(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的に脂肪細胞への分化を抑制できる脂肪細胞分化抑制剤を提供する。【解決手段】一般式（１）で表される有機亜鉛錯体を含有する、脂肪細胞分化抑制剤。2013234150.tif 000015［式中、Ｘ及びＹは同一又は異なって一般式（２）：2013234150.tif 000016（式中、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、及びＲ２５は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2013234150.tif 000011
［式中、Ｘ及びＹは同一又は異なって一般式（２）：
【化２】
2013234150.tif 000012
（式中、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、及びＲ２５は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す）
で表される単座配位子を示し、或いはＸとＹが一体となって一般式（３）：
【化３】
2013234150.tif 000013
（式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、及びＲ３８は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す）
で表される二座配位子を示し、或いはＸとＹが一体となって一般式（４）：
【化４】
2013234150.tif 000014
（式中、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す）
で表される二座配位子を示し、Ａ及びＢは同一又は異なってハロゲン原子又はアルキルチオ基若しくはアリールチオ基を示す］
で表される有機亜鉛錯体を含有する、脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項２】
Ｘ及びＹが一体となって一般式（３）で表される二座配位子又は一般式（４）で表される二座配位子である、請求項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項３】
Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８が水素である、請求項１又は２に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する肥満症予防又は治療剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する糖尿病予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪細胞分化抑制剤に関する。より具体的には、有機亜鉛錯体を含有する脂肪細胞分化抑制剤、該脂肪細胞分化抑制剤を含有する肥満症予防又は治療剤、並びに該脂肪細胞分化抑制剤を含有する糖尿病予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、体脂肪が過剰に蓄積した状態であり、種々の病気（糖尿病等）に関連していることが知られている。この体脂肪の蓄積は、脂肪組織中の脂肪細胞の増殖及び該脂肪細胞への脂肪の蓄積によって引き起こされる。そして、脂肪細胞の増殖は、脂肪組織中の前駆細胞が脂肪細胞に分化することにより起こる。したがって、この脂肪細胞への分化を抑制することが、体脂肪の蓄積の抑制、すなわち肥満の予防又は治療につながり、ひいては肥満に関連する種々の疾患の予防又は改善につながる。
【０００３】
脂肪細胞への分化を抑制する物質としては、従来から、デビルスクロー抽出物、冬虫夏草の菌糸体抽出物、アカザ科アルトロクネヌム抽出物など植物抽出物、フラーレン類、及びビタミン類似物質であるトリコトリエノールが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１３２６３４号公報
【特許文献２】特開２００９−２９８７０１号公報
【特許文献３】特開２０１１−６３４７号公報
【特許文献４】特開２００８−２２２６４５号公報
【特許文献５】特開２００８−２６０７００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、効率的に脂肪細胞への分化を抑制できる脂肪細胞分化抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、特定構造を有する有機亜鉛錯体（下記一般式（１）で表される有機亜鉛錯体）が、効率的に脂肪細胞への分化を抑制できることを見出した。さらに、驚くべきことに、下記一般式（１）で表される有機亜鉛錯体の中でも特定構造を有する有機亜鉛錯体が、脂肪細胞への分化を抑制できると同時に、骨芽細胞への分化を促進できることを見出した。これらの知見に基づいてさらに鋭意研究した結果、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本願は下記構成を有する発明を包含する。
【０００８】
項１．
一般式（１）：
【０００９】
【化１】
2013234150.tif 000002
【００１０】
［式中、Ｘ及びＹは同一又は異なって一般式（２）：
【００１１】
【化２】
2013234150.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、及びＲ２５は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す）
で表される単座配位子を示し、或いはＸとＹが一体となって一般式（３）：
【００１３】
【化３】
2013234150.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、及びＲ３８は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す）
で表される二座配位子を示し、或いはＸとＹが一体となって一般式（４）：
【００１５】
【化４】
2013234150.tif 000005
【００１６】
（式中、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す）
で表される二座配位子を示し、Ａ及びＢは同一又は異なってハロゲン原子又はアルキルチオ基若しくはアリールチオ基を示す］
で表される有機亜鉛錯体を含有する、脂肪細胞分化抑制剤。
【００１７】
項２．
Ｘ及びＹが一体となって一般式（３）で表される二座配位子又は一般式（４）で表される二座配位子である、項１に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【００１８】
項３．
Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８が水素である、項１又は２に記載の脂肪細胞分化抑制剤。
【００１９】
項４．
項１〜３のいずれかに記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する肥満症予防又は治療剤。
【００２０】
項５．
項１〜３のいずれかに記載の脂肪細胞分化抑制剤を含有する糖尿病予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、効率的に脂肪細胞への分化を抑制できる脂肪細胞分化抑制剤を提供することができる。さらに、本発明によれば、該脂肪細胞分化抑制剤を含有する肥満症予防又は治療剤、並びに該脂肪細胞分化抑制剤を含有する糖尿病予防又は治療剤をも提供することができる。そして、本発明の好ましい一態様によれば、効率的に脂肪細胞への分化を抑制しつつも、顕著に骨芽細胞への分化を促進できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】脂肪細胞への分化に有機亜鉛錯体が与える影響を評価した結果を示す。
【図２】骨芽細胞への分化に有機亜鉛錯体が与える影響を評価した結果を示す。
【図３】有機亜鉛錯体の細胞毒性を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（１）脂肪細胞分化抑制剤
本発明の脂肪細胞分化抑制剤は、一般式（１）：
【００２４】
【化５】
2013234150.tif 000006
【００２５】
［式中、Ｘ、Ｙ、Ａ、及びＢは前記に同じである］
で表される有機亜鉛錯体を含有する、脂肪細胞分化抑制剤である。
【００２６】
一般式（１）中、ＺｎとＸ、Ｙ、Ａ、又はＢとの連結は結合を意味する。ＺｎとＸ又はＹとの結合は、通常、配位結合を含み得る結合を示す。ＺｎとＡ又はＢとの結合は、通常、イオン結合を含み得る結合を示す。
【００２７】
一般式（１）中、Ｘ及びＹは同一又は異なって一般式（２）：
【００２８】
【化６】
2013234150.tif 000007
【００２９】
（式中、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、及びＲ２５は前記に同じである）
で表される単座配位子を示し、或いはＸとＹが一体となって一般式（３）：
【００３０】
【化７】
2013234150.tif 000008
【００３１】
（式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、及びＲ３８は前記に同じである）
で表される二座配位子を示し、或いはＸとＹが一体となって一般式（４）：
【００３２】
【化８】
2013234150.tif 000009
【００３３】
（式中、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８は前記に同じである）
で表される二座配位子を示す。
【００３４】
一般式（２）中のＲ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、及びＲ２５は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す。低級アルキル基としては、特に限定されないが、例えば炭素数１〜４の直鎖状又は分枝状のアルキル基が挙げられる。低級アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。低級アルキル基の具体例の中でも、メチル基又はエチル基が好ましく挙げられ、メチル基がより好ましく挙げられる。Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、及びＲ２５としては、好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３５】
一般式（３）中のＲ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、及びＲ３８は同一又は異なって、水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す。低級アルキル基は前記に同じである。Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６、Ｒ３７、及びＲ３８としては、好ましくは水素原子が挙げられる。
【００３６】
一般式（４）中のＲ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８は同一又は異なって水素原子、低級アルキル基、又は塩素原子を示す。低級アルキル基は前記に同じである。脂肪細胞への分化をより効率的に抑制できるという観点からは、Ｒ４２、Ｒ４３、及びＲ４４の内のいずれか１つ並びにＲ４５、Ｒ４６、Ｒ４７の内のいずれか１つは低級アルキル基であり且つその他は水素原子であることが好ましく、Ｒ４２及びＲ４３の内のいずれか１つ並びにＲ４６及びＲ４７の内のいずれか１つは低級アルキル基であり且つその他は水素原子であることがより好ましく、及びＲ４６及びＲ４６が低級アルキル基であり且つその他は水素原子であることが好ましい。骨芽細胞への分化を促進できるという観点からは、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８は水素であることが好ましい。細胞毒性がより低減されているという観点からは、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８の内の１〜３つは塩素原子であり且つその他は水素原子又は低級アルキル基であることが好ましく、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、Ｒ４４、Ｒ４５、Ｒ４６、Ｒ４７、及びＲ４８の内のいずれか１つが塩素原子であり且つその他は水素原子であることがより好ましい。
【００３７】
一般式（１）中のＡ及びＢは同一又は異なってハロゲン原子又はアルキルチオ基若しくはアリールチオ基を示す。
【００３８】
ハロゲン原子としては、特に限定されないが、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等が挙げられ、好ましくは塩素原子が挙げられる。
【００３９】
アルキルチオ基としては、特に限定されないが、例えば炭素数１〜１０の直鎖状又は分枝状アルキルチオ基が挙げられる。アルキルチオ基の具体例としては、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓ−ブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ｎ−ペンチルチオ基、イソペンチルチオ基、２−メチルブチルチオ基、ネオペンチルチオ基、１−エチルプロピルチオ基、ｎ−ヘキシルチオ基、イソヘキシルチオ基、４−メチルペンチルチオ基、３−メチルペンチルチオ基、２−メチルペンチルチオ基、１−メチルペンチルチオ基、３，３−ジメチルブチルチオ基、２，２−ジメチルブチルチオ基、１，１−ジメチルブチルチオ基、ヘプチルチオ基、オクチルチオ基、ノニルチオ基、又はデシルチオ基等が挙げられる。
【００４０】
アリールチオ基としては、特に限定されないが、例えば炭素数６〜１４のアリールチオ基が挙げられる。アリールチオ基の具体例としては、フェニルチオ基、インデニルチオ基、ナフチルチオ基、フェナンスレニルチオ基、又はアントラセニルチオ基等が挙げられる。アリールチオ基の具体例の中でもフェニルチオ基が好ましく挙げられる。
【００４１】
Ａ又はＢとしては、好ましくはハロゲン原子又はアリールチオ基が挙げられる。
【００４２】
脂肪細胞への分化をより効率的に促進できるという観点からは、Ｘ及びＹは一体となって一般式（４）で表される二座配位子であることが好ましい。また、骨芽細胞への分化を促進できるという観点からは、Ｘ及びＹは一体となって一般式（３）で表される二座配位子または一般式（４）で表される二座配位子であることが好ましい。さらに、細胞毒性がより低減されているという観点からは、Ｘ及びＹは同一又は異なって一般式（２）で表される単座配位子であるか、或いはＸ及びＹは一体となって一般式（３）で表される二座配位子であることが好ましい。
【００４３】
一般式（１）で表される有機亜鉛錯体は、有機亜鉛錯体の公知の方法又はこれに準じた方法に従って得ることができる。例えば、ハロゲン化亜鉛又はアルキルチオ亜鉛若しくはアリールチオ亜鉛と、一般式（２）で表される化合物単座配位子、一般式（３）で表される二座配位子、又は一般式（４）で表される二座配位子とを、適当な溶媒（例えば、エタノール）中で反応させることにより、沈殿物として得ることができる。なお、一般式（２）で表される化合物単座配位子、一般式（３）で表される二座配位子、又は一般式（４）で表される二座配位子としては、ピリジン、ビピリジン、又は１，１０フェナントロリンそのものを用いるか、或いはこれらを公知の置換方法により低級アルキル基や塩素原子で置換したものを用いればよい。また、アルキルチオ亜鉛若しくはアリールチオ亜鉛を用いる場合は、市販されているものを用いてもよいし、公知の製造方法、例えば酢酸亜鉛にアルキルチオール又はアリールチオールを反応させることにより製造したものを用いてもよい。
【００４４】
反応温度としては、特に限定されないが、例えば０〜１００℃の反応温度を採用すればよい。反応時間としては、特に限定されないが、例えば１〜１２０分の反応時間を採用すればよい。
【００４５】
ハロゲン化亜鉛を用いる場合は、反応温度として、１０〜３０℃程度の温度を採用し、反応時間として３０〜９０分の時間を採用することが好ましい。また、アルキルチオ亜鉛若しくはアリールチオ亜鉛を用いる場合は、反応温度として、６５〜８０℃の温度を採用し、反応時間として３０秒〜９０秒の反応時間を採用することが好ましい。
【００４６】
得られた沈殿物は、そのまま一般式（１）で表される有機亜鉛錯体として用いてもよいし、公知の方法によって精製したものを一般式（１）で表される有機亜鉛錯体として用いてもよい。精製手段としては、例えば、再結晶、クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４７】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤は、上記一般式（１）で表される有機亜鉛錯体からなるものであってもよいが、一般式（１）で表される有機亜鉛錯体の脂肪細胞分化抑制活性を阻害しない限り、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤、溶剤等が挙げられる。具体的な成分としては、例えば乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、又はその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、オリーブ油、ワセリン、パラフィン、高級アルコール等が挙げられる。
【００４８】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤は、医薬組成物や化粧品組成物として、必要に応じて薬学的に許容される担体と共に用いることができる。製剤形態は種々のものを選択できる。製剤形態としては、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、ローション、クリーム、乳液、浴用剤、注射薬、座薬等の剤形が挙げられる。
【００４９】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤中の一般式（１）で表される有機亜鉛錯体の含有量は、製剤形態、使用目的等によって異なるが、通常、０．００１重量％以上、好ましくは０．０１〜５０重量％程度である。製剤への添加方法は予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。また、本発明の脂肪細胞分化抑制剤の一日の投与量や、使用目的、年齢、体重等によって異なるが、例えば０．０２〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【００５０】
本発明の脂肪細胞分化抑制剤は、効率的に前駆細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）から脂肪細胞への分化を抑制することができる。また、本発明の脂肪細胞分化抑制剤の好ましい１態様によれば、骨芽細胞への分化を促進することができる。脂肪細胞及び骨芽細胞は同一種類の細胞に由来することから、脂肪細胞への分化が抑制されると、同時に骨芽細胞への分化も抑制されてしまう可能性が従来から指摘されており、このような場合は肥満治療を行うと骨密度の低下を引き起こすことが懸念されていた。上記好ましい１態様によれば、脂肪細胞への分化を抑制しつつも、前駆細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）から骨芽細胞への分化を促進できることから、骨密度の減少を懸念することなく使用することができる。
【００５１】
（２）肥満症予防又は治療剤、並びに糖尿病予防又は治療剤
本発明の肥満症予防又は治療剤は、上記脂肪細胞分化抑制剤を含有する肥満症予防又は治療剤である。また、本発明の糖尿病予防又は治療剤は、上記脂肪細胞分化抑制剤を含有する糖尿病予防又は治療剤である。
【００５２】
本発明の肥満症予防又は治療剤、及び本発明の糖尿病予防又は治療剤は、上記一般式（１）で表される有機亜鉛錯体からなるものであってもよいが、一般式（１）で表される有機亜鉛錯体の脂肪細胞分化抑制活性を阻害しない限り、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、上記「（１）脂肪細胞分化抑制剤」と同じものを用いることができる。
【００５３】
本発明の肥満症予防又は治療剤、及び本発明の糖尿病予防又は治療剤は、医薬組成物や化粧品組成物として、必要に応じて薬学的に許容される担体と共に用いることができる。製剤形態は、上記「（１）脂肪細胞分化抑制剤」の記載と同様に選択できる。
【００５４】
本発明の肥満症予防又は治療剤、及び本発明の糖尿病予防又は治療剤中の一般式（１）で表される有機亜鉛錯体の含有量や、一日の投与量については、上記「（１）脂肪細胞分化抑制剤」の記載と同様である。
【００５５】
本発明の肥満症予防又は治療剤は、効率的に脂肪細胞への分化を抑制できる脂肪細胞分化抑制剤を含んでいるが故に、効率的に肥満を予防又は治療（改善）することができる。また、本発明の肥満症予防又は治療剤の好ましい１態様によれば、骨密度を維持あるいは増加させつつ、肥満を予防又は治療（改善）することができる。
【００５６】
本発明の糖尿病予防又は治療剤は、効率的に脂肪細胞への分化を抑制できる脂肪細胞分化抑制剤を含んでいるが故に、効率的に糖尿病を予防又は治療（改善）することができる。また、本発明の糖尿病予防又は治療剤の好ましい１態様によれば、骨密度を維持あるいは増加させつつ、糖尿病を予防又は治療（改善）することができる。糖尿病の治療には、骨密度の減少が伴う場合があることが知られている。従って、骨密度を維持あるいは増加させつつ糖尿病を予防又は治療（改善）できるという効果は、この観点から、特に優れたものである。
【実施例】
【００５７】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５８】
１．有機亜鉛錯体の製造
表１に示す化合物１〜１０を製造した（製造例１〜１０）。なお、化合物番号と製造例番号は対応する。すなわち製造例１は化合物１を製造した例である。
【００５９】
【表１】
2013234150.tif 000010
【００６０】
１−１．製造例３
以下の方法により化合物３を製造した。1,10-フェナントロリン１水和物１mmol及び塩化亜鉛１mmolを、15 mlのエタノール中に入れ、室温で1時間撹拌混合した。該混合液をフィルター（桐山ロート（桐山製作所）に専用ろ紙（桐山製作所、濾紙No.4）を設置したもの）でろ過し、白色固体を得た。該白色固体をエタノールで洗浄した。該洗浄物をニトロメタンに溶解し、該溶解液を加熱濃縮後、室温まで放冷し、その後冷蔵庫中5℃まで冷却することにより再結晶化を行い、化合物３を得た。得られた化合物３を元素分析器（ヤナコテクニカルサイエンス製  炭素・水素・窒素同時測定装置  MT-6）を用いて定法に従って分析した結果を表１に示す。
【００６１】
１−２．製造例５
以下の方法により化合物５を製造した。二酢酸亜鉛1mmolを20 mlのエタノールに溶解した。一方で、ベンゼンチオール（2mmol）を10 mlのエタノールに溶解した。ベンゼンチオール溶解液をエタノール溶解液に緩やかに加え、室温にて10分間混合した。1,10-フェナントロリン１水和物1 mmolを10 mlのエタノールに溶解させた溶解液を、該混合液に緩やかに加えた。この溶液を70℃で1分間加熱後、室温で放置した。放置１時間以内に結晶が形成された。この結晶をフィルター（桐山ロート（桐山製作所）に専用ろ紙（桐山製作所、濾紙No.4）を設置したもの）でろ過した。該洗浄物をエタノールに溶解し、該溶解液を加熱濃縮後、室温まで放冷し、その後冷蔵庫中5℃まで冷却することにより再結晶化を行い、化合物５を得た。得られた化合物５を元素分析器（ヤナコテクニカルサイエンス製  炭素・水素・窒素同時測定装置  MT-6）を用いて定法に従って分析した結果を表１に示す。
【００６２】
１−３．製造例１〜２、４、及び６〜１０
上記製造例３又は製造例５に準じた公知の方法により、化合物１〜２、４、及び６〜１０を製造した。より具体的には以下の通りである。化合物１及び２は、文献１（Inorganic Chemistry 1965, 4, 350-357）及び文献２（Inorg. Chem. 1967, 6, 2030-2032）に記載の方法に従って製造した。化合物４は文献３（Inorganica ChimicaActa 1999, 295, 9-17）に記載の方法に従って製造した。化合物６及び８は文献４（Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 1996, 101, 257-263）に記載の方法に従って製造した。化合物７は文献５（Inorganic Chemistry 1969, 8, 59-63）に記載の方法に従って製造した。化合物９及び１０は文献１〜５に記載の方法に従って製造した。得られた化合物１〜２、４、及び６〜１０を元素分析器（ヤナコテクニカルサイエンス製  炭素・水素・窒素同時測定装置  MT-6）を用いて定法に従って分析した結果を表１に示す。
【００６３】
２．化合物１〜１０の各種性質の評価
化合物１〜１０について、各種性質（脂肪細胞への分化に与える影響、骨芽細胞への分化に与える影響、及び細胞毒性）を評価した。
【００６４】
２−１．試験例１：脂肪細胞への分化に与える影響
ST2細胞は、インスリン、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、及びロシグリタゾンを含むRPMI-1640で培養することにより脂肪細胞に分化することが知られている。そして、脂肪細胞には、微細な多くの脂肪滴が含まれ、脂肪細胞への分化が進むにつれて脂肪滴は互いに融合し大きくなる。この脂肪滴は、アゾ色素の１種で、無極性・脂溶性のOil red O で染色することで赤く染色される。このことを利用して、この分化過程に有機亜鉛錯体を添加し、脂肪細胞分化に有機亜鉛錯体が与える影響を、脂肪滴をオイルレッドで染色することにより評価した。具体的には下記の通りである。
【００６５】
ST2細胞は5% FCS及び50μM 2-MEを含むRPMI-1640培地（以下、「培養液１」と示す）中で前培養した。分化誘導の24時間前に、ST2細胞を1×104cells/cm2になるように48ウェルプレートに播種し、1 mLの培養液１中で培養した。播種24時間後に培養液１を脂肪細胞分化誘導用培養液（培養液１にインスリン（終濃度5μg/mL）、デキサメタゾン（終濃度0.5 mM）、イソブチルメチルキサンチン（終濃度0.25μM）、及びロシグリタゾン（終濃度1μM）を加えたもの）に置換し、48時間の分化誘導を開始した（Day 0〜Day 2）。48時間後、脂肪細胞への分化を維持するため、脂肪細胞分化維持用培養液（培養液１にインスリン（終濃度5μg/mL）を含む）に置換した。また、脂肪細胞分化維持用培養液は、2〜3日おきに置換した（Day 2〜8）。なお、脂肪細胞分化誘導用培養液および脂肪細胞分化維持用培養液中には、化合物１〜１０のいずれかを、各種濃度（0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、又は10μM）となるように添加した。Day 8において細胞を、500 μLの10% パラホルムアルデヒドで固定し（10 min、室温）、500 μLのPBSで洗浄後、300 μLのOil Red O染色液（3 mg/mL Oil red O を60% イソプロパノール溶液で溶解したもの）で染色した（10-20 min、室温）。脂肪細胞の染色像（脂肪滴）は、光学顕微鏡により観察し、デジタルマイクロスコープMoticam2000（島図製作所）を用いて画像化した。
【００６６】
化合物１〜１０それぞれについて、脂肪細胞への分化の抑制が見られた最小の濃度の結果を図１に示す。図１中、コントロールは、分化誘導前のST2細胞及び分化誘導後のST2細胞を、Oil Redで染色した結果を示す。コントロールより、分化誘導前は赤い染色がほとんど見られないが、分化誘導後は細胞が赤く染色されていることが示されている。化合物７については、10μMにおいて、弱いながらも脂肪細胞への分化を抑制した。一方、化合物１〜６及び８〜１０については、図１に記載の濃度において、Oil Redによる赤い染色がほとんど見られず、脂肪細胞への分化を強く抑制していた。
【００６７】
２−２．試験例２：骨芽細胞への分化に与える影響
ST2細胞はBMP-2を含むMEM-α培地で培養することにより骨芽細胞に分化することが知られている。このことを利用して、この分化過程に有機亜鉛錯体を添加し、骨芽細胞分化に有機亜鉛錯体が与える影響を評価した。具体的には下記の通りである。
【００６８】
ST2細胞は5% chelex treated FCS及び50μM 2-MEを含むMEM-α培地（以下、「培養液２」と示す）中で前培養した。分化誘導の24時間前に、ST2細胞を1×104 cells/cm2になるように96ウェルプレートに播種し、100 μLの培養液2中で培養した。播種24時間後、培養液２を骨芽細胞分化誘導用培養液（培養液２にBMP-2（Bone Morphogenetic Protein 2 Human Recombinant & Natural Protein, R＆D systems, Catalog# 355-BEC-010）を100 ng/mLになるように加えたもの）に置換し分化誘導を開始した（Day 0）。骨芽細胞分化誘導用培養液は2〜3日おきに交換した。なお、骨芽細胞分化誘導用培養液中には、化合物２、５、又は６を、骨芽細胞分化誘導用培養液中の濃度が、化合物２については10μM、化合物５については2.5μM、化合物６については0.5μMになるように添加した。Day 7において細胞を回収し、ALP活性を測定することにより、骨芽細胞への分化の程度を評価した。なおALP活性は、Lab AssayTMALPを用い標準プロトコルに従い測定した(和光純薬工業株式会社)。すなわち、ALP活性が高いほど骨芽細胞への分化が促進されており、ALP活性が低いほど骨芽細胞への分化が抑制されていることを示す。
【００６９】
結果を図２に示す。図２中、「分化誘導なし（BMP-2 free）」は、骨芽細胞分化誘導用培地を使用せず、且つ化合物２、５、又は６を添加しなかった以外は、上記と同様の操作を行ったコントロールのALP活性を示す。また、「BMP-2 only」は、化合物２、５、又は６を添加しなかった以外は、上記と同様の操作を行ったコントロールのALP活性を示す。
【００７０】
図２より、化合物２及び５は骨芽細胞への分化を顕著に促進することが明らかとなった。一方、化合物６は骨芽細胞への分化を寧ろ抑制していることが明らかとなった。
【００７１】
２−３．試験例３：細胞毒性
有機亜鉛錯体存在下と非存在下で細胞を培養し、培養後の細胞量をアミドブラック染色により測定することにより、有機亜鉛錯体の細胞毒性を評価した。アミドブラック染色は、アミドブラック10B色素と塩基性アミノ酸の結合を利用したタンパク質の染色法である。塩基性アミノ酸のモル数とアミドブラックの結合量は正の相関を示すことから、細胞をアミドブラックで染色することで、細胞増殖率を評価する。具他的には下記の通りである。
【００７２】
ST2細胞は培養液１で前培養した。有機亜鉛錯体処置の24時間前に、ST2細胞を、1×104 cells/cm2になるように48ウェルプレートに播種し、1 mLの培養液１中で培養した。。播種24時間後、培養液１を細胞毒性評価用培養液（培養液１に化合物１〜１０のいずれかを、各種濃度（0μM、0.1μM、1μM、5μM、又は10μM）になるように添加した培養液）に置換した（Day 0）。Day 2において細胞を500 μLの4% パラホルムアルデヒドで固定し（10 min、室温）、500 μLのPBSで洗浄後、アミドブラック染色液（pH4-5の酢酸Na緩衝液（10% MeOH、50 mM酢酸）で0.1%(w/v)となるようにアミドブラック10B(和光純薬工業株式会社)を調製）で染色した。染色したタンパク質は、400 μLの10 mM NaOHで可溶化し、可溶化した溶液を96 ウェルプレートに移し600 nmの波長光の吸光度を測定した。
【００７３】
その結果、化合物１〜１０全てについて、細胞毒性が少ないことが明らかとなった。代表的な化合物（化合物１、２、４、及び７）についての結果を図３に示す。図３中、縦軸は有機亜鉛錯体濃度が0μMの場合の吸光度の値を100とした相対値を示す。これらの化合物について、10μMの濃度で添加しても細胞増殖にはほぼ影響がないことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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