(57)【要約】【課題】本発明は、生体膜の柔軟化剤、ラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤、冷感効果向上剤を提供することを目的とする。【解決手段】テトラアルキルアンモニウム塩が生体膜を柔軟化できることを見出したことによる。テトラアルキルアンモニウム塩は、ラフト領域を柔軟化でき、ラフト領域に存在する受容体の活性化を調節することが可能であり、またそれにより冷感効果を向上することができる。【選択図】図１
2013227248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１】
2013227248.tif 000007
｛式中、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｃ12-18アルキルであり、
Ｒ3及びＲ4が、それぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｃ1-3アルキルであり、
Ｘ-が、対イオンである｝
で表されるテトラアルキルアンモニウム塩を含む生体膜柔軟化剤。
【請求項２】
Ｒ1及びＲ2が同一のアルキルである、請求項１に記載の生体膜柔軟化剤。
【請求項３】
Ｒ3及びＲ4が共にメチルである、請求項１又は２に記載の生体膜柔軟化剤。
【請求項４】
Ｘ-が、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンからなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体膜柔軟化剤。
【請求項５】
前記生体膜が、ラフト領域又は細胞間脂質層である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体膜柔軟化剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体膜柔軟化剤を含む、ラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤であって、当該活性調節剤が、ラフト領域を柔軟化し、ラフト領域に存在するタンパク質の活性を調節する、前記活性調節剤。
【請求項７】
前記ラフト領域に存在するタンパク質が、ＴＲＰＭ１〜８、ＴＲＰＶ１〜４からなる群から選ばれる、請求項６に記載の活性調節剤。
【請求項８】
前記ラフト領域に存在するタンパク質が、冷感受容体（ＴＲＰＭ８）である、請求項７に記載の活性調節剤。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の生体膜柔軟化剤と、冷感物質とを含む、冷感効果向上剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラアルキルアンモニウム塩を用いた生体膜の柔軟化剤に関する。テトラアルキルアンモニウム塩は、生体膜を柔軟化することにより、経皮吸収の増加、及び生体膜に存在する受容体の活性化を調節することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
生体膜は、細胞や細胞小器官の有する、その外界との境界の膜であり、生体膜の役割としては、外界との境界として内部物質の流出の防止、受容体による情報の感受、輸送体による選択透過性、能動輸送および促進拡散などが挙げられる。生体膜は、主に脂質とタンパク質から構成されている。脂質分子は主に脂質二重層を形成し、脂質二重層中に膜タンパク質が存在して情報伝達や輸送など様々な機能を発揮する。脂質は、主にリン脂質及びコレステロールに大別され、リン脂質には、グリセロール骨格を有するグリセロリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、及びスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴミエリンが含まれる。
【０００３】
脂質二重層は、構成するリン脂質に応じて流動性を有しており、その流動性が膜輸送や膜タンパク質の活性を調節していることが報告されている。脂質二重層を構成する脂質分子は生体膜中に均一に分散されているわけではなく、様々な微小区画を形成している。例えば、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロールからなる合成脂質二重層では、スフィンゴミエリン分子の長い飽和炭化水素鎖間のファンデルワールス力が強く、コレステロールとともに、ラフト領域を形成する。ラフト領域は、長い飽和炭化水素鎖から構成されるスフィンゴミエリン分子のため、脂質二重層の厚みが増大しており、またその特異的な脂質組成のために、ラフト領域特異的な膜タンパク質がラフト領域に局在する。
【０００４】
ラフト領域に局在する膜タンパク質としては、ＰＬＰ、Ｃｂｐ、カベオリン、フロティリンなどのラフト領域貫通タンパク質、ＴＲＰＭ１〜８、ＴＲＰＶ１〜４、カリウムチャンネル、アセチルコリン受容体などのチャンネル、インスリン受容体、Ｔｒｋ、ｐ７５、ＴＲＰＭ８などの受容体、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、ｃ−ｓｒｃなどのプロテインキナーゼなど、様々なタンパク質が知られている（非特許文献１）。ラフトに局在する膜タンパク質を介してシグナル伝達が生じることも知られており、例えばＧＰＩアンカータンパク質であるＳｒｃファミリーチロシンキナーゼを介するシグナル伝達や、ＰＩＰ２を介したシグナル伝達などが知られている。また、ラフト領域に存在する冷感受容体（ＴＲＰＭ８）は、ラフト領域の膜の流動性が受容体の活性に重要であるという報告がされている（非特許文献２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−１１４６４９号公報
【特許文献２】米国特許第５，５９９，９９０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】タンパク質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４７、Ｎｏ．４（２００２）
【非特許文献２】Cruz Morenilla-Palao et al., J. Biol. Chem. 2009, 284, 9215-9224
【非特許文献３】細胞の分子生物学  第５版第６２４−６２５頁
【非特許文献４】R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989, pp.389-408
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ラフト領域を含む生体膜の柔軟性及び／又は流動性を変化させることができる薬剤が、生体膜上に存在するタンパク質の活性を調節できることに着目し、生体膜の柔軟性及び／又は流動性を変化させることができる薬剤の開発が本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが、生体膜の柔軟性及び／又は流動性を変化させることができる薬剤について鋭意研究を行った所、数多くある界面活性剤の中で、飽和アルキル界面活性剤が、生体膜の柔軟性及び／又は流動性を高めることができることを見出し、さらにその中でも特に飽和アルキルアンモニウム塩が生体膜の柔軟性及び／又は流動性を高めると共に、細胞実験においてラフト領域に存在する冷感受容体（ＴＲＰＭ８）の活性を高めることができることを見出し、本発明に至った。
【０００９】
より具体的に本発明は以下のものに関する：
[１]  以下の式：
【化１】
2013227248.tif 000003
｛式中、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｃ12-18アルキルであり、
Ｒ3及びＲ4が、それぞれ同一でも異なっていてもよく、Ｃ1-3アルキルであり、
Ｘ-が、対イオンである｝
で表されるテトラアルキルアンモニウム塩を含む生体膜柔軟化剤。
[２]  Ｒ1及びＲ2が同一のアルキルである、項目１に記載の生体膜柔軟化剤。
[３]  Ｒ3及びＲ4が共にメチルである、項目１又は２に記載の生体膜柔軟化剤。
[４]  Ｘ-が、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンからなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体膜柔軟化剤。
[５]  前記生体膜が、ラフト領域又は細胞間脂質層である、項目１〜４に記載の生体膜柔軟化剤。
[６]  項目１〜５に記載の生体膜柔軟化剤を含む、ラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤であって、当該活性調節剤が、ラフト領域を柔軟化し、ラフト領域に存在するタンパク質の活性を調節する、前記活性調節剤。
[７]  前記ラフト領域に存在するタンパク質が、ＴＲＰＭ１〜８、ＴＲＰＶ１〜４からなる群から選ばれる、項目６に記載の活性調節剤。
[８]  前記ラフト領域に存在するタンパク質が、冷感受容体（ＴＲＰＭ８）である、項目７に記載の活性調節剤。
[９]  項目８に記載の活性調節剤と、冷感物質を含む冷感効果向上剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るテトラアルキルアンモニウム塩は、生体膜流動化、生体膜柔軟化、ラフト領域に存在するタンパク質の活性の調節、及び冷感効果の向上からなる群から選択される少なくとも１つの効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｒ1及びＲ2の炭素数が１２である各種電荷の異なる界面活性剤によるリポソーム膜のラフト領域及びノンラフト領域中に配置された蛍光プローブからの蛍光の異方性の変化を示した図である。異方性の低下は、ラフト領域及びノンラフト領域の柔軟性及び／又は流動性の増加を表す。カチオン性でかつ親水性部位において単純な構造を有するＤＬＡＣ及びＤＬＡＢのみが柔軟性及び／又は流動性を増加することができた。
【図２】図２は、２つの長鎖アルキル鎖の炭素数を変化させたテトラアルキルアンモニウム塩によるリポソーム膜のラフト領域及びノンラフト領域中に配置された蛍光プローブからの蛍光の異方性の変化を示した図である。異方性の低下は、ラフト領域及びノンラフト領域の柔軟性及び／又は流動性の増加を表し、アルキル鎖の炭素数が減少するにつれ柔軟性及び／又は流動性が増加した。
【図３】図３は、２つの長鎖アルキル鎖の炭素数が１６である各種電荷を有する界面活性剤によるリポソーム膜のラフト領域及びノンラフト領域中に配置された蛍光プローブからの蛍光の異方性の変化を示した図である。異方性の低下は、ラフト領域及びノンラフト領域の柔軟性及び／又は流動性の増加を表す。カチオン性でかつ親水性部位において単純な構造を有するＤＰＡＢのみが柔軟性及び／又は流動性を増加することができた。
【図４】図４はＴＲＰＭ８発現細胞におけるメントール誘発膜電流量に対する各種界面活性剤（１μＭ）の増強効果の比較を示す。（第４図の縦軸は、膜電流量（％表記）、横軸は、薬物濃度及び種類を示している）。
【図５】図５はTRPM8発現細胞におけるメントール誘発細胞内Caイオン濃度変化に対する各種界面活性剤（濃度は１０また１００μＭ）の増強効果の比較を示し、ＤＬＡＣのみがメントール作用の持続効果を示す。（第５図の縦軸は、細胞内カルシウム濃度（％表記）、横軸は、薬物濃度及び種類を示している）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の生体膜柔軟化剤とは、生体膜を柔軟化することができる薬剤のことをいう。生体膜とは、生体における膜であればいずれであってもよく、例えば細胞膜、核膜、細胞小器官（例えばリソソーム、ゴルジ体など）を取り囲む膜を指し、さらには角質細胞間に存在する細胞間脂質層も生体膜に含まれる。本発明の特に好ましい態様では、柔軟化される生体膜は、細胞膜であり、さらに好ましい態様では細胞膜におけるラフト領域が柔軟化される。本発明の別の態様では、柔軟化される生体膜は、細胞間脂質層である。
【００１３】
ラフト領域とは、細胞膜の他の領域に比べてスフィンゴ脂質とコレステロールが多く含まれる領域であり、ラフト膜とも呼ばれる。スフィンゴ脂質は、他の膜脂質よりも、長くまっすぐな炭化水素鎖を有することから、ラフト領域は、細胞膜の他の領域よりも厚く、ラフト領域特有の脂質組成を有することからラフト領域にはラフト領域特異的なタンパク質が局在する。
【００１４】
細胞間脂質層とは、角質細胞間に存在する脂質層のことをいい、主にセラミド、遊離脂肪酸及びコレステロールを主成分とし、ラメラ構造を形成していることが知られている。細胞間脂質層は、細菌や有害物質などの異物の接触や浸透から生体を保護すると共に、体内からの水分蒸散を防ぐことによって皮膚を健全な状態に保持するバリア機能を有する。バリア機能が低下すると、皮膚表面からの経表皮水分蒸発量（trans epidermal water loss：ＴＥＷＬ）が増加し、相対的に角質水分量が低下する。細胞間脂質層がバリア機能を有することから、細胞間脂質層が柔軟化することにより、経皮投与による物質の吸収率を向上することが可能になる。
【００１５】
本発明において、生体膜柔軟化作用とは、生体膜の柔軟性及び／又は流動性を高める作用をいう。本発明において、柔軟性と流動性は互換的に用いることができる。脂質二重膜の流動性とは、構成する脂質分子が特定の位置に固定されずに移動することをいい、流動性を高めることにより、例えば脂質分子の側方拡散、回転、フリップフロップが増加する。脂質二重膜の流動性は、その構成成分と温度に依存しており、一般に、脂質二重膜を構成する脂質の炭化水素鎖が短いほど、また二重結合の数が多いほど相転移温度が低くなり、低温でも膜の流動性が保たれる。一方で、他の膜脂質よりも、長くまっすぐな炭化水素鎖を有するスフィンゴ脂質が集積して形成されるラフト領域は、他の領域に比べて膜の流動性が低く、柔軟性に欠けている。
【００１６】
細胞膜が柔軟化及び／又は流動化することにより、細胞膜に存在する膜タンパク質の移動や動きが促進され、他の膜タンパク質との会合及び／又は相互作用が促進される。これにより、膜タンパク質の活性が促進される。
【００１７】
細胞間脂質層が柔軟化される場合、バリア機能を有する細胞間脂質層の透過性が増大し、生体膜柔軟化剤と共に併用投与された物質の経皮吸収が増大する。生体膜柔軟化剤と共に配合されうる物質として、プレドニゾン、デキサメタゾン、β−グリチルリチン酸、β−グリチルリチン酸ジカリウム、30 グリチルリチン酸モノアンモニウム、β−グリチルレチン酸、グリチルレチン酸ステアリル等のステロイド系抗炎症剤、インドメタシン、フルフェナム酸、メフェナム酸等の非ステロイド系抗炎症剤、クロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン、プロメタジン等の抗ヒスタミン剤、スルファモノメトキシン、スルファメチゾール等のサルファ剤、ペニシリン、セファロスポリン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン等の抗生物質、ナフチオメート、クロトリマゾール等の抗真菌剤、５−ナフチオウラシル、シクロホスファミド、ブスルファン、アクチノマイシン等の抗悪性腫瘍剤、モルヒネ、コデイン、ナロルフィン、ペンタゾシン、アスピリン、アセトアニリド、アミノピリン等の鎮痛剤、プロスタグランジン類製剤、バルビタール、チオペンタール等の催眠剤および鎮静剤、クロルプロマジン、レセルピン、クロルジアゼボキシド等の抗精神病剤、クロルゾキサゾン、レボドパ等の抗パーキンソン病剤、ジキトキシン、ジゴキシン等の強心剤、塩酸プロカインアミド、塩酸プロプラノール等の抗不整脈剤、ジピリダモール、亞硝酸アミル等の抗狭心症剤、ジアゾキサイド、ミノキシジル、レセルピン、硝酸グアネチジン等の抗高血圧剤、パラアミノベンゾエートエステル等の紫外線抑制剤、ハイドロキノン、アルブチン、ビタミンＣ、ビタミンＣエステル、ビタミンＣリン酸マグネシウム、ビタミンＣグルコシド、トラネキサム酸、4-メトキシサリチル酸カリウム塩、パラハイドロキシシンナメート等のメラニン生成抑制剤、８−メトキシソラーレン等の乾せんＰＵＶＡ治療剤、レチノール、レチン酸等のビタミンＡ類、ビタミンＡエステル、ビタミンＥ等のビタミン類、インシュリン、エストラジオール、メチルテストステロン等のホルモン剤、診断薬、パッチテスト用アレルゲン、ヒノキチ10オール、防虫剤、殺虫剤、および保湿剤、角質柔軟剤、染毛剤等の化粧料に用いられる効果成分である。これらのうち非水溶性の薬効成分に本発明の経皮吸収促進剤は、特に有効であるがが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
生体膜柔軟化作用、ラフト領域に存在するタンパク質の活性化作用、及び冷感効果向上作用を有する化合物として、以下の式：
【化２】
2013227248.tif 000004
｛式中、
Ｒ1が、Ｃ10-20アルキルであり、
Ｒ2が、Ｃ10-20アルキルであり、
Ｒ3が、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり、
Ｒ4が、Ｈ又はＣ1-3アルキルであり、
Ｘ-が、任意の対イオンである｝
で表されるテトラアルキルアンモニウム塩が挙げられる。ここでＲ1とＲ2は、互いに異なるアルキルであってもよいし、同一のアルキルであってもよい。Ｒ1及びＲ2は、互いに独立に、化粧料として実用の観点からＣ12-18アルキルが好ましく、より好ましくはＣ12-16アルキルである。Ｒ3及びＲ4は、互いに異なる基であってもよいし、同一の基であってもよい。好ましくは、Ｒ3及びＲ4は、共にメチルである。
【００１９】
本発明に係るテトラアルキルアンモニウム塩は、以下のスキームに記載されるようにトリアルキルアミンと、ハロゲン化アルキルとの反応により製造することができる。
【化３】
2013227248.tif 000005
テトラアルキルアンモニウム塩の合成方法は周知であり、例えば特許文献２及び非特許文献４に記載されている。
【００２０】
本発明のテトラアルキルアンモニウムは、アニオンとの塩であり、係るアニオンは、テトラアルキルアンモニウム塩が、生体膜柔軟化作用を有するものであれば、任意のアニオンであってもよく、例えば塩化物イオン、ヨウ化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、酢酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、硫酸イオン、亜硫酸イオン、炭酸イオン、炭酸水素イオン、リン酸二水素イオンなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本発明のテトラアルキルアンモニウム塩は、製造過程で生じた塩であってもよいし、製造過程で生じた塩を強塩基で処理して遊離させた後に所望の酸を添加して形成された塩であってもよい。より好ましくは、本発明における対イオンは、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、フッ化物イオンである。
【００２１】
テトラアルキルアンモニウム塩の濃度は、求める効果に基づき、製品に応じて適宜定めることができ、例えば０.００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．００５％〜０．１％、より好ましくは０．０１％〜０．１％の濃度で用いられる。
【００２２】
本発明のテトラアルキルアンモニウム塩の例として、例えば、ジラウリルジメチルアンモニウムクロライド、ジラウリルジメチルアンモニウムブロミド、ジミリスチルジメチルアンモニウムクロライド、ジミリスチルジメチルアンモニウムブロミド、ジパルミチルジメチルアンモニウムクロライド、ジパルミチルジメチルアンモニウムブロミド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド、ジステアリルジメチルアンモニウムブロミドなどが挙げられる。
【００２３】
本発明において、ラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤とは、細胞膜のラフト領域の柔軟性又は流動性を向上することにより、ラフト領域に存在する膜タンパク質の活性を調節する薬剤のことをいう。活性の調節とは、ラフト領域の柔軟性及び／又は流動性が向上することにより、直接活性化する場合もあれば、直接活性化するわけではないが、膜タンパク質と他の物質、例えばリガンド、又はキナーゼなどの他のタンパク質との会合を促進するなどして、それらが結合した際の活性化を増強及び／又は持続する場合もある。
【００２４】
ラフト領域に存在するタンパク質には、様々な種類があるが、その一例として、ＰＬＰ、Ｃｂｐ、カベオリン、フロティリンなどのラフト領域貫通タンパク質、ＴＲＰＭ１〜８、ＴＲＰＶ１〜４、カリウムチャンネル、アセチルコリン受容体などのチャンネル、インスリン受容体、Ｔｒｋ、ｐ７５、ＴＲＰＭ８などの受容体、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、ｃ−ｓｒｃなどのプロテインキナーゼが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ラフト領域は、全ての細胞の細胞膜に存在しており、本発明に係る生体膜柔軟化剤又はラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤により柔軟化される細胞種は特に限定されるものではないが、本発明に係る生体膜柔軟化剤又はラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤を経皮適用する観点から、特に感覚神経細胞、表皮若しくは真皮の細胞、血管内皮細胞における細胞膜のラフト領域が柔軟化され、当該ラフト領域に存在するタンパク質が、本発明のラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤により活性が調節されるタンパク質の標的となる。
【００２５】
ラフト領域に存在するタンパク質の一つである冷感受容体（ＴＲＰＭ８）は、低温により活性化される受容体であり、活性化されることにより、冷感を生じさせる。より具体的に、ＴＲＰＭ８は、感覚神経の細胞膜のラフト領域に局在するイオンチャネルであり、活性化されるとナトリウムイオン及びカルシウムイオンを細胞内に流入させる。これにより、感覚神経細胞が励起されて、冷感として知覚される。ＴＲＰＭ８は、冷刺激により活性化される他、メントールなどの冷感物質によっても活性化される。ラフト領域の膜の流動性がＴＲＰＭ８受容体の活性に寄与していることが報告がされており（非特許文献２）、ラフト領域の膜の流動性を向上することができる物質、例えば、本発明に係る生体膜柔軟化剤又はラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤は、冷感物質の作用を向上することができると考えられる。
【００２６】
本発明に係る生体膜柔軟化剤又はラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤により、活性が調節されるタンパク質の例として、ＴＲＰＭ８の他にも、温度活性化受容体、例えばＴＲＰＶ１〜４や、ＴＲＰＭ１〜８や、シグナル伝達に係るタンパク質が挙げられる。
【００２７】
冷感物質とは、ヒトに対して使用した際に清涼感又は冷感を与える物質のことをいい、冷感物質として、現在までに様々な物質が特定されており、例えばメントール、メントン、カンファー、ボルネオール、シネオールメントン、サリチル酸メチル、マロン酸メンチル、グリコシル−モノメンチル-Ｏ-アセテート、3-ｌ-メントキシプロパン-１，2-ジオール、ｌ−メンチル−３−ヒドロキシブチレート、イソプレコール、グリコシルモノメンチル−オルトアセテート、スペアミント抽出物、ペパーミント抽出物、ハッカ抽出物及びユーカリプ タス油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
冷感物質は、感覚神経上に存在する冷感受容体（例えばＴＲＰＭ８）を活性化することにより、適用部位において清涼感や冷感を感じさせることができるため、ヘアーケアー製品、トイレタリー製品、入浴剤、医薬品、化粧品などに広く使用されている。清涼感や冷感効果の付与が好ましい製品の例として、シャンプー、リンス、ヘアコンディショナー、育毛剤などのヘアケア製品、ボディシャンプー、発布剤、入浴剤、虫除け剤、日焼け止め剤、スキンローションなどが挙げられる。
【００２９】
本発明のさらなる態様では、本発明は、テトラアルキルアンモニウム塩を含む生体膜柔軟化剤と、冷感物質とを含む冷感効果向上剤にも関する。
【００３０】
冷感効果向上作用とは、冷感物質の作用を向上させる作用であり、冷感作用を向上する他、冷感作用の持続性を向上することも含まれる。したがって、冷感効果向上剤は、冷感効果持続向上剤でもある。本発明の１の態様では、本発明は冷感物質と、膜柔軟化剤とを含む冷感効果向上剤に関しており、当該冷感効果向上剤を適用することにより、冷感を強くかつ長く感じさせることができる。これにより、冷感物質の配合量を低下することができる。
【００３１】
本発明において、生体膜柔軟化剤、ラフト領域に存在するタンパク質の活性調節剤、及び冷感効果向上剤は、それぞれ皮膚に適用される製品の他、口腔内適用される製品、点眼製品、点鼻製品にも配合されうる。皮膚に適用される製品の例として、ローション、クリーム、日焼け止めなどの化粧品、洗顔料、ボディソープ、シャンプー、リンス、コンディショナーなどの洗浄剤、育毛製品、ウエットティッシュ、外用消炎鎮痛剤、下熱剤などのハップ製品が挙げられ、口腔内適用される製品の例として、歯磨き粉、マウスウォッシュ、口臭予防剤、ミントタブレット、ガム、などが挙げられる。
【００３２】
本実施例では、ラフト領域のモデルとして、フォスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロールを、モル比率７：６：６で混合して得たリポソームを用いる。かかる比率で混合されたリポソームは、均一ではなく、パッチワーク状に相分離が生じる。スフィンゴ脂質とコレステロールを多く含む相が、ラフト領域をモデル化していると考えられている（非特許文献３）。ラフト領域の柔軟性及び／又は流動性を計測するため、リポソームの脂質二重層に埋め込まれた蛍光プローブ（例えば、ジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨ）に対して、偏光を照射し、蛍光の異方性を測定する。膜の柔軟性及び／又は流動性が低い場合、蛍光プローブは膜内での動きが制限されるため、異方性（ｒ値）が高い一方で、膜の柔軟性及び／又は流動性が高くなると、蛍光プローブの動きが大きくなり、異方性（ｒ値）は低くなる。
【実施例】
【００３３】
実施例１：ラフト領域を含むリポソームにおける蛍光異方性測定
ラフト領域を含むリポソームの製造
卵黄由来のフォスファチジルコリン（ｅｇｇ  ＰＣ）、卵黄由来のスフィンゴミエリン（ｅｇｇ  ＳＭ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）を、モル比率ｅｇｇ  ＰＣ：ｅｇｇ  ＳＭ：Ｃｈｏｌ＝７：６：６で混合し、脂質薄膜を作成した。そこに３００ｍＭグルコース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、凍結融解を７回行った後、孔サイズ１００ｎｍに対して４０回ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ法を行うことにより、ラフト領域を含む直径１２０〜１５０ｎｍのリポソームを調製した。得られたリポソーム水溶液に対して１．６−ジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨ）のＤＭＳＯ溶液をＤＰＨが全脂質の１ｍｏｌ％になるようにリポソーム水溶液に添加し、５０℃で９０分攪拌することでリポソームの膜中にＤＰＨを取り込ませた。得られたリポソーム溶液を蛍光用石英セルに入れ、３２℃に保温した。各種膜柔軟化候補薬剤をメタノールで１０ｍｇ／ｍｌになるように調整し、各種膜柔軟化候補薬剤が０質量％〜２．０×１０-2質量％の濃度範囲で添加した。添加後１分後に、３６０ｎｍの波長の励起光を照射し、偏光板を挟むことによって４２８ｎｍの波長のＶ−Ｖ、Ｖ−Ｈ、Ｈ−Ｖ、Ｈ−Ｈの蛍光を毎回それぞれ３回ずつ測定する。Ｈは、散乱平面（励起光の方向と検知する蛍光の方向を含む平面）と水平な偏光方向を表し、Ｖは、鉛直な偏光方向を表す。測定値を以下の式：
【数１】
2013227248.tif 000006
に当てはめることにより、異方性（ｒ）を測定した。式中、ＩHVとは、水平偏光の光で励起するときの鉛直偏光の蛍光強度であり、ＩVVとは鉛直偏光の光で励起するときの鉛直偏光の蛍光強度であり、ＩVHとは鉛直偏光の光で励起するときの水平偏光の蛍光強度であり、ＩHHとは、水平偏光の光で励起するときの水平偏光の蛍光強度であり、そしてＧとは鉛直偏光と水平偏光の光に対する測定系の装置に基づく因子である。
【００３４】
膜柔軟化候補薬剤として、炭素数１２の疎水鎖を２本有するカチオン性界面活性剤であるジラウリルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＬＡＣ）（和光純薬）、ジラウリルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＬＡＢ）（東京化成工業）、ジラウロイルエチルフォスファチジルコリン（ｅｔｈｙｌ−ＤＬＰＣ）（Avanti Polar Lipids）、炭素数１２の疎水鎖を２本有するアニオン性界面活性剤であるジラウロイルフォスファチジン酸（ＤＬＰＡ）（Avanti Polar Lipids）、炭素数１２の疎水鎖を２本有する両性界面活性剤であるジラウロイルフォスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）（Avanti Polar Lipids）、並びにジラウロイルグリセロール（ＤＬＧ）（Avanti Pdar Lipids）を用いた際の結果を図１に示す。
【００３５】
ＤＬＡＣ及びＤＬＡＢの添加により異方性は速やかに低下した。このことはＤＬＡＣ及びＤＬＡＢの添加により、リポソームの膜の流動性が上昇した（膜が柔らかくなった）ことを示唆している。それ以外の両性、アニオン性である、ジラウロイルフォスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジラウロイルフォスファチジン酸（ＤＬＰＡ）と比較したところ、異方性の低下量の大きい順にＤＬＡＣ＞ＤＬＰＣ＞ＤＬＰＡであった。一方、カチオン性でかつ同じ疎水鎖長でありながらＤＬＡＣとは親水部の骨格が全く異なるジラウロイルエチルフォスファチジルコリン（ｅｔｈｙｌ−ＤＬＰＣ）では、異方性の低下がほとんど見られなかった（図１）。
【００３６】
蛍光異方性低下能の高かったテトラアルキルアンモニウム系カチオン性界面活性剤について、２つのアルキル鎖長を１２、１４、１６、１８に変えたジラウリルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＬＡＣ）（和光純薬）、ジミリスチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＭＡＢ）（東京化成工業）、ジパルミチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＰＡＢ）（東京化成工業）、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＳＡＣ）（東京化成工業）の４種類を候補薬剤として同様の測定を行った。その結果、異方性の低下量の大きい順にＤＬＡＣ≧ＤＭＡＢ＞ＤＰＡＢ＞ＤＳＡＣとなった（図２）。このことはアルキル鎖長が短いカチオン性界面活性剤ほど、リポソームの膜を流動化させる作用が強いことを示唆している。
【００３７】
膜柔軟化候補薬剤として、炭素数１６の疎水鎖を２本有するカチオン性界面活性剤であるジパルミチルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＰＡＢ）（東京化成工業）、炭素数１６の疎水鎖を２本有する両性界面活性剤であるジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（日油株式会社）、炭素数１６の疎水鎖を２本有するアニオン性界面活性剤であるジパルミチルリン酸（ＤＰＰ）（Sigma Aldrich社）を用いた際の結果を図３に示す。
【００３８】
カチオン性界面活性剤であるジパルミチルジメチルアンモニウムブロミドＤＰＡＢの添加により異方性は低下した一方で、両性、アニオン性界面活性剤であるジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミチルリン酸（ＤＰＰ）では、異方性の低下がほとんど見られなかった（図３）。
【００３９】
図１からは異方性の低下には、界面活性剤の親水性部位における構造が寄与すると考えられる。すなわち、異方性を大幅に低下させたＤＬＡＣやＤＬＡＢは、カチオン性であり、そして親水性部位としてアンモニウムに直接結合する単純な骨格構造を有しているが、その一方で同じカチオン性であるが親水性部位としてグリセロール骨格構造を有するｅｔｈｙｌ−ＤＬＰＣでは異方性の低下はほとんど見られない。一方、図３ではアニオン性であるが親水性部位としてリン酸基に直接結合する単純な骨格構造を有するジパルミチルリン酸が異方性をほとんど低下させないことを示している。図１及び図３の結果をまとめると、異方性には親水性部位の骨格構造のみが寄与するわけではなく、界面活性剤の電荷と、親水性部位の骨格構造の両者が寄与することが示された。
【００４０】
実施例２：ジ長鎖アルキル鎖を有する界面活性剤のＴＲＰＭ８発現細胞における細胞内Ｃａ応答の増強効果の測定
細胞培養
ヒト腎細胞由来株ＨＥＫ２９３細胞にヒトＴＲＰＭ８ｃＤＮＡクローン（ORIGENE UNIQUE VARIANT 1  of Homo sapiens transient receptor potential cation channels, subfamily M, member 8 (TRPM8) as transfection-ready DNA, Vector: pCMV6-XL4  Origine Technologies）を、トランスフェクション試薬(Lipofectamine, Invtrogen)を用いてトランスフェクションし、ヒト腎細胞由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞にメントールを感知する受容体ＴＲＰＭ８を強制発現させ、48時間後に測定に用いた。
【００４１】
ホールセルボルテージクランプ法
ＴＲＰＭ８発現細胞を用いて、定法に従いホールセルボルテージクランプ法を行った（Hamill et al, 1981）。膜電位固定及び電流の記録は、Axopatch 200B (Axon)を用い、解析はpClamp (Axon) にて評価した。測定には、細胞外液として以下の組成の溶液：１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ2、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０．０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１１．１ｍＭ Ｄ−グルコース（ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）を調製し、細胞内液として以下の組成の溶液：１５０ｍＭ ＣｓＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び５ｍＭ グリコールエーテルジアミン四酢酸(ＣｓＯＨを用いてｐＨ７．２に調整)を調製して用いた。保持電位を−６０ｍＶに設定し、未刺激の場合には、細胞外液を還流適用し、各種候補薬剤で細胞を刺激する場合には、細胞外液に溶解した候補薬剤を細胞に対して還流適用した。候補薬剤として、ジラウリルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＬＡＣ）（和光純薬）、ジラウロイルフォスファチジン酸（ＤＬＰＡ）（Avanti Polar Lipids）、ジラウロイルグリセロール（ＤＬＧ）（Avanti Polar Lipids）、ジラウロイルフォスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）（Avanti Polar Lipids）、ジラウロイルエチルフォスファチジルコリン（ｅｔｈｙｌ−ＤＬＰＣ）（Avanti Polar Lipids）を用いた。メントール（１００μＭ）を１０秒間適用し（メントール単独反応）、５分のインターバル後、膜柔軟化候補薬剤を、再度メントールを適用する２分前に還流し、メントールは１０秒間適用した。２回目のメントールを適用する２分前に、候補薬剤（濃度１０μＭあるいは１００μＭ）の還流適用を行った。データは、１回目のメントール単独の反応を１００％とし、界面活性剤添加後のメントールの反応を％表記した。他の候補薬剤（ＤＬＰＡ及びＤＬＧ、ＤＬＰＣ、ｅｔｈｙｌ−ＤＬＰＣ；各１μＭ）に比べて、ＤＬＡＣ（１μＭ）を適用すると２回目のメントールの反応が増大することが示された（図４）。これは、ＤＬＡＣを添加することにより、メントール刺激の増強・持続性を向上させることができることを示唆している。
【００４２】
細胞内Caイオン濃度の測定法
ＢＳＳ溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを水に溶かし、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した水溶液）にカルシウム感受性蛍光色素である、Ｆｕｒａ２−ＡＭ（５μＭ、Sigma）をＴＲＰＭ８発現細胞に取り込ませて４５分間後、細胞をＢＳＳ溶液で洗浄後、１５分間放置した。その後、未刺激の場合には、新たなＢＳＳ溶液を細胞に対して還流適用し、被験物で細胞を刺激する場合には、ＢＳＳ溶液に溶解した被験物を細胞に対して還流適用した。細胞内Ｃａイオン濃度の変化は、Ｃａイメージングシステム（Aquacosmos, 浜松ホトニクス）にて測定（励起波長340nm, 380 nm, 測定波長510 nm）し、解析を行った。カルシウム感受性色素ｆｕｒａ−２ＡＭを上記の培養細胞に添加し、各種候補薬剤に対するＣａ2+応答性をＣａイメージング法により評価した。候補薬剤として、ジラウリルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＬＡＣ）（和光純薬）、ジラウロイルフォスファチジン酸（ＤＬＰＡ）（Avanti Polar Lipids）、ジラウロイルグリセロール（ＤＬＧ）、及びジラウロイルフォスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）（Avanti Polar Lipids）を用い、対照では候補薬剤を含めなかった。ＢＳＳ溶液に溶解したメントール（１００μＭ）を２０秒間還流適用し（メントール１回目の反応）、ＢＳＳの溶液に戻し、５分のインターバル後、再度メントールを２０秒間適用した（メントール２回目の反応）。候補薬剤（濃度１０μＭあるいは１００μＭ）は、２回目のメントールを適用する２分前に還流適用行った。候補薬剤未適用の１回目の反応を１００％としたときの２回目の反応を％表記した。対照では、二回目のメントール添加に対する応答性が脱感作により低下し、ＤＬＰＡ、ＤＬＧ、及びＤＬＰＣでは対照と同様に脱感作が生じているが、ＤＬＡＣ（１０μＭ又は１００μＭ）を適用すると２回目のメントールの反応が増大することが示された。これは、ＤＬＡＣを添加することにより、メントール刺激の増強・持続性を向上させることができることを示唆している。
【００４３】
結果
ラフト膜をある程度柔軟化できる界面活性剤であるＤＬＰＣ、ＤＬＰＡ、ｅｔｈｙｌ−ＤＬＰＣを用いた場合であっても、実施例２の細胞実験では、メントールの作用の増強効果及び持続性向上効果は見られず、リポソーム実験において大幅な柔軟化をもたらしたＤＬＡＣを用いた場合のみ、実施例２の細胞実験でメントールの作用の増強効果及び持続性向上効果が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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