(57)【要約】【課題】本発明の目的は、優れた細胞内シグナル伝達の解析方法を提供することにある。【解決手段】本発明の第１の実施形態に係るｃＡＭＰ応答活性の解析方法は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、前記細胞が放射する光の量を測定する工程と、前記光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、
前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、
前記細胞が放射する光の量を測定する工程と、
前記光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程と
を含むｃＡＭＰ応答活性の解析方法。
【請求項２】
前記セロトニン受容体はセロトニン２Ａ受容体サブタイプである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ドーパミン受容体はドーパミンＤ１受容体サブタイプである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｃＡＭＰ応答配列はｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）配列である請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子は発光タンパク質をコードし、
前記細胞に対して、前記発光タンパク質により触媒されて発光反応を生じる発光基質を供給する工程をさらに含む請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子は蛍光タンパク質をコードする請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記セロトニン受容体に結合する物質はセロトニン２Ａ受容体アゴニストである請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記光の量の測定は、フォトンカウンティングにより行われるか、または撮像素子を用いた撮像により行われる請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記光の量の測定は、複数の細胞から放射される光をフォトンカウンティングすることにより行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記光の量の測定は、撮像素子を用いて、１つまたは複数の細胞を繰り返し撮像することにより行われる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記光の量の測定は、撮像素子を用いて、複数の細胞を同時に撮像することにより行われ、
前記ｃＡＭＰ応答活性の算出は、前記撮像によって得られた画像に含まれる細胞ごとに行われる
請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、
前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、
前記細胞に対して、前記細胞中に発現する細胞内タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤を供給する工程と、
前記細胞が放射する光の量を測定する工程と、
前記光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程と
を含む前記細胞内タンパク質の機能を解析する方法。
【請求項１３】
セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、ｃＡＭＰ結合領域および第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質を含むｃＡＭＰセンサータンパク質とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、
前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、
前記細胞が放射する、第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の量および第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質に起因する光の量をそれぞれ測定する工程と、
前記第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程と、
前記第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質に起因する光の量に基づいて、前記セロトニン受容体と前記ドーパミン受容体との相互作用を検出する工程と
を含む細胞内シグナル伝達の解析方法。
【請求項１４】
セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含むｃＡＭＰ応答活性の低下に起因する疾病を治療するための細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞中のサイクリックアデニル酸（ｃＡＭＰ）応答活性を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンおよび神経伝達物質の多くは、Ｇタンパク質共役型受容体に対して作用し、細胞内セカンドメッセンジャーを介して様々な細胞活動を引き起こす。セロトニンおよびドーパミンは、モノアミンに属する神経伝達物質であり、ヒトの情動、気分、依存、認知、学習および記憶といった広範囲における脳機能の調節に関わる。そのため、セロトニンおよびドーパミン並びにそれらの受容体は、躁うつ病、統合失調症、気分障害、自閉症、注意欠陥および多動性障害といった精神疾患の治療における標的として考えられている。
【０００３】
また、上述のような脳の高次機能は、脳内の伝達物質およびその受容体の時間的および空間的な濃度分布によって制御されている。したがって、特定の情動活動に関する情報伝達機構を解析するにあたって、脳内のセロトニン受容体およびドーパミン受容体が関与するシグナル伝達の時間的および空間的な変化をリアルタイムに捉えることが重要となる。
【０００４】
これまでに、向精神薬および抗うつ薬といった薬物の作用機序の解析から、薬物の薬理作用は投与直後に認められる一方で、治療効果が表れるまでには数週間を要することが知られている。このことから、近年では、向精神薬および抗うつ薬の神経系に対する直接的な作用だけでなく、細胞内の様々なシグナル伝達系に関与する転写因子制御の分子メカニズムが注目されてきている。
【０００５】
様々な転写因子の中で、モノアミンおよびグルタミン酸の受容体の刺激によりリン酸化修飾を受けるｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢタンパク質）による転写制御が、薬物の治療効果に深く関与していると考えられている。ＣＲＥＢタンパク質は、リン酸化された場合、ゲノムＤＮＡ上のｃＡＭＰ応答配列であるｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）配列に結合し、その下流に存在する脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの遺伝子の発現を増加させる。これにより、神経可塑性の変化および神経新生をもたらすと推測されている。このように、脳内のセロトニン受容体およびドーパミン受容体が関与するシグナル伝達の時空間的な変化の解析において、ｃＡＭＰ応答配列の活性を捉えることも非常に重要となる。
【０００６】
特許文献１には、セロトニン受容体およびドーパミン受容体の相互作用を検出する方法が開示されている。具体的には、セロトニン２Ａ受容体と、ドーパミンＤ１受容体と、発光タンパク質であるホタルのルシフェラーゼおよびｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）のｃＡＭＰ結合ドメインを含むｃＡＭＰセンサータンパク質とを細胞に発現させて、細胞から放射される光を検出している。この方法では、セロトニン２Ａ受容体に刺激を与えることで、セロトニン２Ａ受容体、ドーパミンＤ１受容体およびアデニル酸シクラーゼを順次活性化し、細胞内のｃＡＭＰ濃度を上昇させる。このｃＡＭＰ濃度の上昇を、ｃＡＭＰセンサータンパク質によって、発光量の変化に変換している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２４３４８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、優れた細胞内シグナル伝達の解析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の実施形態に係るｃＡＭＰ応答活性の解析方法は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、前記細胞が放射する光の量を測定する工程と、前記光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程とを含む。
【００１０】
本発明の第２の実施形態に係る細胞内タンパク質の機能を解析する方法は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、前記細胞に対して、前記細胞中に発現する細胞内タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤を供給する工程と、前記細胞が放射する光の量を測定する工程と、前記光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程とを含む。
【００１１】
本発明の第３の実施形態に係る細胞内シグナル伝達の解析方法は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、ｃＡＭＰ結合領域および第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質を含むｃＡＭＰセンサータンパク質とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、前記細胞が放射する、第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の量および第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質に起因する光の量をそれぞれ測定する工程と、前記第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程と、前記第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質に起因する光の量に基づいて、前記セロトニン受容体と前記ドーパミン受容体との相互作用を検出する工程とを含む。
【００１２】
本発明の第４の実施形態に係るｃＡＭＰ応答活性の低下に起因する疾病を治療するための細胞は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、優れた細胞内シグナル伝達の解析を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第１の実施形態に係る解析方法の概要を示すフロー図。
【図２】第１の実施形態に係る解析方法において用意される細胞の概要を示す図。
【図３】第１の実施形態に係る解析方法において使用できる、光の量の測定およびｃＡＭＰ応答活性の算出のためのシステムの概要を示す図。
【図４】ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、セロトニン２Ａ受容体とを含むＨＥＫ２９３細胞、および、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、セロトニン２Ａ受容体と、ドーパミンＤ１受容体とを含むＨＥＫ２９３細胞における、セロトニン刺激前（ｃｏｎｔｒｏｌ）および刺激後（５ＨＴ）の発光量を示すグラフ。
【図５】ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、セロトニン２Ａ受容体とを含むＨＥＫ２９３細胞、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、セロトニン２Ａ受容体と、ドーパミンＤ１受容体とを含むＨＥＫ２９３細胞、およびｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、セロトニン２Ａ受容体と、ドーパミンＤ２受容体とを含むＨＥＫ２９３細胞において、セロトニン刺激後の発光量を示すグラフ。
【図６】ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、セロトニン２Ａ受容体とを含むＨＥＫ２９３細胞、およびｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、セロトニン２Ａ受容体と、ドーパミンＤ１受容体とを含むＨＥＫ２９３細胞における、カルモデュリンキナーゼ阻害剤（ＫＮ−９３）およびＰＫＡ阻害剤（ＫＴ５２５７）のｃＡＭＰ応答活性に対する影響を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
図１は、第１の実施形態に係るｃＡＭＰ応答活性の解析方法の概要を示すフロー図である。この解析方法は、細胞を用意する工程Ｓ１、受容体結合物質を供給する工程Ｓ２、細胞から放射される光を検出する工程Ｓ３およびｃＡＭＰ応答活性を算出する工程Ｓ４を含む。
【００１７】
細胞を用意する工程Ｓ１では、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む１つまたは複数の細胞を用意する。
【００１８】
図２には、工程Ｓ１において用意される細胞１が示されている。細胞１の細胞膜には、セロトニン受容体２およびドーパミン受容体３が存在し、細胞質中には、核酸４が存在している。また、細胞外には、セロトニン受容体２に対して供給される受容体結合物質５が示されている。
【００１９】
細胞１は、例えば、動物細胞、植物細胞または微生物の細胞である。動物細胞は、例えばマウス、ラット、ウサギ、サルおよびヒトといった哺乳類の細胞である。また、細胞１は、例えば、培養細胞、単離された組織中の細胞または個体中の組織中の細胞である。細胞１は、例えば神経細胞である。
【００２０】
セロトニン受容体２は、セロトニン受容体の任意のサブタイプである。特に、セロトニン受容体２は、セロトニン２Ａ受容体サブタイプである。セロトニン受容体２は、細胞１によって内因的に発現されるものであってよく、または細胞１に対して外因的に導入されるものであってもよい。セロトニン受容体２を外因的に導入する具体的方法としては、例えば、人為的に制御可能な発現プロモーターとその下流に位置したセロトニン受容体２遺伝子とを含む核酸を細胞１に対して導入し、セロトニン受容体２を細胞内で強制発現させることができる。
【００２１】
ドーパミン受容体３は、ドーパミン受容体の任意のサブタイプである。特に、ドーパミン受容体３は、ドーパミンＤ１受容体サブタイプである。ドーパミン受容体３は、細胞１によって内因的に発現されるものであってよく、または細胞１に対して外因的に導入されるものであってもよい。ドーパミン受容体３を外因的に導入する具体的方法としては、例えば、人為的に制御可能な発現プロモーターとその下流に位置したドーパミン受容体３遺伝子とを含む核酸を細胞１に対して導入し、ドーパミン受容体３を細胞内で強制発現させることができる。
【００２２】
核酸４は、ｃＡＭＰ応答配列と、発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子とを含む。発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、核酸４においてｃＡＭＰ応答配列の付近に配置されており、ｃＡＭＰ応答配列の活性化に起因して転写が開始される。好ましくは、この遺伝子は、ｃＡＭＰ応答配列のすぐ下流に配置されている。核酸４は、例えば、細胞１のゲノムの一部を構成しており、または細胞１に導入された発現ベクターの一部を構成する。
【００２３】
ここにおける発光タンパク質とは、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光タンパク質は、例えばルシフェラーゼである。ルシフェラーゼは、例えば、ホタルに由来するもの、ウミシイタケに由来するものおよびバクテリアに由来するものである。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼによる触媒作用により、発光基質であるルシフェリンの化学変化が生じる。この化学変化に伴い、発光が生じる。
【００２４】
ここにおける蛍光タンパク質とは、励起光の照射を受けて、光を放射するタンパク質を意味する。特に、蛍光タンパク質は、励起光の照射後、直ちに光を放射する。蛍光タンパク質は、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその改変体である。
【００２５】
核酸４に含まれるｃＡＭＰ応答配列とは、ＣＲＥＢタンパク質の結合に依存して、下流に位置する遺伝子の発現を制御できる塩基配列である。ｃＡＭＰ応答配列は、例えばｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）配列である。ＣＲＥ配列によって一般に誘導される遺伝子には、脳由来神経栄養因子、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ＦＫ５０６結合タンパク質、グルタミン酸受容体、ヒスタミン受容体、電位依存性カリウムチャネル、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ、ロドプシン、シナプシンＩ、腫瘍壊死因子受容体、アドレナリン受容体、アクアポリン、サイクリン依存性キナーゼ５、コリンアセチルトランスフェラーゼ、ｃＡＭＰ応答性因子結合タンパク質１、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ｂ受容体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、グルタミン酸受容体、水酸化ステロイド（１１−ベータ）デヒドロゲナーゼ１、インスリン受容体、パーキン、ピリオドホモログ１、タンパク質キナーゼＣ、プリオンタンパク質および電位依存性ナトリウムチャネルが含まれる。
【００２６】
受容体結合物質を供給する工程Ｓ２では、細胞１に対して、セロトニン受容体２に結合する物質５を供給する。
【００２７】
この物質５は、例えば、セロトニン受容体に結合した後、セロトニン受容体を活性化させる物質である。この物質５は、例えばセロトニン受容体アゴニストであり、好ましくはセロトニン２Ａ受容体アゴニストである。セロトニン受容体に結合する物質の具体例は、セロトニン、２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン（（Ｒ）−ＤＯＩ）、Ｎ−（２−ヒドロキシベンジル）−２Ｃ−Ｉ（２５Ｉ−ＮＢＯＨ）、２５Ｉ−ＮＢＯＨの２−メトキシ−アナログ（２５Ｉ−ＮＢＯＭｅ）、ＴＣＢ−２およびＢｒ−ＤＦＬＹである。細胞１に対するこの物質の供給は、例えば、細胞１が培養されている培地に対してこの物質を添加することで行われる。また、細胞１におけるセロトニン受容体２の発現の状態といった、細胞１の状態を考慮して、この物質を供給するタイミングを設定することもできる。
【００２８】
細胞から放射される光を検出する工程Ｓ３では、細胞１が放射する光の量を測定する。
【００２９】
光の量の測定は、細胞ごとに行われるか、または複数の細胞を含む細胞集団において行われる。また、測定は、一度だけ行われるか、または複数回行われる。例えば、測定は、一定時間おきに複数回行われる。あるいは、測定は、特定のタイミングで行われる。例えば、測定は、受容体結合物質５の供給から一定時間後に行われる。
【００３０】
光の量の測定は、フォトンカウンティングにより行われるか、または撮像素子を用いた撮像により行われる。フォトンカウンティングにより行う場合、例えば光電子倍増管を備えたフォトンカウンターによって、細胞から放射される光子の数を計測することで行われる。また、撮像素子を用いた撮像により行う場合、例えばＣＣＤ撮像素子を備えた装置を用いて、細胞から放射される光を画像として得ることができる。この画像に基づいて、光の量を数値化できる。
【００３１】
ｃＡＭＰ応答活性を算出する工程Ｓ４では、光の量に基づいて、細胞１内のｃＡＭＰ応答活性を算出する。
【００３２】
ｃＡＭＰ応答活性とは、ｃＡＭＰ応答配列が、その下流に位置する遺伝子の発現を促す活性を意味する。ｃＡＭＰ応答活性の算出として、例えば、測定した光の量と基準になる量との差が求められる。基準になる量とは、例えば、細胞１に対して受容体結合物質５を供給することなく検出された光の量である。あるいは、基準になる量とは、セロトニン受容体および／またはドーパミン受容体を発現していない細胞から検出された光の量である。あるいは、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質もしくは蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸を含まない細胞から検出された光の量である。同じ細胞に対して光の量の測定を複数回行った場合には、特定の測定結果と別の測定結果との差を求めることもできる。
【００３３】
工程Ｓ３において、フォトンカウンティングによって光の量の測定を行った場合、光の量に応じて得られた数値を算出に使用することができる。一方、撮像素子を用いて撮像を行った場合、得られた画像を比較のために用いることができる。例えば、画像に基づいて、光の量を数値化し、その数値を算出に用いることができる。このとき、画像に含まれる複数の細胞をまとめて数値化することができ、あるいは、画像に含まれる細胞ごとに数値化することができる。
【００３４】
図３には、光の量の測定およびｃＡＭＰ応答活性の算出を行うためのシステムの例が示される。このシステムは、細胞１を収容するための容器１０、光検出器１１および解析装置１２を含む。容器１０は、例えばシャーレである。容器１０の代わりに、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体等を使用することもできる。光検出器１１は、例えば光学顕微鏡に備えられたカメラである。解析装置１２は、例えばパーソナルコンピュータである。図１では、光検出器１１は細胞１の下に配置されているが、光検出器１１は細胞の上に配置してもよい。
【００３５】
なお、発光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸４を使用する場合、第１の実施形態に係るｃＡＭＰ応答活性の解析方法に、発光タンパク質に起因した発光を生じさせるための工程をさらに含めることができる。例えば、細胞に対して、発光タンパク質により触媒されて発光反応を生じる発光基質を供給する工程を含めることができる。この工程は、例えば、細胞から放射される光を検出する工程Ｓ３の直前に行われる。
【００３６】
次に、ｃＡＭＰ応答活性の解析方法において、細胞１中で生じていると考えられる現象を説明する。工程Ｓ２において、細胞１に対して供給された受容体結合物質５は、細胞１の細胞膜に存在するセロトニン受容体２の細胞外側の部分に結合する。セロトニン受容体２は、この結合によって活性化され、細胞１の細胞膜に存在するドーパミン受容体３と相互作用する。その後、ドーパミン受容体３は、細胞内に存在するアデニル酸シクラーゼを活性化する。活性化されたアデニル酸シクラーゼにより、ｃＡＭＰの合成反応が促進され、細胞中のｃＡＭＰ濃度が上昇する。ｃＡＭＰ濃度の上昇によって、細胞内に存在するｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼが活性化し、ＣＲＥＢタンパク質をリン酸化する。リン酸化されたＣＲＥＢタンパク質は、ｃＡＭＰ応答配列に結合し、これが引き金となり、ｃＡＭＰ応答配列の下流に位置する発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子の発現が促進される。発現した発光タンパク質または蛍光タンパク質によって細胞１から照射される光は、工程Ｓ３において測定される。なお、この一連の現象は、あくまでも予想に過ぎない。受容体結合物質５を細胞１に供給し、細胞１から光が照射されるまでの間に、ここで説明した現象とは異なる現象が生じていてもよい。
【００３７】
本発明の第１の実施形態に係るｃＡＭＰ応答活性の解析方法によれば、優れた細胞内シグナル伝達の解析が可能となる。
【００３８】
特許文献１に記載される方法では、ｃＡＭＰセンサータンパク質の活性化に起因して細胞から照射される光を測定する。ｃＡＭＰセンサータンパク質の活性は、ｃＡＭＰ濃度の上昇に直接的に依存する。したがって、特許文献１に記載される方法では、特に、細胞内シグナル伝達のうち、セロトニン受容体、ドーパミン受容体およびアデニル酸シクラーゼが関与する部分に着目して解析することができる。
【００３９】
これに対し、第１の実施形態に係る解析方法では、細胞内で発現した発光タンパク質または蛍光タンパク質に起因して細胞から照射される光を測定する。発光タンパク質または蛍光タンパク質の発現は、ｃＡＭＰ応答配列の作用に直接的に依存する。したがって、第１の実施形態に係る解析方法は、特許文献１に記載された方法によって解析可能な細胞内シグナル伝達に加え、特許文献１に記載された方法では解析できない細胞内シグナル伝達の解析にも利用することができる。すなわち、アデニル酸シクラーゼ以降の細胞内シグナル伝達を解析することができる。
【００４０】
また、セロトニン受容体としてセロトニン２Ａ受容体サブタイプを使用した場合、ドーパミン受容体の活性化およびその後のｃＡＭＰ濃度の上昇をより促進することが可能となり、細胞から照射される光の量を増大することができる。
【００４１】
ドーパミン受容体としてドーパミンＤ１受容体サブタイプを使用した場合、ｃＡＭＰ濃度の上昇をより促進することが可能となり、細胞から照射される光の量を増大することができる。
【００４２】
ｃＡＭＰ応答配列としてｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）配列を使用した場合、ｃＡＭＰ濃度の上昇に依存した発光タンパク質または蛍光タンパク質の遺伝子の発現を増強することが可能となり、細胞から照射される光の量を増大することができる。
【００４３】
発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子として、発光タンパク質をコードする遺伝子を選択し、細胞に対して、発光タンパク質により触媒されて発光反応を生じる発光基質を供給する工程をさらに含めた場合、励起光を照射することなく細胞から光を照射させることが可能となる。
【００４４】
発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子として、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を選択した場合、細胞に対して発光基質を供給することなく細胞から光を照射させることが可能となる。
【００４５】
セロトニン受容体に結合する物質としてセロトニン２Ａ受容体アゴニストを使用した場合、セロトニン受容体の活性化をより促進することが可能となり、細胞から照射される光の量を増大することができる。
【００４６】
光の量の測定を、フォトンカウンティングにより、または撮像素子を用いた撮像により行った場合、精度の高い測定が可能となる。
【００４７】
光の量の測定を、複数の細胞から放射される光をフォトンカウンティングすることで行った場合、複数の細胞から放射される光を累積的に測定できるため高感度の測定が可能となり、また、異常な細胞から放射される光の量が平均化されるため安定した測定が可能となる。
【００４８】
光の量の測定を、撮像素子を用いて、１つまたは複数の細胞を繰り返し撮像することで行った場合、繰り返し撮像するため、ｃＡＭＰ応答活性の時間的な変動を解析することが可能となる。
【００４９】
光の量の測定を、撮像素子を用いて、複数の細胞を同時に撮像することにより行い、さらに、ｃＡＭＰ応答活性の算出を、前記撮像によって得られた画像に含まれる細胞ごとに行った場合、単一の細胞における解析が可能となる。
【００５０】
第２の実施形態に係る細胞内タンパク質の機能を解析する方法は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、前記細胞に対して、前記細胞中に発現する細胞内タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤を供給する工程と、前記細胞が放射する光の量を測定する工程と、前記光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程とを含む。
【００５１】
第２の実施形態に係る方法に含まれる、細胞を用意する工程、受容体結合物質を供給する工程、光の量を測定する工程およびｃＡＭＰ応答活性を算出する工程は、第１の実施形態に係る方法に含まれるそれらと同様である。
【００５２】
一方、第２の実施形態に係る方法は、細胞に対して、細胞中に発現する細胞内タンパク質に対する少なくとも１つの阻害剤を供給する工程を含む。この細胞内タンパク質は、例えば、細胞内シグナル伝達への関与を調べようとするタンパク質である。阻害剤の供給は、例えば、細胞を培養している培地中に添加することで行うことができ、または、マイクロインジェクション法およびリポフェクション法等により細胞内に直接導入することで行うことができる。阻害剤は、単一のものを供給することができ、または複数種のものを供給することができる。例えば、いずれも同一の細胞内タンパク質を標的とする複数種の阻害剤を供給することができる。あるいは、それぞれ異なる細胞内タンパク質を標的とする複数の阻害剤を供給することができる。複数の阻害剤を供給する場合、全て同時に供給することができ、または任意のタイミングで個々に供給することができる。
【００５３】
阻害剤を供給することで、その阻害剤が標的とする細胞内タンパク質の機能は低下または消失する。この細胞内タンパク質が、セロトニン受容体からｃＡＭＰ応答活性までの細胞内シグナル伝達に関与する場合、阻害剤の作用によって、その細胞内シグナル伝達の程度は低下するか、または細胞内シグナル伝達は遮断される。この場合、ｃＡＭＰ応答活性が低下または消失するため、細胞内における発光タンパク質または蛍光タンパク質に起因して細胞から放射される光の量は低下するか、またはゼロとなる。この場合、この細胞内タンパク質は細胞内シグナル伝達に関与している可能性が高いと結論することができる。
【００５４】
一方、阻害剤を供給しても、細胞から放射される光の量に有意な低下が見られない場合、その細胞内タンパク質は細胞内シグナル伝達に関与している可能性が低いと結論することができる。
【００５５】
第２の実施形態に係る方法によれば、特定の細胞内タンパク質が、セロトニン受容体およびドーパミン受容体が関与する細胞内シグナル伝達に関与しているか否かを調べることができる。例えば、多数の阻害剤について、個々にこの方法を実施することで、細胞内シグナル伝達に関与している細胞内タンパク質をスクリーニングすることが可能となる。
【００５６】
本発明の第３の実施形態に係る細胞内シグナル伝達の解析方法は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸と、ｃＡＭＰ結合領域および第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質を含むｃＡＭＰセンサータンパク質とを含む１つまたは複数の細胞を用意する工程と、前記細胞に対して、前記セロトニン受容体に結合する物質を供給する工程と、前記細胞が放射する、第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の量および第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質に起因する光の量をそれぞれ測定する工程と、前記第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の量に基づいて、前記細胞内のｃＡＭＰ応答活性を算出する工程と、前記第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質に起因する光の量に基づいて、前記セロトニン受容体と前記ドーパミン受容体との相互作用を検出する工程とを含む。
【００５７】
第３の実施形態に係る方法に含まれる細胞を用意する工程では、第１の実施形態に係る方法において用意する細胞に対して、さらにｃＡＭＰ結合領域および第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質を含むｃＡＭＰセンサータンパク質を導入する。
【００５８】
ｃＡＭＰ結合領域は、例えば、ｃＡＭＰと結合した結果、構造が変化するタンパク質である。ｃＡＭＰ結合領域として、例えば、マウスのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ−ＲＩα由来のｃＡＭＰ結合領域を使用することができる。
【００５９】
第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質は、ｃＡＭＰセンサータンパク質において、２つの断片に分離した状態で含まれている。これらの断片の間にはｃＡＭＰ結合領域が配置されており、これらの断片の位置関係は、ｃＡＭＰ結合領域の構造に応じて変化する。２つの断片が特定の位置関係となったとき、第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質としての活性を有し、またはその活性を失う。
【００６０】
第２の発光タンパク質は、例えば、ルシフェラーゼである。このルシフェラーゼは、ｃＡＭＰセンサータンパク質において、Ｎ末端側断片とＣ末端側断片とに分離している。
【００６１】
ｃＡＭＰセンサータンパク質として、特許文献１に開示されるＧＬ４＿Ｎ＿ＲＩα＿β１ＡＢ＿ＣまたはｃｐＧＬ４＿Ｃ＿ＲＩα＿αＡＢ＿Ｎを使用することができる。
【００６２】
第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質によって生じる光の波長は、第２の発光タンパク質または第２の発光タンパク質に起因して生じる光の波長とは異なることが好ましい。第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質は、第２の発光タンパク質または第２の発光タンパク質と異なることが好ましい。例えば、第１の蛍光タンパク質としてのＧＦＰと、第２の発光タンパク質としてのルシフェラーゼとが使用される。
【００６３】
第３の実施形態に係る方法では、セロトニン受容体結合物質の供給に起因して、細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇する。ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰセンサータンパク質のｃＡＭＰ結合領域に結合する。この結合によって、ｃＡＭＰ結合領域の構造が変化し、これに起因して、第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質の活性が上昇する。その結果、第２の発光タンパク質または第２の蛍光タンパク質に起因して、細胞から光が放射される。一方、ｃＡＭＰの濃度の上昇に起因して、ＣＲＥＢタンパク質がリン酸化され、ｃＡＭＰ応答配列に結合し、その下流に存在する第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質の発現を増大させる。その結果、第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因して、細胞から光が放射される。このように、細胞内シグナル伝達の上流側に起因した光と下流側に起因した光とを１つの細胞から別々に検出することが可能となる。
【００６４】
なお、第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の波長と、第２の発光タンパク質または第２の発光タンパク質に起因する光の波長とが互いに近いまたは同一である場合、それぞれのタンパク質に由来する光は、例えば放射される時間によって区別される。例えば、先に放射された光を第２の発光タンパク質または第２の発光タンパク質に由来するものと判断し、遅れて放射される光を第１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に由来するものと判断する。一方、１の発光タンパク質または第１の蛍光タンパク質に起因する光の波長と、第２の発光タンパク質または第２の発光タンパク質に起因する光の波長とが互いに区別できる程度に異なる場合、それぞれのタンパク質に由来する光は、例えばそれらの光の波長によって区別される。
【００６５】
第３の実施形態に係る方法は、優れた細胞内シグナル伝達の解析方法を提供できる。例えば、細胞内シグナル伝達の上流側に起因した光が放射される時間、および下流側に起因した光が放射される時間を測定することで、細胞内シグナル伝達の時間的研究が可能となる。また、撮像素子による撮像を行う場合には、上流側に起因した光が放射される細胞中の位置、および下流側に起因した光が放射される細胞中の位置を測定することで、細胞内シグナル伝達の空間的研究が可能となる。
【００６６】
また、一般に、細胞内では、複数のシグナル伝達経路が存在しており、それらは複雑に関係し合っている。そのため、特定のシグナル伝達経路において、その最上流に位置する受容体に刺激を与えた場合に、途中の経路の活性化が確認できないものの、下流の活性化が確認できる場合が存在する。第３の実施形態に係る方法は、細胞内シグナル伝達の上流側と下流側とをそれぞれ調べることができるため、このような複雑な細胞内シグナル伝達経路の解析も可能となる。
【００６７】
本発明の第４の実施形態に係るｃＡＭＰ応答活性の低下に起因する疾病を治療するための細胞は、セロトニン受容体と、ドーパミン受容体と、ｃＡＭＰ応答配列および発光タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸とを含む。
【００６８】
第４の実施形態に係る細胞は、第１の実施形態に係る方法において用意される細胞と同様である。この細胞は、例えば、疾病を有するヒトといった動物の体内に移植することができる。
【００６９】
この細胞は、セロトニン受容体結合物質を供給することで、ｃＡＭＰ応答活性を上昇させることができる。ｃＡＭＰ応答活性を上昇させることで、ｃＡＭＰ応答配列の下流に位置する遺伝子の発現を誘導することができる。
【００７０】
第４の実施形態に係る細胞によれば、ｃＡＭＰ応答活性の低下に起因した疾病を治療することができる。
【実施例】
【００７１】
＜発現ベクターの作製＞
ヒトＤ１受容体遺伝子およびヒトＤ２受容体遺伝子並びにヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子をクローニングした後、それぞれの遺伝子を含む発現ベクターを作製した。
【００７２】
［手順１］
ＰＣＲ法によるクローニングにおいて使用する合成オリゴＤＮＡを作製した。作製した配列の詳細を以下に示す。
（ヒトＤ１受容体遺伝子用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＨＵ＿Ｄ１Ｒ＿Ｆｗ：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号１）
ＨＵ＿Ｄ１Ｒ＿Ｒｖ：５’−ＴＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＴ−３’（配列番号２）
（ヒトＤ２受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＨＵ＿Ｄ２Ｒ＿Ｆｗ：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号３）
ＨＵ＿Ｄ２Ｒ＿Ｒｖ：５’−ＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴ−３’（配列番号４）
（ヒト５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子作製用合成オリゴＤＮＡ配列）
ＨＵ＿５ＨＴ２ＡＲ＿Ｆｗ：５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴ−３’（配列番号５）
ＨＵ＿５ＨＴ２ＡＲ＿Ｒｖ：５’−ＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号６）
【００７３】
［手順２］
上記の通り作製した合成オリゴＤＮＡのセットをプライマーとして使用し、さらに、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリ（タカラバイオ株式会社製）を鋳型として、ＰＣＲ法により、それぞれＤ１受容体遺伝子（ヒトのＤ１受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む）、Ｄ２受容体遺伝子（ヒトのＤ２受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む）、５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子（ヒトの５ＨＴ２Ａ受容体遺伝子の全長に対応する領域を含む）を増幅した。
【００７４】
［手順３］
手順２の通り増幅した３種の遺伝子を、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした後、塩基配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００７５】
［手順４］
手順３の通りサブクローニングして得られた３種のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターから、それぞれ遺伝子を切り出し、哺乳類細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン株式会社製）に挿入した。これにより、ヒトＤ１受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ１Ｒ、ヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒ、およびヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲを得た。
【００７６】
＜cＡＭＰ応答活性の解析＞
上記の通り作製した３種の発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した後、cＡＭＰ応答活性を解析した。
【００７７】
［手順１］
ＡＴＣＣ社より入手したＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター内において、１０％のＦｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍおよび１×Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓが添加されたＥａｒｌｅ‘ｓ  ＭＥＭ／培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で培養した。
【００７８】
［手順２］
手順１の通り培養した細胞を、９６ウェル−マルチウェルプレートに、１ｘ１０４／ウェルの細胞密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。培養後、細胞に対してプラスミドの混合物を添加し、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（ロシュ社製）を用いてトランスフェクションを行い、５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。
【００７９】
添加したプラスミドの混合物は、以下の３通りとした。
（混合物１）
Ｔｒａｎｓｌｕｓｅｎｔ  ＣＲＥ（１）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製）、および
ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲ。  
（混合物２）
Ｔｒａｎｓｌｕｓｅｎｔ  ＣＲＥ（１）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製）、
ヒトＤ１受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ１Ｒ、および
ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲ。  
（混合物３）
Ｔｒａｎｓｌｕｓｅｎｔ  ＣＲＥ（１）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製）、
ヒトＤ２受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｄ２Ｒ、および
ヒト５ＨＴ２Ａ受容体発現用プラスミドｐｃＤＮＡ／５ＨＴ２ＡＲ。
【００８０】
なお、混合物１をトランスフェクションした細胞を「細胞１」と称し、混合物２をトランスフェクションした細胞を「細胞２」と称し、混合物３をトランスフェクションした細胞を「細胞３」と称する。
【００８１】
［手順３］
一晩培養後の３種の細胞に対して、それぞれセロトニン（５ＨＴ）で刺激した。具体的には、培養液中に、最終濃度１０μＭとなるようにセロトニンを添加した。その後、５％ＣＯ２インキュベーター内において１８時間培養した。
【００８２】
なお、一部の細胞には、セロトニンの刺激の前に各種阻害剤を供給した。具体的には、セロトニンの刺激を行う３０分前に阻害剤を培地に加えた。
【００８３】
［手順４］
培養後、それぞれの細胞の発光強度を測定した。具体的には、セロトニン刺激後の細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞に対して４０μＬのＰＢＳおよび４０μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（プロメガ社製）を加え、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ  ＪＮＲ−ＩＩ（アトー社製）を使用して発光量（１０秒間の積算）を測定した。
【００８４】
［結果］
図４は、細胞１および２における、セロトニン刺激前（ｃｏｎｔｒｏｌ）および刺激後（５ＨＴ）の発光量を示すグラフである。図４から、細胞１および２のいずれにおいても、セロトニン刺激によって、ｃＡＭＰ応答活性が上昇したことがわかる。しかしながら、その上昇の程度は、Ｄ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体とを発現している細胞２の方が大きいことがわかる。
【００８５】
図５は、細胞１から３における、セロトニン刺激後の発光量を示すグラフである。Ｄ１受容体と５ＨＴ２Ａ受容体とを発現している細胞２が最も高いｃＡＭＰ応答活性を示しているのに対し、Ｄ２受容体と５ＨＴ２Ａ受容体とを発現している細胞３は、５ＨＴ２Ａ受容体のみを発現している細胞１と同等のｃＡＭＰ応答活性しか示めしていないことがわかる。
【００８６】
図６は、（ａ）細胞１または（ｂ）細胞２において、カルモデュリンキナーゼ阻害剤（ＫＮ−９３）またはｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ阻害剤（ＫＴ５２５７）のｃＡＭＰ応答活性に対する影響を示すグラフである。（ａ）および（ｂ）のそれぞれにおいて、左のバーから順に、阻害剤を供給しない状態におけるセロトニン（５ＨＴ）刺激前、阻害剤を供給しない状態におけるセロトニン（５ＨＴ）刺激後、ＫＮ−９３を供給した状態におけるセロトニン（５ＨＴ）刺激後、およびＫＴ５２５７を供給した状態におけるセロトニン（５ＨＴ）刺激後のｃＡＭＰ応答活性を示す。
【００８７】
図６の結果に示されるように、ＫＮ−９３を供給した場合、細胞１ではｃＡＭＰ応答活性が完全に阻害されているのに対し、細胞２では部分的なｃＡＭＰ応答活性の阻害しか見られなかった。一方、ＫＴ５２５７を供給した場合、細胞１ではｃＡＭＰ応答活性に対する影響は見られないのに対し、細胞２では部分的にｃＡＭＰ応答活性の阻害が見られた。
【００８８】
これらの結果から、５ＨＴ２Ａ受容体刺激からｃＡＭＰ応答活性の活性化までの細胞内シグナル伝達経路は、Ｄ１受容体との相互作用によって変化していることが明らかになった。
【００８９】
これまでのセロトニン受容体とドーパミン受容体との相互作用の研究結果から、個体において５ＨＴ２Ａ受容体を介して、Ｄ１受容体を介すると考えられている行動を引き起こすことが知られている。本実験により得られた結果は、個体において観察した反応を細胞レベルで説明することが出来ることを示している。
【００９０】
以上、本実験によれば、細胞内の情報伝達に影響を及ぼすことなく、細胞からの正確な定量的結果を得ることができ、その結果、細胞においてのｃＡＭＰ応答活性の増強を再現性良く観察することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
以上のように、本発明に係る方法および細胞は、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。
【符号の説明】
【００９２】
１…細胞、２…セロトニン受容体、３…ドーパミン受容体、４…核酸、５…受容体結合物質、１０…容器、１１…光検出器、１２…解析装置。
【図１】
2013158249.tif 000003
【図２】
2013158249.tif 000004
【図３】
2013158249.tif 000005
【図４】
2013158249.tif 000006
【図５】
2013158249.tif 000007
【図６】
2013158249.tif 000008
【配列表】
2013158249000001.app