(57)【要約】 【課題】窒化ケイ素膜チップの表面を簡易かつ効果的に活性化する方法を提供すること、及び活性化された窒化ケイ素膜チップを用いて、高感度のセンサーチップを提供する。【解決手段】窒化ケイ素膜チップをアルカリ液に接触させることで、ターゲットと反応するリガンドを固定化するバインダーと前記窒化ケイ素膜との結合頻度を高めたことを特徴とする窒化ケイ素膜チップの活性化法の構成とした。また、前記バインダーを介して、前記リガンドを結合させたことを特徴とする窒化ケイ素膜センサーチップの構成とした。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒化ケイ素膜チップをアルカリ液に接触させることで、ターゲットと反応するリガンドを固定化するバインダーと前記窒化ケイ素膜との結合頻度を高めたことを特徴とする窒化ケイ素膜チップの活性化法。
【請求項２】
前記接触が、温度１０〜４０℃の範囲で、かつ１〜１０分間の反応であることを特徴とする請求項１に記載の窒化ケイ素膜チップの活性化法。
【請求項３】
前記アルカリ液が、２〜５ｍｏｌ／Ｌの範囲の水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム水溶液であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の窒化ケイ素膜チップの活性化法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３の何れか１項に記載の窒化ケイ素膜チップの活性化法で活性化されたチップに、前記バインダーを介して、前記リガンドを結合させたことを特徴とする窒化ケイ素膜センサーチップ。
【請求項５】
前記バインダーが、有機ケイ素化合物を含むことを特徴とする請求項４に記載の窒化ケイ素膜センサーチップ。
【請求項６】
前記バインダーが、金ナノ粒子を含むことを特徴とする請求項４又は請求項５に記載の窒化ケイ素膜センサーチップ。
【請求項７】
前記バインダーが、金ナノ粒子であり、前記金ナノ粒子をダイレクトに前記チップに固定化し、前記金ナノ粒子に前記リガンドを結合させたことを特徴とする請求項４に記載の窒化ケイ素膜センサーチップ。
【請求項８】
前記金ナノ粒子の前記チップへの固定化が、前記アルカリ処理後、５分以内に、金ナノ粒子コロイドを前記活性化窒化ケイ素膜チップに載せ、室温で、４時間以上接触させ、金ナノ粒子を固定化することを特徴とする請求項７に記載の窒化ケイ素膜センサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサーチップの基板である窒化ケイ素膜チップの活性化法、およびそれを利用した窒化ケイ素膜センサーチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の一般的なセンサーチップは、ガラス基板に金を蒸着したチップが主流であり、このチップの金表面にリガンドを固定化している。この金蒸着チップは、オゾン酸化やピランハ溶液（濃硫酸−過酸化水素＝３：１）によって活性化或いは洗浄して使用される。
【０００３】
チップの活性化とは、ターゲットを捕捉或いはターゲットと反応するリガンドと結合するバインダーの結合頻度を上げることをいう。すなわち高密度にリガンドをチップに固定化できるようにする前処理のことである。
【０００４】
一方、窒化ケイ素膜チップは、これまでフルイドウェアテクノロジーズ（株）がセンサーチップに応用した例（非特許文献１）があるが、市場では、水晶子振動子法（ＱＣＭ）や表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などのセンサーチップに比べると、チップは低コストであるにもかかわらず、ほとんど普及していない。
【０００５】
従来の窒化ケイ素膜チップでは、窒化ケイ素膜チップの表面を活性化させることなく直接アミノシラン処理して、リガンドを固定化するに留まっていた。
【０００６】
窒化ケイ素（ＳｉＮ)は、もともとは半導体のシリコン表面を覆って基板を安定化させるための素材である。そのため、化学的に安定で、簡便に活性化する方法が課題であった。
【０００７】
窒化ケイ素膜チップを活性化しようとして、先に述べた金チップと同様の方法で、ピランハ処理しても、それに続くアミノシラン処理は不十分でチップの活性化は困難であった。また、セラミックスの表面改質において、コロナ放電やプラズマ照射が使用されており（非特許文献２）、本技術の窒化ケイ素膜チップへの応用が期待されている。
【０００８】
しかし、プラズマ照射やコロナ放電による確実な窒化ケイ素膜チップの活性化はほとんど知られていない上、特定の装置（専用機）を必要とするため、簡便で確実な窒化ケイ素膜チップの表面を活性化する技術の開発が待ち望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０７５４９３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】フルイドウェアテクノロジーズ株式会社，平成２２年度〔ＳＢＩＲ技術革新事業〕，プレゼンテーション審査会資料，２０１０年７月２３日（http://www.fluidware-technologies.com/topics/sbir-all.pdf）
【非特許文献２】株式会社浅草製作所Ｗｅｂページ「コロナ放電表面処理装置」、「プラズマシャワー照射表面改質」（http://www.asakusa-machinery.co.jp/korona.htm、http://www.asakusa-machinery.co.jp/purazuma.htm）
【非特許文献３】東レ・ダウコーニング株式会社カタログ「シランカップリング剤」（http://www.silicone.jp/j/products/type/silane/detail/silane_cup/index.shtml）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明は、窒化ケイ素膜チップの表面を簡易かつ効果的に活性化する方法を提供すること、及び活性化された窒化ケイ素膜チップを用いて、高感度のセンサーチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者等は、上記課題を解決するために、鋭意検討したところ、特殊な装置や設備を必要とすることなく、特定のアルカリ処理をするだけで、窒化ケイ素膜チップにダメージを与えることなく、窒化ケイ素膜チップの表面を活性化できることを発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち、
（１）
窒化ケイ素膜チップをアルカリ液に接触させることで、ターゲットと反応するリガンドを固定化するバインダーと前記窒化ケイ素膜との結合頻度を高めたことを特徴とする窒化ケイ素膜チップの活性化法の構成とした。
（２）
前記接触が、温度１０〜４０℃の範囲で、かつ１〜１０分間の反応であることを特徴とする（１）に記載の窒化ケイ素膜チップの活性化法の構成とした。
（３）
前記アルカリ液が、２〜５ｍｏｌ／Ｌの範囲の水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム水溶液であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の窒化ケイ素膜チップの活性化法の構成とした。
（４）
（１）〜（３）の何れかに記載の窒化ケイ素膜チップの活性化法で活性化されたチップに、前記バインダーを介して、前記リガンドを結合させたことを特徴とする窒化ケイ素膜センサーチップの構成とした。
（５）
前記バインダーが、有機ケイ素化合物を含むことを特徴とする（４）に記載の窒化ケイ素膜センサーチップの構成とした。
（６）
前記バインダーが、金ナノ粒子を含むことを特徴とする（４）又は（５）に記載の窒化ケイ素膜センサーチップの構成とした。
（７）
前記バインダーが、金ナノ粒子であり、前記金ナノ粒子をダイレクトに前記チップに固定化し、前記金ナノ粒子に前記リガンドを結合させたことを特徴とする（４）に記載の窒化ケイ素膜センサーチップの構成とした。
（８）
前記金ナノ粒子の前記チップへの固定化が、前記アルカリ処理後、５分以内に、金ナノ粒子コロイドを前記活性化窒化ケイ素膜チップに載せ、室温で、４時間以上接触させ、金ナノ粒子を固定化することを特徴とする（７）に記載の窒化ケイ素膜センサーチップの構成とした。
【００１３】
ここで、「窒化ケイ素膜チップ」とは、表面が窒化ケイ素で構成され、活性化処理を施していなく、かつリガンドを固定化していない基板のことである。
【００１４】
「リガンド」とは、ターゲットに結合するなど、ターゲットに依存した反応をする物質である。例えば、抗体などのタンパク質、糖鎖などがある。「ターゲット」とは、検出したい物質（分析対象体）である。従って、リガンドはターゲットに適した物質が適宜選択される。リガンドは、バインダーなどを介して窒化ケイ素膜チップに固定化される。
【００１５】
「バインダー」としては、有機ケイ素化合物を含むものを用いることができる。「有機ケイ素化合物」とは、ケイ素（Ｓｉ）に、反応性の有機官能基（アミノ基など）と、加水分解性基を備える化合物である、例えば、非特許文献３などのシランカップリング剤がある。また、バインダーとして金ナノ粒子なども例示できる。
【００１６】
他方、「センサーチップ」とは、基板にバインダーを介してリガンドが固定化されたものをいう。従って、窒化ケイ素膜センサーチップは、窒化ケイ素膜チップにリガンドが固定化され、光学的手法などを用いてターゲットを検出することができるものをいう。
【００１７】
窒化ケイ素膜チップの「活性化」とは、バインダーと窒化ケイ素膜チップとの結合頻度を高めるため、窒化ケイ素膜チップの表面処理をすることをいう。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、簡易、短時間のアルカリ処理を施すことにより、窒化ケイ素膜チップの表面を活性化することができ、アミノシラン処理によるアミノ基などのバインダーの結合量が高まった。その結果、リガンドを高密度に窒化ケイ素膜チップに固定化することができることとなる。
【００１９】
従って、活性化した窒化ケイ素被膜にリガンドが高密度に固定化されることによって、高感度にターゲットを検出できるセンサーチップを実現できる。バインダー、リガンドについては、ターゲットに応じて適宜選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、リシンおよびリシン擬剤検出用窒化ケイ素膜センサーチップの作製フローである。下段が実施例１で、上段がアルカリ処理を施さない比較例１である。
【図２】図２は、図１に示した実施例１の窒化ケイ素膜センサーチップ１（図２のＡとＣに対応）、および、比較例１の窒化ケイ素膜センサーチップ１０（図２のＢに対応）を用いてリシン擬剤の検出について比較した結果である。
【図３】図３は、病原性大腸菌Ｏ１５７の抗体を固定したセンサーチップで大腸菌Ｏ１５７を検出したときの検出結果である。
【図４】図４は、リシンおよびリシン擬剤検出用窒化ケイ素膜センサーチップの他の作製フロー（実施例４）である。
【図５】図５は、アルカリ処理後の窒化ケイ素膜チップの表面の活性化モデル、および、金ナノ粒子が固定化されていることを示す模式図である。
【図６】図６は、実施例４の窒化ケイ素膜センサーチップ１ａでリシン擬剤を検出した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【実施例１】
【００２２】
図１の下段に、本発明のセンサーチップの一例であるリシン検出用窒化ケイ素膜センサーチップの作製フローを示した（実施例１）。なお、図１の上段は比較例１で、比較例１は、実施例１におけるアルカリ処理を施さない未活性の窒化ケイ素膜チップ２にアミノシラン処理（ａ）をしたもので、それ以降のフローは実施例１と同じである。以下、各工程を詳細に説明する。
【００２３】
［未修飾の窒化ケイ素膜チップの活性化］  
未修飾の窒化ケイ素膜チップ２は、フルイドウェアテクノロジーズ株式会社製、光学薄膜（ＳｉＮ膜）センサチップ（形式ＳｉＮ−Ｓｅｎｓｏｒ、未処理（ＳｉＮのみ、導入なし）、２サンプル用、外形寸法１８ｍｍ×２６ｍｍ）を使用した。
【００２４】
［アルカリ処理］
アルカリ処理は、先ず未修飾の窒化ケイ素膜チップ２を、２Ｍ〜３．５Ｍ水酸化カリウムであるアルカリ液に、２分〜５分浸した。その後、そのチップを蒸留水で十分に洗浄し、窒素気流でブローさせた。その結果、窒化ケイ素膜チップ２の表面が活性化されて、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａとなる。その後、直ちに、工程（ａ）のアミノシラン処理を行った。アルカリ液は、前記水酸化カリウム液と同濃度の水酸化ナトリウム液を用いてもよい。
【００２５】
以下、従来から行われるバインダー、リガンドの固定化法と同様である。
［工程（ａ）アミノシラン処理］
実施例１では、アミノシラン処理は、アルカリ処理により活性化させた活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ（比較例１ではアルカリ処理をしない窒化ケイ素膜チップ２）に、アミノシラン（シランカップリング剤）を反応させるもので、１０％の３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）−エタノール（ＥｔＯＨ）溶液に、室温下、２分間浸漬して行った。
【００２６】
次に、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａをエタノール洗浄して、５０℃、真空下で３時間焼結処理を行った。その後、室温（ｒｔ）になるまで放置した。その結果、（ｂ）に示す構造の化合物（アミノシラン基３）が活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ上に形成された図１下段のチップ（ｂ）が作製される。アミノシラン基３は、ケイ素（Ｓｉ）及び酸素からなるガラス質３ａとアミノ基３ｂとからなる。
【００２７】
［工程（ｃ）リポ酸導入反応］
リポ酸導入反応は、アミノシラン基３のアミノ基（ＮＨ２）に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドで活性化したリポ酸（ＮＨＳ−ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ）を結合させる反応である。そのために、１００ｍｇのＮＨＳ−ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄを２０ｍＬの脱水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した溶液に、前述のアミノシラン処理したチップ（ｂ）を室温下、２日間、窒素雰囲気下で反応（浸漬）させた。その結果、（ｄ）に示す構造の化合物が活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ上に形成される。すなわち、リポ酸基４を表面に有する図１下段のチップ（ｄ）が作製される。
【００２８】
［工程（ｅ）金ナノ粒子導入反応］
金ナノ粒子導入反応は、リポ酸のジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）に金ナノ粒子５（２０ｎｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製  Ｇ１６２５）を固定化させる反応である。そのために、前記チップ（ｄ）上に金ナノ粒子（ＧＮＰ）コロイド溶液を滴下し、乾燥しないように、室温下、回転数４５−５０ｒｐｍで３時間振とうさせた。
【００２９】
その結果、（ｆ）に示す構造の化合物が活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ上に形成された図１下段のチップ（ｆ）が作製される。なお、金ナノ粒子５は、（１）ターゲットを光学的に高感度に検出するため、（２）リガンド６を金ナノ粒子５の表面に自己組織化によって高密度に固定化するための介在である。
【００３０】
［濡れ性試験］
アミノシラン処理、および、それに続く一連の操作後の図１下段実施例１のチップ（ｆ）の「濡れ性」について試験し、図１上段比較例１の窒化ケイ素膜チップ（ｆ）と比較した。
【００３１】
「濡れ性」とは、窒化ケイ素膜チップの表面の親水性度合いを示す指標である。試験方法は、各窒化ケイ素膜チップ（ｆ）の表面に水を滴下して水滴の状態を目視で観察した。窒化ケイ素膜チップ２そのものは、水をはじいてしまう性質を有するが、金ナノ粒子５が高密度に固定化されると親水性が増すことから、目視によって「濡れ性」を定性的に判断できる。
【００３２】
試験の結果、アルカリ処理していない比較例１の窒化ケイ素膜チップ（ｆ）では、水滴が撥水してしまい、水が窒化ケイ素膜チップ表面に留まらなかった。
【００３３】
比較例１において「濡れ性」が見られないということは、窒化ケイ素膜チップ２の表面はほとんど金ナノ粒子５で覆われていないことを示すものであり、これは、すなわち、窒化ケイ素膜チップ２の表面へのアミノシランの固定化量が少なく不十分であることを意味している。
【００３４】
他方、アルカリ処理した実施例１の窒化ケイ素膜チップ（ｆ）では、水滴は窒化ケイ素膜チップ上に薄く広がってなじんだ。このことからアルカリ処理により、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ上に金ナノ粒子５を固定化したチップ（ｆ）の表面の親水性（濡れ性）が増大したことがわかる。
【００３５】
このことは、金ナノ粒子５が高密度に窒化ケイ素膜チップ２に固定化されたことに由来する。金ナノ粒子５が高密度に固定化されるには、リポ酸が高密度に存在することが必要である。リポ酸の高密度導入が可能になったのは、アミノシラン処理によりアミノシラン基３が高頻度で窒化ケイ素膜チップ上に結合したことを意味している。
【００３６】
すなわち、「濡れ性」が向上したということは、窒化ケイ素膜チップ２をアルカリ処理することによりその表面の組成が大きく変化したことを示すものである。従って、アルカリ処理により窒化ケイ素膜チップの表面を活性化することに成功したといえる。
【００３７】
［工程（ｇ）糖鎖固定化］
糖鎖導入反応は、金ナノ粒子５にリシンやリシン擬剤のリガンド６である糖鎖６ａ（ここでは、リシン擬剤やリシン結合性のラクトース誘導体（特許文献１））を結合させる反応である。そのために、６６μＭのラクトース誘導体−メタノール溶液に、金ナノ粒子固定化チップ（ｆ）を浸し、マイクロウェーブを照射した（東京理化器械製、ＭＷＯ−１０００、４５℃、３００Ｗ、１時間）。
【００３８】
その結果、（ｈ）に示す構造のリガンド６が活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ上にバインダー７を介して形成された図１下段のチップ（ｈ）が作製された。なお、リシンとは、ヒマの種子に含まれることで知られる、人体に有毒なタンパク質である。リシン擬剤は、同じくヒマ種子に含まれ、リシンのホモローグであるが、毒性の低いタンパク質である。
【００３９】
実施例１と比較例１との「濡れ性」の対比から、実施例１では、比較例１に比べ極めて高密度にリガンドであるリシン検出用のラクトース誘導体が、バインダー７を介して固定化された金ナノ粒子５に結合し、窒化ケイ素膜チップに固定化したことが窺える。すなわち、リシン検出用の高感度の窒化ケイ素膜センサーチップ１が作製できた。
【実施例２】
【００４０】
実施例１で作製したリシン検出用の窒化ケイ素膜センサーチップ１、及び、比較例１で作製したリシン検出用の窒化ケイ素膜センサーチップ１０を、各々用いて、リシン擬剤の検出を試みた。
【００４１】
検出方法は、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ）を原理に用いたフルイドウェアテクノロジーズ株式会社製バイオセンサアレイシステムを用いて行った。糖鎖固定化チップを当該装置に装着し、ランニング緩衝液として１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（２５℃）を送液した（流速：２０μＬ／分）。
【００４２】
ベースラインの安定性を確認後、１μｇ／ｍＬおよび０．１μｇ／ｍＬのリシン擬剤（ＲＣＡ１２０，Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来凝集素、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｌ−１０８０）溶液を１００μＬ注入した。その結果を図２に示す。  
【００４３】
図２の横軸は、検出時間（秒）、縦軸は干渉点の波長シフト（Δλ（ｎｍ））でリシン擬剤の結合量に相当する。なお、約５００秒以降において、ターゲットのリシン擬剤が検出されている。
【００４４】
グラフＡ：は、実施例１の窒化ケイ素膜センサーチップ１であって、リシン擬剤の濃度を１μｇ／ｍＬとしたときの検出結果である。
【００４５】
グラフＢ：は、比較例１の窒化ケイ素膜センサーチップ１０であって、リシン擬剤の濃度を１μｇ／ｍＬとしたときの検出結果である。
【００４６】
グラフＣ：は、実施例１の窒化ケイ素膜センサーチップ１であって、リシン擬剤の濃度を０．１μｇ／ｍＬ（Ａの１／１０濃度）としたときの検出結果である。
【００４７】
図２から明らかなように、比較例１のＢの条件では、リシン擬剤を検出することはできなかったが、実施例１の窒化ケイ素膜センサーチップ１を用いた時には高感度にリシン擬剤を検出できた。
【００４８】
Ａの条件から濃度を１／１０にしたリシン擬剤であっても、比較例１のＢでは検出できなかったリシン擬剤を、実施例１の窒化ケイ素膜センサーチップ１を用いれば、グラフＣのように、高感度に検出することができた。従って、本発明によって、窒化ケイ素膜チップ２を高度に活性化し、それに続く、リガンド６を高密度に固定化することが可能になった。
【実施例３】
【００４９】
つぎに、実施例１と同様のアルカリ処理方法で活性化した活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ、及び、比較例１の活性化していない窒化ケイ素膜チップ２を、各々、用いて、大腸菌Ｏ１５７の検出用のセンサーチップを作製し、当該菌の検出を試みた。
【００５０】
大腸菌Ｏ１５７検出用のセンサーチップは、実施例１の金ナノ粒子５を固定化する工程までは、同工程で作製した。その後、実施例１で用いた糖鎖６ａのかわりに、大腸菌Ｏ１５７の抗体を次のようにして固定化した。
【００５１】
図１下段の実施例１に示す金ナノ粒子５を固定化したチップ（ｆ）を、６４０μＭのＨＳＣ１１−ＥＧ６ＯＣＨ２−ＣＯＯＮＨＳ（Ｐｒｏｃｈｉｍｉａ社製、商品コード：ＴＨＯＯ５−ｍ１１．ｎ６−Ｏ，Ｏ５、（下記化１に構造式を示した。））−メタノール溶液中に、室温で１日浸漬し、金ナノ粒子５に疎水性置換基（Ｃ１１のメチレン基）、非特異的吸着を抑制するためのエチレングルコール基（ＯＣＨ２ＣＨ２）および末端にチオール基（ＳＨ）とカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するリンカー（ＨＳＣ１１−ＥＧ６ＯＣＨ２ＣＯ−を固定化した。
【化１】
2013167626.tif 000003
ＨＳＣ１１−ＥＧ６０ＣＨ２−ＣＯＯＮＨＳの構造式
【００５２】
その後、１００μｇ／ｍＬのプロテインＡ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社、商品コード：６５００Ｂ−１０）溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を４℃で１日処理して、先に導入したリンカーにプロテインＡを固定化した。
【００５３】
最後に、５０μg／ｍＬの大腸菌Ｏ１５７抗体（Ａｂｎｏｖａ社、商品コード：ＭＡＢ３９８２）１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）−２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中、４℃で１日、または、室温で４時間反応させて、大腸菌０１５７抗体の固定化処理を行った。
【００５４】
この操作により、大腸菌Ｏ１５７の抗体が固定化された窒化ケイ素膜センサーチップを作製した。なお、比較例２は、実施例３において、窒化ケイ素膜チップ２にアルカリ処理を施さない以外同一の工程で作製されたセンサーチップである。
【００５５】
これら抗体固定化処理を行った各センサーチップを用い、リシン擬剤のかわりに、病原性大腸菌Ｏ１５７（濃度：１×１０４生菌）を用い、実施例２と同様にして測定を行った。病原性大腸菌Ｏ１５７は、初期菌数が約１００個で、ＬＢ培地[トリプトン １％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス ０．５％（Ｗ／Ｖ）、塩化ナトリウム １％（Ｗ／Ｖ）]により、３７℃にてオーバーナイトで前培養したものを用いた。生菌数はＨｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天培地［ハートエキス末  １０ｇ、ペプトン  １０ｇ、塩化ナトリウム  ５ｇ、カンテン  １５ｇ］を用いて３７℃にてオーバーナイトで培養して求めた。その結果を図３に示す。
【００５６】
図３の横軸は検出時間（秒）、縦軸は干渉点の波長シフト（Δλ（ｎｍ））で大腸菌Ｏ１５７の結合量に相当する。実施例３によって作製した大腸菌Ｏ１５７抗体を固定化処理したセンサーチップでは、大腸菌Ｏ１５７を１×１０４個検出できたが、比較例２のセンサーチップでは、当該濃度の大腸菌０１５７を検出することはできなかった。実施例３のセンサーチップを用いると、市販の抗体を用いた大腸菌Ｏ１５７検出キットと比べて、１００倍以上の高感度化が達成された。
【実施例４】
【００５７】
実施例１では、窒化ケイ素膜チップ２をアルカリ処理して活性化した後に、工程（ａ）アミノシラン処理、続いて工程（ｃ）リポ酸導入を行い、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａに金ナノ粒子５を固定化する。
【００５８】
他方、実施例４では、図４に示すように、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａに、直接、金ナノ粒子５を固定化し、窒化ケイ素膜センサーチップ１ａの作製方法を提案する。
【００５９】
［アルカリ処理］
先ず、未処理の窒化ケイ素膜チップ２を、実施例１と同様の方法で、アルカリ処理する。これにより、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａが得られる。
【００６０】
［工程（ｅ’）金ナノ粒子導入反応］
アルカリ処理後、直ちに、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａに金ナノ粒子５（ＧＮＰ）を接触させる。具体的には、アルカリ処理後、５分以内に活性化窒化ケイ素膜チップ２ａに金ナノ粒子５（田中貴金属製、Ａｕコロイド溶液−ＳＣ、粒径２０ｎｍ）を直接載せ、図１の工程（ｅ）と同様にして、４−６時間程度、室温下で固定化させる。その後、水で洗浄し、窒素ガスでチップ表面の水を除去すると、金ナノ粒子５が固定化された窒化ケイ素膜チップ（ｉ）が得られる。
【００６１】
次に、この活性化窒化ケイ素膜チップ（ｉ）に、実施例１で記載した［濡れ性試験］を実施したところ、実施例１の窒化ケイ素膜チップ（ｆ）と同様に、水滴が窒化ケイ素膜チップ上に薄く広がりなじんだ。すなわち、チップ表面の親水性が増して、濡れ性が増大したことを意味する。
【００６２】
［工程（ｊ）糖鎖固定化］
次に、金ナノ粒子５を固定化したチップ（ｉ）に、図４の工程（ｊ）を適用して、実施例１と同じく糖鎖６ａであるラクトース糖誘導体をリシンのリガンド６として金ナノ粒子に固定化した。なお、工程（ｊ）では、実施例１とは異なり、マイクロウェーブを照射することなく、自己集積化単分子膜法（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ、ＳＡＭ）によって、糖鎖を固定化した。具体的には、４０℃にて、１００μＭラクトース糖誘導体−メタノール（ＭｅＯＨ）溶液中に、金ナノ粒子５を固定化した活性化窒化ケイ素膜チップ２ａを１４時間浸漬して、糖鎖を金ナノ粒子５に固定化した。
【００６３】
その結果、図４（ｋ）に示す構造のリガンド６が、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａ上の金ナノ粒子５（バインダー）を介して形成され、窒化ケイ素膜センサーチップ１ａが得られる。
【００６４】
実施例４の手法によって窒化ケイ素膜センサーチップ１ａを作製すれば、実施例１の工程（ａ）のアミノシラン処理、工程（ｃ）のリポ酸導入を省略でき、一層簡易に窒化ケイ素膜チップを基材としたセンサーチップを製作することができる。
【００６５】
活性化窒化ケイ素膜チップ２ａの表面モデルを図５に示した。活性化前の窒化ケイ素膜チップ２の表面は、図５（Ａ）のような構造をとっていると考えられる。窒化ケイ素膜チップ２の表面にアルカリ水溶液を作用させると、図５（Ｂ）のように、アミノ基（−ＮＨ２）と水酸基（−ＯＨ）が窒化ケイ素膜チップ２の表面に形成され、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａとなる。
【００６６】
次に、金ナノ粒子５を活性化窒化ケイ素膜チップ２ａの表面に接触させ、所定時間保持すると、活性化窒化ケイ素膜チップ２ａの表面のアミノ基に金ナノ粒子５が固定化され、図５の（Ｃ）に示すような構造が活性化窒化ケイ素膜チップ２ａの表面に構築されると考えられる。
【実施例５】
【００６７】
次に、実施例４によって得られた窒化ケイ素膜センサーチップ１ａ及び実施例２のバイオセンサアレイシステムを用い、実施例２を参考にして、リシン擬剤の検出試験を行った。その検出結果を図６に示す。図６の表示は、図２と同じである。検査試料は、リシン擬剤（ＲＣＡ１２０）１μｇ／ｍＬとした。
【００６８】
図６のグラフＤが示すように、図４（ｋ）の窒化ケイ素膜センサーチップ１ａによって、リシン擬剤（ＲＣＡ１２０）１μｇ／ｍＬの試料から、図２のグラフＢ（アルカリ未処理）よりも極めて高感度（グラフＡと同程度の感度）で、リシン擬剤（ターゲット）を検出することができた。即ち、アルカリ処理せずに作製された窒化ケイ素膜センサーチップ１０よりも高感度な窒化ケイ素膜センサーチップ１ａが作製できたことが確認された。
【００６９】
図６の結果から、アルカリ処理した活性化窒化ケイ素膜チップ２ａに、直接、金ナノ粒子５が固定化されること、さらにそれを用いて窒化ケイ素膜センサーチップ１ａを作製することが可能なことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明では、アルカリ処理することで、窒化ケイ素膜チップの表面を簡易かつ効率的に活性化することができるので、ターゲットを高感度に検出するセンサーチップを提供できる。例えば、食中毒（菌、毒素）判定用のバイオセンサーや、毒物検出用のバイオセンサーが可能で、食品の安全性、テロ対策などに貢献することができる。
【符号の説明】
【００７１】
１    窒化ケイ素膜センサーチップ（アルカリ処理による活性化）
１ａ  窒化ケイ素膜センサーチップ
２    窒化ケイ素膜チップ
２ａ  活性化窒化ケイ素膜チップ
３    アミノシラン基
３ａ  ガラス質
３ｂ  アミノ基
４    リポ酸基
５    金ナノ粒子
６    リガンド
６ａ  糖鎖
７    バインダー
１０  窒化ケイ素膜センサーチップ（アルカリ未処理）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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