(57)【要約】【課題】実用的に使用できる成熟肝細胞を製造するための方法が切望されていた。【解決手段】多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させる工程を含むことを特徴とする成熟肝細胞の製造方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させる工程を含むことを特徴とする成熟肝細胞の製造方法。
【請求項２】
前記肝前駆細胞が、多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて得られる多能性幹細胞由来の肝前駆細胞であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記増殖因子が、下記（１）〜（７）からなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
（１）Ｗｎｔファミリー因子
（２）Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子
（３）ＦＧＦファミリー因子
（４）ＢＭＰファミリー因子
（５）ＨＧＦファミリー因子
（６）ＥＧＦファミリー因子
（７）グルココルチコイド類因子
【請求項４】
前記肝前駆細胞が、細胞凝集体の形態で存在してなる多能性幹細胞由来の肝前駆細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの請求項記載の製造方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞又はマウス多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請求項記載の製造方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかの請求項記載の製造方法。
【請求項７】
前記多能性幹細胞由来の肝前駆細胞が移植される非ヒト哺乳動物の生体内が、非ヒト哺乳動物の精巣内であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の製造方法。
【請求項８】
前記非ヒト哺乳動物が、非ヒト免疫不全哺乳動物であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかの請求項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成熟肝細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞は、肝臓の７０〜８０％を構成する主要な細胞種であり、生体内のタンパク質、糖及び脂質を合成する機能に加えて、生体外から取り込んだ化学物質を代謝により解毒する機能を果たす。そのため生体外の化学物質である医薬品、農薬、化粧品、工業製品等の安全性を評価する上で、肝細胞は有用である。医薬品・農薬開発で通常行われる試験としては、例えば、肝毒性試験、薬物代謝・排泄等の薬物動態研究、ＣＹＰ酵素誘導・トランスポーター阻害等の薬物相互作用評価試験等を挙げることができる。これらの試験に用いられる肝細胞としては、ヒト・ラット・マウス等の動物の肝臓のｉｎ  ｖｉｔｒｏ初代培養系（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ）がしばしば用いられる。
しかしながら、肝細胞の初代培養系には、細胞の数が増えない点、肝細胞としての機能が維持できない点という問題がある。更に肝細胞のうち特に有用性が高いヒト肝細胞は、現状では提供者由来のヒト肝臓から作成される。そのためヒト肝細胞には、個人差及びロット差に起因する質の問題と、高品質の細胞の供給量が不足している問題という、質・量の両面で課題がある。
【０００３】
近年、肝細胞の製造方法として、多能性幹細胞から肝細胞を培養皿上（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で分化誘導することにより製造する方法が検討されている（例えば、非特許文献１〜３、特許文献１等参照）。
しかしながら、上記検討は現状では不十分である。即ち、肝細胞を用いた薬効・毒性評価では代謝能が高い成熟肝細胞が主に使われるが、現状の多能性幹細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏの分化誘導法では、胎児型の幼若肝細胞は製造できるが、成熟肝細胞を殆ど製造できていない。具体的には、水口らによるアデノウイルスベクターを用いた多能性幹細胞からの肝細胞の製造方法において、当該手法で製造された肝細胞に含まれる代謝酵素ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性は、培養２４時間後の初代培養肝細胞の１０％程度である。培養２４時間後の初代培養肝細胞は、成体のｉｎ  ｖｉｖｏの成熟肝細胞と比べて既に活性が大きく低下した状態であるため、前記手法で製造された肝細胞の酵素活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏの肝組織と比べれば非常に低い水準の留まっている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Gouon−Evans V. et al. 「BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm」 Nat Biotechnol. 2006, 24(11):1402-11.
【非特許文献２】Basma H et al. 「Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes」 Gastroenterology. 2009, 136(3):990-9.
【非特許文献３】Touboul T. et al. 「Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development」 Hepatology. 2010, 51(5):1754-65.
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ２０１１／０５２５０４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
実用的に使用できる成熟肝細胞を製造するための方法が切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このような状況下、本発明者らが鋭意検討した結果、本発明に至った。
１．多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させる工程を含むことを特徴とする成熟肝細胞の製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
２．前記肝前駆細胞が、多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて得られる多能性幹細胞由来の肝前駆細胞であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
３．前記増殖因子が、下記（１）〜（７）からなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする前項２記載の製造方法；
（１）Ｗｎｔファミリー因子
（２）Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子
（３）ＦＧＦファミリー因子
（４）ＢＭＰファミリー因子
（５）ＨＧＦファミリー因子
（６）ＥＧＦファミリー因子
（７）グルココルチコイド類因子
４．前記肝前駆細胞が、細胞凝集体の形態で存在してなる多能性幹細胞由来の肝前駆細胞であることを特徴とする前項１〜３のいずれかの前項記載の製造方法；
５．前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞又はマウス多能性幹細胞であることを特徴とする前項１〜４のいずれかの前項記載の製造方法；
６．前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であることを特徴とする前項１〜５のいずれかの前項記載の製造方法；
７．前記多能性幹細胞由来の肝前駆細胞が移植される非ヒト哺乳動物の生体内が、非ヒト哺乳動物の精巣内であることを特徴とする前項１〜６のいずれかの前項記載の製造方法；
８．前記非ヒト哺乳動物が、非ヒト免疫不全哺乳動物であることを特徴とする前項１〜７のいずれかの前項記載の製造方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、実用的に使用できる成熟肝細胞を製造するための方法が提供可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、多能性幹細胞から肝前駆細胞を得て、得られた多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させる工程の概略図である。
【図２】図２は、マウス多能性幹細胞から肝前駆細胞を得る工程の概略図である。
【図３】図３は、マウスＥＳ細胞から肝前駆細胞を得る過程での、内胚葉、肝前駆細胞、及び、肝細胞マーカーのｍＲＮＡ量の継時変化を示すグラフである。
【図４】図４は、マウスＥＳ細胞から得られた肝前駆細胞をＳＣＩＤマウス精巣内に移植する工程の概略図である。
【図５】図５は、マウスＥＳ細胞から得られた肝前駆細胞をＳＣＩＤマウス精巣内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟（５週間）させる過程での、当該精巣の外観を示す図である。
【図６】図６は、図５で示された精巣の凍結切片の免疫染色像である。上段は、ＣＰＳ１・アルブミン・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、上段左が共染色像、上段右がＣＰＳ１の単染色像である。下段は、ＰＥＰＣＫ・アルブミン・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、下段左が共染色像、下段右がＰＥＰＣＫの単染色像である。
【図７】図７は、図５で示された精巣の凍結切片の免疫染色像である。上段は、ＣＰＳ１・アルブミン・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、上段左が共染色像、上段右がＣＰＳ１の単染色像である。下段は、強拡大像である。
【図８】図８は、図５で示された精巣の凍結切片の免疫染色像である。上段は、ＣＰＳ１・ＡＳＧＲ１・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、上段左が共染色像、上段中央がＣＰＳ１、上段右がＡＳＧＲ１の単染色像である。下段は、強拡大像である。
【図９】図９は、図５で示された精巣の凍結切片の過ヨウ素酸シッフ（以下、「ＰＡＳ」という場合がある）染色像である。図中矢印で示した細胞が、ＰＡＳ染色陽性の上皮細胞であり、肝細胞に類似する形態である。
【図１０】図１０は、ヒト多能性幹細胞から肝前駆細胞を得る工程の概略図である。
【図１１】図１１は、ヒトＥＳ細胞から得られた細胞の免疫染色像である。上段が分化１０日目のＦＯＸＡ２染色像（左）と、ＳＯＸ１７染色像（右）である。下段が分化２５日目のＡｌｂｕｍｉｎ染色像（左）と、ＣＤ１３染色像（右）である。
【図１２】図１２は、ヒトＥＳ細胞から得られた肝前駆細胞をＳＣＩＤマウス精巣内に移植する工程の概略図である。
【図１３】図１３は、マウスＥＳ細胞から得られた肝前駆細胞（左）、及び、ヒトＥＳ細胞から得られた肝前駆細胞（右）をＳＣＩＤマウス精巣内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟（９週間）させる過程での、当該精巣の外観を示す図である。
【図１４】図１４は、図１３で示された精巣の凍結切片の免疫染色像である。Ａ及びＢは、ＣＰＳ１・アルブミン・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、Ａ’及びＢ’がＣＰＳ１の単染色像である。
【図１５】図１５は、図１３で示された精巣の凍結切片の強拡大の免疫染色像である。Ａ及びＢは、ＣＰＳ１・アルブミン・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、Ａ’及びＢ’がＣＰＳ１の単染色像である。
【図１６】図１６は、図１３で示された精巣の凍結切片の免疫染色像である。Ａ及びＢは、ＣＰＳ１・ＡＳＧＲ１・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、Ａ’及びＢ’がＣＰＳ１の単染色像、Ａ’ ’及びＢ’ ’がＡＳＧＲ１の単染色像、Ａ’ ’ ’及びＢ’’ ’が微分干渉像である。
【図１７】図１７は、図１３で示された精巣の凍結切片の免疫染色像である。Ａ及びＢは、ＣＹＰ２Ｅ１・ＡＳＧＲ１・Ｈｏｅｃｈｓｔの共染色像であり、Ａ’及びＢ’がＣＹＰ２Ｅ１の単染色像、Ａ’ ’及びＢ’ ’がＡＳＧＲ１の単染色像、Ａ’ ’ ’及びＢ’’ ’が微分干渉像である。
【図１８】図１８は、図１３で示された精巣の凍結切片のＰＡＳ染色像（低倍）である。図中の矢印で示された細胞が、ＰＡＳ染色陽性の上皮細胞であり、肝細胞に類似する形態である。
【図１９】図１９は、図１３で示された精巣の凍結切片のＰＡＳ染色像（高倍）である。図中の矢印で示された細胞が、ＰＡＳ染色陽性の上皮細胞であり、肝細胞に類似する形態である。
【図２０】ヒトＥＳ細胞から得られた、分化３０日目の細胞の免疫染色像である。上段がＡＦＰ染色像（左）、ＣＤ１３染色像（中）、共染像（右）である。下段がＡｌｂｕｍｉｎ染色像（左）、ＣＤ１３染色像（中）、共染像（右）である。
【図２１】ヒトＥＳ細胞から得られた、細胞のＦＡＣＳ精製を示す図である。ＦＳＣ，ＳＳＣでの展開図（左上）、ＣＤ１３−ＦＩＴＣ及びＣＤ１３３−ＰＥでの展開図（右上）である。
【図２２】ヒトＥＳ細胞から得られた細胞をさらにＦＡＣＳ精製して得られた、ＣＤ１３及びＣＤ１３３共陽性細胞の細胞凝集体の凍結切片の免疫染色像である。上段がＡＦＰ染色像（左）、ＣＤ１３染色像（中）、共染像（右）である。下段がＡＦＰ染色像（左）、ＣＤ１３３染色像（中）、共染像（右）である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００１１】
本明細書において「哺乳動物」としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル等を挙げることができる。また、本明細書において「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトを除く哺乳動物を意味し、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル等を挙げることができる。
【００１２】
本明細書における「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞を意味し、当該細胞由来の組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで「幹細胞」としては、例えば、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）、組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう）、誘導多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｉＰＳ細胞）等を挙げることができるが、それらに限定されない。上記の幹細胞由来の組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができることから分かるように、生体に近い正常な細胞を分化できる。
【００１３】
幹細胞は、所定の機関より入手できる。また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞ＥＢ５細胞は、独立行政法人理化学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞Ｄ３株は、ＡＴＣＣより入手可能である。
【００１４】
幹細胞は、公知の方法により培養できる。例えば、幹細胞は、フィーダー細胞の存在下又は非存在下において、血清、より好ましくは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＴＭ  Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦ、ＦＧＦ２（別名ｂＦＧＦ）等を添加して培養できる。
【００１５】
本明細書における「多能性幹細胞」とは、前記哺乳動物由来の細胞で、多分化能（様々な細胞への分化能）と自己複製能（多分化能を維持した増殖能）とを有する細胞であり、in vitroにおいて培養することが可能な細胞を意味する。多能性幹細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、胚性腫瘍細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ、ＥＣ細胞）、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ、ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ｍＧＳ細胞）、受精卵、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ、ＩＣＭ）といった万能細胞；外胚葉前駆細胞、中胚葉前駆細胞、内胚葉前駆細胞といった三胚葉の前駆細胞；間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）、造血幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ＨＳＣｓ）、神経幹細胞（Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，  ＮＳＣｓ）等の分化可能な細胞系列が限定されている体性幹細胞／前駆細胞；等を挙げることができる。
【００１６】
このような多能性幹細胞のうち、
１．（ｉ）世界中で使用実績がある点、（ｉｉ）性状解析が進んでおり、培養方法が確立している点、（ｉｉｉ）複数ラインを比較することで、製造された成熟幹細胞の人種差を調べられる点から、例えば、前記哺乳動物由来のＥＳ細胞等を好ましく挙げることができる。
２．また、（ｉ）胚を壊すことなく作製することができることにより倫理的問題の少ない点、（ｉｉ）薬物により特異体質性肝障害を起こした患者由来の細胞を用いることで、特異体質性肝障害の実験モデルが作製でき、大変有用である点、（ｉｉｉ）肝細胞移植治療を実施する際、患者と血液型（赤血球型・白血球型）とを適合させ易いという点から、例えば、前記哺乳動物由来の体細胞を用いて調製されたｉＰＳ細胞等を好ましく挙げることができる。
３．更にまた、（ｉ）倫理的な問題がない点、（ｉｉ）ヒトの幼児・成人から比較的簡単に入手できる点、（ｉｉｉ）薬物により特異体質性肝障害を起こした患者由来の細胞を用いることで、特異体質性肝障害の実験モデルが作製でき、大変有用である点、（ｉｖ）再生医療等に用いる際に患者本人から調製できる点から、例えば、前記哺乳動物由来の体細胞を用いて調製された造血幹細胞又は間葉系幹細胞を好ましく挙げることができる。より好ましくは、例えば、間葉系幹細胞を挙げることができる。
尚、造血幹細胞又は間葉系幹細胞から肝前駆細胞を調製するには、例えば、公知の方法（例えば、ＨＧＦ、ＥＧＦ等を添加して培養する方法）を用いればよい。このようにして調製された肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させることもできる。
【００１７】
上記の「多能性幹細胞」は、公知の技術により培養することができる。ここで用いられる培地としては、例えば、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地や分化誘導に適した培地等の公知の培地を挙げることができる。具体的には例えば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ／Ｆ１２等の市販の哺乳類細胞用基礎培地に血清若しくはＫＳＲ、及び、ＦＧＦ２等を加えたもの、市販の霊長類ＥＳ細胞用培地等を挙げることができる。
このような培地には、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の培養に適する公知の添加物、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ−３阻害剤及びＭＡＰＫ阻害剤等の各種阻害剤、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、インシュリン、ＦＧＦ２、アクチビンＡ、ヘパリン等から選択される１種又は複数種の添加物を適当な濃度で添加することができる。
尚、培地及び添加物は、使用する細胞、分化状態等により適宜選択して使用することができる。また、多能性幹細胞は、フィーダー細胞（例えばマウス繊維芽細胞）と共培養することもできる。
【００１８】
本明細書における「肝前駆細胞」とは、多能性幹細胞が分化して生じた分化能が限定された細胞であり、増殖能と成熟肝細胞への分化能とを併せもつ細胞を意味する。肝前駆細胞で発現するマーカー遺伝子としては、例えば、ＣＤ１３、ＣＤ１３３、Ｄｌｋ、Ｌｉｖ２、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＡＦＰ、Ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＮＦ４ａ、ＨＮＦ１ａ、及び、ＦｏｘＡ２からなる群から選択される１つ以上のマーカー遺伝子等を挙げることができる。
【００１９】
本明細書における「多能性幹細胞由来の肝前駆細胞」とは、多能性幹細胞から分化した肝前駆細胞を意味する。ここで「分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的及び／又は機能的に質的な差をもった２つ以上のタイプの細胞が生じる現象をいう。
【００２０】
本明細書における「成熟肝細胞」とは、成熟して肝機能をもつ肝細胞を意味する。成熟肝細胞で発現するマーカー遺伝子としては、例えば、Ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＮＦ４ａ、ＣＰＳ１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＰＥＰＣＫ、及び、ＡＳＧＲ１からなる群から選択される１つ以上のマーカー遺伝子を挙げることができる。肝機能の指標の１つとしては、例えば、グリコーゲン蓄積等を挙げることができる。グリコーゲン蓄積は、後述するＰＡＳ染色にて評価できる。
【００２１】
本発明製造方法は、多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させる工程を含む。
【００２２】
また、本発明製造方法の好ましい態様の一つとして、例えば、前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞又はマウス多能性幹細胞であることを挙げることができる。
【００２３】
また、本発明製造方法の他の好ましい態様の一つとして、例えば、前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であることを挙げることができる。
【００２４】
本発明製造方法の他の好ましい態様の一つとして、例えば、前記肝前駆細胞が、多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて得られる多能性幹細胞由来の肝前駆細胞であることを挙げることができる。ここで「増殖因子」として、例えば、Ｗｎｔファミリー因子、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子、ＦＧＦファミリー因子、ＢＭＰファミリー因子、ＨＧＦファミリー因子、ＥＧＦファミリー因子、グルココルチコイド類因子、レチノイン酸等のレチノイド類因子、インターロイキン／ＯｓＭファミリー因子、ＴＮＦファミリー因子、ＴＧＦ−ａｌｐｈａ、ＶＥＧＦファミリー因子等を挙げることができる。これらは、単独で用いてもよいし、適宜組合せて用いてもよい。
【００２５】
多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて、多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を得るには、公知の技術を用いればよい。
多能性幹細胞と増殖因子とを接触させるには、例えば、培地の存在下で多能性幹細胞を培養し、前記培地に増殖因子を添加することにより行えばよい。この際用いられる培地としては、上述の培地等を挙げることができる。
【００２６】
上記接触において、培地に添加物を適当な濃度で共存させることもできる。共存させる添加物としては、例えば、ＭＡＰキナーゼ経路阻害剤、及びＰＩ３Ｋ経路阻害剤等の各種阻害剤、ナイアシン等のニコチンアミド類縁体、ビタミンＣ等のアスコルビン酸類、ＤＭＳＯ、酪酸ナトリウム等を挙げることができる。これらは、単独で用いてもよいし、適宜組合せて用いてもよい。
【００２７】
多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を得るための多能性幹細胞の培養は、浮遊培養でもよく、また接着培養でもよい。
【００２８】
多能性幹細胞を浮遊培養する場合、多能性幹細胞の細胞凝集体（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を形成させることができる。当該細胞凝集体を形成させるために、低接着性の９６穴ディッシュ、好ましくは低接着性の９６穴Ｕ底ディッシュを用いればよい。また、当該細胞凝集体を形成させるために、低接着性の培養ディッシュ、又は低接着性の培養フラスコを用いてもよい。培養ディッシュとしては、例えば３５ｍｍ〜１５０ｍｍのディッシュが挙げることができる。
【００２９】
多能性幹細胞を接着培養する場合、コーティング処理された培養皿を用いればよい。当該培養皿をコーティング処理するためのコート剤として、例えば、コラーゲン、ラミニン、ファイブロネクチン、ポリリジン及びＥＨＳゲル（マウスＥＨＳ肉腫から精製した細胞外マトリクス成分）からなる群から選択される１種以上のコート剤を挙げることができる。好ましくは、例えば、コラーゲン、ラミニン、ＥＨＳゲル等を挙げることができる。より好ましくは、例えば、ＥＨＳゲル等を挙げることができる。これらは、単独で用いてもよいし、適宜組合せて用いてもよい。
【００３０】
多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて、多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を得る工程は、内胚葉前駆細胞及び／又は肝前駆細胞を分離・精製する工程を含んでもよい。分離・精製においては、内胚葉前駆細胞、肝前駆細胞のマーカーの発現を指標にすることが好ましい。分離・精製する機器としては、例えば、セルソーター等を挙げることができる。
更にまた、前記分離・精製した肝前駆細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、細胞シート及び／又は細胞凝集体を形成させた後、後述のように、これを非ヒト哺乳動物の生体内に移植してもよい。
【００３１】
内胚葉前駆細胞を分離・精製する場合、指標とするマーカーの発現としては、例えば、表面抗原ＣＸＣＲ４、表面抗原ｃ−Ｋｉｔ、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２等の内胚葉マーカーの発現を挙げることができる。前記分離・精製した内胚葉前駆細胞を、低接着型９６ウェルＵ底ディッシュ等に播種した後、培養して、細胞凝集体を形成させ、そして形成された細胞凝集体と増殖因子とを接触させることにより、移植に好適な肝前駆細胞の細胞凝集体を製造することができる。
【００３２】
肝前駆細胞を分離・精製する場合、指標とするマーカーの発現として、例えば、ＣＤ１３、ＣＤ１３３、Ｄｌｋ、Ｌｉｖ２、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＡＦＰ、Ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＮＦ４ａ、ＨＮＦ１ａ等の肝前駆細胞マーカーの発現を挙げることができる。実施例にて後述するように、これら肝前駆細胞マーカーの少なくとも１つが、多能性幹細胞由来の細胞にて発現することを確認すればよい。
【００３３】
多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて、多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を得るための具体的な操作方法の例としては、以下の第１段階〜第４段階（下記の（１）〜（４））の段階を含む操作方法を挙げることができる。但し、増殖因子の種類と、多能性幹細胞と増殖因子とを接触させる順序とは特に限定されることはなく、培養日数も特に限定されることはない。
【００３４】
（１）未分化性維持因子（例えば、マウス多能性幹細胞のＬＩＦ、ヒト多能性幹細胞のＦＧＦファミリー因子）の非存在下で、多能性幹細胞を培養する段階（第１段階）：
この段階で、多能性幹細胞とＷｎｔファミリー因子とを接触させることが好ましい。Ｗｎｔファミリー因子としては、例えば、下流でｂ−ｃａｔｅｎｉｎを活性化させる経路（Ｗｎｔ−ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ経路）を活性化する因子（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ又はＷｎｔ７ｂ等）等を好ましく挙げることができる。またＷｎｔファミリー因子として、例えば、Ｗｎｔ−ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ経路を活性化する化合物（例えば、ＧＳＫ−３阻害剤等）、Ｒ−ｓｐｏｎｓｉｎ２等の因子等を好ましく挙げることができる。
Ｗｎｔファミリー因子を用いる場合、培地中に添加する濃度としては、例えば、５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、２０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。
ヒト多能性幹細胞を用いる場合、この段階で、多能性幹細胞とＲＯＣＫ阻害剤とを接触させることが好ましい。この段階で、酪酸ナトリウムを添加してもよい。この段階での培養時間としては、例えば、０日間〜６日間を挙げることができる。好ましくは、例えば、１日間〜５日間を挙げることができる。より好ましくは、例えば、２日間〜４日間を挙げることができる。
【００３５】
（２）（１）の段階で得られた細胞とＮｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子とを接触させる段階（第２段階）：
Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子としては、様々な動物のＮｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子が適用可能であるが、例えば、Ｎｏｄａｌ，ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢ等を挙げることができる。好ましくは、例えば、Ｓｍａｄ２／３を活性化させるものを挙げることができる。また、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子の代わりに、ＴＧＦ−ｂｅｔａファミリー因子を用いてもよい。Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子と同等の活性をもつ因子として、Ｓｍａｄ２／３を活性化させる化合物を用いてもよい。
Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子を用いる場合、培地中に添加する濃度としては、例えば、５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、２０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。この段階で、酪酸ナトリウムを添加してもよい。この段階の培養時間としては、例えば、１日間〜７日間を挙げることができる。好ましくは、例えば、２日間〜６日間を挙げることができる。より好ましくは、例えば、３日間〜５日間を挙げることができる。
【００３６】
（３）（２）の段階で得られた細胞とＦＧＦファミリー因子及び／又はＢＭＰファミリー因子とを接触させる段階（第３段階）：
この段階で、更にＮｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎファミリー因子が存在してもよい。
ＦＧＦファミリー因子としては、様々な動物のＦＧＦファミリー因子が適用可能であるが、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０等を挙げることができる。
ＦＧＦファミリー因子を用いる場合、培地中に添加する濃度としては、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。
ＢＭＰファミリー因子としては、様々な動物のＢＭＰファミリー因子が適用可能であるが、例えば、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２等を挙げることができる。また、ＢＭＰファミリー因子の代わりに、ＴＧＦ−ｂｅｔａファミリー因子を用いてもよい。また、ＢＭＰファミリー因子と同等の活性をもつ因子として、Ｓｍａｄ１／５／８を活性化させる化合物を用いてもよい。
ＢＭＰファミリー因子を用いる場合、培地中に添加する濃度としては、例えば、５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、２０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。この段階で、レチノイド類因子、ＶＥＧＦファミリー因子、ＭＡＰキナーゼ経路阻害剤及びＰＩ３Ｋ経路阻害剤（例えば、ＬＹ２９４００２）からなる群から選択される１種以上を添加してもよい。この段階の培養時間としては、例えば、１日間〜１０日間を挙げることができる。好ましくは、例えば、１日間〜８日間を挙げることができる。より好ましくは、例えば、１日間〜６日間を挙げることができる。
【００３７】
（４）（３）の段階で得られた細胞に、ＨＧＦファミリー因子、ＥＧＦファミリー因子、及び、グルココルチコイド類因子、から選択される１種以上の因子を接触させる段階（第４段階）：
この段階で、インターロイキン／ＯｓＭファミリー因子、ＴＮＦファミリー因子、ＶＥＧＦファミリー因子、レチノイド類因子及びナイアシン等のニコチンアミド類縁体からなる群から選択される１種以上の添加物を添加してもよい。この段階の培養時間としては、例えば、１日間〜１００日間を挙げることができる。好ましくは、例えば、２日間〜８０日間を挙げることができる。より好ましくは、例えば、３日間〜６０日間を挙げることができる。
ＨＧＦファミリー因子として、例えば、ＨＧＦ、ＨＧＦの効果を模倣する化合物等を挙げることができる。
ＨＧＦファミリー因子を用いる場合、培地中に添加する濃度としては、例えば、５ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、２０ｎｇ／ｍｌ〜６０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。
ＥＧＦ因子としては、例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａｌｐｈａ、ＨＢ−ＥＧＦ等を挙げることができる。
ＥＧＦファミリー因子と同等の活性をもつ因子としては、例えば、ＥＧＦの効果を模倣する化合物を挙げることができる。
ＥＧＦファミリー因子を用いる場合、培地中に添加する濃度としては、例えば、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲を挙げることができる。
グルココルチコイド類因子としては、例えば、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ等を挙げることができる。
グルココルチコイド類因子を用いる場合、培地中に添加する濃度としては、例えば、０．００１マイクロｍｏｌ／ｌ〜１００マイクロｍｏｌ／ｌ等を挙げることができる。好ましくは、例えば、０．０１マイクロｍｏｌ／ｌ〜５マイクロｍｏｌ／ｌ等を挙げることができる。より好ましくは、例えば、０．０５マイクロｍｏｌ／ｌ〜１マイクロｍｏｌ／ｌ等を挙げることができる。
【００３８】
次に、得られた多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植するための具体的な操作方法の例としては、以下の操作方法を挙げることができる。
【００３９】
多能性幹細胞由来の肝前駆細胞が移植される非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト免疫不全哺乳動物を挙げることができる。非ヒト免疫不全哺乳動物を用いることで、移植した肝前駆細胞の生着率が向上することが期待できる。ここで「非ヒト免疫不全哺乳動物」としては、例えば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ＸＳＣＩＤラット、免疫抑制剤を投与して非ヒト免疫不全が誘導された非ヒト哺乳動物等を挙げることができる。
【００４０】
多能性幹細胞由来の肝前駆細胞が移植される非ヒト哺乳動物の生体内としては、例えば、非ヒト哺乳動物の精巣内、腎臓内、皮下内、腹腔内等の各組織内を挙げることができる。好ましくは、例えば、精巣内、腎臓の皮膜下内等を挙げることができる。より好ましくは、例えば、精巣内を挙げることができる。
【００４１】
非ヒト哺乳動物の生体内に移植する前記肝前駆細胞の状態としては、特に制限はなく、例えば、当該肝前駆細胞を分散した細胞懸濁液、当該肝前駆細胞より形成された細胞シート及び／又は細胞凝集体等を挙げることができる。
【００４２】
非ヒト哺乳動物の生体内に移植する際の前記肝前駆細胞の細胞数としては、例えば、５０，０００ｃｅｌｌｓ〜５，０００，０００ｃｅｌｌｓ等を挙げることができる。好ましくは、例えば、１００，０００ｃｅｌｌｓ〜１，０００，０００ｃｅｌｌｓ等を挙げることができる。尚、非ヒト哺乳動物の生体内に移植する肝前駆細胞が細胞シート又は細胞凝集体である場合には、前記肝前駆細胞の細胞量の目安としては、例えば、０．０１ｍｍ〜５０ｍｍ等を挙げることができる。好ましくは、例えば、０．０５ｍｍ〜５ｍｍ等を挙げることができる。
また、非ヒト哺乳動物の生体内に移植する前記肝前駆細胞が細胞懸濁液である場合には、例えば、２℃〜４０℃で調製した後、これを移植まで、例えば、２℃〜１０℃で保存する。前記調製後移植までの時間は、例えば、３時間以内にすることが好ましい。非ヒト哺乳動物の生体内に移植する前記肝前駆細胞が細胞シート又は細胞凝集体である場合には、例えば、２℃〜４０℃で調製した後、これを移植まで、例えば、３２℃〜４０℃で培養すればよい。尚、細胞シートの作製には、温度感受性ポリマーを用いてもよい。
【００４３】
多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植する際に、共培養細胞を同時に移植してもよい。ここで「共培養細胞」としては、例えば、血管内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）等の内皮細胞、Ｍ１５細胞、繊維芽細胞等を挙げることができる。
【００４４】
また、多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植する際に、細胞外マトリクスを同時に移植してもよい。ここで「細胞外マトリクス」としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、ファイブロネクチン、ポリリジン及びＥＨＳゲルからなる群から選択される１種以上の細胞外マトリクスを挙げることができる。好ましくは、例えば、コラーゲン、ラミニン、ＥＨＳゲル等を挙げることができる。より好ましくは、例えば、ＥＨＳゲル等を挙げることができる。
尚、肝前駆細胞と共に細胞外マトリクスを移植する場合、肝前駆細胞の０．５倍〜５倍の体積量である細胞外マトリクスを用いればよい。
【００４５】
本発明製造方法における移植後、肝前駆細胞が生体内に移植された後の非ヒト哺乳動物を飼育することで、当該肝前駆細胞が成熟して成熟肝細胞が得られる。肝前駆細胞が成熟肝細胞に成熟したか否かについては、例えば、上述のマーカー遺伝子の発現又はグリコーゲン蓄積を指標にして確認することができる。尚、通常、肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植した後、１週〜１０週程度で肝前駆細胞から成熟幹細胞へ成熟する。
【００４６】
本発明製造方法における移植後、肝前駆細胞を成熟肝細胞に効率良く成熟させるためには、例えば、肝前駆細胞が生体内に移植された後の非ヒト哺乳動物に、液性因子を投与しながら飼育すればよい。
液性因子を投与するには、公知の技術を用いればよい。ここで「液性因子」としては、例えば、ＨＧＦファミリー因子、ＥＧＦファミリー因子、グルココルチコイド類因子、インターロイキン／ＯｓＭファミリー因子、ＴＮＦファミリー因子、ＶＥＧＦファミリー因子、レチノイド類因子、成長ホルモン類の因子（例えば、ｈＧＨ）、補体抑制剤、免疫抑制剤、ナイアシン等のニコチンアミド類縁体、及び、ビタミンＣ等のアスコルビン酸類からなる群から選択される１種以上の液性因子を挙げることができる。
【００４７】
本発明製造方法における移植後、肝前駆細胞を成熟肝細胞に効率良く成熟させるためには、非ヒト哺乳動物として前記「非ヒト免疫不全哺乳動物」を用いてもよい。
【００４８】
本発明製造方法により製造された成熟肝細胞は、多能性幹細胞由来の肝前駆細胞が生体内に移植された非ヒト哺乳動物から単離・回収してから利用してもよい。
成熟肝細胞を前記非ヒト哺乳動物から単離・回収するには、公知の技術を用いればよい。
単離・回収においては、成熟肝細胞の割合が高い組織は赤色であることを利用し、前記肝前駆細胞が生体内に移植された非ヒト哺乳細胞から、赤色の組織を組織片として切り出してもよい。当該組織片は、細胞分散液を用いて単細胞へと分散してもよい。前記細胞分散液の成分としては、例えばトリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、パパイン等の酵素類・プロテアーゼ類、及び、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤を挙げることができる。前記組織片から、成熟肝細胞を、成熟肝細胞で発現する表面抗原であるＡＳＧＲ１の発現量を指標として単離・回収してもよい。又は、成熟肝細胞と結合することが知られるpoly-NTP-Vinylbenzyl-D-1actonamide（ＰＶＬＡ）との結合状態を指標として単離・回収してもよい。さらに又は、成熟肝細胞と非ヒト哺乳動物との動物種が異なる場合には、種の違いを利用して分離してもよい。単離・回収する機器としては、例えば、セルソーター等を挙げることができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。尚、実施例１〜４については、下記材料を用いて、下記方法等に沿って行った。
【００５０】
＜細胞培養＞
マウスＥＳ細胞としては、マウスＥＳ細胞Ｄ３株を用いた。前記マウスＥＳ細胞Ｄ３株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化誘導実験により、内胚葉組織・中胚葉組織・外胚葉組織のそれぞれへの分化能があることを確認した。
前記マウスＥＳ細胞は、マウスＥＳ培地（ＤＭＥＭ培地に、添加物として牛胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含む。）にて、０．１％ゼラチンをコートした培養皿上で培養した。尚、マウスＥＳ細胞は、２〜３日に一回トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」という場合がある。）（ナカライテスク社製）を用いて継代された。
ヒトＥＳ細胞としては、京都大学樹立株であるＫｈＥＳ―１株を用いた。前記ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ―１株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化誘導実験により、内胚葉組織・中胚葉組織・外胚葉組織のそれぞれへの分化能があることを確認した。
前記ヒトＥＳ細胞は、ＦＧＦ２が添加されたヒトＥＳ培地(ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加物としてＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノール等を含む。）にて、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast：ＭＥＦ）フィーダー細胞上で未分化維持培養した。
【００５１】
＜動物移植法＞
ドナー細胞が移植されたホスト動物として、８週齢のオスのＳＣＩＤマウス（チャールス・リバー社製）を用いた。
ドナー細胞は、凡そ５００，０００ｃｅｌｌｓ／１０マイクロＬの濃度で、培地で懸濁した。得られたドナー細胞懸濁液は氷冷して保存した。尚、移植を行うまでの時間を１時間〜２時間になるようにした。
前記ＳＣＩＤマウスを麻酔した。手術野をエタノール滅菌した後、前記ＳＣＩＤマウスが麻酔にかかったことを確認した上で、当該ＳＣＩＤマウスの表皮及び膜を切開して、精巣を引っ張り出した。
次いで、精巣の外膜に、２１〜２６ゲージの針をつけたシリンジで、血管を傷つけないように穴をあけた。そして、上記のドナー細胞懸濁液をマイクロシリンジで１０マイクロＬとり、穴を開けた部分にマイクロシリンジを２ｍｍ〜３ｍｍ差込んだ。針先が精巣の皮膜から透けて見えることを確認した後、皮膜下に前記ドナー細胞懸濁液を１０マイクロＬ注入した。そして、針先をピンセットで軽くつまんで、懸濁液がもれないようにしながら針を抜いた。
その後、前記ＳＣＩＤマウスの腹を縫合し、保温しながら回復を待った。細胞移植したＳＣＩＤマウスは、個別換気ケージシステム（オリエンタル技研工業社製）にて飼育した。
【００５２】
＜リアルタイムＰＣＲ解析＞
細胞におけるｍＲＮＡの発現を調べるため、リアルタイムＰＣＲ解析を行った。細胞から、ＱＩＡＧＥＮ社製のＲＮＡ抽出キットを用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。前記ｔｏｔａｌ  ＲＮＡにｏｌｉｇｏ  ｄＴを作用させた後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のプローブとＰＣＲ試薬を用いて、それぞれのキットのプロトコルに従って、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。内部標準には、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ又はＡｃｔｂ  ｍＲＮＡを用いた。
【００５３】
＜肝前駆細胞であることを確認するための免疫組織化学解析＞
多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて得られる多能性幹細胞由来の細胞が、肝前駆細胞に分化したことを確認するため、以下の操作手法を用いて免疫染色により解析を行った。
多能性幹細胞と増殖因子とを接触させて得られる多能性幹細胞由来の細胞からなる細胞凝集体を、４％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と記すこともある。）（和光純薬社製）で室温下、２０分間程度固定した後、得られた固定物を２０％スクロース／ＰＢＳに浸漬させた。次いで、得られた細胞凝集体をＯ．Ｔ．Ｃ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｊａｐａｎ社製）にて包埋した後、これから、クライオスタット（Ｌｅｉｋａ社製）を用いて凍結切片を作製した。
作製された凍結切片を、それぞれ２％ロバ血清／トリス緩衝生理食塩水（以下、「ＴＢＳ」と記すこともある。）（界面活性剤を含む。以下同様）でブロッキングした後、これにＴＢＳで希釈された１次抗体を添加し、得られた混合物を４℃で１２時間〜３６時間又は室温下で２時間〜４時間インキュベーションした。
得られた混合物をＴＢＳで洗浄した後、これに２次抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３４３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＴＢＳ希釈液を添加し、得られた混合物を室温で３０分間〜６０分間インキュベーションした。
得られた混合物をＴＢＳで洗浄した後、これを封入した。得られた封入物を共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社製、ＦＶ１０００）及び蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ７０）にて観察した。
【００５４】
＜成熟肝細胞であることを確認するための免疫組織化学解析＞
肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させることにより成熟肝細胞が得られたことを確認するため、以下の操作手法を用いて免疫染色により解析を行った。
肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させることにより得られた細胞からなる組織片を細かく切った後、これを４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（和光純薬社製）で４℃下、２４時間〜７２時間固定した。得られた固定物を１０％スクロース／ＰＢＳに１時間〜３時間、２０％スクロース／ＰＢＳに６時間〜１２時間、続けて３０％スクロース／ＰＢＳに２４時間〜７２時間浸漬させた。次いで、得られた組織片を前記Ｏ．Ｔ．Ｃ．コンパウンドにて包埋した後、これから、前記クライオスタットを用いて凍結切片を作製した。
作製された凍結切片を、それぞれ２％ロバ血清／ＴＢＳでブロッキングした後、これにＴＢＳで希釈された１次抗体を添加し、得られた混合物を４℃で１２時間〜３６時間インキュベーションした。
得られた混合物をＴＢＳで洗浄した後、これに２次抗体及びＨｏｅｃｈｓｔ３３４３２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＴＢＳ希釈液を添加し、得られた混合物を室温で６０分間〜９０分間インキュベーションした。
得られた混合物をＴＢＳで洗浄した後、これを封入した。得られた封入物を前記共焦点レーザー顕微鏡及び前記蛍光顕微鏡にて観察した。
【００５５】
＜一次抗体＞
マウス細胞の免疫染色には以下の抗体を用いた。
・内胚葉マーカーとして、抗ＳＯＸ１７抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ヤギ）、抗ＦＯＸＡ２抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ヤギ）を用いた。幼若肝細胞・肝前駆細胞マーカーとして、抗ＡＦＰ抗体（Ｄａｋｏ社製，ウサギ）を用いた。
・幼若肝細胞及び成熟肝細胞マーカーとして、抗マウスＡｌｂｕｍｉｎ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製、ヤギ）を用いた。
・成熟肝細胞マーカーとして、抗ＡＳＧＲ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、マウス）、抗ＣＰＳ１抗体（発明者による作製、ウサギ）、抗ＣＰＳ１抗体（Ａｂｃａｍ社製、ウサギ）、抗ＰＥＰＣＫ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、ウサギ）を用いた。
【００５６】
ヒト細胞の免疫染色には以下の抗体を用いた。
・内胚葉マーカーとして、抗ＳＯＸ１７抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ヤギ）、抗ＦＯＸＡ２抗体（Ｒ＆Ｄ社製、ヤギ）を用いた。
・幼若肝細胞・肝前駆細胞マーカーとして、抗ＡＦＰ抗体（Ｄａｋｏ社製，ウサギ）、抗ＣＤ１３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、マウス）、抗ＣＤ１３３（ミルテニーバイオテク社製、マウス）を用いた。
・幼若肝細胞及び成熟肝細胞マーカーとして、抗ヒトＡｌｂｕｍｉｎ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製、ヤギ）、抗ＨＮＦ４α抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、ウサギ）を用いた。
・成熟肝細胞マーカーとして、抗ＡＳＧＲ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、マウス）、抗ＣＰＳ１抗体（発明者による作製、ウサギ）、抗ＣＰＳ１抗体（Ａｂｃａｍ社製、ウサギ）、抗ＣＹＰ２Ｅ１抗体（Ｓｉｇｍａ社製、ウサギ）を用いた。
【００５７】
＜二次抗体＞
免疫染色解析には、以下の蛍光標識された二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
・Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ロバ由来抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ロバ由来抗ウサギＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ロバ由来抗ヤギＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識ロバ由来抗マウスＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識ロバ由来抗ウサギＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４標識ロバ由来抗ヤギＩｇＧ抗体を用いた。
【００５８】
＜ＰＡＳ染色解析＞
前記の免疫組織化学解析のための操作方法において調製された凍結切片を蒸留水で洗浄した。これを０．５％過ヨウ素酸水溶液（和光純薬社製）で５分間処理した後、得られた処理物を水で洗浄した。得られた洗浄物をシッフ試薬（和光純薬社製）にて１５分間処理した後、これを亜硫酸水にて洗浄した。このようにして得られたＰＡＳ染色した切片を、ヘマトキシリンで核を対比染色し、これを封入した。得られた封入物を光学顕微鏡にて観察した。
【００５９】
実施例１  （マウス多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を調製する実施例）
マウス多能性幹細胞の一例として前記マウスＥＳ細胞Ｄ３株を用いて、前記マウスＥＳ細胞Ｄ３株から肝前駆細胞を経て成熟肝細胞の製造を行った（例えば、図１参照）。マウス多能性幹細胞からの肝前駆細胞の調製は、第１段階から第４段階までの段階に分けて行った（例えば、図２参照）。
【００６０】
まず第１段階の中内胚葉誘導として、マウスＥＳ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにてシングルセル化した後、これを低接着型９６ウェルＵ底ディッシュ（住友ベークライト社製）に播種し、３日間培養を行うことにより、細胞凝集体（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を形成させた。この間、添加物として５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａを含むマウス肝細胞分化培地（ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地に、ＫＳＲ、アスコルビン酸及びモノチオグリセロールを含む。）にて培養した。
【００６１】
第２段階の内胚葉誘導として、第１段階で得られた細胞凝集体を、添加物として５０ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎＡを加えた上記マウス肝細胞分化培地にて３日間培養した。
【００６２】
第３段階の肝臓領域化として、第２段階で得られた細胞凝集体を、添加物として５０ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を加えた上記マウス肝細胞分化培地にて４日間培養した。
【００６３】
第４段階の肝細胞分化として、第３段階で得られた細胞凝集体を、低接着ディッシュ（Ｎｕｎｃ社製又は住友ベークライト社製）に移し、添加物として２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び１００ｎＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを加えた上記マウス肝細胞分化培地にて培養した。培地は２日〜４日に一度交換した。
【００６４】
第１段階から第４段階までの操作を施した後、マウスＥＳ細胞と増殖因子とを接触させて得られるマウスＥＳ細胞由来の細胞が、肝前駆細胞に分化したことを確認するために、分化誘導過程での各マーカー遺伝子の発現を前記リアルタイムＰＣＲ解析で調べた。
その結果、第１段階から第４段階までの操作を施すことにより、マウスＥＳ細胞由来の細胞において、中内胚葉マーカーＧｓｃ、肝臓原基マーカーＨｈｅｘ、胎児肝臓マーカーＡＦＰ、肝細胞マーカーＡｌｂｕｍｉｎ１，Ｇ６Ｐａｓｅ，ＰＸＲのｍＲＮＡの発現が誘導されたことが判明した（例えば、図３参照）。
これらの結果から、前記操作手法により、多能性幹細胞から肝前駆細胞が得られることが確認できた。
【００６５】
実施例２  （マウス肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植する実施例）
前記マウスＥＳ細胞Ｄ３株から実施例１と同様な操作手法により、マウス肝前駆細胞を調製した。調製されたマウス肝前駆細胞（第１段階から第４段階までの一連の操作を開始した後、１２日目、１７日目又は１９日目の肝前駆細胞を含む細胞凝集体）を、前記動物移植方法を用いて、それぞれＳＣＩＤマウスの精巣の皮膜下に移植した（例えば、図４参照）。移植後、前記動物を飼育し、当該移植後５週間後に前記動物から精巣を取り出した（例えば、図５参照）。そしてＳＣＩＤマウスの精巣の凍結切片を作製し、得られた凍結切片について前記免疫組織化学解析を行った。
その結果、上記の１７日目及び１９日目の肝前駆細胞を含む細胞凝集体が生体内に移植された動物の精巣において、その皮膜下を中心にして、Ａｌｂｕｍｉｎ１とＣＰＳ１との両者に係る共陽性を示す細胞が多数存在することが確認された（例えば、図６参考）。
更に、上記の細胞凝集体の性状解析を行ったところ、当該細胞凝集体が、Ａｌｂｕｍｉｎ１とＰＥＰＣＫとの両者に係る共陽性を示すものであることが確認された（例えば、図６参考）。
また強拡大でみると、Ａｌｂｕｍｉｎ１とＣＰＳ１との両者に係る共陽性を示す細胞が、成熟肝細胞特有の索状に配列した上皮構造を有していることも確認された（例えば、図７参照）。そして当該細胞が、成熟肝細胞マーカーＡＳＧＲ１に関して陽性であることも確認された（例えば、図８参照）。
【００６６】
また更に、上記の細胞凝集体が、肝細胞の機能の一つであるグリコーゲン蓄積をしているか否かについて前記ＰＡＳ染色解析を用いて調べたところ、前記細胞凝集体は、ＰＡＳ染色陽性であることが確認された（例えば、図９参照）。
【００６７】
これらの結果から、前記操作手法により、肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させることにより成熟肝細胞が得られることが確認された。
【００６８】
実施例３  （ヒト多能性幹細胞由来の肝前駆細胞を調製する実施例）
ヒト多能性幹細胞の一例として前記ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ―１株を用いて、前記ヒトＥＳ細胞から肝前駆細胞を経て成熟肝細胞の製造を行った（例えば、図１参照）。ヒト多能性幹細胞からの肝前駆細胞の調製は、第１段階から第４段階までの段階に分けて行った（例えば、図１０参照）。
【００６９】
まず第１段階の中内胚葉誘導として、ヒトＥＳ細胞をトリプシン／コラゲナーゼＩＶを含む解離液を用いて培養皿から回収することにより、ヒトＥＳ細胞のコロニーを得た。得られたコロニーを予め０．１％ゼラチン液でコートしておいた培養皿にて１時間〜２時間培養した。混在するＭＥＦを除去した後、培養されたヒトＥＳ細胞を、トリプシン等を含む細胞分散液で処理し、マイクロピペットを用いてピペッティングすることによりシングルセル化したヒトＥＳ細胞を作製した。前記シングルセル化したヒトＥＳ細胞を、低接着型９６ウェルＵ底ディッシュ（住友ベークライト社製）に播種し、３日間培養を行うことにより、細胞凝集体（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を形成させた。この間、添加物として５０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ及び１０μＭ  Ｙ２７６３２を加えた前記ヒトＥＳ培地にて培養した。
【００７０】
第２段階の内胚葉誘導として、第１段階で得られた細胞凝集体を、添加物として５０ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎＡを加えたヒト肝細胞分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、ＫＳＲ、アスコルビン酸、及び２−メルカプトエタノールを含む）にて４日間培養した。
【００７１】
第３段階の肝臓領域化として、第２段階で得られた細胞凝集体を、添加物として５０ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を加えた上記ヒト肝細胞分化培地にて７日間培養した。
【００７２】
第４段階の肝細胞分化として、第３段階で得られた細胞凝集体を、低接着ディッシュ（Ｎｕｎｃ社製又は住友ベークライト社製）に移し、添加物として２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２及び１００ｎＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを加えた上記ヒト肝細胞分化培地にて培養した。培地は２日〜４日に一度交換した。
【００７３】
第１段階から第４段階までの操作を施した後、ヒトＥＳ細胞と増殖因子とを接触させて得られるヒトＥＳ細胞由来の細胞が、肝前駆細胞に分化したことを確認するために、分化誘導過程での各マーカー遺伝子の発現を前記免疫染色解析で調べた。
その結果、第１段階から第４段階までの操作を施すことにより、ヒトＥＳ細胞由来の細胞において、中内胚葉マーカーＦＯＸＡ２、内胚葉マーカーＳＯＸ１７、肝細胞マーカーＡｌｂｕｍｉｎ１、肝前駆細胞マーカーＣＤ１３陽性細胞が誘導されたことが判明した（例えば、図１１参照）。
これらの結果から、前記操作手法により、多能性幹細胞から肝前駆細胞が得られることが確認できた。
【００７４】
実施例４  （ヒト肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植する実施例）
前記ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ１株から実施例１と同様な操作手法により、ヒト肝前駆細胞を調製した。調製されたヒト肝前駆細胞（分化開始から２７日目の肝前駆細胞を含む細胞凝集体）を、前記動物移植方法を用いて、それぞれＳＣＩＤマウスの精巣の皮膜下に移植した（例えば、図１２参照）。移植後、前記動物を飼育し、当該移植後９週間後に前記動物から精巣を取り出した（例えば、図１３参照）。そしてＳＣＩＤマウスの精巣の凍結切片を作製し、得られた凍結切片について前記免疫組織化学解析を行った。
その結果、上記の２７日目の肝前駆細胞を含む細胞凝集体が生体内に移植された動物の精巣において、その皮膜下を中心にして、Ａｌｂｕｍｉｎ１とＣＰＳ１との両者に係る共陽性を示す細胞が多数存在することが確認された（例えば、図１４参考）。
また強拡大でみると、Ａｌｂｕｍｉｎ１とＣＰＳ１との両者に係る共陽性を示す細胞が、成熟肝細胞特有の索状に配列した上皮構造を有していることも確認された（例えば、図１５参照）。そして当該細胞が、成熟肝細胞マーカーＡＳＧＲ１又はＣＹＰ２Ｅ１に関して陽性であることも確認された（例えば、図１６、図１７参照）。
【００７５】
また更に、上記の細胞凝集体が、肝細胞の機能の一つであるグリコーゲン蓄積をしているか否かについて前記ＰＡＳ染色解析を用いて調べたところ、前記細胞凝集体は、ＰＡＳ染色陽性であることが確認された（例えば、図１８、１９参照）。
【００７６】
これらの結果から、前記操作手法により、肝前駆細胞を非ヒト哺乳動物の生体内に移植して、前記肝前駆細胞を成熟肝細胞に成熟させることにより成熟肝細胞が得られることが確認された。
【００７７】
実施例５  （高純度のヒト肝前駆細胞の細胞凝集体を調製する実施例）
ヒト多能性幹細胞の一例として前記ヒトＥＳ細胞ＫｈＥＳ―３株を用いて、前記ヒトＥＳ細胞から、移植に好適なヒト肝前駆細胞の製造を行った。ヒト多能性幹細胞からの移植に好適な肝前駆細胞の調製は、第１段階から第４段階までの段階に分けて行った。
【００７８】
まず第１段階の中内胚葉誘導として、ヒトＥＳ細胞をトリプシン／コラゲナーゼＩＶを含む解離液を用いて培養皿から回収することにより、ヒトＥＳ細胞のコロニーを得た。得られたコロニーを予め０．１％ゼラチン液でコートしておいた培養皿にて１時間〜２時間培養した。混在するＭＥＦを除去した後、培養されたヒトＥＳ細胞を、トリプシン等を含む細胞分散液で処理し、マイクロピペットを用いてピペッティングすることによりシングルセル化したヒトＥＳ細胞を作製した。前記シングルセル化したヒトＥＳ細胞を、ＥＨＳゲルでコートしたディッシュに播種し、３日間、接着培養した。この間、添加物として１００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ及び１０μＭ  Ｙ２７６３２を加えた前記ヒトＥＳ培地にて培養した。
【００７９】
第２段階の内胚葉誘導として、第１段階で得られた細胞を、添加物として１００ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎＡ及びＢ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて、４日間培養した。
【００８０】
第３段階の肝臓領域化として、第２段階で得られた細胞を、添加物として５０ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎＡ、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を加えた上記ヒト肝細胞分化培地にて４日間培養した。
【００８１】
第４段階の肝細胞分化として、第３段階で得られた細胞を、添加物として２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、１０ｍＭのニコチンアミド及び１００ｎＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを加えた上記ヒト肝細胞分化培地にて培養した。培地は２日〜４日に一度交換した。
【００８２】
第１段階から第４段階までの操作を施した後、ヒトＥＳ細胞と増殖因子とを接触させて得られるヒトＥＳ細胞由来の細胞が、肝前駆細胞に分化したことを確認するために、分化誘導過程での各マーカー遺伝子の発現を前記免疫染色解析で調べた。
その結果、第１段階から第４段階までの操作を施すことにより、ヒトＥＳ細胞由来の細胞において、肝前駆細胞マーカーＡＦＰ、肝細胞マーカーＡｌｂｕｍｉｎ１、肝前駆細胞マーカーＣＤ１３の発現が誘導されたことが判明した（例えば、図２０参照）。
これらの結果から、前記操作手法により、多能性幹細胞から肝前駆細胞が得られることが確認できた。
【００８３】
第４段階目の途中で、ヒト肝前駆細胞のＦＡＣＳ精製を行った。まず第４段階で得られた細胞をトリプシン等を用いて分散し、前記抗ＣＤ１３抗体及び前記抗ＣＤ１３３抗体を作用させ、肝前駆細胞を標識した。さらに７ＡＡＤを作用させて死細胞を標識した。この条件で、ＦＡＣＳＡｒｉａ２（ＢＤ社製）にてＦＡＣＳ精製し、ＣＤ１３及びＣＤ１３３の共陽性細胞を精製した（例えば、図２１参照）。このＣＤ１３及びＣＤ１３３共陽性細胞を、低接着型９６ウェルＵ底ディッシュ（住友ベークライト社製）に播種し、培養を行うことにより、細胞凝集体を形成させた。この間、添加物として２０ｎｇ/ｍｌのＨＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、１０ｍＭのニコチンアミド及び１００ｎＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅを加えた上記ヒト肝細胞分化培地にて培養した。
上記ＦＡＣＳ精製で得られたヒトＥＳ細胞由来の細胞凝集体での各マーカー遺伝子の発現を前記免疫染色解析で調べた。その結果、第１段階から第４段階までの操作を施すことにより、ヒトＥＳ細胞由来の細胞において、７０％以上の細胞が肝前駆細胞マーカーＡＦＰを発現する細胞凝集体が製造できたことが判明した（例えば、図２２参照）。
これらの結果から、前記操作手法により、多能性幹細胞から移植に好適な高純度の肝前駆細胞の細胞凝集体が得られることが確認できた。
【００８４】
実施例６  （移植に好適な肝前駆細胞の細胞凝集体の製造例）
本発明製造方法で用いられる「多能性幹細胞由来の肝前駆細胞」の調製における他の具体的な実施態様を以下に記載する。
まず、第１段階として、多能性幹細胞を、実施例１及び実施例３と同様の操作方法に従い、細胞分散液等を用いてシングルセル化する。これを低接着型９６ウェルＵ底ディッシュ（住友ベークライト社製）等に播種し、１日間〜３日間培養を行うことにより、細胞凝集体（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を形成させる。この間、添加物としてＷｎｔ３ａを加えたマウス肝細胞分化培地又はヒト肝細胞分化培地（以下、肝細胞分化培地と記すこともある。）にて培養する。
次いで、第２段階として、第１段階で得られた細胞凝集体を、ＡｃｔｉｖｉｎＡを加えた前記肝細胞分化培地にて１日間〜３日間培養する。この段階で、細胞分散液（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ）にて処理することにより細胞を分散し、内胚葉マーカー（例えば、表面抗原ＣＸＣＲ４、表面抗原ｃ−Ｋｉｔ、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２）の発現を指標にして内胚葉前駆細胞を、セルソーター等を用いて単離する。
次いで、第３段階として、単離された内胚葉前駆細胞を、低接着型９６ウェルＵ底ディッシュ等に播種し、数日間培養を行うことにより、細胞凝集体（Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を形成させる。その後、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２を添加した前記肝細胞分化培地にて培養する。
次いで、第３段階で得られた細胞凝集体を、低接着ディッシュ（Ｎｕｎｃ社製又は住友ベークライト社製）に移し、添加物としてＨＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ等を加えた上記肝細胞分化培地にて培養する。培地は２日〜４日に一度交換する。
この操作方法により、移植に好適な肝前駆細胞の細胞凝集体を製造する。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、肝前駆細胞から成熟肝細胞を製造することが可能となり、当該製造方法により成熟肝細胞を提供することが可能となる。本発明製造方法により製造された成熟肝細胞は、医薬品・農薬開発で通常行われる試験、例えば、肝毒性試験、薬物代謝・排泄等の薬物動態研究、ＣＹＰ酵素誘導・トランスポーター阻害等の薬物相互作用評価試験等の化学物質安全性評価、及び代謝物合成等に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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