(57)【要約】【課題】カカオ豆の品質を、簡便にかつ精度よく評価する方法を提供すること。【解決手段】本発明のカカオ豆の品質評価方法は、カカオ豆を前処理して分析サンプルを得る工程；該分析サンプルを機器分析（液体クロマトグラフィーや質量分析との組み合わせ）に供して分析結果を得る工程；該分析結果を数値データに変換して多変量解析（特に、主成分分析）する工程；および得られた解析結果から、品質を評価する工程を含む。本発明によれば、従来困難であったカカオ豆の総合品質を簡便な方法で評価することが可能である。すなわち、カカオ豆を、クロマトグラフィーなどの機器分析によりスクリーニングすることによって、迅速かつ有益に品質評価し得る。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カカオ豆の品質評価方法であって、
カカオ豆を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果から、品質を評価する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記多変量解析が、主成分分析である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機器分析が、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記解析結果が、保持時間に基づいて品質評価される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記前処理が、前記カカオ豆から親水性化合物を抽出して抽出物を得る工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記機器分析が、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記分析結果の中で、Ｃ１５Ｈ１４Ｏ６   Ｃ３０Ｈ２８Ｏ１２  Ｃ３０Ｈ２６Ｏ１２   Ｃ４５Ｈ３８Ｏ１８   Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１  Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ７のデータが品質指標として解析される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
品質既知の複数のカカオ豆を前処理して個別の分析サンプルを得る工程；
該個別の分析サンプルを機器分析に供して個別の分析結果を得る工程；および
該個別の分析結果と該品質との関係を数値データに変換して多変量解析する工程；
によって得られる、カカオ豆の品質評価モデル。
【請求項９】
カカオ豆の品質評価方法であって、
カカオ豆を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果を、請求項１２に記載の品質評価モデルと照合する工程；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カカオ豆の品質評価方法に関する。より詳細には、カカオ豆中の代謝物または分解物の機器分析による品質評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、カカオは、チョコレートやココアの主原料として利用されている。
カカオは、主として赤道付近の高温多湿な地方で栽培される熱帯植物であり、カカオの木の果実の中にある種子（カカオ豆、カカオビーンズ）は、チョコレートやココア等に用いられるカカオマスの原料として用いられている。
【０００３】
チョコレートを製造するためのカカオは、乾燥、発酵させたカカオの木の種子から作られる。収穫したカカオポッドを開け、パルプとカカオ豆を取り出し、外皮を捨てる。次いでパルプと豆を通常６〜７日間、山積みにするか、箱に入れるか、又は格子に広げる。発酵したパルプは液化、流出し、残されたカカオ豆を集め、乾燥し、さらに加工して、カカオバターやカカオパウダーを作る。場合によって、この製品をアルカリで処理して、粉末の酸性度を下げる。本来は強い苦味を有する豆の品質や風味にとって発酵は重要である。発酵させていないか、又は発酵の不十分なカカオ豆は生のジャガイモに似た風味を持ち、白カビや真菌の生育に非常に影響を受けるため、食物として消費されるチョコレートの製造には用いられていない。
【０００４】
現在、カカオ豆の最終品質は、熟練者による豆の外観、芳香、色に基づく官能検査により決定されている。これらの技能を獲得するには経験年数がかかる。また、客観性や再現性が低いという欠点がある。そのため、製造工程管理や製品品質管理のためには、簡便な機械化された品質評価方法が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
化学分析は、カカオ豆の品質を評価するために最も信頼性のある方法であると思われる。機器分析法と強力なコンピュータ駆動パターン認識技術との組み合わせから、複雑な材料の品質制御および特徴づけのための新たな可能性が実現されている。そこで、本発明は、カカオ豆の品質を、簡便に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
カカオ豆の風味、呈味は、揮発性成分や糖、フラボノイド類に起因する。その収歛性の味は、カテキン（タンニン）等によるものであり、苦味はテオブロミン等によるものである。栽培品種の差、環境的効果、加工方法などにより、中間経路代謝物の見かけの定常状態の量および／または最終代謝物の末端蓄積も変動する。また、発酵による分解物もカカオ豆の品質に影響を与える。したがって、カカオ豆中の代謝物や分解物を、空間的および時間的の両方でモニターすることは、品質の評価に重要である。
【０００７】
クロマトグラフィーにおいて、パターン認識方法に基づくフィンガープリンティングは、種々の分析領域、例えば、食品および栄養分野で加工モニタリングおよび制御（生材料の等級付け、日常的なオンライン品質チェック、または製品が製造される工程の測定）、地理的起源（成分の化学組成による供与源の測定、風味および芳香成分による最終製品の起源の追跡）の分析に使用されている。（特許文献１〜３）
【０００８】
【特許文献１】特許公開２００９−１４７００号公報
【特許文献２】特許公開２００９−２４４０１５号公報
【特許文献３】特許公開２０１１−８０８１２号公報
【０００９】
そこで、本発明は、医用目的の抗酸化化合物、ならびに呈味および芳香用のカテキンおよび他のフェノール性化合物などの、特定の機能に重要であると考えられる特定の群の限られた数の個々の化合物の特徴づけの代わりに、代謝物や分解物に注目し、これらについての化学的フィンガープリントと多変量解析と組み合わせることによって、総合的にかつ迅速にカカオ豆を分析できることに基づいて完成された。
【００１０】
すなわち、本発明は、カカオ豆の品質評価方法を提供し、該方法は、
カカオ豆を前処理して分析サンプルを得る工程；
該分析サンプルを機器分析に供して分析結果を得る工程；
該分析結果を数値データに変換して多変量解析する工程；および
得られた解析結果から、品質を評価する工程を含む。
【００１１】
好適な実施態様では、上記前処理は、上記カカオ豆中の物質を抽出溶液によって抽出する工程を含み、そして前記機器分析が、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである。より好適な実施態様では、上記解析結果は、保持時間に基づいて品質評価される。
【００１２】
他の好適な実施態様では、上記前処理は、上記カカオ豆から親水性化合物を抽出して抽出物を得る工程を含む。
【００１３】
さらに好適な実施態様では、上記分析結果の中で、組成式がＣ１５Ｈ１４Ｏ６、Ｃ３０Ｈ２８Ｏ１２、Ｃ３０Ｈ２６Ｏ１２、Ｃ４５Ｈ３８Ｏ１８、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１、Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ７の化合物のデータが解析される。
【００１４】
別の好適な実施態様では、上記機器分析は、液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、または超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせである。
【００１５】
他の好適な実施態様では、上記前処理は、上記カカオ豆を粉砕して粉末を得る工程を含む。
【００１６】
別の好適な実施態様では、上記分析結果は、高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ、超高速液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせによる分析結果である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来困難であったカカオ豆の品質を、より精度よくかつ簡便な方法で評価することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において品質評価予測の対象となるカカオ豆は、発酵前、及び発酵、乾燥、焙煎後であってもよいが、好ましくは、発酵、乾燥後のカカオ豆が望ましい。
【００１９】
本発明において、カカオ豆は、以下で述べる機器分析に応じて適切に前処理された後、種々の機器分析に供される。
【００２０】
本発明において、機器分析とは、分析機器を用いる分析・測定手段をいい、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ））、質量分析（ＭＳ）などが挙げられる。これらの機器分析は組み合わせてもよく、例えば、ＬＣ／ＭＳ、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ＵＰＬＣ／ＭＳなどの組み合わせが挙げられる。これらの機器分析に用いられる装置は、特に限定されず、カカオ豆中に含まれる代謝物（例えば、アミノ酸、有機酸、糖）を測定することが可能であれば、通常用いられている装置が用いられ得る。また、測定条件は、これらの物質の測定に適切なように当業者によって適宜設定され得る。
【００２１】
前処理は、カカオ豆中の分析対象物質を機器分析に供するに適した形態にするために、上述のように機器分析に応じて行われる。前処理としては、乾燥、切断、粉砕、抽出などの処理が挙げられる。例えば、粉砕については、ブレンダー、ボールミルなどの適切な器具を用いて行われ得る。また、抽出については、水、有機溶媒、またはこれらの溶媒の混合液を用いて行われ得る。抽出に使用され得る有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、クロロホルムなどが挙げられる。抽出操作としては、カカオ豆を水および／または有機溶媒中で加熱してもよい。加熱温度は、使用される溶媒に応じて適宜決定される。加熱時間も適宜設定される。これらの単位操作を単独でまたは組み合わせて適切な前処理条件を設定する。
【００２２】
機器分析としてＬＣ、特にＨＰＬＣを行う場合については、好ましくは、前処理は、カカオ豆から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。用いるカラムとしては、例えば、アフィニティーカラム、逆相カラム、およびイオン交換カラムが挙げられる。ＨＰＬＣの条件（例えば、流速、検出器、移動相など）は、試料に応じて適宜選択される。
【００２３】
機器分析として超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を行う場合については、好ましくは、前処理は、カカオ豆から水および／または親水性溶媒で抽出して抽出物を得る工程を含む。ＵＰＬＣは、微小なカラム粒子に高い線速度の移動相を通過させて、速い分析スピード、高い分離能、および高感度が達成される。ＵＰＬＣに用いられるカラム粒子は、ＨＰＬＣに用いるカラム粒子（例えば、５μｍまたは３．５μｍ）よりも小さい直径（例えば、１．７μｍ）を有するカラム粒子であり、例えば、アフィニティーカラム、逆相カラム、およびイオン交換カラムが挙げられる。ＵＰＬＣの条件（例えば、流速、検出器、移動相など）は、試料に応じて適宜選択される。
【００２４】
上記の前処理が施されたカカオ豆サンプルは、任意の機器分析に供され、分析結果が得られる。得られた分析結果は、カカオ豆サンプルのフィンガープリントであり得る。このフィンガープリントを数値データに変換して多変量解析が行われる。分析により得られる結果としては、保持時間、ならびにシグナル強度（またはイオン強度）などのスペクトルデータが挙げられる。
【００２５】
多変量解析としては、機器分析データの解析に、種々の解析ツールが採用される。例えば、ＰＣＡ（主成分分析：ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＨＣＡ（階層クラスター分析：ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ＰＬＳ回帰分析（潜在的構造に対する射影：Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、判別分析（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）などの種々の多変量ツールが挙げられる。これらの解析ツールは、ソフトウエアとして多数市販されており、任意のものが入手可能である。このような市販のツールは、一般的に、難しい数学・統計学の知識がなくても、多変量解析を行うことができるように操作マニュアルが備えられている。
【００２６】
例えば、カカオ豆から代謝物を抽出してＬＣ／ＭＳで分析した場合、得られる分析結果は、種々の代謝物の保持時間、マススペクトル、イオン強度などがある。本発明を用い、風味、呈味が異なる6種のカカオ豆を分析した。その結果、組成式がＣ１５Ｈ１４Ｏ６、Ｃ３０Ｈ２８Ｏ１２、Ｃ３０Ｈ２６Ｏ１２、Ｃ４５Ｈ３８Ｏ１８、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１、Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ７の化合物は、カカオ豆の品質評価に重要な役割を果たすことが、明らかになっている。
【００２７】
今回見出した、Ｃ１５Ｈ１４Ｏ６、Ｃ３０Ｈ２８Ｏ１２、Ｃ３０Ｈ２６Ｏ１２、Ｃ４５Ｈ３８Ｏ１８、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１、Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ７の６指標成分をカカオ豆の評価に利用するには、例えば、目的とするカカオ豆をLC或いはLC／ＭＳで分析を行い、６指標成分のピークを検出し、予め定めた基準値と比較することで、カカオ豆の品質を評価できる。
【００２８】
また、上記の方法によって得られる評価モデルは、データの蓄積により、精度が上昇し得る。したがって、例えば、カカオ豆中の代謝物の相対量の傾向がより明確になれば、品質未知のカカオ豆の分析結果からフィンガープリントを得、このフィンガープリントに基づいて品質評価をすることも可能となる。
【実施例】
【００２９】
（実施例１：ＬＣ／ＭＳ用の分析サンプルの調製）
カカオ豆は、採取後、発酵、乾燥させたものをサンプルとして用いた。サンプルには、チョコレート製品にしたときに呈味、芳香が異なる６種のカカオ豆を使用した。
【００３０】
まず、１５ｍＬ容のファルコン管中で乾燥カカオ豆（２００ｍｇ）に、メタノールを２ｍＬ加え、４５℃の温浴中で１５分間ソニケーションし、そして３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、１ｍＬの上清を、８ｍＬ容のガラス管に移した。残渣にメタノール１ｍＬ加え、再び４５℃の温浴中で１５分間ソニケーションし、そして３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。１ｍＬの上清を上記ガラスチューブに移し、収集した上清を窒素により乾固させた後、メタノール２００mｌ加え、再溶解した。１．８ｍＬの水を添加した後、０．４５mｍ 径フィルターを用いて精製し、分析サンプルを得た。
【００３１】
（実施例２：ＬＣ／ＭＳによるカカオ豆サンプルの分析）
上記実施例１で得られた５ μＬの分析サンプルをＬＣ／ＭＳに注入した。本実施例で使用したＬＣ／ＭＳ装置は、ＭｉｃｒＯＴＯＦ  ＩＩ  ＴＯＦ質量分析器（ＢＲＵＫＥＲ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製  商品名）ならびに１００ｍｍ×２．１ｍｍ  ｉ．ｄ.、粒子径１．８ mｍ のＡＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ−３カラムを装着したＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ社製  商品名）であった。移動相には高極性溶媒として水、アセトニトリルを９５：５で混合し、添加剤としてギ酸を０．０５％  添加した溶液を用い、低極性溶媒としてアセトニトリルと水を ９５  ：  ５ で混合し、添加剤としてギ酸を ０．０５％ 添加した溶液を用いた。カラムオーブン温度は４０℃であった。カラムを通る溶媒の流速は、０．３ｍＬ／分であった。低極性溶媒の割合は、３分間２％に保ち、次いで１７分間で３０%まで上昇させ、そして次の２０分間で１００％まで上昇させ、最後に２５分間１００％に保った。ＭＳは、ネガティブモードでエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースを用いた。
【００３２】
カカオ豆サンプルのうち、カカオ豆(2)のトータルイオンクロマトグラムを図１に示す。すべてのサンプルが、同様のクロマトグラムパターンを示した。しかし、図２に示すように，カカオ豆の違いによりピーク強度の差が見られた。
【００３３】
（実施例３：ＬＣ／ＭＳによるデータの解析およびカカオ豆の代謝物のフィンガープリンティング）。
次いで、この複雑なデータから重要な化合物および情報を明らかにするために、多変量分析を行った。多変量データの群中の類似性または相違性で表される関係を把握するために、主成分分析（ＰＣＡ）（ＰｒｏｆｉｌｅＡｎａｌｙｓｉｓ２．０（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製ソフトウエア  商品名）)を選択した。芳香、呈味が異なる６種類のカカオ豆サンプルは、スコアプロット上で分離できた（図３）。スコアプロットに対応するローディングプロットを図４に示す。品質の差によってカカオ豆サンプルの代謝プロファイリングの差が示された。
【００３４】
顕著な化合物を、そのマススペクトルの同位体パターンと理論上のスペクトルの同位体パターンとを比較することによってＣ１５Ｈ１４Ｏ６、Ｃ３０Ｈ２８Ｏ１２、Ｃ３０Ｈ２６Ｏ１２、Ｃ４５Ｈ３８Ｏ１８、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１、Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ７  の６つの化合物が推定された。例えば、カカオ豆(2)には、フラボノイド類と推定される化合物や、フラボノイド重合体と推定される化合物の量が比較的多いが、カカオ豆(3)では、フラボノイド類と推定される化合物や、フラボノイド重合体と推定される化合物の量は比較的少なかった。これは、メタボロミクス解析が、カカオ豆の品質評価に有用であり得ることを示した。
【００３５】
上記の６指標成分をカカオ豆の評価に利用するには、例えば、目的とするカカオ豆をLC或いはLC／ＭＳで分析を行い、６指標成分のピークを検出し、予め定めた基準値と比較することで、カカオ豆の品質を評価できる。
【００３６】
（実施例４：ＬＣ／ＭＳによる６指標成分を用いた未知サンプルの品質評価）。
品質未知の試料（sample）、及び品質が既知のカカオ豆(1)〜(6)中の、実施例３で得られた６指標成分を分析し、得られたクロマトグラムのピークエリア面積を比較した。図５に、それぞれのカカオ豆中の６指標成分のピークエリア面積のグラフを示す。分析の結果、６指標成分の含有量のパターンが品質未知の試料（sample）と最も近いカカオ豆は、カカオ豆(6)であった。以上から、今回分析した品質未知試料は、カカオ豆(6)と似た品質のカカオ豆であることが予測された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、従来困難であったカカオ豆の総合品質を簡便な方法で評価することが可能である。すなわち、カカオ豆を、クロマトグラフィーなどの機器分析によりスクリーニングすることによって、迅速かつ有益に品質評価し得る。
【００３８】
従来のカカオ豆の機器分析は、医用目的の抗酸化化合物、ならびに呈味および芳香用のカテキンおよび他のフェノール性化合物などの、特定の機能に重要であると考えられる特定の群の化合物に焦点が当てられていた。しかし、カカオ豆の特徴づけは、単一の代謝物に由来するのではなく組み合わせに由来し得る。したがって、複数の成分を一度に分析することによる本発明の方法を用いれば、より精度よい品質評価が可能であり、チョコレート製造工程あるいはカカオ豆流通保管工程のさらなる改善が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】カカオ豆(2)のＬＣのトータルイオンクロマトグラムである。
【図２】ＬＣのイオン強度を示すクロマトグラムである。
【図３】すべてのカカオ豆サンプルのＬＣ／ＭＳ分析によるＰＣＡスコアプロットである。
【図４】カカオ豆サンプルのＬＣ／ＭＳ分析のＰＣＡ解析結果を示す図であり、ＰＣ１、及びPC２のローディングプロットである。
【図５】品質未知試料（sample）及び品質既知試料（カカオ豆(1)〜(6)）中の、６指標成分の分析結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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