(57)【要約】      （修正有）【課題】活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を提供する。【解決手段】具体的には、重鎖のＣＤＲ１が特定のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２も特定のアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３も特定のアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１も特定のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２も特定のアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３も特定のアミノ酸配列を有する抗体等を提供する。本発明の抗体は、活性型ＧＩＰと特異的に結合することができることから、糖尿病、インスリン分泌異常、肥満、及びカルシウム蓄積の治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果の測定に利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、３、４、５及び６に記載されたアミノ酸配列をＣＤＲとして有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号１、２及び３に記載されたアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲとして有し、かつ、配列番号４、５及び６に記載されたアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲとして有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
重鎖のＣＤＲ１が配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号５に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有する、請求項１又は請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域が配列番号８に記載されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、活性型ＧＩＰと特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項５】
以下のアミノ酸配列を有する活性型ＧＩＰと特異的に結合するモノクローナル抗体：
（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号８のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号８のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有する：
配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号１０のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１０のアミノ酸配列。
【請求項６】
重鎖が配列番号８に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載された抗体を備える活性型ＧＩＰ測定試薬。
【請求項８】
被験薬の糖尿病治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果を測定するための請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載された抗体を備える活性型ＧＩＰ測定キット。
【請求項１０】
被験薬の糖尿病治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果を測定するための請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
少なくとも１つの請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載された抗体と検体とを接触させる工程を備える、検体中における活性型ＧＩＰの測定方法。
【請求項１２】
以下のステップを備える、請求項１１に記載の活性型ＧＩＰの測定方法：
ａ）少なくとも１つの請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載された抗体に検体を接触させるステップ、及び
ｂ）活性型ＧＩＰの請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載された抗体への結合を検出して活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ。
【請求項１３】
以下のステップを備える、被験者における被験薬の奏効性を判定する方法：
ａ）少なくとも１つの請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載された抗体に、被験薬投与前及び投与後の被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）検体中の活性型ＧＩＰの請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載された抗体への結合を検出して、検体中の活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ、並びに、
ｃ）被験薬投与前及び投与後における活性型ＧＩＰのレベルの変化と被験者における被験薬の奏効性との関連付けを行うステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い結合力で活性型ＧＩＰに特異的に反応する抗体、及び該抗体を利用した活性型ＧＩＰの測定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
インクレチンは、炭水化物や脂質の摂取後に消化管細胞より分泌され、膵β細胞でのインスリン分泌を促進する消化管ホルモンの総称である。インクレチンとしては、ＧＬＰ−１及びＧＩＰが知られている。このうち、ＧＩＰは、食物摂取の際の神経刺激又はブドウ糖の直接刺激により小腸上部Ｋ細胞から分泌される。また、ＧＩＰの受容体は、膵β細胞の他、脂肪細胞、骨芽細胞などにも発現していることが知られている。ＧＩＰは、膵β細胞に対し、グルコース依存的なインスリンの分泌を促し、また、細胞死を抑制することで糖代謝調節の役割を果たしている。このようにインクレチンがインスリン分泌を促すことから、生体内でインクレチンを分解するＤＰＰ４の阻害剤が糖尿病治療薬として開発されている。一方、細胞において摂取した栄養素を生体内に蓄積する上で重要な役割を担っており、体重増加、脂肪蓄積を促進することからＧＩＰシグナルを抑制することで肥満やメタボリックシンドロームの改善につながることが期待されている。
【０００３】
このような治療薬の臨床での評価において、血液中のインクレチンの濃度を測定することが重要視されている。これまで、生体内のインクレチンの定量は総量として測定されていた。しかし、インクレチンには生理活性を有する活性型と有しない非活性型が存在することが知られている。ヒトＧＩＰでは、プレプロＧＩＰが胃、十二指腸、小腸上部に分布するＫ細胞でプロセッシングを受けて活性型のＧＩＰとなり、その後、ＤＰＰ４によりＮ末の２アミノ酸が切断されることにより非活性型のＧＩＰとなる。活性型と非活性型の両方を測定する総量の測定では治療薬の効果を正確に知ることはできず、インクレチンの活性型を測定する方法が望まれていた。
【０００４】
このような要望の下、ＧＬＰ−１の活性型を特異的に測定する方法が開発され、既に提供されている。また、ＧＩＰに関しても活性型を特異的に提供する方法が報告されている(非特許文献１)が、この方法は、基質試薬として発光試薬を用いた検出系を利用している。この検出系には特別な発光が検出できる高価な測定機器を利用しなければならない欠点があり、発光試薬を用いた検出系ではなく汎用的に測定が可能となる一般的な酵素基質試薬の発色反応を用いて同等の性能を実現できることが求められてきた。この問題を解決するためには、より高い検出感度を得られる抗体が必要でこのような抗体の創生は、これまで報告されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊａｓｏｎ  Ｓ．Ｔｒｏｕｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７（６）：８４９−８５５（２０１１）
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ＧＩＰの活性型を測定する方法を提供するため試行錯誤を行った。その結果、驚くべきことに、Ｎ末端の２アミノ酸しか変わらない活性型ＧＩＰと非活性型ＧＩＰを識別可能な抗体を取得することに成功した。更に、本発明者らはこの抗体について分析を進めた結果、得られた抗体が活性型ＧＩＰを測定する上で最適な特性（特には、活性型ＧＩＰの高い検出感度）を有することを見出した。このように、本発明者らは、活性型ＧＩＰを認識し、非活性型ＧＩＰを認識しない優れた抗体を利用してＧＩＰの測定方法を構築することにより本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、高い結合力で活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体及びその利用に関し、具体的には以下の発明に関する。
（１）  配列番号１、２、３、４、５及び６に記載されたアミノ酸配列をＣＤＲとして有するモノクローナル抗体又はその断片。
（２）  配列番号１、２及び３に記載されたアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲとして有し、かつ、配列番号４、５及び６に記載されたアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲとして有する（１）に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（３）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号５に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有する、（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（４）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなり、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなり、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号４に記載されたアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号５に記載されたアミノ酸配列からなり、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号６に記載されたアミノ酸配列からなる、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
（５）  重鎖可変領域が配列番号８に記載されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、活性型ＧＩＰと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片。
（６）  以下のアミノ酸配列を有する活性型ＧＩＰと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片：
（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号８のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号８のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有する：
配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号１０のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１０のアミノ酸配列。
（７）  重鎖が配列番号８に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその断片。
（８）  重鎖が配列番号８に記載されたアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片。
（９）  （１）〜（８）のいずれか１項に記載された抗体又はその断片を備える活性型ＧＩＰ測定試薬。
（１０）  血液中の活性型ＧＩＰを測定するための、（９）に記載の試薬。
（１１）  被験薬の糖尿病治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果を測定するための（９）又は（１０）に記載の試薬。
（１２）  （１）〜（８）のいずれか１項に記載された抗体又はその断片を備える活性型ＧＩＰ測定キット。
（１３）  血液中の活性型ＧＩＰを測定するための、（１２）に記載のキット。
（１４）  被験薬の糖尿病治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果を測定するための（１２）又は（１３）に記載のキット。
（１５）  少なくとも１つの（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片と検体とを接触させる工程を備える、検体中における活性型ＧＩＰの測定方法。
（１６）  以下のステップを備える、（１５）に記載の活性型ＧＩＰの測定方法：
ａ）少なくとも１つの（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片に検体を接触させるステップ、及び
ｂ）活性型ＧＩＰの（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片への結合を検出して活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ。
（１７）  以下のステップを備える、被験者における被験薬の奏効性を判定する方法：
ａ）少なくとも１つの（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片に、被験薬投与前及び投与後の被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）検体中の活性型ＧＩＰの（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体又はその断片への結合を検出して、検体中の活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ、並びに、
ｃ）被験薬投与前及び投与後における活性型ＧＩＰのレベルの変化と被験者における被験薬の奏効性との関連付けを行うステップ。
（１８）  被験薬が糖尿病治療を目的とする場合、関連付けを行うステップが、被験薬投与後の活性型ＧＩＰのレベルが上昇している場合に被験薬の奏効性が有ると判定することを含む（１７）に記載の方法。
【０００８】
本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、高い結合力で活性型ＧＩＰと結合する。本明細書において、「高い結合力で結合する」とは、結合定数（Ｋａ）が、少なくとも１０７Ｍ−１であることを意味し、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１であり、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１であることを意味する。このような結合定数として、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１又はそれより高い、例えば、１０１３Ｍ−１又はそれより高いものであってもよい。
【０００９】
本明細書において、ある抗体が「特異的に結合する」とは、その抗体が活性型ＧＩＰに対して、他のタンパク質（特には、非活性型ＧＩＰ）やペプチドに対する親和性よりも、実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置又は方法によって、活性型ＧＩＰの特定のアミノ酸配列や立体構造を他のアミノ酸配列や立体構造から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば、「特異的に結合する」とは、活性型ＧＩＰへの結合定数が、他のタンパク質（特には、非活性型ＧＩＰ）やペプチドへの結合定数と１桁以上（好ましくは、２桁以上）、例えば、１〜４桁、又は２〜３桁異なることであってもよい。
【００１０】
モノクローナル抗体が活性型ＧＩＰと特異的に結合するか否かは、該モノクローナル抗体と活性型ＧＩＰとの結合、及び該モノクローナル抗体とその他のタンパク質（特には、非活性型ＧＩＰ）又はペプチドとの結合を測定することにより判定することができる。活性型ＧＩＰとモノクローナル抗体との結合、及びその他のタンパク質（特には、非活性型ＧＩＰ）又はペプチドとモノクローナル抗体との結合は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡのいずれの方法により確認されるものであってもよいが、好ましくは、免疫組織化学染色又はＥＬＩＳＡである。よって、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合するモノクローナル抗体として、好ましくは、免疫組織化学染色又はＥＬＩＳＡにより活性型ＧＩＰとの結合を検出可能な抗体である。より、好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、酵素基質試薬を用いた免疫組織化学染色又はＥＬＩＳＡにより活性型ＧＩＰを検出可能な抗体である。
【００１１】
モノクローナル抗体が活性型ＧＩＰ等と結合するか否かをウェスタンブロッティングにより確認する場合、組換タンパク質として発現させた、活性型ＧＩＰ、活性型ＧＩＰのｃＤＮＡが導入されたＣＨＯ細胞、及びその培養液を、２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ジチオスレイトール溶液中に溶解し、煮沸して抗Ｈｉｓ抗体及び被検抗体によりウェスタンブロット分析を行うことにより確認することができる。
【００１２】
モノクローナル抗体と活性型ＧＩＰが結合するか否かを免疫沈降により確認する場合（免疫沈降により活性型ＧＩＰを検出可能であるか否かを確認する場合を含む）、免疫沈降ウェスタンブロッティング分析により確認することができる。具体的には、活性型ＧＩＰトランスフェクタントの上清を被検抗体と共にインキュベートし、共にプロテインＧ  セファロース（ＧＥヘルスケアジャパン）を添加する、更にインキュベートした後、遠心分離を行い、得られたペレットを三回洗浄した。次いでペレットを溶解し、別の抗活性型ＧＩＰ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行うことにより、確認することができる。
【００１３】
モノクローナル抗体と活性型ＧＩＰが結合するか否かを免疫組織化学染色により確認する場合、血管を含む組織を４％パラホルムアルデヒド中で３〜５日間固定化し、パラフィンに包埋し、常法に従ってミクロトーム上で５μｍ厚に切断する。組織切片からパラフィンを除去し、水和させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ギ酸で短時間処理する。内因性の過酸化を防ぐため、３％過酸化水素含有メタノール中で静置後、１０％正常ヤギ血清含有ＰＢＳで切片をブロックし、被検抗体と共に４℃で一晩静置する。その後、ビオチン化第二抗体と共に室温で３０分間静置した。免疫反応性は、ＡＢＣ  ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）などを用いて製造者のプロトコルに従って可視化する。３，３’−ジアミノベンジジンを色原体として使用し、切片はヘマトキシリンで対比染色することにより確認することができる。
【００１４】
モノクローナル抗体と活性型ＧＩＰが結合するか否かをＥＬＩＳＡにより確認する場合（ＥＬＩＳＡにより活性型ＧＩＰを検出可能であるか否かを確認する場合を含む）、被検モノクローナル抗体を用いて後述のＥＬＩＳＡ系を構築し、後述のＥＬＩＳＡ法を実施して、活性型ＧＩＰを検出できるか否かを測定することにより行うことができる。この場合において、好ましくはＥＬＩＳＡの検出系は酵素基質試薬を用いた検出系である。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体は、活性型ＧＩＰと特異的に結合すれば、その認識部位が限定されるものではないが、少なくとも活性型ＧＩＰのＮ末端のアミノ酸、並びに／あるいはその隣接したアミノ酸を認識する抗体である。好ましくは、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、活性型ＧＩＰのＮ末端から１〜６番目のアミノ酸（ＹＡＥＧＴＦ：配列番号１１）を認識する抗体であり、より好ましくは、Ｎ末端から１〜２番目のアミノ酸（ＹＡ）を認識する抗体である。また、例えば、本発明の抗体は、活性型ＧＩＰの１位及び２位のアミノ酸のうち少なくとも１のアミノ酸を認識する抗体であってもよい。
【００１６】
本明細書において「活性型ＧＩＰ」とは、哺乳類の活性型ＧＩＰを意味し、好ましくは、ヒト、ラット、及び／又はマウスの活性型ＧＩＰである。活性型ＧＩＰは４１個のアミノ酸からなるペプチドである。活性型ヒトＧＩＰ、活性型ラットＧＩＰ、及び活性型マウスＧＩＰのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２、１３、及び１４に示す。本明細書においては、「ＧＩＰ（１−４２）」は、ＧＩＰ（特には、配列番号１２、１３、及び１４に記載のアミノ酸配列）の１番目から４２番目のアミノ酸からなるペプチドを意味し、活性型ＧＩＰと同意義である。また、本明細書において、「非活性型ＧＩＰ」とは、活性型ＧＩＰのＮ末端の２アミノ酸（ＹＡ）が切断されたペプチドを意味する。本明細書において、「ＧＩＰ（３−４２）」とは、ＧＩＰ（特には、配列番号１２、１３、及び１４に記載のアミノ酸配列）の３番目から４２番目のアミノ酸からなるペプチドを意味し、非活性型ＧＩＰと同意義である。ヒト、マウス、及びラットの活性型ＧＩＰのアミノ酸配列は相同性が高く、例えば、１〜４２番目のアミノ酸において数個のアミノ酸の違いしか見られない（図１）。特に、Ｎ末端（特には、６Ａ１Ａが認識する１〜６番目のアミノ酸）においてはアミノ酸配列が一致する。よって、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、活性型ヒトＧＩＰの他、活性型ラットＧＩＰ及び及び活性型マウスＧＩＰと特異的に結合することが可能である。
【００１７】
本発明において、「モノクローナル抗体」は、抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものである。更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体を挙げることができる。上記において、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であって活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であって活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことであり、例えば、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）等を挙げることができる。例えば、本発明の抗体を体内に投与することにより用いる場合には、本発明の抗体として好ましくは、ヒト・非ヒト動物のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。
【００１８】
本明細書において、「ＣＤＲ」とは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）又はＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）のいずれの定義によるものであってもよい。
【００１９】
本発明の抗体が認識するアミノ酸の数は、抗体が活性型ＧＩＰに結合することができる数であれば、特に限定はない。抗体又はその断片が認識するアミノ酸の数は、好ましくは、１〜６個であり、より好ましくは、３〜４個である。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
【００２０】
本明細書において、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（部分断片）であって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、又は二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）を挙げることができる。Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。
【００２１】
更に、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の一部を含むペプチドも、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の断片に含まれる。ここで、「抗体の一部を含むペプチド」とは、抗体を構成するアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列を備えるペプチドであって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。本明細書において、「抗体の抗原への作用」とは、抗体の活性型ＧＩＰへの結合作用を意味する。抗体の一部を含むペプチドは、抗体に由来しないアミノ酸配列を含んでいてもよい。活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の一部を含むペプチドとして、好ましくは、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のＣＤＲ配列を含むペプチドである。ここで、ＣＤＲ配列を含むペプチドとは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選ばれる少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の一部を含むペプチドとして、より好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選ばれる複数のＣＤＲのアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００２２】
本発明の抗体又はその断片として具体的には、配列番号１、２、３、４、５及び６に記載されたアミノ酸配列をＣＤＲとして有するモノクローナル抗体又はその断片を挙げることができ、好ましくは、配列番号１、２及び３に記載されたアミノ酸配列を重鎖ＣＤＲとして有し、かつ、配列番号４、５及び６に記載されたアミノ酸配列を軽鎖ＣＤＲとして有するモノクローナル抗体又はその断片であり、より好ましくは、重鎖のＣＤＲ１が配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号５に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体又はその断片であり、更に好ましくは、重鎖のＣＤＲ１が配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなり、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなり、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号４に記載されたアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号５に記載されたアミノ酸配列からなり、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号６に記載されたアミノ酸配列からなる、モノクローナル抗体又はその断片である。
【００２３】
別の具体的な態様において、本発明の抗体又はその断片は、例えば、重鎖可変領域が配列番号８に記載されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、活性型ＧＩＰと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片である。本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」とは、対象となるアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有するか、又は、対象となるアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００２４】
よって、好ましくは、本発明の抗体又はその断片は、以下のアミノ酸配列を有する活性型ＧＩＰと特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片である：
（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号８のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号８のアミノ酸配列、かつ、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有する：
配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号１０のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１０のアミノ酸配列。
より好ましくは、本発明の抗体又はその断片は、重鎖が配列番号８に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその断片であり、よりさらに好ましくは、本発明の抗体又はその断片は、重鎖が配列番号８に記載されたアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が配列番号１０に記載されたアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその断片である。
【００２５】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」するとは、当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば、ハイブリダイズの条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。また、アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。
【００２６】
また、別の態様において、本発明は、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を含有する試薬に関する。本発明の試薬は、活性型ＧＩＰを測定するための試薬であり、好ましくは、非活性型ＧＩＰを検出せず活性型ＧＩＰのみを測定可能な試薬である。また、本発明の試薬として好ましくは、血液中の活性型ＧＩＰを測定するための試薬である。本発明の試薬は、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の他、安定化剤等を含んでいてもよい。また、本発明の試薬は、生体に投与されるための薬剤の形態であってもよい。この場合、本発明の試薬は薬理学的に許容される担体等を適宜含有していてもよい。
【００２７】
また、別の態様において、本発明は、上述の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を備える、活性型ＧＩＰの測定キットに関する。本発明のキットは、例えば、非活性型ＧＩＰを検出せず活性型ＧＩＰのみを検出するためのキットや、糖尿病治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果を測定するためのキットとすることもできる。また、本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的方法、又は、ウェスタンブロット等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の試薬又は測定キットの検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料又は液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液又はそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは血液である。本発明の試薬又は測定キットによる分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。
【００２９】
本発明の試薬又は測定キットは、使用時に活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を利用するものであれば、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体そのものを物質として含有する必要はなく、例えば、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の代わりに活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞を包含するものであってもよい。
【００３０】
また、本発明の試薬又は測定キットにおける活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ−クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ−メチルアクリジニウムエステル、Ｎ−メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識が結合していてもよい。本発明の試薬又は測定キットにおける活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、好ましくはβガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族で標識される。
【００３１】
本発明の試薬又は測定キットは、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を含むものであれば特に限定はない。例えば、本発明の試薬又は本発明の測定キットに含まれる試薬は、固体状、ゲル状又は液状であってもよい。また、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、樹脂、膜、フィルム、容器等に含まれ若しくは固定され、又は、溶媒に溶解されていてもよい。また、本発明の測定キットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を備えていてもよい。
【００３２】
例えば、本発明のキットとしては、例えば、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体が固相化されたプレート、ビオチン標識抗ＧＩＰ抗体、ストレプトアビジンＰＯＤ溶液、洗浄液、ＴＭＢ試薬、２Ｍ  ＨＣｌ、標準物質（ラット活性型ＧＩＰ）を備えるキット、あるいは、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体、抗ＧＩＰマウスモノクローナル抗体結合金コロイド、ウサギ免疫グロブリン結合金コロイド、及び、テストプレートを備えるキットを挙げることができる。
【００３３】
本発明の試薬又はキットは、その一例として、被験薬剤の糖尿病治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果を測定するための試薬又はキットとすることができる。例えば、生体外で使用する場合、糖尿病治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果を測定するための試薬又はキットは、上述の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を備える、試薬又は測定キットに準じた構成とすることができる。
【００３４】
また、本発明の試薬は、生体内における活性型ＧＩＰの分布等を検査するための画像診断用とすることもできる。本発明の試薬を画像診断用として用いる場合、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、標識物質を含有し又は標識物質と結合している。標識物質としては、例えば、放射性同位元素等の当業者周知の物質を用いることができ、好ましくは陽電子放出放射性同位元素又はγ線放射性同位元素であり、これに限定されるものではないが、例えば１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ及び７５Ｂｒを挙げることができる。画像診断用として用いる場合、本発明の試薬が含有する活性型ＧＩＰと結合する抗体は、好ましくは、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。画像診断用として用いる場合、本発明の試薬は、ヒトへの投与に適した医薬上許容される形態であって、生理学的に許容し得る添加剤、例えば、薬学的に許容し得る希釈剤、緩衝剤、可溶化剤、無痛化剤、溶剤、安定化剤又は酸化防止剤を含んでいてもよい。本発明の試薬の投与量は、対象部位、用いる画像診断方法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度により適宜選択することができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の抗体は、活性型ＧＩＰと特異的に結合することができることから、活性型ＧＩＰを特異的に検出することができる。特に、本発明の抗体は、活性型ＧＩＰを高い感度で検出できる。即ち、本発明の抗体は、高い結合力で活性型ＧＩＰと結合することができ、かつ、非活性型ＧＩＰとは低い結合力で結合する。従って、本発明の抗体は、活性型ＧＩＰの検出、特には活性型ＧＩＰの発現量を指標とした治療薬の奏効性評価に利用できる他、活性型ＧＩＰ値の異常を検出するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、上から順にラット、ヒト、及びマウスの活性型ＧＩＰのアミノ酸配列を比較して示した図である。図中、「Ａｎｔｉ−ＧＩＰ，Ａｃｔｉｖｅ（Ｎ）（６Ａ１Ａ）ＭｏＡｂ」の下の枠（ラット、ヒト、及びマウス各１〜６番目のアミノ酸が含まれる）は、６Ａ１Ａ抗体の認識部位を示す。
【図２】図２は、抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａを用いて作製したアッセイキットを用いてヒトＧＩＰ標準品を測定した際の吸光度、及び標準曲線を示す。グラフの縦軸は吸光度（ＯＤ４５０）を示し、横軸は活性型ＧＩＰ（１−４２）の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【図３】図３は、抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａを用いて作製したアッセイキットを用いてラット標準品を測定した際の吸光度、及び標準曲線を示す。グラフの縦軸は吸光度（ＯＤ４５０）を示し、横軸は活性型ＧＩＰ（１−４２）の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【図４】図４は、抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａを用いて作製したアッセイキットを用いてマウス標準品を測定した際の吸光度、及び標準曲線を示す。グラフの縦軸は吸光度（ＯＤ４５０）を示し、横軸は活性型ＧＩＰ（１−４２）の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【図５】図５は、空腹時及び満腹時ラットの血中の活性型ＧＩＰ濃度測定の結果を示す。横軸の「Ｓｔａｒｖｅ」は空腹ラットの結果を、「Ｆｅｄ」は満腹ラットの結果を示す。また、縦軸は活性型ラットＧＩＰ（ＧＩＰ（１−４２））の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
１．活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の作製
本発明の抗体は、例えば、活性型ＧＩＰ又はそのＮ末端のアミノ酸配列を有するペプチド（好ましくは、配列番号１１に記載のペプチド）を、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物又は鳥類に免疫することにより作製することができる。
【００３８】
免疫原としては、活性型ＧＩＰ、好ましくは、活性型ＧＩＰのＮ末端のアミノ酸配列を有するペプチドであり、より好ましくは、配列番号１９又は配列番号２０に記載のペプチドである。免疫原は、当該物質をコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質、又は、合成タンパク質として得ることができる。免疫原は、免疫原をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。また、免疫原は、Ｆｍｏｃ法又はＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製することができる。
【００３９】
免疫原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に単独であるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際しては、抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウス又はラットであり、より好ましくは、マウスである。
【００４０】
動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射又は腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。通常１〜６週毎に１回の免疫を合計２〜１０回程度行い、好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩又は尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００４１】
モノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウス又はラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６,２９２,１９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１，１９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８，１９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９，１９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１，１９８０）等を挙げることができ、好ましくは、抗体産生細胞と同種動物由来の細胞であり、より好ましくは、抗体産生細胞と同系統の動物由来の細胞である。例えば、マウス由来の骨髄腫系細胞として、好ましくは、Ｐ３Ｕ１又はＰ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３である。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギ又はウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。また、細胞融合に用いられる骨髄腫系細胞としては、対数増殖期の細胞が好ましい。
【００４２】
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等を用いる方法（ＰＥＧ法）、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。例えば、ＰＥＧ法の場合、上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を、培地、ＰＢＳ等で洗浄後、３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）等の細胞凝集性媒体を含む適当な培地又は緩衝液中で、脾細胞と骨髄腫細胞を１：２〜１０：１（好ましくは、５：１〜１０：１）の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させる。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。
【００４３】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）を添加した動物細胞用培地で選択的に増殖させることにより、ハイブリドーマ細胞の選別を行なうことができる。選別及び育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％ＣＯ2下で行なうことができる。
【００４４】
培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に特異的に結合し、非抗原タンパク質への結合が弱いクローンを選択する。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことにより単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択することができる。本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、活性型ＧＩＰへの結合能を指標とし、非活性型ＧＩＰに結合しないクローンを選択するスクリーニングを繰り返すことにより得ることができる。例えば、活性型ＧＩＰを認識する抗体は、活性型ＧＩＰ及び非活性型ＧＩＰと、前期方法により得られた抗体等との結合活性を測定し、活性型ＧＩＰとの結合活性が高く、非活性型ＧＩＰとの結合活性が低い抗体等（抗体全体又は抗原結合断片）を選択することにより得ることができる。本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体と活性型ＧＩＰとの結合における結合定数（Ｋａ）としては、例えば、少なくとも１０７Ｍ−１であり、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１であり、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１である。このような結合定数として、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１又はそれより高い、例えば、１０１３Ｍ−１又はそれより高いものである。活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、前記方法により得られた活性型ＧＩＰを認識する抗体等の中から、非活性型ＧＩＰを認識しない抗体等を当業者周知の方法により選択することにより得ることができる。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物又は免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。
【００４６】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィ等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。アフィニティークロマトグラフィに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えば、プロテインＡカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を挙げることができる。また、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムを用いることができる。更に、抗体のクラスによらず、活性型ＧＩＰ（又はそのＮ末端のアミノ酸配列（好ましくは配列番号１１に記載のアミノ酸配列）からなるペプチド）固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィ、疎水相互作用クロマトグラフィ等を用いることもできる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、遠心分離後、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより行うことができる。
【００４７】
あるいは、本発明の抗体は、本明細書において開示するＣＤＲアミノ酸配列（配列番号１〜６）又は可変領域アミノ酸配列（配列番号８及び配列番号１０）若しくは可変領域核酸配列（配列番号７及び配列番号１１）を基に、適宜抗体又は抗体断片遺伝子を設計して得ることができる。例えば、本発明の抗体を、配列番号１、２及び３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖のＣＤＲ１、２及び３として有し、かつ、配列番号４、５及び６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖のＣＤＲ１、２及び３として有する抗体として設計し、当該抗体をコードするＤＮＡを適宜選択することによって、本発明の抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。あるいは、配列番号７及び配列番号１１の核酸配列を、それぞれ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として、適宜定常領域をコードする核酸配列と組み合わせることで本発明の抗体をコードするＤＮＡを得ることもできる。本発明の抗体は、得られたＤＮＡを含有するプラスミドベクターをＣＨＯ細胞等に形質転換して培養し、当業者周知の方法により抗体を産生させることができる。
【００４８】
２．ヒト型キメラ抗体・ヒト化抗体、ヒト抗体の作製
（１）ヒト型キメラ抗体
本発明のヒト型キメラ抗体は、活性型ＧＩＰと結合し、活性型ＧＩＰの機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）。
【００４９】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、次の方法により得ることができる。当該モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当業者周知の方法で行うことができ、例えば、グアニジン−超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９，１９７９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６−１５９，１９８７）等によりＲＮＡを調製した後、ｍＲＮＡピュリフィケーションキット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ファルマシア社製、タカラバイオ社製）等により精製することにより行うことができる。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを使用することによりｃＤＮＡを作製してベクターに組み込む。ベクターに組み込んだｃＤＮＡの中から、非ヒト動物由来モノクローナル抗体の一部をプローブとして使用して、非ヒト動物由来モノクローナル抗体をコードしているｃＤＮＡを単離する。単離されたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。
【００５０】
ヒト型キメラ抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。上述の方法により得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のキメラ抗体を発現するベクターを作製することができる。
【００５１】
（２）ヒト化抗体
本発明のヒト化抗体は、活性型ＧＩＰと特異的に結合する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３；Ｃｌａｒｋ  Ｍ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７−４０２参照）。
【００５２】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体（例えば、６Ａ１Ａモノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較し、各ＣＤＲのアミノ酸配列を得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。
【００５３】
また、ヒト抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が活性型ＧＩＰと特異的に結合するという本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。選択したヒト抗体のＦＲを有するヒト化抗体のＶ領域が、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるか否かは、例えば、選択したヒト抗体のＦＲ含むＶ領域のＤＮＡ配列情報を基にコンピューターモデリングにより立体構造を予測し、使用した非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域の立体構造との比較を行うことにより判断することができる。また、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲとするため、得られたヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に適宜変異をいれることもできる。
【００５４】
使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。例えば、化学合成ＤＮＡ断片をリガーゼ等の酵素を用いて結合させ、設計されたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列の両末端の配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲを行い、所望の長さのＤＮＡ断片を抽出することにより得ることができる。また、使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、部位特異的変異によりＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体のＶ領域のＤＮＡに組み込むことによっても得ることができる。部位特異的変異は、例えば、ジーンテイラーサイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（インビトロジェン社）、トランスフォーマー部位特異的突然変異誘発キット（クローンテック社）、サイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（タカラバイオ社）等を用いて、当該キットの説明に従うことにより行うことができる。
【００５５】
ヒト化抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のヒト化抗体を発現するベクターを作製することができる。
【００５６】
上述のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の作製において使用される、ヒト化抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーター又は非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウス又はヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。
【００５７】
上述のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の作製において使用される、動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２−ｇｐｔ（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ,２０９，１４２２）を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト化抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。
【００５８】
上述のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の作製において使用される、非ヒト動物由来モノクローナル抗体は、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスモノクローナル抗体である。
【００５９】
（３）ヒト抗体
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら（１９９７）ＮＡＴＵＲＥ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６）。
【００６０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジー社；メディカルリサーチカウンセル；ダイアックス社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント社；クルーセル社；モルホシス社）、及び、癌、自己免疫疾患又は感染症患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。
【００６１】
例えば、ナイーブヒト抗体ファージライブラリーは、以下の方法により作製することができる。人の末梢血からｍＲＮＡを調製し、イムノグロブリンのγ、μ、κ、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを用いて、Ｖ遺伝子のｃＤＮＡを合成し、各Ｖ遺伝子をＶ遺伝子ファミリーに特異的なＤＮＡプライマーのセットを用いて合成し、それらを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３等のリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡを用いてＰＣＲによって連結し、ｓｃＦｖ遺伝子を合成する。合成したｓｃＦｖ遺伝子を、両側にベクター導入用の制限酵素サイトを使って、ｐＣＡＮＴＡｂ５Ｅ等のファージミドベクターに挿入し、当該ベクターを大腸菌に形質転換し、ヘルパーファージによるレスキューを行う。
【００６２】
ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、標的となる活性型ＧＩＰを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。
【００６３】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗体作製方法に準じて免疫原を免疫することにより、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を得ることができる。
【００６４】
３．抗体断片の作製
本発明の抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、又は、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。
【００６５】
本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、活性型ＧＩＰと特異的に結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させることにより得ることができる。本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られた活性型ＧＩＰと特異的に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。本発明のＦａｂ断片は、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
【００６６】
本発明のｓｃＦｖは、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）又はその繰り返し配列である。本発明のｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。
【００６７】
本発明の、ＣＤＲを含むペプチドは、本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。
【００６８】
４．測定方法等
本発明の抗体等は、活性型ＧＩＰと特異的に結合することができるので、別の態様において、本発明は、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を用いた被検液中の活性型ＧＩＰの測定方法に関する。活性型ＧＩＰは、糖尿病や肥満治療薬の標的とされていることから、特に、本発明は、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を用いた、糖尿病や肥満の治療薬の奏効性評価方法に関する。本発明の方法が奏効性評価可能な治療薬としては、インクレチン、特には活性型ＧＩＰを対象とする治療薬であれば特に限定されないが、例えば、糖尿病、インスリン分泌異常、肥満、カルシウム蓄積等を対象とした治療薬を挙げることができる。よって、本発明は、糖尿病、インスリン分泌異常、肥満、及びカルシウム蓄積の治療効果、インスリン分泌促進効果、又はＤＰＰ４阻害効果の測定方法を包含する。このような本発明の方法において用いられる活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体は、好ましくは上述の本発明の抗体である。
【００６９】
本発明の方法を生体外における測定により実施する場合、測定方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティークロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。また、本発明の方法を生体内における測定により実施する場合、生体内に活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を投与後、画像診断方法により診断することができる。
【００７０】
ＥＩＡ法により測定する場合、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体（第一抗体）と被験者のサンプル中の活性型ＧＩＰとを反応させ結合させた後、結合物中の活性型ＧＩＰと標識した活性型ＧＩＰと結合する抗体（第二抗体）を結合させ、非結合抗体を除去後、標識物質に適した方法で測定することにより、複合体の形成を測定することができる。例えば、ＥＩＡ法として、ビオチン標識抗体を用いて活性型ＧＩＰを検出する場合、被験者の体液を希釈することにより調製したサンプル又は標準物質（活性型ＧＩＰ）、及び、ビオチン標識抗体溶液を、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を固相化した９６穴プレートの各ウェルに加えて室温で反応後、各ウェルを洗浄液で洗浄し、基質液（ＴＭＢ）を加えて室温で反応させた後、反応停止液（２Ｍ  ＨＣｌ）を加え、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することにより測定することができる。サンプル中の活性型ＧＩＰの濃度は、標準物質で作成した検量線を利用して計算することができる。イムノクロマト法により測定する場合、サンプルを標識抗体と結合させた後、ニトロセルロース膜の毛細管現象を利用したクロマトグラフィを行い、固相化された活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体と結合させることにより検出することができる。なお、イムノクロマト法において、標識として金コロイドを利用することにより、固相化抗体（活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体）とサンプル／標識抗体複合体との結合を目視により確認することもできる。また、例えば、化学発光測定法としてＣＬＩＡ法を用いる場合、ルミノール誘導体又はアクリジニウム誘導体により標識された活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体と被験者のサンプル中の活性型ＧＩＰとを反応させた後、非結合の抗体を分離した後、固相に吸着した化学発光性の標識体を発光させることにより検出することができる。
【００７１】
画像診断により生体内における活性型ＧＩＰを測定する場合、本発明の方法は、例えば、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体を投与することと、前記抗体を、画像診断装置（例えば、シンチグラフィー、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴモダリティー）を用いて前記抗体の一部以上の画像を生成させることにより、生体内における活性型ＧＩＰの存在の有無、局在、及び／又は存在量を測定することができる。本発明の試薬の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、経口的又は非経口的に投与される。非経口的投与経路としては、皮下、腹腔内、血中（静脈内、若しくは動脈内）又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ、好ましくは血中への投与である。
【００７２】
具体的には、本発明の検体中における活性型ＧＩＰの測定方法は、少なくとも１つの本発明の活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体と検体とを接触させる工程を備える。また、好ましくは、本発明の活性型ＧＩＰの測定方法は、以下のステップを備える、
ａ）少なくとも１つの活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体に検体を接触させるステップ、及び
ｂ）活性型ＧＩＰの、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体への結合を検出して活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ。
あるいは、本発明の検体中における活性型ＧＩＰの測定方法は、以下のステップを備えていてもよい：
ａ）少なくとも１つの活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体に検体を接触させるステップ、及び
ｂ）活性型ＧＩＰの、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体への結合を検出して検体中の活性型ＧＩＰの存在を検出するステップ。
【００７３】
また、インクレチン、特に活性型ＧＩＰは、被験薬の治療効果の指標となり得ることから、一の態様において本発明は、下のステップを備える被験者における糖尿病や肥満等の治療薬の奏効性評価方法に関する：
ａ）少なくとも１つの活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体に、被験薬投与後の被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）検体中の活性型ＧＩＰの、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体への結合を検出して、検体中の活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ、並びに、
ｃ）被験薬投与後における活性型ＧＩＰのレベルと被験者における被験薬の奏効性との関連付けを行うステップ。
【００７４】
本明細書において、奏効性を評価するために、測定された活性型ＧＩＰのレベルと被験者における被験薬の奏効性との関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者における活性型ＧＩＰのレベル、又はレベルの変化を、対象疾患に罹患している患者又は対象疾患であろうことが知られている患者、並びに／あるいは、対象疾患ではなかった患者又は対象疾患ではないと信じられている患者における活性型ＧＩＰのレベル、又はレベルの変化と比較すること、あるいは、被験薬投与後の被験者における活性型ＧＩＰのレベルを、被験薬投与前の被験者における活性型ＧＩＰのレベルと比較することを意味する。比較対象となる活性型ＧＩＰのレベル等は、例えば、本発明の開示により、又は、既に対象疾患又はその程度が判明している患者由来の検体における活性型ＧＩＰのレベルを測定することにより、あるいは、日倹約投与前の被験者由来の検体について活性型ＧＩＰのレベルを測定することにより知ることができる。活性型ＧＩＰのレベル又はレベルの変化と対象疾患への奏効性との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００７５】
好ましくは、活性型ＧＩＰは、その存在量の変化により対象疾患に対する奏効性と関連付けることができる。また、例えば、活性型ＧＩＰのレベルについて対象疾患に対する奏効性の指標としての閾値レベル又は対象疾患への奏効性の程度の指標として各程度に対する閾値レベルを設定し、被験者由来の試料における活性型ＧＩＰのレベルを、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００７６】
一例において、本発明は、以下のステップを備える被験者における治療薬の奏効性評価方法に関する：
ａ）少なくとも１つの活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体に、被験薬投与前及び被験薬投与後の被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）検体中の活性型ＧＩＰの、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体への結合を検出して、検体中の活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ、並びに、
ｃ）被験薬投与前及び被験薬投与後における活性型ＧＩＰのレベルの変化と被験者における被験薬の奏効性との関連付けを行うステップ。
ここで、「被験薬投与前及び投与後における活性型ＧＩＰのレベルの変化と被験者における被験薬の奏効性との関連付けを行うステップ」は、被験薬が糖尿病治療や抗肥満を目的とする場合、被験薬投与後の活性型ＧＩＰのレベルが高い場合又は上昇している場合に被験薬の奏効性が有ると判定することにより行うことができる。
よって、一例において、本発明は、以下のステップを備える被験者における糖尿病治療薬又は抗肥満薬の奏効性評価方法であってもよい：
ａ）少なくとも１つの活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体に、被験薬投与前及び投与後の被験者由来の検体を接触させるステップ、
ｂ）検体中の活性型ＧＩＰの、活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体への結合を検出して、検体中の活性型ＧＩＰのレベルを測定するステップ、並びに、
ｃ）被験薬投与前のＧＩＰのレベルと比較して、被験薬投与後の活性型ＧＩＰのレベルが上昇している場合に被験薬の奏効性が有ると判定するステップ。
【００７７】
本発明の方法において使用する被験者由来の検体としては、バイオマーカの発現を検出することができる検体であれば特に限定されず、例えば、生検として被験者から採取した組織試料又は液体を使用することができる。使用される検体は、本発明の測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液（例えば、脳脊髄液）、関節液、眼房水、涙液、唾液又はそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは血液（血漿又は血清を含む）である。また、本発明の方法において使用する患者由来の試料は、測定試験に先立ち前処理されたものであってもよいし、患者から採取した検体をそのまま使用してもよい。また、本発明の方法による分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。
【００７８】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００７９】
（実施例１）抗活性型ＧＩＰ抗体の作製
マウスを人工ペプチドであるＹＡＥＧＴＦＣ（配列番号１９）とキャリアタンパク質であるウシサイクログロブリンの結合物で免疫した。免疫マウスから得られたリンパ節のリンパ球をメラノーマ細胞株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合させた。ヒトＧＩＰの２７番目のロイシン（Ｌ２７）から４２番目のグルタミン（Ｑ４２）に対応する配列である人工ペプチドＣＬＡＱＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号２０）をウサギに免疫し、血清を抗原特異精製して得られた精製ＩｇＧ（抗ヒトＧＩＰ（Ｃ）ウサギポリクローナル抗体）を固相し、ＥＬＩＳＡの結果がヒトＧＩＰ（１−４２）に対し陽性、ヒトＧＩＰ（３−４２）に対し陰性を示すハイブリドーマ細胞の上清の抗体を選択した。幾つかの陽性クローンを限界希釈法により選択を行い、得られた単一クローン６Ａ１Ａを樹立した。６Ａ１ＡのヒトＧＩＰ（１−４２）及びヒトＧＩＰ（３−４２）に対する反応性の違いをＥＬＩＳＡにより検討した結果を表１に示す。表１に示される通り、６Ａ１ＡはヒトＧＩＰ（１−４２）に選択的に反応し、ヒトＧＩＰ（３−４２）に対する交差性は極めて小さい。
【表１】
2013138638.tif 000002
【００８０】
（実施例２）抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａのサブクラスの特定
Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ）を用いて６Ａ１Ａのサブクラスを特定した。６Ａ１Ａのサブクラスは重鎖がＩｇＧ２Ａであり、軽鎖がＫａｐｐａであった。
【００８１】
（実施例３）サンドイッチＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（９６穴）の各穴に、０．５μｇの精製抗ヒトＧＩＰ（Ｃ）ウサギポリクローナル抗体を含有する１００ｍＭのカーボネート緩衝液（ｐＨ９．５）を１００μＬ添加し、４℃で一晩静置して該プレートをコートした。その後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、２００μＬの１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳを各穴に加えて、４℃で一晩静置してブロックした。ＰＢＳ−Ｔにより二度洗浄後、被験サンプルと標準物質であるＧＩＰ（１−４２）を１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔで段階希釈した溶液１００μＬ／穴を、コートされたマイクロタイタープレートに加え、３７℃で１時間静置した。本試験はデュプリケートで行った。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄後、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合６Ａ１ＡマウスＩｇＧ  Ｆａｂ’を各穴に添加し、４℃で１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで穴を５回洗浄後、１００μＬの新たに調製したテトラメチルベンジジン溶液を各穴に基質として添加し、暗室、室温で３０分間静置した。１００μＬの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。溶液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８２】
（実施例４）抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａを用いた標準曲線の作製
抗ヒトＧＩＰ（Ｃ）ウサギポリクローナル抗体を捕捉抗体として、６Ａ１Ａを検出抗体として用いＥＬＩＳＡを構築した。ヒト活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡシステムの標準反応曲線は、ｌｏｇ／ｌｏｇスケールで１．５６から１００ｐｇ／ｍＬの範囲に亘って直線を示し、その直線性は極めて優れていた（Ｒ２＝０．９９９）（図２）。アッセイの感度は、ＮＣＣＬＳ法により１．２ｐｇ／ｍＬと計算された。
【００８３】
（実施例５）抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａを用いた回収率評価及び交差反応性試験
２回希釈した１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地及びヒトＥＤＴＡ血漿サンプルはあらかじめ１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地はＦＣＳ１ｍＬに対し２０μＬ、また、血漿サンプルは１ｍＬに対し２０μＬのＤＰＰIV  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＤＰＰ４）を添加した。それぞれのサンプルにヒトＧＩＰ（１−４２）を終濃度が５０、２５、１２．５ｐｇ／ｍＬとなるよう添加し、上記のＥＬＩＳＡシステムを用いて測定を行った。添加量に対する測定値の割合を回収率として算出した。表２に示す通り、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ培地、ヒトＥＤＴＡ血漿サンプルともに、２回希釈でほぼ１００％の回収率であった。
１００，０００ｐｇ／ｍＬのヒトＧＩＰ（３−４２）、ＧＬＰ−１（７−３６）ａｍｉｄｅ、ＧＬＰ−２、Ｇｌｕｃａｇｏｎを活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡで定量したが、いずれも検出されなかった。表３に示す通り、これらペプチドに対する交差性は極めて小さい。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
【表３】
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【００８６】
（実施例６）ヒト検体を用いた活性型ＧＩＰ測定試験
上述したＥＬＩＳＡシステムを用いてヒト血漿中の活性型ＧＩＰを測定した。ヒト血液検体はＧＬＰ−１保存用真空採血管Ｐ７００（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、３６６４７３）を用いて採血した。測定結果は表５に示す通り、６Ａ１Ａを用いたヒト活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡシステムが血中の活性型ＧＩＰ測定に必要な特異性及び感度を有することを示している。
【００８７】
【表４】
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【００８８】
（実施例７）抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａを用いた、ラット活性型ＧＩＰ及びマウス活性型ＧＩＰの標準曲線の作製
ヒト活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡと同様に、抗ヒトＧＩＰ（Ｃ）ウサギポリクローナル抗体を捕捉抗体、６Ａ１Ａを検出抗体としてＥＬＩＳＡを構築した。ラット活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡシステムの標準反応曲線は、ｌｏｇ／ｌｏｇスケールで２．３４から１５０ｐｇ／ｍＬの範囲に亘って直線を示し（図３）、マウス活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡシステムの標準反応曲線は、ｌｏｇ／ｌｏｇスケールで７．８１から５００ｐｇ／ｍＬの範囲に亘って直線を示した（図４）、ラット及びマウス活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡともに、その直線性は極めて優れていた（Ｒ２＝０．９９９）。アッセイの感度は、ＮＣＣＬＳ法によりラット活性型ＧＩＰ測定系は０．４３ｐｇ／ｍＬ、マウス活性型ＧＩＰ測定系は１．５ｐｇ／ｍＬと計算された。
【００８９】
（実施例８）抗活性型ＧＩＰ抗体６Ａ１Ａを用いた回収率評価及び交差反応性試験
ヒト活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡシステムと同様に、ラット活性型ＧＩＰ  ＥＬＩＳＡシステム、マウス活性型ＧＩＰ測定システムそれぞれにおいて回収率評価を行った。ラット活性型ＧＩＰ測定系はラットＧＩＰ（１−４２）を７５、３７．５、１８．８ｐｇ／ｍＬ、マウス活性型ＧＩＰ測定系はマウスＧＩＰ（１−４２）を２５０、１２５、６２．５ｐｇ／ｍＬを培地、血漿サンプルにそれぞれ添加し、測定後、回収率を算出した。表２に示す通り、２回希釈の血漿サンプルにおいて、ＳＤラットでは８３．６％以上、Ｂａｌｂ／ｃマウスでは９３．６％以上の回収率であった。
【００９０】
【表５】
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【００９１】
【表６】
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【００９２】
（実施例９）空腹時及び満腹時ラットの血中の活性型ＧＩＰ濃度測定
活性型ＧＩＰは食物摂取の刺激により分泌されることが知られている。分泌された活性型ＧＩＰはＤＰＰ４によりＮ末の２アミノ酸が分解され不活化される。天然の活性型ＧＩＰに対する結合活性を確認するため、摂食後の血中活性型ＧＩＰ量の増加を測定できるかを検討した。ＣＤラット（９週齢雌）（日本チャールズ・リバー株式会社）８匹を絶食させた。絶食開始１８時間後、半分の４匹に餌を与え、残りの４匹は採血を行った。前者の４匹は給餌開始後１時間に採血した。０．５Ｍ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ、アプロニチンをあらかじめ入れた注射シリンジを用い腹大動脈より採血したし、採血後速やかに血液１ｍＬに対し１０μＬのＤＰＰIV  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＤＰＰ４）を添加した。混和後、冷却遠心を行い血漿分離した。血漿は測定まで−８０度で保管した。上述したＥＬＩＳＡにより、活性型ＧＩＰの測定を行った。
結果を図５に示す。図からわかるように摂食前に採血した血漿に比べ、摂食後に採血した血漿中には有意に高い濃度の活性型ＧＩＰが含まれることが示された。
【００９３】
（実施例１０）６Ａ１Ａの配列決定及び解析
６Ａ1Ａ抗体の遺伝子配列を決定するため、重鎖(以下、「Ｈｃ」という)及び軽鎖（以下、「Ｌｃ」という）のクローニングを行った。６Ａ１Ａ抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製した。常法に従って、5'-Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ（５‘−ＲＡＣＥ）を行い、Ｈｃ及びＬｃ遺伝子の５’末端の塩基配列を決定した。Ｈｃ、Ｌｃに特異的なプライマーを使用して、それぞれの全長ｃＤＮＡをクローニングした。決定されたＨｃ及びＬｃの遺伝子配列は、配列表に記載の通りであった。
クローニングした６Ａ１Ａ抗体のＨｃ及びＬｃ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｖ７９０−２０）に組み込むことにより発現ベクターを作製し、一過性発現試験により発現を確認した。Ｈｃ発現ベクター及びＬｃ発現ベクターの両方をＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６５０）にトランスフェクションした。無血清のＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地（株式会社免疫生物研究所、３３２５３）中で２日間培養後、培養上清を回収した。
一過性発現させた６Ａ１Ａ抗体の遺伝子産物の結合活性及び抗原特異性を確認するため、ＥＩＡ法を行った。ヒト活性型ＧＩＰを９６穴プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋ．Ｋ．，４３０３４１)に固相化し、０．１％ＢＳＡでブロッキングさせたプレートと、０．１％ＢＳＡでブロッキングのみをしたプレートを作製した。６Ａ１Ａ抗体のＨｃ及びＬｃを共発現させたＣＯＳ−１細胞培養上清を段階希釈し、各ウェルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、４００μｇ／ｍＬに調整したオルトフェニレンジアミン・２ＨＣｌ（ＯＰＤ）（ＳＩＧＭＡ、Ｐ８７８７)溶液１００μＬを添加して呈色させた。１Ｎ硫酸を１００μＬ添加し、呈色反応を停止させた後、ＯＤ４９０ｎｍを測定した。
結果を表５に示す。培養上清中の６Ａ１Ａ抗体は、ヒト活性型ＧＩＰプレートのみと反応し、ブロッキングのみのプレートに対する反応は確認されなかった。よって、発現ベクターにより発現させた６Ａ１Ａ抗体が活性型ＧＩＰと特異的に結合することが示された。
【００９４】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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