(57)【要約】      （修正有）【課題】(i)アメリカ腐蛆病菌の防除作用が高いことに加えて、(ii)蜂病全般に対する防除作用が高く、且つ、(iii)人体や環境に対して安全性の高い、新規の蜂病防除剤、および、蜂病の防除方法を提供する。【解決手段】(A)特定の塩基配列に対して99％以上の相同性を有する塩基配列の16SrRNA遺伝子の塩基配列をゲノムDNA中に有し、且つ、(B1)抗アメリカ腐蛆病菌活性を有する物質を外分泌する性質,及び,(B2)当該乳酸菌を投与したミツバチにおける抗菌ペプチドの産生を促進し病原性微生物全般の感染を抑制する性質を有する、新規乳酸菌。また、前記乳酸菌を有するミツバチ用蜂病防除剤。また、前記乳酸菌を経口投与することを特徴とする蜂病防除方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下(A)に記載の16SrRNA遺伝子の塩基配列をゲノムDNA中に有し、且つ、以下(B1)及び(B2)に記載の性質を有する乳酸菌。
(A) 配列番号1又は2に記載の塩基配列に対して99％以上の相同性を有する塩基配列。
(B1) 抗アメリカ腐蛆病菌活性を有する物質を外分泌する性質。
(B2) 当該乳酸菌を投与したミツバチにおける抗菌ペプチドの産生を促進し、病原性微生物全般の感染を抑制する性質。
【請求項２】
前記16SrRNA遺伝子の塩基配列が、配列番号1又は2に記載の塩基配列に対して99.9％以上の相同性を有する塩基配列である、請求項1に記載の乳酸菌。
【請求項３】
前記16SrRNA遺伝子の塩基配列が、配列番号1又は2に記載の塩基配列である、請求項1又は2に記載の乳酸菌。
【請求項４】
前記乳酸菌が、以下(C1)又は(C2)に記載の菌株である、請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌。
(C1) NITE AP-1207株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
(C2) NITE AP-1206株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
【請求項５】
前記産生が促進される抗菌ペプチドが、Abaecin、Defensin1、及びHymenoptaecinを含むものである、請求項1〜4のいずれかに記載の乳酸菌。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用蜂病防除剤。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用アメリカ腐蛆病防除剤。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を経口投与することを特徴とする、ミツバチの蜂病防除方法。
【請求項９】
請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を経口投与することを特徴とする、ミツバチのアメリカ腐蛆病防除方法。
【請求項１０】
請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アメリカ腐蛆病菌作用を有することに加えて、プロバイオティクス効果によりミツバチの液性自然免疫を向上させる作用、を有する新規乳酸菌に関する。
また、本発明は、当該乳酸菌を有するミツバチ用蜂病防除剤、当該乳酸菌を有するミツバチ用飼料、および、当該乳酸菌を経口投与することを特徴とする蜂病防除方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
社会現象になったミツバチ不足の要因の一つとして蜂病の蔓延が考えられる。
ミツバチは、数万個体が高温多湿な巣内で密集して生活することから、常に感染病の危機に晒されており、アメリカ腐蛆病（細菌）、チョーク病（真菌）、ノゼマ病（微胞子虫）、その他ウイルスによって引き起こされる疾病等、多くの感染病が存在する。
感染が確認された場合に、巣箱ごと蜂群を淘汰する処理が必要であり、養蜂家への被害は甚大である。
【０００３】
その中でも、特にアメリカ腐蛆病菌（Paenibacillus larvae）によって引き起こされるアメリカ腐蛆病は、‘家畜の法定伝染病’に指定され、養蜂現場に広く浸潤している。
現在、アメリカ腐蛆病に対する防除法としては、エチレンオキサイド等を用いたガス薫蒸が用いられている。しかし、人体への毒性の影響や、実施するのに多大な設備や労力が必要である。
【０００４】
そこで、薬剤によってアメリカ腐蛆病を防除する方法が試みられているが、現在、アメリカ腐蛆病に対する薬剤として薬事法で認可されているものは、アピテン（ミロサマイシン）1種類のみである（非特許文献1 参照）。
また、アピテンは抗生物質であるため、抗生物質の蜂蜜への移行と残留による人体への安全性の問題、生態系への影響、病原体の薬剤耐性獲得等、多くの問題が指摘されている。特に、蜂蜜への抗生物質の残留は、投与時期や投与方法等の使用の際に多くの留意事項が課せられている。
さらに、アピテンは抗生物質であるため、細菌以外が病原体である蜂病には効果が期待できない。
【０００５】
そこで、養蜂業界においては、アメリカ腐蛆病菌の防除作用が高いことに加えて、蜂病全般に対する防除作用が高く、且つ、人体や環境に対して安全性の高い、新規の蜂病防除剤の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日獣会誌 50, p429〜437 (1997), アメリカ腐蛆病の防除に有効な薬剤の検索
【非特許文献２】畜産技術 2011年 1月号 p1〜6, ニホンミツバチ消化管から単離された抗アメリカ腐蛆病菌
【非特許文献３】ミツバチ科学 28(1) p39-43 (2010), ニホンミツバチから単離された抗アメリカ腐蛆病菌
【非特許文献４】Journal of Invertebrate Pathology 102 (2009) p91-96
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決し、(i)アメリカ腐蛆病菌の防除作用が高いことに加えて、(ii)蜂病全般に対する防除作用が高く、且つ、(iii)人体や環境に対して安全性の高い、新規の蜂病防除剤、および、蜂病の防除方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本願出願前にニホンミツバチの腸管からin vitroにおいてアメリカ腐蛆病菌の増殖抑制作用を有する細菌35菌株を単離し報告している（非特許文献2〜4 参照）。
しかし、これらの細菌群の中には、ミツバチの免疫力自体を向上させる作用を有する菌株は存在しなかった。
また、これらの細菌群においては、蜂蜜に混入して人体が摂取した際に、安全性が確認されていない菌も混在していた。
【０００９】
そこで、本発明者らは、生体にとって安全性が高く且つプロバイオティクス効果を有する乳酸菌に着目した。そして、様々な菌源から約200菌株の乳酸菌を単離し、これらの菌株に対して阻止円形成能に注目してスクリーニングを行ったところ、抗アメリカ腐蛆病菌活性を有する新規の乳酸菌9菌株を見出した。
次いで、これらの培養菌体を混ぜたローヤルゼリー飼料を、ミツバチの孵化直後の1齡幼虫に投与したところ、ミツバチの抗菌ペプチド産生を促す作用（液性自然免疫向上作用）を有する乳酸菌2菌株を見出した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
〔請求項1〕に係る本発明は、以下(A)に記載の16SrRNA遺伝子の塩基配列をゲノムDNA中に有し、且つ、以下(B1)及び(B2)に記載の性質を有する乳酸菌に関する。
(A) 配列番号1又は2に記載の塩基配列に対して99％以上の相同性を有する塩基配列。
(B1) 抗アメリカ腐蛆病菌活性を有する物質を外分泌する性質。
(B2) 当該乳酸菌を投与したミツバチにおける抗菌ペプチドの産生を促進し、病原性微生物全般の感染を抑制する性質。
〔請求項2〕に係る本発明は、前記16SrRNA遺伝子の塩基配列が、配列番号1又は2に記載の塩基配列に対して99.9％以上の相同性を有する塩基配列である、請求項1に記載の乳酸菌に関する。
〔請求項3〕に係る本発明は、前記16SrRNA遺伝子の塩基配列が、配列番号1又は2に記載の塩基配列である、請求項1又は2に記載の乳酸菌に関する。
〔請求項4〕に係る本発明は、前記乳酸菌が、以下(C1)又は(C2)に記載の菌株である、請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌に関する。
(C1) NITE AP-1207株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
(C2) NITE AP-1206株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
〔請求項5〕に係る本発明は、前記産生が促進される抗菌ペプチドが、Abaecin、Defensin1、及びHymenoptaecinを含むものである、請求項1〜4のいずれかに記載の乳酸菌に関する。
〔請求項6〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用蜂病防除剤に関する。
〔請求項7〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用アメリカ腐蛆病防除剤に関する。
〔請求項8〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を経口投与することを特徴とする、ミツバチの蜂病防除方法に関する。
〔請求項9〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を経口投与することを特徴とする、ミツバチのアメリカ腐蛆病防除方法に関する。
〔請求項10〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用飼料に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、(i)アメリカ腐蛆病の防除作用を有することに加えて、(ii)さらにミツバチの蜂病全般に対する防除作用を有し、且つ、(iii)有効成分が乳酸菌株の菌体であるため人体や環境に対して安全性の高い、蜂病防除剤を提供することを可能とする。
また、本発明は、当該乳酸菌を配合したミツバチ用飼料を提供することを可能とする。
【００１２】
本発明の防除剤及び飼料は、抗アメリカ腐蛆病活性も有するため、養蜂家に甚大な被害をもたらしていたアメリカ腐蛆病を、極めて効果的に防除することを可能とする。
また、本発明の防除剤及び飼料は、経口投与したミツバチの抗菌ペプチドの産生を促し（ミツバチの液性自然免疫を向上させ）、消化管や体腔における病原微生物の感染（アメリカ腐蛆病菌だけでなく、チョーク病やノゼマ病の原因微生物等）を顕著に防除することを可能とする。特には、幼虫に投与することによって、ミツバチの蜂病全般の発生を未然に予防して防除することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例1において、乳酸菌懸濁液を染み込ませた濾紙の周囲に形成された阻止円（アメリカ腐蛆病菌の増殖が阻害されたことによって形成された円）の直径を測定した結果を示す図である。なお、陽性対照としては、テトラサイクリン（図中ではTet.と示した）100μg/mLを染み込ませた濾紙を用いた。
【図２】実施例1において、乳酸菌の16SrRNA遺伝子の塩基配列に基づき近隣結合法によって構築した分子系統樹を示す図である。  図中のbarの長さは、100bpあたり1bpの変異を有する配列間の距離を示す。また、枝の上又は下に記載した数値は、ブートストラップ法により系統樹構築を1000回試行して当該枝が再現された回数（支持値）を示す。
【図３】実施例2において、リアルタイムPCR法によって測定したAbaecin遺伝子の発現量（対照群の発現量を1とした相対値）を示す図である。
【図４】実施例2において、リアルタイムPCR法によって測定したDefensin1遺伝子の発現量（対照群の発現量を1とした相対値）を示す図である。
【図５】実施例2において、リアルタイムPCR法によって測定したHymenoptaecin遺伝子の発現量（対照群の発現量を1とした相対値）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、抗アメリカ腐蛆病菌作用を有することに加えて、プロバイオティクス効果によりミツバチの液性自然免疫を向上させる作用、を有する新規乳酸菌に関する。
また、本発明は、当該乳酸菌を有するミツバチ用蜂病防除剤、当該乳酸菌を有するミツバチ用飼料、および、当該乳酸菌を経口投与することを特徴とする蜂病防除方法、に関する。
【００１５】
〔本発明の乳酸菌の特徴〕
本発明における乳酸菌は、抗アメリカ腐蛆病菌作用を有し、且つ、プロバイオティクス効果によりミツバチの液性自然免疫を向上させる作用を有する、特定の乳酸菌を指すものである。
【００１６】
・抗アメリカ腐蛆病菌作用
本発明の乳酸菌が奏する‘抗アメリカ腐蛆病菌作用’とは、アメリカ腐蛆病菌（Paenibacillus larvae）に対する抗菌作用を指すものである。具体的には、アメリカ蛆病菌に対する増殖抑制、増殖阻害、致死作用等を指すものである。
【００１７】
当該抗菌作用は、本発明の乳酸菌が外分泌する物質によって発揮される。そのため、本発明の乳酸菌の生菌は、当該物質を外分泌することによって、菌体の周囲に抗アメリカ腐蛆病菌作用を発揮させることが可能となる。
また、本発明の乳酸菌の培養液（菌懸濁液）の液体中には、当該外分泌物質が含まれるため、培養液の上清を用いた場合にも当該抗菌作用が発揮される。
【００１８】
本発明の乳酸菌を培養した菌懸濁液（定常期に達した菌濃度）には、10μg/mLのテトラサイクリンに相当する力価の抗菌作用があると認められる。
また、当該培養上清を濃縮することによって、抗菌作用の力価を高めた濃縮物を得ることが可能となる。
【００１９】
・ミツバチの液性自然免疫向上作用
本発明の乳酸菌は、上記抗アメリカ腐蛆病菌活性に加えて、プロバイオティクス効果によるミツバチの液性自然免疫向上作用を有するものである。
ここで、‘プロバイオティクス効果’とは、生体（例えば脊椎動物や昆虫）に対して有用な菌を経口投与することによって、消化管内の病原性微生物等の有害微生物の増殖を抑制・阻害する効果を指すものである。
【００２０】
本発明では、本発明の乳酸菌の菌体（具体的には生菌）をミツバチに経口摂取させることにより、ミツバチ体内（特には、消化管の大部分を占める中腸上皮細胞）での抗菌ペプチドの産生が大幅に増加し、液性自然免疫力が向上する作用が発揮させることが可能となる。なお、当該抗菌ペプチド産生を促進する作用は、菌体表面分子又は外分泌物質によって発揮されるものと推測される。
当該抗菌ペプチド作用の結果として、本発明の乳酸菌はミツバチの消化管及び／又は体腔内での病原性微生物の増殖を大幅に抑制・阻害する作用を奏し、蜂病の病原性微生物全般に対する感染を顕著に防止することを可能とする。
【００２１】
本発明の乳酸菌によって液性自然免疫が向上可能な対象としては、ミツバチ属（Apis）に属する如何なる種類のハチに対しても、当該効果を発揮することができる。
具体的な種類としては、例えば、セイヨウミツバチ（A. mellifera）、トウヨウミツバチ（A. cerana）、ニホンミツバチ（A. cerana japonica）、サバミツバチ（A. koschevnikovi）、キナバルヤマミツバチ（A. nuluensis）、クロオビミツバチ（A. nigrocincta）、オオミツバチ（A. dorsata）、ヒマラヤオオミツバチ（A. laboriosa）、コミツバチ（A. florea）、クロコミツバチ（A. andreniformis）、等を挙げることができる。
これらのうち、特に養蜂産業において重要なセイヨウミツバチ（A. mellifera）、ニホンミツバチ（A. cerana japonica）に対して、好適な効果が期待される。
【００２２】
本発明の乳酸菌による感染防止可能な病原性微生物としては、消化管内に感染する微生物や消化管を経て感染する微生物全般を挙げることができ、特にバクテリア（細菌）の仲間に限定されるものでない。
具体的には、Paenibacillus larvae（アメリカ腐蛆病菌）、Melissococcus plutonius（ヨーロッパ腐蛆病菌）等の細菌；、チョーク病の原因となるAscosphaera apis、微胞子虫であるノゼマ病の原因となるNosema ceranae等の真核性の微生物、；等の様々な分類群の生物に対して、効果的な防除効果を得ることが可能となる。
【００２３】
本発明の乳酸菌によってミツバチ体内での産生が促進される抗菌ペプチドとしては、具体的にはAbaecin（アバエシン）, Defensin1（ディフェンシン1）, Defensin2（ディフェンシン2）, Hymenoptaecin（ヒメノプタエシン）, Apidaecin（アピダエシン）を指す。
本発明では、これらうちの1種類以上の抗菌ペプチドの産生量を増加させることによって、液性自然免疫力の向上作用が発揮される。
なお、乳酸菌の種類によって、複数種類（例えば3種類以上）の抗菌ペプチド産生量を増加させる作用が奏される。その場合、さらに大きな液性自然免疫力の向上効果が発揮される。
【００２４】
・乳酸菌の種類
本発明における乳酸菌は、配列番号1又は2に記載の塩基配列に対して99％以上、好ましくは99.9％以上の相同性を有する16SrRNA遺伝子（16SrDNA）の塩基配列を、ゲノムDNA中に有することを特徴とするものである。ここには、配列番号1又は2に記載の塩基配列と完全に一致する16SrRNA遺伝子の塩基配列を、ゲノムDNA中に有する乳酸菌も含まれる。
なお、16SrRNA遺伝子の塩基配列が当該範囲にある乳酸菌としては、具体的には、Enterococcus thailandicusに属する菌株、Weissella cibariaに属する菌株を挙げることができる。
【００２５】
本発明の乳酸菌としてさらに具体的には、Weissella cibariaに属する577株（NITE AP-1207）, Enterococcus thailandicusに属する102株（NITE AP-1206）を挙げることができる。
また、これらの菌株に由来する菌株であり, 且つ, 前記抗アメリカ腐蛆病活性と液性自然免疫向上作用が保持された菌株も本発明の乳酸菌として用いることができる。
なお、577株及び102株は、2012年1月24日にそれぞれNITE AP-1207及びNITE AP-1206の受領番号で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託申請された菌株である。
【００２６】
〔ミツバチ用蜂病防除剤〕
本発明では、上記乳酸菌（具体的には生菌）を含有してなることを特徴とするミツバチ用の蜂病防除剤を製造することが可能となる。
当該蜂病防除剤は、ミツバチに経口投与させることで、上記乳酸菌のプロバイオティクス効果による液性自然免疫向上作用により、蜂病の病原性微生物の全般の関してオールマイティな防除・予防を可能とする優れた効果を奏するものである。
また、本発明の蜂病防除剤は、当該液性自然免疫向上作用と前記抗アメリカ腐蛆病菌活性物質の分泌作用との相乗効果により、アメリカ腐蛆病菌の防除に極めて優れた効果が発揮される。
特に、本発明の蜂病防除剤を幼虫に経口投与することによって、予防段階での優れた蜂病防除効果が発揮される。
【００２７】
本発明の蜂病防除剤は、前記乳酸菌を生菌として含有させることを要する。例えば、培養後の菌懸濁液、培養液上清を除いた菌体沈殿物を含有させた形態で用いることができる。また、バイアビリティーが維持されている状態で調製した乾燥菌体、グリセロールストック等の状態で含有させた形態で用いることもできる。
【００２８】
本発明の蜂病防除剤に含有させる乳酸菌の有効量としては、実際に経口摂取させる状態での含有量に換算して1×104〜1×109 CFU/g(湿重)、好ましくは1×105〜1×108 CFU/g(湿重)を挙げることができる。本発明では、当該乳酸菌含有量の剤をミツバチに経口摂取させることで、上記優れた効果を発揮させることが可能となる。なお、当該量よりも乳酸菌量が少ない場合、摂取量が少ない場合、十分な病原性微生物防除効果が発揮されず好ましくない。
【００２９】
本発明の蜂病防除剤の形態としては、ミツバチが経口摂取でき且つ乳酸菌の生菌のバイアビリティーが維持できる形態のものであれば、如何なるものも採用することができる。
例えば、液体状、粉末状、ペースト状、賦形剤等と混和して得られ錠剤、カプセルに封入した形態、などの形態を採用することができる。
また、必要に応じて、糖類や、ビタミン類、ミネラル類、タンパク質等を配合することも可能である。
【００３０】
また、ミツバチ成虫が実際に摂取可能な剤形態としては、花粉、ビール酵母、黄粉、砂糖水、等と混合した粉末状、ペースト状、液体状の形態を挙げることができる。
また、幼虫に対して投与可能な形態としては、成虫の働き蜂が口移しで幼虫に餌を与えて育てる性質があるため、前記成虫用の剤をそのまま用いることができるが、液体状の形態にて、巣穴に直接スプレー散布や噴霧し、幼虫に直接与える方法を採用することもできる。
【００３１】
これら蜂病防除剤の剤形態によっては、流通性や保存性等を考慮して乾燥状態や低温状態を保つことが必要となる場合がある。
また、採用した剤形態によっては、そのままミツバチに投与させることができない場合があるが、その場合、飼料原料等に配合することで用いることができる。
【００３２】
〔ミツバチ用飼料〕
また、本発明では、上記乳酸菌や蜂病防除剤を飼料原料に配合して、ミツバチ用飼料とすることが可能となる。
具体的には、上記生菌含有量が上記有効範囲で含むようにミツバチ用の各種飼料原料（例えば、花粉、ビール酵母、黄粉、ローヤルゼリー、砂糖液等）に配合することで、飼料を提供することができる。
【００３３】
〔蜂病防除方法〕
本発明では、上記乳酸菌について、生菌含有量が上記有効範囲で含むように経口投与することにより、ミツバチの蜂病全般を効果的に防除することが可能となる。
特に、当該蜂病防除方法では、当該液性自然免疫向上作用と前記抗アメリカ腐蛆病菌活性物質の分泌作用との相乗効果により、アメリカ腐蛆病菌の防除に極めて優れた効果が発揮される。
また、幼虫に対して投与することで、予防段階での防除を効果的に行うことが可能となる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【００３５】
〔実施例1〕『抗アメリカ腐蛆病菌活性を有する乳酸菌のスクリーニング』
阻止円計測法によりin vitroでの抗アメリカ腐蛆病菌活性を測定し、抗アメリカ腐蛆病菌作用を有する乳酸菌のスクリーニングを行った。
【００３６】
(1) 「阻止円計測法による乳酸菌スクリーニング」
様々な菌源から約200菌株の乳酸菌株を単離し、炭酸カルシウム含有MRS寒天培地の上で培養してコロニーを得た。コロニーから各乳酸菌株を釣菌して1.5mLチューブ中の1.0mlのMRS液体培地に入れ、1週間静置培養した。その後、遠心分離して上清を除去し、菌を200μLの蒸留水に再懸濁した。
一方、別途に培養したアメリカ腐蛆病菌（Paenibacillus larvae）を白金耳で回収してMYPGP液体培地に懸濁し、適量をMYPGP寒天培地の上に撒き、コンラージ棒で均一に塗布し風乾した。
その上に、乳酸菌懸濁液20μLを染みこませた直径7.5mmの濾紙（paper disk）を置き、5％CO2条件下 37℃で2日間培養した。（なお、陽性対照としては、乳酸菌懸濁液の代わりに、テトラサイクリン（100μg/mL）を染み込ませた濾紙を用いて同様にして培養を行った。
培養後、濾紙の周囲に形成された阻止円（アメリカ腐蛆病菌の増殖が阻害されたことによって形成された円）の直径を、デジタルノギスを用いて測定した。測定は3回行い、平均値と標準偏差を求めた。
【００３７】
その結果、単離した約200菌株の乳酸菌のうち、表1に示す9菌株（102株, A52株, 577株, F13株, H17株, H25株, N55株, N61株, 821株）の菌懸濁液に、アメリカ腐蛆病菌に対する高い増殖阻害活性（抗菌活性）があることが示された。なお、これらの菌株の阻止円の直径を図1に示した。
また、阻止円の拡散度合いから、当該抗菌作用を示す有効成分は、菌懸濁液中に外分泌された物質であると推定された。
一方、他の残りの菌株の菌懸濁液を用いた場合には、阻止円が全く形成されない、もしくはごく弱い効果しかなかった。
【００３８】
【表１】
2013158315.tif 000003
【００３９】
(2) 「菌株の同定」
上記得られた9菌株について、16SrRNA遺伝子（16SrDNA）のユニバーサルプライマーセット（配列番号3,4で示すプライマーセット）を用いてコロニーPCRを行い、PCR産物をダイレクトシーケンスして塩基配列を決定した。
なお、決定した16SrRNA遺伝子の塩基配列は、遺伝研のDDBJに登録しAccession numberを取得した。
【００４０】
決定した9菌株の16SrRNA遺伝子の塩基配列と、DDBJ/EMBL/GenBankに登録されている乳酸菌株及び外群としてBacillus subtilis（枯草菌）の16SrRNA遺伝子の塩基配列を用いてClustalXプログラムによりアライメントを行った。
そして、アライメント可能と判断された1417bpに基づいてNJ-PLOTプラグラムによる近隣結合法（NJ法）により、分子系統樹を作成した。
また、系統樹の各クレードの信頼性を示す支持値は、ブートストラップ法により計算した。得られた系統樹を図2に示す。
【００４１】
その結果、抗アメリカ腐蛆病菌活性を有する9菌株の乳酸菌は、Weissella属、Lactobacillus属、Enterococcus属のいずれかに属する新規の乳酸菌であることが明らかになった。
具体的には、821株, A52株, 577株はW. cibariaに属する菌株であり、；H25株, H17株はW. paramesenteroides及びW. thailandensisに近縁な菌株であり、；F13株はW. viridescensと近縁な菌株であり、；N61株, N55株はL. graminis及びL. curvatusと近縁な菌株であり、；102株はE. thailandicusに属する菌株であることが示された。
これらの各菌株近縁な乳酸菌は、抗アメリカ腐蛆病活性を有さないことから、当該抗アメリカ腐蛆病活性は、各乳酸菌の系統（H25株とH17株について、N55株とN61株については、おそらくそれらの共通祖先）において独立に獲得された形質であることが示唆された。
【００４２】
なお、当該9菌株の同定に関する情報を表2に整理して示した。
【００４３】
【表２】
2013158315.tif 000004
【００４４】
〔実施例2〕『ミツバチに対する液性自然免疫向上作用』
上記得られた乳酸菌について、プロバイオティクス効果による液性自然免疫向上作用を有するかを、ミツバチ自身の体内で合成される抗菌ペプチド遺伝子の発現量を測定することで調べた。
【００４５】
実施例1にて単離した各乳酸菌について、MRS液体培地にて培養して1×10７ CFU/mLの菌懸濁液を調製し、ロイヤルゼリーに対して1対1の割合となるように混ぜて各飼料1〜9（乳酸菌 0.5×10７ CFU/mL）を調製した。ここで、CFU（Colony Forming Unit）とは、平板培養した際に形成されたコロニー数を示す。
当該各飼料を孵化直後（1齢）のセイヨウミツバチの幼虫に経口投与した。また、対照として、菌懸濁液の代わりに同量のMRS液体培地のみを混ぜた飼料を幼虫に与えた。当該試験では、幼虫10匹を一群として飼育した。
投与から24時間経過後、各群の幼虫を回収して蒸留水で軽く洗浄し、幼虫全体からRNeasy(R) Plus mini kit (Qiagen)を用いてRNAを抽出した。
得られたRNAからSuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)を用いて各cDNAを合成した。
【００４６】
合成したcDNAを鋳型として、表3に示すプライマーセットを用いてリアルタイムPCRを行い、抗菌ペプチド遺伝子であるAbaecin, Defensin1, Hymenoptaecinの遺伝子の発現量を測定した。
リアルタイムPCR反応は、12.5μLのSYBR Premix Ex Taq (TAKARA)、2μLの各cDNA鋳型、1μLの各プライマー（10μM）、滅菌蒸留水8.5μLを含む全量25μLを、Thermal Cycler Dice(R) Real Time System (TaKaRa)に供した。得られたデータは、Thermal Cycler Dice(R) Real Time System Software Version 3.0 (TaKaRa)にて解析した。
また、各遺伝子の発現量は、リボゾームタンパク遺伝子であるRps5遺伝子（内部標準遺伝子）に対する量として求めた。そして、対照群の発現量を1とした相対値で比較した。また、得られた結果に対して各群間の有意差は、Student t-検定を実施した。
Abaecin遺伝子の結果を図3に、Defensin1遺伝子の結果を図4に、Hymenoptaecin遺伝子の結果を図5に、それぞれ示した。なお、対照群と比較して、遺伝子発現量が有意に増加していると認められる群には「＊」を表示した。
【００４７】
【表３】
2013158315.tif 000005
【００４８】
その結果、‘577株’又は‘102株’の菌懸濁液をローヤルゼリーに混ぜた飼料（飼料1,3）を投与した群では、抗菌ペプチド遺伝子の発現量が、大幅に増加することが示された。
特に‘577株’の菌懸濁液をローヤルゼリーに混ぜた飼料（飼料3）を投与した群では、Abaecin, Defensin1, Hymenoptaecinの遺伝子の全てにおいて、発現量の大幅増加が見られた。
【００４９】
抗菌ペプチドは、昆虫では一般的に脂肪体や血球で産生されることが知られているが、中腸上皮細胞で産生されて、消化管や体腔における病原微生物の感染を防ぐことに重要な役割を担っていることが報告されている（Immunity. 2000 13(5):737-748., Insect Mol Biol. 2001 10(6):561-571.参照）。
これらのことから、経口投与された577株, 102株の菌体は、中腸上皮細胞に何らかの作用をすることによって、抗菌ペプチドの産生を促進していることが示唆された。
なお、当該抗菌ペプチド産生を促進する作用は、577株, 102株の菌体表面分子又は外分泌物質によって発揮されるものと考えられた。
【００５０】
そして、当該ペプチド産生量が大幅に向上した結果として、液性自然免疫力が大幅に高まり、消化管や体腔における病原性微生物の感染が抑制（防止）されることが示された。
【００５１】
〔実施例1,2の総括〕
(1) 実施例1,2から、抗アメリカ腐蛆病菌作用を有し、且つ、プロバイオティクス効果によりミツバチの液性自然免疫向上作用を有する新規乳酸菌株577株, 102株が見出された。
なお、577株及び102株は、2012年1月24日にそれぞれNITE AP-1207及びNITE AP-1206の受領番号で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託申請された菌株である。
【００５２】
(2) 577株はWeissella cibariaに属する菌株であり、102株はWeissella属とは異なるEnterococcus thailandicusに属する菌株であることから、当該抗菌作用及びミツバチの液性免疫向上作用は、W. cibaria, E. thailandicusの一部の系統において、それぞれ独自に獲得された形質であることが示唆された。
なお、系統解析の過程において解明した577株及び102株の16SrRNA遺伝子（16SrDNA）の塩基配列は、配列番号1,2としてそれぞれ記載した。
【００５３】
(3) アメリカ腐蛆病菌に対する抗菌活性は、当該乳酸菌の外分泌物質によって奏されることが示された。
(4) ミツバチの液性自然免疫を向上させる作用は、当該乳酸菌の菌体を投与して中腸上皮細胞の抗菌ペプチドの産生量が大幅に向上することにより、奏されることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、ミツバチの蜂病全般（特にはアメリカ腐蛆病）に対する防除作用を有し且つ人体や環境に対して安全性の高い蜂病防除剤を提供することを可能とする。また、本発明では、当該防除作用を有するミツバチ用飼料を提供することも可能とする。
そのため、本発明は、養蜂業界・農業分野での活用が期待される。
特に本発明は、養蜂家に甚大な被害をもたらしていたアメリカ腐蛆病を、極めて効果的に防除する技術となることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年2月23日(2012.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
前記乳酸菌が、以下(C1)又は(C2)に記載の菌株である、請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌。
(C1) NITE P-1207株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
(C2) NITE P-1206株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
〔請求項1〕に係る本発明は、以下(A)に記載の16SrRNA遺伝子の塩基配列をゲノムDNA中に有し、且つ、以下(B1)及び(B2)に記載の性質を有する乳酸菌に関する。
(A) 配列番号1又は2に記載の塩基配列に対して99％以上の相同性を有する塩基配列。
(B1) 抗アメリカ腐蛆病菌活性を有する物質を外分泌する性質。
(B2) 当該乳酸菌を投与したミツバチにおける抗菌ペプチドの産生を促進し、病原性微生物全般の感染を抑制する性質。
〔請求項2〕に係る本発明は、前記16SrRNA遺伝子の塩基配列が、配列番号1又は2に記載の塩基配列に対して99.9％以上の相同性を有する塩基配列である、請求項1に記載の乳酸菌に関する。
〔請求項3〕に係る本発明は、前記16SrRNA遺伝子の塩基配列が、配列番号1又は2に記載の塩基配列である、請求項1又は2に記載の乳酸菌に関する。
〔請求項4〕に係る本発明は、前記乳酸菌が、以下(C1)又は(C2)に記載の菌株である、請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸菌に関する。
(C1) NITE P-1207株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
(C2) NITE P-1206株, 又は, 当該菌株に由来し且つ前記(B1)及び(B2)に記載の性質を有する菌株。
〔請求項5〕に係る本発明は、前記産生が促進される抗菌ペプチドが、Abaecin、Defensin1、及びHymenoptaecinを含むものである、請求項1〜4のいずれかに記載の乳酸菌に関する。
〔請求項6〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用蜂病防除剤に関する。
〔請求項7〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用アメリカ腐蛆病防除剤に関する。
〔請求項8〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を経口投与することを特徴とする、ミツバチの蜂病防除方法に関する。
〔請求項9〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を経口投与することを特徴とする、ミツバチのアメリカ腐蛆病防除方法に関する。
〔請求項10〕に係る本発明は、請求項1〜5のいずれかに記載の1以上の乳酸菌を含有してなることを特徴とする、ミツバチ用飼料に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の乳酸菌としてさらに具体的には、Weissella cibariaに属する577株（NITE P-1207）, Enterococcus thailandicusに属する102株（NITE P-1206）を挙げることができる。
また、これらの菌株に由来する菌株であり, 且つ, 前記抗アメリカ腐蛆病活性と液性自然免疫向上作用が保持された菌株も本発明の乳酸菌として用いることができる。
なお、577株及び102株は、2012年1月24日にそれぞれNITE AP-1207及びNITE AP-1206の受領番号で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託申請された菌株である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
【表１】
2013158315.tif 000011
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【表２】
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