(57)【要約】【課題】Ｙ染色体及びＹ染色体上精子形成領域の欠失部位を分析し、特定することにより、簡易、迅速、正確な男性不妊症の検査を可能にする分析方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、上記課題を解決するために、Ｙ染色体及びＹ染色体上精子形成領域の欠失パターンを新規に分析する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｙ２８５８欠失分析によりＡＺＦｃ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
【請求項２】
さらに、ｓｙ１１９１、ｓｙ１３０７及びｓｙ１２０６から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析を含むことを特徴とする請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
ｓｙ１０２４、ｓｙ１９６７、ｓｙ１３０９、ｓｙ３１９９、ｓｙ１２３３、ｓｙ３０１０、ｓｙ２９９０及びｓｙ１１９７から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析によりＡＺＦｂ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
【請求項４】
請求項３の分析方法において、請求項１又は請求項２の分析方法を組み合わせることによりＡＺＦｂ欠失、ＡＺＦｃ欠失及び／又はＡＺＦｂ＋ｃ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
【請求項５】
ｓｙ１３２４、ｓｙ１３１６及びｓｙ１７１４から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析によりＡＺＦａ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
【請求項６】
請求項１〜３、５のいずれか２以上の分析方法を組み合わせることによりＡＺＦａ欠失、ＡＺＦｂ欠失、ＡＺＦｃ欠失及び／又はＡＺＦｂ＋ｃ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
【請求項７】
さらに、ｓｙ１４、ｓｙ３１１８及びｓｙ１２５１から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析を含むことを特徴とする請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
以下の（１）〜（１９）からなる群から選択される１以上のＳＴＳの欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
（１）ｓＹ１４
（２）ｓＹ３１１８
（３）ｓＹ１２５１
（４）ｓＹ１３２４
（５）ｓＹ１３１６
（６）ｓＹ１７１４
（７）ｓＹ１０２４
（８）ｓＹ１９６７
（９）ｓＹ１３０９
（１０）ｓＹ３１９９
（１１）ｓＹ１２３３
（１２）ｓｙ３０１０
（１３）ｓｙ２９９０
（１４）ｓｙ１１９７
（１５）ｓｙ１１９１
（１６）ｓｙ１３０７
（１７）ｓｙ１２０６
（１８）ｓｙ２８５８
（１９）ｓｙ３１５９
【請求項９】
前記（１）〜（１９）からなる群から選択されるすべてのＳＴＳの欠失を分析することを特徴とする請求項８に記載の分析方法。
【請求項１０】
下記のＩ〜ＶＩ群のそれぞれの群の１以上のＳＴＳの欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。 
Ｉ群    ：（１）ｓＹ１４、（２）ｓＹ３１１８、（３）ｓＹ１２５１
ＩＩ群  ：（４）ｓＹ１３２４、（５）ｓＹ１３１６、（６）ｓＹ１７１４
ＩＩＩ群：（７）ｓＹ１０２４、（８）ｓＹ１９６７、（９）ｓＹ１３０９、（１０）              ｓＹ３１９９、（１１）ｓＹ１２３３、（１２）ｓｙ３０１０、（１３）              ｓｙ２９９０、（１４）ｓｙ１１９７
ＩＶ群  ：（１５）ｓｙ１１９１、（１６）ｓｙ１３０７、（１７）ｓｙ１２０６
Ｖ群    ：（１８）ｓｙ２８５８
ＶＩ群  ：（１９）ｓｙ３１５９
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｙ染色体及びＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法による、男性不妊症の検査に関する。
【背景技術】
【０００２】
挙児を希望するカップルの１０％は不妊症であり、その半数は男性に起因している。男性不妊症で必要と考えられる検査は、Ｙ染色体長腕の精子形成領域（Ａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ  Ｆａｃｔｏｒ：ＡＺＦ）における欠失部位の検査である。
【０００３】
精子形成に関与するゲノム領域はＹ染色体長腕上に存在している。１９７６年ＴｉｅｐｏｌｏらはＹ染色体長腕遠位部の精子形成候補領域をＡＺＦと命名した（非特許文献１）。１９９６年Ｖｏｇｔらは、無・乏精子症患者のＹ染色体長腕上の微小欠失と精巣の組織表現型と比較した結果、３領域に微小欠失が集中していることを明らかにし、ＡＺＦａ、ＡＺＦｂ、ＡＺＦｃと分類し、ＡＺＦａ欠失者の精巣組織型はＳｅｒｔｏｌｉ  ｃｅｌｌ  ｏｎｌｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＣＯ）、ＡＺＦｂ欠失者はｍａｔｕｒａｔｉｏｎａｒｒｅｓｔであり、ＡＺＦｃ欠失者は様々な表現型を示すと報告した（非特許文献２）。現在、ＡＺＦａ、ＡＺＦｂ、ＡＺＦｃ領域を目安とした欠失分類が用いられている。
【０００４】
Ｙ染色体ゲノムが２００２年に解読されると、Ｙ染色体遠位側にはＹ染色体特異産物（アンプリコン）があり、パリンドローム構造（回文構造）を呈していることがわかった。Ｙ染色体特異産物領域には８つのパリンドローム構造（Ｐ１〜Ｐ８）があり、Ｐ１〜Ｐ３はさらに小さなサブアンプリコンに分割され、パリンドローム複合体を形成している（非特許文献３）。
【０００５】
染色体の再組換えは相同体とのペア間で生じる。一般に染色体間で再組換えが行われるのみならず、同一染色体内においても、相同組換えが頻繁に生じている。すなわち、ハプロイド染色体であるＹ染色体内でも再組換えが行われる。これによって、Ｙ染色体の微小欠失は染色体内相同再組換えによって、欠失が生じると説明できることになった（非特許文献４）。
【０００６】
（ＡＺＦａの欠失）
ＡＺＦａ領域には、直列リピートの２個のＨＥＲＶ（ヒト内在性レトロウイルス）１５ｙｑ１とＨＥＲＶ１５ｙｑ２があり、まったく相同な塩基配列ＩＤ１とＩＤ２が同方向にペアとなり存在する。このＩＤ１及びＩＤ２において相同組換えが生じた結果、欠失が生じたものと考えられる。この領域には、ＤＦＦＲＹとＤＤＸ３Ｙ（ＤＢＹ）が存在し、この領域の欠失は無精子症を惹起する。
【０００７】
（ＡＺＦｂ，ｃ）
従来、ＡＺＦｂ、ＡＺＦｃとして分類されている領域はパリンドロームＰ１〜Ｐ５を含む（図１〜２）。ＡＺＦｃにあるパリンドロームはさらに小さなサブパリンドローム複合体を形成している（図２〜３）。この複合体の中のリピート配列同士が相同組換えによって欠失し精子形成が障害される。
【０００８】
｛ＡＺＦｃの欠失（ｂ２／ｂ４欠失）｝
ＡＺＦｃ領域の欠失は図２のサブアンプリコンｂ２とｂ４相同性（９９．９％以上）によって、相同再組換えが生じた結果、ＢＰＹ２、ＤＡＺ、ＣＤＹ２が欠失したと考えられる。
【０００９】
（ｇｒ／ｇｒ欠失）
パリンドローム（ｇ１，ｇ２）、（ｒ１，ｒ３）、（ｒ２，ｒ４）間の再組換えによる欠失が考えられる（図２）。ｒ１、ｒ２、ｒ３及びｒ４はそれぞれ遺伝子ＤＡＺ１／ＤＡＺ２、ＤＡＺ３／ＤＡＺ４が存在している。前者２つと後者２つはセットになっている。この欠失では、すべてのＤＡＺが欠失することがないので、精子形成能が存在するとされている。したがって、ｇｒ／ｇｒ欠失は、約１．５Ｍｂの大きな欠失にもかかわらず、欠失遺伝子がなく、臨床的障害を惹起しないと考えられている。ちなみにわが国のｇｒ／ｇｒ欠失は、ＤＡＺ１/ＤＡＺ２欠失であり、ほぼ全男性の３０％（縄文系）に存在し妊孕性に影響していないと考えられている（非特許文献５）。
【００１０】
全ゲノムが解明され、理論的に確立した欠失領域は、従来考えられていた欠失領域とは乖離が生じることとなった。また、Ｙ遺伝子欠失のマーカーとして従来使用されていたマーカーは、多くがリピート配列上にあり、特異的に染色体上での位置を反映していなかった。
【００１１】
無精子症の患者の６％が、ＡＺＦの欠失患者である。無精子症による不妊のカップルには、精巣内精子採取術（ＴＥＳＥ）や卵細胞質内精子注入術（ＩＣＳＩ）が施術される。しかし、ＡＺＦ欠失の欠失部位によってはＴＥＳＥが適応とならない。すなわちＡＺＦａ欠失、ＡＺＦｂ欠失とＡＺＦｂ＋ｃ欠失はＴＥＳＥによっても治療効果を得ることはできない。不要な身体的負担、医療費負担をかけないためには、ＡＺＦの欠失部位の分析は必須であり、欠失部位の診断を適時に正確に行う必要がある。
【００１２】
特許文献１では、患者検体からからのＹ染色体の特定の遺伝子座を増幅して得られたポリヌクレオチドをアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、正常男性検体から増幅して得られた対応するポリヌクレオチドと比較している。これら特許の出願時にはパリンドローム構造が解明されておらず、欠失部位が正確に解明されていないため正確な分析が困難であった。また、特許文献に記載の方法は電気泳動の操作が煩雑であり、時間がかかるものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００２−５１０９６２号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｉｅｐｏｌｏ，Ｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，３４：１１９，１９７６
【非特許文献２】Ｖｏｇｔ，Ｐ．Ｈ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５：９３３，１９９６
【非特許文献３】高栄哲等、ホルモンと臨床  ５７（１）  ５９−６５  ２００９
【非特許文献４】Ｋｕｒｏｄａ―ｋａｗａｇｕｃｈｉ ｅｔ.ａｌ.,  Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００１;  ２９:２７９-２８６.
【非特許文献５】Ｓｉｎ ＨＳ  ｅｔ.ａｌ.,  Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ. ２０１０ Ｓｅｐ;２５(９):２３９６-４０３.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ＡＺＦの欠失部位を分析し、特定することにより、簡易、迅速、正確な男性不妊症の検査を可能にする分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、上記課題を解決するために、ＡＺＦの欠失パターンを新規に分析する方法を提供する。すなわち、本発明は以下からなる。
１．ｓｙ２８５８欠失分析によりＡＺＦｃ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
２．さらに、ｓｙ１１９１、ｓｙ１３０７及びｓｙ１２０６から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析を含むことを特徴とする前項１に記載の分析方法。
３．ｓｙ１０２４、ｓｙ１９６７、ｓｙ１３０９、ｓｙ３１９９、ｓｙ１２３３、ｓｙ３０１０、ｓｙ２９９０及びｓｙ１１９７から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析によりＡＺＦｂ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
４．前項３の分析方法において、前項１又は前項２の分析方法を組み合わせることによりＡＺＦｂ欠失、ＡＺＦｃ欠失及び／又はＡＺＦｂ＋ｃ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
５．ｓｙ１３２４、ｓｙ１３１６及びｓｙ１７１４から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析によりＡＺＦａ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
６．前項１〜３、５のいずれか２以上の分析方法を組み合わせることによりＡＺＦａ欠失、ＡＺＦｂ欠失、ＡＺＦｃ欠失及び／又はＡＺＦｂ＋ｃ欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
７．さらに、ｓｙ１４、ｓｙ３１１８及びｓｙ１２５１から選択される１以上のＳＴＳの欠失分析を含むことを特徴とする前項６に記載の分析方法。
８．以下の（１）〜（１９）からなる群から選択される１以上のＳＴＳの欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。
（１）ｓＹ１４
（２）ｓＹ３１１８
（３）ｓＹ１２５１
（４）ｓＹ１３２４
（５）ｓＹ１３１６
（６）ｓＹ１７１４
（７）ｓＹ１０２４
（８）ｓＹ１９６７
（９）ｓＹ１３０９
（１０）ｓＹ３１９９
（１１）ｓＹ１２３３
（１２）ｓｙ３０１０
（１３）ｓｙ２９９０
（１４）ｓｙ１１９７
（１５）ｓｙ１１９１
（１６）ｓｙ１３０７
（１７）ｓｙ１２０６
（１８）ｓｙ２８５８
（１９）ｓｙ３１５９
９．前記（１）〜（１９）からなる群から選択されるすべてのＳＴＳの欠失を分析することを特徴とする前項８に記載の分析方法。
１０．下記のＩ〜ＶＩ群のそれぞれの群の１以上のＳＴＳの欠失を分析することを特徴とするＹ染色体及び／又はＹ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法。 
Ｉ群    ：（１）ｓＹ１４、（２）ｓＹ３１１８、（３）ｓＹ１２５１
ＩＩ群  ：（４）ｓＹ１３２４、（５）ｓＹ１３１６、（６）ｓＹ１７１４
ＩＩＩ群：（７）ｓＹ１０２４、（８）ｓＹ１９６７、（９）ｓＹ１３０９、（１０）              ｓＹ３１９９、（１１）ｓＹ１２３３、（１２）ｓｙ３０１０、（１３）              ｓｙ２９９０、（１４）ｓｙ１１９７
ＩＶ群  ：（１５）ｓｙ１１９１、（１６）ｓｙ１３０７、（１７）ｓｙ１２０６
Ｖ群    ：（１８）ｓｙ２８５８
ＶＩ群  ：（１９）ｓｙ３１５９
【発明の効果】
【００１７】
本発明の分析方法は、ＡＺＦの欠失部位を効率的かつ網羅的に分析することを可能にした。また、１回の分析により、旧来のＡＺＦだけでなく、Ｙ染色体異常、Ｙ染色体微小欠失（亜分類）及びＹ染色体多型も分析することから精子形成能の評価が可能である。
【００１８】
以上のとおり、本発明の分析方法は、ＡＺＦの欠失部位の有無及び複数の欠失部位の同時分析を可能にし、簡易、迅速、正確な検査を可能とし、多くの患者に正しい検査結果を提供できる。これにより、不要なＴＥＳＥ等の手術を回避し、患者に適切な治療を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｙ染色体のゲノム構造とＡＺＦの位置を表す図である。
【図２】サブパリンドロームを含むパリンドローム複合体、及びパリンドロームに基づく欠失部位を示す図である。
【図３】ＡＺＦｂ、ｃ領域におけるＳＴＳの配置。
【図４】ＳＴＳの位置を含むＹ染色体マップである（出所：ｈｔｔｐ：／／ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｍａｐｐｅｒ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｐｐｅｒ．ｈｔｍｌ）。
【図５】Ｙ染色体微小欠失（主分類）の分析結果（図中の「１」は欠失なし、「０」は欠失ありを意味する）
【図６】Ｙ染色体異常の分析結果
【図７】Ｙ染色体微小欠失（亜分類）の分析結果
【図８】Ｙ染色体多型の分析結果
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（本発明のＡＺＦの欠失部位の分析方法）
本発明は、下記表１に記載のＡＺＦのＳＴＳ（シークエンスタグサイト：分子遺伝子のマッピングのアプローチのための道標として使用される染色体上のＤＮＡの領域である）欠失を分析することを特徴とするＡＺＦの欠失部位の分析方法に関する。本発明の分析方法を以下に詳細に説明する。
【００２１】
【表１】
2013236627.tif 000002
【００２２】
上記表１のｓｙ７５７（番号０）はＸ染色体上のＳＴＳであり、本発明の分析方法の陽性コントロールとして使用できる。
また、上記表１のｓｙ１２９１（番号２０）は、人種間によって欠失パターンが異なる。よって、必要に応じて、本発明の分析方法の検出対象のＳＴＳに加える（参照：非特許文献５）。
【００２３】
｛精子形成領域（ＡＺＦ）｝
本発明における精子形成領域（ＡＺＦ）は、Ｙ染色体長腕上に存在する精子形成に関与するゲノム領域であり、そのゲノム上の位置と表現型からＡＺＦａ、ＡＺＦｂ、ＡＺＦｃに分類される（参照：図１〜３）。
【００２４】
（ＡＺＦの欠失部位）
本発明におけるＡＺＦの欠失部位とは、ＡＺＦ上の一部欠失領域である。Ｙ染色体上のＡＺＦのＹ染色体微小欠失（主分類）、Ｙ染色体異常は精子形成に影響し、例えば、ＡＺＦａ欠失、ＡＺＦｂ欠失及びＡＺＦｂ＋ｃ欠失はＴＥＳＥが適合にならない。
【００２５】
｛Ｙ染色体微小欠失（主分類）｝
ＡＺＦのＹ染色体微小欠失（主分類）の分析では、ＡＺＦａ欠失、ＡＺＦｂ（Ｐ５／ｐｒｏｘｉｍａｌ  Ｐ１）欠失、ＡＺＦｂ＋ｃ欠失（Ｐ５／ｄｉｓｔａｌ  Ｐ１）及びＡＺＦｃ欠失（ｂ２／ｂ４）の有無を分析する（参照：図５）。
医師、研究者及びその補助者は、ＡＺＦの主分類の分析結果を基にして、精子形成能の有無、さらに精子形成能レベルを判定することができる。
【００２６】
（Ｙ染色体異常）
Ｙ染色体異常の分析では、Ｙ染色体欠失、Ｙ染色体長腕欠失、Ｙ染色体長腕部分欠失Ｉ（ＡＺＦａ以遠）、Ｙ染色体長腕部分欠失ＩＩ（ＡＺＦｂ以遠）、Ｙ染色体長腕部分欠失ＩＩＩ（ＡＺＦｂ以遠）、Ｙ染色体長腕部分欠失ＩＶ（ＡＺＦｂ以遠）、Ｙ染色体長腕部分欠失Ｖ（ＡＺＦｂ以遠）及びＹ染色体長腕部分欠失ＶＩ（ＡＺＦｂ以遠）の有無を分析する（参照：図６）。
なお、Ｙ染色体異常は、上記主分類の欠失に対応する。例えば、ＡＺＦｂ以遠の欠失はＡＺＦｂを含むＡＺＦｃ及びＹ染色体長腕部のヘテロクロマチンを含んで欠失しているので、ＡＺＦｂ＋ｃ欠失に準じる。
これにより、Ｙ染色体異常の分析結果は、上記ＡＺＦの主分類の分析結果と組み合わせることにより、網羅的かつ詳細な欠失部位を容易かつ高精度に検出することができる。
【００２７】
｛Ｙ染色体微小欠失（亜分類）｝
Ｙ染色体微小欠失（亜分類）の分析では、上記主分類では分類できない亜型であるＹｍ-１  （Ｐ５＋Ｐ４）欠失、Ｙｍ-２  （Ｐ５＋Ｐ４）欠失、Ｙｍ-３  ＡＺＦｂ部分欠失、Ｙｍ-４  ＡＺＦｂ部分欠失、Ｙｍ-５  （Ｐ３欠失）欠失、Ｙｍ-６  （Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３欠失）欠失、Ｙｍ-７  （Ｐ１＋Ｐ２＋Ｐ３欠失）欠失、Ｙｍ-８  （ｂ１／ｂ３欠失）欠失、Ｙｍ-８  （Ｐ３欠失）欠失、Ｙｍ-９  （Ｐ３欠失）欠失、Ｙｍ-１０  （ｂ２／ｂ３欠失）欠失、Ｙｍ-１１  （ｇｒ／ｇｒ欠失）欠失及びＹｍ-１２  （Ｐ１欠失）欠失の有無を分析する（参照：図７）。
Ｙ染色体微小欠失（亜分類）の分析結果は、上記ＡＺＦの主分類の分析結果及びＹ染色体異常分析結果と組み合わせることにより、網羅的かつ詳細な欠失部位を容易かつより高精度に検出することができる。なお、上記亜分類、未だ臨床的な表現型が確立していない。
【００２８】
（Ｙ染色体多型分析）
Ｙ染色体多型分析（参照：図８）では、対象のＳＴＳのいずれかに含まれ、臨床的表現型に影響を与えない１塩基欠失によるＹ染色体多型を検出し、Ｙ染色体微小欠失（主分類）の分析結果及びＹ染色体異常分析結果と組み合わせることにより、網羅的かつ詳細な分析結果を反映することができる。
【００２９】
（分析方法）
本発明のＹ染色体上精子形成領域の分析方法では、試料中のゲノムＤＮＡ上に存在するＡＺＦ領域のＳＴＳ（参照：上記表１）を、増幅用プライマーを用いて、該ＳＴＳを増幅し、増幅産物を得る。さらに、ＳＴＳの欠失部位を検出することができるプローブを使用して、該増幅産物を検出する。なお、各プローブは、各々対応するＡＺＦ上のＳＴＳとハイブリダイズ可能であり、試料中のゲノム上の対応するＳＴＳを検出できる。
本発明の分析方法は、例えば、患者ゲノムＤＮＡから複数のプライマーを用いて増幅させるが、欠失のある場合は増幅されないので、ハイブリダイズされず欠失部位が検出されない。
【００３０】
本発明のＹ染色体上精子形成領域の分析方法では、下記実施例１のＹ染色体微小欠失（主分類）の結果より、最も多く検出されたＡＺＦｃ欠失（ｂ２／ｂ４）を検出するためにｓｙ２８５８の欠失を分析する。
さらに、ＡＺＦｂ＋ｃ欠失（Ｐ５／ｄｉｓｔａｌ  Ｐ１）及び／又はＡＺＦｃ欠失（ｂ２／ｂ４）を検出するためにｓｙ１１９１、ｓｙ１３０７及びｓｙ１２０６から選択される１以上のＳＴＳの欠失を分析する。
次に、ＡＺＦｂ欠失及び／又はＡＺＦｂ＋ｃ欠失（Ｐ５／ｄｉｓｔａｌ  Ｐ１）を検出するためにｓｙ１０２４、ｓｙ１９６７、ｓｙ１３０９、ｓｙ３１９９、ｓｙ１２３３、ｓｙ３０１０、ｓｙ２９９０及びｓｙ１１９７から選択される１以上のＳＴＳの欠失を分析する。
次に、ＡＺＦａ欠失を検出するためにｓｙ１３２４、ｓｙ１３１６及びｓｙ１７１４から選択される１以上のＳＴＳの欠失を分析する。
次に、Ｙ染色体欠失を検出するためにｓｙ１４、ｓｙ３１１８、ｓｙ１２５１から選択される１以上のＳＴＳの欠失を分析する。
【００３１】
また、本発明のＹ染色体上精子形成領域の分析方法の好適な実施態様では、上記表１の少なくとも１以上、好ましくは１０以上、より好ましくは全てのＳＴＳの欠失を分析する。
【００３２】
加えて、本発明のＹ染色体上精子形成領域の分析方法の別の好ましい実施態様では、下記のＩ〜ＶＩ群のそれぞれの群の１以上のＳＴＳの欠失を分析する。 
Ｉ群    ：（１）ｓＹ１４、（２）ｓＹ３１１８、（３）ｓＹ１２５１
ＩＩ群  ：（４）ｓＹ１３２４、（５）ｓＹ１３１６、（６）ｓＹ１７１４
ＩＩＩ群：（７）ｓＹ１０２４、（８）ｓＹ１９６７、（９）ｓＹ１３０９、（１０）              ｓＹ３１９９、（１１）ｓＹ１２３３、（１２）ｓｙ３０１０、（１３）              ｓｙ２９９０、（１４）ｓｙ１１９７
ＩＶ群  ：（１５）ｓｙ１１９１、（１６）ｓｙ１３０７、（１７）ｓｙ１２０６
Ｖ群    ：（１８）ｓｙ２８５８
ＶＩ群  ：（１９）ｓｙ３１５９
【００３３】
（分析方法）
本発明の分析方法は、好ましくは以下の工程を含むが、特に限定されない。
（１）試料中のゲノムＤＮＡを抽出する工程
（２）上記表１に記載のＳＴＳの増幅用プライマーを用いて、抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、そのＤＮＡ上に存在する対応するＳＴＳを増幅し、増幅産物を得る工程
（３）該増幅産物とプローブをハイブリダイズさせる工程
（４）該増幅産物と該プローブのハイブリダイズを検出する工程
【００３４】
（試料）
本発明における試料は、ゲノムＤＮＡを含む生物から得られる試料である、好ましくは哺乳動物由来であり、血液、体液、組織抽出物等を含む。好ましくはヒトの血液である。
【００３５】
（ＤＮＡの抽出）
試料からＤＮＡを抽出する方法は当該技術分野においてよく知られており，例えば，フェノール・クロロホルムによる抽出を用いることができる。あるいは市販のＤＮＡ抽出試薬を用いてもよい。
【００３６】
（抽出されたゲノムＤＮＡ上のＳＴＳの増幅）
抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、例えば、そのＤＮＡ上に存在する上記表１に記載のＳＴＳをマルチプレックスＰＣＲで増幅する。また、好ましくは、コントロールとしてＳｙ７５７に対応したプライマーも使用する。プライマーの塩基配列は公知の塩基配列を用いることができる。なお、抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとすることより、ＰＣＲ反応系に増幅用プライマーが存在しても、抽出されたゲノムに欠失があれば対応するＳＴＳの増幅産物は生成されない。
【００３７】
プライマーは、自体公知の方法により（例えば汎用のＤＮＡ合成装置を用いて）化学的に合成して得ることができる。プライマーの長さは１０〜４０ｍｅｒ、好ましくは、１５〜３０ｍｅｒである。フォワードプライマーとリバースプライマーを合成しプライマーセットを調製する。
【００３８】
（マルチプレックスＰＣＲ）
テンプレートとして抽出されたゲノムＤＮＡ、選択されたプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを用い、ＳＴＳを増幅する。ポリメラーゼとしては例えばＥｘ  Ｔａｑ（登録商標）（ＴａｋａｒａＢｉｏ）を用いることができる。プライマーのＴｍに基づいて適当なＰＣＲ反応条件を選択する方法は当該技術分野においてよく知られている。
【００３９】
（ラベル増幅産物の調整）
ＰＣＲ増幅産物の検出を容易にするために、ラベリングしたヌクレオチドを用いてＰＣＲを行うことができる。このようなラベリング物質としては、当該技術分野においてよく知られる放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン等を用いることができる。
【００４０】
（ハイブリダイゼーション及び検出）
ラベルされた増幅産物とプローブをハイブリダイズさせ、その後生成したハイブリッドを検出する。本発明の分析方法では、増幅産物とプローブのハイブリダイズが検出されなければ、対応するＡＺＦ部位は欠失していることを示す。
好ましくは、プローブはアレイ上に固定されており、ラベルされた増幅産物とアレイを接触させることにより、増幅産物とプローブをハイブリダイズさせ、その後生成したハイブリッドを検出する。アレイ上のプローブのハイブリダイズが検出されなければ、対応するＡＺＦ部位は欠失していることを示す。
なお、プローブは、自体公知の方法により（例えば、汎用のＤＮＡ合成装置を用いて）化学的にＤＮＡオリゴマープローブを合成する。
【００４１】
ハイブリダイゼーション及び検出は，当該技術分野においてよく知られる方法により行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーション後アレイ（メンブレン）をブロッキングしてアルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体、及びＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて、プローブと増幅産物のハイブリッドを青く可視化する。そして、アレイの発色パターンと発色の強度を肉眼で観察し、ＡＺＦにおける欠失の有無及び欠失部位を分析し評価する。
【００４２】
本発明の分析方法は、好ましくは、Ｌｕｍｉｎｅｘ社のＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを使用する。該システムは、同時に多数のＡＺＦのＳＴＳの欠失を高感度に検出することができる。
【００４３】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
男性不妊を主訴に受診した男性由来のＹ染色体上精子形成領域のＳＴＳを分析して、Ｙ染色体微小欠失（主分類）、Ｙ染色体異常、Ｙ染色体微小欠失（亜分類）及びＹ染色体多型を分析した。詳しくは、男性不妊を主訴に受診した男性血液由来ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲとＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｃｏｒｐ．）を使用したＰＣＲ-Ｌｕｍｉｎｅｘ法にて、ＡＺＦにおける欠失部位の分析を行った。詳細は、以下の通りである。
【００４５】
（血液からのＤＮＡ抽出）
男性不妊を主訴に受診した男性２０１３例から採取された血液から、市販キットを用いてＤＮＡを抽出回収した。
【００４６】
（マルチプレックスＰＣＲによる増幅産物の調整）
ＰＣＲ反応液は、１〜５μＬのＤＮＡサンプル（５０〜２００ｎｇ）、０．２μＭ  各プライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１×ＰＣＲバッファー（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  （ｐＨ８．３），  ３０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．６２５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を含む総量２５μＬとして調製した。各ＳＴＳ検出に対応するプライマー（ＳＴＳの増幅用プライマー）は、公共データベースＭＳＹ  Ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  Ｍａｐｐｅｒ  （ｈｔｔｐ：／／ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｍａｐｐｅｒ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｍａｐｐｅｒ．ｈｔｍｌ）  を基に配列設計し、５'末端にビオチン標識したものを使用した。ＰＣＲプログラムは、「９５℃で２分の熱変性後、９５℃で３０秒、６１℃で３０秒、７２℃で６０秒を４５サイクル、さらに７２℃で５分の最終伸長」であった。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００４７】
（ＰＣＲ増幅産物と蛍光標識ビーズ上のブローブとのハイブリダイゼーション反応）
上記増幅後のＰＣＲ産物を、蛍光標識したビーズに固相結合した各ＳＴＳの配列特異的プローブとハイブリダイゼーション反応させた。プローブは、各プライマーセットによる増幅領域に含まれる塩基配列を含む１５〜３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであった。各プローブを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術に基づき、様々な濃度で組み合わせた２色の蛍光色素で染色したマイクロビーズにコーティングしたカルボキシル基を介して結合させた。このプローブが結合したマイクロビーズとＰＣＲ産物を混合し、同一チューブ内でハイブリダイゼーション反応に用いた。ハイブリダイゼーション反応液は、５μＬ  ＰＣＲ産物、１×ハイブリダイゼーションバッファー（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  （ｐＨ８．０）、０．６ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ８．０）、０．１５％  界面活性剤、４．５Ｍ  塩化テトラメチルアンモニウム）２０μＬ、５μＬ  プローブ結合ビーズを含む総量３０μＬとして調製した。ハイブリダイゼーション反応は、９５℃で２分の後、５２℃で３０分インキュベートすることにより行った。続いて、５０μＬのＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加して、２，０００  ｇ×１分で遠心して上清を廃棄し、さらに５０μＬのＰＢＳ-Ｔｗｅｅｎを添加して２，０００  ｇ×１分で遠心して上清を廃棄する洗浄操作を２回実施した。
【００４８】
（ストレプトアビジン標識フィコエリスリン反応及び測定）
ハイブリダイゼーション反応後、ストレプトアビジン標識フィコエリスリン（ＳＡ-ＰＥ）を反応液に加え、５２℃で１５分インキュベートすることによって、二次標識した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。得られた反応液は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｃｏｒｐ．）に基づき、フローサイトメトリーの原理を応用したマイクロビースアレイ技術により、各ＳＴＳマーカーに対応するプローブが結合したビーズのＳＡ-ＰＥ由来蛍光値を検出した。マイクロビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
なお、各プローブ結合ビーズの該中央値について個別のカットオフ値を設定し、その値以上であればＳＴＳの欠失なし、以下であればＳＴＳの欠失ありと判断した。個別のカットオフ値については、男性健常人及び女性健常人由来検体若しくはネガティブコントロール（蒸留水）から得られた数値を参照し設定した。
【００４９】
（Ｙ染色体上精子形成領域のＳＴＳの欠失の分析結果）
Ｙ染色体微小欠失（主分類）の分析結果を図５、Ｙ染色体異常の分析結果を図６、Ｙ染色体微小欠失（亜分類）の分析結果を図７及びＹ染色体多型の分析結果を図８に示す。
図５〜８の結果から明らかなように、すべての男性不妊を主訴に受診した男性８７９名のＹ染色体上精子形成領域のＳＴＳの欠失を分類することができた（３７分類）。なお、１１３４名の男性不妊を主訴に受診した男性は、ＡＺＦの欠失が存在していなかった。
以上により、本発明の分析方法は、Ｙ染色体上精子形成領域のＳＴＳの欠失の有無及び複数の欠失部位の同時分析を可能にし、さらに簡易、迅速、正確な検査を可能とし、多くの男性不妊を主訴にする男性に正しい検査結果を提供できた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の分析方法は、簡易、迅速、そして正確な分析を可能とし、不妊治療をする多くの人々に正しい検査結果を提供し、患者に適切な治療を提供することを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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