(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍組織を採取することなく、非侵襲的な方法で、神経芽腫を検出する方法を提供する。【解決手段】血液由来の検体において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより、11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出する方法。および、該ＬＯＨの検出による、神経芽腫の検出と、予後の予測方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液由来の検体において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、LOHの検出方法。
【請求項２】
血清において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、神経芽腫の検出方法。
【請求項３】
血清において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、悪性神経芽腫の検出方法。
【請求項４】
血清において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、神経芽腫の予後の予測方法。
【請求項５】
11番染色体上のLOHを、マイクロサテライト解析法により検出する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液由来検体を用いた11番染色体のLoss of Heterozygosity（11q LOH）または神経芽腫の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽腫は、小児に発生する腹部固形腫瘍の中でもっとも頻度が多く、進行例の5年生存率は約40%と医療の進歩した現在でも極めて難治である。神経芽腫の予後改善にはリスクに応じた治療が必須であるが、正確なリスク分類には腫瘍組織を用いた遺伝子診断を要する。近年、神経芽腫のリスク分類には、従来から用いられていた年齢、病期、病理学的分類、MYCN遺伝子増幅（MNA）の有無に加え、11番染色体のLoss of Heterozygosity（11q LOH）の有無を組み合わせた新分類が発表された。そのため、MNA、11q LOHはリスク分類に必須の検査項目となったが、遺伝子診断を行うためには、まず手術で腫瘍組織を採取する必要があり、侵襲的な検査を行いにくい小児ではしばしば困難である。
【０００３】
最近、がん組織を用いた遺伝子検査に代わる診断方法として、担癌患者中に存在する腫瘍組織由来の遊離核酸についての研究が報告されだし、多くの臨床医から注目を浴びている。本発明者らは、以前よりこの血清中遊離核酸に注目し、その診断への応用について研究を進めてきた（非特許文献1,2）。すでに本発明者らは、神経芽腫患者の血清中遊離核酸を用いた遺伝子解析の診断、リスク分類に対する有用性につき報告してきた。特に、神経芽腫の強力な予後因子の一つであるMNAについて血清中遊離DNAを用いた検出法を確立し、診断に応用している。この技術は、状態が悪く、遺伝子診断に供する腫瘍組織が採取できないなど、リスク分類が困難であった神経芽腫症例に対し、一般的な血液検査の残余血清わずか200μLを用いるのみで、およそ数時間で遺伝子解析が可能となり、正確な診断とリスク分類を提供することが可能となるため、全国の施設より診断が依頼されるようになっている。一方、11q LOHについては、リスク分類に必須の診断項目にもかかわらずその診断方法は我が国では確立していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gotoh, et al. J Clin Oncol 23:5205-5210, 2005
【非特許文献２】Yagyu, et al. Clin Cancer Res 14:7011-7019, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、腫瘍組織を採取することなく、非侵襲的な方法で、11q LOHを検出する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、11q LOHを検出することにより、神経芽腫を検出またはその予後を予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
11q LOHは、神経芽腫細胞において見られるが、他の細胞では確認できない。したがって、この変異が起こった神経芽腫細胞でのみ11q LOHの検出には、腫瘍組織を用いた遺伝子診断が必須と考えられていた。ところが、驚くべきことに変異を有する神経芽腫細胞の11番染色体は、11q LOHの検出に十分な量が血液中に存在し、血液由来検体を用いた11q LOHの検出、さらに神経学種の検出とその予後の予測が可能であることを本発明者らは見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、11q LOHまたは(悪性)神経芽腫の検出方法、神経芽腫の予後の予測方法を提供するものである。
項１．  血液由来の検体において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、LOHの検出方法。
項２．  血清において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、神経芽腫の検出方法。
項３．  血清において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、悪性神経芽腫の検出方法。
項４．  血清において、マイクロサテライト配列をターゲットとしてPCRを行うことにより11番染色体上のLOH（loss of heterozygosity）を検出することを特徴とする、神経芽腫の予後の予測方法。
項５．  11番染色体上のLOHを、マイクロサテライト解析法により検出する、項１〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
神経芽腫は、尿検査により一次スクリーニングを行うことができる。
【０００９】
一方、尿検査で見出された神経芽腫の多くが自然に退縮するため、自然に退縮する神経芽腫なのか進行性であって予後の悪い神経芽腫なのかを早期に見極めて、治療することが必要になる。
【００１０】
本発明により11q LOHが血液由来検体を用いて簡便に検出できるようになったことで、自然退縮する神経芽腫と進行性の神経芽腫をより正確に見分けることができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アンバランスなLOH 検出を模式的に示す。LOH(+)の場合、１つのバンドのみが検出され、LOH(-)の場合、２つのバンドが検出される。
【図２】マイクロサテライト解析、FISH法による、11q LOH解析。a: 血清、腫瘍、リンパ球DNAを用いた、マイクロサテライト解析の結果。リンパ球DNAでは2つのピークが認められるのに対し、血清、腫瘍DNAでは1つのピークが大きく減少している。b: 同一患者の初代培養細胞を用いた、FISH解析。11番染色体は4つのシグナル（緑）に対し、MLL遺伝子内に作成されたプローブは2つのシグナルが認められ、本症例は11q LOHと判定される。c： 各プローブの模式図。
【図３】各症例のFISH法結果。
【図４】血清でのLOHindexの分布。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で使用する血液由来検体としては、血清、血漿が挙げられ、血清がより好ましい。
【００１３】
本発明の11番染色体のいずれか一方のLOHとは、例えば図１に示すように一方の染色体に欠失があると（アンバランスなLOH(+)）一方のバンドのみが検出され、両方の染色体に欠失がない場合（アンバランスなLOH(-)）２本のバンドが検出されることで区別することができる。すなわち、正常細胞の場合、理論上は、2種類のPCR産物の生成を示すシグナルが検出されるが、11q LOHが存在する腫瘍由来DNAを用いた系では、1つのアレルが消失しているために1種類のシグナルしか検出されない。
【００１４】
11番染色体には、８つのマイクロサテライト領域があり、LOHの検出には、増幅産物がこのマイクロサテライト領域を少なくとも１つ含むようにPCRプライマーを設計する。PCRプライマーとしては、表１に示すプライマーセットが例示できる。マイクロサテライト領域は多数のＣＡリピートを有し、このCAリピート回数の多型性を利用して、アレルの識別を行う。好ましいプライマーセットとしては、表１に示される配列が挙げられる。
【００１５】
PCRの反応産物の長さは、11q LOHが検出可能である限り特に限定されないが、例えば50〜1000bp程度、好ましくは60〜800bp程度、より好ましくは80〜600bp程度、さらに好ましくは90〜500bp程度、特に100〜350bp程度である。表1に示されるプライマーセットを用いる場合、各染色体のCAの繰り返しの回数の差で、174bpから196bpまでの2本のバンドが検出され、LOHがある場合、1本のバンドが欠落する。
【００１６】
本発明の11q LOHは、神経芽腫以外の細胞では正常な配列を有するので、例えば血液サンプルからリンパ球細胞を別途分離し、その11q LOHに対応する配列を増幅させこれをアンバランスなLOH(-)の標準サンプルとして使用することで、神経芽腫がアンバランスなLOH(+)であるのか、アンバランスでないLOH(-)であるのかを容易に検出することができる。
【００１７】
LOH解析される位置は、具体的には、11番染色体の23.3の位置(11q23.3)である。
【００１８】
マイクロサテライト配列をターゲットにしたLOH解析において、LOH指数が0.5以下もしくは2以上であればLOHと判定され、0.5と2の間であれば、LOHではない（正常）と判定される(図４)。
LOH指数＝｛Ａ／Ｂ｝／｛Ｃ／Ｄ｝
ここで、
「Ａ」：正常組織対立遺伝子2のピーク面積
「Ｂ」：正常組織対立遺伝子1のピーク面積
「Ｃ」：腫瘍組織対立遺伝子2のピーク面積
「Ｄ」：腫瘍組織対立遺伝子1のピーク面積
正常と判定  ：０．５＜LOH指数＜２
LOHと判定：０．５≧LOH指数、または、ＬＯＨ指数≦２
【００１９】
PCR産物の検出のためには、プライマーの一方または両方を蛍光標識などで標識するのが好ましい。標識としては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ダンシル、ルシファーイエローＶＳ、ウンベリフェリル、希土キレート、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＴＲＩＴＣ、ＡＬＥＸＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、量子ドットなどの蛍光物質による標識、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、金粒子、鉄粒子、磁性粒子、磁気ビーズによる標識などが挙げられる。
【００２０】
11番染色体上のLOHは、好ましくはマイクロサテライト解析法により検出することができる。
【００２１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２２】
実施例1
１．方法
細胞株、腫瘍検体、血清
京都府立医科大学小児科、京都市立病院小児科で診療を行った神経芽腫患者のうち、初診時血清、凍結保存された腫瘍検体、末梢血リンパ球、腫瘍組織の初代培養細胞が保存され、かつ研究への検体利用の同意が取得できている24症例につき検討を行った。
DNAの抽出
腫瘍検体30μg、初診時血清200μlより、DNAをQIAamp DNA Mini kit（Qiagen）を用いて抽出した。血清については、細胞成分を除去するため、15,000 rpm、10分間の遠心処理をさらに加え、その上清を用いた。
PCR
既に報告されている、神経芽腫の11q LOH領域に含まれる3か所のマイクロサテライト領域を増幅するプライマーセットを作成した（表1）。フォワードプライマーにはそれぞれ蛍光標識を行い、リバースプライマーは、テイルドプライマーとした（Applied Biosystems）。これらのプライマーセットを用い、血清、腫瘍、リンパ球から抽出したDNAを鋳型としてPCR反応を行った。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
キャピラリー電気泳動
それぞれのPCR産物を、ABI PRISM 310 genetic analyzer（Applied Biosystems）を用いてキャピラリー電気泳動した。PCR産物それぞれのフラグメントサイズと蛍光強度は、Genescan Software（Applied Biosystems）で解析した。血清DNAとリンパ球DNAより得られたPCR産物の蛍光強度の比（LOH指数）を計算した（図2a）。
【００２５】
Fluorescent in situ hybridization
腫瘍組織の初代培養細胞をカルノア固定し、スライドガラスに展開して上記固定したものをFISH解析した。11qLOH領域に含まれる、MLL遺伝子内にプローブを作成した（GSP研究所）。また、11番染色体αサテライト部に設定されたプローブ（Abbott Molecular/Visys）をcentromere enumeration probeとし、two-color FISHを行った（図2b、c）。FISH標本はBZ-8000蛍光顕微鏡（KEYENCE）を用いて600倍で観察し、LOH判定を行った。
【００２６】
統計解析
FISH法の結果で11q LOH陽性群、陰性群の2群に分け、それぞれの血清におけるLOH indexをMann-WhitneyのU検定を用いて比較した。
【００２７】
２．結果
FISH法で11q LOH陰性と判定された群（LOH陰性群）は19例、LOH陽性と判定された群（LOH陽性群）は5例であった（図3）。LOH陰性群の血清DNAによるLOH indexと、LOH陽性のLOH indexは有意に差を認めた（p=0.007）。LOH陰性群での血清LOH indexは1前後となるのに対し、LOH陽性群では2を大きく上回る、あるいは0.5を大きく下回り、LOH indexのカットオフ値を0.5、2.0と設定したときの感度、特異度はそれぞれ100%であった（図4）。
【００２８】
３．考察
本発明者らの結果より、腫瘍の11q LOHの有無は、患者の初診時血清より抽出した腫瘍由来DNAを用いたマイクロサテライト解析により予測可能と考えられた。このことは、神経芽腫の強力な予後不良因子である11q LOHの有無を、術前に診断することが可能であることを示している。
【００２９】
神経芽腫の治療方針は、年齢や病期に加えて、遺伝子学的な予後不良因子の有無を考慮したリスク分類に応じて、無治療による経過観察から、手術、化学療法、放射線療法を併用した集学的治療まで多岐にわたる。最近では、MYCN遺伝子増幅、11q LOHの有無が強力な予後因子として報告され、リスク分類に必須の診断項目となった。一方で、乳児期に発症した限局性の神経芽腫に対しては、手術を行わずに自然消退を期待する無治療経過観察も広く行われているが、遺伝子学的な予後不良因子の検索を行わないため、時によりリスクを過小評価する危険性がある。今回の結果より、初診時血清を用いて予後因子判定を行うことが可能となれば、より詳細なリスク分類が、手術することなく可能になるため、患者にリスクに応じた侵襲度の治療を提供することが可能になると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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