(57)【要約】【課題】ホモジニアスのアッセイおよびヘテロジニアスのセンシング（金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴を利用するアナライトの検出方法）を組み合わせることの利点を活かしつつ、磁性粒子および磁力を用いた測定方法に見られるような課題を解決した、より高感度なアナライトの検出方法を提供する。【解決手段】少なくとも、荷電層とは逆に荷電した荷電微粒子およびそれに結合したリガンドにより構成されているリガンド担持荷電微粒子と、アナライトとを媒質中で反応させ、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させる工程、前記リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を含む媒質を前記センサーチップの測定領域の荷電層に接触させる工程、および前記測定領域に測定光を照射し、前記金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴に基づくシグナルを観測する工程を含むことを特徴とする、アナライトの検出方法。【選択図】図１
2013029369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成された正または負に荷電した荷電層とを備える、局在場光センサーチップを使用するアナライトの検出方法であって、少なくとも、
前記荷電層とは逆に荷電した荷電微粒子およびそれに結合したリガンドにより構成されているリガンド担持荷電微粒子と、アナライトとを媒質中で反応させ、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させる工程、
前記リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を含む媒質を前記局在場光センサーチップの測定領域の荷電層に接触させる工程、および
前記測定領域に測定光を照射し、前記金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴に基づくシグナルを観測する工程を含むことを特徴とする、アナライトの検出方法。
【請求項２】
前記荷電層がイオン性ポリマーからなる層である、請求項１に記載のアナライトの検出方法。
【請求項３】
前記イオン性ポリマーがカチオン性官能基を有するポリマーである、請求項２に記載のアナライトの検出方法。
【請求項４】
前記荷電層の表面電荷密度が５０〜２００ｍＣ／ｍ2の範囲にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
【請求項５】
前記荷電層の表面の算術平均粗さが１〜５０ｎｍの範囲にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
【請求項６】
前記アナライトの検出方法が、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance：表面プラズモン共鳴法）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
【請求項７】
前記荷電微粒子が、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、イオン性ポリマー、またはリガンドを固定可能な金属からなるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＰＦＳおよびＳＰＲに代表される、局在場光（エバネッセント波）を利用するアナライトの検出方法用のセンサーチップ（局在場光センサーチップ）、および当該センサーチップを使用するアナライトの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子や有機高分子などのアナライト（被検出物質）を、センサーチップ（典型的にはチップ状に作製されている測定部材）の表面で、当該アナライトとの間に特異的な分子間相互作用が働くリガンド（捕捉物質）を用いて捕捉し、それにより発せられる特有のシグナルを観測することにより、アナライトを直接的かつ定量的に検出する方法の研究開発が進められている。たとえば、あるタンパク質（抗原）をアナライトとする場合は、それと特異的に結合しうるタンパク質（抗体）がリガンドとして表面に固定化されているセンサーチップが使用される。
【０００３】
ノンラベルで、すなわち放射性物質や蛍光体などの標識を用いずにアナライトを検出する方法としては、たとえば、つぎのようなＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance：表面プラズモン共鳴法）が知られている。誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射が起きる所定の入射角度で測定光を照射すると、金属薄膜での表面プラズモン共鳴により反射光の強度が減衰し（全反射減衰：ＡＴＲ）、ある入射角度で反射光の強度は極小となる。ここで、アナライトがセンサー（金属薄膜）上に捕捉されると誘電率が変化し、それにより反射光の強度が極小となる入射角度が変化する。ＳＰＲでは、当該入射角度をシグナルとして測定することにより、アナライトを検出することができる。
【０００４】
一方、蛍光体を用いてアナライトを検出する方法としては、たとえば、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で測定光（励起光）を照射し、金属薄膜を透過したエバネッセント波（非伝播光、局在場光）が金属薄膜の表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライトを標識している蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定することによりアナライトを検出する、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）も知られている。
【０００５】
このようなアナライトの検出方法は、一般的に、アナライトを含有する媒質（液相）と、リガンドが固定化された基板状のセンサーチップ（固相）とを接触させる、ヘテロジニアスなセンシングである。このような測定方法は、高感度ではあるが、基板状の固相と液相との界面のみでしかリガンドとアナライトとの反応が起きないため、アナライトの拡散が反応律速となり反応効率の制約が大きい。
【０００６】
一方、液相中のアナライトと、固相ではあっても液相中に分散している微粒子に担持させたリガンドとを接触させるような、ホモジニアスのアッセイは、前記ヘテロジニアスでの接触に比べて反応効率がよく、反応効率をさらに高めるための加速手段（たとえば撹拌、ボルテックス、振盪、超音波等）があるなどの利点を有する。
【０００７】
上記のようなヘテロジニアスな反応とホモジニアスな反応とを組み合わせた測定方法としては、磁性粒子および磁力を利用するものが知られている。
たとえば、特許文献１には、下記（ａ）〜（ｃ）の工程により液体媒体中の抗原または抗体を定量的に測定する方法において、工程（ａ）における反応に伴う透過光もしくは散乱光の強度を測定することを特徴とする抗原又は抗体の測定方法が記載されている：
（ａ）測定しようとする抗原または抗体、該抗原または該抗体に対する抗体または抗原を担持させた不溶性磁性粒子を含む第１試薬、及び、該抗原または該抗体に対する抗体または抗原を担持させた不溶性標識粒子を含む第２試薬を液体媒体中で反応させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の反応混合物に磁場を付与することにより未反応の不溶性磁性粒子及び不溶性磁性粒子を含む凝集粒子を反応混合物から分離し、次いで該液体媒体及び未反応の不溶性蛍光標識粒子を除去する工程；
（ｃ）残った該不溶性磁性粒子と反応した不溶性標識粒子の量を定量することにより抗原または抗体を定量的に測定する工程。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１４６９７５号公報（特許第３６９５１７８号公報）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した特許文献１に記載されたような磁性粒子を用いた測定方法では、磁性粒子のサイズが小さい方が、単位体積中に含まれる磁性粒子の表面積の総和が大きくなる、すなわちそれらの磁性粒子の表面に担持されているリガンドの量が大きく、したがってアナライトとの反応効率が高いと考えられる。しかしながら、磁性粒子のサイズが一定以下（たとえば１μｍ以下程度）だと、うまく集磁できないという問題が起きる。
【００１０】
本発明は、ホモジニアスのアッセイおよびヘテロジニアスのセンシング（金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴を利用するアナライトの検出方法）を組み合わせることの利点を活かしつつ、磁性粒子および磁力を用いた測定方法に見られるような課題を解決した、より高感度なアナライトの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、まず、局在場光センサーチップ（ＳＰＦＳ用等）の表面に、イオン性ポリマーを塗布することなどによって、正または負の電荷を有するイオン性官能基を高密度で導入することができることを見いだした。その上で、上記イオン性官能基とは逆の電荷を有する荷電微粒子にリガンドを担持させたリガンド担持荷電微粒子と、アナライトとを、液相中で反応させて（ホモジニアスな反応系）リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させたのち、この複合体を含む水溶液を上記のイオン性官能基で修飾されたセンサーチップに接触させ、静電相互作用により前記イオン性官能基と結合させることによって、前記複合体を均質かつ高密度でセンサーチップ表面で捕捉することができること、したがって従来よりも高感度かつ高精度でシグナルを観測することができることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は下記の事項を包含する。
［１］  少なくとも誘電体部材と、前記誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜上に形成された正または負に荷電した荷電層とを備える、局在場光センサーチップを使用するアナライトの検出方法であって、少なくとも、
前記荷電層とは逆に荷電した荷電微粒子およびそれに結合したリガンドにより構成されているリガンド担持荷電微粒子と、アナライトとを媒質中で反応させ、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させる工程、
前記リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を含む媒質を前記局在場光センサーチップの測定領域の荷電層に接触させる工程、および
前記測定領域に測定光を照射し、前記金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴に基づくシグナルを観測する工程を含むことを特徴とする、アナライトの検出方法。
【００１３】
［２］  前記荷電層がイオン性ポリマーからなる層である、［１］に記載のアナライトの検出方法。
［３］  前記イオン性ポリマーがカチオン性官能基を有するポリマーである、［２］に記載のアナライトの検出方法。
【００１４】
［４］  前記荷電層の表面電荷密度が５０〜２００ｍＣ／ｍ2の範囲にある、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
［５］  前記荷電層の表面の算術平均粗さが１〜５０ｎｍの範囲にある、請求項［１］〜［４］のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
【００１５】
［６］  前記アナライトの検出方法が、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance：表面プラズモン共鳴法）である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
【００１６】
［７］  前記荷電微粒子が、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、イオン性ポリマー、またはリガンドを固定可能な金属からなるものである、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のアナライトの検出方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、センサーチップ表面に設けられたイオン性官能基が有する電荷により、逆の電荷を有するリガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を均質かつ高密度で（最密充填状態で）捕捉することができる。このような本発明によるアナライトの検出方法を使用することにより、従来よりも高感度かつ高精度でアナライトの検出や定量を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の実施形態の一例の概略図である。
【図２】図２は、実施例１と同様の方法で作製したサンプルの、荷電層形成工程後のセンサーチップ表面の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）像である。
【図３】図３は、実施例１において、荷電層形成工程終了時点（グラフ中「カチオン」）、複合体接触工程終了時点（グラフ中「カチオン＋Ａｂ＋Ａｇ」）、また比較のため行ったリガンド担持荷電（アニオン）微粒子のみを荷電層に接触させた工程の終了時点（グラフ中「カチオン＋Ａｂ」）それぞれ測定した、ＳＰＲ法におけるシグナルに相当する反射強度を表すグラフである。
【図４】図４は、実施例１において、荷電層形成工程終了時点（グラフ中「カチオン」）、複合体接触工程終了時点（グラフ中「カチオン＋Ａｂ＋Ａｇ」）、また比較のため行ったリガンド担持荷電（アニオン）微粒子のみを荷電層に接触させた工程の終了時点（グラフ中「カチオン＋Ａｂ」）それぞれで測定した、ＰＦＳ法におけるシグナルに相当する蛍光強度を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において「局在場光センサーチップ」を使用するアナライトの検出方法とは、局在場光（エバネッセント波）が発生する測定部材（センサーチップ）を用いて、その表面に固定化された所定の分子（リガンド）と、検出対象となる分子（アナライト）との間の特異的結合に基づくシグナルを観測することによりアナライトを検出するないし定量的に測定する方法の総称である。そのようなアナライトの検出方法としては、代表的には、ＳＰＦＳおよびＳＰＲが挙げられ、エバネッセント（全反射）およびエバネッセント蛍光（全反射蛍光）による測定法も包含される。なお、本明細書において「局在場光センサーチップ」を単に「センサーチップ」と称することもある。
【００２０】
これらのアナライト測定方法はいずれも公知のものであるが、その概略は次の通りである。
ＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance：表面プラズモン共鳴法）は次のような方法である。誘電体部材上に形成された金属薄膜に測定光を角度スキャンしながら照射すると、金属薄膜での表面プラズモン共鳴により反射光の強度が減衰し（全反射減衰：ＡＴＲ）、ある入射角度で反射光の強度は極小となる。ここで、アナライトがセンサー（金属薄膜）上に捕捉されると誘電率が変化し、それにより反射光の強度が極小となる入射角度が変化する。ＳＰＲでは、当該入射角度をシグナルとして測定することにより、アナライトを検出することができる。
【００２１】
ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）は、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射し、金属薄膜を透過したエバネッセント波（局在場光）が金属薄膜の表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライトを標識している蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。
【００２２】
エバネッセント（全反射）は、可視光から赤外領域に透明な高屈折率媒質（プリズム）に試料を密着させ、全反射減衰（ＡＴＲ）測定によりＳＰＲ同様に極小値を求め、アナライト捕捉による変化量で計測できる。ＳＰＲと違い、金属を用いないため電場増強度は大きくないが、センサー性能の安定性が高いという特徴がある。
【００２３】
エバネッセント蛍光（全反射蛍光）は、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射し、金属薄膜を透過したエバネッセント波（局在場光）が数倍〜十倍程度に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライトを標識している蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。
【００２４】
以下、ＳＰＦＳおよびＳＰＲの実施形態を中心として、本発明についてさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明におけるアナライトの検出方法はＳＰＦＳおよびＳＰＲに限定されるものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明を、金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴を利用するその他のアナライトの検出方法において展開することが可能である。
【００２５】
なお、センサーチップに関する以下の説明において、便宜上、最終的にリガンドが固定化される側を「上」または「表」、その反対側を「下」または「裏」と称する。また、ある物質の「上に形成する」は、その物質の直上に（直接接して）形成する場合の他、発明の実施に支障がない範囲において、他の物質を挟んで、その物質の上に（直接は接さずに）形成する場合も含まれる。
【００２６】
−イオン性官能基修飾センサーチップ−
本発明では、表面に正または負に荷電した層（荷電層）が形成されている、つまり表面がイオン性官能基によって修飾されている、イオン性官能基修飾センサーチップを使用する。本発明では、このイオン性官能基修飾センサーチップの表面に荷電微粒子−リガンド−アナライト複合体（を含む媒質）を接触させて、アナライトを検出するための測定に使用する。
【００２７】
（イオン性官能基）
荷電層が有するイオン性官能基には、カチオン性官能基およびアニオン性官能基が包含される。センサーチップが、アニオン性の荷電微粒子と組み合わせて使用される場合は、上記イオン性官能基としてカチオン性官能基が選択され、逆にカチオン性の荷電微粒子と組み合わせて使用される場合は、上記イオン性官能基としてアニオン性官能基が選択される。カチオン性官能基およびアニオン性官能基は、それぞれ、いずれか１種単独であっても、２種以上が混合していてもよい。なお、荷電層中には、通常はカチオン性官能基またはアニオン性官能基のいずれか一方のみを存在させるようにするが、荷電微粒子を捕捉する上で支障がない荷電状態を生み出すことができる場合は、これら両方が存在していてもよい。また、荷電層（イオン性官能基）の荷電状態およびそれと組み合わせて使用される荷電微粒子の荷電状態は、それらが置かれている周囲のｐＨによっても変化する場合があるので、使用時にはそのｐＨを適切な範囲に調節しておくべきである。
【００２８】
・カチオン性官能基
カチオン性官能基としては、たとえば、グアニジウムイオン、−ＮＨ3+、−ＮＨ2（ＣＨ3）+、−ＮＨ（ＣＨ3）2+、−Ｎ（ＣＨ3）3+などの第４級アンモニウムカチオンが挙げられる。このようなカチオン性官能基は、分子内塩を形成しているものが好ましいが、塩素、臭素などのハロゲン陰イオン、硫酸陰イオン、スルホン酸陰イオン、燐酸陰イオン、カルボン酸陰イオンなどと結合して対塩を形成していてもよい。カチオン性官能基は、好ましくは表面電荷密度の観点から４級アンモニウムカチオンである。前記カチオン性官能基を含有させるポリマーとしては特に制限はないが、センサー性能の観点から、成膜性が良く、水溶性でないものが好ましい。
【００２９】
・アニオン性官能基
アニオン性官能基としては、たとえば、−ＣＯ2-（カルボン酸基）、−ＳＯ3-（スルホン酸基）、−ＯＳＯ3-（硫酸基）、−ＯＰＯ4-（リン酸基）、−Ｂ（ＯＨ）2（ボロン酸）などが挙げられる。このようなアニオン性官能基は、分子内塩を形成しているものが好ましいが、金属陽イオンまたは有機陽イオンと結合していてもよい。その金属陽イオンとしては、たとえば、Ｎａ+（ナトリウム陽イオン）、Ｋ+（カリウム陽イオン）、Ｃａ+（カルシウム陽イオン）などのアルカリ金属が挙げられ、有機陽イオンとしては、Ｍｅ3Ｎ+Ｈ（トリメチルアンモニウム陽イオン）、Ｅｔ3Ｎ+Ｈ（トリエチルアンモニウム陽イオン）、Ｍｅ2Ｎ+Ｈ2（ジメチルアンモニウム陽イオン）などが挙げられる。
【００３０】
なお、上記のイオン性官能基（Ａ）は、主鎖となるポリマーに直接結合していてもよいし、他の結合基Ｒを介してポリマー主鎖に結合していてもよい（Ａ−Ｒ−ポリマー主鎖）。結合基−Ｒ−としては、たとえば、炭素原子数１〜６のアルキレン基、フェニレン基、エチレンオキシ基（（Ｃ2Ｈ4Ｏ）n）などが挙げられる。
【００３１】
（荷電層の形成方法）
最表面に荷電層を備えたセンサーチップは、無修飾のセンサーチップの表面に、以下に述べるような方法により荷電層を形成することで、作製することができる。
【００３２】
「無修飾のセンサーチップ」は、アナライトの検出方法に応じたものを用意すればよい。ＳＰＦＳ用およびＳＰＲ用の無修飾のセンサーチップ（以下「センサー基板」と称することもある）は、一般的には、少なくとも、誘電体部材（たとえばＳｉＯ2）からなる基板と、その表層側に形成された金属薄膜（たとえばＡｕ）とを備える。全反射用および全反射蛍光用のセンサー基材は、一般的には、誘電体部材（たとえば高屈折率ガラスまたは高屈折率樹脂チップ）により構成される。
【００３３】
荷電層の形成方法は特に限定されるものではないが、たとえば、表面電荷の強さ、耐久性の観点から、上述したようなイオン性官能基を側鎖に有するポリマー（イオン性ポリマー）からなる被膜をセンサーチップ表面に形成する方法が好適である。
【００３４】
・イオン性ポリマー
イオン性ポリマーは、あらかじめイオン性官能基を有するモノマーを重合して得られたものでもよいし、イオン性官能基を誘導または導入しうる他の官能基を有するモノマーを重合した後、当該官能基にイオン性官能基を誘導または導入することによって得られたものでもよい。
【００３５】
イオン性ポリマーの一つとして、炭化水素骨格を主鎖とするものが挙げられる。そのようなイオン性ポリマーを合成するために用いられるモノマーとしては、たとえば、ビニル基、アリル基、ジエンなどを有するモノマーが挙げられる。より具体的には、たとえば、（メタ）アクリルアミドなどのアミド類；（メタ）アクリル酸、または蟻酸ビニル、酢酸ビニル、酢酸アリル、アセト酢酸アリル、ビニルマレイン酸などのカルボン酸またはそのエステル類；スチレンスルホン酸、またはスチレンスルホン酸エステルなどのスルホン酸またはそのエステル類；この他、硫酸エステル、燐酸エステル、ホスホン酸エステルなども挙げられる。
【００３６】
また、イオン性官能基が導入されたウレタン系樹脂、たとえばカチオン性水性ポリウレタン樹脂（たとえば「ハイドラン（登録商標）ＣＰ」シリーズ、ＤＩＣ株式会社）などとして公知の物質も、本発明で用いることのできるイオン性ポリマーとして挙げられる。
【００３７】
さらに、ポリアミノ酸由来の骨格を主鎖とするイオン性ポリマーも挙げられる。そのようなイオン性ポリマーとしては、たとえば、側鎖にカルボキシル基を有するポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸、ならびに側鎖にアミノ基を有するポリリジンが挙げられる。
【００３８】
上記の各種のイオン性ポリマーは、公知の方法によって合成することができ、市販品として入手することもできる。イオン性ポリマーの性状、たとえば一分子あたりのイオン性官能基の数や数平均分子量などは、目的とするセンサーチップ表面の荷電状態に応じて適宜調整することが可能である。
【００３９】
イオン性ポリマーは、ディップコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング等、公知の手法を用いてセンサーチップの表面に塗布することができる。このようなコーティング方法を用いる場合は、イオン性ポリマーの種類に応じて、適切な溶媒に、適切な濃度（たとえば０．１〜１重量％）となるよう溶解させて塗布液を調製し、これを塗布するようにすればよい。一般的には、塗布液中のイオン性ポリマーの濃度は０．５〜１０重量％、塗布膜厚として５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲で調整することにより、イオン性ポリマーからなる荷電層を形成することができる。
【００４０】
また、必要であれば、センサーチップ（たとえば金薄膜が形成されているＳＰＲまたはＳＰＦＳ用のセンサーチップ）の表面にＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）を予め形成しておき、その表層側にイオン性ポリマーを塗布ないし接触させて、両者の官能基間に結合を生じさせ、固定化する態様であってもよい。また、開始剤を基板に直接、あるいは前記ＳＡＭやシランカップリング剤で固定化し、逐次反応で分子長を制御可能なラジカルリビング重合法を用いてin situでポリマー膜を形成したものであってもよい。
【００４１】
・表面電荷密度
荷電層を備えたセンサーチップは、所望の密度で（好ましくは最密充填で）アナライトと複合体を形成していてもよいリガンド担持荷電微粒子を配置させるために、表面電荷密度が少なくとも一定の水準を満たす程度に高いことが好ましい。センサーチップと荷電微粒子とを接触させる工程における条件下、より具体的には当該工程に用いられるアナライトと複合体を形成したリガンド担持荷電微粒子を含む媒質（水溶液）のｐＨ条件下において、センサーチップ（荷電層）の表面電荷密度は、たとえば１０〜５００ｍＣ／ｍ2、好ましくは５０〜２００ｍＣ／ｍ2で調整することができる。このような表面荷電密度は、ゼータポテンシャル測定装置（例えば、ゼータ電位測定システム「ＥＬＳＺ−２」（大塚電子株式会社製）で平板試料用セルを用いて測定できる。）など、公知の手段を用いて測定することができる。また、アナライトと複合体を形成したリガンド担持荷電微粒子の投影断面積あたりのイオン性官能基の数が少なくとも１となるような表面電荷密度であることが好ましい。イオン性薄膜を形成するために用いるイオン性ポリマーの一分子あたりに導入するイオン性官能基の数や、センサーチップ表面の単位体積あたりに塗布するイオン性ポリマーの量などの条件を調節することにより、表面電荷密度が所望の範囲に収まるようにすることができる。
【００４２】
・表面粗さ
測定精度を高めるために、センサーチップが備える荷電層の表面は平滑であることが理想的である。このような平滑さは、代表的には、表面粗さを指標とすることができる。たとえば、イオン性官能基修飾センサーチップ表面の算術平均粗さ（Ｒｚ）は、１〜５０ｎｍであることが好ましく、１〜１０ｎｍであることがより好ましい。このような表面粗さは、表面粗さ測定装置や原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）など、公知の手段を用いて測定することができる。
【００４３】
（センサー基材の構成）
ＳＰＦＳ用およびＳＰＲ用の無修飾のセンサーチップ（センサー基材）は、少なくとも、誘電体部材（プリズムまたは透明平面基板）と、当該誘電体部材上に形成された金属薄膜、必要に応じてさらにスペーサー層とにより構成されるものであり、本発明おいても公知の一般的なものを用いることができる。
【００４４】
・誘電体部材
センサー基材を構成する誘電体部材は、プリズム形状であっても、平面基板状であってもよい。前者の場合、金属薄膜等は当該誘電体部材の水平面上に形成され、得られるセンサーチップは測定光を照射するプリズムと一体化したものとなる。後者の場合、金属薄膜等は当該誘電体部材の一方の側の平面に形成され、得られるセンサーチップは、測定光を照射するプリズムの水平面上に密着させて積載して用いる、プリズムとは分離したものとなる。
【００４５】
誘電体部材の材料としては、ガラスや、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック、好ましくはｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が１．４０〜２．２０の範囲にある物質を用いることができる。誘電体部材を透明平面基板として作製する場合、その厚さは、たとえば０．０１〜１０ｍｍの範囲で調整することができる。金属薄膜を形成する前に、誘電体部材の表面は酸またはプラズマによる洗浄処理がなされていることが好ましい。
【００４６】
・金属薄膜
センサー基材を構成する金属薄膜は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強効果が大きい、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなる（合金の形態であってもよい）ことが好ましく、特に金からなることが好ましい。
【００４７】
誘電体部材上に金属薄膜を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および金属薄膜を形成することが好ましい。
【００４８】
ガラス製の誘電体部材を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００４９】
表面プラズモンが発生し易いよう、金、銀、アルミニウム、銅、白金、またはそれらの合金からなる金属薄膜の厚さはそれぞれ５〜５００ｎｍが好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜２０ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍがより好ましい。
【００５０】
（スペーサー層）
センサー基材には、必要に応じて、金属薄膜による蛍光色素の金属消光を防止するため、金属薄膜の上に、誘電体からなるスペーサー層を形成してもよい。この場合、荷電層は当該スペーサー層上に形成される、つまりスペーサー層を挟んで金属薄膜上に形成されることになる。
【００５１】
誘電体としては、光学的に透明な各種無機物や、天然または合成ポリマーを用いることができる。なかでも、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を用いることが好ましい。
【００５２】
スペーサー層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強効果の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。
【００５３】
このようなスペーサー層は、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応を用いた方法、またはスピンコータによる塗布など、公知の手段によって形成することができる。
【００５４】
−リガンド担持荷電微粒子−
本発明では、液相中でアナライトと反応させて複合体を形成させるために、荷電微粒子およびそれに結合したリガンドによって構成される、リガンド担持荷電微粒子を使用する。
【００５５】
・荷電微粒子
荷電微粒子としては、正または負に荷電した、通常、１〜１００ｎｍ程度のサイズを有する微粒子を用いることが、静電相互作用を利用した強固な固定化のために重要である。なお、このような荷電微粒子のサイズは、動的光散乱法により測定される体積平均粒子径、または商品の粒径等の公称値（カタログ値）によって表すことができる。
【００５６】
荷電微粒子の分散形態としては、結合力が強い自己乳化型の方が好ましいが、自己乳化型でなくても利用可能である。
本発明において用いることのできる荷電微粒子としては種々のものが知られており、後述するような適切な手段によりリガンドを担持することができるものであれば特に限定されるものではないが、代表的には、ＳｉＯ2およびＴｉＯ2、イオン性ポリマー、ならびにリガンドを固定可能な金属からなるものを挙げることができる。
【００５７】
ＳｉＯ2またはＴｉＯ2からなる荷電微粒子は、いわゆるコロイダルシリカ（たとえば「スノーテック（登録商標）」シリーズ、日産化学工業株式会社）や超微粒子酸化チタン（たとえば「ＳＴＴ−６５Ｃ−Ｓ」、チタン工業株式会社）などとして知られている物質である。これらの荷電微粒子は、酸性では正電荷を、アルカリ性では負電荷を帯びる。ＴｉＯ2は、アナターゼ型であっても、ルチル型であってもよい。
【００５８】
イオン性ポリマーからなる荷電微粒子としては、高分子コロイド、高分子ラテックスなどとして知られている物質を用いることができる。このような荷電微粒子は、イオン性ポリマーが有するイオン性官能基に応じて、水中で正または負に荷電する。このイオン性官能基としては、荷電層に関して前述したようなカチオン性官能基およびアニオン性官能基と同様のものが挙げられる。また、粒子状に凝集するものであれば、荷電層に関して前述したようなイオン性ポリマーと同様のものを荷電微粒子として用いることができる。
【００５９】
金属としては、金、銀、銅、アルミニウム、鉄、等のナノ粒子、あるいは前記金属の酸化物を有する複合物等であってもよい。なお、これらの金属からなる微粒子（典型的にはコロイド粒子）は、通常正または負に荷電している。たとえば、金、銀等のコロイド粒子は通常負に荷電している。このような金属は、荷電微粒子の表面にリガンドを固定化するために、公知の手法（たとえば後述するように、所定の化合物で処理して金属微粒子の表面に所定の修飾基を導入する手法）を適用することができるものであればよい。また、あらかじめリガンドを固定化した金属微粒子（例えば抗体固定金ナノ粒子）は製品として入手することができる。
【００６０】
・リガンド
リガンドは、アナライトと特異的に結合する物質であれば、特に限定されるものではない。たとえば、アナライトがタンパク質である場合は、その一部を認識して特異的に結合する抗体（Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ)2等を含む）がリガンドとなり、アナライトが核酸である場合はそれと相補的な塩基配列を有する核酸がリガンドとなり、アナライトが糖鎖を有する分子である場合は、糖鎖を認識して結合するタンパク質であるレクチン等がリガンドとなる。また、アナライトをあらかじめ特定の物質（たとえばビオチン）で修飾しておいた場合には、当該特定の物質と特異的に結合する物質（たとえばアビジン）をリガンドとして用いればよい。
【００６１】
リガンドがタンパク質（抗体等）である場合、それを構成するアミノ酸の末端または側鎖に、チオール基，アミノ基，カルボキシル基，ヒドロキシル基などの修飾基が存在するので、それらの修飾基を荷電微粒子との結合に利用することができる。一方、核酸は、それを構成する塩基中にアミノ基、ヒドロキシル基は存在するが、通常はカルボキシル基、チオール基は存在しないので、修飾基との関係において必要であれば、公知の手法を用いてそれらの反応基を核酸に導入しておいてもよい。
【００６２】
・作製方法
リガンド担持荷電微粒子は、通常は液相中で、荷電微粒子とリガンドとを結合させる所定の反応を行うことにより作製することができる。荷電微粒子とリガンドとの結合の態様は特に限定されるものではなく、公知の手法を利用することができる。
【００６３】
たとえば、荷電微粒子がＳｉＯ2からなるものである場合、当該荷電微粒子をシランカップリング剤で処理してその表面に所定の修飾基を導入しておき、一方で当該修飾基に対応した反応基を有するリガンドを用意しておき、これらの修飾基および反応基を反応させることにより、当該荷電微粒子にリガンドを結合させることができる。荷電微粒子がＴｉＯ2からなるものである場合にも、同様にシランカップリング剤を用いることが可能である。
【００６４】
荷電微粒子が金属からなるものである場合も、その金属に応じて適切な化合物を選択して処理し、その表面に所定の修飾基を当該荷電微粒子に導入し、それ以後は上記と同様、リガンドが有する反応基と反応させればよい。たとえば金属が金であれば、一方の末端に金と結合するチオール基を有し、もう一方の末端にカルボキシル基、アミノ基等の修飾基を有するＳＡＭを上記化合物として用いることができる。また、あらかじめ所定の修飾基が導入された荷電微粒子は製品としても入手可能である。
【００６５】
また、荷電微粒子がイオン性ポリマーからなるものである場合は、当該イオン性ポリマーが有するイオン性官能基（たとえばアニオン性官能基であるカルボキシル基）の一部を、リガンドが有する反応基（たとえばアミノ基）と反応させるために利用することにより、当該荷電微粒子にリガンドを結合させることができる。
【００６６】
荷電微粒子に担持させるリガンドの量は、荷電微粒子が有する修飾基の数や反応させるリガンドの量（リガンド溶液の濃度）などを調整することにより、所望の範囲とすることができるが、センサーチップへの荷電層との分子間相互作用が妨げられない範囲とすることが適切である。
【００６７】
なお、リガンド担持荷電微粒子を作製した際の反応液は、そのまま、または適切な濃度に希釈して、後の複合体形成工程において、アナライト（を含有する媒質）と混合し、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させるために用いることもできる。この反応液中にリガンドと結合していない荷電微粒子（未反応の荷電微粒子）が含まれていると、複合体形成工程においてもそのままの状態で（アナライトと複合体を形成することなく）存在し、さらに後の複合体接触工程において荷電層と結合するので、アナライトの定量の精度を低下させるおそれがある。そのため、反応させる荷電微粒子とリガンドとの量比を適切に調整する、通常はリガンドの量を荷電微粒子に対して十分に多くすることにより、未反応の荷電微粒子が極力残存しないようにすることが望ましい。あるいは、たとえばアフィニティクロマトグラフィーにより反応液中から未反応の荷電微粒子を除去してリガンド担持荷電微粒子を精製し、この精製物を、必要に応じて所定の濃度の水溶液等を調製した上で、その後の工程で用いるようにすることが望ましい。
【００６８】
−アナライトの検出方法−
本発明に係るアナライトの検出方法は、上述したような荷電層を備えたセンサーチップを使用し、これに別途形成されたリガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を接触させるようにする。
【００６９】
このようなアナライトの検出方法は、一部の工程を除いて従来のアナライトの検出方法に準じた手順で、また従来のと同様の測定装置を用いて、実施することができる。
・アナライト
アナライトは、リガンドと特異的に結合する物質である。たとえば、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む），核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を含む），脂質，糖などの生体分子や、薬剤物質，内分泌錯乱化学物質などの生体分子と結合する外来物質、その他の生体関連物質などがアナライトとなり得る。がんの診断等において重要な指標となる、血液中に存在する腫瘍マーカー（たとえばα−フェトプロテイン）は、重要なアナライトの一例である。アナライトは、あらかじめ特定の物質（たとえばビオチン）で修飾しておくこともできる。このような修飾されたアナライトに対しては、前記特定の物質と特異的に結合する物質（たとえばアビジン）をリガンドとして用いればよい。
【００７０】
また、このようなアナライトを含む、または含んでいる可能性のある物質として、一般的に、生体から採取した検体が用いられる。検体としては、たとえば、ヒトおよびヒト以外の動物（たとえばほ乳類）から採取される血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。このような検体は、必要に応じて、アナライト以外の不純物を除去するための精製処理をした上で用いてもよい。
【００７１】
・測定部材の構築方法
測定部材の構築方法は、ＳＰＦＳ、ＳＰＲ等に共通する事項である。
各種の媒質（たとえばアナライトを含む試料溶液等）を密閉流路を通じて送液して測定領域に接触させる「流路型」のシステムとする場合、上述したようなセンサーチップ（本発明においてはリガンド固定化センサーチップ）の表層側に、密閉流路を形成するための部材である「フローセル」を積載して固定することにより測定部材を構築する。
【００７２】
一方、より広い領域において各種の媒質を測定領域に接触させる「ウェル型」のシステムとする場合、上述したようなセンサーチップ（本発明においてはリガンド固定化センサーチップ）の表層側に、貫通孔を有する「ウェル部材」を積載して固定することにより測定部材を構築する。
【００７３】
センサーチップ上にフローセルまたはウェル部材を固定する際には、誘電体部材と同じ光屈折率を有する接着剤,マッチングオイル，透明粘着シートなどを用いることが好ましい。
【００７４】
以下、金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴を利用するアナライトの検出方法として代表的な、ＳＰＦＳおよびＳＰＲそれぞれの実施形態に即して、アナライトの検出方法を説明する。
【００７５】
＜ＳＰＲの実施形態＞
ＳＰＲ用の測定システムは、主に、測定部材と、当該測定部材の誘電体部材側に備えられ、測定領域の金属薄膜の裏面側から測定光（入射光）を照射する光源と、その測定光の反射光を受光する受光器とを備える。
【００７６】
ＳＰＲに準じた場合、具体的には、上記のようなシステムを用いて、次のような工程を行うことによりアナライトを検出することができる。
（１）複合体形成工程：荷電層とは逆に荷電した荷電微粒子およびそれに結合したリガンドにより構成されているリガンド担持荷電微粒子と、アナライトとを媒質中で反応させ、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させる工程；
（２）複合体接触工程：前述したようなイオン性官能基修飾センサーチップの、荷電層が形成されている測定領域に、アナライトを含む媒質を接触させる工程；
（３）シグナル観測工程；上記工程を経た測定領域に測定光を照射し、金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴に基づくシグナルを観測する工程。
【００７７】
（複合体形成工程）
リガンド担持荷電微粒子とアナライトとを媒質中で反応させ、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させるためには、一般的には、リガンド担持荷電微粒子を含有する媒質（以下「リガンド担持荷電微粒子溶液」と称する。）と、アナライトを含有する媒質（以下「アナライト溶液」と称する。）とを混合すればよい。
【００７８】
これらの「媒質」としては、たとえばアナライトの測定方法において汎用されている水を用いること、つまりリガンド担持荷電微粒子またはアナライトの水溶液を調製することが好適である。この場合の水は、純水の他、緩衝液（たとえばリン酸緩衝液生理食塩水）や、その他の必要な試薬等の水溶液であってもよい。リガンド担持荷電微粒子およびアナライトの複合体の形成や、この後に行われる当該複合体とセンサーチップの荷電層との特異的吸着を妨げずに、所定の測定を適切に行うことが可能な媒質であれば、水以外の媒質を用いることも可能である。
【００７９】
リガンド担持荷電微粒子溶液およびアナライト溶液それぞれの濃度および混合量は、相対的に適切な範囲に調整することができる。通常、アナライト溶液中に含まれる全てのアナライトを検出ないし定量するようにするため、少なくとも全てのアナライトが複合体を形成するのに十分な量のリガンド担持荷電微粒子が反応液中に存在することとなるよう、リガンド担持荷電微粒子溶液およびアナライト溶液それぞれの濃度および混合量を調整することとなる。
【００８０】
なお、リガンド担持荷電微粒子溶液の調製には、リガンド担持荷電微粒子を作製するための反応液を利用することができる。リガンド担持荷電微粒子を作製する際の原料溶液を調整することにより、生成するリガンド担持荷電微粒子の量を調整し、複合体形成工程で用いるリガンド担持荷電微粒子溶液の濃度を調整することも可能である。
【００８１】
また、実際に検体中のアナライトを測定する場合など、通常はアナライト溶液の濃度は未知なので、事前に別途サンプルを用いて、アナライト溶液の濃度の範囲を予想しておくことが好ましい。
【００８２】
また、複合体形成工程においては、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体の形成を促進するために、撹拌などを手段を組み合わせて用いてもよい。
（複合体接触工程）
リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体（以下単に「複合体」と称することもある。）は、通常、当該複合体を含む媒質（以下「試料溶液」と称することもある。）を調製し、当該媒質を介して荷電層に接触させるようにする。
【００８３】
リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を含む「媒質」は、上記リガンド担持荷電微粒子を含有する「媒質」やアナライトを含有する「媒質」と同様のものを用いることができる。
【００８４】
試料溶液は、前述した複合体形成工程において複合体を形成させた反応液をそのまま用いたものであってもよいし、必要に応じて当該反応液を精製したり、必要な試薬類を添加したり、その他の処理をしたものであってもよい。このような試料溶液中には通常、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体と、リガンド担持荷電微粒子そのもの（アナライトと複合体を形成していない未反応物）との両方が含まれており、これら両方が荷電層により捕捉され、薄膜を形成することになる。
【００８５】
（シグナル観測工程）
ＳＰＲの場合、金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴に基づくシグナルは、表面プラズモン共鳴により減衰する反射光の強度を反映したものである。すなわち、反射光の強度が極小となるときの入射光の入射角度（θ）を測定値として取得する。一般的には、複合体接触工程の開始前の測定値（θ1）および当該工程の終了後の測定値（θ1’）の絶対値の差として、測定値の変化量（Δθ1）を算出し（通常、θ1＜θ1’であり、Δθ1＝θ1’−θ1である）、この変化量をアナライトの検出ないし定量のために用いるようにする。
【００８６】
本発明による実際上の測定では、通常、複合体形成工程により生成した、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体および未反応のリガンド担持荷電微粒子の両方が、センサーチップ表面の荷電層に捕捉されて薄膜を形成するが、誘電率の変化量、すなわち測定値の変化量（Δθ1）はそれらの混合割合を反映したものとなる。
【００８７】
ある試料溶液に含まれるアナライトの量は、その試料溶液についてのθ1またはΔθ1を、濃度が既知の試料を用いて取得した基準値と対比することにより定量的に評価することもできるし、他の試料溶液についてのθ1またはθλ1と対比することにより相対的に評価することもできる。
【００８８】
たとえば、前述した複合体形成工程と同様の手順において、リガンド担持荷電微粒子に対して、少なくとも二つの所定の基準量（濃度）のアナライトを添加して得られた反応液を利用することにより、アナライトの量と測定値（ないし測定値の変化量）との関係性、より具体的には関係式を取得することができる。この際、上記この基準量の一つをゼロとする、すなわちアナライトを全く添加せずに得られた反応液を調製することが好ましい。アナライトの基準量がゼロの場合、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を全く含有せず、リガンド担持荷電微粒子のみを含有する試験液が得られる。この試験液をセンサーチップに接触させると、荷電層の表層にはリガンド担持荷電微粒子のみからなる光学的薄膜が形成される。一方、アナライトの基準量がゼロ以外の場合、その基準量に応じて、一部のリガンド担持荷電微粒子はアナライトと複合体を形成し、残部のリガンド担持荷電微粒子は未反応のまま残存している試験液が得られる。この試験液をセンサーチップに接触させると、荷電層の表層にはリガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体とリガンド担持荷電微粒子の両方からなる薄膜が形成される。このとき、前者の誘電率の変化と後者の誘電率の変化には差があるので、前者と後者の存在割合により、形成される薄膜全体による誘電率の変化、すなわち測定されるθ1に差が生じることになる。また、もしもアナライトの基準量がリガンド担持荷電微粒子に対して過剰である場合は、実質的に未反応のリガンド担持荷電微粒子を全く含有せず、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体のみを含有する試験液が得られる。このような試験液から取得できる関係式に基づき、ある試料溶液中についての測定値（ないし測定値の変化量）から、その試料溶液中のアナライトの量（濃度）を推定することができる。
【００８９】
θ1が実質的に変化しない、つまりΔθ1が０ないし十分に小さい（測定誤差の範囲である）場合、センサーチップに固定化されたリガンドと試料溶液中のアナライトとの特異的結合が起きなかった、つまり当溶試料溶液中にアナライトは存在しなかったと判断することができる。
【００９０】
一方、θ1が変化した、つまりΔθ1が一定の値（測定誤差の範囲）より大きい場合、センサーチップに固定化されたリガンドと試料溶液中のアナライトとの分子間相互作用が起きたことが示され、当該試料溶液中にアナライトが存在すると判断することができる。さらに、その変化の程度、つまりΔθ1の大きさから、試料溶液中のアナライトを定量することができる。
【００９１】
なお、ＳＰＲでは、上記のような複合体接触工程の前後にわたって、望ましくは当該工程の開始前、途中および終了後にわたって連続的に、所定の測定値を取得して、シグナル（すなわち測定値の変化）を観測することにより、センサーチップ表面に捕捉されるリガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体をリアルタイムで定量することができる。一定時間経過後、測定値がそれ以上変動しなくなる、ないし変動が十分に小さくなると見込まれるようになった時点をもって、当該工程を終了させることができると判断することが適切である。
【００９２】
＜ＳＰＦＳの実施形態＞
ＳＰＦＳ用の測定システムは、前述したＳＰＲ用の測定システムと同様、主に、測定部材と、当該測定部材の誘電体部材側（金属薄膜裏面側）に備えられ、測定領域の金属薄膜の裏面側から測定光（入射光）を照射する光源と、その測定光の反射光を受光する受光器とを備え、さらに、当該測定部材の固定化リガンド層側（金属薄膜表面側）に備えられ、測定領域で発せられる蛍光を受光する光検出器とを備える。
【００９３】
ＳＰＦＳに準じた場合、具体的には、上記のようなシステムを用いて、次のような工程を行うことによりアナライトを検出することができる。
（１）複合体形成工程：荷電層とは逆に荷電した荷電微粒子およびそれに結合したリガンドにより構成されているリガンド担持荷電微粒子と、アナライトとを媒質中で反応させ、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させる工程；
（２）複合体接触工程：前述したようなイオン性官能基修飾センサーチップの、荷電層が形成されている測定領域に、アナライトを含む媒質を接触させる工程；
（３）シグナル観測工程；上記工程を経た測定領域に測定光を照射し、金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴に基づくシグナルを観測する工程。
【００９４】
ここで、ＳＰＦＳにより測定するためには、次のいずれかの標識方法により、アナライトを蛍光標識する必要がある。
第一の標識方法（標識方法Ａ）は、上記工程（１）において、前記アナライトを蛍光標識しておく、つまりアナライトと蛍光体との複合体（標識化アナライト）を用いて上記工程（１）を行うことである。このような標識化アナライトは、公知の方法により作製することができるが、一般的には液中でアナライトと蛍光体とを反応させるため、迅速にアナライトを標識化することができるため好ましい。通常は、上記工程（１）の前にあらかじめ標識化アナライトを作製しておくようにする。
【００９５】
第二の標識方法（標識方法Ｂ）は、上記工程（２）および（３）の間に、上記工程（１）を経た測定領域に標識リガンドを含む媒質を接触させる工程（以下「蛍光標識工程」と称する。）を設けることである。つまり、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体をセンサーチップ表面に固定化してから、そのアナライトを蛍光標識する。通常は、蛍光標識工程の前にあらかじめ標識リガンドを作製しておくようにする。標識リガンドは公知の方法により作成することができる。
【００９６】
・蛍光体
「蛍光体」は、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称である。本発明では、公知のＳＰＦＳ等または蛍光標識法等で用いられている、公知の各種の蛍光体を用いることができる。代表的な蛍光体としては、蛍光色素および半導体ナノ粒子が挙げられる。
【００９７】
蛍光色素としては、たとえば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社製、たとえばＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＦＩＴＣ）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)製、たとえばＡｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ：ＡＭＣＡ）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス(株)製、たとえば、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：ＴＲＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−Ｘ：ＲＲＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ：ＴＲ）、シアニン・ファミリーの蛍光色素（たとえば、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７）、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素（たとえばＣｙ３（登録商標））、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)製）などが挙げられる。これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００９８】
また、上記のような有機蛍光色素以外に、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素を用いることもできる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００９９】
一方、半導体ナノ粒子は、たとえばＳｉ、Ｇｅ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＧａＡｓ、ＡｌＳｅ、ＣｄＳｅ、ＡｌＡｓ、ＧａＰ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＡｓなどの半導体又はこれらを形成する原料からなるものである。低毒性という観点からはＩｎＰやＳｉが好ましく、可視光の範囲における発光強度の観点からはＣｄＴｅやＣｄＳｅが好ましい。
【０１００】
また、前記半導体ナノ粒子をコアとし、その外層にシェルを付加したコア／シェル構造の半導体ナノ粒子を用いてもよい。シェルを形成するための素材としては、公知のコア／シェル構造の半導体ナノ粒子と同様に、II−VI族、III−Ｖ族、IV族の無機半導体を用いることができる。例えば、Ｓｉ、Ｇｅ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＧａＡｓ、ＡｌＳｅ、ＣｄＳｅ、ＡｌＡｓ、ＧａＰ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＡｓなどの各コア形成無機材料よりバンドギャップが大きく、毒性を有さない半導体又はこれらを形成する原料が好ましい。より具体的には、たとえば、ＩｎＰ、ＣｄＴｅ、及びＣｄＳｅをコアとする場合にはＺｎＳが、Ｓｉをコアとする場合にはＳｉＯ2がシェルとして好適である。なお、コアが部分的に露出しても弊害を生じない限り、シェルはコアの全表面を完全に被覆するものでなくてもよい。
【０１０１】
コア／シェル構造でない（コアのみからなる）半導体ナノ粒子の体積平均粒径は、従来のものと同程度でよいが、１〜１５ｎｍであることが好ましい。また、コア／シェル構造の半導体ナノ体粒子の体積平均粒径も、従来のものと同程度でよいが、１〜２０ｎｍであることが好ましい。
【０１０２】
なお、上述した半導体ナノ粒子、及び以下に述べる蛍光増強微粒子（金属コロイド粒子）やナノ粒子集積体の粒径は、原則として体積平均粒径により表される。この体積平均粒径は、動的光散乱法（Dynamic Light Scattering, DLS）による粒径測定装置（たとえばＭａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）を用いて、上記各粒子の作製直後（凝集前）の粒径分布を測定することにより求められる値であり、粒径分布のピーク（中心）位置の粒径をその粒子の体積平均粒径とする。
【０１０３】
このような半導体ナノ粒子は、公知の方法により作製することができ、また製品として入手することもできる。
（複合体形成工程）
ＳＰＦＳにおける複合体形成工程は、前述したＳＰＲにおける複合体形成工程と同様であるため、ここでの記載は省略する。
【０１０４】
（複合体接触工程）
ＳＰＦＳにおける複合体接触工程は、前述したＳＰＲにおける複合体接触工程と同様であるため、ここでの記載は省略する。
【０１０５】
（蛍光標識工程）
前記標識方法Ｂによりアナライトを蛍光標識化する場合、上記工程を経た測定領域に標識リガンドを含む媒質を接触させる、すなわち、センサーチップ表面に捕捉されているリガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体と標識リガンドとが接触するようにし、リガンド担持荷電微粒子−アナライト−標識リガンド複合体を形成させるようにする。
【０１０６】
・標識リガンド
センサーチップ上に捕捉されたアナライトを蛍光標識化するために用いられる、蛍光体と結合したリガンドを「標識リガンド」（リガンドが抗体であれば「標識抗体」、「二次抗体」などと呼ばれることもある。）と称する。標識リガンドのリガンド（以下「第二リガンド」と称することがある。）とリガンド担持荷電微粒子のリガンド（以下「第一リガンド」と称することがある。）は、同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第一リガンドがポリクローナル抗体である場合、第二リガンドはモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、第一リガンドがモノクローナル抗体である場合、第二リガンドはその第一リガンドが認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【０１０７】
ＳＰＦＳにおける標識リガンドは、一般的な免疫染色法でも用いられているリガンドと蛍光体との複合体（コンジュゲート）と同様にして作製することができる。たとえば、リガンドとアビジン（ストレプトアビジン等を含む）との複合体、および蛍光体とビオチンとの複合体をそれぞれ作製し、これらを反応させることにより、アビジン／ビオチンを介してリガンドに蛍光体が結合した複合体（１のアビジンに対し最大４のビオチンが結合しうる）が得られる。上述のようなビオチンとアビジンの反応以外にも、蛍光標識法で用いられている一次抗体−二次抗体の反応様式や、カルボキシル基とアミノ基、イソチオシアネートとアミノ基、スルホニルハライドとアミノ基、ヨードアセトアミドおよびチオール基などの反応を用いてもよい。
【０１０８】
なお、上記リガンドをアナライトに置き換えることにより、同様の反応方法で標識化アナライトを作製することができる。
（シグナル観測工程）
ＳＰＦＳの場合、金属薄膜で起きる表面プラズモン共鳴に基づくシグナルは、前記蛍光標識工程により形成された複合体中の蛍光体が発する蛍光を反映したものである。すなわち、上記工程を経た測定領域に測定光（蛍光体に対応した励起光）を照射し、測定領域から発せられる蛍光の強度（アッセイシグナルＳ、単位はたとえばａ．ｕ．）を測定値として取得する。通常は、ノイズ等の影響を排除するため、シグナル観測工程前の所定の段階で測定領域から発せられる蛍光の強度（ブランクシグナルＮ、いわゆるノイズ）も測定値として取得しておき、下記式により算出されるＳ／Ｎ比をアナライトの検出ないし定量のために用いる。
【０１０９】
Ｓ／Ｎ比＝｜（アッセイシグナル）｜／｜（ブランクシグナル）｜
このようなＳ／Ｎ比は、センサーチップ表面に形成された複合体中に含まれる蛍光体の数、すなわちそれらの蛍光体から発せられる蛍光の強度を反映している。
【０１１０】
ある試料溶液に含まれるアナライトの量は、その試料溶液についてのＳ／Ｎ比を、濃度が既知の試料を用いて取得した基準値と対比することにより定量的に評価することもできるし、他の試料溶液についてのＳ／Ｎ比と対比することにより相対的に評価することもできる。
【０１１１】
たとえば、Ｓ／Ｎ比が１前後ないし一定の値に達しない（測定誤差の範囲である）場合、センサーチップ表面に形成された複合体中にアナライトを標識する蛍光体が含まれていない、つまり当溶試料溶液中にアナライトは存在しなかったと判断することができる。
【０１１２】
一方、Ｓ／Ｎ比が一定の値（測定誤差の範囲）より大きい場合、センサーチップ表面に形成された複合体中にアナライトを標識する蛍光体が含まれており、当該試料溶液中にアナライトが存在すると判断することができる。さらに、そのＳ／Ｎ比の大きさから、試料溶液中のアナライトを定量することができる。
【実施例】
【０１１３】
［実施例１］
ガラス製の誘電体部材の平面上に、スパッタリング法により形成されたクロム薄膜（厚さは１〜３ｎｍ）と、その上にさらにスパッタリング法により形成された金薄膜（厚さは４４〜５２ｎｍ）とを備えるセンサーチップを用意した。
【０１１４】
（荷電層形成工程）
カチオン性水性ポリウレタン樹脂「ハイドラン  ＣＰ−７６１０」（ＤＩＣ株式会社製、体積平均粒径８ｎｍ）を水で希釈し、濃度１ｗｔ％の塗布液を調製した。この塗布液を、スピンコーター（回転数：３０００ｒｐｍ）を用いて、前記センサーチップの表面に塗布した。塗布後７０℃で３０分間乾燥して、上記カチオン性ポリウレタンからなる被膜が形成された、カチオン性修飾センサーチップを作製した。参考のため、上記と同様の方法で別途作製したカチオン性修飾センサーチップ表面の原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）像を図２に示す。
【０１１５】
（複合体形成工程）
Immunogold conjugate EM.GMHL 10（BB international社製）をリガンド担持荷電（アニオン）微粒子とし、これを１体積％に希釈した水溶液を調製した。
【０１１６】
一方、ＩｇＧをアナライトとし、これをAlexa Fluor 647（登録商標、Invitrogen社）で標識して、標識化アナライトを作製した後（標識率２．４）、この標識化アナライトを５ｎｇ／ｍＬの濃度で含有する試料溶液を調製した。
【０１１７】
上記リガンド担持荷電（アニオン）微粒子の１体積％希釈水溶液１ｍＬと、上記標識化アナライトの５ｎｇ／ｍＬ溶液１ｍＬとを混合し、１０分間振盪した。
（複合体接触工程）
直径φ５ｍｍの円形の貫通穴を有するウェル部材を用意した。このウェル部材を、作製例１により作製したカチオン性修飾センサーチップの表面上に、マッチングオイルを介して固定し、ウェル型の測定部材を作製した。
【０１１８】
複合体形成工程により得られた反応液を、前記工程で作製した荷電層を備えるセンサーチップを底面とするウェルに添加し、５分間振盪した。
センサーチップ（測定部材）をＳＰＦＳ用測定装置に装着し、入射角度を変化させながら測定光を照射して、ＳＰＲ法におけるシグナルに相当する反射強度およびＳＰＦＳ法におけるシグナルに相当する蛍光強度の両方を測定した。比較のため、上記アナライトと反応させず、複合体を形成していない、リガンド担持荷電（アニオン）微粒子のみを荷電層に接触させた場合についても測定を行った。結果を図３および図４に示す。
【０１１９】
図３から金ナノ粒子に固定化したａｎｔｉＩｇＧとＩｇＧ標識体（アナライト）との反応が高効率で行われていることが分かる。このことはホモジニアス系の反応が早く、かつ高効率であることを示している。図４からＳＰＦＳにおける超高感度検出が本発明の方法で達成可能であることが分かる。
【０１２０】
［実施例２］
（リガンド担持荷電微粒子作製工程）
アニオン性ポリマー微粒子として、「ハイドランＷＬＳ  ２０２」（ＤＩＣ株式会社製）を用い、また、リガンドとして、抗αフェトプロテイン〔ＡＦＰ〕マウスモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：１Ｄ５；ミクリ免疫研究所（株））を用いた。「ハイドランＷＬＳ  ２０２」の１０％溶液を２０ｍＬ採取し、２５ｍＭ  ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）バッファー（ｐＨ５．５）１．５ｍＬ、１００当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ：（株）同人化学研究所製）およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え、カルボキシル基を活性化させた。上記溶液に１ｍｇ／ｍＬのＡＦＰ抗体１Ｄ５を１ｍＬ添加し、室温で３０分間反応させて１Ｄ５を微粒子に反応させた。スピンカラムを利用して未反応の抗体を除去した。
【０１２１】
実施例１の固定化リガンド層形成工程、アナライト接触工程、標識抗体接触工程を以下に変更してアッセイを行った。
（複合体形成工程）
上記工程で作製したリガンド担持荷電微粒子（アニオン性ポリマー）を１重量％の濃度で含有する水溶液と、アナライトとしてα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）（ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＧｍｂＨ製）を１μｇ／ｍＬ、１０μg/ml、１００μg/mlの濃度で含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４；ナカライテスク(株)製）溶液とを混合し、リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体を形成させた。
【０１２２】
（複合体接触工程）
直径φ５ｍｍの円形の貫通穴を有するウェル部材を用意した。このウェル部材を、作製例１により作製したカチオン性修飾センサーチップの表面上に、マッチングオイルを介して固定し、ウェル型の測定部材を作製した。
【０１２３】
複合体形成工程により得られた反応液を、前記工程で作製した荷電層を備えるセンサーチップを底面とするウェルに添加し、５分間振盪した。
センサーチップ（測定部材）をＳＰＦＳ用測定装置に装着し、入射角度を変化させながら測定光を照射して、ＳＰＲ法におけるシグナルに相当する反射強度およびＳＰＦＳ法におけるシグナルに相当する蛍光強度の両方を測定した。結果を表１に示す。下記表の結果からＡＦＰのアッセイが定量的にかつ高感度で行われていることが分かる。
【０１２４】
【表１】
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【符号の説明】
【０１２５】
１００  センサー基材
１０２  誘電体部材
１０４  金属薄膜
１２０  荷電層
２００  リガンド担持荷電微粒子
２０２  荷電微粒子
２０４  リガンド
２２０  リガンド担持荷電微粒子−アナライト複合体
２２２  アナライト
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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