(57)【要約】      （修正有）【課題】３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを良好に得ること。【解決手段】次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）前記のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能力を有するタンパク質（ｃ）前記のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【請求項２】
次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２又は３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２又は３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２又は３に表される塩基配列と８５％以上同一性を有する塩基配列からなり、且つ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するポリヌクレオチド
【請求項３】
次の酵素学的性質を有する、Cellvibrio属由来の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。
１．作用：ネオアガロビオースを基質とし、これに親和性を有し、且つ作用して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する。
２．基質特異性：ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースから選ばれる１種以上のものと作用し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する。
３．最適ｐＨ：５〜７である。
４．最適温度：ネオアガロビオースを基質としたとき、１０〜４０℃である。
５．分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における測定で、分子量３５ｋ〜４５ｋＤａを示し、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける測定で、分子量７０〜９０ｋＤａを示すホモ二量体である。
６．Ｎ末端アミノ酸配列がGly-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Lys-Leu-Ser-Lys-Ala-Ser-Leu-Arg-Ala-Ile-Glu（配列番号４）である。
【請求項４】
請求項１若しくは３記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は請求項２記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
宿主が微生物である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記微生物が大腸菌又は枯草菌である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む微生物を培養し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素を回収することを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素の製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【請求項９】
前記微生物が、Cellvibrio属細菌若しくはこれを親株とした変異株、又は請求項５若しくは請求項６記載の形質転換体であることを特徴とする請求項８記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素の製造方法。
【請求項１０】
次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素を用いて、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得ることを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【請求項１１】
前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素の反応条件が、反応温度１０〜４０℃であることを特徴とする請求項１０記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【請求項１２】
次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む微生物を培養し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得ることを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【請求項１３】
前記微生物が、Cellvibrio属細菌若しくはこれを親株とした変異株、又は請求項５若しくは請求項６記載の形質転換体であることを特徴とする請求項１２記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【請求項１４】
さらにネオアガロビオース生成酵素を用いる請求項１０〜１３の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【請求項１５】
前記ネオアガロビオース生成酵素が、Ｄ−ガラクトースβ（１−４）３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースのβ−１，４結合を加水分解するものである請求項１４記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【請求項１６】
Cellvibrio sp. WU-0601と命名され、NITE P-1365として寄託された微生物。
【請求項１７】
請求項１０〜１５の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて美白素材を製造する方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１５の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて得られたものを配合する美白剤。
【請求項１９】
請求項１０〜１５の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて得られたものを配合する美白剤の製造方法。
【請求項２０】
配列番号４に記載のアミノ酸配列、当該アミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列及びこれをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いた３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法、及び当該製造方法にて得られたものを配合する美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
テングサ、オゴノリ等の紅藻類には、ガラクトース又はガラクトース誘導体から構成される多糖類が存在し、その中には水溶性粘質物が存在する。この水溶性粘質物として、例えば、アガロース及びアガロペクチン等を含む寒天、ポルフィラン、カラゲナンが挙げられ、これらには硫酸基を有するものも存在する。これら水溶性粘質物の様々な効能が検討されており、例えば、寒天では、便秘改善、腸内コレステロール吸収阻害、ダイオキシン等の有害物質の排出作用等が知られている。この寒天のアガロースは、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとが交互にそれぞれβ−１，４結合、α−１，３結合で直鎖状に並んだ基本構造を有している。また、このような基本構造は、ポルフィランやカラゲナン等の紅藻類由来の多糖類に多く認められる構造である。
【０００３】
そして、紅藻類は海洋資源として多く存在しているものの、食用や寒天培地等に利用されているに過ぎず、これら資源が有効活用されていないのが実状である。
近年、アガロースのような、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース及びＤ―ガラクトースを有する多糖類からのオリゴ糖等の切り出し、及び切り出されたオリゴ糖の有効活用が試みられてきている。
例えば、寒天等のような構造を有する多糖類からネオアガロビオースが生成可能な酵素及びそれを利用したネオアガロビオース等のオリゴ糖の製造方法（特許文献１及び２）、またネオアガロビオースを含有する美白用外用剤（特許文献３）が提案されている。
【０００４】
しかしながら、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（以下、「ＡＬＧ」ともいう）については十分な知見が得られていないのが実状である。
３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを製造するには、一般的に寒天或いはアガロースを酸存在下で加熱し、加水分解する手法が挙げられるが、ＡＬＧのアンヒドロ構造が加水分解により消失する可能性が高い。また、アルカリ存在下で加熱し加水分解する手法もあるが、同様にアンヒドロ構造が消失する可能性が高く、また、単糖はアルカリ存在下の室温で転位反応が起こることも知られている。このように、酸アルカリ処理では、効率良くＡＬＧを得ることが難しいのが実状である。
このため、良好に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得る手段が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−１４９９７９号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８８９号公報
【特許文献３】特開平８−３１０９３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、斯かる実状に鑑み、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを良好に生成する酵素、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いた３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法等を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（以下、「ＡＬＧ」ともいう）生成酵素の探索について鋭意検討を行った結果、新規な非海洋性微生物の細胞内にネオアガロビオース加水分解酵素(neoagarobiose hydrolase, NAH)の活性があることを見出した。ネオアガロビオース加水分解酵素の報告例は極めて少なく、また海洋由来の多糖類を分解する酵素を非海洋性微生物から見出されたことは、全くの意外であった。さらに、本発明の酵素は、後述するように新規な酵素であり、ネオアガロビオース及びその他のオリゴ糖から、アンヒドロ構造が消失せずに３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得られることも見出した。斯様にして、本発明者は、本発明の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いた３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法、当該ＡＬＧの用途発明等を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１４］に係る発明を提供する。
【０００９】
［１］次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【００１０】
［２］次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２又は３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２又は３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２又は３に表される塩基配列と８５％以上同一性を有する塩基配列からなり、且つ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するポリヌクレオチド
【００１１】
［３］次の酵素学的性質を有する、Cellvibrio属由来の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。
１．作用：ネオアガロビオースを基質とし、これに親和性を有し、且つ作用して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する。
２．基質特異性：ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースから選ばれる１種以上のものと作用し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する。
３．最適ｐＨ：５〜７である。
４．最適温度：ネオアガロビオースを基質としたとき、１０〜４０℃である。
５．分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における測定で、分子量３５ｋ〜４５ｋＤａを示し、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける測定で、分子量７０〜９０ｋＤａを示すホモ二量体である。
６．Ｎ末端アミノ酸配列がGly-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Lys-Leu-Ser-Lys-Ala-Ser-Leu-Arg-Ala-Ile-Glu（配列番号４）である。
【００１２】
［４］上記［１］又は［２］記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は上記［３］記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
［５］上記［４］記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【００１３】
［６］次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む微生物を培養し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素を回収することを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素の製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【００１４】
［７］次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素を用いて、３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの基本構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得ることを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【００１５】
［８］次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む微生物を培養し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの基本構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得ることを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【００１６】
［９］（１）ネオアガロビオース生成酵素を用いて、Ｄ−ガラクトースβ（１−４）３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの基本構造を有する糖質のβ−１，４結合を加水分解することと、
（２）前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素を用いて、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの基本構造を有する糖質を加水分解することと、
（３）３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得ること、を含む、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【００１７】
［１０］Cellvibrio sp. WU-0601と命名され、NITE P-1365として寄託された微生物。
【００１８】
［１１］前記記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて美白素材を製造する方法。
［１２］前記記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて得られたものを配合する美白剤。
［１３］前記記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて得られたものを配合する美白剤の製造方法。
【００１９】
［１４］配列番号４に記載のアミノ酸配列、当該アミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列及びこれをコードするポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを良好に生成する酵素、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いた３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法等を提供することができる。これにより、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを良好に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本開示のＡＬＧ生成酵素を用いて、多糖又はオリゴ糖から３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得る際の反応の一例を示す。
【図２】セルビブリオ属細菌から本開示のＡＬＧ生成酵素の精製。
【図３】本開示のＡＬＧ生成酵素におけるｐＨ依存及び温度依存の酵素活性を示す。
【図４】ＧＨ３２の各酵素と本開示のＡＬＧ生成酵素との相同性の関係を示す。
【図５】本開示のＡＬＧ生成酵素と、これに高い相同性を示す機能未知タンパク質とのアライメントを示す。
【図６】本開示の酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動分析を示す。
【図７】本開示のＡＬＧ生成酵素及びそれをコードする遺伝子を示す。
【図８】本開示のＡＬＧ生成酵素及びそれをコードする遺伝子を示す。
【図９】本開示のＡＬＧ生成酵素及びそれをコードする遺伝子を示す。
【図１０】本開示のＡＬＧの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトラム及び本開示の３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトピラノースの構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
１．本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素
（１）本開示のＡＬＧ生成酵素の酵素学的性質
（２）本開示のＡＬＧ生成酵素のアミノ酸配列及びこれをコードするポリヌクレオチド
（３）本開示のＡＬＧ生成酵素の取得方法
２．本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法
（１）本開示のＡＬＧ生成酵素による３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法
（２）本開示のＡＬＧ生成酵素をコードする遺伝子を有する微生物による３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法
３．本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの用途
（１）医薬品、化粧料、皮膚外用剤、食品など
【００２３】
＜１．本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素＞
本開示は、新規な３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素であり、当該ＡＬＧ生成酵素は、以下の酵素学的性質並びに配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するものである。当該ＡＬＧ生成酵素は、ホモ二量体を形成しているのが好適である。
また、本開示のポリヌクレオチドは、新規なポリヌクレオチドであり、当該ポリヌクレオチドは、前記ＡＬＧ生成酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、配列番号２又は配列番号３で表されるポリヌクレオチドを有するものである。
【００２４】
本開示のＡＬＧ生成酵素は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するものであり、好ましくは３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）糖残基の基本構造を有する糖質の当該α−１，３結合を加水分解して３，６−アンヒドロ−α−Ｌ−ガラクトースを生成するものである。
【００２５】
一般的に糖の還元末端がアルデヒド基やケトン基の開環状になっていると、他の化合物と反応しやすい。そこで回収の際に還元末端にメチル基等を導入させてこの部分を保護することも考えられるが、最終的には保護部分を再び水酸基に戻すことや有機溶媒を除去する必要があり、工程が煩雑となり、ＡＬＧの回収率も低下する。このため、アガロビオース等のようにＡＬＧが開環状になっているものよりも、ネオアガロビオース等のようにＡＬＧが閉環状になっているものを用いる方が、ＡＬＧを高純度で容易に回収することができる。しかし、ネオアガロビオース加水分解酵素の報告例が極めて少なく、斯様な酵素を見出すことは困難であるという実状があった。
しかしながら、本開示のＡＬＧ生成酵素を得、これをＡＬＧの製造に使用することによって、糖質の還元末端が開環状によって引き起こされる構造変化による副産物の生成も少なく、またアンヒドロ構造を消失させないような反応条件にて反応も可能であるため、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを良好に得ることが可能となった。
【００２６】
（１）本開示のＡＬＧ生成酵素の酵素学的性質
〔作用〕
本開示のＡＬＧ生成酵素は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するものである。好ましくは、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）糖残基の基本構造を有する糖質の当該α−１，３結合を加水分解して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成するものである。さらに、ネオアガロビオースを基質とし、これに高い親和性を有するものが好適である。当該糖残基として、ガラクトース、グルコース等が挙げられるが、ガラクトースが好適である。また、糖残基としてピラノース型が好適である。
ネオアガロビオースの他、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースに高い親和性を有する酵素が好適である。この基質のうちで、ネオアガロビオースに、より高い親和性を有する酵素が好適である。
【００２７】
【化１】
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【００２８】
〔基質特異性〕
基質は、ネオアガロビオースに限らず、本開示のＡＬＧ生成酵素にて３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成できるものであればよい。
基質として、例えば、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの基本構造を少なくとも有するオリゴ糖；さらにこのＤ−ガラクトースとβ（１−４）結合した３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの基本構造を有するオリゴ糖；さらにこの３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとα（１−３）結合したＤ−ガラクトースを有するオリゴ糖；及びこれらの繰り返し基本構造を有するオリゴ糖等が挙げられる。
当該オリゴ糖は、好適には２〜９糖残基のもの、より好適には２〜６糖残基のものであり、さらに好適にはネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースから選ばれる１種以上のものである。
【００２９】
〔動力学的定数〕
ＫＭ＝４〜５×１０  （ｍＭ）
Ｖｍａｘ＝６．５〜７．５×１０−３（ｍＭ／ｓｅｃ）
ｋｃａｔ＝３．５〜４．５×１０  （ｓｅｃ−１）
［１〜１６ｍＭのネオアガロビオース濃度で１０〜５０分間反応］
【００３０】
〔最適反応ｐＨ〕
最適ｐＨ（２５℃）は、５〜７付近であるのが好ましく、５．５〜６．０付近であるのが好ましい。特にｐＨ６．０のクエン酸緩衝溶を用いたとき最も高い活性を示す。
【００３１】
〔反応温度〕
最適反応温度は、１０〜４０℃であるのが好ましく、２０〜３０℃であるのがより好ましい。
〔熱安定性〕
４０℃以下では安定、３０℃以下では活性を維持する。４０℃では４５〜５５％の活性が残存する。５０℃以上ではほぼ０％の活性である。
【００３２】
〔分子量〕
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（Lammli等の方法）における測定で、本開示のＡＬＧ生成酵素は、ほぼ単一で、分子量３５〜４５ｋＤａ、特に分子量４０〜４５ｋＤａを示す。
また、ゲル濾過法における測定で、分子量７０〜９０ｋＤａ、特に分子量８０〜８５ｋＤａを示す。
このときのゲル濾過の測定分析には、酵素を予め溶出緩衝液（10％グリセロール, 1 mMジチオトレイトール（DTT）, 20 mMリン酸緩衝液, 0.15 mM NaCl, pH7）で平衡化させたスペロースゲル濾過カラム（Superose 6 10/300）に供し、カラム容量の１倍の溶出緩衝液で溶出する。
ゲル濾過の標準タンパク質として、牛血清アルブミン（M.W.67,000）、キモトリプシノゲン（M.W.25,000）、α−アミラーゼ（M.W.45,000）、β−アミラーゼ（M.W.200,000）を用いる。
【００３３】
〔金属イオン等の影響〕
Ａｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、ｐＣＭＢ（パラクロロマーキュリー安息香酸）から選ばれる１種以上のものによって、ＡＬＧ生成活性が阻害される。このうち、Ａｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｃｕ２＋、ｐＣＭＢが８５〜１００％程度、ＡＬＧ生成活性が阻害する。一方で、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋から選ばれる１種以上のものによって、ＡＬＧ生成活性が向上する。
【００３４】
〔Ｎ末端アミノ酸配列〕
本開示のＡＬＧ生成酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列を有するものが好適であり、当該Ｎ末端アミノ酸配列（開始コドンのMetを除く）として、Gly-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Lys-Leu-Ser-Lys-Ala-Ser-Leu-Arg-Ala-Ile-Glu（配列番号４）である。この部分アミノ酸配列は、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入されていてもよい。
なお、Ｎ末端側のアミノ酸残基の配列は、公知の手法（Edman, P. (1950) Acta Chem. Scand. 4: 283-293）にて得ればよい。一例として、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法にて酵素を泳動し、得られた酵素バンドを電気的にポリビニリデンフロオライド（ＰＶＤＦ）膜等に移動させた後に、プロテインシーケンサーにて分析することで決定することができる。
また、前記Ｎ末端アミノ酸配列（配列番号４）、当該アミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列及びこれをコードするポリヌクレオチドは、本開示のＡＬＧ生成酵素及びＡＬＧ生成酵素産生微生物のスクリーニングや製造等に使用することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドと保存配列（好適にはglycosylhydrolase family 32における保存配列）に基づくプライマー、好ましくは配列番号５及び／又は配列番号６で表されるポリヌクレオチドを用いるのが好ましい。
【００３５】
（２）本開示のＡＬＧ生成酵素のアミノ酸配列及びこれをコードするポリペプチド（遺伝子）
【００３６】
本開示のＡＬＧ生成酵素には、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のタンパク質が包含される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性を有するタンパク質。好適には、ネオアガロビオースに対する高い親和性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性をするタンパク質。好適には、ネオアガロビオースに対する高い親和性を有するタンパク質。
【００３７】
本開示の配列番号１に示すＡＬＧ生成酵素のアミノ酸配列と、Saccharophagus degradans 2-40由来Sde_2657のアミノ酸配列とは、７５％の同一性を示したものの、８０％以上の同一性を示すものは見つからなかった。これにより、本開示のＡＬＧ生成酵素は、ＧＨ３２の中に新規なグループを形成する新規酵素であると考えられる（図４及び図５参照）。クローニングした際のＡＬＧ生成酵素をコードする遺伝子には、Ｎ末端側に分泌に必要とされるシグナルペプチドの領域が存在しないことから、本開示のＡＬＧ生成酵素は細胞内に存在する酵素と考えられる。また、上述の如くＮ末端アミノ酸配列を明らかにしたことにより、これに基づきスクリーニング等に用いることによって、本開示の酵素と高い同一性を有する関連酵素の探索も容易となると考えられる。
また、本開示のＮＡＨ遺伝子は、本開示のＡＬＧ生成酵素をコードするポリヌクレオチドを包含することから、新規な遺伝子である。
【００３８】
本開示において、アミノ酸配列及び塩基配列の相同性は、Lipman-Person法（Science, 227, 1435, （1985））等の公知のアルゴリズムによって計算され、またこれによって配列を比較することにより行うことができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX（登録商標）-ver 8.1（ソフトウエア開発：ゼネティックス社）のホモロジー解析（Search homology）プログラムのサーチホモロジーやマキシムマッチングプログラムを用いて、同一性を算出することができる。例えば、Unit size to compare(ktup)を２として解析を行うことにより算出される。なお、本開示において「相同性」は「同一性」を意図する。
【００３９】
また、本開示において、転写開始領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno (SD)配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463(1974)）に相当する部分である。
【００４０】
ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１とそれぞれ機能的に等価なアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有する配列をいう。好ましくは、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）糖残基の構造を有する糖質の当該α−１，３結合を加水分解して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する活性を有する配列が好適である。さらに、ネオアガロビオースに対する高い親和性を保持する配列が好適である。また、付加には、両末端への１若しくは数個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸の付加も含まれる。
【００４１】
前記機能的に等価なアミノ酸とは、少なくとも３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）糖残基の構造を有する糖質の当該α−１，３結合を加水分解して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する活性能を有する酵素であればよく、更に付加的な性質を有していてもよい。更に、ネオアガロビオースに対する高い親和性を有するのが好適である。また、配列番号２又は配列番号３に示すＮＡＨ遺伝子によりコードされるタンパク質と実質的に同じ機能、具体的には上述の本開示のＡＬＧ生成酵素の機能を有するのが好適である。
【００４２】
また、配列番号１に示すアミノ酸配列において、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列が好適である。
後記実施例に示すように、本開示のＡＬＧ生成酵素の発見により新規な酵素群も発見したことから、本開示の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と、上述の如くＡＬＧを生成する活性を少なくとも有し、好適にはさらにネオアガロビオースに対する高い親和性を有するという機能的に等価な酵素で、かつ８５％程度以上の同一性の範囲内にあるものであれば、この新規な酵素群に含まれるであろう。
【００４３】
本開示のポリヌクレオチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質又は当該アミノ酸配列と機能的に等価なアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するものであるが、次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリヌクレオチドも包含される。なお、本開示の遺伝子は、本開示のポリヌクレオチドからなる遺伝子を包含するものである。
【００４４】
本開示において、このうち、次の（ａ）〜（ｃ）が好ましい。
（ａ）配列番号２又は配列番号３に表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号２又は配列番号３に表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、かつ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。好適には、ネオアガロビオースに対する高い親和性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号２又は配列番号３に表される塩基配列と８５％以上同一性を有する塩基配列からなり、かつ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。好適には、ネオアガロビオースに対する高い親和性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号２又は配列番号３に示す塩基配列において、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列が好適である。
【００４５】
本開示のポリヌクレオチドには、配列番号２又は配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）において、変異剤処理、ランダム変異、特定部位突然変異、欠損或いは挿入等によって部分的に塩基配列が変化したものであっても、これらのＤＮＡ変異体が配列番号２又は配列番号３の塩基配列で表されるＤＮＡとストリンジエントな条件でハイブリダイズし、かつ少なくとも３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含するものである。
好適には、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）糖残基の基本構造を有する糖質の当該α−１，３結合を加水分解して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する活性を有するものである。さらに好適には、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性を有し、かつネオアガロビオースに対する高い親和性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含するものである。
例えば、１若しくは数個（例えば２〜３個）の塩基配列が、置換、欠失若しくは付加された塩基配列等が挙げられる。また、付加には、両末端への付加も含まれる。ここで、「１若しくは数個」とは、１〜６個、好ましくは１〜３個程度をいう。
【００４６】
ここで、「ストリンジエントな条件」とは、例えばMolecular cloning-a laboratory manual, 2nd edition (Sambrook et al, 1989）に記載の条件が挙げられる。すなわち、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブと共に６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００４７】
また、上述の（ｂ）若しくは（ｃ）で表されるポリヌクレオチド又はこれらいずれか１のポリヌクレオチドからなる遺伝子は、例えば、（ａ）で表されるポリヌクレオチドに比べて、ｍＲＮＡの発現量が多い；そのｍＲＮＡの安定性が高い；翻訳されるタンパク質の安定性が優れている等の付加的な性質を有していてもよい。
【００４８】
また、これら（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチド又はこれらいずれか１のポリヌクレオチドからなる遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域の何れか１以上の領域を結合させてもよい。
なお、本開示において、転写開始領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno (SD)配列（Proc. Nalt. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。
また、本開示において、遺伝子の上流又は下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の５’側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の３’側に続く領域を示す。
【００４９】
（３）本開示のＡＬＧ生成酵素の取得方法
本発明のＡＬＧ生成酵素は、Cellvibrio属（セルビブリオ）細菌若しくはその変異株、又は前記ＡＬＧ生成酵素をコードするポリヌクレオチド若しくはその断片を導入した形質転換体（好適には微生物）によって、生産させ、取得することが可能である。
本開示のＡＬＧ生成酵素を取得する方法として、培地成分中で、本開示のＡＬＧ生成酵素を産生する微生物を増殖させ、当該微生物に本開示のＡＬＧ生成酵素を生産させ、生産されたＡＬＧ生成酵素を回収することが挙げられる。
【００５０】
前記培地成分の炭素源として、寒天、アガロース、アガロヘキサオース、アガロトリオースなどを単独あるいは併用して使用することが可能である。グルコースなどの他の炭素源を併用することも可能である。
前記培地成分の窒素源としては、各種無機アンモニア塩、硝酸塩、尿素などの無機窒素源や、カザミノ酸、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、大豆粉、コーンスティープリカー、各種アミノ酸などの有機窒素化合物を、使用微生物の資化性と生育を考慮して、１種又は２種以上を適宜選択して使用することができる。
前記培地成分の無機塩としては、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、カリウムのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩などの１種又は２種以上を適宜添加することができる。 更に、必要に応じて、植物油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。
【００５１】
培養は、前記培地成分を含む液体培地中で振盪培養、通気撹拌培養、連続培養など通常の培養法を用いて実施可能である。
培養条件は、培地の種類、培養法により適宜選択すればよく、微生物が増殖して前記ＡＬＧ生成酵素を生産可能な条件であればよい。通常、培養初発ｐＨ６.０〜８.０、温度２５〜３７℃で通気撹拌して培養を行えば良く、培養日数は１〜２日間程度とすることが多い。
【００５２】
以上のようにして生産された本開示のＡＬＧ生成酵素は、公知の方法で分離、回収すればよい。以下に一例を説明する。
菌体内にＡＬＧ生成酵素がある場合には、培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、物理的・化学的に処理して菌体の外に放出させればよい。例えば、回収した菌体を緩衝溶液にて洗浄を行い、界面活性剤により菌体より酵素を遊離させ、更に遠心分離により菌体を除去することで、酵素の抽出液（粗酵素溶液）が得られる。あるいは、回収した菌体を緩衝溶液にて洗浄を行い、液体窒素（約−８０℃）にて瞬時に凍結して細胞膜や細胞壁を損傷させ、再度緩衝溶液に分散させて混合した後、遠心分離により菌体を除去することで、酵素の抽出液（粗酵素溶液）が得られる。
また、菌体外にＡＬＧ生成酵素がある場合には、培養終了後、濾過や遠心分離により菌体を除去し、当該酵素を含む培養ろ液が得られる。
【００５３】
得られた酵素を含む液は、ゲル濾過などの操作により脱塩処理したのち、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などの精製方法を１種又は２種以上組合せて高純度に精製することが可能である。また、硫安塩析、溶媒沈澱法、凍結乾燥、限界濾過、クロマトフォーカシングなどの方法も利用される。
具体的な一例として、培養液から酵素と微生物とを分離できる状態に処理し、ここから微生物を除去し、この無細胞抽出液から公知の酵素分離精製法を用いて濃縮や回収することができる。分離精製法としては、例えば、ゲル濾過クロマトや限界ろ過膜等の濾過法、また硫安添加による酵素沈殿法等が挙げられる。
【００５４】
本開示のCellvibrio属（セルビブリオ）細菌は、上述のＡＬＧ生成酵素をコードするポリヌクレオチドを有するものであれば特に限定されないが、ネオアガロビオース等の上述の基質から３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生産する機能、さらに３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）糖残基のα−１，３結合部分を加水分解する機能を有するものが好適である。
前記ＡＬＧ生成酵素をコードするポリヌクレオチドを有するCellvibrio属細菌及びこれと同等の菌、並びにその変異株が挙げられる。ここで、変異株とは、野生株を、紫外線、電離放射線、亜硝酸、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等の処理という公知の手法により、得ることができる。なお、変異株には、野生株からの変異株を更に変異させたものも含む。
【００５５】
前記Cellvibrio sp. WU-0601(NITE P-1365)菌株が好適である。この菌学的性質及び生理学的性質を以下に示す。
前記WU-0601菌株は、グラム染色陰性で好気条件下で生育を示す細菌である。（０．７〜０．８）μｍ×（１．５〜２．５）μｍの大きさの桿菌で、鞭毛を有し、運動性がある。オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性で、グルコースやスクロースの資化性を有している。
【００５６】
なお、前記WU-0601菌株は、以下の手順にて取得したものである。土壌や海水、河川水などを分離源として、ＡＤ培地上で生育可能な微生物を多数取得する。ＡＤ培地で３０℃、２４時間培養した細胞を破砕等の物理的・化学的処理をし、遠心分離して、無細胞抽出液を調製する。この無細胞抽出液について、ネオアガロビオースを分解する活性の検出試験を行い、顕著な活性を有する微生物を取得する。このようにして、日本の関東地域の土壌から、前記WU-0601菌株を採取することができた。
更に、本WU-0601菌株に関するこれらの形態観察による性質や細菌学的性質は、Cellvibrio属細菌或いは一部のPseudomonas属細菌のものと類似していたが、16SrDNAは完全一致とはなっていない。このため、本菌株は、Cellvibrio属に属する新規な微生物であると推定し、本菌株をCellvibrio sp. WU-0601(NITE P-1365)菌株と命名した。このCellvibrio sp. WU-0601(NITE P-1365)菌株は、上述のことから新規な微生物として、2012年 5月22日、〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）に、Cellvibrio sp. WU-0601  (NITE P-1365)菌株として寄託した。
【００５７】
本開示のCellvibrio属細菌から、本開示のＡＬＧ生成酵素を生産するには、一般的な土壌細菌の培養用の培地（好適にはCellvibrio属細菌の培養に使用されている一般的な培地）に植菌し、適当な温度で培養すればよい。培養液からの本開示のＡＬＧ生成酵素の生産は、常法に従って行うことができる。具体的には、培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、無細胞抽出液から公知の酵素分離精製法を用いて濃縮や回収することができる。分離精製法としては、例えば、ゲル濾過クロマトや限界ろ過膜等の濾過法、また硫安添加による酵素沈殿法等が挙げられる。
【００５８】
本開示のポリヌクレオチド及び遺伝子は、上述のように自然界から得ることが可能であるが、その遺伝子を上述の微生物（好適にはセルビブリオ属細菌）の染色体ＤＮＡからクローニングし、これに基づき、本開示のＡＬＧ生成酵素を大量に生産、回収することもできる。
ＮＡＨ遺伝子のクローニング方法としては、例えば、当該ポリヌクレオチド及び又は遺伝子を安定的に増幅できるＤＮＡベクターに連結させる、或いは当該遺伝子に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させる等の方法で本開示のＡＬＧ生成酵素をコードするＤＮＡを安定的に増幅し、更に当該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、本開示のＡＬＧ生成酵素を生産させる方法が採用できる。
【００５９】
なお、本開示のポリヌクレオチド及びＮＡＨ遺伝子等は、公知の手法（例えば、「Sambrook, J., Fritch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 2, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY」参照）にて取得すればよい。一例として、ＡＬＧ生成酵素産生菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファージベクターを用いて、ＡＬＧ生成酵素産生菌株のゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。或いは、ＡＬＧ生成酵素産生菌株から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴをプライマーとした逆転写酵素反応にてｍＲＮＡに対応したｃＤＮＡを調製後、ファージベクターを用いて、ＡＬＧ生成酵素産生菌株のｃＤＮＡからなるライブラリーを作成する。
上述の如きＮ末端アミノ酸配列及び保存配列（好適にはglycosyl hydrolase family 32における保存配列）をもとに、適当なプライマーをデザインし、合成し、それを用いてＡＬＧ生成酵素産生菌株由来のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＮＡＨ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅する。このＤＮＡ断片をプローブとして用い、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行う。このようにしてＮＡＨ遺伝子の全領域又は発現に必要な領域を単離することが可能となる。これらのＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、翻訳開始コドンの上流及び翻訳終結コドンの下流に、ＰＣＲ等の手法により適応な制限酵素切断部位を導入し、本開示のＮＡＨ遺伝子のみからなるポリペプチドを含む遺伝子断片を得ることが可能となる。
【００６０】
〔組換えベクター及びその作製方法〕
また、本開示によれば、上述のＡＬＧ生成酵素をコードするポリヌクレオチド、当該酵素をコードする遺伝子又はＮＡＨ遺伝子等を含む組換えベクターを適用することが可能となる。これにより、形質転換体を得、この形質転換体の培養等によって、ＡＬＧ生成酵素を遺伝子工学的に製造することが可能となる。
本開示の組換えベクターの構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる（Sambrook, J., Fritch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 2, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
本開示において使用できるベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組み込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態にて存在させるものが挙げられる。このプラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合、pUC18、pBR322(タカラバイオ）等が挙げられる。なお、宿主細胞内に存在する遺伝子のコピー数は、１又は複数コピーの何れでもよい。
【００６１】
本開示の組換えベクターは、例えば、上述のＡＬＧ生成酵素をコードするポリヌクレオチド配列、当該酵素をコードする遺伝子等の上流にプロモーター（制御領域）を、また下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結し、場合によっては、遺伝子マーカー及び／又は他の制御配列を作動可能に連結することにより作製することが可能である。
本開示の遺伝子へのプロモーターやターミネーターの連結及び発現ユニットのベクターへの挿入は、公知の方法（Sambrook, J., Fritch, E. F., and Maniatis, T. (1989) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol. 2, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）にて行うことが可能である。
ここで、本開示に用いるプロモーター及びターミネーターは、特に限定されず、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等の解糖系酵素遺伝子の制御配列；トリプトファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素遺伝子の制御配列；アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ等の加水分解酵素遺伝子の制御配列；硝酸還元酵素、オロチジン−５’−リン酸脱水酵素、アルコール脱水素等の酸化還元酵素遺伝子の制御配列等が挙げられる。なお、各制御配列とは、通常DNA上で遺伝子（タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域）の上流または下流に存在する各制御領域で、所望の機能を発揮し得るポリヌクレオチドのことを意味する。
なお、本開示のポリペプチド又は遺伝子等を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させてもよい。
【００６２】
また、組換えベクターへの遺伝子マーカーの導入は、例えば、制御配列にＰＣＲ法により適当な制限酵素切断部位を導入し、これをプラスミドベクターに挿入した後、薬剤耐性遺伝子及び／又は栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結することにより行うことができる。
選択マーカーは、形質転換体の選択手法に応じて適宜選択することが可能であるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。
この薬剤耐性遺伝子としては、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。
また、この栄養要求性を相補する遺伝子としては、argB遺伝子、pyr4遺伝子、trpC遺伝子、TRP1遺伝子、niaD遺伝子、LEU2遺伝子、URA3遺伝子等が挙げられる。
【００６３】
〔本開示の組換えベクターを導入した形質転換体〕
本開示によれば、上述にて得られた組換えベクターを用いて宿主（好適には微生物）を形質転換し、形質転換体を得ることができる。
使用される宿主は、遺伝子組換えの宿主として使用可能なもの、好ましくは微生物であれば特に限定されるものではない。使用できる宿主としては、例えば任意の細菌類や真菌類等の微生物が挙げられ、このうち、大腸菌、セルビブリオ菌、コリネ菌、枯草菌、乳酸菌、放線菌、酵母、糸状菌、具体的には、エッシェリシア（Escherichia）属、セルビブリオ（Cellvibrio）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、バチルス（Bacillus）属、セラチア（Serratia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、ラクトバチルスLactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属又はストレプトマイセス（Streptomyces）属、サッカロミセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ニュウロスポラ(Neurospora)属、に属する微生物及びこれらの変異株等を用いることが好適である。組換えが容易な点から、より好ましくは、大腸菌又はこの変異株である。
【００６４】
このとき、これら微生物は、最終的に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが生産しやすいように、遺伝子の置換、挿入、欠失、不活化等の変異を施した組換え微生物であるのが好適であり、この組換え微生物としては、ネオアガロビオース生産可能な組換え微生物が好適である。このネオアガロビオース生産可能な組換え微生物は、公知技術を用いて、ネオアガロビオースを大量生産できるように、遺伝子を変異させた微生物が好ましい。具体的には、ネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼをコードする遺伝子を有する微生物を用いればよい。例えば、ネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼとして配列番号７に示すアミノ酸配列及びネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼをコードする遺伝子として配列番号８に示す塩基配列が挙げられる。また、特許文献１及び２に記載されている方法にてこれら微生物は得ることが可能である。
【００６５】
上述のような遺伝子に変異を生じさせる手法としては、例えば、リコンビナントＰＣＲ法〔PCR Technology, Stockton press (1989)〕、部分特異的変位法〔Kramer, W. and Frits, H., J. Methods in Enzymology, 154,350 (1987)〕、ＳＯＥ(splicing by overlap extension)−ＰＣＲ法〔Gene, 77, 61,(1987)〕により調製されたＤＮＡ断片を用いる二重交差法、化学薬剤処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン、亜硝酸等）する方法、目的遺伝子を化学合成する方法等が挙げられる。
【００６６】
本開示の形質転換体は、上述のように作製された遺伝子発現用の組換えベクターを、常法に従って前記宿主に導入することによって得ることが可能である。
この導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、コンピテント法、酢酸リチウム法及び塩化カルシウム法等が挙げられる。使用する宿主細胞に応じて適宜選択すればよい。
【００６７】
＜２．３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法＞
本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法は、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）糖残基の基本構造を有する糖質を原料として、ＡＬＧを生成できる製造工程（酵素反応系：例えば、上述のスキーム１及び図１参照）を少なくとも有していればよい。
この製造工程では、上述の、本開示のＡＬＧ生成酵素、本開示のＡＬＧ生成酵素をコードする遺伝子を有する微生物等を用いる。
より具体的には、本開示のＡＬＧ生成酵素を用いて、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成させ、これを適宜回収することが好適である。
また、本開示のＡＬＧ生成酵素をコードするヌクレオチド又はこれからなる遺伝子を含む微生物を培養し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成させ、これを回収することが好適である。
【００６８】
前記原料として、ガラクトース又はガラクトース誘導体から構成される糖質が挙げられる。当該糖質として、多糖類及びオリゴ糖が挙げられる。
原料となるオリゴ糖は、上述の〔基質特異性〕に記載のオリゴ糖を用いるのが好適である。当該オリゴ糖として、好ましくは、ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースから選ばれる１種以上のものであり、このうち、好ましくはネオアガロビオースである。
また原料として多糖類を用いる場合には、上述の〔基質特異性〕に記載のオリゴ糖にまで、分解可能な酵素を用いるのが好適である。前記多糖類として、例えば、アガロース及びアガロペクチン等を含む寒天、ポルフィラン、カラゲナン等挙げられる。
【００６９】
本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造法の反応形式は、特に限定されず、バッチ式で行っても良く、連続流通式で行ってもよい。
また、本開示の製造方法で用いられる酵素や微生物は、固定化されていてもよい。この固定化の手法は、公知の手法であれば特に限定されず、例えば、水不溶性の担体に微生物・酵素を物理的吸着、イオン結合、共有結合を介して固定化する担体結合法；グルタルアルデヒドなどの二価性官能基をもつ試薬で架橋固定化する架橋法；網目構造をもつゲルや、半透性膜の中に微生物・酵素を閉じこめる包括法等が挙げられる。
また、本開示の製造方法で用いられる酵素が微生物内に存在する場合には、この微生物を破砕等の処理し、酵素を細胞外に放出させた後にＡＬＧの製造を行なってもよい。また、反応に用いる溶媒は、水が望ましい。
【００７０】
前記ＡＬＧ製造の際の反応温度が、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは１０〜４０℃であるのが好適である。また、ｐＨは、好ましくは５〜８、より好ましくは６〜８であるのが好適である。
本開示のＡＬＧ生成酵素であれば、このような温度及びｐＨの範囲内にて良好にＡＬＧを生産することが可能である。本開示のＡＬＧ生成酵素は、さらに、ＡＬＧを製造する際に、アンヒドロ部分の消失や開環状に伴う構造変化を低減するため、ｐＨ２未満やｐＨ８超のような強酸強アルカリ条件や８５℃以上のような高温条件でない方が望ましい。この点からも、本開示のＡＬＧ生成酵素がＡＬＧを製造するに適している酵素と言える。
さらに、後述するネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼを用いる際にも、当該条件の範囲で行うのが望ましい。この際に、後述する特許文献１及び２に記載のアルテロモナス属由来の酵素を用いるのが好適である。当該β−アガラーゼは、本開示のＡＬＧ生成酵素と一緒に用いるか、又は当該ＡＬＧ生成酵素反応の前処理反応として用いるのが望ましい。
【００７１】
本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの精製手段としては、化学的方法及び物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、活性炭、ゲル濾過、分子量分画膜、電気的薄層クロマト等による分画方法；溶媒抽出方法；結晶析出方法；ゲル濾過、シリカゲルやイオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフ及びＨＰＬＣ等が挙げられる。当該精製手段を単独で又は適宜組み合わせることで、本開示のＡＬＧ等を回収することが可能である。
また、本開示のＡＬＧ等の化合物は、核磁気共鳴方法（１Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ等）、質量分析方法、紫外線吸収スペクトル測定方法、赤外線吸収スペクトル測定方法等の公知の分析方法にて解析することが可能である。
【００７２】
本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法において、さらに、上述のネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼ、当該酵素をコードするポリヌクレオチド及び当該ヌクレオチドからなる遺伝子を有する微生物を用いてもよい。これにより、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの基本構造を有する糖質、例えば紅藻類由来の多糖類及びオリゴ糖を効率良く容易に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースにすることが可能となる。
【００７３】
前記β−アガラーゼについては、以下の寒天分解酵素及びネオアガロビオース生産酵素が挙げられる。
アルテロモナス属に属する微生物が産生し、アガロースを分解して選択的にネオアガロビオースを産生する寒天分解酵素であって、次の性質を有する寒天分解酵素。
（１）  作用：アガロースのβ−１，４結合を加水分解して、ネオアガロビオースを生成するする。好適にはアガロース溶液の粘度を低下させる。
（２）  基質特異性：アガロース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテトラオースに作用し、速やかにネオアガロビオースに分解する。しかし、ネオアガロビオースやラクトース（乳糖）には作用しない。
（３）  ｐＨ安定性および最適ｐＨ：基質が存在しない条件下においては、ｐＨ６．０〜９．０の範囲で安定である。寒天を基質としたとき最適ｐＨは７．５であり、ｐＨ８．０においても高い活性（最高活性の９５％）を示す。
（４）  熱安定性および最適温度：基質が存在しない条件下においては、４０℃以下では安定、５０℃では約３％の活性が残存する。
寒天を基質としたとき最適温度は２０〜５０℃、特に４０℃である。
（５）  分子量：約８０〜９０ＫＤａ（好適には約８４，０００）（電気泳動法）；約１７０〜１９０ＫＤａ（好適には約１８０，０００）（ゲル濾過法）
（６）  金属塩等の影響：Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｈｇ２＋およびＺｎ２＋により阻害される。また、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ａｇ＋、パラクロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によりやや阻害される。Ｋ＋、Ｎａ＋、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）によっては阻害されない。
【００７４】
前記寒天分解酵素は、Alteromonasに属し、FERM.P-14664号として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター(NITE-IPOD)〔旧：工業技術院生命工学工業技術研究所〕に寄託された微生物（受託日：1994年11月25日）より得たものであるのが好適である。当該微生物は、アガロースを分解し、選択的にネオアガロビオースを産生する寒天分解酵素を保有するのが好適である。
また、ネオアガロビオースの製造方法として、前記寒天分解酵素と寒天とを接触させ、ネオアガロビオースを得るのが好適である。
さらに、寒天のβ−１，４結合を加水分解し、選択的にネオアガロビオースを得るのが好適である。
【００７５】
次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなるネオアガロビオース生産酵素。
（ａ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、ネオアガロビオース生産活性能を有するタンパク質。好適には、寒天、アガロース又は４糖以上のネオアガロオリゴ糖に対する高い親和性を有する。
（ｃ）配列番号７に表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ネオアガロビオース生産活性を有するタンパク質。好適には、寒天、アガロース又は４糖以上のネオアガロオリゴ糖に対する高い親和性を有する。
【００７６】
また、配列番号７に示すアミノ酸配列において、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列が好適である。
【００７７】
さらに、以下の性質を有するのが好適である。
（１）作用：  寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖のβ−１，４結合を加水分解して、ネオアガロビオースを生成する。
（２）基質特異性：  アガロース、ネオアガロヘキサオース、ネオアガロテトラオースに作用し、速やかにネオアガロビオースに分解する。しかし、ネオアガロビオースやラクトース  （乳糖）には作用しない。
（３）至適温度：  ４０℃  安定温度：４０℃以下。
（４）分子量：  約１７０〜１９０ｋＤａ（好適には約１８０ｋＤａ）（ゲルろ過クロマトグラフィーによる）；約８０〜９０ｋＤａ（好適には約８２ｋＤａ）（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）の２量体。
【００７８】
また、前記ネオアガロビオース生産酵素をコードするポリヌクレオチドは以下のものが好適である。
寒天、アガロースまたは４糖以上のネオアガロオリゴ糖を選択的に分解し、ネオアガロビオースとするポリペプチドのアミノ酸配列をコードする以下の（ａ）〜（ｇ）に示すポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号７記載のアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号７記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番に表されるアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号７記載のアミノ酸配列の３２〜７９８番において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列により表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号８記載のヌクレオチド配列により表されるポリヌクレオチド。
（ｆ）配列番号８記載のヌクレオチド配列の９４〜２３９４番により表されるポリヌクレオチド。
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００７９】
さらに前記ネオアガロビオース生産酵素をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを用いるのが好適である。さらに、当該ベクターを導入した形質転換体を用いるのが好適である。
【００８０】
前記ネオアガロビオースの製造方法は、寒天、アガロース及び４糖以上のネオアガロオリゴ糖から選ばれる１種又は２種以上のものに、前記ネオアガロビオース生産酵素を作用させて選択的にネオアガロビオースを得るのが好適である。
また、寒天、アガロース及び４糖以上のネオアガロオリゴ糖から選ばれる１種又は２種以上のものに、上述のネオアガロビオース生産酵素を産生するアルテロモナス属微生物や形質転換体等の微生物を培養することにより得られるポリペプチドを作用させて選択的にネオアガロビオースを得るのが好適である。
また、前記形質転換体を培養し、当該培養物中から前記ネオアガロビオース生産酵素を採取したものを使用するのが好適である。
【００８１】
＜３．本開示の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの用途＞
さらに、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースは、従来アンヒドロ部分が消失しやすいことや開環状に起因する構造変化（例えば、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクト−２−ケトース）という難点から、安定的に量を確保することが困難であった。〔C. Rochas, P. Potin, and B. Kloareg, Carbohydrate Research, 253, 69-77 (1994)〕の文献には、還元末端側にＡＬＧがあるアガロテトラオース等のアガロオリゴ糖をＮＭＲ等の機器で分析した例があるが、この末端のＡＬＧのＣ１位が開環状になった構造（３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクト−２−ケトースの構造）の存在を示す分析結果となっている。一方で、還元末端側ではない部位にＡＬＧを含むネオアガロテトラオースでは、ＡＬＧのＣ１位が開環状になった構造は見られず、還元末端側にＡＬＧがあるかどうかについてＮＭＲ等の結果では相違点が明確になっている。
これらの結果からも類推されるように、ＡＬＧのＣ１位は開環状となりやすく、開環状の構造では化学変化を起こしやすいケト基が現れる。したがって、酸やアルカリの存在下では、ＡＬＧの構造はケト基の部分から構造変化を受けやすく、加水分解などの容易な方法ではALGの生成や単離は困難であった。このため、様々な分野でのＡＬＧの基礎研究及び応用研究が進んでいないのが実状である。
【００８２】
しかしながら、本開示のＡＬＧ製造方法にて、効率良く容易に３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトピラノース［α，β型］及び３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトフラノース［α，β型］を提供することが可能となる。さらに、得られたＡＬＧに基づき要望に応じた種々の誘導体（例えば２−ＯＭｅ−ＡＬＧ、３，６−アンヒドロ−α or β−Ｌ−ガラクトシド等のＡＬＧ誘導体等）を有機合成等にて得ることも可能となる。このようなことから、本開示のＡＬＧ製造方法にて得られたものを、医薬品、化粧料、皮膚外用剤、食品等の幅広い分野への活用が期待でき、また新たな用途の提供も可能となる。
例えば、後記実施例に示すように、上述の方法にて得られたＡＬＧは、メラニン産生抑制作用を有することが認められた。従って、本開示の方法にて得られたものは、そのまま美白用素材として又は含有させて有効成分とする美白剤等の製剤として使用することが可能である。
【００８３】
また、本開示のＡＬＧ製造方法にて得られたものは、ヒトを含む動物に摂取、投与又は接触させて、メラニン産生抑制、美白等を図るために、使用することができる物質である。例えば、本開示のＡＬＧ製造方法にて得られたものは、予防、改善若しくは治療、スキンケア及び美容等の目的で使用することができる。また、本開示のＡＬＧ製造方法にて得られたものは、メラニン産生抑制剤、美白剤等の各種製剤に使用することができ、これら各種製剤を製造するために使用することが可能である。
【００８４】
従って、本開示のＡＬＧ製造方法にて得られたものは、メラニン産生抑制作用、美白作用等のために、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、医薬部外品、食品や機能性食品（例えば特定保健用食品等）等に配合することが可能であり、本開示の製剤は、これら皮膚外用剤、化粧品、機能性食品（例えば、錠剤、清涼飲料等）等として有用である。
【００８５】
なお、前記製剤には、本開示の製造方法にて得られたものに、必要に応じて、任意の成分を組み合わせて使用してもよい。好ましい他の成分としては、薬学的に許容される成分であればよく、例えば、細胞賦活剤、抗酸化剤、保湿剤、紫外線防止剤、溶剤（水、一価の炭素数１〜５又は多価のアルコール類等）、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、安定化剤、着色剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、香料等が挙げられ、これらを目的とする製剤に応じて配合すればよい。
【００８６】
また、前記製剤の形態は、特に限定されず、液状、ペースト状、ゲル状、固形状、粉末状等の何れの形態でもよい。
本開示の製造方法にて得られたＡＬＧは、特に皮膚外用剤、化粧品、医薬部外品に用いるのが好ましく、皮膚に塗布などに接触させる製剤が好適である。
また、前記製剤の剤形は特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム、パック、クレンジング料、マッサージ料、美容液等のスキンケア化粧料；ファンデーション、口紅、頬紅等のメークアップ化粧料；洗顔料、シャンプー、ボディーソープ等の洗浄料；リンス、ヘアパック等の毛髪化粧料；軟膏剤、分散液等の皮膚外用剤等の外用剤にすることが可能であり、またこれ以外にも種々の剤形とすることも可能である。
前記製剤中におけるＡＬＧの配合量は、好ましくは０．０００１〜３０質量％であり、より好ましくは０．００１〜５質量％である。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明（本技術）を具体的に説明するために実施例及び比較例等を挙げるが、本
発明（本技術）は実施例等に限定されるものではない。
【００８８】
＜実施例１：ＡＬＧ生成酵素＞
桐村研究室において、非海洋性細菌Cellvibrio sp. WU-0601株の細胞内に、ネオアガロビオース加水分解酵素 (neoagarobiose hydrolase, 「ＮＡＨ」ともいう)の活性を検出した。さらに、Cellvibrio sp. WU-0601株由来のＮＡＨを精製し、その酵素的諸性質を検討した。ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースに反応し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース（以下、「ＡＬＧ」ともいう）を生成することから、この「ＮＡＨ」及びその「ＮＡＨ遺伝子」は、ＡＬＧを生成する「ＡＬＧ生成酵素」及び「ＡＬＧ生成酵素をコードする遺伝子」ともいえることも見出した。
ＮＡＨの精製および酵素的性質についての報告例は極めて少なく、ＮＡＨをコードする遺伝子については現在までに報告はない。したがって、ＮＡＨの酵素的諸性質およびその遺伝子の機能に関する研究には新規性がある。
そして、本開示のＮＡＨは、例えば図１に示すように、アガロース等の「３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１→３）Ｄ−ガラクトース」を有する糖質から、最終的にＡＬＧを効率良く生成することが可能である。また、本開示のＮＡＨをコードする遺伝子のクローニングし、当該遺伝子を大腸菌で高発現させることに成功した。また、生成されたＡＬＧはメラニン産生を抑制することから、美白剤等の外用組成物や医薬品、機能性食品等としても利用することが可能である。よって、本開示のＡＬＧ生成酵素は産業上利用性が非常に高いものであることも見出した。
以下に、本開示のＡＬＧ生成酵素の＜１．実験方法＞及び＜２．結果＞を説明する。
【００８９】
＜１．実験方法＞
＜１．１．使用菌株および培養方法>
供試菌として、非海洋性細菌Cellvibrio sp. WU-0601株を使用した。当該株は、後述のようにして取得し、同定された新規な微生物である。
Cellvibrio sp. WU-0601株の培養にはAD培地を用いた。AD培地は、KCl 0.75 g, MgSO4・7H2O 12.35 g, CaCl2・2H2O 1.45 g, NH4Cl 1.00 g, FeSO4・7H2O 0.012 g, K2HPO4 0.075 g, peptone 1.25 g, yeast extract 1.25 g、Tris 1.21 gを含むもの（表１）で、初発pHを8.0に調整した。
前培養として、5 mlのAD培地 で30℃、120 rpm、24時間培養を行った後、本培養として200 mlのAD培地で30℃、120 rpm、48時間培養を行った。また、遺伝子クローニングの宿主としてEscherichia coli JM109、遺伝子発現用の宿主としてE. coli BL21(DE3)を使用し、その培養には主としてLB培地を使用した。
【００９０】
【表１】
2013247884.tif 000003
【００９１】
＜１．２．ＮＡＨの精製方法＞
＜１．使用菌株および培養方法>にしたがって培養したCellvibriosp. WU-0601株の培養液から菌体を遠心分離 (10000×g、10 min、4℃) により回収し、10 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0) に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機により破砕し、遠心分離 (16000×g、30 min、4℃) を行い、その上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液に１％ (w/v) ストレプトマイシン硫酸塩溶液を加え、除核酸を行った溶液を粗酵素溶液とした。
この粗酵素溶液に対して、硫酸アンモニウムによる分画および3種のカラムに通して、ＮＡＨの精製を行った。以上の精製には生体分子精製用クロマトグラフィーシステムAKTA explorer 10S (アマシャムバイオサイエンス社) を用いた。また、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)にて、目的酵素の精製度について検討を行った。
【００９２】
以下に各精製ステップについて示す。
（Ｓｔｅｐ  １）  硫酸アンモニウムによる分画
無細胞抽出液に10 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)を加えて20 mlとし、硫酸アンモニウムを徐々に加えた。飽和度40%となった点で遠心分離（4℃, 15,000×g, 30 min）し、上清を回収した。さらに、硫酸アンモニウムを徐々に加え、飽和度60%となった点で沈殿を回収し、10 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)に縣濁した。タンパク質濃度を測定し、TLC分析およびHPLCで酵素活性測定を行った。
（Ｓｔｅｐ  １−２）  透析
得られた溶液をDialysis Membrane, Size 36（和光純薬）を用いて、10 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中で、4℃、16h透析を行った。
【００９３】
（Ｓｔｅｐ  ２）  DEAE-Toyopearl 650Sカラムクロマトグラフィー
得られた溶液をCellose acetate 0.20 μmフィルター（Whatman）に通し、50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)で平衡化した、陰イオン交換カラムであるDEAE-Toyopearl 650S（東ソー）に流速2.0 ml/minで供し、0 M〜0.30 MのKCl直線勾配によってタンパク質を溶出させた。得られた各フラクションのＮＡＨ活性をTLC分析で測定し、活性の検出されたフラクションをまとめてCentriprep YM-30（Millipore）で濃縮（1500×g, 15 min）した。その後、溶液の酵素のタンパク質濃度を測定し、酵素活性測定を行った。
表２にStep 2における各種設定条件を示す。
【００９４】
【表２】
2013247884.tif 000004
【００９５】
（Ｓｔｅｐ  ３） HiLoad 16/60 Superdex 200 pgカラムクロマトグラフィー
酵素液を0.15 MのNaCｌを含む50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)で平衡化した、ゲルろ過カラムであるHiLoad 16/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare) に供した。同緩衝液を流速0.5 ml/minで流し、酵素を溶出した。得られた各フラクションのＡＬＧ生成活性能をTLC分析で測定し、活性のあったフラクションをまとめてCentriprep YM-30で濃縮（1500×g, 15 min）し、50 mM Tris-HCl緩衝液で置換した。その後、溶液のタンパク質濃度を測定し、酵素活性測定を行った。
表３にStep 3における各種設定条件を示す。
【００９６】
【表３】
2013247884.tif 000005
【００９７】
（Ｓｔｅｐ  ４）  Mono Q 5/50 GLカラムクロマトグラフィー
酵素液を50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)で平衡化した、陰イオン交換カラムであるMono Q 5/50 GL (GE Healthcare) に供した。同緩衝液10 mlでカラムを洗浄後、酵素を同緩衝液中においてKClの直線濃度勾配(0〜700 mM)により溶出した。得られた各フラクションの酵素のタンパク質濃度を測定し、比色分析およびHPLCで酵素活性測定を行った。
表４にStep 4での各種設定条件を示す。
【００９８】
【表４】
2013247884.tif 000006
【００９９】
＜１．３．ＡＬＧ生成活性の測定方法＞
上述する方法に従って精製したＮＡＨを利用してネオアガロビオースの加水分解反応を実施した。酵素活性の単位 1 unit (U) は30℃においてネオアガロビオースを基質として1 μmolのD-ガラクトースを生成する活性として定義した。標準的な反応条件としては、ＮＡＨ 5 mU、ネオアガロビオース 2 mM、10 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0)として、全体が均一となるように十分混合した上で、所定の温度で120 strokes/minでゆるやかに振とうしながら反応を行った。活性の定性的な検出には薄層クロマトグラフィ(TLC)を用いた。定量的な活性の測定には高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を使用した。
【０１００】
〔薄層クロマトグラフィ(TLC)〕
下記にTLC分析の条件を示す。
固定相：Silicagel 60（Merck）
移動相：n-ブタノール/酢酸/水 (2/1/1(v/v/v))
呈色試薬：0.2%(w/v)ナフトレゾルシノールエタノール/ 20％(w/v)硫酸水溶液 :1/1(v/v)
展開は垂直上方へ行い、展開後は乾燥させ呈色試薬を噴霧した後100℃で5 min間加熱することで呈色させた。
〔高速液体クロマトグラフィ(HPLC)〕
下記にHPLC分析の条件を示す。
システム：HPLC L-7000型（日立ハイテクノロジー）
カラム：SUGAR SP0810×2＋ガードカラム×1連結型(昭和電工)
移動層：H2O
流速：0.8 ml/min
カラム温度：80℃
検出：RI
サンプル：反応液を0.20 μm PTFE (Hydrophobic)メンブランフィルターに通して調製
測定時間：30 min
【０１０１】
＜１．４．ＮＡＨの酵素的諸性質の検討方法＞
精製したＮＡＨを用いて加水分解反応の最適温度、温度安定性、最適pH、金属イオンおよび化学物質の影響、基質特異性について検討した。
標準条件は、反応液 1 ml当たりＮＡＨ 5 mU、ネオアガロビオース濃度 2 mM、温度 30℃、10 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 8.0) として、各条件を変化させた。反応液 1 mlを 1.5 mlマイクロチューブ（エッペンドルフ製）中で 1 時間反応させた後に10分間煮沸して反応を停止させ、反応液中の生成物をHPLCを用いて分析した。
動力学定数の決定の際には、基質濃度を変化させた各反応液を最適反応条件において一定時間反応させた後に10分間煮沸して反応を停止させ、反応液中の生成物をHPLCを用いて分析し、Lineweaver-Burkプロットにより各定数を算出した。
【０１０２】
以下に、ＮＡＨの酵素的諸性質に関する各種検討方法を示す。
〔最適反応温度および温度安定性の検討方法〕
ＮＡＨを精製した酵素溶液を用いて、ネオアガロビオースの加水分解反応の最適温度および温度安定性について検討した。反応温度以外の標準条件下において、温度を20〜50℃に変化させ、1 hの反応における各条件下でのガラクトースの生成量を測定した。また、温度安定性については、4〜60℃の各温度で 30 min保温した後、30℃で 1 hの反応における酵素の残存活性を調べた。
〔最適pHの検討方法〕
ＮＡＨを精製した酵素溶液を用いてネオアガロビオースの加水分解反応における最適pHについて検討した。pH以外の標準条件下において、pHを 4〜9 に変化させ、各条件下での生成したガラクトース量を測定した。このとき、反応液には10 mM クエン酸/NaOH緩衝液（pH 4.0〜7.0）、10 mM クエン酸/リン酸緩衝液（pH 4.5〜7.0）、10 mM トリス/マレイン酸/NaOH緩衝液(pH 5.0〜7.5)、10 mM Tris/HCl緩衝液(pH 7.0〜9.0)を用いた。
〔各種金属イオンの影響の検討方法〕
精製したＮＡＨを用い、ネオアガロビオースの加水分解反応における金属イオンおよび阻害剤の影響を検討した。標準条件下においてEDTAおよび各金属イオンを適量添加した条件下でのガラクトースの生成量を測定した。阻害剤にはSH基阻害剤としてパラクロロマーキュリー安息香酸（pCMB）を用いた。pCMBは 0.2 mM、その他の化合物は 2 mMになるように添加した。
【０１０３】
〔基質特異性の検討方法〕
精製したＮＡＨを用いて基質特異性について検討した。標準条件下においてネオアガロビオースの代わりに各基質を各 20 mM量に調製して添加した条件下において 24 h反応後の反応生成物を測定した。
【０１０４】
〔動力学定数の算出の検討方法〕
酵素の諸性質をより定量的に分析するために、ＮＡＨの反応速度定数を算出した。
後述する＜８．ＮＡＨの酵素的諸性質＞で判断した最適反応条件において 1〜16 mMのネオアガロビオース濃度で10〜50 min反応させ、測定比較を行った。この結果をもとに、基質濃度（S：ネオアガロビオース）と反応速度 (v：各基質濃度における生成物合成初速度) の測定値からKm、Vmaxを求めた。測定値をもとにHanes-Woolfプロット (［S］に対して［S］/ｖをプロットする方法) およびLineweaver-Burk逆数プロット（1/［S］に対して1/vをプロットする方法）を利用してKm、Vmaxを算出した。さらにkcat (=Vmax/Km) も算出した。
【０１０５】
＜１．５．ＮＡＨをコードする遺伝子のクローニングの方法＞
精製したＮＡＨのN末端アミノ酸配列を決定した。得られたＮＡＨのN末端アミノ酸配列および相同性を示したglycosyl hydrolase family 32における保存配列をもとにsence primer (5’- CGA TCT GCC GGA AAA AAA -3’) （配列番号５）とantisence primer (5’-GGR TCR TGN ACY TTR TG -3’) （配列番号６） を作製し、Cellvibriosp. WU-0601株から抽出した全DNAを鋳型としてPCRを行った。
得られた増幅断片をpGEM-T Easyベクターに連結し、E.coli JM109を形質転換し、当該酵素遺伝子の部分塩基配列を取得した。遺伝子の解析には研究室内ではGENETYX（登録商標）を使用し、DDBJなどの公開データベースやソフトを使用して解析を進めた。
また、塩基配列の決定は、ダイターミネーター法により、ABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いて行った。さらに、得られた塩基配列情報を利用して、Cellvibrio sp. WU-0601株から抽出した全DNAをSph IおよびSsp Iで消化した後にセルフライゲーションしたものを鋳型としたインバースPCRを行った。得られたPCR産物のなかにＮＡＨをコードする遺伝子領域を見出し、塩基配列を決定した。
【０１０６】
＜２．結果＞
＜２．１．ＮＡＨ活性を示す微生物の取得結果＞
土壌や海水、河川水などを分離源として、AD培地上で生育可能な微生物を多数取得した。とくに、30 g/lの寒天を加えた固形のAD培地に接種して 30℃で 5 日間培養し、微生物が形成した集落の周囲に寒天の溶解が見られた場合には、寒天分解酵素（agarase）を生産する微生物を含む培養物と判定した。寒天分解酵素生産微生物を含む培養物については、さらに純粋分離の操作を行い、12株の寒天分解酵素生産微生物を単離した。単離した微生物はすべて細菌で、Alteromonas属やPseudomonas属をはじめとする細菌であった。
AD培地で30℃, 24時間培養した細胞を破砕し、遠心分離して、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液について、ネオアガロビオースを分解する活性の検出試験を行ったところ、土壌から単離された 1 細菌（WU-0601株）に最も顕著な活性が検出された。
【０１０７】
WU-0601株は、グラム染色陰性で好気条件下で生育を示す細菌である。( 0.7 - 0.8 ) μm ×( 1.5 - 2.5 ) μmの大きさの桿菌で、鞭毛を有し、運動性がある。オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性で、グルコースやスクロースの資化性を有している。
WU-0601株に関するこれらの形態観察による性質や細菌学的性質は、Cellvibrio属の細菌あるいは一部のPseudomonas属細菌のものと類似していた。
さらに、WU-0601株の16S rDNAの塩基配列を決定し、データベースで照合した。既知の細菌の中では Cellvibrio fibrivoransの16S rDNAと98.2%の相同性、C. ostraviensisのそれと97.8%の相同性、C. mixtus subsp. mixtus のそれと97.2%の相同性、C. fulvusのそれと97.1%の相同性を示す。一方、Pseudomonaskilonensisのそれと92.1%の相同性、P. umsongensisのそれと92.1%の相同性を示す。16S rDNAの塩基配列が完全に一致するものはなかったが、WU-0601株はCellvibrio属に属するものと判断される。しかし、最も近接するC. fibrivoransの16S rDNAとの相同性が98.2%であることから、既知の種とは別個のものと判断し、Cellvibrio sp.とすることが適切と考えられる。
【０１０８】
以上より、ＮＡＨを産生する供試菌をCellvibrio sp. と同定し、Cellvibrio sp. WU-0601株と称することとした。なお、寒天分解酵素生産菌の多くが海洋性であるのに対して、Cellvibrio sp. WU-0601は生育にNaClを必要とせず、脱塩処理が不要なため、非海洋性細菌であることは１つの特徴であり、ＮＡＨを大量生産する際の作業効率が良好なことが有利な点である。
【０１０９】
＜２．２．ＮＡＨの精製結果＞
Cellvibrio sp. WU-0601の粗酵素抽出液から4段階の精製で表５に示すようにＮＡＨを収率2.14%で精製倍率24.3倍まで精製した。本精製酵素はSDS-PAGEでほぼ単一で(図６)、約42 kDaを示した。また、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、本酵素の分子量を約83 kDaと算出した。このことから本酵素はホモ二量体酵素と考えられる。
なお、培養液を遠心分離（ 10000×g, 10 min, 4℃）した溶液（細胞外画分）にはＮＡＨ活性は検出されなかった。
【０１１０】
【表５】
2013247884.tif 000007
【０１１１】
＜２．３．ＮＡＨの酵素的諸性質＞
精製したＮＡＨの酵素的諸性質を検討した。最適反応条件は温度25℃、pH 6.0であった。また、ＮＡＨは AgNO3、HgCl2、NiCl2、CuCl2、FeCl3、pCMBによって阻害され、MnCl2、MgCl2によって活性が上昇した。また、ＮＡＨはネオアガロビオースに最も良く作用し、ネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオースにも反応することから、ALGとD-galactoseのα１，３結合を特異的に切断することが示唆された。
【０１１２】
下記に各検討内容の詳細を示す。
〔最適反応温度および温度安定性の検討結果〕
ネオアガロビオースの加水分解反応における最適温度および温度安定性について検討した結果を以下に示す。温度による活性の変化の結果を図３（Ａ）に、温度安定性の結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）より当該酵素の最適温度は 25℃と決定された。図３（Ｂ）で、温度安定性について検討したところ、30 min後では、30℃までは活性を維持していたのに対して、 40℃において約50％の活性が検出され、50℃以上ではほぼ 0 ％であった。
【０１１３】
〔最適pHの検討結果〕
ネオアガロビオースの加水分解反応における最適pHについて検討した結果を図３（Ｃ）に示す。ＮＡＨにおける最適pHを検討したところ、pH 5.5〜 6.0付近において高い活性を有していた。特にpH 6.0の10ｍM クエン酸-リン酸緩衝液を用いたとき最も高い活性を示したことから、当該酵素における最適pHを 6.0と決定した。
【０１１４】
〔各種金属イオンの影響の検討結果〕
ネオアガロビオース加水分解反応における金属イオンおよび阻害剤の影響を検討した。結果を表６に示す。AgNO3、HgCl2、NiCl2、CuCl2、FeCl3、pCMBによって阻害され、MnCl2、MgCl2によって活性が上昇した。一般的にSH試薬として、〔１〕5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB、エルマン試薬）、2,2’(4,4’)-ジピリジルジスルフィド、テトラチオン酸、2,6-ジクロロフェノールインドフェノール（DCIP）、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、〔２〕p-クロロメルクリ安息香酸（pCMB）、p-メルクリベンゼンスルホン酸（PMBS）などのメルカプチド形成剤、〔３〕ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、N-エチルマレイミド（NEM）などのアルキル化剤、〔４〕Hg2+、Zn2+、Cu2+などの金属イオンに大別される。そのうち今回では、pCMB、Hg2+、Cu2+に阻害された。しかし、他のSH基阻害剤において活性が維持されたことから、SH基（酵素中のシステイン残基）が活性に関与していることが示唆された。
【０１１５】
【表６】
2013247884.tif 000008
【０１１６】
〔基質特異性の検討結果〕
精製したＮＡＨの基質特異性を検討した結果を表７に示す。ＮＡＨはネオアガロビオースに最も良く作用し、ネオアガロテトラオースとネオアガロヘキサオースにも若干反応することから、ALGとD-galactoseのα−１，３結合を特異的に切断することが示唆された。
【０１１７】
【表７】
2013247884.tif 000009
【０１１８】
〔動力学的定数の検討結果〕
ＮＡＨの諸性質をより定量的に分析するために、反応速度定数を算出した。
今回算出した反応速度定数は、酵素と基質の複合体形成反応の平衡定数であるミカエリス定数Kmおよび反応の最大速度Vmaxである。Kmは酵素の基質に対する親和性を示す指標となり、値が小さいほど基質への親和性が高いことを示す。Vmaxはその酵素の回転数を示す指標となり、どれだけ短い時間で一回の反応を触媒することができるかを示す値になる。
さらにkcat (=Vmax/Km) も算出した。kcatとは分子活性であり、酵素1分子が単位時間に変換する基質分子数を示す。この値が大きいほど、その基質が反応しやすい。これらの値を検討することで酵素の反応特性を推測可能である。
ＮＡＨの動力学定数をKM=4.39×10 (mM)、Vmax＝7.07×10-3（mM/sec)、kcat=4.13×10 (sec-1) と決定した。
【０１１９】
＜２．４．Ｎ末端アミノ酸配列の決定＞
精製酵素のＮ末端17アミノ酸配列が得られた。その配列情報を表８に示す。
表８中の、WU-0601株のＮ末端アミノ酸配列は配列番号４に示し、Saccharophagusdegradans 2-40由来Sde_2657のＮ末端アミノ酸配列は配列番号９に示し、Vibrio sp. JT0107株のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１０に示し、Bacillussp. MK03株のＮ末端アミノ酸配列は配列番号１１に示す。
Saccharophagus degradans 2-40由来Sde_2657 (機能未知タンパク質) の上述のN末端アミノ酸配列と高い相同性を示した。さらに、既報のα-ネオアガロオリゴ糖加水分解酵素であるVibrio sp. JT0107株も相同性を示した。ＮＡＨのN末端の17個のアミノ酸配列はGly-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Lys-Leu-Ser-Lys-Ala-Ser-Leu-Arg-Ala-Ile-Glu（配列番号４）と決定され、glycosyl hydrolase family 32に属するSaccharophagus degradans2-40由来Sde_2657 (機能未知タンパク質) のN末端アミノ酸配列と相同性を示した。
ＮＡＨの諸性質を既報のα-ネオアガロオリゴ糖加水分解酵素の諸性質と比較し、本酵素の新規性について検討した。WU-0601株とJT0107株の酵素は基質特異性や分子量、N末端アミノ酸配列において似た性質を保有していた。しかし、N末端のアミノ酸配列にはほとんど相同性がない。一方、MK03株の酵素は、基質特異性においてネオアガロヘキサオースを最も良く分解したが、ネオアガロビオースを最も良く分解するWU-0601株のＮＡＨとは異なる傾向を示す。また、N末端アミノ酸配列も全く異なる。以上より、WU-0601株のＮＡＨは新規性の高い酵素と考えられた。さらに、現在までにＮＡＨをコードする遺伝子のクローニングは行われていない。そこで、ＮＡＨをコードする遺伝子のクローニングを行うこととした。
【０１２０】
【表８】
2013247884.tif 000010
【０１２１】
＜２．５．ＮＡＨをコードする遺伝子のクローニング＞
＜２．４．Ｎ末端アミノ酸配列の決定＞記載のＮ末端アミノ酸配列およびglycosyl hydrolase family 32の保存配列をもとに作製したプライマー（配列番号５及び配列番号６）を用いてWU-0601株由来のDNAを鋳型としたPCRを行ったところ、約620 bpの増幅断片を得た。得られた増幅断片の塩基配列のコードするアミノ酸は、当該Ｎ末端アミノ酸配列と完全に一致し、Saccharophagus degradans2-40由来Sde_2657のアミノ酸残基と75％の相同性を示した。
得られた塩基配列得られた増幅産物の配列情報をもとにPCRプライマーを作成し、インバースPCRを行った。得られたPCR増幅産物について、ダイレクトシーケンスを行った。シーケンス解析を行った結果、364個のアミノ酸をコードする1092 bpのORFの存在を明らかにした。この推定分子量は約41 kDaであり、WU-0601株からの精製ＮＡＨのSDS-PAGEの結果とほぼ一致した。ＮＡＨのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列であり、ＮＡＨをコードする塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列である（図７〜９参照）。
【０１２２】
＜２．６．ＮＡＨをコードする遺伝子と相同性を示すタンパク質＞
＜２．５．ＮＡＨをコードする遺伝子のクローニング＞で得られたアミノ酸配列（配列番号１）についてBLASTにより相同性検索を行ったところ、機能未知タンパク質については、Saccharophagus degradans2-40由来Sde_2657（ABD81917）（74％）、Pseudoalteromonas atlantica T6c由来Patl_1968（ABG40486）（72％）、Mcroscillasp. PRE1由来MS110（AAK62832）（59％）、Flavobactoriales bacterium HTCC2170（EAR01928）（55％）と高い相同性が見られた。一方で、機能の知られているものとしては、Sphingomonas sp. SKA58由来のxylosidase、arabinosidase；Bacillus sp. SG-1由来のsucrose-6-phosphate hydrolase (Sucrase)；Stigmatella aurantiaca DW4/3-1由来のbeta-xylosidaseなどがあるが、いずれもSde_2657に比べると相同性は低い（図４）。
以上より、本酵素はGH32の中に新規なグループを形成する新規酵素であると考えられる。
また、高い相同性を示した機能未知タンパク質とのアライメントを図５に示す。
なお、クローニングしたＮＡＨ遺伝子では、N末端側に分泌に必要とされるシグナルペプチドの領域がないことから、ＮＡＨは細胞内に存在する酵素と考えられた。これは、細胞外画分（3.1）にＮＡＨ活性が検出されないことと一致する結果である。 
【０１２３】
＜２．７．ＮＡＨをコードする遺伝子の大腸菌における高発現＞
＜２．６．ＮＡＨをコードする遺伝子のクローニング＞で取得したＮＡＨをコードする遺伝子を大腸菌高発現用プラスミドpet-21aに連結し、pＮＡＨを作製した。さらに当該遺伝子を導入した組換え大腸菌E.coli BL21(DE3)/pＮＡＨを作製した。この菌株を用いて目的とするＮＡＨをコードする遺伝子の発現誘導を行い、その粗酵素抽出液のSDS-PAGEによって当該酵素が大腸菌内において発現しているかどうか確認した。図６にSDS-PAGE泳動結果を示す。
SDS-PAGEの結果から、組換え大腸菌についてWU-0601株からの精製酵素と同じ位置に強いバンドを確認することができた。また、Whole cellおよびCell-free extractにあまり差が見られなかったことから、封入体の形成がないことも確認した。このように当該酵素をコードする遺伝子は組換え大腸菌内において正常に発現していたため、この粗酵素抽出液を用いて活性測定を行った（表９）。ただし、本項目における活性測定では、表６に示した酵素精製時とは異なり、以下の条件で実施した。反応条件：反応溶液 200 μl当り、タンパク質量 0.05 mg、ネオアガロビオース 10 mM、温度 25℃、 10 mM クエン酸-リン酸緩衝液（pH 6.0）。
【０１２４】
【表９】
2013247884.tif 000011
【０１２５】
図６から、ネオアガロビオースからALGが生成しているのがわかる。また、E.coli BL21(DE3) に pET21a(+)のみ導入した大腸菌において生成物は検出されなかった。これによりＮＡＨが大腸菌内において発現していることが確認された。
また、HPLC分析によって定量分析を行いタンパク質当りの比活性（U/mg-protein）を測定したところ、野生株であるCellvibrio sp. WU-0601株と比較して、約27倍に達した。以上より、当該酵素遺伝子の大腸菌における高発現に成功したといえる。
【０１２６】
本開示では、Cellvibrio sp.WU-0601株由来のＮＡＨを精製し諸性質を検討した。ＮＡＨは分子量 42 kDaの同一サブユニットからなる 83 kDaのホモ二量体酵素であり、ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキサオースに作用し、ALGとD-galactoseのα−１，３結合を特異的に切断する活性を示した。
また、ＮＡＨの最適条件は 25℃、pH 6.0であり、AgNO3、HgCl2、NiCl2、CuCl2、FeCl3、pCMBによって阻害され、MnCl2やMgCl2の添加によりその活性が上昇した。さらに、動力学定数をKM=4.39×10 (mM)、Vmax＝7.07×10-3（mM/sec)、kcat=4.13×10 (sec-1) と決定した。
また、当該酵素のN末端アミノ酸配列をGly-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Lys-Leu-Ser-Lys-Ala-Ser-Leu-Arg-Ala-Ile-Glu（配列番号４）と決定した。さらに、ＮＡＨをコードする遺伝子の全領域をクローニングし、364個のアミノ酸残基からなる推定分子量約41 kDaのポリペプチド鎖をコードする1092 bpのORFの存在を明らかにした。また、当該ORFを大腸菌で高発現させることで、ＮＡＨ活性の検出に成功した。
【０１２７】
＜実施例２：ネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼ及び本開示のＡＬＧ生成酵素によるＡＬＧの製造方法＞
本開示で使用するネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼは、特許文献２（特開２００５−２２９８８９号公報）に記載の内容に基づき、調製されたネオアガロビオース生成酵素を使用した（配列番号７及び配列番号８）。また、ネオアガロビオース生産可能なβ−アガラーゼは、特許３５２９１７３号公報の請求項１記載の寒天分解酵素を用いてもよい。
上述の＜1.5.NAHをコードする遺伝子のクローニング方法＞に従って、ＡＬＧ生成酵素用のDNA断片を精製した。この精製DNA断片と、pET21-a(+)を同様にNdeI、BamHIで処理して得た制限消化物を連結させ、得られたハイブリッドDNAを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換してＡＬＧ生成酵素産生の組換え大腸菌を得た。
これによって、ネオアガロビオース生成酵素及びＡＬＧ生成酵素を得、これらを用いてＡＬＧを製造した。
【０１２８】
4 g/l アガロース（ニッポンジーン製）を加熱溶解させた 10 mMトリス−塩酸緩衝溶液（pH 7.8） 100 mlに対してネオアガロビオース生成酵素 300 Uを添加し、反応( 40℃, 160rpm, 2 h)した後、反応停止( 100℃, 5 min)し、エバポレーターで 5 mlまで濃縮した。
さらに、20 mM クエン酸リン酸buffer(pH 6.0) 25 mlに溶解し、ＡＬＧ生成酵素 20 U添加し、反応( 25℃, 160rpm, 15min)した後、反応停止(アセトン等量)し、遠心（ 15,000×g, 30min, 4℃）後、上清をエバポレーターで 1 mlまで濃縮し、加水分解物を得た。
標準品ALG及びD-Galについて薄層クロマトグラフィーを行った結果、ＡＬＧのRf値 0.46 であり、D-ガラクトースのRf値 0.10 であることから、シリカゲルクロマトグラフィーにて分離精製が可能と考えた。
加水分解物からＡＬＧとＤ−ガラクトースを分離精製するためにシリカカラムクロマトグラフィーを行い、分画（ 1 ml/1 tube）を行った。カラムは口径 20mm、長さ 300mmを用い、担体としてワコーゲルC-300を、展開液にアセトニトリル/水=12/1(v/v)を用いた。各分画を薄層クロマトにて確認し、Rf値 0.46付近にスポットがあり、他の成分が認められない９〜１６画分を回収し、ＡＬＧを得た。
〔糖分析用薄層クロマトグラフィー〕
展開は垂直上方へ行い、展開後は乾燥させ呈色試薬を噴霧した後 100℃で 5 min間加熱することで呈色させる。
固定相  ：Silica gel 60（Merck）
移動相  ：アセトニトリル/水（12/1 (v/v)）
呈色試薬：0.2%(w/v)ナフトレゾルシノールエタノール/ 20％(w/v)硫酸水溶液（1/1(v/v)）
【０１２９】
回収された３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを 13C NMR分析を行った結果、閉環構造の3,6-anhydro-α-galactopyranoseの炭素原子６個についてシグナル（δｃ：90.23，73.17，84.21，78.35，76.88，73.09）を検出した（図１０）。
よって、本開示のＡＬＧ生成酵素を用いれば、アンヒドロ構造を消失させることなく、また３，６−アンヒドロ−ガラクトースを効率良く得ることができる。
【０１３０】
＜実施例３：３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースのメラニン産生抑制効果の評価＞
マウス由来のＢ１６メラノーマ培養細胞を使用して、上述の＜実施例１＞にて得られた３，６−Ｌ−アンヒドロガラクトースについて、メラニン産生抑制効果及び細胞生存率を調べた。
具体的には、２枚の６穴プレートに 10％ＦＢＳ含有ＭＥＮ培地を適量取りＢ１６メラノーマ細胞を播種し、37℃、二酸化炭素濃度 5 ％中にて静置した。翌日、各試料溶液の最終濃度が 0（対照）、10、30、100、300及び1000 μg/mlとなるように、試料溶液を培地に添加し混和した。培養５日目に培地を交換し、再度、各試料溶液を添加した。翌日、培地を除き、１枚のプレートについて、細胞をリン酸緩衝液にて洗浄した後回収し、Ｂ１６メラノーマ培養細胞の白色化度を以下の基準にて評価した。また、本開示の効果を検証するための比較対象として、メラニン産生抑制作用のあることが知られているコウジ酸についても同様の試験を、最終濃度 0(対照)、12.5、25、50、100及び200 μg/mlになるように行った（表１０）。
【０１３１】
（判定基準）
＋＋：コウジ酸 200 μg/mlと同等またはそれ以上の白色である。
＋：コウジ酸 100 μg/mlと同等の白色である。
±：コウジ酸 50 μg/mlと同等の白色である。
−：コウジ酸 50 μg/ml以下の白色である。
また残りの１枚のプレートについて、細胞をホルマリン固定後、 1 ％クリスタルバイオレット溶液に添加し染色した。試料溶液濃度に対する生存細胞率をモノセレーター（オリンパス社製）で測定し、生存率 50％未満の濃度については評価対象外とした。
【０１３２】
【表１０】
2013247884.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本技術により、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの大量生産が可能となる。これにより３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの新たな用途の研究開発を行うことが可能となる。よって、本開示の技術は、化粧品、医薬品及び食品分野等の幅広い分野で利用することが可能である、本開示の技術は、特に皮膚に接触させる皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、機能性食品等への利用に貢献できる。
【０１３４】
本技術は、以下の構成も取り得るものである。
【０１３５】
〔１〕  次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【０１３６】
〔２〕  次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）で表されるポリヌクレオチド及びいずれか１のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号２又は３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２又は３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２又は３に表される塩基配列と８５％以上同一性を有する塩基配列からなり、且つ３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するポリヌクレオチド
【０１３７】
〔３〕次の酵素学的性質を有する、Cellvibrio属由来の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。
１．作用：ネオアガロビオースを基質とし、これに親和性を有し、且つ作用して３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する。
２．基質特異性：ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオース及びネオアガロヘキサオースから選ばれる１種以上のものと作用し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを生成する。
３．最適ｐＨ：５〜７である。
４．最適温度：ネオアガロビオースを基質としたとき、１０〜４０℃である。
５．分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における測定で、分子量３５ｋ〜４５ｋＤａを示し、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける測定で、分子量７０〜９０ｋＤａを示すホモ二量体である。
６．Ｎ末端アミノ酸配列がGly-Asp-Leu-Pro-Glu-Lys-Lys-Leu-Ser-Lys-Ala-Ser-Leu-Arg-Ala-Ile-Glu（配列番号４）である。
【０１３８】
〔４〕  前記〔１〕若しくは〔３〕記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は前記〔２〕記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【０１３９】
〔５〕  前記〔４〕記載の組換えベクターを含む形質転換体。
〔６〕  宿主が微生物である〔５〕記載の形質転換体。
〔７〕  前記微生物が大腸菌又は枯草菌である〔６〕記載の形質転換体。
【０１４０】
〔８〕  次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む微生物を培養し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素を回収することを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素の製造方法。
次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【０１４１】
〔９〕  前記微生物が、Cellvibrio属細菌若しくはこれを親株とした変異株、又は前記〔５〕若しくは〔６〕記載の形質転換体であることを特徴とする前記〔８〕記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素の製造方法。
【０１４２】
〔１０〕  次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素を用いて、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得ることを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【０１４３】
〔１１〕  前記３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素の反応条件が、反応温度１０〜４０℃であることを特徴とする前記〔１０〕記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【０１４４】
〔１２〕  次の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質からなる３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成酵素をコードするポリヌクレオチド又は遺伝子を含む微生物を培養し、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースα（１−３）Ｄ−ガラクトースの構造を有する糖質を原料として、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースを得ることを特徴とする３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１に表されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトース生成活性能を有するタンパク質
【０１４５】
〔１３〕  前記微生物が、Cellvibrio属細菌若しくはこれを親株とした変異株、又は前記〔５〕若しくは〔６〕記載の形質転換体であることを特徴とする前記〔１２〕記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【０１４６】
〔１４〕  さらにネオアガロビオース生成酵素を用いる前記〔１０〕〜〔１３〕の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
〔１５〕  前記ネオアガロビオース生成酵素が、Ｄ−ガラクトースβ（１−４）３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースのβ−１，４結合を加水分解するものである前記〔１４〕記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法。
【０１４７】
〔１６〕  Cellvibrio sp. WU-0601と命名され、NITE P-1365として寄託された微生物。
〔１７〕  前記〔１０〕〜〔１５〕の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて美白素材を製造する方法。
〔１８〕  前記〔１０〕〜〔１５〕の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて得られたものを配合する美白剤。
〔１９〕  前記〔１０〕〜〔１５〕の何れか１項記載の３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの製造方法にて得られたものを配合する美白剤の製造方法。
〔２０〕  配列番号４に記載のアミノ酸配列、当該アミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸列及びこれをコードするポリヌクレオチド。
当該ポリヌクレオチドの、前記ＡＬＧ生成酵素及び前記ＡＬＧ産生微生物のスクリーニングの使用。
【受託番号】
【０１４８】
（１）Cellvibrio sp. WU-0601(NITE P-1365)菌株（受託日：2012年 5月22日）
寄託先：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（NPMD）。
（２）Alteromonas sp.(FERM P-14664)菌株（受託日：1994年11月25日）
寄託先：〒305-8566  茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター中央第6、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター(NITE-IPOD)〔旧：工業技術院生命工学工業技術研究所〕
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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