(57)【要約】【課題】本発明は、支持体にダメージを与えることなく親水性層を回収可能な基材を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、支持体；前記支持体の表面上に静電相互作用により結合している、ポリシロキサンを含むプライマー層；及び前記プライマー層上に結合している、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を有する親水性化合物を含む親水性層；を備える、表面親水性基材に関する。【選択図】図２
2013186070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体；
前記支持体の表面上に静電相互作用により結合している、ポリシロキサンを含むプライマー層；及び
前記プライマー層上に結合している、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を有する親水性化合物を含む親水性層；
を備える、表面親水性基材。
【請求項２】
前記親水性化合物が前記エチレングリコール鎖に連結している反応性官能基を有する、請求項１に記載の表面親水性基材。
【請求項３】
前記反応性官能基が、（１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、及びエポキシ基からなる群から選ばれる少なくとも一種である、請求項２に記載の表面親水性基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的分析や細胞培養などに用いるための親水性層を有する基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、親水性層を有する基材は、タンパク質の吸着や細胞の接着を抑制するため、生化学的分析や浮遊系細胞培養に有用である。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する基材が上記目的に適している。また、ＰＥＧ鎖を介して抗体や抗原を固定化した基材は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫アッセイで感度の高い測定が期待できる。
【０００３】
特許文献１には、ガラスと、ポリシロキサンを含むプライマー層と、ＰＥＧ鎖を含む親水性層とからなる基材が開示されている。ガラス表面とプライマー層、および、プライマー層とＰＥＧ鎖は共有結合を介して連結されている。
特許文献２および３にも同様の基材が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１４３７１５号公報
【特許文献２】特開２００６−５０９２０１号公報
【特許文献３】特開２００７−３１２７３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来のＰＥＧ鎖を有する基材は、プライマー層が支持体と共有結合を介して強固に連結されているため、支持体にダメージを与えることなく親水性層を回収することが困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、支持体と、前記支持体の表面上に配置されたプライマー層と、前記プライマー層上に配置された親水性層とを含む基材において、支持体とプライマー層の結合が静電相互作用である場合に親水性層を容易に回収できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）支持体；
前記支持体の表面上に静電相互作用により結合している、ポリシロキサンを含むプライマー層；及び
前記プライマー層上に結合している、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を有する親水性化合物を含む親水性層；
を備える、表面親水性基材。
（２）前記親水性化合物が前記エチレングリコール鎖に連結している反応性官能基を有する、（１）に記載の表面親水性基材。
（３）前記反応性官能基が、（１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、及びエポキシ基からなる群から選ばれる少なくとも一種である、（２）に記載の表面親水性基材。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、支持体にダメージを与えることなく親水性層を回収することができる。親水性層に被固定化物質が固定化されている場合は、被固定化物質も同時に回収することができる。また、親水性層を回収した後の支持体は再利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されていないＰＥＧ鎖を有する基材である。
【図２】被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されているＰＥＧ鎖を有する基材である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（支持体）
本発明における支持体の材料は、生化学的分析や細胞培養の支持体として利用可能なものであれば特に限定されない。具体的には、プラスチック、ガラス、石英、シリコン、金属等が挙げられる。プラスチックは成型が容易であること、輸送及び廃棄上の問題が小さいことから上記用途に特に好ましい。すなわち本発明において好ましい支持体は、その全部又は少なくとも一部にプラスチックを含む。支持体の、後述する親水性層が形成される側の表面がプラスチックを含むことが好ましく、該表面がプラスチックからなることがより好ましい。その具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。
【００１０】
本発明における支持体の形態は、上記用途に利用可能であれば特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、シャーレ、フラスコ、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は有用である。
【００１１】
本発明における支持体の表面には後述するプライマー層と静電相互作用可能な極性基が存在する。ここで、「静電相互作用」とは分子間に働く静電気的な引力を意味し、イオン結合の他に水素結合も含まれる。このような極性基として、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、イソシアネート基、スルホニル基などが挙げられるが、特にヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基が好ましい。これらの極性基は公知の方法、例えばプラズマ照射、コロナ放電、ガンマ線照射、紫外線照射などによってプラスチック表面に容易に導入することができる。これらの処理が施されたポリスチレン製マイクロウェルプレートは市販品として入手可能である。
【００１２】
（プライマー層）
プラスチックを含む支持体の表面にはプライマー層が静電相互作用により配置されている。この静電相互作用は支持体表面の極性基と、プライマー層に含まれる極性基との間に働く、共有結合よりも弱い引力である。プライマー層に含まれる極性基としては、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、イソシアネート基、スルホニル基、ニトリル基などが挙げられるが、特にヒドロキシル基とアミノ基が好ましい。この静電相互作用は高濃度の塩（例えば、塩化ナトリウム）存在下で実質的に消失する。このとき、プライマー層は後述する親水性層とともに支持体表面から脱離する。
【００１３】
プライマー層は、支持体表面の極性基と静電相互作用可能な極性基を有するポリシロキサンを少なくとも含む。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーである。ポリシロキサンはプライマー層の骨格を成し、プライマー層の機械的強度を高めている。ポリシロキサンは直鎖状、分岐鎖状、網目状の構造をとり得るが、特に分岐鎖状又は網目状の構造が好ましい。ポリシロキサンを含むプライマー層は、支持体表面と親水性層とを連結することに加えて、薬品や熱に弱いプラスチック支持体を保護する役割も果たすことができる。
【００１４】
プライマー層は後述する親水性層に含まれるエチレングリコール鎖と共有結合可能な官能基を更に含む。そのような官能基として、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、イソシアネート基、スルホニル基などが挙げられるが、特にアミノ基、エポキシ基、アルデヒド基が好ましい。
【００１５】
（プライマー層の形成方法）
プライマー層は、例えば以下のように形成することができる。まず、純水にアミノシランを添加し、０．１〜１０％（ｖ／ｖ）のアミノシラノール溶液を調製する。アミノシランの具体例としては、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシランが挙げられるが、これらに限定されない。次に、このアミノシラノール溶液をあらかじめ極性基を導入した支持体表面に接触させ、１〜６０分間放置する。アミノシラノールは分子内にヒドロキシル基とアミノ基を含むため、上記の極性基を導入した支持体表面に静電相互作用により結合する。最後に、支持体を純水で洗浄し、加熱又は乾燥する。これにより、アミノシラノール間で縮合反応が起き、ポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。この場合、ポリシロキサンの側鎖にはアミノ基が存在することになる。
【００１６】
（親水性層）
プライマー層のポリシロキサン側鎖には、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖が共有結合を介して連結されている。「１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖」とは次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す１以上の整数である）
で表される構造を指す。以下、本明細書中ではこれを「ＰＥＧ鎖」と呼ぶことがある。本発明における親水性層は少なくともＰＥＧ鎖を含むが、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００１７】
ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、浮遊系細胞培養に用いる場合は４４以上であることが好ましく、ＥＬＩＳＡに用いる場合は１７６以上であることが好ましい。ＰＥＧ鎖の数平均分子量に上限はないが、数平均分子量が大きくなるほど粘度が増すため取扱いが難しいこと、及び、ＰＥＧ鎖の高密度での配置が難しいことから、２５０００以下であることが好ましく、１００００以下であることがより好ましい。ここで、ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、原料として用いられるＰＥＧ又は担体から解離させたＰＥＧ：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−Ｈ
（ｍは重合度を示す正の整数である）
の数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＰＥＧ数平均分子量は蒸気圧浸透圧法または膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
【００１８】
ＰＥＧ鎖の自由末端には、反応性官能基、具体的には後述の被固定化物質と共有結合可能な、少なくとも１つの官能基が直接的又は間接的に連結されていてもよい。このような官能基としては、例えば(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＰＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＰＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。被固定化物質への反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基が好ましい。これらの官能基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。
【００１９】
（親水性層の形成方法）
親水性層は、例えば以下のように形成することができる。まず、上記の方法で形成したプライマー層のポリシロキサン側鎖に存在する官能基と共有結合を形成可能な官能基を含むＰＥＧ誘導体を準備する。例えば、プライマー層のポリシロキサン側鎖に存在する官能基がアミノ基の場合は、アミノ基と反応して共有結合を形成可能な官能基を含むＰＥＧ誘導体を準備する。そのような官能基としては、例えば (１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
被固定化物質を固定化しない用途では、上記官能基をＰＥＧ鎖の片末端のみに直接的又は間接的に導入し、別の末端は被固定化物質との反応性をもたない不活性な基とする。不活性な基としては、例えばヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基などが挙げられるが、特にヒドロキシル基とメトキシ基が好ましい。すなわち、次式：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｙ
（Ｘはヒドロキシル基又はメトキシ基を表し、Ｙはアミノ基と反応して共有結合を形成可能な官能基を表す）
で表されるＰＥＧ誘導体を準備する。
【００２１】
被固定化物質を固定化する用途では、上記官能基と、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基とを、ＰＥＧ鎖の両末端にそれぞれ導入する。これらの官能基は異なっていてもよいが、同じである方が製造上都合がよい。すなわち、次式：
Ｙ−ＰＥＧ−Ｚ
（Ｙはアミノ基と反応して共有結合を形成可能な官能基を表し、Ｚは被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基を表す。ＹとＺは同じであってもよい）
で表されるＰＥＧ誘導体を準備する。
【００２２】
上記ＰＥＧ誘導体を原液のまま、あるいはアルコールなどの溶媒に溶解した状態でプライマー層と接触させる。時間は１分〜２４時間、温度は室温〜８０℃の範囲で適宜選択される。これによりＰＥＧ鎖がプライマー層のポリシロキサン側鎖に共有結合を介して連結される。最後に、支持体を純水で洗浄し、加熱又は乾燥する。
【００２３】
（被固定化物質）
本発明を免疫アッセイ用固相担体として用いる場合には、目的とする免疫アッセイの態様に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。「標的物質と結合する抗原又は抗体」が被固定化物質である実施形態（後述するサンドイッチ法又は直接競合法）において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。「標的物質」が被固定化物質である実施形態（後述する間接競合法）では、標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。
【００２４】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００２５】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。
【００２６】
被固定化物質は、ＰＥＧ鎖が有する官能基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、ＰＥＧ鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００２７】
（被固定化物質の固定化）
本発明における基材への被固定化物質の固定化は、例えば以下のように行われる。まず、被固定化物質を緩衝液に溶解する。ここで、被固定化物質との競合反応を避けるため、アミノ基成分を含まない緩衝液を用いることが好ましい。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液の種類、緩衝液のｐＨ及び被固定化物質の終濃度は、被固定化物質の種類に応じて適宜選択される。多くの場合、緩衝液のｐＨは４．０〜１０．０、被固定化物質の終濃度は１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で最適化すればよい。この被固定化物質溶解液を基材と所定時間接触させる。接触時間と温度も被固定化物質の種類に応じて適宜選択される。多くの場合、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化すればよい。適切な条件下であれば、被固定化物質に含まれるアミノ基等の官能基がＰＥＧ鎖に連結された官能基と反応し、アミド結合やウレタン結合等の共有結合が形成される。その結果、被固定化物質はＰＥＧ鎖を介して基材表面に固定化される。
【００２８】
ＰＥＧ鎖に連結された官能基と被固定化物質が有する官能基との組合せによっては固定化反応が十分進行しないことがある。そのような場合は、被固定化物質を乾燥濃縮するとよい。これによって被固定化物質の反応系中での濃度が高まるため、被固定化物質の固定化反応が著しく促進される。被固定化物質が少量しか準備できない場合は溶液中の被固定化物質の濃度を高めることは困難であるが、このような場合でも、比較的低濃度の被固定化物質溶解液を基材に接触させ、次いで乾燥濃縮することにより、被固定化物質の反応系中での濃度を高めることができ、固定化反応を促進することができる。この場合も、緩衝液の種類、緩衝液のｐＨ、被固定化物質の終濃度、接触時間、温度などを、被固定化物質の種類に応じて最適化することが望ましい。
【００２９】
被固定化物質が抗原、抗体等のタンパク質である場合は、乾燥によってタンパク質が変性することがある。乾燥に伴うタンパク質の変性を防ぐためには、被固定化物質溶解液にトレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の糖類を添加することが好ましい。糖類のなかでもトレハロースは、適度な保湿性を有していること、溶液の乾燥濃縮が容易であること、並びに、乾燥濃縮時に粗大な結晶が形成されにくく均質な乾燥濃縮が可能であることから好ましい。糖類の終濃度は１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で最適化すると良い。
【００３０】
被固定化物質溶解液を基材の広範囲に渡って接触させたい場合は、被固定化物質溶解液にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。非イオン性界面活性剤の使用により、被固定化物質溶解液が基材表面に薄く濡れ広がるため、被固定化物質の使用量を節約できるだけでなく、乾燥濃縮に要する時間を短縮することができる。被固定化物質溶解液中の非イオン性界面活性剤の終濃度は０．０１〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲で最適化するとよい。
【００３１】
所望の被固定化物質をＰＥＧ鎖に結合させた後は、ＰＥＧ鎖に連結された未反応の官能基を、アミノ基を有する低分子化合物と反応させることにより、当該官能基を反応性のより低い官能基に変換してもよい。この操作により、免疫アッセイに関与する物質が不本意に基材表面に結合するのを防ぐことができる。この操作は、当該官能基の反応性が高い場合に特に必要性が高い。ただし、官能基を前記低分子化合物と反応させた後の基材表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の例としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。これらの低分子化合物を水溶液として調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、所望の被固定化物質を固定化した基材と接触させる。低分子化合物の濃度は１〜１０００ｍＭ、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化するとよい。
【００３２】
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
[実施例１]
図１は被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されていないＰＥＧ鎖を有する基材である。ポリスチレンからなる支持体表面にポリシロキサンを含むプライマー層が静電相互作用により結合している。プライマー層の側鎖にはＰＥＧ鎖の片末端が共有結合を介して連結されている。ＰＥＧ鎖の自由末端にはヒドロキシル基（Ａ）またはメトキシ基（Ｂ）が連結されている。
【００３３】
これらの基材は次のような手順で作製した。まず、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（信越化学工業）を純水に溶解し、０．１％アミノシラノール水溶液を調製した。これを、あらかじめプラズマ処理された９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）に分注し、室温で５分間放置した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した。次に、末端に(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、別の末端にヒドロキシル基（Ａ）またはメトキシ基（Ｂ）を有するＰＥＧ誘導体（数平均分子量４００）を上記プレートに分注し、８０℃で３０分間加熱した。最後に、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した。
【００３４】
これらの基材は１Ｍ以上の高濃度の塩化ナトリウム存在下で容易に脱離したが、それを大きく下回る濃度では安定であった。
【００３５】
[実施例２]
実施例１のプレートが従来よりもタンパク質の吸着を抑制することを次のような手順で確かめた。まず、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、実施例１のプレート（Ａ、Ｂ）と、あらかじめプラズマ処理された９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）に分注した。室温で１０分間放置した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した。次に、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１０分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、実施例１のプレートは従来のプレート（比較例）よりもＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体の吸着を著しく抑制した（表１）。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
[実施例３]
図２は被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されているＰＥＧ鎖を有する基材である。ポリスチレンからなる支持体表面にポリシロキサンを含むプライマー層が静電相互作用により結合している。プライマー層にはＰＥＧ鎖の片末端が共有結合を介して連結されている。ＰＥＧ鎖の自由末端には(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基（Ｃ）、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基（Ｄ）、またはエポキシ基（Ｅ）が連結されている。
【００３８】
これらの基材は次のような手順で作製された。まず、３−アミノプロピルトリメトキシシランまたは３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシランを純水に溶解し、０．１％アミノシラノール水溶液を調製した。これを、あらかじめプラズマ処理された９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）に分注し、室温で５分間放置した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した。次に、両端に(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基（Ｃ）、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基（Ｄ）、またはエポキシ基（Ｅ）を有するＰＥＧ誘導体（数平均分子量４００）を合成し、上記プレートに分注した。これを８０℃で３０分間加熱した後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した。
【００３９】
これらの基材は１Ｍ以上の高濃度の塩化ナトリウム存在下で容易に脱離したが、それを大きく下回る濃度では安定であった。
【００４０】
[実施例４]
実施例３のプレートがＥＬＩＳＡで従来よりも高い感度を示すことを次のような手順で確かめた。まず、卵白リゾチーム（和光純薬）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、市販のＥＬＩＳＡ用プレートと、実施例３のプレート（Ｃ、Ｄ、Ｅ）に分注した（固相化）。市販品は１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングし、実施例３のプレートは２−(２−アミノエトキシ)エタノールで残存活性基を失活させた。その後、０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分注し、室温で６０分間放置した。次に、ＨＲＰ標識２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を分注し、室温で３０分間放置した。その後、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、実施例３のプレートは従来よりも高感度な測定が可能であった（表２）。
【００４１】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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