(57)【要約】【課題】ＲＯＳ遺伝子に関係する融合および欠失においてＲＯＳキナーゼ活性の活性を緩和するように機能し得るＲＯＳの阻害薬を発見すること。【解決手段】本発明は、哺乳動物において異常な細胞増殖を治療するためのＲＯＳキナーゼ阻害薬の使用に関する。詳細には、本発明は、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって媒介されるがんを患っている哺乳動物を治療する方法を提供する。詳細には、本発明は、クリゾチニブの投与によって、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって媒介されるがんを患っている哺乳動物を治療する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって媒介されるがんを治療する方法であって、前記哺乳動物に、治療的有効量の３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳが遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子が、ＲＯＳ融合遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＯＳ融合遺伝子が、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子またはＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＯＳ融合遺伝子がＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳがＲＯＳ融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＯＳ融合タンパク質がＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＯＳ融合タンパク質がＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＯＳ融合タンパク質がＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記がんが、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記がんが神経膠芽細胞腫である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を、３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１１年８月２日出願の米国特許仮出願第６１／５１４，３８６号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、哺乳動物において異常な細胞増殖を治療するためのＲＯＳ阻害薬の使用に関する。詳細には、本発明は、がんを患っている哺乳動物を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトのがんには、世界中の先進国において総じて主な死亡原因の一つである多様な数々の疾患が含まれる（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００５．Ａｔｌａｎｔａ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ；２００５）。がんの進行は、遺伝子突然変異、染色体転座および核型異常を包含する複雑な一連の多数の遺伝子的および分子的事象に起因する（Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ  １００：５７〜７０（２０００））。ベースにあるがんの遺伝子的原因は、多様であり複雑であるが、それぞれのがん型が、その進行を容易にする共通の特色および獲得能力を示すことが観察されている。これらの獲得能力には、細胞増殖の調節異常、血管補充が持続的に可能なこと（即ち、血管形成）および腫瘍細胞が局所的に広がり、さらに二次的臓器部位へ転移することが可能なことが包含される（Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ（２０００））。したがって、１）がんの進行の間に変化する分子標的を阻害するか、または２）様々な腫瘍においてがんの進行に共通する多数のプロセスを標的とする新規な治療薬を同定することは、未だ可能でなく、非常に必要とされている。
【０００４】
ｖ−ｒｏｓ  ＵＲ２肉腫ウイルス発癌遺伝子相同体１（ＲＯＳ−１またはＲＯＳ）は、インスリン受容体サブファミリーに属し、細胞増殖および分化プロセスに関与している癌原遺伝子受容体チロシンキナーゼである（Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３：６５６８〜６５７２（１９８６））。ＲＯＳはヒトにおいては、様々な種々の組織の上皮細胞において発現される。ＲＯＳ発現および／または活性化の欠失が、神経膠芽細胞腫、さらに中枢神経系の腫瘍において見出されている（Ｃｈａｒｅｓｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓ．Ｃａｎ．３７（１）：５８〜７１（２００３））。神経膠芽細胞腫（Ｃｈａｒｅｓｔら（２００３）；Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：９２７０〜９２７４（１９８７））およびＮＳＣＬＣ（Ｒｉｍｋｕｎａｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ｅｐｕｂ、Ｊｕｎ  １．（２０１２））におけるＦＩＧ−ＲＯＳ欠失転座、ＮＳＣＬＣにおけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ転座（Ｒｉｋｏｖａら、Ｃｅｌｌ  １３１：１１９０〜１２０３（２００７））、ＮＳＣＬＣ（Ｒｉｋｏｖａら、（２００７））および胆管癌（Ｇｕら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（１）：ｅ１５６４０（２０１１））におけるＣＤ７４−ＲＯＳ転座ならびにマウスにおいて腫瘍成長を促進することが知られているＲＯＳの切断された活性型（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．６（９）：３１０９〜３１１５（１９８６））を包含する、ＲＯＳキナーゼの異常な融合タンパク質をもたらすＲＯＳに関係する遺伝子変化が記載されている。ＴＰＭ３−ＲＯＳ１、ＳＤＣ４−ＲＯＳ１、ＥＺＲ−ＲＯＳ１およびＬＲＩＧ３−ＲＯＳ１を包含する追加的な融合が、肺がん患者の腫瘍試料において報告されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１２））。
【０００５】
ナトリウム依存性ホスフェートトランスポーターアイソフォームＮａＰｉ−３ｂタンパク質（ＳＬＣ３４Ａ２）は、６９０アミノ酸ホスフェートトランスポータータンパク質であり、これは、ヒトの肺および小腸で発現され、ナトリウム依存性活性を有する。ＳＬＣ３４Ａ２発現および／または活性の欠失は、卵巣がんにおいて見出されている（Ｒａｎｇｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２（４６）：７２２５〜７２３２（２００３））。ＣＤ７４は、ＭＩＦ免疫サイトカインに対して高い親和性を有するＭＨＣクラスＩＩシャペロンタンパク質として機能する内在性膜タンパク質である（Ｌｅｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１４６７〜１４７６（２００３））。ＦＩＧ（Ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）は、ＰＳＤ−９５、Ｄｉｓｃ  Ｌａｒｇｅ、ＺＯ−１（ＰＤＺ）ドメイン、２つのコイルドコイル領域およびロイシンジッパーを包含する４５４アミノ酸タンパク質をコードする遺伝子である。ＦＩＧは、その第２のコイルドコイルドメインを介してＳＮＡＲＥタンパク質と相互作用することによって、ゴルジ体と末梢で関連していることが判明しており、したがって、Ｇｏｌｇｉ媒介小胞輸送において役割を果たしていると仮定されている（Ｃｈａｒｅｓｔら、（２００３））。
【０００６】
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ転座は、染色体（４ｐ１５）と染色体（６ｑ２２）との間で生じ、ナトリウム依存性ホスフェートトランスポーターアイソフォームＮａＰｉ−３ｂタンパク質（ＳＬＣ３４Ａ２）のＮ末端と、癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼＲＯＳ前駆体（ＲＯＳ）キナーゼの膜貫通およびキナーゼドメインとを組み合わせる２つの融合タンパク質変異体をもたらす（ＷＯ２００７／０８４６３１）。現在までに、それぞれ７２４アミノ酸（ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）；ロング型変異体）および６２１アミノ酸（ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）；ショート型変異体）であるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質の２つの変異体が同定されている（ＷＯ２００７／０８４６３１）。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ転座はまた、ＲＯＳ遺伝子とＳＬＣ３４Ａ２遺伝子との融合として記載することもでき、これは続いて、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合遺伝子によってコードされるタンパク質配列によって特徴付けられる異常なＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質をもたらす。
【０００７】
ＣＤ７４−ＲＯＳ転座は、染色体（５ｑ３２）と染色体（６ｑ２２）との間で生じ、ＣＤ７４のＮ末端と、癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼＲＯＳ前駆体（ＲＯＳ）キナーゼの膜貫通およびキナーゼドメインとを組み合わせる融合タンパク質をもたらす。その結果生じたＣＤ７４−ＲＯＳ融合タンパク質は、７０３アミノ酸タンパク質である（ＷＯ２００９／０５１８４６）。ＣＤ７４−ＲＯＳ転座はまた、ＲＯＳ遺伝子およびＣＤ７４遺伝子の融合として記載することもでき、これは続いて、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合遺伝子によってコードされるタンパク質配列によって特徴付けられる異常なＣＤ７４−ＲＯＳ融合タンパク質をもたらす。
【０００８】
ＦＩＧ−ＲＯＳ欠失転座は、染色体（６ｑ２１）での２４０キロベースの染色体内ホモ接合性欠失によって生じ、構成的活性化チロシンキナーゼをもたらす（Ｃｈａｒｅｓｔら、（２００３））。それぞれ８７８アミノ酸（ＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｌ）；ロング型変異体）および６３０アミノ酸（ＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｓ）；ショート型変異体）であるＦＩＧ−ＲＯＳ融合タンパク質の変異体が報告されている（Ｇｕら、（２０１１）；米国特許出願公開第２０１１／０２８７４４５号）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許仮出願第６１／５１４，３８６号
【特許文献２】ＷＯ２００７／０８４６３１
【特許文献３】ＷＯ２００９／０５１８４６
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１１／０２８７４４５号
【特許文献５】米国特許第４，７２７，０２２号
【特許文献６】米国特許第４，６５９，６７８号
【特許文献７】米国特許第４，３７６，１１０号
【特許文献８】米国特許出願公開第２０１０／０２２１７３７号
【特許文献９】米国特許第７，４６８，２５２号
【特許文献１０】米国特許第７２３００９８号
【特許文献１１】米国特許第７，８５８，６４３号
【特許文献１２】ＷＯ２００６／０２１８８１
【特許文献１３】国際特許公開ＷＯ２００６／０２１８８４
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００６／００４６９９１号
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００６／０１２８７２４号
【特許文献１６】米国特許第６，１０６，８６４号
【特許文献１７】ＷＯ００／３５２９８
【特許文献１８】ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１１１７２
【特許文献１９】ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２５１８
【特許文献２０】ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５５１４８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２００５．Ａｔｌａｎｔａ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ；２００５
【非特許文献２】Ｈａｎａｈａｎら、Ｃｅｌｌ  １００：５７〜７０（２０００）
【非特許文献３】Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８３：６５６８〜６５７２（１９８６）
【非特許文献４】Ｃｈａｒｅｓｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓ．Ｃａｎ．３７（１）：５８〜７１（２００３）
【非特許文献５】Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：９２７０〜９２７４（１９８７）
【非特許文献６】Ｒｉｍｋｕｎａｓら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ｅｐｕｂ、Ｊｕｎ  １．（２０１２）
【非特許文献７】Ｒｉｋｏｖａら、Ｃｅｌｌ  １３１：１１９０〜１２０３（２００７）
【非特許文献８】Ｇｕら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（１）：ｅ１５６４０（２０１１）
【非特許文献９】Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．  ６（９）：３１０９〜３１１５（１９８６）
【非特許文献１０】Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１２）
【非特許文献１１】Ｒａｎｇｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２（４６）：７２２５〜７２３２（２００３）
【非特許文献１２】Ｌｅｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７：１４６７〜１４７６（２００３）
【非特許文献１３】ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈによる「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ」（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００２）
【非特許文献１４】ＨａｌｅｂｌｉａｎによるＪ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、６４（８）、１２６９〜１２８８（１９７５年８月）
【非特許文献１５】Ｋ．Ｂａｒｏｖｓｋｙ、Ｎａｎｏｔｅｃｈ．  Ｌａｗ  ＆  Ｂｕｓ．１（２）：Ａｒｔｉｃｌｅ  １４（２００４）
【非特許文献１６】Ｅ．Ｍａｇｇｉｏ、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（１９８０）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）
【非特許文献１７】Ｃｈｏｗら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）４６：７２〜７８（２００１）
【非特許文献１８】ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ  Ｅｄｓ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）
【非特許文献１９】Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＳ．Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）  ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第２版；ＲＯＹＡＬ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ３７、ＢｉｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
【非特許文献２０】ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）
【非特許文献２１】Ｍｅｌｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５９：２３５〜２４４（１９９３）
【非特許文献２２】Ｄｕｐｌａａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９〜２３６（１９９３）
【非特許文献２３】Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．７：１２７〜１３４（１９９３）
【非特許文献２４】Ｔｒａｓｋ，Ｂ．Ｊ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：１４９〜１５４（１９９１）
【非特許文献２５】Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）
【非特許文献２６】１９９４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１〜）
【非特許文献２７】ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４、１９９３６〜１９９４１（２００７）
【非特許文献２８】ＬｉａｎｇおよびＣｈｅｎによるＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ、１１（６）、９８１〜９８６（２００１）
【非特許文献２９】Ｈ．ＬｉｅｂｅｒｍａｎおよびＬ．Ｌａｃｈｍａｎによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ」、Ｖｏｌ．１、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ、Ｎ．Ｙ、１９８０（ＩＳＢＮ  ０−８２４７−６９１８−Ｘ）
【非特許文献３０】Ｖｅｒｍａらによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｎ−ｌｉｎｅ」、２５（２）、１〜１４（２００１）
【非特許文献３１】ＦｉｎｎｉｎおよびＭｏｒｇａｎによるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、８８（１０）、９５５〜９５８（１９９９年１０月）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＲＯＳ遺伝子に関係する融合および欠失は、ヒトがんの病因に関与しているので、そのような融合および欠失においてＲＯＳキナーゼ活性の活性を緩和するように機能し得るＲＯＳの阻害薬を発見することが、がんの治療において未だ達成されておらず非常に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様では、本発明は、そのような治療を必要とするヒトにおいて、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって媒介されるがんを治療する方法を提供し、この方法は、前記ヒトに、治療的有効量の式１のＲＯＳキナーゼ阻害薬または薬学的に許容できるその塩を投与するステップを含む：
【００１３】
【化１】
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式１の化合物は本明細書において、その一般名であるクリゾチニブによって、またはその化学名である３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンによって様々に称され得る。
【００１４】
本発明のこの態様の一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、ＲＯＳの融合遺伝子である。この態様の他の実施形態では、ＲＯＳの融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子またはＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子である。この態様の他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失である。この態様の他の実施形態では、遺伝子欠失は、ＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子である。この態様の他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼである。この態様の他の実施形態では、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳ融合である。この態様の他の実施形態では、ＲＯＳ融合は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼまたはＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼである。この態様の他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質である。この態様の他の実施形態では、欠失タンパク質は、ＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼである。
【００１５】
この態様の他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。この態様の他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。この態様の他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。この態様の他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。この態様の他の実施形態では、式１の化合物を、式１の化合物と少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００１６】
他の態様では、本発明は、ＲＯＳキナーゼによって媒介される異常な細胞増殖を有する哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与するステップを含む方法を提供する。本発明のこの態様の一実施形態では、異常な細胞増殖は、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合遺伝子によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。この態様のうちの一部のそのような実施形態では、方法は、ＲＯＳキナーゼによって媒介される異常な細胞増殖を有する前記哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与し、それによって、前記の異常な細胞増殖を治療するステップを含む。
【００１７】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。
【００１８】
本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００１９】
【化２】
2013032355.tif 000004
【００２０】
本発明のこの態様の他の実施形態では、異常な細胞増殖はがんである。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００２１】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。本発明の前述の各態様のさらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００２２】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００２３】
他の態様では、本発明は、ＲＯＳキナーゼによって媒介されるがんを有する哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与するステップを含む方法を提供する。本発明のこの態様の一実施形態では、がんは、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼの融合遺伝子によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。この態様のうちの一部のそのような実施形態では、方法は、ＲＯＳキナーゼによって媒介されるがんを有する前記哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与し、それによって、前記がんを治療するステップを含む。
【００２４】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００２５】
【化３】
2013032355.tif 000005
【００２６】
他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００２７】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００２８】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００２９】
他の態様では、本発明は、少なくとも１種のＲＯＳキナーゼによって媒介されるがんを、そのような治療を必要とする哺乳動物において、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与することによって治療するステップを含む方法を提供する。本発明のこの態様の一実施形態では、がんは、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼの融合遺伝子によって媒介される。他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。
【００３０】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００３１】
【化４】
2013032355.tif 000006
【００３２】
他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００３３】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００３４】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００３５】
他の態様では、本発明は、異常な細胞増殖を、そのような治療を必要とする哺乳動物において治療する方法を提供し、この方法は、前記哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与するステップを含む。本発明のこの態様の一実施形態では、異常な細胞増殖は、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合遺伝子によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。
【００３６】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００３７】
【化５】
2013032355.tif 000007
【００３８】
本発明のこの態様の他の実施形態では、異常な細胞増殖はがんである。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００３９】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。本発明の前述の各態様のさらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００４０】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００４１】
本発明の前述の各態様の一実施形態では、哺乳動物はヒトである。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、哺乳動物はイヌである。
【００４２】
他の態様では、本発明は、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼについて陽性であることが判明しているがんを、そのような治療を必要とする哺乳動物において治療する方法を提供し、この方法は、前記哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与するステップを含む。本発明のこの態様の一実施形態では、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳの融合遺伝子である。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失である。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質である。他の実施形態では、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質である。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。
【００４３】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００４４】
【化６】
2013032355.tif 000008
【００４５】
他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００４６】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００４７】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００４８】
他の態様では、本発明は、ＲＯＳ陽性がんを治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与するステップを含む。本発明のこの態様の一実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、ＲＯＳの融合遺伝子によって媒介される。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼの欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。
【００４９】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００５０】
【化７】
2013032355.tif 000009
【００５１】
他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００５２】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは神経膠芽細胞腫である。
【００５３】
この態様の一部の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００５４】
他の態様では、本発明は、ＲＯＳキナーゼによって媒介される異常な細胞増殖を有する哺乳動物に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与するステップを含む方法を提供する。本発明のこの態様の一実施形態では、異常な細胞増殖は、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合遺伝子によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、異常な細胞増殖は、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。
【００５５】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である： 
【００５６】
【化８】
2013032355.tif 000010
【００５７】
本発明のこの態様の他の実施形態では、異常な細胞増殖はがんである。他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００５８】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。さらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００５９】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００６０】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００６１】
他の態様では、本発明は、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を、ＲＯＳ陽性であることが分かっている患者に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、患者は、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介されるがんを有する。他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼの融合遺伝子によって媒介される。他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。
【００６２】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００６３】
【化９】
2013032355.tif 000011
【００６４】
他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００６５】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。本発明の前述の各態様のさらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００６６】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００６７】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００６８】
他の態様では、本発明は、
ｉ．少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼについて陽性であることが判明しているがんを有する患者を同定するステップと；
ｉｉ．前記患者に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与するステップとを含む方法を提供する。
【００６９】
本発明のこの態様の一実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳの融合遺伝子である。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失である。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質である。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。この態様のうちの一部のそのような実施形態では、方法は、（ｉ）少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼについて陽性であることが判明しているがんを有する患者を同定するステップと；（ｉｉ）前記患者に、治療的有効量のＲＯＳキナーゼ阻害薬を投与し、それによって前記がんを治療するステップとを含む。この態様の一部の実施形態では、前記治療は、がんの進行の逆転または阻害をもたらす。
【００７０】
この態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である： 
【００７１】
【化１０】
2013032355.tif 000012
【００７２】
本発明のこの態様の他の実施形態では、異常な細胞増殖はがんである。本発明の前述の各態様の他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００７３】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。本発明の前述の各態様のさらに他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００７４】
本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。この態様の他の実施形態では、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００７５】
一態様では、本発明は、そのような治療を必要とするヒトにおいて、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって媒介されるがんを治療するのに有用な医薬品を調製するためのＲＯＳキナーゼ阻害薬の使用を提供し、その使用は、前記哺乳動物に、治療的有効量の式１のＲＯＳキナーゼ阻害薬または薬学的に許容できるその塩を投与するステップを含む。
【００７６】
【化１１】
2013032355.tif 000013
本発明のこの態様の一実施形態では、がんは、ＲＯＳの融合遺伝子によって媒介される。この態様の他の実施形態では、ＲＯＳの融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子またはＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子である。この態様の他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失によって媒介される。この態様の他の実施形態では、遺伝子欠失は、ＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子である。この態様の他の実施形態では、がんは、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。この態様の他の実施形態では、遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳ融合である。この態様の他の実施形態では、ＲＯＳ融合は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼまたはＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼである。この態様の他の実施形態では、がんは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質によって媒介される。この態様の他の実施形態では、欠失タンパク質は、ＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼである。
【００７７】
この態様の他の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。この態様の他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。この態様の他の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。この態様の他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。この態様の他の実施形態では、式１の化合物を、式１の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００７８】
他の態様では、本発明は、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介されるがんを治療する際に有用な医薬品を調製するためのＲＯＳキナーゼ阻害薬の使用を提供する。一実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００７９】
【化１２】
2013032355.tif 000014
本発明のこの態様の一実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳの融合遺伝子である。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失である。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質である。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは神経膠芽細胞腫である。
【００８０】
他の態様では、本発明は、ＲＯＳ陽性がんを治療する際に有用な医薬品を調製するためのＲＯＳキナーゼ阻害薬の使用を提供する。一実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼの低分子阻害薬である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、アミノ−ピリジン化合物またはアミノ−ピラジン化合物である。他の実施形態では、ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩である：
【００８１】
【化１３】
2013032355.tif 000015
本発明のこの態様の一実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳの融合遺伝子である。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失である。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質である。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは神経膠芽細胞腫である。
【００８２】
他の態様では、本発明は、ＲＯＳキナーゼ阻害薬の医薬組成物と、前記医薬組成物をＲＯＳ陽性がんを有する患者に投与するための説明書セットとを含むキットを提供する。本発明のこの態様の一実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは神経膠芽細胞腫である。
【００８３】
他の態様では、本発明は、ＲＯＳキナーゼ阻害薬の医薬組成物と、前記医薬組成物をＲＯＳ陽性がんを有する患者に投与するための説明書セットとを含むキットを提供する。一実施形態では、前記ＲＯＳ陽性がんは、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳの融合遺伝子である。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失である。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質である。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、欠失タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳである。本発明のこの態様の一実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは神経膠芽細胞腫である。
【００８４】
他の態様では、本発明は、クリゾチニブの医薬組成物と、前記医薬組成物をＲＯＳ陽性がんを有する患者に投与するための説明書セットとを含むキットを提供する。一実施形態では、前記ＲＯＳ陽性がんは、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳキナーゼによって媒介される。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳの融合遺伝子である。他の実施形態では、融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する遺伝子欠失である。他の実施形態では、遺伝子欠失はＦＩＧ−ＲＯＳである。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼの融合タンパク質である。他の実施形態では、前記遺伝子変化ＲＯＳキナーゼは、ＲＯＳキナーゼに関係する欠失タンパク質である。他の実施形態では、融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳまたはＣＤ７４−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳである。他の実施形態では、融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳである。本発明のこの態様の一実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。本発明のこの態様のさらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。さらに他の実施形態では、ＲＯＳ陽性がんは神経膠芽細胞腫である。
【００８５】
さらに他の態様では、本発明は、式１の化合物または薬学的に許容できるその塩を投与することによって、細胞におけるＲＯＳキナーゼ活性を阻害する方法を提供する：
【００８６】
【化１４】
2013032355.tif 000016
【００８７】
他の態様では、本発明は、哺乳動物において、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって媒介されるがんを治療する方法を提供し、この方法は、前記哺乳動物に、治療的有効量の３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を投与するステップを含む。一部のそのような実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子または遺伝子変化ＲＯＳタンパク質である。
【００８８】
この態様の一部の実施形態では、前記治療は、がんの進行の逆転または阻害をもたらす。この態様の多くの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００８９】
この態様の多くの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、ＲＯＳ融合遺伝子などの遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子である。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子またはＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子である。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子である。
【００９０】
この態様の多くの実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、ＲＯＳ融合タンパク質などの遺伝子変化ＲＯＳタンパク質である。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼまたはＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼである。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼである。
【００９１】
この態様の一部の実施形態では、本発明は、哺乳動物において、ＲＯＳ融合遺伝子によって媒介されるがんの進行を逆転または阻害する方法を提供し、この方法は、前記哺乳動物に、治療的有効量の３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を投与するステップを包含する。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子である。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子である。さらに他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子である。ある種の実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子、ＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子およびＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子からなる群から選択される。
【００９２】
この態様の他の実施形態では、本発明は、哺乳動物において、ＲＯＳ融合タンパク質によって媒介されるがんの進行を逆転または阻害する方法を提供し、この方法は、前記哺乳動物に、治療的有効量の３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を投与するステップを含む。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼである。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼである。さらに他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼである。ある種の実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼ、ＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼおよびＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼからなる群から選択される。
【００９３】
この態様の一部の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【００９４】
この態様の他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。この態様の一部の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。この態様の他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【００９５】
この態様の多くの実施形態では、３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を、３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【００９６】
この態様の一部の実施形態では、方法はさらに、前記投与ステップの前に、遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子または遺伝子変化ＲＯＳタンパク質などの少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって特徴付けられるがんを有する哺乳動物を同定するステップを含む。一部のそのような実施形態では、がんは、遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドおよび／または遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドを有すると特徴付けられる。
【００９７】
さらに他の態様では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳによって特徴付けられるがんを有する哺乳動物を同定するステップと；（ｉｉ）前記哺乳動物に、治療的有効量の３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を投与するステップとを含む、哺乳動物においてがんを治療する方法を提供する。一部のそのような実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子または遺伝子変化ＲＯＳタンパク質である。
【００９８】
この態様の一部の実施形態では、前記治療は、がんの進行の逆転または阻害をもたらす。この態様の多くの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００９９】
この態様の一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子、例えば、ＲＯＳ融合遺伝子である。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子またはＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子である。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子である。
【０１００】
この態様の一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子変化ＲＯＳは、遺伝子変化ＲＯＳタンパク質、例えば、ＲＯＳ融合タンパク質である。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼまたはＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼである。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼである。
【０１０１】
この態様の一部の実施形態では、本発明は、哺乳動物においてがんの進行を逆転または阻害する方法を提供し、この方法は、（ｉ）少なくとも１つのＲＯＳ融合遺伝子によって特徴付けられるがんを有する哺乳動物を同定するステップと；（ｉｉ）前記哺乳動物に、治療的有効量の３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を投与するステップとを含む。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子である。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子である。さらに他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子はＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子である。ある種の実施形態では、ＲＯＳ融合遺伝子は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子、ＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子およびＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子からなる群から選択される。
【０１０２】
この態様の一部の実施形態では、本発明は、哺乳動物においてがんの進行を逆転または阻害する方法を提供し、この方法は、（ｉ）少なくとも１つのＲＯＳ融合タンパク質によって特徴付けられるがんを有する哺乳動物を同定するステップと；（ｉｉ）前記哺乳動物に、治療的有効量の３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を投与するステップとを含む。一部のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼである。他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼである。さらに他のそのような実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質はＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼである。ある種の実施形態では、ＲＯＳ融合タンパク質は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳキナーゼ、ＣＤ７４−ＲＯＳキナーゼおよびＦＩＧ−ＲＯＳキナーゼからなる群から選択される。
【０１０３】
この態様の一部の実施形態では、がんは、遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドおよび／または遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドを有すると特徴付けられる。
【０１０４】
この態様の一部の実施形態では、がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頚部のがん、皮膚または眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、ファロピウス管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺腫およびこれらの組み合わせから選択される。
【０１０５】
この態様の他の実施形態では、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽細胞腫、扁平上皮細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、乳頭状腎細胞癌、結腸直腸腺癌、神経芽細胞腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）および胃がんからなる群から選択される。この態様の一部の実施形態では、がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。この態様の他の実施形態では、がんは神経膠芽細胞腫である。
【０１０６】
この態様の多くの実施形態では、３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩を、３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンまたは薬学的に許容できるその塩と、少なくとも１種の薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物として投与する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】クリゾチニブによるＵ１３８ＭＧ細胞およびＨＣＣ７８細胞におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳリン酸化の濃度依存的阻害を示すグラフである。
【図２】クリゾチニブによるＨＣＣ７８細胞生存力の濃度依存的阻害を示すグラフである。
【図３】ＨＣＣ７８ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるクリゾチニブによるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳリン酸化およびＲＯＳ媒介シグナル伝達の濃度依存的阻害を示すグラフである。
【図４】ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合を内包するＨＣＣ７８ヒトＮＳＣＬＣ細胞における切断Ｃａｓｐａｓｅ３レベルのクリゾチニブによる用量依存的上昇を示す図である。
【図５】ヌードマウスにおけるヒトＣＤ７４−ＲＯＳ、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）、ＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｌ）およびＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｓ）を内包するＲＯＳ融合操作３Ｔ３−ＲＯＳ腫瘍モデルのパネルでのクリゾチニブの細胞減少性効果を示すグラフである。
【図６】ヌードマウスにおける３Ｔ３−ＣＤ７４−ＲＯＳ異種移植片モデルでのＲＯＳリン酸化（Ａ）および腫瘍増殖（Ｂ）のクリゾチニブによる用量依存的阻害を示す図である。
【図７】ヌードマウスにおける３Ｔ３−ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）異種移植片モデルでのクリゾチニブによる腫瘍増殖の用量依存的阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
別段に示されていない限り、本発明の化合物に関する本明細書中の全ての言及には、多形、立体異性体および同位体標識されたそのバージョンを包含するその塩、溶媒和物、水和物および複合体ならびにその塩の溶媒和物、水和物および複合体に対する言及が包含される。
【０１０９】
定義
別段に定義されていない限り、本明細書で使用される技術および化学用語は全て、本発明が属する分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の任意の方法および物質を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が、本明細書では記載されている。実施形態の記載および本発明の請求において、ある種の専門用語を、下記の定義に従って使用する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で別段に明示されていない限り、複数の言及を包含する。したがって、例えば、「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ」という言及には、本明細書に記載されていて、かつ／または本開示を読めば当業者には明らかになる種類の１種または複数の方法および／またはステップが包含される。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、別段に示されていない限り、「異常な細胞増殖」という用語は、正常な調節機構から独立（例えば接触阻害を喪失）した細胞増殖を指す。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、別段に示されていない限り、「投与すること」という用語は、患者が自分自身の努力によって、本明細書に記載されている治療薬を摂取する自己投与の行為、患者が他者（例えば、医師、看護士、家族またはＩＶ）の努力を介して本明細書に記載されている治療薬を摂取する投与行為を指す。投与はまた、本明細書に記載されている治療薬を処方する動作を包含する。「投与」という用語は、本明細書で使用される場合、別段に示されていない限り、「投与」が直前で定義されているとおり、治療行為を指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、Ｆａｂまたはその抗原認識断片を包含し、キメラ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を包含するＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを包含する全ての種類の免疫グロブリンを指す。「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト抗体により緊密に似せるために、アミノ酸が非抗原結合領域において置き換えられているが、元の結合性はまだ残している抗体分子を指す。
【０１１４】
「生体試料」という用語は本明細書では、その最も広範な意味で使用されており、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合、ＦＩＧ−ＲＯＳ融合または切断されたＲＯＳポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその断片を含有すると考えられる任意の生体試料を意味し、細胞、細胞から単離された染色体（例えば、中期染色体のスプレッド）、ゲノムＤＮＡ（溶液中、またはサザン分析などのために固体支持体に結合）、ＲＮＡ（溶液中、またはノーザン分析などのために固体支持体に結合）、ｃＤＮＡ（溶液中、または固体支持体に結合）、細胞からの抽出物、血液、尿、骨髄または組織などを含んでよい。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「欠失遺伝子」という用語は、ゲノム内の同じ染色体上の異なる位置からの２つの遺伝子が、２つの遺伝子の間にあるヌクレオチドの欠失を介して融合する遺伝子事象（「遺伝子欠失」とも称される）から生じている遺伝子を指す。欠失遺伝子には、これらに限られないが、上記のＦＩＧ−ＲＯＳ遺伝子が包含される。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「融合遺伝子」という用語は、ゲノム内の異なる位置からの２つの遺伝子が、融合、転座または転化して、新たな遺伝子を作る遺伝子事象から生じている遺伝子を指す。融合遺伝子の具体的な例には、これらに限られないが、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ遺伝子を形成するＳＬＣ３４Ａ２遺伝子とＲＯＳ遺伝子との融合およびＣＤ７４−ＲＯＳ遺伝子を形成するＣＤ７４遺伝子とＲＯＳ遺伝子との融合が包含される。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子変化ＲＯＳ」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドかどうかに関わらず、本明細書に記載のＲＯＳ融合または欠失のいずれかを指す。「遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチド」という用語は、本明細書に記載の遺伝子変化ＲＯＳタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドを指す。「遺伝子変化ＲＯＳタンパク質」という用語は、本明細書に記載の融合、欠失、トランケーションまたは突然変異のいずれかを指す。「遺伝子変化ＲＯＳタンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、「遺伝子変化ＲＯＳポリペプチド」と互換的に使用される。好ましい遺伝子変化ＲＯＳタンパク質には、「ＲＯＳ融合」が包含される。好ましいＲＯＳ融合には、これらに限られないが、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質およびＣＤ７４−ＲＯＳ融合タンパク質が包含される。好ましい遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドには、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチドおよびＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドが包含される。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳキナーゼ」は、ＲＯＳタンパク質のキナーゼ部分を含有する本明細書に記載されている任意のタンパク質を指す。ＲＯＳキナーゼには、これらに限られないが、本明細書に記載の遺伝子変化ＲＯＳタンパク質および野生型ＲＯＳタンパク質が包含される。「遺伝子変化ＲＯＳキナーゼ」という用語は、遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質またはポリペプチドを指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳポリペプチド特異的試薬」という用語は、抗体、ＡＱＵＡペプチド、核酸プローブ、核酸プライマーなど、本明細書に記載されているＲＯＳキナーゼのいずれかに特異的な任意の試薬を指す。例えば、好ましい「ＲＯＳポリペプチド特異的試薬」は、本明細書に記載の遺伝子変化ＲＯＳキナーゼのいずれかに特異的な抗体である。より好ましくは、本明細書で使用される場合、「ＲＯＳポリペプチド特異的試薬」は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチドおよび／またはＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドおよび／またはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチドに特異的な抗体である。「ＲＯＳポリペプチド特異的試薬」が抗体である場合、試薬は、「ＲＯＳポリペプチド特異的抗体」として本明細書では称され得る。そのようなＲＯＳポリペプチド特異的抗体は例えば、「ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド抗体」、「ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質抗体」または「ＦＩＧ−ＲＯＳ融合タンパク質抗体」である。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、別段に示されていない限り、「治療すること」という用語は、そのような用語が適用されている障害もしくは状態またはそのような障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の進行の逆転、緩和、阻害を意味する。「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、別段に示されていない限り、「治療すること」が直前で定義されているとおり、治療行為を指す。「治療」という用語には、上記のとおりの「投与すること」または「投与」が包含される。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる塩」という用語には、酸付加塩および塩基塩（二塩を包含）が包含される。
【０１２２】
適切な酸付加塩は、非毒性の塩を形成する酸から形成される。例には、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプ酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびトリフルオロ酢酸が包含される。
【０１２３】
適切な塩基塩は、非毒性の塩を形成する塩基から形成される。例には、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リシン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛塩が包含される。
【０１２４】
適切な薬学的に許容できる塩についての総説に関しては、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈによる「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ」（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００２）を参照されたい。
【０１２５】
本発明の化合物の薬学的に許容できる塩は、化合物の溶液および所望の酸または塩基を適切に一緒に混合することによって容易に調製することができる。塩を溶液から沈殿させ、濾過によって集めるか、または溶媒を蒸発させることによって回収することができる。塩の電離度は、完全なイオン化からほぼ非イオン化まで変動し得る。
【０１２６】
本発明の化合物は、非溶媒和および溶媒和形態の両方で存在し得る。「溶媒和物」という用語は本明細書では、本発明の化合物および１個または複数の薬学的に許容できる溶媒分子、例えば、エタノールを含む分子複合体を記載するために使用されている。「水和物」という用語は、溶媒が水である場合に使用されている。本発明による薬学的に許容できる溶媒和物には、結晶化の溶媒が同位体置換されている水和物および溶媒和物が包含される（例えば、Ｄ２Ｏ、ｄ６−アセトン、ｄ６−ＤＭＳＯ）。
【０１２７】
本発明はまた、式１の化合物と同一であるが、但し、１個または複数の原子が、自然に通常は存在する原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子に置き換えられている、同位体標識されている化合物を包含する。本発明の化合物に導入することができる同位体の例には、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌなどの水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体が包含される。前記の同位体および／または他の原子の他の同位体を含有する本発明の化合物および前記化合物の薬学的に許容できる塩も、本発明の範囲内である。本発明のある種の同位体標識された化合物、例えば、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が導入されたものは、薬物および／または基質組織分布アッセイで有用である。トリチウム、即ち、３Ｈおよび炭素−１４、即ち１４Ｃ同位体が、その調製の容易さおよび検出性により特に好ましい。さらに、ジュウテリウム、即ち２Ｈなどの重い同位体での置換は、より大きな代謝安定性、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の上昇または投薬量要求の減少から生じるある種の治療上の利点をもたらすことができ、したがって、場合によっては好ましいことがある。非同位体標識試薬を容易に利用可能な同位体標識試薬に代えて、非標識化合物のために記載された手順を実施することによって、同位体標識された本発明の式１の化合物を一般に調製することができる。
【０１２８】
包接化合物、薬物−ホスト包接複合体などの複合体も、本発明の範囲内に包含され、ここで、上記の溶媒和物とは対照的に、薬物およびホストは、化学量論的量または非化学量論的量で存在する。また、化学量論的量または非化学量論的量であってよい２種以上の有機および／または無機成分を含有する薬物の複合体も包含される。生じる複合体は、電離しているか、部分的に電離しているか、非電離であってよい。このような複合体の総説に関しては、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるＨａｌｅｂｌｉａｎによるＪ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ、６４（８）、１２６９〜１２８８（１９７５年８月）を参照されたい。
【０１２９】
診断検査
本発明に関連して、生体試料に遺伝子変化ＲＯＳが存在するか、または存在しないかを決定するための診断検査として、当業者に知られているいくつかのアッセイフォーマットを使用することができる。診断検査が、生体試料が遺伝子変化ＲＯＳを含有することを示す検査結果を返してきた場合に、その生体試料を得た患者をＲＯＳ陽性とみなす。同様に、診断検査が、生体試料ががん腫瘍生検である場合に、生体試料が遺伝子変化ＲＯＳを含有することを示す試験結果を返してきた場合、そのがんをＲＯＳ陽性がんとみなす。詳細には、生体試料ががん細胞を含む場合、そのがんは、当業者に知られているか、または本明細書に記載されている技術を使用して遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの存在を検出することによって、ＲＯＳ融合遺伝子またはＲＯＳ融合タンパク質などの遺伝子変化ＲＯＳ遺伝子または遺伝子変化ＲＯＳタンパク質を含有すると特徴付けられ得る。
【０１３０】
イムノアッセイ
本発明の方法を実施する際に有用なイムノアッセイは、ホモジニアスイムノアッセイまたはヘテロジニアスイムノアッセイであってよい。ホモジニアスアッセイでは、免疫反応は通常、変異型ＲＯＳポリペプチド特異的試薬（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド特異的抗体、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチド特異的抗体またはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチド特異的抗体）、標識された分析物および該当する生体試料を必要とする。標識から生じるシグナルは、抗体が標識された分析物に結合すると、直接か、または間接的に変化する。免疫反応およびその規模の検出の両方を、ホモジニアス溶液中で実施する。使用することができる免疫化学的標識には、遊離ラジカル、放射性同位体、蛍光染料、酵素、バクテリオファージ、補酵素などが包含される。半導体ナノ結晶標識または「量子ドット」もまた、有利に使用することができ、その調製および使用は、十分に記載されている（一般には、Ｋ．Ｂａｒｏｖｓｋｙ、Ｎａｎｏｔｅｃｈ．  Ｌａｗ  ＆  Ｂｕｓ．１（２）：Ａｒｔｉｃｌｅ  １４（２００４）およびそこに挙げられている特許を参照されたい）。
【０１３１】
ヘテロジニアスアッセイ手法では、試薬は通常、生体試料、変異型ＲＯＳキナーゼポリペプチド特異的試薬（例えば、抗体）および検出可能なシグナルを生じさせるために適した手段である。下記でさらに記載されているとおりの生体試料を使用することができる。抗体を一般に、ビーズ、プレートまたはスライドなどの支持体に固定化し、抗原を含有すると考えられる試料と液相で接触させる。次いで支持体を液相から分離し、支持体相または液相を検出可能なシグナルについて、そのようなシグナルを生じさせる手段を使用して検査する。シグナルは、生体試料中の分析物の存在に関連している。検出可能なシグナルを生じさせるための手段には、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、量子ドットなどの使用が包含される。例えば、検出される抗原が、第２結合部位を含有する場合、分離ステップの前に、その部位に結合する抗体を、検出可能な基に結合させ、液相反応溶液に加えることができる。固体支持体上での検出可能な基の存在は、検査試料中に抗原が存在することを示している。適切なイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法、酵素結合イムノアッセイなどである。
【０１３２】
本明細書に開示されている方法を実施するために有用であり得るイムノアッセイフォーマットおよびその変形形態は、当分野でよく知られている（一般には、Ｅ．Ｍａｇｇｉｏ、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（１９８０）（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．）を参照されたい；また例えば、米国特許第４，７２７，０２２号（Ｓｋｏｌｄら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」）；米国特許第４，６５９，６７８号（Ｆｏｒｒｅｓｔら、「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ」）；米国特許第４，３７６，１１０号（Ｄａｖｉｄら、「Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）も参照されたい）。試薬−抗体複合体を形成するために適した条件は、当業者によく知られている。検出可能な試薬の濃度は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチドの結合を、背景に対して検出することができる程度に十分であるべきである。
【０１３３】
本明細書に開示されている方法（例えば、ＩＨＣ、ウェスタンブロット、免疫蛍光およびフローサイトメトリー）を実施する際に有用な抗体には、限定ではないが、特に全長ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４（例えば、タンパク質のＮ末端に結合）または全長ＲＯＳ（例えば、ＲＯＳのキナーゼドメイン中のエピトープに結合）のいずれかに特異的に結合する抗体が包含される。そのような抗体は市販されていることがある（例えば、Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡによって製品ａｂ５５１２として販売されているＲＯＳ特異的ポリクローナル抗体）。使用される抗体がウェスタンブロット分析またはフローサイトメトリーなどにおいて、全長ＲＯＳまたは全長ＳＬＣ３４Ａ２に特異的に結合する場合、本発明の変異型ＲＯＳポリペプチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の存在を検出するための追加的な方法を同じ試料で使用することができる。例えば、透過処理された細胞でのフローサイトメトリーをＡｂｃａｍのａｂ５５１２抗体で行い、その後、細胞を溶解させ、遺伝子物質（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を、ＳＬＣ３４Ａ２またはＣＤ７４をコードするｃＤＮＡの５’末端（例えば、フォワードプライマー）およびＲＯＳをコードするｃＤＮＡの３’末端の補体（例えば、リバースプライマー）に特異的な（即ちハイブリダイズする）ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ分析する。
【０１３４】
本発明の方法で使用するための抗体は全て、診断アッセイに適した固体支持体（例えば、ラテックスまたはポリスチレンなどの材料から形成されたビーズ、プレート、スライドまたはウェル）に、沈殿などの知られている技術に従って結合されていてよい。抗体または他のＲＯＳポリペプチド特異的試薬は同様に、放射性標識（例えば、３５Ｓ、１２５１、１３１１）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）および蛍光標識（例えば、フルオレセイン）などの検出可能な基に、知られている技術に従って結合されていてよい。
【０１３５】
フローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）または免疫蛍光（ＩＦ）などの細胞ベースのアッセイが、本発明の方法を実施する際には特に望ましい。それというのも、そのようなアッセイフォーマットは、臨床的に適していて、遺伝子変化ＲＯＳタンパク質発現の検出をｉｎ  ｖｉｖｏで可能にし、抽出物を得るために例えば腫瘍試料から得られた細胞の操作によって生じる活性の人為的変化の危険性を回避するためである。したがって、一部の好ましい実施形態では、本発明の方法を、フローサイトメトリー（ＦＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）または免疫蛍光（ＩＦ）アッセイフォーマットで実施する。
【０１３６】
フローサイトメトリー（ＦＣ）は、ＲＯＳキナーゼ活性の阻害をターゲットとする薬物での治療前、その間およびその後に、哺乳動物腫瘍における遺伝子変化ＲＯＳタンパク質の発現を決定するために使用することができる。例えば、微細針吸引液からの腫瘍細胞を、フローサイトメトリーによって、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド発現またはＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチド発現および／または活性化について、さらに所望ならば、がん細胞型などを同定するためのマーカーについて分析することができる。フローサイトメトリーは、標準的な方法に従って実施することができる。例えば、Ｃｈｏｗら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）４６：７２〜７８（２００１）を参照されたい。簡単には例えば、サイトメトリー分析のための次のプロトコルを使用することができる：細胞を２％パラホルムアルデヒドで３７℃で１０分間固定し、続いて、９０％メタノール中、氷上で３０分間、透過処理する。次いで、細胞を一次ＲＯＳポリペプチド特異的抗体で染色し、洗浄し、蛍光標識二次抗体で標識することができる。次いで、細胞をフローサイトメーター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００）で、使用される装置の特異的なプロトコルに従って分析する。そのような分析によって、腫瘍において発現されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドのレベルを同定する。ＲＯＳ阻害治療薬で腫瘍を治療した後の同様の分析によって、ＲＯＳキナーゼの標的阻害薬に対するＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド発現腫瘍またはＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチド発現腫瘍の応答性が明らかになるであろう。
【０１３７】
免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色もまた、ＲＯＳキナーゼ活性の阻害をターゲットとする薬物での治療前、その間およびその後に、哺乳動物のがん（例えば、ＮＳＣＬＣ）における遺伝子変化ＲＯＳタンパク質の発現および／または活性化状態を決定するために使用することができる。ＩＨＣは、よく知られている技術に従って実施することができる（例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ  Ｅｄｓ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照されたい）。簡単には例えば、パラフィン包埋組織（例えば、生検からの腫瘍組織）を免疫組織化学的染色のために、キシレンで、続いて、エタノールで組織切片を脱パラフィン処理し；水中、次いで、ＰＢＳ中で水和させ；クエン酸ナトリウム緩衝液中でスライドを加熱することによって抗原をアンマスク処理し；過酸化水素中で切片をインキュベートし；ブロッキング溶液中でブロッキングし；一次抗ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド抗体または抗ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチド抗体および二次抗体中でスライドをインキュベートし；かつ最後に、製造者の指示に従って、ＡＢＣアビジン／ビオチン方法を使用して検出することによって調製する。免疫蛍光（ＩＦ）アッセイもまた、ＲＯＳキナーゼ活性の阻害をターゲットとする薬物での治療前、その間およびその後に、哺乳動物のがんにおけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドの発現および／または活性化状態を決定するために使用することができる。ＩＦは、よく知られている技術に従って実施することができる。例えば、Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＳ．Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）  ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＩＭＭＵＮＯＣＹＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第２版；ＲＯＹＡＬ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ３７、ＢｉｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい。簡単には例えば、患者試料をパラホルムアルデヒド中、続いて、メタノール中で固定し、ウマ血清などのブロッキング溶液でブロックし、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチドに対する一次抗体で、続いて、Ａｌｅｘａ  ４８８などの蛍光染料で標識された二次抗体と共にインキュベートし、落射蛍光顕微鏡で分析することができる。
【０１３８】
上記アッセイで使用される抗体を有利には他のシグナル伝達（ＥＧＦＲ、ホスホ−ＡＫＴ、ホスホ−Ｅｒｋ１／２）および／または細胞マーカー（サイトケラチン）抗体と共にマルチパラメトリック分析において使用するために、蛍光染料（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、ＰＥ）または量子ドットなどの他の標識に結合させることができる。遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドを測定するための酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を包含する様々な他のプロトコルが当分野では知られており、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチド発現レベルの変化または異常を診断するための基礎を提供している。ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチド発現の正常または標準的な値は、正常な哺乳動物対象、好ましくはヒトから採取された体液または細胞抽出物と、複合体形成に適した条件下でのＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチドに対する抗体との組み合わせによって確立される。標準的な複合体形成の量は、様々な方法によって、しかし好ましくは測光の手段によって定量化され得る。対象、対照および生検組織からの疾患試料において発現されるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチドの量を標準的な値と比較する。標準値と対象値との偏差によって、疾患を診断するためのパラメーターが確立される。
【０１３９】
ペプチドおよびヌクレオチドアッセイ
上記のＳｅｃｔｉｏｎ  Ｅにおいて詳述したとおりに、同様に、腫瘍からの細胞を含む生体試料中で発現される遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドを検出／定量化するためのＡＱＵＡペプチドを調製し、標準的なＡＱＵＡアッセイにおいて使用することができる。したがって、本発明の方法の一部の好ましい実施形態では、ＲＯＳポリペプチド特異的試薬は、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチドの融合結合を含むペプチド配列に対応する重同位体標識ホスホペプチド（ＡＱＵＡペプチド）を含む。本発明の方法を実施する際に有用なＲＯＳポリペプチド特異的試薬はまた、生体試料において融合または切断されたポリペプチド発現転写物に直接ハイブリダイズし、検出し得るｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡプローブであってよい。
【０１４０】
簡単には例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋患者試料を、フルオレセイン標識されたＲＮＡプローブでプローブし、続いて、ホルムアミド、ＳＳＣおよびＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で分析することができる。遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、診断目的で使用することができる。使用することができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子ならびにＰＮＡが包含される。ポリヌクレオチドを使用して、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたは欠失ＲＯＳポリペプチドの発現が疾患と相関し得る生検組織において、遺伝子発現を検出および定量することができる。診断アッセイを使用して、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたは欠失ＲＯＳポリペプチドの不在、存在および過剰発現を区別し、治療的に介入している間のＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたは欠失ＲＯＳポリペプチドレベルの調節を監視することができる。好ましい一実施形態では、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドもしくはＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたは近縁の分子をコードするゲノム配列を包含するポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを使用して、遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドをコードする核酸配列を同定することができる。そのようなプローブの構築および使用は当業者に知られており、米国特許出願公開第２０１０／０２２１７３７号に記載されている。
【０１４１】
高度に特異的な領域、例えば、融合結合に特有のヌクレオチドまたは特異性の低い領域、例えば、３’コーディング領域からなるかどうかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーションまたは増幅の厳密性（最大、高度、中程度、低度）とによって、そのプローブが遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドをコードする天然に生じる配列、対立遺伝子または関連配列のみを同定するかどうかが決定される。プローブはまた、関連配列を検出するためにも使用することができ、好ましくは、遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドをコードする配列のいずれかに由来するヌクレオチドのうちの少なくとも５０％を含有すべきである。
【０１４２】
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリヌクレオチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリヌクレオチドまたは欠失ＲＯＳポリヌクレオチドを、サザンまたはノーザン分析、ドットブロットまたは他の膜ベースの技術で；ＰＣＲ技術で；または患者生検からの液体または組織を利用するディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡまたはチップアッセイで使用して、遺伝子変化ＲＯＳポリペプチド発現を検出することができる。そのような定性または定量方法は、当分野でよく知られている。特定の態様では、遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＮＳＣＬＣを包含する肺がんを包含する様々ながんの活性化または誘発を検出するアッセイにおいて有用であり得る。遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドを標準的な方法によって標識し、ハイブリダイゼーション複合体を形成するために適した条件下で患者からの液体または組織試料に加えることができる。適切なインキュベーション期間の後に、試料を洗浄し、シグナルを定量し、標準的な値と比較する。生検または抽出試料中でのシグナルの量が比較可能な対照試料の量から有意に変化していたら、ヌクレオチド配列は試料中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしていて、試料においてＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたは欠失ＲＯＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のレベル変化が存在することは、関連する疾患の存在を示している。そのようなアッセイはまた、動物研究、臨床試験または個々の患者の治療の監視において特定の治療的処置レジメンの効力を評価するために使用することができる。
【０１４３】
遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドの発現によって特徴付けられる疾患を診断するためのベースを得るために、発現に関する正常または標準プロファイルを確立する。これは、動物またはヒトのいずれかの正常な対象から採取された体液または細胞抽出物を、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたは欠失ＲＯＳポリペプチド（例えば、ＦＩＧ−ＲＯＳ融合ポリペプチド）をコードする配列またはその断片と、ハイブリダイゼーションまたは増幅に適した条件下で組み合わせることによって達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な対象から得られた値と、実験からの値とを比較することによって定量化することができ、その際、既知の量の十分に精製されたポリヌクレオチドを使用する。正常な試料から得られた標準的な値を、疾患の症候を有する患者からの試料から得られた値と比較することができる。標準と対象との値の偏差を使用して、疾患の存在を確認する。
【０１４４】
疾患を確認し、治療プロトコルを開始したら、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返して、患者における発現レベルが、正常患者において観察されるレベルに近づき始めているかどうかを評価することができる。連続したアッセイから得られた結果を使用して、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたって治療の効果を見ることができる。
【０１４５】
遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドに関する追加的な診断用の使用は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、当業者には標準的な他の好ましいアッセイフォーマットを使用することを必要とすることがある（例えば、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。ＰＣＲオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素によって生じさせるか、または組換え源から製造することができる。オリゴマーは好ましくは、一方はセンスオリエンテーション（５’から３’）を有し、他方はアンチセンス（３’から５’）を有する２つのヌクレオチド配列からなり、特異的遺伝子または状態を同定するために最適化された条件下で使用される。同じ２つのオリゴマー、重なったオリゴマーセットまたはオリゴマーの変性プール（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｏｏｌ）を近縁のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出および／または定量するために、厳密性の低い条件下で使用することができる。
【０１４６】
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリペプチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリペプチドまたは欠失ＲＯＳポリペプチドの発現を定量するために使用することもできる方法には、ヌクレオチドの放射性標識またはビオチン化、対照核酸の同時増幅および実験結果が挿入される標準曲線が包含される（Ｍｅｌｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５９：２３５〜２４４（１９９３）；Ｄｕｐｌａａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２９〜２３６（１９９３））。多数の試料を定量する速度を、該当するオリゴマーが様々な希釈で与えられ、分光光度計または比色計の応答が迅速な定量をもたらすＥＬＩＳＡフォーマットでアッセイを作動させることによって加速することができる。
【０１４７】
遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドを使用して、天然に生じるゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生じさせることができる。よく知られている技術を使用して、配列を、特定の染色体または特定の染色体領域にマッピングすることができる。そのような技術には、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＦＡＣＳまたは酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌Ｐ１構造もしくは単一染色体ｃＤＮＡライブラリなどの人工染色体構造が包含され、Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．７：１２７〜１３４（１９９３）およびＴｒａｓｋ，Ｂ．Ｊ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：１４９〜１５４（１９９１）に概説されている。非限定的な一実施形態では、ＦＩＳＨを使用し（Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されているとおり）、他の物理的染色体マッピング技術および遺伝子地図データと相関させることができる。遺伝子地図データの例は、１９９４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１〜）において見出すことができる。物理的染色体地図上でのＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合ポリヌクレオチド、ＣＤ７４−ＲＯＳ融合ポリヌクレオチドまたは欠失ＲＯＳポリヌクレオチドをコードする遺伝子の位置と具体的な疾患との相関または具体的な疾患に対する素因が、その遺伝的疾患に関連するＤＮＡの領域を区切るのに役立ち得る。ヌクレオチド配列を使用して、正常か、保因者か、または罹患している個体における遺伝子配列の差違を検出することができる。
【０１４８】
染色体標本のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび確立されている染色体マーカーを使用する連関分析などの物理的マッピング技術を使用して、遺伝子地図を拡大することができる。多くの場合に、マウスなどの他の哺乳動物種の染色体に遺伝子を置くと、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合にも、関連マーカーを明らかにすることができる。物理的マッピングによって、新たな配列を、染色体アームまたはその一部に割り当てることができる。これは、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見技術を使用して疾患遺伝子をサーチしている研究者に価値ある情報を提供する。
【０１４９】
遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドを検出する方法（例えば、ＰＣＲおよびＦＩＳＨ）は全て、遺伝子変化ＲＯＳポリヌクレオチドまたは遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドを検出する他の方法と組み合わせることができることは理解されるであろう。例えば、生体試料（例えば、循環腫瘍細胞）の遺伝子材料におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳポリヌクレオチドの検出に、試料のタンパク質のウェスタンブロット分析または免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を続けて、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳポリヌクレオチドが生体試料においてＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳポリペプチドとして実際に発現されているかどうかを決定することができる。そのようなウェスタンブロットまたはＩＨＣ分析は、検出されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用して行うことができるか、または分析は、全長ＳＬＣ３４Ａ２（例えば、タンパク質のＮ末端に結合）または全長ＲＯＳ（例えば、ＲＯＳのキナーゼドメインのエピトープに結合）のいずれかに特異的に結合する抗体を使用して行うことができる。そのようなアッセイは、当分野で知られている（例えば、米国特許第７，４６８，２５２号を参照されたい）。
【０１５０】
ＲＯＳキナーゼ治療薬
遺伝子変化ＲＯＳポリペプチドは、ヒトＮＳＣＬＣの少なくとも１つのサブグループにおいて生じることが判明している（Ｒｉｋｏｖａら、Ｃｅｌｌ  １３１：１１９０〜１２０３（２００７）を参照されたい）。したがって、少なくとも１つのＲＯＳ融合タンパク質（例えばＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質）が発現される哺乳動物のがん（例えばＮＳＣＬＣ）の進行は、そのようながんにおけるＲＯＳキナーゼの活性を阻害することによって、またはそのようながんにおけるＲＯＳキナーゼの発現を阻害することによってｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することができる。突然変異ＲＯＳキナーゼの発現によって特徴付けられるがんにおけるＲＯＳ活性は、がん（例えば腫瘍）をＲＯＳキナーゼ治療薬と接触させることによって阻害することができる。
【０１５１】
ＲＯＳキナーゼ治療薬は、下記のＲＯＳキナーゼ阻害薬化合物を包含するＲＯＳキナーゼの発現および／または活性をｉｎ  ｖｉｖｏで直接的または間接的に阻害する少なくとも１つの化合物、生物学的製剤または化学的製剤を含む任意の組成物であってよい。そのような化合物には、ＲＯＳキナーゼ自体に、またはＲＯＳの活性を変えるタンパク質もしくは分子に直接働くか、またはＲＯＳの発現を阻害することによって間接的に働く治療薬が包含される。そのような組成物にはまた、単一のＲＯＳキナーゼ阻害性化合物のみを含む組成物、さらに、化学療法薬または一般的な転写阻害薬などの非特異的治療薬も包含してよい多数の治療薬（他のＲＴＫに対するものを包含）を含む組成物も包含される。
【０１５２】
低分子ＲＯＳキナーゼ阻害薬
本発明の方法を実施する際に有用なＲＯＳキナーゼ治療薬は、低分子ＲＯＳキナーゼ阻害薬である。低分子キナーゼ阻害薬は典型的には、酵素の触媒部位に特異的に、かつ多くの場合に不可逆的に結合することによって、かつ／または酵素内のＡＴＰ結合溝または他の結合部位に結合して、酵素がその活性に必要な構造を取り込むことを妨げることによってその標的酵素の活性を阻害する一群の分子である。低分子ＲＯＳキナーゼ阻害薬は、ＲＯＳキナーゼ三次元構造のＸ線結晶学的またはコンピューターモデリングを使用して合理的に設計することができるか、またはＲＯＳを阻害するための化合物ライブラリのハイスループットスクリーニングによって見出すことができる。そのような方法は、当分野でよく知られており、記載されている。ＲＯＳ阻害の特異性は例えば、キナーゼのパネルにおいてそのような化合物が他のキナーゼ活性ではなく、ＲＯＳ活性を阻害する能力を検査することによって、かつ／またはＲＯＳ融合タンパク質を発現することが知られているか、または発現が変化している腫瘍細胞を含む生体試料においてＲＯＳ活性の阻害を検査することによって確認することができる。
【０１５３】
ＲＯＳキナーゼ治療薬として有用であることが本明細書で示されている低分子ＲＯＳ阻害薬の例には、それらが開示しているその全体がそれぞれ参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７２３００９８号、米国特許第７，８５８，６４３号およびＷＯ２００６／０２１８８１に開示されている種類のアミノ−ピリジンおよびアミノ−ピラジン化合物が包含される。特に、ＲＯＳキナーゼ治療薬として本発明に関連して有用なアミノ−ピリジンおよびアミノ−ピラジン化合物には、下記一般式の化合物または薬学的に許容できるその塩が包含される：
【０１５４】
【化１５】
2013032355.tif 000017
［式中、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２およびＡ１は、米国特許第７，２３０，０９８号に記載されている一般的な意味を有する］。より具体的には、ＲＯＳキナーゼ治療薬として本発明に関連して有用なアミノ−ピリジンおよびアミノ−ピラジン化合物には、下記一般式の化合物または薬学的に許容できるその塩が包含される：
【０１５５】
【化１６】
2013032355.tif 000018
［式中、Ｙ、Ｒ１およびＲ２は、米国特許第７，８５８，６４３号に記載されているとおりの一般的な意味を有する］。上記の種類のアミノ−ピリジンおよびアミノ−ピラジン化合物は、ＲＯＳキナーゼ阻害薬であることが判明しており、したがって、本発明に関連してＲＯＳキナーゼ治療薬として有用である。特に、がんが遺伝子変化ＲＯＳキナーゼ（例えば、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ、ＣＤ７４−ＲＯＳまたはＦＩＧ−ＲＯＳ）について陽性であると判明している場合、そのような化合物は、がんの治療を必要とする患者に投与することができる。
【０１５６】
特に好ましい化合物の１種は、その調製が米国特許第７，８５８，６４３号に記載されている式１によって表される化合物３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミン（クリゾチニブ）である：
【０１５７】
【化１７】
2013032355.tif 000019
（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４、１９９３６〜１９９４１（２００７）も参照されたい）。式１の化合物は、それぞれその内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ２００６／０２１８８４および米国特許出願公開第２００６／００４６９９１号に開示されている。加えて、式１の化合物のラセミ化合物は、それぞれその内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ２００６／０２１８８１および米国特許出願公開第２００６／０１２８７２４号に開示されている。
【０１５８】
ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦＲ阻害薬としてもともとは設計されたクリゾチニブは本明細書において、ＲＯＳキナーゼに対して活性であり、したがって、本明細書に記載されているＲＯＳ融合タンパク質およびＲＯＳ欠失タンパク質に対して活性であることが判明した。クリゾチニブは、ＲＯＳ触媒活性でのその効果について、酵素および細胞ベースアッセイの両方において評価された。本明細書に示されているデータは、クリゾチニブが、組換えヒトＲＯＳ−１キナーゼ（触媒ドメイン）の有効なＡＴＰ拮抗阻害薬であることを示している。
【０１５９】
下記のＲＯＳ−１酵素アッセイによって、０．０９７ｎＭの平均Ｋｉ値（ｎ＝４）が得られた。クリゾチニブは、構成的に活性なＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質の発現をもたらす４ｐ１５、６ｑ２２染色体転座事象を示すＨＣＣ７８細胞（Ｒｉｋｏｖａら、（２００７））において、４１ｎＭの平均ＩＣ５０値（ｎ＝１１）でＲＯＳリン酸化を用量依存的に阻害した（表１、図１）。クリゾチニブはまた、ＦＩＧ−ＲＯＳ融合を内包するＵ１３８ＭＧヒト神経膠芽細胞腫細胞（Ｃｈａｒｅｓｔら、（２００３））において、４９ｎＭの平均ＩＣ５０値（ｎ＝２）でＲＯＳリン酸化を用量依存的に阻害した（表１、図１）。
【０１６０】
ＣＤ７４−ＲＯＳ、ＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｓ）、ＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｌ）、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）およびＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）を包含する様々なＲＯＳ−融合タンパク質を発現するように操作された３Ｔ３細胞系のパネルにおいて、クリゾチニブは、３．４ｎＭから３６ｎＭの範囲のＩＣ５０値でＲＯＳリン酸化を阻害した（表１）。
【０１６１】
クリゾチニブを、構成的に活性なＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質の発現をもたらす４ｐ１５、６ｑ２２染色体転座事象を示すＨＣＣ７８（Ｒｉｋｏｖａら、（２００７））の細胞生存力に対するその効果について評価した。クリゾチニブは、ＨＣＣ７８細胞生存力の濃度依存的阻害を示した（図２）。ＨＣＣ７８細胞生存力の阻害に関して算出されたＩＣ５０値は、ほぼ５９ｎＭであった。これらの結果は、ＨＣＣ７８細胞が細胞増殖および生存力に関してＲＯＳ融合に依存していること、およびクリゾチニブがＲＯＳ依存性細胞の増殖および生存力の有効な阻害薬であることを示唆している。
【０１６２】
分子レベルでは、構成的に活性化されたＲＯＳ融合キナーゼは、ＲＴＫ触媒活性および制御基質のドッキングを調節する細胞内領域で多数のチロシン残基のリン酸化を誘発する。抗腫瘍作用機構のさらなる理解を得、ＲＯＳキナーゼ活性の阻害が下方のシグナル伝達と相関していることを確認するために、クリゾチニブを、ＨＣＣ７８ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ依存性シグナル伝達経路を阻害するその能力について評価した。クリゾチニブはＨＣＣ７８細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＲＯＳリン酸化（活性化ループ）、さらに、ＳＨＰ２、ＳＴＡＴ３、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２を包含する下方のアダプターまたはシグナル伝達分子を用量依存的に阻害した（図３）。これらの結果は、重要なシグナル伝達経路とクリゾチニブの有効な用量との相関を示している。
【０１６３】
クリゾチニブを、ＨＣＣ７８ヒトＮＳＣＬＣ細胞において細胞アポトーシスを誘発するその能力についてさらに評価した。クリゾチニブは、ＨＣＣ７８ＮＳＣＬＣ細胞において活性化カスパーゼ３レベルの用量依存的誘発を示したが（図４）、このことは、アポトーシスの上昇はまた、有効な用量レベルと相関していることを示している。
【０１６４】
クリゾチニブの抗腫瘍効力を、ＲＯＳ融合操作された腫瘍異種移植片モデルのパネルにおいて評価した。ＣＤ７４−ＲＯＳ、ヒトＮＳＣＬＣで同定されているＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳのロング型およびショート型変異体ならびにヒトＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫および胆管がんで同定されているＦｉｇ−ＲＯＳのロング型およびショート型変異体を包含するＲＯＳ染色体転座が関与しているヒトがん適応症を代表する腫瘍異種移植片をＮＩＨ３Ｔ３細胞において操作した（Ｒｉｍｋｕｎａｓら（２０１２）；Ｇｕら、（２０１１））。クリゾチニブは、７５／ｍｇ  ＰＯ  ＢＩＤの投与レジメンで、３Ｔ３−ＲＯＳ操作された腫瘍モデルの全てにおいて有意な細胞減少性効果を示した（図５）。
【０１６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＯＳリン酸化および腫瘍増殖を阻害するクリゾチニブの能力を、ヌードマウスにおいて３Ｔ３−ＣＤ７４−ＲＯＳおよび３Ｔ３−ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）異種移植片モデルで評価した。クリゾチニブは、１６０ｍｇ／ｋｇ／日（８０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）、８０ｍｇ／ｋｇ／日（４０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）、４０ｍｇ／ｋｇ／日（２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）および２０ｍｇ／ｋｇ／日（１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）の用量で、３Ｔ３−ＣＤ７４−Ｒｏｓ腫瘍異種移植片において腫瘍増殖の用量依存的阻害を示した（図６Ｂ）。クリゾチニブはまた、全ての治療群にわたって３Ｔ３−ＣＤ７４−Ｒｏｓ腫瘍でのＲＯＳリン酸化の有意な阻害を示した（図６Ａ）。クリゾチニブによる同様の抗腫瘍効力が、３Ｔ３−ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）異種移植片モデルにおいて観察された（図７）。
【０１６６】
投与経路および剤形
経口投与
本発明の化合物は、経口投与することができる。経口投与は、化合物が胃腸管に入るような嚥下を伴ってもよいか、または化合物が口から直接、血流に入る頬側または舌下投与を使用することもできる。
【０１６７】
経口投与に適している製剤には、錠剤などの固体製剤、微粒子、液体または粉末を含有するカプセル剤、ロゼンジ剤（液体充填を包含）、チューイング剤、マルチおよびナノ粒子剤、ゲル剤、固溶体、リポソーム剤、フィルム剤（粘膜付着剤を包含）、膣坐剤、噴霧剤、液体製剤が包含される。
【０１６８】
液体製剤には、懸濁剤、液剤、シロップ剤およびエリキシル剤が包含される。そのような製剤は、軟質カプセルまたは硬質カプセル中の充填剤として使用することもでき、典型的には、薬学的に許容できる担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロースまたは適切なオイルならびに１種または複数の乳化剤および／または懸濁化剤を包含する。液体製剤はまた、固体、例えばサシェからの再構成によって調製することもできる。
【０１６９】
本発明の化合物はまた、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるＬｉａｎｇおよびＣｈｅｎによるＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ、１１（６）、９８１〜９８６（２００１）に記載されている剤形などの急速溶解、急速分解剤形で使用することもできる。
【０１７０】
錠剤剤形では、用量に応じて、薬物は、剤形の１重量％から８０重量％、より典型的には剤形の５重量％から６０重量％を構成していてよい。薬物に加えて、錠剤は通常、崩壊剤を含有する。崩壊剤の例には、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶性セルロース、低級アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、α化デンプンおよびアルギン酸ナトリウムが包含される。通常、崩壊剤は、剤形の１重量％から２５重量％、好ましくは５重量％から２０重量％を構成している。
【０１７１】
通常は結合剤を使用して、錠剤製剤に粘着性を付与する。適切な結合剤には、微結晶性セルロース、ゼラチン、糖、ポリエチレングリコール、天然および合成ゴム、ポリビニルピロリドン、α化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロースならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースが包含される。錠剤はまた、ラクトース（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物など）、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、微結晶性セルロース、デンプンおよび二塩基性リン酸カルシウム二水和物などの希釈剤を含有してもよい。
【０１７２】
錠剤はまた、ラウリル硫酸ナトリウムおよびポリソルベート８０などの界面活性剤ならびに二酸化ケイ素およびタルクなどの流動促進剤を包含してもよい。存在する場合には、界面活性剤は典型的には、錠剤の０．２重量％から５重量％の量であり、流動促進剤は典型的には、錠剤の０．２重量％から１重量％の量である。
【０１７３】
また錠剤は通常、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムとの混合物などの滑沢剤を含有する。滑沢剤は通常、錠剤の０．２５重量％から１０重量％、好ましくは０．５重量％から３重量％の量で存在する。
【０１７４】
他の慣用の成分には、抗酸化剤、着色剤、香味剤、保存剤および矯味剤が包含される。
【０１７５】
例示的な錠剤は、薬物約８０重量％まで、結合剤約１０重量％から約９０重量％、希釈剤約０重量％から約８５重量％、崩壊剤約２重量％から約１０重量％および滑沢剤約０．２５重量％から約１０重量％を含有する。
【０１７６】
錠剤ブレンドを、直接か、またはローラーによって圧縮して、錠剤を形成することができる。別法では、錠剤ブレンドまたは一部のブレンドを湿潤、乾燥または溶融顆粒化するか、溶融凝固させるか、または押し出し、その後に製錠することができる。最終製剤は、１つまたは複数の層を包含してよく、コーティングされているか、もしくはコーティングされてなくてよいか、またはカプセル封入されていてよい。
【０１７７】
錠剤の製剤は、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるＨ．ＬｉｅｂｅｒｍａｎおよびＬ．Ｌａｃｈｍａｎによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ」、Ｖｏｌ．１、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎ．Ｙ、Ｎ．Ｙ、１９８０（ＩＳＢＮ  ０−８２４７−６９１８−Ｘ）で詳細に検討されている。
【０１７８】
経口投与のための固体製剤は、即時および／または変更放出であるように製剤化することができる。変更放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、調節放出、ターゲット放出およびプログラム放出が包含される。
【０１７９】
適切な変更放出製剤は、米国特許第６，１０６，８６４号に記載されている。高エネルギー分散液および浸透性のコーティングされた粒子などの他の適切な放出技術の詳細は、Ｖｅｒｍａらによる「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｏｎ−ｌｉｎｅ」、２５（２）、１〜１４（２００１）に見出すことができる。調節放出を達成するためにチューインガムを使用することは、ＷＯ００／３５２９８に記載されている。これらの参照文献の開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
非経口投与
本発明の化合物はまた、血流中、筋肉中または内臓に直接投与することもできる。非経口投与に適している手段には、静脈内、動脈内、腹腔内、クモ膜下、心室内、尿管内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下が包含される。非経口投与のための適切なデバイスには、針（微細針を包含する）注射器、無針注射器および点滴技術が包含される。
【０１８１】
非経口製剤は典型的には、塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくはｐＨ３から９に）などの添加剤を含有してよい水溶液であるが、いくつかの用途では、これらをより適切に、無菌非水溶液として、または無菌の発熱物質不含水などの適切なビヒクルと共に使用される乾燥形態として製剤化することができる。
【０１８２】
例えば、凍結乾燥による無菌条件下での非経口製剤の調製は、当業者によく知られている標準的な製薬技術を使用して容易に達成することができる。
【０１８３】
非経口溶液を調製する際に使用される本発明の化合物の溶解性は、溶解性増強剤を導入するなどの適切な製剤技術を使用することによって高めることができる。
【０１８４】
非経口投与のための製剤は、即時および／または変更放出であるように製剤化することができる。変更放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、調節放出、ターゲット放出およびプログラム放出が包含される。したがって本発明の化合物を、活性化合物の変更放出をもたらす移植デポーとして投与するための固体、半固体もしくはチキソトロピー液として製剤化することができる。そのような製剤の例には、薬物コーティングされたステントおよびＰＧＬＡマイクロスフェアが包含される。
【０１８５】
局所投与
本発明の化合物はまた、皮膚または粘膜に局所で、即ち皮膚または経皮で投与することもできる。この目的のための典型的な製剤には、ゲル剤、ヒドロゲル剤、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤、散布剤、包帯、フォーム剤、フィルム剤、皮膚パッチ剤、ウェハ剤、インプラント剤、スポンジ、繊維、帯具およびマイクロエマルション剤が包含される。リポソームもまた使用することができる。典型的な担体には、アルコール、水、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが包含される。透過促進剤を導入することもできる。例えば、ＦｉｎｎｉｎおよびＭｏｒｇａｎによるＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ、８８（１０）、９５５〜９５８（１９９９年１０月）を参照されたい。局所投与の他の手段には、電気穿孔法、イオン導入法、音波泳動法、音泳動法および微細針または無針（例えば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）など）注射による送達が包含される。これらの参照文献の開示はその全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
局所投与のための製剤は、即時および／または変更放出であるように製剤化することができる。変更放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、調節放出、ターゲット放出およびプログラム放出が包含される。
【０１８７】
吸入／鼻腔内投与
本発明の化合物はまた、鼻腔内または吸入により、典型的には乾燥粉末の形態（単独で、混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドで、または混合成分粒子として、例えば、ホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合して）で、乾燥粉末吸入器から、またはエアロゾルスプレーとして、加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは、微細な霧を生じさせるために電磁流体力学を使用する噴霧器）またはネブライザから、１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンなどの適切な噴射剤を使用して、もしくは使用せずに投与することができる。鼻腔内使用では、散剤は、生体用粘着剤、例えば、キトサンまたはシクロデキストリンを包含してもよい。
【０１８８】
加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器またはネブライザは、例えば、エタノール、エタノール水溶液または活性剤の分散、可溶化もしくはその放出の延長のために適している別の薬剤、溶媒としての噴射剤およびトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸もしくはオリゴ乳酸などの任意選択の界面活性剤を含む本発明の化合物（複数可）の溶液または懸濁液を含有する。
【０１８９】
乾燥散剤または懸濁液製剤で使用する前に、薬物生成物を、吸入により送達するために適したサイズ（典型的には５ミクロン未満）まで超微粉砕する。これは、スパイラルジェット粉砕、流動床ジェット粉砕、ナノ粒子を形成するための臨界液体処理、高圧均一化または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法により達成することができる。
【０１９０】
吸入器または注入器で使用するためのカプセル（例えば、ゼラチンまたはＨＰＭＣ製）、ブリスターおよびカートリッジを、本発明の化合物、ラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤基剤およびｌ−ロイシン、マンニトールまたはステアリン酸マグネシウムなどの性能改良剤の粉末混合物を含有するように製剤化することができる。ラクトースは、無水であってよいか、または一水和物の形態であってよいが、後者が好ましい。他の適切な賦形剤には、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロースおよびトレハロースが包含される。
【０１９１】
微細な霧を発生させるために電磁流体力学を使用する噴霧器で使用するために適している液剤は、動作１回当たり本発明の化合物１μｇから２０ｍｇを含有してよく、その動作体積は、１μｌから１００μｌまで変動してよい。典型的な製剤は、本発明の化合物、プロピレングリコール、無菌水、エタノールおよび塩化ナトリウムを包含する。プロピレングリコールの代わりに使用することができる別の溶媒には、グリセロールおよびポリエチレングリコールが包含される。
【０１９２】
メントールおよびレボメントールなどの適切な香味剤またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味剤を、吸入／鼻腔内投与を意図されている本発明の製剤に加えることができる。
【０１９３】
吸入／鼻腔内投与のための製剤は、例えば、ポリ（ＤＬ−乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＧＬＡ）を使用して、即時および／または変更放出であるように製剤化することができる。変更放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、調節放出、ターゲット放出およびプログラム放出が包含される。
【０１９４】
乾燥散剤吸入器およびエアロゾルの場合、投薬単位は、計測量を送達するバルブ手段により決定される。本発明による単位は典型的には、所望の量の本発明の化合物を含有する計測用量または「パフ」を投与するように設計される。全１日用量を単回用量で、またはより通常は、１日を通して分けた用量として投与することができる。
【０１９５】
直腸／膣内投与
本発明の化合物は、例えば、坐剤、膣坐剤または浣腸剤の形態で直腸または膣投与することができる。カカオバターは、慣用的な坐剤基剤であるが、様々な代替物を適宜使用することができる。
【０１９６】
直腸／膣投与のための製剤を、即時および／または変更放出であるように製剤化することができる。変更放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、調節放出、ターゲット放出およびプログラム放出が包含される。
【０１９７】
眼投与
本発明の化合物はまた、典型的には等張性ｐＨ調節無菌食塩水中の超微粉砕された懸濁液または溶液の液滴の形態で、眼または耳に直接投与することもできる。眼および耳投与に適している他の製剤には、軟膏剤、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性（例えば、シリコーン）インプラント、ウェハ、レンズならびに粒子またはニオソームもしくはリポソームなどの小胞系が包含される。架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、セルロース系ポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースもしくはメチルセルロースまたはヘテロ多糖ポリマー、例えば、ゲランゴムなどのポリマーを、塩化ベンザルコニウムなどの保存剤と共に導入することができる。そのような製剤はまた、イオン泳動法によって送達することができる。
【０１９８】
眼／耳投与のための製剤は、即時および／または変更放出であるように製剤化することができる。変更放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、調節放出、ターゲット放出またはプログラム放出が包含される。
【０１９９】
他の技術
前記の投与方法のいずれかで使用するために、本発明の化合物を、シクロデキストリンおよび適切なその誘導体などの溶解性高分子成分またはポリエチレングリコール含有ポリマーと組み合わせて、その溶解性、溶解速度、矯味、生物学的利用率および／または安定性を改良することができる。
【０２００】
例えば、薬物−シクロデキストリン複合体は通常、多くの剤形および投与経路に有用であることが判明している。包接複合体と非包接複合体の両方を使用することができる。薬物との直接的な複合化の代わりに、シクロデキストリンを補助的添加剤、即ち、担体、希釈剤または可溶化剤として使用することができる。これらの目的のために最も一般的に使用されるのは、アルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキストリンであり、この例は、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ９１／１１１７２、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２５１８およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／５５１４８に見出すことができる。
【０２０１】
投薬
投与される活性化合物の量は、治療される対象、障害または状態の重症度、投与速度、化合物の素質および処方する医師の裁量に左右される。しかしながら、有効投薬量は典型的に、単回または分割用量で、体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．００１から約１００ｍｇ、好ましくは約０．０１から約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。７０ｋｇのヒトでは、これは、約０．０７から約７０００ｍｇ／日、好ましくは約０．７から約２５００ｍｇ／日になる。場合によっては、前記の範囲の下限未満の投薬量レベルが、より適切であることもあり、他の場合では、有害な副作用を何ら誘発することなく、さらに多い用量を使用することもできるが、但し、そのようなさらに多い用量は典型的に、投与のために一日を通して複数のより小さな用量に分割される。
【０２０２】
パーツキット
例えば、特定の疾患または状態を治療する目的で、活性化合物の組み合わせを投与することが望ましい限り、そのうちの少なくとも１種は本発明による化合物を含有する２種以上の医薬組成物を簡便に、組成物を同時投与するのに適したキットの形態で組み合わせることができることは、本発明の範囲内である。したがって、本発明のキットは、そのうちの少なくとも１種は本発明による化合物を含有する２種以上の別々の医薬組成物と、コンテナ、分離ボトルまたは分離フォイルパケットなどの前記組成物を別々に保持するための手段とを包含する。そのようなキットの例は、錠剤、カプセル剤などをパッケージングするために使用される普通のブリスターパックである。
【０２０３】
本発明のキットは、例えば、経口および非経口の種々の剤形を投与するために、別々の組成物を異なる投薬間隔で投与するために、または相互に別々の組成物を力価測定するために特に適している。服薬遵守を補助するために、キットは典型的には、投与のための指示書または説明書を包含し、記憶補助体と共に提供され得る。そのような指示書または説明書は、「ラベル」またはパンフレットの形であってよい。さらにそのような指示書または説明書は、がんがＲＯＳ陽性であるかどうか、または患者がＲＯＳ陽性であるかどうかを決定するための診断検査に関連する情報を含有してよい。
【実施例】
【０２０４】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイ
材料および方法
Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ方法
ＲＯＳ−１酵素アッセイ
ＲＯＳ−１酵素の阻害を、マイクロフルイディック移動度シフトアッセイを使用して測定した。反応を５０μＬ体積で９６ウェルプレート中で行ったが、これは、０．２５ｎＭのＧＳＴ標識された組換えヒトＲＯＳ−１触媒ドメイン（ａａ  １８８３−２３４７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ）、１．５μＭのホスホルアクセプターペプチド５’ＦＡＭ−ＫＫＳＲＧＤＹＭＴＭＱＩＧ−ＣＯＮＨ２（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）、試験化合物（１１種の用量、３倍連続希釈、最終２％ＤＭＳＯ）またはＤＭＳＯのみ、１ｍＭのＤＴＴ、０．００２％のＴｗｅｅｎ−２０および５ｍＭのＭｇＣｌ２を２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．１中に含有し、２０分間の予備インキュベーションの後にＡＴＰ（５６μＭの最終濃度、ほぼＫｍレベル）を加えることによって開始した。反応物を室温で１時間インキュベートし、次いで、０．１ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を加えることによって停止した。反応の完了程度（ＤＭＳＯで約５％の変換率）を、ＬａｂＣｈｉｐ  ＥＺ  Ｒｅａｄｅｒ  ＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光標識されたペプチド基質とリン酸化生成物とを電気泳動によって分離した後に決定した。各試験でのＫｉ値を、非線形回帰方法（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および実験によって測定されたＡＴＰ  Ｋｍ＝５６μＭを使用して、変換％を拮抗的阻害に関する式に当てはめることによって算出した。４つの試験からなるパネルによって、０．０９７ｎＭの平均Ｋｉ値が得られた。
【０２０５】
細胞系
ＨＣＣ７８細胞は、非小細胞肺癌と種別された肺腺癌を有する６５歳の男性の胸膜滲出液から樹立されたヒト非小細胞肺癌細胞系である。ＨＣＣ７８細胞は、ＤＳＭＺ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｕ１３８細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＴＣＣから購入した。
【０２０６】
ＮＩＨ３Ｔ３−ＲＯＳ融合細胞系の作製
ＮＩＨ３Ｔ３  ＲＯＳ融合操作された細胞系を自家で作製した。ＲＯＳ融合変異体ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）、ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｓ）、ＣＤ７４−ＲＯＳ（Ｌ）、ＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｌ）およびＦＩＧ−ＲＯＳ（Ｓ）をレトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ  ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。ｐＭＳＣＶベクターおよびパッケージングプラスミドｐＣ１０Ａ１を同時トランスフェクションすることによって、ＥＭＬ４−ＡＬＫ遺伝子を担うレトロウイルスを２９３Ｔ細胞で生じさせた。レトロウイルス上清を使用して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質導入し、貯留された集団を２μｇ／ｍｌのピュロマイシンで５日間選択し、ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した後に、後続の実験で使用した。
【０２０７】
細胞でのキナーゼリン酸化アッセイ
クリゾチニブがリガンド依存性または構成的キナーゼリン酸化を阻害する能力を直接的に決定するために使用される細胞アッセイ（即ち、ＥＬＩＳＡまたは免疫ブロット）を、様々な血清飢餓細胞を使用して行った。
【０２０８】
細胞ベースのホスホ−ＲＯＳＥＬＩＳＡアッセイ
様々な種類のＲＯＳ融合を内包する細胞系からなるパネルを使用して、ＲＯＳリン酸化に対するクリゾチニブの効力を決定した。細胞を増殖培地１００μｌ中、２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播いた。ＲＯＳ融合陰性細胞ウェルをバックグラウンドとして使用した。播かれた細胞を一晩付着させた。翌日、増殖培地を除去し、細胞を血清不含培地（０．０４％のＢＳＡを有する）中で培養した。クリゾチニブの連続希釈を行い、適切な対照または指定濃度のクリゾチニブを各ウェルに加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。細胞溶解産物を生じさせ、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｏｓ（ｐａｎＴｙｒ）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ＃：７０９３）を製造者のプロトコルに記載されているとおりに使用することによって、ＨＣＣ７８細胞におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳの全ホスホ−チロシンレベルを決定した。ＥＣ５０値を、４パラメーター分析法を利用する濃度反応曲線フィッティングによって算出した。
【０２０９】
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳについての細胞ベースのホスホ−ＲＯＳ  ＥＬＩＳＡアッセイ
ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合を内包するＨＣＣ７８細胞を使用して、ＲＯＳリン酸化に対するクリゾチニブの効力を決定した。ＨＣＣ７８細胞を、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ培地１００μｌ中、２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播いた。細胞を含まないウェルをバックグラウンドとして使用した。播かれた細胞を一晩付着させた。翌日、増殖培地を除去し、細胞を血清不含培地（０．０４％のＢＳＡを有する）中で培養した。クリゾチニブの連続希釈を行い、適切な対照または指定濃度のクリゾチニブを各ウェルに加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。細胞溶解産物を生じさせ、ＰａｔｈＳｃａｎ（登録商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｒｏｓ（ｐａｎＴｙｒ）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃａｔ＃：７０９３）を製造者のプロトコルに記載されているとおりに使用することによって、ＨＣＣ７８細胞におけるＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳの全ホスホ−チロシンレベルを決定した。ＩＣ５０値を、４パラメーター分析法を利用する濃度反応曲線フィッティングによって算出した。細胞ベースのホスホ−ＲＯＳ  ＥＬＩＳＡアッセイによって、４５ｎＭの平均ＩＣ５０値（ｎ＝８）が得られた。
【０２１０】
免疫ブロット法
免疫ブロット法も使用して、ＨＣＣ７８細胞および３Ｔ３−ＣＤ７４−ＲＯＳ腫瘍溶解産物における相対的なキナーゼリン酸化状態および全タンパク質レベルを該当するタンパク質について決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、ＨＣＣ７８細胞を様々な用量レベルのクリゾチニブで３時間処理した。細胞を冷１×Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＴ）中で溶解させた。
【０２１１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、腫瘍を持つマウスをクリゾチニブで、７５ｍｇ／ｋｇ  ＰＯ  ＢＩＤで１０日間処置した。研究の終了時に、最後の投与の７時間後に、腫瘍を切除した。切除された腫瘍をドライアイス上でスナップ冷凍し、液体窒素で冷却された冷却乳鉢（ｃｒｙｏｍｏｒｔａｒ）および乳棒を使用して微粉砕し、冷１×Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＴ）中で溶解させた。タンパク質を細胞および腫瘍溶解産物から抽出し、ＢＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）使用してタンパク質濃度を決定した。細胞および腫瘍溶解産物の両方から抽出されたタンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ナイロン膜に移し、該当するタンパク質についての免疫ブロットハイブリダイゼーションを次の抗体で行った。
【０２１２】
免疫ブロット研究で利用された抗体は全て、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）製であり、次のとおり列挙される：抗全ＲＯＳ（ｃａｔａｌｏｇ＃：３２６６）、抗ホスホＲＯＳ（ｃａｔａｌｏｇ＃：３０７８）、抗ホスホＳＨＰ２（ｃａｔａｌｏｇ＃：５４３１）、抗ホスホＳＴＡＴ３（ｃａｔａｌｏｇ＃：９１３１）、抗全ＡＫＴ（ｃａｔａｌｏｇ＃：９２７２）、抗ホスホ−ＡＫＴ  Ｓ４７３（ｃａｔａｌｏｇ＃：４１６１）、抗全−ＭＡＰＫ４４／４２（ｃａｔａｌｏｇ＃：９１０２）、抗ホスホ−ＭＡＰＫ４４／４２（ｃａｔａｌｏｇ＃：４３７０）、切断Ｃａｓｐａｐｓｅ−３（ｃａｔａｌｏｇ＃：９６６１）。
【０２１３】
細胞生存力、増殖および生存アッセイ
細胞生存力アッセイ
スクリーニングの正規化が可能である限り、培養ＨＣＣ７８細胞を１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＲＰＭＩ増殖培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に適応させた。特殊な培地を必要とする一部の細胞は、供給者が推奨する培地中で増殖させた。細胞をトリプシン処理し、３０００〜５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ＃３９０４プレート、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ）に播き、一晩付着させた。翌日、細胞を、９種の連続濃度（１０μＭから１５２ｐＭへと連続して４倍比で低下させて、完全なＳ字状曲線をもたらす）で投与される単一の薬物で２回処置した。３７℃でさらに３〜５日間インキュベートした後に（細胞集密度が約７０〜８０％に達するまで）、製造者が推奨する体積のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の１／５を加えて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ｍｕｌｔｉ−ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して細胞生存力／増殖を間接的に測定した。ベースラインの細胞数読み取りをまた、細胞播種の１日後、かつ薬物治療の前に、細胞プレートから取った。ベースラインの数を最終細胞数から引き、ＰＲＩＳＭ（Ｇｒａｐｈｐａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）またはＸＬＦＩＴ（ＩＤＢＳ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）でプロットした。ＨＣＣ７８細胞生存力の阻害について算出されたＩＣ５０値は、約５９ｎＭであった。
【０２１４】
細胞増殖／生存アッセイ
細胞を９６ウェルプレートに低密度で、増殖培地（２％、５％または１０％のウシ胎児血清−ＦＢＳを補足されている培地）に播き、３７℃で一晩培養した。翌日、連続希釈のクリゾチニブまたは適切な対照を指定されたウェルに加え、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を行って、相対細胞数を決定した。４パラメーター分析法を利用する濃度反応曲線フィッティングによって、ＥＣ５０値を算出した。
【０２１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ方法
無胸腺マウスでの皮下異種移植片モデル
雌のｎｕ／ｎｕマウス（５〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から得た。クリーンルーム条件下、ＨＥＰＡ濾過換気孔を設けたラック上に置いたＡｌｐｈａ−Ｄｒｉ／ｂｅｄ−ｏ−ｃｏｂ櫛型ベッドを備えた殺菌フィルタートップケージ中で、動物を維持した。動物に、無菌のげっ歯類用餌および水を自由に摂取させた。胸腺欠損マウスへの移植のために指定された細胞を回収し、４５０×ｇで５〜１０分間、遠心分離することによってペレット化した。細胞ペレットを１回洗浄し、無血清培地に再懸濁させた。細胞に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を補足して、腫瘍の獲得を促進した。各実験で化合物を投与する前に、細胞（１００μｌ中、５×１０６）をマウスの後側腹部にＳＣ移植し、所定の大きさに成長させた。電子キャリパーで測定することによって、腫瘍の大きさを決定し、腫瘍体積を、長さ×幅２×０．４の積として算出した。
【０２１６】
データおよび結果
【実施例１】
【０２１７】
クリゾチニブによる生化学酵素アッセイにおけるＲＯＳ１キナーゼ活性の阻害
酵素および細胞ベースのアッセイの両方で、ＲＯＳ触媒活性に対するその効果についてクリゾチニブを評価した。クリゾチニブは、０．０９７ｎＭの平均Ｋｉ値（ｎ＝４）で、組換えヒトＲＯＳ１キナーゼ（触媒ドメイン）の有効なＡＴＰ拮抗阻害薬であることが示された。
【実施例２】
【０２１８】
細胞ベースのアッセイにおけるクリゾチニブのキナーゼ活性
クリゾチニブは、構成的に活性なＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ融合タンパク質の発現をこれらの細胞においてもたらす４ｐ１５、６ｑ２２染色体転座事象を示すＨＣＣ７８細胞（Ｒｉｋｏｖａら、（２００７））において、４１ｎＭの平均ＩＣ５０値（ｎ＝１１）でＲＯＳリン酸化を用量依存的に阻害した（表１、図１）。
【０２１９】
クリゾチニブはまた、ＦＩＧ−ＲＯＳ融合を内包するＵ１３８ＭＧヒト神経膠芽細胞腫細胞（Ｃｈａｒｅｓｔら、（２００３））においてＲＯＳリン酸化を４９ｎＭの平均ＩＣ５０値（ｎ＝２）で阻害した（表１、図１）。
【０２２０】
様々なＲＯＳ−融合タンパク質を発現するように操作された３Ｔ３細胞系のパネルにおいて、クリゾチニブは、ＲＯＳリン酸化をこれらの細胞において３．４ｎＭから３６ｎＭの範囲のＩＣ５０値で阻害した（表１）。
【０２２１】
【表１】
2013032355.tif 000020
【実施例３】
【０２２２】
ＨＣＣ７８ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＲＯＳ媒介シグナル伝達の阻害および細胞アポトーシスの誘発
クリゾチニブを、ＨＣＣ７８細胞においてＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ依存性シグナル伝達経路を阻害するその能力について評価した。
【０２２３】
図３のイムノブロットに示されているとおり、クリゾチニブは、ＲＯＳリン酸化（活性化ループ）、さらに、ＳＨＰ２、ＳＴＡＴ３、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２を包含する下方のアダプターまたはシグナル伝達分子を薬物処置の３時間後には、ＨＣＣ７８細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで用量依存的に阻害した。これらのデータは、重要なシグナル伝達経路とクリゾチニブの有効な用量との相関を示した。
【０２２４】
ウェスタンブロット分析を利用して、クリゾチニブを、アポトーシスのカスパーゼ−３マーカーのその用量依存的モジュレーションについて評価した。薬物処置の３時間後に、活性化カスパーゼ−３レベルの有意な用量依存的誘発がＨＣＣ７８ＮＳＣＬＣ細胞において観察されたが（図４）、このことは、アポトーシスの上昇もまた、有効な用量レベルと相関していることを示している。
【実施例４】
【０２２５】
ヌードマウスにおける発癌性ＲＯＳ融合変異体操作された異種移植片腫瘍モデルのパネルでの経口投与後のクリゾチニブの細胞減少効果
クリゾチニブの抗腫瘍効力を、ＣＤ７４−ＲＯＳ、ヒトＮＳＣＬＣで同定されたＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳの２つの形態およびヒトＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫および胆管がんで同定されたＦＩＧ−ＲＯＳの２つの形態を包含するＲＯＳ染色体転座が関与しているヒトがん適応症を代表するＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＲＯＳ融合操作された腫瘍異種移植片モデルのパネルで評価した（Ｒｉｍｋｕｎａｓら、（２０１２）  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｊｕｎ  １．［印刷前にＥｐｕｂ］）；Ｇｕら、（２０１１）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．６（１）：ｅ１５６４０）。
【０２２６】
図５に示されているとおり、クリゾチニブは、ヒト発癌性ＲＯＳ融合変異体を内包する３Ｔ３−ＲＯＳ操作された腫瘍モデルの５種全てにおいて、７５／ｍｇ  ＰＯ  ＢＩＤの投与レジメンで、有意な細胞減少効果を示した。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したときに、マウスはクリゾチニブ処置を受け始め、約４から５日の薬物治療で、腫瘍は、５から１０ｍｍ３のサイズへと迅速に退行した。対照腫瘍は、投与開始後約７日で１５００ｍｍ３の大きさに達し、この研究での平均クリゾチニブ処置期間は約１０日であった。
【実施例５】
【０２２７】
クリゾチニブによる、ヌードマウスにおける３Ｔ３−ＣＤ７４−ＲＯＳおよび３Ｔ３−ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）異種移植片モデルでのＲＯＳリン酸化および腫瘍増殖の用量依存的阻害
クリゾチニブによるＲＯＳキナーゼ活性および腫瘍増殖の薬力学的阻害を評価するために、３Ｔ３−ＣＤ７４−ＲＯＳ腫瘍異種移植片研究をヌードマウスにおいて、複数の用量レベルで投与される経口ＢＩＤで行った。研究を通して、電子バーニヤキャリパーを利用して腫瘍体積を測定し、１０日間のクリゾチニブの経口投与の後、７時間目に腫瘍試料を採取した（定常状態）。腫瘍におけるＲＯＳリン酸化状態をＥＬＩＳＡによって定量した。
【０２２８】
図６Ｂに示されているとおり、クリゾチニブは、腫瘍増殖において用量依存的阻害を示した。９４％および６１％の腫瘍退縮が１６０ｍｇ／ｋｇ／日群（８０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）および８０ｍｇ／ｋｇ／日群（４０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）でそれぞれ観察され、７８％および５４％の腫瘍増殖阻害が、４０ｍｇ／ｋｇ／日群（２０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）および２０ｍｇ／ｋｇ／日群（１０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）でそれぞれ観察された。
【０２２９】
最後のクリゾチニブ経口投与後７時間目に、３Ｔ３−ＣＤ７４−ＲＯＳ腫瘍におけるＲＯＳリン酸化の有意な阻害が全ての治療群で観察された（図６Ａ）。
【０２３０】
３Ｔ３−ＳＬＣ３４Ａ２−ＲＯＳ（Ｌ）モデルにおいても同程度のクリゾチニブによる抗腫瘍効力が観察された（図７）。
【実施例６】
【０２３１】
式１の化合物（クリゾチニブ）の合成
ＰＬＥは、一般的にはＰＬＥ−ＡＳとして知られている、ブタ肝臓からの粗製エステラーゼ製剤としてＲｏｃｈｅによって製造され、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．を介して販売されている酵素である（ＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓからＩＣＲ−１２３として購入、硫酸アンモニウム懸濁液として販売）。この酵素は、ＣＡＳ登録では「カルボキシル酸エステルヒドロラーゼ、ＣＡＳ番号９０１６−１８−６」と分類されている。対応する酵素分類番号は、ＥＣ３．１．１．１である。酵素は、幅広い範囲のエステルの加水分解に対して広い基質特異性を有することが知られている。ｐＨ滴定器中での酪酸エチルの加水分解に基づく方法を使用して、リパーゼ活性を決定する。１ＬＵ（リパーゼ単位）は２２℃、ｐＨ８．２で１分当たりに、滴定可能な酪酸１μｍｏｌを遊離する酵素の量である。本明細書に報告されている製剤（ＰＬＥ−ＡＳ、懸濁液として）は通常、４５ＬＵ／ｍｇより高い公表されている活性（タンパク質含有率は約４０ｍｇ／ｍＬ）を有する不透明な茶色から緑色の液体として出荷される。
【０２３２】
（１Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノール
下記スキーム中に化合物（Ｓ−１）として示されている（１Ｓ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノールをスキームＢに従って、ラセミ体１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エチルアセテートの酵素加水分解、エステル化および転位を伴う化学的加水分解の組み合わせによって調製した。ラセミ体１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エチルアセテート（化合物Ａ２）は、スキームＡに従って調製した。
【０２３３】
【化１８】
2013032355.tif 000021
１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エタノール（Ａ１）：ホウ水素化ナトリウム（９０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を、２’，６’−ジクロロ−３’−フルオロ−アセトフェノン（Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔａｌｏｇ＃５２，２９４−５）（２０７ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ３ＯＨ２ｍＬ中の溶液に加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次いで、蒸発させて、無色のオイル残渣を得た。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中０→１０％のＥｔＯＡｃで溶離）によって精製して、化合物Ａ１を無色のオイル（１８０ｍｇ；０．８８ｍｍｏｌ；収率８６．５％）として得た；MS (APCI) (M-H)- 208; 1H NMR (400 MHz, クロロホルム-D) δ ppm 1.64 (d, J=6.82 Hz, 3 H) 3.02 (d, J=9.85 Hz, 1 H) 6.97 - 7.07
(m, 1 H) 7.19 - 7.33 (m, 1 H).
【０２３４】
１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エチルアセテート（Ａ２）：無水酢酸（１．４２ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．７ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を、化合物Ａ１（２．２ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２２０ｍＬ中の溶液に順次加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、次いで、蒸発させて、黄色がかったオイル残渣を得た。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中７→９％のＥｔＯＡｃで溶離）によって精製して、化合物Ａ２を無色のオイル（２．２６ｇ；９．０ｍｍｏｌ；収率８５．６％）として得た；1H NMR (400 MHz, クロロホルム-D) δppm 1.88 (d,
J=6.82 Hz, 3 H) 2.31 (s, 3 H) 6.62 (q, J=6.82 Hz, 1 H) 7.25 (t, J=8.46 Hz, 1 H)
7.49 (dd, J=8.84, 5.05 Hz, 1 H).
【０２３５】
【化１９】
2013032355.tif 000022
ｐＨ電極、オーバーヘッド撹拌機および塩基添加導管（１ＭのＮａＯＨ）を備えた５０ｍＬジャケット付きフラスコに、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．２ｍＬおよびＰＬＥ  ＡＳ懸濁液０．１３ｍＬを加えた。次いで、化合物Ａ２（０．１３ｇ、０．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴加し、生じた混合物を室温で２０時間撹拌したが、その際、１ＭのＮａＯＨを使用して、反応のｐＨを７．０に一定に維持した。反応の変換率および鏡像異性体過剰率（ｅｅ’ｓ）をＲＰ−ＨＰＬＣによって監視し、出発物質５０％が消費された後に（これらの条件下で約１７時間後に）停止した。次いで、混合物を酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出して、エステルおよびアルコールの両方をＲ−１およびＳ−２の混合物として回収した。
【０２３６】
塩化メタンスルホニル（０．０６ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）を、Ｒ−１およびＳ−２の混合物（０．４８ｍｍｏｌ）のピリジン４ｍＬ中の溶液に窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、蒸発させてオイルを得た。水（２０ｍＬ）を混合物に加え、次いで、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×２）を加えて、水溶液を抽出した。有機層を合わせ、乾燥させ、濾過し、蒸発させて、Ｒ−３およびＳ−２の混合物を得た。この混合物をさらに精製することなく、次のステップ反応で使用した。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-D) δ ppm 1.66 (d, J=7.1 Hz, 3 H) 1.84 (d, J=7.1 Hz, 3 H) 2.09 (s, 3 H)
2.92 (s, 3 H) 6.39 (q, J=7.0 Hz, 1 H) 6.46 (q, J=6.8 Hz, 1 H) 6.98 - 7.07 (m, 1
H) 7.07 - 7.17 (m, 1 H) 7.23 - 7.30 (m, 1 H) 7.34 (dd, J=8.8, 4.80 Hz, 1 H).
【０２３７】
酢酸カリウム（０．０２７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ４ｍＬ中のＲ−３およびＳ−２の混合物（０．４８ｍｍｏｌ）に、窒素雰囲気下で加えた。反応混合物を１００℃に１２時間加熱した。水（２０ｍＬ）を反応混合物に加え、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×２）を加えて、水溶液を抽出した。合わせた有機層を乾燥させ、濾過し、蒸発させて、Ｓ−２のオイル（７２ｍｇ、２ステップで収率６１％）を得た。キラリティーｅｅ：９７．６％。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-D) δ ppm 1.66 (d, J=7.1 Hz, 3 H) 2.09 (s, 3 H) 6.39 (q, J=6.8 Hz, 1 H)
7.02 (t, J=8.5 Hz, 1 H) 7.22 - 7.30 (m, 1 H).
【０２３８】
ナトリウムメトキシド（１９ｍｍｏｌ；メタノール中０．５Ｍ）を化合物Ｓ−２（４．６４ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）に窒素雰囲気下、０℃で徐々に加えた。生じた混合物を室温で４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）を加えた。冷却された反応混合物を酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液でｐＨ７まで中和した。酢酸エチル（１００ｍＬ×２）を加えて、水溶液を抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、Ｓ−１を白色の固体（４．３６ｇ、収率９４．９％）として得た；ＳＦＣ−ＭＳ：９７％ｅｅ。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-D) δ ppm 1.65 (d, J=6.8 Hz, 3 H) 5.58 (q, J=6.9 Hz, 1 H) 6.96 - 7.10 (m,
1 H) 7.22 - 7.36 (m, 1 H).
【０２３９】
５−ブロモ−３−［１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−ピリジン−２−イルアミン（ラセミ化合物）：
【０２４０】
【化２０】
2013032355.tif 000023
１．  氷浴を使用して、２，６−ジクロロ−３−フルオロアセトフェノン（１５ｇ、０．０７２ｍｏｌ）をＴＨＦ（１５０ｍＬ、０．５Ｍ）中、０℃で１０分間撹拌した。水素化アルミニウムリチウム（２．７５ｇ、０．０７２ｍｏｌ）を徐々に加えた。反応物を周囲温度で３時間撹拌した。反応物を氷浴中で冷却し、水（３ｍＬ）を滴加し、続いて、１５％ＮａＯＨ（３ｍＬ）を徐々に加えた。混合物を周囲温度で３０分間撹拌した。１５％ＮａＯＨ（９ｍＬ）、ＭｇＳＯ４を加え、混合物を濾過して、固体を除去した。固体をＴＨＦ（５０ｍＬ）で洗浄し、濾液を濃縮して、１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エタノール（１４．８ｇｍ、収率９５％）を黄色のオイルとして得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.45 (d, 3H), 5.42 (m, 2H), 7.32 (m, 1H),
7.42 (m, 1H).
【０２４１】
２．  トリフェニルホスフィン（８．２ｇ、０．０３ｍｏｌ）およびＤＥＡＤ（トルエン中４０％の溶液１３．６５ｍＬ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）中の撹拌溶液に０℃で、１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エタノール（４．５５ｇ、０．０２１ｍｏｌ）および３−ヒドロキシ−ニトロピリジン（３．３５ｇ、０．０２３ｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）中の溶液を加えた。生じた明オレンジ色の溶液を窒素雰囲気下、周囲温度で４時間撹拌したが、その時点で、全ての出発物質が消費されていた。溶媒を除去し、粗製物質をシリカゲルに乾燥状態でロードし、酢酸エチル−ヘキサン（２０：８０）で溶離して、３−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−ベンジルオキシ）−２−ニトロ−ピリジン（６．２１ｇ、０．０２１ｍｏｌ、９８％）をピンク色の固体として得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 1.8-1.85 (d, 3H), 6.0-6.15 (q, 1H),
7.0-7.1 (t, 1H), 7.2-7.21 (d, 1H), 7.25-7.5 (m, 2H), 8.0-8.05 (d, 1H).
【０２４２】
３．  ＡｃＯＨ（６５０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（５００ｍＬ）の撹拌混合物に、３−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−ベンジルオキシ）−２−ニトロ−ピリジン（９．４３ｇ、０．０２８ｍｏｌ）および鉄チップ（１５．７ｇ、０．２８ｍｏｌ）を懸濁させた。反応物を徐々に加熱して還流させ、１時間撹拌した。反応物を室温に冷却し、次いで、ジエチルエーテル（５００ｍＬ）および水（５００ｍＬ）を加えた。炭酸ナトリウムを加えることによって、溶液を慎重に中和した。合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２×１００ｍＬ）およびブライン（１×１００ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、乾燥するまで真空下で濃縮して、３−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−ベンジルオキシ）−ピリジン−２−イルアミン（９．０４ｇ、０．０２７ｍｏｌ、９９％）を薄ピンク色の固体として得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 1.8-1.85 (d, 3H), 4.9-5.2 (brs, 2H),
6.7-6.84 (q, 1H), 7.0-7.1 (m, 1H), 7.2-7.3 (m, 1H), 7.6-7.7 (m, 1H).
【０２４３】
４．  氷浴を使用して、３−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−ベンジルオキシ）−ピリジン−２−イルアミン（９．０７ｇ、０．０３ｍｏｌ）のアセトニトリル中の撹拌溶液を０℃に冷却した。この溶液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）（５．３３ｇ、０．０３ｍｏｌ）を少量ずつ加えた。反応物を０℃で１５分間撹拌した。反応物を乾燥するまで真空下で濃縮した。生じた暗色のオイルをＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶かし、シリカゲルクロマトグラフィーを介して精製した。次いで、溶媒を真空除去して、５−ブロモ−３−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−ベンジルオキシ）−ピリジン−２−イルアミン（５．８ｇ、０．０１５ｍｏｌ、５１％）を白色の結晶質の固体として得た。1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 1.85-1.95 (d, 3H), 4.7-5.0 (brs, 2H),
5.9-6.01 (q, 1H), 6.8-6.95 (d, 1H), 7.01-7.2 (t, 1H), 7.4-7.45 (m, 1H),
7.8-7.85 (d, 1H).
【０２４４】
５−ブロモ−３−［１（Ｒ）−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−ピリジン−２−イルアミン：
【０２４５】
【化２１】
2013032355.tif 000024
鏡像異性的に純粋なＲ異性体をラセミ化合物に関しての上記のとおり調製したが、その際、上記の鏡像異性的に純粋な出発物質を使用した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.74 (d, 3H), 6.40 (m, 1H), 6.52 (br s,
2H), 7.30 (m, 1H), 7.48 (m, 1H), 7.56 (s, 1H); MS m/z 382 (M+1).
【０２４６】
４−メタンスルホニルオキシ−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２）
【０２４７】
【化２２】
2013032355.tif 000025
０℃に冷却されている４−ヒドロキシ−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７．９４ｇ、３９．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（５．５４ｍＬ、３９．４５ｍｍｏｌ）を、続いて、メタンスルホニルクロリド（３．０６ｍＬ、３９．４５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４８ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。混合物に水（３０ｍＬ）を加えた。ＣＨ２Ｃｌ２（３×３０ｍＬ）で抽出し、続いて、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、溶媒を真空中で除去して、４−メタンスルホニルオキシ−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを白色の固体（１１．００ｇ、収率＞９９％）として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ4.89 (m, 1H), 3.69 (m, 2H), 3.31 (m, 2H),
3.04 (s, 3H), 1.95 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 1.46 (s, 9H).
【０２４８】
ｔｅｒｔ−ブチル−４−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］ピペリジン−１−カルボキシレート
【０２４９】
【化２３】
2013032355.tif 000026
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ヨード−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）ピペリジン−１−カルボキシレート（３）
ＮａＨ（１．２当量、０．６８ｍｍｏｌ）を４−ヨードピラゾール（０．５７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２Ｌ）中の撹拌溶液に４℃で少量ずつ加えた。生じた混合物を４℃で１時間撹拌し、次いで、４−メタンスルホニルオキシ−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル、化合物２（１．１当量、０．６３ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を１００℃に１２時間加熱した。反応物をＨ２Ｏでクエンチし、ＥｔＯＡｃで複数回抽出した。合わせた有機層を乾燥させ、濾過し、濃縮して、オレンジ色のオイルを得た。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ペンタン中５％のＥｔＯＡｃで溶離）によって精製して、化合物３を白色の固体（１４０ｇ、６６％）として得た。
【０２５０】
ｔｅｒｔ−ブチル−４−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］ピペリジン−１−カルボキシレート（４）
ビス（ピナコラト）ジボロン（１．４当量、１３４ｇ、０．５２ｍｏｌ）および酢酸カリウム（４当量、１４５ｇ、１．４８ｍｏｌ）を化合物３（１４０ｇ、０．３７ｍｏｌ）のＤＭＳＯ１．５Ｌ中の溶液に順次加えた。混合物を窒素で数回パージし、次いで、ジクロロビス（トリフェニルホスフィノ）パラジウム（ＩＩ）（０．０５当量、１２．９ｇ、０．０１８ｍｏｌ）を加えた。生じた混合物を８０℃で２時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）ベッドで濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を飽和ＮａＣｌ（５００ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中５％のＥｔＯＡｃで溶離）によって精製して、化合物４を白色の固体（５５ｇ、４０％）として得た。
【０２５１】
３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミン（１）
【０２５２】
【化２４】
2013032355.tif 000027
３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（４，４，５，５−テトラメチル−［１，３，２］ジオキサボロラン−２−イル）−ピリジン−２−イルアミン（１５．２２ｇ、３５．６４ｍｍｏｌ）および４−（４−ブロモ−ピラゾール−１−イル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１４．１２ｇ、４２．７７ｍｍｏｌ）のＤＭＥ（１４３ｍＬ）中の撹拌溶液に、Ｎａ２ＣＯ３（１１．３３ｇ、１０６９２ｍｍｏｌ）の水（３６ｍＬ）溶液を加えた。溶液を脱ガスし、窒素を３回充填した。溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（１．２５ｍｇ、１．７８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を脱ガスし、再び窒素を３回充填した。反応溶液を８７℃の油浴で約１６時間（またはボランピナコールエステルが消費されるまで）撹拌し、周囲温度に冷却し、ＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）で希釈した。反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）パッドで濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。ＥｔＯＡｃ溶液をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗製の生成物をシリカゲルカラムで、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン系（Ｂｉｏｔａｇｅ  ９０＋  Ｃｏｌｕｍｎ：平衡１００％ヘキサン６００ｍＬ、セグメント１：５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン２２５０ｍＬ、直線、セグメント２：７５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン４５００ｍＬ、直線、セグメント３：１００％ＥｔＯＡｃ４５００ｍＬ）で溶離して精製して、４−（４−｛６−アミノ−５−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−ピリジン−３−イル｝−ピラゾール−１−イル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１．８ｇ、収率６０％、純度約９５％）を０．１５のＲｆで得た（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）。MS m/e 550(M+1)+。
【０２５３】
４−（４−｛６−アミノ−５−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−ピリジン−３−イル｝−ピラゾール−１−イル）−ピペリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１．８ｇ、２１．４５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５９ｍＬ、０．２Ｍ）中の溶液に、４ＮのＨＣｌ／ジオキサン（２１ｍＬ）を加えた。溶液を一晩撹拌して、固体を形成した。固体をガラス棒で十分に粉砕し、音波処理して、固体中に捕捉されている出発物質を遊離した。追加の４ＮのＨＣｌ／ジオキサン（２１ｍＬ）を加え、室温でさらに２時間撹拌すると、ＬＣＭＳは出発物質を示さなかった。懸濁液を濾紙でライニングされたブフナー漏斗で濾過した。５％未満の生成物を含有するので、母液を取っておいた。固体を５００ｍＬビーカーに移し、固体が完全に溶けるまで、ＨＰＬＣ水を加えた。固体Ｎａ２ＣＯ３を加えることで、ｐＨを１０に調節した。またはＬＣＭＳが水性層中に生成物を示さなくなるまで、水溶液をＣＨ２Ｃｌ２（５×２００ｍＬ）で抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２溶液をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１ｍＬ）に再び溶かした粗製の生成物をシリカゲルカラムで、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅｏＨ／ＮＥｔ３系（Ｂｉｏｔａｇｅ  ４０＋Ｃｏｌｕｍｎ：平衡１００％ＣＨ２Ｃｌ２６００ｍＬ、副生成物の取得、セグメント１：１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２１２００ｍＬ、直線、セグメント２：１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２２４００ｍＬ、ステップ、セグメント３：９％ＭｅＯＨ／１％ＮＥｔ３／ＣＨ２Ｃｌ２２４００ｍＬ）で溶離して精製した。所望の画分を集めて、３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミン（７．１９ｇ、合わせた収率７５％、白色の固体）を得た。MS m/e 450 (M+1)+.  1H NMR (DMSO-d6,
400 MHz) δ7.92 (s, 1H), 7.76
(s, 1H), 7.58 (m, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.45 (m, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.10 (m, 1H),
5.55 (bs, 2H), 4.14 (m, 1H), 3.05 (m, 2H), 2.58 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.80 (d,
3H), 1.76 (m, 2H).
【０２５４】
固体生成物３−［（Ｒ）−１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロ−フェニル）−エトキシ］−５−（１−ピペリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミンをジクロロメタンに溶かし、溶媒を徐々に蒸発させて、微細な結晶質固体を生じさせた。高真空乾燥の後に、試料が、１９４℃の融点を有する単結晶多形形態Ａであることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【外国語明細書】
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