(57)【要約】【課題】低強度のイレース光で効率的に発光を抑制でき、超解像顕微鏡を廉価でコンパクトに構成できる、超解像顕微鏡用発光ラベラを提供する。【解決手段】超解像顕微鏡により、ポンプ光及びイレース光を一部重ね合わせて試料に集光して、試料から発光する光応答信号を検出するために、試料を染色するのに用いられる超解像顕微鏡用発光ラベラ１であって、極性応答性色素分子３を分子集合体２の疎水環境に内包してなる。【選択図】図１
2013145201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超解像顕微鏡により、ポンプ光及びイレース光を一部重ね合わせて試料に集光して、前記試料から発光する光応答信号を検出するために、前記試料を染色するのに用いられる超解像顕微鏡用発光ラベラであって、
極性応答性色素分子を分子集合体の疎水環境に内包してなる、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項２】
請求項１に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記分子集合体は、環状性分子、デンドリマー又は脂質膜である、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、電子供与部位及び電子吸引部位を含む、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項４】
請求項３に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、6‐（p‐トルイジニル）ナフタレン‐2‐スルホン酸、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、アラダン、エチジウムブロミド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ−１、ヘキスト３３２５８、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ナイルレッド、ナイルブルー、３−ＡＢＮ、３−ＤＭＡＢＮ、Ｂｏｃ−ＤＬ−ＣＤＡＰＡ−ＯＨ、のいずれかを含む、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項５】
請求項３に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、チオフェン基、フラン基、エチレンディオキシチオフェン基、ビチオフェン基、３−アミノ−ベンゾニトリル類のいずれかを含む、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項６】
請求項３に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、前記電子供与部位にジメチルアミノフェニルを含み、前記電子吸引部位にベンゼンスルフォン酸ジメチルプロピルエステルを含む、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項７】
請求項２に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記環状性分子は環状オリゴ糖である、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項８】
請求項２に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記脂質膜はグリセロリン脂質又はスフィンゴ脂質である、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項９】
請求項２に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記脂質膜はリポソーム構造からなる、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項１０】
請求項２に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記脂質膜はミセル構造からなる、ことを特徴とする超解像顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラによって染色された試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記極性応答性色素分子を安定状態から第１量子状態に励起するためのポンプ光、及び、前記極性応答性色素分子を更に他の量子状態に遷移させるためのイレース光を、前記試料に一部重ね合わせて集光する、対物レンズを含む光学系と、
前記ポンプ光及び前記イレース光の集光により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記検出部への前記光応答信号の入射光路中に配置され、前記ポンプ光の波長の光を遮光するフィルタ素子と、を備える、
ことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１１に記載の超解像顕微鏡において、
前記検出部への前記光応答信号の入射光路中に配置され、前記試料からの前記イレース光による散乱光を遮光するイレース光遮光部を、更に備える、
ことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項１３】
請求項１２に記載の超解像顕微鏡において、
前記イレース光遮光部は、前記極性応答性色素分子の発光波長の光を含む透過波長域が可変の分光器からなる、
ことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記光学系は、前記試料への前記イレース光の集光状態において、前記イレース光の強度を光軸上で最小となるように、前記イレース光の位相を空間変調する位相変調素子を、更に備える、
ことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記光学系は、前記ポンプ光及び前記イレース光を、光軸を一致させて前記試料に集光させるように構成されている、
ことを特徴とする超解像顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超解像顕微鏡用発光ラベラ及び超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術レーザ子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明して二重共鳴吸収過程を誘導することにより、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収及び蛍光を観察するものである。この原理について、図１０〜図１３を参照して説明する。図１０は、染色に用いられる色素分子の価電子軌道の電子構造を示す。先ず、図１０に示す基底状態（Ｓ０状態：安定状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１１に示す第１励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１２に示す第２励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１３に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１２の吸収過程や図１３の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１１のように色素分子をＳ１状態に励起させる。この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられる。したがって、図１２のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１及び波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１２の励起状態から図１３に示す基底状態への蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法は、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能である。すなわち、図１０に示す最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有のエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で試料を照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能である。しかし、一般に、いくつかの分子は、吸収帯の波長領域が重複するため、単一波長で試料を照明する場合には、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１及び波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルを持つ光のみが強く吸収されるので、波長λ１及び波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１４は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１励起状態Ｓ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２励起状態Ｓ２に励起されている様子を示している。なお、図１４は、ある種の分子のＳ２状態からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１４に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１５は、図１４と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１５において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、第１励起状態Ｓ１の分子のほとんどが即座に高位の第２励起状態Ｓ２に励起されて、第１励起状態Ｓ１の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなる。しかも、第２励起状態Ｓ２からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このような現象は、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１５の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を、空間的に一部重ね合わせて蛍光領域を抑制するので、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を利用した超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
特許文献２に開示の顕微鏡においては、中空状に整形されたイレース光をポンプ光と同軸に合成して観察試料に集光している。ここで、イレース光を中空状に整形する方法としては、例えば図１６や図１７に示すような、イレース光の位相差が光軸周りに２πで周回するような位相板を用いる位相空間変調が知られている。図１６に示す位相板は、位相が連続的に変化するようにガラス基板を切削又はエッチングして形成される。図１７に示す位相板は、イレース光波長に対してλ／８ずつ位相を異ならせて光学多層膜を形成したり、あるいはガラス基板をエッチングしたりして形成される。このような位相板を通過したイレース光を集光すると、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ところで、近年では、超解像顕微鏡の進展とともに、超解像顕微鏡専用の発光色素の要求が強まっている。具体的には、可能な限り弱いイレース光の照射強度で、効率的に発光抑制を行うことが求められている。すなわち、可能な限り小型のレーザ光源を用いて照明系を構成し、廉価でコンパクトな顕微鏡システムをユーザに提供することが求められている。また、観察試料へのダメージの低減や、色素自体の褪色防止なども求められている。
【００２０】
本発明は、かかる要望に応えるべくなされたもので、低強度のイレース光で効率的に発光を抑制でき、超解像顕微鏡を廉価でコンパクトに構成できる、超解像顕微鏡用発光ラベラ及び超解像顕微鏡を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
上記目的を達成する本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラの要旨構成は、以下に示す通りである。
（１）超解像顕微鏡により、ポンプ光及びイレース光を一部重ね合わせて試料に集光して、前記試料から発光する光応答信号を検出するために、前記試料を染色するのに用いられる超解像顕微鏡用発光ラベラであって、
極性応答性色素分子を分子集合体の疎水環境に内包してなる、ことを特徴とするものである。
【００２２】
（２）上記（１）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記分子集合体は、環状性分子、デンドリマー又は脂質膜である、ことを特徴とするものである。
【００２３】
（３）上記（１）又は（２）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、電子供与部位及び電子吸引部位を含む、ことを特徴とするものである。
【００２４】
（４）上記（３）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、6‐（p‐トルイジニル）ナフタレン‐2‐スルホン酸、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、アラダン、エチジウムブロミド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ−１、ヘキスト３３２５８、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ナイルレッド、ナイルブルー、３−ＡＢＮ、３−ＤＭＡＢＮ、Ｂｏｃ−ＤＬ−ＣＤＡＰＡ−ＯＨ、のいずれかを含む、ことを特徴とするものである。
【００２５】
（５）上記（３）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、チオフェン基、フラン基、エチレンディオキシチオフェン基、ビチオフェン基、３−アミノ−ベンゾニトリル類のいずれかを含む、ことを特徴とするものである。
【００２６】
（６）上記（３）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記極性応答性色素分子は、前記電子供与部位にジメチルアミノフェニルを含み、前記電子吸引部位にベンゼンスルフォン酸ジメチルプロピルエステルを含む、ことを特徴とするものである。
【００２７】
（７）上記（２）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記環状性分子は環状オリゴ糖である、ことを特徴とするものである。
【００２８】
（８）上記（２）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記脂質膜はグリセロリン脂質又はスフィンゴ脂質である、ことを特徴とするものである。
【００２９】
（９）上記（２）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記脂質膜はリポソーム構造からなる、ことを特徴とするものである。
【００３０】
（１０）上記（２）に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記脂質膜はミセル構造からなる、ことを特徴とするものである。
【００３１】
更に、上記目的を達成する本発明に係る超解像顕微鏡の要旨構成は、以下示す通りである。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡用発光ラベラによって染色された試料を観察する超解像顕微鏡であって、
前記極性応答性色素分子を安定状態から第１量子状態に励起するためのポンプ光、及び、前記極性応答性色素分子を更に他の量子状態に遷移させるためのイレース光を、前記試料に一部重ね合わせて集光する、対物レンズを含む光学系と、
前記ポンプ光及び前記イレース光の集光により前記試料から発光する光応答信号を検出する検出部と、
前記検出部への前記光応答信号の入射光路中に配置され、前記ポンプ光の波長の光を遮光するフィルタ素子と、を備える、
ことを特徴とするものである。
【００３２】
（１２）上記（１１）に記載の超解像顕微鏡において、
前記検出部への前記光応答信号の入射光路中に配置され、前記試料からの前記イレース光による散乱光を遮光するイレース光遮光部を、更に備える、
ことを特徴とするものである。
【００３３】
（１３）上記（１２）に記載の超解像顕微鏡において、
前記イレース光遮光部は、前記極性応答性色素分子の発光波長の光を含む透過波長域が可変の分光器からなる、
ことを特徴とするものである。
【００３４】
（１４）上記（１１）〜（１３）のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記光学系は、前記試料への前記イレース光の集光状態において、前記イレース光の強度を光軸上で最小となるように、前記イレース光の位相を空間変調する位相変調素子を、更に備える、
ことを特徴とするものである。
【００３５】
（１５）上記（１１）〜（１４）のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記光学系は、前記ポンプ光及び前記イレース光を、光軸を一致させて前記試料に集光させるように構成されている、
ことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、低強度のイレース光で効率的に発光を抑制でき、超解像顕微鏡を廉価でコンパクトに構成できる、超解像顕微鏡用発光ラベラ及び超解像顕微鏡が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】環境応答性分子の励起構造変化の過程を示す図である。
【図２】図１の環境応答性分子の蛍光発光を説明するためのエネルギーダイヤグラムである。
【図３】色素分子の一般的な光化学反応を説明するための図である。
【図４】本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラの一例の構成を模式的に示す図である。
【図５】図４に示した超解像顕微鏡用発光ラベラ１の製造方法の一例を説明する模式図である。
【図６】本発明に係る超解像顕微鏡の一例の構成を示す模式図である。
【図７】ミセル構造の脂質膜を模式的に示す図である。
【図８】分子集合体として使用可能なシクロデキストリンの一例の分子構造を示す図である。
【図９】分子集合体として使用可能なデンドリマーの一例の分子構造を示す図である。
【図１０】色素分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１１】図１０に示す分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１２】図１０に示す分子の第２励起状態を示す概念図である。
【図１３】図１０に示す分子が第２励起状態から基底状態に戻る状態を概念的に示す図である。
【図１４】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１５】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１６】超解像顕微鏡に使用される位相板の一例を示す拡大平面図である。
【図１７】超解像顕微鏡に使用される位相板の他の例を示す拡大平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
先ず、本発明の実施の形態の説明に先立って、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラの原理について説明する。
【００３９】
例えば、蛍光色素分子には、溶媒との相互作用により、全く別の分子構造を持つものに変化するものが存在する。その中で、代表的なものが環境応答性分子である。図１は、環境応答性分子の励起構造変化の過程を示す図である。ポンプ光によりＳ０状態からＳ１状態に励起されると、環境応答性分子は外界に存在する溶媒中の分子と衝突を繰り返す。その際、水分子のように極性をもつ分子が衝突すると、クーロン相互作用により色素分子の電子が更に励起されて、すなわち溶媒緩和されて、別の分子構造もつように分子軌道が再編成される。
【００４０】
その結果、分子の構成元素は同じであっても、価電子軌道が変化して、光学特性が変化する。すなわち、Ｓ１状態の分子よりもエネルギー準位の低い別の電子構造をもつ分子のＳ’1状態に変化する。そして、Ｓ’1状態から、同じく別の電子構造をもつ分子の基底状態Ｓ’０状態に緩和する。その際、蛍光を出すが、この場合の蛍光は、図２に示すように、元の分子構造を持つ分子が出すＳ１状態からＳ０状態へ緩和する場合の蛍光よりも波長が長くなる。この現象は、溶媒分子の極性が強いほど、長波長側にシフトする性質がある。また、蛍光収率も著しく悪くなる。その後、基底状態Ｓ’０状態の分子は、外界に存在する溶媒中の分子と衝突を繰り返して、すなわち溶媒緩和して、元の分子構造におけるＳ０状態に戻る。
【００４１】
このような分子は、極性応答性色素分子と呼ばれる。この分子は、トルエンなど非極性中分子の溶媒中ではクーロン相互作用が働かないため、Ｓ１状態より別の電子構造をもつ分子のＳ’1状態に変化せず、Ｓ１状態からＳ０状態への緩和に伴う短波長の蛍光を出す。極性応答性色素分子は、生物用蛍光顕微鏡における試料染色材料として用いられる。
【００４２】
一般に、極性応答性色素分子は、電子供与部位と電子吸引部位をもつ。すなわち、単一の分子内において、電子密度がリッチな化学基（電子供与部位）と電子密度が疎の化学基（電子吸引部位）をもっている。このような分子は、外的な電場の摂動により分子内の電子構造を変える。すなわち、電子供与部位に存在する電子が電子吸引部位に移行する。同時に、分子構造を変化させ、光学的特性も変化する。一般に、電子供与部位に存在する電子が電子吸引部位に移行する場合は、各分子軌道のエネルギー準位が低くなるため、蛍光波長が長くなる。極性応答性色素分子は、多くの場合、極性溶媒中に置かれると、その電場により構造変化を起こす。
【００４３】
このように、極性応答性色素分子は、存在する周辺環境の電場の影響を敏感に受けるため、生物試料内おける環境センサとしても機能する。例えば、脂肪細胞のように極性の弱い試料を染色した場合は、短波長で強度の強い蛍光が出る。しかし、極性分子が近くに存在すると、Ｓ１状態からＳ’1状態への分子構造の変性が起こり、蛍光波長が赤色方向に変位して、蛍光強度が弱くなる。この性質を利用して、生物試料内の部位の特定や化学状態の分析に利用できる。
【００４４】
本発明は、極性応答性色素分子の上記の性質に着目して、超解像顕微鏡用発光ラベラを提案するものである。すなわち、超解像顕微鏡では、イレース光の照射によって、色素分子をＳ１状態からＳ２状態に励起する。その際、色素分子が環境応答性であると、Ｓ１状態からＳ２状態への励起の過程とＳ２状態からの緩和の過程とで、イレース光の電場と分子とが相互作用してＳ’1状態へ変化する。そのため、イレース光を照射した瞬間に、蛍光波長の変化及び蛍光収率の低下が生じて、蛍光抑制効果が誘導される。
【００４５】
そこで、本発明においは、極性応答性色素分子を分子集合体の疎水環境（疎水ポケット）に内包することにより、弱いイレース光強度で蛍光抑制効果を有効に誘導可能な超解像顕微鏡用発光ラベラを提案する。以下、本発明とその原理を述べる。
【００４６】
本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラは、試料中でも管理された環境で極性応答性色素分子が存在し得ること保証するものである。より、具体的には、光を照射しない状況では、極性応答性色素分子が非極性環境におかれていること指す。そのため、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラは、極性応答性色素分子を非極性媒質内に封入して構成するものである。非極性媒質としては、天然ではβシートや糖鎖などが利用可能であり、人工物ではシリカゼオライトやデンドリマーなどが利用可能である。
【００４７】
ここで、疎水環境にある極性応答性色素分子の蛍光抑制効果について、改めて考察する。疎水環境にある極性応答性色素分子は、ポンプ光で励起しても、図２に示したように、Ｓ’１状態に移行せず、Ｓ１状態で蛍光緩和する。しかし、イレース光の照射によりＳ２状態に更に励起されると、一部がＳ２状態から熱緩和し、残りがＳ’1状態に移行する。そして、Ｓ’1状態の一部はより長波長の蛍光を出して緩和し、残りはイレース光によりＳ’１状態からＳ２状態よりもエネルギー準位の低いＳ’２状態に励起される。
【００４８】
更に、蛍光強度について考察すると、先ず、Ｓ１状態からの蛍光は、従来の蛍光抑制効果に加え、Ｓ１状態がＳ’1状態にも移行するため、言い換えると蛍光色が赤色方向にシフトした分、蛍光が更に減少する。また、Ｓ’1状態からの蛍光は、蛍光収率が低いため、極性応答性色素分子からの蛍光強度の全体総量も低下する。更に、イレース光によりＳ’２状態に励起できる場合は、蛍光抑制効果のためＳ’1状態からの蛍光強度も減少する。
【００４９】
ここで、ポンプ光及びイレース光をカットし、無極性環境中の極性応答性色素分子のＳ１状態からの蛍光スペクトルを透過する分光器（例えば、バンドパスフィルタ）を検出光学系に挿入すれば、蛍光抑制した無極性環境中の極性応答性色素分子のＳ１状態からの蛍光信号を検出することができる。この場合、従来法と比較して、検出される蛍光信号量の抑制率が非常に高い。
【００５０】
すなわち、通常のＳ２状態からの蛍光抑制に加え、Ｓ’1状態に移行して発光する蛍光成分も検出器に混入しないので、実質上の蛍光抑制効果として寄与する。しかし、一般に、Ｓ１状態及びＳ’1状態からの蛍光発光の波長帯域は、一部、オーバーラップする。そのため、分光器により、Ｓ１状態からの蛍光成分のみを完全に分離して抽出することができなくても、Ｓ’1状態からの蛍光発光が抑制される。
【００５１】
これにより、結果的には、検出すべきＳ１状態からの蛍光成分の純度が向上する。特に、分光器の透過波長範囲を可変にすれば、Ｓ’1状態からの蛍光信号を最小にし、かつ、Ｓ１状態からの蛍光成分を最大にすることができ、Ｓ／Ｎを飛躍的に向上することが可能となる。ここで、透過波長範囲を可変にする方法としては、分光器の交換、分光器を構成する回折格子（分光光学素子）への入射角や射出スリット幅の調整等により可能である。
【００５２】
以上により、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラによると、超解像顕微鏡の光源装置を簡略化でき、所望の蛍光信号のＳ／Ｎを向上することが可能となる。つまり、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラは、通常の分子の蛍光抑制過程とは異なり、赤色方向にシフトした分の蛍光量も減少する。そのため、強度の低いイレース光で効率的に発光を抑制して、超解像顕微鏡による計測が可能となる。これにより、より小型のレーザ光源でイレース光を生成することが可能となり、超解像顕微鏡を廉価でコンパクトに構成することが可能となる。
【００５３】
また、イレース光の強度を低くできることで、所望の蛍光信号のＳ／Ｎを向上することが可能となる。つまり、超解像顕微鏡においては、ポンプ光に対してイレース光の強度が高い。そのため、イレース光の散乱光が検出器に入り込んでバックグラウンド信号となってＳ／Ｎを低下させる原因となっていたが、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラを用いれば、イレース光の強度を低くできることから、バックグラウンド信号の低減にも寄与でき、Ｓ／Ｎを向上することが可能となる。
【００５４】
更に、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラは、褪色にも強い。特に、生物試料においては、水分子とともに酸素分子が溶け込んでいる。酸素分子の基底状態は、３重項状態（Ｔ１）であり、絶えず色素分子と衝突を繰り返している。色素分子の一般的な光化学反応においては、図３に示すように、Ｓ１状態からＴ１状態に転換すると、酸素分子とエネルギー交換が起こる。その結果、電子（−ｅ）が酸素に引き抜かれる現象（酸化）が生じて、褪色の原因となる。これに対し、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラは、分子集合体により外界の酸素分子から隔離されているため、褪色が起きにくい。したがって、蛍光観察では安定したラベラとして機能する。
【００５５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００５６】
図４は、本発明に係る超解像顕微鏡用発光ラベラの一例の構成を示す模式図である。この超解像顕微鏡用発光ラベラ１は、分子集合体であるリポソーム構造のスフィンゴリン脂質２重膜２の疎水基側の空間に、極性応答性色素分子としてナイルレッド（Nile red）３を挿入して成る。つまり、極性応答性色素分子を、脂質２重膜内の疎水環境すなわち無極性環境に閉じ込めてなるものである。ここで、リポソーム構造のスフィンゴリン脂質２重膜２は、最小で直径２０ｎｍと、回折限界よりも十分小さくできるので、高空間分解能に対応できる。しかも、多量のナイルレッド３を膜内に抱合できるので、極めて明るいラベラとして機能させることが可能となる。なお、ナイルレッド３は、無極性環境では、波長５５０ｎｍを中心に±５０ｎｍの蛍光発光帯域を有し、極性領域では、波長６５０ｎｍを中心に±５０ｎｍの蛍光発光帯域を有する。
【００５７】
図５（ａ）〜（ｈ）は、図４に示した超解像顕微鏡用発光ラベラ１の製造方法の一例を説明する模式図である。この製造方法は、逆相蒸発法と呼ばれるものである。先ず、図５（ａ）に示すように、リン脂質分子１１をジエチルエーテル１２（重量0.5％）に溶解させる。次に、図５（ｂ）に示すように、無極性溶媒として、例えば、トルエン１３を混入する。すると、極性溶媒のジエチルエーテル１２の層と無極性溶媒のトルエン１３の層とに分離する。その結果、溶解したリン脂質分子１１は、極性部１１ａをジエチルエーテル１２側に、無極性部１１ｂをトルエン１３側に向けて平面展開する。
【００５８】
その後、図５（ｃ）に示すように、界面層１４が形成されたのち、ナイルレッド３をトルエン１３側に溶解させる。この際、例えば、1mg/mlの濃度で、ナイルレッドを溶解させる。更にHEPES緩衝液(pH7.2)を加える。これにより、ナイルレッド３は、図５（ｄ）に示すように、リン脂質分子１１の無極性部１１ｂに吸着して、安定に固着される。次に、約１時間の超音波により界面層１４を切断して、図５（ｅ）に示すように、エマルジョン１５を形成する。その後、ジエチルエーテル１２を留除して、図５（ｆ）に示すように、エマルジョン１５を集合させる。次に、渦を与えて拡散する。これにより、図５（ｇ）に示すように、一部のエマルジョンのリン脂質分子１１の相が逆転して、リン脂質２重膜が形成し始め、ナイルレッド３が無極性のリン脂質２重膜２の内側に封入される。
【００５９】
その後、最後工程として、減圧下でジエチルエーテル１２を完全に留除して、図５（ｈ）に示すように、ナイルレッド３がリン脂質２重膜２の内側の閉じ込められたリポソーム構造の超解像顕微鏡用発光ラベラ１を形成する。これにより、直径２０ｎｍ〜２００ｎｍの粒径分布をもつリポソームが得られる。これらを、遠心分離機や精密ろ過法により、すなわち、例えばポリスチレンろ過膜を通すことで、求めるサイズのリポソームが分別でき、回折限界サイズ以下の所望の径を有する超解像顕微鏡用発光ラベラ１が得られる。
【００６０】
図４に示した超解像顕微鏡用発光ラベラ１は、ポンプ光（例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍波：５３２ｎｍ）によりＳ１状態に励起されると、最大蛍光波長５５０ｎｍで発光する。また、Ｓ１状態からＳ２状態へ遷移する過渡吸収帯が、波長６４０ｎｍ前後に存在する。したがって、例えば、クリプトンレーザの波長６４７ｎｍの光をイレース光として照射して、Ｓ１状態からＳ２状態への遷移を誘導すると、Ｓ１状態からＳ２状態への励起と、Ｓ２状態からＳ１状態への緩和を繰り返しているうちに、イレース光の電場によりＳ’1状態に転換する。この状態より、ナイルレッド３は、最大蛍光波長６００ｎｍで発光する。すなわち、イレース光照射により分子の蛍光波長が長波長側にシフトする。
【００６１】
図６は、本発明に係る超解像顕微鏡の一例の構成を示す模式図である。この超解像顕微鏡は、ポンプ光光源１０１及びイレース光光源１０２からのポンプ光及びイレース光を、図４に示した超解像顕微鏡用発光ラベラ１によって染色された試料Ｓに集光して、試料Ｓを超解像で観察するものである。ポンプ光光源１０１は、上述した超解像顕微鏡用発光ラベラ１の光学特性を考慮して、例えばＮｄ：ＹＡＧレーザが用いられ、その２倍高調波である波長５３２ｎｍの光をポンプ光として射出する。イレース光光源１０２は、同様に、超解像顕微鏡用発光ラベラ１の光学特性を考慮して、例えばクリプトンレーザが用いられ、その発振波長６４７ｎｍの光をイレース光として射出する。
【００６２】
ポンプ光光源１０１から射出されるポンプ光は、ダイクロイックプリズム１０３で反射された後、ダイクロイックミラー１０４を透過する。そして、ポンプ光は、ビーム走査用の２枚のガルバノミラー１０５，１０６及び２枚の瞳投影レンズ１０７，１０８を経て、対物レンズ１１０により、試料ステージ１１１上の試料Ｓに集光される。
【００６３】
また、イレース光光源１０２から射出されるイレース光は、図１６や図１７に示したような位相板（位相変調素子）１１５により位相が空間変調された後、ダイクロイックプリズム１０３を透過して、ポンプ光と同軸に合成される。そして、イレース光は、ダイクロイックミラー１０４を透過した後、ガルバノミラー１０５，１０６及び瞳投影レンズ１０７，１０８を経て、対物レンズ１１０により、試料ステージ１１１上の試料Ｓに集光される。これにより、イレース光は、集光状態において、光軸上の強度が最小となる超解像用の中空状のラゲールガウシアンビームとして試料Ｓに照射される。
【００６４】
一方、ポンプ光及びイレース光の照射により試料Ｓから発生する蛍光は、往路と逆の経路を辿ってダイクロイックミラー１０４で反射される。そして、ダイクロイックミラー１０４で反射された蛍光は、ポンプ光の波長の光を遮光するフィルタ素子である蛍光分離フィルタ１１６、及び集光レンズ１１７を経て、回折格子を有する分光器１１８により波長選択されて、検出部を構成する光電子増倍管１２０で検出される。なお、分光器１１８の入射側及び射出側には、それぞれ共焦点ピンホール（スリット）１２１，１２２が設けられている。
【００６５】
ここで、図４に示した超解像顕微鏡用発光ラベラ１を構成するナイルレッド３は、上述したように、無極性環境では波長５５０ｎｍを中心に±５０ｎｍの蛍光発光帯域を有し、極性領域では波長６５０ｎｍを中心に±５０ｎｍの蛍光発光帯域を有する。したがって、分光器１１８の回折角及びスリット幅は、波長５５０ｎｍの光を中心に±５０ｎｍのバンド幅の光が通り抜けるように設定する。
【００６６】
図６に示す構成において、試料Ｓにポンプ光のみが単独照射させた場合、試料Ｓの極性応答性色素分子から発生する殆どの蛍光は、分光器１１８を通過して光電子増倍管１２０で検出されることになる。ところが、イレース光を同時に照射すると、多くの極性応答性色素分子は、極性溶媒中の蛍光スペクトルを持つようになるので、蛍光は分光器１１８を通過できない。したがって、光電子増倍管１２０の信号強度の変化は、まさに蛍光抑制効果と同等になる。しかも、極性溶媒中では蛍光収率も低くなり、蛍光信号の総量も小さい。加えて、無極性環境であっても、イレース光の照射により蛍光抑制効果が起きるので、低強度のイレース光で光電子増倍管１２０の信号強度を抑制することができる。
【００６７】
特に、図４に示した超解像顕微鏡用発光ラベラ１を構成するリポソーム構造のスフィンゴリン脂質２重膜は、近年、ドラックデリバリー手段として注目されている。ドラックデリバリーでは、リポソーム構造の内側の球体空間に薬剤を導入し、細胞内あいは血液内に展開させる。そして、特定の罹患部に到達すると、内部の薬剤を放出する仕組みである。したがって、超解像顕微鏡観察を行えば、どのように薬剤が運搬されて、細胞内で薬剤が拡散するかを観察することが可能となる。
【００６８】
このように、図４に示した超解像顕微鏡用発光ラベラ１は、単に蛍光観察用の標識としてのみではなく、医用薬剤用の生体機能材料としても機能する。したがって、図６に示した超解像顕微鏡によれば、試料Ｓを顕微鏡観察することにより、細胞への薬剤投与に伴う生体反応等を、超高解像度で、かつ、リアルタイムで観察することが可能となる。
【００６９】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、図４において、脂質２重膜は、スフィンゴリン脂質に限らず、グリセロリン脂質を用いてもよい。また、脂質膜は、リポソーム構造に限らずミセル構造とすることもできる。
【００７０】
ミセル構造の場合、例えばスフィンゴリン脂質分子２１は、図７に模式図を示すように、水溶液中で親水部２１ａが外側を向き、疎水部（無極性部）２１ｂが内側に向く１重の粒径構造をとる。この場合、内側に無極性領域が形成されるので、この領域に極性応答性色素分子を封入する。ミセル構造の場合、リポソーム構造のようにドラックデリバリー手段として用いることはできないが、リポソーム構造よりも小さい粒径にできるので、高解像度用の発光ラベラとして利用できる。また、この場合は、例えば、親水基側にタンパクやリンカー分子を修飾することにより、生体内の特定の部位に展開される蛍光ラベラ分子を得ることが可能となる。
【００７１】
また、リポソーム構造を形成する膜は、人工のものを含め界面活性剤を利用することもできる。界面活性剤は、親水性部分がイオン性（カチオン性・アニオン性・双性）のものと、非イオン性（ノニオン性）のものとに大別される。また、低分子系と高分子系とに分類されることもある。その具体例として、以下のものが挙げられる。
【００７２】
陰イオン系界面活性剤（アニオン性界面活性剤）
陰イオン系界面活性剤は、水中で解離したとき陰イオンとなるもので、親水基として、カルボン酸、スルホン酸、あるいはリン酸構造を持つものが多い。カルボン酸系としては、石鹸の主成分である脂肪酸塩やコール酸塩等がある。スルホン酸系としては、合成洗剤に多く使われる直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムや、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にも利用されるラウリル硫酸ナトリウム等がある。例えば、石鹸（脂肪酸ナトリウム）：RCOO-Na+、モノアルキル硫酸塩：ROSO3-M+、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩：RO(CH2CH2O)mSO3-M+、アルキルベンゼンスルホン酸塩：RR'CH2CHC6H4SO3-M+、モノアルキルリン酸塩：ROPO(OH)O-M+、が利用可能である。
【００７３】
陽イオン系界面活性剤（カチオン性界面活性剤）
陽イオン系界面活性剤は、水中で解離したとき陽イオンとなるもので、親水基として、テトラアルキルアンモニウムを持つものが多い。例えば、逆性石鹸、リンス、柔軟剤などに利用される、アルキルトリメチルアンモニウム塩：RN+(CH3)3X-、ジアルキルジメチルアンモニウム塩：RR'N+(CH3)2X-、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩：RN+(CH2Ph)(CH3)2X-、が原理的に利用可能である。
【００７４】
両性界面活性剤（双性界面活性剤）
両性界面活性剤は、分子内にアニオン性部位とカチオン性部位の両方を持つもので、溶液のpHに応じて陽・両性・陰イオンとなる。上記の陰イオン系界面活性剤及び陽イオン系界面活性剤を組み合わせた構造を持つ、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド：R(CH3)2NO、アルキルカルボキシベタイン：R(CH3)2N+CH2COO-、が利用可能である。
【００７５】
非イオン性界面活性剤（ノニオン性界面活性剤）
非イオン性界面活性剤は、親水部が非電解質、つまりイオン化しない親水性部分を持つもので、アルキルグリコシドのような低分子系、あるいはポリエチレングリコールやポリビニルアルコールのような高分子系が存在する。TritonX、Pluronic、Tweenなどの商品名で知られている、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル：RO(CH2CH2O)mH、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド：RCON(CH2CH2OH)2、アルキルモノグリセリルエーテル：ROCH2CH(OH)CH2OH、が利用可能である。
【００７６】
さらに、極性応答性色素分子を内包させる分子集合体は、図８に模式図を示すように、環状性分子の環状オリゴ糖の一種であるシクロデキストリンを用いることも可能である。この分子の環状内部は、無極性環境であり、十分に超解像機能を発揮する蛍光ラベラとなり得る。なお、図８は、グルコースが６個結合したα−シクロデキストリンを示すものである。
【００７７】
また、極性応答性色素分子を内包させる分子集合体は、通称「分子珊瑚」と呼ばれる球状のデンドリマーも使用可能である。デンドリマーは、基本的には、図９に模式図を示すように、最小ユニットの化学基の繰り返しであり、様々なサイズを有するが、ほぼ１０ｎｍ以下と極めて微小である。そして、デンドリマーは、中心部に機能性分子あるいは原子を導入できる微小空間を複数有している。したがって、最小ユニットの選択により無極性の微小空間に極性応答性色素分子を導入すれば、超解像顕微鏡用の発光ラベラとして機能させることができる。また、デンドリマーは、外縁部にアミノ基やチオール基など、特定のタンパク質に結合できる側鎖を化学修飾できるので、生体内の特定の部位に展開される蛍光ラベラ分子を得ることが可能となる。
【００７８】
さらに、極性応答性色素分子は、ナイルレッドの他に、蛍光収率の高いものを用いることができる。例えば、6‐（p‐トルイジニル）ナフタレン‐2‐スルホン酸、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、アラダン、エチジウムブロミド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ−１、ヘキスト３３２５８、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、ナイルブルー、３−ＡＢＮ、３−ＤＭＡＢＮ、Ｂｏｃ−ＤＬ−ＣＤＡＰＡ−ＯＨ、なども利用できる。
【００７９】
特に、Ｓ１状態からＳ’１状態への転換効率の良い極性応答性色素分子の特徴として、チオフェン基、フラン基、エチレンディオキシチオフェン基、ビチオフェン基、３−アミノ−ベンゾニトリル類のいずれかを含むものは、波長シフトが大きい。したがって、超解像顕微鏡により、Ｓ１状態からの蛍光をＳ’１状態からの蛍光と分離して計測する際に、分光器のスリットの幅を広くして、Ｓ１状態からの多くの信号を検出することができる。しかも、その際、Ｓ’１状態からの蛍光の分離が良いので、高いＳ／Ｎが得られる。
【００８０】
さらに、電子供与部位にジメチルアミノフェニル、電子吸引部位にベンゼンスルフォン酸ジメチルプロピルエステルを含む分子は、弱いイレース光で分子構造の転換が可能なので、超解像顕微鏡の光源の選定の幅が広くなり、より小型化が可能となる。
【符号の説明】
【００８１】
１  超解像顕微鏡用発光ラベラ
２  スフィンゴリン脂質２重膜（分子集合体）
３  ナイルレッド（極性応答性色素分子）
１０１  ポンプ光光源
１０２  イレース光光源
１０３  ダイクロイックプリズム
１０４  ダイクロイックミラー
１０５，１０６  ガルバノミラー
１０７，１０８  瞳投影レンズ
１１０  対物レンズ
１１１  試料ステージ
１１５  位相板（位相変調素子）
１１６  蛍光分離フィルタ（フィルタ素子）
１１７  集光レンズ
１１８  分光器
１２０  光電子増倍管（検出部）
１２１，１２２共焦点ピンホール（スリット）
Ｓ  試料
【図１】
2013145201.tif 000003
【図２】
2013145201.tif 000004
【図３】
2013145201.tif 000005
【図４】
2013145201.tif 000006
【図５】
2013145201.tif 000007
【図６】
2013145201.tif 000008
【図７】
2013145201.tif 000009
【図８】
2013145201.tif 000010
【図９】
2013145201.tif 000011
【図１０】
2013145201.tif 000012
【図１１】
2013145201.tif 000013
【図１２】
2013145201.tif 000014
【図１３】
2013145201.tif 000015
【図１４】
2013145201.tif 000016
【図１５】
2013145201.tif 000017
【図１６】
2013145201.tif 000018
【図１７】
2013145201.tif 000019