(57)【要約】【課題】真皮部分のみならず表皮部分の再生をも促進できる皮膚再生促進方法を提供すること。【解決手段】４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート（ＨＰＡ）を含む皮膚再生促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート（ＨＰＡ）を含む皮膚再生促進剤。
【請求項２】
さらに、１’−アセトキシチャビコールアセテート（ＡＣＡ）を含む、請求項１に記載の皮膚再生促進剤。
【請求項３】
表皮再生促進剤である、請求項１又は２に記載の皮膚再生促進剤。
【請求項４】
外用剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚再生促進剤。
【請求項５】
外用医薬品又は外用化粧品である、請求項４に記載の皮膚再生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚再生促進剤に関する。より詳細には、本発明は、４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート（ＨＰＡ）を含む皮膚再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の創傷を治癒させるために、また、皮膚の抗老化のために、皮膚の再生を促進させることが重要である。皮膚が傷ついている場合には、皮膚再生促進により当該傷を回復させ得ることが期待できる。また、老化により皮膚に様々な症状（シワ、シミ、くすみ、乾燥、弾力性低下など）が出てくる場合には、皮膚の再生を促進することで、古い皮膚が新たな皮膚へと早期に置き代わり、このような老化による皮膚症状が改善されることが期待できる。
【０００３】
このため、これまでも、皮膚再生を促進する物質が種々探索されている。皮膚再生促進物質の探索においては、通常、コラーゲン産生能が指標として用いられている。コラーゲンの産生が高まることにより、皮膚の再生が促進されると期待されるからである。これまでに、コラーゲン産生能を向上させる様々な物質が見出されてきている。例えば、特許文献１（特開２００６−１５１８６０号公報）には、１’−アセトキシチャビコールアセテート（ＡＣＡ）が、特許文献２（特開２０１１−１７３８０３号公報）には、４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート（ＨＰＡ）が、それぞれ、コラーゲン産生能を向上させることが記載されている。
【０００４】
しかしながら、皮膚は、大まかには、表面側から「表皮」「真皮」「皮下脂肪」の各層からなっているところ、コラーゲン産生は真皮部分で行われており、真皮部分でコラーゲンがいくら産生されたとしても、表皮部分の再生には関係がない。皮膚再生促進のためには、真皮部分の再生促進のみならず、表皮部分の再生促進も重要である。ところが、表皮の再生に関しては、あまり注目されていないのが現状である。特に、肌のシミやそばかすは、メラノサイトにより産生されるメラニン色素が皮膚の内側に沈着して起こるところ、表皮の基底層における角化細胞のターンオーバーにより当該沈着が抑制されるため、角化細胞の再生は特に肌のシミやそばかすの防止（つまり、肌の美白）のために非常に重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１５１８６０号公報
【特許文献２】特開２０１１−１７３８０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、真皮部分のみならず表皮部分の再生をも促進できる皮膚再生促進方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、驚くべき事に、４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート（ＨＰＡ）が、真皮部分のみならず表皮部分の再生をも促進できることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は例えば以下の項に係る皮膚再生促進剤を包含する。
項１．
４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート（ＨＰＡ）を含む皮膚再生促進剤。
項２．
さらに、１’−アセトキシチャビコールアセテート（ＡＣＡ）を含む、項１に記載の皮膚再生促進剤。
項３．
表皮再生促進剤である、項１又は２に記載の皮膚再生促進剤。
項４．
外用剤である、項１〜３のいずれかに記載の皮膚再生促進剤。
項５．
外用医薬品又は外用化粧品である、項４に記載の皮膚再生促進剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の皮膚再生促進剤によれば、真皮部分のみならず表皮部分の再生をも促進できる。このため、皮膚の創傷の治癒や、皮膚の抗老化のために、好ましく用いることができる。より詳細には、皮膚が傷ついている場合には、皮膚再生促進により当該傷を回復させ得ることが期待できる。また、老化により皮膚に様々な症状（シワ、くすみ、乾燥、弾力性低下など）が出てくる場合には、皮膚の再生を促進することで、古い皮膚が新たな皮膚へと早期に置き代わり、このような老化による皮膚症状が改善されることが期待できる。
【００１０】
またさらに、本発明の皮膚再生促進剤には、特に光による皮膚損傷を抑制又は回復する効果もあり、この点からも、皮膚の創傷の治癒や、皮膚の抗老化のために、好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒトケラチノサイト培養時、培地に４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテート（ＨＰＡ）を添加して培養し、ニュートラルレッド法により吸光度を測定し、コントロールを１００％とした際の割合を算出して、細胞数を見積もった結果を示す。
【図２】ヒトケラチノサイト培養時、培地に１’−アセトキシチャビコールアセテート（ＡＣＡ）を添加して培養し、ニュートラルレッド法により吸光度を測定し、コントロールを１００％とした際の割合を算出して、細胞数を見積もった結果を示す。
【図３】ヒトケラチノサイト培養時、培地にＨＰＡ又はＡＣＡを添加し、さらに紫外線を照射した後、ＤＣＦＨ−ＤＡを添加して発せられる蛍光を測定した結果を示す。なお、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて測定する蛍光の強さは、活性酸素量を反映する。
【図４】ヒトケラチノサイト培養時、培地にＨＰＡを添加し、さらに紫外線を照射した後、ニュートラルレッド法により吸光度を測定し、コントロールを１００％とした際の割合を算出して、細胞数を見積もった結果を示す。
【図５】ヒト由来線維芽細胞培養時、培地にＨＰＡ又はＡＣＡを添加して培養した際の、Ｉ型コラーゲン染色像を示す。
【図６】ヒト由来線維芽細胞培養時、培地にＨＰＡを添加して培養し、ニュートラルレッド法により吸光度を測定し、コントロールを１００％とした際の割合を算出して、細胞数を見積もった結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１３】
本発明の皮膚再生促進剤は、４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテートを含む。４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテートは、以下の構造式で表される化合物であり、「ＨＰＡ」又は「ＡＣＡｉ−ＯＨ」とも呼ばれる（以下、本明細書においても、４−（（Ｅ）−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）フェニルアセテートを「ＨＰＡ」又は「ＡＣＡｉ−ＯＨ」と標記することがある）。
【００１４】
【化１】
2013193994.tif 000002
【００１５】
ＨＰＡは、公知の物質であり、また公知の方法により容易に製造することができる。例えば、ＨＰＡは、１’−アセトキシチャビコールアセテート（以下「ＡＣＡ」ともいう）を高温且つ水存在下におくことにより、下記のような分子内転移反応が容易に起こることで生成され得る。 
【００１６】
【化２】
2013193994.tif 000003
【００１７】
また、ＡＣＡも公知の物質であり、また公知の方法により容易に製造することができる。例えば、ＡＣＡはナンキョウ（タイショウガ）の根茎に含まれることが知られており、ナンキョウの抽出物を生成して得ることができる。また、公知の方法により合成したものを用いてもよい。
【００１８】
また、ＨＰＡの合成方法については、例えば特許文献２（特開２０１１−１７３８０３号公報）に詳述されているので、それに従って合成することができる。
【００１９】
本発明の皮膚再生促進剤は、ＨＰＡに加え、さらにＡＣＡを好ましく含む。ＡＣＡは、ＨＰＡと同様、コラーゲン産生能を向上させるのみならず、表皮部分の再生をも促進させるため、本発明の皮膚再生促進剤に好ましく用いることができる。
【００２０】
本発明の皮膚再生促進剤がＨＰＡ及びＡＣＡを含む場合、特に制限はされないが、ＨＰＡ及びＡＣＡ合計モル量を１００モル部とした場合、好ましくは、ＨＰＡは５０モル部以上であり、より好ましくは、５５モル部以上、６０モル部以上、６５モル部以上、７０モル部以上、７５モル部以上、又は８０モル部以上であり得る。 
【００２１】
また、本発明の皮膚再生促進剤は、真皮の再生のみならず表皮の再生をも促進する。従って、本発明の皮膚再生促進剤は、真皮再生促進剤及び表皮再生促進剤を包含する。このうち、表皮再生促進剤として用いられるのが好ましい。特に、本発明の皮膚再生促進剤は、角化細胞の再生及びターンオーバーを促進できるため、肌美白剤として好適に用いることができる。真皮再生促進効果（例えばコラーゲン産生能向上効果）しか奏さない公知の皮膚再生促進剤と本発明の表皮再生促進剤とを組み合わせて用いることにより、より優れた皮膚再生促進効果を得ることができる。このように、本発明の表皮再生促進剤は、従来から知られた公知の真皮再生促進剤と組み合わせて用いるという、新たな用途を提供することができる。この観点から見れば、上述のＨＰＡ及びＡＣＡを含む皮膚再生促進剤とは、コラーゲン産生能向上効果（すなわち真皮再生促進効果）が知られていたＡＣＡと、本発明のＨＰＡを含む表皮再生促進剤とを組み合わせた、皮膚再生促進剤であるということができる。 
【００２２】
本発明の皮膚再生促進剤は、皮膚に直接適用して用いることが好ましい。すなわち、外用剤であることが好ましい。例えば、外用医薬品や外用化粧品として好ましく用いることができる。
【００２３】
当該外用医薬品は公知の方法により製造することができる。例えば、薬学的に許容される基剤、担体、及び／又は添加剤（例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤等）等を適宜ＨＰＡ（場合によっては更にＡＣＡ）と混合して常法に従って製造することができる。
【００２４】
また、当該化粧品は公知の方法により製造することができる。例えば、化粧品に添加することが許容される基剤、担体、及び／又は添加剤（例えば溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤等）等を適宜ＨＰＡ（場合によっては更にＡＣＡ）と混合して常法に従って製造することができる。形態も特に制限されず、例えばローション、化粧水、乳液、クリーム、パック剤、美容液、洗顔料、メーキャップ剤、ヘアケア用品、ボディーソープ、入浴剤等が例示できる。 
【実施例】
【００２５】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
〔被験化合物の調製〕
ＨＰＡの調製
ＨＰＡを以下に示す方法に従って調製した。
【００２６】
【化３】
2013193994.tif 000004
【００２７】
4-Iodophenol(Wako,3 g, 13.6 mmol) を乾燥CH2Cl2に溶解し、Et3N (Wako, 2.75 g, 2 equiv)、4-dimethylaminopyridine(Wako, 83 mg, 0.05 equiv)、Ac2O (Wako, 0.93 g, 2 equiv) を加え、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、クロロホルムに溶解した後、1 M HCl水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 10 : 1）にて精製を行い、4-Iodophenyl acetateを得た (3.3 g, 92.5%)。
【００２８】
【化４】
2013193994.tif 000005
【００２９】
4-Iodophenyl acetate (500 mg, 1.91 mmol) をDMF（脱水，Wako）4 mLに溶解し、allyl alcohol (Wako, 260 mL, 3 equiv), AgOAc (Wako, 318 mg, 1 equiv), Ph3P(Wako, 50 mg, 0.1 equiv), Pd(OAc)2(Wako, 21.4 mg, 0.05 equiv) を加え、N2下、70℃で一晩撹拌した。セライトで沈殿物を除去し、EtOAcを加え、1 M HCl、続いて飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 2 : 1）にて精製を行い、得られた粗結晶をHexane-EtOAc (5:1) より再結晶して4-((E)-3-hydroxyprop-1-enyl)phenyl acetate（ＨＰＡ）を得た (150 mg,41%)。当該ＨＰＡを以下の検討に用いた。
【００３０】
なお、例えば以下に示す方法によりHPAを調製することもできる。
【００３１】
ACA 200 mg (0.85mmol) を20%エタノール含有水溶液80 mLに溶解し、80℃で2日間撹拌した。溶媒を濃縮後、凍結乾燥を行い、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane : EtOAc = 2 : 1）にて分離精製を行った。わずかに赤みがかった結晶をHexane-EtOAc (5 : 1) より再結晶して無色の結晶を得た（収量 87 mg）。
【００３２】
この化合物のマススペクトル及び重メタノール中での1H NMRスペクトル結果を下記に示す。MSより分子式はC11H12O3、また1H NMRスペクトルの解析により得られた化合物がHPAであることが分かった。すなわち、ACAの熱分解より得られた化合物はHPAであることを確認できた。
MS: JMS-700T
(JEOL)
HRMS (CI, direct) calcd for C11H13O3,
[M+H]+ 193.0865; found, 193.0873.
NMR: AVANCE 300N
(BRUKER)
1H NMR (300 MHz, MeOD); d 2.26 (s, 3 H, a), 4.22 (dd, 2 H, J
= 1.5, 5.4 Hz, b), 6.34 (dt, 1 H, J = 15.9, 5.4 Hz, c), 6.61
(dd, 1 H, J = 1.5, 15.9 Hz, d), 7.04 (d, 2 H, J = 8.7 Hz, e),
7.43 (d, 2 H, J = 8.7 Hz, f).
【００３３】
ＡＣＡの調製
4-Hydroxybenzaldehyde (Wako, 12.5 g, 102.4 mmol), triethylamine (Wako, 15.5g, 1.5eq) 及び4-dimethylaminopyridine (Wako, 500mg, 0.04eq) を乾燥ジクロロメタン３００ｍＬに溶解し、０℃で撹拌しながら、tert-butyldimethylsilyl chloride (TCI, 18.5g, 1.2eq) を少しずつ加えた。室温で３時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =20:1）にて精製を行い、化合物１を得た(21.5g, 87%)。当該工程スキームを次に示す。
【００３４】
【化５】
2013193994.tif 000006
【００３５】
次に、化合物１ (20 g, 84.6 mmol) を乾燥ＴＨＦ３００ｍＬに溶解し、窒素気流下、０℃でvinylmagnesium bromide (TCI, 1 mol/L in THF, 102 mL, 1.2 eq) を滴下した。室温で３時間撹拌後、０．５Ｍ  ＨＣｌ水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =8:1）にて精製を行い、化合物２を得た(17.1 g, 76.4%)。当該工程スキームを次に示す。
【００３６】
【化６】
2013193994.tif 000007
【００３７】
さらに、化合物２(12g, 45.4mmol)を乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶解し、tetra-n-butylammonium Fluoride (TCI, 1 mol/L in THF, 54.5 mL, 1.2 eq)を０℃で滴下した。０℃で１時間撹拌後、飽和食塩水を加え、エーテル及びジクロロメタンで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した後、ピリジン３００ｍＬに溶解し、無水酢酸（18.5 g, 4 eq）を加えて室温で一晩撹拌した。ピリジンを減圧留去した後、クロロホルムに溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：Hexane:EtOAc =4:1）にて精製を行った。ヘキサンを加えて結晶化させた後、ヘキサンにより再結晶を行い、ラセミＡＣＡ（ラセミ混合物）を得た（7.01 g, 65.9%, mp. 68℃）。当該工程スキームを次に示す。
【００３８】
【化７】
2013193994.tif 000008
【００３９】
また、ラセミＡＣＡのスペクトル解析結果を次に示す。
HRMS (FAB, direct) calcd for C13H14O4,
[M]+234.0892; found, 234.0916.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); d 2.10 (s, 3 H), 2.29 (s, 3 H), 5.25 (d, 1 H, J = 10.5 Hz), 5.30 (d, 1 H, J = 17.1 Hz), 5.98 (ddd, 1 H, J = 5.9, 10.5, 17.1 Hz), 6.26 (d, 1 H, J = 5.9 Hz), 7.08 (d, 2 H, J = 8.5 Hz), 7.37 (d, 2 H, J = 8.5 Hz).
以下、得られたラセミＡＣＡを用いて検討を行った。
【００４０】
〔表皮に対する作用の検討〕
角化細胞増殖促進能の検討
１０%牛胎児血清（ＦＢＳ、株式会社ニチレイバイオサイエンス）、ペニシリン（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、明治製菓株式会社）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ、明治製菓株式会社）を含むダルベッコ修正イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））（日水製薬株式会社）に、ヒトケラチノサイト（ＨａＣａｔ細胞）を１．２５×１０５個播き、サブコンフルエント（約８０％密度）になるまで約１週間培養した。以下の培養にも当該培地を用いた。なお、当該培養は、ＴＣフラスコ５０ｍＬ（株式会社グライナー・ジャパン）内で行った。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳ２ｍＬで１回洗浄した後、０．０１％ＥＤＴＡ／０．０２５％トリプシン溶液（和光純薬工業株式会社）３ｍＬで細胞を処理して剥離させ、更にトリプシン中和液３ｍＬを添加し、遠心分離（４℃、１，３００ｒｐｍ、５分）して上清を除き、細胞を回収した。回収した細胞を、直径３５ｍｍのプラスチックシャーレ（株式会社グライナー・ジャパン）に１．３×１０５ｃｅｌｌｓずつ播種し、ＨＰＡ又はＡＣＡを添加した培地、及びコントロールとしてＨＰＡもＡＣＡも添加しない培地、を用いて２４時間培養した後、培地を除去し、ニュートラルレッド試薬（０．２５ｍｇ／ｍｌ、和光純薬工業株式会社）を最終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように細胞に加えた。３７℃で２時間インキュベーションした後、細胞を１％ Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／１％ ＣａＣｌ２の混合液で２回洗い、次に１％ ＣＨ３ＣＯＯＨ／５０％ ｅｔｈａｎｏｌを含む脱色抽出液を１ｍＬ細胞に加え、３０分静置した。上清を吸光光度計（ＵＶ ｍｉｎｉ １２４０）を用いて５４０ｎｍで測定し、コントロールの吸光度を１００％とした際の割合を算出した。
【００４１】
ＨＰＡを添加して培養した検討から得た結果を図１に、ＡＣＡを添加して培養した検討から得た結果を図２に、それぞれ示す。当該結果から、ＨＰＡ及びＡＣＡは、ヒトケラチノサイトの増殖を促進する効果を有することが分かった。このことから、ＨＰＡ及びＡＣＡは、表皮部分の再生を促進する効果を有することが分かった。
【００４２】
光（紫外線）による角化細胞損傷抑制能の検討
ヒトケラチノサイト（ＨａＣａT細胞）数を１.０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整して、直径３５ｍｍのプラスチックシャーレ（株式会社グライナー・ジャパン）に１.０×１０５ｃｅｌｌｓずつ播種し、被験化合物（ＨＰＡ又はＡＣＡ）を各種濃度となるように添加した培地中で、３時間培養を行った。被験化合物を添加した培地を用いて培養した細胞と、被験化合物を添加しない培地を用いて培養した細胞とに、それぞれ、ＵＶを２０μＷ、６０秒間（１２０ｍＪ）照射した。細胞損傷の測定方法として、（i）蛍光顕微鏡による観察法と（ii）上記「角化細胞増殖促進能の検討」で用いたように、ニュートラルレッド試薬を用いて吸光度を測定し、コントロールの吸光度を１００％とした際の割合を算出する方法を用いた。当該（i）の方法では、上記ＵＶ照射後３０分後に、各培地に細胞浸透性蛍光プローブ２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（２’，７’−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＨ−ＤＡ））を加えてさらに３０分間培養を続けた。培地を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄後、カバーガラスをかけて蛍光顕微鏡下で観察し、写真撮影を行った。結果を図３に示す。なお、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて測定する蛍光の強さは、活性酸素量を反映する。一方、当該（ii）の方法では、上記ＵＶ照射後、さらに１時間培養し、上記「角化細胞増殖促進能の検討」と同様にして吸光度を測定し、コントロールの吸光度を１００％とした際の割合を算出した。結果を図４に示す。なお、何れの方法においても、被験化合物を添加せずに培養し、ＵＶも照射していないものを、コントロールとして用いた。
【００４３】
これらの結果からＨＰＡ及びＡＣＡは、光（紫外線）による角化細胞の損傷を抑制又は回復させる効果を有することが分かった。
【００４４】
〔真皮に対する作用の検討〕
コラーゲン産生促進能の検討
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（CCD-1059SK、DSファーマバイオメディカル株式会社）を、10% FBS（fetal bovine serum）を含むDMEM培地で3〜6回継代培養した。次いで、細胞数が1 x 106個になるようにカルチャースライド（Culture slide: Falcon社製）に調整し、10% FBSを含むDMEM培地で24時間培養して、細胞をスライドに固定させ、更に、細胞周期を合わせるためにDMEM培地のみで24時間培養した。その後、10% FBSを含むDMEM培地に交換し、同時に被験化合物（ＨＰＡ又はＡＣＡ）を添加し、24時間培養して、以下に示す各サンプル群を調製した。なお、コントロールとして被験化合物を添加しない群も調製した。
〈サンプル群〉
サンプル１）コントロール（化合物無添加）
サンプル２）ＨＰＡ０．１μＭ添加
サンプル３）ＨＰＡ１．０μＭ添加
サンプル４）ＡＣＡ０．１μＭ添加
サンプル５）ＡＣＡ１．０μＭ添加
【００４５】
そして、次の手順により、コラーゲンの産生量を免疫組織化学的に解析した。
【００４６】
カルチャースライドをPBS溶液で5分間、3回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒド溶液を添加して4℃で一晩静置し、サンプルを固定した。0.1％Triton-Xを含むPBS溶液で5分間、3回洗浄後、3% H2O2溶液で5分間、内因性peroxidaseのブロッキングを行った。次いで、10% 標準ヤギ血清（normal goat serum）を用いて5分間、非特異的反応のブロッキングを行った。その後、抗ラットI型コラーゲン抗体（Anti-rat type I collagen 抗体（LSL社製）200倍希釈液）を用いて一次抗体の反応を60分間行った。PBS溶液で5分間、3回洗浄した後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Biotinylated Goat anti-rabbit immunogloblins抗体（DAKO社製）400倍希釈液）を用いて二次抗体の反応を30分間行った。PBS溶液で5分間、3回洗浄した後、酵素溶液（Streptavidine/HRP (DAKO社製)400倍希釈液）による反応を30分間行った。PBS溶液で5分間、3回洗浄した後、DAB（3,3’-diaminobenzidin tetrahydrocheloride）溶液を5分間反応させ、peroxidase発色反応を行った。PBS溶液で5分間、3回洗浄した後、水溶性封入剤で封入して、標本を作製した。得られた標本における陽性反応（I型コラーゲンの発現）箇所における染色強度について画像解析を行った。
【００４７】
以上のようにして得られたヒト由来線維芽細胞のＩ型コラーゲン染色像を図５に示す。また、染色強度の解析結果を表１に示す。表中の強度の値は、コントロールを100としたときの各サンプルの染色強度（1スライドにつき細胞20個について測定し、平均した値）の割合として表したものである。
【００４８】
【表１】
2013193994.tif 000009
【００４９】
図３及び表１より、HPA（サンプル２及び３）は、コントロール（サンプル１）と比較するとコラーゲンの産生量が顕著に向上していることが確認できた。また、ACA（サンプル４及び５）も同様にコラーゲンの産生量が顕著に向上していることが確認できた。これらの結果から、ＨＰＡ及びＡＣＡは、いずれも、コラーゲン産生促進能を有することが分かった。
【００５０】
線維芽細胞増殖促進能の検討
上記「コラーゲン産生促進能の検討」と同様にしてヒト正常皮膚由来線維芽細胞を24時間培養した。そして、上記「角化細胞増殖促進能の検討」と同様に、ニュートラルレッド試薬を細胞に加え、吸光度を測定して、コントロールの吸光度を１００％とした際の割合を算出した。ＨＰＡを添加して培養した場合の結果を図６に示す。当該結果から、ＨＰＡは線維芽細胞増殖促進作用も有することが分かった。
【図１】
2013193994.tif 000010
【図２】
2013193994.tif 000011
【図３】
2013193994.tif 000012
【図４】
2013193994.tif 000013
【図５】
2013193994.tif 000014
【図６】
2013193994.tif 000015