(57)【要約】【課題】個々の細胞について分子の機能を総合的に解析することのできる生物試料の画像解析装置、画像解析方法、およびプログラムを提供する。【解決手段】時間経過に従って複数枚の生物試料の分子の分布画像を取得し、取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第１の小領域ごとに分子の移動速度と移動方向とを解析し、取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第２の小領域ごとに分子の分子数と拡散速度とを解析する生物試料の画像解析方法である。【選択図】図１
2013195127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
時間経過に従って複数枚の生物試料の分子の分布画像を取得する取得手段と、
取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第１の小領域ごとに分子の移動速度と移動方向とを解析する移動解析手段と、
取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第２の小領域ごとに分子の分子数と拡散速度とを解析する拡散解析手段と
を有することを特徴とする生物試料の画像解析装置。
【請求項２】
前記取得手段は、全取得期間をＮ（２以上の整数）個のセグメントに区分し、それぞれのセグメントでｎ（自然数）枚の分布画像を取得し、
前記移動解析手段は、１セグメントごとに１枚抽出した複数の分布画像に基づいて解析を実行し、
前記拡散解析手段は、１セグメント内の複数の分布画像に基づいて解析を実行することを特徴とする請求項１に記載の生物試料の画像解析装置。
【請求項３】
前記移動解析手段は、
取得したそれぞれの分布画像内に複数の第１の小領域を設定する設定手段と、
取得した複数の分布画像から任意の２枚の分布画像を選択する選択手段と、
選択した２枚の分布画像について、対応する２つの第１の小領域の画像間の相関を複数の第１の小領域を対象として演算する演算手段と、
前記選択手段と演算手段とを繰り返して実行させて、第１の小領域ごとに分子の移動速度と移動方向とを解析する解析実行手段と
を更に備えたことを特徴とする請求項２に記載の生物試料の画像解析装置。
【請求項４】
前記移動解析手段は、前記分布画像から不動成分、もしくは低速な成分を除去した新たな分布画像に基づいて解析を実行することを特徴とする請求項３に記載の生物試料の画像解析装置。
【請求項５】
前記第１の小領域ごとの分子の移動速度と移動方向とを表す矢印画像を、前記分布画像上の対応する位置に重ねた合成画像を生成することを特徴とする請求項４に記載の生物試料の画像解析装置。
【請求項６】
前記解析の対象となる分子は、シグナル伝達、転写に係るタンパク質、蛍光あるいは発光標識タンパク質であることを特徴とする請求項５に記載の生物試料の画像解析装置。
【請求項７】
時間経過に従って複数枚の生物試料の分子の分布画像を取得し、
取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第１の小領域ごとに分子の移動速度と移動方向とを解析し、
取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第２の小領域ごとに分子の分子数と拡散速度とを解析すること
を特徴とする生物試料の画像解析方法。
【請求項８】
前記分布画像の取得では、全取得期間をＮ（２以上の整数）個のセグメントに区分し、それぞれのセグメントでｎ（自然数）枚の分布画像を取得し、
前記分子の移動の解析では、１セグメントごとに１枚抽出した複数の分布画像に基づいて解析を実行し、
前記分子の拡散の解析では、１セグメント内の複数の分布画像に基づいて解析を実行することを特徴とする請求項７に記載の生物試料の画像解析方法。
【請求項９】
生物試料の画像解析プログラムにおいて、
時間経過に従って複数枚の生物試料の分子の分布画像を取得するステップ、
取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第１の小領域ごとに分子の移動速度と移動方向とを解析するステップ、
取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第２の小領域ごとに分子の分子数と拡散速度とを解析するステップ
をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項１０】
前記分布画像の取得ステップでは、全取得期間をＮ（２以上の整数）個のセグメントに区分し、それぞれのセグメントでｎ（自然数）枚の分布画像を取得し、
前記分子の移動の解析ステップでは、１セグメントごとに１枚抽出した複数の分布画像に基づいて解析を実行し、
前記分子の拡散の解析ステップでは、１セグメント内の複数の分布画像に基づいて解析を実行することを特徴とする請求項９に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料の画像解析装置、画像解析方法、およびプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦＡＴ(Nuclear factor of activated T cell)を例とする転写因子は様々な酵素によって転写活性調節を行っている。ＮＦＡＴは細胞内カルシウム濃度の変化に応じて、カルシニューリンによる脱リン酸化が起こって核内に移行する。この核内移行は細胞内カルシウム濃度の低下や免疫抑制剤によって阻害される。これらの転写活性に伴うシグナル伝達について核内移行を指標として定量化することは、免疫抑制剤などの効果を検討するうえで重要である。  
このようにラベルした分子が刺激などの条件変化によって細胞を移動する場合、従来から解析されている画像処理方法として、分子が移動する前後について複数の小領域を指定し、それら小領域内においてシグナル値の変化を時間と関連付けて移動の程度を定量化するという方法が用いられてきた（例えば、特許文献１，２参照）。
【０００３】
しかし、この方法はダイナミックな分子移動を計測するには精度が低いため、細胞の経時変化とともに分子がどのように移動するかを把握することは出来なかった。  
そこで、分子がある方向性をもって移動する場合の変化量の計測方法として、ＳＴＩＣＳ（Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy）が提案されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、分子が自由拡散する場合の計測法として、ＦＣＳ（Fluoresce Correlation Spectroscopy）、ＦＲＡＰ，ＲＩＣＳ（Raster-scan Image Correlation Spectroscopy）などの拡散計測法が知られている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２５０６５２号公報
【特許文献２】特表２００５−５１９６２５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Probing the integrin-actin linkage using high-resolution protein velocity mapping.”, J.Cell Society, 2006, 119, 5204-14, Brown CM. et.al.
【非特許文献２】“Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope.”, Biophysic. J., 2005 ,89(2).
【非特許文献３】“Cell Nucleus: Organization & MechanoBiology”, “Fluorescence Fluctuation Microscopy to Reveal 3D Architecture and Function in the Cell Nucleus.”, Thorsten Lenser, et.al., METHODS IN CELL BIOLOGY, VOL. 98 , 2-33, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの計測法を用いて分子の挙動を解析しようとしても、それぞれの特徴が有効に生かされていないために、個々の細胞について分子の機能を解析し検討を進める際には限界があった。  例えば、ＲＩＣＳは特定領域の分子拡散を定量化することによって、分子のサイズ情報が得られるが、その分子の移動方向についての情報は得られない。一方、ＳＴＩＣＳでは分子の方向と移動速度が求められるが、分子サイズは分からない。このように、細胞の経時変化とともに移動する分子の情報はＳＴＩＣＳによって把握されるものの、ＲＩＣＳ計測による局所における分子の経時変化との対応付けは十分なされていない。
【０００８】
本願発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、個々の細胞について分子の機能を総合的に解析することのできる生物試料の画像解析装置、画像解析方法、およびプログラムを提供する事を解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための本発明は、時間経過に従って複数枚の生物試料の分子の分布画像を取得し、取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第１の小領域ごとに分子の移動速度と移動方向とを解析し、取得した分布画像に基づいて当該分布画像内に設定した複数の第２の小領域ごとに分子の分子数と拡散速度とを解析する生物試料の画像解析方法である。
【発明の効果】
【００１０】
この発明によれば、個々の細胞について分子の機能を総合的に解析することのできる生物試料の画像解析装置、画像解析方法、およびプログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本実施の形態の画像解析方法が適用されるレーザ顕微鏡システムの構成を示す図。
【図２】本実施の形態の画像解析方法を説明するための図。
【図３】本実施の形態の画像解析方法を説明するための図。
【図４】本実施の形態の解析方法の一例を説明するための図。
【図５】本実施の形態の解析方法によってサイトカラシンＤによるアクチン分子の移動方向と移動速度とを解析した２つの例を示す図。
【図６】本実施の形態の画像解析方法の精度の良い測定に関連する諸量を示す模式図。
【図７】本実施の形態の画像解析方法のフレームの取得動作を説明する図。
【図８】本実施の形態の画像解析方法の空間相関演算の内容を説明するための図。
【図９】本実施の形態の画像解析方法の相関関数図を示す図。
【図１０】本実施の形態の画像解析方法のフィッティング方法を説明するための図。
【図１１】本実施の形態の画像解析方法で取得した画像を示す図。
【図１２】本実施の形態の画像解析方法のうちＳＴＩＣＳ解析を行った結果を示す図。
【図１３】本実施の形態の画像解析方法のうちＲＩＣＳ解析に用いた画像を示す図。
【図１４】本実施の形態の画像解析方法のうちＲＩＣＳ解析を行った結果を示す図。
【図１５】本実施の形態の画像解析方法の概略の手順を示すフロー図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１は、本実施の形態の画像解析方法が適用されるレーザ顕微鏡システムの構成を示す図である。  
レーザ顕微鏡システムは、顕微鏡本体１、レーザコンバイナ２、スキャンユニット３、ディテクタユニット４、コントロールユニット５、表示装置６及び記憶装置７を備えている。
【００１３】
レーザコンバイナ２に設けられた１つのレーザ光源から出射したレーザ光は、ダイクロイックミラー（不図示）で反射された後スキャンユニット３に入射する。このスキャンユニット３によって、光軸はＸ軸、Ｙ軸方向に偏向走査され、顕微鏡本体１の対物レンズ（不図示）に入る。これによって視野内の焦点面上にある蛍光標識されたサンプル試料の任意の位置に、測定領域（焦点領域）を位置することができる。
【００１４】
焦点領域内の蛍光分子から発した蛍光は同じ対物レンズで補足され、逆の光路を通りダイクロイックミラーに導かれる。ダイクロイックミラーでは、励起光と比べ波長の長い蛍光を透過するように設計されており、蛍光はディテクタユニット４に到達する。ディテクタユニット４としてはＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）、あるいは光電子増倍管などが好適である。
【００１５】
ディテクタユニット４で光電変換された蛍光の強度信号は、コントロールユニット５に入力される。コントロールユニット５では、解析ソフトウエアによって解析（ＳＴＩＣＳ、ＲＩＣＳ）が行われる。コントロールユニット５は、ディテクタユニット４からの蛍光強度信号と、スキャンユニット３からの走査位置情報とを対応づけて解析を行う。解析した結果は、適宜、表示装置６に表示され、また記憶装置７に記憶される。
【００１６】
なお、本レーザ顕微鏡システムでは、複数のレーザ光源を用いて波長の異なる複数の蛍光像を得ることができるが、以下の説明では１つのレーザ光源により得られた蛍光像を用いて解析する態様について説明する。
ＲＩＣＳが基本的に１フレームのスキャンイメージをもとに計算する相関解析であるのに対して、ＳＴＩＣＳは連続フレーム画像から分子移動を計測する時空間相関解析であり、分子が移動する方向と速度について情報が得られる点に特徴があり、細胞内での分子の流れ方向と速さからシグナル伝達系の機能解析が可能となる。
【００１７】
ＲＩＣＳは、画像中の各画素が取得される時間に差異があることを利用し、二点の蛍光強度の時間空間相関を測定する手法である。ＲＩＣＳを用いることで、例えば、蛍光修飾された分子の拡散係数を測定することができる。
そして、ＳＴＩＣＳ、ＲＩＣＳを代表とする分子拡散計測においては、画像の中から解析を行いたい一部分を選び出し、その範囲内で数値的な処理を行うことが良く行われている。その画像中の一部分は関心領域あるいはＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）と呼称されている。ＲＯＩ内の小領域に注目してその領域における分子拡散情報を求めることによって、複雑な細胞形態が反映される妥当な分子動態を評価することが可能になる。
【００１８】
図２は、本実施の形態の画像解析方法を説明するための図である。  
本実施の形態の画像解析方法では、取得した生物試料の画像に対してＳＴＩＣＳ解析とＲＩＣＳ解析とを協働して実行する。
ＳＴＩＣＳ解析では、全測定期間をＮ個の時間セグメントに区分して、おのおのの時間セグメントにおいて１枚の画像を取得し、取得した複数枚（Ｎ枚）の画像について解析を実行する。一方、ＲＩＣＳ解析では、おのおのの時間セグメントにおいてｎ枚の画像を取得し、そのｎ枚の画像について解析を実行する。このような画像解析方法は、ＳＴＩＣＳ解析が長い時間スパンでの分子の移動を解析するのに対して、ＲＩＣＳ解析は短い時間における分子拡散を解析するという、それぞれの適用する対象の特性に対応させたものである。
【００１９】
続いて、ＳＴＩＣＳ解析とＲＩＣＳ解析との処理内容を説明する。  
なお、以下に説明するＳＴＩＣＳとＲＩＣＳに関する技術は、公知のＳＴＩＣＳとＲＩＣＳそのままではない。本願の技術課題を解決するために、公知の技術に改良を加えたものである。但し、説明のために、ＳＴＩＣＳ、ＲＩＣＳなる用語を用いる。
【００２０】
[ＳＴＩＣＳ解析]  
本実施の形態では、説明のため、連続画像の空間座標ｘおよびｙと時間座標ｔを整数として取り扱う。撮影倍率と撮影間隔から決定する比例係数を掛ける事により、容易に試料の実際の位置および撮影時間に換算する事が可能である。また、説明のために画像は二次元であるとしたが、共焦点顕微鏡などによって撮影された立体的な情報を持つ三次元画像に対しても、容易に拡張可能である。
【００２１】
図３は、本実施の形態の画像解析方法を説明するための図である。  
生物試料を、Ｍ×Ｍ（ピクセル）の大きさの画像で一定時間間隔で撮影して、Ｎ枚の連続画像を取得する。このＮ枚の連続画像から時間間隔τである２枚（１組）の画像について画像相関演算を行う。Ｎ枚の連続画像からは、（Ｎ−τ）組の画像について画像相関演算が行われる。図３では、τ＝２の場合を示している。
【００２２】
次に、画像相関演算によって得られた（Ｎ−τ）枚の相関像を平均した平均画像相関像を求める。平均画像相関像は、それぞれの相関像の対応するピクセル位置の画像データを加算して平均値を演算することで求めることが出来る。
以上の処理を数式で表す。  
時刻ｔに取得された座標（ｘ、ｙ）における画像の信号強度がＩ（ｘ、ｙ；ｔ）である時、平均画像相関は、式（１）で表される。  
【数１】
2013195127.tif 000003
【００２３】
式（１）、式（２）中の〈Ｉ（ｘ、ｙ；ｔ）〉は、Ｍ×Ｍ（ピクセル）の大きさの画像のｘおよびｙについて画像データを平均化することを示している。すなわちｘ、ｙ、ｔの関数Ｆに対して、〈Ｆ（ｘ、ｙ；ｔ）〉は式（３）で定義される。
【数２】
2013195127.tif 000004
【００２４】
なお、ｘおよびｙについて、周期的境界条件、すなわち、整数ｎおよびｍについて、Ｆ（ｘ＋ｎＭ、ｙ＋ｍＭ；ｔ）＝Ｆ（ｘ、ｙ；ｔ）が成立する場合は、式（１）の分子に記載される相互相関関数はフーリエ変換を用いて高速に計算する事が可能である。
【００２５】
また、時間とともに試料中の発現分布が移動する事を鋭敏に捕らえるために、解析する時間区分内で不動な成分、もしくは低速な成分を予め除去しておくことができる。除去の方法は、各座標ごとに信号強度変化の低周波成分を除去しても良い。あるいは、定常成分を除去しても良い。すなわち、移動成分Ｉｍｏｖを式（４）に従って計算し、Ｉｍｏｖを式（１）のＩ（ｘ、ｙ；ｔ）の代わりに用いても良い。
【数３】
2013195127.tif 000005
【００２６】
次に、平均画像相関像を用いた解析方法について説明する。  
図４は、本実施の形態の解析方法の一例を説明するための図である。
連続画像中の分布画像が時間とともに特定の方向へ移動しているとき、上述の方法によって得られる平均画像相関像Ｒ（ξ、η、τ）は画像の中心（Ｍ／２、Ｍ／２）から外れた位置に極大値を持つ分布画像となる。この極大値の位置を決定する方法の一つとして、ガウシアン分布を仮定して、相互相関画像に対して当てはめを行う方法がある。
【００２７】
すなわち、式（５）で表されるガウシアンをＡ、β、ｐ、ｑ、Ｃを可変パラメータとして平均画像相関像に対して最小二乗法によって当てはめを行う。
【数４】
2013195127.tif 000006
【００２８】
当てはめによって得られたｐ、ｑが、時間間隔τにおける平均画像相関像の極大位置（ｐτ、ｑτ）である。従って、遅延時間τ（＝１〜Ｎ−１）ごとに平均画像相関像の極大位置（ｐτ、ｑτ）が決定される。
[移動速度]  
画像中の分布の移動速度（ｖｘ、ｖｙ）は、式（６）で表される極大位置と遅延時間の比例係数ｖｘ、ｖｙとして決定される。
【数５】
2013195127.tif 000007
【００２９】
統計的に正確なｖｘ、ｖｙを導出するため、図４に示すように、最小二乗法などを用いた回帰分析によって比例係数ｖｘ、ｖｙを算出しても良い。
[移動速度の分布]  
Ｍ×Ｍ（ピクセル）の全体画像に内包される、ｍ×ｍ（ピクセル）の部分領域内の画像に対して上述の解析を行う事により、その部分領域内での局所的な移動速度を導出する事が出来る。すなわち、ｘがｘｉからｘｉ＋ｍ−１で、ｙがｙｉからｙｉ＋ｍ−１である部分領域Ａｉに対して画像相関を計算し、その部分領域に対する移動速度を決定することができる。多数の部分画像について局所的な移動速度を求める事によって、移動速度の分布を得る事が出来る。
【００３０】
[ベクトル表示]  
上述の解析方法によって得られた、移動速度は、画面上に表示する事によって、結果を可視化し、利用者が結果を視覚的に理解する事を補助する事が出来る。表示方法としては、例えば、図４の右下に示すように、連続画像上に速度ベクトルを表す図形を重ねて表示する方法が考えられる。速度ベクトルを表す図形としては、長さが移動速度の大きさに比例し、矢頭がベクトルの方向を示す矢印がある。また、矢印の色彩を速度の大きさに応じて表示する事も出来る。
【００３１】
図５は、本実施の形態の解析方法によって、培養細胞の細胞質から細胞核へと転写因子が移行する様子を解析した例を示す図である。転写因子の移動方向と移動速度とが細胞の画像に重ねて表示されている。
図５に示す図は、次のような手順によって作成した。  
まず発光イメージを記録した連続画像に対して、小領域（ＲＯＩ）を縦横方向に所定ピクセルずつずらしながら、各ＲＯＩについて処理を実行した。  
各ＲＯＩ中の処理は以下のように行った。
【００３２】
ステップ１：時間間隔τである二枚の画像をついての相互相関画像を計算し、複数枚の相互相関画像について平均化して相互相関平均画像を得た。この処理をτを変化させて繰り返して実行し、各τについて相互相関平均画像を得た。
ステップ２：各τ値に対する相互相関平均画像から、ピーク値の位置を求めた。ピーク値の位置は、二次元ガウシアン関数を元の画像に対して最小二乗法によるフィッティングを行い、ガウシアンの頂点の位置から決定した。
【００３３】
ステップ３：各τ値に対するピークの位置（ｘτ、ｙτ）から、そのＲＯＩでのシグナル移動速度を導出した。シグナル移動速度のｘ軸成分値ｖｘの導出は、各τ値に対するｘ軸ピーク位置ｘτに対してｘτ＝ｖｘ×τを最小二乗法によって当てはめる事によって行った。ｙ軸成分についても同様の方法によってｖｙを導出した。
【００３４】
ステップ４：ピーク位置が同定できない場合は、同定出来た時間間隔の範囲のデータに基づいて速度を導出した。ピーク位置がτ＞０について同定出来なかった場合は、有意な速度成分が無いものとみなし、そのＲＯＩについての速度成分は不定とした。
ステップ５：各ＲＯＩにおけるシグナル移動速度は、ＲＯＩの中心座標から、速度の向きで速度の大きさに比例する長さの矢印を描画する事によって表示を行った。
これによって、転写因子の移動がどのように行われるかをより詳細に把握することが可能となっている。
【００３５】
[ＲＩＣＳ解析]  
続いて、ＲＩＣＳ解析の内容について詳細に説明する。このＲＩＣＳ解析ではレーザスキャンにより得られた画像におけるピクセル毎の蛍光強度シグナルを空間相関演算することにより、標識した分子数及びその拡散定数を求める。
【００３６】
＊ステップ１：ターゲット（蛍光）分子がピクセル毎に検出できるようにレーザ光をスキャンする。  
図６は、本実施の形態の画像解析方法の精度の良い測定に関連する諸量を示す模式図である。  
図６には、ターゲット１０の移動する速度（軌跡）と、ターゲット１０に照射されたレーザスポット１１の大きさと、検出素子のピクセル位置（１，２,・・・）とが表されている。
【００３７】
図６によれば、ターゲットの動く速さ、スキャンスピード及びピクセルサイズ（１ピクセル当りの実サイズ）との間には密接な関係があることがわかる。従って、ターゲットの分子数、拡散速度などをＲＩＣＳ解析によって求める際には、図６に示す諸量が適正な値となるように設定されることが重要である。
【００３８】
＊ステップ２：設定したフレーム内でレーザをスキャンする。このスキャンを複数回実行して複数のフレームを取得する。  
図７は、本実施の形態の画像解析方法のフレームの取得動作を説明する図である。  
１つのフレーム１２のサイズ（縦長さ×横長さ）はステップ１において解析者が設定する。レーザ光は、このフレーム領域内をスキャンユニット３によって走査される。例えば、フレーム領域の左上の位置から右方向にレーザ光を１ライン走査し、続いて１段下のラインを左から右方向に走査する。この動作を一番下のラインまで繰り返して１フレーム走査を完了する。  
このフレーム走査を同様にして複数回繰り返して実行して、複数のフレーム画像を取得する（ｔ＝０〜ｎ）。
【００３９】
ここで、１ピクセルを走査する時間はμｓｅｃのオーダであり、１ラインを走査する時間はｍｓｅｃのオーダであり、１フレームを走査する時間はｓｅｃのオーダである。１フレーム走査時間を例えば１秒とし、１００枚のフレームを取得する場合は、計測時間は約１００秒となる。
【００４０】
原理的に、空間相関演算を行うためには、１枚のフレーム画面で十分である。しかし本実施の形態では、取得フレーム数を増やすことによって空間相関演算に関する平均計算を行っている。フレーム数を増やして相関関数の平均値を計算することによって遅い動きの分子情報を除去することが可能である。
【００４１】
＊ステップ３：空間相関演算を実行する。  
空間相関演算は、以下の相関関数式に従って実行する。  
【数６】
2013195127.tif 000008
【００４２】
図８は、本実施の形態の画像解析方法の空間相関演算の内容を説明するための図である。  
２枚の同一フレーム１２を、Ｘ軸方向にξ、Ｙ軸方向にψだけずらして重ね合わせる。そして、重なり合った位置の蛍光強度値を乗算した値をフレーム全体にわたって加算する。加算結果を正規化した値を点（ξ、ψ）における空間相関値とする。このξ、ψを２次元平面上で変化させて、２次元の空間相関値を取得する。
【００４３】
次に、他のフレームについてもそれぞれ２次元の空間相関値を演算する。そして、このようにして取得した複数の空間相関値をそれぞれの点について平均処理して、相関関数図（空間相関関数図）を得る。
図９は、本実施の形態の画像解析方法の相関関数図を示す図である。  
上述の式からわかるように、図９の中心に位置する原点（０，０）において、相関関数値は最大値（＝１）をとる。
【００４４】
＊ステップ４：相関関数演算の結果得られる相関関数図を用いてフィッティング演算を行う。  
このようにして得られた相関関数図に基いて高さ方向（Ｚ軸方向）に蛍光強度値をプロットすると、原点を中心とした山形の形状が得られる。この測定した形状を、複数の基準パターンの形状と比較して、良くフィットする基準パターンを特定する。
【００４５】
図１０は、本実施の形態の画像解析方法のフィッティング方法を説明するための図である。  
図の下側には、演算によって得られた相関関数値を３次元で表している。図の上側には、ある基準パターンとの差を３次元で表している。この差が最も小さいと評価される基準パターンを特定する。そして、特定された基準パターンに対応する分子数と拡散速度とをサンプルの平均分子数と平均拡散速度として得ることができる。
【００４６】
続いて、本実施の形態の画像解析方法を適用した実施例を説明する。
転写因子であるＮＦＡＴ（Nuclear factor of activated T cell）に蛍光蛋白質ＥＧＦＰを融合させた蛋白質（以下ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰ）をＵ２ＯＳ細胞にて発現させ、細胞内カルシウム濃度を高めるためにカルシウムイオノフォアであるＡ２３１８７（２μｇ／ｍｌ）を培養液に加え、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰが培養細胞（Ｕ２ＯＳ）の細胞質から細胞核へと移行する様子をレーザー共焦点蛍光顕微鏡（ＦＶ１０００：Ｏｌｙｍｐｕｓ）にて画像取得してＳＴＩＣＳにて解析した。
【００４７】
Ａ２３１８７の刺激スタート後、画像を２５６ｘ２５６サイズ、３０秒間隔でトータル６０フレームを取得した。その後、細胞外液からＡ２３１８７を除いてからさらに１２０フレームの画像を取得した。それぞれにおいてＳＴＩＣＳ解析を行い、分子の移動速度と方向を矢印にてマップ化した。マップでは最大速度０．００１５μｍ／ｓｅｃを赤色矢印で示し、それ以下については画面中スケールに従って表示した。
【００４８】
また、上記と同様の細胞、発現蛋白質、刺激薬品などの条件において核内ドメインのサイズ変化についてＲＩＣＳ解析を行った。具体的には、分子の移動を示すタイムラプス画像取得の際に、適当な時間間隔でＲＩＣＳ計測に相応しいパラメータ設定（スキャンスピード：１２．５μｓｅｃ／ｐｉｘｅｌ，画像サイズ：２５６ｘ２５６ｐｉｘｅｌｓ，ピクセルサイズ：０．０５〜０．０６２μｍ／ｐｉｘｅｌ，取得フレーム数：５０〜１００）のもとで画像取得した。
【００４９】
図１１は、本実施の形態の画像解析方法で取得した画像を示す図である。図１１（１）は、Ａ２３１８７の刺激スタート（カルシュウム濃度を増加）後の推移画像を示し、図１１（２）は、Ａ２３１８７を除去後の推移画像を示す。
図１１（１）によれば、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰ発現Ｕ２ＯＳ細胞は、定常状態においてＮＦＡＴ局在は細胞質のみに現れ、核内にはほとんどＮＦＡＴは存在しない（フレーム１）。Ａ２３１８７による刺激後、ＮＦＡＴは時間とともに核内へ移行するにつれて細胞質のＮＦＡＴは減少し、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰの蛍光強度は低下した（フレーム２０〜６０）。核内では移動したＮＦＡＴ−ＥＧＦＰによる蛍光強度が増加し、核内ドメイン凝集体が形成された。核内ドメインはＮＦＡＴの移行量が増加するにつれてその大きさが大きくなった。
【００５０】
ＮＦＡＴの移行がほぼ終了したと考えられる時点で、細胞外溶液であるＯＰＴＩ−ＭＥＭメディウムからＡ２３１８７を取り除くために何度かＯＰＴＩ−ＭＥＭで細胞を洗浄した。その後、観察を続けると、図１１（２）に示したように、核内ドメインの蛍光は次第に減少し、その反対に細胞質のＮＦＡＴ−ＥＧＦＰが回復する様子が観察された（フレーム１〜１２０）。
【００５１】
図１２は、本実施の形態の画像解析方法のうちＳＴＩＣＳ解析を行った結果を示す図である。
取得した画像フレームを用いてＳＴＩＣＳ解析を行った結果、図１２に示すように細胞内のいくつかの選択箇所において矢印の色と大きさによって、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰの移動方向と速度を表示できた。図１２（１）は、細胞質から核へと移動するＮＦＡＴ−ＥＧＦＰの方向と移動速度を表すマップ図である。図１２（２）は、核から細胞質へと戻るＮＦＡＴ−ＥＧＦＰの方向と移動速度を表すマップ図である。  
図１２（１）では、核付近において細胞質から核へ、つまり内側への向きを示す箇所が多いのに対して、図１２（２）では、核である内側から細胞質の外側へと向きを示す様子が見られた。但し、図１２（２）では、核から外に向かう矢印はそれほど明確ではなく、逆に核に向かう動きも見られた。
【００５２】
図１３は、本実施の形態の画像解析方法のうちＲＩＣＳ解析に用いた画像を示す図である。
図中の矢印に沿った、Ｎｏ．１〜５の図が、Ａ２３１８７の刺激スタート（カルシュウム濃度を増加）後の推移画像を示し、Ｎｏ．６〜１１の図が、Ａ２３１８７を除去後の推移画像を示す。各図中に表された小領域はＲＯＩを表している。Ｎｏ．１の図では、ＲＯＩが核（図中左側の部分）と細胞質（図中右側の部分）の境界付近に設定されていることがわかる。Ｎｏ．３以降の図では、この境界部分が不明瞭となっているが、ＲＯＩの位置は核内に固定されている。設定されたＲＯＩ中には、ＮＦＡＴ−ＥＧＦＰが輝点として表されている。
【００５３】
図１３を参照すると、ＮＦＡＴの核内移行とともに核内ドメインのサイズは大きくなる傾向があり、ＮＦＡＴが核外に戻る際にはそのサイズは再び小さくなっていることがわかる。
図１４は、本実施の形態の画像解析方法のうちＲＩＣＳ解析を行った結果を示す図である。図１４（１）は、ＲＯＩにおける拡散係数Ｄの推移を示し、図１４（２）は、ＲＯＩにおける分子数の推移を示している。また、図中の点線は、Ａ２３１８７を取り除いたタイミングを示している。
【００５４】
図１４（１）では、分子数ＮはＮＦＡＴ核内移行に伴い減少した。このことから、図１３（１−５）では、ＮＦＡＴが寄り集まって見かけ上サイズが大きくなっているが、ＲＩＣＳの解析結果からは分子数としては減ることが示唆されている。ＮＦＡＴの核外移行においては、その逆に図１３（６−１１）では、集積したＮＦＡＴが徐々に分散してサイズが小さくなっていく様子が示され、ＲＩＣＳの解析結果からはこの結果として分子数が戻ることが示された。
【００５５】
一方、図１４（２）では、ＲＯＩにおける拡散係数ＤはＮＦＡＴ核内移行とともに小さくなった。これは、ＮＦＡＴが凝集してサイズが大きくなったために動きが抑制されていることを示している。ＮＦＡＴの核外移行については、Ｄ値は元のレベルに戻る傾向ではあったが、その程度は核内移行に比べて顕著ではなかった。このことは、ＳＴＩＣＳ解析を行った図１２のマップ図において、核外移行のＮＦＡＴの移動方向が、核内移行のＮＦＡＴの移動方向よりも大きくバラついていることからも裏付けられ、ＲＩＣＳの解析からは、一度核内ＤＮＡなどに結合したＮＦＡＴの動きが依然として抑制されていることを示唆した。このように、ＳＴＩＣＳおよびＲＩＣＳの各原理を組み合わせることにより、従来の解析では発見および／または説明できなかった分子サイズと動態の両方を総合判断できるような解析データを提供できることが分かった。
【００５６】
以上の結果から、ＲＩＣＳとＳＴＩＣＳとの比較において、ＲＩＣＳは特定領域の分子拡散を定量化することが出来るが、その分子の移動方向などについての情報を得ることはできない。一方、ＳＴＩＣＳでは分子の方向と移動速度が求められるが、分子サイズは不明である。これに対し、本実施の形態の画像解析方法を用いた上述の実施例によれば、ＳＴＩＣＳによって細胞全体を移動するＮＦＡＴの移動方向と速度を求めることができ、ＲＩＣＳによって核に移動したＮＦＡＴ分子の拡散定数より核内ドメインと凝集するＮＦＡＴ含有体のダイナミックな変化を捉えることが出来た。
【００５７】
このように、ＳＴＩＣＳとＲＩＣＳという二つの手法を同一対象について同一のタイミングで適用することによって、ＮＦＡＴ転写因子の機能プロセスを複数の解析結果を組み合わせて検討することが可能となった。
なお、本解析の対象となる分子は、上述の転写因子に限られず、シグナル伝達、転写に係るタンパク質、蛍光あるいは発光標識タンパク質など広い対象に適用される。
【００５８】
図１５は、本実施の形態の画像解析方法の概略の手順を示すフロー図である。このフロー図は、図１に示すコントロールユニット５の動作を表している。
ステップＳ０１において、コントロールユニット５は、作業者から入力された共焦点レーザ顕微鏡の動作条件などを取得する。例えば、ＳＴＩＣＳとＲＩＣＳについての画像取得時刻、取得周期、取得間隔、取得枚数、取得条件（光源種類、露光時間、フィルタ種類など）などの情報を入力する。
【００５９】
ステップＳ０２において、コントロールユニット５は、入力された動作条件に従って、レーザコンバイナ２、スキャンユニット３を制御して、ディテクタユニット４に生物試料の画像を取得させる。コントロールユニット５は、ディテクタユニット４から送られる連続画像を受信して記憶装置７に当該連続画像を識別する情報と共に保存する。
【００６０】
所定の画像取得動作（例えば所定サイクルの連続画像の取得を終了したときなど）が実行されたときは、コントロールユニット５（解析ソフトウエア）が、記憶装置７に格納された連続画像の解析を実行する。
ステップＳ０３において、コントロールユニット５は、取得した画像に基づいてＳＴＩＣＳ解析を実行する。ＳＴＩＣＳ解析は、図５を参照して説明したステップ１乃至５の処理を実行することで行われる。  
なお、ＳＴＩＣＳ解析において、式（４）で示す画像中から移動成分を抽出して（不動成分もしくは低速な成分を除去して）画像相関を演算することにより、Ｓ／Ｎの高い結果を得ることができる。
【００６１】
ステップＳ０４において、コントロールユニット５は、取得した画像に基づいて、作業者から指定されたＲＯＩについて、ＲＩＣＳ解析を実行する。解析は、図６乃至図１０を参照して説明したステップ１乃至４の処理を実行することで行われる。
ステップＳ０５において、コントロールユニット５は、解析結果を出力する。出力する解析結果としては、例えば、解析結果データの他に、それぞれの解析に用いた連続画像、生物試料の画像に移動速度ベクトルを重ねたマップ図、拡散係数の推移図、分子量の推移図などである。
【００６２】
以上説明した処理手順によれば、生物試料の画像取得終了後、短時間で（直ちに）解析結果を得ることができる。  
なお、上述の処理は全自動で実施しても良く、またステップごとに作業者の指示に従った処理を実行するように構成しても良い。更に上述の処理は、種々変形した態様で実施することができる。例えば、ステップＳ０２で取得した画像に基づいて、作業者がＲＩＣＳ解析用のＲＯＩを指定し、ステップＳ０３のＳＴＩＣＳ解析とステップＳ０４のＲＩＣＳ解析とを並行して実施するように構成しても良い。また、本実施の形態の画像解析装置によれば、ステップＳ０３のＳＴＩＣＳ解析とステップＳ０４のＲＩＣＳ解析とをそれぞれ単独で実施することも可能である。
【００６３】
なお、上述の各実施の形態で説明した機能は、ハードウェアを用いて構成するに留まらず、ソフトウェアを用いて各機能を記載したプログラムをコンピュータに読み込ませて実現することもできる。また、各機能は、適宜ソフトウェア、ハードウェアのいずれかを選択して構成するものであっても良い。
【００６４】
尚、本発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。  
上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
この発明は、個々の細胞について分子の機能を総合的に解析することのできる生物試料の画像解析方法、画像解析装置、画像撮影装置およびプログラムを提供する産業で利用することができる。
【符号の説明】
【００６６】
１…顕微鏡本体、２…レーザコンバイナ、３…スキャンユニット、４…ディテクタユニット、５…コントロールユニット、６…表示装置、７…記憶装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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