(57)【要約】【課題】  感染初期においても優れた検出感度と操作性のもとに齧歯類コロナウイルスを検出できる方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、配列番号１〜５で示される５種類のプライマーからなるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出する方法である。Ｆ３プライマーは１６種類の塩基配列を有するものからいずれかを選択して単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。【選択図】  図３
2013042732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の５種類のプライマーからなるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出する方法。
（１）ＦＩＰプライマー：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１）
（２）ＢＩＰプライマー：５’−ＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号２）
（３）Ｆ３プライマー：５’−ＴＧＣＴＫＡＹＡＴＴＴＧＴＲＲＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）
（４）Ｂ３プライマー：５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
（５）ループプライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
【請求項２】
Ｆ３プライマーとして以下の４種類の塩基配列を有するものから選択される少なくとも１種類を用いる請求項１記載の方法。
（３−１）５’−ＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴ−３’（配列番号６）
（３−２）５’−ＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＴＴＣＣＴ−３’（配列番号７）
（３−３）５’−ＴＧＣＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号８）
（３−４）５’−ＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号９）
【請求項３】
齧歯類コロナウイルスがマウス肝炎ウイルスである請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出するための以下の５種類のプライマーからなるプライマーセット。
（１）ＦＩＰプライマー：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１）
（２）ＢＩＰプライマー：５’−ＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号２）
（３）Ｆ３プライマー：５’−ＴＧＣＴＫＡＹＡＴＴＴＧＴＲＲＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）
（４）Ｂ３プライマー：５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
（５）ループプライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
【請求項５】
請求項４記載のプライマーセットを含んでなるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスやラットなどの齧歯類に感染する病原体の１つとして、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ：Ｍｏｕｓｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）に代表されるコロナウイルスが知られている。マウスやラットなどに対するコロナウイルスの感染は、時にこれらを実験動物として用いた研究活動に多大な障害を引き起こす。従って、こうした感染による研究障害の発生を未然に防止するために、コロナウイルスを検出する方法が研究の現場で望まれており、これまでにも酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法を用いたＭＨＶの検出方法（例えば非特許文献１）や、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いたＭＨＶの検出方法（例えば非特許文献２や非特許文献３）が提案されている。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法による方法には、体内でウイルスに対する抗体が産生されていない感染初期にはウイルスを検出できないといった問題がある。また、ＲＴ−ＰＣＲ法による方法は、感染初期においてもウイルスを検出できるといった点においては優れているものの、操作が煩雑であるといった点において必ずしも満足できるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊａｍｅｓ  Ｒ．Ｆａｈｅｙ，２０００．ＪＡＸ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．４
【非特許文献２】Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ４３，２８５−２９０
【非特許文献３】Ｏｙａｎａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｅｘｐ  Ａｎｉｍ  ５３，３７−４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、感染初期においても優れた検出感度と操作性のもとに齧歯類コロナウイルスを検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記の点に鑑みて検討を重ねる過程において、ＰＣＲ法に代わる核酸増幅法として栄研化学株式会社によって開発されたＬＡＭＰ法に着目した。環状型等温増幅反応法とも呼ばれるＬＡＭＰ法は、４種類のプライマー（ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー）からなるプライマーセットを用いて検出対象遺伝子の特定領域の核酸増幅反応を行う方法であり（場合によってループプライマーをさらに用いる）、技術的に種々の利点を有していることは当業者に周知の通りである（必要であれば例えばＧｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４６，１６７−１７２およびその参考文献を参照のこと）。具体的には、（１）１組のプライマーセットを用いて行うＰＣＲ法に比べて特異性が高いこと、（２）核酸増幅反応が等温反応であるために複雑な装置を要しないこと、（３）核酸増幅反応に長時間を要しないこと（１時間以内の完結が可能）、（４）増幅産物の有無を反応液の目視で判定できること、（５）検出感度はＰＣＲ法と同等またはそれ以上であること、といった利点が挙げられる。
【０００６】
齧歯類コロナウイルスを検出するためのＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットを設計する際には、コロナウイルスはＲＮＡウイルスであるため遺伝子変異を起こしやすく、従って変異株が多いということに留意する必要がある。例えばヌクレオキャプシド蛋白質をコードする遺伝子領域であるＯＲＦ７は、変異が比較的少ないことから検出領域として適していると考えられており、上記の非特許文献２や非特許文献３で提案されているＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＭＨＶを検出するための１組のプライマーセットもＯＲＦ７の塩基配列をもとに設計されている。しかしながら、少なくとも４種類のプライマーからなるプライマーセットを用いて行うＬＡＭＰ法においては、遺伝子変異が比較的少ないとされるＯＲＦ７を検出領域としても、多数の変異株を検出できるプライマーセットであるためには、各プライマーの塩基配列に複数の変異を含む必要がある可能性がある。そのため、全ての変異を網羅するためには、各プライマーに対して複数の塩基配列を有するプライマーが必要となり、このことは、ウイルスの検出感度を低下させる原因となることが懸念される。また、プライマーの塩基配列に変異を含む場合、当該箇所においてウイルスの遺伝子の新たな変異が生じる可能性を否定できない。
【０００７】
そこで本発明者はさらに検討を行った結果、ＭＨＶ−２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２０１９２９）のリーダー配列（７１−３５０ｎｔ）が、ＭＨＶの変異株のみならず、ラットコロナウイルス（ＲＣＶ：Ｒａｔ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）においても高度（９７．５％）に保存されていること、この領域をＬＡＭＰ法によって核酸増幅するためのプライマーセットを設計して核酸増幅反応を行うと、多数のＭＨＶの変異株とともにＲＣＶやラット唾液腺涙腺炎ウイルス（ＳＤＡＶ：Ｓｉａｌｏｄａｃｒｙｏａｄｅｎｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）を優れた検出感度のもとに検出できることを見出した。
【０００８】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、以下の５種類のプライマーからなるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出する方法である。
（１）ＦＩＰプライマー：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１）
（２）ＢＩＰプライマー：５’−ＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号２）
（３）Ｆ３プライマー：５’−ＴＧＣＴＫＡＹＡＴＴＴＧＴＲＲＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）
（４）Ｂ３プライマー：５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
（５）ループプライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｆ３プライマーとして以下の４種類の塩基配列を有するものから選択される少なくとも１種類を用いる。
（３−１）５’−ＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴ−３’（配列番号６）
（３−２）５’−ＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＴＴＣＣＴ−３’（配列番号７）
（３−３）５’−ＴＧＣＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号８）
（３−４）５’−ＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号９）
また、請求項３記載の方法は、請求項１記載の方法において、齧歯類コロナウイルスがマウス肝炎ウイルスである。
また、本発明は、請求項４記載の通り、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出するための以下の５種類のプライマーからなるプライマーセットである。
（１）ＦＩＰプライマー：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１）
（２）ＢＩＰプライマー：５’−ＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号２）
（３）Ｆ３プライマー：５’−ＴＧＣＴＫＡＹＡＴＴＴＧＴＲＲＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）
（４）Ｂ３プライマー：５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
（５）ループプライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
また、本発明は、請求項５記載の通り、請求項４記載のプライマーセットを含んでなるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行って齧歯類コロナウイルスを検出するためのキットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、感染初期においても優れた検出感度と操作性のもとに齧歯類コロナウイルスを検出できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各種の齧歯類コロナウイルスのリーダー配列と本発明のＬＡＭＰ法に用いる各プライマーの塩基配列の関係を示す図である。
【図２】実施例１におけるＭＨＶ３株に対する遺伝子増幅結果を示す表である。
【図３】実施例２におけるコロナウイルス３０株に対する遺伝子増幅結果を示す表である。
【図４】実施例３における本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法と従来例としてのＲＴ−ＰＣＲ法との検出感度の比較結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の齧歯類コロナウイルスを検出する方法は、以下の５種類のプライマーからなるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行うことによるものである。本発明における検出対象である齧歯類コロナウイルスとしては、ＭＨＶの他、ＲＣＶやＳＤＡＶなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（１）ＦＩＰプライマー：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１）
（２）ＢＩＰプライマー：５’−ＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号２）
（３）Ｆ３プライマー：５’−ＴＧＣＴＫＡＹＡＴＴＴＧＴＲＲＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３）
（４）Ｂ３プライマー：５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号４）
（５）ループプライマー：５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
【００１２】
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットを設計する方法は自体公知である（必要であれば例えばＧｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４６，１６７−１７２およびその参考文献を参照のこと）。検出対象遺伝子の核酸増幅領域から３’側に向かってＦ１ｃ，Ｆ２ｃ，Ｆ３ｃ、５’側に向かってＢ１，Ｂ２，Ｂ３の６つの領域を規定し、ＦＩＰプライマーは３’側にＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域の塩基配列を有するとともに、５’側にＦ１ｃ領域と同じ塩基配列を有するものとする。ＢＩＰプライマーは３’側にＢ２領域と同じ塩基配列を有するとともに、５’側にＢ１領域と相補的なＢ１ｃ領域の塩基配列を有するものとする。Ｆ３プライマーはＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域の塩基配列を有するものとする。Ｂ３プライマーはＢ３領域と同じ塩基配列を有するものとする。ループプライマーは、ＬＡＭＰ法における核酸増幅産物のダンベル構造の５’末端側のループ構造の１本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を有するものであり、反応時間の短縮や検出感度の上昇に寄与する。
【００１３】
本発明において用いるＦＩＰプライマーは配列番号１で示される５’−ＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＣ−３’であり、これはＭＨＶ−２のリーダー配列の２３８−２１７ｎｔと１５７−１７４ｎｔを連結させたものに相当する。ＢＩＰプライマーは配列番号２で示される５’−ＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＡＧＧ−３’であり、これはＭＨＶ−２のリーダー配列の２４６−２６６ｎｔと３００−３１８ｎｔを連結させたものに相当する。Ｆ３プライマーは配列番号３で示される５’−ＴＧＣＴＫＡＹＡＴＴＴＧＴＲＲＴＴＣＣＴ−３’であるが、具体的にはＭＨＶ−２のリーダー配列の１２６−１４５ｎｔに相当する配列番号６で示される５’−ＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴ−３’に加え、配列番号７で示される５’−ＴＧＣＴＧＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＴＴＣＣＴ−３’や配列番号８で示される５’−ＴＧＣＴＴＡＣＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＴ−３’や配列番号９で示される５’−ＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＣＴ−３’が挙げられる。Ｆ３プライマーは１６種類の塩基配列を有するものからいずれかを選択して単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。Ｂ３プライマーは配列番号４で示される５’−ＣＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴ−３’であり、これはＭＨＶ−２のリーダー配列の３３６−３１９ｎｔに相当する。ループプライマー（ＬＢプライマー）は配列番号５で示される５’−ＡＴＧＣＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＡＴＣＧＧ−３’であり、これはＭＨＶ−２のリーダー配列の２６７−２８５ｎｔに相当する。各種の齧歯類コロナウイルスのリーダー配列と各プライマーの塩基配列の関係を図１に示す。なお、各プライマーは、天然から単離精製したものであってもよいし、化学合成したものであってもよい。
【００１４】
本発明におけるＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行うための試料は、コロナウイルスに感染しているか、感染している疑いのある個体の血液、尿、糞便、組織などが挙げられる。これらの試料に対しては抽出や精製などの自体公知の前処理を行ってもよい。核酸増幅反応は、例えば、試料、本発明のプライマーセット、逆転写酵素（齧歯類コロナウイルスはＲＮＡウイルスであるため本発明のＬＡＭＰ法はＲＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行うＲＴ−ＬＡＭＰ法である）、ＤＮＡ合成酵素（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼなど）、核酸合成基質となる４種類のｄＮＴＰ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液などを反応チューブ内で混合し、６０〜６５℃付近の一定温度で保温することで行うことができる。試料中にコロナウイルスに由来するＲＮＡが存在した場合、コロナウイルスに由来するＲＮＡを鋳型として逆転写酵素によってＤＮＡが合成され、合成されたＤＮＡを鋳型として本発明のプライマーセットに基づく核酸増幅が起こる。増幅産物の有無の判定は、例えば反応液に硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩を含ませておいた場合、核酸合成の基質が消費されることで副産物として生成するピロリン酸と反応し、ピロリン酸マグネシウムとなって反応液が白濁するので、この白濁をリアルタイムで目視することや光学的に測定することで行うことができる。
【００１５】
なお、本発明のプライマーセットは、逆転写酵素、ＤＮＡ合成酵素、核酸合成基質、緩衝液、マグネシウム塩などとともにキットとして実用に供することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は、以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００１７】
実施例１：本発明のプライマーセットを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法による齧歯類コロナウイルスの検出（Ｆ３プライマーの評価）
１．試料
ＭＨＶ−２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２０１９２９）、ＭＨＶ−３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＦＪ６４７２２４）、ＭＨＶ−Ａ５９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ７００２１１）の３株について、それぞれの培養上清２００μＬよりＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてゲノムＲＮＡを抽出し、ＲＮＡグレード精製水により１０倍希釈列を作製した。
【００１８】
２．ＲＴ−ＬＡＭＰ法に用いる反応液の組成
ＲＴ−ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行うため、最終反応液量２０μＬ中の各成分濃度が下記のようになるように３種類の反応液（Ｍｉｘｔｕｒｅ１〜３）を調製した。なお、各プライマーは化学合成した。
（Ｍｉｘｔｕｒｅ１）
・２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１０ｍＭ  ＫＣｌ
・８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
・１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
・１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
・０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）
・０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
・０．１２ｍＭ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｎａｐｈｔｈｏｌ  Ｂｌｕｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）
・１．６μＭ  ＦＩＰプライマー（配列番号１）
・１．６μＭ  ＢＩＰプライマー（配列番号２）
・０．２μＭ  Ｆ３−１プライマー（配列番号６）
・０．２μＭ  Ｂ３プライマー（配列番号４）
・０．８μＭ  ＬＢプライマー（配列番号５）
・０．５Ｕ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・６．４Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
・２μＬ  ゲノムＲＮＡの１０倍希釈列
（Ｍｉｘｔｕｒｅ２）
・２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１０ｍＭ  ＫＣｌ
・８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
・１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
・１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
・０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）
・０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
・０．１２ｍＭ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｎａｐｈｔｈｏｌ  Ｂｌｕｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）
・１．６μＭ  ＦＩＰプライマー（配列番号１）
・１．６μＭ  ＢＩＰプライマー（配列番号２）
・０．２μＭ  Ｆ３プライマー（配列番号３：１６種類の塩基配列を有するものの混合物）
・０．２μＭ  Ｂ３プライマー（配列番号４）
・０．８μＭ  ＬＢプライマー（配列番号５）
・０．５Ｕ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・６．４Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
・２μＬ  ゲノムＲＮＡの１０倍希釈列
（Ｍｉｘｔｕｒｅ３）
・２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
・１０ｍＭ  ＫＣｌ
・８ｍＭ  ＭｇＳＯ４
・１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
・１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４
・０．８Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）
・０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
・０．１２ｍＭ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｎａｐｈｔｈｏｌ  Ｂｌｕｅ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）
・１．６μＭ  ＦＩＰプライマー（配列番号１）
・１．６μＭ  ＢＩＰプライマー（配列番号２）
・０．２μＭ  Ｆ３−１プライマー（配列番号６）
・０．２μＭ  Ｆ３−２プライマー（配列番号７）
・０．２μＭ  Ｆ３−３プライマー（配列番号８）
・０．２μＭ  Ｆ３−４プライマー（配列番号９）
・０．２μＭ  Ｂ３プライマー（配列番号４）
・０．８μＭ  ＬＢプライマー（配列番号５）
・０．５Ｕ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
・６．４Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）
・２μＬ  ゲノムＲＮＡの１０倍希釈列
【００１９】
３．遺伝子増幅
上記の最終反応液量２０μＬの反応液を０．２ｍＬの専用チューブ内で６３℃で４５分間加温を行い、室温に冷却して反応終了とした。遺伝子増幅の有無は、目視によるＨｙｄｒｏｘｙ  Ｎａｐｈｔｈｏｌ  Ｂｌｕｅの色の変化、即ち、遺伝子増幅無しは青紫色、遺伝子増幅有りは水色により判定した（Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４６，１６７−１７２を参照）。
【００２０】
４．３種類の反応液（Ｍｉｘｔｕｒｅ１〜３）による検出感度の比較
ＭＨＶ−２、ＭＨＶ−３、ＭＨＶ−Ａ５９のそれぞれに対する遺伝子増幅の結果を図２に示す（＋は増幅有りで−は増幅無し）。図２から明らかなように、いずれの反応液においてもすべてのマウスコロナウイルスに対して低濃度の試料であっても遺伝子増幅が認められ、これらのマウスコロナウイルスを優れた検出感度のもとに検出できることがわかった。なお、Ｆ３−１プライマー（配列番号６）の塩基配列はＭＨＶ−２のリーダー配列の塩基配列と完全一致しているが、ＭＨＶ−２の検出感度はＦ３−１プライマーのみを含むＭｉｘｔｕｒｅ１よりもＦ３プライマーとして４種類の塩基配列を有するもの（Ｆ３−１プライマー（配列番号６）、Ｆ３−２プライマー（配列番号７）、Ｆ３−３プライマー（配列番号８）、Ｆ３−４プライマー（配列番号９））を含むＭｉｘｔｕｒｅ３の方が優れていたことから、Ｆ３プライマーはＭｉｘｔｕｒｅ３の４種類の塩基配列を有するものの混合物が最も好適であると判断された。
【００２１】
実施例２．齧歯類コロナウイルスの検出における本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法の特異性の評価
１．試料
齧歯類コロナウイルスとして、ＭＨＶ１７株、ＲＣＶ１株、ＳＤＡＶ５株、非齧歯類コロナウイルスとして、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ：Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）３株、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）１株、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ：Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｄｉａｒｒｈｅａ  ｖｉｒｕｓ）１株、牛コロナウイルス（ＢＣＶ：Ｂｏｖｉｎｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）２株、合計３０株のコロナウイルスそれぞれについて、培養上清２００μＬよりＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてゲノムＲＮＡを抽出した。
【００２２】
２．ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応条件
それぞれのウイルスに対する遺伝子増幅の有無を確認するため、２μＬの各ウイルスのゲノムＲＮＡを含む最終反応液量２０μＬの実施例１に記載のＭｉｘｔｕｒｅ３と同じ組成の反応液を０．２ｍＬの専用チューブ内で６３℃で４５分間加温を行い、室温に冷却して反応終了とし、遺伝子増幅の有無を実施例１と同様にして目視により判定した。
【００２３】
３．結果
図３に示す（＋は増幅有りで−は増幅無し）。図３から明らかなように、すべての齧歯類コロナウイルス２３株に対して遺伝子増幅が認められた一方で、すべての非齧歯類コロナウイルス７株に対して遺伝子増幅が認められなかったことから、本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法は、齧歯類コロナウイルスを特異的に検出できるものであることがわかった。
【００２４】
実施例３．本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法と従来例としてのＲＴ−ＰＣＲ法との検出感度の比較
１．試料
マウスコロナウイルスＭＨＶ−３の培養上清２００μＬよりＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてゲノムＲＮＡを抽出し、ＲＮＡグレード精製水により１０倍希釈列を作成した。
【００２５】
２．ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応条件
２μＬのゲノムＲＮＡの１０倍希釈列を含む最終反応液量２０μＬの実施例１に記載のＭｉｘｔｕｒｅ３と同じ組成の反応液を０．２ｍＬの専用チューブ内で６３℃で６０分間加温を行い、室温に冷却して反応終了とし、遺伝子増幅の有無を実施例１と同様にして目視により判定した。
【００２６】
３．ＲＴ−ＰＣＲ法の反応条件
ＲＴ−ＰＣＲ法は、Ｈｏｍｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９，２７８９−２７９３に記載された方法に従い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）の使用説明書に従って一部を改変して行った。最終反応液量２５μＬ中の各成分濃度は以下の通りとした。
・２μＬ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ
・１２．５μＬ  ２×  １  ｓｔｅｐ  ｂｕｆｆｅｒ
・０．４μＭ  ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  
・０．４μＭ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
・２μＬ  ゲノムＲＮＡの１０倍希釈列
この反応液を、０．２ｍＬの専用チューブ内で、逆転写酵素反応を５０℃×３０分間、続いて最初のＤＮＡ変性を９４℃×２分間、ＰＣＲ反応を９４℃×１５秒間→５６℃×１５秒間→７２℃×３０秒間を１サイクルとして３０サイクル、ＤＮＡ合成反応を７２℃×３分間行った後、４℃に冷却して反応終了とした。遺伝子増幅の有無の確認は１．２％アガロースゲルによる電気泳動とエチジウムブロマイド染色により行った。
【００２７】
４．所要時間おび検出感度の比較
本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法における遺伝子増幅から判定までの所要時間は約６０分であった一方で、従来例としてのＲＴ−ＰＣＲ法においては遺伝子増幅から判定まで約１２０分を要した。遺伝子増幅の結果を図４に示す。図４から明らかなように、本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法においては１Ｅ−５希釈まで遺伝子増幅が認められた一方で、従来例としてのＲＴ−ＰＣＲ法においては１Ｅ−４希釈までしか遺伝子増幅が認められなかった。よって、本発明のＲＴ−ＬＡＭＰ法は所要時間と検出感度の点において従来例としてのＲＴ−ＰＣＲ法よりも優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、感染初期においても優れた検出感度と操作性のもとに齧歯類コロナウイルスを検出できる方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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