(57)【要約】      （修正有）【課題】新たなユビキチン活性化酵素の提供。また、新たなユビキチン活性化酵素阻害剤を含む医薬品の提供。【解決手段】下記一般式Ｉで表される化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物からなる、ユビキチン活性化酵素を阻害する新規なインドールアルカロイド。2013237627.tif 000025該化合物は、ユビキチン活性化酵素阻害剤として有用である。該化合物はまた、医薬組成物の有効成分として有用である。さらに、該医薬組成物は、抗癌剤としても有用である。【選択図】図２
2013237627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉ：
【化１】
2013237627.tif 000019
で表される化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物からなるユビキチン活性化酵素阻害剤。
【請求項２】
一般式ＩＩ：
【化２】
2013237627.tif 000020
または一般式ＩＩＩ：
【化３】
2013237627.tif 000021
で表される化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物からなるユビキチン活性化酵素阻害剤。
【請求項３】
上記化合物が上記一般式ＩＩで表される化合物である、請求項２に記載のユビキチン活性化酵素阻害剤。
【請求項４】
一般式Ｉ：
【化４】
2013237627.tif 000022
で表される化合物またはその製薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項５】
一般式ＩＩ
【化５】
2013237627.tif 000023
または一般式ＩＩＩ：
【化６】
2013237627.tif 000024
で表される化合物またはその製薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項６】
上記化合物が上記一般式ＩＩで表される化合物である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
抗癌剤としての請求項４〜６のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なユビキチン活性化酵素阻害剤に関する。本発明はまた、該阻害剤を含む医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチン−プロテアソーム経路（ＵＰＰ）を介したタンパク質分解は、細胞周期制御、転写および発達等の細胞内事象において、必須の細胞内の重要な調節プロセスである。また、ＵＰＰの欠陥は、発癌や神経変性疾患を含む種々の疾患に関連しているとされている。ＵＰＰは、ユビキチンシステムおよび２６Ｓプロテアソームからなるタンパク質分解装置である。ユビキチンは、７６アミノ酸からなり、標的のタンパク質に結合して分解へと進める。ユビキチンシステムでは、３つの酵素、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）およびユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の順次の作用により標的タンパク質のユビキチン化が行われ、ポリユビキチンが形成される。ユビキチンはまず、Ｅ１によって活性化される。ユビキチンとＡＴＰはＥ１のそれぞれの結合部位に結合し、Ｅ１はユビキチン−アデニル酸中間体を形成し、次いで、ユビキチンがチオールエステル結合を介してＥ１の活性部位のシステイン残基に結合する。活性化されたユビキチンは、Ｅ２の活性部位のシステインへと移動し、次いで、Ｅ３を介して標的タンパク質に結合する。標的タンパク質をタグ化しているポリユビキチン鎖は、２６Ｓプロテアソームによって認識され、タンパク質が分解される。
【０００３】
ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ：登録商標）は、米国において、多発性骨髄腫の治療に承認された合成プロテアソーム阻害剤であり、２６Ｓプロテアソームの阻害によるＵＰＰの調節が、抗癌剤のターゲットとして有効であることを示している。Ｅ１活性もまたＵＰＰにおいて必須であることより、抗癌剤としてＥ１に対する阻害剤が考えられる。
【０００４】
本出願の発明者を含むグループは、Ｅ１阻害剤として、海洋性アスペルギウス（Aspergillus）属からヒメイン酸Ａ（himeic acid A）を単離した（非特許文献１）。他にも多くの選択的Ｅ１阻害剤の研究がなされているが、現在までに天然資源から単離されているＥ１阻害剤は、パネポフェナンスリン（panepophenanthorine）（非特許文献２）、ヒメイン酸Ａおよびラルガゾール（largazole）（非特許文献３）のみである。最近、合成ピラゾン誘導体であるＰＹＲ−４１や合成ジスルフィド化合物であるＮＳＣ６２４２０６が、細胞透過性のＥ１阻害剤として商用スクリーニングライブラリーより見いだされている。ＰＹＲ−４１は、タンパク分解やＮＦ−κＢのサイトカイン誘導活性化をブロックし、細胞内のｐ５３を活性化し、野生型ｐ５３で形質転換した細胞を殺す。ＮＳＣ６２４２０６は、ｐ２７ユビキチン化を阻害する。これらの化合物（パネポフェナンスリン、ヒメイン酸Ａ、ラルガゾール、ＰＹＲ−４１、およびＮＳＣ６２４２０６）の構造を図１に示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tsukamotoら Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 191.
【非特許文献２】Sekizawaら J. Nat. Prod. 2002, 65, 1491.
【非特許文献３】Ungermannovaら PLoS ONE 2012, 7, e29208.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、ＵＰＰに関与するユビキチン活性化酵素（Ｅ１）に対する阻害剤は、ＵＰＰの第１のステップを阻害でき、ユビキチンシステムの下流の生物学的機能を調整できる。つまり、Ｅ１阻害剤は、細胞周期制御、転写および発達などの疾患機序に関与して新たな医薬品を提供できる可能性がある。特には上記のように、ＵＰＰの欠陥は、癌や神経変性を含む種々の疾患に関連しているとされているので、Ｅ１阻害剤が新たな抗癌剤として期待される。従って、本発明は、新たなＥ１阻害剤を提供することを目的とする。本発明はまた、新たなＥ１阻害剤を含む医薬品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、海綿Ｈｙｒｔｉｏｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓより単離し以前本発明者らにより報告された新規なインドールアルカロイドが、Ｅ１阻害活性を示すことを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は以下を含むものである。
（１）一般式Ｉ：
【０００９】
【化１】
2013237627.tif 000003
で表される化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物からなるユビキチン活性化酵素阻害剤。
（２）一般式ＩＩ：
【００１０】
【化２】
2013237627.tif 000004
または一般式ＩＩＩ：
【００１１】
【化３】
2013237627.tif 000005
で表される化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物からなるユビキチン活性化酵素阻害剤。
（３）上記化合物が上記一般式ＩＩで表される化合物である、前記（２）に記載のユビキチン活性化酵素阻害剤。
（４）一般式Ｉ：
【００１２】
【化４】
2013237627.tif 000006
で表される化合物またはその製薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む医薬組成物。
（５）一般式ＩＩ
【００１３】
【化５】
2013237627.tif 000007
または一般式ＩＩＩ：
【００１４】
【化６】
2013237627.tif 000008
で表される化合物またはその製薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む医薬組成物。
（６）上記化合物が上記一般式ＩＩで表される化合物である、前記（５）に記載の医薬組成物。
（７）抗癌剤としての前記（４）〜（６）のいずれか一つに記載の医薬組成物。
（８）さらに薬物担体を含有する前記（４）〜（６）のいずれか一つに記載の医薬組成物。
（９）一般式Ｉ：
【００１５】
【化７】
2013237627.tif 000009
で表される化合物またはその製薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を有効量投与することを含む、癌の予防又は治療方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、前記一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩで表される化合物またはその塩、水和物もしくは溶媒和物からなるユビキチン活性化酵素の阻害剤が提供される。本発明によればまた、前記一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩで表される化合物またはその製薬上許容される塩、水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】公知のＥ１阻害剤を示している。
【図２】本発明の化合物１および２によるＥ１阻害活性を、ウェスタンブロッティングを用いて測定した結果である。
【図３】本発明の化合物１および２、およびヒメイン酸による、Ｅ１−ユビキチン結合阻害活性を、免疫沈降法を用いて測定した結果である。
【図４】Ｅ１阻害機構を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明のＥ１阻害活性を有する化合物は、以下の式Ｉで表される化合物である。
【００１９】
【化８】
2013237627.tif 000010
【００２０】
本発明のＥ１阻害活性を有する化合物は、特に好ましくは、以下の式ＩＩまたは式ＩＩＩで表される化合物である。
【００２１】
【化９】
2013237627.tif 000011
【００２２】
【化１０】
2013237627.tif 000012
【００２３】
上記式ＩＩまたはＩＩＩで表される化合物の構造については本発明者により既に開示されており、独立行政法人科学技術振興機構により運営されている日本化学物質辞書に、日化辞番号Ｊ２．９０９．８９０ＥおよびＪ２．９０９．８８８Ｃとして登録されている。
【００２４】
本発明のＥ１阻害活性を有する化合物は、上記化合物Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに加え、その塩を含む。上記化合物の塩、好ましくは製薬上許容される塩としては、上記化合物の活性に悪影響を与えず、且つ有害な作用を引き起こさない限り特に限定されず、例えば、アルカリ金属塩（リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩など）などを挙げることができる。特に限定するものではないが、ナトリウム塩が好ましい
【００２５】
本発明のＥ１阻害活性を有する化合物は、上記化合物Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに加え、その水和物もしくは溶媒和物を含む。上記化合物の溶媒和物、好ましくは製薬上許容される溶媒和物としては、上記化合物の活性に悪影響を与えず、且つ有害な作用を引き起こさない限り特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸、エタノールアミン、酢酸エチルなどの有機溶媒が結合した溶媒和物などを挙げることができる。
【００２６】
本発明のＥ１阻害活性を有する化合物は、本発明の目的を害さない範囲で、上記式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩで表される化合物を修飾した化合物を含む。かかる修飾としては、本技術分野で公知の方法を用いることができる。
【００２７】
本発明の一つの態様において、上記化合物のいずれかを含むユビキチン活性化酵素阻害剤が提供される。ユビキチン活性化酵素は、ユビキチン−プロテアソーム経路の最も上流に位置する重要な酵素である。本発明の阻害剤は、ＩＣ50で、５０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、さらに好ましくは５μＭ以下という優れたユビキチン活性化酵素阻害活性を有する。
【００２８】
本発明のユビキチン活性化酵素阻害剤は、ユビキチン活性化酵素にかかわる種々の測定・分析系において用いることができ、これに限定されないが、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）の活性測定系、Ｅ１阻害剤のスクリーニング系、ユビキチン−プロテアソーム経路の測定系等に用いることができる。これらの用途での本発明のユビキチン活性化酵素阻害剤の使用も本発明の範囲である。
【００２９】
本発明のユビキチン活性化酵素阻害剤は、ユビキチン活性化酵素の阻害に基づく種々の用途、またはユビキチン−プロテアソーム経路の阻害に基づく種々の用途に用いることができる。これに限定されないが、例えば、癌や神経変性疾患に対する薬剤として用いることができる。これらの用途での本発明のユビキチン活性化酵素阻害剤の使用も本発明の範囲である。
【００３０】
本発明の他の一つの態様において、本発明はまた、本発明のＥ１阻害活性を有する化合物を含む医薬組成物である。本発明の化合物は、Ｅ１活性を阻害してユビキチン−プロテアソーム経路（ＵＰＰ）を制御できる。その結果、ＵＰＰの欠陥に基づく、種々の疾患、例えば癌や神経変性疾患に有用である。すなわち本発明はまた、本発明のＥ１阻害活性を有する化合物を含む癌の治療のための医薬組成物でもある。癌の種類は特に限定されず、例えば、膵臓癌、肺癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、歯肉癌、食道癌、胃癌、胆管癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、前立腺癌、悪性リンパ腫などを挙げることができる。
【００３１】
本発明の医薬組成物の剤形としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、注射剤、液剤、懸濁剤、乳剤、エアゾール剤などを挙げることができる。また、医薬組成物は、製薬上許容される添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、溶剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶解補助剤、分散剤、抗酸化剤、保存剤などを挙げることができる。それらの添加剤は、医薬分野で用いられている公知の添加剤を用いることができ、その添加量は、剤形、投与量に応じて適宜選択できる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
１．化合物の単離
インドネシアの北スラウェシ州で採取された海綿Ｈｙｒｔｉｏｓ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓをエタノールで抽出し、濃縮した。水溶性残渣を、酢酸エチルエステル、次いでｎ−ブタノールで抽出した。ｎ−ブタノール分画（9.55g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHCl3/MeOH 次いでCHCl3/MeOH/H2O）で精製し、Ａ〜Ｃの分画を得た。分画Ｃ（2.99g）をCHCl3/MeOH/H2O (6:4:1および5:5:1)で溶出し、溶出液を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（10％ CH3CN-H2O）、次いで、ＨＰＬＣ（Phenomenex社、Phenyl-hexylカラム、10% CH3CN-H2O (0.05% TFA)）、COSMOSIL πNAP カラム（10% CH3CN-H2O (0.05% TFA)）で精製し、ヒルチオレチクリンＡ(Hyrtioreticulin A)（化合物１、4.0mg)およびヒルチオレチクリンＢ(Hyrtioreticulin B)（化合物２、6.0mg)を得た。
【００３４】
ヒルチオレチクリンＡの構造を以下に示す。
【００３５】
【化１１】
2013237627.tif 000013
[α]25D +23.8° (c 1.35, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 309 (3.42), 274 (3.67), 210.5 (4.16); IR (film) νmax 3357, 3147, 2852, 1675, 1629, 1390, 1205, 1133, 1081, 838, 800, 719, 667 cm-1; 1H and 13C NMR data（下記表１参照）; positive ESIMS m/z 313 [M+H]+. HRESIMS m/z 313.1300 (calcd for C16H17N4O3, 313.1301).
【００３６】
ヒルチオレチクリンＢの構造を以下に示す。
【００３７】
【化１２】
2013237627.tif 000014
[α]25D -49.2° (c 0.90, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 307.5 (3.54), 273 (3.75), 208.5 (4.21); IR (film) νmax 3293, 3116, 2921, 1675, 1619, 1413, 1394, 1203, 1139, 838, 800, 723, 667 cm-1; 1H and 13C NMR data（下記表１参照）; positive ESIMS m/z 313 [M+H]+. HRESIMS m/z 313.1297 (calcd for C16H17N4O3, 313.1301).
【００３８】
また、ヒルチオレチクリンＡ（化合物１）およびヒルチオレチクリンＢ（化合物２）のＮＭＲ分析データは以下の通りである。
【００３９】
【表１】
2013237627.tif 000015
【００４０】
分画Ａ（1.02g）を、CHCl3/MeOH/H2O (7:3:0.5)で溶出し、溶出液を、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（10％および30％ CH3CN-H2O）、次いで、ＨＰＬＣ（Phenomenex社、Phenyl-hexylカラム、10% CH3CN-H2O (0.01% TFA)）で精製し、ヒルチオレチクリンＥ(Hyrtioreticulin E)（化合物３、10.4mg)、およびヒルチオエレクチンＢ(Hyrtioerectine B)（化合物４、7.5.mg)を得た。また、分画Ｂ（1.51g）を、CHCl3/MeOH/H2O (6:4:1)で溶出し、溶出液から直接、ヒルチオエレクチンＢ（化合物３、247.9mg)を得た。対照としてのヒルチオエレクチンＢは、合計で255.4mgを得た。
【００４１】
ヒルチオレチクリンＥの構造を以下に示す。
【００４２】
【化１３】
2013237627.tif 000016
[α]25D -11.2° (c 0.28, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 272 (3.23), 224 (3.60), 209 (3.63) nm; IR (film) νmax 3227, 2361, 2334, 1674, 1635, 1456, 1398, 1201, 1145, 841, 802, 722 cm-1; 1H and 13C NMR data（下記表２参照）; FABMS m/z 247 [M+H]+; HRFABMS m/z 247.1086 (calcd for C13H15N2O3, 247.1082).
【００４３】
【表２】
2013237627.tif 000017
【００４４】
対照であるヒルチオエレクチンＢの構造を以下に示す。
【００４５】
【化１４】
2013237627.tif 000018
【００４６】
２．ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）阻害活性の測定
Ｅ１活性は、ＡＴＰ存在下で、Ｅ１とユビキチンからのＥ１−ユビキチン中間体の形成に基づいて測定した。組換えＦＬＡＧ−タグ化Ｅ１（0.1μg）を前もって、50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 0.1 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl2, 2 mM ATP, および0.25 ユニット無機ピロホスファターゼ（SIGMA-ALDRICH）を含む25μlの反応混合液中で37℃、30分間インキュベートした。続いて、0.5μgのＧＳＴ-ユビキチン（MBL）を添加し、得られた混合液を、37℃で60分間インキュベートした。反応をＳＤＳ−ローディングバッファを加えて停止し、反応液を、9％ポリアクリルアミドを含むスラブゲルにて、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。タンパク質をニトロセルロース膜（BIO-RAD）にブロットした後、5％スキムミルクを含むリン酸緩衝液（0.1% Tween20 含有）でブロックし、次いで、イムノブロティングを行った。ＦＬＡＧ−タグ化Ｅ１の免疫学的検出は、１次抗体としてＦＬＡＧ−タグに対するマウスモノクローナルM２抗体（SIGMA-ALDRICH）、および２次抗体としてペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（GEヘルスケア）をそれぞれ用いた。検出は、増幅化学発光システム（和光純薬（株））を用いて行い、バンドは、FUJIFILM発光イメージアナライザー（Fuji LAS-300mini、富士フィルム(株)）を用いて可視化した。
【００４７】
測定化合物はＤＭＳＯ溶液に溶解して用いた。ＦＬＡＧ−タグ化Ｅ１、ＧＳＴ-ユビキチンおよびＡＴＰを含む反応液に、ＤＭＳＯに溶解した化合物１（ヒルチオレチクリンＡ）または化合物２（ヒルチオレチクリンＢ）を、それぞれ100μＭとなるように添加し、インキュベートして反応を行った。反応液のＤＭＳＯ濃度は２％であった。反応を停止後、反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行い、Ｅ１−ユビキチン中間体を検出した。コントロールとしては、ＤＭＳＯ溶液のみを添加したものを用いた。結果を図２に示す。化合物１、２の添加により、Ｅ１−ユビキチン中間体の形成が有意に阻害された。
【００４８】
添加する化合物１および２の濃度を変えて阻害活性を測定した。その結果、化合物１および２は、容量依存的に、Ｅ１−ユビキチン中間体の形成を阻害することが確認できた。化合物１および２のＩＣ50は、それぞれ、0.75μg/mL（2.4μM）および11μg/mL（35μM）であった。一方、化合物３（ヒルチオレチクリンＥ）およびヒルチオエレクチンＢについて同様に、Ｅ１阻害活性を測定したところ、25μg/mL（100μM）でも、Ｅ１−ユビキチン中間体の形成を阻害しなかった。
このことより、Ｅ１阻害には、イミダゾール環の存在が必要であること、および化合物１および２のＣ−１における配置がｔｒａｎｓであることが好ましいことが示唆された。
【００４９】
３．免疫沈降法（ＩＰ法）によるユビキチン活性化酵素（Ｅ１）阻害活性の測定
抗ＧＳＴモノクローナル抗体（MBL）（1.6μg）を、プロテインG固定アガロースゲルビーズ（25μL）とともに、0.1% Tween20含有リン酸緩衝液中で、20℃で10分間インキュベーションした。50μMのＥ１阻害剤の存在／不存在下で、抗ＧＳＴ抗体固定ビーズをＧＳＴ−ユビキチン（1.5μg）およびＦＬＡＧ−タグ化Ｅ１とともに、200μLのIP緩衝液（50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 2% glycerol, および 0.25% NP-40）中で混合して、20℃で20分間インキュベートした。IP緩衝液で４回洗浄した後、ビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファ（30μL）で懸濁し、7.5％ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動を行った。次いで、ペルオキシダーゼを結合した抗ＦＬＡＧＭ２抗体を用いてウェスタンブロティングを行った。
【００５０】
Ｅ１阻害剤として、化合物１、化合物２、およびヒメイン酸を用いた免疫沈降法の結果を図３に示す。ヒメイン酸は、ユビキチンのＥ１への結合を阻害することが知られている。ＧＳＴ−ユビキチンを、５０μMの化合物１、化合物２、またはヒメイン酸存在下で、ＦＬＡＧ−Ｅ１と混合した。コントロールとして、０．５％ＤＭＳＯを用いた。混合液を、抗ＧＳＴ抗体固定化ビーズを用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。次いで、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、ウェスタンブロティングを行った。
結果は、ヒメイン酸を添加した場合は、コントロール（ＤＭＳＯのみ）に比べて有意に、免疫沈降ＦＬＡＧ−タグ化Ｅ１（ＦＬＡＧ−Ｅ１）が減少していたが、化合物１および２では、ユビキチンのＥ１結合部位への結合を阻害していなかった。従って、図４に示すように、化合物１および２によるＥ１の阻害は、ヒメイン酸とは異なる作用によると考えられる。
【００５１】
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明の化合物はＥ１阻害剤として、研究分野において有用である。本発明のＥ１阻害活性を有する化合物はまた、ユビキチン−プロテアソーム経路が関与する疾患の治療のための医薬組成物として有用である。
【図１】
2013237627.tif 000026
【図２】
2013237627.tif 000027
【図３】
2013237627.tif 000028
【図４】
2013237627.tif 000029