(57)【要約】【課題】セルロース含有原料から糖を効率よく製造することができる、生産性に優れる糖の製造方法を提供する。【解決手段】下記工程（１）及び工程（２）を有する糖の製造方法である。工程（１）：セルロース含有原料を、塩基性化合物の存在下、該セルロース含有原料の乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下の条件下で粉砕処理し、セルロース含有粉砕物を得る工程工程（２）：工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酵素で糖化処理する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）及び工程（２）を有する、糖の製造方法。
工程（１）：セルロース含有原料を、塩基性化合物の存在下、該セルロース含有原料の乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下の条件下で粉砕処理し、セルロース含有粉砕物を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酵素で糖化処理する工程
【請求項２】
塩基性化合物を固体状態で添加する、請求項１に記載の糖の製造方法。
【請求項３】
塩基性化合物の量が、セルロース含有原料中のホロセルロースを構成するアンヒドログルコース単位に対して０．０１〜１０倍モルである、請求項１又は２に記載の糖の製造方法。
【請求項４】
工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酸で中和する工程を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項５】
酵素が、セルラーゼ及びヘミセルラーゼから選ばれる１種以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項６】
酵素が、エンドグルカナーゼを含み、該エンドグルカナーゼの配合割合が、酵素中の総タンパク質量中１０〜９０質量％である、請求項１〜５のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項７】
酵素が、キシラナーゼを含み、該キシラナーゼの配合割合が、酵素中の総タンパク質量中２〜７５質量％である、請求項１〜６のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項８】
セルロース含有原料が、パルプ類、紙類、針葉樹又は広葉樹から得られる木材、植物茎・葉・果房類、及び藻類から選ばれる１種以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項９】
塩基性化合物が、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物及び硫化物から選ばれる１種以上である、請求項１〜８のいずれかに記載の糖の製造方法。
【請求項１０】
工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を、該セルロース含有粉砕物に対する水分量が５０〜１００００質量％の条件下で熟成する工程を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境問題への取り組みなどから、セルロースを含有するバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法などでエタノールや乳酸などへ変換する試みがなされている。セルロースを含有するバイオマス材料をセルラーゼなどの酵素により処理し、該セルロースを糖化して糖を製造する方法においては、その前処理工程として、該セルロースの結晶構造を非晶化させる処理を行うことが有用である。例えば、前処理工程として、塩化リチウム／ジメチルアセトアミドなどのセルロース溶剤を用いてセルロースを非晶化することが開示されている（特許文献１）。
【０００３】
一方、セルロースの糖化方法としては、特定のセルラーゼを用いる方法（特許文献２）、過酸化水素を用いてセルロース又はヘミセルロースを熱水処理してから酵素処理する方法（特許文献３及び４）などが知られている。
セルロース含有原料から糖を製造する方法としては、セルロース含有原料をロッドを充填した振動ミルで処理して、セルロースＩ型結晶化度を低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させて糖化する方法が知られている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２２３１５２号公報
【特許文献２】特開２００３−１３５０５２号公報
【特許文献３】特開２００７−７４９９２号公報
【特許文献４】特開２００７−７４９９３号公報
【特許文献５】特開２００９−１７１９５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１〜４に記載の方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。特許文献５に記載の方法は、優れた糖化効率を達成できるが、更に糖化効率を向上させることが求められている。
本発明は、セルロース含有原料から糖を効率よく製造することができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、塩基性化合物の存在下、かつ水分量が一定量以下の条件下でセルロース含有原料を粉砕処理することにより、前記課題を解決できることを見出した。
すなわち本発明は、下記工程（１）及び工程（２）を有する、糖の製造方法を提供する。
工程（１）：セルロース含有原料を、塩基性化合物の存在下、該セルロース含有原料の乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下の条件下で粉砕処理し、セルロース含有粉砕物を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酵素で糖化処理する工程
【発明の効果】
【０００７】
本発明の糖の製造方法によれば、セルロース含有原料を特定条件下で粉砕処理してから酵素処理することで、該酵素処理によるセルロースの糖化効率が向上し、セルロース含有原料から糖を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［糖の製造方法］
本発明の糖の製造方法は、下記工程（１）及び工程（２）を有する。
工程（１）：セルロース含有原料を、塩基性化合物の存在下、該セルロース含有原料の乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下の条件下で粉砕処理し、セルロース含有粉砕物を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酵素で糖化処理する工程
【０００９】
＜工程（１）＞
工程（１）は、セルロース含有原料を、塩基性化合物の存在下、該セルロース含有原料の乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下の条件下で粉砕処理し、セルロース含有粉砕物を得る工程である。
工程（１）において、水分量が所定量以下の条件下でセルロース含有原料（以下、「原料セルロース」と称する場合がある。）を塩基性化合物と共に粉砕することにより、該セルロース含有原料中に塩基性化合物を均一に分散させることができる。また、水分量が所定量以下の条件下で粉砕処理を行うことで、セルロース含有原料を効率的に粉砕することができる。その結果、セルロースを非晶化、小粒子径化することができ、更に塩基性化合物の作用により脱リグニン化、脱ヘミセルロース化することができる。
【００１０】
（セルロース含有原料）
セルロース含有原料の種類には特に制限はなく、カラマツやヌマスギなどの針葉樹、アブラヤシ、ヒノキなどの広葉樹から得られる各種木材；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎などの植物茎・葉・果房類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類；藻類などが挙げられる。
上記のうち、糖化効率の向上の観点、入手容易性及び原料コストの観点から、パルプ類、紙類、針葉樹又は広葉樹から得られる木材、及び植物茎・葉・果房類、藻類から選ばれる１種以上が好ましく、木材、植物茎・葉・果房類から選ばれる１種以上がより好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）から選ばれる１種以上がより好ましく、バガスが更に好ましい。
【００１１】
本発明に用いられるセルロース含有原料は、ホロセルロース含有量が２０質量％以上であることが好ましく、４０質量％以上であることがより好ましく、４５質量％以上であることが更に好ましく、５０質量％以上がより更に好ましい。
【００１２】
セルロース含有原料中の水分量は、粉砕効率の向上、及び結晶化度低減などの観点から、原料セルロースの乾燥重量に対して４０質量％以下であり、好ましくは３５質量％以下、より好ましくは３０質量％以下である。水分量の下限は原料セルロースに対して０質量％であるが、セルロース含有原料中の水分量を０質量％にすることは困難であるため、該水分量は原料セルロースの乾燥重量に対して好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、更に好ましくは１質量％以上である。また、該水分量は、原料セルロースの乾燥重量に対して０．０１〜４０質量％であることが好ましく、０．１〜３５質量％であることがより好ましく、１〜３０質量％であることが更に好ましい。
なお、セルロース含有原料中の水分量が４０質量％を超える場合には、該セルロース含有原料を公知の方法で乾燥させ（以下、「乾燥処理」と称する場合がある。）、その水分量がセルロース含有原料の乾燥重量に対し４０質量％以下となるように調整することによって用いることができる。
セルロース含有原料中の水分量は市販の赤外線水分計などを用いて測定することができ、具体的には実施例に記載の方法により測定することができる。
【００１３】
（塩基性化合物）
工程（１）において用いられる塩基性化合物としては、無機塩基性化合物が好ましく、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物及び硫化物から選ばれる１種以上が挙げられる。
アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどが挙げられる。また、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の酸化物としては、酸化ナトリウム、酸化カリウム、酸化マグネシウム、酸化カルシウムなどが挙げられ、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の硫化物としては、硫化ナトリウム、硫化カリウム、硫化マグネシウム、硫化カルシウムなどが挙げられる。
上記の塩基性化合物のうち、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物を用いることがより好ましく、アルカリ金属水酸化物を用いることが更に好ましく、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを用いることがより更に好ましい。これらの塩基性化合物は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
工程（１）において用いられる塩基性化合物の量は、セルロース含有原料中のホロセルロースをすべてセルロースとして仮定した場合に、該セルロースを構成するアンヒドログルコース単位（以下「ＡＧＵ」と称する場合がある。）に対し、好ましくは０．０１倍モル以上、より好ましくは０．０５倍モル以上、更に好ましくは０．１倍モル以上であり、また、好ましくは１０倍モル以下、より好ましくは８倍モル以下、更に好ましくは５倍モル以下、より更に好ましくは１．５倍モル以下である。また、該塩基性化合物の量は、セルロース含有原料中のホロセルロースを構成するアンヒドログルコース単位に対し、０．０１〜１０倍モルであることが好ましく、０．０５〜８倍モルであることがより好ましく、０．１〜５倍モルであることが更に好ましく、０．１〜１．５倍モルであることがより更に好ましい。塩基性化合物の使用量が０．０１倍モル以上であれば、後述する工程（２）において糖化効率が向上する。また、該使用量が１０倍モル以下であれば、塩基性化合物の中和及び／又は洗浄容易性の観点、及び塩基性化合物のコストの観点から好ましい。
【００１４】
セルロース含有原料への塩基性化合物の添加方法に特に限定はなく、セルロース含有原料中に塩基性化合物を一括添加してもよく、分割添加してもよい。塩基性化合物を一括添加する場合は、セルロース含有原料中に該塩基性化合物を均一に分散させる観点から、セルロース含有原料に塩基性化合物を添加した後に撹拌混合するか、セルロース含有原料を撹拌しながら塩基性化合物を添加して混合することが好ましい。
塩基性化合物の添加は、後述する粉砕処理を行う装置の中で行ってもよいし、別途撹拌及び混合を行う装置で行ってもよい。
上記撹拌及び混合を行う装置は、塩基性化合物を原料セルロース中に分散可能な装置であれば特に限定はない。例えば、リボン型混合機、パドル型混合機、円錐遊星スクリュー型混合機、粉体、高粘度物質、樹脂などの混錬に用いられるニーダーなどの混合機が挙げられる。これらの中では、水平軸型パドル型混合機がより好ましく、具体的には、チョッパー翼を有する水平軸型のパドル型混合機であるレディゲミキサー（中央機工株式会社製；特徴的なスキ状ショベルを用いる混合機、チョッパー翼を設置可能）、プロシェアミキサー（太平洋機工株式会社製；独自形状のショベル翼による浮遊拡散混合と多段式チョッパー翼による高速剪断分散の２つの機能を備えた混合機）が更に好ましい。
【００１５】
塩基性化合物を添加する際の形態には特に制限はないが、粉砕効率の観点から、原料セルロース中に固体状態で添加することが好ましい。塩基性化合物を固体状態で添加する場合、製造時の取り扱い性の観点、及び塩基性化合物をセルロース含有原料中に均一に分散させる観点から、塩基性化合物はペレット状、粒状又は粉末状であることが好ましい。なお、塩基性化合物が固体状態であることは、水分を含有しないことを意味するものではなく、空気中の水分の吸湿などにより水分を含有していてもよい。
【００１６】
（水分量）
工程（１）は、原料セルロースの乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下の条件下で行われる。該水分量が原料セルロースの乾燥重量に対して４０質量％以下であれば、セルロース含有原料の粉砕効率、及びセルロース含有原料と塩基性化合物との混合・浸透・拡散性が向上し、工程（２）の糖化処理が効率よく進行する。水分量の下限は０質量％である。
セルロースの結晶化度の低減、生産性及び糖化効率の向上の観点から、工程（１）における水分量は、原料セルロースの乾燥重量に対し好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、更に好ましくは１質量％以上、より更に好ましくは５質量％以上、より更に好ましくは７質量％以上であり、好ましくは３５質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２５質量％以下、より更に好ましくは２０質量％以下、より更に好ましくは１５質量％以下である。また、工程（１）における水分量は、原料セルロースの乾燥重量に対し０．１〜３５質量％であることが好ましく、０．５〜３５質量％であることがより好ましく、１〜３０質量％であることが更に好ましく、１〜２５質量％であることがより更に好ましく、５〜２５質量％であることがより更に好ましく、７〜２０質量％であることがより更に好ましく、７〜１５質量％であることがより更に好ましい。
工程（１）の粉砕処理時の水分量は、原料セルロースの乾燥重量に対する水分量を意味し、乾燥処理などにより原料セルロースならびに塩基性化合物に含まれる水分量を低減することや、粉砕処理時に水を添加することなどにより、所定の水分量に調整することができる。
【００１７】
（粉砕処理）
粉砕処理は、セルロース含有原料を小粒径化し、かつ該セルロース含有原料中に塩基性化合物を可及的に均一に分散させる操作である。固体状態の塩基性化合物を用いた場合には、粉砕処理によって、同時に塩基性化合物の粉末化も進行する。
【００１８】
粉砕処理は、公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、セルロース含有原料を小粒子化することができ、塩基性化合物をセルロース含有原料中に可及的に分散できる装置であればよい。
粉砕機の具体例としては、高圧圧縮ロールミルや、ロール回転ミルなどのロールミル、リングローラーミル、ローラーレースミル又はボールレースミルなどの竪型ローラーミル、転動ボールミル、振動ボールミル、振動ロッドミル、振動チューブミル、遊星ボールミル又は遠心流動化ミルなどの容器駆動媒体ミル、塔式粉砕機、攪拌槽式ミル、流通槽式ミル又はアニュラー式ミルなどの媒体攪拌式ミル、高速遠心ローラーミルやオングミルなどの圧密せん断ミル、乳鉢、石臼、マスコロイダー、フレットミル、エッジランナーミル、ナイフミル、ピンミル、カッターミルなどが挙げられる。これらの中では、セルロースの粉砕効率、及び生産性の観点から、容器駆動式媒体ミル又は媒体攪拌式ミルが好ましく、容器駆動式媒体ミルがより好ましく、振動ボールミル、振動ロッドミル及び振動チューブミルから選ばれる振動ミルが更に好ましく、振動ロッドミルがより更に好ましい。
【００１９】
粉砕方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
粉砕に用いる装置や媒体の材質としては特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラスなどが挙げられるが、セルロースの結晶化度低下効率の観点から、鉄、ステンレス、ジルコニア、炭化珪素、窒化珪素が好ましく、更に工業的利用の観点から、鉄又はステンレスが好ましい。
用いる装置が振動ミルであって、媒体がロッドの場合には、セルロース含有原料の粉砕効率の観点から、ロッドの外径は好ましくは０．１〜１００ｍｍ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍの範囲である。ロッドの大きさが上記の範囲であれば、セルロース含有原料を効率的に小粒子化させることができるとともに、ロッドのかけらなどが混入してセルロースが汚染されるおそれが少ない。
ロッドの充填率は、振動ミルの機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは１０〜９７％、より好ましくは１５〜９５％である。充填率がこの範囲内であれば、セルロースとロッドとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、原料セルロースの粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの攪拌部の容積に対するロッドの見かけの体積をいう。
【００２０】
粉砕処理時の温度に特に限定はないが、操作コスト及び原料セルロースの劣化抑制の観点から、−１００〜２００℃が好ましく、０〜１５０℃がより好ましく、５〜１００℃が更に好ましい。
粉砕時間は、粉砕後のセルロース含有原料が小粒子化されるよう適宜調整すればよい。用いる粉砕機や使用するエネルギー量などによって変わるが、通常１分〜１２時間であり、セルロース含有原料の粒子径の低下の観点、及びエネルギーコストの観点から、２分間〜６時間が好ましく、５分間〜３時間がより好ましく、５分間〜２時間が更に好ましい。
以上のようにして工程（１）を行うことにより、セルロース含有粉砕物が得られる。
【００２１】
（熟成工程）
また、工程（１）を行った後に、塩基性化合物の作用によるリグニンやヘミセルロースの結合の加水分解、すなわちリグニンの脱離、ヘミセルロースの脱離をより促進させて糖化効率を向上させる観点から、工程（２）の前、好ましくは後述する中和工程及び洗浄工程を行う場合にはその前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を、該セルロース含有粉砕物に対する水分量が５０〜１００００質量％の条件下で熟成する工程（以下「熟成工程」ということがある。）を有することが好ましい。塩基性化合物を含むセルロース含有粉砕物を所定の水分条件下で熟成させることにより、塩基性化合物の作用によるリグニンの脱離、ヘミセルロースの脱離が促進されて、糖化効率が更に向上すると考えられる。
本発明の製造方法において、熟成工程は、例えば、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物に水を添加して混合し、所望により加熱しながら、一定時間の間撹拌又は静置することにより行うことができる。
水をセルロース含有粉砕物中に均一に分散させる観点から、水をセルロース含有粉砕物中に添加した後、撹拌混合するか、又はセルロース含有粉砕物を撹拌しながら、水を添加し混合することが好ましい。
水の添加方法に特に限定はなく、一括添加でも、分割添加でもよい。
【００２２】
熟成工程における水分量は、塩基性化合物の作用によるリグニンやヘミセルロースの結合の加水分解、すなわちリグニンの脱離、ヘミセルロースの脱離をより促進させて糖化効率を向上させる観点から、セルロース含有粉砕物に対して、好ましくは５０質量％以上、より好ましくは１００質量％以上、更に好ましくは２００質量％以上、より更に好ましくは２３０質量％以上であり、また製造コストの低減の観点から、好ましくは１００００質量％以下、より好ましくは８０００質量％以下、更に好ましくは５０００質量％以下、より更に好ましくは４０００質量％以下、より更に好ましくは３５００質量％以下である。また、上記観点から、熟成工程における水分量は、セルロース含有粉砕物に対して好ましくは５０〜１００００質量％、より好ましくは１００〜８０００質量％、更に好ましくは２００〜５０００質量％、より更に好ましくは２３０〜３５００質量％である。
なお、セルロース含有粉砕物に対する水分量とは、セルロース含有粉砕物から塩基性化合物を除いた乾燥原料に対する質量％である。
【００２３】
熟成を行う装置に特に限定はない。その具体例としては、前記塩基性化合物の撹拌及び混合に用いられる装置が挙げられる。
【００２４】
熟成温度は、リグニン及びヘミセルロースの脱離を促進して糖化効率を向上させる観点から、好ましくは０℃以上、より好ましくは２０℃以上、更に好ましくは５０℃以上、更に好ましくは８０℃以上であり、ヘミセルロースに由来する成分の過分解の抑制、及び製造コスト低減の観点から、好ましくは２５０℃以下、より好ましくは２００℃以下、更に好ましくは１５０℃以下、より更に好ましくは１００℃以下である。
上記と同様の観点から、熟成温度は、好ましくは０℃以上２５０℃以下、より好ましくは２０℃以上２００℃以下、更に好ましくは５０℃以上１５０℃以下、更に好ましくは８０℃以上１００℃以下である。また、製造設備の簡素化、製造コスト低減の観点から、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは２０〜１００℃、更に好ましくは５０〜１００℃、より更に好ましくは８０〜１００℃である。
なお、後述する工程（２）に供する溶液中のセルロース含有粉砕物が適度な濃度となるように、熟成工程時に余剰の水分を蒸発させる操作を行ってもよい。例えば、熟成時に開放系にすることにより水分の蒸発を同時に行うこと等が挙げられる。
【００２５】
熟成時間は、リグニン及びヘミセルロースの脱離を促進して糖化効率を向上させる観点から、好ましくは０．０１時間以上、より好ましくは０．１時間以上、更に好ましくは０．５時間以上、より更に好ましくは１時間以上であり、ヘミセルロースに由来する成分の過分解の抑制、及び製造コストの低減の観点から、好ましくは２４時間以下、より好ましくは１８時間以下、更に好ましくは１２時間以下、より更に好ましくは６時間以下である。上記観点から、熟成時間は、好ましくは０．０１〜２４時間、より好ましくは０．１〜１８時間、更に好ましくは０．５〜１２時間、より更に好ましくは１〜６時間である。
【００２６】
また、工程（１）で用いた塩基性化合物や、セルロース含有原料中に含まれる夾雑物を除去するために、工程（２）の前、かつ熟成工程を行う場合は好ましくはその後に、以下のような中和工程や洗浄工程を有していてもよい。
【００２７】
（中和工程）
本発明の製造方法において、後述する工程（２）における糖化効率を向上させる観点から、工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酸で中和する工程を有することが好ましい（以下、これを「中和工程」と称する場合がある）。
用いられる酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸などの無機酸や、酢酸、クエン酸などの有機酸が挙げられるが、生産性、糖化効率並びに糖の収率の向上の観点から、塩酸、酢酸、硫酸、硝酸及びリン酸から選ばれる１種以上を用いることがより好ましく、塩酸、酢酸及び硫酸から選ばれる１種以上を用いることが更に好ましい。
また塩酸、硫酸などの無機酸を用いた場合には、中和工程において生成する塩の糖化反応に対する悪影響が少ないため、糖の収率向上の観点からもより更に好ましい。
中和工程は、例えば、セルロース含有粉砕物に適量の酸を添加して撹拌することにより行うことができる。中和工程は、ｐＨが中性付近、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ４〜７になるまで行う。
【００２８】
（洗浄工程）
工程（１）で用いた塩基性化合物や、セルロース含有原料中に含まれる夾雑物を除去し、工程（２）における糖化効率を向上させる観点から、工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を水で洗浄する工程を有していてもよい（以下、これを「洗浄工程」と称する場合がある）。
セルロース含有粉砕物の洗浄は、例えば、セルロース含有粉砕物を遠心分離した後、イオン交換水などの洗浄液を用いてｐＨが中性付近、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ４〜７になるまで洗浄を繰り返す方法などにより行うことができる。
【００２９】
上記中和工程及び洗浄工程は、いずれか一方の工程のみを行ってもよく、中和工程を行った後に更に洗浄工程を行ってもよい。また工程（２）で得られる糖の収率向上の観点から、無機酸を用いた中和工程のみを行うことも可能である。
【００３０】
＜工程（２）＞
工程（２）は、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酵素で糖化処理する工程である。
工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物は、非晶化・小粒径化され、また脱リグニン化・脱ヘミセルロース化されているため、酵素で処理することにより、グルコースもしくはキシロースといった単糖や、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロトリオースといったオリゴ糖などの混合物を効率よく得ることができる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合などを考慮すると、単糖まで分解することが好ましい。
【００３１】
工程（２）において用いられる酵素としては、糖化効率の向上の観点から、セルラーゼやヘミセルラーゼが挙げられる。
ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。また、へミセルラーゼとは、へミセルロースを加水分解する酵素を指し、キシラナーゼ、ガラクタナーゼなどと称される酵素の総称である。本発明に使用されるセルラーゼやヘミセルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のものが含まれる。
【００３２】
セルラーゼの具体例としては、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）などのトリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）由来のセルラーゼ製剤やバチルス  エスピー（Bacillus sp．）KSM-N145（FERM P-19727）株由来のセルラーゼ、またはバチルス  エスピー（Bacillus sp．）KSM-N252（FERM P-17474）、バチルス  エスピー（Bacillus sp．）KSM-N115（FERM  P-19726）、バチルス  エスピー（Bacillus sp．）KSM-N440（FERM P-19728）、バチルス  エスピー（Bacillus sp．）KSM-N659（FERM P-19730）などの各株由来のセルラーゼ、更には、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、アスペルギルス  アクレアタス（Aspergillus acleatus）、クロストリジウム  サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム  ステルコラリウム（Clostridium stercorarium）、クロストリジウム  ジョスイ（Clostridium josui）セルロモナス  フィミ（Cellulomonas fimi）、アクレモニウム  セルロリティクス（Acremonium celluloriticus）、イルペックス  ラクテウス（Irpex lacteus）、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、フミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス  ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の耐熱性セルラーゼなどが挙げられる。これらの中で、糖化効率向上の観点から、好ましくはトリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、あるいはフミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼが好ましい。
【００３３】
市販されているセルラーゼ製剤としては、例えば、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製、商品名）、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（ジェネンコア社製、商品名）、あるいはウルトラフロＬ（ノボザイムズ社製、商品名）が挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）が好ましく、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）がより好ましく、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）が更に好ましい。
【００３４】
また、セルラーゼの１種であるβ−グルコシダーゼの具体例としては、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）由来のβ−グルコシダーゼ（例えば、ノボザイム１８８（ノボザイムズ社製、商品名）やメガザイム社製β-グルコシダーゼ）やトリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、ペニシリウム  エメルソニイ（Penicillium emersonii）由来のβ−グルコシダーゼなどが挙げられる。
【００３５】
また、ヘミセルラーゼの具体例としては、市販のヘミセルラーゼ製剤やバチルス  エスピー（Bacillus sp．）KSM-N546（FERM P-19729）由来のキシラナーゼのほか、トリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、フミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）、バチルス  アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）由来のキシラナーゼ、更には、サーモマイセス（Thermomyces）、オウレオバシジウム（Aureobasidium）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、クロストリジウム（Clostridium）、サーモトガ（Thermotoga）、サーモアスクス（Thermoascus）、カルドセラム（Caldocellum）、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属由来のキシラナーゼなどが挙げられる。
【００３６】
市販されているヘミセルラーゼ製剤としては、例えば、ＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）、スクラーゼ（三菱化学フーズ株式会社製、商品名）、Ｓｈｅａｒｚｙｍｅ５００Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）、が挙げられる。このうち、糖化効率向上の観点から、ＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ、又はＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ２が好ましい。
【００３７】
工程（２）において用いられる酵素は、糖化効率の向上の観点から、上記セルラーゼ及びヘミセルラーゼから選ばれる１種以上であることが好ましい。
【００３８】
また、工程（２）において用いられる酵素は、セルラーゼの１種であるエンドグルカナーゼを含むことが好ましい。本発明で用いるエンドグルカナーゼとしては、セルロースの糖化効率の観点から、トリコデルマ（Trichoderma）族由来のエンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、及びエンドグルカナーゼII（ＥＧII）から選ばれる１種以上であることが好ましく、これらの酵素は異種宿主により発現させて用いてもよい。異種宿主により発現させる調製法は、特に制限はないが、例えば実施例記載の方法が挙げられる。
【００３９】
また、本発明で用いられるエンドグルカナーゼは、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のセルラーゼを精製したものを用いてもよい。精製方法については、特に制限はないが、例えば、実施例記載の方法が挙げられる。精製対象となるセルラーゼとしては、例えば、前述のセルラーゼが挙げられる。前述のセルラーゼのうち、トリコデルマ  リーゼ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ  ビリデ（Trichoderma viride）、あるいはフミコーラ  インソレンス（Humicola insolens）由来のセルラーゼ、例えばセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製、商品名）、あるいはウルトラフロＬ（ノボザイムズ社製、商品名）を用いることが好ましい。
【００４０】
工程（２）において用いられる酵素中のエンドグルカナーゼの配合割合は、糖化効率の向上及びグルコース生成量の増加の観点から、酵素中の総タンパク質量中、好ましくは１０質量％以上、より好ましくは１４質量％以上、更に好ましくは１６質量％以上、より更に好ましくは１８質量％以上、より更に好ましくは２０質量％以上であり、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは７５質量％以下、更に好ましくは７０質量％以下、より更に好ましくは６０質量％以下、より更に好ましくは５０質量％以下である。また、工程（２）において用いられる酵素中のエンドグルカナーゼの配合割合は、酵素中の総タンパク質量中１０〜９０質量％が好ましく、より好ましくは１４〜７５質量％、更に好ましくは１６〜７０質量％、より更に好ましくは１８〜６０質量％、更により好ましくは２０〜５０質量％である。なお、エンドグルカナーゼの配合割合は、実施例に記載の方法により調整することができる。
【００４１】
糖化効率をさらに向上させる観点から、工程（２）において用いられる酵素は、ヘミセルラーゼの１種であるキシラナーゼを含むことが好ましい。工程（２）で用いられる好ましいキシラナーゼの具体例としては、ＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）が挙げられる。
工程（２）において用いられる酵素中のキシラナーゼの配合割合は、糖化効率の向上及び還元糖量の増加の観点から、酵素中の総タンパク質量中、好ましくは２質量％以上、より好ましくは３質量％以上、更に好ましくは４質量％以上、より更に好ましくは５質量％以上、より更に好ましくは６質量％以上であり、好ましくは７５質量％以下、より好ましくは５０質量％以下、更に好ましくは４０質量％以下、より更に好ましくは２５質量％以下、より更に好ましくは２０質量％以下、より更に好ましくは１６質量％以下である。また、工程（２）において用いられる酵素中のキシラナーゼの配合割合は、酵素中の総タンパク質量中２〜７５質量％が好ましく、より好ましくは２〜５０質量％、より好ましくは３〜４０質量％、更に好ましくは４〜２５質量％、より更に好ましくは５〜２０質量％、より更に好ましくは６〜１６質量％である。なお、キシラナーゼの配合割合は、実施例に記載の方法により調整することができる。
【００４２】
工程（２）において、セルロース含有粉砕物を酵素で糖化処理する場合の処理条件は、該粉砕物中のセルロースの結晶化度や、使用する酵素の種類により適宜選択することができる。
例えば、セルロース原料を基質とする場合は、０．５〜２０％（ｗ／ｖ）の基質懸濁液に対して、酵素を、基質に対し酵素タンパク量が０．０４〜６００質量％となるように添加し、ｐＨ２〜１０の緩衝液中、反応温度１０〜９０℃で、反応時間３０分〜５日間、好ましくは０．５〜３日間反応させることにより糖を製造することができる。
上記緩衝液のｐＨは、用いる酵素の種類により適宜選択することが好ましく、好ましくはｐＨ３〜７、より好ましくはｐＨ４〜６である。また、上記反応温度は、用いる酵素の種類により適宜選択することが好ましく、好ましくは２０〜７０℃、より好ましくは４０〜６０℃である。
【００４３】
上述した実施の形態に関し、本発明は以下の製造方法を開示する。
＜１＞下記工程（１）及び工程（２）を有する、糖の製造方法。
工程（１）：セルロース含有原料を、塩基性化合物の存在下、該セルロース含有原料の乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下、好ましくは３５質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２５質量％以下、より更に好ましくは２０質量％以下、より更に好ましくは１５質量％以下であり、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、更に好ましくは１質量％以上、より更に好ましくは５質量％以上、より更に好ましくは７質量％以上であり、好ましくは０．１〜３５質量％、より好ましくは０．５〜３５質量％、更に好ましくは１〜３０質量％、より更に好ましくは１〜２５質量％、より更に好ましくは５〜２５質量％、より更に好ましくは７〜２０質量％、より更に好ましくは７〜１５質量％の条件下で粉砕処理し、セルロース含有粉砕物を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酵素で糖化処理する工程
【００４４】
＜２＞塩基性化合物を固体状態で添加する、前記＜１＞に記載の糖の製造方法。
【００４５】
＜３＞塩基性化合物の量が、セルロース含有原料中のホロセルロースを構成するアンヒドログルコース単位に対して０．０１倍モル以上、好ましくは０．０５倍モル以上、より好ましくは０．１倍モル以上であり、１０倍モル以下、好ましくは８倍モル以下、より好ましくは５倍モル以下、更に好ましくは１．５倍モル以下であり、０．０１〜１０倍モル、好ましくは０．０５〜８倍モル、より好ましくは０．１〜５倍モル、更に好ましくは０．１〜１．５倍モルである、前記＜１＞又は＜２＞に記載の糖の製造方法。
【００４６】
＜４＞工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酸で中和する工程を有する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００４７】
＜５＞酸が無機酸又は有機酸、好ましくは塩酸、酢酸、硫酸、硝酸及びリン酸から選ばれる１種以上、より好ましくは塩酸、酢酸及び硫酸から選ばれる１種以上である、前記＜４＞に記載の糖の製造方法。
【００４８】
＜６＞酸が無機酸である、前記＜４＞又は＜５＞に記載の糖の製造方法。
【００４９】
＜７＞酵素が、セルラーゼ及びヘミセルラーゼから選ばれる１種以上である、前記＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５０】
＜８＞酵素が、エンドグルカナーゼを含み、該エンドグルカナーゼの配合割合が、酵素中の総タンパク質量中１０質量％以上、好ましくは１４質量％以上、より好ましくは１６質量％以上、更に好ましくは１８質量％以上、より更に好ましくは２０質量％以上であり、９０質量％以下、好ましくは７５質量％以下、より好ましくは７０質量％以下、更に好ましくは６０質量％以下、より更に好ましくは５０質量％以下であり、１０〜９０質量％、好ましくは１４〜７５質量％、より好ましくは１６〜７０質量％、更に好ましくは１８〜６０質量％、より更に好ましくは２０〜５０質量％である、前記＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５１】
＜９＞セルロース含有原料が、パルプ類、紙類、針葉樹又は広葉樹から得られる木材、植物茎・葉・果房類、及び藻類から選ばれる１種以上、好ましくは木材又は植物茎・葉・果房類から選ばれる１種以上、より好ましくはバガス、ＥＦＢ、及びアブラヤシ（幹部）から選ばれる１種以上、更に好ましくはバガスである、前記＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５２】
＜１０＞酵素が、キシラナーゼを含み、該キシラナーゼの配合割合が、酵素中の総タンパク質量中２質量％以上、好ましくは３質量％以上、より好ましくは４質量％以上、更に好ましくは５質量％以上、より更に好ましくは６質量％以上であり、７５質量％以下、好ましくは５０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、更に好ましくは２５質量％以下、より更に好ましくは２０質量％以下、より更に好ましくは１６質量％以下であり、２〜７５質量％、好ましくは２〜５０質量％、より好ましくは３〜４０質量％、より好ましくは４〜２５質量％、更に好ましくは５〜２０質量％、より更に好ましくは６〜１６質量％である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５３】
＜１１＞セルロース含有原料が、ホロセルロース含有量が２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは４５質量％以上、更に好ましくは５０質量％以上である、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５４】
＜１２＞塩基性化合物が、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物及び硫化物から選ばれる１種以上、好ましくはアルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物、より好ましくはアルカリ金属水酸化物、更に好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５５】
＜１３＞工程（１）における粉砕処理を、振動ボールミル、振動ロッドミル、及び振動チューブミルから選ばれる振動ミル、好ましくは振動ロッドミルを用いて行う、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５６】
＜１４＞工程（１）における粉砕処理を、ロッドの充填率が１０〜９７％、好ましくは１５〜９５％の振動ロッドミルを用いて行う、前記＜１３＞に記載の糖の製造方法。
【００５７】
＜１５＞工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を水で洗浄する工程を有する、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５８】
＜１６＞工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を、該セルロース含有粉砕物に対する水分量が５０質量％以上、好ましくは１００質量％以上、より好ましくは２００質量％以上、更に好ましくは２３０質量％以上であり、１００００質量％以下、好ましくは８０００質量％以下、より好ましくは５０００質量％以下、更に好ましくは４０００質量％以下、より更に好ましくは３５００質量％以下であり、５０〜１００００質量％、好ましくは１００〜８０００質量％、より好ましくは２００〜５０００質量％、更に好ましくは２３０〜３５００質量％の条件下で熟成する工程を有する、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれかに記載の糖の製造方法。
【００５９】
＜１７＞熟成温度が、０℃以上、好ましくは２０℃以上、より好ましくは５０℃以上、更に好ましくは８０℃以上であり、２５０℃以下、好ましくは２００℃以下、より好ましくは１５０℃以下、更に好ましくは１００℃以下である、前記＜１６＞に記載の糖の製造方法。
【００６０】
＜１８＞熟成時間が、０．０１時間以上、好ましくは０．１時間以上、より好ましくは０．５時間以上、更に好ましくは１時間以上であり、２４時間以下、好ましくは１８時間以下、より好ましくは１２時間以下、更に好ましくは６時間以下である、前記＜１６＞又は＜１７＞に記載の糖の製造方法。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例において、「％」は特に断りのない場合、及び結晶化度（％）を除き、「質量％」を意味する。セルロース含有原料（原料セルロース）中のセルロース含有量として、ホロセルロース含有量を用いた。
【００６２】
（１）セルロース含有原料中のホロセルロース含有量の算出
粉砕したセルロース含有原料を、エタノール−ジクロロエタン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５ｇに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇ及び酢酸０．２ｍＬを添加し、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウム及び酢酸を添加して加温する操作を、試料が白く脱色するまで３〜４回繰り返し行った。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水及びアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求めた。下記式によりホロセルロース含有量を算出し、これをセルロース含有量とした。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／セルロース含有原料の採取量（ｇ：塩基性化合物を除いた乾燥原料換算）］×１００
【００６３】
（２）アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）モル数の算出
ＡＧＵモル数は、セルロース含有原料中のホロセルロースをすべてセルロースと仮定して、以下の式に基づき算出した。
ＡＧＵモル数＝ホロセルロース重量（ｇ）／１６２
【００６４】
（３）セルロース含有原料の水分量の測定
セルロース含有原料の水分量の測定には、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、製品名「ＦＤ−６１０」）を使用した。１５０℃にて測定を行い、３０秒間の重量変化率が０．１％以下となる点を測定の終点とした。測定された水分量の値を、セルロース含有原料の乾燥重量に対する質量％に換算した。
【００６５】
（４）還元糖量及び糖化率の測定
実施例及び比較例において、ＤＮＳ法（「生物化学実験法  還元糖の定量法」学会出版センター）に基づき、以下の手順で糖の定量を行った。
工程（２）の糖化処理終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離した。ＤＮＳ溶液（０．５％−３，５−ジニトロサリチル酸、３０％−酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６％−水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より、上清液中の還元糖量を定量した。
得られた還元糖量の値から、糖化率、及び、セルロース含有粉砕物１ｇを糖化した際に生成した還元糖量を求めた。糖化率は下記の計算式により算出した。
糖化率（％）＝上清中の還元糖量濃度（ｇ／ｍｌ）／（セルロース含有粉砕物濃度（ｇ／ｍｌ（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算））×ホロセルロース含有量（ｇ／ｇ−セルロース含有原料）／０．９（グルコースの分子量／ＡＧＵの分子量））×１００
【００６６】
（５）ＨＰＬＣによるグルコース及びキシロース生成量の定量
本発明の方法により生成した糖の組成分析を以下の方法により行い、グルコース生成量及びキシロース生成量を求めた（実施例１４〜３０及び比較例６）。
Dionex社製のDX500クロマトグラフィーシステム；カラム：CarboPac PA1（Dionex社製、商品名、４×２５０ｍｍ）、検出器：ED40パルスドアンペロメトリー検出器、溶離液：Ａ液；１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｂ液；１Ｍ酢酸ナトリウムを含む１００ｍＭ水酸化ナトリウム溶液、Ｃ液；超純水を用いた。注入から初期濃度Ａ液１０％：Ｃ液９０％、０〜１５分Ａ液９５％：Ｂ液５％のリニアグラジエントにより糖を分析した。標準として０．０１％（ｗ／ｖ）のグルコース（和光純薬工業株式会社製）、キシロース（和光純薬工業株式会社製）、キシロビオース（和光純薬工業株式会社製）、セロビオース（生化学工業株式会社製）を用いた。
【００６７】
（６）タンパク質の定量
ＤＣプロテインアッセイキット（Bio Rad社製）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線よりタンパク質量を計算した。
【００６８】
実施例１
（乾燥処理）
バガス〔サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量７．０質量％〕を減圧乾燥機（アドバンテック東洋株式会社製、商品名「ＶＯ−３２０」）の中に入れ、窒素流通下の条件で２時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量２．０質量％の乾燥バガスを得た。
（工程（１））
得られた乾燥バガス１００ｇと粒径０．７ｍｍの粒状の水酸化ナトリウム（東ソー株式会社製、商品名「トーソーパール」）４．４ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．２５モル相当量）を、バッチ式振動ミル（中央化工機株式会社製、商品名「ＭＢ−１」：容器全容積３．５Ｌ、媒体としてφ３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、断面形状が円形のＳＵＳ３０４製ロッドを１３本使用、ロッド充填率５７％）に投入し、１時間粉砕処理してセルロース含有粉砕物を得た。
（中和工程）
工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物１５０ｍｇ（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算、以下同じ）を、蓋つきスクリュー管（株式会社マルエム製、Ｎｏ．５，φ２７×５５ｍｍ）に投入し、１Ｎ−ＨＣｌで中和した。
さらに水と１００ｍＭ酢酸緩衝液０．３ｍｌを添加して３ｍｌスケールとし、ｐＨが５．０となるように調整した。
（工程（２））
中和後のセルロース含有粉砕物（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算で１５０ｍｇ相当、以下同じ）に対して、酵素タンパク量が１．５ｍｇ（酵素使用量：１０ｍｇ／ｇ−セルロース含有原料）となるようにセルラーゼ酵素標品ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）を加えて、振とう攪拌しながら５０℃で２４時間糖化処理を行った。工程（２）の糖化処理における溶液中のセルロース含有原料濃度は５質量％であった。
反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を上述したＤＮＳ法によって定量して糖化率及びセルロース含有粉砕物１ｇを糖化した際に生成した還元糖量を求めた。結果を表１に示す。
【００６９】
実施例２
工程（１）における粉砕処理時に水分を添加し、乾燥バガスに対する水分量を１０質量％としたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００７０】
実施例３
工程（１）における粉砕処理時に水分を添加し、乾燥バガスに対する水分量を２０質量％としたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００７１】
実施例４
工程（１）における粉砕処理時に水分を添加し、乾燥バガスに対する水分量を３０質量％としたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００７２】
比較例１
塩基性化合物を添加せずに工程（１）を行い、また中和工程を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００７３】
比較例２
工程（１）における粉砕処理時に水分を添加し、乾燥バガスに対する水分量を５０質量％としたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
実施例５
塩基性化合物である水酸化ナトリウムの使用量を４．４ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．２５モル相当量）とし、粉砕処理時間を２時間としたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００７６】
実施例６
塩基性化合物である水酸化ナトリウムの使用量を８．８ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．５モル相当量）としたこと以外は、実施例５と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００７７】
実施例７
塩基性化合物である水酸化ナトリウムの使用量を１７．６ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し１．０モル相当量）としたこと以外は、実施例５と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００７８】
実施例８
塩基性化合物として水酸化ナトリウムの代わりに水酸化カリウムを２４．７ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し１．０モル相当量）用いたこと以外は、実施例７と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００７９】
実施例９
セルロース含有原料としてバガスの代わりにパーム空果房（ＥＦＢ）を用い、塩基性化合物である水酸化ナトリウムの使用量を１５．２ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し１．０モル相当量）としたこと以外は、実施例７と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００８０】
実施例１０
セルロース含有原料としてバガスの代わりにアブラヤシ（幹部）を用い、塩基性化合物である水酸化ナトリウムの使用量を１４．０ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し１．０モル相当量）としたこと以外は、実施例７と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００８１】
実施例１１
酵素としてＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２の代わりにセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）を用いたこと以外は、実施例７と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００８２】
実施例１２
中和工程において塩酸（１Ｎ−ＨＣｌ）の代わりに酢酸を用いたこと以外は、実施例７と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００８３】
実施例１３
中和工程及び洗浄工程を下記のように行ったこと以外は、実施例７と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
（中和工程及び洗浄工程）
工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物を酢酸水溶液に添加し、攪拌して中和した（中和工程）。これを遠沈管（ＩＷＡＫＩ製、５０ｍｌ、２９ｍｍ×１１５ｍｍ）に入れて遠心分離を行い、イオン交換水を用いて、生成した塩が取り除けるまで３回以上洗浄を繰り返した（洗浄工程）。洗浄後の試料（乾燥原料換算で１５０ｍｇ）を蓋つきスクリュー管（株式会社マルエム製、Ｎｏ．５、φ２７×５５ｍｍ）に投入し、さらに水と１００ｍＭ酢酸緩衝液０．３ｍｌを添加して、ｐＨが５．０となるように調整した。
【００８４】
比較例３
塩基性化合物を添加せずに工程（１）を行い、また中和工程を行わなかったこと以外は、実施例９と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００８５】
比較例４
塩基性化合物を添加せずに工程（１）を行い、また中和工程を行わなかったこと以外は、実施例１０と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００８６】
比較例５
塩基性化合物を添加せずに工程（１）を行い、また中和工程を行わなかったこと以外は、実施例１１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表２に示す。
【００８７】
【表２】
2013255430.tif 000003
【００８８】
表１及び表２より、本発明の糖の製造方法は、工程（１）において塩基性化合物を用いなかった比較例１及び比較例３〜５、ならびに工程（１）における水分量が多い比較例２に比べ、セルロースの糖化率が向上し、また、生成する還元糖量が向上することから生産性にも優れることがわかる。
【００８９】
実施例１４〜２２
酵素として、表３に示す量（酵素使用量：３ｍｇ／ｇ−セルロース含有原料）のセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）及び異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）を用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表３に示す。なお、後述するように、セルクラスト１．５Ｌのエンドグルカナーゼの含有割合は９質量％（ＥＧＩ：４質量％、ＥＧII：５質量％）であった。
【００９０】
比較例６
塩基性化合物を添加せずに工程（１）を行い、また中和工程を行わなかったこと以外は、実施例１４と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表３に示す。
なお、実施例１４〜２２及び比較例６で使用した各種タンパク質は、以下のように精製及び調製して得た。また、以下の記載において、特に断りがない限り、試薬は和光純薬工業株式会社製のものを用いた。
【００９１】
＜精製又は調製酵素の確認＞
セルクラスト１．５Ｌより精製したセロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）、セロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）及び異種発現ＥＧＩは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／）に記載のそれぞれの酵素（Endoglucanase EG-1（P07981）、ＥＧ２：Endoglucanase EG-II（P07982）、ＣＢＨ１：Exoglucanase 1（P62694）、ＣＢＨ２：Exoglucanase 2（P07987））の分子量及び部分アミノ酸配列と比較することにより確認した。
【００９２】
（ｉ）セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）の精製
以下の操作は１０℃以下で行った。セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）を脱イオン水で２倍に希釈した後、脱塩カラムＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いて、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換を行った。得られた酵素溶液１００ｍＬを、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陰イオン交換体（ａ）ＳｕｐｅｒＱトヨパール６５０Ｍ（φ２．５ｃｍ×２５ｃｍ、東ソー株式会社製、商品名）に供し、２５０ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．３Ｍの塩化ナトリウム２０００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。
陰イオン交換体（ａ）に吸着した吸着画分を、限外濾過膜ＰＢＣＣ（分画分子量：５０００、ミリポア社製、商品名）により、１９ｍＬに濃縮した。濃縮した吸着画分３ｍＬを、セファクリルＳ２００ＨＲ（φ２．５ｃｍ×１００ｃｍ、ＧＥサイエンス社製、商品名）を用いてゲルろ過を行った。溶出画分について、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」ともいう）でほぼ単一であることを確認できたパス画分を、限外濾過膜を用いて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、セロビオハイドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）を得た。
【００９３】
（ii）エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）の精製
上記陰イオン交換体（ａ）を素通りしたパス画分を、上述の限外濾過膜を用いて５０ｍＬに濃縮し、続いて１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて平衡化した陽イオン交換体（ｂ）ＳＰトヨパール６５０Ｍ（φ２．５ｃｍ×２６ｃｍ、東ソー株式会社製、商品名）に供した。３００ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．３Ｍの塩化ナトリウム１５００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。
陽イオン交換体（ｂ）を素通りしたパス画分を、上述の限外濾過膜を用いて濃縮した後、脱塩カラムを用いて、２０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７．８）に置換した。このパス画分４０ｍＬを同緩衝液で平衡化した陰イオン交換体（ｃ）ＳｕｐｅｒＱトヨパール６５０Ｍ（φ２．５ｃｍ×２５ｃｍ、東ソー株式会社製、商品名）に供し、２５０ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．３Ｍの塩化ナトリウム２０００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。
陰イオン交換体（ｃ）に吸着した吸着画分をプールし、上述の限外濾過膜にて１２ｍＬに濃縮を行った。濃縮した吸着画分１２ｍＬを、セファクリルＳ２００ＨＲ（φ２．５ｃｍ×１００ｃｍ、ＧＥサイエンス社製、商品名）を用いて、ゲルろ過を行った。溶出画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでほぼ単一であることを確認できた画分を、上述の限外濾過膜を用いて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、エンドグルカナーゼＩ（ＥＧＩ）を得た。
【００９４】
（iii）エンドグルカナーゼII（ＥＧII）の精製
上記陰イオン交換カラム（ｃ）を素通りしたパス画分を、上述の限外濾過膜にて濃縮後、脱塩カラムにて１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に置換した。このパス画分１６ｍＬを、同緩衝液にて平衡化した陽イオン交換体（ｄ）ＳＰトヨパール６５０Ｍ（φ２．５ｃｍ×２６ｃｍ、東ソー株式会社製、商品名）に供し、３００ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．１Ｍの塩化ナトリウム１０００ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。溶出画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてほぼ単一であることを確認できたパス画分を、上述の限外濾過膜にて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、エンドグルカナーゼII（ＥＧII）を得た。
【００９５】
（iv）セロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）の精製
上記陽イオン交換カラム（ｄ）に吸着した吸着画分を、上述の限外濾過膜にて濃縮し、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、セロビオハイドロラーゼII（ＣＢＨII）を得た。
【００９６】
上記のセルクラスト１．５Ｌの総タンパク質量中、ＣＢＨＩは７０質量％、ＣＢＨIIは１１質量％、ＥＧＩは４質量％、ＥＧIIは５質量％であった。
【００９７】
（v）異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）の調製
以下の手順により、異種発現ＥＧＩを調製した。
〔Trichoderma reesei cDNAの合成〕
Trichoderma reesei QM9414（NBRC31329）をＰＤＡ寒天培地で２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させた。その胞子の１白金耳を、液体培地［０．５０％（ｗ／ｖ）ＫＣフロック（日本製紙ケミカル株式会社製、商品名）、０．１４％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、０．０３％（ｗ／ｖ）尿素、０．２５（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬株式会社製、商品名）、０．２０（ｗ／ｖ）リン酸一カリウム、０．０３％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム・二水和物、０．０３％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、５．０ｐｐｍ硫化鉄・七水和物、１．６ｐｐｍ硫酸マンガン・五水和物、１．６ｐｐｍ硫酸亜鉛・七水和物、２．０ｐｐｍ塩化コバルト・六水和物）］５０ｍＬを含む５００ｍＬ容ひだ付き三角フラスコに接種して、２８℃、１６０ｒｐｍで６日間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）によって得られた菌体から、TRIzol（登録商標） Reagent（invitrogen社製）を用いて、プロトコールに従いtotal RNAを分離した。得られたtotal RNAから、cDNA Synthesis Kit (M-MLV Version)（タカラバイオ株式会社製）を用いて、プロトコールに従いTrichoderma reesei cDNAを合成した。
【００９８】
〔EGＩ遺伝子断片の取得〕
得られたcDNAを鋳型として、swissprotデータベースに公開されているT. reesei (Taxonomy ID:51453)のエンドグルカナーゼＩ遺伝子配列を元に設計したプライマー［フォワードプライマー（配列番号１：atggcgccctcagttacactgccg）、リバースプライマー（配列番号２：ttaaaggcattgcgagtagtagtcgtt）］を用いてＰＣＲを行った。
具体的には、鋳型cDNA０．５μＬ、５０μＭフォワードプライマー０．５μＬ、５０μＭリバースプライマー０．５μＬ、PrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）２５μＬ、滅菌脱イオン水２３．５μＬを混合した後、DNA Engine PTC-200（MJ Japan社製）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で８秒間を１サイクルとして３０サイクル反応させ、増幅した遺伝子断片をHigh Pure PCR Product Purification kit（Roche社製）にて精製した。
【００９９】
〔EGＩ遺伝子とamyBプロモーター及びターミネーターの連結化〕
得られたEGＩ遺伝子とA. oryzae由来α-アミラーゼ遺伝子（amyB）由来のプロモーター及びターミネーター領域の各PCR断片を鋳型DNAとして、amyBプロモーター領域を元に設計したフォワードプライマー（配列番号３：gtgaattcgagctcggtaccattacgcactacccgaatcg）及びamyBターミネーター領域を元に設計したリバースプライマー（配列番号４：tgattacgccaagcttgagttgtacctagaggagac）を用いてＰＣＲを行った。
具体的には、各ＰＣＲ断片３．０μＬ、５０μＭフォワードプライマー０．４μＬ、５０μＭリバースプライマー０．４μＬ、PrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）２５μＬ、滅菌脱イオン水１５．２μＬを混合した後、GeneAmp PCR System 9700（PE Applied Biosystems社製）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で２０秒間を１サイクルとして３０サイクル反応させ、増幅した遺伝子断片をHigh Pure PCR Product Purification kit（Roche社製）にて精製した。
【０１００】
〔プラスミドの構築と大量調製〕
pPTRIベクター（タカラバイオ株式会社製）を含む溶液に、Hind III及びKpn Iを添加し、３７℃で一晩制限酵素反応を行った。７０℃で１５分間制限酵素の失活処理を行った後、High Pure PCR Product Purification kit（Roche社製）にて精製した。線状化したpPTRIベクターに対して、連結化したＥＧＩ断片を３倍量（モル比）加えて混合し、In-FusionTM  Advantage PCR Cloning Kit（Clontech社製）を用いてIn-fusion反応（３７℃で１５分間、５０℃で１５分間）を行った。反応終了液（総量１０μＬ）にＴＥバッファー（ｐＨ８．０）で４０μＬ添加した。この混合液３μＬに大腸菌コンピテントセルDH5α株（東洋紡績株式会社製）５０μＬを加えて形質転換を行い、X-galおよびIPTGを添加したＬＢ寒天培地（１００ｐｐｍアンピシリン含有）に塗沫した後、３７℃で１８時間培養を行った。生育したコロニーのうち白色コロニーを釣菌し、Quick TaqTM HS DyeMix（東洋紡績株式会社製）を用いてコロニーダイレクトＰＣＲによるプラスミドのインサートチェックを行った。アガロース電気泳動解析により、目的のインサートサイズのバンドを確認できた形質転換コロニーを、１００ｐｐｍアンピシリン含有ＬＢ液体培地に植菌し、坂口フラスコを用いて一晩振とう培養（３７℃、１２０ｒｐｍ）を行った。この培養液を遠心（６０００×ｇ、４℃、１５分間）して菌体を回収した後、QIAfilter Plasmid Midi Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドの抽出及び精製を行った。
【０１０１】
〔A. oryzaeの形質転換〕
形質転換用宿主として、A. oryzae RIB40株（正式名称：Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn var brunneus Murakami）をNITEより購入（NBRC100959）したものを用いた。本株をＰＤＡ寒天平板培地上で、２５℃、７日間復元培養した後、ＰＤＡスラント培地上で、２５℃、７日間継代培養したものを冷蔵保存し、形質転換用の宿主として用いた。A. oryzae RIB40株を宿主に用いて、構築したプラスミドによる形質転換を行い、０．２ｐｐｍピリチアミンを含有する再生用ＣＤ寒天培地を用いて、３０℃、７日間培養した。ＣＤ寒天培地上に生育してきた形質転換コロニーを、ＣＤ寒天培地で２回、３０℃、７日間継代培養した。
【０１０２】
〔A. oryzae形質転換株の液体培養〕
A. oryzae形質転換株を白金耳でＣＤ寒天培地上に接種し、３０℃で５〜７日間培養した後、胞子懸濁液を調製した。ヘマチトメーター（トーマ血球計算盤）を用いて胞子濃度を計測した後、約５×１０5個の胞子を５０ｍＬの液体培地［５％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ（日本製薬株式会社製）、２．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス（Difco社製）、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸一カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、１０％（ｗ／ｖ）マルトース）に接種し、５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを用いて、培養温度３０℃、回転数１５０ｒｐｍで約５日間振とう培養を行った。このようにして、最終的に７００ｍＬ分の培養液を調製した。
【０１０３】
〔培養液からの異種発現ＥＧＩの精製〕
フィルター（ポアサイズ０．４５μｍ、ＮＡＬＧＥＮＥ社製）ろ過した培養液７００ｍＬを平膜（Polyethersulfone、76mm、30,000cutoff、ミリポア社製）で２００ｍＬに濃縮し、さらに、遠心式フィルターＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（30,000cutoff、ミリポア社製、商品名）で１５ｍＬに濃縮した。この濃縮液１５ｍＬを、脱塩カラムＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧカラム（Bio Rad社製）を用いて、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換した。得られた酵素溶液のうち５ｍＬを、予め１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陰イオン交換体ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（φ１．４６ｃｍ×３ｃｍ、東ソー株式会社製、商品名）に供し、１５ｍＬの同緩衝液でカラム内を洗浄後、０〜０．５Ｍの塩化ナトリウム４０ｍＬによる直線濃度勾配溶出を行った。陰イオン交換体を素通りしたパス画分を、脱塩カラムにて１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に置換し、異種発現エンドグルカナーゼＩ（異種発現ＥＧＩ）を得た。
【０１０４】
【表３】
2013255430.tif 000004
【０１０５】
表３に示すように、酵素中の総タンパク質量中のエンドグルカナーゼの配合割合を１０〜９０質量％とすれば、グルコース生成量が増加し、また、セルロース含有粉砕物１ｇを糖化した際に生成する還元糖量が向上することがわかる。
【０１０６】
実施例２３〜３０
酵素として、表４に示す量（酵素使用量：３ｍｇ／ｇ−セルロース含有原料）のセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）及びＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ（ノボザイムズ社製、商品名）を用いたこと以外は、実施例６と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表４に示す。
【０１０７】
【表４】
2013255430.tif 000005
【０１０８】
表４に示すように、酵素中の総タンパク質量中のキシラナーゼの配合割合を２〜７５質量％とすれば、キシロース生成量が増加し、また、セルロース含有粉砕物１ｇを糖化した際に生成する還元糖量が向上することがわかる。
【０１０９】
実施例３１
工程（１）における水酸化ナトリウムの使用量を８．８ｇ（セルロース含有原料中のホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．５モル相当量）とし、粉砕処理時間を０．５時間としたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表５に示す。
【０１１０】
実施例３２
工程（１）における水酸化ナトリウムの使用量を８．８ｇ（セルロース含有原料中のホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．５モル相当量）とし、粉砕時間を０．５時間としたこと以外は、実施例１と同様の方法で乾燥処理及び工程（１）を行い、セルロース含有粉砕物を得た。
（熟成工程）
工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物１５０ｍｇ（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算）を蓋つきスクリュー管（株式会社マルエム製、Ｎｏ．５，φ２７×５５ｍｍ）に投入し、その後水１２４５ｍｇを一括添加して混合した後、蓋つきスクリュー管を密閉し、１００℃で２時間静置して熟成を行った。熟成工程時の水分量は、セルロース含有粉砕物（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算）に対し８３０質量％であった。
（中和工程）
熟成工程後の混合物を、１Ｎ−ＨＣｌで中和した。
さらに１００ｍＭ酢酸緩衝液０．３ｍｌを添加して３ｍｌスケールとし、ｐＨが５．０となるように調整した。
（工程（２））
中和後のセルロース含有粉砕物（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算で１５０ｍｇ相当）に対して、酵素タンパク量が１．５ｍｇ（酵素使用量：１０ｍｇ／ｇ−セルロース含有原料）となるようにセルラーゼ酵素標品ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）を加えて、振とう攪拌しながら５０℃で２４時間糖化処理を行った。工程（２）の糖化処理における溶液中のセルロース含有原料濃度は５質量％であった。
反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を上述したＤＮＳ法によって定量して糖化率を求めた。結果を表５に示す。
【０１１１】
実施例３３
熟成工程における水の添加量を２４９０ｍｇとし、熟成工程時の水分量をセルロース含有粉砕物に対し１６６０質量％としたこと以外は、実施例３２と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表５に示す。
【０１１２】
実施例３４
実施例３２と同様の方法で乾燥処理、工程（１）を行った。また、熟成工程における水の添加量を４９８０ｍｇとし、熟成工程時の水分量をセルロース含有粉砕物に対し３３２０質量％として１００℃で２時間熟成工程を行ったが、その際、スクリュー管の蓋を開放して密閉状態を解除し、セルロース含有原料濃度が５質量％となるように、余剰の水分を蒸発させた。
熟成工程の後、実施例３２と同様の方法で中和工程及び工程（２）を行い、糖の製造を行った。工程（２）における溶液中のセルロース含有原料濃度は５質量％であった。結果を表５に示す。
【０１１３】
実施例３５
中和工程において、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物６００ｍｇ（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算）を使用したこと以外は、実施例３１と同様の方法で糖の製造を行った。工程（２）における溶液中のセルロース含有原料濃度は２０質量％であった。結果を表５に示す。
【０１１４】
実施例３６
熟成工程において、工程（１）で得られたセルロース含有粉砕物６００ｍｇ（塩基性化合物を除いた乾燥原料換算）を使用し、水の添加量を８５０ｍｇとして熟成工程時の水分量をセルロース含有粉砕物に対し１４２質量％としたこと以外は、実施例３２と同様の方法で糖の製造を行った。工程（２）における溶液中のセルロース含有原料濃度は２０質量％であった。結果を表５に示す。
【０１１５】
実施例３７
熟成工程における水の添加量を１７００ｍｇとし、熟成工程時の水分量をセルロース含有粉砕物に対し２８３質量％としたこと以外は、実施例３６と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表５に示す。
【０１１６】
実施例３８
熟成工程における水の添加量を３４００ｍｇとし、熟成工程時の水分量をセルロース含有粉砕物に対し５６７質量％としたこと以外は、実施例３６と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表５に示す。
【０１１７】
比較例７
工程（１）における粉砕処理時間を０．５時間としたこと以外は、比較例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表５に示す。
【０１１８】
比較例８
塩基性化合物を添加せずに工程（１）を行い、また中和工程を行わなかったこと以外は、実施例３５と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表５に示す。
【０１１９】
【表５】
2013255430.tif 000006
【０１２０】
実施例３９〜４９
熟成工程における温度、時間をそれぞれ表６に示すように変更したこと以外は、実施例３７と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表６に示す。
【０１２１】
【表６】
2013255430.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、セルロース含有原料から糖を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸などの発酵生産などに有用である。
【配列表】
2013255430000001.app