(57)【要約】【課題】抗菌性に優れたペプチド等を提供する。【解決手段】イシカワガエル(Odorrana ishikawae)の皮膚から３６個のアミノ酸からなるペプチド（palustrin-2ISb）を単離した。更に、このペプチドに基づいて２９個のアミノ酸からなる合成ペプチド（palustrin-2ISb-des-C7）を作製した。これらペプチド及び合成ペプチドは、いずれも優れた抗菌性を有することが認められた。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される２９個のアミノ酸の配列からなる合成ペプチド。
【請求項２】
配列番号２で表される３６個のアミノ酸の配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載の合成ペプチドを含む抗菌剤。
【請求項４】
請求項２に記載のペプチドを含む抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性を有するペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
カエルの皮膚から分泌される分泌液には、抗菌性を有するペプチド（抗菌ペプチドともいう）が含まれていることが知られており、この種の抗菌ペプチドについては様々な検討が行われている（特許文献１，２）。
【０００３】
本発明者らは、奄美大島と沖縄本島の固有種であるイシカワガエル(Odorrana ishikawae)について研究を行っている。イシカワガエルは、天然記念物であり、絶滅危惧ＩＢ類に分類された絶滅危惧種でもある。広島大学両生類研究施設では、そのイシカワガエルの人工繁殖に成功している。
【０００４】
イシカワガエルは、感染症に対して強い抵抗性を示すことが分かっており、本発明者らは、イシカワガエルの皮膚から９種類の抗菌ペプチドを単離、同定している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−８０６９５号公報
【特許文献２】特表２００２−５２２５５６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Iwakoshi-Ukena E, Ukena K, Okimoto A, Soga M, Okada G, Sano N, Fujii T, Sugawara Y, Sumida M. Identification and characterization of antimicrobial peptides from the skin of the endangered frog Odorrana ishikawae. Peptides 32:670-676 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）等、多剤耐性菌による院内感染が大きな社会問題となっている。抗生物質は、細菌の基質の合成を特異的に阻害するため、優れた抗菌性を発揮するが、抗生物質が乱用されると、細菌の薬剤耐性遺伝子に変異が生じ、細菌に抗生物質が作用しなくなるという問題がある。
【０００８】
それに対し、抗菌ペプチドは、抗生物質とは作用機序が異なり、耐性菌が生まれにくいということが分かってきている。そのため、抗菌ペプチドは、抗生物質の代替品として期待されている。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、抗菌性に優れ、特にＭＲＳＡに対して有効なペプチド等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、イシカワガエルの皮膚に含まれる抗菌ペプチドについて、更なる同定を進めた結果、先の９種の抗菌ペプチドとは異なる、３６個のアミノ酸からなる新たな抗菌ペプチドを単離、同定した（palustrin-2ISb）。
【００１１】
palustrin-2ISbのアミノ酸配列は、「Gly-Leu-Trp-Asn-Ser-Ile-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Lys-Leu-Phe-Val-Asn-Val-Leu-Asp-Lys-Ile-Arg-Cys-Lys-Val-Ala-Gly-Gly-Cys-Lys-Thr-Ser-Pro-Asp-Val-Glu」である（配列番号２）。
【００１２】
このpalustrin-2ISbのＣ末端側には、２個のシステインがジスルフィド結合した構造（この構造をラナボックスと称する）が存在し、そのラナボックスに続いて７つのアミノ酸が連なるという構造的な特徴が認められる。先の９種の抗菌ペプチドでもラナボックスは認められたが、ラナボックス以降に連なるアミノ酸は認められなかったことから、palustrin-2ISbのラナボックス以降の７つのアミノ酸を除去した２９個のアミノ酸からなる合成ペプチドを作製した（palustrin-2ISb-des-C7）。
【００１３】
palustrin-2ISb-des-C7のアミノ酸配列は、「Gly-Leu-Trp-Asn-Ser-Ile-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Lys-Leu-Phe-Val-Asn-Val-Leu-Asp-Lys-Ile-Arg-Cys-Lys-Val-Ala-Gly-Gly-Cys」である（配列番号１）。
【００１４】
天然ペプチドであるpalustrin-2ISbと、合成ペプチドであるpalustrin-2ISb-des-C7とについて、抗菌活性を調べたところ、いずれのペプチドにも抗菌活性が認められた。特に、palustrin-2ISb-des-C7は、palustrin-2ISbに比べて強い抗菌活性が認められた。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のペプチド等には、優れた抗菌性があるので、抗菌剤等に活用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】抗菌性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。ただし、以下の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物あるいはその用途を制限するものではない。
【００１８】
＜palustrin-2ISbの単離、同定＞
（１）抽出
奄美大島産（人工増殖体：２００４年４月７日交配）のイシカワガエル（２年４ヶ月齢：体長約６ｃｍ）の５個体を試料とした。試料のそれぞれについて、断頭後、全身の皮膚を剥がした。次に、その皮膚を直ちにハサミで細断した後、液体窒素で凍結しながら粉砕した。粉砕した皮膚は、ペプチド分解酵素を失活させるために、少量ずつ沸騰した１００ｍｌの湯の中に投入し、７分間保持した。皮膚を含む湯を氷水で冷却することにより、粗抽出液を得た。その粗抽出液に対し、容量の５％になるように酢酸を４ｍｌ加え、ハンディミキサーでホモジナイズすることにより酢酸抽出を行った。
【００１９】
更に、酢酸抽出を行った粗抽出液に対し、容量の６０％になるように冷アセトンを１２０ｍｌ加え、３０分間冷却しながら攪拌し、除タンパクを行った。その後、４℃、１００００ｇ、２０分間の条件で遠心分離することにより、粗抽出液から沈殿物を除去した。そうして得られた上清を遠心エバポレーターにより濃縮し、第１試料液を得た。
【００２０】
第１試料液は、使い捨てカラムであるＣ１８カートリッジ（ＢＯＮＤ  ＥＬＵＴ）に通し、次の各ステップの処理を行うことにより、精製に用いる保持物質（第２試料液）を得た。
【００２１】
第１ステップ：Ｃ１８カートリッジに１００％メタノールを６ｍｌ通して、活性基を活性化した。
【００２２】
第２ステップ：Ｃ１８カートリッジに０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を６ｍｌ通して、Ｃ１８カートリッジを洗浄した。
【００２３】
第３ステップ：Ｃ１８カートリッジに第１試料液を注入し、非吸着物質を溶出した。
【００２４】
第４ステップ：Ｃ１８カートリッジに０．１％ＴＦＡを１２ｍｌ通して、非吸着物質を溶出した。
【００２５】
第５ステップ：Ｃ１８カートリッジに７０％メタノールを１２ｍｌ通して、Ｃ１８カートリッジに保持されていた保持物質を溶出し、第２試料液を回収した。
【００２６】
（２）精製
第２試料液を遠心エバポレーターを用いて濃縮し、その濃縮した第２試料液を用いて逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により、５段階の処理を通じて精製を行った。ＨＰＬＣの諸条件は次の通りである。
【００２７】
カラムオーブン温度は４０℃、第２試料液の流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎとした。溶出液については２２０ｎｍの波長での吸光度をモニタリングし、２分毎の分画をサンプリングした。第２段階以降の精製は、後述する抗菌アッセイによって抗菌活性が見られた分画に対してのみ、続けて逆相ＨＰＬＣによる精製を進めた。
【００２８】
精製に用いた逆相ＨＰＬＣカラムとアセトニトリルの濃度勾配を次に示す。
・第１段階：Ｃ１８逆相カラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ  ４．６×１５０ｍｍ、東ソー株式会社製）、０−７０％アセトニトリル／３５分間
・第２段階：Ｃ１８逆相カラム（ＯＤＳ−８０ＴＭ  ４．６×１５０ｍｍ、東ソー株式会社製）、３５−６５％アセトニトリル／６０分間
・第３段階：Ｃ１８逆相カラム（ＯＤＳ‐８０ＴＭ  ４．６×１５０ｍｍ、東ソー株式会社製）、３５−４５％アセトニトリル／５０分間
・第４段階：Ｃ８逆相カラム（Ｏｃｔｙｌ−８０ＴＳ  ４．６×２５０ｍｍ、東ソー株式会社製）、３６−４６％アセトニトリル／５０分間
・第５段階（最終段階）：シアノプロピル逆相カラム（ＣＮ−８０ＴＳ  ４．６×２５０ｍｍ、東ソー株式会社製）、２２−２６％アセトニトリル／２０分間
【００２９】
（３）抗菌アッセイ
精製した各分画を乾固し、その１／５０量を５０μｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地に溶解し、試料培地を作製した。対数増殖期のＢＬ２１大腸菌を１×１０6ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）／ｍｌに希釈し、大腸菌希釈液を作製した。そして、各試料培地に５０μｌの大腸菌希釈液を混合し、９６穴マイクロプレートに入れ、３７℃で一晩培養した。なお、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地のみに５０μｌの大腸菌希釈液を混合したブランクコントロールも同じプレートで培養した。
【００３０】
一晩培養後、大腸菌希釈液を混合した各試料培地の吸光度（波長６００ｎｍ）を測定した。大腸菌が増殖すれば、培地が濁って吸光度が増加する。従って、ブランクコントロールよりも吸光度が著しく（１／２〜１／３程度）低い分画を抗菌活性のある分画として選択した。
【００３１】
（４）構造決定
精製によって最終的に得られた試料に含まれるペプチドの質量値は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  ｐｌｕｓ、島津製作所製）により測定した。また、そのペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサ（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所製）により決定した。その結果、得られたペプチド（palustrin-2ISb）のアミノ酸一次配列（１文字表記）を次に示す。
【００３２】
ＧＬＷＮＳＩＫＩＡＧＫＫＬＦＶＮＶＬＤＫＩＲ「Ｃ」ＫＶＡＧＧ「Ｃ」ＫＴＳＰＤＶＥ
【００３３】
３文字表記に変換して表すと、Gly-Leu-Trp-Asn-Ser-Ile-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Lys-Leu-Phe-Val-Asn-Val-Leu-Asp-Lys-Ile-Arg-「Cys」-Lys-Val-Ala-Gly-Gly-「Cys」-Lys-Thr-Ser-Pro-Asp-Val-Gluとなる（配列番号２）。
【００３４】
このように、palustrin-2ISbは、３６個のアミノ酸からなり、そのＣ末端側には、２つのシステイン（配列中「」で示す）がジスルフィド結合した構造（ラナボックス）が存在していることがわかった。palustrin-2ISbでは、ラナボックス以降に更に連なる７つのアミノ産（ＫＴＳＰＤＶＥの部分）が認められた。
【００３５】
本発明者らが先にイシカワガエルの皮膚から単離、同定した９種類の抗菌ペプチドにも、同様のラナボックスは認められたが、いずれもＣ末端に位置しており（非特許文献１参照）、palustrin-2ISbのように、ラナボックス以降に連なるアミノ酸は認められなかった。
【００３６】
そこで、本発明者らは、palustrin-2ISbのラナボックス以降に連なる７個のアミノ酸を削除することで抗菌活性が高まるのではないかとの仮説を立て、そのような２９個のアミノ酸の配列からなる合成ペプチド（palustrin-2ISb-des-C7）を作製した。
【００３７】
（５）合成ペプチドの作製
合成ペプチド（palustrin-2ISb-des-C7）は、ペプチド合成機（ＰＳＳＭ−８、島津製作所製）を用いて作製した。palustrin-2ISb-des-C7のアミノ酸一次配列（１文字表記）を次に示す。
【００３８】
ＧＬＷＮＳＩＫＩＡＧＫＫＬＦＶＮＶＬＤＫＩＲＣＫＶＡＧＧＣ
【００３９】
３文字表記に変換して表すと、Gly-Leu-Trp-Asn-Ser-Ile-Lys-Ile-Ala-Gly-Lys-Lys-Leu-Phe-Val-Asn-Val-Leu-Asp-Lys-Ile-Arg-Cys-Lys-Val-Ala-Gly-Gly-Cysとなる（配列番号１）。
【００４０】
（６）抗菌性の測定
天然ペプチド（palustrin-2ISb）と、合成ペプチド（palustrin-2ISb-des-C7）のそれぞれの抗菌性を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定により行った。
【００４１】
具体的には、９６穴マイクロプレートの各ウェルに、培地４９μｌ、ペプチド１μｌ（２倍希釈系列で７段階の濃度）、各菌種の菌液５０μｌを加えて混合し、３７℃で１晩静置培養した。培養後、各ウェルに対し、マイクロプレートリーダーで吸光度（波長６００ｎｍ）の測定を行うとともに、ウェル内の白濁や沈殿の有無を目視により観察し、その発育阻止効果を判定した。
【００４２】
抗菌性を評価する菌種には、大腸菌(Escherichia coli)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(ＭＲＳＡ)、真菌のカンジダ(Candida albicans)の４種を用いた。それぞれの菌種に用いた培地と接種した菌濃度を次の表１に示す。
【００４３】
【表１】
2013035782.tif 000003
【００４４】
図１に、これら菌種に対する天然のペプチド（palustrin-2ISb）及び合成ペプチド（palustrin-2ISb-des-C7）のＭＩＣの測定結果を示す。なお、ＭＩＣは微生物の発育を阻止する最も低い濃度であり、その数値が低いほど抗菌活性が強いことを意味する。また、ＮＡは、１００μＭでも抗菌活性が認められなかったことを示している。
【００４５】
同図に示すように、palustrin-2ISbは、カンジダでは１００μＭでは抗菌活性は認められなかったが、ＭＲＳＡでは１００μＭ、大腸菌及び黄色ブドウ球菌では６．３μＭで抗菌活性が認められた。また、palustrin-2ISb-des-C7は、カンジダで１００μＭ、ＭＲＳＡで１２．５μＭ、大腸菌で６．３μＭ、黄色ブドウ球菌で１．６μＭで抗菌活性が認められた。
【００４６】
ペプチド（palustrin-2ISb）、合成ペプチド（palustrin-2ISb-des-C7）の双方に抗菌活性が認められたことから、これらは抗菌剤として利用できる。抗菌剤の具体例としては、例えば、ペプチドを希釈媒体に混合して所定濃度に調整し、液状や粉状に加工して抗菌剤を作製する。そして、求める抗菌性を示す濃度以上となるように、被抗菌対象の素材に抗菌剤を添加すればよい。
【００４７】
特に、palustrin-2ISb-des-C7は、palustrin-2ISbよりも強い抗菌活性が認められ、院内感染が問題となっているＭＲＳＡに強い抗菌活性が認められたことから、ＭＲＳＡに対する抗菌剤としての利用が期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明のペプチド等は、医療分野や生活関連分野などの分野で利用でき、塗料、洗剤、食品添加物など、抗菌性が求められる用途に好適である。
【図１】
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【配列表】
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