(57)【要約】【課題】従来のような一般的なアフィニティの抗体分子を用いたトロポニンＩの測定では、高感度にトロポニンＩを検出することが困難であるという課題があった。【解決手段】トロポニンＩの異なる部位に結合する二つの分子及び、その二つの分子に同時に結合することができる分子を用いることで、高感度にトロポニンＩを検出することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心筋由来トロポニンＩの第一の結合部に特異的に結合することができる第一の結合分子と、
前記第一の結合分子とは異なる部位でトロポニンＩに特異的に結合することができる第二の結合分子と、
前記第一の結合分子及び前記第二の結合分子のトロポニンＩ結合部位とは異なる部位に結合することができる第三の結合分子と、
を用いることを特徴とするトロポニンＩの測定方法。
【請求項２】
請求項１に記載の第一の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項１に記載のトロポニンＩの測定方法。
【請求項３】
請求項１に記載の第二の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項１〜２に記載のトロポニンＩの測定方法。
【請求項４】
請求項１に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、C末端側に第３の結合分子が結合することができるアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項１〜３に記載のトロポニンＩの測定方法。
【請求項５】
請求項１に記載の第三の結合分子が、抗体分子由来のアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項１〜４に記載のトロポニンＩの測定方法。
【請求項６】
請求項１に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、ｓ ｃ Ｆ ｖ抗体で構成されることを特徴とする請求項１〜５に記載のトロポニンＩの測定方法。
【請求項７】
請求項１に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子において、第３の結合分子に結合することができるアミノ酸配列が同じアミノ酸配列から構成されることを特徴とする請求項１〜６に記載のトロポニンＩの測定方法。
【請求項８】
請求項７に記載の第一の結合分子及び第二の結合分子が第三の結合分子と結合するアミノ酸配列は、２０以下のアミノ酸から構成されることを特徴とする請求項１〜７に記載のトロポニンＩの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロポニンＩの測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞は医学的突発事故の代表であり、世界的に死亡および心臓血管罹病の主な原因である。血管形成術などの新しい治療手段により、冠動脈循環を迅速に回復させることが可能になり、梗塞領域の大きさを制限し、死亡率および罹病率を低下させることが可能になった。これらの治療器具は、臨床的発現開始後のより早い時期に用いられるほど、より有効である。トロポニンは、トロポニンＣ、ＩおよびＴの３種類のタンパク質からなる筋原線維タンパク質複合体である。心臓トロポニンＩは、心筋にのみ存在する収縮タンパク質である。その生理学的役割は、カルシウムの不在下、アクチン−ミオシン複合体のＡＴＰase活性を阻害することであり、筋肉収縮を予防することである。心臓を供給する動脈（冠動脈）の１つの閉塞による梗塞の間、虚血に続いて、心筋壊死が出現し、心筋細胞の破壊および心臓トロポニンＩの血液中への放出を生じる。したがって、トロポニンＩは、心筋梗塞に対して非常に特異的であるマーカーを表し、トロポニンＩのアッセイは、近年、心筋梗塞の早期診断のために推奨されている。
【０００３】
このような背景において、トロポニンＩを検出する方法として、トロポニンＩを認識する抗体を用いるイムノアッセイが知られている。例えば、特許文献１では、血液中のトロポニンＩを測定するために、アフィニティが５．７×１０^−９である抗体分子を用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平１０−５１２６７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載のような結合力の抗体分子では、高感度にトロポニンＩを検出することが困難であるという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するために、本発明の測定方法では、
ヒト心筋由来トロポニンＩの第一の結合部に特異的に結合することができる第一の結合分子と、
第一の結合分子とは異なる部位でトロポニンＩに特異的に結合することができる第二の結合分子と、
第一の結合分子及び前記第二の結合分子のトロポニンＩ結合部位とは異なる部位に結合することができる第三の結合分子と
を用いる。
【０００７】
第一の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。
【０００８】
第二の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。
【０００９】
第一の結合分子及び第二の結合分子は、C末端側に第３の結合分子が結合することができるアミノ酸配列を持つ。
【００１０】
第三の結合分子が、抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。
【００１１】
第一の結合分子及び第二の結合分子は、ｓ ｃ Ｆ ｖ抗体で構成される。
【００１２】
第一の結合分子及び第二の結合分子において、第３の結合分子に結合することができるアミノ酸配列が同じアミノ酸配列から構成される。
【００１３】
第一の結合分子及び第二の結合分子が第三の結合分子と結合するアミノ酸配列は、２０以下のアミノ酸から構成される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のトロポニンＩの測定方法は、これまでのトロポニンＩ検査に対して高感度にトロポニンＩを検出することができる測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の測定方法は、ヒト心筋由来トロポニンＩの第一の結合部に特異的に結合することができる第一の結合分子と、
第一の結合分子とは異なる部位でトロポニンＩに特異的に結合することができる第二の結合分子と、
第一の結合分子及び前記第二の結合分子のトロポニンＩ結合部位とは異なる部位に結合することができる第三の結合分子とを用いる。
【００１６】
このような構成にすると、アビディティ効果により、強固にトロポニンＩと結合することができるため、好ましい。また、第三の分子を用いることで、第一の分子及び第二の分子を近傍に配置することができるため、好ましい。
【００１７】
また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。
【００１８】
このような構成にすると、トロポニンＩに対して特異性が高く、かつ比較的強い結合力でトロポニンＩに結合することができるため、好ましい。また、ハイブリドーマ法であったり、進化分子工学的手法で分子を作製することができるため、好ましい。
【００１９】
また、本発明の測定方法は、前記第二の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。
【００２０】
このような構成にすると、トロポニンＩに対して特異性が高く、かつ比較的強い結合力でトロポニンＩに結合することができるため、好ましい。また、ハイブリドーマ法であったり、進化分子工学的手法で分子を作製することができるため、好ましい。
【００２１】
また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、C末端側に第３の結合分子が結合することができるアミノ酸配列を持つ。
【００２２】
このような構成にすると、第一の結合分子及び第二の結合分子のトロポニンＩ認識部位とは異なる領域に結合することができるため、好ましい。
【００２３】
また、本発明の測定方法は、前記記載の第三の結合分子が、抗体分子由来のアミノ酸配列を持つ。
【００２４】
このような構成にすると、第一の結合分子及び第二の結合分子に対し、特異性が高く、かつ比較的強い結合力で結合することができるため、好ましい。また、ハイブリドーマ法や、進化分子工学的手法といった既存の方法で分子を作製することができるため、好ましい。
【００２５】
また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子は、ｓ ｃ Ｆ ｖ抗体で構成される。
【００２６】
このような構成にすると、抗体分子に対し分子量が小さいため、第一の結合分子と第二の結合分子が立体障害を受けずに、同時にトロポニンＩに結合できる可能性が高くなるため好ましい。
【００２７】
また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子において、第３の結合分子に結合することができるアミノ酸配列が同じアミノ酸配列から構成される。
【００２８】
このような構成にすると、例えば抗体分子などを第三の結合分子に用いた場合、第一の結合分子、第二の結合分子、及び第三の結合分子で三者複合体を形成することができるため、好ましい。三者複合体を形成することで、上記に記載のアビディティ効果をより効果的に利用することができる。
【００２９】
また、本発明の測定方法は、前記記載の第一の結合分子及び第二の結合分子が第三の結合分子と結合するアミノ酸配列は、２０以下のアミノ酸から構成される。
【００３０】
このような構成にすると、第一の結合分子及び第二の結合分子が、第三の結合分子と結合する際、立体障害の影響を受けにくいため、好ましい。また、FLAG、His、HA、ｃ−Mycなどのタグ配列を用いることができるため、好ましい。
【００３１】
本発明の結合分子作製には、ファージディスプレイ法を用いることができる。また、ファージディスプレイを用いた結合タンパク質の分子フォーマットには、scＦｖ抗体を用いることができる。ファージディスプレイ法は、Ｓ ｍ ｉ ｔ ｈ により考案されたもので、Ｍ １ ３ ファージのような一本鎖環状Ｄ Ｎ Ａ を持つ線状のバクテリオファージが用いられる。ファージ粒子はＤ Ｎ Ａ の周囲を取り囲んでファージ粒子の大部分を構成するｇ ｐ ８ というタンパク質と、ファージが大腸菌に感染する時に機能する５ 個のｇ ｐ ３ と呼ばれるタンパク質などからなっている。このｇ ｐ ３ もしくはｇ ｐ ８ と融合した形でポリペプチドをコードするように遺伝子を構築し、ファージ粒子表面にそのタンパクを発現させるシステムがファージディスプレイシステムである。他の物質との結合活性を持つタンパク質を表面に保持したファージ粒子は、そのリガンドとの結合活性を利用して濃縮することができる。こうして目的とする結合活性を有するファージ粒子を濃縮する方法は、パニング法と呼ばれている。濃縮されたファージ粒子には、必要な結合活性を持つタンパク質をコードするＤ Ｎ Ａ がパッケージングされている。このように繊維状ファージの利用によって、結合活性に基づくスクリーニングと、Ｄ Ｎ Ａ のクローニングとをきわめて効率的に行うことができるシステムが実現した。ファージディスプレイシステムでは、特定の抗原に結合可能な抗体分子と、その抗体分子をコードする遺伝子も同時に得られる点に大きな利点がある。
【００３２】
本発明において、「ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体」とは、Ｆ ｖ 領域、即ち、重鎖可変領域（ Ｖ Ｈ 領域） 及び軽鎖可変領域（ Ｖ Ｌ 領域） を含み、これらがリンカーにより架橋されて構成される抗体である。また、「ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子」とは、Ｖ Ｈ 領域をコードする遺伝子（ Ｖ Ｈ 遺伝子） 、Ｖ Ｌ領域をコードする遺伝子（ Ｖ Ｌ 遺伝子） 、及びリンカー配列から構成される。Ｖ Ｈ 領域とＶ Ｌ 領域とを架橋するリンカーには、汎用的なものを用いることができ、例えば、グリシン− セリンからなるペプチドリンカーが用いられる。本発明において、「ライブラリー」とは、多様な同種の構成要素からなる集合体を意味する。
【００３３】
ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーとは、多様なｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を含有する集合体である。本発明においては、各ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体はファージ表面に発現されている。換言すれば、表面にｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を発現しているファージクローンの集合によりｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーが形成される。
【００３４】
また、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーは、生体内の多様性を包含するのに十分なクローン数を有することが好ましい。これにより、多種多様な抗原に対して、当該抗原と結合可能なｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を表面に発現するクローンを選択することが可能となる。本発明におけるｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーは、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体をその表面に発現しているファージクローンの集合により構成されるが、かかるｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーはｓ ｃ Ｆ ｖ抗体遺伝子を保有するファージミドクローンの集合（ 以下、「ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ファージミドライブラリー」という） より調製することができる。
【００３５】
なお、本発明において、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を保有するクローンの集合から構成されるライブラリーをｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子ライブラリーと呼ぶ。したがって、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ファージミドライブラリーはｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子ライブラリーでもある。また、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を保有するファージミドにより形質転換された大腸菌の集合もｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子ライブラリーを構成する。ファージミドには、ｇ ｐ ３ やｇ ｐ ８ 等のファージの構成タンパク質をコードする遺伝子に、発現させたい外来タンパク質をコードする遺伝子、即ち、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を連結する。ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子は、上述のようにＶ Ｈ 遺伝子、Ｖ Ｌ 遺伝子、及びリンカー配列から構成されるが、Ｖ Ｈ 遺伝子、Ｖ Ｌ 遺伝子は、任意の抗体産生細胞より得ることができる。抗体産生細胞としては、例えば、末梢血リンパ球や脾臓細胞等を挙げることができる。それぞれの遺伝子の単離には、公知のプライマーを用いたＲ Ｔ − Ｐ Ｃ Ｒ 法を利用することができる。得られた各領域の遺伝子とリンカー配列とを連結することによりｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子が構成される。ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ファージミドライブラリーからのｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーの調製方法は次のように行うことができる。まず、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ファージミドライブラリーを構成する各クローンを宿主にトランスフェクションさせる。次に、この宿主にヘルパーファージを重感染させる。ヘルパーファージＭ １ ３ Ｋ０ ７ の重感染によってファージ粒子として回収することができる。このとき利用されるファージミドのｇ ｐ ３ タンパク質が外来タンパク質すなわちｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体と融合されていれば、完成するファージの表面にはｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体が提示されることとなる。
【００３６】
ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーを特定の抗原でスクリーニングし、当該抗原に結合可能なｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を発現しているファージクローンが選択される。抗原は、目的に応じて種々のものが用いられる。また、抗原を用いたスクリーニングは以下に示すパニング法により行うことができる。まず、目的とする抗原にｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体ライブラリーを接触させ、この抗原に結合するクローンを回収する。回収したクローンを増幅し、再び目的の抗原と接触させて、結合するクローンを回収する工程を繰り返す。ファージの増幅は、ファージを大腸菌に感染させ、回収することによって行われる。この工程を繰り返すことによって、目的とする反応性を持つｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮される。抗原との結合性に基づくスクリーニングは、一般にクローンの回収率が上昇するまで行われる。ここで回収率とは、抗原に対して添加したファージクローンの数に対する、抗原への結合性を有するものとして回収されたファージクローンの数の割合である。回収率がその前のスクリーニングに比較して明らかに上昇するとき、目的とする反応性を持つｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体をその表面に発現しているファージクローンが濃縮されつつあることを意味する。
【００３７】
上記工程 により選択したファージクローンより、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体をコードする遺伝子（ ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子） が取得される。即ち、ファージクローンより、ＶＨ 領域、Ｖ Ｌ 領域、及びリンカーをコードする遺伝子が切り出される。このとき、Ｈ ｉ ｓ ， Ｍ ｙ ｃ などのＴ ａｇ を含有するものを用いてもよい。具体的なｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子の切り出し方法としては、ファージＤ Ｎ Ａ のｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子導入部位、即ち、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子の両端の制限酵素サイトを特異的に切断する制限酵素を用いる。ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を切り出す際に、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子の一端又は両端の配列を変換する２ つのプライマーを用いてＰ Ｃ Ｒ を行い、制限酵素サイトの変換されたｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を切り出し、かつ増幅する。また、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子の末端に適当なリンカーを付加することにより、所望の制限酵素サイトを形成してもよい。
【００３８】
上記工程で取得したｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を発現ベクターに組み込むことが行われる。発現ベクターはｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を組み込むことによりｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子発現産物を発現可能なものを用いる。このような発現ベクターとしては、５ ’ 側より順に、開始コドン、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子を導入する部位をコードする塩基配列を有するものが用いられる。また、ｓ ｃ Ｆ Ｖ 抗体遺伝子を導入する部位の後にＨ ｉ ｓ − ｔ ａ ｇ 、ｍ ｙ ｃ −ｔ ａ ｇ 、又はＨ Ａ − ｔ ａ ｇ などをコードする塩基配列（ 以下、「タグ配列」という） を有する発現ベクターを用いることができる。タグ分子の特定物質との親和性を利用してｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を精製することが可能となる。また、タグ配列を入れる位置はこれに限られるものではなく、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体遺伝子導入部位の５ ’ 上流域に入れておくこともできる。但し、タグ配列にコードされる分子とｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体とが融合したものとして発現される位置に入れる必要がある。上記特性を備える発現ベクターは、市販の発現ベクターを周知の遺伝子操作技術を用いて改良することにより作製することができる。また、上記特性を備えるファージミドベクターは、市販のベクターを周知の遺伝子操作技術を用いて改良することにより作製することができる。
【００３９】
［実施例］
本実施例では、ヒト心筋由来のトロポニンＩに結合し得るｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体分子を作製するために以下の工程を行った。
１）トロポニンＩの配列に含まれる２種類ペプチドをマウスに免疫し、その脾臓及び骨髄より抗体可変領域の遺伝子を増幅する工程、
２）工程１）より得られた抗体可変領域の遺伝子を用い、ｓ ｃ Ｆ ｖ抗体ライブラリーを調製する工程、
３）トロポニンＩに結合可能なｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を発現しているファージクローンを選択する工程、及び選択したファージクローンより、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体をコードする遺伝子を取得する工程、
４） 工程３ ） で取得した遺伝子を発現可能な発現ベクターに組込み、大腸菌から封入体を抽出し、封入体を巻き戻すことによりscＦｖタンパク質を得る工程。
【００４０】
１）トロポニンＩをマウスに免疫し、その脾臓及び骨髄より抗体可変領域の遺伝子を増幅する工程
ヒト心筋由来のトロポニンＩのペプチド配列（RPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK（配列番号：１）及びQPLELAGLGFAELQDL（配列番号：２））を、sulfo-ＳMCCクロスリンカー(Thermo)を介しヒト血清アルブミンと結合させた。完全フロイドアジュバンドにて、ＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、２週間毎にPBS溶液にて計３回免疫を行った。その免疫したマウスより、骨髄・脾臓を摘出し、それぞれ１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社）を加え、十分に攪拌した。次に、０．２ｍＬの９９．９％クロロホルムを加え、再度攪拌を行い、１２０００ｇ、４℃にて１５分間遠心機にかけた。遠心チューブより上清を５００μＬ採取し、エタノール沈殿を行うことで、乾燥状態の全ＲＮＡを取得した。さらに、得られた全ＲＮＡよりＯｌｉｇｏｔｅｘTM−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （タカラバイオ株式会社）を使用し、ｍＲＮＡを抽出した。また、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔのスピンカラムよりｍＲＮＡを溶出する際には、４０μＬのＤｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ  ＤＮＡｓｅ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  （ＧＩＢＣＯ）を用いて行った。
【００４１】
次に、ＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔTMＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （タカラバイオ株式会社）を用い、上記にて得られたｍＲＮＡよりｃＤＮＡ合成を行った。次に、得られたｃＤＮＡより、抗体Ｈ鎖、Ｌ鎖可変領域のＰＣＲ増幅を行った。ここで、ＰＣＲ増幅に用いるプライマーとしては、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９（７）１３２５−１３３０（２００６）記載の塩基配列を含むプライマーを用いた。ここで、ＶＬを伸張させるプライマーにＳｆ１Ｉ、ＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付加し、ＶＨを伸張させるプライマーには、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩの制限酵素サイトを付加した。ポリメラーゼには、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ株式会社）を用いた。ＰＣＲ反応の温度サイクルは、９５℃にて２分間反応させた後、９６℃で３０秒間反応、５２℃で１分間反応、６８℃にて１分間反応を３５回繰り返し、さらに、６８℃にて４分間反応させた。
【００４２】
上記ＰＣＲ反応を終えた反応溶液を２重量％濃度のアガロースを含むゲルにて電気泳動により分離し、ＷｉｚａｒｄＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｒｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ＶＨ（Ｈ鎖可変領域）及びＶＬ（Ｌ鎖可変領域）のＤＮＡ断片の精製を行った。
【００４３】
２）トロポニンＩに結合し得るscＦｖを含むｓ ｃ Ｆ ｖ抗体ライブラリーを調製する工程
次に、上記工程１）にて調製したＶＬ及びＶＨ遺伝子をファージミドベクターへと組み込んだ。ファージミドベクターとしては、市販のｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅベクター（ファルマシア）と同様の機能となるよう所望の遺伝子工学技術により作製した。ＶＬ遺伝子及びファージミドベクターを制限酵素Ｓ ｆ ｉ Ｉ （ ＴＯＹＯＢＯ）、ＢglＩＩ（ ＴＯＹ
ＯＢＯ）で処理した後に、アガロース電気泳動し、目的分子量付近のバンドを切り出して、ＷｉｚａｒｄＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｒｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。次に、制限酵素処理を加えたＶＬ遺伝子及びファージミドベクターをLigation high ver.2（TOYOBO）で連結させた後、
エレクトロポレーションを用いて、大腸菌ＴＧ１株（Lucigen）に導入させた。
形質転換を行った大腸菌を１ ％ グルコース、１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有２ × Ｔ Ｙ プレート培地にて、３０℃、１６時間培養を行った。
【００４４】
次に、上記プレート培地上に形成された全コロニーを１５％グリセロール含有ＰＢＳ溶液にて懸濁させ、QIAprep Spin Miniprep Kit（株式会社キアゲン）を用いてファージミドベクターの抽出を行った。
【００４５】
次に、VL遺伝子が組み込まれたファージミドベクターにVH遺伝子を組み込んだ。
VL遺伝子が組み込まれたファージミドベクター及びVH遺伝子をそれぞれ、BamHＩ及びNot
Ｉ制限酵素で処理した後に、アガロース電気泳動し、目的分子量 付近のバンドを切り出
して、ＷｉｚａｒｄＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｒｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。次に、制限酵素処理を加えたＶＨ遺伝子及びファージミドベクターをLigation high ver.2（TOYOBO）で連結させた後、
エレクトロポレーションを用いて、大腸菌ＴＧ１株（Lucigen）に導入させた。
形質転換を行った大腸菌を１ ％ グルコース、１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有２ × Ｔ Ｙ プレート培地にて、３０℃、１６時間培養を行った。
上記プレート培地上に形成された全コロニーを１５％グリセロール含有ＰＢＳ溶液にて懸濁させ、１ ％ グルコース、１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有２ × Ｔ Ｙ培地で波長６ ０ ０ ｎ ｍ の吸光度が０ ．５ になるよう培養した後、ヘルパーファージM13K07（インビトロジェン）を加え、３０℃で３０分静置することで、ヘルパーファージM13K０７を感染させた。次に、ヘルパーファージM13K０７を加えた大腸菌溶液を５０００ｇ、４℃にて５分間遠心した後、形成された沈殿物に、培地（ ２ × Ｙ Ｔ 培地に１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリンと５ ０μ ｇ ／ ｍ Ｌ のカナマイシンを加えた液） １ ０ ０ ｍ Ｌ を加えて懸濁し、３ ０ ℃ で一晩培養した。上記培養液を４ ℃ で８ ０ ０ ０ ｇ 、１ ０ 分間遠心し、その上澄８０ｍｌに２ ． ５ Ｍ の塩化ナトリウムを加えた平均分子量約８０００の２ ０ ％ ポリエチレングリコール水溶液を２０ｍｌ加えて氷上で１時間静置した後、４ ℃ で１０ ８ ０ ０ ｇ 、３０ 分間遠心して沈殿を回収し、１５％のグリセロールを加えたＰ Ｂ Ｓ を２ｍｌ加えて沈殿を溶解させることで、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を提示したファージ群を回収した。
【００４６】
３）トロポニンＩに結合可能なｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を発現しているファージクローンを選択する工程
トロポニンＩ 抗原をＰ Ｂ Ｓ で１ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ に調製し、試験管３ 本（ Ｎ ｕ ｎ ｃ 社製Ｍ ａ ｘ ｉｓ ｏ ｒ ｐ ） に１ ｍ Ｌ ずつ添加して４ ℃ で２４ 時間インキュベートして、試験管内表面へトロポニンＩ抗原を吸着させた。吸着後、抗原溶液を捨て、Ｐ Ｂ Ｓ で３回洗浄した後、３ ％ スキムミルク含有Ｐ Ｂ Ｓ 溶液を４ ｍ Ｌ ずつを加えて２ ５ ℃ で１ 時間反応させ、ｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を提示したファージが非特異的に試験管に結合することを防ぐためにブロッキングを行った。
【００４７】
作製した抗原吸着済試験管に前記工程で得たｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を提示したファージ群を１ × １ ０＾ １２ Ｃ Ｆ Ｕ ／  ｍ Ｌ に調製し、その溶液１ｍｌを２ｍｌの３ ％ スキムミルク、０． ０５ ％ Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ２ ０ 含有Ｐ Ｂ Ｓと混合させ、この液を試験管に添加して２ ５ ℃ で２ 時間反応させた後、０ ． ０５ ％ Ｔｗ ｅ ｅ ｎ ２ ０ を加えたＰ Ｂ Ｓ で１０回、Ｐ Ｂ Ｓ で１０ 回洗浄した。
【００４８】
続いて抗原結合試験管に結合したファージを以下のように回収した。０．５Ｍグリシン塩酸塩（ ｐ Ｈ  ２ ． ６ ） を試験管に１ ｍ Ｌ 添加し、ローテーターを用いて室温で６ 分間反応させ乖離させた後、１ Ｍ   Ｔ ｒ ｉ ｓ − Ｈ Ｃ ｌ 緩衝液（ ｐ Ｈ ７．４） １ ｍ Ｌ を加えて中和し、この液を回収した。
【００４９】
回収した液はファージの大腸菌への感染、ヘルパーファージの感染、ファージの回収のそれぞれの工程処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
大腸菌（ TG1） を２ × Ｙ Ｔ 培地５ ｍ Ｌ で培養し、波長６ ０ ０ ｎ ｍ の吸光度が０ ．５ になるよう増殖させ、上記で乖離させたファージ液１ｍｌを加えて３ ７ ℃ で３０分静置させた。静置後の培地を５０００ｇ、４℃にて５分間遠心し、沈殿した菌体を
２ × Ｙ Ｔ 培地１ ｍ Ｌで再懸濁し、１ ％ グルコース、１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有２ × Ｔ Ｙプレート培地にて３０℃で１６時間培養した。
【００５０】
上記プレート培地上に形成された全コロニーを１５％グリセロール含有ＰＢＳ溶液にて溶解させ、１ ％ グルコース、１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有２ × Ｔ Ｙ培地で波長６ ０ ０ ｎ ｍ の吸光度が０ ．５ になるよう培養した後、ヘルパーファージM13K07（インビトロジェン）を加え、３０℃で３０分静置することで、ヘルパーファージM13K０７を感染させた。次に、ヘルパーファージM13K０７を加えた大腸菌溶液を５０００ｇ、４℃にて５分間遠心した後、沈殿物を培地（ ２ × Ｙ Ｔ 培地に１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリンと５ ０μ ｇ ／ ｍ Ｌ のカナマイシンを加えた液） １ ０ ０ ｍ Ｌ で懸濁し、３ ０ ℃ で一晩培養した。上記培養液を４ ℃ で８ ０ ０ ０ ｇ 、１ ０ 分間遠心し、その上澄８０ｍｌに２ ． ５ Ｍ の塩化ナトリウムを加えた平均分子量約８０００の２ ０ ％ ポリエチレングリコール水溶液を２０ｍｌ加えて氷上で１時間静置した後、４ ℃ で１０ ８ ０ ０ ｇ 、３０ 分間遠心して沈殿を回収し、１５％のグリセロールを加えたＰ Ｂ Ｓ を２ｍｌ加えて沈殿を溶解し、ファージ群を回収した。
上記のようにして、トロポニンＩ結合試験管に結合したファージの回収、増幅という作業を３回繰り返し行った。
【００５１】
次に、上記の作業３回後に乖離させたファージ液１ｍｌを２ × Ｙ Ｔ 培地５ ｍ Ｌで波長６ ０ ０ ｎ ｍ の吸光度が０ ．５ になるよう増殖させた大腸菌（ TG1） に加えて、３ ７ ℃ で３０分静置させた。静置後の培地を５０００ｇ、４℃にて５分間遠心し、沈殿した菌体を２ × Ｙ Ｔ 培地１ ｍ Ｌで再懸濁し、懸濁液１μｌを２ × Ｙ Ｔ 培地１０ ｍ Ｌに加え、１ ％ グルコース、１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有２ × Ｔ Ｙプレート培地にて３０℃で１６時間培養した。培養後形成されたコロニーをランダムに９６個ピックアップし、上記と同様にして９６クローンのscＦｖ提示ファージを回収・増幅した。
【００５２】
次に９６クローンのうち、トロポニンＩに結合可能なｓ ｃ Ｆ ｖ 抗体を発現しているファージクローンの選択をＥ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法で行った。まず、Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 用のプレートを以下のように調製した。トロポニンＩ抗原２ μ ｇ ／ ｍ Ｌを９ ６ ウェルマイクロタイタープレート（ Ｎ ｕ ｎ ｃ 社製Ｍ ａ ｘ ｉ ｓ ｏ ｒ ｐ ） の各ウェルに５ ０ μ Ｌ 添加して４ ℃ で１ ８ 時間結合させたのち、３％ スキムミルク 含有PBS（ ブロッキング液） を各ウェルに２ ０ ０ μ Ｌ 添加して３ ７ ℃ で１ 時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、Ｐ Ｂ Ｓ で３ 回洗浄した。
【００５３】
このようにして得られたプレートの各ウェルに、６％スキムミルク含有PBSを２５μ Ｌずつ加え、さらに上記９６クローンのファージ溶液を２５μ Ｌずつ加え混合し、２ ５ ℃で１ 時間反応させた。反応後、0.05%のTWEEEN20含有Ｐ Ｂ Ｓ で４ 回洗浄し、５ ０ ００ 倍希釈のHRPで標識された抗M13 抗体（GEヘルスケア製） を５ ０ μ Ｌ 加えて２ ５ ℃ で１ 時間反応させた。次に、各ウェルを0.05%のTWEEEN20含有Ｐ Ｂ Ｓ で４ 回洗浄した後、TMB peroxidase EIA substrate kit (BIO-RAD)の溶液５０ μ Ｌ を加えて暫時反応させた後、１Ｎ硫酸 を加えて反応を停止し、波長４５０ ｎ ｍ における吸光度を測定した。その結果、RPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK及びQPLELAGLGFAELQDLに対し、特異的に結合することができるA２及びA１ｓｃFv抗体を得ることができた。
【００５４】
４）上記工程にて取得したscFv遺伝子を発現可能な発現ベクターに組込み、大腸菌から封入体を抽出し、封入体を巻き戻すことによりscＦｖタンパク質を得る工程
前記で得られたトロポニンＩに結合するクローンのファージミドベクターより、scＦｖ遺伝子をNcoＩ,NotＩ制限酵素処理し、アガロースゲル電気泳動して目的の断片を回収し
、
市販のpＥＴ１５ｂベクター（タカラバイオ）に連結させた。また、ｐET１５ｂベクターのマルチクローニングサイトのC末端側にヒスチジンタグを導入し、ｓｃFv抗体のC末端側にヒスチジンタグが導入されるように設計した。
【００５５】
次に上記発現ベクターをBL21(DE3)pLysS大腸菌株（タカラバイオ）に導入させ、１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有LBプレート培地にて３７℃で１６時間培養した。プレート培地上に形成されたシングルコロニーを１Lの１ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ Ｌ アンピシリン含有LBプレート培地にうつし、波長６ ０ ０ ｎ ｍ の吸光度が０ ．５ になるよう３７℃にて増殖させ、１mＭ ＩＰＴＧを１ｍｌ加え、３７℃にて５時間振とう培養した。
【００５６】
次に、培養液を５０００ｇ、４℃にて５分間遠心し、菌体を沈殿させ、５０mＬのPBSで菌体を再懸濁した。再懸濁液を超音波処理により菌体を破砕した後、１００００ｇ、４℃、３０分間遠心することで、封入体を含む不溶性物を沈殿させた。
【００５７】
封入体を含む不溶性物を４％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳで２回、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、得られた沈殿物に１０mＬの可溶化溶液（6Mグアニジン塩酸塩、０．１M  NaCl、５０mＭ  MES、１０mＭ  EDTA、pＨ６．０）を加え、４℃にて１８時間反応させ、封入体の可溶化を行った。可溶化後の溶液を０．４５μｍのフィルターを通し、不溶化物を除去した。次に、可溶化溶液１mＬに対し、巻き戻し溶液（０．１M Tris-HCl,2mM EDTA,1.0アルギニン塩酸塩,3.73mMシスタミン、 6.73mM システアミン塩酸塩 ｐH８．０）２ｍLを５０μｌずつ混合しながら滴下した。次に、得られた３mＬの溶液を１Lの上記巻き戻し溶液に５０μｌずつ混合しながら滴下した後、４℃にて撹拌しながら９６時間インキュベートした。インキュベート後の溶液を１０mＬまで濃縮し、HiLoad 26/60 Superdex 75 pgにて精製した。
【００５８】
このようにして、ヒト心筋由来のトロポニンＩに結合することができるA1及びA2scＦｖ抗体を得ることができた。
【００５９】
A1及びA2scＦｖ抗体のアフィニティ測定
次に、BiacoreT100（GEヘルスケア）を用い、A1及びA2ｓｃFv抗体のアフィニティ測定を行った。測定用センサチップには、CM5（GEヘルスケア）を用いた。ヒト心筋由来のトロポニンＩ（フナコシ）をアミドカップリング法にて、約１０００RUをCM5チップ上のフローセル２に固定化させた。また、フローセル１をEDC／NHSで活性後、エタノールアミンで処理し、リファレンスとした。
【００６０】
次に、上記工程で得られたA1及びA2ｓｃFv抗体をPD-10（GEヘルスケア）カラムを用い、HBS-EPバッファーに置換した。それぞれの溶液を、HBS-EPにて50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.13nM,1.07nMに希釈し、アナライト溶液とした。
ランニングバッファーにHBS-EPを用い、流速６０μｌ／min、結合時間１２０秒、解離時間１２００秒にて結合実験を行った。また、再生溶液には、pＨ２．０のグリシン溶液を用いた。得られたセンサグラムをBIAevaluation Software（GEヘルスケア）にて解析した結果、A2ｓｃＦｖ抗体のアフィニティ（KD(M)=2.631E-9）及びA1ｓｃＦｖ抗体のアフィニティ（KD=1.96E-10）が決定された。
【００６１】
抗ヒスチジンタグ抗体、A1scＦｖ抗体、A2scＦｖ抗体を用いたトロポニンＩの測定
以下では、作製したA1scＦｖ抗体、A2scＦｖ抗体及び抗ヒスチジンタグ抗体を用い、BiacoreT100でトロポニンＩを測定した場合の例を示す。
【００６２】
上記と同様にして抗ヒスチジンタグ抗体（キアゲン）を約３６００R.U CM5チップ上のフローセル２に固定化させた。また、フローセル１をエタノールアミンで処理し、リファレンス用とした。次に、A1scＦｖ抗体及びA2scＦｖ抗体を等モル濃度で混合させ、フローセルに流した。A1scＦｖ抗体及びA2scＦｖ抗体は上記に記載したようにC末端側にヒスチジンタグを持つため、チップ上に固定化された抗ヒスチジンタグ抗体に結合することができる。次にアナライト溶液として、HBS−EPにバッファー置換したヒト心筋由来のトロポニンＩ（フナコシ）を100nM,50nM,25nM,12.5nM,6.25nM,3.12nMに調製した。
抗ヒスチジンタグ抗体、A1scＦｖ抗体、A2scＦｖ抗体を用いたトロポニンＩの測定には
BiacoreT100（GEヘルスケア）のキャプチャー法を用いた。キャプチャー分子の溶液は、
上記のA1scＦｖ抗体及びA2scＦｖ抗体を等モル濃度で混合させたものを用いた。
ランニングバッファーにHBS-EPを用い、流速６０μｌ／min、キャプチャー時間４０秒、結合時間１８０秒、解離時間１８００秒にて結合実験を行った。また、再生溶液には、pＨ２．０のグリシン溶液を用いた。
【００６３】
得られたセンサグラムをBIAevaluation Software（GEヘルスケア）にて解析した結果、
KD(M)= 1.11E-12のアフィニティが決定された。
【００６４】
上記のようにして、異なるエピトープに結合する２種の抗トロポニンＩscＦｖ及び２種の抗体を同時に結合することができる抗ヒスチジンタグ抗体を用いることで、強い結合力でトロポニンＩと結合することができた。
【００６５】
なお、本実施例においてはトロポニンＩの高感度な検出にBiacoreT100（ＧＥヘルスケア）を用いた例を示したが、本発明の測定方法に関しては、これに限定されない。
なお、本実施例においては、ｓｃFvの作製にマウス免疫ライブラリーを用いたが、これに限定されない。その他の動物種、あるいはナイーブライブラリーや合成ライブラリーを用いて作製することもできる。また、ハイブリドーマより抗体分子のｍＲＮＡを抽出し、そこからｃＤＮＡ化を行うことで、抗体遺伝子を得ることもできる。
【００６６】
なお、本実施例においては、ｓｃFvにヒスチジンタグを用いたが、これに限定されない。例えばＦＬＡＧタグやＨＡタグ、Ｅタグといった既存のタグ配列を用いることもできる。また、任意のペプチド配列をタグとして利用し、任意のペプチド配列に対する抗体は、既存の免疫法により得ることもできる。
【００６７】
なお、本実施例においては、抗体を第三の分子として用いたが、これに限定されない。例えばｓｃFvのＣ末端をビオチン化し、ストレプトアビジンを第三の結合分子として用いることもできる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のトロポニンＩの測定方法によれば、従来のような抗体分子を用いる測定方法に対し、より高感度にトロポニンＩを検出することができる。
【配列表】
2013029441000001.app