(57)【要約】      （修正有）【課題】甲状腺髄様がんを特異的に検出することができる、甲状腺髄様がんの有無を判定する方法を提供する。【解決手段】判定用試料中の、特定の塩基配列からなるｃＤＮＡ等のＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント、又は前記塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質等の前記スプライシングバリアント、の発現を検出する工程（ａ）；及び工程（ａ）でＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント、又は該スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現が検出された場合、判定用試料提供者が甲状腺髄様がんである可能性が高いと評価する工程（ｂ）；を備えた方法を用いて、甲状腺髄様がんの有無を判定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び工程（ｂ）を備えたことを特徴とする甲状腺髄様がんの有無を判定する方法。
１）判定用試料中の、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント、又は該スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する工程（ａ）；
２）工程（ａ）でＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント、又は該スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現が検出された場合、判定用試料提供者が甲状腺髄様がんである可能性が高いと評価する工程（ｂ）；
【請求項２】
ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントであり、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質が、配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）でＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出する方法がＰＣＲ法であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）でＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する方法がウェスタンブロッティング法であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
以下の工程（ａ’）〜工程（ｄ’）を備えたことを特徴とする甲状腺髄様がん治療薬の有効性を判定する方法。
（ａ’）甲状腺髄様がんに罹患したモデル動物に被検薬剤又は被検物質を投与する工程；
（ｂ’）前記モデル動物より採取された判定用試料における、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント、又は該スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現を検出する工程；
（ｃ’）前記判定用試料におけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント、又は該スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現量と、対照となる被検薬剤又は被検物質を未投与の場合における発現量とを比較する工程；
（ｄ’）判定用試料におけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント、又は該スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して減少している場合、被検薬剤又は被検物質が甲状腺髄様がんの治療に有効な治療薬と評価する工程；
【請求項６】
ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントであり、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質が、配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ’）でＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントのオーソログの発現を検出する方法がＰＣＲ法であることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ’）でＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する方法がウェスタンブロッティング法であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする甲状腺髄様がんの有無の判定用キット。
【請求項１０】
ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対が、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなるｃＤＮＡの上流及び下流から増幅するプライマー対であり、前記上流から増幅するプライマーが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列中の、任意の連続１５〜３０塩基のプライマーであり、前記下流から増幅するプライマーが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列のそれぞれの相補配列中の、任意の連続１５〜３０塩基のプライマーであることを特徴とする請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする甲状腺髄様がんの有無の判定用キット。
【請求項１２】
配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺髄様がんの有無を判定する方法や、甲状腺髄様がんの有無の判定用キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺は、のどの甲状軟骨のやや下方に位置し、気管を前面から囲むように存在する、Ｈ形（蝶々が羽を広げたような形）の臓器である。甲状腺は、濾胞細胞とＣ細胞（濾胞傍細胞[parafollicular cell]）の２種類の細胞から構成されており、濾胞細胞は、代謝や自律神経をコントロールする甲状腺ホルモンを産生する細胞であるのに対して、Ｃ細胞は、血液中のカルシウム濃度を下げる作用を有するホルモン（カルシトニン）を産生する細胞であることが知られている。
【０００３】
甲状腺髄様がんは、Ｃ細胞ががん化したものであり、そのうち２０％は遺伝性のものであるのに対して、残りの８０％は孤発性であることが知られている。遺伝性甲状腺髄様がんの原因遺伝子としてＲＥＴ遺伝子が知られており、ＲＥＴ遺伝子に変異があるとほぼ１００％甲状腺髄様がんを発症することが知られているが、それ以外の甲状腺髄様がんの発症メカニズムはよくわかっていない。また、甲状腺髄様がん発症の割合は、甲状腺がんのうち数％に過ぎないものの、甲状腺髄様がんはリンパ節転移を起こしやすく、また、予後不良ながんのひとつであるため、甲状腺髄様がんの早期治療及び診断のための腫瘍マーカーの開発が急がれている。
【０００４】
現在のところ、甲状腺髄様がんの腫瘍マーカーとして、カルシトニンやがん胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）が知られている。甲状腺髄様がんに罹患すると、カルシトニンの血中濃度が上昇することが知られているが、一方で異所性カルシトニン産生腫瘍、肺小細胞がん、肝がんなどのがんに罹患した場合や、慢性腎不全、原発性副甲状腺機能亢進症などの疾患に罹患した場合においても、カルシトニンの血中濃度が上昇することが知られている。このため、甲状腺髄様がんを特異的に判定するためには、カルシトニンの検出では不十分と考えられている。
【０００５】
他方、ＣＥＡは、がん細胞から産生される胎児性抗原の一つであり、分子量２０万前後の糖タンパク質であることが知られている。ＣＥＡは、がんに罹患していない血中には検出されないが、大腸がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、甲状腺髄様がんなど臓器がんに罹患すると、がん細胞中や血中におけるＣＥＡ濃度が上昇することが知られている。そのため、ＣＥＡは、がんの有無を検出するためや術後の再発予防のための腫瘍マーカーとして、広く用いられている。また、現在までにＣＥＡに加えて、ＣＥＡと配列・構造上の相同性が高い約２０種類のＣＥＡ関連分子も知られており、そのうち、上述のがん細胞において産生が認められるＣＥＡが、腫瘍マーカーとして唯一知られているものの（特許文献１、非特許文献１）、甲状腺髄様がん細胞に対する感度及び特異度の面から十分なＣＥＡ関連分子は未だ見つかっていない（非特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１１−５２７４１４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tsujimoto M., et al. Clinical Cancer Research 13 : 4807-4816 (2007)
【非特許文献２】J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57: 11-22 (1976)
【非特許文献３】Nehls 0., et al. Semin Liver Dis 24: 139-154 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、甲状腺髄様がんを特異的に検出することができる、甲状腺髄様がんの有無を判定する方法や甲状腺髄様がんの有無の判定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、ＣＥＡの分子型（バリアント、糖鎖修飾）や類似構造を有することが推測されるＣＥＡ関連分子群に着目して検討したところ、試行錯誤の末、ＣＥＡＣＡＭ４（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 4）遺伝子の３種類のスプライシングバリアントが甲状腺髄様がんで発現することを見いだした。さらに、大腸がん細胞、胃がん細胞、膵臓がん細胞、甲状腺がん細胞、肺がん細胞、乳がん細胞などの甲状腺髄様がん以外のがん細胞においては、かかるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子の３種類のスプライシングバリアントは発現しないことが確認された。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）判定用試料中の、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント（以下、「本件スプライシングバリアント」ということがある）、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する工程（ａ）；及び工程（ａ）で本件スプライシングバリアント、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現が検出された場合、判定用試料提供者が甲状腺髄様がんである可能性が高いと評価する工程（ｂ）；を備えたことを特徴とする甲状腺髄様がんの有無を判定する方法や、（２）本件スプライシングバリアントが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる本件スプライシングバリアントであり、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質が、配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする上記（１）に記載の方法や、（３）工程（ｂ）で本件スプライシングバリアントの発現を検出する方法がＰＣＲ法であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法や、（４）工程（ｂ）で本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する方法がウェスタンブロッティング法であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法に関する。
【００１１】
上記本発明の判定方法は、医師による甲状腺髄様がんの診断を補助する方法であって、医師による診断行為は含まない。また上記判定方法のその他の態様としては、甲状腺髄様がんの有無を判定するためのデータを収集する方法や、甲状腺髄様がん治療の予後を予測するためのデータを収集する方法を挙げることができる。
【００１２】
さらに本発明は、（５）（ａ’）甲状腺髄様がんに罹患したモデル動物に被検薬剤又は被検物質を投与する工程；（ｂ’）前記モデル動物より採取された判定用試料における、本件スプライシングバリアント、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現を検出する工程；（ｃ’）前記判定用試料における本件スプライシングバリアント、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現量と、対照となる被検薬剤又は被検物質を未投与の場合における発現量とを比較する工程；及び（ｄ’）判定用試料における本件スプライシングバリアント、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して減少している場合、被検薬剤又は被検物質が甲状腺髄様がんの治療に有効な治療薬と評価する工程；の工程（ａ’）〜工程（ｄ’）を備えたことを特徴とする甲状腺髄様がん治療薬の有効性を判定する方法や、（６）本件スプライシングバリアントが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる本件スプライシングバリアントであり、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質が、配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする上記（５）に記載の方法や、（７）工程（ｂ’）で本件スプライシングバリアントのオーソログの発現を検出する方法がＰＣＲ法であることを特徴とする上記（５）又は（６）に記載の方法や、（８）工程（ｂ’）で本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する方法がウェスタンブロッティング法であることを特徴とする上記（５）〜（７）のいずれかに記載の方法に関する。
【００１３】
また上記甲状腺髄様がん治療薬の有効性を判定する方法のその他の態様としては、甲状腺髄様がん治療薬をスクリーニングする方法を挙げることができる。
【００１４】
また、本発明は、（９）本件スプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする甲状腺髄様がんの有無の判定用キットや、（１０）本件スプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対が、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなるｃＤＮＡの上流及び下流から増幅するプライマー対であり、前記上流から増幅するプライマーが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列中の、任意の連続１５〜３０塩基のプライマーであり、前記下流から増幅するプライマーが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列のそれぞれの相補配列中の、任意の連続１５〜３０塩基のプライマーであることを特徴とする上記（９）に記載のキットや、（１１）本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする甲状腺髄様がんの有無の判定用キットに関する。このキット発明は、甲状腺髄様がんを診断するためのキットに関する用途発明であり、このキットには、通常、甲状腺髄様がんを診断するための説明書が含まれる。
【００１５】
また、本発明は、（１２）配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡや、（１３）配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、甲状腺髄様がんを特異的に検出することにより、甲状腺髄様がんの早期診断を行うことや、甲状腺髄様がんの進行度を判定することが可能となり、甲状腺髄様がんの治療を行う上で極めて有用な情報を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】甲状腺髄様がん由来の細胞株（IIA-21 ヒト甲状腺髄様がん細胞株；ＴＴ）におけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を解析した結果を示す図である。図１Ａには、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物を、SYBRR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen社製)による染色とアガロースゲル電気泳動で検出した結果を示す。また、図１Ｂには、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３の配列を同定した結果を示す図である。図１Ｂ中の棒線は、ＰＣＲによる増幅領域を示す。
【図２】１４種類の胃がん細胞株（ＨＧＣ−２７、ＮＣＩ−Ｎ８７、Ｈｓ７４６Ｔ、ＡＧＳ、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−１、ＫＡＴＯIII、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ１、Ａｚ５２１−Ｐ７ａ−１Ｇ３、Ａｚ５２１−Ｐ７ａ−Ａｓｃ、Ａｚ５２１、ＭＫＮ４５−Ｐ１４ＧＡ、及びＭＫＮ４５）（図２Ａのレーン１〜１４）及び１２種類の大腸がん細胞株（ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＨＣＴ−１１６、Ｃ１７０、Ｃｏｌｏ２０５、ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ、Ｃｏｌｏ７４１、ＳＮＵ−Ｃ１、ＨＣＣ５６、ＬＳ１２３、及びＳＷ９４８）（図２Ｂのレーン１〜１２）におけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を解析した結果を示す図である。図２Ａ及びＢには、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物が、SYBRR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen社製)による染色とアガロースゲル電気泳動で検出されなかった結果を示す。なお、ポジティブコントロールとしてＴＴ細胞株由来のＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物を用いた（図２Ａのレーン１５、及び図２Ｂのレーン１３）。
【図３】４種類の大腸がん細胞株（ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６、ＬＳ１０３４、及びＴ８４）（図３Ａのレーン１〜４）、２種類の胃がん細胞株（ＨＳＣ３９及びＫＡＴＯIII）（図３Ａのレーン５〜６）、１種類の胃がん細胞株（ＭＫＮ４５）（図３Ａのレーン７）、３種類の膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、及びＱＧＰ−１）（図３Ａのレーン８〜１０）、７種類の膵臓がん細胞株（Ｐａｎｃ１０．０５、ＳＵ．８６．８６、ＣＦＰＡＣ−１、ＰＳＮ１、ＨｕＰ−Ｔ３、ＨｕＰ−Ｔ４、及びＡｓＰＣ−１）（図３Ｂのレーン１〜７）におけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を解析した結果を示す図である。図３Ａ及びＢには、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物が、SYBRR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen社製)による染色とアガロースゲル電気泳動で検出されなかった結果を示す。なお、ポジティブコントロールとしてＴＴ細胞株由来のＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物を用いた（図３Ａのレーン１１、図３Ｂのレーン８）。
【図４】７種類の乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＦＭ−２２３、ＨＣＣ−１９５４、Ｔ−４７Ｄ、ＭｃＦ７、及びＨＣＣ−１８０６）（図４Ａのレーン１〜７）、５種類の肺がん細胞株（ＡＢＣ−１、ＨＣＣ８２７、ＰＣ−１４、ＰＣ−９、及びＳＫ−ＬＵ−１）（図４Ａのレーン８〜１２）、３種類の甲状腺がん細胞株（８５０５Ｃ、ＦＴＣ−１３３、及びＫ１）（図４Ａのレーン１３〜１５）、及び１種類の肺がん細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５９６）（図４Ｂのレーン１）におけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの発現を解析した結果を示す図である。図４Ａ及びＢには、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物が、SYBRR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen社製)による染色とアガロースゲル電気泳動で検出されなかった結果を示す。なお、ポジティブコントロールとしてＴＴ細胞株由来のＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物を用いた（図４Ａのレーン１６、及び図４Ｂのレーン２）。
【図５】甲状腺髄様がんにおけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の甲状腺髄様がんの有無を判定する方法としては、例えば、被験者（提供者）から採取された判定用試料中の、本件スプライシングバリアントの発現、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する工程（ａ）；及び工程（ａ）で本件スプライシングバリアントの発現、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現が検出された場合、判定用試料提供者（被験者）が甲状腺髄様がんである可能性が高いと評価する工程（ｂ）；を順次備えた方法（但し、医師による診断行為を除く。）であれば特に制限されず、また、本発明の甲状腺髄様がん治療薬の有効性を判定する方法としては、（ａ’）甲状腺髄様がんに罹患したモデル動物に被検薬剤又は被検物質を投与する工程：（ｂ’）前記モデル動物より採取された判定用試料における、本件スプライシングバリアントのオーソログの発現、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現を検出する工程：（ｃ’）前記判定用試料における本件スプライシングバリアントのオーソログの発現量、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現量と、対照となる被検薬剤又は被検物質を未投与の場合における発現量とを比較する工程；（ｄ’）判定用試料における本件スプライシングバリアントのオーソログの発現量、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現量が、被検薬剤又は被検物質を未投与のときの発現量と比較して減少している場合、被検薬剤又は被検物質が甲状腺髄様がんの治療に有効な治療薬と評価する工程；を順次含む方法であれば特に制限されず、さらに、本発明の甲状腺髄様がんの有無の判定用キットとしては、本件スプライシングバリアントの発現量を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット１」ということがある）や、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット２」ということがある）であれば特に制限されず、ここで本件キット１や本件キット２は、甲状腺髄様がんの有無の判定用キットとしての用途発明に限定されるものである。そして、これらキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書等の添付文書が通常含まれる。なお、本発明の甲状腺髄様がんの有無を判定する方法には、甲状腺髄様がんの有無を判定するためのデータを収集する方法や甲状腺髄様がん治療の予後を予測するためのデータを収集する方法が含まれ、本発明の甲状腺髄様がん治療薬の有効性を判定する方法には、甲状腺髄様がん治療薬をスクリーニングする方法が含まれる。本発明において、「甲状腺髄様がん」には、遺伝性のものも孤発性のものも含まれる。
【００１９】
上記判定用試料提供者としては、甲状腺髄様がん、すなわち、甲状腺組織中のＣ細胞（濾胞傍細胞[parafollicular cell]）にがんが存在するかどうか不明な被験者であれば特に制限されず、この中には、甲状腺組織中のＣ細胞へのがんの転移が不明な、大腸がん患者、胃がん患者、膵臓がん患者、甲状腺がん患者、肺がん患者、乳がん患者などの非甲状腺髄様がん患者も含まれる。
【００２０】
本件スプライシングバリアントには、ゲノムＤＮＡにコードされるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子から転写された一次転写産物（不均質核内ＲＮＡ[ｈｎＲＮＡ]）が、スプライシング過程により、イントロンが切除され、エキソン配列が連結したｍＲＮＡ又はその逆転写物（ｃＤＮＡ）の他に、スプライシング過程において、異なるパターンのスプライシングが起こることにより産生された異なるｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡも含まれる。本件スプライシングバリアントとしては、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにも登録されている、配列番号２に示される塩基配列からなる本件スプライシングバリアントの他に、本実施例で初めて同定された、配列番号１に示される塩基配列からなる本件スプライシングバリアントや、配列番号３に示される塩基配列からなる本件スプライシングバリアントを具体的に挙げることができる。
【００２１】
本件スプライシングバリアントを検出する方法としては、本件スプライシングバリアントの一部又は全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡ）に相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いたＰＣＲ法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、本件スプライシングバリアント（ｃＤＮＡ）に相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができ、これらの中でもＰＣＲ法で検出する方法が好ましい。なお、上記ＰＣＲ法には、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法が含まれる。
【００２２】
本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質としては、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにも登録されている、配列番号２に示される塩基配列からなるｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列である、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の他に、配列番号１に示される塩基配列からなるｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列である、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列である、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を具体的に挙げることができる。
【００２３】
本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を検出する方法としては、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の一部又は全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法や、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができる。免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法等を挙げることができ、これらの中でもウェスタンブロッティング法を好適に例示することができる。上記質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を使用することも、質量分析計へ導入前にペプチド試料を液体クロマトグラフ（ＬＣ）やＨＰＬＣで分離することもでき、また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。
【００２４】
本件スプライシングバリアントのオーソログや、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの配列情報は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索し、適宜入手することができ、例えば、本件スプライシングバリアントのオーソログや、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログがラット等において知られている。
【００２５】
本発明の甲状腺髄様がんの有無を判定する方法において、甲状腺髄様がんに罹患したモデル動物としては、甲状腺髄様がんを自然に罹患したモデル動物であってもよいし、がん遺伝子の過剰発現や甲状腺髄様がん原因遺伝子の変異体の過剰発現や発がん物質で甲状腺髄様がんを誘導したモデル動物であってもよく、甲状腺髄様がん原因遺伝子の変異体の過剰発現で甲状腺髄様がんを誘導したモデル動物としては、例えばＲＥＴ変異体が過剰発現するトランスジェニックマウスが報告されていることから（Kawai K., et al. Cancer Res. 60: 5254-5260, 2000）、かかるトランスジェニックマウスを作製し用いることができる。上記モデル動物としてマウスの他、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物モデルを例示することができる。
【００２６】
本発明の甲状腺髄様がんの有無を判定する方法において、対照となる被検薬剤又は被検物質を未投与の場合における発現量とは、被検薬剤又は被検物質の未投与の、甲状腺髄様がんに罹患したモデル動物より採取された試料における本件スプライシングバリアントのオーソログや本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質のオーソログの発現量のことをいい、ここで被検薬剤又は被検物質の未投与の、甲状腺髄様がんに罹患したモデル動物より採取された試料は、判定用試料と同様の処理が施された試料であることが好ましい。
【００２７】
本発明の判定する方法における判定用試料としては、甲状腺におけるＣ細胞由来の組織、細胞等の非液性試料や、血液、唾液等の液性試料を例示することができる。例えば、上記甲状腺におけるＣ細胞由来の非液性試料は、Ｃ細胞を含むものであれば濾胞細胞の一部を含むものであってもよく、また、非液性試料は、判定用試料提供者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。
【００２８】
本件キット１におけるプライマー対としては、本件スプライシングバリアント（ｃＤＮＡ）の上流及び下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー対であり、且つ本件スプライシングバリアントを特異的に検出できるものであれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができ、ここで特異的に検出するとは、本件スプライシングバリアント以外のｃＤＮＡをほとんど又は全く検出せずに、本件スプライシングバリアントを検出することを意味する。
【００２９】
本件スプライシングバリアントとして、例えば、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる本件スプライシングバリアント（ｃＤＮＡ）を検出する場合、本件キット１におけるプライマー対としては、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなるｃＤＮＡの上流及び下流から増幅するプライマー対であればよいが、上流から増幅するプライマーが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列中の、任意の連続１５〜３０塩基のプライマーであり、下流から増幅するプライマーが、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列のそれぞれの相補配列中の、任意の連続１５〜３０塩基のプライマーが好ましく、配列番号１〜３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡを同時に検出する場合、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子の少なくともエキソン２の一部又は全部、エキソン３〜６、及びエキソン７の一部又は全部を含む領域を増幅できるプライマー対がより好ましく、具体的には配列番号７及び８に示される塩基配列からなるプライマー対を挙げることができる。また、上記本件キット１には、ＧＡＰＤＨやアクチンなどのハウスキーピング遺伝子を検出する内部コントロール用プライマー対を含めることができる。
【００３０】
本件キット１におけるプローブとしては、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡやそのｃＤＮＡ）の一部又は全部がハイブリダイゼーションし、且つ本件スプライシングバリアントを特異的に検出できるものであれば、プローブの長さ、かかるスプライシングバリアントとハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができ、ここで特異的に検出するとは、本件スプライシングバリアント以外のｍＲＮＡやそのｃＤＮＡをほとんど又は全く検出せずに、本件スプライシングバリアントを検出することを意味する。
【００３１】
本件スプライシングバリアントとして、例えば、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなる本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡやそのｃＤＮＡ）を検出する場合、本件キット１におけるプローブとしては、配列番号１〜３のいずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイゼーションするプローブであればよく、ハイブリダイゼーションするプローブの長さ（塩基）としては、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮すると、通常３００塩基以下であり、２００塩基以下が好ましく、１５０塩基以下がより好ましく、１００塩基以下がさらに好ましい。
【００３２】
本件キット２における抗体としては、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合できる抗体であれば特に制限されず、ここで、「本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する」とは、本発明の抗体又はその標識物の、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に対する親和性が、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質以外のタンパク質に対する親和性と比較して高いことを意味する。上記「高い親和性」とは、通常、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１、さらに好ましくは、少なくとも１０１０Ｍ−１である結合親和性を意味する。
【００３３】
本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質として、例えば、配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を検出する場合、本件キット２における抗体としては、配列番号４〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の構造（一次構造、二次構造、三次構造）を特異的に結合できるものであれば、抗体のエピトープは特異性を考慮して適宜選択することができ、エピトープの長さとしては、通常５〜４０アミノ残基数であり、１０〜３０アミノ酸残基数が好ましく、１３〜１７アミノ酸残基数がより好ましい。
【００３４】
本件キット２における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。また、上記本件キット２には、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に結合した本発明の抗体を検出するための、蛍光物質、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Horse Radish Peroxidase;ＨＲＰ）等の標識物質をコンジュゲートした２次抗体を含めることや、本発明の抗体とは異なる部位で本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質と反応する少なくとも１種類の抗体を含めることができる。また、本件キット２には、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器等をさらに備えたものであってもよい。
【００３５】
本件キット１のプライマー対又はプローブの標識物における標識物質や、本件キット２の抗体の標識物における標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジンなどを挙げることができる。
【００３６】
本件キット２における抗体（以下、「本件抗体」ということがある）は、慣用のプロトコールを用いて、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を構成するポリペプチドをマウス、ラット等のヒト以外の動物へ投与し、本件抗体を産生する細胞クローンを細胞融合技術によりスクリーニングすることにより、得ることができる。上記スクリーニングする方法としては、例えば本件抗体を用いた上述の免疫学的測定法により、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質以外のものはほとんど検出されずに、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を特異的に検出することを確認する方法を挙げることができる。
【００３７】
本件抗体は、本件抗体を産生する細胞クローンを基に本件抗体をコードする遺伝子配列を同定し、遺伝子組換え技術により、本件抗体遺伝子を発現させることにより、組換え抗体として作製することもできる。組換え抗体を作製する方法としては、例えば本件抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、かかる発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞などの宿主細胞へ導入して、宿主細胞において組換え抗体を生産させる方法を挙げることができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。特に、キメラ抗体は、特開２００５−２４５３３７に記載の技術に基づいて作製することができる。発現ベクターに組み込む抗体遺伝子の塩基配列は、発現させる宿主細胞に合わせてコドン配列の最適化がされていてもよい。
【００３８】
また、トランスジェニック動物作製技術を用いて本件抗体遺伝子が組み込まれたマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ブタ等のトランスジェニック動物を作製し、かかるトランスジェニック動物の血液、ミルク中などから本件抗体遺伝子に由来する抗体を大量に産生させることもできる。
【００３９】
形質転換細胞、トランスジェニック動物、ハイブリドーマ等により産生された本件抗体は、例えばＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を用いて精製することができる。
【００４０】
本発明の配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡは、本件スプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対やプローブの設計に有用であり、また本発明の配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体の作製に有用である。さらに、本発明の配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡや本発明の配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、本発明の判定方法や判定用キットにおいてコントロールとして用いることができる。
【００４１】
本発明の配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡは、例えば以下の方法で作製することができる。ＴＴ細胞株などの甲状腺髄様がん由来の細胞株から、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning,A laboratorymanual）などに記載の方法や、RNeasy(登録商標) Plus Mini Kit（QIAGEN社製）などの市販のキットを用いて、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のｍＲＮＡを含む全ＲＮＡを単離することができる。また、単離した全ｍＲＮＡを鋳型として、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアルに記載の方法や、PrimeScript(登録商標) II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa社製）などの市販のキットを用いてｃＤＮＡを合成し、本発明の配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、本発明の配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡを増幅することができる。ここでｃＤＮＡを増幅する方法としては、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの全長を増幅できるプライマー対を用いて増幅する方法であっても、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントを少なくとも２以上のパーツに分けて増幅できるプライマー対を用いて各パーツを増幅した後、各パーツを鋳型としてＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアントの全長を増幅できるプライマー対を用いて増幅する方法であってもよい。
【００４２】
本発明の配列番号４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、例えば次の方法で作製することができる。本発明の配列番号１又は３に示される塩基配列からなるｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み大腸菌等によってタンパク質を合成する。得られたタンパク質は、タグ配列を利用した精製法等の公知の条件・方法によって精製することができる。精製したタンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、ＢＣＡ法などのタンパク質定量法で正確な量（濃度）を算出することができる。
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
１．がん胎児性抗原関連細胞接着分子４（ＣＥＡＣＡＭ４）遺伝子のｍＲＮＡの発現解析
甲状腺髄様がん細胞において、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のｍＲＮＡが発現するかどうかを、ＴＴ細胞株を用いて検討した。
１−１  方法
〔１〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養したＴＴ細胞株から、キット（RNeasy Plus Mini Kit、QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを単離した。
〔２〕単離した全ＲＮＡ４０μｇに、Promega社製ＤＮａｓｅ処理溶液（RQ1 DNase 10x Reaction Buffer；１０μｌ、RNasin(登録商標) Plus RNase Inhibitor１μｌ、RQ1 RNase - Free Dnase１０μｌ）を加え、RNase Free Waterで最終体積を１０１μｌに調整した後、３７℃で３０分間、ＤＮａｓｅ処理を行った。
〔３〕ＤＮａｓｅ処理後のサンプルから、キット（RNeasy MinElute Cleanup Kit、QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを精製した。
〔４〕精製した全ＲＮＡを用いて、キット（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis  Kit、TaKaRa社製）によりｃＤＮＡを合成した。
〔５〕合成したｃＤＮＡを用いて、キット（QIAquick PCR Purification Kit、QIAGEN社製）によりｃＤＮＡを精製した。
〔６〕精製したｃＤＮＡ溶液に、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のエキソン２〜７を含む領域を増幅するプライマー対（配列番号７及び８）１０μＭ、及びTaKaRa社製ＰＣＲ反応溶液（10x LA PCR(登録商標) Buffer II（Mg2+ free）；５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；４μｌ、２．５ｍＭdNTP Mixture for PCR；８μｌ、TaKaRa LA TaqTM；０．５μｌ）を加えた後、以下の１）〜６）に示した条件でサーマルサイクラー（TGRADIENT、Biometra社製）を用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅した後、ＰＣＲ産物をSYBRR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen社製）による染色とアガロースゲル電気泳動で検出した（図１Ａ）。なお、生成したＰＣＲ産物は４℃で保存した。
１）９５℃、２分を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９５℃、３０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）６０℃、３０秒を１サイクル（プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング）
４）６８℃、１５秒を１サイクル（プライマー対によるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子由来のｃＤＮＡの増幅）
５）２）〜４）のサイクルをさらに３４回繰り返す。
６）６８℃、７分を１サイクル（プライマー対によるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子由来のｃＤＮＡの増幅）
【００４５】
１−２  結果
甲状腺髄様がん由来のＴＴ細胞株における、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のｍＲＮＡの発現を解析した結果、図１Ａに示した３種類のＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のｍＲＮＡ（塩基配列が長い順に、スプライシングバリアント１〜３という）由来のＰＣＲ産物がＴＴ細胞株で検出されることが明らかとなった。さらに、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３が、甲状腺髄様がん細胞で特異的に発現するかどうかを解析した。１５種類の胃がん細胞株（ＨＧＣ−２７、ＮＣＩ−Ｎ８７、Ｈｓ７４６Ｔ、ＡＧＳ、ＳＮＵ−１６、ＳＮＵ−１、ＫＡＴＯIII、ＭＫＮ７４、ＭＫＮ１、Ａｚ５２１−Ｐ７ａ−１Ｇ３、Ａｚ５２１−Ｐ７ａ−Ａｓｃ、Ａｚ５２１、ＭＫＮ４５−Ｐ１４ＧＡ、ＭＫＮ４５、及びＨＳＣ３９）、１６種類の大腸がん細胞株（ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＨＣＴ−１１６、Ｃ１７０、Ｃｏｌｏ２０５、ＤＬＤ−１、Ｌｏｖｏ、Ｃｏｌｏ７４１、ＳＮＵ−Ｃ１、ＨＣＣ５６、ＬＳ１２３、ＳＷ９４８、ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６、ＬＳ１０３４、及びＴ８４）、１０種類の膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、ＱＧＰ−１、Ｐａｎｃ１０．０５、ＳＵ．８６．８６、ＣＦＰＡＣ−１、ＰＳＮ１、ＨｕＰ−Ｔ３、ＨｕＰ−Ｔ４、及びＡｓＰＣ−１）、７種類の乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＦＭ−２２３、ＨＣＣ−１９５４、Ｔ−４７Ｄ、ＭｃＦ７、及びＨＣＣ−１８０６）、６種類の肺がん細胞株（ＡＢＣ−１、ＨＣＣ８２７、ＰＣ−１４、ＰＣ−９、ＳＫ−ＬＵ−１、及びＮＣＩ−Ｈ５９６）、及び３種類の甲状腺がん細胞株（８５０５Ｃ、ＦＴＣ−１３３、及びＫ１）におけるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子由来のスプライシングバリアント１〜３を、上記「１−１  方法」に記載の方法により解析したところ、これらいずれのがん細胞株においても、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物は検出されなかった（図２〜４）。この結果は、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３が、甲状腺髄様がん細胞で特異的に発現することを示している。
【実施例２】
【００４６】
２．ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３の同定
上記実施例１に記載の方法により検出された、甲状腺髄様がん細胞で特異的に発現するＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３について、その配列を同定することを試みた。
２−１  方法
〔１〕上記実施例１のアガロースゲル電気泳動後における、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物（バンド）を切り出した。
〔２〕アガロースゲルからＰＣＲ産物の精製は、キット（QIAquick Gel Extraction Kit、QIAGEN社製）を用いて行った。
〔３〕ＰＣＲ産物のクローニングは、キット（TOPO TA Cloning(登録商標) Kit for Sequencing、invitrogen社製）を用いて行った。すなわち、ＰＣＲ産物をTOPO(登録商標) Cloning Reactionを用いてpCRTM2.1-TOPOベクターへ挿入した後、ＰＣＲ産物を含むベクターをOne Shot(登録商標) TOP10 Competent Cells（コンピテントセル）へ形質転換した。
〔４〕形質転換したコンピテントセルから、キット（QuickLyse Miniprep Kit、QIAGEN社製）を用いてＰＣＲ産物を含むベクターを精製した。
〔５〕ＰＣＲ産物を含むベクターを鋳型としたシーケンス用ＰＣＲは、プライマー（配列番号７〜１０）、キット（BigDye(登録商標) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit、Applied Biosystems社製）を用いて、以下の１）〜５）に示した条件でサーマルサイクラー（GeneAmp(登録商標)R PCR System 9700、Applied Biosystems社製）により行った。なお、生成したシーケンス用ＰＣＲ産物は４℃で保存した。
１）９６℃、１分を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９６℃、１０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）５０℃、５秒を１サイクル（プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング）
４）６０℃、４分を１サイクル（プライマーからの伸長反応）
５）２）〜４）のサイクルをさらに２４回繰り返す。
〔６〕シーケンス用ＰＣＲ産物の塩基配列は、ＤＮＡシークエンサー（3130xl Genetic Analyzer、Applied Biosystems社製）を用いて決定した。
【００４７】
２−２  結果
ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３由来のＰＣＲ産物を基に、その塩基配列を同定した結果、それぞれ配列番号１１〜１３で示される塩基配列からなるＰＣＲ産物であることが明らかとなった。かかる塩基配列情報を基に、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のエキソン２〜７の領域を詳細に調べたところ、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１は、エキソン６と７との間に配列番号１４で示される塩基配列からなるイントロンが挿入されたものであること、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント３は、エキソン３が欠失したものであることが確かめられた（図１Ｂ）。また、これらのスプライシングバリアントは、本発明において、新規に同定されたスプライシングバリアントであることが明らかとなった。他方、ＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント２は、エキソン２〜７に挿入や置換や欠失などは認められなかった（図１Ｂ）。また、かかるスプライシングバリアントは、ＮＣＢＩのデータベースにも登録されている既知のものであることが明らかとなった。以上の結果から、配列番号１〜３で示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３が、甲状腺髄様がん細胞で特異的に発現していることが明らかとなった。さらに、かかるスプライシングバリアント１〜３がコードするタンパク質は、それぞれ配列番号４〜６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることも明らかとなった。なお、配列番号４及び６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、それぞれイントロンの挿入及びエキソン３の欠失により、フレームシフトが起こっていることも確認された。
【実施例３】
【００４８】
３．ＣＥＡＣＡＭ４タンパク質の発現解析
上記実施例１及び２における解析から、甲状腺髄様がん細胞でＣＥＡＣＡＭ４遺伝子のスプライシングバリアント１〜３が特異的に発現することがわかったので、甲状腺髄様がん細胞でＣＥＡＣＡＭ４タンパク質が発現しているかどうかを解析した。インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養したＴＴ細胞株から、lysisバッファー （50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、7.5 M Urea、2.5 M Thio-Urea、12.5% glycerol、2.5% N-Octylglucosid、6.25 mM TCEP、1.25 mM protease inhibitor）を用いて細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでかかる細胞抽出液に含まれるタンパク質（２０μｇ）を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写させた後、抗ＣＥＡＣＡＭ４抗体（rabbit polyclonal antibody、abcam社製、又はmouse monoclonal antibody、R&D社製）を一次抗体として、ＨＲＰ標識ラビットＩｇＧ抗体又はマウスＩｇＧ抗体を二次抗体として用いてウェスタンブロッティング法による解析を行った。検出は化学発光検出（ECL Prime Western Blotting Detection Reagent）（GE Healthcare社製）を用いて行った。その結果、甲状腺髄様がん細胞で、ＣＥＡＣＡＭ４タンパク質が発現していることがわかった（図５の矢印参照）。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、甲状腺髄様がん発症予防や早期発見に必要な定期検診等のがんの検診者の増加が期待される他、早期がんの段階で診断・治療をうける検診者が増えることや、甲状腺髄様がんによる死亡率を下げることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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