(57)【要約】【課題】ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤を提供する。【解決手段】紅茶抽出物を有効成分とするミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
紅茶抽出物を有効成分とするミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。
【請求項２】
紅茶抽出物を有効成分とするサテライト細胞分化促進剤。
【請求項３】
紅茶抽出物を有効成分とする筋量増加剤。
【請求項４】
紅茶抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤、サテライト分化促進剤、筋量増加剤及び筋萎縮抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、交通手段の発達や情報・通信技術の発展に伴い、運動が不足している。運動不足による筋量・筋力の低下は、運動機能の低下の原因となり、特に高齢者にとっては、加齢による筋変化と相俟って、その後の生活の質（ＱＯＬ）に重大な悪影響をもたらすと考えられる。筋委縮、筋量・筋力の低下を基盤とする日常動作中の転倒、及びそれに伴う骨折等は高齢者における主要な寝たきりの原因である。
一般的に、筋委縮、筋量・筋力の低下を防ぐ手段としては、適度な運動を実践する、或いはリハビリテーションを実践する等がある。しかし、時間的・物理的理由、モチベーションの維持の困難さ等から現実的には難しく、より効果的な方法が望まれている。
【０００３】
斯かる観点から、栄養学的アプローチにより運動機能を調節し得る成分の探索が行われ、例えば、プロアントシアニジンを有効成分とする筋萎縮抑制剤（特許文献１）、果実由来のポリフェノールを有効成分とする筋張力増強剤及び体脂肪調整剤（特許文献２）等が提案されている。また、発酵茶から抽出された高分子ポリフェノールを有効成分とする筋肉遅筋化促進剤（特許文献３）が提案されている。
しかしながら、従来の方法は効果の面で十分とは云えず、また、特許文献３では、持久性運動と組み合わせたときの骨格筋の筋線維タイプの変化（ＩＩｂからＩＩａへの移行、遅筋化）促進が検討されているものの、運動不足や加齢等に伴う筋委縮、筋量の低下に対する効果は何ら検討されていない。
【０００４】
一方、ミオスタチンは、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属し、筋肉成長を負に調節することにおいて役割を果たしていると考えられている。ミオスタチンは、筋芽細胞の増殖及び分化を阻害すること（非特許文献１）、サテライト細胞の増殖を抑制し、サテライト細胞を休止状態としていること（非特許文献２）等が明らかにされている。また、ミオスタチン欠損マウスでは正常なマウスよりも筋線維の過形成及び肥大のために骨格筋量が約２倍に増大すること（非特許文献３）、さらに、ミオスタチンの内因性阻害剤であるフォリスタリンの過剰発現マウスで筋量増加が認められること（非特許文献４）が報告されている。
したがって、細胞におけるミオスタチンの活性を阻害することで、サテライト細胞の活性を高め筋肉の肥大・再生を促し、筋量の調節・増加による筋萎縮の予防、改善等が期待できる。
【０００５】
ミオスタチンは、アクチビンＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ）に結合し、さらにＩ型受容体（ＡＬＫ４又はＡＬＫ５）のリン酸化を引き起こすことで、細胞内シグナルカスケードが働く。リン酸化されたＩ型受容体は細胞内のＳｍａｄ２、３をリン酸化し、リン酸化されたＳｍａｄ２、３はヘテロダイマーを形成し、さらにＳｍａｄ４との複合体を形成することで核内へと移行可能となり、標的遺伝子上流のＳＢＥ（Ｓｍａｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、転写を開始することが知られている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３３８４６４号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０７４９６２号
【特許文献３】特開２０１０−３７３２３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．， J  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００  ２７５：４０２３５−４０２４３
【非特許文献２】ＭｃＣｒｏｓｋｅｒｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００３  １６２：１１３５−１１４７
【非特許文献３】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ＡＣ  ｅｔ  ａｌ．， ＮＡＴＵＲＥ  １９９７  ３８７：８３−９０
【非特許文献４】Ｇｉｏｓｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００９  ２９７：Ｅ１５７−Ｅ１６４
【非特許文献５】Ｊｏｕｌｉａ−Ｅｋａｚａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００７  ７：３１０−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、斯かる実情に鑑み、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、ミオスタチンの細胞内シグナル伝達（ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル）を阻害する物質について鋭意研究を重ねた結果、紅茶抽出物に優れたミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用があること、さらにサテライト細胞の分化を促進する作用があることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）に係るものである。
（１）紅茶抽出物を有効成分とするミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤。
（２）紅茶抽出物を有効成分とするサテライト細胞分化促進剤。
（３）紅茶抽出物を有効成分とする筋量増加剤。
（４）紅茶抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等は、細胞におけるミオスタチンのシグナル伝達を阻害し、また、サテライト細胞の分化を促進することから、筋量の増加、筋萎縮の抑制等の効果を発揮し得る医薬品、医薬部外品、食品等として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】紅茶抽出物のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）を示す図である。
【図２】紅茶抽出物によるサテライト細胞分化に関与するＭｙＨＣ１遺伝子の発現量を示す図である。
【図３】紅茶抽出物によるミオスタチン遺伝子の発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル」とは、ＡｃｔＲＩＩ、Ｓｍａｄタンパク質が関与するミオスタチンの細胞内シグナル伝達経路であり、「ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害」とは、例えば、ミオスタチンのＡｃｔＲＩＩへの結合阻害、Ｓｍａｄタンパク質の不活性化等により当該シグナル伝達のいずれかを減少、調節或いは阻害することを意味する。これにより細胞におけるミオスタチンの活性を抑制することができる。「ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用」は、後記実施例に示すように、Ｓｍａｄ複合体のＳＢＥへの結合、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を判別することにより評価することができる。
【００１４】
本明細書において、「サテライト細胞」とは、筋の細胞膜間に存在する未分化の幹細胞であり、「サテライト細胞の分化促進」とは、サテライト細胞の活性化、細胞分裂、分化によって既存の筋細胞に融合或いは細胞自身によって筋管細胞形成へと導くことを意味する。
【００１５】
本明細書において、「筋量増加」とは、例えばサテライト細胞の増殖及び筋繊維への融合により筋肉組織中の筋繊維断面積又は筋繊維径が増加すること、また筋蛋白の合成速度が分解速度を上回ることにより、筋組織中の蛋白質重量が増加し、筋重量が増加することを意味する。
また、「筋萎縮」とは、筋蛋白の分解速度が合成速度を上回ることにより筋細胞が減少・縮小し、筋量が低下することをいい、長期間の安静臥床や骨折等によるギプス固定、あるいは微小重力暴露によるもの（廃用性筋萎縮という）と筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）等の疾病による進行性筋萎縮に大別される。さらに、加齢に伴っても筋萎縮と同様の症状が起きることがあり、これは加齢性筋減弱症（サルコペニア）と呼ばれている。したがって「筋萎縮の抑制」とは、不活動や加齢、疾病等による筋量の低下を抑制することをいう。
【００１６】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００１７】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止、抑制又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止、抑制又は遅延をいう。
【００１８】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止、抑制又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１９】
本発明に用いられる紅茶抽出物は、紅茶から得られた抽出物を意味し、紅茶としては、Ｃａｍｅｌｌｉａ属、例えばＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ａｓｓａｉｍｉｃａ又はそれらの雑種から得られる茶葉から発酵工程を経て製茶された紅茶が挙げられる。紅茶葉としては、特に限定されず、例えば、ヌワラエリヤ、ウバ、ディンブラ、ダージリン、アッサム、スリランカ等が挙げられ、これらは１種又は２種以上混合して使用することができる。
紅茶抽出物を得る方法としては、特に限定されず、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。
【００２０】
抽出のための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；並びにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類、アルコール−水混合液が挙げられ、水がより好ましい。
【００２１】
紅茶葉から抽出する時の溶剤の温度は、風味の観点から７０〜１００℃（沸騰水）が好ましく、更に好ましくは８０〜１００℃（沸騰水）である。紅茶葉からの抽出時の溶剤の量は、紅茶葉に対して５〜７０質量倍が好ましく、更に好ましくは５〜６０質量倍である。紅茶葉からの抽出時間は３０秒〜６０分が好ましく、より好ましくは３０秒〜４０分、更に好ましくは３０秒〜３０分である。
【００２２】
紅茶抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００２３】
本発明の紅茶抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００２４】
後記実施例で示すとおり、本発明の紅茶抽出物は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルに着目した、ＳＢＥを利用したレポータージーンアッセイ系において優れたミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用を示した。また、本発明の紅茶抽出物は、筋分化に関するＭｙＨＣ１（Ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ１）遺伝子の発現を亢進し、他方、ミオスタチン遺伝子の発現を抑制した。
ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）は筋肉の主要構成タンパク質であり、筋収縮において重要な役割を担っている。ＭｙＨＣ遺伝子発現の亢進は筋収縮タンパク質の合成を亢進し、その結果筋繊維の肥大や骨格筋肥大をもたらす。また、ミオスタチン遺伝子の発現が抑制されたことから、筋肉減少シグナルが解除され、タンパク質合成、骨格筋肥大をもたらすものと考えられる。
したがって、本発明の紅茶抽出物は、細胞におけるミオスタチンのシグナル伝達を阻害し、また、サテライト細胞の分化を促進することが有用と考えられる各種疾病や症状の予防、改善又は治療に有効であると考えられる。例えば、本発明の紅茶抽出物は、筋量の増加、筋萎縮の抑制に有効であると考えられる。
【００２５】
本発明の紅茶抽出物は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害のため、サテライト細胞の分化促進のため、或いは筋量の増加、筋萎縮の抑制のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００２６】
また、本発明の紅茶抽出物は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤、サテライト細胞分化促進剤、筋量増加剤、筋萎縮抑制剤（以下、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等には、本発明の紅茶抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２７】
当該ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等は、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害、サテライト細胞の分化促進、筋量の増加、筋萎縮の抑制効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品又は飼料の有効成分として配合して使用することができる。食品としては、ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害、サテライト細胞の分化促進、筋量の増加、筋萎縮の抑制等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等に応用できる。
【００２８】
本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等を医薬品（医薬部外品も含む）の有効成分として用いる場合、これらは任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口、経腸、経粘膜、注射等が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、徐放性製剤、懸濁液、エマルジョン剤、内服液、糖衣錠、丸剤、細粒剤、シロップ剤、エリキシル剤等が挙げられる。非経口投与としては、静脈内注射、筋肉注射剤、吸入、輸液、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等を単独で、又は他の薬学的に許容される担体と組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、希釈剤等が挙げられる。
【００２９】
これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与でありミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等を含む製剤中の本発明の紅茶抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．００００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０００１〜１質量％とするのがより好ましい。
【００３０】
本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等を食品の有効成分として用いる場合、当該食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明の紅茶抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．０１〜１００質量％とするのが好ましく、０．１〜１００質量％とするのがより好ましく、更に好ましくは１〜１００質量％とするのが好ましい。
【００３１】
また、本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等を、飼料の有効成分として用いる場合には、当該飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等の他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を組み合わせて用いることができる。
また、飼料中の、本発明の紅茶抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい
【００３２】
本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、紅茶抽出物（乾燥物換算）として、１日あたり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましく、更に０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇとするのが好ましい。
また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与又は摂取され得るが、１日１回〜数回に分けて投与又は摂取することが好ましい。
投与又は摂取対象者としては、それを必要としている者であれば特に限定されないが、本発明のミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤等はミオスタチン／Ｓｍａｄシグナルの阻害、サテライト細胞の分化促進、筋量の増加、筋萎縮の抑制を図ることができることから、特に、運動愛好者やアスリート、ロコモティブシンドローム発症者、加齢性筋減弱症（サルコペニア）者、神経・筋疾患（炎症性筋疾患、内科的疾患に伴うミオパチー、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、ミトコンドリア脳筋症、糖原病等）者、運動不足者、ベッドレスト者、外科的/内科的疾患後のリハビリトレーニング者における投与又は摂取が有効である。
【実施例】
【００３３】
製造例１［紅茶抽出物の調製］
（１）紅茶抽出物Ａ
ＳＤ紅茶エキスパウダー＃１６６９１（ケニア産紅茶のスプレードライ品、三栄源エフエフアイ（株）製）を濃度１（ｗ／ｖ）％となるように２０（ｖ／ｖ）％エタノール水に溶解し、試験サンプルとした。
【００３４】
（２）紅茶抽出物Ｂ
市販紅茶葉（三井農林（株）製）７ｇを、９０℃の蒸留水４００ｍＬにて１分間抽出した後、２号ろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）でろ過し、抽出液を得た。得られた抽出液を凍結乾燥し、紅茶抽出物１．３７ｇを得た。これを濃度１（ｗ／ｖ）％となるように２０（ｖ／ｖ）％エタノール水に溶解し、試験サンプルとした。
【００３５】
（３）紅茶抽出物Ｃ
ＳＤ紅茶エキスパウダー＃１６６９３（ケニア産紅茶のスプレードライ品、三栄源エフエフアイ（株）製）を濃度１（ｗ／ｖ）％となるように２０（ｖ／ｖ）％エタノール水に溶解し、試験サンプルとした。
【００３６】
（４）紅茶抽出物Ｄ
ＦＤ紅茶エキスパウダー＃１６６００（ケニア産紅茶のフリーズドライ品、三栄源エフエフアイ（株）製）を濃度１（ｗ／ｖ）％となるように２０（ｖ／ｖ）％エタノール水に溶解し、試験サンプルとした。
【００３７】
（５）紅茶抽出物Ｅ
ＦＤ中国紅茶エキスパウダー＃１６３４２（中国産紅茶のフリーズドライ品、三栄源エフエフアイ（株）製）を濃度１（ｗ／ｖ）％となるように２０（ｖ／ｖ）％エタノール水に溶解し、試験サンプルとした。
【００３８】
実施例１［ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害活性試験］
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児由来腎細胞）を９６穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ）中で一晩培養した。ＣｉｇｎａｌTM  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に含まれるＣｉｇｎａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ(ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＳＢＥをつないだレポータープラスミドと内部標準用ウミシイタケルシフェラーゼが４０：１の比率で混合されたもの)を、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞に導入した。その６時間後に、被験物質として終濃度０．００２（ｗ／ｖ）％の紅茶抽出物Ａ〜Ｅをそれぞれ含むＤＭＥＭ（０．２％  ＦＢＳ）へと培地交換を行い、さらに２時間後にミオスタチン（０．０５μｇ／ｍＬ；ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）を含むＤＭＥＭ（０．２％  ＦＢＳ）を加え、一晩培養した。翌日、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。コントロールとして紅茶抽出物の代わりに２０（ｖ／ｖ）％エタノールを用いた。結果を図１に示す。
【００３９】
ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）は以下のように定義した。
ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）＝（ホタルルシフェラーゼ活性）/(ウミシイタケルシフェラーゼ活性)
ミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害活性測定試験の結果は、ミオスタチン非刺激のルシフェラーゼ活性を０％、Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ刺激によるルシフェラーゼ活性を１００％とした際の転写活性化率を％表示し、５０％以上の抑制を示したものをミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害剤とした。
数値は平均値±標準誤差（Ａｖｅｒａｇｅ（Ａｖｅ）±ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ（ＳＥ））で示した。群間の統計学的有意差については、コントロール群に対するｔ−ｔｅｓｔを行ない、ｐ値が０．０１未満の場合を有意差ありとし、図に＊＊を示した。
【００４０】
図１に示すように、各種紅茶抽出物によりミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル依存的な転写活性（ルシフェラーゼ活性）が約５０％以上抑制され、紅茶抽出物は、有意なミオスタチン／Ｓｍａｄシグナル阻害作用を有していることが確認された。
【００４１】
実施例２［ヒト成人骨格筋由来の初代培養サテライト細胞の分化誘導条件下での遺伝子発現解析］
ヒト成人骨格筋由来の初代培養サテライト細胞（Ｌｏｎｚａ）を１２穴プレートに播種し、２４時間後に、ＭｙＨＣ１（Ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ１）の遺伝子発現を検討するため、被験物質として終濃度０．００２（ｗ／ｖ）％の紅茶抽出物Ａ〜Ｅをそれぞれ含むＤＭＥＭ培地（２％  Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）と交換を行い、分化誘導を開始した。分化誘導後４８時間培養し、ＰＢＳで洗浄後、細胞を回収し、−８０℃にて保存した。また、ミオスタチンの遺伝子発現を検討するため、被験物質として終濃度０．００４（ｗ／ｖ）％の紅茶抽出物Ａ〜Ｅをそれぞれ含むＤＭＥＭ培地（２％  Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）と交換を行い、分化誘導を開始した。分化誘導後２４時間培養し、ＰＢＳで洗浄後、細胞を回収し、−８０℃にて保存した。コントロールとして紅茶抽出物の代わりに２０（ｖ／ｖ）％エタノールを用いた。
【００４２】
遺伝子発現解析
遺伝子発現解析用のサンプルからのＲＮＡの調製は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付プロトコルに従い行った。調製したＲＮＡは濃度をそろえ、６５℃、１０分間の熱処理を行い、急冷後に使用した。逆転写には、１２５ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、２０μＬの反応液（１×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ），２．５ｍＭ  Ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）１８  ｍＲＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ））を調製した。反応は４２℃，６０分→５２℃、３０分→９９℃、５分→４℃で行い、得られたｃＤＮＡは、使用時まで−２０℃で保存した。また、定量的ＰＣＲのスタンダード用として、５００ｎｇ相当のＲＮＡを使用し、同様の反応系で逆転写を行った。
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７５００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて定量的ＰＣＲを行った。スタンダード用ｃＤＮＡを７段階希釈したものをスタンダードとして、作成した標準曲線に基づき、定量を行った。反応液は、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）１０μＬ、１００μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．２μＬ、１００μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．２μＬ、ｄＨ２Ｏ  ４．６μＬ、ｃＤＮＡ  ５μＬとなるように調製した。定量的ＰＣＲの温度条件は５０℃２分、９５℃１０秒の後、９５℃１５秒と６０℃１分の反応を４０サイクル繰り返した。
筋分化に関与する遺伝子ＭｙＨＣ１（Ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ１）、ミオスタチンを定量的ＰＣＲにて測定した。結果を図２〜図３に示す。
表１に、定量的ＰＣＲに用いたプライマーの配列を示す。
【００４３】
【表１】
2013091608.tif 000002
【００４４】
結果
試験結果は平均値±標準誤差（Ａｖｅｒａｇｅ（Ａｖｅ）±ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ（ＳＥ））で表し、３６Ｂ４の発現量を内部標準として補正し、相対的ｍＲＮＡ発現量として表した。有意差検定はｔ−ｔｅｓｔを用いて行い、ｐ値が０．０５未満のもの、０．０１未満のものを統計学的有意差があるとした（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
図２及び３より、紅茶抽出物は、ＭｙＨＣ１遺伝子の発現を有意に亢進し（図２）、他方、ミオスタチン遺伝子の発現を有意に抑制した（図３）。
このことから、紅茶抽出物にはサテライト細胞の分化促進作用があることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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