(57)【要約】【課題】生理活性物質を細胞内に導入するために使用できる、生体適合性及び温度応答性に優れた組成物、それを含有するキット及びそれを利用した細胞導入方法を提供する。【解決手段】（Ａ）下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物；及び（Ｂ）ポリエチレングリコール構造を含有する脂質を含有する、分子集合体。ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２）２【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物；及び
（Ｂ）ポリエチレングリコール構造を含有する脂質
を含有する、分子集合体
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２）２
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一または異なって飽和又は不飽和の長鎖炭化水素基を示し、
Ｒ３及びＲ４は、同一のまたは異なるオリゴエチレングリコ−ル構造を含有する炭化水素基を含有し、
Ｒ１〜Ｒ４は、環状構造を含有していてもよく、かつ一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよく、かつＸは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）。
【請求項２】
前記Ｒ３及びＲ４が、以下の式（Ｉ）で表される、請求項１に記載の分子集合体
【化１】
2013237631.tif 000021
（式中、ｎは１〜１０のいずれかの整数を示し、かつＲ５は炭素数１〜１０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）を示す。）。
【請求項３】
前記脂質（Ｂ）が、以下の式（ＩＩ）で表される、請求項１又は２に記載の分子集合体
【化２】
2013237631.tif 000022
（式中、Ｙは炭素数１０〜５０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）であり、かつｎは１０〜２０のいずれかの整数を示し、かつＲ６は炭素数１〜１０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）を示す。）。
【請求項４】
生理活性物質を細胞内に導入するために使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項５】
生理活性物質を細胞内に導入することにより疾患を治療するために使用される、請求項１〜３のいずれかに記載の分子集合体。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載の分子集合体を含有する組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の分子集合体又は組成物を含有するキット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の分子集合体、組成物又はキットの、生理活性物質を細胞内に導入する方法における使用。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の分子集合体又は組成物を生理活性物質とともに細胞内に導入する工程を含有する、生理活性物質を細胞内に導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、温度応答性分子集合体、それを含有する組成物及びキット、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進医療技術の開発において、薬物を細胞内の標的部位に正確に送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）が求められている。ＤＤＳを利用することにより、治療効果の向上、副作用の低減又は患者の利便性向上等に資することができる。
【０００３】
ＤＤＳとして、薬物の標的指向性を向上することを目的として、温度に応答して薬物を放出する機能を有する、いわゆる温度応答性キャリアの構築が試みられている。具体的には、非加温時にはベシクル形状を示すが、加温により形状が変化する分子集合体をキャリアとして利用する試みがなされている。このベシクル内部に薬物を保持させた上で生体内に投与した後、例えば患部等の所望の部位を選択的に加温することにより、分子集合体の構造を大きく変化させ、これにより所望の部位においてのみ薬物を放出させる技術の開発が試みられている。より具体的には、ポリアミドデンドロン構造を有する脂質（ポリアミドデンドロン脂質）を、温度応答性を示すイソブチルアミド（ＩＢＡＭ）基で修飾した化合物で構成される分子集合体を上記目的に利用しようとする試みが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｅｎｊｉ  Ｋｏｎｏら、「Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）  Ｄｅｎｄｒｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｌｉｐｉｄｓ」、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」、２０１１年、５０、ｐｐ．６３３２−６３３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、薬物の標的指向性を向上することを目的として、温度応答性キャリアを利用しようとする場合、温度応答性キャリアにおいては鋭敏な温度応答性だけでなく、生体内において安定であること、及び生体適合性を有していることが求められることに着目した。本発明は、上記目的で利用されうる温度応答性キャリアにおいて、（１）温度応答性、（２）生体内安定性及び（３）生体適合性のバランスを改良することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った。この検討の過程で本発明者らは、温度応答性キャリアにおいて（２）生体内安定性及び（３）生体適合性を同時に向上させようとしてもうまくいかないことを見出した。詳細には、生体適合性に優れることが期待される、オリゴエチレングリコ−ル構造を含有する炭化水素基でポリアミドデンドロン脂質を修飾することにより得られる化合物を用いて分子集合体を形成しても、生体内安定性に難があることを本発明者らは見出した。そこで、本発明者らは、上記化合物に加えてさらにポリエチレングリコール構造を含有する脂質を用いて分子集合体を形成し、かかる分子集合体においては、（１）温度応答性、（２）生体内安定性及び（３）生体適合性のバランスが従来のものに比べて改良されていることを見出した。
【０００７】
本発明は、本発明者らが上記知見に基づいてさらに鋭意検討を加えることにより完成されたものであり、以下に示す通りである。
【０００８】
項１．
（Ａ）下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物；及び
（Ｂ）ポリエチレングリコール構造を含有する脂質
を含有する、分子集合体
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２）２
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一または異なって飽和又は不飽和の長鎖炭化水素基を示し、
Ｒ３及びＲ４は、同一のまたは異なるオリゴエチレングリコ−ル構造を含有する炭化水素基を含有し、
Ｒ１〜Ｒ４は、環状構造を含有していてもよく、かつ一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよく、かつＸは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）。
項２．
前記Ｒ３及びＲ４が、以下の式（Ｉ）で表される、項１に記載の分子集合体
【化１】
2013237631.tif 000002
（式中、ｎは１〜１０のいずれかの整数を示し、かつＲ５は炭素数１〜１０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）を示す。）。
項３．
前記脂質（Ｂ）が、以下の式（ＩＩ）で表される、項１又は２に記載の分子集合体
【化２】
2013237631.tif 000003
（式中、Ｙは炭素数１０〜５０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）であり、かつｎは５〜２００のいずれかの整数を示し、かつＲ６は炭素数１〜１０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）を示す。）。
項４．
生理活性物質を細胞内に導入するために使用される、項１〜３のいずれかに記載の分子集合体。
項５．生理活性物質を細胞内に導入することにより疾患を治療するために使用される、項１〜３のいずれかに記載の分子集合体。
項６．
項１〜３のいずれかに記載の分子集合体を含有する組成物。
項７．
項１〜６のいずれかに記載の分子集合体又は組成物を含有するキット。
項８．
項１〜７のいずれかに記載の分子集合体、組成物又はキットの、生理活性物質を細胞内に導入する方法における使用。
項９．
項１〜７のいずれかに記載の分子集合体又は組成物を生理活性物質とともに細胞内に導入する工程を含有する、生理活性物質を細胞内に導入する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、薬物として生体に投与されうる生理活性物質の標的指向性を向上することを目的として利用される温度応答性キャリアであって、（１）温度応答性、（２）生体内安定性及び（３）生体適合性のバランスが改良されたキャリアを提供できる。また、本発明によれば、上記キャリアを利用することにより、標的指向性がより向上し、かつ生体に与えうる害が低減された生理活性物質の送達方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】DL-G-0.5-2C18の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 )である。
【図２】DL-G0-2C18の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図３】DL-G0.5-2C18の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図４】DL-G1-2C18の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図５】DL-G1.5-2C18の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図６】DL-G2-2C18の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図７】オレイルオレイルアミドの1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図８】ジオレイルアミンの1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図９】DL-G-0.5-2C18-U2の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１０】DL-G0-2C18-U2の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１１】DL-G0.5-2C18-U2の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１２】DL-G1-2C18-U2の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１３】MDEG-DL-G1の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１４】MDEG-DL-G1 のマススペクトルである。
【図１５】MDEG-DL-G2 の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１６】MDEG-DL-G2 のマススペクトルである。
【図１７】MDEG-DL-G1-U2の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１８】EDEG-DL-G1の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図１９】EDEG-DL-G1 のマススペクトルである。
【図２０】EDEG-DL-G2の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図２１】EDEG-DL-G1-U2の1H NMR スペクトル (溶媒CDCl3 ) である。
【図２２】種々のデンドロン脂質集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の透過率の温度依存性を示すグラフである。
【図２３】種々のpHにおけるEDEG-DL-G2デンドロン脂質集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液）の透過率の温度依存性を示すグラフである。
【図２４】EDEG-DL-G2デンドロン脂質集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液）の曇点のpH依存性を示すグラフである。
【図２５】MDEG-DL-G1集合体分散液 , MDEG-DL-G2集合体分散液、および MDEG-DL-G1-U2集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の示差走査熱量測定（DSC）チャートである。
【図２６】EDEG-DL-G1集合体分散液, EDEG-DL-G2集合体分散液、および EDEG-DL-G1-U2集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の示差走査熱量測定（DSC）チャートである。
【図２７】EDEG-DL-G1 集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の10 ℃および40 ℃の写真である。
【図２８】EDEG-DL-G1 集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の10 ℃および40 ℃の位相差顕微鏡写真である。
【図２９】種々の組成比のEDEG-G1/PEG-Chol集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の透過率の温度依存性を示すグラフである。
【図３０】EDEG-G1/PEG-Chol 集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の曇点に及ぼすPEG-Chol 含率の影響を示すグラフである。
【図３１】種々のpHにおけるEDEG-G1/PEG-Chol (5%) 集合体分散液の透過率の温度依存性（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液）を示すグラフである。
【図３２】EDEG-G1/PEG-Chol (95/5) 集合体分散液および EDEG-DL-G1集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液）の曇点のpH依存性を示すグラフである。
【図３３】EDEG-DL-G1/PEG-Chol (95/5)集合体の粒子径の温度依存性を示すグラフである（粒子径は動的光散乱によって求めた。）。
【図３４】EDEG-DL-G1/PEG-Chol (95/5)集合体の10℃および50℃における原子間力顕微鏡画像である。
【図３５】ローダミン脂質（0.6 mol%）でラベル化したEDEG-G1/PEG-Chol (95/5) 集合体とインキュベートしたHeLa細胞 の共焦点レーザー顕微鏡写真である（インキュベート温度は36 ℃または42 ℃）。
【図３６】ローダミン脂質（0.6 mol%）でラベル化したEDEG-G1/PEG-Chol (95/5) 集合体とインキュベートしたHeLa細胞 の共焦点レーザー顕微鏡写真（インキュベート温度は36 ℃または42 ℃。図35の高倍率写真）。
【図３７】種々の組成比のMDEG-G1/PEG-Chol集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の透過率の温度依存性を示すグラフである（PEG-Chol含率（mol%）は、0,2,5,および10%。）。
【図３８】MDEG-G1/PEG-Chol 集合体分散液（10 mM リン酸140 mM NaCl水溶液、pH7.4）の曇点に及ぼすPEG-Chol 含率の影響を示すグラフである。
【図３９】EDEG-DL-G1-2C18/PEG-Chol (95/5)集合体およびMDEG-DL-G1-2C18/PEG-Chol(98/2)集合体(いずれも約40℃に曇点を示す)と細胞との相互作用に及ぼすインキュベーション温度の影響を示すグラフである（デンドロン脂質／PEG-Chol集合体はローダミン脂質(0.6 mol%)でラベル化した。インキュベーション後の細胞からのローダミン蛍光強度を示した。）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．本発明の分子集合体
本発明の分子集合体は、
（Ａ）下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４のいずれかで表される化合物；及び
（Ｂ）ポリエチレングリコール構造を含有する脂質
を含有する、分子集合体
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨＲ３）ＸＨＲ４）２）２）２
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一または異なって飽和又は不飽和の長鎖炭化水素基を示し、
Ｒ３及びＲ４は、同一のまたは異なるオリゴエチレングリコ−ル構造を含有する炭化水素基を含有し、
Ｒ１〜Ｒ４は、環状構造を含有していてもよく、かつ一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよく、かつＸは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）である。
【００１２】
１．１  化合物（Ａ）についての説明
１．１．１  Ｘについての説明
Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を表し、その末端のＮは、通常２個の水素原子を有するが、１個の水素原子が疎水性アミノ酸又はアルキル基で置換されていてもよい。疎水性アミノ酸としては、ロイシン、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン及びチロシン等が挙げられる。また、アルキル基としては、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基及びシクロプロピル基等が挙げられる。
【００１３】
１．１．２  Ｒ１及びＲ２についての説明
Ｒ１及びＲ２は、飽和又は不飽和の長鎖炭化水素基である。
【００１４】
長鎖炭化水素基は、天然由来であってもよく、天然由来のものを修飾したものでもよく、又は人工的に合成されたものであってもよい。
【００１５】
長鎖炭化水素基の炭素数は、主鎖が長鎖であればよく限定されない。主鎖の炭素数は好ましくは８〜３０であり、より好ましくは１０〜２２であり、さらに好ましくは１２〜２０である。
【００１６】
長鎖炭化水素基は、分岐を有していてもよい。なお、主鎖についてはＩＵＰＡＣ命名法に基づいて、又はそれが困難若しくは不可能な場合はそれに準ずる方法に基づいて決定する。
【００１７】
長鎖炭化水素基は、環状構造を有していてもよい。環状構造としては、特に限定されないが、例えば、フェニル基、コレステリル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。特に、コレステリル基が好ましい。
【００１８】
長鎖炭化水素基は、少なくとも１つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているものであってもよい。本発明において、ヘテロ原子とは、酸素原子、窒素原子又は硫黄原子をいう。したがって、長鎖炭化水素基には、酸素含有炭化水素基、窒素含有炭化水素基及び硫黄含有炭化水素基が含まれる。
【００１９】
本発明において、炭化水素基とは、アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基をいう。
【００２０】
酸素含有炭化水素基としては、例えば、エーテル結合及びカルボニル結合からなる群より選択される少なくとも１種の結合を有する酸素含有炭化水素基が挙げられる。カルボニル結合を有する酸素含有炭化水素基としては、例えば、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、酸塩化物又は無水物等からなる群より選択される少なくとも１種の構造を有する基が挙げられる。
【００２１】
窒素含有炭化水素基としては、例えばニトリル、アミン、アミド及びイミドからなる群より選択される少なくとも１種の構造を有する窒素含有炭化水素基が挙げられる。
【００２２】
硫黄含有炭化水素基としては、例えばチオール、チオエーテル、チオアセタール、スルフィド、ジスルフィド、ジチオカルボン酸、チオエステル、チオケトン、チオアルデヒド、チオカルバメート、チオウレタン、ホスフィンスルフィド、チオホスフェート、チオホスホネート、スルホネート、スルホン及びスルホンアミドからなる群より選択される少なくとも１種の結合を有する硫黄含有炭化水素基が挙げられる。
【００２３】
長鎖炭化水素基は、上に例示したような構造の基においてさらに少なくとも１つ以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、疎水性を示すものが好ましい。置換基としては、例えば、フェニル基、コレステリル基及びピレニル基等が挙げられる。特にコレステリル基が好ましい。
【００２４】
不飽和長鎖炭化水素基は、不飽和結合を主鎖に有しており、かつ主鎖が鎖状構造を有する炭化水素基であれば好ましい。
【００２５】
不飽和結合の種類は、二重結合であってもよく、又は三重結合であってもよい。二重結合が好ましい。不飽和結合の数は、少なくとも１つ以上であればよく、限定されない。また、二重結合と三重結合の両方を有していてもよい。二重結合を１つ有していることが好ましい。
【００２６】
二重結合としては、シス型二重結合であってもよいし、トランス型二重結合であってもよい。シス型二重結合が好ましい。
【００２７】
不飽和長鎖炭化水素基としては、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、オクタデカジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサペンタエニル基又はドコサヘキサエニル基が好ましい。
【００２８】
不飽和長鎖炭化水素基としては、９−ヘキサデセニル基、９−オクタデセニル基（オレイル基）、１２−オクタデカジエニル基、６，９，１２−オクタデカトリエニル基、８，１１，１４−イコサトリエニル基、５，８，１１，１４−イコサテトラエニル基、９，１２，１５−オクタデカトリエニル基、５，８，１１，１４，１７−イコサペンタエニル基又は４，７，１３，１６，１９−ドコサヘキサエニル基がより好ましい。
【００２９】
不飽和長鎖炭化水素基としては、９−オクタデセニル基（オレイル基）がさらに好ましい。
【００３０】
不飽和長鎖炭化水素基の好適例としては、上に好適例として例示したような構造の基においてさらに少なくとも1つ以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されているものも挙げられる。
【００３１】
不飽和長鎖炭化水素基の好適例としては、上に好適例として例示したような構造の基を基礎として、酸素含有炭化水素基、窒素含有炭化水素基、又は硫黄含有炭化水素基に特有な構造として上に例示したような構造をさらに有しているものであってもよい。
【００３２】
不飽和長鎖炭化水素基の好適例としては、上に好適例として例示したような構造の基においてさらに少なくとも１つ以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、疎水性を示すものが好ましい。置換基としては、例えば、フェニル基、フェニレン基、コレステリル基、及びピレニル基等が挙げられる。特にコレステリル基が好ましい。
【００３３】
１．１．３  オリゴエチレングリコ−ル構造を含有する炭化水素基についての説明
オリゴエチレングリコ−ル構造を含有する炭化水素基（オリゴエチレングリコ−ル含有炭化水素基）は、オリゴエチレングリコ−ル構造を含有していればよく、他の構造をさらに含有していてもよい。オリゴエチレングリコ−ル含有炭化水素基は、オリゴエチレングリコ−ル構造の間に他の構造が介在していてもよいし、他の構造の間にオリゴエチレングリコ−ル構造が介在していてもよい。
【００３４】
上記他の構造は、分岐を有していてもよい直鎖構造であってもよい。そのような構造として、特に限定されないが、例えば、炭素数１〜１０の分岐を有していてもよい、炭素数１〜１０の直鎖部分を有するものが挙げられる。
【００３５】
上記他の構造は、環状構造であってもよい。環状構造としては、特に限定されないが、例えば、シクロプロピル基、エポキシ基、シクロへプチル基、シクロブチル基、フェニル基、コレステリル基及びシクロヘキシル基、等が挙げられる。特に、シクロヘキシル基が好ましい。
【００３６】
上記他の構造は、一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい。
【００３７】
オリゴエチレングリコ−ル構造としては、本発明の効果が奏されればよく特に限定されないが、例えば、オキシエチレンユニットを連続して、言い換えれば他の構造が介在することなく、１〜１０個有する構造が挙げられる。オリゴエチレングリコ−ル構造としては、オキシエチレンユニットを連続して１〜４個有するものが好ましい。
【００３８】
オリゴエチレングリコ−ル構造としては、本発明の効果が奏されればよく特に限定されないが、例えば、二以上の分断されたオキシエチレンユニットを有する構造、言い換えれば他の構造を介して、合計１〜１０個のオキシエチレンユニットを有する構造が挙げられる。この場合、オキシエチレンユニットを合計１〜４個有するものが好ましい。
【００３９】
オリゴエチレングリコ−ル含有炭化水素基は、分岐部分がさらにオリゴエチレングリコ−ル構造を有していてもよい。
【００４０】
オリゴエチレングリコ−ル含有炭化水素基は、好ましくは、以下の式（Ｉ）で表される
【００４１】
【化３】
2013237631.tif 000004
【００４２】
（式中、ｎは１〜１０のいずれかの整数を示し、かつＲ５は炭素数１〜１０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）を示す。）
オリゴエチレングリコ−ル含有炭化水素基は、具体的には、下記の式（ＩＩＩ）で表されるものが挙げられる
【００４３】
【化４】
2013237631.tif 000005
【００４４】
（式中、ｎは１〜１０のいずれかの整数を示す。）。
【００４５】
１．２  ポリエチレングリコール構造を含有する脂質（Ｂ）についての説明
ポリエチレングリコール構造を含有する脂質（Ｂ）は、ポリエチレングリコール構造を含有していればよく、本発明の効果が奏される限り、特に限定されない。
【００４６】
ポリエチレングリコール構造を含有する脂質（Ｂ）は、ポリエチレングリコール構造を含有する部分、及び脂質部分に分けられる。
【００４７】
１．２．１  ポリエチレングリコール構造を含有する部分についての説明
ポリエチレングリコール構造を含有する部分は、ポリエチレングリコール構造を含有していればよく、他の炭化水素構造をさらに含有していてもよい。ポリエチレングリコール構造を含有する部分は、ポリエチレングリコール構造の間に他の炭化水素構造が介在していてもよいし、他の炭化水素構造の間にポリエチレングリコール構造が介在していてもよい。  上記他の炭化水素構造は、分岐を有していてもよく直鎖構造であってもよい。そのような構造として、特に限定されないが、例えば、炭素数１〜１０の分岐を有していてもよい、炭素数１〜１０の直鎖部分を有するものが挙げられる。
【００４８】
上記他の炭化水素構造は、環状構造であってもよい。環状構造としては、特に限定されないが、例えば、シクロプロピル基、エポキシ基、シクロへプチル基、シクロブチル基、フェニル基、コレステリル基及びシクロヘキシル基、等が挙げられる。特に、シクロヘキシル基が好ましい。
【００４９】
上記他の炭化水素構造は、一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい。
【００５０】
ポリエチレングリコ−ル構造としては、本発明の効果が奏されればよく特に限定されないが、例えば、オキシエチレンユニットを連続して、言い換えれば他の構造が介在することなく、３〜２００個有する構造が挙げられる。ポリエチレングリコ−ル構造としては、オキシエチレンユニットを連続して３〜２００個有するものが好ましく、１０〜１００個有するものがより好ましい。
【００５１】
１．２．２  脂質部分についての説明
脂質部分は、本発明の効果が奏される限り、特に限定されない。
【００５２】
脂質部分としては、例えば、炭素数１０〜５０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）が挙げられる。上記において炭化水素基は、飽和であってもよく不飽和であってもよく、また環状構造を有していてもよい。
【００５３】
脂質部分としては、例えば、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、アラキドン酸などの長鎖脂肪酸、ジアシルグリセロール、等が挙げられる。
【００５４】
ポリエチレングリコール構造を含有する脂質（Ｂ）は、好ましくは、以下の式（ＩＩ）で表される
【００５５】
【化５】
2013237631.tif 000006
【００５６】
（式中、Ｙは炭素数５〜５０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）であり、かつｎは１０〜２０のいずれかの整数を示し、かつＲ６は炭素数１〜１０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）を示す。）。  ポリエチレングリコール構造を含有する脂質（Ｂ）としては、具体的には、以下の式（ＩＶ）で表されるものが挙げられる
【００５７】
【化６】
2013237631.tif 000007
【００５８】
（式中、Ｙは炭素数５〜５０の炭化水素基（一以上の炭素原子がヘテロ原子で置換されていてもよい）であり、かつｎは１０〜２０のいずれかの整数を示す。）。
【００５９】
１．３  分子集合体についての説明
本発明の分子集合体は、化合物（Ａ）及び脂質（Ｂ）を含有する分子集合体である。
【００６０】
本発明において、分子集合体とは、少なくとも化合物（Ａ）及び脂質（Ｂ）が集合したものをいう。溶液中では、本発明の分子集合体は、ベシクル形状又は逆ヘキサゴナル形状である。分子集合体がベシクル形状であるか逆ヘキサゴナル形状であるかは、原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＡＦＭ）を用いて確認できる。ＡＦＭ観察により球状の分子集合体が観察されれば、分子集合体はベシクル形状であると評価できる。特に限定されるものではないが、例えば、ベシクル形状分子集合体として、粒径が約１５０〜２００ｎｍの球状が観察されうる。これに対して、ＡＦＭ観察により棒状の分子集合体が観察されれば、分子集合体は逆ヘキサゴナル形状であると評価できる。
【００６１】
また、本発明の化合物（Ａ）は、オリゴエチレングリコ−ル構造の作用により、温度応答性を示す。このため、本発明の分子集合体は、所定の温度の環境下においてベシクル形状であるが、環境の温度が上昇すると逆ヘキサゴナル形状へと変化する。
【００６２】
本発明のベシクル形状分子集合体は、水溶液中で、Ｒ１及びＲ２側が内側を、そしてＲ３及びＲ４側が外側を向くようにして脂質二重膜を形成している。このベシクル形状分子集合体は、表面が親水性を示すため、生体内に投与すると、細胞表面に弱く吸着する。このベシクル形状分子集合体の脂質二重膜の内部には、所望の疎水性物質を保持させることができる。
【００６３】
これに対して、本発明の逆ヘキサゴナル形状分子集合体は、表面が疎水性であり、エンドサイトーシスにより細胞内により取り込まれやすい性質を有する。
【００６４】
したがって、脂質二重膜の内部に所望の疎水性物質を保持させた状態でベシクル形状分子集合体を生体内に投与し、当該分子集合体が送達された部位のうち所望の部位の環境温度を上昇させて逆ヘキサゴナル形状に変化させることにより、当該部位において選択的に当該物質を細胞内に導入できる。  本発明の分子集合体は、乾燥した状態であってもよいし、凍結した状態であってもよい。
【００６５】
乾燥した状態の本発明の分子集合体は、例えば、化合物（Ａ）及び脂質（Ｂ）を含有する各成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことで製造できる。
【００６６】
１．４  製法についての説明
本発明の化合物（Ａ）は、例えば以下のようにして得られたポリアミドデンドロン（ＤＬ）に対して、Ｒ３及びＲ４を付加することにより得られる。なお、下記においてＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ４とあるのは、第１〜４世代のポリアミドデンドロンをそれぞれ示している。なお、ＤＬ−Ｇ０は、第０世代であり、デンドロン構造を有していない。
【００６７】
【化７】
2013237631.tif 000008
【００６８】
具体的には、Ｒ１及びＲ２が不飽和炭化水素基である場合、以下のようにして製造することができる。オレイルアミン及びオレイルクロリドを反応させて、オレイルオレイルアミドを合成する。次にヒドリド還元によりジオレイルアミンを合成し、アクリル酸メチルを用いたマイケル付加反応と、エチレンジアミンを用いたエステルアミド交換反応を繰り返すことによりポリアミドアミンデンドロンを合成する。このポリアミドアミンデンドロンを、ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８−Ｕ２と表記する。
【００６９】
【化８】
2013237631.tif 000009
【００７０】
また、Ｒ１及びＲ２が飽和炭化水素基である場合、以下のようにして製造することができる。ジアオクタデシルアミンを開始物質として、アクリル酸メチルを用いたマイケル付加反応と、エチレンジアミンを用いたエステルアミド交換反応を繰り返すことによりポリアミドアミンデンドロンを合成する。このポリアミドアミンデンドロンを、ＤＬ−Ｇ１−２Ｃ１８と表記する。
【００７１】
【化９】
2013237631.tif 000010
【００７２】
本発明の化合物を製造する際に中間物質として用いられる、Ｒ３及びＲ４を付加する前の状態のポリアミドアミンデンドロンの例を以下に示す。
【００７３】
【化１０】
2013237631.tif 000011
【００７４】
Ｒ３及びＲ４の付加は、例えば下記式に示すように、次のようにして行うことができる。ポリアミドアミンデンドロンの末端アミノ基に、パラニトロフェニルカーボネート基で活性化したメトキシジエチレングリコール（ＭＤＥＧ）基又はエトキシジエチレングリコール（ＥＤＥＧ）を反応させることにより、それぞれＭＤＥＧ基及びＥＤＥＧ基を導入する。
【００７５】
【化１１】
2013237631.tif 000012
【００７６】
【化１２】
2013237631.tif 000013
【００７７】
【化１３】
2013237631.tif 000014
【００７８】
２．本発明の組成物
本発明の組成物は、本発明の分子集合体のほか、さらに他の成分を含有する。例えば、水系溶媒（分散媒）を含有する。特に限定されるべきものではないが、他の成分としては水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。
【００７９】
この水系溶媒に分散した本発明の分子集合体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが重要である。
【００８０】
さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、糖水溶液を、凍結保存する場合には、糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。
【００８１】
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、２から２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５から１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、１から５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２から２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が５から５０ｍＭが好ましく、１０から２０ｍＭがさらに好ましい。
【００８２】
水系溶媒中の本発明の分子集合体の濃度は、特に限定されるべきものではないが、０．０１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、０．１ｍＭから１０ｍＭがさらに好ましい。
【００８３】
本発明の分子集合体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造できる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造でき、特に限定されるべきものではない。本発明の分子集合体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
【００８４】
また、上記の水系溶媒に分散した分子集合体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上記したように、糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した分子集合体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、分子集合体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した分子集合体に所望の物質を含有する水溶液を添加すると、当該物質が効率よく分子集合体に保持されるため好ましい。
【００８５】
３．  用途についての説明
本発明の分子集合体及び組成物は、好ましくは、疎水性の所望の物質を細胞内に導入するためにそれぞれ使用される。
【００８６】
疎水性の所望の物質としては、特に限定されないが、例えば低分子化合物、ペプチド、脂質、ホルモン、タンパク質、及び核酸誘導体等の生理活性物質が挙げられる。  特に限定されないが、例えば、がん治療を目的として、ドキソルビシンなどの各種抗がん剤、ホルモン製剤、及びWT1ペプチドとその誘導体などの癌免疫治療用抗原分子を用いることができる。
【００８７】
本発明の分子集合体及び組成物は、上記疾患の治療目的で、導入しようとする生理活性物質とともに治療対象である個体にそれぞれ直接導入してもよい。この場合、本発明の分子集合体又は組成物を個体に投与すればよい。個体への投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。剤形としては、通常知られたものでよく、経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等を挙げることができる。また、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。
【００８８】
疎水性の所望の物質と本発明の化合物（Ａ）の配合割合は、当該物質１重量部に対し、本発明の化合物（Ａ）を１〜１０００重量部、好ましくは１０〜５００重量部、より好ましくは１０〜１００重量部使用する。
【実施例】
【００８９】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の例にのみ限定されるものではない。
【００９０】
１．本発明の分子集合体の製造
１．１  試薬
Fetal Bovine Serum (FBS)はMP Biomedicals,Inc から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)は日水製薬（株）から購入した。N,N-ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、石油エーテル、シアン化ナトリウム、水素化リチウムアルミニウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ベンジルペニシリンカリウム、ストレプトマイシン硫酸塩は和光純薬から購入した。ピラニンは東京化成(株)から購入した。クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、n-ヘキサン、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム6 水和物、塩化カリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)はキシダ化学から購入した。トリエチルアミン、アクリル酸メチル、エチレンジアミン、ジエチルエーテル、塩化ナトリウム、RPMI-1640 液体培地、MEM 非必須アミノ酸溶液はナカライテスクから購入した。トリプシンはDIFCOLABORATORIES(U.S.A)から購入した。ジオクタデシルアミン、カルセインはSigma から購入した。オレイルアミン、オレオイルクロリド、シクロヘキサンジカルボン酸無水物、3-メチルグルタル酸無水物はALDRICH から購入した。
【００９１】
ジクロロメタンはSigma-ALDRICH から購入した。2-メルカプトエタノール、DPX、Hoechst、Lysotracker Green DND-26、Lysotracker Red DND-99、Tf-Alexa555はInvitrogen から購入した。透析膜はSpectra/Por 6 (分画分子量 2000,FE-0526-33)をSpectrum Laboratories Inc.から購入した。Merck Kieselgel 60(230-400 mesh) をシリカゲルクロマトグラフィーに使用した。
【００９２】
１．２  本発明の化合物（Ａ）の合成
１．２．１  概要
2本のアルキル鎖を持つ第1、第2世代のデンドロン脂質(DL-G1、DL-G2)と、2本のオレイル鎖を持つ第1世代のデンドロン脂質(DL-G1-U2)の合成経路を下記化８及び９に示し、そのアミノ基末端にメトキシジエチレングリコール(MDEG)基、又は、エトキシジエチレングリコール(EDEG)基を導入したデンドロン脂質(MDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1、MDEG-DL-G2、EDEG-G2、MDEG-DL-G1-U2、EDEG-DL-G1-U2)の合成経路を下記式に示した。
【００９３】
DL-G1、DL-G2は、ジオクタデシルアミンを出発物質として、アクリル酸メチルによるマイケル付加反応と、それに続くエチレンジアミンによるエステルアミド交換反応を交互に行うことにより合成した。この方法は、デンドリマーの合成において、Tomaliaらが報告した方法である。又、DL-G1-U2は、オレイルアミンとオレイルクロライドとを反応させ、リチウムアルミニウムヒドリド(LiAlH4)でヒドリド還元した後、アクリル酸メチルによるマイケル付加反応と、それに続くエチレンジアミンによるエステルアミド交換反応を交互に行うことにより合成した。
【００９４】
更に合成したDL-G1、DL-G2、DL-G1-U2の末端アミノ基にパラニトロフェニルカーボネート基で活性化したMDEG基、EDEG基を反応させ末端に導入しMDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2、MDEG-DL-G1-U2、EDEG-DL-G1-U2を合成した。
【００９５】
【化１４】
2013237631.tif 000015
【００９６】
【化１５】
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【００９７】
【化１６】
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【００９８】
【化１７】
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【００９９】
【化１８】
2013237631.tif 000019
【０１００】
１．２．２  DL-G-0.5-2C18の合成
アクリル酸メチル(35 ml, 0.39 mmol)にジオクタデシルアミン(2.00 g, 3.9 mmol)を加え、加熱溶解し、窒素雰囲気下、75℃で28時間還流した。その後、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：石油エーテル/ジエチルエーテル＝2/1, v/v)によって精製した。(収量2.18g、収率：90.9%)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)15-), δ 1.22(s, CH3(CH2)15-),δ 1.40(m, -CH2CH2N-), δ 2.38 (t, -CH2COOCH3), δ 2.44 (t, -CH2N-),δ 2.77 (t,-CH2CH2COOCH3), δ 3.67 (s, -OCH3).
【０１０１】
１．２．３  DL-G0-2C18の合成
メタノール(40 ml)にDL-G-0.5(2.18g,3.58mmol)を加え、加熱溶解した。この溶液を、シアン化ナトリウム(36.2 mg, 0.734mmol)を含むエチレンジアミン(70ml,1.05mol)に徐々に加え、窒素雰囲気下、50℃で6日間撹拌した。その後、未反応のエチレンジアミンとメタノールを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム/メタノール/水＝60/35/5, v/v)によって精製した。(収量：1.47g、収率：64.8%)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)15-), δ 1.26 (s, CH3(CH2)15-),δ 1.45(m, -CH2CH2N-), δ 2.39(t, -CH2CONH-), δ 2.46(t, -CH2N-),δ 2.69(t, -CH2CH2CONH-), δ 2.82(t, -CH2NH2), δ 3.29(m, -CH2CH2NH2), δ 8.63(m, -CONH-).
【０１０２】
１．２．４  DL-G0.5-2C18の合成
メタノール(20 ml)にDL-G0(1.37 g, 2.16mmol)を加え、加熱溶解した。この溶液を、アクリル酸メチル(39 ml, 0.432 mol)に徐々に加え、窒素雰囲気下、35℃で48時間撹拌した。その後、未反応のアクリル酸メチルとメタノールを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：石油エーテル/ジエチルエーテル＝2/1, v/v のちクロロホルム/メタノール＝95/5, v/v)によって精製した。(収量：1.30g、収率：74.5%)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)15-), δ 1.26 (s, CH3(CH2)15-), δ 1.44(m, -CH2CH2N-), δ 2.41(t, -CH2CONH-), δ 2.43(m, -CH2COOCH3), δ 2.46(m, -CH2N-), δ2.54(t, -CONHCH2CH2-), δ 2.75(t, -CH2CH2CONH-), δ 2.78(t, -CH2CH2COOCH3), δ 3.28(m, -CONHCH3-), δ 3.67 (s, -OCH3), δ 7.00(m, -CONH-).
【０１０３】
１．２．５  DL-G1-2C18の合成
メタノール(25 ml)にDL-G0.5(1.29 g, 3.64mmol)を加え、加熱溶解した。この溶液を、シアン化ナトリウム(18.4 mg, 0.38mmol)を含むエチレンジアミン(62.5ml,0.88mol)に徐々に加え、窒素雰囲気下、45℃で76時間撹拌した。その後、未反応のエチレンジアミンとメタノールを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム（溶離液：クロロホルム）によって精製した。(収量：0.615g、収率：44.0%)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)15-), δ 1.26 (s, CH3(CH2)15-), δ1.43(m, -CH2CH2N-),δ 2.17(m, -NH2),δ 2.36(m, -CH2CONHCH2CH2NH2), δ 2.40(m, -CH2CONH-), δ 2.42(m, -CH2N-), δ 2.44(t,-CONHCH2CH2-), δ 2.68(t, -CH2CH2CONH-), δ 2.74 (t, -CH2CH2CONHCH2CH2NH2), δ 2.84(t, -CH2NH2), δ 3.29 (m, -CONHCH2-), δ 3.30 (m, -CH2CH2NH2), δ 7.00(m, -CONH-).
【０１０４】
１．２．６  DL-G1.5-2C18の合成
メタノール(23 ml)にDL-G1(0.615 g, 7.11mmol)を加え、加熱溶解した。この溶液を、アクリル酸メチル(145 ml, 1.6 mol)に徐々に加え、窒素雰囲気下、35℃で65時間撹拌した。その後、未反応のアクリル酸メチルとメタノールを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルムのちクロロホルム/メタノール＝9/1, v/v)で精製した。(収量：0.558g、収率：65.1%)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)15-), δ 1.25 (s, CH3(CH2)15-), δ 1.43(m, -CH2CH2N-), δ 2.36(m, -CH2COOCH3), δ 2.43 (m, -CH2N-), δ 2.54 (m, -CONHCH2CH2-), δ 2.75 (m, -CH2CH2COOCH3), δ 3.28(m, -CONHCH2-), δ 3.67 (s, -OCH3), δ 7.00and 8.04 (m, -CONH-).
【０１０５】
１．２．７  DL-G2-2C18の合成
メタノール(12 ml)にDL-G1.5(0.558 g, 0.461mmol)を加え、加熱溶解した。この溶液を、シアン化ナトリウム(9.3 mg, 0.19mmol)を含むエチレンジアミン(40ml, 0.6mol)に徐々に加え、窒素雰囲気下、45℃で72時間撹拌した。その後、未反応のエチレンジアミンとメタノールを減圧留去し、Sephadex LH-20カラム(溶離液：メタノール)によって精製した。(収量：0.53g、収率87.5%)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)15-), δ 1.25(s, CH3(CH2)15-), δ 1.42 (m, -CH2CH2N-), δ 2.09(m,-NH2), δ 2.32 (m, -CH2CONHCH2CH2NH2), δ 2.37 (m, -CH2N-), δ 2.52(m, -CONHCH2CH2-),δ 2.73 (m, -CH2CH2CONHCH2CH2NH2), δ 2.82 (m, -CH2NH2), δ 3.26(m, -CONHCH2-), δ 3.29(m, -CH2CH2NH2), δ 7.63, 7.90and 8.47(m, -CONH-).
【０１０６】
１．２．８  Oleyloleoylamideの合成
Oleoylchlorideを7.7 mL (20 mmol)をジクロロメタン100 mLに溶解させ氷水浴で撹拌し、これにジクロロメタン50 mLにOleylamine 9.4 mL (20 mmol)とトリエチルアミン3.3 mL (0.024 mol)を溶解したものをゆっくり滴下した後、室温窒素雰囲気化で71時間還流した。その後、エバポレータにより溶媒を留去し真空乾燥した後、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒クロロホルム：酢酸エチル=2：1)。その後1H NMRにより化合物の同定を行った。（収量9.38 g、収率86.4 %）
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)6-), δ 1.23 (s, CH3(CH2)6-,-CH2(CH2)5CH2-), δ 1.41 (m, -CH2CH2CO-),δ 1.55 (m, -CH2CH2CO-),δ 1.91 (m, -CH2CH2CH-),δ 2.05 (m, -CH2CH2NH-),δ 3.15 (m, -CH2CH2NH-),δ 5.25 (m, -CH2CHCHCH2-).
【０１０７】
１．２．９  Dioleylamineの合成
THF 84.5 mLにゆっくりとLAH 1.489 gを加え、これにOleyloleoylamide 2.99 g(5.61 mmol)をTHF 84.5 mLで溶解したものをパスツールピペットを用いてゆっくり加えた。これを50 ℃の窒素雰囲気化で83時間反応させた。その後、LAHを濾別し、この時に酢酸エチル、クロロホルム、THFで洗浄した。その後エバポレータにより溶媒を留去し、残留物を飽和食塩水で4回洗浄した。硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後エバポレータにより溶媒を留去、粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒クロロホルム：酢酸エチル=2：1、後クロロホルム：メタノール=9：1)。得られた生成物を1H NMRにより化合物の同定を行った。（収量1.67 g、収率56.3%）
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)6-), δ 1.23 (s, CH3(CH2)6-,-CH2(CH2)5CH2-), δ 1.41 (m, -CH2CH2NH-), δ 1.99 (m, -CH2CH2CH-), δ 2.60 (m, -CH2CH2NH-), δ 5.35 (m, -CH2CHCHCH2-).
【０１０８】
１．２．１０  DL-G-0.5-2C18-U2の合成
Dioleylamine 1.32 g (3.45 mmol)をアクリル酸メチル98 mL (1.23 mol)に溶解して、70 ℃の窒素雰囲気化で攪拌した。反応終了後(95 時間)、エバポレータにより未反応のアクリル酸メチルをカラムクロマトグラフィーにより分離精製した(展開溶媒クロロホルム：酢酸エチル＝2：1)。得られた生成物を1H NMR により化合物の同定を行った。（収量1.32 g、収率64.9%）
1H NMR (CDCl3): δ 0.85 (m, CH3(CH2)6-), δ 1.3 (m, CH3(CH2)6-, -CH2(CH2)5CH2-, -CH2CH2N-), δ 1.99 (m, -CH2CH2CH-), δ 2.40 (m, -CH2CH2NH-, -CH2CH2COO), δ 2.78 (m, -CH2CH2COO), δ 5.35 (m, -CH2CHCHCH2-).
【０１０９】
１．２．１１  DL-G0-2C18-U2の合成
DL-G-0.5-2C18-U2の1.32 g(2.18 mmol)をメタノール100 mLに溶解し、これをシアン化ナトリウム32.2 mg(0.659 mmol)を含む蒸留精製したエチレンジアミン70 mL(1.05 mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、70 ℃の窒素雰囲気化で93.5時間反応させた。反応終了後、エバポレータを用いて溶媒を留去し真空乾燥した。その後、1H NMRにより化合物の同定を行った。（収量1.41 g 未精製）
1H NMR (CDCl3): δ 0.85 (m, CH3(CH2)6-), δ 1.3 (m, CH3(CH2)6-, -CH2(CH2)5CH2-, -CH2CH2N-), δ 2.0 (m, -CH2CH2CH-), δ 2.3-2.8 (m, -CH2CH2NH-, -CH2CH2COO, -CH2CH2NH2), δ 3.25 (m, -CH2CH2NH2), δ 5.35 (m, -CH2CHCHCH2-), δ 8.55 (s, -CONHCH2-).
【０１１０】
１．２．１２  DL-G0.5-2C18-U2の合成
DL-G0-2C18-U2の1.41 mg(2.22 mmol)をメタノール141 mLに溶解した。これをアクリル酸メチル94 mL(1.03 mol)にパスツールピペットを用いてゆっくりと滴下した。その後、45 ℃の窒素雰囲気化で54時間反応させた。反応終了後、エバポレータを用いて溶媒及び未反応のアクリル酸メチルを留去し真空乾燥したのち、得られた粗生成物をオープンカラムクロマトグラフィーにより分離精製した。(展開溶媒ヘキサン：酢酸エチル=10：3、のちクロロホルム：メタノール=4：1)。その後、1H NMRにより化合物の同定を行った。（収量1.74 g、収率99.3%）
1H NMR (CDCl3): δ 0.85 (m, CH3(CH2)6-), δ 1.3 (m, CH3(CH2)6-, -CH2(CH2)5CH2-, -CH2CH2N-), δ 2.0 (m, -CH2CH2CH-), δ 2.3-2.6 (m, -CH2CH2NH-, -CH2CH2COO, -CH2CH2NH2), δ 2.8 (m, -CH2CH2COO),δ 3.25 (m, -CH2CH2NH2),δ 3.67 (s, -OCH3),  δ 5.35 (m, -CH2CHCHCH2-), δ 8.55 (s, -CONHCH2-).
【０１１１】
１．２．１３  DL-G1-2C18-U2の合成
DL -G0.5-2C18-U2の1.74 g(2.88 mmol)をメタノール50 mLに溶解し、これをシアン化ナトリウム47.9 mg(0.98 mmol)を含む、蒸留精製したエチレンジアミン92.8 mL(1.39 mol)にパスツールピペットを用いてゆっくり滴下した。その後、50 ℃で72時間、窒素雰囲気化で反応させた。反応終了後、ロータリーエバポレータで溶媒及び未反応のエチレンジアミンを留去し、得られた粗生成物を2日間透析することで精製し、凍結乾燥により黄色のロウ状物質を得た。（収量1.03 g、収率41.5 %）
1H NMR (CDCl3): δ 0.88 (m, CH3(CH2)6-), δ 1.2-1.4 (m, CH3(CH2)6-, -CH2(CH2)5CH2-, -CH2CH2N-), δ 2.0 (m, -CH2CH2CH-), δ 2.3-2.7 (m, -CH2CH2NH-, -CH2CH2COO), δ 2.6-2.8 (m, -CH2CH2COO, -CH2CH2NH2), δ 3.25 (m,-CH2CH2N-), δ 5.35 (m, -CH2CHCHCH2-), δ 8.55 (s, -CONHCH2-).
【０１１２】
１．２．１４  MDEG-DL-G1の合成
DL-G1(100 mg, 0.12 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、ジクロロメタン(2 mL)に溶解させたMDEG-4-nitrophenyl carbonate(131 mg, 0.48 mmol)を徐々に加え、窒素雰囲気下、室温で、6日間撹拌した。その後、ジクロロメタンを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム/メタノール＝9/1, 8/2, v/v)によって精製した。(収量：100 mg、収率：71.7 %)
1H NMR (CDCl3): δ 0.89(m, CH3(CH2)15-), δ 1.27(s, CH3(CH2)15-), δ1.52(m, -CH2CH2N-),δ 2.39(m, -NCH2CH2CONH-),δ 2.51(m, CH3(CH2)16CH2N-), δ 2.72(m,-NCH2CH2CONH-, -NHCH2CH2N-),δ 3.25(t, -NHCH2CH2NH-), δ 3.32(m, -NHCH2CH2NH-, -NHCH2CH2N-), δ 3.38(s, -OCH3),δ 3.56(t, -CH2OCH3), δ 3.57(t, -CH2CH2OCH3),δ 3.65(t, -CH2OCH2CH2OCH3),δ 4.21(t, -CH2CH2OCH2CH2OCH3),δ 6.04 and 7.45(s, -NH-).
【０１１３】
１．２．１５  MDEG-DL-G2の合成
DL-G2(110 mg, 83.3 μmol)をDMF(6 mL)に溶解させ、DMF (2 mL)に溶解させたMDEG-4-nitrophenyl carbonate(190 mg,666.4 μmol)を徐々に加え、窒素雰囲気下、室温で、6日間撹拌した。その後、DMFを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム/メタノール＝85/15, 8/2, v/v)によって精製した。(収量：140 mg、収率：88.2 %)
1H NMR (CDCl3): δ 0.89(m, CH3(CH2)15-), δ 1.27(s, CH3(CH2) 15-), δ 1.44(m, -CH2CH2N-), δ 2.38 and 2.44(m,-NCH2CH2CO-),δ 2.53(t, CH3(CH2)16CH2N-),δ2.73(m, -NHCH2CH2N-, -NCH2CH2CO-), δ 3.29(t, -NHCH2CH2NH-), δ 3.35(t, -NHCH2CH2N-), δ 3.39(s, -OCH3), δ 3.57(t, -NHCH2CH2NH-),δ 3.65(t, -O(CH2)2OCH3),δ 3.69(t, -COOCH2CH2O-),δ 4.22(t, -COOCH2CH2O-),δ 6.12, 7.57and 8.49(m, -NH-).
【０１１４】
１．２．１６  MDEG-DL-G1-U2の合成
DL-G1-U2(400 mg, 0.50 mmol)をDMF(6 mL)に溶解させ、DMF (3 mL)に溶解させたMDEG-4-nitrophenyl carbonate(713mg, 2.50mmol)を徐々に加え、窒素雰囲気下、室温で、6日間撹拌した。その後、DMFを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム/メタノール＝9/1, v/v)によって精製した。(収量：277mg、収率：48.0%)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88(m, CH3(CH2)7-), δ 1.26and 1.42(t, -CHCH2(CH2)6-),δ2.00(m, -CHCH2-),δ 2.37(m, -NCH2CH2CONH-),δ 2.50(m, CH3(CH2)16CH2N-), δ 2.71(m,-NCH2CH2CONH-, -NHCH2CH2N-),δ 3.22(t, -NHCH2CH2NH-), δ 3.31(m, -NHCH2CH2NH-, -NHCH2CH2N-), δ 3.37(s, -OCH3),δ 3.54(t, -CH2OCH3), δ 3.63(t, -CH2CH2OCH3), δ 3.68(t, -CH2OCH2CH2OCH3), δ 4.20(t, -CH2CH2OCH2CH2OCH3), δ 5.34(m, -(CH)2-),δ 5.95 , 7.36and 8.51(s, -NH-).
【０１１５】
１．２．１７  EDEG-DL-G1の合成
DL-G1(110 mg, 0.13 mmol)をジクロロメタン(6 mL)に溶解させ、ジクロロメタン(3 mL)に溶解させたEDEG-4-nitrophenyl carbonate(228 mg, 0.76 mmol)を徐々に加え、窒素雰囲気下、室温で、7日間撹拌した。その後、ジクロロメタンを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム/メタノール＝9/1, 8/2, v/v)によって精製した。(収量：100 mg、収率：66.5 %)
1H NMR (CDCl3): δ 0.87(m, CH3(CH2)15-),δ 1.20(t, -OCH2CH3),δ 1.25 (t, CH3(CH2)15-), δ1.48(m, -CH2CH2N-),δ 2.37(t, -NCH2CH2CONH-),δ 2.50(t, CH3(CH2)16CH2N-), δ 2.70(m,-NCH2CH2CONH-, -NHCH2CH2N-),δ 3.25(t, -NHCH2CH2NH-), δ 3.31(t, -NHCH2CH2NH-),δ 3.35(t,-NHCH2CH2N-),δ 3.53(m, -OCH2CH3),δ 3.58(t, -CH2OCH2CH3), δ 3.62(t, -CH2CH2OCH2CH3), δ 3.68(t, -CH2OCH2CH2OCH2CH3), δ 4.20(t, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH3), δ 6.01and 7.42(s, -NH-).
【０１１６】
１．２．１８  EDEG-DL-G2の合成
DL-G2(200 mg, 151.5 μmol)をジクロロメタン(10 mL)に溶解させ、ジクロロメタン(3 mL)に溶解させたEDEG-4-nitrophenyl carbonate(544 mg, 1818 μmol)を徐々に加え、窒素雰囲気下、室温で、5日間撹拌した。その後、ジクロロメタンを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム/メタノール＝9/1, 8/2, v/v)によって精製した。(収量：120 mg、収率：40.4 %)
1H NMR (CDCl3): δ 0.87(m, CH3(CH2)15-),δ 1.20(t, -OCH2CH3),δ 1.25(t, CH3(CH2)15-),δ 1.44(m, -CH2CH2N-), δ 2.36(m,-NCH2CH2CO-), δ 2.52(t, CH3(CH2)16CH2N-), δ 2.71(m, -NHCH2CH2N-, -NCH2CH2CO-), δ 3.27(t, -NHCH2CH2NH-), δ 3.33(t, -NHCH2CH2N-), δ 3.51(m, -OCH2CH3), δ 3.57(t, -NHCH2CH2NH-), δ 3.62(t, -O(CH2)2OCH2CH3), δ 3.67(t, -COOCH2CH2O-),δ 4.19(t, -COOCH2CH2O-), δ 6.10 and7.50(m, -NH-).
【０１１７】
１．２．１９  EDEG-DL-G1-U2の合成
DL-G1-U2(400 mg, 0.38 mmol)をDMF(4 mL)に溶解させ、DMF (3 mL)に溶解させたEDEG-4-nitrophenyl carbonate(673 mg, 2.25 mmol)を徐々に加え、窒素雰囲気下、室温で、7日間撹拌した。その後、DMFを減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィー(展開溶媒：クロロホルム/メタノール＝9/1, v/v)によって精製した。(収量：160 mg、収率：36.8 %)
1H NMR (CDCl3): δ 0.88(m, CH3(CH2)7-),δ 1.20 (t, -OCH2CH3),δ 1.26and 1.42(t, -CHCH2(CH2)6-),δ2.00 (m, -CHCH2-),δ 2.37 (m, -NCH2CH2CONH-),δ 2.50 (m, CH3(CH2)16CH2N-), δ 2.69(m,-NCH2CH2CONH-, -NHCH2CH2N-),δ 3.31(t, -NHCH2CH2NH-), δ 3.35(m, -NHCH2CH2NH-, -NHCH2CH2N-), δ 3.51(m, -OCH2CH3),δ 3.58(t, -CH2OCH2CH3), δ 3.63(t, -CH2CH2OCH2CH3), δ 3.68(t, -CH2OCH2CH2OCH2CH3), δ 4.20(t, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH3), δ 5.34(m, -(CH)2-),δ 5.98, 7.37and 8.49(s, -NH-).
【０１１８】
１．３  結果
温度応答性デンドロン脂質の1H NMRによるキャラクタリゼーション
デンドロン脂質は実験項に示した通り、メタノール中において、開始剤であるジオクタデシルアミンにアクリル酸メチルおよびエチレンジアミンを交互に反応させることによって合成した。同定は1H NMRによって行い、DL-G-0.5からDL-G2が合成できていることを確認した。更に、末端アミノ基を修飾したデンドロン脂質の1H NMRスペクトルでは、末端アミノ基に由来するピークが消失し、修飾したOEG基に由来するピークが出現したことにより合成できていることを確認した。このとき、MDEG-DL-Gn (n=1, 2)、MDEG-DL-G1-U2は、1H NMRスペクトルで、メトキシジエチレングリコール基の末端メチル基に由来する3.24ppm付近のピークが出現したことにより合成できていることを確認した。また、EDEG-DL-Gn (n=1, 2)、EDEG-DL-G1-U2は、1H NMRスペクトルで、エトキシジエチレングリコール基の末端エチル基に由来する1.11ppm付近と、3.41ppm付近のピークが出現したことにより合成できていることを確認した。
【０１１９】
MDEG-DL-Gn (n=1, 2)、MDEG-DL-G1-U2については1H NMRにおいて、オクタデシル基末端のメチル基に由来する0.88ppm付近のピーク、又はオレイル鎖末端のメチル基に由来する0.96ppm付近のピークの積分比と、導入されたメトキシジエチレングリコール基の末端メチル基に由来する3.24 ppm付近のピークの積分比から、デンドリマー脂質に導入されたメトキシジエチレングリコール基の数を算出した。その結果、MDEG-DL-G1とMDEG-DL-G2とMDEG-DL-G1-U2の末端には、それぞれ、2.0、4.0、2.0個のメトキシジエチレングリコール基が導入されたことがわかった。
【０１２０】
EDEG-DL-Gn (n=1, 2)、EDEG-DL-G1-U2については1H NMRにおいて、オクタデシル基末端のメチル基に由来する0.88 ppm付近のピーク、又はオレイル鎖末端のメチル基に由来する0.96ppm付近のピークの積分比と、導入されたエトキシジエチレングリコール基の末端エチル基に由来する1.11ppm付近と、3.41ppm付近のピークの積分比から、デンドリマー脂質に導入されたエトキシジエチレングリコール基の数を算出した。その結果、EDEG-DL-G1とEDEG-DL-G2とEDEG-DL-G1-U2の末端には、それぞれ、2.0、4.0、2.4個のメトキシジエチレングリコール基が導入されたことがわかった。
【０１２１】
以上の通り、2本のアルキル鎖を持つ第1、第2世代までのPAMAMデンドロン脂質と、2本のオレイル鎖を持つ第1世代のPAMAMデンドロン脂質を合成した。それらの末端アミノ基に、温度応答性を持つ種々のOEG基を導入することによって、第1世代、第2世代で種々のOEG基結合デンドロン脂質であるMDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2、MDEG-DL-G1-U2、EDEG-DL-G1-U2を合成した。
【０１２２】
前述したように、デンドロン脂質は両親媒性分子であるため、水中に分散することで分子集合体を形成し、それによって親水性領域へ導入した温度応答性基が集合体表面へ集積すると考えられる。そして、その集積した温度応答性基間の相互作用により、脂質分子集合体が温度応答性を発現すると期待できる。そこで、次に、合成した温度応答性デンドロン脂質の分散液を用いて、脂質分子集合体の温度応答性について検討した。
【０１２３】
２．オリゴエチレングリコール鎖を導入したポリアミドアミンデンドロン脂質からなる集合体の温度応答性の評価
合成された種々のデンドロン脂質は両親媒性分子であるため、水中に分散すると疎水性相互作用により自己組織化し、ミセルやベシクルといった分子集合体を形成すると考えられる。このとき、脂質の親水性部位末端に導入された種々のOEG基は、脂質分子集合体表面へ高密度に集積化されるため、脂質分子集合体が温度応答性を発現することが期待できる。そこでこの温度応答性デンドロン脂質を水中に分散させることで集合体を形成させ、その集合体の温度応答性及びその形態について評価を行った。
【０１２４】
２．１  試薬
リン酸水素二ナトリウム(12水和物)(Na2HPO4・12H2O)、リン酸二水素ナトリウム(2水和物) (Na2HPO4・2H2O)、はキシダ化学から購入した。水酸化ナトリウムは和光純薬工業株式会社から購入した。
【０１２５】
２．２  脂質分散液の調製
各々の脂質のクロロホルム溶液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これに10 mMリン酸緩衝溶液を加え、pH 3.0、濃度2 mg/mlに調整した。これにバス型超音波照射装置を用いて超音波を45℃で10分間照射した後、45℃で20分間静置した。その後、氷冷下において60分以上静置した。
【０１２６】
２．３  透過率測定による温度応答性の評価
種々のpHの10 mM リン酸緩衝水溶液(140 mM NaCl)1.80mlに、上記で調製したpH 3.0の脂質分散液0.20mlを加え(0.2mg/ml)、10℃で30分間、撹拌・保持した後、測定を行った。測定は脂質分散液を10℃から昇温速度2℃/minで加熱し、そのときの透過率の変化を測定した。測定には日本分光製V-560型紫外・可視分光光度計を用いた(測定波長500 nm)。温度制御はETC-505Tを用いて行った。このとき透過率が下がり始める温度を曇点とした。測定後、室温にて溶液のpHを測定し、その値を濁度測定時のpHとした。
【０１２７】
２．４  示差走査熱量測定(Differential scanning calorimetry)(DSC)による温度応答時の吸熱評価
10 mM リン酸緩衝水溶液(140 mM NaCl)630μlに、2.2.で調製したpH 3.0の脂質分散液70μlを加え(0.2mg/ml)、pH 7.4に調節した後、10℃で30分間保持した後、測定を行った。測定はpH 7.4の10 mM リン酸緩衝水溶液(140 mM NaCl)と脂質分散液をそれぞれ600 μl用いて、昇温速度1℃/minで加熱し測定した。測定にはTA Instruments Japan Inc.製ナノDSCを用いた。
【０１２８】
２．５  位相差顕微鏡による分子集合体の形態観測
10 mM リン酸緩衝水溶液(140 mM NaCl) 0.90 mlに、2.2.で調製したpH 3.0のEDEG-DL-G1分散液0.10 mlを加え(0.2mg/ml)、pH 7.4に調節し、10℃で30分間、撹拌・保持した後、観察を行った。また、40℃で1分以上湯浴した後、観察を行った。
【０１２９】
２．３  結果
２．３．１  種々のデンドロン脂質集合体の温度応答性の評価
MDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2、MDEG-DL-G1-U2、EDEG-DL-G1-U2について、それぞれの脂質分散液(pH 7.4)を昇温させたときの透過率の変化によって温度応答性の評価を行った。そのときの結果を図22に示した。MDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1について、低温時(10 ℃)の時点で、すでに透過率が低下していた。そして、分散液の温度を上昇させていくと、MDEG-DL-G1は32℃付近において、EDEG-DL-G1は22℃付近において、透過率の減少が見られた。また、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2、MDEG-DL-G1-U2、EDEG-DL-G1-U2分散液についても、分散液の温度を上昇させていくと、MDEG-DL-G2は68 ℃付近において、EDEG-DL-G2は32 ℃付近において、MDEG-DL-G1-U2は44℃付近において、EDEG-DL-G1-U2は24 ℃付近において、透過率の減少が見られた。これらの透過率の減少は、分子集合体が不安定化し、凝集したことを示している。ここで、分散液の透過率が下がり始める温度を曇点(Cloud Point)と定義すると、MDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2、MDEG-DL-G1-U2、
EDEG-DL-G1-U2の曇点は、それぞれ、34.2 ℃、22.5 ℃、67.6 ℃、34.2 ℃、45.4℃、26.1 ℃となった。以上のことから、種々のOEG基を分子集合体表面へ集積化させることにより温度応答性を付与できることが示された。また、それぞれの曇天温度を比較すると、末端基がより疎水的になるほど、曇点温度は下がり、世代数が高くなると、曇点温度は上がった。これは、疎水性が高まると、温度応答による脱水での疎水性相互作用による凝集が起こりやすくなるためであると考えられる。また、世代数が高まると、第三級アミンの数も増え、より親水的になるために、高温側での温度応答となったと考えられる。加えて、アルキル鎖とオレイル鎖での時では、オレイル鎖を持つデンドロン脂質の分子集合体の方が、曇点は高温側へシフトした。これは、二重結合を持つことで、分子集合体が作り出す脂質二重層がより流動的になり、安定性を高めているためであると考えられる。
【０１３０】
また、種々のpHにおいてEDEG-DL-G2の分散液の透過率の変化を測定することで、温度応答性のpH依存性についての評価を行った。そのときの結果の一部を図23に、また、pHに対して曇天をプロットした結果を図24に示した。分散液のpHの低下に伴い、曇点の上昇が見られた。これは、pHの低下に伴い、極性基における三級アミノ基のプロトン化の度合いが大きくなり、分子の親水性が高くなったため、また、電荷を帯びることで分子内や分子間で静電反発が起き、種々のOEG基の表面密度が低下したため、より高温に曇点を示したと考えられる。また、pHが高くなりすぎた時は、曇点が下がり続けるわけではなく、ある一定の温度に曇点を示すようになった。これは、極性基における三級アミノ基のプロトン化がされなくなったためだと、考えられる。
【０１３１】
２．３．２  種々のデンドロン脂質分子集合体の温度応答時における吸熱評価
MDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2、MDEG-DL-G1-U2、EDEG-DL-G1-U2について、それぞれの脂質分散液(pH 7.4)を昇温させたときの吸熱エネルギーによって温度応答時の吸熱評価を行った。そのときの結果を表１に、温度変化における吸熱ピークを図２５及び２６に示した。
【０１３２】
MDEG-DL-G1、EDEG-DL-G1について、約40 ℃付近に示す大きな吸熱ピークがみられた。このピーク温度は、これらの曇点温度とは異なっていることから、温度応答時の脱水和による吸熱ではないことが分かった。しかし、組成の異なるデンドロン脂質を扱っているのに関わらず、ピーク温度がほぼ同じとなったのは、これらの分子集合体の疎水部としてアルキル鎖が集まってゲルとなしている部分が、液晶状態へと転移したことからの、吸熱だと考えられる。また、この時の吸熱ピークの温度は、EDEG-DL-G1の方が低温で、吸熱の熱量は低かったことから、分子集合体の疎水性度が高まることによって、応答温度領域もわずかに低温側にシフトし、脱水和した時の吸熱した熱量も低くなったのだと考えられる。
【０１３３】
さらに、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2においては、第一世代と同じように、40 ℃付近に吸熱ピークが見られると予想していたが、ピークが見られなかった。これは、世代数が高くなることにより、第三級アミンの数が増え、デンドロン脂質の分子集合体の親水性が高まり、親疎水性バランスが向上することで、アルキル鎖の疎水部がゲル状とならずに分子集合体を形成したことに起因していると考えられる。しかし、MDEG-DL-G2、EDEG-DL-G2においては、曇点付近温度でわずかな吸熱ピークが見られた。これは、デンドロン脂質の分子集合体の温度応答時の、脱水和における吸熱ピークだと考える。これより、第一世代では十分に水和していなかったが、第二世代となることで親水性が高まり、より水和したことで、わずかではあるがピークがみえるほどの脱水和が起こったためであると考えられる。
【０１３４】
また、MDEG-DL-G1-U2、EDEG-DL-G1-U2においては、大きな吸熱ピークがみられなかったが、35 ℃付近に小さな吸熱ピークが見られた。これは、アルキル鎖を持つデンドロン脂質の時には示していた約40 ℃付近のピークが、アルキル鎖からオレイル鎖に変わることによって、少し低温側にシフトし、吸熱の熱量が小さくなったと考えられる。これは、分子集合体の疎水部がアルキル鎖によるものでなく、オレイル鎖になることで流動性が高まり、ゲルと液晶状態となっているため、ゲルから液晶への転移が少なくなったためだと考えられる。
【０１３５】
【表１】
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【０１３６】
２．３．３  EDEG-DL-G1分子集合体の形態評価
まず、目視によってEDEG-DL-G1分子集合体(pH 7.4)の様子を観察した結果を図27に、さらに、位相差顕微鏡を用いて形態観測を行った結果を図28に示す。曇点以下の10 ℃の時、EDEG-DL-G1の分散液は、わずかに濁っているのが観察された。また、曇点以上の40 ℃の時は、白い凝集体が観察された。
【０１３７】
次に、これらの状況時においての顕微鏡観察では、10 ℃の時、EDEG-DL-G1の分子集合体が水和した状態で少し凝集しているのが観察された。また、40 ℃になると、分子集合体は強く凝集され、巨大な凝集体を形成していた。
【０１３８】
これらは、低温時においては、EDEG-DL-G1の分子集合体は水和している状態であるが、親疎水性バランスが悪いため、疎水性相互作用によって、少し凝集していると考えられる。また、加熱をして曇点温度を超えると、温度応答を示し、分子集合体が脱水和されることにより、強烈な疎水性相互作用が働き、巨大な凝集体を形成したと考えられる。
【０１３９】
以上の通り、種々のOEG基を導入したデンドロン脂質分子の集合体の温度応答性評価と分子集合体の形態評価を行った。
【０１４０】
デンドロン脂質の集合体の温度応答性評価は、脂質分散液の透過率測定によって行った。種々のOEG基末端を有するデンドロン脂質の分散液の温度を上昇させていくと、ある温度以上で透過率の減少を示した。このことから、分子集合体が凝集したことが示された。つまり、種々のOEG基を分子集合体表面へ集積化させることにより、集合体へ温度応答性を付与できることがわかった。また、pHの低下に伴い、曇点は上昇した。これは、デンドロン脂質内部の第三級アミンのプロトン化が促進され、分子集合体がより水和したためであると考えられる。
【０１４１】
また、EDEG-DL-G1分子集合体(pH 7.4)の様子を観察した結果、10 ℃の時、分子集合体が水和した状態で少し凝集しているのが観察され、40 ℃になると、分子集合体は強く凝集され、巨大な凝集体を形成していた。つまり、このEDEG-DL-G1分子集合体は、低温時において、水和している状態であるが、親疎水性バランスが悪いため、疎水性相互作用によって、少し凝集していると考えられる。また、曇点以上では、温度応答を示し、分子集合体が脱水和されることにより、強烈な疎水性相互作用が働き、巨大な凝集体を形成したと考えられる。
【０１４２】
以上より、合成した種々のデンドロン脂質の性質が評価された。これらの末端にOEG鎖を有するデンドロン脂質からなる分子集合体は、特定の温度領域において温度応答を示すことが分かった。しかし、EDEG-DL-G1において、DDSでのキャリアへの応用を考えた時、デンドロン脂質ベシクルの、コロイドとしての安定性の不足が問題となる。そこで、このデンドロン脂質ベシクルのコロイドとしての安定性を向上させるために、PEG脂質を導入することで、ベシクルの安定性を向上させ、PEG鎖によるさらなる生体適合性の付与を目指した。次に、PEG脂質を導入することで、温度応答性と分子集合体にどのような影響を与えるかについて調べた。
【０１４３】
３．  ポリエチレングリコール脂質導入によるオリゴエチレングリコール鎖を末端に有するデンドロン脂質集合体の温度応答性機能評価
前述の実験において温度応答性デンドロン脂質を構築はできたが、温度応答を示すよりも、低温の時から、すでにコロイドとして不安定な状態であった。この温度応答性デンドロン脂質をDDSへ応用するためには、よりコロイドとしての安定性を高めながら温度応答性を発現させることが重要となる。そこで、より生理的条件に近い環境におけるコロイドとしての安定性や、生体適合性を向上させるために、PEG脂質をベシクルに導入することを試みた。そこで、EDEG-DL-G1にPEG脂質を組み合わせた分子集合体の温度応答性や形態を調べることで、温度応答機能と形態に与えるPEG脂質の影響について検討し、評価した。
【０１４４】
３．１  試薬
リン酸水素二ナトリウム(12水和物)(Na2HPO4・12H2O)、リン酸二水素ナトリウム(2水和物)(NaH2PO4・2H2O)、塩酸、はキシダ化学から購入した。水酸化ナトリウムは和光純薬工業株式会社から購入した。CS-010(PEG脂質)は日油から購入した。
【０１４５】
３．２  デンドロン脂質分散液の調製
EDEG-DL-G1とPEG脂質を種々の比で混合したクロロホルム溶液からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これに10 mMリン酸緩衝溶液を加え、pH 3.0、濃度2 mg/mlに調整した。これにバス型超音波照射装置を用いて超音波を45℃で10分間照射した後、45℃で20分間静置した。その後、氷冷下において60分以上静置した。
【０１４６】
３．３  透過率測定による温度応答性の評価
種々のpHの10 mM リン酸緩衝水溶液(140 mM NaCl)1.80mlに、上記で調製したpH 3.0の脂質分散液0.20mlを加え(0.2mg/ml)、10℃で30分間保持した後、測定を行った。測定は脂質分散液を10℃から昇温速度2 ℃/minで加熱し、そのときの透過率の変化を測定した。測定には日本分光製V-630型紫外・可視分光光度計を用いた(測定波長500 nm)。
【０１４７】
温度制御はETC-717を用いて行った。このとき透過率が急激に下がる温度を曇点とした。測定後、室温にて溶液のpHを測定し、その値を濁度測定時のpHとした。
【０１４８】
３．４  動的光散乱測定(Dynamic light scattering)(DLS)による分子集合体の粒径測定
10 mM リン酸緩衝水溶液(140 mM NaCl) 1.80 mlに、2.2.で調製したpH 3.0の脂質分散液0.20 mlを加え(0.2mg/ml)、pH 7.4に調節し、10℃で30分間撹拌し保持した後、測定を行った。測定は脂質分散液を10℃から昇温しながら、各温度における、そのときの分子集合体の粒径を測定した。測定には大塚電子株式会社製DLS-6000型ダイナミック光散乱光度計を用いて行った。
【０１４９】
３．５  原子間力顕微鏡(Atomic force microscope)(AFM)による分子集合体の形態観測
３．５．１  形態観測に用いるサンプル作製
種々のpHの10 mM リン酸緩衝水溶液(140 mM NaCl)180 μlに、2.2で調製したpH 3.0のEDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質分散液20 μlを加え(0.2mg/ml)、10℃で30分間撹拌し保持した後、AFM観測のマイカ作製に用いた。また、この溶液を50℃で10分間攪拌した後、AFM観測のマイカ作製に用いた。
【０１５０】
３．５．２  AFM観測に用いるサンプル作製
2.5.1.で調製した脂質分散液20μlをマイカ上に滴下、10分間、それぞれ10 ℃と50 ℃の雰囲気下で静置した。余分な分散液を濾紙で吸い取った後、形態観測に用いた。観測は、原子間力顕微鏡(SPI3800 Probe Station 及びSPA400 SOUNDPROOF HOUSING)を用いて観測した。
【０１５１】
３．６．結果
３．６．１  分子集合体の温度応答機能に及ぼすPEG脂質の影響
PEG-Chol含率が5 %のEDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質について、この脂質分散液(pH 7.4)を昇温させたときの透過率の変化によって温度応答性の評価を行った。そのときの結果を図29に示した。分散液の温度を上昇させていくと、ある温度付近において急激な透過率の減少が見られた。これらの急激な透過率の減少は、分子集合体が不安定化し、凝集したことを示している。このことから、PEG脂質を加えることで分子集合体の温度応答機能が損なわれることはないということがわかった。しかし、38 ℃付近において少し減少していた透過率が増加しているのが見られた。これは、デンドロン脂質のアルキル鎖部位におけるゲル-液晶転移によって、凝集し始めた分子集合体が再分散化されたためによる、透過率の増加だと考えられる。
【０１５２】
また、PEG脂質を導入した割合に対して曇点をプロットした結果を図30に示した。PEG脂質の含有量が増加に伴い、曇点の上昇が見られた。これは、PEG脂質の増加に伴い、分子集合体表面がより親水的になったため、また、表面に導入されたPEG鎖の量が増加し、EDEG基間の表面密度が低下し、相互作用が抑制され、さらに、コレステロールが導入されることで、分子集合体の疎水部の流動性が高められたことによって安定化したためであると考えられる。
【０１５３】
また、種々のpHにおいてPEG-Chol含率が5 %のEDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質の分散液の透過率の変化を測定することで、温度応答のpH依存性についての評価を行った。そのときの結果を図31に、そして、pHに対して曇点をプロットした結果を図32に示した。また、図32には比較として、EDEG-DL-G1のみの時の結果も、併せて載せた。分散液のpHの低下に伴い、曇点はほとんど変化しなかった。これは、pHの低下に伴う、極性基における三級アミノ基のプロトン化による分子の親水性の増加の影響が、PEG鎖による表面の水和と比べるとわずかなものであったためだと考えられる。また、どのpHにおいても、PEG脂質を導入した方がより高温側に曇点を示すことがわかった。
【０１５４】
３．６．２  EDEG-DL-G1/PEG-Chol (5 %)脂質からなる分子集合体の粒径測定
DLSを用いてPEG脂質を5％導入したEDEG-DL-G1/PEG-Chol (5 %)脂質分子集合体(pH 7.4)の各温度における粒径測定を行った結果を図33に示す。曇点以下の温度においては、約200 nm程度の粒径の分子集合体を形成しているのが分かる。しかし、曇点温度を超えると粒径は急激に増大した。そして、50 ℃では巨大な凝集体が観察され、DLSでの測定が出来なかった。これは、曇点以下の温度では、分子集合体がコロイドとして安定的であり、分子集合体表面が十分に水和しているため、一定の粒径を保っているのだと考えられる。そして、曇点温度となると、温度応答の脱水により分子集合体の親疎水バランスが崩れ、疎水性相互作用で凝集体を形成しているのだと考えられる。
【０１５５】
３．６．３  EDEG-DL-G1/PEG-Chol (5 %)脂質からなる分子集合体の形態評価
AFMを用いてPEG脂質を5％導入したEDEG-DL-G1/PEG-Chol (5 %)脂質分子集合体(pH 7.4)の形態観測を行った結果を図34に示す。曇点以下の10 ℃においては、粒径が約150〜200nmの球状の分子集合体が観測された(図34(A))。この集合体は、その粒径の大きさより、ベシクル構造をとっていると考えられる。
【０１５６】
次に、曇点以上の50℃においては、棒状構造の集合体が観測された(図34(B))。これは、以前の研究で分かっているIBAM-DL-G2の時と同様に、逆ヘキサゴナル構造をとっているものと考えられる。
【０１５７】
以上の通り、PEG脂質を導入したEDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質分子集合体の温度応答性評価と分子集合体の粒径・形態評価を行った。そして、この結果と第3項での結果とを比較することにより、PEG脂質がEDEG-DL-G1分子集合体に与える影響について検討した。
【０１５８】
EDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質分子集合体の温度応答性評価は、脂質分散液の透過率測定によって行った。EDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質分散液の温度を上昇させていくと、ある温度以上で急激に透過率の減少を示した。このことから、分子集合体が凝集したことが示された。つまり、PEG脂質を導入することによって温度応答機能が損なわれることはないことがわかった。また、PEG脂質の導入率を増加させると、分子集合体の曇点は上昇した。これは、PEG-Cholが導入されたことにより、分子集合体表面がより水和され、脱水和して転移するためにより多くのエネルギーが必要になったためであると考えられる。
【０１５９】
次に、EDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質＝95/5の組成の分子集合体の粒径をDLS測定によって行った。曇点以下の低温では、約200 nm程度の粒径を示し、曇点以上の温度となると粒径は増大した。これは、曇点以下温度では分子集合体が水和した状態で一定の粒径を保ち安定しており、曇点を超えることで、温度応答による脱水和のために親疎水性バランスが不安定になり、疎水性相互作用が働き凝集体を形成したためだと考えられる。
【０１６０】
４．  ポリエチレングリコール脂質導入によるオリゴエチレングリコール鎖を末端に有するデンドロン脂質集合体の細胞内デリバリー機能評価
前述の実験で、デンドロン脂質とPEG脂質とを複合化させることで、デンドロン脂質が形成する分子集合体のコロイドとしての安定化は図れ、一定の粒径を持ちながら、体温付近に曇点を持ち、温度応答によって形態変化を起こすベシクルが形成された。そこで、このベシクルが細胞内へと取り込まれるかのデリバリー機能実験を試みた。そこで、このデンドロン脂質ベシクルに蛍光ラベル化を施し、ヒト子宮頸ガン由来細胞(HeLa細胞)を用いて、温度制御を行うことによってベシクルのデリバリー機能を評価した。
【０１６１】
４．１  試薬
Fetal Bovine Serum (FBS)はMP Biomedicals,Incから購入した。ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)は日水製薬（株）から購入した。リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ベンジルペニシリンカリウム、ストレプトマイシン硫酸塩、アセチルCoA、アンピシリンナトリウム、クロラムフェニコール、臭化エチジウムは和光純薬から購入した。塩化カルシウム、塩化マグネシウム6水和物、塩化カリウム、トリスヒドロキシミチルアミノメタン(Tris)、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)はキシダ化学から購入した。細胞溶解剤Luc-PGC-50は、東洋インキから購入した。塩化ナトリウムはナカライテスクから購入した。トリプシンはDIFCO LABORATORIES(U.S.A)から購入した。
【０１６２】
４．２  蛍光ラベル化したデンドロン脂質ベシクルの調製
EDEG-DL-G1とPEG脂質を95/5の割合で混合したクロロホルム溶液に、Rhodamine-PEを加え(0.6 mol%)、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これに10 mMリン酸緩衝溶液を加え、pH 3.0、濃度1.0 mMに調整した。これにバス型超音波照射装置を用いて超音波を45℃で10分間照射した後、45℃で20分間静置した。その後、氷冷下において60分以上静置した。最後に、pH 7.4に調節し、分散液を作製した。
【０１６３】
４．３  細胞内デリバリー機能評価
Hela細胞をガラスボトムディッシュに1つ当たり2×105個になるように撒き、10% FBS含有DMEMメディウム2.0 ml中、37 ℃で一晩培養した。その後、PBS(+)で2回、PBS(-)で1回洗浄した後、DMEMメディウム(血清なし)1.0mlを加えた。そこに1穴当たり1 .0mlのRhodamine-PEでラベル化したPEG複合型デンドロン脂質ベシクルの分散液を加え、36℃と42 ℃で15分間インキュベートした。その後、PBS(+)で2回、PBS(-)で1回洗浄して細胞に吸着や取り込まれていないベシクルを除去した。その後、PBS(-)を1 ml再び加え、共焦点レーザー顕微鏡(LSM 5 EXCITER(ZEISS))により細胞内動態を観察した。
【０１６４】
４．４  結果
４．４．１  デンドロン脂質ベシクルの温度制御による細胞内デリバリーへの影響
36 ℃と42 ℃のそれぞれにおいて、incubateした時の共焦点レーザー顕微鏡画像の結果を、図35に示す。この結果より、曇点温度前後では、ラベル化したローダミン脂質の蛍光の強さがかなり異なることが分かる。明らかに、曇点以上でincubateした方が蛍光が強く光っていた。また、このときの細胞内におけるベシクルの分布を詳しく調べるために、拡大図を図36に示す。36 ℃においては、主に細胞の表面に蛍光が観察された。一方、42 ℃においては、細胞の表面だけでなく内部にも蛍光が観察された。これは、低温側ではベシクル表面が、温度応答を示す前で親水的なために、細胞表面に弱く吸着するだけなのに対し、曇点以上になると、ベシクルが温度応答により脱水和し、形態変化するために、細胞内に取り込まれたと考えられる。この時、ベシクルは形態変化し、細胞膜と強く相互作用し、効率良くエンドサイトーシスにより、細胞内に取り込まれるか、あるいは、疎水性相互作用によって、細胞膜を直接通過することによって、細胞内に移行し、取り込まれたものと考えられる。
【０１６５】
以上の通り、構築したPEG脂質を導入したEDEG-DL-G1/PEG-Chol脂質分子集合体に、蛍光ラベル化を施し、このベシクルの細胞内におけるデリバリー機能を評価した。
【０１６６】
HeLa細胞において、incubate時の温度を曇点前後に制御すると、ベシクルの細胞内デリバリー機能の差が明らかに観察された。曇点温度前後では、ラベル化したローダミン脂質の蛍光の強さがかなり異なることが分かり、曇点以上でincubateした方が蛍光が強く光っていた。36 ℃においては、おもに、細胞の表面に蛍光が観察された。一方、42 ℃においては、細胞の表面だけでなく内部にも蛍光が観察された。これは、低温側ではベシクル表面が、温度応答を示す前で親水的なために、細胞表面に弱く吸着するだけなのに対し、曇点以上になると、ベシクルが温度応答により脱水和し、形態変化するために、細胞内に取り込まれたと考えられる。この時、ベシクルは形態変化し、細胞膜と強く相互作用し、効率良くエンドサイトーシスにより、細胞内に取り込まれるか、あるいは、疎水性相互作用によって、細胞膜を直接通過することによって、細胞内に移行し、取り込まれたものと考えられる。
【０１６７】
以上より、細胞への結合・取り込みを温度制御できる、新しい温度応答性ベシクルが開発できた。
【０１６８】
５．  曇点に及ぼすPEG脂質含率の影響
MDEG-G1/PEG-Chol 集合体の曇点に及ぼすPEG-Chol 含率の影響を調べた。実験法は、前述の方法に従った。詳細には次の通りである。
【０１６９】
種々の比率のMDEG-G1とPEG-Chol(PEG分子量1000)の混合薄膜を分散させて得られたデンドロン脂質／PEG-Chol集合体分散液（10 mM リン酸、140 mM NaCl、 pH3.0）を作成し、10 mM リン酸、140 mM NaCl、 pH7.4のバッファー中に加えてその透過率の温度依存性測定を行うことで、温度応答性を評価した。昇温速度 4 ℃/min 。
【０１７０】
MDEG-G1/PEG-Chol 集合体の曇点はPEG-Chol含率の増大とともに上昇した。PEG-Chol含率を調節することで、集合体の応答温度（曇点）の調製が可能であることが分かった。また、PEG-Chol  を2％含有させることで、曇点を40℃付近にもつデンドロン脂質集合体が得られることが分かった。
【０１７１】
６．  細胞による集合体の取り込みに及ぼすインキュベーション温度の影響
12穴dishにHeLa細胞(ヒト子宮頸ガン由来)を10万/wellで播種し、24時間培養した。PBS(+)で２回、PBS(-)で１回洗浄し、DMEM(血清なし)を500 μL加え、脂質濃度が0.5 mM となるようにデンドロン脂質／PEG-Chol集合体分散液を500 μL加えて、CO2 インキュベーターで、37℃,42℃,44℃で15分,30分間インキュベートした。その後、PBS(+)で２回、PBS(-)で１回洗浄し、トリプシンで細胞を剥がした後、フローサイトメーターにより細胞の蛍光強度を調べて、細胞による集合体の取り込み量を評価した。(n=2)
細胞自体の蛍光強度を基準として相対蛍光強度によって評価した。結果を図３９に示す。インキュベーション温度を曇点以上にすると、EDEG-DL-G1-2C18/PEG-Chol (95/5)集合体では取り込み量が増大した。EDEG-DL-G1-2C18/PEG-Chol (95/5)集合体が疎水性化して、細胞に強く結合して効率よく取り込まれたものと考えられる。また、細胞とのインキュベーション時間を延ばすことでも、取り込みを大きく促進できた。一方、MDEG-DL-G1-2C18/PEG-Chol (98/2)集合体は、温度・接触時間を変化させても、取り込みがあまり変化しなかった。これは、デンドロン脂質MDEG-DL-G1-2C18末端基の疎水性度がEDEG-DL-G1-2C18に比べて低いことから、形態変化を起こしても細胞との相互作用があまり強く働かなかったためと考えられる。
【０１７２】
以上の通り、温度応答性基として生体適合性に優れるオリゴエチレングリコール鎖を、デンドロン脂質の極性基に導入し、その分子集合体の表面に集積させることにより、分子集合体に温度応答性を付与できることが確認された。また、世代・末端基の違いによって、曇点の温度が異なった。このことは、分子構造内の疎水性、親水性のバランスが起因していると考えられる。よって、分子構造における疎水性部位、親水性部位のバランスの設計によって、所望の温度で応答する分子集合体の構築が可能であると考えられる。
【０１７３】
また、この温度応答性デンドロン脂質の分子集合体にコロイドとしての安定性を持たせるために、ポリエチレングリコールを極性基にもつ脂質を導入したが、温度応答機能が損なわれることなく、形態変化も起こすことが確認された。更に、ポリエチレングリコール脂質の導入率を変化させることにより曇点の温度も変化することがわかった。
【０１７４】
よって、分子構造における疎水性部位、親水性部位のバランスの設計、ポリエチレングリコール脂質の導入率を変化させることによって、所望の温度で、そのベシクルのサイズや形状を変化させる分子集合体の構築が可能である。
【０１７５】
そして、ポリエチレングリコール脂質を導入した温度応答性デンドロン脂質集合体は、体温付近の曇点以上でその形状が劇的に変化し、ポリエチレングリコール脂質の効果によって高い安定性と生体適合性とを併せもつベシクルが構築できた。この、PEG-Chol複合型デンドロン脂質ベシクルは、細胞内へのデリバリー機能を温度によって制御できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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