(57)【要約】      （修正有）【課題】セシウムの吸収性が低いイネ、また、セシウムトランスポータを提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。また、上記タンパク質をコードする遺伝子、または、特定の配列のＤＮＡ、を欠損したまたは欠損させたことを特徴とするセシウム低吸収性イネ。【選択図】図５
2013158327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ａ１またはＡ２に示すタンパク質。
Ａ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ａ２：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記Ｂ１もしくはＢ２に示すタンパク質をコードするＤＮＡまたは下記Ｂ３もしくはＢ４に示すＤＮＡ。
Ｂ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ｂ２：配列番号１〜１６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
Ｂ３：配列番号３３に記載のＤＮＡ。
Ｂ４：配列番号３３に記載のＤＮＡにおいて、配列中に置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＮＡからなり、かつ、イネ中でセシウム輸送活性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ。
【請求項３】
下記Ｃ１もしくはＣ２に示すタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターまたは下記Ｃ３もしくはＣ４に示すＤＮＡを含有するベクター。
Ｃ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ｃ２：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
Ｃ３：配列番号３３に記載のＤＮＡ。
Ｃ４：配列番号３３に記載のＤＮＡにおいて、配列中に置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＮＡからなり、かつ、イネ中でセシウム輸送活性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ。
【請求項４】
下記Ｄ１もしくはＤ２に示すタンパク質をコードする遺伝子、または、Ｄ３もしくはＤ４に示すＤＮＡ、を欠損したまたは欠損させたことを特徴とするセシウム低吸収性イネ。
Ｄ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ｄ２：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
Ｄ３：配列番号３３に記載のＤＮＡ。
Ｄ４：配列番号３３に記載のＤＮＡにおいて、配列中に置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＮＡからなり、かつ、イネ中でセシウム輸送活性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セシウムトランスポータおよびセシウム低吸収性イネに関する。
【背景技術】
【０００２】
福島原発事故以降、放射性元素のうち、飛散量が多く、かつ、半減期が長いものとして、セシウム（Ｃｓ）が問題視されている。特に、食品中に存在すると、体内被爆の原因となるので、原発隣接地域では出荷ができず、また、出荷制限地区に隣接等する特定地域ではサンプリング調査をおこない、基準値以下であることを確認して出荷されているのが現状である。
【０００３】
食品のうち農産品は、土壌から栄養分を吸収するため、土着したＣｓの蓄積可能性が特に懸念される。加えて、Ｃｓは、植物の必須元素であるカリウムと同族であるため、上記可能性が一層懸念される。
【０００４】
農産品のうち、米は全国的に栽培され、また、栽培面積も他の農作物に比べて圧倒的に多い。そして、水稲は、基本的に上流からの水を引き込むので、栽培地だけでなく広範囲かつ長期間にわたる監視が必要となる。
【０００５】
一方で、Ｃｓを初めとする放射性元素ないしその同位体である安定同位元素の植物体内への吸収検討は、常時は必要とされないため、知見が少なく、米についても手探り的な状況であるのが実情である。
【０００６】
消費者心理の観点からも、現象論的な裏付けより科学的根拠を以てセシウムを取り込まないまたは取り込んでいない米が潜在的に求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ChoiY.H. et al. Journal of Environmental Radioactivity, 80, 45-58 (2005) 'Transferof 137Cs to rice plants from various paddy soils contaminatedunder flooded conditions at different growth stages'
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記に鑑みて検討されたものであり、セシウムの吸収性が低いイネを提供し、また、今後の基礎研究に資するセシウムトランスポータ等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１に記載の発明は、下記Ａ１またはＡ２に示すタンパク質。
Ａ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ａ２：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、下記Ｂ１もしくはＢ２に示すタンパク質をコードするＤＮＡまたは下記B３もしくはＢ４に示すＤＮＡ。
Ｂ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ｂ２：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
Ｂ３：配列番号３３に記載のＤＮＡ。
Ｂ４：配列番号３３に記載のＤＮＡにおいて、配列中に置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＮＡからなり、かつ、イネ中でセシウム輸送活性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、下記Ｃ１もしくはＣ２に示すタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターまたは下記Ｃ３もしくはＣ４に示すＤＮＡを含有するベクター。
Ｃ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ｃ２：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
Ｃ３：配列番号３３に記載のＤＮＡ。
Ｃ４：配列番号３３に記載のＤＮＡにおいて、配列中に置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＮＡからなり、かつ、イネ中でセシウム輸送活性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ。
【００１２】
請求項４に記載の発明は、下記Ｄ１もしくはＤ２に示すタンパク質をコードする遺伝子、または、Ｄ３もしくはＤ４に示すＤＮＡ、を欠損したまたは欠損させたことを特徴とするセシウム低吸収性イネ。
Ｄ１：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列を有するセシウムトランスポータ。
Ｄ２：配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，または，３２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、セシウム輸送活性を有するタンパク質。
Ｄ３：配列番号３３に記載のＤＮＡ。
Ｄ４：配列番号３３に記載のＤＮＡにおいて、配列中に置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＤＮＡからなり、かつ、イネ中でセシウム輸送活性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、セシウムの吸収性が低いイネを提供し、また、今後の基礎研究に資するセシウムトランスポータ、ＤＮＡ、または、ベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】トランスポータの候補遺伝子を示すアクセッション番号の一覧である。
【図２】入手した３種のプラスミドマップである。
【図３】ｐＹＥＳ２プラスミドのマップである。
【図４】液体培地におけるセシウムトランスポータを有する酵母の成長曲線を示した図である。
【図５】各種濃度のセシウムを含む固体培地における、セシウムトランスポータを有する酵母の培養結果を示した写真である。
【図６】それぞれのセシウムトランスポータ遺伝子の発現部位をＲＴ−ＰＣＲによって調査した実験結果である。
【図７】アクセッション番号ＡＫ２４１５８０の遺伝子を酵母に導入した際の酵母中のセシウム吸収量の経時変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本実施の形態では、農業機器を含めて管理技術が普及している稲作、すなわち、米に着目して、セシウムトランスポータを特定することを主眼とし、また、セシウムトランスポータを欠損させることにより、セシウム低吸収性イネを作出する態様を説明する。
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら詳細に説明する。
＜候補遺伝子の選択＞
まず、酵母ライブラリを構築することとした。イネの完全長ｃＤＮＡはおおよそ３２０００個単離されているが、このうち、栄養素等を輸送するタンパク質、すなわちトランスポータもしくはその候補はおよそ１３００個程度存在する。
【００１７】
そこで、これらに本発明者らによるこれまでの研究結果を加え、イネトランスポータ候補遺伝子（完全長ｃＤＮＡ）をイネゲノムリソースセンタ（独立行政法人農業生物資源研究所）から約１３５０取り寄せた。そのアクセッション番号の一覧を図１に示した。
【００１８】
これらの遺伝子は、原核生物である大腸菌で組換えタンパク質を発現するプラスミドの形態で分譲される。分譲されたプラスミドは３タイプあり、プラスミドマップをそれぞれ図２に示した。
【００１９】
＜ｐＹＥＳ２への候補遺伝子の組み換え＞
酵母中で組換えタンパク質を発現させる目的で、酵母タンパク質発現ベクターｐＹＥＳ２プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ遺伝子を組み込む作業をおこなうこととした。このプラスミドは、ウラシル合成遺伝子も有するため、ウラシルを合成しない酵母を用いることにより、導入された遺伝子発現の評価もこなうことができる。また、ガラクトース誘導性のＧＡＬ１プロモーターの下流に遺伝子が挿入されるため、酵母内での導入遺伝子の発現を制御することが可能である。このプラスミドマップを図３に示した。なお、相同組換えに用いた配列を配列番号３４と３５に示した。
【００２０】
＜目的遺伝子の増幅＞
ｐＹＥＳ２に挿入するｃＤＮＡフラグメントは、イネゲノムリソースセンタから入手したプラスミドを鋳型とし、ＰＣＲにより目的の部分のみを増幅することにより作成した。プラスミドは上述の通り３種類あるが、挿入遺伝子近辺の配列は、ｐＭＥ１８ＦＬ−３とｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６とが同じであるため、ＰＣＲにより遺伝子近辺の配列ごと増幅するようなプライマセットを２組設計した。ｐＦＬＣ１用のフォワードプライマとリバースプライマをそれぞれ配列番号３６と３７に示し、ｐＭＥ１８ＦＬ−３およびｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６用のフォワードプライマとリバースプライマをそれぞれ配列番号３８と３９に示す。
【００２１】
なお、ＰＣＲには、合成速度と正確性の高さを考慮しＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。５μｌの反応系に２．５μｌの２ｘ  Ｐｒｉｍｅ  Ｓｔａｒ  Ｍａｘバッファ、プライマを０．１２５μｌ（フォワードプライマとリバースプライマがそれぞれ１０ｐｍｏｌになるように調製したもの）、ＭＱを４．８７５μｌ加えた。鋳型ＤＮＡはチップの先をプラスミド溶液に浸し、チップの先端にわずかについたものを利用した。ＰＣＲは９８℃２分間の変性を行った後、９８℃１０秒、５５℃５秒、７２℃３０秒間を３０サイクル行い、最後に７２℃３分間反応させた。
【００２２】
＜ｐＹＥＳ２の準備＞
ｐＹＥＳ２は予め制限酵素ＸｂａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIII（何れもＴａｋａｒａ社）にて切断し、直鎖化した。切断反応はｐＹＥＳ２溶液７２μｌ（１０μｇ）に１０×Ｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ９μｌと、ＸｂａＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIIIを３μｌづつ加え、３７℃で終夜反応させた。続いて、１％のアガロースゲル電気泳動にて分離した後、目的のバンドをゲルから切り出した。ゲルからのＤＮＡの抽出は、Ｍａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社）を使用した。方法はマニュアルに従った。
【００２３】
＜ＰＣＲ産物のｐＹＥＳ２への挿入＞
サブクローニングに際しては、Ｇａｐ−ｒｅｐａｉｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ法[Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D (1987) “Plasmid construction
by homologous recombination in yeast” Gene; 58(2-3):201-16.]によった。先のＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片  １００ｎｇ程度と、直鎖化したｐＹＥＳ２  ５ｎｇ程度を同時に酵母(W303-1A株Genotype: MATa {leu2-3,112 trp1-1 can1-100
ura3-1 ade2-1 his3-11,15})に導入することにより目的のプラスミドを得た。
【００２４】
＜目的の遺伝子の挿入確認＞
目的の遺伝子がプラスミドに正しく挿入されたことを確認するため、ＤＮＡシーケンサを用いて配列の確認を行った。まず、酵母からプラスミドを抽出し、得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、さらに大腸菌を培養しプラスミドを抽出した。
【００２５】
酵母からのプラスミドの抽出は以下の方法により行った。
抽出にはプラスミド抽出キットＨｉＹｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＲＢＣ社）を用いた。３ｍｌのＳＣ−ｕｒａ液体培地で終夜培養した酵母を丸底２ｍｌチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、３０００ｒｐｍ、３分間、室温で遠心して集菌した。ＰＤＡ１を２００μｌ加え、そこにＺｙｍｏｌｙａｓｅを１０μｌ加え３７℃で一時間反応させた。ＰＤＡ２を２００μｌ加えよく攪拌したのち、ＰＤＡ３を３００μｌ加えよく攪拌した。１５０００ｒｐｍで１０分間室温で遠心し、上清をフィルタカラムに移した。吸引により溶液を濾過した後、Ｗ１バッファを４００μｌ加え吸引濾過した。続いて６００μｌのＷａｓｈバッファを加えて吸引濾過した。フィルタカラムをエンプティカラムに移し、１５０００ｒｐｍで１分間室温で遠心した。フィルタカラムを新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移し、Ｅｌｕｔｉｏｎバッファを３０μｌ加えて１分間静置した。１５０００ｒｐｍで１分間室温で遠心し濾液をプラスミド溶液とした。
【００２６】
得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換した。
コンピテントセルの作成はＨａｎａｈａｎらの方法で作成した[Hanahan, D (1983) “Studies on transformation of Escherichia coli
with plasmids” Journal of Molecular Biology 166 (4): 557-580]。形質転換はＦｒｅｅｚｅ−ｔｈｏｕｇｈ法を用いて行った。１００μｌのコンピテントセルが完全に溶けきる前に酵母から抽出したプラスミド溶液１０μｌを加え軽く撹拌し、３０分間氷上に静置した。その後、４２℃で４５秒間反応させた後、氷上で３分間静置した。その後、３７℃に保温しておいたＳＯＣ培地を８００μｌ加え、軽く撹拌したのち３７℃のインキュベータ内にて３０分間静置した。静置後、５０００ｒｐｍ、２分間遠心し集菌した後、デカンテーションで上清を捨てた。３７℃に保温しておいたＬＡ培地に植菌し終夜培養した。
【００２７】
用いたＬＡ培地の組成を表１に示す。
【表１】
2013158327.tif 000003
ＮａＯＨによりｐＨは７．２〜７．５に調整する。
１２１℃２０分間のオートクレーブ後、６０℃程度まで培地温度が下がったところで
終わり濃度１００ｕｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンナトリウム（Ｗａｋｏ）を加
えた。
【００２８】
大腸菌からのプラスミド抽出にはプラスミド抽出キットＨｉＹｉｅｌｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＲＢＣ社）を用いた。３ｍｌのＬＡ液体培地で終夜培養した大腸菌を丸底２ｍｌチューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、３０００ｒｐｍ、３分間、室温で遠心して集菌した。ＰＤＡ１を２００μｌ加え完全に懸濁した。続いて、ＰＤＡ２を２００μｌ加え１０回上下転倒した後、２分間静置した、ＰＤＡ３を３００μｌ加えよく攪拌した。１５０００ｒｐｍで１０分間室温で遠心し、上清をフィルタカラムに移した。吸引により溶液を濾過した後、Ｗ１バッファを４００μｌ加え吸引濾過した。続いて６００μｌのＷａｓｈバッファを加えて吸引濾過した。フィルタカラムをエンプティカラムに移し、１５０００ｒｐｍで１分間室温で遠心した。フィルタカラムを新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移し、Ｅｌｕｔｉｏｎバッファを３０μｌ加えて１分間静置した。１５０００ｒｐｍで１分間室温で遠心し濾液をプラスミド溶液とした。
【００２９】
シーケンサはＡＢＩ社の３１３０ＤＮＡシーケンサを用いた。ＰＣＲ反応液は、プラスミドＤＮＡ溶液を２μｌ（２００〜４００ｎｇ）、ＢｉｇＤｙｅ（ＡＢＩ社）を０．３μｌ、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＡＢＩ社）を４μｌ、Ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）を０．２５μｌ、超純水を１３．４５μｌとした。ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラ９７００（ＡＢＩ社）を用いて行った。ＰＣＲは９６℃２分間の変性を行った後、９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分間を３５サイクル行った。
【００３０】
未反応のＢｉｇＤｙｅの除去は、ｓｈｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（ＧＥヘルスケア）を用いて行った。３ｇのｓｈｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（Ｆｉｎｅ  Ｇｒａｄｅ）を５０ｍｌのファルコンチューブに入れ、超純粋を５０ｍｌ加え一晩静置した。使用直前に、Ｓｈｅｐａｄｅｘ溶液を良く混ぜマルチスクリーン（ＧＥヘルスケア）に３００μｌ加えた。マルチスクリーンをＰＣＲプレート上に置き、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。５分間遠心した後、プレートの中心側と外側を逆にして１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。ゲルの入ったマルチスクリーンを新たなＰＣＲプレートに乗せかえ、ゲルの中央にシーケンス反応産物をアプライした。１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。濾液をシーケンサに供した。
【００３１】
＜目的の遺伝子が挿入されていることが確認できたプラスミドの酵母への導入＞
酵母へのプラスミドの形質転換は、H Ito,Y Fukuda,K Murata, and A Kimura (1983) “Transformation of
intact yeast cells treated with alkali cations.” Journal of
bacteriology,163-168を一部改変して行った。
【００３２】
まず、酵母(W303-1A株Genotype: MATa {leu2-3,112 trp1-1 can1-100
ura3-1 ade2-1 his3-11,15})を３ｍｌのＹＰＤ培地にて３０℃で終夜培養し前培養液とした。１００ｍｌのＹＰＡＤ培地が入った３００ｍｌ容量のコルベン（ＩＷＡＫＩ）に前培養液３ｍｌを加え、ＯＤ６００＝０．４〜０．６程度になるまで３０℃、９０ｒｐｍで回転培養した。ＯＤ６００＝０．４〜０．６程度になったところで２本の５０ｍｌのチューブ（Ｌａｂｃｏｎ）に移し、３０００ｒｐｍ、２分間、室温で遠心し集菌した。上清を捨てて２５ｍｌの滅菌水でリンスを一回行い、さらに集菌して上清を完全に除いた。２ｍｌの０．１Ｍ酢酸リチウムをそれぞれ加えて懸濁し、３０００ｒｐｍ、２分間、室温で遠心して集菌した。
【００３３】
上清を除いた後、５０％  ＰＥＧ４０００  ６ｍｌ、１Ｍ酢酸リチウム  ９００μｌ、キャリアＤＮＡ（２．０ｍｇ／ｍｌ）６２５μｌ、ジメチルスルホキシド１ｍｌ、滅菌水１．２５ｍｌを加えてボルテックスした。２本を合して９６穴プレートに２００μｌづつ分注し、それぞれにＤＮＡ溶液を加えた。もれのないようにシールし、その後３０℃で３０分間静置した。次に恒温機（ＴＡＩＴＥＣ）により４２℃で２０分間ヒートショックを行った。ヒートショック中は３〜５分間おきに上下転倒により混合した。３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、室温で遠心し、上清を完全に除き、２００μｌのＹＰＡＤ液体培地を加え懸濁し、３０℃、１時間保温した。３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、室温で遠心し、上清を完全に除き２０μｌの滅菌水に懸濁し、ＳＣ−ｕｒａ固体培地に総て植菌した。
【００３４】
＜ライブラリのスクリーニング＞
・酵母の菌株および培養条件：
酵母(W303-1A株Genotype: MATa {leu2-3,112 trp1-1 can1-100
ura3-1 ade2-1 his3-11,15})はＳＣ−ｕｒａ培地にて培養を行った。液体培養時はシェーカ（ＮＲ−３，ＴＡＩＴＥＣ）で１８０ｒｐｍの回転培養を行った。前培養時はＳＣ−ｕｒａ培地を用いて、本培養時にはＳＧ−ｕｒａ＋Ｇａｌ培地を用いた。いずれも３０℃で培養を行った。
【００３５】
なお、ＳＣ−ｕｒａまたはＳＧ−ｕｒａ培地１００  ｍｌ中の組成とおよび作成は次の通りである。
Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（日本ＢＤ社）：０．６７ｇ
Ｄｒｏｐ  ｏｕｔ  ｍｉｘ：０．１８２ｇ
ａｄｅｎｉｎｅ（Ｗａｋｏ）：０．０４ｇ
ｓａｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ：５ｍｌ添加
これを脱イオン水で９０ｍｌとなるまで調製し、ａｇａｒｏｓｅ（Ｗａｋｏ）を２ｇ添加して、１２１℃で２０分間オートクレーブした。
ＳＣ−ｕｒａ培地にはｇｌｕｃｏｓｅを２ｇ添加
ＳＧ−ｕｒａ培地にはｇａｌａｃｔｏｓｅを２ｇ添加
【００３６】
・スクリーニング条件：
セシウムトランスポータのスクリーニングに際しては、塩化セシウム（Ｗａｋｏ）を用いて評価をおこなった。
塩化セシウムを滅菌水に溶かして４Ｍセシウム溶液を作成し、オートクレーブ後にＳＧ−ｕｒａ培地またはＳＣ−ｕｒａ培地に添加することでセシウム含有培地を作成した。選択培地には培地中のｐＨを一定に揃えることを目的にコハク酸／Ｔｒｉｓバッファを終濃度２０ｍＭになるように添加した。スクリーニング時、前培養は９６穴マイクロタイタープレート（ＢＭ機器）で行った。各ウェルに１００μｌのＳＣ−ｕｒａ液体培地を分注し、酵母をピンレプリケータ（ワトソン）または楊枝を用いて植菌した後、恒温振とう機（タイテック社）を用い、１８０ｒｐｍで３０℃、終夜培養した。続いて、１．５ｍｌのディープウェルプレートの各ウェルに２００μｌのＳＣ−ｕｒａ培地を入れ、そこに前培養した酵母を２０μｌ植菌し、３０℃で４時間３０分培養した。培養後、新しい９６穴マイクロタイタープレートに１００μｌ分注し、吸光度を測定した（Ｍｏｄｅｌ６８０，ＢＩＯ−ＲＡＤ）。
【００３７】
また、本培養液を１０μｌ加えるとＯＤ５９５が０．０１となるように滅菌水を１．５ｍｌのディープウェルプレートに加えた。この滅菌水に１０μｌの本培養液を加え総ての菌液の濁度を揃えた後、サージカルテープ（３Ｍ社）で蓋をして、３分間卓上ミキサーで良く攪拌した。懸濁液１５０μｌを新しい９６穴マイクロタイタープレートに分注した。この菌液を固体培地に植菌する際にはベル・ブロッター９６穴リプリケーター（サンプラテック社）を使った。３０℃で４０〜４８時間培養を行った。
【００３８】
セシウムは植物の生育に必要ではない。酵母においても同様で、酵母内のセシウム濃度が高まると、酵母増殖等が抑制される。液体培養による吸光度測定も、固体培地によるコロニー評価も、いずれも、ライブラリ中の１７株にセシウム輸送活性があることが確認できた。図４は、液体培地におけるセシウムトランスポータを有する酵母の成長曲線を示した図である。図５は、各種濃度のセシウムを含む固体培地における、セシウムトランスポータを有する酵母の培養結果を示した写真である。
なお、ガラクトース誘導性とウラシル要求性も合わせて検討しており、これら１７株のスクリーニングの適正を保証した。
【００３９】
以上の実験により、アクセッション番号ＡＫ１０７６８８，ＡＫ１０７０７８，ＡＫ１１１９５９，ＡＫ０５８８５６，ＡＫ０６６１９４，ＡＫ０６８５７４，ＡＫ１０２１８０，ＡＫ０５８６７３，ＡＫ０５９０３５，ＡＫ０６５８９１，ＡＫ０７１１１８，ＡＫ０７０８４４，ＡＫ１００５２４，ＡＫ１０５０８８，ＡＫ１０５６６７，ＡＫ２４１５８０，ＡＫ１２０８２１の遺伝子は、セシウムトランスポータを形成する遺伝子であると確認できた。なお、それぞれのＤＮＡを配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３に示した。また、ＡＫ１２０８２１（配列番号３３）を除き、翻訳されるタンパク質をそれぞれ配列番号２、４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２に示した。
【００４０】
＜セシウムトランスポータの発現部位＞
次に、イネにおける発現部位を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調査した。２８℃１６時間、２４℃８時間の環境で栽培した３葉期のイネからＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出方法はキット付属のマニュアルに従った。ただ一点変更した点は以下である。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１処理を行った後、１０μｌのＤＮａｓｅＩ（ニッポンジーン社）と７０μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＲＤＤの混合液をカラムに加え、１５分間室温で放置し、ＤＮＡの分解を行った。
【００４１】
抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５μｇを鋳型として逆転写反応を行った。反応には、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。方法は付属のマニュアルに従った。反応液６０μｌに２４０μｌのＴＥを加えて５倍に希釈し、ＰＣＲまで−３０度で保存した。ＰＣＲにはＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢｉｏＢａｓｉｃ社）を用いた。反応液の組成はマニュアルに従った。
【００４２】
合成オリゴはリストのものを利用した。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間反応させた後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒のサイクルを２４−２９サイクル行った。ＰＣＲ産物を１．５％のアガロース電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドにより染色した後、デジタルカメラでバンドを撮影した。写真を図６に示す。これから、アクセッション番号ＡＫ１０７０７８とＡＫ０６８５７４の株を除き、根にセシウムトランスポータが形成されることが確認できる。
【００４３】
なお、ＰＣＲに用いたプライマセットと配列番号との関係を表２に示す。
【表２】
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【００４４】
＜酵母における輸送活性＞
次に、上記１７株の酵母におけるセシウムトランスポータの輸送活性の測定をおこなった。３ｍｌのＳＤ−ｇａｌ−Ｕｒａ液体培地に酵母を植菌して、グロースチャンバーの温度を３０℃、１５０ｒｐｍの振盪培養で終夜前培養を行った。翌朝に、３ｍｌのＳＤ−ｇａｌ−Ｕｒａ液体培地を前培菌液に追加し、全量を６ｍｌとし、グロースチャンバーの温度を３０℃、１５０ｒｐｍの振盪培養で３時間本培養した。１３５ｍｌのＳＤ−ｇａｌ−Ｕｒａ培地に、後に加える菌液を入れてＣｓＣｌ濃度が３０ｍＭになるように４ＭのＣｓＣｌを１０５０μｌ加えよく混ぜた。この培地を５０ｍｌのファルコンチューブに９ｍｌずつ分注した。本培養菌液を１ｍｌをファルコンチューブに入れた培地に植菌し、グロースチャンバーの温度を３０℃、１５０ｒｐｍで３０分〜５時間振盪培養した。
【００４５】
振盪中、２０ｍＭＣａＣｌ２を氷上に静置して冷やした。スイングローターで３５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、上清をデカンテーションで静かに除いた。以下テフロンチューブに菌液を移すまで氷上で作業を行った。上記の時間培養したチューブを氷上に置き、培養を止めた。スイングローターで３５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心した後、氷冷した２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を５ｍｌ加えてボルテックスで懸濁し、スイングローターで３５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心してリンスした。リンスは３回行った。最後のリンスの後、上清を少量だけ残し、ピペッティングでペレットを懸濁し、１．５ｍｌエッペンチューブに移し、遠心機で１００００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心し、上清を完全に除き、１ｍｌのＭＱをそれぞれのエッペンチューブに加えた。
【００４６】
各エッペンチューブから１０μｌを取り、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒで細胞数を３反復数えその平均を取った。９９０μｌ残っている残りのチューブを遠心機で１００００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心し、デカントで上清を除いた。ペレットをピペッティングで懸濁しテフロンチューブに菌液を移し、ヒートブロックで３０分間、８０℃で完全に乾燥させた。テフロンチューブに硝酸１２５μｌを加えて１２０℃で２時間静置し酵母を酸分解した。分解後、過酸化水素水を５０μｌ各テフロンチューブに加え、遠心機で１００００ｒｐｍ、４℃で１分間遠心して１０分間室温で静置した。静置後、ＭＱを２９５０μｌ各テフロンチューブに加え、３ｍｌにメスアップした。テフロンチューブをチューブラックにセットした後、超音波洗浄機にて１０分間懸濁した。懸濁液を新しい１５ｍｌチューブに移し、測定まで４℃で保存した。サンプル中のセシウム濃度は、原子吸光度計（日立社製）にて測定した。
【００４７】
結果を図７に示す。ここでは、アクセッション番号ＡＫ２４１５８０の遺伝子を酵母に導入した際の酵母中のセシウム吸収量の経時変化を示しているが、他の１６株も同様の傾向が見られた。実際に酵母にセシウムトランスポータが形成されていることが確認できる。
【００４８】
＜セシウム低吸収性イネ＞
セシウムトランスポータが欠失していれば、セシウムを植物体内に吸収しなくなるので、放射性セシウムが付着した土壌においても流通可能なイネの栽培が可能となる。すなわち、アクセッション番号ＡＫ１０７６８８，ＡＫ１０７０７８，ＡＫ１１１９５９，ＡＫ０５８８５６，ＡＫ０６６１９４，ＡＫ０６８５７４，ＡＫ１０２１８０，ＡＫ０５８６７３，ＡＫ０５９０３５，ＡＫ０６５８９１，ＡＫ０７１１１８，ＡＫ０７０８４４，ＡＫ１００５２４，ＡＫ１０５０８８，ＡＫ１０５６６７，ＡＫ２４１５８０，またはＡＫ１２０８２１の遺伝子を欠損したイネを用いることにより、または、当該遺伝子を欠損したイネを作出してこれを用いることにより、効率的にセシウム低吸収性イネを作出できる。なお、好ましくは、２つ以上の遺伝子を欠損させたイネであり、より好ましくは５以上欠損させたイネであり、さらに好ましくは１０以上欠損させたイネであり、最も好ましくは１７すなわち総ての遺伝子を欠損させたイネである。
【００４９】
イネの作出の例としては、γ線照射等の変異源を用いて、セシウムトランスポータを欠損させ、これを戻し交配し、選抜することにより、食味よく、かつ、セシウムを取り込まない、若しくは、取り込みにくいイネを作出できる。戻し交配や選抜手法については、汎用技術を用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明のセシウムトランスポータを利用し、その輸送活性を高め、イネ植物体全体または特定の部位にセシウムを備蓄・濃縮させ、田畑その他の地面の徐染をおこなうこともできる。備蓄・濃縮されたものは適宜、さらに後工程で濃縮し、環境から分離することができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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