(57)【要約】【課題】簡便に、生体成分中で共存するＣＫ−ＭＢ以外のアイソザイムであるＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢ等の夾雑物質からの干渉反応を軽減し、ＣＫ−ＭＢをより正確に測定できる、ラテックス凝集免疫試薬及び測定法を提供する。【解決手段】前記ラテックス凝集免疫試薬は、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子を含み、これらの粒子の平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子を含み、これらの粒子の平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍである、ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫試薬。
【請求項２】
前記ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、請求項１に記載のラテックス凝集免疫試薬。
【請求項３】
前記ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、請求項２に記載のラテックス凝集免疫試薬。
【請求項４】
検体と、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子及びＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子とを反応させ、ラテックス粒子の凝集を光学的に検出する工程を含み、これらの粒子の平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍである、ＣＫ−ＭＢのラテックス凝集免疫測定方法。
【請求項５】
前記ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、請求項４に記載のラテックス凝集免疫測定方法。
【請求項６】
前記ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、請求項５に記載のラテックス凝集免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫試薬及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クレアチンキナーゼ（以下、ＣＫ）は、クレアチンリン酸とＡＤＰとをクレアチンとＡＴＰに触媒する酵素で、生体内では脳や心筋、平滑筋、神経系などに存在し、骨格筋に最も多く存在する。ＣＫは２つのサブユニット構造からなり、骨格筋型のＣＫ−ＭＭ、心筋由来型のＣＫ−ＭＢ、脳や平滑筋型のＣＫ−ＢＢの３種のアイソザイムが存在する。その他、ミトコンドリア由来のＣＫや免疫グロブリン結合型のＣＫが存在する。特にＣＫ−ＭＢは心筋由来のアイソザイムで、心筋逸脱マーカーとして酵素活性やタンパク質量を測定し、心筋梗塞の診断や、発症時のモニタリングに頻用される。前記アイソザイムは、通常、それぞれ２量体で存在する。
【０００３】
ＣＫ−ＭＢの測定法としては、その酵素活性を測定する方法や、抗原抗体反応によりＣＫ−ＭＢのタンパク質濃度を測定する方法が頻用されている。酵素活性測定法としては、免疫阻害法と組み合わせたＣＫ−ＭＢ活性測定法が多用されている。測定原理は、ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合し酵素活性を阻害する抗ＣＫ−Ｍ抗体を用い、ＣＫ−ＭＭ及びＣＫ−ＭＢの酵素活性を阻害し、残存するＣＫ活性から、ＣＫ−ＭＢ活性を求める方法である。なお、残存ＣＫ活性は以下の反応式に基づき、ＮＡＤＰＨの増加量から導かれる。
【０００４】
【化１】
2013125005.tif 000002
【０００５】
一方、抗原抗体反応によりＣＫ−ＭＢのタンパク質濃度を測定する方法としては、化学発光酵素免疫測定法（以下、ＣＬＩＡ法）、酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡ法）による技術が開示され、またラテックス凝集反応による方法も開示されている（特許文献１）。特にラテックス凝集反応による測定法はＢ／Ｆ分離が不要で、その簡便さや汎用装置への対応が容易な点から臨床検査薬としての適用が期待されている。
【０００６】
ラテックス凝集法の測定原理は、測定対象の抗原に結合する抗体をラテックス粒子に担持させ、抗原の存在下で抗原抗体反応させるものである。ラテックス粒子の凝集を光学的に検出することで、その凝集の程度から測定対象の抗原量を測定する方法である。
【０００７】
ＣＫ−ＭＢは、ＣＫ−ＭサブユニットとＣＫ−Ｂサブユニットとから成る。ＣＫ−ＭＢを測定可能な抗体は、（１）ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合する抗体、（２）ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的に結合する抗体、そして、（３）ＣＫ−ＭサブユニットやＣＫ−Ｂサブユニットには結合しないがＣＫ−ＭＢに特異的に結合する抗体に分類できる（特許文献１）。ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集試薬を構築する場合は、これらの抗体群から好適な２種以上を選択することが考えられる。例えば、ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的な抗体のみでは、ＣＫ−ＭＢがサンドイッチされず測定系が成立しない場合が多いからである。
【０００８】
具体的には、２種の抗体によるＣＫ−ＭＢのサンドイッチが成立する組合せ例として、ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的に結合する抗体と、ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合する抗体とを、それぞれ、別のラテックス粒子に担持させる場合が考えられる。しかし、ＣＫ−Ｂサブユニットに特異的に結合する抗体は、ＣＫ−ＭＢの他、ＣＫ−ＢＢへも結合する。同様に、ＣＫ−Ｍサブユニットに特異的に結合する抗体は、ＣＫ−ＭＢの他、ＣＫ−ＭＭへも結合する。従って、当該抗体の組合せの場合、共存するＣＫ−ＢＢやＣＫ−ＭＭも検出することから、ＣＫ−ＭＢの正確な測定ができない。
【０００９】
しかし、Ｂ／Ｆ分離のステップを含む測定系、例えばＣＬＩＡ法やＥＩＡ法であれば、当該抗体の組み合わせであっても上記のようなＣＫ−ＢＢやＣＫ−ＭＭの干渉の影響は受けにくい。すなわち、試料を第一の抗体担持担体と接触させる工程と、引き続く第二の抗体担持担体を接触させる工程とが、Ｂ／Ｆ分離前後で分離されるため、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢがサンドイッチされないためである。
一方、しかしながら、ラテックス凝集法においての測定工程は簡素でＢ／Ｆ分離のステップを必要としないことが特徴である。そのため、ＣＬＩＡ法等のように共存物を排除することができない為、それらの干渉の影響を受けやすい。
【００１０】
ラテックス凝集法での当該課題を解決するために、特許文献１ではＭサブユニットやＢサブユニットには結合せずＣＫ−ＭＢに特異的に結合する抗体を使用した技術を開示されている。当該文献では、ＣＫ−ＢＢ又はＣＫ−ＭＭへの交差性のある抗体を使用するとＣＫ−ＢＢ又はＣＫ−ＭＭの干渉を受けることから、ＣＫ−ＭＢにのみ特異的な抗体であれば、干渉反応を回避できるとして干渉の影響を解決している。これまでのＣＫ−ＭＢのサンドイッチアッセイに関するいずれの記載も、干渉の影響が主として抗体の特異性に依存するため、課題を解決する為には抗体の反応性やそれらの組合せを工夫することに主眼をおくものばかりである。
【００１１】
例えば、特許文献２および特許文献３では、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合し他のアイソザイムに結合しない抗体を見出し、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢの干渉を回避する技術を提示している。
非特許文献１では、ＣＫ−ＭＢに特異的な抗体を使用し試料からＣＫ−ＭＢを回収し、ＣＫ−ＭＢの酵素活性を測定することでＣＫ−ＭＢを測定し、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢの干渉を回避する手法を開示している。
非特許文献２〜４では、サンドイッチイムノアッセイで２種類のＣＫ−ＭＢ特異抗体を使用することで、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢの干渉を回避する手法を開示している。
しかし、このような特異的な反応性を有する抗体を取得することは難しく、簡便且つ正確なＣＫ−ＭＢ測定用のラテックス凝集試薬が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９４／２５６１７号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ８７／０３０９４号パンフレット
【特許文献３】特開平１−２６２４７１号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Clinical Chemistry, Vol.32, No.4, 1986 657-663
【非特許文献２】Clinical Chemistry, Vol.33, No.9, 1987 1517-1987
【非特許文献３】Clinical Chemistry, Vol,36, No.8, 1990 1502-1505
【非特許文献４】Clinical Chemistry, Vol,34, No.11, 1988 2364-2367
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の課題は、上記問題点を解決することのできる、生体成分中のＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫測定試薬及び測定方法であって、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢなどの共存物の干渉を回避し、簡便且つ正確なＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫測定試薬及び測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫測定方法において、ＣＫ−ＭＢやＣＫ−ＢＢに特異的な抗体であっても、組み合わせによっては、それらの分子（例えばＣＫ−ＢＢ）への干渉影響が生じる場合があること、更に、そのような交差性を有する抗体を使用する場合であっても、ラテックス粒子の平均粒子径が特定の範囲内にあることにより、意外にもＣＫ−ＢＢに対する反応性を低減できることを見出し、より正確にＣＫ−ＭＢを測定する技術を創出した。
【００１６】
すなわち、本発明は、
［１］ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子を含み、これらの粒子の平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍである、ＣＫ−ＭＢ測定用ラテックス凝集免疫試薬、
［２］前記ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［１］のラテックス凝集免疫試薬、
［３］前記ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［２］のラテックス凝集免疫試薬、
［４］検体と、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子及びＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子とを反応させ、ラテックス粒子の凝集を光学的に検出する工程を含み、これらの粒子の平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍである、ＣＫ−ＭＢのラテックス凝集免疫測定方法、
［５］前記ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［４］のラテックス凝集免疫測定方法、
［６］前記ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体が、該ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相したラテックス粒子単独では、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を生じない抗体である、［５］のラテックス凝集免疫測定方法
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、簡便に、生体成分中で共存するＣＫ−ＭＢ以外のアイソザイムであるＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢ等の夾雑物質からの干渉反応を軽減し、ＣＫ−ＭＢをより正確に測定できる、ラテックス凝集免疫試薬及び測定法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の試薬は、生体成分中のＣＫ−ＭＢを測定するラテックス凝集法による免疫測定試薬であって、用手法によっても測定可能であるが、ラテックス凝集法が測定可能な自動分析機に搭載される試薬として特に好適に用いられる。
【００１９】
本発明の試薬は、ラテックス凝集反応において、生体成分中のＣＫ−ＭＢの存在によりラテックス凝集が生じる２種以上の抗体の組み合わせを含めばよいが、具体的には、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体と、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体との組み合わせが挙げられる。本明細書において、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するとは、ＥＩＡ法やＣＬＩＡ法等のＢ／Ｆ分離工程を含むサンドイッチ法によるアッセイで、ＣＫ−ＭＢ以外のアイソザイムや他のタンパク質などに反応せず、ＣＫ−ＭＢに強い反応を示すことを意味する。また、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するとは、同アッセイでＣＫ−ＢＢ以外のアイソザイムや他のタンパク質などに反応せず、ＣＫ−ＢＢに強い反応を示すことを意味する。
【００２０】
ＣＫ−ＭＢ又はＣＫ−ＢＢは、生体内あるいは溶液中では２量体を形成していることが知られている。よって、ＣＫ−ＭＢ又はＣＫ−ＢＢに特異的な抗体（特に、ＣＫ−ＢＢに特異的な抗体）は、１種類であってもラテックス凝集を起こす場合がある。しかし、本発明では、それぞれ１種類の抗体では、ＣＫ−ＭＢ又はＣＫ−ＢＢの存在に応じてラテックス凝集を生じない抗体を組み合わせることが好ましい。すなわち、ＣＫ−ＭＢに特異的な抗体としては、その抗体１種類のみを固相化したラテックス粒子を単独で用いた場合に、ＣＫ−ＭＢとのラテックス凝集を起こさない抗体であることが好ましい。また、ＣＫ−ＢＢに特異的な抗体としては、その抗体１種類のみを固相化したラテックス粒子を単独で用いた場合に、ＣＫ−ＢＢとのラテックス凝集を起こさない抗体であることが好ましい。
更に、後述する実施例にも示すように、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体とＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を組み合わせることにより、ラテックス凝集反応を起こすことから、前記ＣＫ−ＢＢ抗体は、ＣＫ−ＭＢのＣＫ−Ｂサブユニットに反応することが推測される。このことから、本発明のＣＫ−ＢＢに特異的に結合する抗体は、少なくともラテックス凝集反応時に、ＣＫ−ＭＢのＣＫ−Ｂサブユニットに反応することが好ましい。
【００２１】
本発明で使用するＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体と、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体の作製は、例えば、公知の細胞融合法で作製されたハイブリドーマによるモノクローナル抗体産生法により得ることができる。抗体産生細胞としては、ヒトを除く動物、例えば、マウス・ラット・モルモット等から選択することができる。すなわち、ＣＫ−ＭＢやＣＫ−ＢＢを抗原として使用し、次いで、該ＣＫ−ＭＢや該ＣＫ−ＢＢを用いてスクリーニングを実施することによって、本発明で使用できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製することができ、そのハイブリドーマから目的のモノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製は、定法、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って行うことができる。また、ＣＫ−ＭＢ特異的に結合する抗体やＣＫ−ＢＢ特異的に結合する抗体は、ハイブリドーマから得られた血清や抗体を、ＥＩＡ法やＣＬＩＡ法等で他のアイソザイムや他のタンパク質などに反応せず、それぞれＣＫ−ＭＢあるいはＣＫ−ＢＢに強い反応を示すことを指標としてスクリーニングすることで得ることができる。
【００２２】
本発明で使用可能なモノクローナル抗体には、抗体フラグメントが含まれる。前記抗体フラグメントは、所望のモノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとのモノクローナル抗体と同じ反応性を有する抗体フラグメントである。本発明で用いることのできる抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、モノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。これらは、そのままラテックス粒子に固相して使用することができるが、Ｆａｂ’フラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントに調製したものをラテックス粒子に固相することができる。抗体のＦｃフラグメントに対する非特異反応を回避する観点から、Ｆａｂ’やＦ（ａｂ’）２がより好ましい。
【００２３】
また、本発明で使用するＣＫ−ＭＢに特異的に結合する抗体は、Ｒｏｃｈｅ社やＢｉｏｐａｃｉｆｉｃ社、Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ社、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社、Ｍｅｄｉｘ社、Ｔｒｉｎａ社、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社などから購入することができ、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体も、Ｂｉｏｐａｃｉｆｉｃ社、Ｆｉｚｇｅｒａｌｄ社、Ｍｅｒｉｄｉａｎ社、Ｄａｋｏ社などから購入することができる。当業者であれば、本発明で用いることのできるモノクローナル抗体に関する上述の説明に従って、あるいは、後述の実施例に記載の具体的手順に従って、これらの抗体が、本発明に利用可能か容易に決定することができる。
【００２４】
本発明に使用するラテックス粒子は、平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍであればよく、１種類のラテックス粒子のみを使用してもよいし、複数のラテックス粒子を使用してもよい。例えば、粒子径の異なるラテックス粒子を組み合わせて使用することができる。ラテックス粒子は単一粒径で製造することは実質的に困難であることから、粒子全体の平均粒子径として規定される。従って、本発明では平均粒子径を０．２３μｍ〜０．３２μｍと特定するが、当該範囲に含まれないラテックス粒子を含む場合であっても、本発明に該当する場合がある。例えば、平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍのラテックス粒子が、重量パーセント換算で８５％以上含まれていれば良い。なお、この平均粒子径は、公知の方法で測定することが可能であり、例えば、透過型電子顕微鏡装置を用いた画像解析によりより算出される。
【００２５】
また、本発明に使用するラテックス粒子の平均粒子系の下限は０．２３μｍ、上限は０．３２μｍである。当該範囲内であれば、ＣＫ−ＭＭやＣＫ−ＢＢによる干渉を軽減してＣＫ−ＭＢを検出することが可能となる。なお、平均粒子径が０．２３μｍ未満では、ＣＫ−ＭＢによる特異的な凝集を示すシグナルが小さく、検出感度が悪化することがあり、ＣＫ−ＭＢの高感度な測定を達成できない場合がある。一方、０．３２μｍを超えると、共存するＣＫ−ＢＢの影響が生じやすい。
【００２６】
本発明に係るラテックス粒子としては、通常この分野で用いられているものであれば特に限定はされないが、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーを重合させてなる単一重合体（例えば、ポリスチレン、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体等）からなる粒子、ブタジエン系共重合体（例えば、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン共重合体等）からなる粒子、それ以外の共重合体（例えば、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸エステル共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体等）からなる粒子を挙げられる。官能基としてカルボキシル基、１級アミノ基、カルバモイル基（−ＣＯＮＨ２）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ、基体が上記有機系微粒子からなる粒子を挙げられる。
【００２７】
本発明におけるラテックス粒子への抗体固相の第１の態様としては、抗体の種類ごとに固相ラテックス液を調製し、次いで複数の前記固相ラテックス液を混合して試薬を調製することが挙げられる。ラテックス液の混合比は、特に限定しない。
また、本発明におけるラテックス粒子への抗体固相の第２の態様としては、ラテックス粒子に対して、２種以上の抗体を同時に感作して試薬を調製することが挙げられる。ラテックス液の混合比は、特に限定しない。
好適な試薬の調製が行いやすいこと等から、第１の態様のように、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相した第１のラテックス粒子、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を固相した第２のラテックス粒子として、抗体の種類ごとに固相ラテックス液を調製する方が好ましい。
【００２８】
ラテックス粒子に抗体を固相する方法としては、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、抗体とラテックス粒子とを緩衝液中で懸濁させ、２５℃で１時間反応させた後、遠心分離、ブロッキング処理等、通常この分野で行われる処理により得ることができる。また、抗体とラテックスとを化学結合により固相する方法や、ビオチン−アビジン反応により抗体を固相する方法も選択できる。
【００２９】
本発明の試薬は、１試薬系であってもよいし、２試薬系であってもよい。本発明の試薬が１試薬系である場合は、検体に前記抗体を固相したラテックス粒子懸濁液を添加し、抗原抗体反応を生じさせることにより、検体中のＣＫ−ＭＢを測定することができる。本発明の試薬が２試薬系である場合には、緩衝液成分を主体とした第１試薬を検体に添加した後、更に前記抗体を固相したラテックス粒子を含む第２試薬を添加することで、抗原抗体反応を生じさせ、検体中のＣＫ−ＭＢを測定することができる。
【００３０】
ラテックスの凝集の度合いは、例えば吸光度を用いて測定し、予め求めておいた標準品の検量線からその濃度を求めることにより、検体中のＣＫ−ＭＢ濃度を定量することができる。なお、吸光度の測定波長は、通常は３４０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜９００ｎｍで測定すればよい。ラテックス凝集反応を測光する時間は、ラテックス凝集反応が生じている時間を時間当たりの変化速度、あるいは一定時間の変化量によって測光することができる。例えば、吸光度を測定する場合、ラテックス凝集反応が始まってから３０秒後から５分後の時間当たりの吸光度変化速度、あるいは一定時間の吸光度変化量によって測光することができる。反応温度は１０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃であることがより好ましい。反応時間は適宜決定することができ、例えば汎用自動分析機では１０〜１５分間の反応時間で測定することができる。なお、当業者であれば、光学機器あるいは汎用自動分析機を用いた分析において、公知の方法に従って、反応温度、反応時間、測定波長、測定時間、試薬構成、ラテックス濃度、ラテックス固定化するモノクローナル抗体濃度、各種添加剤濃度を適宜決定することができる。
【００３１】
本発明に用いられるラテックス粒子の濃度は、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に適用できる濃度であれば特に限定されるものではないが、ＣＫ−ＭＢを測定するために必要な反応時のラテックスの濃度は０．００５ｗ／ｖ％〜０．２ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。
【００３２】
本発明の試薬に適用することのできる被検試料は、ＣＫ−ＭＢを含有する可能性のある被検試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生体試料、より具体的には、血清、血漿、尿、又は体液などを挙げることができる。好ましくは、血清、血漿が使用できる。
【００３３】
本発明の試薬は、モノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子以外にも、ラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に添加可能な添加剤、例えば、緩衝液、凝集促進剤、非特異反応抑制剤などを更に含有することができる。
【００３４】
前記緩衝液としては、ｐＨ５．５〜８．５に緩衝能を有する緩衝液が好ましく、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、又はグッド緩衝液などが好適に使用され、反応時の緩衝液濃度は１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好まししい。緩衝液濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である場合、ラテックス粒子が自己凝集を起こしたり、非特異的な反応を起こしやすい。また、緩衝液濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上の場合、ラテックス凝集生じにくい。反応時の緩衝液のｐＨは５．５〜８．５であることが好ましい。ｐＨがこの範囲外であると、ラテックス粒子が自己凝集を起こしたり、ラテックス凝集反応を起こしづらかったり、非特異的な反応を起こしやすい。
【００３５】
本発明の試薬に添加可能な凝集促進剤としては、水溶性高分子やタンパク質が好適に用いられる。例えば、デキストランやデキストラン硫酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子や、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン類、γ−グロブリンなどのグロブリン類が挙げられる。
【００３６】
本発明の試薬に添加可能な非特異反応抑制剤としては、非特異反応の原因物質に対する抗体やレセプター、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液又はグッド緩衝液などの緩衝液類、ＥＤＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰなどのキレート剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムなどの塩類、脂肪酸ジエタノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルグリコシドなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
《実施例１〜３及び比較例１〜２》
ＣＫ−ＭＢ測定試薬は、緩衝液成分を主体とした第１試薬と、ラテックス粒子を主体とした第２試薬とからなる２試薬系として構成し、自動分析機による評価を実施した。
【００３９】
（検体）
ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢ、ＣＫ−ＭＭは、ヒトリコンビナントタンパク質としてオリエンタル酵母社から購入し、検体希釈液〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１７５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ〕にて、それぞれ、最終濃度１０Ｕ／Ｌ、１００Ｕ／Ｌ、１０００Ｕ／Ｌに調製した。
【００４０】
（第１試薬の調製）
２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．２４％非イオン性界面活性剤、０．１％アルブミンを溶解させた水溶液を調製し、第１試薬とした。
【００４１】
（第２試薬の調製）
平均粒子径０．２０μｍのラテックス粒子を使用した系を比較例１、平均粒子径０．２３μｍのラテックス粒子を使用した系を実施例１、平均粒子径０．３０μｍのラテックス粒子を使用した系を実施例２、平均粒子径０．３２μｍのラテックス粒子を使用した系を実施例３、平均粒子径０．４３μｍのラテックス粒子を使用した系を比較例２とした。なお、いずれのラテックス粒子も、表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ株式会社製）である。
【００４２】
抗ＣＫ−ＭＢ抗体としては、ヒト由来ＣＫ−ＭＢアイソザイムをマウスに免疫し、定法に従って作製され、ヒト由来ＣＫ−ＭＢを抗原として用いるＥＩＡ法により、ＣＫ−ＢＢアイソザイム及びＣＫ−ＭＭアイソザイムとは反応しないＣＫ−ＭＢ特異的な抗体であることが確認されたものを使用した。前記の各ポリスチレンラテックス粒子（実施例１〜３及び比較例１〜２）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．１）に０．１ｗ／ｖ％となるように分散させ、塩酸−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを添加し、２５℃条件下で３分間反応させた後、ペプシン消化でＦ（ａｂ’）２フラグメント化した前記抗ＣＫ−ＭＢ抗体を添加し、更に１時間反応させた。１９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ラテックス固形分を０．０５％アジ化ナトリウム溶液にて分散させ、抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１とした。
【００４３】
一方、抗ＣＫ−ＢＢ抗体としては、ヒト由来ＣＫ−ＢＢアイソザイムをマウスに免疫し、定法に従って作製され、ヒト由来ＣＫ−ＢＢを抗原として用いるＥＩＡ法により、ＣＫ−ＭＢアイソザイム及びＣＫ−ＭＭアイソザイムとは反応しないＣＫ−ＢＢ特異的な抗体であることが確認されたものを使用した。同様に、前記の各ポリスチレンラテックス（実施例１〜３及び比較例１〜２）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．１）に０．１ｗ／ｖ％となるように分散させ、塩酸−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを添加し、２５℃条件下で３分間反応させた後、ペプシン消化したＦ（ａｂ’）２フラグメント化した前記抗ＣＫ−ＢＢ抗体を添加し、更に１時間反応させた。１９０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を廃棄した後、ラテックス固形分を０．０５％アジ化ナトリウム水溶液にて分散させ、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２とした。
【００４４】
前記ラテックス液１及び２において、抗体感作時の各成分の濃度は、０．１ｗ／ｖ％  ポリスチレンラテックス１ｍＬ当たり、塩酸−１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１１．２μｇ、抗ＣＫ−ＭＢ抗体または抗ＣＫ−ＢＢ抗体１０μｇとした。
抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１と、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２とを等量で混合し、第２試薬とした。
【００４５】
（自動分析機による測定）
汎用自動分析機  日立７１７０Ｓ形日立自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ製）を用いてＣＫ−ＭＢ測定試薬の評価を行った。測定条件は、検体１１μＬに第１試薬９０μＬを添加混合させ、３７℃で５分間保持した後、第２試薬９０μＬを添加混合させ、更に５分間保持した。第２試薬添加後３０秒後から５分後の５７０ｎｍにおける吸光度変化量を求めた。実施例１〜３及び比較例１〜２を用いた測定結果（各検体の吸光度変化量）を表１に示す。
【００４６】
【表１】
2013125005.tif 000003
【００４７】
表１に示すように、ＣＫ−ＢＢ検体は、ラテックス粒子の平均粒子径が大きい系で凝集反応が生じた。平均粒子径が小さいとＣＫ−ＢＢによる凝集の程度は低かった。特に、実施例１においては、ＣＫ−ＢＢに対する凝集反応が低く良好であった。また、実施例１は、比較例１と比較して、ＣＫ−ＭＢとの反応性も高い点で良好である。ＣＫ−ＭＢは、生体成分中に１０Ｕ／Ｌ以上あると臨床意義が高いことが知られている。実施例１でのＣＫ−ＢＢ  １００Ｕ／Ｌ検体の数値は、ＣＫ−ＭＢ  １０Ｕ／Ｌ検体での数値より低値であり、ＣＫ−ＢＢによる干渉の影響を回避した試薬組成であると考えられる。
【００４８】
また、実施例２、実施例３でのＣＫ−ＢＢ  １００Ｕ／Ｌ検体の反応性は、実施例１より若干高いものの、ＣＫ−ＭＢ  １０Ｕ／Ｌ、ＣＫ−ＭＢ  １００Ｕ／Ｌ、ＣＫ−ＭＢ  １０００Ｕ／Ｌ共に高い反応性が得られた。比較例２ではＣＫ−ＢＢ  １００Ｕ／Ｌが干渉反応を示し、ＣＫ−ＭＢ  １０００Ｕ／Ｌでも高い反応が得られなかった。
一方、ＣＫ−ＭＭについては、ＣＫ−ＭＢ抗体とＣＫ−ＢＢ抗体との組み合わせである本実施例では、どの条件でも干渉反応を認めないことを確認した。
以上より、実施例１〜３においては、ＣＫ−ＢＢ及びＣＫ−ＭＭによる干渉反応が低減され、ＣＫ−ＭＢの高い反応性が得られる条件であることが明らかとなった。
【００４９】
《比較例３及び４》
（１種類のモノクローナル抗体（抗ＣＫ−ＭＢ抗体又は抗ＣＫ−ＢＢ抗体）を使用したラテックス凝集反応の検討）
以下の点を除き、先述と同様な２試薬系として構成し、評価を実施した。すなわち、表面にカルボキシル基が導入された平均粒子径０．３２μｍのポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ株式会社製）を使用し、抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１と、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２とを作製した。抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合ラテックス液１のみで調製した第２試薬を用いた系を比較例３、抗ＣＫ−ＢＢ抗体結合ラテックス液２のみで調製した第２試薬を用いた系を比較例４とした。
比較例３〜４を用いた測定結果（各検体の吸光度変化量）を表２に示す。
【００５０】
【表２】
2013125005.tif 000004
【００５１】
表２に示すように、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独（比較例３）や、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独（比較例４）でも、ＣＫ−ＭＢだけではなく、ＣＫ−ＢＢ、ＣＫ−ＭＭ共に反応性を示さなかった。特に、ＣＫ−ＭＢ及びＣＫ−ＢＢは、生体内あるいは液体中で２量体を形成することが知られている。よって、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独や、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独でも、ラテックス凝集を生じる可能性があった。本検討により、ＣＫ−ＭＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独や、ＣＫ−ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させたラテックス粒子単独では、ラテックス凝集を生じない抗体を使用し、それぞれの抗体を平均粒子径が０．２３μｍ〜０．３２μｍのラテックス粒子に固相したラテックス粒子を含む試薬構成により、簡便且つ正確に、生体成分中のＣＫ−ＭＢを測定するラテックス凝集免疫試薬及び測定方法を提供できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、臨床検査、特には心筋逸脱マーカーとして心筋梗塞の診断等に有用なＣＫ−ＭＢの測定に利用することができる。