揮する物質、又はＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性を誘導する活性を有する物質を有効成分として含有する。ＷＴ１発現細胞に対して細胞傷害性を発揮する物質は、例えば「ＷＴ１発現細胞特異的細胞傷害活性を有する細胞」及び「ＷＴ１発現細胞を特異的に認識する抗体」からなる群より選択される物質である。ＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性を誘導する活性を有する物質は、例えば、「ＷＴ１」、「ＷＴ１由来ペプチド」、「ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞」、「ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプター」及び「ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプターをコードする核酸」からなる群より選択される物質である。以下に各物質について詳細に記載する。
【００１９】
（１）ＷＴ１を特異的に認識するレセプターをコードする核酸
本発明の一つの態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプターをコードする核酸を有効成分として含有する。当該レセプターとしては、例えば、ＴＣＲやＣＡＲが例示される。したがって、本発明のさらなる態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸を有効成分として含有する。
本発明の一つの態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲをコードする核酸を有効成分として含有する。ここで、「ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ」はＷＴ１由来のペプチドとＭＨＣとの複合体に結合する能力を有するＴＣＲを意味する。当該ＴＣＲをコードする核酸は、生体中に存在するＴ細胞を含有する細胞集団からＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴ細胞を選別し、このＴ細胞から調製することができる。例えば、哺乳動物からＴ細胞を含有する細胞集団（例えばＰＢＭＣ）を採取して、ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチド存在下でこれらの細胞集団を刺激しながら培養する。この細胞集団から、ＷＴ１発現細胞に対する特異性と、ＣＤ８やＣＤ４等の細胞表面抗原を指標として単離したＣＴＬやヘルパーＴ細胞、ナイーブＴ細胞から公知の方法でＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲをコードする核酸を調製することができる。Ｔ細胞を含有する細胞集団の採取は、例えばＷＴ１陽性の腫瘍のような疾患を有する生体から実施することが好ましい。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性のＣＴＬクローンＴＡＫ−１［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第９５巻、第２８６−２９３頁（２０００）］は、Ｖα２０／Ｊ３３／ＣαのＴＣＲα鎖遺伝子及びＶβ５．１／Ｊ２．１／Ｃβ２のＴＣＲβ鎖遺伝子を有している。Ｔ細胞のＷＴ１発現細胞特異性は、例えば、クロム放出アッセイ又は増殖アッセイを利用して、溶解性や増殖性を陰性コントロールと比較して測定することができる。また、サイトカインの産生を測定してＴ細胞のＷＴ１発現細胞特異性を評価することができる。
【００２０】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲを発現する細胞から抽出したＤＮＡを鋳型として、ＴＣＲの定常領域の核酸配列を基にＴＣＲ遺伝子を増幅し、クローニングすることができる。また、常法により細胞からＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域をそれぞれコードする核酸に相補的なアンチセンスプライマーを用いて５’−ラピッド  アンプリフィケーション  オブ  ｃＤＮＡ  エンド（ＲＡＣＥ）を行うことにより調製することができる。５’−ＲＡＣＥは公知の方法により行えばよく、例えばＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）のような市販のキットを用いて行うことができる。前記手法により増幅されたＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換する。形質転換体からプラスミドを調製し、挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定する。得られた塩基配列と既知のＴＣＲα鎖又はβ鎖の遺伝子の配列を比較することにより、５’−ＲＡＣＥにより増幅された、ＴＣＲ遺伝子とは無関係のＤＮＡを除外することができる。
【００２１】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲをコードする核酸をＴ細胞に導入する場合に、当該Ｔ細胞が本来発現する内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現をｓｉＲＮＡによって抑制することにより、ＷＴ１発現細胞を認識するＴＣＲを高い比率で発現するＴ細胞を得る方法が知られている（国際公開第２００８／１５３０２９号パンフレット）。前記の核酸を当該方法に適用する場合、その塩基配列を、内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現を抑えるｓｉＲＮＡが作用するＲＮＡに対応する塩基配列とは異なる配列（コドン変換型配列）とすることにより、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲを高い比率で発現するＴ細胞を得ることができる。前記の塩基配列は、天然から取得されたＴＣＲをコードする核酸へのサイレント変異の導入や、人為的に設計した核酸を化学的に合成することで作製することができる。
【００２２】
本発明の別の態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＣＡＲをコードする核酸を有効成分として含有する。当該核酸は、ＷＴ１に結合する細胞外ドメイン、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸である。ＣＡＲについては、  カレント  オピニオン  イン  イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第２１巻、第２１５−２２３頁（２００９）に総説されている。
【００２３】
ＷＴ１に結合する細胞外ドメインは、ＷＴ１に結合することができるオリゴ又はポリペプチドを含むドメインである。このドメインは、ＷＴ１と結合し、相互作用することによりＣＡＲに特異性を付与する。ＣＡＲに使用可能な細胞外ドメインとしては、抗ＷＴ１抗体（Ｈ鎖及びＬ鎖）、ＴＣＲの可変領域（ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ）に由来するものが例示される。これらのタンパク質全体を使用するのが有効なこともあるが、例えば、抗体Ｆａｂフラグメント又は抗体可変領域［Ｈ鎖のＶ領域（ＶＨ）及びＬ鎖のＶ領域（ＶＬ）］を使用することができる。特に単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が好適に使用できる。
【００２４】
ＣＡＲの細胞内ドメインは、同一分子内に存在する細胞外ドメインがＷＴ１と結合（相互作用）した際に、細胞内にシグナルを伝達することが可能な分子である。ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する一次細胞質シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインが例示される。また、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ及びＣＤ１５４に由来する二次細胞質シグナル伝達配列を含む細胞内ドメインが例示される。
【００２５】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲの膜貫通ドメインを使用することができる。また、人為的に設計した配列でもよい。
【００２６】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識したＴＣＲ又はＣＡＲは、その細胞内ドメインを介して細胞内にシグナルを伝達して細胞を刺激する。刺激を受けた細胞はサイトカイン等を産生し、ＷＴ１発現細胞に対し細胞傷害性を発揮し、又は他の免疫細胞の細胞傷害性を誘導することができる。このＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸は、生体より得られた核酸を増幅することにより得られた核酸及びこれらの核酸を連結した核酸を使用してもよいし、同じ配列を有する核酸を化学合成して使用してもよい。更に、前記の核酸と同じアミノ酸配列をコードする、前記核酸とは異なる塩基配列の核酸を作製して使用することもできる。前記核酸とは異なる塩基配列の核酸の設計の際には、細胞におけるコドンの使用頻度やその他の目的に基づいて使用するコドンを選択することが可能である。
【００２７】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸は、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別の核酸と連結することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター等の哺乳類由来プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、各種レトロウイルスのＬＴＲプロモーター等のウイルス由来プロモーターを使用することができる。また、核酸の効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含む核酸を連結してもよい。また、更に核酸の発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。なお、ＴＣＲα鎖ポリペプチドをコードする核酸とＴＣＲβ鎖ポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ別のプロモーターにより転写、翻訳されてもよく、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）又は自己消化性２Ａペプチドを使用して一つのプロモーターで転写、翻訳されてもよい。
また、ＷＴ１を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸は、ウイルスベクター粒子中に含有されていてもよい。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。常法により、ＷＴ１を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸を適当なウイルスベクター中に挿入することによって、該核酸をウイルスベクター粒子中に含有させることができる。
【００２８】
本発明は、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸を有効成分として、薬学的に許容できる賦形剤と共に含む髄膜腫治療用医薬組成物を提供する。適している賦形剤は、当業者にはよく知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水溶液、生理食塩液、グリコール又はエタノールなどの溶液及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含む。湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、及びｐＨ緩衝剤も使用することができる。薬学的に許容できる賦形剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）に記載される。組成物は、非経口投与、例えば、注射又は注入に適した公知の形態とすることができる。更に、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤補助剤、保存中の有効期限を延ばすために保存剤を使用することができる。組成物は、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。微粒子仲介投与用には、顕微鏡サイズの金粒子などの粒子上にＤＮＡをコーティングすることができる。有効成分が核酸である場合の投与量としては、例えば、１回につき体重１ｋｇあたり該核酸が０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲で投与される。例えば、ヒト患者に投与する場合、体重６０ｋｇの患者に対し０．００１〜５０ｍｇの範囲で投与される。有効成分がウイルスベクター粒子である場合の投与量は、体重６０ｋｇの対象に対して、１回につき、例えばウイルスの力価として約１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１５ｐｆｕの範囲で投与される。
【００２９】
（２）ＷＴ１特異的細胞傷害活性を有する細胞
本発明の別の態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物はＷＴ１発現細胞特異的細胞傷害活性を有する細胞を有効成分として含有する。当該細胞は、例えば、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲを発現する細胞である。このような細胞は前記（１）に記載するように生体からＷＴ１を特異的に認識する細胞を採取すること、又は前記（１）に記載するＷＴ１を特異的に認識するＴＣＲもしくはＣＡＲをコードする核酸を細胞に導入すること、ＷＴ１由来ペプチドを提示する抗原提示細胞によりＴ細胞又はその前駆細胞を刺激すること、等の方法により調製することができる。これらの細胞は、ＴＣＲ又はＣＡＲを介してＷＴ１発現細胞と結合することにより細胞内にシグナルが伝達され活性化される。ＴＣＲ又はＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類や細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、ＷＴ１を発現する髄膜腫細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等を刺激する。従って、本発明の組成物は養子免疫療法において有用である。
【００３０】
前記細胞を調製するためのＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸の導入は、ヒト生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で実施される。核酸を導入する細胞は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。また、細胞の種類としては、例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。ＰＢＭＣ、免疫細胞［樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球又はＮＫ細胞、血球系細胞（好中球、好塩基球、単球）］、造血幹細胞、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、血球細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。本発明においては、特にＴ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）又はこれらを含有する細胞集団の使用が好ましい。Ｔ細胞には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、又はＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞及びＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののどちらでもよい。核酸を導入した細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが好ましい。
【００３１】
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲをコードする核酸をベクターに挿入して、このベクターを細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲをコードする核酸をＴ細胞に導入する場合、前記（１）に記載するように、当該Ｔ細胞が本来発現する内在性のＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の発現をｓｉＲＮＡによって抑制することにより、ＷＴ１発現細胞を認識するＴＣＲを高い比率で発現するＴ細胞を得ることができる。
【００３２】
また、リポソーム及び国際公開第９６／１００３８号パンフレット、国際公開第９７／１８１８５号パンフレット、国際公開第９７／２５３２９号パンフレット、国際公開第９７／３０１７０号パンフレット及び国際公開第９７／３１９３４号パンフレットに記載されている陽イオン脂質などの縮合剤との併用により、本発明に非ウイルスベクターも使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明の核酸を導入することができる。
【００３３】
例えばレトロウイルスベクターを使用する場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製して実施することができる。例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５２７８０５６号公報）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［米国科学アカデミー紀要、第８５巻、第６４６０−６４６４頁（１９８８）］のパッケージング細胞が例示される。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することもできる。多くの種類のレトロウイルスを基に製造されたレトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、各社より広く市販されている。
【００３４】
ＷＴ１発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有する細胞は、対象に投与する前に適切な培地及び／又は刺激分子を使用して培養及び／又は刺激を行ってもよい。刺激分子にはサイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分が含まれる。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ等が例示され、好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。また、適当なタンパク質としては、例えばＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、抗ＩＬ−４抗体が例示される。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。更に、培地中に血清や血漿を添加してもよい。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０容量％〜２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清や血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用される。
【００３５】
細胞の培養に使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の細胞集団を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られる細胞集団の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
【００３６】
本発明において、ＷＴ１発現細胞に特異的な細胞傷害活性を有する細胞を有効成分として含有する医薬組成物は、非経口的に対象に投与して用いる。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、及び皮下投与などの方法が包含される。抗腫瘍作用を高めるため、髄膜腫又は近傍の組織、例えば皮下に投与することもできる。また、投与量は、対象の状態、体重、年齢等応じて適宜選択されるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り、１０７〜１０９細胞程度、好ましくは、５×１０７〜５×１０８細胞程度投与される。本発明の医薬組成物は、１回又は複数回にわたって投与することができる。本発明の医薬組成物は、非経口投与に適した公知の形態、例えば、注射又は注入剤とすることができる。本発明の医薬組成物は、適宜、薬理学的に許容できる賦形剤を含んでいてもよい。薬理学的に許容できる賦形剤としては、前記（１）に記載のものが挙げられる。本発明の医薬組成物は、また、細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含んでもよい。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。
【００３７】
（３）ＷＴ１を特異的に認識するレセプター
本発明の別の態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するレセプターを有効成分として含有する。当該レセプターは、例えばＴＣＲやＣＡＲが例示される。当該ＴＣＲ又はＣＡＲは、前記（１）の核酸や（２）の細胞を利用して製造することができる。したがって、本発明のさらなる態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１発現細胞を特異的に認識するＴＣＲ又はＣＡＲを有効成分として含有する。
【００３８】
前記のレセプターを有効成分として含有する医薬組成物の投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。抗腫瘍作用を高めるため、髄膜腫又は近傍の皮下に投与することもできる。投与量は、治療に有効な量であればよく、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象に対し１日当りのポリペプチド有効量として体重６０ｋｇの対象に対し０．０００１μｇ〜１０００μｇ、好ましくは０．００１μｇ〜１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。
前記のレセプターを有効成分として含有する医薬組成物は、適宜、薬理学的に許容できる賦形剤、湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、ｐＨ緩衝剤、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤補助剤を含有していてもよい。薬理学的に許容できる賦形剤としては、前記（１）に記載のものが挙げられる。本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、粉末剤、液剤などの経口投与形態、または注射剤、注入剤などの非経口投与形態であってもよい。また、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。
【００３９】
（４）ＷＴ１及びＷＴ１由来ペプチド
本発明の別の態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドを有効成分として含有する。本発明には、遺伝的に改変されていない生物によって発現される天然のＷＴ１又は遺伝子組換え技術により調製された組換えＷＴ１が使用できる。更に、ＷＴ１の改変体を使用することができる。改変体は、そのタンパク質の免疫原性が保持されるように、１つ以上、好ましくは１０以下のアミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入において天然のタンパク質と異なるポリペプチドである。例えば、ＷＴ１改変体は、免疫原性部分内の１〜３アミノ酸残基が置換され、その結果、抗原特異的抗血清及び／又はＴ細胞株との反応が、天然のタンパク質に比べて向上している。特に、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合性が向上することが好ましい。ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドは抗原提示細胞に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々のＷＴ１由来ペプチドがＭＨＣ分子と結合して複合体を形成し、当該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示される。この複合体に特異的なＣＴＬが増殖し、ＷＴ１発現細胞に対する細胞傷害性が誘導される。
【００４０】
ＷＴ１由来ペプチドは、ＷＴ１の免疫原性部分を含むペプチドで、少なくとも９アミノ酸のＷＴ１由来の配列を含む任意の長さである。例えば、９〜４００アミノ酸、好ましくは９〜２００アミノ酸、より好ましくは９〜５０アミノ酸、特に好ましくは９〜２５アミノ酸である。ＷＴ１由来ペプチドはＴＣＲによって認識され特異的に結合するペプチドで、ＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。これらの分子とＷＴ１由来ペプチドとの結合は、当該分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能で、例えば、ペプチドがＭＨＣクラスＩに結合する能力は、１２５Ｉで標識されたβ２ミクログロブリン（β２ｍ）のＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体複合体への取り込みを促進する能力をモニターすることや、ペプチド競合アッセイによって評価することができる。例えばＷＴ１由来ペプチドとして、ヒトＷＴ１（配列番号１４）のアミノ酸番号６〜２２、アミノ酸番号１１７〜１３９、アミノ酸番号２４４〜２６２、アミノ酸番号２４４〜２５２、アミノ酸番号２３５〜２４３、アミノ酸番号１３６〜１４４、アミノ酸番号２２５〜２３３、アミノ酸番号１０〜１８、アミノ酸番号１２６〜１３４、アミノ酸番号３７〜４５、アミノ酸番号３７〜４６のペプチドが使用できる。
【００４１】
ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドは、そのＮ末端にシグナル配列や固体支持体への結合を増強するためのリンカー配列を結合させることができる。例えば、ＦＬＡＧ、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等の公知のペプチドを結合させることができる。このようにして作製された融合タンパク質を適切なプロテアーゼで処理し、目的のペプチドを回収することにより、タンパク質又はペプチドを調製してもよい。
【００４２】
ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドは、それらをコードする核酸から調製することができる。例えば、組換えＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドをコードする核酸を含む任意の発現ベクターを用いて形質転換した適切な宿主細胞により調製することができる。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞及び高等真核生物細胞を使用することができる。例えば、大腸菌、酵母細胞又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳもしくはＣＨＯ）を使用することができる。天然に発現しているＷＴ１や、宿主細胞により製造されたＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドは、フィルターを使用して濃縮され、適切な精製マトリクス（例えば、アフィニティーマトリクス又はイオン交換樹脂）を使用して精製してもよい。
【００４３】
ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドは、そのアミノ酸配列に基づいて合成して得ることができる。ペプチドの合成は、通常のペプチドの化学的合成に用いられる方法に準じて行うことが可能である。通常用いられる合成方法は、例えば、ペプチド  シンセサイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版、（１９６６）、ザ  プロテインズ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、第２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．出版（１９７６）、ペプチド合成、丸善（株）出版（１９７５）、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）出版（１９８５）、国際公開第ＷＯ９９／６７２８８号パンフレット等に記載されている。
【００４４】
ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドを有効成分とする髄膜腫治療用医薬組成物は、細胞性免疫が効果的に成立するように薬理学的に許容可能なキャリア又は賦形剤を含むことができる。更に、タンパク質やペプチドを輸送するためのデリバリーシステムを利用することができる。例えば、アジュバント又はリポソームなどの非特異的免疫応答エンハンサーを利用することができ、ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドに対するＴ細胞応答のレベルを増強することができる。アジュバントとしては、文献［クリニカル  マイクロバイオロジカル  レビュー（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）、第７巻、第２７７−２８９頁（１９９４）］に記載のものなどが利用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールのような界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、又は油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、本発明の医薬組成物は、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などにすることもできる。
【００４５】
ＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドを有効成分として含有する髄膜腫治療用医薬組成物の投与方法としては、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが利用でき、全身投与、髄膜腫又は近傍の組織、例えば皮下に局所投与しても良い。本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、粉末剤、液剤などの経口投与形態、または注射剤、注入剤などの非経口投与形態であってもよい。また、使用前に適切な無菌の液体により再構成するための乾燥形態であってもよい。タンパク質又はペプチドの投与量は、対象の年齢、体重、投与方法等により適宜調整することができるが、通常体重６０ｋｇの対象に対し０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。当業者であれば、適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、本発明の組成物は、徐放性処方物（投与後に有効成分の緩やかな放出をもたらす、カプセル又はスポンジのような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、周知の技術を使用して調製することができ、例えば、経口、直腸、皮下又は所望の標的部位の埋め込みによって投与され得る。
【００４６】
（５）ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞
本発明の別の態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞（抗原提示細胞）を有効成分として含有する。当該抗原提示細胞は、前記（４）に記載するペプチドとＭＨＣ分子（ＨＬＡ抗原）との複合体が提示された抗原提示細胞であれば良い。このような抗原提示細胞は、生体から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞にＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドを体外でパルスするか、又はＷＴ１又はＷＴ１由来ペプチドを発現するベクターを細胞内に導入して細胞表面に提示させることにより作製することができる。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、ＷＴ１由来ペプチドを提示可能なＭＨＣ分子を細胞表面に発現している細胞（マクロファージ、Ｂ細胞等）であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が特に好ましい。樹状細胞を用いる場合は、例えば、生体の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、次いで非付着細胞を除去し、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導して、当該樹状細胞をペプチドと共に培養してパルスすることにより、抗原提示細胞を調製することができる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞を含有する細胞集団から前記（２）に記載するＷＴ１を特異的に認識するＴＣＲを発現する細胞を誘導するのに有用である。
【００４７】
本発明において、ＷＴ１由来ペプチドを提示する細胞を有効成分として含有する医薬組成物は、非経口的に対象に投与して用いる。本発明の医薬組成物は、非経口投与に適した公知の形態、例えば、注射又は注入剤とすることができる。本発明の医薬組成物は、適宜、薬理学的に許容できる賦形剤を含んでいてもよい。薬理学的に許容できる賦形剤としては、前記（１）に記載のものが挙げられる。本発明の医薬組成物は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。培地としては、特に限定するものではないが、ＲＰＭＩ、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ１０などの培地が一般的に挙げられる。非経口的な投与方法としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、及び皮下投与などの方法が包含される。抗腫瘍作用を高めるため、髄膜腫又は近傍の組織、例えば皮下に投与することもできる。更に、免疫賦活剤、免疫調整剤などと共に投与することができる。また、投与量は、対象の状態、体重、年齢等応じて適宜選択されるが、通常、細胞数として、体重６０ｋｇの対象に対し、１回当り１０７〜１０９細胞程度、好ましくは、５×１０７〜５×１０８細胞程度投与される。抗原提示細胞を生体に投与することにより、生体内で効率良くＷＴ１特異的ＣＴＬが活性化され、髄膜腫細胞に対して細胞性免疫が誘導される。
【００４８】
（６）ＷＴ１を特異的に認識する抗体
本発明の別の態様において、本発明の髄膜腫治療用医薬組成物は、ＷＴ１を特異的に認識する抗体又はその抗体の抗原認識部位を含むポリペプチドを有効成分として含有する。これらの抗体やポリペプチドはポリクローナル抗体由来であってもよく、モノクローナル抗体由来でもよい。これらの抗体やポリペプチドは髄膜腫細胞の表面上に存在するＷＴ１と特異的に結合し、髄膜腫細胞に対する細胞性免疫を誘導する。
【００４９】
ＷＴ１を特異的に認識する抗体は、当業者に公知の技術により調製することができる。例えば、前記（４）に記載するＷＴ１やＷＴ１由来ペプチドを抗原として、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ等の哺乳動物に注射して免疫を誘導する。特に比較的短いペプチドに対しては、キャリアタンパク質［例えば、ウシ血清アルブミン又はＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）］に結合させてもよい。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇの抗原−アジュバント混合物を投与することにより行われる。免疫された哺乳動物から定期的に採血し、抗血清から、例えば適切な固形支持体と結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによってＷＴ１に対して特異的なポリクローナル抗体が精製される。
【００５０】
ＷＴ１を特異的に認識するモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって作製されたハイブリドーマを使用して製造される。前記ハイブリドーマは、抗ＷＴ１抗体産生細胞の集団と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ＷＴ１を認識する抗体を産生するクローンを選択することによって樹立される。クローン化されたハイブリドーマからのモノクローナル抗体の調製は公知の方法、例えば実験動物腹腔内でのハイブリドーマの増殖及び腹水からのモノクローナル抗体精製手法を利用することで達成できる。さらに、こうして得られた動物由来のモノクローナル抗体をヒト化する手法も公知である。
【００５１】
抗体の抗原認識部位を含むポリペプチドとして、抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素を作用させ、抗体のＦｃ部分を除去して得られる、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントを使用することができる。更に、得られたモノクローナル抗体を基に、遺伝子工学的に製造される組換え抗体や、定常領域を他の抗体の定常領域に置換したキメラ抗体、二重特異性抗体（二価抗体）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ３、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ、ｉｎｔａｃｔ−ＩｇＧも使用することができる。これらのポリペプチドは、ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２３巻、第９号、第１１２６−１１３６頁（２００５）に詳述される。
更に、抗体の抗原認識部位は、前記（１）に記載するＣＡＲの細胞外ドメインとして使用することができる。
【００５２】
ＷＴ１を特異的に認識する抗体又はその抗体の抗原認識部位を含むポリペプチドを含有する医薬組成物は、必要に応じて、ポリペプチドに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。担体又は媒体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
【００５３】
また、必要に応じ本発明の抗体又はその抗原認識部位を含むポリペプチドをマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入しても良く、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる。更に、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の医薬組成物に適用し得る。
【００５４】
ＷＴ１を特異的に認識する抗体又はその抗体の抗原認識部位を含むポリペプチドを含有する医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、対象の年齢や体重、患者の症状、疾患の種類や進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定されるものであるが、一般に、体重６０ｋｇの対象に対し１日当たり、０．１〜２０００ｍｇを１〜数回に分けて投与することができる。より好ましくは１〜１０００ｍｇ／日、更により好ましくは５０〜５００ｍｇ／日、最も好ましくは１００〜３００ｍｇ／日である。これらの投与量は対象の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、対象の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。
【００５５】
また、ＷＴ１を特異的に認識する抗体又はその抗体の抗原認識部位を含むポリペプチドをコードする核酸を遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。これらの核酸の投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングするか、前記（２）に記載するウイルスベクターを使用して細胞に導入する、又は、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆して投与することができる。なお、これらの核酸の投与方法、投与量、同時に投与可能な賦形剤等は、前記（１）のＷＴ１を特異的に認識するレセプターをコードする核酸と同様である。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。
【００５７】
実施例１  髄膜腫におけるＷＴ１の発現
インフォームドコンセントを得て髄膜腫患者から採取された髄膜腫細胞２９サンプルと、悪性髄膜腫細胞株であるＨＫＢＭＭ細胞、Ｋｔｅｌｍｇｌ細胞、ＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞を用意した。各細胞よりキット（アンビオン社製）を用いてＲＮＡを抽出した。続いて、抽出したそれぞれのＲＮＡから、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（ロシュ社製）を使用してｃＤＮＡを調製した。同様に、正常脳ＲＮＡサンプルとして、Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＰａｎｅｌＩＩ（クロンテック社製）からもｃＤＮＡを調製した。調製したｃＤＮＡは−２０℃のフリーザー内で保存した。
【００５８】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ社製）を使用してＷＴ１遺伝子の発現を定量した。各ｃＤＮＡ並びに最終濃度０．５μＭのプライマー（配列番号１５及び１６）、０．２μＭのプローブ（配列番号１７）含む反応溶液２０μＬを調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  ｓｙｓｔｅｍによりＰＣＲを行った。インターナルコントロールとしてＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ（ロシュ社製）を使用し、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）により相対的なＷＴ１発現量を比較した。正常脳でのＷＴ１の発現量を１とした時の各サンプルでのＷＴ１発現量の相対値を図１に示す。図１中、縦軸はＷＴ１の正常脳の発現に対する相対値、横軸はサンプル番号及び髄膜腫細胞株名を示す。図１の通り、患者より採取された髄膜腫細胞及び髄膜腫由来の細胞株では、正常脳での発現と比較して、ＷＴ１遺伝子の発現量が数倍から数十倍上昇していることが分かった。
【００５９】
実施例２  ＷＴ１−ＴＣＲα及びβ遺伝子の作製
Ａｎ  Ｊら、インターナショナル  ジャーナル  オブ  ヘマトロジー（Ｉｎｔ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第９３巻、第１７６−１８５頁（２０１１）の記載に従い、腫瘍抗原ＷＴ１の２３５−２４３のペプチドを認識するＨＬＡ−Ａ２４０２拘束性のＴＣＲのα鎖遺伝子（Ｖα２０／Ｊ３３／Ｃα）及びＴＣＲβ鎖遺伝子（Ｖβ５．１／Ｊ２．１／Ｃβ２）を含む核酸断片をそれぞれ調製した。次に、こうして得られたＴＣＲα鎖遺伝子の、配列番号３、６で示されるＣ領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列（それぞれ配列番号１、４）を、それぞれ配列番号２、５の塩基配列に変換した。こうして野生型ＴＣＲ遺伝子と同じアミノ酸配列をコードするが、Ｃ領域をコードする部分の塩基配列が異なるコドン変換型のＷＴ１−ＴＣＲのα鎖遺伝子を作製した。同様に、ＴＣＲβ鎖遺伝子の、配列番号９、１２で示されるＣ領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列（それぞれ配列番号７、１０）を、それぞれ配列番号８、１１の塩基配列に変換したコドン変換型のＷＴ１−ＴＣＲのβ鎖遺伝子を作製した。以上の塩基配列変換の詳細を表１に示す。また、配列番号１３に示す人工遺伝子を合成した。この人工遺伝子は、ステム−ループ構造を形成する４種類の一本鎖ＲＮＡを転写する。これらの一本鎖ＲＮＡは細胞内でそれぞれ配列番号１、４、７、１０の塩基配列を標的とする、野生型ＴＣＲα鎖及び野生型ＴＣＲβ鎖遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを生成する。野生型とコドン変換型の塩基配列がコードするアミノ酸配列は共通であるが、コドン変換型ＴＣＲの塩基配列には変異が導入されているので、配列番号１３記載のＤＮＡより転写される二本鎖ｓｉＲＮＡによりコドン変換型ＴＣＲの発現は抑制されない。
【００６０】
【表１】
2013116891.tif 000002
【００６１】
実施例３  ＷＴ１−ＴＣＲ発現レトロウイルスベクターの作製
ｐＭＳＣＶｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型に、制限酵素ＸｈｏＩの認識配列が付加されたプライマーと制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列が付加されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＭＳＣＶの３’ＬＴＲ部位を増幅してＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで切断した。切断したＤＮＡ断片をｐＭＴベクター［ジーン  セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）、第１１巻、第９４−９９頁（２００４）に記載されているｐＭＴベクター］のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩサイトにクローニングし、ｐＭＳを作製した。次にｐＤＯＮ−５ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＭｌｕＩとＮｏｔＩで切断して、ヒトＥＦ１αの非翻訳領域を切り出し、ｐＭＳベクターのＭｌｕＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングし、ｐＭＳ３を得た。
【００６２】
実施例２で調製したコドン変換型のＷＴ１−ＴＣＲのα鎖遺伝子を含む核酸断片と、ｓｉＲＮＡを生成する人工遺伝子を含む核酸断片をｐＭＳ３のＡｐａＩ−ＮｏｔＩサイトにクローニングしてｐＭＳ３−ＷＴ１−Ａ−ｓｉを得た。
また、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）を鋳型に、制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩの認識配列が付加されたプライマーと制限酵素ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩの認識配列が付加されたプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＧＫプロモーター配列を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｏｔＩとＢａｍＨＩで切断した核酸断片を調製した。
最後に、実施例２で調製したコドン変換型のＷＴ１−ＴＣＲのβ鎖遺伝子を含む核酸断片と、ＰＧＫプロモーター配列を含む核酸断片をｐＭＳ３−ＷＴ１−Ａ−ｓｉのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングして、プラスミドベクターｐＭＳ３−ＷＴ１−ｓｉＴＣＲを得た。ｐＭＳ３−ＷＴ１−ｓｉＴＣＲのＬＴＲ間の構造を図２に示す。
【００６３】
実施例４  ＷＴ１−ＴＣＲ発現レトロウイルス溶液の作製及びヒトＰＢＭＣへの感染
実施例３で調製したｐＭＳ３−ＷＴ１−ｓｉＴＣＲにより大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体を得た。この形質転換体の保持するプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして以下の操作に供した。
調製したｐＭＳ３−ＷＴ１−ｓｉＴＣＲを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。この操作にはＲｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）をその製品プロトコールに従って使用した。得られた形質導入細胞よりエコトロピックウイルスを含有する上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過した。この上清を用いて、ポリブレンを使用する方法によりＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）にエコトロピックウイルスを感染させた。得られた細胞を培養して培養液上清を回収し、この上清を０．４５μｍフィルターによりろ過して得られたＷＴ１−ＴＣＲ発現レトロウイルス溶液をＭＳ３−ＷＴ１−ｓｉＴＣＲとした。
インフォームドコンセントの得られたヒト末梢血より分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に、ＭＳ３−ＷＴ１−ｓｉＴＣＲを、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）を用いた標準的な方法で２回感染させてＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞を作製し細胞を回収した。
【００６４】
実施例５  細胞内サイトカイン測定
実施例４で調製したＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞について、Ｔ細胞表現型及び細胞内ＩＦＮ−γ合成を、同時フローサイトメトリー評価法により測定した。まず、実施例４で調製したＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞をＲＰＭＩ−１６４０培養液（ＳＩＧＭＡ社製）中に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。この懸濁液を２４穴細胞培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）に０．５ｍＬ／ウェルで播種し、ここに１×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁したＨＬＡ−Ａ０２０７髄膜腫細胞株であるＫｔｅｌｍｇｌ細胞又はＨＬＡ−Ａ２４０２髄膜腫細胞株であるＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞をそれぞれ０．５ｍＬ／ウェルで添加した。対照として、ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞に代えてウイルスを感染させていないＰＢＭＣ（ＷＴ１−ＴＣＲ非導入細胞）を使用し、同様の操作を行った。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した（培養０時間目）。培養1時間後、各ウェルにＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を加えた後、更に培養を継続した。培養８時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳ及び０．１％ＮａＮ３を含むリン酸緩衝食塩水）で２度洗浄した。洗浄後の細胞にイソチオシアン酸フルオレッセイン（ＦＩＴＣ）結合抗ＣＤ８抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＩＦＮ−γ抗体（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を添加して氷上で３０分間染色し、続いてＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  キット（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を用いて細胞内サイトカイン染色を行った。これらをフローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎｔｏＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で分析した。その結果を図３に示す。図３中、（ａ）はＫｔｅｌｍｇｌ細胞とＷＴ１−ＴＣＲ非導入細胞（ＮＧＭＣ）、（ｂ）はＫｔｅｌｍｇｌ細胞とＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞（ＧＭＣ）、（ｃ）はＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞とＷＴ１−ＴＣＲ非導入細胞、（ｄ）はＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞とＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞をそれぞれ共培養した結果であり、縦軸はＩＦＮ−γ量、横軸はＣＤ８量を示す。図３−（ｄ）に示す通り、ＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞とＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞との共培養により、ＣＤ８陽性であるＴ細胞においてＩＦＮ−γの細胞内発現が認められた。一方、図３−（ａ）〜（ｃ）の組合せの共培養では、ＩＦＮ−γの細胞内発現が認められなかった。このことから、ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞がＨＬＡ−Ａ２４０２陽性の髄膜腫細胞に特異的にＩＦＮ−γを生成することが示された。
【００６５】
実施例６  ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞の髄膜腫細胞に対する細胞傷害活性
髄膜腫細胞株Ｋｔｅｌｍｇｌ細胞又はＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞をウシ胎仔血清（ＦＣＳ）不含ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、１×１０６細胞を１ｍＬの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にそれぞれ懸濁した。これらの細胞懸濁液に、１０μＬのＤＭＳＯに懸濁した２．５ｍＭ  Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）溶液を添加し、３７℃で１時間標識した。得られた髄膜腫細胞株を標的細胞として、細胞傷害活性の測定に使用した。
【００６６】
実施例４で調製したＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞又はＷＴ１−ＴＣＲ非導入細胞（エフェクター細胞）と、前記の標識した標的細胞とその２０倍量の非標識細胞からなるＫｔｅｌｍｇｌ細胞又はＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞の標的細胞を、５０：１、２５：１、１２：１、６：１、３：１、１：１となるように１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にそれぞれ懸濁し、その１００μＬを９６穴Ｖ底プレートのウェルに入れた。３７℃で５時間反応させた後、遠心分離により上清を回収し、蛍光プレートリーダーにて上清の蛍光強度を測定（ｅｘ：４８５、ｅｍ：５３８ｎｍ）した。蛍光強度の測定値から、次の式により特異的細胞傷害活性を計算した：
【００６７】
細胞傷害活性（％）＝［サンプル（蛍光強度）−自然放出（蛍光強度）］／［完全放出（蛍光強度）−自然放出（蛍光強度）］×１００
【００６８】
上記の式において、自然放出とはエフェクター細胞を加えないウェルにおける蛍光強度であり、標的細胞からの自然遊離量を示す。また、完全放出とは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を標的細胞に加えて破壊した時の蛍光強度を示す。
【００６９】
この結果を図４に示す。横軸はエフェクター細胞数／標的細胞数比（Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ）を、縦軸は細胞傷害活性（％）を示す。ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞はＨＬＡ−Ａ２４０２陽性髄膜腫細胞株であるＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞に対して細胞傷害活性を示し、ＨＬＡ−Ａ０２０７髄膜腫細胞株であるＫｔｅｌｍｇｌ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかった。また、非導入細胞はＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞及びＫｔｅｌｍｇｌ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかった。以上の結果から、ＷＴ１を特異的に認識するＴＣＲは、そのＨＬＡ拘束性に従った髄膜腫細胞に対する特異的細胞傷害活性を、ＰＢＭＣに付与することが明らかになった。
【００７０】
実施例７  ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞の髄膜腫モデルマウスに対する治療効果
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞を調製するために、ｐＲｅｔｒｏＱ−ＡｃＧＦＰ−Ｃ１  Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）を使用してＧＦＰ遺伝子をＩＯＭＭ−Ｌｅｅ細胞に導入し、ＩＯＭＭ−Ｌｅｅ−ＧＦＰ細胞を調製した。
ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍｌＳｕｇ／Ｊｉｃ（ＮＯＧ）マウス（公益財団法人  実験動物中央研究所製）の頭蓋底にＩＯＭＭ−Ｌｅｅ−ＧＦＰ細胞を移植して悪性頭蓋底髄膜腫マウスモデルを作成し、腫瘍径が２〜５ｍｍに達した後（移植後約５日）に、実施例４で調製したＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞及び非導入細胞を使用して治療を開始した。各細胞５×１０７細胞／匹をマウス１０匹の尾静脈に投与した。
【００７１】
ＩＯＭＭ−Ｌｅｅ−ＧＦＰ細胞移植後１２日目に、マウス頭部を１０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬社製）で４８時間固定した。腫瘍サイズを蛍光領域から算出した。算出した腫瘍サイズを図５に示す。図５に示す通り、ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞の投与は悪性頭蓋底髄膜腫マウスモデルの腫瘍の増殖を抑制することが示された。
また、ホルマリンで固定したマウス頭部をＤｅｃａｌｃｉｆｙｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（和光純薬社製）で９６時間脱灰し、パラフィンに包埋して５μｍの連続薄切標本を作製した。この薄切標本に対し、抗ヒトＣＤ８抗体（ＭＢＬ社製）、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍ．Ｏ．Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用して免疫組織化学染色を行った。正常組織（口腔粘膜及び粘膜下軟組織）に浸潤したＣＤ８陽性細胞及び腫瘍に浸潤したＣＤ８陽性細胞を顕微鏡を用いて計測した。その結果を図６に示す。図６に示す通り、ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞投与群及び非導入細胞投与群で正常組織に浸潤したＣＤ８陽性細胞に違いは見られなかった。対照的に、腫瘍細胞に浸潤したＣＤ８陽性細胞は、ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞投与群の方が非導入細胞投与群より多かった。
さらに、各マウスの生存率をＩＯＭＭ−Ｌｅｅ−ＧＦＰ細胞移植後２８日目まで追跡した。その結果を図７に示す。横軸は移植後の日数を、縦軸は生存率を示す。図７に示す通り、ＷＴ１−ＴＣＲ導入細胞の投与は悪性頭蓋底髄膜腫マウスモデルにおいて生存期間を延長することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により、髄膜腫の治療において有用な髄膜腫治療用医薬組成物が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００７３】
SEQ ID NO:1: A part of wild type TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:2: A part of codon modified TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:3: A part of TCR alpha chain amino acid sequence
SEQ ID NO:4: A part of wild type TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:5: A part of codon modified TCR alpha chain coding sequence
SEQ ID NO:6: A part of TCR alpha chain amino acid sequence
SEQ ID NO:7: A part of wild type TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:8: A part of codon modified TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:9: A part of TCR beta chain amino acid sequence
SEQ ID NO:10: A part of wild type TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:11: A part of codon modified TCR beta chain coding sequence
SEQ ID NO:12: A part of TCR beta chain amino acid sequence
SEQ ID NO:13: siRNA generating sequence for wild type TCR genes
SEQ ID NO:15: WT1 forward primer
SEQ ID NO:16: WT1 reverse primer
SEQ ID NO:17: WT1 probe
【図１】
2013116891.tif 000003
【図２】
2013116891.tif 000004
【図３】
2013116891.tif 000005
【図４】
2013116891.tif 000006
【図５】
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【図６】
2013116891.tif 000008
【図７】
2013116891.tif 000009
【配列表】
2013116891000001.app