(57)【要約】【課題】核酸検出に適したイオン化支援キット及びこれを用いた質量分析方法を提供する。【解決手段】本発明の質量分析用イオン化支援キットは、Ｆｅ２Ｏ３を含んだ酸化鉄からなるコアを有した機能性ナノ微粒子（溶液）と、クエン酸塩水溶液と、を含み、分析対象物中の核酸のイオン化を支援することを特徴とする。このイオン化支援キットを用いた質量分析方法によって得られたマススペクトルから核酸の有無や塩基鎖長を解析することができる。解析工程では、マススペクトルの質量電荷比がＦｅ２＋−２Ｈの質量で示された間隔で２つ以上存在するか否かを判定することを含む。【選択図】図１
2013011586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｅ２Ｏ３を含んだ酸化鉄からなるコアを有した機能性ナノ微粒子と、
クエン酸塩水溶液と、
を含み、かつ、分析対象物中の核酸のイオン化を支援することを特徴とするイオン化支援キット。
【請求項２】
前記微粒子は、前記コアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェルと、
前記シェルの表面に共有結合的に導入された官能基と、
を有していることを特徴とする請求項１記載のイオン化支援キット。
【請求項３】
機能性ナノ微粒子を質量分析用プレートに固定化する工程と、
分析対象物にクエン酸塩を添加する工程と、
前記プレート上に修飾した前記微粒子に前記分析対象物を近接させる工程と、
前記プレート上の前記分析対象物に向けて紫外線レーザー照射を行い、前記分析対象物のイオン化を支援する工程と、
質量分析によって得られたマススペクトルから核酸の有無や塩基鎖長を解析する工程と、
を含む質量分析方法であって、
前記微粒子はＦｅ２Ｏ３を含んだ酸化鉄からなるコアを有し、
前記解析工程では、前記マススペクトルの質量電荷比がＦｅ２＋−２Ｈの質量で示された間隔で２つ以上存在するか否かを判定することを含むことを特徴とする質量分析方法。
【請求項４】
前記解析工程では、前記マススペクトルのシグナルの総数と各シグナルにおける質量電荷比とをＮｓと（ｍ／ｚ）ｘとによって表した場合に、Ｎｓと（ｍ／ｚ）ｘとが次式で示される規則性を示すか否かを判定することを含むことを特徴とする請求項３記載の質量分析方法。
【数１】
2013011586.tif 000008
ここで、ｎとＭとは前記核酸の塩基数と質量とであり、Ｈは水素イオンの質量であり、
Ｆｅ２＋は鉄イオンの質量、ｘは１からＮｓまでの整数である。
【請求項５】
前記核酸が、分子量が１０４以下のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項３又は請求項４記載の質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸のイオン化および検出に優れたイオン化支援キット及び質量分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝情報を担う核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、遺伝子治療やオーダーメイド医療の医薬品候補化合物として利用されるとともに、血液等から人物の特定などを行う犯罪捜査や親子鑑定、感染症の病原菌の同定などに利用されている重要な天然化合物である。
【０００３】
核酸の検出は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法での増幅および蛍光法による検出が主流であるが、細胞や組織などからの核酸の抽出などの前処理工程を要する。
【０００４】
一方、近年の質量分析の発達により、微量成分の核酸を検出するために、種々のイオン化法が検討されており、例えば、エレクトロンスプレーイオン化法、マトリックス支援型脱離イオン化法（Ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）、高速原子衝撃法が挙げられる。しかしながら、これらの方法は、手法や測定条件によって、マススペクトルで生成する質量電荷比（ｍ／ｚ）が異なり、法則性がわかりにくい。従って、これらの方法を用いて試料を検出しても解析が困難であり、ＤＮＡの判断がつきにくいといった問題が指摘されていた（非特許文献１及び非特許文献２を参照）。
【０００５】
ところで、近年、直径１．３〜３ｎｍのサイズの磁気超ナノ微粒子を機能化し、生きた細胞、組織内に導入する技術が開発されている（特許文献１を参照）。また、ナノ微粒子を用いて生体試料のイオン化が可能なナノ微粒子レーザー脱離イオン化法（ｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ）と呼ばれた手法も既に提案されている（特許文献２を参照）。なお、この従来のｎａｎｏ‐ＰＡＬＤＩ法で分析可能な物質は、蛋白質、ペプチド、糖、脂質などの生体物質や、合成低分子化合物、合成ポリマーなどとされているが、今までに開発されている微粒子では核酸をイオン化することが比較的困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−１７０３２６号公報
【特許文献２】特開２００８−２６１８３７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wu J., McLuckey S.A., International Journal of Mass Spectrometry2004, 237, 197-241
【非特許文献２】横澤  勉，小野  晶，神奈川大学工学研究所所報，２００７，３０，９２−９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、ｎａｎｏ‐ＰＡＬＤＩ法に基づいて核酸の検出に特化した質量分析方法を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、この質量分析における核酸の検出に適したイオン化支援キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、機能性ナノ微粒子を含んだイオン化支援剤にクエン酸塩を加えて質量分析を行うことで、核酸のイオン化効率を上昇させることができること、得られたマススペクトルの質量電荷比（ｍ／ｚ）が特有の法則性を有すること、及びこれらの現象を利用すれば容易に核酸を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明によれば、以下の態様の発明が提供される。
（態様１）
Ｆｅ２Ｏ３を含んだ酸化鉄からなるコアを有した機能性ナノ微粒子と、
クエン酸塩水溶液と、
を含み、かつ、分析対象物中の核酸のイオン化を支援することを特徴とするイオン化支援キット。
（態様２）
前記微粒子は、前記コアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェルと、
前記シェルの表面に共有結合的に導入された官能基と、
を有していることを特徴とする態様１記載のイオン化支援キット。
（態様３）
機能性ナノ微粒子を質量分析用プレートに固定化する工程と、
分析対象物にクエン酸塩を添加する工程と、
前記プレート上に修飾した前記微粒子に前記分析対象物を近接させる工程と、
前記プレート上の前記分析対象物に向けて紫外線レーザー照射を行い、前記分析対象物のイオン化を支援する工程と、
質量分析によって得られたマススペクトルから核酸の有無や塩基鎖長を解析する工程と、
を含む質量分析方法であって、
前記微粒子はＦｅ２Ｏ３を含んだ酸化鉄からなるコアを有し、
前記解析工程では、前記マススペクトルの質量電荷比がＦｅ２＋−２Ｈの質量で示された間隔で２つ以上存在するか否かを判定することを含むことを特徴とする質量分析方法。
（態様４）
前記解析工程では、前記マススペクトルのシグナルの総数と各シグナルにおける質量電荷比とをＮｓと（ｍ／ｚ）ｘとによって表した場合に、Ｎｓと（ｍ／ｚ）ｘとが次式で示される規則性を示すか否かを判定することを含むことを特徴とする態様３記載の質量分析方法。
【数１】
2013011586.tif 000003
ここで、ｎとＭとは前記核酸の塩基数と質量とであり、Ｈは水素イオンの質量であり、
Ｆｅ２＋は鉄イオンの質量、ｘは１からＮｓまでの整数である。
（態様５）
前記核酸が、分子量が１０４以下のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする態様３又は態様４記載の質量分析方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のイオン化支援キットは、以上のように、酸化鉄ナノ微粒子とクエン酸塩とを含んでおり、質量分析の際にＦｅ３＋から変換したＦｅ２＋が核酸中のリン酸に特異的に配位することで、核酸のイオン化効率を上昇させ、核酸の検出を容易にするものである。
【００１２】
また、上記イオン化支援キットを用いた質量分析によって得られた核酸のマススペクトルの質量電荷比（ｍ／ｚ）は、ナトリウムやカリウムなどの通常のイオン付加体とは異なるＦｅ２＋付加体特有の法則性を有するので、核酸の検出を容易にする。ゆえに、試料中に複数の他の成分が核酸と共存していても、ｍ／ｚの法則性から核酸の存在を容易に検出することができる。従って、本発明の質量分析方法によれば、組織や細胞など生体試料中での微量な核酸が検出可能となり、その他、代謝解析、遺伝子治療薬やオーダーメイド薬の開発、個体識別などの鑑定に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の質量分析方法の各工程を示したフローチャートである。
【図２】本発明において酸化鉄ナノ微粒子にクエン酸塩を添加する役割を説明した図である。
【図３】実施例の質量分析法により得られたマススペクトルと従来技術（比較例１）の質量分析法により得られたマススペクトルとを示した図である。
【図４】実施例の質量分析法により得られたマススペクトルを示した図である。
【図５】実施例の質量分析法により得られたマススペクトルを示した図である。
【図６】比較例２の質量分析法により得られたマススペクトルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明するが、これらの記載は本発明の実施形態の一例（代表例）であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００１５】
（１）本発明の質量分析方法の概要
図１は本発明の質量分析方法の各工程を示したフローチャートである。図１に示すように、本発明の質量分析方法は、機能性ナノ微粒子を質量分析用プレートに塗布（固定化）する工程（工程Ｓ１）と、分析対象物にクエン酸塩水溶液を添加する工程（工程Ｓ２）と、質量分析用プレート上に修飾したナノ微粒子に分析対象物を近接させる工程（工程Ｓ３）と、質量分析用プレート上の分析対象物に向けてレーザー照射を行い、分析対象物のイオン化を支援する工程（工程Ｓ４）と、質量分析によって得られたマススペクトルから核酸の有無や種類を解析する工程（工程Ｓ５）と、を含む。
【００１６】
次に、各工程Ｓ１〜Ｓ５について詳細に説明する。
（工程Ｓ１：機能性ナノ微粒子溶液の滴下・乾燥）
工程Ｓ１の機能性ナノ粒子の塗布（固定化）は、例えば、機能性ナノ微粒子溶液を質量分析用プレートに滴下して乾燥させることで可能となる。ここで、工程Ｓ１で使用する機能性ナノ微粒子溶液は、以下のように調製されることが好ましい。先ず、溶質となる機能性ナノ微粒子として、例えば、以下の式で与えられるナノ微粒子［ｘＭ（ＯＨ）２・ｙＳｉＯ２］が挙げられる。ここで、ｘＭ（ＯＨ）２はコア成分を、ｙＳｉＯ２はシェル成分を表す。なお、詳しくは、シェル成分はコア成分の表面上に形成されるＳｉ−Ｏの層である。
【００１７】
【数２】
2013011586.tif 000004
【００１８】
上記式中、Ｍは遷移金属を示し、具体的にはＦｅである。ＸはＦ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉから選ばれるハロゲン元素を示す。ｐは２または３、ｎは０から９までの整数、ｍは９または０である。ｘおよびｙはともに１未満の正数である。
【００１９】
なお、ナノ微粒子のコア成分は、後述するクエン酸塩との適切な反応を生じるように、Ｆｅ２Ｏ３を含んだ酸化鉄から構成される。なお、この酸化鉄に含まれる成分としてＦｅ２Ｏ３のみを用いることは本発明の効果を発揮する上で好ましいが、Ｆｅ２Ｏ３は微量であっても後述のクエン酸塩と反応（Ｆｅ２＋への変換）していくため、酸化鉄中にはＦｅ２Ｏ３の以外にも、ＦｅＯやＦｅ３Ｏ４等の他の酸化鉄成分が含まれていても良い。
【００２０】
本発明の上記ナノ微粒子は、例えば、上記コアを覆うアモルファスシリカネットワークからなるシェルを調製する工程と、このシェルの表面に共有結合的に官能基を導入する工程との二段階の工程を経た手法により調製することができる。調製された機能性微粒子の平均粒子径は、３０ｎｍ以下であればよいが、好ましくは１〜２０ｎｍである。
【００２１】
なお、この最初の工程では、コア成分の表面では、Ｓｉ−Ｏが非晶質（アモルファス）状態のネットワークを形成するため、コア成分全体がＳｉ−Ｏの層に被覆された状態となる。これがナノ微粒子のシェル成分となる。ここで作られたシェル成分は、後述の官能基を共有結合的に導入するために用いられる。
【００２２】
また、核酸検出用の官能基は、核酸を構成する糖と親和性を示すことから、アミノ基が好ましい。官能基は、例えばシランカップリング剤を介して共有結合的に導入できる。特に、シランカップリング剤は、上述したように、分析対象物質と複合体を形成できるような反応性または親和性を有する官能基を有しているものが好ましく、以下の理由から、特に、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、また、本明細書ではＡＰＴＥＳとも呼ぶ。）又は３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）が好ましい。
【００２３】
また、シランカップリング剤は、それ自身が有する官能基（例えば、アミノ基）に加えてシラノール基を有するため、水酸基も導入される。なお、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、または３−アミノプロピルトリメトキシシランなどは、それ自体が水中でアルカリ性を示すために、水溶性金属塩の水溶液（例えば、塩化鉄水溶液）に混ぜるだけで核酸検出に好適なアミノ基と水酸基とを有するナノ微粒子を調製することができる。またマコーレート様構造を有する微粒子を調製することも可能である。
【００２４】
また、二段階の工程を経て微粒子を調整する上述の方法とは別に、水溶性金属塩の水溶液とシランカップリング剤をアルカリ条件下で混合する一段階の工程のみで微粒子を調製する方法（特許文献２を参照）を用いても良い。アルカリ条件下とはｐＨ７を超えるｐＨであればよいが、好ましくはｐＨ１０〜１２である。なお、水溶性金属塩としては、コア金属の塩であって水に溶解して金属イオンを生じさせるものであれば良いが、核酸検出に用いるには、塩化鉄、例えば、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏが好ましい。なお、得られたナノ微粒子をさらに焼結することによって、微粒子の粒径を調節することができる。
【００２５】
なお、工程Ｓ１の湿式沈殿法（一段階処理）を行う際には、水溶性金属塩（例えば、塩化鉄）及びシランカップリング剤（例えば、ＡＰＴＥＳ）に対して超純水を注水して、水溶性金属塩の分散処理及び沈殿物の洗浄を行うことが好ましい。また、水溶性金属塩とシランカップリング剤との仕込み比（単位はモル比）は、水溶性金属塩を１とした場合に１〜１００が好ましく、４０〜５０がさらに好ましく、約４５が最も好ましい。以上のように作製されたナノ微粒子析出物を蒸留水などで懸濁することで、機能性ナノ微粒子溶液（好ましくは飽和溶液）が調製される。ナノ微粒子を懸濁する溶液は、微粒子本体や官能基を分解・変性させないものであれば、特に限定されるものではないが、メタノール又はエタノール等のアルコールや蒸留水等の水溶液に懸濁させることが好ましい。
【００２６】
工程Ｓ１では、以上のように調整された機能性ナノ微粒子溶液を質量分析用プレートに滴下し、乾燥させる。溶液の滴下量及び乾燥温度は、分析対象試料の種類や大きさに依存するが、通常、室温程度（２５℃程度）に設定された環境で、１ｍｇ／ｍｌ濃度のナノ微粒子溶液（懸濁液）を１μｌ程度、基板上に滴下することが好ましい。
【００２７】
（工程Ｓ２：サンプル溶液へのクエン酸塩の添加）
本発明の質量分析方法では、工程Ｓ１の後に、分析対象物にクエン酸塩を添加する工程（工程Ｓ２）を行う。工程Ｓ２は、具体的には、分析対象物（核酸）を含んだサンプル溶液にクエン酸塩水溶液を添加して混合溶液の調整を行うことで達成される。
【００２８】
（工程Ｓ３：ナノ微粒子と分析対象物との近接）
次いで、上述の工程Ｓ１に従って質量分析用プレート上に修飾したナノ微粒子に分析対象物を近接させる（工程Ｓ３）。工程Ｓ３は、工程Ｓ２で調整された混合溶液を質量分析用プレート上に修飾したナノ微粒子に向けて滴下し、乾燥させることで達成される。
【００２９】
分析対象物質である核酸は、塩基と糖とリン酸とからなるヌクレオチドがリン酸エステル結合で連なった生体高分子である。糖の違い（２’位が、水素基か水酸基であるか）によって、２−デオキシリボースを持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と、リボースを持つリボ核酸（ＲＮＡ）とに分類される。本発明に用いられる核酸として、微粒子のイオン化効率の面から、その塩基数が３０以下のオリゴヌクレオチドが望ましく、その分子量が１０４以下であるものが好ましい。
【００３０】
分析対象物質の核酸は必ずしも精製された物質である必要はなく、核酸を含む試料をそのまま微粒子に添加することによって核酸とナノ微粒子とを近接させてもよい。核酸を含む試料としては、植物、動物または微生物などに由来する細胞、組織、血液や体液、またはこれらからの抽出物など核酸を含んだ生体試料が挙げられる。また、土壌や排水などから単離された試料であってもよい。
【００３１】
なお、添加するクエン酸塩としては、クエン酸を含み、微粒子のコア成分Ｆｅ３＋をＦｅ２＋にするものであればよく、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸カルシウム、クエン酸アンモニウムなどが挙げられる。クエン酸塩水溶液を調製する際には、クエン酸塩の濃度は、ナノ微粒子を沈殿させないようにするため、終濃度で０．１〜１．０ｍＭ、好ましくは、０．５〜１．０ｍＭである。
【００３２】
本発明では、以上のようにｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ法に基づいて核酸を検出する際には、酸化鉄ナノ微粒子（コア成分：Ｆｅ２Ｏ３：Ｆｅ（ＩＩＩ））をプレートに塗布させる他に、クエン酸アンモニウム等のクエン酸塩をサンプル溶液に添加することを特徴とする。
【００３３】
（従来のクエン酸の役割）
質量分析の分野において、クエン酸は、一般に、サンプル溶液中に溶存したアルカリ金属イオンをキレートするために添加される。これにより、アルカリ金属付加体を減らし、核酸を優先的にイオン化する。実験操作上、クエン酸がアルカリ金属をキレートするのは、サンプル溶液にクエン酸を添加した時（溶液状態）である。このキレート効果を発揮させるために、例えば、従来のＭＡＬＤＩ法に基づく質量分析では、クエン酸を組み合わせた専用マトリクス（３−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（つまり、３−ＨＰＡ）とＤｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｃｉｔｒａｔｅ（つまり、ＡＨＣ）との組み合わせ）が知られている（Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ａｓａｒａ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ａｌｌｉｓｏｎ，  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ＵＶ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｅｔｒａａｍｉｎｅ  Ｓｐｅｒｍｉｎｅ  ａｓ  ａ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９９，  ７１，  ２８６６−２８７０を参照）。
【００３４】
（工程Ｓ２におけるクエン酸の役割）
これに対して、本発明においてクエン酸を添加する主な役割は、次式及び図２（ａ）に示すように、酸化鉄ナノ微粒子コア成分に含まれる三価の鉄イオンＦｅ３＋（式中では、Ｆｅ（ＩＩＩ））に対してクエン酸存在下で紫外光（紫外線レーザー）を照射することで、このＦｅ３＋を二価の鉄イオンＦｅ２＋（式中では、Ｆｅ（ＩＩ））に変換することである。なお、図２（ｂ）は、図２（ａ）中に示した矩形枠部分の組成を詳しく示した図である。
【００３５】
【数３】
2013011586.tif 000005
【００３６】
これにより、図２（ｂ）に示すように、プレート上に修飾されたナノ微粒子中の鉄がＦｅ２＋として、近接した核酸骨格のリン酸２個に配位するものと考えられる。なお、本発明の手法によって質量分析を行うと、アルカリ金属付加体のシグナルが観察されず、Ｆｅ２＋付加体のみが観察されるようになる。これは、鉄イオンがナノ微粒子（固体）のコアに存在し、気相中でＦｅ（ＩＩＩ）からＦｅ（ＩＩ）に変換されるためにクエン酸がＦｅ２＋をキレートしないと推察される。但し、本発明においてもサンプル溶液中に溶存している他のアルカリ金属については、サンプル調製（溶液状態）の過程でキレートされていると推察される。
【００３７】
言い換えれば、本発明においてクエン酸塩を添加することの効果は、（１）レーザー照射反応と組み合わせて気相中でＦｅ（ＩＩＩ）をＦｅ（ＩＩ）に変換することと、（２）Ｆｅ２＋付加体以外のサンプル溶液中の他のアルカリ金属については、これらをサンプル調製段階でキレートすることと、の２つの現象を得ることであるといえる。
【００３８】
従来のＭＡＬＤＩでは、核酸専用マトリクスを用いるので、試料中に核酸以外に薬剤やペプチドが混入した場合には混入物の分析は望めない。これに対して、本発明の質量分析方法で用いる酸化鉄ナノ微粒子は、ペプチド、薬剤、配糖体、タンパク質もイオン化できるため、混合物の各成分を検出できる可能性がある。これはイオン化支援剤としての汎用性を高める。
【００３９】
但し、従来のＭＡＬＤＩでも、マトリクスの選択を正しく行えば効率よく分析対象物をイオン化できる。故に、例えば、試料が低分子のものについてはｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩに基づく本発明の手法で検出を行い、タンパク質を含む試料についてはＭＡＬＤＩで行うことが考えられる。また、未知の混合物があったときの、最初のスクリーニングとして、本発明のｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ法を用い、その後、詳細に検出したい領域をＭＡＬＤＩで行うなどの棲み分けを行えば、既存法を否定せずに、既存法と本発明のｎａｎｏ−ＰＡＬＤＩ法との双方を有効に利用して分析対象物の検出と分析とを行うことができる。
【００４０】
（工程Ｓ４：レーザー照射）
工程Ｓ３の後、質量分析用プレート上の乾燥物に向けて紫外線レーザー照射を行い、分析対象物をイオン化する（工程Ｓ４）。この工程Ｓ４は市販の質量分析装置によって行うことができる。質量分析で用いる紫外線レーザーには、例えば、窒素レーザー（３３７ｎｍ）やＹＡＧレーザー（３５７ｎｍ）が挙げられる。レーザーの強度は、１〜２０マイクロジュール（μＪ）／ｃｍ２の範囲が好ましい。
【００４１】
（工程Ｓ５：分析対象物の解析）
工程Ｓ４の後、質量分析によって得られたマススペクトルから核酸の有無を判断する（工程Ｓ５）。工程Ｓ４にて核酸をイオン化すると、上述したように、核酸内のリン酸２個からＨ＋イオンが脱離し、その部分に、１個のＦｅ２＋イオン（以下、Ｆｅ２＋とも呼ぶ。）が付与される（図２（ｂ）を参照）。これは分析対象物の中でも核酸に対して特異的に表れる事象であり、核酸のＦｅ２＋付加体の質量を測定できる他、Ｆｅ２＋の付与数から核酸の塩基鎖長を推測できる。
【００４２】
すなわち、本発明の質量分析法によって得られるマススペクトルのシグナルの総数と、各シグナルにおける質量電荷比と、をＮｓと（ｍ／ｚ）ｘとよって表した場合に、以下の関係式が成立する。
【００４３】
【数４】
2013011586.tif 000006
【００４４】
ここで、ｎとＭとは核酸の塩基数と質量とであり、Ｈは水素イオンの質量であり、
Ｆｅ２＋は鉄イオンの質量、ｘは１からＮｓまでの整数である。
【００４５】
なお、この分野の質量分析において、単にリン酸基２個に対して、Ｆｅ２＋が１個配位したマススペクトルのシグナルが１本観察されたのでは、分析対象物が核酸であるか否かを推測できず、また、元の核酸の質量が分からない。しかしながら、本手法では、元の質量［Ｍ−Ｈ］−の他に、Ｆｅ２＋が複数配位した配位シグナルが複数本Ｎｓ（上記式を参照）だけ観察される。例えば、核酸の鎖長が６塩基（ｎ＝６）であれば、［Ｍ−Ｈ］−のシグナルの他に、Ｆｅ２＋が１個、２個、又は３個配位したシグナルが１本ずつ観察される（合計４本のスペクトル）。塩基鎖長の総本数は、質量電荷比の所定の間隔のシグナル（具体的にはＦｅ２＋−２Ｈの質量（つまり約５４（＝５５．８５−２））おきのシグナル）の数から推測できる。これにより、混合サンプル溶液中の核酸の有無の判定のみならず、存在する核酸の種類を特定することができるようになる。
【実施例】
【００４６】
次に本発明の具体的な実施例を示すが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４７】
（１）ナノ微粒子の調製（露出される官能基；水酸基及びアミノ基）
微粒子は単分散に微粒子が得られる湿式沈殿法を用いた。調製に際して、上述した金属塩水溶液とシランカップリング剤の材料として、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏと３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いて、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）をコア成分とするマコーレート様構造を持つナノ微粒子を調製した（Ｆｅ−Ｏ）。より詳しくは、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２ｇを秤量し１００ｍｌの超純水に溶解させて（終濃度１０ｍＭ）、水溶液を得た。さらに、この水溶液を室温で約１０分、充分攪拌したのち、１００ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）混合させ６０分間反応を完結させた。その後、この溶液を６０分間遠心分離器に掛け上澄み液を捨て、超純水を注いで再分散させてから遠心分離器に掛け上澄み液を捨てる操作を数回繰り返し、沈殿物を洗浄した。ついで、約７７℃に保持した恒温槽で乾燥後、乳鉢で微粉砕して酸化鉄ナノ微粒子を得た。この場合の水溶性金属塩とシランカップリング剤との仕込み比は、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ：ＡＰＴＥＳ＝１：４５とした。
【００４８】
（２）ナノ微粒子溶液の調製
上記（１）で得られた酸化鉄ナノ微粒子粉末を、蒸留水０．５ｍｌに懸濁し、ナノ微粒子析出物を有するナノ微粒子飽和液を調製した。
【００４９】
（３）核酸水溶液の調製
オリゴヌクレオチドを蒸留水で溶解して核酸水溶液を調整した。ここでは、以下の表１に示すように、７種類のオリゴヌクレオチド（終濃度各１００  ｐｍｏｌ／μＬ）を用意して、７種類の核酸水溶液を調製した。尚、表中（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｇ）の核酸の種類はＤＮＡであり、一方（ｂ）及び（ｆ）の核酸の種類はＲＮＡである。
【００５０】
【表１】
2013011586.tif 000007
【００５１】
（４）ナノ微粒子による質量分析
酸化鉄ナノ微粒子溶液を質量分析専用プレート（Ｖ７００８１３；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）に１μＬ滴下し真空乾燥させた。乾燥後、上記（３）で調製した核酸水溶液とクエン酸２アンモニウム（ＡＣＨ）水溶液（終濃度１ｍＭ）の混合溶液１μＬを質量分析専用プレートに滴下し、自然乾燥させた。その後、質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＲＰ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）によりレーザー照射を行い、サンプル検出を行った。
【００５２】
（塩基数ｎ＝６の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）に対する本発明手法による質量分析）
上記核酸水溶液（ａ）及び（ｂ）に対して本発明の質量分析を実施して得られた質量電荷比のマススペクトルを図３（ａ）及び（ｃ）に示す。ここで、マススペクトルとは、図３の各図中に示された質量電荷比（ｍ／ｚ）の強度曲線全体を指し、シグナルとは、マススペクトルのうち、強度が顕著に変化（上昇）している部分を指す。この点、図４及び図５の説明においても同様である。
【００５３】
先ず、図３（ａ）は、塩基数ｎ＝６（この場合、ｎは偶数）の核酸水溶液（ＤＮＡ）を用いた結果である。図３（ａ）では、質量電荷比（ｍ／ｚ）が［Ｍ−Ｈ］−に相当するシグナルの他、［Ｍ＋Ｆｅ２＋−３Ｈ］−、［Ｍ＋２Ｆｅ２＋−５Ｈ］−、及び［Ｍ＋３Ｆｅ２＋−７Ｈ］−に相当する合計４本のシグナルが観測された。この結果より、塩基数とシグナルの総数とをそれぞれｎ、ＮｓとするとＮｓ＝（ｎ）／２＋１＝４の関係が成立していることが分かる（上述の数４の上段の式を参照）。
【００５４】
一方、各シグナルの順序ｘに対応した質量電荷比（ｍ／ｚ）ｘで表現すると、（ｍ／ｚ）ｘ＝1＝［Ｍ−Ｈ］−、（ｍ／ｚ）ｘ＝2＝［Ｍ＋Ｆｅ２＋−３Ｈ］−、（ｍ／ｚ）ｘ＝3＝［Ｍ＋２Ｆｅ２＋−５Ｈ］−、及び（ｍ／ｚ）ｘ＝4＝［Ｍ＋３Ｆｅ２＋−７Ｈ］−となる。この結果より、上述の数式（数４の下段の式）に示す関係が成立していることが分かる。
【００５５】
また、各シグナルの（ｍ／ｚ）ｘの質量間隔（図３（ａ）中、隣接するシグナルの間隔）はＦｅ２＋−２Ｈの質量である約５４の質量間隔に対応していることが分かる。
【００５６】
図３（ｃ）に示す塩基数ｎ＝６（ｎは偶数）の核酸水溶液（ＲＮＡ）の場合も同様に、合計４つのシグナル（つまり、Ｎｓ＝４）が観測され、質量電荷比を上述のｎ＝６のＤＮＡの場合と同様に（ｍ／ｚ）ｘで表現することができ、上述の数式（数４の上段と下段の式）の関係が成立することが分かった。
【００５７】
（比較例１  塩基数ｎ＝６の核酸に対する従来手法による質量分析）
これらの結果と比較するため、上記核酸水溶液（ａ）及び（ｃ）に対して従来のマトリックス支援型（ＭＡＬＤＩ）法の質量分析手法を実施して得られた結果を図３（ｂ）及び（ｄ）に示す。
【００５８】
これらの比較例の核酸水溶液の作製にあたっては、３−ヒドロキシピコリン酸粉末１０ｍｇを９９０μＬに溶解し、クエン酸２アンモニウム（１００ｍｇ／ｍＬ）水溶液１０μＬを添加したものをマトリックスとした。該マトリックス溶液を質量分析専用プレート（Ｖ７００８１３；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）に１μＬ滴下し自然乾燥させた。乾燥後、前述の核酸１μＬを滴下し自然乾燥させ共結晶体を調製した。その後、質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＲＰ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社）によりＬｉｎｅａｒ  Ｎｅｇａｔｉｖｅモードでサンプル解析を行った。
【００５９】
図３（ｂ）及び図３（ｄ）では、通常観察される脱プロトン体（各図中、［Ｍ−Ｈ］−のシグナル）と、ナトリウム及びカリウム付加体のシグナルは検出されたが、上述したような法則性（上記数式（数４）に示す関係）を示さなかった。言い換えれば、従前の手法と異なり、核酸溶液に対して本発明の分析手法を適用すると上記の法則性が表れてくるため、本発明の分析手法はサンプル溶液中の核酸の有無を判断したり、核酸の種類を特定したりすることができるのである。
【００６０】
以上、表１中の（ａ）及び（ｂ）の核酸水溶液に対して本発明の質量分析手法を適用し、これらの結果を図３の（ａ）及び（ｃ）に示しながら説明を加えた。次に、表１中の（ｃ）〜（ｇ）の核酸水溶液に対して本発明の質量分析手法を適用した結果を図４及び図５に示す。
【００６１】
先ず、図４（ａ）は、塩基数ｎ＝８（ｎは偶数）のＤＮＡ水溶液に対する本発明の質量分析結果である。この図４（ａ）では、（ｍ／ｚ）が［Ｍ−Ｈ］−に相当するシグナルの他、［Ｍ＋Ｆｅ２＋−３Ｈ］−、［Ｍ＋２Ｆｅ２＋−５Ｈ］−、［Ｍ＋３Ｆｅ２＋−７Ｈ］−、及び［Ｍ＋４Ｆｅ２＋−９Ｈ］−に相当する合計５本のシグナル（つまり、Ｎｓ＝５）が、図３（ａ）及び（ｃ）と同様の質量間隔（つまり質量約５４）で観測された。また、上述のｎ＝６のＤＮＡの場合（図３（ａ）の場合）と同様に（ｍ／ｚ）ｘで表現することができ、上述の数式（数４の上段と下段の式）の関係が成立することが分かった。
【００６２】
次に、図４（ｂ）は、塩基数ｎ＝９（ｎは奇数）のＤＮＡ水溶液に対する本発明の質量分析結果である。この図４（ｂ）では、（ｍ／ｚ）が［Ｍ−Ｈ］−に相当するシグナルの他、［Ｍ＋Ｆｅ２＋−３Ｈ］−、［Ｍ＋２Ｆｅ２＋−５Ｈ］−、［Ｍ＋３Ｆｅ２＋−７Ｈ］−、及び［Ｍ＋４Ｆｅ２＋−９Ｈ］−に相当する合計５本のシグナルが、図３（ａ）及び（ｃ）と同様の質量間隔（つまり質量約５４）で観測された。この結果より、塩基数とシグナルの総数とをそれぞれｎ、ＮｓとするとＮｓ＝（（ｎ−１）／２）＋１＝５の関係が成立していることが分かる（上述の数４の中段の式を参照）。加えて、上述のｎ＝６のＤＮＡの場合（図３（ａ）の場合）と同様に（ｍ／ｚ）ｘで表現することができ、上述の数式（数４の下段の数式）の関係が成立することが分かった。
【００６３】
また、図４（ｃ）は、塩基数ｎ＝１０（ｎは偶数）のＤＮＡ水溶液に対する本発明の質量分析結果である。この図４（ｃ）では、（ｍ／ｚ）が［Ｍ−Ｈ］−に相当するシグナルの他、［Ｍ＋Ｆｅ２＋−３Ｈ］−、［Ｍ＋２Ｆｅ２＋−５Ｈ］−、［Ｍ＋３Ｆｅ２＋−７Ｈ］−、［Ｍ＋４Ｆｅ２＋−９Ｈ］−及び［Ｍ＋５Ｆｅ２＋−１１Ｈ］−に相当する合計６本のシグナル（つまり、Ｎｓ＝６）が、図３（ａ）及び（ｃ）と同様の質量間隔（つまり質量約５４）で観測された。また、上述のｎ＝６のＤＮＡの場合（図３（ａ）の場合）と同様に（ｍ／ｚ）ｘで表現することができ、上述の数式（数４の上段と下段の式）の関係が成立することが分かった。
【００６４】
また、図４（ｄ）は、塩基数ｎ＝１２（ｎは偶数）のＤＮＡ水溶液に対する本発明の質量分析結果である。この図４（ｄ）では、（ｍ／ｚ）が［Ｍ−Ｈ］−に相当するシグナルの他、［Ｍ＋Ｆｅ２＋−３Ｈ］−、［Ｍ＋２Ｆｅ２＋−５Ｈ］−、［Ｍ＋３Ｆｅ２＋−７Ｈ］−、［Ｍ＋４Ｆｅ２＋−９Ｈ］−、［Ｍ＋５Ｆｅ２＋−１１Ｈ］−及び［Ｍ＋６Ｆｅ２＋−１３Ｈ］−に相当する合計７本のシグナル（つまり、Ｎｓ＝７）が、図３（ａ）及び（ｃ）と同様の質量間隔（つまり質量約５４）で観測された。また、上述のｎ＝６のＤＮＡの場合（図３（ａ）の場合）と同様に（ｍ／ｚ）ｘで表現することができ、上述の数式（数４の上段と下段の式）の関係が成立することが分かった。
【００６５】
また、図５は、塩基数ｎ＝１０（ｎは偶数）のＲＮＡ水溶液に対する本発明の質量分析結果である。この図５では、（ｍ／ｚ）が［Ｍ−Ｈ］−に相当するシグナルの他、［Ｍ＋Ｆｅ２＋−３Ｈ］−、［Ｍ＋２Ｆｅ２＋−５Ｈ］−、［Ｍ＋３Ｆｅ２＋−７Ｈ］−、［Ｍ＋４Ｆｅ２＋−９Ｈ］−、及び［Ｍ＋５Ｆｅ２＋−１１Ｈ］−に相当する合計６本のシグナル（つまり、Ｎｓ＝６）が図３（ａ）及び（ｃ）と同様の質量間隔（つまり質量約５４）で観測された。また、上述のｎ＝６のＤＮＡの場合（図３（ａ）の場合）と同様に（ｍ／ｚ）ｘで表現することができ、上述の数式（数４の上段と下段の式）の関係が成立することが分かった。
【００６６】
以上のように、本発明の質量分析を行った各オリゴヌクレオチドは効率よくイオン化され、分析に依って得られたＮｅｇａｔｉｖｅイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）は、前記（１）の式で表現される法則性を有したＦｅ２＋付加体が観察されることが分かった。従って、この法則性を利用すれば、サンプル溶液中での核酸の有無や存在する核酸の種類の特定が可能になる。
【００６７】
（比較例２）
核酸以外の成分（物質）を、酸化鉄ナノ微粒子を用いて、実施例１と同様に質量分析を行った。試料は、Ｎｅｇａｔｉｖｅイオンとして、（ａ）タウロコール酸ナトリウム（牛胆汁由来、Ｍ＝５３７．４）と、（ｂ）ポリエチレングリコール  ６００スルファート（平均分子量Ｍ＝６００）との２種類を、Ｐｏｓｉｔｉｖｅイオンとして、（ｃ）ペプチドのサブスタンスＰ（Ｍ＝１３４７．６）の１種類を用いた。三種類の各サンプル（ａ）〜（ｃ）の終濃度は１００ｐｍｏｌ／μＬとした。各サンプル（ａ）〜（ｃ）に対する質量分析によって得られたマススペクトルを図６（ａ）〜（ｃ）に示す。図６の各グラフに示すように、得られたマススペクトルのｍ／ｚには、Ｆｅ２＋の付加体を観察することはできなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明のイオン化支援キットは、質量分析において核酸の効率的なイオン化を支援する。また、本発明の質量分析方法によって得られたマススペクトルの質量電荷比（ｍ／ｚ）は、特有の法則性を示すことにより、混合物中の微量な核酸の検出を容易にする。従って、本発明は、代謝解析、遺伝子治療薬やオーダーメイド薬の開発、個体識別などの鑑定に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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