(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中に微量に存在するニバレノール及びデオキシニバレノールを高精度で、迅速かつ簡便に抽出・精製しうる前処理法を提供する。【解決手段】試料を遠沈管に採り、水を加えて十分膨潤させた後、アセトンで振とう抽出し、遠心分離後の上澄に色素除去用吸着剤及び塩析剤を加えて再度振とう・遠心分離し、その上澄を乾固した後、ヘキサン−アセトン混合溶媒で再溶解し、弱イオン性の両性イオン型官能基を有する固相抽出剤を充填した固相抽出カートリッジに通液してニバレノール及びデオキシニバレノールを捕捉させた後、固相抽出カートリッジを適切な洗浄液で洗浄し、捕捉されたニバレノール及びデオキシニバレノールを水で溶出させるという前処理で得られた試料溶液を、高速液体クロマトグラフィ−紫外吸収検出法を用いて測定、定量する。【選択図】図１
2013195359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品あるいは飼料中のニバレノール及びデオキシニバレノールの化学分析において、弱イオン性の両性イオン型官能基を有する固相抽出剤を充填した固相抽出カートリッジを用いて、測定対象である食品あるいは飼料中のニバレノール及びデオキシニバレノールを抽出・精製して分析を行う分析法であって、
試料を遠沈管に採り、水を加えて十分に膨潤させた後、アセトンで振とう抽出し、遠心分離後の抽出液に色素除去用吸着剤及び塩析剤を加えて再度振とう・遠心分離して上澄を得る、
という予備抽出工程と、
予備抽出工程で得られた上澄を乾固した後、ヘキサン−アセトン混合溶媒で再溶解し、前記固相抽出カートリッジに前記再溶解後の試料溶液を通液してニバレノール及びデオキシニバレノールを捕捉させた後、前記固相抽出カートリッジを洗浄液で洗浄して夾雑成分を除去し、前記固相抽出カートリッジに捕捉されたニバレノール及びデオキシニバレノールを水で溶出させる、
という精製工程と、を備えた前処理により得られる試料溶液を、高速液体クロマトグラフィ−紫外吸収検出法で測定してニバレノール及びデオキシニバレノールを分離・定量することを特徴とするニバレノール及びデオキシニバレノールの分析法。
【請求項２】
前記弱イオン性の両性イオン型官能基を有する固相抽出剤が、下記式（１）で示される弱イオン性の両性イオン型高分子が多孔質の親水性基材に導入されている固相抽出剤であることを特徴とする請求項１に記載のニバレノール及びデオキシニバレノールの分析法。
【化１】
2013195359.tif 000009
【請求項３】
前記弱イオン性の両性イオン型官能基を有する固相抽出剤が、下記式（２）で示される弱イオン性の両性イオン型高分子が多孔質の親水性基材に導入されている固相抽出剤であることを特徴とする請求項１に記載のニバレノール及びデオキシニバレノールの分析法。
【化２】
2013195359.tif 000010
【請求項４】
前記親水性基材が、前記式（１）または式（２）の化合物を導入可能な官能基を有する多孔質の非芳香族系親水性高分子ゲルまたはシリカゲルからなることを特徴とする請求項２または請求項３に記載のニバレノール及びデオキシニバレノールの分析法。
【請求項５】
前記色素除去用吸着剤が、活性炭またはカーボンと、アミノプロピル基結合シリカゲルまたはＮ−（２−アミノエチル）−アミノプロピル基結合シリカゲルと、からなることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１つに記載のニバレノール及びデオキシニバレノールの分析法。
【請求項６】
前記塩析剤が、塩化ナトリウム及び硫酸マグネシウムからなることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１つに記載のニバレノール及びデオキシニバレノールの分析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品あるいは飼料中のニバレノール及びデオキシニバレノールの定量を行う化学分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコトキシン（ｍｙｃｏｔｏｘｉｎ）はカビの二次代謝産物として産生される毒物で、現在３００種類以上が知られている。代表的なマイコトキシンとしては、アフラトキシン、オクラトキシン、ニバレノール（以下、「ＮＩＶ」という）やデオキシニバレノール（以下、「ＤＯＮ」という）などのトリコテセン系、パツリン、フモニシンなどがある。ヒトや動物がマイコトキシンを摂取した場合、肝臓、腎臓、胃腸などに重篤な健康傷害が生じ、深刻な場合には死亡に至ることがある。これらのマイコトキシンは農産物を汚染する危害要因であり、生産段階や貯蔵段階において、植物病原菌であるカビが貯蔵穀物などを汚染する。ＮＩＶやＤＯＮは、麦類（小麦及び大麦）の品質低下や収穫量の減少の原因となる赤カビ病の病原菌であるフザリウム属のカビにより産生される。わが国は麦の生育後期に降雨が多く、赤カビ病が発生しやすい環境にある。我が国において、１９５０年代に赤カビ病の被害を受けた米・麦を摂食した人や家畜の間に急性赤カビ中毒症が多発している。現在では赤かび病の被害は減少しているが、気象条件により赤カビ病が蔓延した場合には、ＮＩＶやＤＯＮによる汚染や健康障害が発生する可能性がある。ＮＩＶやＤＯＮは加工や調理工程においても完全に除去・分解することは難しいため、生産段階において汚染を防止することが重要とされる。厚生労働省では、平成１４年に、小麦に対するＤＯＮの暫定基準（１．１ｍｇ／ｋｇ）を設定している（非特許文献１）。農林水産省では、平成１４年、飼料にＤＯＮの暫定許容値（生後３ヵ月以上の牛に給与される飼料：４ｐｐｍ、生後３ヵ月以上の牛を除く家畜などに給与される飼料：１ｐｐｍ）を設定（非特許文献２）し、平成２０年に、実施規範「麦類のデオキシニバレノール・ニバレノール汚染低減のための指針」を策定している（非特許文献３）。ＤＯＮについては暫定基準値が設定されているが、ＮＩＶに関しては、我が国におけるＮＩＶの暴露量は食品安全委員会が設定した耐容一日摂取量（ＴＤＩ：Ｔｏｌｅｒａｂｌｅ  Ｄａｉｌｙ  Ｉｎｔａｋｅ）を下回っていることから、一般的な日本人における食品からのＮＩＶの摂取が健康に悪影響を及ぼす可能性は低いと考えられる、という視点から基準値は設定されていない。しかしながら、ＮＩＶの毒性はＤＯＮよりも１０倍も高いとされ、高温多湿である我が国の気候では赤カビ病が発生しやすいという点を鑑みると、ＤＯＮだけでなくＮＩＶに関しても厳密な管理・規制が必要である。
【０００３】
マイコトキシンの分析法に関しては既に総説（非特許文献４）が出されており、ガスクロマトグラフィ（以下、「ＧＣ」という）や液体クロマトグラフィ（以下、「ＨＰＬＣ」という）を用いる分析法が主に用いられている。ＤＯＮについては、厚生労働省から通知試験法（以下、「通知法」という）が出されており、広く使用されている（非特許文献１及び非特許文献５）。通知法（非特許文献１）では、定性及び定量試験として紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（以下、「ＨＰＬＣ−ＵＶ法」という）を用い、確認試験としてＨＰＬＣ−質量分析計（以下、「ＨＰＬＣ−ＭＳ法」という）又はＧＣ−質量分析計（以下、「ＧＣ−ＭＳ法」という）を用いる、としている。この方法の概要を示すと以下の通りである。検体を１ｍｍの標準網ふるいを通るように粉砕した後、その５０ｇを量り採り、５００ｍＬの三角フラスコに移す。これにアセトニトリル及び水の混液（８５：１５）２００ｍＬを加え、振とう機を用いて３０分間激しく振り混ぜた後、グラスろ紙を用いてろ過する。ろ液１０ｍＬを逆相樹脂、イオン交換樹脂及び活性炭の混合樹脂約２．５ｇを充填した多機能ミニカラムに注入し、毎分１ｍＬ以下の流速で流出させる。ＤＯＮが流出する分画の約５ｍＬを採る。この流出液の４．０ｍＬを共栓付き試験管に正確に採り、４５℃以下で溶媒を除去する。残留物にアセトニトリル、水及びメタノールの混液（５：９０：５）１．０ｍＬを加えて溶かした後、１０、０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を試験溶液とする。この試験溶液を、オクタデシルシリル化シリカゲルを用いてＨＰＬＣで分離し、波長２２０ｎｍで検出する。通知法では夾雑成分の除去には多機能カラムを用いるが、小麦であっても夾雑成分の除去が十分ではないため、ＨＰＬＣ−ＵＶ法（検出検出波長２２０ｎｍ）ではＤＯＮの周辺に夾雑成分が検出されてしまう。そのため、確認試験としてＨＰＬＣ−ＭＳ又はＧＣ−ＭＳを用いるとしているが、２回の試験を行うことは煩雑であるだけでなく、設備や維持管理コスト、分析時間という点からも課題が多い。また、ビスケットやクッキーなどの加工品の場合には、アセトニトリルと水の混液（８５：１５）で抽出すると、バターや油脂成分の影響により乳化したり、３層に分離したりして効率よい抽出ができないことが多い。一方、ＮＩＶに関しては、ＤＯＮの通知法のような公定試験法は設定されていない。ＤＯＮに対する通知法を用いて前処理を行った場合、ＮＩＶが溶出する周辺の夾雑成分の除去が困難であり、この通知法では定性・定量を行うことができない。この問題の解決策として、ＨＰＬＣ−タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用いるという報告がある（非特許文献４）。しかし、このような機器は非常に高価で、維持管理コストも高いため、オンサイト（現場）分析や簡便で迅速な分析が必要とされるマイコトキシンには決して有効な手法であるといえない。
【０００４】
ところで、食品中の残留農薬分析における前処理の煩雑さを解消する手法として、ＱｕＥＣｈＥＲＳ法が注目されている。ＱｕＥＣｈＥＲＳ法とは、Ｑｕｉｃｋ、Ｅａｓｙ、Ｃｈｅａｐ、Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ、Ｒｕｇｇｅｄ、Ｓａｆｅの頭文字を繋いだものである（非特許文献６）。この方法は、ディスポーザブルの遠沈管に試料と抽出溶媒としてのアセトニトリル（基本的には試料と同量）と、塩析脱水のための硫酸マグネシウムと、夾雑成分除去のための吸着剤を入れ、素早く混合・振とうし、遠心分離をかけ、その上澄を試験溶液とするという、非常に簡便化された前処理法で、この方法により多数の農薬の抽出が可能であるとされている。この方法を用いることにより、従来１〜２時間もかかっていた残留農薬分析のための前処理が３０分程度で完了するとされ、前処理の簡便化だけでなく、省力化手法としても有望である。マイコトキシンの前処理においてもこのような前処理の簡便化が期待されるが、ＱｕＥＣｈＥＲＳ法を利用したマイコトキシン分析の前処理手法に関する報告はない。また、ＱｕＥＣｈＥＲＳ法では極性の高い農薬の抽出・回収率が低い、極性農薬の溶出位置周辺に夾雑成分が多数溶出するなどの問題も指摘されている。ＱｕＥＣｈＥＲＳ法は選択的検出が可能なＨＰＬＣ−ＭＳやＧＣ−ＭＳ法のために開発されたものであり、この方法を汎用のＨＰＬＣ−ＵＶ法に適用させた場合には、夾雑成分による妨害は非常に深刻なものとなる。従って、水溶性の高いＮＩＶ及びＤＯＮのＨＰＬＣ−ＵＶ法による分析に適用させるには更なる工夫が必要である。また、ＱｕＥＣｈＥＲＳ法で用いられるアセトニトリル抽出では、上述したような乳化や３層になるなどの問題も生じる。
【０００５】
マイコトキシンの一種であるアフラトキシンやオクラトキシンの分析のための前処理法用として、選択的な反応性抗体を固定した吸着剤を充填したイムノアフィニティカラムが市販されているが、ＮＩＶ及びＤＯＮ前処理用のイムノアフィニティカラムも市販されている。測定試料をイムノアフィニティカラムに通液し、緩衝液の洗浄により夾雑成分を除去した後、メタノールで溶出してＨＰＬＣ−ＵＶ法で分離定量するという方法である。前処理としては簡便な方法であるが、水溶液中からしかＮＩＶ及びＤＯＮを抽出できないため、通知法のような有機溶媒抽出により得られた試料溶液の前処理には適用できない。しかし、抽出溶媒を水溶液として、食品試料などからＮＩＶ及びＤＯＮを効率よく抽出することは困難であるため、既存法とはまったく異なる新規な抽出法を開発しなければならないという課題がある。また、麦加工品などを分析対象とする場合には、抽出液中に疎水性を示す夾雑成分も混在し、これらの夾雑成分は、ＮＩＶ及びＤＯＮとともにこのイムノアフィニティカラムに吸着される。イムノアフィニティカラムからのＮＩＶ及びＤＯＮの溶出はメタノール行うため、これらの夾雑成分も同時に溶出されるため測定溶液に含まれてしまうこととなり、ＨＰＬＣ−ＵＶ法における大きな妨害となりうる。さらに、このイムノアフィニティカラムは１検体限りの使い捨てであり、コストが非常に高いという問題もある。
【０００６】
ＮＩＶやＤＯＮを検出する別の方法としては、トリコテセン系マイコトキシンに対して親和性の高いモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いてトリコテセン系マイコトキシンを検出・定量する方法（特許文献１）、Ｔ細胞と検体とを接触させることにより当該Ｔ細胞にアポトーシスを誘導させ、誘導されたアポトーシスを測定することによりトリコテセン系マイコトキシンを検出・定量する方法（特許文献２）がある。これらの方法はトリコテセン系マイコトキシンに対して特異性の高い認識機構により検出するため、夾雑成分の妨害を受けにくいという特徴がある。しかしながら、トリコテセン系マイコトキシンを包括的に検出・定量するものであるため、個別の定量値を得ることはできない。さらに、ＤＯＮに対してだけであるが、ＥＬＩＳＡキットも商品化されている。このキットにおけるＮＩＶに対する交差反応性は５％であるのでＮＩＶによる検出の妨害は少ないが、当然のこととしてＮＩＶを定量することはできない。また、アセチル化されたＤＯＮに対する交差反応性は１２０％であり、ＤＯＮとしての個別定量値を得ることはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公２００５−２４５２１１号公報
【特許文献２】再表０１／０１８１９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】平成１４年５月２１日付、食安発第０５２１００１号厚生労働省食品安全部長通知
【非特許文献２】平成１４年７月５日付、１４生畜第２２６７号農林水産省飼料課長通知
【非特許文献３】平成２０年１２月１７日付、２０消安第８９１５号、２０生産第５７３１号農林水産省消費・安全局長、生産局長連名通知
【非特許文献４】田端節子、「カビ毒の分析法」、ぶんせき、２００８、Ｎｏ．１０、ｐ．５３１（２００８）。
【非特許文献５】平成１５年７月１７日付、食安発第０７１７００１号厚生労働省食品安全部長通知
【非特許文献６】Ｍ．  Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｅｓ、Ｓ．Ｊ．  Ｌｅｈｏｔａｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ｖｏｌ．８６、Ｎｏ．２、ｐ．４１２（２００３）
【非特許文献７】Ｙ．  Ｉｎｏｕｅ、  Ｗ．  Ｋａｍｉｃｈａｔａｎｉ、  Ｍ．  Ｓａｉｔｏ、  Ｙ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、  Ａ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．９−１０、ｐ．８４９（２０１１）．
【非特許文献８】小林泰之、山本敦、上茶谷若、井上嘉則、分析化学、ｖｏｌ．６０、Ｎｏ．８、ｐ．６３５（２０１１）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の問題点を鑑みてなされたもので、食品あるいは飼料中のトリコテセン系マイコトキシンであるＮＩＶ及びＤＯＮの定量を行う化学分析法において、煩雑な操作を行うことなく、被検試料中に微量に存在するＮＩＶ及びＤＯＮを高精度で、迅速かつ簡便に抽出・精製しうる前処理法及びＨＰＬＣ−ＵＶ法を用いる分析法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者などは、トリコテセン系マイコトキシンであるＮＩＶ及びＤＯＮを迅速、安価かつ簡便に同時定量可能な分析手法を提供すべく鋭意研究を行った結果、新規な予備抽出工程を開発するとともに、その予備抽出液を親水性基材に弱イオン性の両性イオン型官能基が導入された固相抽出剤（以下、「両性イオン型固相抽出剤」という」）を用いて捕捉・精製することで、夾雑成分の妨害を受けることなくＨＰＬＣ−ＵＶ法でＮＩＶ及びＤＯＮを高精度かつ容易に同時定性・定量可能であることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、食品あるいは飼料中のニバレノール及びデオキシニバレノールの化学分析において、弱イオン性の両性イオン型官能基を有する固相抽出剤を充填した固相抽出カートリッジを用いて、測定対象である食品あるいは飼料中のニバレノール及びデオキシニバレノールを抽出・精製して分析を行う分析法であって、試料を遠沈管に採り、水を加えて十分に膨潤させた後、アセトンで振とう抽出し、遠心分離後の抽出液に色素除去用吸着剤及び塩析剤を加えて再度振とう・遠心分離して上澄を得る、という予備抽出工程と、予備抽出工程で得られた上澄を乾固した後、ヘキサン−アセトン混合溶媒で再溶解し、前記固相抽出カートリッジに前記再溶解後の試料溶液を通液してニバレノール及びデオキシニバレノールを捕捉させた後、前記固相抽出カートリッジを洗浄液で洗浄して夾雑成分を除去し、前記固相抽出カートリッジに捕捉されたニバレノール及びデオキシニバレノールを水で溶出させる、という精製工程からなる前処理により得られる試料溶液を、高速液体クロマトグラフィ−紫外吸収検出法（ＨＰＬＣ−ＵＶ法）で測定してニバレノール及びデオキシニバレノールを分離・定量する、というニバレノール及びデオキシニバレノールの分析法である。
【００１２】
本発明において、前記弱イオン性の両性イオン型官能基を有する固相抽出剤の一つの形態は、下記式（１）で示される弱イオン性の両性イオン型高分子が多孔質の親水性基材に導入されている固相抽出剤である。
【００１３】
【化１】
2013195359.tif 000003
【００１４】
また、本発明において、弱イオン性の両性イオン型官能基を有する固相抽出剤のもう一つの形態は、下記式（２）で示される弱イオン性の両性イオン型高分子が多孔質の親水性基材に導入されている固相抽出剤である。
【００１５】
【化２】
2013195359.tif 000004
【００１６】
本発明において、両性イオン型固相抽出剤の親水性基材としては、前記式（１）または式（２）の化合物が導入可能な官能基を有する多孔質の非芳香族系親水性高分子ゲルまたはシリカゲルを用いることができる。
【００１７】
本発明においては、前記色素除去用吸着剤として、活性炭またはカーボンと、アミノプロピル基結合シリカゲルまたはＮ−（２−アミノエチル）−アミノプロピル基結合シリカゲルを用いることができる。
【００１８】
また、本発明においては、前記塩析剤として、塩化ナトリウム及び硫酸マグネシウムからなる塩析剤を用いることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の分析法は、簡便な抽出法と水溶性の高い化合物に高い親和性を示す両性イオン型固相抽出剤との組み合わせにより、食品あるいは飼料中のＮＩＶ及びＤＯＮを、安価な器具で、迅速かつ簡便に高効率で抽出することができ、夾雑成分の除去率も高いため、汎用のＨＰＬＣ−ＵＶ法でＮＩＶ及びＤＯＮを高精度に同時定量することが可能である。本法は、既存の通知法に代わる高精度な試験法となり得る方法であり、本法を利用することで、ＮＩＶ及びＤＯＮの分析精度を高めると共に、分析効率の改善やコストの低減を達成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の分析法における操作フローを示した図である。
【図２】図２は、本発明に用いられる両性イオン型固相抽出剤が充填された固相抽出カートリッジの構成の一例を示した説明図である。
【図３】図３は、本発明の分析法と通知法により得られたふすま抽出液のクロマトグラムである。図３ａ）はＮＩＶ及びＤＯＮ各１ｐｐｍ標準液のクロマトグラムである。図３ｂ）は、本発明の分析法により前処理して測定したふすまのクロマトグラムである。図３ｃ）は、本発明の分析法により前処理して測定したＮＩＶ及びＤＯＮ各１ｐｐｍを添加したふすまのクロマトグラムである。図３ｄ）は、通知法により前処理して測定したふすまのクロマトグラムである。図３ｅ）は、通知法により前処理して測定したＮＩＶ及びＤＯＮ各１ｐｐｍを添加したふすまのクロマトグラムである。
【図４】図４は、本発明の分析法と通知法により得られたふすま抽出液のクロマトグラムである。図４ａ）は、本発明の分析法により前処理して測定したふすまのクロマトグラムである。図４ｂ）は、通知法により前処理して測定したふすまのクロマトグラムである。
【図５】図５は、本発明の分析法と通知法により得られたブランビスケット抽出液のクロマトグラムである。図５ａ）は、ＮＩＶ及びＤＯＮ各１ｐｐｍ標準液のクロマトグラムである。図５ｂ）は、本発明の分析法により前処理して測定したブランビスケットのクロマトグラムである。図５ｃ）は、本発明の分析法により前処理して測定したＮＩＶ及びＤＯＮ各１ｐｐｍを添加したブランビスケットのクロマトグラムである。図５ｄ）は、通知法により前処理して測定したブランビスケットのクロマトグラムである。図５ｅ）は、通知法により前処理して測定したＮＩＶ及びＤＯＮ各１ｐｐｍを添加したブランビスケットのクロマトグラムである。
【図６】図６は、本発明の分析法により得られたクッキート抽出液のクロマトグラムである。図６ａ）は、ＮＩＶ及びＤＯＮ各０．５ｐｐｍ標準液のクロマトグラムである。図６ｂ）は、本発明の分析法により前処理して測定した小麦クッキーのクロマトグラムである。図６ｃ）は、本発明の分析法により前処理して測定したＮＩＶ及びＤＯＮ各０．５ｐｐｍを添加した小麦クッキーのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、遠沈管を用いて簡便に抽出を行う予備抽出工程と、両性イオン型固相抽出剤を充填した固相抽出カートリッジを用いて夾雑成分除去を行う精製工程とを組み合わせて試料前処理を行い，得られた測定用試料溶液をＨＰＬＣ−ＵＶ法を用いて分離・定量するという点が、最も特徴的な構成である。
【００２２】
本実施例の操作フローを図１に示す。図１の操作フローに従い、本発明の実施形態を説明する。
【００２３】
本発明の前処理は、予備抽出工程と精製工程の２つから構成される。予備抽出工程では、食品あるいは飼料中からＮＩＶ及びＤＯＮを抽出した後、色素などの夾雑成分をある程度除去すると共に、水分を取り除き、次の精製工程に供しやすい状態の溶液を調製する。精製工程では、両性イオン型固相抽出剤を用いてＮＩＶ及びＤＯＮを捕捉・濃縮するとともに、ＨＰＬＣ分析において妨害となる残存した夾雑成分の除去を行う。
【００２４】
予備抽出工程では、測定対象試料の膨潤⇒アセトンによる振とう抽出⇒遠心分離⇒塩析剤・吸着剤による色素などの夾雑成分除去⇒遠心分離、という段階を経て、精製工程に供させる上澄を得る。
測定対象である食品あるいは飼料は、粉砕または細切後、その一定量が遠沈管に採取される。ここで使用される遠沈管は、ガラス製のものでも樹脂製のものでもよい。採取された試料に、試料と同量の水を加えて激しく振とう後、２０〜３０分放置する。これにより、試料が膨潤して次工程のアセトン抽出の抽出率を向上させることができる。通知法ではアセトニトリル：水（８５：１５）で直接抽出することとなっているが、試料の膨潤が不十分である場合には高い抽出率を得ることができない。そこで、事前に水を加えて振とう放置することにより試料が十分に膨潤して抽出しやすい状態とすることができる。
次いで、加えた水の倍量のアセトンを加えて、速やかに１分間激しく振とうする。通知法の抽出法は小麦粉やふすまなどからの抽出には適用可能であるが、バターやマーガリン、植物油、ショートニングなどを含むクッキーなどの麦加工品には適用することができない。これらの油脂成分とアセトニトリルとが均一に混和しないため、３層に分離したり、乳化したりしてしまい、遠心分離によって上澄を得ることができない。また、油脂層や乳化層中にＮＩＶ及びＤＯＮが残存してしまい高い回収率を得ることはできない。これらの理由から、抽出溶媒として両性溶媒であるアセトンを用いることが必須である。
アセトンによる振とう抽出を行った後、速やかに遠心分離を行い、上澄を得る。遠心分離条件は特に規定するものではないが、３０００〜６０００回転で、２〜５分行う。
得られた上澄を別の遠沈管に移し、色素除去用吸着剤及び塩析剤加えて再度振とうし、遠心分離して上澄を得る。色素除去用吸着剤としては、活性炭またはカーボンと、アミノプロピル基結合シリカゲルまたはＮ−（２−アミノエチル）−アミノプロピル基結合シリカゲルと、からなる色素除去用吸着剤を用いることができる。これらは市販されているものを使用することができる。これらの使用量は、得られた上澄２０ｍＬに対して、活性炭あるいはカーボンは１〜１．５ｇ、アミノプロピル基結合シリカゲルあるいはＮ−（２−アミノエチル）−アミノプロピル基結合シリカゲルは１００〜２００ｍｇである。また、この工程において添加される塩析剤は、塩析及び脱水効果によって、ＮＩＶ及びＤＯＮの抽出溶媒（本発明ではアセトン）への移行度合い（溶解性）を高めるために添加される。このような効果をもたらすものとしては無水硫酸ナトリウムが広く用いられているが、無水硫酸ナトリウムを用いた場合には、ＮＩＶ及びＤＯＮが無水硫酸ナトリウムに吸着して抽出回収率が低下するという問題が生じる。無水硫酸ナトリウムの代わりとして塩化ナトリウム単独でも塩析効果は得られるが、アセトンからの脱水効率が低く、次工程の乾固に多大な時間が必要となる。そこで、本発明においては、塩析剤として、塩化ナトリウムとアセトンからの脱水効率の高い硫酸マグネシウムを併用する。これらの使用量は、得られた上澄２０ｍＬに対して、塩化ナトリウムは１〜３ｇ、硫酸マグネシウムは４〜６ｇである。
上記のような、予備抽出工程により得られた上澄は、次の精製工程に供せられる。
【００２５】
精製工程では、予備抽出工程により得られた上澄の乾固⇒ヘキサン−アセトンによる再溶解⇒両性イオン型固相抽出剤でＮＩＶ及びＤＯＮを捕捉⇒洗浄液による夾雑成分除去⇒水による溶出、という段階を経て、ＨＰＬＣ−ＵＶ法に供させる試料溶液を得る。
予備抽出工程により得られたアセトン抽出液を直接次工程に示す両性イオン型固相抽出剤に通液して精製することも可能であるが、僅かではあるが水分を含むアセトン抽出液のままでは、溶液中の夾雑成分が変化すると捕捉率が変化することがある。そこで、一旦乾固して、精製効率の高い溶媒に転溶することが必要となる。予備抽出工程により得られた上澄から２ｍＬを採取し、窒素ガスあるいは乾燥空気を用いて乾固する。これにより、残存すると分析値に影響を及ぼす水分を十分に除去することができる。乾固成分は、５ｍＬのヘキサン−アセトン混合溶媒、例えばヘキサン：アセトン＝８０：２０のヘキサン−アセトン混合溶媒で再溶解し、両性イオン型固相抽出剤を用いる精製工程に供する。両性イオン型固相抽出剤における精製度合いを向上させるためには、両性イオン型固相抽出剤における捕捉率を高める必要がある。一般に、固相抽出剤と極性が離れた溶媒、例えは、ヘキサンのような無極性溶媒を用いると捕捉率が高まる。しかし、ＮＩＶ及びＤＯＮはヘキサンへの溶解度は低いため、本発明においてはヘキサン−アセトン混合溶媒を使用する。ヘキサン−アセトンの比率は７５：２５〜９５：１０、好ましくは、ヘキサン：アセトン比率は８０：２０〜９０：１０を用いる。
ヘキサン−アセトン混合溶媒に再溶解した溶液を０．５〜２ｍＬ／ｍｉｎで固相抽出カートリッジに通液してＮＩＶ及びＤＯＮを捕捉させる。ヘキサン−アセトン混合溶媒に再溶解した溶液５ｍＬを処理する場合、１００ｍｇの両性イオン型固相抽出剤を充填した固相抽出カートリッジを用いる。ここで、両性イオン型固相抽出剤を用いるのは、ＮＩＶ及びＤＯＮに対する親和性が高く、効率よく捕捉して濃縮できるというだけでなく、試験溶液となる固相抽出カートリッジからの溶出液を水溶液として得ることができ、かつ疎水性の高い成分を保持することなく除去することができるからである。ＮＩＶ及びＤＯＮのＨＰＬＣによる分離は、オクタデシルシリル化シリカゲルを固定相に用い、アセトニトリル：水：メタノール（５：９０：５）を移動相として逆相分配モードで行われる。この分離モードでは、試料溶液の液性が移動相よりも溶離力の強い場合には保持や分離の変動が大きくなる。また、試料中に疎水性の高い夾雑成分が含まれる場合には、測定対象成分が溶出した後も夾雑成分の溶出が続き、分析時間が異常に長くなるという問題が生じる。従って、ＮＩＶ及びＤＯＮの捕捉・濃縮、疎水性夾雑成分の除去、そして測定試料が水溶液で得られる、という点から、両性イオン型固相抽出剤の使用が好適である。
再溶解した溶液を全量通液後、適切な洗浄液５ｍＬを通液し、充填ベッド内に残存する負荷溶液や疎水性夾雑成分の溶出・除去を行う。洗浄液としては、固相抽出カートリッジに残存する試料負荷液の押し出しも兼ねるため、試料負荷液と混和するものでなければならず、また両性イオン型固相抽出剤に捕捉されたＮＩＶ及びＤＯＮを溶出させないものでなければならない。通常は、試料負荷液と同じ、好ましくは試料負荷液よりもヘキサン比率の高いものを使用する。すなわち、ヘキサン：アセトン比率は７５：２５〜１００：０、好ましくは、ヘキサン：アセトン比率は８０：２０〜１００：０を用いる。
固相抽出カートリッジの洗浄後、水０．５ｍＬを用いて、両性イオン型固相抽出剤に捕捉されたＮＩＶ及びＤＯＮを溶出させる。この溶出液がＨＰＬＣ−ＵＶ法による測定試料となる。本発明において使用される両性イオン型固相抽出剤はＮＩＶ及びＤＯＮのような水溶性の高い成分を水だけで溶出可能である。従って、上述したようなＨＰＬＣ−ＵＶ法における試料液性に基づく分離への影響が生じることはない。
【００２６】
本発明は、水溶性化合物に対して高い親和性を有する両性イオン型固相抽出剤にＮＩＶ及びＤＯＮを捕捉させて精製を行う。本実施形態において、両性イオン型固相抽出剤には、多孔質の親水性基材に弱イオン性の両性イオン型高分子が導入された固相抽出剤が使用される。
【００２７】
本発明において親水性基材に導入される両性イオン性の高分子の第１及び第２の形態としては、下記式（１）に示されるジアリルアミン誘導体−マレイン酸共重合体または下記式（２）に示されるアリルアミン誘導体−マレイン酸共重合体であり、これらが親水性基材に導入される。また、これら共重合体を混合して親水性基材に導入してもよい。これらの両性イオン型高分子は、例えば、ジアリルアミン誘導体またはアリルアミン誘導体と無水マレイン酸との共重合により得られる共重合体を加水分解することにより得ることができる。ジアリルアミン誘導体またはアリルアミン誘導体とマレイン酸との組成比（式（１）及び式（２）におけるｍとｎの比）は１〜２：１であるものが用いられる。これらの両性イオン性高分子の分子量を正確に求めることは難しいが、大凡の平均分子量として５、０００〜１００、０００のものが本発明に用いられる。
【００２８】
【化１】
2013195359.tif 000005
【００２９】
【化２】
2013195359.tif 000006
【００３０】
前記両性イオン型高分子は水溶性であり、それぞれのイオン性基の周りに多数の水分子が水和しているため、親水性基材にこれらの高分子が導入された固相抽出剤は高い保水性を示す。ジアリルアミン−マレイン酸共重合体を導入した固相抽出剤の保水性に関しては既に報告があり、親水性化合物が親水性相互作用に基づき捕捉されるとされている（非特許文献７及び非特許文献８）。本発明では、両性イオン型高分子の水和力に基づいて固相抽出剤表面に形成される保水層に水溶性の高いＮＩＶ及びＤＯＮを親水性相互作用によって捕捉する。親水性相互作用とは固定相の親水基に基づく極性や水素結合などの相互作用や、固定相表面に形成された水和相への分配などの複合的な相互作用であり、親水性化合物のクロマトグラフィック分離に用いられている。この分離系は極性固定相とアセトニトリルなどの極性移動相とにより構成され、極性固定相への親和性を利用して極性化合物の分離を行うものである。
【００３１】
本発明では、ＮＩＶ及びＤＯＮの捕捉機構として、一般に広く用いられている疎水性相互作用ではなく、水溶性化合物の捕捉に有効な親水性相互作用を利用する。一般に広く用いられている固相抽出剤の基材は芳香族化合物であるスチレンあるいはジビニルベンゼンとの共重合体である。このような基材は疎水性有機物の捕捉には有効であるが、本発明の対象であるＮＩＶ及びＤＯＮのような水溶性の高い化合物の捕捉には有効ではない。また、このような疎水性を示す基材に本発明の弱イオン性の両性イオン型高分子を導入させる方法もあるが、基材の疎水性のため、親水性相互作用を効果的に発現させることができなくなる。従って、本発明においては、親水性相互作用を明確かつ効果的に発現させるため、前記両性イオン型高分子を導入する基材には、非芳香族系の親水性基材を使用する。親水性基材の一つの形態としては、公知の親水性モノマーと親水性架橋性モノマーとの共重合により得られる多孔質の親水性の高分子ゲルを使用することが可能であるが、前記両性イオン型高分子を化学的に導入させるため、反応性官能基を有する必要がある。
このような反応性基材は、反応性官能基を有する反応性モノマーと架橋性モノマーとの共重合、または親水性基材に後反応により反応性官能基を導入することにより得られる。前記両性イオン型高分子の導入においては、アンモニウム基（以下、イミノ基も含めて「アンモニウム基」という）との反応、またはカルボキシル基との反応により行うことが可能であるが、導入反応の容易さ及び反応生成物の安定性の点を考えると、アンモニウム基との反応を利用するのが有利である。従って、本発明においては、反応性官能基としてアンモニウム基と反応可能なエポキシ基、ハロゲン化アルキル基などの官能基を有する多孔質の親水性高分子ゲルまたはシリカゲルを基材として用いる。
【００３２】
アンモニウム基と反応可能な官能基を有する親水性高分子ゲルの一つの形態は、アンモニウム基と反応可能な官能基を有する親水性のビニルモノマーと、２個以上のビニル基を有する親水性の架橋性モノマーとの懸濁共重合によって得られる架橋性高分子である。アンモニウム基と反応する官能基を有する親水性のビニルモノマーの官能基としては、ハロゲン化アルキル基、エポキシ基などがあげられる。ハロゲン化アルキル基を有する反応性モノマーとしては、例えば、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−クロロエチルメタクリレート、２−クロロエチルアクリレートなどがあげられる。エポキシ基を有する官能性モノマーとしては、例えば、グリシジルメタクリレート、グリシジルアクリレートなどがあげられる。これらモノマーと共重合が可能なビニル基を２個以上有する親水性の架橋性モノマーとしては、エチレンジメタクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、グリセリンジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ネオペンチルグリコールトリメタクリレートなどの多官能メタクリレート系モノマー、この他、トリアリルイソシアヌレート、トリメタアリルイソシアヌレートなどのシアヌル酸骨格を持つ架橋性モノマーなどがあげられる。また、親水性高分子ゲルの親水性や水素結合性などの物性を改善するために、第三のビニルモノマーを添加することも可能である。物性改善のためのビニルモノマーとしては、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、モルホリノアクリルアミドなどのアミド系モノマー、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセリンメタクリレート、ネオペンチルグリコールメタクリレート、トリメチロールプロパンメタクリレートなどのメタクリレートモノマー、さらにはＮ−ビニルピロリドンなどがあげられる。本発明の親水性高分子ゲルにおいて、アンモニウム基と反応する官能基を有するビニルモノマーの量は、全ビニルモノマーに対して２０〜８０重量％、好ましくは３０〜８０重量％であり、十分な硬度を確保するためにビニル基を２個以上有する親水性の架橋性モノマーは少なくとも２０重量％以上用いる。また、親水性基材の親水性や水素結合性などの物性を改善するために添加される他のビニルモノマーは、０〜２０重量％で用いるのが好ましい。
【００３３】
アンモニウム基と反応可能な官能基を有する親水性高分子ゲルのもう一つの形態は、水酸基を多数有する親水性担体に、アンモニウム基と反応可能な官能基を化学反応によって導入することにより得られる。水酸基を多数有する親水性担体としては、ポリビニルアルコール系架橋性樹脂、ヒドロキシメタクリレート系架橋性樹脂などの合成高分子系の親水性担体、さらにはセルロース、デキストランなどの多糖類を原料とする親水性担体などを使用することができる。これらの親水性担体の水酸基に公知の方法により、ハロゲン化アルキル基、エポキシ基などのアンモニウム基と反応可能な官能基を導入することが可能である。
【００３４】
本発明において用いられる親水性基材のさらなる形態としては、公知の方法により得られる多孔質のシリカゲルである。前記両性イオン型高分子を化学的に導入させるため、アンモニウム基と反応可能な官能基を事前に導入しておく必要がある。アンモニウム基と反応が可能な反応性官能基の導入方法としては、反応性官能基を有するシランカップリング剤を公知の方法によりシリカゲル表面のシラノール基に反応させればよい。例えば、γ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのトルエン溶液中にシリカゲルを入れ、還流条件下で反応させることで、シリカゲル表面にアンモニウム基と反応可能なエポキシ基を導入することが可能である。
【００３５】
本発明においては、高い吸着能が要求されるため、十分な比表面積を有する多孔質の親水性基材が必要となる。そのため、本発明においては、非膨潤時の細孔物性として、平均細孔径６〜５０ｎｍ、比表面積１０〜８００ｍ２／ｇのものを用いるのが好ましい。また、本発明において使用される親水性基材の粒子径は任意に設定することができるが、一般に、平均粒子径で２５〜２００μｍのものを用いる。また、親水性基材の形状に関しては、不定形の破砕型であっても、球形であってもかまわない。このような親水性の基材の反応性官能基に、両性イオン型官能基が導入される。
【００３６】
上記両性イオン型官能基が導入された固相抽出剤は、固相抽出用のエンプティカートリッジに充填され使用される。エンプティカートリッジの形状としては種々のものを入手することができるが、本発明においては特に規定するものではない。また、エンプティカートリッジやフリットの材質においても特別な規定はないが、本分析法で使用されるヘキサンやアセトンに対して耐性のあるものでなければならず、通常は安価なポリプロピレンやポリエチレン製のものが用いられる。図２に本発明に用いられる固相抽出カートリッジの構造の一例を示す。両性イオン型官能基が導入された固相抽出剤１２は、下部フリット１３が挿入されているエンプティカートリッジ（図２においてはシリンジ型）１１に充てんされる。上部フリット１４を挿入して固相抽出剤の充填ベッドを固定する。このようにして作製された固相抽出カートリッジ１０が、ＮＩＶ及びＤＯＮの前処理の精製工程に用いられる。
【００３７】
上述した、予備抽出工程及び精製工程を経て、調製されたＮＩＶ及びＤＯＮを含む試料溶液は、高速液体クロマトグラフィ−紫外吸収検出法（ＨＰＬＣ−ＵＶ法）により、分離検出され、定量される。分離条件については通知法に規定されるものに準じて、オクタデシルシラン結合シリカゲルを充填したカラム用い、アセトニトリルとメタノールをそれぞれ５％ずつ添加した水を移動相として用いる。この分離機構は、逆相分配モードと呼ばれ、水溶性の高いものから溶出し、疎水性の高いものほど強くカラムに保持される。但し、分離カラムのメーカーや製法が異なる場合には、通知法規定の移動相を用いたとしても、同一の分離が得られるという訳ではない。つまり、分離カラムに合わせて移動相条件を変更する必要がある。従って、本発明においては、何ら分離条件を規定するものではなく、通知法を参考に適宜最適な分離が得られる条件を設定すればよい。
【００３８】
以上のように、本発明のＮＩＶ及びＤＯＮの分析法を用いることで、食品や飼料、食品原料などに残存するＮＩＶ及びＤＯＮを簡便かつ迅速に同時定性・定量することが可能となる。次に実施例によって本発明を説明するが、この実施例によって本発明を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００３９】
（実施例１）  
（１）両性イオン型高分子導入固相抽出剤の合成：親水性基材の合成
親水性基材は、水系懸濁重合法により合成した。グリシジルメタクリレート１６０ｇ、エチレンジメタクリレート４０ｇ、酢酸ブチル２００ｇの混合溶液に２、２’−アゾビスイソブチロニトリル２ｇを溶解した混合物を、０．１％メチルセルロース水溶液１、０００ｍＬ中に加え、攪拌機を用いて攪拌羽根を４００ｒｐｍで回転させ、油層を分散した。その後、分散液（懸濁液）を加温し、８０℃で６時間重合反応を行った。生成した共重合体粒子を濾取し、水、メタノールの順で洗浄した。一日風乾後、分級を行い、４５〜９０μｍの親水性基材７５ｇを得た。この親水性基材の平均粒子径と分散度（ｄ７５／ｄ２５）をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒで測定したところ、平均粒子径は６４．５μｍ、分散度は１．２６であった。また、比表面積と平均細孔径をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＳＡ３１００  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｒｅａ  Ａｎａｌｙｚｅｒで測定したところ、比表面積は３１ｍ２／ｇ、平均細孔径は２０ｎｍであった。
【００４０】
（２）  両性イオン型高分子導入固相抽出剤の合成：両性イオン型高分子の導入
ジアリルアミン−マレイン酸共重合体（日東紡績製ＰＡＳ−４１０Ｃ、濃度４０％）５０ｍＬを、水２５０ｍＬ、２−プロパノール１００ｍＬの混合溶媒中に加え、均一な溶液とした後、実施例１の（１）で得られた親水性基材５０ｇを加え、攪拌して均一なスラリーとした。さらに、５Ｍ  ＮａＯＨ  ５０ｍＬを加えて、攪拌しながら６０℃で２０時間反応をさせた。反応終了後、２−プロパノール、水、メタノールの順で洗浄し、一晩風乾させ、両性イオン型固相抽出剤を得た。導入された両性イオン型高分子の量を求めるため、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍａｒ  ２４００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ  ＣＨＮＳ／Ｏ  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒで測定したところ、窒素量は０．６４Ｎ％であった。この両性イオン型固相抽出剤１００ｍｇを固相抽出用エンプティカートリッジ（容量：３ｍＬ）に充填した。
【００４１】
（３）  本発明の方法によるふすまの前処理
ネジ式蓋付きポリエチレン製遠沈管（容量：２５ｍＬ）にふすま５ｇを採取し、水５ｍＬを加えて激しく１分間振とうし、２０分間放置した。その後、アセトン１０ｍＬを加え、速やかに激しく１分間振とう後、５０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄を別のポリエチレン製遠沈管に採取した。この操作をさらに１回行い、得られた上澄と先の上澄とを混合した。混合した上澄に、活性炭１ｇ、Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノプロピル基結合シリカゲル１００ｍｇ、塩化ナトリウム２ｇ、硫酸マグネシウム４．８ｇを加え、振とう後、上記と同一の条件で遠心分離し、上澄を得た。前記上澄から２ｍＬをポリエチレン製遠沈管（容量：１０ｍＬ）に採取し、窒素ガスを吹き付けて乾固した。その後、５ｍＬのヘキサン：アセトン（８：２）で再溶解した。この溶液全量を、実施例１（２）で作製した両性イオン型固相抽出剤充填固相抽出カートリッジに、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で通液した。次いで、ヘキサン５ｍＬを、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で通液し、両性イオン型固相抽出剤の洗浄を行った。ヘキサンを十分に押し出した後、水０．５ｍＬを通液し、両性イオン型固相抽出剤に捕捉されたＮＩＶ及びＤＯＮを溶出させ、測定用試料溶液を得た。また、ふすまの水による膨潤時に各１ｐｐｍとなるようにＮＩＶ及びＤＯＮを添加して、同様の方法で前処理した標準添加試料溶液も調製した。
【００４２】
（４）  比較例１：通知法によるふすまの前処理
５００ｍＬ三角フラスコにふすま５０ｇを採取し、アセトニトリル：水（８５：１５）２００ｍＬを加えて、３０分間振とう器にかけ、激しく振とうさせた。フラスコの内容物をグラスフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｂ）で濾過した。ろ液１０ｍＬを多機能カラム（Ｒｏｍｅｒ  Ｌａｂ製、ＭｕｌｔｉＳｅｐ  ２２７）に、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で通液し、最初の流出液約３ｍＬを捨て、次いで流出する５ｍＬを共栓付き試験管に採取した。この流出液の４．０ｍＬを共栓付き試験管に正確に採り、４０℃の水浴で加温して溶媒をゆっくり除去した。次いで、上記の残留物にアセトニトリル：水：メタノール（５：９０：５）１．０ｍＬを加えて溶かした後、１０、０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、測定用試料溶液を得た。また、ふすまの水による膨潤時に各１ｐｐｍとなるようにＮＩＶ及びＤＯＮを添加して、同様の方法で前処理した標準添加試料溶液も調製した。
【００４３】
（５）  ＨＰＬＣ−ＵＶ法によるふすま抽出液中のＮＩＶ及びＤＯＮの分析
実施例２及び比較例１により得られた測定用試料溶液をＨＰＬＣ−ＵＶ法により測定した。ＨＰＬＣ−ＶＵ法の測定条件は次の通りである。カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８（５μｍ、４．０×２５０ｍｍ）、移動相：水：メタノール：アセトニトリル＝９０：５：５、流速：１．０ｍＬ、カラム温度：４０℃、検出：紫外吸収検出器、２２０ｎｍ。得られたクロマトグラムを図３に示す。通知法ではＮＩＶの近傍に夾雑成分のピークが検出され微量のＮＩＶを定量することはできないが、本発明の方法では夾雑成分の妨害を受けることなくＮＩＶ及びＤＯＮを同時に定性・定量できることが判る。一方、ＤＯＮに関しては、本発明の方法でも通知法でも高精度に測定できることが判る。尚、この時添加したＮＩＶ及びＤＯＮから添加回収率を求めると、通知法ではそれぞれ７８％と４８％、本発明の分析法では８８％と７６％であり、本発明の分析法のほうが高い回収率を得ることができた。
【００４４】
（実施例２）  抽出溶媒の比較
通知法ではアセトニトリル系溶媒での抽出が規定されているため、種々の溶媒を用いて抽出効率の比較を行った。操作方法は本発明の方法を用い、小麦粉に各１ｐｐｍとなるようにＮＩＶ及びＤＯＮを添加して抽出を行った。測定条件は、実施例１（５）と同じである。測定回数３回の平均値を表１に示す。アセトニトリルではＮＩＶは良好な回収率が得られたが、ＤＯＮの回収率は若干低い値であった。アセトンでもＮＩＶは良好な回収率が得られたが、ＤＯＮの回収率は若干低い値であった。しかし、アセトニトリルよりは若干高い値であった。酢酸エチルでは、ＤＯＮの回収率は比較的高かったが、ＮＩＶの回収率はかなり低く、溶解度の影響によるものと推定された。また、ヘキサンを用いた場合にはＮＩＶ及びＤＯＮのピークは検出されなかった。ヘキサンに対するＮＩＶ及びＤＯＮの溶解度が非常に低いためと判断された。これらの結果から、抽出溶媒には両性溶媒として機能するアセトンが好適であると判断された。
【００４５】
【表１】
2013195359.tif 000007
【００４６】
（実施例３）  ＨＰＬＣ−ＵＶ法によるふすま抽出液中の疎水性夾雑成分の確認
抽出液中の疎水性夾雑成分の除去状態を確認するため、比較試験１で測定したふすま抽出液をＨＰＬＣ−ＵＶに注入し、一時間モニターした。ＨＰＬＣ−ＶＵ法の測定条件は実施例１（５）と同じであるが、分離カラムには溶出時間が早く、分離能の高いＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８（５μｍ、４．０×２５０ｍｍ）を用いた。結果を図４に示す。図中に、ＮＩＶ及びＤＯＮが溶出する位置を↓で示した。図で明白なように、通知法ではＤＯＮが溶出する１５分以降にも多数のピークが検出され、前処理により疎水性夾雑成分が除去し切れていないことが判る。しかし、本発明の分析法によりしたものは１５分以降に夾雑成分のピークは検出されていない。このことは、本発明の両性イオン型固相抽出剤を用いる精製工程において疎水性夾雑成分が効率よく除去されていることを示す。また、本発明の分析法では、ＤＯＮの溶出以降に夾雑成分に基づくピークが検出されないため、ＤＯＮの測定後に続けて次の試料を注入することができ、実質的な分析時間を短縮できることとなる。
【００４７】
（実施例４）  添加回収率の比較
本発明の分析法と通知法を用いて小麦、ふすま、ビスケット、ブランビスケットに各１ｐｐｍとなるようにＮＩＶ及びＤＯＮを添加して、それぞれの前処理法で調製した試料溶液も測定し、添加回収率を調べた。前処理はそれぞれ実施例１（３）及び（４）と同じ手順で行い，測定条件は実施例３と同じである。結果を表２に示す。表で明白なように、小麦及びふすまに関しては、本発明の分析法のほうが高い回収率を示した。また、繰り返し測定における相対標準偏差（ＲＳＤ）も、本発明の分析法のほうが良好な値となった。一方、ビスケット及びブランビスケットに関しては、通知法ではＮＩＶ及びＤＯＮの溶出位置に夾雑成分のピークが検出され、回収率を求めることができなかった。この時の、ブランビスケットのクロマトグラムを図５に示す。図で明白なように、本発明の分析法では夾雑成分の妨害を受けずにＮＩＶ及びＤＯＮを精度よく同時に定量できることが判る。尚、このブランビスケット中にはＮＩＶが検出され、その値は０．１３ｐｐｍであった。
【００４８】
【表２】
2013195359.tif 000008
【００４９】
（実施例５）  ＨＰＬＣ−ＵＶ法によるクッキー抽出液中のＮＩＶ及びＤＯＮの分析
上述のように、本発明の分析法では夾雑成分の妨害を受けずに、小麦、ふすま、ビスケット中のＮＩＶ及びＤＯＮの同時定量が可能である。小麦加工品であるクッキー中には、バター、マーガリン、植物油脂、鶏卵、ショートニングなどが含まれており、これらの夾雑成分が抽出や分離・検出の妨害となる。このような麦加工品への本発明の分析法の適用性を調べるため、バターオイル、植物油脂、マーガリン、鶏卵を含むクッキーの分析を行った。前処理は実施例２と同じ手順で行い，測定条件は実施例３と同じである。結果を図６に示す。図６に示す通り、本発明の分析法は夾雑成分の妨害を受けず良好にＮＩＶ及びＤＯＮの同時定量が可能であることが判る。尚、このクッキーを用いて通知法で抽出を行ったが、グラスフィルターでの濾過液は乳化したような状態で濁っており、多機能カラムを通過させた後もその濁りが残っていた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、簡便な抽出法と水溶性の高い化合物に高い親和性を示す両性イオン型固相抽出剤とを組み合わせることにより、食品あるいは飼料中のＮＩＶ及びＤＯＮを、安価な器具で、迅速かつ簡便に高効率で抽出することが可能となる。本発明の分析法は、食品あるいは飼料中からＮＩＶ及びＤＯＮを効率よく抽出することが可能であり、ＨＰＬＣ−ＵＶ法による測定においてＮＩＶ及びＤＯＮの分離・検出の妨害となる夾雑成分を両性イオン型固相抽出剤により除去することが可能であるため、ＮＩＶ及びＤＯＮを高精度に同時定量することが可能である。また、前処理に要する時間も短く、かつ簡便で、多検体同時処理も可能である。さらに、疎水性夾雑成分の除去率も高く、ＨＰＬＣ−ＵＶ法におけるスループットも高い。本法を利用することで、ＮＩＶ及びＤＯＮの分析精度が高まるだけでなく、分析効率の改善やコストの低減を達成することが可能である。本発明の分析法は、既存の通知法に代わる簡便かつ高精度な試験法となり得る方法であり、本発明の分析法の普及により食の安全の確保に貢献することも可能である。
【符号の説明】
【００５１】
１０：カラム（両性イオン型固相抽出剤充填固相抽出カートリッジ）
１１：エンプティカートリッジ（シリンジ型）
１２：両性イオン型固相抽出剤
１３：下部フリット
１４：上部フリット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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