(57)【要約】【課題】エンドセリン作用抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するエンドセリン作用抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤。2013032311.tif 000012（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するエンドセリン作用抑制剤。
【化１】
2013032311.tif 000009
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表す。）
【請求項２】
下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する美白剤。
【化２】
2013032311.tif 000010
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表す。）
【請求項３】
下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する皮膚外用剤。
【化３】
2013032311.tif 000011
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリン作用抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリンは、内皮細胞由来のペプチドホルモンで、受容体を通して種々の細胞や組織に作用する。例えば、血管平滑筋細胞等において細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。
近年、エンドセリンが表皮メラノサイト（メラニン細胞）に対し細胞内カルシウム濃度上昇を促し、細胞内のシグナル伝達系を介して細胞増殖を促進するとともに、メラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼの活性を増強することが報告されている（非特許文献２参照）。また、エンドセリンは表皮角化細胞（ケラチノサイト）が産生するメラノサイト活性化因子の１つであること（非特許文献３）、紫外線誘導性色素沈着や老人性色素斑形成の重要な要因であることが報告されている（非特許文献４、５）。
このようなエンドセリンの生体作用から、エンドセリンの作用を抑制しうる物質はメラニン生成や色素沈着等の改善や予防に有用であることが十分予想される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Hirata  Y.  et  al.  (1988)  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  154,  868-875
【非特許文献２】Yada  et  al.  (1991)  J.  Biol.  Chem.  266,  18352-18357
【非特許文献３】Imokawa  et  al.  (1992)  J.  Biol.  Chem.  267,  24675-24680
【非特許文献４】Imokawa  et  al.  (1995)  J.  Invest.  Dermatol.  105,  32-37
【非特許文献５】Kadono  et  al.  (2001)  J.  Invest.  Dermatol.  116,  571-577
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、エンドセリンの作用を効果的に抑制するエンドセリン作用抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、エンドセリンの作用を抑制しメラニン生成を抑制しうる美白剤及び皮膚外用剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は上記課題に鑑み、エンドセリンの作用を抑制する新規物質を探求すべく鋭意検討を行った。その結果、下記一般式（１）で表される化合物が、エンドセリンの作用によって引き起こされるメラノサイト内のカルシウム（イオン）濃度上昇を効果的に抑制することを見出し、該化合物が新規の美白成分として有用であるとの知見を得た。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００６】
すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有するエンドセリン作用抑制剤に関する。
【０００７】
【化１】
2013032311.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表す。）
【０００９】
また、本発明は、前記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する美白剤に関する。
さらに、本発明は、前記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する皮膚外用剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のエンドセリン作用抑制剤は、優れたエンドセリン作用抑制効果を奏し、エンドセリンによるメラノサイト内のカルシウム濃度上昇を効果的に抑制することができる。また、本発明の美白剤及び皮膚外用剤は、メラノサイトに対するエンドセリンの作用を抑制し、メラニン生成を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１の参考例において、ジャーマンカミツレ抽出物を添加した系での細胞内カルシウム濃度上昇率（相対値％）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエンドセリン作用抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤は、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分として含有する。後述の実施例で実証するように、当該化合物は優れたエンドセリン作用抑制効果を有する。
【００１３】
【化２】
2013032311.tif 000003
【００１４】
一般式（１）中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４のアルキル基を表す。炭素原子数１〜４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、sec-ブチル基、t−ブチル基が挙げられる。なかでも、Ｒは水素原子又はメチル基であることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。
本発明のエンドセリン作用抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤は、前記一般式（１）で表される化合物の塩を有効成分としてもよい。塩としては特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン等のアルキルアミン塩及び４級アンモニウム塩、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン等のアルカノールアミン塩、又はリジン、ヒスチジン、アルギニン等のアミノ酸塩などが挙げられ、好ましくは、アルカリ金属塩、アルカノールアミン塩、アミノ酸塩である。（以下、「一般式（１）で表される化合物又はその塩」を纏めて、単に一般式（１）で表される化合物ともいう。）
【００１５】
前記一般式（１）で表される具体的な化合物としては、下記の化合物が示される。しかし、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、下記の例示化合物においてＭｅはメチル基を表す。
【００１６】
【化３】
2013032311.tif 000004
【００１７】
前記一般式（１）で表される化合物は、化学合成により製造することも、天然物由来の材料から抽出・精製等して得ることもできる。
【００１８】
前記一般式（１）で表される化合物を化学合成する方法としては、例えば前記例示化合物（１−ａ）は、下記文献１）〜３）を参考に合成することができる。具体的には、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの縮合剤を使用し、水酸基をベンジル基で保護した6−メトキシ−2−メチル−4−ヒドロキシ安息香酸とレカノール酸を縮合後、生成物のベンジル基を脱保護することにより合成することができる（下記文献２参照）。
１）Synthesis  of  orcinol  tridepsides  and  aphthosin,  an  orcinol  tetradepside.  Bryan,  Anthony  J.;  Elix,  John  A.;  Norfolk,  Susan.  Australian  Journal  of  Chemistry  (1976),  29(5),  1079-86.
２）Synthesis  of  lichen  tridepsides.  Jayalakshmi,  V.;  Neelakantan,  Sankara;  Seshadri,  Tiruvenkata  R.  Indian  Journal  of  Chemistry  (1969),  7(1),  56-8.
３）Lichen  substances.  LXXV.  Synthesis  of  gyrophoric  acid.  2.  Umbilicarinic  and  umbilicaric  acid.  Asahina,  Yasuhiko;  Yosioka,  Itiro.  Berichte  der  Deutschen  Chemischen  Gesellschaft  [Abteilung]  B:  Abhandlungen  (1937),  70B  200-6.
【００１９】
植物等の天然素材から抽出・単離する方法としては、特に限定されないが、例えば、植物等を適当な溶媒を用いて抽出し、得られた抽出物からクロマトグラフィー等の手法により前記一般式（１）で表される化合物を単離する方法が挙げられる。植物等の天然素材としては、例えば、地衣類のイワタケ（岩茸、石茸、学名：Umbilicaria esculenta）を用いることができる。抽出溶媒としては、植物成分の抽出に通常用いられるものを使用でき、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他オイル等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。また抽出条件も通常の条件を適用でき、一例として、植物を０〜１００℃で数分間〜数週間程度浸漬又は加熱還流することが挙げられる。
【００２０】
本発明のエンドセリン作用抑制剤、美白剤及び皮膚外用剤においては、有効成分として前記一般式（１）で表される化合物を単独で用いてもよく、２種以上混合して用いてもよい。
【００２１】
後述の実施例で実証しているように、前記一般式（１）で表される化合物は、エンドセリンによるメラノサイトのカルシウム濃度上昇を効果的に抑制することができる。さらに、当該化合物は、メラノサイトに対するエンドセリンの作用を抑制することでメラニン生成を抑制しうるため、美白効果を奏する。なお、本発明において「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【００２２】
本発明において、前記一般式（１）で表される化合物は、そのままエンドセリン作用抑制剤又は美白剤として用いてもよい。また、当該化合物に、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えて用いてもよい。この場合、剤中に含有される前記一般式（１）で表される化合物の量は特に制限されないが、前記一般式（１）で表される化合物が０．００００１〜５質量％含まれることが好ましく、０．００００１〜３質量％含まれることがより好ましく、０．０００１〜３質量％含まれることが特に好ましい。
【００２３】
本発明のエンドセリン作用抑制剤又は美白剤には、前記一般式（１）で表される化合物に加え、他の薬効成分を加えてもよい。例えば、その他の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、色材種等を加えることができる。他の薬効成分とともに組成物として用いる場合、剤中に含有される前記一般式（１）で表される化合物の量は特に制限されないが、前記一般式（１）で表される化合物が０．００００１〜５質量％含まれることが好ましく、０．０００１〜５質量％含まれることがより好ましく、０．０００１〜３質量％含まれることが特に好ましい。
【００２４】
本発明のエンドセリン作用抑制剤及び美白剤は、皮膚外用剤の形態で使用することができる。「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚に適用されるものを意味し、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
皮膚外用剤の形態で使用する場合には、前記一般式（１）で表される化合物の他、通常の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、高分子化合物、防腐剤、前記以外の薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。また、前記一般式（１）で表される化合物を含有する皮膚外用剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ２当たり０．１〜５μｇ、液状製剤の場合、同じく０．１〜１０μｇ使用するのが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２６】
製造例１
例示化合物（１−ａ）：ウンビリカル酸の単離
イワタケ（新和物産社製）５ｇに９５％エタノール水溶液１００ｍＬを加え、４０℃で１週間抽出後、ろ過し、イワタケ抽出物８８ｍＬ（固形分０．２５ｇ）を得た。この抽出物３２ｍｇを分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ３  １０＊５００ｍｍ、）で分画し、成分Ａ  ２．００ｍｇ（抽出物固形分からの収率６．２５％）を得た。
単離した成分Ａの構造解析は、ＮＭＲにより行った。ＮＭＲによる構造解析の結果を表１に示す。その結果、単離成分ＡのＮＭＲスペクトルデータ（単離成分ＡはＤＭＳＯ−ｄ６  ０．５０ｍＬに溶解後測定）から、当該成分が例示化合物（１−ａ）の構造を有することがわかった。また、文献で報告されているウンビリカル酸のスペクトルデータ（Phytochemistry,  Vol48.,  No5,  P815-822）とほぼ一致したことから、単離された成分は、ウンビリカル酸であると同定した。
なお、表中のＭｅはメチル基を表す。各水素原子の番号は結合している炭素原子の番号を示している。また、水酸基の水素原子の場合、酸素原子の結合する炭素原子の番号を示している。
【００２７】
【表１】
2013032311.tif 000005
【００２８】
製造例２
例示化合物（１−ｂ）：ギロホール酸の単離
製造例１で得た抽出物３２ｍｇを分取ＨＰＬＣで分画し、成分Ｂ  ４．５０ｍｇ（抽出物固形分からの収率１４．０６％）を得た。
単離した成分Ｂの構造解析は、ＮＭＲにより行った。ＮＭＲによる構造解析の結果を表２に示す。単離成分ＢのＮＭＲスペクトルデータ（単離成分ＢはＤＭＳＯ−ｄ６  ０．４５ｍＬと２０％重水素化塩酸含有重水０．０５ｍＬの混合溶媒に溶解後測定）から、当該成分が例示化合物（１−ｂ）の構造を有することがわかった。また、文献で報告されているギロホール酸のスペクトルデータ（Phytochemistry,  Vol48.,  No5,  P815-822）とほぼ一致したことから、単離された成分は、ギロホール酸であると同定した。
なお、表中のＭｅはメチル基を表す。各水素原子の番号は結合している炭素原子の番号を示している。また、水酸基の水素原子の場合、酸素原子の結合する炭素原子の番号を示している。
【００２９】
【表２】
2013032311.tif 000006
【００３０】
比較例１
オルセリン酸エチルの単離
製造例１で得た抽出物３２ｍｇを分取ＨＰＬＣで分画し、成分Ｃ  １０．８０ｍｇ（抽出物固形分からの収率３３．７５％）を得た。
単離した成分Ｃの構造解析は、ＮＭＲにより行った。ＮＭＲによる構造解析の結果を表３に示す。単離成分ＣのＮＭＲスペクトルデータ（単離成分ＣはＣＤＣｌ３  ０．５０ｍＬに溶解後測定）が文献で報告されているオルセリン酸エチルのスペクトルデータ（中国中薬（漢方薬）雑誌，  Vol26.,  No9,  P608-610）とほぼ一致したことから、単離された成分は、オルセリン酸エチルであると同定した。
なお、表中のＭｅはメチル基を表す。各水素原子の番号は結合している炭素原子の番号を示している。また、水酸基の水素原子の場合、酸素原子の結合する炭素原子の番号を示している。
【００３１】
【表３】
2013032311.tif 000007
【００３２】
参考例１：ジャーマンカミツレ抽出物
ジャーマンカミツレ（和名：カミツレ、新和物産（株）より入手）の花部４０ｇに、５０％エタノール含有水溶液４００ｍＬを加え、室温で１４日間抽出後、濾過し、ジャーマンカミツレ抽出物（２２１ｍＬ）を得た（蒸発残分２．６３％）。
【００３３】
実施例１  エンドセリン作用抑制効果の検証
上記で製造した各化合物及び抽出物について、下記の評価系を用いてエンドセリン作用抑制効果を検証した。
（１）評価系
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）を、蛍光検出用の９６穴プレートに３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で播種し、５％ＣＯ２下にて３７℃で培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ  ２５４を用いた。
３日間培養後、培養プレートからデカントで培地を除去し、細胞内Ｃａ２＋＋測定試薬Ｆｌｕｏ４−ＡＭを含むアッセイバッファーに置換し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＦＤＳＳ（Functional  Drug  Screening  System）機器において測定開始２０秒後に所定濃度の上記化合物を１分間前処理した後、リガンドであるエンドセリン（ＥＴ−１、終濃度１００ｎＭ）を添加し、Ｆｌｕｏ４−ＡＭの蛍光をＥｘ．４８０ｎｍ／Ｅｍ．５４０ｎｍの測定波長で測定開始から５分後まで経時的に検出した。
コントロールにおけるＦｌｕｏ４−ＡＭの蛍光増加比（Ｍａｘ  ｒａｔｉｏ−Ｍｉｎ  ｒａｔｉｏ）を１００とした場合の相対値（％）で、各化合物の細胞内カルシウム（カルシウムイオン）濃度上昇率（％）を算出し、エンドセリン作用抑制効果を評価した。なお、コントロールとして、エタノール又は１０〜９５ｖ／ｖ％の含水エタノール溶液を終濃度０．１〜０．５ｖ／ｖ％で添加したものを用いた。
【００３４】
（２）ジャーマンカミツレ抽出物の評価
ポジティブコントロールとして、上記で調製したジャーマンカミツレ抽出物（蒸発残分２．６３％、５０％ＥｔＯＨ溶媒）を用いた。ジャーマンカミツレ抽出物はエンドセリンの作用によるメラノサイトのＣａ濃度上昇を抑制し、メラニン産生を抑制することが知られている。
ジャーマンカミツレ抽出物を、０．５ｖ／ｖ％及び１．０ｖ／ｖ％の終濃度で前処理して上記評価系に供し、エンドセリン刺激によるカルシウム（Ｃａ）濃度上昇率を算出した（Ｎ＝６）。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、ジャーマンカミツレ抽出物を添加した系では、濃度依存的なＣａ濃度上昇抑制作用が確認された。特に濃度が１ｖ／ｖ％の系では、２０％以上もＣａ濃度上昇が抑制され、優れたエンドセリン抑制作用が確認された。
【００３５】
（３）単離化合物の評価
上記で単離した各化合物を、表４に示す終濃度で前処理して上記評価系に供し、エンドセリン刺激によるＣａ濃度上昇率を算出した（Ｎ＝６）。結果を表４に示す。
【００３６】
【表４】
2013032311.tif 000008
【００３７】
表４から明らかなように、例示化合物（１−ａ）：ウンビリカル酸、（１−ｂ）：ギロホール酸を添加した系ではいずれも、濃度５２μＭにおいて、エンドセリン刺激による細胞内Ｃａ濃度上昇がそれぞれ、６０％、１０％抑制されることが確認された。すなわち、前記一般式（１）で表される化合物は、優れたエンドセリン抑制作用を有し、その抑制効果は公知の美白成分であるジャーマンカミツレ抽出物と同等或いはそれ以上のものであることがわかった。
一方、オルセリン酸エチルを添加した系では、濃度１２７．５μＭにおいても、細胞内Ｃａ濃度上昇は５％以下の抑制にとどまった。
【００３８】
（処方例）
前記製造例で得られた化合物を有効成分として、下記に示す組成のローション、乳液、美容液及びクリームを常法により各々調製した。
【００３９】
１．ローションの調製
（組成）                                                      （配合：質量％）
１，３−ブチレングリコール                                        ８．０
グリセリン                                                        ５．０
エタノール                                                        ３．０
ウンビリカル酸                                                    ０．０００１
カミツレエキス                                                    ３．０
キキョウエキス                                                    １．０
チョウジエキス                                                    １．０
キサンタンガム                                                    ０．１
ヒアルロン酸                                                      ０．１
リン酸二ナトリウム                                                ０．１
リン酸二水素ナトリウム                                            ０．１
アスコルビン酸２−グルコシド                                      ２．０
精製水                                                            残部
香料                                                              適量
防腐剤                                                            適量
【００４０】
２．乳液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
ウンビリカル酸                                                      ０．００１
カミツレエキス                                                      １．０
キキョウエキス                                                      １．０
アルテアエキス                                                      ２．０
スクワラン                                                          ３．０
オリブ油                                                            ３．０
グリセリン                                                          ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40）１．０
カルボキシビニルポリマー                                            ０．２
水酸化カリウム                                                      ０．１
キサンタンガム                                                      ０．２
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０２
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
【００４１】
３．美容液の調製
（組成）                                                      （配合：質量％）
ウンビリカル酸                                                    ０．００１
カミツレエキス                                                    １．０
キキョウエキス                                                    １．０
チョウジエキス                                                    １．０
カルボキシビニルポリマー                                          ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                          ０．２
水酸化カリウム                                                    ０．２
キサンタンガム                                                    ０．１
ヒアルロン酸                                                      ０．２
クエン酸ナトリウム                                                ０．１５
クエン酸                                                          ０．０３
グリセリン                                                      １０．０
１，３−ブチレングリコール                                        ５．０
エデト酸二ナトリム                                                ０．０５
精製水                                                            残部
防腐剤                                                            適量
香料                                                              適量
【００４２】
４．美容液の調製
（組成）                                                      （配合：質量％）
ウンビリカル酸                                                    ０．００１
カミツレエキス                                                    １．０
チョウジエキス                                                    １．０
キキョウエキス                                                    １．０
キサンタンガム                                                    ０．２
カルボキシメチルセルロース                                        ０．２
カルボキシビニルポリマー                                          ０．２
水酸化カリウム                                                    ０．１
クエン酸                                                          ０．０３
クエン酸ナトリウム                                                ０．１５
グリセリン                                                        ５．０
プロピレングリコール                                              ３．０
ポリエチレングリコール（分子量１５００）                          １．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール                            ０．５
精製水                                                            残部
防腐剤                                                            適量
【００４３】
５．クリームの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
ウンビリカル酸                                                      ０．００１
カミツレエキス                                                      ２．０
キキョウエキス                                                      ２．０
チョウジエキス                                                      ２．０
メチルポリシロキサン                                                ３．０
スクワラン                                                          ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール                                  ３．０
ステアリルアルコール                                                １．５
セタノール                                                          １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60）０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                            ０．３
水酸化カリウム                                                      ０．１５
キサンタンガム                                                      ０．１
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
香料                                                                適量
【図１】
2013032311.tif 000013