(57)【要約】【課題】酸性タンパク質を含有する試料液中から効率よく優れた精度で酸性タンパク質を精製することができる精製方法を提供する。【解決手段】酸性タンパク質と、該酸性タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、前記酸性タンパク質を精製する精製方法であり、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記試料液を接触させ、前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記酸性タンパク質を吸着させる第１の工程と、フッ素アパタイトで構成される吸着剤に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記酸性タンパク質を精製する第２の工程とを有し、前記第１の工程において、前記吸着剤に対して前記試料液を接触させる前および／またはほぼ同時に、前記吸着剤にＣａイオンを接触させることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性タンパク質と、該酸性タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、前記酸性タンパク質を精製する精製方法であって、
フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記試料液を接触させ、前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記酸性タンパク質を吸着させる第１の工程と、
前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記酸性タンパク質を精製する第２の工程とを有し、
前記第１の工程において、前記吸着剤に対して前記試料液を接触させる前および／またはほぼ同時に、前記吸着剤にＣａイオンを接触させることを特徴とする精製方法。
【請求項２】
前記第１の工程において、前記吸着剤に前記試料液を接触させるのに先立って、前記Ｃａイオンを含有する平衡化液を前記吸着剤に接触させる請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記平衡化液は、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む請求項２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記第１の工程において、前記吸着剤に接触させる前記試料液中には、さらに前記Ｃａイオンを含有する請求項１ないし３のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
前記試料液は、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む請求項４に記載の精製方法。
【請求項６】
前記第２の工程に先立って、前記Ｃａイオンを含有する洗浄液を用いて、前記酸性タンパク質が吸着した前記吸着剤を洗浄する請求項１ないし５のいずれかに記載の精製方法。
【請求項７】
前記洗浄液は、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む請求項６に記載の精製方法。
【請求項８】
前記溶出液は、濃度が１ｍＭ〜４００ｍＭのリン酸緩衝液である請求項１ないし７のいずれかに記載の精製方法。
【請求項９】
前記溶出液は、ｐＨが４〜１２のリン酸緩衝液である請求項８に記載の精製方法。
【請求項１０】
前記酸性タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有するものである請求項１ないし９のいずれかに記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料液中から酸性タンパク質を精製する精製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、血漿中に含まれる抗体（天然の抗体）や、遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される定常（Ｆｃ）部を有する組換え融合タンパク質（人工の抗体）のような酸性タンパク質を精製する方法として、アフィニティークロマトグラフィー法や、イオン交換クロマトグラフィー法が用いられている。
【０００３】
特に、アフィニティークロマトグラフィー法は、プロテインＡ、プロテインＧのような結合性タンパク質を個体支持体に固定化したものを吸着剤として用い、この結合性タンパク質に対して、酸性タンパク質のうち抗体および組換え融合タンパク質が有する定常（Ｆｃ）部が優れた可逆的相互作用を有することから、かかる相互作用を利用して、抗体および組換え融合タンパク質を容易に精製することができるため広く利用されている（例えば、非特許文献１、２参照。）。
【０００４】
また、このような抗体および組換え融合タンパク質を薬理学的用途で使用する場合、抗体および組換え融合タンパク質とともに試料液中に含まれる混入物を高い精度で除去する必要がある。
【０００５】
なお、この混入物としては、酸性タンパク質の凝集体、不活性または部分的に不活性な酸性タンパク質の他、組換え融合タンパク質である場合には、宿主細胞に由来する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質等が挙げられ、また、抗体である場合には、血漿中に含まれるアルブミン、βグロブリン、γグロブリンのようなタンパク質等が挙げられる。さらに、精製にアフィニティークロマトグラフィー法を用いた場合には、個体支持体から離脱したプロテインＡ、プロテインＧのような結合性タンパク質や、この結合性タンパク質と酸性タンパク質との複合体も含まれる。
【０００６】
特に、酸性タンパク質の凝集体、さらには、結合性タンパク質および結合性タンパク質と酸性タンパク質との複合体は免疫原性であり、大量に含まれていると有毒となる可能性があるため、より高精度に除去しておく必要がある。
【０００７】
しかしながら、このような混入物を効率よく優れた精度で除去して、酸性タンパク質を精製することができる精製方法については知られていないのが実状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒ．Ｖｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２７−３６
【非特許文献２】Ａｙｂａｙ ａｎｄ Ｉｍｉｒ（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３（１−２）：７７−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、酸性タンパク質を含有する試料液中から効率よく優れた精度で酸性タンパク質を精製することができる精製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような目的は、下記（１）〜（１０）の本発明により達成される。
（１）  酸性タンパク質と、該酸性タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、前記酸性タンパク質を精製する精製方法であって、
フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記試料液を接触させ、前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に前記酸性タンパク質を吸着させる第１の工程と、
前記フッ素アパタイトで構成される吸着剤に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、前記酸性タンパク質を精製する第２の工程とを有し、
前記第１の工程において、前記吸着剤に対して前記試料液を接触させる前および／またはほぼ同時に、前記吸着剤にＣａイオンを接触させることを特徴とする精製方法。
【００１１】
これにより、酸性タンパク質を含有する試料液中から効率よく優れた精度で酸性タンパク質を精製することができる。
【００１２】
（２）  前記第１の工程において、前記吸着剤に前記試料液を接触させるのに先立って、前記Ｃａイオンを含有する平衡化液を前記吸着剤に接触させる上記（１）に記載の精製方法。
【００１３】
これにより、吸着剤に試料液を接触させる際に、フッ素アパタイトが有するリン酸基の表面がＣａイオンで覆われたカルシウムサイトを確実に形成することができる。
【００１４】
（３）  前記平衡化液は、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む上記（２）に記載の精製方法。
【００１５】
このように、平衡化液を、塩を含むものとすることで、平衡化液は、Ｃａイオンを含有するものとなる。そのため、この平衡化液を、吸着剤に接触させることで、吸着剤にＣａイオンを接触させることができるようになる。
【００１６】
（４）  前記第１の工程において、前記吸着剤に接触させる前記試料液中には、さらに前記Ｃａイオンを含有する上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の精製方法。
【００１７】
これにより、吸着剤に試料液を接触させる際に、フッ素アパタイトが有するリン酸基の表面がＣａイオンで覆われたカルシウムサイトを確実に形成することができる。
【００１８】
（５）  前記試料液は、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む上記（４）に記載の精製方法。
【００１９】
このように、試料液を、塩を含むものとすることで、試料液は、Ｃａイオンを含有するものとなる。そのため、この試料液を、吸着剤に接触させることで、吸着剤にＣａイオンを接触させることができるようになる。
【００２０】
（６）  前記第２の工程に先立って、前記Ｃａイオンを含有する洗浄液を用いて、前記酸性タンパク質が吸着した前記吸着剤を洗浄する上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の精製方法。
【００２１】
これにより、吸着剤には吸着していないが、カラム内等に残存している混入物を確実に除去することができる。
【００２２】
（７）  前記洗浄液は、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む上記（６）に記載の精製方法。
【００２３】
これにより、酸性タンパク質を吸着剤から溶出させることなく、カラム内等に残存している混入物を確実に除去することができる。
【００２４】
（８）  前記溶出液は、濃度が１ｍＭ〜４００ｍＭのリン酸緩衝液である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の精製方法。
【００２５】
これにより、Ｃａイオンが接触したフッ素アパタイトで構成される吸着剤から、酸性タンパク質を確実に溶出させることができる。
【００２６】
（９）  前記溶出液は、ｐＨが４〜１２のリン酸緩衝液である上記（８）に記載の精製方法。
【００２７】
これにより、Ｃａイオンが接触したフッ素アパタイトで構成される吸着剤から、酸性タンパク質を確実に溶出させることができる。
【００２８】
（１０）  前記酸性タンパク質は、免疫グロブリン定常ドメインを有するものである上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の精製方法。
【００２９】
本発明の精製方法は、免疫グロブリン定常ドメインを有する酸性タンパク質の精製に好適に適用される。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の精製方法によれば、酸性タンパク質と、この酸性タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から効率よく優れた精度で酸性タンパク質を精製することができる。
【００３１】
また、フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において、吸着剤としてフッ素アパタイトで構成されるものを用いるので、吸着剤から酸性タンパク質を溶出させる際に用いる溶出液の選択の幅が広がり、溶出液のｐＨ値を広範囲に設定することができるため、分画された各画分の流出液中に高精度で酸性タンパク質が精製される条件により確実に設定することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の精製方法に用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明の精製方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
なお、本発明の精製方法を説明するのに先立って、好適な実施形態を説明するにあたり、説明に使用する用語を以下に定義する。
【００３４】
「吸着剤」とは、固体支持体に固定した少なくとも１種類の分子、またはそれ自体が固体である少なくとも１種類の分子で構成され、各種クロマトグラフィーを実施するために用いられるものである。
【００３５】
「アフィニティークロマトグラフィー」とは、クロマトグラフィー分離を行うために、分子の一般的な特性（例えば、等電点、疎水性またはサイズ）ではなく、生体分子間の特異的な可逆的相互作用（例えば、プロテインＡがＩｇＧ抗体のＦｃ部に結合する能力）を利用するクロマトグラフィーである。具体的には、アフィニティークロマトグラフィーは、例えば、固体支持体にプロテインＡ等の結合性タンパク質が固定化されたものを吸着剤として用いて、吸着剤に対する分子の吸着力（結合力）の差に基づいて分子をクロマトグラフィー分離することをいう（Ｏｓｔｒｏｖｅ（１９９０）Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８２：３５７−３７９参照。）。
【００３６】
「陰イオン交換クロマトグラフィー」とは、第三級または第四級アミノ基などの共有結合した正に帯電した基を有するイオン交換樹脂を用いて、試料液中に含まれる陰イオンと交換することを利用するクロマトグラフィーである。
【００３７】
「抗体」とは、タンパク質またはタンパク質複合体であり、それぞれが、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン、および少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインを含むものをいう。また、「抗体」は、一本鎖抗体、二量体抗体、またはいずれかの高次タンパク質複合体であってよく、これにはヘテロ二量体抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
「免疫グロブリン定常ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＣL、ＣH１、ＣH２、ＣH３またはＣH４ドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言い、抗体のＦｃ部もこれに含まれる。（例えば、Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ Ｈａｓｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｊ．Ｄｏｎａｌｄ Ｃａｐｒａ，免疫グロブリン：構造と機能，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，２０９，２１０−２１８（１９８９）参照。）。
【００３９】
「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、ヒトまたは動物由来のＶLまたはＶHドメインと同一または実質的に類似する免疫グロブリンドメインのことを言う。なお、本発明では、実質的類似性を判定するための免疫グロブリン可変ドメインの生物学的活性は、抗原結合性である。
【００４０】
「酸性タンパク質」とは、中性のｐＨ領域で負電荷を帯びる、酸性の等電点(ｐＩ)を有し、一般的に、アスパラギン酸、グルタミン酸のような酸性アミノ酸を多量に含むタンパク質のことを言う。
【００４１】
「不活性なタンパク質」または「部分的に不活性なタンパク質」とは、酸性タンパク質と同様のアミノ酸配列および分子量を有しているが、酸性タンパク質と比較して、ターゲット（抗原等）に対する結合能力を有しないか、有していても著しく低いもののことを言う。
【００４２】
「プロテインＡ」とは、最初にブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合する特性を有するものである。本発明では、「プロテインＡ」は、ブドウ球菌由来のプロテインＡと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＡも含まれる。なお、本発明では、実質的類似性を判定するためのプロテインＡの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。
【００４３】
「プロテインＧ」とは、最初に連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁に発見されたタンパク質であり、ＩｇＧ抗体のＦｃ部に特異的に結合する特性を有するものである。本発明では、「プロテインＧ」は、連鎖球菌由来のプロテインＧと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＧも含まれる。なお、本発明では、実質的類似性を判定するためのプロテインＧの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。
【００４４】
「プロテインＬＧ」とは、ＩｇＧ抗体に結合する組換え融合タンパク質のことを言い、前記プロテインＧとプロテインＬの両方の一部を含む。また、「プロテインＬ」とは、最初にペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細胞壁から単離されたタンパク質である。プロテインＬＧは、プロテインＬとＧの両方に由来するＩｇＧ結合ドメインを含む（例えば、Ｖｏｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：２７−３６参照。）。本発明では、「プロテインＬＧ」は、プロテインＬＧと同一または実質的に類似するいずれかのタンパク質のことを言い、市販および／または組換え型のプロテインＬＧも含まれる。本発明の目的に関して、実質的類似性を判定するためのプロテインＬＧの生物学的活性は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部への結合能である。
【００４５】
「組換え融合タンパク質」とは、それらの天然状態では融合していない２以上のタンパク質の一部または全体を含むいずれかのタンパク質のことを言い、そのようなタンパク質としては、例えば、抗体のＦｃ部に融合したＮＦ−κＢのヒト受容体アクチベーター（ｈｕＲＡＮＫ：Ｆｃ）、抗体のＦｃ部に融合した内膜内皮細胞キナーゼ−δ（ＴＥＫδ：Ｆｃ）、および抗体のＦｃ部に融合した腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「酸性タンパク質を精製する」とは、酸性タンパク質を含む試料液中に存在する可能性のある異質または不都合な要素、特に精製すべき酸性タンパク質と異なるタンパク質およびＤＮＡのような生体高分子の量を減らすことを意味する。また、精製すべき酸性タンパク質とは異なるタンパク質の存在は、ゲル電気泳動と染色および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含めた、いずれかの適切な方法で特定できる。さらに、ＤＮＡの存在は、ゲル電気泳動と染色および／またはポリメラーゼ連鎖反応を用いるアッセイを含めた、いずれか適切な方法で特定できる。
【００４７】
「実質的に類似」とは、タンパク質のアミノ酸配列が互いに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％同一であり、かつ変化していないタンパク質の生物学的活性を保持するか、または望ましい様式で活性が変化している場合、それらのタンパク質は実質的に類似すると言う。タンパク質が実質的に類似するかを判定する目的について同一とみなされるアミノ酸に含まれるのは、生物学的活性に影響を与える可能性がない保存的置換であり、下記のものが含まれる。すなわち、ＡｌａがＳｅｒを、ＶａｌがＩｌｅを、ＡｓｐがＧｌｕを、ＴｈｒがＳｅｒを、ＡｌａがＧｌｙを、ＡｌａがＴｈｒを、ＳｅｒがＡｓｎを、ＡｌａがＶａｌを、ＳｅｒがＧｌｙを、ＴｙｒがＰｈｅを、ＡｌａがＰｒｏを、ＬｙｓがＡｒｇを、ＡｓｐがＡｓｎを、ＬｅｕがＩｌｅを、ＬｅｕがＶａｌを、ＡｌａがＧｌｕを、ＡｓｐがＧｌｙを置換、およびこれらの逆の交換の場合が含まれる（例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９７９）参照。）。
【００４８】
「ＴＮＦＲ」とは、天然の哺乳動物の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の配列と同一または実質的に類似するアミノ酸配列を含むタンパク質のこと言う。実質的類似性を判定するための生物学的活性とは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合する、ＴＮＦの結合によって開始する生物学的信号を細胞へ伝達する、または天然（すなわち非組換え）源由来ＴＮＦＲに対して産生された抗−ＴＮＦＲ抗体と交差反応する能力を意味する。ＴＮＦＲはいずれの哺乳動物ＴＮＦＲであってもよく、ネズミまたはヒトＴＮＦＲがこれに含まれる。そのようなＴＮＦＲは、米国特許第５，３９５，７６０号および米国特許第５，６１０，２７９号に記載されている。なお、特に好ましいＴＮＦＲは、米国特許第５，３９５，７６０号に記載のものであり、グリコシル化型でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる見掛け分子量は約８０キロダルトンである。
【００４９】
「ＴＮＦＲ：Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域に融合したＴＮＦＲの細胞外ドメインの全体または部分を含む組換え融合タンパク質のことを言う。そのような細胞外ドメインには、米国特許第５，３９５，７６０号の図２Ａのアミノ酸配列１〜１６３、１〜１８５または１〜２３５に実質的に類似するアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
次に、本発明の精製方法に用いられる吸着装置（分離装置）の一例について説明する。
なお、以下では、吸着装置として、このものが備える吸着剤の種類が異なるもの、すなわち、固体支持体にプロテインＡ等の結合性タンパク質が固定化された固定化部材と、陰イオン交換樹脂と、フッ素アパタイトとで吸着剤がそれぞれ構成されるものを、３つ用意する。そして、これらの吸着装置を用いて、精製タンパク質を含む試料液中に対して、アフィニティークロマトグラフィー処理、陰イオン交換クロマトグラフィー処理およびフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理をこの順で施すことにより、試料液中から精製タンパク質を精製する場合を代表に説明する。
【００５１】
＜吸着装置＞
図１は、本発明の精製方法に用いられる吸着装置の一例を示す縦断面図である。なお、以下の説明では、図１中の上側を「流入側」、下側を「流出側」と言う。
【００５２】
ここで、流入側とは、精製すべき酸性タンパク質を精製（分離）する際に、例えば、試料液（酸性タンパク質を含む液体）、溶出液等の液体を、吸着装置内に供給する側のことを言い、一方、流出側とは、前記流入側と反対側、すなわち、前記試料液が流出液として吸着装置内から流出する側のことを言う。
【００５３】
なお、以下では、吸着装置１の吸着剤３以外の構成について説明した後、吸着剤３について説明する。
【００５４】
図１に示す吸着装置１は、カラム２と、吸着剤（充填剤）３と、２枚のフィルタ部材４、５とを有している。
【００５５】
カラム２は、カラム本体２１と、このカラム本体２１の流入側端部および流出側端部に、それぞれ装着されるキャップ（蓋体）２２、２３とで構成されている。
【００５６】
カラム本体２１は、例えば円筒状の部材で構成されている。カラム本体２１を含めカラム２を構成する各部（各部材）の構成材料としては、例えば、各種ガラス材料、各種樹脂材料、各種金属材料、各種セラミックス材料等が挙げられる。
【００５７】
カラム本体２１には、その流入側開口および流出側開口を、それぞれ塞ぐようにフィルタ部材４、５を配置した状態で、その流入側端部および流出側端部に、それぞれキャップ２２、２３が螺合により装着される。
【００５８】
このような構成のカラム２では、カラム本体２１と各フィルタ部材４、５とにより、吸着剤充填空間２０が画成されている。そして、この吸着剤充填空間２０の少なくとも一部に（本実施形態では、ほぼ満量で）、吸着剤３が充填されている。
【００５９】
吸着剤充填空間２０の容積は、試料液の容量に応じて適宜設定され、特に限定されないが、試料液１ｍＬに対して、０．０５〜１００ｍＬ程度が好ましく、０．１〜１００ｍＬ程度がより好ましく、０．５〜５０ｍＬ程度がさらに好ましい。
【００６０】
また、カラム２では、カラム本体２１に各キャップ２２、２３を装着した状態で、これらの間の液密性が確保されるように構成されている。
【００６１】
これらキャップ２２、２３のほぼ中央には、それぞれ、流入管２４および流出管２５が液密に固着（固定）されている。この流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に、試料液（液体）が供給される。また、吸着剤３に供給された試料液は、吸着剤３同士の間（間隙）を通過して、フィルタ部材５および流出管２５を介して、カラム２外へ流出する。
【００６２】
各フィルタ部材４、５は、それぞれ、吸着剤充填空間２０から吸着剤３が流出するのを防止する機能を有するものである。これらのフィルタ部材４、５は、それぞれ、例えば、ガラス焼結体、金属あるいはポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエーテルポリアミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート等の合成樹脂からなる不織布、発泡体（連通孔を有するスポンジ状多孔質体）、織布、メッシュ等で構成されている。
【００６３】
また、３つの吸着装置のうち、１の吸着装置１（第１の吸着装置１Ａ）は、後述するアフィニティークロマトグラフィー処理において用いられ、吸着剤３として、固体支持体にプロテインＡ等の結合性タンパク質が固定化された固定化部材を備え、また、２の吸着装置１（第２の吸着装置１Ｂ）は、後述する陰イオン交換クロマトグラフィー処理において用いられ、吸着剤３として、陰イオン交換樹脂で構成され、さらに、３の吸着装置１（第３の吸着装置１Ｃ）は、後述するフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において用いられ、吸着剤３としてフッ素アパタイトで構成されている。
【００６４】
固定化部材は、結合性タンパク質が固体支持体に固定化されたものである。
この固定化部材は、結合性タンパク質と可逆的相互作用（親和性）を有する各種物質（例えば、免疫グロブリン定常ドメインを有する酸性タンパク質）に対して優れた吸着特性を発揮するため、結合性タンパク質と可逆的相互作用を有する各種物質を吸着させる吸着剤として好適に使用されるものである。
【００６５】
結合性タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、免疫グロブリン定常ドメインに結合する特性を備えるタンパク質であり、具体的には、例えば、プロテインＧ、プロテインＬＧおよびプロテインＡ等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６６】
また、固体支持体の構成材料としては、例えば、アガロース、セファロース、シリカ、コロジオン木炭および砂等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６７】
陰イオン交換樹脂は、ポリエチレンまたはポリスチレン主鎖に、第三級または第四級アミノ基等の共有結合した正に帯電した基が導入されたものである。
【００６８】
かかる構成の陰イオン交換樹脂は、正に帯電した基を有することから、陰イオン交換体として静電相互作用に基づく吸着能を発揮する。このため、陰イオン交換樹脂は、負電荷を有する（負に帯電する）各種物質に対して優れた吸着能を発揮する。
【００６９】
ここで、酸性タンパク質も負電荷を有する物質ではあるが、試料液の条件を、酸性タンパク質は陰イオン交換樹脂に結合しないが、試料液中に含まれる酸性タンパク質以外の物質のうち酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質（例えば、ＤＮＡ等）が結合する条件に設定する。そして、この条件で、試料液を陰イオン交換樹脂に接触させると、酸性タンパク質が陰イオン交換樹脂に結合することなく、酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質が陰イオン交換樹脂に結合する。したがって、後述する陰イオン交換クロマトグラフィー処理において、フロースルー液および洗浄液を、陰イオン交換クロマトグラフィー処理が施された試料液として採集することで、この試料液中には、酸性タンパク質が含まれ、試料液中に含まれる酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質が陰イオン交換樹脂に吸着して除去される。
【００７０】
また、フッ素アパタイトは、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２−２ｘＦ２Ｘ［式中、ｘは０＜ｘ≦１である。］で表され、ハイドロキシアパタイトが有する水酸基の少なくとも一部がフッ素原子で置換されたものである。
【００７１】
かかる構成のフッ素アパタイトは、そのＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のものが用いられ、Ｃａイオン（カルシウムサイト）とリン酸基（リン酸サイト）とが高密度に規則的に配列した構造を有し、通常、両性イオン交換体として静電相互作用に基づく吸着能を有する。このため、フッ素アパタイトで構成された粒子は、正または負電荷を有する各種物質に対して優れた吸着能を発揮する。
【００７２】
本発明では、このような吸着特性を有するフッ素アパタイトで構成される吸着剤３に対して精製タンパク質を含有する試料液を接触させる前および／またはほぼ同時に、吸着剤３にＣａイオンを接触させる。すなわち、吸着剤３に試料液を接触させるのに先立ってＣａイオンを接触させる処理、および吸着剤３に試料液を接触させるのとほぼ同時にＣａイオンを接触させる処理の少なくとも一方の処理を施す。このように、吸着剤３にＣａイオンを接触させると、フッ素アパタイトが有するＣａイオン（カルシウムサイト）およびリン酸基（リン酸サイト）のうち、リン酸基に対して選択的に、Ｃａイオンが吸着する。そのため、リン酸基（リン酸サイト）に吸着したＣａイオンにより、リン酸基の表面が覆われ、その結果、第２のカルシウムサイトが形成される。
【００７３】
したがって、Ｃａイオンを接触させたフッ素アパタイトで構成された粒子は、正電荷を有する各種物質に対する吸着能を有さず、負電荷を有する各種物質に対してより優れた吸着能を発揮するものとなる。すなわち、かかる粒子は、負電荷を有する各種物質を選択的に吸着する吸着能を発揮するものとなる。さらに、負電荷を有する各種物質を多量に吸着させることができるものとなる。そのため、１度の処理により精製することができる酸性タンパク質量の向上を図ることができ、酸性タンパク質をより効率よく精製することができる。
【００７４】
上記のような、Ｃａイオンを接触させたフッ素アパタイトが有する吸着特性を利用して、試料液中に含まれる負電荷を有する酸性タンパク質がフッ素アパタイトに結合する条件で、試料液をフッ素アパタイトと接触させる。これにより、試料液中に含まれる各種物質のうち、正電荷を有する各種物質および精製すべき精製タンパク質よりも小さい負電荷を有する各種物質はフッ素アパタイトに結合しないが、酸性タンパク質とほぼ等しい負電荷を有する各種物質および酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する各種物質は、フッ素アパタイトに結合する。したがって、後述するフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において、試料液中に含まれる酸性タンパク質を吸着剤３に吸着させた後、この吸着剤３に溶出液を供給して、得られる流出液を、所定量ずつ分画することで、この分画により得られる各画分の流出液中には、酸性タンパク質が含まれ、酸性タンパク質以外の物質からなる混入物がフッ素アパタイトに吸着して除去されていることから、酸性タンパク質が精製される。
【００７５】
また、フッ素アパタイトは、ハイドロキシアパタイトと比較して、耐酸性および耐アルカリ性に優れることから、フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において、各画分の流出液を得る際に用いる溶出液の選択の幅が広がる。すなわち、溶出液のｐＨ値を広範囲に設定することができる。そのため、目的とする画分の流出液中に高精度で酸性タンパク質が精製される条件により確実に設定することができるようになる。
【００７６】
なお、これらのフッ素アパタイトは、公知の湿式合成法、乾式合成法等によって合成することができる。この場合、フッ素アパタイト中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００７７】
以上のような３つの吸着装置１（第１の吸着装置１Ａ、第２の吸着装置１Ｂおよび第３の吸着装置１Ｃ）に、それぞれ充填される吸着剤３の形態（形状）は、図１に示すように、粒子状（顆粒状）のものであるのが好ましいが、その他、例えばペレット状（小塊状）、ブロック状（例えば、隣接する空孔同士が互いに連通する多孔質体、ハニカム形状、モノリス）等とすることもできる。なお、吸着剤３を粒子状とすることにより、その表面積を増大させることができ、酸性タンパク質と混入物との分離特性の向上を図ることができる。
【００７８】
粒状の吸着剤３の平均粒径は、特に限定されないが、０．５〜１５０μｍ程度であるのが好ましく、１０〜８０μｍ程度であるのがより好ましい。このような平均粒径の吸着剤３を用いることにより、前記フィルタ部材５の目詰まりを確実に防止しつつ、吸着剤３の表面積を十分に確保することができる。
【００７９】
次に、このような吸着装置（分離装置）１（第１の吸着装置１Ａ、第２の吸着装置１Ｂおよび第３の吸着装置１Ｃ）を用いて、酸性タンパク質と、この酸性タンパク質以外の物質からなる混入物とを含有する試料液中から、酸性タンパク質を精製する精製方法について説明する。
【００８０】
＜精製方法＞
本実施形態の精製方法は、試料液にアフィニティークロマトグラフィー処理を施すことにより、混入物の少なくとも一部を試料液中から除去するアフィニティー工程と、アフィニティー工程が施された試料液に陰イオン交換クロマトグラフィー処理を施すことにより、混入物の少なくとも一部をアフィニティー工程が施された試料液中から除去する陰イオン交換工程と、陰イオン交換工程が施された試料液に、フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理を施すことにより、酸性タンパク質を陰イオン交換工程が施された試料液中から精製するフッ素アパタイト工程とを有する。
【００８１】
以下、この精製方法について詳述する。
［１］  調製工程
まず、精製すべき酸性タンパク質と、酸性タンパク質以外の物質である混入物とを含有する試料液を用意する。
【００８２】
酸性タンパク質は、中性のｐＨ領域で負電荷を帯びるものであり、本実施形態では、免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）を有するタンパク質またはタンパク質複合体である。このような酸性タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー処理［２］において、免疫グロブリン定常ドメインの結合性タンパク質に対する可逆的相互作用（親和性）に基づいて、固定化部材に吸着する特性を発揮する。
【００８３】
免疫グロブリン定常ドメインを有する酸性タンパク質は、例えば、かかる酸性タンパク質が産生されるように遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される。
【００８４】
この場合、この酸性タンパク質が産生されるように細胞を遺伝子工学的に処理する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ａｕｓａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編（１９９０），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｅｙ，ニューヨーク）参照。）。
【００８５】
なお、この酸性タンパク質は、１以上の免疫グロブリン定常ドメインを有するものであればよく、１個または２個以上の免疫グロブリン可変ドメインを有するものであってもよく、免疫グロブリン可変ドメインを有しないものであってもよい。
【００８６】
さらに、酸性タンパク質は、天然タンパク質（天然の抗体）または組換え融合タンパク質であってもよく、組換え融合タンパク質としては、例えば、抗体のＦｃ部を有するものが挙げられ、非抗体タンパク質であってもよい。
【００８７】
組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、下記のタンパク質のいずれかと同一または実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００８８】
前記タンパク質としては、例えば、ｆｌｔ３リガンド（国際特許出願ＷＯ９４／２８３９１参照。）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９号参照。）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーターに対するリガンド（ＲＡＮＫＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、国際特許出願ＷＯ９７／０１６３３参照。）、胸腺ストローマ由来リンホポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許Ｎｏ．５８８８１９参照。）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、グルカゴン、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病阻害因子、オンコスタチン−Ｍ、ならびに細胞表面分子ＥＬＫおよびＨｅｋに対する種々のリガンド（例えば、ｅｐｈ関連キナーゼまたはＬＥＲＫＳに対するリガンド）等が挙げられる。
【００８９】
また、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、前記タンパク質のいずれかに対する受容体またはそのような受容体と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００９０】
前記受容体としては、両形態のＴＮＦＲ（ｐ５５およびｐ７５と呼ばれる）、Ｉ型およびＩＩ型インターロイキン−１受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ４６０ ８４６、米国特許第４，９６８，６０７号および米国特許第５，７６７，０６４号参照。）、インターロイキン−２受容体、インターロイキン−４受容体（ＥＰ特許Ｎｏ．０ ３６７ ５６６および米国特許第５，８５６，２９６号参照。）、インターロイキン−１５受容体、インターロイキン−１７受容体、インターロイキン−１８受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子受容体、オンコスタチン−Ｍおよび白血病阻害因子に対する受容体、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター（ＲＡＮＫ、米国特許第６，２７１，３４９号参照。）、ＴＲＡＩＬに対する受容体（ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４を含む）、ならびにデスドメインを含む受容体、例えば、Ｆａｓまたはアポトーシス誘導受容体（ＡＩＲ）等が挙げられる。
【００９１】
さらに、組換え融合タンパク質の具体例としては、１以上の免疫グロブリン定常ドメイン（例えば、抗体のＦｃ部）と、分化抗原（ＣＤタンパク質と呼ばれる）もしくは分化抗原または分化抗原と実質的に類似するタンパク質とを含むものが挙げられる。
【００９２】
前記分化抗原としては、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＶＩ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＩｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋｉｋｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．編，日本，神戸，１９９６）に示されており、具体的には、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３９、ＣＤ４０、およびそれらに対するリガンド（ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、など）が挙げられる。
【００９３】
なお、幾つかのＣＤ抗原は、ＴＮＦ受容体ファミリーの１種であり、これには４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０も含まれる。上記リガンドは、４１ＢＢリガンドおよびＯＸ４０リガンドと同様にＴＮＦファミリーの１種である。
【００９４】
その例には、少なくとも１つの免疫グロブリン定常ドメインと、下記のタンパク質のいずれかもしくはそれらのリガンドまたはこれらのいずれかと実質的に類似するタンパク質の全体または一部とを含む組換え融合タンパク質が挙げられ、例えば、メタロプロテイナーゼ−ディスインテグリンファミリーのメンバー、種々のキナーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、グロビン、ＩＬ−２アンタゴニスト、α−１アンチトリプシン、ＴＮＦ−α変換酵素、前記酵素のいずれかに対するリガンド、ならびに他の多数の酵素およびそれらのリガンドが挙げられる。
【００９５】
さらに、酸性タンパク質としては、抗体（天然の抗体）またはその一部、およびキメラ抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン定常ドメインが１以上のネズミ免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントであってもよいし、抗体と細胞傷害性物質または発光物質とを含む結合体であってもよい。細胞傷害性物質または発光物質としては、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）誘導体（例えば、ＤＭ１）；エンテロトキシン（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン）；ヨウ素同位体（例えば、Ｉ−１２５）；テクニウム同位体（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）；シアニン蛍光色素（例えば、Ｃｙ５．５．１８）；およびリボソーム不活性化タンパク質（例えば、ボーガニン（ｂｏｕｇａｎｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、またはサポリン−Ｓ６（ｓａｐｏｒｉｎ−Ｓ６））等が挙げられる。
【００９６】
なお、抗体、抗体／細胞毒素結合体、または抗体／発光団結合体としては、例えば、前記タンパク質および／または下記抗原のうちいずれか１種類またはその組合わせを認識するものが挙げられ、抗原としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｃ５補体、ＩｇＥ、腫瘍抗原ＣＡ１２５、腫瘍抗原ＭＵＣＩ、ＰＥＭ抗原、ＬＣＧ（肺癌に関連して発現する遺伝子産物）、ＨＥＲ−２、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２、ＳＫ−１抗原、結腸癌および／または膵臓癌の患者血清中に高濃度で存在する腫瘍関連エピトープ、胸部、結腸、扁平上皮細胞、前立腺、膵臓、肺および／または腎臓癌細胞、および／または黒色腫、グリオーマもしくは神経芽細胞に発現する癌関連エピトープまたはタンパク質、腫瘍壊死コア、インテグリンα４β７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ−α、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシンＨ鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２（ＶＩＩａ因子−組織因子の阻害薬）、ＭＨＣ Ｉ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原である）、Ｆｃ−γ−１受容体、ＨＬＡ−ＤＲ １０β、ＨＬＡ−ＤＲ抗原、Ｌ−セレクチン、ＩＦＮ−γ、呼吸系発疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｓ）等が挙げられる。
【００９７】
また、混入物は、試料液中に含まれる精製すべき酸性タンパク質以外の異質または不都合な分子のことを総称して言い、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質（塩基性タンパク質）、タンパク質の凝集体のような生体高分子が挙げられる。
【００９８】
具体的には、混入物としては、酸性タンパク質が遺伝子工学的に処理した宿主生細胞により産生される場合、宿主細胞に由来する、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の他、培地成分、および酸性タンパク質の凝集体等が挙げられ、また、酸性タンパク質が天然の抗体である場合、血漿中に含まれるアルブミン、βグロブリン、αグロブリンのようなタンパク質等が挙げられる。さらに、アフィニティークロマトグラフィー処理［２］において用いる第１の吸着装置１Ａが備える吸着剤（固定化部材）３から離脱して試料液中に浸出したプロテインＡ等の結合性タンパク質、および結合性タンパク質と酸性タンパク質との複合体も含まれる。
【００９９】
［２］  アフィニティークロマトグラフィー処理（アフィニティー工程）
［２−１］  第１の吸着装置への供給工程
次に、得られた試料液を、まず、３つの吸着装置１のうち第１の吸着装置１Ａに供給する。すなわち、第１の吸着装置１Ａの流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給する。
【０１００】
これにより、カラム２（第１の吸着装置１Ａ）内を、試料液が通過して、固体支持体に結合性タンパク質が固定化された固定化部材で構成される吸着剤３に試料液が接触する。
【０１０１】
この際、試料液中に含まれる物質のうち、固体支持体（特に、結合性タンパク質）に対する可逆的相互作用（親和性）が高いものが、カラム２内に吸着（保持）され、固体支持体（特に、結合性タンパク質）に対する可逆的相互作用（親和性）が低いものが、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出液として流出する。
【０１０２】
すなわち、免疫グロブリン定常ドメインを有する酸性タンパク質と、混入物のうち固体支持体に対して親和性が高いものがカラム２内に吸着され、混入物のうち固体支持体に対して親和性が低いものがカラム２内から流出する。
【０１０３】
なお、第１の吸着装置１Ａへの試料液の供給の前後において、酸性タンパク質の免疫グロブリン定常ドメインが、結合性タンパク質に結合するのを妨害しない溶液を、第１の吸着装置１Ａに供給することで、吸着剤３を洗浄するようにしてもよい。
【０１０４】
また、吸着剤３を洗浄する洗浄液としては、緩衝液および／または塩類を含むものを用いることができる。
【０１０５】
緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液およびクエン酸緩衝液が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１０６】
また、塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、カルシウム塩およびマグネシウム塩等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることできる。
【０１０７】
なお、この溶液としては、具体的には、例えば、トリスを約５〜１００ｍＭの濃度とし、塩化ナトリウムを約５０〜２５０ｍＭの濃度で添加したものが挙げられる。
【０１０８】
［２−２］  第１の吸着装置による分画工程
次に、第１の吸着装置１Ａの流入管２４からカラム２内に、吸着剤３に対して酸性タンパク質を溶出させるための溶出液（第１溶出液）を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する試料液（流出液）を回収する。
【０１０９】
これにより、溶出液の作用により、吸着剤３に吸着している酸性タンパク質が吸着剤３から離脱することから、試料液（アフィニティー工程が施された試料液）に溶出した状態で回収される。
【０１１０】
溶出液としては、結合性タンパク質による、酸性タンパク質が備える免疫グロブリン定常ドメインに対する結合を阻害する機能を有するものが用いられ、例えば、ｐＨを上昇または低下させる物質であるカオトロピック剤、例えば、グアニジニウム、および塩類のうちの少なくとも１種を含有するものが挙げられる。
【０１１１】
なお、この溶出液は、酢酸、グリシンまたはクエン酸を含有するものであってもよい。
また、酸性タンパク質の離脱（溶離）は、例えば、前記溶出液のｐＨを低下させることで、より確実に実施することができる。
【０１１２】
具体的には、例えば、クエン酸塩または酢酸塩を含む溶液を用いてｐＨを好ましくは４．５程度以下、より好ましくは２．５程度〜３．５程度に低下させることにより、酸性タンパク質を吸着剤３から離脱させることができる。
【０１１３】
なお、ｐＨの上昇により酸性タンパク質を吸着剤３から離脱させる場合には、前記溶液のｐＨを好ましくは８．５程度以上に設定すればよい。
【０１１４】
なお、溶出液の流速は、５０〜４００ｃｍ/時程度であるのが好ましく、１００〜３６０ｃｍ／時程度であるのがより好ましい。
【０１１５】
以上のような操作により、アフィニティークロマトグラフィー処理が施された試料液は、酸性タンパク質が第１精製（混入物の少なくとも一部が除去）された状態で回収される。
【０１１６】
なお、本工程を施すことにより、回収された試料液中には、酸性タンパク質と、酸性タンパク質以外の物質との他、固体支持体から乖離した結合性タンパク質や、この結合性タンパク質と酸性タンパク質との複合体が混入物として含まれる。
【０１１７】
なお、回収した試料液（流出液）に対して、必要に応じて、そのｐＨを２．５〜４．５程度に調整するｐＨ調整を行うようにしてもよい。これにより、混入物中にベクターウイルスのようなウイルスが混入する場合であっても、このウイルスを確実に不活化することができる。
【０１１８】
さらに、回収した試料液に対して、ろ過を行うようにしてもよい。このろ過に用いるフィルタ（ろ膜）としては、特に限定されないが、０．１〜０．３μｍ程度であるのが好ましく、０．２μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、試料液中に含まれる酸性タンパク質をフィルタで捕捉することなく、酸性タンパク質よりもサイズの大きい混入物（具体的にはＤＮＡ等）を確実に試料液中からフィルタで捕捉することで除去することができる。
【０１１９】
［３］  陰イオン交換クロマトグラフィー処理（陰イオン交換工程）
［３−１］  第２の吸着装置への供給工程
次に、第１の吸着装置１Ａから回収された試料液（アフィニティー工程が施された試料液）を、第２の吸着装置１Ｂに供給する。すなわち、第１の吸着装置１Ａから回収された試料液を、第２の吸着装置１Ｂの流入管２４およびフィルタ部材４を介して吸着剤３に供給する。
【０１２０】
これにより、カラム２（第２の吸着装置１Ｂ）内を試料液が通過して、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に試料液が接触する。
【０１２１】
この際、第１の吸着装置１Ａから回収された試料液中に含まれる緩衝液のｐＨおよび塩類の濃度が以下のようになるように設定されている。
【０１２２】
すなわち、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に対する吸着能が、負電荷を有する酸性タンパク質に対しては有しないが、混入物のうち酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質（例えば、ＤＮＡ等）に対して発揮されるように設定されている。
【０１２３】
換言すれば、陰イオン交換クロマトグラフィー処理［３］は、酸性タンパク質は、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に吸着（結合）しないが、試料液中に含まれる酸性タンパク質以外の物質（混入物）のうち酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する物質（例えば、ＤＮＡ等）は、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に吸着（結合）する条件下で実施される。
【０１２４】
緩衝液または塩類としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、フッ化物、酢酸塩、リン酸塩および／またはクエン酸塩、ならびに／あるいはトリス緩衝液が挙げられ、中でも、トリス緩衝液またはリン酸ナトリウム緩衝液であるのが好ましい。
【０１２５】
また、リン酸ナトリウム緩衝液を用いる場合、その濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜６００ｍＭ、より好ましくは５〜４００ｍＭ程度に設定される。
【０１２６】
さらに、リン酸緩衝液（リン酸ナトリウ緩衝液）のｐＨは、４〜１２程度であるのが好ましく、５．５〜８．５程度であるのがより好ましい。
【０１２７】
［３−２］  第２の吸着装置による分画工程
次に、第２の吸着装置１Ｂの流入管２４からカラム２内に、酸性タンパク質を流出させるための供給液（洗浄液）を供給する。そして、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、陰イオン交換工程が施された試料液として回収する。
【０１２８】
この際、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に混入物のうちの少なくとも一部（酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する混入物）が吸着し、酸性タンパク質が吸着されていないことから、流出液中に酸性タンパク質が含まれ、少なくとも一部の混入物が流出液中から除去される。
【０１２９】
かかる構成とすることで、負電荷を有する酸性タンパク質がフロースルー液および洗浄液中に回収され、試料液中で酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する混入物が陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に保持される。そのため、吸着剤３に吸着した酸性タンパク質を、溶出させるための溶出工程が省略されることから、酸性タンパク質を精製するための本実施形態の精製方法の簡略化を図ることができる。
【０１３０】
ここで、カラム２内に供給する供給液は、前記工程［３−１］で供給した試料液と同様に、酸性タンパク質が、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に結合しないが、混入物のうち酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有するものが、陰イオン交換樹脂で構成される吸着剤３に結合するようなものが用いられる。
【０１３１】
このような供給液は、前記工程［３−１］で説明した、緩衝液または塩類と、同一の濃度およびｐＨであるものが用いられる。
【０１３２】
以上のような操作、すなわち、カラム２内から流出する流出液すなわちフロースルー液および洗浄液を、陰イオン交換工程が施された試料液として採集することにより、陰イオン交換クロマトグラフィー処理が施された試料液は、酸性タンパク質が第２精製（さらに混入物の少なくとも一部が除去）された状態で回収される。
【０１３３】
［４］  フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理（フッ素アパタイト工程）
このフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理において、本発明の精製方法が適用される。
【０１３４】
すなわち、フッ素アパタイトクロマトグラフィー処理は、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を接触させ、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に酸性タンパク質を吸着させる第１の工程と、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に溶出液を供給し、得られる流出液を、所定量ずつ分画することにより、この分画された各画分の流出液中に、酸性タンパク質を精製する第２の工程とを有しており、前記第１の工程において、吸着剤３に対して試料液を接触させる前および／またはほぼ同時に、吸着剤３にＣａイオンを接触させるよう構成されている。
【０１３５】
なお、以下では、吸着剤３に対して試料液を接触させる前およびほぼ同時の双方で、吸着剤３にＣａイオンを接触させる場合について説明する。
【０１３６】
［４−１］  吸着剤へのＣａイオンの接触工程
まず、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を、吸着剤３に接触させるのに先立って、Ｃａイオンを吸着剤３に接触させる。
【０１３７】
すなわち、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を、第３の吸着装置１Ｃに供給するのに先立って、Ｃａイオンを含有する平衡化液を第３の吸着装置１Ｃに供給する。これにより、カラム２（第３の吸着装置１Ｃ）内を試料液が通過して、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に平衡化液が接触することから、吸着剤３にＣａイオンが接触することとなる。
【０１３８】
このように、吸着剤３にＣａイオンを接触させると、フッ素アパタイトが有するＣａイオン（カルシウムサイト）およびリン酸基（リン酸サイト）のうち、リン酸基に対して選択的に、Ｃａイオンが吸着する。そのため、リン酸基（リン酸サイト）に吸着したＣａイオンにより、リン酸基の表面が覆われた第２のカルシウムサイトが形成される。
【０１３９】
したがって、Ｃａイオンを接触させたフッ素アパタイトで構成される吸着剤３は、正電荷を有する各種物質に対する吸着能を有さず、負電荷を有する各種物質に対してより優れた吸着能を発揮するものとなるため、吸着剤３は、負電荷を有する各種物質（例えば、酸性タンパク質）を選択的に吸着する吸着能を発揮するものとなる。
【０１４０】
平衡化液としては、Ｃａイオンを含有するものであれば特に限定されないが、例えば、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む水溶液が挙げられる。このように、平衡化液を上記のような塩を含むものとすることで、平衡化液は、Ｃａイオンを含有するものとなる。そのため、この平衡化液を、吸着剤３に接触させることで、吸着剤３にＣａイオンを接触させることができるようになる。
【０１４１】
また、この場合、上記のような塩の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜２０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭ程度に設定される。塩の濃度をかかる範囲内に設定することにより、平衡化液中で塩から解離したＣａイオンを、確実に吸着剤３に接触させることができるようになる。
【０１４２】
さらに、平衡化液は、ヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液のような緩衝液であってもよい。この場合、緩衝液の濃度は、１０〜２００ｍＭであるのが好ましく、１０〜５０ｍＭであるのがより好ましく、１０ｍＭであるのがさらに好ましい。
【０１４３】
また、平衡化液のｐＨは、６．１〜８．１程度であるのが好ましく、７．２程度であるのがより好ましい。
【０１４４】
［４−２］  第３の吸着装置への供給工程（第１の工程）
次に、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液（陰イオン交換工程が施された試料液）を、Ｃａイオンの接触が施された吸着剤３を備える第３の吸着装置１Ｃに供給する。すなわち、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液を、第３の吸着装置１Ｃの流入管２４およびフィルタ部材４を介して、Ｃａイオンの接触が施された吸着剤３に供給する。
【０１４５】
この際、本実施形態では、第２の吸着装置１Ｂから回収された試料液には、予めＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種が添加されており、その結果、試料液は、上記のような塩を含むものとされる。
【０１４６】
したがって、カラム２（第３の吸着装置１Ｃ）内を試料液が通過して、フッ素アパタイトで構成される吸着剤３に試料液が接触するのとほぼ同時に、吸着剤３にＣａイオンが接触することとなる。
【０１４７】
このように、吸着剤３に試料液が接触するのとほぼ同時に、吸着剤３にＣａイオンを接触させる構成とすることで、試料液中にはＣａイオンが共存することとなるため、カルシウムサイト（特に、前記工程［４−１］で形成された第２のカルシウムサイト）からＣａイオンが溶出してしまうのを的確に抑制または防止することができる。これにより、吸着剤３に試料液を接触させることによる、フッ素アパタイトが有するＣａイオン（カルシウムサイト）の減少を的確に抑制または防止することができる。
【０１４８】
したがって、吸着剤３は、前記工程［４−１］で説明した、負電荷を有する各種物質（例えば、酸性タンパク質）を選択的に吸着する吸着能をより確実に発揮するものとなる。
【０１４９】
よって、このような吸着特性を有する吸着剤３に対して、試料液中に含まれる酸性タンパク質が吸着剤３（Ｃａイオンを接触させたフッ素アパタイト）に結合する条件で、試料液を接触させると、試料液中に含まれる各種物質のうち、正電荷を有する各種物質および精製すべき精製タンパク質よりも小さい負電荷を有する各種物質は、吸着剤３に結合しない。これに対して、酸性タンパク質、酸性タンパク質とほぼ等しい負電荷を有する各種物質および酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する各種物質は、吸着剤３に結合する。
【０１５０】
よって、吸着剤３に結合しなかった正電荷を有する各種物質（混入物）等は、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から流出する。これに対して、吸着剤３に結合した酸性タンパク質等は、カラム２内に保持される。
【０１５１】
また、上記のような塩の濃度は、特に限定されないが、好ましくは１〜２０ｍＭ、より好ましくは２〜５ｍＭ程度に設定される。塩の濃度をかかる範囲内に設定することにより、試料液中で塩から解離したＣａイオンを、確実に吸着剤３に接触させることができるようになる。
【０１５２】
さらに、試料液のｐＨは、６．１〜８．１程度であるのが好ましく、７．２程度であるのがより好ましい。
【０１５３】
［４−３］  吸着剤の洗浄工程
次に、酸性タンパク質等が結合（吸着）した吸着剤３を、Ｃａイオンを含有する洗浄液を第３の吸着装置１Ｃに供給することにより洗浄する。
【０１５４】
これにより、吸着剤３には吸着していないが、カラム２内に残存している正電荷を有する各種物質（混入物）等を、フィルタ部材５および流出管２５を介してカラム２内から確実に流出させることができる。
【０１５５】
この洗浄液としては、前記工程［４−１］で説明した平衡化液と同様のものを用いることができる。すなわち、洗浄液としては、ＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、ＣａＳＯ４およびＣａＣＯ３のうちの少なくとも１種を含む水溶液を用いることができる。これにより、吸着剤３に結合した酸性タンパク質等を吸着剤３から解離（溶出）させることなく、カラム２内に残存している正電荷を有する各種物質（混入物）等を、カラム２内から確実に流出させることができる。
【０１５６】
なお、本工程［４−３］は、次工程［４−４］において用いる溶出液の種類等によっては省略することができる。
【０１５７】
［４−４］  第３の吸着装置による分画工程（第２の工程）
次に、第３の吸着装置１Ｃの流入管２４からカラム２内に、酸性タンパク質を流出させるための溶出液を供給して、カラム２内から流出管２５を介して流出する流出液を、所定量ずつ分画（採取）する。
【０１５８】
これにより、吸着剤３に吸着している酸性タンパク質および混入物は、それぞれが有する吸着剤３に対する吸着力の差に応じて、各分画内に溶出した状態で回収（分離）される。
【０１５９】
すなわち、吸着剤３には、酸性タンパク質および混入物（酸性タンパク質、酸性タンパク質とほぼ等しい負電荷を有する各種物質および酸性タンパク質よりも大きい負電荷を有する各種物質）が、それぞれに固有の吸着（担持）力で特異的に吸着しているため、この吸着力の差に応じて、酸性タンパク質と混入物とが分離・精製される。
【０１６０】
ここで、吸着剤３としてＣａイオンを接触させたフッ素アパタイトを用いると、Ｃａイオンを接触させたフッ素アパタイトは、前述のとおり、フッ素アパタイトが元来有するＣａイオン（カルシウムサイト）と、リン酸基（リン酸サイト）に吸着したＣａイオンにより、リン酸基の表面が覆われた第２のカルシウムサイトとを有する構成となっている。そのため、吸着剤３は、負電荷を有する各種物質に対して優れた吸着能を発揮し、この負電荷を有する各種物質は、それぞれ固有の吸着力で吸着していることから、供給する溶出液の条件を適宜設定することで、試料液中に含まれる混入物の除去を高精度に行うことができるようになる。
【０１６１】
カラム２内に供給する溶出液は、特に限定されないが、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸リチウムを含有するリン酸系緩衝液が好ましく用いられる。
【０１６２】
リン酸系緩衝液のｐＨは、特に限定されないが、好ましくは４〜１２程度、より好ましくは５．５〜８．５程度に設定される。これにより、酸性タンパク質を確実に溶出させることができ、その精製率の向上を図ることができる。また、吸着剤３がＣａイオンを接触させたフッ素アパタイトで構成されることで吸着剤３は優れた耐酸性を有しているため、かかるｐＨの範囲のリン酸系緩衝液を用いたとしても、吸着剤３の変質（溶解等）を好適に防止することができ、第３の吸着装置１Ｃにおける分離能の変化を確実に防止することもできる。
【０１６３】
このリン酸系緩衝液の温度も、特に限定されないが、３０〜５０℃程度であるのが好ましく、３５〜４５℃程度であるのがより好ましい。これにより、分離する酸性タンパク質の変質（変成）を防止することができる。
【０１６４】
したがって、溶出液として、かかるｐＨ範囲および温度範囲のリン酸系緩衝液を用いることにより、目的とする酸性タンパク質の収率（回収率）の向上を図ることができる。
【０１６５】
また、リン酸系緩衝液の濃度は、５００ｍＭ以下であるのが好ましく、４００ｍＭ以下であるのがより好ましい。このような濃度のリン酸系緩衝液を用いて、酸性タンパク質の分離を行うことにより、リン酸系緩衝液中の金属イオンによる酸性タンパク質への悪影響を防止することができる。
【０１６６】
具体的には、濃度が１〜４００ｍＭ程度のリン酸系緩衝液を用いることがより好ましい。また、リン酸系緩衝液は、酸性タンパク質の分離操作の際に、連続的または段階的に変化させるのが好ましい。これにより、酸性タンパク質の分離操作の効率化を図ることができる。
【０１６７】
なお、リン酸系緩衝液中には、さらに、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ、ＮＨ４Ｃｌのような塩が含まれていてもよい。これにより、目的とする酸性タンパク質の収率をより向上させることができる。
【０１６８】
このような塩の濃度は、特に限定されないが、例えば、好ましくは３０ｍＭ〜１．０Ｍ程度、より好ましくは３００〜５００ｍＭ程度に設定される。
【０１６９】
さらに、リン酸系緩衝液中には、ヘペス（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、およびトリス（Tris-hydroxymethylammonium）等が含まれていてもよい。この場合、リン酸系緩衝液中におけるこれらの濃度は、１０〜２００ｍＭであるのが好ましく、１０〜５０ｍＭであるのがより好ましく、１０ｍＭであるのがさらに好ましい。
【０１７０】
また、リン酸系緩衝液の流速は、０．１〜１０ｍＬ／分程度であるのが好ましく、１〜５ｍＬ／分程度であるのがより好ましい。このような流速で、酸性タンパク質の分離を行うことにより、分離操作に長時間を要することなく、目的とする酸性タンパク質を確実に分離すること、すなわち、高純度な酸性タンパク質を得ることができる。
以上のような操作により、所定の画分に、酸性タンパク質が回収される。
【０１７１】
なお、本実施形態では、吸着剤３に対して試料液を接触させる前およびほぼ同時の双方で、吸着剤３にＣａイオンを接触させる場合について説明したが、かかる場合に限定されず、試料液を接触させる前およびほぼ同時のいずれか一方であってもよい。ただし、本実施形態のように、試料液を接触させる前およびほぼ同時の双方で、吸着剤３にＣａイオンを接触させる構成とすることにより、吸着剤３に試料液を接触させる際に、フッ素アパタイトが有するリン酸基の表面がＣａイオンで覆われた第２のカルシウムサイトをより確実に形成することができる。
【０１７２】
さらに、本実施形態では、免疫グロブリン定常ドメインを有する酸性タンパク質を精製することを目的に、アフィニティークロマトグラフィー処理、陰イオン交換クロマトグラフィー処理およびフッ素アパタイトクロマトグラフィー処理をこの順で施す３ステップで試料液を処理する場合について説明したが、酸性タンパク質が免疫グロブリン定常ドメインを有しないものである場合には、アフィニティークロマトグラフィー処理および陰イオン交換クロマトグラフィー処理を省略することができる。なお、免疫グロブリン定常ドメインを有しない酸性タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、ＢＳＡ、ＨＳＡ、フィブリノゲン、ペプシノーゲン、α−グロブリンおよびβ−グロブリン等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１７３】
また、上記のような３ステップの処理の他に、疎水性相互作用クロマトグラフィー処理、金属親和性クロマトグラフィー処理、体積排除クロマトグラフィー処理、限外濾過処理等の他の処理を、試料液に施すようにしてもよい。
【０１７４】
以上、本発明の精製方法について説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１７５】
例えば、本発明では、任意の目的で、工程[４−１]の前工程、各工程[４−１]〜［４−４］同士の間に存在する中間工程、または工程[４−４]の後工程を追加するようにしてもよい。
【実施例】
【０１７６】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
・酸性タンパク質（ＢＳＡ）の吸着量の測定
（実施例）
−１−  まず、セラミックフルオロアパタイト Type II、４０μｍ（Bio-rad Laboratories, Inc.）を吸着剤として詰めたφ４．０ｘ１００ｍｍのステンレス製カラム（吸着装置）を用意した。
【０１７７】
−２−  次に、１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に、１０ｍｇ／ｍＬＢＳＡを溶解させた試料液を調製し、その後、この試料液を吸着装置に１ｍＬ／ｍｉｎの流速で供給（アプライ）した。
【０１７８】
−３−  次に、クロマト装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製、「ＤｕｏＦｌｏｗ」）を用いて、吸着剤に対するＢＳＡの動的吸着量を測定した。
【０１７９】
以上のような工程−１−〜工程−３−によるＢＳＡの動的吸着量の測定を、試料液（リン酸緩衝液）中におけるＣａＣｌ２の濃度を、０ｍＭ、０．１ｍＭおよび０．５ｍＭに代えて行った。
【０１８０】
さらに、かかるＣａＣｌ２濃度におけるＢＳＡの動的吸着量の測定を、２０回繰り返して行った。
【０１８１】
（比較例）
吸着装置が備える吸着剤として、セラミックフルオロアパタイトに代えて、セラミックハイドロキシアパタイトType II、４０μｍ（Bio-rad Laboratories, Inc.）を用いたこと以外は、前記実施例と同様にして、ＢＳＡの動的吸着量の測定を２０回繰り返して行った。
【０１８２】
以上のような実施例および比較例において、測定されたＢＳＡの動的吸着量について、１回目および２０回目の測定で得られた測定値を表１に示す。
【０１８３】
【表１】
2013227254.tif 000002
【０１８４】
以上のように、実施例および比較例の１回目における測定値から明らかなように、吸着装置が備える吸着剤として、セラミックフルオロアパタイトを用いた場合と、セラミックハイドロキシアパタイトを用いた場合との双方とも、試料液中におけるＣａＣｌ２の濃度が高くなるにしたがって、ＢＳＡ（酸性タンパク質）の吸着量が向上する結果となった。
【０１８５】
しかしながら、実施例および比較例の２０回目における測定値から明らかなように、吸着装置が備える吸着剤として、セラミックフルオロアパタイトを用いた場合では、吸着剤の複数回の使用によってもＢＳＡの吸着量に変化が認められなかったが、セラミックハイドロキシアパタイトを用いた場合では、吸着剤の複数回の使用によりＢＳＡの吸着量が大幅に減少する結果となった。
【０１８６】
これは、実施例の吸着装置では、吸着剤としてセラミックフルオロアパタイトを用いたことで、試料液としてｐＨ５．０のように低ｐＨ領域のものを用いた吸着剤に対するＢＳＡの吸着を複数回繰り返して行なったとしても、吸着剤（セラミックフルオロアパタイト）の溶解が的確に防止されていることによると考えられる。
【０１８７】
これに対して、比較例の吸着装置では、吸着剤としてのセラミックハイドロキシアパタイトが、低ｐＨ領域（ｐＨ５．０）の溶出液を用いた吸着剤に対するＢＳＡの吸着を複数回繰り返して行うことにより吸着剤が溶解し、これに起因して、２０回目におけるＢＳＡの吸着量が低下したものと推察される。
【０１８８】
以上のことから、吸着剤としてのセラミックハイドロキシアパタイトを用いた場合と比較して、吸着剤としてセラミックフルオロアパタイトを用いた場合では、低ｐＨ領域（酸性条件下）で酸性タンパクを吸着させたい際に、Ｃａイオンを添加することで安定的（長期的）に吸着させることができることが判った。
【符号の説明】
【０１８９】
１            吸着装置
１Ａ          第１の吸着装置
１Ｂ          第２の吸着装置
１Ｃ          第３の吸着装置
２            カラム
２０          吸着剤充填空間
２１          カラム本体
２２、２３    キャップ
２４          流入管
２５          流出管
３            吸着剤
４、５        フィルタ部材
【図１】
2013227254.tif 000003