(57)【要約】【課題】生活習慣病を予防又は治療するための、新たな作用機序の薬剤を提供する。【解決手段】鉄キレート剤が、マクロファージの脂肪組織への浸潤を抑制し、マクロファージからの炎症性サイトカインの産生や活性酸素種の産生を低下させることができ、その結果、インスリン抵抗性が改善できることを見出した。これらのことから、鉄キレート剤を用いて、生活習慣病の新たな作用機序の薬剤を提供できるようになった。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄キレート剤を有効成分とする、細胞又は組織に対するマクロファージの浸潤抑制剤。
【請求項２】
上記細胞又は組織が、脂肪細胞又は脂肪組織である、請求項１に記載のマクロファージの浸潤抑制剤。
【請求項３】
鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノール類から選択されるものである、請求項１〜３のいずれかに記載のマクロファージの浸潤抑制剤。
【請求項４】
鉄キレート剤を有効成分とする、脂肪細胞の炎症抑制剤。
【請求項５】
鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノール類から選択されるものである、請求項４に記載の炎症抑制剤。
【請求項６】
鉄キレート剤を有効成分とする、脂肪細胞へのマクロファージの浸潤抑制によるインスリン抵抗性改善剤。
【請求項７】
鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノール類から選択されるものである、請求項６に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項８】
鉄キレート剤を有効成分とする、血管内皮細胞の酸化ストレス抑制と炎症抑制による動脈硬化症の改善剤。
【請求項９】
鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノール類から選択されるものである、請求項８に記載の動脈硬化症の改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄キレート剤によるマクロファージの浸潤抑制という新たなメカニズムを用いた、生活習慣病の新たな薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の発症原因の一つが、栄養過多による肥満であることは良く知られている。また、糖尿病に移行して行くプロセスも、次のように進むことが明らかとなっている。まず、肥満になることにより、脂肪細胞が肥大化し，アディポネクチン（Ａｄ）が低下する。次に、脂肪組織において酸化ストレスが増加するなどしてケモカインであるＭＣＰ−１の発現・分泌が増加する。次に、動脈硬化巣と同様に、活性化されたＭ１マクロファージが肥大化した脂肪細胞に浸潤する。Ｍ１マクロファージが脂肪細胞に浸潤することにより、脂肪細胞に炎症が惹起され、Ｍ１マクロファージから炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α等）や、脂肪細胞からＦＦＡなどの悪玉アディポカインの発現・分泌が協調的・統一的に増加する。その結果、善玉アディポカインであるＡｄの低下と相まってインスリン抵抗性，メタボリックシンドローム（ＭＳ），糖尿病，心血管疾患が順次、惹起・増悪されて来ると報告されている（非特許文献１）。
このように、脂肪細胞における酸化ストレスの亢進は、アディポサイトカインの分泌異常を引き起こすことにより、糖尿病発症において重要な役割を担うことが報告されている。即ち、酸化ストレスを改善することが、糖尿病の発症および進展予防につながる可能性があると考えられる。
【０００３】
また、酸化ストレスは，血管障害のみならず，神経細胞においてもタンパク質の機能障害，細胞内輸送の障害，ひいてはアポトーシスを引き起こし，糖尿病性神経障害の病態に深くかかわっていることが明らかにされている。特に糖尿病血管障害に関しては，酸化ストレス亢進により血管内皮細胞の機能障害，血栓形成やＬＤＬの酸化変性を促進する一方，細胞内情報伝達系を修飾しサイトカイン，接着因子，増殖因子の発現を増強させて血管病変の進行を促進すると考えられている。また最近では，酸化ストレスがインスリン抵抗性や膵β細胞からのインスリン分泌にも影響することが報告されている（非特許文献２）。
一方、酸化ストレスに最も影響の強い体内因子は鉄イオンであると言われている。即ち、鉄は，酸素の運搬や各種酵素活性などに利用される必須の元素であるが、鉄が過剰に存在するようになると，逆にラジカル産生などを招き，細胞に対して毒性を示すようになる。例えば、鉄の過剰蓄積を引き起こす遺伝性ヘモクロマトーシスという疾患では、５０歳前後になると、膵臓ランゲルハンス氏島のβ細胞に鉄が沈着しインスリン分泌が低下するため糖尿病が発症すると報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
そこで、上記鉄キレート剤を用いて、糖尿病の治療剤として応用することが報告されている（特許文献１、２，３）。更には、糖尿病性腎症の治療剤としての可能性が検討されている（特許文献４）。しかしながら、これらの治療に用いる化合物については、適用の可能性が示されているにすぎず、実現可能なものであるか否かは示されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５００３４７号公報
【特許文献２】特表２００９−５１８４１４号公報
【特許文献３】特表２０１０−５２６８４９号公報
【特許文献４】特表２００２−５２９４２１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】医学のあゆみ、２２９巻７号５１２−５１８（２００９年）
【非特許文献２】日本薬理学雑誌、Ｖｏｌ．１２５、Ｎｏ．３、１２５−１２８（２００５）
【非特許文献３】「Ｉｒｏｎ  Ｏｖｅｒｌｏａｄと鉄キレート療法」（ノバルテイスＨＰ、http://www.exjade.jp/ironoverload/index.html）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、脂肪細胞へのマクロファージの浸潤抑制による生活習慣病の症状（インスリン抵抗性等）を改善する治療剤を提供することを目的とする。更には、血管内皮細胞での酸化ストレスを低下させて内皮障害を抑制し動脈硬化を改善する治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、非特許文献３に指摘されるように、生体における鉄の過剰蓄積により糖尿病を発症するとの知見から、鉄イオンと糖尿病との関係を鋭意研究してきた。即ち、本発明者らは、肥満２型糖尿病モデルマウスである  ＫＫＡｙ  ｍｉｃｅ  を使用して脂肪細胞における鉄の役割を検討した。
まず、鉄キレート剤であるデフェロキサミン（ＤＦＯ）を上記モデルマウスに２週間投与することにより、ＫＫＡｙ  ｍｉｃｅの脂肪の鉄濃度と血清フェリチンが低下することを見出した。更に、このＤＦＯ投与により脂肪量と脂肪細胞のサイズが低下することも見出した。
【０００９】
そこで、ＫＫＡｙ  ｍｉｃｅを用いて、脂肪細胞と脂肪組織における鉄キレート剤の影響を詳細に検討したところ、以下のことが見出された。
ａ）脂肪組織に侵入するマクロファージが減少した。
ｂ）脂肪組織におけるスーパーオキサイド（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ）産生やＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ  活性は、尿中の８−ヒドロキシ−２‘−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）排泄と同様に低下した。
ｃ）脂肪細胞でのｐ２２  ｐｈｏｘ  発現が低下した。
ｄ）脂肪組織における炎症性サイトカインの  ｍＲＮＡ  発現が低下した。
ｅ）骨格筋におけるＡｋｔ  ａｎｄ  ＩＲＳ−１  のリン酸化レベルが増加した。このリン酸化レベルの増加は、全身での糖耐性やインスリン感受性の改善に寄与する。
【００１０】
鉄キレート剤のこれらの効果は、血清フェリチンの低下と臓器の鉄の濃度を低下させることにより、脂肪細胞と脂肪組織に対する酸化ストレスとマクロファージの浸潤を抑制することにより、炎症性サイトカインの発生を抑制することができ、脂肪細胞の肥大化を改善できることを見出した。本発明者らは、これらの知見により、本発明を完成した。
【００１１】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）鉄キレート剤を有効成分とする、細胞又は組織に対するマクロファージの浸潤抑制剤。
（２）上記細胞又は組織が脂肪細胞である、上記（１）に記載のマクロファージの浸潤抑制剤。
（３）鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノールから選択されるものである、上記（１）または（２）のいずれかに記載のマクロファージの浸潤抑制剤。
【００１２】
（４）鉄キレート剤を有効成分とする、脂肪細胞または血管内皮細胞の炎症抑制剤。
（５）鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノールから選択されるものである、上記（４）に記載の炎症抑制剤。
【００１３】
（６）鉄キレート剤を有効成分とする、脂肪細胞へのマクロファージの浸潤抑制によるインスリン抵抗性改善剤。
（７）鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノールから選択されるものである、上記（６）に記載のインスリン抵抗性改善剤。
（８）鉄キレート剤を有効成分とする、血管内皮細胞の酸化ストレス抑制と炎症抑制による動脈硬化症の改善剤。
鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノールから選択されるものである、上記（７）に記載の動脈硬化症の改善剤。
（９）鉄キレート剤を有効成分とする、生活習慣病予防又は治療剤
（１０）鉄キレート剤が、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノールから選択されるものである、上記（１０）に記載の生活習慣病の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の鉄キレート剤は、体内環境の鉄イオンを低濃度に維持することにより、脂肪細胞及びそれらの組織へのマイクロファージの浸潤を抑制することができる。その結果、脂肪細胞の肥大化を防ぐことができ、脂肪組織における炎症性サイトカインの発現を抑制することができる。そして、全身での耐糖性とインスリン感受性を改善することができるようになる。更に、血管内皮細胞の酸化ストレスと炎症を抑制し、動脈硬化の進行を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】鉄キレート剤が投与されたＫＫＡｙ  ｍｉｃｅの精巣上体、後腹膜、腸管周囲の白色脂肪の重量と、非投与のＫＫＡｙマウスの精巣上体、後腹膜、腸管周囲の白色脂肪の重量を比較した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与の有無により、精巣上体等の脂肪細胞の重量とサイズが大きく異なっている。
【図２】鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与の有無により得られる、脂肪細胞のサイズの平均値を示した図（Ｃ）と脂肪細胞のサイズの分布を示した図（Ｄ）が表わされている。鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与した方が、脂肪細胞のサイズの平均値、分布の傾向が小さくなる方向にある。
【図３】Ｅの左図は、脂肪細胞周囲に分布するマクロファージを、マクロファージを認識するＦ４／８０抗体で染色した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与により、脂肪細胞の周囲では、脂肪細胞に浸潤するマクロファージの数が低下していた。Ｅの右図は、脂肪細胞に浸潤するマクロファージの数の平均値を示した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与した場合、脂肪細胞に浸潤するマクロファージの数が有意に低下している。
【図４】Ａの左図では、尿中８−ＯＨｄＧ排泄量に対する鉄キレート剤の効果を示した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与した群では、明らかに尿中８−ＯＨｄＧ排泄量が低下している。Ｂの右図では、精巣上体周囲の脂肪細胞におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼの産生を表わした図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与によりＮＡＤＰＨオキシダーゼの産生は抑制されている。このことは、鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与した群では、酸化ストレスが低下している。
【図５】Ｃの左図は、脂肪組織を蛍光色素のＤＨＥで染色し、活性酸素種の存在を確認した図である。Ｃの右図の棒グラフは、左図の結果を定量化したものである。
【図６】精巣上体脂肪細胞における、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのコンポーネント（ｇｐ９１ｐｈｏｘ，ｐ６７ｐｈｏｘ，ｐ４７ｐｈｏｘ）の発現を、リアルタイムＰＣＲで評価した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与の有無で、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの遺伝子発現に有意差は出なかった。
【図７】Ｅの左図では、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのコンポーネントの１つであるｐ２２ｐｈｏｘの発現変化を示した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群で、発現が低値を示した。Ｅの右図には、実際のバンドとβアクチンで補正した定量化した棒グラフを示した。  Ｆでは、精巣上体脂肪細胞をｐ２２ｐｈｏｘ抗体で染色した図である。明らかに鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群で染色性が薄くなっており、ｐ２２ｐｈｏｘタンパク質の産生量（ＮＡＤＰＨオキシダーゼの産生量）が少ないことを示している。
【図８】精巣上体脂肪組織の連続切片を用いて、マクロファージをＦ４／８０で、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ｐ２２ｐｈｏｘ）を特異的抗体で染色した。図８から、マクロファージの位置と活性酸素種の位置（ＮＡＤＰＨオキシダーゼの位置）が同じ位置にあり、重なっていることが示された。
【図９】精巣上体脂肪組織を用いて、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βの発現量に対する鉄キレート剤の効果を検討した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群で、これらの炎症性サイトカインの発生が抑制されることを見出した。また、モノサイト・マクロファージを組織に呼び込む働きをしているＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）の発現が肥満と共に増加するが、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群では抑制されている。
【図１０】Ａでは、精巣上体脂肪細胞におけるフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔの発現（左図）とフェリチンＬ−ｓｕｂｕｎｉｔの発現（右図）を定量的なリアルタイクＰＣＲで評価した図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群の場合、フェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔ（左図）が有意に低下していた。Ｂの右図は、精巣上体脂肪細胞においてフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔの免疫組織化学的染色を行った図である。上段が非投与（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群であり、下段が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群である。Ｂに示されるように、明らかにＶｅｈｉｃｌｅ群がフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔの染色性が強い。
【図１１】Ｃは、連続切片でフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔとマクロファージの表面抗原Ｆ４／８０を染色した結果を表わした図である。フェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔとマクロファージの位置は、一致している。すなわち、フェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔは主に浸潤してきたマクロファージで増加している。
【図１２】鉄キレート剤（ＤＦＯ）の１０週間投与後における、脂肪細胞の抗酸化酵素の発現量変化の評価を行った図である。Ａに示されるように、ＧＰＸ−１，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）の各ｍＲＮＡの発現を定量的リアルタイムＰＣＲで評価した。その結果によると、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の１０週間投与により大きな変化は観察出来なかった。
【図１３】Ｂで示されるように、インスリンシグナルのＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナル経路について検討した。左図の下段は、Ａｋｔの活性化の評価結果を表わし、上段は検出されたバンドを示している。活性化されたＡｋｔを示すＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）が、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の１０週間投与により増加している。また、右図はＩＲＳ−１（インスリン・レセプター・サブストレート−１）のリン酸化（活性化）の評価結果を表わし、上段は検出されたバンドを示している。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりＩＲＳ−１が増加している。このことは、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により、インスリンシグナルが活性化され、インスリン抵抗性が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により改善することが示されている。
【図１４】骨格筋におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼの発現を、ｇｐ９１ｐｈｏｘ，ｐ６７ｐｈｏｘ，ｐ４７ｐｈｏｘ，ｐ２２ｐｈｏｘを用いて評価した図である。この結果、脂肪細胞の場合と同様に、ｐ２２ｐｈｏｘの発現が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により抑制される。
【図１５】肝臓におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼの発現を、ｇｐ９１ｐｈｏｘ，ｐ６７ｐｈｏｘ，ｐ４７ｐｈｏｘ，ｐ２２ｐｈｏｘを用いて評価した。その結果、骨格筋の場合とは異なり、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与による有意な変化は観察されなかった。
【図１６】骨格筋における抗酸化酵素（ＧＰＸ−１，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ）のｍＲＮＡ発現変化を評価した図である。この結果、骨格筋では、ＧＰＸ−１とＣｕＺｎ−ＳＯＤの発現が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により抑制されることが示された。
【図１７】肝臓における抗酸化酵素（ＧＰＸ−１，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ）のｍＲＮＡ発現変化を評価した図である。この結果、肝臓組織では、骨格筋とは異なり、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により有意な変化は観察されなかった。
【図１８】骨格筋におけるＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルに対する鉄キレート剤の効果を評価した図である。骨格筋では、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルの活性化が起こる。すなわち、骨格筋においては、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により、インスリンシグナルが活性化され、インスリン抵抗性が改善する。
【図１９】肝臓におけるＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルに対する鉄キレート剤の効果を評価した図である。肝臓では、骨格筋の場合と異なり、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルが変化することはなかった。
【図２０】左図は、２４時間絶食後のマウスに、グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を行い、血糖値の変化を表わした図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群では、非投与群と比較して、糖負荷後の高血糖の変化が改善している。また、右図は、血糖の曲線下面積を表わした図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群の方が血糖の曲線下面積が少なくなっている。
【図２１】左図は、４時間絶食のマウスに、インスリン負荷試験を行い、血糖値の変化を表わした図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群は、非投与群と比較して、インスリン負荷後の血糖値が明らかに低下しており、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりインスリン抵抗性が改善したことを示している。また、右図は、血糖の曲線下面積を表わした図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群の方が血糖の曲線下面積が少なくなっている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の「鉄キレート剤」とは、生体内の鉄イオンを吸着して除去することのできるキレート剤のことを言う。特に鉄キレート剤としては、公知のものを適宜使用することができる。例えば、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン、ポリフェノール類を挙げることができる。ポリフェノール類としては、公知のもので、鉄キレート作用のあるものであれば特に限定されるものではない。例えば、カテキン類、スダチチン、ノビレチンなどを挙げることができる。
好ましい鉄キレート剤としては、デフェロキサミン、デフェラシラクス、デフェリプロン、トランスフェリン、ラクトフェリン等を挙げることができる。
【００１７】
本発明の「細胞又は組織」とは、生活習慣病の初期において、マクロファージの浸潤を受けやすい細胞又は組織のことを言う。特に、脂肪細胞又は脂肪組織のことを挙げることができる。
本発明の「マクロファージの浸潤抑制」とは、マクロファージが組織等に浸潤する数を抑制することであり、結果として、炎症を抑制することになっている。
【００１８】
本発明の鉄キレート剤による脂肪細胞又は脂肪組織へのマクロファージの浸潤抑制剤は、脂肪細胞における慢性炎症を改善し、アディポネクチン産生増強・促進活性を促すと共に、アディポネクチン分泌不全に起因する動脈硬化症、糖尿病及びメタボリック・シンドロームの予防、治療に有用である。更には、本発明の鉄キレート剤による血管内皮細胞に対する酸化ストレスの軽減又は炎症抑制剤は、動脈の肥厚を抑制し、動脈硬化症の症状を改善することが出来る。そのため、生活習慣病に起因する動脈硬化症の治療に有用である。
そのため、本発明の鉄キレート剤は、医薬品、飲食品またはサプリメントとして、そのままであるいはこれらの製品に添加して使用できる。また、他の生活習慣病治療剤などと共に併用しても良い。
【００１９】
＜医薬品＞
本発明の鉄キレート剤は、そのまま、もしくはこれを公知の医薬用担体と共に製剤化することにより医薬品として使用できる。本発明の鉄キレート剤は、例えば、錠剤、顆粒剤、粉剤、シロップ剤などの経口剤、坐剤、外用剤などの非経口剤として製剤化できる。医薬用担体としては、特に制限はなく、例えば、固形担体（デンプン、乳糖、カルボキシメチルセルロースなど）、液体担体（蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール、プロピレングリコールなど）、油性担体（各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィンなど）が挙げられる。
【００２０】
製剤化に関しては、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （１９９５年），９版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡに具体的に記載されており、その記載は本発明の医薬品の製剤化のために利用することができる。
上記医薬品は、人及び人以外の動物用に使用できる。上記医薬の服用量は、それを使用する患者などの症状、性別、年齢に応じて適宜設定すればよいが、例えば、成人一人当たり一日に一回又は数回投与され、一回０．１〜１０００ｍｇ程度摂取できるよう服用すればよい。
【００２１】
＜飲食品、サプリメント＞
本発明の鉄キレート剤を飲食品に添加することにより、その飲食品に、鉄イオン軽減効果を付与することができる。添加されるべき飲食品は特に限定されないが、適宜、選択することができる。
また、本発明の鉄キレート剤をサプリメントとして使用するため、その他の食品素材を混合して、顆粒状・粉末状・錠剤状あるいはブロック状などに成形し、食品素材や健康食品などとしてもよい。その他の食品素材とは、例えば、糖類、食用タンパク質、アルコール、ビタミン、増粘多糖類、アミノ酸、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤などである。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２３】
[実施例１]２型糖尿病モデルマウスであるＫＫＡｙマウスにデフェロキサミン（ＤＦＯ）を投与し、脂肪細胞の変化を評価する試験
（１）試剤：
ＫＫＡｙ／Ｔａ  Ｊｅｌマウス（雄性）を日本ＣＬＥＡから購入。東洋酵母製の飼料（タイプＮＭＦ）を自由に摂取させる。８週令になったマウスを実験に使用する。
デフェロキサミン（ＤＦＯ）はカルビオケム社より購入。
使用する抗体は市販のものを使用。抗ホスホＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体、抗トータルＡｋｔ抗体は、セル  シグナリングテクノロジー社製を使用。抗フェリチン重鎖抗体、抗ｐ２２ｐｈｏｘ抗体、抗ＩＲＳ−１抗体はサンタ  クルス  バイオテクノロジー社製を使用。抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）抗体は、ミリポア社製を使用。抗ラットＦ４／８０抗体は、ＡｂＤ  セロテック社製を使用。ローデイング指標として用いた抗βアクチン抗体は、セル  シグナリングテクノロジー社製である。
【００２４】
（２）試験方法：
ａ）８週令の雄性ＫＫＡｙマウスを２群に分け、それぞれにＤＦＯを含有する溶液と、含有しない溶液を腹膜内に投与する。ＤＦＯの投与量は、１００ｍｇ／ｋｇ・ｄａｙで、投与期間は２週間である。
ｂ）血清フェリチン濃度の測定：
血清フェリチン濃度は、マウス  フェリチン  ＥＬＩＳＡキットを使用し、手順書（イムノロジー  コンサルタント  ラボ）に従い測定した。
ｃ）血中グルコースとインスリンの濃度、インスリン抵抗性指標（ＨＯＭＡ−ＩＲ）は、文献（Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５１：５１３−５１９，２０１０）に記載の方法に従って測定した。
（グルコース負荷試験）
２４時間絶食後のマウスに、２０%グルコース溶液を腹膜内に投与する（２．０ｇ／ｋｇ体重）。血液はマウスの尾静脈から、０、３０，６０，１２０，１８０分後に採取する。血中のグルコース濃度は、ロシュ社製ＡＣＣＵ−ＣＨＥＣＫ  Ａｖｉｖａを使用して測定した。
（インスリン負荷試験）
４時間絶食のマウスに、インスリン（Ｅ．リリー社製ヒューマリンＲ）を腹膜内に投与する（１．０Ｕ／ｋｇ体重）。血液はマウスの尾静脈から、０、３０，６０，１２０，１８０分後に採取する血中のインスリン濃度は、ロシュ社製ＡＣＣＵ−ＣＨＥＣＫ  Ａｖｉｖａを使用して測定した。
【００２５】
ｄ）血清インスリン濃度の測定：
血清インスリン濃度は、マウス  インスリン  ＥＬＩＳＡキットを使用し、手順書（森永バイオサイエンス研究所）に従い測定した。
ｅ）尿中の８−ＯＨｄＧの分泌量の測定：
尿中クレアチニンと尿中８−ＯＨｄＧの濃度が、１０週令のマウスで測定された。尿サンプルは２４時間分が集められた。尿中のクレアチニン濃度は、イムノアッセイ  キットを使用し、手順書（クレアチニンテスト和光）に従い測定した。尿中８−ＯＨｄＧの濃度は、酵素結合の免疫吸着アッセイ  キットを使用し、手順書（伏見製薬）に従い測定した。
ｆ）組織解析：
マウスを薬殺（ペンタバルビタール、腹膜内投与）し、精巣上体脂肪の白色脂肪細胞を採取し、４℃のパラホルムアルデヒド中に一夜浸漬して固定する。脱脂後、１０μｍの厚さの切片に切断し、ヘマトキシリン−エオジンで染色した。脂肪細胞のサイズは、それぞれのサンプルの５箇所の測定平均を取ったものである。
ｇ）精巣上体脂肪組織の全鉄イオン濃度の測定：
鉄濃度の測定方法は、先行文献（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ  Ｒｅｓ  ３３：７１３−７２１，２０１０）に記載されている。まず、脂肪細胞を５０℃１２時間乾燥させ、重量を秤量する。酸洗浄用容器に移し、０．５ｍｌの硝酸を加える。室温で１時間振揺させ、次いで６６℃で４時間振揺する。遠心分離を行った後、上清を用いて鉄の分析をおこなった。鉄の濃度は、組織重量で補正し、ｎｇ／ｇ組織として表記した。
【００２６】
ｈ）ｍＲＮＡの発現濃度の定量的測定：
精巣上体白色脂肪細胞から、ＲＮＡが採取され、先行文献（Ｍｏｌ  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０）に基いてｃＤＮＡが合成された。定量的リアルタイムＰＣＲを行い、プライマーとして次の表のものを使用した。
【００２７】
【表１】
2013035788.tif 000002
【００２８】
なお、ＣｕＺｎ−スーパーオキサイド  デイスムターゼ（ＳＯＤ）とカタラーゼのプライマーは、先行文献（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５８：９３４−９４５，２００９）に記載のものを使用した。
【００２９】
ｉ）ウェスタン・ブロット解析：
Ａｋｔの活性化をウェスタン・ブロット解析を用いて評価した。まず、試料からタンパクを抽出する。試料にＴ−ＰＥＲ試薬（ピアース  バイオテクノロジー社製）を用いて均一拡散する。同時に、タンパク分解酵素の阻害剤の混合物とホスファターゼ阻害剤を共存させ、先行文献（Ｍｏｌ  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０)に準じて行う。免疫反応し発色した箇所の濃度測定分析は、イメージＪ  ソフトウェアを使用して行なった。
ｊ）免疫沈降試験：
免疫沈降試験については、先行文献（Ｍｏｌ  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０)に記載している。免疫沈降したタンパクについて、ＩＳＲ-１に対するチロシン・リン酸化反応を確認するため、ウェスタン・ブロット分析をおこなった。
ｋ）免疫組織化学的染色：
パラフィンで固定した脂肪組織を切断し、パラフィンを除く。抗原を復活させた後、組織片を一次抗体と４℃終夜反応させる。抗体の分布は、ストレプト・アビジン−ビオチン複合体、ＤＡＢ基質（ＤＡＫＯジャパン社製）を使用して可視化した。
【００３０】
ｌ）系内のスーパーオキサイドの確認試験：
ＤＨＥ染色法については、先行文献（Ｍｏｌ  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌ２４：１３３８−１３４８，２０１０)に記載している。採取された脂肪組織をＯＣＴ化合物中で凍結させ、切断して、ガラス・スライドに設置する。切片を暗室内でＰＢＳ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）中、ジヒドロエチジュウムで処理し、保湿容器中で室温下３０分静置する。切片にカバーグラスを掛けて、脂肪組織を蛍光顕微鏡を用いて観察する。
ｍ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性の測定：
脂肪組織を溶解緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＧＴＡ，プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．４）で均一拡散させ、３秒間超音波を掛ける。ルシジェニン−誘導の化学蛍光アッセイが、脂肪組織均一溶液のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性を測定するために使用される。反応は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ溶液（０．１ｍＭ）を、試料（５０μｌ）、ルシジェニン（５μＭ）、リン酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＧＴＡ，プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．４）からなる分散溶液（２５０μｌの最終容量）に添加することによって開始される。蛍光計で、３分毎に１．８秒、蛍光を測定する。緩衝液のみの場合の蛍光の値を差し引きする。活性は、任意のｕｎｉｔｓ／ｍｇタンパクで表示する。
【００３１】
（３）測定結果：
鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与効果を以下に整理して示す。
イ）脂肪重量と脂肪サイズに対する効果：
鉄キレート剤を投与して、生体内の鉄を低下させた場合、図１のＡで示されるように、非投与群と対比して、精巣上体、後腹膜、腸管周囲の白色脂肪の重量が軽く、脂肪が少なくなっている。図１のＢで示されるように、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与の有無により、精巣上体の脂肪細胞のサイズが大きく異なっている。即ち、ヘマトキシエオジン染色による所見から、明らかに鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与したマウスの脂肪細胞のサイズが小さくなっている。
図２のＣには、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与の有無により得られる、脂肪細胞のサイズの平均値が示されている。平均値でも、鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与したマウスの方が、脂肪サイズが小さくなっている。一般に肥満が進行するとヒトでもマウスでも個々の脂肪のサイズが大きくなることが分かっている。図２のＤでは、脂肪細胞のサイズの分布を示している。このＤで明らかなように、鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与したマウスの方が、脂肪細胞のサイズの分布が小さくなる傾向にある。
【００３２】
ロ）脂肪細胞周囲に分布するマクロファージへの効果：
図３のＥの左図は、脂肪細胞周囲に分布するマクロファージを、マクロファージを認識するＦ４／８０抗体で染色して表わしている。コントロールに比べて、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与により生体内の鉄が低下したマウスの場合、脂肪細胞に浸潤するマクロファージの数が低下していた。
一般に、肥満患者の肥大した内臓細胞周囲には活性化したマクロファージが浸潤して各種サイトカインを分泌して脂肪細胞に炎症反応を起こし、脂肪細胞の性格を変えているのではないかと考えられている。このような状況が脂肪細胞での炎症性サイトカインや脂肪から分泌されるサイトカインの悪循環を作り上げていると考えられている。
図３のＥの右図は、脂肪細胞に浸潤するマクロファージの数の平均値を示したものであり、鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与したマウスでは、非投与マウスと対比して脂肪細胞に浸潤するマクロファージの数が有意に低下していることが示されている。
ハ）脂肪細胞に対する酸化ストレスの緩和効果：
図４のＡでは、生体の酸化ストレスの指標の１つである尿中８−ＯＨｄＧ排泄量に対する鉄キレート剤の効果を示している。鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与した群では、明らかに尿中８−ＯＨｄＧ排泄量が低下していることが示された。
前項イ）では、鉄キレート剤の投与により生体内の鉄量を低下させることにより、脂肪細胞周囲のマクロファージの数が減少したが、この事実が酸化ストレスマーカーである尿中８−ＯＨｄＧの排泄量にも反映している。即ち、鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与した群では、酸化ストレスが低下して、尿中８−ＯＨｄＧ排泄量が低下している。
図４のＢでは、精巣上体周囲の脂肪細胞におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼ（組織での活性酸素種生成の中心的酵素、多くの酸化ストレスが増加するときにこの酵素の活性化が起こる）は、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の投与により抑制された。このことは、鉄キレート剤（ＤＦＯ）を投与した群では、明らかに酸化ストレスが低下していることを示している。
【００３３】
ニ）活性酸素種の存在量への低減効果：
図５のＣの左図は、脂肪組織を蛍光色素のＤＨＥで染色し、活性酸素種の存在を確認した図である。一般に、肥満に伴い脂肪細胞でも活性酸素種が増加してＤＨＥの染色性が強くなる。本発明の鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群では、活性酸素種の生成が少なくなっているためにＤＨＥの染色性が弱くなっている。
図５のＣの右図の棒グラフは、左図の結果を定量化したものである。
ホ）ＮＡＤＰＨオキシダーゼの遺伝子発現に対する効果：
精巣上体脂肪細胞における、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのコンポーネント（ｇｐ９１ｐｈｏｘ，ｐ６７ｐｈｏｘ，ｐ４７ｐｈｏｘ）の発現を、リアルタイムＰＣＲで評価した。図６に示されるように、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与の有無で、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ遺伝子発現に対する効果に有意差は無かった。
一方、図７のＥで示されるように、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのコンポーネントの１つであるｐ２２ｐｈｏｘは、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群で低値を示した。Ｅの右図には、実際のバンドとβアクチンで補正した定量化した棒グラフを示した。
図７のＦでは、精巣上体脂肪細胞をｐ２２ｐｈｏｘ抗体で染色した。明らかに鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群で染色性が薄くなっており、ｐ２２ｐｈｏｘタンパク質の産生量（ＮＡＤＰＨオキシダーゼの産生量）が少ないことを示している。
ヘ）炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βの発現抑制効果：
精巣上体脂肪組織を用いて、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βの発現量に対する鉄キレート剤の効果を検討した。まず、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βのｍＲＮＡ量を評価したところ、図９のＨに示されるように、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群で、これらの炎症性サイトカインの発生が抑制されることを見出した。また、モノサイト・マクロファージを組織に呼び込む働きをしているＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）の発現が肥満と共に増加するが、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群では抑制されていることを見出した。
【００３４】
（４）その他の知見：
ａ）脂肪細胞におけるマクロファージの影響：
精巣上体脂肪組織を用いて、図８のＧで示されるようにマクロファージをＦ４／８０で染色し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ｐ２２ｐｈｏｘ）を特異抗体で染色した。すなわち、図８から、マクロファージの位置と活性酸素種の位置（ＮＡＤＰＨオキシダーゼの位置）が重なっていることが示された。
以上のことから、酸化ストレスの原因となる活性酸素種を産生するのは、脂肪組織に入り込んだマクロファージである可能性が強いと判断された。即ち、脂肪細胞の肥大化を防ぐためには、生体内の鉄を減少させて、脂肪細胞に浸潤するマクロファージの数を抑制し、活性酸素種の量を抑制することが重要であることが示された。
ｂ）脂肪細胞におけるフェリチン発現に対する鉄キレート剤の効果：
図１０のＡでは、精巣上体脂肪細胞におけるフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔの発現（左図）とフェリチンＬ−ｓｕｂｕｎｉｔの発現（右図）を定量的なリアルタイムＰＣＲで評価した。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群の場合、フェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔ（左図）が有意に低下していた。
また、図１０のＢは、精巣上体脂肪細胞においてフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔの免疫組織化学的染色を行った図である。上段が非投与（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群であり、下段が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群である。図１０のＢに示されるように、明らかにＶｅｈｉｃｌｅ群がフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔの染色性が強いことが示された。
図１１のＣは、連続切片でのフェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔとマクロファージの表面抗原Ｆ４／８０の染色結果を表わした図である。フェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔとマクロファージの位置を見ると、染色場所が一致している。すなわち、フェリチンＨ−ｓｕｂｕｎｉｔは主に浸潤してきたマクロファージで増加していることを示している。すなわち、鉄キレート剤で生体内の鉄を減少させると、マクロファージの細胞内鉄の含量が減少して遊走能やサイトカイン産生能が低下して臓器障害を抑制する可能性が考えられる。
【００３５】
ｃ）脂肪細胞における抗酸化酵素とインスリンシグナルの発現に対する効果：
鉄キレート剤（ＤＦＯ）の１０週間投与後における、脂肪細胞の抗酸化酵素の発現量変化の評価を行った。図１２のＡに示されるように、ＧＰＸ−１，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）の各ｍＲＮＡの発現を定量的リアルタイムＰＣＲで評価した。その結果では、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の１０週間投与により大きな変化は観察出来なかった。
図１３のＢで示されるように、インスリンシグナルのＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナル経路について検討した。左図の下段は、Ａｋｔの活性化の評価結果を表わし、上段は検出されたバンドを示している。活性化されたＡｋｔを示すＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）が、鉄キレート剤（ＤＦＯ）の１０週間投与により増加している。また、右図はＩＲＳ−１（インスリン・レセプター・サブストレート−１）のリン酸化（活性化）の評価結果を表わし、上段は検出されたバンドを示している。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりＩＲＳ−１が増加している。このことは、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により、インスリンシグナルが活性化され、インスリン抵抗性が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により改善することが示されている。
【００３６】
ｄ）骨格筋と肝臓での酸化ストレスに対する鉄キレート剤の効果：
ＫＫＡｙマウスの骨格筋と肝臓組織における、ＮＡＤＰＨオキシダーゼと抗酸化酵素、インスリンシグナルに対する鉄キレート剤の効果を明らかにした。
図１４のＡに示されるように、骨格筋におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼの発現を、ｇｐ９１ｐｈｏｘ，ｐ６７ｐｈｏｘ，ｐ４７ｐｈｏｘ，ｐ２２ｐｈｏｘを用いて評価した。その結果、脂肪細胞の場合と同様に、ｐ２２ｐｈｏｘの発現が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により抑制されることが示された。
図１５のＢでは、肝臓におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼの発現を、ｇｐ９１ｐｈｏｘ，ｐ６７ｐｈｏｘ，ｐ４７ｐｈｏｘ，ｐ２２ｐｈｏｘを用いて評価した。その結果、骨格筋の場合とは異なり、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与による有意な変化は観察されなかった。
図１６のＣでは、骨格筋における抗酸化酵素（ＧＰＸ−１，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ）のｍＲＮＡ発現変化を評価した。その結果、骨格筋では、ＧＰＸ−１とＣｕＺｎ−ＳＯＤの発現が鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により抑制されることが示された。
図１７のＤでは、肝臓における抗酸化酵素（ＧＰＸ−１，ＣｕＺｎ−ＳＯＤ、カタラーゼ）のｍＲＮＡ発現変化を評価した。その結果、肝臓組織では、骨格筋とは異なり、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により有意な変化は観察されなかった。
ｅ）骨格筋と肝臓でのインスリン抵抗性に対する鉄キレート剤の効果：
図１８のＥでは、骨格筋におけるＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルに対する鉄キレート剤の効果を評価した。骨格筋では、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルの活性化が起こる。すなわち、骨格筋においては、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与により、インスリンシグナルが活性化され、インスリン抵抗性が改善することが示されている。
図１９のＦでは、肝臓におけるＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルに対する鉄キレート剤の効果を評価した。肝臓では、骨格筋の場合と異なり、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりＡｋｔ−ＩＲＳ−１シグナルには影響がなかった。
【００３７】
ｆ）グルコール負荷試験とインスリン負荷試験における鉄キレート剤の改善効果：
（グルコール負荷試験）
２４時間絶食後のマウスに、２０%グルコース溶液を腹膜内に投与する（２．０ｇ／ｋｇ体重）。血液はマウスの尾静脈から、０、３０，６０，１２０，１８０分後に採取する。グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）中の血糖値の変化を表わしたものが図２０のＡの左図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群では、非投与群と比較して、糖負荷後の高血糖の変化が改善している。また、右図に示すように、血糖の曲線下面積でも鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群の方が少なくなっている。
（インスリン負荷試験）
４時間絶食のマウスに、インスリン（Ｅ．リリー社製ヒューマリンＲ）を腹膜内に投与する（１．０Ｕ／ｋｇ体重）。上記と同様に血液を採取し、血糖値の変化を表わしたものが図２１のＢの左図である。鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与群では、非投与群と比較して、インスリン負荷後の血糖値が明らかに低下しており、鉄キレート剤（ＤＦＯ）投与によりインスリン抵抗性が改善したことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の鉄キレート剤を含有するマクロファージの脂肪細胞への浸潤抑制剤は、鉄キレート剤の効果によって体内の鉄イオンの濃度をコントロールし、低下させ、その結果、マクロファージの脂肪細胞への浸潤を抑制することが出来、炎症反応を抑制することができる。これにより、肥満を原因とするインスリン抵抗性を改善することができる。更には、糖尿病に起因する動脈硬化を改善することができる。これらのことから、鉄キレート剤を用いた、新たな生活習慣病の予防剤及び／又は治療剤を提供することができるようになる。
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図９】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１８】
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【図１９】
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