(57)【要約】      （修正有）【課題】酵素反応による光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の効率的な製造方法を提供する。【解決手段】アルキル側鎖の長い芳香族アルデヒドやアルキルアルデヒドと２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体に酵素を作用させることで、立体選択的な縮合反応による光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の効率的な製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2013074811.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはニトロ基である。）で表される２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体と一般式（２）：
【化２】
2013074811.tif 000012
（式中、Ｒ６〜Ｒ８は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ6〜Ｒ8が互いに結合し環を形成しても良い。ただし、Ｒ６〜Ｒ８のいずれか２つが水素原子であり、１つがフェニル基である場合は除く）で表されるアルデヒド化合物に酵素を作用させることを特徴とする、一般式（３）：
【化３】
2013074811.tif 000013
（式中Ｒ１〜Ｒ８は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の製造方法。
【請求項２】
前記Ｒ１〜Ｒ３及びＲ５が水素であり、Ｒ４が水素原子、メチル基、水酸基、メトキシ基のいずれかである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記Ｒ６が水素原子、Ｒ７が水素原子または直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、Ｒ８が直鎖状または分岐鎖状の炭素数２〜１０のアルキル基、置換されていても良い炭素数７〜１７のアラルキル基、置換されていても良い炭素数１〜１０のアルコキシ基である、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
前記Ｒ６〜Ｒ８が下記（１）〜（１０）：
（１）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がエチル基、
（２）前記Ｒ６が水素原子、Ｒ７がメチル基、Ｒ８がメチル基、
（３）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−プロピル基、
（４）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−ブチル基、
（５）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−ペンチル基、
（６）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−プロピルアルデヒド基、
（７）前記Ｒ６が水素原子、Ｒ７がメチル基、Ｒ８がフェニル基、
（８）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がベンジル基、
（９）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８が４−（トリフルオロメチル）ベンジル基、
（１０）前記Ｒ６が水素原子、Ｒ７がメチル基、Ｒ８が ４−(イソプロピル)ベンジル基、
のいずれかである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記酵素がノルコクラウリンシンターゼもしくはＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ  １０／Ｂｅｔ  Ｖ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙに属する酵素である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記酵素が、以下の(a)〜(c)：
(a)配列表の配列番号１、２、３、４、又は５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b) 配列表の配列番号１、２、３、４、又は５に示すアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸配列が欠失、挿入、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c) 配列表の配列番号１、２、３、４、又は５に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
のいずれかである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記酵素が、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から、Ｎ末端のアミノ酸を１１〜４１個削除し、Ｎ末端にメチオニンを付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の製造方法に用いるポリペプチドであって、以下の（d）〜（f）：
（d）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／又は付加されている、
（e）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から、Ｎ末端のアミノ酸が１１〜４１個削除され、Ｎ末端にメチオニンが付加されている、
（f）配列表の配列番号２のポリヌクレオチドに比べて遺伝子組換え生産時の不溶化が低減されている、
を特徴とする、ポリペプチド。
【請求項９】
一般式（４）；
【化４】
2013074811.tif 000014
（式中、Ｒ11はメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、エチルアルデヒド基、フェニル基、４−（トリフルオロメチル）フェニル基のいずれかである）で表される、光学活性化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体には、(Ｓ)-ラウダノシン、(Ｓ)-シナクチン、(Ｓ)-カルネギン、(Ｓ)-カリコトミン等、生理活性を示す化合物が多く、医薬品や農薬の合成中間体として有用な化合物群である（非特許文献１）。
【０００３】
１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の製造方法としては、２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体と、ケトンやアルデヒド化合物を、リン酸やカルシウム存在下で縮合する方法（Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応）が知られている。しかし、この方法では、ラセミ体の１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体しか得られない（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００４】
一方、光学活性な１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の製造方法としては、プロキラルな１−置換３,４−ジヒドロイソキノリンの不斉水素化反応や、３,４−ジヒドロイソキノリン類の不斉アルキル化、３−（２−フェニルエチルアミン）−２−プロペン−１−オール誘導体の不斉分子内アリル位アミノ化反応による方法が知られている。しかし、これらの方法では、高価な希少金属錯体の触媒や多段階の反応が必要であり、効率的、経済的な製造方法とは言えない（非特許文献４、非特許文献５、特許文献１）。
【０００５】
また、１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の生合成メカニズムが植物において明らかになっており、ノルコクラウリンシンターゼ（以下、ＮＣＳ）が初発反応を触媒することが知られている。しかし、ＮＣＳの作用する基質は、ドーパミンと４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、及び一部の限られた代替基質のみであり（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）、基質特異性が非常に厳密で、非天然の基質に対する寛容性は低いと考えられていた（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−４１８１４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．（１９８９），６，４０５−４３２
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ. （２０１１）， ４７， ３２４２
【非特許文献３】Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２０１０），７５，８５４２
【非特許文献４】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８６），１０８，７１１７
【非特許文献５】Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（１９９７），５９
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００２），２７７，３３８７８
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７），４６，１０１５３
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７），２８２，６２７４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、酵素反応により光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の効率的な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＮＣＳの基質としては困難と考えられていた、アルキル側鎖の長い芳香族アルデヒドやアルキルアルデヒドと、２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体にＮＣＳを作用させることで、立体選択的に光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は
一般式（１）：
【００１１】
【化１】
2013074811.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１〜Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはニトロ基である。）で表される２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体と一般式（２）：
【００１３】
【化２】
2013074811.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ６〜Ｒ８は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ6〜Ｒ10が互いに結合し環を形成しても良い。ただし、Ｒ６〜Ｒ８のいずれか２つが水素原子であり、１つが置換されていても良いフェニル基である場合は除く）で表されるアルデヒド化合物に酵素を作用させることを特徴とする、一般式（３）：
【００１５】
【化３】
2013074811.tif 000004
【００１６】
（式中Ｒ１〜Ｒ８は前記と同じ、＊は不斉炭素を表す）で表される光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の製造方法である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、光学活性１−置換テトラヒドロイソイソキノリン誘導体の効率的、な製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施例６に係る遺伝子組換え生産したＮ末端削除ＮＣＳの電気泳動写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳述する。
【００２０】
本発明の酵素反応の基質となる２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体は一般式（１）：
【００２１】
【化４】
2013074811.tif 000005
【００２２】
（式中、Ｒ１〜Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、ヒドロキシル基、アミノ基、またはニトロ基である。）である。好ましくは前記Ｒ１〜Ｒ３及びＲ５が水素であり、Ｒ４が水素原子、メチル基、水酸基、メトキシ基のいずれかである。最も好ましくはＲ１〜Ｒ３及びＲ５が水素であり、Ｒ４が水酸基である。
【００２３】
また、本発明の酵素反応のもう１つの基質であるアルデヒド化合物は、
一般式（２）：
【００２４】
【化５】
2013074811.tif 000006
【００２５】
（式中、Ｒ６〜Ｒ８は水素原子、ハロゲン原子、置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアラルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていても良いアルコキシ基、アミノ基、またはニトロ基であるか、もしくは、Ｒ6〜Ｒ10が互いに結合し環を形成しても良い。ただし、Ｒ６〜Ｒ８のいずれか２つが水素原子であり、１つがフェニル基である場合は除く）である。好ましくは前記Ｒ６が水素原子、Ｒ７が水素原子または直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜１０のアルキル基、Ｒ８が直鎖状または分岐鎖状の炭素数２〜１０のアルキル基、置換されていても良い炭素数７〜１７のアラルキル基、置換されていても良い炭素数１〜１０のアルコキシ基である。さらに好ましくは下記（１）〜（１０）のいずれかで表される化合物である。
（１）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がエチル基；
（２）前記Ｒ６が水素原子、Ｒ７がメチル基、Ｒ８がメチル基；
（３）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−プロピル基；
（４）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−ブチル基；
（５）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−ペンチル基；
（６）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がn−プロピルアルデヒド基；
（７）前記Ｒ６が水素原子、Ｒ７がメチル基、Ｒ８がフェニル基；
（８）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８がベンジル基；
（９）前記Ｒ６及びＲ７が水素原子、Ｒ８が４−（トリフルオロメチル）ベンジル基；
本発明では酵素を触媒とした不斉Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応により、前記一般式（１）：
【００２６】
【化６】
2013074811.tif 000007
【００２７】
で表される２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体と前記一般式（２）：
【００２８】
【化７】
2013074811.tif 000008
【００２９】
で表されるアルデヒド化合物を縮合し、一般式（３）：
【００３０】
【化８】
2013074811.tif 000009
【００３１】
で表される光学活性１−置換テトラヒドロイソイソキノリン誘導体を合成する。
【００３２】
Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応は、β−アリールエチルアミンとアルデヒド化合物を縮合閉環させる反応である。有機合成反応では補助剤やキラルな酸触媒を利用した不斉Ｐｉｃｔｅｔ−Ｓｐｅｎｇｌｅｒ反応が知られている（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２０００）, ２，１９５５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００６）１２８，１０８６）。
【００３３】
なお、ここでいう「光学活性」とは、考えられる各種光学異性体のうち、ひとつの光学異性体の光学純度が高いことをいう。
【００３４】
光学純度は高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーによって光学異性体を分析し、そのピーク面積から下記式より求めることができる。
【００３５】
一般式（３）で示される光学異性体の（Ｓ）体が主生成物である場合：
（（Ｓ）体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（（Ｓ）体のピーク面積）−（（Ｒ）体ピーク面積）｝÷｛（Ｓ）体のピーク面積）＋（（Ｒ）体ピーク面積）｝×１００
本発明では前記一般式（３）で表される光学活性１−置換テトラヒドロイソイソキノリン誘導体においては、光学純度は５０％ｅ．ｅ．以上が好ましく、より好ましくは７５％ｅ．ｅ．以上、さらに好ましくは９０％ｅ．ｅ．以上である。
【００３６】
なお、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４，８９７に示される触媒機構から、ＮＣＳによって生成される光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリン誘導体の絶対立体配置はＳ体と予想される。
【００３７】
前記酵素としては、前記反応を触媒する酵素であればいかなる酵素を用いても良いが、好ましくは国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ４．２．１．７８に分類されるノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）、もしくはＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ  １０／Ｂｅｔ  Ｖ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙに属する酵素（以下、ＰＲ１０タンパク質）である。ＰＲ１０タンパク質は生体防御タンパク質ファミリーの１つであり、アミノ酸配列の相同性や血清学的・免疫学的な相関性、酵素活性の特徴に基づいて１７種類に分類されたうちの１つである（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ．（１９９４），１２，２４５、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ． （１９９９），５５，８５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．(１９９８) ，１０，１６）。ＰＲ１０タンパク質にはアレルギー抗原であるＢｅｔ  Ｖ１やリボヌクレアーゼ様タンパク質の構造類似タンパク質が含まれる。
【００３８】
ＮＣＳ及びＰＲ１０タンパク質は植物中から単離することが可能である。ＮＣＳ及びＰＲ１０タンパク質の由来となる植物は特に限定されないが、アルカロイドを体内に蓄積するアマリリダセエ（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）科、アリストロチセエ（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ）科、ベルベリダセエ（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）科、ユーホルビアセエ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）科、ファバセエ（Ｆａｂａｃｅａｅ）科、リリアセエ（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）科、パパベラセエ（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）科、ラヌンチュラセエ（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）科、ソラナセエ（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）科の植物が好ましい。特に好ましくはラヌンチュラセエ（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）科のコプティス・ジャポニカ（Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、タリクトラム・フラバム（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ ｆｌａｖｕｍ）及びパパベラセエ（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）科のパパヴェラ・ソムニフェラム（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）パパヴェラ・ブラクテアタム（Ｐａｐａｖｅｒ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）である。また、酵素を単離せずに、植物体もしくは植物培養細胞をそのまま利用することも可能である。具体的にはＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７），２８２，６２７４に記載の方法で植物培養細胞を得ることができる。
【００３９】
ここで、ＮＣＳ及びＰＲ１０タンパク質の酵素活性は以下のようにして検出することが可能である。例えば、ドーパミン塩酸塩１０ｍＭ、ジメチルホルムアミドに溶解したヒドロキシシンナムアルデヒド１０ｍＭを添加した１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に、ＮＣＳもしくはＰＲ１０が含まれる溶液（例えば、該酵素を生産した組換え生物や植物の精製物など）を加え、３０℃で１５分間反応を行う。反応後、下記溶離液を添加して反応を停止し、遠心後、上清を下記分析条件で分析して１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの生成量を定量する。
【００４０】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：日本分光工業株式会社製Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８Ｔ−５（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：アセトニトリル ５５５ｍｌ、蒸留水  ９４５ｍｌ、リン酸二水素カリウム  ４．７５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム  ２．１６ｇ（リン酸にてｐＨ３．５に調整）                      
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：４０℃
検出時間：ドーパミン４．８分、１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン  １１．５分
【００４１】
ＮＣＳ及びＰＲ１０タンパク質のアミノ酸配列は、その上記の方法で検出している酵素活性を有している限り特に限定されないが、好ましくは配列表の配列番号１、２、３、４、５のいずれかで表されるポリペプチドと好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を示すタンパク質である。
【００４２】
配列表の配列番号１、２、３、４、５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を利用して、前記の植物から配列相同性の高いＤＮＡを取得し、その生産物を本発明に利用することもできる。具体的にはＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７），２８２，６２７４に記載の方法で取得することができる。また、ゲノム情報が解析され、塩基配列が明らかになっている場合は、ＤＮＡを人工合成することも可能である。
【００４３】
本明細書におけるポリペプチドやポリヌクレオチドの「配列同一性」とは、対比される２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
【００４４】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（ウィスコンシン大学）、ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ分子生物学用サーバー（スイスバイオインフォマティックス研究所）、ＢＬＡＳＴ（米国生物工学情報センター）、GENETYX（ゼネティックス社）。
【００４５】
また、本発明に利用するＮＣＳ及びＰＲ１０タンパク質は、目的のＮＣＳ活性を有している限りにおいては、そのアミノ酸配列（例えば、配列表の配列番号１〜５）の１若しくは複数個（例えば、４０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたポリペプチドであってもよい。また、目的のＮＣＳ活性を有する限り、本発明に利用するＮＣＳ及びＰＲ１０のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、目的のＮＣＳ活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００４６】
また、本発明に利用するＮＣＳ及び／またはＰＲ１０タンパク質は下記に示す方法で、適当な宿主生物内で本発明に利用するＮＣＳ及び／またはＰＲ１０タンパク質をコードする遺伝子を発現し、遺伝子組換え生産して利用することもできる。
【００４７】
ＮＣＳ及び／またはＰＲ１０タンパク質のＮ末端部分にはシグナル配列が存在する場合があるため、宿主生物内で遺伝子組換え生産する場合はこのシグナル配列を一部もしくは全て削除することが好ましい。
【００４８】
ＮＣＳ及び／またはＰＲ１０タンパク質を遺伝子組換え生産する場合、宿主生物中で不溶化し、酵素活性が低下することがある。本発明では配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列のうちＮ末端のアミノ酸を１０個削除し、メチオニンを付加した場合（実施例４のＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）が生産するΔ１０ＮＣＳ）はＮＣＳの大部分が不溶化するが、Ｎ末端をさらに削除し、メチオニンを付加したポリペプチドを遺伝子組換え生産することで、不溶化が低減され、酵素活性が向上することを見出した（例えば実施例４のＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１９ＮＣＳ）が生産するΔ１９ＮＣＳ）。削除するアミノ酸の数としては、好ましくは１１〜４１個、さらに好ましくは１９〜２９個である。最も好ましくは１９個もしくは２９個である。
【００４９】
本発明においては、ＮＣＳ及びＰＲ１０タンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用すると、より効率的に光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリンを製造することができる。なお、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。
【００５０】
上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用するＮＣＳ及びＰＲ１０タンパク質をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００５１】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）などが挙げられる。
【００５２】
なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００５３】
また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００５４】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどについては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学」（共立出版、１９８７）などに詳細に記述されている。
【００５５】
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)属、バシラス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属、シュードモナス(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)属、セラチア(Ｓｅｒｒａｔｉａ)属、ブレビバクテリウム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、コリネバクテリイウム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、ストレプトコッカス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)属、及びラクトバシラス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ)属及びストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クライベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、トリコスポロン(Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ)属、ロドスポリジウム(Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、及びキャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ)属、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属、セファロスポリウム(Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、及びトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５,５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が特に好ましい。
【００５６】
本発明に利用するＮＣＳ及び／またはＰＲ１０をコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（以下、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００５７】
ＮＣＳ及び／またはＰＲ１０をコードするＤＮＡを含むベクターとしては、実施例３に記載のｐＮＮＣＳが挙げられる。また、ＮＣＳ及び／またはＰＲ１０をコードするＤＮＡを含む形質転換体の例としては、ベクターｐＮＮＣＳでＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、実施例４に記載のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＣＳ）が挙げられる。
【００５８】
形質転換体の培養には、通常、これらの宿主微生物が資化しうる栄養源を含む培地であればどのようなものでも使用しうる。例えば、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、エタノール、グリセリン等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源；更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源；を適宜混合・配合した通常の培地を用いることが出来る。これら培地は用いる微生物の種類によって適宜選択すればよい。
【００５９】
微生物の培養は、一般的な条件により行なうことができる。例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜４５℃の範囲で、好気的に１０〜９６時間培養するのが好ましい。
【００６０】
次に、酵素を用いた２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体とアルデヒド化合物の縮合反応について説明する。
【００６１】
酵素を用いた縮合反応の際には、適当な溶媒と基質の２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体とアルデヒド化合物、前記酵素、前記形質転換体、その培養物、またはその処理物等を混合し、ｐＨ調整下に攪拌する。
【００６２】
反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液が挙げられる。本反応においては、非酵素的な縮合反応によりラセミ体の１−置換テトラヒドロイソキノリンが生成するため、酵素反応によって得られる光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリンの光学純度が低下する。Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ. （２０１１）， ４７， ３２４２に記載されているようにリン酸緩衝液中ではこの非酵素的な縮合反応が促進されるため、不適である。一方、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液中では非酵素的な縮合反応の影響が少ないため、好適である。
【００６３】
酵素は、通常、上記微生物の菌体を含んだ培養液をそのまま反応に使用する。培養液を濃縮して用いてもよい。また、培養液中の成分が反応に悪影響を与える場合には、培養液を遠心分離等により処理して得られる菌体または菌体処理物を使用するとよい。
【００６４】
基質である２−（３−ヒドロキシフェニル）エチルアミン誘導体とアルデヒド化合物は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。高濃度の基質存在下では非酵素的な縮合反応が促進されるため、基質の逐次分割添加が特に好適である。
【００６５】
反応時の温度は、通常、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃とする。
【００６６】
反応時のｐＨは２．５〜９、好ましくはｐＨ５〜９の範囲である。
【００６７】
反応液中の微生物の量は、これらの基質を縮合する能力に応じ適宜決定すればよく、菌体湿重量として、０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）である。
【００６８】
反応液中の基質濃度は０．０１〜５０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．１〜３０％（Ｗ／Ｖ）である。
【００６９】
反応は、通常、振とうまたは通気攪拌しながら行なう。
【００７０】
反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。
【００７１】
更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。
【００７２】
更に、基質及び／または縮合反応の生成物による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。
【００７３】
更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
【００７４】
縮合反応により生成した光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリンを取り出す方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後に、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留や結晶化操作、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、高純度の光学活性１−置換テトラヒドロイソキノリンを容易に得ることができる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。また、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））。
【００７６】
（参考例１）１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの合成
１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジメトキシ−３，４−ジヒドロイソキノリン１．４８ｇ（５ｍｍｏｌ）のメタノール溶液１０ｍｌを５℃に冷却した。ここに、水素化ホウ素ナトリウム１８９ｍｇ（５ｍｍｏｌ）を添加して１時間撹拌し、更に２５℃まで昇温して２時間撹拌した。別の容器に濃塩酸２．６１ｇ（２５ｍｍｏｌ）と水１０ｍｌを加えて５℃に冷却し、ここに反応液をゆっくりと加えた。３０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ＝１２に調整後、減圧下にメタノールを留去した。残渣に酢酸エチル２０ｍｌを加えて抽出し、有機層を更に水１０ｍｌで洗浄した。減圧濃縮することにより、１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジメトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを淡黄色油状物として得た（１．５８ｇ、含量：９４．２％、収率は定量的）。
【００７７】
続いて、前記化合物１．０６ｇ（３．３７ｍｍｏｌ）に４８ｗｔ％臭化水素酸１０ｇ（１７．６当量）を加えて、９０℃、１６時間撹拌した。室温まで冷却後、３０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ＝７に調整し、水２０ｍＬと酢酸エチル１０ｍｌを加えた。５℃まで冷却して３０分撹拌後、析出している結晶を減圧濾別した。結晶を水１０ｇに懸濁して２５℃、３０分撹拌後、減圧濾別し、水１０ｇで洗浄、５０℃で真空乾燥することにより、１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン５２０．６ｍｇを得た（淡褐色結晶、含量：９２．１％）下記分析条件で分析し、ラセミ体のそれぞれのピークを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．８６（２Ｈ，ｍ）、２．１−２．７（４Ｈ，ｍ）、３．０２（１Ｈ，ｍ）、３．２７（１Ｈ，ｍ）、３．５−４．４（２Ｈ，ｂｒｓ）、３．９１（１Ｈ，ｍ）、６．５７（１Ｈ，ｓ）、６．６０（１Ｈ，ｓ）、７．１−７．３（５Ｈ，ｍ）
【００７８】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞  光学純度分析
カラム：ダイセル化学工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝８０／２０／０．１
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：３０℃
検出時間：１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン  １１．５分、１４．４分
【００７９】
（実施例１）ＮＣＳをコードするＤＮＡの調製
配列表の配列番号１のアミノ酸配列で示されるコプティス・ジャポニカ（Ｃｏｐｔｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のＮＣＳ（ＣｊＰＲ１０Ａ）をコードする配列番号６のＤＮＡを人工合成した。この合成ＤＮＡを鋳型としてプライマー１：5’-GGAGTCCATATGCGTATGGAAGTGGTTCT-3’（配列表の配列番号７）、プライマー２：5’-TATATACTGCAGTTATTCGGAAGATTTGTG -3’（配列表の配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＰｓｔＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡ（ＮＣＳ遺伝子）が得られた。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。
【００８０】
（実施例２）Ｎ末端配列を削除したＮＣＳをコードするＤＮＡの調製
ＮＣＳのＮ末端アミノ酸配列を１０、１９、２９、４２個削除し、Ｎ末端にメチオニンを付加したポリペプチドをコードするＤＮＡを調製した（以下、それぞれΔ１０ＮＣＳ、Δ１９ＮＣＳ、Δ２９ＮＣＳ、Δ４２ＮＣＳ遺伝子と呼ぶ）。実施例１で増幅したＤＮＡ（ＮＣＳ遺伝子）を鋳型としてプライマー３：5’-GGAGTCCATATGCTGATGTTCATTGGCACC-3’（配列表の配列番号９、Δ１０ＮＣＳ増幅用）、プライマー４：5’-GGAGTCCATATGGAACGCCTGATTTTTAA-3’（配列表の配列番号１０、Δ１９ＮＣＳ増幅用）、プライマー５：5’-GGAGTCCATATGCTGCATCGCGTTACGAAA-3’（配列表の配列番号１１、Δ２９ＮＣＳ増幅用）、プライマー６：5’- GGAGTCCATATGCACGAACTGGAAGTGGCG -3’（配列表の配列番号１２、Δ４３ＮＣＳ増幅用）のいずれか１つとプライマー２：5’- TATATACTGCAGTTATTCGGAAGATTTGTG -3’（配列表の配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸から１０、１９、２９、４２残基削除されて、かつＮ末端にメチオニンが付加されたポリペプチドをコードする二本鎖ＤＮＡ（配列開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＰｓｔＩ認識部位が付加された）が４種類（Δ１０ＮＣＳ、Δ１９ＮＣＳ、Δ２９ＮＣＳ、Δ４３ＮＣＳ遺伝子）得られた。
【００８１】
（実施例３）組換えベクターの調製
実施例１及び２で得られた５種類のＮＣＳ遺伝子をＮｄｅＩ及びＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＰｓｔＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＮＣＳ、ｐＮΔ１０ＮＣＳ、ｐＮΔ１９ＮＣＳ、ｐＮΔ２９ＮＣＳ、ｐＮΔ４２ＮＣＳを構築した。
【００８２】
（実施例４）ＮＣＳを生産する組換え大腸菌の育種
実施例３で構築した５種類の組換えベクターを用いて、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、５種類の組換え生物Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１９ＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ４２ＮＣＳ）を得た。また、ｐＵＣＮ１８を用いてＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え生物Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を得た。
【００８３】
（実施例５）  組換え生物におけるＤＮＡの発現
実施例４で得た６種類の組換え生物（Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１９ＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ４２ＮＣＳ）を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。上記の培養で得られたそれぞれ培養液１ｍｌについて、遠心分離により菌体を集め、１ｍｌの１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液のＮＣＳ活性を測定した。
【００８４】
ＮＣＳ活性は、１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に、ドーパミン塩酸塩１０ｍＭ、ジメチルホルムアミドに溶解したヒドロキシシンナムアルデヒド１０ｍＭ、および無細胞抽出液を添加して３０℃で１５分間反応を行い、下記溶離液を添加して反応を停止し、遠心後、上清を下記分析条件で分析し、１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの生成量を定量した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌの１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを生成する酵素活性（ＮＣＳ活性）を１Ｕと定義した。
【００８５】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：日本分光工業株式会社製Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８Ｔ−５（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：アセトニトリル ５５５ｍｌ、蒸留水  ９４５ｍｌ、リン酸二水素カリウム  ４．７５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム  ２．１６ｇ（リン酸にてｐＨ３．５に調整）                      
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：４０℃
検出時間：ドーパミン４．８分、１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン  １１．５分
それぞれの組換え生物のＮＣＳ活性を以下に示す。  Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）については、ＮＣＳ活性は０．０１Ｕ／ｍｇ以下であった。一方、ＮＣＳを発現させた組換え生物のＮＣＳ活性はそれぞれ、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＣＳ）：０．０３Ｕ／ｍｇ、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）：０．１Ｕ／ｍｇ、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１９ＮＣＳ）：０．３Ｕ／ｍｇ、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）：１．２Ｕ／ｍｇ、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ４２ＮＣＳ）：０．１Ｕ／ｍｇであった。Ｎ末端アミノ酸を１９または２９残基削除したＮＣＳでは高いＮＣＳ活性を示した。
【００８６】
（実施例６）  Ｎ末端アミノ酸を削除したＮＣＳの可溶化の確認
実施例４で作製したＮＣＳを生産する組換え大腸菌５種類について、実施例５と同様の方法で無細胞抽出液を調製した。これを可溶性画分とした。また、遠心分離後の菌体残渣を１ｍｌの１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、これを不溶性画分とした。各組換え生物の可溶性、不溶性画分についてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、クマシーブリリアントブルー染色によって可溶性画分のＮＣＳを確認した。結果を図１に示す。
【００８７】
シグナル配列を含むＮＣＳ全長を生産するＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＮＣＳ）では高生産されているタンパク質が確認できなかった。一方、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）ではΔ１０ＮＣＳが高生産されいていることが確認できた。しかし、大部分のΔ１０ＮＣＳは不溶性画分に確認された。Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１９ＮＣＳ）及びＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）ではＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）に比べ可溶性画分のＮ末端削除ＮＣＳが増加していた。Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ４２ＮＣＳ）では高生産されているタンパク質が確認できなかった。
【００８８】
Ｎ末端アミノ酸を１９もしくは２９個削除したＮＣＳでは遺伝子組換え生産時の不溶化が低減できた。
【００８９】
（実施例７）光学活性１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの製造   
Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）について実施例５と同様の方法で無細胞抽出液１ｍｌを調製した。この無細胞抽出液にドーパミン塩酸塩１０ｍＭ、ヒドロシンナムアルデヒド１０ｍＭを添加し、３０℃で３０分反応した。また、対照実験として、無細胞抽出液の代わりに１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７）でも同様に反応を実施した。反応液から酢酸エチルにて生成した１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを抽出し、参考例１及び実施例５に示した分析条件で分析した。その結果、１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンへの変換率は１１％、であり、参考例１の分析条件において検出時間１１．５分の光学活性体が生成しており、その光学純度は９６．１％ｅ．ｅ．であった。一方、対照実験では１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンへの変換率は１％であり、ラセミ体が生成していた。
【００９０】
Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）が高い立体選択性で光学活性１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを生成することが分かった。
【００９１】
（実施例８）光学活性−１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの製造
Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）について実施例５と同様の方法で無細胞抽出液２０ｍｌを調製した。この無細胞抽出液にドーパミン塩酸塩０．２５ｇを添加し、攪拌しながら、ヒドロシンナムアルデヒド０．２１ｇを逐次添加した。１６時間後の反応液を実施例５及び実施例７記載の分析条件で分析したところ、変換率は５８％、光学純度は７６．３％ｅ．ｅ．（検出時間１１．５分の光学活性体）であった。
【００９２】
（実施例９）光学活性−１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの製造
Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）について実施例５と同様の方法で無細胞抽出液２０ｍｌを調製した。この無細胞抽出液にドーパミン塩酸塩０．２５ｇを添加し、攪拌しながら、ヒドロシンナムアルデヒド０．２１ｇを逐次添加した。１６時間後の反応液を実施例５及び実施例７記載の分析条件で分析したところ、変換率は８６％、（Ｓ）−１−（２−フェニルエチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの光学純度は９５．３％ｅ．ｅ．（検出時間１１．５分の光学活性体）であった。
【００９３】
（実施例１０）３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピルアルデヒドの製造
３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピオン酸８．３３ｇ（３７．４ｍｍｏｌ）にＴＨＦ  ４０ｍｌを加え、−１０℃に冷却し、１．０３Ｍ  ＢＨ３−ＴＨＦ  ４２．３ｍｌ（４３．６ｍｍｏｌ）を添加した（内温推移−７〜０℃）。室温まで昇温し、１３時間撹拌した。反応液に水４０ｍｌと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２０ｍｌ、酢酸エチル４０ｍｌ、飽和食塩水２０ｍｌを添加し、分液した。有機層に水４０ｍｌと飽和食塩水２０ｍｌを加え、撹拌後、分液した。有機層を減圧濃縮することで３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロパノール８．２７ｇを得た。ここで得た３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロパノール、炭酸水素ナトリウム  ９．３８ｇ（０．１１２ｍｏｌ）、ＮａＢｒ  ３．８３ｇ（３７．２ｍｍｏｌ）、水８０ｍｌ、酢酸エチル８０ｍｌ、Ｔｅｍｐｏ  ０．２９１ｇ（１．８６ｍｍｏｌ）を氷冷し、１３．０２％次亜塩素酸ナトリウム  ２１．２８ｇ（３７．２ｍｍｏｌ）を３５分間で添加した。添加終了後、１．５時間撹拌し、水１２０ｍｌを添加し、分液した。有機層を水４０ｍｌで２回洗浄し、減圧濃縮することで３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピルアルデヒド８．０８ｇを得た。ガスクロマトグラフィーで分析したところ純度８９．７ｗｔ％、収率９５．８ｍｏｌ％であった。
【００９４】
３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロパノール  
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．８７−１．９４（ｍ、２Ｈ）、２．７８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、３．６７−３．７７（ｍ、２Ｈ）、７．３１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．５３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）
３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピルアルデヒド
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝２．８１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、３．０１（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．３０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．５３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、９．８１（ｓ、１Ｈ）
＜ガスクロマトグラフィー分析系＞
カラム：Ｒｅｓｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製Ｒｔｘ−３５Ａ（３０ｍｘ０．２５ｍｍ）
検出器：ＦＩＤ
カラム温度：５０℃→（１７分）→２２０℃→（１３分）→２２０℃
キャリアー：Ｈｅ  １５０Ｋｐａ
【００９５】
（参考例２）１−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの製造
１．９４ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にドーパミン塩酸塩１９４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、メタノール０．５ｍｌを添加し４０℃で攪拌した。３−（４−トリフルオロメチルフェニル）プロピルアルデヒド２０７ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）を分割添加し、４時間反応した。反応液にＮａＣｌ添加後、生成した１−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンをｎ−ブタノールで抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを添加後、ろ過により除去した。ろ液から溶媒を留去した後、濃縮物をトルエンで洗浄した後、有機層を除去した。これを真空乾燥し、５１ｍｇの１−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（淡黄色の固体）を得た。さらに結晶化により精製した後、下記分析条件で分析し、ラセミ体のそれぞれのピークを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ２．０７−２．１９（ｍ、２Ｈ）、２．７４−２．８４（ｍ、４Ｈ）、３．０９−３．１２（ｍ、１Ｈ）、３．３２−３．３８（ｍ、１Ｈ）、４．１２−４．１３（ｍ、１Ｈ）、６．５１（ｓ、１Ｈ）、６．５７（ｓ，１Ｈ）、７．４０−７．４１（ｄ，２Ｈ）、７．５４−７．５９（ｄ、２Ｈ）
【００９６】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞  光学純度分析
カラム：ダイセル化学工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝８０／２０／０．１
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：３０℃
検出時間：１−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン  ９．２分、１１．５分
【００９７】
（実施例１１）光学活性１−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの製造
Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ１０ＮＣＳ）について実施例５と同様の方法で無細胞抽出液１２０ｍｌを調製した。この無細胞抽出液にドーパミン塩酸塩１．５１ｇを添加し、攪拌しながら、４−トリフルオロメチルヒドロシンナムアルデヒド２ｇを逐次添加した。２８時間後の反応液を下記分析条件で分析したところ、変換率は４５％であった。また、参考例２に記載の分析条件で光学純度を求めたところ、検出時間９．２分の光学活性１−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの光学純度が８２．０％ｅ．ｅ．であった。
【００９８】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞  変換率分析
カラム：日本分光工業株式会社製Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８Ｔ−５（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：アセトニトリル ６００ｍｌ、蒸留水  ９００ｍｌ、リン酸二水素カリウム  ４．７５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム  ２．１６ｇ（リン酸にてｐＨ３．５に調整）                      
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：４０℃
検出時間：ドーパミン４．８分、１−（２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチル）−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン  ２８．１分
【００９９】
（実施例１２）ＮＣＳの基質特異性の評価
組換え生物Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）及びＥ． ｃｏｌｉＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）を実施例５と同様の方法で培養した。各培養液から遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これらの無細胞抽出液１ｍｌにドーパミン塩酸塩１０ｍＭ、表１に示すアルデヒド化合物１０ｍＭ（ジメチルホルムアミドに溶解して添加）を添加し、３０℃で１５分反応した（対照実験としてＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）の無細胞抽出液についても同様に反応した）。反応終了後、下記溶離液を添加して反応を終了し、遠心後、上清を下記分析条件で分析し、ドーパミンの減少量を定量した。
【０１００】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：日本分光工業株式会社製Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８Ｔ−５（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：アセトニトリル ６００ｍｌ、蒸留水  ９００ｍｌ、リン酸二水素カリウム  ４．７５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム  ２．１６ｇ（リン酸にてｐＨ３．５に調整）                      
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：４０℃
検出時間：ドーパミン４．８分
Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）を用いた反応でのドーパミン減少量からＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）の反応液でのドーパミン減少量を差し引いた値をＮＣＳの触媒作用によって減少したドーパミン量と見なした。本条件において、１分間に１μｍｏｌのドーパミンが消費される酵素活性を１Ｕと定義した。また、フェニルアセトアルデヒドをアルデヒド化合物の標準基質とし、フェニルアセトアルデヒドに対する酵素活性を１００％としたときの相対活性で各アルデヒド化合物に対する酵素活性を示した。結果を表１に示す。
ＮＣＳはフェニルアセトアルデヒドや、ヒドロシンナムアルデヒド以外にもアルキルアルデヒドに対して活性を示した。
【０１０１】
【表１】
2013074811.tif 000010
【０１０２】
（参考例３）１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの製造
１．９４ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にドーパミン塩酸塩１９４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルアルデヒド１１１ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）を添加し、４０℃で２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィーによりドーパミンの消失を確認した後、生成した１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを４ｍｌのｎ−ブタノールで２回抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを添加後、ろ過により除去した。ろ液から溶媒を留去し、２４１ｍｇの１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを得た（黄色の固体）。下記分析条件で分析し、ラセミ体であることを確認した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：δ１．０２（ｔ、Ｊ＝７．４５Ｈｚ、３Ｈ）、１．４２−１．６５（ｍ、２Ｈ）、１．７６−２．０９（ｍ、２Ｈ）、２．７９−３．０４（ｍ、２Ｈ）、３．２１（ｍ、１Ｈ）、３．４８（ｄｔ，Ｊ＝１２．４６，６．０９Ｈｚ、１Ｈ）、４．２５−４．４２（ｍ，１Ｈ）、６．５９（ｓ，１Ｈ）、６．７１（ｓ、１Ｈ）
【０１０３】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
ダイセル化学工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝８０／２０／０．１
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：３０℃
検出時間：１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン  ３３．９分、３９．１分
【０１０４】
（実施例１３）光学活性１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンの製造
組換え生物Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮΔ２９ＮＣＳ）を実施例５と同様の方法で培養した。培養液から遠心分離により菌体を集め、１ｍｌの１００ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液１ｍｌに１９．４ｍｇのドーパミン塩酸塩を加え、攪拌しながらｎ−ブチルアルデヒド２１ｍｇを分割添加した（反応時間１．５時間）。反応液を下記分析条件で分析したところ、変換率は９９．６％であった。
【０１０５】
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
カラム：日本分光工業株式会社製Ｆｉｎｅｐａｋ ＳＩＬ Ｃ１８Ｔ−５（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：アセトニトリル ６００ｍｌ、蒸留水  ９００ｍｌ、リン酸二水素カリウム  ４．７５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム  ２．１６ｇ（リン酸にてｐＨ３．５に調整）                      
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２３０ｎｍ
カラム温度：４０℃
検出時間：ドーパミン４．８分、１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン  ７．１分
反応終了後、ｎ−ブタノールで生成物を抽出し、溶媒を留去して２０ｍｇの１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを得た。参考例３に示した分析方法で分析したところ、検出時間３３．９分の光学活性体の光学純度が９８．０％ｅ．ｅ．であった。
【０１０６】
ＮＣＳを用いて光学活性１−プロピル−６，７−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンを合成できた。
【図１】
2013074811.tif 000015
【配列表】
2013074811000001.app