(57)【要約】【課題】凍結材料、特に凍結された植物組織・細胞の氷結晶形態の痕跡及びその周辺組織の破壊状態の観察を可能にすると共に、浸漬置換・固定工程に要する時間を大幅に短縮でき、かつ凍結時の氷結晶の状態を正確に観察可能にする。【解決手段】凍結材料１０を凍結温度下で凍結用包埋材１２０を用いて包埋処理した後、プラスチック製のフィルム１２４に貼着する。次に凍結材料１０を刃１２６で３〜１０μｍの厚さに薄切し、薄切片に凍結温度条件下で静置乾燥するか又は冷風を当てて乾燥し、氷結晶を昇華する。次に薄切片を常温下で有機溶剤に浸漬して固定処理し、その後染色して薄切試料２４を作製する。フィルム１２４に貼着して薄切した薄切片を有機溶剤で浸漬固定しているため、浸漬固定工程２０に要する時間を大幅に短縮できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結材料の氷結晶を観察するための試料を作製する凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法において、
前記凍結材料を凍結用包埋材で包埋する包埋工程と、
該包埋工程で包埋した凍結材料に、該凍結材料の凍結温度下で粘着性を有する粘着面を備えたフィルムを貼着するフィルム貼着工程と、
前記フィルムに貼着された凍結材料を薄切する薄切工程と、
該薄切工程で製造された薄切片を凍結状態のまま凍結温度条件下で氷を昇華させて乾燥し、前記フィルムに固着させる昇華乾燥工程と、
フィルムに固着された凍結材料を常温下で有機溶剤に浸漬し、該凍結材料の細胞質内物質の構造変化を抑える浸漬固定工程と、
該浸漬固定工程の後で、薄切片を染色して観察用試料を作製する染色工程と、からなり、
作製された観察用試料から氷結晶の存在形態及び組織の損傷程度を観察するようにしたことを特徴とする凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法。
【請求項２】
前記昇華乾燥工程は、前記薄切片を凍結状態のまま、前記凍結材料の凍結温度条件下で静置するか又は冷風に当て、氷結晶を溶解させずに昇華させて乾燥し、前記フィルムに固着させるものであることを特徴とする請求項１に記載の凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法。
【請求項３】
前記薄切片は、３〜１０μｍの厚さであることを特徴とする請求項１又は２に記載の凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結材料の内部に形成される氷結晶の存在形態及び氷結晶の周辺組織の損傷程度を観察するための氷結晶観察用試料作製方法に関し、特に、植物組織からなる凍結材料の氷結晶形態の痕跡及び周辺組織の破壊状態の観察を可能にした方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品や生体組織等を凍結する際に生成される氷結晶の状態把握は、凍結温度、風速、時間等の凍結条件が適切か否かを評価する上で重要な判断項目の一つとなっている。従来、凍結試料における氷結晶の観察には、偏光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡、電子顕微鏡、近赤外顕微鏡、冷凍顕微鏡等を用いた直接観察法と、凍結置換法等を用いた間接観察法とがある。しかし、直接観察法は、特殊な装置を必要とし、高コストであり、また、凍結材料の全体像を把握しにくかったため、安価で凍結材料の全体像が把握可能な間接観察法が多く普及している。
【０００３】
非特許文献１には、間接観察法のひとつである凍結置換法が開示されている。この方法は、凍結材料を凍結状態のまま、水分をアセトン、アルコールなどの有機溶剤と置換し、同時に、有機溶剤に溶けているホルマリン、エタノールなどの固定剤により固定する。即ち、細胞質内物質の流出を抑え、構造の変化を最小限に抑えることで、生鮮組織の状態のまま包埋工程に移行し、凍結試料の氷結晶痕跡を観察するものである。以下、この凍結置換法による氷結晶観察用試料の作製フローを図４により説明する。
【０００４】
図４において、まず、浸漬置換・固定工程１０２で、凍結材料１００を凍結状態のまま有機溶剤に浸漬し、凍結材料１００の水分と有機溶剤とを置換すると共に、固定剤により固定する。有機溶剤には、例えば、ホルマリン・エタノール混合液が用いられる。浸漬置換・固定工程１０２では、凍結材料１００を低温下で２〜４週間静置して固定させる。その後、固定が完了した凍結材料１００の固定液を除去するため、冷蔵・流水工程１０４で、凍結材料１００を冷蔵状態で流水で水洗する。
【０００５】
次いで、水洗いした凍結材料１００をゼラチン溶液に浸漬して数日間放置する（ゼラチン浸漬（包埋）工程１０６）。即ち、包埋材としてゼラチンを用い、凍結材料１００の組織に均一な硬度をもたせて、薄切しやすくするため、ゼラチンを凍結材料１００の内部まで完全に含浸させる。この場合、一度に濃いゼラチン溶液に浸漬させるのではなく、順次濃度の濃いゼラチン溶液にさせ含浸させる。なお、植物系組織の場合、包埋材としてパラフィンを用いるのが良い。次に、凍結材料１００を薄切・染色して凍結試料１１０を作製する。
【０００６】
非特許文献２には、植物組織・細胞の観察用試料の作製フローが開示されている。以下、この作製フローを図５により説明する。図５において、切り出した植物組織２００を有機溶剤に浸漬し、植物組織２００の水分と有機溶剤とを置換し固定する（浸漬置換・固定工程２０２）。有機溶剤兼固定剤として、例えば、ホルマリン、氷酢酸及びエタノールの混合液が用いられ、半日以上静置して固定する。その後、順次、５０％エタノール、６０％エタノール、７０％エタノール、８０％エタノール、９０％エタノール及び１００％エタノールに浸漬させ、固定液の除去及び脱水を同時に行なう（エタノール脱水工程２０４）。
【０００７】
次に、包埋工程２０６を行なう。ここでは、包埋材としてパラフィン又は樹脂が用いられる。次に、包埋工程後の植物組織２００を薄切及び染色し（薄切・染色工程２０８）、標本として観察用に用いられる試料２１０を作製する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】特集  生体内や氷晶を観察する技術「２．凍結食品内氷結晶観察のための凍結置換法（冷凍２００８年３月号第８３巻第９６５号Ｐ．１４３〜Ｐ．１４８）
【非特許文献２】細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ６「植物の細胞を観る  実験プロトコール」（Ｐ．２０〜Ｐ．３１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１に開示された凍結置換法は、浸漬置換・固定工程１０２で長い時間がかかり、凍結試料１１０の作製に１ヶ月近くを要する。このため、例えば、工場などでは、凍結製品の製造効率を低下させたり、作製中に凍結条件が変化し、不適切な凍結条件で凍結してしまい、凍結製品の品質低下を招くおそれがあった。また、植物組織・細胞に対しては、植物の種類によっては十分に固定できないことも多く、凍結時の氷結晶や組織状態を正確に観察することが困難である場合もあった。また、凍結材料をプラスチックフィルム等の支持体に粘着させた状態で薄切し、その後に浸漬置換・固定工程を行なう方法の場合であっても、植物組織の場合、浸漬置換工程や染色工程において、支持体からの薄切片の遊離が起こることがあった。
【００１０】
また、浸漬置換・固定工程で、有機溶剤を用いる理由は、凍結材料のたんぱく質構造に架橋をつくり、凝固・変性させ、組織構造を保ち組織に硬度を持たせることと同時に、氷を溶出（融解ではなく）させるためである。しかし、植物組織や炊飯粒など糖質系組織は、たんぱく質が主体でないため、十分な固定ができないこともあり、このため、正確な観察ができない場合もあった。
【００１１】
非特許文献２に開示された植物組織・細胞の試料作製フローは、常温における組織観察方法であり、凍結温度以下の材料を用いた試料作製方法ではない。従って、凍結材料の氷結晶形態の痕跡及び周辺組織の破壊状態を観察するのに適した方法ではない。
【００１２】
本発明は、かかる従来技術の課題に鑑み、凍結材料、特に凍結された植物組織・細胞の氷結晶形態の痕跡及び周辺組織の破壊状態の観察を可能にすると共に、浸漬置換・固定工程に要する時間を大幅に短縮でき、かつ凍結時の氷結晶の状態を正確に観察可能な試料作製方法を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
かかる目的を達成するため、本発明の凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法は、凍結材料の氷結晶を観察するための試料を作製する凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法において、凍結材料を凍結用包埋材で包埋する包埋工程と、包埋工程で包埋した凍結材料に、凍結材料の凍結温度下で粘着性を有する粘着面を備えたフィルムを貼着するフィルム貼着工程と、フィルムに貼着された凍結材料を薄切する薄切工程と、薄切工程で製造された薄切片を凍結状態のまま凍結温度条件下で氷を昇華させて乾燥し、フィルムに固着させる昇華乾燥工程と、フィルムに固着された凍結材料を常温下で有機溶剤に浸漬し、凍結材料の細胞質内物質の構造変化を抑える浸漬固定工程と、浸漬固定工程の後で、薄切片を染色して観察用試料を作製する染色工程と、からなり、作製された観察用試料から氷結晶の存在形態及び組織の損傷程度を観察するようにしたものである。
【００１４】
本発明方法では、凍結材料をフィルムに貼着して薄切した薄切片を、凍結材料の凍結温度条件下で凍結材料に含まれる氷を昇華させることで、氷結晶を融解させることなく、乾燥できる。これによって、凍結材料をフィルムの粘着面に固着させることができる。このように、凍結材料をフィルムに固着させることで、昇華乾燥工程以降に常温下で行われる浸漬固定工程や染色工程で、凍結材料の薄切片のフィルムからの遊離や、凍結材料の氷結晶痕跡や組織の変形を防止でき、かかる良好な状態での観察が可能となる。
【００１５】
また、凍結材料をフィルムに貼着して薄切した薄切片を有機溶剤で浸漬固定するので、浸漬固定に要する時間を大幅に短縮でき、観察用試料を短時間で作製できる。非特許文献１に開示された従来の凍結置換法は、有機溶剤への浸漬時間が長かったため、組織の脱水収縮が生じることがあった。これに対し、本発明方法によれば、浸漬時間を大幅に短縮できるため、凍結材料の組織の脱水収縮を最小限に抑えることができ、これによって、凍結材料の氷結晶の存在形態及び組織の損傷を正確に観察できる。
【００１６】
さらに、凍結材料をフィルムに貼着した状態で薄切しているため、薄切時や浸漬固定時における凍結材料の組織の変形や欠損を防止でき、氷結晶形態の痕跡を良好に維持することが可能になる。
【００１７】
なお、有機溶剤は、一般的に植物組織観察で用いられているＦＡＡ（ホルマリン：氷酢酸：５０％エタノール）は組織浸透性が良く、入力手しやすく、かつ安価であり、これを用いるとよい。
【００１８】
本発明方法において、昇華乾燥工程では、薄切片を凍結状態のまま、凍結材料の凍結温度条件下で静置するか又は冷風に当て、氷結晶を溶解させずに昇華させて乾燥し、フィルムに固着させるようにするとよい。これによって、凍結材料からの氷結晶の分離・除去を容易にかつ短時間で行なうことができる。
【００１９】
また、薄切片は、３〜１０μｍの厚さであることが好ましい。薄切片の厚さが３μｍ未満では、氷結晶の痕跡が薄切片に明瞭に残らない可能性があり、１０μｍを超えると、薄切片の浸漬置換・固定に時間がかかってしまう。前記厚さ範囲とすることで、短時間で薄切片の浸漬置換・固定が可能であり、氷結晶の痕跡を精度良く観察できる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明方法によれば、凍結材料の氷結晶を観察するための試料を作製する凍結材料の氷結晶観察用試料作製方法において、凍結材料を凍結用包埋剤で包埋する包埋工程と、包埋工程で包埋した凍結材料に、凍結材料の凍結温度下で粘着性を有する粘着面を備えたフィルムを貼着するフィルム貼着工程と、フィルムに貼着された凍結材料を薄切する薄切工程と、薄切工程で製造された薄切片を凍結状態のまま凍結温度条件下で氷を昇華させて乾燥し、フィルムに固着させる昇華乾燥工程と、フィルムに固着された凍結材料を有機溶剤に浸漬し、凍結材料の細胞質内物質の構造変化を抑える浸漬固定工程と、浸漬固定工程の後で、薄切片を染色して観察用試料を作製する染色工程と、からなり、作製された観察用試料から氷結晶の存在形態及び組織の損傷程度を観察するようにしたので、昇華乾燥工程を行なうことで、浸漬固定工程及び染色工程で薄切片の遊離や組織の変形を防止できる。
【００２１】
また、薄切工程後に昇華乾燥工程及び浸漬固定工程を行なうようにしたので、昇華乾燥工程及び浸漬固定工程に要する時間を大幅に短縮でき、観察用試料を短時間で作製可能となる。また、従来の凍結置換法は、有機溶剤への浸漬時間が長かったため、組織の脱水収縮が生じることがあったが、本発明方法によれば、有機溶剤への浸漬時間を大幅に短縮できるため、組織の脱水収縮を最小限に抑えることが可能になり、これによって、凍結時の氷結晶の状態を正確に観察することができる。
【００２２】
さらに、凍結材料をフィルムに貼着させた状態で薄切し、かつ凍結材料の凍結温度条件下で氷結晶を昇華させ、フィルムに固着させているため、薄切工程及び浸漬固定工程における組織の変形を防止でき、氷結晶形態の痕跡を良好な状態のまま維持することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明方法を凍結された植物組織の観察用試料作製に適用した第１実施形態の作製フロー図である。
【図２】（Ａ）は第１実施形態で凍結材料へのフィルム貼着工程を説明する図であり、（Ｂ）は凍結材料の薄切工程を説明する図である。
【図３】第１実施形態で作製された氷結晶観察用試料の顕微鏡写真である。
【図４】従来の凍結置換法による観察用試料の作製フロー図である。
【図５】従来の植物組織の観察用試料の作製フロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を図に示した実施形態を用いて詳細に説明する。但し、この実施形態に記載されている構成部品の寸法、材質、形状、その相対配置などは特に特定的な記載がない限り、この発明の範囲をそれのみに限定する趣旨ではない。
【００２５】
本発明方法を凍結された植物組織の観察用試料作製に適用した一実施形態を図１〜図３に基づいて説明する。図１において、本実施形態の観察用試料作製工程は、凍結された植物組織からなる凍結材料１０を凍結温度下で包埋処理する包埋工程１２と、凍結材料１０にフィルムを貼着するフィルム貼着工程１４と、凍結材料１０を薄切する薄切工程１６と、薄切工程１６で薄切された薄切片を昇華・乾燥する昇華・乾燥工程１８と、乾燥されフィルムに固着された薄切片を常温下で有機溶剤に浸漬し、細胞質内物質の流出を抑え、構造の変化を最小限に抑える固定処理を行なう浸漬固定工程２０と、浸漬固定工程後の薄切片を染色して薄切試料２４を作製する染色工程２２とからなる。そして、作製された薄切試料２４のうち染色されていない部分を氷結晶の存在痕跡として観察するようにしている。
【００２６】
包埋工程１２は、凍結用包埋材を用いて凍結材料１０を凍結温度条件下で包埋処理する工程であるが、凍結用包埋材として、例えば、ＣＭＣ（carboxymethylcellcelose）又はＯＣＴ（Optimal Cutting Temperature）コンパウンドを用いる。この包埋工程１２により、凍結材料１０に均一な硬度をもたせ、後工程の薄切工程１４で凍結材料１０が変形するのを防止する。
【００２７】
フィルム貼着工程１４では、包埋した凍結材料１０に、凍結材料１０の凍結温度条件下で粘着性を有する粘着面を備えたフィルムを貼着する。即ち、図２（Ａ）に示すように、凍結用包埋材１２０で包埋処理された凍結材料１０を、後述する薄切装置に固定するための支持台１２２に固定しておき、該支持台１２２と対面する側の凍結材料面にプラスチック製のフィルム１２４を貼着する。
【００２８】
薄切工程１６では、凍結温度下で、フィルム１２４に貼着した状態の凍結材料１０を所定厚さに薄切する。薄切装置として、例えば、ミクロトーム等の薄切装置を用いる。図２（Ｂ）に示すように、凍結材料１０の支持台１２２を薄切装置（図示省略）に固定し、フィルム１２４に平行となるように、凍結材料１０に刃１２６を挿入し、凍結材料１０を所定厚さに薄切する。このとき、薄切片の厚さは３〜１０μｍとすることが好ましい。薄切片の厚さが３μｍ未満の場合、薄切片に氷結晶の痕跡が明瞭に残らない可能性があり、１０μｍを超えると、薄切片の浸漬固定に薄切片の浸漬固定に時間がかかる。
【００２９】
浸漬固定工程に時間がかかると、例えば、凍結食品の製造工場などでは、凍結製品の製造効率を低下させたり、作製中に凍結条件が変化し、不適切な凍結条件で凍結してしまい、凍結製品の品質低下を招くおそれがある。前記範囲とすることで、短時間で薄切片の浸漬固定が可能になり、氷結晶の痕跡を精度良く観察可能になると共に、凍結食品の製造効率を向上でき、かつ凍結食品の品質低下を招かない。
【００３０】
昇華・乾燥工程１８では、凍結材料１０が薄切された薄切片を、凍結状態のまま凍結材料１０の凍結温度条件下で氷結晶の昇華及び乾燥を行なう。昇華・乾燥工程１８では、凍結材料１０の凍結温度条件下の低温薄切装置内又は冷凍庫内で、好ましくは５〜３０分程度静置乾燥するか又は冷風を当てて乾燥する。これによって、昇華・乾燥工程を容易に実施できると共に、薄切片の氷結晶を溶解させることなく昇華除去でき、氷結晶の痕跡及びその周辺組織を良好な状態に保持できる。また、乾燥により凍結材料１０がフィルム１２４に固着し、浸漬固定工程２０及び染色工程２２で、フィルム１２４から薄切片が遊離・離脱するのを防止できる。
【００３１】
浸漬固定工程２０では、常温下で薄切片を化学固定する。即ち、常温下で乾燥されフィルム１２４に固着された薄切片を有機溶剤に浸漬し、細胞質内物質の流出を抑え、構造の変化を最小限に抑え、できるだけ凍結材料１０を凍結時の状態に保存する。本実施形態では、有機溶剤として、ＦＡＡ（ホルマリン：氷酢酸：５０％エタノール＝５：５：９０）を用いている。ＦＡＡは、組織浸透性が良く、入力手しやすく、かつ安価であり、ＦＡＡを用いることで、固定処理に要する時間を短縮できる。
【００３２】
ＦＡＡ以外に、例えば、エタノール、ホルマリン、アセトン、又はこれらのうち少なくとも２以上の有機溶剤を混合した混合液を用いることができる。浸漬固定工程２０では、組織内物質の流出を抑えると共に、薄切片の構造変化を最小限に抑え、氷結晶の痕跡やその周辺組織を凍結時の状態に保持する。
【００３３】
染色工程２２では、常温下で薄切片を染色剤により染色し、封入剤を浸透させた薄切試料２４を作製する。染色剤として、例えば、トルイジンブルー、アニリンブルー、ファストグリーンＦＣＦ等の周知の染色剤を用いることができる。その後、薄切試料２４を、フィルム１２４に貼着したまま、フィルム１２４とガラス板との間に挟み込み、正立型顕微鏡などの顕微鏡で、薄切試料２４のうち染色されていない部分で示される氷結晶の痕跡の大きさや周辺組織の損傷程度を観察する。
【００３４】
本実施形態によれば、包埋工程１２から染色工程２２までの所要時間は数十分に短時間で行うことができる。即ち、フィルム１２４に貼着して薄切した薄切片を有機溶剤で浸漬固定しているため、浸漬固定工程２０に要する時間を大幅に短縮でき、そのため、観察用試料を短時間で作製できる。従来の凍結置換法は、有機溶剤への浸漬時間が長かったため、組織の脱水収縮が生じることがあったが、本実施形態の試料作製方法によれば、浸漬固定時間を大幅に短縮できるため、組織の脱水収縮を最小限に抑えることが可能になり、凍結材料１０の凍結時の氷結晶の状態を正確に観察できる。
【００３５】
また、薄切片をフィルム１２４に貼着した状態で薄切しているため、薄切時や浸漬固定時における組織の変形を防ぐことができる。さらに、氷結晶の昇華及び乾燥を行なうことで、薄切片をフィルム１２４に固着できるので、フィルム１２４からの薄切片の遊離・離脱を防ぎ、氷結晶形態の痕跡を良好な状態のまま保存できる。
【実施例】
【００３６】
次に、前記実施形態による観察用試料の作製を実際に行なったときの実施例を説明する。本実施例では、凍結材料として、庫内温度を−１５℃に設定した連続式フリーザで凍結させた枝豆を用いた。この凍結枝豆を凍結用包埋材（ＣＭＣ又はＯＣＴコンパウンド）で包埋し、−２０℃以下に設定したクリオスタットにセットし、トリミングした後、凍結枝豆の表面に低温で粘着性を有する粘着面を備えたプラスチックフィルムを貼着した。
【００３７】
そして、該プラスチックフィルムを貼着した状態で、凍結枝豆を回転式ミクロトームに設置し、凍結温度条件下で薄切した。この薄切片を、プラスチックフィルムを貼着したまま、−２０℃以下の環境下で氷結晶の昇華及び乾燥を行なった。この際、−２０℃以下の冷風を当てることで、昇華及び乾燥に要する時間を早めることができた。
【００３８】
次に、有機溶剤としてＦＡＡ（ホルマリン：氷酢酸：５０％エタノール＝５：５：９０）を用い、薄切片をＦＡＡに０．５〜２分程度浸漬させて固定処理した。次に、固定処理した薄切片を、染色剤としてトルイジンブルーを用い、水洗→トルイジンブルーによる染色→水洗の手順で染色した。
【００３９】
このようにして作製された薄切試料の顕微鏡写真を図３に示す。同写真において、染色されている部分が凍結枝豆の組織３０を示し、染色されていない部分が氷結晶の痕跡３２を示す。本実施例によれば、全工程が１０〜４０分程度の短時間しかかからず、この時間で薄切試料を作製でき、かつ薄切試料の氷結晶の痕跡を明瞭に観察可能できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、凍結材料、特に植物組織を有する凍結材料から短時間で観察用試料を作製できると共に、観察用試料の組織の変質を最小限に抑え、氷結晶の痕跡及びその周辺組織を正確に観察できる。
【符号の説明】
【００４１】
１０，１００                凍結材料
１２                        包埋工程
１２０                    凍結用包埋材
１２２                    支持台
１２４                    フィルム
１２６                    刃
１４                        フィルム貼着工程
１６                        薄切工程
１８                        昇華・乾燥工程
２０                        浸漬固定工程
２２                        染色工程
２４                        薄切試料
３０                        凍結枝豆組織
３２                        氷結晶痕跡
【図１】
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【図２】
2013029436.tif 000004
【図４】
2013029436.tif 000005
【図５】
2013029436.tif 000006
【図３】
2013029436.tif 000007