(57)【要約】      （修正有）【課題】乳酸生産能が向上したリゾプス属菌及び当該菌を用いた乳酸の製造方法の提供。【解決手段】リゾプス属菌の胞子を特定の条件で界面活性剤を含有する培養液中で発芽させ、菌糸体を得ることを含むリゾプス属菌の乳酸脱水素酵素活性の向上方法であって、当該界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＥＯ付加モル数５以下のＰＯＥアルキルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、リゾプス属菌の乳酸脱水素酵素活性の向上方法、及び当該リゾプス属菌の菌糸体を用いた乳酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（Ａ１）及び（Ｂ）：
（Ａ１）リゾプス属菌の胞子を、界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、乳酸脱水素酵素活性が向上した菌糸体を得る工程；及び
（Ｂ）得られた菌糸体をさらに第３の培養液中で培養し、乳酸を得る工程、
を含む乳酸の製造方法であって、
当該界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＥＯ付加モル数５以下のＰＯＥアルキルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、
乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記第３の培養液中における前記界面活性剤の濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１の培養液中における前記界面活性剤の濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以上２．５％（ｗ／ｖ）未満である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ＥＯ平均付加モル数が２０以下のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＥＯ平均付加モル数が５以下であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びＥＯ平均付加モル数が１０のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記工程（Ａ１）と工程（Ｂ）の間に、下記工程（Ａ２）：
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた菌糸体を第２の培養液中で増殖させる工程、
をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記第２の培養液中における前記界面活性剤の濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以下である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記リゾプス属菌が、Rhizopus oryzaeである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記Rhizopus oryzaeが、Rhizopus oryzae NBRC 4707、Rhizopus oryzae NBRC 4785、Rhizopus oryzae NBRC 5384、及びRhizopus oryzae NBRC 5418からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
下記工程（Ａ１）：
（Ａ１）リゾプス属菌の胞子を、界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得る工程、
を含むリゾプス属菌の乳酸脱水素酵素活性の向上方法であって、
当該界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＥＯ付加モル数５以下のＰＯＥアルキルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、
リゾプス属菌の乳酸脱水素酵素活性の向上方法。
【請求項１０】
前記第１の培養液中における前記界面活性剤の濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以上２．５％（ｗ／ｖ）未満である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ＥＯ平均付加モル数が２０以下のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＥＯ平均付加モル数が５以下であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びＥＯ平均付加モル数が１０のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（Ａ１）の後に、下記工程（Ａ２）：
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた菌糸体を第２の培養液中で増殖させる工程、
をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の培養液中における前記界面活性剤の濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以下である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記リゾプス属菌が、Rhizopus oryzaeである、請求項９〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記Rhizopus oryzaeが、Rhizopus oryzae NBRC 4707、Rhizopus oryzae NBRC 4785、Rhizopus oryzae NBRC 5384、及びRhizopus oryzae NBRC 5418からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれか１項記載の方法により乳酸脱水素酵素活性が向上したリゾプス属菌を得ることを含む、乳酸生産能の向上したリゾプス属菌の生産方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法により生産されたリゾプス属菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生分解性プラスチック材料として注目されるポリ乳酸（poly-lactic acid、ＰＬＡ）の原料となる乳酸は、植物由来原料から生物学的な生産法により得られる。このため、ＰＬＡは大気中のＣＯ2量を増加させない素材（カーボンニュートラル素材）と言われる。乳酸には、光学異性体のＤ−体とＬ−体が存在するが、プラスチック材料としてのポリ乳酸の特性を制御するには、光学純度の高い乳酸が必要とされる。
【０００３】
従来、生物学的な乳酸生産法としては、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）等の乳酸菌を嫌気的に培養し、乳酸発酵させる方法が知られている（非特許文献１）。さらに、Ｌ−乳酸を特異的に生産する方法として、糸状菌であるリゾプス属（Rhizopus）を培養する方法が知られている（特許文献１〜３）。リゾプス属菌を用いた乳酸生産は、光学純度の高い乳酸が得られること、比較的単純な培地組成にて培養が可能であること等の利点があるが、一方で、生産速度の面で満足のいくものではない。
【０００４】
糸状菌の培養では、接種量をコントロールするために、スラント等の固体培地にて十分増殖させることにより胞子を形成させ、その胞子を無菌水等に少量の界面活性剤により分散させ、単位培地当たり一定の胞子数となるように接種することが一般的に行われている（例えば特許文献２及び４）。また、一般的な糸状菌の培養法として、固体培養又は液体培養が知られている。リゾプス属を用いた物質生産には専ら液体培養が用いられ、この際の菌体形態は、繊維状、塊状、又はペレット状など様々な形態が利用されている（非特許文献２、特許文献２〜５）。
【０００５】
リゾプス属菌を用いた乳酸生産において、その生産能を向上させるため、培地条件、培養条件などが種々検討されている（非特許文献３、特許文献３、４、６）。非特許文献４では、乳酸生産能と乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性に相関を見出しており、Rhizopus oryzaeに遺伝子組換え技術によりＬＤＨを導入し高発現させることで、乳酸生産能を向上させることに成功している。しかしながら、遺伝子組換えに因らずリゾプス属菌のＬＤＨ活性を向上させる方法は未だ明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５１−１２９９０号公報
【特許文献２】特開２０００−０３７１９６号公報
【特許文献３】特開２００６−２４６８４６号公報
【特許文献４】特開平６−２５３８７１号公報
【特許文献５】特開平９−０７７８０３号公報
【特許文献６】米国特許第４５６４５９４号公報
【０００７】
【非特許文献１】Enzyme and Microbial Technology (2000) vol.26:87-107
【非特許文献２】生物工学会誌（2000）第78巻第12号:487-493
【非特許文献３】Applied Biochemistry and Biotechnology (1999) vol.78:401-407
【非特許文献４】Applied Microbiology and Biotechnology (2004) vol.64:237-242
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、リゾプス属菌の乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性又は乳酸生産能を向上させる方法、当該方法で得られたＬＤＨ活性又は乳酸生産能が向上したリゾプス属菌、及び当該リゾプス属菌を用いて効率よく乳酸を製造する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、人工的な遺伝子組換え技術に因らないで、リゾプス属菌の乳酸生産能を向上させる方法について検討した。その結果、本発明者らは、特定の条件で界面活性剤を含有する培地で胞子から発芽させ、菌糸体へと成長させたリゾプス属菌が、高いＬＤＨ活性を示し、さらに高い乳酸生産能を有することを見出した。また本発明者らは、当該リゾプス属菌を培養することにより、効率よく乳酸を製造することができることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記工程（Ａ１）：
（Ａ１）リゾプス属菌の胞子を、界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得る工程、
を含むリゾプス属菌の乳酸脱水素酵素活性（ＬＤＨ）の向上方法であって、
当該界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＥＯ付加モル数５以下のＰＯＥアルキルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、リゾプス属菌の乳酸脱水素酵素活性の向上方法を提供する。
【００１１】
また本発明は、上記本発明のＬＤＨ活性向上方法により乳酸脱水素酵素活性が向上したリゾプス属菌を得ることを含む、乳酸生産能の向上したリゾプス属菌の生産方法を提供する。
【００１２】
また本発明は、上記生産方法で得られたリゾプス属菌を提供する。
【００１３】
また本発明は、下記工程（Ａ１）及び（Ｂ）：
（Ａ１）リゾプス属菌の胞子を、界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、乳酸脱水素酵素活性が向上した菌糸体を得る工程；及び
（Ｂ）得られた菌糸体をさらに第３の培養液中で培養し、乳酸を得る工程、
を含む乳酸の製造方法であって、
当該界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＥＯ付加モル数５以下のＰＯＥアルキルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種である、乳酸の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により得られたリゾプス属菌の菌体は、高いＬＤＨ活性を有しており、乳酸生産能も向上している。当該菌体を培養することにより、効率よく乳酸を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
一態様において、本発明は、リゾプス属菌のＬＤＨ活性を向上する方法を提供する。ＬＤＨは、ピルビン酸を乳酸へと変換する酵素であり、ＬＤＨ活性の高いリゾプス属菌がより多くの乳酸を生産することが報告されている。本発明により得られたリゾプス属菌は、高いＬＤＨ活性や高い乳酸生産能を有しており、乳酸製造用のリゾプス属菌として有用である。
【００１６】
上記本発明のＬＤＨ活性向上方法に供されるリゾプス属菌としては、生来的にＬＤＨ活性を有するリゾプス属菌、及び生来的に乳酸生産能を有するリゾプス属菌が挙げられる。ＬＤＨ活性の向上、乳酸生産能の向上の観点から、本発明の方法に供される好ましいリゾプス属菌としては、Rhizopus oryzae、Rhizopus arrhizus、Rhizopus chinensis、Rhizopus nigricans、Rhizopus tonkinensis、Rhizopus tritici等が挙げられる。さらに、本発明のＬＤＨ活性向上方法に供されるリゾプス属菌は、生来的にはＬＤＨ活性又は乳酸生産能がない又は低いが、人工的にＬＤＨ活性又は乳酸生産能が向上する改変を加えられたリゾプス属菌であってもよい。そのようなリゾプス属菌の例としては、乳酸生産能が低いRhizopus属菌株にｌｄｈＡ遺伝子を導入したRhizopus属菌株が挙げられる。上記に挙げたリゾプス属菌のうち、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能の向上性の観点、入手性の観点からは、Rhizopus oryzae がより好ましい。好ましいRhizopus oryzae菌株としては、菌株保存機関である（独）製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ）に寄託され、登録されているRhizopus oryzaeのＮＢＲＣ ４７０７、ＮＢＲＣ ４７８５、ＮＢＲＣ ５３８４、及びＮＢＲＣ ５４１８が挙げられる。これらの菌株は、ＮＢＲＣのほか、独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター（Ｒｉｋｅｎ  ＢＲＣ）等から入手可能である。
【００１７】
本発明のＬＤＨ活性向上方法は、ＬＤＨ活性又は乳酸生産性の向上が所望される上記に挙げたリゾプス属菌の胞子を、界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得る工程（以下、「工程（Ａ１）」ということがある。）を含む。
【００１８】
工程（Ａ１）に供するリゾプス属菌は全て胞子であることが好ましいが、菌糸を含んでいてもよい。リゾプス属菌の胞子は、例えば、上記に挙げたリゾプス属菌を含む胞子懸濁液を培地に接種して静置培養し、目視により菌糸成長と胞子形成を確認した後、培養物を界面活性剤を含む液体に懸濁し、静置後、上清を胞子懸濁液として回収することで調製することができる。回収した胞子懸濁液中の胞子数は、顕微鏡観察下でヘモサイトメーター等を用いて計数することができる。胞子懸濁液は、適宜希釈して所望の胞子数に調整することができる。
【００１９】
工程（Ａ１）においては、上記で得られた胞子懸濁液を、第１の培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種するリゾプス属菌の胞子数は、好ましくは１×１０2〜５×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、より好ましくは５×１０2〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液、さらに好ましくは１×１０3〜１×１０4個−胞子／ｍＬ−培養液である。工程（Ａ１）で使用する胞子発芽用の第１の培養液には、市販の培地、例えば、ポテトデキストロース培地（以下、ＰＤＢ培地、例えばベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー製）、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（以下、ＬＢ培地「ダイゴ」、例えば日本製薬製）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（以下、ＮＢ培地、例えばベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製）、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地（以下、ＳＢ培地、例えばＯＸＯＩＤ製）等が利用できる。必要に応じて、工程（Ａ１）で使用する第１の培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖；グリセリン、クエン酸などの生体成分；窒素源として硫酸アンモニウム、尿素等、アミノ酸等；その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、クエン酸の好ましい濃度は０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム、尿素及びアミノ酸の好ましい濃度は０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、無機物の好ましい濃度は０．０００１〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００２０】
さらに、工程（Ａ１）で使用される第１の培養液は、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）ソルビタン脂肪酸エステル、エチレンオキサイド（ＥＯ）平均付加モル数が５以下のポリオキシエチレン（ＰＯＥ）アルキルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種の界面活性剤を含有する。これらの界面活性剤の存在下でリゾプス属菌を胞子から菌糸体へと培養することにより、菌のＬＤＨ活性及び乳酸生産能が向上する。上記界面活性剤のうち、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能向上の観点、培養中の発泡を抑制する観点からは、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ＥＯ平均付加モル数が２０以下のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＥＯ平均付加モル数が５以下であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びＥＯ平均付加モル数が１０のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ＥＯ平均付加モル数が４であるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＥＯ平均付加モル数が３又は４であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、及びアルケニルコハク酸塩からなる群より選択される少なくとも１種がより好ましく、ソルビタンモノラウレートがさらに好ましい。
【００２１】
上記界面活性剤は、市販品を購入することができる。具体例として、ソルビタンモノラウレートとしては、レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｌ１０、レオドール（登録商標）スーパーＳＰ−Ｌ１０（いずれも花王製）；ソルビタンモノオレートとしては、レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｏ１０Ｖ；ＥＯ平均付加モル数が２０以下のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしては、レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｌ１０６、レオドール（登録商標）スーパーＴＷ−Ｌ１２０（いずれも花王製）；ＥＯ平均付加モル数が５以下のポリオキシエチレンラウリルエーテルとしては、エマルゲン（登録商標）１０３、エマルゲン（登録商標）１０４Ｐ、エマルゲン（登録商標）１０６（いずれも花王製）；デオキシコール酸塩としては、デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業製）；アルケニルコハク酸塩としては、ラテムル（登録商標）ＡＳＫ（花王製）；ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルとしては、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社)、等を挙げることができる。
【００２２】
工程（Ａ１）に使用する第１の培養液には、上述した界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種を添加すればよい。当該第１の培養液における上記界面活性剤の濃度は、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能向上の観点から、培養液中の最終濃度として、０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以上である。また、同様の観点から、当該界面活性剤の培養液中の最終濃度は、好ましくは２．５％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）未満、さらに好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）未満、さらにより好ましくは０．８％（ｗ／ｖ）未満である。さらに、工程（Ａ１）で用いる培養液中における上記界面活性剤の濃度は、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能向上の観点から、培養液中の最終濃度として、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上２．５％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上１．５％（ｗ／ｖ）未満、さらに好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上１．０％（ｗ／ｖ）未満、さらにより好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以上０．８％（ｗ／ｖ）未満である。
【００２３】
工程（Ａ１）においては、上記界面活性剤を含有する第１の培養液を用いて、上記リゾプス属菌を培養する。培養は、通常の手順にて行なえばよい。例えば、当該界面活性剤を含有する第１の培養液を含む培養容器に、リゾプス属菌胞子を接種し、好ましくは８０〜２５０ｒｐｍ、より好ましくは１００〜１７０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、好ましくは２４〜１２０時間、より好ましくは４８〜７２時間培養する。培養に供する第１の培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は５０〜１００ｍＬ程度、５００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は１００〜３００ｍＬ程度であればよい。この培養により、リゾプス属菌胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。
【００２４】
本発明のＬＤＨ活性向上方法は、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能向上の観点から、さらに、工程（Ａ１）で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程（以下、工程（Ａ２）ということがある。）を含むことが好ましい。工程（Ａ２）で使用する増殖用の培養液（以下、「第２の培養液」ということがある。）は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．０５〜２％硫酸アンモニウム、０．０３〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。第２の培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、５００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は５０〜３００ｍＬ、好ましくは１００〜２００ｍＬであればよい。この培養液に、工程（Ａ１）で培養したリゾプス属菌菌糸体を、湿重量として１〜６ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地、好ましくは３〜４ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地となるよう接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、１２〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間培養する。
【００２５】
工程（Ａ２）で使用する第２の培養液は、第１の培養液に関して上記で挙げた界面活性剤を含有している必要はないが、含んでいてもよい。第２の培養液中における当該界面活性剤の濃度は、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能の向上の観点から、工程（Ａ１）で使用した第１の培養液中の該界面活性剤濃度の５分の１以下であることが好ましく、より好ましくは１０分の１以下、さらに好ましくは２０分の１以下である。例えば、工程（Ａ２）で使用する第２の培養液における界面活性剤の濃度は、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能向上の観点から、培養液中の最終濃度として、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である。
【００２６】
上記工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）により得られたリゾプス属菌の菌糸体は、好ましくはペレット形状を有している。さらに、１つ１つの粒がはっきり独立しており、表面が滑らかで、粒径０．５〜５ｍｍ程度、且つ互いにほぼ均一な形状を有するペレットであると、後述する乳酸製造過程において取り扱いやすく、且つ繰り返し使用しても形状が壊れにくいためより好ましい。培養の時間、温度、培養中の攪拌速度などを変更することにより、所望の大きさや外観のペレットを形成することができる。しかし、本発明の方法においては、必ずしも菌糸体をペレット化する必要はなく、また必ずしもペレットの大きさや外観を調節する必要はない。
【００２７】
次いで、上記工程（Ａ１）又は工程（Ａ２）により得られた菌糸体を、ＬＤＨ活性が向上したリゾプス属菌として回収する。菌糸体の回収方法は、特に限定されず、傾斜法、ろ過、遠心分離等の通常の方法によって行うことができる。
【００２８】
以上の本発明のリゾプス属菌のＬＤＨ活性の向上方法によって得られたリゾプス属菌は、ＬＤＨ活性が向上していることによって、より高い乳酸生産能を有することができる。したがって、本発明の別の態様として、上記工程（Ａ１）、好ましくはさらに上記工程（Ａ２）を含むリゾプス属菌の乳酸生産能の向上方法が提供される。
【００２９】
本発明のリゾプス属菌のＬＤＨ活性向上方法により、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能が向上したリゾプス属菌体を得ることができる。当該リゾプス属菌は、効率の良い乳酸製造に有用である。よって、本発明のさらに別の一態様として、上記工程（Ａ１）、好ましくはさらに上記工程（Ａ２）を行うことによってＬＤＨ活性又は乳酸生産能が向上したリゾプス属菌菌糸体を得ることを含む、ＬＤＨ活性又は乳酸生産能が向上したリゾプス属菌の生産方法が提供される。本発明のさらに別の一態様として、上記工程（Ａ１）、好ましくはさらに上記工程（Ａ２）を行うことによって得られた、ＬＤＨ活性又は乳酸生産能が向上したリゾプス属菌が提供される。
【００３０】
なお別の一態様において、本発明は、上記工程（Ａ１）、好ましくはさらに工程（Ａ２）によって得られたリゾプス属菌の菌糸体を培養する工程（以下、「工程（Ｂ）」ということがある。）をさらに含む、乳酸の製造方法を提供する。当該本発明の乳酸の製造方法においては、上記の手順で得られたＬＤＨ活性又は乳酸生産能が向上したリゾプス属菌の菌糸体を培養して当該菌に乳酸を生産させ、その後生産された乳酸を回収すればよい。
【００３１】
工程（Ｂ）で使用される乳酸生産用培養液（以下、「第３の培養液」ということがある。）は、グルコース等の炭素源、硫酸アンモニウム等の窒素源及び各種金属塩等を含み、乳酸を生産できる培養液であればよい。当該工程（Ｂ）に使用される第３の培養液としては、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．０５〜２％硫酸アンモニウム、０．０３〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１２．５％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。
【００３２】
工程（Ｂ）で使用する第３の培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容三角フラスコの場合は２０〜８０ｍＬ程度、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜２００ｍＬ程度であればよい。この第３の培養液に、上述のＬＤＨ活性又は乳酸生産能が向上したリゾプス属菌体を、湿重量として１０ｇ〜９０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液、好ましくは１５ｇ〜５０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液の量となるように接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４５℃の培養温度制御下で、４時間〜２４時間、好ましくは６時間〜１２時間培養する。
【００３３】
工程（Ｂ）で使用する第３の培養液は、第１の培養液に関して上記で挙げた界面活性剤を含有している必要はないが、含んでいてもよい。第３の培養液中の当該界面活性剤の濃度は、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能の向上の観点から、工程（Ａ１）で使用した第１の培養液中の界面活性剤濃度の５分の１以下であることが好ましく、より好ましくは１０分の１以下、さらに好ましくは２０分の１以下である。例えば、工程（Ｂ）で使用する培養液中の界面活性剤の濃度は、ＬＤＨ活性及び乳酸生産能向上の観点から、培養液中の最終濃度として、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である。
【００３４】
上記第３の培養液から培養上清を回収することにより、乳酸を得ることができる。必要に応じて、傾斜法、膜分離、遠心分離、電気透析法、イオン交換樹脂の利用、蒸留、塩析等の方法、又はこれらの組み合わせにより、当該培養液中の乳酸を乳酸塩として回収した後、回収された乳酸塩から乳酸を単離又は精製してもよい。以上の手順により、高純度且つ高収量でＬ−乳酸を製造することができる。
【００３５】
上記乳酸製造に供されたリゾプス属菌体は、乳酸製造のために繰り返し使用することができる。すなわち、乳酸を回収した後の第３の培養液から当該菌体を回収し、これを再度上記と同様に第３の培養液にて培養することで、再び乳酸を製造することができる。
【００３６】
本発明の乳酸の製造方法は、菌の培養と、培養液に蓄積した乳酸の回収及び培養液の入れ替えとを交互に行う回分式方法であってもよいが、一部の培養液を断続的又は連続的に入れ替えて、菌の培養と培養液からの乳酸の回収とを並行して行う半回分式又は連続的な方法であってもよい。
【００３７】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の組成物、製造方法、用途又は方法を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００３８】
＜１＞リゾプス属菌の乳酸脱水素酵素活性の向上方法であって、
リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得る工程を含む方法。
【００３９】
＜２＞乳酸脱水素酵素活性の向上したリゾプス属菌の生産方法であって、
リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得る工程を含む方法。
【００４０】
＜３＞リゾプス属菌の乳酸生産能の向上方法であって、
リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得る工程を含む方法。
【００４１】
＜４＞乳酸生産能の向上したリゾプス属菌の生産方法であって、
リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得る工程を含む方法。
【００４２】
＜５＞上記＜１＞〜＜４＞において、上記方法は、好ましくは、得られた菌糸体を第２の培養液中で増殖させる工程をさらに含む。
【００４３】
＜６＞リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、菌糸体を得ることによって生産されたリゾプス属菌。
【００４４】
＜７＞リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、得られた菌糸体を第２の培養液中で増殖させることによって生産されたリゾプス属菌。
【００４５】
＜８＞乳酸の製造方法であって、
（Ａ１）リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、乳酸脱水素酵素活性が向上した菌糸体を得る工程；及び
（Ｂ）得られた菌糸体を第３の培養液中で培養し、乳酸を得る工程、
を含む方法。
【００４６】
＜９＞乳酸の製造方法であって、
（Ａ１）リゾプス属菌の胞子を界面活性剤を０．０１％（ｗ／ｖ）以上含有する第１の培養液中で発芽させ、乳酸脱水素酵素活性が向上した菌糸体を得る工程；
（Ａ２）工程（Ａ１）で得られた菌糸体を第２の培養液中で増殖させる工程；及び
（Ｂ）工程（Ａ２）で得られた菌糸体を第３の培養液中で培養し、乳酸を得る工程、
を含む方法。
【００４７】
＜１０＞上記＜８＞〜＜９＞において、上記方法は、好ましくは、生産された乳酸を回収する工程をさらに含む。
【００４８】
＜１１＞上記＜１＞〜＜１０＞において、上記界面活性剤は、
好ましくは、ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル、ＥＯ付加モル数５以下のＰＯＥアルキルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種であり、
より好ましくは、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ＥＯ平均付加モル数が２０以下のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＥＯ平均付加モル数が５以下であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、デオキシコール酸塩、アルケニルコハク酸塩、及びＥＯ平均付加モル数が１０のポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルからなる群より選択される少なくとも１種であり、
さらに好ましくは、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ＥＯ平均付加モル数が４であるポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＥＯ平均付加モル数が３又は４であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、及びアルケニルコハク酸塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、
なお好ましくは、ソルビタンモノラウレートである。
【００４９】
＜１２＞上記＜１＞〜＜１１＞において、上記第１の培養液中における上記界面活性剤の濃度は、
該培養液中の最終濃度として、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以上であり、そして好ましくは２．５％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）未満、さらに好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）未満、さらにより好ましくは０．８％（ｗ／ｖ）未満であるか、又は
培養液中の最終濃度として、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上２．５％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上１．５％（ｗ／ｖ）未満、さらに好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上１．０％（ｗ／ｖ）未満、さらにより好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以上０．８％（ｗ／ｖ）未満である。
【００５０】
＜１３＞上記＜１＞〜＜１２＞において、上記リゾプス属菌は、好ましくはRhizopus oryzaeであり、より好ましくはRhizopus oryzae NBRC 4707、Rhizopus oryzae NBRC 4785、Rhizopus oryzae NBRC 5384及びRhizopus oryzae NBRC 5418からなる群より選択される。
【００５１】
＜１４＞上記＜５＞、＜７＞及び＜９＞〜＜１３＞において、第２の培養液における界面活性剤の濃度は、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である。
【００５２】
＜１５＞上記＜８＞〜＜１４＞において、第３の培養液における界面活性剤の濃度は、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは０．１５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以下である。
【００５３】
＜１６＞上記＜１＞〜＜１５＞において、リゾプス属菌の胞子は、第１の培養液中で下記条件にて培養される。
攪拌：好ましくは８０〜２５０ｒｐｍ、より好ましくは１００〜１７０ｒｐｍ
温度：好ましくは２５〜４２．５℃
時間：好ましくは２４〜１２０時間、より好ましくは４８〜７２時間
【００５４】
＜１７＞上記＜５＞、＜７＞及び＜９＞〜＜１６＞において、菌糸体は、第２の培養液中で下記条件にて培養される。
攪拌：好ましくは１００〜３００ｒｐｍ、より好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍ
温度：好ましくは２５〜４２．５℃
時間：好ましくは１２〜１２０時間、より好ましくは２４〜７２時間
【００５５】
＜１８＞上記＜８＞〜＜１７＞において、菌糸体は、第３の培養液中で下記条件にて培養される。
攪拌：好ましくは１００〜３００ｒｐｍ、より好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍ、
温度：好ましくは２５〜４５℃
時間：好ましくは４時間〜２４時間、より好ましくは６時間〜１２時間
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００５７】
製造例１  胞子懸濁液の調製法
菌株保存機関であるＲｉｋｅｎ  ＢＲＣ（理研バイオリソースセンター）より入手したRhizopus oryzae JCM14625株（＝NBRC 5384）の胞子懸濁凍結保存試料（−８０℃）をＰＤＡ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ、ベクトン・ディッキンソン  アンド  カンパニー製）に１白金耳接種し、３０℃にて７〜１０日間静置培養を行なった。菌糸成長と胞子形成に伴う菌糸先端の黒色化を目視にて確認し、これに生理食塩水を３０〜４０ｍＬ加え、菌糸とともに胞子を白金耳にて５０ｍＬ容フタ付き遠心チューブ（グライナー製）に移し採り、チューブ内で激しく混和した。混和後の胞子懸濁液を３ＧＰ１００円筒ロート形ガラスろ過器（柴田科学製）にてろ過し、これを胞子液とした。胞子液中の胞子数は、生理食塩水にて適宜希釈し、ヘモサイトメーター（血球計算盤、Ｄ＝１／５０ｍｍ・１／４００ｍｍ2）を用いて測定した。
【００５８】
製造例２  菌糸体の調製
２００ｍＬ容バッフル付三角フラスコ（旭硝子製）に下記に記載の界面活性剤を無添加又は最終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）添加した８０ｍＬのＰＤＢ培地を供し、製造例１で調製したRhizopus oryzae の胞子懸濁液を１×１０3個−胞子／ｍＬ−培地となるように接種後、２７℃にて３日間、１７０ｒｐｍで撹拌培養した。菌糸体はフィルター上に残るため、上記の培養物を予め滅菌処理したメッシュ網目２５０μｍのステンレスふるい（アズワン製）を用いて濾過し、菌体をフィルター上に回収した。
界面活性剤
ソルビタンモノラウレート：レオドール（登録商標）SP-L10（花王）
ソルビタンモノオレート：レオドール（登録商標）SP-O10V（花王）
ポリオキシエチレン（3）ラウリルエーテル：エマルゲン（登録商標）103（花王）
ポリオキシエチレン（4）ラウリルエーテル：エマルゲン（登録商標）104P（花王）
ポリオキシエチレン（5）ラウリルエーテル：エマルゲン（登録商標）106（花王）
ポリオキシエチレン（6）ラウリルエーテル：エマルゲン（登録商標）108（花王）
ポリオキシエチレン（4）ソルビタンモノラウレート：レオドール（登録商標）TW-L106（花王）
ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート：レオドール（登録商標）TW-L120（花王）
デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業）
アルケニルコハク酸カリウム塩（28%）：ラテルム（登録商標）ASK（花王）
ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル：TRITON（登録商標）X-100（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）
（界面活性剤の名称における「ポリオキシエチレン」に続く（  ）内の数字は、ＥＯ平均付加モル数を表す。）
【００５９】
製造例３  菌糸体の増殖
５００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液１００ｍＬ（組成：１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に、回収した菌体３．０〜４．０ｇ（湿重量）を接種し、２７℃で約４０時間、２２０ｒｐｍにて撹拌培養した。続いて、上記無機培養液にて培養を行なった培養物を、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて濾過し、フィルター上に菌体を回収した。さらにこのフィルターホルダー上で、１００ｍＬの生理食塩水で菌体を洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。得られた菌体を、以下のＬＤＨ活性評価及び乳酸発酵生産能評価に用いた。
【００６０】
試験例１  ＬＤＨ活性評価−１
製造例３で得られたリゾプス属菌の湿菌体６．０ｇを、２００ｍＬ容三角フラスコに供した乳酸生産評価用無機培養液４０ｍＬ（組成：８．０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に接種し、３５℃、１７０ｒｐｍにて撹拌培養した。リゾプス属菌体の撹拌培養を４．５時間行い、予め滅菌処理したステンレススクリーンフィルターホルダー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて菌体を濾過し、フィルター上に菌体を回収した。さらに、このフィルターホルダー上で１００ｍＬの生理食塩水にて菌体を洗浄した。洗浄に用いた生理食塩水は吸引ろ過して除去した。得られた菌体０．３ｇを３ｍＬ破砕チューブ（安井器械製）に回収し、３ｍＬ用メタルコーン（安井器械製）を入れ、蓋を閉めた後、液体窒素で凍結した。凍結した３ｍＬ破砕チューブをマルチビーズショッカー（安井器械製）に供し、１７００ｒｐｍ、１０秒間菌体を破砕した。その後、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を１ｍＬ添加し、マルチビーズショッカーにて１７００ｒｐｍ、１０秒間処理した。処理液を１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行い、得られた上清を菌体抽出液とした。
ＬＤＨ活性は、ピルビン酸を乳酸へと変換する活性であり、補酵素としてＮＡＤＨを要求する酵素反応である。適宜希釈した菌体抽出液１０μＬを１５０μＬの反応液（組成：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７００μＭ ＮＡＤＨ）と混合し、３０℃で５分間静置した。これに予め３０℃に保温した２０ｍＭピルビン酸ナトリウム溶液を４０μＬ添加して酵素反応を開始させた。この反応液の吸光度３４０ｎｍを測定することで、ＬＤＨ活性を測定した（非特許文献４参照）。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤ+を生成する酵素量と定義した。また、タンパク質濃度の測定では、ＢＳＡを標準とし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｓｅｎｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。
結果を表１に示す。結果は、界面活性剤無添加時のＬＤＨ活性を１００としたときの相対値で示した。ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート、ＥＯ平均付加モル数が２０以下のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＥＯ平均付加モル数が５以下であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、デオキシコール酸ナトリウム、アルケニルコハク酸塩、又はＥＯ平均付加モル数が１０であるポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルを添加した培地で胞子から菌糸体へと調製されたリゾプス属菌体は、界面活性剤を添加しない培地で胞子から菌糸体へと調製されたリゾプス属菌（対照）と比較して、高いＬＤＨ活性を有していた。また、ＥＯ平均付加モル数が６であるポリオキシエチレンラウリルエーテルを添加した培地で胞子から菌糸体へと調製されたリゾプス属菌体は、界面活性剤を添加しない培地で胞子から菌糸体へと調製されたリゾプス属菌（対照）と比較して、ＬＤＨ活性がやや低下することを確認した。
【００６１】
【表１】
2013236624.tif 000002
【００６２】
試験例２  乳酸生産能評価−１
試験例１にて対照と比較してＬＤＨ活性を１．３倍以上に向上させた界面活性剤を用いてリゾプス属菌菌糸体を調製し、乳酸生産能を評価した。
すなわち、リゾプス属菌菌糸体を、上記界面活性剤を用いて製造例２の方法で調製し、製造例３の方法で増殖させた。得られたリゾプス属菌の湿菌体６．０ｇを、２００ｍＬ容三角フラスコに供した乳酸生産評価用無機培養液４０ｍＬ（組成：８．０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に接種し、３５℃、１７０ｒｐｍにて撹拌培養した。菌体接種３０分後より、培養液上清を２時間毎に回収し、後述の参考例１に記載の手順にてグルコース及び乳酸の定量を行ない、参考例２に記載の算出方法に基づいて乳酸生産速度の相対値を求めた。
結果を表２に示す。結果は、界面活性剤無添加時の乳酸生産速度を１００としたときの相対値で示した。試験例１で高いＬＤＨ向上活性を示した界面活性剤を添加した培地で胞子から菌糸体へと調製されたリゾプス属菌はいずれも、界面活性剤を添加しない培地で胞子から菌糸体へと調製されたリゾプス属菌（対照）と比較して、高い乳酸生産能を有していた。
【００６３】
【表２】
2013236624.tif 000003
【００６４】
試験例３  起泡性評価
上記試験例２で用いた界面活性剤の起泡性を反転撹拌法により評価した。直径５０ｍｍの目盛り付き円筒状容器に、界面活性剤を無添加又は最終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）添加した１００ｍＬのＰＤＢ培地を入れ、平型プロペラを用いて１０００ｒｐｍで６秒毎に該プロペラを反転させながら、３００秒間反転撹拌した。撹拌終了の３０秒後、培地中の泡の体積量を測定した。
結果を表３に示す。結果は界面活性剤無添加時の泡量を１００としたときの相対値で示した。界面活性剤無添加時と比較して泡量が６倍以下のものは、ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｌ１０）、ソルビタンモノオレート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｏ１０Ｖ）、ポリオキシエチレン（３）ラウリルエーテル（エマルゲン（登録商標）１０３）、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル（エマルゲン（登録商標）１０４Ｐ）、ポリオキシエチレン（４）ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｌ１０６）及びアルケニルコハク酸カリウム塩（２８％）（ラテムル（登録商標）ＡＳＫ）であり、これらは培養に適すると考えられた。さらに泡量が２倍以下のものは、ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｌ１０）、ソルビタンモノオレート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｏ１０Ｖ）及びポリオキシエチレン（４）ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＴＷ−Ｌ１０６）であり、これらはより好ましく培養に適すると考えられた。
【００６５】
【表３】
2013236624.tif 000004
【００６６】
試験例４  乳酸生産能評価−２
（菌糸体の調製）
（１）菌株保存機関ＮＢＲＣより入手したRhizopus oryzae NBRC 4707株、NBRC 4785株、NBRC 5384株（＝JCM14625株）、及びNBRC 5418株を用いて、製造例１と同様の方法にて胞子懸濁液を調製した。
（２）界面活性剤無添加又はソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｌ１０、花王製）を最終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）添加した６０ｍＬのＰＤＢ培地を用いて、１００ｒｐｍで撹拌しながら、製造例２と同様の条件で胞子から菌糸体を調製した。（３）（２）で得られた菌体の全量を製造例３と同様の条件で無機培養液１００ｍＬに接種し、菌糸体を増殖させた。尚、界面活性剤無添加の対照条件では、活性剤無添加のＰＤＢ培地を用いて同様の手順で撹拌培養を行なった後、同様の無機培養液培地１００ｍＬにＰＤＢ種培養液を４〜８ｍＬ接種した。
（乳酸生産能評価）
上記調製した各種リゾプス属菌の湿菌体３０ｇを、５００ｍＬ容三角フラスコに供した乳酸生産評価用無機培養液１００ｍＬ（組成：１２．５％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、６．２５％炭酸カルシウム、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に接種し、３３．５℃、１７０ｒｐｍにて撹拌培養を行ない、試験例２と同様の手順で乳酸生産速度を求めた。
結果を表４に示す。結果は各菌株の対照（界面活性剤無添加）の乳酸生産速度を１００としたときの相対値で示した。いずれの菌株でも、界面活性剤添加培地で胞子から調製された菌糸体は、乳酸生産能が向上した。
【００６７】
【表４】
2013236624.tif 000005
【００６８】
試験例５  乳酸生産能評価−３
（菌糸体の調製）
（１）５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコ（旭硝子製）に、ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ−Ｌ１０、花王製）を、無添加又は最終濃度が、それぞれ０．０１、０．０５、０．２５、０．５０、１．０、１．５、及び２．５％（ｗ／ｖ）となるように添加した２００ｍＬのＰＤＢ培地を供し、これに製造例１にて調製したRhizopus oryzae の胞子懸濁液を１×１０3個−胞子／ｍＬ−培地となるように接種し、２７℃にて３日間、１１０ｒｐｍで撹拌培養した。
（２）上記の培養物を、予め滅菌処理したフィルターサポート及びメッシュ網目１８０μｍのナイロンネットフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて濾過し、菌体をフィルター上に回収した。回収した菌体を５００ｍＬ容三角フラスコに供した無機培養液１００ｍＬ（組成：１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、５．０％炭酸カルシウム、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に２．０〜３．０ｇを接種し、２７℃で約４０時間、２２０ｒｐｍにて撹拌培養を行なった。
（３）対照となる界面活性剤無添加の条件では、活性剤無添加のＰＤＢ培地を用いて上記（１）と同様の手順で撹拌培養を行なった後、上述の（２）と同様の手順で無機培養液１００ｍＬにＰＤＢ種培養液を４〜８ｍＬ接種し、培養した。
（４）続いて、上記無機培養液にて培養を行なった培養物を、予め滅菌処理したフィルターサポート及びメッシュ網目１８０μｍのナイロンネットフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて濾過し、フィルター上に菌体を回収した。さらに、このフィルター上で５０〜２００ｍＬの生理食塩水にて菌体を洗浄し、菌体を得た。
（乳酸生産能評価）
上記で調製したリゾプス属菌の湿菌体３０ｇを、乳酸生産評価用無機培養液１００ｍＬ（組成：１２．５％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、６．２５％炭酸カルシウム、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））に接種し、３３．５℃、１７０ｒｐｍにて撹拌培養した。菌体接種３０分後より、菌体を含まない培養液上清を１時間毎に回収し、後述の参考例１に記載の手順にてグルコース及び乳酸の定量を行ない、参考例２に記載の算出方法に基づいて乳酸生産速度の相対値を求めた。
結果を表５に示す。表５の乳酸生産能は、界面活性剤無添加（対照）での結果を１００としたときの相対値で示した。濃度０．０１％（ｗ／ｖ）以上２．５％（ｗ／ｖ）未満の範囲で界面活性剤を添加した培地中で胞子から調製された菌糸体は、対照に比べて高いか又は同等の乳酸生産能を有していた。
【００６９】
【表５】
2013236624.tif 000006
【００７０】
試験例６  菌体繰り返し利用による乳酸生産能評価
試験例４（２）と同様の手順で、界面活性剤無添加又はソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ-Ｌ１０）を最終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）含む培地でリゾプス属菌菌糸体を調製し、試験例４（３）と同様の手順で培養した。
得られた菌体を試験例５（４）と同様の手順で回収し、次いで湿菌体２５ｇを用いて試験例５と同様の手順で、乳酸生産評価用無機培養液で４時間まで培養して乳酸生産速度を求めた。さらに同様の菌体回収と培養の手順を繰り返し、各回での乳酸生産速度を求めた（繰り返し数３）。各回の乳酸生産速度を、繰り返し１回目の対照（界面活性剤無添加）の乳酸生産速度の相対値として算出した。
結果を表６に示す。本発明の乳酸生産用リゾプス属菌体ペレットは、繰り返し利用においても高い乳酸生産能を維持していた。
【００７１】
【表６】
2013236624.tif 000007
【００７２】
試験例７  乳酸生産能評価−４
製造例２と同様の手順で、ソルビタンモノラウレート（レオドール（登録商標）ＳＰ-Ｌ１０）を最終濃度で０．５％（ｗ／ｖ）含む培地でリゾプス属菌菌糸体を調製し、製造例３と同様の手順で培養した。その菌体を用い、試験例２と同様の手順で培養し、乳酸生産速度を評価した。その際、乳酸生産評価用無機培地にレオドール（登録商標）ＳＰ-Ｌ１０を無添加、又は終濃度でそれぞれ０．１％（ｗ／ｖ）、０．２％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）及び１％（ｗ／ｖ）添加した。培養４時間目と８．５時間目での乳酸量を測定し、乳酸生産速度を算出した。結果を表７に示す。乳酸生産の際にレオドール（登録商標）ＳＰ-Ｌ１０が培地に０．１％（ｗ／ｖ）以上混入すると、乳酸生産速度が低下した。
【００７３】
【表７】
2013236624.tif 000008
【００７４】
参考例１  乳酸生産能評価培養におけるグルコース及び乳酸の定量
グルコース及び乳酸の定量は、ＨＰＬＣ装置ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて行なった。分析カラムには、ガードカラムＣａｔｉｏｎ  Ｈ（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×３．０ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ製）を接続した糖・有機酸分析カラムＨＰＸ−８７Ｈ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ製）を用い、溶離液１０ｍＭ硫酸、流速０．８５ｍＬ／分、カラム温度５０℃の条件にて溶出を行なった。グルコース及び乳酸の検出は、それぞれ示唆屈折率検出器（ＲＩ検出器）及びＵＶ検出器（検出波長２１０ｎｍ）を用いた。標準試料には、グルコース（販売元コード０４９−３１１６５、和光純薬工業製）、及びＬ−乳酸リチウム（製品番号Ｌ２２５０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）を使用し、これらを用いて作成した濃度検量線にて定量を行なった。
ＨＰＬＣ分析に供する各培養液上清試料は、予め３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、ＤＩＳＭＩＣ−１３ｃｐ（０．２０μｍセルロースアセテート膜、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）又はＭＵＬＴＩ  ＳＣＲＥＥＮ  ＭＮＨＶ４５（０．４５μｍデュラポア膜、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製）を用いて不溶物の除去を行なった。
【００７５】
参考例２  乳酸生産速度の計算法
各培養液上清試料を、参考例１に従って乳酸濃度（単位：ｇ−乳酸／Ｌ−培地）を測定し、乳酸濃度の変化に要した時間（単位：ｈｒ）で除することにより、単位時間当たりの乳酸生産速度（単位：ｇ−乳酸／Ｌ／ｈｒ）を算出した。さらに、各製造例における対照条件の乳酸生産速度に対する相対値を求めた。