(57)【要約】【課題】レジオネラ・ニューモフィラ核酸を検出するための組成物及び方法の提供。【解決手段】レジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ若しくは２３ＳｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに特異的なプライマー、試料調製のための捕捉プローブ、及び検出プローブを含有する、増幅オリゴマーとして用いうる核酸配列としての組成物を開示する。開示した組成物を使用し、１６ＳｒＲＮＡ配列若しくは１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡをインビトロ核酸増幅させて検出可能な増幅生成物を製造することを含む方法で、試料中のレジオネラ・ニューモフィラの存在を検出する方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
［０００１］  本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  １１９（ｅ）に基づき、米国仮特許出
願第６０／７２７，８８３（２００５年１０月１７日出願）及び６０／７３５，７０９（
２００５年１１月９日出願）に基づく優先権を主張し、これらを共に援用する。
【０００２】
発明の分野
［０００２］  本発明は、分子生物学的方法を用いて試料中の細菌の存在を検出するこ
とに関し、特にレジオネラ・ニューモフィラ（在郷軍人病菌）（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  
ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）核酸配列を増幅し、増幅した核酸配列を検出することにより、
試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出することに関する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］  １つの属レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）からなるレジオネラ科（
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｅ）は、湿潤環境で淡水産原虫の細胞内寄生菌として見出された偏
好性グラム陰性菌である（Fields, et al., 2002, Clin. Microbiol. Rev. 15(3): 506-5
26）。レジオネラ科の菌は、その細菌を含有する水又はエアロゾルを感受性宿主が吸入又
は吸引した場合、哺乳動物細胞内で増殖してヒトの呼吸器疾患を誘発する可能性がある。
少なくとも４８種のレジオネラ属菌が知られているが、レジオネラ・ニューモフィラは肺
炎を伴う重篤な多臓器系疾患をもたらすレジオネラ症の大部分の報告症例に関与しており
、他の大部分のレジオネラ症の症例はレジオネラ・ボゼマニイ（Ｌ．ｂｏｚｅｍａｎｉｉ
）、レジオネラ・デュモフィイ（Ｌ．ｄｕｍｏｆｆｉｉ）、レジオネラ・ロングビーチェ
（Ｌ．ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ）及びレジオネラ・ミクダデイ（Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉ）
が原因である。
【０００４】
［０００４］  レジオネラ菌は多数の検体タイプから多様な方法で検出できる。気管支
鏡検査、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）又は肺生検の検体から得られる細菌を特殊な緩衝化木
炭酵母エキス培地（ＢＣＹＥ）で培養するのは感受性が高く正確であるが、最大回収率を
得るために最高２週間のインキュベーション、続いてコロニー形態検査、グラム染色及び
血清学的検査、例えばイムノアッセイの組合わせによる細菌同定が必要である。培養して
いない臨床検体中のレジオネラ菌を免疫蛍光法又はラジオイムノアッセイ法で直接検出す
ることはできるが、当該試験法の感受性はより低い場合が多い。レジオネラ症は尿中のレ
ジオネラ・ニューモフィラ血清グループ１の可溶性多糖抗原を間接検出して診断できるが
、当該アッセイ法は血清変換に遅延時間を要し、診断有用性に限界があり、環境試験に用
いても検出できない。ＤＮＡプローブ又は核酸増幅とＤＮＡプローブの組合わせを用いて
レジオネラ・ニューモフィラのｍｉｐ遺伝子を含めたレジオネラ菌遺伝子配列を検出する
分子診断試験法が開発された。当該方法では、多様な検体中のレジオネラ菌由来の核酸の
存在が、多様な特異度及び感度で検出される。しかし、該試験法の多くが労力集約的であ
って実施に少なくとも１日を要し、擬陽性結果を生じる汚染を受けやすい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
［０００５］  レジオネラ菌は水生環境及び湿潤環境、例えば溜め池や冷却塔の水中で
長期間にわたって生存及び持久できるので、院外感染又は院内感染の原因となる可能性が
ある。したがって、感染源を正確に検出し、排除して感染を阻止できるように、環境試料
中のレジオネラ菌、特にレジオネラ・ニューモフィラを検出するための迅速で感度の高い
正確な方法が求められている。感染者を速やかに処置して罹病、死亡及び感染拡大を制限
できるように、ヒトのレジオネラ・ニューモフィラ感染を迅速かつ正確に検出できる方法
も求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
［０００６］  レジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ ｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮ
Ａ又はそれらをコードするＤＮＡに含まれる標的配列を増幅及び検出することにより、環
境試料又は感染したヒトから得た生物検体を含めた試料中のレジオネラ・ニューモフィラ
を検出する方法を開示する。本明細書に開示する特異的なプライマー及びプローブを用い
て、本発明方法によりレジオネラ・ニューモフィラの１６Ｓ及び／又は２３ＳｒＲＮＡ
配列中の標的配列を増幅し、増幅生成物を検出する。ある態様では増幅工程中に特異的増
幅生成物の発現をモニターし、一方、他の態様では増幅工程後に増幅生成物を検出する。
ある方法態様は、内部対照又は検量体、例えば非レジオネラ菌配列の検出を含む。
【０００７】
［０００７］  試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出するための、下記の工程を
含む方法を開示する：１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ
であるレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製し、配列番号３０、
３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５
３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレ
オチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２
、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オ
リゴヌクレオチドと組み合わせたものを、試料と混合し、核酸ポリメラーゼ活性がある酵
素及び核酸前駆物質を供給して、第１及び第２増幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ
・ニューモフィラの標的核酸を含有する増幅用混合物を調製し、レジオネラ・ニューモフ
ィラの標的核酸にハイブリダイズした少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端
を、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び鋳型としてのレジオネラ・ニューモフィラの標
的核酸を用いてインビトロで延長して増幅生成物を製造し、そして増幅生成物を検出して
、試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することの指標とする。ある態様では、検
出する工程で、増幅生成物を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、６２、６３、６４及び６５から選択される検出プローブオリゴマーに特異的にハ
イブリダイズさせる。ある態様は、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオネラ・ニュ
ーモフィラの標的核酸を試料から捕捉する試料処理工程をも含み、これは好ましくは、配
列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列を含む捕捉プローブ
オリゴマーを用いることにより行われ、標的特異的配列は３’テール配列に共有結合して
いてもよい。ある態様では、混合工程に、配列番号２９と配列番号３１、配列番号２８と
配列番号３１、配列番号２９と配列番号３３、配列番号２８と配列番号３３、配列番号４
１と配列番号４６、配列番号４１と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配列番
号５４と配列番号５５、配列番号５１と配列番号４３、配列番号５２と配列番号４３、配
列番号５１と配列番号４５、配列番号５２と配列番号４５、配列番号６０と配列番号５８
及び配列番号５６、配列番号６０と配列番号５９及び配列番号５６、配列番号６０と配列
番号５８及び配列番号５７、配列番号６０と配列番号５９及び配列番号５７、配列番号６
１と配列番号５８及び配列番号５６、配列番号６１と配列番号５９及び配列番号５６、配
列番号６１と配列番号５８及び配列番号５７、並びに配列番号６１と配列番号５９及び配
列番号５７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌ
クレオチドの組合わせを用いる。ある好ましい態様では、混合工程に、配列番号２９と配
列番号３１、配列番号２８と配列番号３１、配列番号４１と配列番号４６、配列番号４１
と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配列番号５４と配列番号５５、配列番号
５２と配列番号４３、及び配列番号５２と配列番号４５からなる群から選択される、第１
増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる。
【０００８】
［０００８］  配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４
１、４２、４３、４４、４５、５３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少な
くとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７
、４８、４９、５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択
される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを含む、インビト
ロでの増幅を用いてレジオネラ・ニューモフィラの１６ＳｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲ
ＮＡ配列をコードするＤＮＡを検出するための組成物を開示する。この組成物は、配列番
号６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１
の捕捉プローブオリゴマーをも含むことができ、標的特異的配列は場合により３’テール
配列と結合していてもよい。この組成物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４
、２５、２６、２７、６２、６３、６４及び６５からなる群から選択される少なくとも１
の検出プローブオリゴマーをも含むことができる。好ましい態様は、配列番号５、１３、
１５及び２１からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーを含む。
そのような組成物の好ましい態様はキットの形で提供され、これは場合により、核酸の増
幅及び／又は検出に使用される他の試薬を含むことができる。
【０００９】
［０００９］  試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出するための、下記の工程を
含む方法を開示する：２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ
であるレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製し、配列番号６９、
７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び８３からなる
群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号８４、８５、８
６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み
合わせたものを、試料と混合し、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び核酸前駆物質を供
給して、第１及び第２増幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ・ニューモフィラの標的
核酸を含有する増幅用混合物を調製し、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸にハイブ
リダイズした少なくとも１の増幅オリゴヌクレオチドの３’末端を、核酸ポリメラーゼ活
性がある酵素及び鋳型としてのレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を用いてインビト
ロで延長して増幅生成物を製造し、そして増幅生成物を検出して、試料中にレジオネラ・
ニューモフィラが存在することの指標とする。ある態様では、検出する工程で、増幅生成
物を、配列番号７２、８８及び８９からなる群から選択される検出プローブオリゴマーに
特異的にハイブリダイズさせる。他の態様は、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオ
ネラ・ニューモフィラの標的核酸を試料から捕捉する試料処理工程をも含むことができ、
これは好ましくは、配列番号７３からなる標的特異的配列を含む捕捉プローブオリゴマー
を用いることにより行われ、標的特異的配列は場合により３’テール配列に共有結合して
いてもよい。ある態様では、混合工程に、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８４
、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８４、配列番号７８又は配列番号７９と配
列番号８４、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８４、配列番号６９又は配列番
号７０と配列番号８５、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８５、配列番号７８
又は配列番号７９と配列番号８５、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８５、配
列番号６９又は配列番号７０と配列番号８６、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番
号８６、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８６、配列番号８０〜８３のいずれか
１と配列番号８６、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８７、配列番号７１〜７７
のいずれか１と配列番号８７、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８７、及び配列
番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴ
ヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる。好ましい態様には、混
合工程に、配列番号７９と配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列番号８４
及び配列番号８７；並びに配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からなる群から
選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用
いる態様が含まれる。
【００１０】
［０００１０］  配列番号６９、７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、
８０、８１、８２及び８３からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌク
レオチドを配列番号８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の
第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを含む、インビトロでの増幅を用いてレ
ジオネラ・ニューモフィラの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３ＳｒＲＮＡ配列をコードする
ＤＮＡを検出するための組成物を開示する。好ましい態様では、組成物は配列番号７９と
配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列番号８４及び配列番号８７；並びに
配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリ
ゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせである。ある態様は、配列番号
７３からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１の捕捉プローブオリゴマーをも含み
、標的特異的配列は３’テール配列に共有結合していてもよい。ある態様の組成物は、配
列番号７２、８８及び８９からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴ
マーをも含む。そのような組成物の好ましい態様はキットの形で提供され、これは場合に
より、核酸の増幅及び／又は検出に使用される他の試薬を含むことができる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中のレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｕｅｍｏｐｈｉｌ
ａ）を検出する方法であって、以下の：
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡであるレジオネラ・
ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製する工程；
配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３
、４４、４５、５３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少なくとも１の第１
増幅オリゴヌクレオチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７、４８、４９、
５０、５１、５２、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択される少なくと
も１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組み合わせたものを、試料と混合する工程；
核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び核酸前駆物質を供給する工程で、第１及び第２増
幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する増幅用混
合物を調製する工程；
レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸にハイブリダイズした少なくとも１の増幅オリ
ゴヌクレオチドの３’末端を、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び鋳型としてのレジオ
ネラ・ニューモフィラの標的核酸を用いてインビトロで延長して増幅生成物を製造する工
程；そして
増幅生成物を検出する工程で、試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することの
指標とする工程；
を含む、前記方法。
（項目２）
検出する工程で、増幅生成物を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、６２、６３、６４及び６５からなる群から選択される検出プローブオリゴマ
ーに特異的にハイブリダイズさせる、項目１記載の方法。
（項目３）
さらに、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を
試料から捕捉する試料処理工程を含む、項目１記載の方法。
（項目４）
試料処理工程で配列番号６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列
を含む捕捉プローブオリゴマーを用いるが、前記標的特異的配列は場合により３’テール
配列に共有結合している、項目３記載の方法。
（項目５）
混合する工程に、配列番号２９と配列番号３１、配列番号２８と配列番号３１、配列番
号２９と配列番号３３、配列番号２８と配列番号３３、配列番号４１と配列番号４６、配
列番号４１と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配列番号５４と配列番号５５
、配列番号５１と配列番号４３、配列番号５２と配列番号４３、配列番号５１と配列番号
４５、配列番号５２と配列番号４５、配列番号６０と配列番号５８及び配列番号５６、配
列番号６０と配列番号５９及び配列番号５６、配列番号６０と配列番号５８及び配列番号
５７、配列番号６０と配列番号５９及び配列番号５７、配列番号６１と配列番号５８及び
配列番号５６、配列番号６１と配列番号５９及び配列番号５６、配列番号６１と配列番号
５８及び配列番号５７、並びに配列番号６１と配列番号５９及び配列番号５７からなる群
から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせ
を用いる、項目１記載の方法。
（項目６）
混合する工程に、配列番号２９と配列番号３１、配列番号２８と配列番号３１、配列番
号４１と配列番号４６、配列番号４１と配列番号５５、配列番号５４と配列番号４６、配
列番号５４と配列番号５５、配列番号５２と配列番号４３、及び配列番号５２と配列番号
４５からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオ
チドの組合わせを用いる、項目１記載の方法。
（項目７）
インビトロでの増幅を用いてレジオネラ・ニューモフィラ１６ＳｒＲＮＡ配列又は１
６Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを検出するための組成物であって、配列番号３０
、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４３、４４、４５、
５３、５４、６０及び６１からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌク
レオチドを配列番号２８、２９、３８、３９、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５
２、５５、５６、５７、５８及び５９からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅
オリゴヌクレオチドと組合わせたものを含む、前記組成物。
（項目８）
さらに、標的特異的配列に共有結合した３’テール配列を場合により備えた、配列番号
６６、配列番号６７又は配列番号６８からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１の
捕捉プローブオリゴマーを含む、項目７記載の組成物。
（項目９）
さらに、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７、１８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、６２、６３
、６４及び６５からなる群から選択される少なくとも１の検出プローブオリゴマーを含む
、項目７記載の組成物。
（項目１０）
さらに、配列番号５、１３、１５及び２１からなる群から選択される少なくとも１の検
出プローブオリゴマーを含む、項目７記載の組成物。
（項目１１）
試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出する方法であって、以下の：
２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡであるレジオネラ・
ニューモフィラの標的核酸を含有する試料を調製する工程；
配列番号６９、７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２
及び８３からなる群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番
号８４、８５、８６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌ
クレオチドと組み合わせたものを、試料と混合する工程；
核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び核酸前駆物質を供給する工程で、第１及び第２増
幅オリゴヌクレオチド並びにレジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を含有する増幅用混
合物を調製する工程；
レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸にハイブリダイズした少なくとも１の増幅オリ
ゴヌクレオチドの３’末端を、核酸ポリメラーゼ活性がある酵素及び鋳型としてのレジオ
ネラ・ニューモフィラの標的核酸を用いてインビトロで延長して増幅生成物を製造する工
程；そして
増幅生成物を検出して、試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在することの指標と
する工程；
を含む、前記方法。
（項目１２）
検出する工程で、増幅生成物を、配列番号７２、８８及び８９からなる群から選択され
る検出プローブオリゴマーに特異的にハイブリダイズさせる、項目１１記載の方法。
（項目１３）
さらに、ハイブリダイズさせる工程の前に、レジオネラ・ニューモフィラの標的核酸を
試料から捕捉する試料処理工程を含む、項目１１記載の方法。
（項目１４）
試料処理工程に、配列番号７３からなる標的特異的配列を含む捕捉プローブオリゴマー
を用いるが、標的特異的配列は場合により３’テール配列に共有結合している、項目１
３記載の方法。
（項目１５）
混合する工程に、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８４、配列番号７１〜７７
のいずれか１と配列番号８４、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８４、配列番号
８０〜８３のいずれか１と配列番号８４、配列番号６９又は配列番号７０と配列番号８５
、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８５、配列番号７８又は配列番号７９と配
列番号８５、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８５、配列番号６９又は配列番
号７０と配列番号８６、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番号８６、配列番号７８
又は配列番号７９と配列番号８６、配列番号８０〜８３のいずれか１と配列番号８６、配
列番号６９又は配列番号７０と配列番号８７、配列番号７１〜７７のいずれか１と配列番
号８７、配列番号７８又は配列番号７９と配列番号８７、及び配列番号８０〜８３のいず
れか１と配列番号８７からなる群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増
幅オリゴヌクレオチドの組合わせを用いる、項目１１記載の方法。
（項目１６）
混合する工程に、配列番号７９と配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列
番号８４及び配列番号８７；並びに配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からな
る群から選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合
わせを用いる、項目１１記載の方法。
（項目１７）
インビトロでの増幅を用いてレジオネラ・ニューモフィラ２３ＳｒＲＮＡ配列又は２
３Ｓ ｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを検出するための組成物であって、配列番号６９
、７０、７１、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２及び８３からな
る群から選択される少なくとも１の第１増幅オリゴヌクレオチドを配列番号８４、８５、
８６及び８７からなる群から選択される少なくとも１の第２増幅オリゴヌクレオチドと組
み合わせたものを含む、前記組成物。
（項目１８）
組成物が、配列番号７９と配列番号８５及び配列番号８７；配列番号７５と配列番号８
４及び配列番号８７；並びに配列番号７５と配列番号８５及び配列番号８７からなる群か
ら選択される、第１増幅オリゴヌクレオチドと第２増幅オリゴヌクレオチドの組合わせで
ある、項目１７記載の組成物。
（項目１９）
さらに、標的特異的配列に共有結合した３’テール配列を場合により備えた、配列番号
７３からなる標的特異的配列を含有する少なくとも１の捕捉プローブオリゴマーを含む、
項目１７記載の組成物。
（項目２０）
さらに、配列番号７２、８８及び８９からなる群から選択される少なくとも１の検出プ
ローブオリゴマーを含む、項目１７記載の組成物。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な記述
［０００１１］  レジオネラ・ニューモフィラ核酸を検出することにより環境試料又は
生物試料中のレジオネラ・ニューモフィラの存在を高感度で特異的に検出する方法を開示
する。この方法は、１６Ｓ又は２３Ｓ ｒＲＮＡ配列の核酸増幅を実施し、一般に増幅生
成物に特異的にハイブリダイズして試料中にレジオネラ・ニューモフィラが存在すること
を指示するシグナルを発する核酸プローブを用いて増幅生成物を検出することを含む。増
幅工程には、試料を１６Ｓ又は２３Ｓ ｒＲＮＡ中の標的配列に対して特異的な１以上の
増幅オリゴマーと接触させて、試料中にレジオネラ・ニューモフィラｒＲＮＡが存在する
場合には増幅生成物を製造する工程が含まれる。増幅によって、増幅オリゴマー（プライ
マー）からレジオネラ・ニューモフィラ鋳型鎖を用いて配列を延長する少なくとも１種類
の核酸ポリメラーゼにより、標的配列又はその相補配列の追加コピーが合成される。増幅
生成物を検出するための好ましい態様には、増幅生成物を、増幅配列に対して特異的な少
なくとも１種類のプローブ、例えば標的配列に含まれる配列であって一対の増幅オリゴマ
ーにより囲まれた配列と接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を用いる。
検出する工程は、増幅反応が終了した後に実施でき、あるいは増幅反応と同時に実施でき
る（「リアルタイム」という場合もある）。好ましい態様では、均一反応で検出されるプ
ローブを用いる検出する工程により増幅生成物を検出する。すなわち、ハイブリダイズし
たプローブの検出に、ハイブリダイズしていないプローブを混合物から除去する必要がな
い（例えば米国特許第５，６３９，６０４号及び第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄ
Ｊｒ．ら）。増幅工程の終了時付近又は終了時に増幅生成物を検出する好ましい態様で
は、線状プローブは増幅生成物にハイブリダイズして、プローブが増幅配列にハイブリダ
イズしたことを指示するシグナルを発する。リアルタイム検出を用いる好ましい態様では
、プローブは、プローブが増幅生成物に結合した場合に検出シグナルを発するレポーター
部分を含むヘアピン構造プローブであることが好ましい。例えば、ヘアピンプローブは、
プローブの一端に結合したレポーター部分又は標識、例えば発蛍光団（「Ｆ」）及びヘア
ピン構造の他端に結合した相互作用化合物、例えばクエンチャー（「Ｑ」）を含んでもよ
く、ヘアピン構造が「閉鎖」配置で増幅生成物にハイブリダイズしていない場合にはシグ
ナルの発生が阻害され、これに対しプローブが増幅生成物中の相補配列にハイブリダイズ
してプローブが「開放」配置に変換された場合にはシグナルが発せられる。ヘアピン構造
プローブの例としては、分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ）、分子トー
チ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｒｃｈ）又はハイブリダイゼーションスイッチプローブそ
の他の形態があげられる（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７
２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；米国特許第５，９２５，５１７号及び第６，１５０，０９７
号、Ｔｙａｇｉら；米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，
５３４，２７４号及び第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；米国特許出願公開第１
１／１７３，９１５号、Ｂｅｃｋｅｒら；並びに米国特許出願公開第２００６−０１９４
２４０号Ａ１、Ａｒｎｏｌｄ Ｊｒ．ら）。
【００１２】
［０００１２］  本明細書の開示内容の理解の一助として、本明細書中で用いる用語を
若干以下に記載する。別途記載しない限り、本明細書中で用いる科学用語及び技術用語は
、技術文献、例えばDictionaryof Microbiology and Molecular Biology, 第2版 (Singl
eton et al,1994, John Wiley & Sons,ニューヨーク州ニューヨーク）、The Harper Col
lins Dictionaryof Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial,ニューヨーク州
ニューヨーク）、又はDorland’s Illustrated Medical Dictionary, 第30版(2003, W.B.
Saunders,Elsevier Inc.,ペンシルベニア州フィラデルフィア）に基づいて当業者が一
般に理解しているものと同じ意味で用いられる。別途記載しない限り、本明細書中で使用
又は意図する技術は分子生物学の分野で周知の標準法である。
【００１３】
［０００１３］  「試料」には、レジオネラ菌又はその成分、例えば核酸又は核酸断片
を含有しうる、いかなる検体も含まれる。試料は環境源、例えば水、土壌、汚泥、壊死組
織片、水性流体の容器由来のバイオフィルム、空中粒子又はエアロゾルなどから得ること
ができ、これには処理済み試料、例えば環境試料をフィルターに導通することにより、遠
心分離により、又は媒体、マトリックス若しくは支持体に吸着させることにより得られた
ものを含めてもよい。「生物試料」には、レジオネラ菌又はそれに由来する標的核酸を含
有しうる生存又は死亡した哺乳類（ヒトを含む）から得られるいかなる組織又は材料、例
えば呼吸器又は滲出物、例えば気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）又は肺生検の検
体、喀痰、末梢血、血漿、血清、リンパ節、消化器、尿、滲出物、又は他の体液も含まれ
る。試料を処理して物理的又は機械的に凝塊又は細胞を破壊し、核酸を含めた細胞内成分
を溶液中へ放出させることができ、この溶液は他の成分、例えば酵素、緩衝剤、塩類、界
面活性剤などを含有してもよい。
【００１４】
［０００１４］  「核酸」は、窒素複素環式の塩基又は塩基類似体を含むヌクレオシド
又はヌクレオシド類似体を含み、これらがホスホジエステル結合又は他の結合により連結
してポリヌクレオチドを形成した、多量体化合物をいう。核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は
キメラＤＮＡ−ＲＮＡポリマー、及びその類似体が含まれる。核酸の「主鎖」は、糖−ホ
スホジエステル結合、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）結合（国際公開第９５／３２３０５号）
、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、又はその組合わせのうち１以上を
含む多様な結合で構成されてもよい。核酸の糖部分は、リボース若しくはデオキシリボー
スか、あるいは既知の置換、例えば２’メトキシ置換及び２’ハライド置換（例えば２’
−Ｆ）がある類似化合物であってもよい。窒素塩基は、一般的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、
Ｕ）、その類似体（例えばイノシン；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Ad
ams et al.編, 第11版,1992）、プリン又はピリミジン塩基の誘導体、例えばＮ４−メチ
ルデオキシグアノシン、デアザ−若しくはアザ−プリン、デアザ−若しくはアザ−ピリミ
ジン、５又は６位に置換基をもつピリミジン塩基、２、６及び／又は８位に変更又は交換
された置換基をもつプリン塩基、例えば２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メ
チルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒド
ラジンピリミジン類及びＯ４−アルキル−ピリミジン類、並びにピラゾロ化合物、例えば
非置換又は３−置換ピラゾロ［３，４，−ｄ］ピリミジン（米国特許第５，３７８，８２
５号、第６，９４９，３６７号及び国際公開第９３／１３１２１号）であってもよい。核
酸は、主鎖が１以上の残基について窒素塩基を含まない「非塩基」位置を含んでもよい（
米国特許第５，５８５，４８１）。核酸は、ＲＮＡ及びＤＮＡにみられる一般的な糖、塩
基及び結合のみを含むか、あるいは一般的な構成要素及び置換（例えば、２’メトキシ主
鎖により連結した一般的な塩基、又は一般的な塩基と１種類以上の塩基類似体の混合物を
含む核酸）を含んでもよい。核酸には「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）、すなわちＲＮＡ
模倣糖配置でロックされた二環式フラノース単位を含む１以上のＬＮＡヌクレオチドモノ
マーを含有する類似体も含まれ、これは一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓ
ｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補配列に対するハイブリダイゼーショ
ン親和性を高める（Vesteret al., 2004, Biochemistry 43(42); 13233-41）。インビト
ロで核酸を合成する方法は当技術分野で周知である。
【００１５】
［０００１５］  互換性がある用語「オリゴマー」及び「オリゴヌクレオチド」は、一
般に１，０００未満のヌクレオチド（ｎｔ）を含む核酸をいい、下限約２〜５ｎｔ及び上
限約５００〜９００ｎｔである範囲のポリマーを含む。好ましいオリゴマーの大きさは下
限約５〜１５ｎｔ及び上限約５０〜６００ｎｔの範囲にあり、特に好ましい態様は下限約
１０〜２０ｎｔ及び上限約２２〜１００ｎｔの範囲にある。好ましいオリゴマーは、周知
のいずれかの酵素法又は化学的方法により合成され、クロマトグラフィー等の標準法で精
製される。
【００１６】
［０００１６］  「増幅オリゴマー」は、標的核酸又はその相補配列にハイブリダイズ
し、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴマーの一例としては
、鋳型核酸にハイブリダイズし、増幅プロセスでポリメラーゼにより延長される３’ヒド
ロキシル末端を含む、「プライマー」である。他の例としては、増幅に関与し、又は増幅
を促進するが、３’遮断末端をもつためポリメラーゼにより延長されないオリゴヌクレオ
チドである。増幅オリゴマーの大きさとして好ましい範囲としては、長さが約１０〜約６
０ｎｔであって、標的核酸配列（又はその相補配列）のある領域に相補的な少なくとも約
１０の連続塩基、より好ましくは少なくとも１２の連続塩基があるものが含まれる。当該
連続塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して、好ましくは少なくとも８０％
、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは約１００％、相補的である。増幅オ
リゴマーは、場合により修飾ヌクレオチド若しくは類似体又は場合により追加配列を含ん
でもよく、これらは増幅反応に関与するが、標的又は鋳型配列に相補的でないか、又は含
まれないか、又は相補的である。例えば「プロモータープライマー」は５’側プロモータ
ー配列を含むオリゴヌクレオチドであり、この配列は標的核酸に対して相補的ではなく、
プライマーの標的相補的配列に隣接又は近接する。当業者であれば、プライマーとして機
能する増幅オリゴマーが５’側プロモーター配列を含み、したがってプロモーター−プラ
イマーとして機能するように修飾しうること、またプロモーター−プライマーがそのプロ
モーター配列に関係なくプライマーとして機能しうること、すなわちこのオリゴヌクレオ
チドをそのプロモーター配列の除去又はプロモーター配列を含まない合成により修飾する
ことができることを理解するであろう。「プロモータープロバイダー（ｐｒｏｍｏｔｏｒ
ｐｒｏｖｉｄｅｒ）」という増幅オリゴマーは重合の鋳型として用いられるプロモータ
ー配列を含むが、このオリゴヌクレオチドはその３’末端（遮断されているため、ポリメ
ラーゼ活性による延長には用いられない）からは延長されない。
【００１７】
［０００１７］  「増幅」は、多数コピーの標的核酸配列若しくはその断片又はその相
補配列を得るためのいずれか既知のインビトロでの方法をいう。「断片」の増幅は、例え
ば標的核酸の内部位置にハイブリダイズしてそこから重合を開始する増幅オリゴヌクレオ
チドを用いて、完全な標的核酸又はその相補配列より少ない核酸を含む増幅核酸を製造す
ることをいう。既知の増幅法としては、例えばレプリカーゼ介在増幅、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び転写介在又は
転写関連増幅があげられる。レプリカーゼ介在増幅には、自己複製ＲＮＡ分子、及びレプ
リカーゼ、例えばＱＢ−レプリカーゼを用いる（例えば米国特許第４，７８６，６００号
、Ｋｒａｍｅｒら）。ＰＣＲ増幅には、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対及びサーマル
サイクリングを用いて、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖又はｃＤＮＡから、多数コピーを合成
する（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８０
０，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓら）。ＬＣＲ増幅には４種類以上の異なるオリゴヌクレオチ
ドを使用し、多数サイクルのハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性を用いて
、標的及びその相補鎖を増幅する（例えば米国特許第５，４２７，９３０号、Ｂｉｒｋｅ
ｎｍｅｙｅｒら；米国特許第５，５１６，６６３号、Ｂａｃｋｍａｎら）。ＳＤＡには、
制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含むプライマー及び標的配列を含む半修飾二
本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断するエンドヌクレアーゼを使用し、これにより一連のプライ
マー延長工程及び鎖置換工程で増幅が行われる（例えば米国特許第５，４２２，２５２号
、Ｗａｌｋｅｒら；米国特許第５，５４７，８６１号、Ｎａｄｅａｕら；米国特許第５，
６４８，２１１号、Ｆｒａｉｓｅｒら）。
【００１８】
［０００１８］  「転写関連増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ
ｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「転写介在増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（ＴＭＡ）は、ＲＮＡポリメラー
ゼを用いて核酸鋳型から多数のＲＮＡ転写体を製造するいかなるタイプの核酸増幅をもい
う。当該方法は、一般にＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸基質（ｄＮＴＰ
及びｒＮＴＰ）、及びプロモーター配列を含む鋳型相補的オリゴヌクレオチドを使用し、
場合により１種類以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。転写関連増幅の変法は
当技術分野で周知である（例えば米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５
１６号、Ｋａｃｉａｎら；米国特許第５，４３７，９９０号、Ｂｕｒｇら；国際公開第８
８／０１３０２号及び国際公開第８８／１０３１５号、Ｇｉｎｇｅｒａｓら；米国特許第
５，１３０，２３８号、Ｍａｌｅｋら；米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２
４，２４６号、Ｕｒｄｅａら；国際公開第９５／０３４３０号、Ｒｙｄｅｒら；並びに米
国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１、Ｂｅｃｋｅｒらに詳述）。Ｋａｃｉ
ａｎらのＴＭＡ法及び単一プライマー型の転写随伴法（米国特許出願公開第２００６−０
０４６２６５号Ａ１、Ｂｅｃｋｅｒら）は、本明細書に開示するレジオネラ菌標的配列の
検出に用いるための転写関連増幅法の好ましい態様である。好ましい態様を当該増幅反応
で説明するが、当業者であればプライマー（１以上）からポリメラーゼで配列を延長する
他の増幅法に本明細書に開示する増幅オリゴマーを容易に用いうることを認識するであろ
う。
【００１９】
［０００１９］  「プローブ」は、ハイブリダイゼーションしうる条件下で、核酸、好
ましくは増幅核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズして、標的配列又は増幅核酸を
検出することができる核酸オリゴマーをいう。検出は直接（すなわち、その標的配列に直
接ハイブリダイズしたプローブ）又は間接（すなわち、その標的に中間分子構造体を介し
て結合したプローブ）のいずれであってもよい。プローブの「標的配列」とは一般に、よ
り大きな配列（例えば増幅配列のサブセット）内の小配列であって、プローブの少なくと
も一部に標準塩基対合によりハイブリダイズするものをいう。プローブは、標的特異的配
列及びプローブの三次元配置に関与する他の配列を含んでもよい（例えば米国特許第５，
１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら；米国特許第６，８４
９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７４号及び第６，３６１，９
４５号、Ｂｅｃｋｅｒら；並びに米国特許出願公開第２００６−００６８４１７号Ａ１、
Ｂｅｃｋｅｒらに記載）。
【００２０】
［０００２０］  「十分に相補的」とは、一連の相補的塩基間の水素結合により他の配
列にハイブリダイズしうる連続配列を意味し、これは配列中の各位置で標準塩基対合（例
えばＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ対合）により相補的であってもよく、あるいは標準水素結
合による相補的塩基ではない１以上の位置（非塩基位置を含む）を含んでもよい。連続塩
基は、オリゴマーを特異的にハイブリダイズさせることを意図する配列に対して、少なく
とも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約１００％相補的である。「
十分に相補的」である配列は、その配列が完全に相補的ではない場合ですら、選択された
ハイブリダイゼーション条件下で核酸オリゴマーがその標的配列に安定にハイブリダイズ
するのを可能にする。適当なハイブリダイゼーション条件は当技術分野で周知であり、塩
基配列組成に基づいて容易に推定できるか又はルーティン試験を用いて判定できる（例え
ばSambrooket al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版(Cold Spring Har
bor LaboratoryPress,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，1989), §§ 1
.90-1.91,7.37-7.57, 9.47-9.51及び11.47-11.57、特に§§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 
11.45-11.47及び11.55-11.57）。
【００２１】
［０００２１］  「試料の調製」は、試料中に存在するレジオネラ菌核酸をその後増幅
及び検出するのために試料を調製するいずれかの工程又は方法をいう。試料の調製は、よ
り多量の試料又は実質的に水性の混合物から成分を濃縮するいずれか既知の方法を含んで
もよい；例えば、空気試料から空中粒子を又は水試料から微生物を濾過又は捕捉すること
による。試料の調製は、細胞成分を溶解し、例えば濾過又は遠心分離により細胞屑を除去
することを含んでよく、核酸オリゴマーを用いて標的核酸を他の試料成分から選択的に捕
捉することを含んでよい。
【００２２】
［０００２２］  「捕捉プローブ」又は「捕捉オリゴマー」は、標的配列と固定化オリ
ゴマーを塩基対ハイブリダイゼーションにより結合させて標的配列を選択的に捕捉する少
なくとも１の核酸オリゴマーをいう。好ましい態様の捕捉プローブは、２つの結合領域、
すなわち標的配列結合領域及び固定化プローブ結合領域を、通常は同一オリゴマー上に含
むが、当該２領域は１以上のリンカーで結合させた、異なるオリゴマー上にあってもよい
。例えば第１オリゴマーは固定化プローブ結合領域を含み、第２オリゴマーは標的配列結
合領域を含んでよく、当該２つの異なるオリゴマーが２配列を結合して機能性単位にする
リンカーにより結合される。
【００２３】
［０００２３］  「固定化プローブ」又は「固定化核酸」は、捕捉オリゴマーを固定化
支持体に直接又は間接的に結合させる核酸をいう。好ましい固定化プローブは、支持体に
結合したオリゴマーであって、試料中の結合していない物質から結合した標的配列を分離
することを促進する。支持体には、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレ
ート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属で作製した、マトリ
ックス、及び溶液中の自由粒子等の既知の材料を含めてよく、好ましい態様は磁気付着性
粒子である。好ましい支持体は単分散磁性球体（例えば均一サイズ±５％）であり、これ
に固定化プローブが直接（共有結合、キレート形成又はイオン性相互作用により）又は間
接的に（１以上のリンカーにより）結合するが、その場合、プローブと支持体の結合又は
相互作用はハイブリダイゼーション条件で安定である。
【００２４】
［０００２４］  「分離」又は「精製」は、試料等の混合物の１以上の成分を１以上の
他の成分から除去又は分離することを意味する。試料成分には一般に水性の混合物（溶液
相）中の標的核酸が含まれ、この混合物は細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質及び他
の核酸を含有しうる。分離又は精製により、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８
０％、より好ましくは約９５％の標的核酸が他の混合物成分から分離される。
【００２５】
［０００２５］  「標識」は、検出されるか又は検出可能なシグナルを発する分子部分
又は化合物をいう。標識は核酸プローブに直接又は間接的に結合させることができる。直
接標識化は標識をプローブに連結させる結合又は相互作用により行うことができ、これに
は共有結合又は非共有相互作用、例えば水素結合、疎水性及びイオン性相互作用、又はキ
レート若しくは配位錯体の形成が含まれる。間接標識化は架橋部分又はリンカー（例えば
抗体又は追加オリゴマー）を用いて行うことができ、これは直接又は間接的に標識され、
検出可能なシグナルを増幅する場合がある。標識には、放射性核種、リガンド（例えばビ
オチン、アビジン）、酵素、酵素基質、反応性基、発色団（例えば検出可能な色を付与す
る色素、粒子又はビーズ）、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性
の標識）又は発蛍光団等の検出可能ないずれかの部分が含まれる。好ましい標識には、均
一反応で検出可能なシグナルを発する「均一検出可能な標識」が含まれ、この場合、混合
物中の結合した標識プローブが、安定性又は異なる分解性のような、結合していない標識
プローブのものと異なる検出可能な変化（例えば米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒ
ｎｏｌｄら；米国特許第５，６５６，２０７号、Ｗｏｏｄｈｅａｄら；米国特許第５，６
５８，７３７号、Ｎｅｌｓｏｎら）を示す。好ましい標識には化学発光性化合物、好まし
くは標準的ＡＥ及びその誘導体を含むアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物が含ま
れる（米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号及び第５，６３９，６
０４号に記載）。標識を核酸に結合させる合成方法及び標識からのシグナルを検出する方
法は周知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第
2版(Cold SpringHarbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハー
バー,1989),１０章；米国特許第５，６５８，７３７号、第５，６５６，２０７号、第５
，５４７，８４２号、第５，２８３，１７４号及び第４，５８１，３３３号）。
【００２６】
［０００２６］  レジオネラ菌の核酸、具体的にはレジオネラ・ニューモフィラの１６
Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを増幅及
び検出する方法を開示する。レジオネラ・ニューモフィラの標的配列１６Ｓ及び２３Ｓ
ｒＲＮＡ又はその相補配列、あるいは１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを
特異的に認識する、特定のオリゴヌクレオチド配列を開示する。そのオリゴヌクレオチド
は増幅オリゴマー、例えばプライマー、プロモータープライマー、遮断オリゴマー、及び
プロモータープロバイダーオリゴマーとして機能でき、その機能は既知である（例えば米
国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第
５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号及び第５，８２４，５１８号、並びに名
国特許出願公開２００６−００４６２６５Ａ１に開示）。他の態様は、増幅したレジオネ
ラ・ニューモフィラ配列を検出するためのプローブとして機能できる。
【００２７】
［０００２７］  転写介在増幅（ＴＭＡ）を用いる増幅法は、本明細書に概説する工程
を含む（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号及び第５，８２４，
５１８号に詳述）。増幅すべき配列を含む標的核酸は、一本鎖核酸（例えばｓｓＲＮＡ又
はｓｓＤＮＡ）として提示され、あるいは常法により、例えば温度及び／又は化学的に二
本鎖核酸を融解して一本鎖標的核酸にして一本鎖にされる。プロモータープライマーが標
的核酸中のプロモータープライマーの標的配列を特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）活
性をもつ酵素が標的鎖を鋳型として用いてプロモータープライマーの３’末端を延長し、
標的配列のｃＤＮＡが作製されてＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の形態になる。ＲＮアーゼ酵素活
性（例えばＲＮアーゼＨ）によりこのＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖が消化され、ｃＤ
ＮＡ鎖上のプロモータープライマー末端から下流にある第２プライマーの標的配列に第２
プライマーが特異的に結合する。ＲＴが第１ｃＤＮＡを鋳型として用いて第２プライマー
の３’末端を延長して新たなＤＮＡ鎖が合成され、機能性プロモーター配列を含むｄｓＤ
ＮＡが作製される。次いでプロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼが転写を開始
して、多数のＲＮＡ転写体、例えばその反応における最初の標的鎖の約１００〜１０００
の増幅コピー（「アンプリコン」）が製造される。各アンプリコン中の第２プライマーの
標的配列に第２プライマーが特異的に結合すると、増幅が継続し、ＲＴがアンプリコンの
ＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを作製して、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖が製造される。反応物中
のＲＮアーゼがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からアンプリコンＲＮＡを消化し、新たに合成され
たＤＮＡ中のプロモータープライマーの相補配列にプロモータープライマーが特異的に結
合する。ＲＴがプロモータープライマーの３’末端を延長して機能性プロモーターを含む
ｄｓＤＮＡを作製し、これにＲＮＡポリメラーゼが結合して、最初の標的鎖に相補的な追
加アンプリコンを転写する。当該自触媒反応により、増幅反応が完了するまでにさらに多
数のアンプリコンが反復作製され、試料中に存在していた標的配列が約１０億倍増幅され
る。増幅中に、すなわちリアルタイム又は増幅反応が完了した時点で、増幅生成物中の標
的配列に特異的に結合するプローブを用いて増幅生成物を検出することができる。結合プ
したローブから検出されるシグナルは、その試料中に標的核酸が存在する指標となる。
【００２８】
［０００２８］  本明細書に概説する他の転写関連増幅法は、１種類のプライマー及び
１種類以上の追加の増幅オリゴマーを用いて転写体（アンプリコン）を作製することによ
りインビトロで核酸を増幅し、これは試料中に標的核酸が存在することの指標となる（米
国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１、Ｂｅｃｋｅｒらに詳述）。要約する
と、この単一プライマー法には、プライマー又は「プライミングオリゴマー」、自身の３
’末端からの合成延長を阻止するように修飾された（一般に３’−遮断部分を含有させる
ことによる）「プロモータープロバイダー」オリゴマー、及び場合により、標的鎖からの
ｃＤＮＡの延長を終止させる結合分子（例えば３’−遮断されたエキステンダーオリゴマ
ー）を用いる。この方法には、標的配列を含む標的ＲＮＡをプライマー及び場合により結
合分子と結合させる工程が含まれる。プライマーが標的鎖の３’末端にハイブリダイズし
、酵素ＲＴ活性によりプライマーの３’からのプライマー延長が開始してｃＤＮＡが製造
され、この新たな鎖と標的鎖の二本鎖（ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖）が作製される。３’−
遮断オリゴマーなどの結合分子が反応に含まれると、これは増幅すべき標的配列の５’末
端の隣で標的鎖に結合する。プライマーがＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性により延長され
てｃＤＮＡ鎖が製造される際、プライマー延長生成反応が標的鎖上の結合分子に到達した
時点で重合が停止し、こうして標的鎖上の結合分子の位置によりｃＤＮＡの３’末端が決
定され、ｃＤＮＡの３’末端は標的配列の５’末端に相補的となる。このＲＮＡ：ｃＤＮ
Ａ二本鎖を、例えばＲＮＡ鎖のＲＮアーゼＨ分解によるか又は一般的な鎖分離法により分
離する。次いでプロモータープロバイダーオリゴマーがｃＤＮＡ鎖の３’末端付近にハイ
ブリダイズする。プロモータープロバイダーオリゴマーは、５’側プロモーター配列、ｃ
ＤＮＡの３’側領域の配列に相補的な３’側領域及びプロモータープロバイダーオリゴマ
ーの３’末端からのＤＮＡ合成開始を阻止するための遮断部分を含む修飾された３’末端
を含む。プロモータープロバイダーオリゴマーとｃＤＮＡ鎖からなる二本鎖において、プ
ロモーターオリゴマーを鋳型として用いてｃＤＮＡの３’末端がＲＴ酵素のＤＮＡポリメ
ラーゼ活性により延長されてプロモーター配列がｃＤＮＡに付加され、機能性二本鎖プロ
モーターが作製される。次いで、この機能性プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラ
ーゼがプロモーターに結合し、ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ転写体を転写する。当該転写体
は、最初の標的鎖から増幅された標的領域配列と実質的に同一である。増幅されたＲＮＡ
転写体は、次いでプライマーを結合し、さらにｃＤＮＡを製造するための鋳型として用い
られることにより、増幅プロセスの基質として用いられる。この方法で、試料中に最初に
存在していた標的核酸から最終的に多数のアンプリコンが製造され、すなわち、標的配列
の多数コピーが作製される。結合分子を含まない態様のこの方法では、プライマーから作
製されたｃＤＮＡの３’末端は不定であるが、他の工程は前記と同様に進行する。
【００２９】
［０００２９］  増幅生成物の検出は、多様な方法で達成できる。増幅核酸をある表面
と会合させて、電気シグナル等の検出可能な物理的変化を発生させることができる。増幅
核酸をマトリックス内又はマトリックス上に濃縮し、濃縮核酸又は会合した色素（例えば
挿入剤、例えば臭化エチジウム又はサイバーグリーン（ｃｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ））から
のシグナルを検出することにより検出できる。溶液中の核酸は、溶液相中の色素会合の増
加を検出することにより検出できる。好ましい態様では、増幅生成物中の配列に対して相
補的な核酸プローブであって、検出可能なシグナルを発するプローブ：増幅生成物複合体
を形成するものを検出する（例えば米国特許第５，４２４，４１３号及び第５，４５１，
５０３号、Ｈｏｇａｎら；並びに第５，８４９，４８１号、Ｕｒｄｅａら）。増幅生成物
と特異的に会合する直接又は間接標識プローブが、試料中に標的核酸が存在することを指
示する検出可能なシグナルを発する。例えば、標的核酸であるレジオネラ・ニューモフィ
ラ１６Ｓ ｒＲＮＡが試料に含まれると、増幅生成物はレジオネラ・ニューモフィラ１６
Ｓ ｒＲＮＡ中の標的配列又はその相補配列を含有しており、このプローブは増幅生成物
の標的配列に直接又は間接的に結合して、試料中に標的核酸が存在することを指示するシ
グナルを発する。
【００３０】
［０００３０］  増幅生成物配列に特異的にハイブリダイズする好ましいプローブ態様
は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡのヌクレオチド混合物のオリゴマーであってもよ
く、これらは修飾された主鎖をもつもの、例えば１以上の２’−メトキシ置換ＲＮＡ基を
含む合成オリゴヌクレオチドとして合成されてもよい。増幅したレジオネラ菌ｒＲＮＡ配
列を検出するためのプローブは、標識されておらず間接的に（例えば検出される他の結合
パートナーに結合することにより）検出されてもよく、あるいは検出可能なシグナルを発
する標識で標識されていてもよい。好ましい態様は、検出可能な光シグナルを発する標識
化合物、例えば均一混合物中で検出される発蛍光団又は発光性化合物を含む。プローブは
１より多い標識及び／又は１より多いタイプの標識を含むことができ、あるいは検出は各
プローブが検出可能なシグナルを発する化合物で標識されたプローブ混合物を用いたもの
であってもよい（例えば米国特許第６，１８０，３４０号及び第６，３５０，５７９号）
。多様な既知の手段のいずれか、例えば共有結合、キレート形成及びイオン性相互作用に
より標識をプローブに結合させることができるが、好ましい態様では標識をオリゴヌクレ
オチドに共有結合させる。プローブは、実質的に線状のオリゴヌクレオチド、すなわち分
子内結合により保持された配置をもたないものであってもよく、あるいは機能性配置構造
、すなわち分子内ハイブリダイゼーションにより互いに保持されたヘアピン構造プローブ
にみられるような配置を含むこともできる。好ましい態様の線状オリゴマーは、一般に化
学発光性標識、好ましくはＡＥ化合物を含む。
【００３１】
［０００３１］  ヘアピンプローブは、好ましくは多様な異なるタイプの相互作用性標
識で標識され、一方の相互作用メンバーは通常はプローブの５’末端に結合し、他方の相
互作用メンバーは通常はプローブの３’末端に結合している。そのような相互作用メンバ
ーには、しばしばレポーター色素／クエンチャー対、発光体／クエンチャー対、発光体／
付加物対、フォレスター（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ）エネルギー伝達対、又は色素二量体とい
うものが含まれる。発光体／クエンチャー対は、１種類以上の発光性標識、例えば化学発
光性又は蛍光性の標識と、１種類以上のクエンチャーから構成されうる。好ましい態様で
は、特定の第１波長又は波長範囲で光を吸収し、第２発光波長又は波長範囲で光を発する
発蛍光団（「Ｆ」）でヘアピンプローブの一端を標識し、他端をクエンチャー（「Ｑ」）
で標識する；Ｑは、発蛍光団と近接している際には、励起されたＦから発せられるシグナ
ルを部分的又は完全に減衰させる。そのようなヘアピンプローブを蛍光体／クエンチャー
（Ｆ／Ｑ）対で標識されたということができる。発蛍光団は周知の化合物であり、例えば
アクリジン、フルオレセイン、スルホローダミン１０１、ローダミン、５−（２’−アミ
ノエチル）アミノアフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、テキサスレッド（Ｔｅｘ
ａｓ  Ｒｅｄ）、エオシン、ボディピイ（Ｂｏｄｉｐｙ）及びルシファーイエロー（ｌｕ
ｃｉｆｅｒ  ｙｅｌｌｏｗ）を含む（Tyagi et al., Nature Biotechnology 16: 49-53, 
1998）。クエンチャーは周知であり、例えば４−（４’−ジメチル−アミノ−フェニルア
キソ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、タリウム、セシウム、及びｐ−キシレン−ビス−ピリ
ジニウムブロミドを含む。種々のＦ／Ｑ組合わせが知られ、多くの組合わせが互いに機能
しうる；例えばＤＡＢＣＹＬとフルオレセイン、ローダミン又はＥＤＡＮＳ。ヘアピンプ
ローブのための標識の他の組合わせには、レポーター色素、例えばＦＡＭ（商標）、ＴＥ
Ｔ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（商標）を、クエンチャー、例えばＴＡＭＲＡ（商
標）又は非蛍光性クエンチャーと組み合わせたものが含まれる。機能性Ｆ／Ｑ組合わせは
ルーティン試験を用いて既知の方法で決定できる。
【００３２】
［０００３２］  好ましい態様のヘアピンプローブは「分子トーチ」であり、これは試
料中に標的レジオネラ菌配列が存在することの指標となる増幅生成物を増幅工程後に検出
する。分子トーチは下記のものを含む：（１）標的配列にハイブリダイズして開放配置を
生じる標的検出手段；（２）標的配列の不存在下で標的検出手段にハイブリダイズして閉
鎖配置を生じるトーチ閉鎖手段；及び（３）標的検出手段とトーチ閉鎖手段を連結する連
結手段（米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２
７４号及び第６，３６１，９４５号に詳述）。開放配置のトーチプローブは増幅した標的
配列が存在することを指示する検出可能なシグナルを発し、一方、閉鎖配置は開放配置の
ものと識別できるある量のシグナルを発するが、これは標的配列が存在しないことの指標
となる。他の好ましいヘアピンプローブ態様は「分子ビーコン」であり、これはヘアピン
配列の一方のアーム上の標識、他方のアーム上のクエンチャー、及びこれら２つのアーム
を連結するループ領域を含む（米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２
８号に詳述）。そのヘアピンプローブを用いる方法は当技術分野で周知である。
【００３３】
［０００３３］  核酸ポリメラーゼで延長されないオリゴマーは、増幅反応中でのオリ
ゴマーの酵素介在延長を阻止するために３’ＯＨを置換する遮断基を含む。増幅に際して
存在する、遮断された増幅オリゴマー及び／又は遮断された検出プローブ（リアルタイム
検出で）は好ましくは３’ＯＨがないが、３’末端又はその付近に位置する１以上の遮断
基を含む。遮断基はオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合するか又は３’末端付近、
好ましくは３’末端の５残基以内に位置し、ポリメラーゼがオリゴマーに結合するのを制
限するのに十分なほど大きい。アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオー
ルジデオキシヌクレオチド、及びコルジセピン（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ）等の多種多様な
化学基を遮断部分として用いうる。
【００３４】
［０００３４］  レジオネラ・ニューモフィラ配列を検出するための好ましい方法には
、分子トーチ又は分子ビーコン等ヘアピンプローブを用いる転写関連増幅を用いる。プロ
ーブを増幅前に添加しておけば、試薬をさらに添加せずに検出を行えるからである。増幅
した標的配列にプローブが早期に結合するのを阻止するために、例えばヘアピンプローブ
のハイブリダイズしたアーム（例えば、分子トーチの標的結合ドメイン：標的閉鎖ドメイ
ン複合体）のＴｍが増幅反応温度より高くなるようにプローブを設計することができる。
増幅期間後に混合物を加熱し、トーチプローブのアームを開放して標的結合ドメインが増
幅生成物中の標的配列にハイブリダイズできるようにする。次いで溶液を冷却して、増幅
生成物に結合していないプローブを閉鎖すると、これにより標識／クエンチャー（Ｆ／Ｑ
）対が閉鎖し、増幅した標的配列にハイブリダイズしたプローブからのシグナルを均一反
応において検出することができる。例えば、Ｆ／Ｑ標識ヘアピンプローブを含有する混合
物を適当な励起光で照射し、発生するシグナルを測定する。
【００３５】
［０００３５］  他の態様では、増幅中に増幅生成物がプローブの標的結合ドメインに
優先的にハイブリダイズするようにヘアピン検出プローブを設計し、これにより、増幅の
進行に伴いヘアピンが閉鎖配置から開放配置に変化する。増幅反応混合物を増幅反応中で
間隔をおいて照射して、開放プローブから発せられるシグナルを増幅中、すなわちリアル
タイムで検出する。
【００３６】
［０００３６］  レジオネラ菌配列の増幅のための試料の調製には、試料に含有される
有機体を他の試料成分から分離及び／又は濃縮すること、例えば空気、水その他のタイプ
の試料から粒状物質を濾過することが含まれる場合がある。試料の調製には、細胞を化学
的、物理的及び／又は酵素により破壊して、レジオネラ菌１６Ｓ若しくは２３ＳｒＲＮ
Ａ又は１６Ｓ若しくは２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含めた細胞内容物を放出さ
せることが含まれる場合もある。試料の調製には、標的核酸を他の試料成分から特異的又
は非特異的に分離するための標的捕捉工程が含まれる場合がある。非特異的な標的調製法
は、実質的に水性の混合物から核酸を選択的に沈殿させるか、核酸を支持体に付着させ、
支持体を洗浄して他の試料成分を除去するか、あるいは他の手段を用いて他の成分を含有
する混合物からレジオネラ菌核酸を含めた核酸を物理的に分離することができる。他の非
特異的な標的調製法は、レジオネラ菌１６Ｓ又は２３Ｓ ｒＲＮＡを含めたＲＮＡを、試
料中のＤＮＡから選択的に分離することができる。
【００３７】
［０００３７］  好ましい態様では、レジオネラ菌標的配列に特異的な捕捉オリゴマー
にレジオネラ菌核酸を特異的にハイブリダイズさせて標的配列：捕捉プローブ複合体を形
成し、これを試料成分から分離して、レジオネラ菌ｒＲＮＡ又はｒＲＮＡをコードするＤ
ＮＡを他の試料成分から選択的に分離する。特異的な標的捕捉の好ましい態様では、レジ
オネラ菌標的：捕捉プローブ複合体を固定化プローブに結合させて、標的：捕捉プローブ
：固定化プローブ複合体を形成し、これを試料から分離し、場合により洗浄して非標的試
料成分を除去する。捕捉プローブは、１６Ｓ若しくは２３ＳｒＲＮＡ中又は１６Ｓ若し
くは２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ中のレジオネラ菌標的配列に特異的に結合する
配列を含み、かつ捕捉プローブをその標的配列が結合した状態で支持体（例えばマトリッ
クス又は粒子）に付着させる特異的結合パートナーをも含み、これにより標的配列を試料
成分から分離するのが容易になる。好ましい態様では、捕捉プローブの特異的結合パート
ナーは、レジオネラ菌標的配列に対して相補的ではなく、支持体に結合している固定化プ
ローブ上の相補配列にハイブリダイズする、３’テール配列である。好ましい３’テール
配列は、支持体に結合している相補的な固定化配列（例えばポリ−Ｔ）に結合する実質的
にホモポリマー状の１０〜４０ｎｔ配列（例えばＡ１０〜Ａ４０）である。標的捕捉は、
通常はテール配列：固定化プローブ配列二本鎖のＴｍより高い温度のハイブリダイゼーシ
ョン条件下でレジオネラ菌標的核酸に特異的にハイブリダイズする捕捉オリゴマーを含有
する溶液相混合物中で行われる。次いで捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリ
ダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調整して、レジオネラ菌標的：捕捉プロ
ーブ複合体を捕捉して支持体上の複合体全体を他の試料成分から分離する。レジオネラ菌
標的配列を含む複合体が付着した支持体を洗浄して、他の試料成分をさらに除去すること
ができる。好ましい支持体は粒子、例えば常磁性ビーズであり、したがって捕捉したレジ
オネラ菌標的配列を含有する複合体を含む粒子を洗浄溶液に懸濁し、洗浄溶液から磁気引
力で回収することができる。他の態様では、捕捉プローブはレジオネラ菌標的配列を含め
た試料中の核酸に非特異的に結合してもよく、次いで捕捉プローブ：核酸複合体を支持体
に付着させ、支持体に捕捉された複合体を分離する同様な工程を実施する。標的の捕捉が
レジオネラ菌標的配列に特異的又は非特異的のいずれであっても、捕捉された核酸を次い
で意図するレジオネラ菌標的配列に特異的なインビトロでの増幅により処理する。操作工
程の数を制限するために、支持体に捕捉されている複合体中のレジオネラ菌標的配列を増
幅試薬と混合してレジオネラ菌標的核酸を増幅させることができる。あるいはプライマー
を標的捕捉反応混合物に含有させてもよく、これにより標的捕捉に際してレジオネラ菌特
異的プライマーと標的配列をハイブリダイズさせ、捕捉された複合体中で共に試料から分
離することができる。
【００３８】
［０００３８］  レジオネラ菌核酸を検出するためのアッセイ法は、場合によりレジオ
ネラ菌ではない内部対照（ＩＣ）核酸を含んでもよく、これはＩＣ配列に特異的な増幅オ
リゴマー及び検出オリゴマーを用いて、同一アッセイ混合物中で増幅及び検出される。Ｉ
Ｃ配列が増幅され、増幅されたＩＣ配列からのシグナルが検出されると、意図する標的レ
ジオネラ菌核酸についてシグナルが得られない場合に（例えばレジオネラ・ニューモフィ
ラについて陰性結果を示す試料）、そのアッセイでアッセイ試薬、条件及び操作工程が適
正に使用及び実施されたことの証明となる。定量結果を得たい場合、ＩＣをアッセイの内
部検量物質として用いうる。すなわち、ＩＣの増幅及び検出から得られるシグナルを用い
、増幅したレジオネラ菌標的配列について得たシグナルに基づき、試料中のレジオネラ菌
核酸量を定量するためのアルゴリズムに用いるパラメーターを設定する。好ましいＩＣの
態様は、天然源に由来するランダム化配列である（例えばランダムに再配列したＨＩＶ配
列）。好ましいＩＣは、天然源から単離したＲＮＡ転写体又は例えばクローニングしたラ
ンダム化配列から転写体を作製してインビトロ合成したものであってもよく、これにより
アッセイに含有されるＩＣのコピー数を正確に測定できる。ＩＣ標的配列に対するプライ
マー及びプローブは、いずれか周知の方法を用いて設計及び合成される。ただし、そのプ
ライマー及びプローブは、レジオネラ菌標的配列の増幅及び検出に用いるものと実質的に
同じアッセイ条件でＩＣ標的配列の増幅及び増幅したＩＣ配列の検出について機能し、か
つアッセイに際してＩＣ成分はレジオネラ菌標的配列の増幅及び検出に用いる成分を妨げ
ない。標的捕捉に基づく精製工程を含む好ましい態様では、ＩＣ標的に特異的な標的捕捉
プローブを標的捕捉工程に含有させ、ＩＣはすべてのアッセイ工程で、意図するレジオネ
ラ菌被分析体に用いるものと同じ条件で処理される。
【００３９】
［０００３９］  レジオネラ・ニューモフィラの１６ＳｒＲＮＡ配列の増幅及び検出
［０００４０］  レジオネラ・ニューモフィラの１６ＳｒＲＮＡ配列（１６Ｓ ｒＲＮ
Ａ、及び１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む）中の標的配列を増幅及び検出する
ために、既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を比較
し、レジオネラ・ニューモフィラ単離株に共通であるが好ましくはレジオネラ属の他の種
又は他の細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と完全には同一でない配列を選択して、増幅オリゴ
マー及び検出プローブとして作用するオリゴマーを設計した。レジオネラ属の種（レジオ
ネラ・アニサ（Ｌ．ａｎｉｓａ）、レジオネラ・ベリアルデンシス（Ｌ．ｂｅｌｉａｒｄ
ｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ブリミンガミエンシス（Ｌ．ｂｒｉｍｉｎｇｈａｍｉｅｎｓ
ｉｓ）、レジオネラ・ボゼマニイ、レジオネラ・ブルネンシス（Ｌ．ｂｒｕｎｅｎｓｉｓ
）、レジオネラ・ブサネンシス（Ｌ．ｂｕｓａｎｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・チェリイ（
Ｌ．ｃｈｅｒｒｉｉ）、レジオネラ・シンシナチエンシス（Ｌ．ｃｉｎｃｉｎａｔｉｅｎ
ｓｉｓ）、レジオネラ・デュモフィイ、レジオネラ・エリスラ（Ｌ．ｅｒｙｔｈｒａ）、
レジオネラ・フィーレイィ（Ｌ．ｆｅｅｌｅｉｉ）、レジオネラ・グレシレンシス（Ｌ．
ｇｒｅｓｉｌｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・グラチアナ（Ｌ．ｇｒａｔｉａｎａ）、レジオ
ネラ・ハッケリエ（Ｌ．ｈａｃｋｅｌｉａｅ）、レジオネラ・ジャメストウニエンシス（
Ｌ．ｊａｍｅｓｔｏｗｎｉｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ジョルダンシス（Ｌ．ｊｏｒｄａ
ｎｓｉｓ）、レジオネラ・リチクム（Ｌ．ｌｙｔｉｃｕｍ）、レジオネラ・ロングビーチ
ェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・モラビカ（Ｌ．ｍｏｒａｖｉｃａ）、レジオ
ネラ・オークリッジネシス（Ｌ．ｏａｋｒｉｄｇｅｎｅｓｉｓ）、レジオネラ・パリシエ
ンシス（Ｌ．ｐａｒｉｓｉｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍ
ｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ・クアテイレンシス（Ｌ．ｑｕａｔｅｉｒｅｎｓｉｓ）、レ
ジオネラ・ルブリルセンス（Ｌ．ｒｕｂｒｉｌｕｃｅｎｓ）、レジオネラ・サンチクルシ
ス（Ｌ．ｓａｎｔｉｃｒｕｃｉｓ）、レジオネラ・セイントヘレンシ（Ｌ．ｓａｉｎｔｈ
ｅｌｅｎｓｉ）、レジオネラ・シェイクスピアレイ（Ｌ．ｓｈａｋｅｓｐｅａｒｅｉ）、
レジオネラ・スピリテンシス（Ｌ．ｓｐｉｒｉｔｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ステイジェ
ルワルチイ（Ｌ．ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｔｉｉ）、レジオネラ・タウリネシス（Ｌ．ｔａ
ｕｒｉｎｅｓｉｓ）、レジオネラ・ワズワーシイ（Ｌ．ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ））、並
びに他の細菌種（大腸菌、緑膿菌、シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナ
ス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）
、ボルデテラ・パラペルタス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓ）、ボルデ
テラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌）（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、コ
リネバクテリウム・ゼローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｘｅｒｏｓｉｓ）、
コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（偽結核菌）（Ｃ．  ｐｓｅｕｄｏｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、
及びインフルエンザ菌）の既知の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列（ｒＲＮＡ又は遺伝子）を用いて
配列比較を実施した。特異的オリゴクレオチド配列を選択し、インビトロで合成し、標準
実験法を用いてそのオリゴヌクレオチドのＴｍ及び相補的標的配列（合成又は細菌から精
製したｒＲＮＡ配列）とのハイブリダイゼーション特性を測定することによりオリゴヌク
レオチドを特性分析した。種々の組み合わせの増幅オリゴマーを、合成１６ＳＲＮＡ標
的配列又は培養増殖させた多様なレジオネラ属菌種から精製した１６ＳｒＲＮＡである
鋳型と共に増幅反応に用いて、選択したオリゴマーをさらに試験して、選択した増幅オリ
ゴマーの使用による標的配列増幅の相対効率を判定した。一般に、標識プローブオリゴマ
ーを増幅生成物に結合させて増幅生成物の量の指標となるシグナルの相対量を検出するこ
とにより増幅反応の増幅生成物を検出して、種々の組み合わせのオリゴマーの効率をモニ
ターした。一般に、増幅効率の初期試験のために、ＡＥ化合物で標識した線状検出プロー
ブを増幅生成物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしていないプローブ中のＡＥ標識
を選択的に分解してハイブリダイズしているプローブからのシグナルを検出するハイブリ
ダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）により検出した（実質的に米国特許第５，２８３
，１７４号、第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号及び第５，８２４，４７
５号の記載に従う）。
【００４０】
［０００４１］  レジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列について選択
した好ましい態様の増幅オリゴマーを表１に示す。増幅オリゴマーには、プライマー、プ
ロモータープライマー、及び／又はプロモータープロバイダープライマーとして機能しう
るものが含まれる。後の２つについては、プロモーター配列を表１に小文字で示す。若干
のオリゴマー態様は、対応するプロモータープライマー又はプロモータープロバイダーオ
リゴマーの標的特異的配列のみを含む。例えば配列番号３０は、５’側プロモーター配列
を含む配列番号３１に含まれる標的特異的配列と同一の標的特異的配列である。当業者で
あれば、表１に挙げた標的特異的配列は、場合により既知のいずれかのプロモーター配列
の３’末端に結合して、選択したプロモーター配列に適当なＲＮＡポリメラーゼと共にプ
ロモータープライマー又はプロモータープロバイダーとして機能しうることを認識するで
あろう。好ましい態様には、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに対して特異
的なプロモーター配列（例えば配列番号９０、９１又は９２）が含まれる。増幅オリゴマ
ーの好ましい態様は、ＤＮＡ塩基とＲＮＡ塩基の混合物、及び２’メトキシＲＮＡ基を含
むことができ、例えば配列番号５６及び５７のオリゴマーは、ＲＮＡ塩基、及び５’末端
から最初の４つの位置に２’メトキシ結合を含んでもよい。増幅オリゴマーの態様は、オ
リゴマーを単一プライマー型の転写関連増幅反応において遮断分子又はプロモータープロ
バイダーオリゴマーとして機能するのに最適なものにするために、３’遮断されたオリゴ
マーの合成により修飾されてもよい。３’遮断オリゴマーの好ましい態様には、３’末端
又はその付近に遮断されたＣを含む配列番号５８、５９、６０及び６１のオリゴマーが含
まれる。
【００４１】
【表１】
2013247965.tif 000002
【００４２】
【表２】
2013247965.tif 000003
【００４３】
［０００４２］  １６Ｓ ｒＲＮＡ配列又は１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの増幅
生成物を検出するために選択した検出プローブの好ましい態様を表２に示す。好ましい態
様の線状検出プローブは、リンカーによりプローブオリゴマーに結合した化学発光性ＡＥ
化合物で標識される（実質的に米国特許第５，５８５，４８１号及び米国特許第５，６３
９，６０４号、特に１０欄６行−１１欄３行及び例８に従う）。好ましい標識位置の例は
、プローブオリゴマーの中央領域、及びＡ：Ｔ塩基対合領域付近、オリゴマーの３’又は
５’末端、並びに目的の標的配列ではない既知配列との不適正塩基対合部位又はその付近
である。そのようなＡＥ標識オリゴマーの好ましい態様には、下記の位置にリンカーがあ
るものが含まれる：配列番号６のｎｔ４とｎｔ５の間、配列番号２及び１４のｎｔ５とｎ
ｔ６の間、配列番号１４のｎｔ６とｎｔ７の間、配列番号７及び１８のｎｔ７とｎｔ８の
間、配列番号１３及び１４のｎｔ８とｎｔ９の間、配列番号２、１１、２４、２６及び２
７のｎｔ９とｎｔ１０の間、配列番号４、１２、１５及び１６のｎｔ１０とｎｔ１１の間
、配列番号２５のｎｔ１１とｎｔ１２の間、配列番号７及び１８のｎｔ１２とｎｔ１３の
間、配列番号７、１０、１７及び２３のｎｔ１３とｎｔ１４の間、配列番号１、２、３、
１６、２１及び２２のｎｔ１４とｎｔ１５の間、配列番号９及び１５のｎｔ１５とｎｔ１
６の間、配列番号５、８、１３及び１４のｎｔ１６とｎｔ１７の間、配列番号１１のｎｔ
１７とｎｔ１８の間、配列番号６のｎｔ１８とｎｔ１９の間、並びに配列番号１０、１３
及び１４のｎｔ１９とｎｔ２０の間である。標識されておらず、標識された検出プローブ
が標的に結合するのを容易にする他の１種類以上のヘルパープローブと共に、検出プロー
ブを用いうる（米国特許第５，０３０，５５７号、Ｈｏｇａｎら）。ヘルパープローブの
好ましい態様には、配列番号１９及び２０のものが含まれる。他の検出プローブ態様は、
プローブ配列の分子内ハイブリダイゼーションによりヘアピン構造を形成するオリゴマー
であり、そのうち好ましい態様は配列番号６２、６３、６４及び６５のものである。好ま
しいヘアピンプローブオリゴマーは、配列の一端に蛍光標識を結合させ、他端にクエンチ
ャー化合物を結合させた状態で合成される。ヘアピンプローブの態様は、５’側発蛍光団
と３’側クエンチャーで、例えば５’側フルオレセイン標識と３’側ＤＡＢＣＹＬクエン
チャーで標識することができる。ある態様のヘアピンオリゴマーは、配列内の選択した位
置に非ヌクレオチドリンカー部分を含む；例えば、下記に位置する非塩基９−炭素（「Ｃ
９」）リンカーを含むオリゴマー：配列番号６２のｎｔ５とｎｔ６の間又はｎｔ２０とｎ
ｔ２１の間、配列番号６３のｎｔ５とｎｔ６の間又はｎｔ２３とｎｔ２４の間、配列番号
６４のｎｔ２３とｎｔ２４の間、及び配列番号６５のｎｔ２５とｎｔ２６の間である。
【００４４】
【表３】
2013247965.tif 000004
【００４５】
【表４】
2013247965.tif 000005
【００４６】
［０００４３］  レジオネラ菌１６Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸を他の試料成分から分離する
ための試料調製に用いる捕捉プローブオリゴマーの態様には、
【００４７】
【化１】
2013247965.tif 000006
【００４８】
の標的特異的配列を含むものが含まれる。捕捉プローブの好ましい態様は、標的特異的配
列に共有結合した結合パートナーとして作用する３’テール領域を含む。結合パートナー
は、標的核酸と捕捉プローブからなるハイブリダイゼーション複合体を、支持体上の固定
化プローブに結合させる。配列番号６６、６７及び６８の標的特異的配列を含む捕捉プロ
ーブの好ましい態様は、実質的にホモポリマー配列、例えばｄＴ３Ａ３０配列からなる３
’テール領域をさらに含む。
【００４９】
［０００４４］  本明細書中の実施例に記載する標的捕捉、増幅及び検出の工程に用い
る試薬には、下記のうち１以上が含まれる：試料輸送溶液：１５ｍＭの一塩基性リン酸ナ
トリウム、１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ
、及び３％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ｐＨ６．７。細胞溶解用緩衝
液：７９０のｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２３０ｍＭのコハク酸、１０％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、及
び６８０ｍＭのＬｉＯＨ。検体希釈用緩衝液：３００ｍＭのＨＥＰＥＳ、３％（ｗ／ｖ）
のＬＬＳ、４４ｍＭのＬｉＣｌ、１２０ｍＭのＬｉＯＨ、４０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４。標的捕捉試薬：２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３１０ｍＭのＬｉＯＨ、１．８８ＭのＬｉ
Ｃｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．４、及び２５０μｇ／ｍｌの常磁性粒子（０．７
〜１．０５μの粒子、ＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）ＭＧ−ＣＭ、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．
、インディアナ州インディアナポリス）に（ｄＴ）１４オリゴマーが共有結合したもの。
洗浄用緩衝液：（標的捕捉用）１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６．５ｍ
ＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．０２％（ｗ／
ｖ）のメチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）のプロピルパラベン、及び０．１％（ｗ／
ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５。増幅試薬：他の反応成分（例えば試料又は
検体希釈用の緩衝液）と混合して混合物を調製するための、下記のものを含有する濃厚混
合物：４７．６ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン
、２．５％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、５４．８ｍＭのＫＣｌ、２３ｍＭのＭｇ
Ｃｌ２、３ｍＭのＮａＯＨ、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭのｒＡＴＰ、１．３５ｍＭのｒＣＴＰ、１．３５ｍＭのＵＴ
Ｐ、８．８５ｍＭのｒＧＴＰ、０．２６ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５％ｖ／ｖのグリセロー
ル、２．９％のトレハロース、０．２２５％のエタノール、０．０７５％のメチルパラベ
ン、０．０１５％のプロピルパラベン、及び０．００２％のフェノールレッド、ｐＨ７．
５−７．６。増幅オリゴマー（プライマー、プロモータープライマー、遮断オリゴマー、
又はプロモータープロバイダーオリゴマー）及び場合によりプローブは、増幅試薬中にお
いて、又は別個に、反応混合物に添加することができる。ＴＭＡ反応における酵素；反応
当たり約９０Ｕ／μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）及び約２０Ｕ／μｌのＴ
７ＲＮＡポリメラーゼ（１ＵのＲＴが３７℃で２００〜４００μＭのオリゴｄＴ−プライ
ムドポリＡ鋳型を用いて１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを１０分で取り込み、１ＵのＴ７  ＲＮＡ
ポリメラーゼが３７℃でＤＮＡ鋳型中のＴ７プロモーターを用いて１ｎｍｏｌのＡＴＰを
ＲＮＡ中に１時間で取り込む）。プローブ試薬：ＡＥ標識した検出プローブ用：１００ｍ
Ｍのコハク酸リチウム、０．１〜３％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、１０ｍＭのメルカプトエタン
スルホネート、及び場合により３％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン。ハイブリダイゼ
ーション試薬：核酸へのＡＥ標識プローブ結合用：１００ｍＭのコハク酸、２％（ｗ／ｖ
）のＬＬＳ、１００ｍＭのＬｉＯＨ、１５ｍＭのアルドリチオール−２（ａｌｄｒｉｔｈ
ｉｏｌ−２）、１．２ＭのＬｉＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び３．０％（ｖ／ｖ）のエ
タノール、ｐＨ４．７。選択試薬：結合していない検出プローブ上のＡＥ標識を優先的に
加水分解するためのもの：６００ｍＭのホウ酸、１８２．５ｍＭのＮａＯＨ、１％（ｖ／
ｖ）のオクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ｐＨ８．５。ＡＥ標
識から化学発光応答を発生させるための検出試薬は、検出試薬Ｉ（１ｍＭの硝酸及び３２
ｍＭのＨ２Ｏ２）、及びｐＨを中和するための検出試薬ＩＩ（１．５Ｍ  ＮａＯＨ）から
なっていた（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号及び第５，６５
８，７３７号）。試薬の添加及び混合の工程はすべて手動で、又は手動工程と自動化工程
の組合わせにより、又は完全自動化システムにより実施できる。ＴＭＡを用いる増幅法は
、実質的に米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号に開示された方
法を用いる。単一プライマー型の転写関連増幅を用いる増幅法は、実質的に米国特許出願
公開第２００６−００４６２６５号Ａ１（Ｂｅｃｋｅｒら）に開示された方法を用いる。
ＡＥ標識プローブの使用、及び標的配列を含むハイブリダイゼーション複合体を検出する
ためのシグナル検出は、実質的に米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４
４号及び第５，６５８，７３７号に開示された方法を用いる。ヘアピンプローブの使用方
法は、米国特許第６，８４９，４１２号、第６，８３５，５４２号、第６，５３４，２７
４号及び第６，３６１，９４５号に開示されている。
【実施例】
【００５０】
［０００４５］  試料が約１００コピーの１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列を含有する場合、
種々の組合わせの当該増幅オリゴマー及びＡＥ標識した検出プローブを用いて検出可能な
化学発光シグナルを発生させることにより、レジオネラ・ニューモフィラ１６ＳｒＲＮ
Ａ配列が特異的に検出された。本発明方法の好ましい態様を実施例１〜４に示す。
【００５１】
［０００４６］  実施例１：レジオネラ・ニューモフィラの標的配列の特異的な増幅及
び検出
［０００４７］  レジオネラ・ニューモフィラ及びレジオネラ・ワズワーシイに由来す
る１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の既知数のインビトロ転写体を、同一の条件及び増幅オリゴマー
組合わせを用いるＴＭＡ反応で別個に増幅させ、増幅生成物を同一プローブ（配列番号１
３をｎｔ１６と１７の間でＡＥ標識）により検出した。要約すると、レジオネラ・ニュー
モフィラ又はレジオネラ・ワズワーシイの１６Ｓ ｒＲＮＡインビトロ転写体１００、１
０００、１００００又は１０００００コピーを検体希釈用緩衝液中で混合することにより
、検体を調製した。検体を増幅試薬及び増幅オリゴマー（増幅オリゴマーの組合わせ：配
列番号４１と４６、又は４１と５５、又は５４と４６、又は５４と５５）と混合し、実質
的に米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）に
詳述された方法を用いるＴＭＡ反応において増幅させた。要約すると、増幅試薬、標的核
酸、及び増幅オリゴマー（反応当たり１５ｐｍｏｌの各オリゴマーの組合わせ）を含有す
る反応混合物（約０．０８ｍｌ）を混合し、シリコーン油（０．２ｍｌ）で覆って蒸発を
防ぎ、６２℃で１０分間、次いで４２℃で５分間、インキュベートした。次いで酵素試薬
（０．０２５ｍｌ；ＭＭＬＶ−ＲＴ及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有）を添加し、反
応混合物を４２℃で６０分間インキュベートした。増幅の後、増幅生成物の検出には、標
識した配列番号１３の検出プローブオリゴマー（反応当たり０．１ｐｍｏｌ、０．１ｍｌ
のプローブ試薬中、ハイブリダイズした標識プローブから約５，０００，０００相対光単
位（ＲＬＵ）の検出範囲の検出可能な最大シグナルを発するように予め定めた量）を増幅
混合物と混合することを伴っていた。プローブと増幅配列の混合物をインキュベートして
検出プローブを増幅生成物にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプローブから発せ
られる化学発光シグナルを実質的に米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，
６０４号の記載に従って検出した。要約すると、プローブと増幅配列の混合物を６２℃で
２０分間インキュベートし、次いで室温で約５分間冷却し、選択試薬（０．２５ｍｌ）を
添加し、混合し、６２℃で１０分間、続いて室温で１５分間インキュベートして、結合し
ていないプローブ上の標識を加水分解した。検出試薬Ｉを添加し、インキュベートし、検
出試薬ＩＩを添加することにより、結合したプローブ上のＡＥから化学発光シグナルを発
生させ、ルミノメーター（例えばＬＥＡＤＥＲ（登録商標）、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎ
ｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いてシグナル（ＲＬＵ）を
測定した。当該アッセイの結果を、それぞれの増幅オリゴマー組合わせについて実施した
２回のアッセイに関する平均ＲＬＵとして表３に示す。すべての場合、陰性対照（すなわ
ち、標的コピー数ゼロの検体を用いて同一様式で実施した反応）は１９９６〜２５７９Ｒ
ＬＵのバックグラウンドシグナルを発した。当該結果は、配列番号４１と４６、又は４１
と５５、又は４６と５４、又は５５と５４の増幅オリゴマー組合わせが、増幅生成物にハ
イブリダイズした配列番号１３のＡＥ標識プローブからのシグナルにより検出して、ＴＭ
Ａ反応においてわずか１０Ｏコピーのレジオネラ・ニューモフィラ由来１６ＳｒＲＮＡ
標的配列を増幅できたことを示す。これに対し、レジオネラ・ワズワーシイ１６ＳｒＲ
ＮＡを用いた場合、同一の条件並びに増幅オリゴマー組合わせ及び検出プローブを用いて
、一般に陰性結果が得られた。高いコピー数のレジオネラ・ワズワーシイ１６ＳｒＲＮ
Ａ（１００００〜１０００００）を含有する反応のみがバックグラウンドより高いシグナ
ルを発した。
【００５２】
【表５】
2013247965.tif 000007
【００５３】
配列番号５１と４３、又は５２と４３、又は５１と４５、又は５２と４５（各プライマ
ーを反応当たり１５ｐｍｏｌで使用）の増幅オリゴマー組合わせ、及びＡＥ標識した配列
番号２１の検出プローブを用いて、同様なアッセイを実施した。ＴＭＡ増幅及び化学発光
検出の工程を、実質的に前記に従い、鋳型核酸としてレジオネラ・ニューモフィラ又はレ
ジオネラ・ワズワーシイの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列のインビトロ転写体を反応当たり１０、
１００、１０００、１００００及び１０００００コピーで用いて実施した。配列番号５２
と４３の増幅オリゴマー組合わせは、１００００及び１０００００コピーのレジオネラ・
ニューモフィラの標的を信頼性をもって検出し（それぞれ、３１，４３７及び２，２０６
，１０２の平均ＲＬＵ）、同一コピー数のレジオネラ・ワズワーシイの標的を検出しなか
った（それぞれ、７，１５２及び７，４３７の平均ＲＬＵ）。配列番号５２と４５の増幅
オリゴマー組合わせは、１０００、１００００及び１０００００コピーのレジオネラ・ニ
ューモフィラの標的を信頼性をもって検出し（それぞれ、１４８，８６９、８７４，７４
８及び４，０９９，６８２の平均ＲＬＵ）、同一コピー数のレジオネラ・ワズワーシイの
標的を検出しなかった（それぞれ、１２，０４５、７，８６８及び２０，４８２の平均Ｒ
ＬＵ）。他の増幅オリゴマー組合わせでは、レジオネラ・ニューモフィラの標的配列につ
いて信頼性のある陽性シグナルを発しなかった。
【００５４】
［０００４８］  実施例２：レジオネラ・ニューモフィラの標的配列の特異的な増幅及
び検出
［０００４９］  実質的に実施例１の記載に従い、配列番号５４と５５の増幅オリゴマ
ー（反応当たりそれぞれ１５ｐｍｏｌ）、及びＡＥ標識した配列番号１３の検出プローブ
（反応当たり１００ｆｍｏｌ）を用い、標的核酸として下記の培養細菌からの全ＲＮＡ精
製抽出物を用いて、同様なＴＭＡ反応を実施した：レジオネラ・ニューモフィラの３株、
レジオネラ属の他の種（レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオ
ネラ・スピリテンシス、及びレジオネラ・ワズワーシイ）、及びレジオネラ属以外の種（
肺炎杆菌、ボルデテラ・パラペルタッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕ
ｓｓｉｓ）、及びボルデテラ・ブロンキセプチカ（気管支敗血症菌））。全ＲＮＡを標準
法により精製してＲＮＡを可逆的に支持体に結合させ（例えばＡＭＢＩＯＮ（登録商標）
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ製品についての製造業者による記載に従う）、精製ＲＮＡを標準蛍光
測定法により定量した。各ＲＮＡ標的を各供給源につき個別に四重試料を用いたアッセイ
で試験した。同一条件を用い、ただしレジオネラ・ニューモフィラ１６ＳｒＲＮＡ配列
の既知量のインビトロ転写体を用いて、実施例１の記載に従って陽性対照を増幅させた。
陽性対照を、反応当たり１００コピー以上を検出する二重反応によりアッセイした（検出
した平均ＲＬＵ：１００コピーにつき１，５０４，９９８ＲＬＵ、１０００コピーにつき
４，７５４，７７６、１００００コピーにつき５，１３６，９５３、及び１０００００コ
ピーにつき５，２６７，７１３）。陰性対照は標的核酸を含有しない反応混合物であり、
２０４１及び２０９５ＲＬＵのバックグラウンドシグナルを発した。種々の標的からの全
ＲＮＡについての当該アッセイの結果（平均ＲＬＵ）を表４に示す。当該結果は、この方
法がレジオネラ・ニューモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ標的配列を特異的に増幅及び検出し、
レジオネラ属の他の種又はレジオネラ属以外の一般的な細菌に由来する他の１６ＳｒＲ
ＮＡ配列を有意には増幅及び／又は検出しないことを示す。このアッセイ法は、反応当た
り１０ｆｇのレジオネラ・ニューモフィラ精製ｒＲＮＡから増幅した１６ＳｒＲＮＡ標
的からのシグナルを検出したが、同一条件で反応当たり１０ｆｇ又は反応当たり１００ｆ
ｇのレジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・スピリテンシ
ス、レジオネラ・ワズワーシイ、肺炎杆菌、ボルデテラ・パラペルタッシス、及びボルデ
テラ・ブロンキセプチカからの精製ｒＲＮＡを試験した場合は陰性結果が得られた。
【００５５】
【表６】
2013247965.tif 000008
【００５６】
［０００５０］  実施例３：レジオネラ・ニューモフィラ１６ＳｒＲＮＡ標的配列の
増幅及び検出
［０００５１］  異なる増幅オリゴマー組合わせ：配列番号２９と３１、又は２８と３
１、又は２９と３３、又は２８と３３（それぞれ、反応当たり１５ｐｍｏｌ）を用いた以
外は実質的に実施例１の記載に従い、レジオネラ・ニューモフィラ１６ＳｒＲＮＡイン
ビトロ転写体を増幅の標的として用いてＴＭＡ反応を実施した。実質的に実施例１の記載
に従い、ただしＡＥ標識した配列番号５のプローブを用いて増幅生成物を検出した。すべ
ての増幅オリゴマー組合わせで１０００コピー以上の標的核酸が検出され、コピー数がさ
らに低いの標的も検出できる可能性はあったが、陰性対照試験（標的核酸を添加しない）
で検出された比較的高いバックグラウンドによりシグナルが隠蔽された。当該組合わせの
うち、配列番号２９と３１、及び配列番号２８と３１のオリゴマーが、レジオネラ・ニュ
ーモフィラ１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を検出したアッセイにおいて最良の性能を示した。
【００５７】
［０００５２］  実施例４：レジオネラ・ニューモフィラ１６ＳｒＲＮＡ配列の標的
の捕捉、増幅及び検出
［０００５３］  ここに提示するこの方法は、増幅工程の前に試料から標的核酸を精製
することを含んでいた。実質的に米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５
２号及び第６，５３４，２７３号の記載に従って、標的捕捉により標的精製を行った。要
約すると、既知量の１６Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸（試料当たり１、１０、１００及び１００
００コピーのインビトロ転写体、全容量０．４ｍｌの試料輸送溶液中）を含有する試料を
調製し、配列番号６６又は配列番号６７にｄＴ３Ａ３０テールを共有結合させた標的捕捉
オリゴマー（アッセイ当たり２．５ｐｍｏｌ）、及びポリｄＴオリゴマーを共有結合させ
た磁性粒子と混合した。混合物をまず６０℃で３０分間、次いで室温で３０分間インキュ
ベートして、レジオネラ菌ＲＮＡが粒子に捕捉されたハイブリダイゼーション複合体を形
成した。容器の外側に磁界を１０分間付与し、次いで溶液相を吸引して他の試料成分を除
去することにより、レジオネラ菌ＲＮＡを捕捉した磁性粒子を分離し、ハイブリダイゼー
ション複合体が付着した粒子を続けて２回洗浄した（室温の洗浄溶液それぞれ１ｍｌで、
洗浄溶液を磁性粒子から吸引除去して）。レジオネラ菌標的核酸を含むハイブリダイゼー
ション複合体が付着した粒子を、配列番号５４と５５の増幅オリゴマー（アッセイ当たり
、それぞれ１５ｐｍｏｌ）を含有する増幅試薬に懸濁し、実質的に実施例１の記載に従っ
てＴＭＡ反応を実施した。次いでＡＥ標識した配列番号１５のプローブ（アッセイ当たり
０．１ｐｍｏｌ）を用いて増幅生成物を検出し、実質的に実施例１の記載に従って化学発
光シグナルを検出した。各条件について二重試料を調製してアッセイし、検出した平均Ｒ
ＬＵとして報告した結果を表５に示す。陰性対照を同様に、ただし標的ＲＮＡを含有させ
ずに処理し、１４８５〜１６４０ＲＬＵのバックグラウンドが得られた。表５の結果は、
増幅及び検出と標的捕捉を組み合わせると反応当たりわずか１コピーのレジオネラ菌標的
を検出できたことを示す。ただし、低いコピー数（１〜１０コピー）の試料については１
００コピー以上を含有する試料の場合より二重試料間の結果の変動が大きかった。
【００５８】
【表７】
2013247965.tif 000009
【００５９】
［０００５４］  前記に従い、同一の標的捕捉プローブ、増幅プライマー及び検出プロ
ーブを用い、ただしレジオネラ・ニューモフィラ血清グループ１、レジオネラ・ニューモ
フィラ血清グループ７９９、レジオネラ・ロングビーチェ、大腸菌、化膿連鎖球菌（Ｓ．
ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、ストレプトコッカ
ス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅ
ｕｓ）の培養物から実施例２の記載に従って調製した標的ＲＮＡを用いるアッセイにおい
て、同様な実験を実施した。結果は、このアッセイが血清グループ１及び７９９の両方の
レジオネラ・ニューモフィラを特異的に検出する（４．９〜５．３×１０６ＲＬＵを検出
）が、他の細菌から単離した他のいずれの標的核酸についても陽性シグナルを検出しない
（すべて１０，０００ＲＬＵ未満、通常は約２０００ＲＬＵのバックグラウンドレベルで
）ことを示した。
【００６０】
［０００５５］  レジオネラ・ニューモフィラの２３ＳｒＲＮＡ配列の増幅及び検出
［０００５６］  レジオネラ・ニューモフィラの２３ＳｒＲＮＡ配列（２３Ｓ ｒＲＮ
Ａ、又は２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む）中にある配列を増幅及び検出する
ために、既知の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列又は２３Ｓ ｒＲＮＡをコードする遺伝子配列を比較
し、レジオネラ・ニューモフィラ単離株に共通であるけれども好ましくはレジオネラ属の
他の種又は他の細菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ配列と完全には同一でない配列を選択することに
より、増幅オリゴマー及び検出プローブとして作用するオリゴマーを設計した。レジオネ
ラ属の種（レジオネラ・アニサ、レジオネラ・ブリミンガミエンシス、レジオネラ・ボゼ
マニイ、レジオネラ・チェリイ、レジオネラ・デュモフィイ、レジオネラ・ゴルマニイ（
Ｌ．ｇｏｒｍａｎｉｉ）、レジオネラ・ハッケリエ、レジオネラ・イスラエレンシス（Ｌ
．ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ジャメストウニエンシス、レジオネラ・ジョ
ルダンシス、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・オー
クリッジネシス、レジオネラ・パリシエンシス、レジオネラ・ニューモフィラ、レジオネ
ラ・ルブリルセンス、レジオネラ・サンチクルシス、レジオネラ・セイントヘレンシ、及
びレジオネラ・ワズワーシイ）及び他の細菌種（アシネトバクター・カルコエセチカス（
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏｅｃｅｔｉｃｕｓ）、エンテロバクター・エロ
ゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロア
カエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・ジェルゴビエ
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｒｇｏｖｉａｅ）、緑膿菌、シュードモナス・アルカ
リゲネス、シュードモナス・セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）、シュードモナス・フルオ
レッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・マルトフィリア（Ｐ．ｍ
ａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、プロテウス・ミラボリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｏｌｉｓ）、プロテ
ウス・ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナス・スタッツェリ、コリネバ
クテリウム・ダイバーサス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ）、コ
リネバクテリウム・シュードツベルクローシス（偽結核菌）、肺炎杆菌、鼻硬腫菌（Ｋ．
ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ
）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸炎菌（Ｓ．
ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、ソネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、及び腸炎
ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ））の既知の２３ＳｒＲ
ＮＡ配列（ＲＮＡ又は遺伝子）を用いて配列比較を実施した。特異的配列を選択し、イン
ビトロで合成し、標準実験法を用いてそのオリゴヌクレオチドのＴｍ及び相補的標的配列
（合成したもの、又は細菌から精製したｒＲＮＡ配列）とのハイブリダイゼーション特性
を測定してレジオネラ・ニューモフィラ用オリゴマーを特性分析した。種々の組み合わせ
の増幅オリゴマーを、合成２３Ｓ  ＲＮＡ標的配列又は培養増殖した多様なレジオネラ属
菌種から精製した２３Ｓ ｒＲＮＡと共に増幅反応に用いて、２３ＳｒＲＮＡ標的配列の
増幅効率を判定することにより、選択したレジオネラ・ニューモフィラ用オリゴマー配列
をさらに試験した。一般に、標識プローブを増幅生成物に結合させて増幅生成物の量の指
標となるシグナルの相対量を検出することにより反応の増幅生成物を検出することによっ
て、種々の組み合わせの増幅オリゴマーの相対効率を測定した。通常は、増幅効率の初期
試験は、増幅生成物にハイブリダイズしたＡＥ標識した線状検出プローブを用いて増幅生
成物を検出することを伴い、ハイブリダイズしていないプローブ中のＡＥを選択的に分解
してハイブリダイズしたプローブからのシグナルを検出するＨＰＡ法により検出を行った
（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号
及び第５，８２４，４７５号の記載に従う）。
【００６１】
［０００５７］  ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的配列について選択した増幅オリゴマーを表６に
示す。表中、プロモータープライマー及びプロモータープロバイダーオリゴマー中のプロ
モーター配列には小文字を用いた。表６に対応するプロモータープライマー中のものと同
一の標的特異的配列からなるオリゴマーをあげる（例えば配列番号７１の標的特異的配列
は、配列番号７５〜７７の３つのプロモータープライマー中に含まれる）。分子増幅法の
当業者であればいかなる既知のプロモーター配列も標的特異的配列の５’末端に結合した
標的特異的配列を合成しうることを認識するであろう。好ましい態様には、配列番号９０
、９１及び９２に示す、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーターが含まれる。
【００６２】
【表８】
2013247965.tif 000010
【００６３】
［０００５８］  表６に示す増幅オリゴマーの組合わせを用いて作製した２３ＳｒＲ
ＮＡ配列の増幅生成物に特異的なプローブには、
【００６４】
【化２】
2013247965.tif 000011
【００６５】
のものが含まれる。配列番号７２の好ましい態様の検出プローブを、ヌクレオチド６と７
、８と９、又は１２と１３の間の位置で非ヌクレオチドリンカーによりこのオリゴマーに
結合したＡＥ標識で標識する。配列番号８８及び８９の好ましい態様のプローブは、５’
側−発蛍光団（例えばフルオレセイン）、３’側−クエンチャー（例えばＤＡＢＣＹＬ）
、及びヌクレオチド５と６の間の非塩基部分（例えばＣ９）を含む。
【００６６】
［０００５９］  レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的核酸を他の試料成
分から分離するための試料調製に用いる捕捉プローブの態様には、２３ＳｒＲＮＡ配列
又は２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡにハイブリダイズする
【００６７】
【化３】
2013247965.tif 000012
【００６８】
の標的特異的配列を含むものが含まれる。好ましい捕捉プローブ態様は、配列番号７３の
標的特異的配列に共有結合した、例えば配列番号７３の３’末端に結合したｄＴ３Ａ３０
の３’テール配列を含み、これはレジオネラ菌標的核酸と捕捉プローブからなるハイブリ
ダイゼーション複合体を支持体上の固定化プローブに結合させる結合パートナーとして機
能する。
【００６９】
［０００６０］  表６にあげたものから種々の増幅オリゴマー組合わせを作り、レジオ
ネラ・ニューモフィラ及び他の細菌から単離した全ＲＮＡ又は２３ＳｒＲＮＡを標的核
酸として用いる前記の単一プライマー型の転写関連増幅において試験した。発蛍光団（５
’側−フルオレセイン）及び３’側−クエンチャー（ＤＡＢＣＹＬ）で標識したヘアピン
プローブ（分子トーチ又は分子ビーコンプローブ）を用い、プローブが増幅配列に結合し
た際に発せられる蛍光を検出することにより、増幅生成物を検出した。当該アッセイによ
り、レジオネラ・ニューモフィラ配列が反応当たり１０−１０Ｍコピーの感度で特異的に
増幅及び検出された。
【００７０】
［０００６１］  実施例５：レジオネラ・ニューモフィラ２３ＳｒＲＮＡ標的配列の
増幅及び検出
［０００６２］  増幅反応中に増幅生成物にハイブリダイズするプローブを用いて、レ
ジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的配列の増幅及び検出をリアルタイムで証
明した。実質的に米国特許出願公開第２００６−００４６２６５号Ａ１に詳述された単一
プライマー型の転写関連増幅法を用い、選択した幾つかの増幅オリゴマーを用いて行うこ
とにより、増幅を実施した。試験した増幅オリゴマーの組合わせには下記のものが含まれ
た：（１）配列番号８７のプライマーと、配列番号７９のプロモータープロバイダー及び
配列番号８５の遮断オリゴマー、又は（２）配列番号８７のプライマーと、配列番号７５
のプロモータープロバイダー及び配列番号８４の遮断オリゴマー。レジオネラ・ニューモ
フィラの標的ＲＮＡ及び増幅試薬を含有する増幅反応物（全容量０．０６０ｍｌ）中で、
実質的にＴＭＡ反応に関する記載に従い、プロモータープロバイダーオリゴマー（反応当
たり１２ｐｍｏｌ）、プライマーオリゴマー（反応当たり１２ｐｍｏｌ）、及び遮断オリ
ゴマー（反応当たり０．８ｐｍｏｌ）、並びに配列番号８９のヘアピンプローブ（分子ト
ーチ）を用いて各アッセイを実施した。増幅オリゴマー、標的及び増幅試薬を含有する（
ただし酵素を含まない）反応混合物を覆って蒸発を防ぎ、９５℃で５分間、次いで４２℃
で２分間インキュベートし、次いで酵素（１０μｌ容量）を添加し、反応物を混合し、４
２℃で３０分間インキュベートし、酵素添加後の増幅反応に際して３０秒毎に蛍光を測定
した。当該試験の結果は、両方の組合わせの増幅オリゴマーとも良好な性能を示し、ヘア
ピンプローブは増幅開始後、一般に予定した第１５回〜第２５回の間隔で検出可能なシグ
ナルを発することを示した。このアッセイで１００コピー以上の標的核酸が検出された。
【００７１】
［０００６３］  レジオネラ・ニューモフィラ２３Ｓ ｒＲＮＡ標的を配列番号８７の
プライマーオリゴマー、配列番号７５のプロモータープロバイダーオリゴマー、及び配列
番号８４又は８５の遮断オリゴマーの組合わせと共に用いて、同様な試験を実施した。配
列番号８８のヘアピンプローブを用いて増幅生成物を検出した。当該試験の結果は、配列
番号８８のプローブが１０３コピー以上の標的核酸を検出することを示した。
【００７２】
［０００６４］  当該試験により測定するレジオネラ・ニューモフィラ２３ＳｒＲＮ
Ａ標的のリアルタイム検出に好ましい増幅オリゴマーの組合わせには、配列番号７５、８
４及び８７が含まれていた。レジオネラ・ニューモフィラ２３ＳｒＲＮＡを増幅及び検
出するための好ましい方法は、実質的にレジオネラ・ニューモフィラ１６ＳｒＲＮＡの
捕捉について前記に延べたものと同様に実施し、ただし２３ＳｒＲＮＡ配列に特異的な
標的捕捉オリゴマー、例えば配列番号７３を含むオリゴマーを用いる標的捕捉工程をも含
む。好ましい方法には、標的特異的配列中に２’メトキシＲＮＡ基を含み、かつ３’テー
ル配列、例えばｄＴ３Ａ３０に共有結合させて合成した、配列番号７３の捕捉プローブを
用いる。当該アッセイ法を用いて、０．１ｍｌにつき約６×１０５細胞から得たＲＮＡを
試験した場合、レジオネラ・ニューモフィラ血清グループ１〜１４（ＡＴＣＣ寄託番号３
３１５２、２２１５４、２２１５５、３３１５６、３３２１５、３３８２３、３５０９６
、３５２８９、４３２８３、４３１３０、４３２９０、４３７３６、及び４３７０３）が
陽性検出された。しかし、レジオネラ属の１４種（レジオネラ・ニューモフィラ以外の菌
種）及びレジオネラ属以外の２８種の細菌から同様な試料を調製して試験した場合、交差
反応性はみられなかった。試験したレジオネラ・ニューモフィラ以外の菌種には、レジオ
ネラ・フィーレイ（Ｌ．ｆｅｅｌｅｉ）、レジオネラ・ロングビーチェ、レジオネラ・ワ
ズワーシイ、レジオネラ・デュモフィイ、レジオネラ・ハッケリエ、レジオネラ・オーク
リッジエンシス（Ｌ．ｏａｋｒｉｄｇｅｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・バーミンガメンシス
（Ｌ．ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ジャメストウネンシス（Ｌ．ｊ
ａｍｅｓｔｗｎｅｎｓｉｓ）、レジオネラ・ヨルダニス（Ｌ．ｊｏｒｄａｎｉｓ）、レジ
オネラ・ルブリルセンス、レジオネラ・ミクダデイ、レジオネラ・パリシエンシス、レジ
オネラ・ゴルマンディイ（Ｌ．ｇｏｒｍａｎｄｉｉ）及びレジオネラ・ボゼマニイが含ま
れていた。試験したレジオネラ属以外の細菌には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア、シュードモナス・スタッツ
ェリ、シュードモナス・アシドベランス（Ｐ．ａｃｉｄｏｖｅｒａｎｓ）、シュードモナ
ス・アルカリゲネス、緑膿菌、シュードモナス・メドシナ（Ｐ．ｍｅｄｏｃｉｎａ）、ア
シネトバクター・カルコアセチカス、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎杆菌、ミクロコッカス・カタラリス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  
ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｅｒｒｈｏｅａｅ）、
大腸菌、モラクセラ・オビス（ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｏｖｉｓ）、インフルエンザ菌、パ
ラインフルエンザ菌（Ｈ．  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス・サ
ングイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミュ
ータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ピロゲネ（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅ
）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
、コリネバクテリウム・アクアティクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｑｕａｔ
ｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ゼローシス、及びコリネバクテリウム・ストリアトゥ
ム（Ｃ．ｓｔｒｉａｔｕｍ）が含まれていた。
【数１】
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【数２】
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【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
2013247965.tif 000028
【数１７】
2013247965.tif 000029
【数１８】
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【数１９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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