(57)【要約】【課題】  出発細胞を変換して目的細胞にするための転写因子を短期間で効率よく実施できる転写因子探索方法を提供する。【解決手段】  本発明は、出発細胞を目的細胞に変換するための転写因子を探索する転写因子探索方法であって、目的細胞における重要度に応じて転写因子をランク付けする転写因子重要度ランク付け工程と、前記転写因子重要度ランク付け工程によって上位にランク付けられた複数の転写因子の中から、前記複数の転写因子によって構成される目的細胞に特異的な転写因子ネットワークの最上流に位置する転写因子を決定する最上流転写因子決定工程とを含むことを特徴とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発細胞を目的細胞に変換するための転写因子を探索する転写因子探索方法であって、
目的細胞において重要度に応じて転写因子をランク付けする転写因子重要度ランク付け工程と
前記転写因子重要度ランク付け工程によって上位にランク付けられた複数の転写因子の中から、前記複数の転写因子によって構成される目的細胞に特異的な転写因子ネットワークの最上流に位置する転写因子を決定する最上流転写因子決定工程と、
を含むことを特徴とする転写因子探索方法。
【請求項２】
前記最上流転写因子決定工程が、前記上位にランク付けられた複数の転写因子遺伝子を過剰発現させることで発現が誘導される転写因子遺伝子を特定する転写因子遺伝子過剰発現を含むことを特徴とする請求項１記載の転写因子探索方法。
【請求項３】
前記転写因子重要度ランク付け工程が、
目的細胞以外の細胞の転写因子遺伝子発現に対する目的細胞の転写因子遺伝子発現比情報によって転写因子をランク付けする発現比情報転写因子ランク付け、及び／又は
文献情報データベースから、目的細胞に特異的に発現している転写因子情報を取得し、前記転写因子情報を基に転写因子をランク付ける文献情報転写因子ランク付け、
を含むことを特徴とする請求項１または２記載の転写因子探索方法。
【請求項４】
前記各工程の少なくとも一つの工程がコンピューターの使用を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の転写因子探索方法。
【請求項５】
出発細胞を目的細胞に変換する細胞変換方法であって、
出発細胞に、目的細胞に特異的な転写因子ネットワークの最上流に位置する転写因子を導入する転写因子導入工程を含み、
前記転写因子導入工程において、請求項１から４のいずれか一項の転写因子探索方法で探索された最上流転写因子を導入することを特徴とする細胞変換方法。
【請求項６】
さらに、出発細胞に特異的な転写因子ネットワークの発現を抑制する出発細胞転写因子ネットワーク発現抑制工程を含むことを特徴とする請求項５記載の細胞変換方法。
【請求項７】
さらに、目的細胞に特異的な転写因子ネットワークにおいて発現する遺伝子を修飾する遺伝子修飾工程を含むことを特徴する請求項５または６記載の細胞変換方法。
【請求項８】
目的細胞の製造方法であって、
出発細胞を目的細胞に変換する細胞変換工程を含み、
前記細胞変換工程が、請求項５から７のいずれか一項に記載の細胞変換方法によって実施されることを特徴とする製造方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の転写因子探索方法に使用されるプログラム。
【請求項１０】
請求項９記載のプログラムが格納された記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞変換のための転写因子探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞のような採取容易な細胞を、免疫細胞または幹細胞等のような別の細胞に変換する細胞変換技術が開発され、一部で実用化されている。例えば、細胞変換技術としては、線維芽細胞に４つの転写因子を発現させて全能性を持つ幹細胞（ｉＰＳ  ｃｅｌｌ）に変換する技術が知られている（非特許文献１）。その他にも、線維芽細胞から筋芽細胞に変換する技術（非特許文献２）、Ｂ細胞からマクロファージに変換する技術（非特許文献３）、線維芽細胞からマクロファージ様細胞に変換する技術（非特許文献４）および膵臓外分泌細胞からＢ細胞に変換する技術が開発されている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  １２６（２００６）６６３−６７６．
【非特許文献２】ＰＮＡＳ  ８６（１９８９）５４３４−５４３８．
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ  １１７（２００４）６６３−６７６．
【非特許文献４】ＰＮＡＳ  １０５（２００８）６０５７−６０６２．
【非特許文献５】ＮＡＴＵＲＥ  ４５５（２００８）６２７−６３２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１に記載されるようなｉＰＳ細胞の登場で、再生医療の実用化が現実的になってきたが、ｉＰＳ細胞を用いた場合、癌化の問題がある。そこで、再生医療において、ｉＰＳ細胞を経ずに目的細胞変換する非特許文献２〜５に記載されるような技術が重要になる。しかしながら、これらの従来の細胞変換技術は、目的細胞に変換するための転写因子を見つけるために長期間にわたる多大な労力を必要とするという問題がある。
【０００５】
そこで、本発明は、目的細胞への変換を短期間で効率良く実施できる転写因子探索方法を提供することを、目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明は、出発細胞を目的細胞に変換するための転写因子を探索する転写因子探索方法であって、
目的細胞において重要度に応じて転写因子をランク付けする転写因子重要度ランク付け工程と
前記転写因子重要度ランク付け工程によって上位にランク付けられた複数の転写因子の中から、前記複数の転写因子によって構成される目的細胞に特異的な転写因子ネットワークの最上流に位置する転写因子を決定する最上流転写因子決定工程と、
を含むことを特徴とする。
ここで、「複数の転写因子」の数は、そこに含まれる最上流に位置する転写因子を出発細胞に導入した際に目的細胞への変換が達成されるために十分な数であり、例えば２〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは１０〜２０である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の転写因子探索方法によれば、出発細胞を目的細胞に変換するための転写因子を短期間で効率良く見つけ出すことができ、その結果、目的細胞を短期間で効率良く得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、細胞変換における転写制御ネットワークの基本概念を説明する図である。
【図２】図２は、細胞変換における転写制御ネットワークの基本概念を説明する図である。
【図３】図３は、本発明の実施例において、転写因子重要度ランク付け工程で得られた各転写因子（表３）の中から、単球に特異的なネットワークの上流に位置する転写因子（ネットワークインデユーサー）を決定した結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明の実施例の変換細胞における、単球マーカーの発現をqRT-PCRで解析した結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例の変換細胞の貪食能を解析した結果を示す写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例の変換細胞における、炎症反応に関わる遺伝子の発現変動を調べた結果を示すグラフである。
【図７】図７は、単球およびヒト線維芽細胞における、全体の遺伝子発現の類似性を確認するためにマイクロアレイ解析を行った結果を示すグラフである。
【図８】図８は、単球と線維芽細胞とにおけるモチーフ活性の変化を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の転写因子探索方法において、前記最上流転写因子決定工程が、前記上位にランク付けられた複数の転写因子遺伝子を過剰発現させることで発現が誘導される転写因子遺伝子を特定する転写因子遺伝子過剰発現を含むことが好ましい。
【００１０】
本発明の転写因子探索方法において、前記転写因子重要度ランク付け工程が、目的細胞以外の細胞の転写因子遺伝子発現に対する目的細胞の転写因子遺伝子発現比情報によって転写因子をランク付けする発現比情報転写因子ランク付け、及び／又は文献情報データベースから、目的細胞に特異的に発現している転写因子情報を取得し、前記転写因子情報を基に転写因子をランク付ける文献情報転写因子ランク付け、を含むことが好ましい。発現比情報転写因子ランク付けの結果と文献情報転写因子ランク付けの結果を統合して転写因子重要度ランク付け工程を実施する方法は、特に制限されない。例えば、発現比情報転写因子ランク付けの結果としてスコアを算出し、文献情報転写因子ランク付けの結果としてスコアを算出し、前記の各スコアの結果から、転写因子重要度ランク付けのスコアを算出してもよい。
【００１１】
前記発現比情報転写因子ランク付け工程において、前記転写因子遺伝子発現比情報が、CAGE(Cap  Analysis  Gene  Expression)法およびマイクロアレイ法の少なくとも一方の方法で得られた情報であることが好ましい。CAGE法は具体的にはNature  Methods  3  （２００６）  211-222に記載されている。
【００１２】
本発明の転写因子探索方法において、例えば、前記各工程の少なくとも一つの工程がコンピューターの使用を含んでもよい。
【００１３】
次に、本発明の細胞変換方法は、出発細胞を目的細胞に変換する細胞変換方法であって、出発細胞に、目的細胞に特異的な転写因子ネットワークの最上流に位置する転写因子を導入する転写因子導入工程を含み、前記転写因子導入工程において、前記本発明の転写因子探索方法で探索された最上流転写因子を導入することを特徴とする。
【００１４】
本発明の細胞変換方法において、さらに、出発細胞に特異的な転写因子ネットワークの発現を抑制する出発細胞転写因子ネットワーク発現抑制工程を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の細胞変換方法において、さらに、目的細胞に特異的な転写因子ネットワークにおいて発現する遺伝子を修飾する遺伝子修飾工程を含むことが好ましい。
【００１６】
次に、本発明の製造方法は、目的細胞の製造方法であって、出発細胞を目的細胞に変換する細胞変換工程を含み、前記細胞変換工程が、前記本発明の細胞変換方法によって実施されることを特徴とする。
【００１７】
次に、本発明のプログラムは、前記本発明の転写因子探索方法に使用されるプログラムである。
【００１８】
次に、本発明の記録媒体は、前記本発明のプログラムが格納された記録媒体である。なお、本発明において、「プログラム」は、コンピュータープログラムをいう。例えば、本発明のプログラムによれば、前記本発明の転写因子探索方法をコンピューター上で実行可能である。
【００１９】
本発明において、出発細胞は、特に制限されず、例えば、ヒト線維芽細胞、ヒト角化細胞（ケラチノサイト）、ヒトｉＰＳ細胞等があげられる。本発明において、細胞変換の目的となる目的細胞は、例えば、免疫細胞、脂肪細胞、各種臓器又は器官を構成する細胞があげられる。前記免疫細胞は、例えば、単球、マクロファージ細胞、ＮＫＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、レギュラトリーＴ細胞、Ｂ細胞等があげられる。前記脂肪細胞は、例えば、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等があげられる。各種臓器又は器官を構成する細胞は、例えば、神経細胞、膵臓ベータ細胞、肝細胞、心筋細胞、網膜細胞等があげられる。また、前記目的細胞は、例えば、例示した細胞への分化が容易な体性幹細胞（神経幹細胞、造血肝細胞など）もあげられる。
【００２０】
（細胞変換における転写制御ネットワークの基本概念）
図１及び図２を基に、細胞変換における転写制御ネットワークの基本概念を説明する。まず、細胞内の遺伝子の転写制御は、複数の転写因子から構成されているコア転写ネットワークにより制御されている。コア転写ネットワークは、細胞間で共通する細胞の基本的な機能を制御するための共通ネットワーク（Common  network）と、個々の細胞において特異的な機能を制御するための特異的ネットワーク（Specific  network）とから構成されている。図１に、出発細胞（Start  Cell）及び目的細胞（Target  Cell）のコア転写ネットワークを示す。図１に示すように、出発細胞（Start  Cell）及び目的細胞（Target  Cell）には、共通ネットワーク（Common  network）が存在する。一方、出発細胞（Start  Cell）には、出発細胞に特異的な転写因子ネットワーク又は出発細胞特異的ネットワーク（Start  cell-specific  network）が存在し、同様に、目的細胞（Target  Cell）には、目的細胞に特異的な転写因子ネットワーク又は目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）が存在する。
図２に示すように、出発細胞（Start  Cell）を目的細胞（Target  Cell）に変換するために、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）を出発細胞（Start  Cell）に導入し、かつ持続的に発現させることができる。このようにした結果、出発細胞（Start  Cell）において出発細胞特異的ネットワーク（Start  cell-specific  network）が消失し、図中で曲線で囲った共通ネットワーク（Common  network）と目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）とから構成される目的細胞のコア転写ネットワークが形成され、その結果、出発細胞（Start  Cell）を目的細胞（Target  Cell）に変換できる。
ここで、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）の出発細胞（Start  Cell）への導入のためには、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）を構成する全ての転写因子を導入する必要はなく、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）の最上流に位置する転写因子を導入すればよい。ここで、「最上流に位置する転写因子」とは、ネットワークを構成する全ての転写因子の発現を制御する転写因子をいう。なお、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）における最上流の転写因子の数は、出発細胞に導入した際に目的細胞への変換が達成されるために十分な数であり、１の場合もあれば、１より多い場合もある。上記の最上流転写因子決定工程において上位にランク付けられた（したがって、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）を構成する蓋然性が高い）複数の転写因子遺伝子の発現は、その中に含まれる遺伝子によってコードされる最上流に位置する転写因子によって制御されている。複数の転写因子の全てが単一の目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）を構成している場合には、最上流に位置する転写因子の数は１となり、複数の転写因子遺伝子が複数の目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）を構成している場合には、最上流に位置する転写因子の数は１より多くなる。
また、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）の出発細胞（Start  Cell）への導入と併せて、出発細胞特異的ネットワーク（Start  cell-specific  network）の発現を抑制すれば、細胞変換効率は更に向上するため、好ましい。出発細胞特異的ネットワーク（Start  cell-specific  network）の発現抑制は、特に制限されないが、例えば、出発細胞特異的ネットワーク（Start  cell-specific  network）の最上流に位置する転写因子の発現を抑制すればよく、発現抑制の手法は、例えば、遺伝子ノックダウン法、ＲＮＡ干渉法（ＲＮＡｉ）等の公知の遺伝子発現抑制方法を適用できる。さらに、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）の各転写因子の遺伝子がメチル化等の修飾を受けることが必要な場合、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）が導入された出発細胞（Start  Cell）において、目的細胞特異的ネットワーク（Target  cell-specific  network）の各転写因子の遺伝子が修飾されるようにすることが好ましい。
本発明による出発細胞から目的細胞への変換を、主にタンパク質である転写因子をコードする遺伝子の転写の制御に関して説明した。しかし、それによる遺伝子発現の制御（例えば、遺伝子発現の促進または抑制）によって目的細胞への変換が達成される物質（本発明において、「発現制御因子」ということがある）であれば、特に、転写因子のみに限定されない。前記発現制御因子は、例えば、転写因子に代えて、転写因子でない他のタンパク質であってもよく、または、タンパク質以外の物質であってもよい。さらには、発現制御は転写レベルのものに限定されず、翻訳または翻訳後レベルのものであってもよい。発現制御は、例えば、転写後のRNAに影響を与えるmiRNAなどによってRNA量を制御するものであってもよいし、また、例えば、エピゲノムに影響を与えるlncRNAやクロマチンリモデリング因子によってゲノム状態を制御してRNA発現を制御するものであってもよい。このような態様も本発明に含まれる。
【実施例】
【００２１】
つぎに、本発明の実施例について、以下説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限および限定されない。
【００２２】
本実施例は、出発細胞を線維芽細胞とし、目的細胞を単球細胞とし、細胞変換のための転写因子を探索し、探索された転写因子を用いて実際に細胞変換を実施した例である。
【００２３】
（発現比情報転写因子ランク付け工程）
マイクロアレイデータを、Illumina社が提供するソフトウェアであるIllumina  Beads  studioを用いて、標準化（quintile  normalization）を行った。標準化後のデータから、単球で発現の高かった遺伝子の上位30％を抽出し、さらにその中から転写因子を選択した。選択した転写因子を、線維芽細胞と単球細胞とでの発現比をもとに順位付け（ランク付け）を行った。ランク付けの結果を、下記の表１に示す。下記表１において、ランク付けされた転写因子は、単球細胞で上位30％に入る発現を示し、かつ線維芽細胞での発現量と比較して５倍以上高い発現を示すものである。なお、プローブが複数ある場合、複数回名前が挙がる場合がある。
【００２４】
【表１−１】
2013074857.tif 000002
【表１−２】
2013074857.tif 000003
【００２５】
（文献情報転写因子ランク付け工程）
医学系論文データベースMEDLINEより、各論文の要旨中に「Reprogramming」、「differentiation」、「transformation」の言葉を含むものを抽出し、それらで、別途、文献情報転写因子ランク付け工程用のデータベースを構築した。構築したデータベースから、さらに、要旨中に「単球（Monocyte）」と共に現れる転写因子名の数（共起数）をカウントし、共起数の多い方から順位付け（ランク付け）を行った。下記表２は、「単球（Monocyte）」と共に現れる転写因子名の共起数ランキング上位５０位までを示す。
【００２６】
【表２−１】
2013074857.tif 000004
【表２−２】
2013074857.tif 000005
【００２７】
（転写因子重要度ランク付け工程）
発現比情報転写因子ランク付け工程のスコア（Rfc）と、文献情報転写因子ランク付け工程によるスコア（Rco）を統合して転写因子重要度ランク付けをするため、スコア（Rfc）及びスコア（Rco）の各逆数を算出し、それぞれの逆数を足し合わせて、その転写因子の重要度をあらわすImportance  Score  (IS)とした。下記表３に、ISの高い転写因子から順に上位20転写因子をコア転写制御ネットワーク構成因子の候補としたものを示す。
【００２８】
【表３】
2013074857.tif 000006
【００２９】
（最上流の転写因子（ネットワークインデユーサー）の決定）
レンチウイルスをベクターとした過剰発現試験により、転写因子重要度ランク付け工程で得られた各転写因子（表３）の中から、単球に特異的なネットワークの上流に位置する転写因子（ネットワークインデユーサー）を決定した。前記レンチウイルスをベクターとした過剰発現試験は、下記のように行った。
【００３０】
（プラスミド作製）
第３世代レンチウイルスベクター作製用SINベクター  CSII-RfA-IRES2-Venus  150ngと、前記表３に示す各転写因子のエントリークローンそれぞれ100ngとを用いてGatewayテクノロジーLR反応(Life  Technologies)により、それぞれの遺伝子のORFをSINベクターに組み換えた。遺伝子を組み換えたSINベクターと、パッケージングプラスミドpCAG-HIVgp,  pCMV-VSV-G-RSV-Revとを、PureYield  midiプラスミド精製キットを用いて抽出・精製した。
【００３１】
（レンチウイルス作製）
4×106  細胞の293T細胞をポリリジンコートの10cmディッシュに、OptiMEM(GlutaMax)(5%  FBS)を用いて播種した。293Ｔ細胞播種から24時間後、培地を、新鮮なOptiMEM(GlutaMax)(5%  FBS)に交換した。SINベクタープラスミド  8.5μg,  pCAG-HIVgp  5μg,  pCMV-VSV-G-RSV-Rev  5μg,  OptiMEM  600μl,  FuGene  HD  50μlを混合し、室温で15分静置し、DNAと試薬との混合物を、293T細胞に滴下した。トランスフェクション24h後に培地を、OptiMEM(GlutaMax)に交換した。さらに、24時間後および48時間後に培地を回収した。回収された培地を、0.45μmフィルターでフィルタリングし、19600rpmで超遠心し、ウイルスペレット化した。上清を除去し、ペレットをHBSS  100μlに懸濁した。得られたレンチウイルスは使用まで-80℃で保存した。
【００３２】
（タイター測定）
HBSSで600倍に希釈したレンチウイルス  150μlに、キャリアーRNAを含むBuffer  RAV1  600μlを加え、70℃で5分間インキュベートした。600μlのエタノール（96〜100％）を加えボルテックスした後、NucleoSpin  RNA  Virus  Columnsにウイルス溶液を通しカラムにウイルスのRNAを吸着させた。500μlのBuffer  RAWでカラムを洗浄し、次に600μlのBuffer  RAW3で同様にカラムを洗浄した。200μlのBuffer  RAW3でカラムを洗浄しカラムからエタノールを可能な限り除去した。70℃に加温したElution  Buffer  50μlをカラムに加え、室温で2分間インキュベートした後、遠心分離によりRNAを溶出した。次に4μlのDNase  I（5U/μl  TaKaRa  Recombinant  DNase  I）、6μlの10×DNase  I  Bufferを溶出したウイルスRNAに加え、37℃、30分間インキュベートした。qRT-PCR（TaKaRa  One  Step  SYBR  PrimeScript  RT-PCR  Kit  II）を、次のようにおこなった。2×One  Step  SYBR  RT-PCR  Buffer4  5μl、PrimeScript  1step  Enzyme  Mix2  0.4μl、PCR  Forward  Primer  (10μM)  0.4μl、PCR  Reverse  Primer  (10μM)  0.4μl、ROX  Reference  Dye  0.2μl、RNase  Free  dH2O  2.8μl、DNase  I処理したウイルスRNA  0.8μlを混合し、リアルタイムPCRにかけた。プログラムは、42℃/5分、95℃/10秒、95℃/5秒から60℃/34秒を40サイクルで行った。Ct値を、あらかじめタイター既知のウイルスを用いて作製した検量線から計算されたタイター算出式、［Titer(ifu/ml  (＝Exp(-0.48(Ct-Ct_posi))×2×107))］に当てはめ、タイターを算出した。タイター測定の際は、任意のタイター既知のウイルスをポジティブコントロール（Ct_posi）として使用し、測定誤差を補正した。
【００３３】
（遺伝子導入）
NB1RGB細胞  1×105  細胞を24h培養し、8μg/mlのポリブレンを加えた培地に交換し、10MOIで前記表３に示す各転写因子の遺伝子を導入した各レンチウイルスベクターを感染させた。感染後24時間後、MEM  alpha培地に交換し、さらに７日間培養した。
【００３４】
（qRT-PCR解析）
変換細胞  5×  105  細胞から、Fast  Pure  RNA  Kit  (takara,  9190)を用いてtotal  RNAを抽出した。抽出されたtotal  RNAは、PrimeScript（登録商標）  II  1st  strand  cDNA  Synthesis  Kit  (Takara,  6210A)を用いて逆転写し、SYBR（登録商標）  Premix  Ex  Taq（商品名）(Perfect  Real  Time)を用いて、ABI  7500  リアルタイムPCRシステムで解析した。遺伝子発現は、GAPDH遺伝子を内部標準として、ΔΔCt法で算出した。前記表３に示す各転写因子の遺伝子のプライマーの配列は、下記表４に示すとおりである。
【００３５】
図３に、その結果を示す。図３（Ａ）に示すように、過剰発現した結果、他の遺伝子（若しくは自己遺伝子）の発現が誘導される転写因子として、SPI1、CEBPA、IRF8及びMNDAの４個の転写因子が、単球の特異的転写ネットワークの最上流に位置する遺伝子として決定された。図３（Ｂ）は、前記の４個の転写因子の遺伝子を外因的に過剰発現させることにより、発現する内因性の遺伝子の関係を模式的に示した図である。図３（Ｂ）に示すように、前記の４個の遺伝子の過剰発現により、他の内因性遺伝子の発現が誘導されており、CEBPAに関しては、自己の外因的な過剰発現により自己の内因的な発現が誘導されている。また、単球の特異的な転写ネットワークの中流に位置する転写因子として、NR4A2が決定された。
【００３６】
（転写因子導入による細胞変換）
前述のようにして決定された４個の転写因子の遺伝子を、ヒト線維芽細胞に導入して単球に細胞変換した。細胞変換された細胞について、単球細胞と比較して評価した。なお、具体的な操作および条件は、以下のとおりである。
【００３７】
（細胞培養）
CD14陽性ヒト単球細胞（Lonza,  2W-400C）は、RPMI1640培地（10%  FBS,  50μM  2-Mercaptoethanol,  1mM  Sodium  Pyruvate,  10mM  HEPES,  100U/ml  Penicillin,  100μg/ml  Streptomycin）で培養した。ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NB1RGB細胞（RCB0222)）は、MEM  ALPHA培地（10%  FBS）で培養した。
【００３８】
（マイクロアレイ解析）
1×107  細胞のCD14陽性ヒト単球細胞、NB1RGB細胞、前記の４個の転写因子の導入細胞から、FastPure  RNA  Kit（Takara,  9190）でtotal  RNAを回収した。回収されたtotal  RNA  500ngからIllumina（登録商標）TotalPrep（商品名）  RNA  Amplification  Kit  (Ambion,  AMIL1791)を用いて、ビオチン化cRNAを合成した。合成されたビオチン化cRNA  100ngを、Illumina  beads  array  Human-WG6  v3.0  (Illumina)にハイブリダイゼーションした。マイクロアレイ解析は、3  biological  replicatesで行った。
【００３９】
前記ヒト新生児皮膚線維芽細胞への前記４個の転写因子の導入は、NB1RGB細胞に導入する転写因子を、前記４個の転写因子（CEBP,  SPI1,  IRF8及びMNDA）とした以外は、前述のレンチウイルスをベクターとした過剰発現試験と同様にして行った。具体的には、下記のように行った。
【００４０】
（プラスミド作製）
前記表３に示す各転写因子に代えて、前記４個の転写因子（CEBP,  SPI1,  IRF8及びMNDA）を使用した以外は、前述と同様にしてプラスミド作製を行った。すなわち、第３世代レンチウイルスベクター作製用SINベクター  CSII-RfA-IRES2-Venus  150ngと、CEBP,  SPI1,  IRF8及びMNDAのエントリークローンそれぞれ100ngとを用いてGatewayテクノロジーLR反応(Life  Technologies)により、それぞれの遺伝子のORFをSINベクターに組み換えた。遺伝子を組み換えたSINベクターと、パッケージングプラスミドpCAG-HIVgp,  pCMV-VSV-G-RSV-Revとを、PureYield  midiプラスミド精製キットを用いて抽出・精製した。
【００４１】
（レンチウイルス作製）
前述のレンチウイルスをベクターとした過剰発現試験と同様にして、レンチウイルス作製を行った。すなわち、4×106  細胞の293T細胞をポリリジンコートの10cmディッシュに、OptiMEM(GlutaMax)(5%  FBS)を用いて播種した。293Ｔ細胞播種から24時間後、培地を、新鮮なOptiMEM(GlutaMax)(5%  FBS)に交換した。SINベクタープラスミド  8.5μg,  pCAG-HIVgp  5μg,  pCMV-VSV-G-RSV-Rev  5μg,  OptiMEM  600μl,  FuGene  HD  50μlを混合し、室温で15分静置し、DNAと試薬との混合物を、293T細胞に滴下した。トランスフェクション24h後に培地を、OptiMEM(GlutaMax)に交換した。さらに、24時間後および48時間後に培地を回収した。回収された培地を、0.45μmフィルターでフィルタリングし、19600rpmで超遠心し、ウイルスペレット化した。上清を除去し、ペレットをHBSS  100μlに懸濁した。得られたレンチウイルスは使用まで-80℃で保存した。
【００４２】
（タイター測定）
前述のレンチウイルスをベクターとした過剰発現試験と同様にして、タイター測定を行った。すなわち、HBSSで600倍に希釈したレンチウイルス  150μlに、キャリアーRNAを含むBuffer  RAV1  600μlを加え、70℃で5分間インキュベートした。600μlのエタノール（96〜100％）を加えボルテックスした後、NucleoSpin  RNA  Virus  Columnsにウイルス溶液を通しカラムにウイルスのRNAを吸着させた。500μlのBuffer  RAWでカラムを洗浄し、次に600μlのBuffer  RAW3で同様にカラムを洗浄した。200μlのBuffer  RAW3でカラムを洗浄しカラムからエタノールを可能な限り除去した。70℃に加温したElution  Buffer  50μlをカラムに加え、室温で2分間インキュベートした後、遠心分離によりRNAを溶出した。次に4μlのDNase  I（5U/μl  TaKaRa  Recombinant  DNase  I）、6μlの10×DNase  I  Bufferを溶出したウイルスRNAに加え、37℃、30分間インキュベートした。qRT-PCR（TaKaRa  One  Step  SYBR  PrimeScript  RT-PCR  Kit  II）を、次のようにおこなった。2×One  Step  SYBR  RT-PCR  Buffer4  5μl、PrimeScript  1step  Enzyme  Mix2  0.4μl、PCR  Forward  Primer  (10μM)  0.4μl、PCR  Reverse  Primer  (10μM)  0.4μl、ROX  Reference  Dye  0.2μl、RNase  Free  dH2O  2.8μl、DNase  I処理したウイルスRNA  0.8μlを混合し、リアルタイムPCRにかけた。プログラムは、42℃/5分、95℃/10秒、95℃/5秒から60℃/34秒を40サイクルで行った。Ct値を、あらかじめタイター既知のウイルスを用いて作製した検量線から計算されたタイター算出式、［Titer(ifu/ml  (＝Exp(-0.48(Ct-Ct_posi))×2×107))］に当てはめ、タイターを算出した。タイター測定の際は、任意のタイター既知のウイルスをポジティブコントロール(Ct_posi)として使用し、測定誤差を補正した。
【００４３】
（遺伝子導入）
NB1RGB細胞に、前記表３に示す各転写因子の遺伝子に代えて、前記４個の転写因子の遺伝子を導入した各レンチウイルスベクターを感染させた以外は、前述と同様にして遺伝子導入を行った。すわなち、NB1RGB細胞  1×105  細胞を24h培養し、8μg/mlのポリブレンを加えた培地に交換し、10MOIで前記の遺伝子及び各転写因子を導入した各レンチウイルスベクターを感染させた。感染後24時間後、MEM  alpha培地に交換し、さらに７日間培養した。
【００４４】
（qRT-PCR解析）
前記４個の転写因子が導入された変換細胞を使用した以外は、前述のレンチウイルスをベクターとした過剰発現試験と同様にして、前記qRT-PCR解析を行った。すなわち、変換細胞  5×  105  細胞から、Fast  Pure  RNA  Kit  (takara,  9190)を用いてtotal  RNAを抽出した。抽出されたtotal  RNAは、PrimeScript（登録商標）  II  1st  strand  cDNA  Synthesis  Kit  (Takara,  6210A)を用いて逆転写し、SYBR（登録商標）  Premix  Ex  Taq（商品名）(Perfect  Real  Time)を用いて、ABI  7500  リアルタイムPCRシステムで解析した。遺伝子発現は、GAPDH遺伝子を内部標準として、ΔΔCt法で算出した。前記４個の転写因子の遺伝子のプライマーの配列は、下記表４に示すとおりである。
【００４５】
（貪食能解析）
変換細胞をCC2コートのスライドチャンバーに播種し、24時間後に、赤色蛍光色素標識ラテックスビーズ（0.２μm）を終濃度0.002%となるように加え、24時間培養した。24時間培養した細胞は、PBSで2回洗浄、封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００４６】
（炎症反応解析）
変換細胞、線維芽細胞、陰性対照細胞培養液中に、終濃度10μg/mlになるようにLPSを添加し、２４時間培養した。２４時間培養した細胞を回収し、Fast  Pure  RNA  Kit  でRNAを抽出し、上記方法に準じてqRT-PCR解析を行った。各遺伝子のプライマー配列は、下記表４に示すとおりである。
【００４７】
（プライマー配列）
【表４−１】
2013074857.tif 000007
【表４−２】
2013074857.tif 000008
【００４８】
（単球マーカーの発現）
前記の４個の転写因子（SPI1,  CEBPA,  MNDA,  IRF8）をヒト線維芽細胞に導入して得られた変換細胞と、単球の類似性とを評価するために、遺伝子導入後8日後の変換細胞からRNAを回収し、６個の単球マーカーの発現を、qRT-PCRで解析した。その結果を図４のグラフに示す。なお、６個の単球マーカーは、TYROBP,  HLA-DRA,  MMP9,  CSF1R,  LILRB3,  CSF2Rである。図４に示すように、６個の遺伝子のすべてが線維芽細胞と比べて4倍以上発現が上昇した。
【００４９】
（貪食能解析結果）
単球の特徴的な機能のひとつである貪食能を解析するために、変換細胞にラテックスビーズを加えてビーズを24時間貪食させた。なお、対照として、転写因子を導入していない細胞を用いた。その結果を図５に示す。図５に示すように、対照の細胞（陰性対照）ではほとんどビーズの貪食が見られなかったが、４個の転写因子を導入した変換細胞（４因子導入細胞）では多くのビーズが細胞内に貪食された（図中矢印）。
【００５０】
（炎症反応解析結果）
単球に特徴的な機能である炎症反応を、リポポリサッカライド（LPS）を用いて検証した。ヒト線維芽細胞、陰性対照ウイルス導入細胞（転写因子非導入細胞）、４因子導入細胞（前記４個の転写因子を導入して変換した細胞）の各培養液中に、終濃度10μg/mlでLPSを添加し、添加後24時間の細胞を回収してRNAを抽出し、６個の代表的な炎症反応に関わる遺伝子の発現変動を調べた。６個の炎症反応に関わる遺伝子は、TNF,  IL6,  IL1A,  IL1B,  IL8及びCCL2である。その結果を、図６に示す。図６に示すように、陰性対照と４因子導入細胞を比較すると、６個中４個の遺伝子が、陰性対照よりも有意に変動した（*  P-value  <  0.05,  **  P-value  <  0.01）。
【００５１】
（マイクロアレイ解析）
全体の遺伝子発現の類似性を確認するために、変換細胞をIllumina  beads  arrayを用いてマイクロアレイ解析を行った。その結果を図７に示す。なお、単球のマイクロアレイデータより、単球とヒト線維芽細胞を比較して、単球で遺伝子の発現比が23倍以上高くかつt検定のP-value  <  0.03のものを単球特異的遺伝子、線維芽細胞で遺伝子の発現比が23倍以上高くかつt検定のP-value  <  0.03のものを線維芽細胞特異的遺伝子とした。図７に示すように、単球特異的な遺伝子のうち、52.6％の遺伝子が4因子導入細胞で、線維芽細胞より発現が22倍以上高くかつt検定のP-value  <  0.05であった。一方で、線維芽細胞特異的遺伝子のうち57.2％の遺伝子が4因子導入細胞で、線維芽細胞より発現が22倍以上低くかつt検定のP-value  <  0.05であった。
【００５２】
（モチーフ活性解析）
転写因子は、遺伝子のプロモーター領域に存在する転写因子結合配列（モチーフ）に結合して発現制御を行なう。転写因子結合モチーフには、その配列を認識する複数の転写因子が結合し得る。モチーフ活性とは、各細胞において、各々の転写因子結合モチーフがどの程度転写制御に寄与しているかを表す指標である。ひとつのモチーフを考えた場合、そのモチーフには発現を正に制御する転写因子も負に制御する転写因子も含めて、複数の転写因子が結合する場合が多いので、これら全ての影響をすべて合算した結果としてモチーフ活性が得られる。本発明者らは、モチーフ活性解析のために、MARA（Motif  Acitvity  Response  Analysis）と名づけたアルゴリズムを開発した（Nature  Genetics  41  (2009)  553-562）。本発明者が構築したプロモーター発現のモデルでは、時間tにおけるプロモーターpの理論的な発現量ｅｐｔは、下記の式（Ｉ）で表すことができる。
【００５３】
ｅｐｔ＝ｃｏｎｓｔａｎｔ＋ΣｍＮｐｍＡｍｔ      （Ｉ）
ｅｐｔ：時間ｔにおけるプロモーターｐの理論的な発現量
Ｎｐｍ：プロモーターｐにおけるモチーフｍの反応効率
Ａｍｔ：時間ｔにおけるモチーフｍの活性
【００５４】
上記に示すように、Ｎｐｍはプロモーターpにおけるモチーフmの反応効率と定義し、モチーフmの出現数と類似度、他の動物種との保存度、位置指向性の重みから計算できる。Ａｍｔは時間tにおけるモチーフmの活性である。プロモーター発現量ｅｐｔは、各モチーフについて反応効率とモチーフ活性を掛け算してそれを全て合算したものに定数(constant)を足したものとなる。プロモーター発現量ｅｐｔは、ＣＡＧＥまたはマイクロアレイから得られた実測値を使うことができる。よって、この式を時間tで活性のある全プロモーター（遺伝子）に対して適用すると、全ての調べ得るモチーフについてその活性を計算で求めることができる。したがって、モチーフ活性解析により、そのモチーフに対応する転写因子とその直接の下流遺伝子のネットワークを調べることができる。
【００５５】
そこで、上記マイクロアレイデータを用い、４因子導入細胞（前記の４個の転写因子を導入して変換した細胞）、陰性対照ウイルス導入細胞（転写因子非導入細胞）、ヒト線維芽細胞、単球の各細胞のモチーフ活性を測定した。単球と線維芽細胞を比較した場合、単球で活性がより高いモチーフ上位１０モチーフについて、その活性の変化を調べた。その結果を、図８のグラフに示す。図８に示すように、１０モチーフ中、８モチーフの活性が上昇していた。
【００５６】
（ジーンオントロジー（GO）解析）
４因子導入細胞（前記４個の転写因子を導入して変換した細胞）において発現上昇した遺伝子の機能を調べるために、ジーンオントロジー(GO)解析を行った。具体的には、前記マイクロアレイ解析において同定された、単球特異的遺伝子と４因子導入細胞でヒト線維芽細胞よりも発現が上昇している遺伝子とについて、DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/,  Genome  Biology  4  (2003)  3)を用いて、濃縮されているジーンオントロジー（GO）を解析した。下記表５に、単球と４因子導入細胞で、ヒト線維芽細胞と比較した際に有意に濃縮されているGOを示す。下記表５に示すように、４因子導入細胞で有意に濃縮されている８個のGOのうち、６個のGOが単球と一致した。
【００５７】
【表５】
2013074857.tif 000009
【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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