(57)【要約】【課題】ストレス性大腸運動亢進、ストレス性大腸知覚過敏等の炎症を伴わない過敏性腸症候群の予防又は改善剤の提供。【解決手段】ブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮及びこれらの抽出物から選ばれる１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮及びこれらの抽出物から選ばれる１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
【請求項２】
過敏性腸症候群が、ストレス性大腸運動亢進又はストレス性大腸知覚過敏である請求項１又は２記載の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過敏性腸症候群の予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
下痢には病原性微生物の感染、炎症性腸疾患などの炎症性の下痢の他に、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、機能性下痢など、炎症を伴わない非炎症性の下痢がある。これらの非炎症性の下痢発症には、ストレスの関与が大きいと考えられており、ストレスがその症状を増悪させることが報告されている（非特許文献１−３）。また近年、ストレスは、視床下部室傍核のcorticotropin-releasing factor（ＣＲＦ）分泌を介して、大腸運動亢進（下痢）と大腸知覚過敏を招くことが報告されている（非特許文献４）。
【０００３】
従来、斯かる過敏性腸症候群の治療方法としては、心理療法、食餌療法などのほか、薬物療法として下痢等の症状を緩和するための対症療法が行われているに過ぎない。例えば、オンダンセトロン（Ondansetron）等のセロトニン（５−ＨＴ）受容体拮抗薬、トリメブチン（Trimebutine）、ロペラミド（Loperamide）等のオピオイド受容体作動薬の投与が行われているが、これらは腸の筋層間神経叢に存在する受容体の調節により、大腸運動亢進（下痢）を改善するものであり、原因を制御する薬物療法は未だ確立されていない。
【０００４】
一方、ブドウ種子はプロアントシアニジンを含有し、抗アレルギー作用や抗炎症作用があること（特許文献１）、冬虫夏草には免疫調整作用や血圧降下作用があること（特許文献３）、ピーナッツ（落花生）の種皮にはコラゲナーゼ活性阻害作用があること（特許文献１）等が報告されている。
【０００５】
しかしながら、ブドウ種子、冬虫夏草及びピーナッツ種皮が、過敏性腸症候群の予防や改善に有効であることは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２７８７９２号公報
【特許文献２】特開２００２−１４５７５７号公報
【特許文献３】特開平８−１５７３８８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄ．２００４；９５：４４３−４５０
【非特許文献２】Ｇｕｔ  ２００４；５３：１１０２−１１０８
【非特許文献３】Ｃｕｒｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｒｅｐ．２００４；６：２１０−２１５
【非特許文献４】過敏性腸症候群  脳と腸の対話を求めて  ２００６；９−１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ストレス性大腸運動亢進、ストレス性大腸知覚過敏等の炎症を伴わない過敏性腸症候群の予防又は改善剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ストレスが大腸機能に与える影響について検討した結果、大腸内のマスト細胞の脱顆粒が炎症を伴わないストレス性の大腸機能低下に関与しており、マスト細胞の安定化とストレス性大腸運動亢進の改善及び大腸知覚過敏の改善には正の相関関係があることを明らかにしている（特願２０１０−０５３０６６、後記参考例参照）。そして、更に研究を進めたところ、ブドウ種子抽出物、冬虫夏草抽出物及びピーナッツ種皮抽出物にマスト細胞の安定化作用があり、且つ大腸知覚過敏改善作用があることを見出し、これが、過敏性腸症候群の予防又は改善に有用であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）−２）に係るものである。
１）  ブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮及びこれらの抽出物から選ばれる１種以上を有効成分とする過敏性腸症候群の予防又は改善剤。
２）過敏性腸症候群が、ストレス性大腸運動亢進又はストレス性大腸知覚過敏である上記１）の予防又は改善剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ストレス性大腸運動亢進、ストレス性大腸知覚過敏等の過敏性腸症候群を予防又は改善することができる食品、医薬品、医薬部外品、飼料又はこれらに配合して使用される素材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ストレス負荷が大腸知覚に与える影響を示すグラフ。
【図２】ストレス性大腸知覚過敏に対するマスト細胞安定化剤の影響を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「ブドウ種子」としては、ブドウ科ブドウ属に属するブドウ（V. vinifera、V. labursca、V. amurensis、V. coignetiae、V. rupestris、V. riparia、V. berlandieri、V. champiniなど）の種子が挙げられる。
「ピーナッツ種皮」としては、マメ科のピーナッツ（Arachis hypogaea LINNE）の種皮が挙げられ、当該種子は渋皮、薄皮、甘皮などを包含する。
「冬虫夏草」とは、蛾の幼虫などに寄生する菌類の総称を意味し、冬虫夏草属（Cordyceps）中のCordyceps sinensis（冬虫夏草）、Cordyceps militaris（サナギタケ）、Cordyceps nutans（ミミカキタケ）、Cordyceps sobolifera（セミタケ）などの種が包含される。本発明においては何れの種のものも使用できるが、コウモリ蛾科の幼虫（Hepialus armoricanus）に寄生する冬虫夏草（Cordyceps sinensis）が好適である。当該冬虫夏草は、その子実体又はその複合体を使用することが好ましい。
斯かるブドウ種子、冬虫夏草及びピーナッツ種皮は、これらの乾燥物又はその粉砕物、あるいはこれらの抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
【００１４】
抽出物としては、ブドウ種子、冬虫夏草又はピーナッツ種皮を、常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等公知の抽出方法により得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられる。
公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。
【００１５】
抽出溶剤としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類等が挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用でき、溶剤を変えて繰り返し行うことも可能である。このうち、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類等を用いるのが好ましく、特に水、エタノール混液、例えば２０〜８０ｖ／ｖ％エタノール水を用いるのが好ましい。
【００１６】
抽出は、例えばブドウ種子、冬虫夏草又はピーナッツ種皮１質量部に対して１〜１０質量部の溶剤を用い、０〜７０℃、好ましくは１０〜３０℃で数時間〜数週間、好ましくは１２時間〜２日間、浸漬又は加熱還流することにより行うことができる。なお、水蒸気蒸留によって得ることもできる。
【００１７】
上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。
【００１８】
また、本発明の植物又はその抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。また、前記抽出処理物の他、市販品を用いても良い。
【００１９】
また、上記抽出物は、さらに液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸収樹脂、イオン交換樹脂等の公知の技術によって不活性な夾雑物を除去して用いることが好ましい。このとき用いる溶剤は、上記の抽出溶剤の例示のものを用いてもよい。また、これらは、必要により公知の方法により脱臭、脱色等の処理を施してから用いてもよい。また、抽出物をさらに精製する際には、当該公知の技術及び方法を用いてもよい。
【００２０】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、一般的には、下腹部を中心とした腹痛あるいは腹部不快感、便秘あるいは下痢などの便通異常、そして排便による腹部症状の改善、の症状があり、その病態を説明しうる器質的疾患や血液生化学的異常がないもので、症状が慢性的に持続する疾患と定義されている（日本臨床  ２００６；８：１４１５）。斯かる過敏性腸症候群は、炎症を伴わないものであり、炎症を伴う下痢や知覚過敏、すなわち病原性微生物の感染や炎症性腸疾患などの炎症性の下痢や知覚過敏とは区別される。この観点から、本発明における過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、非炎症性の過敏性腸症候群と称することもある。
ストレスを負荷すると、脳内でcorticotropin-releasing factor（ＣＲＦ）が放出される。ＣＲＦにより仙髄副交感神経が刺激され、筋層間神経叢のアセチルコリン性ニューロンを刺激して、輪状筋の収縮を起こすことにより大腸運動亢進が起こると考えられている（日本臨床  ２００６；６４：１４０６−１４０８）。また、同時にストレスはＣＲＦの分泌を介して大腸知覚過敏を招くと考えられている（前記非特許文献４）。本発明の過敏性腸症候群には、このように、身体的あるいは精神的に与えられたストレスによって惹起される大腸運動亢進（下痢）及び大腸知覚過敏等が包含される。また、従来、痙攣性大腸、痙攣性大腸炎、神経性大腸炎、神経性下痢、粘液性大腸炎、機能性大腸炎、大腸神経症、刺激結腸症候群などと称されてきた疾患についても、炎症を伴わない限りこれらを含むものである。
そして、前述のごとく、炎症を伴わない、ストレス性の大腸機能低下は、大腸内のマスト細胞の脱顆粒と関係し、マスト細胞の安定化とストレス性大腸運動亢進の改善及び大腸知覚過敏の改善には正の相関関係が認められている（特願２０１０−０５３０６６、後記参考例参照）。
【００２１】
ブドウ種子抽出物、冬虫夏草抽出物及びピーナッツ種皮抽出物は、後記実施例に示すように、マスト細胞を安定化すると共に、ラットを用いた大腸拡張試験によりＡＷＲスコアを有意に低下させストレス性の大腸知覚過敏を改善する作用を有する。
よって、本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物は、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、過敏性腸症候群の予防又は改善のために使用でき、非炎症性の過敏性腸症候群の予防又は改善剤となり得る。
【００２２】
当該過敏性腸症候群の予防又は改善剤は、それ自体、過敏性腸症候群の予防又は改善のための、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品であってもよく、又は当該医薬品、医薬部外品、食品又は飼料に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
また、当該食品には、過敏性腸症候群の予防又は改善、ストレス性大腸運動亢進の予防又は改善、ストレス性大腸知覚過敏の予防又は改善等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品若しくは特定保健用食品等の機能性食品が包含される。
【００２３】
本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物を含有する上記医薬品の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、腸溶剤、トローチ剤、ドリンク剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。
また、このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤（ソルビトール、グルコース、乳糖、デキストリン、澱粉等の糖類、炭酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、ゴマ油、とうもろこし油、オリーブ油、菜種油等）、結合剤、滑沢剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口投与用製剤中の本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物の含有量は、一般的に０．００１〜５０質量％とするのが好ましく、０．０１〜１０質量％とするのがより好ましい。
【００２４】
本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物を含有する食品の形態としては、例えば、パン、麺類等に代表される小麦粉加工食品、お粥、炊き込みご飯等の米加工食品、ビスケット、ケーキ、ゼリー、チョコレート、せんべい、アイスクリーム等の菓子類、豆腐、その加工食品等の大豆加工食品、清涼飲料、果汁飲料、乳飲料、炭酸飲料等の飲料類、ヨーグルト、チーズ、バター、牛乳等の乳製品、醤油、ソース、味噌、マヨネーズ、ドレッシング等の調味料、ハム、ベーコン、ソーセージ等の蓄肉、蓄肉加工食品、はんぺん、ちくわ、魚の缶詰等の水産加工食品、調理油ならびにフライ用油等が挙げられる。また、この他、当該製剤を配合して、カプセル等の錠剤食、濃厚流動食、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク栄養食等の経口経腸栄養食品、機能性食品等の形態とすることもできる。
また、飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等の飼料等が挙げられる。
種々の形態の食品や飼料を調製するには、本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物の含有量は、一般的に固形分濃度として０．００１〜５０質量％とするのが好ましく、０．０１〜１０質量％とするのがより好ましい。
【００２５】
上記医薬品、医薬部外品、食品又は飼料における本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物の摂取・投与量は、効果が得られる量であれば特に限定されない。また、その摂取・投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たりの１日の投与又は摂取量としては、本発明のブドウ種子、冬虫夏草、ピーナッツ種皮又はこれらの抽出物（乾燥物換算）として、例えば０．００１〜１００００ｍｇとするのが好ましく、更に０．０１〜５０００ｍｇ、特に０．３〜３０００ｍｇとするのが好ましい。また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して摂取・投与することが好ましい。
また、上記医薬品、医薬部外品又は食品の摂取又は投与対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、過敏性腸症候群、ストレス性大腸運動亢進（下痢）及び大腸知覚過敏等の予防又は改善又は治療を目的とするヒトやヒト以外の哺乳動物が好ましい。尚、当該対象者には、過敏性腸症候群の症状が認められる者及びそのおそれがある者やその疾患・症状の予防を期待する者も含まれる。
【実施例】
【００２６】
参考例１
＜ストレスが血中成分に与える影響解析＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように４群に群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。２群は自由摂食下で、２群は絶食下で２０時間飼育した。
自由摂食群、絶食群各１群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した（部分拘束ストレス、ストレス群）。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。対照群は、自由摂食群、絶食群各１群をイソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した。
麻酔下で腹部大動脈より全採血し、血中ヒスタミン、セロトニン、（ＥＬＩＳＡ法：Ｈ
ｉｓｔａｍｉｎｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ＥＬＩＳＡ；ＤＲＧ）、ＣＲＦ量（ＥＬＩＳＡ法：Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＣＲＦ−ＨＳ＿ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、矢内原研究所）、血中サイトカイン量（ＩＬ−１β，ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１０，ＩＬ−１３，ＴＮＦ−α）（マイクロビーズアレイ: Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をそれぞれ定量した。
【００２７】
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝３匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除した。麻酔下にて腹部大動脈からの全採血により安楽死させた後、結腸7区画（盲結腸移行部より１ｃｍ下流から１ｃｍ長に７分割）を摘出後、各区画を０．５  ｍＬ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ/Ｒｉｎｇｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ(６０μＭ)中で６０分間インキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法（Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ;Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により結腸組織からのヒスタミン放出量を定量した。
【００２８】
２．結果
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−１３量が絶食時、非絶食時共に高い傾向であった（表１）。絶食時の血中ＩＬ−１，ＩＬ−２量は、ストレス負荷群で低い傾向であった。その他のサイトカイン及びＣＲＦ量は、両群で差がなかった。
部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、血中ヒスタミン量（表２）が有意に高く、血中セロトニン量は増加傾向であった（表２）。また、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ刺激による摘出結腸からのヒスタミン放出量が有意に高かった（表３）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５）。
【００２９】
【表１】
2013063941.tif 000002
【００３０】
【表２】
2013063941.tif 000003
【００３１】
【表３】
2013063941.tif 000004
【００３２】
参考例２
＜ストレスが大腸運動に与える影響解析＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように２群に群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。１群（ストレス群）は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置し、その間の排泄糞便数を測定した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＣＬ．  ｅｔ  ａｌ.  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９８８;  ９４:  ６１１−６２１）。なお、排泄糞便数は、大腸運動の指標である。対照群は、イソフルラン吸入麻酔処理した後、覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した。
雄性ＷｓＲＣ−＋／＋（野生型）ラット、ＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓ（マスト細胞欠損）ラット（９−１２週齢: 日本ＳＬＣ）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で７日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝９匹/群、平均体重２６０ｇ）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置し、その間の排泄糞便数を測定した。
【００３３】
２．結果
Ｗｉｓｔａｒラットに、部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、排泄糞便数が有意に増加していた（表４）。
野生型（＋／＋）ラットでは、部分拘束ストレス負荷により、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、排泄糞便数が有意に増加していた（表５）。このストレス負荷による排便数の増加は、マスト細胞欠損（Ｗｓ／Ｗｓ）ラットでは認められなかった。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを行なった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３４】
【表４】
2013063941.tif 000005
【００３５】
【表５】
2013063941.tif 000006
【００３６】
参考例３  ストレスが大腸知覚に与える影響解析
＜ストレスが大腸知覚に与える影響解析＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝８匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除し、大腸拡張試験により大腸知覚を既報の方法（Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００７；  １３２：  ６１５−６２７）で評価した。すなわち、麻酔下ラットの大腸に経肛門的にバルーンカテーテル（シリコーンフォーリーカテーテル、２．０ ｍｍ（６Ｆｒ）、東レ・メディカル）を４cm挿入した。覚醒後、測定用ケージ内でバルーンカテーテルへの注水により、大腸を段階的に拡張させた。下記に示す各拡張容量における「Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  Ｒｅｆｌｅｘ （ＡＷＲ）スコア」をブラインド評価し、大腸知覚を半定量的に評価した。
２０時間絶食させた、雄性ＷｓＲＣ−＋／＋（野生型）ラット、ＷｓＲＣ−Ｗｓ／Ｗｓ（マスト細胞欠損）ラット（９−１３週齢: 日本ＳＬＣ）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝８−１２匹/群、平均体重２５０ｇ）した。
イソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の拘束を解除し、大腸拡張試験により大腸知覚を評価した。
【００３７】
≪Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  Ｒｅｆｌｅｘ （ＡＷＲ）スコア≫
０：ｎｏ  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  （変化なし）
１：ｂｒｉｅｆ  ｈｅａｄ  ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｔｙ  （頭を動かした後、静止）
２：ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｍｕｓｃｌｅ
ｗｉｔｈｏｕｔ  ｌｉｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｅｎ  （腹筋の収縮）
３：ｌｉｆｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｅｎ  （腹部を上げる）
４：ｂｏｄｙ  ａｒｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｆｔｉｎｇ  ｏｆ
ｐｅｌｖｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （体をアーチ状にし、骨盤を持ち上げる）
【００３８】
２．結果
Ｗｉｓｔａｒラットに、部分拘束ストレスを負荷した場合、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、より少ない拡張容量で大きなＡＷＲ応答を示した（図１）。
野生型（＋／＋）ラットでは、部分拘束ストレス負荷により、対照群（ストレス負荷なし）に比べて、各拡張容量におけるＡＷＲスコアが有意に高かった（図１）。このストレス負荷によるＡＷＲ応答の上昇は、マスト細胞欠損（Ｗｓ／Ｗｓ）ラットでは認められなかった（図１）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００３９】
参考例４
＜ストレス性大腸運動亢進に対する各種薬剤の影響＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で５日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝１０匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、表６示す各種薬剤（メチルセルロース水溶液（和光純薬、０．５  ｗ／ｖ％ メチルセルロース４００溶液、０．５  ｗ／ｖ％）に懸濁）又はメチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）し、覚醒下にて個別ケージ内に１時間静置した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）した。ストレス群はイソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置し、その間の排泄糞便数を測定した。
【００４０】
【表６】
2013063941.tif 000007
【００４１】
２．結果
薬剤非投与群（メチルセルロース投与）では、部分拘束ストレス負荷により、対照群に対して排泄糞便数が有意に増加した。５−ＨＴ３受容体拮抗薬（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ）、５−ＨＴ４受容体作動薬（ｍｏｓａｐｒｉｄｅ）、オピオイド受容体作動薬（ｔｒｉｍｅｂｕｔｉｎｅ）、オピオイド受容体作動薬（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）を前投与した場合、ストレス負荷による排便数の増加は有意に抑制された(表７)。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｓｃｈｅｆｆｅ  ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４２】
【表７】
2013063941.tif 000008
【００４３】
参考例５
＜定常時の大腸運動に対する各種薬剤の影響＞
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で５日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝５匹/群）した。
表６に示す各種薬剤を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）し、覚醒下にて個別ケージ内にて１２時間（暗期）飼育し、その間の排泄糞便数を測定した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｖ／ｗ ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）した。
【００４４】
２．結果
オピオイド受容体作動薬（ｌｏｐｅｒａｍｉｄｅ）を前投与した場合、排泄糞便数は対照群（メチルセルロース投与）に比べて有意に少なかった（表８）。一方、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ）、５−ＨＴ３受容体拮抗薬（ｏｎｄａｎｓｅｔｒｏｎ）、５−ＨＴ４受容体作動薬（ｍｏｓａｐｒｉｄｅ）、及びオピオイド受容体作動薬（ｔｒｉｍｅｂｕｔｉｎｅ）は排泄糞便数に影響が認められなかった。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｓｃｈｅｆｆｅ  ｔｅｓｔを行なった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４５】
【表８】
2013063941.tif 000009
【００４６】
参考例６
＜ストレス性大腸知覚過敏に対するマスト細胞安定化剤の影響＞
１．方法
２０時間絶食させた雄性Ｗｉｓｔａｒラット（８−１０週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝８匹/群）した。
マスト細胞安定化剤投与群は、イソフルラン吸入麻酔下、マスト細胞安定化剤（ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ，メチルセルロース溶液に懸濁）を胃内投与（５ｍｇ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）と同時に、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置した後、動物の固定を解除し、参考例３と同様に大腸拡張試験により大腸知覚を評価した。
【００４７】
２．結果
Ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ投与ラットでは、対照群（メチルセルロース投与）に比べて、各拡張容量におけるＡＷＲスコアが有意に低かった（図２）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、対照群に対するＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔを行なった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００４８】
以上の結果から、マスト細胞の安定化がストレス性の大腸運動亢進改善及びストレス性の大腸知覚過敏改善に寄与しているものと考えられた。
【００４９】
参考例７
＜マスト細胞安定化剤のスクリーニング系の構築＞
１．方法
ラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地中で増殖させた後、２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を８×１０3 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（Ｎ＝３）となるように播き、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（０〜１５０μg／ｍＬ  フェノールレッド、血清、抗生物質を含まないＲＰＭＩ培地）で１５分間インキュベートした。
また、同様に、ＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）を含むＲＰＭＩ培地で室温で３０分間インキュベートした後、ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（０−４００μＭ）＋１５μｇ／ｍＬ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０を含むＲＰＭＩ培地（フェノールレッド、血清、抗生物質不含）で、室温で１５分間インキュベートした。
各ｗｅｌｌより培養上清を５０μＬずつ、次に各ｗｅｌｌに５００μＬの０．１％  Ｔ
ｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて細胞を溶解させ５０μＬずつを採取した。これにβ−ヘキソサミニダーゼの基質である２ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを含む０．２Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５０μＬを加えて３７℃で２時間反応させた。反応終了後、１５０μＬ  １Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ９．０）で停止後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞内外のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、β−ヘキソサミニダーゼ分泌（脱顆粒）（Ｏ．Ｄ．上清/(Ｏ．Ｄ．上清＋Ｏ．Ｄ．細胞溶解液)×１００(％)）を算出した。
【００５０】
２．結果
ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０は濃度依存的に脱顆粒を促進した（表９）。ｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅは濃度依存的に脱顆粒を抑制した（表１０）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ＰＬＳＤを行なった（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００５１】
【表９】
2013063941.tif 000010
【００５２】
【表１０】
2013063941.tif 000011
【００５３】
実施例１  各種抽出物の調製
（１）ブドウ種子抽出物
中国産のブドウ科ブドウ（Vitis vinifera）種子の含水エタノール抽出物（製品名ブドウ種子エキス（Ningbo Green Health社製）を、50%エタノール水にて濃度１％（w/v）となるように溶解して試験サンプルとした。
（２）ピーナッツ種皮抽出物
マメ科落花生（Arachis hypogaea）の種皮の抽出物（製品名「ピーナッツ種皮エキス」、常磐植物化学研究所製）を、50%エタノール水にて濃度１％（w/v）となるように溶解して試験サンプルとした。
（３）冬虫夏草抽出物
冬虫夏草（コウモリガの幼虫にフユムシナツクサタケを感染させて培養したものの子実体、虫体）の70％エタノール水抽出液（製品名「冬虫夏草エキス」、サントリー社製）エキス濃度１％となるように濃縮して試験サンプルとした。
【００５４】
実施例２  マスト細胞安定化作用
１．方法
ラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍＬ）を含むＭＥＭ培地中で増殖させた後、２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を８×１０3 ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ（Ｎ＝３）となるように播き、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン（１００  ｕｎｉｔ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００  μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２日間培養した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、実施例１で調製した各試験サンプル（０．００１％）を其々含むＲＰＭＩ１６４０培地で３０分間インキュベートした後、同サンプル１又は２（０．００１％）、及びｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（５０ μｇ/ｍL）を含むＲＰＭＩ培地（フェノールレッド、血清、抗生物質を含まない）で１５分間インキュベートした。
各ｗｅｌｌより培養上清を５０μＬずつ、次に各ｗｅｌｌに５００μＬの０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えて細胞を溶解させ５０μＬずつを採取した。これにβ−ヘキソサミニダーゼの基質である２ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅを含む０．２Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５０μＬを加えて３７℃で２時間反応させた。反応終了後、１５０μＬ  １Ｍ  トリス緩衝液（ｐＨ９．０）で停止後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定し、細胞内外のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、β−ヘキソサミニダーゼ分泌（脱顆粒）（Ｏ．Ｄ．上清/(Ｏ．Ｄ．上清＋Ｏ．Ｄ．細胞溶解液)×１００(％)）を算出した。ポジティブコントロールとしてｄｏｘａｎｔｒａｚｏｌｅ（４００μＭ）を用いた。
【００５５】
２．結果
ブドウ種子抽出物、冬虫夏草抽出物及びピーナッツ種皮抽出物は、β−ヘキソサミニダーゼ分泌率について溶媒対照（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ４８／８０（５０ μｇ/ｍL）を含むＲＰＭＩ培地（フェノールレッド、血清、抗生物質を含まない））を1とした相対値が０．８以下であり、マスト細胞安定化効果を有していた（表１１）。
【００５６】
【表１１】
2013063941.tif 000012
【００５７】
実施例３  ストレス性大腸運動亢進に対するマスト細胞安定化剤の影響
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で５日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝６匹/群）した。
ストレス群は、イソフルラン吸入麻酔下、実施例１で調製した各試験サンプル（メチルセルロース水溶液（和光純薬、０．５  ｗ／ｖ％ メチルセルロース４００溶液、０．５  ｗ／ｖ％）に懸濁）又はメチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を表１２に示すように胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）し、覚醒下にて個別ケージ内に１時間静置した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｗ／ｖ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）した。ストレス群はイソフルラン吸入麻酔下、肩、前肢、胸部をテープで軽く固定し、前肢の動きの一部を制限した。覚醒下にて２時間個別ケージ内に静置し、その間の排泄糞便数を測定した。
【００５８】
【表１２】
2013063941.tif 000013
【００５９】
２．結果
薬剤非投与群（メチルセルロース投与）では、部分拘束ストレス負荷により、対照群に対して排泄糞便数が有意に増加した。ブドウ種子抽出物、冬虫夏草抽出物、ピーナッツ種皮抽出物を前投与した場合、ストレス負荷による排便数の増加は有意に抑制された(表１３)。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｓｃｈｅｆｆｅ  ｔｅｓｔを行なった（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００６０】
【表１３】
2013063941.tif 000014
【００６１】
実施例４  定常時の大腸運動に対するマスト細胞安定化剤の影響
１．方法
雄性Ｗｉｓｔａｒラット（９週齢: 日本クレア）を集合ケージ中、ＣＥ−２飼料（日本クレア）自由摂食下で５日間飼育した後、各群間に体重差がないように群分け（Ｎ＝４匹/群）した。
実施例１で調製した各試験サンプルを表１４に示すように胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）し、覚醒下にて個別ケージ内にて１２時間（暗期）飼育し、その間の排泄糞便数を測定した。対照群には、メチルセルロース０．５  ｖ／ｗ ％水溶液を胃内投与（４ｍＬ／ｋｇ体重）した。
【００６２】
【表１４】
2013063941.tif 000015
【００６３】
２．結果
ブドウ種子エキス、冬虫夏草エキス、ピーナッツ種皮エキスを前投与した場合、対照群に対して排泄糞便数に影響が認められなかった（表１５）。
なお、各ポイントは平均±標準誤差で示し、群間の統計学的有意差については、Ｓｃｈｅｆｆｅ  ｔｅｓｔを行なった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００６４】
【表１５】
2013063941.tif 000016
【００６５】
以上の結果から、マスト細胞の安定化作用を有するブドウ種子抽出物、冬虫夏草抽出物、ピーナッツ種皮抽出物がストレス性の大腸運動亢進改善に寄与しているものと考えられた。
【図１】
2013063941.tif 000017
【図２】
2013063941.tif 000018