(57)【要約】      （修正有）【課題】煩雑な操作を有することなく任意形状の三次元細胞集合体を作製する方法の提供。【解決手段】三次元細胞集合体の作製方法は、体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体を担体とし、その担体上に細胞を播種して培養し、担体の体積を変化させることにより三次元構造が付与された培養細胞を三次元細胞集合体として剥離する。親水性ポリマーゲルに温度応答性ポリマーゲルを用いる。臨界温度（Ｔｃ）以上で収縮する下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を有する親水性ポリマーゲルであり、該下限臨界共溶温度より高い温度で細胞を培養し、該下限臨界共溶温度以下の温度で培養細胞を親水性ポリマーゲルから剥離する。【選択図】図５Ｅ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体を担体とし、該担体上に細胞を播種して培養し、該担体の体積を変化させることにより三次元構造が付与された培養細胞を三次元細胞集合体として剥離する、三次元細胞集合体の作製方法。
【請求項２】
上記親水性ポリマーゲルに温度応答性ポリマーゲルを用いる請求項１記載の作製方法。
【請求項３】
上記温度応答性ポリマーゲルが、臨界温度（Ｔｃ）以上で収縮する下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を有する親水性ポリマーゲルであり、該下限臨界共溶温度より高い温度で細胞を培養し、該下限臨界共溶温度以下の温度で培養細胞を親水性ポリマーゲルから剥離する請求項２記載の作製方法。
【請求項４】
上記温度応答性ポリマーゲルが、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミドの単独重合体または共重合体の架橋体である請求項３記載の作製方法。
【請求項５】
上記親水性ポリマーゲルを、三次元印刷法を用いて作製した樹脂製母型を用いて成形する請求項１記載の作製方法。
【請求項６】
細胞を播種するに先立って、上記ポリマーゲルの表面に細胞接着を促進する有機質を塗布する請求項１記載の作製方法。
【請求項７】
体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体からなり、培養細胞に三次元構造を付与する鋳型として用いる細胞培養用三次元ゲル担体。
【請求項８】
上記親水性ポリマーゲルが温度応答性ポリマーゲルである請求項７記載の細胞培養用三次元ゲル担体。
【請求項９】
上記温度応答性ポリマーゲルが、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミドの単独重合体または共重合体の架橋体である請求項８記載の細胞培養用三次元ゲル担体。
【請求項１０】
表面に細胞接着を促進する有機質を付着させてなる請求項７記載の細胞培養用三次元ゲル担体
【請求項１１】
体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体を鋳型として培養され、該鋳型により三次元構造を付与された細胞の集合体からなる、三次元細胞集合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元細胞集合体の作製方法およびそれに用いる細胞培養用三次元ゲル担体並びに三次元細胞集合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の再生医療では、細胞とスキャフォールドとを体外で複合化し、体の中に埋入することで、生体内で組織再生を誘導する方法が取られてきた。しかし、使用するスキャフォールド材料は、多くの場合、非自己であるため、生体への為害性が懸念される。また、組織再生の遅延の原因となる場合もある。
【０００３】
これに対し、組織再生の誘導に、スキャフォールドを用いず、細胞シートを用いる方法が開発された（特許文献１）。特許文献１の方法は、水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が０〜８０℃の範囲にあるポリマーもしくはコポリマーで表面を被覆した支持体材料を用いて細胞を培養し、上限臨界溶解温度以上もしくは下限臨界溶解温度以上の温度で支持体材料から剥離して細胞シートを回収している。
【０００４】
しかし、この方法で得られる細胞シートは、単層であるため強度が弱く、その取り扱いが困難であるという問題がある。そのため、臨床応用における効能の点から、近年、積層化した細胞シートを使用することが多くなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、細胞シートの積層にあたり、１層ずつの細胞シートを作製したうえで、それらの取り出したシートを重ね合わせるという煩雑な操作が必要であるという問題があった。また、作製される細胞シートは、シート作製用ディッシュの形状に依存するため、任意形状のシートを作製することが不可能であるという問題もあった。さらに、細胞培養ディッシュ表面から得られるものは、あくまでも二次元の細胞シートであり、生体組織を再現できるような三次元細胞集合体を作製できる技術ではないという問題もあった。
【０００７】
そこで、本発明は、上記課題を解決し、煩雑な操作を有することなく任意形状の組織再生用移植材として使用できる三次元細胞集合体を提供することが可能な三次元細胞集合体の作製方法およびそれに用いる細胞培養用三次元ゲル担体並びにその作製方法により得られる任意形状の三次元細胞集合体を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、体積変化可能な親水性ポリマーゲルの成形体上に細胞を播種して培養し、その親水性ポリマーゲルの体積を変化させることにより、培養した細胞を三次元細胞集合体として剥離することが可能なことを見出して本発明を完成させたものである。
すなわち、本発明の三次元細胞集合体の作製方法は、体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体を担体とし、該担体上に細胞を播種して培養し、該担体の体積を変化させることにより三次元構造が付与された培養細胞を三次元細胞集合体として剥離することを特徴とする。
【０００９】
本発明の作製方法においては、上記親水性ポリマーゲルに温度応答性ポリマーゲルを用いることが好ましい。
【００１０】
また、本発明の作製方法においては、上記温度応答性ポリマーゲルが、臨界温度（Ｔｃ）以上で収縮する下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を有する親水性ポリマーゲルであり、該下限臨界共溶温度より高い温度で細胞を培養し、該下限臨界共溶温度以下の温度で培養細胞を親水性ポリマーゲルから剥離することが好ましい。また、その温度応答性ポリマーゲルには、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミドの単独重合体または共重合体の架橋体を用いることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の作製方法においては、上記親水性ポリマーゲルを、三次元印刷法を用いて作製した樹脂製母型を用いて成形することが好ましい。
【００１２】
また、本発明の作製方法においては、細胞を播種するに先立って、上記親水性ポリマーゲルの表面に細胞接着を促進する有機質を塗布することが好ましい。
【００１３】
さらに、本発明の別の発明は、上記の三次元細胞集合体の作製方法に用いる細胞培養用三次元ゲル担体を提供するものであり、体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体からなり、培養細胞に三次元構造を付与する鋳型として用いることを特徴とする。
【００１４】
本発明の三次元ゲル担体においては、上記親水性ポリマーゲルが温度応答性ポリマーゲルであることが好ましい。
【００１５】
また、本発明の三次元ゲル担体においては、上記温度応答性ポリマーゲルが、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミドの単独重合体または共重合体の架橋体であることが好ましい。
【００１６】
さらに、本発明の別の発明は、上記の三次元細胞集合体の作製方法を用いて作製した三次元細胞集合体を提供するものであり、体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体を鋳型として培養され、該鋳型により三次元構造を付与された細胞の集合体からなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の作製方法によれば、親水性ポリマーゲルを膨張させることにより培養した細胞を三次元細胞集合体として剥離することができるので、煩雑な操作を有することなく三次元細胞集合体の作製が可能となる。また、親水性ポリマーゲルは任意形状に成形することができるので、その親水性ポリマーゲルを担体として用いることにより、任意形状の三次元細胞集合体を作製することが可能となる。また、生体組織を再現することの可能な三次元細胞集合体を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に用いる親水性ポリマーゲルの外観を示す写真であり、Ａはポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧ−ＤＭＡ）を架橋剤に用いたゲル、ＢはＮ，Ｎ’−ビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）を架橋剤に用いたゲルを示す。
【図２Ａ】図１のＡで示した親水性ポリマーゲルの膨潤度と温度の関係を示すグラフである。
【図２Ｂ】図１のＡで示した親水性ポリマーゲルの長さ基準膨張率と時間の関係を示すグラフである。
【図２Ｃ】図１のＡで示した親水性ポリマーゲルの膨潤・収縮を示す写真である。左が２５℃、右が３７℃での状態を示している。
【図２Ｄ】図１のＡで示した親水性ポリマーゲルの２５℃と３７℃における気泡の接触角を示すグラフである。
【図３】図１のＡで示した親水性ポリマーゲル表面の細胞の状態を示す光学顕微鏡であり、Ａはコントロール（細胞接着を促進する有機質を塗布せず）であり、Ｂはゼラチン（１重量％）を塗布したもの、ＣはＦＮを１μｇ／ｍｌの濃度で塗布したもの、ＤはＦＮを２μｇ／ｍｌの濃度で塗布したものを示す。
【図４】培養時における細胞数と時間の関係を示すグラフである。
【図５Ａ】グラフィックモデリングソフトウェアを用いて作製した母型のモデル図であり、複数の平行凸条を有する母型と、複数の半球状凸部を有する母型を示している。
【図５Ｂ】三次元印刷法を用いて作製した樹脂製母型の外観を示す写真であり、上側が複数の平行凸条を有する母型と、下側が複数の半球状凸部を有する母型を示している。
【図５Ｃ】樹脂製母型中で重合させ、その樹脂製母型から取り出したゲルの成形体の外観を示す写真であり、上側が複数の平行溝を有する鋳型、下側が複数の半球状凹部を有する鋳型を示している。
【図５Ｄ】培養細胞を含むゲル鋳型の外観を示す写真である。
【図５Ｅ】ゲル鋳型から取り出した細胞集合体の外観を示す写真であり、上側は棒状、下側は半球状の細胞集合体を示している。
【図５Ｆ】ゲル鋳型にＦＮを塗布した場合と塗布しなかった場合の、棒状細胞集合体の長さの変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を図面等を参照して説明する。
本発明の三次元細胞集合体の作製方法は、三次元構造を有し体積変化可能な親水性ポリマーゲルの成形体を担体とし、該担体上に細胞を播種して培養し、該担体の体積を変化させることにより該三次元構造が付与された培養細胞を三次元細胞集合体として剥離することを特徴とするものである。
【００２０】
本明細書で用いる「三次元細胞集合体」とは、単層以上の厚みを有し、任意の三次元形状を有する細胞の集合体を指す。任意の三次元形状とは、フィルムやシート等の平面状、矩形状、球状、柱状、湾曲状等を含むあらゆる形状を指す。
【００２１】
一方、本明細書で用いる「細胞シート」とは、単層の細胞の集合体であり、二次元的な広がりのみを有するものを指す。
【００２２】
（ポリマーゲル）
本発明で用いる親水性ポリマーゲルは、親水性ポリマーを架橋剤を用いて架橋したものであり、三次元構造を有し体積変化可能なものである。本発明で用いる親水性ポリマーゲルは、細胞を培養する際の担体としてだけでなく、培養細胞に三次元構造を付与する鋳型としての役割も有する。
ここで、体積変化可能とは、水溶液中において、外部刺激に対して応答し、その刺激を受ける前と後で体積が変化することをいう。その外部刺激としては、温度変化、光照射、電場印加、ｐＨ変化、溶質濃度変化、溶媒組成変化等を挙げることができる。外部刺激としては温度変化が好ましい。細胞への影響が少なく、また周囲温度を制御するだけで良く操作が簡単だからである。
【００２３】
本明細書においては、温度変化に対応して、形状および／または性質が変化するポリマーゲルを温度応答性ポリマーゲルという。水溶液中で、温度変化に応答して、体積が変化する温度応答性ポリマーゲルとしては、臨界温度（Ｔｃ）以上で収縮する下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を有する親水性ポリマーゲルと、Ｔｃ以上で膨張する上限臨界共有温度（ＵＣＳＴ）を有する親水性ポリマーゲルが知られている。ここで、ＬＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルは、臨界温度よりも低温側で親水性となり膨潤し、逆に臨界温度よりも高温側で疎水性で収縮した状態となることが知られている。一方、ＵＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルは、臨界温度よりも高温側で親水性となり膨潤し、逆に臨界温度よりも低温側で疎水性で収縮した状態となることが知られている。
【００２４】
本発明においては、ＬＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルおよびＵＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルのいずれも使用することができる。細胞培養温度よりも高温側でポリマーゲルから細胞集合体を剥離する場合には、ＵＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルを用いることができる。また、細胞培養温度よりも低温側でポリマーゲルから細胞集合体を剥離する場合には、ＬＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルを用いることができる。好ましくは、ＬＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルである。一般的な細胞培養温度が３７℃であり、室温（２０℃±５℃）でポリマーゲルから細胞集合体を剥離することができるからである。
【００２５】
ここで、ＬＣＳＴは、２相分離を目視観察することにより求めることができる。すなわち、親水性ポリマーゲルを水溶液中に浸漬し、温度を徐々に上げることによりあるいは下げることにより、透明から白色、あるいは白色から透明へ変化する温度を求める。あるいは、ゲルのサイズや重量を測定し、サイズもしくは重量が変化する温度を求める方法を用いることもできる。
【００２６】
ＬＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルとしては、以下の水溶性モノマーの単独重合体または共重合体の架橋体を用いることができる。その水溶性モノマーとしては、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミドやＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミドを挙げることができる。ここでアルキル基は炭素数１から４である。これら水溶性モノマーの具体例としては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（３２℃）、Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド（４３℃）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（２２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド（２７℃）、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（４３℃）、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド（６０℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（３５℃）、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（４５℃）、Ｎ−エチルアクリルアミド（７２℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（３２℃）等を挙げることができる。なお、上記の括弧内の温度は、単独重合体のＬＣＳＴを示す。
【００２７】
これらの親水性モノマーを共重合させることにより、および／または架橋剤の種類および濃度を調整することにより、ＬＣＳＴを調整することができる。ＬＣＳＴは３７℃〜０℃の範囲が好ましい。０℃より低いと、細胞増殖速度が極端に低下するか、細胞が死滅するからである。また、３７℃より高いと、培養時に剥離し易くなるからである。
【００２８】
共重合体は、上記水溶性モノマーを２種以上含むものを挙げることができ、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドの組合せを挙げることができる。
【００２９】
また、共重合体には、上記の水溶性モノマーに加え、必要に応じ、アクリルアミド、アクリロイルモルフォリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド等の水溶性モノマーを含有させることもできる。
【００３０】
本発明に用いる親水性ポリマーゲルは、上記のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミドやＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド等の水溶性モノマーを架橋剤および重合開始剤存在下で重合することに得ることができる。架橋剤としては二官能性架橋剤や三官能性架橋剤を用いることができる。二官能性架橋剤としては、Ｎ，Ｎ−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビス（メタ）アクリルアミド等の二官能性アクリルアミド、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等のアルキレングリコールジ（メタ）アクリレートまたはポリアルキレングリコールジ（メタ）アクリレートを挙げることができる。また、三官能性架橋剤としては、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート等を挙げることができる。
【００３１】
架橋剤の種類と濃度を変えることにより、親水性ポリマーゲルのＬＣＳＴ、透明性および膨張性を調整することができる。
【００３２】
一般的に、架橋剤濃度を高くすれば、ＬＣＳＴを下げることができるので、ＬＣＳＴが培養温度より低くなるように、架橋剤濃度を調整する。もちろん、ＬＣＳＴは、上記の親水性モノマーを共重合させるモノマー種を選択することにより調整することもできる。例えば、より疎水性のモノマーと共重合させれば、ＬＣＳＴを下げることができる。
【００３３】
また、本発明において、ゲルの透明性とは、細胞培養温度における波長５００ｎｍにおける光透過率をいう。一般的に、架橋剤濃度を高くすると、透明性は低下する。ゲルの透明性は必ずしも必須ではないが、光透過率が高い程、細胞培養期間における細胞の状態を観察することが容易となるので好ましい。光透過率は、７０％以上、好ましくは９０％以上である。このような透明性を付与する架橋剤としては、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレートまたはポリアルキレングリコールジ（メタ）アクリレートが好ましい。
【００３４】
また、本発明において、ゲルの膨張性とは、ＬＣＳＴを有する親水性ポリマーゲルのＬＣＳＴ前後の温度におけるゲルの体積の膨張の程度をいい、膨潤度で表すことができる。本発明においては、ＬＣＳＴより高温の温度ＡからＬＣＳＴ以下の温度Ｂに温度を下げた場合、膨潤度は以下の式で表すことができる。
膨潤度＝（温度Ｂにおけるゲル重量／温度Ａにおけるゲル重量）
ここで、温度Ａ＞温度Ｂである。
【００３５】
本発明においては、細胞培養温度を３７℃とし、細胞集合体をゲルから剥離する温度を２５℃とした場合、膨潤度は１．１以上が好ましい。より好ましくは１．１〜５である。
【００３６】
また、ゲルの膨張には、異方的な膨張と等方的な膨張が含まれるが、等方的な膨張が好ましい。異方的な膨張では、ゲルの特定方向のみが膨張する結果、剥離時に細胞が破損し易くなるからである。等方的な膨張は、ゲルの長さの変化またはゲルの表面積の変化で表すことができる。本発明においては、矩形シート状のゲルについて、以下の式で表される長さ基準膨張率または表面積基準膨張率を用いる。ここで、長さとは、矩形シートのｘ軸方向またはｙ軸方向の長さを意味し、表面積とは矩形シートのｘ軸方向の長さおよびｙ軸方向の長さで規定される二次元平面の面積をいう。
長さ基準膨張率＝（温度Ｂにおけるゲル長さ／温度Ａにおけるゲル長さ）×１００（％）
表面積基準膨張率＝（温度Ｂにおけるゲル表面積／温度Ａにおけるゲル表面積）×１００（％）
長さ基準膨張率は、１１０％〜２００％が好ましい。また、表面積基準膨張率も同様であり、１１０％〜２００％が好ましい。いずれの場合も２００％を越えると細胞が破損し易くなるからである。また、細胞集合体が破損する可能性があるので、急激に膨張することは好ましくない。少なくとも温度を変化させてから１分以上かけて長さ基準膨張率または表面積基準膨張率が１１０％以上となることが好ましい。このような等方的な膨張性を付与する架橋剤としては、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレートまたはポリアルキレングリコールジ（メタ）アクリレートが好ましい。
【００３７】
本発明に用いる親水性ポリマーゲルは、公知の水溶液ラジカル重合により合成することができる。上記の親水性モノマー等のモノマーと上記の架橋剤および重合開始剤の存在下で重合容器中で合成する。重合容器には、親水性ポリマーゲルに鋳型としての三次元構造を付与するために、所定の三次元構造を有する後述の母型中で重合させることが好ましい。重合開始剤としては、水溶性ラジカル開始剤として一般的に知られているものを用いることができる。例えば、過酸化水素、過硫酸アンモニウムや過硫酸カリウム等の過硫酸塩、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド等のハイドロパーオキサイド類を挙げることができる。重合開始剤の濃度は、水溶性モノマーに対して、０．０１〜１０ｍｍｏｌ％である。
【００３８】
本発明における、特に好ましい親水性ポリマーゲルとしては、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの単独重合体に、架橋剤としてポリエチレングリコールジメタアクリレートを用いたものであり、架橋剤濃度は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマーに対して、０．５ｍｍｏｌ％〜５ｍｍｏｌ％である。０．５ｍｍｏｌ％より少ないとゲルが白濁し、５ｍｍｏｌ％を越えると温度応答性が消失するからである。架橋剤濃度が３．５ｍｍｏｌ％のとき、この親水性ポリマーゲルは、３７℃の細胞培養温度において光透過率が９４％であり、高い透明性を有する。また、３７℃から２５℃に温度を下げると、等方的に膨張して細胞集合体が容易に剥離する。
【００３９】
（ポリマーゲルの成形）
親水性ポリマーゲルの成形は、三次元構造を有する重合容器中で重合させる方法や、重合したゲルを切削加工する方法を用いることができるが、三次元構造を有する重合容器中で重合させる方法を用いることが好ましい。三次元構造を有する重合容器には、注型法、圧縮法、射出成形法、押し出し法、三次元印刷法等の公知の樹脂成形法により成形した樹脂製母型を用いることができるが、三次元印刷法で作製した樹脂製母型を用いることが好ましい。三次元印刷法は、薄層の材料を連続的に堆積ないし形成することにより三次元構造体を作製する方法である。例えば、液体または粉末のモノマーを基板上に吹き付け、段面パターンに基づいて印刷ヘッドを移動させインクジェットにより硬化剤を吹き付けて一層を作製し、同様の手順を繰り返し多層を積層して所定の三次元構造を有する樹脂製母型を作製する。この三次元印刷法によれば、複雑な形状を有する母型であっても、従来に比べより、高精度かつ低コストで作製することができる。そのため、三次元細胞集合体に対し、欠損部位等の移植部位の微細形態の再現することや、任意形状を正確に付与することが可能となる。
【００４０】
樹脂製母型には、三次元印刷法に使用されている公知の熱硬化性樹脂や光硬化性樹脂を用いることができる。
【００４１】
（三次元細胞集合体の作製）
細胞の培養は、親水性ポリマーゲルの成形体からなる担体上に、細胞を播種し、所定の培地にて所定の期間培養することにより行う。三次元細胞集合体を作製するためには、細胞を高密度で培養する必要があり、細胞濃度が０．５×１０６〜２×１０６個／ｍｌ、好ましくは１×１０６個／ｍｌ〜２×１０６個／ｍｌである培養液をポリマーゲルの三次元ゲル担体上に播種する。培地や培養条件は、培養する細胞の種類に応じて選択することができる。
【００４２】
培養細胞は、担体である親水性ポリマーゲルの体積を変化させることにより三次元細胞集合体として剥離する。例えば、臨界温度（Ｔｃ）以上で収縮する下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を有する親水性ポリマーゲルを用いる場合、Ｔｃが培養温度（例えば３７℃）より低い親水性ポリマーゲルを用いる。培養終了後、ＬＣＳＴより低い温度まで親水性ポリマーゲルの温度を下げると、親水性ポリマーゲルが膨張し、それに伴い培養細胞は剥離する。具体例を挙げると、親水性ポリマーゲルにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ゲル（ＬＣＳＴ：３２℃）を用いた場合、３７℃で培養し、ゲルの温度をＬＣＳＴより低い温度、すなわち３２℃以下に下げることにより、培養細胞がゲルから剥離する。
【００４３】
本発明を用いて培養可能な細胞としては、ＥＳ細胞（Embryonic stem cells）、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）、間葉系幹細胞といった幹細胞、また、各種上皮系、間葉系の体細胞や、腫瘍細胞など、すべての動物細胞である。また、動物細胞に加えて、昆虫、植物、あるいは細菌など、真核、原核を問わず、すべての細胞について培養可能である。
【００４４】
また、細胞を播種するに先立って、成形した親水性ポリマーゲルの表面に、細胞接着を促進する有機質を塗布することが好ましい。親水性ポリマーゲルの表面に細胞接着を促進する有機質を付着させることにより、親水性ポリマーゲルに対する細胞の接着を促進させて、成長を促進することができる。また、作製する細胞集合体の成形精度を高めることができる。細胞接着を促進する有機質は、細胞同士または細胞と細胞外マトリックスとの接着に関与する物質で、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチンの他、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＹＩＧＳＲ等各種ペプチドを挙げることができる。本発明においては、フィブロネクチンまたはゼラチンが好ましい。フィブロネクチンの濃度は、０．５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１．０μｇ／ｍｌ以上である。
【００４５】
（三次元細胞集合体）
本発明の作製方法を用いて得られる三次元細胞集合体は、三次元構造を有し体積変化可能な親水性ポリマーゲルの成形体を鋳型として培養され、該鋳型により該三次元構造を付与された細胞の集合体からなる。
【００４６】
本発明の三次元細胞集合体の大きさや厚さは特に限定されず、用途に応じて適宜選定することができる。
【００４７】
本発明の三次元細胞集合体には、例えば以下の用途が考えられる。
（１）組織再生用移植材料
１種類もしくは複数種類の細胞をもとに、欠損部位の大きさや形態を反映した移植材料として用いることができる。組織再生を誘導する移植材料としても用いることができる。
（２）ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞をもとにした人工胚の作製用材料
一定数の細胞をもとに、特定サイズの人工初期胚を作製できる可能性がある。
（３）組織形態形成過程のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検討用ツール
ＥＳ細胞等を用いた初期胚だけでなく、ある程度分化の進んだ細胞を用い、それを用いて細胞集合塊を作製することで、組織形態形成の検討用ツールとして用いることが可能である。
（４）人工腫瘍組織の構築材料
腫瘍細胞をもとに人工腫瘍組織を構築、移植部位における血管新生の状態や、転移の起こり易さ等を再現性良く検討できるツールとして用いることも可能である。
（５）薬剤スクリーニング用ツール
各種細胞由来の構造体を作製、薬剤の種類や量、投与期間における細胞への影響を三次元的環境で検討するためのツールとして用いることが可能である。また、細胞集合塊の大きさや細胞数の制御が容易であり、多くの検体に対して適用することが可能である。
（６）人工バイオフィルムの構築材料
生体への感染性を示す細菌をもとに人工バイオフィルム（細菌叢）を作製する。特殊環境での細菌や感染のメカニズムを知るためのツールとしての適用が可能である。
【実施例】
【００４８】
本発明を実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
合成例１．
（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ゲルの作製）
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）（興人社製）をヘキサンで再結晶して用いた。架橋剤として、ポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＥＧ−ＤＭＡ）（シグマ社製）を用いた。ＮＩＰＡＡｍ  ０．７９ｇを超純水１０ｍｌに溶解させ、次いで開始剤として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（ナカライテスク社製）を１６ｍｇ（全モノマーに対し１ｍｏｌ％）およびＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（ナカライ社製）を１０μｌ添加した。その混合液をガラス製のモールド（大きさ：１００×１００×１ｍｍ）に注ぎ、インキュベータ中で３７℃、２時間放置した。重合したゲルをモールドから取り出し、蒸留水で７２時間、次いでアルコール（７０％溶液）で４８時間洗浄した。得られたゲルは、ＬＣＳＴが３２℃であった。
【００４９】
合成例２．
架橋剤として、ＰＥＧ−ＤＭＡに代えてＮ，Ｎ’−ビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）（シグマ社製）を用いた以外は、合成例１と同様の方法により、ゲルを作製した。得られたゲルはＬＣＳＴが３２℃であった。
【００５０】
（ゲルの特性評価）
ゲルの光透過性を評価するため、紫外可視分光光度計（日本分光社製Ｖ−５５０）を用い、５００ｎｍでの光透過率を測定した。
【００５１】
細胞集合体のゲルからの剥離し易さを評価するために、ゲルの膨潤性を測定した。ゲルの温度を２５℃〜３７℃の範囲で変化させ、以下の式を用いて膨潤度を算出した。
膨潤度＝（３７℃を除く各温度でのゲル重量／３７℃でのゲル重量）
【００５２】
ゲルの親疎水性を評価するため、接触角計（協和界面科学社製Ｄｒｏｐ  Ｍａｓｔｅｒ  ５００）を用いて、気泡の接触角を水中気型法により測定した。水中気型法では、ゲルを水中に浸したまま、下方から１０μｌの空気を接触させ、室温下で、３０秒経過後の接触角を測定した。
【００５３】
実験例１（ゲル上での細胞培養の最適条件検討）
ゲル上での細胞培養の最適条件を検討するため、細胞には骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（理研、日本）を用い、表面に細胞接着を促進する有機質を塗布したゲル上で培養した。インキュベータ以外での操作は、すべて３７℃に制御したホットプレート上で行った。
【００５４】
ゲルには合成例１で合成したゲルを用いた。細胞接着を促進する有機質には、ヒトフィビロネクチン（ＦＮ）（０〜２μｇ／ｍｌ、ＢＤバイオサイエンス社製）またはゼラチン（１重量％／ｍｌ、和光純薬社製）を用いた。ＦＮまたはゼラチンを溶解させたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液にゲルを浸漬し、６時間インキュベートした。
【００５５】
次に、２×１０４個／ｍｌの細胞を、細胞接着を促進する有機質でプレコートしたゲルの表面に３７℃で播種した。培地には、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、飽和湿度および５％ＣＯ２雰囲気で１０日間、細胞を培養した。
【００５６】
培養時の細胞付着および増殖の状態を評価するために、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を測定した。
【００５７】
付着した細胞およびゲルから剥離した細胞シートを、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡（ニコン社製ＴＥ２０００、ＣｏｏｌＳＮＡＰ）を用いて観察した。
【００５８】
得られた細胞シートにおいて細胞とマトリックスとの接着を確認するため、ＦＮの蛍光免疫染色を抗ＦＮ、シグマ社製を用い、得られた細胞シートの底面と、細胞シートを剥離したゲル表面の両方について行った。ゲル鋳型および細胞集合体のデジタル画像を撮影し、画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｊ，ＮＩＨ）を用いて解析した。
【００５９】
（統計処理）
データは、ＡＮＯＶＡ検定で統計処理した。比較のため、９９％の信頼区間でステューデントｔ検定を用いた。グラフ中のデータ点とエラーバーは、各実験における平均値と標準偏差を示す。
【００６０】
細胞シートのゲルとの付着面を走査型電子顕微鏡（日本電子製ＪＥＯＬ６３５０）により観察した。
【００６１】
（結果）
（１）ゲル特性
一般的な細胞培養温度である３７℃における、ゲルの透明性を調べた。図１中のＡとＢは、それぞれＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルとＭＢＡＡを架橋剤に用いたゲルの外観写真である。また、表１は、ＡとＢのゲルの波長５００ｎｍにおける透過率の値を示す。
【００６２】
【表１】
2013116045.tif 000003
【００６３】
ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルは、３７℃において透明であり光透過率は９４％であった。一方、ＭＢＡＡを用いたゲルは、１５℃から３７℃に温度を上げると透明から白色に変化した。
【００６４】
これより、ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いた場合、通常の培養温度３７℃において、透明性を確保できることがわかった。
【００６５】
図２Ａは、ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルの、温度と膨潤度の関係を示すグラフであり、膨潤度は３７℃でのゲル重量を基準にして算出している。このグラフから２５℃における膨潤度は約４であった。
【００６６】
図２Ｂは、温度２５℃における、ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルの長さ基準膨張率と時間の関係を示すグラフである。ゲルの長さ基準膨張率は、１分で約１１０％、１０分で１２０％、２０分で約１３０％となり、６０分程度経過すると概ね一定となり約１３７％となった。
【００６７】
図２Ｃは、ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルの可逆的な膨張・収縮の状態を示す外観写真であり、左が２５℃、右が３７℃での状態を示している。この写真から算出した、３７℃から２５℃への温度変化に伴う表面積基準膨張率は約１４０％であった。
【００６８】
図２Ｄは、ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルの２５℃と３７℃における気泡の接触角を示すグラフである。接触角は、２５℃から３７℃の間で変化せず、約１５０度という大きな角度を有していた。接触角は、材料表面の親疎水性の程度を示すが、この結果は、２５℃から３７℃の間では、ゲル表面の親疎水性に大きな変化がないことを示している。
【００６９】
以上の結果から、ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルは、３７℃から２５℃に温度を下げる場合、大きな膨張率を示すが、その際ゲル表面の親疎水性には変化がないことがわかった。
【００７０】
（２）細胞接着を促進する有機質の効果
図３は、ゲル表面の細胞の状態を示す光学顕微鏡像であり、Ａはコントロール（細胞接着を促進する有機質を塗布せず）であり、Ｂはゼラチン（１重量％）を塗布したもの、ＣはＦＮを１μｇ／ｍｌの濃度で塗布したもの、ＤはＦＮを２μｇ／ｍｌ塗布したものを示す。また、図４は、時間と細胞数の関係を示すグラフであり、◇はＡ、○はＢ、△はＣ、□はＤの場合の結果を示す。１０日経過後では概ね同一の細胞数となるが、ＦＮまたはゼラチンをゲル表面に塗布することにより、ゲルに接着する細胞数がより短い日数で増加させることができることがわかった。さらに、ゼラチンよりもＦＮが細胞数を増加させる効果が大きいことがわかった。ＦＮの場合、１μｇ／ｍｌ以上の濃度で十分な効果が得られるため、以降の実験には、ＦＮを１μｇ／ｍｌの濃度で塗布したゲルを用いた。
【００７１】
（３）細胞シート
ＰＥＧ−ＤＭＡを架橋剤に用いたゲルを担体として用いて、細胞シートを作製した。
播種された細胞がゲル上でコンフルエントになったあと、ゲルの温度を３７℃から２５℃に下げると、細胞シートをその形状を損なうことなくゲルから剥離することができた。
【００７２】
また、免疫蛍光染色法により、ゲル表面と、細胞シートのゲルとの接着面を観察したところ、ＦＮは細胞シートの底面のみに検出され、ゲル表面には検出されなかった。これは、本発明の作製方法によれば培養した細胞集合体を傷つけることなく剥離して回収できること、回収した細胞集合体は細胞外基質を完全に含んでいることを示している。
【００７３】
実験例２（三次元細胞集合体の作製）
三次元の細胞集合体を作製するための鋳型となるゲルは、樹脂製鋳型を用いて作製した。樹脂製鋳型は、グラフィックモデリングソフトウェア（ＦｒｅｅＦｏｒｍ，Ｓｅｎｓａｂｌｅ，ＭＡ）を用いて設計し、三次元印刷システム（Ｅｄｅｎ，Ｏｂｊｅｔ，Ｉｓｒａｅｌ）を用いて作製した。
【００７４】
図５Ａは、上記のグラフィックモデリングソフトウェアを用いて作製した母型のモデル図であり、複数の平行凸条を有する母型と、複数の半球状凸部を有する母型を示している。また、図５Ｂは、上記の三次元印刷システムを用いて作製した光硬化性樹脂製の母型の外観を示す写真であり、上側が複数の平行凸条を有する母型、下側が複数の半球状凸部を有する母型を示している。また、図５Ｃは、その樹脂製母型中で重合させ、その樹脂製母型から取り出したゲルの成形体（以下、ゲル鋳型ともいう。）の外観を示す写真であり、母型の形状が転写されている。上側が複数の平行溝を有する鋳型、下側が複数の半球状凹部を有する鋳型を示している。
【００７５】
図５Ｃに示す複数の平行溝を有するゲル鋳型に、骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を細胞濃度１×１０６個／ｍｌで播種し、３７℃で４８時間培養し、温度を２５℃に下げて細胞集合体をゲル鋳型から剥離して、棒状の細胞集合体を得た。なお、ゲル鋳型にはＦＮを塗布したものと塗布しなかったものを用いた。
【００７６】
（結果）
図５Ｄは、培養細胞を含むゲル鋳型の外観を示す写真である。また、図５Ｅは、ゲル鋳型から取り出した細胞集合体の外観を示す写真であり、上側は棒状、下側は種々の大きさの半球状の細胞集合体を示している。
【００７７】
図５Ｇは、ゲル鋳型にＦＮを塗布した場合と塗布しなかった場合の、棒状細胞集合体の長さの変化を示すグラフである（図中の「長さ（％）」は、ゲル鋳型の長さに対する棒状細胞集合体の長さの比率を表す）。ゲル鋳型にＦＮを塗布した場合、棒状細胞集合体の長さはゲル鋳型の溝の長さの９１％であるのに対し、ＦＮを塗布しない場合には６５％であった。これより、ゲル鋳型の形状に合わせて細胞集合体を作製するためには、ゲル鋳型にＦＮを塗布することが好ましいことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
以上の説明から明らかなように、本発明によれば、従来は作製が困難であった任意形状の三次元細胞集合体を容易に作製することが可能になる。本発明により得られる三次元細胞集合体は、新しい組織再生用ツールを提供するだけでなく、擬似的な腫瘍組織や細菌感染モデルの構築、薬剤スクリーニング用のツールとしても利用することが可能である。
【図１】
2013116045.tif 000004
【図２Ａ】
2013116045.tif 000005
【図２Ｂ】
2013116045.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
2013116045.tif 000009
【図４】
2013116045.tif 000010
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2013116045.tif 000012
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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