(57)【要約】【課題】血液学的手法または病理学的手法による肝臓毒性の検出は指標（マーカー）が限られているため、その評価が困難である。【解決手段】外部環境の変化による生体内の遺伝子発現変化は鋭敏であるため、生体毒性を判別するための遺伝子セットを同定することは、生体毒性が起こる前に及びそれが病理学的検査により実証される前に生体毒性を迅速かつ正確に検出することが可能である。本発明は、その新たな遺伝子セットを用いた生体毒性の検出・予測方法、そのキット、生体毒性の処置方法及び生体毒性の候補薬剤確認方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化学物質を生体または細胞に所定期間曝露させた後の遺伝子発現レベルを測定することにより該被検化学物質の毒性を評価する方法であって、
（Ａ）実験動物または肝臓由来の細胞試料を複数用意し、その一部について前記被検化学物質を所定期間だけ曝露した後の肝臓または肝臓由来の細胞試料を検査試料とするとともに、残りを未処理または前記化学物質の溶媒を曝露した後の肝臓または肝臓由来の細胞試料を参照試料とするステップと、
（Ｂ）前記検査試料について、配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子群としての生体応答遺伝子群のうちから選択される任意の１以上の選択生体応答遺伝子群に対する遺伝子の発現レベルを測定する第１の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｃ）前記参照試料について、前記選択生体応答遺伝子群に対する遺伝子の発現レベルを測定する第２の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｄ）前記第１の遺伝子発現レベル測定ステップ及び前記第２の遺伝子発現レベル測定ステップで測定した遺伝子発現レベルを対応する遺伝子ごとに比較し、前記遺伝子の発現レベルの差異に基づいて前記被験化学物質が有する毒性を評価するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性評価方法。
【請求項２】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項１記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項３】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項１記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項４】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項１記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項５】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項１記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項６】
前記遺伝子の発現レベルは、前記生体応答遺伝子群のうちのそれぞれの生体応答遺伝子におけるプロモーター配列に連結されたレポータータンパク質をコードする配列を含むレポーター遺伝子における発現レベルを指標として測定されることを特徴とする請求項１乃至５のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法に使用されるレポーター遺伝子を含む核酸構成物、これを含むベクター、又は、これらを宿主細胞に導入した形質転換細胞であって、前記生体応答遺伝子のプロモーター配列に連結されたレポータータンパク質をコードする配列を含むことを特徴とする核酸構成物、これを含むベクター、又は、これらを宿主細胞に導入した形質転換細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞は、動物細胞、幹細胞、または胚性幹細胞であることを特徴とする請求項７記載の形質転換細胞。
【請求項９】
化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を判別・予測する方法であって、
（Ａ）肝毒性を有することが既知の化学物質について所定量を所定期間生体または肝臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）肝毒性を有さないことが既知の化学物質について所定量を所定期間生体または肝臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｃ）前記化学物質の溶媒を対照として所定量を所定期間生体または肝臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｄ）前記生体の肝臓または前記肝臓由来の細胞試料からmRNAを単離して、配列番号１〜１４４の塩基配列を有する遺伝子群としての生体応答遺伝子群のうちから選択される任意の１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定する測定ステップと、
（Ｅ）前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量、曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｆ）被検化学物質を適当な濃度で一定期間生体または肝臓由来の細胞試料に曝露させるステップと、
（Ｇ）前記生体由来の前記肝臓または前記肝臓由来の細胞試料からmRNAを単離して、（Ｄ）のステップで選択した生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｈ）（Ｇ）で得られた前記遺伝子発現レベルを前記被検化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｉ）（Ｈ）で収集された遺伝子発現データを（Ｅ）で収集された照合用の対応する遺伝子発現データと比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性評価方法。
【請求項１０】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項９記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１１】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項９記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１２】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項９記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１３】
前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする請求項９記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１４】
前記遺伝子発現データの比較が、被検化学物質曝露群と肝毒性を有さないことが既知の化学物質曝露群における遺伝子発現レベルの差異であることを特徴とする、請求項９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１５】
前記遺伝子発現データの比較が、被検化学物質曝露群と肝毒性を有さないことが既知の化学物質曝露群における前記生体応答遺伝子群の発現プロファイルを指標としたクラスタ分析であることを特徴とする、請求項９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１６】
前記遺伝子発現データの比較が、被検化学物質曝露群と肝毒性を有さないことが既知の化学物質曝露群における前記生体応答遺伝子群の発現プロファイルの相関係数を指標とすることを特徴とする、請求項９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１７】
肝毒性を有することが既知の化学物質が、2-ブタノンオキシム（CAS登録番号96-29-7）、3-シアノピリジン（CAS登録番号100-54-9）、スルホラン（CAS登録番号126-33-0）、2-イソプロポキシエタノール（CAS登録番号109-59-1）、ヒドラジン一水和物（CAS登録番号7803-57-8）、4-エチルモルホリン（CAS登録番号100-74-3）、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール（CAS登録番号56539-66-3）、o-ジクロロベンゼン（CAS登録番号95-50-1）、3,4-キシリジン（CAS登録番号95-64-7）、N-メチルアニリン（CAS登録番号100-61-8）、トリレンジイソシアナート（CAS登録番号26471-62-5）、2-（ジブチルアミノ）エタノール（CAS登録番号102-81-8）、p-クミルフェノール（CAS登録番号599-64-4）、m-クレゾール（CAS登録番号108-39-4）、2,3-ジメチルアニリン（CAS登録番号87-59-2）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（CAS登録番号538-75-0）、フタル酸ジヘプチル（CAS登録番号3648-21-3）、テトラブロモエタン（CAS登録番号79-27-6）、p-エチルフェノール（CAS登録番号123-07-9）、2,4-ジ-tert-ブチルフェノール（CAS登録番号96-76-4）、3,5-キシリジン（CAS登録番号108-69-0）、1,3-ジブロモプロパン（CAS登録番号109-64-8）、1-ブロモ-3-クロロプロパン（CAS登録番号109-70-6）、プソイドクメン（CAS登録番号95-63-6）、1,4-ジブロモベンゼン（CAS登録番号106-37-6）のうちから選択される任意の１以上の化学物質であることを特徴とする、請求項９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１８】
肝毒性を有さないことが既知の化学物質が、2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール（CAS登録番号111-41-1）、テトラヒドロフルフリルアルコール（CAS登録番号97-99-4）、メタクリルアミド（CAS登録番号79-39-0）、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（CAS登録番号5039-78-1）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム（CAS登録番号56-93-9）、m-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（CAS登録番号127-68-4）、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物（CAS登録番号130-13-2）、アジピン酸ジブチル（CAS登録番号105-99-7）、N,N-ジメチルベンジルアミン（CAS登録番号103-83-3）、n-ヘキサデカン（CAS登録番号544-76-3）、ジシクロヘキシルアミン（CAS登録番号101-83-7）、及び2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸（CAS登録番号88-44-8）のうちから選択される任意の１以上の化学物質であることを特徴とする、請求項９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項１９】
前記遺伝子発現レベルの測定は、RT-PCR法、Real  Time  PCR法、iAFLP（introduced  Amplified  Fragment  Length  Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）法、nCounter  Analysis  system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つの方法を用いることを特徴とする請求項１乃至１８のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２０】
前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする請求項１９記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２１】
前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項２０記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチドは、mRNA、cDNA、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２１記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２３】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２１または２２記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２４】
前記遺伝子発現レベルの測定は、前記生体応答遺伝子に対応する核酸、又は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質について、存在するか、もしくは、量の測定によることを特徴とする請求項１乃至１８のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２５】
前記タンパク質は、免疫学的方法で測定されることを特徴とする請求項２４記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２６】
前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法によることを特徴とする請求項２５記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２７】
前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、及び抗体フラグメントから選択されることを特徴とする請求項２６記載の化学物質の毒性評価方法。
【請求項２８】
請求項１乃至２７のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含む化学物質の毒性判別キットであって、前記プローブは、前記生体応答遺伝子またはその転写産物に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性評価キット。
【請求項２９】
前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項２８記載の化学物質の毒性評価キット。
【請求項３０】
前記ヌクレオチドは、mRNA、cDNA、又は合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項２９記載の化学物質の毒性評価キット。
【請求項３１】
前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、１０〜１００塩基であることを特徴とする請求項３０記載の化学物質の毒性評価キット。
【請求項３２】
前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項３０または３１記載の化学物質の毒性評価キット。
【請求項３３】
前記プローブは、抗体及び／又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする請求項３２記載の化学物質の毒性評価キット。
【請求項３４】
前記プローブは、任意の１つ以上を固体支持体に固定したDNAマイクロアレイ、DNAチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする請求項２８乃至３３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価キット。
【請求項３５】
前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする請求項３４記載の化学物質の毒性評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質が生体に与える影響、毒性の検出、診断、予測及び／もしくは処置のための方法、及び、生体毒性を検出又は予測するためのキットに関する。特に、本発明は、化学物質が生体に与える影響を指標とした化学物質の毒性の検出・予測方法、肝毒性の処置の有効性を確認することを助けるための遺伝子発現解析手段及びその結果の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類の生活する環境の中で、膨大な数の化学物質が利用されており、現在でも年々新しい化学物質が開発され続けている。しかしながら、これらの化学物質が環境中に放出されることにより、人体を含む生態系に有害な影響を及ぼすことが問題となっており、特に化学物質に起因する環境汚染による人体への影響は社会問題にまでなっている。新規化学物質の人体に及ぼす有害な影響による事故を未然に防ぎ安全性を確保するためには、それらの化学物質の毒性の有無・強さ・ターゲット臓器等の情報を事前に調査し把握しておくことが重要である。そのような観点から、新規化学物質の許認可・承認・登録等を行う各省庁は新規化学物質の届け出の際には一定の毒性試験を行うことを求めており、その試験の基準には法的な規制がなされている。
【０００３】
これまでの化学物質のリスク評価は、OECD等で国際標準化された試験方法を踏まえて我が国の「化学物質審査規制法」等に導入された試験法である細菌等を用いた単純で簡便な試験と、ラット等の実験動物を用いた長期毒性試験等によって取得・蓄積されてきた知見とを、その基盤としていた（非特許文献１参照）。
【０００４】
近年、急速な発展を見せるゲノム学的なアプローチが、個別化医療に向けてバイオマーカーを用いた薬剤の感受性や副作用との相関を調べるファーマコゲノミクス（非特許文献２及び３参照）、食品成分の摂取に伴って起こるmRNAやタンパク質の発現量の変動を網羅的に解析し、食物が生体に与える影響を調べるニュートリゲノミクス（非特許文献４）等と同様に、化学物質の生物学的活性（特にその有害性）の評価にも応用され始めてきたトキシコゲノミクスと呼ばれる手法が用いられ始めてきた（非特許文献５乃至７参照）。
【０００５】
これらのゲノム学的手法は、全遺伝子を個々のパラメータとして活用することで、従来の手法では得られない膨大かつ多様な観点による生物学的現象の評価を可能にした。
【０００６】
遺伝子発現変動解析を用いた化学物質の毒性評価手法としては、酵母を用いた毒性物質の検出方法（特許文献１及び２参照）、細胞を用いた遺伝毒性の判定方法（特許文献３参照）、哺乳動物を用いた発達神経毒性の検出方法（特許文献４乃至６参照）、哺乳動物を用いた発がん物質の予測方法（特許文献７及び８参照）、哺乳動物を用いた発生毒性の予測方法（特許文献９参照）などが公開されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４０２２６１０号公報
【特許文献２】特許第４４７５３７３号公報
【特許文献３】特許第４５７３８７６号公報
【特許文献４】特開２００６−１１５７４８号公報
【特許文献５】特開２００９−２３２８４２号公報
【特許文献６】特開２００９−７７７０１号公報
【特許文献７】特開２００９−１５９８５２号公報
【特許文献８】特開２００７−５４０２２号公報
【特許文献９】特開２０１０−１１８４３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】非臨床試験マニュアル（株式会社エル・アイ・シー）（２００１）
【非特許文献２】Alison  H.  Harrill  et  al.,  Expert  Opin.  Drug  Metab.  Tosicol.  November；４（１１）：１３７９−１３８９（２００８）
【非特許文献３】Elisa  Giovannetti  et  al.,  Mol.  Cancer  Ther.  ５（６）：１３８７−１３９４（２００６）
【非特許文献４】Licia  Iacoviello  et  al.,  Genes  Nutr.  ３：１９−２４（２００８）
【非特許文献５】Preeti  Chavan  et  al.,  Evid  Based  Complement  Alternat  Med.  Dec；３（４）：４４７−４５７（２００６）
【非特許文献６】渡邉肇  YAKUGAKU  ZASSHI：１２７（１２）：１９６７−１９７４（２００７）
【非特許文献７】Uehara,  Takeki  et  al.,  Mol.  Nutr.  Food  Res.  ５４：２１８−２２７（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の化学物質のリスク評価は、細菌等を用いた単純で簡便な試験、及び、ラット等の実験動物を用いた長期毒性試験によって取得・蓄積されてきた知見を、その基盤としていた。しかしながら、これらの従来の毒性学的な手法によって獲得される生物学的情報は知見の種類が限られること、並びに、長期毒性試験では費用と効率等の面で問題があることから、これらの課題を解決できる新規の手法の確立が望まれていた。
【００１０】
特に、ラット等の実験動物を用いた従来の２８日間反復投与毒性試験は、血液学的検査や病理組織学的検査を主体としており、それらの生物学的情報は限られていた。さらに、病理組織学的検査での評価は、判断した者の主観に左右されやすく、同じ病態を見ているにもかかわらず別の表現を用いるなど、異なる化学物質間の毒性を評価するための客観的な指標が乏しかった。
【００１１】
本発明は化学物質の肝毒性を簡便かつ確実に検出するための客観的な指標の一つを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、1,4-ジブロモベンゼン（CAS登録番号106-37-6）をラットに２８日間反復投与した後の肝臓で対照群と比較して顕著に発現変動した遺伝子を特定することにより、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は以下を提供する。
１．被検化学物質を生体または細胞に所定期間曝露させた後の遺伝子発現レベルを測定することにより該被検化学物質の毒性を評価する方法であって、
（Ａ）実験動物または肝臓由来の細胞試料を複数用意し、その一部について前記被検化学物質を所定期間だけ曝露した後の肝臓または肝臓由来の細胞試料を検査試料とするとともに、残りを未処理または前記化学物質の溶媒を曝露した後の肝臓または肝臓由来の細胞試料を参照試料とするステップと、
（Ｂ）前記検査試料について、配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子群としての生体応答遺伝子群のうちから選択される任意の１以上の選択生体応答遺伝子群に対する遺伝子の発現レベルを測定する第１の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｃ）前記参照試料について、前記選択生体応答遺伝子群に対する遺伝子の発現レベルを測定する第２の遺伝子発現レベル測定ステップと、
（Ｄ）前記第１の遺伝子発現レベル測定ステップ及び前記第２の遺伝子発現レベル測定ステップで測定した遺伝子発現レベルを対応する遺伝子ごとに比較し、前記遺伝子の発現レベルの差異に基づいて前記被験化学物質が有する毒性を評価するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性評価方法。
２．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記１記載の化学物質の毒性評価方法。
３．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記１記載の化学物質の毒性評価方法。
４．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記１記載の化学物質の毒性評価方法。
５．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記１記載の化学物質の毒性評価方法。
６．前記遺伝子の発現レベルは、前記生体応答遺伝子群のうちのそれぞれの生体応答遺伝子におけるプロモーター配列に連結されたレポータータンパク質をコードする配列を含むレポーター遺伝子における発現レベルを指標として測定されることを特徴とする前記１乃至５のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
７．前記６記載の方法に使用されるレポーター遺伝子を含む核酸構成物、これを含むベクター、又は、これらを宿主細胞に導入した形質転換細胞であって、前記生体応答遺伝子のプロモーター配列に連結されたレポータータンパク質をコードする配列を含むことを特徴とする核酸構成物、これを含むベクター、又は、これらを宿主細胞に導入した形質転換細胞。
８．前記宿主細胞は、動物細胞、幹細胞、または胚性幹細胞であることを特徴とする前記７記載の形質転換細胞。
９．化学物質が生体に与える影響を遺伝子発現レベルで検出することにより被検化学物質の毒性を判別・予測する方法であって、
（Ａ）肝毒性を有することが既知の化学物質について所定量を所定期間生体または肝臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｂ）肝毒性を有さないことが既知の化学物質について所定量を所定期間生体または肝臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｃ）前記化学物質の溶媒を対照として所定量を所定期間生体または肝臓由来の細胞試料に投与（曝露）するステップと、
（Ｄ）前記生体の肝臓または前記肝臓由来の細胞試料からmRNAを単離して、配列番号１〜１４４の塩基配列を有する遺伝子群としての生体応答遺伝子群のうちから選択される任意の１以上の生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定する測定ステップと、
（Ｅ）前記遺伝子発現レベルを対応する前記化学物質、曝露量、曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｆ）被検化学物質を適当な濃度で一定期間生体または肝臓由来の細胞試料に曝露させるステップと、
（Ｇ）前記生体由来の前記肝臓または前記肝臓由来の細胞試料からmRNAを単離して、（Ｄ）のステップで選択した生体応答遺伝子に対する遺伝子発現レベルを測定するステップと、
（Ｈ）（Ｇ）で得られた前記遺伝子発現レベルを前記被検化学物質、曝露量及び曝露期間とともに遺伝子発現データとして収集するステップと、
（Ｉ）（Ｈ）で収集された遺伝子発現データを（Ｅ）で収集された照合用の対応する遺伝子発現データと比較するステップと、
を含むことを特徴とする化学物質の毒性評価方法。
１０．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記９記載の化学物質の毒性評価方法。
１１．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記９記載の化学物質の毒性評価方法。
１２．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記９記載の化学物質の毒性評価方法。
１３．前記生体応答遺伝子群が配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子群であることを特徴とする前記９記載の化学物質の毒性評価方法。
１４．前記遺伝子発現データの比較が、被検化学物質曝露群と肝毒性を有さないことが既知の化学物質曝露群における遺伝子発現レベルの差異であることを特徴とする、前記９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
１５．前記遺伝子発現データの比較が、被検化学物質曝露群と肝毒性を有さないことが既知の化学物質曝露群における前記生体応答遺伝子群の発現プロファイルを指標としたクラスタ分析であることを特徴とする、前記９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
１６．前記遺伝子発現データの比較が、被検化学物質曝露群と肝毒性を有さないことが既知の化学物質曝露群における前記生体応答遺伝子群の発現プロファイルの相関係数を指標とすることを特徴とする、前記９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
１７．肝毒性を有することが既知の化学物質が、2-ブタノンオキシム（CAS登録番号96-29-7）、3-シアノピリジン（CAS登録番号100-54-9）、スルホラン（CAS登録番号126-33-0）、2-イソプロポキシエタノール（CAS登録番号109-59-1）、ヒドラジン一水和物（CAS登録番号7803-57-8）、4-エチルモルホリン（CAS登録番号100-74-3）、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール（CAS登録番号56539-66-3）、o-ジクロロベンゼン（CAS登録番号95-50-1）、3,4-キシリジン（CAS登録番号95-64-7）、N-メチルアニリン（CAS登録番号100-61-8）、トリレンジイソシアナート（CAS登録番号26471-62-5）、2-（ジブチルアミノ）エタノール（CAS登録番号102-81-8）、p-クミルフェノール（CAS登録番号599-64-4）、m-クレゾール（CAS登録番号108-39-4）、2,3-ジメチルアニリン（CAS登録番号87-59-2）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（CAS登録番号538-75-0）、フタル酸ジヘプチル（CAS登録番号3648-21-3）、テトラブロモエタン（CAS登録番号79-27-6）、p-エチルフェノール（CAS登録番号123-07-9）、2,4-ジ-tert-ブチルフェノール（CAS登録番号96-76-4）、3,5-キシリジン（CAS登録番号108-69-0）、1,3-ジブロモプロパン（CAS登録番号109-64-8）、1-ブロモ-3-クロロプロパン（CAS登録番号109-70-6）、プソイドクメン（CAS登録番号95-63-6）、1,4-ジブロモベンゼン（CAS登録番号106-37-6）のうちから選択される任意の１以上の化学物質であることを特徴とする、前記９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
１８．肝毒性を有さないことが既知の化学物質が、2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール（CAS登録番号111-41-1）、テトラヒドロフルフリルアルコール（CAS登録番号97-99-4）、メタクリルアミド（CAS登録番号79-39-0）、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（CAS登録番号5039-78-1）、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム（CAS登録番号56-93-9）、m-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（CAS登録番号127-68-4）、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物（CAS登録番号130-13-2）、アジピン酸ジブチル（CAS登録番号105-99-7）、N,N-ジメチルベンジルアミン（CAS登録番号103-83-3）、n-ヘキサデカン（CAS登録番号544-76-3）、ジシクロヘキシルアミン（CAS登録番号101-83-7）、及び2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸（CAS登録番号88-44-8）のうちから選択される任意の１以上の化学物質であることを特徴とする、前記９乃至１３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
１９．前記遺伝子発現レベルの測定は、RT-PCR法、Real  Time  PCR法、iAFLP（introduced  Amplified  Fragment  Length  Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）法、nCounter  Analysis  system、ハイブリダイゼーション法のうちの１つの方法を用いることを特徴とする前記１乃至１８のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
２０．前記ハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ法又はブロット法であることを特徴とする前記１９記載の化学物質の毒性評価方法。
２１．前記マイクロアレイ法又はブロット法に用いられるプローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする前記２０記載の化学物質の毒性評価方法。
２２．前記ヌクレオチドは、mRNA、cDNA、合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする前記２１記載の化学物質の毒性評価方法。
２３．前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする前記２１または２２記載の化学物質の毒性評価方法。
２４．前記遺伝子発現レベルの測定は、前記生体応答遺伝子に対応する核酸、又は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質について、存在するか、もしくは、量の測定によることを特徴とする前記１乃至１８のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価方法。
２５．前記タンパク質は、免疫学的方法で測定されることを特徴とする前記２４記載の化学物質の毒性評価方法。
２６．前記免疫学的方法は、前記生体応答遺伝子によってコードされるタンパク質又はその断片に対する特異抗体と標的タンパク質との免疫学的複合体を検出する方法によることを特徴とする前記２５記載の化学物質の毒性評価方法。
２７．前記特異抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、及び抗体フラグメントから選択されることを特徴とする前記２６記載の化学物質の毒性評価方法。
２８．前記１乃至２７のうちのいずれか１つに記載の方法に用いられるプローブを含む化学物質の毒性判別キットであって、前記プローブは、前記生体応答遺伝子またはその転写産物に特異的にハイブリダイズする配列を有する分子を含むことを特徴とする化学物質の毒性評価キット。
２９．前記プローブは、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする前記２８記載の化学物質の毒性評価キット。
３０．前記ヌクレオチドは、mRNA、cDNA、又は合成オリゴヌクレオチドであることを特徴とする前記２９記載の化学物質の毒性評価キット。
３１．前記ヌクレオチドは、前記生体応答遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖とハイブリダイズし、１０〜１００塩基であることを特徴とする前記３０記載の化学物質の毒性評価キット。
３２．前記ヌクレオチドは、標識化ヌクレオチドであることを特徴とする前記３０または３１記載の化学物質の毒性評価キット。
３３．前記プローブは、抗体及び／又はアプタマーであるタンパク質であることを特徴とする前記３２記載の化学物質の毒性評価キット。
３４．前記プローブは、任意の１つ以上を固体支持体に固定したDNAマイクロアレイ、DNAチップ、タンパクチップまたは抗体チップを含むことを特徴とする前記２８乃至３３のうちのいずれか１つに記載の化学物質の毒性評価キット。
３５．前記固体支持体は、ガラス、シリコン、プラスチック又は生体膜であることを特徴とする前記３４記載の化学物質の毒性評価キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、化学物質を生体に投与した後の肝臓又は化学物質を曝露した後の肝臓由来の細胞試料における遺伝子発現パターンを比較することにより、化学物質が生体に対して毒性を有するか否かを簡便に判定あるいは予測できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析結果を示す図である。
【図２】配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析結果を示す図である。
【図３】配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析結果を示す図である。
【図４】配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析結果を示す図である。
【図５】配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
他に特に規定されない限り、明細書及び特許請求の範囲を含む本出願に使用される用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者（当業者）によって、一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【００１７】
当業者は、本明細書中に記載されるものと同等又は類似の多くの方法及び物質を認識する。ただし、本発明は本明細書に記載される方法及び物質に限定されない。
【００１８】
被検化学物質の投与量は、被検化学物質を曝露された試験動物または細胞内の遺伝子発現レベルが適度に増加または減少する量であることが望ましい。例えば、試験動物又は細胞の致死量未満の最大用量が望ましく、被検化学物質の試験動物に対するLD50値を基準にして決定することも可能である。
【００１９】
被検化学物質（被検群）またはその溶媒（対照群）を投与する対象となる試験動物には、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サルなどの哺乳動物を使用することもできる。また、その対象となる細胞には、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来の細胞を使用することができる。
【００２０】
被検化学物質の投与期間は１〜９０日が望ましく、より好ましくは１〜６０日であり、さらに好ましくは１〜２８日であるが、より迅速に試験を行う観点から１〜１４日でも構わない。投与は１日数回が望ましく、より好ましくは１日１回が望ましい。
【００２１】
被検化学物質の投与方法は特に制限されない。例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈注射等の一般的な方法を使用できる。
【００２２】
「遺伝子発現レベルを測定する」とは、該遺伝子の発現レベルを検出又は定量する限り特に制限されず、例えば、該遺伝子のmRNAやcDNAを検出又は定量してもよい。さらには、該遺伝子がコードするタンパク質を検出又は定量してもよい。これらの検出又は定量には、該遺伝子又はその遺伝子産物であるペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する分子を用いることが望ましい。遺伝子又はその遺伝子産物であるペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する分子とは、特に制限されないが、該遺伝子に特異的に結合するヌクレオチド、DNA、cDNA、RNA、ペプチド若しくはタンパク質に特異的に結合する抗体等を例示することができる。また、該遺伝子の発現レベルの検出又は定量には、該遺伝子のmRNAもしくはタンパク質の断片又はホモログを用いてもよい。
【００２３】
配列番号１〜１４４に示される塩基配列は、例えば、National  Center  for  Biotechnology  InformationのBLAST（URL;  http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）を利用したホモロジー検索により遺伝子を特定することが可能である。
【００２４】
「DNAマイクロアレイ」とは、オリゴヌクレオチドや一本鎖または二本鎖のDNAをガラス基板上などに高密度に配置したものをいい、「DNAマイクロアレイ法」とは、そのDNAマイクロアレイ上で蛍光標識したcDNA分子などとハイブリッド形成を行わせて定性的且つ定量的にDNAと結合した核酸の種類や量を測定する手法をいう。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドが数個重合した分子の総称のことをいう。
【００２６】
mRNAの「ホモログ」とは、該mRNAに実質的に類似したヌクレオチドに関連する。「実質的に類似した」とは、当業者によって十分理解され、具体的にはそれぞれの配列類似性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を有することを意味する。
【００２７】
また、タンパク質の「ホモログ」とは、該mRNAに実質的に類似したペプチドに関連する。「実質的に類似した」とは、当業者によって十分理解され、具体的にはそれぞれの配列類似性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を有することを意味する。
【００２８】
「化学物質に曝露された臓器組織または細胞試料」とは、組織もしくは細胞試料、または試料が由来した動物が、化学物質により処理されたことを意味する。
【００２９】
「幹細胞」とは、自己複製能と分化した細胞をつくる能力を併せ持った未分化細胞のことを言い、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Embryonic  stem  cell）、組織幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：induced  pluripotent  stem  cell）で例示できるが、これらに限られるものではない。
【００３０】
「プロモーター」とは、転写開始反応の効率に関与するDNA領域をいう。
【００３１】
「レポーター遺伝子」とは、目的の因子の機能を測定するために代用される遺伝子のことであり、産物の活性が簡単に定量化できるものが好まれる。本発明のレポーター遺伝子には、生体応答遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質をコードする配列とを含み、レポータータンパク質としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、青色蛍光タンパク質（CFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）または赤色蛍光タンパク質（dsRed）等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００３２】
本発明において「生体応答遺伝子のプロモーター配列に連結される」とは、対象の遺伝子の発現が該プロモーター配列の制御下に配置されることをいい、通常、対象となる遺伝子のすぐ上流にプロモーター配列が配置されるが、必ずしも隣接している必要はない。
【００３３】
「ベクター」とは、組換えDNA技術において、外来性DNAを組み込み、宿主細胞中で増えることのできるDNAのことをいい、プラスミド、ファージ、ウイルス、酵母人工染色体などが挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００３４】
「形質転換細胞」とは、形質転換体、トランスフォーマントとも呼ばれ、ある形質を示す細胞（供与細胞）のDNAを、それを示さない細胞（受容細胞）へ導入して生じた供与細胞の形質を示す細胞をいう。供与細胞又は受容細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等が例示される。
【００３５】
「毒性作用」とは、化学物質の存在に起因する、生体、臓器系、各臓器、組織、細胞、又は細胞内単位に対する有害作用を指す。毒性作用は、生理的もしくは物理的な症状、又は細胞もしくは臓器の壊死のような撹乱であり得る。
【００３６】
「試料」には、好ましくは肝臓組織由来の材料、並びに、例えば血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、尿、便のような任意の体液が含まれるものとする。なお、これに限られるものではない。
【００３７】
明細書及び特許請求の範囲を含む本出願で使用される際には、「個体」とは、ヒトの個体、動物又は個体の集団もしくはプールを意味するものとする。
【００３８】
「CAS登録番号」とは米国化学会の一部門であるCAS（Chemical  Abstracts  Service）が運営・管理する化学物質登録システムから付与される化学物質に固有の数値識別番号のことを意味する。
【００３９】
本出願に係る特許請求の範囲及び明細書で使用する「生体応答遺伝子」とは、化学物質の曝露等の外的な刺激により生体内において発現レベルが変動する遺伝子を意味し、「生体応答遺伝子群」とは複数の生体応答遺伝子の組合せのことを意味する。
【００４０】
遺伝子の発現レベルを検出、測定又は定量する具体的な方法としては、該遺伝子に特異的に結合するプローブ用の標識化ヌクレオチド、標識化cDNAまたは標識化RNAを用いたノーザンブロット法、ドットブロット法、iAFLP（introduced  Amplified  Fragment  Length  Polymorphism）法、LAMP（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）法、PCR法、又はmRNA分子を直接測定する方法等を用いることができる。PCR法としては、RT-PCR法、Real  Time  PCR法、競合PCR法を挙げることができる。
【００４１】
前記Real  Time  PCR法としては、例えば、試料内の全RNAやmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、該cDNAを鋳型にして目的領域をPCR法により増幅し、該増幅産物の生産過程をリアルタイムにモニタリングする方法が挙げられる。リアルタイムにモニタリングする試薬としては、例えば、SYBR（登録商標：Moleclar  Probes社）Green  Iや、TaqMan（登録商標：アプライドバイオシステムズ社）プローブ等が挙げられる。
【００４２】
前記競合PCR法としては、例えば、試料内の全RNAやmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、該cDNAと内部標準DNAを同一の反応チューブ内で反応させる方法や、さらに前記逆転写反応時にmRNAとともにRNA内部標準を加えて反応させる方法等が挙げられる。また、内部標準遺伝子の配列は、例えば、増幅目的遺伝子の配列と相同配列でもよく、非相同な配列でもよい。
【００４３】
さらに、遺伝子の発現レベルを検出又は定量する具体的な方法としては、DNAマイクロアレイ、DNAチップ、又は抗体アレイ等を用いる方法が挙げられる。DNAマイクロアレイ又はDNAチップには該遺伝子のヌクレオチド又はcDNAが１つ以上固定化されているものを用いる。
【００４４】
なお、ヌクレオチド又はcDNAは、該遺伝子の一部に相当する部分でもよい。
【００４５】
上記プローブの標識化に用いられる標識試薬は、例えば放射性同位元素である［１２５Ｉ］、［１３１Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ］、［３２Ｐ］、［３５Ｓ］、酵素であるβ‐ガラクトシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、また、蛍光物質であるシアニン蛍光色素蛍光色素（例えば、Cy２、Cy３、Cy５、Cy5.5、Cy７、Cyanine３、Cyanine５など）を用いることができる。
【００４６】
また、上記Real  Time  PCR法としては、例えば、組織内又は細胞内の全RNAやmRNAから逆転写酵素により合成したcDNAを鋳型にして、PCRの増幅産物をリアルタイムでモニタリングする方法が挙げられる。リアルタイムPCR用モニタリング試薬としては、例えばSYBR  GreenＩやTaqManプローブ等が用いられる。
【００４７】
通常、DNAマイクロアレイやDNAチップは、プローブが支持体の上に固定されているアレイ又はチップであり、DNAマイクロアレイ又はDNAチップの支持体としては、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであればよく、例えばガラス、シリコン、プラスチックなどの基板や、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等を用いることができる。
【００４８】
なお、DNAマイクロアレイとは、生体応答遺伝子群に含まれる遺伝子全長、またはその部分配列と相補的なcDNA断片若しくはオリゴDNAを固定支持体に１つ以上固定したものをいう。ここでいう相補的なオリゴDNAは一般的には２５〜１００塩基の長さのものが用いられるが、必ずしもこれに限定されない。
【００４９】
DNAマイクロアレイやDNAチップの使用方法については特に制限されない。例えば、生体試料からmRNAを精製し、該mRNAを鋳型とした逆転写反応を行う際に、適切な標識を付したプライマーや標識ヌクレオチドを使用することにより、標識されたcDNAを得ることができる。この標識化cDNAとDNAマイクロアレイやDNAチップ表面上に固定された本発明におけるプローブとの間でハイブリダイゼーションを行わせ、被検試料とのハイブリダイゼーション及び対照試料とのハイブリダイゼーションのそれぞれの結果を比較し、該遺伝子の有無を検出したり、発現レベルを測定したりすることにより、臓器毒性の検出または予測を行うことができる。
【００５０】
遺伝子に対応するポリペプチド又はタンパク質は上記生体応答遺伝子の発現産物であり、該ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の配列情報は、NCBIの遺伝子データベースにおいて、それぞれのアクセッションナンバーによりアプローチすることもできる。
【００５１】
上記ポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する方法としては、所定のポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する方法であれば特に制限されない。例えば、該ポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体やアプタマー等を用いることができ、抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示できる。これらの抗体は、慣用のプロトコルを用いて該ポリペプチド又はタンパク質又はそれらの断片を抗原として用いて作製することができる。また、アプタマーとは、タンパク質、アミノ酸等の分子に特異的に結合する核酸分子である。
【００５２】
上記ポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、被検試料中に存在する該ポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する場合、免疫沈降法、電気化学発光法、ＲＩＡ（Radioimmunoassay）法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-liked  immunosorbent  assay）法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的方法を用いることができる。
【００５３】
上記判定の基準としては、被検試料中に存在する該遺伝子の発現レベル（又は該遺伝子に対応するポリペプチド若しくはタンパク質の発現レベル）が正常対照試料中に存在する、該遺伝子の発現レベル（又は該遺伝子に対応するポリペプチド若しくはタンパク質の発現レベル）よりも高い又は低いことを利用する。例えば、１群３検体以上の試料の発現レベルを測定した結果について、ｔ検定を行った場合に、P＜0.05、より好ましくはP＜0.01、さらに好ましくはP＜0.001、さらにより好ましくはP＜0.0001である場合が挙げられる。
【００５４】
検定方法はｔ検定に限定されるものではなく、Ｕ検定、Ｆ検定、マン・ホイットニ検定やウィルコクサン符号付順位検定でもよい。また検定に限定されるものではなく、例えば各群の発現レベルの平均値の差を用いてもよい。
【００５５】
基準値は、被検試料における発現レベルを測定する度に毎回測定する必要はなく、例えば、様々な種の生体試料における正常対照試料中に存在する遺伝子の発現レベルをあらかじめ測定しておき、その測定値を用いて比較することができる。
【００５６】
遺伝子発現レベルの変化には特定の化学物質と生体組織との直接の反応のみならず、臓器に障害が生じた結果としての二次的反応も含まれる。
【００５７】
生体応答遺伝子群に含まれる遺伝子は、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、又はサルのような任意の哺乳動物において、マーカーとして用いられ得る。好ましくは、生体応答遺伝子群に含まれる遺伝子は、ラット又はマウスにおいてマーカーとして用いられる。
【００５８】
動物の種類は特に限定されるものではなく、例えば、ラットの場合にはSprague  Dawleyラット、Wistarラットなどでもよく、雄でも雌でも構わない。
【００５９】
以下、実施例により本発明による化学物質の毒性判別・予測方法、核酸構成物、ベクター、形質転換細胞、照合用遺伝子発現データベースの作成方法、及び、化学物質の毒性判別キットをより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６０】
本発明の毒性作用を検出または予測するための方法に用いられる生体応答遺伝子群は、1,4-ジブロモベンゼン（CAS登録番号106-37-6）を雄のSprague  Dawleyラット（６週齢）（日本チャールス・リバー社）に２８日間反復投与することにより肝臓で発現レベルが著しく変動した遺伝子群である。
【００６１】
本発明で用いられる生体応答遺伝子群は以下の方法により得られる。なお、ここで、「発現レベル」とは絶対量である必要はなく相対量でよい。
【００６２】
＜遺伝子発現データベース＞
本発明による遺伝子発現データベースの作成は、
（１）種々の化学物質について、ラットなどが死亡しない適当な投与量を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質を一定期間、ラットなどに繰り返し曝露し、
（３）曝露した生体から各臓器を摘出し、
（４）摘出した臓器からmRNAを単離し、
（５）DNAマイクロアレイ法などにより特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（６）得られた遺伝子発現レベルを化学物質、その濃度、曝露時間とともに遺伝子発現データベースとしてまとめる、と以上６つの工程によりなされる。
【００６３】
＜動物試験＞
５週齢のCrl:CD(SD)ラット（雄）を準備し、ポリカーボネイトケージに入れ、エアーコンディショニング・アニマルラック（商品名）内で飼育した。エアーコンディショニング・アニマルラックは、温度２２℃、湿度５５％に設定し、照明は明期7:00〜19:00、暗期19:00〜7:00の１２時間サイクルに設定した。水は給水ビンを用いて、浄水器を通した水道水を不断給与し、飼料は固形飼料を不断給餌した。実験開始までに１週間の馴化検疫期間を設けた。
【００６４】
国立医薬品食品衛生研究所の「既存化学物質毒性データベース」（http://dra4.nihs.go.jp/mhlw_data/jsp/SearchPage.jsp）に登録されている３７種類の化学物質、2-ブタノンオキシム、3-シアノピリジン、2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、m-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、p-クミルフェノール、m-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、p-エチルフェノール、2,4-ジ-tert-ブチルフェノール、3,5-キシリジン、N,N-ジメチルベンジルアミン、1,3-ジブロモプロパン、n-ヘキサデカン、1-ブロモ-3-クロロプロパン、プソイドクメン、ジシクロヘキシルアミン、1,4-ジブロモベンゼン、又は2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸を２８日間反復してSprague  Dawleyラット（６週齢、雄）に経口投与した。正常対照群として、オリブ油、注射用水又はゴマ油を２８日間反復してSprague  Dawleyラット（６週齢、雄）に経口投与した。また、１群あたり３個体のラットを使用した。なお、動物試験は２８日間に制限されることはなく、例えば数日間でもよい。
【００６５】
化学物質の投与液は、化学物質を必要量秤量し、適当な溶媒（注射用水、オリブ油、ゴマ油など）を用いて溶液又は均一な懸濁液を作製した。経口投与は2.5mL用または5.0mL用注射用シリンジにフレキシブル経口ゾンデ（商品名）を装着したものを用いたが、これに限定されるものではない。なお、溶媒は、2-ブタノンオキシム、3-シアノピリジン、2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、m-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、および3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールは注射用水（大塚製薬株式会社製）を使用し、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、p-クミルフェノール、m-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、p-エチルフェノール、2,4-ジ-tert-ブチルフェノール、3,5-キシリジン、N,N-ジメチルベンジルアミン、1,3-ジブロモプロパンおよびn-ヘキサデカンはオリブ油（小堺製薬株式会社製）を使用し、1-ブロモ-3-クロロプロパン、プソイドクメン、ジシクロヘキシルアミン、1,4-ジブロモベンゼン、および2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸はゴマ油（小堺製薬株式会社製）を使用した。なお、投与液に使用する溶媒はこれらに限定されることはない。
【００６６】
各化学物質の投与量はそれぞれ、2-ブタノンオキシムが100mg/kg/day、3-シアノピリジンが180mg/kg/day、2-（2-アミノエチルアミノ）エタノールが1,000mg/kg/day、テトラヒドロフルフリルアルコールが600mg/kg/day、メタクリルアミドが150mg/kg/day、スルホランが700mg/kg/day、2-イソプロポキシエタノールが500mg/kg/day、ヒドラジン一水和物が30mg/kg/day、4-エチルモルホリンが500mg/kg/day、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリドが1,000mg/kg/day、塩化ベンジルトリメチルアンモニウムが120mg/kg/day、m-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムが1,000mg/kg/day、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物が1,000mg/kg/day、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールが1,000mg/kg/day、o-ジクロロベンゼンが500mg/kg/day、3,4-キシリジンが250mg/kg/day、N-メチルアニリンが125mg/kg/day、トリレンジイソシアナートが300mg/kg/day、2-（ジブチルアミノ）エタノールが250mg/kg/day、p-クミルフェノールが700mg/kg/day、m-クレゾールが1,000mg/kg/day、2,3-ジメチルアニリンが200mg/kg/day、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドが300mg/kg/day、フタル酸ジヘプチルが1,000mg/kg/day、テトラブロモエタンが200mg/kg/day、アジピン酸ジブチルが1,000mg/kg/day、p-エチルフェノールが1,000mg/kg/day、2,4-ジ-tert-ブチルフェノールが300mg/kg/day、3,5-キシリジンが200mg/kg/day、N,N-ジメチルベンジルアミンが200mg/kg/day、1,3-ジブロモプロパンが250mg/kg/day、n-ヘキサデカンが1,000mg/kg/day、1-ブロモ-3-クロロプロパンが300mg/kg/day、プソイドクメンが1,000mg/kg/day、ジシクロヘキシルアミンが70mg/kg/day、1,4-ジブロモベンゼンが300mg/kg/day、2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸が1,000mg/kg/dayとし、投与対象となるラットの体重の測定値から投与液量を計算して、ラットに投与した。
【００６７】
臓器の採取は、化学物質の最終投与の約２４時間後に行った。具体的には、ラットを麻酔下で腹部大動脈より放血（全採血）して安楽死させた後、肝臓を採取し、速やかに液体窒素で凍結させた。凍結させた肝臓はISOGEN（ニッポンジーン社製）溶液中でホモジナイズすることにより粉砕した。
【００６８】
＜全RNAの抽出＞
肝臓組織からの全RNAの抽出はISOGEN試薬（ニッポンジーン社製）を用いて推奨のプロトコルに従って行った。
【００６９】
＜核酸検体の調製＞
検体用mRNAの調製は、肝臓組織からISOGEN試薬（ニッポンジーン社製）を用いて抽出した全RNAから、Poly（A）Pureキット（Ambion社製）を用い、各社推奨のプロトコルに従って行った。
【００７０】
＜マイクロアレイの作製＞
ラット遺伝子断片ライブラリー（マイクロダイアグノスティック社製）を用いてマイクロアレイを作製した。該ラット遺伝子断片ライブラリーには、配列番号１〜１４４で示される塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを含んでいた。また、マイクロアレイの作製方法・条件に限定はないが、例えば（Schena,M.et.al.,Science,270,467-470.(1995)）に記載の作製方法を用いることができる。
【００７１】
ラット遺伝子断片ライブラリーを超微量分注装置（マイクロダイアグノスティク社製）によりスライドガラス（松波硝子工業社製、HAコートスライドガラス）にプリントしてマイクロアレイを作製した。該マイクロアレイを気相恒温器内にて80℃で1時間静置し、さらにUVクロスリンカー（Hoefer社製、UVC500）を用いて120mJの紫外線を照射した。
【００７２】
＜マイクロアレイの後処理＞
マイクロアレイの後処理については、特許公報（特許第４１９０８９９号）記載の方法により行った。
【００７３】
＜標識cDNAの合成＞
該mRNA  1.5μgを核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）、逆転写酵素SuperScriptII（登録商標：ライフテクノロジーズ）（インビトロジェン社製）、Cyanine5-deoxyuridinetriphosphate(Cyanine5-dUTP)（Perkin  Elmer社製）を用い、標識cDNAを作製した。一方、対照としてラット共通レファレンス（マイクロダイアグノスティック社製）を使用した。共通レファレンスに対しては核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）、逆転写酵素SuperScriptII（インビトロジェン社製）、Cyanine3-deoxyuridinetriphosphate(Cyanine3-dUTP)（Perkin  Elmer社製）を用い、標識cDNAを作製した。作製方法は、各社推奨のプロトコルに従った。
【００７４】
＜標識プローブの作製＞
これらの標識cDNA、すなわち、Cyanine5-dUTPで標識した検体及びCyanine3-dUTPで標識した対照レファレンスを同一試験管内で混合した後、MicropureEZ（ミリポア社製）及びMicroconYM30（登録商標：ミリポア）（ミリポア社製）により精製した。最終的には核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬に付属のハイブリダイゼーションバッファー及び純水を用いて15μlに調製した。
【００７５】
＜ハイブリダイゼーション＞
該溶液を99℃で5分間加熱して熱変性させた後に、DNAマイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイゼーションカセット（マイクロダイアグノスティック社製）に格納した。該ハイブリダイゼーションカセットを気相恒温器（三洋電機バイオメディカ社製）に入れ、42℃で約20時間、静置した状態で保温した。この操作によって、サンプル中に含まれる標識cDNAがDNAマイクロアレイ上の相補的なオリゴDNAと特異的に結合する。
【００７６】
＜洗浄＞
ハイブリダイゼーションカセットからスライドガラスを取り出し、核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）付属のハイブリダイゼーション洗浄溶液を用い、同社推奨のプロトコルに従ってスライドガラスを洗浄した。
【００７７】
＜蛍光強度の検出及び数値化＞
各遺伝子の発現レベルはDNAマイクロアレイ上に固定されたオリゴDNAと結合した標識cDNAの蛍光強度を測定することにより見積もることができる。洗浄したスライドガラスをスキャナGenePix4000B（Axon  Instrument社製）を用いて蛍光を測定し、スキャナに付属の解析ソフトウェアGenePixPro（Axon  Instrument社製）を用いて光学的に評価し、蛍光強度の相対値（Cyanine5/Cyanine3）数値化した。すなわち、DNAマイクロアレイ上に固定されたオリゴDNAのスポットの蛍光強度をそれぞれ別々に測定し、蛍光強度をヒト共通レファレンスとの相対比（log2比）で表した。また、スポット以外の場所の蛍光強度からバックグラウンドを算出してノイズとしてそれぞれのスポットの蛍光強度から差し引いた。さらに、サンプルにおける蛍光強度/共通レファレンスの蛍光強度を算出するという解析を行った。すなわち、各サンプルの遺伝子発現レベルはすべて共通レファレンスに対する相対比として検出されるため、単純に複数サンプルを横並び比較できる状態となっている。このようにして取得された数値を集積してデータベース化した。
【００７８】
＜二次比の算出＞
次に、すべての対照群の平均値を算出し、それぞれのサンプルについてその平均値との相対値（「二次比」と呼ぶ。）を算出した。以下の計算はすべて二次比を用いて行った。
【００７９】
＜肝臓に影響を与える化学物質の選択＞
「既存化学物質毒性データベース」（国立医薬品食品衛生研究所）に登録されている化学物質から３７種類の化学物質、すなわち、2-ブタノンオキシム、3-シアノピリジン、2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、メタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリン、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、m-ニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール、o-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノール、p-クミルフェノール、m-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチル、テトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、p-エチルフェノール、2,4-ジ-tert-ブチルフェノール、3,5-キシリジン、N,N-ジメチルベンジルアミン、1,3-ジブロモプロパン、n-ヘキサデカン、1-ブロモ-3-クロロプロパン、プソイドクメン、ジシクロヘキシルアミン、1,4-ジブロモベンゼン、2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸を選択した。
【００８０】
＜遺伝子群の抽出＞
1,4-ジブロモベンゼンを２８日間反復投与したラットの肝臓とその溶媒を投与した対照群ラットの肝臓とを比較して、各遺伝子の対数変換相対的発現比に対するスチューデントのｔ検定を行ってP値を算出した。それぞれの化学物質投与群と対照群との間で発現レベルの平均値の差の絶対値が1.0以上、かつ、P値が0.01未満である遺伝子群を抽出したところ１４４プローブ（配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子群）存在した。表１〜２８には配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子群の発現情報を記しており、数値は二次比で表している。また表中、「配列番号」の欄には特定した遺伝子の配列番号を記している。また、表中の略号は「C1」は「第１回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「2bo」は「2-ブタノンオキシム投与群」を、「3cp」は「3-シアノピリジン投与群」を、「2ae」は「2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール投与群」を、「thf」は「テトラヒドロフルフリルアルコール投与群」を、「C2」は「第２回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「mca」は「メタクリルアミド投与群」を、「suf」は「スルホラン投与群」を、「2ip」は「2-イソプロポキシエタノール投与群」を、「hmh」は「ヒドラジン一水和物投与群」を、「4em」は「4-エチルモルホリン投与群」を、「C3」は「第３回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「mta」は「メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド投与群」を、「bac」は「塩化ベンジルトリメチルアンモニウム投与群」を、「mns」は「m-ニトロベンゼンスルホンサンナトリウム投与群」を、「nat」は「1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物投与群」を、「mmb」は「3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群」を、「C4」は「第４回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「dcb」は「o-ジクロロベンゼン投与群」を、「34x」は「3,4-キシリジン投与群」を、「nma」は「N-メチルアニリン投与群」を、「tdn」は「トリレンジイソシアナート投与群」を、「2de」は「2-（ジブチルアミノ）エタノール投与群」を、「C5」は「第５回目の実験に使用したオリブ油投与群」を、「pcp」は「p-クミルフェノール投与群」を、「mcs」は「m-クレゾール投与群」を、「23d」は「2,3-ジメチルアニリン投与群」を、「dhc」は「N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド投与群」を、「dhp」は「フタル酸ジヘプチル投与群」を、「C6」は「第６回目の実験に使用したオリブ油投与群」を、「tbe」は「テトラブロモエタン投与群」を、「dba」は「アジピン酸ジブチル投与群」を、「pep」は「p-エチルフェノール投与群」を、「C7」は「第７回の実験に使用したオリブ油投与群」を、「24b」は「2,4-ジ-tert-ブチルフェノール投与群」を、「35x」は「3,5-キシリジン投与群」を、「nda」は「N,N-ジメチルベンジルアミン投与群」を、「13d」は「1,3-ジブロモプロパン投与群」を、「nhd」は「n-ヘキサデカン投与群」を、「C8」は「ゴマ油投与群」を、「bcp」は「1-ブロモ-3-クロロプロパン投与群」を、「tmb」は「プソイドクメン投与群」を、「dha」は「ジシクロヘキシルアミン投与群」を、「14d」は「1,4-ジブロモベンゼン投与群」を、「ams」は「2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸投与群」を表す。また、略号に付随の数字は個体の別を表している。
【００８１】
実験は８回に分けて行い、第１回目の実験では2-ブタノンオキシム、3-シアノピリジン、2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール、テトラヒドロフルフリルアルコールの４種類の化学物質をそれぞれ注射用水に溶解して投与し、第２回目の実験ではメタクリルアミド、スルホラン、2-イソプロポキシエタノール、ヒドラジン一水和物、4-エチルモルホリンの５種類の化学物質をそれぞれ注射用水に溶解して投与し、第３回目の実験ではメタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、塩化ベンジルトリメチルアンモニウム、m-ニトロベンゼンスルホンサンナトリウム、1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノールの５種類の化学物質をそれぞれ注射用水に溶解して投与し、第４回目の実験ではo-ジクロロベンゼン、3,4-キシリジン、N-メチルアニリン、トリレンジイソシアナート、2-（ジブチルアミノ）エタノールの５種類の化学物質をそれぞれ注射用水に溶解して投与し、第５回目の実験ではp-クミルフェノール、m-クレゾール、2,3-ジメチルアニリン、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド、フタル酸ジヘプチルの５種類の化学物質をそれぞれオリブ油に溶解して投与し、第６回目の実験ではテトラブロモエタン、アジピン酸ジブチル、p-エチルフェノールの３種類の化学物質をそれぞれオリブ油に溶解して投与し、第７回目の実験では2,4-ジ-tert-ブチルフェノール、3,5-キシリジン、N,N-ジメチルベンジルアミン、1,3-ジブロモプロパン、n-ヘキサデカンの５種類の化学物質をそれぞれオリブ油に溶解して投与し、第８回目の実験では1-ブロモ-3-クロロプロパン、プソイドクメン、ジシクロヘキシルアミン、1,4-ジブロモベンゼン、2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸の５種類の化学物質をそれぞれゴマ油に溶解して投与した。
【００８２】
【表１】
2013031374.tif 000002
【００８３】
【表２】
2013031374.tif 000003
【００８４】
【表３】
2013031374.tif 000004
【００８５】
【表４】
2013031374.tif 000005
【００８６】
【表５】
2013031374.tif 000006
【００８７】
【表６】
2013031374.tif 000007
【００８８】
【表７】
2013031374.tif 000008
【００８９】
【表８】
2013031374.tif 000009
【００９０】
【表９】
2013031374.tif 000010
【００９１】
【表１０】
2013031374.tif 000011
【００９２】
【表１１】
2013031374.tif 000012
【００９３】
【表１２】
2013031374.tif 000013
【００９４】
【表１３】
2013031374.tif 000014
【００９５】
【表１４】
2013031374.tif 000015
【００９６】
【表１５】
2013031374.tif 000016
【００９７】
【表１６】
2013031374.tif 000017
【００９８】
【表１７】
2013031374.tif 000018
【００９９】
【表１８】
2013031374.tif 000019
【０１００】
【表１９】
2013031374.tif 000020
【０１０１】
【表２０】
2013031374.tif 000021
【０１０２】
【表２１】
2013031374.tif 000022
【０１０３】
【表２２】
2013031374.tif 000023
【０１０４】
【表２３】
2013031374.tif 000024
【０１０５】
【表２４】
2013031374.tif 000025
【０１０６】
【表２５】
2013031374.tif 000026
【０１０７】
【表２６】
2013031374.tif 000027
【０１０８】
【表２７】
2013031374.tif 000028
【０１０９】
【表２８】
2013031374.tif 000029
【０１１０】
なお、前記３７種類の化学物質の中で２１種類の化学物質をラットに投与した場合に、肝臓の病理所見の異常が報告されていた。「3-シアノピリジン投与群」、「4-エチルモルホリン投与群」、「2-（ジブチルアミノ）エタノール投与群」、「m-クレゾール投与群」、「テトラブロモエタン投与群」、「2,4-ジ-tert-ブチルフェノール投与群」、「1,3-ジブロモプロパン投与群」、「1-ブロモ-3-クロロプロパン投与群」、「1,4-ジブロモベンゼン投与群」は肝細胞肥大が、「o-ジクロロベンゼン投与群」、「フタル酸ジヘプチル投与群」は肝細胞肥大、肝細胞の脂肪化（減少性変化）および小葉中心性の単細胞壊死が、「3,5-キシリジン投与群」は髄外造血や色素沈着が、「3,4-キシリジン投与群」は髄外造血や色素沈着の他さらに単細胞壊死が、「2,3-ジメチルアニリン投与群」、「p-クミルフェノール投与群」は胆管増殖が、「2-ブタノンオキシム投与群」、「2-イソプロポキシエタノール投与群」、「N-メチルアニリン投与群」は髄外造血および色素沈着が、「ヒドラジン一水和物投与群」、「トリレンジイソシアナート投与群」は肝細胞の脂肪化が、「N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド投与群」は肝細胞壊死が報告されていた。また、病理所見では顕著な変化はなかったが、他の検査で肝臓に毒性があると報告された化学物質は「スルホラン投与群」、「3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群」、「p-エチルフェノール投与群」、「プソイドクメン投与群」であった。
【実施例２】
【０１１１】
＜クラスタ分析＞
DNAマイクロアレイで取得した遺伝子発現データの分析手法として、例えばクラスタ分析が挙げられる。クラスタ分析とは、遺伝子発現変化パターンの類似した遺伝子同士をグルーピングする統計的手法である。データ間の類似度（例えばユークリッド距離など）を定義し、その類似度を用いることにより遺伝子発現パターンが類似した、すなわち、遺伝子発現に対して類似した影響を持つ化学物質同士がグループ化される。
【０１１２】
配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析を行った。階層的クラスタ分析は解析用ソフトウェア「Expression  View  Pro」（マイクロダイアグノスティック社製）を用いて行った。また、階層的クラスタ分析は「cluster」や「treeview」などのソフトウェアを用いても行うことができる。その結果、化学物質を大きく６つのクラスタに分類することができた。図１にクラスタ分析の結果を示す。なお、図中、「C1」は「第１回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「2bo」は「2-ブタノンオキシム投与群」を、「3cp」は「3-シアノピリジン投与群」を、「2ae」は「2-（2-アミノエチルアミノ）エタノール投与群」を、「thf」は「テトラヒドロフルフリルアルコール投与群」を、「C2」は「第２回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「mca」は「メタクリルアミド投与群」を、「suf」は「スルホラン投与群」を、「2ip」は「2-イソプロポキシエタノール投与群」を、「hmh」は「ヒドラジン一水和物投与群」を、「4em」は「4-エチルモルホリン投与群」を、「C3」は「第３回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「mta」は「メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド投与群」を、「bac」は「塩化ベンジルトリメチルアンモニウム投与群」を、「mns」は「m-ニトロベンゼンスルホンサンナトリウム投与群」を、「nat」は「1-ナフチルアミン-4-スルホン酸ナトリウム四水和物投与群」を、「mmb」は「3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群」を、「C4」は「第４回目の実験に使用した注射用水投与群」を、「dcb」は「o-ジクロロベンゼン投与群」を、「34x」は「3,4-キシリジン投与群」を、「nma」は「N-メチルアニリン投与群」を、「tdn」は「トリレンジイソシアナート投与群」を、「2de」は「2-（ジブチルアミノ）エタノール投与群」を、「C5」は「第５回目の実験に使用したオリブ油投与群」を、「pcp」は「p-クミルフェノール投与群」を、「mcs」は「m-クレゾール投与群」を、「23d」は「2,3-ジメチルアニリン投与群」を、「dhc」は「N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド投与群」を、「dhp」は「フタル酸ジヘプチル投与群」を、「C6」は「第６回目の実験に使用したオリブ油投与群」を、「tbe」は「テトラブロモエタン投与群」を、「dba」は「アジピン酸ジブチル投与群」を、「pep」は「p-エチルフェノール投与群」を、「C7」は「第７回の実験に使用したオリブ油投与群」を、「24b」は「2,4-ジ-tert-ブチルフェノール投与群」を、「35x」は「3,5-キシリジン投与群」を、「nda」は「N,N-ジメチルベンジルアミン投与群」を、「13d」は「1,3-ジブロモプロパン投与群」を、「nhd」は「n-ヘキサデカン投与群」を、「C8」は「ゴマ油投与群」を、「bcp」は「1-ブロモ-3-クロロプロパン投与群」を、「tmb」は「プソイドクメン投与群」を、「dha」は「ジシクロヘキシルアミン投与群」を、「14d」は「1,4-ジブロモベンゼン投与群」を、「ams」は「2-アミノ-5-メチルベンゼンスルホン酸投与群」を表す。サンプル名を表す略号の下にある黒と白のバーは肝毒性の有無を表しており、黒が肝毒性を有する化学物質、白が肝毒性を有さない化学物質を表している。さらに、黒丸と白丸は、配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子を特定する際に比較対象としたサンプルを表しており、��丸が化学物質投与サンプルを、白丸が対照サンプルを表している。また、「A」〜「F」はクラスタの分類を表している。
【０１１３】
「A」のクラスタには、3,4-キシリジン投与群（34x）が３個体中３個体、3-シアノピリジン投与群（3cp）が３個体中２個体、o-ジクロロベンゼン投与群（dcb）が３個体中３個体、テトラブロモエタン投与群（tbe）が３個体中３個体、1,4-ジブロモベンゼン投与群（14d）が３個体中３個体含まれていた。「B」のクラスタには、フタル酸ジヘプチル投与群（dhp）が３個体中３個体含まれていた。「C」のクラスタには、ヒドラジン一水和物投与群（hmh）が３個体中３個体、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群（mmb）が３個体中３個体含まれていた。「D」のクラスタには、スルホラン投与群（suf）が３個体中３個体、p-クミルフェノール投与群（pcp）が３個体中３個体、3-シアノピリジン投与群（3cp）が３個体中１個体、プソイドクメン投与群（tmb）が３個体中２個体、1-ブロモ-3-クロロプロパン投与群（bcp）が３個体中３個体、1,3-ジブロモプロパン投与群（13d）が３個体中３個体含まれていた。「E」のクラスタには、トリレンジイソシアナート投与群（tdn）が３個体中２個体含まれていた。「F」のクラスタには、対照群を含むその他のサンプルが含まれていた。また、「A」〜「E」のクラスタに含まれていた化学物質は、すべて肝毒性を有することが既知の化学物質であった。この結果は、配列番号１〜１４４に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンによって、これらの化学物質を対照群と区別することができ、また、化学物質を分類できることを意味する。
【実施例３】
【０１１４】
次に、1,4-ジブロモベンゼンを２８日間反復投与したラットの肝臓とその溶媒を投与した対照群ラットの肝臓とを比較して、各遺伝子の対数変換相対的発現比に対するスチューデントのｔ検定を行ってP値を算出し、両者の間で発現レベルの平均値の差の絶対値が1.0以上、かつ、P値が0.005未満である遺伝子群を抽出したところ９７プローブ（配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子群）であった。配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析を行った。その結果、化学物質を大きく６つのクラスタに分類することができた。図２にクラスタ分析の結果を示す。なお、図中の略号等は図１と同様に表している。
【０１１５】
「A」のクラスタには、3-シアノピリジン投与群（3cp）が３個体中２個体、3,4-キシリジン投与群（34x）が３個体中３個体、テトラブロモエタン投与群（tbe）が３個体中３個体、o-ジクロロベンゼン投与群（dcb）が３個体中３個体、1,4-ジブロモベンゼン投与群（14d）が３個体中３個体含まれていた。「B」のクラスタには、フタル酸ジヘプチル投与群（dhp）が３個体中３個体、ヒドラジン一水和物投与群（hmh）が３個体中３個体、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群（mmb）が３個体中３個体含まれていた。「C」のクラスタには、スルホラン投与群（suf）が３個体中３個体、p-クミルフェノール投与群（pcp）が３個体中３個体含まれていた。「D」のクラスタには、3-シアノピリジン投与群（3cp）が３個体中１個体、プソイドクメン投与群（tmb）が３個体中３個体、1-ブロモ-3-クロロプロパン（bcp）が３個体中３個体、1,3-ジブロモプロパン投与群（13d）が３個体中３個体、N-メチルアニリン（nma）が３個体中１個体、3,5-キシリジン（35x）が３個体中３個体、p-エチルフェノール（pep）が３個体中３個体、トリレンジイソシアナート（tdn）が３個体中１個体、2,4-ジ-tert-ブチルフェノール（24b）が３個体中３個体含まれていた。「E」のクラスタには、トリレンジイソシアナート投与群（tdn）が３個体中２個体含まれていた。「F」のクラスタには、対照群を含むその他のサンプルが含まれていた。また、「A」〜「E」のクラスタに含まれていた化学物質は、すべて肝毒性を有することが既知の化学物質であった。この結果は、配列番号１〜９７に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンによって、これらの化学物質を対照群と区別することができ、また、化学物質を分類できることを意味する。
【実施例４】
【０１１６】
次に、1,4-ジブロモベンゼンを２８日間反復投与したラットの肝臓とその溶媒を投与した対照群ラットの肝臓とを比較して、各遺伝子の対数変換相対的発現比に対するスチューデントのｔ検定を行ってP値を算出し、両者の間で発現レベルの平均値の差の絶対値が1.0以上、かつ、P値が0.001未満である遺伝子群を抽出したところ３７遺伝子（配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子群）であった。配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析を行った。その結果、化学物質を大きく４つのクラスタに分類することができた。図３にクラスタ分析の結果を示す。なお、図中の略号等は図１と同様に表している。
【０１１７】
「A」のクラスタには、3-シアノピリジン投与群（3cp）が３個体中３個体、3,4-キシリジン投与群（34x）が３個体中３個体、テトラブロモエタン投与群（tbe）が３個体中３個体、o-ジクロロベンゼン投与群（dcb）が３個体中３個体、1-ブロモ-3-クロロプロパン（bcp）が３個体中３個体、1,3-ジブロモプロパン投与群（13d）が３個体中３個体、1,4-ジブロモベンゼン投与群（14d）が３個体中３個体含まれていた。「B」のクラスタには、スルホラン投与群（suf）が３個体中３個体、プソイドクメン（tmb）が３個体中２個体、p-クミルフェノール投与群（pcp）が３個体中３個体含まれていた。「C」のクラスタには、フタル酸ジヘプチル投与群（dhp）が３個体中３個体、ヒドラジン一水和物投与群（hmh）が３個体中１個体、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群（mmb）が３個体中３個体含まれていた。「D」のクラスタには、対照群を含むその他のサンプルが含まれていた。「A」〜「C」のクラスタに含まれていた化学物質は、すべて肝毒性を有することが既知の化学物質であった。この結果は、配列番号１〜３７に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンによって、これらの化学物質を対照群と区別することができ、また、化学物質を分類できることを意味する。
【実施例５】
【０１１８】
次に、1,4-ジブロモベンゼンを２８日間反復投与したラットの肝臓とその溶媒を投与した対照群ラットの肝臓とを比較して、各遺伝子の対数変換相対的発現比に対するスチューデントのｔ検定を行ってP値を算出し、両者の間で発現レベルの平均値の差の絶対値が1.0以上、かつ、P値が0.0005未満である遺伝子群を抽出したところ２３プローブ（配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子群）であった。配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析を行った。その結果、化学物質を大きく４つのクラスタに分類することができた。図４にクラスタ分析の結果を示す。なお、図中の略号等は図１と同様に表している。
【０１１９】
「A」のクラスタには、3-シアノピリジン投与群（3cp）が３個体中３個体、3,4-キシリジン投与群（34x）が３個体中３個体、テトラブロモエタン投与群（tbe）が３個体中３個体、o-ジクロロベンゼン投与群（dcb）が３個体中３個体、1-ブロモ-3-クロロプロパン（bcp）が３個体中３個体、1,3-ジブロモプロパン投与群（13d）が３個体中３個体、1,4-ジブロモベンゼン投与群（14d）が３個体中３個体含まれていた。「B」のクラスタには、プソイドクメン（tmb）が３個体中３個体、p-クミルフェノール投与群（pcp）が３個体中３個体、スルホラン投与群（suf）が３個体中３個体含まれていた。「C」のクラスタには、ヒドラジン一水和物投与群（hmh）が３個体中２個体、フタル酸ジヘプチル投与群（dhp）が３個体中２個体、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群（mmb）が３個体中３個体含まれていた。「D」のクラスタには、対照群を含むその他のサンプルが含まれていた。「A」〜「C」のクラスタに含まれていた化学物質は、すべて肝毒性を有することが既知の化学物質であった。この結果は、配列番号１〜２３に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンによって、これらの化学物質を対照群と区別することができ、また、化学物質を分類できることを意味する。
【実施例６】
【０１２０】
次に、1,4-ジブロモベンゼンを２８日間反復投与したラットの肝臓とその溶媒を投与した対照群ラットの肝臓とを比較して、各遺伝子の対数変換相対的発現比に対するスチューデントのｔ検定を行ってP値を算出し、両者の間で発現レベルの平均値の差の絶対値が1.0以上、かつ、P値が0.0001未満である遺伝子群を抽出したところ９プローブ（配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子群）であった。配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンに基づいて階層的クラスタ分析を行った。その結果、化学物質を大きく４つのクラスタに分類することができた。図５にクラスタ分析の結果を示す。なお、図中の略号等は図１と同様に表している。
【０１２１】
「A」のクラスタには、1,4-ジブロモベンゼン投与群（14d）が３個体中３個体含まれていた。「B」のクラスタには、p-クミルフェノール投与群（pcp）が３個体中３個体、スルホラン投与群（suf）が３個体中３個体、プソイドクメン（tmb）が３個体中２個体、3,4-キシリジン投与群（34x）が３個体中３個体、3-シアノピリジン投与群（3cp）が３個体中３個体、テトラブロモエタン投与群（tbe）が３個体中３個体、フタル酸ジヘプチル投与群（dhp）が３個体中１個体、o-ジクロロベンゼン投与群（dcb）が３個体中３個体含まれていた。「C」のクラスタには、o-ジクロロベンゼン投与群（dcb）が３個体中１個体、ヒドラジン一水和物投与群（hmh）が３個体中１個体、3-メトキシ-3-メチル-1-ブタノール投与群（mmb）が３個体中３個体含まれていた。「D」のクラスタには、対照群を含むその他のサンプルが含まれていた。「A」〜「C」のクラスタに含まれていた化学物質は、すべて肝毒性を有することが既知の化学物質であった。この結果は、配列番号１〜９に示される塩基配列を有する遺伝子の発現変動パターンによって、これらの化学物質を対照群と区別することができ、また、化学物質を分類できることを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明の毒性判定遺伝子セットは、肝毒性のモニタリング、それらの診断および/またはそれらに対する種々の措置もしくは薬剤の有効性を判定することを助けることができる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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