(57)【要約】【課題】ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた塩基配列から４塩基ないし６塩基のＳＳＲを見出し、そのＳＳＲをマーカーとしてブナシメジの品種識別を迅速かつ高精度に行うことができる技術を提供すること。【解決手段】ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた塩基配列のうち４塩基ないし６塩基のＳＳＲマーカーを増幅できるプライマーセットを複数用いて、検査対象のブナシメジの全ゲノムに対してPCRによりＳＳＲマーカーを増幅し、品種間での多型を比較することでブナシメジの品種を識別する。【選択図】図２１
2013255466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基の反復配列の両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列であって、その反復配列の前及び後から各1配列ずつを選択したプライマーセットを設計する事を特徴とするブナシメジの品種識別に使用するプライマーセットの設計方法。
【請求項２】
ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基の反復配列の両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の任意の連続した塩基配列が、Tmが５２ないし７０の範囲の数値で設計されたことを特徴とする請求項1記載のプライマーセットの設計方法。
【請求項３】
ブナシメジの品種識別に使用するプライマーセットであって、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち、４塩基ないし６塩基の反復配列のＳＳＲ領域を増幅することができる請求項1又は請求項２に記載された方法で設計されたプライマーセット。
【請求項４】
ブナシメジの品種識別に使用するプライマーセットであって、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち、４塩基反復配列がACCT、CGTT、AGGG、AAGG、又はACGGのＳＳＲ領域を増幅することができる請求項1又は請求項２に記載された方法で設計されたプライマーセット。
【請求項５】
ブナシメジの品種識別に使用するプライマーセットであって、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち、５塩基反復配列がAGAGG、CCTCT、AACAT、ACCTC、AAACG又はATACGの ＳＳＲ領域増幅することができる請求項1又は請求項２に記載された方法で設計されたプライマーセット。
【請求項６】
ブナシメジの品種識別に使用するプライマーセットであって、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち、６塩基反復配列がGGTGTT、ACTATC、ACCAGC、CTCCTT、GGATTT、GCTGGT、CTCTGT、CCGAGT、GGCTCT又はAAGGGGのＳＳＲ領域を増幅することができる請求項1又は請求項２に記載された方法で設計されたプライマーセット。
【請求項７】
ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基の反復配列の両端からそれぞれ外側へ５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列であって、その反復配列の前及び後から各１配列ずつを選択して設計されたプライマーセットを使用して、識別対象のブナシメジの全ゲノム上からPCR法によりDNAの増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うブナシメジの品種識別方法。
【請求項８】
請求項２に記載された方法で設計されたプライマーセットを使用して、ブナシメジの品種ごとにそのオルガネラを含む全ゲノムに対してPCR法によりDNAの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することで品種の識別を行うブナシメジの品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のブナシメジ（学名：Hypsizygus marmoreus (Peck) Bigelow）の品種を識別するにあたり、任意の遺伝子座のＳＳＲ配列を増幅するためのプライマーセットの作成方法、当該作成方法により作成されたプライマーセット及び当該プライマーセットを利用したブナシメジの品種識別方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ブナシメジは料理への使い勝手の良さから消費が累増し、工業的な手法で大量栽培がされるようになった。そして、ブナシメジの実用的な品種が増加し、多様なブナシメジ品種が流通するようになったため早期の品種識別の確立をして適正な品種の流通を確保することが必要となっている。
【０００３】
きのこのゲノム配列を利用した品種識別は、例えばシイタケの品種識別が知られている（特許文献１）が、この方法は、ｒRNA遺伝子のスペーサー領域の高頻度重複配列や短い繰り返し配列等の菌株間差について、その塩基配列のシーケンスをすることで品種を識別する方法であって、シーケンスをしなければならないことで品種識別までに時間がかかり、また、シーケンスをするまでの過程が煩雑なため、別のテンプレートDNAが混入してしまい、試験結果に影響が出てしまうことが頻繁にあるという問題があった。
【０００４】
他に、エリンギの品種識別について２塩基の繰り返し配列のＳＳＲをマーカーにした技術が確立されている（特許文献２、特許文献３、非特許文献１）が、２塩基の繰り返し配列であると、フラグメント解析において誤差を生じることがあり、識別したい複数の品種が近縁である場合には、品種識別の精度が低下するという欠点があった。さらに最近では、幾つかの植物で好ましい品種識別方法として４塩基以上のＳＳＲマーカーを利用した品種識別方法が開発されてきている（例えば、特許文献４、特許文献５）。しかし、これらのマーカーはその植物のゲノムを利用するため、植物種によって特異的であった。現在までにブナシメジに利用できる品種識別方法が確立されていないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−３２５０８４号公報
【特許文献２】特開２００５−２６１２２８号公報
【特許文献３】特開２００８−１６７７６１号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１１９４４号公報
【特許文献５】特開２０１２−５５２５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】北村眞希ら、エリンギにおける品種識別のためのＳＳＲマーカー、日本きのこ学会誌、１８（１）、７−１２（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた塩基配列から４塩基ないし６塩基のＳＳＲを見いだし、そのＳＳＲを含む７０塩基ないし６００塩基の領域を増幅するためのプライマーを設計することにより、ブナシメジの品種識別を迅速かつ高精度に行うことができる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねたところ、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムを解読し、４塩基ないし６塩基の反復配列のＳＳＲを見いだして、当該ＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列から相補的な塩基配列によりプライマーセットを作成する方法、当該作成方法により作成したプライマーセット及び当該プライマーセットを用いることでブナシメジを識別する品種識別方法を発明した。
【０００９】
すなわち、請求項１に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択してなるプライマーセットの設計方法である。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択するにあたり、Tmが５２ないし７０になるか又は、最適アニーリング温度が５２℃ないし７０℃になるように塩基配列の連続数を決定するという特徴がある。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択してなるプライマーセットの設計方法により設計されたプライマーセットであるか又は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択するにあたり、Tmが５２ないし７０になるか若しくは最適アニーリング温度が５２℃ないし７０℃になるように塩基配列の連続数を決定する方法により設計されたプライマーセットであって、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち、4塩基ないし６塩基の反復配列のＳＳＲ領域を増幅することができるという特徴を有するプライマーセットである。
【００１２】
請求項４に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち、塩基配列がACCT、CGTT、AGGG、AAGG、又はACGGからなる４塩基反復配列のＳＳＲ領域を増幅することができるプライマーセットであって、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた当該４塩基反復配列のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択してなるプライマーセットの設計方法により設計されたプライマーセットであるか又は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた当該４塩基反復配列のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択するにあたり、Tmが５２ないし７０になるか若しくは最適アニーリング温度が５２℃ないし７０℃になるように塩基配列の連続数を決定する方法により設計することでブナシメジの品種識別に使用することができる特徴を有する。
【００１３】
請求項５に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち塩基配列がAGAGG、CCTCT、AACAT、ACCTC、AAACG又はATACGからなる５塩基反復配列のＳＳＲ領域を増幅することができるプライマーセットであって、ブナシメジの、オルガネラを含む全ゲノム上にコードされた当該５塩基反復配列のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択してなるプライマーセットの設計方法により設計されたプライマーセットであるか又は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた当該５塩基反復配列のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択するにあたり、Tmが５２ないし７０になるか若しくは最適アニーリング温度が５２℃ないし７０℃になるように塩基配列の連続数を決定する方法により設計することでブナシメジの品種識別に使用することができる特徴を有する。
【００１４】
請求項６に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムのうち、塩基配列がGGTGTT、ACTATC、ACCAGC、CTCCTT、GGATTT、GCTGGT、CTCTGT、CCGAGT、GGCTCT又はAAGGGGからなる６塩基反復配列のＳＳＲ領域を増幅することができるプライマーセットであって、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた当該６塩基反復配列のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択してなるプライマーセットの設計方法により設計されたプライマーセットであるか又は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた当該６塩基反復配列のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択するにあたりTmが５２ないし７０になるか若しくは最適アニーリング温度が５２℃ないし７０℃になるように塩基配列の連続数を決定する方法により設計することでブナシメジの品種識別に使用することができる特徴を有する。
【００１５】
請求項７に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基の反復配列の両端からそれぞれ外側へ５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列であって、その反復配列の前及び後から各１配列ずつを選択して設計されたプライマーセットを使用して、識別対象のブナシメジの全ゲノムに対してPCR法によりDNAの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することでブナシメジの品種の識別ができるという特徴を有する。
【００１６】
請求項８に記載の発明は、ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノム上にコードされた４塩基ないし６塩基のＳＳＲの両端からそれぞれ外側へ約５００塩基以内にある１５塩基以上の連続した任意の塩基配列を選択するにあたり、Tmが５２ないし７０になるか又は最適アニーリング温度が５２ないし７０℃になるように塩基配列の連続数を決定する方法により得られたプライマーセットを使用して、識別対象のブナシメジの全ゲノムに対してPCR法によりDNAの増幅を行い、その増幅産物の多型を比較することでブナシメジの品種の識別ができるという特徴を有する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ブナシメジのＳＳＲマーカー領域を増幅することができるプライマーセット及びそのプライマーセットを用いてブナシメジのＳＳＲマーカーを比較してなる品種識別方法が提供される。さらに、ブナシメジの品種ごとにおいてＳＳＲマーカーの増幅断片長の多型との関連づけを行うことで、多数のブナシメジ品種の品種識別を網羅的かつ容易にすることができる。そのため、優良な新品種の保護、コピー品種の不正な輸入の防止及び品種の適正な流通の確保のための有効な手段となり、ブナシメジのブランド化やブナシメジを利用した産業の発達に貢献する。
【００１８】
請求項１にかかる発明は、ブナシメジの全ゲノム上にコードされた塩基配列からＳＳＲ領域を特定したことにより、ブナシメジの品種識別に適したプライマーセットを容易に設計できることを可能とした。なお、ブナシメジの全ゲノムのうち、４塩基ないし６塩基の反復配列を本明細書の図１ないし図２０に開示した。また、ＳＳＲの塩基配列を４塩基ないし６塩基の反復配列としたことで、そのマーカー領域について当該プライマーセットを使用して増幅した場合の増幅産物において誤差が生じることがほとんどなく、精度の高いブナシメジの品種識別を可能とした。
【００１９】
請求項２にかかる発明は、プライマーの設計段階でアニーリング温度が決まるので、PCRを行うときの温度条件を設定するための試行錯誤をする必要がほとんどなくなる。また、複数のプライマーセットのアニーリング温度条件を同一にすることができるため、本願のプライマーセットを用いてブナシメジの全DNAに対してPCRを行うときに、複数のプライマーセットを同時に使用して効率よくPCRを行うこともできる。
【００２０】
請求項３ないし請求項６にかかる発明のプライマーを用いれば、ブナシメジの品種識別が高い精度で行うことができる。また、請求項３ないし請求項６にかかる発明のプライマーセットのうち複数のプライマーセットを用いることでより精度を高めたブナシメジの品種識別も可能となる。また、請求項４ないし請求項６にかかる発明は、ＳＳＲ領域を具体的に特定したことにより、品種識別が可能なマーカーの領域が特定され、それに対応したプライマーセットも開示されているため、特にプライマーセットを設計する必要がないという利便性がある。
【００２１】
請求項７及び請求項８にかかる発明は、ブナシメジの品種識別をより効率よくさらに精度が向上されたという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＳＳＲマーカーHypMS1の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図２】ＳＳＲマーカーHypMS2の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図３】ＳＳＲマーカーHypMS3の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図４】ＳＳＲマーカーHypMS4の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図５】ＳＳＲマーカーHypMS5の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図６】ＳＳＲマーカーHypMS6の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図７】ＳＳＲマーカーHypMS7の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図８】ＳＳＲマーカーHypMS8の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図９】ＳＳＲマーカーHypMS9の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１０】ＳＳＲマーカーHypMS10の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１１】ＳＳＲマーカーHypMS11の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１２】ＳＳＲマーカーHypMS12の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１３】ＳＳＲマーカーHypMS13の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１４】ＳＳＲマーカーHypMS14の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１５】ＳＳＲマーカーHypMS15の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１６】ＳＳＲマーカーHypMS16の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１７】ＳＳＲマーカーHypMS17の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１８】ＳＳＲマーカーHypMS18の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図１９】ＳＳＲマーカーHypMS19の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図２０】ＳＳＲマーカーHypMS20の周辺領域の塩基配列を示す図である（太文字は反復配列、下線はプライマーの設計のための塩基配列を示す。）。
【図２１】ブナシメジ３０品種におけるＳＳＲマーカーの増幅断片長の違いを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ブナシメジの品種識別方法、当該方法に用いるプライマーセット及び当該プライマーセットの作成方法を提供するものである。
【００２４】
本願の発明を実施する形態として以下に具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
ブナシメジのオルガネラを含む全ゲノムの塩基配列を解読し、４塩基ないし６塩基の反復配列のＳＳＲ領域を含む塩基配列を抽出する方法について例示する。
【００２６】
本実施例では、農林水産省で品種登録されているホクト白１号菌（品種登録番号：第１３２９４号）の菌糸体を使用した。当該菌糸体を凍結乾燥させホモジナイザーで粉末にしたのち、当該粉末５ｇをDNA抽出キット（Plant Geno DNA Template Kit : Geno Technology社製）を使用してDNAを抽出した。
【００２７】
抽出したDNAのうち２本鎖のDNAを５００μｇ使用して、シーケンサー（Genome Sequencer FLX+System : Roche社製）を用いて、ロシュGSFLX解析を行った。その結果、３９メガ塩基対の塩基配列を解読した。解読した塩基配列の中から品種識別に利用可能と考えられる４塩基ないし６塩基の反復配列のＳＳＲを含む周辺領域を図１ないし図２０に示した。
【実施例２】
【００２８】
次にプライマーセットの設計について、図１に示したＳＳＲマーカー名HypMS1を例に挙げて説明する。
【００２９】
図１に太字で示したＳＳＲマーカーの反復モチーフは、（GGTGTT)が９回の反復であり、配列表１の１８５番から２３８番に該当する。次にそのモチーフの前後において連続した１５塩基以上の配列を任意に選択した。当該任意に選択した配列はプライマーがアニーリングする位置に該当する。任意に連続した１５塩基以上の配列の位置を選択するにあたり、当該任意の塩基配列間の塩基数が６００塩基対以内にすることが好ましく、より好ましくは３００塩基対以内にするのがよい。これは、品種識別を実施するにあたり、PCR産物の蛍光発色をDNAシーケンサーで解析するときに反復モチーフの繰り返し回数の差が確認しやすく、大幅に断片長が異なる品種間でも３００塩基対以内の差であれば検出が可能となるからである。本実施例では、ＳＳＲマーカーの反復モチーフの前側（フォワード）から配列表１の７０番から８８番目までの１９塩基配列を選択し、ＳＳＲマーカーの反復モチーフの後ろ側（リバース）は配列表１の４３８番から４５７番まで１９塩基配列を選択した。そして、配列表の７０番からモチーフ配列に向かって８８番までの塩基配列及び４５７番からモチーフ配列に向かって４３８番までの塩基配列に相補的な配列のプライマーセットを設計した。
【実施例３】
【００３０】
次にTm又はアニーリング温度の値を設定してプライマーセットを設計する方法について具体的に説明する。
【００３１】
Tmとは、Melting temperatureの略であり、DNAの二本鎖が熱変性して一本鎖になる温度のことをいう。また、アニーリング温度とは、鋳型DNAとオリゴヌクレオチドが２本鎖を形成してプライミング反応が起こるときの温度のことをいう。そして、一般的にはTmの値はアニーリング温度の値として扱われている。Tm又はアニーリング温度の値は簡単に計算する方法として数１の計算方法で与えることができる。ただし、Tmを計算するための市販のソフトは多数あるので、そのような市販ソフトを使用すれば、さらに細かい数値を計算して導き出すことができる。
【数１】
2013255466.tif 000003
（式中、G、C、A、Tは、１５塩基以上の任意の連続した塩基配列中に含まれるG、C、A又はTの個数であり、nはG、C、A及びTの総数を表す。）
【００３２】
本実施例ではjPCRソフト（PrimerDigital Ltd）を用い、Tmを５２ないし７０に設定して、G、C、A又はTの値を計算しプライマーを設計するための配列を選択した。なお、Tmを設定するためのソフトは、他にも多数存在し、インターネット上で検索してダウンロードすることもできる。
【００３３】
本発明者らは、実施例２及び３の方法により２０セットのプライマーの設計を行った。上記実施例に沿って設計したプライマーとTmとを表１に示した。
【表１】
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【００３４】
表１に示したTmは、５８．２ないし６１．１の値であるが、このようにしたのはPCRを行うときにTmの値が近似していれば、同じ温度サイクルの条件で良いという利点があり、すなわち複数のプライマーセットを用いて同時にPCRを行うことができるからである。そして、PCRにおいて所望の温度サイクルがある場合には、任意にTmを変更したプライマーセットを図１ないし図２０に示した領域内で設計することができる。
【実施例４】
【００３５】
例えば、図７に示す領域においてTmを５２．８と５１．３に設定するとフォワードは５２番から６７番までの塩基配列及びリバースは６９２番から７０７番までの塩基配列に相補的な配列でプライマーセットを設計することができ、また同領域においてTmを６８．８と６８．４に設定するとフォワードは１１７番から１４２番までの塩基配列及びリバースは３９３番から４２１番までの塩基配列に相補的な配列でプライマーセットを設計することができる。
【００３６】
次に、実施例５では配列表３、５、７、９、１７及び１８に示した６種類のプライマーセットを用いたブナシメジの品種識別について具体的に説明する。なお、本実施例においては、６種類のＳＳＲマーカーを使用し３０種類のブナシメジの識別を行ったが、本願で開示された他のＳＳＲマーカーも組み合わせてPCRを行えば、さらに増幅産物の多型が多様化しより多くのブナシメジの品種を識別することや品種識別の精度を向上させることも可能である。
【実施例５】
【００３７】
本実施例では３０品種のブナシメジの菌糸体を使用した。これらの３０品種のブナシメジの菌糸体からDNAを抽出した。DNAの抽出は、菌糸体以外にも子実体からも抽出することができる。また、抽出されたDNAの損傷が激しくなければ、品種識別に利用が可能なため、子実体の加工品などからも抽出をすることができる。例えば、ブナシメジの漬け物や、惣菜、瓶詰め、缶詰、水煮等が挙げられる。DNAの抽出は、実施例１で説明した方法と同様に行った。
【００３８】
本発明でのPCR条件を以下に説明する。なお、本実施例におけるそれぞれプライマーセットのPCR条件はすべて同一であり、下記の具体例において、本実施例で用いたすべてのプライマーセットを使用してDNA増幅産物を得ることができるが、PCR条件は、本実施例の条件に限定されるものではない。
【００３９】
使用した試薬は、AmpliTaq Gold 360 Master Mix（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）（以下、PCR試薬と呼ぶ）を使用した。また、ブナシメジから抽出したDNA（以下、DNA溶液と呼ぶ）は５０〜１００μｇ/ｍｌの濃度に調整した。６種類のプライマーセットはライフテクノロジーズジャパン株式会社に合成を依頼し、１０μMに調製しフ
ォワードプライマー及びリバースプライマーが混合されたＳＳＲプライマー溶液を使用した。３０品種のブナシメジから抽出されたそれぞれのDNA溶液は、それぞれPCR試薬１２．５μｌ、DNA溶液１μｌ、ＳＳＲプライマー溶液１μｌ及び滅菌超純水１０．５μｌで混合した後、サーマルサイクラー（BioRad社  CFX96）で９４℃で１０分間DNAを変性させた。その直後、PCR操作として、９４℃で３０秒その後連続的に６０℃で３０秒さらに連続的に７２℃で３０秒のサイクルを４０回繰り返し、その後７２℃で７分間最終伸長反応をさせ、PCR産物を得た。
【００４０】
上記PCR操作により得られたPCR産物は、キャピラリー電気泳動法により増幅断片長を確認した。3130ジェネティックアナライザ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、５０cmのキャピラリー及びポリマーはPOP7を使用し、フラグメント解析を行った。フラグメント解析の結果から増幅断片長の違いを確認した。３０品種におけるそれぞれのＳＳＲマーカーの増幅断片長の違いを図２１に示した。
【００４１】
図２１に示したようにＳＳＲマーカーごとに品種特有の多型がみられ、６種類のＳＳＲマーカーをくみあわせて多型を品種ごとに比較した場合には、品種間でＳＳＲマーカーがすべて一致する品種は一つもなかった。つまり、本実施例で用いた６種類のＳＳＲマーカーによって、３０品種のブナシメジを識別することができた。
【００４２】
なお、ブナシメジの品種のうちＭＨ０２５０６６は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３３７として、ＭＨ０２５２８７は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３７として、ホクト白１号菌は受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３９として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託してある。また、ＭＨ０２５２１６とＭＨ０２５２１７はホクト白１号菌の親品種であり、ホクト白１号菌及びＭＨ０２５３７４は同じ親から交配により作出された兄弟に該当する菌株である。ＭＨ０２５２８７の親品種はホクト白１号菌とＭＨ０２５１７５であり、ＭＨ０２５２１６の親品種はＭＨ０２５０６６とＭＨ０２５０１９である。図２１の他の品種は野生種である。つまり、本実施例によれば、親子関係にあっても兄弟関係にあっても品種を識別することが可能であり、野生種を考慮すれば増幅断片長に多型が存在することで広範囲のブナシメジ品種において品種識別が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、農業及び食品分野において、ブナシメジの品種識別方法として有用である。
【受託番号】
【００４４】
ＭＨ０２５０６６  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３３７
ＭＨ０２５２８７  ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３７
ホクト白１号菌    ＦＥＲＭ  Ｐ−２０５３９
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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