(57)【要約】【課題】二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスを基質として２-プロパノールを生合成する微生物を提供する。【解決手段】アセトバクテリウム属の細菌に、（ａ）アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase）をコードする外来性遺伝子、（ｂ）アセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase）をコードする外来性遺伝子、（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）をコードする外来性遺伝子、及び（ｄ）二級アルコール デヒドロゲナーゼ（Secondary alcohol dehydrogenase）をコードする外来性遺伝子を導入する。【選択図】図２
2013042701.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスから２-プロパノールを生産する組換え微生物であって、
上記ガスからアセチル-ＣｏＡを生成する経路をもつ宿主微生物に、アセチル-ＣｏＡから２-プロパノールを生成する代謝経路を発現させる遺伝子が導入されていることを特徴とする２-プロパノールを生産する組換え微生物。
【請求項２】
アセトバクテリウム属の細菌に、以下の（ａ）〜（ｄ）の遺伝子が導入されてなる形質転換体。
（ａ）アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase）をコードする外来性遺伝子
（ｂ）アセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase）をコードする外来性遺伝子
（ｃ）アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）をコードする外来性遺伝子
（ｄ）二級アルコール デヒドロゲナーゼ（Secondary alcohol dehydrogenase）をコードする外来性遺伝子
【請求項３】
請求項２において、
アセトバクテリウム属の細菌はアセトバクテリウム・ウッディである形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二酸化炭素及び水素を含むガス、一酸化炭素及び水素を含むガスから２-プロパノールを生産するように操作された微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境保全や経済収支の観点からバイオマス由来のプロピレンが注目されている。バイオマスからのプロピレン製造に関しては、既にＡＢＥ（アセトン-ブタノール-エタノール）発酵産物からプロピレンの直接原料となる２-プロパノールが得られることが報告されている。しかし、微生物の野生株による２-プロパノール単独の生産はこれまでに報告されておらず、２-プロパノールを単独で生産する微生物を自然界から見いだすことは難しい。
【０００３】
一方、近年急速に発展した合成代謝工学的アプローチにより２-プロパノール生産菌の育種が可能となりつつある。例えば、特許文献１には、組換え大腸菌による２-プロパノール発酵生産について記載されている。それは、バイオマス糖質から２-プロパノールを生成するために必要な遺伝子（群）を、その代謝経路を持たない大腸菌に人為的に導入するというものである。この組換え大腸菌を用い、好気培養によってグルコースから２-プロパノールを生産したところ、対糖収率が０．４３％(mol/mol)であったと報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１１−５０００３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでは２-プロパノールの生産における基質としては、通常、糖質が想定されている。草本バイオマス中に多く含まれるセルロース、ヘミセルロースは、加水分解することによりグルコース、またはキシロース、アラビノースなどの単糖とすることができる。上述の組換え大腸菌による２-プロパノール生産も基質はグルコースである。
【０００６】
しかし、バイオマスには、タンパク質、脂質、リグニンなどの糖質以外の有機物も多く含まれており、これらは上記組換え大腸菌による２-プロパノールの生産には利用することができない。さらに、セルロース系バイオマス以外にも家畜糞尿、下水汚泥など非糖質のバイオマス資源も多く存在している。従って、糖質のみを利用した従来の技術では、用いることができる資源が大きく限定される。
【０００７】
そこで、本発明は、様々なバイオマスを利用することができるように、二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスを基質とする２-プロパノールの微生物生産プロセスを提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく研究を重ね、Woods-Ljungdahl経路（アセチル-ＣｏＡ経路）を利用すれば、二酸化炭素と水素とを含むガスのみならず、一酸化炭素と水素とを含むガス（例えば、合成ガス）を基質として、２-プロパノールの微生物生産を行なうことが可能になることに着目し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、ここに開示する２-プロパノール生産能を有する組換え微生物は、二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスからアセチル-ＣｏＡを生成する経路をもつ宿主微生物に、アセチル-ＣｏＡから２-プロパノールを生成する代謝経路を発現させる遺伝子が導入されていることを特徴とする。
【００１０】
＜Woods-Ljungdahl経路＞
図１はWoods-Ljungdahl経路を示す。この経路の特徴は、２分子のＣＯ２から１分子のアセチル-ＣｏＡが生成される点である。図１の左側の反応系ではＣＯ２のメチル基への還元が触媒され、右側の反応系ではＣＯ２の活性型ＣＯへの還元が触媒されている。最後にメチル基、活性型ＣＯ及びＣｏＡが結合してアセチル-ＣｏＡが生成される。アセチル-ＣｏＡから最終的に酢酸を生産し、アセチル-ＣｏＡのリン酸化によってＡＴＰを生産することができる。ＣＯ２の活性型ＣＯへの還元反応はＣＯデヒドロゲナーゼにより触媒され、メチル基とＣｏＡを結合する反応はアセチル-ＣｏＡシンターゼにより触媒される。左側反応系に示すように水性ガスシフト反応を利用することにより、Ｈ２-ＣＯ２ガスに代えて合成ガスを用いることができる。また、アセチル-ＣｏＡ経路をもつ酢酸生産菌の中にはガス基質としてＣＯを利用できるものも知られている。
【００１１】
＜２-プロパノール代謝経路＞
図２はＨ２-ＣＯ２ガス基質から２-プロパノールを生産する代謝経路を示す。すなわち、まず、図１のWoods-Ljungdahl経路によりＨ２-ＣＯ２ガス基質からアセチル-ＣｏＡが合成される。
４ＣＯ２＋８Ｈ２＋２ＨＳ-ＣｏＡ  →  ２ＣＨ３ＣＯ-Ｓ-ＣｏＡ＋６Ｈ２Ｏ
ついで、ＡＢＥ発酵菌がもつ遺伝子群によって２-プロパノールが生産される。
２ＣＨ３ＣＯ-Ｓ-ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ２  →  ＣＨ３ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ３
＋ＣＯ２＋２ＨＳ-ＣｏＡ
【００１２】
具体的にはアセチル-ＣｏＡからアセトアセチル-ＣｏＡへの反応がアセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase）（別名；チオラーゼ（Thiolase））によって触媒され、アセトアセチル-ＣｏＡからアセトアセテートへの反応がアセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase）によって触媒され、アセトアセテートからアセトンへの反応がアセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）によって触媒され、アセトンから２-プロパノールへの反応が二級アルコール デヒドロゲナーゼ（Secondary alcohol dehydrogenase）（別名イソプロパノール デヒドロゲナーゼ）によって触媒される。
【００１３】
全体の反応は次のとおりになる。
３ＣＯ２＋９Ｈ２  →  ＣＨ３ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ３＋５Ｈ２Ｏ
比較としてグルコースからの２-プロパノール合成反応を示すと次のようになる。
Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋Ｈ２Ｏ  →  ＣＨ３ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ３＋３ＣＯ２＋３Ｈ２
【００１４】
グルコースからの２-プロパノール合成反応の場合、余剰の還元力として水素が放出される。水素の発生は微生物の代謝をかく乱するため、好気培養によって余剰の還元力を消去する必要があり、生産物収率が低下する原因となる。これに対して、本発明に係る２-プロパノール生産では、異化された基質のすべてが２-プロパノールに変換されるので、従来の糖を基質とした２-プロパノール生産よりも効率が高くなりうる。
【００１５】
＜宿主微生物＞
図２の代謝経路を構築するためのプラットフォームとなるのは、Woods-Ljungdahl経路を持つ微生物、例えば、中温菌であれば、クロストリジウム属のクロストリジウム・オートエタノゲナム（Clostridium autoethanogenum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）、アセトバクテリウム属のアセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、その他にオキソバクター・フェニジイ（Oxobacter pfennigii）、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcus productus）、ユーバクテリウム・リモーサム（Eubacterium limosum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、クロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）があげられ、好熱性菌であれば、モーレラ属のモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（M.thermoautotrophica）や、デスルホトマクルム・クズネツォビイ（Desulfotomaculum kuznetsovii）などのホモ酢酸菌と呼ばれる微生物群があげられる。
【００１６】
＜外来性遺伝子＞
これらの微生物を宿主として、図２に列挙している、アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase）をコードする外来性遺伝子、アセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase）をコードする外来性遺伝子、アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）をコードする外来性遺伝子、並びに二級アルコールデヒドロゲナーゼ（Secondary alcohol dehydrogenase）をコードする外来性遺伝子の４遺伝子を導入して、たんぱく質発現をさせることにより、Ｈ２-ＣＯ２ガス又は合成ガスから２-プロパノールを生産する２-プロパノール生産菌が得られる。
【００１７】
上記４遺伝子が導入された微生物が２-プロパノール生成能を有する限り、上記４遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は限定されない。
【００１８】
上記４遺伝子は、例えば、ブタノール・イソプロパノール発酵菌として知られるクロストリディウム属細菌、クロストリジウム  ベージェリンキー（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム  オウランティブチィリカム（Clostridium aurantibutyricum）などが保有し、これらの菌から取得することができる。
【００１９】
また、ブタノール・アセトン発酵を行なうクロストリジウム・アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカム（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム・サッカロアセトブチィリカム（Clostridium saccharoacetobutylicum）、クロストリジウム・パスツーリアウム（Clostridium pasteurianum）、クロストリジウム・スポロゲンズ（Clostridium sporogenes）、クロストリジウム・カダベリス（Clostridium cadaveris）、クロストリジウム・テタノモルフュウム（Clostridium tetanomorphum）等のクロストリジウム属細菌は、アセチル-ＣｏＡからアセトンを生産するまでの３ステップの酵素をコードする遺伝子を有することが知られている。
【００２０】
また、サーモアナエロバクター・エサノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）、サーモアナエロバクター・テングコンゲネシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）、サーモアナエロバクター・ブロッキー（Thermoanaerobacter brockii）、サーモシナス・カルボキシディボランス（Thermosinus carboxydivorans）、メタノサシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）など細菌は、第４ステップ（アセトン→２-プロパノール）の酵素をコードする遺伝子を有することが知られている。
【００２１】
従って、ブタノール・イソプロパノール発酵菌由来の遺伝子に代えて、或いはこれらと共に、上記ブタノール・アセトン発酵を行なうクロストリジウム属細菌由来の遺伝子や、サーモアナエロバクター エサノリカス等由来の遺伝子を組み合わせて用いることもできる。
【００２２】
好ましいのは、クロストリジウム・アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する、アセチル-ＣｏＡからアセトンを生産するまでの３ステップの酵素をコードする各遺伝子と、サーモアナエロバクター・エサノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）に由来する上記第４ステップの酵素をコードする遺伝子とを使用することである。
【００２３】
これらの遺伝子は、中温菌であるClostridium属細菌ゲノムなどからクローニングすることができる。
【００２４】
本発明では、
アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを用い、
アセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡを用い、
アセトアセテート デカルボキシラーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡを用い、
二級アルコール デヒドロゲナーゼをコードする外来性遺伝子として、配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡを用いるのが好ましい。
【００２５】
配列番号１〜３の塩基配列のＤＮＡは、クロストリジウム・アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）に由来する遺伝子である。配列番号４の塩基配列のＤＮＡは、サーモアナエロバクター・エサノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）に由来する遺伝子である。
【００２６】
＜遺伝子増幅＞
上述の種々の微生物由来の遺伝子の配列をＰＣＲ（polymerase chain reaction）法により増幅する。ＰＣＲ法は、公知のＰＣＲ装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用することができる。ＰＣＲのサイクルは、公知の技術にしたがって行なわれてよく、例えば、変性、アニーリング、伸張を１サイクルとし、通常１０〜１００サイクル、好ましくは、約２０〜５０サイクルである。ＰＣＲの鋳型として、上述の２-プロパノール代謝経路の酵素活性を示す微生物から単離したＤＮＡを用い、各遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができる。ＰＣＲ法によって得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターに導入することができる。クローニング法としては、商業的に入手可能なＰＣＲクローニングシステムなどを使用することができる。
【００２７】
＜シャトルベクターの構築＞
各遺伝子のＰＣＲ産物を大腸菌等に由来するベクターに組込む。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。ＰＣＲ産物とベクターとを反応させた後、このＰＣＲ産物が組み込まれたベクターを用いて大腸菌を形質転換する。この形質転換にはコンピテントセルによる化学的遺伝子導入法を用いることができる。この形質転換された大腸菌を培養し、培養物からプラスミドＤＮＡを抽出する。このようにして上記４遺伝子各々を単独でもつプラスミドを得た後、これらプラスミドから当該４遺伝子が融合した２-プロパノール生合成遺伝子群オペロンを作成する。このオペロンを大腸菌と宿主微生物とのシャトルベクターに組み込む。
【００２８】
＜形質転換＞
上記４遺伝子を含むシャトルベクターの宿主微生物への導入は、例えば、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーションなどの公知の方法で行うことができる。得られた形質転換体は、微生物の培養に通常使用される培地を用い嫌気条件下で培養すればよい。この培地としては、通常、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等を用いることができる。
【００２９】
＜２-プロパノールの生産＞
上記の如くして得られる培養物から回収分離された形質転換体の培養菌体又はその菌体処理物は、嫌気条件下で２-プロパノール生成反応に供せられる。すなわち、有機汚泥、糞尿、厨芥、木材、その他のバイオマスから発酵或いは熱化学的な方法により得た水素−二酸化炭素含有ガス、或いは水素−一酸化炭素含有ガスを原料として２-プロパノールを生産することができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、二酸化炭素及び水素を含むガス、又は一酸化炭素及び水素を含むガスからアセチル-ＣｏＡを生成する経路をもつ宿主微生物に、アセチル-ＣｏＡから２-プロパノールを生成する代謝経路を発現させる遺伝子群を導入したから、タンパク質、脂質、リグニンなどの糖質以外の有機物も原料として利用することができ、様々なバイオマスを利用した２-プロパノールの効率的な生産を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Woods-Ljungdahl経路を示す図である。
【図２】Ｈ２-ＣＯ２ガス基質から２-プロパノールを生産する代謝経路を示す図である。
【図３】アセトバクテリウム・ウッディ株の増殖特性を示すグラフ図である。
【図４】シャトルベクターｐＩＫＭ１を示す図である。
【図５】形質転換候補株TotalＤＮＡ中のカナマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ結果を示す図（電気泳動写真）である。
【図６】形質転換候補株TotalＤＮＡ中のプラスミドによる大腸菌の再形質転換試験結果を示す図（電気泳動写真）である。
【図７】エレクトロポレーション緩衝液中のＭｇＣｌ２濃度の形質転換効率に及ぼす影響を示すグラフ図である。
【図８】アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を持つプラスミドを示す図である。
【図９】アセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子を持つプラスミドを示す図である。
【図１０】アセトアセテート デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を持つプラスミドを示す図である。
【図１１】二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を持つプラスミドを示す図である。
【図１２】アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼとアセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼの融合遺伝子を持つプラスミドを示す図である。
【図１３】アセトアセテート デカルボキシラーゼと二級アルコールデヒドロゲナーゼの融合遺伝子を持つプラスミドを示す図である。
【図１４】２-プロパノール生合成遺伝子群オペロンを示す図である。
【図１５】２-プロパノール生合成遺伝子群導入プラスミドを示す図である。
【図１６】２-プロパノール生合成遺伝子群を組込んだｐＩＫＭ１のＥｃｏＲＩ処理後の電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【００３３】
本実施形態では、水素-二酸化炭素資化性酢酸生成菌宿主株として中温性ホモ酢酸生成菌であるアセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii ATCC29683）を用いた。
【００３４】
１．アセトバクテリウム・ウッディ株の増殖特性
[基本培地の調製]
培養にはクロストリジウム・リュングダリイ( Clostridium ljungdahlii)に用いられるATCC 1754 PETC寒天培地を改変したものを基本培地として用いた。改変部分は、還元剤としてＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除き、代わりにCysteine・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏを０．３ｇ／Ｌとなるように添加した。培地作製においては、還元剤(３０ｇ／ＬのCysteine・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ)と基質(フルクトース等)を別に作製した。嫌気的に培地を調製する方法として、Hungateの方法を改変したMillerらの方法を用いた。改変型ATCC 1754 PETC寒天培地の組成を表１に、トレースエレメント溶液(Trace element solution)の組成を表２に、Wolfe's ビタミン溶液(Wolfe's Vitamin solution)の組成を表３に示す。
【００３５】
【表１】
2013042701.tif 000003
【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
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【００３８】
改変型ATCC 1754 PETC寒天培地については、ＨＣｌでｐＨ６．９に調整後、滅菌水９００ｍＬを加えた。トレースエレメント溶液については、ニトリロ三酢酸(Nitrilotriacetic acid)を溶解し、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整後、残りの試薬を添加した。最終的に全量が１Ｌとなるように滅菌水を加え、遮光して４℃で保存した。Wolfe's ビタミン溶液についても、各成分を混合し全量が１Ｌになるように滅菌水を加え、４℃で遮光保存した。
【００３９】
[フルクトース溶液(Fructose solution)の調製]
滅菌水１００ｍＬを２０分間ボイルして脱気した後、Ｎ２を注入しながら氷中で室温まで冷却後、フルクトース１０ｇを添加し、Ｎ２雰囲気下、氷中でさらに２０分間冷却した。ついで、冷却後の溶液を０．４５μｍフィルターで濾過滅菌しつつ、Ｎ２を注入した滅菌済みバイアル瓶に注入した。
【００４０】
[還元剤(Reducing Agent)の調製]
滅菌水１００ｍＬを２０分間ボイルして脱気した後、Ｎ２を注入しながら氷中で室温まで冷却後、L-Cysteine・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏを３．０ｇ添加した。その後、Ｎ２を注入しながら、さらに氷中で２０分間冷却後、その冷却された溶液を０．４５μｍフィルターで濾過滅菌し、Ｎ２を注入した滅菌済みバイアル瓶に注入した。そして、遮光保存した。
【００４１】
[培地作製]
表１の基本培地を２０分間湯浴しながら、培地が青から赤に変色するまで脱気した後、ＣＯ２を注入しながら氷中で２０分間冷却した。その後、予めＣＯ２を注入しておいた１２５ｍＬのバイアル瓶に基本培地を１８ｍＬずつ分注した。ロールチューブ法では、ここでバイアル瓶一本(１５ｍＬ)につき０．３５ｇの低温培養用寒天（ナカライテスク）を添加後、さらにＣＯ２を３分間注入した。最後にブチルゴム栓とアルミシールで密閉後、オートクレーブ（１２１℃×１５分間）した。
【００４２】
菌体接種直前にバイアル瓶一本につきフルクトース溶液１ｍＬ及び還元剤０．２ｍＬ を添加し、培地が赤い場合にはＴｉ(III)クエン酸溶液を１、２滴添加した。
【００４３】
[実験結果]
フルクトース（２ｇ／Ｌ）を炭素源とした基本培地でＯＤ６６０＝０．６になるまで培養した菌体１ｍＬを基本培地５０ｍＬに植菌し、菌体増殖をＯＤ６６０にて測定したところ、図３に示すように、アセトバクテリウム・ウッディ株は増殖遅延なく対数増殖し、培養開始から２８時間後にほぼ増殖停止した。このときのｐＨの経時変化を測定したところ、酢酸生成によりｐＨは低下し、培養開始から３５時間後にｐＨ５となった。フルクトースは完全に消費されており、さらにフルクトース濃度を上げることにより更なる菌体増殖が見込まれるが、ｐＨの過剰な低下は菌体活性の低下、ひいては継代時の増殖遅延を引き起こす可能性があることから、フルクトース濃度としては２ｇ／Ｌ程度で充分と考えられる。
【００４４】
２．アセトバクテリウム・ウッディの薬剤耐性試験
アセトバクテリウム・ウッディ(ATCC 29683)に外来性遺伝子を導入できたことを確認する手段として、アセトバクテリウム・ウッディが感受性を持つ抗生物質に対して耐性を有する遺伝子をマーカーとして、このマーカー遺伝子を目的遺伝子と同時に導入し、抗生物質存在下で増殖する抗生物質耐性株を取得する方法がある。そこで、まず、アセトバクテリウム・ウッディのいくつかの抗生物質に対する感受性を調べた。
【００４５】
[実験方法]
菌体を５０ｍＬのフルクトース含有基本培地に植菌し、ＯＤ６６０が０．５付近になったところで、その培養液を基本培地を用いて１０４倍に希釈した。ついで、表４の抗生物質を添加した１５ｍＬの基本培地(２％低温培養用寒天入り)と抗生物質を添加していない寒天培地に、上記の希釈菌体液を１ｍＬ植菌し、ロールチューブ法を実施し、寒天培地を３０℃のインキュベーターで静置培養した。
【００４６】
【表４】
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【００４７】
[実験結果]
培養開始から１週間後にコロニー形成を確認したところ、抗生物質を添加していない寒天培地ではコロニー形成が確認された。一方、抗生物質を添加したロールチューブでは全てコロニー形成を確認することができなかった。このことは、表４の抗生物質を当該濃度範囲で使用した場合、抗生物質耐性遺伝子による薬剤選択が可能であることを示している。
【００４８】
３．アセトバクテリウム・ウッディへの外来遺伝子導入試験
アセトバクテリウム・ウッディ(ATCC 29683)は多くの抗生物質に対して感受性を持つことから、それら抗生物質耐性遺伝子をマーカーとして使用できる可能性があることがわかった。そこで、以下の実験方法にてカナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとしたアセトバクテリウム・ウッディの形質転換試験を行なった。同時にエレクトロポレーションによる形質転換効率に対する菌体集菌時の菌体濃度の影響を調べた。
【００４９】
[実験方法]
大腸菌の形質転換
２-プロパノール生合成遺伝子のクローニングのために、コンピテントセルであるエシェリヒア コリ(Escherichia coli DH5α)を、ベクターとしてｐＵＣ１９プラスミド用いた化学的遺伝子導入法によって形質転換した。大腸菌の培養には、表５の基本培地を用いた。基本培地は５Ｎ-ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整後、滅菌水で１０００ｍＬにメスアップした。
【００５０】
【表５】
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【００５１】
プレート培地にすべくAgarを１０ｇ加え、オートクレーブ（１２１℃×１５分間）した。ここで、選択物質である抗生物質は、１００μｇ／ｍＬ（最終濃度）のアンピシリンか、４０〜１００μｇ／ｍＬ（最終濃度）のカルベニシリン（カルベニシリン２ナトリウム：ナカライテスク）を使用した。また、青白判定法用に０．１Ｍ（最終濃度）のＩＰＴＧ、５％（最終濃度）のＸ-Gal（Ｘ-gal ２６５ｍｇ，ＤＭＦ５ｍＬ）を培地に添加した。また、大腸菌からのプラスミドＤＮＡの分離・精製にはQuantum Prep Plasmid miniprep キット(BioRad:732-6100)を用いた。
【００５２】
アガロースゲル電気泳動
ＤＮＡ断片の長さを確認するために表６の緩衝液、表７のアガロースを用いて電気泳動を行なった。泳動後のゲルの染色には表８のエチジウムブロマイド溶液を用いた。また、ＰＣＲ産物の精製にはMagExtractor-PCR & Gel Clean Up-(TOYOBO)を用いた。
【００５３】
【表６】
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【００５４】
【表７】
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【００５５】
【表８】
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【００５６】
アセトバクテリウム・ウッディの形質転換
アセトバクテリウム・ウッディの形質転換には、図４に示す大腸菌（Ｅ.coli）由来のプラスミドであるｐＵＣ９と、クロストリジウム・アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のプラスミドであるｐＩＭ１３とを融合してなる、アセトバクテリウム・ウッディと大腸菌とのシャトルベクターであるｐＩＫＭ１プラスミドを用いた。
【００５７】
アセトバクテリウム・ウッディへの遺伝子導入はエレクトロポレーション法により以下の手順で行った。
(1) アセトバクテリウム・ウッディ菌体を５０ｍＬのフルクトース含有基本培地に植菌し、ＯＤ６６０＝０．７付近になったところで菌体１ｍＬを５０ｍＬのフルクトース含有基本培地に植え継いだ（前培養）。
(2) 菌体濃度（ＯＤ６６０）が０．３、０．５、０．７の各々になるまで培養した。
(3) 培養液を遠心加速度２２００×ｇ×１０分間，４℃の条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。その菌体を予め氷中で冷却しておいた表９のエレクトロポレーション緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬで洗浄した。上記緩衝液を、２０分間煮沸して脱気後、Ｎ２−ＣＯ２ガスを注入しながら氷中で２０分間冷却した。この冷却後の緩衝液を、予めＮ２−ＣＯ２ガスを注入しておいた１２５ｍＬのバイアル瓶に１００ｍＬずつ分注後、さらにＮ２−ＣＯ２ガスを３分間注入し嫌気性とした。
【００５８】
【表９】
2013042701.tif 000011
【００５９】
(4) 懸濁液を遠心加速度２２００×ｇで１０分間，４℃の条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。
(5) 回収された菌体を予め氷中で冷却しておいたエレクトロポレーション緩衝液（塩化マグネシウム無添加）で懸濁した。この時、ＯＤ６６０が１．０となるように調製した。
(6) ０．６ｍＬの懸濁液をエレクトロポレーションキュベット（４ｍｍＧａｐ）に添加した。
(7) 上記エレクトロポレーションキュベットにＤＮＡ（１μｇ）を加え、よく混ぜ、１．８ｋＶ、６００Ω、５０μＦの条件でエレクトロポレーションを実施した。
(8) ５０ｍＬのフルクトース含有基本培地にエレクトロポレーション後の菌体溶液を加え、３０℃で２４時間培養を行った。
(9) ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１５ｍＬのフルクトース含有基本培地（２％低温培養用寒天入り）に培養液を１ｍＬ植菌し、ロールチューブ法により培養した。
【００６０】
[実験結果]
遺伝子導入実験の結果、選択マーカーとしてカナマイシンを添加したロールチューブ寒天培地上に形質転換株と考えられるコロニーが形成された。その効率は、表１０に示すように集菌時菌体濃度によって大きく変化した。集菌時ＯＤ６６０が０．３であるときに、最も高いコロニー形成効率（２．５×１０１cfu／μｇＤＮＡ）が得られた。しかし、集菌時の菌体濃度の上昇につれて効率は低下し、ＯＤ６６０が０．７のときには、形質転換株は得られなかった。このことから、形質転換に使用する菌体は対数増殖初期のＯＤ６６００．３以下が適当と考えられる。
【００６１】
【表１０】
2013042701.tif 000012
【００６２】
４．形質転換候補株への外来遺伝子導入の確認
上記実験で得られたアセトバクテリウム・ウッディ形質転換候補株に実際にプラスミドが導入されていることを確認するため、ランダムに選択したアセトバクテリウム・ウッディ形質転換候補株からTotalＤＮＡを抽出し、ｐＩＫＭ１のカナマイシン耐性遺伝子ＰＣＲ試験、大腸菌への再形質転換試験を行なった。
【００６３】
＜形質転換候補株への外来遺伝子導入のＰＣＲ増幅による確認＞
[実験方法]
アセトバクテリウム・ウッディ ゲノムＤＮＡの抽出
(1) 上記遺伝子導入試験で得られたコロニーを５ｍＬの基本液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍＬ）にて培養した。
(2) ２ｍＬの培養液を遠心加速度１４０００×ｇで１分間，４℃の条件で集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。回収した菌体に、１ｍＬのＴＥ-bufferに溶解された２０ｍｇのアクロモペプチダーゼと、１ｍＬのＴＥ-bufferに溶解された２０ｍｇのリゾチームとをそれぞれ９０μＬ入れて混合し、３０℃で１０分間静置した。
(3) NucleoSpin(登録商標)Tissue (Cat.No. 740 952.50)を用いて、菌体からTotalＤＮＡ抽出をした。
【００６４】
TotalＤＮＡ中のカナマイシン耐性遺伝子の確認
形質転換候補株ＤＮＡにおいて、形質転換前には存在しないカナマイシン耐性遺伝子を確認するために、表１１乃至表１３の条件でＰＣＲを行った。
【００６５】
【表１１】
2013042701.tif 000013
【００６６】
【表１２】
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【００６７】
【表１３】
2013042701.tif 000015
【００６８】
[実験結果]
形質転換候補株から得られたTotalＤＮＡに対するカナマイシン耐性遺伝子のＰＣＲ増幅結果を図５に示す。同図によれば、カナマイシン耐性遺伝子と考えられる位置にＤＮＡのバンドが検出されており、アセトバクテリウム・ウッディ（A. woodii）形質転換候補株にカナマイシン耐性遺伝子が導入されていることが示唆されている。
【００６９】
＜大腸菌の再形質転換試験による形質転換候補株への外来遺伝子導入の確認＞
ここで、アセトバクテリウム・ウッディ形質転換候補株がｐＩＫＭ１を持っていればそこから抽出したTotalＤＮＡにより大腸菌は形質転換され、ｐＩＫＭ１がクローニングされるはずである。そこで、上記形質転換候補株から抽出したTotalＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ-５αコンピテントセルを形質転換した。具体的には、−８０℃のディープフリーザーからコンピテントセルを取り出して掌の温度で融かし、１０分間氷冷し、コンピテントセル１００μＬに表１１の反応液を１０μＬ入れてピペッティングし、３０分間氷冷し、その後４２℃×９０秒のヒートショック後、１分間氷冷し、氷冷後の溶液全量を８００μＬのＳＯＣ培地に加え、３７℃で４５分間保持後、１％のアガロース及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地のプレートに２０μＬの培養液を植菌し、３７℃で１４時間の静置培養を行なった。
【００７０】
[実験結果]
再形質転換の結果、全てのtotalＤＮＡにおいて、形質転換されたと考えられる大腸菌コロニーが見られた。そこで、コロニーを５ｍＬの２×ＹＴ液体培地 (アンピシリン１００μｇ／ｍＬ)に植菌し、３７℃で一晩静置した後、Quantum Prep(登録商標)Plasmid miniprep kit を用いてプラスミドを抽出し、そのプラスミドをＥcoＲＩで切断し、電気泳動で確認した。その結果、図６に示すように、確かにプラスミドと考えられるＤＮＡバンドが見られ、候補株１，２ではｐＩＫＭ１標品と同一の高さにバンドが見られた。これは、候補株がｐＩＫＭ１を菌体内に実際に有していたことを示唆する。一方、候補株３ではｐＩＫＭ１標品とは異なる位置にＤＮＡバンドが見られた。これは、ｐＩＫＭ１に何らかの挿入変異が起きたことを示唆している。
【００７１】
以上の結果から、今回行なった条件下でエレクトロポレーション法により、ｐＩＫＭ１が実際にアセトバクテリウム・ウッディに導入されていることが確認された。
【００７２】
５．形質転換効率に及ぼすエレクトロポレーション緩衝液中のＭｇＣｌ２濃度の影響
エレクトロポレーション法によりｐＩＫＭ１をアセトバクテリウム・ウッディに導入できることがわかったので、さらに形質転換効率を向上させるために、エレクトロポレーション用緩衝液中に含まれるＭｇＣｌ２濃度の形質転換効率に及ぼす影響を検討した。集菌時ＯＤ６６０を０．３とし、洗浄も含めＭｇＣｌ２濃度を変更した緩衝液を用い、それ以外は先と同様の方法で形質転換を行なった。結果を図７に示す。ＭｇＣｌ２濃度は形質転換効率に大きな影響を及ぼし、ＭｇＣｌ２濃度３５ｍＭのとき、４．０×１０１cfu／μｇＤＮＡの最大形質転換効率が得られた。ＭｇＣｌ２濃度を最適化すると、ＭｇＣｌ２濃度を最適化していない場合と比較して約２倍の形質転換効率が得られる。
【００７３】
６．アセトバクテリウム・ウッディへの遺伝子導入試験のまとめ
(1) アセトバクテリウム・ウッディ（A.Woodii ATCC 29683）株を宿主とし、クロストリジウム・アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum ATCC 824）株由来のプラスミドであるｐＩＫＭ１をベクターとするエレクトロポレーション法による遺伝子組換え系を構築した。
(2) 上記宿主-ベクター系において集菌菌体濃度をＯＤ６６０＝０．３とし、エレクトロポレーション緩衝液中のＭｇＣｌ２濃度を３５ｍＭとした時、４．０×１０１cfu／μｇＤＮＡの最大形質転換効率が得られた。
【００７４】
２-プロパノール生合成遺伝子を組込んだプラスミドの構築
上述の通り、中温性水素-二酸化炭素資化性菌への遺伝子導入が可能であることがわかったので、ｐＩＫＭ１に２-プロパノール生合成遺伝子を組込んだプラスミドの構築を行なった。
【００７５】
図２に示すように２-プロパノール生合成に必要な酵素遺伝子は４つあり、クロストリジウム・アセトブチィリカム（Clostridium acetobutylicum ATCC 824）から３つの遺伝子、すなわち、(1) アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase）、(2) アセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase）及び(3) アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）を、サーモアナエロバクター・エサノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus 39E ATCC33223）から(4) 二級アルコールデヒドロゲナーゼ（Secondary alcohol dehydrogenase）を単独でクローニング後、シャトルベクターｐＩＫＭ１に連結して組込んだ。
【００７６】
１．連結可能な２-プロパノール生合成遺伝子のクローニング
４つの２-プロパノール生合成遺伝子を連結してｐＩＫＭ１に導入するためには、連結すべき遺伝子同士が、連結方向に従って同じ制限酵素サイトを持っていればよい。そこで、４つの遺伝子を上記(1)から(4)の順番で連結することができるように、制限酵素サイトを付加した遺伝子増幅プライマーを以下のように設計し、表１１に示す反応液を用い表１４に示す条件でＰＣＲ増幅後、大腸菌にクローニングした。
【００７７】
【表１４】
2013042701.tif 000016
【００７８】
表１５はアセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase）遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーＦ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase gene-F）はアニーリングサイトに制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加してなり、プライマーＲ（Acetyl-ＣｏＡ acetyltransferase gene-R）はアニーリングサイトに制限酵素ＥｃｏＲＩサイト及びＸｈｏＩサイトを付加してなる。
【００７９】
【表１５】
2013042701.tif 000017
【００８０】
配列番号１はアセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼの遺伝子配列を示す。１塩基から２７塩基まで、並びに１３７６塩基から１３９９塩基までがそれぞれプライマー結合位置である。遺伝子発現のために、７４塩基から７９塩基までのプロモータ配列「ttgata」、９７塩基から１０２塩基までのプロモータ配列「tataat」、１９６塩基から２０１塩基までのＳＤ配列「aggagg」を有する。
【００８１】
表１６はアセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase）遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーＦ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase gene-F）はアニーリングサイトに制限酵素ＸｈｏＩサイトを付加してなり、プライマーＲ（Acetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferase gene-R）はアニーリングサイトに制限酵素ＸｈｏＩサイト及びＢｇｌIIサイトを付加してなる。
【００８２】
【表１６】
2013042701.tif 000018
【００８３】
配列番号２はアセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼの遺伝子配列を示す。１塩基から１８塩基まで、並びに１２３０塩基から１２４５塩基までがそれぞれプライマー結合位置であり、１塩基から６塩基までにＳＤ配列「aggagg」を有する。これは、１４塩基から６７０塩基までがAcetoacetyl CoA:acetate/Butyrate:CoA transferaseのサブユニットＡをコードし、６７２塩基から１３３７塩基までがサブユニットＢをコードしているオペロンである。
【００８４】
表１７はアセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーＦ（Acetoacetate decarboxylase gene-F）はアニーリングサイトに制限酵素ＢｇｌIIサイトを付加してなり、プライマーＲ（Acetoacetate decarboxylase gene-R）はアニーリングサイトに制限酵素ＢｇｌIIサイト及びＢａｍＨＩサイトを付加してなる。
【００８５】
【表１７】
2013042701.tif 000019
【００８６】
配列番号３はアセトアセテート デカルボキシラーゼの遺伝子配列を示す。１塩基から２４塩基まで、並びに７４６塩基から７７３塩基までがそれぞれプライマー結合位置であり、１４塩基から２０塩基までにＳＤ配列「aggaagg」を有する。
【００８７】
表１８は二級アルコール デヒドロゲナーゼ（Secondary alcohol dehydrogenase）遺伝子増幅プライマーの構成を示す。プライマーＦ（Secondary alcohol dehydrogenase gene-F）はアニーリングサイトに制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加してなり、プライマーＲ（Secondary alcohol dehydrogenase gene-R）はアニーリングサイトに制限酵素ＢａｍＨＩサイト及びＥｃｏＲＩサイトを付加してなる。
【００８８】
【表１８】
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【００８９】
配列番号４は二級アルコール デヒドロゲナーゼの遺伝子配列を示す。１塩基から２２塩基まで、並びに１０５０塩基から１０７４塩基までがそれぞれプライマー結合位置であり、１塩基から６塩基までにＳＤ配列「aggagg」を有する。
【００９０】
２．２-プロパノール生合成遺伝子群を導入したシャトルベクターの構築
クローニングした２-プロパノール生合成遺伝子群を以下の手順で、シャトルベクターｐＩＫＭ１に導入した。まず、４種類の各遺伝子のＰＣＲ産物をMagExtractor-PCR & Gel Clean Up-(TOYOBO)を用いて精製した。ついで、大腸菌用ベクターｐＵＣ１９に対してＳｍａＩ処理（３０℃×１時間）を行ない、MagExtractor-PCR & Gel Clean Up- (TOYOBO)を用いて精製した。さらに、ＳｍａＩ処理後のｐＵＣ１９をベクターとし、それぞれの遺伝子のＰＣＲ産物をインサートとし、１μＬのベクター、９μＬのインサート、１０μＬのLigation Mix (TaKaRa)を混合して１６℃で１時間ライゲーション反応させたのち、反応後のプラスミドを用いてコンピテントセル（ＤＨ−５α）を形質転換し、図８〜図１１に示すそれぞれ単独遺伝子を持つ４種類のプラスミドを得た。
【００９１】
次いで、アセチル-ＣｏＡ アセチルトランスフェラーゼ（Acetyl-CoA acetyltransferase）遺伝子とアセトアセチル-ＣｏＡ：酢酸/酪酸：CoA-トランスフェラーゼ（Acetoacetyl-CoA:acetate butyrate:CoA-transferase）遺伝子とが連結した融合遺伝子を作製するために以下の操作を行なった。
【００９２】
ｐＵＣ１９-Acetyl-CoA acetyltransferase gene をＸｈｏＩにより処理（３７℃×２時間）した後に、MagExtractor-PCR & GelClean Up- (TOYOBO)を用いて精製した。さらに、ｐＵＣ１９-Acetoacetyl-CoA:acetate butyrate:CoA-transferase gene を、Ｍ−１３プライマー（M13-F: GTTTTCCCAGTCACGAC、M13-R:CAGGAAACAGCTATGAC）によりＰＣＲ増幅した後、得られたＰＣＲ産物をMagExtractor-PCR & Gel Clean Up-(TOYOBO)を用いて精製した。ついで、ＸｈｏＩ処理後のｐＵＣ１９-Acetyl-CoA acetyltransferase geneをベクター、ＰＣＲ産物をインサートとし、１μＬのベクター、９μＬのインサート、１０μＬのLigation Mix (TaKaRa)を混合し１６℃で１時間ライゲーション反応させたのち、反応後のプラスミドをコンピテントセル（ＤＨ−５α）に導入し、図１２に示す目的プラスミドをクローニングした。
【００９３】
アセトアセテート デカルボキシラーゼ（Acetoacetate decarboxylase）遺伝子と二級アルコールデヒドロゲナーゼ（Secondary alcohol dehydrogenase）遺伝子の融合プラスミド（図１３）も同様にして作製した。
【００９４】
同様の方法で図１４に示す４つの遺伝子が融合した２-プロパノール生合成遺伝子群オペロンをｐＵＣ１９の中に組み込んだ。そして、このオペロンをｐＩＫＭ１のＥｃｏＲＩサイトに導入することにより、図１５に示すアセトバクテリウム・ウッディ（A.woodii）への２-プロパノール生合成遺伝子群導入プラスミドを構築した。
【００９５】
図１６に２-プロパノール生合成遺伝子群を組込んだｐＩＫＭ１をＥｃｏＲＩ処理（３７℃×２時間）したときの電気泳動写真を示す。制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した場合、６．３ｋｂの位置にｐＩＫＭ１のバンドが見られ、そして、予想通り４．５ｋｂ付近に２-プロパノール生合成遺伝子のバンドが見られる。
【００９６】
３．アセトバクテリウム・ウッディの形質転換
上述のｐＩＫＭ１に２-プロパノール生合成遺伝子群を組込んでなるプラスミドを用いてアセトバクテリウム・ウッディの形質転換を行なった。この形質転換はエレクトロポレーション法により以下の手順で行った。
(1) アセトバクテリウム・ウッディ菌体を５０ｍＬのフルクトース含有基本培地に植菌し、ＯＤ６６０が０．７付近になったところで１ｍＬの培養液を５０ｍＬのフルクトース含有基本培地に植え継いだ。
(2) 菌体濃度（ＯＤ６６０）が０．３になるまで培養した後、その培養液を遠心加速度２２００×ｇで１０分間，４℃の条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。予め氷中で冷却しておいた表９のエレクトロポレーション緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍＬで洗浄した。上記緩衝液は、２０分間煮沸して脱気後、Ｎ２−ＣＯ２ガスを注入しながら氷中で２０分間冷却、予めＮ２−ＣＯ２ガスを注入しておいた１２５ｍＬのバイアル瓶に１００ｍＬずつ分注後、さらにＮ２−ＣＯ２ガスを３分間を注入し嫌気性とした。
(3) 懸濁液を遠心加速度２２００×ｇで１０分間，４℃の条件で遠心して菌体を集菌し、上清を除去し、菌体を回収した。
(4) 回収された菌体を予め氷中で冷却しておいたエレクトロポレーション緩衝液（塩化マグネシウム無添加）で懸濁した。この時、ＯＤ６６０が１．０となるように調製した。
(5) ０．６ｍＬの懸濁液をエレクトロポレーションキュベット（４ｍｍＧａｐ）に添加した。
(6) 上記エレクトロポレーションキュベットにプラスミド（１μｇ）を加え、よく混ぜ、１．８ｋＶ、６００Ω、５０μＦの条件でエレクトロポレーションを実施した。
(7) ５０ｍＬのフルクトース含有基本培地にエレクトロポレーション後の菌体溶液を加え、３０℃で２４時間培養を行った。
(8) カナマイシンを５０μｇ／ｍＬ含む１５ｍＬのフルクトース含有基本培地（２％低温培養用寒天入り）に培養液を１ｍＬ植菌し、ロールチューブ法により培養した。
【００９７】
以上により、２-プロパノール生合成遺伝子群を含むプラスミドＤＮＡを保持したアセトバクテリウム・ウッディ菌株を得た。
【００９８】
４．２-プロパノールの生産
上記の如くして得られたアセトバクテリウム・ウッディ菌株を接種したクロストリジウム・リュングダリイ( Clostridium ljungdahlii)培地（先に説明したATCC 1754 PETC寒天培地を改変したもの）２０ｍＬを滅菌済みバイアル瓶１２５ｍＬに入れ、Ｈ２-ＣＯ２ガス（Ｈ２：ＣＯ２＝２：１）を封入し、振とうしながら３７℃で３６時間培養し、培養液を作製した。
【００９９】
上記培養液を培地（ブイヨン）が入った発酵槽に移し、Ｈ２-ＣＯ２ガスを再封入した。ｐＨを７．０、温度を３０℃とし、Ｈ２-ＣＯ２ガスを循環させ、且つ発酵槽内を攪拌しながら２-プロパノール生成実験を行なった。その結果、２-プロパノールの生成が認められた。
【符号の説明】
【０１００】
なし
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2013042701.tif 000033
【図５】
2013042701.tif 000034
【図６】
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【図１６】
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【配列表】
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