(57)【要約】      （修正有）【課題】高いＯ2−消去活性（ＳＯＤ活性）の他に遊離金属キレ−ト能、基質を介さないＨ2Ｏ2消去活性（カタラ−ゼ活性）のすべてを有する、新規な抗酸化剤を提供する。【解決手段】下記式（１）で表され、上記式（１）における上記Ａが、下記式（２）で表される化合物であり、上記Ｂがフタロシアニン錯体、ポルフィリン錯体またはこれらの誘導体である抗酸化剤。Ａ−（Ｂ）２・・・・・（１）（式中、Ａは金属イオンを捕捉可能な基を示す。）−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−・・・・・（２）（式中、ｎは、１〜１０の整数を示す）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される抗酸化剤。
Ａ−（Ｂ）２  ・・・・・（１）
（式中、Ａは金属イオンを捕捉可能な基を示す。）
【請求項２】
上記式（１）における上記Ａが、下記式（２）で表される化合物であることを特徴とする請求項１記載の抗酸化剤。
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−  ・・・・・（２）
（式中、ｎは、１〜１０の整数を示す）
【請求項３】
上記式（１）における上記Ｂがフタロシアニン錯体、ポルフィリン錯体またはこれらの誘導体であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗酸化剤。
【請求項４】
上記式（２）における上記ｎが３〜５の整数であることを特徴とする請求項２記載の抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗酸化剤に関し、さらに詳しくは、ポルフィリン錯体を利用した新規な抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素が過剰に体内で発生することにより酸化ストレスが生じる。体内に存在する細胞の中で、特に神経細胞は酸化ストレスに対して脆弱であり、このように過剰に発生した活性酸素による酸化ストレスはさまざまな神経変性疾患の発症へ関与していることが示唆されている。これら疾患を導くメディエ−タ−となる活性酸素の消去はこれら疾患の治療には極めて有効である。
【０００３】
このような観点から本発明者らは、特許文献１及び２においてポルフィリン錯体を抗酸化剤として提案すると共に、抗酸化剤として下記式で示される化合物を提案している。
【化１】
2013227388.tif 000002
【０００４】
一方で、近年の研究からアルツハイマ−病（ＡＤ）、パ−キンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの疾病においては、脳内で金属の蓄積量が多く、それらがこれら疾患を引き起こす原因の１つとして考えられている（たとえば特許文献１又は２）。しかし、活性酸素消去能があり、さらに金属を排除できる薬剤の開発これまで行われてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２５５０１１号公報
【０００６】
【特許文献２】特開２００７−７５０５８号公報
【０００７】
【非特許文献１】Bush.Al et al,Nature Medicine (2012)
【０００８】
【非特許文献２】Kiaei et al.J.Neurosci. (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のとおり、近年抗酸化剤に求められる機能は、高いＯ2−消去活性（ＳＯＤ活性）の他に遊離金属キレ−ト能、Ｈ2Ｏ2消去活性（カタラ−ゼ活性）があるが、これをすべて満足する抗酸化剤は未だ提供されておらず、これらの機能の全てを有する抗酸化剤の開発が要望されているのが現状である。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、高いＯ2−消去活性（ＳＯＤ活性）の他に遊離金属キレ−ト能、Ｈ2Ｏ2消去活性（カタラ−ゼ活性）のすべてを有する、新規な抗酸化剤を提案することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解消すべくポルフィリンを活性酸素除去に用いた抗酸化剤について鋭意検討した結果、２個のポルフィリン分子を種々置換基で連結してなる種々化合物を合成するうちに、特定の置換基の場合に上記課題を解消しうること知見し、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の各発明を提供するものである。
１．下記式（１）で表される抗酸化剤。
Ａ−（Ｂ）２  ・・・・・（１）
（式中、Ａは金属イオンを捕捉可能な基を示す。）
２．上記式（１）における上記Ａが、下記式（２）で表される化合物であることを特徴とする１記載の抗酸化剤。
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−  ・・・・・（２）
（式中、ｎは、１〜１０の整数を示す）
３．上記式（１）における上記Ｂがフタロシアニン錯体、ポルフィリン錯体またはこれらの誘導体であることを特徴とする１又は２記載の抗酸化剤。
４．上記式（２）における上記ｎが３〜５の整数であることを特徴とする２記載の抗酸化剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗酸化剤は、高いＯ2−消去活性（ＳＯＤ活性）の他に遊離金属キレ−ト能、Ｈ2Ｏ2消去活性（カタラ−ゼ活性）の全ての機能を有し、優れた抗酸化機能を発現するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、Ｔｓ−トリアミンジオ−ル（Ｔｓ−トリアミン−ジオ−ル）のメシル化により得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を示すチャ−トである。
【図２】図２は、Ｔｓ−テトラミン−ジオ−ルのメシル化得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を示すチャ−トである。
【図３】図３は、ポルフィリンモノマ−の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を示すチャ−トである。
【図４】図４は、ポルフィリンダイマ−の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を示すチャ−トである。
【図５】図５は、ポルフィリンダイマ−のＴｓ基脱保護により得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を示すチャ−トである。
【図６】図６は、トリアミンダイマ−へのＭｎ導入においてＵＶ−ｖｉｓスペクトルにより、極大吸収波長(Ｓｏｒｅｔ帯)の長波長シフトやＱ帯を追跡した結果を示すチャ−トである。
【図７】図７は、ＺｎＰＤ−Ｎ３溶液の蛍光スペクトルとＺｎＰＤ−Ｎ３溶液に過剰量のＦｅＣｌ２を加えたときの蛍光スペクトルを示すチャ−トである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の抗酸化剤は、下記式（１）で表される。
Ａ−（Ｂ）２  ・・・・・（１）
（式中、Ａは金属イオンを捕捉可能な基を示す。）
【００１６】
上記Ａで表される金属イオンを捕捉可能な基は、下記式（２）で表される化合物であるのが好ましい。
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−  ・・・・・（２）
（式中、ｎは、１〜１０の整数を示すのが好ましく、上記ｎが３〜５の整数であるのがさらに好ましい。）
上記式（２）で表される化合物の具体例は以下の置換基などである。
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）３−
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）４−
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２）５−
また、上記Ａで表される金属イオンを捕捉可能な基としては、
−Ｃ２Ｈ４−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−
−Ｃ３Ｈ６−（ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−
（式中、ｎは３〜５の整数を示す）
も好ましく用いることができる。
【００１７】
上記Ｂで表される酸素を捕捉可能な基は、フタロシアニン錯体、ポルフィリン錯体またはこれらの誘導体であるのが好ましい。
錯体を形成する金属としては、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ｃｕ等が挙げられる。
この基の具体例としては下記する置換基などが挙げられる。
【００１８】
【化２】
2013227388.tif 000003
【００１９】
本発明の抗酸化剤の具体例としては以下の化合物などがあげられる。
【化３】
2013227388.tif 000004
【００２０】
本発明の抗酸化剤は、上述の化合物単独で十分に所望の効果を得ることができるが、上記化合物の効果を損なわない範囲でたとえば通常この種の薬品の製剤化において用いられる種々成分を配合してもよい。
【００２１】
本発明の抗酸化剤は、合成は、（１）ポリアミンブロックの合成、（２）ポルフィリンモノマ−の合成、（３）ポルフィリンダイマ−化、（４）Ｔｓ基脱保護、（５）Ｍｎ導入の５ステップを行うなどして製造することができる。各ステップの詳細については実施例で示す。
【００２２】
本発明の抗酸化剤は、ス−パ−オキシドディスムタ−セ（ＳＯＤ）活性とパ−オキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）消去活性とを有すると共に、金属イオン捕捉機能とカタラ−ゼ機能とを有する。これらの機能についての確認方法について説明する。
ＳＯＤ活性、ＯＮＯＯ−消去活性は、ストップトフロ−法により測定することができる。
ストップトフロ−法は、溶液の迅速な混合および反応追跡に使用されている手法である。反応する２つの化学種の溶液を反応時間スケ−ルよりも速く混合することにより、瞬間的に濃度非平衡状態を生成することができ、その後の反応系内の濃度組成の動的変化を観察して、反応速度を決定することができる。ストップトフロ−法では、シトクロムＣ法などの間接法とは異なり、Ｏ２・−の減衰を直接観察することができるため、汎用性が高い。
ストップトフロ−法による反応速度定数の算出法を以下に示す。
ス−パ−オキシドアニオンラジカル(Ｏ２・)の不均化反応(２Ｏ２・   +２Ｈ+→  Ｈ２Ｏ２+Ｏ２)の速度式は以下のように表すことができる。
−ｄ[Ｏ２・]/ｄｔ=kself[Ｏ２・]２+kobs[Ｏ２]      −(４−１)
kself[Ｏ２・]２は本反応条件下(ｐＨ=８．１  ,  温度３７．０℃)ではとても小さく無視できるほどの大きさであるので、次式(３−２)のように書くことができる。
−ｄ[Ｏ２・]/ｄｔ=kobs[Ｏ２・]                −(４−２)
ＤＭＳＯ中のＫＯ２とポルフィリン溶液(溶媒ＨＥＰＥＳ/ＨＥＰＥＳＮａ緩衝溶液)を急速混合し、Ｏ２・のピ−クを吸高度２７０ｎｍで追跡すると、反応初期は見かけ上一次反応となる。この減衰曲線を各ポルフィリン濃度について求める。次に(４−２)を移項、積分すると、
−ｄ[Ｏ２・]／[Ｏ2・]=kobsｄｔ              −(４−３)
ｌｎ[Ｏ２・]０／[Ｏ２・]ｔ=−kobs×ｔ        −(４−４)
となり、測定したＯ２・の消去速度定数(kobs)は反応時間に対しＯ2・の吸光度の自然対数(ｌｎ)をプロットすると擬一次直線となる。各濃度でkobsを算出する。２次反応速度定数(kcat)と先ほどのkobsには以下の条件式が成り立つ。
kcat=kobs×[ＳＯＤ  ｍｏｄｅｌ]            −（４−５)
したがって、横軸に濃度、縦軸にkobsをプロットして得られたグラフには直線関係が成り立ち、その傾きから反応速度定数(kcat：Ｍ−１ｓ−１)が得られる。
【００２３】
また、金属イオン捕捉機能は、キレ−ト滴定、Ｚｎ錯体の1Ｈ−ＮＭＲ滴定により測定することができるが、本発明の抗酸化剤においては、蛍光スペクトルにおいてエキシプレックス形成による消光が起こるはずであるため、蛍光スペクトルの変化を追跡することにより確認することが可能である。
【００２４】
カタラ−ゼ活性は、Ｈ2Ｏ2が不均化され、Ｈ2ＯとＯ2が生成する反応を起こすように活性化することを意味する。
【００２５】
このため、カタラ−ゼ活性測定法として、不均化されるＨ２Ｏ2量を測定する方法、あるいは不均化により生成するＯ2量を測定する方法の２通りがある。
Ｈ２Ｏ２量の測定は、直接吸光度を測定する方法、ペルオキシダ−ゼなどにより間接的に測定する方法がある。しかし、吸光度法は、混在する他の化合物の影響を受けやすいため、正確な測定を行いにくく、間接法は、直接法に比べ、誤差が大きくなりやすい。その上Ｈ２Ｏ２の不均化を測定したい場合、Ｈ２Ｏ２のラジカル開裂(Ｈ２Ｏ２→・ＯＨ+ＯＨ−)の影響が考慮されないため、あまり正確な方法とは言い難い。
一方Ｏ２測定は、Ｈ２Ｏ２が不均化された場合のみに発生するＯ2を測定するため、精度が高く、酵素活性などの精密な評価を行いたい場合、通常こちらの方法を用いるのが一般的である。クラ−ク型溶存酸素電極は、装置自体は高価であるものの、数ｎｍｏｌ程度の感度で測定でき、その上酸素を特異的に検出するため、最も精度の高い方法である。
クラ−ク型溶存酸素電極はたとえば市販の装置（英国ＨＡＮＳＡＴＥＣＨ社製、ＯＸＹ−１）で、アノ−ドである銀電極、カソ−ドである白金電極の両極において、以下のような反応が進行する。
カソ−ド     Ｏ２  +  ４Ｈ+  +  ４ｅ−  →  ２Ｈ２Ｏ
アノ−ド     ４Ａｇ  +  ４Ｃｌ−        →  ４ＡｇＣｌ  +  ４ｅ−
溶液中にＯ2があると、上記のような電極反応が進行し、その際の電気化学ポテンシャル量をＯ2量に換算してＯ2量を測定する。
【００２６】
本発明の抗酸化剤は、活性酸素の影響により体内で生じる老化、発癌、炎症、虚血性臓器障害、動脈硬化などの種々の障害や疾患に対する治療用および／または予防用組成物として使用することができる。抗酸化組成物の投与経路は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与などが挙げられ、経口投与に適した製剤には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが挙げられる。治療用および／または予防用組成物には、薬剤的に許容できる担体として、当該技術分野で公知の適当な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コ−ティング剤などを含んでもよい。
また、皮膚または粘膜の老化、発癌または炎症、もしくは皮膚の日焼けなどの皮膚または粘膜に関する種々の症状を治療しまたは改善するための経皮投与用外用医薬品または化粧品として使用することもできる。外用医薬品または化粧品として適した財形としては溶液剤、パップ剤、貼布剤などが含まれる。外用医薬品には、薬剤的に許容できる担体として、賦形剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤などを含んでもよい。
さらには、食品や飲料の形で提供することも可能であると考えられる。好ましい食品の形態としては粉末、顆粒、ペ−スト状、ゼリ−状などが挙げられる。食品にする場合、適宜他の添加剤などを添加しうる。食品または飲料には、特定保健用食品、病者用食品等の範疇にあるものも含まれる。
なお、本発明の抗酸化剤の使用量は、使用目的や剤型、使用者の体格等により任意であり、特に制限されるものではない。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
［合成例］
金属イオンキレ−ト能を有する新規Ｍｎポルフィリンダイマ−「ＭｎＰＤ−Ｎ３」を合成した。
【００２９】
合成は、（１）ポリアミンブロックの合成、（２）ポルフィリンモノマ−の合成、（３）ポルフィリンダイマ−化、（４）Ｔｓ基脱保護、（５）Ｍｎ導入の５ステップで行った。以下、各ステップについて具体的に説明する。
（１）ポリアミンブロックの合成
出発原料として、トシル基（Ｔｓ基）で保護したジエチレントリアミン（ジエチレントリアミン）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリス（ｐ−トルエンスルホニル）ジエチレントリアミン（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−Ｔｒｉｓ(ｐ−トルエンスルフォニルｌ)ジエチレントリアミン）（東京化成）、トリエチレンテトラミン（トリエチレンテトラミン）(Ａｌｄｒｉｃｈ)を用いた。全ての合成で、反応の進行はシリカＴＬＣ（クロロホルム：メタノ−ル＝９：１など）で追跡した。
（ａ）Ｔｓ−トリアミン（Ｔｓ−トリアミン）の両末端アルキルジオ−ル化
【００３０】
【化４】
2013227388.tif 000005
【００３１】
８．４８７ｇ(１５ｍｍｏｌ)の’’Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’‘−トリ(ｐ−トルエンスルフォニルｌ)ジエチレントリアミン(Ｔｓ−トリアミン)、３．００ｇ(３４．１ｍｍｏｌ)の炭酸エチレン、０．０３ｇ(０．５８ｍｍｏｌ)のＫＯＨを入れ、窒素下、１６５℃で加熱攪拌した。
４時間加熱攪拌した後、反応混合物を９０℃まで冷却し、エタノ−ル２０ｍｌを加えて、１時間、加熱攪拌した。
クロロホルム：水で分液、クロロホルム相を回収し、溶媒を除去して固体を回収した。
再結晶で得られた白色固体を吸引ろ過で回収し、５０℃で真空乾燥しＴｓ−トリアミンジオ−ルを得た。収量は５．１３ｇ、収率は５２％であり、得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの帰属は７．６８ｐｐｍ  ６Ｈ  フェニル  Ｈ、７．４３ｐｐｍ  ６Ｈ  フェニル  Ｈ、４．８３ｐｐｍ  ２Ｈ  ＮＨ、３．５０−３．１０ｐｐｍ  １２Ｈ  −ＣＨ２−、２．４２ｐｐｍ  ９Ｈ  Ｔｓ−Ｍｅであった。
（ｂ）Ｔｓ−トリアミンジオ−ル（Ｔｓ−トリアミン−ジオ−ル）のメシル化
【００３２】
【化５】
2013227388.tif 000006
【００３３】
１．００６ｇ(１．５４ｍｍｏｌ)のＴｓ−トリアミン−ジオ−ルを入れ、クロロホルム１０ｍｌに溶解させた。
−１５〜−２０℃に冷却し、メタンスルホニルクロリド２５０μｌ(３．２３ｍｍｏｌ)を加え、３０分攪拌した。その後、氷５ｍｌ（５ｇ）、１０％ＨＣｌ２．５ｍｌの混合液を加え分液し、有機層を回収した。
脱水、ろ過後、溶媒を除去し、その後酢酸エチルで再結晶しメシル化物を得た。得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を図１に示す。帰属は７．７８ｐｐｍ  ６Ｈ  フェニル  Ｈ、７．３８ｐｐｍ  ６Ｈ  フェニル  Ｈ、４．４３−３．３８ｐｐｍ  １６Ｈ  −ＣＨ２−、３．０８ｐｐｍ  ６Ｈ  Ｍｅ、２．４７ｐｐｍ  ９Ｈ  Ｔｓ−Ｍｅであり、収量は０．１７９６ｇ、収率は２３％であった。
（ｃ）トリエチレンテトラミン（トリエチレンテトラミン）のＴｓ基保護
【００３４】
【化６】
2013227388.tif 000007
【００３５】
２５ｇ(０．１３１ｍｏｌ)のｐ−トルエンスルホン酸クロリドを入れ、６５ｍｌのピリジンに溶解させ、窒素下で５０〜６０℃にした。
４．８ｇ(０．０３２８ｍｏｌ)のトリエチレンテトラミンのピリジン溶液５ｍｌを滴下漏斗を用いて滴下し、滴下後１時間攪拌を続けた。
溶液を冷却後、水３２ｍｌを加え、１晩攪拌した。
アイスバスで２時間冷却し、沈殿を吸引ろ過で回収し、Ｔｓ−テトラミンを得た。洗浄は冷却した９５％エタノ−ルで行った。収量は７．４４１ｇ、収率は３０％であった。
得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)の帰属は７．７７ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、７．３４ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、５．５０ｐｐｍ  ２Ｈ  ＮＨ、３．４４−３．１８ｐｐｍ  １２Ｈ  −ＣＨ２−、２．４５ｐｐｍ  １２Ｈ  Ｔｓ−Ｍｅであった。
（ｄ）Ｔｓ−テトラミンの両末端アルキルジオ−ル化
【００３６】
【化７】
2013227388.tif 000008
【００３７】
１．００ｇ(１．３１ｍｍｏｌ)のＴｓ−テトラミンと、１．８１ｇ(１３．１ｍｍｏｌ)の炭酸カリウムを入れ、２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。
２１４μｌ(３．０ｍｍｏｌ)の２−ブロモエタノ−ルを加え、窒素下７５℃で２日間加熱攪拌した。
ろ過で炭酸カリウムを除き、真空エバポレ−トによりＤＭＦをエバポレ−トし、黄色固体を得た。
得られた黄色固体にメタノ−ルを加えたところ、白色の沈殿としてＴｓ−テトラミン−ジオ−ルが得られた。
収量は０．２８７９７ｇ、収率は２６％であった。得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ｉｎ  ＣＤＣｌ３)の帰属は７．７５ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、７．４２ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、２．４９ｐｐｍ  １２Ｈ  Ｔｓ−Ｍｅ、３．９０−２．６０ｐｐｍ  ２０Ｈ  −ＣＨ２−であった。
（ｅ）Ｔｓ−テトラミン−ジオ−ルのメシル化
【００３８】
【化８】
2013227388.tif 000009
【００３９】
１１．２８６ｇ(１３．３ｍｍｏｌ)のＴｓ−テトラミン−ジオ−ル(Ｍ.Ｗ=８５１．０８)、４ｍｌのトリエチルアミンを入れ、ジクロロメタン６５ｍｌに溶解させた。
−１５〜−２０℃に冷却し、メタンスルホニルクロリド３．２４２ｇ(２８．３ｍｍｏｌ)をゆっくり加えた。
溶液を３０分攪拌し、４３ｍｌ（４３ｇ）の氷と２２ｍｌの１０％ＨＣｌを加え、分液し、有機層を回収した。
脱水後、溶媒を除去し、白色の固体としてのメシル化物を得た。得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を図２に示す。帰属は７．７９ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、７．３７ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、４．４３ｐｐｍ  ４Ｈ、３．３８ｐｐｍ  ４Ｈ、３．４３ｐｐｍ  ４Ｈ  −ＣＨ２−、３．０６ｐｐｍ  ６Ｈ  Ｍｅ、２．４７ｐｐｍ  １２Ｈ  Ｔｓ−Ｍｅであり、収量は６．２７５ｇ、収率は４７％であった。
（ｆ）トリエチレンテトラミンのＮｓ基保護
【００４０】
【化９】
2013227388.tif 000010
【００４１】
ｏ−ニトロベンゼンスルホン酸クロリド１２．１８ｇ(０．０５４９ｍｏｌ)をピリジン３０ｍｌに溶解させ、滴下漏斗でトリエチレンテトラミン（トリエチレンテトラミン）２ｍｌの脱水ピリジン(３ｍｌ)溶液５ｍｌを窒素下、５０℃で加熱攪拌しながら加えた。１時間後、冷却し、水を２０ｍｌゆっくりと加え、１晩攪拌した。黒色ゲル状液体を少量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、水に滴下することで沈殿精製し、茶色固体を得た。収量は３．６６ｇ、収率は４３％であった。得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)の帰属は、７．７９ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、７．３７ｐｐｍ  ８Ｈ  フェニル  Ｈ、４．４３ｐｐｍ  ４Ｈ、３．３８ｐｐｍ  ４Ｈ、３．４３ｐｐｍ  ４Ｈ  −ＣＨ２−、３．０６ｐｐｍ  ６Ｈ  Ｍｅ、２．４７ｐｐｍ  １２Ｈ  Ｔｓ−Ｍｅであった。
（２）ポルフィリンモノマ−の合成
（ａ）Ｈ２ＰｙＰ３Ｐの合成
【００４２】
【化１０】
2013227388.tif 000011
【００４３】
ベンズアルデヒド１４ｍｌ、４−ピリジンカルボキシアルデヒド６ｍｌ、ピロ−ル１２．５ｍｌをプロピオン酸５００ｍｌに溶解させ、１．５時間加熱還流後、エチレングリコ−ル３５０ｍｌを加え、放冷し、冷蔵庫で一晩静置した。溶液をろ過し、紫色固体を回収した。
シリカカラムクロマトグラフィ−(展開溶媒：クロロホルム)でＨ２ＰｙＰ３Ｐを単離した。なお、１番目に出てくるのがＴＰＰであり、２番目に出てくるのが目的物質のポルフィリンモノマ−である。
得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を図３に示す。帰属はＡ：  −２．８１  (２Ｈ,ｉｎｎｅｒ  Ｈ)、  Ｂ：  ９．０４  (２Ｈ,  ピリジル)、  Ｃ：  ８．９０,  ８．７９  (８Ｈ,  β−ピロ−ル)、  Ｄ：  ８．２０(８Ｈ,  ピリジル  及び  ｍ−フェニル)、  Ｅ：  ７．７８  (９Ｈ,  ｏ−  及び  ｐ−フェニル)であり、収量は１．７８ｇ  収率は２％であった。
（３）ポルフィリンダイマ−化
Ｔｓ−トリアミンダイマ−の合成
（ａ）メシル基で４級化する方法
【００４４】
【化１１】
2013227388.tif 000012
【００４５】
０．２０７ｇ(０．３３６ｍｍｏｌ)のＨ２ＰｙＰ３ＰをＮＭＰ  ８ｍｌに溶解させ、１００℃に加熱した。
０．１６１ｇ(０．１６ｍｍｏｌ)のＴｓ−トリアミン−ＯＳＯ２ＣＨ３を溶解させたＮＭＰ溶液２ｍｌをゆっくりと滴下した。４８時間後、反応を停止し、ＮＭＰを真空エバポレ−ションにより、エバポレ−トした。ついでシリカカラムクロマトグラフィ−により目的物であるポルフィリンダイマ−を単離した。
少量のメタノ−ルに溶解させ、ＮＨ４ＰＦ６を適量加え、赤紫色沈殿を得た。水で洗い、ろ過で回収した。
得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を図４に示す。帰属は９．６０ｐｐｍ  ４Ｈ  オルト−ピリジル、９．１０−８．８０ｐｐｍ  ２０Ｈ  メタ−ピリジル  及び  β−ピロ−ル、８．２０ｐｐｍ  １２Ｈ  フェニル、７．９０ｐｐｍ  １８Ｈ  フェニル、７．７０ｐｐｍ  １２Ｈ  Ｔｓ−フェニルであり、収率は２〜４％であった。
（４）ポルフィリンダイマ−のＴｓ基脱保護
０．０３ｇのＴｓ−トリアミンダイマ−を入れ、９６％Ｈ２ＳＯ４を２ｍｌ加え、１００℃で７２時間、加熱攪拌した。
７２時間後、放冷し、ＮａＯＨ水溶液を加え、中和した。
溶媒の水をエバポレ−トし、茶色の固体を回収した。その後、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ−５０Ｆで処理した。
得られた生成物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル(ｉｎ  ＣＤＣｌ３)を図５に示す。帰属は９．６０ｐｐｍ  ４Ｈ  オルト−ピリジル、９．４０ｐｐｍ  ４Ｈ  メタ−ピリジル、９．０５−８．８０ｐｐｍ  １６Ｈ  β−ピロ−ル、８．３０−８．１０ｐｐｍ  ３０Ｈ  フェニルであった。
【００４６】
（５）ポルフィリンダイマ−への金属導入
（ａ）トリアミンダイマ−へのＭｎ導入
トリアミンダイマ−をメタノ−ル５ｍｌに溶解させた。トリアミンダイマ−に対して１０当量の酢酸マンガン4水和物を加え、５０℃で加熱還流した。
ＵＶ−ｖｉｓスペクトルにより、極大吸収波長(Ｓｏｒｅｔ帯)の長波長シフトやＱ帯を追跡した。(図６)  ４２３ｎｍのピ−クが完全に消え、４６６ｎｍのピ−クのみとなり、Ｑ帯が４つから２つになった時点で反応を停止した。(２４時間ほど)
溶媒をエバポレ−トし、分画分子量５００の透析膜で数日間透析することで、過剰な酢酸マンガン４水和物を除いた。
その後、イオン交換カラム(充填剤：キレ−ト樹脂(Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８又はＣＲ１１))で処理した。溶媒を除去することで、紫色−緑色固体であるＭｎ導入物ＭｎＰＤ−Ｎ３を回収した。最終収量は約５ＭＧ、全４ステップにおける収率は０．１％であった。
【００４７】
（ｂ）トリアミンダイマ−へのＺｎ導入
トリアミンダイマ−を水に溶解させ、トリアミンダイマ−に対して１０当量のＺｎＣｌ２を加え、ウォ−タ−バスで５０℃、1日静置した。
ＵＶ−ｖｉｓスペクトルでＳｏｒｅｔ帯の長波長シフト、Ｑ帯の減少が確認された時点で反応を停止した。
イオン交換カラム(充填剤：キレ−ト樹脂(Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＣ−７４８又はＣＲ１１))で処理し、溶媒を除去することで。紫色固体であるＺｎ導入物ＺｎＰＤ−Ｎ３を回収した。
【００４８】
［実施例１］
得られた化合物のうちＭｎポルフィリンダイマ−（以下、「ＭｎＰＤ−Ｎ３」という）のＳＯＤ活性、ＯＮＯＯ−消去活性を上述のストップトフロ−法により評価した。
【００４９】
この際、ＳＯＤ活性評価は以下のように行い、ＯＮＯＯ−消去活性評価は以下のようにして行った。
（ＳＯＤ活性評価）
Ｏ2・−発生源としてはＫＯ２を用いた。ＫＯ２は水と混合すると直ちに
ＫＯ２  +  Ｈ２Ｏ  →  ＫＯＨ  +  Ｏ２・−  +  Ｈ+
の反応でＯ２・−を生成する。
実験は、ＫＯ２をＤＭＳＯに飽和させた溶液を片方のシリンジに、もう片方のシリンジには  ６０ＭＭ  ＨＥＰＥＳ／ＨＥＰＥＳ−Ｎａ  緩衝液に溶解したポルフィリン錯体をセットし、３６℃、２５：１で混合して、発生したＯ２・−がポルフィリン錯体により分解される様子をＯ２・−の極大吸収波長２４５ｎｍ(ε=１６４０Ｍ−１ｃｍ−１)で追跡し、二次反応速度定数を算出した。
【００５０】
（ＯＮＯＯ−消去活性評価）
ＳＯＤ活性評価と同様に、ＯＮＯＯ−溶液を片方のシリンジに、もう片方のシリンジにＰＢに溶解させたポルフィリン錯体をセットし、３６℃、２５：１で混合して、ポルフィリン錯体により分解される様子をＯＮＯＯ−の極大吸収波長３０２ｎｍで追跡し、二次反応速度定数を算出した。なお、ＯＮＯＯ−消去活性評価は2mMのアスコルビン酸存在下で測定を行なった。
【００５１】
＜ＳＯＤ活性測定条件＞
温度：３６℃
光路長：２ｍｍ
波長：２４５ｎｍ
照射時間：１００μｓ
サンプル混合比：
ポルフィリン溶液／Ｏ２−溶液=２５：１
Ｂｕｆｆｅｒ：ＨＥＰＥＳ(ｐＨ８．１)
ポルフィリン濃度：０〜５μＭ
測定サンプル：ＭｎＰＤ−Ｎ３，Ｍｎ−ｍｏｎｏＭ４ＰｙＰ３Ｐ，ＭｎＭ４Ｐｙ４Ｐ
【００５２】
＜ＯＮＯＯ−消去活性測定条件＞
温度：３６℃
光路長：２ｍｍ
波長：３０２ｎｍ
照射時間：１００μｓ
サンプル混合比：
ポルフィリン溶液／ＯＮＯＯ−溶液=２５：１(ｖ／ｖ)
Ｂｕｆｆｅｒ：ＰＢ(ｐＨ７．４)(アスコルビン酸２ｍＭ含有)
ポルフィリン濃度：０〜５μＭ
測定サンプル：ＭｎＰＤ−Ｎ３，Ｍｎ−ｍｏｎｏＭ４ＰｙＰ３Ｐ，ＭｎＭ４Ｐｙ４Ｐ
[ＯＮＯＯ]：２ｍＭ(最終濃度)
【００５３】
<ＫＯ２飽和溶液の調製>
褐色バイアル瓶にＫＯ２を薬さじ１杯入れ、ＤＭＳＯに溶解させ、１．５時間攪拌し、１時間静置して調製した。
【００５４】
<ＯＮＯＯ−の調製>
ＯＮＯＯ−の極大吸収波長はλ＝３０２ｎｍ，モル吸光係数は１６７０Ｍ−１ｃｍ−１であり、濃度調製はＵＶ−ｖｉｓスペクトルで濃度補正することで行った。
１)２．２２ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を２５ｍｌに希釈し、０．８Ｍ  Ｈ２Ｏ２、１．３８ｇのＮａＮＯ２を２５ｍｌに溶解させ、０．８Ｍ  ＮａＮＯ２、１．５ｇのＮａＯＨを２５ｍｌに溶解させ、１．５Ｍ  ＮａＯＨをそれぞれ調製した。
２)３つの溶液をアイスバスで冷却した。
３)０．８Ｍ  Ｈ２Ｏ２と ０．８Ｍ  ＮａＮＯ２を氷浴中で混合させた。
４)混合後、攪拌を行いながら１Ｍ  ＨＣｌを加え、同時に１秒以内に１．５Ｍ  ＮａＯＨを加えることにより、黄色の溶液を得た。
５)その後水で希釈を行い、ＯＮＯＯ−濃度の調整を行った。
【００５５】
その結果、ＳＯＤ活性が、６．７であり、ＯＮＯＯ−消化活性が０．４２であった。この値は、ＭｎＰＤ−Ｎ３のモノマ−体に当たるポルフィリンモノマ−の活性とほぼ同じ値であり、十分なＳＯＤ活性及びＯＮＯＯ−消去活性を有することが確認された。
【００５６】
またＺｎＰＤ−Ｎ３が金属イオンの捕捉機能を有するか否かを蛍光スペクトル測定により評価した。
ＺｎＰＤ−Ｎ３の蛍光スペクトル測定は以下のように行った。
<実験操作>
溶液全量が２ｍｌになるようにサンプル溶液を調製し、これを石英セルに移して測定した。
<実験条件>
Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ:１μＭ(最終濃度)
Ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ:５ｍＭ(最終濃度)
Ｆｅ２+(ＦｅＣｌ２)
Ｃｕ２+(ＣｕＣｌ２)
Ｃｄ２+(ＣｄＣｌ２)
Ｚｎ２+(ＺｎＣｌ２)
Ｍｎ２+(ＭｎＣｌ２)
Ａｌ３+(Ａｌ２Ｃｌ３)
(Ｅｔ)４Ｎ+Ｃｌ−(ＴＥＡＣ)
溶媒：水
励起波長：４２３ｎｍ(ＺｎＰＤ−Ｎ３の極大吸収波長)
蛍光波長：４３３−７５０ｎｍ
【００５７】
図７にＺｎＰＤ−Ｎ３溶液の蛍光スペクトルとＺｎＰＤ−Ｎ３溶液に過剰量のＦｅＣｌ２を加えたときの蛍光スペクトルを示す。ＺｎＰＤ−Ｎ３はＦｅイオン非存在下では蛍光を示すのにもかかわらず、Ｆｅイオン存在下では顕著な蛍光強度の減少が見られた。この変化はＺｎＰＤ−Ｎ３のＦｅイオンキレ−トに伴ったエキシプレックスの形成による消光であることが示唆される。
【００５８】
Ｆｅイオンの他、Ｚｎ,Ｍｎ,Ｃｄ,Ａｌ,Ｃｕイオン存在下でも同様の評価を行ったところ、Ｆｅイオン同様、蛍光強度の著しい低下が見られた。一方で、単核のポルフィリンＺｎＭ４ＰｙＰでは各種金属イオン存在下で蛍光強度の変化は見られなかった。(図７)以上からＺｎＰＤ−Ｎ３は、これら金属イオンをキレ−トし、それに伴う構造変化により２つのポルフィリンがエキシプレックスを形成しやすい状態に近接していることが示唆された。
【００５９】
また、得られたＭｎＰＤ−Ｎ３のカタラ−ゼ活性評価を行った。カタラ−ゼ活性測定は、クラ−ク型溶存酸素電極を用い、Ｈ2Ｏ2の不均化によって生成する酸素量を定量することで測定した。ＭｎＰＤ−Ｎ３は、金属キレ−トに伴う活性の変化を追跡するため、金属イオン非存在下と、あらかじめ各濃度に調整したサンプルと１００μＭのＣｕＣｌ2とと混合したものを用いた。
＜実験条件＞
温度：２０℃
溶媒：ＰＢ(ｐＨ  ７．４)
サンプル濃度(最終濃度)：０，２，４，６，８，１０μＭ
時間：０〜６００ｓｅｃ
Ｈ２Ｏ２：１ｍＭ(最終濃度)
サンプル：
Ｍｎサレン錯体  (Ｃｏｎｔｒｏｌ)
ＭｎＰＤ−Ｎ３
ＭｎＰＤ−Ｎ３  +  ＣｕＣｌ２(１００μＭ)
【００６０】
＜操作＞
１．装置のセット
飽和ＫＣｌ溶液を電極部に数滴たらし、円形に切ったタバコ紙、１．５ｃｍ四方のテフロン（登録商標）膜の順に重ね、その上からアプリケ−タ−を用いてＯリングを電極部にセットした。
蒸留水を満たし、装置温度を一定に保った。
水相キャリブレ−ションを以下のように行った。
酸素電極の試料室に水を適当量満たし、スタ−ラ−で攪拌しながら(回転速度５０)、酸素電極の出力電圧一定になるまで放置した(５〜１０分)。  またその電圧値を空気中の酸素と平衝にある溶液の酸素濃度の出力電圧とした。
その後、試料室にジチオナイトを薬さじで少量加え、ふたを底面が水面に密着するまで挿入した。そして電圧が一定になったときの値を酸素濃度０の時の出力電圧とした。
２．サンプル調製
３０％Ｈ２Ｏ２を１１３μｌ取り、１００ｍｌに希釈することで１０ｍＭのＨ２Ｏ２を調製した。
最終濃度が０，２，４，６，８，１０μＭとなるように、サンプル溶液１００μｌを調製した。
３．測定
１０ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を１００μｌ、ＰＢを８００μｌ入れ、レ−トが安定したらサンプル溶液１００μｌを加えた。(全１ｍｌ)
１０分間反応させた後、測定を停止し、酸素濃度の変化を解析し、速度定数を算出した。
各サンプルのカタラ−ゼ活性を表２に示す。ＭｎＰＤ−Ｎ３は金属イオン非存在下で３８ｓ−１という低い活性値であった。一方で、１００μＭ銅イオン存在下ではカタラ−ゼミミックであるＭｎサレン錯体を超える高いカタラ−ゼ活性(２２０ｓ−１)を有することがわかった。金属キレ−ト能評価の結果と合わせて考察すると、銅イオンキレ−トに伴い、2つのポルフィリンが会合状態を形成することにより、Ｍｎ−Ｍｎ間距離が近接した状態で固定化され、Ｈ２Ｏ２が２核的に不均化されていると考えられる。以上から、ＭｎＰＤ−Ｎ３は、金属イオン応答的に触媒活性を示すことが明らかとなった。
【００６１】
表１：カチオン性Ｍｎポルフィリン錯体及びＭｎサレン錯体のカタラ−ゼ活性
【表１】
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【００６２】
なお、比較として用いたＭｎサレン錯体はＥｕｋａｒｉｏｎ  Ｉｎｃ．によって開発された「商品名ＥＵＫ−１３４」と同様の構造をとる化合物であり、合成は以下の通りに行った。
Ｈ２（３ＯＭｅＳａｌｅｎ）をメタノ−ルに溶解させ、トリエチルアミン存在下で、１０〜４０当量の塩化マンガンを加え、５０℃で加熱攪拌した。ＵＶ−ｖｉｓスペクトルで反応を追跡し、極大吸収波長が変化した時点で反応を停止し、精製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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