(57)【要約】【課題】本発明は、凝集したアミロイドβ蛋白に対する高い結合特異性を有し、且つ凝集したアミロイドβ蛋白の高感度な測定を可能にする物質の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、式(I)：2013227243.tif 000010〔式中、R1及びR2のそれぞれはアルキル基であり、nは0〜11の整数である。〕で表されるスチリルベンゾオキサゾール誘導体又はその塩に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)：
【化１】
2013227243.tif 000009
〔式中、R1及びR2のそれぞれはアルキル基であり、nは0〜11の整数である。〕で表されるスチリルベンゾオキサゾール誘導体又はその塩。
【請求項２】
請求項１に記載のスチリルベンゾオキサゾール誘導体又はその塩を有効成分とする凝集したアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の体外診断薬。
【請求項３】
凝集したアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患がアルツハイマー病である、請求項３に記載の体外診断薬。
【請求項４】
請求項１に記載のスチリルベンゾオキサゾール誘導体又はその塩を有効成分とする脳をはじめとする生体試料中の凝集したアミロイドβ蛋白又は老人斑の定量試薬。
【請求項５】
請求項４に記載の定量試薬を用いて生体試料中の凝集したアミロイドβ蛋白又は老人斑を定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集したアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の体外診断薬、特に、アルツハイマー病の診断に有用な新規スチリルベンゾオキサゾール誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、初老期から老年期に起こる進行性の認知症を特徴とする疾患であり、現在、国内の患者数は100万人以上と言われている。今後、人口の高齢化に伴いその数は確実に増加すると予想される。
【０００３】
アルツハイマー病の臨床症状は、記憶障害、高次脳機能障害(失語、失行、失認、構成失行)等である。その症状は他の認知症疾患でも共通して見られることが多く、臨床症状だけでアルツハイマー病と確定診断することは極めて困難である。
【０００４】
一方、アルツハイマー病の特徴的な病理組織所見としては、老人斑と神経原線維変化がある。前者の主構成成分はβシート構造をとったアミロイドβ蛋白であり、後者のそれは過剰リン酸化されたタウ蛋白である。アルツハイマー病においては臨床症状が発症するかなり前から、脳内では凝集したアミロイドβ蛋白の蓄積等の上記病理的組織変化が始まっていることが知られている。したがって、凝集したアミロイドβ蛋白をマーカーとして検出することが、アミロイドが蓄積する疾患、特にアルツハイマー病の早期診断方法の１つとなる。
【０００５】
このような観点から、近年、脳内アミロイドβ蛋白に選択的に結合するポジトロン断層撮影法(PET)やシングルフォトン断層撮影法(SPECT)用の放射性造影剤の研究が進められている。アミロイドに親和性の高い古典的な化合物としては、アルツハイマー病の病理的確定診断に使用されているコンゴーレッド、チオフラビンS及びチオフラビンTがある。その多くは、血液−脳関門を通過しがたく静脈内投与しても殆ど脳内へは移行しない。
【０００６】
そこで、血液−脳関門の透過性を考慮した造影剤の研究が進められ、ISB、PIB(非特許文献１)、BF-168(特許文献１、非特許文献２)、BF-227(非特許文献３)等の造影剤が開発されており、そのいくつかは臨床試験で良好な成績が得られている(非特許文献１，３)。しかし、それらは、11C、13N、15O、18F等の放射性核種を用いるため放射線障害による副作用が懸念されるとともに非常に高価であることが問題になっている。
【０００７】
そのため、画像診断に至る前にスクリーニング可能な体外診断法が望まれている。
【０００８】
特許文献２及び３では、アルツハイマー病の核磁気共鳴イメージング法(MRI)診断用造影剤として好適なアミロイドβ蛋白に対する高い結合特異性を有するアニリン誘導体及びアミノスチレン誘導体が報告されている。しかしながら、特許文献２及び３には画像診断薬や染色薬に関することが記載されているのみであって、体外診断薬や定量試薬への適用についての記載はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第2003/106439号
【特許文献２】国際公開第2007/111179号
【特許文献３】特開2009-67762号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Klunk WE, Engler H, Nordberg A, et al: Imaging brain amyloid in Alzheimer's disease with Pittsburgh Compound-B. Ann Neurol, 55, 306-319, 2004.
【非特許文献２】Okamura N, Suemoto T, Shimadzu H, Suzuki M, Shiomitsu T, Akatsu H, Yamamoto T, Staufenbiel M, Yanai K, Arai H, Sasaki H, Kudo Y, Sawada T: Styrylbenzoxazole derivatives for in vivo imaging of amyloid plaques in the brain. J Neurosci, 24(10), 2535-41, 2004.
【非特許文献３】Furukawa K, Okamura N, Tashiro M, Waragai M, Furumoto S, Iwata R, Yanai K, Kudo Y, Arai H: Amyloid PET in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease with BF-227:comparison to FDG-PET. J Neurol, 257, 7321-727, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、凝集したアミロイドβ蛋白に対する高い結合特異性を有し、且つ凝集したアミロイドβ蛋白の高感度な測定を可能にする物質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、アミロイドβ蛋白に対する非常に高い結合特異性を有する一定の化学構造の化合物に、アビジンを介してアビジン・ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体(Avidin Biotin Peroxidase Complex)法やケミルミネッセンス法などの高感度測定システムを利用することが可能な構造を付け加えることで、上記目的を達成することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、式(I)：
【００１４】
【化１】
2013227243.tif 000002
〔式中、R1及びR2のそれぞれはアルキル基であり、nは0〜11の整数である。〕で表されるスチリルベンゾオキサゾール誘導体に関する。
【００１５】
また、本発明は、式(I)の化合物を有効成分とする凝集したアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の体外診断薬に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、式(I)の化合物を有効成分とする脳をはじめとする生体試料中の凝集したアミロイドβ蛋白又は老人斑の定量試薬に関する。
【００１７】
R1又はR2のアルキル基としては、直鎖又は分枝状のC1-6アルキルであれば良く、その具体例としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチルなどが挙げられ、直鎖又は分枝状のC1-3アルキル基が好ましい。
【００１８】
nは0〜11の整数であり、好ましくは1〜11の整数である。
【００１９】
式(I)の化合物の塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸塩；酒石酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、グリコール酸塩、琥珀酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸塩などが挙げられる。また、これらの塩の中で結晶水を持つものもある。
【発明の効果】
【００２０】
本発明化合物は、凝集したアミロイドβ蛋白に対する高い親和性を有すると共にビオチンを含むことから、アビジンを介してアビジン・ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法やケミルミネッセンス法などの高感度測定システムを利用することが可能で、凝集したアミロイドβ蛋白を検出する診断薬の有効成分として有用である。また、脳をはじめとする生体試料中の凝集したアミロイドβ蛋白又は老人斑の定量試薬の有効成分として有用である。従って、本発明化合物を用いれば、アルツハイマー病のようなアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の早期診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】試験例１の本発明化合物（３）のQCM測定結果を示すグラフである。
【図２】試験例２の本発明化合物（３）を用いたアミロイドβ凝集体測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
式(I)の化合物又はその塩は、下記製法［Ａ］〜［Ｄ］に記載の方法により製造することができる。
【００２３】
製法［Ａ］
式(I)の化合物は、式(II)の化合物とD-ビオチンを反応させることにより製造することができる。
【００２４】
【化２】
2013227243.tif 000003
〔式中、R1及びR2は前述の定義通りである〕
【００２５】
本反応は、適当な溶媒の存在下で行うことができる。具体的に使用される溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル、リグロイン、石油ベンジンなどの脂肪族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類；スルホランなどのスルホン類；ヘキサメチルホスホルアミドなどのリン酸アミド類；クロロホルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、1,2-ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；水、緩衝溶液などが挙げられるが、これらの混合溶媒も用いることができる。
【００２６】
本反応において、反応を効率的に行うためには、カルボジイミド誘導体など脱水反応を促進させる試薬を用いるのが望ましい。
【００２７】
本反応は、一般に-70〜150℃、望ましくは-10〜100℃の反応温度で行うことができ、その反応時間は、一般に0.5〜150時間である。
【００２８】
D-ビオチンは、式(II)の化合物に対して1〜5当量、望ましくは1〜3当量の割合で使用することができる。
【００２９】
前記式(II)の化合物は、公知の類似化合物の製造方法又はそれに準じた方法によって製造でき、例えば下記製法［Ｂ］に記載の方法により製造することができる。すなわち、化合物(III)を加水分解することにより製造できる。
【００３０】
製法［Ｂ］
【００３１】
【化３】
2013227243.tif 000004
〔式中、R1及びR2は前述の定義通りである〕
【００３２】
本反応は、適当な溶媒の存在下で行うことができる。具体的に使用される溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；水などが挙げられるが、これらの混合溶媒も用いることができる。
【００３３】
加水分解はハロゲン化水素酸又はアルカリと加熱して行う。酸としては濃塩酸、濃臭化水素酸などの濃ハロゲン化水素酸が挙げられ、アルカリとしては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムなどの苛性アルカリに加え、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどが挙げられる。
【００３４】
更に、ヒドラジン水和物、フェニルヒドラジンなどのヒドラジン誘導体を用いてフタロイル基を除去することによっても化合物(II)を製造することができる。
【００３５】
本反応は、一般に20〜150℃、望ましくは50〜100℃の反応温度で行われ、反応時間は、0.5〜48時間である。
【００３６】
前記式(III)の化合物は、公知の類似化合物の製造方法又はそれに準じた方法によって製造でき、例えば下記製法（Ｃ）に記載の方法により製造することができる。すなわち、式(IV)の化合物とフタルイミドカリウムを反応させることにより製造できる。
【００３７】
製法［Ｃ］
【００３８】
【化４】
2013227243.tif 000005
〔式中、R1及びR2は前述の定義通りである〕
【００３９】
本反応は、適当な溶媒の存在下で行うことができる。具体的に使用される溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類；ヘキサン、ペンタンなどの脂肪族炭化水素類；ジオキサンなどのエーテル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類及びこれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００４０】
本反応は、一般に20〜150℃、望ましくは20〜100℃の反応温度で行われ、反応時間は0.5〜48時間である。
【００４１】
本反応において、式(IV)の化合物1モルに対してフタルイミドカリウムは1〜3当量の割合で使用することができる。
【００４２】
前記式(IV)の化合物は、公知の類似化合物の製造方法又はそれに準じた方法によって製造でき、例えば下記製法［Ｄ］に記載の方法により製造することができる。すなわち、式(Ｖ)の化合物に臭化アンモニウムを反応させることにより製造できる。
【００４３】
製法［Ｄ］
【００４４】
【化５】
2013227243.tif 000006
〔式中、R1及びR2は前述の定義通りであり、Tsはトシル基である。〕
【００４５】
製法［Ｄ］の反応は適当な溶媒の存在下で行うことができる。具体的に使用される溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドなどの酸アミド類；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類；スルホランなどのスルホン類；ヘキサメチルホスホルアミドなどのリン酸アミド類及びこれらの混合溶媒を挙げることができる。
【００４６】
製法［Ｄ］の反応は、一般に20〜150℃、望ましくは20〜100℃の反応温度で行われ、反応時間は、一般に0.5〜48時間である。
【００４７】
製法［Ｄ］において、式(Ｖ)の化合物1モルに対して臭化アンモニウムは、1〜10当量、望ましくは1〜3当量の割合で使用することができる。
【００４８】
前記式(Ｖ)の化合物について、nが0〜5の場合は、公知の方法(例えば、国際公開第2007/111171 号参照)により製造することができる。nが6〜11の場合は、一方の水酸基が(例えば、テトラヒドロピラニル基で)保護されたポリエチレングリコールのナトリウム塩に、n=5の化合物(Ｖ)を反応させることにより化合物(VI)が得られるので、この化合物から脱保護して得られるアルコール体をトシル化することにより、nが6〜11の化合物(Ｖ)を製造することができる。
【００４９】
【化６】
2013227243.tif 000007
〔式中、R1及びR2は前述の定義通りであり、mは0〜5の整数である。〕
【００５０】
上記した製法［Ａ］〜［Ｄ］及びそれに付随した方法で得られる前記式(I)の化合物は、公知の手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、蒸留、分留、転溶、溶媒抽出、結晶化、再結晶、クロマトグラフィーなどにより単離、精製することができる。
【００５１】
式(Ｉ)の化合物のいくつかの例を第１表に示す。
【００５２】
【表１】
2013227243.tif 000008
【００５３】
式(I)の化合物又はその塩は、凝集したアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の体外診断薬として使用することができる。また、式(I)の化合物又はその塩は、脳をはじめとする生体試料中のアミロイドβ蛋白又は老人斑の定量試薬として使用することができる。
【００５４】
本発明の望ましい実施形態は、次のものである。
（１）式(I)の化合物又はその塩を有効成分とする凝集したアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患の体外診断薬。
（２）凝集したアミロイドβ蛋白が蓄積する疾患がアルツハイマー病である（１）に記載の体外診断薬。
（３）式(I)の化合物又はその塩を有効成分とする脳をはじめとする生体試料中のアミロイドβ蛋白又は老人斑の定量試薬。
（４）（１）に記載の体外診断薬を用いる、蛋白のβシート構造が病因又は病因の一部となる疾患の診断方法。
（５）（３）に記載の定量試薬を用いて生体試料中の凝集したアミロイドβ蛋白又は老人斑を定量する方法。
【００５５】
本発明の化合物は、スチリルベンゾオキサゾール部とビオチン部がエチレンジオキシ鎖を介して結合している。従って、分子全体として髄液や血液中に含まれるアミロイドβ蛋白凝集体を感度良く検出できる構造になっている。スチリルベンゾオキサオール部がアミロイドβ蛋白凝集体との結合部となり、ビオチン部が検出部となる。
【００５６】
本発明の化合物を体外診断薬として使用する場合、まず本化合物のスチリルベンゾオキサゾール部がアミロイドβ蛋白凝集体に特異的に結合する。
【００５７】
検出部となるビオチン部はアビジンを介してビオチン・アビジン−ぺルオキシダーゼ複合体法により検出することが可能であり、更にケミルミネッセンス法など感度の高い発光法による検出も可能になる。このことにより、高感度にアミロイドβ蛋白凝集体の存在を検出することができる。
【００５８】
ビオチン部とスチリルベンゾオキサゾール部がエチレンジオキシ鎖で結ばれているが、これは水溶性を高めるのに極めて有効である。
【００５９】
本発明の化合物又はその塩を体外診断薬として使用する場合の使用量は、アミロイドβ蛋白凝集体の存在についての判別が可能になる程度にまで結合量が十分となる量であれば良く、検体の種類、濃度等の条件により適宜選択される。また、本発明の体外診断薬は、本発明の化合物又はその塩の機能を阻害しない程度で他の添加剤を含んでいても良い。
【００６０】
本発明の体外診断薬の試料及び定量試薬の生体試料としては、被験対象から単離された、血液、脳脊髄液の他、涙、唾液、鼻汁、尿などの体液が挙げられる。また、本発明の体外診断薬及び定量試薬の被験対象は、哺乳動物(ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラット等)であり、特にヒトである。
【００６１】
アミロイドβ蛋白が蓄積する疾患としては、アルツハイマー病の他、ダウン症候群が挙げられ、蛋白のβシート構造が病因又は病因の一部となる疾患しては、アルツハイマー病、ダウン症候群の他、前頭側頭型痴呆症、ピック病、進行核上性麻痺(PSP)、プリオン病等が挙げられる。
【実施例】
【００６２】
次に本発明に係わる合成例及び試験例を記載するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
【００６３】
［合成例］6-(17'-D-ビオチンアミド-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール(化合物（３）)の合成
【００６４】
(1) 6-(17'-p-トルエンスルホニルオキシ-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール840 mg(1.2 mmol)をジメチルホルムアミド(4 mL)に溶かした溶液に臭化アンモニウム236 mg(2.4 mmol)を加えて、80℃で6時間加熱した。ロータリーエバポレータで減圧下に濃縮して得られる残渣を酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られる残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、6-(17'-ブロモ-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール620 mg(収率85%)を赤色油状物として得た。
【００６５】
(2) 前記工程(1)で得られた6-(17'-ブロモ-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール590 mg(0.97 mmol)をジメチルホルムアミド(4 mL)に溶かした溶液にフタルイミドカリウム235 mg(1.27 mmol)を加え、65℃で2時間加熱した。反応液を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水洗した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して6-(17'-フタルイミドイル-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール490 mg(収率75%)を橙色油状物として得た。1HNMR (CDCl3) δ3.03 (s, 6H), δ3.5〜4.3 (18H), δ3.90 (4H,m), δ4.17 (2H,m), δ6.7〜7.1 (5H), δ7.4〜7.9 (8H)
【００６６】
(3) 前記工程(2)で得られた6-(17'-フタルイミドイル-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール380 mg(0.56 mmol)のエタノール(5 mL)溶液にヒドラジン水和物56 mg(1.12 mmol)を加えて75℃に5時間加熱した。析出するフタルヒドラジドを濾過して除き、濾液を濃縮乾固した。残渣を酢酸エチルで抽出し、溶媒を留去すると6-(17'-アミノ-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール290 mg(収率94%)を橙赤色油状物として得た。得られた油状物をさらなる精製はせずに、次のビオチン化反応に用いた。
【００６７】
(4) 前記工程(3)で得られた6-(17'-アミノ-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール190 mg(0.35 mmol)、D-ビオチン90 mg(0.37 mmol)及び1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩81 mg(0.42 mmol)をアセトニトリル(7 mL)とメタノール(2.5 mL)の混合溶媒に溶かし、室温で9時間攪拌した。反応液を濃縮乾固して得られる残渣をジクロロメタンで抽出した。抽出液を水洗した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、6-(17'-D-ビオチンアミド-3',6',9',12',15'-ペンタオキサヘプタデカニルオキシ)-2-(4'-ジメチルアミノスチリル)ベンゾオキサゾール147 mg(収率55%)を黄褐色粉末として得た。 M.p. 94〜95℃. 1HNMR (CDCl3) δ1.43 (2H, m), δ1.69 (4H, m), δ2.22 (2H, t, J = 7Hz), δ2.72 (1H, d, J = 13Hz), δ2.89 (1H, dd, J = 13Hz, 5Hz), δ3.03 (6H, s), δ3.11 (1H, m), δ3.43 (4H, m), δ3.5〜3.8 (16H), δ3.89 (2H, m), δ4.17 (2H, m), δ4.30 (1H, m), δ4.48 (1H, m), δ5.22 (1H, br.s), δ6.13 (1H, br.s), 6.2〜7.1 (5H), δ7.4〜7.9 (4H)
【００６８】
〔試験例１〕
化合物（１）、（２）及び（３）の10 mMのDMSO溶液を調製した。アミロイドβ凝集体を固定したセンサーを8 mLのPBSに浸し、そこに上記溶液8μLを加えた。溶液添加後の周波数変化をQCM装置(AffinixQ; Initium)により測定した。又、陰性対照試験としてアミロイドβ凝集体を固定していないセンサーを用いて同測定を行った。
【００６９】
図１に本発明化合物（３）のQCM測定結果を示す。縦軸は周波数変化(Hz)、横軸は経過時間(秒)を表す。本発明化合物（３）の添加により、アミロイドβ凝集体を固定したセンサーでは周波数の顕著な減少が認められた。一方、陰性対照では周波数の減少はわずかであったことから、本発明化合物（３）はアミロイドβ凝集体に高い親和性を示すと考えられる。尚、化合物（１）、（２）も同様にアミロイドβ凝集体に高い親和性を示す。
【００７０】
〔試験例２〕
化合物（３）の10 mMのDMSO溶液を調製した後、希釈液(和光純薬工業)にて10μMに希釈した。マウス抗ヒトアミロイドβモノクローナル抗体固相マイクロプレート(和光純薬工業)に30 nM、100 nM及び300 nMのアミロイドβ凝集体を100μL加え、4℃で一晩反応させた。陰性対照として、同濃度の未凝集アミロイドβペプチドを用いた。洗浄操作後、各ウェルに本発明化合物（３）の上記溶液を100μL加え、4℃で1時間反応させた。洗浄操作後、各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Thermo Fisher Scientific)を100μL加え、4℃で1時間反応させた。洗浄操作後、各ウェルにTMB溶液(和光純薬工業)を100μL加えた。室温暗所で30分間反応させた後、各ウェルに反応停止液を100μL加え、マイクロプレートリーダーにて450 nmにおける吸光度を測定した。
【００７１】
図２に本発明化合物（３）を用いたアミロイドβ凝集体測定結果を示す。縦軸は吸光度、横軸はアミロイドβ濃度(nM)を表す。本発明化合物（３）を利用した測定において、アミロイドβ凝集体の濃度に依存して吸光度の増加が認められた。一方、陰性対照として未凝集アミロイドβペプチドを用いた場合では定量的な測定結果は得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の化合物は、アミロイドβ蛋白のモノマーやオリゴマーに結合せずβシート構造をとる凝集したアミロイドβ蛋白に対する親和性が高く、検出感度が高い上、しかも水溶性があるので、髄液や血液に含まれるアミロイドβ蛋白の凝集体を検出するのに適しており、アルツハイマー病の診断試薬として有望である。
【図１】
2013227243.tif 000011
【図２】
2013227243.tif 000012