(57)【要約】【課題】難治性神経変性疾患のバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを提供する。また、ｍｉＲＮＡを利用した疾患バイオマーカーの探索法を提供する。【解決手段】本発明で特定したｍｉＲＮＡを測定することにより、筋萎縮性側索硬化症、多系統萎縮症を検出することができる。また、本発明のバイオマーカーペプチドの特定化方法は、ｍｉＲＮＡを分析同定する工程、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子を予測する工程、標的遺伝子をバイオインフォマティクスで絞り込む工程を含み、好ましくは、プロテオーム解析でペプチドを同定する工程を更に含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定し、前記ｍｉＲＮＡが表５〜表１０に記載のｍｉＲＮＡである、神経変性疾患の検出方法。
【請求項２】
表５〜表１０に記載のｍｉＲＮＡである、神経変性疾患を検出するためのバイオマーカー。
【請求項３】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定し、前記ｍｉＲＮＡが表５〜表８に記載のｍｉＲＮＡである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法。
【請求項４】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定し、前記ｍｉＲＮＡが表９、表１０に記載のｍｉＲＮＡである、多系統萎縮症の検出方法。
【請求項５】
ｍｉＲＮＡを分析同定する工程、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子を予測する工程、標的遺伝子をバイオインフォマティクスで絞り込む工程、から成るバイオマーカーペプチドを特定化する方法。
【請求項６】
プロテオーム解析でペプチドを同定することと組み合わせてバイオマーカーペプチドを特定化する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患の存在を検出するためのマイクロＲＮＡとその利用に関する。また、マイクロＲＮＡを利用したバイオマーカー探索に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症を含む神経変性疾患は、一般に進行性であり、脳神経細胞の不可逆的な変性を伴うことから、早期に診断し治療を開始することが重要である。しかし、現時点では有効なバイオマーカーが確立されておらず、血清学的検査方法を用いた診断法は確立されておらず、また確実な治療法も確立されていない。その結果、難治性で、日常生活が破壊される状況となり、患者本人の肉体的負担のみならず、家族にも多大の負担を来している。神経変性疾患は患者本人だけでなく、介護者にも多大な負担が及び、社会全体の活力の大きな損失につながるという実態がある。血清学的診断法により簡便に早期の診断及び病態のモニタリングが実施できるようになれば、早期治療が可能となり、多くの患者の不可逆的なダメージを最小限に抑えることが可能となる。早期診断が可能となれば、患者だけでなく介護者のＱＯＬの向上、ひいては超高齢化を迎えた日本社会全体の活力の維持にも大きく貢献することは間違いない。
【０００３】
神経変性疾患の発症や病態に関わる生体内因子は、遺伝子から細胞まで広く研究されているが、未解明な部分が非常に多く、未だに診断や治療につながる有用なバイオマーカーは見出されていない。難治性神経変性疾患のうちでも、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis：ＡＬＳ）と多系統萎縮症（Mutiple System Atrophy: ＭＳＡ）は重篤な神経機能障害と死に至る疾患であり、有用なバイオマーカーの開発は緊急の課題となっている。
【０００４】
近年、生体内因子の重要な因子として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略す）が注目されている。ｍｉＲＮＡは、約２２塩基の蛋白質非翻訳ＲＮＡ（small non-coding RNA）であり、ヒトには約１０００種類以上存在することが示唆されている。ｍｉＲＮＡは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されている。ゲノム上には各ｍｉＲＮＡ遺伝子の領域が存在し、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写され、約数百塩基のｍｉＲＮＡ初期転写産物が形成される。ｍｉＲＮＡ初期転写産物は核内でＤｒｏｓｈａ、細胞質内でＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類のＲＮａｓｅ III酵素によってプロセシングされ、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。成熟ｍｉＲＮＡは制御タンパク質複合体（RNA-induced silencing complex：ＲＩＳＣ）と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている。
【０００５】
ｍｉＲＮＡはヒト疾患に広く関連が示唆されているが、特にがんとｍｉＲＮＡの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのｍｉＲＮＡの発現様式が異なる事から、発がん過程へのｍｉＲＮＡ発現異常の関与が強く示唆されている。すなわち、腫瘍抑制的ｍｉＲＮＡの発現低下あるいは発がん促進的ｍｉＲＮＡの発現上昇がヒト発がん過程に関与している可能性が強く示唆されている（非特許文献１）。
ｍｉＲＮＡの産業上の利用に関しても、頭頚部腫瘍（特許文献１）、婦人科がん（特許文献２）、下咽頭がん（特許文献３）などのバイオマーカーとしての利用や治療薬への応用（特許文献４）など、現状ではもっぱらがんの領域での利用が主体である。
【０００６】
しかしながら、ｍｉＲＮＡは各種疾患に広く関与している可能性が高いにもかかわらず、神経疾患へのｍｉＲＮＡの関与に関する情報は非常に乏しく、ＡＬＳの進行抑制にｍｉＲＮＡ−２０６が関与することを示唆した文献（非文献情報２）や脊髄性筋萎縮症（Spinal Muscular Atrophy: ＳＭＡ）への関与を示唆する文献（非文献情報３）など、少数の報告があるにすぎない。
進行性で内因的な因子の関与が大きいと考えられる神経変性疾患では、特にｍｉＲＮＡを利用した検査診断あるいは創薬に有用な疾患バイオマーカーの開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2010-094122号公報
【特許文献２】特開2010-154843号公報
【特許文献３】特開2011-072229号公報
【特許文献４】特開2011-093892号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】microRNAの制御異常と癌、実験医学  vol.27, No.8, 2009
【非特許文献２】Haramati S et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jul 20;107(29):13111-6.
【非特許文献３】Williams AH et al., Science. 2009 Dec 11;326(5959):1549-54.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のとおり、難治性のＡＬＳやＭＳＡに対する検査法や治療法は確立しておらず、医療上の大きな課題になっている。疾患に関与すると言われているｍｉＲＮＡの神経変性疾患におけるバイオマーカーとなりえるｍｉＲＮＡを見出し、その利用方法を確立すれば、新しい検査診断法、病態管理法、さらには治療薬への応用が可能となる。
本発明の目的は、難治性神経変性疾患のバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡを臨床検査や病態管理、さらには治療法へ応用することである。また、ｍｉＲＮＡを利用した疾患バイオマーカーの探索法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
［１］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定し、前記ｍｉＲＮＡが表５〜表１０に記載のｍｉＲＮＡである、神経変性疾患の検出方法、
［２］表５〜表１０に記載のｍｉＲＮＡである、神経変性疾患を検出するためのバイオマーカー、
［３］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定し、前記ｍｉＲＮＡが表５〜表８に記載のｍｉＲＮＡである、筋萎縮性側索硬化症の検出方法、
［４］被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定し、前記ｍｉＲＮＡが表９、表１０に記載のｍｉＲＮＡである、多系統萎縮症の検出方法、
［５］ｍｉＲＮＡを分析同定する工程、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子を予測する工程、標的遺伝子をバイオインフォマティクスで絞り込む工程、から成るバイオマーカーペプチドを特定化する方法、
［６］プロテオーム解析でペプチドを同定することと組み合わせてバイオマーカーペプチドを特定化する、［５］の方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の検出方法によれば、簡便な血清学的検査により、神経変性疾患、特には、多系統萎縮症（ＭＳＡ）又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を検出することができる。
また、本発明の特定化方法によれば、減少するためにプロテオーム解析では把握できないタンパク質をｍｉＲＮＡの増加という相反する現象で把握できることができ、プロテオーム解析とｍｉＲＮＡ解析の相互補完的解析でバイオマーカーを特定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の特定化方法で得られた結果を示すネットワーク図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の検出方法では、神経変性疾患、特には筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）又は多系統萎縮症（ＭＳＡ）を検出するバイオマーカーとして、表５〜表１０に記載のｍｉＲＮＡを使用することができる。
該ｍｉＲＮＡは、単独で使用することもできるし、複数を使用することもできる。精度を高めるため複数を組み合わせて使用する方が好ましい。実際上の臨床検査の場合では１〜１０のｍｉＲＮＡ、さらに好ましくは２〜５のｍｉＲＮＡを組み合わせて利用することが望ましい。
【００１４】
後述の実施例において具体的実験データを示すとおり、ＡＬＳ患者では、健常者と比較して、表５、表６に記載のｍｉＲＮＡが増大しており、表７、表８に記載のｍｉＲＮＡが減少している。従って、被験者、特に、神経変性疾患が疑われる患者又は神経変性疾患患者から採取した試料中のこれらのｍｉＲＮＡ（以下、ＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡと称する）の少なくとも１つを、それ自体公知の方法に従って測定することにより、ＡＬＳであるか否かを判定することができる。
これらのＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡの中でも、表５〜表８において好適と記載されたｍｉＲＮＡは、特に多くの神経系に関与する因子を標的とするため、ＡＬＳ検出用のバイオマーカーとして、より好ましく使用することができる。
【００１５】
また、存在率が増大しているｍｉＲＮＡの場合は、前記のより好ましい標的遺伝子が、その変化率（signal ratio）が高い傾向にある。よって、変化率（ｌｏｇ２表記）が１．５以上、好ましくは１．８以上、より好ましくは２．０以上、特に好ましくは３．０以上のｍｉＲＮＡをＡＬＳ検出用のバイオマーカーとして使用することができる。
また、存在率が減少しているｍｉＲＮＡの場合は、前記のより好ましい標的遺伝子が、その変化率（signal ratio）が低い傾向にある。よって、変化率（ｌｏｇ２表記）が０．７以下、好ましくは０．５以下、より好ましくは０．３以下のｍｉＲＮＡをＡＬＳ検出用のバイオマーカーとして使用することができる。
【００１６】
前記ＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡの標的遺伝子としては、後述の表１１、表１２に示す各遺伝子を挙げることができる。これらの標的遺伝子でコードされるタンパク質又はペプチド因子（以下、併せてペプチド因子と称する）は、それ自体、ＡＬＳ検出用のバイオマーカーとして使用することができるだけでなく、ＡＬＳ治療剤または予防剤のターゲットとしても使用することができる。
【００１７】
表１１、表１２に示す標的遺伝子の内、表１に示す標的遺伝子は、それを標的とするｍｉＲＮＡの少なくとも３種類がＡＬＳ患者において増大しており、標的遺伝子と強く相互作用していると考えられる。従って、これらのｍｉＲＮＡにより発現抑制がかかると予測されるため、これらの遺伝子でコードされるペプチド因子は、その減少を指標とすることにより、ＡＬＳ検出用あるいは治療・予防用のバイオマーカーとして、より好ましく使用することができる。
一方、表１１、表１２に示す標的遺伝子の内、表２に示す標的遺伝子は、それを標的とするｍｉＲＮＡの少なくとも３種類がＡＬＳ患者において減少している。従って、これらのｍｉＲＮＡが減少することにより発現亢進がかかると予測されるため、これらの遺伝子でコードされるペプチド因子は、その増加を指標とすることにより、ＡＬＳ検出用あるいは治療・予防用のバイオマーカーとして、より好ましく使用することができる。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
【表２】
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【００２０】
次に、ＭＳＡ患者では、健常者と比較して、表９に記載のｍｉＲＮＡが増大しており、表１０に記載のｍｉＲＮＡが減少している。従って、被験者、特に、神経変性疾患が疑われる患者又は神経変性疾患患者から採取した試料中のこれらのｍｉＲＮＡ（以下、ＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡと称する）の少なくとも１つを、それ自体公知の方法に従って測定することにより、ＭＳＡであるか否かを判定することができる。
これらのＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡの中でも、表９、表１０において好適と記載されたｍｉＲＮＡは、特に多くの神経系に関与する因子を標的とするため、ＭＳＡ検出用のバイオマーカーとして、より好ましく使用することができる。
【００２１】
また、存在率が増大しているｍｉＲＮＡの場合は、前記のより好ましい標的遺伝子が、その変化率（signal ratio）が高い傾向にある。よって、変化率（ｌｏｇ２表記）が１．５以上、好ましくは１．７以上、より好ましくは２．０以上のｍｉＲＮＡをＡＬＳ検出用のバイオマーカーとして使用することができる。
また、存在率が減少しているｍｉＲＮＡの場合は、前記のより好ましい標的遺伝子が、その変化率（signal ratio）が低い傾向にある。よって、変化率（ｌｏｇ２表記）が０．７以下、好ましくは０．６以下、より好ましくは０．４以下のｍｉＲＮＡをＡＬＳ検出用のバイオマーカーとして使用することができる。
【００２２】
前記ＭＳＡ検出用ｍｉＲＮＡの標的遺伝子としては、後述の表１３、表１４に示す各遺伝子を挙げることができる。これらの標的遺伝子でコードされるペプチド因子は、それ自体、ＭＳＡ検出用のバイオマーカーとして使用することができるだけでなく、ＭＳＡ治療剤または予防剤のターゲットとしても使用することができる。
【００２３】
表１３、表１４に示す標的遺伝子の内、表３に示す標的遺伝子は、それを標的とするｍｉＲＮＡの少なくとも３種類がＭＳＡ患者において増大しており、標的遺伝子と強く相互作用していると考えられる。従って、これらのｍｉＲＮＡにより発現抑制がかかると予測されるため、これらの遺伝子でコードされるペプチド因子は、その減少を指標とすることにより、ＭＳＡ検出用あるいは治療・予防用のバイオマーカーとして、より好ましく使用することができる。
一方、表１３、表１４に示す標的遺伝子の内、表４に示す標的遺伝子は、それを標的とするｍｉＲＮＡの少なくとも３種類がＭＳＡ患者において減少している。従って、これらのｍｉＲＮＡが減少することにより発現亢進がかかると予測されるため、これらの遺伝子でコードされるペプチド因子は、その増加を指標とすることにより、ＭＳＡ検出用あるいは治療・予防用のバイオマーカーとして、より好ましく使用することができる。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
【表４】
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【００２６】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡを使用する場合、それ自体公知の方法、例えば、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法や、ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ法により、測定することができる。
また、本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてペプチド因子を使用する場合、タンパク質の各種の公知分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法、電気泳動等の生化学的分析方法により実施することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。
【００２７】
本発明方法で用いる試料としては、例えば、脳脊髄液、血液試料（例えば、末梢血、血漿、血清）、尿、リンパ液、唾液、その他の体液、好ましくは、脳脊髄液、血漿、血清を用いることができる。さらには生検で採取された病理組織からの抽出成分も利用できる。
【００２８】
本発明では、さらにバイオインフォマティクスを活用して得られたｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補を解析し、リンケージの高い因子を絞り込める可能性を新たに見出した。このｍｉＲＮＡリンケージ法により、病態変化に伴って減少するためにプロテオーム解析では把握できないタンパク質やペプチドの減少をｍｉＲＮＡの増加という相反する現象で把握できることであり、プロテオーム解析とｍｉＲＮＡ解析の相互補完的解析でバイオマーカーを特定することができる。これによって、プロテオーム解析と連動して用いることにより、病態における増大及び減少するタンパク質やペプチド因子を絞り込み、バイオマーカーとして利用できる手法を考案した。
【００２９】
本発明の基本となる考え方は以下のとおりである。網羅的なプロオーム解析で得られる数１００種以上のぺプチド因子をさらに絞り込むことは、プロテオーム解析を行う場合には必ず遭遇する障壁である。この解決のためには、疾患とリンクする別の解析情報が求められる。プロテオーム解析で得られるペプチド情報は、それ自体は独立した因子の存在として得られるが、生体内では因子間で誘導や抑制がかかるなど相互作用している可能性が高い。この誘導と抑制という制御機構にはぺプチド自体のみならず、ｍｉＲＮＡが強く関与していることから、ｍｉＲＮＡ解析情報をプロテオーム解析情報にリンクさせることができれば、相互に得られた情報から、細胞内で起きているイベントをより明確に推測することができる。ｍｉＲＮＡは細胞内で標的遺伝子たるペプチドのメッセンジャーＲＮＡを標的遺伝子として抑制していることから、増加したｍｉＲＮＡの標的となるペプチドは減少し、プロテオーム解析では検出しにくくなる。反対に、減少したｍｉＲＮＡの標的となるペプチドは増加し、プロテオーム解析では検出されやすくなると推測される。実際には、減少した成分を分析することは分析システムの検出限界が絡み、信頼性に乏しいので、増大した成分で評価する方が確実である。よって、プロテオーム解析で検出されたペプチド群は産生増加して細胞外に放出された因子と見ることができ、他方、ｍｉＲＮＡ解析で検出されたｍｉＲＮＡ群からは、実施例２の手法を用いて絞り込まれたｍｉＲＮＡ群の標的遺伝子を抽出することによって、細胞内で抑制されたペプチド群を推定することができる。生体内の細胞内で産生抑制された因子を体液中で検出することは相当に困難であるが、増大したｍｉＲＮＡを指標として抑制されたぺプチド因子を推定することによって、細胞内で増大した因子と減少した因子の両方をリストアップすることができると考えられる。
【００３０】
この手法によってリストアップされた因子群を、ネットワーク解析やパスウェイ解析を行うことによってリンケージ解析を行うことにより、因子間の相互作用がより明確に解析でき、病態因子の絞り込みを行うことができる。ネットワーク解析とパスウェイ解析を行うバイオインフォマティクスツールは独自に開発されたものでも構わないが、商用ツールでは、“ＭｅｔａＣｏｒｅ”（ＴｈｏｍｓｏｎＲｅｕｔｅｒ社）、ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ社）、ＫｅｙＭｏｌｎｅｔ（医薬分子設計研究所）などが利用できる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
《実施例１：脳脊髄液中のｍｉＲＮＡの分析》
確定診断された筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または多系統萎縮症（ＭＳＡ）の患者、及び対象群として健常者に対して、腰椎穿刺によって脳脊髄液を採取した。採取後、速やかに４℃、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心処理し、上清を０．６ｍＬずつポリプロピレンチューブに分注して−８０℃で凍結保存した。凍結保存した各群３例から、それぞれＲＮＡ抽出後、マイクロアレイによるｍｉＲＮＡ分析を行った。
【００３３】
マイクロアレイは３Ｄ−ｇｅｎｅチップ（東レ（株）製）を用い、メーカー指定のｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション試薬セットとHuman miRNA Oligo chip（データベースmiRBase Release16.0から選定したヒト約１，２００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載）で行い、対象群に対する患者群のシグナル強度の変化を求めた。変化率はｌｏｇ２表記で、対象群に対してｌｏｇ２＝１．５以上であるものを「増大したｍｉＲＮＡ（upregulated miRNA）」、ｌｏｇ２＝０．７以下であるものを「減少したｍｉＲＮＡ（downrwgulated miRNA）」と規定した。
【００３４】
結果を表５〜表１０に示す。表５、表６は、ＡＬＳ患者の脳脊髄液中で増大したｍｉＲＮＡ群であり、表７、表８は、ＡＬＳ患者の脳脊髄液中で減少したｍｉＲＮＡ群である。表９は、ＭＳＡ患者の脳脊髄液中で増大したｍｉＲＮＡ群であり、表１０は、ＭＳＡ患者の脳脊髄液中で減少したｍｉＲＮＡ群である。
これらのｍｉＲＮＡ群は、それぞれの疾患の検査診断バイオマーカーとして利用することができる。また、表５〜表１０において「好適」欄に記号○を付してあるｍｉＲＮＡは、以下の実施例２で特定した、それぞれの疾患のバイオマーカーとして特に好ましく用いることができるｍｉＲＮＡである。
【００３５】
【表５】
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【００３６】
【表６】
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【００３７】
【表７】
2013138637.tif 000008
【００３８】
【表８】
2013138637.tif 000009
【００３９】
【表９】
2013138637.tif 000010
【００４０】
【表１０】
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【００４１】
《実施例２：ｍｉＲＮＡの標的遺伝子を特定する方法》
実施例１で検出されたｍｉＲＮＡ群が生体内で制御する標的遺伝子群を特定するために、２段の解析法を用いた。
まず、検出されたｍｉＲＮＡリスト（ｍｉＲＮＡリストＡ；前記表５〜表１０）から標的遺伝子を推定するために、miRanda-mirSVRをベースにした解析ツールmicroRNA.org-Targets and Expression（http://www.microrna.org/microrna/home.do）にて、ｍｉＲＮＡ配列情報とのマッチングによる標的遺伝子候補をリストアップした（〜１００種程度。標的遺伝子候補リストＡ）。
ＡＬＳで変動（増大または減少）したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補を表１１、表１２に、ＭＳＡで変動したｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補を表１３、表１４に、それぞれ示す。なお、右端欄に「抑制」と記載した標的遺伝子候補は、以下の解析で特定した「ｍｉＲＮＡで抑制がかかるｍｉＲＮＡ標的遺伝子」を意味し、「亢進」と記載した標的遺伝子候補は、以下の解析で特定した「ｍｉＲＮＡで亢進がかかるｍｉＲＮＡ標的遺伝子」を意味する。
【００４２】
【表１１】
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【００４３】
【表１２】
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【００４４】
【表１３】
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【００４５】
【表１４】
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【００４６】
ＭＳＡに関して解析したＴＮＮＩ１を例にとって、作成したｍｉＲＮＡリストＢを表１５に示す。表１５に示す「MSA患者」欄に示す「増大」は、実施例１で検出した「ＭＳＡ患者で増大したｍｉＲＮＡ」であることを示す。
表１５に示すように、ＴＮＮＩ１遺伝子に関連するｍｉＲＮＡとして抽出した１３種類のｍｉＲＮＡの内、ＭＳＡ患者で増大したｍｉＲＮＡは５種類であった。本実施例では、それぞれの疾患において、実施例１で検出したｍｉＲＮＡが３種類以上含まれる標的遺伝子候補を「ｍｉＲＮＡ制御因子」と特定した。特に、増大したｍｉＲＮＡを３種類以上含む標的遺伝子候補を「ｍｉＲＮＡで抑制がかかるｍｉＲＮＡ標的遺伝子」と、減少したｍｉＲＮＡを３種類以上含む標的遺伝子候補を「ｍｉＲＮＡで亢進がかかるｍｉＲＮＡ標的遺伝子」とした。
【００４７】
【表１５】
2013138637.tif 000016
【００４８】
以上の２種のｍｉＲＮＡリストを比較し、共通するｍｉＲＮＡが複数存在することを確認し、脳脊髄液中に含まれるｍｉＲＮＡで複数の標的遺伝子に関与するｍｉＲＮＡは神経変性に関与するｍｉＲＮＡとして特定することができた。ｍｉＲＮＡリストＡは実際に患者脳脊髄液から変動のあるｍｉＲＮＡとして検出され、神経変性疾患の検査診断に利用できるｍｉＲＮＡ群であるが、本手法で特定されたｍｉＲＮＡ群（前記表５〜表１０参照）は、特に多くの神経系に関与する因子を標的とし、特に好ましく用いることができるｍｉＲＮＡである。
【００４９】
《実施例３：関連ペプチド因子のリンケージ解析法の開発》
網羅的なプロオーム解析で得られる１００種以上のぺプチド因子をさらに絞り込むことは、プロテオーム解析を行う場合には必ず遭遇する障壁である。この解決のためには、疾患とリンクする別の解析情報が求められる。このリンケージ情報として、ｍＲＮＡ発現を制御するｍｉＲＮＡに着目した。すなわち、脳脊髄液中のｍｉＲＮＡ解析を新たに行い、得られたｍｉＲＮＡの標的遺伝子候補をバイオインフォマティクスを活用して、リンケージの高い因子に絞り込めることを新たに見出した。この手法により、病態によって抑制されるペプチド因子を推定できると考えられる。すなわち、脳脊髄液中に出現するタンパク質は細胞から分泌されたものであり、上昇あるいは下降するマーカーとして測定できる。一方、細胞内で起きたイベントでは、ｍｉＲＮＡも一部放出されているこが知られており、このｍｉＲＮＡを新たに測定するのである。ｍｉＲＮＡは結合する標的遺伝子を分解・抑制するので、上昇あるいは減少したｍｉＲＮＡから標的遺伝子を予測し、その遺伝子のコードするタンパク質の増加あるいは減少する程度と照合するのである。この手法の利点は、減少するためにプロテオーム解析では把握できないタンパク質をｍｉＲＮＡの増加という相反する現象で把握できることであり、プロテオーム解析とｍｉＲＮＡ解析の相互補完的解析でバイオマーカーを特定することができる。
【００５０】
この手法をＡＬＳ患者の脳脊髄液で試みた。
まず、実施例１に記載したように、ＡＬＳ患者から採取された脳脊髄液でｍｉＲＮＡ解析し、実施例２に記載したように、標的遺伝子を特定化した。
また、並行して、公知の方法に従ってプロテオーム解析を行った。具体的には、脳脊髄液１００μＬに内部標準蛋白質２μｇを加え、脳脊髄液の４倍量の１０％トリクロロ酢酸／アセトン溶液を添加し、蛋白質を沈殿させるとともに  アルブミンを除去し、沈殿蛋白質に変性剤（尿素、還元剤）添加したのち、３７℃暗室条件下にて還元アルキル化した。このタンパク質画分を一晩３７℃条件下にてトリプシン消化し、得られたペプチド断片をＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  Ｑ−ＴＯＦ型：Ａｇｉｌｅｎｔ社）にて分析し、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用して解析し、候補蛋白質を得た。
【００５１】
上記の手法によって得られた結果をネットワーク図にプロットして図１にまとめた。ネットワーク図とは、公知の学術文献等の情報から構築された関係図である。本実施例では、ＡＬＳに関与する細胞内外の因子群のネットワーク図を“ＭｅｔａＣｏｒｅ”（Ｔｈｍｓｏｎ  Ｒｅｕｔｅｒｓ社）によって作成した。四角囲みのionotrophic glutamate receptor、ＳＯＤ１、ＴＡＲＤＢＰは、ＡＬＳとの関連性が文献上確立されているものである。実線丸囲みのＣ１ｑ、ＣｏｌｌａｇｅｎIV、ＴＩＭＰ２、ＶＧＦ、Ｃ５９、Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ、Ａｃｔｉｎ、ＳＯＤ１、ＭｅｔａｌｌｐｔｉｏｎｅｉｎIII、Ｓｅｃｒｅｔｏｇｒａｎｉｎ１は、上記のプロテオーム解析で同定されていた因子である。点線丸囲みのionotrophic glutamate receptor、ＮＥＦＬ、は上記ｍｉＲＮＡ解析で同定されていた因子である。
【００５２】
すなわち、細胞分泌性の因子はプロテオーム解析によって検出され、従来の解析で同定が難しい細胞内因子はｍｉＲＮＡ解析から予測できることがわかった。これによって、プロテオーム解析とｍｉＲＮＡ解析の組み合わせによって、細胞因子間のリンケージがより明確に解析できることになり、バイオマーカーの特定化が容易となることが示された。
【００５３】
更に、上記の結果から、ＡＬＳを特異的に検出可能なｍｉＲＮＡを容易に選び出すことができた。例えば、ＡＬＳを特異的に検出可能なｍｉＲＮＡとして、ＮＥＦＬを調節するhsa-miR-30d、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-23b、好ましくは、hsa-miR-30d、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-491-5p、特に好ましくは、hsa-miR-30dが考えられる。同様に、ionotrophic glutamate receptorであるＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＡ４が挙げられ、特に、ＧＲＩＡ１、ＧＲＩＡ２、ＧＲＩＡ４が考えられる。ＧＲＩＡ１を調節するｍｉＲＮＡとしては、hsa-miR-302b、hsa-miR-15b、hsa-miR-195、hsa-miR-24、特に好ましくは、hsa-miR-302bが考えられる。ＧＲＩＡ２を調節するｍｉＲＮＡとしては、hsa-miR-302b、hsa-miR-30d、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-133b、特に好ましくは、hsa-miR-302b、hsa-miR-30d、hsa-miR-371-5pが考えられる。ＧＲＩＡ４を調節するｍｉＲＮＡとしては、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-551b*、hsa-miR-496、特に好ましくはhsa-miR-371-5p、hsa-miR-551b*が考えられる。
【００５４】
なお、本明細書に記載のｍｉＲＮＡは、先述したとおり、データベースmiRBase Release16.0から選定したヒト約１，２００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載した市販の３Ｄ−ｇｅｎｅチップ（東レ（株）製）を使用したため、データベースmiRBase Release16.0に基づいた名称（ID）を使用している。本明細書に記載したｍｉＲＮＡの名称と、データベースmiRBaseにおけるAccession No.を表１６〜表２１に示す。
【００５５】
【表１６】
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【００５６】
【表１７】
2013138637.tif 000018
【００５７】
【表１８】
2013138637.tif 000019
【００５８】
【表１９】
2013138637.tif 000020
【００５９】
【表２０】
2013138637.tif 000021
【００６０】
【表２１】
2013138637.tif 000022
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、神経変性疾患の検出に利用することができる。
【図１】
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