(57)【要約】【課題】再生不良性貧血に特異的なマーカー、および当該マーカーを用いた再生不良性貧血の鑑別技術を提供すること。【解決手段】配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメント、あるいは、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントを、被験体サンプル中にて検出することによって再生不良性貧血の鑑別を容易にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を少なくとも１つ備えている、再生不良性貧血を鑑別するためのキット。
【請求項２】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ備えている、再生不良性貧血を鑑別するためのキット。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１７〜３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなる、請求項２に記載のキット。
【請求項４】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを少なくとも１つ備えている、再生不良性貧血を鑑別するためのキット。
【請求項５】
再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測するために用いられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を少なくとも１つ含んでいる、請求項１または５に記載のキットを作製するための、組成物。
【請求項７】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含んでいる、請求項２または５に記載のキットを作製するための、組成物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１７〜３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなる、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを少なくとも１つ含んでいる、請求項４または５に記載のキットを作製するための、組成物。
【請求項１０】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを、被験体サンプル中にて検出する工程を包含する、再生不良性貧血を鑑別する方法。
【請求項１１】
前記工程が、前記タンパク質に対する抗体を用いる免疫アッセイによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントを、被験体サンプル中にて検出する工程を包含する、再生不良性貧血を鑑別する方法。
【請求項１３】
前記工程が、前記遺伝子またはそのフラグメントに核酸プローブをハイブリダイズさせることによって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸プローブが、配列番号１７〜３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドからなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を、被験体サンプル中にて検出する工程を包含する、再生不良性貧血を鑑別する方法。
【請求項１６】
前記工程が、前記抗体と特異的に結合するタンパク質を用いる免疫アッセイによって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体が、汎血球減少症を呈する患者である、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測するために用いられる、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生不良性貧血を鑑別するためのマーカーおよびその利用に関するものであり、より詳細には、再生不良性貧血の診断に好適なマーカーの検出方法および当該方法に用いられるツールに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生不良性貧血（以下、ＡＡともいう。）は、汎血球減少症を呈する症候群である。一般に、再生不良性貧血は、血液中の血球数が低下していること、骨髄の細胞密度が低い（低形成）こと、他の血液疾患でないことを確認すること等によって診断される。ＡＡを、他の疾患、特に骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）と鑑別することが困難な症例が少なくない。ＡＡおよびＭＤＳを総称して骨髄不全症候群ということもあるが、これらに対する治療内容は全く異なる。一般に、ＡＡと診断されると免疫抑制剤による治療または骨髄移植が行われ、ＭＤＳと診断されると抗がん剤による治療が行われる。
【０００３】
ＡＡの５０〜７０％は免疫抑制剤が奏功する。このことから、免疫異常がＡＡの病態形成に深く関与しているといえる。一般に、自己免疫疾患において自己細胞成分に対する多種類の抗体（自己抗体）が検出され、その抗体が臨床症状と密接な関係を有することが知られている。近年、多くの自己抗体に対する抗原（自己抗原）が細胞内のタンパク質であることが明らかになっている。ＡＡ患者の血清中に存在する自己抗体を測定することによって、免疫異常のマーカーとなるタンパク質を同定しようとする研究が、これまでにいくつか報告されている。例えば、非特許文献１ではキネクチンが、特許文献１および非特許文献２ではモエシンが、非特許文献３ではＰＭＳ−１が、非特許文献４ではｈｎＲＮＰＫが、マーカータンパク質として挙げられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１４５２９９号公報（平成１８年６月８日公開）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hirano et al., Blood; 102, 4567-75, 2003
【非特許文献２】Takamatsu et al., Blood; 109, 2514-20, 2007
【非特許文献３】Hirano et al., Br J Haematol, 128; 221-223, 2004
【非特許文献４】Qi et al.,  Ann Hematol, 89, 1255-63, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上述した報告に開示されたタンパク質はあくまでも免疫異常のマーカーであり、ＡＡに特異的なマーカーとはいえない。また、特許文献１には、モエシンを用いて、自己免疫性再生不良性貧血と造血幹細胞異常性再生不良性貧血とを判別できることができる旨が開示されているが、ＡＡをＡＡ以外の疾患と識別する（すなわち、ＡＡを鑑別する）ことについて、何ら示されていない。しかも、特許文献１には、モエシンに対する自己抗体が慢性関節リウマチ患者の血清中に存在することが記載されている。すなわち、ＡＡに特異的な免疫反応の詳細はこれまで知られていない。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＡＡに特異的な診断マーカー、および当該マーカーを用いたＡＡの判別技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、serological identification of antigens by recombinant cDNA expression cloning（ＳＥＲＥＸ）法を用いて、ＡＡにおいて自己抗体が認識する分子の同定を試み、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の第１のキットは、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を少なくとも１つ備えていることを特徴としている。
【００１０】
本発明の第２のキットは、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ備えていることを特徴としている。
【００１１】
本発明の第２のキットは、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１７〜３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなることが好ましい。
【００１２】
本発明のキットは、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測するために用いられてもよい。
【００１３】
本発明の第３のキットは、再生不良性貧血を鑑別するために、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを少なくとも１つ備えていることを特徴としている。
【００１４】
本発明の第１の組成物は、第１のキットを作製するために、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を少なくとも１つ含んでいることを特徴としている。
【００１５】
本発明の第２の組成物は、第２のキットを作製するために、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含んでいることを特徴としている。
【００１６】
本発明の第２の組成物は、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１７〜３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなることが好ましい。
【００１７】
本発明の第３の組成物は、第３のキットを作製するために、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを少なくとも１つ含んでいることを特徴としている。また、本発明の第３の組成物は、第１のキットを構成する抗体を惹起するために用いられてもよい。
【００１８】
本発明の第１の方法は、再生不良性貧血を鑑別するために、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を、被験体サンプル中にて検出する工程を包含することを特徴としている。
【００１９】
本発明の第１の方法は、上記工程が、上記抗体と特異的に結合するタンパク質を用いる免疫アッセイによって行われることが好ましく、上述した第１のキットを用いて行われてもよい。
【００２０】
好ましくは、本発明の第１の方法は、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗体を被験体サンプルとインキュベートする工程、および被験体サンプルに由来するタンパク質またはそのフラグメントと上記抗体との結合が形成されているか否かを確認する工程を包含し得る。
【００２１】
本発明の第２の方法は、再生不良性貧血を鑑別するために、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントを、被験体サンプル中にて検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２２】
本発明の第２の方法は、上記工程が、上記遺伝子またはそのフラグメントに核酸プローブをハイブリダイズさせることによって行われることが好ましく、上述した第２のキットを用いて行われてもよい。
【００２３】
本発明の第２の方法において、上記核酸プローブは、配列番号１７〜３２のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドからなることが好ましい。
【００２４】
好ましくは、本発明の第２の方法は、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４もしくは１６のヌクレオチド配列からなる遺伝子またはそのフラグメントを被験体サンプルとインキュベートする工程、および被験体サンプルに由来するポリヌクレオチドと上記オリゴヌクレオチドとの結合が形成されているか否かを確認する工程を包含し得る。
【００２５】
本発明の第３の方法は、再生不良性貧血を鑑別するために、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを、被験体サンプル中にて検出する工程を包含することを特徴としている。
【００２６】
本発明の第３の方法は、上記工程が、上記タンパク質に対する抗体を用いる免疫アッセイによって行われることが好ましく、上述した第３のキットを用いて行われてもよい。
【００２７】
好ましくは、本発明の第３の方法は、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３もしくは１５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはそのフラグメントを被験体サンプルとインキュベートする工程、および被験体サンプルに由来する自己抗体と上記タンパク質またはそのフラグメントとの結合が形成されているか否かを確認する工程を包含し得る。
【００２８】
本発明の方法において、上記被験体は、汎血球減少症を呈する患者であることが好ましい。
【００２９】
本発明の方法は、再生不良性貧血の鑑別の判断基準を提供するために用いられても、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測するために用いられてもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明を用いれば、再生不良性貧血であるか否かの診断が容易になる。また、本発明を用いれば、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測する基準を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ｈＴＳ−５細胞に対する自己抗体よりもＫ５６２細胞に対する自己抗体が、ＡＡの血清中に検出されることを示す図である。
【図２】ＳＥＲＥＸによって同定された抗原に対する自己抗体がＡＡの血清中に検出されることを示す図である。
【図３】ＳＥＲＥＸによって同定された抗原がＫ５６２細胞およびＣＤ３４陽性骨髄単核細胞（bone marrow mononuclear cells、ＢＭＭＮＣ）に発現していることを示す図である。
【図４】ＨＳＰＢ１１が再生不良性貧血患者に特異的に発現していることを示す図である。
【図５】ＣＬＩＣ１、ＲＰＬ４１およびＲＰＳ２７に対するＩｇＧ型自己抗体の抗体価が、免疫抑制療法に対する奏功率とポジティブに相関することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
〔１．ＡＡを鑑別するマーカー〕
汎血球減少症を呈する再生不良性貧血（ＡＡ）では、クローナルなＴ細胞が存在し、治療に伴い消失すること、血中ＩＦＮγ濃度が上昇していること、骨髄ＣＤ３４陽性細胞でＦＡＳが発現増強していることなどが報告されている。さらに、ＡＡの治療に用いられるステロイド、シクロスポリンや抗胸腺細胞グロブリンは、Ｔ細胞を標的としている。すなわち、その病態形成に細胞性免疫が重要な役割を担っていることは、疑う余地がない。近年、自己抗体の存在も報告されているが、その標的細胞や分子に関しては、未だ不明な点が少なくない。
【００３３】
本発明者らは、ＳＥＲＥＸ法を用いて、ＡＡにおいて自己抗体が認識する抗原分子を同定し、これらの分子に対する自己抗体の認識パターンは、患者間で異なっており、極めて多彩であることを見出した。このように、本発明は、ＡＡを鑑別するに好適なマーカーを提供する。一実施形態において、本発明に用いられるマーカーはＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはそのフラグメントである。他の実施形態において、本発明に用いられるマーカーはＳＥＲＥＸ抗原タンパク質をコードする遺伝子（ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子）またはそのフラグメントである。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかであることが好ましい：（Ａ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３または１５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；（Ｂ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３または１５に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチド；（Ｃ）（Ａ）に記載のポリペプチドと８０％以上の同一性を有するポリペプチド。また、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質は、以下の（Ｄ）〜（Ｇ）のいずれかであってもよい：（Ｄ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；（Ｅ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってコードされかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチド；（Ｆ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチド；（Ｇ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドによってコードかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチド。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＳＥＲＥＸ抗原活性」は、ＳＥＲＥＸ抗原を用いて惹起される抗体との結合能が意図され、より好ましくは、ＡＡ患者の血清中に存在する自己抗体との結合能が意図される。なお、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質は、リコンビナントのヒトタンパク質であっても単離精製された天然のヒトタンパク質であってもよい。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであることが好ましい：（ａ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３または１５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３または１５に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）上記（Ａ）に記載のポリペプチドと８０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。また、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子は、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかであってもよい：（ｄ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加されたヌクレオチド配列からなりかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｆ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドでありかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｇ）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４または１６に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドでありかつＳＥＲＥＸ抗原活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用され、アミノ酸の重合体が意図される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、組換え的に生成されても、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。
【００３８】
ポリペプチド（アミノ酸）の観点で用いられる場合、「１または数個」は、当業者が、過度の実験を行うことなく、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法によって欠失、置換もしくは付加し得る程度の数が意図され、１〜３０個の範囲内であることが好ましく、２０個以下であることがより好ましく、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個（すなわち１０個以下）であることがさらに好ましく、１、２、３、４または５個（すなわち５個以下）であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリペプチドの長さに応じて、用語「１または数個」によって示されるアミノ酸数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得るとともに、過度の実験を行うことなく、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたポリペプチド」を作製し得る。また、このようなポリペプチドは、人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されず、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。そして、当業者は、本明細書中に記載の手順に従って、上記ポリペプチドが所望の活性を有しているか否かを、試行錯誤することなく確認することができる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、目的のポリペプチドについての同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがなおさらに好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、当該ポリヌクレオチドの部分断片が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用される。
【００４１】
ポリヌクレオチド（塩基）の観点で用いられる場合、「１または数個」は、１〜１００個の範囲内であることが好ましく、１〜５０個の範囲内であることがより好ましく、１〜３０個の範囲内であることがさらに好ましく、１〜１５個の範囲内であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリヌクレオチドの長さに応じて、用語「１または数個」によって示される塩基数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、目的のポリヌクレオチドについての同一性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがなおさらに好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【００４３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。
【００４６】
本発明に用いられるマーカーはＡＡの鑑別基準を提供することができるので、本発明に用いられるマーカーを利用することにより、ＡＡであるか否かの診断が容易になる。また、後述する実施例に示されるように、本発明に用いられるマーカーを利用することにより、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測する基準を提供することができるので、免疫抑制療法の効果を期待し得るか否かの診断が容易になる。
【００４７】
〔２．キット、組成物および方法〕
本発明は、ＡＡを鑑別するマーカーを検出するためのキットを提供する。本発明に係るキットは、被験体サンプル中のＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはＳＥＲＥＸ抗原遺伝子を検出するためのツールを備えていることを特徴としている。本発明に係るキットを用いて目的のマーカーを検出することによって、ＡＡを鑑別することができる。なお、「ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質」、「ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子」については、上記〔１．ＡＡを鑑別するマーカー〕の項を参照のこと。
【００４８】
本明細書中において使用される場合、「被験体サンプル」は、被験体から採取された任意の組織（血液等の体液を含む。）または細胞が意図され、これらに由来する調製物もまた被験体サンプルに包含され得る。本発明に用いるに好ましい被験体サンプルとしては、血清および骨髄が挙げられるがこれらに限定されない。なお、サンプル取得の第一段階として組織または細胞を被験体から直接取り出す工程は、医師によるものであり、本発明の範囲外である。また、本発明の方法によって得られた結果を用いて、疾患か否かの判定を下す工程もまた、医師によるものであり、本発明の範囲外である。
【００４９】
本発明の対象とされるべき被験体は、汎血球減少症を呈する患者（すなわち、ＡＡに罹患している可能性がある患者）が好ましく、ＡＡを発症している患者がより好ましいが、正常な患者であってもよい。本発明に係る方法において、上記被験体サンプルは汎血球減少症を呈する患者から採取された血清もしくは骨髄またはその培養物であることが好ましいが、これに限定されない。サンプルの取得手順は、目的に応じて適宜選択され得ることを当業者は容易に理解する。
【００５０】
一実施形態において、本発明に係るキット（第１のキット）は、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはそのフラグメントを検出するための抗体を備えている。上記抗体は、ＳＥＲＥＸ抗原に対する抗体であることが好ましい。なお、本実施形態に係るキットは、上記抗体を検出するための試薬をさらに備えていることが好ましいが、上述したように、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはそのフラグメントを検出するための抗体を含有している組成物として提供されてもよい。
【００５１】
他の実施形態において、本発明に係るキット（第２のキット）は、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子またはそのフラグメントを検出するためのオリゴヌクレオチドを備えている。上記オリゴヌクレオチドは、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであることが好ましく、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子またはそのフラグメントに対するハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーであることが好ましい。なお、本実施形態に係るキットは、上記オリゴヌクレオチドを検出するための試薬をさらに備えていることが好ましいが、上述したように、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子またはそのフラグメントを検出するためのオリゴヌクレオチドを含有している組成物として提供されてもよい。
【００５２】
さらなる実施形態において、本発明に係るキット（第３のキット）は、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはそのフラグメントを備えている。上述したように、本発明に用いられるマーカーはＡＡに特異的な自己抗体に対する抗原（自己抗原）である。被験体に上記マーカーが存在することによって惹起された自己抗体を検出すれば、ＡＡを鑑別することができる。すなわち、本発明はまた、ＡＡに特異的な自己抗体を検出するためのキットを提供する。本実施形態に係るキットは、被験体サンプル中の、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質によって惹起された自己抗体を検出するためのツールを備えていることを特徴としている。なお、本実施形態に係るキットは、上記抗体を検出するための試薬をさらに備えていることが好ましいが、上述したように、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはそのフラグメントを含有している組成物として提供されてもよい。
【００５３】
第１のキットを用いれば、目的のＳＥＲＥＸ抗原を検出することによって、ＡＡを鑑別することができる。第２のキットを用いれば、目的のＳＥＲＥＸ抗原遺伝子を検出することによって、ＡＡを鑑別することができる。第３のキットを用いれば、目的の自己抗体を検出することによって、ＡＡを鑑別することができる。このように、本発明に係る第１〜第３のキットは、ＡＡを鑑別するためのキットであることが好ましいが、ＡＡの鑑別の判断基準を提供するためのキットでもあり得る。また、後述する実施例に示されるように、本発明に用いられるマーカーを利用することにより、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測することができる。すなわち、本発明に係るキットは、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測するためのキットであり得る。
【００５４】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を、容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）に内包された態様にて備えた包装が意図されるが、組成物としての一物質中に材料を含有している形態もまた、用語「キット」に包含される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましく、指示書には、本発明の目的を達成するための手順（例えば、ＡＡを鑑別するための、上記材料の使用手順や、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測するための、上記材料の使用手順）が記載されていることが好ましい。記載されるべき手順としては、後述する方法の各工程が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に上記材料が内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、被験体サンプルを採取するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。また、本発明に係るキットは、被験体サンプルに由来する調製物を生成するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。
【００５５】
なお、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体を少なくとも１つ含んでいる組成物（第１の組成物）は、第１のキットを作製するために利用され、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含んでいる組成物（第２の組成物）は、第２のキットを作製するために利用され、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはそのフラグメントを少なくとも１つ含んでいる組成物（第３の組成物）は、第３のキットを作製するために利用される。すなわち、上述したキットを作製するための組成物もまた、本発明の範囲内である。
【００５６】
このように、本発明に係るキットは、ＡＡを鑑別するためのキットであることが好ましいが、ＡＡの鑑別の判断基準を提供するためのキットでもあり得る。また、後述する実施例に示されるように、本発明に用いられるマーカーを利用することにより、ＡＡに対する免疫抑制療法の効果を予測することができる。すなわち、本発明に係るキットは、ＡＡに対する免疫抑制療法の効果を予測するためのキットであり得、ＡＡに対する免疫抑制療法の効果を予測するための判断基準を提供するためのキットでもあり得る。
【００５７】
本発明は、ＡＡを鑑別する方法を提供する。本発明に係る方法は、上述した第１〜第３のキットを用いることが好ましい。第１のキットを用いる場合、被験体サンプル中のＳＥＲＥＸ抗原タンパク質を検出する工程を包含する。第２のキットを用いる場合、被験体サンプル中のＳＥＲＥＸ抗原遺伝子を検出する工程を包含する。第３のキットを用いる場合、被験体サンプル中の、ＳＥＲＥＸ抗原に対する自己抗体を検出する工程を包含する。
【００５８】
第１のキットを用いてＳＥＲＥＸ抗原タンパク質を検出する実施形態（第１の方法）において、ＳＥＲＥＸ抗原を検出する工程は、ＳＥＲＥＸ抗原に対する抗体を用いる免疫アッセイであり得る。また、第３のキットを用いてＳＥＲＥＸ抗原に対する自己抗体を検出する実施形態において、ＳＥＲＥＸ抗原に対する自己抗体を検出する工程は、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質またはそのフラグメントを用いる免疫アッセイであり得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫アッセイ」は、抗原抗体反応に基づいた免疫学的な結合反応を利用して行われるアッセイが意図される。免疫学的な結合反応を利用したアッセイとしては、ウエスタンブロット、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、放射性イムノアッセイ、および抗体アッセイ（例えば免疫拡散アッセイ）、ならびにアフィニティクロマトグラフィー、免疫組織化学、免疫電子顕微鏡法などが挙げられる。これらの技術は、当該分野において周知であり、当業者は、容易に本発明を実行し得る。これらの免疫アッセイは、治療前の鑑別診断に用いられることが好ましく、診断または治療の方針を速やかに決定し得る。
【００６０】
第１のキットを用いる場合、本発明の方法は、（Ｉ）ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体を被験体サンプルとインキュベートする工程、（ＩＩ）上記抗体を回収し、洗浄する工程、（ＩＩＩ）回収した上記抗体とともにＳＥＲＥＸ抗原タンパク質が存在するか否かを確認する工程、を包含する方法であり得る。また、上記（ＩＩ）に次いで、（ＩＩ’）ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体に特異的に結合する因子（例えば抗体）を洗浄後のＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体とインキュベートする工程、（ＩＩ’’）インキュベート後の上記因子を回収し、洗浄する工程、を包含してもよく、この場合、上記（ＩＩＩ）の代りに（ＩＩＩ’）ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質が上記因子とともに存在するか否かを確認する工程を包含すればよい。なお、本発明を構成する工程はこれらに限定されず、被験体サンプル中のタンパク質成分を固相（膜、ウエルなど）に固定化しておけば、上記固相をＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体とインキュベートすることによって上記（Ｉ）を実行する工程、インキュベート後の固相表面を洗浄する工程、固相表面に上記抗体が存在するか否かを確認する工程を包含すればよい。この場合、例えば、識別可能な標識化合物（例えば、蛍光物質、放射性物質など）を上記抗体に予め結合させておけば、上記標識化合物が固相表面上に存在するか否かを確認すればよい。もちろん、本発明の方法は、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体と上記標識化合物とを結合させる工程（すなわち、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体を標識する工程）をさらに包含してもよい。
【００６１】
このように、本発明の第１の方法は、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に対する抗体を被験体サンプルとインキュベートする工程、および被験体サンプルに由来するタンパク質と上記抗体との結合が形成されているか否かを確認する工程、を包含すればよいといえる。
【００６２】
第３のキットを用いる場合、本発明の第３の方法は、（Ｉ）ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質を被験体サンプルとインキュベートする工程、（ＩＩ）上記タンパク質を回収し、洗浄する工程、（ＩＩＩ）回収した上記タンパク質とともに自己抗体が存在するか否かを確認する工程、を包含する方法であり得る。また、上記（ＩＩ）に次いで、（ＩＩ’）ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質に特異的に結合する因子（例えば抗体）を洗浄後のＳＥＲＥＸ抗原タンパク質とインキュベートする工程、（ＩＩ’’）インキュベート後の上記因子を回収し、洗浄する工程、を包含してもよく、この場合、上記（ＩＩＩ）の代りに（ＩＩＩ’）自己抗体が上記因子とともに存在するか否かを確認する工程を包含すればよい。なお、本発明を構成する工程はこれらに限定されず、被験体サンプル中のタンパク質成分を固相（膜、ウエルなど）に固定化しておけば、上記固相をＳＥＲＥＸ抗原タンパク質とインキュベートすることによって上記（Ｉ）を実行する工程、インキュベート後の固相表面を洗浄する工程、固相表面に上記タンパク質が存在するか否かを確認する工程を包含すればよい。この場合、例えば、識別可能な標識化合物（例えば、蛍光物質、放射性物質など）を上記タンパク質に予め結合させておけば、上記標識化合物が固相表面上に存在するか否かを確認すればよい。もちろん、本発明の方法は、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質と上記標識化合物とを結合させる工程（すなわち、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質を標識する工程）をさらに包含してもよい。
【００６３】
このように、本発明の第３の方法は、ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質を被験体サンプルとインキュベートする工程、および被験体サンプルに由来する自己抗体と上記タンパク質との結合が形成されているか否かを確認する工程、を包含すればよいといえる。
【００６４】
第２のキットを用いてＳＥＲＥＸ抗原遺伝子を検出する実施形態（第２の方法）において、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子を検出する工程は、核酸プローブを、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子またはそのフラグメントにハイブリダイズさせる工程であり得る。本明細書中で使用される場合、「核酸プローブ」は、目的の核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定されず、いわゆるハイブリダイゼーションプローブであってもＰＣＲプライマーであってもよい。ハイブリダイゼーション技術およびＰＣＲ技術は、当該分野において周知であり、当業者は、容易に本発明を実行し得る。
【００６５】
核酸プローブは、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子（またはその相補鎖）の部分配列を含むオリゴヌクレオチドであれば特に限定されず、配列番号１７〜３２に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、核酸プローブは、上記「ＳＥＲＥＸ抗原タンパク質のフラグメント」をコードするオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００６６】
ハイブリダイゼーション技術を用いる場合、核酸プローブは、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３または１５に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列の、１５〜５０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、より好ましくは２０〜５０個、さらに好ましくは２０〜４５個、最も好ましくは２５〜４０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである。また、ＰＣＲ技術を用いる場合、核酸プローブ（ＰＣＲプライマー）は、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３または１５に示されるヌクレオチド配列またはその相補配列の、１５〜５０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、より好ましくは１５〜４０個、さらに好ましくは１５〜３５個、最も好ましくは１５〜３０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
【００６７】
なお、本実施形態に係る方法は、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子を検出する工程を包含することを特徴としているが、上述したＳＥＲＥＸ抗原タンパク質を検出する工程をさらに包含してもよい。このように、本発明の第２の方法は、ＳＥＲＥＸ抗原遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドを被験体サンプルとインキュベートする工程、および被験体サンプルに由来するポリヌクレオチドと上記オリゴヌクレオチドとの結合が形成されているか否かを確認する工程、を包含すればよいといえる。
【００６８】
このように、本発明に係る方法は、ＡＡを鑑別する方法であることが好ましいが、ＡＡの鑑別の判断基準を提供する方法でもあり得る。また、後述する実施例に示されるように、本発明に用いられるマーカーを利用することにより、ＡＡに対する免疫抑制療法の効果を予測することができる。すなわち、本発明に係る方法は、ＡＡに対する免疫抑制療法の効果を予測する方法であり得、ＡＡに対する免疫抑制療法の効果を予測するための判断基準を提供する方法でもあり得る。
【００６９】
本発明の目的は、再生不良性貧血を鑑別するマーカーを提供するとともに、当該マーカーを検出することによる再生不良性貧血の診断基準を提供することにある。またさらに、本発明の目的は、再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果を予測するためのマーカーを提供するとともに、当該マーカーを検出することによる再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の診断基準を提供することにある。本明細書を読んだ当業者は、本明細書中の記載および技術常識に基づいて、種々の形態にて本発明を実行し得ることを容易に理解する。
【実施例】
【００７０】
〔材料および方法〕
〔患者〕
再生不良性貧血の患者（１７例）、低形成性骨髄を示す不応性貧血の患者（６例）、および健常ボランティア（２０例）から血清を得た。個々の患者からインフォームドコンセントを得た。免疫抑制療法に対する反応を、Kosakaら（Blood, 111, 1054-1059 (2008)）に記載の基準を用いて評価した。
【００７１】
〔細胞培養〕
ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を、１０％ＦＢＳ（Hyclone, Logan, UT）で補完したＲＰＭＩで、５％  ＣＯ２の加湿環境下にて培養した。不死化したヒトストローマ細胞株ｈＴＳ５（札幌医科大学・小船博士より供与いただいた。）を、１２．５％ウマ血清（Gibco BRL, Rockville, MD）、１２．５％ウシ胎児血清（Gibco BRL），１×１０−６Ｍ  ヒドロコルチゾン（Sigma, St Louis, MO），および１×１０−４Ｍ  β−メルカプトエタノール（Sigma）で補完したαＭＥＭ（最小必須培地α）を用い、５％  ＣＯ２の加湿環境下にて３７℃で培養した。
【００７２】
〔フローサイトメトリー分析による自己抗体の検出〕
Ｋ５６２細胞およびｈＴＳ−５細胞をメタノールで４℃、１０分間固定し、これらのサンプルを、リン酸化緩衝液で１：２０に希釈した患者血清とインキュベートした。これらのサンプルを洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート複合体化抗ヒトＩｇＧ（Dako, Cambridgeshire, UK）とインキュベートし、EPICS XL-MCL cytometer （Beckman Coulter, Tokyo, Japan）を用いて１サンプルあたり２０，０００個の細胞を分析した。蛍光強度のカットオフ値を、２０例の健常ボランティアからのサンプルの平均＋２標準偏差を用いて決定した。
【００７３】
〔ｃＤＮＡライブラリーの構築〕
Ｋ５６２細胞から、RNeasy Plus Mini Kit（QIAGEN, Valencia, CA）を用いて、総ＲＮＡを製造業者の指示書に従い調製した。SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech, Paolo Alto, CA）を用い、抽出した総RNAからｃＤＮＡ発現ライブラリーを製造業者の指示書に従い構築した。すなわち、３μｇの総ＲＮＡを、SMART IVオリゴヌクレオチドとCDS III/3’ PCR プライマー（それぞれＳｆｉＩＡサイトとＳｆｉＩＢサイトを有する。）を用いｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをＲＮａｓｅで消化し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿にて精製した後、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。ＰＣＲ産物をプロテイナーゼＫで消化し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿法により精製し、ＳｆｉＩで消化した後に、再度フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿法にて精製した。CHROMA SPIN-400（Clontech）を用い小さなＤＮＡを除去し、エタノール沈殿により濃縮した。これを、λTripleEx2ベクター（Clontech）内へ、方向を合せて連結し、Gigapack III Gold Packaging Extract（Agilent Technology, La Jolla, CA）を用いファージ粒子中へパッケージングし、XL1-blue super competent cells（Agilent Technology）へ形質導入した。オリジナルライブラリーのサイズは、１．２×１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ）であった。
【００７４】
〔ＳＥＲＥＸ法による、自己抗原の血清学的スクリーニング〕
形質導入した細菌を、トップアガー上に１００ｍｍ  ＬＢアガープレートあたり約３，０００ｐｆｕのファージ密度でプレーティングした。プラークを、PROTRAN nitrocellulose membrane (Whatman, Kent, UK)上に転写し、一晩、１０ｍＭ  イソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で予め湿潤させ、リコンビナントタンパク質を誘導した。この転写膜を、1% ECL Advance Blocking Agent (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK; blocking buffer)を含むＴＢＳＴ（25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% Tween-20）を用い、室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。Ｋ５６２のフローサイトメトリー分析で陽性となった９名の患者から得たプール血清を、ｃＤＮＡ挿入物のないファージを用いて吸収した。これをブロッキング緩衝液で１：１００に希釈し、転写膜と４℃で一晩インキュベートした。次に、転写膜を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化抗ヒト抗体（Dako）とともにインキュベートし、洗浄した後に、TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase (Promega, Madison, WI)を用いて発色した。陽性ファージを形質導入したＢＭ２５．１  Ｅ．ｃｏｌｉからプラスミドを調製し、塩基配列を決定した後に、ヌクレオチドＢＬＡＳＴデータベースを参照し抗原を同定した。
【００７５】
〔ＳＥＲＥＸ法によって同定された抗原の発現および精製〕
ＳＥＲＥＸ法によって同定された抗原のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、pGEX-6P-1 (GE Healthcare)ベクターのBamHI-XhoI部位へクローニングし、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。これらのｃＤＮＡの増幅に用いたプライマーを表１に挙げた。
【００７６】
【表１】
2013145178.tif 000002
【００７７】
プラスミドベクターをＢＬ２１コンピテント細胞（Agilent Technology）に形質導入し、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧによりリコンビナントタンパク質を誘導した。誘導タンパク質を、Glutathione Sepharose 4B (GE healthcare)を用い製造業者の指示書に従い精製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に、抗ＧＳＴ抗体（GE healthcare）を用いたウエスタンブロッティングとクーマシーブリリアントブルー染色で、タンパク質の特異性および純度を、それぞれ確認した（データは示さず）。
【００７８】
〔ＳＥＲＥＸ法により同定された抗原の、半定量性逆転写ポリメラーゼ鎖反応解析〕
QIAGEN RNeasy kit (Qiagen, Tokyo, Japan)を用い、総ＲＮＡを抽出した。Taqman Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) を用い、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、表１に挙げたプライマーを用いＰＣＲに供した。ＧＡＰＤＨを内部標準とし、フォワードプライマー５’−ＧＣＡＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号３３）とリバースプライマー５’−ＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号３４）で増幅した。２０サイクルのＰＣＲの後に、５サイクル毎にアガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ産物を半定量した。
【００７９】
〔骨髄からのＣＤ３４陽性細胞の精製〕
健常ボランティアの腸骨陵から骨髄を吸引し、単核細胞を、Ficoll-Paque (GE Healthcare)を用い精製した。単核細胞をＦＩＴＣ複合体化抗ヒトＣＤ３４抗体（8G12, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）とインキュベートし、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄した後に、BD FACS AriaSE (Becton Dickinson) を用い、ＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ３４陰性細胞を収集した。
【００８０】
〔患者血清サンプルにおける自己抗体の検出〕
ＳＥＲＥＸ抗原（５０ｎｇ／ウエル）を、９６ウエルの酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）／放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）プレート（Corning, NY）にコーティングし、４℃で一晩静置した。このプレートを、Block Ace (DS Pharma Biomedical, Japan, Osaka)で、４℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング試薬を除去した後に、ウエルを、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０で補完したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。サンプルをウエルに添加しＲＴで３０分間インキュベートした。ウエルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後に、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体化抗ヒトＩｇＧ抗体（Dako）をウエルに加え、ＲＴで３０分間インキュベートし、ウエルを洗浄した後に、TMB Blue (DAKO)で２０分間発色し、１Ｍ硫酸で反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度を、Infinite 2000 plate reader (TECAN, Japan, Kawasaki)で測定した。参照値の作成には、抗ＧＳＴ抗体（GE-Healthcare）を用いた。２０例の健常ボランティアからのサンプルの平均＋２標準偏差を用い、カットオフ値を決定した。
【００８１】
〔結果〕
〔後天性ＡＡ血清サンプルはＫ５６２細胞と反応する〕
後天性ＡＡの免疫異常が血球を標的としていることが明らかとなっている。一方、骨髄ストローマ細胞の機能不全が、後天性ＡＡの病因に関与することも数多く報告されている。後天性ＡＡの免疫異常が、血球と骨髄ストローマ細胞のどちらを標的としているのかを調べる目的で、患者血清中の自己抗体の発現を、血球細胞株Ｋ５６２と骨髄ストローマ細胞株ｈＴＳ−５を用いＦＡＣＳ解析した。カットオフ値を、健常ボランティア血清を用い決定した。
【００８２】
結果を図１に示す。図１は、ｈＴＳ−５細胞に対する自己抗体よりもＫ５６２細胞に対する自己抗体が、ＡＡの血清中に検出されることを示している。図１Ａには、ＡＡ患者の血清中の自己抗体の発現を、標的化する細胞としてＫ５６２細胞およびｈＴＳ−５細胞を用いて、本明細書中に記載の方法に従って試験した結果を示す。図中の点線は、２１例の健常者から得た平均＋２標準偏差の値を用いて定めた、蛍光強度のカットオフ値である。図１Ｂは、各ＡＡ患者における自己抗体の発現を要約した表である。ＮＩ；健常者、ＡＡ；再生不良性貧血患者。
【００８３】
図１に示すように、サンプルの４２．９％（９／２１）がＫ５６２細胞と反応し、サンプルの１４．２％（３／２１）がｈＴＳ−５細胞と反応した。ｈＴＳ−５に対する陽性サンプルは、Ｋ５６２細胞とも反応した。これらの結果は、後天性ＡＡの免疫異常が、骨髄ストローマ細胞よりも血球細胞を標的としていることを示唆する。
【００８４】
〔ＡＡにおけるＳＥＲＥＸ抗原の同定〕
後天性ＡＡの自己抗体を同定するために、Ｋ５６２のｃＤＮＡライブラリーを作製し、ＳＥＲＥＸに供した。合計１６８個のプラークを一次スクリーニングし、３０個の免疫反応性クローンを得た。これらのクローンをさらに二次スクリーニングに供し、８個のＳＥＲＥＸ抗原を同定した。これらは、リボソームタンパク質Ｓ２７（Ｒｐｓ２７，ＮＭ＿００１０３０）、ヒートショックタンパク質ファミリーＢ  メンバー１１（ＨｓｐＢ１１，ＢＣ００５２４５）、リボソームタンパク質Ｌ４１（Ｒｐｌ４１，ＮＭ＿００１０３５２６７）、クロライド細胞内チャネル１（Ｃｌｃｉ１，ＮＭ＿００１２８８）、染色体１４オープンリーディングフレーム１５６（Ｃ１４ｏｒｆ１５６，ＮＭ＿０３１２１０）、ＮＨＰ２非ヒストン染色体タンパク質２様１（Ｎｈｐ２ｌ１，ＢＣ０９５４３９）、リコンビネーション活性化遺伝子１活性化タンパク質１（Ｒａｇ１ａｐ１，ＢＣ００９６２１）、および小核リボヌクレオタンパク質ポリペプチドＦ（Ｓｎｒｐｆ，ＮＭ＿００３０９５）であった。これらのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１，３，５，７，９，１１，１３および１５によって示され、これらをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４および１６によって示される。
【００８５】
〔ＡＡはＳＥＲＥＸ抗原に対する自己抗体を発現する〕
後天性ＡＡ患者の血清がＳＥＲＥＸ抗原に対する自己抗体を発現しているかどうかを確認するために、ＳＥＲＥＸ法により同定された抗原をクローニングし、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、これを抗原としたＥＬＩＳＡを行った。
【００８６】
結果を図２に示す。図２は、ＳＥＲＥＸによって同定された抗原に対する自己抗体がＡＡの血清中に検出されることを示す図である。ＳＥＲＥＸによって同定された抗原に対するＩｇＧ型自己抗体の発現を、本明細書中に記載の方法に従いＥＬＩＳＡによって試験した結果を示す。図中の点線は、２１例の健常者から得た平均＋２標準偏差の値を用いて定めた、蛍光強度のカットオフ値である。ＮＩ；健常者、ＡＡ；再生不良性貧血患者、ＭＤＳ；骨髄異形成症候群、ＲＡ；関節リウマチ。
【００８７】
図２に示されるように、ＣＬＩＣ１，ＨＳＰＢ１１，ＲＰＬ４１およびＲＰＳ２７に対する自己抗体は、健常ボランティア、ＭＤＳ患者または間接リウマチ患者によりも後天性ＡＡにおいて高かった。１４例のＭＤＳ患者のサンプル２つが、ＨＳＰＢ１１、ＲＰＬ４１およびＲＰＳ２７で陽性となった。これら２つの陽性サンプルは、同一の症例から得られた。表１に示されるように、ＩｇＧ型の自己抗体は、ＲＰＳ２７（配列番号１），ＨＳＰＢ１１（配列番号３），ＲＰＬ４１（配列番号５），ＣＬＩＣ１（配列番号７），ステロイドレセプターＲＮＡアクチベータステムループ相互作用ＲＮＡ結合タンパク質（ＳＲＡ−ＲＮＡＢＰ（配列番号９），Ｃ１４ｏｒｆ１５６によってコードされるタンパク質），ＮＨＰ２Ｌ１（配列番号１１），ＲＡＧ１ＡＰ１（配列番号１３），およびｓｎＲＮＰ−Ｆ（配列番号１５）に対して、ＡＡ血清サンプル中のそれぞれ５２．２％（１２／２３），３４．８％（８／２３），３０．４％（７／２３），３９．１％（９／２３），４．３％（１／２３），４．３％（１／２３），１７．４％（４／２３），および２１．７％（５／２３）が陽性であった。
【００８８】
〔ＳＥＲＥＸ法により同定された抗原は、Ｋ５６２細胞とＣＤ３４陽性血球細胞に発現している〕
ＳＥＲＥＸ法により同定された抗原を血球細胞が発現しているかどうか、ＲＴ−ＰＣＲ法で確認した。
【００８９】
結果を図３に示す。図３は、ＳＥＲＥＸ法により同定された抗原がＫ５６２細胞およびＣＤ３４陽性ＢＭＭＮＣに発現していることを示す図である。（Ａ）には、ＳＥＲＥＸ法により同定された抗原の、Ｋ５６２細胞およびｈＴＳ−５細胞における発現レベルを、本明細書中に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法で半定量した結果を示す。（Ｂ）には、健常ボランティアから回収した骨髄単核細胞を用い、ＣＤ３４陽性画分およびＣＤ３４陰性画分の、ＳＥＲＥＸ法により同定された抗原の発現レベルを、本明細書中に記載の方法に従って行った、ＲＴ−ＰＣＲ法で半定量した結果を示す。
【００９０】
図３（Ａ）に示されるように、ＳＥＲＥＸによって同定された抗原の全てが、Ｋ５６２細胞に発現している。ｈＴＳ−５細胞と比較した場合、これらの抗原のほとんどがＫ５６２細胞で、より高い発現レベルを示した。続いて、これらの抗原が健常ボランティアの血球細胞に発現されているかどうかを調べた。図３（Ｂ）に示されるように、Ｃｌｉｃ１，Ｎｈｐ２ｌ１，Ｒａｇ１ａｐ１，Ｒｐｌ４１，Ｒｐｓ２７およびＳｎｒｐｆが骨髄単核細胞に発現されていた。また、その遺伝子のほとんどが、ＣＤ３４陰性細胞よりもＣＤ３４陽性細胞において、より高いレベルで発現していた。
【００９１】
図３（Ｂ）に示すように、健常者においてＨＳＰＢ１１が発現していない。そこで、ＨＳＰＢ１１の発現が再生不良性貧血患者に特異的であるか否かを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ法での半定量を行った（図４）。具体的には、自己抗体陰性の再生不良性貧血（ＡＡ）の患者（図中１）、自己抗体陽性の骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者（図中２）、自己抗体陰性のＭＤＳの患者（図中３および４）、および健常者（図中５〜７）から得た骨髄単核球画分を用いて、ＨＳＰＢ１１の発現レベルを、本明細書中に記載の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法で半定量した。図４の上段にＨＳＰＢ１１の結果を示し、下段に内部標準として用いたＧＡＰＤＨの結果を示した。
【００９２】
図４に示されるように、ＡＡと自己抗体陽性のＭＤＳにおいて、ＨＳＰＢ１１の発現が認められた。一方、健常者と自己抗体陰性のＭＤＳにおいてはＨＳＰＢ１１の発現が認められなかった。これらの結果から、骨髄でのＨＳＰＢ１１の発現は、ＡＡまたは免疫異常を有する患者（ＭＤＳとＡＡの症状が重複する患者）を診断するに有用である。
【００９３】
〔ＣＬＩＣ１，ＲＰＬ４１およびＲＰＳ２７のＩｇＧ抗体価が免疫抑制療法に対する奏功率と相関する〕
続いて、ＩｇＭ型自己抗体の抗体価を調べたが、健常ボランティアと顕著な差異を示さなかった（表２）。
【００９４】
【表２】
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【００９５】
自己抗体の発現パターンから、ＡＡ患者は以下の４群に分類される：ＩｇＭ陽性かつＩｇＧ陽性（ケース５，２０，２２，２３）；ＩｇＭ陽性かつＩｇＧ陰性（ケース１０，１１）；ＩｇＭ陰性かつＩｇＧ陽性（ケース１，３，４，７，８，１２，１４，１６，１７，１８，１９，２１）；および、ＩｇＭ陰性かつＩｇＧ陰性（ケース２，６，９，１３，１５，２２）。自己抗体の発現パターンと免疫抑制療法に対する反応との関係を調べると、１２例の中１１例が、いずれかのＳＥＲＥＸ抗原に対するＩｇＧ型自己抗体を発現していた。一方、本研究における４例の非反応例では、ＩｇＧ型自己抗体を発現していなかった。さらに、ＩｇＧ型自己抗体の抗体価と免疫抑制療法に対する反応性との関係を調べた。
【００９６】
結果を図５に示す。図５は、ＣＬＩＣ１、ＲＰＬ４１およびＲＰＳ２７に対するＩｇＧ型自己抗体の抗体価が、免疫抑制療法に対する奏功率とポジティブに相関することを示す図である。
【００９７】
図５に示されるように、免疫抑制療法の非応答者よりも応答者において、ＣＬＩＣ１，ＲＰＬ４１またはＲＰＳ２７に対するＩｇＧ型自己抗体の抗体価は、より高かった。さらに、ＣＬＩＣ１，ＲＰＬ４１またはＲＰＳ２７に対するＩｇＧ型自己抗体の抗体価が高ければ高いほど、免疫抑制療法に対する奏功率が高かった。ＣＬＩＣ１，ＲＰＬ４１およびＲＰＳ２７の相関係数は、それぞれ０．８２８、０．８３０および０．９４９であった。以上の結果は、ＣＬＩＣ１，ＲＰＬ４１またはＲＰＳ２７に対するＩｇＧ型自己抗体の抗体価が高いほど、免疫抑制療法に対する良好な結果が予測されることを、示している。
【００９８】
〔考察〕
本研究において、後天性ＡＡにおける新規ＳＥＲＥＸ抗原を標的とする自己抗体を同定した。これらの抗原のほとんどが、Ｋ５６２細胞およびＣＤ３４陽性の骨髄単核細胞において、より強く発現していた。さらに、これらの自己抗体は、ｈＴＳ−５ストローマ細胞よりもＫ５６２血球細胞を標的としていた。
【００９９】
これらの自己抗体陽性率は、再生不良性貧血で５２．２％、骨髄不全症候群で１４．３％であった。ＭＤＳ陽性の２例は、５ｑ−症候群とＲＡＥＢ２患者であった。すなわち、これらの２例は、血球異常と免疫異常とを合併する症例であった可能性がある。現在、再生不良性貧血を診断するための血清マーカーはない。よって、ＭＤＳとＡＡ（特に、低形成骨髄で染色体異常がなく、異形成に乏しい症例）との鑑別は、困難を極める。本研究によって同定された自己抗体を測定することで、骨髄不全症候群の中で、ＡＡの鑑別（免疫学的病因を有する患者を抽出すること）が期待される。
【０１００】
ＣＬＩＣ１，ＲＰＳ２７およびＲＰＬ４１のＩｇＧ抗体価が、免疫抑制療法の反応性と高い相関性を示したことから、これらの抗体価を測定することにより、免疫抑制療法に対する効果を予測できる可能性がある。すなわち、本マーカーは、免疫抑制療法の開始や中止、あるいは骨髄移植を行う際の判断材料となることが期待できる。特に、骨髄移植を行うにはある一定の準備期間を必要とする。骨髄移植までの前治療の期間と骨髄移植の成功率との間には逆相関関係があることから、本研究で見出したマーカーは、骨髄移植を必要とする患者の予後の改善に寄与するであろう。
【０１０１】
このように、本発明は、ＡＡにおける新規な自己抗体を提供する。本発明の自己抗体は、ＡＡでの免疫抑制療法の結果を予測するに有力なツールであり得る。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明を用いれば、再生不良性貧血の鑑別、および再生不良性貧血に対する免疫抑制療法の効果の予測が容易になる。このように優れたツールを提供する本発明は、医学、薬学の分野において利用可能であり、医薬品、生化学試薬の開発に大いに寄与することができる。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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