(57)【要約】      （修正有）【課題】本発明は、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブを提供することを課題とする。【解決手段】（Ｐ１）特定の塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンである塩基配列からなり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ特定の塩基配列の塩基番号２２８〜２３０のうち少なくとも一つの塩基の多型を認識する蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブ：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンである塩基配列からなり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における塩基配列の塩基番号２２８〜２３０のうち少なくとも一つの塩基の多型を認識するオリゴヌクレオチド（但し、配列番号７又は配列番号１９に示すオリゴヌクレオチドを除く）。
【請求項２】
前記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドが、下記Ｐ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の多型検出用プローブ：
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンであり、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号２２８〜２３０のうち２以上の塩基が配列番号１に示す塩基とは異なる塩基であり、前記塩基番号２３７に対応するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された塩基を３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に有する、請求項１又は請求項２に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記蛍光標識のオリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された塩基を３’末端に有する、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少または増加する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が１０〜４０である請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が１０〜３０である請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項９】
融解曲線分析用のプローブである、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１０】
配列番号１に示す塩基配列において２２８番目に対応する塩基がグアニン又はアデニン、配列番号１に示す塩基配列において２２９番目に対応する塩基がアデニン又はグアニン、及び、配列番号１に示す塩基配列において２３０番目に対応する塩基がグアニン又はチミンである請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いるＢＲＡＦ遺伝子Ｖ６００部位の多型検出方法。
【請求項１２】
（Ｉ）請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＢＲＡＦ遺伝子Ｖ６００部位における変異の存在を検出することと、
を含む、請求項１１に記載の多型検出方法。
【請求項１３】
さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む、請求項１１又は請求項１２に記載の多型検出方法。
【請求項１４】
請求項１１〜請求項１３のいずれか１項に記載の変異検出方法により、ＢＲＡＦ遺伝子Ｖ６００部位における変異を検出することと、
検出された変異の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することと、
を含む薬剤の薬効判定方法。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の変異検出用プローブを含む、多型検出用試薬。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の変異検出用プローブと、
配列番号１に示す塩基配列において、前記変異検出用プローブがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーとを含む多型検出用キット。
【請求項１７】
配列番号１に示す塩基配列における２２８番目〜２３０番目の塩基を含む塩基長５０〜１０００の領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含む、請求項１６に記載の多型検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＲＡＦ遺伝子は、細胞内の信号伝達と細胞の増殖とに関与するＢＲＡＦ蛋白をコードする遺伝子である。ＢＲＡＦ遺伝子が変異し、ＢＲＡＦ蛋白の６００番目のアミノ酸が、バリン（Ｖ）から、グルタミン酸（Ｅ）に変異すると、細胞内の信号伝達系が常時活性化された状態になることが知られている。このようなＢＲＡＦの活性化変異体はＶ６００Ｅと呼ばれており、ヒトの悪性腫瘍の約７％、悪性黒色腫（メラノーマ）の約６０％に認められる（例えば、非特許文献１参照）。また、Ｖ６００Ｅ変異を有する進行性黒色腫に対しては、ＢＲＡＦキナーゼ阻害剤ベムラフェニブ（ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）等による治療が有効であることが報告されている。ＢＲＡＦキナーゼ阻害剤ベムラフェニブの投薬に際しては、有効性及び安全性の観点から、Ｖ６００Ｅの変異の有無を事前に検出することが要求される。
Ｖ６００Ｅ変異を正確に短時間、且つ低コストで簡便に測定する方法が開発されている（例えば、特許文献１又は特許文献２参照）。また、この他にも、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ダイレクトシークエンス法、ＨＲＭＡ法等を用いて、ＢＲＡＦ遺伝子変異を検出するための方法が知られている（例えば、非特許文献２〜４参照）。
【０００３】
現在、Ｖ６００Ｅの他に、６００番目のアミノ酸がバリンから、リシン（Ｋ）に変異したＶ６００Ｋ、アルギニン（Ｒ）に変異したＶ６００Ｒ、アスパラギン酸（Ｄ）に変異したＶ６００Ｄが知られている（例えば、非特許文献５参照）。さらに、これらの他にもグリシン（Ｇ）に変異したＶ６００Ｇ、メチオニン（Ｍ）に変異したＶ６００Ｍが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０７１０４６号パンフレット
【特許文献２】特開２００９−７７７１２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ．（２０１０）Ｄｅｃ １６；４６８（７３２６）：９７３−７．
【非特許文献２】Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ．（２００７）Ｊｕｎ  ５４（３）ｐ．３９９−４０５
【非特許文献３】Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄ．Ｊ．（２００９）Ａｐｒ  ３０；５０（２）：ｐ．２６６−７２
【非特許文献４】Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００８）Ａｕｇ；１３０（２）：ｐ２４７−５３
【非特許文献５】Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１０）Ｊｕｌ  １４；８：ｐ６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、Ｖ６００Ｅ以外の変異であるＶ６００Ｋ、Ｖ６００Ｒ及びＶ６００Ｄの二つ以上を、同時に検出できる方法は見出されていない。
そこで、Ｖ６００Ｅに加え、それ以外の変異（Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｒ、Ｖ６００Ｄ）を高い感度で、簡便に検出するための方法について、さらなる技術開発が待ち望まれていた。
【０００７】
本発明は、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
＜１＞  下記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブ：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンである塩基配列からなり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における塩基配列の塩基番号２２８〜２３０のうち少なくとも一つの塩基の多型を認識するオリゴヌクレオチド（但し、配列番号７又は配列番号１９に示すオリゴヌクレオチドを除く）。
＜２＞  前記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドが、下記Ｐ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドである＜１＞に記載の多型検出用プローブ：
（Ｐ１’）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンであり、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号２２８〜２３０のうち２以上の塩基が配列番号１に示す塩基とは異なる塩基であり、前記塩基番号２３７に対応するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
＜３＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された塩基を３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に有する、＜１＞又は＜２＞に記載の多型検出用プローブ。
＜４＞  前記蛍光標識のオリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された塩基を３’末端に有する、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜５＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少または増加する、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜６＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドが、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜７＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が１０〜４０である＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜８＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が１０〜３０である＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜９＞  融解曲線分析用のプローブである＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜１０＞  配列番号１に示す塩基配列において２２８番目に対応する塩基がグアニン又はアデニン、配列番号１に示す塩基配列において２２９番目に対応する塩基がアデニン又はグアニン、及び、配列番号１に示す塩基配列において２３０番目に対応する塩基がグアニン又はチミンである＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜１１＞  ＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブを用いるＢＲＡＦ遺伝子Ｖ６００部位の多型検出方法。
＜１２＞  （Ｉ）＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブおよび試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＢＲＡＦ遺伝子Ｖ６００部位における変異の存在を検出することと、
を含む、＜１１＞に記載の多型検出方法。
＜１３＞  さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含む、＜１１＞又は＜１２＞に記載の多型検出方法。
＜１４＞  ＜１１＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の変異検出方法により、ＢＲＡＦ遺伝子Ｖ６００部位における変異を検出することと、
検出された変異の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することと、
を含む薬剤の薬効判定方法。
＜１５＞  ＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の変異検出用プローブを含む、多型検出用試薬。
＜１６＞  ＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の変異検出用プローブと、
配列番号１に示す塩基配列において、前記変異検出用プローブがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーとを含む多型検出用キット。
＜１７＞  配列番号１に示す塩基配列における２２８番目〜２３０番目の塩基を含む塩基長５０〜１０００の領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含む、＜１６＞に記載の多型検出用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）は、核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。
【図２】（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の実施例１及び比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図３】（Ａ）〜（Ｊ）は、本発明の実施例２及び比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図４】（Ａ）〜（Ｏ）は、本発明の比較例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明にかかるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンである塩基配列からなり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における塩基配列の塩基番号２２８〜２３０のうち少なくとも一つの塩基の多型を認識するオリゴヌクレオチド（但し、配列番号７又は配列番号１９に示すオリゴヌクレオチドを除く）。
本発明にかかるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出方法は、前記ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型を検出するための多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出することを含む方法である。
本発明にかかる薬剤の薬効評価方法は、前記ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出方法によりＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価することを含む方法である。
本発明にかかる多型検出用キットは、ＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを含むものである。
【００１２】
本発明における「ＢＲＡＦ遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＧ＿００７８７３により入手することができる。
本発明における配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＧ＿００７８７３の１７６２０１〜１７６７００の配列であり、１７６２０１を塩基番号１とした塩基番号１〜５００で構成される塩基配列である。
【００１３】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００１４】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。
【００１５】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。
以下、本発明について説明する。
【００１６】
＜ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブ＞
本発明にかかるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンである塩基配列からなり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における塩基配列の塩基番号２２８〜２３０のうち少なくとも一つの塩基の多型を認識するオリゴヌクレオチド（但し、配列番号７又は配列番号１９に示すオリゴヌクレオチドを除く）。
【００１７】
本発明の前記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３０のうち少なくとも一つの塩基の多型を検出することができるプローブである。
また、本発明の前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号１で示される配列において、塩基番号２２８〜２３７に対応する塩基を含む配列である。
【００１８】
本発明の前記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシン（Ｃ）である以外は、塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有することを要する。なお、「配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３７を含む１０〜５０塩基長の塩基配列」を、以下、単に「特定部分塩基配列」ともいう。
また、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。
本発明の前記Ｐ１蛍光標識オリゴヌクレオチドと、前記配列番号１における２３７番目の塩基に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は配列番号１と同一の塩基を有する塩基配列とを比較した際の同一性が８０％未満である場合には、変異型のＢＲＡＦ遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００１９】
また、本発明にかかる前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記特定部分塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシンであり、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号２２８〜２３０のうち２以上の塩基が配列番号１に示す塩基とは異なる塩基であり、前記塩基番号２３７に対応するシトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド（Ｐ１’）であってもよい。
当該Ｐ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号２２８〜２３０のうち２以上の塩基が配列番号１に示す塩基とは異なることにより、変異型のＢＲＡＦ遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高くなる傾向がある。
【００２０】
配列番号１に示す塩基配列における塩基番号２２８〜２３０のうち２以上の塩基が配列番号１に示す塩基とは異なる場合、２以上の塩基としては、以下の（１）〜（３）で挙げられる塩基から選ばれる２以上の塩基が挙げられる。
（１）配列番号１に示す塩基配列において２２８番目に対応する塩基がグアニン又はアデニン、
（２）配列番号１に示す塩基配列において２２９番目に対応する塩基がアデニン又はグアニン、及び
（３）配列番号１に示す塩基配列において２３０番目に対応する塩基がグアニン又はチミンからなる群より選ばれる塩基が挙げられる。
【００２１】
また、２以上の塩基の具体的な組み合わせとしては、例えば、塩基番号２２８、２２９及び２３０に対応する塩基が、アデニン、アデニン及びグアニン；アデニン、アデニン及びチミン；アデニン、グアニン及びチミン；アデニン、グアニン及びグアニン；グアニン、アデニン及びチミン；又は、グアニン、グアニン及びチミンであることが挙げられる。
２以上の塩基を同時に検出する観点から、２以上の塩基の組み合わせとしては、塩基番号２２８、２２９及び２３０に対応する塩基は、アデニン、アデニン及びグアニン；アデニン、グアニン及びグアニン；又は、グアニン、アデニン及びチミンとすることができる。
【００２２】
また、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において２２８番目に対応する塩基がグアニン又はアデニン、配列番号１に示す塩基配列において２２９番目に対応する塩基がアデニン又はグアニン、及び、配列番号１に示す塩基配列において２３０番目に対応する塩基がグアニン又はチミンである蛍光標識オリゴヌクレオチドであってもよい。
当該蛍光標識オリゴヌクレオチドは、野生型と変異型のＴｍ値の差が大きいことにより、正確に変異検出が可能であり試験に対する信頼性が高くなる、また高い検出感度にて変異を含むサンプルを検出することが可能であるという傾向がある。
【００２３】
本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記特定部分塩基配列において塩基番号２３７に対応する塩基がＣ（シトシン）である以外は、前記特定部分塩基配列と同一の塩基を有する塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。
【００２４】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）  に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００２５】
さらに、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドには、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基又は１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００２６】
挿入、欠失又は置換の中でも、本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基が置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。置換の位置は、特に限定されない。例えば、検出感度の観点より、配列番号１で示される配列のうち２３１番目〜２３７番目の塩基以外に位置する塩基が置換されることが挙げられる。置換される塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられる。置換される塩基の数は、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜５塩基、又は１塩基〜３塩基が挙げられる。
【００２７】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける、オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類から構成されてもよいし、複数種類から構成されてもよい。
【００２８】
本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、塩基長が１０〜５０であることを要する。前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長が９ｍｅｒ以下や、５０ｍｅｒ以上である場合には、ＢＲＡＦ遺伝子多型の検出感度が低下する。
また、本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長としては、１０〜５０、１０〜４０、又は１０〜３０としうる。１０〜５０という範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
また前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、例えばＰ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖（標的配列）と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を所望の値とすることができる。
【００２９】
以下に本発明における前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表１に示すが、本発明はこれらに限定されない。
なお、表１では、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３０の塩基に対応する塩基を大文字で記載し、当該配列番号１の塩基番号２２８、２２９及び２３０に対応する塩基が、アデニン、アデニン及びグアニン；アデニン、グアニン及びグアニン；グアニン、アデニン及びチミンの場合であるであるオリゴヌクレオチドと、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドのＴｍ値を併せて示した。
ここでＴｍ値は、Ｍｅｌｔｃａｌｃ  ９９  ｆｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）を用い、設定条件：Ｏｌｉｇｏｃｏｎｃ［μＭ］０．２、Ｎａ ｅｑ．［ｍＭ］５０の条件で算出した。
【００３０】
【表１】
2013236625.tif 000002
【００３１】
本発明において、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表１におけるＴｍ（Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｒ、Ｖ６００Ｄ））と、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３０の塩基に対応する塩基が非相補的なＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値（表１におけるＴｍ（ＷＴ））との差は、例えば３℃以上が挙げられる。前記Ｔｍ値の差が３℃以上であることで、例えば、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３０の塩基の変異をより高感度に検出することができる。
また、前記Ｔｍ値の差としては、３℃以上、５℃以上、又は７℃以上等が挙げられる。
前記Ｔｍ値の差を大きくする方法としては、例えばプローブがハイブリダイズする領域に対応する塩基配列に対して、ミスマッチとなる塩基を該プローブに含める方法などが挙げられる。具体的には、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（１９９７）ｖｏｌ１５  ｐ．３３１−３３５等に記載の方法が挙げられる。
【００３２】
また、本発明の前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、塩基番号２３７に対応する塩基がシトシン（Ｃ）であり、該シトシンが蛍光色素で標識されていることを要する。
【００３３】
前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、この蛍光標識された２３７番目の塩基が、３’末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することができる。また、３’末端に存在することができる。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００３４】
本発明の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１における塩基配列の塩基番号２２８〜２３０を含む配列（標的配列）にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。
【００３５】
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ  Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、３’末端もしくは５’末端がシトシン（Ｃ）となるように設計され、その末端のＣがグアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが特に好ましい。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００３６】
なお、Ｑ  Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００３７】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
【００３８】
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００３９】
上記塩基配列を有し、３’末端のＣが蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドの具体例を以下に示す（大文字の塩基は変異点を示し、（ＰＢ）、（ＦＬ）、（ＴＡＭＲＡ）は、前記蛍光色素に該当する。）。但し、本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドは以下のものに限定されない。
【００４０】
【表２】
2013236625.tif 000003
【００４１】
前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドはＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００における多型検出用プローブとして使用することができる。
また、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
さらに、前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、多型検出用試薬として使用することができる。これにより、本発明の多型検出用試薬は、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号２２８〜２３０に対応する塩基における多型を簡便にかつ感度よく検出することができる。
なお、本発明に係る前記Ｐ１又は前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号２３７の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
【００４２】
＜プライマー＞
後述するＢＲＡＦ遺伝子の多型検出方法では、検出対象となるＢＲＡＦ遺伝子を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＢＲＡＦ遺伝子の多型の部位である、配列番号１で示される塩基配列のうち塩基番号２２８〜２３０の塩基に対応する塩基を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
【００４３】
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）であることが好ましい。
【００４４】
以下に本発明の多型検出方法において、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００４５】
前記プライマーとしては、（Ｐ２）配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１１５〜１４４に対応する塩基を含む塩基長３０〜４０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における塩基配列において塩基番号２２８〜２３０に対応する塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号１１５〜１４４に対応する塩基を含む塩基長３０〜４０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ２のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４６】
また、前記プライマーとしては、以下のプライマーであってもよい。すなわち、（Ｐ３）配列番号１で示される塩基配列において塩基番号２３９〜２６０に対応する塩基を含む塩基長２２〜４０の塩基配列の相補鎖に対して少なくとも８０％以上の同一性を有するオリゴヌクレオチドであり、且つ配列番号１における塩基配列において塩基番号２２８〜２３０に対応する塩基を含む領域を増幅するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドとしては配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２３９〜２６０に対応する塩基を含む塩基長２２〜４０の塩基配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ３のオリゴヌクレオチドの塩基が挿入、欠失又は置換したオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４７】
なお、ハイブリダイゼーションを行う方法についてはプローブの項において記載した方法に従えばよく、ストリンジェントな条件についてもプローブの項において記載の条件と同様の条件を適用することができる。また、同一性の範囲や、挿入、欠失又は置換についても、プローブの項に記載したものと同様の範囲を適用することができる。
【００４８】
以下に、本発明の多型検出方法における配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３０に対応する塩基を含む領域の増幅に使用できるプライマーの一例を示す。
【００４９】
【表３】
2013236625.tif 000004
【００５０】
なお、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２２８〜２３０に対応する塩基における多型を検出するためには、前記Ｐ２及びＰ３で表される各オリゴヌクレオチドを、一対のプライマーセットとして用いることが挙げられる。
【００５１】
多型の検出方法は前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
【００５２】
＜多型検出方法＞
本発明にかかるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出方法は、前記ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００の多型を検出することを含む多型検出方法である。
本発明にかかる多型検出方法によれば、前記多型検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００の多型を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の多型検出方法は、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズしてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型の存在を検出すること。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
【００５３】
また、本発明においては、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は上記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）のハイブリダイズの前又は工程（Ｉ）のハイブリダイズすることと同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリットの融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
【００５４】
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることを含むことが好ましい。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【００５５】
本発明において、検出対象である試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＢＲＡＦ遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが好ましい。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００５６】
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
【００５７】
前記ＤＮＡに対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００５８】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが好ましい。このため、前記多型検出用プローブとして、前述の蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または相補配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【００５９】
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体的例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００６０】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特にＢＲＡＦ遺伝子を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００６１】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【００６２】
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００６３】
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型を評価できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【００６４】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＢＲＡＦ遺伝子Ｖ６００多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
【００６５】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数や存在比を評価することができる。
【００６６】
本発明の多型検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【００６７】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
【００６８】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【００６９】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
【００７０】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７１】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
【００７２】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００７３】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【００７４】
具体例として、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７５】
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、上述した多型検出方法によりＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいて薬剤に対する耐性又は薬剤の薬効を判定することを含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型を検出するので、ＢＲＡＦ遺伝子におけるこの多型に基づいて薬剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
また、多型の有無や変異配列と正常配列の存在比に基づいて薬剤に対する耐性や薬剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の薬効判定方法は、変異の有無や変異配列の存在比に基づいて、薬剤の投与量の増加、他の治療薬への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる薬剤としては、具体的には、分子標的治療薬、悪性黒色腫用薬、抗がん剤が挙げられ、特に分子標的治療薬及び悪性黒色腫用薬が挙げられる。
【００７６】
＜多型検出用キット＞
本発明のＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型を検出するための多型検出用キットは、上述した多型検出用プローブを含む。
この多型検出用キットには、ＢＲＡＦ遺伝子のうち、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号２２８〜２３０に対応する塩基における多型を簡便にかつ感度よく検出することが可能な既述の多型検出用プローブの少なくとも１種を含むことにより、例えばＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型の検出をより簡便に行うことができるなどの傾向がある。
【００７７】
また、本発明における多型検出用キットは、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含んでいてもよい。これにより、本発明における多型検出用キットは、精度よくＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型の検出を行うことができる。
また、本発明における多型検出用キットは、配列番号１に示す塩基配列における２２８番目〜２３０番目の塩基を含む塩基長５０〜１０００の領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含んでいてもよい。
なお、多型検出用キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【００７８】
多型検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
また、２種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明の多型検出用キットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば使用時に同じ反応系で各蛍光標識オリゴヌクレオチドと各検出対象配列とのＴｍ解析を行う場合、２種以上の各プローブは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていることが好ましい。
このように蛍光物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出を行うことも可能になる。
【００７９】
また、本発明における検出用試薬キットは、プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
【００８０】
さらに本発明の多型検出用キットは、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００における多型を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことが好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００８２】
［実施例１、２及び比較例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）にて、下記表４に記載のサンプル（人工核酸混合液１μＬ／反応液）と下記表５に記載のＰＣＲ反応液とを用いて、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。なお、下記表４に記載のサンプルにおいて、配列番号２に記載の野生型プラスミド、配列番号３に記載のＶ６００Ｅプラスミド、配列番号４に記載のＶ６００Ｋプラスミド、配列番号５に記載のＶ６００Ｒプラスミド、配列番号６に記載のＶ６００Ｄプラスミドをそれぞれ用いた。
【００８３】
【表４】
2013236625.tif 000005
【００８４】
【表５】
2013236625.tif 000006
【００８５】
なお、上記表５で使用したプローブとプライマーの詳細を以下の表６及び表７にそれぞれ示す。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。
【００８６】
【表６】
2013236625.tif 000007
【００８７】
【表７】
2013236625.tif 000008
【００８８】
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５８℃で１５秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
またＴｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【００８９】
なお、蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅの励起波長は３６５ｎｍ〜４１５ｎｍであり、検出波長は４４５ｎｍ〜４８０ｎｍである。蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０〜５５５ｎｍである。蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【００９０】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図２及び図３を得た。
図２中、（Ａ）〜（Ｅ）は配列番号８で表されるプローブを用いた場合の結果であり、（Ｆ）〜（Ｊ）は、配列番号７で表されるプローブを用いた場合の結果である。
図３中、（Ａ）〜（Ｅ）は配列番号９で表されるプローブを用いた場合の結果であり、（Ｆ）〜（Ｊ）は、配列番号７で表されるプローブを用いた場合の結果である。
図２及び図３中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
【００９１】
図２（Ｃ）では、図２（Ａ）に認められる野生型の４３℃付近のピークに加えて、５１℃にもピークが認められた。また、図２（Ｅ）では、４３℃付近のピークに加えて、４９℃にもピークが認められた。
この結果より、本発明の多型検出用プローブである配列番号８で表されるプローブを用いた場合には、Ｖ６００Ｋ及びＶ６００Ｄの２つの変異を同時に検出できることが明らかになった。
一方、図２（Ｆ）〜（Ｊ）の結果から明らかである通り、配列番号７で表されるプローブを用いた場合には、Ｖ６００Ｅの変異のみしか検出することができなかった。
【００９２】
図３（Ｃ）では、図３（Ａ）に認められる野生型の４５℃付近のピークに加えて、４９℃にもピークが認められた。また、図３（Ｄ）では、４５℃付近のピークに加えて、５７℃にもピークが認められた。
この結果より、本発明の多型検出用プローブである配列番号９で表されるプローブを用いた場合には、Ｖ６００Ｋ及びＶ６００Ｒの２つの変異を同時に検出できることが明らかになった。
一方、図３（Ｆ）〜（Ｊ）の結果から明らかである通り、配列番号７で表されるプローブを用いた場合には、Ｖ６００Ｅの変異のみしか検出することができなかった。
【００９３】
［比較例２］
多型検出用プローブを、下記表８で示される配列番号１４〜１６のプローブに変更した以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ解析を行った。
【００９４】
【表８】
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【００９５】
その結果、プローブの蛍光値の変化量を示す図４を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
【００９６】
図４の（Ａ）〜（Ｏ）に記載の通り、配列番号１４〜１６のプローブを用いた場合には、ＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００変異を検出することができないことが明らかになった。
【００９７】
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００多型を検出することができることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2013236625.tif 000013
【配列表】
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