(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体若しくはその一部、該ヒトモノクローナル抗体を産生する細胞、該ヒトモノクローナル抗体または該酸化LDL受容体とそのリガンドの相互作用を阻害する物質を含んでなる医薬組成物を提供する。【解決手段】遺伝子工学技術を用いて作製したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに可溶性ヒト酸化LDL受容体（LOX-1）を免疫することにより、ヒトLOX-1に結合し、LOX-1の生体内リガンドのLOX-1への結合、及びLOX-1を介する該リガンドの細胞内への取込みを阻害する種々のヒトモノクローナル抗体。さらに、種々の疾患の予防及び治療に有効であることを見出された、該ヒトモノクローナル抗体を含む医薬品組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項２】
該ヒトモノクローナル抗体が、酸化LDLのヒト酸化LDL受容体への結合または酸化LDLのヒト酸化LDL受容体を介した細胞内への取込を阻害する活性を有することを特徴とする請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項３】
該ヒトモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラスが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項４】
該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との結合速度定数（ｋａ）が、1.0×104(1/M.Sec)以上の数値であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項５】
該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との解離速度定数（ｋｄ）が、1.0×10-2(1/Sec)以下の数値であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項６】
該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-6(M)以下の数値であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項７】
該結合速度定数（ｋａ）が、1.0×105(1/M.Sec)以上の数値であることを特徴とする請求項４に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項８】
該解離速度定数（ｋｄ）が、1.0×10-4(1/Sec)以下の数値であることを特徴とする請求項５に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項９】
該解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-7(M)以下の数値であることを特徴とする請求項６に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１０】
該解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-8(M)以下の数値であることを特徴とする請求項９に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１１】
該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１乃至請求項１０のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１２】
該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト酸化LDL受容体を発現する細胞、該細胞の可溶性膜画分またはヒト酸化LDL受容体の全部若しくは一部を、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１３】
該トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項１３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体を産生する細胞。
【請求項１５】
該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体を産生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体の重鎖をコードするDNA若しくはその軽鎖をコードするDNAのいずれか一方のDNA、または両方のDNAが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項１３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
該医薬組成物が、ヒト酸化LDL受容体の生体内リガンドの該酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を発現する細胞による取込を阻害するために用いられることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該医薬組成物が、動脈硬化症の治療に用いられることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
該医薬組成物が、該酸化LDL受容体への血小板若しくは活性化血小板の結合、または該酸化LDL受容体を発現する細胞による血小板若しくは活性化血小板の取込に起因する疾患を治療するために用いられることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
該疾患が、血小板減少を伴う疾患であることを特徴とする請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該疾患が、腎臓疾患であることを特徴とする請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
該医薬組成物が、白血球の組織への浸潤を阻害するために用いられることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
該白血球の組織への浸潤が、動脈硬化症、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症反応で見られるものであることを特徴とする請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
該医薬組成物が、炎症の治療に用いられることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
該炎症が、動脈硬化症、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症であることを特徴とする請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該医薬組成物が、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後血管再狭窄の治療に用いられることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ヒト酸化LDL受容体の生体内リガンドの該酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を発現する細胞による取込を阻害する活性を有する物質を含んでなる血栓形成の抑制または予防のための医薬組成物。
【請求項２９】
該物質が、ヒト酸化LDL受容体に結合するモノクローナル抗体またはその一部であることを特徴とする請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
該モノクローナル抗体またはその一部が、請求項１乃至請求項１３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部であることを特徴とする請求項２９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヒト酸化LDL受容体（oxidized-LDL receptor；以下「LOX-1」と呼ぶこともある。）に結合するヒトモノクローナル抗体若しくはその一部、該ヒトモノクローナル抗体を産生する細胞、該ヒトモノクローナル抗体または該酸化LDL受容体とそのリガンドの相互作用を阻害する物質を含んでなる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
あらゆる組織及び血中に存在する種々形態のコレステロール（遊離型、長鎖脂肪酸型、及びエステル型）は、主に肝臓での生合成に由来する。肝臓で生合成された遊離型コレステロールは、超低密度リポ蛋白（VLDL）に取り込まれ、血中でリポ蛋白リパーゼ（LPL）及び肝性トリグリセリドリパーゼ（HTGL）の作用により、中間密度リポ蛋白（IDL）を経た後、低密度リポ蛋白（LDL；Low-Density Lipoprotein）へと代謝される。このLDLは、LDL受容体を 介して末梢細胞へと取り込まれることにより、生体の細胞膜の構成において重要な役割を果たしている。
【０００３】
しかしながら、このLDLが、血管内皮細胞などの細胞による作用、種々の化学的・物理的な要因、あるいは熱などの種々の要因により酸化変性を受けると、酸化LDL（Oxidized LDL）と呼ばれる変性LDLが血中に生ずることとなる。血流中には十分量の抗酸化物質があるため、もともと血流中には酸化LDLが生じにくくはあるが、例え生じた場合であっても、それらのほとんどは肝臓で代謝される。
【０００４】
一方、血管内皮下及び血管壁では、血管内皮細胞やマクロファージなどの細胞依存性化学変性並びにＦｅ3+などの作用による細胞非依存性化学変性とにより酸化LDLが生ずるが、血流中での生成の場合と異なり、血管内皮下及び血管壁で生じた酸化LDLは、マクロファージの細胞内に蓄積されることとなる。
【０００５】
酸化LDLのマクロファージ細胞内への蓄積は、そのようにして生成した酸化LDLが、種々の変性LDL（酸化LDL、アセチルLDL、サクシニルLDL、マロンジアルデヒドLDL）に対する受容体であるマクロファージの細胞表面のスカベンジャー受容体を介して細胞内に取り込まれることによるものである（Nature, Vol.343, p.531-535, 1990；Nature, Vol.343, p.570-572, 1990；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p.9133-9137, 1990；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.87, p.8810-8814, 1990；Curr. Opin. Lipodol., Vol.2, p.295-300, 1991；及びJ. Clin. Invest., Vol.90, p.1450-1457, 1992）。
【０００６】
このマクロファージスカベンジャー受容体は、LDL受容体と異なり、細胞内のコレステロールの量に依存した受容体のダウンレギュレーションを受けない。従って、血管内皮下や血管壁に潜り込んだマクロファ−ジは、多量の変性LDLを取込むことにより細胞内に多量のコレステロールを蓄積し、泡沫細胞化することとなる（「分子動脈硬化学」、第４章「炎症細胞  １．スカベンジャー受容体」、第249-258頁、1995年、メディカルレビュー社発行）。
【０００７】
一方、上述の血管内皮下や血管壁に潜り込んだマクロファ−ジは、血流中、血管内皮下あるいは血管壁などの種々部位で生じた酸化LDLの生成シグナルに応答して、血流中から移入してきたマクロファージに由来する。即ち、酸化LDLが、血流中のマクロファージや単球に対して走化性を示し、血管内皮細胞上に単球やマクロファージを集結させる性質、集結した単球やマクロファージの血管内皮下への潜り込み並びに血管壁へ引き込みを誘導する性質、引き込まれた単球のマクロファージへ分化を誘導する性質を誘導、さらに分化を完了したマクロファージの遊走を抑制する性質を有することによるものである。
【０００８】
この単球やマクロファージの血管内皮細胞への集結には、最近同定された血管内皮細胞上に発現している酸化LDL受容体（Oxidized-LDL Receptor、Ox-LDL ReceptorまたはLOX-1と称される。Nature, Vol.386, p.73-77, 1997、及び脂質生化学研究, Vol.39, p.83-84, 1997；Genomics, Vol.54, No.2, p.191-199, 1998; Biochem. J., Vol.339, Part 1, p,177-184, 1999; Biochem. J., Vol.330, Part 3, p.1417-1422, 1998）が深く関与していることが明らかにされつつある。
【０００９】
これまでの研究から、血流中の酸化LDLが、酸化LDL受容体を介して血管内皮細胞に取り込まれると、細胞内での一酸化窒素（NO）の産生が阻害され、この結果、血管内皮細胞の表面に細胞接着分子の発現が誘導されることが実験的に証明されている。このことから、細胞接着分子が発現する結果、マクロファージや単球が、血管内皮細胞上にトラップされ、トラップされたマクロファージや単球が、血管内皮下及び血管壁に潜り込むものと考えられている。そうして、血管内皮下及び血管壁に潜り込んだマクロファージは、上述したようにマクロファージスカベンジャー受容体を介した酸化LDLの取込みにより泡沫細胞化するものと考えられている。
【００１０】
この血管壁でのマクロファージの泡沫細胞化は、動脈硬化症の主な原因であることから、動脈硬化症の発症の引金は、上述した単球やマクロファージの血管内皮細胞への集結であると考えられている。
【００１１】
この単球やマクロファージの血管内皮細胞への集結に深く関与する酸化LDL受容体（LOX-1）の生物学的機能及び種々疾患との関連性については目下精力的に研究が進められているところであるが、最近になってさらなる知見が報告されている。
【００１２】
（１）血管動脈硬化巣においてLOX-1の顕著な発現が見られる（Circulation, Vol.99, No.24, p.3110-3117, 1999）。
（２）高血圧モデルラットにおいてLOX-1の発現の上昇が見られる（Biochem. BiopHys. Res. Commun., Vol.237, No.3, p.496-498, 1997）。
（３）シアストレス（shear stress）によりLOX-1の発現が上昇する（Circ. Res., Vol.83, No.3, p.328-333, 1998）。
（４）LOX-1は、血管内皮細胞のみならずマクロファージにも発現し、その発現は、TNFαの刺激により上昇する（FEBS Lett., Vol.440, No.1-2, p.29-32, 1998）。
（５）LOX-1の発現は、アンギオテンシンIIにより増強される（Circ. Res., Vol.84, No.9, p.1043-1049, 1999; Circulation, Vol.100, No.9, p.899-902, 1999）。
（６）酸化LDLのみならず、生体内の老廃物であるapoptotic細胞（アポトーシスにより細胞死に向かっている細胞）、老化赤血球、及び活性化血小板なども酸化LDL受容体（LOX-1）を介して細胞内に取り込まれる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.95, p.9535-9540, 1998；Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.97, No.1, p.360-364, 2000）。
【００１３】
一方、ヒト酸化LDL受容体（LOX-1）に対する抗体については、非ヒト哺乳動物由来の抗体が報告されているに過ぎず、ヒト由来のモノクローナル抗体の作製、並びに該ヒトモノクローナル抗体を用いた種々疾患の治療の試みについては、未だ全く報告されていない。
【発明の概要】
【００１４】
発明の開示
酸化LDL受容体（LOX-1）と種々の生体内リガンド（酸化LDLなどの変性LDL、apoptotic細胞、老化赤血球、活性化血小板など）の相互作用（該リガンドのLOX-1への結合、及び該リガンドのLOX-1を介した細胞内への取込）は、種々の疾患症状、例えば、動脈硬化症、血小板減少症、腎疾患、種々の炎症（例えば、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症反応など）、PTCAやPTCRの術後の血管再狭窄、血管における血栓の形成などの発症に深く関与する可能性が示唆される。
【００１５】
従って、酸化LDL受容体に結合する物質または酸化LDL受容体を介する該酸化LDL受容体のリガンドの細胞内への取込を阻害する物質（例えば、合成低分子化学物質や抗体またはその一部など）を用いて酸化LDL受容体と該リガンドとの相互作用を抑制することにより、それらの病態を治療または予防できるものと考えられる。
【００１６】
即ち、本発明は、上述のような種々の疾患の治療に極めて有用なヒト酸化LDL受容体（LOX-1）に対するヒトモノクローナル抗体、並びに該ヒトモノクローナル抗体や該酸化LDL受容体とそのリガンドとの相互作用を阻害する物質（例えば、酸化LDL受容体に対する種々のモノクローナル抗体や合成低分子化学物質など）を用いる上述の種々疾患を治療するための医薬組成物及びその治療・予防方法を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明者らは、上述の目的を達成するために、ヒト酸化LDL受容体（LOX-1）に対するヒトモノクローナル抗体に関して鋭意研究した結果、遺伝子組換え技術を用いてヒトの抗体を産生するように作製したトランスジェニックマウスを可溶性酸化LDL受容体などで免疫することによって、ヒト酸化LDL受容体に結合する種々のヒトモノクローナル抗体、特にはヒト酸化LDL受容体に結合し、酸化LDL受容体の生体内リガンド（酸化LDLなど）の細胞内への取込を阻害する種々のヒトモノクローナル抗体を作製することに世界に先駆けて初めて成功した。
【００１８】
さらに、本発明のヒト酸化LDL受容体（LOX-1）に結合するヒトモノクローナル抗体が、ヒト酸化LDL受容体を介する種々の生体内リガンド（酸化LDLなど）の細胞内への取込を有意に阻害するのみならず、種々疾患（例えば、動脈硬化症、血小板減少症、腎疾患、種々の炎症（例えば、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症反応など）、PTCAやPTCRの術後の血管再狭窄など）、血管における血栓の形成の治療、抑制及び／または予防効果を有することを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトに由来する抗体であることから、マウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副作用）であったヒトに対する抗原性、即ちHAMA（Human anti-mouse antigenicity）に起因する宿主の重篤な免疫拒絶反応を全く惹起しないことから、抗体の医薬品としての価値を劇的に増大させるものである。
【００２０】
従って、本発明のヒト酸化LDL受容体（LOX-1）に対するヒトモノクローナル抗体及び該ヒトモノクローナル抗体からなる医薬組成物は、HAMAに起因する宿主の免疫拒絶反応を惹起することなく、上述のような種々疾患の発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
【００２１】
また、該モノクローナル抗体と同様に、ヒト酸化LDL受容体とそのリガンドの相互作用（該リガンドの該酸化LDL受容体との結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を介する細胞内への取込）を阻害する活性を有する物質を含んでなる医薬組成物も、前記のような種々の疾患症状の治療または予防に極めて有用である。
【００２２】
即ち、本発明の下記(1)乃至(27)に記載されるとおりの発明である。
(1)  ヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(2)  該ヒトモノクローナル抗体が、酸化LDLのヒト酸化LDL受容体への結合または酸化LDLのヒト酸化LDL受容体を介した細胞内への取込を阻害する活性を有することを特徴とする前記(1)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(3)  該ヒトモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラスが、IgG1またはIgG4のいずれかであることを特徴とする前記(1)または前記(2)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(4)  該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との結合速度定数（ｋａ）が、1.0×104(1/M.Sec)以上の数値であることを特徴とする前記(1)乃至前記(3)のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(5)  該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との解離速度定数（ｋｄ）が、1.0×10-2(1/Sec)以下の数値であることを特徴とする前記(1)乃至前記(3)のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(6)  該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-6(M)以下の数値であることを特徴とする前記(1)乃至前記(3)のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(7)  該結合速度定数（ｋａ）が、1.0×105(1/M.Sec)以上の数値であることを特徴とする前記(4)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(8)  該解離速度定数（ｋｄ）が、1.0×10-4(1/Sec)以下の数値であることを特徴とする前記(5)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(9)  該解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-7(M)以下の数値であることを特徴とする前記(6)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(10)  該解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-8(M)以下の数値であることを特徴とする前記(9)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(11)  該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来するモノクローナル抗体であることを特徴とする前記(1)乃至前記(10)のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(12)  該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト酸化LDL受容体を発現する細胞、該細胞の可溶性膜画分またはヒト酸化LDL受容体の全部若しくは一部を、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られるモノクローナル抗体であることを特徴とする前記(11)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(13)  該トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トランスジェニックマウスであることを特徴とする前記(11)または前記(12)に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
(14)  前記(1)乃至前記(13)のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体を産生する細胞。
(15)  該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体を産生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする前記(14)に記載の細胞。
(16)  該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体の重鎖をコードするDNA若しくはその軽鎖をコードするDNAのいずれか一方のDNA、または両方のDNAが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記(14)に記載の細胞。
(17)  前記(1)乃至前記(13)のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体若しくはその一部、及び薬学的に許容されうる担体とを含んでなる医薬組成物。
(18）  該医薬組成物が、ヒト酸化LDL受容体の生体内リガンドの該酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を発現する細胞による取込を阻害するために用いられることを特徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。
(19)  該医薬組成物が、動脈硬化症の治療に用いられることを特徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。
(20)  該医薬組成物が、該酸化LDL受容体への血小板若しくは活性化血小板の結合、または該酸化LDL受容体を発現する細胞による血小板若しくは活性化血小板の取込に起因する疾患を治療するために用いられることを特徴とする前記(18)に記載の医薬組成物。
(21)  該疾患が、血小板減少を伴う疾患であることを特徴とする前記(20)に記載の医薬組成物。
(22)  該疾患が、腎臓疾患であることを特徴とする前記(20)に記載の医薬組成物。
(23)  該医薬組成物が、白血球の組織への浸潤を阻害するために用いられることを特徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。
(24)  該白血球の組織への浸潤が、動脈硬化症、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症反応で見られるものであることを特徴とする前記(23)に記載の医薬組成物。
(25)  該医薬組成物が、炎症の治療に用いられることを特徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。
(26)  該炎症が、動脈硬化症、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症であることを特徴とする前記(25)に記載の医薬組成物。
(27)  該医薬組成物が、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後血管再狭窄の治療に用いられることを特徴とする前記(17)に記載の医薬組成物。
(28)  ヒト酸化LDL受容体の生体内リガンドの該酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を発現する細胞による取込を阻害する活性を有する物質を含んでなる血栓形成の抑制または予防のための医薬組成物。
(29)  該物質が、ヒト酸化LDL受容体に結合するモノクローナル抗体またはその一部であることを特徴とする前記(28)に記載の医薬組成物。
(30)  該モノクローナル抗体またはその一部が、前記(1)乃至前記(13)のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部であることを特徴とする前記(29)に記載の医薬組成物。
【００２３】
以下、本発明で用いる語句の意味を明らかにすることにより、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明における「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等を意味し、好ましくは、ヒト、ウシ、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスであり、特に好ましくは、ヒト、ウサギ、ラット、ハムスターまたはマウスである。
【００２５】
本発明で用いられる「ヒト以外の哺乳動物」及び「非ヒト哺乳動物」なる用語は各々同義であり、前述に定義した哺乳動物におけるヒト以外のあらゆる哺乳動物を意味する。
【００２６】
本発明において用いられる「アミノ酸」とは、自然界に存在するあらゆるアミノ酸を意味し、好ましくは、アミノ酸を表記するために用いられるアルファベットの三文字表記法または一文字表記法に従って各々下記のように表されるアミノ酸を意味する。
【００２７】
グリシン（Gly／G）、アラニン（Ala／A）、バリン（Val／V）、ロイシン（Leu／L）、イソロイシン（Ile／I）、セリン（Ser／S）、スレオニン（Thr／T）、アスパラギン酸（Asp／D）、グルタミン酸（Glu／E）、アスパラギン（Asn／N）、グルタミン（Glu／Q）、リジン（Lys／K）、アルギニン（Arg／R）、システイン（Cys／C）、メチオニン（Met／M）、フェニルアラニン（PHe／F）、チロシン（Tyr／Y）、トリプトファン（Trp／W）、ヒスチジン（His／H）、プロリン（Pro／P）。
【００２８】
本発明でいう「ヒト酸化LDL受容体」（「ヒトLOX-1」と称する場合もある。）とは、既報及び配列表等に記載される構造及び機能を有するヒトの酸化LDL受容体（human oxidized-LDL receptor; ox-LDL receptor）を意味する（配列番号２；Nature, Vol.386, p.73-77, 1997；Genomics, Vol.54, No.2, p.191-199, 1998; Biochem. J., Vol.339, Part 1, p,177-184, 1999； GenBank Accession No.NP 002534）。
【００２９】
また、本発明で言う「ヒト酸化LDL受容体」（「ヒトLOX-1」と称する場合もある。）には、上述の既報に記載される天然型のタンパク一次構造（アミノ酸配列）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する天然型ヒト酸化LDL受容体の変異体も包含する。
【００３０】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有する天然型ヒト酸化LDL受容体の変異体」とは下記変異蛋白を意味する。
【００３１】
即ち、天然型のヒト酸化LDL受容体と実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が置換、欠失及び／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異蛋白、並びに該天然のヒト酸化LDL受容体のアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１乃至１０個のアミノ酸、特に好ましくは１乃至５個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異蛋白。
【００３２】
さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異体であってもよい。
【００３３】
本発明におけるヒト酸化LDL受容体は、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
【００３４】
また、本発明における「ヒト酸化LDL受容体」（「ヒトLOX-1」とも呼ぶ。）には、該ヒト酸化LDL受容体の「一部」も包含される。ここで「一部」とは、前記に定義したヒト酸化LDL受容体のアミノ酸配列中の任意の部分配列を含むポリペプチドを意味する。
【００３５】
好ましくは、前記に定義したヒト酸化LDL受容体の細胞外領域若しくはその任意の一部を意味する。
【００３６】
ヒト酸化LDL受容体の「一部」（好ましくはヒト酸化LDL受容体の細胞外領域若しくはその任意の一部）は、後述する当該技術的分野において知られる公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したヒト酸化LDL受容体をタンパク分解酵素等を用いて適切に切断することにより製造することができる。
【００３７】
本発明を構成する「物質」、具体的には「ヒト酸化LDL受容体の生体内リガンドの該酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を発現する細胞による取込を阻害する活性を有する物質」には、自然界に存在する天然の物質あるいは人工的に調製される任意の物質を意味する。
【００３８】
該物質は、「蛋白性物質」と「非蛋白性物質」に大別することができる。
【００３９】
ここで、「酸化LDL受容体の生体内リガンド」とは、該酸化LDL受容体の結合する任意の生体内リガンドを意味し、例えば、酸化LDL、変性LDL（アセチル化されたLDLやスクシニル化されたLDLなど）、アポトーシスに向かっている細胞（apoptotic cell）、老化赤血球、あるいは活性化血小板などを挙げることができる。
【００４０】
該「蛋白性物質」としては、ポリペプチド、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または該モノクローナル抗体の一部が挙げられる。
【００４１】
該物質が抗体である場合には、好ましくはモノクローナル抗体である。該物質がモノクローナル抗体である場合には、非ヒト哺乳動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、組換えキメラモノクローナル抗体、組換えヒト型モノクローナル抗体、及び後述の「ヒトモノクローナル抗体」が包含される。
【００４２】
該物質が、ポリペプチドである場合には、後述するポリペプチド、該ポリペプチドの断片（オリゴペプチド）、融合ポリペプチド、及びそれらいずれかの化学修飾体が包含される。オリゴペプチドとしては、５乃至３０個のアミノ酸、好ましくは５乃至２０個のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。該化学修飾は、生体に投与された場合の血中半減期の増大あるいは経口投与時における消化管での分解に対する耐性若しくは吸収性の増大の目的等の種々の目的に応じて設計することができる。
【００４３】
該「非蛋白性物質」としては、DNA、RNA及び化学的に合成された化合物が挙げられる。
【００４４】
ここで、「DNA」とは、前述の酸化LDL受容体（LOX-1）をコードするDNA（cDNA及びゲノミックDNAを含む）の塩基配列を基に設計されるアンチセンスDNA医薬として有用な「該DNAの部分塩基配列を含むDNAあるいはそれらを化学修飾した化学修飾DNA」を意味する。即ち、該アンチセンスDNAは、LOX-1をコードするDNAまたはRNAにハイブリダイズすることにより、該LOX-1をコードするDNAのmRNAへの転写あるいは該mRNAの蛋白への翻訳を阻害することができる。
【００４５】
ここで、「部分塩基配列」とは、任意の部位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味する。該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。
【００４６】
また、該DNAをアンチセンス医薬として用いる場合には、該DNAが患者の体内に投与された場合の血中半減期の増大（安定性）、細胞内膜の透過性の増大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該DNAの塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学修飾としては、例えば、オリゴヌクレオチドの構造中のリン酸結合、リボース、核酸塩基、糖部位、3'及び／または5'末端等の化学修飾が挙げられる。
【００４７】
リン酸結合の修飾としては、１以上の該結合を、ホスホジエステル結合（D-オリゴ）、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合（S-オリゴ）、メチルホスホネート結合（MP-オリゴ）、ホスホロアミデート結合、非リン酸結合及びメチルホスホノチオエート結合のいずれかまたはそれらの組み合わせへの変更を挙げることができる。リボースの修飾としては、2'-フルオロリボースあるいは2'-O-メチルリボースへなどへの変更を挙げることができる。核酸塩基の修飾としては、5-プロピニルウラシルまたは2-アミノアデニンなどへの変更が挙げられる。
【００４８】
ここで、「RNA」とは、前述の酸化LDL受容体（LOX-1）をコードするRNAの塩基配列を基に設計されるアンチセンスRNA医薬として有用な「該RNAの部分塩基配列を含むRNAあるいはそれらを化学修飾した化学修飾RNA」を意味する。該アンチセンスRNAは、該LOX-1をコードするDNAまたはRNAにハイブリダイズすることにより、該LOX-1をコードするDNAのmRNAへの転写あるいは該mRNAの蛋白への翻訳を阻害することができる。
【００４９】
ここで、「部分塩基配列」とは、任意の部位における任意の数の塩基からなる部分塩基配列を意味する。該部分塩基配列としては、連続した５乃至１００塩基の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した５乃至７０塩基の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した５乃至５０塩基の部分塩基配列、より好ましくは連続した５乃至３０塩基の部分塩基配列が挙げられる。
【００５０】
該アンチセンスRNAは、該RNAが患者の体内に投与された場合の血中半減期の増大、細胞内膜の透過性の増大、あるいは経口投与の場合の消化器官での分解耐性の増大若しくは吸収の増大などの目的のために、該RNAの塩基配列の一部に化学修飾を施すことが可能である。化学修飾としては、例えば、前述のアンチセンスDNAに適用されるような化学修飾を挙げることができる。
【００５１】
「化学的に合成された化合物」とは、上述のDNA、RNA及び蛋白性物質を除く任意の化合物であって、分子量約100乃至約1000以下の化合物、好ましくは分子量約100乃至約800の化合物であり、より好ましくは分子量約100乃至約600の化合物を挙げることができる。
【００５２】
本発明の「ヒトモノクローナル抗体」とは、前記に定義したヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体である。
【００５３】
さらに詳細には、イムノグロブリンを構成する重鎖（Ｈ鎖）の可変領域（Variable region）及びＨ鎖の定常領域（Constant Region）並びに軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域及びＬ鎖の定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するヒトイムノグロブリンである。Ｌ鎖としては、ヒトκ鎖またはヒトλ鎖が挙げられる。
【００５４】
本発明のヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体は、前記のとおりの本発明の(1)乃至(13)のいずれかに記載される特徴を有するモノクローナル抗体である。
【００５５】
さらに具体的には、後述の実施例並びに図面に記載されるような様々な特性及び産業上の有用性を有する各種のモノクローナル抗体である。
【００５６】
本発明のヒトモノクローナル抗体における好ましい態様としては、前記本発明の(2)乃至(13)のいずれかに記載のヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体である。
【００５７】
本発明の「ヒトモノクローナル抗体」は、下記のいずれかの免疫原（抗原）を以下に述べるヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製することができる。
【００５８】
（イ）  前記に定義したヒト酸化LDL受容体を細胞表面に発現する天然の細胞または人工的に樹立した細胞株；
（ロ）  前記に定義したヒト酸化LDL受容体を細胞表面に発現するように遺伝子組換え技術を用いて作製された遺伝子組換え細胞；
（ハ）  前記（イ）または（ロ）の細胞を可溶化して得た細胞可溶化物（cell lysate）、または該cell lysateから精製したヒト酸化LDL受容体のポリペプチド断片；
（ニ）  前記に定義したヒト酸化LDL受容体の一部（特に好ましくは、その細胞外領域若しくはその任意のペプチド）を可溶性ポリペプチドとして発現するように遺伝子組換え技術を用いて作製された遺伝子組換え細胞；
（ホ）  前記（ニ）の遺伝子組換え細胞を培養して得た培養上清若しくは該培養上清から精製されたヒト酸化LDL受容体の細胞外領域ポリペプチド（可溶性ヒト酸化LDL受容体）；または
（ヘ）  化学的に合成されたヒト酸化LDL受容体の一部（（特に好ましくは、その細胞外領域若しくはその任意のペプチド）。
【００５９】
さらには、本発明のヒトモノクローナル抗体は、遺伝子組換え技術を用いて、そのような本発明のヒトモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするcDNAにより宿主細胞を形質転換して得られる遺伝子組換え細胞であって、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」を培養することにより培養上清中から得ることもできる。
【００６０】
また、本発明ヒトモノクローナル抗体は、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA（IgA1、IgA2）、IgDまたはIgEのいずれのアイソタイプを有するヒトモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）であり、好ましくはIgG1、IgG2またはIgG4であり、特に好ましくはIgG1またはIgG4である。
【００６１】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、後述するヒト抗体産生トランスジェニックマウスのようなヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に前述の（イ）乃至（ヘ）のいずれかの免疫原（抗原）を免疫し、モノクローナル抗体の既存の一般的な製造方法に従って製造することができる。
【００６２】
即ち、例えば、該抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫する。ポリクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た血清から取得することができる。またモノクローナル抗体は、該免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）から融合細胞（ハイブリドーマ）を調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００６３】
さらに具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、前述の（イ）乃至（ハ）のいずれかの免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、該ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物（特に好ましくは後述の「ヒト抗体産生トランスジェニックマウス」）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１乃至１４日毎に１乃至４回免疫を行って、最終免疫より約１乃至５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。免疫を施す回数及び時間的インターバルは、使用する免疫原の性質などにより、適宜変更することができる。
【００６４】
ヒトモノクローナル抗体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）の調製は、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作されたヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合させることにより調製される。
【００６５】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（ATCC No. CRL-1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/O,Sp2）、PAI、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11あるいはCEM-T15を使用することができる。
【００６６】
モノクローナル抗体を産生する細胞（例えば、ハイブリドーマ）のスクリーニングは、該細胞を、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、例えばRIA（radio immunoassay）やELISA（enzyme-linked immuno-solvent assay）等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００６７】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の製造は、ハイブリドーマをインビトロ、またはマウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはウサギ等、好ましくはマウスまたはラット、より好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
【００６８】
また、該ハイブリドーマあるいは後述する遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」からモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、トランスジェニック動物作製技術を用いて当該遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタを作製し、当該トランスジェニック動物のミルク中から当該ヒトモノクローナル抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である（日系サイエンス、1997年４月号、第７８頁乃至８４頁）。
【００６９】
該モノクローナル抗体産生細胞をインビトロで培養する場合には、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々条件に合わせて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
【００７０】
基本培地としては、例えば、Ham'F12培地、MCDB153培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D-MEM培地、RPMI1640培地、ASF104培地あるいはＲＤ培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び／または種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。
【００７１】
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００７２】
本発明のヒトモノクローナル抗体には、該抗体を構成する重鎖及び／または軽鎖の各々のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する重鎖及び／または軽鎖からなるヒトモノクローナル抗体も包含される。
【００７３】
ここで、「数個のアミノ酸」とは、複数個のアミノ酸を意味し、具体的には１乃至１０個のアミノ酸であり、好ましくは１乃至５個のアミノ酸である。
【００７４】
本発明のヒトモノクローナル抗体のアミノ酸配列中に、前記のようなアミノ酸の部分的改変（欠失、置換、挿入、付加）は、該アミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Site specific mutagenesis ）を用いて常法により導入することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, p.5662-5666, 1984）。
【００７５】
本発明における「ヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物」、特に好ましい態様であるヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、既報に従って作製することができる（Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994；及び特表平６−５００２３３号公報など）。
【００７６】
該ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、具体的には、例えば下記の工程からなる手法を用いることにより作製できる。他のヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物も同様にして製造することができる。
【００７７】
（１）マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することにより該マウス内在性イムノグロブリン重鎖遺伝子が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作製する工程。
【００７８】
（２）マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で置換することにより該マウス内在性イムノグロブリン軽鎖遺伝子（特にκ鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックアウトマウスを作製する工程。
【００７９】
（３）酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome, YAC）ベクター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
【００８０】
（４）YAC等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベクターを用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特にκ鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
【００８１】
（５）前記（１）乃至（４）のノックアウトマウス及びトランスジェニックマウスを任意の順序で交配することにより、マウス内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及びマウス内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能的に不活性化され、且つヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の所望の領域及ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の所望の領域がともにマウス染色体上に組み込まれたトランスジェニックマウスを作製する工程。
【００８２】
前記ノックアウトマウスは、マウス内在性イムノグロブリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子など）で相同組換えにより置換することにより該遺伝子座が再構成（リアレンジメント）できないように不活性化することにより作製できる。該相同組換えを用いた不活性化には、例えば、ポジティブ・ネガティブ・セレクション（Positive Negative Selection; PNS）と呼称される方法を用いることができる（日経サイエンス, ５月号, p.52-62, 1994）。
【００８３】
イムノグロブリン重鎖遺伝子座の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成できる。またイムノグロブリン軽鎖（例えばκ鎖）に機能的不活性化は、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
【００８４】
トランスジェニックマウスは、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような常法（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年を参照）に従って作製することが可能である。具体的には、例えば、正常マウス胚盤胞（blastcyst）に由来するHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ES細胞（embryonic stem cell）を、該ヒトイムノグロブリン重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子またはその一部並びにHPRT遺伝子が挿入されたYACベクターを含む酵母とスフェロプラスト融合法により融合する。該外来性遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたES細胞をHATセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, No.12, pp.7380-7384, 1980；米国特許第4,873,191号公報）。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得る。該ヘテロ（heterogeneic）トランスジェニックマウス同士を交配することにより、メンデルの法則に従って、ホモ（homogeneic）トランスジェニックマウスが得られる。
【００８５】
本発明における「モノクローナル抗体の一部」とは、前述の本発明のヒトモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはF(ab')2、Fab'、Fab、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulpHide stabilised Fv）あるいはｄＡｂ（single domain antibody）等が挙げられる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ(Exp. Opin. Ther. Patents)，第６巻，第５号，第441〜456頁，1996年）。
【００８６】
ここで、「F(ab')2」及び「Fab'」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）を、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてＶL（Ｌ鎖可変領域）とＣL（Ｌ鎖定常領域）からなるＬ鎖、及びＶH（Ｈ鎖可変領域）とＣHγ1（Ｈ鎖定常領域中のγ1領域）とからなるＨ鎖フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つの抗体フラグメントを製造することができる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Fab'という。またＩｇＧをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのFab'がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')2という。
【００８７】
本発明における「結合速度定数（ｋａ）」とは、抗原抗体反応速度論に基づき算出される該モノクローナル抗体の標的抗原への結合の強さ（程度）を示す値を意味する。「解離速度定数（ｋｄ）」とは、抗原抗体反応速度論に基づき算出される該モノクローナル抗体の標的抗原からの解離の強さ（程度）を示す値を意味する。「解離定数（Ｋｄ）」とは、該「解離速度定数（ｋｄ）」値を該「結合速度定数（ｋａ）」値で除して求められる値である。これらの定数は、該モノクローナル抗体の抗原に対する親和性及び抗原の中和活性を表す指標として用いられる。
【００８８】
当該定数は、種々の方法に従って解析することができるが、市販の測定キットであるBiacoreＸ（アマシャムファルマシア社製）または類似のキットを用い、 当該キットに添付の取扱い説明書及び実験操作方法に従って容易に解析することができる。当該キットを用いて求められるｋａ値、ｋｄ値及びＫｄ値は各々、1/M.Sec、1/Sec及びM（モル）なる単位を以て表される。試験されたモノクローナル抗体は、ｋａ値が大きいほど強い抗原結合活性を有していることを示し、Ｋｄ値が小さいほど強い中和活性を有していることを示す。
【００８９】
本発明のヒトモノクローナル抗体には、下記（１）乃至（３）に示されるようなｋａ値、ｋｄ値またはＫｄ値を有するヒトモノクローナル抗体が含まれる。
【００９０】
（１）ヒト酸化LDL受容体との結合速度定数（ｋａ）が、1.0×104(1/M.Sec)以上の数値、好ましくは1.0×105(1/M.Sec)以上の数値であるヒト酸化LDL受容体または一部に反応性を有するヒトモノクローナル抗体。
【００９１】
（２）ヒト酸化LDL受容体との解離速度定数（ｋｄ）が、1.0×10-2(1/Sec)以下、好ましくは1.0×10-4(1/Sec)以下の数値であるヒト酸化LDL受容体またはその一部に反応性を有するヒトモノクローナル抗体。
【００９２】
（３）ヒト酸化LDL受容体との解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-2(1/Sec)以下、好ましくは1.0×10-7(M)以下、より好ましくは1.0×10-8(M)以下の数値であるヒト酸化LDL受容体またはその一部に反応性を有するヒトモノクローナル抗体。
【００９３】
なお、上述のｋａ、ｋｄ及びＫｄの各々の値は、測定時の諸条件に依存して多少の変動は誤差範囲として起こり得ることが予測されるが、指数についてはほとんど変動しないのが一般的である。
【００９４】
本発明の「モノクローナル抗体を産生する細胞」あるいは遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する本発明の「遺伝子組換え細胞」とは、前述した本発明のヒトモノクローナル抗体を産生する任意の細胞を意味する。
【００９５】
具体的には、例えば、下記（１）乃至（３）のいずれかに記載される細胞を挙げることができるがこの限りではない。
【００９６】
（１）前記で定義した免疫原（抗原）を前述のヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られ、該被免疫動物から採取され得るヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞。
【００９７】
（２）そのようにして得られたヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を哺乳動物由来のミエローマ細胞と細胞融合して得られる前述の融合細胞（ハイブリドーマ）。
【００９８】
（３）該ヒトモノクローナル抗体産生Ｂ細胞またはヒトモノクローナル抗体産生融合細胞（ハイブリドーマ）から単離される該ヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子（重鎖をコードする遺伝子若しくは軽鎖をコードする遺伝子のいずれか一方、または両方の遺伝子）で、該Ｂ細胞及びハイブリドーマ以外の細胞（例えば、CHO（Chinese hamster ovarian）細胞）、BHK（Baby hamster kydney）細胞など）を形質転換して得られる遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する遺伝子組換え細胞。
【００９９】
ここで、前記（３）に記載の遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する遺伝子組換え細胞は、即ち、前記（１）のＢ細胞または（２）のハイブリドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の遺伝子組換え体を産生する遺伝子組換え細胞を意味する。
【０１００】
本発明における「医薬組成物」は、有効成分としての本発明の（１）ヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体若しくはその一部と「薬学的に許容され得る担体」とからなる医薬品として有用な組成物、及び（２）ヒト酸化LDL受容体の生体内リガンドの該酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を発現する細胞による取込を阻害する活性を有する物質と「薬学的に許容され得る担体」とからなる医薬品として有用な組成物を意味する。
【０１０１】
ここで「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。
【０１０２】
そのような担体の一つ以上を用いることにより、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
【０１０３】
これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、腸溶内投与のための坐剤およびペッサリーなどが含まれる。
【０１０４】
投与量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分（前記タンパクや抗体など）の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき10μgから1000mg（あるいは10μgから500mg）の範囲で投与することができる。しかしながら、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量より少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を越える投与量が必要な場合もある。
【０１０５】
とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容され得る担体中に0.1μg抗体／ml担体〜10mg抗体／ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。
【０１０６】
このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μg〜100mgの割合で、好ましくは50μg〜50mgの割合で、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
【０１０７】
また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。
【０１０８】
そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【０１０９】
本発明の医薬組成物は、種々の病態及び疾患の発症に関与する酸化LDL受容体の生体内リガンド（酸化LDLなどの種々の変性LDL、apoptotic細胞、老化赤血球、活性化血小板など）の酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの酸化LDL受容体を介した細胞内への取込を阻害するために有用である。
【０１１０】
とりわけ、本発明の医薬組成物の一つである前記ヒトモノクローナル抗体からなる医薬組成物は、ヒト由来のモノクローナル抗体からなることから、HAMAに起因する宿主の免疫拒絶反応を惹起することなく以下のような種々の疾患の治療または予防に適用することができる。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、上述のような酸化LDL受容体とその生体内リガンドとの相互作用（結合または取り込み）に起因する種々の疾患（例えば、動脈硬化症、血小板減少症、腎疾患、種々の炎症（例えば、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症反応など）、PTCAやPTCRの術後の血管再狭窄など）、動脈等の血管での血栓の形成などの種々の疾患の発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患または疾患症状を治療または予防するための医薬品として有用である。
【０１１２】
ここで、  本発明における「炎症」とは、内的要因または細菌感染、外傷、物理的刺激（例えば、熱、寒冷、放射線、電気など）あるいは化学物質などの外的要因に限定されない種々要因による生体組織の傷害あるいは機能不全において、白血球が血管内皮細胞上でのローリング、接着を経て、血流中からの血管外組織への浸潤を伴う基本的な病理上の局所反応を意味する。
【０１１３】
通常炎症は、その発現速度及び進行速度により急性炎症と慢性炎症に大別される。一般に急性炎症とは、炎症反応が比較的急速に発現し進行が速く、その終了が明確な炎症である。一方、慢性炎症とは、炎症反応が比較的ゆっくりあるいは徐々に発現し、あるいはその発現の存在すた不明確な程度に発現し、数週間乃至数年間にわたり持続され、その終了も不明確な炎症である。本発明の炎症には、そのような急性炎症及び慢性炎症のいずれをが包含される。
【０１１４】
本発明における炎症としては、脳、眼、気管、血管、肺、肝臓、心臓、膵臓、胃、腸、腸間膜、腎臓、皮膚、鼻炎膜あるいは関節などの組織における炎症が含まれる。具体的には、例えば、脳炎、気管支炎、血管炎、肺炎、肝炎、心筋炎、膵炎、腸炎、胃炎、腹膜炎、腎炎（糸球体腎炎など）、関節炎（関節リウマチなど）、虚血後再潅流障害（心筋虚血再潅流障害など）における炎症、移植後免疫拒絶に起因する炎症、火傷、多発性臓器障害における炎症、PTCAやPTCRの術後における炎症、及び動脈硬化症に伴う炎症を挙げることができる。
【０１１５】
また、本発明の医薬組成物の種々疾患症状の治療効果については、常法に従って、本発明の医薬組成物（ヒト抗体や合成低分子化合物など）を既知の疾患モデル動物に投与することにより試験、検討することができる。
【０１１６】
例えば、動脈硬化症及び血管再狭窄への効果の検討の場合には、ラット大動脈にバルーンカテーテルを挿入しPTCAを施し疑似的に作成した再狭窄モデルを使用することができる。
【０１１７】
また、炎症や組織傷害に対する治療効果の検討の場合には、ラットにLPSを投与することにより誘導した炎症や組織傷害（例えば、肺傷害）の疾患モデルを使用することができる。
【０１１８】
さらには、グリセロール誘発ラット急性腎障害モデル、ラットGBM腎炎モデル、アンギオテンシンII誘発ラット動脈硬化モデル（高血圧誘発性動脈硬化症モデル）、ApoEノックアウトマウス（高脂血症動脈硬化モデル）などに本発明の抗体を投与することにより、本発明のヒト抗体の種々腎疾患や動脈硬化症に対する治療効果を測定することができる。
【０１１９】
本発明において用いられるヒト酸化LDL受容体をコードするDNAは、常法に従って、該ヒト酸化LDL受容体をコードするmRNAからcDNAをクローン化する方法、ゲノムDNAを単離してスプライシング処理する方法、該cDNA配列若しくはmRNA配列を鋳型としてPCRにより調製する方法、または化学合成する方法等により取得することができる。
【０１２０】
本発明のヒト酸化LDL受容体をコードするDNAは、そのようにして調製した該ヒト酸化LDL受容体をコードする各々のDNAを適切な制限酵素による切断（消化）し、得られたDNA断片を、必要に応じてリンカーDNAあるいはタグ（Tag）と共に、適切なDNAポリメラーゼ等を用いて連結することにより調製することができる。
【０１２１】
該ヒト酸化LDL受容体（以下、目的蛋白という）をコードするcDNAをmRNAからクローン化する方法としては、以下の方法が例示される。
【０１２２】
まず、目的蛋白を発現・産生する組織あるいは細胞から目的蛋白をコードするmRNAを調製する。mRNAの調製は、例えばグアニジンチオシアネート法（Biochemistry, Vol.18, p.5294, 1979）、熱フェノール法もしくはAGPC法等の公知の方法を用いて調製した全RNAをオリゴ（dT）セルロースやポリＵ−セファロース等によるアフィニティクロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
【０１２３】
次いで得られたmRNAを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法、例えばオカヤマらの方法（Mol. Cell. Biol., Vol.2, p.161, 1982及び同誌 Vol.3, p.280, 1983）やホフマン（Hoffman）らの方法（Gene, Vol.25, p.263, 1983）等によりcDNA鎖を合成し、cDNAの二本鎖cDNAへの変換を行う。このcDNAをプラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベクターに組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりcDNAライブラリーを作製する。
【０１２４】
ここで用いられるプラスミドベクターとしては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限されず、また用いられるファージベクターとしても宿主内で増殖できるものであれば良い。常法的に用いられるクローニング用ベクターとしてpUC19、λgt10、λgt11等が例示される。ただし、後述の免疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内で目的蛋白をコードする遺伝子を発現させうるプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
【０１２５】
プラスミドにcDNAを組み込む方法としては、例えばマニアティス（Maniatis）らの方法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.53, 1989）に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクターにcDNAを組み込む方法としては、ヒュン（Hyunh）らの方法（DNA Cloning, a practical approach, Vol.1, p.49, 1985）などが挙げられる。簡便には、市販のクローニングキット（例えば、宝酒造社製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えプラスミドやファージベクターは、原核細胞（例えば、E.coli：HB101, DH5α, Y1090, DH10BまたはMC1061/P3等）等の適当な宿主に導入する。
【０１２６】
プラスミドを宿主に導入する方法としては、（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p.1.74, 1989）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法としてはファージDNAをインビトロパッケージングした後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。インビトロパッケージングは、市販のインビトロパッケージングキット（例えば、ストラタジーン社製、アマシャム社製等）を用いることによって簡便に行うことができる。
【０１２７】
上記の方法によって作製されたcDNAライブラリーから、目的蛋白をコードするcDNAを単離する方法は、一般的なcDNAスクリーニング法を組み合わせることによって行うことができる。
【０１２８】
例えば、別個に目的蛋白のアミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合成したのち、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーション法（クランシュタイン（Crunstein）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.72, p.3961, 1975）またはプラークハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition , Cold Spring Harbor Laboratory、p.2.108, 1989）により、目的のcDNAを含有するクローンをスクリーニングする方法、PCRプライマーを作製し目的蛋白の特定領域をPCR法により増幅し、該領域をコードするDNA断片を有するクローンを選択する方法等が挙げられる。
【０１２９】
また、cDNAを発現しうるベクター（例えば、λgt11等のファージベクター）を用いて作製したcDNAライブラリーを用いる場合には、目的蛋白に反応性を有する抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、目的のクローンを選択することができる。大量にクローンを処理する場合には、PCR法を利用したスクリーニング法を用いることが好ましい。
【０１３０】
この様にして得られたDNAの塩基配列はマキサム・ギルバート法（マキサム（Maxam）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol74, p.560, 1977）あるいはファージM13を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停止の方法（サンガー（Sanger）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.74, p.5463-5467, 1977）によって決定することができる。目的蛋白をコードする遺伝子は、その全部または一部を上記のようにして得られるクローンから制限酵素等により切り出すことにより取得できる。
【０１３１】
また、前述のような目的蛋白を発現する細胞に由来するゲノムDNAから目的蛋白をコードするDNAを単離することによる調製方法としては、例えば以下の方法が例示される。
【０１３２】
該細胞を好ましくはSDSまたはプロテナーゼＫ等を用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してDNAの脱蛋白質を行う。RNAを好ましくはリボヌクレアーゼにより消化する。得られるDNAを適当な制限酵素により部分消化し、得られるDNA断片を適当なファージまたはコスミドで増幅しライブラリーを作成する。そして目的の配列を有するクローンを、例えば放射性標識されたDNAプローブを用いる方法等により検出し、該クローンから目的蛋白をコードする遺伝子の全部または一部を制限酵素等により切り出し取得する。
【０１３３】
目的蛋白をコードするDNAのPCRによる調製は、該目的蛋白の既知のmRNAまたはcDNA等を鋳型として常法により調製することができる（「遺伝子増幅PCR法・基礎と新しい展開」、共立出版株式会社発行、1992年など）。
【０１３４】
また、化学的合成による目的蛋白をコードするDNAの製造は、目的蛋白の塩基配列をもとにして、常法に従って行うことができる。
【０１３５】
本発明のヒト酸化LDL受容体またはその一部（好ましくは細胞外領域）は、上述に例示した方法を用いて調製したヒト酸化LDL受容体をコードするDNA（cDNAあるいはイントロンを含むゲノミックDNA）を、各々適切な制限酵素で切断することにより、該ヒト酸化LDL受容体コードするDNA断片を得、それらの断片を、必要に応じてリンカーDNAあるいはタグ（Tag）と共に、適切なDNAポリメラーゼ等を用いて連結させて得たDNAを用いて、慣用される遺伝子組換え技術を用いて、常法により組換え蛋白として調製することができる。
【０１３６】
具体的には下記の例示されるとおりである。即ち、上述のようにして調製したDNAを、下記に詳述するようなベクターに挿入して発現ベクターを作成し、該発現ベクターで後述するような宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る。該形質転換体を培養することにより、培養上清中に該目的蛋白を産生させる。培養上清中の該目的蛋白は、カラムクロマトグラフィー等を用いて容易に精製することができる。
【０１３７】
組換えヒト酸化LDL受容体（またはその細胞外領域）を製造するために用いられる発現ベクター、原核細胞及び／または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクターおよびファージベクターが包含される（Cloning Vectors: A Laboratory Manual, エルスビュ−社、ニューヨーク、1985年）。
【０１３８】
当該発現ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドDNAおよびバクテリアファージDNA）にヒト酸化LDL受容体（またはその細胞がい領域）をコードするDNAを常法により連結することによって調製することができる。用いられる組換え用ベクターとして具体的には、大腸菌由来のプラスミドとして例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19など、酵母由来プラスミドとして例えばpSH19、pSH15など、枯草菌由来プラスミドとして例えばpUB110、pTP5、pC194などが例示される。また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイルス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、インビトロゲン社製）が例示される。
【０１３９】
本発明のヒト酸化LDL受容体またはその可溶性細胞外領域をコードするDNAを発現させヒト酸化LDL受容体を宿主細胞表面に発現させ、またはヒト酸化LDL受容体の可溶性細胞外領域を生産させる目的においては、プラスミドベクターが有用である。プラスミドベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で該ヒト酸化LDL受容体またはその可溶性細胞外領域をコードする遺伝子を発現し、これらのポリペプチドを生産する機能を有するものであれば特に制限されない。例えば、pMAL C2、pcDNA3.1(-)、pEF-BOS（Nucleic Acid Research, Vol.18, p.5322, 1990など）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、1992年等）等を挙げることができる。
【０１４０】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のタンパクをコードするDNA、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位から構成される。
【０１４１】
宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは少なくともプロモーター、開始コドン、本発明のヒト酸化LDL型受容体（またはその細胞外領域）コードするDNA、終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグナルペプチドをコードするDNA、エンハンサー配列、本発明のヒト酸化LDL受容体をコードする遺伝子の５'側および３'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子（マーカー）を含んでいてもよい。
【０１４２】
細菌中で本発明のヒト酸化LDL受容体（またはその細胞外領域）を発現させるためのプロモーター−オペレータ−領域は、プロモーター、オペレーターおよびShine-Dalgarno(SD)配列（例えば、AAGGなど）を含むものである。例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、好適にはTrpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーターなどを含むものが例示される。
【０１４３】
酵母中で本発明のヒト酸化LDL受容体（またはその細胞外領域）を発現させるためのプロモーターとしては、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターが挙げられ、宿主がバチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。
【０１４４】
また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、例えばSV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
【０１４５】
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。
【０１４６】
終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG,TAA,TGA）が例示される。
【０１４７】
ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
【０１４８】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全DNA配列を複製することができる能力をもつDNAを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたDNAフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E.coliではプラスミドpBR322、もしくはその人工的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られるDNAフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体DNAが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミドpSV2neo ATCC 37149、プラスミドpSV2bsr等があげられる。
【０１４９】
エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【０１５０】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
【０１５１】
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
【０１５２】
本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、本発明のタンパクをコードするDNA、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なDNAフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【０１５３】
本発明の形質転換細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
【０１５４】
本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞など）が例示される。
【０１５５】
好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、具体的には大腸菌（DH5α、DH10B、TB1、HB101、XL-2Blue等）、マウス由来細胞（COP、L、C127、Sp2/0、NS-1またはNIH3T3等）、ラット由来細胞、ハムスター由来細胞（BHKおよびCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびNamalwa等）などが例示される。
【０１５６】
発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は従来公知の方法を用いて行うことができる。
【０１５７】
例えば、細菌（E.coli、Bacillus subtilis等）の場合は、例えばCohenらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1972）、プロトプラスト法（Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979）やコンピテント法（J. Mol. Biol., Vol.56, p.209, 1971）によって、Saccharomyces cerevisiaeの場合は、例えばハイネン（Hinnen）らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978）やリチウム法（J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983）によって、動物細胞の場合は、例えばグラハム（Graham）の方法（Virology, Vol.52, p.456, 1973）、昆虫細胞の場合は、例えばサマーズ（Summers）らの方法（Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983）によってそれぞれ形質転換することができる。
【０１５８】
本発明のヒト酸化LDL受容体の細胞外領域（可溶性ヒト酸化LDL受容体）は、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換細胞（以下、形質移入体を包含する意味で使用する。）を栄養培地で培養することによって製造することができる。
【０１５９】
栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【０１６０】
培養は当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のpHおよび培養時間は、本発明のタンパクが大量に生産されるように適宜選択される。
【０１６１】
なお、下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、何らこれらに限定されるものではない。
【０１６２】
宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、pHが５〜８である培地である。
【０１６３】
宿主がE.coliの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（ミラー（Miller）ら、Exp. Mol. Genet、Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972）、ＹＴ培地等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常14〜43℃、約３〜24時間行うことができる。
【０１６４】
宿主がBacillus属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常30〜40℃、約16〜96時間行うことができる。
【０１６５】
宿主が酵母である場合、培地として、例えばBurkholder最小培（ボスチアン（Bostian）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980）が挙げられ、pHは５〜８であることが望ましい。培養は通常約20〜35℃で約14〜144時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【０１６６】
宿主が動物細胞の場合、培地として例えば約５〜20%の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science, Vol.122, p.501, 1952）、DMEM培地（Virology, Vol.8, p.396, 1959）、RPMI1640培地（J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967）、１９９培地（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.1, 1950）、HamF12培地等を用いることができる。培地のpHは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約30〜40℃で約15〜72時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【０１６７】
宿主が昆虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985）等が挙げられ、そのpHは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約20〜40℃で15〜100時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【０１６８】
本発明のヒト酸化LDL受容体の細胞該領域（可溶性ヒト酸化LDL受容体）は、上述のような形質転換細胞（特に動物細胞または大腸菌）を培養することにより、培養上清中に分泌させることにより製造することができる。即ち、得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って目的蛋白を精製、単離する。
【０１６９】
単離、精製方法としては、例えばアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【０１７０】
一方、目的蛋白が培養された形質転換体のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で目的蛋白を含有する膜画分を得る。該膜画分をトライトン−X100等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、ヒトLOX-Fcキメラ蛋白を用いたELISAにより測定した抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体のヒトLOX-1に対する反応性（結合活性）を示す図。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の種類を示す。
【図２】図２は、ヒトLOX-1発現組換えCHO細胞を用いた細胞ELISAにより測定した抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体のヒトLOX-1に対する反応性（結合活性）を示す図。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の種類を示す。
【図３】図３は、ヒトLOX-1発現組換えCHO細胞を用いた酸化LDLの細胞内への取込試験における、抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の酸化LDL取込阻害活性を示す図。縦軸は細胞内に取り込まれた酸化LDLの量の指標となる蛍光強度を示し、横軸は加えた抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の濃度を示す。
【図４】図４は、抗ヒト酸化LDL受容体（LOX-1）に対する各種のヒトモノクローナル抗体の特性を示す図。  丸印は、下記を意味する。  ＜ELISA＞  ○：  有意な抗原結合活性（反応性）が検出された。  △：  弱いながら有意な抗原結合活性（反応性）が検出された。  ×：  有意な抗原結合活性（反応性）が検出されなかった。  ＜酸化LDL取込阻害試験＞  ○：  有意な酸化LDLの取込阻害活性を示した。  △：  弱いながら有意な酸化LDLの取込阻害活性を示した。  ×：  有意な酸化LDLの取込阻害活性を示さなかった。
【図５】図５は、細胞ELISAにより測定した抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体のヒト由来天然細胞株HeLa S-3上のヒトLOX-1に対する反応性（結合活性）を示す図。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の種類を示す。
【図６】図６は、ヒト由来天然細胞株HeLa S-3を用いた酸化LDLの細胞内への取込試験における、抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の酸化LDL取込阻害活性を示す図。縦軸は酸化LDLを取込んだ細胞の割合（％）示し、横軸は加えた抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の濃度を示す。
【図７】図７は、ヒト由来天然細胞株HeLa S-3を用いた酸化LDLの細胞内への取込試験における、抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の酸化LDL取込阻害活性を示す図。縦軸は細胞内に取り込まれた酸化LDLの量の指標となる蛍光強度を示し、横軸は加えた抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の濃度を示す。
【図８】図８は、ウシLOX-1発現組換えCHO細胞を用いた酸化LDLの細胞内への取込試験における、抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の酸化LDL取込阻害活性を示す図。縦軸は細胞内に取り込まれた酸化LDLの量の指標となる蛍光強度を示し、横軸は加えた抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の濃度を示す。
【図９】図９は、血小板減少症に対する抗LOX-1抗体の治療学的効果を示す図。
【図１０】図１０は、白血球の組織への浸潤に対する抗LOX-1抗体の阻害効果を示す図。
【図１１】図１１は、白血球の組織への浸潤に対する抗LOX-1抗体の阻害効果を示す図。
【図１２】図１２は、白血球の組織への浸潤に伴う炎症反応の進行のパラメーターである蛋白漏出に対する抗LOX-1抗体の阻害効果を示す図。
【図１３】図１３は、PTCAを施術した後の血管再狭窄に対する抗LOX-1抗体の阻害効果を示す図。
【図１４】図１４は、動脈における血栓の形成に対する抗LOX-1抗体の阻害効果を示す図。黒色の領域は、血管の閉塞（血栓の形成）が見られた時間を模式的に示し、また白色の領域は血流が見られた時間を模式的に示す。
【図１５】図１５は、動脈における血栓の形成に対する抗LOX-1抗体の阻害効果を示す図。縦軸は、血流（血流音）が見られた時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７２】
以下、実施例を以て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明が該実施例に記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
【０１７３】
なお、以下の実施例においては、「酸化LDL受容体」を「LOX-1」と称する場合もある。
【実施例】
【０１７４】
実施例１  各種組換えLOX-1の調製
<1-1>  可溶性ウシLOX-1（ウシLOX-Fc)の作製
ウシ酸化LDL受容体LOX-1（bLOX-1）をコードするcDNA（配列番号３）を、既報（Nature, Vol.386, p.73-77, 1997及び特開平9-98787号公報）に記載の方法と同様にして調製した。
【０１７５】
得られたcDNAを、２つのプライマー（5'-GGGGATCCTGATCTCATAAAGAAACAG-3'（配列番号５）、及び5'-GCGGATCCTGTGCTCTCAATAGATTCGC-3'（配列番号６）を用いてＰＣＲにより増幅し、BamHI切断部位が両端に付加されたウシLOX-1の細胞外領域をコードするcDNA（配列番号３の塩基番号215乃至844）を含むcDNA断片を調製した。
【０１７６】
ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域、Ｃγ１２、及びＣγ１３の各々コードするエクソンを含むゲノミックDNAを含んでいるプラスミドpCd5lneg1（DNA and Cell Biol., Vol.9, p.347-353, 1990参照。マサチューセッツ・ゼネラル・ホスピタルのシード博士（B. Seed）から入手。配列番号７に記載の塩基配列を有する）を、BamHIで消化して線状化した。
【０１７７】
前述のようにして得られたウシLOX-1の細胞外領域をコードするcDNAを、T4 DNAリガーゼを用いて、この線状化プラスミドのBamHI切断部位（配列番号７の塩基番号169番目）に連結し、プラスミドpBLOX-Fcを構築した。
【０１７８】
１０％FBS（fetal bovine serum）含有HamF12培地中でサブコンフルエントに単層培養したCHO-K1細胞を、リポフェクタミン（Lipofectamine、GIBCO製）を用いて、pBLOX-Fc（１μｇ）並びに発現プラスミドベクターpSVbsr（１０ｎｇ、フナコシ製；ｂｓｒ（Blasticidin S-resistance）遺伝子及びＳＶ４０ウイルス由来のプロモーターを含む）により共形質転換した。
【０１７９】
４８時間の培養後、培地を、blasticidin-S（10μg/ml、フナコシ製）含有HamF12培地に替えたさらに培養することにより、pBLOX-Fc及びpSVbsrで共形質転換された形質転換細胞を選択、取得した。
【０１８０】
得られた形質転換細胞は、１０％ＦＣＳ（fetal calf serum）及びblasticidin-S（10μg/ml、フナコシ製）を含有するHamF12培地中で維持した。
【０１８１】
bLOX-1-Fcを精製するため、blasticidin-S（10μg/ml、フナコシ製）を含有するHamF12培地中でコンフルエントに培養した形質転換体CHO-K1細胞の培地をCHO-SFM-II（GIBCO/BRL製）に替え、３日間培養した。この操作を数回繰返した後、 培養上清800mlを得た。培養上清中のbLOX-Fcは、Affi-Gel Protein A MAPS-II kit（Bio-rad製）を用いて次のように精製した。
【０１８２】
培養上清を、予め結合緩衝液（binding buffer）で平衡化したプロテインＡアガロースゲルカラムに加えた。次いで、カラムを結合緩衝液（15 bed volume）で洗浄した後、溶出緩衝液（elution buffer、5 bed volume）で溶出させた。溶出液を回収し、リン酸緩衝液で２回以上外液交換することにより透析し、精製bLOX-Fcを得た。得られた精製bLOX-Fcを、濃縮するためCentriprep（アミコン製）を用いて限外濾過した。BCA protein assay kit（PIERCE製）を用いて、866μg/mlの精製bLOX-Fcが得られたことを確認した。
【０１８３】
また、上記精製bLOX-Fcの取得は、下記ウェスタンブロッティングによっても確認した。
【０１８４】
精製bLOX-Fcを12.5%SDSアガロースゲル（第一化学）にアプライし、電気泳動した。泳動終了後、Immobilonメンブラン（ミリポア製）にブロッティングした。メンブランをBlock Ace（雪印製）で一晩ブロッキングした。一次抗体としてのビオチン標識ヤギ抗ヒトIgG抗体及びＡＢＣキット（Vector製）を用いて反応を行い、コニカイムノステインキットを用いて発色を行った。
【０１８５】
さらに、上記と同様にして、サル腎臓由来細胞株COS7を宿主細胞とする組換え細胞を用いてbLOX-Fcを調製した。
【０１８６】
<1-2>  CHO細胞でのウシLOX-1の作製
ウシLOX-1（アミノ酸配列：配列番号４、GenBank Accession No.BAA19005；塩基配列：配列番号３、GenBank Accession No.D89049）を発現する組換えCHO細胞（Chinese hamster ovarian cell）を、沢村の報文（Nature, Vol.386, p.73-77, 1997）と同様にして調製した。
【０１８７】
<1-3>  抗ウシLOX-1マウスモノクローナル抗体の作製
後述する抗ヒト酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体の作製で用いた抗原（ヒトLOX-1を発現する組換えCHO細胞の細胞膜画分）の調製と同様にして、前記で調製したウシLOX-1を発現するCHO細胞から細胞膜画分を抗原として調製した。
【０１８８】
得られた細胞膜画分を、後述する抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の作製と同様の方法に従って正常マウスに免疫し、ウシLOX-1に対するマウスモノクローナル抗体（ヒトLOX-1にも交叉反応性を有する）を調製した。
【０１８９】
<1-4>  可溶性ヒトLOX-1（ヒトLOX-Fc; hLOX-Fc)の作製
ヒトLOX-1の全長をコードするcDNA（配列番号１）をPCR法を用いて常法により調製した。
【０１９０】
具体的には、市販のヒト胎盤由来mRNA（Clontech製；カタログ番号＃6501）から逆転写酵素を用いて作製した1本鎖DNAを鋳型とし、ヒトLOX-1の全長cDNA（Nature, Vol.386, p.73-77, 1997及び特開平9-98787号公報）を基に設計したプライマーを用いて常法に従ってPCRにより合成した。
【０１９１】
プライマーとしては、5'-ATGACTTTTGATGACCTAAAGATCCAG-3'（配列番号８）及び5'-CACTGTGCTCTTAGGTTTGCCTTC-3'（配列番号９）を使用した。
【０１９２】
PCRは、１サイクル（94℃で2分）、30サイクル（94℃で30秒、65℃で30秒、及び72℃で90秒）、及び１サイクル（72℃で7分）を行った。
【０１９３】
DNAポリメラーゼには、市販のKOD DNAポリメラーゼ（TOYOBO製）を用いた。
【０１９４】
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動（Qiaquick PCR Purification Kit；Quiagen製）に付した。得られたcDNA断片をゲルから切り出し、常法に従ってプラスミドに挿入した。このcDNA断片を後述のハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。
【０１９５】
前記ヒト由来mRNAを基に、市販のcDNA作製キット（SuperScript Lamda System; Gibco BRL製）を用いcDNAを作製した。得られたcDNAを市販のラムダアーム（λZipLox；Gibco BRL製）に連結した後、市販のGigaPack Gold（Amersham製）を用いてインビトロパッケージングした。得られたファージ粒子を用いて、Y1090を宿主細胞として、組換えファージを含有するプラークからなるcDNAライブラリーを作製した。
【０１９６】
cDNAライブラリー（4×104プラーク／プレート）を寒天プレートに蒔き、ナイロンメンブレン（Hybond N+、Amersham製）に写しレプリカを作製した。上記で得たヒトLOX-1のcDNA断片を[32P]dCTPで標識（Quickprime；Pharmacia製）しプラークハイブリダイゼーション用プローブ溶液とした。このプローブ溶液を用いて、該レプリカの１次及び２次スクリーニングをし、複数の陽性クローンを得た。各クローンをシングルプラークで単離した後、GIBCO-BRL社のマニュアルに従ってインビボエクサイジョン（in vivo Excision）に供し、プラスミドDNAとして回収した（プラスミド：M13K07; Gibco BRL製）。
【０１９７】
次いで、市販のキット（Dye Primer Cycle Sequencing FS Core Kit; PerkinElmer Applied Biosystems製）及び機械（ABI Prism 373A；PerkinElmer Applied Biosystems製）を用いて、各クローンに挿入されているヒトLOX-1のcDNAの塩基配列を決定し、ヒトLOX-1の全長をコードするcDNAが得られたことを確認した。
【０１９８】
得られたヒトcDNAを用いて、実施例<1-1>と同様にしてヒトLOX-1の可溶性領域（アミノ酸番号：65-273）とヒトIgG-Fcとからなるキメラ蛋白（hLOX-Fc）をサル腎臓由来細胞株COS7を宿主とする組換え細胞より調製した。
【０１９９】
<1-5>  CHO細胞での組換えヒトLOX-1の作製
実施例<1-2>で得たヒトLOX-1の全長をコードするcDNAを、ベクターｐEF-NEOに挿入した後、該組換え発現ベクターを、常法に従ってエレクトロポレーション（960μF、320ボルト）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）に導入した。細胞を、Geneticin（0.8mg/ml; Gibco BRL製）及び10％FCS含有RPMI1640培地中で培養することにより薬剤耐性形質転換細胞を選択した。さらに、前記で調製したヒトLOX-1に交叉反応性を有するウシLOX-1に対するモノクローナル抗体を用いて後述の実施例と同様のELISA及び後述の実施例と同様のDiI標識酸化LDLの取込アッセイにより有意な値を示す細胞を選択し、限界希釈法によってクローニングを行った。得られたヒトLOX-1発現CHO細胞からISOGEN（日本ジーン製）を用いて全RNAを抽出後、常法に従ってRT-PCRを行い、制限酵素マッピングによりヒトLOX-1の全長cDNAの導入を確認した。
【０２００】
<1-6>  CHO細胞での各種非ヒト哺乳動物の組換えLOX-1の作製
沢村らの報文（Nature, Vol.386, p.73-77, 1997）を参照しながら、前述の実施例と同様にしてブタ、ウサギ及びラット各々のLOX-1を発現する組換えCHO細胞を作製した。
【０２０１】
ウサギLOX-1
アミノ酸配列：配列番号１０、GenBank Accession No.BAA81912
塩基配列    ：配列番号１１、GenBank Accession No.AB016237
【０２０２】
ブタLOX-1
アミノ酸配列：配列番号１２、GenBank Accession No.BAA88894
塩基配列    ：配列番号１３、GenBank Accession No.AB018668
【０２０３】
ラットLOX-1
アミノ酸配列：配列番号１４、GenBank Accession No.BAA25785
塩基配列    ：配列番号１５、GenBank Accession No.AB005900
【０２０４】
<1-7>  フラグ（FLAG）付加した可溶性ヒトLOX-1の調製
ヒトLOX-1の全長をコードするcDNA配列を基に設計した一対のプライマーを用いて、該全長cDNAを鋳型としてPCRにより、ヒトLOX-1の細胞該領域（アミノ酸番号：65-273）をコードするcDNAを調製した。得られたcDNAを市販の発現ベクターpFLAGCMV-1（Kodak製）に挿入した。
【０２０５】
ここで、FLAGとは、該ベクターに挿入される目的遺伝子によりコードされる蛋白のN末端に付加される付加ペプチド配列を意味する。即ち、当該プラスミドに目的遺伝子を挿入して取得される組換え蛋白発現ベクターで形質転換した形質転換細胞を培養することにより得られる目的の組換え蛋白は、N末端にFLAGが付加されることとなる。従って、本試験で調製される組換え蛋白は、N末端にFLAGペプチドが付加された可溶性ヒトLOX-1組換え蛋白である。
【０２０６】
エレクトロポレーション法（960μF、300ボルト）により、常法に従って、サル腎臓由来細胞株COS7に上記で得たヒトLOX-1の細胞外領域をコードするcDNAが挿入されたpFLAGCMVを導入した。細胞を、FCSをコーティングした培養皿を用いてASF104培地（味の素製）中で無血清培養し、培養上清を回収した。
【０２０７】
回収した培養上清は、抗体FLAG抗体アフィニティーゲル（Kodak製）を充填したカラムに加えた。カラムをTBSで洗浄した後、0.1Mのグリシン-HCl（pH3.0；0.9ml/フラクション）で溶出した。溶出後、直ちに、1MのTris-HCl（pH9.0）で中和した。回収した溶出分画をSDSゲル電気泳動に付し、FLAG付加ヒトLOX-1可溶性蛋白（FLAG-hLOX-1）が溶出されている分画を同定した。
【０２０８】
FLAG-hLOX-1を含む分画をリン酸緩衝液で透析（0.22μmフィルトレーション）した後、し得られた精製FALG-hLOX-1の吸光度（O.D.280）を測定し蛋白量を算出した。
【０２０９】
<1-8>  フラグ（FLAG）付加した可溶性ウシLOX-1の調製
前記と同様にして、ウシ酸化LDL受容体の細胞外領域（アミノ酸番号：61-270）のN末にFLAGペプチドが付加されたFALG-bLOX-1を調製した。
【０２１０】
実施例２  抗原の調製
前記で調製したヒトLOX-1発現CHO細胞を5mMのEDTA-PBSで処理（室温、5分）した後、プロテアーゼ阻害剤含有緩衝液（25mMのHEPES（pH7.4）、10mMのMgCl2、0.25MのSucrose、及びプロテアーゼ阻害剤（10U/mlのAprotinine、2μg/mlのPepstatin、50μg/mlのLeupeptin、及び0.35mg/mlのPMSF））中に懸濁し、ポッター式ホモジナイザーで破砕し、低速遠心（1,500rpm、10分、4℃）した。次いで、上清を回収し、超遠心（100,000g、1時間、4℃）し、沈殿した膜画分を回収しリン酸緩衝液中に懸濁しマイナス20℃で保存した。この懸濁液を後述する本発明のヒト抗体の作製における抗原（免疫原）として用いた。
【０２１１】
実施例３  抗ヒト酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体の調製
本実施例におけるモノクローナル抗体の作製は、実験医学（別冊）細胞工学ハンドブック（黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第66〜第74頁、1992年）及び単クローン抗体実験操作入門（安東民衛ら著作、講談社発行、1991年）等に記載されるような一般的方法に従って調製した。
【０２１２】
免疫原としてのヒト酸化LDL受容体は、前記で調製したヒトLOX-1発現CHO細胞から調製した膜画分を用いた。
【０２１３】
被免疫動物としては、前述の方法を用いて製造したヒト抗体産生トランスジェニックマウスを用いた（Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994；Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997；特表平4-504365号公報；特表平7-509137号公報；日経サイエンス、６月号、第40〜第50頁、1995年等）。
【０２１４】
細胞培養操作は、マルチウェルマイクロプレートを用いて行った。
【０２１５】
<3-1>  抗ヒト酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
前記で調製したヒトLOX-1発現CHO細胞の膜画分と完全フロインドアジュバント（Freund's Complete Adjuvant、ICN/CAPPEL社製）との等量混合物を、前記のヒト抗体産生トランスジェニックマウスのフッドパッド内に注射することにより初回（０日）免疫した。初回免疫から１週間毎に該ヒトLOX-1発現CHO細胞の膜画分のみを該トランスジェニックマウスのフッドパッド内に注射により５回以上追加免疫し、さらに以下に述べるリンパ節細胞の取得の前々日にも同細胞膜画分のみを同様にして注射し最終免疫した。
【０２１６】
最終免疫の2日後に、各々のマウスから膝下、鼠けい部、及び腸骨からリンパ節を採取し、マウスミエローマ細胞P3/X63-AG8.653（ATCC No.: CRL-1580）とを５：１で混合し、融合剤としてポリエチレングリコール1500（ベーリンガーマンハイム製）を用いて細胞融合させることにより細胞融合を行った。次いで、HAT（Sigma製）及び10％FCS含有Excel301培地中で薬剤選択し多数のハイブリドーマを得た。
【０２１７】
<3-2>  モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのELISAによるスクリーニング
以下に述べるELISAにより、前記で調製したハイブリドーマから抗ヒト酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングした。
【０２１８】
<3-2-1>  ELISA（その１）
前記で調製した可溶性組換えヒトLOX-Fcキメラ蛋白発現COS7細胞を培養し、回収した培養上清をプロテインAカラム（Pharmacia製）で精製して可溶性組換えヒトLOX-Fcキメラ蛋白（hLOX-Fc）を取得した。
【０２１９】
該hLOX-Fc（4μg/ml×50μl／well、PBS中）を、ELISA用96穴マイクロプレート（Coaster製）の各ウェルに加え、37℃で１時間インキュベートし、hLOX-Fcをマイクロプレートに吸着させた。
【０２２０】
次いで、上清を捨て、各ウェルに、ブロッキング試薬（200μl；市販のBlock-Ace（商品名））を加え室温で２時間インキュベートし、hLOX-Fcが結合していない部位をブロックした。各ウェルを、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液で２回洗浄した。このようにして、各ウェルをhLOX-Fcでコーティングしたマイクロプレートを作製した。
【０２２１】
各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（50μl）を加え、１時間反応させた後、各ウェルを、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液で３回洗浄した。
【０２２２】
次いで、該ハイブリドーマ上清に含まれるヒトイムノグロブリン（ヒトモノクローナル抗体）の重鎖の検出のために、各ウェルにペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトイムノグロブリン（Fc）抗体（1/7000希釈を50μl；Ameircan Corex製）を加え、室温下で30分インキュベートした。
【０２２３】
一方、該ハイブリドーマ上清に含まれるヒトイムノグロブリン（ヒトモノクローナル抗体）の軽鎖の検出のためには、各ウェルにペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトイムノグロブリンκ鎖抗体（1/3000希釈を50μl）を加え、室温下で30分インキュベートした。
【０２２４】
マイクロプレートを、0.1%のTween20を含有するリン酸緩衝液で3回洗浄後、テトラメチルベンジジン（3,3',5,5',-tetramethylbenzidine (TMB)、100μl、BIO-RAD製）を各ウェルに加え、室温下30分間インキュベートした。
【０２２５】
次いで、0.5MのH2SO4（25μl）を各ウェルに加え、反応を止めた。波長450nmでの吸光度をバイオラッド、モデル3550マイクロプレートリーダー（Model 3550 Microplate Reader、BIO-RAD製）で測定した。
【０２２６】
この結果、抗ヒト酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体を産生する複数ハイブリドーマが選択された。
【０２２７】
陰性対照試験は、いずれのハイブリドーマの上清を加えないで上記と同様にして操作した。
【０２２８】
結果を図１に示す。
【０２２９】
この結果、いずれのハイブリドーマが産生する抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体も、組換え可溶性ヒトLOX-1に有意に結合する（親和性を有する）ことが示された。
【０２３０】
<3-2-2>  ELISA（その２；細胞ELISA）
前記で作製したヒト酸化LDL受容体発現CHO細胞（１×104細胞／ウェル）を、ELISA用96穴マイクロプレートの各ウェルに蒔き、37℃で2日間培養した。
【０２３１】
次いで、上清を捨て、各ウェルに、各々のハイブリドーマの培養上清（50μl/ウェル）を加え、１時間反応させた後、各ウェルを、FCSを含有しないASF104培地（味の素製）で２回洗浄した。
【０２３２】
次いで、該ハイブリドーマ上清に含まれるヒトイムノグロブリン（ヒトモノクローナル抗体）の重鎖の検出のために、各ウェルにペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトイムノグロブリン（Fc）抗体（1/7000希釈を50μl；Ameircan Corex製；0.5％BSA/ASF104培地中）を加え、室温下で30分インキュベートした。
【０２３３】
マイクロプレートを、FCSを含まないASF104培地で２回洗浄後、テトラメチルベンジジン（3,3',5,5',-tetramethylbenzidine (TMB)、100μl、BIO-RAD製）を各ウェルに加え、室温下30分間インキュベートした。
【０２３４】
次いで、0.5MのH2SO4（25μl）を各ウェルに加え、反応を止めた。波長450nmでの吸光度をバイオラッド、モデル3550マイクロプレートリーダー（Model 3550 Microplate Reader、BIO-RAD製）で測定した。
【０２３５】
この結果、抗ヒト酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体を産生する複数ハイブリドーマが選択された。
【０２３６】
対照試験として、ヒト酸化LDL受容体発現CHO細胞の代わりにに前記で作製したウシ酸化LDL受容体発現CHO細胞を上記と同様にして各ウェルに蒔いたマイクロプレートを用いて同様にして試験を行った。
【０２３７】
陰性対照試験は、いずれの組換えCHO細胞をも含まないマイクロプレートを用いて上記と同様にして操作した。
【０２３８】
また、陰性対照抗体として、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、KLH (keyhole limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫して前記と同様にして調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用いて、上記と同様にして試験した。
【０２３９】
結果を図２に示す。
【０２４０】
この結果、いずれのハイブリドーマが産生する抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体も、組換えCHO細胞が発現するヒトLOX-1に有意に結合する（親和性を有する）ことが示された。また、いくつかの抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体が、ウシLOX-1にも交叉反応性を有することが示された。
【０２４１】
実施例４  抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体による酸化LDLの取込阻害活性
上記でスクリーニングした各ハイブリドーマの培養上清に含まれる抗酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体の酸化LDL受容体に対する中和活性を、酸化LDLの細胞内への取込の阻害活性の有無を測定することにより下記のようにして分析した。
【０２４２】
<4-1>  DiI標識ヒト酸化LDLの調製
健常人の血漿を、臭化カリウム（KBr）を加えて、比重を1.019に調整した後、Beckman L-80超遠心機で遠心し（20時間、58000rpm）、下層を別のチューブに回収した。回収した液量を測定し、臭化カリウムを加えて比重を1.063に調整した。次いで、Beckman L-80超遠心機で遠心し（20時間、58000rpm）、上層を別のチューブに回収した。回収した画分を、リン酸緩衝液で透析（外液を２回以上交換）し、精製ヒトLDLを得た。蛋白量をBCA protein assay kit（PIERCE製）を用いて測定した。蛋白量は、10.3 mg/mlであった。
【０２４３】
得られた精製LDLから酸化LDLを調製するため、精製LDL及び硫酸銅（CuSO4）の濃度が、各々3 mg/ml及び75μMとなるように調整した溶液を、CO2インキュベーター内で２０時間インキュベートした。次いで、EDTAを含有する0.15Mの塩化ナトリウム溶液にて透析し（外液を２回以上交換）、ヒト酸化LDLを得た。蛋白量をBCA protein assay kit（PIERCE製）を用いて測定した。蛋白量は、2.32 mg/mlであった。
【０２４４】
上記のように調製した精製LDL及び酸化LDLの各々を、アガロースゲル（Titan Gel Lipoproteins, ヘレナ研究所製）にのせ、アガロース電気泳動を行った（定電圧：90ボルト、25分間）。ゲルを55℃の乾燥機中で乾燥させ、Fat red 7B染色液を加え、脂質の染色を行った。次いで、70％メタノールで脱色させ、再度ゲルを55℃の乾燥機中で乾燥させた。TBARS（過酸化脂質LPO）測定キット（LPOテストワコー（和光製））を用いて、脂質の酸化度を計測した。得られた脂質の酸化度は24.74 mol/mg proteinであった。このようにして得たヒト酸化LDLを標準物質として用いた。
【０２４５】
得られたヒト酸化LDLを、市販の標識物質（「DiI」と略称；1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine-perclorate；フナコシ製）を用いて実験操作マニュアルに従って標識し、DiI-ヒト酸化LDLを得た。
<4-2>  酸化LDLの細胞内取込阻害活性の測定
【０２４６】
前記で作製したヒトLOX-1発現CHO細胞（５×104細胞/ウェル）またはウシLOX-1発現CHO細胞（５×104細胞/ウェル）を24穴マイクロプレートに蒔きコンフルエント（confluent）な状態になるまで培養した。培養上清を捨て、各ウェルに、上記で作製したハイブリドーマの培養上清（150μl/ウェル）、40%NBCS（New born calf serum；40μl/ウェル）、及び前記で調製したDiI-ヒト酸化LDL（80μg/ml×10μl/ウェル）の順で加え、37℃で2時間培養した。プレートをリン酸緩衝液で洗浄した後、各ウェルに1％NP-40（200μlPBS/ウェル；Nonizet P-40；ナカライテスク製）を加え、室温で30分間培養した。
【０２４７】
各ウェルの培養上清（180μl/ウェル）を96穴マイクロプレートに移した後、Fluoroscan II（Labsystems製）を用いて蛍光解析（蛍光波長：590nm；励起波長：544nm）を行った。
【０２４８】
なお、対照試験として、いずれのハイブリドーマ上清をも加えない場合、及びDiI-ヒト酸化LDLを加えない場合の各々について上記と同様にして試験した。
【０２４９】
また、陰性対照抗体として、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、KLH (keyhole limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫して前記と同様にして調製した抗KLH ヒトモノクローナル抗体を用いて、上記と同様にして試験した。
【０２５０】
結果を図３に示す。
【０２５１】
この結果、いずれのハイブリドーマが産生する抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体も、LOX-1を介する酸化LDLの細胞内への取込を有意に阻害する活性を有することが示された。
【０２５２】
実施例５  抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプの決定
前記でスクリーニングした各々のハイブリドーマが産生する抗ヒト酸化LDL受容体ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを、前述したELISA（その１）と同様にして決定した。
【０２５３】
但し、本ELISAにおいてはプレートにコーティングする可溶性ヒト酸化LDL受容体として、hLOX-Fcキメラ蛋白の代わりに前記で調製した精製FALG-hLOX-1を用いた。
【０２５４】
該ヒトモノクローナル抗体の重鎖（H鎖）がIgGであるかIgMであるかを解析するために、2次抗体として、市販のペーオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG-Fc抗体または抗ヒトIgM抗体を用いた。
【０２５５】
該ヒトモノクローナル抗体の軽鎖（L鎖）がIgκであるかIgλであるかを解析するために、2次抗体として、市販のペーオキシダーゼで標識した抗ヒトIgκ抗体または抗ヒトIgλ抗体を用いた。
【０２５６】
いずれのハイブリドーマが産生する抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体も、IgG/κであることが確認された。
【０２５７】
実施例６  ハイブリドーマのクローニング
上記の複数のELISA、酸化LDL取込阻害活性試験、及びアイソタイピングにより同定したヒト酸化LDLに対する中和ヒトモノクローナル抗体を産生する各々のハイブリドーマを、上記の試験を複数回繰り返すことによりサブクローニングし、該抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体を産生する複数種類の各々単一なハイブリドーマを取得した。
【０２５８】
実施例７  抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の大量調製
10％のUltra Low Bovine IgG FBS（GIBCO-BRL社製）を含有するASF104培地（味の素社製）に馴化した前記の各々のハイブリドーマクローン（各々1〜2×106個／ml）を、インテグラセルライン1000（INTEGRA CL1000、インテグラバイオサイエンス社製）に播種し培養を行った。７乃至10日間の培養後、培養細胞数が約１×108個／mlに達した時点で、各々のハイブリドーマの培養上清を回収した。
【０２５９】
次いで、各々のハイブリドーマの培養上清を遠心（3,000rpm、10分間）して得た遠心上澄を、ハイトラッププロテインＧカラム（HiTrap affinity column Protein G、アマシャムファルマシア社製）に供した。次いで、リン酸緩衝液でカラムを洗浄後、プロテインＧカラムに100mMのクエン酸と150mMのNaClからなる溶液（pH2.0）を加え抗体を溶出させた。溶出液に750mMのTris-HClからなる溶液（pH9.0）を加え中和した後、フィルター（ミリポア社製）で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液をリン酸緩衝液で透析（一晩）した後、フィルター（ミリポア社製）で濾過して各々の精製ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体を得た。
【０２６０】
実施例８  抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体のサブクラスの決定
前記で調製した各々の該抗ヒトLOX-1IgGヒトモノクローナル抗体のサブクラスを、ヒトモノクロ−ナル抗体アイソタイプ決定用キット（アメリカン・コーレックス社製）を用い、該キットに添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い決定した。
【０２６１】
いずれの抗LOX-1ヒトモノクローナル抗体もIgG2/κもしくはIgG4／κであることが確認された（図４）。
【０２６２】
実施例９  ヒトLOX-1を発現する天然ヒト由来細胞に対する反応性の試験
前記で調製した各々の抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の天然ヒト由来細胞に対する反応性（結合活性）を下記のようにして測定した。
<9-1>  HeLa S-3でのヒトLOX-1の発現（その１：細胞ELISA）
【０２６３】
天然ヒト由来細胞HeLa S-3でのLOX-1分子の発現を前述のELISA（その２；細胞ELISA）と同様にして確認した。
【０２６４】
HeLa S-3細胞（１×104細胞/ウェル；ATCC CLL-2.2；大日本製薬製）をコラーゲンTypeIコーティングした96穴マイクロプレートに蒔き10％FCS含有Ham's F12培地中で37℃で２日間培養した。培養上清を捨て、0.1％BSA含有Ham's F12培地で洗浄した後、各ウェルに組換えヒトTNFα（10ng/ml×200μl/ウェル）を加え37℃で6時間培養した。培養上清を捨て、前記で調製した各種の抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体（50μl/ウェル）を加え室温で１時間反応させた後、各ウェルを、培地で２回洗浄した。
【０２６５】
次いで、各ウェルにペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ヒトイムノグロブリン（Fc）抗体（1/7000希釈を50μl；Ameircan Corex製）を加え、室温下で30分インキュベートした。マイクロプレートを培地で２回洗浄後、テトラメチルベンジジン（3,3',5,5',-tetramethylbenzidine (TMB)、100μl、BIO-RAD製）を各ウェルに加え、室温下30分間インキュベートした。
【０２６６】
次いで、0.5MのH2SO4（25μl）を各ウェルに加え、反応を止めた。波長450nmでの吸光度をバイオラッド、モデル3550マイクロプレートリーダー（Model 3550 Microplate Reader、BIO-RAD製）で測定した。
【０２６７】
対照試験として、HeLa S-3細胞を10％FCSを含有しないHam's F12培地中で培養したマイクロプレートを用いて同様にして試験を行った。
【０２６８】
また、陰性対照試験として、前記で調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用いて、上記と同様にして試験した。
【０２６９】
結果を図５に示す。
【０２７０】
この結果、HeLa S-3細胞がヒトLOX-1を有意に発現することが確認された。
【０２７１】
<9-2>  HeLa S-3でのヒトLOX-1の発現（その１：ノーザンブロッティング）
天然ヒト由来細胞HeLa S-3でのLOX-1分子の発現を常法に従ってノーザンブロッティング法を用いて確認した。
【０２７２】
HeLa S-3細胞（１×104細胞/ウェル；ATCC CLL-2.2；大日本製薬製）をコラーゲンTypeIコーティングした96穴マイクロプレートに蒔き10％FCS含有Ham's F12培地中で37℃で２日間培養した。培養上清を捨て、0.1％BSA含有Ham's F12培地で洗浄した後、各ウェルに組換えヒトTNFα（10ng/ml×200μl/ウェル）を加え37℃で6時間培養した。次いで、常法に従って該細胞から取得した全RNAからpoly(A)+RNAを調製した。該poly(A)+RNAをアガロースゲル電気泳動に供し、常法に従ってナイロン膜上にブロッティングした。
【０２７３】
前記で調製した組換えヒトLOX-Fcキメラ蛋白発現プラスミドを[α-32P]dCTP（Amersham製）で標識したものをハイブリダイゼーションプローブとした。
【０２７４】
作製したpoly(A)+RNAブロッティング膜に、[α-32P]dCTP標識hLOX-1 DNAをハイブリダイズさせた後、膜を洗浄（1×SSCと0.1％SDSで室温20分、及び0.1×SCSと0.1％SDSで65℃20分（3回））し、オートラジオグラフィーに供した。
【０２７５】
なお、ハイブリダイゼーションは、下記試薬及び条件を用いて常法に従って行った。
【０２７６】
（１）ハイブリダイゼーション溶液（20×SSC（45ml；6倍希釈；ナカライテスク製）、50×Denhardt溶液（15ml；5倍希釈；和光純薬製）、10％SDS（7.5ml；0.5％)、及び蒸留水（82.5ml）；全量150ml）
（２）サケ精子DNA（10mg/ml；Gibco BRL製）
（３）ハイブリダイゼーションプローブ溶液（[α-32P]dCTP標識hLOX-1 DNA（5μl；5ng/μl）及び蒸留水（40μl）；全量45μl）
（４）プレハイブリダイゼーション１（サケ精子DNAを含まないハイブリダイゼーション溶液10mlで10分）
（５）プレハイブリダイゼーション２（サケ精子DNA含有ハイブリダイゼーション溶液18mlで3時間（65℃）
（６）ハイブリダイゼーション（プローブ13.6μl、65℃、氷上）
その結果、約2.5Kbの大きさのバンド（理論値：約2.5Kb）が検出され、HeLa S-3細胞がLOX-1を発現する細胞であることが示された。
【０２７７】
<9-3>  HeLa S-3細胞の酸化LDLの取込活性及び抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体による取込阻害活性
前記の試験でヒトLOX-1の発現が確認された天然ヒト由来細胞HeLa S-3の酸化LDLの取込活性、並びに抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の該酸化LDLの細胞内への取込の阻害活性を下記のように測定した。
【０２７８】
HeLa S-3細胞（5×104細胞/ウェル；ATCC CLL-2.2；大日本製薬製）をコラーゲンTypeIコーティングした24穴マイクロプレートに蒔き10％FCS含有Ham's F12培地中で37℃で２日間培養した。培養上清を捨て、0.1％BSA含有Ham's F12培地で洗浄した後、各ウェルに組換えヒトTNFα（10ng/ml×200μl/ウェル）を加え37℃で6時間培養した。培養上清を捨て、前記で調製した各種の抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体（150μl/ウェル）、40％NBCS（New born calf serum；40μl/ウェル）、及び前記で調製したDiI-ヒト酸化LDL（80μg/ml×10μl/ウェル）の順で加え、37℃で1時間培養した。プレートをリン酸緩衝液で洗浄した後、各ウェルに5mMのEDTA（PBS100μl/ウェル中）を加え、室温で５分間培養した。次いで、各ウェルに10％FCS（PBS100μl/ウェル中）を加え細胞を回収した。
【０２７９】
フローサイトメーター（励起波長：488nm、測定波長：575nm）を用いて、DiI-酸化LDLを取り込んだ細胞の割合（％）、及び細胞内に取り込まれたDiI-酸化LDLの量（蛍光強度）を測定した。
【０２８０】
なお、対照試験として、いずれの抗LOX-1ヒトモノクローナル抗体をも加えない場合、及びDiI-ヒト酸化LDLを加えない場合の各々について上記と同様にして試験した。
【０２８１】
また、陰性対照抗体として、前述したヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、KLH (keyhole limpet hemocyanin、ピアース(PIERCE)社製）を免疫して前記と同様にして調製した抗KLHヒトモノクローナル抗体を用いて、上記と同様にして試験した。
【０２８２】
結果を図６及び図７に示す。
【０２８３】
この結果、HeLa S-3細胞が酸化LDLを取り込むこと、並びにいずれの抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体もが天然細胞によるLOX-1を介する酸化LDLの取込を有意に阻害する活性を有することが示された。
【０２８４】
実施例１０  抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体の抗原に対する親和性及び中和活性の測定
前記で作製した種々の抗ヒト酸化LDL受容体（LOX-1）に対するヒトモノクローナル抗体のヒトLOX-1との結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び解離定数（Ｋｄ）を、市販の測定キットBiacore X（Amersham-PHarmacia製）を用いて測定した。
【０２８５】
なお、下記に述べる抗原のセンサーチップへの固定化以外の操作は、当該キットに添付の取扱い説明書及び実験操作法に従って行った。
【０２８６】
センサーチップに固定化するヒトLOX-1は、前記で調製したヒトLOX-Fcキメラ蛋白を用いた。
【０２８７】
キットに付随のフローセル１（Flow Cell 1）に、0.01MのHBS緩衝液（0.15MのNaCl、3mMのEDTA及び0.005%の界面活性剤P20を含有。pH7.0）を５μl/分で流し、100μlの0.005M NHS（N-Hydroxysuccinimide）／0.2M EDC（N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbodiimide）を添加し、センサーチップ表面に被覆されているCMのカルボキシル基を活性化させた。次いで、5μlのヒトLOX-Fc（10μg/ml；10mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）中）を添加しヒトLOX-Fcをセンサーチップに固定化した。固定化されたヒトLOX-Fcの量は、231RU（resonance unit）であった。なお、未反応の活性化されたカルボキシル基は、35μlの1M Ethanol amine hydrochlorideを添加することによりブロックした。
【０２８８】
リファレンスとしてのフローセル２（Flow Cell 2）は、ヒトLOX-Fcを加えないで上記と同様にして処理することによりキャッピングした。
【０２８９】
フローセルに、リン酸緩衝液を20μl/分の流速で流し、前記実施例で作製した精製抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体（10〜50μg/ml、60μl）を添加した。
【０２９０】
測定は、結合相３分間及び解離相10分間を標準条件として行った。抗体の結合量を経時的に測定しセンサーグラムを得た。得られたセンサーグラムのデータに基づき、キットに付随の解析ソフト（BIAevaluation3.0）を用いて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び解離定数（Ｋｄ；Kd=kd/ka）を算出した。結果を図４に示す。
【０２９１】
いずれの抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体も、ヒトLOX-1に対して極めて高い結合親和性及び中和活性を有していた。
【０２９２】
実施例１１  各種非ヒト哺乳動物のLOX-1に対する交叉反応性
前述のようにして調製した抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体のウシ、ブタ及びウサギの各々のLOX-1に対する交叉反応性の有無を、実施例１で調製した該各々のLOX-1を発現する組換えCHO細胞を用いて、実施例４の酸化LDL取込阻害試験と同様にして解析した。
【０２９３】
結果を図８（ウシLOX-1に対する交叉反応性）及び図４（各種非ヒト哺乳動物にのLOX-1に対する交叉反応性）に示す。
【０２９４】
さらに、ウシ、ブタ及びウサギの各々のLOX-1に対する交叉反応性の有無を、実施例１で調製した当該各々のLOX-1を発現する組換えCHO細胞を用いて、実施例３の細胞ELISA（その２）と同様にして解析した。
【０２９５】
結果を図４に示す。
【０２９６】
この結果、本発明の抗ヒトLOX-1ヒトモノクローナル抗体が、様々な交叉反応性プロファイルを有する抗体であることが示された。
【０２９７】
実施例１２  抗LOX-1抗体のLPS誘発血小板減少症に対する治療学的効果
Sprague-Dawleyラット（雄5乃至７週齢、JCL製）に、生理食塩水にて1mg/mlに調整したLPS（リポ多糖；Sigma製）を3mg/kgの濃度で腹腔内投与して血小板減少症のモデルを作製した。
【０２９８】
前記と同様にしてラットLOX-1（Biochem. J., Vol.330, Pt.3, p.1417-1422, 1998; GenBank Accession No.BAA25785, AB005900；配列番号14及び配列番号15）に交叉反応性を有するウシLOX-1に対するモノクローナル抗体を作製した。なお、ラットLOX-１に対する交叉反応性は、実施例１で調製した当該ラットLOX-1を発現する組換えCHO細胞を用いて、実施例３の細胞ELISA（その２）と同様にして解析した。
【０２９９】
LPSの投与の直後に、生理食塩水にて1mg/mlに調整した抗LOX-1抗体またはLOX-1に反応性を有しない対照抗体を5mg/kgの濃度で静脈内投与した。またLPS及び抗体のいずれも投与しないラットを正常対照として用いた。LPS投与前、並びにLPS投与から２時間後に採血し、自動血球測定装置Sysmex F800（日本光電製）により血中血小板数を測定した。
【０３００】
結果を図９に示す。対照抗体投与群では、LPS投与から2時間後に血小板の減少が起こった。一方、抗LOX-1抗体投与群では、その血小板の減少が有意に抑制された。
【０３０１】
実施例１３  抗LOX-1抗体のLPS誘発肺障害に対する治療学的効果
Sprague-Dawleyラット（雄6乃至７週齢、各群６匹、SLC製）に、抗LOX-1抗体（２、５、10mg/kg）または生理食塩水（5mg/kg）を静脈内投与した。次いで、ペントバルビタール（30乃至50mg/kg, i.p.）で麻酔し、抗体（または生理食塩水）の静脈内投与から1時間後に、生理食塩水にて調整したLPS（リポ多糖；Sigma製）を1mg/kgの濃度で経気道的に投与した。対照群である正常ラットには生理食塩水を経気道的に投与した。
【０３０２】
LPS投与から24時間後に、各ラットをエーテル麻酔下で開腹し、腹部大動脈を切断し、放血死させた。次いで、咽頭部を切開し、気道にカットダウンチューブ（JMS製）を挿入した。該チューブを通じて5mlシリンジで0.05mMのEDTAを含有する生理食塩水、即ちBALF（肺胞液）回収液（5ml）を注入し15回シリンジを往復させてBALFを回収した。回収したBALFを氷冷保存した後、遠心（1000rpm、10分、4℃）し、遠心上清をデカントにて除去し、0.5mlのBALF回収液を加え軽く懸濁させた。この懸濁液に含まれる白血球数を、自動血球測定装置Sysmex F800（日本光電製）で計測した。
【０３０３】
結果を図１０に示す。抗LOX-1抗体投与群では、組織に浸潤する白血球数を抗体濃度依存的に有意に抑制した。驚くべきことに、抗体濃度が10mg/kgでは、白血球の組織浸潤を約50％阻害した。
【０３０４】
実施例１４  抗LOX-1抗体のLPS誘発炎症に対する治療学的効果
Sprague-Dawleyラット（200g、SLC製）に、抗LOX-1抗体（10mg/kg）または生理食塩水（10mg/kg）を静脈内投与した。次いで、抗体（または生理食塩水）の静脈内投与から1時間後に、生理食塩水にて調整したLPS（リポ多糖；Sigma製）を1mg/kgの濃度で足底に投与した。対照群である正常ラットには生理食塩水を足底に投与した。
【０３０５】
LPS投与から12時間後に、各ラットから常法に従って採血し、眼前房に浸潤した白血球数を、自動血球測定装置Sysmex F800（日本光電製）で計測した。また、眼前房に漏出した総蛋白量を測定した。
【０３０６】
結果を図１１及び図１２に示す。抗LOX-1抗体投与群では、眼前房組織に浸潤する白血球数並びに漏出する蛋白量を有意に抑制した。
実施例１５  抗LOX-1抗体のPTCAの術後再狭窄に対する治療学的効果
【０３０７】
Sprague-Dawleyラット（雄約300g、SLC製）をペントバルビタール（30乃至50mg/kg, i.p.）で麻酔した。外科手術により頚動脈及び外頚を露出させ、両動脈を一時的に結合させ血流を一時的に止めた。次いで、外頚動脈に穴を空け、２Fバルーンカテーテル（Baxter製）を挿入し、0.4mlの空気を送り込み、その圧力で血管を内膜を3回擦った。次いで、外頚動脈を縛り、一時的に結合させておいた頚動脈と内頚動脈を解き血流を再開させた。手術部位を縫い合わせ、直ちに抗LOX-1抗体（10mg/kg）を静脈内投与した。
【０３０８】
その後3日毎に４回ずつ抗体（10mg/kg）を静脈内投与した。2週間後、ラットを再度ペントバルビタール（30乃至50mg/kg, i.p.）で麻酔し、4％ホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で還流固定を行い、頚動脈を取り出した。頚動脈をパラフィンで包埋し、１つのサンプルから６つの切片を作成し、エラスチカ・ワンギーソン染色を行った。NIH analyze systemを用いて、各切片の血管内膜の肥厚の状態を評価した。内膜と中膜の面積の比を算出し、有意な肥厚が見られる２つの切片を選びその平均をそのサンプルの肥厚量とした。
【０３０９】
結果を図１３に示す。抗LOX-1抗体により、PTCAの術後再狭窄が有意に抑制された。
【０３１０】
実施例１６  抗LOX-1抗体の動脈での血栓形成に対する抑制・予防効果
本試験は、光化学的により人工的に血栓形成を誘導したラットモデル（PITモデル；pHotochemically-induced thrombosis model）を用いた（J. Pharmacol. Method., Vol.25, p.303, 1991; Thrombo. Res., Vol.63, p.405, 1991など）。
【０３１１】
正常ラットをチオブタバルビタール（100mg/kg, i.p.）で麻酔した。各ラットを背位に固定し、左大腿動脈に血圧測定用のカニューレを挿入して血圧を連続的に測定した。また、左大腿静脈には、ラジカル誘導剤であるローズベンガル（rose bengal; 20mg/kg）を投与するためのカニューレを挿入した。さらに、右大腿動脈の末梢部を剥離露出させ、パルスドップラー血流プローブを装着した。
【０３１２】
パルスドップラー血流プローブを装着した部位の中枢側約２mmの部位に、キセノンランプを用いて波長540nmの緑色光を照射し、その5分後にローズベンガル（20mg/kg）を静脈内投与し、血栓形成を誘導した。10分後に光照射を中止し、以降90分間に亘り、検知される血流音を指標に血栓形成の状態を観察した。
【０３１３】
この血栓形成に対する抗LOX-1抗体の抑制効果の試験のために、キセノンランプの照射の１時間前に、前記実施例で調製した抗LOX-1モノクローナル抗体（10mg/kg）を静脈内投与した。
【０３１４】
結果を図１４及び図１５に示す。
抗LOX-1抗体により、血栓の形成が有意に抑制された。
【産業上の利用可能性】
【０３１５】
産業上の利用の可能性
本発明のヒト酸化LDL受容体（hLOX-1）に結合するヒトモノクローナル抗体は、ヒトに由来する抗体であることから、マウス由来の抗体等の非ヒト哺乳動物由来の抗体からなる抗体医薬品の治療上の大きな問題点（副作用）であったヒトに対する抗原性、即ちHAMA（Human anti-mouse antigenicity）に起因する宿主の重篤な免疫拒絶反応を全く惹起しない（HAMAに起因する宿主の免疫拒絶反応を惹起しない。）ことから、抗体の医薬品としての価値を劇的に増大させるものである。
【０３１６】
従って、本発明のヒト酸化LDL受容体に対するヒトモノクローナル抗体及び該ヒトモノクローナル抗体からなる医薬組成物、並びに、該酸化LDL受容体の生体内リガンドの該酸化LDL受容体への結合、または該リガンドの該酸化LDL受容体を発現する細胞による取込を阻害する活性を有する物質（例えば、該ヒトモノクローナル抗体等の種々のモノクローナル抗体、あるいは化学合成低分子化合物など）は、ヒトLOX-1の生体内リガンド（例えば、酸化LDLなどの変性LDL、老化赤血球、apoptotic細胞、活性化血小板など）のLOX-1への結合及び／または該リガンドのLOX-1を介する細胞内への取込を阻害することができ、該LOX-1リガンドとLOX-1との相互作用（結合、取込）に起因する種々の疾患（例えば、動脈硬化症、血小板減少症、腎疾患、種々の炎症（例えば、心筋虚血再潅流傷害、経皮的冠動脈血栓溶解術（PTCR）の術後、または経皮的冠血管形成術（PTCA）の術後における炎症反応など）、PTCAやPTCRの術後の血管再狭窄など）、血管（動脈など）における血栓の形成などの疾患または疾患症状の発症及び／または進行を抑制、阻止し、該疾患を治療または予防するための医薬品として有用である。
【０３１７】
「配列表フリーテキスト」
配列番号：５
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
配列番号：６
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
配列番号：７
他の情報：人工配列についての記載：ヒト免疫グロブリンIgG１のＦｃ領域をコードするエクソンからなるゲノミックDNAを含むプラスミドpCd51neg1のベクターDNA。
配列番号：８
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
配列番号：９
他の情報：人工配列についての記載：人工的に合成したプライマー配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年5月30日(2013.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト酸化LDL受容体に結合するヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項２】
該ヒトモノクローナル抗体が、酸化LDLのヒト酸化LDL受容体への結合または酸化LDLのヒト酸化LDL受容体を介した細胞内への取込を阻害する活性を有することを特徴とする請求項１に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項３】
該ヒトモノクローナル抗体のイムノグロブリンクラスが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかであることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項４】
該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との結合速度定数（ｋａ）が、1.0×104(1/M.Sec)以上の数値であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項５】
該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との解離速度定数（ｋｄ）が、1.0×10-2(1/Sec)以下の数値であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項６】
該ヒトモノクローナル抗体とヒト酸化LDL受容体との解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-6(M)以下の数値であることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項７】
該結合速度定数（ｋａ）が、1.0×105(1/M.Sec)以上の数値であることを特徴とする請求項４に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項８】
該解離速度定数（ｋｄ）が、1.0×10-4(1/Sec)以下の数値であることを特徴とする請求項５に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項９】
該解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-7(M)以下の数値であることを特徴とする請求項６に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１０】
該解離定数（Ｋｄ）が、1.0×10-8(M)以下の数値であることを特徴とする請求項９に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１１】
該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１乃至請求項１０のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１２】
該ヒトモノクローナル抗体が、ヒト酸化LDL受容体を発現する細胞、該細胞の可溶性膜画分またはヒト酸化LDL受容体の全部若しくは一部を、ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に免疫することにより得られるモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１３】
該トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、トランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載のヒトモノクローナル抗体またはその一部。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項１３のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体を産生する細胞。
【請求項１５】
該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体を産生する能力を哺乳動物由来のＢ細胞と哺乳動物由来のミエローマ細胞とを融合して得られる融合細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
該細胞が、該ヒトモノクローナル抗体の重鎖をコードするDNA若しくはその軽鎖をコードするDNAのいずれか一方のDNA、または両方のDNAが細胞内に導入されることにより形質転換された遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。