(57)【要約】【課題】特発性炎症性筋疾患を、効果的且つ安全に予防／治療するための、新規の予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片を、特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤の有効成分として用いる。より具体的には、抗ＤＮＡＭ−１抗体から、Ｆ（ａｂ’）２部分を単離することによって作製したＦ（ａｂ’）２化抗体を、特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤の有効成分として用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片を有効成分として含有する特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
抗体が、ヒト抗体、ヒトキメラ抗体、又はヒト化抗体である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、又はＳｃ（Ｆｖ）２である請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
抗体断片が、ヒト抗体、ヒトキメラ抗体、又はヒト化抗体の断片である、請求項３記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２である請求項１、３又は４記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
抗体又は抗体断片が、ＰＥＧ化された抗体又は抗体断片である請求項１〜５のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
特発性炎症性筋疾患が、多発性筋炎、皮膚筋炎、筋症状を伴わない皮膚筋炎、小児皮膚筋炎、悪性腫瘍を合併する筋炎、膠原病を合併する筋炎、又は封入体筋炎である請求項１〜６のいずれかに記載の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片を有効成分として含有する特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
特発性炎症性筋疾患は、自己免疫機序による横紋筋のびまん性炎症筋疾患であり、筋炎の症状によって特徴付けられる多発性筋炎（Polymyositis：ＰＭ）と、皮膚炎の症状を伴うことによって特徴付けられる皮膚筋炎（Dermatomyositis：ＤＭ）とを含む疾患である。ＰＭとＤＭは厳密に区別できないものと考えられているが、特発性炎症性筋疾患患者において、筋炎のみを発症する場合にＰＭと診断され、筋炎と皮膚炎とを発症する場合にはＤＭと診断される。また、皮膚筋炎のみで筋炎の症状が見られない無筋炎型ＤＭ（amyopathic DM：ＡＤＭ）や、筋炎所見が極めて軽度で筋力低下症状のない症状（hypomyopathic DM）も特発性炎症性筋疾に含まれる。特発性炎症性筋疾患の主な症状は、体幹四肢近位筋群、頸筋、咽頭筋の対称性筋低下であり、嚥下に関わる筋力の低下は、誤嚥や窒息死の原因となることが知られている。また、ＤＭに特徴的な症状は、上眼瞼、手指の指節間関節、肘頭、膝頭等の皮疹である。さらに、特発性炎症性筋疾患は、急性進行性間質性肺炎や悪性腫瘍等の重篤な合併症を引き起こす危険性があることが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
特発性炎症性筋疾患の治療としては、抗炎症効果と免疫抑制効果を併せ持つ副腎皮質ステロイド薬の投与が一般的であり、ＤＭの治療にはステロイド外用薬も使用される。また、ステロイド薬によって十分な治療効果を得られない場合や、副作用の危険のある場合には、ステロイド薬と併せて、メトトキサート、カルシニューリン阻害薬（シクロスポリンＡ、タクロリムス）、アザチオプリン、シクロフォスファミド等の免疫抑制剤が使用される。しかし、特発性炎症性筋疾患の治療において、ステロイド薬の長期投与はステロイド筋症を引き起こし、筋力回復を妨げる原因となることが知られており（非特許文献１）、より効果的で副作用の少ない、新たな治療薬の開発が強く求められている。
【０００４】
特発性炎症性筋疾患の病態解析や治療薬開発に用いるためのモデル動物としては、Ｃタンパク質誘導筋炎（ＣＩＭ）誘導マウスが知られている（非特許文献２）。ＣＩＭ誘導マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスに、組換えヒト骨格筋Ｃ蛋白を免疫して筋炎を誘導したものであり、骨格筋にＣ蛋白誘導筋炎（ＣＩＭ）が認められ、臨床的に筋力低下を示す。また、ＣＩＭ誘導マウスは、免疫学的にもヒトＰＭに類似した症状を呈し、さらに、ヒトＰＭにおいて有効な治療方法であるγグロブリン大量療法をＣＩＭ誘導マウスに適用したところ、筋炎に対する治療効果が確認されたことから、ＣＩＭ誘導マウスは、ヒト特発性炎症性筋疾患（特にＰＭ）の特徴を正確に反映したモデル動物であると考えられている。
【０００５】
ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）は、分子量６５ｋＤａの免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着分子であり、ヒト及びマウスでは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫細胞の細胞膜表面に発現していることが報告されている（非特許文献３）。ＤＮＡＭ−１のリガンドとしては、ポリオウイルス受容体ファミリーであるＣＤ１５５及びＣＤ１１２が知られており、ＤＮＡＭ−１はこれらのリガンドと結合することによって、ＣＤ８陽性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の細胞傷害活性の活性化やサイトカイン分泌の促進を誘導することが明らかにされている（非特許文献３）。また、非特許文献４には、抗ＤＮＡＭ−１抗体（Ｔｘ４２）が、ＤＮＡＭ−１−Ｆｃキメラタンパク質と、ＣＤ１５５及びＣＤ１１２との結合を阻害することが開示されている。さらに、特許文献１には、ＤＮＡＭ−１が急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症に関与すること、Ｔｘ４２等の抗ＤＮＡＭ−１抗体が、中和抗体としてＧＶＨＤの治療に使用できることが開示されている。しかし、これまでのところ、特発性炎症性筋疾患とＤＮＡＭ−１との関連については何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／１１６９４５パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】臨床検査、Vol. 55, no. 11, 1151-1155, 2011
【非特許文献２】Arthritis & Rheumatism, Vol. 56, No. 4, 1304-1314, 2007
【非特許文献３】Biochemical and Biophysical Research Communications 321, 996-1000, 2005
【非特許文献４】Blood, Vol. 107, No. 4, 1491-1496, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、効果的且つ安全な、新規の特発性炎症性筋疾患の予防及び治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者は、抗ＤＮＡＭ−１抗体（ＩｇＧ型Ｔｘ４２）から、Ｆ（ａｂ’）２部分を単離してＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２を作製した。そして、ＩｇＧ型Ｔｘ４２及びＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２の特発性炎症性筋疾患に及ぼす効果を、モデルマウス（ＣＩＭマウス）を使用して検討した。具体的には、まず、本願発明者は、特発性炎症性筋疾患の予防におけるＩｇＧ型Ｔｘ４２及びＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２の効果を検討する目的で、ラットＩｇＧ（対照）、ＩｇＧ型Ｔｘ４２、又はＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２を予め投与したマウスに、ＣＩＭ誘導を行い、各投与群における筋組織の病理学スコアを比較検討した。この実験の結果、ＩｇＧ型Ｔｘ４２投与群における筋組織の病理学スコアは、対照群と比較して変化が認められなかったが、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群における筋組織の病理学スコアは、対照群と比較して有意に改善されていることが明らかとなった。さらに、本願発明者は、特発性炎症性筋疾患の治療におけるＩｇＧ型Ｔｘ４２及びＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２の効果を検討する目的で、ＣＩＭ誘導後のマウスに、ラットＩｇＧ（対照）、ＩｇＧ型Ｔｘ４２、又はＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２を投与し、各投与群における筋組織の病理学スコアを比較した。この実験の結果、ＩｇＧ型Ｔｘ４２投与群における筋組織の病理学スコアは、対照群と比較して変化が認められなかったが、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群における筋組織の病理学スコアは、対照と比較して有意に改善されることが明らかとなった。以上の結果から、ＩｇＧ型Ｔｘ４２、すなわち、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合する可変領域と、Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域の両方を有する抗ＤＮＡＭ−１抗体は、特発性炎症性筋疾患の予防及び治療に有効な作用を示さないが、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２、すなわち、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合する可変領域からなり、Ｆｃ受容体に結合するＦｃ領域を有さない抗体断片は、特発性炎症性筋疾患の予防及び治療に優れた作用を示すことが明らかとなった。特発性炎症性筋疾患とＤＮＡＭ−１とが関連することはこれまで知られておらず、また、抗ＤＮＡＭ−１抗体の機能的なＦｃ領域の有無が特発性炎症性筋疾患の予防及び治療において重要な鍵となることは全く予想外のことであった。本願発明者は、以上のような予想外の知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は〔１〕ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片を有効成分として含有する特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤や、〔２〕抗体が、ヒト抗体、ヒトキメラ抗体、又はヒト化抗体である前記〔１〕記載の予防又は治療剤や、〔３〕抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、又はＳｃ（Ｆｖ）２である前記〔１〕記載の予防又は治療剤や、〔４〕抗体断片が、ヒト抗体、ヒトキメラ抗体、又はヒト化抗体の断片である、前記〔３〕記載の予防又は治療剤や、〔５〕抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２である前記〔１〕、〔３〕又は〔４〕記載の予防又は治療剤や、〔６〕抗体又は抗体断片が、ＰＥＧ化された抗体又は抗体断片である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の予防又は治療剤や、〔７〕特発性炎症性筋疾患が、多発性筋炎、皮膚筋炎、筋症状を伴わない皮膚筋炎、小児皮膚筋炎、悪性腫瘍を合併する筋炎、膠原病を合併する筋炎、又は封入体筋炎である前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の予防又は治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、特発性炎症性筋疾患の予防又は治療を、効果的且つ安全に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗ＤＮＡＭ−１抗体Ｔｘ４２（ＩｇＧ型Ｔｘ４２）の抗原結合性を示す図である。Ｂａ／ｆ３細胞（Ａ）又はＤＮＡＭ−１遺伝子導入Ｂａ／ｆ３細胞（ＳＴ２６８）（Ｂ）に、Ｔｘ４２（破線）又は対照ＩｇＧ（実線）を反応させた後、さらに、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体を２次抗体として反応させて結合を検出した。
【図２】ＰＭモデルマウス（ＣＩＭ誘導マウス）における筋炎の病理学的スコアを示す図である。図中の右上の像は病理学的スコアグレード１に、中央左の像は病理学的スコアグレード２に相当する。なお、実際のスコアリングでは、１つの筋切片に同じグレードの筋炎像がみられたときは、＋０．５のグレードとした。
【図３】ＰＭモデルマウス（ＣＩＭ誘導マウス）を用いて、ＩｇＧ型Ｔｘ４２による筋炎予防効果を検討した結果を示す図である。ＩｇＧ型Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアは、対照であるラットＩｇＧ投与群と比較して有意な違いは認められなかった。
【図４】ＰＭモデルマウス（ＣＩＭ誘導マウス）を用いて、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２による筋炎予防効果を検討した結果を示す図である。Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアは、対照であるラットＩｇＧ投与群と比較して有意に低下することが明らかとなった。
【図５】ＰＭモデルマウス（ＣＩＭ誘導マウス）を用いて、ＩｇＧ型Ｔｘ４２又はＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２の筋炎治療効果を検討した結果を示す図である。ＩｇＧ型Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアは、対照であるラットＩｇＧ投与群と比較して有意な違いは認められなかった。一方、４００μｇのＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアは、対照であるラットＩｇＧ投与群と比較して有意に低下することが明らかとなった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤としては、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片を有効成分として含有するものであれば特に制限されず、ここで、「ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない抗体（以下、「本抗体」ということがある）」とは、可変領域と定常領域とから構成されている抗体であって、該可変領域がＤＮＡＭ−１を特異的に認識する可変領域であり、且つ、該定常領域が、定常領域を構成するアミノ酸配列における欠失、置換、付加等により、機能的なＦｃ受容体結合部位を含まない定常領域である抗体を意味し、また、「ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない抗体断片（以下、「本抗体断片」ということがある）」とは、ＤＮＡＭ−１を特異的に認識する可変領域から構成されており、機能的なＦｃ領域を含まない抗体断片を意味する。上記本抗体として、具体的には、例えば、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等を好適に挙げることができる。また、上記本抗体断片として、具体的には、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２等を好適に挙げることができ、中でも、Ｆ（ａｂ’）２であることが好ましく、抗ＤＮＡＭ−１抗体Ｔｘ４２を断片化して得られたＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２であることが特に好ましい。上記本抗体又は本抗体断片は、ＰＥＧ化された抗体又は抗体断片であってもよく、また、本発明の特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤は、上記本抗体又は本抗体断片から選択される１又は複数の抗体又は抗体断片を含有することができる。
【００１４】
上記本抗体は、慣用のプロトコールに従って作製することができる。例えば、上記のヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＤＮＡＭ−１抗原によって感作されたヒトリンパ球と、ヒトミエローマ細胞（例えば、Ｕ２６６等）とを融合させて得られるハイブリドーマの中から、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを適宜選択することによって作製することができる。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に、抗原となるＤＮＡＭ−１を投与し、前述の方法に従って所望のヒト抗体を取得してもよい（例えば、特公平１−５９８７８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５等を参照のこと）。また、上記のキメラ抗体は、例えば、抗ＤＮＡＭ−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、Ｖ領域をコードするＤＮＡを慣用方法により単離して配列決定し、該ＤＮＡ断片と、Ｆｃ受容体への結合能を有さないヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡとを連結して発現ベクターに導入し、宿主細胞（例えば、大腸菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ミエローマ細胞等）にトランスフェクトすることによって作製することができる。さらに、上記のヒト化抗体は、例えば、マウス抗ＤＮＡＭ−１抗体のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡと、Ｆｃ受容体への結合能を有さないヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡとを連結させて、適当なベクターに組み込み、該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より調製することができる。（例えば、ＥＰ２３９４００、ＷＯ９６／０２５７６等を参照のこと）。また、上記「Ｆｃ受容体への結合能を有さないヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡ」は、例えば、特許第４６５９６８号、特表２０１０−５１２１５２等に記載されたＦｃ受容体結合部位に変異が導入された変異体の遺伝子情報に基づいて作製することができる。
【００１５】
また、上記本抗体断片は、慣用のプロトコールに従って作製することができる。例えば、上記Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、及びＦｖは、ヒト又はヒト以外の動物に由来する抗ＤＮＡＭ−１抗体の全長抗体を、パパイン、ペプシン等のタンパク質分解酵素を用いて消化することによって作製するか（例えば、ＷＯ９４/２９３４８、及び以下の実施例を参照のこと）、又は、これらの抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現さることによって作製することができる（例えば、J. Immunol. 152, 2968-2976, 1994、Methods Enzymol. 178, 476-496, 1989、Methods Enzymol. 178, 497-515, 1989、Methods Enzymol. 121, 652-663, 1986、Methods Enzymol. 121, 663-669, 1986、Trends Biotechnol. 9, 132-137, 1991等を参照のこと）。さらに、上記ＳｃＦｖ及びＳｃ（Ｆｖ）２は、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域からなるＦｖの片方の鎖のＣ末端に、他方のＮ末端を適当なペプチドリンカーを挟んで連結し一本鎖化することによって作製することができる。より具体的には、例えば、上記本抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）３等）をコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、該ベクターを用いて形質転換した形質転換体より調製することができる。
【００１６】
上記本抗体又は本抗体断片は、ヒト抗体ライブラリーを用いて単離することもできる（例えば、Nature, 348, 552-554, 1990等を参照のこと）。より具体的には、例えば、ファージディスプレイ法により、ヒト抗体の可変領域をｓｃＦｖとしてファージの表面に発現させ、ＤＮＡＭ−１を固定化したプレートを用いて、ＤＮＡＭ−１に結合するファージを選択し、選択されたファージの遺伝子を解析することによって、ＤＮＡＭ−１に結合する抗体の可変領域をコードする遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子配列を用いれば、ヒト抗ＤＮＡＭ−１抗体又はその抗体断片を作製することができる（例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８等を参照のこと）。
【００１７】
さらに、上記本抗体又は本抗体断片は、任意の分子によって修飾された抗体又は抗体断片であってもよく、具体的には、例えば、ＰＥＧ化抗体又は抗体断片、フコシル化抗体又は抗体断片、グリコシル化抗体又は抗体断片、アセチル化抗体又は抗体断片、ホスホリル化抗体又は抗体断片、アミド化抗体又は抗体断片等を好適に挙げることができるが、中でも、ＰＥＧ化抗体又は抗体断片を特に好適に挙げることができる。
【００１８】
本発明の予防又は治療剤を適用する特発性炎症性筋疾患としては、特に制限されないが、例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、筋症状を伴わない皮膚筋炎、小児皮膚筋炎、悪性腫瘍を合併する筋炎、膠原病を合併する筋炎、封入体筋炎等を好適に挙げることができる。特発性炎症性筋疾患の診断には様々な手法が用いられるが、一般的には、以下の［１］〜［９］の項目のうち１又は複数の症状を呈する場合に多発性筋炎ないし皮膚筋炎であると判断される。例えば、患者が、以下の［１］の（ａ）〜（ｃ）のうち１項目以上の項目を満たし、且つ、経過中に以下の［２］〜［９］の項目のうち４項目以上を満たす場合には、該患者は皮膚筋炎であると判断される。また、患者が、以下の［２］〜［９］の項目のうち４項目以上を満たす場合には、該患者は多発性筋炎であると判断される。
［１］皮膚症状：
（ａ）ヘリオトロープ疹：両側又は片側の眼瞼部の紫紅色浮腫性紅斑
（ｂ）ゴットロン徴候：手指関節背面の角質増殖や皮膚萎縮を伴う紫紅色紅斑
（ｃ）四肢伸側の紅斑：肘、膝関節などの背面の軽度隆起性の紫紅色紅斑
［２］上肢又は下肢の近位筋の筋力低下
［３］筋肉の自発痛又は把握痛
［４］血清中筋原性酵素（クレアチンキナーゼ又はアルドラーゼ）の上昇
［５］筋電図の筋原性変
［６］骨破壊を伴わない関節炎又は関節痛
［７］全身性炎症所見（発熱、ＣＲＰ上昇、又は赤沈促進）
［８］抗Ｊｏ−１抗体陽性
［９］筋生検で筋炎の病理所見：筋線維の変性及び細胞浸潤
【００１９】
本発明の予防又は治療剤は、薬理学的に許容される公知の担体又は希釈剤等からなる補助成分や、特発性炎症性筋疾患の治療及び予防のための他の生理活性物質をさらに含有していてもよい。上記生理活性物質としては、特に制限されないが、例えば、副腎皮質ステロイド薬（例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメサゾン、デキサメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、酢酸ジフロラゾン、プロピオン酸デキサメタゾン、シプロピオン酸ベタメタゾン等）や、免疫抑制薬（例えば、メトトレキサート、シクロスポリンＡやタクロリムス等のカルシニューリン阻害薬、アザチオプリン、シクロフォスフォミド）や、グロブリン製剤等を挙げることができる。また、本発明の予防又は治療剤は、患者が特発性炎症性筋疾患であると判断された後に、治療を目的として投与してもよいし、患者が特発性炎症性筋疾患であると判断される前に、予防を目的として投与してもよい。本発明の予防又は治療剤の投与方法としては、特に制限されないが、例えば、注射投与（静脈内、筋肉内、動脈内等）、経口投与、経皮投与、経粘膜投与、経直腸投与、経腔投与等を好適に挙げることができる。
【００２０】
また、本発明は、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片を、特発性炎症性筋疾患の予防又は治療を必要とする患者に投与することにより、特発性炎症性筋疾患を予防又は治療する方法や、特発性炎症性筋疾患を予防又は治療するための、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片や、特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤の製造における、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない性質を有する、抗体又は抗体断片の使用にも関する。
【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
［抗ＤＮＡＭ−１抗体（ＩｇＧ型Ｔｘ４２）の作製］
ラット抗マウスＤＮＡＭ−１モノクローン抗体Ｔｘ４２（ＩｇＧ型Ｔｘ４２）を産生するハイブリドーマをヌードマウス腹腔に接種した。得られた腹水にカプリン酸を添加し、凝集物を遠心分離除去した。上清に飽和硫安を加えて免疫グロブリンを沈殿させＩｇＧ型Ｔｘ４２を精製した。なお、カプリン酸と飽和硫安は１０ｋＤａの透析膜で取り除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて、γグロブリン軽鎖と重鎖に相当するバンドが現れることを確認した。ＩｇＧ型Ｔｘ４２の軽鎖と重鎖の分子量は２５ｋＤａと５０ｋＤａであった。また、ＩｇＧ型Ｔｘ４２の抗原結合性は、ＤＮＡＭ−１遺伝子を導入したＢａ／ｆ３細胞（ＳＴ２６８）への結合をフローサイトメトリーで検出することにより確認した（図１）。
【００２３】
［Ｆ（ａｂ’）２化抗体の作製］
ペプシンを用いてＩｇＧ型Ｔｘ４２の酵素分解を行い、ＩｇＧ型Ｔｘ４２のＦ（ａｂ’）２部分を単離した。酵素分解反応は以下の通りに行った。まず、ＩｇＧ型Ｔｘ４２を、４℃の緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ４．０）中で透析することによって、緩衝液以外の溶媒を除去した。次にAmicon Ultra-4（MILLIPORE社製）を使用して、ＩｇＧ型Ｔｘ４２溶液を１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ペプシン結合ゲルImmobilized Pepsin（Thermo scientific社製）を上記緩衝液で洗浄し、洗浄したペプシン結合ゲル２５μＬに、濃縮した抗体溶液１００μＬと緩衝液５０μＬとを加えて、３７℃で１２時間〜１６時間反応させた。反応中は、チューブを撹拌し、溶液が常に混合すようにした。反応後、ペプシン結合ゲルを遠心分離除去して上清を回収した。回収したＦ（ａｂ’）２溶液から、ペプシンと切断された抗体のＦｃ部位とを５０ｋＤａの透析膜を用いて取り除いた。
【００２４】
以上のようにして得られたＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、Ｆ（ａｂ’）２が回収できたことを確認した。また、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２の抗原結合性は、ＤＮＡＭ−１遺伝子を導入したＢａ／ｆ３細胞（ＳＴ２６８）への結合をフローサイトメトリーで検出することにより確認した。なお、抗原結合能を保持したＦ（ａｂ’）２の作製には、緩衝液のｐＨや反応条件を至適化することが必要であり、予備実験にて酵素反応条件を検討した。候補として用いた条件は、緩衝液のＰＨが４．０または４．５、反応時間は１時間から４８時間までとした。予備実験の結果、緩衝液のＰＨを４．０とし、３７℃で１２〜１６時間反応させることで、抗原結合能を保持したＦ（ａｂ’）２を作製できることがわかった。
【実施例２】
【００２５】
［ＰＭモデルマウスの誘導と筋炎活動性の判定］
組換え骨格筋Ｃタンパク断片を大腸菌で産生して精製した。この骨格筋Ｃタンパク質断片と、完全フロイトアジュバントとを混合してＣ５７ＢＬ６マウスに免疫し、同時に百日咳毒素を腹腔内投与して、ＰＭモデルマウスであるＣタンパク質誘導筋炎（ＣＩＭ）を誘導した。筋炎がピークとなる免疫後１４〜２１日目に筋組織をＨＥ染色し、以下に示すグレード１〜４からなる病理学的スコアを用いて筋炎活動性を評価した（図２）。また、抗体治療後における病理学的スコアの比較には、マン・ホイットニーＵ検定を用いた。
グレード１：筋線維１〜５本分の範囲に炎症がおきている。
グレード２：筋組織の破壊が筋線維５〜３０本に及ぶ
グレード３：筋組織の破壊が筋束に及ぶ
グレード４：びまん性、広範囲の筋組織の破壊
【実施例３】
【００２６】
［予防実験］
ＩｇＧ型Ｔｘ４２及びＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２が、ＰＭを予防する効果があるかどうかを、以下のようにして検討した。マウスにＣＩＭを誘導する前日から、ＩｇＧ型Ｔｘ４２（１００μｇ）又はＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２（１００μｇ）を隔日にマウス腹腔内に投与した。また、対照群マウスには、ラットＩｇＧ（SIGMA-ALDRICH社製）を同様に投与した。これらのマウスにＣＩＭ誘導を行い、１４日又は２１日後に後肢大腿筋組織を病理学的に検討した。対照群とＩｇＧ型Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアを比較した結果を図３に、対照群とＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアを比較した結果を図４にそれぞれ示す。図３に示すように、対照群とＩｇＧ型Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアを、ＣＩＭ誘導２１日後に検討した結果、両群の病理スコア間に統計学的に有意な違いは認められなかった。一方、図４に示すように、対照群とＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群における筋組織病理スコアを、ＣＩＭ誘導１４日後に検討した結果、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群では、対照群と比較して有意に病理学的スコアが低く、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２によるＣＩＭ予防効果が認められた。
【００２７】
［治療実験］
ＩｇＧ型Ｔｘ４２及びＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２が、ＰＭを治療する効果があるかどうかを、以下のようにして検討した。マウスにＣＩＭを誘導して、７日後からラットＩｇＧ（２００μｇ）、ＩｇＧ型Ｔｘ４２（２００μｇ）、又はＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２（２００μｇ又は４００μｇ）を隔日に投与し、ＣＩＭ誘導から１４日後に後肢大腿筋組織を病理学的に検討した。その結果、図５に示すように、ＩｇＧ型Ｔｘ４２投与群においては、対照群と比較して有意な病理スコアの違いは認められなかったが、４００μｇのＦ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２投与群においては、対照群に比して、有意に病理学的スコアが低下することが明らかとなった。
【００２８】
以上の結果から、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２が、ＰＭに対して予防及び治療効果を有することが明らかとなった。また、予想外にも、このような予防及び治療効果は、ＩｇＧ型Ｔｘ４２では認められないことが明らかとなった。このような、Ｆ（ａｂ’）２化Ｔｘ４２とＩｇＧ型Ｔｘ４２の作用の違いはＦｃ領域の有無に起因すると考えられる。すなわち、ＩｇＧ型Ｔｘ４２は、そのＦｃ領域がＦｃ受容体と結合することによって、ＤＮＡＭ−１の部分アゴニストとして作用していると考えられる。これらのことから、特発性炎症性筋疾患の予防及び治療には、ＤＮＡＭ−１に特異的に結合し、且つ、Ｆｃ受容体に結合しない抗体又は抗体断片が有効であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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