(57)【要約】【課題】収量、力価、及び純度の点で、商業プロセスの要求を満たすイソプレノイドの製造方法を提供する。【解決手段】抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される
１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、
ポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項２】
Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する
１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、
ポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項３】
ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性を有する
１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、
ポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項４】
増産剤が、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものである、
請求項１〜３のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項５】
細胞が真核生物の細胞である、
請求項１〜４のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項６】
細胞が細菌の細胞である、
請求項１〜４のいずれかに記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【請求項７】
細菌が遺伝子組換大腸菌である、
請求項６に記載のポリイソプレノイドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリイソプレノイドの製造方法の技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で生合成された天然ゴム（イソプレノイド）を、植物から採取することにより得られる。しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でしか生育できない。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、天然ゴム（イソプレノイド）を採取できる期間は２０〜３０年に限られている。
【０００３】
一方、ゴム産生植物から得られるイソプレノイド以外に、遺伝子組換微生物により製造されるイソプレノイドを利用する方法が知られている（特許文献１〜５）。しかしながら、収量、力価、及び純度の点で、商業プロセスの要求を充分に満たすものとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２０７３７６号公報
【特許文献２】特表２０１１−５０５８４１号公報
【特許文献３】国際公開第０９／０７６６７６号パンフレット
【特許文献４】特表２００９−５３８６０１号公報
【特許文献５】特表２０１１−５３９９０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前述の問題を解決し、ポリイソプレノイドの製造効率を改善することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養することにより、イソプレノイドの製造効率を改善できること、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養することにより、イソプレノイドの製造効率を改善できること、及びＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養することにより、イソプレノイドの製造効率を改善できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【０００８】
また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【０００９】
また、本発明は、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【００１０】
増産剤が、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させたものであることが好ましい。
【００１１】
細胞が真核生物の細胞であることが好ましい。
【００１２】
細胞が細菌の細胞であることが好ましい。
【００１３】
細菌が遺伝子組換大腸菌であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法により、収量、力価、及び純度の点で、商業プロセスの要求を満たすイソプレノイドを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬から選択される１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害から選択される活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。また、本発明は、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる活性、及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させる活性を有する１種類以上の増産剤の存在条件下で細胞を培養する工程を含む、ポリイソプレノイドの製造方法に関する。
【００１６】
ポリイソプレノイドは、イソプレン（Ｃ５Ｈ８）、及びイソプレン単位（Ｃ５Ｈ８）で構成された重合体の総称である。イソプレノイドとしては、例えばモノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０）、天然ゴムなどの重合体が挙げられる。
【００１７】
細胞は、培養してイソプレノイドを製造できる細胞であれば特に限定されず、例えば真核細胞、細菌、古細菌などが挙げられる。真核細胞としては、酵母や、植物の細胞などが挙げられる。
【００１８】
酵母としては、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロマイセス属、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロマイセス属が挙げられる。出芽酵母の具体例として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＢＲＣ  ０２６２や、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＮＢＲＣ  ０５６５が挙げられる。
【００１９】
植物としては、培養してイソプレノイドを製造できる細胞であれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  Ｋｏｉｄｚ．）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール  （Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）、ベンガルボダイジュ等が挙げられる。なかでも、Ｈｅｖｅａ属、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属、Ｆｉｃｕｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の属に属する植物であることが好ましく、パラゴムノキ、ノゲシ、セイタカアワダチソウ、ヒマワリ、タンポポ、及びイチジクからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。また、培養細胞は、植物の組織に由来するカルスであってもよい。
【００２０】
細菌は、培養してイソプレノイドを製造できる細胞であれば特に限定されず、例えば、エシェリキア属、枯草菌、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、緑膿菌、シュードモナス・メバロニ、シュードモナス・プディカ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター・カプスラータ、ロドスピリルム・ルブルム等が挙げられる。エシェリキア属に属する細菌の具体例として大腸菌が挙げられる。
【００２１】
また、細胞は形質転換体であってもよい。形質転換体は、宿主となる細胞に、イソプレノイド産生に関与する外来遺伝子を導入して得られる。イソプレノイド産生に関与する外来遺伝子としては、ファルネシル二リン酸合成酵素、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素等のトランス−イソプレニル二リン酸合成酵素及び／又はネリル二リン酸合成酵素、ウンデカプレニルリン酸合成酵素等のシス−イソプレニル二リン酸合成酵素などの直鎖プレニル二リン酸合成酵素が挙げられる。宿主細胞としては、真核細胞、細菌が挙げられる。細菌の中でも、遺伝子組換大腸菌は安価であり、遺伝子組換え操作や培養による増殖が容易であることから特に好ましい。真核細胞としては、酵母の細胞や、植物の細胞が挙げられる。
【００２２】
培養条件は、細胞がイソプレノイドを製造できる条件であれば特に限定されない。細胞を培養する際に使用される培地としては、細胞の培養に通常使用される培地であればよい。具体的には、細菌の場合にはＫＢ培地、ＬＢ培地が挙げられる。酵母の場合には、ＹＭ培地、ＫＹ培地、Ｆ１０１培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＡＤ培地が挙げられる。植物の場合には、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地が挙げられる。
【００２３】
炭素源としては、菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【００２４】
さらに、微生物や酵母を培養する場合には、イソプレノイドの生産量が最大となるように、培地に炭素源（例えば、糖類及び／又は油脂類等）を添加することができる。
【００２５】
糖類としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、例えばスクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、グルコース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、フルクトース、イドース、ガラクトース及びキシロース等或いは転化糖（例えば、酵素的に処理されたショ糖シロップ）等を用いることができる。
【００２６】
油脂類としては、例えば大豆油、ひまし油、綿実油、あまに油、なたね油、パーム油、やし油、落花生湯、ロジン、パインオイル、パインタール、トール油、コーン油、こめ油、べに花油、ごま油、オリーブ油、ひまわり油、パーム核油、椿油、ホホバ油、マカデミアナッツ油、桐油、またそれらを分解して生成したグリセロール、グリセリン、脂肪酸等を用いることができる。炭素源の添加量は、糖類や油脂類を合わせて培地に対して、５〜４００ｇ／Ｌであることが好ましく、２０〜１００ｇ／Ｌであることがより好ましい。
【００２７】
培養温度は、細胞の種類によって異なるが、０〜５０℃であることが好ましく、１０〜４０℃であることがより好ましく、２０〜３５℃であることが更に好ましい。ｐＨは、ｐＨ３〜１１であることが好ましく、４〜１０であることがより好ましく、５〜９であることが更に好ましい。また、培養は、細胞の種類に応じて嫌気的条件下、或いは好気的条件下のいずれにおいても行うことができる。
【００２８】
増産剤は、抗生物質、副腎皮質ホルモン、ステロイド系抗炎症剤、抗コレステロール剤、及び高血圧薬、或いは／及び、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、及び電子伝達阻害、から選択される活性を有する１種類以上の物質、或いは／及び、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させる、或いは／及びＨＭＧＲ遺伝子を活性化させる１種類以上の物質から選択される。イソプレノイドはメバロン酸経路と非メバロン酸経路の２種の経路により合成されることが一般に良く知られている。これらの経路は、ミトコンドリアにある呼吸鎖複合体の調節により制御を受けるという理由で、増産剤としては、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害、呼吸鎖関連酵素の機能の阻害、カリウムチャネル開口、又は電子伝達阻害から選択される１つ以上の活性を有することがより好ましい。或いは、メバロン酸経路における主要酵素を制御するという理由で、ＨＭＧＲ遺伝子を活性化させる物質であることがより好ましい。
【００２９】
抗生物質とは、微生物が産生し、ほかの微生物の増殖を抑制する物質のことをいう。抗生物質の具体例としては、アンチマイシン、アンホテリシン、ツニカマイシン、ニスタマイシン、フォスミドマイシンが挙げられる。この中でも、呼吸鎖複合体阻害剤であるという理由でアンチマイシンが好ましい。アンチマイシンとしては、アンチマイシンＡが好ましい。アンチマイシンＡのタイプはＡ１であってもよく、Ａ３であってもよい。
【００３０】
副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤は、メバロン酸経路におけるＨＭＧＲ−ＣｏＡ還元酵素のはたらきを阻害するという理由で増産剤として好ましい。副腎皮質ホルモン、或いは／及びステロイド系抗炎症剤としては、ハイドロコルチゾン、グルココルチコイド、フルドロコチゾン、プロドニゾロン、デキサメタゾン等が挙げられる。
【００３１】
抗コレステロール剤としては、スタチン系薬剤、例えばロバスタチン、メバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチンが挙げられる。
【００３２】
高血圧薬としては、ロテニン等が挙げられる。
【００３３】
抗真菌剤としてロダニン−３−酢酸、呼吸鎖複合体ＩおよびＩＩＩ阻害剤としてアラキドン酸、呼吸鎖ＩＶ阻害剤としてシアン酸塩、起炎物質としてカプサイシン、呼吸阻害剤としてアジ化合物（アジ化ナトリウム等）、呼吸鎖複合体Ｉ阻害剤としてアミタール、電子伝達阻害剤として硫化ナトリウム、呼吸鎖複合体ＩＩＩ阻害剤としてｎ−ヘプチルヒドロキシキノリン−Ｎ−オキシド、電子伝達阻害剤として２，３−ジメルカプトプロパノールを使用することもできる。これらは、単独で用いても、２つ以上を併用しても構わない。
【００３４】
増産剤は、水又は水溶性媒体に溶解又は分散させてから使用されることが好ましい。水又は水溶性媒体に溶解又は分散させることにより、増産剤を細胞に対して効果的に作用させることができる。具体的には、増産剤は、少量の水溶性媒体に溶かし、さらに水で希釈してから使用されることが好ましい。増産剤を溶解又は分散させるための水溶性媒体としては、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【００３５】
水溶性媒体／（水溶性媒体＋水）の希釈率は、１／１００〜１／１０００であることが好ましく、１／２００〜１／８００であることがより好ましく、１／３５０〜１／６５０であることがさらに好ましい。これより水の量が多いと、必要な増産剤の濃度が得られない傾向がある。他方、これより水の量が少ないと、水溶性媒体が、イソプレノイドを製造する細胞に対し悪影響を及ぼす可能性がある。
【００３６】
増産剤の存在条件は特に限定されず、イソプレノイドの製造時に、イソプレノイドの製造効率を向上させる条件であればよい。増産剤を含む培養液を用いて細胞を培養することにより、イソプレノイドの製造効率を向上させることができる。培養液中の増産剤の濃度は、イソプレノイドの製造効率を向上させる濃度であって、かつ、細胞の培養を阻害しない濃度であることが好ましい。
【００３７】
培養液中の増産剤の濃度は、イソプレノイドの合成効率を向上させると共に、不必要に高濃度としてコストを増大させてしまうことを防ぐために、０．１〜２０μｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．５〜１５μｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、１〜１０μｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましく、１．５〜４．５μｍｏｌ／Ｌであることが最も好ましい。
【００３８】
細胞の培養工程では、増産剤と共に、１種類以上の植物生長ホルモンを用いることが好ましい。植物生長ホルモンとしては、オーキシン系植物ホルモン、サイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。
【００３９】
細胞の培養は、バッチ式培養でも可能であり、また、バイオリアクターを用いた連続式培養でも可能である。具体的な培養方法として、振とう培養、回転培養などが挙げられる。イソプレノイドは、細胞内に蓄積させることができ、また、培養上清中に生成蓄積させることもできる。
【００４０】
培養後の細胞からイソプレノイドを取得する場合、遠心分離により細胞を回収した後、細胞を破砕し、破砕液から１−ブタノール等の溶剤を使用して抽出することができる。また、溶剤抽出法に、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することもできる。ここで、細胞の破砕は、イソプレノイドの変性・崩壊を防ぐために、例えば４℃等の低温で行うことが好ましい。細胞は、例えば、ガラスビーズを使用した物理的破砕等により破砕することができる。
【００４１】
培養上清からイソプレノイドを取得するには、遠心分離にて菌体を除去した後、得られた上清から、１−ブタノール等の溶剤にて抽出する。
【００４２】
製造されたイソプレノイドの生成量は、薄層クロマトグラフィーによるヨウ素呈色法、及びＧＣ／ＭＳ方法により測定することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
（調製例）増産剤の調製
抗真菌性抗生物質であり、Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  １遺伝子によりコードされるペンタトリコペプチド含有タンパク質の機能の阻害作用のあるアンチマイシンＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．製、有効成分９０％以上）１０ｍｇをエタノール１８．２ｃｃに溶解し１ｍｍｏｌ／Ｌとした。更に、これを水で１００倍〜１０００倍に希釈し、全培地容量に対して、１μｍｏｌ／Ｌ(実施例１)、２μｍｏｌ／Ｌ(実施例２)、１０μｍｏｌ／Ｌ(実施例３)となる様に添加した。
【００４５】
（実施例１〜３）ファルネシル二リン酸の製造
ＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）１０Ｌを２Ｌ三角フラスコ１０個に小分けして、１２１℃、１．２気圧で２０分間オートクレーブ滅菌を行った。この培地に、上記増産剤１０ｍｌ、５％グルコース、及び１％大豆油を無菌的に添加し、独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲購入したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＢＲＣ０２６２）を植菌した。３０℃、１３０ｒｐｍの回転培養で７２時間培養した。
【００４６】
培養終了後、培養液中の菌体をプラスチックチューブに移し、ガラスビーズ（シグマ社製）を加え、安井器械社製マルチビーズショッカーを使用し、４℃で冷却破砕した。菌体の破砕は、２５００ｒｐｍで３０秒間破砕し、３０秒間停止する工程を２０サイクル繰り返すことにより行った。
【００４７】
菌体の冷却破砕液を１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後の上清に１−ブタノール２５０ｍＬを数回に分けて加える事でファルネシル二リン酸を抽出し、エバポレーターを用いて濃縮を行った。ファルネシル二リン酸の生成量を、薄層クロマトグラフィーによるヨウ素呈色法、及びＧＣ／ＭＳにより測定した。
【００４８】
（比較例１）ファルネシル二リン酸の製造
アンチマイシンＡを含まないエタノール２０ｃｃに水を加えて５００倍に希釈し、１Ｌとしたものをコントロール増産剤として使用した以外は、実施例１〜３と同様の操作を行い、ファルネシル二リン酸の生成量を測定した。
【００４９】
実施例１〜３で得られたファルネシル二リン酸の収量を、比較例１の収量を１００とした指数に換算した。その結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
表１の結果から、増産剤を使用することにより、従来技術と比較して効率的にポリイソプレノイドを製造できることが確認できた。
【００５２】
更に、上記実施例１〜３及び比較例１に記載の培地から、菌体を取り出し、その菌体における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により解析して比較した。その結果より、アンチマイシンＡが、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させ、またＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させていることがわかった。
【００５３】
（実施例４〜６）ゲラニル二リン酸の製造
独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲購入したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＢＲＣ ０５６５）を使用した以外は実施例１〜３と同様の条件で培養・抽出を行い、ゲラニル二リン酸を回収した。ゲラニル二リン酸の生成量を、薄層クロマトグラフィーによるヨウ素呈色法、及びＧＣ／ＭＳにより測定した。
【００５４】
（比較例２）ゲラニル二リン酸の製造
アンチマイシンＡを含まないエタノール２０ｃｃに水を加えて５００倍に希釈し、１Ｌとしたものをコントロール増産剤として使用した以外は、実施例４〜６と同様の操作を行い、ゲラニル二リン酸の生成量を測定した。
【００５５】
実施例４〜６で得られたゲラニル二リン酸の収量を、比較例２の収量を１００とした指数に換算した。その結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
2013116069.tif 000003
【００５７】
表２の結果から、増産剤を使用することにより、従来技術と比較して効率的にポリイソプレノイドを製造できることが確認できた。
【００５８】
更に、上記実施例４〜６及び比較例２に記載の培地から、菌体を取り出し、その菌体における遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により解析して比較した。その結果より、アンチマイシンＡが、ＩＰＰ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ遺伝子発現量を減少させ、またＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子発現量を増加させていることがわかった。