(57)【要約】【課題】ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌から樹立した新規な癌細胞株を提供する。【解決手段】ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌に由来する細胞株を樹立した。この細胞株は、ＡＦＰを産生し、かつ、ＧＣＰ３を発現することを特徴とする。この細胞株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１５として寄託されている。本発明の細胞株は、肝様細胞癌、特に特にヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌を標的とする癌治療薬剤候補物質のスクリーニングに用いることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌に由来する細胞株。
【請求項２】
ＡＦＰを産生し、かつ、ＧＰＣ３を発現することを特徴とする請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌に由来する細胞株であって、ＡＦＰを産生し、かつ、ＧＰＣ３を発現することを特徴とする、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１５の細胞株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞株を移植した非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
非ヒト哺乳動物が免疫不全マウスである請求項４に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
癌治療薬剤候補物質を請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞株と接触させて、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む、肝様細胞癌治療薬剤のスクリーニング法。
【請求項７】
癌治療薬剤候補物質を請求項４又は５に記載の非ヒト哺乳動物に移植して、癌細胞増殖抑制を試験する工程を含む、肝様細胞癌治療薬剤のスクリーニング法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌から樹立した新規の癌細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】  肝様細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃａｎｃｅｒ）は、肝外臓器を原発巣とし、肝細胞癌に類似した組織像を呈する癌である。肝様細胞癌と肝細胞癌との類似性は細胞機能にも見られることが知られており、代表的な例としてａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）の産生が挙げられる。【０００３】  また、肝様細胞癌は、主として胃、大腸等の消化管ではじめに発症し、次いで肝転移を高頻度に起こすことが知られ、予後不良の疾患である。治療の第一選択は手術による癌切除であり、再発や転移を伴う患者では化学療法による治療が行われる。【０００４】  癌治療薬剤の開発では、同臓器、同癌腫の細胞株を用いて癌治療薬剤候補物質の効果判定、癌の浸潤、転移に関係する因子の同定が行われる。しかしこの方法はすでに細胞株が樹立された癌にのみ使用できるため、細胞株が樹立されていない癌においては適用できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】病理と臨床２０１０年Ｖｏｌ．２８臨時増刊号１２０−１２１ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  肝様細胞癌は予後不良の疾患であり、癌治療薬剤又はその候補物質の治療効果判定、あるいは予後の予測に関連する因子の同定を行うために用いられ得る細胞株は未だに樹立されていない。【０００７】  特に、ヒト十二指腸乳頭部での肝様細胞癌は症例が極めて少なく、上記目的に用いられ得る細胞株は得られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌から新規な癌細胞株を樹立することに成功し、本発明を完成させた。【０００９】  すなわち、本発明はヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌から樹立した新規な癌細胞株を提供する。【００１０】  また、ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌から樹立した新規な癌細胞株を移植した非ヒト哺乳動物を提供する。さらに、当該癌細胞株又は当該非ヒト哺乳動物を用いた肝様細胞癌治療薬剤のスクリーニング法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】  肝様細胞癌であって、特にヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌に対する癌治療薬剤又はその候補物質の治療効果判定、あるいは予後の予測に関連する因子の探索ならびに開発に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＶＡＴ−３９細胞株の位相差顕微鏡写真
【図２】ＶＡＴ−３９細胞株のＨＥ染色写真
【図３】ＶＡＴ−３９細胞株の電子顕微鏡写真
【図４】ＶＡＴ−３９細胞株におけるＡＦＰ、ＧＰＣ３のｍＲＮＡ発現
【図５】ＶＡＴ−３９細胞株のヌードマウス移植写真
【図６】移植片のＨＥ染色写真（低倍率）
【図７】移植片のＨＥ染色写真（高倍率）
【発明を実施するための形態】
【００１３】  本発明の癌細胞株は、ヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌患者の癌組織を用いて樹立することができる。具体的には以下の手順に従って行うことができる。
【００１４】（１）癌細胞の分離
癌細胞株は、ヒト十二指腸乳頭部に肝様細胞癌を発症した患者の患部から得ることができる。
【００１５】（２）癌細胞の株化
患部より分離した細胞株は、公知の組織培養培地（例えば、ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０、ＨＡＭ  Ｆ１２の混合培地）で培養し、安定的に増殖するまで定期的に（例えば、１〜数日間隔で）培地を交換して培養を行う。その後、一年間以上あるいは数十の継代にわたり安定的に増殖する細胞株を選択し、これを候補株とする。
【００１６】（３）腫瘍マーカーの確認
候補とされた細胞株を組織培養培地でさらに培養し、その培養上清で各種腫瘍マーカーが発現していることを確認する。腫瘍マーカーには、肝様細胞癌で確認される遺伝子、タンパク質を用いることができる。代表的な腫瘍マーカーとして、ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３（ＧＰＣ３）、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ＩＩ（ＰＩＶＫＡ  ＩＩ）、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９（ＣＡ１９−９）、Ｅｌａｓｔａｓｅ−１等の遺伝子又はタンパク質を用いることができる。特に、肝様細胞癌の特徴的なマーカーである、血清ＡＦＰ又はＧＰＣ３の遺伝子もしくはタンパク質を用いることが好ましい。
【００１７】  また、腫瘍マーカーの測定には、公知の手法、すなわち、ＰＣＲ法、各種のハイブリダイゼーション法、免疫沈降法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、化学発光免疫測定法、フローサイトメトリー、放射免疫測定法などが使用できる。
【００１８】  本発明より提供される細胞株は、以上（１）〜（３）の手法によって確立されたヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌細胞株である。
【００１９】  この細胞株としてＶＡＴ−３９細胞株が存在する。ＶＡＴ−３９細胞株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１５として寄託されている。
【００２０】  本発明は、ヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株を移植した非ヒト哺乳動物も提供する。ヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株を移植された非ヒト哺乳動物は、癌治療薬剤候補物質の治療効果判定や副作用検証等の各種実験用の動物として利用することができる。
【００２１】  非ヒト哺乳動物として、Ｔ細胞やＢ細胞等の機能に障害が生じ、免疫不全状態にあるヌードマウスやＳＣＩＤマウスなどの免疫不全動物が特に好ましい。
【００２２】  ヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株を非ヒト哺乳動物に移植する際には、常法に従うことができ、例えば皮下移植、腹腔内移植等を行うことができる。
【００２３】  ヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株は、肝様細胞癌治療薬剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングに有用である。例えば、癌治療薬剤候補物質をヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株と接触させて癌細胞増殖抑制効果を試験する工程を含む、肝様細胞癌治療薬剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングが可能である。このとき、肝様細胞癌の腫瘍マーカーとして血清ＡＦＰ、ＧＰＣ３等の濃度や、細胞株の増殖率、遊走能、浸潤能を測定することで、癌治療薬剤候補物質の癌細胞増殖抑制効果を判定することができる。
【００２４】  ヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株ではＧＰＣ３を発現することから、癌治療薬剤候補物質としてＧＰＣ３を認識する抗体などの分子標的薬剤候補物質をも含む。
【００２５】  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングにおける細胞株の培養方法、癌治療薬剤候補物質と接触させる方法は、当業者であれば対象候補物質に応じて適宜至適条件を設定することができる。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングにおける腫瘍マーカーの測定は、上述の手法を用いることができる。
【００２６】  また、ヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株を移植した非ヒト哺乳動物は、肝様細胞癌治療薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングに有用である。例えば、癌治療薬剤候補物質をヒト十二指腸乳頭部肝様細胞癌細胞株を移植した非ヒト哺乳動物に投与して癌細胞増殖抑制効果を試験する工程を含む、肝様細胞癌治療薬剤のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングが可能である。このとき、肝様細胞癌の腫瘍マーカーである血清ＡＦＰ、ＧＰＣ３等の量を指標とすることで、あるいは腫瘍の組織学的所見をもとに、癌治療薬剤候補物質の癌細胞増殖抑制効果を判定することができる。
【００２７】  Ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングにおける癌治療薬剤候補物質の投与方法は、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射もしくは、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に投与するなど、当業者であれば適宜選択することができる。また、ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングにおける腫瘍マーカーの測定は、上述の手法を用いることができる。組織学的所見に関しても、常法により行うことができる。
【実施例】
【００２８】  以下に本発明を実施例に則して詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。【００２９】実施例１：細胞株の樹立
（１）癌細胞の分離
十二指腸乳頭部に発生した肝様細胞癌の患者（６０歳代、男性）の同意を得て、当該癌のリンパ節転移部を切除し、癌細胞を分離した。【００３０】（２）癌細胞の株化
上記細胞をＨＡＭ  Ｆ１２（日水製菓株式会社）とＲＰＭＩ１６４０（日水製菓株式会社）を１：１の割合で混合し、１０％ウシ胎児血清（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を加えた培地で培養、増殖を行った。インキュベーター内は３７℃、５％ＣＯ２環境下に保ち、三日に１回の割合で培地を交換した。継代は１／４から１／１０の割合で行うことができた。一年以上の継代を重ね、継代数８０以上の状態で安定的に増殖する細胞株を選択した。【００３１】  この細胞株を、ＶＡＴ−３９と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１３１５として寄託した。【００３２】  図１〜３に、ＶＡＴ−３９細胞株の写真を示す。ＶＡＴ−３９細胞株は、多角形の細胞でシート状の形態を保ちつつ増殖する。細胞質内には多数の顆粒構造を含んでいる。【００３３】（３）腫瘍マーカーの確認
ＶＡＴ−３９細胞株を用いて、ＡＦＰ及びＧＰＣ３のｍＲＮＡの発現を検討した。【００３４】  ＶＡＴ−３９細胞株が９０％コンフルエントになった状態で、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）１ｍｌを直接振りかけて、細胞を回収した。ＤＮａｓｅ処理を行った後にＰＣＩ（ｐｈｅｎｏｌ／ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ／ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ）法でＲＮＡを抽出した。６μｇのＲＮＡに対して逆転写反応を用いてｃＤＮＡを作製し、その１／９０をＲＴ−ＰＣＴ法に供した。【００３５】  ＡＦＰ及びＧＰＣ３に対するプライマーを用い、ＶＡＴ−３９のｃＤＮＡで確認したところ、両者ともに明瞭なバンドが認められた（図４）。このことにより、ＶＡＴ−３９細胞株でＡＦＰ及びＧＰＣ３のｍＲＮＡの発現が確認された。なお、図４中のＶＡＴ−３９Ｐ１は継代数１のＶＡＴ−３９細胞株を示し、ＶＡＴ−３９Ｐ５０は継代数５０のＶＡＴ−３９細胞株を示す。ＶＡＴ−３９細胞株は、継代を重ねても性質に変化が無いことが確認された。【００３６】  さらに、ＶＡＴ−３９細胞株を用いて、培地中へのＡＦＰタンパク質の分泌を検討した。【００３７】  全自動化学発光免疫測定装置Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｏ  ｉ２００ＳＲ（アボット社）により、ＶＡＴ−３９細胞株培養培地のＡＦＰタンパク質量を測定した。測定されたＡＦＰタンパク質の量は、ＨＡＭ  Ｆ１２とＲＰＭＩ１６４０を１：１の割合で混合したのみの無血清培地では０．４０ｎｇ／ｍＬ、１０％ウシ胎児血清を加えた培地では１．７８ｎｇ／ｍＬであった。ＶＡＴ−３９細胞株の培養を開始し２４時間経過後では、７３６９．９９ｎｇ／ｍＬ、４８時間経過後では、１０１０５．７５ｎｇ／ｍＬ、７２時間経過後では、１２７２１．６０ｎｇ／ｍＬであった。このように、ＶＡＴ−３９細胞株では、ＡＦＰタンパク質が産生されていることが確認された。【００３８】  ＶＡＴ−３９細胞株を免疫組織化学染色した結果からも、ＶＡＴ−３９細胞株では、ＡＦＰ及びＧＰＣ３のタンパク質が発現していることが確認された。【００３９】（４）継代による影響の確認
ＶＡＴ−３９細胞株が継代を重ねることの影響を検討した。【００４０】  ＶＡＴ−３９Ｐ１（継代数１）及びＶＡＴ−３９Ｐ５０（継代数５０）の細胞株が９０％コンフルエントになった状態で、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡをそれぞれ抽出した。抽出したＤＮＡをＳＴＲ−ＰＣＲ分析に供した。ＳＴＲ−ＰＣＲ分析の結果は継代数１，５０ともにＡＭＥＬ：Ｘ、ＣＳＦ１ＰＯ：１２、Ｄ１３Ｓ３１７：１１、Ｄ１６Ｓ５３９：９，１２、Ｄ２１Ｓ１１：３０、Ｄ５Ｓ８１８：１２、Ｄ７Ｓ８２０：１２，１３、ＴＨ０１：９、ＴＰＯＸ：８，１１、ｖＷＡ：１４，１７であった。樹立した細胞株に他細胞株は混入しておらず、ＡＦＰ及びＧＰＣ３のｍＲＮＡ発現の結果とあわせて考えても、ＶＡＴ−３９細胞株は、継代を重ねても性質に変化が無いことが確認された。【００４１】実施例２：ＶＡＴ−３９細胞株のヌードマウスへの移植
（１）ＶＡＴ−３９細胞株の可移植性の確認
上記実施例１で樹立したＶＡＴ−３９細胞株の可移植性を検討した。【００４２】  ＶＡＴ−３９細胞株をＴｒｉｓ／ＥＤＴＡで処理して細胞をｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌの懸濁液として回収し、１０００ｒｐｍで５分間遠心してペレットを作製した。ペレットの細胞数を計測して、１匹あたり１×１０７／０．２ｍＬの濃度になるようＰＢＳで調整し、ヌードマウス（日本クレア、ＢＡＬＢ／ｃＡｊｃｌ−ｎｕ／ｎｕ）の右側腹部皮下に移植した。その結果、移植１〜３週間後には７例中全７例で腫瘍形成が確認された（図５）。【００４３】（２）ＶＡＴ−３９細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代の確認
ＶＡＴ−３９細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏでの継代を検討した。【００４４】  この腫瘍を無菌的に切除し、はさみで細切した後にコラゲナーゼ、ディスパーゼを添加した培地内で２時間ゆっくりと攪拌し、セルストレイナーを通した細胞懸濁液を７００ｒｐｍで３分間遠心した。得られたペレットを培地で再懸濁し、同条件で培養すると翌日にはシャーレの底に細胞の接着が認められ増殖した。このように、ＶＡＴ−３９細胞株はｉｎ  ｖｉｖｏでの継代が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】  本発明の細胞株は、肝様細胞癌、特に特にヒト十二指腸乳頭部における肝様細胞癌を標的とする癌治療薬剤候補物質のスクリーニングに用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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