(57)【要約】【課題】優れた上皮型ナトリウムチャネル発現抑制効果を有する上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤を提供する。【解決手段】下記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤。2013091615.tif 000009【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤。
【化１】
2013091615.tif 000006
【請求項２】
前記式（１）で表される化合物の配糖体がフロリジンである、請求項１記載の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤。
【請求項３】
下記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、腎ナトリウム再吸収抑制剤。
【化２】
2013091615.tif 000007
【請求項４】
前記式（１）で表される化合物の配糖体がフロリジンである、請求項３記載の腎ナトリウム再吸収抑制剤。
【請求項５】
下記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、腎機能改善剤。
【化３】
2013091615.tif 000008
【請求項６】
前記式（１）で表される化合物の配糖体がフロリジンである、請求項５記載の腎機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腎皮質集合管（腎遠位尿細管）は、結合尿細管と、皮質・髄質外層・髄質内層集合管とで構成されている。このうち、尿細管腔膜には、α、β、γ、δの各サブユニットからなる上皮型ナトリウムチャネル（epithelial  Na+  channel、以下、本明細書において「ENaC」ともいう）が発現している。ENaCの腎臓での生理機能として、腎皮質集合管においてナトリウムを再吸収することにより体内ナトリウム量を緻密に制御することが知られており、体液量、血漿浸透圧、血圧等の調節に非常に重要な役割を有するものである。特に、ENaCは腎皮質集合管細胞内へのナトリウム流入過程を担うものである。
【０００３】
一方、鉱質コルチコイドの１種で、副腎皮質球状層で合成・分泌されるアルドステロンは、血液中のナトリウムイオン及びカリウムイオンのバランスを制御する機能を有する。具体的には、アルドステロンは体液喪失により賦活化され、ENaC数を著明に増大させてナトリウムポンプを活性化することにより、ENaCを介して尿細管細胞に取り込まれたナトリウムイオンを基底膜側のナトリウムポンプで汲み出し、腎皮質集合管細胞へのナトリウムの再吸収を亢進し、尿中へのナトリウムの排泄を減少させる。また、ナトリウムの腎皮質集合管細胞内への流入は、尿細管腔側を電気的に陰性へ傾け、カリウムチャンネルを介したカリウムの分泌を促進する。したがって、ENaCの発現が過度に亢進し、腎ナトリウムの再吸収が促進されると、腎機能が悪化する場合がある（例えば、非特許文献１〜２参照）。
ENaCの過剰な発現（機能亢進型変異）による疾患としては、腎機能悪化に加えて、過活動膀胱炎、うっ血性心不全、胃粘膜炎症、副鼻腔炎、眼乾燥症（ドライアイ）、遠位腸閉塞、口腔乾燥症、乾皮症、便秘症、喘息（咳）、慢性気管支炎、中耳炎、嚢胞性線維症、食道炎等が知られている（例えば、特許文献１〜３参照）。
したがって、ENaCを介して発症する上記症状の予防・改善に、効果的なENaC発現抑制剤が望まれている。
【０００４】
一方、フロレチンはリンゴやナシなどに含まれるグリコシルフラボノイドのアグリコンの１種であり、その配糖体としては、フロリジン等が知られている。フロレチンの生理作用としては、活性酸素消去酵素であるＳＯＤ（Superoxide  dismutase）の発現促進効果（例えば、特許文献４参照）、ブラシニンによる血圧低下作用の増強効果（例えば、特許文献５参照）、ブラシニンによる糖負荷後の血糖上昇抑制作用の増強効果（例えば、特許文献６参照）、ブラシニンとの併用においてストレスによる血糖値上昇を抑制する効果（例えば、特許文献７参照）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１０−５２６１１８号公報
【特許文献２】特表２００９−５２０７２９号公報
【特許文献３】特表２００５−５３０６９２号公報
【特許文献４】特開２００７−３２６７９９号公報
【特許文献５】特開２００８−７４７４４号公報
【特許文献６】特開２００８−７４７４５号公報
【特許文献７】特開２００８−７４７４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】F．R．Perez  et  al.，Hypertension，vol．53，p．1000-1007，2009
【非特許文献２】T．Nakayama  et  al.，Am．J．Physiol．Renal．Physiol.，vol．296，p．F317-F327，2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れたENaC発現抑制効果を有するENaC発現抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、フロレチン（3-(4-ヒドロキシフェニル)-1-(2,4,6-トリヒドロキシフェニル)-1-プロパノン）が、優れたENaC発現抑制作用を奏し、腎臓へのナトリウムの再吸収を抑制し、腎機能の改善に有用であることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至った。
【０００９】
本発明は、下記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤に関する。
【００１０】
【化１】
2013091615.tif 000002
【００１１】
また、本発明は、前記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、腎ナトリウム再吸収抑制剤に関する。
さらに、本発明は、前記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする、腎機能改善剤に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、優れたENaC発現抑制効果を有するENaC発現抑制剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤は、下記式（１）で表される化合物（本明細書において、「フロレチン」ともいう。）及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分として含有する。
【００１４】
【化２】
2013091615.tif 000003
【００１５】
前述の通り、フロレチンは、ＳＯＤの発現促進効果、ブラシニンによる血圧低下作用の増強効果、ブラシニンによる糖負荷後の血糖上昇抑制作用の増強効果、ブラシニンとの併用においてストレスによる血糖値上昇を抑制する効果等を有することが知られている。しかし、これまでに、フロレチンがENaC発現抑制効果を有することは全く知られておらず、フロレチンを有効成分とすることで、ENaC発現抑制剤を提供できることを本発明者らが見出した。さらに、ENaCを介して尿細管細胞に取り込まれたナトリウムイオンを基底膜側のナトリウムポンプで汲み出し、腎皮質集合管細胞へのナトリウムの再吸収が行われる。したがって、フロレチンを有効成分とすることで、腎ナトリウム再吸収抑制剤の提供が可能となる。さらに、ENaCの発現が過度に亢進し、腎ナトリウムの再吸収が促進されると、腎機能が悪化する場合がある。したがって、フロレチンを有効成分とすることで、腎機能改善剤の提供が可能となる。
【００１６】
本発明において、前記式（１）で表される化合物の配糖体とは、前記式（１）で表される化合物（アグリコン）と、グルコース、ラムノース、ガラクトースなどの糖とが結合した化合物である。
本発明において、前記式（１）で表される化合物の配糖体としては、下記式（２）で表されるフロリジン（1-［2-（β-D-グルコピラノシル）-4,6-ジヒドロキシフェニル］-3-（4-ヒドロキシフェニル）-1-プロパノン）であることが好ましい。
【００１７】
【化３】
2013091615.tif 000004
【００１８】
フロリジン等のフロレチンの配糖体を投与すると、配糖体の大部分はアグリコン（配糖体の非糖成分）であるフロレチンと、グルコースなどの糖に加水分解される（例えば、特開平６−３０５９７１号公報等参照）。
後述の実施例で示すように、フロレチンはENaC発現抑制効果を有する。従って、体内で代謝されてフロレチンに変換される、フロリジン等のフロレチンの配糖体も、ENaC発現抑制効果を有する。
【００１９】
本発明に用いる、前記式（１）で表される化合物及びその配糖体は、広く一般に入手できる。例えば、通常の合成方法により化学的に合成してもよいし、天然物やカルスから抽出してもよい。また、本発明では市販のものを用いてもよい。
前記式（１）で表される化合物及びその配糖体は、Sato  S.，et  al.，Carbohydrate  Research，vol．341(8)，p．964-970，2006等を参考に合成することができる。
前記式（１）で表される化合物若しくはその配糖体を天然物やカルスから抽出する場合には、リンゴ、ナシ、セイヨウミザクラ、スミミザクラから抽出することが好ましい。具体的には、バラ（Rosaceae）科リンゴ（Malus）属のリンゴ（Malus pumila）の果実、樹皮及び／又は根皮、バラ科ナシ（Pyrus）属のナシ（Pyrus communis）の果実、樹皮及び／又は根皮、バラ科サクラ（Prunus）属のセイヨウミザクラ（Prunus avium）の果実、樹皮及び／又は根皮、バラ科サクラ属のスミミザクラ（Prunus cerasus）の果実、樹皮及び／又は根皮等から抽出することができる（例えば、Ki  Won  Lee，et  al.，J．Agric．Food  Chem.，vol．51，p．6516-6520，2003等参照）。
【００２０】
上記植物から本発明に用いる化合物を抽出する抽出条件としては特に制限はなく、室温（例えば、４〜５０℃）又は加温（室温〜溶媒沸点）下にて抽出する、ソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出する、等の通常の方法により抽出することができる。得られる化合物の形態に特に制限はなく、各種溶剤抽出液、及びその希釈液、濃縮液、ペースト並びに乾燥末等の何れの形態でもよい。
【００２１】
本発明に用いる化合物を植物より抽出するために用いられる抽出溶剤としては特に制限はなく、極性溶剤、非極性溶剤のいずれも使用することができる。抽出溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状又は環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤が挙げられる。これらの抽出溶剤は単独で用いてもよいし、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００２２】
植物抽出物から本発明に用いる化合物を精製するため、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等の分離技術を用いてもよい。
【００２３】
本発明によれば、ENaCの発現抑制及び／又は腎ナトリウムの再吸収抑制が治療に有効な組織障害又は病態が予防又は改善される。ENaCの過剰発現や腎ナトリウムの再吸収亢進により障害を受ける組織は、生体内の任意の組織であり得、例えば、眼、耳、皮膚、上皮、血液、リンパ、食道、消化管、胃、血管、皮膚、心臓、腎臓、膀胱、小腸、大腸等が挙げられる。組織障害及び病態の例としては、過活動膀胱炎、うっ血性心不全、胃粘膜炎症、副鼻腔炎、眼乾燥症（ドライアイ）、遠位腸閉塞、口腔乾燥症、乾皮症、便秘症、喘息（咳）、慢性気管支炎、中耳炎、嚢胞性線維症、食道炎等が挙げられる（例えば、生体の科学、56巻5号（2005.10）、p．446-447；The  Autonomic  nervous  system，43(4)，p．309-314；特開２０１０−５９２１０号公報；特表２０１０−５０２７３８号公報；国際公開第２００３／０７０１８４号；特表２００９−５２０７００号公報；特開２００６−２３２６８４号公報；等参照）。
【００２４】
本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤には、前記式（１）で表される化合物及びその配糖体のうちのいずれか１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００２５】
本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤は、医薬品としてヒト又は動物に投与できる。医薬品として使用する場合は、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。また、本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤は、各種の医薬品や、飲食品、ペットフード等に有効成分として配合することができる。なお、前記飲食品は、一般飲食品の他、ENaCの過剰な発現により発症し、ENaCの発現抑制が治療に有効な症状の予防若しくは改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品又は特定保健用食品等の機能性飲食品の形態とすることができる。
なお、経口用固形製剤を調製する場合は、前記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物と、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤等とを混合した後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、前記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物と、矯味剤、緩衝剤、安定化剤等とを混合した後、常法により内服液剤、シロップ剤等を製造することができる。
【００２６】
本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤中の前記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物の配合量は、その使用形態により異なるが、医薬品、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の場合は、0.0001〜40質量％が好ましく、0.001〜10質量％がより好ましく、0.01〜4質量％がさらに好ましい。飲食品やペットフード等に配合する場合は、0.00002〜20質量％が好ましく、0.0001〜5質量％がより好ましく、0.001〜１質量％がさらに好ましい。
【００２７】
本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤の投与又は摂取量は、個体の状態、体重、性別、年齢、又はその他の要因に従って変動し得る。成人（体重６０kg）の１日当りの投与又は摂取量は、0.01ｍｇ〜5ｇが好ましく、0.1ｍｇ〜2ｇがより好ましく、1ｍｇ〜1ｇがさらに好ましい。本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤は、１日に３回、１日に２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、又は任意の期間及び間隔で投与又は摂取され得る。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
（１）  フロレチンの調製
フロレチンをシグマアルドリッチ（商品番号：P7912）より入手し、濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、サンプルを調製した。
【００３０】
（２）  ENaC発現の抑制
培養液として、増殖因子添加培地（D-MEM/Ham’s  F-12(1:1、インビトロジェン社製)に10%ウシ胎児血清(FBS、インビトロジェン社製)及び１％ペニシリンストレプトマイシン溶液(インビトロジェン社製)を添加したもの）を用いた。マウス腎皮質集合管細胞（商品名：M-1、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を細胞数が１×１０4cells/wellとなるように24well細胞培養用マルチウェルプレート（平底、ファルコン社製）に播き、前記培養液で３日間培養した。その後、FBSを添加していないD-MEM/Ham’s  F-12(FBS(-))で１日培養し、培地交換を行った。
【００３１】
前記のように培養し、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）を介した経路でシグナル伝達が行われるという報告がされているM-1細胞に、ＧＲに作用し、ミネラロコルチコイドレセプター（ＭＲ）に作用するアルドステロンと同様にENaC発現促進作用を有するデキサメタゾン（５０ｎＭ）、及びフロレチンのＤＭＳＯ溶液を濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、２４時間培養した。また、コントロールとして、ＤＭＳＯを添加した以外は同様に試験を行った。
【００３２】
培養細胞を回収し、RNeasy（登録商標）mini  kit(キアゲン社)を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。さらに、得られたＲＮＡを鋳型として用い、Omniscript（登録商標）Reverse  Transcriptase（インビトロジェン社製）（RNase-free  water  １．６μＬ、５×First  strant  bffer  ４μＬ、０．１Ｍ  dTT  ２μＬ、１０ｍＭ  sNTP  Mix  １μＬ、0.5μｇ／μＬ  oligo(dT)  ０．４μＬ、２００unit／μＬ  M-MLVRT  １μＬ）を混合して逆転写反応を行い、ｃＤＮＡサンプルを合成した。合成したｃＤＮＡサンプルを鋳型とし、ENaCのαサブユニット（αENaC）の遺伝子発現量をTaqMan  Fast  Universal  PCR  Master  Mix（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解析した（試薬：TaqMan  Fast  Universal  PCR  Master  Mix、装置：ABIPRISM7500Sequence  Detector（商品名、アプライドバイオシステムズ社製））を用いた。αＥＮａＣ遺伝子の発現量は、内部標準として36B4（ハウスキーピング遺伝子）を用いて補正し、36B4の発現量に対する相対値とした。また、ＰＣＲプライマー及びTaqManプローブとして、TaqMan（登録商標）gene  expression  assays（商品番号：Mm00803386_m1（αENaC）、Mｍ99999223_gH（36B4））を用いた。得られた解析結果は、平均値±標準偏差を用いて示し、dunnettによりコントロール群に対する有意差検定を行った。
結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2013091615.tif 000005
【００３４】
表１の結果から明らかなように、αENaC遺伝子の発現量は、式（１）で表される化合物により有意に抑制される。
【００３５】
上記実施例から明らかなように、式（１）で表される化合物は、αENaC遺伝子の発現抑制作用を奏し、ENaCの発現を抑制する。したがって、一般式（１）で表される化合物を有効成分とするENaC発現抑制剤は、優れたENaC発現抑制効果を有する。さらには、ENaCを介して、腎皮質集合管細胞へのナトリウムの再吸収が行われ、ENaCの発現が過度に亢進し、腎ナトリウムの再吸収が促進されると、腎機能が悪化する場合がある。したがって、ENaC発現抑制作用を奏する一般式（１）で表される化合物を有効成分とすることで、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤の提供が可能となる。
さらには、前述したように、フロリジン等のフロレチンの配糖体は、体内でフロレチンへと代謝される。従って、式（１）で表される化合物同様、式（１）で表される化合物の配糖体もENaCの発現を抑制する。さらに、式（１）で表される及び化合物及びその配糖体は、ENaCが介する腎ナトリウム再吸収の抑制作用を有し、これに伴う腎機能の改善効果も有する。よって、一般式（１）で表される化合物の配糖体を有効成分とすることでも、ENaC発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤の提供が可能となる。
【００３６】
（処方例）
前記式（１）で表される化合物及びその配糖体からなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物を有効成分とする腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤として、下記に示す組成の軟カプセル剤、コーヒー飲料、キャンディを常法により各々調製した。
【００３７】
１．軟カプセル剤の調製
ゼラチン７０質量％、グリセリン２２．９質量％、パラオキシ安息香酸メチル０．１５質量％、パラオキシ安息香酸プロピル０．５１質量％、水６．４４質量％の組成からなる軟カプセル剤皮の中に、大豆油４００ｍｇと前記フロレチン又はその配糖体５０ｍｇを充填し、軟カプセル剤を製造した。
【００３８】
２．コーヒー飲料の調製
（成分）                                      （配合：質量％）
フロレチン又はその配糖体                      ０．００００２
コーヒー豆                                    ５．５
牛乳                                          ７．０
砂糖                                          ６．０
香料                                          適量
水                                            残分
【００３９】
３．キャンディの調製
（成分）                                      （配合：質量％）
フロレチン又はその配糖体                      ０．００２
ショ糖エステル                                ０．２
水飴                                        ３５
砂糖                                        ３５
小麦粉                                        ５
練乳                                        １７
ミルク                                        ６
バター                                        ２
香料                                        適量