(57)【要約】【課題】赤血球容積比が比較的高い場合であっても、血液中からがん細胞などの非血球細胞を容易に分離することができる、血液中の粒子分離装置１０を提供する。【解決手段】流路１１が、上流側に流入口１２を有し、下流側に回収口１３と排出口１４とを有している。流路１１は、流入口１２から回収口１３に向かって、幅が狭い狭窄部１５ａ〜１５ｇと、それらより幅が広い拡幅部１６ａ〜１６ｇとを交互に複数連通して形成されている。拡幅部１６ｂ〜１６ｇは、下流に向かって幅方向に分岐する分岐路１７ｂ〜１７ｇを有している。分岐路１７ｂ〜１７ｇは、排出口１４に連通している。血液試料を流入口１２から流路１１に流したとき、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎを利用して、血液試料中に含まれる所定の粒子と他の粒子とが、回収口１３と排出口１４とに分離されて流れるようになっている。【選択図】図８
2013152171.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流側に設けられた流入口と、下流側に設けられた回収口と、下流側に設けられた排出口とを有する流路を有し、
前記流路は前記流入口から前記回収口に向かって、幅が狭い狭窄部と、前記狭窄部より幅が広い拡幅部とを交互に複数連通して形成されており、各拡幅部のうち少なくとも１つの拡幅部は下流に向かって幅方向に分岐する１または複数の分岐路を有し、全ての分岐路のうち少なくとも一つの分岐路が前記排出口に連通しており、
血液試料を前記流入口から前記流路に流したとき、前記血液試料中に含まれる所定の粒子と他の粒子とが、前記回収口と前記排出口とに分離されて流れるよう構成されていることを
特徴とする血液中の粒子分離装置。
【請求項２】
各拡幅部のうち少なくとも１つの拡幅部は、上流側で連通する狭窄部に対して、前記狭窄部の幅方向の一方の側に拡がるよう形成され、幅方向が拡がった側から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していることを特徴とする請求項１記載の血液中の粒子分離装置。
【請求項３】
上流側および下流側に拡幅部が連通した狭窄部のうち少なくとも一つの狭窄部に対して、前記狭窄部の幅方向の一方の側に拡がるよう形成された拡幅部が上流側に連通し、前記狭窄部の幅方向の他方の側に拡がるよう形成された拡幅部が下流側に連通しており、
前記狭窄部の下流側に連通した拡幅部は、幅方向が拡がった側から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していることを
特徴とする請求項１または２記載の血液中の粒子分離装置。
【請求項４】
上流側および下流側に狭窄部が連通した拡幅部のうち少なくとも一つの拡幅部に対して、前記拡幅部の幅方向で対向する１対の側壁のうち、一方の側壁に沿って上流側の狭窄部が連通し、他方の側壁に沿って下流側の狭窄部が連通しており、
前記拡幅部は、前記他方の側壁から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していることを
特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の血液中の粒子分離装置。
【請求項５】
前記他の粒子は、大きさおよび機械特性のうち少なくともいずれか一方が前記所定の粒子とは異なっており、
前記血液試料の赤血球容積比を１０％以下とし、前記所定の粒子の粒子レイノルズ数を０．２以上として前記血液試料を前記流路に流すことを
特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の血液中の粒子分離装置。
【請求項６】
前記流路は、最も上流側の拡幅部が、下流に向かって幅方向の中央で２つに分岐するよう形成されており、その２つの分岐路に対して、それぞれ狭窄部と拡幅部とが交互に１または複数、前記回収口に向かって連通されており、
上流側および下流側に拡幅部が連通した狭窄部に対して、その狭窄部の幅方向の一方の側に拡がるよう形成された拡幅部が上流側に連通し、その狭窄部の幅方向の他方の側に拡がるよう形成された拡幅部が下流側に連通しており、
上流側および下流側に狭窄部が連通した拡幅部のうち、最も上流側の拡幅部以外の拡幅部に対して、その拡幅部の幅方向で対向する１対の側壁のうち、一方の側壁に沿って上流側の狭窄部が連通し、他方の側壁に沿って下流側の狭窄部が連通しており、
最も上流側の拡幅部以外の拡幅部は、前記他方の側壁から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していることを
特徴とする請求項１記載の血液中の粒子分離装置。
【請求項７】
前記所定の粒子はがん細胞であり、前記他の粒子は血球細胞であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の血液中の粒子分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の粒子分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、転移性乳がん等の予後や治療効果を予測する方法として、末梢血中を流れるがん細胞数を測定する循環がん細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ；ＣＴＣ）検査が行われている。しかし、ＣＴＣ検査では、がん細胞を同定するために、抗原抗体反応を利用して血液中の非血球細胞を事前に染色したり、非血球細胞に磁気ビーズを付けたりする必要があり、手順が煩雑で、処理時間が長くなるという問題があった。また、装置が大掛かりで高価になり、分離した細胞の生存能力（バイアビリティ）が低いという問題もあった。
【０００３】
そこで、これらの問題を解決するために、免疫染色や磁気ビーズの付着を行うことなく、血液中から非血球細胞を分離する装置や方法が提案されている（例えば、非特許文献１乃至３参照）。なお、本発明者等も、流体中を流れる粒子の慣性力により粒子が移動・集中する、“Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ”と呼ばれる現象（例えば、非特許文献４参照）を利用して、血液中のがん細胞を分離するための微小流体チップの開発を行っている（例えば、非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kuntaegowadanahalli SS, Bhagat AAS, Kumar Get al, “Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiralmicrochannels”, Lab on a chip, 2009年, 9, p.2973-2980
【非特許文献２】Hur SC, Tse HTK and Carlo DD, “Sheathlessinertial cell ordering for extreme throughput flow cytometry”, Lab on a chip,2010年, 10, p.274-280
【非特許文献３】Carlo DD, Edd JF, Irimia D et al,“Equilibrium Separation and Filtration of Particles Using Differential InertialFocusing”, Anal Chem, 2008年, 80, p.2204-2211
【非特許文献４】Segre G. and Silbergerg A., “Behaviour ofmacroscopic rigid spheres in Poiseuille flow. Part 2. Experimental results andinterpretation”, J. Fluid Mech., 1962年, 14, p.136-157
【非特許文献５】T. Tanaka, T. Ishikawa, K. Numayama-Tsuruta,Y. Imai, H. Ueno, T. Yoshimoto, N. Matsuki and T. Yamaguchi, “Inertialmigration of cancer cells in blood flow in microchannels”, BiomedicalMicrodevices, [online], 2011.9.6, インターネット, 〈URL:http://www.springerlink.com/content/1387-2176〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に記載の方法は、曲りによる慣性力を利用しており、赤血球が非常に希薄な場合にしか適用できないという課題があった。また、非特許文献２に記載の方法は、粒子を３次元的に移動させ、最終的に画像解析によって粒子を判別するものであり、粒子を分離することはできないという課題があった。非特許文献３に記載の方法は、血液から血小板を分離することはできるが、がん細胞などの大きな非血球細胞を分離することはできないという課題があった。
【０００６】
本発明は、このような課題に着目してなされたもので、赤血球容積比が比較的高い場合であっても、血液中からがん細胞などの非血球細胞を容易に分離することができる、血液中の粒子分離装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、非特許文献５に記載のように、血液中のがん細胞が慣性力によってどのように移動するかについて、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎに基づいた、以下に示す基礎的実験を行い、その結果に基づいて、血液中から非血球細胞を分離可能な装置を開発し、本発明に至った。
【０００８】
［Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎの原理］
図１に示すように、流体中を流れる粒子には、流路中心から壁面方向へ移動させようとする慣性力ＦＩＬが作用している。ある程度高い粒子レイノルズ数の条件では、慣性力ＦＩＬが、流線に沿って粒子を流そうとする粘性力に勝り、流路中心付近を流れていた粒子は壁方向へ移動する。一方、壁面近傍を流れる粒子には、壁との相互作用により、壁面から流路中心方向への慣性力ＦＷＬが作用している。このため、流体中を流れる粒子は、この２つの慣性力ＦＩＬおよびＦＷＬの釣り合う安定な位置に、移動・集中するようになる。
【０００９】
なお、このときの粒子レイノルズ数は、次式で表される。
【数１】
2013152171.tif 000003
【００１０】
［微小流路内でのがん細胞の流動挙動実験］
Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎを利用して、血液中のがん細胞を分離できることを示すため、微小流路内でのがん細胞の流動挙動を調べる実験を行った。実験には、ソフトリソグラフィー技術により作製した、図２に示す流路５１を使用した。図２に示すように、流路５１は、中央に長さ０．５〜２．０ｃｍ、幅８０μｍの狭窄部５２を有し、その両端にそれぞれ幅４５０μｍの拡幅部５３ａ、５３ｂを有し、各拡幅部５３ａ、５３ｂの端部にそれぞれ入口（Ｉｎｌｅｔ）および出口（Ｏｕｔｌｅｔ）を有する形状を成している。なお、流路５１の高さは、２２０μｍである。
【００１１】
実験では、粒子試料をヒト乳がん由来培養細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、作動流体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とし、流路５１に流す試料として、ＰＢＳ中にがん細胞を分散させたものを使用した。また、がん細胞の濃度を、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとし、流量を、式（１）の粒子レイノルズ数Ｒｅｐが０．１５６、０．３１１、０．６２２となるよう、シリンジポンプにより制御した。
【００１２】
がん細胞の流動挙動を入口側の拡幅部５３ａおよび出口側の拡幅部５３ｂで観察し、流路幅方向に対するがん細胞の確率密度分布を求めた。図３に示すように、流路半幅（２２５μｍ）を５０等分し、分割した各部分の幅方向位置をｉ（ｉ＝１〜５０）とし、その確率密度Ｐｉを次式で計算した。
【００１３】
【数２】
2013152171.tif 000004
【００１４】
Ｒｅｐ＝０．６２２のときの、がん細胞の確率密度分布を、図４に示す。図４に示すように、入口（Ｉｎｌｅｔ）での確率密度（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｎｓｉｔｙ）は、流路幅方向にほぼ一様であるのに対し、出口（Ｏｕｔｌｅｔ）での確率密度は、流路中心からの距離（Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｅｒ）が約１１５μｍの位置に、鋭いピークを有していることが確認された。このことから、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎにより、流路内を流れるがん細胞が移動・集中したものと考えられる。
【００１５】
また、Ｒｅｐ＝０．１５６、０．３１１、０．６２２の各場合の、出口での確率密度分布を、図５に示す。図５に示すように、Ｒｅｐ＝０．１５６のときの確率密度（Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｎｓｉｔｙ）は、流路中心からの距離（Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｅｒ）が８０〜１２０μｍの範囲でやや盛り上がっているように見えるが、ピークは不明瞭であり、Ｒｅｐ＝０．３１１、０．６２２のときの確率密度は、明瞭なピークが認められることが確認された。また、そのピークは、粒子レイノルズ数が大きいほど、鋭くなっていることが確認された。このことから、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎによる流路内でのがん細胞の移動・集中には、大きい粒子レイノルズ数が必要であるといえる。図４および図５の結果から、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎを利用して、血液中のがん細胞を分離可能であることが示唆される。
【００１６】
［がん細胞の分離実験および赤血球容積比による影響］
Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎを利用して、血液中のがん細胞を分離する実験を行った。また、同時に、赤血球容積比（赤血球ヘマトクリット）が、がん細胞回収効率に及ぼす影響も調べた。実験には、ソフトリソグラフィー技術により作製した、図６に示す流路６１を使用した。図６に示すように、流路６１は、中央に長さ１．５ｃｍ、幅７０μｍの狭窄部６２を有し、その両端にそれぞれ幅４００μｍの拡幅部６３ａ、６３ｂを有し、一方の拡幅部６３ａの端部に入口（Ｉｎｌｅｔ）を有する形状を成している。また、流路６１は、他方の拡幅部６３ｂが３つに分岐しており、それぞれの端部に出口（Ｏｕｔｌｅｔ１〜３）を有している。なお、流路の高さは、２１０μｍである。
【００１７】
実験では、粒子試料をヒト乳がん由来培養細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および赤血球、作動流体を、５％デキストラン４０を含む乳酸リンゲル液（以下、「ＤＥＸ４０」と呼ぶ）とし、流路６１に流す試料として、ＤＥＸ４０に赤血球とがん細胞とを加えたものを使用した。また、赤血球容積比Ｈｃｔを０．１〜４０％、がん細胞と赤血球との細胞数比を０．２〜０．８％とし、流量を、式（１）の粒子レイノルズ数Ｒｅｐが０．６となるよう制御した。
【００１８】
試料を流路６１に流した後、各出口（Ｏｕｔｌｅｔ１〜３）からサンプルを回収した。回収した各サンプルに対し、ＤＲＡＱ５（１，５−ｂｉｓ｛［２−（ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）  ｅｔｈｙｌ］ａｍｉｎｏ｝−４，  ８−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ−９，１０−ｄｉｏｎｅ）を用いてがん細胞の核染色を行い、フローサイトメータを用いて、がん細胞および赤血球の割合を測定した。Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎによりがん細胞が移動していれば、Ｏｕｔｌｅｔ１およびＯｕｔｌｅｔ３の出口からがん細胞が回収されると考えられる。このため、各出口（Ｏｕｔｌｅｔｉ；ｉ＝１〜３）から回収されたサンプルに含まれるがん細胞数をｎｏｕｔｉとして、がん細胞の回収効率（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を、次式で計算した。
【００１９】
【数３】
2013152171.tif 000005
【００２０】
Ｈｃｔ＝０．１〜４０％のときの、がん細胞の回収効率を、図７に示す。図７に示すように、Ｈｃｔ＝０．１〜１０％のときは、回収効率が８０％を超えていることが確認された。このことから、Ｈｃｔが１０％までは、赤血球が作り出す、乱れた流れの中でも、がん細胞は慣性力のつり合いの位置まで移動できており、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎを利用して、血液中のがん細胞を分離可能であると考えられる。また、図７に示すように、Ｈｃｔ＝４０％のときは、回収効率が約５０％であることが確認された。このことから、Ｈｃｔ＝４０％では、多量の赤血球が含まれているため、がん細胞と赤血球との相互作用が増加し、慣性力による移動が十分に起きなかったものと考えられる。
【００２１】
本発明者等は、以上の実験の結果に基づいて検討を行い、本願発明に至った。
すなわち、本発明に係る血液中の粒子分離装置は、上流側に設けられた流入口と、下流側に設けられた回収口と、下流側に設けられた排出口とを有する流路を有し、前記流路は前記流入口から前記回収口に向かって、幅が狭い狭窄部と、前記狭窄部より幅が広い拡幅部とを交互に複数連通して形成されており、各拡幅部のうち少なくとも１つの拡幅部は下流に向かって幅方向に分岐する１または複数の分岐路を有し、全ての分岐路のうち少なくとも一つの分岐路が前記排出口に連通しており、血液試料を前記流入口から前記流路に流したとき、前記血液試料中に含まれる所定の粒子と他の粒子とが、前記回収口と前記排出口とに分離されて流れるよう構成されていることを特徴とする。
【００２２】
本発明に係る血液中の粒子分離装置は、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎを利用して、血液試料中に含まれる所定の粒子および他の粒子のいずれか一方が、分岐路に流れるよう構成することにより、所定の粒子および他の粒子を回収口と排出口とに分離して流すことができる。例えば、図６および図７に示す実験例では、狭窄部が１つしかないが、各出口のうち、Ｏｕｔｌｅｔ１およびＯｕｔｌｅｔ３を回収口とし、Ｏｕｔｌｅｔ２を排出口とすることにより、他の粒子としての赤血球を含む血液中から、所定の粒子としてがん細胞を分離することができる。本発明に係る血液中の粒子分離装置は、狭窄部と拡幅部とを交互に複数連通して形成されているため、複数段階で粒子を分離することができ、粒子の分離精度が高い。
【００２３】
本発明に係る血液中の粒子分離装置は、流路に血液試料を流すだけで、血液中からがん細胞などの非血球細胞を容易に分離することができる。このため、事前に核染色や磁気ビーズの付着などを行う必要がなく、それらを行う場合に比べて、分離に係る処理時間を短縮することができ、装置にかかるコストを低減することができる。所定の流速で、短時間に比較的多くの血液試料を流路に流すことができるため、分離効率が高い。また、分離後の細胞のバイアビリティを高く維持することができ、その細胞を再び培養することにより、どのような細胞であるかの追試験を行うこともできる。
【００２４】
本発明に係る血液中の粒子分離装置は、赤血球容積比が比較的高い場合であっても、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎの慣性力により非血球細胞が移動可能であれば、血液中から非血球細胞を分離することができる。図６および図７に示す実験例では、赤血球容積比Ｈｃｔが１０％までであれば、分離可能であった。また、赤血球容積比が高すぎて非血球細胞を分離できない場合には、血液試料を希釈することにより分離することができ、その際の希釈の倍率が小さい。
【００２５】
本発明に係る血液中の粒子分離装置で、各狭窄部は、血液試料の流れを伸長することにより血球細胞を大変形させ、流れの方向に対して垂直方向に血球細胞を移動させる効果を持つ。この効果は、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎと異なり、慣性力が作用しなくとも粒子に変形能があれば現れ、赤血球のように変形能の高い粒子では特に強く現れる。この効果によって、血球細胞は狭窄部流入前後で側壁から離れる方向に大きく移動し、側壁近傍には血球細胞の存在しない血漿層が形成される。非血球細胞がＩｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎによって側壁に寄せられるようにすることにより、形成される血漿層が十分に厚くなれば、非血球細胞は血漿層中を流れることになり、血球細胞との分離を容易にすることができる。なお、血液試料は、被験者から採取した血液そのままでもよく、採取した血液を希釈したものでもよく、採取した血液に対して何らかの処理を施したものであってもよい。
【００２６】
本発明に係る血液中の粒子分離装置で、狭窄部および拡幅部は、複数であれば、交互にいくつ連通されていてもよい。一つの拡幅部における分岐路の数は、いくつであってもよいが、特に１つまたは２つであることが好ましい。分岐路が１つである場合、流路を２つに分割することができる。また、拡幅部の幅方向の片側に寄って流れる所定の粒子を分離するのにも効果的である。分岐路が２つである場合、図６および図７の実験例に示すように、血液試料中の粒子の分離に効果的である。
【００２７】
本発明に係る血液中の粒子分離装置は、血液中に含まれる各粒子相互の粒子レイノルズ数の関係に応じて、どの粒子を分離するかにより、所定の粒子を回収口に流して他の粒子を排出口に流したり、所定の粒子を排出口に流して他の粒子を回収口に流したりしてもよい。また、各拡幅部での分岐の仕方を変更してもよい。これらの場合、所定の粒子を効率良く高精度で分離するために、最適な流路を構成することができる。
【００２８】
本発明に係る血液中の粒子分離装置で、各拡幅部のうち少なくとも１つの拡幅部は、上流側で連通する狭窄部に対して、前記狭窄部の幅方向の一方の側に拡がるよう形成され、幅方向が拡がった側から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していることが好ましい。この場合、粒子レイノルズ数を調整することにより、血液試料が上流側の狭窄部から拡幅部に流入したとき、血液試料に含まれるいずれかの粒子が、拡幅部の幅方向のうち、上流側の狭窄部が連通する側に寄って流れるようにすることができる。これにより、その粒子が分岐路に流入するのを抑制することができ、血液中の粒子を分離するのに効果的である。
【００２９】
本発明に係る血液中の粒子分離装置は、上流側および下流側に拡幅部が連通した狭窄部のうち少なくとも一つの狭窄部に対して、前記狭窄部の幅方向の一方の側に拡がるよう形成された拡幅部が上流側に連通し、前記狭窄部の幅方向の他方の側に拡がるよう形成された拡幅部が下流側に連通しており、前記狭窄部の下流側に連通した拡幅部は、幅方向が拡がった側から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していてもよい。この場合にも、粒子レイノルズ数を調整することにより、血液試料が上流側の狭窄部から拡幅部に流入したとき、血液試料に含まれるいずれかの粒子が、拡幅部の幅方向のうち、上流側の狭窄部が連通する側に寄って流れるようにすることができる。これにより、その粒子が分岐路に流入するのを抑制することができ、血液中の粒子を分離するのに効果的である。また、狭窄部に対して、上流側および下流側の拡幅部が、それぞれ幅方向の異なる側に拡がっているため、血液細胞の存在しない血漿層を効率良く形成することができ、分離効率を高めることができる。
【００３０】
本発明に係る血液中の粒子分離装置は、上流側および下流側に狭窄部が連通した拡幅部のうち少なくとも一つの拡幅部に対して、前記拡幅部の幅方向で対向する１対の側壁のうち、一方の側壁に沿って上流側の狭窄部が連通し、他方の側壁に沿って下流側の狭窄部が連通しており、前記拡幅部は、前記他方の側壁から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していてもよい。この場合にも、粒子レイノルズ数を調整することにより、血液試料が上流側の狭窄部から拡幅部に流入したとき、血液試料に含まれるいずれかの粒子が、拡幅部の一方の側壁に寄って流れるようにすることができる。これにより、その粒子が分岐路に流入するのを抑制することができ、血液中の粒子を分離するのに効果的である。また、拡幅部に対して、上流側および下流側の狭窄部が、それぞれ拡幅部の異なる側壁に沿って設けられているため、血液細胞の存在しない血漿層を効率良く形成することができ、分離効率を高めることができる。
【００３１】
本発明に係る血液中の粒子分離装置で、前記他の粒子は、大きさおよび機械特性のうち少なくともいずれか一方が前記所定の粒子とは異なっており、前記血液試料の赤血球容積比を１０％以下とし、前記所定の粒子の粒子レイノルズ数を０．２以上として前記血液試料を前記流路に流すことが好ましい。この場合、所定の粒子の分離効率をより高めることができる。粒子の大きさや比重、変形能などにより、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎの慣性力による粒子への作用が異なるものと考えられるため、その作用の違いを利用して所定の粒子を分離することができる。
【００３２】
本発明に係る血液中の粒子分離装置で、前記流路は、最も上流側の拡幅部が、下流に向かって幅方向の中央で２つに分岐するよう形成されており、その２つの分岐路に対して、それぞれ狭窄部と拡幅部とが交互に１または複数、前記回収口に向かって連通されており、上流側および下流側に拡幅部が連通した狭窄部に対して、その狭窄部の幅方向の一方の側に拡がるよう形成された拡幅部が上流側に連通し、その狭窄部の幅方向の他方の側に拡がるよう形成された拡幅部が下流側に連通しており、上流側および下流側に狭窄部が連通した拡幅部のうち、最も上流側の拡幅部以外の拡幅部に対して、その拡幅部の幅方向で対向する１対の側壁のうち、一方の側壁に沿って上流側の狭窄部が連通し、他方の側壁に沿って下流側の狭窄部が連通しており、最も上流側の拡幅部以外の拡幅部は、前記他方の側壁から分岐する分岐路を有し、前記分岐路が前記排出口に連通していてもよい。この場合、所定の粒子の分離効率をより高めることができる。
【００３３】
本発明に係る血液中の粒子分離装置で、血液試料中に含まれる粒子は、血球成分である赤血球、白血球および血小板や、外部から血管内に入り込んだ癌細胞、ウイルス、リポ蛋白質などの非血球細胞である。本発明に係る血液中の粒子分離装置では、特に、前記所定の粒子はがん細胞であり、前記他の粒子は血球細胞であることが好ましく、この場合、血液中からがん細胞を分離することができ、ＣＴＣ検査に利用することができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、赤血球容積比が比較的高い場合であっても、血液中からがん細胞などの非血球細胞を容易に分離することができる、血液中の粒子分離装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎの原理を示す（ａ）流路の縦断面図、（ｂ）流路の斜視図である。
【図２】微小流路内でのがん細胞の流動挙動実験で使用した流路を示す平面図である。
【図３】微小流路内でのがん細胞の流動挙動実験の解析方法を示す説明図である。
【図４】微小流路内でのがん細胞の流動挙動実験での、がん細胞の確率密度分布を示すグラフである。
【図５】微小流路内でのがん細胞の流動挙動実験での、粒子レイノルズ数を変えたときの流路出口での確率密度分布を示すグラフである。
【図６】微小流路による血液中のがん細胞の分離実験で使用した流路を示す平面図である。
【図７】微小流路による血液中のがん細胞の分離実験での、赤血球容積比Ｈｃｔに対するがん細胞の回収効率（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態の血液中の粒子分離装置を示す平面図である。
【図９】図８に示す血液中の粒子分離装置の、剛体粒子の流動挙動を示す各分岐位置での顕微鏡写真である。
【図１０】図８に示す血液中の粒子分離装置の、赤血球の流動挙動を示す各分岐位置での顕微鏡写真である。
【図１１】図８に示す血液中の粒子分離装置の、がん細胞および赤血球の流動挙動を示す最後の分岐位置での顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、図面に基づき、本発明の実施の形態について説明する。
図８乃至図１０は、本発明の実施の形態の血液中の粒子分離装置を示している。
図８に示すように、血液中の粒子分離装置１０は、血液試料を流すための流路１１を有している。流路１１は、ソフトリソグラフィー技術により、矩形状のシリコン基板上に作製されている。
【００３７】
流路１１は、上流側に流入口１２を有し、下流側に回収口１３と排出口１４とを有している。また、流路１１は、幅が狭い７つの狭窄部１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇと、狭窄部１５ａ〜１５ｇより幅が広い７つの拡幅部１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇとを有している。流路１１は、流入口１２から回収口１３に向かって、狭窄部１５ａ〜１５ｇと拡幅部１６ａ〜１６ｇとを交互に連通して形成されている。流路１１は、流入口１２に狭窄部１５ａが連通し、狭窄部１５ａの下流側に拡幅部１６ａが連通している。拡幅部１６ａは、下流に向かって幅方向の中央で２つに分岐しており、各分岐の下流側にそれぞれ狭窄部１５ｂおよび狭窄部１５ｃが連通している。
【００３８】
狭窄部１５ｂの下流側には、順番に拡幅部１６ｂ、狭窄部１５ｄ、拡幅部１６ｄ、狭窄部１５ｆ、拡幅部１６ｆが連通している。また、狭窄部１５ｃの下流側には、順番に拡幅部１６ｃ、狭窄部１５ｅ、拡幅部１６ｅ、狭窄部１５ｇ、拡幅部１６ｇが連通している。拡幅部１６ｆ、１６ｇの下流側には、回収口１３が連通している。
【００３９】
狭窄部１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇは、それぞれ、その幅方向の一方の側に拡がるよう形成された拡幅部１６ａ、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅが上流側に連通し、その幅方向の他方の側に拡がるよう形成された拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇが下流側に連通している。また、拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅは、それぞれ、その幅方向で対向する１対の側壁のうち、一方の側壁に沿って上流側の狭窄部１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅが連通し、他方の側壁に沿って下流側の狭窄部１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇが連通している。
【００４０】
拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇは、それぞれ上流側の狭窄部１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇに対して幅方向が拡がった側の側壁から分岐する分岐路１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ、１７ｅ、１７ｆ、１７ｇを有している。分岐路１７ｂ〜１７ｇは、排出口１４に連通している。なお、拡幅部１６ｆ、１６ｇは、回収口１３に連通した水路よりも、分岐路１７ｆ、１７ｇの方が幅が広くなるよう形成されている。
【００４１】
流路１１は、小さいシリコン基板面積内にコンパクトにまとめるため、拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅが、それぞれの分岐路１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ、１７ｅより下流側で、Ｕ字型に曲げられており、血液試料が蛇行して流れるよう形成されている。
【００４２】
なお、図８に示す具体的な一例では、流路１１の高さは、１６０μｍで、狭窄部１５ａ〜１５ｇの幅は６０μｍである。また、流路１１を載せたシリコン基板の大きさは、４５ｍｍ角である。
【００４３】
次に、作用について説明する。
血液中の粒子分離装置１０は、血液中に含まれるがん細胞などの非血球細胞を分離するのに好適に使用される。以下では、非血球細胞の一例として、がん細胞を分離する場合について説明する。血液中の粒子分離装置１０は、まず、被験者から採取した血液を希釈して血液試料を作製する。このとき、血液試料の赤血球容積比が１０％以下になるよう調製する。作製した血液試料を流入口１２から入れて、流路１１に流す。このとき、分離するがん細胞の粒子レイノルズ数が０．２以上になるよう、流量等を調整して流す。
【００４４】
流入口１２から入った血液試料は、狭窄部１５ａから拡幅部１６ｂに入り、拡幅部１６ｂで２つの流れに分岐して、それぞれ回収口１３に向かって流れる。血液試料が上流側の狭窄部１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇから、それぞれ拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇに流入したとき、血液試料に含まれるがん細胞は、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎの慣性力により、拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇの幅方向のうち、上流側の狭窄部１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇが連通する側に寄って流れる。これに対し、血液試料に含まれる赤血球などの他の粒子は、拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇの幅全体に広がって流れる。このため、分岐路１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ、１７ｅ、１７ｆ、１７ｇには、がん細胞はほとんど流入せず、赤血球などの他の粒子のみが流入して排出口１４に流れる。
【００４５】
こうして、流路１１に沿って回収口１３まで流れていくうちに、赤血球などの他の粒子が分岐路１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ、１７ｅ、１７ｆ、１７ｇに流れて徐々に減少し、がん細胞の割合が増加していく。回収口１３まで流れると、その血液試料中には、赤血球などの他の粒子がほとんど含まれず、ほぼがん細胞のみが含まれた状態となる。このように、血液中の粒子分離装置１０は、血液試料中に含まれるがん細胞と赤血球などの他の粒子とを、それぞれ回収口１３と排出口１４とに分離して流すことができる。このため、血液中の粒子分離装置１０は、転移性乳がん等のがん患者の予後や治療効果を診断するためのＣＴＣ検査に利用することができる。
【００４６】
血液中の粒子分離装置１０は、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎを利用することにより、流路１１に血液試料を流すだけで、血液中からがん細胞などの非血球細胞を容易に分離することができる。このため、事前に核染色や磁気ビーズの付着などを行う必要がなく、それらを行う場合に比べて、分離に係る処理時間を短縮することができ、装置にかかるコストを低減することができる。所定の流速で、短時間に比較的多くの血液試料を流路１１に流すことができるため、分離効率が高い。また、分離後の細胞のバイアビリティを高く維持することができ、その細胞を再び培養することにより、どのような細胞であるかの追試験を行うこともできる。
【００４７】
血液中の粒子分離装置１０は、狭窄部１５ａ〜１５ｇと拡幅部１６ａ〜１６ｇとを交互に複数連通して形成されているため、複数段階で粒子を分離することができ、粒子の分離精度が高い。また、狭窄部１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇに対して、それぞれ、上流側の拡幅部１６ａ、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅおよび下流側の拡幅部１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇが、それぞれ幅方向の異なる側に拡がっているため、血液細胞の存在しない血漿層を効率良く形成することができ、分離効率を高めることができる。
【００４８】
血液中の粒子分離装置１０は、血液試料の赤血球容積比が１０％以下になるよう調製されているため、がん細胞などの非血球細胞を効果的に分離することができる。このように、赤血球容積比が１０％程度と比較的高い場合であっても、Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎの慣性力により非血球細胞が移動可能であり、血液中から非血球細胞を分離することができる。なお、赤血球容積比が高すぎて非血球細胞を分離できない場合には、血液試料を希釈することにより分離することができる。
【実施例１】
【００４９】
血液中の粒子分離装置１０の流路１１に、剛体粒子を含む流体試料を流したときの剛体粒子の回収効率を調べる実験を行った。実験では、粒子試料を径１５μｍの剛体粒子、作動流体をＤＥＸ４０とし、流路１１に流す流体試料として、ＤＥＸ４０に剛体粒子を分散させたものを使用した。また、剛体粒子の粒子レイノルズ数を考慮して、流量を６００μｌ／ｍｉｎとした。
【００５０】
拡幅部１６ａの分岐位置、分岐路１７ｃ、１７ｅ、１７ｇの位置での剛体粒子の流動挙動を、図９に示す。図９に示すように、分岐路１７ｃ、１７ｅ、１７ｇには、剛体粒子（図９中の黒い点）はほとんど流入していないことが確認された。また、回収口１３での剛体粒子の回収効率は、約９０％であった。この結果から、血液中の粒子分離装置１０によれば、所定の粒子を効率良く分離することができるといえる。
【実施例２】
【００５１】
血液中の粒子分離装置１０の流路１１に、赤血球を含む流体試料を流したときの赤血球の分離効率を調べる実験を行った。実験では、粒子試料を赤血球、作動流体をＤＥＸ４０とし、流路１１に流す流体試料として、ＤＥＸ４０に赤血球を分散させたものを使用した。また、赤血球容積比Ｈｃｔを１％とし、流量を６００μｌ／ｍｉｎとした。
【００５２】
拡幅部１６ａの分岐位置、分岐路１７ｃ、１７ｅ、１７ｇの位置での赤血球の流動挙動を、図１０に示す。図１０に示すように、分岐路１７ｃ、１７ｅ、１７ｇには、赤血球（図１０中の黒い点）が大量に流入しており、特に分岐路１７ｇには、ほとんどの赤血球が流入していることが確認された。排出口１４での赤血球の濃度は、７．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、回収口１３での赤血球の濃度は、１．８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、回収口１３と排出口１４での赤血球濃度比は、約１／４００であった。また、拡幅部１６ａの分岐位置から、分岐路１７ｃ、１７ｅ、１７ｇへと流れるに従い、赤血球の存在しない血漿層が徐々に厚く形成されていくことが確認された。この結果から、血液中の粒子分離装置１０によれば、赤血球が回収口１３に流入するのを抑制することができるといえる。このため、実施例１を考慮すると、血液試料からがん細胞などの非血球細胞を容易に分離することができるといえる。
【実施例３】
【００５３】
血液中の粒子分離装置１０の流路１１に、がん細胞および赤血球を含む流体試料を流したときの、がん細胞の分離効率を調べる実験を行った。実験では、粒子試料をヒト乳がん由来培養細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）と赤血球、作動流体をＤＥＸ４０とし、流路１１に流す流体試料として、ＤＥＸ４０にがん細胞と赤血球とを分散させたものを使用した。また、赤血球容積比Ｈｃｔを０．１％とし、流量を６００μｌ／ｍｉｎとした。
【００５４】
分岐路１７ｇの位置でのがん細胞および赤血球の流動挙動を、図１１に示す。実験の結果、図示していないが、分岐路１７ｃ、１７ｅには、赤血球が大量に流入していることが確認された。また、図１１に示すように、拡幅部１６ｇでは、がん細胞（図１１中の黒い大きい点）が回収口１３の側に流れ、ほとんどの赤血球（図１１中の黒い小さい点）が分岐路１７ｇに流入していることが確認された。排出口１４でのがん細胞の濃度は、赤血球とがん細胞とを合わせて５００００粒子あたり、がん細胞が９個であった。一方、回収口１３でのがん細胞の濃度は、赤血球とがん細胞とを合わせて５００００粒子あたり、がん細胞が９７９個であり、回収口１３と排出口１４でのがん細胞の濃縮率は約１００倍であった。また、流入口１２から入れたがん細胞のうち、約７５％が回収口１３から回収された。この結果から、血液中の粒子分離装置１０により、血液試料からがん細胞を効率的に分離できることが確認された。
【符号の説明】
【００５５】
１０  血液中の粒子分離装置
１１  流路
１２  流入口
１３  回収口
１４  排出口
１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ、１５ｆ、１５ｇ  狭窄部
１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ、１６ｆ、１６ｇ  拡幅部
１７ｂ、１７ｃ、１７ｄ、１７ｅ、１７ｆ、１７ｇ  分岐路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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