(57)【要約】【課題】鳥類だけでなく他の生物のＤＮＡも混在している試料を利用して鳥類の種判定を行う。【解決手段】ミトコンドリアプロリンｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第一プライマーとミトコンドリアグルタミン酸ｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第二プライマーとの組み合わせで構成される鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、鳥類の細胞と共に鳥類以外の１以上の細胞を含む試料から鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子を特異的に増幅させた後、この遺伝子の配列から鳥類の種を判定するようにした。【選択図】図１
2013106562.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアプロリンｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第一プライマーとミトコンドリアグルタミン酸ｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第二プライマーとの組み合わせで構成される鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子増幅用プライマーセット。
【請求項２】
前記第一プライマーは以下の（１）〜（５）のいずれか１つであり、以下の（２）〜（５）のプライマーは前記第二プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子を増幅し得るプライマーである請求項１に記載のプライマーセット。
（１）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー
（２）配列番号１に示す塩基配列において、１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマー
（３）配列番号１に示す塩基配列のうち連続した２５〜２７塩基からなるプライマー
（４）配列番号１に示す塩基配列の３’末端又は５’末端に１〜５塩基が付加されたプライマー
（５）配列番号１に示す塩基配列の３’末端及び５’末端に合計で１〜５塩基が付加されたプライマー
【請求項３】
前記第二プライマーは以下の（６）〜（１０）のいずれか１つであり、以下の（７）〜（１０）のプライマーは前記第一プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子を増幅し得るプライマーである請求項１又は２に記載のプライマーセット。
（６）配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（７）配列番号２に示す塩基配列において、１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマー
（８）配列番号２に示す塩基配列のうち連続した２３〜２５塩基からなるプライマー
（９）配列番号２に示す塩基配列の３’末端又は５’末端に１〜５塩基が付加されたプライマー
（１０）配列番号２に示す塩基配列の３’末端及び５’末端に合計で１〜５塩基が付加されたプライマー
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて、鳥類の遺伝子と共に鳥類以外の１以上の生物の遺伝子を含む試料から前記鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子を特異的に増幅させた後、この遺伝子の配列から前記鳥類の種を判定することを特徴とする鳥類の種判定方法。
【請求項５】
前記試料が鳥類の糞である請求項４に記載の鳥類の種判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鳥類の種判定方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子増幅用プライマーセットと、このプライマーセットを利用した鳥類の種判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
送電線や鉄塔等の送配電設備では、飛来した鳥類の接触や、巣作りのために持ち込まれた鉄線等の材料によって、短絡事故が発生することが問題となっている。また、鳥類が排泄する糞による汚染（糞害）が生じることも問題となっている。そこで、送配電設備においては、各種の鳥害防止対策が実施されている（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許４２３６１８８号
【０００４】
【非特許文献１】Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrigenhoek R. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294-299.
【非特許文献２】Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society London B 270: 313-321.
【非特許文献３】Hebert PDN, Ratnasingham S, deWaard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society London B 270 (Supplement): S96-S99.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
鳥類は、種によって大きさや習性が異なる。したがって、送配電設備に飛来する鳥類の種を把握して、その大きさや習性に適した鳥害防止対策を実施することができれば、より効果的に鳥害を防止できるものと考えられる。
【０００６】
ここで、送配電設備において糞害が問題となっていることからも明らかなように、送配電設備に飛来した鳥類は、飛来した痕跡として糞を残す。そこで、本願発明者は、この糞を利用して飛来した鳥類の種判定ができると考え、ミトコンドリアＤＮＡのチトクロムＣ酸化酵素サブユニットＩ（ＣＯＩ）遺伝子の一部を増幅する公知のプライマーセット（非特許文献１〜３を参照）を用いて検討を行った。その結果、鳥類の糞を利用してＣＯＩ遺伝子の増幅を行うと、鳥類のＣＯＩ遺伝子だけでなく、鳥類が餌として食した生物のＣＯＩ遺伝子も増幅して遺伝子の混在が生じてしまい、鳥類の種判定ができないことが明らかとなった。したがって、鳥類の糞等のように、鳥類の遺伝子だけでなく他の生物の遺伝子も混在している試料を利用して鳥類の種判定を行う場合には、鳥類以外の他の生物の遺伝子の影響を受けることなく、鳥類の遺伝子のみを特異的に増幅することが必要であると考えられた。
【０００７】
そこで、本発明は、鳥類の糞等のように、鳥類だけでなく他の生物の遺伝子も混在している試料を利用して鳥類の種判定を行う場合に用いて好適な、鳥類の遺伝子のみを特異的に増幅することができるプライマーセットを提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、鳥類の糞等のように、鳥類だけでなく他の生物の遺伝子も混在している試料を利用して鳥類の種判定を行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため、本願発明者は、遺伝子解析技術からのアプローチにより種々検討を行った。まず、変異が多いことで知られているミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ遺伝子にて鳥類のみに見られる特徴的な配列を見出すことを試みたが、そのような配列を見出すことは困難であった。そこで、本願発明者は、さらなる検討を進めた結果、鳥類のミトコンドリアＤＮＡの遺伝子配列の特殊性を見出すに至った。即ち、本願発明者は、図１に示すように、哺乳類と鳥類とでは、ミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット５（ＮＤ５）遺伝子とＤ−ｌｏｏｐ遺伝子との間に挟まれているＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６（ＮＤ６）遺伝子及びシトクロムｂ（ｃｙｔ−ｂ）遺伝子の位置が逆転（転座）していることを見出した。そして、この位置の逆転により、鳥類のＮＤ６遺伝子が、ミトコンドリアプロリン（Ｐｒｏ）ｔＲＮＡとミトコンドリアグルタミン酸（Ｇｌｕ）ｔＲＮＡとに挟まれて存在しているという鳥類の遺伝子配列の特殊性を見出すに至った。
【００１０】
そこで、本願発明者は、ミトコンドリアプロリン（Ｐｒｏ）ｔＲＮＡとミトコンドリアグルタミン酸（Ｇｌｕ）ｔＲＮＡの塩基配列に基づいてプライマーセットを設計し、このプライマーセットを用いて鳥類の糞をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に供したところ、糞に鳥類以外の他の生物の遺伝子（鳥類の餌となる哺乳類（小動物）、昆虫、魚類等）が含まれている場合でも、鳥類のＮＤ６遺伝子のみを特異的に増幅できることを知見するに至った。本願発明者はこの知見に基づいてさらに種々検討を行い、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明の鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子増幅用プライマーセットは、ミトコンドリアプロリンｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第一プライマーとミトコンドリアグルタミン酸ｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第二プライマーとの組み合わせで構成される。
【００１２】
ここで、第一プライマーは、以下の（１）〜（５）のいずれか１つであることが好ましく、以下の（２）〜（５）のプライマーは第二プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子を増幅し得るプライマーであることが好ましい。
（１）配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー
（２）配列番号１に示す塩基配列において、１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマー
（３）配列番号１に示す塩基配列のうち連続した２５〜２７塩基からなるプライマー
（４）配列番号１に示す塩基配列の３’末端又は５’末端に１〜５塩基が付加されたプライマー
（５）配列番号１に示す塩基配列の３’末端及び５’末端に合計で１〜５塩基が付加されたプライマー
【００１３】
また、第二プライマーは、以下の（６）〜（１０）のいずれか１つであることが好ましく、以下の（７）〜（１０）のプライマーは第一プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子を増幅し得るプライマーであることが好ましい。
（６）配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー
（７）配列番号２に示す塩基配列において、１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマー
（８）配列番号２に示す塩基配列のうち連続した２３〜２５塩基からなるプライマー
（９）配列番号２に示す塩基配列の３’末端又は５’末端に１〜５塩基が付加されたプライマー
（１０）配列番号２に示す塩基配列の３’末端及び５’末端に合計で１〜５塩基が付加されたプライマー
【００１４】
次に、本発明の鳥類の種判定方法は、本発明のプライマーセットを用いて、鳥類の遺伝子と共に鳥類以外の１以上の生物の遺伝子を含む試料から鳥類のミトコンドリア上のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子を特異的に増幅させた後、この遺伝子の配列から鳥類の種を判定するようにしている。鳥類の遺伝子と共に鳥類以外の１以上の生物の遺伝子を含む試料としては、例えば、鳥類の糞が挙げられる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のプライマーセットによれば、鳥類の糞等のように、鳥類だけでなく他の生物の遺伝子も混在している試料から、鳥類の遺伝子（ＮＤ６遺伝子）のみを特異的に増幅することが可能となる。
【００１６】
また、本発明の鳥類の種判定方法によれば、鳥類の糞等のように、鳥類だけでなく他の生物の遺伝子も混在しているような試料を利用して鳥類の種判定を行うことが可能となる。したがって、送配電設備に残されている糞を利用して、送配電設備に飛来している鳥類の種を判定することができ、鳥類の種に応じた鳥害防止対策を実施することが可能となる。また、住宅等において糞害の原因となっている鳥類を特定し、その種に適した対策を施すことが可能となる。さらには、近年問題となっている、鳥類を媒介とする鳥インフルエンザ等のウィルスの蔓延に対し、媒介となった鳥類の種を、鶏舎等の周辺に存在している鳥類の糞を利用して特定することが可能となる。したがって、媒介となる鳥類の種の鶏舎等への接近を防いだり、隔離したりすることにより、鳥インフルエンザ等のウィルスの蔓延を防止することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】哺乳類と鳥類のミトコンドリアＤＮＡの遺伝子配列を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００１９】
本発明の鳥類の種判定方法は、ミトコンドリアプロリンｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第一プライマーとミトコンドリアグルタミン酸ｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなる第二プライマーとの組み合わせで構成される鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子増幅用プライマーセットを用いて、鳥類の遺伝子と共に鳥類以外の１以上の生物の遺伝子を含む試料から鳥類のミトコンドリア上のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット６遺伝子（以降の説明ではＮＤ６遺伝子と呼ぶ）を特異的に増幅させた後、この遺伝子の配列から鳥類の種を判定する。以下、鳥類の遺伝子と共に鳥類以外の１以上の生物の遺伝子を含む試料として、鳥類の遺伝子だけでなく、鳥類が餌として食した１以上の生物（小動物や昆虫、魚類等）の遺伝子が含まれ得る、鳥類の糞を用いた場合を例に挙げて説明する。
【００２０】
＜第一プライマー＞
本発明において用いることのできる第一プライマーは、ミトコンドリアプロリン（Ｐｒｏ）ｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなるプライマーであれば特に限定されるものではないが、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーを用いることが好適である。
【００２１】
但し、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーは、、第二プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＤ６遺伝子を増幅させ得る限りにおいて、１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるものとしても構わない。特に、配列番号１に示す塩基配列のうち連続した２５〜２７塩基からなるプライマーや、配列番号１に示す塩基配列の３’末端又は５’末端に１〜５塩基が付加されたプライマー、さらには配列番号１に示す塩基配列の３’末端及び５’末端に合計で１〜５塩基が付加されたプライマーは、第二プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＤ６遺伝子を増幅させ易いものである。
【００２２】
尚、第一プライマーは、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知又は新規の他の方法を用いて合成することもできる。
【００２３】
＜第二プライマー＞
本発明において用いることのできる第二プライマーは、ミトコンドリアグルタミン酸（Ｇｌｕ）ｔＲＮＡに対して相補的な塩基配列からなるプライマーであれば特に限定されるものではないが、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーを用いることが好適である。
【００２４】
但し、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーは、第一プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＤ６遺伝子を増幅させ得る限りにおいて、１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるものとしても構わない。特に、配列番号２に示す塩基配列のうち連続した２３〜２５塩基からなるプライマーや、配列番号２に示す塩基配列の３’末端又は５’末端に１〜５塩基が付加されたプライマー、さらには配列番号２に示す塩基配列の３’末端及び５’末端に合計で１〜５塩基が付加されたプライマーは、第一プライマーと組み合わせて用いて鳥類のミトコンドリアＤＮＡのＮＤ６遺伝子を増幅させ易いものである。
【００２５】
尚、第二プライマーは、第一プライマーと同様、例えば汎用のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学的に合成することができるがこれに限定されるものではなく、当該技術分野において公知又は新規の他の方法を用いて合成することもできる。
【００２６】
＜ＤＮＡ抽出＞
鳥類の糞を採取し、ＤＮＡ抽出に供する。尚、鳥類は糞と尿（尿酸を含む白色の排出物）を同時に排出するので、糞を採取する際には、尿以外の部分（褐色の部分）を主体として採取する。ＤＮＡ抽出処理は、鳥類の糞試料からのＤＮＡ抽出処理が可能な公知又は新規の方法を適宜採用して実施することができる。具体的には、例えば、QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN社）を用いたＤＮＡ抽出処理が挙げられるが、ＤＮＡ抽出処理法はこれに限定されるものではない。
【００２７】
＜ＰＣＲ＞
ＤＮＡ抽出処理により得られた鋳型ＤＮＡに対し、上記第一プライマーと上記第二プライマーとの組み合わせにより構成される本発明のプライマーセットを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行う。ＰＣＲは、当該技術分野において公知又は新規の方法を適宜採用して実施することができる。具体的には、例えば、ExTaq Hot Start version（TaKaRa）を利用し、サーマルサイクラーとしてTaKaRa PCR Thermal cycler GP(TP500)を利用して、以下の条件（（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ））によりホットスタートＰＣＲを行うことで、鳥類のＮＤ６遺伝子を良好に増幅させることができるが、ＰＣＲ条件はこれに限定されるものではない。
（ａ）９８℃、１分
（ｂ）［９８℃、１０秒→６０℃、９０秒→７２℃、３０秒］１５サイクル
（ｃ）［９０℃、１０秒→６０℃、９０秒→７２℃、３０秒］３０サイクル
（ｄ）６０℃  ３０分
（ｅ）４℃
【００２８】
＜塩基配列解析＞
ＰＣＲ産物を塩基配列解析に供し、増幅されたＮＤ６遺伝子の塩基配列を決定する。塩基配列の解析は、当該技術分野における公知又は新規の方法を適宜採用して実施することができる。具体的には、例えば、ＰＣＲ後の反応液をBigDye Terminator version 3.0 cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いたシークエンス反応に供した後、精製を行い、アナライザーによるシークエンスを行う塩基配列解析方法が挙げられるが、これに限定されるものではなく、別のキットによるシークエンス反応を利用した塩基配列解析方法や、ゲル電気泳動による精製工程を含む塩基配列解析方法等により塩基配列決定を行うようにしてもよい。
【００２９】
＜鳥類の種判定＞
決定されたＮＤ６遺伝子の塩基配列に基づいて、公知のデータベース及び／又は種が明らかとなっている鳥類の組織等から決定されたＮＤ６遺伝子の塩基配列についての新規データベース（例えば自作データベース）に対してホモロジーサーチを行い、鳥類の種を決定する。本発明によれば、ＰＣＲにより鳥類以外の生物（例えば、鳥類の餌となる小動物、昆虫、魚類等）のＮＤ６遺伝子（さらには他の領域の遺伝子）が増幅することなく、糞の排泄主たる鳥類のみのＮＤ６遺伝子を増幅させて、塩基配列を確実に決定することができる。したがって、鳥類の種を、糞試料から確実に判定することができる。
【００３０】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の実施形態では、鳥類の糞試料からの鳥類の種判定を例に挙げて説明したが、鳥類の糞試料以外の試料から鳥類の種判定を行うようにしてもよい。例えば、複数の動物の肉が混在しうる加工食品やミンチ状食肉等からの鳥類の検出さらには種判定に利用するようにしてもよい。具体的には、加工食品やミンチ状食肉等をＤＮＡ抽出に供して鋳型ＤＮＡを得て、この鋳型ＤＮＡに対し本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ＮＤ６遺伝子の増幅の有無を電気泳動等により検出することで、加工食品やミンチ状食肉等に鳥類が含まれているか否かを容易に検出することが可能である。さらには検出されたＮＤ６遺伝子の塩基配列解析を行うことで鳥類の種を判定することも可能となる。これにより、例えば、原材料として牛肉のみを使用したことを謳っているにもかかわらず、鶏肉を混入してコストダウン等を図っている偽装食品等を簡便な検査で見抜くことが可能となる。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００３２】
［実施例１］
（１）鳥類の糞試料の採取及びＤＮＡ抽出
鳥類の糞を、野外にて１０サンプル採取し、糞試料とした。糞試料は、ＤＮＡ抽出に供するまで冷凍保存した。ＤＮＡ抽出は、QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN社）を使用し、チャック付きポリ袋に糞試料（０．０３−１ｇ）とバッファー（２ｍＬ）を収容して抽出作業を開始する以外は、該キットに添付されているマニュアル通りに実施した。
【００３３】
（２）ＰＣＲ
ExTaq Hot Start version（TaKaRa）に添付されたマニュアルに従ってＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲを実施した。
【００３４】
ＰＣＲ反応液の組成は以下の通りとした。
・TaKaRa Ex Taq HS(5 units / μL)： ０．１μＬ
・10×ExTaq buffer： １．０μＬ
・dNTP Mixture（2.5mM each）： ０．８μＬ
・テンプレート： １．０μＬ（抽出したＤＮＡ溶液）
・第一プライマー： ０．１μＭ
・第二プライマー： ０．１μＭ
・BSA（Bovine Serum Albumin, １μｇ／ｍＬ）： １．０μＬ
・ＤＭＳＯ： ０．４μＬ
・滅菌蒸留水： 最終液量が１０μＬとなるように添加
【００３５】
サーマルサイクラーとして、TaKaRa PCR Thermal cycler GP(TP500)を用いた。
【００３６】
＜ＮＤ６遺伝子の増幅＞
ミトコンドリアプロリン（Ｐｒｏ）ｔＲＮＡの塩基配列に基づいて設計した配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー（ｂＰｒｏ）を第一プライマーとし、ミトコンドリアグルタミン酸（Ｇｌｕ）ｔＲＮＡの塩基配列に基づいて設計した配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー（ｂＧｌｕ）を第二プライマーとして、以下の条件（（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ））でＰＣＲを行い、鳥類のＮＤ６遺伝子の増幅を試みた。
（ａ）９８℃、１分
（ｂ）［９８℃、１０秒→６０℃、９０秒→７２℃、３０秒］１５サイクル
（ｃ）［９０℃、１０秒→６０℃、９０秒→７２℃、３０秒］３０サイクル
（ｄ）６０℃  ３０分
（ｅ）４℃
【００３７】
＜ｃｙｔ−ｂ遺伝子の増幅＞
Kocherの文献（Kocher(1989）Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 6196-6200）に基づき、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ（ｃｙｔ−ｂ）遺伝子を増幅するためのプライマーであるＬ１４８４１（配列番号３）を第一プライマーとし、Ｈ１５１４９（配列番号４）を第二プライマーとして、上記と同様の条件（（ａ）→（ｂ）→（ｃ）→（ｄ）→（ｅ））でＰＣＲを行った。
【００３８】
＜１２Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の増幅＞
Meyerの文献（A. Meyer, Evolution of Mitochondrial DNA in fishes, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1993), 1-38 pp..）に基づき、ミトコンドリアＤＮＡの１２Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマーであるＬ１０９１（配列番号５）を第一プライマーとし、Ｈ１４７８（配列番号６）を第二プライマーとして、以下の条件（（ｆ）→（ｇ）→（ｈ）→（ｉ）→（ｊ））でＰＣＲを行った。
（ｆ）９８℃、１分
（ｇ）［９８℃、１０秒→５５℃、９０秒→７２℃、３０秒］１５サイクル
（ｈ）［９０℃、１０秒→５５℃、９０秒→７２℃、３０秒］３０サイクル
（ｉ）６０℃  ３０分
（ｊ）４℃
【００３９】
＜ＣＯＩ遺伝子の増幅＞
非特許文献１〜３に基づき、ミトコンドリアＤＮＡのＣＯＩ遺伝子を増幅するためのプライマーであるＬＣＯ１４９０（配列番号７）を第一プライマーとし、ＨＣＯ２１９８（配列番号８）を第二プライマーとして、以下の条件（（ｋ）→（ｌ）→（ｍ）→（ｎ）→（ｏ））でＰＣＲを行った。
（ｋ）９８℃、１分
（ｌ）［９８℃、１０秒→４５℃、３０秒→７２℃、６０秒］１５サイクル
（ｍ）［９８℃、１０秒→５１℃、３０秒→７２℃、６０秒］３０サイクル
（ｎ）７２℃  ５分
（ｏ）４℃
【００４０】
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列解析
ＰＣＲ後の反応液をBigDye Terminator version 3.0 cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を使用してシークエンス反応に供した。シークエンス反応液（計２０μＬ）の組成は以下の通りとした。シークエンス用プライマーは、ＰＣＲの際に使用した第一プライマーまたは第二プライマーとし、第一プライマーを用いた場合における塩基配列解析結果と第二プライマーを用いた場合における塩基配列解析結果とを比較して第一プライマーと第二プライマーの間の塩基配列を決定した。
・ＰＣＲ後の反応液： ０．３μＬ
・シークエンス用プライマー：  ３．２μＬ（プライマー濃度：１μＭ）
・５×Buffer：  ３．５μＬ
・Pre Mix：  １．０μＬ
・超純水：１２．０μＬ
【００４１】
シークエンス反応条件は、以下の（ｐ）→（ｑ）とした。
（ｐ）９６℃、１分
（ｑ）［９６℃、１０秒→５０℃、５秒→６０℃、４分］２５サイクル
【００４２】
シークエンス反応後、Clean SEQ（日本ジェネティックス社）を使用して、添付のマニュアルにしたがって精製を行い、ジェネティックアナライザーGA3130xl（アプライドバイオシステムズ社）を使用してＰＣＲ産物の塩基配列解析を実施した。
【００４３】
塩基配列解析の結果、決定された塩基配列の配列番号、増幅された遺伝子領域、糞試料番号を以下に示す。
・配列番号９  ：ｃｙｔ−ｂ、試料１
・配列番号１０：ｃｙｔ−ｂ、試料２
・配列番号１１：ｃｙｔ−ｂ、試料３
・配列番号１２：ｃｙｔ−ｂ、試料４
・配列番号１３：ＣＯＩ、試料４
・配列番号１４：ＣＯＩ、試料５
・配列番号１５：１２Ｓ−ｒＲＮＡ、試料１
・配列番号１６：１２Ｓ−ｒＲＮＡ、試料２
・配列番号１７：１２Ｓ−ｒＲＮＡ、試料３
・配列番号１８：１２Ｓ−ｒＲＮＡ、試料４
・配列番号１９：１２Ｓ−ｒＲＮＡ、試料６
・配列番号２０：１２Ｓ−ｒＲＮＡ、試料８
・配列番号２１：１２Ｓ−ｒＲＮＡ、試料１０
・配列番号２２：ＮＤ６、試料１
・配列番号２３：ＮＤ６、試料２
・配列番号２４：ＮＤ６、試料３
・配列番号２５：ＮＤ６、試料４
・配列番号２６：ＮＤ６、試料５
・配列番号２７：ＮＤ６、試料６
・配列番号２８：ＮＤ６、試料７
・配列番号２９：ＮＤ６、試料８
・配列番号３０：ＮＤ６、試料９
・配列番号３１：ＮＤ６、試料１０
【００４４】
ｃｙｔ−ｂ遺伝子の塩基配列解析は、試料１〜５について実施し、試料１〜４について塩基配列を決定することができた。試料５については、複数の塩基配列が検出され、塩基配列の決定ができなかった。
【００４５】
ＣＯＩ遺伝子の塩基配列解析は、試料１〜５について実施し、試料４及び５について塩基配列を決定することができた。試料１及び２については、複数の塩基配列が検出され、塩基配列の決定ができなかった。また、試料３については、塩基配列解析ができなかった。
【００４６】
１２Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析は、全試料について実施し、試料１，２，３，４，６，８及び１０について塩基配列を決定することができた。試料７については、複数の塩基配列が検出され、塩基配列の決定ができなかった。また、試料５及び９については、塩基配列解析ができなかった。
【００４７】
ＮＤ６遺伝子の塩基配列解析は、全試料について実施し、全試料について塩基配列を決定することができた。
【００４８】
（４）In-house databaseの作成
以下の鳥類について、ＮＤ６遺伝子の塩基配列を決定し、In-house databaseを作成した。決定された塩基配列の配列番号と鳥類の種を以下に示す。
・配列番号３２：アオサギ（Ardea cinerea  コウノトリ目サギ科アオサギ属）
・配列番号３３：イヌワシ（Aquila chrysaetos  タカ目タカ科イヌワシ属）
・配列番号３４：オオタカ（Accipiter gentilis  タカ目タカ科オオタカ属）
・配列番号３５：オオワシ（Haliaeetus pelagicus  タカ目タカ科オジロワシ属）
・配列番号３６：オジロワシ（Haliaeetus albicilla  タカ目タカ科オジロワシ属）
・配列番号３７：トビ（Milvus migrans  タカ目タカ科トビ属）
・配列番号３８：ノスリ（Buteo japonicus  タカ目タカ科ノスリ属）
・配列番号３９：ハイタカ（Accipiter nisus  タカ目タカ科オオタカ属）
・配列番号４０：ハシブトガラス（Corvus macrorhynchos  スズメ目カラス科カラス属）
・配列番号４１：ハシボソガラス（Corvus corone  スズメ目カラス科カラス属）
・配列番号４２：ミヤマガラス（Corvus frugilegus  スズメ目カラス科カラス属）
【００４９】
塩基配列は、鳥類の組織（羽、筋肉片）から、DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN社）を使用して添付のマニュアルに従ってＤＮＡ抽出した後、第一プライマーとしてｂＰｒｏ（配列番号１）を、第二プライマーとしてｂＧｌｕ（配列番号２）を用い、上記（２）及び上記（３）と同様の条件でＰＣＲと塩基配列解析を実施して決定した。
【００５０】
（５）糞試料からのＤＮＡ解析結果
糞試料について、塩基配列解析により決定された配列番号９〜３１の生物種を同定した結果を表１に示す。ｃｙｔ−ｂ遺伝子、１２Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子及びＣＯＩ遺伝子の塩基配列からの生物種の同定は、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のデータベースにホモロジーサーチをかけ、最も相同性が高いものをピックアップすることにより行った。ＮＤ６遺伝子の塩基配列からの鳥類の種の同定は、In-house database（In-house DB）の塩基配列と比較することにより行った。
【００５１】
生物種の同定結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
2013106562.tif 000003
【００５３】
次に、表１に示す同定結果に基づいて、塩基配列解析結果を糞試料毎に纏めた表を表２として示す。
【００５４】
【表２】
2013106562.tif 000004
【００５５】
表２において、「−」は解析不実施であったことを意味し、「×」は塩基配列の解析ができなかったことを意味し、「△」は複数の塩基配列が検出されたために塩基配列の決定ができなかったことを意味している。
【００５６】
表２に示される結果から、ｃｙｔ−ｂ遺伝子、ＣＯＩ遺伝子及び１２Ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子については、塩基配列解析が困難な場合（×）や、塩基配列の決定が困難な場合（△）、及び決定された塩基配列から鳥類以外の餌動物（小動物、昆虫、魚類等）が同定される場合があり、これらの遺伝子領域の塩基配列を利用して鳥類の種判定を行うことは困難であることが明らかとなった。これに対し、ＮＤ６遺伝子については、塩基配列を確実に決定することができると共に、決定された塩基配列から鳥類の種を確実に判定することができ、この遺伝子領域の塩基配列を利用することで鳥類の種判定を確実に行うことが可能であることが明らかとなった。
【００５７】
（実施例２）
さらに、以下の鳥類について、ＮＤ６遺伝子の塩基配列解析を行った。
・アオジ（Emberiza spodocephala  スズメ目ホオジロ科ホオジロ属）
・カケス（Garrulus glandarius  スズメ目カラス科カケス属）
・カワラヒワ（Carduelis sinica  スズメ目アトリ科ヒワ属）
・キジバト（Streptopelia orientalis  ハト目ハト科キジバト属）
・コガモ（Anas crecca  カモ目カモ科マガモ属）
・コゲラ（Dendrocopos kizuki  キツツキ目キツツキ科アカゲラ属）
・シロハラ（Turdus pallidus  スズメ目ツグミ科ツグミ属）
・ツグミ（Turdus naumanni  スズメ目ツグミ科ツグミ属）
・ツバメ（Hirundo rustica  スズメ目ツバメ科ツバメ属）
・トラツグミ（Zoothera dauma  スズメ目ツグミ科トラツグミ属）
・ニワトリ（Gallus gallus domesticus  キジ目キジ科ヤケイ属）
・ハクセキレイ（Motacilla alba  スズメ目セキレイ科セキレイ属）
・ヒヨドリ（Hypsipetes amaurotis  スズメ目ヒヨドリ科ヒヨドリ属）
・メジロ（Zosterops japonicus  スズメ目メジロ科メジロ属）
【００５８】
ＮＤ６遺伝子の塩基配列は、組織（羽、筋肉片）から、実施例１と同様の方法でＤＮＡ抽出（DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN社）使用）、ＰＣＲ及び塩基配列解析を実施して決定した。
【００５９】
その結果、解析を行った全ての鳥類について、ＮＤ６遺伝子の塩基配列を決定することができた。糞試料を用いた場合にも、他の塩基配列が混在することなく、一種の塩基配列のみが検出され、本発明のプライマーセットの有効性が示された。
・配列番号４３：アオジ（Emberiza spodocephala  スズメ目ホオジロ科ホオジロ属）
・配列番号４４：カケス（Garrulus glandarius  スズメ目カラス科カケス属）
・配列番号４５：カワラヒワ（Carduelis sinica  スズメ目アトリ科ヒワ属）
・配列番号４６：キジバト（Streptopelia orientalis  ハト目ハト科キジバト属）
・配列番号４７：コガモ（Anas crecca  カモ目カモ科マガモ属）
・配列番号４８：コゲラ（Dendrocopos kizuki  キツツキ目キツツキ科アカゲラ属）
・配列番号４９：シロハラ（Turdus pallidus  スズメ目ツグミ科ツグミ属）
・配列番号５０：ツグミ（Turdus naumanni  スズメ目ツグミ科ツグミ属）
・配列番号５１：ツバメ（Hirundo rustica  スズメ目ツバメ科ツバメ属）
・配列番号５２：トラツグミ（Zoothera dauma  スズメ目ツグミ科トラツグミ属）
・配列番号５３：ニワトリ（Gallus gallus domesticus  キジ目キジ科ヤケイ属）
・配列番号５４：ハクセキレイ（Motacilla alba  スズメ目セキレイ科セキレイ属）
・配列番号５５：ヒヨドリ（Hypsipetes amaurotis  スズメ目ヒヨドリ科ヒヨドリ属）
・配列番号５６：メジロ（Zosterops japonicus  スズメ目メジロ科メジロ属）
【００６０】
また、ハクセキレイ、オジロワシ、アオサギについて、その糞から、実施例１と同様の方法でＤＮＡ抽出（QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN社）使用）、ＰＣＲ及び塩基配列解析を実施してＮＤ６遺伝子の塩基配列を決定したところ、それぞれ、上記塩基配列（ハクセキレイ：配列番号５４、オジロワシ：配列番号３６、アオサギ：配列番号３２）と一致することが確認できた。このことからも、本発明のプライマーセットの有効性及び本発明の鳥類の種判定方法の有効性を確認することができた。
【図１】
2013106562.tif 000005
【配列表】
2013106562000001.app