(57)【要約】【課題】腹膜偽粘液腫を特異的に検出することができる腫瘍マーカー（遺伝子またはタンパク質）を提供することを課題とする。【解決手段】腹膜偽粘液腫において発現が亢進している遺伝子の発現解析を行い、腹膜偽粘液腫で特異的に発現する遺伝子およびタンパク質（腫瘍マーカー）を見出し、さらにその遺伝子の発現を評価するプライマー群を作製した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくとも１の遺伝子、または該遺伝子にコードされるタンパク質を患者由来の試料より検出する腹膜偽粘液腫の検査方法；
（ａ）ヒトＰＲＧ４遺伝子、
（ｂ）ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子、
（ｃ）ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子、
（ｄ）ヒトＴＲＥＭ２遺伝子、
（ｅ）ヒトＩＱＣＡ１遺伝子、
（ｆ）ヒトＳＦＲＰ４遺伝子、
（ｇ）ヒトＥＧＦＬ６遺伝子。
【請求項２】
前記ヒトＰＲＧ４遺伝子がヒトＰＲＧ４バリアントＣである請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記遺伝子の塩基配列の一部またはその相補塩基配列の一部からなり、前記遺伝子のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するオリゴヌクレオチドを用いて前記遺伝子を検出する請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
下記（１）〜（７）から選択される少なくとも１のプライマーセットを使用する請求項１〜３のいずれか１に記載の検査方法；
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ  ＰＲＧ４）、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ２  ＰＲＧ４）、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ３  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー、並びに、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−a  ＰＲＧ４）、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７  ＮＭ００１１２７７０９  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー
を含むプライマーセット、
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ｓ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ａ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（３）配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ｓ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ａ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（４）配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ｓ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ａ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（５）配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ｓ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ａ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、
を含むプライマーセット
（６）配列番号１４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ｓ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ａ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（７）配列番号１６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ｓ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ａ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項５】
下記（１）〜（７）から選択される１以上のプライマーセットを含む腹膜偽粘液腫検査用プライマーセット；
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ  ＰＲＧ４）、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ２  ＰＲＧ４）、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ３  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー、並びに、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−a  ＰＲＧ４）、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７  ＮＭ００１１２７７０９  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー
を含むプライマーセット、
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ｓ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ａ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（３）配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ｓ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ａ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（４）配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ｓ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ａ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（５）配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ｓ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ａ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、
を含むプライマーセット
（６）配列番号１４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ｓ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ａ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（７）配列番号１６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ｓ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ａ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項６】
下記の（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくとも１の遺伝子、または該遺伝子にコードされるタンパク質を検出する工程を含む、腹膜偽粘液腫の治療剤のスクリーニング方法；
（ａ）ヒトＰＲＧ４遺伝子、
（ｂ）ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子、
（ｃ）ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子、
（ｄ）ヒトＴＲＥＭ２遺伝子、
（ｅ）ヒトＩＱＣＡ１遺伝子、
（ｆ）ヒトＳＦＲＰ４遺伝子、
（ｇ）ヒトＥＧＦＬ６遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腹膜偽粘液腫の腫瘍組織が特異的に発現する遺伝子又はタンパク質を検出する腹膜偽粘液腫の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹膜偽粘液腫（ｐｓｅｕｄｏｍｙｘｏｍａ  ｐｅｒｉｔｏｎｅｉ（ＰＭＰ））は、１００万人に１人の割合で発生する稀な疾患であり、発生頻度や発生原因は全く解明されておらず、標準的治療方法は確立されていない。しかし、腹腔内の腫瘍を完全に切除すれば長期生存が可能である（非特許文献１）。
【０００３】
腹膜偽粘液腫は、主に虫垂や卵巣で発生し、虫垂や卵巣の粘液産生腫瘍が内腔に粘液を貯留し続け内圧が上がり、遂には、虫垂や卵巣の壁を突き破り、粘液と腫瘍細胞が腹腔内に放出（播種）され、こぼれた腫瘍細胞が腹膜で増殖する（腹膜転移）。
【０００４】
腹膜偽粘液腫は、ＰＥＴ、ＣＴ、ＭＲＩ等の画像診断により、腹水、粘液の有無、転移の分布を診断する。また、一般的な消化器系腫瘍マーカーであるＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５等の測定により、転移の量と完全切除できるか否かを予測している。しかし、早期診断や正確な診断は困難であり、治療方針を立てるのが難しいのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】米村豊  ほか、癌と化学療法  ２００６年  ３３巻１２号  ｐ．１８２２−１８２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
腹膜偽粘液腫を特異的に検出できる腫瘍マーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、３４０００以上の転写産物について、ヒト正常虫垂および胃癌細胞等と比較して腹膜偽粘液腫において特徴的に発現が亢進している遺伝子の発現解析を行った。その結果、腹膜偽粘液腫で特異的に発現が亢進している遺伝子およびタンパク質（腫瘍マーカー）、並びにその遺伝子の発現を評価するプライマー群を作製した。
【０００８】
本発明は以下からなる。
１．下記の（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくとも１の遺伝子、または該遺伝子にコードされるタンパク質を患者由来の試料より検出する腹膜偽粘液腫の検査方法；
（ａ）ヒトＰＲＧ４遺伝子、
（ｂ）ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子、
（ｃ）ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子、
（ｄ）ヒトＴＲＥＭ２遺伝子、
（ｅ）ヒトＩＱＣＡ１遺伝子、
（ｆ）ヒトＳＦＲＰ４遺伝子、
（ｇ）ヒトＥＧＦＬ６遺伝子。
２．前記ヒトＰＲＧ４遺伝子がヒトＰＲＧ４バリアントＣである前項１に記載の検査方法。
３．前記遺伝子の塩基配列の一部またはその相補塩基配列の一部からなり、前記遺伝子のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するオリゴヌクレオチドを用いて前記遺伝子を検出する前項１または２に記載の検査方法。
４．下記（１）〜（７）から選択される少なくとも１のプライマーセットを使用する前項１〜３のいずれか１に記載の検査方法；
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ  ＰＲＧ４）、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ２  ＰＲＧ４）、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ３  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー、並びに、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−a  ＰＲＧ４）、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７  ＮＭ００１１２７７０９  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー
を含むプライマーセット、
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ｓ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ａ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（３）配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ｓ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ａ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（４）配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ｓ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ａ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（５）配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ｓ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ａ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、
を含むプライマーセット
（６）配列番号１４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ｓ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ａ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（７）配列番号１６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ｓ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ａ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット。
５．下記（１）〜（７）から選択される１以上のプライマーセットを含む腹膜偽粘液腫検査用プライマーセット；
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ  ＰＲＧ４）、配列番号２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ２  ＰＲＧ４）、配列番号３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−ｓ３  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー、並びに、
配列番号４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７−a  ＰＲＧ４）、配列番号５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ５８０７  ＮＭ００１１２７７０９  ＰＲＧ４）およびこれら塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマーからなる群から選択される１以上のプライマー
を含むプライマーセット、
（２）配列番号６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ｓ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ４９３−ａ  ＣＯＬ１０Ａ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（３）配列番号８に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ｓ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号９に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ６７７０−ａ  ＭＡＲＣＯ）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（４）配列番号１０に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ｓ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１１に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ１８９６５−ａ  ＴＲＥＭ２）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（５）配列番号１２に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ｓ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１３に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ０２４７２６−ａ  ＩＱＣＡ１）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、
を含むプライマーセット
（６）配列番号１４に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ｓ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１５に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００３０１４−ａ  ＳＦＲＰ４）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット、
（７）配列番号１６に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ｓ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー、並びに、
配列番号１７に記載の塩基配列からなるプライマー（ＮＭ００１１６７８９０−ａ  ＥＧＦＬ６）または該塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなるプライマー
を含むプライマーセット。
６．下記の（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくとも１の遺伝子、または該遺伝子にコードされるタンパク質を検出する工程を含む、腹膜偽粘液腫の治療剤のスクリーニング方法；
（ａ）ヒトＰＲＧＡ遺伝子、
（ｂ）ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子、
（ｃ）ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子、
（ｄ）ヒトＴＲＥＭ２遺伝子、
（ｅ）ヒトＩＱＣＡ１遺伝子、
（ｆ）ヒトＳＦＲＰ４遺伝子、
（ｇ）ヒトＥＧＦＬ６遺伝子。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検査方法で検出される遺伝子およびタンパク質は、腹膜偽粘液腫で特異的に発現が亢進されており、正常組織や腹膜偽粘液腫以外の腫瘍組織における発現頻度や発現レベルは極めて低い。したがって、該遺伝子およびタンパク質は、腹膜偽粘液腫の診断において有用な腫瘍マーカーとすることができる。本発明の検査方法は、正確な診断および早期診断を可能にし、適切な治療方針を立てることを可能にする。また、これら腫瘍マーカーの発現の抑制または低減を指標として腹膜偽粘液腫の治療剤のスクリーニングが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトＰＲＧ４遺伝子の各バリアントの欠失部位、欠失領域の大きさ、プライマーの位置、増幅ＤＮＡの長さを示す図である。センスプライマーNM5807-s PRG4とアンチセンスプライマーNM5807-a PRG4のプライマーセットで増幅されるＤＮＡに星印が付されている。
【図２】ヒトＰＲＧ４遺伝子の各バリアントの塩基配列比較とプライマーの位置を示す図である。
【図３】ヒトＰＲＧ４遺伝子の各バリアントについて、センスプライマーＮＭ５８０７−ｓ  ＰＲＧ４とアンチセンスプライマーＮＭ５８０７  ＮＭ００１１２７７０９  ＰＲＧ４のプライマーセットによりバリアントＣのみが検出可能であることを示す図である。
【図４】ヒトＰＲＧ４バリアントＣ遺伝子（NM5807C 637bp）およびヒトＭＯＲＣＯ遺伝子（NM6770 671 bp）は腹膜偽粘液腫（ＰＭＰ）でのみ発現し、胃癌細胞では発現していないことを示す電気泳動の写真である。
【図５】ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子（NM_000493）はＰＭＰでのみ発現し、胃癌細胞では発現していないことを示す電気泳動の写真である。
【図６】ＰＭＰにおけるヒトＰＲＧ４遺伝子の発現と胃癌細胞ＭＫＮ−４５におけるヒトＰＲＧ４遺伝子の発現を４種のプライマーセットを用いて解析した結果を示す電気泳動の写真である。ＰＭＰではバリアントＣのみを発現していた。
【図７】１１種の胃癌細胞におけるヒトＰＲＧ４遺伝子発現を３種のプライマーセットを用いてＲＴ-ＰＣＲ法により解析した結果を示す電気泳動の写真である。いかなるヒトＰＲＧ４バリアント遺伝子も発現していなかった。
【図８】ヒトＩＱＣＡ１遺伝子（NM_24726）はＰＭＰでのみ発現し、胃癌細胞および大腸癌細胞では発現していないことを示す電気泳動の写真である。
【図９】ヒトＴＲＥＭ２遺伝子（NM_018965）はＰＭＰでのみ発現し、胃癌細胞および大腸癌細胞では発現していないことを示す電気泳動の写真である。
【図１０】ヒトＥＧＦＬ６遺伝子（NM_001167890）およびヒトＳＦＲＰ４遺伝子（NM_003014）はＰＭＰでのみ発現し、胃癌細胞では発現していないことを示す電気泳動の写真である。
【図１１】ヒトＥＧＦＬ６遺伝子（NM_001167890）およびヒトＳＦＲＰ４遺伝子（NM_003014）は胃癌細胞および大腸癌細胞では発現していないことを示す電気泳動の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の腹膜偽粘液腫の検査方法は、患者由来の試料中に存在する上記（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくとも１の遺伝子（腫瘍マーカー）、またはこれら遺伝子にコードされるタンパク質（腫瘍マーカー）を検出する検査方法である。
【００１２】
（遺伝子の検出）
検出される遺伝子および検出方法は、これら遺伝子の発現の亢進を検出することができる限り制限はない。例えば、患者由来の試料中に存在する遺伝子を直接検出する方法、それら遺伝子の相補配列からなる遺伝子を生成させて間接的に検出する方法、タンパク質に翻訳して間接的に検出する方法等が挙げられる。例えば、遺伝子全体の検出であっても、その遺伝子の一部の検出であってもよい。さらに、その遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡを検出してもよい。また、検出される遺伝子の塩基配列は、各遺伝子およびその一部の遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列であって８０％以上、好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列であってもよい。検出にはこれら遺伝子に結合するオリゴヌクレオチドを用いることが望ましい。
【００１３】
（タンパク質の検出）
検出される該遺伝子にコードされるタンパク質についても、これら遺伝子の発現の亢進を検出することができる限り制限はない。例えば、前記遺伝子に対応するタンパク質の検出であっても、その一部からなるタンパク質の検出であってもよい。また、検出されるタンパク質およびその一部からなるタンパク質のアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって８０％以上、好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。検出には、これらタンパク質に特異的に結合する抗体を用いることが望ましい。
【００１４】
（患者由来の試料）
患者由来の試料は患者から得られる試料であれば特に制限されるものではない。例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織、腹水、腹腔内粘液、腹腔内洗浄液、血液、尿等が挙げられる。
【００１５】
（ヒトＰＲＧ４遺伝子）
本発明の検査方法により検出されるヒトＰＲＧ４遺伝子には、ＰＲＧ４バリアントＡ遺伝子、ＰＲＧ４バリアントＢ遺伝子、ＰＲＧ４バリアントＣ遺伝子またはＰＲＧ４バリアントＤ遺伝子が含まれる。バリアントＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００５８０７．３）はエクソン１−１３からなり、スプライシングバリアントＢはバリアントＡのエクソン３を欠損し、バリアントＣはエクソン５およびエクソン６、バリアントＤはエクソン３、エクソン５およびエクソン６を欠損している（図１、図２）。標的遺伝子として、より好適であるのはＰＲＧ４バリアントＣ遺伝子である。
【００１６】
本発明の検査方法により検出されるＰＲＧ４バリアントＡ遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５８０７の遺伝子（Homo sapiens proteoglycan 4 (PRG4), transcript variant A, mRNA  [NM_005807]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿００５８０７の遺伝子は５０５９ｂｐの塩基配列からなり、５２〜４２６６番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。
【００１７】
本発明の検査方法により検出されるＰＲＧ４バリアントＢ遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１２７７０８の遺伝子（Homo sapiens proteoglycan 4 (PRG4), transcript variant B, mRNA  [NM_001127708]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿００１１２７７０８の遺伝子は４９３６ｂｐの塩基配列からなり、５２〜４１４３番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。
【００１８】
本発明の検査方法により検出されるＰＲＧ４バリアントＣ遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１２７７０９の遺伝子（Homo sapiens proteoglycan 4 (PRG4), transcript variant C, mRNA  [NM_001127709]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿００１１２７７０９の遺伝子は４７８０ｂｐの塩基配列からなり、５２〜３９８７番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。
【００１９】
本発明の検査方法により検出されるＰＲＧ４バリアントＤ遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１２７７１０の遺伝子（Homo sapiens proteoglycan 4 (PRG4), transcript variant D, mRNA  [NM_001127710]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿００１１２７７１０の遺伝子は４６５７ｂｐの塩基配列からなり、５２〜３８６４番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。
【００２０】
本発明の検査方法により検出される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列全長からなる遺伝子であっても、該遺伝子の一部からなる遺伝子であってもよい。「該遺伝子の一部からなる遺伝子」は、該遺伝子の発現の亢進を検出できる限り、特に制限はない。
【００２１】
前記変異体は、上記遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列を有する。変異体の塩基配列は、上記遺伝子の塩基配列と好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。また、これら塩基配列の相補配列であってもよい。
【００２２】
（ヒトＰＲＧ４遺伝子にコードされるタンパク質）
本発明の検査方法により検出されるヒトＰＲＧ４遺伝子にコードされるタンパク質には、１４０４のアミノ酸からなるproteoglycan 4 isoform A precursor [NP_005798]、１３６３のアミノ酸からなるproteoglycan 4 isoform B precursor [NP_001121180]、１３１１のアミノ酸からなるproteoglycan 4 isoform C precursor [NP_001121181]、１２７０のアミノ酸からなるproteoglycan 4 isoform D precursor [NP_001121182]、およびこれらタンパク質の変異体が含まれる。これら変異体は、該タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたタンパク質であって、変異前のタンパク質のアミノ酸配列と、好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
また、ヒトＰＲＧ４バリアントＣ遺伝子にコードされるタンパク質が、腫瘍マーカーとしてより好適である。
【００２３】
（ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子）
本発明の検査方法により検出されるヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４９３の遺伝子（Homo sapiens collagen, type X, alpha 1 (COL10A1), mRNA [NM_000493]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿０００４９３の遺伝子は、３３０７ｂｐの塩基配列からなり、９７〜２１３９番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。本発明の検査方法により検出される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列全長からなる遺伝子であっても、該遺伝子の一部からなる遺伝子であってもよい。「該遺伝子の一部からなる遺伝子」は、該遺伝子の発現の亢進を検出できる限り、特に制限はない。前記変異体は、上記遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列を有する。変異体の塩基配列は、上記遺伝子の塩基配列と好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。また、これら塩基配列の相補配列であってもよい。
【００２４】
（ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子にコードされるタンパク質）
本発明の検査方法により検出されるヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子にコードされるタンパク質には、６８０のアミノ酸からなるcollagen alpha-1(X) chain precursor [NP_000484]、および該タンパク質の変異体が含まれる。この変異体は、該タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたタンパク質であって、collagen alpha-1(X) chain precursor [NP_000484]のアミノ酸配列と、好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２５】
（ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子）
本発明の検査方法により検出されるヒトＭＡＲＣＯ遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６７７０の遺伝子（Homo sapiens macrophage receptor with collagenous structure (MARCO)，mRNA [NM_006770]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿００６７７０の遺伝子は、１８５３ｂｐの塩基配列からなり、１３３〜１６９５番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。本発明の検査方法により検出される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列全長からなる遺伝子であっても、該遺伝子の一部からなる遺伝子であってもよい。「該遺伝子の一部からなる遺伝子」は、該遺伝子の発現の亢進を検出できる限り、特に制限はない。前記変異体は、上記遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列を有する。変異体の塩基配列は、上記遺伝子の塩基配列と好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。また、これら塩基配列の相補配列であってもよい。
【００２６】
（ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子にコードされるタンパク質）
本発明の検査方法により検出されるヒトＭＡＲＣＯ遺伝子にコードされるタンパク質には、５２０のアミノ酸からなるmacrophage receptor MARCO [NP_006761]、および該タンパク質の変異体が含まれる。この変異体は、該タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたタンパク質であって、macrophage receptor MARCO [NP_006761]のアミノ酸配列と、好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２７】
（ヒトＴＲＥＭ２遺伝子）
本発明の検査方法により検出されるヒトＴＲＥＭ２遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１８９６５の遺伝子（Homo sapiens triggering receptor expressed on myeloid cells 2（TREM2），mRNA  [NM_018965]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿０１８９６５の遺伝子は、１０５９ｂｐの塩基配列からなり、１０３〜７９５番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。本発明の検査方法により検出される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列全長からなる遺伝子であっても、該遺伝子の一部からなる遺伝子であってもよい。「該遺伝子の一部からなる遺伝子」は、該遺伝子の発現の亢進を検出できる限り、特に制限はない。前記変異体は、上記遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列を有する。変異体の塩基配列は、上記遺伝子の塩基配列と好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。また、これら塩基配列の相補配列であってもよい。
【００２８】
（ヒトＴＲＥＭ２遺伝子にコードされるタンパク質）
本発明の検査方法により検出されるヒトＴＲＥＭ２遺伝子にコードされるタンパク質には、２３０のアミノ酸からなるtriggering receptor expressed on myeloid cells 2 precursor [NP_061838]、および該タンパク質の変異体が含まれる。この変異体は、該タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたタンパク質であって、triggering receptor expressed on myeloid cells 2 precursor  [NP_061838]のアミノ酸配列と、好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２９】
（ヒトＩＱＣＡ１遺伝子）
本発明の検査方法により検出されるヒトＩＱＣＡ１遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２４７２６の遺伝子（Homo sapiens IQ motif containing with AAA domain 1 (IQCA1), mRNA  [NM_024726]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿０２４７２６の遺伝子は、３２５０ｂｐの塩基配列からなり、１８３〜２６５１番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。本発明の検査方法により検出される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列全長からなる遺伝子であっても、該遺伝子の一部からなる遺伝子であってもよい。「該遺伝子の一部からなる遺伝子」は、該遺伝子の発現の亢進を検出できる限り、特に制限はない。前記変異体は、上記遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列を有する。変異体の塩基配列は、上記遺伝子の塩基配列と好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。また、これら塩基配列の相補配列であってもよい。
【００３０】
（ヒトＩＱＣＡ１遺伝子にコードされるタンパク質）
本発明の検査方法により検出されるヒトＩＱＣＡ１遺伝子にコードされるタンパク質には、８２２のアミノ酸からなるIQ and AAA domain-containing protein 1 [NP_079002]、および該タンパク質の変異体が含まれる。この変異体は、該タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたタンパク質であって、IQ and AAA domain-containing protein 1 [NP_079002]のアミノ酸配列と、好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３１】
（ヒトＳＦＲＰ４遺伝子）
本発明の検査方法により検出されるヒトＳＦＲＰ４遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３０１４の遺伝子（Homo sapiens secreted frizzled-related protein 4 (SFRP4), mRNA  [NM_003014]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿００３０１４の遺伝子は、２９７４ｂｐの塩基配列からなり、３８７〜１４２７番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。本発明の検査方法により検出される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列全長からなる遺伝子であっても、該遺伝子の一部からなる遺伝子であってもよい。「該遺伝子の一部からなる遺伝子」は、該遺伝子の発現の亢進を検出できる限り、特に制限はない。前記変異体は、上記遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列を有する。変異体の塩基配列は、上記遺伝子の塩基配列と好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。また、これら塩基配列の相補配列であってもよい。
【００３２】
（ヒトＳＦＲＰ４遺伝子にコードされるタンパク質）
本発明の検査方法により検出されるヒトＳＦＲＰ４遺伝子にコードされるタンパク質には、３４６のアミノ酸からなるsecreted frizzled-related protein 4 precursor [NP_003005]、および該タンパク質の変異体が含まれる。この変異体は、該タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたタンパク質であって、secreted frizzled-related protein 4 precursor [NP_003005]のアミノ酸配列と、好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３３】
（ヒトＥＧＦＬ６遺伝子）
本発明の検査方法により検出されるヒトＥＧＦＬ６遺伝子には、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１６７８９０の遺伝子（Homo sapiens EGF-like-domain, multiple 6 (EGFL6), transcript variant  2, mRNA [NM_001167890]）、該遺伝子の一部からなる遺伝子、およびこれら遺伝子の変異体が含まれる。ＮＭ＿００１１６７８９０の遺伝子は、２４４８ｂｐの塩基配列からなり、２８８〜１９５２番目の塩基がタンパク質をコードする領域（ＣＤＳ）である。本発明の検査方法により検出される遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列全長からなる遺伝子であっても、該遺伝子の一部からなる遺伝子であってもよい。「該遺伝子の一部からなる遺伝子」は、該遺伝子の発現の亢進を検出できる限り、特に制限はない。前記変異体は、上記遺伝子の塩基配列に１以上の塩基が欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加された塩基配列を有する。変異体の塩基配列は、上記遺伝子の塩基配列と好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。また、これら塩基配列の相補配列であってもよい。
【００３４】
（ヒトＥＧＦＬ６遺伝子にコードされるタンパク質）
本発明の検査方法により検出されるヒトＥＧＦＬ６遺伝子にコードされるタンパク質には、５５４のアミノ酸からなるepidermal growth factor-like protein 6 isoform 2 precursor  [NP_001161362]、および該タンパク質の変異体が含まれる。この変異体は、該タンパク質のアミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたタンパク質であって、epidermal growth factor-like protein 6 isoform 2 precursor[NP_001161362]のアミノ酸配列と、好適には８０％以上、より好適には９０％以上、さらに好適には９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３５】
（オリゴヌクレオチドによる検出）
本発明の検査方法は、オリゴヌクレオチドを用いて前記遺伝子を検出することができる。オリゴヌクレオチドは、前記遺伝子の塩基配列の一部またはその相補塩基配列の一部からなり、前記遺伝子のｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成することができる。
【００３６】
前記オリゴヌクレオチドとして、ＰＣＲ用プライマーを挙げることができる。適切な位置と適切な配列を選択してセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作成できる。これらプライマーセットにより、ＤＮＡを増幅して検出を可能にする。プライマーの大きさは、１０〜５０ｂｐ、好ましくは、１５〜３５ｂｐである。例えば、バリアント（変異体）識別して検出する場合、欠損領域や置換領域に結合するプライマー、欠損領域の接続部分を含む（跨ぐ）領域に結合するプライマーおよび非変異部位に結合するプライマーを適宜組み合わせてバリアントを識別することができる。ヒト遺伝子ＰＲＧ４遺伝子のバリアントＢはバリアントＡ（NM_005807.3）のエクソン３を欠損し、バリアントＣはエクソン５および６、バリアントＤはエクソン３、エクソン５および６を欠損している。よって、ヒト遺伝子ＰＲＧ４遺伝子のバリアントの検出用プライマーは、これらの欠損領域を含まないプライマー、あるいはエクソン２と４、またはエクソン４と７の接続部分を含む（跨ぐ）プライマーおよび非変異部位のプライマーを適宜組み合わせることによりバリンアントを識別できることができる。
【００３７】
また、前記オリゴヌクレオチドとして、標識化プローブを挙げることができる。標識物質は、例えば、放射性同位元素、酵素、または蛍光物質などであり、具体的な標識試薬は公知の試薬を用いることができる。プライマーやプローブは、通常公知の方法により（例えば汎用のＤＮＡ合成装置を用いて）化学的に合成して得ることができる。
【００３８】
（プライマー）
本発明は、腹膜偽粘液腫の検査に好適なプライマーおよびプライマーセットを提供する。また、そのプライマーセット使用する腹膜偽粘液腫の検査方法を提供する。本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの塩基配列を下記表１に示す。各プライマーは１以上の塩基が欠失、置換、挿入、付加されていてもよく、これら変異プライマーの塩基配列は、変異前のプライマーの塩基配列と９０％以上の相同性を有する。好ましくは、９５％以上、より好ましくは９７%以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
ヒトＰＲＧ４遺伝子検出用プライマーセットは、例えば次の６セットが挙げられる。複数のセットにより、バリアント（バリアントＡ、バリアントＢ、バリアントＣおよびバリアントＤ）を識別することができる。用いるプライマーセットによって、増幅されるＤＮＡ長が異なる。また、組合せによってはバリアント特異的な検出が可能となる。プライマー［ＮＭ５８０７−ｓ  ＰＲＧ４］はエクソン３（バリアントＢとＤで欠損）内に結合領域があり、プライマー［ＮＭ５８０７  ＮＭ００１１２７７０９  ＰＲＧ４］はエクソン４と７の接続部分を含む（跨ぐ）領域（バリアントＡとＢには結合しない）に結合領域があることより、これらのプライマーを組み合わせて反応を行った場合、バリアントＣのみを特異的に検出できる（図１、図２、図３）。
NM5807-s PRG4とNM5807-a PRG4を含むプライマーセット
NM5807-s2 PRG4とNM5807-a PRG4を含むプライマーセット
NM5807-s3 PRG4とNM5807-a PRG4を含むプライマーセット
NM5807-s PRG4とNM5807 NM001127709 PRG4を含むプライマーセット
NM5807-s2 PRG4とNM5807 NM001127709 PRG4を含むプライマーセット
NM5807-s3 PRG4とNM5807 NM001127709 PRG4を含むプライマーセット
【００４１】
ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子検出用プライマーセットは、例えば次のセットが挙げられる。
NM493-s COL10A1とNM493-a COL10A1を含むプライマーセット
【００４２】
ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子検出用プライマーセットは、例えば次のセットが挙げられる。
NM6770-s MARCOとNM6770-a MARCOを含むプライマーセット
【００４３】
ヒトＴＲＥＭ２遺伝子検出用プライマーセットは、例えば次のセットが挙げられる。
NM18965-s TREM2とNM18965-a TREM2を含むプライマーセット
【００４４】
ヒトＩＱＣＡ１遺伝子検出用プライマーセットは、例えば次のセットが挙げられる。
NM024726-s IQCA1とNM024726-a IQCA1を含むプライマーセット
【００４５】
ヒトＳＦＲＰ４遺伝子検出用プライマーセットは、例えば次のセットが挙げられる。
NM003014-s SFRP4とNM003014-a SFRP4を含むプライマーセット
【００４６】
ヒトＥＧＦＬ６遺伝子検出用プライマーセットは、例えば次のセットが挙げられる。
NM001167890-s EGFL6とNM001167890-a EGFL6を含むプライマーセット
【００４７】
本発明のプライマーセットは、上記プライマーセットを複数含むことができる、例えば上記プライマーセットを１〜１０、好ましくは２〜７、さらに好ましくは３〜６含むことができる。
【００４８】
（遺伝子の検出方法）
本発明の腹膜偽粘液腫の検査方法の一実施態様は、上記プライマーセットの少なくとも１つが使用される。患者由来試料中の標的とする遺伝子（腫瘍マーカー）をＲＴ−ＰＣＲで増幅する際に本発明のプライマーセットは用いられる。標的とする遺伝子（腫瘍マーカー）が存在すれば、そのｃＤＮＡに本発明のプライマーは結合しＤＮＡが増幅されて試料中の腫瘍マーカーの存在が検出される。
【００４９】
具体的には、次の工程からなる。
ア）患者由来の試料からｍＲＮＡを抽出する工程、
イ）得られたＲＮＡを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程、
ウ）本発明のプライマーセットの少なくとも１種をｃＤＮＡ試料中に加えてＰＣＲを行う工程、
エ）増幅されたＤＮＡを検出する工程
ア）〜エ）の各工程は公知の方法により行うことができる。
さらに、正常細胞や他の癌細胞由来の試料を対照試料として、その対象試料を同様の工程により処理した後に比較する工程を含むこともできる。
【００５０】
その他の遺伝子を検出する方法としては、該遺伝子に特異的に結合するプローブ用の標識化ヌクレオチド、標識化ｃＤＮＡまたは標識化ＲＮＡを用いたノーザンブロット法、ドットブロット法、またはｍＲＮＡを直接測定する方法等を用いることができる。ＰＣＲ法としては、リアルタイムＰＣＲ法、競合ＰＣＲ法等も挙げることができる。
【００５１】
さらに、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、または抗体アレイ等が挙げられる。ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップには該遺伝子のヌクレオチド又はｃＤＮＡが少なくとも１つ以上固定化されているものを用いる。なお、ヌクレオチド又はｃＤＮＡは、該遺伝子の一部に相当する部分でもよい。
【００５２】
（タンパク質の検出方法）
タンパク質を検出する方法としては、特定のタンパク質を検出する方法であれば特に制限されない。例えば、タンパク質に特異的に結合する抗体やアプタマー等を用いることができ、抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示できる。これらの抗体は、慣用のプロトコルを用いて該ポリペプチド又はタンパク質又はそれらの断片を抗原として用いて作製することができる。また、アプタマーとは、タンパク質、アミノ酸等の分子に特異的に結合する核酸分子である。
【００５３】
上記タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、被検試料中に存在する該ポリペプチド又はタンパク質を検出又は定量する場合、免疫沈降法、電気化学発光法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的方法を用いることができる。抗体としては、例えば、Lubricin（H-140）Antibody: sc-98454（santa cruz biotechnology製）、Anti-Proteoglycan-4（NBP1-19048）（フナコシ (Novus Biologicals, LLC)製）、Anti-Collagen X antibody (ab104601)（アブカム社製）、Anti-MARCO  antibody（ab103311）（アブカム社製）等が挙げられる。
【００５４】
（腹膜偽粘膜腫の治療剤のスクリーニング方法）
本発明の腹膜偽粘膜腫の治療剤のスクリーニング方法は、上記（ａ）〜（ｇ）の遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子、または該遺伝子にコードされるタンパク質を検出する工程を含む。上記（ａ）〜（ｇ）の遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子を発現する培養細胞、または実験動物モデルに、腹膜偽粘膜腫の治療剤の候補である物質を接触させ、または投与し、該遺伝子の発現の抑制または低減を検出する。検出方法は上記の患者由来の試料より検出する方法と同様の方法でよい。また、検出される遺伝子、使用されるオリゴヌクレオチド、プライマー等も上記方法と同様である。
【００５５】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
（ＲＮＡ）
腹膜偽粘膜腫（以下、ＰＭＰと称する）の組織のＲＮＡと胃癌培養細胞のＲＮＡは、以下のように抽出し、虫垂（Appendix）のＲＮＡはBioChain社（輸入元：WAKO）から購入した。
【００５７】
（ＲＮＡの抽出）
培養癌細胞は、培養フラスコ(Nunc)上に細胞を播種し、subconfluentになったところで、培養上漬を吸引除去した後、ｌｍｌのＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン，東京)を加え、細胞を溶解させた。また、ＰＭＰ組織については氷上で細切した後、ガラスホモジナイザーに移し、ＩＳＯＧＥＮ(１ｍｌ)を加え溶解した。溶解した細胞または組織を含むＩＳＯＧＥＮをチューブに移し、室温において５分間放置した後、２００μｌのクロロホルムを加え、１５秒間振とう後、室温にて３分間放置した。続いて、４℃で１２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上層を新しいチューブに移し、５００μｌのイソプロパノールを加え混合し、室温にて５分間放置した後、４℃で１２，０００ｒｐｍ、１０分間遠心してＲＮＡの沈殿を得た。１ｍｌの７５％エタノールにより洗浄、風乾し、滅菌蒸留水を加え沈殿を溶解し、ＲＮＡ試料とした。分光光度計(島津製作所，京都)で２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、１ＯＤを４０μｇ／ｍｌとしてＲＮＡ濃度を算出した。７症例の腹膜偽粘液腫（ＰＭＰ）の腫瘍から７検体（ＰＭＰ−１、ＰＭＰ−２、ＰＭＰ−３、ＰＭＰ−４、ＰＭＰ−５、ＰＭＰ−６、ＰＭＰ−７）を得た。
【００５８】
７症例の腹膜偽粘液腫（ＰＭＰ）の腫瘍から得られた検体の内、特に良好なｔｏｔａｌＲＮＡ試料が得られた３検体（ＰＭＰ−４、ＰＭＰ−５、ＰＭＰ−７）とヒト正常虫垂(BioChain社)、ヒト胃がん細胞ＭＫＮ−４５の網羅的遺伝子発現解析を実施した。遺伝子発現解析にはAgilent社のオリゴアレイ（SurePrint G3 Human Expression 8x60k）を用い、34,127の転写産物についてヒト正常虫垂およびＭＫＮ−４５細胞で比較し、ＰＭＰに特徴的に発現が亢進している遺伝子の予備的検索を行った。その結果、３検体のすべてのＰＭＰで発現が３倍以上亢進している遺伝子として８個の候補遺伝子を抽出した。
【００５９】
これらの８遺伝子について、ＲＴ−ＰＣＲを行うために各遺伝子についてセンスプライマーとアンチセンスプライマーを公知のプライマー作成ソフトおよびＤＮＡ合成装置を用いて作製した。ヒトＰＲＧ４遺伝子については４つのバリアントを差別化するために、センスプライマーを３つ、アンチセンスプライマーを２つ作成した。
【００６０】
（逆転写反応）
上記ＲＮＡの抽出方法と同様の方法によりｍＲＮＡを抽出した。３００μｇ／ｍｌに調整したＲＮＡ試料ｌ０μｌに対し、２０μＭのoligo-(dT12-18)プライマー(GE Healthcare, UK)５μｌを加え、６８℃で１５分間アニーリングを行い、氷中に５分間放置した。ReverTra Ace（登録商標）（東洋紡績，大阪）に添付の５x反応緩衝液１０μｌ、各２．５ｍＭのヌクレオチド混合液ｄＮＴＰ：（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ：TAKARA，大津)１０μｌ、ReverTra Ace（登録商標）３μｌ、ＲＮａｓｉｎ（登録商標）（Promega,san Luis Obispo,CA,USA）０．５μｌに蒸留水１１．５μｌを加え、全量５０μｌとした。４２℃で９０分間の逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。引き続き、９５℃で５分間加熱し逆転写酵素を失活させｃＤＮＡを得た。
【００６１】
（ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ用チューブに逆転写反応により作製したｃＤＮＡ３μｌ、センス及びアンチセンスプライマーを各３μｌ、Go Taq（登録商標）master  mix（Promega, san Luis Obispo,CA,USA）９μｌを加え、全量ｌ８μｌとした。ＰＣＲは９４℃、３分間のホットスタートを行い、９４℃，５０秒、６２℃，５０秒、７２℃，１分３０秒を１サイクルとし、２７回繰り返し、さらに９４℃，１分、６２℃，１分３０秒、７２℃，２分３０秒のサイクルを３回繰り返した。ＰＣＲ反応後、全量を１．２％ low melting temperature agarose gelにより１００Ｖで泳動を行い、ゲルの写真を撮影した。
【００６２】
上記で得られた８個の候補遺伝子の８症例のＰＭＰにおける発現をＲＴ-ＰＣＲ法により解析したところ、オリゴアレイ解析に供した３検体以外の４検体においてもＭＫＮ−４５細胞に比較し発現が亢進していることが確認された。さらに、１１種のヒト胃がん細胞（ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ-４５Ｐ、ＴＭＫ−１、ＡＺ５２１、Ｎａｋａｊｉｍａ、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＮＵＧＣ−３、ＮＵＧＣ−４、ＮＫＰＳ、ＭＫＮ−７、ＭＫＮ−２８）における遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲで解析したところ８遺伝子の内、３遺伝子［ヒトＰＲＧ４遺伝子（ＮＭ＿００５８０７）（使用プライマー：NM5807-s PRG4とNM5807-a PRG4）、ヒトＣＯＬ１０Ａ１遺伝子（ＮＭ＿０００４９３）（使用プライマー：NM493-s COL10A1とNM493-a COL10A1）、ヒトＭＡＲＣＯ遺伝子（ＮＭ＿００６７７０）（使用プライマー： NM6770-s MARCOとNM6770-a MARCO）］は胃癌細胞では発現が認められず、ＰＭＰで特異的に発現する遺伝子であることが示唆された（図４、図５）。そこで、ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅデータベースに公開されているＥＳＴ（expressed sequence tag）プロファイルの各種腫瘍組織での遺伝子発現データを参照したところ、これらの３遺伝子は腫瘍組織における発現頻度や発現レベルは極めて低いことも確認され、ＰＭＰ診断の有用な腫瘍マーカーになることを確認した。
【００６３】
ヒトＰＲＧ４遺伝子には、４種のバリアントが存在するため、８症例のＰＭＰにおけるヒトＰＲＧ４バリアント遺伝子の発現と胃癌細胞ＭＫＮ−４５におけるヒトＰＲＧ４バリアント遺伝子の発現を４種のプライマーセット（NM5807-s PRG4とNM5807-a PRG4のセット、NM5807-s2 PRG4とNM5807-a PRG4のセット、NM5807-s3 PRG4とNM5807-a PRG4のセットおよびNM5807-s PRG4とNM5807 NM001127709 PRG4のセット）を用いてＲＴ-ＰＣＲ法により解析したところ、ＰＭＰではバリアントＣのみを発現していた（図６）。また、１１種の胃癌細胞におけるヒトＰＲＧ４遺伝子発現を３種のプライマーセット（NM5807-s PRG4とNM5807-a PRG4のセット、NM5807-s2 PRG4とNM5807-a PRG4のセットおよびNM5807-s3 PRG4とNM5807-a PRG4のセット）を用いてＲＴ-ＰＣＲ法により解析したところ、いかなるバリアントも発現していなかった（図７）。
【００６４】
前記予備的検索で得られた遺伝子からさらに２３個の候補遺伝子を抽出し、各遺伝子についてセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作成した。これら２３遺伝子の７症例のＰＭＰにおける発現と、胃癌細胞（前記胃癌細胞およびＫＫＬＳ）および大腸癌細胞（ＨＴ−２９およびＤＬＤ−１）における遺伝子発現をＲＴ-ＰＣＲ法により解析した。その結果、ヒトＴＲＥＭ２遺伝子（ＮＭ＿０１８９６５）（使用プライマー：NM18965-s TREM2とNM18965-a TREM2）およびヒトＩＱＣＡ１遺伝子（ＮＭ＿０２４７２６）（使用プライマー：NM024726-s IQCA1とNM024726-a IQCA1）は胃がん細胞および大腸癌細胞では発現が認められず、ＰＭＰで特異的に発現する遺伝子であることが示唆された（図８、図９）。なお、ＰＭＰ−Ｍｉｘは複数のＰＭＰ由来のｃＤＮＡを混合したもの（陽性コントロール）である。ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅデータベースに公開されているＥＳＴ（expressed sequence tag）プロファイルの各種腫瘍組織での遺伝子発現データを参照したところ、これらの２遺伝子は腫瘍組織における発現頻度や発現レベルは極めて低いことも確認され、ＰＭＰ診断の有用な腫瘍マーカーになることを確認した。
【００６５】
ＰＭＰにおいて発現の亢進が確認できた上記５遺伝子について、ヒト正常虫垂（Appendix）(BioChain社)およびＭＫＮ−４５細胞の発現量に対するＰＭＰにおける発現量比を下記表２にまとめた。ただし、第２列および第３列のＭＫＮ−４５およびAppendixの値は補正されたシグナル強度の値を示す。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
予備的検索で得られた遺伝子からさらに８個の候補遺伝子を抽出し、各遺伝子についてセンスプライマーとアンチセンスプライマーを作成した。これら８遺伝子の８症例のＰＭＰにおける発現と、胃癌細胞における遺伝子発現をＲＴ-ＰＣＲ法により解析した。その結果、ヒトＳＦＲＰ４遺伝子（ＮＭ＿００３０１４）（使用プライマー：NM003014-s SFRP4とNM003014-a SFRP4）およびヒトＥＧＦＬ６遺伝子（ＮＭ＿００１１６７８９０）（使用プライマー：NM001167890-s EGFL6とNM001167890-a EGFL6）は胃がん細胞および大腸癌細胞では発現が認められず、ＰＭＰに特異的に発現する遺伝子であることが示唆された（図１０、図１１）。ＮＣＢＩのＵｎｉＧｅｎｅデータベースに公開されているＥＳＴ（expressed sequence tag）プロファイルの各種腫瘍組織での遺伝子発現データを参照したところ、これらの２遺伝子は腫瘍組織における発現頻度や発現レベルは極めて低いことも確認され、ＰＭＰ診断の有用な腫瘍マーカーになることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
腹膜偽粘液腫の特異的な検出を可能とする腫瘍マーカー（遺伝子またはタンパク質）を提供し、患者に適切な治療を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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