(57)【要約】【課題】チロシナーゼを用いることによって、簡便に、あざやかな緑色〜青色を呈色する呈色反応を行う方法およびキットを提供すること。【解決手段】上記課題は、ａ）ペプチドとチロシナーゼとを混合する工程；（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、（ｄ）インキュベートした該混合物を低温保存する工程、を包含する、呈色方法を提供すること、および、呈色反応を行うためのキットであって、以下：（ｉ）ペプチド；および、（ｉｉ）チロシナーゼ；とを含むキットを提供することによって解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）ペプチドとチロシナーゼとを混合する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、
（ｄ）インキュベートした該混合物を低温保存する工程、
を包含する、呈色方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、２マーから５マーの長さである、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、３マーから４マーの長さである、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項４】
前記低温保存が−８０℃から０℃で行われる、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項５】
前記低温保存が−４０℃から−２０℃で行われる、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項６】
前記低温保存が−３０℃で行われる、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）において、さらに、アミノ酸が混合される、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）において、さらに、グリシンが混合される、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）の後、かつ、前記工程（ｄ）の前に、
（ｃ）該混合物のｐＨを調整する工程、
を包含する、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項１０】
前記工程（ｃ）におけるｐＨが８〜１１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、前記工程（ａ）において、さらに、アミノ酸が混合される、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、前記工程（ａ）において、さらに、グリシンが混合される、請求項１に記載の呈色方法。
【請求項１６】
前記Ｎ末端の修飾が、Ｎ末端アミノ基のアセチル化である、請求項１４または１５に記載の呈色方法。
【請求項１７】
呈色反応を行うためのキットであって、以下：
（ｉ）ペプチド；
（ｉｉ）チロシナーゼ；
とを含むキット。
【請求項１８】
前記ペプチドが、２マーから５マーの長さである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ペプチドが、３マーから４マーの長さである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
さらに、アミノ酸を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
さらに、グリシンを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２２に記載のキット。
【請求項２５】
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、さらに、
（ｉｖ）アミノ酸
を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２６】
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、さらに、
（ｉｖ）グリシン
を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２７】
請求項１に記載の呈色方法によって得られた産物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシナーゼとペプチドとを用いた呈色反応に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
チロシナーゼは、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、あるいは、カテコールオキシダーゼとも呼ばれる酵素であり、フェノール類の酸化反応を触媒する。
【０００３】
チロシナーゼは、チロシンを酸化して重合させることによって、メラニンを合成し、その結果、褐色〜黒色を呈する。
【０００４】
基質としてＤＯＰＡ又はドーパミンを用いることにより得られるメラニン前駆体もまた、重合により黒色のメラニンになる。また基質としてチロシンのα−アルキルエステル又はＤＯＰＡのα−アルキルエステルを用いることにより得られるメラニン前駆体は重合により黒色のメラニンになるが、ｐＨを調節して重合させることにより黄色〜紫のメラニンを合成することができる。また基質としてチロシンやＤＯＰＡとシステインとを併用することにより得られるメラニン前駆体は重合により褐色のメラニンになる（非特許文献１〜２）。
【０００５】
上記のとおり、従来法では、褐色ないし黒色以外の呈色のためには、酵素反応のｐＨを調整する必要があり、また、たとえ、酵素反応のｐＨを調整しても、あざやかな緑色〜青色の呈色を行うことができなかった。
【０００６】
チロシナーゼは元来、黒色、赤褐色、黄褐色、紫色、黒紫色に変色させる反応に関与し、食品等では歓迎されてこなかった。しかしながら、チロシナーゼにより青色〜緑色の鮮やかな呈色物質を作製することができれば、食品等への応用が可能となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】特開２００６−１５８３０４号明細書
【非特許文献２】特開２０１０−１１５２１３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、チロシナーゼを用いることによって、簡便に、あざやかな緑色〜青色を呈色する呈色反応の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、予想外にも、短いペプチド（代表的には、３マーないし４マー）をチロシナーゼと反応させることによって、簡便にあざやかな緑色〜青色を呈色する呈色反応を開発し、本発明を完成させた。
【００１０】
例えば、本発明によって、以下が提供される：
（項目１）
以下：
（ａ）ペプチドとチロシナーゼとを混合する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、
（ｄ）インキュベートした該混合物を低温保存する工程、
を包含する、呈色方法。
（項目２）
前記ペプチドが、２マーから５マーの長さである、項目１に記載の呈色方法。
（項目３）
前記ペプチドが、３マーから４マーの長さである、項目１に記載の呈色方法。
（項目４）
前記低温保存が−８０℃から０℃で行われる、項目１に記載の呈色方法。
（項目５）
前記低温保存が−４０℃から−２０℃で行われる、項目１に記載の呈色方法。
（項目６）
前記低温保存が−３０℃で行われる、項目１に記載の呈色方法。
（項目７）
前記工程（ａ）において、さらに、アミノ酸が混合される、項目１に記載の呈色方法。
（項目８）
前記工程（ａ）において、さらに、グリシンが混合される、項目１に記載の呈色方法。
（項目９）
前記工程（ｂ）の後、かつ、前記工程（ｄ）の前に、
（ｃ）該混合物のｐＨを調整する工程、
を包含する、項目１に記載の呈色方法。
（項目１０）
前記工程（ｃ）におけるｐＨが８〜１１である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、前記工程（ａ）において、さらに、アミノ酸が混合される、項目１に記載の呈色方法。
（項目１５）
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、前記工程（ａ）において、さらに、グリシンが混合される、項目１に記載の呈色方法。
（項目１６）
前記Ｎ末端の修飾が、Ｎ末端アミノ基のアセチル化である、項目１４または１５に記載の呈色方法。
（項目１７）
呈色反応を行うためのキットであって、以下：
（ｉ）ペプチド；
（ｉｉ）チロシナーゼ；
とを含むキット。
（項目１８）
前記ペプチドが、２マーから５マーの長さである、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
前記ペプチドが、３マーから４マーの長さである、項目１７に記載のキット。
（項目２０）
さらに、アミノ酸を含む、項目１７に記載のキット。
（項目２１）
さらに、グリシンを含む、項目１７に記載のキット。
（項目２２）
前記チロシナーゼがナメコ由来のチロシナーゼである、項目１７に記載のキット。
（項目２３）
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（１）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列、あるいは、そのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列、あるいは、そのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有する、項目２２に記載のキット。
（項目２４）
前記ナメコ由来のチロシナーゼが、
（６）配列番号１または配列番号３に記載の塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；および、
（７）配列番号２または配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする配列からなる、ポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる、項目２２に記載のキット。
（項目２５）
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、さらに、
（ｉｖ）アミノ酸
を含む、項目１７に記載のキット。
（項目２６）
前記ペプチドが、Ｎ末端が修飾されたペプチドであり、そして、さらに、
（ｉｖ）グリシン
を含む、項目１７に記載のキット。
（項目２７）
項目１に記載の呈色方法によって得られた産物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、チロシナーゼを用いて、簡便に、鮮やかな緑色〜青色を呈色する呈色反応を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＧＧＹＲペプチド（チューブ番号１〜３）、ＧＬＹペプチド（チューブ番号４〜６）、および、チロシン（チューブ番号７〜９）のそれぞれと、チロシナーゼとを用いた呈色反応の結果を示す写真である。
【図２】図２は、Ｎ末端のアミノ基をアセチル化したＹＶＧペプチド、グリシン、および、チロシナーゼとの混合物をインキュベートし、ｐＨを調整し、低温保存した結果示された呈色を示す写真である。
【図３】図３は、Ｎ末端のアミノ基をアセチル化したＹＶＧペプチド、グリシン、および、チロシナーゼとの混合物をインキュベートし、低温保存し、その後、室温保存したサンプルの吸収スペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（Ｉ．用語の定義）
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１４】
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００１５】
本明細書において使用する場合、「ペプチド」のアミノ酸残基は、修飾されていない天然のアミノ酸であっても、修飾されていてるアミノ酸であってもよい。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ペプチドのアミノ末端のアミノ基がアシル化される。
【００１６】
チロシナーゼが作用する限り、ペプチドの代わりに、「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」を使用してもよい。本明細書において使用する場合、用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むオリゴマーないしポリマーであり得る。
【００１７】
本明細書において使用するペプチドは、２マーから５マー、好ましくは３マー〜４マーである。本発明において使用するペプチドは、好ましくはチロシンを少なくとも１つ含む。
【００１８】
本明細書において使用する場合、用語「チロシナーゼ」とは、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、あるいは、カテコールオキシダーゼとも呼ばれる酵素であり、フェノール類の酸化反応を触媒する。例えば、チロシナーゼは、
Ｌ−チロシン＋Ｌ−ドーパ＋Ｏ２→Ｌ−ドーパ＋ドーパキノン＋Ｈ２Ｏ
という反応を触媒する。それゆえ、チロシナーゼは、チロシンを酸化してメラニンを生じる。チロシナーゼ活性の測定方法については特に制限はなく、通常の方法により測定することができる。チロシナーゼの供給源としては、代表的には、ナメコ、糸状菌、バクテリア、植物、および、動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
本明細書において「チロシナーゼ」の供給源として利用する「ナメコ」としては、Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ（菌界，担子菌門，菌じん綱，ハラタケ目，モエギダケ科，スギタケ属，ナメコ）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において使用される場合、「ナメコ由来のチロシナーゼ」とは、「ナメコ」から単離されたチロシナーゼ、または、ナメコのゲノムにコードされるチロシナーゼをいう。「ナメコ由来のチロシナーゼ」としては、配列番号１に記載の塩基配列またはその改変体によってコードされるポリペプチド、あるいは、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその改変体を含むポリペプチドをいい、例えば、
（１）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を含む、ポリヌクレオチド；
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする配列を含む、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、；
（４）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；および
（５）（１）〜（３）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされ、そして、チロシナーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
【００２１】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
【００２２】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００２３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００２４】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃（好ましくは６５℃）、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４（好ましくはｐＨ７．０）で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００２５】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００２６】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列(他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（８）：２４４４−２４４８、  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
【００２７】
（１）  ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）  ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）  ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）  ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）  ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
【００２８】
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
【００２９】
（遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）
あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００３０】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００３１】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
【００３２】
当該分野において、親水性指数もまた、改変設計において考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００３３】
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３４】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００３５】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【００３６】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００３７】
（変異型ポリペプチドの作製方法）
本発明のポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
【００３８】
（チロシナーゼ活性測定法）
チロシナーゼ活性測定法としては、周知の活性測定法を利用することが可能である。例えば、ｔ−ｂ−カテコールを基質とした比色法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
（ＩＩ．本発明の呈色反応条件）
本発明の呈色方法は、代表的には、以下：
（ａ）ペプチドとチロシナーゼとを混合する工程；
（ｂ）該混合物をインキュベートする工程；および、
（ｄ）インキュベートした該混合物を低温保存する工程、
を包含するが、必要に応じて、
・工程（ａ）においてアミノ酸を混合してもよく、
・工程（ｂ）の後、かつ、前記工程（ｄ）の前に、工程（ｃ）として、混合物のｐＨを調整する工程を行ってもよい。
【００４０】
本発明において用いるペプチドは、天然のペプチドであっても、修飾したペプチドであってもよい。ペプチドの長さは、特に限定されることはないが、２マーから５マー、好ましくは３マー〜４マーである。本発明において使用するペプチドは、好ましくはチロシンを少なくとも１つ含む。本発明において使用するペプチドは、好ましくはチロシンを少なくとも１つ含む。ペプチドの修飾法は特に限定されることはないが、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などが挙げられる。代表的な修飾は、アミノ末端のアミノ基のアシル化である。修飾ペプチドを用いた場合には、工程（ａ）においてアミノ酸を混合することが好ましい。
【００４１】
ペプチドに加えて添加するアミノ酸は、特に限定されないが、好ましくは、グリシン、アルギニン、バリン、および、ヒスチジンなどを利用することができる。添加するアミノ酸によって色調を変化させることができ、例えば、グリシンの場合は青色、アルギニンの場合は青色、バリンの場合は緑色、ヒスチジンの場合は黄緑色を呈色することが可能である。
【００４２】
本発明の呈色方法において使用するインキュベーションの温度としては、チロシナーゼが作用する任意の温度を利用することができる。代表的には、インキュベーションの温度は２５℃であるがこれに限定されない。
【００４３】
本発明の呈色方法において使用する低温保存の温度は、−８０℃〜０℃、好ましくは−５０℃〜−１０℃、より好ましくは−４０℃〜−２０℃、さらにより好ましくは−３０℃であるが、これらに限定されない。
【００４４】
工程（ｃ）においてｐＨを調整する場合、ｐＨは、好ましくはｐＨ８〜ｐＨ１１、より好ましくはｐＨ８．５〜ｐＨ１０．５、さらにより好ましくはｐＨ９〜ｐＨ１０であるが、これらに限定されない。
【００４５】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：ペプチドおよびアミノ酸を基質としたチロシナーゼ酵素による呈色反応）
基質として、４マーのペプチド（配列番号５：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）、３マーのペプチド（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ）、およびアミノ酸（チロシン）を利用した。１６ｍＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）に、２ｍＭの基質および０．１Ｕのチロシナーゼを添加し、混合した。混合液を２５℃で４０分間インキュベートし、Ｏ２の取り込みをモニターした。その後、氷上に数時間放置し、次に、−３０℃で１６時間、低温保存した。その結果、図１に示すように、４マーのペプチドを用いた場合には鮮やかな緑色を呈色し、３マーのペプチドを用いた場合には鮮やかな青色を呈色したのに対して、チロシンを用いた場合には、褐色を呈色した。
【００４７】
この結果は、チロシナーゼの基質としてチロシンではなく、ペプチドを用いた場合に、鮮やかな色調の呈色反応が起きたことを実証するものである。
【００４８】
（実施例２：修飾ペプチドの使用）
実施例１における緑色ないし青色の呈色物質生成はチロシナーゼ反応によりキノン生成後、低温下で非酵素的に起こる反応で生成していると推測し、チロシナーゼ反応後の非酵素的反応に影響を与える可能性のある条件を検討した。
【００４９】
まず、呈色物質生成反応はチロシナーゼによりキノンが生成された後、非酵素的に基質のN末端のアミノ基と反応して起きると予測し、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの３マーのＮ末端アミノ基をアセチル化によりブロックした修飾ペプチド（ＡｃＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）で実験を行なったところ、呈色は見られなかった。
【００５０】
続いて、アミノ基をブロックした上記ペプチド（基質）とグリシン（Ｇｌｙ）とチロシナーゼとを混合し、インキュベートし、そして、−３０℃で低温保存したところ青色を呈色した。この結果は基質と共に添加したＧｌｙのアミノ基により呈色物質生成反応が進行したと結果であると考えられる。
【００５１】
（実施例３：チロシナーゼ反応後のｐＨの調整による色調の制御）
非酵素的に起こる反応はチロシナーゼ反応と最適ｐＨが異なると仮定し、チロシナーゼ反応後ｐＨを変化させて結果を確認した。具体的には、以下の手順で実験を行った。
【００５２】
２ｍＭの基質（実施例２で用いたＡｃＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）と２ｍＭ  Ｇｌｙをチロシナーゼ（０．８Ｕ/ｍｌ）と混合し、２５℃、４０分インキュベートした（１６ｍＬの１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中）。酵素反応後に、１０ｍＭ  ＮａＯＨを適量添加することによりｐＨを調整した。次に、反応混合物を−３０℃保存で１６時間低温保存し、色調を確認した。その結果を、図２に示す（チューブ番号１＝ｐＨを８．０に調整；チューブ番号２＝ｐＨを９．０に調整；チューブ番号３＝ｐＨを９．５に調整；チューブ番号４＝ｐＨを１０に調整；チューブ番号５＝ｐＨを１０．５に調整；チューブ番号６＝ｐＨを１１に調整；および、チューブ番号７＝ｐＨを１２に調整）。この結果は、チロシナーゼ酵素反応の後にｐＨを変化させることによって、色調を変化させることができたことを実証するものである。すなわち、この結果は、チロシナーゼ反応後に起こる非酵素的呈色反応において、ｐＨを変化させることによって、呈色する色調を変化することができることを示すものである。特に、ｐＨを８．０〜１０に調整した結果、鮮やかな青色〜緑色の呈色が確認できた。その一方で、ｐＨが１０．５以上の場合は、呈色反応によって黄色〜褐色を示した。
【００５３】
（実施例４：色調の評価）
２ｍＭの基質（実施例２で用いたＡｃＴｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）と２ｍＭ  Ｇｌｙをチロシナーゼ（０．８Ｕ/ｍｌ）と混合し、２５℃、４０分インキュベートした（１６ｍＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中）。数時間氷上に放置し、反応混合物を−３０℃保存で１６時間低温保存し、室温で融解し、室温に３日間放置した。０．１ｍｍの光路長の石英キュベットを用いて、吸収スペクトルを測定した。結果を図３に示す。「１」にピークは６１６．５ｎｍであり、「２」のピークは４２０ｎｍであり、そして、「３」のピークは２７９．５ｎｍであった。この結果から、以下の考察を行った。
６１６．５ｎｍの吸光度が０．１ｃｍのセルで０．３４６２６であった。２ｍＭの基質がすべて反応したとすると、モル吸光係数は１，７３０Ｍ−１ｃｍ−１となることから、上記の結果、青色が強いことが確認された。なお、実際の反応は２５℃で行われたが、２５℃での溶存酸素濃度は２５３μＭであり、それが反応の上限濃度だと推定される。そのため、基質として利用可能な最大量が２ｍＭではなくて２５３μＭだとすると、計算上の吸光係数は１３，６８６Ｍ−１ｃｍ−１となり、さらに青色が強いことになる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明に従って、ペプチドとチロシナーゼを用いることによって、簡便に、あざやかな緑色〜青色を呈色する呈色反応を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
配列番号１：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ１をコードする遺伝子の核酸配列
配列番号２：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ１のアミノ酸配列
配列番号３：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ２をコードする遺伝子の核酸配列
配列番号４：ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のチロシナーゼｔｙｒ２のアミノ酸配列
配列番号５：実施例で使用した４マーペプチドのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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