(57)【要約】      （修正有）【課題】イソフラボン類がエストロゲン受容体非依存的な抗がん作用を発現するために必須の遺伝子として同定した、Pap associated domain containing 5（Papd5）の使用方法を提供する。【解決手段】Papd5遺伝子又はその産物を用いることを特徴とする、イコール（equol）又はダイゼイン（daidzein）のエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のための、物質のスクリーニング方法、およびPapd5遺伝子の変異の有無、又は転写若しくは発現の量を決定する段階を含む、イコール又はダイゼインのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置が必要な細胞の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Papd5遺伝子又はその産物を用いることを特徴とする、イコール又はダイゼインのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のための、物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
イコール又はダイゼインのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
Papd5遺伝子又はその産物の、イコール又はダイゼインのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のためのマーカーとしての使用。
【請求項４】
イコール又はダイゼインのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、請求項3に記載の使用。
【請求項５】
Papd5遺伝子の変異の有無、又は転写若しくは発現の量を決定する段階を含む、イコール又はダイゼインのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置が必要な細胞の検出方法。
【請求項６】
イコール又はダイゼインのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
Papd5遺伝子の変異の有無、又は転写若しくは発現の量を指標とした、イコール又はダイゼインのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のための、医薬品若しくは食品の、又はその投与若しくは摂取計画の、設計方法。
【請求項８】
イコール又はダイゼインのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、請求項7に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソフラボン類がエストロゲン受容体非依存的に対象に作用する際に依拠する遺伝子又はその産物に関する。本発明は、特にがんの処置のための、医療、代替医療、並びに医薬品及び食品開発のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
がんは1981年以降、わが国の死因第1位の疾患であり、その数は年々増加の一途をたどっている。現在、がんに対する有効な治療法はまだ確立されていないと言える。こうした中、我々は、がんの予防や治療に役立つ物質として食品成分に着目している。がんに有効な食品については現在までに多くの報告がなされている。肉や卵に含まれるConjugatedLinoleic Acid (CLA)や緑茶葉中の主要成分であるEpigallocatechin-3-O-gallate(EGCG)に抗がん作用が報告されている（非特許文献1、2）。また、イソフラボン類であるgenisteinやdaidzeinにも抗がん作用が報告されている（非特許文献3）。
【０００３】
イソフラボン類は大豆、主に大豆胚芽に多く含まれるフラボノイドの一種であり、genistein、daidzein、glyciteinの3種類が存在する。味噌、納豆等の大豆発酵食品中にはこれらがアグリコンとして多く含まれるが、ほとんどの食品中では配糖体の状態で含まれる。配糖体は、消化酵素や腸内細菌の持つβ-グルコシダーゼにより加水分解され、アグリコンが生成される。また、daidzeinはある種の腸内細菌によってequolへ代謝される。日本人の約半分、西洋人の約20％が、daidzeinをequolへと変換する腸内細菌を有していると言われている。イソフラボン類は、多彩な生理機能を有しており、閉経後の女性において更年期障害の改善作用や骨粗鬆症改善効果（非特許文献4）等が報告されている。がんに対しては、乳がん（非特許文献5）や前立線がん（非特許文献6）のようにホルモン依存性のがんに対して、抗がん作用を発揮することが広く知られている。イソフラボン類は、分子構造がestrogenに類似しているため、生体内でestrogen receptor(ER)に結合し(エストロゲン様作用)、又はエストロゲンと拮抗して(抗エストロゲン作用)、このような生理作用を発揮すると考えられている。
【０００４】
一方において、イソフラボン類のER非依存的作用の存在が注目されている。例えば、genisteinは、チロシンキナーゼやトポイソメラーゼを阻害することにより、胃がん、メラノーマ、膵臓がん等のホルモン非依存性のがんに対して抗がん作用を発揮する（非特許文献7）。また、genisteinは胸腺を委縮させるが、その作用の一部はER非依存的な作用であることが報告されている（非特許文献8）。一方、equolの機能として抗アレルギー機能（非特許文献9）や血管弛緩機能（非特許文献10）もER非依存性の作用であることが明らかとなっている。しかしながら、こうしたイソフラボン類のER非依存的作用のメカニズムについては不明である。
【０００５】
抗がん作用を示す食品因子をがんの予防、治療、再発予防などの代替医療の手段として利用する試みがあるが、一方でがんの増悪化を招く可能性などの弊害が指摘されている。イソフラボン類に関するin vitroの報告として、ヒトがん細胞に対してアポトーシスの誘導や増殖抑制作用（前掲非特許文献5）を示す一方、発がん促進を示唆する作用が報告されている（非特許文献11）。またin vivo動物実験において、臓器によっては発がん促進作用を示す等の報告がある（非特許文献12及び13）。
【０００６】
一方、Pap associated domain containing 5(Papd5)については、トポイソメラーゼをターゲットにした抗がん剤カンプトテシンの効果がPapd5の存在により低下することが報告されているに過ぎない（非特許文献14）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kelly NS, Hubbard NE, Elickson KL. Conjugated linoleic acid isomers and cancer. J. Nutr. 137, 2599-2607 (2007).
【非特許文献２】Yang CS, Wang X, Lu G, Picinich SC. Cancer prevention by tea: animal studies, molecular mechanisms and human relevance. Nat. Rev. Cancer. 9,429-439 (2009).
【非特許文献３】Messina MJ, Persky V, Setchell KD, Barnes S. Soy intake and cancer risk: a review of the in vitro and in vivo data. Nutr Cancer 21, 113-131 (2009).
【非特許文献４】Ishimi Y. Soybean isoflavones in bone health. Forum Nutr. 61, 104-116 (2009).
【非特許文献５】Katdare M, Osborne M, Telang NT.  Soy isoflavone genistein modulates cell cycle progression and induces apoptosis in HER-2/neu oncogene expressing human breast epithelial cells.  Int J Oncol. 21, 809-815 (2002).
【非特許文献６】Mitchell JH, Duthie SJ, Collins AR. Effects of phytoestrogens on growth and DNA integrity in human prostate tumor cell lines: PC-3 and LNCaP. Nutr Cancer. 38, 223-228 (2000).
【非特許文献７】Banerjee S, Li Y, Wang Z,Fazlul H. Sarkar.Multi-targeted therapy of cancer by genistein. Cancer Lett. 269, 226-242 (2008).
【非特許文献８】Yellayl S, Naaz A, Szewczycowski MA, Sato T, Woods JA, Chang J, Segre M, Allred CD, Helferich WG, Cooke PS. The phytoestrogen genistein induces thymic and immune changes : A human health concern ? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 7616-7621 (2002).
【非特許文献９】立花宏文, 矢野知美, 山田耕路. 大豆成分の抗アレルギー性発現に関与する標的分子に関する研究.  大豆たん白質研究. Vol.10. 128-133 (2007)
【非特許文献１０】Joy S, Siow RCM, Rowlands DJ, Becker M,  Wyatt AW, Aaronson PI, Coen CW, Kallo I, Jacob R, Mann GE. The Isoflavone Equol Mediates Rapid Vascular Relaxation.  J. Biol. Chem. 291, 27335-27345  (2006).
【非特許文献１１】Murata M, Midorikawa K, Koh M, Umezawa K, Kawanishi S. Genistein and daidzein induce cell proliferation and their metabolites cause oxidative DNA damage in relation to isoflavone-induced cancer of estrogen-sensitive organs.  Biochemistry.  43, 2569-2577 (2004)
【非特許文献１２】Rao CV, Wang CX, Simi B, Lubet R, Kelloff G, Steele V, Reddy BS. Enhancement of experimental colon cancer by genistein. Cancer Res. 57, 3717-3722 (1997).
【非特許文献１３】Seike N, Wanibuchi H, Morimura K, Wei M, Nishikawa T, Hirata K, Yoshikawa J, Fukushima S. Enhancement of lung carcinogenesis by nonylphenol and genistein in a F344 rat multiorgan carcinogenesis model.  Cancer Lett. 192, 25-36 (2003).
【非特許文献１４】Walowsky C, Fitzhugh DJ, Castano, IB, Ju JY, Levin NA, Christman MF.  The Topoisomerase-related function Gene TRF4 Affects Cellular Sensitivity to the Antitumor Agent Camptothecin.  J. Biol. Chem. 274, 7320-7308 (1999).
【発明の開示】
【０００８】
イソフラボン類をがん予防・治療剤として安全かつ効果的に活用するためには、イソフラボン類が抗がん作用を示すがんを個別に見極める必要がある。機能性食品因子の生理作用に対する感受性には、医薬品同様、個人差や臓器差があると認識されつつあるが、その差が何に起因するのか多くの場合不明である。この原因の一つは、食品因子の機能性発現を担う生体側の遺伝子 (食品因子感知遺伝子)がほとんど明らかにされていないことにある。
【０００９】
本発明者らは、緑茶カテキン EGCG の場合、その抗がん作用が発揮されるために不可欠ながん細胞側に発現する遺伝子(EGCG感知遺伝子)として67 kDa laminin receptor (67 LR) を同定してきた（Tachibana H, Koga K, Fujimura Y, Yamada K.  A receptor for green tea polyphenol EGCG.  Nat Struct Mol Biol. 11, 380-381 (2004)）。今般、equol のER 非依存的な抗がん作用が発現するために必須の遺伝子を同定すべく、鋭意研究した。本発明者らは、まず、イソフラボン類の一種であるequolが、前立線がん細胞株 PC-3 やヒト子宮頸がん細胞株 HeLaの増殖を抑制することを見出し、さらにエストロゲン受容体（ER）アンタゴニストであるICI182,780存在下でも、このequolの細胞増殖抑制作用が阻害されないことから、この作用がER非依存性であることを明らかにした(実施例及び図1)。さらにgenetic suppressor elements (GSE) 法を用いて、equolのがん細胞増殖抑制活性や細胞致死活性の発現を担う遺伝子の同定を試みた。その結果、equolのがん細胞増殖抑制活性の発現に必須の遺伝子としてPap associated domain containing 5(Papd5)を同定した。
【００１０】
本発明は、以下を提供する。
1）  Papd5遺伝子又はその産物を用いることを特徴とする、イコール（equol）又はダイゼイン（daidzein）のエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のための、物質のスクリーニング方法。
2）  equol又はdaidzeinのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、1）に記載の方法。
3）  Papd5遺伝子又はその産物の、equol又はdaidzeinのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のためのマーカーとしての使用。
4）  equol又はdaidzeinのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、3）に記載の使用。
5）  Papd5遺伝子の変異の有無、又は転写若しくは発現の量を決定する段階を含む、equol又はdaidzeinのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置が必要な細胞の検出方法。
6）  equol又はdaidzeinのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、5）に記載の方法。
7）  Papd5遺伝子の変異の有無、又は転写若しくは発現の量を指標とした、equol又はdaidzeinのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のための、医薬品若しくは食品の、又はその投与若しくは摂取計画の、設計方法。
8）  equol又はdaidzeinのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態が、がんである、7）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、各種がん細胞に対するequolの細胞増殖抑制活性と ER 依存性を示したグラフである。ヒト子宮頸がん細胞株HeLa又はヒト前立腺がん細胞株 PC-3 を 2 x 104 cells/mLにて24穴培養プレートに播種し、24時間前培養した。ERアンタゴニストである ICI182,780 を1 mM になるよう添加した培地で 30 分間処理した後、equolを添加して 72 時間培養し、細胞数を計測した。
【図２】図2は、マウスメラノーマ細胞株 B16 に対するequolの細胞増殖抑制活性を示したグラフである。マウスメラノーマ細胞株 B16 を 2 x 104 cells/mL で 24 穴培養プレートに播種し、 equol を添加した培地で 72 時間培養後、細胞数を計測した。
【図３】図3は、B16 細胞のequol感受性に及ぼすICIの影響を示したグラフである。B16 細胞を 2 x 104 cells/mL で 24 穴プレートに播種し、ICI182,780 を終濃度 1 mM で添加した培地で 30 分間前処理した後、各濃度の equol  を添加した。 72 時間培養後、細胞数を測定した。ICI : ER 阻害剤 ICI182,780
【図４】図4は、HeLa 細胞の equol 感受性に対する Papd5 発現の関与について示したグラフである。a) Scramble-shRNA 発現ベクター導入 HeLa 細胞又は Papd5-shRNA 発現ベクター導入 HeLa 細胞から RNA を回収しcDNA 合成後、 Real time RT-PCR によってPapd5 mRNA 発現量を検討した。b) Scramble-shRNA あるいは Papd5-shRNA 発現ベクターを導入した HeLa 細胞を 2 x 104 cells/mL で 24 穴 培養プレート に播種し、各濃度の equol を添加した培地で 72 時間培養し、細胞数を測定した。scramble：scramble-shRNA 発現ベクター導入 HeLa 細胞、siPapd5：Papd5-shRNA 発現ベクター導入 HeLa 細胞
【図５】図5は、Figure  5  B16 細胞の equol 感受性に対するPapd5 発現の関与について示したグラフである。a) Scramble-shRNA 発現ベクター導入 B16 細胞又は Papd5-shRNA 発現ベクター導入 B16 細胞から RNA を回収しcDNA 合成後、 RT-PCR によって Papd5 mRNA 発現量を検討した。b) Scramble-shRNA あるいは Papd5-shRNA 発現ベクターを導入した B16 細胞を 2 x 104 cells/mL で 24 穴 培養プレート に播種し、equol を添加した培地で 72 時間培養し、細胞数を測定した。
【図６】図6は、機能性食品因子のがん細胞増殖抑制作用における Papd5 発現の関与について示したグラフである。Scramble-shRNA あるいは Papd5-shRNA 発現ベクターを導入した HeLa 細胞に、 equol、genistein、 daidzein、 EGCG をそれぞれ各濃度添加し、 72 時間培養した後細胞数を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明においては、Papd5遺伝子又はその産物がイソフラボン類のエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用に関連して利用される。
本発明で「Papd5遺伝子」というときは、特に記載した場合を除き、配列表に、配列番号：1、3又は5として表されたヌクレオチド配列若しくはそれと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又はそのホモログを指す。具体的には、下記（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）又は（g）のいずれかである。
（a）配列番号：1、3若しくは5のヌクレオチド配列、又はそれと相補的なヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（b）（a）のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド；
（c）（a）のポリヌクレオチドと高い配列同一性を有し、かつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド；
（d）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列をコードし、かつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド；
（f）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつかつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド。
【００１３】
本明細書の配列表には、配列番号：1として、ヒトのPapd5のmRNAのヌクレオチド配列、配列番号：2として、ヒトのPapd5タンパク質のアミノ酸配列を示した。また、配列番号：3として、マウスのPapd5のmRNAのヌクレオチド配列、配列番号：4として、マウスのPapd5タンパク質のアミノ酸配列、配列番号：5として、ラットのPapd5のmRNAのヌクレオチド配列、配列番号：6として、ラットのPapd5タンパク質のアミノ酸配列を示した。
【００１４】
Papd5遺伝子は、好ましくはヒト由来である。
本発明でPapd5遺伝子の「産物」というときは、特に記載した場合を除き、上述のPapd5遺伝子の、転写産物（mRNA）又は発現産物（タンパク質）をいう。
【００１５】
産物の一例は、配列番号：1、3又は5として表されたヌクレオチド配列（ただし、tはuに置換できる。）からなるmRNA又はそのホモログである。具体的には、下記（a'）、（b'）、（c'）、（d）、（e）、（f）又は（g）のいずれかである。
（a'）配列番号：1、3若しくは5のヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチド；
（b'）（a'）のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド；
（c'）（a'）のポリヌクレオチドと高い配列同一性を有し、かつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド；
（d）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（e）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列をコードし、かつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド；
（f）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、かつかつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、ポリヌクレオチド。
【００１６】
産物の他の例は、2、4又は6のアミノ酸配列をからなるタンパク質又はそのホモログである。具体的には、下記（d'）、（e'）、（f'）又は（g'）のいずれかである。
（d'）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e'）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、タンパク質；
（f'）配列番号：2、4又は6のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつかつequol又はdaidzein存在下でエストロゲン受容体（ER）非依存的に細胞増殖抑制活性を発揮しうる、タンパク質。
【００１７】
本発明でいう「ストリンジェントな条件」とは、特別な場合を除き、6M尿素、0.4％ SDS、0.5×SSCの条件又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を指し、さらに必要に応じ、本発明には、よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4％ SDS、0.1×SSC又はこれと同等のハイブリダイゼーション条件を適用してもよい。それぞれの条件において、温度は約40℃以上とすることができ、よりストリンジェンシーの高い条件が必要であれば、例えば約50℃、さらに約65℃としてもよい。
【００１８】
また、本発明で「1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度である。そのようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドを調製するための手段には、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer W & Fritz H-J: Methods Enzymol 154: 350、 1987）がある。
【００１９】
本発明においてヌクレオチドに関し、同一性が「高い」というときは、少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の配列の同一性を指す。また、本発明においてアミノ酸配列に関し、同一性をいうときは、少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の配列の同一性を指す。ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268、 1990、Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873、 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF、 et al: J Mol Biol 215: 403、 1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００２０】
本発明で「ポリヌクレオチド」というときは、特に記載した場合を除き、DNAであってもRNAであってもよい。一本鎖又は二本鎖であり得る。
本発明者らの検討によると、抗がん作用を示す機能性食品因子、equol、genistein、daidzein, エピガロカテキンガレート（EGCG）のうち、GenisteinとEGCGはequolと同様にHeLa細胞の増殖を抑制したが、その作用はPapd5発現低下の影響を受けなかった。一方、daidzeinの細胞増殖抑制作用はequolと同様に、Papd5の発現を低下させた細胞では阻害された(実施例及び図6)。
【００２１】
本発明に関与するイソフラボン類を下記に示す。
【００２２】
【化１】
2013126374.tif 000002
【００２３】
【化２】
2013126374.tif 000003
【００２４】
【化３】
2013126374.tif 000004
【００２５】
本発明者らの検討によると、ヒト子宮頸がん細胞株HeLa及びヒト前立腺がん細胞株PC-3は、equolによって増殖が抑制され、ERアンタゴニストであるICI182,780(ICI)で処理した場合においてもその作用は阻害されなかった。このことから、これらのがん細胞株に対してequolはER非依存的な作用機序により、細胞増殖抑制活性を示すといえる(図1)。
【００２６】
「エストロゲン受容体（ER）」は、エストロゲン（エストロン(E1)、エストラジオール(E2)及びエストリオール(E3)）と結合能を有し、ステロイド受容体スーパーファミリーに属する分子の一つであって、卵胞ホルモン受容体とも呼ばれる。2つのアイソフォームERα（NR3A1、595アミノ酸残基）及びERβ（NR3A2、530残基）が存在する。エストロゲンは生殖機能の形成及び細胞の増殖を促進する働きを有する。
【００２７】
本発明で「ER非依存性」又は「ER非依存的（に）」というときは、特に記載した場合を除き、ERに依拠せずに対象に作用することを指す。ある物質の作用が「ER非依存性」であるか否かは、当業者であれば、適宜判断することができる。例えば、ERのアンタゴニストの存在により、発揮されるべき効果が影響を受けないか又は影響を受けたとしても無視できる（例えば、存在しない場合の効果と比較して、±30%の範囲内の効果を発揮する。）ことを指標に、判断することができる。より詳細な条件は、本願明細書の実施例の記載を参考にすることができる。
【００２８】
本発明で、equol又はdaidzeinのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態というときは、特に記載した場合を除き、がん、特に子宮頸がん、子宮体がん、前立線がん；胃がん、メラノーマ、膵臓がん（前掲非特許文献7）；胸腺の肥大又は萎縮（前掲非特許文献8）；アレルギー（前掲非特許文献9）、血管狭窄又は弛緩（前掲非特許文献10）を含む。好ましくはがんである。体がんの発生経路にはエストロゲン依存性と非依存性のものがあり、前者は類内膜腺がん、後者は漿液性腺がんが代表的なものである。
【００２９】
本発明により、Papd5遺伝子又はその産物を用いることを特徴とする、イコール（equol）又はダイゼイン（daidzein）のエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のための、物質のスクリーニング方法が提供される。スクリーニング方法は、例えば、以下の工程を含む：
1)対象となる物質を、Papd5遺伝子を発現させた細胞に供与する工程；     
2)該物質が細胞増殖に影響を与えるか否かを確認する工程。
【００３０】
本発明に基づき、Papd5遺伝子又はその産物は、equol又はdaidzeinのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のためのバイオマーカーとして使用することができる。また、Papd5遺伝子の変異の有無、又は転写若しくは発現の量は、equol又はdaidzeinのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置が必要な対象を検出するためのデータとして使用することができる。Papd5遺伝子又はその一部、Papd5遺伝子の産物又はその一部、Papd5遺伝子又はその産物に対する抗体を搭載したマイクロアレイやチップは、上述の方法において主要なツールとして用いることができる。本発明はまた、equol又はdaidzeinのエストロゲン受容体（ER）非依存的な作用により改善する疾患又は状態の診断キット、検査用チップ、Papd5に対する抗体（Papd5タンパク質を大腸菌で発現させた組み換えタンパク質又はPapd5のアミノ酸配列情報から抗原性の高いPapd5に由来するペプチドで免疫することでPapd5特異的抗体を得ることができる。）、それを利用したイムノクロマトグラフィー、ELISAキット、DNAマイクロアレイ、プロテインアレイ等も提供する。
【００３１】
本発明により、Papd5遺伝子の変異の有無、又は転写若しくは発現の量を指標として、対象者の個性に応じ、equol又はdaidzeinのER非依存的な作用により改善する疾患又は状態の処置のための医薬品の投与計画、又は食品の摂取計画を設計することができる。例えば、Papd5の発現が高い対象は、抗がん剤カンプトテシンの効果が低下する（前掲非特許文献14）が、むしろequol又はdaidzeinのER非依存的な作用が期待できると思われる。また、本発明により、ER非依存性の対象におけるequol又はdaidzeinによる細胞増殖抑制作用が期待できる。
【実施例】
【００３２】
＜実験材料及び実験方法＞
1．各種がん細胞に対するequolの細胞増殖抑制活性とER依存性
細胞数の測定に使用したヒト子宮頸がん細胞株HeLaは、10%ウシ胎児血清(FCS)(BIOLOGICAL)添加DMEM培地で、ヒト前立線がん細胞株PC-3は10%FCS添加RPMI1640培地で、37℃、水蒸気飽和した5%CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。培養に使用したDMEM培地は、dH2O 1LあたりダルベッコMEM培地(コスモ・バイオ株式会社、東京)13.38g、HEPES(和光純薬工業株式会社、大阪)5.958g、注射用ペニシリンGカリウム20万単位(明治製菓株式会社、東京)0.5 vial、硫酸ストレプトマイシン注射用1g(明治製菓株式会社、東京)0.1 vial、NaHCO3(nacalai tesque、京都)3.7gを懸濁した後、0.22μmフィルターで滅菌した。RPMI-1640培地は、dH2O 1LあたりRPMI-1640培地(日水製薬,東京)10.4g、2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethane sulfonic acid(HEPES)2.38g、ペニシリン100U/mL、ストレプトマイシン100mg/L、NaHCO3(和光純薬工業,大阪)2.0gを懸濁し、炭酸ガスを吹き込んでpHを6.8〜7.4に調整後、0.22μmフィルターで濾過滅菌した。そして、ウシ胎児血清(FCS)を10%添加し、細胞培養に使用した。細胞の継代の際は、PBSで洗浄した後、トリプシン溶液で細胞をはがした。PBSはdH2O 1LあたりNaCl(nacalai tesque、京都)8.0g、KCl(nacalai tesque、京都)0.2g、Na2HPO4(和光純薬工業株式会社、大阪)1.15g、KH2PO4(nacalai tesque、京都)0.2gを懸濁し、オートクレーブ滅菌した。トリプシン溶液は、100mLPBSあたりEDTA・2Na(和光純薬工業株式会社、大阪)0.05g、トリプシン(nacalai tesque、京都)0.02gを懸濁し、フィルター滅菌した。また、細胞の継代、維持には、5mL又は10mL接着dish(nuncTM、東京)を使用した。Equol(フナコシ)、Daidzein(フナコシ)、Genistein(フナコシ)は、100mMになるようにDMSO(nacalai tesque、京都)に溶解し、4℃で保存しておいた。ICI182,780(invitrogen)は10mMになるようにDMSOに溶解し、-80℃で保存しておいた。細胞数の測定は、各細胞を2x104cells/mLに調整して24穴プレート(nuncTM、東京)に播種し、10%FCS含有培地で24時間前培養した。その後、1μMになるようICI182,780を添加した2%FCS含有培地に置換し30分間処理し、各濃度になるようにequolを添加した。72時間培養した後、セルカウンターにて細胞数を計測した。実験結果の統計処理にはStudent's t検定を用いた。
【００３３】
2．マウスメラノーマ細胞株B16に対するequolの細胞増殖抑制活性
細胞数及び細胞生存率の測定に使用したマウスメラノーマ細胞株B16(American Type Culture Collection)は、5%FCS添加DMEM培地で37℃、水蒸気飽和した5%CO2条件下で継代、維持した。細胞は対数増殖期で培養維持した。細胞数及び細胞生存率の測定は、マウスメラノーマ細胞株B16を2x104cells/mLに調整して24穴プレートに播種し、5%FCS含有DMEM培地で24時間前培養した。その後、終濃度0,1,5,10,25,50μMのequolを含む2%FCS含有DMEM培地で72時間又は、24,48,72,96時間培養後、細胞数をセルカウンターにより計測した。実験結果の統計処理にはStudent's t検定を用いた。
【００３４】
3．B16細胞のequol感受性に及ぼすICIの影響
細胞数の測定は、B16細胞を2x104cells/mLに調整して24穴プレートに播種し、5％FCS含有DMEM培地で24時間前培養した。終濃度1μMのICI182,780を含む2%FCS含有DMEM培地で30分間処理した後、終濃度0,1,5,10,25μMのequolを添加した。72時間培養した後、細胞数をセルカウンターにより計測した。実験結果の統計処理にはStudent's t検定を用いた。
【００３５】
4．equol感知遺伝子の同定
EcoPack2-293及びAmphoPack-293パッケージング細胞(Clontech)を2x105cells/mLに調整して5mL dishに播種し、10%FCS含有DMEM培地で培養した。翌日、Mouse Embryo cDNAライブラリーML8000BB(Clontech,Mountain View, CA)を制限酵素EcoRI、Sph Iで断片化し、pLPCX改変レトロウイルスベクターに導入したFGS library(MFL-ESP)(1.0μg/μL)3μL、pVSV-G vector(タカラバイオ株式会社、滋賀)(1.0μg/μL)3μL、FuGENE 6 Transfection Reagent(Roche、東京)6μLで混合し、それぞれのパッケージング細胞に導入した。翌日、パッケージング細胞の培養上清をフィルター(0.22μm)に通し、ポリブレン(Hexadimethrine bromide)(SIGMA-ALDRICH、東京)を終濃度8μg/mLになるように添加した後、前日1x104cells/mLに調整して5mL dishに播種し、5%FCS含有DMEM培地で培養しておいたB16細胞にふりかけ、培養上清中のウイルスを感染させた。パッケージング細胞には新しい10%FCS含有DMEM培地を添加し、培養を継続した。この操作を12時間ごとに計4回行った。感染の終了したB16細胞を1x104cells/mLに調整して、96穴プレート(nuncTM、東京)に播種し、2%FCS含有DMEM培地で24時間回復培養を行った。回復培養後、1%FCS含有DMEM培地で、80μMのequol含有培地で培養し、equol耐性B16細胞を獲得した。
【００３６】
Equol耐性細胞にTRIzol（登録商標） Reagent(invitogen、東京)1mLを添加し、室温で5分間放置した。次に、クロロホルム(nacalai tesque、京都)200μLを添加・撹拌し、室温で3分間放置後、4℃で15分間遠心(12000 x g)した。その後、上層を取り出し、2-プロパノール(nacalai tesque、京都)500μLを添加・撹拌し、室温で10分間放置後、4℃で10分間遠心(12000 x g)した。その後、上清を除去し、75%EtOH(nacalai tesque、京都)in DEPE水(DEPC(SIGMA-ALDRICH、東京)1mLをdH2O 1Lに溶かし、オートクレーブ滅菌したもの)を1mL添加・撹拌後、4℃で5分間遠心(12000 x g)した。その上清を完全に除去し、DEPC水を10から20μL入れて懸濁した。それに、株式会社ジーンネット(福岡)に合成を委託した(dT)20 primer(5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3',DEPC水で0.5μg/μLになるように調整したもの,以下のプライマーも全て株式会社ジーンネットに委託した。)を1.0μL添加し、70℃で10分間放置後、氷上で10分間放置した。その後、dNTP 2.0μL、M-MLV Reverse Transcriptase buffer 4.0μL、M-MLV Reverse Transcriptase(Promega、東京)0.1μL、RNase inhibitor(タカラバイオ株式会社、滋賀)0.1μL  を添加して37℃で1時間放置後、5分間煮沸した。調製したcDNAは-20℃で保存した。
【００３７】
そのcDNAを鋳型として、pLPCX-SとpLPCX-Aのプライマーセット(5'-GAT CCG CTA GCG CTA CCG GAC TCA GAT-3')pLPCX-A(5'-CTT TCA TTC CCC CCT TTT TCT GGA GAC-3')(TE bufferで20μMになるように調整して使用した。以下のPCRに用いたプライマーも全て同様である。TE buffer(10mM Tris(nacalai tesque,京都)-HCl,1mM EDTA, pH8.0)を用いて、導入cDNA断片をPCRにより増幅した。PCR装置として、TGRADIENT(Biometra（登録商標）, Germany) 又はPC320(ASTEC、福岡)を使用した。PCRは1サンプルあたり、プライマー(senseプライマーとantisenseプライマー)各0.5μLずつと、タカラバイオ株式会社(滋賀)より購入したdNTP mix 1μL、10 x buffer 1μL、Ex taq 0.1μLとdH2O 5.9μL、鋳型1μLを懸濁し、初期変性94℃で2分間、変性反応94℃で30秒間、アニーリング67.1℃で30秒間、伸長反応72℃で1分間行い、変性反応、アニーリング及び伸長反応を40サイクル行った。PCR後、1サンプルあたり、BPB溶液  1μLとSYBR（登録商標） Green I nucleic acid gel stein(Molecular probes(invitrogen)、東京)0.5μLを添加した。BPB溶液は0.25%Bromophenol blue(和光純薬工業株式会社、大阪)、30%グリセリン(nacalai tesque、京都)となるようにdH2Oに溶解した。SYBR（登録商標） Green I nucleic acid gel steinはdH2Oで1000倍希釈して用いた。
【００３８】
そのサンプルを用い、1.5%アガロースゲルで電気泳動を行った。アガロースゲルは、TAE bufferに1〜1.5%の濃度でAgarose S(和光純薬工業株式会社、大阪)を溶かして作成した。TAE bufferは1LあたりTris(nacalaitesque、京都)-HCl 242g、EDTA・2Na 37.2g、氷酢酸(nacalai tesque、京都)57.1mLをdH2Oに溶解してpH8.5に調整後、dH2Oで1Lにフィルアップし、オートクレーブ滅菌をし、50 x TAE bufferを作成し、dH2Oで50倍希釈して使用した。電気泳動槽はGelMate(TOYOBO、大阪)を使用した。電気泳動後、250μL EtBrを添加した500mL TAE bufferに15分間浸した。その後、ChemiImagerTM 5500(Alpha Innotech)を用いてDNAの検出を行った。その後、photoshopのヒストグラムからDNA量を数値化した。その結果確認できたpLPCX特異的なバンドをGENECLEAN II kit(フナコシ、東京)を用いてアガロースゲルより回収した。
【００３９】
そのDNA断片をDNA Ligation Kit Ver.2.1(タカラバイオ株式会社、滋賀)を用いてpTargeTTMMammalian Expression Vector System(Promega、東京)にTAクローニングを行った。このvectorを、次のように大腸菌に形質転換した。大腸菌は、Escherichia coli JM109(タカラバイオ株式会社、滋賀)を使用した。-80℃で保管しておいたEscherichia coli JM109のグリセロールストックを、SOBに加え、OD600=0.6になるまで16℃で振とうした後、遠心して上清を捨て、TB(Transfer Buffer)に懸濁した。それを遠心して上清を捨て、DMSO添加TBに懸濁し、液体窒素中で保存しておいたものを用いた。SOBは、150mlあたりBacto Tryptone(和光純薬工業株式会社、大阪)を3.0g、Bacto Yeast Extract（和光純薬工業株式会社、大阪）を0.75g、NaClを0.078g、KClを0.027g、dH2Oを全量が148.5mlになるまで加えた。この溶液をオートクレーブ滅菌し室温まで冷ました後、これとは別にオートクレーブした2M Mg2+液（12.324gのMgSO4・7H2O(和光純薬工業株式会社、大阪)+10.165gのMgCl2・6H2O(nacalai tesque、京都)を水に混ぜて50mlにし、オートクレーブ滅菌した）を無菌的に1.5ml加えた。TBはTBは100mlあたりPIPES(和光純薬工業株式会社、大阪)を0.3g、CaCl2(和光純薬工業株式会社、大阪)を0.22g、KClを1.86gを90mlの水に混ぜた後、pHをKOH(nacalai tesque、京都)で6.7に合わせた。MnCl2・4H2O(和光純薬工業株式会社、大阪)を1.09g加えた後、全量を100mlに合わせ、フィルター滅菌（0.22μm）してから4℃にて保存した。
【００４０】
大腸菌の培養は、アンピシリン含有液体LB培地又はアンピシリン含有LBプレートを用いた。アンピシリン含有液体LB培地は、1LにつきBacto Tryptone 10g、Bacto Yeast Extract 5g、NaCl 10gをdH2Oで1Lにフィルアップして、pHを7.0にし、オートクレーブ滅菌した。そして使用前に、150mg/mlのアンピシリンを1000倍希釈で添加して使用した。LBプレートは200mlにつきBacto Tryptone 2g、Bacto Yeast Extract 1g、NaCl 2g、Bacto Agar（和光純薬工業株式会社、大阪）5g加え、dH2Oで200mlにフィルアップしてオートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、60℃に冷ましてから150mg/mlのアンピシリンを200μl加え、10ml dish（Falcon 1029）(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、東京)に10mlずつ分注した。アンピシリンはアンピシリンナトリウム（和光純薬工業株式会社、大阪）を150mg/mlになるようにdH2Oで溶かし、フィルター滅菌（0.22μm）して-20℃で保存したものを使用した。形質転換は、vectorをEscherichia coli JM109の懸濁液100μLに混和し、氷中に30分間放置した。その後、42℃で30秒間放置した後、氷中に戻し、1から3分間冷却した。これに、0.9mLのSOCを加え、37℃で1時間回復培養を行った。SOCは100mlあたり100mLのSOBに1mL  の2Mグルコース溶液（18.016gを水に混ぜて50mlにしてオートクレーブしたもの）を加え、分注して室温あるいは4℃で保存したものを使用した。それを、室温で5分間遠心(1000 x g)して、上清900μLを取り除いた。
【００４１】
その大腸菌をアンピシリン含有LBプレートに塗布し37℃で1晩培養後、立ち上がってきたコロニーを、青白判定のため、x-gal及びIPTGを塗布したアンピシリン含有LBプレートに塗布した。このプレートは、アンピシリン含有LBプレートに、20mg/ml X-gal 25μLと0.1M IPTG 25μLを塗布して使用した。20mg/ml X-galは、100mgのX-galを5 mlのN-N-dimethyl-formamide（和光純薬工業株式会社、大阪）に溶解し、-20℃で保存した。0.1M IPTGは、1gのIPTG（和光純薬工業株式会社、大阪）を4.2mlのdH2Oに溶解し、-20℃で保存した。37℃で1晩培養後、立ち上がってきた白コロニーを鋳型に1サンプルあたり、pLPCX-SとpLPCX-Aのプライマーセット各0.5μLずつと2.5mM dNTP mix 1μL、Fermentas UABより購入した25mM MgCl2 1μL、10 x buffer with (NH4)2SO4 1μL、Taq DNA Polymerase(Recombinant)0.1μLとdH2O 4.9μL、鋳型適量を懸濁した。PCRは、初期変性94℃で2分間、変性反応94℃で30秒間、アニーリング67.1 ℃で30秒間、伸長反応72℃で2分間行い、変性反応、アニーリング及び伸長反応を30サイクル行った。PCR後、各サンプルに、BPBを1μL添加し、1.5%アガロースゲルで電気泳動を行った。
【００４２】
インサートが確認できたクローンからLaboPassTM Mini(LaboPass)によりプラスミドDNAを回収し、TE bufferに懸濁した。回収したプラスミドDNAを鋳型として、シークエンス用の伸長反応を行った。反応は、Big Dye Terminatorサイクルシークエンシングプロトコールに従い、BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kitを用いて反応させた。反応液は、buffer 3.5μL、プライマー3.2pmol、鋳型適量、BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(プレミックス)1.0μLを混和し、dH2Oにて20μLとした。反応は、初期変性96℃で1分間、変性反応96℃で10秒間、アニーリング50℃で5秒間、伸長反応60℃で4分間行い、変性反応、アニーリング及び伸長反応を25サイクル行った。プライマーにはT7,LacZ(T7:5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3', LacZ:5'-AGA TAT GAC CAT GAT TAC GCC-3') (TE bufferで1.0pmol/μLになるように調整して使用した。)を用いた。その後、ABI3130xl DNAシークエンサーにより塩基配列を決定した。その塩基配列情報からequol耐性原因遺伝子を特定した。
【００４３】
5．Papd5の発現をノックダウンさせたHeLa細胞の構築
Papd5をノックダウンさせたヒト子宮頸がん細胞株HeLaの構築は以下の様に行った。Papd5の発現をノックダウンするためのベクター(shPapd5-RNA)は、ターゲット配列として5'-GCCACATATAGAGATTGGATA-3を持つpLKO.1-puro vector(SIGMA-ALDRICH、東京)を使用した。遺伝子導入方法は、HeLa細胞を2 x 104cells/mLで播種し24時間後、vectorを2μg、Fugene6を6μLそれぞれDMEMで全量200μLになるように混合し、細胞に添加した。遺伝子が導入された細胞の選択方法は、細胞にベクターを添加して48時間後に細胞を回収し、96穴プレートに播種し、puromycin(invivogen)によるセレクションを行った。生存し、増殖してきた細胞を用い、次のようにPapd5のノックダウンの確認を行った。用いた試薬は、equolの抗がん作用関連遺伝子の同定の際に調整したものを用いた。細胞にTRIzol（登録商標）Reagent 1mLを添加し、室温で5分間放置した。次に、クロロホルム200μLを添加・撹拌し、室温で3分間放置後、4℃で15分間遠心(12000 x g)した。その後、上層を取り出し、2-プロパノール500μLを添加・撹拌し、室温で10分間放置後、4℃で10分間遠心(12000 x g)した。その後、上清を除去し、75% EtOH in DEPE水1mLを添加・撹拌後、4℃で5分間遠心(12000x g)した。その上清を完全に除去し、DEPC水を10から20μL入れて懸濁した。そこに、(dT)20を0.5μLとRamdom 6 mers(5'-NNN NNN-3'、DEPC水で0.5μg/μLになるように調整したもの)を0.5μL、5 x PrimeScript Buffer(for Real time)2μL、PrimesScript RT Enzyme Mix I 0.5μL(いずれもタカラバイオ)を添加し、37℃で15分間逆転写反応を行った。85℃で5秒間処理した後、-4℃で保存した。Real Time PCRは、Papd5を増幅するプライマー、Papd5-F、Papd5-R(5'-CACAAAGTCGCAGATGAGGA-3',5'-TGGACTGTGTGGCAGAAGAG-3'を10mMになるようにTE bufferで希釈したもの)を用いた。調整したcDNA2μL、各プライマー1μL、SYBR Premix Ex Taq II(2x,SYBR PrimerScript RT-PCR Kit II)12.5μLを混合し、Thermal Cycler Dice Real Time Systemにセットし反応を行った。PCR条件は、初期変性が95℃10秒、その後95℃5秒、60℃20秒で行った。また同様にして、内部標準物質としてGAPDH発現量をこれまでと同様の方法で検討した。
【００４４】
6．HeLa細胞のequol感受性に対するPapd5の関与
5で作成したPapd5-shRNA導入HeLa細胞は、10%FCS含有のDMEM培地でWildTypeのHeLa細胞と同様の方法で継代、維持した。
【００４５】
細胞数の測定は、このHeLa細胞を2 x 104cells/mLにて24穴プレートに播種し、10% FCS含有DMEM培地にて24時間前培養した。その後、終濃度1,5,10,25μMのequolを含む10% FCS含有DMEM培地に置換して72時間培養し、セルカウンターにて細胞数を計測した。実験結果の統計処理にはStudent's t検定を用いた。
【００４６】
7．Papd5の発現をノックダウンさせたB16細胞の構築
Papd5をノックダウンさせたB16細胞の構築は以下の様に行った。Papd5の発現をノックダウンするためのベクター(shPapd5-RNA)は、ターゲット配列として5'-CTGACGAGGATTCCGTGAAAG-3'を持つpLKO.1-puro vector(SIGMA-ALDRICH、東京)を使用した。遺伝子導入方法は、B16細胞を2 x 104cells/mLで播種し24時間後、vectorを2μg、Fugene6を6μLそれぞれDMEMで全量200μLになるように混合し、細胞に添加した。遺伝子が導入された細胞の選択方法は、細胞にベクターを添加して48時間後に細胞を回収し、96穴プレートに播種し、puromycin(invivogen)によるセレクションを行った。生存し、増殖してきた細胞を用い、次のようにPapd5のノックダウンの確認を行った。用いた試薬は、equolの抗がん作用関連遺伝子の同定の際に調整したものを用いた。細胞にTRIzol（登録商標）Reagent 1mLを添加し、室温で5分間放置した。次に、クロロホルム200μLを添加・撹拌し、室温で3 分間放置後、4℃で15分間遠心(12000 x g)した。その後、上層を取り出し、2-プロパノール500μLを添加・撹拌し、室温で10分間放置後、4℃で10分間遠心(12000 x g)した。その後、上清を除去し、75% EtOH in DEPE水1mLを添加・撹拌後、4℃で5分間遠心(12000 x g)した。その上清を完全に除去し、DEPC水を10から20μL入れて懸濁した。そこに、(dT)20を0.5μLとRamdom 6 mers(5'-NNN NNN-3'、DEPC水で0.5μg/μLになるように調整したもの)を0.5μL、5x PrimeScript Buffer(for Real time)2μL、PrimesScript RT Enzyme Mix I 0.5μL(いずれもタカラバイオ)を添加し、37℃で15分間逆転写反応を行った。85℃で5秒間処理した後、-4℃で保存した。RT-PCRは、Papd5を増幅するプライマー、Papd5-F、Papd5-R(5'-GGAGGTAGTGAGCAGGATCG-3',5'-ATCCTCGTCAGCGACTTTGT-3'を10mMになるようにTE bufferで希釈したもの)を用いた。調整したcDNA 1μL、各プライマー0.5μL、2.5mM dNTP mix 1μL、25mM MgCl2 1μL、10 x buffer with(NH4)2SO41μL、Taq DNA Polymerase(Fermentas)0.1μL、dH2O 4.9μLを用いてPCRに供した。PCRは、初期変性94℃で2分間、変性反応94℃で1分間、アニーリング60℃で1分間、伸長反応72℃で1分間行い、変性反応、アニーリング及び伸長反応を35サイクル行った。また同様にして、内部標準物質としてβ-Actin発現量を、これまでと同様の方法で検討した。PCR後BPBを1μL添加し、EtBr Solution(和光純薬株式会社)を10000倍希釈で添加した1.5%アガロースゲルで電気泳動を行った。
【００４７】
8．B16細胞のequol感受性に対するPapd5の関与
7で作成したPapd5-shRNA導入B16細胞は、5%FCS含有のDMEM培地でWild TypeのB16細胞と同様の方法で継代、維持した。
【００４８】
細胞数の測定は、このB16細胞を2 x 104cells/mLにて24穴プレートに播種し、5%FCS含有DMEM培地にて24時間前培養した。その後、終濃度10μMのequolを含む2%FCS含有DMEM培地に置換して72時間培養し、セルカウンターにて細胞数を計測した。実験結果の統計処理にはStudent's t検定を用いた。
【００４９】
9．食品成分の細胞増殖抑制作用に及ぼすPapd5の関与
用いたEGCG(テアビゴ)は、超純水で5mMとなるように溶解し、4℃で保存しておいた。
細胞数の測定は、このHeLa細胞を2x104cells/mLにて24穴プレートに播種し、10%FCS含有DMEM培地にて24時間前培養した。その後、終濃度1,5,10,20μMの各サンプルを含む2%FCS含有DMEM培地に置換して72時間培養し、セルカウンターにて細胞数を計測した。実験結果の統計処理にはStudent's t検定を用いた。
【００５０】
＜結果＞
1．各種がん細胞に対するequolの細胞増殖抑制活性とそのER依存性
ヒト子宮頸がん細胞株HeLa及びヒト前立腺がん細胞株PC-3をそれぞれ2 x 104 cells/mLで24穴プレートに播種し、ERアンタゴニストであるICI182,780(ICI)で処理した後、equolを添加して72時間培養し細胞数を計測した(図1)。その結果、これらのがん細胞株はequolによって増殖が抑制され、ICIで処理してもその作用は阻害されなかった。このことから、これらのがん細胞株に対してequolはER非依存的な作用機序により、細胞増殖抑制活性を示すことが示唆された(図1)。
【００５１】
2．マウスメラノーマ細胞株B16に対するequolの細胞増殖抑制活性
Equolの抗がん作用が発現するために必須な遺伝子を同定するために、その遺伝子の働きを遺伝子断片の導入により阻害することでequol耐性となるがん細胞株をスクリーニングし、耐性細胞からその原因となった遺伝子断片を得る手法(genetic suppressor elements (GSE)法)を用いることにした。GSE法を用いるためにはequolによって増殖抑制や致死作用が誘導されるがん細胞株が必要である。マウスメラノーマ細胞株B16を2 x 104 cells/mLで24穴培養プレートに播種し、equolを添加した培地で72時間培養後、もしくは24時間毎に細胞数を測定した(図2)。その結果、本細胞株は、equolによって顕著にその増殖が抑制されたことから、GSE法の適応が可能ながん細胞株であることを見出した(図2)。
【００５２】
3．B16細胞に対するequolの細胞増殖抑制活性のER依存性
ICIで処理してもequolの細胞増殖抑制作用は阻害されないことから、equolのB16細胞における細胞増殖抑制作用にはERが関与しないことが示された(図3)。 
【００５３】
4．Equol 耐性 B16 細胞から検出されたマウス胎児由来cDNA断片の由来遺伝子
マウス胚由来cDNAライブラリーを導入したB16細胞を、equol(80μM)含有培地で培養し、equol耐性となった細胞をスクリーニングした。これらequol耐性となった細胞から遺伝子断片を網羅的に回収し、その遺伝子配列を解析した結果、Pap associated domain containing 5(Papd5)に由来する遺伝子断片であることが明らかになった。
【００５４】
5．HeLa細胞のequol感受性に対するPapd5ノックダウンの影響
Papd5の発現をRNA干渉法を用いて特異的にノックダウンさせるため、Papd5特異的shRNA発現ベクター(Papd5-shRNA)とそのコントロールベクター(scramble-shRNA)をそれぞれ恒常的に発現導入させたヒト子宮頸がん細胞株HeLaを作製した。その結果、Papd5の発現が低下したHeLa細胞を得ることができた(図4a)。
【００５５】
Papd5-shRNA又はscramble-shRNAを導入したHeLa細胞を2 x 104cells/mLで24穴培養プレートに播種し、各濃度のequolを添加した培地で72時間培養し、細胞数を測定し、equolに対する感受性を検討した。その結果、scramble-shRNAを導入したHeLa細胞はequolによってその細胞増殖が抑制された。一方、Papd5-shRNAを導入しPapd5発現量を低下させたHeLa細胞では、equolに対する感受性が完全に消失していた(図4b)。
【００５６】
6．B16細胞のequol感受性に対するPapd5ノックダウンの影響
マウスメラノーマ細胞株B16のequol感受性におけるPapd5の関与を明らかにするため、Papd5特異的shRNA発現ベクター(Papd5-shRNA)とそのコントロールベクター(scramble-shRNA)をそれぞれ恒常的に発現導入させたマウスメラノーマ細胞株B16を作製した。その結果、Papd5の発現が低下したB16細胞を得ることができた(図5a)。
【００５７】
Papd5-shRNA又はscramble-shRNAを導入したB16細胞を2 x 104cells/mLで24穴培養プレートに播種し、各濃度のequolを添加した培地で72時間培養し、細胞数を測定し、equolに対する感受性を検討した。その結果、scramble-shRNAを導入したB16細胞はequolによってその細胞増殖が抑制された。一方、Papd5-shRNAを導入しPapd5発現量を低下させたB16細胞では、equolに対する感受性が完全に消失していた(図5b)。
【００５８】
7．食品成分の細胞増殖抑制作用に対するPapd5の関与
抗がん作用を示す機能性食品因子（equol、genistein、daidzein、EGCG）のがん細胞増殖抑制作用におけるPapd5の関与を検討した。Papd5-shRNA又はScramble-shRNAを導入したHeLa細胞を各濃度の食品因子を添加した培地で72時間培養し、細胞数を測定した。GenisteinとEGCGはequolと同様にHeLa細胞の増殖を抑制したが、その作用はPapd5発現低下の影響を受けなかった。一方、daidzeinの細胞増殖抑制作用はequolと同様に、Papd5の発現を低下させた細胞では阻害された(図6)。
【００５９】
＜考察＞
Equolがヒト子宮頸がん細胞株HeLa、ヒト前立腺がん細胞株PC-3、マウスメラノーマ細胞株B16の細胞増殖を抑制することを見出した。さらに、これらの細胞増殖抑制活性にERが関与していないことが明らかとなった。EquolがER非依存的に増殖抑制作用を示すB16細胞からequolの細胞増殖抑制活性を担う遺伝子候補としてPapd5が同定されたことから、Papd5がER非依存性のequolの機能性発現に関与する遺伝子であることが考えられた。RNA干渉法を用いてB16細胞ならびにHeLa細胞におけるPapd5の発現を特異的に低下させると、equolの細胞増殖抑制活性に対する感受性が両がん細胞株から消失した。以上の結果から、Papd5がER非依存性のequolの機能性発現に必須の遺伝子であることが明らかとなった。また、equolの前駆体であるdaidzeinの抗がん作用においても、Papd5が必須の遺伝子であることが明らかになった。
【００６０】
Papd5に関する論文は1報のみで、詳細な機能については不明である。今回の発見は、Papd5を標的とした、全く新しいコンセプトに基づく抗がん剤の開発を可能にするとともに、Papd5の発現量を指標として、抗がん剤の効き方や適応性を診断するためのバイオマーカーとしての利用（診断薬）が期待できる。また、equolの効き方(適応者)を判断するバイオマーカーとしてPapd5を利用した、テーラーメード食品や代替医療剤の開発が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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