(57)【要約】【課題】本発明は、分化誘導後の細胞集団中において、生成した分化細胞とわずかに残存する未分化iPS細胞を非侵襲的に識別する技術を提供することを可能とする。【解決手段】光が細胞を透過することにより生じる光の位相差の値や光が細胞を透過する際の光の屈折率の値を用いることを特徴とする、幹細胞の培養経過中における個々の細胞の分化状態の診断方法。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光が細胞を透過することにより生じる光の位相差の値を用いることを特徴とする、幹細胞の培養経過中における個々の細胞の分化状態の診断方法。
【請求項２】
光が細胞を透過する際の光の屈折率の値を用いることを特徴とする、幹細胞の培養経過中における個々の細胞の分化状態の診断方法。
【請求項３】
分化状態が分化の有無であることを特徴とする請求項１乃至２に記載の診断方法。
【請求項４】
幹細胞がヒトiPS細胞であることを特徴とする請求項１乃至３に記載の診断方法。
【請求項５】
光の透過方向が細胞接着面に対する垂直方向±45度以内であることを特徴とする請求項１乃至４に記載の診断方法。
【請求項６】
用いる光がレーザー光であることを特徴とする請求項１乃至５に記載の診断方法。
【請求項７】
用いる光の波長が500〜700 nmであることを特徴とする請求項１乃至６に記載の診断方法。
【請求項８】
用いる光の波長が532 nmであることを特徴とする請求項１乃至６に記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療など移植用に培養した細胞の品質診断方法に係わる。
【背景技術】
【０００２】
ヒト心筋細胞を用いた拡張型心筋症の再生治療の様に、再生治療に用いる細胞の入手が困難な場合に、特に人工多能性幹細胞が有用と期待されている。京都大学の山中伸弥教授らのグループが、ES細胞の初期化因子の実体がES細胞の未分化性や高い増殖能力を維持する遺伝子ではないかと考えて24種類の遺伝子をスクリーニングし、最終的に4種類の遺伝子（Oct3/4,c-Myc,Sox2,Klf4）を組み合わせてマウス胎児線維芽細胞に導入することによって、2006年8月にマウス人工多能性幹細胞（induced  pluripotent  stem  cells：iPS細胞）を樹立することに成功した（非特許文献１）。マウスiPS細胞の開発に続き、さらに2007年には同グループがマウスで特定されたOct3/4,c-Myc,Sox2,Klf4の4つの遺伝子をヒト皮膚線維芽細胞に導入することでヒトiPS細胞を作製することができると報告した（非特許文献２）。
【０００３】
iPS細胞はES細胞とほぼ同等の多分化能と自己増殖能力を持ち、神経細胞、心筋細胞、血液細胞などの細胞に分化し得ることが報告されている。iPS細胞は作製に受精卵を必要としないため倫理的な障壁が低く、また患者自身の細胞から作製すれば免疫拒絶反応のない移植療法が可能になることなどから、ES細胞の持つ問題点を回避できる可能性を持っていると考えられる。そのためES細胞に代わって再生医療分野への応用において非常に有用な細胞源として期待されている。
【０００４】
これらES細胞やiPS細胞を細胞移植治療に応用する際は、これらの多能性幹細胞から目的の細胞へ分化誘導を行った後に移植するという方法が一般的に考えられる。しかし、この際に問題となるのが、分化誘導後に残存する未分化細胞によって移植後に引き起こされる奇形腫（テラトーマ）形成である。
【０００５】
マウスES細胞とマウスiPS細胞から神経幹／前駆細胞を含むneurosphereを作製し、免疫不全であるNOD/SCIDマウスの脳線条体へ移植することによって、安全性の検討を行った報告では、ES細胞由来neurosphere移植マウス群の1割、iPS細胞由来neurosphere移植マウス群の4割において、混入した未分化細胞由来のテラトーマ形成が観察された。さらにiPS細胞由来neurosphere中に約0.02%以上の未分化iPS細胞が含まれていた場合、移植後にテラトーマ形成が生じ得るということが明らかとなった（非特許文献３）。
【０００６】
また、大阪大学の澤芳樹教授らは、温度に応じて培養皿表面の性質を親水性／疎水性に変化させることで細胞の脱着を制御できるインテリジェントナノ表面（温度感応性培養皿）を用いた細胞シート工学（非特許文献４）の技術を用いて、マウスのiPS細胞から分化誘導して得られた心筋細胞から心筋細胞シートを作製し、心筋梗塞モデルマウスに移植し、心機能を改善することに成功した。澤芳樹教授らはiPS細胞から分化誘導した心筋細胞集団を独自の培養法によって99.2％まで純化することに成功したが、この純化後の細胞集団から作製した細胞シートを移植すると、移植したマウスの半数で腫瘍が形成された。
【０００７】
これらの結果は、分化誘導後に残存するわずかな未分化細胞のほぼ完全な除去を行わなければならないことを示している。つまり、残存するわずかな未分化iPS細胞が腫瘍を形成する事が本再生医療の大きな壁であり、この問題を解決し、臨床応用を可能にするためには、少なくとも移植直前の培養細胞集団から全ての未分化iPS細胞を除去する細胞純化技術の確立が必須であると考えられた。
【０００８】
この細胞純化技術の要素技術として、培養細胞集団中の任意の細胞にレーザーを照射して破壊する方法を我々は考案し、報告した（非特許文献５）。iPS細胞に関わる細胞純化技術を完成させるためには、もうひとつの要素技術として、「分化誘導後の細胞集団にわずかに残存するiPS細胞を非侵襲的に識別する技術」が必要であるが、これまでにこのような技術の報告はほとんどなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Takahashi K. andYamanaka S.: Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126, 663-676(2006).
【非特許文献２】Takahashi K., TanabeK., Ohnuki M., Narita M., IchisakaT., Tomoda K. And YamanakaS.: Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors. Cell, 131, 861-872 (2007).
【非特許文献３】Miura K., Okada Y., Aoi T.,Okada A., Takahashi K., Okita K., Nakagawa M., Koyanagi M.,Tanabe K., Ohnuki M., Ogawa D., Ikeda E., Okano H. and Yamanaka S.:Variation in the safety of induced pluripotent stemcell lines. Nat. Biotechnol.,27, 743-745 (2009).
【非特許文献４】Okano T., Yamada N., Sakai H. and Sakurai Y.: A novelrecovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishesgrafted with poly(N-isopropylacrylamide). J. Biomed. Mater. Res., 27, 1243-1251 (1993).
【非特許文献５】Jun Sakai, Daniel Roldan,Kosei Ueno, Hiroaki Misawa, Yoichiroh Hosokawa, Takanori Iino, Shigeyuki Wakitani,and Mutsumi Takagi, Effect of the Distance between Adherent Mesenchymal Stem Cell and the Focus of Irradiation of Femtosecond Laser on Cell Replication Capacity. Cytotechnology, 受理済み
【非特許文献６】Endo J., Chen J., Kobayashi D., Wada Y. and Fujita H.: Transmission laser microscope using thephase-shifting technique and its application to measurement of opticalwaveguides. Appl. Opt.,41, 1308-1314 (2002).
【非特許文献７】Maquet P., Rappaz B., MagistrettiP. J., Cuche E., Emery Y., ColombT. and Depeursinge C.: Digital holographicmicroscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitativevisualization of living cells with subwavelengthaxial accuracy. Opt. Lett.,30, 468-470 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、分化誘導後の細胞集団中において、生成した分化細胞とわずかに残存する未分化iPS細胞を非侵襲的に識別する技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させたものである。即ち、本発明は少なくとも、光が細胞を透過することにより生じる光の位相差の値や光が細胞を透過する際の光の屈折率の値を用いることを特徴とする、幹細胞の培養経過中における個々の細胞の分化状態の診断方法に関する。
【００１２】
本発明で用いる細胞とは、幹細胞の培養中に存在する細胞であり、特に限定しないが、幹細胞そのもの、幹細胞が分化して生成する細胞および幹細胞の培養のために添加されたフィーダー細胞などを例として挙げることができる。幹細胞としては、特に限定しないが、iPS細胞、ES細胞、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞などを例として挙げることができる。
【００１３】
本発明における培養経過の長さは、特に限定しないが、1分〜100日、望ましくは1時間〜60日を例として挙げることができる。
【００１４】
本発明で診断する分化状態の種類としては、もともとの幹細胞そのものであること、幹細胞から他の細胞種に分化した細胞であること、および幹細胞の培養のために添加されたフィーダー細胞などの他の細胞であること、などを例として挙げることができる。ここで幹細胞から分化して生成する他の細胞種としては、特に限定しないが、たとえば肝細胞、心筋細胞、関節軟骨細胞、神経細胞、造血細胞などを例として挙げることができる。
【００１５】
本発明で用いる光としては、電球、蛍光灯などの光でもよいが、レーザー光が望ましい。
本発明で用いる光の波長としては、特に限定しないが、５３２±１０ｎｍ又は６３２±１０ｎｍを例として挙げることができる。光の出力は、特に限定しないが、０．０１〜２００ｍＷ、望ましくは０．０１〜５ｍＷを例として挙げることができる。光透過のための光照射時間も、特に限定しないが、０．０１分〜３０分、望ましくは０．０１分〜１０分を例として挙げることができる。
【００１６】
本発明で光が細胞を透過する方向は、特に限定しないが、細胞接着面に対する垂直方向±45度以内が望ましい。
【００１７】
光が細胞を透過することにより生じる光の位相差の値の求め方は、特に限定しないが、試料を透過したレーザー光と試料を置いていない参照面を透過したレーザー光により生じる干渉縞を８枚程度取得し、これらの光の間の位相差を定量する位相シフトレーザー顕微鏡（Phase-shifting laser microscope：PLM）（非特許文献６）や、試料から反射した光と参照光をある角度を持たせて干渉させ、試料のホログラムを作成し、位相差を求めるデジタルホログラフィック顕微鏡（Digital holographic microscope：DHM）（非特許文献７）を例として挙げることができる。
【００１８】
PLMの構造を図１に示す。試料を光軸の片側に設置し、光源からレーザー光を照射すると対物レンズによって試料の像が一度拡大され、さらに拡大レンズによって像が拡大される。拡大された試料の像はバイプリズムと呼ばれる特殊な形状のプリズムを通過する。このバイプリズムはレーザー光を中央に引き寄せるという働きを持っており、試料を透過したレーザー光と、光軸に対して反対側の試料のない部分（参照面）を透過してきたレーザー光が互いに中央に引き寄せられ、CCDカメラの画面上で重なる。このときCCDカメラの画面上には、試料を透過したレーザー光と透過していないレーザー光により干渉縞が形成される。この干渉縞はコンピュータに内蔵された画像取り込み装置によって画像化され、記録される。
【００１９】
PLMは、電圧を加えることで体積を変化させる性質を持つピエゾ素子を内蔵させたステージにバイプリズムを搭載し、バイプリズムを光軸と直行する方向にコンピュータによって少しずつ定量的に動かし、複数の干渉縞画像を得る。それら複数の干渉縞画像を組み合わせ、コンピュータによって視野内の各座標における位相差を算出し、位相差の二次元分布を画像化することができる。
【００２０】
干渉縞の形成原理を更に詳しく述べる。図２ではレーザー光の進み具合を模式的に表すため、レーザー光が描くサインカーブを頂上でつないで上から見てできた面、「波面」を用いている。また、Fig. 2では光軸の左側に試料を置いている。試料を透過したレーザー光は試料の屈折率の分だけ位相が遅れ、光軸の右側を通った参照光とCCDカメラの画面上で干渉を起こす。このようにして干渉縞が形成され、細胞の形態を干渉縞で観察することができる。PLMによって得られた位相差は以下の式で表される。ここでΔφは位相差値、λは透過したレーザー光の波長（=532 nm）、ncは細胞の屈折率である。
【数１】
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【００２１】
光が細胞を透過する際の光の屈折率の値の求め方は、特に限定しないが、例として次の方法を挙げることができる。
【００２２】
PBS およびPBSとほぼ等浸透圧になるように調製した30% w/v Nycodenz溶液（SERVA
Electrophoresis, 31000）の屈折率をデジタルアッベ屈折計（ATAGO, DR-A1）を用いて測定する。PBSを細胞が接着したディッシュに1 ml入れた後、PLMを用いて細胞の位相差を測定する。次に、ディッシュからPBSを除去した後、屈折率既知の30% w/v Nycodenz溶液1 mlに置き換え、PBSを用いて位相差を測定した細胞と同じ細胞に対して、同様に位相差を測定する。
【数２】
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【数３】
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【００２３】
PBSおよび30%  w/v  Nycodenz溶液の2種類の溶液を用いて測定した位相差値を用いて以下の式から計算によって細胞屈折率および高さを算出する。ここでφ1、φ2はそれぞれPBSおよび30%  w/v  Nycodenz溶液を用いて測定した細胞の位相差値であり、nmはPBSの屈折率、nm+δnは30%  w/v  Nycodenz溶液の屈折率である。またλはレーザーの波長である。
【数４】
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【数５】
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【実施例】
【００２４】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
DMEM-F12（Sigma,D6421）培地に、100units/mlペニシリン−0.1mg/mlストレプトマイシン（Sigma,P7539）、0.1mM  non-essential amino acid（Sigma,M7145）、2mM  L-glutamine（Invitrogen,25030-081）、0.1 mM  2-mercaptoethanol（Sigma,M7522）を添加したDMEM-F12（Sigma,D6421）培地に20%の濃度になるようにKNOCKOUTTM  Serum  Replacement（KSR）（Invitrogen,10828-028）を添加し、bFGF（basic  fibroblast  growth  factor）（Wako,064-04541）を5ng/mlとなるように添加したものを、ヒトiPS細胞増殖用培地として用いた。この培地およびフィーダー細胞（マウス胎児線維芽細胞（Millipore,R-PMEF-CFL）(MEF)）を用いて増殖・回収したヒトiPS細胞（253G1,HPS0002）を、10μM  Y-27632、5ng/ml  bFGFを添加したヒトiPS細胞増殖用培地を用いて、播種密度1.0×104 cells/cm2でマトリゲルコーティングディッシュに播種し、無フィーダー単一分散培養した。播種21時間後にアルカリフォスファターゼ（ALP）染色後、ALP染色陽性の未分化細胞とALP染色陰性の分化細胞についてPLMを用いて位相差測定を行った。その結果、ALP染色陽性細胞、ALP染色陰性細胞の平均位相差はそれぞれ7.147rad.および5.055rad.となった。また、これらの結果に対してt検定を行ったところ、有意水準1%において有意差が認められた（図３）。ただし、図３において、ALP(+)はアルカリフォスファターゼ染色陽性未分化細胞、ALP(-)はアルカリフォスファターゼ染色陰性分化細胞を示す。
【実施例２】
【００２６】
ALP染色陰性細胞群にMEFが混入している可能性を考慮し、取得したALP染色陰性細胞データからMEFのデータを除去するためのパラメータ選択を目的として、まずMEF単独培養により得られたMEF細胞および実施例１と同様に準備したALP(-)細胞の各パラメータのデータを取得した。条件を揃えるために、MEFの培養にはマトリゲルコーティングディッシュを使用し、播種密度1.0×104 cells/cm2で播種し、播種21時間後に固定およびPLMを用いた位相差測定、円形度測定を行った。その結果、MEFの平均位相差は3.382 rad.、平均円形度は0.307、ALP(-)細胞の平均位相差は5.055rad.、平均円形度は0.789となった（図４）。ただし図４において、ALP(-)はアルカリフォスファターゼ染色陰性分化細胞、MEFはMEF細胞を示す。 
【実施例３】
【００２７】
実施例１と同様の方法で、ヒトiPS細胞を播種密度1.0×104cells/cm2で無フィーダー単一分散培養し、播種21時間後にALP染色後、PLMを用いた位相差測定および円形度測定を行った。ここで、実施例２の結果をもとにして、円形度0.549以下の値を持つ細胞をMEF細胞と考えた（図５）。その結果、円形度0.549以下の細胞を除いたとしても、ALP染色陽性細胞の平均位相差はALP染色陰性細胞の平均位相差よりも有意水準1%において有意に高かった。但し図５において、ALP(+)はアルカリフォスファターゼ染色陽性未分化細胞、ALP(-)wMEFはすべてのアルカリフォスファターゼ染色陰性細胞、ALP(-)w/oMEFは円形度0.549以下のアルカリフォスファターゼ染色陰性細胞、MEFはMEF細胞を示す。 
【実施例４】
【００２８】
実施例１と同様の方法で、ヒトiPS細胞を播種密度1.0×104cells/cm2で無フィーダー単一分散培養し、播種21時間後にALP染色後、屈折率の異なる２種類の液を培養器に順次入れ、PLMを用いて位相差測定することにより細胞屈折率および細胞高さを算出した（図６）。ALP染色陽性細胞と陰性細胞の平均高さはそれぞれ6,880 nmと6,766 nmであり、有意差は認められなかった。しかし、平均屈折率はそれぞれ1.416と1.397となり、t検定の結果、有意水準1%において有意に差が認められた。但し図６において、ALP(+)はアルカリフォスファターゼ染色陽性未分化細胞、ALP(-)はアルカリフォスファターゼ染色陰性分化細胞 を示す。
【実施例５】
【００２９】
MEFフィーダー細胞およびヒトiPS細胞増殖用培地を用いてヒトiPS細胞をコロニー状態で増殖維持培養を行った後にALP染色を行った。その後、コロニー中のALP染色陽性細胞および陰性細胞についてそれぞれ位相差をPLMを用いて測定した（図７）。その結果、ALP染色陽性細胞の平均位相差は5.969 rad.、ALP染色陰性細胞の平均位相差は3.943rad.となり、コロニー中においてもALP染色陽性細胞の方が位相差が高い結果となった。また、これらの結果についてt検定を行ったところ、有意水準1%において有意差が認められた。但し図７において、ALP(+)はアルカリフォスファターゼ染色陽性未分化細胞、ALP(-)はアルカリフォスファターゼ染色陰性分化細胞 を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】位相シフトレーザー顕微鏡の構造
【図２】干渉縞のイメージ
【図３】iPS細胞単一分散培養における分化状態が位相差に与える影響
【図４】iPS細胞とMEF細胞の位相差と円形度の違い
【図５】iPS細胞単一分散培養における分化状態が位相差および円形度に与える影響
【図６】iPS細胞単一分散培養における分化状態が細胞屈折率および細胞高さに与える影響
【図７】iPS細胞コロニー培養における分化状態が位相差に与える影響
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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