(57)【要約】【課題】光クロスリンク能を持つ新規な非天然型アミノ酸、及びその利用を提供する。【解決手段】本発明に係る化合物は、式（１）で示されるものである。【化１】2013107842.tif 000008（ｎは１以上で３以下の整数を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有しうる炭素数１〜３の炭化水素基、置換基を有しうるアジドメチル基、又はアセチル基を表し、Ｒ５は、置換基を有しうる炭素数１〜３のアルキル基、置換基を有しうるアジドメチル基、又は水素原子を表す）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される、
【化１】
2013107842.tif 000007
（式（１）中で、ｎは１以上で３以下の整数を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素原子、ハロゲン原子、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１〜３の炭化水素基、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基、又はアセチル基を表し、
Ｒ５は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基、又は水素原子を表す）
化合物。
【請求項２】
Ｒ５は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよいメチル基、又は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素原子、又は炭素数１〜３の炭化水素基である請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４から選択される３つ又は４つが水素原子である請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
ｎが１又は２である請求項１〜４の何れか一項に記載の化合物。
【請求項６】
式（１）中におけるアミノ基が、水酸基、ヒドロキシアミノ基、メチルアミノ基、チオール基、又はセレノール基に置き換えられている請求項１〜５の何れか一項に記載の化合物。
【請求項７】
式（１）中におけるカルボキシル基が、リン酸基、スルホ基、チオカルボキシル基、又はセレノカルボキシル基に置き換えられている請求項１〜６の何れか一項に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の化合物とアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体とが結合してなるポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドを含む光架橋形成キット。
【請求項１０】
請求項８に記載のポリペプチドと、対象試料とを接触させる接触工程と、
次いで、上記ポリペプチドに光架橋反応を生じさせる所定波長の光を照射する光照射工程とを含む、光架橋形成方法。
【請求項１１】
上記所定波長が３００ｎｍ以上で３８０ｎｍ以下の範囲内である請求項１０に記載の光架橋形成方法。
【請求項１２】
上記ポリペプチドと対象試料との相互作用検出の目的で行われる、請求項１０又は１１に記載の光架橋形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光クロスリンク能を持つ新規な非天然型アミノ酸、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質同士をクロスリンクする方法は、細胞内でのタンパク質のオリゴマー化の分析、タンパク質同士の直接的な相互作用の分析、並びに、共有結合を介してインビトロでタンパク質複合体を安定化させる等の目的において有用である。
【０００３】
例えば、非特許文献１〜６には、光応答性を示すアリルアジド、ｐ−ベンゾイルフェニル又はジアジリニル部分を有している非天然型アミノ酸（人工合成アミノ酸）が、生細胞においてタンパク質へ部位特異的に導入されたことが記載されている。そして、これらの非天然型アミノ酸は、特定波長の光に応答して、相互作用するタンパク質との間でクロスリンクを形成したことが記載されている。
【０００４】
上記非天然型アミノ酸のようなクロスリンカーを、標的タンパク質の特定の部位に導入すれば、実験的に観察されたクロスリンク（相互作用）のパターンの解釈がより容易となる。具体的には、例えば、細胞内でのタンパク質同士の相互作用の分析、及び標的タンパク質に直接結合する分子の同定がより容易となる（非特許文献２、３、７、８）。
【０００５】
これまでに報告されている、遺伝的にコードされた、光クロスリンク能を持つアミノ酸の大部分はフェニルアラニン誘導体である（非特許文献９）。これらアミノ酸は、その反応中心がタンパク質の表面付近に位置するように導入され、当該反応中心のごく近傍に位置する、他のタンパク質のアミノ酸残基とのみクロスリンクを形成する。クロスリンクが形成可能な範囲（リーチ）が短いため、これらのアミノ酸は、他のタンパク質中のクロスリンクサイトに対して高い部位選択性を示し、タンパク質間の本来の結合様式をよく反映することが、クロスリンクしたタンパク質複合体の結晶構造解析により示されている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J.W. Chin, S.W. Santoro, A.B. Martin, D.S. King, L. Wang, and P.G. Schultz, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9026-9027.
【非特許文献２】J.W. Chin, A.B. Martin, D.S. King, L. Wang, and P.G. Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 11020-11024.
【非特許文献３】N. Hino, Y. Okazaki, T. Kobayashi, A. Hayashi, K. Sakamoto, and S. Yokoyama, Nat. Methods 2005, 2, 201-206.
【非特許文献４】E.M. Tippmann, W. Liu, D. Summerer, A.V. Mack, and P.G. Schultz, Chembiochem. 2007, 8, 2210-2214.
【非特許文献５】L.Y. Huang, G. Umanah, M. Hauser, C. Son, B. Arshava, F. Naider, and J.M. Becker, Biochemistry 2008, 47, 5638-5648.
【非特許文献６】A. Grunbeck, T. Huber, P. Sachdev, and T.P. Sakmar, Biochemistry 2011, 50, 3411-3413.
【非特許文献７】T. Kanamori, S. Nishikawa, I. Shin, P.G. Schultz, and T. Endo, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997, 94, 485-490.
【非特許文献８】N. Hino, M. Oyama, A. Sato, T. Mukai, F. Iraha, A. Hayashi, H. Kozuka-Hata, T. Yamamoto, S. Yokoyama, and K. Sakamoto, J. Mol. Biol. 2011, 406, 343-353.
【非特許文献９】L. Wang, J. Xie, and P.G. Schultz, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2006, 35, 225-249.
【非特許文献１０】S. Sato, S. Mimasu, A. Sato, N. Hino, K. Sakamoto, T. Umehara, and S. Yokoyama, Biochemistry 2011, 50, 250-257.
【非特許文献１１】G. Srinivasan, C.M. James, and J.A. Krzycki, Science 296, 1459-1462.
【非特許文献１２】B. Hao, W. Gong, T.K. Ferguson, C.M. James, J.A. Krzycki, and M.K. Chan, Science 2002, 296, 1462-1466.
【非特許文献１３】S.K. Blight, R.C. Larue, A. Mahapatra, D.G. Longstaff, E. Chang, G. Zhao, P.T. Kang, K.B. Green-Church, M.K. Chan, and J.A. Krzycki, Nature 2004, 431, 333-335.
【非特許文献１４】C. Polycarpo, A. Ambrogelly, A. Berube, S.M. Winbush, J.A. McCloskey, P.F. Crain, J.L. Wood, and D. Soll, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101, 12450-12454.
【非特許文献１５】T. Mukai, T. Kobayashi, N. Hino, T. Yanagisawa, K. Sakamoto, and S. Yokoyama, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008, 371, 818-822.
【非特許文献１６】C.R. Polycarpo, S. Herring, A. Berube, J.L. Wood, D. Soll, and A. Ambrogelly, FEBS lett. 2006, 580, 6695-6700.
【非特許文献１７】A. Ambrogelly, S. Gundllapalli, S. Herring, C. Polycarpo, C. Frauer, and D. Soll, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007, 104, 3141-3146.
【非特許文献１８】T. Yanagisawa, R. Ishii, R. Fukunaga, T. Kobayashi, K. Sakamoto, and S. Yokoyama, Chem. Biol. 2008, 15, 1187-1197.
【非特許文献１９】C. Chou, R. Uprety, L. Davis, J.W. Chin, and A. Deiters, Chem. Sci. 2011, 2, 480-483.
【非特許文献２０】H.W. Ai, W. Shen, A. Sagi, P.R. Chen, and P.G. Schultz, Chembiochem in press
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来のアミノ酸のようにクロスリンクが形成可能な範囲が短いと、クロスリンク機能が発揮可能に当該アミノ酸を導入できる位置が大きく制限されるという問題があった。加えて、クロスリンクを形成する機会が減少するという問題があった。
【０００８】
ピロリジン（図１参照）は、長い側鎖の末端にかさ高い置換基を有するリジン誘導体である。ピロリジンは、メタン生成古細菌（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｅ属）、及びある種の硫黄還元真正細菌においてアンバーコドンＵＡＧにより遺伝的にコードされている（非特許文献１１、１２）。この非標準的なアミノ酸は、ピロリジル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＰｙｌＲＳ）の働きで、ＵＡＧをデコードするｔＲＮＡＰｙｌと結合する（非特許文献１３、１４）。
【０００９】
本願発明者らは、これまでに、特別なシステムの下、Ｍ．ｍａｚｅｉ由来のｔＲＮＡＰｙｌ及びＰｙｌＲＳ変異型を用いれば、哺乳類細胞において、タンパク質にリジン誘導体を部位特異的に導入できることを示している（非特許文献１５）。さらに、古細菌のＰｙｌＲＳ−ｔＲＮＡＰｙｌのペアが、大腸菌だけでなく、真核細胞においても、リジン誘導体を部位特異的に導入できることが示されている（非特許文献１３、１６−１８）。
【００１０】
また、近年、ジアジリニル部分を有するリジン−カルバミン酸塩誘導体（ＡｂＫ）（図１）が、生細胞中で遺伝的にコードされ（非特許文献１９）、クロスリンク能を有することが示されている（非特許文献１９、２０）。
【００１１】
しかし、上記リジン誘導体は何れも、フェニルアラニン誘導体型のクロスリンカーと比較して、クロスリンクが形成可能な範囲がより長いか否かすらも判明していない。
【００１２】
本願発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、クロスリンクが形成可能な範囲がより長い新規な非天然型アミノ酸、及びその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本発明は、上記の課題を解決するために以下のものを提供する。
１）下記式（１）で示される、
【００１４】
【化１】
2013107842.tif 000002
【００１５】
（式（１）中で、ｎは１以上で３以下の整数を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素原子、ハロゲン原子、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１〜３の炭化水素基、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基（アジドメチル基）、又はアセチル基を表し、Ｒ５は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基（アジドメチル基）、又は水素原子を表す）化合物。
２）Ｒ５は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよいメチル基、又は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基である１）に記載の化合物。
３）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、互いに独立に、水素原子、又は炭素数１〜３の炭化水素基である上記１）又は２）に記載の化合物。
４）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４から選択される３つ又は４つが水素原子である上記３）に記載の化合物。
５）ｎが１又は２である上記１）〜４）の何れかに記載の化合物。
６）式（１）中におけるアミノ基が、水酸基、ヒドロキシアミノ基、メチルアミノ基、チオール基、又はセレノール基に置き換えられている上記１）〜５）の何れかに記載の化合物。
７）式（１）中におけるカルボキシル基が、リン酸基、スルホ基、チオカルボキシル基、又はセレノカルボキシル基に置き換えられている上記１）〜６）の何れかに記載の化合物。
８）上記１）〜７）の何れか一項に記載の化合物とアミノ酸及び/又はアミノ酸誘導体とが結合してなるポリペプチド。なお、「Ａ及び／又はＢ」とは、Ａ及びＢ、Ａ又はＢの双方を含む概念である。なお、当該ポリペプチドの一例としては、天然型ポリペプチド又はその断片を構成するアミノ酸の一部が上記化合物で置換されたアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが挙げられる。
９）上記８）に記載のポリペプチドを含む光架橋形成キット。
１０）上記８）に記載のポリペプチドと、対象試料とを接触させる接触工程と、次いで、上記ポリペプチドに光架橋反応を生じさせる所定波長の光を照射する光照射工程とを含む、光架橋形成方法。
１１）上記所定波長が３００ｎｍ以上で３８０ｎｍ以下の範囲内である上記１０）に記載の光架橋形成方法。
１２）上記ポリペプチドと対象試料との相互作用検出の目的で行われる、上記１０）又は１１）に記載の光架橋形成方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、タンパク質の相互作用等の解析に利用可能な新規な非天然型アミノ酸及びその利用を提供することができるという効果を奏する。また、本発明の方法は、細胞内におけるタンパク質相互作用の解析を行うための分析用、研究用試薬のみならず、治療薬、診断薬、農薬、光機能性素材等の開発においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例で用いたＴｍｄＺＬｙｓを含む各種リジン誘導体の化学構造を示す図である。
【図２】Ａ〜Ｄは、本発明の実施例において、全長ＧＳＴタンパク質へのリジン誘導体の取り込みを細胞系で行った結果を示す図である。
【図３】Ａ〜Ｂは、本発明の他の実施例において、リジン誘導体を取り込んだＧＲＢ２タンパク質と、ＥＧＦＲ又はＳＨＣとの光架橋（光クロスリンク）を行った結果を示す図である。
【図４】本発明のさらに他の実施例において、リジン誘導体と、対応するｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）とのアミノアシル化を行った結果を示す図である。
【図５】リジン誘導体が導入される全長ＧＳＴタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１９】
〔新規化合物〕
（概要）
本発明に係る新規化合物は、下記式（１）で示される非天然型アミノ酸（リジン誘導体）である。
【００２０】
【化２】
2013107842.tif 000003
【００２１】
上記式（１）中で、ｎは１以上で３以下の整数を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４（総称する場合はＲ１〜Ｒ４と表す場合もある）は、互いに独立に、水素原子、ハロゲン原子、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１〜３の炭化水素基、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基（すなわち、アジドメチル基、又はハロゲン化アジドメチル基）、又はアセチル基を表し、Ｒ５は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基、又は水素原子を表す。
【００２２】
ここで、炭素数１〜３の炭化水素基とは、具体的には、環状炭化水素基としてのシクロプロピル基；鎖状炭化水素基としてのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基；を指す。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−又はiso−プロピル基が挙げられる。アルケニル基としては、ビニル基、アリル基が挙げられる。アルキニル基としては、エチニル基、プロパルギル基が挙げられる。また、上記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子から選択される何れかの原子を指す。
【００２３】
式（１）に示す化合物は、ジアジニリル基を用いた光クロスリンク（光架橋）反応が可能である。また、ジアジニリル基に至るまでのリーチが、従来の光クロスリンク型の非天然型アミノ酸と比較して長くなっている。さらに、後述するように、所定のアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼにより認識されてポリペプチド内に導入可能という特性も有する。
【００２４】
（Ｒ１〜Ｒ４の詳細）
Ｒ１〜Ｒ４は何れも、上記の通り、水素原子、又は比較的かさ高さの少ない置換基のみである。そのため、細胞系等を用いて、本発明に係る化合物を取り込んだペプチドを合成する場合に、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（具体的にはピロリジル−ｔＲＮＡシンセターゼ）による当該化合物の認識を不所望に阻害する虞が実質的にない。
【００２５】
アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによる当該化合物の認識精度を向上させる観点では、水素原子；ハロゲン原子；炭素数１〜２のアルキル基又はハロゲン化アルキル基；炭素数２のアルケニル基（ビニル基）；炭素数２のアルキニル基（エチニル基）；から選択されるものが好ましい。
【００２６】
さらに、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによる当該化合物の認識精度を向上させる観点では、Ｒ１〜Ｒ４のうち少なくとも２つが水素原子であることが好ましく、３つが水素原子であることがより好ましく、４つが水素原子であることがさらに好ましい。なお、Ｒ１〜Ｒ４のうち少なくとも２つが水素原子の場合、Ｒ１とＲ３とが少なくとも水素原子であることが好ましい。
【００２７】
また、Ｒ１〜Ｒ４は、外部からタグ等を導入する導入起点として用いることもできる。この用途で用いる場合は、Ｒ１〜Ｒ４は、ハロゲン原子、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、アジドメチル基、ハロゲン化アジドメチル基、又はアセチル基から選択され、中でも好ましくは、ヨウ素原子等のハロゲン原子、エチニル基、プロパルギル基、アジドメチル基、ハロゲン化アジドメチル基（例えば、−ＣＨＦＮ３、−ＣＦ２Ｎ３、−ＣＨＩＮ３、−ＣＩ２Ｎ３）、又はアセチル基である。
【００２８】
すなわち、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼによる認識精度への影響を抑制し、かつ外部からタグ等を導入可能とする観点では、Ｒ１とＲ３とは水素原子であり、かつ、Ｒ２及びＲ４の一方が水素原子であり、他方がハロゲン原子、エチニル基、又はビニル基であることが特に好ましい。
【００２９】
なお、式（１）に記載の化合物をポリペプチド内に導入する工程を円滑に進めるため、外部からタグ等を導入する工程は、後述する光架橋反応を行う工程（光照射工程）よりも後に行われる。タグ等の種類は特に限定されないが、例えば、蛍光基、カチオン性分子等が挙げられる。カチオン性分子として四級アンモニウムイオン等を付加させれば、その後に行われる質量分析をより高感度で行うことができる。
【００３０】
（Ｒ５の詳細）
Ｒ５も、Ｒ１〜Ｒ４と同様に、比較的かさ高さの少ない置換基のみである。そのため、細胞系等を用いて、本発明に係る化合物を取り込んだペプチドを合成する場合に、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（具体的にはピロリジル−ｔＲＮＡシンセターゼ）による当該化合物の認識を不所望に阻害する虞が実質的にない。また、これらの置換基は、隣接する光反応性基の反応を阻害する虞も実質的にない。
【００３１】
なお、Ｒ５は、隣接する光反応性基の反応も考慮すると、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよいメチル基、又は、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよい炭素数１の脂肪族アジド基であることが好ましい。具体的には、メチル基、ハロゲン化メチル基（例えば、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＨＦ２、−ＣＨＩ２、−ＣＦ３、−ＣＩ３）、アジドメチル基、ハロゲン化アジドメチル基（例えば、−ＣＨＦＮ３、−ＣＦ２Ｎ３、−ＣＨＩＮ３、−ＣＩ２Ｎ３）、等が好ましいものとして挙げられる。
（ｎの詳細）
ｎは３以下の正の整数であればよいが、本発明に係る化合物全体のかさ高さを抑制する観点では、ｎが１又は２であることが好ましく、１であることがより好ましい。
【００３２】
（化合物の製造方法の一例）
上記式（１）で示される化合物は、ベンジルオキシカルボニル基類縁体でアミノ酸を保護した構造と捉えることもできる。従って、ベンジルオキシカルボニル基でアミノ酸を保護する反応に準じて、本発明の化合物を合成可能である。なお、ベンジルオキシカルボニル基に光反応性基（ジアジリニル基）、及び必要に応じて置換基Ｒ１〜Ｒ５を導入することも、ベンゼン環に対する各種有機合成反応に準じて行うことができる。なお、化合物合成の一例は、実施例でも示されている。
【００３３】
（より具体的な化合物の例示）
上記式（１）で示される本発明の化合物のより具体的な例としては、以下のものが挙げられる。
【００３４】
【化３】
2013107842.tif 000004
【００３５】
上記式（２）及び（３）におけるＲ５の定義は、式（１）と同じであるが、メチル基、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２Ｉ、−ＣＨＦ２、−ＣＨＩ２、−ＣＦ３、−ＣＩ３等の、水素原子の一部又は全部がハロゲン原子に置換されていてもよいメチル基が好ましい。
【００３６】
（式（１）で示される化合物の誘導体）
誘導体の一例として、式（１）に示される化合物が有するアミノ基が、水酸基、ヒドロキシアミノ基、メチルアミノ基、チオール基、又はセレノール基に置き換えられている化合物が挙げられる。ここで、置換の対象となるアミノ基は、より具体的には、カルボキシル基を構成する炭素原子に隣接した炭素原子（α炭素原子）に結合するアミノ基（式（１）中で−ＮＨ２）と示すもの）等である。
【００３７】
誘導体の他の例として、式（１）に示される化合物が有するカルボキシル基が、リン酸基、スルホ基、チオカルボキシル基、又はセレノカルボキシル基に置き換えられている化合物が挙げられる。
【００３８】
なお、上記アミノ基及びカルボキシル基の何れもが上記した他の基へ置き換えられている化合物も誘導体の範疇に含まれる。
【００３９】
〔ポリペプチド〕
（ポリペプチドの定義）
本発明において「ポリペプチド」とは、アミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体が複数個結合してなる分子を広く指す。結合するアミノ酸及びアミノ酸誘導体数の上限は特に限定されない。アミノ酸とは、２０種類の天然型アミノ酸（通常、生物のタンパク質合成に使われるアミノ酸）であり、Ｌ−型でもＤ−型でもよい。「アミノ酸誘導体」とは、アミノ酸と化学構造が異なるがアミノ酸の基本骨格を有する非天然型アミノ酸、及びアミノ酸と共通した部分構造を持つ分子、例えば、アミノ酸を構成するアミノ基が水酸基、ヒドロキシアミノ基、メチルアミノ基、チオール基、セレノール基に置換された分子、アミノ酸を構成するカルボキシル基がリン酸基、スルホ基、チオカルボキシル基、又はセレノカルボキシル基に置換された分子などが含まれる。なお、アミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体同士の結合の様式は、例えば、ペプチド結合、アミド結合、エステル結合等が挙げられる。
【００４０】
また、本発明において「天然型ポリペプチド」とは、自然界に存在するポリペプチドと同じアミノ酸配列を持つものであり、天然供給源で産生されるものであっても、化学合成したものであってもよく、自然界に存在する限りにおいて１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異体も含む概念である。
【００４１】
本発明に係るポリペプチドの一例は、上記式（１）に記載の化合物とアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体とが結合（例えばペプチド結合等）してなるもの（すなわち、アロタンパク質）である。当該ポリポリペプチドは、式（１）に記載の化合物を一つ以上と、アミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体を一つ以上とを含むものであれば特に限定されない。本発明に係るポリペプチドの他の例は、式（１）に記載の化合物及び／又は当該化合物の誘導体と、アミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体とが結合してなるものである。当該ポリポリペプチドは、式（１）に記載の化合物及び／又はその誘導体を一つ以上と、アミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体を一つ以上とを含むものであれば特に限定されない。
【００４２】
本発明に係るポリペプチドの一例では、天然型ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列に基づいて設計される。すなわち、天然型ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列における一部のアミノ酸を上記式（１）に記載の化合物及び／又はその誘導体で置換して、本発明に係るポリペプチドを得る。天然型ポリペプチド又はその断片において、その立体構造等から、他のポリペプチド等と相互作用する部位（相互作用部位）が推定できる場合は、相互作用部位を構成する少なくとも一部のアミノ酸を上記式（１）に記載の化合物及び／又はその誘導体で置換する。
【００４３】
本発明に係るポリペプチドの設計の元となる上記天然型ポリペプチドの種類は特に限定されないが、タンパク質同士の相互作用に関与するものが好ましく、例えば、リガンド、受容体、シグナル伝達関連タンパク質、転写因子、翻訳因子、輸送関連タンパク質、酵素、疾患関連タンパク質などが挙げられる。
【００４４】
なお、本発明に係るポリペプチドは、例えば、蛍光タンパク質、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ等の標識タンパク質；その他の機能性タンパク質；等と融合タンパク質を構成するものであってもよい。
【００４５】
（ポリペプチドの製造例）
本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を設計した後に、当該ポリペプチドは固相合成法等の化学合成法で製造することもできる。また、当該ポリペプチドは、以下に一例を示すように、生物が有するペプチド合成系を利用して製造することもできる。
【００４６】
宿主細胞を用いて本発明に係るポリペプチドを製造する場合、例えば、所望の位置にナンセンス変異を受けた遺伝子（ポリペプチドをコードする）、ピロリジルｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）、式（１）に示す化合物、及び、ＰｙｌＲＳ（ピロリジル-ｔＲＮＡシンセターゼ）変異体を、宿主細胞内で共存させることにより製造を行う。これにより、式（１）に示す化合物が、ナンセンス変異を受けた箇所特異的に導入されたポリペプチドが製造される。
【００４７】
ここで、ＰｙｌＲＳ変異体とは、式（１）に示す化合物（リジン誘導体）とｔＲＮＡＰｙｌとを特異的に認識し、両者が結合したサプレッサーｔＲＮＡを生成させることができるものである。ＰｙｌＲＳ変異体は、メタン生成古細菌由来のＰｙｌＲＳの変異体が好ましく、中でもメタノサルシーナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）由来のものがより好ましい。ＰｙｌＲＳ変異体の具体的な一例は実施例にも示している。なお、式（１）に示す化合物（リジン誘導体）について、アミノ基は水酸基、ヒドロキシアミノ基、メチルアミノ基、チオール基、又はセレノール基で置換されていてもよく、カルボキシル基はリン酸基、スルホ基、チオカルボキシル基、又はセレノカルボキシル基で置換されていてもよい。このような誘導体もＰｙｌＲＳ変異体を用いたポリペプチドの製造に用いうる。
【００４８】
上記ＰｙｌＲＳ変異体は、宿主細胞としての原核細胞、又は真核細胞内で発現させる。原核細胞の種類は特に限定されないが、例えば、大腸菌、枯草菌等が挙げられる。真核細胞の種類も特に限定されないが、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、線虫、酵母、植物細胞等が挙げられる。なお、ＰｙｌＲＳ変異体を真核細胞で発現させる場合、実施例の記載の他に、参考特許文献：特開２００７−３７４４５の記載も参酌すればよい。
【００４９】
ＰｙｌＲＳ変異体をコードする遺伝子断片を含むベクターを、宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、電気穿孔法（Nucleic,Acids Res.15,1311-1326(1987)）、リン酸カルシウム法（Mol.Cell Biol. 7,2745-2752(1987)）、リポフェクション法（Cell 7,1025-1037(1994);Lamb,Nature Genetics 5,22-30(1993)）などが挙げられる。
【００５０】
上記ｔＲＮＡＰｙｌは、サプレッサーｔＲＮＡとして機能するためのナンセンスコドンに相補的なアンチコドン及び立体構造を保持しており、宿主細胞としての原核細胞、又は真核細胞内で発現させる。ここで、ナンセンスコドンとしては、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）、ＵＧＡ（オパール）が挙げられるが、ＵＡＧ（アンバー）コドンを用いることが好ましい。上記ｔＲＮＡＰｙｌは、上記ＰｙｌＲＳ変異体にのみ認識され、宿主の通常のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）には認識されない、という要件を備えることが好ましい。ｔＲＮＡＰｙｌは、メタン生成古細菌由来のものが好ましく、中でもメタノサルシーナ・マゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）由来のものがより好ましい。ｔＲＮＡＰｙｌの具体的な一例は実施例にも示している。
【００５１】
なお、ｔＲＮＡＰｙｌを真核細胞で発現させる場合、実施例の記載の他に、参考特許文献：特開２００７−３７４４５の記載も参酌すればよい。概略的には、野生型のｔＲＮＡＰｙｌの５’末端に真核生物由来のｔＲＮＡを結合させて真核細胞内で転写させる。このとき、ｔＲＮＡＰｙｌの３’末端に転写終結配列を結合させることが好ましい。
【００５２】
また、本発明に係るポリペプチドの製造は、上記した宿主細胞の細胞抽出物を用いた、無細胞タンパク質合成系を用いても行うことができる。
【００５３】
〔ポリペプチドの用途〕
本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドと相互作用する物質（単に相互作用物質と称する）との間で光クロスリンクを形成するための光架橋形成キットの一構成となる。すなわち、当該ポリペプチドは、式（１）に示すアミノ酸誘導体（リジン誘導体）又はその誘導体を含んでいる。このアミノ酸誘導体（リジン誘導体）等は、光クロスリンク可能な範囲（リーチ）が長いので、ポリペプチドと相互作用物質との間のクロスリンク形成の機会を大きく増やすことができる。なお、相互作用物質は、好ましくはタンパク質又はその断片であるが、遺伝子等でもありえる。
【００５４】
本発明に係るポリペプチドは、例えば、１）対象試料中における相互作用物質のスクリーニング（相互作用物質が知られていない場合）、２）対象試料中における相互作用物質の有無、又は存在量の検出（相互作用物質が知られている場合）、３）ポリペプチドと、対象試料中に含まれる相互作用物質との間の相互作用の詳細解明（クロスリンクサイトの同定、結晶構造解析等）、等の種々の目的で使用可能である。そして、何れの目的で使用する場合にも、以下に示す光架橋形成方法が行われる。
【００５５】
すなわち、上記の光架橋形成方法は、本発明に係るポリペプチドと、相互作用物質を含みうる対象試料とを接触させる接触工程と、次いで、上記ポリペプチドに光架橋反応を生じさせる所定波長の光を照射する光照射工程とを含む。ここで、所定波長の光とは、ジアジリニル基が相互作用物質との間で炭素−炭素共有結合を形成可能な波長、例えば、波長が３００ｎｍ以上で３８０ｎｍ以下の範囲内の光を指す。なお、接触工程及び光照射工程を行う時間は適宜設定される。
【００５６】
対象試料中に、上記ポリペプチドに対する相互作用物質が含まれていれば、両者は光架橋された複合体を形成する。したがって、光照射工程後に、当該複合体の形成有無を確認する工程をさらに設ければ、相互作用物質のスクリーニング、相互作用物質の有無の検出、又は相互作用物質の存在量の検出を行うことができる。
【００５７】
また、得られた上記複合体を精製して更なる詳細分析に供することで、ポリペプチドと相互作用物質との相互作用の詳細解明を行うことができる。一例では、得られた複合体を断片化し（例えばトリプシン等のタンパク分解酵素による断片化）、さらに接触還元を行うことで、式（１）で示される化合物又はその誘導体が有するベンジルオキシカルボニル基類縁体の部分（マスタグと称する）を相互作用物質側に移転することができる（ＴｍｄＺＬｙｓを例にとって示す下記の反応式参照）。その後に、質量分析によってマスタグを有するペプチドを同定すれば、相互作用物質の同定に加えて、相互作用物質中のクロスリンクサイトの同定までを行うことができる。
【００５８】
【化４】
2013107842.tif 000005
【００５９】
なお、上記接触還元の方法は特に限定されず、例えば、水素源として水素ガス、ギ酸、又はギ酸塩の水溶液を用い、適切な触媒の存在下で行うことができる。水素源は、ギ酸、又はギ酸塩（例えば、ギ酸アンモニウム、ギ酸グアニジウム等）の水溶液を用いることが緩和な接触還元を実現する上で好ましい。また、触媒は、例えば、活性炭上に担持させたパラジウム触媒を用いることができる。
【００６０】
上記した対象試料は、生物から抽出したサンプル（例えば、血液、リンパ液等の体液；細胞抽出液；等）を用いることもできるが、細胞そのものを用いることもできる。細胞そのものを用いる場合は、例えば、本発明に係るポリペプチドを宿主細胞中で発現させて細胞内容物と当該ポリペプチドとを接触させ（接触工程）、次いで、上記光照射工程を行う。そして、光照射工程後の宿主細胞から内容物を抽出し、必要に応じて免疫沈降等の手法によりポリペプチド−相互作用物質の複合体を精製し、得られた複合体をトリプシン消化等で断片化する。次いで、接触還元を行うことで、式（１）で示される化合物又はその誘導体が有するマスタグを相互作用物質側に移転する。その後に、質量分析によってマスタグを有するペプチドを同定して、相互作用物質及びそのクロスリンクサイトを同定する。
【実施例】
【００６１】
本発明について、以下の実施例等に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００６２】
〔実施例〕
（略称の説明）
実施例中で用いた略称は以下の通りである。
PylRS：  pyrrolysyl-tRNA synthetase
TyrRS：  tyrosyl-tRNA synthetase
GST：  glutathione-S-transferase
EGFP：  enhanced green fluorescent protein
GRB2：  growth factor receptor-bound protein 2
EGFR：  epidermal growth factor receptor;
SHC：  Src homology 2 domain-containing adaptor protein
HEK：  human embryonic kidney
CHO：  chinese hamster ovary
PAGE：  polyacrylamide gel electrophoresis
MALDI-TOF：  matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight; PMF, peptide mass fingerprinting
ESI-IT-TOF：  electrospray ionization ion-trap/time-of-flight
ESI-Q-TOF：  electrospray ionization quadruple/time-of-flight
（材料及び方法）
実施例で用いた材料の入手、調製方法、及び実験手法を以下に纏めた。
生化学及び分子生物学的実験は、商業的に入手可能な材料、酵素、及び化合物を用いて行った。ｐＮＯ２ＺＬｙｓ（図１参照）はＢａｃｈｅｍ社から購入した。４−（３−（トリフルオロメチル）−３−Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンジルアルコールはテイカ製薬株式会社から購入した。ＥＳＩ−ＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルはＬＣＱ−ＤＥＣＡ  ＸＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＱＳＴＡＲ  Ｅｌｉｔｅを用いて測定した。ＮＭＲ測定はＢｒｕｋｅｒ  ＡＶ８００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて実施した。
【００６３】
（１）  プラスミドの構築及び部位特異的変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｅｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ｐＥＴ−ＧＳＴｗｔプラスミド中にある野生型ＧＳＴ遺伝子の２５番目のチロシンコドンをアンバーコドンに変異させ、ｐＥＴ−ＧＳＴ（２５Ａｍ）プラスミドを作製した（参考文献１）。なお、この野生型ＧＳＴ遺伝子はS. japonicum由来のもので、当該ＧＳＴ遺伝子がコードするアミノ酸配列は図５に示す。
【００６４】
トリプトファニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ｔｒｐＳ）プロモーター制御下のＭ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）遺伝子及びプロリポタンパク質（ｌｐｐ）プロモーター制御下のｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子を含むｐＴＫ２．１−ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）−ｔＲＮＡＰｙｌプラスミドを、ｐＴＫ２．１−ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）−ｔＲＮＡＰｙｌプラスミド（参考文献１）からＰＣＲ変異誘導した。ｐＴＫ２．１−ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）−ｔＲＮＡＰｙｌプラスミドは、ｐＡＣＹＣ１８４由来のプラスミドである。
【００６５】
なお、上記ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）とは、Ｍ．ｍａｚｅｉの野生型ＰｙｌＲＳにおける３０６番目のＴｙｒがＧｌｙに、３８４番目のＴｙｒがＰｈｅに置換されたＰｙｌＲＳ変異体である。同様に、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）とは、Ｍ．ｍａｚｅｉの野生型ＰｙｌＲＳにおける３０６番目のＴｙｒがＡｌａに、３８４番目のＴｙｒがＰｈｅに置換されたＰｙｌＲＳ変異体である。
【００６６】
ＧＲＢ２−ＥＧＦＰ遺伝子（両者の融合タンパク質をコードする）を含む哺乳類用発現プラスミドｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＧＲＢ２ＧＦＰ、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をコードする配列を持つＧＲＢ２遺伝子を含む哺乳類用発現プラスミドｐＯｒｉＰ−ＧＲＢ２、ＳＨＣ遺伝子及びＥＧＦＲ遺伝子を含む哺乳類用発現プラスミドｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＳＨＣ−ＥＧＦＲ、ｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子の９つのコピーを含む哺乳類用発現プラスミドｐＯｒｉＰ９ｘＵ６ｔＲＮＡＰｙｌ、及びＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）遺伝子又はＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）遺伝子を含む哺乳類用発現プラスミドｐＯｒｉＰ−ＰｙｌＲＳを、参考文献２に記載されたように構築した。
【００６７】
野生型ＧＲＢ２遺伝子の変異誘導は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｋｉｔを用いて行い、１０３〜１１２番目の位置にアンバーコドンを有するクローン群を作製した（参考文献２）。
【００６８】
（２）  ＰｙｌＲＳ変異体及びｔＲＮＡＰｙｌの発現及び精製
ｐＥＴ２８−ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）プラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ(ＤＥ３)細胞で、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）を過剰発現させた。得られたＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）を、ＨｉｓＴｒａｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた３つのカラムクロマトグラフィーによって精製した。このプロセスは、幾つかの変更を加えた他は参考文献３の記載に従い行った。
【００６９】
精製したＰｙｌＲＳタンパク質を、３００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、濃度が３．５ｍｇ／ｍｌになるまで濃縮した。
【００７０】
また、ｔＲＮＡＰｙｌは、Ｍ．ｍａｚｅｉのｔＲＮＡＰｙｌを転写し、精製した。
【００７１】
（３）アミノアシル化アッセイ
参考文献１、３、及び４の記載に従い、酸性尿素ＰＡＧＥによるアミノアシル化アッセイを行った。アミノアシル化反応は３７℃、１時間行なった。標準的なアミノアシル化アッセイ溶液（２０μｌ）は、１００ｍＭのＮａ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に、精製した２．８μＭのＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ、４ｍＭのＤＴＴ、２．１μＭのｔＲＮＡＰｙｌ転写物、及び適切な濃度のアミノ酸（ここでは、ＴｍｄＺＬｙｓ、ｐＮＯ２ＺＬｙｓ等）が加えられている。なお、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）及びｔＲＮＡＰｙｌ転写物は、上記「（２）ＰｙｌＲＳ変異体及びｔＲＮＡＰｙｌの発現及び精製」の記載に従い得たものである。
【００７２】
非アミノアシル化ｔＲＮＡＰｙｌ及びアミノアシル化ｔＲＮＡＰｙｌを、１０％変性尿素−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し（変性は酸性条件下（ｐＨ５．０）で４℃、１８時間で行った）、２％のトルイジンブルーで染色した。
【００７３】
（４−１〜４−２）  タンパク質へのＴｍｄＺＬｙｓの部位特異的導入、及び細胞内での光クロスリンク
（４−１）タンパク質へのＴｍｄＺＬｙｓ等の部位特異的導入
ｐＥＴ−ＧＳＴ（２５Ａｍ）プラスミド、及びｐＴＫ２．１−ＰｙｌＲＳ(Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ)−ｔＲＮＡＰｙｌ又はｐＴＫ２．１−ＰｙｌＲＳ(Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ)−ｔＲＮＡＰｙｌプラスミドを、参考文献１の記載に従い大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ(ＤＥ３)（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入した。
【００７４】
すなわち、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）／ｔＲＮＡＰｙｌの系、及びＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）／ｔＲＮＡＰｙｌの系を用いて、大腸菌細胞内で、ＧＳＴタンパク質にＴｍｄＺＬｙｓを導入した。そして、得られたＧＳＴタンパク質を精製し、ＭＡＬＤ−ＴＯＦ ＭＳ及びＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによる質量分析を行った。この一連の操作は、幾つかの変更を加えた以外は、参考文献１及び５に記載の方法に従って行った。ＧＳＴタンパク質へのＴｍｄＺＬｙｓの導入は、７．５％のＤＭＳＯを含むＭ９培地中で行った。
【００７５】
なお、ＴｍｄＺＬｙｓに代えてｐＮＯ２ＺＬｙｓを用いれば、ｐＮＯ２ＺＬｙｓが部位特異的に導入されたＧＳＴタンパク質を得ることができる。
（４−２）細胞内での光クロスリンク
大腸菌細胞中で発現したＧＳＴタンパク質のウエスタンブロット分析は、参考文献１の記載に従い行った。
【００７６】
Ｔ−Ｒｅｘ  ＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＨＥＫ２９３ ｃ−１８細胞（ＡＴＣＣ）における、タンパク質へのＴｍｄＺＬｙｓの部位特異的導入、細胞中でのタンパク質の光クロスリンク、免疫沈降、及びウエスタンブロット分析を、参考文献２及び６に記載の方法により行った。１０種類のＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体（ＧＲＢ２（１０３ＴｍｄＺＬｙｓ）〜ＧＲＢ２（１１２ＴｍｄＺＬｙｓ））（２０ｋＤａ）の何れかが、ＥＧＦＲ（１７０ｋＤａ）及びＳＨＣ（５０〜５５ｋＤａ）と共発現しているＨＥＫ２９３細胞に対して、波長３６５ｎｍのＵＶ光を０℃で１５分間照射した。なお、ＧＲＢ２（１０３〜１１２ＴｍｄＺＬｙｓ）とは、ＧＲＢ２の１０３番目〜１１２番目（ＳＨ２ドメイン内）にＴｍｄＺＬｙｓが導入されたＧＲＢ２変異体である。
【００７７】
＜実施例１＞  Ｎε−[（（４−（３−（トリフルオロメチル）−３−Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンジル）オキシ）カルボニル]−Ｌ−リジン（ＴｍｄＺＬｙｓ：図１参照）の合成
４−（３−（トリフルオロメチル）−３−Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンジルアルコール（３００ｍｇ，１３．９ｍｍｏｌ）を１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化した。
【００７８】
得られた４−（３−（トリフルオロメチル）−３−Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンジルオキシカルボニルイミダゾール炭酸塩（４５ｍｇ，１．４５ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ存在下において、Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）−Ｌ−リジン（３６２ｍｇ，１４．７ｍｍｏｌ）とカップリングした。
【００７９】
得られたＮα−Ｂｏｃ−Ｎε−[（（４−（３−（トリフルオロメチル）−３−Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンジル）オキシ）カルボニル]−Ｌ−リジンを２０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で脱保護し、ＴｍｄＺＬｙｓ（１８０ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を得た。
【００８０】
ＴｍｄＺＬｙｓの化学構造は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、及び１９Ｆ−ＮＭＲ（８００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）、並びに質量分析によって確認した。
（ＮＭＲデータ）
1H NMR (800 MHz, DMSO-d6): ・ (ppm) 1.380−1.525 (m, 2H), 1.4496−1.562 (m, 2H), 1.774−1.907 (m, 2H), 3.8230 (s, 1H), 3.076−3.123 (m, 2H), 5.183 (s, 2H), 7.4275 (d, J= 8.3 Hz, 2H), 7.4474 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 7.5290 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.156 (bs, 1H). 13C-NMR (200 MHz, DMSO-d6): ・ (ppm) 22.28, 28.495 (d, J = 40.69Hz), 29.377, 30.389, 40.543, 52.857, 64.735, 122.176 (d, J = 273.73 Hz), 127.047, 127.304, 128.757, 140.377, 156.355, 171.358. 19F-NMR (376 MHz, DMSO-d6): ・ (ppm) −64.665.
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ）：Ｃａｌｃｄ，ｍ／ｚ＝３８８．３５[Ｍ＋Ｈ]＋，Ｏｂｓｄ，ｍ／ｚ＝３８９．１０[Ｍ＋Ｈ]＋。
【００８１】
＜実施例２＞  タンパク質にｐＮＯ２ＺＬｙｓを導入するＰｙｌＲＳ変異体のスクリーニング
Ｔｍｄ基を効果的な光クロスリンクプローブとして適用する場合、ＺＬｙｓのベンゼン環のパラ位置換はオルト位置換よりも相当によい。
【００８２】
そこで、ＺＬｙｓのベンゼン環のパラ位置換誘導体に適合するＰｙｌＲＳの活性部位を作製するため、タンパク質内に、ベンゼン環のパラ位にニトロ基を有するＺＬｙｓ誘導体（ｐＮＯ２ＺＬｙｓ）を導入可能なＰｙｌＲＳ変異体をスクリーニングした。
【００８３】
ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）は野生型ＰｙｌＲＳと比較して、かさ高いリジンに対する高いアミノアシル化活性を有するため（参考文献１）、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）を変異体作製のテンプレートとして用いた。ＰｙｌＲＳ・ピロリジン複合体の立体構造に基づき（参考文献３）、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３８４Ｆ）の活性部位の残基であるＴｙｒ３０６、Ｌｅｕ３０９、及びＩｌｅ４１３が、合成オリゴヌクレオチドプライマー（意図された変異型はＮＮＫ（Ｎ＝Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ）によりコードされる）を用いたオーバーラップ伸長ＰＣＲによりランダム化されてなるＰｙｌＲＳ変異体のライブラリを作製した。
【００８４】
次いで、このライブラリを、大腸菌の細胞中でｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子と共発現することによって、ｐＮＯ２ＺＬｙｓを認識できるＰｙｌＲＳ変異体をスクリーニングした。より具体的には、以下に説明する２回のポジティブ及びネガティブセレクションの交互選抜によってスクリーニングを行った。
【００８５】
まず、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子中にあるアンバーストップコドンのサプレッションに基づいて、ＰｙｌＲＳ変異体のライブラリに対してポジティブセレクションをした。ＰｙｌＲＳ変異体のライブラリ及びｔＲＮＡＰｙｌ遺伝子により形質転換された細胞を１ｍＭのｐＮＯ２ＺＬｙｓを含むＬＢ培地で生育させ、クロラムフェニコール存在下で生育するものをスクリーニングした。次いで、ｐＮＯ２ＺＬｙｓ非存在下で、有毒なバルナーゼ遺伝子中にある２つのアンバーストップコドンのサプレッションに基づいて、ＰｙｌＲＳ変異体のライブラリに対してネガティブセレクションした。２回のポジティブ及びネガティブセレクションの交互選抜を行った後、ｐＮＯ２ＺＬｙｓを認識できるＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）変異体を得た。この結果は、Ｔｙｒ３０６がより小さい残基（グリシン）に変異しているＰｙｌＲＳが、ベンゼン環のパラ位が置換されたＺＬｙｓ誘導体を効率的に認識できることを示唆した。
【００８６】
＜実施例３＞  インビトロにおけるアミノアシル化実験
ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）変異体を用いて、各種アミノ酸とｔＲＮＡＰｙｌとのアミノアシル化実験を、インビトロで行った。なお、アミノアシル化実験は、上記「（３）アミノアシル化アッセイ」の記載に従い行っている。実験の結果を図４に示す。
【００８７】
図４において、コントロール以外の各レーンには、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）変異体とｔＲＮＡＰｙｌ転写物とを加えている。各レーンは左側から順に、（１）アミノ酸の添加なし、（２）１ｍＭのＮε−アセチル−Ｌ−リジン（ＡｃＬｙｓ）の添加、（３）１ｍＭのＮε−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン（ＢｏｃＬｙｓ）の添加、（４）１ｍＭのＺＬｙｓの添加、（５）１ｍＭのｐＮＯ２ＺＬｙｓの添加、（６）２ｍＭのｐＮＯ２ＺＬｙｓの添加、（７）１ｍＭのＴｍｄＺＬｙｓの添加、（８）２ｍＭのＴｍｄＺＬｙｓの添加、という条件下で反応を行ったものである。なお、右側の二つのレーンは、（９）酵素なし（−enz）、（１０）ｔＲＮＡＰｙｌ転写物のみ添加、という条件のコントロールを示す。
【００８８】
インビトロでのアミノアシル化実験では、ＴｍｄＺＬｙｓ及びｐＮＯ２ＺＬｙｓは同等の効率でｔＲＮＡＰｙｌと結合できることが示された。
【００８９】
＜実施例４＞  パラ位置換されたＺＬｙｓを認識するＰｙｌＲＳ変異体の比較等
ＺＬｙｓを認識するＭ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳ変異体として、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）変異体が報告されている（参考文献１）。
【００９０】
本実施例では、ＰｙｌＲＳの３０６番目のアミノ酸の置換が、パラ位置換されたＺＬｙｓ誘導体を大腸菌のＵＡＧコドンに対応して導入する効率に与える影響を評価した。
【００９１】
具体的には、上記「（４−１）タンパク質へのＴｍｄＺＬｙｓ等の部位特異的導入」の記載に従い、２５番目にアンバーコドンを有するグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子ｇｓｔ（Ａｍ２５）（参考文献１及び７）の翻訳を行い、部位特異的にＴｍｄＺＬｙｓ等が導入された全長ＧＳＴタンパク質を産生させた。全長ＧＳＴタンパク質の産生は、最終濃度１ｍＭとなるように生育培地に添加されたｐＮＯ２ＺＬｙｓ又はＴｍｄＺＬｙｓの存在下で行った。
【００９２】
図２中の（Ａ）は、抗ＧＳＴ抗体を用いて、得られた全長ＧＳＴタンパク質を含む試料をウエスタンブロット分析した結果を示す。上段は、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）変異体を用いた結果であり、下段は、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）変異体を用いた結果である。同図に示す通り、ｐＮＯ２ＺＬｙｓの導入に関しては、ＰｙｌＲＳ変異体の種類によらず非常に効率よく導入された。一方、ＴｍｄＺＬｙｓの導入に関しては、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）変異体の方が、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ｇ−Ｙ３８４Ｆ）変異体よりも導入効率の観点でより優れていた。
【００９３】
なお、Ｍ．ｍａｚｅｉのＰｙｌＲＳの結晶構造に基づく、結合ポケットにおけるＴｍｄＺＬｙｓの構造モデルは、Ｔｙｒ３０６Ａｌａの置換によって、Ｚ部分（ベンジル部分）だけでなく、そのパラ位のニトロ置換基又はジアジリニル置換基も収容可能なスペースが、当該ポケット中に作り出されることを示す（図示は省略）。
【００９４】
図２中の（Ｂ）は、得られた全長ＧＳＴタンパク質を精製してゲル電気泳動にかけ、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した結果を示す。同図の下方に示す数値は、細胞培養液１リットル当たりの全長ＧＳＴタンパク質の収量（単位ｍｇ）であり、ＴｍｄＺＬｙｓが部位特異的に導入された全長ＧＳＴタンパク質が、細胞培養液１リットル当たり０．４ｍｇ得られた。なお、ＴｍｄＺＬｙｓが導入された全長ＧＳＴタンパク質の収量は、ｐＮＯ２ＺＬｙｓが導入された全長ＧＳＴタンパク質と比較して少ないが、インビトロでのアミノアシル化の効率には差が無いことから（実施例３参照）、その一因は、細胞による、ＴｍｄＺＬｙｓ及びｐＮＯ２ＺＬｙｓの取り込み効率の相違と推定される。
【００９５】
図２中の（Ｃ）は、ＴｍｄＺＬｙｓが導入された全長ＧＳＴタンパク質を精製し、そのトリプシン消化物を、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析した結果を示す。当該質量分析では、２５番目のＴｍｄＬｙｓを含む２３〜３３番目のアミノ酸残基（ＮＳＸＳＰＩＬＧＹＷＫ：ＸがＴｍｄＺＬｙｓ）に対応する、ペプチドの二次ポジティブイオン（ｍ／ｚ＝７６７．９[Ｍ＋２Ｈ]２＋）を検出した。
【００９６】
＜実施例５＞  哺乳類細胞に添加するＴｍｄＺＬｙｓ濃度の好適化と光クロスリンク
哺乳類細胞に添加するＴｍｄＺＬｙｓの最適な濃度を、次の方法で決定した。
【００９７】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、細胞シグナルアダプタータンパク質ＧＲＢ２のＣ末端に融合し、さらにＧＲＢ２のＳＨ２ドメインにおける１１１番目のアミノ酸に対応するコドンをＵＡＧに置換することで、当該ＵＡＧにＴｍｄＺｌｙｓが導入されたか否かを蛍光発光の有無で検出できるシステムであるＧＲＢ２（１１１Ａｍ）−ＧＦＰを構築した。具体的には、上記「（１）プラスミドの構築及び部位特異的変異誘発」欄の記載に従い、プラスミドｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＧＲＢ２ＧＦＰを得、このＧＲＢ２遺伝子内にＵＡＧに置換する変異を導入した。なお、ＳＨ２ドメインは、Ｓｒｃホモロジー２ドメインの略称であり、本来的な機能は、成長刺激で自己リン酸化された上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する。
【００９８】
ＧＲＢ２（１１１Ａｍ）−ＧＦＰは、ＰｙｌＲＳ（Ｙ３０６Ａ−Ｙ３８４Ｆ）−ｔＲＮＡＰｙｌペアと共にＴ−Ｒｅｘ  ＣＨＯ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で発現させた。細胞培養液中に、ＴｍｄＺＬｙｓが０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭの濃度で添加された場合に最大の蛍光が観察された（図２のＤ：ｎ＝４）。当該濃度は、大腸菌で最大の蛍光が観察される濃度と比較してかなり低かった。
【００９９】
＜実施例６＞  ＴｍｄＺＬｙｓとの長距離の光クロスリンクの実証
ＴｍｄＺＬｙｓを、ＧＲＢ２のＳＨ２ドメインの１０３〜１１２番目の位置それぞれに別個に導入して、１０種類のＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体を作製した。
【０１００】
具体的には、上記「（１）プラスミドの構築及び部位特異的変異誘発」欄の記載に従い、プラスミドｐＯｒｉＰ−ＧＲＢ２を得、このＧＲＢ２遺伝子内の所定位置にＵＡＧに置換する変異を導入した。そして、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞内に、プラスミドｐＯｒｉＰ−ＧＲＢ２及びｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−ＳＨＣ−ＥＧＦＲを発現可能に導入して、Ｃ末端がＦＬＡＧペプチドで標識された、各ＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体を、ＥＧＦＲ及びＳＨＣと共に一時的に発現させた。なお、ＳＨＣは、ＥＧＦＲと同様の結合様式でＧＲＢ２のＳＨ２ドメインに結合する分子である。
【０１０１】
そして、ＨＥＫ２９３細胞に、ＥＧＦ刺激（成長刺激）を与え、かつ波長３６５ｎｍの光を照射して光クロスリンク反応を行った。これにより、フリーのＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体、及び、相互作用物（ＳＨＣ又はＥＧＦＲ）と複合体を形成したＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体が生じた。次いで、フリーのＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体、及び受容体と光クロスリンクした複合体を細胞抽出物から免疫沈降し、ウエスタンブロット分析に供した。なお、免疫沈降は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて行った。また、ウエスタンブロット分析は夫々、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗ＳＨＣ抗体を用いて行った。
【０１０２】
結果を図３に示すが、図中、左側から伸びる矢印はＥＧＦＲ又はＳＨＣを示し、右側から伸びる矢印はクロスリンクで生じた複合体を示す。ＧＲＢ２のＳＨ２ドメインの１０４、１０６、１０８、１０９、及び１１１番目の位置にＴｍｄＺＬｙｓが導入されたＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体は、ＥＧＦＲとのクロスリンクが効率的に形成されていた。一方で、ＧＲＢ２のＳＨ２ドメインの１０３及び１１２番目の位置にＴｍｄＺＬｙｓが導入されたＧＲＢ２（ＴｍｄＺＬｙｓ）変異体では、ＥＧＦＲとのクロスリンクで生じた生成物（複合体）の弱いシグナルが観察された（図３中のＡ）。同様のクロスリンクのパターンは、ＳＨＣの場合でも観察され、ＳＨＣの場合はさらに１０５及び１１０番目の位置にＴｍｄＺＬｙｓが導入された変異体で、クロスリンクで生じた生成物の弱いシグナルが観察された（図３中のＢ）。
【０１０３】
なお、フェニルアラニン誘導体である、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＢｐａ）及び４−（３−（トリフルオロメチル）−３−Ｈ−ジアジリン−３−イル）−Ｌ−フェニルアラニン（ＴｍｄＰｈｅ）は、ＥＧＦＲのごく近傍に位置するように導入された場合にのみ、ＧＲＢ２とＥＧＦＲとの間のクロスリンクを効果的に形成した。すなわち、これらフェニルアラニン誘導体が、ＧＲＢ２のＳＨ２ドメインの１０８、１０９、及び１１１番目の位置に導入された場合には、ＧＲＢ２とＥＧＦＲとの間のクロスリンクが効果的に形成されるが、１０４〜１０６番目の位置に導入された場合には弱いクロスリンクが形成されるのみであり、１０３又は１１２番目の位置に導入された場合にはクロスリンクが全く形成されない（参考文献２、６）。
【０１０４】
ＧＲＢ２・ＥＧＦＲ複合体構造において、ＧＲＢ２のＳＨ２ドメインの１０３及び１１２番目のアミノ酸残基のＣα原子は、ＥＧＦＲの最も近いＣ原子（それぞれ、Ｉｌｅ４のＣδ１及びＧｌｎ６のＣδ１）から１１〜１３Å離れており、また、反応中心とＴｍｄＺＬｙｓのＣαとの距離は１５Åである。一方、当該反応中心とｐＢｐａのＣαとの距離は７．９Åであり、反応中心とＴｍｄＰｈｅのＣαとの距離は６．９Åである。したがって、同様の実験により得られたクロスリンクのデータを比較すると、ＴｍｄＺＬｙｓによるクロスリンクは、２つのフェニルアラニン誘導体よりも、かなり長距離をカバーしうることが示された。
【０１０５】
＜実施例７＞  Ｅｔｙ−ＴｍｄＺｌｙｓの合成
本実施例で合成するＥｔｙ−ＴｍｄＺｌｙｓは、実施例１で合成したＴｍｄＺｌｙｓにエチニル基が導入された化合物、より具体的には、上記式（３）で示す化合物においてＲ５が−ＣＦ３である化合物に相当する。Ｅｔｙ−ＴｍｄＺｌｙｓの合成ルートは、以下に示す通りである。
【０１０６】
【化５】
2013107842.tif 000006
【０１０７】
（化合物１．から化合物２．を得る工程：  ハロゲン化工程）
１等量の４−（３−（トリフルオロメチル）−３−Ｈ−ジアジリン−３−イル）ベンジルアルコール、２．８９等量のトリフルオロ酢酸タリウム（III）、１０．１等量のトリフルオロメタンスルホン酸、及び１４．５等量のヨウ化ナトリウムを、トリフルオロ酢酸／水の混合溶媒中で反応させて、化合物２．を得る。
【０１０８】
（化合物２．から化合物３．を得る工程：  ＴＨＰでの保護工程）
次いで、１等量の化合物２．、２．０７等量の３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン、及び０．１等量のパラトルエンスルホン酸を、ジクロロメタン溶媒中で反応させて、水酸基がテトラヒドロピラニル基（ＴＨＰ）で保護された化合物３．を得る。
【０１０９】
（化合物３．から化合物４．を得る工程：  ＴＭＳ−アセチレンの導入工程）
次いで、１等量の化合物３．、１等量のトリメチルシリル（ＴＭＳ）アセチレン、０．０１等量のＣｕＩ、及び０．０２等量のビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム二塩化物を、ジエチルアミン溶媒中で反応させて、化合物４．を得る。
【０１１０】
（化合物４．から化合物５．を得る工程：  脱ＴＭＳ工程）
次いで、１等量の化合物４．、及び１．５等量のＫＯＨを、メタノール溶媒中で反応させて、化合物５．を得る。
【０１１１】
（化合物５．から化合物６．を得る工程：  脱ＴＨＰ工程）
次いで、１等量の化合物５．、及び０．０２等量のトルエンスルホン酸ピリジニウムを、エタノール溶媒中で反応させて、化合物６．を得る。
【０１１２】
（化合物６．から化合物７．を得る工程：  フェニルオキシカルボニル化工程）
次いで、１等量の化合物６．、１．２等量のビス（４−ニトロフェニル）カーボネート、及び１．２等量のトリエチルアミンを、テトラヒドロフラン溶媒中で反応させて、化合物７．を得る。
【０１１３】
（化合物７．から化合物８．を得る工程：  リジン誘導体化工程）
次いで、１等量の化合物７．、１．２等量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（リジン）−ＯＨ．ＨＣｌ、及び１．２等量のトリエチルアミンを、ジメチルホルムアミド溶媒中で反応させて、化合物８．を得る。なお、Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を指す。
【０１１４】
（化合物８．から化合物９．（Ｅｔｙ−ＴｍｄＺｌｙｓ）を得る工程：脱Ｆｍｏｃ工程）
次いで、１等量の化合物８．を、２０体積％でピペリジンを含むジメチルホルムアミド溶媒中で反応させて、Ｆｍｏｃを脱保護することで、化合物９．を得る。
【０１１５】
＜実施例中の参考文献リスト＞
参考文献１：  T. Yanagisawa, R. Ishii, R. Fukunaga, T. Kobayashi, K. Sakamoto, and S. Yokoyama, Chem. Biol. 2008, 15, 1187-1197.
参考文献２：  N. Hino, Y. Okazaki, T. Kobayashi, A. Hayashi, K. Sakamoto, and S. Yokoyama, Nat. Methods 2005, 2, 201-206.
参考文献３：  T. Yanagisawa, R. Ishii, R. Fukunaga, T. Kobayashi, K. Sakamoto, and S. Yokoyama, J. Mol. Biol. 2008, 378, 634-652
参考文献４：  U. Varshney, C.P. Lee, and U.L. RajBhandary. J Biol Chem. 1991, 266, 24712-24718.
参考文献５：  T. Yanagisawa, T. Sumida, R. Ishii, C. Takemoto, and S. Yokoyama, Nat. Struct. Mol. Biol. 2010, 17, 1136-1143.
参考文献６：  N. Hino, M. Oyama, A. Sato, T. Mukai, F. Iraha, A. Hayashi, H. Kozuka-Hata, T. Yamamoto, S. Yokoyama, and K. Sakamoto, J. Mol. Biol. 2011, 406, 343-353.
参考文献７：  K. Sakamoto, K. Murayama, K. Oki, F. Iraha, M. Kato-Murayama, M. Takahashi, K. Ohtake, T. Kobayashi, S. Kuramitsu, M. Shirouzu, and S. Yokoyama, Structure 2009, 17, 335-344.
本発明は上述した各実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、タンパク質の相互作用等の解析に利用可能な新規な非天然型アミノ酸及びその利用を提供することができる。
【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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