(57)【要約】【課題】活性化Ｔ細胞に起因する疾患の治療に適した、長期服用しても安心かつ安全な免疫抑制剤を提供すること。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類を有効成分として免疫抑制剤に含有させる。下記一般式（Ｉ）中、Ｒ1は飽和または不飽和のアルキル基を表し、Ｒ2は水素原子またはメチル基を表す。下記一般式（Ｉ）において、Ｒ1はＲ2に対してパラ位に結合していることが好ましく、Ｒ1は炭素原子数１３〜２７の飽和または不飽和のアルキル基であることが好ましい。2013091612.tif 000004【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類を有効成分とする免疫抑制剤。
【化１】
2013091612.tif 000003
（式中、Ｒ1は飽和または不飽和のアルキル基を表し、Ｒ2は水素原子またはメチル基を表す。）
【請求項２】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ1が、Ｒ2に対してパラ位に結合した請求項１記載の免疫抑制剤。
【請求項３】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ1が、炭素原子数１３〜２７の飽和または不飽和のアルキル基である請求項１または２記載の免疫抑制剤。
【請求項４】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ1が炭素原子数１５または１７の飽和アルキル基であり、Ｒ2が水素原子である請求項１又は２に記載の免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症薬の効果が低い活性化Ｔ細胞に起因する炎症反応、自己免疫疾患、臓器障害、臓器移植時／骨髄移植時の拒絶反応、アレルギー疾患等の疾患の原因となるＴ細胞活性化を抑制する、植物から調製可能な免疫抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制剤としては、タクロリムス（ＦＫ５０６）やサイクロスポリンＡが有効な免疫抑制効果を有していることが知られている。これらの免疫抑制剤は、医療現場で実用化されているが、長期投与に伴う血球減少、腎毒性や糖尿病といった副作用の発症が明らかになっている。
【０００３】
一方、４−アルキルレゾルシノールは、医薬品や化粧品の成分あるいはその中間体として、また、樹脂の添加剤や原料として、工業的に用いられている。例えば、４−アルキルレゾルシノールは、ニキビ原因菌に対する抗菌作用（特許文献１）、フケ原因菌に対する抗菌作用（特許文献２）、美白作用（特許文献３〜４）など、化粧品や皮膚外用品において有用な効果を有することが知られており、４−ｎ−ブチルレゾルシノールは美白剤として既に化粧品に実用化されている。また、４−ｎ−へキシルレゾルシノールは回虫や十二指腸虫の駆虫剤として使用されている。さらに、レゾルシノール誘導体には、肥満患者の脂肪減少作用（特許文献５）、抗動脈硬化、抗肥満および抗糖尿病作用（特許文献６）など、医薬品において有効な効果があることも知られている。
【０００４】
アルキルレゾルシノール類は、天然の非イソテルぺノイド系フェノール性両親媒性化合物であるレゾルシノール脂質として広く植物に含まれることが報告されている（非特許文献１）。非特許文献１には、レゾルシノール脂質の給源となる植物として、ウルシ科、イチョウ科、ヤマモガシ科、ヤブコウジ科、サクラソウ科、ニクズク科、アヤメ科、サトイモ科、キク科のヨモギ、マメ科、イネ科が報告されている。なお、アルキルレゾルシノール類の毒性に関しては、カシューナッツの殻由来の炭素原子数１５の飽和アルキル基を有する４−アルキルレゾルシノールを、ラットに５ｇ／ｋｇ体重の量で経口投与しても、明らかな毒性は観察されなかったことが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２８７５３７４号公報
【特許文献２】特許第２８０１９６０号公報
【特許文献３】特開平５−００４９０５号公報
【特許文献４】特公平６−０５１６１９号公報
【特許文献５】特許第２８４２０４１号公報
【特許文献６】特開２００５−０６８１３２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Chemical Reviews (1999)、 Vol.99、 No.1、 pp.1-25、 Arkadiusz Kozubek et al.
【非特許文献２】Nutrition Reviews (2004)、 Vol.62、 No.3、 pp.81-95、 Alastair B. Ross et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多くの実験や研究により活性化Ｔ細胞に起因する疾患に対する治療法が開発されており、例えば慢性関節リウマチや全身性エリテマトーデス、強皮症に対しては、ステロイド剤や非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、免疫抑制剤が使用されている。しかし、ステロイド剤やＮＳＡＩＤｓは疾患の対処療法でしかない。また、臓器移植時の拒絶反応を抑制するために各種免疫抑制剤が利用されているが、血球減少や腎不全、ショック症状等の重篤な副作用を有するものも多い。
【０００８】
活性化Ｔ細胞に依存する炎症性障害としては、上記の疾患以外に、喘息、アレルギー、乾癬性関節炎、内毒素症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、多発性硬化症（ＭＳ）、移植片拒絶、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性障害の他、クローン病、シェーグレン症候群、自己免疫性溶血性貧血などの各種自己免疫疾患がある。これらの疾患に対しても、前述と同様に、長期服用しても安心かつ安全で治療に適した、活性化Ｔ細胞に対する活性抑制剤は存在しなかったのが実情である。
【０００９】
従って、本発明の目的は、活性化Ｔ細胞に起因する疾患の治療に適した、長期服用しても安心かつ安全な免疫抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、鋭意検討した結果、小麦成分中に含まれることが知られるアルキルレゾルシノール類に、活性化したＴ細胞の活性を抑制する作用があることを見出し、その結果として、安全に使用可能な免疫抑制剤を提供することを可能とした。
【００１１】
即ち、本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類を有効成分とする免疫抑制剤を提供するものである。
【００１２】
【化１】
2013091612.tif 000002
（式中、Ｒ1は飽和または不飽和のアルキル基を表し、Ｒ2は水素原子またはメチル基を表す。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、活性化Ｔ細胞に起因する疾患の治療に適した、長期服用しても安心かつ安全な免疫抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、試験例１−１のサイトカイン産生量測定における実施例１または２の免疫抑制剤の用量と各種サイトカイン産生量との関係を示すグラフであり、（ａ）はＩＬ−２産生量、（ｂ）はＩＬ−４産生量、（ｃ）はＩＦＮ−γ産生量、（ｄ）はＩＬ−６産生量、（ｅ）はＩＬ−５産生量、（ｆ）はＩＬ−１０産生量、（ｇ）はＩＬ−１２ｐ４０産生量についての結果である。
【図２】図２は、試験例１−２のサイトカイン産生量測定における実施例１または２の免疫抑制剤の用量と各種サイトカイン産生量との関係を示すグラフであり、（ａ）はＩＬ−２産生量、（ｂ）はＩＬ−４産生量、（ｃ）はＩＦＮ−γ産生量、（ｄ）はＩＬ−６産生量、（ｅ）はＩＬ−５産生量、（ｆ）はＩＬ−１０産生量についての結果である。
【図３】図３は、試験例２の細胞のＶｉａｂｉｌｉｔｙ試験（ＭＴＴアッセイ）における実施例１または２の免疫抑制剤の用量と吸光度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の免疫抑制剤について、好ましい実施形態に基づき詳細に説明する。
【００１６】
本発明の免疫抑制剤は、上記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類を有効成分とするものである。該アルキルレゾルシノール類は、Ｔ細胞の活性化を抑制する作用を有する。
【００１７】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ1で表される飽和または不飽和のアルキル基は、その炭素原子数により制限されるものではないが、活性化Ｔ細胞に対する優れた活性抑制作用をより確実に奏させる観点からは、炭素原子数１３〜２７であることが好ましい。
【００１８】
炭素原子数１３〜２７の飽和アルキル基としては、代表例として、ｎ−トリデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−ノナデシル、ｎ−ヘンイコシル、ｎ−トリコシル、ｎ−ペンタコシル、ｎ−ヘプタコシルなどの直鎖状のものが挙げられ、これらのほかに、分岐状又は環状のものでもよい。これらの中でも、炭素原子数１５または１７の飽和アルキル基が好ましく、炭素原子数１５または１７の直鎖飽和アルキル基がさらに好ましい。
【００１９】
炭素原子数１３〜２７の不飽和アルキル基としては、上記の炭素原子数１３〜２７の飽和アルキル基に対応するものが挙げられる。不飽和アルキル基に含まれる不飽和結合の数および位置に特に制限はない。
【００２０】
また、活性化Ｔ細胞に対する活性抑制作用の観点から、上記一般式（Ｉ）におけるＲ2は水素原子であることが好ましく、また、Ｒ1はＲ2に対してパラ位に結合していることが好ましい。
【００２１】
本発明の免疫抑制剤において有効成分として用いられる上記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類の具体例としては、以下のものが挙げられる。
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−トリデシルベンゼン（Ｃ１３：０）
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ペンタデシルベンゼン（Ｃ１５：０）
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ヘプタデシルベンゼン（Ｃ１７：０）
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ノナデシルベンゼン（Ｃ１９：０）
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ヘンイコシルベンゼン（Ｃ２１：０）
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−トリコシルベンゼン（Ｃ２３：０）
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ペンタコシルベンゼン（Ｃ２５：０）
１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ヘプタコシルベンゼン（Ｃ２７：０）
【００２２】
上記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類としては、Ｒ1が炭素原子数１５または１７の飽和アルキル基であり、Ｒ2が水素原子であるものが特に好ましく、とりわけ、１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ペンタデシルベンゼン（Ｃ１５：０）、１，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ヘプタデシルベンゼン（Ｃ１７：０）が好ましい。
【００２３】
上記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類は、市販品として入手することができ、また、植物から常法により抽出したものを用いることもできる。アルキルレゾルシノール類を含有する植物としては、ウルシ科、イチョウ科、ヤマモガシ科、ヤブコウジ科、サクラソウ科、ニクズク科、アヤメ科、サトイモ科、キク科のヨモギ、マメ科、イネ科などが挙げられる。これらの植物の中でも、イネ科植物は、可食性有効成分としてのアルキルレゾルシノール類の研究が進んでおり、本発明の免疫抑制剤に用いる有効成分の給源に適している。イネ科植物の中でも、特に小麦、ライ麦は、上記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類の含量が全粒重量の０．０１５〜０．３質量％程度と高く、給源として好適である。
【００２４】
本発明の免疫抑制剤は、有効成分である上記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類、および必要に応じて薬学的に許容される種々の担体、賦形剤、安定化剤、その他の添加剤、その他の成分を含有するものである。本発明の免疫抑制剤は、常法により製剤化することができ、その場合、本発明の免疫抑制剤の剤型は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などの経口剤、または上記一般式（Ｉ）で表されるアルキルレゾルシノール類を、溶解補助剤と共に滅菌蒸留水または滅菌生理食塩水に溶解し、アンプル封入した注射用製剤などの非経口剤である。また、その他の成分としては、その他の薬効作用を有する成分、抗炎症薬、各種ビタミン類、生薬、ミネラル類を適宜配合することができる。
【００２５】
本発明の免疫抑制剤中の有効成分の含有量は、特に制限されるものではなく、免疫抑制剤の剤型、投与される者の症状や年齢性別などによって適宜変化させることができ、ヒトを対象とする場合、通常、本発明の免疫抑制剤の有効成分の投与量が成人１人１日当たり０．０１〜１０ｇとなるように含有させることが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例および試験例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例により限定されるものではない。
【００２７】
以下では、市販の２種類のアルキルレゾルシノール類を実施例１及び２の免疫抑制剤とし、鶏卵アルブミン（ＯＶＡ）の３２３−３３９残基を認識するＴ細胞受容体遺伝子のトランスジェニックマウスであるＤＯ１１．１０マウスの脾臓細胞、及び該脾臓細胞から単離したＴ細胞に免疫抑制剤を添加し、抗原刺激応答（サイトカイン産生、抗体産生）の測定（試験例１−１及び１−２）並びに細胞のＶｉａｂｉｌｉｔｙ試験（ＭＴＴアッセイ；試験例２）を行った。なお、試験例１−１では、脾臓細胞を特異抗原であるＯＶＡで刺激して試験を行い、試験例１−２では、脾臓細胞から単離したＴ細胞のＴ細胞レセプターを抗マウスＣＤ３εモノクローナル抗体で直接刺激して試験を行った。
【００２８】
＜被験マウス＞
ＳＰＦ飼育した３０週齢のメスのＤＯ１１．１０マウス（ジャクソンラボラトリーからライセンス購入したものをＳＰＦ飼育施設で繁殖）
＜試験サンプル＞
（１）免疫抑制剤
実施例１；  １，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ペンタデシルベンゼン（Ｃ１５：０）
実施例２；  １，３−ジヒドロキシ−５−ｎ−ヘプタデシルベンゼン（Ｃ１７：０）
以上の化合物は、いずれもＲｅｓｅａＣｈｅｍ  ＧｍｂＨ社より購入した（純度＞９５％ＨＰＬＣ）。
（２）オボアルブミン（ＯＶＡ）；生化学工業、フラクションＶ
（３）抗マウスＣＤ３ε  アルメニアハムスターモノクローナル抗体；クローン１４５−２ｃ１１（ＢＤ  Ｐｈｅｒｍｉｎｇｅｎ、ファンクショナルグレード）
【００２９】
なお、以下の試験においては、複数匹のマウスから採取した脾臓細胞を混合した後、最初に３群に分けて試験を行い、試験結果はその平均値をとった。
【００３０】
〔試験例１−１〕サイトカイン産生量の測定１
ＤＯ１１．１０マウス２頭分の混合脾臓細胞３×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを被験対象とした。９６ウェルプレートにて、ＯＶＡ（７．５μＭ）と免疫抑制剤（０／２．５／５／１０μＭ）を含むＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）培地で５％ＣＯ2、３７℃、ｔｏｔａｌ  ３００μＬ／ｗｅｌｌで刺激、培養した。培養開始後４８時間目にサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５の実験区の細胞培養上清を、７２時間目にサイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−γの実験区の細胞培養上清を回収した。
回収した細胞培養液上清中のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−γ）の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。各サイトカインの測定にはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の分析キット「抗マウスサイトカインｒｅａｄｙ−ｓｅｔ−ｇｏ！」を使用した。測定はｄｕｐｌｉｃａｔｅで実施した。測定結果を図１に示す。
【００３１】
〔試験例１−２〕サイトカイン産生量の測定２
試験前日に抗マウスＣＤ３εモノクローナル抗体（クローン１４５−２ｃ１１、ＩｇＧ濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）を０．５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈し、５０μＬずつｗｅｌｌに入れてプレートを４℃で一晩コートした。プレートは試験当日にＰＢＳで３回洗浄した。
ＤＯ１１．１０マウス２頭分の混合脾臓細胞を材料に、抗マウスＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ．Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて脾臓由来ＣＤ４+Ｔ細胞の分離を実施した。分離した細胞１×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを被験対象とした９６ウェルプレートにて、免疫抑制剤（０／１０μＭ）を含むＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）培地で５％ＣＯ2、３７℃、ｔｏｔａｌ  ３００μＬ／ｗｅｌｌで刺激、培養した。培養開始後４８時間目にサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５の実験区の細胞培養上清を、７２時間目にサイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γの実験区の細胞培養上清を回収した。
回収した細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ）の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。各サイトカインの測定にはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の分析キット「抗マウスサイトカインｒｅａｄｙ−ｓｅｔ−ｇｏ！」を使用した。測定はｄｕｐｌｉｃａｔｅで実施した。測定結果を図２に示す。
【００３２】
〔試験例２〕細胞のＶｉａｂｉｌｉｔｙ試験（ＭＴＴアッセイ）
ＤＯ１１．１０マウス２頭分の混合脾臓細胞１×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌを被験対象とした。９６ウェルプレートにて免疫抑制剤（０／２．５／５／１０μＭ）を含むＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）培地で５％ＣＯ2、３７℃、ｔｏｔａｌ  ３００μＬ／ｗｅｌｌで培養した。培養開始から３日後、１０μＬ／ｗｅｌｌのＭＴＴ試薬（ＷＳＴ−１、タカラバイオ）を添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定はｄｕｐｌｉｃａｔｅで実施した。測定結果を図３に示す。
【００３３】
〔試験結果〕
図１は、ＤＯ１１．１０マウス由来脾臓細胞を用いた抗原特異的免疫応答抑制の結果を示している。図２は、ＤＯ１１．１０マウス由来脾臓細胞からＣＤ４+Ｔ細胞を分離した後、得られたＴ細胞を用いたＴ細胞特異的免疫応答抑制の結果を示している。図３は、ＤＯ１１．１０マウス由来脾臓細胞に対する免疫抑制剤の細胞毒性の結果を示している。
【００３４】
図１からは、特異的抗原であるＯＶＡで抗原刺激したＤＯ１１．１０マウスの脾臓細胞を、本発明の免疫抑制剤を添加した培地で培養した結果、免疫抑制剤未添加の場合に比べ、 活性化ＣＤ４+Ｔ細胞中の１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）が産生するＩＬ−２（図１（ａ））やＩＦＮ−γ（図１（ｃ））、活性化ＣＤ４+Ｔ細胞中の２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）が産生するＩＬ−４（図１（ｂ））、ＩＬ−５（図１（ｅ））、ＩＬ−６（図１（ｄ））、ＩＬ−１０（図１（ｆ））の産生量が、免疫抑制剤の用量依存的に大幅に抑制され、活性化Ｔｈ１及びＴｈ２細胞の免疫活性を抑制していることが示された。同時にＴｈ１への細胞分化を誘導するＩＬ−１２ｐ４０（図１（ｇ））の産生量も、免疫抑制剤の用量依存的に大幅に抑制された。
【００３５】
図２から明らかなように、試験例１−２においても、試験例１−１と同様に、免疫抑制剤の添加によって各種サイトカインの産生量が大幅に抑制された。このことから、試験例１−１の結果が、脾臓細胞中の活性化ＣＤ４+Ｔ細胞に起因しており、本発明の免疫抑制剤が活性化ＣＤ４+Ｔ細胞の活性を直接的に抑制することが示された。
【００３６】
また、試験例２においては、図３から明らかな通り、本発明の免疫抑制剤を添加した場合、その用量に関わらず、免疫抑制剤無添加の場合と吸光度は大きく変わらなかった。即ち、試験例２においては、免疫抑制剤の添加による脾臓細胞の細胞死の増大が検出できなかった。このことから、本発明の免疫抑制剤は、本試験の用量の範囲では細胞毒性を示さず安全であることが判った。
【図１】
2013091612.tif 000005
【図２】
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【図３】
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