(57)【要約】【課題】本発明は、ポリスチレンなどのプラスチック表面にＰＥＧ鎖を十分な密度で結合させる方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、親水性層を表面に備える表面親水性基材の製造方法であって、表面に極性基を有する、プラスチックを含む支持体の表面上に、前記極性基と静電相互作用により結合することが可能な極性基を有するポリシロキサンを含み、前記支持体の表面上に静電相互作用により結合するプライマー層を形成する、プライマー層形成工程；及び前記プライマー層上に、親水性化合物を含む親水性層を形成する、親水性層形成工程；を含む方法に関する。【選択図】図３
2013186057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性層を表面に備える表面親水性基材の製造方法であって、
表面に極性基を有する、プラスチックを含む支持体の表面上に、前記極性基と静電相互作用により結合することが可能な極性基を有するポリシロキサンを含み、前記支持体の表面上に静電相互作用により結合するプライマー層を形成する、プライマー層形成工程；及び
前記プライマー層上に、親水性化合物を含む親水性層を形成する、親水性層形成工程；
を含む、表面親水性基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的分析や細胞培養などに用いるための親水性層を有する基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、親水性層を有する基材は、タンパク質の吸着や細胞の接着を抑制するため、生化学的分析や浮遊系細胞培養に有用である。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する基材が上記目的に適している。また、ＰＥＧ鎖を介して抗体や抗原を固定化した基材は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫アッセイで感度の高い測定が期待できる。
【０００３】
特許文献１には、ＰＥＧ鎖を介して抗体を金表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、金表面に導入した非極性基にＰＥＧ鎖の片末端を連結し、別の末端に抗体を連結する。この方法によって表面プラズモン共鳴法におけるノイズが有意に低減されることが記載されている。
【０００４】
特許文献２には、ＰＥＧ鎖を介して核酸やタンパク質をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、ＰＥＧ鎖を有するシラン化合物を合成し、これをガラス表面に適用した後、ＰＥＧ鎖の末端に核酸やタンパク質を連結する。この方法によってバイオチップのＳ／Ｎ比（感度）が改善されることが記載されている。
【０００５】
特許文献３には、ＰＥＧ鎖を介して核酸をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、アミノシランを適用してアミノ基を導入したガラス表面にＰＥＧ鎖の片末端を連結し、別の末端に核酸を連結する。この方法によってバイオセンサの感度が改善されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１６４３４８号公報
【特許文献２】特開２００６−１４３７１５号公報
【特許文献３】特開２００６−５０９２０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のＰＥＧ鎖を有する基材はガラスや金などの無機物を支持体としていたため、用途が制限されていた。ＥＬＩＳＡや細胞培養などの用途では、ポリスチレンなどのプラスチックを支持体とすることが望ましいが、その表面にＰＥＧ鎖を十分な密度で結合させることは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、プラズマ処理などによって極性基を導入したプラスチック表面に、ポリシロキサンを含むプライマー層を静電相互作用により結合させ、さらにポリシロキサン側鎖に共有結合を介してＰＥＧ鎖を連結することで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）親水性層を表面に備える表面親水性基材の製造方法であって、
表面に極性基を有する、プラスチックを含む支持体の表面上に、前記極性基と静電相互作用により結合することが可能な極性基を有するポリシロキサンを含み、前記支持体の表面上に静電相互作用により結合するプライマー層を形成する、プライマー層形成工程；及び
前記プライマー層上に、親水性化合物を含む親水性層を形成する、親水性層形成工程；
を含む、表面親水性基材の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、高密度なＰＥＧ鎖を有する基材を、プラスチックを支持体として製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】支持体への極性基導入からプライマー層形成までの一実施形態である。
【図２】プライマー層のポリシロキサン側鎖に、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されていないＰＥＧ鎖を、共有結合を介して連結させる一実施形態である。
【図３】プライマー層のポリシロキサン側鎖に、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されているＰＥＧ鎖を、共有結合を介して連結させる一実施形態である。
【図４】プライマー層のポリシロキサン側鎖に、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されているＰＥＧ鎖を、共有結合を介して連結させる一実施形態である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（支持体）
本発明における支持体は、生化学的分析や細胞培養の支持体として利用可能なプラスチックを含む。プラスチックは成型が容易であること、輸送及び廃棄上の問題が小さいことから上記用途に特に好ましい。すなわち本発明において好ましい支持体は、その全部又は少なくとも一部にプラスチックを含む。支持体の、後述する親水性層が形成される側の表面がプラスチックを含むことが好ましく、該表面がプラスチックからなることがより好ましい。その具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。
【００１２】
本発明における支持体の形態は、上記用途に利用可能であれば特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、シャーレ、フラスコ、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は有用である。
【００１３】
本発明における支持体の表面には後述するプライマー層と静電相互作用可能な極性基が存在する。ここで、「静電相互作用」とは分子間に働く静電気的な引力を意味し、イオン結合の他に水素結合も含まれる。このような極性基として、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、イソシアネート基、スルホニル基などが挙げられるが、特にヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基が好ましい。これらの極性基は公知の方法、例えばプラズマ照射、コロナ放電、ガンマ線照射、紫外線照射などによってプラスチック表面に容易に導入することができる。これらの処理が施されたポリスチレン製マイクロウェルプレートは市販品として入手可能である。
【００１４】
極性基の導入は支持体表面の一部分においてのみ行ってもよい。極性基が導入されていない表面部分にはプライマー層は形成されず、親水性層も形成されないため、表面の一部分において異なる性質を示す基材を提供することができる。
【００１５】
（プライマー層）
プラスチックを含む支持体の表面にはプライマー層が静電相互作用により配置される。この静電相互作用は、支持体表面の極性基と、プライマー層に含まれる極性基との間に働く、共有結合よりも弱い引力である。プライマー層に含まれる極性基としては、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、イソシアネート基、スルホニル基、ニトリル基などが挙げられるが、特にヒドロキシル基とアミノ基が好ましい。
【００１６】
プライマー層は、支持体表面の極性基と静電相互作用可能な極性基を有するポリシロキサンを少なくとも含む。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーである。ポリシロキサンはプライマー層の骨格を成し、プライマー層の機械的強度を高めている。ポリシロキサンは直鎖状、分岐鎖状、網目状の構造をとり得るが、特に分岐鎖状又は網目状の構造が好ましい。ポリシロキサンを含むプライマー層は、支持体表面と親水性層とを連結することに加えて、薬品や熱に弱いプラスチック支持体を保護することもできる。
【００１７】
プライマー層は後述する親水性層に含まれる親水性化合物と共有結合可能な官能基を更に含む。そのような官能基として、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、イソシアネート基、スルホニル基などが挙げられるが、特にアミノ基、エポキシ基、アルデヒド基が好ましい。
【００１８】
（プライマー層の形成方法）
プライマー層は、例えば以下のように形成することができる。まず、純水にアミノシランを添加し、０．１〜１０％（ｖ／ｖ）のアミノシラノール溶液を調製する。アミノシランの具体例としては、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシランが挙げられるが、これらに限定されない。次に、このアミノシラノール溶液をあらかじめ極性基を導入した支持体表面に接触させ、１〜６０分間放置する。アミノシラノールは分子内にヒドロキシル基とアミノ基を含むため、上記の極性基を導入した支持体表面に静電相互作用により結合する。最後に、支持体を純水で洗浄し、加熱又は乾燥する。これにより、アミノシラノール間で縮合反応が起き、ポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。この場合、ポリシロキサンの側鎖にはアミノ基が存在することになる。
【００１９】
静電相互作用を利用することにより、共有結合の場合と比較して、短時間でプライマー層を形成することができる。これにより、表面親水性基材の生産効率を向上させることが可能となる。
【００２０】
（親水性層）
プライマー層のポリシロキサン側鎖には、親水性化合物が共有結合を介して連結されている。好ましくは、親水性化合物は１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を有する。「１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖」とは次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す１以上の整数である）
で表される構造を指す。以下、本明細書中ではこれを「ＰＥＧ鎖」と呼ぶことがある。本発明における親水性層はＰＥＧ鎖を有する親水性化合物を含むことが好ましいが、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００２１】
ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、浮遊系細胞培養に用いる場合は４４以上であることが好ましく、ＥＬＩＳＡに用いる場合は１７６以上であることが好ましい。ＰＥＧ鎖の数平均分子量に上限はないが、数平均分子量が大きくなるほど粘度が増すため取扱いが難しいこと、及び、ＰＥＧ鎖の高密度での配置が難しいことから、２５０００以下であることが好ましく、１００００以下であることがより好ましい。ここで、ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、原料として用いられるＰＥＧ又は担体から解離させたＰＥＧ：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−Ｈ
（ｍは重合度を示す１以上の整数である）
の数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＰＥＧ数平均分子量は蒸気圧浸透圧法又は膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
【００２２】
ＰＥＧ鎖の自由末端には、後述の被固定化物質と共有結合可能な、少なくとも１つの官能基が直接的又は間接的に連結されていてもよい。このような官能基としては、例えば(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＰＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＰＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。被固定化物質への反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基が好ましい。これらの官能基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。
【００２３】
（親水性層の形成方法）
親水性層は、例えば以下のように形成することができる。まず、上記の方法で形成したプライマー層のポリシロキサン側鎖に存在する官能基と共有結合を形成可能な官能基を含むＰＥＧ誘導体を準備する。例えば、プライマー層のポリシロキサン側鎖に存在する官能基がアミノ基の場合は、アミノ基と反応して共有結合を形成可能な官能基を含むＰＥＧ誘導体を準備する。そのような官能基としては、例えば (１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
被固定化物質を固定化しない用途では、上記官能基をＰＥＧ鎖の片末端のみに直接的又は間接的に導入し、別の末端は被固定化物質との反応性をもたない不活性な基とする。不活性な基としては、例えばヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基などが挙げられるが、特にヒドロキシル基とメトキシ基が好ましい。すなわち、次式：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｙ
（Ｘはヒドロキシル基又はメトキシ基を表し、Ｙはアミノ基と反応して共有結合を形成可能な官能基を表す）
で表されるＰＥＧ誘導体を準備する。
【００２５】
被固定化物質を固定化する用途では、上記官能基と、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基とを、ＰＥＧ鎖の両末端にそれぞれ導入する。これらの官能基は異なっていてもよいが、同じである方が製造上都合がよい。すなわち、次式：
Ｙ−ＰＥＧ−Ｚ
（Ｙはアミノ基と反応して共有結合を形成可能な官能基を表し、Ｚは被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基を表す。ＹとＺは同じであってもよい）
で表されるＰＥＧ誘導体を準備する。
【００２６】
上記ＰＥＧ誘導体を原液のまま、あるいはアルコールなどの溶媒に溶解した状態でプライマー層と接触させる。時間は１分〜２４時間、温度は室温〜８０℃の範囲で適宜選択される。これによりＰＥＧ鎖がプライマー層のポリシロキサン側鎖に共有結合を介して連結される。最後に、支持体を純水で洗浄し、加熱又は乾燥する。
【００２７】
（被固定化物質）
本発明を免疫アッセイ用固相担体として用いる場合には、目的とする免疫アッセイの態様に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。「標的物質と結合する抗原又は抗体」が被固定化物質である実施形態（後述するサンドイッチ法又は直接競合法）において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。「標的物質」が被固定化物質である実施形態（後述する間接競合法）では、標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。
【００２８】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００２９】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。
【００３０】
被固定化物質は、ＰＥＧ鎖が有する官能基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、ＰＥＧ鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００３１】
（被固定化物質の固定化）
本発明における基材への被固定化物質の固定化は、例えば以下のように行われる。まず、被固定化物質を緩衝液に溶解する。ここで、被固定化物質との競合反応を避けるため、アミノ基成分を含まない緩衝液を用いることが好ましい。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液の種類、緩衝液のｐＨ及び被固定化物質の終濃度は、被固定化物質の種類に応じて適宜選択される。多くの場合、緩衝液のｐＨは４．０〜１０．０、被固定化物質の終濃度は１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で最適化すればよい。この被固定化物質溶解液を基材と所定時間接触させる。接触時間と温度も被固定化物質の種類に応じて適宜選択される。多くの場合、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化すればよい。適切な条件下であれば、被固定化物質に含まれるアミノ基等の官能基がＰＥＧ鎖に連結された官能基と反応し、アミド結合やウレタン結合等の共有結合が形成される。その結果、被固定化物質はＰＥＧ鎖を介して基材表面に固定化される。
【００３２】
ＰＥＧ鎖に連結された官能基と被固定化物質が有する官能基との組合せによっては固定化反応が十分進行しないことがある。そのような場合は、被固定化物質を乾燥濃縮するとよい。これによって被固定化物質の反応系中での濃度が高まるため、被固定化物質の固定化反応が著しく促進される。被固定化物質が少量しか準備できない場合は溶液中の被固定化物質の濃度を高めることは困難であるが、このような場合でも、比較的低濃度の被固定化物質溶解液を基材に接触させ、次いで乾燥濃縮することにより、被固定化物質の反応系中での濃度を高めることができ、固定化反応を促進することができる。この場合も、緩衝液の種類、緩衝液のｐＨ、被固定化物質の終濃度、接触時間、温度などを、被固定化物質の種類に応じて最適化することが望ましい。
【００３３】
被固定化物質が抗原、抗体等のタンパク質である場合は、乾燥によってタンパク質が変性することがある。乾燥に伴うタンパク質の変性を防ぐためには、被固定化物質溶解液にトレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の糖類を添加することが好ましい。糖類のなかでもトレハロースは、適度な保湿性を有していること、溶液の乾燥濃縮が容易であること、並びに、乾燥濃縮時に粗大な結晶が形成されにくく均質な乾燥濃縮が可能であることから好ましい。糖類の終濃度は１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で最適化すると良い。
【００３４】
被固定化物質溶解液を基材の広範囲に渡って接触させたい場合は、被固定化物質溶解液にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ（登録商標）２０などの非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。非イオン性界面活性剤の使用により、被固定化物質溶解液が基材表面に薄く濡れ広がるため、被固定化物質の使用量を節約できるだけでなく、乾燥濃縮に要する時間を短縮することができる。被固定化物質溶解液中の非イオン性界面活性剤の終濃度は０．０１〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲で最適化するとよい。
【００３５】
所望の被固定化物質をＰＥＧ鎖に結合させた後は、ＰＥＧ鎖に連結された未反応の官能基を、アミノ基を有する低分子化合物と反応させることにより、当該官能基を反応性のより低い官能基に変換してもよい。この操作により、免疫アッセイに関与する物質が不本意に基材表面に結合するのを防ぐことができる。この操作は、当該官能基の反応性が高い場合に特に必要性が高い。ただし、官能基を前記低分子化合物と反応させた後の基材表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の例としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。これらの低分子化合物を水溶液として調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、所望の被固定化物質を固定化した基材と接触させる。低分子化合物の濃度は１〜１０００ｍＭ、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化するとよい。
【実施例】
【００３６】
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
[実施例１]
図１は支持体への極性基導入からプライマー層形成までの本発明の一実施形態である。まず、ポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）の表面（Ａ）に公知の方法（例えば、特開２００７−４６０５６）でプラズマ処理を施し、カルボキシル基などの極性基を導入した（Ｂ）。次に、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ、信越化学工業）を加水分解したアミノシラノール溶液（０．１％）を上記プレートに分注し、５分間放置した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃のオーブンで１５分間乾燥した。これにより、ポリシロキサンとアミノ基を含むプライマー層が形成された（Ｃ）。ＡＰＳの代わりに３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン（ＥＰＳ、信越化学工業）を用いたときも、同様のプライマー層が形成された（Ｄ）。なお、極性基を導入したポリスチレン製マイクロウェルプレートとして市販品を用いることもできた。
【００３７】
[実施例２]
図２は実施例１のプレート（Ｃ）に、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されていないＰＥＧ鎖を、共有結合を介して連結させる、本発明の一実施形態である。ＰＥＧ鎖の自由末端はヒドロキシル基（Ｅ）又はメトキシ基（Ｆ）である。
【００３８】
これらの基材は次のような手順で作製した。まず、片末端に(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、別の末端にヒドロキシル基を有するＰＥＧ誘導体（数平均分子量４００）を合成した（ＰＥＧ−ＣＤＩ）。これを原液のまま実施例１のプレート（Ｃ）に分注し、８０℃で３０分間加熱した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した（Ｅ）。
【００３９】
同様に、片末端に(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、別の末端にメトキシ基を有するＰＥＧ誘導体（数平均分子量４００）を合成した（ＭＰＥＧ−ＣＤＩ）。これを原液のまま実施例１のプレート（Ｃ）に分注し、８０℃で３０分間加熱した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した（Ｆ）。
【００４０】
[実施例３]
図３は実施例１のプレート（Ｃ）に、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されているＰＥＧ鎖を、共有結合を介して連結させる、本発明の一実施形態である。ＰＥＧ鎖の自由末端はＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル基（Ｇ）又は(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基（Ｈ）である。
【００４１】
これらの基材は次のような手順で作製した。まず、両末端にＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル基を有するＰＥＧ誘導体（数平均分子量４００）を合成した（ＰＥＧ−ＤＳＣ）。これを原液のまま実施例１のプレート（Ｃ）に分注し、８０℃で３０分間加熱した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した。
【００４２】
同様に、両末端に(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基を有するＰＥＧ誘導体（数平均分子量４００）を合成した（ＰＥＧ−ＣＤＩ）。これを原液のまま実施例１のプレート（Ｃ）に分注し、８０℃で３０分間加熱した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した。
【００４３】
[実施例４]
図４は実施例１のプレート（Ｄ）に、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基が連結されているＰＥＧ鎖を、共有結合を介して連結させる、本発明の一実施形態である。ＰＥＧ鎖の自由末端はエポキシ基（Ｉ）である。この基材は次のような手順で作製した。
【００４４】
まず、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（数平均分子量４００、共栄社化学）を原液のまま実施例１のプレート（Ｄ）に分注し、６０℃で３０分間加熱した。その後、プレートを純水で洗浄し、８０℃で１５分間乾燥した。
【００４５】
[実施例５]
実施例２のプレートが従来よりもタンパク質の吸着を抑制することを次のような手順で確かめた。まず、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、実施例２のプレート（Ｅ、Ｆ）と、あらかじめプラズマ処理された９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）に分注した。室温で１０分間放置した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した。次に、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１０分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、実施例２のプレートは従来のプレート（比較例）よりもＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体の吸着を著しく抑制した（表１）。
【００４６】
【表１】
2013186057.tif 000003
【００４７】
[実施例６]
実施例３と４のプレートがＥＬＩＳＡで従来よりも高い感度を示すことを次のような手順で確かめた。まず、卵白リゾチーム（和光純薬）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、市販のＥＬＩＳＡ用プレートと、実施例３と４のプレート（Ｇ、Ｈ、Ｉ）に分注した（固相化）。市販品は１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングし、実施例３と４のプレートは２−(２−アミノエトキシ)エタノールで残存活性基を失活させた。その後、０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分注し、室温で６０分間放置した。次に、ＨＲＰ標識２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を分注し、室温で３０分間放置した。その後、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、実施例３と４のプレートは従来よりも高感度な測定が可能であった（表２）。
【００４８】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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