(57)【要約】【課題】正常皮膚細胞に対するリコピンの新たな用途を提供することである。また、正常皮膚細胞に対して高い活性を有する新規なＮｒｆ２活性化剤、及びＮｒｆ２経路の活性化に基づく種々の新規な生理活性剤を提供する。また、これらの生理活性剤を含有する皮膚外用剤及び機能性食品を提供する。【解決手段】リコピンを有効成分とする正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤及び正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤と、当該正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤、又は正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤を含有する皮膚外用剤及び機能性食品。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リコピンを有効成分とする正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤。
【請求項２】
リコピンを有効成分とする正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤。
【請求項３】
リコピンを有効成分とする正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤。
【請求項４】
請求項１に記載の正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、請求項２に記載の正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤、又は請求項３に記載の正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項５】
請求項１に記載の正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、請求項２に記載の正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤、又は請求項３に記載の正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤を含有する機能性食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のフリーラジカルや活性酸素（ＲＯＳ）といった酸化ストレス因子が増えると、癌、動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、肝機能障害、糖尿病などを引き起こすことが知られている。このような酸化ストレス因子に対する生体の防除機構として、転写因子であるＮｒｆ２（NF-E2 related factor-2）が関与していることが知られている（特許文献１参照）。非ストレス状態の細胞において、Ｎｒｆ２は通常、Ｋｅａｐ１（Kelch like ECH associated protein 1）によって、活性が抑制された状態で細胞質に存在する。一方、核内には、第二相異物代謝酵素や抗酸化タンパク質などをコードした抗酸化遺伝子が存在する。細胞が酸化ストレスにさらされると、Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との相互作用が減弱し、Ｎｒｆ２が核へと移行する。核内に移行したＮｒｆ２は小Ｍａｆ転写因子と複合体を形成し、抗酸化遺伝子のＡＲＥ領域（抗酸化剤応答配列；Antioxidant response element）に結合し、第二相異物代謝酵素や抗酸化タンパク質等の発現を亢進すると考えられている。
【０００３】
Ｎｒｆ２を活性化することによって、酸化ストレス等から細胞を保護し、各種の疾患に対して予防又は治療を行う種々の技術が知られている。
例えば、特許文献２には、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン、オルチプラズ、スルフォラン、クルクミン等のＮｒｆ２活性化物質を有効成分として含む角結膜障害の予防又は治療剤が開示されている。
特許文献３には、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトールを含むＮｒｆ２活性増強剤が開示されている。このＮｒｆ２活性増強剤によれば、皮膚線維芽細胞において過酸化水素による細胞死を抑制することができることが開示されている。また、特許文献３では、ホスファチジルセリン又はホスファチジルイノシトールによってＮｒｆ２が活性化されると、Ｎｒｆ２に発現制御される第二相酵素であるＨＯ−１、ＧＣＬＣの発現が増加されて、グルタチオンの生成が増加し、酸化ストレスから細胞が保護されると記載されており、神経細胞におけるグルタチオンの産生することが開示されている。
また、特許文献４には、１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２、ジエチルマレイン酸、ブロッコリー由来のスルフォラン、又はブナハリタケエキスを用いてＮｒｆ２を活性化することにより、マクロファージにおけるＦＰＮ１、ＨＯ−１、Ｎｒａｍｐ１の各遺伝子の発現が上昇することが記載されている。特許文献４には、Ｎｒｆ２活性化作用を有する化合物として多くの例示化合物のひとつとしてリコピンを挙げているが、具体的な作用については何ら開示されていない。
【０００４】
一方、カロチノイドには種々の生理活性があることが知られている。非特許文献１には、ある種のがんとカロチノイドとの関係について開示されており、ヒト乳がん細胞株と肝細胞がん細胞株において、リコピンが、ＡＲＥ領域に融合した各種のレポーター遺伝子の発現を亢進することが開示されている。
また、特許文献５には、リコピン又はその誘導体が乳癌細胞又は前立腺癌細胞の増殖を抑制することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２０８０３８号公報
【特許文献２】特開２００８−１１０９６２号公報
【特許文献３】特開２０１１−１６８５４１号公報
【特許文献４】特開２００９−１０７９７０号公報
【特許文献５】特表２００９−５１１５７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mol. Cancer Ther., 2005, Vol.4(1), pp177-186
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、カロチノイドの中でもリコピンの生理活性については未だに解明が続けられており、特に正常皮膚細胞に対する機能については、充分に解明されていない。
本発明の目的は、正常皮膚細胞に対するリコピンの新たな用途を提供することである。また、本発明の目的は、正常皮膚細胞に対して高い活性を有する新規なＮｒｆ２活性化剤、及びＮｒｆ２の活性化に基づく種々の新規な生理活性剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下のとおりである。
［１］  リコピンを有効成分とする正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤。
［２］  リコピンを有効成分とする正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤。
［３］  リコピンを有効成分とする正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤。
［４］  ［１］に記載の正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、［２］に記載の正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤、又は［３］に記載の正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤を含有する皮膚外用剤。
［５］  ［１］に記載の正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、［２］に記載の正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤、又は［３］に記載の正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤を含有する機能性食品。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、正常皮膚細胞に対するリコピンの新たな用途を提供することができる。また、本発明によれば、正常皮膚細胞に対して高い活性を有する新規なＮｒｆ２活性化剤、及びＮｒｆ２の活性化に基づく種々の新規な生理活性剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１にかかるヒト表皮角化細胞株での核内Ｎｒｆ２タンパク質量を確認したウェスタンブロットの結果を示す画像である。
【図２】実施例２にかかるヒト表皮角化細胞株でのＮＱＯ１遺伝子、ＨＯ−１遺伝子及びＧＣＬＣ遺伝子の発現を確認したリアルタイムＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３にかかるヒト表皮角化細胞株におけるグルタチオンの産生量を確認したグラフである。
【図４】実施例４にかかるヒト表皮角化細胞株におけるＨＯ−１タンパク質の産生量を確認したグラフである。
【図５】実施例５にかかるヒト表皮角化細胞株での過酸化水素による細胞死に対する抑制効果を確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤及び正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤は、それぞれ、正常皮膚細胞に対して適用されるリコピンを有効成分とした生理活性剤である。
即ち、正常皮膚細胞がリコピンと接触することにより、正常皮膚細胞においてＮｒｆ２が活性化すること、核内においてＮｒｆ２転写因子により制御されている各種の遺伝子の発現が亢進し、生体に対して所定の機能を有する物質、例えばグルタチオン及び／又はヘムオキシゲナーゼＩ（ＨＯ−１）の産生が正常皮膚細胞において増加すること、並びに、過酸化水素による細胞死の誘導が抑制されることが見出された。本発明は、このような新しい知見に基づくものである。
【００１２】
なお、本発明において正常皮膚細胞内で、Ｎｒｆ２が活性化している点、ＧＣＬＣ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子及びＮＱＯ１遺伝子の発現量が増加している点、グルタチオンの産生量が増加している点、ＨＯ−１タンパク質の産生量が増加している点が確認されていることから、上記のタンパク質だけではなく、Ｎｒｆ２によって活性化される他の抗酸化酵素、抗酸化タンパク質及び第二相異物代謝酵素等の発現も当然に増加しているであろうことは、本発明の開示から当業者に自明である。
【００１３】
ここで、正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤は、Ｎｒｆ２活性化作用に加えて、グルタチオン産生増加作用及びヘムオキシゲナーゼＩ産生増加作用の少なくとも一方を有してもよい。正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤は、グルタチオン産生増加作用に加えてＮｒｆ２活性化作用及びヘムオキシゲナーゼＩ産生増加作用の少なくとも一方を有していてもよい。正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤は、ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加作用に加えてＮｒｆ２活性化作用及びグルタチオン産生増加作用の少なくとも一方を有していてもよい。
【００１４】
本発明では、特に断らない限り、前記正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤、前記正常皮膚細胞用グルタチオン産生増加剤及び前記正常皮膚細胞用ヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤を「生理活性剤」と総称する。また、本発明では、Ｎｒｆ２の活性化を契機として発現が亢進又は産生量が増加しうる一群の遺伝子又はそのタンパク質により形成される一連の経路をＮｒｆ２経路と総称する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１５】
本発明にかかる生理活性剤において有効成分となるリコピン（場合によって、「リコペン（lycopene）」と称される場合がある）は、化学式Ｃ４０Ｈ５６（分子量５３６．８７）のカロチノイドであり、カロチノイドの一種カロチン類に属している。４７４ｎｍ（アセトン）に吸収極大を示す赤色色素である。
リコピンには、分子中央の共役二重結合のｃｉｓ−、ｔｒａｎｓ−の異性体も存在し、例えば、全ｔｒａｎｓ−、９−ｃｉｓ体と１３−ｃｉｓ体などが挙げられるが、本発明においては、これらのいずれであってもよい。
【００１６】
リコピンはそれを含有する天然物から分離・抽出されたリコピン含有オイルやリコピン含有ペーストとして、本発明の生理活性剤に含まれていてもよい。
リコピンは、天然においてはトマト、柿、スイカ、ピンクグレープフルーツに含まれており、上記のリコピン含有オイルはこれらの天然物から分離・抽出されたものであってもよい。製品での形態は、オイルタイプ、乳化液タイプ、ペーストタイプ、粉末タイプの４種類が知られている。
また、本発明で用いられるリコピンは、前記抽出物、また、更にこの抽出物を必要に応じて適宜精製したものでもよく、また、合成品であってもよい。
【００１７】
本発明におけるリコピンの特に好ましい形態としては、トマトパルプから抽出された脂溶性抽出物である。該トマトパルプから抽出された脂溶性抽出物は、当該脂溶性抽出物を含む組成物中における安定性、品質、生産性の点から特に好ましい。
ここで、トマトパルプから抽出された脂溶性抽出物とは、トマトを粉砕して得られた粉砕物を遠心分離して得られたパルプ状の固形物から、油性溶剤を用いて抽出された抽出物を意味する。
脂溶性抽出物であるリコピンとしては、リコピン含有オイル又はペーストとして広く市販されているトマト抽出物を用いることができ、例えば、サンブライト（株）より販売されているＬｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ  １５％、Ｌｙｃ−Ｏ−Ｍａｔｏ  ６％、協和発酵工業（株）より販売されているリコピン１８等が挙げられる。
【００１８】
本発明にかかる生理活性剤の投与量としては、剤型等によって異なるが、一般に、１日あたり、体重ｋｇあたり、有効成分として０．０１ｍｇ〜１００００ｍｇとすることができ、好ましくは０．２ｍｇ〜５０００ｍｇとすることができる。
本発明にかかる生理活性剤の投与経路としては、有効成分を直接正常皮膚細胞へ投与可能な局所投与、具体的には経皮投与が好ましいが、これに限定されず、経口投与であってもよい。経口投与であっても、本発明の生理活性剤は、正常皮膚細胞内のＮｒｆ２活性化、グルタチオン産生増加、及び／又はヘムオキシゲナーゼＩ産生増加を奏し得る。
【００１９】
本発明にかかる生理活性剤は、正常皮膚細胞において、Ｎｒｆ２活性化作用、グルタチオン産生増加作用、又はＨＯ−１産生増加作用を有する。
本発明における正常皮膚細胞とは、癌化していない表皮細胞のことを指す。表皮細胞には、ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、α樹状細胞、メルケル細胞が含まれるが、本発明においては、ケラチノサイトが含まれていればよい。
【００２０】
本発明にかかる正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤は、正常皮膚細胞においてＮｒｆ２活性化作用を奏することにより、例えば、正常皮膚細胞におけるＮｒｆ２経路の構成要素であるグルタチオン及びヘムオキシゲナーゼＩの産生を増加することができる。
また、前記正常皮膚細胞用Ｎｒｆ２活性化剤により、皮膚細胞における酸化ストレスが低減されて皮膚の老化現象を予防することが期待できる。また、皮膚細胞において抗炎症作用が生じ、肌荒れなどの皮膚トラブルを早期に緩和することが期待できる。
【００２１】
本発明にかかるグルタチオン産生増加剤は、正常皮膚細胞において、Ｎｒｆ２経路を介してグルタチオンの産生量を増加させることにより、ターンオーバーの乱れの改善、にきびの発生抑制又は症状緩和、しわの発生抑制又は改善、美白、くすみの改善、抗アレルギー等の肌の改善効果も期待できる。
【００２２】
本発明にかかるヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤は、正常皮膚細胞において、Ｎｒｆ２経路を介してヘムオキシゲナーゼＩの産生を増加させることにより、ターンオーバーの乱れの改善、にきびの発生抑制又は症状緩和、しわの発生抑制又は改善、美白、くすみの改善、抗アレルギー等の肌の改善効果も期待できる。
【００２３】
本発明におけるＮｒｆ２活性化剤とは、転写因子であるＮｒｆ２を活性化させる作用を有する。Ｎｒｆ２の活性化とは、Ｎｒｆ２と複合体を形成するＫｅａｐ１タンパク質から、Ｎｒｆ２を解離させることで、Ｎｒｆ２が核内へ移行し、第二相異物代謝酵素や抗酸化タンパク質等の遺伝子発現を誘導することをいう。
【００２４】
本発明におけるＮｒｆ２活性化剤は、Ｎｒｆ２転写因子を活性化して、Ｎｒｆ２により制御されているＮｒｆ２経路を構成する一連の遺伝子群を発現させることができる。Ｎｒｆ２活性化剤によって発現し得る遺伝子群としては、例えば、次のものが挙げられる：
thioredoxin reductase 1 (TXNRD1)、
glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit (GCLC)、
glutamate-cysteine ligase, modifier subunit (GCLM)、
glutathione reductase (GSR)、
glutathione S-transferase pi 1 (GSTP1)、
glutathione S-transferase A 1 (GSTA1)、
glutathione peroxidase (GPx) 、
γ-glutamylcysteine synthetase(γ-GCS)
heme oxygenase (decycling) 1 (HMOX1) 、
epoxide hydrolase 1, microsomal (xenobiotic) (EPHX1) 、
NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 (NQO1) 、
UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A6 (UGT1A6) 、
UDP glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide A1(UGT1A1) 、
ferritin、
superoxide dismutase (SOD) 、
catalase、
glutathione reductase （GR）、
glucose-6-phosphate dehydrogenase （G6PD）、
sulfiredoxin（Srxn1）、及び
xenobiotic carbonyl compounds（AFAR1）。
【００２５】
本発明におけるＮｒｆ２活性化剤は、好ましくは、ＨＯ−１遺伝子、ＧＣＬＣ遺伝子及びＮＱＯ１遺伝子の正常皮膚細胞内の発現量を顕著に増加する。また、本発明におけるＮｒｆ２活性化剤は、グルタチオン及びヘムオキシゲナーゼＩの正常皮膚細胞内のタンパク質の量を顕著に増加させる。
【００２６】
本発明における生理活性化剤を正常皮膚細胞と接触させるときのリコピン量は、細胞タンパク量１ｇ当たり０．０１〜１００００００ｍｇが好ましく、０．１〜１０００００ｍｇがより好ましく、１〜１００００ｍｇが特に好ましい。
また細胞１万個当たりの場合、リコピン量は０．００１〜１０００μｇが好ましく、０．００１〜１００μｇがより好ましく、特に好ましくは０．０１〜１０μｇである。
【００２７】
本発明にかかるグルタチオン産生増加剤は、驚くべきことに正常皮膚細胞中のグルタチオン量を約２倍に増加させる。一般的に細胞内のグルタチオン産生量を増加させることは困難であるため、今までにグルタチオン産生量を約２倍に向上させた例は存在しない。そのため、本発明にかかるグルタチオン産生増加剤は優れた効果を有するといえる。
【００２８】
本発明にかかるヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤は、驚くべきことに正常皮膚細胞中のヘムオキシゲナーゼＩの量を約４倍に増加させる。一般的に細胞内のヘムオキシゲナーゼＩ産生量を増加させることは困難であるため、今までにヘムオキシゲナーゼＩ産生量を約４倍に向上させた例は存在しない。そのため、本発明にかかるヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤は優れた効果を有するといえる。
【００２９】
本発明にかかる生理活性剤を使用する際の形態には特に制限はなく、有効成分の他、医薬として許容可能な担体、必要に応じた他の任意成分とを含む組成物の形態としてもよい。前記組成物の形態としては、オイル組成物、乳化組成物、粉末組成物などが挙げられる。乳化組成物としては水中油型の乳化組成物であることが好ましい。粉末組成物は、例えば、乳化組成物を乾燥させることにより調製することができる。
本発明にかかる生理活性剤は、有効成分を正常皮膚細胞へ直接的に投与可能な皮膚外用組成物の形態とすることが好ましいが、これに限定されない。
本発明にかかる生理活性剤を組成物の形態で用いる場合、当該組成物におけるリコピンの含有量は、剤型によって異なるが、一般に組成物の全質量に対して、好ましくは０．０００００００１質量％〜５質量％であり、より好ましくは０．００００００１質量％〜０．２５質量％であり、特に好ましくは０．０００００１質量％〜０．０２５質量％である。
【００３０】
前記他の成分は、本発明の組成物の形態、目的などに応じて適宜選択することができる。他の成分の好適な例としては、例えば、機能性油性成分、乳化剤、その他の添加成分などが挙げられる。
【００３１】
（機能性油性成分）
機能性油性成分としては、水性媒体に溶解せず、油性媒体に溶解する油溶性成分であれば、特に限定はなく、目的に応じた物性や機能性を有するものを適宜選択して使用することができる。該他の油性成分としては、通常、紫外線吸収剤、抗炎症剤、保湿剤、毛髪保護剤、美白剤、抗シミ剤、細胞賦活剤、エモリエント剤、角質溶解剤、帯電防止剤、脂溶性ビタミン類、メタボリックシンドローム改善剤、降圧剤、鎮静剤などとして使用されているものが挙げられる。
ここで、機能性油性成分とは、生物体内に存在した場合に生体において所望の生理学的作用の発揮が期待され得る油性成分を意味する。
【００３２】
機能性油性成分の例としては、天然型セラミド類、スフィンゴ糖脂質などの糖修飾セラミドなどセラミド及びセラミド類縁体を含むセラミド類、オリーブ油、ツバキ油、マカデミアナッツ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂類；流動パラフィン、パラフィン、ワセリン、セレシン、マイクロクリスタリンワックス、スクワランなどの炭化水素；カルナウバロウ、キャンデリラロウ、ホホバ油、ミツロウ、ラノリンなどのロウ類；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸２−オクチルドデシル、２−エチルヘキサン酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリルなどのエステル類；パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸などの脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノールなどの高級アルコール類；メチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサンなどのシリコーン油；グリセリンの脂肪酸エステル類；ビタミンＥ(トコフェロール）類、ビタミンＡ類、ビタミンＤ類等の脂溶性ビタミン；その他、高分子類、他のカロチノイド類などの油溶性色素類、油溶性蛋白質などを挙げることができる。また、それらの混合物である各種の植物由来油、動物由来油も含まれる。
【００３３】
（乳化剤）
本発明にかかる皮膚外用組成物を乳化組成物として構成する場合などにおいては、乳化剤を含有することが好ましい。
【００３４】
本発明に適用しうる乳化剤としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤のいずれであってもよい。
また、本発明における乳化剤は、乳化力の観点から、ＨＬＢが１０以上であることが好ましく、１２以上が更に好ましい。ＨＬＢが低すぎると、乳化力が不十分となることがある。なお、抑泡効果の観点からＨＬＢ＝５以上１０未満の乳化剤を併用してもよい。
ここで、ＨＬＢは、通常界面活性剤の分野で使用される親水性−疎水性のバランスで、通常用いる計算式、例えば川上式等が使用できる。川上式を次に示す。
ＨＬＢ＝７＋１１．７ｌｏｇ（Ｍｗ／Ｍ０）
ここで、Ｍｗは親水基の分子量、Ｍ０は疎水基の分子量である。
また、カタログ等に記載されているＨＬＢの数値を使用してもよい。
また、上記の式からも分かるように、ＨＬＢの加成性を利用して、任意のＨＬＢ値の乳化剤を得ることができる。
【００３５】
乳化剤の中でも、低刺激性であること、環境への影響が少ないこと等から、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤の例としては、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセリド、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどが挙げられる。
【００３６】
更に、本発明における乳化剤として、レシチンなどのリン脂質を含有してもよい。
本発明に用いうるリン脂質は、グリセリン骨格と脂肪酸残基及びリン酸残基を必須構成成分とし、これに、塩基や多価アルコール等が結合したもので、レシチンとも称されるものである。リン脂質は、分子内に親水基と疎水基を有しているため、従来から、食品、医薬品、化粧品分野で、広く乳化剤として使用されている。
【００３７】
産業的にはレシチン純度６０％以上のものがレシチンとして利用されており、本発明でも利用できるが、微細な油滴粒径の形成及び機能性油性成分の安定性の観点から、好ましくは一般に高純度レシチンと称されるものであり、これはレシチン純度が８０％以上、より好ましくは９０％以上のものである。
【００３８】
リン脂質としては、植物、動物及び微生物の生体から抽出分離された従来公知の各種のものを挙げることができる。
このようなリン脂質の具体例としては、例えば、大豆、トウモロコシ、落花生、ナタネ、麦等の植物や、卵黄、牛等の動物及び大腸菌等の微生物等から由来する各種レシチンを挙げることができる。
このようなレシチンを化合物名で例示すると、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルメチルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ビスホスアチジン酸、ジホスファチジルグリセリン（カルジオリピン）等のグリセロレシチン；スフィンゴミエリン等のスフィンゴレシチン等を挙げることができる。
また、本発明においては、上記の高純度レシチン以外にも、水素添加レシチン、酵素分解レシチン、酵素分解水素添加レシチン、ヒドロキシレシチン等を使用することができる。本発明で用いることができるこれらのレシチンは、単独又は複数種の混合物の形態で用いることができる。
【００３９】
（その他の添加成分）
上記成分の他、食品、化粧品等の分野において通常用いられる添加成分を、本発明の組成物に、その形態に応じて適宜含有させてもよい。他の添加成分は、その特性によって、油溶性又は水溶性の添加成分として、本発明の組成物に含有させることができる。
【００４０】
例えば、その他の添加成分としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；グルコース、果糖、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ペクチン、カッパーカラギーナン、ローカストビーンガム、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアガム、キサンタンガム、カラヤガム、タマリンド種子多糖、アラビアガム、トラガカントガム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デキストリン等の単糖類又は多糖類；ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクトース、マルトトリイトール、キシリトールなどの糖アルコール；塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムなどの無機塩；カゼイン、アルブミン、メチル化コラーゲン、加水分解コラーゲン、水溶性コラーゲン、ゼラチン等の分子量５０００超のタンパク質；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリン等のアミノ酸及びそれらの誘導体；カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、酸化エチレン・酸化プロピレンブロック共重合体等の合成高分子；ヒドロキシエチルセルロース・メチルセルロース等の水溶性セルロース誘導体；フラボノイド類（カテキン、アントシアニン、フラボン、イソフラボン、フラバン、フラバノン、ルチン）、アスコルビン酸又はその誘導体（アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウム、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウム、硫酸アスコルビル、硫酸アスコルビル２ナトリウム塩、及びアスコルビル−２−グルコシド等）、トコトリエノール及びその誘導体、フェノール酸類（クロロゲン酸、エラグ酸、没食子酸、没食子酸プロピル）、リグナン類、クルクミン類、クマリン類、プテロスチルベン等を含むヒドロキシスチルベン、などを挙げることができ、その機能に基づいて、例えば機能性成分、賦形剤、粘度調整剤、ラジカル捕捉剤などとして含んでもよい。
その他、本発明においては、例えば、種々の薬効成分、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、着色剤など、通常、その用途で使用される他の添加物を併用することができる。
【００４１】
本発明にかかるＮｒｆ２活性化剤、グルタチオン産生増加剤、及びヘムオキシゲナーゼＩ産生増加剤は、それぞれ、正常皮膚細胞において、Ｎｒｆ２活性化作用、グルタチオン産生増加作用、及びヘムオキシゲナーゼＩ産生増加作用を有するので、前記生理活性剤は、Ｎｒｆ２経路の活性化に関連する正常皮膚における疾患の治療に用いることができ、本発明は、前記生理活性剤を適用することを含む正常皮膚の状態の維持又は改善方法も包含する。
前記生理活性剤により正常皮膚の状態の維持又は改善が期待される正常皮膚の症状としては、にきび、しわ、しみ、くすみ、肌荒れ、アレルギー等が挙げられる。ここで、「状態維持又は改善」とは、前記生理活性剤の適用前後において、各症状の進行が抑制又は停止すること、又は各症状が緩和することを意味する。各症状の進行の抑制若しくは停止、又は症状の緩和については、各症状において通常用いられる評価に基づいて評価すればよい。
正常皮膚の状態の維持又は症状改善方法における前記生理活性剤に関する事項は、前記生理活性剤について記述した事項をそのまま適用する。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００４３】
［実施例１］
ＨａＣａＴ細胞株（ヒト表皮角化細胞株、ＤＫＦＺ，Ｇｅｒｍａｎｙより購入、以下同じ）を、１０v/v％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。ＤＭＳＯに溶解したリコピン（和光社あるいはサンブライト社）１０ｍＭ溶液を最終濃度０．１質量％となるように添加したＤＭＥＭ培地に置換し、３７℃にて５％ＣＯ２下で５時間培養し、その後、常法により細胞を回収した。
リコピンの添加によるＨａＣａＴ細胞でのＮｒｆ２の核移行を、ウェスタンブロッティング法を用いて以下のように確認した。
【００４４】
回収した細胞から、Nuclear/Cytosol Fractionation Kit（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社）を用いて核タンパクを抽出した。得られたタンパク質（１０μｇ）をＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって分離し、次いでＰＶＤＦ膜に転写した。５質量％スキムミルク入りＴＰＢＳバッファーにて室温、１時間ブロッキング反応させ洗浄した後、一次抗体（抗Ｎｒｆ２抗体（ａｂｃａｍ  ａｂ６２３５２）又は抗ｌａｍｉｎＡ抗体（ａｂｃａｍ  ａｂ２６３００））をそれぞれ１：１０００希釈にて室温、２時間反応させた。その後二次抗体（抗ウサギＩｇ抗体（ＨＲＰ−ＬＩＮＫＥＤ  ＷＨＯＬＥ  ＡＢ  ＤＯＮＫＥＹ（ＧＥヘルスケア社））を１：５０００希釈となるように添加して、１時間反応させた。ウェスタンブロッティングの結果は、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ（ＧＥヘルスケア社）を使用して可視化した。結果を図１に示す。
【００４５】
図１に示されるように、リコピンの添加によってＨａＣａＴ細胞株では、核内のＮｒｆ２タンパク質の量が増加した。このことから、リコピンには、正常皮膚細胞においてＮｒｆ２活性化作用があることがわかった。
【００４６】
［実施例２］
ＨａＣａＴ細胞株を播種し、１０v/v％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。ＤＭＳＯに溶解したリコピン（和光社あるいはサンブライト社）１０ｍＭ溶液を最終濃度０．１質量％となるように添加したＤＭＥＭ培地に置換し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４時間培養し、その後、常法により細胞を回収した。
回収した細胞から、FastPure RNA kit（ＴａＫａＲａ社）を用いて細胞内のＲＮＡを回収し、PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time（ＴａＫａＲａ社）を用いてｃＤＮＡを調製した。
得られたｃＤＮＡに対して、ＧＣＬＣ遺伝子、ＨＯ−１遺伝子及びＮＱＯ１遺伝子の発現量を、SYBR Premix Ex Taq II Tli RNaseH Plus（ＴａＫａＲａ社）を用い、Ｍｘ３０００Ｐ（ストラタジーン）により解析した。ハウスキーピング遺伝子としてβアクチン遺伝子の発現量により補正を行った。
【００４７】
プライマーは、ＧＣＬＣ遺伝子にはＧＣＬＣ  ＨＡ１６４５１６（TaKaRa Perfect Real Time Primer）を使用し、ＨＯ−１遺伝子には、ＨＭＯＸ１  ＨＡ１０９３５６（TaKaRa Perfect Real Time Primer）を使用し、ＮＱＯ１遺伝子には、ＮＱＯ１ ＨＡ１６６２０３（TaKaRa Perfect Real Time Primer）を使用した。βアクチン遺伝子には、ＨＡ０６７８０３（TaKaRa Perfect Real Time Primer）を使用した。
ＰＣＲのサイクリング条件は、９５℃で３０秒間の初期変性後、次いで９５℃で５秒間、アニーリング温度６０℃で３０秒間を１サイクルとして、４０サイクル行った。結果を図２に示す。
【００４８】
図２に示されるように、リコピンの添加によって、ＨａＣａＴ細胞株ではＨＯ−１遺伝子、ＧＣＬＣ遺伝子及びＮＱＯ１遺伝子それぞれのｍＲＮＡが増加した。このことから、正常皮膚細胞において、Ｎｒｆ２経路の下流にあるＮＱＯ１遺伝子、ＨＯ−１遺伝子及びＧＣＬＣ遺伝子の発現は、リコピンの添加により増加することがわかった。
【００４９】
［実施例３］
ＨａＣａＴ細胞株を播種し、１０v/v％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。ＤＭＳＯに溶解したリコピン（和光社あるいはサンブライト社）１０ｍＭ溶液を最終濃度０．１質量％となるように添加したＤＭＥＭ培地に置換し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養し、その後、常法により細胞を回収した。
回収後の細胞におけるグルタチオン量を、Total Glutatione Quantification Kit（同仁化学社）を用いて測定した。また、細胞中のタンパク質の量を、Protein Quantification Kit-Rapid（同仁化学社）を用いて測定し、タンパク質当たりのグルタチオン量を算出した。結果を図３に示す。
【００５０】
図３において、リコピンを添加した細胞におけるタンパク質の量は、コントロールを１００としたときの割合で示した。コントロール（図３左）は、ＤＭＳＯに溶解したリコピンの代わりに、ＤＭＳＯを０．１ｖ／ｖ％の濃度で添加したＤＭＥＭ培地で培養した細胞におけるタンパク質の量を意味する。
図３に示されるように、リコピンの添加によって、ＨａＣａＴ細胞株ではグルタチオンのタンパク質の量がコントロールに比べて約２００％増加した。これは驚くべき結果である。このことから、リコピンの添加により、正常皮膚細胞においてグルタチオンの産生量が顕著に増加することが判明した。
【００５１】
実施例１〜実施例３の結果から、本発明の生理活性剤は、正常皮膚細胞において、Ｎｒｆ２活性化作用、グルタチオン産生増加作用及びヘムオキシゲナーゼＩ産生増加作用を効果的に発揮することができることが明らかとなった。
特に、本発明の生理活性剤におけるグルタチオン産生増加作用は、がん細胞などの他の細胞における産生増加率よりも正常皮膚細胞における産生増加率の方が顕著に高く、正常皮膚細胞において特に有効であることが明らかとなった。
【００５２】
［実施例４］
ＨａＣａＴ細胞株を、１０v/v％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。ＤＭＳＯに溶解したリコピン（和光社あるいはサンブライト社）１０ｍＭ溶液を最終濃度０．１質量％となるように添加したＤＭＥＭ培地に置換し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４時間培養し、その後、常法により細胞を回収した。
回収後の細胞におけるＨＯ−１の量を、ＨＯ−１（ｈｕｍａｎ）、ＥＩＡ  Ｋｉｔ（enzolifescience社）を用いて測定した。また、細胞中のタンパク質の量を、Protein Quantification Kit-Rapid（同仁化学社）を用いて測定し、タンパク質量当たりのＨＯ−１量を算出した。結果を図４に示す。リコピンを添加した細胞におけるタンパク質の量は、コントロールを１００としたときの割合で示した。コントロール（図４左）は、ＤＭＳＯに溶解したリコピンの代わりに、ＤＭＳＯを０．１ｖ／ｖ％の濃度で添加したＤＭＥＭ培地で培養した細胞におけるタンパク質の量を意味する。
図４に示されるように、リコピンの添加により、正常皮膚細胞においてＨＯ−１タンパク質の量も増加することがわかった。
【００５３】
実施例４の結果から、本発明の生理活性剤におけるヘムオキシゲナーゼＩ産生増加作用は、がん細胞などの他の細胞における産生増加率よりも正常皮膚細胞における産生増加率の方が非常に高く、正常皮膚細胞において特に有効であることが明らかとなった。
【００５４】
［実施例５］
ＨａＣａＴ細胞株を、１０v/v％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、ＤＭＳＯに溶解したリコピン（和光社あるいはサンブライト社）１０ｍＭ溶液を最終濃度０．１質量％となるように添加したＤＭＥＭ培地に置換し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２時間インキュベートした。なお、コントロールはＤＭＳＯ溶液０．１v/v％添加した。その後、過酸化水素０．２５mＭ となるよう添加したＤＭＥＭ培地に置換し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。
ＰＢＳで２回洗浄後、ＭＴＴ試薬（ＤＯＪＩＮＤＯ）５ｍｇを１ｍｌＰＢＳに溶解した溶液に置換し、３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートした。その後、ＤＭＳＯ：ＰＢＳ＝４：１の溶液を各ｗｅｌｌに１００μｌずつ添加し、ソニケーションを軽く行い、５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。リコピンを添加した群の吸光度を、リコピン及び過酸化水素を添加しない対照群での吸光度の値を１００とした時の割合で示した。結果を図５に示す。
図５に示されるように、過酸化水素の添加により吸光度が２０％低下し、正常皮膚細胞において細胞死が誘導されることがわかった（図５中央）。このような過酸化水素の添加による正常皮膚細胞の細胞死は、リコピンを添加することによって抑制されることがわかった（図５右）。この結果は、正常皮膚細胞が、リコピンのＮｒｆ２経路亢進作用によって酸化ストレスから保護されることを示している。
【００５５】
［実施例６］
以下各処方に従って、それぞれ常法により、皮膚外用組成物及び食品を調製する。以下の数値は各処方の全質量に対する質量％を意味する。（リコピン量：０．１％〜５０％）とは、リコピン量として０．１％〜５０％の濃度のトマト抽出液を任意に用いることができることを意味する。
【００５６】
（１）化粧料Ａ
（成分）                                              （％）
トマト抽出液（リコピン量：０．１％〜５０％）            １．０
グリセリン                                              ５．０
１，３−ブチレングリコール                              ６．５
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル      １．２
エタノール                                              ３．０
カルボキシビニルポリマー                                ０．２
クエン酸ナトリウム                                      １．０
コラーゲン                                              １．０
パラオキシ安息香酸メチル                                ０．０５
Ｎ−アセチルヒドロキシプロリン                          １．０
精製水                                                    残量
【００５７】
（２）化粧料Ｂ
（成分）                                              （％）
トマト抽出液（リコピン量：０．１％〜５０％）        ０．００１
グリセリン                                              ５．０
１，３−ブチレングリコール                              ６．５
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル      １．２
エタノール                                              ３．０
カルボキシビニルポリマー                                ０．２
クエン酸ナトリウム                                      １．０
コラーゲン                                              １．０
パラオキシ安息香酸メチル                                ０．０５
Ｎ−アセチルヒドロキシプロリン                          １．０
精製水                                                    残量
【００５８】
（３）乳液Ａ
（成分）                                              （％）
トマト抽出物（リコピン量：０．１％〜５０％）            １．０
スクワラン                                              ８．０
ホホバ油                                                ７．０
パラアミノ安息香酸グリセリル                            １．０
セチルアルコール                                        １．５
グリセリンモノステアレート                              ２．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル                        ３．０
ポリオキシエチレンソオルビタンモノオレート              ２．０
１，３−ブチレングリコール                              １．０
グリセリン                                              ２．０
メチルパラベン                                          ０．４
コラーゲン                                              １．０
クエン酸ナトリウム                                      １．０
香料                                                      適量
精製水                                                    残量
【００５９】
（４）乳液Ｂ
（成分）                                              （％）
トマト抽出物（リコピン量：０．１％〜５０％）        ０．００１
スクワラン                                              ８．０
ホホバ油                                                ７．０
パラアミノ安息香酸グリセリル                            １．０
セチルアルコール                                        １．５
グリセリンモノステアレート                              ２．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル                        ３．０
ポリオキシエチレンソオルビタンモノオレート              ２．０
１，３−ブチレングリコール                              １．０
グリセリン                                              ２．０
メチルパラベン                                          ０．４
コラーゲン                                              １．０
クエン酸ナトリウム                                      １．０
香料                                                      適量
精製水                                                    残量
【００６０】
（５）クリーム
（成分）                                              （％）
リコピン（トマト抽出由来）                              ０．５
セトステアリルアルコール                                ３．０
グリセリン脂肪酸エステル                                ２．０
モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン      １．０
モノステアリン酸ソルビタン                              １．０
Ｎ−ステアロイル−Ｎ−メチルタウリンナトリウム          ０．５
ワセリン                                                ５．０
ジメチルポリシロキサン（１００ｍＰａ・ｓ）              ３．０
トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル                  ２０．０
乳酸                                                    １．０
ジプロピレングリコール                                １０．０
クエン酸ナトリウム                                      ０．５
酸化チタン                                              ０．１
香料                                                      適量
エデト酸２ナトリウム                                    ０．０３
パラオキシ安息香酸エチル                                ０．０５
精製水                                                    残量
【００６１】
（６）錠剤
（成分）                                                （％）
トマト抽出物（リコピン量：０．１％〜５０％）              １０．０
乳糖                                                      ５６．０
コーンスターチ                                            ２８．０
グアーガム                                                  １．０
ショ糖脂肪酸エステル                                        ５．０
【００６２】
（７）美白用飲料
（成分）                                                  （％）
トマト抽出物（リコピン量：０．１％〜５０％）              １０．０
果糖ブトウ糖液糖                                          １５．０
クエン酸                                                  １０．０
ビタミンＣ                                                  ５．０
香料                                                        １．０
色素                                                        １．０
精製水                                                      残余
【００６３】
（８）ソフトカプセル
（成分）                                                  （％）
トマト抽出物（リコピン量：０．１％〜５０％）              １０．０
食用大豆油                                                ３３．０
グリセリン脂肪酸エステル                                  １２．０
ミツロウ                                                    ５．０
被包剤（ゼラチンカプセル）                                  残余
【図１】
2013126965.tif 000003
【図２】
2013126965.tif 000004
【図３】
2013126965.tif 000005
【図４】
2013126965.tif 000006
【図５】
2013126965.tif 000007