(57)【要約】【課題】本発明は、高い蛍光発光強度比が得られる、モレキュラービーコン法に好適に用いられる蛍光プローブを提供する。また、本発明は、標的鎖中の一塩基変異を蛍光変化によって容易に識別できる蛍光プローブを提供する。【解決手段】本発明者らは、一部自己相補的なステムループ構造を形成しうるポリヌクレオチド配列を有するプローブにおいて、ステムを形成する第１の配列に、蛍光剤として、式（Ｉ）で表されるヌクレオチドを含有させ、ステムを形成する第１の配列に相補的な第２の配列に、消光剤として、消光基で修飾されたヌクレオチドを含有させることで高い蛍光発光強度比が得られることを見出した。さらに本発明者らは、当該プローブが標的鎖中の一塩基変異を蛍光変化によって容易に識別できることを見出した。【選択図】図４
2013158290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一部自己相補的なステムループ構造を形成しうるポリヌクレオチド配列を有するプローブにおいて、
ステムを形成する第１の配列に、蛍光剤として、式（Ｉ）で表されるヌクレオチドを含有し、
ステムを形成する第１の配列に相補的な第２の配列に、消光剤として、消光基で修飾されたヌクレオチドを含有することを特徴とする、蛍光プローブ。
【化１】
2013158290.tif 000025
［式中、ｎは１〜３の整数を表す。］
【請求項２】
前記消光剤として、式（ＩＩ）で表されるヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項１に記載の蛍光プローブ。
【化２】
2013158290.tif 000026
［式中、ｎは２〜４の整数を表し、Ｒは消光基を表す。］
【請求項３】
前記消光基（Ｒ）がメチルレッド、アゾベンゼン、メチルチオアゾベンゼン、アントラキノン、カルミン酸、アリザリン又はラッカイン酸である請求項２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
前記式（ＩＩ）の化合物が以下の構造を有する、請求項２又は３に記載の蛍光プローブ。
【化３】
2013158290.tif 000027
［式中、ｎは２〜４の整数を表す。］
【請求項５】
式（Ｉ）においてはｎ＝１であり、式（ＩＩ）においてはｎ＝２である、請求項２〜４のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるヌクレオチドがステムの二重鎖において互いに１塩基離れて位置することを特徴とする、請求項２〜５のいずれかに記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の蛍光プローブを、核酸を含む検体と混合する工程を含む、核酸検出方法。
【請求項８】
標的とする核酸が一塩基多型を含む配列を有することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モレキュラービーコン法に好適に用いられる蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子に蛍光物質を結合した蛍光性核酸プローブはこれまで数多く発表されている。最近は相補的核酸と二重鎖形成を行うことを引き金にした蛍光変化を指標に、例えば溶液中などでの相補的核酸（標的核酸）の存在を検出するモレキュラービーコン型プローブの開発が盛んである。このようなプローブの蛍光性有機基の一つとして未修飾のペリレンを用いることが開示されている（特許文献１）。また、未修飾のペリレンおよびアントラキノンをそれぞれ核酸以外の物質（D-Threoninol）に結合したユニットを作製し、これらを複数個モレキュラービーコン型ＤＮＡ中に連結したプローブが、標的核酸存在下でのみ強い蛍光発光を行うことが報告されているが（特許文献２、非特許文献１）、これらの報告では蛍光剤（フルオロフォア）としてペリレン及び消光剤（クエンチャー）としてアントラキノンを結合したユニットが、ステム中に特定の位置関係を保ってそれぞれ複数個存在しないと、特にクエンチャーが複数個存在しないと、十分な検出感度が得られない。また、該報告では標的鎖中に一塩基ミスマッチが存在するときのプローブの蛍光変化については明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−０６０３９４号公報
【特許文献２】特開２０１１−１３５８２３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 7044-7047
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、消光剤（クエンチャー）を１単位用いるだけでも高い蛍光発光強度比が得られる、モレキュラービーコン法に好適に用いられる蛍光プローブを提供することを課題とする。また、本発明は、標的鎖中の一塩基変異を蛍光変化によって容易に識別できる蛍光プローブを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、シリル化によって吸光効率及び蛍光量子収率のいずれもが増強されたペリレン誘導体を用い、これを消光剤と組み合わせることによって、消光剤を１単位のみ用いるだけで高い蛍光発光強度比が得られる蛍光プローブを見出した。さらに本発明者らは、当該プローブが標的鎖中の一塩基変異を蛍光変化によって容易に識別できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）一部自己相補的なステムループ構造を形成しうるポリヌクレオチド配列を有するプローブにおいて、
ステムを形成する第１の配列に、蛍光剤として、式（Ｉ）で表されるヌクレオチドを含有し、
ステムを形成する第１の配列に相補的な第２の配列に、消光剤として、消光基で修飾され
たヌクレオチドを含有することを特徴とする、蛍光プローブ。
【０００８】
【化１】
2013158290.tif 000003
［式中、ｎは１〜３の整数を表す。］
（２）前記消光剤として、式（ＩＩ）で表されるヌクレオチドを含有することを特徴とする、（１）に記載の蛍光プローブ。
【０００９】
【化２】
2013158290.tif 000004
［式中、ｎは２〜４の整数を表し、Ｒは消光基を表す。］
（３）前記消光基（Ｒ）がメチルレッド、アゾベンゼン、メチルチオアゾベンゼン、アントラキノン、カルミン酸、アリザリン又はラッカイン酸である（２）に記載の蛍光プローブ。
（４）前記式（ＩＩ）の化合物が以下の構造を有する、（２）又は（３）に記載の蛍光プローブ。
【００１０】
【化３】
2013158290.tif 000005
［式中、ｎは２〜４の整数を表す。］
（５）式（Ｉ）においてｎ＝１であり、式（ＩＩ）においてｎ＝２である、（２）〜（４）のいずれかに記載の蛍光プローブ。
（６）式（Ｉ）および（ＩＩ）で表されるヌクレオチドがステムの二重鎖において互いに１塩基離れて位置することを特徴とする、（２）〜（５）のいずれかに記載の蛍光プローブ。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の蛍光プローブを、核酸を含む検体と混合する工
程を含む、核酸検出方法。
（８）標的とする核酸が一塩基多型を含む配列を有することを特徴とする、（７）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、相補的配列を持つＤＮＡ非存在下ではシリル化ペリレンに由来する蛍光シグナルが殆ど検出されない一方で、相補鎖存在下では短時間のうちに蛍光発光が相補鎖非存在下と比較して大きく増大する蛍光プローブが提供される。また、当該プローブによって、標的鎖中の一塩基変異を蛍光変化によって容易に識別できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ステムループ構造の模式図。
【図２】蛍光性DNAプローブの構造上の特徴。Ｘは蛍光剤、Ｙは消光剤を表す。
【図３】温度上昇に伴う蛍光強度の変化（GK-2100を使用。濃度は3.0μＭ）。
【図４】蛍光性DNAプローブの蛍光スペクトル。点線は相補鎖DNA(tDNA-1)非存在下、実線は相補鎖DNA存在下。DNA濃度は3.0μＭ。
【図５】GK-2100の蛍光（写真）；左はGK-2100単独、右はこれに相補的DNA(tDNA-1)を混合したもの。DNA濃度は3.0μＭ。
【図６】フルマッチ相補鎖DNAとGK-2100の二重鎖形成時における蛍光スペクトルの時間変化。
【図７】一塩基ミスマッチ鎖DNAの存在下でのGK-2100の蛍光スペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、モレキュラービーコン法などに用いられる蛍光プローブに関する。また本発明は当該プローブを用いた核酸の検出方法に関する。本発明の蛍光プローブは、標的核酸が存在しない場合はステムループ構造を形成し、蛍光剤（フルオロフォア）と消光剤（クエンチャー）が近接するため、消光剤により蛍光が抑制され、安定的に消光する。一方で、標的核酸が存在する場合、本発明のプローブは当該核酸と特異的にハイブリダイズすることで、ステムループ構造が解消し、蛍光剤と消光剤の距離が離れて蛍光を発するようになる。
【００１４】
本発明において、ステムループ構造とは、例えば図１で表されるような構造を示し、二重鎖を形成している部分がステム（茎）、一本鎖で輪になっている部分がループ（輪）と呼ばれる。本発明の蛍光プローブは、少なくとも１つのステムと、少なくとも１つのループを形成可能であればよい。ループ部分の配列は標的にハイブリダイズしうる配列を含む。
【００１５】
本発明の蛍光プローブによる蛍光強度は、シリル化ペリレンの蛍光極大波長である４６３ｎｍ付近の455nm〜470nmにおける相対的蛍光強度によって測定できる。また、蛍光プローブの蛍光強度比として、455nm〜470nmにおける相補鎖ＤＮＡ（標的配列）非存在下、及び存在下の相対的蛍光強度から、前者をバックグランド（Ｂ）、後者をシグナル（Ｓ）としてその比を算出した値（Ｓ／Ｂ比）を用いることができる。当該蛍光強度比が高いほど相補配列を有する標的配列との結合を識別しやすくなる。
【００１６】
本発明の蛍光プローブの骨格としては、ポリヌクレオチドが用いられる。ポリヌクレオチドとしてはＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられるが、ＤＮＡが好ましい。本発明の蛍光プローブの鎖長は特に制限されないが、２０〜５０mer程度が考えられ、２５〜４０merが好ましい。
【００１７】
本発明の蛍光プローブのステムの鎖長は、特に制限されないが、５〜１０の塩基対を形
成する長さが挙げられる。一方、ループの長さも特に制限されないが、１０〜３０塩基程度とすることができる。
【００１８】
本発明の蛍光プローブは、蛍光剤として、式（Ｉ）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有する。
【００１９】
【化４】
2013158290.tif 000006
［式中、ｎは１〜３の整数を表す。］
【００２０】
本発明では、式（Ｉ）で表されるように、蛍光性有機基としてシリル化ペリレンを用いることを特徴とする。式（Ｉ）において、シリル化ペリレンと核酸塩基はアルキルリンカーで結合されている。アルキルリンカーは炭素数ｎ＝１〜３のアルキレン基で構成されるが、ｎ＝１が好ましい。
【００２１】
また、本発明の蛍光プローブは消光剤を有するが、好ましくは消光剤として、式（ＩＩ）で表されるヌクレオチドを構成単位として含有する。
【００２２】
【化５】
2013158290.tif 000007
［式中、ｎは２〜４の整数を表し、Ｒは消光基を表す。］
【００２３】
式（ＩＩ）中、消光基であるＲには消光作用を有する化合物を用いることができる。このような化合物としては、アゾベンゼン及びその誘導体が挙げられ、メチルレッド、アゾベンゼン、メチルチオアゾベンゼンが好ましく例示できる。
【００２４】
また、アントラキノン骨格を有する化合物を用いることができる。アントラキノンや、アントラキノンのベンゼン環を構成する炭素原子に結合する水素原子の１又は２以上を、ヒドロキシル基、ニトロ基、アミノ基、アルキル基、スルホン酸基、ハロゲン原子、アルキルアミノ基等から選択される１又は２以上で置換したアントラキノン誘導体が例示され、アントラキノン誘導体としてはコチニール色素（カルミン酸）、アカネ色素（アリザリン）、ラック色素（ラッカイン酸）等が挙げられるが、アントラキノンが好ましい。
【００２５】
その他、消光作用を有する化合物としては、モレキュラープローブ社のＱＳＹ−７、ＱＳＹ−９、ＱＳＹ−２１、ＱＳＹ−３５や、バイオサーチテクノロジーズ社のＢＨＱ−１
、ＢＨＱ−２等が例示できる。
【００２６】
本発明の式（ＩＩ）において、消光作用を有する化合物Ｒと核酸塩基はアルキルリンカーで結合されている。アルキルリンカーは炭素数ｎ＝２〜４のアルキレン基で構成されるが、ｎ＝２が好ましい。
【００２７】
本発明の消光剤に用いる核酸塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）を用いることができるが、ピリミジン塩基であるシトシン、チミン、ウラシルが好ましく、チミン、ウラシルがより好ましい。
【００２８】
本発明の蛍光プローブは、一部自己相補的なステムループ構造を形成しうるポリヌクレオチド配列のステムを形成する二重鎖の一方（第１の配列）に蛍光剤を有し、二重鎖のもう一方である第１の配列に相補的な第２の配列に消光剤を有することを特徴とする。本発明の蛍光プローブでは、前記ステムに蛍光剤と消光剤を１単位ずつ（一組）用いることが好ましい。
【００２９】
前記ステムにおける蛍光剤と消光剤の位置は特に制限されないが、例えば、図２に表されるように、ステムの二重鎖を形成した時に互いに１塩基離れて位置するようにプローブ配列に導入することが好ましい。
【００３０】
本発明の蛍光プローブの合成方法は特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法により、ヌクレオシドをホスホロアミダイトで保護して合成に用いることができる。合成には既知のポリヌクレオチド合成機を用いることができる。合成方法として実施例に記載の方法が例示される。
【００３１】
本発明の蛍光プローブにより、特定の塩基配列を有する核酸を検出する方法が提供される。対象とする核酸を含む検体に、本発明の蛍光プローブを混合することで検出可能である。対象の核酸がプローブのループ部分とハイブリダイズすれば、二重鎖を形成し蛍光が増大する。一方、対象の核酸がハイブリダイズしない場合は二重鎖を形成しないため蛍光を発しない。
【００３２】
本発明の蛍光プローブは、標的とする核酸と一塩基ミスマッチを有する核酸の検出に用いることができる。本発明の蛍光プローブは、プローブのループ部分に完全に相補的な核酸に対して、二重鎖を形成することで顕著に蛍光が増大するだけでなく、相補鎖と１塩基の違いを有するミスマッチ鎖（一塩基多型を有する核酸）に対しては蛍光が弱くなる（例えば、蛍光強度が完全相補鎖の場合の４５％以下になる）性質を有する。一塩基ミスマッチを有する核酸の検出を行う場合、完全相補鎖の検出より高ストリンジェントな条件で行うことが好ましい。使用するバッファーの塩濃度は、完全相補鎖の検出に用いるバッファーの塩濃度（ＮａＣｌであれば１００ｍＭ程度）の１／３〜２／３程度が好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を参照して本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例の態様に制限されない。
【００３４】
＜実施例１＞
〔本発明の蛍光剤および消光剤の合成〕
1H-NMR、及び31P-NMRは日本電子株式会社製AL-300型核磁気共鳴装置で測定した。
ESI-Mass（エレクトロスプレーイオン化質量分析）はパーキンエルマー社製  Sciex API-100を用い、ポジティブイオンモードで測定した。
紫外・可視吸収スペクトルは島津製作所製 UV2450により、蛍光発光スペクトルは島津製
作所製RF-5300型分光蛍光光度計を用いて測定した。
DNAの合成はApplied Biosystems 社製DNA / RNA synthesizer 392型を用いて行った。
縮合剤であるDMT-MM [4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride]は文献 (Z. J. Kaminski, P. Paneth, J. Rudzinski, J. Org. Chem., 4248-4255, 63, 1998)に従って合成した。
３−ブロモペリレン(1)はペリレンンから論文記載の方法（R. H. Mitchell, Y.-H. Lai, R. V. Williams, J. Org. Chem. 1979, 44, 4733-4735.）により合成した。
化合物(9-a)は化合物(1)から文献（Y. Sato1, A. Ozaki, M. Hosaka, T. Moriguchi, K. Shinozuka, Key Engineering Materials Vol. 459 (2011) pp 63-66）に記載の通り合成
した。
【００３５】
合成の全体像を以下に示す。
【００３６】
【化６】
2013158290.tif 000008
【００３７】
〔化合物２の合成〕
【化７】
2013158290.tif 000009
【００３８】
窒素雰囲気下で、3-ブロモペリレン（化合物１） 2.38 g(8.7 mmol)を蒸留THF 100 mL
に溶解させ、ドライアイス-エタノール浴で-78 ℃で攪拌した。n-ブチルリチウム8.2 mL(13.1 mmol)をゆっくり滴下し、1時間攪拌した。アリルジメチルクロロシラン2.62 mL(17.4 mmol)を加え、一時間−78℃で攪拌した。その後、徐々に室温に戻し室温で2時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去し、得られた個体をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸水ナトリウム水溶液で2回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥し、濾過後、
溶媒を減圧留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ジクロロメタン)で精製し、3-アリルジメチルシリルペリレン（化合物２）を得た。
収量 ： 2.12 g
収率 ： 76.2 %
1H-NMR(CDCl3)
δ 8.23-8.15 (4H, m peryrene), 7.94-7.91 (1H, d, perylene), 7.76-7.65 (3H, m, perylene), 7.53-7.43 (3H, m, perylene), 5.86-5.77 (1H, m, -SiCH2CHCH2), 4.93-4.84 
(2H, t, -SiCH2CHCH2), 2.0-1.98 (2H, d, -SiCH2CHCH2), 0.51 (6H, s, -Si(CH3)2-)
【００３９】
〔化合物３の合成〕
【化８】
2013158290.tif 000010
【００４０】
化合物２ (2.0g , 5.75mmol)を9-ボラビシクロ[3.3.1]ノナン(9-BBN) のTHF 溶液に溶
解させ、55℃で1時間加熱撹拌した。その後フラスコを氷浴に移し、EtOH 10ml、1M水酸化ナトリウム水溶液21ml、過酸化水素水2.4mlを加え氷浴で1時間、室温で2時間撹拌した。
反応溶液からジクロロメタンで抽出し、炭酸水素ナトリウム水溶液で3 回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：ヘキサン＝4：1)で精製し黄色固体の3-ヒドロキシプロピルジメチルシリルペリレン（化合物３）を得た。
収量 ： 980 mg
収率 ： 46.7 %
1H-NMR(CDCl3)
δ 8.22-8.17 (4H, m peryrene), 7.98-7.92 (1H, d, perylene), 7.76-7.65 (3H, m, perylene), 7.53-7.43 (3H, m, perylene), 3.61-3.57 (1H, m, CH2CH2CH2OH), 1.66-1.60 (2H, m, CH2CH2CH2OH), 1.02-0.96 (2H, m, CH2CHCH2OH), 0.48 (6H, s, -Si(CH3)2-)
【００４１】
〔化合物４の合成〕
【化９】
2013158290.tif 000011
【００４２】
化合物３ (550mg, 1.49mmol)を、1, 4-ジオキサン30mlに溶解させ、フタルイミド(329.6 mg, 2.24 mmol)、トリフェニルフォスフィン(587.5 mg, 2.24 mmol)、ジエチルアゾジ
カルボキシレイト-トルエン溶液(1.0 ml, 2.24 mmol)を加え、室温で30分撹拌した。溶媒を減圧留去後、個体をジクロロメタンに溶解させ、水で2回洗浄した。有機層に硫酸ナト
リウムを加えて乾燥させ、濾過後、溶媒を減圧留去した。その後、ジエチルエーテル 25 mlに懸濁し、析出した結晶を濾取し、ジエチルエーテル 10 mlで洗浄した。得られた結晶を真空乾燥し、化合物４を得た。
収量 ： 600 mg
収率 ： 81 %
1H-NMR(CDCl3)
δ 8.22-8.12 (4H, m peryrene), 7.89-7.86 (1H, d, perylene), 7.87-7.45 (10H, m, perylene + phthalimide), 3.70-3.65 (2H, t, -SiCH2CH2CH2-), 1.69-1.60 (2H, m, -SiCH2CH2CH2-), 1.07-1.01 (2H, m, -SiCH2CHCH2-), 0.49 (6H, s, -Si(CH3)2-)
【００４３】
〔化合物５の合成〕
【化１０】
2013158290.tif 000012
【００４４】
化合物４(600 mg, 1.21 mmol)をTHF 50 mlに溶解後、過剰量のヒドラジン一水和物を加え、3時間加熱還流した。溶媒を減圧留去後、個体をジクロロメタンに溶解させ、水で2回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加えて乾燥し、濾過後、溶媒を減圧留去した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：ヘキサンメタノール：25％
アンモニア水 = 4：1：0.2)で精製し、黄色個体の化合物５を得た。
収量 ： 330 mg
収率 ： 75 %
1H-NMR(CDCl3)
δ 8.22-8.13 (4H, m peryrene), 7.92-7.89 (1H, d, perylene), 7.68-7.66 (3H, m, perylene), 7.53-7.45 (3H, m, perylene), 2.69-2.64 (2H, t, -SiCH2CH2CH2-), 1.69-1.60 (2H, m, -SiCH2CH2CH2-), 1.00-0.95 (2H, m, -SiCH2CHCH2-), 0.48 (6H, s, -Si(CH3)2-)
【００４５】
〔化合物７の合成〕
化合物７は既知化合物であり、その合成は文献記載（H. Ozaki, A. Nakamura, A. Arai, M. Endoh, H. Sawai, J. Chem. Soc.,Chem. Commun., 1995, 68, 1981-1987.）の方法
に従った。
【００４６】
〔化合物８−ｂの合成〕
【化１１】
2013158290.tif 000013
【００４７】
5-カルボキシメチル-5'-O-(4, 4'-ジメトキシトリチル)-2'-デオキシウリジン（化合物７） (100 mg, 0.166 mmol) をメタノールに溶解させ、化合物５ (74 mg, 0.20 mmol)、DMT-MM(100 mg, 0.35 mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。反応溶媒にジクロロメタン50 mlを加え完全に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 30 ml で2 回洗浄した。有機層
を無水硫酸マグネシウムにより乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：メタノール＝9：1 + 1 % トリエチルアミン)により精製し、
化合物８−ｂを得た。
収量 ： 120 mg
収率 ： 85.0 %
1H NMR (CDCl3)
δ 8.20-8.11(m, 4H, perylene), 7.89-7.86(1H, d, perylene), 7.75-7.61(m, 3H, perylene), 7.50-7.45(m, 3H, perylene), 7.40-6.83(m, 13H, DMTr), 6.29-6.25(t,1H, H1'), 4.48(s, 1H, H3'), 3.95(s, 1H, H4'), 3.75(s,6H, -OCH3), 3.36(s, 1H, H5'), 3.12-3.10(d, 2H, -NH-CH2-), 2.88-2.73(2H, dd, -CH2-CO-), 2.73-2.60(2H, dd, -CH2-CH2-CH2-), 1.47-1.46(2H, m, -CH2-Si-), 0.45(6H, s, -Si(CH3)2-)
【００４８】
〔化合物９−ｂの合成〕
【化１２】
2013158290.tif 000014
【００４９】
化合物８−ｂ(120 mg, 0.2 mmol)をジクロロメタン 10ml に溶解し、氷浴中でN, N-ジ
イソプロピルアミン(0.4 ml, 2.05 mmol)、ジイソプロピルアミノ-β-シアノエトキシク
ロロホスフィン(0.25 ml, 1.03 mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。反応液を分液ろうとに移し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 20ml で2回洗浄した。有機層を無水硫酸マグ
ネシウムにより乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸
エチル+ 1 % トリエチルアミン)により精製し、化合物９−ｂを得た。
収量 ： 85 mg
収率 ： 80.0 %
1H NMR (CDCl3)
δ 8.18-7.55(m, 9H, perylene), 7.79(s, 1H, H6), 7.40-6.81(m, 13H, DMTr), 6.46-6.28(m, 1H, H1'), 4.65-4.62(m, 1H, H3'), 4.18-4.10(m, 3H, H4' + -CH2-), 3.72(s, 6H, -OCH3), 3.62-3.21(m, 4H, H5' + -CH2-), 2.75-2.52(dd,4H,- CH2CH2-), 2.42-2.38(m, 2H, H2'), 1.28-1.10(m, 12H, i-Pro×2), 0.45(6H, s, -Si(CH3)2-)
【００５０】
〔化合物１１−ａの合成〕
【化１３】
2013158290.tif 000015
化合物７(100 mg, 0.166 mmol) をメタノールに溶解させ、1-アミノエチルアミノアン
トラキノン（化合物１０−ａ） (54 mg, 0.204 mmol)、DMT-MM(100 mg, 0.361 mmol)を加
え、室温で3時間攪拌した。反応溶媒にジクロロメタン50 mlを加え完全に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムにより乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：メタノール
＝9：1 + 1 %トリエチルアミン)により精製し、化合物１１−ａを得た。
尚、化合物10-aは既知化合物であり、その合成は文献記載（M. Sato, T. Moriguchi, K. Shinozuka, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14, 1305-1308.）の方法に従った。
収量  ：  132mg
収率  ：  93.0％
1H NMR (CDCl3)
δ 9.69(s, baseNH, 1H), 8.11-6.84(m, 21H, ant+DMTr+H6), 6.25(s,1H, H1'), 4.53(s,
1H, H3'), 3.99(s, 1H, H4'), 3.75(s,6H, -OCH3), 3.58-3.35(m, 6H, -NH-CH2-CH2- +H5'), 2.87(d, 2H, -CH2-CO-), 2.51(2H, m, H2')
【００５１】
〔化合物１１−ｂの合成〕
【化１４】
2013158290.tif 000016
化合物７(300 mg, 0.510 mmol)をメタノールに溶解させ、1-アミノブチルアミノアントラキノン（化合物１０−ｂ）(181 mg, 0.612 mmol)、DMT-MM(423 mg, 1.53 mmol)を加え
、室温で3時間攪拌した。反応溶媒にジクロロメタン50 mlを加え完全に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2 回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムにより乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン：メタノール＝9：1 + 1 %トリエチルアミン)により精製し、化合物１１−ｂを得た。
尚、化合物１０−ｂは既知化合物であり、その合成は文献記載（L. Shnur, U. Bachrach, G. Bar-Ad, M. Haran, Z. Tashma, M. Taimi, J. Katzendler, Biochemical Pharmacology, 1983, 32, 1729-1732.）の方法に従った。
収量  ：  366mg
収率  ：  82.8％
1H NMR (CDCl3)
δ 9.70(s, baseNH, 1H),8.11-6.84(m, 21H, ant+DMTr+H6), 6.24(s,1H, H1'), 4.53(s, 1H, H3'), 3.98(s, 1H, H4'), 3.75(s,6H, -OCH3), 3.58-3.35(m, 4H, -NH-CH2- +H5'), 2.87-2.78(m, 4H, -CH2-CO-+CH2-NH-), 2.51(2H, m, H2'), 1.78-1.60(4H, m, -CH2-CH2-)
【００５２】
〔化合物１２−ａの合成〕
【化１５】
2013158290.tif 000017
化合物１１−ａ(330 mg, 0.394 mmol)をジクロロメタン20 mlに溶解し、氷浴中でN,N-
ジイソプロピルアミン(0.34 ml, 1.97 mmol)、ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシクロロホスフィン(0.26 ml, 1.18 mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。反応液を分液ろうとに移し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネ
シウムにより乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エ
チル+ 1 %トリエチルアミン)により精製し、化合物１２−ａを得た。
収量  ：  210mg
収率  ：  51.3％
1H NMR (CDCl3)
δ 8.11-6.84(m, 21H, ant+DMTr+H6), 6.28(t, 1H, H1'), 4.65-4.62(m, 1H, H3'), 4.18-4.10(m, 3H, H4' + -CH2-), 3.80(s, 2H, -O-CH2-), 3.72(s, 6H, -OCH3(2), 3.70-3.51(m, 4H, H5' + -NH-CH2-), 3.35(m, 2H, -CH2-NH-),  3.10(m. 2H, i-Pr(2), 2.75-2.52(m,4H, -CH2-CO, -CH2-CN), 2.42-2.38(m, 2H, H2'), 1.20-1.10(m, 12H, i-Pro×2)
31P NMR (CDCl3)
146.0ppm, 146.4ppm
【００５３】
〔化合物１２−ｂの合成〕
【化１６】
2013158290.tif 000018
化合物１１−ｂ(366 mg, 0.42 mmol)をジクロロメタン15 mlに溶解し、氷浴中でN, N-
ジイソプロピルアミン(0.36 ml, 2.05 mmol)、ジイソプロピルアミノ−β−シアノエトキシクロロホスフィン(0.27 ml, 1.26 mmol)を加え、室温で15分間撹拌した。反応液を分液ろうとに移し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムにより乾燥後、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エ
チル+ 1 %トリエチルアミン)により精製し、化合物１２−ｂを得た。
収量  ：  296mg
収率  ：  58.2％
1H NMR (CDCl3)
δ 8.11-6.84(m, 21H, ant+DMTr+H6), 6.28(t, 1H, H1'), 4.65-4.62(m, 1H, H3'), 4.18-4.10(m, 3H, H4' + -CH2-), 3.80(s, 2H, -O-CH2-), 3.72(s, 6H, -OCH3(2), 3.70-3.51
(m, 4H, H5' + -NH-CH2-), 3.10(m. 2H, i-Pr(2), 2.75-2.52(m,6H, -CH2-CO, -CH2-CN, CH2-NH-), 2.42-2.38(m, 2H, H2'), 1.85-1.60(m, 4H, -CH2-CH2- ), 1.20-1.10(m, 12H,
i-Pro×2)
31P NMR (CDCl3)
146.0ppm, 146.4ppm
【００５４】
＜実施例２＞
〔本発明の蛍光プローブの合成〕
上記化合物９−ａと９−ｂ、および１２−ａと１２−ｂを用いたシリル化ペリレンとアントラキノンで修飾された蛍光性ＤＮＡプローブの合成は、Applied Biosystemes社製DNA/RNA自動合成機（Model-392型）を用い、1マイクロモルスケールで行った。合成では化合物９−ａと９−ｂ、および１２−ａと１２−ｂのアセトニトリル溶液濃度を0.15M とすること、及びこれらの縮合時間を360秒とすること以外は、全てメーカー推奨の合成プロト
コルに従って行った。詳しくは以下の通りである。
【００５５】
化合物９−ａと９−ｂ、および１２−ａと１２−ｂのアセトニトリル溶液（0.15M）を
調製し、これらを合成機専用ボトルを用いて自動合成機に装着した。デオキグアノシン（１μＭ）が結合したコントロールドポアガラス担体を用い、合成機よってオリゴDNAを合
成し、その間に適宜９−ａ、９−ｂ、１２−ａ、１２−ｂの何れかを用いて反応を行った。
【００５６】
反応後、通常のプロトコルに従い濃アンモニア水処理による担体からの修飾オリゴ核酸の切り出し、及び脱保護を行った後、これを逆相HPLCによって精製した。核酸に由来する260nmでのUV吸収、及びペリレンに由来する430nmでのUV吸収が一致するピークを分取し、さらにこれをエタノール沈澱、ゲルろ過などの通常の操作によって精製した。
【００５７】
こうして得られたシリル化ペリレンおよびアントラキノンで修飾された蛍光性ＤＮＡプローブ（GK-2094：配列番号１、GK-2100：配列番号２、GK-2103：配列番号３）について
は、ESI-マススペクトロメトリーによってその分子量を確認したところ、いずれも許容範囲内で計算値と一致したことから、合成することに成功した。その結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
2013158290.tif 000019
【００５９】
合成を行った蛍光性DNAプローブの構造を以下に示す。
【化１７】
2013158290.tif 000020
【００６０】
蛍光性DNAプローブの構造上の特徴
蛍光性DNAプローブは一部自己相補的な配列を持ち、標的鎖DNA（相補鎖）非存在下においては図２に示すような、シリル化ペリレン結合塩基（Ｘ）とアントラキノン結合塩基（Ｙ）が接近して存在する、ステムループ型高次構造を形成すると考えられる。
【００６１】
＜実施例３＞
〔蛍光性DNAプローブの標的鎖（相補鎖）非存在下における融解温度測定、及びそれによ
る構造確認〕
蛍光性DNAプローブが形成すると考えられる高次構造を確認し、その高次構造の熱安定
性を求める為に、標的鎖DNA（相補鎖）非存在下におけるUV 融解曲線を測定して融解温度を算出した。
【００６２】
測定UV 融解曲線の測定条件としては、100mM NaCl を含む10mM リン酸緩衝液(pH 7.2)
中、蛍光性DNAプローブの濃度をそれぞれ3.0μＭとし、それぞれの蛍光性DNAプローブの
みを含む溶液を調製した後、温度変化率0.1℃/min で液温を上昇させて260nm における吸光度をモニターし、得られたUV融解曲線の一次微分から二重鎖の融解温度(Tm値)を求めた。その結果、以下の表２に示す様に何れの蛍光性DNAプローブも70℃以上の非常に高いTm
値を示したことから、これらが溶液中に相補鎖が存在しない状態で、図２のようなステムループ型高次構造を形成していることが判明した。
【００６３】
さらに同様の条件下で、温度変化に対する蛍光極大波長である463nmの蛍光強度変化を
測定したところ図３のように温度上昇に伴って蛍光強度が上昇する曲線が得られ、この一次微分からもUV融解曲線の一次微分から求めた融解温度とほぼ等しい値（74.6 ℃）が得
られた。これは高温領域において蛍光性DNAプローブの高次構造が解消し、蛍光剤である
シリル化ペリレンと消光剤であるアントラキノンの距離が離れたことにより、蛍光が回復するためであると考えられ、このことからも低温領域では蛍光性DNAプローブが図２のよ
うな高次構造を形成していることが明らかとなった。
【００６４】
【表２】
2013158290.tif 000021
【００６５】
＜実施例４＞
〔蛍光性DNAの標的鎖（完全相補鎖）非存在下、および存在下における蛍光測定〕
蛍光性DNAプローブのループ部分に完全に相補的な天然型DNA（tDNA-1：配列番号４（表４参照））を実験に用いた。
【００６６】
相補鎖存在下および非存在下での蛍光強度比較
蛍光測定の実験条件としては、100mM NaCl を含む10mM リン酸緩衝液(pH 7.2)中、蛍光性DNAプローブのみ、または蛍光性DNAプローブと相補的なDNA(tDNA-1) が1：1 となるよ
うに溶液を調製し、アニーリング操作は行わず、溶液調製後１時間以上経過してから室温で測定を行った。蛍光スペクトル測定は脱気を行わずに行い、蛍光量子収率測定は窒素バブリングによる脱気を20分行って測定した。
【００６７】
得られた蛍光スペクトルを図４に示す。また、ここからコンピュータを用いて(使用ソ
フトImageJ)算出した、蛍光極大波長である463nmにおける相補鎖非存在下、及び存在下の各蛍光性DNAプローブの相対的蛍光強度、及び前者をバックグランド(B)、後者をシグナル(S)としてその比を算出した値（S/B比）を表３に示す。
【００６８】
【表３】
2013158290.tif 000022
【００６９】
得られたスペクトル及び表からも明らかな様に、各蛍光性DNAプローブは相補鎖非存在
下では非常に微弱な蛍光を示し、一方相補鎖存在下では顕著な蛍光を発することが明らか
となった。これは先のUV融解温度測定の結果とも合わせ、相補鎖非存在下において各蛍光性DNAプローブはステムループ型高次構造を形成し、それによってシリル化ペリレンと消
光剤であるアントラキノンが非常に近接して存在する結果、ペリレンの蛍光が顕著に抑制されるものの、一方相補鎖存在下ではループ部分と新たな二重鎖を形成することでステムループ構造が解消し、その結果ペリレンと消光剤が遠く離れて存在することでペリレンの蛍光が回復することによると考えられる。
【００７０】
またここで全ての蛍光性DNAプローブは、そのS/B比が２０を越えており、特にGK-2100
ではS/B比が５０近くになっている。最近発表されたペリレン及びアントラキノン分子を
導入した類似の蛍光性DNA (H. Kashida, T. Takatsu, T. Fujii, K. Sekiguchi, X. Liang, K. Niwa, T. Takase, Y. Yoshida, H. Asanuma, Angew. Chem. Int., 2009, 48, 7044-7047.) において、この比が２５を越えるためにはペリレン及びアントラキノン分子がそれぞれ２つ以上特定の位置に存在することを必要としていることに比べて、優れた性能を持つことが明らかとなった。また、図４および表３から、GK-2100が特に高いS/B比を示したのは、二重鎖形成時の相補鎖非存在下における消光の効率が、他に比べて非常に高いことに依ることも明らかとなった。
【００７１】
本蛍光性DNAプローブが相補鎖非存在下で非常に効率よく消光されている理由は、シリ
ル化されたペリレンとアントラキノンが何れもピリミジン塩基のC-5位に連結されている
ことから、自動的にこれらが二重鎖形成時に二重鎖中のメージャーグルーブ中に張り出すことになるが、シリル化によって疎水性が高まったペリレンが、より親水的環境にあるメージャーグルーブ中で、本来疎水的なペリレンとの間で強い疎水性相互作用を起こし、両者が近接することによるものと考えられる。また、ペリレンとアントラキノンが持つアルキルリンカーの長さ（nの数）によって、両者の接近しやすさが変化し、結果としてのシ
リル化ペリレンではアルキル鎖の数が１（n＝１）、アントラキノンでは２(n＝２)の組み合わせを持つGK-2100において最も効率よい消光を起こすことが明らかとなった。
【００７２】
ここで確認された相補鎖非存在下と存在下における蛍光強度の違いは、目視によっても容易に識別することが可能である（図５）。また相補鎖存在下における蛍光強度は、蛍光性DNAプローブの溶液中に相補鎖を混合した直後から素早く増加し、５分以内にほぼ最大
に達することも明らかとなった（図６）。これらのことから本蛍光性DNAプローブは溶液
中で単純にサンプルと混合するだけで、素早く、かつ簡便にサンプル中の特定の核酸分子を確認できる優れた遺伝子検出プローブとなりうることも確認された。
【００７３】
＜実施例５＞
〔蛍光性DNAプローブの不完全相補鎖（一塩基ミスマッチ相補鎖）存在下における蛍光測
定〕
蛍光性DNAプローブが実用的な遺伝子検出プローブ（特定の塩基配列を持つ核酸の検出
プローブ）となるためには、標的とする完全に相補的な核酸中存在下でこれと二重鎖を形成することよって顕著に蛍光が増大するだけでなく、本来の標的鎖とは１塩基の違いを持ついわゆるミスマッチ鎖が存在する場合には蛍光の程度が低い性質を持つことが必要となる。
【００７４】
そこで完全相補鎖と混合した時に、単独で存在する時に比べて蛍光変化の最も大きかったGK-2100を用い、50mM NaCl を含む10mM リン酸緩衝液(pH 7.2)中、各蛍光性DNAプロー
ブ濃度1.5μＭの条件で、完全相補鎖であるtDNA-1：配列番号４及びその配列中の１塩基
を多の塩基に変換した（表４に太字のイタリックで表示）１塩基ミスマッチ相補鎖（tDNA-2：配列番号５、tDNA-3：配列番号６、tDNA-4：配列番号７）を1:1の比率で混合して蛍
光測定を行った。得られた蛍光スペクトルを図７に示す。また、ここからコンピュータを用いて(使用ソフトImageJ)算出した、蛍光極大波長である463nmにおける相補鎖非存在下
、及び存在下の各蛍光性DNAプローブの相対的蛍光強度、GK-2100単独存在時の蛍光強度を1とした場合のそれぞれの相対蛍光強度(S/B-1)、GK-2100の完全相補鎖である tDNA-1存在下での蛍光強度を１とした場合のそれぞれの相対蛍光強度(S/B-2)を表５に示す。
【００７５】
【表４】
2013158290.tif 000023
【００７６】
【表５】
2013158290.tif 000024
【００７７】
図７、及び表５から明らかな様に、GK-2100はミスマッチ相補鎖の存在下では、GK2100
単独時よりも若干蛍光が増大するものの、その蛍光強度は完全相補鎖であるtDNA-1存在時に比べて何れも大きく低下しており、特にGあるいはTのミスマッチ塩基を持つtDNA-2あるいはtDNA-4の場合には、その蛍光強度は完全相補鎖であるtDNA-1に比べて２０％以下となり、GK-2100が特にこのような１塩基ミスマッチを持つ核酸の検出に優れていることを示
している。
【図１】
2013158290.tif 000028
【図２】
2013158290.tif 000029
【図３】
2013158290.tif 000030
【図４】
2013158290.tif 000031
【図６】
2013158290.tif 000032
【図５】
2013158290.tif 000033
【図７】
2013158290.tif 000034
【配列表】
2013158290000001.app