(57)【要約】【課題】検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査する際、短時間に正確に水の検査を行うことができる水検査方法及び水検査システムを提供する。【解決手段】検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査するとき、検査対象の水を塗沫した寒天培地の温度を恒温槽で一定温度に保持する。前記恒温槽内で前記寒天培地を一定温度で保持した後、計測装置を用いて前記寒天培地の表面の盛り上がりを計測する。前記盛り上がりの計測結果に基いて、判定装置が微生物を含む水か否かの判定をする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査する水検査方法であって、
検査対象の水を塗沫した寒天培地の温度を恒温槽内で一定温度に保持する工程と、
前記恒温槽を一定温度で保持した後、計測装置を用いて前記寒天培地の表面の盛り上がりの高さを計測する工程と、
前記盛り上がりの計測結果に基いて、判定装置が微生物を含む水か否かの判定をする工程と、を有する水検査方法。
【請求項２】
前記計測装置は、デジタルホログラフィ顕微鏡である、請求項１に記載の水検査方法。
【請求項３】
前記計測装置は、０．２μｍ〜５μｍの盛り上がりの高さを計測する、請求項１または２に記載の水検査方法。
【請求項４】
前記計測装置は、前記寒天培地の表面の盛り上がり分布を求める、請求項１〜３のいずれか１項に記載の水検査方法。
【請求項５】
前記計測装置による計測は、予め定められた時間間隔毎に行われ、前記判定装置は、前記寒天培地の同じ位置における、前記時間間隔内の盛り上がり量に基いて前記判定をする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の水検査方法。
【請求項６】
前記一定温度は、２０〜４０℃であり、請求項１〜５のいずれか１項に記載の水検査方法。
【請求項７】
検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査する水検査システムであって、
検査対象の水を塗沫した寒天培地の温度を一定温度に保持する恒温槽と、
前記寒天培地を前記恒温槽で一定温度に保持した後、前記寒天培地の表面の盛り上がりの高さを計測する計測装置と、
前記盛り上がりの計測結果に基いて、微生物を含む水か否かの判定をする判定装置と、を有することを特徴とする水検査システム。
【請求項８】
前記計測装置は、デジタルホログラフィ顕微鏡である、請求項７に記載の水検査システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査する水検査方法及び水検査システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
貨物船やタンカー等の船舶においては、荷揚港で積荷や原油等を降ろした後、再度積荷港に向けて航行する際、航行中の船舶のバランスを取るため、所定のタンク内にバラスト水と呼ばれる海水を貯留する。バラスト水は、一般に、荷揚港で積荷を降ろす際に海水を汲み上げタンク内に貯留されると共に、積荷港で積荷を積む際にタンクから排出される。
荷揚港で海水から取水するバラスト水には、コレラ菌や大腸菌などの有害な微生物が混入している場合がある。積荷港でバラスト水が排出されると、有害な微生物が積荷港付近の海域を汚染することになる。これらの有害な微生物は、環境条件によっては、積荷港付近の海域で増殖し、その海域に本来生息する生物を死滅させるなどの大きな被害をもたらすことがある。このため、バラスト水に有害な微生物が含まれるか否かを検査することを、港湾の管理事業体が行っている。
【０００３】
バラスト水に有害な微生物を含んでいるか否かを検査する検査方法として、従来より、培養法、染色法及びマイクロコロニー法が用いられている。
例えば、培養法では、シャーレの上に形成された寒天培地に検査対象のバラスト水を塗沫し、約１日、一定の温度条件で放置させることにより寒天培地上で増殖して形成された微生物のコロニーを判別し、コロニーの数を計数することにより、バラスト水の上記検査を行う。
染色法では、微生物の呼吸活性に反応する試薬をバラスト水に含ませる。この試薬を取り込んだ微生物が呼吸することにより微生物が染色される。この染色した微生物を顕微鏡等により係数することにより、バラスト水の上記検査を行う。
また、マイクロコロニー法では、培養法と同様に、シャーレの上に形成された寒天培地に検査対象のバラスト水を塗沫し、一定の温度条件で一定時間放置した後、微小なコロニーの成長を微視的な段階で調べることにより、バラスト水の上記検査を行う。
例えば、大腸菌群及び大腸菌がバラスト水に含まれるか否かを検査する場合、塗末平板法を用いる。具体的には、寒天培地として培地ＭＩmediumが用いられ、リン酸塩緩衝液等を含んだ希釈液を用いてバラスト水が希釈される。すなわち、希釈されたバラスト水が培地ＭＩmediumの形成された平板に塗沫される。培養は、３３〜４７℃の温度条件下で１８〜２４時間の極めて長い時間放置されることで行われる。なお、培地ＭＩmediumは、プロテオースペプトンＮｏ．３、酵母エキス、β-Ｄ-乳酸等と寒天（アガー）とを含む公知の寒天培地である。そして、大腸菌のコロニー（集落）の数は、波長３６６ｎｍの紫外線を培地に照射することにより、大腸菌が発する青色の領域を計数することで得られる。
なお、２００４年には、国際海事機構（ＩＭＯ）でバラスト水管理条約が採択されて以来、船舶バラスト水問題（バラスト水による水生生物拡散・広域化問題）の解決策であるバラスト水処理技術の開発が進んでいる。それに伴い、バラスト水中微生物を迅速かつ簡便に検出する方法が求められている。
【０００４】
例えば、上記マイクロコロニー法の一例として、シャーレ上に形成された寒天培地に検査対象の水を塗沫し、大腸菌の増殖によって形成されるマイクロコロニーをＣＣＤカメラで画像として捕らえて、マイクロコロニーを識別する方法が知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「微生物の迅速検査技術」，野田直広、浅野貴正、北出雄二郎，富士時法，Ｖｏｌ．７７  Ｎｏ．２，２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記「微生物の迅速検査技術」では、コロニーを自動検出することができ、従来の寒天培地に比べて迅速に検査することができるが、よりさらに迅速な検査を行うことが、今後の水の検査には求められている。特に、バラスト水を海水に排出してよいか否かを判定するために行うバラスト水の検査には、港への停泊時間によって増える停泊使用料の点から、迅速に行われることが求められる。
また、染色法では、検査対象の水に含まれる夾雑物により、微生物以外の染色された物質も誤ってカウントされるため、正確な測定が難しい。
【０００７】
そこで、本発明は、検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査する際、短時間に正確に水の検査を行うことができる水検査方法及び水検査システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査する水検査方法である。当該方法は、
検査対象の水を塗沫した寒天培地の温度を恒温槽内で一定温度に保持する工程と、
前記恒温槽を一定温度で保持した後、計測装置を用いて前記寒天培地の表面の盛り上がりの高さを計測する工程と、
前記盛り上がりの計測結果に基いて、判定装置が微生物を含む水か否かの判定をする工程と、を有する。
【０００９】
その際、前記計測装置は、デジタルホログラフィ顕微鏡であることが好ましい。
【００１０】
また、前記計測装置は、０．２μｍ〜５μｍの盛り上がりの高さを計測することが好ましい。
【００１１】
前記計測装置は、前記寒天培地の表面の盛り上がり分布を求めることが好ましい。
【００１２】
前記計測装置による計測は、予め定められた時間間隔毎に行われ、前記判定装置は、前記寒天培地の同じ位置における、前記時間間隔内の盛り上がり量に基いて前記判定をすることが好ましい。
【００１３】
前記一定温度は、２０〜４０℃であることが好ましい。
【００１４】
本発明の他の一態様は、検査対象の水に微生物が含まれるか否かを検査する水検査システムである。当該システムは、
検査対象の水を塗沫した寒天培地の温度を一定温度に保持する恒温槽と、
前記寒天培地を前記恒温槽で一定温度に保持した後、前記寒天培地の表面の盛り上がりの高さを計測する計測装置と、
前記盛り上がりの計測結果に基いて、微生物を含む水か否かの判定をする判定装置と、を有する。
【００１５】
前記計測装置は、デジタルホログラフィ顕微鏡であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
上述の水検査方法及び水検査システムでは、短時間に正確に水の検査を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施形態の水検査方法のフローを示す図である。
【図２】本実施形態の水検査システムの概要を示す図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態の寒天培養を用いた培養を説明する図である。
【図４】本実施形態にける、対数増殖期に入ったときの寒天培地上の微生物の増加を示す一例のグラフである。
【図５】対数増殖期直後の大腸菌の密集開始の状態を示す写真である。
【図６】本実施形態の寒天培地上の盛り上がりが計測される領域を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の水検査方法及び水検査システムについて詳細に説明する。
図１は、本実施形態の水検査方法のフローを示す図であり、図２は、本実施形態の水検査システムの概要を示す図である。本実施形態では、船舶がタンクに貯留したバラスト水に有害な微生物が含まれるか否かを判定する例に基づいて説明するが、検査対象はバラスト水に限らず、海水あるいは水であってもよい。本実施形態でいう微生物とは、０．２〜５μｍのサイズの細菌、例えば、結核菌、ジフテリア菌、赤痢菌、大腸菌、チフス菌、百日咳菌、ブドウ球菌、コレラ菌等の細菌を対象とする。
【００１９】
本実施形態の水検査方法は、寒天培地にバラスト水を塗沫し、バラスト水に含まれる微生物を増殖させることにより、微生物が増殖してコロニーあるいはマイクロコロニーを形成する前の段階で、短時間に水の検査を行うことができる。
まず、シャーレ１０に寒天培地１２が形成された検査シャーレ１４を複数用意し、バラスト水を寒天培地１２上に塗沫する（ステップＳ１０）。
【００２０】
バラスト水の検査では、例えば、コレラ菌、大腸菌（大腸菌群）、腸球菌等の微生物がバラスト水に許容限度を越えて含まれているか否かを判定する。寒天培地１２は、増殖させようとする微生物の種類によって異なる。例えば、コレラ菌を培養するには、例えばＴＣＢＳ寒天培地が用いられる。ＴＣＢＳ寒天培地とは、酵母エキス、細菌用パプトン、チオ硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ウシ胆汁酸、ショ酸、塩化ナトリウム、クエン酸第二鉄、プロモチエールブルー、チモールブルー、及びアガーを含む。また、大腸菌を培養するには、例えばトリプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、アガー等を含むＬＢ寒天培地が用いられる。腸球菌を培養するには、胆汁酸、塩化ナトリウム、ニュートラルレッド、乳糖、ペプトン、アガーを含むマッコンキー寒天培地が用いられる。
【００２１】
コレラ菌は、例えば、０．３〜５．０μｍのサイズであり、大腸菌は、０．５〜３．０μｍのサイズであり、本実施形態において、前記寒天培地の表面の盛り上がりを、ホログラフィック顕微鏡を用いて計測するのに適したサイズである。
【００２２】
バラスト水の塗沫された寒天培地１２を備えたシャーレ（検査シャーレ１４）は、恒温槽１６に入れられ、恒温槽１６内で寒天培地１４を一定温度に保持し、放置する（ステップＳ１０）。恒温槽１６は、特に制限されず、微生物を増殖させることができる点で、例えば２０〜４０℃であることが好ましい。さらに、一定温度に保持し放置する時間は、８時間以内に設定することが可能であり、好ましくは７時間以内、好ましくは、６時間以内、より好ましく５時間以内である。後述するように、デジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、微生物の大きさと同程度の盛り上がりの高さ、例えば０．３μｍ〜５μｍの盛り上がり高さを計測することができるので、マイクロコロニーが目視によって視認できるまでに要する時間よりも短い時間で、微生物の有無を判定することができる。
【００２３】
また、寒天培地１４を保持する時間や、保持温度は、増殖させる微生物の種類によって異なる。保持温度は、コレラ菌の場合、例えば３５〜３７℃であり、大腸菌の場合、例えば３３〜３７℃であり、腸球菌の場合、例えば３５〜３９℃である。
【００２４】
次に、一定時間後、寒天培地１４を恒温槽１６から取り出し、ホログラフィック顕微鏡１８を用いて寒天培地１４の表面の盛り上がり（微生物の増殖による盛り上がり）の高さを計測する（ステップＳ１４）。例えば、寒天培地１４による培養を開始してから例えば３時間経過後以降、ホログラフィック顕微鏡１８は、１０〜２０分間隔で寒天培地１４の表面の盛り上がりを計測する。
図３（ａ）〜（ｃ）は、寒天培養１２を用いた培養を説明する図である。図３（ａ）に示すように、バラスト水の液滴２０を寒天培養１２上に滴下して、寒天培養１２上にバラスト水を塗沫する。バラスト水は、プランクトンネットやメンブレンフィルタ等を用いて予めプランクトン等の水中生物を除去したものを用いる。バラスト水の液滴２０は、寒天培地１２上に広げる。図３（ｂ）に示すように、寒天培地１２上には、滴下当初、大腸菌等の微生物２２が分散した状態で存在するが、上記ステップＳ１２の処理により、微生物２２は増殖を開始する。特に、活発な増殖を行う部分では、図３（ｃ）に示すように微生物が増殖してかたまって存在するので、寒天培地１２の表面が僅かに盛り上がった部分２４を形成する。このような増殖は、培養を開始してから、例えば３時間後に始まる。すなわち、微生物２２は対数増殖期に入る。図４は、対数増殖期に入ったときの寒天培地１２上の微生物の単位体積あたりの数の増加を示す一例のグラフである。このような対数増殖期は、時間Ｔ、例えば１時間の間に５回、すなわち１５分毎（一定時間間隔毎）に、寒天培地１２の表面の盛り上がりを計測する。図５は、対数増殖期直後の大腸菌の密集開始の状態を示す写真を示している。
このような対数増殖期において、寒天培地１２の表面は、微生物１２の密集により急激に盛り上がる。したがって、このような盛り上がりを、ホログラフィック顕微鏡１８は計測する。
【００２５】
ホログラフィック顕微鏡１８は、平面波のレーザ光を分離して、一方のレーザ光を、寒天培地１２の表面で反射させてＣＣＤカメラ等に取り込むとともに、他方の分離されたレーザ光を光学系を介して図示されないＣＣＤカメラに取り込む。その際、寒天培地１２の盛り上がりがない場合、ＣＣＤカメラで受光されるレーザ光の位相は揃うように、各レーザ光の光路長は調整されている。これにより、２つのレーザ光の位相差により形成される寒天培地１２上の明暗の縞を計測することにより、寒天培地１２の表面の盛り上がりの高さを求めることができる。ホログラフィック顕微鏡１８としては、例えば、Lyncee Tec社のデジタルホログラフィック顕微鏡が挙げられる。このデジタルホログラフィック顕微鏡で用いるレーザ光の波長は６８３ｎｍである。寒天培地１２の表面の盛り上がりによって生じるレーザ光の位相のずれを利用して、寒天培地１２上の明暗の像を取得して、寒天培地１２の表面の盛り上がりを求めるので、ホログラフィック顕微鏡１８は、例えば０．３μｍ〜５μｍの盛り上がりの高さを計測することができる。この盛り上がりは、増殖する細菌のサイズに対応する。
【００２６】
ホログラフィック顕微鏡１８は、例えば、寒天培地１２の狭い範囲をレーザ光で走査しながら照射し、表面の盛り上がり分布を計測することができる。計測では、寒天培地１２上の計測位置の情報を常に取得しつつ、寒天培地１２上の表面の盛り上がり分布を取得する。寒天培地１２上の計測位置を常に取得するのは、後述するように、一定時間毎の表面の盛り上がり量を求めるために、同じ計測位置の情報が必要だからである。図６は、寒天培地１２上の盛り上がりが計測される領域Ａ〜Ｃを示す図である。ホログラフィック顕微鏡１８は、一定時間経過毎の計測では、第１回目の計測で盛り上がりが計測される領域Ａ〜Ｃの計測位置（領域Ａ〜Ｃの中心位置）の情報を予め記憶しておき、第２回目以降の計測では、領域Ａ〜Ｃの盛り上がりの計測を優先的に行うことで、短時間の計測を実現する。勿論、第２回目以降で計測された新たに盛り上がった領域を取得するたびに、この領域の計測位置の情報を領域Ａ〜Ｃの計測位置の他に付加していくこともできる。
【００２７】
計測された寒天培地１２の表面の盛り上がり分布の情報は、判定装置２６に送られる。判定装置２６は、コンピュータで構成され、図示されないメモリに記録されたプログラムを起動することにより、判定装置２６は機能を発揮する。具体的には、判定装置２６は、ホログラフィック顕微鏡１８から送られてきた寒天培地１２の表面の盛り上がり分布の情報を処理して、バラスト水に許容範囲を超えて微生物が含まれているか否かを判定する。
【００２８】
まず、判定装置２６は、表面の盛り上がりについて一定時間毎に計測した回数が予め設定された回数Ｎ以上であるか否かを判定する（ステップＳ１６）。すなわち、本実施形態では、判定装置２６は、一定時間毎にＮ回盛り上がりを計測したか否かを判定する。この判定が否定である場合、判定装置２６は、ステップＳ１４に戻り、計測を繰り返すように、ホログラフィック顕微鏡１８に指示を出す。上記判定が肯定である場合、判定装置２６はステップ１８に進む。
判定装置１８は、ステップＳ１６の判定が肯定である場合、Ｎ回分の寒天培地１２の表面の盛り上がりの情報を用いて、バラスト水に微生物が許容範囲を超えて含まれるか否かを判定する（ステップＳ１８）。
【００２９】
判定装置２６は、まず、表面の盛り上がりの情報に対してフィルタリング処理を施して、微細な表面凹凸の情報を除去する。判定装置２６は、このフィルタリングされた表面の盛り上がりの情報に基いて、一定時間間隔毎の寒天培地１２の表面の盛り上がり量の分布を求める。盛り上がり量とは、一致時間経過前後の表面の盛り上がりの差分をいう。判定装置２６は、この表面の盛り上がりの位置が固定されており、しかも、盛り上がり量がいずれの一定時間間隔においても予め定められた第１閾値以上であり、しかも、盛り上がりの面積が予め設定された面積よりも広いことを第１判定条件として定める。判定装置２６は、盛り上がる領域（例えば図６に示す場合の領域Ａ〜Ｃ）のいずれか１つが、この第１判定条件を満足する場合、判定装置２６は、微生物の増殖により寒天培地１２の表面は盛り上がったと判断して、バラスト水には許容範囲を超えて微生物が含まれている、と判定する。一方、判定装置２６は、盛り上がり量がいずれの時間間隔においても予め定められた第２閾値以下であり、しかも、盛り上がりの面積が予め設定された面積よりも小さいことを第２条件とする。判定装置２６は、この第２条件を満足する場合、バラスト水には微生物が含まれていない、と判定する。また、上記第１判定条件を満足せず、上記第２判定条件も満足しない場合、判定装置２６は、バラスト水には微生物が含まれていないとはいえない、と判定する。判定結果は、図示されないプリンタにプリント出力され、あるいは図示されないディスプレイに画面表示される。なお、判定装置２６がバラスト水に微生物が含まれていると判定した場合、さらに、バラスト水に微生物が含まれていないとはいえない、と判定した場合、バラスト水は、図示されない公知のバラスト水処理装置に送られて処理される。
すなわち、寒天培地１２の表面の盛り上がりの計測は、予め定められた一定時間間隔毎に行われ、判定装置２６は、寒天培地１２の同じ位置における、時間間隔内の盛り上がり量に基いて上記判定をする。図６に示す例では、領域Ａ〜Ｃの計測位置の情報を用いて、この同じ計測位置における盛り上がり量が一定時間間隔毎に求められる。
【００３０】
図２に示すように複数の寒天培地１２を用いてバラスト水を検査するので、バラスト水に対して複数の判定結果が得られる。したがって、判定装置２６は、複数の判定結果に対して、バラスト水には許容範囲を超えた微生物が含まれるといった判定結果の発生頻度が、予め定められた割合以上の場合、個々の寒天培地１２の判定結果とは別に、タンクに貯留されたバラスト水全体には、許容範囲を超えて微生物が含まれている、といった検査結果を生成してもよい。また、寒天培地１２によって増殖する微生物が異なるので、どの微生物が許容範囲を超えてバラスト水に含まれているかを、寒天培地１２の種類によって判定することもできる。このような微生物の種類も図示されないプリンタにプリント出力され、あるいは図示されないディスプレイに画面表示される。
【００３１】
以上のように、本実施形態では、恒温槽１６を用いて検査対象のバラスト水を塗沫した寒天培地１２の温度を一定温度に保持した後、ホログラフィック顕微鏡１８を用いて寒天培地１２の表面の盛り上がりを計測し、この盛り上がりの計測結果に基いて、判定装置２６が細菌を含む水か否かの判定をするので、細菌の対数増殖期の開始直後の数時間以内に、例えば約１時間以内に、水が細菌を含む否かの判定をすることができる。
本実施形態では、寒天培地１２の表面の盛り上がりの計測に、デジタルホログラフィ顕微鏡１８を用いるので、大腸菌等の増殖による寒天培地１２の表面の盛り上がりを正確に、定量的に判定を行うことができる。
ホログラフィック顕微鏡１８は、寒天培地１２の表面の盛り上がり分布を求めるので、寒天培地１２のどの領域で増殖しても、寒天培地１２の表面の盛り上がりを求めることができる。
本実施形態では、ホログラフィック顕微鏡１３による計測は、予め定められた時間間隔毎に行われ、判定装置２６は、寒天培地１２の同じ位置（領域）における、時間間隔内の盛り上がり量に基いて判定をするので、極めて正確に寒天培地１２の表面の盛り上がりの有無を得ることができる。
本実施形態では、恒温槽１６内の一定温度は、２０〜４０℃とし、大腸菌、コレラ菌、腸球菌等の細胞の増殖をより活発に行わせることができ、短時間に対数増殖期に移行させることができる。このため、水の検査も短時間、例えば８時間以内に行うことができる。
従来のようにコロニーやマイクロコロニーが寒天培地上で形成されるまで恒温槽に放置する必要があり、迅速な水の検査は難しかったが、本実施形態のように、細菌が対数増殖期に入った直後の寒天培地の表面の盛り上がりを、極めて正確に計測することができるので、迅速かつ簡便に水の検査を行うことができる。
【００３２】
以上、本発明の微生物検査方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態および変形例に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００３３】
１０  シャーレ
１２  寒天培地
１４  検査シャーレ
１６  恒温槽
１８  ホログラフィック顕微鏡
２０  液滴
２２  微生物
２４  部分
２６  判定装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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