(57)【要約】【課題】低分子量の薬物であってもコラーゲン中に安定に保持できる医薬組成物を提供する。【解決手段】薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物と、基材としてのコラーゲンとを含む医薬組成物により、上記の課題を解決する。【選択図】図１１
2013126973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物の多孔体と、基材としてのコラーゲンとを含む医薬組成物。
【請求項２】
前記リン酸カルシウム化合物がヒドロキシアパタイトである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記薬物が抗癌剤である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗癌剤がタキソールである請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤がアドリアマイシンである請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記多孔体が、基材としてのコラーゲン中に包含されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ゲルの形態である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
薬物を生体適合性リン酸カルシウム化合物の多孔体に吸着させ、コラーゲンと混合することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項９】
前記多孔体を包含するコラーゲンをゲル化させることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物を吸着させたリン酸カルシウム化合物を含むコラーゲン医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の転移は、癌の治療において大きな問題の１つである。癌の転移は、癌細胞がマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)などのタンパク質分解酵素を分泌して、ラミニン、ゼラチン、フィブロネクチン、プロテオグリカンなどの細胞外マトリクスを分解して浸潤し、血管などの循環経路に浸透することにより進行すると推測されている。
【０００３】
癌の治療に関して、送達システムを利用することが、現在までに開発されている。例えば、特開昭６１−５６１３４号(特許文献１)には、化学療法薬物を分散させたコラーゲン組成物を、腫瘍部位、その周囲又は腫瘍を除去したあとの組織に注入して、該薬物を含む組成物を組織に付着させて薬物を組織に送達することが記載されている。
【０００４】
しかし、コラーゲンは繊維状タンパク質であり、網目構造を有しているので、薬物を包含する特許文献１のような医薬組成物を用いた場合、薬物が網目構造から外れて漏れ出し、正常な細胞に接触してしまう。通常、抗癌剤のような薬物は、正常細胞にとっては毒性が高いので、このような医薬組成物を用いることにより副作用が発生してしまうという問題が発生する。
【０００５】
そこで、本発明者は、抗癌剤のような薬物を、デンドリマーのような生体適合性高分子化合物と複合させ、これをコラーゲンゲル中に含有させた医薬組成物を作製した(特開２００９−２６３３３９号；特許文献２)。このようなコラーゲンゲルからは、抗癌剤がほとんど漏れ出すことがなく、また、癌細胞が放出するタンパク質分解酵素によりコラーゲンゲルが分解されたときに抗癌剤が放出されるので、癌細胞に対して特異的に抗癌剤を放出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６１−５６１３４号公報
【特許文献２】特開２００９−２６３３３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、デンドリマーのような生体適合性高分子の代わりに、ヒドロキシアパタイトに代表される生体適合性リン酸カルシウム化合物を用いても、コラーゲンゲルに抗癌剤などの薬物を安定して保持させることができることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
よって、本発明は、薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物と、基剤としてのコラーゲンとを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明は、薬物を生体適合性リン酸カルシウム化合物に吸着させ、基材としてのコラーゲンと混合することを含む、上記の医薬組成物を製造する方法も提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の医薬組成物は、薬物がリン酸カルシウム化合物に吸着しているので、コラーゲンの網目構造から外れて漏れ出し難い。よって、コラーゲン中に包含されている抗癌剤のような正常細胞に悪影響を与え得る薬物がコラーゲンから漏れ出し難く、副作用の低い薬物送達を可能にする。本発明の医薬組成物は、コラーゲンが、癌細胞により放出されるタンパク質分解酵素によって分解される結果、抗癌剤を放出するので、癌細胞に対して特異的に抗癌剤の機能を発揮させることができる。また、コラーゲンは、ゲル状とすることができるので、例えば手術により切開した患部に直接塗布して用いることもできる。
さらに、本発明で用いるリン酸カルシウム化合物は、生体適合性が確認されているので、生体に対して悪影響を与えることが少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】湿式法により製造したヒドロキシアパタイトのＸ線回折パターンを示す。
【図２】湿式法により製造したヒドロキシアパタイトの量と、タキソールの吸着率との関係を示すグラフである。
【図３】水熱法により製造したヒドロキシアパタイトのＸ線回折パターンを示す。
【図４】水熱法により製造したヒドロキシアパタイトの走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図５】タキソールを溶解するエタノール/水の混合比が、ヒドロキシアパタイトへのタキソールの吸着に与える影響を示すグラフである。
【図６】ヒドロキシアパタイトの量がタキソールの吸着に与える影響を示すグラフである。
【図７】水熱法により製造したヒドロキシアパタイトの細胞毒性を調べた実験結果を示すグラフである。
【図８】ヒドロキシアパタイトに吸着したか又は吸着していないタキソールの、乳癌由来細胞(MDA-MB-231)への細胞毒性を示すグラフである。
【図９】ヒドロキシアパタイトに吸着したか又は吸着していないタキソールの、乳癌由来細胞(MCF-7)への細胞毒性を示すグラフである。
【図１０】ヒドロキシアパタイトに吸着したか又は吸着していないタキソールを含むコラーゲンゲルの、ヒト乳癌由来細胞MDA-MB-231又はMCF-7の三次元培養における細胞毒性を調べた結果を示す。
【図１１】ヒドロキシアパタイトに吸着したか又は吸着していないタキソールを含むコラーゲンゲルの、正常細胞(MC3T3-E1)又は乳癌細胞(MDA-MB-231)の三次元培養における細胞毒性を調べた結果を示す。
【図１２】ヒドロキシアパタイトに吸着したタキソールを含むコラーゲンゲル(Tax/HA/Col)のインビボにおける抗腫瘍作用を示すグラフである。
【図１３】ヒドロキシアパタイトに吸着したアドリアマイシンの、ヒト乳癌由来細胞MDA-MB-231又はMCF-7の細胞毒性を調べた結果を示す。
【図１４】ヒドロキシアパタイトに吸着したアドリアマイシンを含むコラーゲンゲルの、ヒト乳癌由来細胞MDA-MB-231又はMCF-7における細胞毒性を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の医薬組成物は、薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物の多孔体と、基材としてのコラーゲンとを含むことを特徴とする。
本発明で用いられる薬物としては、抗癌剤が好ましい。抗癌剤としては、アドリアマイシン(ドキソルビシン)、ブレオマイシン、マイトマイシンＣのような抗生物質、シスプラチン、オキサリプラチンのような白金化合物、５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビンのような代謝拮抗剤、ビンクリスチン、タキソール(パクリタキセル)、ビンブラスチン、ドセタキセルのような天然物由来抗癌剤などが挙げられる。なかでも、他の薬物と併用せずに抗癌剤としての効果が発揮されるものが好ましく、そのようなものとしては、タキソールが挙げられる。
【００１２】
生体適合性リン酸カルシウム化合物は、リン酸とカルシウムとを主成分とする生体適合性の化合物である。本発明においては、所望の薬物を吸着できる化合物であればいずれのリン酸カルシウム化合物を用いてもよい。薬物とリン酸カルシウム化合物との吸着は、当業者に公知の方法により確認できる。生体適合性リン酸カルシウム化合物としては、例えばCaHPO4、Ca(PO4)2、Ca(PO4)3OH、Ca4O(PO4)2、Ca10(PO4)6(OH)2 (ヒドロキシアパタイト)、Ca(PO3)2、Ca2P2O7、Ca(H2PO4)2、Ca(H2PO4)2・H2Oなどが挙げられる。好ましくは、リン酸カルシウム化合物は、多孔性である。なかでも、入手が容易であり、現在までに生体適合性材料としてよく研究されている点で、ヒドロキシアパタイトが好ましい。
【００１３】
ヒドロキシアパタイトは、多孔性であり、薬物を吸着できるものであれば特に限定されず、従来公知のものを適切に用いることができる。薬物とヒドロキシアパタイトとの吸着は、当業者に公知の方法により確認することができる。
ヒドロキシアパタイトは、カルシウム源化合物(例えばCaCl2、Ca(NO3)2、Ca(OH)2などが挙げられる)と、リン源化合物(例えばNa2HPO4、NaH2PO4，H3PO4、KH2PO4、(NH4)2HPO4、NH4H2PO4などが挙げられる)とを混合し、水熱法、湿式法、焼結法などにより処理することにより製造できることが知られており、これらのいずれを用いて製造したヒドロキシアパタイトも、本発明において良好に用いることができる。また、市販されているヒドロキシアパタイトも用いることができる。特に、水熱法又は湿式法により製造したものが、ヒドロキシアパタイトの表面に付着し得る水分の量の点で好ましいと考えられる。
【００１４】
水熱法は、カルシウム源化合物とリン源化合物とを混合し、その水溶液を120℃以上の温度で10時間以上還流する方法である。
焼結法は、カルシウム源化合物とリン源化合物とを混合し、800℃以上、より好ましくは1000℃以上の温度で焼成する方法である。
湿式法は、カルシウム源化合物の水溶液とリン源化合物の水溶液とを混合し、熟成を行う方法である。
【００１５】
上記のヒドロキシアパタイトは、1.67程度のカルシウム/リン比率(Ca/Ｐ比率)を有することが好ましい。Ca/Ｐ比率は、当業者に公知の方法により測定でき、例えば、以下の実施例に記載するように、誘導結合プラズマ法により測定した値に基づいて算出できる。
上記のヒドロキシアパタイトは、大きな(例えば、50〜300 m2/gの)BET吸着表面積を有することが好ましい。このような範囲のBET吸着表面積を有することにより、薬物を良好に吸着することができる。BET吸着表面積は、以下の実施例に記載するように、BET吸着法により測定できる。
上記のヒドロキシアパタイトは、棒状(針状)、球状などのいずれの形状のものであっても良好に用いることができる。棒状(針状)である場合、棒(針)の長径は、200 nm未満、より好ましくは150 nm以下である。球状の場合、球の粒径は、200 nm未満、より好ましくは150 nm以下である。本発明において、ヒドロキシアパタイトの寸法は、走査型電子顕微鏡により測定できる。
ヒドロキシアパタイトは、粒径又は長径が小さいほど表面積が向上して薬物の吸着力が増加すると考えられるので、これらの粒径又は長径の下限は、製造可能なヒドロキシアパタイトの粒径又は長径に依存して適宜選択でき、例えば１nmとすることができる。
【００１６】
上記の薬物は、適切な溶媒に溶解させ、リン酸カルシウム混合物と混合することにより、リン酸カルシウム化合物に吸着させることができる。混合は、薬物及びリン酸カルシウム化合物に悪影響を与えない温度及び時間で行うことができ、例えば室温にて１〜10時間程度であればよい。
薬物を溶解するための溶媒は、薬物の種類に応じて適宜選択できる。例えば、タキソールは、エタノールと水の混液に溶解できる。例えば、薬物としてタキソールを用いる場合、タキソールを、エタノール：水＝5.5：4.5の容量比の溶媒に溶解してリン酸カルシウム化合物と混合することにより、良好な吸着を得ることができる。また、例えばアドリアマイシンを用いる場合、アドリアマイシンは水溶液に溶解してリン酸カルシウム化合物と混合することにより、良好な吸着を得ることができる。
薬物とリン酸カルシウム化合物との混合比率は、薬物及びリン酸カルシウム化合物の種類に応じて適宜選択できる。例えば、薬物としてタキソールを用い、リン酸カルシウム化合物としてヒドロキシアパタイトを用いる場合、タキソールとヒドロキシアパタイトは、１:20程度の重量比で混合すると、ヒドロキシアパタイトへのタキソールの吸着が飽和し得る。
薬物及びリン酸カルシウム化合物として、タキソール又はアドリアマイシン及びヒドロキシアパタイト以外の物質を用いる場合も、最適な吸着を得るための条件を当業者に公知の方法により決定できることが明らかである。
【００１７】
本発明の医薬組成物を構成する基材としてのコラーゲンは、医療用コラーゲンとして通常用いられるものである。このようなコラーゲンとしては、哺乳動物、特にヒトの腫瘍細胞が分泌するマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)により分解され得るものである。
コラーゲンは、天然のものであってもよいし、変性したものであってもよい。変性したコラーゲンとしては、免疫原性を低減させたアテロコラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、アシル化コラーゲン、エステル化コラーゲンなどが挙げられる。市販のコラーゲンを用いることもできる。
【００１８】
コラーゲンは、現在、30種類以上が知られており、これらの１種又は複数種を用いることができる。ＭＭＰにより分解されやすい点で、ＩＶ型コラーゲンを含むことが好ましい。また、ゲル化しやすい点でＩ型コラーゲンを含むことが好ましい。より好ましくは、Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとの混合物である。
Ｉ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンとを混合して用いる場合、これらの重量比は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン：ＩＶ型コラーゲン＝100〜25：0〜75の重量比(％)で混合して用いることができる。すなわち、Ｉ型コラーゲンを単独で用いることもできる。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物とコラーゲンとを、薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム：コラーゲン＝３：20〜200000の重量比で含むことが好ましい。このような重量比でこれらの物質を含むことにより、コラーゲンがＭＭＰにより分解された際に、薬物が吸着した生体適合性リン酸カルシウム化合物を効率よく放出することができる。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物の多孔体が、基材としてのコラーゲンに包含されていることが好ましい。薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物の多孔体を包含するコラーゲンは、ゲル化させることが好ましい。ゲル化させることにより、本発明の医薬組成物を患者へ塗布により投与することが容易になる。また、ゾル溶液を患部に注入して局所でゲル化させることによって、患部にコラーゲンゲルを投与することもできる。
【００２１】
本発明の医薬組成物は、上記のようにして得られた薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物の多孔体をコラーゲンと混合して、得ることができる。
コラーゲンと薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウムの多孔体との混合は、コラーゲンがゲル化しない条件下で行うことができる。該条件は、低温、好ましくは０〜４℃の温度である。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、上記の混合物をゲル化して得られるものが好ましい。ゲル化は、上記の混合物を20〜40℃の温度で５〜60分間インキュベートすることにより行うことができる。このようにゲル化した組成物は、例えば、患者の腫瘍部位を外科手術により切除した後に、処置された組織部分に塗布することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を、薬物としてタキソール(実施例１)及びアドリアマイシン(実施例２)を用い、リン酸カルシウム化合物としてヒドロキシアパタイトを用いた例により説明するが、本発明は、これらの特定の例により限定されるものではない。
実施例１
(１)ヒドロキシアパタイト(HA)の調製(湿式法)及び特徴決定
(1-1)製造方法
硝酸カルシウム四水和物4.25g (18mmol、ナカライテスク株式会社)を蒸留水に溶解し、1N水酸化ナトリウム(NaOH、ナカライテスク株式会社)水溶液を用いてpHを８とした後、容量を180mlに合わせた(0.1M)。次にリン酸水素二アンモニウム1.58g (12.0mmol、ナカライテスク株式会社)を蒸留水に溶解し、１N NaOHを用いてpHを12とした後、120mlに合わせた(0.1M)。分液ロートを用いて、硝酸カルシウム水溶液に対し、リン酸水素二アンモニウム水溶液を攪拌しながら約30分かけてゆっくり滴下し、さらに１時間攪拌を続けた。次に、吸引濾過により結晶をろ別し、蒸留水100mlで３回洗浄した。その後、50℃に設定したオーブンで１日乾燥させ、乳鉢及び乳棒で結晶を細かく潰した後、600℃で24時間加熱処理を行うことで目的のHAを得た。
収量：1.18g、収率：65.2%
【００２４】
(1-2)特徴決定
得られたHAを、Ｘ線回折法(XRD)により測定した。XRDの条件は、次のとおりであった。X線源:CuKα、管電圧:40kV、管電流:40mA、走査範囲:２θ= 10°〜60°、スキャンスピード:１°/分、サンプリング幅:0.01°、スリット:１/２°。
【００２５】
XRDの結果を、図１に示す。図１より、黒の丸で示したようなHA由来のピークが多数確認できることから、HAが調製できたと考えられる。特定できないピークも確認できるが、これはリン酸水素カルシウムなどの不純物によるものと考えられる。
【００２６】
(1-3)HAへのタキソール(tax)の吸着
タキソール(tax)５mg (5.90μmol、LKT Laboratories, Inc.)をエタノール(ナカライテスク)500μlに溶解し、10mg/ml tax溶液を調製した。10mg/ml tax溶液50μl、エタノール60μl、蒸留水90μlをそれぞれ混合してエタノール/水混合比が5.5/4.5のtax溶液を調製した。このtax溶液に、(１)で調製したHAを10〜50mg加え、５時間攪拌した後、遠心分離(11000rpm、20℃、60分)を行い、上澄み液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定することによって上澄み液に残存しているtaxを定量し、HAに吸着したtax量を算出した。
なお、HPLC測定条件は以下の通りであった。
カラム:5C18_MS_II、移動相:メタノール/水=７/３、流速:1.0ml/分、検出:UV (254nm)、注入量:５μl
【００２７】
HAへのtax吸着結果を図２に示す。なお、実験で加えたtax全量をａ、HPLCにより測定したtax吸着量をｂ、沈殿量をｃとして、tax吸着率を以下の式により算出した。
tax吸着率(％) = ｂ/ (ａ−ｃ)×100
図２から、溶解しているtaxの約60%がHAに吸着したことがわかる。また、HA量とtax吸着率との間の相関はあまり見られないことが分かった。これは、この実験条件では、HA量を増やすことによる吸着表面積の増大よりも溶液中でのtaxの分散状態が大きく影響しているためだと考えられる。
また、湿式法によって調製したHAへのtaxの吸着量はロット間での差が大きいことがわかった。
【００２８】
次に、市販の粒径200nm以下のHA (以下、HAsという；ヒドロキシアパタイト(nanopowder、＜200 nm(BET)、synthetic/ grade、powder、synthetic；Aldrich Chemical))及び粒径の大きなHA (HAL) 10mg (Sigma-Aldrich Chemistry)を用いて同様にtax吸着実験を行うことで、HAへのtax吸着実験における粒径の影響を調べた。
結果を、以下の表１に示す。
【００２９】
【表１】
2013126973.tif 000003
【００３０】
粒径200nm未満のHAsでは約40%のタキソールが吸着したが、粒径の大きなHALではほとんど吸着しなかった。HAの吸着表面積の増大よりもtaxの溶液中での分散状態が大きく影響していると上で述べたが、表１の結果によると、ある一定の吸着表面積以下ではtaxは吸着しにくいとも考えられる。
【００３１】
(２)HAの調製(EDTA支援水熱法)及び特徴決定
(2-1)製造方法
硝酸カルシウム四水和物5.90g (25.0mmol、ナカライテスク株式会社)及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム1.86g (5.53mmol、ナカライテスク株式会社)を蒸留水に溶解し、pHを12とした後、容量を50mlに合わせた。また、リン酸水素二ナトリウム2.13g (15.0mmol、ナカライテスク株式会社)を蒸留水に溶解し、pHを12とした後、容量を50mlに合わせた。次に、リン酸水素二ナトリウム水溶液50mlに対し、硝酸カルシウム及びエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを含む水溶液50mlを、分液ロートを用いて攪拌しながら30分かけて滴下した。次に、混合溶液を60℃で２時間加熱・攪拌し、さらに還流条件下で120℃、12時間水熱反応を行った。その後、遠心分離(11000rpm、20℃、30分)及び蒸留水50mlで洗浄操作を3回繰り返し、50℃で24時間乾燥させることでHAを得た。得られたHAを、(１)で製造したHAと区別するために、以下、HA-EDTAという。
収量：2.08g、収率：82.9%
【００３２】
(2-2)特徴決定
(2-2-1)Ｘ線回折
このHA-EDTAを、(１)と同様の条件下でＸ線回折法(XRD)により分析した。
結果を、図３に示す。図３において、黒丸で示したようなHA由来のピークが多数確認できた。これを図１の結果と比べてみると、水熱法で調製したHA-EDTAの方が強度が非常に大きい。これはEDTAの効果と水熱反応によりHAの結晶性が向上したためではないかと考えられる。HA結晶の形成過程にはHA前駆体と呼ばれるリン酸水素カルシウム二水和物(CaHPO4・2H2O、DCPD)とリン酸水素カルシウム(CaHPO4、DCPA)とが生成することが知られている。そしてDCPDからDCPAへ、DCPAからHAへ遷移することでHA結晶が形成される。この系にEDTAを加えるとCa-EDTA錯体が形成され、DCPD及びDCPAの生成が抑制される。これによって最終生成物であるHAの純度が向上するのではないかと考えられる。また、水熱反応によってDCPAからHAへの遷移が行われる温度ではCa-EDTA錯体は分解され、これがCaの供給源となるためHA形成を促進していると考えられる。
【００３３】
(2-2-2)誘導結合プラズマ(ICP)による同定
以下のようにして誘導結合プラズマ(ICP)による同定を行った。
まずHA-EDTA 10mgをはかりとり、塩酸10ml(キシダ化学株式会社)に溶解した。次にこの溶液200μlに蒸留水10mlを加えてCa濃度を10ppm以下とした後、検量線を用いてICPによりCaおよびＰの定量分析を行い、Ca/Ｐを算出した。
結果を、以下の表２に示す。
【００３４】
【表２】
2013126973.tif 000004
【００３５】
HAの構造式は、化学式Ca10(PO4)6(OH)2で表され、Caが10個とＰが６個含まれることからCa/Ｐの理論値は1.67と算出される。水熱法で調製したHA-EDTAのCa/Ｐは、ICPにより測定して、1.66となり、理論値とほぼ等しい値が得られた。またHA結晶は一般に空間群P63/mを持つ六方晶構造(ａ軸: 9.43Å, ｃ軸: 6.88Å)であることが知られている。今回調製したHA-EDTAの格子定数はこれと良く一致しており、空間の歪みのない六方晶構造をしていると考えられる。
【００３６】
(2-2-3)BET吸着法
以下のようにしてBET吸着法を用いてHA-EDTAのBET吸着表面積を求めた。
HA-EDTA１gをはかりとり試験管内に入れ、前処理として真空引きを行い130℃で12時間熱処理を行った。その後、窒素ガスを用いて圧力の増減よりBET吸着表面積を算出した。
BET吸着法により測定したところ、水熱法により調製したHA-EDTAのBET吸着表面積は、72.0 m2/gであることが分かった。HAのBET吸着表面積は、一般に50〜300 m2/gとされており、このことから今回調製したものが通常のHAと同程度のBET吸着表面積を持つことが分かった。
【００３７】
(2-2-4)走査型電子顕微鏡観察
以下のようにして走査型電子顕微鏡(SEM)を用いてHA-EDTA粒子を観察した。
まずHA-EDTAを少量とり、スパッタリングにより金蒸着を施した後、加速電圧を15kVとしてSEM観察を行った。用いた電子顕微鏡は、日立製S-4500であった。
観察したSEM写真を、図４に示す。
図４より、水熱法により調製したHA-EDTAが、長径約100nmの棒状HAであることが分かった。
【００３８】
(2-3)tax吸着試験
タキソール(tax)５mg (5.90μmol、LKT Laboratories, Inc.)をエタノール(ナカライテスク)500μlに溶解し、10mg/ml tax溶液を調製した。10mg/ml tax溶液、エタノール及び蒸留水を用いてエタノール/水の比(容量)が４/６、５/５、5.5/4.5、６/４になるようにtax溶液(2.5ｍｇ/ｍｌ)を作製した。このとき、各溶液に含まれるtax量は全て0.5mg (0.590μmol)に合わせた。次に、HA-EDTA 10mgを各溶液にそれぞれ加え、室温で５時間攪拌した後、遠心分離(11000rpm、20℃、60分)を行い、上澄み液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)測定することによって上澄み液に残存しているtaxを定量し、HA-EDTAに吸着したtax量を算出した。
次に2.5mg/ml tax溶液(エタノール/水 = 5.5/4.5) 200μlにHA-EDTA 10〜50mgを加え、室温で５時間攪拌した後、遠心分離(11000rpm、20℃、60分)を行い、上澄み液をHPLC測定することで上澄み液に残存するtaxを定量し、同様にHA-EDTAに吸着したtax量を算出した。なお、HPLC測定条件は以下の通りである。
カラム:5C18_MS_II、移動相:メタノール/水=７/３、流速:1.0ml/min、検出:UV (254nm)、注入量:５μl
【００３９】
エタノール/水の混合比を変化させた場合のtax吸着結果を、図５に示す。
図５より、エタノール/水= 5.5/4.5で最も効率良くtaxが吸着することが分かった。４/６では加えたtaxのほぼ全量が沈殿しているためHA-EDTAへのtax吸着は見られなかった。一方、６/４ではtaxの沈殿は全く見られないがHA-EDTAへのtaxの吸着もなく、フリーなtaxとして全て溶液中に存在していた。以上より、taxの溶媒への溶解性が大きな影響を及ぼしていることが示唆された。この結果より、今後のtax吸着実験は、エタノール/水= 5.5/4.5に統一して行った。
【００４０】
HA-EDTAの量を10〜50mgに変化させた場合のtax吸着挙動を評価した結果を、図６に示す。
図６より、溶解しているtaxの約50%がHA-EDTAに吸着し、図２と同様にHA-EDTA量とtax吸着率との間の相関はあまり見られないことが分かった。ここで、吸着率(％)は(全量-沈殿量−溶液残存量)/(全量)×100で算出したものである。tax吸着率が約50%で頭打ちになっているのは、図５の結果より、この実験系ではHAの吸着表面積の増大よりもtaxと溶媒との親和性がtax吸着量に大きな影響を及ぼしているためであると考えられる。(３)以降の細胞実験は、この実験で作製したtax吸着HA-EDTA (以下tax/HAともいう)を用いて行った。
【００４１】
(2-4)HA-EDTAの細胞毒性の評価
Nunc社製48ウェルディッシュに、ヒト乳癌由来細胞であるMDA-MB-231細胞を１万細胞/ウェルとなるようにまき、培地(10%ウシ胎児血清(FBS)含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM))を加えて全量を500μl/ウェルとし、37℃、５％CO2条件下で24時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、１mg/ml HA-EDTA含有培地を300μl/ウェル加えて37℃、５％CO2条件下で72時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、各ウェルに培地200μlとMTT溶液(10mg/ml PBS(-)) 40μlとを加えて37℃、５％CO2条件下で３時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、0.1N HCl含有イソプロパノールを各ウェルに500μl/ウェルで加えて、マルチプレートリーダー(パーキンエルマーライフサイエンス製 Wallac 1420 ARVOsx)を用いて490nmにおける吸光度を測定した。なお、100%の細胞生存率は、培地のみを300μl加えた溶液の吸光度から、細胞のいない条件で１mg/ml HA-EDTA含有培地を300μl加え、溶液を吸い取った後に0.1N HCl含有イソプロパノールを500μl加えたものの吸光度を差し引いたものとした。
【００４２】
結果を、図７に示す。
図７より、今回調製したHA-EDTA１mg/ml (PBS(-))が細胞毒性を示さなかったことがわかる。細胞生存率が100%を超えているのはHA粒子による光の散乱によって溶液の吸光度が上昇したためであると考えられる。この結果から、HA-EDTAは、細胞毒性を示さず、よって薬物運搬体として利用できることが示唆された。
【００４３】
(３)tax及びtax/HAの薬理活性の評価
Nunc社製24穴ウェルディッシュに、ヒト乳癌由来細胞であるMDA-MB-231及びMCF-7細胞をそれぞれ2万細胞/ウェルとなるようにまき、培地(10％ FBS含有DMEM)を加えて全量を500μl/ウェルとし、37℃、５％CO2条件下で24時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、種々の濃度に培地中で調整したtax又はtax/HAの溶液を300μl/ウェルとなるように加えて、37℃、５％CO2条件下で72時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、PBS(-)を500μl/ウェルとなるように加えて洗浄した。PBS(-)を吸い取り、各ウェルに培地200μlとMTT溶液(10mg/ml PBS(-)) 40μlとを加えて37℃、５％CO2条件下で３時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、0.1N HCl含有イソプロパノールを各ウェルに500μl/ウェル加えて、マルチプレートリーダーを用いて490nmにおける吸光度を測定した。
【００４４】
これらの結果を、図８及び図９に示す。
図８は、tax及びtax/HAがMDA-MB-231細胞に与える影響を示し、図９は、tax及びtax/HAがMCF-7細胞に与える影響を示す。
図８及び９の結果より、tax/HAでは、taxのみの場合と比べて約１/100倍薬理活性が低下したことがわかる。このことからHA-EDTAは高濃度のtaxを安定に保持できることが示唆された。なお、MDA-MB-231細胞とMCF-7細胞とではtaxの薬理活性が大きく異なり、MCF-7細胞の方がMDA-MB-231細胞よりもtax濃度を30倍以上高濃度にしなければ同等の細胞毒性が得られなかった。
【００４５】
(４)三次元培養におけるtax吸着HA包埋コラーゲンゲルの細胞毒性評価
三次元培養において、tax吸着HAを包埋したコラーゲンゲルの薬理活性を評価した。
氷冷下、Nunc社製48ウェルディッシュに、Ｉ型コラーゲン(80μl；Cellmatrix Type I-A、新田ゼラチン)、10倍濃度無機塩培地(10μl)、再構成液(10μl；NaHCO3 219.7mg、Hepes 477.12mgを0.05N NaOH水溶液10mlに溶解したもの)をこの順で混合し、さらにtax濃度がそれぞれ0.1、１、10、30μMとなるようにtax/HAのPBS分散液を加え、37℃で１時間静置した。
次に氷冷下、Ｉ型コラーゲン(60μl)、IV型コラーゲン(60μl；Cellmatrix Type IV、新田ゼラチン)、10倍濃度無機塩培地(15μl)、再構成液(15μl)をこの順で混合した溶液に、MDA-MB-231細胞(氷冷PBS分散液)を加えて攪拌し、細胞が１ウェルあたり1.0×104個となるように混合した溶液を、tax/HAコラーゲンを含む上記のウェルに150μlずつ加えて37℃で1時間静置した。一方、MCF7細胞の場合はゲル内の増殖スピードが遅いため、細胞が１ウェルあたり3.0×104個となるように混合したコラーゲンゾルを、tax/HAコラーゲンを含む上記のウェルに150μlずつ加えて37℃で1時間静置した。その後、DMEM 200μlを加え37℃、５%CO2条件下で72時間培養した。培地を吸い取り、DMEM 35μl及び10mg/ml MTT溶液15μlを各ウェルに加えて37℃、５%CO2条件下で３時間培養した。培地を吸い取り、最終濃度が0.02重量%となるようにコラゲナーゼS-1/PBS(-)溶液を加え、37℃で１時間振とうした。0.1N HCl含有イソプロパノールを500μl/ウェル加え、マルチプレートリーダーで490nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。細胞生存率は、tax/HAを包埋していないコラーゲンゲルを用いて同様の操作を行ったものを100%とした。
【００４６】
結果を、図10に示す。
図10の結果から、tax/HAを包埋したコラーゲンゲルは、転移能の低いMCF-7細胞に対してはそれほど細胞毒性を示さないが、転移能の高いMDA-MB-231細胞に対しては、tax濃度の上昇とともに細胞毒性の向上が確認できた。このことにより、tax吸着HA包埋コラーゲンゲルが、細胞の転移能に応答して薬物放出できる可能性が示唆された。
【００４７】
(５)正常細胞及び乳癌細胞に対するtax吸着HA包埋コラーゲンゲルの細胞毒性評価
細胞として正常細胞(MC3T3-E1、マウス骨芽細胞)又は乳癌細胞(MDA-MB-231)を用いて、上記の(４)と同様の手順でtax/HA包埋コラーゲンゲルの薬理活性を評価した。なお、用いたtax濃度は、0.1、0.3、１、３、10、30μMであり、MC3TC-E1はMCF7細胞と同様の方法で行った。
結果を、図11に示す。
図11の結果から、tax/HAを包埋したコラーゲンゲルは、正常細胞と比較して、乳癌細胞の生存性をより大きく低下させることがわかった。以上より、tax吸着HA包埋コラーゲンゲルは、転移能の高い癌細胞にのみ選択的に作用し、副作用の少ないＤＤＳ材料として利用できることが明らかとなった。
【００４８】
(６)tax吸着HA包埋コラーゲンゲルのインビボ抗腫瘍効果の評価
ヌードマウス(Balb/cnu/nu；日本エスエルシー)の皮下に乳癌細胞(MDA-MB-231)を移植し、150mm3程度になるまで成長させた。その後、氷冷下でＩ型コラーゲン(60μl)、IV型コラーゲン(60μl；Cellmatrix Type IV、新田ゼラチン)、10倍濃度無機塩培地(15μl)、再構成液(15μl) この順で混合した溶液に、taxが0.09mgとなるようにtax/HAのPBS分散液を加えることでtax吸着HA包埋コラーゲンゲル(tax/HA/Col)を調製し、このうち100μLを腫瘍部位付近にインジェクトした(tax ３mg/kg)。４日後にも同様の操作でtax/HA/Colを投与した。tax/HA/Colに代えてコラーゲンゲルのみを投与したマウスをコントロール群とした。
腫瘍サイズは、投与前、１回目の投与の１日後、３日後、７日後、14日後に計測した。
【００４９】
結果を図12に示す。
図12の結果から、tax/HA/Colはインビボで腫瘍成長を抑制することが確認できる。
【００５０】
実施例２
(１)ヒドロキシアパタイトへのアドリアマイシンの吸着
アドリアマイシン塩酸塩(ADR・HCl、協和発酵工業)の2.5mg/ml水溶液を調製した。次に、HA-EDTA 10mgを加え、室温で５時間攪拌した後、遠心分離(11000rpm、20℃、60分)を行い、上澄み液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)測定することによって上澄み液に残存しているADRを定量し、HA-EDTAに吸着したADR量を算出した。
HA 10mgへのADRの吸着は0.482 (±0.012)mg (96.4±2.4％)であった。
【００５１】
(２)ADR吸着HAの薬理活性の評価
Nunc社製24穴ウェルディッシュに、ヒト乳癌由来細胞であるMDA-MB-231及びMCF-7細胞をそれぞれ５万細胞/ウェルとなるようにまき、培地(10％ FBS含有DMEM)を加えて全量を500μl/ウェルとし、37℃、５％CO2条件下で24時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、種々の濃度に培地中で調整したADR/HAの溶液を300μl/ウェルとなるように加えて、37℃、５％CO2条件下で24時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、PBS(-)を500μl/ウェルとなるように加えて洗浄した。PBS(-)を吸い取り、各ウェルに培地200μlとMTT溶液(10mg/ml PBS(-)) 40μlとを加えて37℃、５％CO2条件下で３時間インキュベートした。その後、溶液を吸い取り、0.1N HCl含有イソプロパノールを各ウェルに500μl/ウェル加えて、マルチプレートリーダーを用いて490nmにおける吸光度を測定した。
【００５２】
結果を図13に示す。
図13から明らかなように、コラーゲンに包埋されていないADR/HAは、転移性が異なる乳癌細胞に対して同程度の細胞毒性を示した。
【００５３】
(３)ADR吸着HA包埋コラーゲンゲルの細胞毒性評価
ADR吸着HAを包埋したコラーゲンゲル(ADR/HA/Col)の薬理活性を評価した。
氷冷下、Nunc社製48ウェルディッシュに、Ｉ型コラーゲン(40μl；Cellmatrix Type I-A、新田ゼラチン)、Ｉ型コラーゲン(40μl；Cellmatrix Type I-A、新田ゼラチン)、10倍濃度無機塩培地(10μl)、再構成液(10μl；NaHCO3 219.7mg、Hepes 477.12mgを0.05N NaOH水溶液10mlに溶解したもの)をこの順で混合し、さらにADR濃度がそれぞれ0.1、0.3、１、３、10、30、100μMとなるようにADR/HAのPBS分散液を加え、37℃で１時間静置した。
次に上記のゲルの上部にMDA-MB-231細胞およびMCF7細胞を１ウェルあたり2.0×104個となるように播種し、その後、37℃、５%CO2条件下で24時間培養した。培地を吸い取り、DMEM 35μl及び10mg/ml MTT溶液15μlを各ウェルに加えて37℃、５%CO2条件下で３時間培養した。培地を吸い取り、最終濃度が0.02重量%となるようにコラゲナーゼS-1/PBS(-)溶液を加え、37℃で１時間振とうした。0.1N HCl含有イソプロパノールを500μl/ウェル加え、マルチプレートリーダーで490nmにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。細胞生存率は、ADR/HA/Colを用いて同様の操作を行ったものを100%とした。
【００５４】
結果を、図14に示す。
図14の結果から、ADR/HA/Colは、転移能の低いMCF-7細胞と比較して、転移能の高いMDA-MB-231細胞に対して、より高い細胞毒性を示すことが確認できる。
図13及び14に示される結果を併せて考えると、コラーゲンがADR/HAを安定して保持する結果として、ADR/HA/Colは転移能の高い細胞に対して選択的に抗腫瘍作用を示すと理解できる。
【００５５】
実施例１及び２より、薬物を吸着させた生体適合性リン酸カルシウム化合物の多孔体と、コラーゲンとを含む医薬組成物は、コラーゲン中に多孔体を安定に保持する結果、薬物を細胞選択的に(例えば、転移性の高い細胞に選択的に)送達できる。
【図１】
2013126973.tif 000005
【図２】
2013126973.tif 000006
【図３】
2013126973.tif 000007
【図４】
2013126973.tif 000008
【図５】
2013126973.tif 000009
【図６】
2013126973.tif 000010
【図７】
2013126973.tif 000011
【図８】
2013126973.tif 000012
【図９】
2013126973.tif 000013
【図１０】
2013126973.tif 000014
【図１１】
2013126973.tif 000015
【図１２】
2013126973.tif 000016
【図１３】
2013126973.tif 000017
【図１４】
2013126973.tif 000018