(57)【要約】【課題】化粧料原料（但し、医薬部外品を含む）として好適な成分、特に新たな作用機序に基づいた抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に選別することができるスクリーニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】被検物質を接触させた細胞と被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態を評価し、これらの核膜異常状態の差を指標とすることによって、抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に選別することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態を評価し、被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態の差を指標として、抗老化作用を有する成分を選別することを特徴とする、抗老化作用のある成分のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記細胞が、核膜異常が生じた細胞である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記核膜異常が生じた細胞が、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかの細胞である、請求項２に記載のスクリーニング方法。
（ａ）核膜異常が生じている患者から採取した細胞
（ｂ）圧力を加えることによって核膜異常を生じさせた細胞
（ｃ）アンチセンスオリゴを接触させることによって核膜異常を生じさせた細胞
【請求項４】
前記細胞が、ヒト線維芽細胞である、請求項１〜３の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
核膜異常因子の量を測定すること及び／又は核形態を定量することによって細胞の核膜異常状態を評価する、請求項１〜４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記核膜異常因子が、プロジェリン（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ）である、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
プロジェリンタンパクの量を測定することによって核膜異常因子の量を測定する、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
プロジェリンｍＲＮＡの発現量を測定することによって核膜異常因子の量を測定する、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞の核染色像を画像解析することによって核形態を定量する、請求項５〜６の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記核染色像が、ラミンＡタンパクの免疫染色による染色像又はＤＡＰＩによる染色像である、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被検物質を接触させていない細胞に比べて、被検物質を接触させた細胞の核膜異常が抑制されている場合に、前記被検物質を抗老化作用を有する成分として選別する、請求項１〜１０の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
皮膚の抗老化作用を有する成分を選別するものである、請求項１〜１１の何れか１項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
シワの予防作用又は改善作用を有する成分を選別するものである、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか１項に記載のスクリーニング方法によって選別された抗老化作用を有する成分を含有する、抗老化用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１３の何れか１項に記載のスクリーニング方法によって選別された抗老化作
用を有する成分を含有する、皮膚外用剤。
【請求項１６】
化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、請求項１５に記載の皮膚外用剤。
【請求項１７】
シワの予防又は改善用である、請求項１５又は１６に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料原料等として好適な抗老化作用を有する成分のスクリーニング方法、並びに当該抗老化作用を有する成分を含有してなる抗老化用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の核を細胞質から隔離する役割を果たす核膜は、内膜と外膜よりなる脂質二重膜構造を有すると共に、核ラミナと呼ばれる成分が核膜構造の形成・維持に重要な役割を果たしている。核ラミナは、ラミンやラミン結合蛋白質により形成され、内膜の内側（核質側）の中間径フィラメントによる格子状の裏打ち構造を構築し、核の状態を保持するほか、クロマチンの構造変化の動態や機能制御（例えば、非特許文献１を参照）にも関与することが知られている。このため、ラミン等の核膜上の蛋白質成分の異常は、核膜異常が関連する組織特異的な遺伝病や老化などの多細胞生物に特有な問題を引き起こす生体分子として注目されている。
【０００３】
前記の核膜異常が関連する疾患としては、先天的遺伝子異常を原因とするハッチソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）が有名である。ＨＧＰＳは、原因遺伝子の特定により、ヒト１番染色体上にあるラミンＡ（ＬＭＮＡ）遺伝子の異常プロセッシングにより、プロジェリンと呼ばれる異常タンパクが産生され、核膜に異常が生じることにより、老化促進が引き起こされることが明らかにされている。本疾患の主要な症状としては、身長、体重の発育が乏しいことのほか、症状の進行に伴い皮膚の老化、高コレステロール血症、動脈硬化の亢進、糖尿病、骨粗鬆症、老年性の白内障、白髪、脱毛などの早老変化が顕著になることが挙げられる。このことは、核膜異常が、様々な老化現象の発現に深く関与していることを示唆している。また近年、ＨＧＰＳに観察されるのと類似の核膜異常が正常老化皮膚細胞や、紫外線を照射した正常皮膚細胞において確認されたこと（例えば、非特許文献２、３を参照）により、核膜異常現象と正常皮膚老化との関連性に注目が集まっている。しかしながら、核膜異常現象が、いかなる生体反応を経由し老化現象を促進・顕在化させるかに関する研究は、はじまったばかりであり、その詳細な機構に付いては、得られた知見も限られているのが現状である（例えば、非特許文献４を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】古川和広ほか、蛋白質・核酸・酵素、４６（１５），（２００１）
【非特許文献２】Ｐａｏｌａ  Ｓｃａｆｆｉｄｉ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１２（５７７６），１０５９−１０６３（２００６）
【非特許文献３】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｈｉｒｏｔａｋａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ．Ｒｕｅｎｇｅｒ，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１３３（７），１８５７−６２（２０１３）
【非特許文献４】Ｄａｙｌｅ  Ｍｃｃｌｉｎｔｏｃｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｓ  Ｏｎｅ，１２（ｅ１２６９），１−１２（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、化粧料原料（但し、医薬部外品を含む）として好適な成分、特に新たな作用機序に基づいた抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に選別することができるスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、被検物質を接触させた細胞と被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態を評価し、これらの核膜異常状態の差を指標とすることによって、抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に選別することができることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下に示す通りである。
＜１＞ 被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態
を評価し、被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態の差を指標として、抗老化作用を有する成分を選別することを特徴とする、抗老化作用のある成分のスクリーニング方法。
＜２＞ 前記細胞が、核膜異常が生じた細胞である、＜１＞に記載のスクリーニング方法
。
＜３＞ 前記核膜異常が生じた細胞が、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかの細胞である、＜２
＞に記載のスクリーニング方法。
（ａ）核膜異常が生じている患者から採取した細胞
（ｂ）圧力を加えることによって核膜異常を生じさせた細胞
（ｃ）アンチセンスオリゴを接触させることによって核膜異常を生じさせた細胞
＜４＞ 前記細胞が、ヒト線維芽細胞である、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載のスクリー
ニング方法。
＜５＞ 核膜異常因子の量を測定すること及び／又は核形態を定量することによって細胞
の核膜異常状態を評価する、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載のスクリーニング方法。
＜６＞ 前記核膜異常因子が、プロジェリン（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ）である、＜５＞に記載
のスクリーニング方法。
＜７＞プロジェリンタンパクの量を測定することによって核膜異常因子の量を測定する、＜６＞に記載のスクリーニング方法。
＜８＞ プロジェリンｍＲＮＡの発現量を測定することによって核膜異常因子の量を測定
する、＜６＞に記載のスクリーニング方法。
＜９＞ 細胞の核染色像を画像解析することによって核形態を定量する、＜５＞〜＜６＞
の何れかに記載のスクリーニング方法。
＜１０＞ 前記核染色像が、ラミンＡタンパクの免疫染色による染色像又はＤＡＰＩによ
る染色像である、＜９＞に記載のスクリーニング方法。
＜１１＞ 被検物質を接触させていない細胞に比べて、被検物質を接触させた細胞の核膜
異常が抑制されている場合に、前記被検物質を抗老化作用を有する成分として選別する、＜１＞〜＜１０＞の何れかに記載のスクリーニング方法。
＜１２＞ 皮膚の抗老化作用を有する成分を選別するものである、＜１＞〜＜１１＞の何
れかに記載のスクリーニング方法。
＜１３＞ シワの予防作用又は改善作用を有する成分を選別するものである、＜１２＞に
記載のスクリーニング方法。
＜１４＞ ＜１＞〜＜１３＞の何れかに記載のスクリーニング方法によって選別された抗
老化作用を有する成分を含有する、抗老化用組成物。
＜１５＞ ＜１＞〜＜１３＞の何れかに記載のスクリーニング方法によって選別された抗
老化作用を有する成分を含有する、皮膚外用剤。
＜１６＞ 化粧料（但し、医薬部外品を含む）である、＜１５＞に記載の皮膚外用剤。
＜１７＞ シワの予防又は改善用である、＜１５＞又は＜１６＞に記載の皮膚外用剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に判別することができることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】正常細胞及び核膜異常線維芽細胞におけるプロジェリンタンパク量を示した図である。
【図２】正常細胞及び核膜異常線維芽細胞におけるプロジェリンｍＲＮＡ発現量を示した図である。
【図３】正常細胞及び核膜異常線維芽細胞におけるコンター比を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜抗老化作用を有する成分のスクリーニング方法＞
本発明の一態様である抗老化作用を有する成分のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と略す場合がある。）は、被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態を評価し、被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態の差を指標として、抗老化作用を有する成分を選別することを特徴とする。
本発明者らは、化粧料原料（但し、医薬部外品を含む）として好適な成分、特に新たな作用機序に基づいた抗老化作用を有する成分を選別することができるスクリーニング方法を求めて研究を重ねた結果、被検物質を接触させた細胞と被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態を評価し、これらの核膜異常状態の差を指標とすることによって、抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に選別することができることを見出した。
核膜異常が関連する疾患としては、先天的遺伝子異常を原因とするハッチソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）が有名である。ＨＧＰＳは、原因遺伝子の特定により、ヒト１番染色体上にあるラミンＡ（ＬＭＮＡ）遺伝子の異常プロセッシングにより、プロジェリンと呼ばれる異常タンパクが産生され、核膜に異常が生じることにより、老化促進が引き起こされることが明らかにされている。本発明者らは、核膜異常を抑制することが老化の抑制に繋がることを確認するとともに、被検物質を接触させた細胞の核膜異常状態を評価することが抗老化作用を有する成分を選別する上で非常に有効であることを見出したのである。
【００１０】
本発明のスクリーニング方法において使用する細胞は、核膜を有するものであればその具体的種類は特に限定されないが、角化細胞、線維芽細胞等が挙げられる。これらの中でも、線維芽細胞が好ましく、ヒト線維芽細胞が特に好ましい。ヒト線維芽細胞を使用することによって、特に皮膚の抗老化作用を有する成分をより精度良く選別するものと考えられる。
また、本発明のスクリーニング方法において使用する細胞は、正常な細胞のほか、核膜異常が生じた細胞であってもよい。核膜異常が生じた細胞を使用することによって、抗老化作用を有する成分をより精度良く選別することができる。
なお、「核膜異常が生じた細胞」として、下記（ａ）〜（ｃ）の何れかの細胞を挙げることができる。
（ａ）核膜異常が生じている患者から採取した細胞
核膜異常が生じている患者は、例えば後述する核膜異常状態の評価方法によって判別することができる。
（ｂ）圧力を加えることによって核膜異常を生じさせた細胞
本発明者らは、細胞に圧力を加えることによって、効率的に核膜異常を生じさせることができるという新たな知見を見出している。圧力を加える方法として、例えばシリコン製の培養容器（ＳＴＢ−ＣＨ−４Ｗ、ストレックス株式会社）等を水平方向に伸展させ、伸展状態を保持しながら細胞を培養した後に、横方向に３３％収縮して８日間培養することで横方向の圧力刺激を加えることによって核膜異常を生じさせることができる。かかる方法は、精度良く、かつ簡便に核膜異常を生じさせることができる方法であり、抗老化作用を有する成分をより精度良く、かつより簡便に選別することに繋がる。
（ｃ）アンチセンスオリゴを接触させることによって核膜異常を生じさせた細胞
アンチセンスオリゴは、核膜異常を生じさせることができるものであれば特に限定されないが、Ｆｏｎｇ  Ｌ．Ｇ．らの方法（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ．１８（１３），２４６２−２４７１）により提示された、特定の配列を有するアンチセンスオリゴを使用することが好ましい。
また、本発明のスクリーニング方法は、採取等した細胞をそのまま使用するほか、培養した細胞を使用してもよい。細胞の培養は、例えば被検物質を接触させる細胞の場合、被検物質を接触させる前に行っても、被検物質を接触させた後に行っても、或いは被検物質を接触させる前及び被検物質を接触させた後の両方で行ってもよい。また、核膜異常が生じた細胞を使用する場合、核膜異常を生じさせる前に行っても、核膜異常を生じさせた後に行っても、或いは核膜異常を生じさせる前及び核膜異常を生じさせた後の両方で行ってもよい。なお、培養条件は、使用する細胞に応じて公知の培養方法を適宜採用することができる。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、「被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態を評価する」ことを特徴とするが、核膜異常状態を評価する具体的な評価方法は特に限定されず、光学顕微鏡等によって核膜を観察する等の公知の方法を適宜採用することができるが、核膜異常状態を定量的に表すことができる評価方法によって評価することが好ましい。具体的には、核膜異常因子の量を測定すること、及び核形態を定量することが挙げられる。
「核膜異常因子」とは、具体的には核膜異常の原因となるタンパク質を意味し、核膜異常因子の量が多いほど核膜異常が進んでいると評価することができる。なお、核膜異常因子として、例えばプロジェリン（Ｐｒｏｇｅｒｉｎ）等が挙げられる。
核膜異常因子の量を測定する方法は、特に限定されないが、タンパク発現量を測定する方法、及びｍＲＮＡ発現量を測定する方法等が挙げられる。タンパク発現量を測定する方法としては、ウェスタンブロット法（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等が挙げられる。一方、ｍＲＮＡ発現量を測定する方法としては、ノーザンブロット法（ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）法、さらにはリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ  ｔｉｍｉ  ＰＣＲ）とＲＴ−ＰＣＲを組み合わせた方法等が挙げられる。
【００１２】
核形態を定量する方法は、特に限定されないが、光学顕微鏡等によって核を観察し、核の寸法、面積等の核膜異常状態を表す数値を測定する方法が挙げられる。なお、光学顕微鏡等によって核を観察する場合において、核の染色を行ってもよい。染色方法も特に限定されず、公知の方法を適宜採用することができるが、例えばラミンＡタンパクの免疫染色、ＤＡＰＩによる染色が挙げられる。また、核膜異常状態を表す数値を測定するために、画像をコンピューターに取り込み、公知の画像解析ソフトを利用して測定を行ってよい。本発明のスクリーニング方法においては、細胞の核染色像を画像解析することによって核形態を定量することが好ましく、ラミンＡタンパクの免疫染色による染色像又はＤＡＰＩによる染色像を画像解析することによって核形態を定量することが好ましい。
また、光学顕微鏡等によって核を観察して測定した核の寸法、面積等の数値を直接使用するほか、これらの数値に基づいて核のコンター比等の数値を算出してもよい。コンター比は、式（コンター比＝４π×面積／周辺長2）によって算出することができる値であり
、１に近づくほど正円であり、０に近づくほど輪郭が歪んでいることを表す。従って、核のコンター比が０に近づくほど核膜異常が進んでいると評価することができる。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法は、「被検物質を接触させた細胞及び被検物質を接触させていない細胞の核膜異常状態の差を指標として、抗老化作用を有する成分を選別する」ことを特徴とするが、具体的には被検物質を接触させていない細胞に比べて、被検物質を接触させた細胞の核膜異常が抑制されている場合に、被検物質を抗老化作用を有する成分と
して選別するものである。
なお、抗老化作用を有する成分をより精度良く選別するため、或いは抗老化作用の強い成分を選別するために、核膜異常が抑制されているか否かの判断について独自の基準を設けて判断してもよい。
例えば、プロジェリンの量を測定することによって細胞の核膜異常状態を評価する場合、下記式によって算出されるプロジェリンの量の比率が、好ましくは９５％以下、より好ましくは８０％以下となった場合に、核膜異常が抑制されていると判断することが挙げられる。
（プロジェリンの量の比率）＝（被検物質を接触させた細胞のプロジェリンの量）／（被検物質を接触させていない細胞のプロジェリンの量）×１００
また、核のコンター比を算出することによって細胞の核膜異常状態を評価する場合、被検物質を接触させた細胞の核のコンター比が被検物質を接触させていない細胞の核のコンター比に対して増加する場合、より好ましくは統計学的に有意に増加する場合に、核膜異常が抑制されていると判断することが挙げられる。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法は、「抗老化作用を有する成分を選別する」ことを特徴とするが、抗老化作用を有する成分が対象とする具体的な老化現象は特に限定されず、核膜異常との関連性がある皮膚の老化、高コレステロール血症、動脈硬化の亢進、糖尿病、骨粗鬆症、老年性の白内障、白髪、脱毛等の老化現象に広く適用することができる。但し、本発明のスクリーニング方法は、皮膚の抗老化作用を有する成分を選別するものであることが好ましく、シワの予防作用又は改善作用を有する成分を選別するものであることがより好ましい。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法が選別対象とする被検物質の種類は、特に限定されず、単純な化学物質、植動植物由来の抽出物、植動植物由来の抽出物の分画精製物、及びこれらの混合組成物等に広く適用することができる。
例えば、植物由来の抽出物として、自生又は生育された植物、漢方生薬原料等として販売される日本産のものを抽出及び／又は精製したものを使用するほか、丸善製薬株式会社等の会社より販売されている市販の抽出物を購入し、使用することも挙げられる。前記抽出に用いる植物部位も特に限定されず、全草を使用するほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することもできる。抽出に際し、植物体などの抽出に用いる部位は、予め、粉砕或いは細切して抽出効率を向上させるように加工することが好ましい。抽出物製造においては、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬する。浸漬後は、室温まで冷却し、所望により不溶物を除去した後、溶媒を減圧濃縮するなどにより除去することが出来る。しかる後、シリカゲルやイオン交換樹脂を充填したカラムクロマトグラフィーなどで分画精製し、所望の抽出物を得ることが出来る。
前記抽出溶媒としては、極性溶媒が好ましく、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエ−テル、テトラヒドロフランなどのエーテル類から選択される１種乃至は２種以上が好適に例示することができる。
【００１６】
＜抗老化用組成物・皮膚外用剤＞
本発明のスクリーニング方法によって、抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に選別することができることを前述したが、本発明のスクリーニング方法によって選別された抗老化作用を有する成分を含有する抗老化用組成物（以下、「本発明の抗老化用組成物」と略す場合がある。）も本発明の一態様である。
本発明の抗老化用組成物は、本発明のスクリーニング方法によって選別された抗老化作
用を有する成分を含有するものであれば、その用途は特に限定されず医薬品、化粧品、食品、飲料等として利用することができる。また、抗老化作用を有する成分以外の成分についても特に限定されず、食品、医薬品、化粧料等の用途に基づき、それぞれの製剤化で使用される任意成分を含有することができる。例えば、経口投与組成物であれば、乳糖や白糖等の賦形剤、デンプン、セルロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロ−スカルシウム等の崩壊剤、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤、マルチトールやソルビトール等の甘味剤、クエン酸等の酸味剤、リン酸塩等の緩衝剤、シェラックやツェイン等の皮膜形成剤、タルク、ロウ類などの滑沢剤、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル等の流動促進剤、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈剤、矯味矯臭剤、着色剤、殺菌剤、防腐剤、香料等が挙げられる。経皮投与組成物であれば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシル等のエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油等のトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸等の脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等が挙げられる。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法によって、抗老化作用を有する成分を精度良く、かつ簡便に選別することができることを前述したが、本発明のスクリーニング方法によって選別された抗老化作用を有する成分を含有する皮膚外用剤（以下、「本発明の皮膚外用剤」と略す場合がある。）も本発明の一態様である。
本発明の皮膚外用剤は、本発明のスクリーニング方法によって選別された抗老化作用を有する成分を含有するものであれば、その他については特に限定されないが、抗老化作用を有する成分の含有量は、皮膚外用剤全量に対し、通常０．００００１質量％〜１５質量％、好ましくは０．０００１質量％〜１０質量％、より好ましくは０．００１質量〜５質量％である。抗老化作用を有する成分の含有量が、少なすぎると目的とする抗老化作用が発揮されず、多すぎても効果が頭打ちになり、この系の自由度を損なう場合が存するためである。
また、本発明の皮膚外用剤は、化粧料（但し、医薬部外品を含む）であることが好ましく、シワの予防又は改善用の皮膚外用剤であることが好ましい。
【実施例】
【００１８】
以下に、実施例を挙げて本発明に付いて更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定を受けないことは、言うまでもない。
【００１９】
［実施例１］
＜試験例１：プロジェリン量の変化を指標とした核膜異常状態評価＞
正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４穴プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）に７００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＦＢＳ：ハナ・ネスコバイオ社製、ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）で２４時間培養した。次いで核膜異常誘導のため、１００ｎＭのラミンＡアンチセンスオリゴ（ＧＴＧＡＣＧＴＧＣＡＣＴＧＡ：シグマジェノシス合成品）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ライフテクノロジーズ製）を用いてトランスフェクションした。なお、コントロールとしてスクランブルオリゴ（ＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＡ：シグマジェノシス合成品）を同手法にてトラ
ンスフェクションした細胞も用意した。その後それぞれの被検物質を所定濃度加え、７日間培養した。培養後に得られた細胞を、Ｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．０％  ＮＰ−４０、１錠  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ／５０ｍＬ超純水）にて溶解し、ＤＣプロテインアッセイ（バイオラッド製）にてタンパク量を調整後、Ｅ−ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ製）を用いて電気泳動を行った。泳動により分離されたタンパクを、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（ミリポア製）に電圧をかけることで転写し、４００倍希釈したヤギ抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（サンタクルズ製）及び内在性コントロールとしてウサギ抗β-アクチン
抗体(アブカム製)を反応させた。ＴＢＳバッファー（ミリポア製）にて洗浄後、５０００倍希釈したＨＲＰ含有抗ヤギＩｇＧ抗体（ＺｙＭａｘ製）及び抗ウサギＩｇＧ抗体（ＺｙＭａｘ製）を反応させ、洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＷｅｓｔＦｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモサイエンティフィック製）にてＨＲＰを発色させた。その後ＣｏｏｌＳａｖｅｒ（ＡＴＴＯ製）にて画像を取得し、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ製）にてプロジェリン及びβ-アクチンの
バンド強度を計測した。プロジェリンのバンド強度／β-アクチンのバンド強度を求め、
さらにアンチセンスオリゴをトランスフェクションした核膜異常細胞の値を１とした時の比を算出した。また、同様に、ラミンＡアンチセンスオリゴもしくはスクランブルオリゴをトランスフェクションして７日間培養した細胞を、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ製、配列非公開）を用い、cDNAを合成し、リアルタイムＰＣＲ（ライフテクノロジーズ製）にてプロジェリンｍＲＮＡ（プライマー配列：(1)５’−ＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧＧＧ−３’，(2)５’−ＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣ−３’，プローブ配列：５’−ＦＡＭ−ＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＣＣＴ−ＭＧＢ−３’、ライフテクノロジーズ合成品）の発現量を測定した。スクランブルオリゴとラミンＡアンチセンスオリゴ導入細胞のプロジェリン量を比較した結果を図１に、プロジェリンｍＲＮＡ発現量を比較した結果を図２に、アンチセンスオリゴ導入細胞に対して被験物質もしくは溶媒対照を添加した際のプロジェリン量を比較した結果を表１に示す。表１の結果より、プロジェリンの産生を抑制する植物抽出物が存在することが判る。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
［実施例２］
＜試験例２：核形態の変化を指標とした核膜異常状態評価＞
正常ヒト皮膚線維芽細胞を、２４穴プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製）に７００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになる様に播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ＦＢＳ：ハナ・ネスコバイオ社製、ＤＭＥＭ：シグマアルドリッチ社製）で２４時間培養した。次いで核膜異常誘導のため、１００ｎＭのラミンＡアンチセンスオリゴ（ＧＴＧＡＣＧＴＧＣＡＣＴＧＡ：シグマジェノシス合成品）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ライフテクノロジーズ製）を用いてトランスフェクションした。なお、コントロールとしてスクランブルオリゴ（ＴＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＡ：シグマジェノシス合成品）を同手法にてトランスフェクションした細胞も用意した。その後それぞれの被検物質を所定濃度加え、７日間培養した。培養後に得られた細胞を、アセトン（和光純薬製）にて固定し、１５０倍希釈したマウス抗ＬａｍｉｎＡ／Ｃ抗体（Ａｂｃａｍ製）を４℃で一昼夜反応させた。続いてＰＢＳ（−）（和光純薬製）にて洗浄後、２００倍希釈した抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｌｅｘａ４８８）（ライフテクノロジーズ製）を３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、１００００倍希釈したＤＡＰＩ（シグマアルドリッチ製）を室温で５分反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、フルオロマウントＧ（コスモバイオ製）にて封入し、共焦点顕微鏡ＬＭＳ５１０（カールツァイス製）にて画像を取得した。得られた画像から、画像解析ソフトＩＰ−Ｌａｂ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ製）を用いて１細胞核あたりの周辺長及び面積を計測し、式（４π×面積／周辺長2）にてコンター比を算出した。スクラン
ブルオリゴとラミンＡアンチセンスオリゴ導入細胞のコンター比を比較した結果を図３に、アンチセンスオリゴ導入細胞に対して被験物質もしくは溶媒対照を添加した際のコンター比を比較した結果を表２に示す。表２の結果より、核膜異常を抑制する植物抽出物が存
在することが判る。
【００２２】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、化粧料（但し、医薬部外品を含む）等に好適な、抗老化作用を有する成分をスクリーニング方法、並びに、当該成分を含有する組成物を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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