(57)【要約】【課題】細胞培養液処方及びＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法を提供すること。【解決手段】本発明に係る末梢血液中のＣＤ１４０ｂ＋細胞の成長を誘導するために使用される細胞培養液処方は、培養液と、血清と、総合添加物と、特定因子と、を含む。そのうち、培養液、血清、総合添加物、及び特定因子の濃度は、それぞれ５９〜９８％（ｖ／ｖ）、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、１０−７〜１０％（ｖ／ｖ）である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血液中のＣＤ１４０ｂ＋細胞の成長を誘導するために使用される細胞培養液処方であって、
培養液と、血清と、総合添加物と、特定因子と、を含み、
前記培養液、前記血清、前記総合添加物、及び前記特定因子の濃度は、それぞれ５９〜９８％（ｖ／ｖ）、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、１０−７〜１０％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする、
細胞培養液処方。
【請求項２】
前記血清は、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、ウシ新生仔血清（Ｎｅｗｂｏｒｎ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，ＮＣＳ）、またはウシ血清（Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，ＣＳ）のいずれかを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の細胞培養液処方。
【請求項３】
前記特定因子は、成長因子、化学活性物質、または細胞活性物質のいずれかを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の細胞培養液処方。
【請求項４】
前記成長因子は、トランスフォーミング成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ，ＴＧＦ−β）、またはカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ）を含むことを特徴とする、
請求項３に記載の細胞培養液処方。
【請求項５】
前記培養液は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地、または基礎培養液のいずれかを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の細胞培養液処方。
【請求項６】
前記ＣＤ１４０ｂ＋細胞は、平滑筋前駆細胞（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，ＳＭＰＣｓ）、循環線維細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ）、または癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）のいずれかを含むことを特徴とする、
請求項１に記載の細胞培養液処方。
【請求項７】
前記総合添加物は、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、最小必須培地非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ，Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ）、または抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）のいずれかを含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養液処方。
【請求項８】
ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法であって、
遠心分離機を用いて血液中の単核球細胞を収集するステップと、
前記単核球細胞を細胞培養液処方と均一に混合した後、細胞混合液を生成するステップと、
前記細胞混合液を培養皿に置き、前記培養皿を細胞培養箱に放置して、所定時間にわたって培養することにより、前記ＣＤ１４０ｂ＋細胞を得るステップと、を含み、
前記細胞培養液処方は、培養液と、血清と、総合添加物と、特定因子と、を含み、また、前記培養液、前記血清、前記総合添加物、及び前記特定因子の濃度は、それぞれ５９〜９８％（ｖ／ｖ）、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、１０−７〜１０％（ｖ／ｖ）であることを特徴とする、
ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法。
【請求項９】
前記所定時間は１日間〜７日間であることを特徴とする、
請求項８に記載のＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法。
【請求項１０】
前記総合添加物は、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、最小必須培地非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ，Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ）、または抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）のいずれかを含むことを特徴とする、
請求項８に記載のＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法。
【請求項１１】
前記ＣＤ１４０ｂ＋細胞は、平滑筋前駆細胞（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，ＳＭＰＣｓ）、循環線維細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ）、または癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）のいずれかを含むことを特徴とする、
請求項８に記載のＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法。
【請求項１２】
前記ＣＤ１４０ｂ＋細胞の定量方法は、フローサイトメーター法、ＲＮＡ定量法、または酵素定量法のいずれかを含むことを特徴とする、
請求項８に記載のＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養液処方及びＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法に係り、特に新たな処方の細胞培養液により、高いＣＤ１４０ｂ発現量を有するＣＤ１４０ｂ＋細胞を効率的に培養することができる細胞培養液処方及びＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化は、動脈における慢性的な炎症病変であり、年齢の増加に伴って血管疾患として現れてくる。それは、青少年時期に発生し始め、中高年時期に症状が徐々に悪化し、発症に至るのが一般的であり、また、男性は女性より多く罹患する。近年、台湾においては、動脈硬化は増加の一途を辿っており、老人の死亡の主要な原因の一つとなっている。また、動脈硬化は、先進諸国においても、最も頻発する死因になっており、それを防ぐことは常に医学と生物学の研究の重点となっている。
【０００３】
一般的に言えば、動脈硬化は、動脈の慢性的な退化及び動脈壁が徐々に変化することによって引き起こされる。動脈硬化は、主として血管壁層中の結合組織（平滑筋細胞、平滑筋前駆細胞など）が異常に増殖、集合することにより、動脈の血管壁が肥厚し、硬化して血管内腔が狭窄し、最後に、動脈全体が弾力性を失ったりまたは閉塞したりすることにより起こる病変である。臨床上、血液循環中の平滑筋前駆細胞（ＣＤ１４０ｂ＋細胞）を定量化して測定することは、心血管疾患の測定、心血管疾患の治療評価、心血管疾患のリスク評価、及び心血管疾患の予後評価に応用される。従って、動脈硬化のリスクを評価する際に、血液循環中の平滑筋前駆細胞（ＣＤ１４０ｂ＋細胞）を定量化して測定することはとても重要である。そのほかに、血液循環中の平滑筋前駆細胞（ＣＤ１４０ｂ＋細胞）を定量化して測定することは、癌の評価及び予後、創傷癒合の評価及び予後などの参考にもなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、血液中のＣＤ１４０ｂ＋細胞の数量は少なく、かつ培養も困難であった。したがって、フローサイトメーターを用いて細胞の計数を行おうとしても、細胞表面のＣＤ１４０ｂ抗原の発現量が十分ではなく、細胞数を正確に数えることは非常に難しいものであった。さらに、従来の、血液中のＣＤ１４０ｂ＋細胞を培養する時に使う培養液は非常に高価であり、かつ培養されたＣＤ１４０ｂ＋細胞の数量が少なく、培養時間が長いことから、細胞の計数を行う場合、再現性よく、かつ科学的にも信頼性のある結果を得ることが困難であった。
【０００５】
そこで、上記の問題に基づき、本発明者らは、高いＣＤ１４０ｂ発現量を有するＣＤ１４０ｂ＋細胞を培養することができる新たな処方の細胞培養液を発明するに至った。
【０００６】
本発明は、既存技術の細胞培養液を用いた場合には、ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養が困難であり、かつ培養時間が長い、安定性が高くない、実験の再現性が低いという問題を解決するために、上述した従来技術の問題点に鑑みてなされたもので、その目的は、細胞培養液処方及びＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的に基づき、末梢血液中のＣＤ１４０ｂ＋細胞の分化及び成長を誘導するために使用される細胞培養液処方が提供され、従来よりも正確かつ簡便に定量が可能な細胞培養液処方は、培養液と、血清と、総合添加物と、特定因子と、を含む。そのうち、培養液、血清、総合添加物、及び特定因子の濃度は、それぞれ５９〜９８％（ｖ／ｖ）、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、１０−７〜１０％（ｖ／ｖ）であってもよい。
【０００８】
血清は、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、ウシ新生仔血清（Ｎｅｗｂｏｒｎ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，ＮＣＳ）、またはウシ血清（Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，ＣＳ）のいずれかを含むことがより好ましい。
【０００９】
特定因子は、成長因子、化学活性物質、または細胞活性物質のいずれかを含むことがより好ましい。
【００１０】
成長因子は、トランスフォーミング成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ，ＴＧＦ−β）、またはカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ）を含むことがより好ましい。
【００１１】
培養液は、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＲＰＭＩ）培地、または基礎培養液のいずれかを含むことがより好ましい。
【００１２】
ＣＤ１４０ｂ＋細胞は、平滑筋前駆細胞（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，ＳＭＰＣｓ）、循環線維細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ）、または癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）のいずれかを含むことがより好ましい。
【００１３】
総合添加物は、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、最小必須培地非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ，Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ）、または抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（ペニシリン）／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ストレプトマイシン
））のいずれかを含むことがより好ましい。
【００１４】
本発明の目的に基づき、ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法がさらに提供され、かかる方法は、遠心分離機を用いて血液中の単核球細胞を収集するステップと、単核球細胞を細胞培養液処方と均一に混合した後、細胞混合液を生成するステップと、細胞混合液を培養皿に置き、培養皿を細胞培養箱に放置して、所定時間にわたって培養することにより、ＣＤ１４０ｂ＋細胞を得るステップと、を含んでいる。そのうち、細胞培養液処方は、培養液と、血清と、総合添加物と、特定因子と、を含み、また、培養液、血清、総合添加物、及び特定因子の濃度は、それぞれ５９〜９８％（ｖ／ｖ）、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、１０−７〜１０％（ｖ／ｖ）であってもよい。
【００１５】
所定時間は１日間〜７日間であることがより好ましい。
【００１６】
総合添加物は、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、最小必須培地非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ，Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ）、または抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）のいずれかを含むことがより好ましい。
【００１７】
ＣＤ１４０ｂ＋細胞は、平滑筋前駆細胞（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，ＳＭＰＣｓ）、循環線維細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ）、または癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）のいずれかを含むことがより好ましい。
【００１８】
ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法は、フローサイトメーター法、ＲＮＡ定量法、または酵素定量法のいずれかを含むことがより好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
以上、述べたように、本発明の細胞培養液処方及びＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法によれば、新たな処方の細胞培養液により、ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養が行われ、ＣＤ１４０ｂ＋細胞を迅速に成長させ、ＣＤ１４０ｂ抗原を強く発現することが可能となるので、既存技術の培養液において、価格が高い、及びＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養と定量が困難であるという問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法のフローチャートである。
【図２】本発明の新たな細胞培養液処方で培養したＣＤ１４０ｂ＋細胞の、第０日〜第３日にわたる細胞変化についてのフローサイトメーター分析結果を示す図である。
【図３】本発明の細胞培養液処方で培養した細胞について、ＣＤ１４０ｂ及びＶＥ−カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の陽性細胞を標識し、フローサイトメーターによって分析した結果を示す図である。
【図４Ａ】本発明のＴＧＦ−βが添加された細胞培養液処方で培養した細胞をフローサイトメーターによって分析した細胞群の分化状態を示す図である。
【図４Ｂ】本発明のＴＧＦ−βが添加された細胞培養液処方で培養した細胞をフローサイトメーターによって分析した細胞群の分化状態を示す図である。
【図４Ｃ】本発明のＴＧＦ−βが添加された細胞培養液処方で培養した細胞をフローサイトメーターによって分析した細胞群の分化状態を示す図である。
【図５Ａ】本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞を用いて行った動物実験の分析状態を示す図である。
【図５Ｂ】本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞を用いて行った動物実験の分析状態を示す図である。
【図５Ｃ】本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞を用いて行った動物実験の分析状態を示す図である。
【図５Ｄ】本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞を用いて行った動物実験の分析状態を示す図である。
【図５Ｅ】本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞を用いて行った動物実験の分析状態を示す図である。
【図５Ｆ】本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞を用いて行った動物実験の分析状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明をより完全に理解するために、その技術特徴、内容と利点及びそれが達成できる作用効果について、添付図面と併せて実施例の表現形式を参照して本発明について以下のように詳細な説明を行う。
【００２２】
図１は、本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法のフローチャートを示す。ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法は、下記のステップを含む。まず、ステップＳ１１において、遠心分離機を用いて血液中の単核球細胞を収集する。続いて、ステップＳ１２において、単核球細胞を細胞培養液処方と均一に混合した後、細胞混合液を生成する。最後に、ステップＳ１３において、細胞混合液を培養皿に置き、それからその培養皿を細胞培養箱に放置して、所定時間にわたって培養することにより、ＣＤ１４０ｂ＋細胞が得られる。
【００２３】
なお、上記において、細胞培養液処方は、培養液と、血清と、総合添加物と、特定因子と、を含み、また、培養液、血清、総合添加物、及び特定因子の濃度は、それぞれ５９〜９８％（ｖ／ｖ）、０．１〜２０％（ｖ／ｖ）、１〜１０％（ｖ／ｖ）、１０−７〜１０％（ｖ／ｖ）であってもよい。そのうち、特定因子の濃度は、さらに好ましくは０．０１ｐｇ〜１００ｍｇ／ｍｌである。なお、培養液は、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＲＰＭＩ）培地、や基礎培養液などを含むことが好ましい。また、血清は、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、ウシ新生仔血清（Ｎｅｗｂｏｒｎ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，ＮＣＳ）、またはウシ血清（Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ，ＣＳ）のいずれかを含むことが好ましい。さらに、特定因子は、成長因子、化学活性物質、や細胞活性物質などを含むことが好ましく、かつその成長因子は、トランスフォーミング成長因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ，ＴＧＦ−β）、やカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ）などを含むことが好ましい。またさらに、総合添加物は、Ｌ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、最小必須培地非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ  ＮＥＡＡ，Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ）、や抗生物質（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）などを含むことが好ましい。そのうち、ＣＤ１４０ｂ＋細胞は、平滑筋前駆細胞（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，ＳＭＰＣｓ）、循環線維細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｃｙｔｅｓ）、または癌細胞（Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ）のいずれかとして定義される。また、以上に記載したものは、単に本発明の好適な実施例であるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
なお、上記において、細胞培養の所定時間は１日間〜７日間であることが好ましい。培養皿の直径寸法は１０ｃｍであることが好ましい。細胞培養箱の温度条件が３７℃であることが好ましい。また、以上に記載したものは、単に例示的なものであるが、この説明に限定されるものではない。
【００２５】
図２は、本発明の新たな細胞培養液処方で培養したＣＤ１４０ｂ＋細胞の、第０日〜第３日にわたる細胞変化についてのフローサイトメーター分析結果を示す。まず、採取した血液に対して遠心分離を行い、血液中の単核球細胞を収集する。続いて、この単核球細胞を本発明に係る細胞培養液処方に懸濁し、次いで二酸化炭素を５％含有する湿度飽和雰囲気中で３７℃に保持した細胞培養箱で培養を行った。その後、細胞分析試験を行い、第０日〜第３日にわたる細胞の変化状態について分析を行った。その分析結果から見れば、培養液中にＴＧＦ−βが添加されていない状態で細胞培養を行ったところ、３日間を経過しても、細胞群の種類は、リンパ球細胞群（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，Ｌ）と単核球細胞群（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ，Ｍ）の二種類しか現れないことが分かった。しかしながら、培養液中にＴＧＦ−βが添加された場合には、培養３日目の細胞において、リンパ球細胞群（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，Ｌ）、単核球細胞群（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ，Ｍ）、Ｘ１群及びＸ２群の四群の細胞群に分化した。
【００２６】
図３は、本発明の細胞培養液処方で培養した細胞についてＣＤ１４０ｂ及びＶＥ−カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の陽性細胞を標識し、フローサイトメーターによって分析した結果を示す。まず、細胞培養条件としては、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）未添加とトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）添加に分類する。続いて、細胞培養を行い、第１日及び第３日に、異なる培養条件下で培養された細胞をＣＤ１４０ｂ抗体で標識し、抗体と抗原との間での特異性免疫複合反応を利用して分析試験を行い、第０日〜第３日にわたる細胞の変化状態について分析を行った。その分析結果から見れば、培養液中にＴＧＦ−βが未添加の場合には、細胞培養を行ったところ、第０日〜第３日にわたって培養された細胞のいずれもＣＤ１４０ｂ表面抗原を標識できない、もしくは極めて低いＣＤ１４０ｂ発現量を有する細胞しか標識できない。故に、このような培養条件下では、ＣＤ１４０ｂ発現量を有しない、もしくは僅かな低いＣＤ１４０ｂ発現量を有する陽性細胞しか現れないことが分かった。しかしながら、培養液中にＴＧＦ−βが添加された場合には、培養された細胞は、第３日に、ＣＤ１４０ｂ表面抗原の発現を多く有する細胞として検出された。以上の結果から、ＴＧＦ−βが添加された細胞培養液処方の方では、ＣＤ１４０ｂ＋細胞におけるＣＤ１４０ｂの発現強度を著しく高めることができ、それによって、計数をより正確に行うことができることが分かった。また、ＣＤ１４０ｂの陽性細胞のいずれもＶＥ−カドヘリンに対して陰性反応を示した。そのうち、ＶＥ−カドヘリンは内皮細胞の標識であり、ＣＤ１４０ｂは平滑筋前駆細胞の標識である。
【００２７】
図４Ａ〜４Ｃは、本発明のＴＧＦ−βが添加された細胞培養液処方で培養した細胞をフローサイトメーターによって分析した細胞群の分化状態を示す。血液を遠心分離し、純化した細胞沈殿物をフローサイトメーター分析で解析した結果、リンパ球細胞群（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，Ｌ）と単核球細胞群（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ，Ｍ）の二群の細胞群しか得られなかった。トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）が添加された細胞培養液処方で培養する場合には、この分析結果から見れば、図４Ａに示すように、ＴＧＦ−β添加して培養後、３日目の細胞は、それぞれＲ１、Ｒ２及びＲ３の三群の細胞群に誘導分化し、ＣＤ１４０ｂの陽性細胞のいずれもがＲ２群中に該当することが分かった。さらに、図４Ｂに示すように、Ｒ２細胞群を詳しく分析すると、このＲ２細胞群は、Ｘ１及びＸ２の二群の細胞群に細かく分類することができ、ＣＤ１４０ｂ表面抗原を有するＣＤ１４０ｂの陽性細胞のいずれもがＸ１細胞群の領域中に該当した。その結果、図４Ｃに示すように、患者から採取された血液を分離して、本発明の細胞培養液処方で３日間培養した結果、当該患者の血液では、より多くのＣＤ１４０ｂの陽性細胞が定量され、長期に培養した後に、明らかにより大きな確率で成熟な平滑筋前駆細胞が培養された。以上の結果から、このような短期な細胞培養液処方及び定量方法を用いて末梢血液中に存在する平滑筋前駆細胞の数量を有効に予測できることが証明された。
【００２８】
図５Ａ〜５Ｆは、本発明のＣＤ１４０ｂ＋細胞を用いて行った動物実験の分析状態を示す。その結果から見れば、図５Ａに示すように、末梢血液中の平滑筋前駆細胞（ＳＭＰＣ，ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）は、ＰＤＧＦ−β受容体が発現する反面、内皮前駆細胞（ＥＰＣ，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）は、ＣＤ１４０ｂが発現しない。次に、動物実験の分析について説明する。図５Ｂに示すように、まず、マウスの大腿動脈に対してスプリング・ワイヤーを用いて、傷をつける。前記血管傷害の４日間後、培養された成熟な平滑筋前駆細胞（ＣＤ１４０ｂ＋細胞）を注入し、もしくは末梢血液から分離して純化した単核球細胞を注入して、４日間または２４日間を経て、傷つけたマウスの大腿動脈の血管を切り出し、取得し、免疫染色分析を行った。そして、図５Ｃに示すように、４日間後、成熟な平滑筋前駆細胞（ＣＤ１４０ｂ＋細胞）を既に注入した傷つけたマウスの大腿動脈の血管を切り出し、取得し、免疫染色分析を行い、その分析結果から見れば、傷つけたマウスの大腿動脈の血管上のヒトの平滑筋前駆細胞は、ＣＤ１４０及びα−ＳＭＡ（ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ）の陽性の平滑筋前駆細胞の特性を同時に発現できる。また、図５Ｄに示すように、注入した細胞が末梢血液から分離して純化した単核球細胞であれば、２４日間後、この細胞は傷つけたマウスの大腿動脈の血管壁上に粘着し、かつα−ＳＭＡの陽性細胞に分化し、ヒトの平滑筋前駆細胞は、末梢血液の単核球細胞群に存在し、かつ、平滑筋前駆細胞に分化することができることが証明された。早期の血管病理分析から見れば、図５Ｅに示すように、細胞注入４日間後、注入したヒトの平滑筋前駆細胞が既に傷つけた血管壁上に粘着し、かつこの単核球細胞はＣＤ１４０ｂの陽性細胞であった。さらに、図５Ｆに示すように、末梢血液の単核球細胞を注入し、細胞注入２４日間後、注入したＣＤ１４０ｂの陽性の単核球細胞のいずれもα−ＳＭＡの陽性の平滑筋前駆細胞に分化した。そのうち、図中に示す矢印は、血管中の内弾性線維組織を示し、ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｌは血管内腔を示し、Ａは血管の末梢組織を示す）は、細胞がヒトから由来することを表示する。従って、これらの実験から、本発明の細胞培養液処方で定量された細胞は、動物体内で、成熟な平滑筋前駆細胞に分化することができることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
上記のように、本発明に係る細胞培養液処方及びＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養方法と定量方法によれば、新たな処方で配合された細胞培養液により、ＣＤ１４０ｂ＋細胞の培養が行われ、ＣＤ１４０ｂ＋細胞の発現量を大幅に増加させることによって、この細胞培養液処方を用いて培養されたＣＤ１４０ｂ＋細胞は、細胞の計数上の安定性が優れ、かつ実験の再現性が向上するなど、多くの利点がある。
【符号の説明】
【００３０】
Ｓ１１〜Ｓ１３：ステップ
【図１】
2013236614.tif 000003
【図２】
2013236614.tif 000004
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2013236614.tif 000009
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月9日(2012.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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