(57)【要約】【課題】ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択する方法を提供すること。【解決手段】がん患者由来の試料におけるＲｉｃｔｏｒの発現量、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合い、およびＲｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量の少なくとも１つ以上を指標とすることにより、ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を、迅速かつ高確率で選択することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択する方法であって、がん患者由来の試料におけるＲｉｃｔｏｒの発現量、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合い、およびＲｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量の少なくとも１つ以上を指標とすることを特徴とするがん患者の選択方法。
【請求項２】
試料が、がん患者由来のがん細胞またはその内容物を含むことを特徴とする請求項１に記載のがん患者の選択方法。
【請求項３】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体であることを特徴とする請求項１または２に記載のがん患者の選択方法。
【請求項４】
Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡが、ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡ領域を標的とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のがん患者の選択方法。
【請求項５】
Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡが、ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を標的とすることを特徴とする請求項４に記載のがん患者の選択方法。
【請求項６】
Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−５０３および／またはｍｉＲ−４２４であることを特徴とする請求項５に記載のがん患者の選択方法。
【請求項７】
がんが、固形がんであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のがん患者の選択方法。
【請求項８】
ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つ以上を含むことを特徴とするキット。
（ａ）Ｒｉｃｔｏｒの発現量を測定するための試薬
（ｂ）４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いを測定するための試薬
（ｃ）Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量を測定するための試薬
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者の選択方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin）はマクロライド系抗生物質ラパマイシンの標的分子として同定されたセリン・スレオニンキナーゼである。ｍＴＯＲ（ＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ１、またはＲＡＦＴ１とも言われる）は、ほとんど全ての臓器、組織に発現しており、細胞の生存や増殖などの調節に中心的な役割を果たすと考えられている。ｍＴＯＲは、Ｒａｐｔｏｒ（regulatoy associated protein of mTOR）およびＲｉｃｔｏｒ（rapamycin-insensitive companion of mTOR）などのアダプタータンパク質とそれぞれｍＴＯＲＣ１複合体およびｍＴＯＲＣ２複合体を形成し、細胞外からのシグナルを伝達する（非特許文献１参照）。
【０００３】
ｍＴＯＲ阻害剤はｍＴＯＲの活性を阻害することにより、細胞周期の進行や血管新生を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制すると考えられている。ｍＴＯＲ阻害剤であるラパマイシンは、細胞内でＦＫＢＰ１２（ＦＫ−５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合して複合体を形成し、この複合体がｍＴＯＲに結合することによりｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻害する。現在、種々のラパマイシン誘導体が、様々ながん腫に対する臨床試験に用いられている。例えば、ラパマイシン誘導体であるエベロリムスやテムシロリムスは根治切除不能または転移性の腎細胞がんに効果が認められている。最近、Ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ（ＡＰ２３５７３）は、転移を有する軟部組織肉腫・骨肉腫に対して有効であることが示された。さらに、ｍＴＯＲ阻害剤が膵の神経内分泌腫瘍にも有用性が明らかとなっている。また、一部の転移性乳がんに対して、従来の治療法とｍＴＯＲ阻害剤を併用することで効果があることも報告されている（非特許文献２参照）。
【０００４】
ｍＴＯＲＣ２はラパマイシンにより阻害されないため、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２を共に阻害する新規ｍＴＯＲ阻害剤（Ｔｏｒｉｎ１、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｋｕ−００６３７９４など）が報告されている。これらは、ｍＴＯＲのＡＴＰ結合部位に対して競合的に作用するｍＴＯＲキナーゼ阻害剤である。これらは、ラパマイシンよりも効果的にｍＴＯＲＣ１による基質のリン酸化を阻害するだけでなく、ｍＴＯＲＣ２のキナーゼ活性も選択的に抑制することが知られており、臨床応用に向けて開発が盛んに進められている（非特許文献２参照）。
しかし、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性はがん患者によって異なるため、ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を高い確率で選択できる有効な指標が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nat Rev Mol Cell Biol, 12(1), 21-35, 2011.
【非特許文献２】Drug Discov Today Ther Strateg, 6(2), 47-55, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択する方法であって、がん患者由来の試料におけるＲｉｃｔｏｒの発現量、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合い、およびＲｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量の少なくとも１つ以上を指標とすることを特徴とするがん患者の選択方法。
［２］試料が、がん患者由来のがん細胞またはその内容物を含むことを特徴とする前記［１］に記載のがん患者の選択方法。
［３］ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載のがん患者の選択方法。
［４］Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡが、ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡ領域を標的とすることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれかに記載のがん患者の選択方法。
［５］Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡが、ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を標的とすることを特徴とする前記［４］に記載のがん患者の選択方法。
［６］Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−５０３および／またはｍｉＲ−４２４であることを特徴とする前記［５］に記載のがん患者の選択方法。
［７］がんが、固形がんであることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載のがん患者の選択方法。
［８］ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択するためのキットであって、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つ以上を含むことを特徴とするキット。
（ａ）Ｒｉｃｔｏｒの発現量を測定するための試薬
（ｂ）４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いを測定するための試薬
（ｃ）Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量を測定するための試薬
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を、迅速かつ高確率で選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】８種類のトリプルネガティブ乳がん細胞の細胞溶解液を試料として、ｍＴＯＲシグナルに関わる分子に対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図２】５種類のトリプルネガティブ乳がん細胞から調製したトータルＲＮＡを試料として、ｍｉＲ−５０３の発現量をリアルタイムＰＣＲで評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
乳がんを引き起こし増殖に関係する主要な因子として、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２が知られている。これらのいずれかが陽性の乳がん患者には、タモキシフェン（商品名ノルバデックスなど）やトラスツズマブ（商品名ハーセプチン）などの薬剤が投与されている。一方、これらのいずれの因子も陰性の乳がんは「トリプルネガティブ」と呼ばれ、選択する薬剤がなく、一般に予後が悪いとされている。
本発明者らは、複数のトリプルネガティブ乳がん細胞についてｍＴＯＲ阻害剤の有効性を検討した結果、細胞の種類によってｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性に差があることを見出した。さらに検討した結果、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が高いトリプルネガティブ乳がん細胞に共通する性質を見出した。
【００１１】
〔ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者の選択方法〕
本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択する方法を提供するものであり、がん患者由来の試料におけるＲｉｃｔｏｒの発現量、４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合い、およびＲｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量の少なくとも１つ以上を指標とすることを特徴としている。２つ以上を指標とすることが好ましく、その場合、Ｒｉｃｔｏｒの発現量および４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いを組み合わせることが好ましい。より好ましくは、３つ全部を指標とすることである。
【００１２】
ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲの活性を阻害することにより抗がん作用を奏する薬剤であれば特に限定されない。具体的は、例えばラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＰＩ-１０３、ＮＶＰ-ＢＥＺ２３５、ＸＬ-７６５、ＧＳＫ２１２６４５８、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、ＰＰ４８７、ＰＰ１２１、ＫＵ-００６３７９４、ＫＵ-ＢＭＣＬ-２００９０８０６９-１、ＫＵ-ＢＭＣＬ-２００９０８０６９-５、ＷＡＹ-００１、ＷＡＹ-６００、ＷＹＥ-６８７、ＷＹＥ-３５４、Ｗｙｅｔｈ-ＢＭＣＬ-２００９１００７５-９ｂ、Ｗｙｅｔｈ-ＢＭＣＬ-２００９１００９６-２７、Ｐ５２９、Ｐ２２８１、Ｔｏｒｉｎ１などが挙げられる。好ましくはラパマイシンまたはその誘導体である。ラパマイシン誘導体としては、例えばエベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス（ＡＰ２３５７３）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
がんの種類は特に限定されず、ｍＴＯＲ阻害剤が有効である可能性のあるがんであればどのようながんでも本発明の方法を適用することができる。したがって、本発明の方法を適用可能ながんは、固形がんでもよく血液がんでもよい。好ましくは固形がんである。固形がんは、固形の形状があるがんを意味し、例えば、乳がん、肝がん、胃がん、肺がん、すい臓がん、腎臓がん、頭頸部がん、子宮頸部がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、食道がん、脳腫瘍、骨腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは上皮性固形がんである。
【００１４】
試料は被験がん患者由来の試料であれば特に限定されない。具体的には、例えば、血液、組織液、リンパ液、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類；皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織；鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液；透析排液などが挙げられる。好ましくはがん細胞またはその内容物を含む試料であり、より好ましくはがん細胞を含む組織である。さらに好ましくは固形がん組織を含む生検試料である。
【００１５】
Ｒｉｃｔｏｒは、ｍＴＯＲと結合してｍＴＯＲＣ２複合体を形成するタンパク質である。ヒトＲｉｃｔｏｒをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）は、アクセッション番号：ＮＭ＿１５２７５６で登録されており、そのアミノ酸配列（配列番号２）は、アクセッション番号：ＮＰ＿６８９９６９で登録されている。
【００１６】
４Ｅ−ＢＰ１（eIF4EBP-1; eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 ）は、ｍＴＯＲＣ１の代表的生理基質と考えられる翻訳調節因子であり、タンパク質合成の制御に関わることが知られている。リン酸化されていない４Ｅ−ＢＰ１はｅＩＦ４Ｅに結合し、ｅＩＦ４Ｅが５’−キャップ構造を持つｍＲＮＡに結合するのを妨げでいるが、ｍＴＯＲＣ１が４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化すると、ｅＩＦ４Ｅの機能が回復する。ヒト４Ｅ−ＢＰ１をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号３）は、アクセッション番号：ＮＭ＿００４０９５で登録されており、そのアミノ酸配列（配列番号４）は、アクセッション番号：ＮＰ＿００４０８６で登録されている。
【００１７】
本発明の方法では、試料におけるＲｉｃｔｏｒの発現量、および４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いがｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効な患者を選択するための指標となる。具体的には、試料中のＲｉｃｔｏｒの発現量が低い患者をｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効である蓋然性が高い患者として選択でき、試料中の４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いが高い患者をｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効である蓋然性が高い患者として選択することができる。
【００１８】
Ｒｉｃｔｏｒの発現量は、試料中のＲｉｃｔｏｒのタンパク質量、またはＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡ量を測定することにより評価することができる。Ｒｉｃｔｏｒのタンパク質量は、試料から公知の方法でタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法などが挙げられる。また、試料中のＲｉｃｔｏｒのタンパク質量は、試料の組織切片（凍結切片、パラフィン切片など）を作製して、抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体を用いた免疫組織染色によっても評価することができる。抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体は、市販の抗体を購入して使用することができる。また公知の抗体作製方法で所望の抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体を自作してもよい。
ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡ量は、試料から公知の方法でＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、アレイ法、シーケンサーによる配列解析法などが挙げられる。
【００１９】
試料におけるＲｉｃｔｏｒの発現量の高低は、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が高くかつＲｉｃｔｏｒ発現量が低いことが確認されている細胞、および、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が低くかつＲｉｃｔｏｒ発現量が高いことが確認されている細胞を対照として用い、対照細胞のＲｉｃｔｏｒ発現量と比較することにより判定することができる。ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が高くかつＲｉｃｔｏｒ発現量が低いことが確認されている細胞としては、例えば乳がん細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１３２）、Ｈｓ５７８Ｔ（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１２６）、ＢＴ−５４９（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１２２）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が低くかつＲｉｃｔｏｒ発現量が高いことが確認されている細胞としては、例えば乳がん細胞株のＨＣＣ１９３７（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２３３６）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１３０）、ＭＤＡ−ＭＢ−２１３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−２６）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性とＲｉｃｔｏｒ発現量に関する背景データを蓄積し、これに基づいて判定することもできる。
【００２０】
４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いは、試料中のリン酸化４Ｅ−ＢＰ１を定量することにより評価することができる。例えば、試料から公知の方法でタンパク質を抽出し、抗リン酸化４Ｅ−ＢＰ１抗体を用いたウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法などにより定量することができる。また、試料中のリン酸化４Ｅ−ＢＰ１量は、試料の組織切片（凍結切片、パラフィン切片など）を作製して、抗リン酸化４Ｅ−ＢＰ１抗体を用いた免疫組織染色によっても評価することができる。抗リン酸化４Ｅ−ＢＰ１抗体は、市販の抗体を購入して使用することができる。また公知の抗体作製方法で所望の抗リン酸化４Ｅ−ＢＰ１抗体を自作してもよい。
【００２１】
試料における４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いの高低は、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が高くかつ４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いが高いことが確認されている細胞、および、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が低くかつ４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いが低いことが確認されている細胞を対照として用い、対照細胞の４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いと比較することにより判定することができる。ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が高くかつ４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いが高いことが確認されている細胞としては、例えば乳がん細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１３２）、Ｈｓ５７８Ｔ（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１２６）、ＢＴ−５４９（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１２２）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が低くかつ４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いが低いことが確認されている細胞としては、例えば乳がん細胞株のＨＣＣ１９３７（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２３３６）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１３０）、ＭＤＡ−ＭＢ−２１３（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−２６）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性と４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いに関する背景データを蓄積し、これに基づいて判定することもできる。
【００２２】
試料の組織切片の免疫組織染色による評価は、抗Ｒｉｃｔｏｒ抗体と抗リン酸化４Ｅ−ＢＰ１抗体とを同時に用いることにより、Ｒｉｃｔｏｒの発現量および４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いの２つの指標を同時に評価できる点で好適である。試料の組織切片の免疫組織染色により評価を行う場合は、例えば上記例示した対照細胞をマウス等の適当な実験動物に接種して腫瘍を形成させ、摘出した腫瘍組織を対照試料として、被験試料と同様に組織切片を作製して用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の方法では、Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量もｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効な患者を選択するための指標となる。具体的には、試料中のＲｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量が高い患者をｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効である蓋然性が高い患者として選択することができる。
【００２４】
ここでマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、細胞内に存在する約２０〜２５塩基程度の一本鎖ＲＮＡであり、タンパク質への翻訳はされないノンコーディングＲＮＡの一種である。自身の配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡを標的として、ｍＲＮＡの翻訳抑制またはｍＲＮＡの分解を促進することにより遺伝子発現を負に制御する。複数のヒトがん種において、マイクロＲＮＡの発現異常が報告され、発がんおよびがん悪性化過程におけるマイクロＲＮＡの機能破綻の重要性が示唆されている。また、がんの薬剤耐性と発現に相関性を示すマイクロＲＮＡがいくつか報告されており、化学療法を行う際の薬剤の選択や、予後の予測の判断因子として期待されている。
【００２５】
Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡは特に限定されないが、ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡを標的とするマイクロＲＮＡが好ましく、ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を標的とするマイクロＲＮＡがより好ましい。配列番号１で表される塩基配列がヒトＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡに相当し、配列番号１で表される塩基配列の第５１５２位〜第９５３５位がヒトＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域に相当する。ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を標的とするマイクロＲＮＡとしては、例えば、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（http://www.targetscan.org/vert_50/）において、標的遺伝子にＲｉｃｔｏｒを選択して検索することによりヒットするマイクロＲＮＡが挙げられる。具体的には、例えば、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３３、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−１９６ａｂ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１２７１、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１などが挙げられる。
【００２６】
ＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡの３’ＵＴＲのなかでも配列番号１で表される塩基配列の第８９００位〜第９５３５位に相当するＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡ領域を標的とするマイクロＲＮＡがより好ましい。このようなマイクロＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１２７１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４９７などが挙げられる。
さらに好ましくは、配列番号１で表される塩基配列の第９２００位〜第９３００位に相当するＲｉｃｔｏｒのｍＲＮＡ領域を標的とするマイクロＲＮＡであり、特に好ましくはｍｉＲ−５０３およびｍｉＲ−４２４である。
マイクロＲＮＡの詳細な情報は、マイクロＲＮＡのデータベース（例えばｍｉＲＢａｓｅ、http://www.mirbase.org/）から入手することができる。ｍｉＲＢａｓｅにおけるヒトｍｉＲ−５０３のアクセッション番号はＭＩ０００３１８８、ヒトｍｉＲ−４２４のアクセッション番号はＭＩ０００１４４６である。
【００２７】
Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量は、測定対象のマイクロＲＮＡを特定し、試料中の当該マイクロＲＮＡを測定することにより評価することができる。具体的には、試料から公知の方法でＲＮＡを抽出し、公知のＲＮＡ測定方法を用いて定量することができる。公知のＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、アレイ法、シーケンサーによる配列解析法などが挙げられる。
【００２８】
試料における特定のマイクロＲＮＡの発現量の高低は、例えば、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が高くかつ特定のマイクロＲＮＡの発現量が高いことが確認されている細胞、および、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が低くかつ当該マイクロＲＮＡの発現量が低いことが確認されている細胞を対照として用い、対照細胞の当該マイクロＲＮＡ発現量と比較することにより判定することができる。ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が高くかつｍｉＲ−５０３の発現量が高いことが確認されている細胞としては、例えば乳がん細胞株のＢＴ−５４９（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１２２）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性が低くかつｍｉＲ−５０３の発現量が低いことが確認されている細胞としては、例えば乳がん細胞株のＨＣＣ１９３７（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２３３６）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１３０）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−２６）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、ｍＴＯＲ阻害剤に対する感受性と特定のマイクロＲＮＡの発現量に関する背景データを蓄積し、これに基づいて判定することもできる。
【００２９】
〔キット〕
本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤の投与が有効ながん患者を選択するためのキットを提供する。本発明のキットを用いることにより、上記本発明の方法を簡便かつ迅速に実施することができる。本発明のキットは、以下の（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つ以上を含むものであればよい。
（ａ）Ｒｉｃｔｏｒの発現量を測定するための試薬
（ｂ）４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いを測定するための試薬
（ｃ）Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量を測定するための試薬
【００３０】
Ｒｉｃｔｏｒの発現量を測定するための試薬としては、例えばＲｉｃｔｏｒと特異的に結合する抗体が挙げられる。Ｒｉｃｔｏｒと特異的に結合する抗体を含む場合には、標識された二次抗体、発色用試薬などをさらに含むことが好ましい。また、Ｒｉｃｔｏｒの発現量を測定するための試薬としては、例えばＲｉｃｔｏｒ遺伝子を検出するためのプライマーセットが挙げられる。Ｒｉｃｔｏｒ遺伝子を検出するためのプライマーセットを含む場合には、試料からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用チューブ、ＰＣＲ用プレートなどをさらに含むことが好ましい。また、Ｒｉｃｔｏｒの発現量を測定するための試薬としては、例えばＲｉｃｔｏｒ遺伝子と相補的に結合する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が挙げられる。Ｒｉｃｔｏｒ遺伝子と相補的に結合する核酸は適切な担体に結合していることが好ましく、アレイの形態であることがより好ましい。Ｒｉｃｔｏｒ遺伝子と相補的に結合する核酸を含む場合には、試料からＲＮＡを調製するための試薬、検出用蛍光試薬などをさらに含むことが好ましい。
【００３１】
４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いを測定するための試薬としては、例えばリン酸化４Ｅ−ＢＰ１と特異的に結合する抗体が挙げられる。リン酸化４Ｅ−ＢＰ１と特異的に結合する抗体を含む場合には、標識された二次抗体、発色用試薬などをさらに含むことが好ましい。
【００３２】
Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量を測定するための試薬としては、例えばＲｉｃｔｏｒの発現制御に関わる特定のマイクロＲＮＡを検出するためのプライマーセットが挙げられる。特定のマイクロＲＮＡを検出するためのプライマーセットを含む場合には、試料からＲＮＡを調製するための試薬、逆転写酵素、逆転写反応に用いる緩衝液、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、ＰＣＲ用チューブ、ＰＣＲ用プレートなどをさらに含むことが好ましい。また、Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わるマイクロＲＮＡの発現量を測定するための試薬としては、例えば特定のマイクロＲＮＡと相補的に結合する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が挙げられる。特定のマイクロＲＮＡと相補的に結合する核酸は適切な担体に結合していることが好ましく、アレイの形態であることがより好ましい。特定のマイクロＲＮＡと相補的に結合する核酸を含む場合には、試料からＲＮＡを調製するための試薬、検出用蛍光試薬などをさらに含むことが好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
〔乳がん細胞のｍＴＯＲ阻害剤感受性の解析〕
８種のトリプルネガティブ乳がん細胞を用いた（表１参照）。ｍＴＯＲ阻害剤として、ラパマイシン（Rapamycin; SIGMA）およびその誘導体であるテムシロリムス（Temsirolimus; SIGMA）を用いた。細胞の培養には、１０％血清を含む培地（DMEM、RPMIまたはMEM）を用いた。各細胞を９６ウェルプレートに２０００個／１００μＬ／ウェルで播き、ラパマイシンまたはテムシロリムスを０、１、１０および１００ｎＭの各濃度になるよう添加し、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で静置培養した。培養３日後にＷＳＴ−１試薬（Roche）を１０μＬ／ウェル添加し、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で３０分間反応させた。反応終了後、マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。薬剤無添加（0nM）の値を１００％とし、それぞれの薬剤濃度における生細胞の割合で感受性を評価した。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
ラパマイシンの結果を表２に、テムシロリムスの結果を表３にそれぞれ示した。表２および表３から明らかなように、８種のトリプルネガティブ乳がん細胞はそれぞれラパマイシンまたはテムシロリムスの添加により細胞増殖が抑制された。一方、細胞によって細胞増殖抑制効果の見られる薬剤濃度が異なることを見出した。この結果から、トリプルネガティブ乳がん細胞によって、ｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性に差があることが明らかとなった。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
【表３】
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【００３９】
〔薬剤感受性に伴って変動するタンパク質の探索〕
薬剤感受性に伴って変動するタンパク質を探索するために、実施例１で使用した８種類のトリプルネガティブ乳がん細胞について、表４に記載のｍＴＯＲシグナルに関わる分子の量を各タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより評価した。具体的には、実施例１で使用した８種類のトリプルネガティブ乳がん細胞に、それぞれ２×ＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅバッファーを加えて９８℃で１０分間煮沸し、細胞溶解液を調製した。各細胞溶解液ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ｍＴＯＲシグナルに関わる分子に対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。なお、内部標準としてＧＡＰＤＨを抗ＧＡＰＤＨ抗体（Santa Cruz Biotechnology社 #sc-32233）を用いて検出した。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
結果を図１に示した。図１から明らかなように、ｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性が高いＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ−５４９およびＨＣＣ３８ではＲｉｃｔｏｒの発現が減少していることが示された。また、ｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性が高いＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｈｓ５７８Ｔ、ＢＴ−５４９、ＢＴ−２０およびＨＣＣ３８では４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化が亢進していることが示された。図示していないが、Ｒｉｃｔｏｒおよびリン酸化４Ｅ−ＢＰ１以外のタンパク質は、ｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性に伴う変動は認められなかった。この結果から、がん細胞におけるＲｉｃｔｏｒの発現量または４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化の度合いを調べることで、がん細胞のｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性を推測できると考えられた。
【００４２】
〔薬剤感受性に伴って変動する遺伝子の探索〕
薬剤感受性に伴って変動する遺伝子を探索するために、実施例１で使用したトリプルネガティブ乳がん細胞について、Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わる可能性のあるマイクロＲＮＡ量を測定し、評価した。具体的には、実施例１で使用した８種類のトリプルネガティブ乳がん細胞のうち５種に、それぞれＳｅｐａｚｏｌ試薬（ナカライテスク）を加え、常法に従ってトータルＲＮＡ液を調製した。Ｒｉｃｔｏｒの発現制御に関わる可能性のあるマイクロＲＮＡについて、それぞれのプローブ（Applied Biosystems）に対してリアルタイムＰＣＲを行った。なお、Ｒｉｃｔｏｒ遺伝子の発現制御に関わる可能性のあるマイクロＲＮＡは、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（http://www.targetscan.org/vert_50/）を用いて選択した。以下、ｍｉＲ−５０３のリアルタイムＰＣＲの方法および結果について示す。
【００４３】
リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ａｓｓａｙｓを用いて行った。逆転写は、１０ｎｇのトータルＲＮＡと、ｍｉＲ−５０３に特異的なプライマー（P/N: 4373228）と、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて行った。リアルタイムＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ａｓｓａｙｓの標準的なプロトコールに従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の７９００ＨＴ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。具体的には、１μｌの逆転写反応液に５μｌのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘと、０．５μｌのｍｉＲ−５０３プローブ（P/N: 4373228）と、水を加えて１０μｌとし、ＰＣＲ反応は３８４ウエルプレートを用いて９５℃１０分の後に、９５℃１５秒間および６０℃１分間を４０サイクル行った。ｍｉＲ−５０３の発現量は、内部標準であるＲＮＵ４８（Applied Biosystems社、P/N: 4373383）の発現量に対する比として計算した。
【００４４】
図２に結果を示した。図２から明らかなように、ｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性が低い細胞ほどｍｉＲ−５０３の発現量が減少していることが示された。この結果から、がん細胞におけるＲｉｃｔｏｒの発現制御に関わる可能性のあるマイクロＲＮＡの発現量を調べることで、がん細胞のｍＴＯＲ阻害剤に対する薬剤感受性を推測できると考えられた。
【００４５】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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