(57)【要約】【課題】フィルターの目詰まりが抑制され、分離効率が高められた分離装置を提供すること。【解決手段】この分離装置は、貪食能を有する細胞を含む細胞群の分散液を、前記細胞群に含まれる細胞の大きさに応じて分画し、前記分散液よりも前記貪食能を有する細胞の含有割合が高い分散液を得る分離装置であって、前記分離装置は、フィルターを備え、前記フィルターの少なくとも一部は、金薄膜によって被覆され、当該金薄膜に非イオン性親水基を有するアルカンチオールが硫黄−金の結合を介して形成された自己組織化単分子膜、および、生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルの単独重合体または共重合体、の少なくとも一方によって被覆された親水性表面を有する。これによって、フィルターの目詰まりが抑制され、分離効率が高められた分離装置分離装置を実現できる。【選択図】図１
2013215109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
貪食能を有する細胞を含む細胞群の分散液を、前記細胞群に含まれる細胞の大きさに応じて分画し、前記分散液よりも前記貪食能を有する細胞の含有割合が高い分散液を得る分離装置であって、
前記分離装置は、フィルターを備え、
前記フィルターの少なくとも一部は、
金薄膜によって被覆され、当該金薄膜に非イオン性親水基を有するアルカンチオールが硫黄−金の結合を介して形成された自己組織化単分子膜、および、
生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルの単独重合体または共重合体、
の少なくとも一方によって被覆された親水性表面を有する分離装置。
【請求項２】
請求項１において、
前記非イオン性親水基は、ポリエチレングリコール基である分離装置。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記生体膜を構成するリン脂質は、グリセロリン脂質である分離装置。
【請求項４】
請求項３において、
前記生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルは、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである分離装置。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれか１項において、
前記貪食能を有する細胞は、当該細胞表面にスカベンジャー受容体を有する分離装置。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれか１項において、
前記貪食能を有する細胞は、単球、樹状細胞およびマクロファージの少なくとも一種である分離装置。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のいずれか１項において、
前記フィルターに形成された親水性表面は、水に対して７０度以下の接触角を有する分離装置。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のいずれか１項において、
前記親水性表面は、少なくとも前記貪食能を有する細胞が接触する部分に形成された、分離装置。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８のいずれか１項において、
開口を備えた第１容器と、
第１開口と、該第１開口と対向する第２開口と、該第２開口を塞ぐ前記フィルターと、を含む筒状の第２容器と、
を含み、
前記第２容器の前記フィルターは、前記第１容器に収容され、
前記第１容器と前記第２容器の内壁面の少なくとも一部は、前記親水処理面を有する分離装置。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項８のいずれか１項において、
第１導入口と、第１排出口を備えた第１容器と、
第２導入口と、第２排出口を備え、前記フィルターを介して前記第１容器と連続した第２容器と、
を含み、
前記第１容器の内壁面の少なくとも一部は、前記親水処理面を有する分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
単球、樹状細胞、マクロファージなどの貪食機能を有する細胞は、様々な疾患の治療に有用であることが知られている。例えば、樹状細胞療法は患者末梢血を成分採血し、その中から単球のみを取り出し体外で樹状細胞に分化誘導したのち患者がん抗原を認識させ、患者体内に投与するプロトコルを経る。しかしながら、患者末梢血より採取した成分採血血液は単球のみばかりではなく、リンパ球などの血液成分を多く含んでいる。したがって、このような細胞を使用するために、骨髄や末梢血等から効率よく分離することができる分離装置が求められている。
【０００３】
単球等の細胞を分離する従来の手法として、（１）比重遠心法、（２）接着法、（３）磁気ビーズ法などが知られている。しかしながら、これらの手法では、汚染リスク、細胞ダメージ、分離効率の低さ、長時間の処理工程、高額な試薬コストなどの課題を有する。
【０００４】
そこで、より簡便な手法としてフィルターを用いた分離装置が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、前述された分離手法の１つに「接着法」が挙げられていることから分かるように、単球及び単球から分化誘導される樹状細胞は容器や基材など、細胞と接触する材料との接着性が非常に高いという性質を有する。血液細胞における細胞接着メカニズムとしては、細胞接着分子（例えば、カドヘリン、インテグリンファミリー、セレクチン）を介した接着機構が血管内皮細胞やリンパ管等にて機能している。単球等の細胞がプラスチックやガラス等の容器や基板等の「非生体材料（非接着タンパク質材料）」と接着するメカニズムとしては、「非生体材料」上に被覆・吸着した接着タンパク質（リガンド）に細胞表面接着タンパク質（レセプター）が接着・結合することで容器や基材への細胞接着が完了すると考えられている（非特許文献１）。
【０００６】
末梢血中の単球は血管外に遊走しマクロファージに分化する特性を持つ。マクロファージも単球及び樹状細胞と同様に容器や基板などに接着する性質がある。マクロファージを例とすると、マクロファージの細胞表面に存在する非生体材料異物に対し非特異的な接着に関与するレセプター（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｌｌａｇｅｎｅｏｕｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ＭＡＲＣＯ）が非生体異物を認識し、異物を接着・細胞内へ取り込む。非生体異物が微小なプラスチックビーズの場合、異物を細胞表面に接着する過程を経て細胞内に取り込む（貪食する）が、異物が細胞内に取り込めないサイズの場合（例えば、容器や基板の場合）、これらの細胞は貪食を完了できないため異物（容器、基板等）の認識・接着を継続することになる。
【０００７】
以上から、貪食能を有する単球、樹状細胞、マクロファージは、容器や基板などの非生体材料に接着する性質を他の血球細胞よりも強力に有すると考えられる。したがって、フィルターを用いて末梢血等から貪食能を有する細胞を分離する場合、他の血球細胞よりもフィルター表面に付着しやすく、フィルターの目詰まりが容易に発生する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２７４９２３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】岩田博夫著「バイオマテリアル」共立出版、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように強い接着性を有する単球等の細胞を、フィルターを用いて分離するためには、細胞接着を抑制してフィルターの目詰まりをさらに抑制することが望まれている。
【００１１】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、フィルターの目詰まりが抑制され、分離効率が高められた分離装置を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（１）本形態に係る分離装置は、貪食能を有する細胞を含む細胞群の分散液を、前記細胞群に含まれる細胞の大きさに応じて分画し、前記分散液よりも前記貪食能を有する細胞の含有割合が高い分散液を得る分離装置であって、前記分離装置は、フィルターを備え、前記フィルターの少なくとも一部は、金薄膜によって被覆され、当該金薄膜に非イオン性親水基を有するアルカンチオールが硫黄−金の結合を介して形成された自己組織化単分子膜、および、生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルの単独重合体または共重合体、の少なくとも一方によって被覆された親水性表面を有する。
【００１３】
本形態に係る分離装置の備えるフィルターの少なくとも一部は、金薄膜によって被覆され、当該金薄膜に非イオン性親水基を有するアルカンチオールが硫黄−金の結合を介して形成された自己組織化単分子膜、および、生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルの単独重合体または共重合体、の少なくとも一方によって被覆された親水性表面を有する。貪食能を有する細胞のフィルター等の各部材へ細胞接着を抑制しようとする場合、細胞表面の非特異的接着関与レセプターＭＡＲＣＯが各部材を異物と認識しない処理を各部材に行う必要がある。本発明では、フィルター１０の表面を被覆膜１８で覆うことで、表面が親水性表面となる。これによれば、単球及び樹状細胞のＭＡＲＣＯレセプターによる各処理部材の認識を低減することができるため、フィルター１０への細胞接着を抑制できる。したがって、貪食能を有する細胞がフィルターの表面に付着しにくくなるため、フィルターの目詰まりが抑制され分離効率が高められた分離装置を提供できる。また、フィルターの配置とフロー制御による簡易な構成からなる分離装置でもって、血液中の血球種を分離できる。すなわち、従来の細胞分離技術（遠心分離・磁気ビーズ等）ではなし得なかった低コスト・密閉系・試薬レスでの細胞を分離することができる。
【００１４】
（２）上述の分離装置において、前記非イオン性親水基は、ポリエチレングリコール基であってもよい。
【００１５】
これによれば、親水基であるポリエチレングリコールを有する部材表面の長鎖分子が熱運動により揺らぐため、細胞表面の非特異的接着関与レセプターと部材表面の結合機会をさらに低減することができる。
【００１６】
（３）上述の分離装置において、前記生体膜を構成するリン脂質は、グリセロリン脂質であってもよい。
【００１７】
これによれば、親水基であるリン酸基を有する部材表面の長鎖分子が熱運動により揺らぐため、細胞表面の非特異的接着関与レセプターと部材表面の結合機会をさらに低減することができる。
【００１８】
（４）上述の分離装置において、前記生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルは、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンであってもよい。
【００１９】
（５）上述の分離装置において、前記貪食能を有する細胞は、当該細胞表面にスカベンジャー受容体を有していてもよい。
【００２０】
（６）上述の分離装置において、前記貪食能を有する細胞は、単球、樹状細胞およびマクロファージの少なくとも一種であってもよい。
【００２１】
（７）上述の分離装置において、前記フィルターに形成された親水性表面は、水に対して７０度以下の接触角を有していてもよい。
【００２２】
（８）上述の分離装置において、前記親水性表面は、少なくとも前記貪食能を有する細胞が接触する部分に形成されていてもよい。
【００２３】
（９）上述の分離装置において、開口を備えた第１容器と、第１開口と、該第１開口と対向する第２開口と、該第２開口を塞ぐ前記フィルターと、を含む筒状の第２容器と、を含み、前記第２容器の前記フィルターは、前記第１容器に収容され、前記第１容器と前記第２容器の内壁面の少なくとも一部は、前記親水処理面を有していてもよい。
【００２４】
本実施形態に係る分離装置によれば、フィルター表面に加えて、貪食能を有する細胞が接触する可能性のある第１容器と第２容器の内壁面の少なくとも一部においても親水処理面が形成される。したがって、貪食能を有する細胞が分離装置内の表面に付着しにくくなるため、フィルターの目詰まりを抑制して分離効率を高めた分離装置を提供できる。
【００２５】
（１０）上述の分離装置において、第１導入口と、第１排出口を備えた第１容器と、第２導入口と、第２排出口を備え、前記フィルターを介して前記第１容器と連続した第２容器と、を含み、前記第１容器の内壁面の少なくとも一部は、前記親水処理面を有していてもよい。
【００２６】
本実施形態に係る分離装置によれば、フィルター表面に加えて、貪食能を有する細胞が接触する可能性のある第１容器の内壁面の少なくとも一部においても親水処理面が形成される。したがって、貪食能を有する細胞が分離装置内の表面に付着しにくくなるため、フィルターの目詰まりを抑制して分離効率を高めた分離装置を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１（Ａ）は、実施形態に係る分離装置が備えるフィルターの要部平面図、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＩＢ−ＩＢ線における要部断面図。
【図２】図２（Ａ）は、実施形態に係る分離装置１の斜視図、図２（Ｂ）は、実施形態に係る分離装置１の要部平面図及び要部平面図のＡ−Ａ線における要部断面図。
【図３】図４（Ａ）は、実施形態に係る分離装置２の要部断面図。
【図４】図３（Ａ）および図３（Ｂ）は、実施形態に係る分離装置１の使用例を説明するための要部断面図。
【図５】図５（Ａ）および図５（Ｂ）は、実施形態に係る分離装置２の使用例を説明するための要部断面図。
【図６】実施例１−３、比較例１における測定結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００２９】
１．本実施形態に係る分離装置の構成
次に、本実施形態に係る分離装置の構成を説明する。まず本実施形態に係る分離装置が備えるフィルター１０の構成を説明した後、本実施形態に係る分離装置の例として分離装置１、２を説明する。なお、本実施形態に係る分離装置は、フィルター１０を備える分離装置である限り特に限定されず、分離装置１、２の構成のみに限定されるものではない。
【００３０】
１−１．フィルターの構成
図１（Ａ）は、実施形態に係る分離装置が備えるフィルター１０の要部平面図、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＩＢ−ＩＢ線における要部断面図である。
【００３１】
フィルター１０は、貪食能を有する細胞を含む細胞群の分散液（被分離液）を、細胞群に含まれる細胞の大きさに応じて分画し、分散液（被分離液）よりも貪食能を有する細胞の含有割合が高い分散液（残渣成分を含む液）を得るために用いられる。
【００３２】
ここで貪食能を有する細胞とは、細胞表面にスカベンジャー受容体（例えば、ＭＡＲＣＯレセプター）を有する細胞である。貪食能を有する細胞は、例えば、単球、樹状細胞およびマクロファージの少なくとも一種であってもよい。
【００３３】
図１（Ａ）および図１（Ｂ）に示すように、フィルター１０は、複数の貫通孔１５を有する基板１１と、基板１１の表面を覆う被覆膜１８から構成される。
【００３４】
基板１１は、第１基面１２と、第１基面１２と対向する第２基面１３を有する。貫通孔１５の内壁面１４は、第１基面１２と第２基面１３を連続する面である。ここで、基板１１は、図１（Ａ）および図１（Ｂ）に示される例では、平面状に構成されているが、これに限らず、曲面状に構成されていてもよい。基板１１の材料としては、被分離液の組成などを考慮して、例えば、金属、樹脂、ガラスなど、種々の公知の材料から選択して用いることができる。
【００３５】
基板１１の厚みＴおよび貫通孔１５の孔径Ｄは、被分離液の組成を考慮して適宜設定することができる。例えば、被分離液が貪食能を有する細胞を含む細胞群の分散液である場合、基板１１の厚みＴは、５μｍ以上、２０μｍ以下であってもよい。また、貫通孔１５の孔径Ｄ（後述される被覆膜１８の膜厚を考慮した孔径）は、貪食能を有する細胞の径の３０％以上、５０％以下であってもよい。しかしながら、このような細胞の大きさには個体差があるため、上記範囲に限定されるものではなく、細胞の大きさに応じて適宜調整が可能である。
【００３６】
また、フィルター１０は、被分離液をろ過する際に所定の粒径以下の細胞を通過させることができる限り、特に限定されない。したがって、図示はされないが、フィルター１０は、貫通孔がスリット状のフィルターであってもよい。
【００３７】
被覆膜１８は、フィルターの少なくとも一部を被覆することができる。図１（Ｂ）に示すように、被覆膜１８は、基板１１の第１基面１２、第２基面１３、および内壁面１４を覆っていてもよい。また、図示はされないが、被覆膜１８は、第１基面１２および／または第２基面１３のみを覆っていてもよい。
【００３８】
被覆膜１８は、（１）金薄膜と、当該金薄膜に非イオン性親水基を有するアルカンチオールが硫黄−金の結合を介して形成された自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）、および（２）生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルの単独重合体または共重合体、の少なくとも一方から構成される。
【００３９】
ここで、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）とは、有機分子と基板材料の化学反応が起こり、有機分子が基板表面に化学吸着した後、複数の有機分子同士の相互作用によって吸着分子が密に集合して、分子の配向性がそろうように形成された有機薄膜のことである。
【００４０】
被覆膜１８が（１）金薄膜と、当該金薄膜に非イオン性親水基を有するアルカンチオールが硫黄−金の結合を介して形成された自己組織化単分子膜から構成される場合、非イオン性親水基（末端官能基）は、ポリエチレングリコール基であることができる。言い換えれば、フィルター１０の表面１９は、ポリエチレングリコール基（ＰＥＧ基）で構成されることができる。
【００４１】
ここで、金薄膜の膜厚は特に限定されないが、例えば、３０ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下であってもよい。
【００４２】
被覆膜１８が（２）生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルの単独重合体または共重合体から構成される場合、生体膜を構成するリン脂質は、グリセロリン脂質であることができる。生体膜を構成するリン脂質の親水基の少なくとも一部と（メタ）アクリル酸とのエステルは、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣポリマー）であることができる。
【００４３】
フィルターの表面が被覆膜１８に覆われていることで、フィルター１０の表面１９は親水性の表面となることができる。表面１９は、水に対して７０度以下の接触角を有していてもよい。より好適には、表面１９は、水に対して３０度以上５０度以下の接触角を有していてもよい。
【００４４】
貪食能を有する細胞のフィルター等の各部材へ細胞接着を抑制しようとする場合、細胞表面の非特異的接着関与レセプターＭＡＲＣＯが各部材を異物と認識しない処理を各部材に行う必要がある。本発明では、フィルター１０の表面を被覆膜１８で覆うことで、表面１９が親水性表面となる。これによれば、単球及び樹状細胞のＭＡＲＣＯレセプターによる各処理部材の認識を低減することができるため、フィルター１０への細胞接着を抑制できる。その詳細は後述される。
【００４５】
１−２．分離装置１の構成
図２（Ａ）は、本実施形態に係る分離装置１の斜視図、図２（Ｂ）は、本実施形態に係る分離装置１の要部平面図及び要部平面図のＡ−Ａ線における要部断面図である。
【００４６】
本実施形態に係る分離装置１は、開口２１を備えた第１容器２０と、第１開口３１と、第１開口３１と対向する第２開口３２と、第２開口３２を塞ぐフィルター１０と、を含む筒状の第２容器３０と、を含み、第２容器３０のフィルター１０は、第１容器２０に収容されている。
【００４７】
第１容器２０は、開口２１を有している。開口２１の機能の１つは、被分離液の入口となることである。また、開口２１の機能の１つは、フィルター１０を介したろ液の出口となるところである。開口２１は、フィルター１０を通過したろ液の取り出しや、被分離液の供給に十分な大きさ及び形状であればよい。また、開口２１は、少なくとも第２容器３０に備えられたフィルター１０が第１容器２０に収容されるために十分な大きさ及び形状であればよい。図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示される例では、開口２１の形状は円形である。
【００４８】
第１容器２０は、内壁面２２を有している。図２（Ａ）および図２（Ｂ）に示されるように、内壁面２２は、テーパー状の側面と、第２容器３０が第１容器２０に収容された場合に、フィルター１０と対向する底面を有していてもよい。図示はされないが、内壁面２２は、円柱状の側面であってもよい。また、内壁面２２は、連続した曲面状の形状であってもよい。
【００４９】
ここで、内壁面２２の少なくとも一部は、フィルター１０の被覆膜１８と同じ被覆膜によって被覆されていてもよい。つまりは、内壁面２２の少なくとも一部は、親水処理面を有していてもよい。これによれば、第１容器２０の内壁面において単球等の貪食能を有する細胞の細胞接着を抑制することができ、分離装置の分離効率がより向上する。
【００５０】
第２容器３０は、第１開口３１を有する。第１開口３１の機能の１つは、フィルター１０を介したろ液の出口となることである。また、第１開口３１の機能の１つは、被分離液の入口となることである。第１開口３１は、フィルター１０を通過したろ液の取り出しや、被分離液の供給に十分な大きさ及び形状であればよい。図１（Ａ）及び図１（Ｂ）に示される例では、第１開口３１の形状は円形である。
【００５１】
第２容器３０は、第２開口３２を有する。第２開口３２は、フィルター１０が設けられるために十分な大きさ及び形状であればよい。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示される例では、第２開口３２の形状は円形である。
【００５２】
第２容器３０は、フィルター１０を有する。フィルター１０は、第２開口３２を塞ぐように設けられている。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示される例では、第２開口３２の形状は円形であるので、フィルター１０の平面形状も円形に構成されている。また、図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示される例では、フィルター１０は平面状に構成されているが、これに限らず、曲面状に構成されていてもよい。
【００５３】
第２容器３０は、筒状の胴部３４を有する。胴部３４とフィルター１０とは、一体的に形成されていてもよいし、独立に形成されていてもよい。胴部３４は、内壁面３５を有する。
【００５４】
ここで、内壁面３５の少なくとも一部は、フィルター１０の被覆膜１８と同じ被覆膜によって被覆されていてもよい。つまりは、内壁面３５の少なくとも一部は、親水処理面を有していてもよい。また、胴部３４の外壁面も同様に親水処理面を有していてもよい。これによれば、第２容器３０の内壁面や外壁面において単球等の貪食能を有する細胞の細胞接着を抑制することができ、分離装置の分離効率がより向上する。
【００５５】
１−３．分離装置２の構成
図３は、本実施形態に係る分離装置２の要部断面図である。
【００５６】
本実施形態に係る分離装置２は、第１導入口１２１と、第１排出口１２２を備えた第１容器１２０と、第２導入口１３１と、第２排出口１３２を備え、フィルター１０を介して第１容器１２０と連続した第２容器１３０と、を含む。
【００５７】
第１容器１２０は、第１導入口１２１と、第１排出口１２２を有している。第１導入口１２１の機能は、被分離液の入口となることである。したがって、第１導入口１２１は、被分離液の供給経路１５１と接続されている。また、第１排出口１２２の機能は、ろ過後の残渣成分が含まれる被分離液および洗浄液の出口となることである。したがって、第１排出口１２２は、被分離液の排出経路（回収経路）１５２と接続されている。
【００５８】
第１容器１２０は、内壁面１２３を有している。図３に示されるように、内壁面１２３の第２容器１３０側は、フィルター１０で構成されている。図３に示すように、第２容器１３０側内壁面１２３の全面がフィルター１０であってもよいし、一部のみがフィルター１０で構成されていてもよい。
【００５９】
ここで、内壁面１２３の少なくとも一部は、フィルター１０の被覆膜１８と同じ被覆膜によって被覆されていてもよい。つまりは、内壁面１２３の少なくとも一部は、親水処理面を有していてもよい。また、供給経路１５１および排出経路１５２の内壁面においても親水処理面が形成されていてもよい。これによれば、第１容器１２０の内壁面において単球等の貪食能を有する細胞の細胞接着を抑制することができ、分離装置の分離効率がより向上する。
【００６０】
第２容器１３０は、第２導入口１３１と、第２排出口１３２を有している。第２導入口１３１の機能は、洗浄液の入口となることである。したがって、第１導入口１３１は、洗浄液の供給経路１６１と接続されている。また、第２排出口１３２の機能は、ろ過後のろ液および洗浄液の出口となることである。したがって、第２排出口１３２は、ろ液の排出経路１６２と接続されている。
【００６１】
第２容器１３０は、内壁面１３３を有している。図３に示されるように、内壁面１３３の第１容器１２０側は、フィルター１０で構成されている。図３に示すように、第１容器１２０側内壁面１３３の全面がフィルター１０であってもよいし、一部のみがフィルター１０で構成されていてもよい。
【００６２】
ここで、内壁面１３３の少なくとも一部は、フィルター１０の被覆膜１８と同じ被覆膜によって被覆されていてもよい。つまりは、内壁面１３３の少なくとも一部は、親水処理面を有していてもよい。また、供給経路１６１および排出経路１６２の内壁面においても親水処理面が形成されていてもよい。単球などの細胞は、物理的ダメージによって粒径が変形することがある。また、単球などの細胞の粒径は、個体差があり、少量ではあるが、フィルター１０の貫通孔１５を通過する場合も考えられる。したがって、このような場合であっても、第２容器１３０や排出経路１６２内において単球等の貪食能を有する細胞の細胞接着を抑制することができ、細胞接着による経路の狭窄化等を防ぐことができるため、分離装置の分離効率がより向上する。
【００６３】
２．本実施形態に係る分離装置の分離方法
次に、本実施形態に係る分離装置を使用した細胞の分離方法について、図面を参照しながら説明する。
【００６４】
２−１．分離装置１
図４（Ａ）および図４（Ｂ）は、本実施形態に係る分離装置１を使用した分離方法を説明するための要部断面図である。白抜き矢印は液体の流れを表す。なお、図２（Ａ）及び図２（Ｂ）に示される構成と同一の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００６５】
図４（Ａ）に示される分離方法においては、第２容器３０の第１開口３１を入口として被分離液４１を第２容器３０に注入し、フィルター１０を介したろ液４２を第１容器２０の開口２１から回収する。
【００６６】
図４（Ｂ）に示される分離方法においては、第１容器２０の開口２１を入口として被分離液４１を第１容器２０に注入し、フィルター１０を介したろ液４２を第２容器３０の第１開口３１から回収する。
【００６７】
２−２．分離装置２
図５（Ａ）および図５（Ｂ）は、本実施形態に係る分離装置２を使用した分離方法を説明するための要部断面図である。白抜き矢印は液体の流れを表す。なお、図３に示される構成と同一の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００６８】
図５（Ａ）に示されるように、ろ過工程においては、供給経路１５１と排出経路１６２のみを使用するため、排出経路１５２および供給経路１６１は図示しない弁等により経路を閉めておく。
【００６９】
ろ過工程では、第１容器１２０の第１導入口１２１を入口として被分離液１４１を第１容器１２０に注入し、フィルター１０を介したろ液１４２を第２容器１３０の排出口１３２から回収する。
【００７０】
次に、図５（Ｂ）に示されるように、残渣成分（フィルター１０を通過しなかった粒子）の回収（洗浄）工程おいては、供給経路１６１と排出経路１５２のみを使用するため、供給経路１５１および排出経路１６２は図示しない弁等により経路を閉めておく。
【００７１】
回収（洗浄）工程では、第２容器１３０の第２導入口１３１を入口として洗浄液１４３を第２容器１２０に注入し、フィルター１０上の残渣成分を含む洗浄液１４３を第１容器１２０の排出口１２２から回収する。
【００７２】
また、排出経路１６２を開放状態のままで回収（洗浄）工程を行ってもよい。これによれば、洗浄液１４３によって第２容器１３０内に残ったろ液１４２を排出経路１６２から排出することができる。
【００７３】
３．実施例
以下に実施例および比較例を示し、表および図面を参照しながら、本発明の分離装置に係るフィルター１０等における目詰まりの抑制効果に関してより具体的に説明する。
【００７４】
［実施例１］
Ｓｉ基板表面にＡｕ蒸着（膜厚２００ｎｍ）を行った。その後、Ａｕ膜上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成した（ＳＡＭ処理）。具体的には、基板表面をＵＶ洗浄後（ｎｍ、Ｗ×５ｍｉｎ）、ポリエチレングリコール鎖を有するアルカンチオール化合物（ＰＥＧチオール）をエタノールに希釈(０．１％)した溶液に４ｈｒ浸漬した。浸漬後の基板をエタノールにて洗浄し、さらに純水洗浄を行った。ＰＥＧチオール化合物のＰＥＧ鎖長は３であった（ＳＡＭ処理条件１）。以上のＰＥＧチオール処理の結果得られた基板の表面の接触角は約３９°（親水性表面）であった。なお、接触角の測定は接触角計（協和界面科学社製：ＣＡ−Ｗ）にて、純粋に対する基板の接触角を測定した。
【００７５】
次に、末梢血１０ｍＬを準備して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて２倍希釈後、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社製）にて密度勾配遠心（４００×ｇ、３０ｍｉｎ）を行い、バフィーコートを採取した。得られたバフィーコートはＰＢＳにて再懸濁し、遠心分離により再沈後、上清除去する操作を２〜３回繰り返し単核球細胞を得た。バフィーコートには単核球（リンパ球、単球）が分離されており、基板に対し強い接着性を有するのは単球であると考えられるため、今回基板に接着した細胞は単球として計数した。得られた単核球細胞をＰＢＳに１×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁した。５ｍｍφの開口スペースを設けたＡｕ蒸着基板表面上に細胞懸濁液５０μＬを滴下、３０ｍｉｎ静置した。静置後基板表面をＰＢＳにて洗浄し、基板表面に接着した単球細胞数を顕微鏡（０．４ｍｍ×０．６ｍｍの範囲内）にて計測した。
【００７６】
また、樹状細胞に関しては、まず末梢血単球より分化誘導した未熟樹状細胞を培地に２×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁した。５ｍｍφの開口スペースを設けたＡｕ蒸着基板表面上に細胞懸濁液５０μＬを敵化、３０ｍｉｎ静置した。静置後基板表面をＰＢＳにて洗浄し、基板表面に接着した樹状細胞数を顕微鏡（０．４ｍｍ×０．６ｍｍの範囲内）にて計測した。
【００７７】
基準となる細胞数は、樹状細胞数は２４９であり、単球細胞は７００であった。これを基準として接着率を算出した。また、細胞数の計測（樹状細胞）は、４℃、室温、３７℃の３つの水準で行った。
【００７８】
［実施例２］
実施例２においては、ＰＥＧチオール化合物のＰＥＧ鎖長は５であった（ＳＡＭ処理条件２）。以上のＰＥＧチオール処理の結果得られた基板の表面の接触角は約３７°（親水性表面）であった。ＰＥＧ鎖長と表面を接触角以外は、実施例１と同じ条件の基板を準備した。
【００７９】
［実施例３］
実施例３においては、ＰＥＧチオール化合物のＰＥＧ鎖長は６であった（ＳＡＭ処理条件３）。以上のＰＥＧチオール処理の結果得られた基板の表面の接触角は約３６°（親水性表面）であった。ＰＥＧ鎖長と表面を接触角以外は、実施例１と同じ条件の基板を準備した。
【００８０】
［実施例４］
実施例４においては、Ｓｉ基板の代わりに、Ｎｉからなる基板に複数の貫通孔が形成されたフィルターを用いた。Ｎｉからなるフィルターを用いた点以外は、実施例１と同じ条件（ＳＡＭ処理条件１）で金薄膜の上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）が形成されたフィルターを準備した。ただし、基板表面に接着した細胞数の計測は、樹状細胞に関してのみ行った。
【００８１】
［実施例５］
実施例５においては、Ｓｉ基板の代わりに、Ｎｉからなる基板に複数の貫通孔が形成されたフィルターを用いた。Ｎｉからなるフィルターを用いた点以外は、実施例２と同じ条件（ＳＡＭ処理条件２）で金薄膜の上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）が形成されたフィルターを準備した。ただし、基板表面に接着した細胞数の計測は、樹状細胞に関してのみ行った。
【００８２】
［実施例６］
実施例６においては、Ｓｉ基板の代わりに、Ｎｉからなる基板に複数の貫通孔が形成されたフィルターを用いた。Ｎｉからなるフィルターを用いた点以外は、実施例３と同じ条件（ＳＡＭ処理条件３）で金薄膜の上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）が形成されたフィルターを準備した。ただし、基板表面に接着した細胞数の計測は、樹状細胞に関してのみ行った。
【００８３】
［実施例７］
フィルター材質（ポリカーボネート）、フィルタハウジング部材（ポリスチレン）及びろ液・残渣回収容器（例えばポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ナイロン樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリウレア樹脂、ガラス等）から構成されるろ過装置を、親水化処理剤ＭＰＣポリマー（日油製、０．５％エタノール溶液）に浸漬し、部材表面の親水化処理（ＭＰＣ処理）を行った。末梢血をＰＢＳにて４倍希釈し、親水化処理を行ったろ過装置を用いてろ過処理を行った。
【００８４】
ろ過処理後のろ液及び残渣の血球数を多項目自動血球装置（Ｓｙｓｍｅｘ製：ＸＥ−２１００）にて測定し、ろ液及び残渣の血球数を血球種ごとに合算し、ろ過前の各種血球数と比較し、ろ過装置による各血球種の回収率を算出した。
【００８５】
［比較例１］
比較例１においては、実施例１において、金薄膜の上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成していない基板を使用した。基板が異なる点以外は、実施例１と同じ条件で基板表面に接着した細胞数の計測を行った。
【００８６】
［比較例２］
比較例２においては、Ｓｉ基板の代わりに、Ｎｉからなる基板に複数の貫通孔が形成されたフィルターであって、かつ金薄膜および自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成していないフィルターを使用した。基板が異なる点以外は、実施例１と同じ条件で基板表面に接着した細胞数の計測を行った。
【００８７】
［比較例３］
比較例３においては、比較例２と同じフィルターではあるが、実施例１と同じ条件のＵＶ洗浄のみを行ったフィルターを使用した。基板が異なる点以外は、実施例１と同じ条件で基板表面に接着した細胞数の計測を行った。
【００８８】
［比較例４］
比較例４においては、Ｓｉ基板の代わりに、Ｎｉからなる基板に複数の貫通孔が形成されたフィルターであって、かつ金薄膜のみが形成されたフィルターを使用した。基板が異なる点以外は、実施例１と同じ条件で基板表面に接着した細胞数の計測を行った。
【００８９】
［比較例５］
比較例５においては、Ｓｉ基板の代わりに、プラスチック製の培養ディッシュであって、かつ金薄膜および自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成していないものを使用した。基板が異なる点以外は、実施例１と同じ条件で基板表面に接着した細胞数の計測を行った。
【００９０】
［比較例６］
比較例６においては、Ｓｉ基板の代わりに、ろ過装置のハウジングに使用されるハウジング用プラスチック部材（ケモタキセル、クラボウ製、材質ポリスチレン）であって、かつ金薄膜および自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成していないものを使用した。基板が異なる点以外は、実施例１と同じ条件で基板表面に接着した細胞数の計測を行った。ただし、表面に接着した細胞数の計測は、単球細胞に関してのみ行った。
【００９１】
［比較例７］
比較例７においては、Ｓｉ基板の代わりに、ろ過装置のケースに使用されるプラスチック部材（ケモタキセル、クラボウ製、材質ポリスチレン）であって、かつ金薄膜および自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成していないものを使用した。基板が異なる点以外は、実施例１と同じ条件で表面に接着した細胞数の計測を行った。
【００９２】
［比較例８］
比較例６においては、実施例７において、ＭＰＣ処理を行っていないろ過装置を使用した。ろ過装置がＭＰＣ処理されていない点以外は、実施例７と同じ条件でろ過装置による各血球種の回収率を算出した。
【００９３】
以上の実施例１−７、および比較例１−８の測定結果を表１と表２に示す。表１は、実施例１−６、比較例１−７における計測結果を示す表であり、表２は実施例７および比較例８の測定結果を示す表である。
【００９４】
【表１】
2013215109.tif 000003
【００９５】
【表２】
2013215109.tif 000004
【００９６】
３−１．接着率低減効果の評価
図６（Ａ）は、実施例１−３、比較例１における単球の計測結果と基板表面の接触角の関係性を示す図である。図６（Ａ）に示されるように、実施例１−３では単球の接着はまったく確認されなかったのに対し、ＳＡＭ処理を行っていない比較例１では、８１．９％の単球の細胞接着が確認された。また、接触角が水に対して７０度以下（３０度以上５０度以下）である場合、単球の接着が確認されなかった。
【００９７】
以上の結果、フィルターの表面を親水化処理することで、単球の細胞接着を顕著に抑制することができることが確認された。
【００９８】
図６（Ｂ）は、実施例１−３、比較例１における樹状細胞の計測結果と基板表面の接触角および温度との関係性を示す図である。図６（Ｂ）に示されるように、実施例１−３では樹状細胞の接着は実質的に確認されなかったのに対し、ＳＡＭ処理を行っていない比較例１では、７１．９％（室温）の単球の細胞接着が確認された。また、接触角が水に対して７０度以下（３０度以上５０度以下）である場合、樹状細胞の接着が確認されなかった。また、温度条件を室温から３７℃に上昇させた場合、比較例１では、接着率の上昇し、９１．２％となったことが確認されたのに対し、実施例１−３では、接着率の上昇は確認されなかった。
【００９９】
以上の結果、フィルター表面を親水化処理することで、樹状細胞の細胞接着を顕著に抑制することができることが確認された。また、室温以上の温度環境下（３７℃）であっても、細胞接着を抑制する効果が発揮されることが確認された。
【０１００】
３−２．分離装置の回収率の評価
表２の結果から、貪食能を有する単球においてのみ、顕著な回収率の差異が確認された。単球以外の血液成分（赤血球、血小板、リンパ球）について接着抑制効果は認められなかった。好中球については若干の回収ロス低減が見られた。この結果から、各種ろ過部材への親水処理は単なる物理吸着の抑制ではなく、単球（好中球）のような貪食細胞由来の接着機構を抑制していると考えられる。
【０１０１】
以上の結果から、フィルターを含む分離装置の構成部材に親水化処理を行うことで、貪食能を有する細胞をより効率的に分離できることが確認された。
【０１０２】
３−３．基板材料の評価
Ｎｉからなるフィルターを使用した実施例４−６においても、表面を親水化処理することで、細胞接着を抑制する効果が発揮されることが確認された。また、比較例２−４の結果から、ＡｕやＮｉ等の金属製部材では、非常に高い比率で細胞接着が発生することが確認された。また、比較例５−７の結果から、ブラスチック部材に対しても、非常に高い比率で細胞接着が発生することが確認された。
【０１０３】
よって、フィルターを用いたろ過装置等の分離装置を使用した場合、フィルターのみならず、ハウジングや経路などの周辺部材表面においても細胞接着が発生することが確認された。
【０１０４】
なお、上述した実施形態及び変形例は一例であって、これらに限定されるわけではない。例えば各実施形態及び各変形例は、複数を適宜組み合わせることが可能である。
【０１０５】
本発明は、上述した実施形態及び使用例に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１０６】
１、２…分離装置、１０…フィルター、１１…基板、１２…第１基面、１３…第２基面、
１４…内壁面、１５…貫通孔、１８…被覆膜、１９…表面、２０…第１容器、
２１…開口、２２…内壁面、３０…第２容器、３１…第１開口、３２…第２開口、
３４…胴部、３５…内壁面、４１…被分離液、４２…ろ液、１２０…第１容器、
１２１…第１導入口、１２１…第１排出口、１２３…内壁面、１３０…第２容器、
１３１…第２導入口、１３２…第２排出口、１３３…内壁面、１５１…供給経路、１５２…排出経路、１６１…供給経路、１６２…排出経路
【図１】
2013215109.tif 000005
【図２】
2013215109.tif 000006
【図３】
2013215109.tif 000007
【図４】
2013215109.tif 000008
【図５】
2013215109.tif 000009
【図６】
2013215109.tif 000010