(57)【要約】【課題】生後数週間以上の成体由来のサンプルを含む生体サンプルに十分な細胞内イオンイメージング用色素を導入し、組織サンプル中の神経機能、筋収縮等を担うイオンの分布を画像化すること。【解決手段】本発明は、チャンバ中で、細胞内イオンイメージング用色素を含む溶液に生体サンプルを浸漬する工程、及び当該チャンバを酸素環境下でインキュベートする工程を含む、生体サンプルの細胞への細胞内イオンイメージング用色素の導入方法であって、該チャンバが、平板状で親水性の底部材と、前記底部材の表面に液体を貯留可能な貯留部が形成されるように環状に配置された側壁部材と、を備え、前記側壁部材は、前記底部材の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を備えている、方法及び上記方法により細胞内イオンイメージング用色素が導入された生体サンプル中の細胞内イオンイメージング用色素由来の蛍光を検出する工程を含む、細胞内イオンイメージング法を提供する。【選択図】図１
2013215114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャンバ中で、細胞内イオンイメージング用色素を含む溶液に生体サンプルを浸漬する工程、及び
当該チャンバを酸素環境下でインキュベートする工程
を含む、
生体サンプルの細胞への細胞内イオンイメージング用色素の導入方法であって、
該チャンバが、平板状で親水性の底部材と、
前記底部材の表面に液体を貯留可能な貯留部が形成されるように環状に配置された側壁部材と、を備え、
前記側壁部材は、前記底部材の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を備えている、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により細胞内イオンイメージング用色素が導入された生体サンプル中の細胞内イオンイメージング用色素由来の蛍光を検出する工程を含む、
細胞内イオンイメージング法。
【請求項３】
平板状で親水性の底部材と、
前記底部材の表面に液体を貯留可能な貯留部が形成されるように環状に配置された側壁部材と、を備え、
前記側壁部材は、前記底部材の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を備えている、細胞内イオンイメージング用色素導入用容器。
【請求項４】
前記底部材の表面に対する前記傾斜面の角度が、２０°未満である、請求項１もしくは２に記載の方法、又は請求項３に記載の容器。
【請求項５】
前記側壁部材は、シリコーンにより形成されている、請求項１、２もしくは４に記載の方法、又は請求項３もしくは４に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体サンプル中のイオン動態を調べるための細胞内イオンイメージング法、生体サンプルの細胞への細胞内イオンイメージング用色素の導入方法及び細胞内イオンイメージング用色素導入用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は無数のニューロンから構成され、それらは無数のシナプスで結合している。この脳の情報処理機構を知るためには、神経回路を構成する複数のニューロン同士がどのようにコミュニケーションし、動作しているのかを知る必要がある。従来、細胞内記録法、細胞外記録法、パッチクランプ法等の電気生理学的な手法により、単一あるいは少数のニューロン活動を計測する手法がとられてきた。一般的にこれらの方法では、あるニューロンに刺激を与えた時に別のあるニューロンから応答が取れたとすると、それらのニューロン間には結合があると結論づけていた。しかし、実際の脳では、無数のニューロンが無数のシナプス結合を形成しており、信号伝達回路は無数に存在するため、信号がどのような経路を通っているのかを断定することは困難である。この問題を解決するために、記録電極の位置を変えて複数の場所からデータを得ることにより神経回路における信号の流れを同定しようという試みがなされてきた。しかし、この方法では、サンプリングできる細胞の数に限りがあるだけでなく、ニューロン活動が確率的であるため、信号伝播の途中に存在するニューロン全てに常に同じ活動が起こっているとは限らないという問題がある。従ってこの方法では神経回路の振る舞いを同定することは困難である。
【０００３】
そこで、多点電極を用いた神経信号の多点同時計測がなされるようになってきた（非特許文献１〜３）。しかし、多点電極であっても、市販品で多くても２５６電極と電極数が限られており、電極間隔も通常１００μｍ以上なので、ニューロンの細胞体の大きさが１０〜２０μｍであることを考えると、ニューロン集団の少数の細胞からしか情報を得ることができない、また計測結果からどの位置のニューロンの活動が記録されているのか同定することが困難であるという問題がある。
【０００４】
これらの問題点を解決するためには、光学顕微鏡によるイメージング法（以下、単に細胞内イオンイメージングと示すこともある）が有利である。細胞内イオンイメージングでは解剖学的構造を可視化することができると共に、顕微鏡の視野に含まれる多くのニューロン集団の活動を同時に計測することが可能である。
【０００５】
また、細胞内イオンイメージングで可視化されるカルシウム等のイオンは、脳細胞以外の細胞においても、細胞内の情報伝達機構における重要な役割を果たしているため、細胞内イオンイメージングは、脳組織に限らず、その他の生体組織におけるイオンの挙動を調べるために非常に重要である。そのため、カルシウムイメージング等の細胞内イオンイメージングが種々研究されているが（非特許文献４）、組織サンプルの細胞へのダメージが大きいこと、大量の色素を必要とすること等の問題がある。また、従来の方法では、生後０〜３週齢の幼若動物由来のサンプルにしか細胞内イオンイメージング用色素が充分に導入されず、生後１ヶ月を超える成体のサンプルに細胞内イオンイメージング用色素を充分に導入することはできなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Proceedings of the 18th Annual Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, 1, 245-247, 1996
【非特許文献２】Biophys. J., 76, 670-678, 1999
【非特許文献３】J. Neurosci. Methods, 93, 6-67, 1999
【非特許文献４】Neuroscience  Research,vol52,pp132-138, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、生後数週間以上の成体由来のサンプルを含む生体サンプルの細胞に十分な細胞内イオンイメージング用色素を導入し、組織サンプル中のイオンの分布を画像化することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記のような状況の下、本発明者らは、鋭意検討した結果、平板状で親水性の底部材と底部材の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を有する側壁部材を備えた容器を用い、当該底部材の表面と傾斜面とによって囲まれた領域である液体貯留部にて、生体サンプルを、細胞内イオンイメージング用色素を含む溶液に浸漬し、酸素環境下でインキュベートすることにより、細胞内イオンイメージング用色素が充分量生体サンプルの細胞中に導入されることを見出した。本発明者らは、上記新規の知見に基づき、さらに、傾斜面の傾斜角、インキュベーション条件、チャンバの前処理等を種々検討した結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本発明は、以下の項を提供する：
項１．チャンバ中で、細胞内イオンイメージング用色素を含む溶液に生体サンプルを浸漬する工程、及び
当該チャンバを酸素環境下でインキュベートする工程
を含む、
生体サンプルの細胞への細胞内イオンイメージング用色素の導入方法であって、
該チャンバが、平板状で親水性の底部材と、
前記底部材の表面に液体を貯留可能な貯留部が形成されるように環状に配置された側壁部材と、を備え、
前記側壁部材は、前記底部材の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を備えている、方法。
【００１０】
項２．項１に記載の方法により細胞内イオンイメージング用色素が導入された生体サンプル中の細胞内イオンイメージング用色素由来の蛍光を検出する工程を含む、
細胞内イオンイメージング法。
【００１１】
項３．平板状で親水性の底部材と、
前記底部材の表面に液体を貯留可能な貯留部が形成されるように環状に配置された側壁部材と、を備え、
前記側壁部材は、前記底部材の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を備えている、細胞内イオンイメージング用色素導入用容器。
【００１２】
項４．前記底部材の表面に対する前記傾斜面の角度が、２０°未満である、項１もしくは２に記載の方法、又は項３に記載の容器。
【００１３】
項５．前記側壁部材は、シリコーンにより形成されている、項１、２もしくは４に記載の方法、又は項３もしくは４に記載の容器。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、生後０〜３週齢といった短い週齢の生体サンプルだけでなく、生後数カ月の生体サンプルに対してもその細胞内に細胞内イオンイメージング用色素を導入し、細胞内イオンイメージングをすることができる。また、本発明の方法によれば、ごく少量の色素を用いるのみで細胞内イオンイメージングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の斜視図を示す。
【図２】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の平面図を示す。
【図３】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の断面図を示す。
【図４】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の斜視図を示す。
【図５】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の製造過程の透視図を示す。
【図６】本発明の細胞内イオンイメージング用色素の導入方法の一実施形態の概略図を示す。
【図７】本発明の細胞内イオンイメージング用色素導入法の一実施形態を示す概略図を示す。
【図８】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の斜視図を示す。
【図９】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の平面図を示す。
【図１０】本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の斜視図を示す。
【図１１】実施例１及び２におけるカルシウム感受性蛍光色素を導入した脳スライス標本の蛍光写真を示す。
【図１２】実施例３におけるカルシウム感受性蛍光色素を導入した脳スライス標本の蛍光写真及び当該脳スライス標本の各位置における蛍光強度の経時的変化を示すグラフを示す。
【図１３】実施例４におけるカルシウム感受性蛍光色素を導入した脳スライス標本の蛍光写真及び当該脳スライス標本の各位置における蛍光強度の経時的変化を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照しながら本発明を説明するが、本発明は、当該図面に記載の実施形態に限定されない。
【００１７】
細胞内イオンイメージング用色素導入用容器
図１は、本発明の一つの実施形態における細胞内イオンイメージング用色素の導入用容器の斜視図を示す。また、図２は、当該細胞内イオンイメージング用色素導入用容器の平面図を示す。本発明の細胞内イオンイメージング用色素導入用容器は、平板状で親水性の底部材１と、底部材１上に環状に配置された側壁部材２とを備える。本発明においては、側壁部材２は、前記底部材の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を備えていることを特徴とする。
【００１８】
底部材１の素材としては、親水性の素材または親水化処理を施した素材であれば特に限定されず、例えば、ポリスチレン、ポリオレフィン等のプラスチック、ガラス等の素材に親水化処理（例えば、ガスプラズマ処理等）をしたもの等を挙げることができる。底部材に親水性の素材を用いることによって、生体サンプルの細胞の少なくとも一部が底部材に接触した状態で安定する。そのため、生体サンプルが容器の貯留部内で動くことにより曲がる等の物理的な損傷を受けにくくなるため好ましい。
【００１９】
本発明においては、側壁部材２は底部材１上に環状に配置されている。ここで、環状とは、側壁部材の外周部分が図１及び２に示すような円形となるような形状に限られず、外周部分が四角形、６角形等の多角形であっても、楕円形であってもよい。
【００２０】
本発明において側壁部材２は、底部材１の表面から斜め上方に延びる疎水性の傾斜面を備えている。疎水性材料としては、例えば、シリコーン、フッ素樹脂、親水性処理をしていない疎水性プラスチック等が挙げられる。本発明においては、底部材に親水性の素材を用い、さらにこれを囲む側壁部材として疎水性の傾斜面を有するものを組合わせることによって、貯留部内で生体サンプルが安定して保持されるため好ましい。生体サンプルを構成する細胞は非常に物理的損傷を受けやすく、例えば、細胞膜が損傷を受けた場合には、細胞内に一旦導入された色素が細胞膜の損傷部分から漏出してしまうことが考えられる。従って、本発明においては、貯留部内で生体サンプルが安定して保持されることが非常に重要である。
【００２１】
本発明において、側壁部材２は、上記疎水性材料でその全体が構成されていてもよいが、疎水性材料以外の材料（例えば、上記底部材１の材料として列挙されたもの等）で構成した上で、傾斜面を上記疎水性材料でコーティングしたものであってもよい。本発明の容器において、側壁部材２が疎水性の傾斜面を有することにより、生後数カ月以上の成体由来のサンプルの細胞に対しても細胞内イオンイメージング用色素を導入することができ、細胞内イオンイメージングをすることができる。その理由は明らかではないが、例えば、以下のことが考えられる。上記疎水性傾斜面により底部材１が囲まれていることにより、当該領域に生体サンプルを浸漬した溶液を配置すると、溶液は容器全体に広がらずに底部材１のうち環状の側壁部材２に囲まれた部分付近に集まる。その結果、少量の溶液中に生体サンプルを浸漬することができる。このように少量の溶液に覆われた状態で静置されることで生体サンプルの状態（細胞膜の状態等）が生理的な条件に近い状態に保持され、細胞内イオンイメージング用色素の導入及びその活性化によい影響を与えていることが予想される。尚、本発明において、生体由来のサンプルの細胞への細胞内イオンイメージング用色素の導入とは、生体由来のサンプルの細胞の細胞内イオンイメージング用色素による負荷といいかえることもできる。
【００２２】
本発明において、側壁部材２の傾斜面と底部材１の表面との角度は、０°より大きく、好ましくは、２０°未満、より好ましくは１５°以下、さらに好ましくは１０°以下である。当該実施形態の細胞内イオンイメージング用色素導入用容器を、図２における点線を通り、底部材１に垂直な平面で切り取った断面図を図３に示す。当該実施形態において、側壁部材２の傾斜面と底部材１の表面との角度とは、図３におけるＡの角度を示す。側壁部材２の傾斜面が高さ方向に湾曲している場合等のように、側壁部材２の傾斜面のうち、底部材１の表面と接する位置と底部材１の表面から離れた位置とで傾斜の程度が異なる場合、「側壁部材２の傾斜面と底部材１の表面との角度」とは、底部材１の表面と側壁部材２の傾斜面とが接する位置の角度を示す。底部材１の表面に対する側壁部材２の傾斜面の角度が底部材１の平面上の位置によって異なる場合には、最も大きい角度を「側壁部材２の傾斜面と底部材１の表面との角度」とする。
【００２３】
本発明において、底部材１のうち、環状の側壁部材２に囲まれ、露出している面の面積としては、例えば、好ましくは２５〜９００ｍｍ２、より好ましくは１００〜４００ｍｍ２の範囲で適宜設定することができる。
【００２４】
また本発明に係る細胞内イオンイメージング用色素導入用容器は、図４に示すように、側壁部材の外側を囲むようにさらに外壁を有していてもよい。当該外壁の素材は特に限られず、例えば、前述の底部材１の材料として列挙したもの等を挙げることができる。また、当該外壁は、底部材１と一体化していてもよい。
【００２５】
本発明の細胞内イオンイメージング用色素導入用容器を製造する方法としては、特に限定されないが、例えば、まず、底部材１を一定の角度傾けた状態で、当該底部材１に疎水性素材の原料である樹脂溶液を塗布し、当該疎水性材料を硬化させることにより底部材の一部に傾斜面を有する疎水性の側壁の一部が形成される（図５）。底部材１を、これに垂直かつ円の中心を通る軸に対し９０°回転させ、この操作を繰り返すことにより、環状になるように疎水性の側壁部材を形成することができる。
【００２６】
細胞内イオンイメージング用色素の導入方法
本発明は、上記細胞内イオンイメージング用色素導入用容器をチャンバとして用い、当該チャンバ中で、細胞内イオンイメージング用色素を含む溶液に生体サンプルを浸漬する工程、及び
当該チャンバを酸素環境下でインキュベートする工程
を含む、
生体サンプルの細胞への細胞内イオンイメージング用色素の導入方法を提供する。本発明の方法の一実施形態の概略図を図６に示す。
【００２７】
生体サンプルの浸漬工程
本発明の方法においては、まず、細胞内イオンイメージング用色素導入用容器１０１をチャンバとして用い、当該チャンバ内で、細胞内イオンイメージング用色素を含む溶液４（本明細書中において、単に色素導入溶液４と示すこともある）に生体サンプル３を浸漬する。
【００２８】
細胞内イオンイメージング用色素
細胞内イオンイメージング用色素とは、細胞内で種々の機能を担っているイオン又は当該イオンに起因して生じる膜電位をイメージングするための色素を示し、より具体的には、カルシウム等のイオンに対し感受性の色素及び細胞内外のイオンの濃度勾配により生じる膜電位に対し感受性の色素を示す。ここで、細胞内イオンイメージング用色素としては、細胞膜挿入型あるいは、イオン結合部位を脂溶性にした細胞膜透過型色素全般が含まれる。細胞膜透過型としては、例えばカルシウム感受性色素、マグネシウム感受性色素、亜鉛感受性色素、ナトリウム感受性色素、カリウム感受性色素、塩化物イオン感受性色素、水素イオン濃度 (pH) 感受性色素等のイオン感受性色素、及び細胞膜挿入型として、膜電位感受性色素等が挙げられる。
【００２９】
カルシウム感受性蛍光色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、Fura-2（化合物名：2-(6-(ビス(カルボキシメチル)アミノ)-5-(2-(2-(ビス(カルボキシメチル)アミノ)-メチルフェノキシ)エトキシ)-2-ベンゾフラニル)−５−オキサゾールカルボン酸  カリウム塩（5-Oxazolecarboxylic acid, 2-(6-(bis(carboxymethyl)amino)-5-(2-(2-(bis(carboxymethyl)amino)-5-methylphenoxy)ethoxy)-2-benzofuranyl)-, pentapotassium salt））、BAPTA （化合物名：N,N'-(1,2-エタンジイルビス(オキシ−２，１−フェニレン))ビス(N-(カルボキシメチル))グリシン  カリウム塩（Glycine, N,N'-(1,2-ethanediylbis(oxy-2,1-phenylene))bis(N-(carboxymethyl))-, tetrapotassium salt））等の色素またはその誘導体、これらの色素のアセトキシメチルエステル体［例えば、Fura-2 AM（化合物名：2-(6-(ビス(2-((アセチルオキシ)メトキシ)-2-オキソエチル)アミノ)-5-(2-(2-(ビス(2-((アセチルオキシ)メトキシ)-2-オキソエチル)アミノ)-5-メチルフェノキシ)エトキシ)-2-ベンゾフラニル)-5−オキサゾールカルボン酸  (アセチルオキシ)メチルエステル（5-Oxazolecarboxylic acid, 2-(6-(bis(2-((acetyloxy)methoxy)-2-oxoethyl)amino)-5-(2-(2-(bis(2-((acetyloxy)methoxy)-2-oxoethyl)amino)-5-methylphenoxy)ethoxy)-2-benzofuranyl)-, (acetyloxy)methyl ester））、Fura-PE3-AM （化合物名：アセトキシメチル2-[5-[2-[5-[3-[4-[2-(アセトキシメトキシ)-2-オキソエチル]ピペラジン-1-イル]-3-オキソプロピル]-2-[ビス[2-(アセチロキシメトキシ)-2-オキソエチル]アミノ]フェノキシ]エトキシ]-6-[ビス[2-(アセチロキシメトキシ)-2-オキソエチル]アミノ]-1-ベンゾフラン-2-イル]-1,3-オキサゾール-5-カルボキシレート；Fura-2-LR-AMとしても知られている）、Oregon Green （登録商標）488 BAPTA-1-AM（化合物名：N-[2-[(アセチルオキシ)メトキシ]-2-オキソエチル]-N-[4-[[[3',6'-ビス(アセチルオキシ)-2',7'-ジフルオロ-3-オキソスピロ[イソベンゾフラン-1(3H),9'-[9H]キサンテン]-5-イル]カルボニル]アミノ]-2-[2-[2-[ビス[2-[(アセチルオキシ)メトキシ]-2- オキソエチル]アミノ]フェノキシ]エトキシ]フェニル]-グリシン (アセチルオキシ)メチルエステル（Glycine, N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]-N-[4-[[[3',6'-bis(acetyloxy)-2',7'-difluoro-3-oxospiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthen]-5-yl]carbonyl]amino]-2-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-, (acetyloxy)methyl ester））、Fluo4-AM（化合物名：N-[4-[6-[(アセチルオキシ)メトキシ]-2,7-ジフルオロ-3-オキソ-3H-キサンテン-9-イル]-2-[2-[2-[ビス[2-[(アセチルオキシ)メトキシ]-2-オキソエチル]アミノ]-5-メチルフェノキシ]エトキシ]フェニル]-N-[2-[(アセチルオキシ)メトキシ]-2-オキソエチル]-グリシン  (アセチルオキシ)メチルエステル（Glycine, N-[4-[6-[(acetyloxy)methoxy]-2,7-difluoro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl]-2-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-5-methylphenoxy]ethoxy]phenyl]-N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]-,(acetyloxy)methyl ester））等］等が挙げられる。
【００３０】
マグネシウム感受性色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、Mag-Fura-2（化合物名：２−［６−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−５−（カルボキシメトキシ）−２−ベンゾフラニル］−５−オキサゾールカルボン酸  カリウム塩（5-Oxazolecarboxylic acid, 2-[6-[bis(carboxymethyl)amino]-5-(carboxymethoxy)-2-benzofuranyl]-, tetrapotassium salt））、Mag-Indo-1（化合物名：2-[4-[ビス(カルボキシメチル)アミノ]-3-(カルボキシメトキシ)フェニル]-1H-インドール-6-カルボン酸 カリウム塩（1H-Indole-6-carboxylic acid, 2-[4-[bis(carboxymethyl)amino]-3-(carboxymethoxy)phenyl]-, tetrapotassium salt））、Mag-Fluo-4（化合物名：２，２’−（２−（カルボキシメトキシ）−４−（２，７−ジフルオロ−６−オキシド−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）フェニルアザネジイル）ジアセチックアシッド  カリウム塩）（2,2'-(2-(carboxymethoxy)-4-(2,7-difluoro-6-oxido-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)phenylazanediyl)diacetic acid, tetrapotassium salt））等の色素またはその誘導体、これらの色素のアセトキシメチルエステル体［例えば、Mag-Fura-2 AM（化合物名：２−［５−［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエトキシ］−６−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］−２−ベンゾフラニル］−５−オキサゾールカルボン酸（アセチルオキシ）メチルエステル（2-[5-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethoxy]-6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-2-benzofuranyl]-5-Oxazolecarboxylic acid (acetyloxy)methyl ester））、Mag-Indo-1 AM(化合物名：２−［３−［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエトキシ］−４−［ビス［２−［（アセチルオキシ）メトキシ］−２−オキソエチル］アミノ］フェニル−１Ｈ−インドール−６−カルボン酸  （アセチルオキシ）メチルエステル(1H-Indole-6-carboxylic acid, 2-[3-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethoxy]-4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]phenyl]-, (acetyloxy)methyl ester))等］等が挙げられる。
【００３１】
亜鉛感受性色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、FluoZin-1（化合物名：９−（４−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）−３−メトキシフェニル）−２，７−ジフルオロ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−６−オレート  カリウム塩（9-(4-(bis(carboxymethyl)amino)-3-methoxyphenyl)-2,7-difluoro-3-oxo-3H-xanthen-6-olate, tripotassium salt））、FluoZin-3 （化合物名：９−（３−（２−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）−５−メトキシフェノキシ）エトキシ）−４−（カルボキシメチルアミノ）フェニル）−２，７−ジフルオロ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−６−オレート  カリウム塩（9-(3-(2-(2-(bis(carboxymethyl)amino)-5-methoxyphenoxy)ethoxy)-4-(carboxymethylamino)phenyl)-2,7-difluoro-3-oxo-3H-xanthen-6-olate, tetrapotassium salt））、TSQ（化合物名：Ｎ−（６−メトキシ−８−キノリル）−ｐ−トルエンスルホンアミド（N-(6-methoxy-8-quinolyl)-p-toluenesulfonamide））等の色素またはその誘導体、これらの色素のアセトキシメチルエステル体［例えば、FluoZin-1 AM（化合物名：ビス（アセトキシメチル）  ２，２’−（４−（６−（アセトキシメトキシ ）−２，７−ジフルオロ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−２−メトキシフェニルアザネジイル）ジアセテート（bis(acetoxymethyl) 2,2'-(4-(6-(acetoxymethoxy)-2,7-difluoro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-methoxyphenylazanediyl)diacetate））、FluoZin-2 AM (化合物名：ビス（アセトキシメチル）２，２’−（４−（６’−アセトキシ−３’−（アセトキシメチル）−２，７’−ジフルオロ−３−オキソ−３’，９ａ’−ジヒドロ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−イルカルボキサミド）−２−メトキシフェニルアザネジイル）ジアセテート（bis(acetoxymethyl) 2,2'-(4-(6'-acetoxy-3'-(acetoxymethyl)-2',7'-difluoro-3-oxo-3',9a'-dihydro-3H-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthene]-5-ylcarboxamido)-2-methoxyphenylazanediyl)diacetate））、FluoZin-3 AM(化合物名：（ビス（アセトキシメチル）  ２，２’−（２−（２−（５−（６−（アセトキシメトキシ）−２，７−ジフルオロ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−２−（２−（アセトキシメトキシ）−２−オキソエチルアミノ）フェノキシ）エトキシ）−４−メトキシフェニルアザネジニル）ジアセテート（bis(acetoxymethyl) 2,2'-(2-(2-(5-(6-(acetoxymethoxy)-2,7-difluoro-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)-2-(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethylamino)phenoxy)ethoxy)-4-methoxyphenylazanediyl)diacetate））)等］等が挙げられる。
【００３２】
ナトリウム感受性色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、SBFI（化合物名：4,4'-[1,4,10-トリオキサ-7,13-ジアザシクロペンタデカン-7,13-ジイルビス(5-メトキシ-6,2-ベンゾフランジイル)]ビス-1,3-ベンゼンジカルボン酸  アンモニウム塩（1,3-Benzenedicarboxylic acid, 4,4'-[1,4,10-trioxa-7,13-diazacyclopentadecane-7,13-diylbis(5-methoxy-6,2-benzofurandiyl)]bis-, tetraammonium salt））等の色素またはその誘導体、これらの色素のアセトキシメチルエステル体［例えば、SBFI-AM（化合物名：4,4'-[1,4,10-トリオキサ-7,13-ジアザシクロペンタデカン-7,13-ジイルビス(5-メトキシ-6,12-ベンゾフランジイル)]ビス-1,3-ベンゼンジカルボン酸 テトラキス[(アセチルオキシ)メチル] エステル（1,3-Benzenedicarboxylic acid, 4,4'-[1,4,10-trioxa-7,13-diazacyclopentadecane-7,13-diylbis(5-methoxy-6,12-benzofurandiyl)]bis-, tetrakis[(acetyloxy)methyl] ester））等］等が挙げられる。
【００３３】
カリウム感受性色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、PBFI（化合物名：4,4'-[1,4,10,13-テトラオキサ-7,16-ジアザシクロオクタデカン-7,16-ジイルビス(5-メトキシ-6,2-ベンゾフランジイル)]ビス-1,3-ベンゼンジカルボン酸(1,3-Benzenedicarboxylic acid, 4,4'-[1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecane-7,16-diylbis(5-methoxy-6,2-benzofurandiyl)]bis-））等の色素またはその誘導体、これらの色素のアセトキシメチルエステル体［例えば、PBFI-AM（化合物名：4,4'-[1,4,10,13-テトラオキサ-7,16-ジアザシクロオクタデカン-7,16-ジイルビス(5-メトキシ-6,2-ベンゾフランジイル)]ビス-1,3-ベンゼンジカルボン酸 テトラキス[(アセチルオキシ)メチル]エステル（1,3-Benzenedicarboxylic acid, 4,4'-[1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecane-7,16-diylbis(5-methoxy-6,2-benzofurandiyl)]bis-, tetrakis[(acetyloxy)methyl] ester））等］等が挙げられる。
【００３４】
塩化物イオン感受性色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、SPQ（化合物名：６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（6-Methoxy-N-(3-Sulfopropyl)Quinolinium））、MEQ（化合物名：６−メトキシ−Ｎ−エチルキノリニウムヨウ化物（6-Methoxy-N-Ethylquinolinium Iodide））等の色素またはその誘導体、これらの色素のアセトキシメチルエステル体等が挙げられる。
【００３５】
水素イオン濃度 (pH) 感受性色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、SNARF（化合物名：2-[10-(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-ベンゾ[c]キサンテン-7-イル]-ベンゼンジカルボン酸及び4-[10-(ジメチルアミノ)-3-オキソ-3H-ベンゾ[c]キサンテン-7-イル]-ベンゼンジカルボン酸（Benzenedicarboxylic acid, 2(or 4)-[10-(dimethylamino)-3-oxo-3H-benzo[c]xanthene-7-yl]-））、BCECF (化合物名：２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−カルボキシフルオレセイン及び２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−６−カルボキシフルオレセイン (2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein))等の色素またはその誘導体、これらの色素のアセトキシメチルエステル体［例えば、SNARF-AM （化合物名：3-(アセチルオキシ)-10-(ジメチルアミノ)-3'-オキソ-スピロ[7H-ベンゾ[c]キサンテン-7,1'(3H)-イソベンゾフラン]-ar'-カルボン酸  (アセチルオキシ)メチルエステル（Spiro[7H-benzo[c]xanthene-7,1'(3H)-isobenzofuran]-ar'-carboxylic acid, 3-(acetyloxy)-10-(dimethylamino)-3'-oxo-, (acetyloxy)methyl ester））、BCECF AM（化合物名：２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル及び２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−６−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester））等］等が挙げられる。
【００３６】
膜電位感受性色素としては、特に限定されず、自体公知のものを適宜使用することができ、例えば、DiBAC4(3)（化合物名：ビス-(1,3-ジブチルバルビツール酸)トリメチンオキソノール）、Di-4-ANEPPS（化合物名：4-(2-(6-(ジブチルアミノ)-2-ナフタレニル)エテニル)-1-(3-スルホプロピル)-ピリジニウム  水酸化物（Pyridinium, 4-(2-(6-(dibutylamino)-2-naphthalenyl)ethenyl)-1-(3-sulfopropyl)-, hydroxide, inner salt））、Di-8-ANEPPS（化合物名：4-[2-[6-(ジオクチルアミノ)-2-ナフタレニル]エテニル]-1-(3-スルホプロピル)-ピリジニウム（Pyridinium, 4-[2-[6-(dioctylamino)-2-naphthalenyl]ethenyl]-1-(3-sulfopropyl)-, inner salt））、RH 414（化合物名：4-[4-[4-(ジエチルアミノ)フェニル]-1,3-ブタジエニル]-1-[3-(トリエチルアンモニオ)プロピル]-ピリジニウム  ジブロミド（Pyridinium, 4-[4-[4-(diethylamino)phenyl]-1,3-butadienyl]-1-[3-(triethylammonio)propyl]-, dibromide））、RH 795（化合物名：4-[4-[4-(ジエチルアミノ)フェニル]-1,3-ブタジエニル]-1-[2-ヒドロキシ-3-[(2-ヒドロキシエチル)ジメチルアンモニオ]プロピル]-ピリジニウム  ジブロミド（Pyridinium, 4-[4-[4-(diethylamino)phenyl]-1,3-butadienyl]-1-[2-hydroxy-3-[(2-hydroxyethyl)dimethylammonio]propyl]-, dibromide））等が挙げられる。
【００３７】
細胞内イオンイメージングの中でも、特に、カルシウム感受性蛍光指示薬を用いた、カルシウムイメージングは、Ｓ／Ｎ比が大きいため有効である。またカルシウムイメージングは、単一細胞以下の空間分解能があるため、脳スライス標本やin vivo標本において、信号が検出された細胞の位置を同定した上で、そのカルシウム動態を計測することができるという大きな利点を有する。従って、細胞内イオンイメージング用色素としては、カルシウム感受性蛍光色素を用いることが好ましい。
【００３８】
色素導入溶液４における細胞内イオンイメージング用色素の濃度は、特に限定されないが、例えば、１〜５０μＭ、より好ましくは５〜３０μＭの範囲で設定することができる。
【００３９】
色素導入溶液４には、細胞内イオンイメージング用色素以外に、生体サンプルを生理的な条件に近い状態に保つために、適宜、塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等）、糖類（グルコース等）を配合してもよい。また、色素導入溶液４には、これ以外に、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリ(オキシエチレン)ポリ(オキシプロピレン)グリコール等が挙げられ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油が好ましい。かかる界面活性剤の市販品としては、例えば、Cremophor EL (Sigma-Aldrich 社)、Pluronic F127 (Life Technologies社)、PowerLoad (Life Technologies社)等が挙げられる。また、色素導入溶液４としては、ＨＥＰＥＳ等のグッドバッファー等に細胞内イオンイメージング用色素を添加したもの、またはさらに適宜これに上記の塩等を添加したものを用いてもよい。
【００４０】
生体サンプル３は、生体から取り出した固形サンプルであり、哺乳動物（マウス、ラット、サル、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ウマ、ヒト等）及び非哺乳動物（例えば、昆虫、魚類、鳥類、両生類、爬虫類、水産無脊椎動物（甲殻類、アメフラシ、ウミウシ、海綿、ウニ等）、線虫等）に由来するものが挙げられる。生体サンプルの部位としては、特に限定されないが、脳、筋肉（心筋、平滑筋等）、血管、血球、全ての内臓実質、精子、卵子、脂肪細胞、肥満細胞、骨 (特に破骨細胞等)等が挙げられる。脳サンプルとしては、特に限定されず、種々のものが挙げられ、例えば、大脳皮質、大脳基底核（又はこれに含まれる線条体）、視床下部、海馬、小脳、視床、網膜、脊髄、末梢神経等を用いることができ、これらの脳細胞は、ニューロンでもグリア細胞でもよい。ヒトの生体サンプルとしては、例えば、てんかん患者、脳腫瘍患者等から摘出したものが挙げられる。これらのサンプルは、生後数週間の動物から摘出したサンプルであっても、生後１ヶ月以上（例えば、２ヶ月以上）経過した成体から摘出したサンプルであってもよい。生体サンプルの形体としては、スライス状、ブロック状等が挙げられるが、平面画像化の観点から、スライス状に加工したものが適している。サンプルは、ドナー生物から摘出した臓器を上記形状に加工したものであっても、生体から取得した細胞をシート状等に培養したものを用いてもよい。
【００４１】
生体サンプル３の体積は特に限定されないが、例えば、１５００ｍｍ３以下の大きさに加工すればよい。
【００４２】
生体サンプル３を浸漬させる色素導入溶液４の体積は、上記生体サンプルを浸漬させることができる量であれば特に限定されないが、例えば、１０〜５００μＬ、より好ましくは５０〜３００μＬの範囲で設定することにより、生体サンプルを液中に充分に浸漬させつつインキュベーションの際に生体サンプル近傍の酸素濃度を高めることができるため好ましい。
【００４３】
浸漬工程は、例えば、チャンバに生体サンプル３を配置した後、色素導入溶液４をサンプル上に滴下することによって行うことができる。また、本発明において、「チャンバ中で、細胞内イオンイメージング用色素を含む溶液に生体サンプルを浸漬する工程」としては、チャンバ外で組織サンプル３を色素導入溶液４に浸漬した液をサンプルごとピペット等で吸い取り、チャンバ内に導入する工程も含まれる。ここで、スライス状の生体サンプル３を用いる場合、溶液をバブリングすることなく生体サンプル３近傍の酸素濃度を保つという観点から、生体サンプル３を色素導入溶液４に浸漬した状態での生体サンプル３のスライスの上側表面と色素導入溶液４の液面との距離が短いこと（例えば、０．５ｍｍ以下）であることが好ましい。
【００４４】
また、色素導入溶液への生体サンプルの浸漬工程の前に、細胞内イオンイメージング用色素を含まない溶液でチャンバをすすぐことにより前処理しておくことが好ましい。すすぎに用いる溶液としては、細胞内イオンイメージング用色素を含まないこと以外、色素導入溶液と同様の組成とした水溶液を用いることができる。従って、例えば、前述した色素導入溶液に配合し得る塩、糖類等を含む水溶液を用いることができる。
【００４５】
インキュベーション工程
次に本発明の方法においては、チャンバを酸素環境下でインキュベートする工程を行う。当該工程は、例えば、図６においては、密閉容器５中にチャンバ１０１を配置し、密閉容器５内に酸素を通気しつつ静置することにより行うことができる。かかる工程により色素導入溶液４に含まれる細胞内イオンイメージング用色素が生体サンプル３に導入される。酸素が不足すると生体サンプルが細胞死またはそれに近い状態となってしまう。細胞死またはそれに近い細胞では、細胞膜を構成するリン脂質が粗な状態になるため色素を細胞内に留めておくことができなくなる。また、細胞死の状態では神経機能、筋収縮等を担うイオンの変動がないため、神経機能、筋収縮等の機構を調査するという目的を達することができなくなる。従って、生体サンプル近傍の酸素濃度を高めることが重要である。しかし、酸素を導入溶液中でバブリングしてしまうと気泡による圧力で生体サンプルが損傷を受けてしまうため、生理的な状態でのイオン動態を画像化できないだけでなく、細胞膜の損傷により、導入された細胞内イオンイメージング用色素が細胞内にとどまらずに放出されてしまうことも懸念される。
【００４６】
本発明の方法によれば、疎水性の傾斜面を有するチャンバを用いることによってごく少量の導入溶液４中に生体サンプル３を浸漬させることができるため、チャンバ内を酸素雰囲気下にすることによって、バブリングをすることなく、導入溶液４中の生体サンプル３付近の酸素濃度を高めることができるものと考えられる。
【００４７】
インキュベートの時間としては、例えば、１０〜９０分、より好ましくは２０〜５０分の間で設定でき、インキュベートの温度としては、例えば、２０〜４０℃、より好ましくは室温〜３７℃の範囲で適宜設定できる。例えば、個体から摘出した臓器をスライス等して得られたサンプルの場合には、例えば、３３〜３７℃の範囲で設定できる。また、例えば、培養細胞の場合には、室温〜37℃の範囲で設定できる。
【００４８】
本発明において、酸素環境下とは、上記チャンバ周辺に酸素を含む気体（例えば、酸素濃度９０％以上の気体）を通気した状態を示す。上記酸素を含む気体には、ｐＨ保持のため、二酸化炭素を１０％以下の濃度で含めてもよい。密閉容器５には、酸素を通気するため、圧力を逃がすための開口部７を設けてもよい。
【００４９】
本発明において、密閉容器５の内部が湿潤なのが好ましい。そのため好ましい実施形態においては、含水材料６（例えば、水を含有させた紙、ポリマー等）を配置してもよい。
【００５０】
細胞内イオンイメージング法
本発明は、前記の方法により細胞内イオンイメージング用色素が導入された生体サンプル中の細胞内イオンイメージング用色素由来の蛍光を検出する工程を含む、細胞内イオンイメージング法を提供する。生体サンプルを必要に応じて洗浄し、本方法にて細胞内イオンイメージングを行う。
【００５１】
細胞内イオンイメージングとは、細胞内で種々の機能を担っているイオンそのもの又は当該イオンに起因して生じる一定の膜電位を可視化する方法を示す。かかる細胞内イオンイメージング法には、細胞内のカルシウムに対し感受性の色素を用いるカルシウムイメージング法及び膜電位の変化を直接蛍光量の変化として捉える膜電位イメージング法があるが、いずれの方法を採用する場合であっても、蛍光を検出するための装置、及び方法は、自体公知のもの（例えば、Neuroscience Letters 402(2006) 81-85等に記載のもの）を適宜用いることができる。本発明の細胞内イオンイメージング法の一実施形態を示す概略図を図７に示す。また、図７に示すように、生体サンプルの特定の位置にStimulatorで電気刺激を加えた上で神経機能、筋収縮等を担うイオンの濃度の変化を測定してもよい。図７においては、カルシウム感受性色素を用いて測定したカルシウム濃度の変化を示す。
【００５２】
以上、本発明の特定の実施形態について説明したが、本発明は当該実施形態に限定されるものではない。
【００５３】
例えば、図１及び２では、底部材１のうち側壁部材２に囲まれ、露出している面の形状は、四角形であるが、図８及び図９に示すように底部材１が円形に露出していてもよい。また当該露出している部分の形状は、これに限られず、三角形、五角形、六角形等の多角形であっても、楕円形であってもよい。
【００５４】
また、図１及び２では、１つの底部材１に対し１つの側壁部材２を備える容器が示されているが、図１０に示すように、１つの底部材に対し複数の側壁部材を備えていてもよい。
【実施例】
【００５５】
実施例１
１−１  色素導入用ストック溶液の作成
Fura-PE3 AM(AM はアセトキシメチルエステル体の意味) を5 mM の濃度になるように DMSO で溶解し、-20 ℃ 以下で保存してストック溶液とした。界面活性剤溶液としては、Cremophor(R) EL の 10% 水溶液を作成し、室温で保存した。人工脳脊髄液 (Artificial cerebrospinal fluid、以下単にACSFと示すこともある)として、以下の組成で塩及び糖類を水に溶解して ACSF を作成した：
NaCl 137, KCl 2.5, NaHCO3 21, NaH2PO4 0.6, CaCl2 2.5, MgCl2 1.2, D-glucose 10 (単位: mM)。
【００５６】
１−２  脳スライス作成
生後１５日齢のマウスに、吸入麻酔薬のハロタン又はイソフルランを用いて、麻酔をかけた。断頭し、脳を取り出し、95%O2-5%CO2を通気した氷中のACSFに浸し冷却した。上記脳から大脳基底核線条体を含む脳ブロックを切り出し、ビブラトーム(振動刃スライサー)で厚さ300-400μｍの脳スライス標本を作成した。この脳スライス標本を95%O2-5%CO2を通気した室温のACSF中に1 時間以上保存した。
【００５７】
１−３  色素導入チャンバの準備
色素導入チャンバとして、表面を親水性にするために酸素プラズマ処理を施したポリスチレン製のプラスチックシャーレ（直径３５ｍｍ）の内壁に、図４に示すような形状を有し、傾斜面を有する側壁部材をシリコーン系エラストマー（ＳＹＬＧＡＲＤ（登録商標）１８４）を用いて形成したものを用いた。底面に対する傾斜面の角度は１°とした。また、シャーレの底面のうち、上記側壁で囲まれ、露出した部分（親水性部分）の寸法は、約１．５ｃｍ×約１．５ｃｍとした。
【００５８】
当該色素導入チャンバを超純水で洗い、チャンバ内を超純水で満たしておいた。色素導入の 10 分程度前に、チャンバ内を ACSF ですすぎ、ACSF を満たしておいた。
【００５９】
１−４  細胞内イオンイメージング用色素導入溶液の準備 (導入溶液)
１枚のスライスに色素を導入するために、100 μｌ の導入溶液を用いた。100μｌあたりの導入溶液組成ならびに作成法は以下の通りである：
ACSF 99.4μｌに 10% Cremophor EL 溶液を 0.2μｌ添加し、ボルテックスミキサーなどで十分に混和する。この溶液に前述のFura-PE3色素溶液 0.4μｌを添加し、ボルテックスミキサーなどで 1 分以上激しく混和する。導入溶液の最終的な組成は以下の通りである：
Fura-PE3 20μＭ, Cremophor(R)EL 0.02%, DMSO 0.4%, in ACSF。
【００６０】
１−５  色素導入
ACSF中に浸漬させた状体の脳スライス標本を、ピペットを用いてスライスが曲がらないように色素導入用チャンバの親水性部分に静置させ、ACSF を全て取り除いた。色素導入溶液をスライスの直上から静かに滴下した（この状態で、脳スライスの上側表面と色素導入溶液の液面との距離は、約１００μｍであった）。内部を湿潤にした密閉容器内に、色素導入用チャンバを入れ、密閉容器内に95% O2 - 5% CO2 を通気させ、この密閉容器を湿潤なインキュベータ内に静置する。このインキュベータ内の温度は35℃とした。そのまま、４５分静置した。
【００６１】
１−６  洗浄
インキュベータから密閉容器を取り出し、その中のチャンバを取り出す。チャンバ内の導入溶液を全て捨て、ACSF 100μｌで3 回洗浄後、再びACSF 100μｌをスライスに滴下し、色素導入と同様の方法でインキュベータ内に15-30 分静置した。
【００６２】
１−７  観察
洗浄が終了した脳スライス標本を、顕微鏡の対物レンズ下に置き、95% O2 - 5% CO2 を通気した ACSF を灌流しながら、蛍光を観察した。
【００６３】
本実施例でカルシウム感受性蛍光色素を導入した脳スライス標本の蛍光写真を、図１１の左側に示す。図１１に示されるように、顕微鏡の視野中の多数の細胞を可視化することができた。
【００６４】
実施例２
色素導入用チャンバの底面に対する傾斜面の角度を２０°とする以外は、上記実施例１と同様にして、脳スライス標本のカルシウムイメージングを行った（インキュベーションの状態で、脳スライスの上側表面と色素導入溶液の液面との距離は、約１００μｍであった）。結果を図１１の右側に示す。図１１に示されるように、１°の場合と比較して染色された細胞の数は少なかったものの、この角度でもカルシウム感受性蛍光色素による染色は認められた。
【００６５】
実施例３
生体サンプルとして生後６４日齢のマウス線条体スライス標本を用い、色素導入用チャンバとして、底面に対する傾斜面の角度を約８°としたものを用いる以外は、上記実施例１と同様にして、脳スライス標本のカルシウムイメージングを行った（インキュベーションの状態で、脳スライスの上側表面と色素導入溶液の液面との距離は、約１００μｍであった）。結果を図１２の左側に示す。図１２に示されるように、顕微鏡の視野中の多数の細胞を可視化することができた。
【００６６】
さらに、図１２の左側の画像に１〜５として示した位置の蛍光強度を経時的に測定した結果のグラフを図１２の右側に示す。本発明者らは、幼弱なラット、マウスの線条体では自発カルシウム変動が観察されることを報告しているが (Osanai et al.,Neurosci. Lett. 402, 1996, 小山内ら 電気学会論文誌 C 128, 2008)、図１２に示すように、本発明の方法を用いることによって、64 日齢の成獣にも色素が導入でき、なおかつ幼弱マウスと同様の自発カルシウム変動が観察された。
【００６７】
実施例４
生体サンプルとして生後５２日齢のマウスの大脳皮質スライス標本を用い、色素導入用チャンバとして、底面に対する傾斜面の角度を８°としたものを用いる以外は、上記実施例１と同様にして、脳スライス標本のカルシウムイメージングを行った（参考文献：Osanai M, Tanaka S, Takeno Y, Takimoto S, Yagi T (2010) Spatiotemporal Properties of the Action Potential Propagation in the Mouse Visual Cortical Slice Analyzed by Calcium Imaging. PLoS ONE 5(10): e13738. doi:10.1371/journal.pone.0013738）。インキュベーションの状態で、脳スライスの上側表面と色素導入溶液の液面との距離は、約１００μｍであった。結果を図１３に示す。図１３に示されるように、顕微鏡の視野中の多数の細胞を可視化することができた。さらに、図１３のアスタリスク（＊）の場所にガラス管微小電極より振幅２００μＡ、持続時間２００μｓの２相性電流刺激を与え、図１３の１〜５で示した箇所の蛍光強度を測定したところ、当該電気刺激に応じた細胞内カルシウム濃度変化を測定することができた。
【００６８】
比較例
色素導入用チャンバとして、側壁部材が底面に対する傾斜面を有するのではなく、底面に対する側壁部材の角度を９０°としたものを用いる以外、実施例１と同様にして、脳スライス標本のカルシウムイメージングを試みた。
【００６９】
しかし、この場合、蛍光による脳サンプル中への色素の導入がほとんど確認できなかった。底面に対し側壁部材が垂直の場合に色素の導入が確認できなかった原因は不明だが、当該比較例では、脳スライス標本に色素導入溶液を滴下した状態において、液面が表面張力で盛り上がっていた。このことが脳スライス標本自体のコンディションや脳スライス標本付近の酸素濃度（前述のように酸素濃度が不足すると細胞死を起こしてしまう）に影響したこと等が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の方法によれば、生後０〜３週齢といった短い週齢の生体サンプルだけでなく、生後数カ月の生体サンプルに対しても細胞内イオンイメージング用色素を導入し、細胞内イオンイメージングをすることができる。前述のように、カルシウム等のイオンによる情報伝達はあらゆる組織において生じているため、これを担うイオンの動態を調査することは非常に重要である。従って本願発明は、医療分野の基礎研究、創薬研究等において広く利用可能である。
【符号の説明】
【００７１】
１  底部材  ；  ２  側壁部材  ；  ３  生体サンプル  ；  ４  色素導入溶液  ；  ５  密閉容器  ；  ６  含水材料  ；１０１  細胞内イオンイメージング用色素導入用容器
【図１】
2013215114.tif 000003
【図２】
2013215114.tif 000004
【図３】
2013215114.tif 000005
【図８】
2013215114.tif 000006
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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