(57)【要約】【課題】新たなディフェンシン等の抗菌性ペプチドの分泌誘導剤を提供することを課題とする。【解決手段】レスベラトロールを有効成分とするα−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの分泌誘導剤【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロールを有効成分とする抗菌性ペプチドの発現誘導剤。
【請求項２】
レスベラトロールを有効成分とする腸管内細胞の産生する抗菌ペプチド分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性ペプチドの分泌誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染症や真菌感染症は人類の寿命を左右する大きな疾患であり、抗生物質や合成抗菌剤など種々の薬剤が開発されてきた。しかし抗生物質や抗菌剤は常に抵抗性微生物が出現する。ひとたびこのような抗生物質耐性菌が出現すると、従来の抗菌剤では治療の手段がなく、耐性菌に対する対策は新たな抗菌剤を開発するしかなかった。
近年高齢者の間で、免疫の低下に伴う常在菌による感染症が問題となっている。常在菌は所謂多剤耐性株が多く、いったん老人介護施設などで多剤耐性菌の感染患者が発生すると効果的な治療手段がなく、施設内で多数の患者が連鎖的に発生し、状況によっては施設の閉鎖や患者の隔離などが必要になってくる。このため、多剤耐性菌に対する対策は大きな社会問題となっている。
このため、インターフェロン類やインターロイキン類の分泌を誘導する多糖や糖タンパク質などを投与して生体の免疫システムを増強する治療や予防方法が提案されているが、あまり効果はあがっていない。
ところで動物、植物、昆虫、酵母、乳酸菌などのさまざまな生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っている。このような外来からの進入を防御するために、アミノ酸が10数個〜50数個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生していることが明らかになっている。これらの抗菌ペプチドは、細菌、真菌などに対してはば広い範囲の抗菌スペクトルを有しているとともに、生物自らが産生していることから生体に対しては副作用も阻害作用も有していない。
【０００３】
このような抗菌ペプチドのうち、ヒト由来の抗菌ペプチドとしては、例えば、ディフェンシン・ファミリー（α−ディフェンシン、β−ディフェンシン等）、カセリシジン（LL-37）、ダームシジン（dermcidin）、LEAP-1（ヘプシジン）、LEAP-2などが知られている。また、ウシ好中球から単離された、トリプトファンリッチな13アミノ酸からなる広域スペクトル抗菌活性を示す抗菌ペプチドであるインドリシジンの類似体の合成カチオン性抗菌ペプチド、オミガナン(Ominagan pentahydrochloride) が、カテーテル用局所感染予防薬として開発されている（例えば、非特許文献１参照）。さらに、乳酸菌が産生する抗菌ペプチドであるナイシンが、食品添加物としてすでに使用されている。
【０００４】
この抗菌ペプチドを人為的に人に発現増強または分泌促進することができれば多剤耐性菌などの感染により一層大きな効果が期待できる。このような技術として、例えば、有機酸をヒトβディフェンシンの分泌促進剤の有効成分として使用する技術（特許文献１：国際公開第２００５／０２７８９３号）、酵母由来の多糖類含有組成物によってディフェンシン遺伝子を発現誘導する技術（特許文献２：特開２００３−１９７号公報）、酵母由来の不溶性画分によってディフェンシン遺伝子を発現誘導する技術（特許文献３：特開２００３−２６２号公報）、酵母由来のマンナン含有成分を用いて抗菌ペプチドを発現誘導する技術（特許文献４：特開２００６−２４１０２３号公報）、イソロイシン、ロイシンまたはバリンから選ばれた分岐鎖必須アミノ酸の有効成分による抗菌ペプチドの発現誘導に関する技術（特許文献５：特開２００３−９５９３８号公報）、ヨーグルト、甘酒の抽出物、焼酎もろみ、糠味噌濃縮物などの有効成分を使用した抗菌ペプチドの発現誘導技術（特許文献６：特開２００５−２７０１１７号公報）などが提案されている。
現在も日常で簡便に使用できる抗菌ペプチドの誘導剤の探索が行われている。
【０００５】
近年、ポリフェノールの1種であるレスベラトロール（t-レスベラトロール：3,4',5-Trihydroxy-stillben）に健康維持の観点から注目が集まっている。レスベラトロールはブドウや赤ワインに含まれる抗酸化作用を有するフィトアレキシンである。本物質には、心臓病予防改善効果、抗酸化活性、抗炎症効果や脳血栓症予防、抗癌効果や、脳梗塞後の脳組織障害進展抑制効果が示されているほか、サーチュインの活性化による抗肥満効果が示されている。
【０００６】
レスベラトロールは、ブドウのほか、ラッカセイやイタドリに含まれていることが知られているが、イタドリの根から高濃度のレスベラトロールを濃縮・回収する方法が開示され（特許文献７：特開２００５−２８１１７９号公報）、化粧料などの製剤への配合が提案されている。また、特許文献８（特開２００６−２７３８３４号公報）には、ブドウ等から抽出したレスベラトロールをAMPK（AMP-activated protein kinase）活性化による脂質代謝促進作用を有する物質として、脂質代謝活性化剤として用いることが、特許文献９（特開２００８−２３９５７６号公報）には、ブドウの芽や蔓から抽出したレスベラトロール類を体脂肪低減剤として用いることが開示されている。更に、特許文献１０（特開２００９−１３１５９号公報）には、アントシアニジンや、プロアントシアニジン、及び、レスベラトロールを含有するコケモモ果実からの抽出物を、フケ防止、カロリー摂取に対するダイエット、抗酸化フリーラジカルの除去、心脳血管の疾病の予防、血栓形成の抑制、及び美白を目的とする機能性食品に用いることが開示されている。一方、レスベラトロールのファイトアレキシン作用に注目して、レスベラトロールの重合物を抗菌剤とすることが提案されている（特許文献１１：特開２００５−２３０００号公報、特許文献１２：特開２０１１−２５１９１４号公報）。
しかしレスベラトロールが生体内でディフェンシンのような抗菌性ペプチドを分泌誘導することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／０２７８９３号
【特許文献２】特開２００３−１９７号公報
【特許文献３】特開２００３−２６２号公報
【特許文献４】特開２００６−２４１０２３号公報
【特許文献５】特開２００３−９５９３８号公報
【特許文献６】特開２００５−２７０１１７号公報
【特許文献７】特開２００５−２８１１７９号公報
【特許文献８】特開２００６−２７３８３４号公報
【特許文献９】特開２００８−２３９５７６号公報
【特許文献１０】特開２００９−１３１５９号公報
【特許文献１１】特開２００５−２３０００号公報
【特許文献１２】特開２０１１−２５１９１４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Selsted, et al.; J．Biol．Chem．267:4292，1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒトに備わっている自己生体防御機構を発揮する抗菌性ペプチドの一種であるα−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）レスベラトロールを有効成分とする抗菌性ペプチドの発現誘導剤。
（２）レスベラトロールを有効成分とする腸管内細胞の産生する抗菌ペプチド分泌促進剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る抗菌ペプチドの発現誘導剤または分泌促進剤は、経口投与によって腸管内に抗菌ペプチドの発現の誘導または分泌を促進できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明による抗菌性ペプチドの分泌促進効果を示すグラフ。
【図２】レスベラトロール及びε−ビニフェリン単独の抗菌作用を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に用いるレスベラトロール（3,4',5-Trihydroxy-stillbene）は、ポリフェノールの一種であるスチルベントリオールである。レスベラトロールは、エチルアルコールに易溶なポリフェノールでありトランス型とシス型が存在する。本発明においては、レスベラトロールの重合体や誘導体を含まないことが好ましい。
【００１４】
本発明において、レスベラトロールは、合成や生合成によって得られるものを使用できるほか、レスベラトロールを含有する植物や食品をそのままの状態か、切断、破砕、天然乾燥、熱風乾燥、凍結乾燥、醗酵の加工を行なったものを使用したり、更に常法に従って、抽出、濃縮、粉末化、顆粒化などの処理を行なって得られたものも使用できる。例えば、ブドウ、落花生、ピーナッツ、及びイタドリやツルドクダミ等のタデ科植物が挙げられる。
【００１５】
本発明において有効成分として用いるレスベラトロールの採取源としては、ブドウが特に好ましい。ブドウの種類は、特に限定されるものではないが、デラウエア、巨峰、甲州、ピオーネ、マスカット、シュナンブラン、グレナッシュ、マタロ、ミュラーテュルガウ、トレッビアーノ、ベリーＡ、カベルネソービニオン、メルロー、ピノノアール、カベルネフラン、シラー、シャルドネ、ソービニヨンブラン、セミヨン、シラー、ガメイ、リースリング、アリゴテ等が好ましい。ブドウ抽出物は、ブドウ果実、ブドウ葉又はブドウに由来する物からの抽出物を指す。ブドウに由来する物としては、ブドウジュース、ワイン、ワイン製造時の残渣、ワイン濃縮物等をいう。
【００１６】
本発明において有効成分として用いるレスベラトロールは、上記天然物由来の材料から、抽出により調製することができる。抽出は、ブドウの果皮や葉に多く含まれているので、それらから水や熱水、アルコール水、有機溶剤等を用いた一般的な抽出方法で行う。また、ワイン、ワインの濃縮物又は濃縮乾固した固形物中にも含まれているので、それらを用いることもできる。また、ワイン製造時に発生するブドウの残渣をそのまま用いるか、それから有機溶剤／水等により抽出することもできる。有機溶剤としてはエタノール等のアルコールが好ましく、特にエタノールが好ましい。
【００１７】
本発明は、α−ディフェンシン等の抗菌性ペプチドの誘導剤、 食品添加物、食品およびペットフード、動物用医薬として利用することができる。剤型は、公知の方法により助剤とともに任意の形態に製剤化して、経口摂取（投与）することができる。カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液状として摂取（投与）できる。
摂取（投与）量は、摂取（投与）方法と、対象者の年齢、病状や一般状態等によって変化し得るが、成人では体重1kg当たり通常、1日当たり有効成分として0.1〜600mgが適当である。
【００１８】
本発明のα−ディフェンシン等抗菌性ペプチドの誘導剤は、一般食品や健康食品に配合することができ、また、食品添加物の成分とすることもできる。配合する食品は特に限定されず、例えば食パン、菓子パン、パイ、デニッシュ、ドーナツ、ケーキ等のベーカリー食品、うどん、そば、中華麺、焼きそば、パスタ等の麺類、天ぷら、コロッケ等のフライ類、カレー、シチュー、ドレッシング等のソース類、ふりかけ類、かまぼこ等の練り製品、ジュース等の飲料、スナック菓子、米菓、飴、ガム等の菓子類を挙げることができる。
【００１９】
経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤、顆粒剤等の場合には、乳糖、白糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉のり液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して、製剤化することができる。
【００２０】
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
【００２１】
経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えばビール、発酵アルコール飲料、ビールテイスト飲料、ジュース類、清涼飲料水、茶類、乳酸菌飲料、発酵乳、冷菓、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂乳等の乳製品、ハム、ソーセージ、ハンバーグ等の畜肉製品、蒲鉾、竹輪、さつま揚げ等の魚肉練り製品、だし巻き、卵豆腐等の卵製品、クッキー、ゼリー、チューインガム、キャンディー、スナック菓子等の菓子類、パン類、麺類、漬物類、燻製品、干物、佃煮、塩蔵品、スープ類、調味料等、粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等に配合して健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品等の飲食品として用いてもよい。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例、試験例を示し、本発明をさらに説明する。
＜ディフェンシン誘導試験＞
Ｉ．材料及び方法
特開２０１１−７８３１８号公報に開示されているマウス小腸陰窩を用いたパネト細胞からのα−ディフェンシン分泌アッセイ系を用いて、パネト細胞から抗菌性ペプチドであるα−ディフェンシンの分泌誘導効果を、抗菌活性を指標にして確認した。試験をおこなった化合物は、ブドウから抽出した精製レスベラトロールおよびその重合体（2量体）であるε−ビニフェリンである。
１．小腸陰窩材料採取：
ICRマウス（日本チャールズ・リバー社）から、従来法に従ってクリプト（小腸陰窩）を含む小腸の組織を採取し、1mLのPBS（−）に懸濁して、クリプトを含む懸濁液を調製した｛Ayabe Tら、Nature Immunol．第1巻、第113-118頁、2000年｝。この懸濁液に含まれるクリプト数を血球計算盤（Burker-Turk；サンリード硝子社）を用いて数えたところ、5〜8×104個であった。また、位相差顕微鏡（オリンパス社）を用いて弱拡大視野で観察して、この懸濁液に含まれる組織のうちクリプトが占める割合を求めたところ、その割合は70%以上であった。
２. パネト細胞 分泌反応および ex vivo殺菌アッセイ：
回収した小腸陰窩と上記のレスベラトロール、ε−ビニフェリンをex vivo共培養して 粗分泌物を回収した。レスベラトロール、ε−ビニフェリンはともに1μg/ml、10μg/mlの濃度になるよう生理食塩水を用いて希釈した。同時に小腸陰窩の試験物質非曝露のPBS対照上清も回収した。30%酢酸中でペプチドを抽出、透析に引き続いて真空凍結乾燥した。回収した分泌物および非曝露対照上清抽出物を1μLが小腸陰窩100個由来となるように純水に溶かした。次に、分泌物のSalmonella Typhimurium phoP-に対する殺菌活性を解析した。
パネト細胞分泌物および非曝露対照上清、抽出物を1×106 colony-forming units (CFU) の S. Typhimurium phoP-と37℃で60分反応させた後、TSAプレート上で一晩培養した。生存CFUをカウントし、6ウエルの平均殺菌率を図１に示した。
【００２３】
ＩＩ．結果
レスベラトロール及びε-ビニフェリンのPaneth細胞分泌誘導によるS. Typhimurium phoP-に対するex vivo殺菌活性を解析した。レスベラトロール及びε−ビニフェリンともに、1μg/ml及び10μg/mlの濃度で殺菌活性を示さなかった（図２）。レスベラトロール及びε−ビニフェリンをマウス小腸陰窩に暴露させる濃度および小腸陰窩数を変えて検討したところ、図１に示すように、10μg/ml及び1μg/mlのレスベラトロール に暴露した時の小腸陰窩100個由来分泌物（生存細菌：順に0.15×106±0.03×106CFU, 0.17×106±0.1×106 CFU）は、細菌のみのコントロール（生存細菌：1.86×106±0.36×106CFU）及びPBSのみに暴露したコントロール（生存細菌：2.15×106±0.73×106CFU）と比較していずれも91%以上の殺菌率を認め、有意（p<0.05）な殺菌活性を確認した。ε−ビニフェリンの暴露では、10μg/ml（生存細菌：0.65×106±0.36×106 CFU）で約70%の殺菌率を認めたが、1μg/ml（生存細菌：1.29×106±0.28×106CFU）では30%程度の殺菌率であった。
以上の結果より、レスベラトロールはマウス小腸Paneth細胞からのex vivo殺菌活性放出を強力に誘導することが明らかとなった。10μg/mlまでのε−ビニフェリン刺激ではex vivo殺菌活性放出は確認したものの有意でなかった。すなわち、レスベラトロールは、腸管内で抗菌性ペプチドの分泌の強い誘導作用を有していることが明らかとなった。
【００２４】
以下にレスベラトロールを用いた処方例を示す。
処方例１
[カプセル剤]
組成
ブドウ抽出精製レスベラトロール … 100mg
ミツロウ … 10mg
ぶどう種子オイル … 110mg
上記成分を混合し、ゼラチンおよびグリセリンを混合したカプセル基剤中に充填し、軟カプセルを得た。
【００２５】
処方例２
[錠剤]
組成
ブドウ抽出精製レスベラトロール … 150mg
セルロース … 80mg
デンプン … 20mg
ショ糖脂肪酸エステル … 2mg
上記成分を混合、打錠し、錠剤を得た。
【図１】
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【図２】
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