(57)【要約】【課題】本発明は、移植細胞による効果が得られるまでの期間、十分に細胞を保持することが可能な複合粒子、及び該複合粒子に細胞を担持させてなる細胞製剤を提供することを主な課題とする。【解決手段】Ｌ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる粒子表面に無機粒子を吸着させてなる複合粒子であって、前記共重合体におけるＬ-ラクチドとε−カプロラクトン共重合体の構成モル比が略７５／２５である複合粒子により実現される。更に、本発明は、前記複合粒子に細胞を担持させてなる細胞担持複合粒子を含む、細胞担持複合粒子を含む細胞製剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる粒子表面に無機粒子を吸着させてなり、前記共重合体におけるＬ-ラクチドとε−カプロラクトンの構成モル比が略７５：２５である複合粒子。
【請求項２】
前記無機粒子がハイドロキシアパタイトである、請求項１に記載の複合粒子。
【請求項３】
移植細胞用のスキャフォールドとして使用される、請求項１又は２に記載の複合粒子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の複合粒子に細胞を担持させてなる細胞担持複合粒子を含む、細胞製剤。
【請求項５】
前記細胞が骨髄単核細胞である、請求項４に記載の細胞製剤。
【請求項６】
血管新生促進用である、請求項５に記載の細胞製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞移植による効果が得られるまでの期間、十分に細胞を保持することが可能な複合粒子、及び当該複合粒子に細胞を担持させてなる細胞担持複合粒子を含む細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄中に存在する多能幹細胞又は血管内皮前駆細胞は、各組織における生理学的及び病的血管新生に関与することが明らかとなっている。これらの細胞の血管新生能を利用し、骨髄や末梢血から分離された幹細胞を虚血下肢、虚血心筋等に直接移植して血管新生を促し、血行再建を目指す血管新生療法が試みられている。このような治療は、細胞工学的手法やサイトカインを併用した移植法により有効性を高める検討がなされているものの、いまだ十分な効果は得られていないのが現状である。
【０００３】
近年、血管新生療法のメカニズムにおいて、新生血管の構造内に取り込まれる移植細胞はごくわずかであり、むしろ移植細胞が複数のサイトカインを移植部位において分泌することが血管新生に重要であることが明らかとなった。しかしながら、移植細胞は４８時間以内に、その７０〜８０％が体循環に移行し、移植部位に留まるものが少ないことが確認された。これらの知見は、非特許文献１〜７において報告されている。従って、十分な治療効果を実現するためには、移植細胞を移植の効果が得られるまでの期間、血行再建を必要とする部位（すなわち移植部位）に留まらせる技術が求められていた。
【０００４】
再生医療においては、細胞を用いて機能低下や機能不全に陥った組織・臓器の再生を行う際、投与される培養細胞を担持させるための細胞移植用スキャフォールド（細胞担体）が不可欠である。細胞移植用スキャフォールドとしては、ゼラチン、コラーゲン等が知られている。ゼラチンやコラーゲンは、非常に有効な素材であるが、動物由来であるため抗原性等の問題がある。また、ゼラチンやコラーゲンを用いた細胞スキャフォールドは、体内で分解されやすいため、移植部位に細胞を長期間保持することが困難である。
【０００５】
これに対し、ハイドロキシアパタイト等の無機物は、非動物性であることから抗原性等の心配がなく、生体適合性にも優れている。しかも、細胞の接着と増殖をも可能にするため、細胞移植用スキャフォールドとして好適である。ただし、無機物には、強度や靱性が低いという欠点があり、この欠点を補うために、無機物と生体吸収性高分子を複合化させた複合粒子が開発されている。例えば、特許文献１には、ポリエステル又は極性末端基を含む重合体により形成された支持体表面に、カルシウム塩によって形成されたナノ粒子が固定化されてなる非球形微粒子が開示されている。また、特許文献２には、生体への影響が懸念されるような有機溶剤、及び分子レベルの界面活性剤や分散安定剤等の添加剤を使用せず、熱可塑性樹脂粒子の表面に無機粒子が吸着した球状の複合微粒子を製造する方法が開示されている。
【０００６】
このように、無機物と生体吸収性高分子で構成される複合粒子の分野においても、細胞を担持させる複合粒子に対して、細胞スキャフォールドとして好適な物性及び高い安全性を付与するための様々な技術が開発されてきている。このような背景から、生体内において移植の効果が得られるまでの十分な期間に亘って移植細胞を保持することが可能であり、且つ細胞移植の効果が得られた後は速やかに吸収され得る、細胞スキャフォールドとしてより一層優れた物性を有する細胞スキャフォールドが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２３５６８６号公報
【特許文献２】特開２０１１−１８４６１５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｅｅｌ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ２００８；２２：５８２−５９７
【非特許文献２】Ｐｈｅｌｐｓ  ＥＡ  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ  ＡＪ．Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００９；４：６５−８０
【非特許文献３】Ａｎｄｒｅｗ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ  ２００８；２０：４９−１０１
【非特許文献４】Ｓｉｅｖｅｋｉｎｇ  ＤＰ  ａｎｄ  Ｎｇ  ＭＫＣ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００９；１４：１５３−１６６
【非特許文献５】Ｍｈｅｉｄ  ＩＡＩ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ  ２００９；５９：７０５−７１６
【非特許文献６】Ａｒａｎｇｕｒｅｎ  ＸＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００９；８７：３−１６
【非特許文献７】福本真也，小山英則，田中新二，前野孝明，庄司拓仁他：重症下肢虚血に対する自家骨髄単核細胞移植の有効性―透析患者を含めた検討―．日本透析医学会雑誌  ２００４，３７：１４９３−１５０１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細胞移植の効果が得られるまでの期間、移植部位において細胞を保持することが可能な複合粒子を提供することを主な目的とする。更に、本発明は、前記複合粒子に細胞を担持させてなる細胞担持複合粒子を含む細胞製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｌ-ラクチドとε−カプロラクトンの構成モル比が略７５：２５であるＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる粒子表面にハイドロキシアパタイト等の無機粒子を吸着させた複合粒子上に細胞を担持させて移植すると、移植部位において細胞移植の効果が得られるまでの期間に亘って十分に細胞が保持され、細胞移植の効果が顕著に高められることを見出した。本発明は、このような知見に基づいて更に研究を重ねた結果、完成されたものである。すなわち、本発明は下記態様の複合粒子及び細胞製剤を提供する。
項１．Ｌ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる粒子表面に無機粒子を吸着させてなり、前記共重合体におけるＬ-ラクチドとε−カプロラクトンの構成モル比が略７５：２５である複合粒子。
項２．前記無機粒子がハイドロキシアパタイトである、項１に記載の複合粒子。
項３．移植細胞用のスキャフォールドとして使用される、項１又は２に記載の複合粒子。
項４．項１〜３のいずれかに記載の複合粒子に細胞を担持させてなる細胞担持複合粒子を含む、細胞製剤。
項５．前記細胞が骨髄単核細胞である、項４に記載の細胞製剤。
項６．血管新生促進用である、項５に記載の細胞製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の複合粒子は、Ｌ-ラクチドとε−カプロラクトンの構成モル比が略７５：２５であるＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる粒子の表面に無機粒子を吸着させてなることを特徴とする。このようなＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体を使用することにより、細胞移植後の無機粒子の脱落を抑制することが可能であり、しかも、細胞移植の効果が得られるまでの十分な期間に亘って（例えば１週間〜数か月間）細胞を保持することが可能である。そのため、本発明の複合粒子上に細胞を担持させて移植することにより、生体内で安定に細胞を保持することができ（すなわち、細胞担持力に優れる）、移植先の組織再生効率を飛躍的に高めることができる。また、本発明の複合粒子は、細胞移植の効果が得られた後は、速やかに分解吸収されるため、細胞移植の効果が得られた後も生体から除去する必要がない。
【００１２】
更に、本発明の複合粒子は、動物性材料を使用せずに調製されることから、抗原性等の問題がない。しかも、本発明の複合粒子に細胞を担持させる場合、単に複合粒子と移植細胞を混合するだけで高い細胞接着が実現されることから、短期間且つ簡便に本発明の細胞製剤を調製することができる。とりわけ、本発明の複合粒子に骨髄単核細胞を担持させた細胞製剤は、血管新生促進用として有用であり、下肢虚血の治療に好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、複合粒子の素材及び平均粒子径による粒子単位表面積あたりの組織内での細胞担持力の評価結果を示すグラフである。図中Ｐ＜０．０５はＡＮＯＶＡ  Ｓｃｈｅｆｆｅ検定による有意差を示す。
【図２】図２は、ＧＦＰ濃度（即ち、複合粒子に担持される細胞量）と血流改善度（血流比）の関係を示すグラフである。図中、ＧＦＰ濃度は、単位筋肉組織中のＧＦＰ濃度を示し、Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔにて表されている。
【図３】図３は、複合粒子の素材の違いによる血流改善度（血流比）を示すグラフである。図中Ｐ＜０．０５はＡＮＯＶＡ  Ｓｃｈｅｆｆｅ検定による有意差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．複合粒子
本発明の複合粒子は、Ｌ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体からなる粒子表面に無機粒子を吸着させてなる複合粒子であり、前記共重合体におけるＬ-ラクチドとε−カプロラクトンの構成モル比が略７５：２５であることを特徴とする。以下、本発明の複合粒子について詳述する。
【００１５】
本発明において、複合粒子における核粒子を構成するポリマーとして、Ｌ-ラクチド：ε−カプロラクトン（モル比）が略７５：２５であるＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（以下、「ＰＬＣＬ（７５／２５）」と略記することもある）を用いる。ＰＬＣＬ（７５／２５）を、無機粒子を吸着させる核粒子として使用することにより、無機粒子に対する表面吸着作用に優れたものとすることができる。また、ＰＬＣＬ（７５／２５）は、細胞を担持させて移植した際、細胞移植の効果が発現されるまでの期間に亘って細胞を保持でき、更に生体内で分解・吸収されることから、細胞スキャフォールドとして好適な物性を実現することができる。
【００１６】
本発明で使用されるＰＬＣＬ（７５／２５）は、Ｌ−ラクチド（Ｌ-乳酸の環状二量体）及びεカプロラクトンを所定量のモル比でモノマーとし、それらを開環重合して得られる。本発明で使用されるＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体の重量平均分子量としては、特に制限されるものではないが、例えば、２０，０００〜１,０００，０００、好ましくは３００，０００〜９００，０００、更に好ましく５００，０００〜８００，０００が挙げられる。ここで、重量平均分子量は、ＧＰＣ分析により算出される値である。
【００１７】
本発明の複合粒子において、ＰＬＣＬ（７５／２５）の含有割合としては、特に制限されないが、例えば、当該複合粒子の総重量当たり、５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、更に好ましくは８０〜９９．９質量％が挙げられる。
【００１８】
本発明の複合粒子において、ＰＬＣＬ（７５／２５）により構成される各粒子は、中空又は非中空のいずれの構造であってもよいが、好ましくは非中空構造が挙げられる。
【００１９】
本発明の複合粒子は、ＰＬＣＬ（７５／２５）からなる粒子の表面に無機粒子が吸着した構造をとる。
【００２０】
本発明で使用される無機粒子を構成する無機化合物の種類については、特に制限されないが、例えば、リン酸カルシウム、シリカ、チタニア、アルミナ、ジルコニア、酸化鉄、酸化錫、酸化亜鉛、金、銀、パラジウム、白金、カーボンブラック、炭酸カルシウム、クレイ（例えば、モンモリロナイト）等が挙げられる。これらの無機化合物は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの無機化合物の中でも、好ましくはリン酸カルシウムが挙げられる。
【００２１】
リン酸カルシウムとしては、具体的には、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2）、リン酸トリカルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2）、メタリン酸カルシウム（Ｃａ（ＰＯ3）2）、フッ化アパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6Ｆ2）、クロロアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6Ｃｌ2）等が挙げられる。これらのリン酸カルシウムは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのリン酸カルシウムの中でも、ＰＬＣＬ（７５／２５）に対する吸着性、生体適合性、移植用細胞の保持・増殖性等にも優れているという観点から、好ましくはハイドロキシアパタイトが挙げられる。
【００２２】
また、これらの無機化合物は、焼結処理に供された焼結物であることが好ましい。上記無機化合物の焼結物を使用することにより、耐熱性や化学的安定性を備えさせることが可能になる。
【００２３】
本発明で使用される無機粒子の平均粒子径については、無機粒子を構成する無機化合物の種類や本発明の複合粒子の用途等に応じて適宜設定されるが、ＰＬＣＬ（７５／２５）に対する吸着性を向上させるという観点から、１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜８００ｎｍ、更に好ましくは１５〜５００ｎｍが挙げられる。当該平均粒子径は、走査型電子顕微鏡を用いて、無機粒子５０個以上の粒子径を測定し、平均値を算出することにより求められる値である。このような平均粒子径の無機粒子は、例えば、湿式法、水熱法、熱分解法、ゾルゲル法、アルコキシド法等の製法によって得ることができる。
【００２４】
本発明の複合粒子において、無機粒子の含有割合としては、特に制限されないが、例えば、当該複合粒子の総重量当たり、０．００１〜５０質量％、好ましくは０．０１〜３０質量％、更に好ましくは０．１〜２０質量％が挙げられる。
【００２５】
本発明の複合粒子の平均粒子径については、当該複合粒子の用途等に応じて適宜設定されるが、例えば１〜１,０００μｍ、好ましくは５〜５００μｍ、更に好ましくは２５〜１５０μｍが挙げられる。平均粒子径は、光学顕微鏡を用いて、本発明の複合粒子５０個以上の粒子径を測定し、平均値を算出することにより求められる値である。また、本発明の複合粒子における粒度分布としては、例えば、全粒子に対する７５μｍ以上３００μｍ未満の粒子の割合が５〜１００％、好ましくは１０〜１００％が挙げられる。これらの粒度分布は、走査型電子顕微鏡を用いて測定される。
【００２６】
本発明の複合粒子において、ＰＬＣＬ（７５／２５）からなる核粒子の平均粒子径、無機粒子からなる表面層の厚さについては、特に制限されず、複合粒子の平均粒子径、ＰＬＣＬ（７５／２５）や無機粒子の含有量等に応じて適宜設定される。
【００２７】
２．製造方法
本発明の複合粒子の製造方法については、特に制限されず、従来公知の方法に従って、ＰＬＣＬ（７５／２５）からなる粒子に無機粒子を吸着させればよい。本発明の複合粒子の製造方法の好適な一例として、下記の第１工程及び第２工程を含む方法が挙げられる。
【００２８】
第１工程
第１工程では、疎水性溶媒中に前記ＰＬＣＬ（７５／２５）を溶解させた疎水性溶液、無機粒子、及び親水性溶液を含む混合液に対して、ホモジナイザーを用いて撹拌してピッカリングエマルジョンを形成させる。
【００２９】
本第１工程において、疎水性溶液に使用される疎水性溶媒としては、ＰＬＣＬ（７５／２５）を溶解できることを限度として特に制限されないが、例えば、モノクロロメタン、ジクロロメタン、トリクロロメタン、テトラクロロメタン、トリフルオロ酢酸、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール等のハロゲン系炭化水素、トルエン等が挙げられる。これらの疎水性溶媒は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、好ましくはハロゲン系炭化水素、更に好ましくはジクロロメタンが挙げられる。
【００３０】
本第１工程で使用される疎水性溶液の粘度は、得られる複合粒子の平均粒子径に影響を与え得る。後述する撹拌速度によって複合粒子の平均粒子径を所望の範囲に調整するためには、疎水性溶媒と混合するＰＬＣＬ（７５／２５）の配合割合を所定の範囲に調整することにより疎水性溶液の粘度を約７００ｍＰａ・Ｓ以下に設定することが望ましい。なお、ここで粘度は、回転振動式粘度計（具体的には、ビスコメイトＶＭ−１０Ａ−Ｌ：ＣＢＣマテリアルズ（株）製が例示される）により、溶媒をジクロロメタンとして室温（約２０）℃で測定して得られる値である。また、測定の際には、溶媒の揮発による粘度の変動を避けるため粘度計のプローブを疎水性溶液に浸漬後、すぐに測定することが望ましい。疎水性溶液をこのような粘度に調整するためのＰＬＣＬ（７５／２５）の含有割合は、例えば、０．０１〜３０質量％、好ましくは２〜２０質量％、更に好ましくは４〜１０質量％が挙げられる。
【００３１】
また、本第１工程で使用される親水性溶液としては、前記疎水性溶液と相溶性のないことを限度として特に制限されず、例えば、水、メタノール、エタノール等が挙げられる。これらの親水性溶液は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、好ましくは水が挙げられる。
【００３２】
本第１工程では、先ず、前記疎水性溶液、無機粒子、及び親水性溶液を混合して、混合液を調製する。当該混合液において、前記疎水性溶液、無機粒子、及び親水性溶液の各含有量については特に制限されないが、例えば、前記疎水性溶液は１〜２０質量％、好ましくは５〜１５質量％、更に好ましくは８〜１２質量％；前記無機粒子は、０．０５〜２質量％、好ましくは０．１〜１質量％、更に好ましくは０．２〜０．５質量％；前記親水性溶液は７８〜９８．９５質量％、好ましくは８４〜９４．９質量％、更に好ましくは８７．５〜９１．８質量％を充足するように設定すればよい。
【００３３】
また、前記混合液の調製において、前記疎水性溶液、無機粒子、及び親水性溶液の添加順序については特に制限されないが、複合粒子の表面に無機粒子を一層均一に吸着させるという観点から、前記無機粒子と親水性溶液を混合した後に、これに前記疎水性溶液を添加することが望ましい。また、前記無機粒子と親水性溶液を混合する際には、必要に応じて超音波処理等に供して、無機粒子の凝集を抑制させておくことが望ましい。
【００３４】
本第１工程において、前記混合液に対して、ホモジナイザーを用いて撹拌処理することにより、ピッカリングエマルジョンが形成される。ホモジナイザーによる撹拌速度として、好ましくは４．５〜８ｍ／ｓ、更に好ましくは４．５〜７ｍ／ｓが挙げられる。また、ホモジナイザーによる撹拌時間としては、例えば、０．１〜３０分間、好ましくは０．５〜２５、更に好ましくは１〜２０分間が挙げられる。撹拌速度を上記範囲内で調整することにより、得られる複合粒子の平均粒子径を調整することができる。例えば、複合粒子の平均粒子径を５０μｍとする場合、撹拌速度は３〜１０ｍ／ｓ、好ましくは３．５〜８ｍ／ｓ、更に好ましくは４．５〜７ｍ／ｓとすればよく、撹拌時間としては例えば１０〜３０分、好ましくは１５〜２５分が挙げられる。また、例えば複合粒子の平均粒子径を１００μｍとする場合、撹拌速度は２〜９ｍ／ｓ、好ましくは２．５〜７ｍ／ｓ、更に好ましくは３．５〜６ｍ／ｓとすればよく、撹拌時間としては例えば５〜２０分、好ましくは５〜１５分が挙げられる。また、撹拌は、得られる複合粒子の粒子径に応じて多段階、好ましくは２段階で行ってもよい。例えば、最初の撹拌後に得られた粒子が目的とする平均粒子径よりも大きい場合、更に高速で撹拌して所望の平均粒子径となるように調整すればよい。
【００３５】
上記のように撹拌処理することにより、ＰＬＣＬ（７５／２５）粒子表面が無機微粒子によって被覆された複合粒子が、親水性溶液に分散した状態のピッカリングエマルジョンが形成される。
【００３６】
第２工程
本第２工程では、前記第１工程で形成されたピッカリングエマルジョンから疎水性溶媒を除去して、複合粒子を回収する。
【００３７】
ピッカリングエマルジョンから疎水性溶媒を除去する方法としては、特に制限されず、使用する疎水性溶媒の種類に応じて、常温・常圧で揮散させる方法、分散剤を減圧蒸留により留去する方法、加熱乾燥する方法等の中から適宜設定すればよい。
【００３８】
疎水性溶媒として、ハロゲン系炭化水素を使用する場合であれば、本第２工程における分散媒の除去方法の好適な例として、ポットミル回転台を使用して常温で１〜５０ｒｐｍの回転速度でハロゲン系炭化水素を揮散させる方法が挙げられる。
【００３９】
本第２工程によって、複合粒子の核層を形成している疎水性溶媒が除去された後、遠心分離、留去等によって親水性溶液を分離することにより、目的物である複合粒子が得られる。なお、本第２工程では、疎水性溶媒の除去と共に、親水性溶液の除去も同時に行ってもよい。
【００４０】
斯して回収された複合粒子は、超音波処理、エタノールや水等の洗浄液による洗浄処理等の更なる洗浄処理に供してもよい。更に、必要に応じて篩分け等によって分画することにより、所望の粒子径に調整された複合粒子を得ることができる。篩分けは、従来公知の方法により行うことができ限定されないが、所望の粒子径が分画される目開きを有する篩網が設置された振動篩器等を用いて行うことができる。
【００４１】
例えば、平均粒子径５０μの複合粒子を得る場合であれば、ＪＩＳ  Ｚ８８０１−１に準じ、目開き１０〜９０μｍ、好ましくは２０〜９０μｍ、更に好ましくは２５〜７５μｍの篩網（具体的にはＴＨＥ  ＩＩＤＡ  ＴＥＳＴＩＮＧ  ＳＩＥＶＥ（ＩＩＤＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＣＯ．ＬＴＤ．）が例示される）を使用することにより分画できる。より具体的には、例えば、７５μｍ目開きの篩網を通過し、２５μｍ目開きの篩網を通過しなかったものを平均粒子径５０μｍの複合粒子として得ることができる。また、平均粒子径１００μの複合粒子を得る場合であれば、目開き２０〜１８０μｍ、好ましくは５３〜１８０μｍ、更に好ましくは７５〜１５０μｍの篩網を使用することにより分画できる。より具体的には、例えば、１５０μｍ目開きの篩網を通過し、７５μｍ目開きの篩網を通過しなかったものを平均粒子径１００μｍの複合粒子として得ることができる。
【００４２】
３．細胞製剤
本発明の複合粒子は、培養細胞、又は生体内の細胞や組織に接着し、細胞増殖の足場として使用されるので、医用材料として好適に使用される。医用材料として、具体的には、細胞培養用の担体、骨補充材、軟組織補充材、細胞担持用担体等が例示される。とりわけ、本発明の複合粒子は、再生医療等によって細胞を移植する際に、細胞移植用のスキャフォールド（移植細胞を担持させる担体）として好適である。即ち、本発明は、更に、前記複合粒子に細胞を担持させてなる細胞担持複合粒子を含む細胞製剤をも提供する。
【００４３】
本発明の複合粒子に担持させる細胞の種類については、特に制限されないが、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、各種間葉系幹細胞、骨髄単核細胞、末梢血単核細胞、血管内皮前駆細胞、血小板、血管内皮細胞、平滑筋細胞、中皮細胞、骨格筋芽細胞、骨芽細胞、前骨芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、神経細胞等が挙げられる。ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、及び間葉系幹細胞は分化されたものであってもよい。これらの細胞中でも、好ましくは単核細胞、更に好ましくは骨髄単核細胞が挙げられる。本発明の複合粒子に骨髄単核細胞を担持させて、これを細胞製剤として使用することにより、血管新生を顕著に増幅させることができ、より効果的な細胞移植による血管新生療法が可能になる。即ち、本発明の複合粒子に骨髄単核細胞を担持させた細胞製剤は血管新生促進用として好適に使用され得る。従来、下肢血管の動脈硬化等が原因で潰瘍や壊死が生じる下肢虚血は下肢切断の危険があったが、本発明の複合粒子に骨髄単核細胞を担持させた細胞製剤を下肢虚血患部周辺に移植することによって、患部における血管新生を促進し、下肢虚血の効果的な治療が可能になる。
【００４４】
本発明の複合粒子に担持させる細胞数については、担持させる細胞の種類や用途等に応じて適宜設定されるが、例えば、複合粒子１個当たり、担持させる細胞数が１０〜１００，０００個、好ましくは１００〜１０，０００個、更に好ましくは５００〜５，０００個が挙げられる。
【００４５】
本発明の複合粒子に上記細胞を担持させる方法としては、特に限定されないが、例えば、当該複合粒子と担持させる細胞を、適当な液体中で混合する方法等が挙げられる。このような複合粒子と細胞の混合に使用される液体としては、担持させる細胞の種類等に応じて適宜調製され得るが、ＤＭＥＭ等の培地、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、血漿（ヘパリン加血漿、クエン酸ナトリウム加血漿等）等が挙げられる。本発明の細胞製剤が主に成体への移植を目的として使用されることから、これらの液体の中でも、好ましくは培地、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、血漿等が挙げられ、更に好ましくは血漿が挙げられる。
【００４６】
また、本発明の複合粒子に上記細胞を担持させる他の方法としては、例えば、複合粒子の存在下で担持させる細胞を培養し、複合粒子と細胞の間の相互作用を介して接着させる方法が挙げられる。
【００４７】
また、本発明の複合粒子は細胞接着性に優れることから、移植前にインキュベーションを行わなくても生体内で十分に細胞を保持することができる。しかしながら、複合粒子に細胞を担持してから移植するまでに、必要に応じてインキュベーションを行ってもよい。インキュベーションを行う場合、インキュベーション時間及び条件は、複合粒子上に細胞が担持される限り特に限定されないが、好ましくは、３７℃、５％ＣＯ2条件下で約１〜３時間が挙げられる。
【００４８】
本発明の複合粒子に細胞を担持させた細胞担持複合粒子は、必要に応じて、薬学的に許容される担体に混合されて細胞製剤として使用されてもよい。このような担体としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、血漿等が挙げられる。当該細胞製剤の投与法等については、使用する細胞の種類、適用対象となる疾患の種類等に応じて適宜設定される。
【実施例】
【００４９】
以下に実施例等を示して本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。後述する試験例において使用するため、下記実施例１及び比較例１〜３の複合粒子を調製した。
【００５０】
実施例１：ＨＡｐ-ＰＬＣＬ（７５／２５）複合粒子
１．低結晶性ハイドロキシアパタイト粒子の調製
球状形態の低結晶性ハイドロキシアパタイト粒子を以下に示す湿式法で調製した。なお、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏ及び（ＮＨ4）2ＨＰＯ4は、ナカライテスク株式会社製のものを用い、２５％アンモニア水は和光純薬工業株式会社製のものを用い、純水としてＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｗａｔｅｒを使用した。
【００５１】
先ず、２５％アンモニア水でｐＨを１２に調整したＣａ（ＮＯ3）2水溶液（４２ｍＮ、８０ｍＬ）を、冷却管及び半月状撹拌翼を接続した１Ｌフラスコに注ぎいれ、室温に保った。このフラスコに、アンモニア水でｐＨを１２に調整した(ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液（１００ｍＮ、２００ｍＬ）を室温にて添加し、１０時間反応させた。次に、得られた反応物を遠心分離により分離洗浄することにより、低結晶性ハイドロキシアパタイト粒子を得た。
【００５２】
２．高結晶性ハイドロキシアパタイト粒子の調製
上記で得られた低結晶性ハイドロキシアパタイト粒子を、次に示す方法によって焼成することで高結晶性ハイドロキシアパタイトナノ粒子を作製した。
【００５３】
まず、融着防止剤として、０．５ｇのポリアクリル酸（ＡＬＤＲＩＣＨ社製、重量平均分子量１５，０００ｇ／ｍｏｌ）を含むｐＨ７．０の水溶液（以下、水溶液Ａ）１００ｍｌに、０．５ｇの低結晶性ハイドロキシアパタイトナノ粒子を分散させることで、同粒子表面にポリアクリル酸を吸着させた。次に、上記で調製した分散液に、水酸化カルシウム〔Ｃａ（ＯＨ）2〕飽和水溶液５００ｍｌを添加することで、同粒子表面にポリアクリル酸カルシウムを析出させた。結果として生じる沈澱物を回収し、減圧下８０℃にて乾燥させることで、混合粒子を取得した。
【００５４】
上記混合粒子をルツボに入れ、焼結温度８００℃にて一時間焼結を行なった。この際、ポリアクリル酸カルシウムは熱分解し、酸化カルシウム〔ＣａＯ〕となった。
【００５５】
次に、上記で調製した水溶液Ａ５００ｍｌに得られた焼結体を懸濁し、遠心分離により分離洗浄し、更に蒸留水に懸濁し、同様に遠心分離により分離洗浄を行なうことによって、融着防止剤及び硝酸アンモニウムを除去し、高結晶性ハイドロキシアパタイトナノ粒子を回収した。
【００５６】
得られた高結晶性ハイドロキシアパタイトナノ粒子を走査型電子顕微鏡にて観察して平均粒子径を測定した結果、同平均粒子径は４８ｎｍであった。なお、走査型電子顕微鏡は、日本電子株式会社製、モデル名ＪＳＭ−６３０１Ｆを用いて、倍率９０，０００倍で観察を行った。
【００５７】
３．複合粒子の調製
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（ＰＬＣＬ）からなる粒子の表面にハイドロキシアパタイト粒子が吸着した複合粒子を以下の方法に従って調製した。
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体は、ガラス反応管にラクチド及ε-カプロラクトン（モル比７５：２５）を入れ、これにオクチル酸スズ３００ｐｐｍ（スズ金属換算：８７ｐｐｍ）加えて、窒素雰囲気下で重合することにより、重量平均分子量７８万の共重合体を得た。得られた共重合体を粉砕機で粉砕し、核粒子となるＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体の粒子（平均粒子径３．０ｍｍ）を得た。以下、このＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体の粒子を『ＰＬＣＬ（７５／２５）』と略記することがある。
【００５８】
（平均粒子径５０μｍの複合粒子の調製）
上記で得られた高結晶性ハイドロキシアパタイト粒子１ｇを純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）５００ｍＬに分散させ、１分間超音波処理を行った。これに、ＰＬＣＬ（７５／２５）１５ｇをジクロロメタン２６５ｇ（２００ｍＬ）に溶解させたジクロロメタン溶液２８０ｇを添加して、ホモジナイザー（マイクロテック・ニチオン製ヒスコトロンＮＳ−５６；ジェネレーターシャフトＮＳ−２０）で撹拌速度６．２８ｍ／ｓで２０分間撹拌することにより、ピッカリングエマルジョンを形成させた。次に、得られたピッカリングエマルジョンを、ポットミル回転高架台（ＡＮＺ−５１Ｓ；日陶科学株式会社製）にて４．５ｒｐｍの速度で室温（約２０℃）で７２時間回転させながら、ジクロロメタンを除去して、複合粒子の分散液を得た。
【００５９】
次いで、得られた複合粒子の分散液をエタノール洗浄処理に供した。まず、各複合粒子の分散液を遠心分離（３００ｒｐｍ、２分間）した後、上澄みを除去して沈澱物（複合粒子）を回収した。回収した沈澱物にエタノールに添加して、３０秒間の超音波処理を行った後に、遠心分離（３００ｒｐｍ、２分間）により、沈澱物（複合粒子）を回収した。得られた沈澱物に対して、エタノール洗浄処理を４回繰り返し行った後に乾燥することにより、複合粒子を得た。Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体の粒子（ＰＬＣＬ（７５／２５））の表面にハイドロキシアパタイト粒子が吸着した複合粒子を『ＨＡｐ−ＰＬＣＬ（７５／２５）』と略記することがある。
【００６０】
その後、ＴＨＥ  ＩＩＤＡ  ＴＥＳＴＩＮＧ  ＳＩＥＶＥ（ＩＩＤＡ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ  ＣＯ．ＬＴＤ．（ＪＩＳ  Ｚ８８０１−１））を用いた篩分けにより平均粒子径５０μｍの複合粒子を分画した。平均粒子径５０μｍの複合粒子は、目開き７５μｍの篩を通過して得開き２５μｍの篩を通過しなかった粒子を回収して得た。このようにして得られた平均粒子径５０μｍの複合粒子の収率は、仕込み量（使用した高結晶ハイドロキシアパタイトとＰＬＣＬの総量：１６ｇ）に対して４８％であった。
【００６１】
（平均粒子径１００μｍの複合粒子の調製）
上記で得られた高結晶性ハイドロキシアパタイト粒子１ｇを純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）５２０ｍLに分散させ、１分間超音波処理を行った。これに、ＰＬＣＬ（７５／２５）１５ｇをジクロロメタン２３９ｇ（１８０ｍL）に溶解させたジクロロメタン溶液２５４ｇを添加して、ホモジナイザー（マイクロテック・ニチオン製ヒスコトロンＮＳ−５６；ジェネレーターシャフトＮＳ−２０）で撹拌速度４．１９ｍ／ｓで１０分間撹拌し、さらに、ホモジナイザー（マイクロテック・ニチオン製ヒスコトロンＮＳ−５６；ジェネレーターシャフトＮＳ−２０）で撹拌速度６．２８ｍ／ｓで１０分間撹拌することにより、ピッカリングエマルジョンを形成させた。次に、得られたピッカリングエマルジョンを、ポットミル回転高架台（ＡＮＺ−５１Ｓ；日陶科学株式会社製）にて４．５ｒｐｍの速度で室温（約２０℃）で７２時間回転させながら、ジクロロメタンを除去して、複合粒子の分散液を得た。
【００６２】
次いで、得られた複合粒子の分散液を前記平均粒子径５０μｍの複合粒子の調製と同様のエタノール洗浄処理、及び篩分けに供した。平均粒子径１００μｍの複合粒子の篩分けは、目開き１５０μｍの篩を通過して目開き７５μｍの篩を通過しなかった粒子を回収することにより行った。このようにして得られた平均粒子径１００μｍの複合粒子の収率は仕込み量（使用した高結晶ハイドロキシアパタイトとＰＬＣＬの総量：１６ｇ）に対して７３％であった。
【００６３】
比較例１：ハイドロキシアパタイトとポリ−Ｌ−ラクチド（ＰＬＬＡ）との複合粒子
上記で得られた高結晶性ハイドロキシアパタイト粒子１ｇを純水（Ｍｉｌｌｉ-Ｑ  Ｗａｔｅｒ）５００ｍＬに分散させ、１分間超音波処理を行った。これに、ポリ−Ｌ−ラクチド（ＰＬＬＡ：重量平均分子量＝１００，０００）１ｇをジクロロメタン１３ｇ（約８．８ｍＬ）に溶解させたジクロロメタン溶液１４ｇを添加して、ホモジナイザー（Ｄｉｓｐｅｒｇｉｅｒａｎｔｒｉｅｄ  Ｔ１０  ｂａｓｉｃ（ＩＫＡ社製））で周速度６．５４ｍ／ｓで３分間撹拌することにより、ピッカリングエマルジョンを形成させた。次に、マグネティックスターラーを用いて一晩撹拌し、得られたピッカリングエマルジョンからジクロロメタンを除去して複合粒子の分散液を得た。
【００６４】
得られた分散液に対し、実施例１に記載されるエタノール洗浄処理を行い、その後、実施例１（平均粒子径１００μｍの複合粒子の調製）と同様の方法に従って篩分けすることより平均粒子径１００μｍの複合粒子を得た。以下、ハイドロキシアパタイトとポリ−Ｌ−ラクチドとの複合粒子を、「ＨＡｐ−ＰＬＬＡ」と略記することがある。
【００６５】
比較例２：ハイドロキシアパタイトとＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（５０／５０）との複合粒子
上記で得られた高結晶性ハイドロキシアパタイト粒子１．５ｇを純水（Ｍｉｌｌｉ-Ｑ  Ｗａｔｅｒ）８００ｍＬに分散させ、１分間超音波処理を行った。これに、Ｌ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（５０／５０）（Ｌ-ラクチド：カプロラクトンのモル比５０：５０、重量平均分子量２８０，０００）８ｇをジクロロメタン９２ｇ（約６２ｍＬ）に溶解させたジクロロメタン溶液１００ｇを添加して、ホモジナイザー（マイクロテック・ニチオン製ヒスコトロンＮＳ−５６（ジェネレーターシャフトＮＳ−２０））で撹拌速度２．９３ｍ／ｓで３分間撹拌することにより、ピッカリングエマルジョンを形成させた。次に、振とう機に瓶を固定して一晩揺らすことにより、得られたピッカリングエマルジョンからジクロロメタンを除去して複合粒子の分散液を得た。
【００６６】
得られた分散液に対し、実施例１に記載されるエタノール洗浄処理を行い、その後、実施例１と同様の方法に従って篩分けすることより平均粒子径５０μｍ又は１００μｍをそれぞれ分画し、各平均粒子径の複合粒子を得た。以下、ハイドロキシアパタイトとＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（５０／５０）との複合粒子を、「ＨＡｐ−ＰＬＣＬ（５０／５０）」と略記することがある。
【００６７】
比較例３：ハイドロキシアパタイトとＬ-ラクチド／グリコリド共重合体（９０／１０）との複合粒子
上記で得られた高結晶性ハイドロキシアパタイト粒子３．５ｇを純水（Ｍｉｌｌｉ-Ｑ  Ｗａｔｅｒ）７００ｍＬに分散させ、１分間超音波処理を行った。これに、Ｌ-ラクチド／グリコリド共重合体（９０／１０）（Ｌ-ラクチド：グリコリドのモル比９０：１０、重量平均分子量＝１５０，０００）２４ｇをジクロロメタン１７６ｇ（約１１９ｍＬ）に溶解させたジクロロメタン溶液２００ｇを添加して、ホモジナイザー（マイクロテック・ニチオン製ヒスコトロンＮＳ−５６（ジェネレーターシャフトＮＳ−２０））で撹拌速度４．１９ｍ／ｓで３分間撹拌することにより、ピッカリングエマルジョンを形成させた。次に、ポットミル回転高架台（ＡＮＺ−５１Ｓ；日陶科学株式会社製）にて３７ｒｐｍの速度で室温（約２０℃）で７２時間回転させながら、得られたピッカリングエマルジョンからジクロロメタンを除去し、複合粒子の分散液を得た。
【００６８】
得られた分散液に対し、実施例１に記載されるエタノール洗浄処理を行い、その後、実施例１と同様の方法に従って篩分けすることより平均粒子径５０μｍ又は１００μｍをそれぞれ分画し、各平均粒子径の複合粒子を得た。このようにして得られた平均粒子径５０μｍの複合粒子の収率は、仕込み量（使用した高結晶ハイドロキシアパタイトとＰＬＧＡの総量：２７．５ｇ）に対して１８．２％であり、平均粒子径１００μｍの複合粒子の収率は仕込み量に対して５３．５％であった。以下、ハイドロキシアパタイトとＬ-ラクチド／グリコリド共重合体（９０／１０）との複合粒子を、「ＨＡｐ−ＰＬＧＡ（９０／１０）」と略記することがある。
【００６９】
［試験例１］
麻酔下（ペントバルビタール５０μｇ／体重（ｇ）、腹腔内投与）でＣ５７ＢＬ６−Ｃｒ−Ｓｌｃ（雄、８週齢：日本エスエルシー株式会社より入手）の左大腿動脈とその分岐を結紮、切除して下肢虚血マウスモデルを作製した。
【００７０】
グリーンマウス（ＥＧＦＰ-トランスジェニックマウス）由来のＧＦＰ産生骨髄単核細胞（ＢＭＣ）を、複合粒子の細胞担持力を評価するために用いた。ＧＦＰ産生骨髄単核細胞は、次のようにして調製した。すなわち、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスを頸椎脱臼にて屠殺後、両側大腿骨及び脛骨を摘出して骨髄液を抽出した。得られた骨髄液を、Ｆｉｃｏｌｌ液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ：（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＢ（Ｓｗｅｄｅｎ）製）にて処理し、骨髄単核細胞のみを分離回収した。この骨髄単核細胞を、培養液（ＤＭＥＭ  血清（−））で懸濁し、１×１０6細胞／１００μｌとなるよう調整した（インキュベーション時間は０時間）。
【００７１】
上記で得られた細胞懸濁液（１００μｌ）を、上記実施例１及び比較例１〜３の各複合粒子（それぞれ１．５ｍｇ）と混合することにより、ＧＦＰ産生骨髄単核細胞を担持させた複合粒子を得た。また、コントロールとして、上記で得られた細胞懸濁液（１００μｌ）を、ポリ−Ｌ-ラクチド（ＰＬＬＡ）（ＰＬＡ−Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；Ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社製）のみの粒子（平均粒子径：１００μｍ）（１．５ｍｇ）と混合することにより、ＧＦＰ産生骨髄単核細胞を担持させたＰＬＬＡ粒子を得た。
【００７２】
ＧＦＰ産生骨髄単核細胞を担持させた複合粒子を、マウス虚血肢の４箇所に筋肉内注射（２４Ｇ針を使用）した。移植７日目にマウスを頸椎脱臼にて屠殺し、大腿部筋肉を採取して筋肉の溶解液を調製した。大腿部筋肉の溶解液の調製は、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４；１０９：２４５４−２４６１に記載される方法に準じて行った。
【００７３】
ＧＦＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製）を用いて溶解液中のＧＦＰ濃度を測定した。また、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ（ＢＣＡ）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ法により溶解液中の総タンパク濃度を測定した。各溶解液中のＧＦＰ濃度を総タンパク濃度で割った値を単位筋肉組織中のＧＦＰ濃度として算出した。更にその測定結果に基づいて複合粒子の単位表面積あたりのＧＦＰ濃度（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔ）を算出し、これを筋肉組織における複合粒子の骨髄単核細胞担持力として比較した。結果を図１に示す。
【００７４】
図１から明らかなように、比較例２（ＨＡｐ−ＰＬＣＬ（５０／５０）；平均粒子径１００μｍ）を用いた場合は、比較例１（ＰＬＬＡ粒子にハイドロキシアパタイトを被覆させた複合粒子：平均粒子径１００μｍ）と同程度の細胞担持力であった。これに対し、実施例１の複合粒子（ＨＡｐ−ＰＬＣＬ（７５／２５））を用いた場合、組織内での細胞担持力が飛躍的に向上した。また、実施例１の複合粒子は、比較例３のＨＡｐ−ＰＬＧＡ（９０／１０）の場合と比較しても、組織内において顕著に高い細胞担持力を示した。
【００７５】
すなわち、Ｌ-ラクチドとε−カプロラクトンのモル比が７５：２５であるＬ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体にハイドロキシアパタイトを吸着させて得られる複合粒子は、極めて高い細胞担持力を有することが示された。
【００７６】
［試験例２］
試験例１と同様の方法で調製したＧＦＰ産生骨髄単核細胞の細胞懸濁液（１００μｌ）を、上記実施例１及び比較例２の各複合粒子（それぞれ１．５ｍｇ）と混合することにより、ＧＦＰ産生骨髄単核細胞を担持させた複合粒子を得た。
【００７７】
ＧＦＰ産生骨髄単核細胞を担持させた複合粒子を、下肢虚血マウスに筋肉内注射した。注射（移植）１４日目の下肢の血流量を血流ドップラー法で測定（オメガフローＦＬＯ−Ｎ１：オメガウェーブ株式会社製）し、虚血肢（左下肢）の血流量を正常肢（右下肢）の血流量で割った値を血流改善度（血流比）とした（図２）。また、各群の血流改善度を比較する場合は、Ｖｉｈｉｃｌｅ処理（ＤＭＥＭ  血清（−）１００μｌを注入）マウスの下肢の血流改善度を１として、各群の血流改善度（血流比）をＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔとして表した（図３）。なお、本試験で使用した下肢虚血マウスは、前記試験例１で用いたものと同様である。各単位筋肉組織中のＧＦＰ濃度は、下肢血流量の測定後に試験例１と同様の方法で測定された。得られた結果を図２及び３に示す。
【００７８】
図２は、ＨＡｐ-ＰＬＣＬ（７５／２５）にＧＦＰ産生骨髄単核細胞を担持させ、虚血肢に注射した場合の単位筋肉組織中のＧＦＰ濃度と血流比の関係を示すグラフである。図２より、ＧＦＰ濃度が高いほど血流改善度も高いことが示された。即ち、細胞担持力が高いほど血流改善度も高くなることが示された。
【００７９】
図３は、複合粒子に使用される材料（ＰＬＣＬ（７５／２５）又はＰＬＣＬ（５０／５０））によって血流の改善度が異なることを示す。即ち、高い細胞担持力を有する実施例１の複合粒子を用いた場合、Ｖｉｈｉｃｌｅ処理及び比較例２（ＨＡｐ−ＰＬＣＬ（５０／５０））の複合粒子を用いた場合に比べて、顕著な血流改善効果を示した。従って、実施例１の複合粒子に骨髄単核細胞を担持させた細胞製剤によって、虚血下肢において高い血流改善効果が得られることが示された。
【００８０】
［試験例３］
前述の実施例１及び比較例３の複合粒子を用いてハイドロキシアパタイトの脱離速度を評価した。具体的には、３７℃のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に実施例１又は比較例３の複合粒子を浸漬し、浸漬直後（０週間）から２４週間後までの表面モルフォロジィ変化を観察した。観察は、３Ｄリアルサーフィスビュー顕微鏡（株式会社キーエンス製）を使用し、倍率１０，０００倍で行った。３Ｄリアルサーフィスビュー写真の印刷物をハイドロキシアパタイト被覆部と非被覆部に切り分け、印刷物の全重量に対する、ハイドロキシアパタイト被覆部の重量％を計算することにより、ハイドロキシアパタイト粒子がＰＬＣＬ粒子表面を被覆している割合を求めた。結果を下表１に示す。
【表１】
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【００８１】
表１に示されるように、ハイドロキシアパタイトを被覆させる粒子としてＰＬＣＬ（７５／２５）を使用した場合、３７℃のＰＢＳに２４週間浸漬させた後でも４８％のハイドロキシアパタイト被覆率を保持していた。これに対し、ＰＬＧＡ（９０／１０）粒子にハイドロキシアパタイトを被覆させた場合は、浸漬４週間後で４８％、２４週間後で７％まで被覆率が著しく低下した。
【００８２】
ハイドロキシアパタイトは、細胞の接着に有用であることから、生体内でのハイドロキシアパタイトの脱離速度が遅いことは、複合粒子上において、移植細胞による効果が得られるまでの間、安定に細胞を保持するために有効であると考えられる。即ち、この試験結果からも、ハイドロキシアパタイトを被覆させる粒子としてＰＬＣＬ（７５／２５）が好適であることが示された。
【００８３】
［まとめ］
Ｌ-ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（Ｌ-ラクチド：ε−カプロラクトンの構成モル比：７５／２５）からなる粒子に無機粒子が吸着されてなる複合粒子上に細胞を担持させることにより、生体内で細胞が組織再生に十分な期間、複合粒子上に留まることができ、組織再生の効率を高めることが可能であった。また、上記結果に示されるように、ＰＬＣＬ（７５／２５）粒子にハイドロキシアパタイトが吸着された複合粒子に骨髄単核細胞を担持させて虚血下肢モデルマウスに移植することにより、顕著に優れた血流改善効果が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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