(57)【要約】【課題】リポソーム製剤の製造方法において工程中に起こっているリポソーム溶液中の薬物含有量の変化または不要分排出速度等をリアルタイムで把握することができ、予め測定しておいた標準ロットと比較してリポソーム製剤を製造する製造方法の提供。【解決手段】リポソーム製剤溶液に存在する不要分を含む外液に、１）実質的に不要分を含まない外液を供給しながら、２）不要分を含む外液の少なくとも一部を限外濾過して廃液として抜き出し、３）リポソーム製剤溶液を容器内に戻して、前記１）、２）、３）工程を必要な回数循環させてリポソーム製剤を製造するリポソーム製剤の外液置換工程において、リポソームを含む溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を、同一ロット内で複数の時点で測定して、予め測定してある標準ロットの測定値と比較して、標準ロットからの製造条件の変化を知得してリポソーム製剤を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム製剤溶液に存在する不要分を含む外液に、
１）実質的に不要分を含まない外液を供給しながら、
２）不要分を含む外液の少なくとも一部を限外濾過して廃液として抜き出し、
３）リポソーム製剤溶液を容器内に戻して、
前記１）、２）、３）工程を必要な回数循環させてリポソーム製剤を製造するリポソーム製剤の外液置換工程において、
リポソームを含む溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を、同一ロット内で複数の時点で測定して、予め測定してある標準ロットの測定値と比較して、標準ロットからの製造条件の変化を知得してリポソーム製剤を製造する方法。
【請求項２】
前記リポソーム溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を測定する工程が、リポソーム溶液を含む容器および・または廃液に設置された、電気伝導度測定、重量測定、流量測定、ｐＨ測定、蛍光測定、並びに紫外および・または可視光測定からなる群から選択される少なくとも一つを測定する装置を用いた測定である請求項１に記載のリポソーム製剤を製造する方法。
【請求項３】
前記同一ロット内の複数の時点が少なくとも２点であり、
前記標準ロットからの製造条件の変化がリポソーム溶液の流量変化、リポソームの平均粒径の変化、限外濾過条件の変化、および限外濾過膜の変化からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１または２に記載のリポソーム製剤を製造する方法。
【請求項４】
前記請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム製剤の外液置換工程の後にさらに、以下のリポソーム製剤の洗浄工程を有するリポソーム製剤の製造方法であって、
１）リポソーム製剤を含む溶液から溶液を廃液として除去し、
２）水を加えて所定時間循環させリポソーム製剤を洗浄する第１の水洗浄工程、
３）洗浄後の溶液を廃液として除去する、
前記２）、３）工程を必要な回数循環させ、その後、
４）リポソーム製剤を含む溶液にアルカリ水溶液を加えて所定時間循環させリポソーム製剤を洗浄する第２のアルカリ洗浄工程、
５）洗浄後のリポソーム製剤の溶液を廃液として除去する、
前記４）、５）工程を必要な回数循環させ、その後、
前記２）、３）工程を必要な回数循環させて第３の水洗浄工程を行う、
リポソーム製剤を洗浄する方法において、廃液の電気伝導度と廃液重量とを同一ロット内で複数の時点で測定し、予め測定してある標準ロットの測定値と比較して、標準ロットからの製造条件の変化を知得してリポソーム製剤を製造する請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム製剤を製造する方法。
【請求項５】
前記標準ロットからの製造条件の変化が、リポソーム溶液の流量変化、リポソームの平均粒径の変化、限外濾過条件の変化、限外濾過膜の変化および洗浄条件の変化からなる群から選択される少なくとも一つである請求項４に記載のリポソーム製剤を製造する方法。
【請求項６】
前記リポソーム溶液中の特定物質の濃度に関連する情報を測定する工程が、該測定値を、該当する廃液中の測定値と比較する工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のリポソーム製剤を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はドラッグデリバリーシステムに有用なリポソーム製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Drug Delivery System (DDS)は、副作用の軽減、標的部位への集積性向上などの多くの利点を有する観点から注目を集めている。代表的なＤＤＳ製剤の一つとしてリポソーム製剤がある。リポソーム製剤は、生体と同様に脂質二重膜を隔壁としてリポソーム内部と外部に分けられている。このような構造を利用し、水溶性の薬剤はリポソームの内部に、脂溶性の薬剤は、主に脂質二重膜内に埋胞されており、炎症部位などの特定の蓄積部位へ薬物を直接送達することを可能にしている。さらに、リポソーム表面に親水性高分子や抗体などを付与することにより標的部位への薬物送達をより効果的にできる製剤である。
リポソーム製造工程は、主にリポソームを形成する工程、リポソームを一定の粒子径に整粒する工程、リポソームの外部の不要分を除去する工程、ろ過滅菌などの手段により滅菌する工程と多岐にわたる。これらの工程中でリポソーム外部の不要分の除去が十分に行なわれず、リポソームに取り込まれていない不要分がリポソーム外部に存在する場合、不要な成分がリポソーム内に薬物を導入する際に影響し、さらに、リポソーム外部に不要分を含んだ状態で生体に投与された際には毒性を惹起させる可能性があることから、リポソーム外部の不要分を除去する工程もまた重要工程の一つである。
【０００３】
不要分は、リポソームの製造方法により異なる。例えば、受動的薬物導入法を用いるリポソーム製造では、リポソーム形成工程で薬剤とリポソームの構成成分を混合し、リポソーム形成後にリポソーム外部の液中に存在する薬剤を除去する際に除去されるリポソーム外部の液中に存在する薬剤である。能動的薬物導入方法を用いるリポソーム製造では、薬物導入のための駆動力を得るためにリポソーム内外に存在する成分の濃度勾配を形成させる工程において必要となるリポソーム外部の液中に存在する成分を除去する際に除去されるリポソーム外部の液中に存在する成分と、濃度勾配を形成した後のリポソームに対しリポソーム外部に薬剤を存在させることによって能動的に薬剤を導入させた後、リポソーム外部に残ったリポソームに取り込まれていない薬剤を除去する際に除去されるリポソーム外部の液中に存在する薬剤の両方を意味する。例えば、前記した受動的薬物導入方法においては、その封入効率は10%程度であることが知られている。つまり、この方法を選択した場合、リポソーム外には、高濃度の未封入薬物が存在することになる。そのため、除去工程において、この未封入薬物を許容できる薬物濃度まで低くする必要があり、他の製造法を選択した場合よりも厳密に除去工程を管理することが重要となる。
【０００４】
これら除去工程は、その製造スケールに関わらずリポソーム製剤製造には必須の項目である。通常、これらの工程を行う際には、外部に存在する不要分を除去する閾値を設定し、これらの値を達成しうる方法を用いることで工程設定を行っている。
しかし、これらの値を達成したか否かは、工程後に得られる試料を用いて測定する方法であり、通常、工程バリデーションを取ることによって不要分除去に関する工程設定がなされている。しかし、工程バリデーションは通常ある均一の試料を用いて行うものであり、除去工程前に発生した不具合により通常調製されるべき試料が調製できなかった場合、例えば、リポソーム粒子形成の不具合によるリポソーム内への薬剤あるいは能動的薬物導入方法に必須である駆動力となる成分の低封入化により、リポソーム外部に過剰量の不要分が存在した場合、設定された工程条件では十分な除去効率が得られないため、目的とする製剤品質を達成することができない。
【０００５】
また、何らかの製造条件の変動によって所定の粒径範囲のリポソーム製剤溶液が通常容積の半分ぐらいしか製造できなかったときでもほぼ同一の装置を用いて各工程を行わなければならない場合、製造条件のうち可変である条件をどの範囲でどのように変化させればよいかは従来製造者のカンで行われてきた。
リポソーム製剤の製造方法では、限外濾過フィルターなどの製造装置の製品ごとの性能のバラツキや、使用による経時による変化や洗浄条件の変化が大きく、リポソーム製剤の製造を工業的に規模を拡大して行うには、これらの条件を実際の製造ロットで把握することが必須の条件であるが、現状そのような条件を製造中に把握できる方法がない。
【０００６】
一方、工程中に試料をとりだし、高速液体クロマトグラフ法や分光光度計などの測定装置を用いることにより工程途中の試料状況を把握することが可能であるが、工程を一時的にとめることは現実的ではなく、さらに、リポソーム製剤の多くは無菌製剤であり、工程途中に試料採取などの工程を入れることにより菌混入のリスクが生じるため工程中の試料採取は好ましくはない。
これらのことから、常に一定の製剤品質を達成するためには、作業者が直接試料と接触することなく、リアルタイムに工程の状況を把握できる不要分除去システムを構築する必要がある。特に、リポソーム形成と同時に薬物を封入する受動的薬物導入法を選択した場合、より厳密な不要分除去管理が必要となってくる。
しかし、このようなシステムは現状存在していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
リポソーム製剤の製造工程において、不要分除去工程は現状において必須の工程であり、リポソーム製剤の品質を決定する因子でもある。しかし、この工程は、バリデーションデータに基づき遂行されているに過ぎず、実際の工程で起こっている不要分除去の除去能を評価しているものでもなければ、リアルタイムにこれらの能力を評価しているものでもない。
従って、本発明は、同一製造ロット内で製造条件の変化を監視できる、例えばリアルタイムに不要分除去工程を監視するシステムを構築し、予め測定された標準ロットの測定値と比較することにより均一の製剤品質をもつリポソーム製剤を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上の点を鑑みて、上記の課題を解決すべく検討した結果、リポソーム製剤の製造工程において、不要分除去において簡易的な測定装置をリポソーム製剤を含む試料溶液中に組み入れ、必要な場合は廃液の同様な情報と比較することにより、測定装置から得られる情報を不要分の量に変換でき、リアルタイムに不要分の除去能を評価することができるという知見を得ることができた。この技術は、実験室スケールのような小規模なリポソーム製剤製造から工業スケールにも十分対応できる。
即ち、本発明は、以下を提供する。
【０００９】
（１）リポソーム製剤溶液に存在する不要分を含む外液に、
１）実質的に不要分を含まない外液を供給しながら、
２）不要分を含む外液の少なくとも一部を限外濾過して廃液として抜き出し、
３）リポソーム製剤溶液を容器内に戻して、
前記１）、２）、３）工程を必要な回数循環させてリポソーム製剤を製造するリポソーム製剤の外液置換工程において、
リポソームを含む溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を、同一ロット内で複数の時点で測定して、予め測定してある標準ロットの測定値と比較して、標準ロットからの製造条件の変化を知得してリポソーム製剤を製造する方法。
（２）前記リポソーム溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を測定する工程が、リポソーム溶液を含む容器および・または廃液に設置された、電気伝導度測定、重量測定、流量測定、ｐＨ測定、蛍光測定、並びに紫外および・または可視光測定からなる群から選択される少なくとも一つを測定する装置を用いた測定である（１）に記載のリポソーム製剤を製造する方法。
（３）前記同一ロット内の複数の時点が少なくとも２点であり、
前記標準ロットからの製造条件の変化がリポソーム溶液の流量変化、リポソームの平均粒径の変化、限外濾過条件の変化、および限外濾過膜の変化からなる群から選択される少なくとも一つである（１）または（２）に記載のリポソーム製剤を製造する方法。
【００１０】
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のリポソーム製剤の外液置換工程の後にさらに、以下のリポソーム製剤の洗浄工程を有するリポソーム製剤の製造方法であって、
１）リポソーム製剤を含む溶液から溶液を廃液として除去し、
２）水を加えて所定時間循環させリポソーム製剤を洗浄する第１の水洗浄工程、
３）洗浄後の溶液を廃液として除去する、
前記２）、３）工程を必要な回数循環させ、その後、
４）リポソーム製剤を含む溶液にアルカリ水溶液を加えて所定時間循環させリポソーム製剤を洗浄する第２のアルカリ洗浄工程、
５）洗浄後のリポソーム製剤の溶液を廃液として除去する、
前記４）、５）工程を必要な回数循環させ、その後、
前記２）、３）工程を必要な回数循環させて第３の水洗浄工程を行う、
リポソーム製剤を洗浄する方法において、廃液の電気伝導度と廃液重量とを同一ロット内で複数の時点で測定し、予め測定してある標準ロットの測定値と比較して、標準ロットからの製造条件の変化を知得してリポソーム製剤を製造する（１）〜（３）のいずれかに記載のリポソーム製剤を製造する方法。
（５）前記標準ロットからの製造条件の変化が、リポソーム溶液の流量変化、リポソームの平均粒径の変化、限外濾過条件の変化、限外濾過膜の変化および洗浄条件の変化からなる群から選択される少なくとも一つである（４）に記載のリポソーム製剤を製造する方法。
（６）前記リポソーム溶液中の特定物質の濃度に関連する情報を測定する工程が、該測定値を、該当する廃液中の測定値と比較する工程を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載のリポソーム製剤を製造する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、不要分除去工程等のリポソーム製剤の製造方法の工程において工程中に起こっているリポソーム溶液中の薬物含有量の変化または不要分排出速度をリアルタイムで正確に把握することができる。このため必要な場合は、至適終点でロットを停止することができる。また、本製造方法を用いることにより各リポソーム製剤の製造工程において、製造工程稼動前後の製造に用いる媒体や装置の状態を監視することができ、製造装置や製造媒体を適切に管理できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】不要分除去装置を説明する模式図である。
【図２】不要分除去工程中の排出重量および電気伝導度の変化を示すグラフである。図２（Ａ）は、限外濾過膜使用枚数: １枚のグラフであり、図２(Ｂ)は、限外濾過膜使用枚数: ２枚のグラフである。図２（Ａ）：■: 試料溶液の電気伝導度、●: 廃液電気伝導度、▲: 廃液重量、図２（Ｂ）：□: 試料溶液の電気伝導度、○: 廃液電気伝導度、△: 廃液重量、を示す。
【図３】図３（Ａ）は、吸光度測定によるリン酸プレドニゾロン濃度と電気伝導度測定による濃度との相関を示すグラフである。図３（Ｂ）、図３（Ｃ）は、図３（Ａ）の直線式より算出した試料溶液中外液リン酸プレドニゾロン濃度および廃液中のリン酸プレドニゾロン濃度の予測値および実測値を示すグラフである。図３（Ｂ）は、不要分除去工程中でのリン酸プレドニゾロン濃度実測値と予測値 (限外濾過膜枚数 1枚)、図３（Ｃ）は、不要分除去工程中でのリン酸プレドニゾロン濃度実測値と予測値 (限外濾過膜枚数 ２枚)を示す。●廃液中リン酸プレドニゾロン実測値、■試料中外液リン酸プレドニゾロン実測値、○廃液中リン酸プレドニゾロン予測値、□試料中外液リン酸プレドニゾロン予測値、を示す。
【図４】図４は、図２（Ａ）および図２（Ｂ）を同一Ｘ-Ｙ軸で重ねて記載したグラフである。
【図５】電気伝導度および排出重量を指標として洗浄工程について評価した結果を示すグラフである。●廃液中電気伝導度、○水排出量、を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜製造方法１、不要分除去工程の製造条件の変化を検知する製造方法＞
以下に本発明の製造方法１の好適態様を示す図１を用いて説明する。本発明は図示する好適態様に限定されない。
製造方法１は、
「リポソーム製剤溶液に存在する不要分を含む外液に、
１）実質的に不要分を含まない外液を供給しながら、
２）不要分を含む外液の少なくとも一部を限外濾過して廃液として抜き出し、
３）リポソーム製剤溶液を容器内に戻して、
前記１）、２）、３）工程を必要な回数循環させてリポソーム製剤を製造するリポソーム製剤の外液置換工程において、
リポソームを含む溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を、同一ロット内で複数の時点で測定して、予め測定してある標準ロットの測定値と比較して、標準ロットからの製造条件の変化を知得してリポソーム製剤を製造する方法。」である。
本発明において、不要分除去装置１を図1に示した。この装置は限外濾過膜１７を利用し、リポソーム分散溶液中に含まれる成分の分子量の違いを利用し、必要成分の保持と不要分の排出を同時に行う装置である。図1の装置５に示すように、リポソーム外水相となる外液１０を連続的にリポソーム溶液１４が入ったリポソーム容器１５にポンプ１１を介する経路から供給するとともに、リポソーム溶液１４の一部を、ポンプ１２を介する経路で抜き出し、限外濾過膜１７を通して保持される溶液と不要分を含む排出される溶液を振り分け、リポソーム外液の溶液特性から不要分を経路１６を介して廃液容器１８へと抜き出し、保持されるリポソーム溶液１４をリポソーム容器１５に経路１９を介して戻し、リポソーム溶液１４を不要分を含まない外水相に置換する不要分除去装置５である。なお、この装置の複数の箇所にリポソームを含む溶液を製造系外に抜き出すことなく試料中の特定物質の濃度に関連する情報の測定装置を取り付け、装置から発するシグナルや値から定量的な解析を同一ロット内で所定の時間間隔で複数点で検知することが可能である。
【００１４】
＜Ａ．リポソームを含む溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を測定する工程＞
リポソームを含む溶液を製造系外に抜き出すことなく溶液中の製剤の濃度に関連する情報を測定する工程は、試料溶液を含む容器に、電気伝導度測定、重量測定、流量測定、ｐＨ測定、蛍光測定、または紫外および・もしくは可視光測定からなる群から選択される少なくとも一つを測定する装置を設置して測定する。
不要分除去工程において、溶液中の製剤の濃度に関連する情報は、実質的に不要分を含まない外液と不要分を含む試料溶液の溶液特性を測定できる検出器を用いて不要分の定量化を行えるものであればよく、両溶液間で数値が異なるものであれば特に限定されないが、好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上数値が異なる情報が好ましい。具体的には不要分がリポソーム内に取り込まれなかった薬剤である場合は、不要分を含まない外液と不要分を含む試料溶液の薬剤濃度を測定できる方法が好ましい。
【００１５】
以下の説明では、図１に示すように、リポソーム容器１５には電気伝導度計１、廃液容器１８には、電気伝導度計２および天秤４を設置した例で説明する。また、リポソーム溶液１４は後に実施例で詳述する薬剤としてリン酸プレドニゾロンを封入しポリエチレングリコールで修飾して調整したものを用いた。
＜電気伝導度測定＞
外液中のリン酸プレドニゾロン定量試料および廃液中リン酸プレドニゾロン定量試料はそれぞれ、電気伝導度計を用いて電気伝導度を測定した。
本発明において用いる電気伝導度測定は、不要分の溶液特性を利用した測定方法であり、その測定法により得られる値は、後に実施例および図３で具体的に説明するように、吸光度測定で得られた値と良好な相関関係を示し、その精度は高いことが本発明によって見出された。不要分除去工程のリポソーム試料容器に、電気伝導度測定装置を組み込む、同様に廃液容器にも電気伝導度測定装置を設置することにより、リポソームを含む試料溶液を製造系外に抜き出すことなく試料中の特定物質の濃度に関連する情報をリポソーム試料溶液又は廃液中で測定することができる。
【００１６】
不要分除去工程
１.  試料容器にPEG修飾後リポソームを入れ、図１に示すポンプ１２を介して不要分除去装置５内を循環させ、限外濾過膜 (Viva Flow50, MWCO; 100,000Da)１７を介してリポソーム容器１５内に保持される溶液１４と廃液側へと排出される液を分離した。
２.  工程中試料容量が一定となるようにポンプ１１を介して５％グルコース溶液を外液１０としてリポソーム容器１５に供給した。
３.  工程中は、電気伝導度計１、２で電気伝導度を測定し、天秤４で排出重量を測定した。
【００１７】
本実施例では、物理的に排出速度を上げるために限外濾過膜1枚の場合と２枚の場合で検討を行った。限外濾過膜の使用枚数を２倍にすると限外濾過膜の比表面積が２倍となり、廃液の排出速度を大きくすることができる。その結果、図２に示すように試料および廃液の電気伝導度は経時的に変化し、さらに、限外濾過膜の使用枚数により排出速度は増加するが、その増加に伴い、電気伝導度の消失は早くなることが図２の結果から本発明の方法により測定できることが明らかとなった。すなわち製造条件の変化が知得できる。
【００１８】
＜Ｂ．製剤の濃度に関連する情報を、同一ロット内で複数の時点で測定して、予め測定してある標準ロットの測定値と比較して、標準ロットからの製造条件の変化を知得してリポソームを製造する方法＞
図４は、図２（Ａ）および図２（Ｂ）を同一Ｘ‐Ｙ軸で重ねて記載したグラフである。図４に示すように、例えば限外ろ過膜の有効面積が限外ろ過膜１枚分と２枚分との場合のように不要分除去工程の製造条件が何らかの原因により異なった場合に、リポソームを含む試料溶液や廃液を製造系外に抜き出すことなく測定し、試料中の製剤の濃度に関連する情報を取得できる。
例えばある製造中のロットで、工程の開始から１００分と１５０分でのリポソーム製剤外溶液の電気伝導度を測定して、図４の×印の２点が得られたとする。得られた値を予め測定した図４の標準ロットの測定値と比較する。この２点はほぼ点線の上に乗る２点であることが分かる。この結果から、製造中のロットでは、標準ロットの限外ろ過膜１枚と２枚との中間の製造条件で不要分除去工程が正常に行われており、この点線を外挿すれば、２００分から２５０分の間で、不要分除去工程は最適な終点となることが製造工程中に判断することができる。
【００１９】
リポソーム製剤の製造方法においては、固体の化成品を分散した分散液中の不純物を限外濾過装置にクロスフローして不純物除去を行うような場合と異なり、一定のレベルを超えてさらに過剰な不要分除去工程を実施した場合、リポソーム製剤中の組成物が分解する可能性があり、標準ロットと製造装置の条件が異なり、予想が困難な場合に不要分除去工程の最適な終点を工程中に予測することが重要である。一般的な化成品の不純物除去の場合は、不純物をある一定のレベルまで除去できさえすればよいのであって、一定のレベルに達した後も継続的に除去工程を実施しても固体の化成品に悪影響を与えることはない。
【００２０】
本発明方法では、必要な場合にはさらに廃液中で測定された対応する情報と比較して、同一ロット内で所定の時間間隔で複数点で検知する工程により、図４のグラフ上の複数の情報が得られることになり、これらの情報および予め標準条件の標準ロットでの製造条件で同一情報を測定し比較すれば、製造条件の変化を同一ロット内で所定の時間間隔で複数点で検知できる。必要な場合は製造条件の変化をフィードバックして製造条件を同一ロット内で適切に変えることができる。また、許容範囲内に製造条件が推移していることが検知できる場合は、目的とする工程の終点を定量的に予測することができる。さらに、特定の製造条件の記録と共に測定結果を検討すれば異なるロット間の製造条件の変化を検知することもできる。
本発明の製造方法は、不要分除去工程中の各種装置や条件の稼動状況などを監視するのに優れている方法である。
【００２１】
次に、上記で説明した以外のリポソームおよびその製造工程を説明する。
＜１．リポソーム＞
以下、本発明のその他の工程をより詳細に説明する。リポソームは、リン脂質二重膜からなる閉鎖小胞体であり、その小胞空間内に水相（内水相）を含む。リポソーム製剤は、このリポソームを担体として、これらに薬物を担持させたものである。リポソームは、脂質二重膜層の一枚膜からなるユニラメラ小胞から複数枚からなる多重ラメラ小胞などの構造が知られている。
【００２２】
(リン脂質）
リン脂質は、一般的に、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基とリン酸基より構成される親水性基とを持つ両親媒性物質である。リン脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン（レシチンともいう）、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトールのようなグリセロリン脂質；スフィンゴミエリンのようなスフィンゴリン脂質；カルジオリピンのような天然または合成のジフォスファチジル系リン脂質およびこれらの誘導体；これらを常法に従って水素添加したもの（例えば、水素添加大豆フォスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等を挙げることができる。以下、これらのリン脂質を「リン脂質類」と称することもある。これらのうちでも、水素添加大豆フォスファチジルコリン等の水素添加されたリン脂質、スフィンゴミエリン等が好ましい。
主要構成成分であるリン脂質の量は、膜脂質全体中、通常、20-100mol%であり、好ましくは40-100mol%である。またリン脂質以外の他の脂質類の量は、膜脂質全体中、通常、0-80mol%であり、好ましくは0-60mol%である。
【００２３】
(親水性高分子）
本発明において、上記のような脂質二重膜は、親水性高分子修飾工程において脂質二重膜の表面に親水性高分子が修飾される。修飾される親水性高分子としては、特に限定されないがポリエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸などが挙げられる。
これらの中でも、リポソーム製剤の血中滞留性を優れたものにする効果があることから、本発明の主旨にかなったものとしてポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましい。なお、このような親水性高分子は、保存安定性に優れるので片末端がアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化、プロポキシ化）されているものが好ましい。これらの中でも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は最も汎用であり、血中滞留性を向上させる効果があり、好ましい。
【００２４】
（その他）
リポソームは、上記リン脂質、親水性高分子の脂質誘導体の他に、他の膜構成成分を含むことができる。他の膜構成成分としては、例えば、コレステロールや飽和・不飽和脂肪酸などのリン脂質以外の脂質およびその誘導体（以下、これらを「他の脂質類」と称することもある。）が挙げられる。リポソームは、主膜材として上記のリン脂質および親水性高分子の脂質誘導体とともに、他の脂質類を含む混合脂質による膜で形成されるのが好ましい。このように、本発明に係るリポソームは、上記脂質および親水性高分子とともに、上記膜構造を保持しうるものであって、リポソームに含むことができる他の膜成分を、本発明の目的を損なわない範囲で含むことができる。
【００２５】
＜２．リポソーム製剤の製造工程＞
一般的なリポソーム製剤の製造工程は、均一化工程、リポソーム形成工程、不要分除去工程、無菌化工程の順である。薬剤封入は、リポソーム形成工程時のリポソーム形成脂質分散媒に封入薬剤を添加し、リポソーム形成と同時に薬剤を封入する方法やリポソーム形成工程後、リポソーム膜内外にイオン濃度勾配などの勾配を生じさせ、この勾配に従って膜外に添加した薬剤をリポソーム膜内の内液に移送させリポソーム内に薬剤を封入する方法などによって実施される。本発明においてこれらの工程の順序は特に限定されない。また、イオン勾配を用いる方法などにおいては未封入薬物除去工程を含む外液置換工程が２回入るものも存在する。また、製造方法においては凍結乾燥工程が入る場合もあるが、本発明がこれらの工程の重複及び追加に影響を受けるものではない。
【００２６】
（均一化工程）
均一化工程は、リポソーム膜構成成分を有機溶媒などを用いて溶解し、各成分の分散状態を均一化する工程のことを示す。一般的にリポソーム構成成分としては、リン脂質とコレステロールなど、複数の脂質構成成分が存在することが多い。複数の脂質構成成分が存在する場合、リポソーム膜形成時の脂質の不均一化を避けるため、均一化工程をとる。単一の脂質を用いる場合、均一化工程は必ずしも必須というわけではないが、以下に示す均一化工程をとることが望ましい。均一化する方法としては、クロロホルムなどを用いて完全溶解させ、真空乾燥することにより均一化する薄膜法がよく知られている。製造スケールが大きいときの製造方法としては、エタノールなどの有機溶媒に完全溶解させることで均一化し、その脂質−有機溶媒溶液を次工程のリポソーム形成工程に用い、リポソーム形成工程時に発生する熱を利用して、あるいは外液置換工程時に有機溶媒を除去するという方法が広く用いられている。
【００２７】
（リポソーム形成工程）
リポソーム形成工程とは、均一化された脂質を用いて粒子径の整っていない粗リポソームを形成するとともに、引き続いて行なわれる粗リポソームを所望の粒子径に制御する工程を示す。粗リポソームの一般的な製造方法としては水和法（Bangham法）、超音波処理法、逆相蒸発法などを用いた方法が既に報告されている。また、工業レベルでの実用化を指向したスケールでの製造方法としては、加温法、脂質溶解法などがある。また、内水相に保持する薬物量を多くするための方法として、ＤＲＶ法（Dehydrated/Rehydrated Vesicles）や凍結融解法なども報告されている。リポソーム形成工程は、リポソーム形成後、粒子径制御の工程を含む。粒子径制御の工程は、膜乳化及び剪断力の持続を含む様々な公知の技術を用いて制御することができる。より具体的には、フィルターを複数回強制通過させる膜乳化法、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させる高圧乳化法などがある。何れの製造法もG.Gregoriadis編「Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques」2nd edition, Vol.Ｉ-III、CRC Pressにおいて公知であり、この記載を引用して本明細書に記載されているものとする。近年、新しい製造法としては、超高圧による圧縮からの速度変換を利用し、液相下でのジェット流により剪断乳化を行う方法（ジェット流乳化）や超臨界二酸化炭素を利用したリポソーム調製技術がある。また、近年においては粒子径制御工程を簡便化する改良型エタノール注入法などが登場している。これらも本発明のリポソーム形成工程に該当する。
【００２８】
（不要分除去工程）
不要分除去工程とは、リポソーム外に存在する不要分の除去工程であり、リポソーム製剤の調製途中あるいは最終製剤に不必要な物質、あるいは存在することが好ましくない物質を除去する工程である。これら除去工程は、リポソームと不要分の分子量や粒子の大きさの違いを利用した方法が用いられ、具体的な手段としては、透析膜、ゲルろ過、限外濾過などが広く用いられている。
【００２９】
上記に記載した不要分除去工程での管理は、現状ではvalidationデータに基づいて行われるものであり、不要分の除去性能や存在状態などを知りえる手段はない。しかし、本発明における不要分除去工程のシステムにある種のセンサーを用いて工程中の不要分管理を行うことにより不要分除去の状況をリアルタイムに監視し、目的とする終点を定量的に決定できる。具体的には、測定結果が当該ロットと標準ロットで同一傾向（同一カーブ）を示していれば、標準ロットで分かっている外挿を行えば最適な終点が当該ロットの測定結果から導き出せる。さらに、不要分除去工程後に実施される洗浄あるいは本工程に使用されるフィルターの性能などを管理することにより、システムの不具合を検知できるのに適しているシステムになりうる。
通常、不要分の分析には、既存の定量装置を用いる。しかし、これらの装置を用いて分析を実施する場合、試料調製を必要としてリアルタイムに測定することは不可能である。
本発明における測定装置は、製剤中に含まれる成分の分解や形質的変化を引き起こさないものであれば、いかなる場所にも設置可能であるが、リポソーム製剤の多くは、無菌製剤であることから、菌混入のリスクをできる限り低減するために不要分除去工程システムにおける廃液ラインあるいは容器に装着するのがより好ましい。
【００３０】
洗浄工程とは、不要分除去工程後に実施するラインおよび装置の洗浄工程である。洗浄方法は特に限定されない。例えば、不要分除去工程後に試料成分が溶解できる洗浄液で一定時間および複数回循環洗浄した後、さらに、水を用いて許容できる濃度まで洗浄液を除去するために一定時間および複数回循環洗浄する。また、洗浄工程に使用する溶媒は試料成分を溶解できる液であればよく、特に限定されない。例えば、洗浄液に使用される液としては、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、アルカリ溶液、酸性溶液、メタノールやエタノールなどの有機溶媒が挙げられる。電気伝導度を指標とする場合に好ましい洗浄液としてはアルカリ溶液と酸性溶液である。
【実施例】
【００３１】
実施例、試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例、試験例に限定されるべきものではない。
【００３２】
以下に使用した略称および分子量を示す。
ＨＳＰＣ: 水素添加大豆フォスファチジルコリン (分子量790、Lipoid社製)
PEG5000-DSPE: ポリエチレングリコール(分子量5000)−フォスファチジルエタノールアミン（分子量6081、日本油脂社製）
Ｃｈｏｌ : コレステロール (分子量: 386.86、Solvay社製)
ＴＲＸ-２０: 3.5-Dipentadecyloxybenzenecarboxamidine Hydrochloride (分子量: 609.42、純正化学社製)
リン酸プレドニゾロン: (分子量: 440.02、Newchem社製)
【００３３】
始めに、吸光度測定による濃度定量と電気伝導度測定による濃度定量との相関関係を示す。
（１）外液中リン酸プレドニゾロン定量
リポソーム試料１００μLをとり、生理食塩液３ｍＬを加え混合した。この液を超遠心処理 (29,400 rpm ×180 min, at 10min)し、上清を回収した。なお、回収した上清については必要に応じて上清試料１００μＬを生理食塩液３ｍＬに分散させた。
別に、リン酸プレドニゾロン約２０ｍｇをはかりとり、水を加えて溶解し、正確に２０ｍＬとした。この液を１００μＬとり、生理食塩液３ｍＬに分散して標準溶液とした。
上清試料、上清希釈試料および標準溶液につき、２４２ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度を算出した。
外液中リン酸プレドニゾロン濃度(mg/mL)
=リン酸プレドニゾロン秤取量／２０ ×試料溶液吸光度/標準溶液吸光度 ×希釈倍率
【００３４】
（２）廃液中リン酸プレドニゾロン定量
本定量方法は、廃液より経時的にサンプリングした液を用いて行った。
試料１００μＬをとり、生理食塩液３ｍＬを加え混合した。この液を必要に応じて上清試料１００μＬを生理食塩液３ｍＬに分散させた。
別に、リン酸プレドニゾロン約２０ｍｇをはかりとり、水を加えて溶解し、正確に２０ｍＬとした。この液を１００μLとり、生理食塩液３ｍＬに分散せて標準溶液とした。
試料、希釈試料および標準溶液につき、２４２ｎｍにおける吸光度を測定し、濃度を算出した。
廃液中リン酸プレドニゾロン濃度(mg/mL)
=リン酸プレドニゾロン秤取量／２０ ×試料溶液吸光度/標準溶液吸光度 ×希釈倍率
【００３５】
＜調製例1＞
リポソーム形成工程
１．  ＨＳＰＣ 6.5165g、コレステロール 2.6792 g、ＴＲＸ-２０0.8043gをそれぞれガラス容器に秤量する。
２.  脂質を秤量したガラス容器にエタノール１０ｍＬを加えて７０℃に設定した恒温槽中で加温溶解した。
３．  リン酸プレドニゾロン6.7815ｇを秤量し、５％グルコースを加えて溶解し正確に１００ｍＬとした。この液９０ｍＬを７０℃に設定した恒温槽中で加温した。
４．  脂質が完全に溶解しているのを確認し、リン酸プレドニゾロン溶液を添加し、５分以上恒温槽中で加温し、脂質分散体を形成させた。
５．  この液をExtruder T100を用いて整粒化を行った。なお、Extruder T100は７０℃に設定した恒温槽で加温するとともに、整粒化工程中は試料を７０℃に設定した恒温槽で加温する。また、整粒化は０．２μｍのpolycarbonate membraneを２枚重ねとし３回通した後、０．１μｍのpolycarbonate membraneを２枚重ねとして１０回通した。
６．  PEG5000-DSPE濃度が０．３７mg/mLとなるようにPEG5000-DSPE溶液を水に溶解したPEG5000-DSPE溶液２０ｍＬを６５℃に設定した恒温槽中で加温しておき、整粒化後リポソームにPEG5000-DSPE溶液を添加した。この液をさらに恒温槽中で３０分間加温しＰＥＧ修飾工程とした。
表１.に上記調製方法に従い得られたリポソーム特性を示した。
【００３６】
【表１】
2013126953.tif 000002
＊いずれもリポソームの調製時の値を計算して得られた値である。修飾量はリポソーム全脂質モルに対するPEG5000-DSPEモル量であり、DSPE量は全脂質量に含まれない。平均粒子径は、Zetasizer 3000HS (Malvern Inc.)で測定した。
【００３７】
（実施例１） 不要分除去工程
発明を実施するための形態で記載した不要分除去工程および得られた図４の結果は、本発明の実施例である。
（実施例２） クロスフロー工程中におけるリン酸プレドニゾロン濃度変化
１．  実施例1の工程中に経時的に試料容器および廃液容器より１ｍＬサンプリングした。
２．  この液を外液中リン酸プレドニゾロン濃度および廃液中リン酸プレドニゾロン濃度を上記定量方法に従い測定を行った。
３．  リン酸プレドニゾロン約２０ｍｇをはかりとり、５％グルコースを加えて溶解し、２０ｍＬとした。さらに、この液を５％グルコースで段階希釈した液の電気伝導度を測定した。
【００３８】
図３に示すように、リン酸プレドニゾロン濃度と電気伝導度には良好な直線性 (r2=0.9998)が得られることが明らかとなった。（図３（Ａ））この直線式より算出した試料溶液中外液リン酸プレドニゾロン濃度および廃液中のリン酸プレドニゾロン濃度の予測値は、実測値と近似することが明らかとなった（図３（Ｂ, Ｃ））。従って、不要分除去工程中の試料および廃液中濃度をモニタリングすることが可能であり、この結果から至適終点を工程中に決定できることが明らかとなり、また、リアルタイムに試料の状態をモニタリングできる不要分除去システムを構築することに成功した。本実施例では、リン酸プレドニゾロンの特異的吸光度などを用いて定量化する方法ではなく、リン酸プレドゾロン溶液特性ならびにリポソームを構成する溶液特性を利用して定量化できる手法により十分な予測性精度を示した。従って、使用する溶液の溶液特性および被験体の物理化学的物性を利用し、その特性を検知できる装置を本不要分除去システムに導入することでいかなる薬物であっても工程を監視できるシステムになりえることが示唆された。
【００３９】
（実施例３） 不要分除去工程後の洗浄工程とそのモニタリング
１．  図１と同様の装置に不要分除去工程後に得られたリポソーム製剤をリポソーム容器１５に加えて、限外濾過膜を介して1時間循環させた。
２．  リポソーム容器より溶液を取り除き、リポソーム容器に水を２５０ｍＬ加えて５分間、循環した（水洗浄１）。
３．  水洗浄1後にリポソーム容器より溶液を取り除き、リポソーム容器に１mol/L NaOH水溶液を２５０ｍＬ加えて５分間、循環した（アルカリ洗浄）。
４．  アルカリ洗浄後、リポソーム容器より溶液を取り除き、リポソーム容器に水を２５０ｍＬ加え５分間、循環した(水洗浄２)。
５．  洗浄回数は、水洗浄１を３回、アルカリ洗浄を１回、水洗浄を２回行い合計５回とした。また、５分間の循環中に試料容器中の溶液の電気伝導度を測定するとともに、循環後の溶液排出重量の測定を行った。
【００４０】
不要分除去工程後の洗浄についてリポソーム溶液の電気伝導度をリポソーム容器に設置した電気伝導度計で測定し、排出重量を廃液容器で測定した。電気伝導度と廃液重量とを指標として評価した結果を図５に示した。その結果、水洗浄1において洗浄ごとに水の排出量が増加し、アルカリ洗浄後の水の排出量は大きく変化した。また、水洗浄２において洗浄ごとに水の排出量がわずかに増加し、アルカリ洗浄後の水洗浄２の一回目において急激に水の排出量が増加した。しかし、その後の洗浄では水の排出量は大きく変化しなかったが、水酸化ナトリウムに由来する電気伝導度は、アルカリ洗浄後でも水洗浄回数ごとに経時に大きく減少した。これは、アルカリ洗浄により限外濾過膜に対する水の透過性は向上するが、cross-flowシステム内にアルカリが残存しており、このアルカリを完全に除去するために水洗浄が数回必要である。このアルカリ残存性は、水の排出量だけでの評価では製造条件の監視は不十分であるが、電気伝導度を測定することによりアルカリ残存性を高感度に評価できることが明らかとなった。この知見は、構築したシステムが限外濾過膜の状態およびシステムの洗浄性をモニタリングできることを示唆している。
【符号の説明】
【００４１】
１、２  電気伝導度計
４  天秤
５  不要分除去装置
１０  外液
１１、１２  ポンプ
１４  リポソーム溶液
１５  リポソーム容器
１６、１９  経路
１７  限外ろ過膜
１８  廃液容器
【図１】
2013126953.tif 000003
【図２】
2013126953.tif 000004
【図３】
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【図４】
2013126953.tif 000006
【図５】
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