(57)【要約】【課題】タングステンを効率良く回収する。【解決手段】パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のWtpA遺伝子を細胞表層に発現する組換え微生物を利用してタングステンを効率良く回収する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表層提示型のタングステントランスポートタンパク質A（WtpA）を有する組換え酵母。
【請求項２】
上記細胞表層提示型のタングステントランスポートタンパク質Aは、タングステン捕捉能を有するタングステントランスポートタンパク質A及び細胞表層局在タンパク質の融合タンパク質であることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
【請求項３】
分泌シグナルペプチド、タングステン捕捉能を有するタングステントランスポートタンパク質A及び細胞表層局在タンパク質をコードする融合遺伝子を宿主酵母に導入したものである請求項１記載の組換え酵母。
【請求項４】
上記タングステントランスポートタンパク質Aは、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
(a)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、タングステン吸着能を有するタンパク質
【請求項５】
請求項１乃至４いずれか一項記載の組換え酵母を含む、タングステン回収剤。
【請求項６】
タングステンを含有する溶液に請求項１乃至４いずれか一項記載の組換え酵母を接触させる工程と、
組換え酵母からタングステンを分離し回収する工程と
を含むタングステンの回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表層に所定のタンパク質が存在するよう、当該タンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え酵母及び当該組換え酵母を利用したタングステンの回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タングステンは、特殊鋼、切削工具等の超硬工具に使われ、近年使用量は増加傾向にある。また、日本等のタングステン供給量が低い国では、中国等のタングステン供給量の多い国に依存することとなる。そのため、タングステンについては、供給不安が生じる虞がある。このような状況下では、いわゆる都市鉱山から、簡易的に安価にリサイクルすることが求められている。
【０００３】
都市鉱山からレアメタルをリサイクルする手法として、物理的化学的手法が知られている。この物理化学的手法は、安価にレアメタルを回収できる手法である。しかし、この手法には、都市鉱山における目的金属の含有率が低い場合には効率が悪いといった問題がある。また、都市鉱山からレアメタルをリサイクルする手法として、生物的手法が知られている。この生物学的手法は、都市鉱山における目的金属の含有率が低い場合における物理化学的手法を補うことができ、常温・常圧下での回収が可能であるという特徴がある。
【０００４】
生物的手法としては、バイオアドソープションと呼ばれる微生物に金属を吸着させる手法がある。バイオアドソープションに利用する微生物は、回収する対象の金属によって異なる。また、回収対象の金属の種類によって、微生物に吸着する量が異なることがある。例えば、特許文献１及び非特許文献１には、分泌シグナルペプチド、金属捕捉能を有するポリペプチド、細胞表層局在タンパク質をコードする融合遺伝子を宿主に導入し、当該宿主の細胞表層に金属捕捉機能を付与する技術が開示されている。特許文献１及び非特許文献１には、特に、硝酸銅、硫酸銅及び塩化銅といった銅や、ニッケル、カドミウムイオンを補足できたことが開示されている。より具体的に、特許文献１及び非特許文献１では、(His)6を細胞表層に発現させたアーミング酵母を用い、硝酸銅の細胞吸着結果が1.21μmol/g dry cellであったことが開示されている。
【０００５】
また、非特許文献２には、モリブデン吸着タンパクModEを細胞表層に発現させた組換え微生物を利用してモリブテンを回収する技術が開示されている。非特許文献２によれば、この組換え微生物を利用したモリブデンの吸着量を実験した結果は、約0.9（Number of adsorbed molybdate ×108molybdate/cell）であったことが理解できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2003-284556号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】植田充実・黒田浩一、細胞表層デザインによる金属高効率回収バイオ技術、工料、vol55(No.8)、第66-70頁(2007)
【非特許文献２】Kouichi Kuroda・Mitsuyoshi Ueda, et al. Molecular design of yeast cell surface for adsorption and recovery of molybdenum one of rare metals, Appl Microbiol Biotechnol, 86, 641-648 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述したタングステンの回収効率に優れた生物的手法は知られておらず、タングステンを効率良く回収できる技術、特にタングステン吸着能を有する組換え微生物、当該組換え微生物を用いたタングステン回収方法が求められていた。そこで、本発明は、タングステン吸着能を有する組換え微生物、当該組換え微生物を用いたタングステン回収方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のWtpA遺伝子を細胞表層に発現する組換え微生物におけるタングステン吸着能が著しく高いことを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。
【００１０】
（１）細胞表層提示型のタングステントランスポートタンパク質A（WtpA）を有する組換え酵母。
（２）上記細胞表層提示型のタングステントランスポートタンパク質Aは、タングステン捕捉能を有するタングステントランスポートタンパク質A及び細胞表層局在タンパク質の融合タンパク質であることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（３）分泌シグナルペプチド、タングステン捕捉能を有するタングステントランスポートタンパク質A及び細胞表層局在タンパク質をコードする融合遺伝子を宿主酵母に導入したものである（１）記載の組換え酵母。
（４）上記タングステントランスポートタンパク質Aは、以下の(a)又は(b)のタンパク質であることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
(a)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の一致度を有するアミノ酸配列からなり、タングステン吸着能を有するタンパク質
（５）上記（１）乃至（４）いずれかに記載の組換え酵母を含む、タングステン回収剤。
（６）タングステンを含有する溶液に上記（１）乃至（４）いずれかに記載の組換え酵母を接触させる工程と、組換え酵母からタングステンを分離し回収する工程とを含むタングステンの回収方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る組換え酵母は、優れたタングステン吸着能を有している。したがって、本発明に係る組換え酵母を利用することによって、タングステンを含む溶液からタングステンを効率良く回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】pTOPO-TDH3P-ss.glu-wtpAを構築するフロー図である。
【図２】pTOPO-agglutinin-PGK1Tを構築するフロー図である。
【図３】pTOPO-TDH3P-ss.glu-wtpA-agglutinin-PGK1Tを構築するフロー図である。
【図４】pYES2-TRP1を構築するフロー図である。
【図５】P189@pYES2-TDH3-P_ATF1-ss.gla-wtpA-agglutinin-T_PGK1-TRP1を構築するフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明に係る組換え酵母、及び当該組換え酵母を用いたタングステン回収方法について詳細に説明する。
【００１４】
<組換え酵母>
本発明に係る組換え酵母は、細胞表層提示型のタングステントランスポートタンパク質A（WtpA）を有する酵母である。言い換えると、本発明に係る組換え酵母は、細胞表層にWtpAが存在するという特徴を有している。本発明に係る組換え酵母は、細胞表層に存在するWtpAを介してタングステンを吸着することができる。
【００１５】
本発明に係る組換え酵母は、細胞表層提示型タングステントランスポートタンパク質A遺伝子（以下、細胞表層提示型WtpA遺伝子と称する）を導入することで作製することができる。ここで、細胞表層提示型WtpA遺伝子とは、発現したWtpAが酵母細胞の表層にディスプレイされるように、WtpA遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。
【００１６】
細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開2006-174767号公報参照）。また、細胞表層局在タンパク質は、特開2003-284556号公報に開示されているものを使用することもできる。
【００１７】
WtpA遺伝子は、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）において見いだされた新規なABCトランスポーターシステムを構成するタングステントランスポートタンパク質Aをコードする遺伝子である（J. Bacteriol., Vol. 188, No. 18, Sep. 2006, p. 6489-6505）。WtpA遺伝子の塩基配列及びWtpA遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
【００１８】
本発明に係る組換え酵母において細胞表層提示型として発現するWtpA遺伝子は、これら配列番号１及び２にて規定されるWtpA遺伝子に限定されない。
【００１９】
WtpA遺伝子としては、配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、タングステン吸着能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。換言すれば、本発明に係る組換え酵母においては、配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加したアミノ酸配列からなり、タングステン吸着能を有するタンパク質を細胞表層提示型として発現させても良い。ここで、複数のアミノ酸とは、例えば２〜１００個、好ましくは２〜８０個、より好ましくは２〜５０個、更に好ましくは２〜１５個のアミノ酸を意味する。
【００２０】
また、WtpA遺伝子としては、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、タングステン吸着能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。換言すれば、本発明に係る組換え酵母においては、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、タングステン吸着能を有するタンパク質を細胞表層提示型として発現させても良い。配列間の同一性とは、BLAST、PSI-BLAST、HMMERといった配列類似性検索ソフトウェアをデフォルトの設定で使用して２つのアミノ酸配列間の一致度を示す値（割合）を意味する。
【００２１】
さらに、WtpA遺伝子としては、配列番号１の塩基配列の相補鎖からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、タングステン吸着能を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。換言すれば、本発明に係る組換え酵母においては、配列番号１の塩基配列の相補鎖からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、タングステン吸着能を有するタンパク質を細胞表層提示型として発現させても良い。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。また、ポリヌクレオチドの少なくとも一部とは、所定の塩基配列の相補鎖からなるポリヌクレオチドの全部、当該相補鎖からなるポリヌクレオチドの全部の連続する部分の両者を含む意味である。
【００２２】
なお、所定のアミノ酸配列に対する変異の導入は、WtpA遺伝子の塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
【００２３】
所定の塩基配列からなる遺伝子が、タングステン吸着能を有するタンパク質をコードしているかは、該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて適当な宿主を形質転換し、発現するタンパク質のタングステン吸着能を測定すればよい。ここで、タンパク質のタングステン吸着能は、例えばタングステン酸ナトリウム二水和物溶液に当該タンパク質を混合し、所定時間経過後にタンパク質成分を分離し、溶液中のタングステン濃度を測定することで評価できる。なお、溶液中のタングステン濃度は、高周波誘導結合プラズマ(ICP)を光源とする発光分光分析法によって測定することができる。
【００２４】
また、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）におけるWtpA遺伝子、すなわち配列番号１及び２にて規定されるWtpA遺伝子については、部位特異的変異誘発法によりタングステンに対する選択的吸着の研究が公知となっている（J. Bacteriol., Vol. 193, No. 18, Sep. 2011, p. 4999-5001）。具体的には、変異型WtpA遺伝子として、E218A、E218Q、D160A及びD160Nといった変異型タンパク質をコードする遺伝子が作製され、これら変異型タンパク質におけるタングステン吸着能を評価している。本発明に係る組換え酵母においては、これら公知の変異型WtpA遺伝子を使用して、変異型タンパク質を細胞表層提示型として発現させても良い。
【００２５】
上述したように、WtpA遺伝子は、発現ベクターに組み込まれ、宿主となる酵母に導入されることで細胞表層提示型として発現することができる。このとき、WtpA遺伝子は、３’末端側の上流に所謂、分泌シグナルペプチド（分泌シグナル又は分泌シグナル配列ともいう）をコードする遺伝子、５’末端側の下流に上述した胞表層局在タンパク質をコードする遺伝子を融合した融合遺伝子として発現できるように発現ベクターに組み込まれる。ここで、分泌シグナルペプチドとは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のN-末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むペプチドであり、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。本発明において分泌シグナルペプチドとしては、何ら限定されず従来公知のものを使用することができる。特に分泌シグナルペプチドとしては、宿主となる酵母において機能することが知られている分泌シグナルペプチドを使用することができる。また、分泌シグナルペプチドとしては、α-ファクター前駆体のプレプロリーダー配列、酵母のα-又はａ-アグルチニンのシグナル配列、グルコアミラーゼの分泌シグナル等を使用することができる。
【００２６】
分泌シグナルペプチド、WtpAタンパク質及び細胞表層局在タンパク質をN末端側からこの順で有する融合タンパク質をコードする遺伝子は、各領域をコードする塩基配列情報に基づいて設計したプライマーを用いたPCR、各種の制限酵素を用いた制限酵素処理等を利用したクローニング方法により作製することができる。また、所謂、in-fusion法を利用して上記融合タンパク質をコードする遺伝子を作製してもよい。さらに、上記融合タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部を化学合成により作製しても良い。化学合成により遺伝子を合成する場合、例えば、WtpA遺伝子について酵母のコドン使用頻度を鑑みて最適化したかたちで合成することが好ましい。
【００２７】
上記融合タンパク質をコードする遺伝子は、宿主の酵母内において発現できるように、適当なプロモーターの下流に配置される。プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。その他にも、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどを使用することで、下流の遺伝子を強発現させることができる。
【００２８】
また、宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae等のCandida属酵母、Pichia stipitis等のPichia属酵母、Pachysolen tannophilus等のPachysolen属酵母、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属酵母及びSchizosaccharomyces pombe等のSchizosaccharomyces属酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。
【００２９】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００３０】
以上のように、本発明に係る組換え酵母は、細胞表層提示型のWtpAタンパク質を有することとなる。このように、本発明に係る組換え酵母は、WtpAタンパク質を細胞表層にディスプレイしているため、タングステン吸着能を有することとなる。すなわち、本発明に係る組換え酵母におけるタングステン吸着能は、細胞表層提示型WtpAタンパク質に異存しており、細胞表層における当該タンパク質の量が多いほど優れることとなる。細胞表層提示型WtpAタンパク質の量は、当該タンパク質をコードする遺伝子のコピー数や当該遺伝子のプロモーターの強度により調整することができる。なお、本発明に係る組換え酵母において、細胞表層に提示されるWtpAタンパク質は、分泌シグナルペプチドの全部が切断された状態でも良いし、分泌シグナルペプチドの一部又は全部が残った状態であってもよい。
【００３１】
本発明に係る組換え酵母は、上述のようにタングステン吸着能を有するため、タングステン回収剤として利用することができる。言い換えれば、本発明に係る組換え酵母をタングステンの回収方法に利用することができる。
【００３２】
本発明に係る組換え酵母をタングステン回収剤として利用する場合、特に限定されないが、当該組換え酵母を適当な担体に固定して使用することができる。担体とは、本発明の組換え酵母を固定化することができる物質を意味し、好ましくは、水又は特定の溶媒に対して不溶性の物質を意味する。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォーム、セルロース多孔質体等の発泡体又は樹脂が挙げられる。担体は、組換え酵母の増殖及び活性の維持に有利である点、及び死滅した細胞を速やかに脱離させる点で、多孔質の担体が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは細胞によって異なるが、多孔質内に入り込んで増殖できる大きさが適当であり、50μm〜1,000μmが好ましい。但し、これらの大きさに限定されるものではない。また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率等を考慮すると、球状又は立方体状が好ましく、大きさは、球状の場合は直径が2mm〜50mm、立方体状の場合は2mm〜50mm角が好ましい。
【００３３】
固定化とは、組換え酵母が遊離の状態ではなく、担体に結合若しくは付着し、又は担体内部に取り込まれた状態等をいう。組換え酵母の固定化には、例えば、担体結合法、架橋法及び包括法等の公知の方法を適用することができる。凝集性の酵母の固定化には、担体結合法が最適である。担体結合法としては、イオン交換性の樹脂に吸着させる化学的吸着法又は物理的吸着法が挙げられる。凝集性酵母は、担体に固定化されているにもかかわらず増殖可能であり、活性が低下すると自然に脱落していく性質を有している。このため、担体に結合した酵母は、生菌数がほぼ一定に保たれ、活性が高いという特徴を有する。従って、組換え酵母の担体への結合は物理的吸着が最も好ましい。凝集性又は接着性の細胞と前記多孔質の担体とを混合して培養することにより、細胞は多孔質体の開口部に入りこみ、担体に付着する。
【００３４】
このようにして得られる固定化された組換え酵母を、担体に付着した状態のまま浮遊状態で培養するか、あるいはカラムに充填して、いわゆるバイオリアクターとして用いることができる。カラムとしては、例えば通常のゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等に使用されているものと同様のものを用いることができる。また、上記カラムを、ポンプ、回収容器、金属検出計などと組み合わせて、金属回収用装置として使用することができる。
【００３５】
本発明に係る酵母は、例えばタングステンを含む溶液と接触させることで、当該溶液内のタングステンを吸着することができる。タングステンを含む溶液とは、特に限定されず、海水、淡水（河川、池、湖）又は廃水（生活廃水、厨房廃水、工場廃水等）のいずれであっても良い。
【００３６】
また、タングステンを吸着した組換え酵母から、タングステンを回収するには、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等のキレート剤を用いて当該組換え酵母を処理することでタングステンを組換え酵母の表層より脱離し、脱離したタングステンを回収することができる。或いは、キレート剤の代わりにパパイン等のプロテアーゼを用いて当該組換え酵母を処理しても、タングステンを組換え酵母の表層から脱離して回収することができる。ここで、キレート剤やプロテアーゼを用いて組換え酵母を処理するとは、当該組換え酵母を含む溶液にキレート剤やプロテアーゼを投入し、必要に応じて撹拌するなどの手法を意味する。
【００３７】
以上のように、本発明に係る組換え酵母を使用することにより、タングステンを含む溶液からタングステンをより簡易に回収することができる。定法に従ってWtpAタンパク質を精製し、これを用いてタングステンを回収することも考えられるが、タングステン回収に十分な量のWtpAタンパク質を精製するには工数がかかり簡便な方法とは言えない。これに対して、本発明に係る組換え酵母を利用する場合には、当該組換え酵母を培養するだけでタングステン回収に十分な量のWtpAタンパク質を準備することができる。また、本発明に係る組換え酵母を利用する場合には、上述のようにキレート剤やプロテアーゼを利用してタングステンを回収でき、組換え酵母を破砕してそこからタングステンを回収するといった作業が不要となる。この点においても、本発明に係る組換え酵母を利用する場合には、タングステンを含む溶液からのタングステン回収をより簡便に行うことができる。さらに、本発明に係る組換え酵母は、上述のようにキレート剤やプロテアーゼを利用してタングステンを回収した後、再利用することができる。したがって、本発明に係る組換え酵母を利用する場合には、タングステンを含む溶液からのタングステン回収をより簡便に且つ低コストに行うことができる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
＜ベクター作製方法＞
S. cerevisiae OC2菌株のゲノムをテンプレートに、後述の表１に記載したプライマー名：A1及びA2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、 S.cerevisiae 由来TDH3プロモーター領域を増幅した。得られたTDH3プロモーター領域は、ゼロブラントTOPO PCRクローニングキット（インビトロジェン社製）を使用してサブクローニングした。得られたベクターをpTOPO-TDH3Pと命名した。
【００４０】
次に、R.oryzae由来のシグナル配列、及びPyrococcus.furiosus由来のWtpA遺伝子（PF0080）〔参考文献1：Loes E. Bevers, Peter-Leon Hagedoorn, Gerard C. Krijger, and Wilfred R. Hagen J. Bacteriol. September 15, 2006 188:6498-6505、及び参考文献２：Loes E. Bevers, Guenter Schwarz, and Wilfred R. Hagen J. Bacteriol. September 2011 193:4999-5001〕は酵母のコドン使用頻度を鑑みて最適化して人工遺伝子合成した。
【００４１】
次に、 pTOPO-TDH3Pをテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：B1及びB2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、3‘末端にR.oryzae由来のシグナル配列と相同する配列を20bp付与したTDH3プロモーター部位を増幅させた。また、人工遺伝子合成したR.oryzae由来のシグナル配列をテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：C1及びC2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、5’末端にTDH3プロモーター部位と相同する配列を20bp付与し、3‘末端にWtpA遺伝子と相同する配列を20bp付与したR.oryzae由来のシグナル配列を増幅させた。最後に、人工遺伝子合成したwtpA遺伝子をテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：D1及びD2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、 5’末端に R.oryzae由来のシグナル配列と相同する配列を20bp付与したwtpA遺伝子を増幅させた。
【００４２】
そして、これらの遺伝子増幅断片を精製してから、再度3個のフラグメントを同時にテンプレートにしたPCRを行うことでTDH3プロモーター領域とR.oryzae由来のシグナル配列及びPyrococcus.furiosus由来のwtpA遺伝子をこの順で繋げた核酸断片を作製した。増幅した核酸断片をゼロブラントTOPO PCRクローニングキットを使用してサブクローニングした。得られたベクターをpTOPO-TDH3P-ss.glu-wtpAと命名した（図１参照）。
【００４３】
一方、S. cerevisiae OC2菌株のゲノムをテンプレートに、表１に記載したプライマー名：E1及びE2のプライマーセット、並びにF1及びF2のプライマーセットを用いてそれぞれ遺伝子増幅を行い、 S.cerevisiae 由来3'側のαアグルニチン、及びPGK1ターミネータ領域を各々増幅した。得られたS.cerevisiae 由来3'側のαアグルニチン及びPGK1ターミネータ領域をそれぞれゼロブラントTOPO PCRクローニングキットを使用してサブクローニングした。得られたベクターをそれぞれpTOPO-agglutinin及びpTOO-PGK1Tと命名した。
【００４４】
次に、 pTOPO-agglutininをテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：G1及びG2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、3'末端にPGK1ターミネータ領域と相同する配列を20bp付与したαアグルニチンを増幅させた。また、pTOPO-PGK1Tをテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：H1及びH2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、5'末端にαアグルニチンと相同する配列を20bp付与したPGK1ターミネータ領域を増幅させた。これらの遺伝子増幅断片を精製してから、再度2個のフラグメントを同時にテンプレートにしたPCRを行うことでS.cerevisiae 由来3'側のαアグルニチンとPGK1ターミネータ領域を繋げて核酸断片を作製した。得られた核酸断片をゼロブラントTOPO PCRクローニングキットを使用してサブクローニングした。得られたベクターをpTOPO-agglutinin-PGK1Tと命名した（図２参照）。
【００４５】
一方、pTOPO-TDH3P-ss.glu-wtpAをテンプレートして、表１に記載したプライマー名：I1及びI2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、3'末端にαアグルニチンと相同する配列を20bp付与した遺伝子断片を増幅させた。また、 pTOPO-agglutinin-PGK1Tをテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：J1及びJ2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、5'末端にwtpA遺伝子と相同する配列を20bp付与した遺伝子断片を増幅させた。これらの遺伝子増幅断片を精製してから、再度2個のフラグメントを同時にテンプレートにしたPCRを行うことでTDH3プロモーター領域と、R.oryzae由来のシグナル配列と、Pyrococcus.furiosus由来のwtpA遺伝子と、S.cerevisiae由来3'側のαアグルニチンと、PGK1ターミネータ領域とこの順で繋げた核酸断片を作製した。得られた核酸断片をゼロブラントTOPO PCRクローニングキットを使用してサブクローニングした。得られたベクターをpTOPO-TDH3P-ss.glu-wtpA-agglutinin-PGK1Tと命名した（図３）。
【００４６】
一方、pYES2（インビトロジェン社製）をテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：L1及びL2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、遺伝子増幅断片の5'側にS.cerevisiae 由来TRP1のターミネータ領域と相同する配列を16bp付与し、3'側にTRP1のプロモーター領域と相同する配列を16bp付与した遺伝子断片を増幅させた（E.coli由来Ampr、PUCori、S.cerevisiae 由来2μm遺伝子等を含む）。一方、OC2菌株のゲノムをテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：K1及びK2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、 S.cerevisiae 由来TRP1のプロモーター領域、TRP1遺伝子、TRP1のターミネータ領域を含む核酸断片を増幅させた。次にそれぞれの増幅断片をPCR精製キットにより精製し、in-fusion法（クローンテック社製）により反応させることでpYES2-TRP1を作製した（図４参照）。
【００４７】
そして最後に、pTOPO-TDH3P-ss.glu-wtpA-agglutinin-PGK1Tをテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：M1及びM2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行い、また、pYES2-TRP1をテンプレートにして、表１に記載したプライマー名：N1及びN2のプライマーセットを用いて遺伝子増幅を行うことで遺伝子増幅断片の5'側にS.cerevisiae由来PGK1のターミネータ領域と相同する配列を16bp付与し、3'側にTDH3のプロモーター領域と相同する配列を16bp付与した遺伝子断片を増幅させた。それぞれの遺伝子増幅断片をPCR精製キットにより精製し、in-fusion法（クローンテック社製）により反応させることでP189@pYES2-TDH3-P_ATF1-ss.gla-wtpA-agglutinin-T_PGK1-TRP1を作製した。得られたベクターを最終的な遺伝子導入ベクターとした（図５参照）。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
＜酵母への遺伝子導入方法＞
酵母への遺伝子導入はFrozen-EZ Yeast TransformationIIキット（ZYMO RESEARCH社製）を用いた。宿主酵母としてはS. cerevisiae OC2-T株（トリプトファン要求性）を用いた。すなわち、上記キットを用いてS. cerevisiae OC2-T株に対して、上述のように作製したP189@pYES2-TDH3-P_ATF1-ss.gla-wtpA-agglutinin-T_PGK1-TRP1を導入した。得られた形質転換体はSDC-Trp寒天培地（Yeast Nitrogen base w/o amimo acids and ammonium slufate 0.34%、グルタミン酸ナトリウム0.1%、アスパラギン酸カリウム0.3%、尿素0.3%、グルコース2%、CSM-Trp0.2%及び寒天1.5%）にて選別し、生育が良かったコロニーを組換え酵母とした。
【００５０】
＜酵母の培養方法＞
上述のように選抜された組換え酵母を、SDC-Trp（Yeast Nitrogen base w/o amimo acids and ammonium slufate 0.34%、グルタミン酸ナトリウム0.1%、アスパラギン酸カリウム0.3%、尿素0.3%、グルコース2%及びCSM-Trp0.2%）150ml/500mlバッフル付きフラスコを用いて30℃で48時間培養した。この菌体をO.D.(Optical density)が10となるまで培養し、20mlの培養液を分取した後、遠心を行って菌体を集めた。
【００５１】
一方、比較対象のOC2-T株は、YPD(酵母エキス1%、ペプトン2%及びグルコース2%）を用いて150ml/500mlバッフル付きフラスコを用いて30℃で24時間培養した。この菌体をO.D.が10となるまで培養し、20mlの培養液を分取した後、遠心を行って菌体を集めた。
【００５２】
＜タングステン回収実験方法＞
集めた菌体に、タングステン酸ナトリウム二水和物を50mlのファルコンチューブに終濃度1mMになるように10ml加えてよく懸濁した後、32℃、150rpmで2時間振盪した。 5000rpm、5分遠心を行って菌体と上清とに分離し、上清をバイアル瓶にとって、分析を実施した。なお、タングステン分析は、試料を超純水で希釈して直接ICP発光分光分析装置ICPS-8100に導入して分析した。結果を表２に示した。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
表２に示すように、菌体の細胞表層に吸着したタングステン量（mg/L）は、細胞表層提示型WtpAタンパク質を有する組換え酵母で50mg/L、コントロールのOC2-T株で20mg/Lであった。この結果を（μmol/g dry cell）の単位にするとタングステンの吸着量は、組換え酵母で49.45μmol/g dry cell（= 9.09[mg/g dry cell]＝4.09[Number of adsorbed tungstate ×108 tungstate /cell]）であった。この結果から、WtpAタンパク質を細胞の表層に発現させることで、タングステンの吸着量を著しく増加できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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