(57)【要約】      （修正有）【課題】新たな美白成分を探索し、それを含有する皮膚外用剤の提供。【解決手段】代表的には、次式で表される配糖体等を含有する皮膚外用剤。2013032307.tif 000016【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）〜（８）で表される配糖体から選ばれる１種又は２種以上を含有する皮膚外用剤。
【化１】
2013032307.tif 000012
【請求項２】
美白用皮膚外用剤である請求項１記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
次式（１）〜（８）で表される配糖体から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする美白剤。
【化２】
2013032307.tif 000013
【請求項４】
次式（１）〜（８）で表される配糖体から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【化３】
2013032307.tif 000014
【請求項５】
次式（１）、（２）、（５）又は（７）で表される配糖体。
【化４】
2013032307.tif 000015
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン生成抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シミ、ソバカス、日焼け後の色素沈着、肝斑や雀卵斑等の皮膚病等に代表される色素沈着は、皮膚内に存在するメラノサイトの活性化によりメラニン生成が亢進することによって生じる。このメラニンは、メラノサイト内のメラニン生成顆粒において産生され、生成したメラニンは隣接細胞へ抗散する。
【０００３】
このようなメラニンの生成を抑制する美白剤としては、（１）チロシナーゼ活性抑制剤、（２）メラニン生成抑制剤、（３）ターンオーバ促進に基づくメラニン排出を促進させるために、基底細胞の細胞分裂を活性化する成分等がある。当該作用を有する美白剤としては、アスコルビン酸又はその誘導体、アルブチン、微生物抽出物、発酵生産物や植物抽出物が知られている。このうち、植物抽出物の例としては、ヒヨドリラクトンＡ（特許文献１）、ファルネソール等のセスキテルペンアルコール（特許文献２）、ゲルマクラン骨格を有するセスキテルペンラクトン（特許文献３）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−３０６２３１号公報
【特許文献２】特開２００４−１１５３９６号公報
【特許文献３】特開２００５−２０５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来用いられている美白剤の効果は十分ではなく、さらに有効性の高い美白剤が要望されている。
従って、本発明の課題は、新たな美白成分を探索し、それを含有する皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の植物由来の成分を探索し、その美白作用を検討してきたところ、ニガウリ葉部から単離した特定の８種の配糖体がアルブチンよりも強力なメラニン生成抑制作用を有し、かつ細胞毒性がなく安全性が高いので、美白剤及び皮膚外用剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次式（１）〜（８）で表される配糖体から選ばれる１種又は２種以上を含有する皮膚外用剤を提供するものである。
【０００８】
【化１】
2013032307.tif 000002
【０００９】
また、本発明は、上記式（１）〜（８）で表される配糖体から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とする美白剤を提供するものである。
さらに本発明は、上記式（１）〜（８）で表される配糖体から選ばれる１種又は２種以上を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供するものである。
さらに本発明は、上記式（１）、（２）、（５）又は（７）で表される配糖体を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
式（１）〜（８）の配糖体は、現在美白剤として広く使用されているアルブチンよりも優れたメラニン生成抑制効果を有し、かつ細胞毒性はない。従って、式（１）〜（８）の配糖体はメラニン生成抑制剤及び美白剤として有用であり、美白用等の皮膚外用剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】配糖体（１）〜（８）のメラニン産生抑制効果及び細胞毒性を示す図である（１００μＭ）。
【図２】配糖体（１）〜（８）のメラニン産生抑制効果及び細胞毒性を示す図である（３０μＭ）。
【図３】配糖体（１）〜（８）のメラニン産生抑制効果及び細胞毒性を示す図である（１０μＭ）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のメラニン生成抑制剤及び美白剤の有効成分は、上記式（１）〜（８）で表される配糖体（以下、配糖体（１）〜（８）ともいう）である。
【００１３】
【化２】
2013032307.tif 000003
【００１４】
これらのうち、配糖体（１）、（２）、（５）及び（７）は、新規化合物である。
Hexa-3-en-1-ol 1-O-β-D-glucopyranoside（１）、Benzyl alcohol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside（２）、(6ζ)-α-Terpineol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside（５）、Myrtenol 10-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside（７）。
【００１５】
配糖体（１）〜（８）は、ニガウリの葉部からアルコール含有溶媒で抽出することができる。
ニガウリ葉部から配糖体を抽出するには、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールで抽出すればよい。抽出溶媒はメタノールが特に好ましい。低級アルコール抽出画分は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー等によりさらに精製することができる。
【００１６】
配糖体（１）〜（８）は、後記実施例に示すように、アルブチンよりも優れたメラニン生成抑制効果を有するとともに、細胞毒性がない。従って、配糖体（１）〜（８）は、メラニン生成抑制剤、美白剤及び美白用皮膚外用剤の有効成分として有用である。本発明の皮膚外用剤は、化粧料、医薬部外品及び医薬品として用いることができる。
【００１７】
本発明のメラニン生成抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤は配糖体（１）〜（８）から選ばれる１種又は２種以上を含有していればよく、精製された配糖体（１）〜（８）を配合してもよいが、当該化合物を含有するニガウリ葉部抽出物を配合してもよい。
【００１８】
本発明のメラニン生成抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤中の配糖体（１）〜（８）の含有量は０．００００１〜６０質量％が好ましく、０．０００１〜１０質量％がより好ましく、０．０００１〜５質量％がさらに好ましい。配糖体（１）〜（８）をこの範囲で含有すれば、優れたメラニン生成抑制効果及び美白効果が得られる。
【００１９】
本発明のメラニン生成抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤（皮膚外用剤等ともいう）の剤型は、溶液系、可溶化系、乳化系、水−油二層系等のような剤型でもよい。また、本発明の皮膚外用剤等の製品形態も任意であり、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料やファンデーション、口紅、アイシャドー等のメーキャップ化粧料やボディー化粧料、芳香化粧料、洗浄料、軟膏等に用いることができる。
【００２０】
本発明の皮膚外用剤等には、上記の有効成分の他に通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる他の成分、例えば、粉末成分、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿剤、水溶性高分子、増粘剤、皮膜剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、ビタミン、酸化防止剤、酸化防止助剤、香料、水等を必要に応じて適宜配合し、目的とする剤形に応じて常法により製造することができる。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）化合物の単離
1-1. ニガウリ葉部の抽出
乾燥ニガウリ葉部（4385 g）は、メタノールで、室温、3日間、3回抽出しメタノール抽出物（399 g）を得た。
メタノール抽出物は、酢酸エチル/ 水（1 : 1, v / v）で溶剤分別し、得られた酢酸エチル層は、n-ヘキサン / メタノール / 水（95 : 95 : 10, v / v / v）で、水層については、n-ブタノールで再度抽出を行い、n-ヘキサン画分（47.6 g）、メタノール-水画分（75.0 g）、n-ブタノール画分（40.4 g）、水画分（170.2 g）を得た。
【００２３】
1-2. n-ブタノール画分の分画
ニガウリ葉部n-ブタノール画分（39 g）は、Diaion HP-20カラムクロマトグラフィー（Diaion HP-20重量 1226 g）で、フラクション（Fr.）B1（溶離液、メタノール : 水 = 1 : 9 ; 11.3 g）、B2 （メタノール : 水 = 3 : 7 ; 3.9 g）、B3 （メタノール : 水 = 1 : 1 ; 3.3 g）、B4 （メタノール : 水 = 7 : 3 ; 2.4 g）およびB5 （メタノール 100 % ; 3.9 g）に分画した。B2およびB3は、合わせてB2/3とした。同様にB4およびB5は、合わせてB4/5とした。
【００２４】
1-3. n-ブタノール画分B2/3の分画
n-ブタノール画分B2/3（6.92 g）をシリカゲルカラム（シリカゲル重量160 g）で、Fr. B2/3-1（溶離液、n-ヘキサン100 %およびn-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1 ; 5 mg）、B2/3-2（n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1 、39 mg）、B2/3-3（n-ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 1 およびn-ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 7 ; 101 mg）、B2/3-4（酢酸エチル100 %および酢酸エチル : メタノール = 7 : 3 ; 61 mg）、B2/3-5（酢酸エチル : メタノール = 7 : 3 ; 746 mg）、B2/3-6（酢酸エチル : メタノール = 7 : 3 ; 1609 mg）、B2/3-7（同; 610 mg）、B2/3-8（同; 336 mg）、B2/3-9（同; 908 mg）、B2/3-10（同; 225 mg）、B2/3-11（酢酸エチル : メタノール = 7 : 3および酢酸エチル : メタノール = 1 : 1 ; 338 mg）、B2/3-12（酢酸エチル : メタノール = 1 : 1 ; 410 mg）、B2/3-13（酢酸エチル : メタノール = 1 : 1および酢酸エチル : メタノール = 3 : 7 ; 192 mg）、B2/3-14（酢酸エチル : メタノール = 3 : 7およびメタノール 100% ; 103 mg）およびB2/3-15（酢酸 100 % ; 974 mg）を得た。
【００２５】
1-4. n-ブタノール画分B2/3-3の分画
n-ブタノール画分B2/3-3（101 mg）をODSカラムHPLC（センシュー科学（株）製、Pegasil ODS-II 5 μm、10 φ × 250 mm、メタノール : 水 = 1 : 1 (酢酸 0.1 %）、2.0 mL / min）で分画し、化合物1（Hex-3-en-1-ol 1-O-β-D-glucopyranoside）を得た（3.0 mg、保持時間14.8分）。
【００２６】
1-5. n-ブタノール画分B2/3-6の分画
n-ブタノール画分B2/3-6（1609 mg）をODSカラムクロマトグラフィー（ODS重量48 g）で、Fr. B2/3-6-1（溶離液、メタノール : 水 = 3 : 7 ; 693 mg）、B2/3-6-2（同; 365 mg）、B2/3-6-3（同; 162 mg）、B2/3-6-4（同; 104 mg）、B2/3-6-5（同; 81 mg）、B2/3-6-6（同; 84 mg）、B2/3-6-7（メタノール : 水 = 1 : 1 ; 72 mg）、B2/3-6-8（メタノール : 水 = 7 : 3 ; 13 mg）、B2/3-6-9（メタノール 100% ; 13 mg）を得た。B2/3-6-3およびB2/3-6-4は、あわせてB2/3-6-3/4とした。
【００２７】
1-6. n-ブタノール画分B2/3-6-3/4の分画
n-ブタノール画分B2/3-6-2-3/4（193 mg）をODSカラムHPLC（（株）資生堂製、Capcell pak AQ、10 φ × 250 mm、メタノール : 水 = 1 : 9 (酢酸 0.1 %）、2.0 mL / min）で、化合物2（Benzyl alcohol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6）-β-D-glucopyranoside）（4.4 mg、保持時間 27.2 min）および化合物3（(6S,9R）-Roseoside）（27.5 mg、保持時間 33.6 min）を得た。
【００２８】
1-7. n-ブタノール画分B4/5の分画
n-ブタノール画分B4/5（5.47 g）をODSカラム（ODS重量144 g）で、Fr. B4/5-1（溶離液、メタノール : 水 = 6 : 4 ; 762 mg）、B4/5-2（同; 1408 mg）、B4/5-3（同; 503 mg）、B4/5-4（同; 362 mg）、B4/5-5（同; 288 mg）、B4/5-6（同，およびメタノール : 水 = 7 : 3 ; 173 mg）、B4/5-7（メタノール : 水 = 7 : 3 ; 260 mg）、B4/5-8（メタノール : 水 = 8 : 2 ; 354 mg）、B4/5-9（メタノール : 水 = 8 : 2およびメタノール : 水 = 9 : 1 ; 425 mg）、B4/5-10（メタノール : 水 = 9 : 1およびメタノール 100 % ; 159 mg）、B4/5-11（メタノール 100 % ; 109 mg）およびB4/5-12（酢酸 100 % ; 48 mg）を得た。B4/5-3、B4/5-4、B4/5-5およびB4/5-6はあわせてB4/5-3/6とした。
【００２９】
1-8. n-ブタノール画分B4/5-2の分画
n-ブタノール画分B4/5-2（94 mg）をODSカラムHPLC（（株）資生堂製、Capcell pak AQ、10 φ × 250 mm、メタノール : 水 = 45 : 55 (酢酸 0.1 %）、2.0 mL / min）で、化合物4（3-Oxo-α-ionol 9-O-β-D-glucopyranoside）（2.1 mg、保持時間 32.0 min）を得た。
【００３０】
1-9. n-ブタノール画分B4/5-3/6の分画
n-ブタノール画分B4/5-3/6（1326 mg）をODSカラムクロマトグラフィー（ODS重量48 g）で、Fr. B4/5-3/6-1（溶離液、メタノール : 水 = 3 : 7 ; 104 mg）、B4/5-3/6-2（メタノール : 水 = 1 : 1 ; 96 mg）、B4/5-3/6-3（同1 ; 97 mg）、B4/5-3/6-4（同2 ; 115 mg）、B4/5-3/6-5（同3 ; 65 mg）、B4/5-3/6-6（メタノール : 水 = 6 : 4 ; 95 mg）、B4/5-3/6-7（メタノール : 水 = 7 : 3 ; 91 mg）、B4/5-3/6-8（同;112 mg）、B4/5-3/6-9（同; 76 mg）、B4/5-3/6-10（メタノール : 水 = 8 : 2 ; 113 mg）、B4/5-3/6-11（メタノール : 水 = 9 : 1 ; 42 mg）、B4/5-3/6-12（メタノール 100 % ; 22 mg）、B4/5-3/6-13（クロロホルム、酢酸およびメタノール ; 53 mg）を得た。
【００３１】
1-10. n-ブタノール画分B4/5-3/6-3の分画
n-ブタノール画分B4/5-3/6（97mg）をODSカラムHPLC（（株）資生堂製、Capcell pak AQ、10 φ × 250 mm、アセトニトリル : 水 = 35 : 65 (酢酸 0.1 %）、3.0 mL / min）で、配糖体（５） [(6ζ)-α-Terpineol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6）-β-D-glucopyranoside]（3.1 mg、保持時間 25.6 min）、配糖体（６）（Sacranoside A）（3.2 mg、保持時間 27.6 min）、配糖体（７）（Myrtenol 10-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6）-β-D-glucopyranoside）（6.4 mg、保持時間 30.4 min）および配糖体（８）（Myrtenol 10-O-β-D-glucopyranoside）（7.4 mg、保持時間 41.6 min）を得た。
【００３２】
（２）化合物の構造解析
2-1 Hex-3-en-1-ol 1-O-β-D-glucopyranoside (配糖体（１）)
新規化合物である配糖体（１）は、Hex-3-en-1-ol 1-O-β-D-glucopyranosideである。
配糖体（１）は、HR-ESIMSによりm/z 285.1328のナトリウム付加イオンを与え、分子式C12H22O6と決定した。1H，13C-NMRは、Hexenyl基部分のシグナルを示した。HMBC実験よりH-4 (δH5.41) およびH-5 (δH 5.41) とC-5 (δC 21.5) の相関およびH-2 (δH 2.37) とH-5 (δH 2.04) とC-3 (δC 134.5) の相関が観測され、C-3が2重結合であることが明らかとなった。配糖体（１）の13C-NMRスペクトルは、β-D-glucupyranoseであるδC 104.3 (d)，75.1 (d)，77.9 (d)，71.6 (d)，70.5 (d)，62.7 (t) のシグナルを示した。以上のデータと1H -1H COSY，NOESY，HMQCおよびHMBCスペクトルより、配糖体（１）はhex-3-en-1-ol 1-O-β-D-glucopyranosideであることが明らかとなった。HMBC実験は，H-1' (δ 4.25) とC-1 (δC 69.9) およびH-1 (δ 3.52，3.82) とC-1' (δC 104.3) の相関を観測した。
以下に配糖体（１）のスペクトルデータを示す。
HR-ESIMS : m/z 285.1328 [M + Na]+ (C12H22O6Na：計算値m/z 285.1314)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 表1参照
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) : 表1参照
【００３３】
【表１】
2013032307.tif 000004
【００３４】
2-2. Benzyl alcohol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (配糖体（２）)
新規化合物である配糖体（２）は、Benzyl alcohol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosideである。
配糖体（２）はHR-ESIMSでm/z 425.1411 [M + Na]+のナトリウム付加イオンを与え、分子式C18H26O10 であると決定した。1H，13C-NMRは、ベンジル基部分のシグナルを示した。配糖体（２）の1H-NMRスペクトルデータは、2種のアノマープロトンδH 4.34 (d，J = 8.2 Hz) およびδH 4.35 (d，J = 9.1 Hz)を示した。配糖体（２）の13C-NMRスペクトルは、末端のα-L-arabinopyranoseである105.2(d)，72.4(d)，74.2(d)，69.6(d)，66.7(t)のシグナルを示した。また、内部のβ-D-glucopyranoseである103.4(d)，75.1(d)，77.9(d)，71.6(d)，77.0(d)，69.5(t)のシグナルを示した。6'-O-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside部分はSacranoside A [文献：Kawahara E.; Fujii M.; Ida Y.; Akita H. Chemoenzymatic Synthesis of Sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull. 2006, 54(3), 387-390, Yoshikawa M.; Shimada H.; Horikawa, S.; Murakami, T.; Shimoda, H.; Yamahara, J.; Matsuda, H.; Bioactive constituents of Chinese natural medicines. IV. Rhodiolae Radix. (2).: on the histamine release inhibitors from the underground part of Rhodiola sacra (Prain ex Hamet) S. H. Fu (Crassulaceae): chemical structures of rhodiocyanoside D and sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull.1997,45(9),1498-1503.] と比較し、末端α-L-arabinopyranoseが内部glucoseのC-6に結合していることが示唆された。以上のデータとHMQCおよびHMBCスペクトルより、配糖体（２）はBenzyl alcohol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosideであることを決定した。Benzyl基の内部グルコースのHMBC実験は、H-1 (δH 4.65，4.09) とC-1' (δC 103.4) の相関および内部グルコースのH-6' (δH 3.75，4.11) と末端アラビノースのC-1'' (105.2) の相関を示した。
以下に配糖体（２）のスペクトルデータを示す．
HR-ESIMS : m/z 425.1411 [M + Na]+ (C18H26O10Na計算値：m/z 425.1423)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 表2参照
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) : 表2参照
【００３５】
【表２】
2013032307.tif 000005
【００３６】
2-3. (6S, 9R)-Roseoside （配糖体（３））
配糖体（３）は、1Hおよび13C-NMRスペクトルデータを文献 [Yamano Y.; Ito M. Synthesis of Optically Active Vomifoliol and Roseoside Stereoisomers. Chem. Pharm. Bull. 2005, 53(5), 541-546.] と比較し(6S, 9R)-Roseosideと同定した。
以下にスペクトルデータを示す。
HR-ESIMS:m/z 409.1855 (C19 H30 O8Na計算値：409.1838)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 1.02 (3H, s, H-11 or 12), 1.03 (3H, s, H-11 or 12), 1.28 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-9), 1.91 (3H, d, J = 1.2 Hz, H-13), 2.15 (1H, d, J = 6.9 Hz, H-2), 2.51 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-2), 3.16 (1H, m, H-2'), 3.24 (1H, m, H-5'), 3.33 (1H, m, H-3'), 3.63 (1H, dd, J = 5.5, 11.9 Hz, H-6'), 3.86 (1H, m, H-6'), 4.34 (1H, d, 7.8 Hz, H-1'), 4.41 (1H, m, H-9), 5.85 (1H, s, H-8), 5.86 (1H, brs, H-4).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) : 19.5 (C-13), 21.1 (C-10), 23.3 (C-11 or 12), 24.6 (C-11 or 12), 42.3 (C-1), 50.6 (C-2), 62.7 (C-6'), 71.5 (C-4'), 77.2 (C-9), 77.9 (C-5'), 78.0 (C-3'), 79.9 (C-6), 102.6 (C-1'), 127.0 (C-4), 131.4 (C-7), 135.1 (C-8), 167.1 (C-5), 201.1 (C-3).
【００３７】
【化３】
2013032307.tif 000006
【００３８】
2-4. 3-Oxo-α-ionol 9-O-β-D-glucopyranoside (配糖体（４）)
配糖体（４）は1H-NMRスペクトルデータを文献[Wang M.; Shao Y.; Huang T.; Wei G.; Ho C. Isolation and Structural Elucidation of Aroma Constituents Bound as Glycosides from Sage (Salvia officinalis). J. Agric. Food Chem. 1988, 46, 2509-2511.]と比較し3-Oxo-α-ionol 9-O-β-D-glucopyranosideであると同定した。
以下にスペクトルデータを示す。
HR-ESIMS:m/z 393.1880 (C19 H30 O7Na計算値：393.1889)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 1.00 (3H, s, H-12), 1.03 (3H, s, H-11), 1.29 (3H, d, J = 6.4 Hz, H-10), 1.93 (3H, s, H-13), 2.04 (1H, d, J = 16.8 Hz, H-2α), 2.43 (1H, d, J = 16.8 Hz, H-2β), 2.67 (1H, d, J = 9.2 Hz, H-6), 3.16 (1H, m, H-2'), 3.26 (1H, m, H-4'), 3.30 (1H, m, H-3'), 3.35 (1H, m, H-5') 3.65 (1H, dd, J = 6.4, 12.0 Hz, H-6'), 3.82 (1H, m, H-6'), 4.34 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1'), 4.48 (1H, m, H-9), 5.63 (1H, dd, J = 6.0, 15.2 Hz, H-8), 5.77 (1H, dd, J = 8.8, 15.2 Hz, H-7), 5.88 (1H, brs, H-4).
【００３９】
【化４】
2013032307.tif 000007
【００４０】
2-5. (6ζ)-α-Terpineol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (配糖体（５）)
新規化合物である配糖体（５）は、(6ζ)-α-Terpineol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosideである。
配糖体（５）はHR-ESIMSでm/z471.2206[M+Na]+のナトリウム付加イオンを与え、分子量448(C21H36O10)であると決定した。配糖体（５）のアグリコン部分の1H，13C-NMRシグナルは、α-terpinyl[α-L-(2-O-galloyl)arabinofranosyl]-(1→6)-β-D-glucopyranoside [文献：Kikuzaki H.; MiyajimaY.; Nakatani N. Phenolic Glycosides from Berries of Pimenta dioica. J. Nat. Prod. 2008, 71, 861-865.] のアグリコン部分と同様のシグナルを示した。また、13C-NMRより末端α-L-arabinopiranoseを示すδC 104.9 (d)，72.2 (d)，74.0 (d)，69.4 (d)，66.3 (t) および内部グルコース示すδC 98.6 (d)，75.2 (d)，78.1 (d)，71.5 (d)，76.3 (d)，69.3 (t) を示し、これらの糖部分のシグナルはSacranoside A [文献：Kawahara E.; Fujii M.; Ida Y.; Akita H. Chemoenzymatic Synthesis of Sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull. 2006, 54(3), 387-390, Yoshikawa M.; Shimada H.; Horikawa, S.; Murakami, T.; Shimoda, H.; Yamahara, J.; Matsuda, H.; Bioactive constituents of Chinese natural medicines. IV. Rhodiolae Radix. (2).: on the histamine release inhibitors from the underground part of Rhodiola sacra (Prain ex Hamet) S. H. Fu (Crassulaceae): Chemical structures of rhodiocyanoside D and sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull.1997,45(9),1498-1503.] の糖部分と同様のシグナルを示した。以上のデータとNOESY，H-HCOSY，HMBC，HMQC実験より、配糖体（５）の構造を(6ζ)-α-Terpineol 6-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosideと決定した。C-6の立体配置は未決定である。
以下に配糖体（５）のスペクトルデータを示す。
HR-ESIMS : m/z 471.2206 [M + Na]+ (C21H36O10Na計算値：m/z 471.2206)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 表3参照
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) : 表3参照
【００４１】
【表３】
2013032307.tif 000008
【００４２】
2-6. Sacranoside A (配糖体（６）)
配糖体（６）は1Hおよび13C-NMRスペクトルデータを文献 [Kawahara E.; Fujii M.; Ida Y.; Akita H. Chemoenzymatic Synthesis of Sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull. 2006, 54(3), 387-390, Yoshikawa M.; Shimada H.; Horikawa, S.; Murakami, T.; Shimoda, H.; Yamahara, J.; Matsuda, H.; Bioactive constituents of Chinese natural medicines. IV. Rhodiolae Radix. (2).: on the histamine release inhibitors from the underground part of Rhodiola sacra (Prain ex Hamet) S. H. Fu (Crassulaceae): chemical structures of rhodiocyanoside D and sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull.1997,45(9),1498-1503.] と比較しSacranoside A (Myrtenol 10-O-α-L-arabinopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside) と同定した。
【００４３】
以下にスペクトルデータを示す。
HR-ESIMS:m/z 469.2040 (C21 H34 O19Na計算値：469.2049)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 0.86 (3H, s, H-8 or 9), 1.18 (1H, m, H-6), 1.29 (3H, s, H-8 or 9), 2.08 (1H, m, H-5), 2.23 (1H, t, J = 5.5 Hz, H-1), 2.28 (2H, m, H-4), 2.42 (1H, m, H-6), 3.26 (1H, m, H-2'), 3.34 (1H, m, H-4'), 3.36 (1H, m, H-3'), 3.44 (1H, m, H-5'), 3.50 (1H, m, H-3''), 3.52 (1H, m, H-5''), 3.59 (1H, dd, J = 3.2, 12.4 Hz, H-2''), 3.73 (1H, dd, J = 3.2, 12.4 Hz, H-6'), 3.79 (1H, m, H-4''), 3.85 (1H, dd, J = 3.2, 12.4 Hz, H-5''), 3.98 (1H, dd, J = 1.3, 12.3 Hz, H-10), 4.08 (1H, dd, J = 1.9, 11.0 Hz, H-6'), 4.20 (1H, dd, J = 1.9, 12.9 Hz, H-10), 4.26 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.32 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-1''), 5.57 (1H, brs, H-3).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) : 21.6 (C-8 or 9), 26.6 (C-8 or 9), 32.2 (C-4), 32.5 (C-6), 38.9 (C-7), 42.2 (C-5), 44.5 (C-1), 66.7 (C-5''), 69.4 (C-6'), 71.6 (C-4'), 72.4 (C-2''), 72.9 (C-10), 74.2 (C-3''), 75.0 (C-2'), 76.9 (C-5'), 78.0 (C-3'), 103.4 (C-1'), 105.1 (C-1''), 120.9 (C-3), 146.2 (C-2).
【００４４】
【化５】
2013032307.tif 000009
【００４５】
2-7. Myrtenol 10-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (配糖体（７）)
新規化合物である配糖体（７）は、Myrtenol 10-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosideである。
配糖体（７）はHR-ESIMSでm/z 469.2043 [M+Na]+のナトリウム付加イオンを与え、分子量446 (C21H34O10) であると決定した。配糖体（７）の1H-NMRスペクトルデータは、2種のアノマープロトンδH 4.25 (d，J=7.8 Hz) およびδH 5.00 (d，J = 2.3 Hz) を示した。配糖体（７）のアグリコン部分の1H, 13C-NMRスペクトルデータは、Myrtenol 10-O-β-D-glucopyranosideのアグリコン部分のそれと同様のシグナルを示し[文献：Kawahara E.; Fujii M.; Ida Y.; Akita H. Chemoenzymatic Synthesis of Sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull. 2006, 54(3), 387-390.]，アグリコン部分がMyrtenolであることが示唆された。また、配糖体（７）の13C-NMRスペクトルは、末端のβ-D-apiofuranoseを示す111.0(d)，78.0(d)，80.6(d)，80.6(d)，75.0(t), 65.6 (t) および内部のβ-D-glucopyranoseである103.4(d)，75.1(d)，78.1(d)，71.7(d)，77.0(d)，68.6(t)を示し、これらのシグナルはeverlastosides A, B, C, D および Eの1H, 13C-NMRスペクトルデータ[文献：Wang, L.-B.; Morikawa, T.; Nakamura, S.; Ninomiya, K.; Matsuda, H.; Muraoka, O.; Wu, L.-J.; Yoshikawa, M. Medicinal flowers. XXVIII. Structures of five new glycosides, everlastosides A, B, C, D, and E, from the flowers of Helichrysum arenarium. Heterocycles. 2009,78(5),1235-1242.]と比較し、末端β-D-apiofuranoseが内部glucopyranoseのC-6に結合している6'-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosideであることが示唆された。以上のデータとHMQCおよびHMBCスペクトルより、配糖体（７）は、Myrtenol 10-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosideであることを決定した。HMBC実験は、Myrtenyl基と内部グルコースのH-10 (δH4.00，4.19) とC-1' (δC103.4) の相関および内部グルコースのH-6' (δH3.58，3.97) と末端アピオースのC-1''(111.0)の相関を示した。
以下に配糖体（７）のスペクトルデータを示す。
HR-ESIMS : m/z 469.4043 [M + Na]+ (C21H34O10Na計算値：m/z 469.4049)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 表4参照
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) : 表4参照
【００４６】
【表４】
2013032307.tif 000010
【００４７】
2-8. Myrtenol 10-O-β-D-glucopyranoside (配糖体（８）)
配糖体（８）は1Hおよび13C-NMRスペクトルデータを文献[Kawahara E.; Fujii M.; Ida Y.; Akita H. Chemoenzymatic Synthesis of Sacranosides A and B. Chem. Pharm. Bull. 2006, 54(3), 387-390]と比較し、Myrtenol 10-O-β-D-glucopyranosideと同定した。
【００４８】
HR-ESIMS:m/s 337.1623 (C16H26O6Na計算値：337.1627) 
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) : 0.86 (3H, s, H-8 or 9), 1.18 (1H, m, H-6), 1.29 (3H, s, H-8 or 9), 2.07 (1H, m, H-5), 2.23 (1H, m, H-1), 2.28 (2H, m, H-4), 2.41 (1H, dt, J = 5.5, 8.7 Hz, H-6), 3.18 (1H, m, H-2'), 3.26 (1H, m, H-4'), 3.31 (1H, m, H-3'), 3.35 (1H, m, H-5'), 3.66 (1H, dd, J = 5.5, 11.9 Hz, H-6'), 3.84 (1H, dd, J = 2.3, 11.9 Hz, H-6'), 4.00 (1H, dd, J = 1.3, 12.3 Hz, H-10), 4.21 (1H, dd, J = 1.9, 12.4 Hz, H-10), 4.26 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1'), 5.56 (1H, m, H-3).
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) : 21.6 (C-8 or 9), 26.6 (C-8 or 9), 32.2 (C-4), 32.5 (C-6), 38.9 (C-7), 42.1 (C-5), 44.5 (C-1), 62.7 (C-6'), 71.6 (C-4'), 72.6 (C-10), 75.1 (C-2'), 77.9 (C-5'), 78.2 (C-3'), 103.4 (C-1'), 120.8 (C-3), 146.3 (C-2).
【００４９】
【化６】
2013032307.tif 000011
【００５０】
実施例２（メラニン産生抑制試験）
１）メラニン産生抑制試験
メラニン産生抑制試験は、マウスＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞を用い、これを２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０4ｃｅｌｌｓ／mlで５００μＬ撒き、２４時間培養した。培養後、このＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞に対し、α−ＭＳＨ（Melanocyte-stimulating hormone）と、前記の配糖体（１）〜（８）及びアルブチン（β−Arbutin）を試料として添加した。その後、これを４日間作用させた後、上清を吸引除去し、１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含む２Ｍ  ＮａＯＨ溶液で溶解した。次いで、その溶解物の４０５nmにおける吸光度を測定し、各試料のメラニン量（検体濃度１０−１００μＭにおけるメラニン量（％））とした。
【００５１】
２）細胞毒性試験（ＭＴＴ法）
前記のメラニン産生抑制試験と並行して、同じＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａ  ４Ａ５細胞を用い、これを２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０4ｃｅｌｌｓ／mLで５００μＬ撒き、２４時間培養した。培養後、このＢ１６  ４Ａ５細胞に対し、配糖体（１）〜（８）およびアルブチンを試料として添加した。その後、これをメラニン産生抑制試験と同様に４日間作用させた後、０．５％ＭＴＴ溶液を添加し３時間作用させ、０．０８Ｍ  ＨＣｌを含むイソプロパノールを加え溶解した。次いで、波長５７０（ｔｏｐ）−６３０（bottom）nmにおける吸光度を測定し細胞生存率を算出した。
【００５２】
３）メラニン産生抑制試験結果
メラニン産生抑制試験の結果は図１〜図３に示した。アルブチン処理Ａ４５細胞上清中のメラニン含有率は８６．２−１０３．５％（１００μＭ−１０μＭ）であったのに対し、配糖体（１）〜（８）のそれは、いずれも約５３．６−９９．９％（１００μＭ−１０μＭ）のメラニン量で優れた抑制効果を示した。
一方、細胞毒性試験の結果は図１から図３に示した。配糖体化合物（１）〜（８）は、１００μＭの高濃度でもいずれも約８０％程度の優れた細胞生存率を示した。これは、既に高い安全性が確認され、従来から用いられているアルブチンに迫る優れた細胞生存率である。
【００５３】
実施例３
９５％エタノール（５５質量％）、ポリオキシエチレン（４０モル）硬化ヒマシ油（２５質量％）、配糖体化合物（１）〜（８）のいずれか（０．０００１〜０．１質量％）、酸化防止剤及び防腐剤（適量）を含むアルコール相を得た。一方、ジプロピレングリコール（５質量％）、ヘキサメタリン酸ナトリウム（適量）、イオン交換水（全量を１００質量％とする量）を含む水相を得た。これを混合攪拌してローションを得た（カッコ内の質量％は、ローション全量あたりの質量％）。
【図１】
2013032307.tif 000017
【図２】
2013032307.tif 000018
【図３】
2013032307.tif 000019