(57)【要約】      （修正有）【課題】クロストリジウム・ディフィシル菌株検出用組成物及びそれを利用した検出方法を提供する。【解決手段】（ａ）（ｉ）特定の塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）特定の塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに（ｂ）（ｉ）特定の塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）特定の塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットからなる群から選択される一つ以上のプライマーセットを含むクロストリジウム・ディフィシル菌株の検出用組成物。【選択図】図１Ａ
2013255492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットからなる群から選択される一つ以上のプライマーセットを含むクロストリジウム・ディフィシル菌株の検出用組成物。
【請求項２】
（ｉ）配列番号：１４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：１５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ｉ）配列番号：２８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２９で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；
（ｂ）（ｉ）配列番号：２２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２３で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに
（ｃ）（ｉ）配列番号：２５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２６で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；からなる群から選択される一つ以上のプライマーセットをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号：３または配列番号：６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
配列番号：１６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
配列番号：３０で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
配列番号：９，２４および２７から構成される群から選択される一つ以上のヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
試料において、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出する方法であって、
前記試料から得られた核酸試料を、
（ａ）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに
（ｂ）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；からなる群から選択される一つ以上のプライマーセットと、ハイブリダイゼーションさせる段階と、
標的核酸配列を増幅させる段階と、
増幅された標的核酸配列を検出する段階と、を含み、
前記増幅された標的核酸配列の検出は、試料において、クロストリジウム・ディフィシル菌株の存在を示すものである方法。
【請求項１０】
前記試料から得られた核酸試料を、（ｉ）配列番号：１４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：１５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットと、ハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料から得られた核酸試料を、（ｉ）配列番号：２８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２９で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットと、ハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料から得られた核酸試料を、
（ａ）（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；
（ｂ）（ｉ）配列番号：２２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２３で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに
（ｃ）（ｉ）配列番号：２５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２６で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；からなる群から選択される一つ以上のプライマーセットと、ハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
増幅された核酸配列を、配列番号：３または６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
増幅された核酸配列を、配列番号：１６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
増幅された核酸配列を、配列番号：３０で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
増幅された核酸配列を、配列番号：９、２４、および２７から構成される群から選択される一つ以上のヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料は、糞便、綿棒で採取した試料、体液または組織切片を含むことを特徴とする請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅は、マルチプレックスＰＣＲによって遂行されることを特徴とする請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
プライマーセットによって増幅された増幅標的核酸配列は、４０ｂｐないし１００ｂｐの長さを有する、請求項９〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
増幅された核酸を検出する段階は、リアルタイムで遂行される、請求項９〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシル菌株または毒性のあるクロストリジウム・ディフィシル菌株を検出するプライマーセットを含む組成物、およびプライマーセットを利用して、試料においてクロストリジウム・ディフィシル菌株を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）はクロストリジウム属のグラム陽性細菌の種類であり、嫌気性であって胞子（spore）を形成する細菌である。
【０００３】
クロストリジウム・ディフィシルは、抗生物質の使用に関連して見られる下痢の最も深刻な原因である。クロストリジウム・ディフィシル菌保有者に対して、抗生物質が投与されると、正常腸内菌叢が攪乱される結果、菌の異常増殖や毒素産生が起こる。毒素は、腹部痛を伴う膨満感（bloating）、便秘および下痢を誘発し、偽膜性大腸炎などを引き起こす。潜伏期の症状は、しばしばインフルエンザと類似の症状のようになる。原因となる抗生物質治療を中断することによってほとんど改善する。
【０００４】
クロストリジウム・ディフィシル感染の症状は、無症状の場合もあるが、特に、高齢者にとっては生命を脅かすほど深刻となる場合がある。病院、養老院または保護施設で感染する場合が多いが、地域や外来患者診療時にクロストリジウム・ディフィシルに感染するケースが増加している。クロストリジウム・ディフィシル感染の比率は、２週間以下の入院患者で１３％、および４週間以上の入院患者で５０％と見積もられている。クロストリジウム・ディフィシル大腸炎の頻度および重症度は高く、初期の治療および集中的な管理が、回復に重要となる。
【０００５】
クロストリジウム・ディフィシルの毒性因子は、Ａ毒素、Ｂ毒素、二元毒素（binary toxin）および強毒素（hypervirulent toxin)がある。Ａ毒素は、エンテロトキシンであって、ｔｃｄＡ遺伝子をコードする。Ｂ毒素は、サイトトキシンであって、ｔｃｄＢ遺伝子をコードする。二元毒素は、ｃｄｔＡおよびｃｄｔＢ遺伝子をコードし、毒性の作用メカニズムは、まだ確認されていない。強毒素（hypervirulent toxin）は、毒性の菌株ＮＡＰ１／ＢＩ／０２７に関連し、△１１７ ｔｃｄＣ ＳＮＰ(single nucleotide polymorphism、一塩基変異多型)によるものである。北米で地域的な発生拡大を引き起こし、シフロ（Ｃｉｐｒｏ；シプロフロキサシン）およびレバキン（levaquin；レボフロキサシン）などのフルオロキノロン抗生物質に耐性があるクロストリジウム・ディフィシルの新しい高毒性菌株の出現が２００５年に報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
毒性があるクロストリジウム・ディフィシルは、胞子を形成して接触性感染を誘発するため、患者を隔離する必要がある。このため、毒性のあるクロストリジウム・ディフィシル菌株を短時間内に特異的に検出し、正確で迅速な診断を行う必要がある。
【０００７】
クロストリジウム・ディフィシルの感染検査方法としては、分離培養法、細胞毒性試験法、抗原検査法、トキシン検出法などがある。
【０００８】
しかしながら、分離培養法は、培養時間が必要であるため、結果の判定に数日を要するため、早期の検出が難しい。細胞毒性試験法は、試料中の物質が細胞毒性を示すことがあり、偽陽性がでやすいことや、試験方法が煩雑である。抗原検査法は、検査方法は非常に簡便であるが、低感度であり、偽陰性がでやすい。トキシン検出法は、イムノクロマト法やＥＬＩＳＡ法を用いた方法であり、検査キットが市販されているが、検出域量の毒素が排出されている必要があり、感染初期の段階では検出が難しく、また、特定の毒素の検出を対象としているために、例えば変異株などの菌に対して偽陰性となる可能性がある。
【０００９】
したがって、本発明の一目的は、クロストリジウム・ディフィシルを迅速かつ高感度で検出することである。また、本発明の他の一目的は、クロストリジウム・ディフィシルを一次的に迅速かつ高感度で検出することである。さらに、本発明の他の一目的は、毒性を有するクロストリジウム・ディフィシル菌株を迅速かつ高感度で検出することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、（ａ）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットからなる群から選択される一つ以上のプライマーセットを含むクロストリジウム・ディフィシル菌株の検出用組成物である。
【００１１】
本発明のさらに他の態様は、上記組成物を用いて試料からクロストリジウム・ディフィシル菌株を検出する方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一態様の組成物によれば、クロストリジウム・ディフィシル菌株を特異的に検出することができる。また、毒性遺伝子に対するプライマーセットを使用して、毒性または強毒性を有するクロストリジウム・ディフィシル菌株を、短時間で特異的に、高い感度で検出することができる。
【００１３】
また、一態様の検出方法によれば、クロストリジウム・ディフィシル菌株を特異的に検出することができる。また、毒性遺伝子に対するプライマーセットを使用して、毒性または高度毒性を有するクロストリジウム・ディフィシル菌株を、短時間内に特異的に高い感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ｇｌｕＤ遺伝子を検出するために、配列番号：１または２で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図１Ｂ】ｇｌｕＤ遺伝子を検出するために、配列番号：４または５で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図１Ｃ】ｇｌｕＤ遺伝子を検出するために、配列番号：１または２で表される塩基配列を有するプライマーを使用し、かつ配列番号：３で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。
【図１Ｄ】ｇｌｕＤ遺伝子を検出するために、配列番号：４または５で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：６で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。
【図２Ａ】標的ｔｃｄＡ遺伝子を検出するために、配列番号：７または８で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（response unit：ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図２Ｂ】標的ｔｃｄＡ遺伝子を検出するために、配列番号：１０または１１で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：１２または１３で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（response unit：ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図３】［図３Ａ］：標的ｔｃｄＡ遺伝子を検出するために、配列番号：７または８で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：９で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。［図３Ｂ］：標的ｔｃｄＡ遺伝子を検出するために、配列番号：１０または１１で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：１２または１３で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。
【図４Ａ】標的ｔｃｄＢ遺伝子を検出するために、配列番号：１４または１５で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：１６で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図４Ｂ】標的ｔｃｄＢ遺伝子を検出するために、配列番号：１７または１８で表される塩基配列からなる順方向プライマー、および配列番号：１９または２０で表される塩基配列からなる逆方向プライマーを使用し、かつ配列番号：２１で表される塩基配列を有するプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図５】［図５Ａ］：標的ｔｃｄＢ遺伝子を検出するために、配列番号：１４または１５で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：１６で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。［図５Ｂ］：標的ｔｃｄＢ遺伝子を検出するために、配列番号：１７または１８で表される塩基配列からなる順方向プライマー、および配列番号：１９または２０で表される塩基配列からなる逆方向プライマーを使用し、かつ配列番号：２１で表される塩基配列を有するプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。
【図６Ａ】標的ｃｄｔＡ遺伝子を検出するために、配列番号：２２または２３で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：２４で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図６Ｂ】標的ｃｄｔＢ遺伝子を検出するために、配列番号：２５または２６で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：２７で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図７】［図７Ａ］：標的ｃｄｔＡ遺伝子を検出するために、配列番号：２２または２３で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：２４で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。［図７Ｂ］：標的ｃｄｔＢ遺伝子を検出するために、配列番号：２５または２６で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：２７で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。
【図８Ａ】野生型（wild type）ｔｃｄＣ遺伝子を検出するために、配列番号：２８および２９で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：３０で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図８Ｂ】Δ１１７ ＳＮＰを含む突然変異（mutant）ｔｃｄＣ遺伝子を検出するために、配列番号：２８または２９で表される塩基配列からなるΔ１１７ ＳＮＰを含む突然変異（mutant）ｔｃｄＣ遺伝子のためのプライマーを使用し、かつ配列番号：３０で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示すグラフであり、ｙ軸は、反応単位（ＲＵ）であり、ｘ軸は、サイクル数である。
【図９】［図９Ａ］：野生型（wild type）ｔｃｄＣ遺伝子を検出するために、配列番号：２８または２９で表される塩基配列からなるプライマーを使用し、かつ配列番号：３０で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。［図９Ｂ］：Δ１１７ ＳＮＰを含む突然変異（mutant）ｔｃｄＣ遺伝子を検出するために、配列番号：２８または２９で表される塩基配列からなるΔ１１７ ＳＮＰを含む突然変異（mutant）ｔｃｄＣ遺伝子のためのプライマーを使用し、かつ配列番号：３０で表される塩基配列からなるプローブを使用して、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出した結果を示す電気泳動図である。
【図１０Ａ】マルチプレックスＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】マルチプレックスＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１０Ｃ】マルチプレックスＰＣＲの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態は、（ａ）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；（ｂ）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；（ｃ）（ｉ）配列番号：１４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：１５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；（ｄ）（ｉ）配列番号：２８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２９で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；（ｅ）（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；（ｆ）（ｉ）配列番号：２２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２３で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに（ｇ）（ｉ）配列番号：２５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２６で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；からなる群から選択されるクロストリジウム・ディフィシル菌の検出用プライマーセットである。
【００１６】
これらのプライマーセットを用いて、試料中の標的核酸とハイブリダイゼーションを行って、増幅させることによって、高感度かつ迅速に試料中にクロストリジウム・ディフィシル菌株が存在するか否かが判別される。それぞれのプライマーセットについては下記に詳述する。
【００１７】
各プライマーセットは、クロストリジウム・ディフィシル菌を検出するにあたり、セルフダイマー（ｓｅｌｆ−ｄｉｍｅｒ）の発生が少なく、交差反応性が低い。このため、検出感度が高く、また、これらのプライマーセットの組み合わせにより、クロストリジウム・ディフィシル菌株を特異的に検出することができる。また、それぞれの遺伝子に対して、アンプリコンの大きさが１００ｂｐ以下であるため、短時間で増幅が可能である。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いることができるため、さらに検出時間を短縮化させることができる。
【００１８】
ここで、「配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー」とは、配列番号：１で表される塩基配列のうち、１０個以上連続している任意の塩基配列に相当するポリヌクレオチドを含むプライマーを指し、好適には、配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマーである。以下、全ての同様の表記のプライマーおよびプローブにおいて、上記配列番号１と同様である。
【００１９】
本発明は、クロストリジウム・ディフィシルの検出にあたって、分子遺伝学的手法を用いたものである。病原性遺伝子を分子的診断に利用する場合、遺伝子変異によるエラー発生の可能性があり、変種によって陰性と誤って判定を行う可能性がある。このため、さまざまな系統（strain）のクロストリジウム・ディフィシル菌株において共通して発現し、かつ変異が少ないタンパク質をコードする遺伝子を用いることに着目した。かような遺伝子を利用すれば、クロストリジウム・ディフィシルを迅速かつ簡便に一次的に検出することができる。
【００２０】
また、さらに、一次検出の後、毒性を有したクロストリジウム・ディフィシル菌株を検出することによって、迅速かつ簡便に毒性株への感染を診断することができる。
【００２１】
ここで、種々検討した結果、さまざまな系統（strain）のクロストリジウム・ディフィシル菌株において共通して発現し、かつ変異が少ないタンパク質をコードする遺伝子として、ｇｌｕＤ遺伝子に着目した。
【００２２】
したがって、本発明の他の一実施形態は、（ａ）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットからなる群から選択される一つ以上のプライマーセットを含むクロストリジウム・ディフィシル菌株の検出用組成物である。
【００２３】
配列番号：１、２、４および５で表される塩基配列に対応するプライマーの標的核酸配列はｇｌｕＤ（ＧＤＨ：glutamate dehydrogenase）遺伝子である。ｇｌｕＤ遺伝子によってコード化されるｇｌｕＤタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシルで発現される代謝性酵素であって、毒性のないクロストリジウム・ディフィシルおよび毒性のあるクロストリジウム・ディフィシルのいずれでも発現している。このために、ｇｌｕＤ遺伝子を検出することができれば、多様な系統のクロストリジウム・ディフィシルを、すぐれた感度をもって検出することができると考え、プライマーセットおよびプローブの探索にあたった。また、ｇｌｕＤ遺伝子を検出することにより、病原性遺伝子の遺伝子変異による誤謬発生の可能性、または誤陽性（false positive）判定の可能性を低減させることができる。
【００２４】
併せて、プライマーセット（ａ）または（ｂ）によって増幅された増幅標的核酸配列は、４０〜１００ｂｐの長さであるため、短時間で特異的にクロストリジウム・ディフィシルを検出することができる。
【００２５】
好適には、上記組成物は、（ａ'）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列からなるプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列からなるプライマーから構成されるプライマーセット；および／または（ｂ'）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列からなるプライマー、（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列からなるプライマーから構成されるプライマーセットを含む。
【００２６】
さらに、前記組成物は、配列番号：３または６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含んでもよい。配列番号：３および６で表される塩基配列に対応するプローブの標的核酸配列はｇｌｕＤ（ＧＤＨ：glutamate dehydrogenase）遺伝子である。このため、プライマーセット（ａ）または（ｂ）で標的配列を増幅させ、増幅した標的配列を上記プローブで検出することができる。好適には、プローブは、配列番号：３、配列番号：６で表される塩基配列およびこれらの相補配列からなる群から選択される少なくとも一からなる。
【００２７】
前記組成物は、（ｃ）（ｉ）配列番号：１４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドおよび、（ｉｉ）配列番号：１５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーセット（以下、単にプライマーセット（ｃ）とも称する）；（ｄ）（ｉ）配列番号：２８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２９で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット（以下、単にプライマーセット（ｄ）とも称する）；（ｅ）（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット（以下、単にプライマーセット（ｅ）とも称する）；（ｆ）（ｉ）配列番号：２２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２３で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット（以下、単にプライマーセット（ｆ）とも称する）；ならびに（ｇ）（ｉ）配列番号：２５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２６で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット（以下、単にプライマーセット（ｇ）とも称する）；からなる群から選択される一つ以上のプライマーセットをさらに含んでもよい。上記プライマーセットの標的配列は、有毒株のクロストリジウム・ディフィシルが産生する各毒素である。このため、プライマーセット（ａ）または（ｂ）により一次スクリーニングした後、または、同時に、各プライマーセットを用いることによって、検出感度を向上させることができるとともに、迅速でかつ簡便に毒性または高度毒性を有するクロストリジウム・ディフィシル菌株を検出することができる。
【００２８】
配列番号：１４および１５で表される塩基配列に対応するプライマーの標的核酸配列は、Ｂ毒素（ｔｃｄＢ：toxin Ｂ Clostridium difficile）遺伝子である。ｔｃｄＢ遺伝子によってコード化されるｔｃｄＢタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシルの毒性を誘発するタンパク質である。ｔｃｄＢ遺伝子は、多様な系統で保存された領域が小さいが、ｔｃｄＢ遺伝子に対して特異的なプライマーセット（ｃ）を使用することにより、毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルを、高感度で検出することができる。併せて、プライマーセット（ｃ）によってＰＣＲ（polymerase chain reaction）増幅される生成物の大きさは４０〜１００ｂｐであるため、短時間で特異的にＢ毒素を産生するクロストリジウム・ディフィシル菌株を検出することができる。また、プローブセット（ｃ）を用いることにより、リアルタイムＰＣＲでのｔｃｄＢ遺伝子の増幅が顕著に進行するため、検出感度が高くなる。
【００２９】
好適には、前記組成物は、（ｃ'）（ｉ）配列番号：１４で表される塩基配列からなるプライマー、および（ｉｉ）配列番号：１５で表される塩基配列からなるプライマーから構成されるプライマーセットを含む。
【００３０】
また、前記組成物は、配列番号：１６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含んでもよい。配列番号：１６で表される塩基配列に対応するプローブの標的核酸配列は、Ｂ毒素（ｔｃｄＢ：toxin Ｂ Clostridium difficile）遺伝子である。このため、プライマーセット（ｃ）で標的配列を増幅させ、増幅した標的配列を上記プローブで検出することができる。好適には、プローブは、配列番号：１６で表されるヌクレオチド配列からなる。
【００３１】
配列番号：２８および２９で表される塩基配列に対応するプライマーの標的核酸配列は、Δ１１７ ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）を含むｔｃｄＣ遺伝子である。ｔｃｄＣ遺伝子の１１７番位置のＳＮＰは、強毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルで確認された毒性遺伝子である。Δ１１７ ＳＮＰを含むｔｃｄＣ遺伝子を検出するために、追加的なプライマーまたはプローブを使用せずに検出することができる対立形質特異的なプライマーセットを使用することができ、それにより、強毒性を有するクロストリジウム・ディフィシル菌株を優れた感度で検出することができる。併せて、プライマーセット（ｄ）によって増幅される増幅標的核酸配列は、４０〜１００ｂｐの長さを有するため、短時間で特異的に強毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルを検出することができる。
【００３２】
好適には、前記組成物は、（ｄ'）（ｉ）配列番号：２８で表される塩基配列からなるプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２９で表される塩基配列からなるプライマーから構成されるプライマーセットを含む。
【００３３】
また、前記組成物は、配列番号：３０で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含んでもよい。配列番号：３０で表される塩基配列に対応するプローブの標的核酸配列は、Δ１１７ ＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）を含むｔｃｄＣ遺伝子である。このため、プライマーセット（ｄ）で標的配列を増幅させ、増幅した標的配列を上記プローブで検出することができる。好適には、プローブは、配列番号：３０で表されるヌクレオチド配列からなる。
【００３４】
配列番号：７および８で表される塩基配列に対応するプライマーの標的核酸配列は、Ａ毒素（ｔｃｄＡ：toxin Ａ Clostridium difficile）遺伝子である。ｔｃｄＡ遺伝子によってコード化されるｔｃｄＡタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシルの毒性を誘発するタンパク質である。ｔｃｄＡ遺伝子に対して特異的なプライマーセット（ｅ）を使用することにより、毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルを、高感度で検出することができる。また、プローブセット（ｅ）を用いることにより、リアルタイムＰＣＲでのｔｃｄＡ遺伝子の増幅が顕著に進行するため、検出感度が高くなる。
【００３５】
好適には、前記組成物は、（ｅ'）（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列からなるプライマー、および（ｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列からなるプライマーから構成されるプライマーセットを含む。
【００３６】
また、クロストリジウム・ディフィシル菌の検出用キットは、配列番号：９で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含んでもよい。配列番号：９で表される塩基配列に対応するプローブの標的核酸配列は、Ａ毒素（ｔｃｄＡ：toxin Ａ Clostridium difficile）遺伝子である。このため、プライマーセット（ｅ）で標的配列を増幅させ、増幅した標的配列を上記プローブで検出することができる。好適には、プローブは、配列番号：９で表されるヌクレオチド配列からなる。
【００３７】
配列番号：２２および２３で表される塩基配列に対応するプライマーの標的核酸配列は、二元毒素を暗号化するｃｄｔＡ遺伝子である。ｃｄｔＡ遺伝子に対して固有デザインのプライマーセット（ｆ）を使用することにより、二元毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルを、高感度で検出することができる。
【００３８】
好適には、前記組成物は、（ｆ'）（ｉ）配列番号：２２で表される塩基配列からなるプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２３で表される塩基配列からなるプライマーから構成されるプライマーセットを含む。
【００３９】
また、クロストリジウム・ディフィシル菌の検出用キットは、配列番号：２４で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含んでもよい。配列番号：２４で表される塩基配列に対応するプローブの標的核酸配列は、ｃｄｔＡ遺伝子である。このため、プライマーセット（ｆ）で標的配列を増幅させ、増幅した標的配列を上記プローブで検出することができる。好適には、プローブは、配列番号：２４で表されるヌクレオチド配列からなる。
【００４０】
配列番号：２５および２６で表される塩基配列に対応するプライマーの標的核酸配列は、二元毒素を暗号化するｃｄｔＢ遺伝子でもある。ｃｄｔＢ遺伝子に対して固有デザインのプライマーセット（ｇ）を使用することにより、二元毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルを、高感度で検出することができる。併せて、プライマーセット（ｇ）によってＰＣＲ増幅される生成物の大きさは４０〜１００ｂｐであるため、短時間で特異的に毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルを検出することができる。
【００４１】
好適には、クロストリジウム・ディフィシル菌の検出用キットは、（ｇ'）（ｉ）配列番号：２５で表される塩基配列からなるプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２６で表される塩基配列からなるプライマーから構成されるプライマーセットを含む。
【００４２】
また、前記組成物は、配列番号：２７で表されるヌクレオチド配列を含むプローブをさらに含んでもよい。配列番号：２７で表される塩基配列に対応するプローブの標的核酸配列は、ｃｄｔＢ遺伝子である。このため、プライマーセット（ｇ）で標的配列を増幅させ、増幅した標的配列を上記プローブで検出することができる。好適には、プローブは、配列番号：２６で表されるヌクレオチド配列からなる。
【００４３】
前記組成物は、前記記載されたプライマーセットおよび／またはプローブを一つ以上（例えば、２以上または３以上）含み、それぞれのプライマーセットおよび／またはプローブは、異なる遺伝子、同一の遺伝子の異なる領域、またはいずれも標的にすることができる。
【００４４】
また、本発明のプライマーは、標識物質で標識化されていてもよい。本発明のプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。例えば、放射性同位体としては32Ｐ，33Ｐ，35Ｓ等、酵素としてはアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等、蛍光物質としてはＣｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅ系のＣｙ３、Ｃｙ５（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルオレセイン等、発光物質としてはＡｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒを含む化学発光試薬等が挙げられる。
【００４５】
プライマーを放射性同位体により標識する場合は、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチド  キナーゼによる５’−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチ
ドトランスフェラーゼを用いた３’−末端標識法、ＲＮＡラベリング法等が挙げられる。プライマーを酵素で標識する場合は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野に於ける常法である直接標識法を用いればよい。
【００４６】
プライマーを蛍光物質により標識する場合は、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野に於ける常法の標識手法によりプライマーに取り込ませればよい。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換する方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８６年，  第１４巻，  ｐ．６１１５参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。その場合、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法もある。発光物質で標識する方法およびビオチンで標識する方法は、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法に従って行えばよい。
【００４７】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されていてもよい。プローブを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。これらの具体的例示は、プライマーの標識物質と同様である。
【００４８】
なお、上記組成物は、クロストリジウム・ディフィシル菌の検出用キットとして用いられてもよい。したがって、本発明の他の好適な一実施形態は、下記（１）〜（７）のいずれかの構成の少なくとも一を含む、クロストリジウム・ディフィシル菌の検出用キットである；（１）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット、ならびに配列番号：３で表される塩基配列を含むプローブ、（２）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット、ならびに配列番号６で表される塩基配列を含むプローブ、（３）（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット、ならびに配列番号９で表される塩基配列を含むプローブ、（４）（ｉ）配列番号：１４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：１５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット、ならびに配列番号１６で表される塩基配列を含むプローブ、（５）（ｉ）配列番号：２２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２３で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット、ならびに配列番号２４で表される塩基配列を含むプローブ、（６）（ｉ）配列番号：２５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２６で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット、ならびに配列番号２７で表される塩基配列を含むプローブ、（７）（ｉ）配列番号：２８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２９で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット、ならびに配列番号３０で表される塩基配列を含むプローブ。
【００４９】
さらに本発明の他の好適な一実施形態は、上記（１）および／または（２）の構成を含む、クロストリジウム・ディフィシル菌の検出用キットである。さらに、本発明の他の好適な一実施形態は、さらに、上記（３）〜（７）のいずれか一の構成を含む、クロストリジウム・ディフィシル菌の検出用キットである。
【００５０】
本発明のプライマーおよびプローブは、その配列中の一部又は全部の塩基が人工塩基に置換されていても良く、このような人工塩基としては、例えばＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｄ．Ｌａｔｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，１７，２５３−２５９，２００３）やＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃ
ｉｄｓ；Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．．８，１４４−１４９，２００６）等が挙げられる。
【００５１】
また、前記組成物またはキットに使用されるいずれか一つ以上のプローブは、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）対で標識されたものであってもよい。また、リアルタイムＰＣＲ法において用いられるプローブとしては、例えば、５'末端が、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＣＹ３、ＣＹ５、ＲＯＸ、ＲＥＤ６１０、ＴＥＸＡＳＲＥＤ、ＲＥＤ６７０およびＮＥＤから構成された群から選択された一つ以上の蛍光マーカーで標識されたり、あるいは３'末端が、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１，２，３およびＭＧＢＮＦＱ（molecular groove binding non-fluorescence quencher）から構成された群から選択された一つ以上の蛍光クエンチャ（fluorescent quencher）で標識されたプローブが挙げられる。
【００５２】
上記プライマーセットは、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出するにあたり、固有デザインの配列により、セルフダイマー（self-dimer）発生を抑制させ、交差反応性を低減し、検出効率感度を向上させ、かつ／または遺伝子の組み合わせを基に、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出して特異性を向上させることができる。また、それぞれの遺伝子に対して、アンプリコンの大きさが１００ｂｐ以下であり、従って、短時間で特異的に標的の増幅が可能である。一つ以上の複数個の遺伝子組み合わせを、一つまたは複数の空間で同時にリアルタイム検出可能にすることにより、検出時間を短縮化させることができる。
【００５３】
用語「ヌクレオチド（nucleotide）配列」は、二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ｃＤＮＡ、または一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡであり、取り立てて記載していない限り、ヌクレオチド類似体を含んでもよい。ヌクレオチド配列は、当業界に公知の方法によって、適切な方法（例えば、化学的合成）によって合成されて製造される。また、ヌクレオチド配列は、商業的に購入することができる。
【００５４】
用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」と同義である。
【００５５】
ヌクレオチドは、当業界に公知の方法によって、適切な方法（例えば、化学的合成）によって合成される。また、ヌクレオチドは、商業的に購入することができる。
【００５６】
用語「プライマー（primer）」は、適した温度で適したバッファ内で適した条件（例えば、４種の異なるヌクレオシド三リン酸および重合反応酵素）において、テンプレート依存型（template-dependent）ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの適した長さは、多様な因子、例えば、温度およびプライマーの用途によって違いがあるが、典型的には、１５〜３５個のヌクレオチド（例えば、１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３または３４ヌクレオチド）である。短いプライマーは、テンプレートと十分に安定したハイブリダイゼーション複合体を形成するために、一般的に、さらに低い温度を要求する。用語「順方向プライマー（forward primer）」および「逆方向プライマー（reverse primer）」は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されるテンプレートの一定部位の３'末端および５'末端にそれぞれ結合するプライマーを意味する。
【００５７】
プライマーは、テンプレート核酸の一領域に、ハイブリダイゼーションまたはアニーリングされ、二本鎖構造を形成することができる。かような二本鎖構造を形成するのに適した核酸ハイブリダイゼーションの条件は、当業者に周知である。
【００５８】
用語「プローブ（probe）」は、特定ポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションされるデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む単量体（monomer）、またはオリゴマー（oligomer）を意味する。例えば、プローブは、ハイブリダイゼーションの効率を高めることが可能なように一本鎖でもある。一態様で、プローブは、テンプレートになるポリヌクレオチド配列に完全に相補的な配列であるが、特異的ハイブリダイゼーションを妨害しない範囲内で、実質的に相補的な配列であってもよい。
【００５９】
用語「標的核酸（target nucleic acid）」または「標的核酸配列（target nucleic acid sequence）」は、ＤＮＡ増幅によって標的になる核酸を意味する。標的核酸配列は、ＰＣＲ反応または逆転写ＰＣＲ反応で、増幅のためのテンプレートとして提供される。標的核酸配列は、天然分子および合成分子を含んでもよい。標的核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡでもある。
【００６０】
前記組成物またはキットは、標的核酸を増幅する、場合によって増幅された標的核酸を検出するのに使用される。増幅は、核酸増幅のために公知の方法でもある。増幅は、例えば、ＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅でもある。増幅方法は、熱循環（thermal cycling）を必要とするもの、または等温（isothermal）で遂行されるものでもある。増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＮＡＳＢＡ：nucleic acid sequence-based amplification法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）法、ＳＤＡ：strand displacement amplification法、ＲＣＡ：rolling circle amplification法などを含んでもよい。増幅とは、標的核酸配列、またはそれに相補的な配列のコピー数を増加させることでもある。「ＰＣＲ」は、重合酵素を利用して、標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅する方法でもある。
【００６１】
また、前記組成物またはキットは、標的核酸の増幅に要求される公知の物質をさらに含んでもよい。例えば、核酸ポリメラーゼ、その活性に必要なバッファ、補助因子、および／または基質をさらに含んでもよい。核酸ポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（reverse transcriptase）およびそれらの組み合わせが挙げられる。逆転写とは、ＲＮＡをテンプレートにして、ＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ鎖を合成するものでもある。核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有するものでもある。例えば、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ、ＭＭＬＶおよびＡＭＶから由来した一つ以上の逆転写酵素でもある。核酸ポリメラーゼは、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity）を有さないものでもある。前記組成物またはキットは、好適にはＰＣＲ増幅に必要な物質を含む。
【００６２】
本発明の好適な一実施形態は、試料から得られた核酸試料と、プライマーセット（ａ）〜（ｇ）の少なくとも一と、をハイブリダイゼーションさせる段階と、標的核酸配列を増幅させる段階と、増幅された標的核酸配列を検出する段階と、を含む、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出する方法である。
【００６３】
本発明の好適な他の一実施形態は、試料において、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出する方法であって、前記試料から得られた核酸試料を、（ａ）（ｉ）配列番号：１で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；からなる群から選択される一つ以上のプライマーセットと、ハイブリダイゼーションさせる段階と、標的核酸配列を増幅させる段階と、増幅された標的核酸配列を検出する段階と、を含み、前記増幅された標的核酸配列の検出は、試料において、クロストリジウム・ディフィシル菌株の存在を示すものである、クロストリジウム・ディフィシル菌株を検出する方法である。この際、増幅された核酸配列を、配列番号：３または６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含んでもよい。好適には、増幅された標的核酸配列の検出を、配列番号：３、６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせることによって行う。
【００６４】
上記方法は、試料から得られた核酸試料を、（ｃ）（ｉ）配列番号：１４で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：１５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットと、ハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含んでもよい。また、増幅された核酸配列を、配列番号：１６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含んでもよい。好適には、増幅された標的核酸配列の検出を、配列番号：１６で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせることによって行う。
【００６５】
上記方法は、試料から得られた核酸試料を、（ｄ）（ｉ）配列番号：２８の１０個以上で表される塩基配列のうち連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２９で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセットと、をハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含んでもよい。また、増幅された核酸配列を、配列番号：３０で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含んでもよい。好適には、増幅された標的核酸配列の検出を、配列番号：３０で表されるヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせることによって行う。
【００６６】
上記方法は、試料から得られた核酸試料と、（ｅ）（ｉ）配列番号：７で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；（ｆ）（ｉ）配列番号：２２で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２３で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；ならびに（ｇ）（ｉ）配列番号：２５で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマー、および（ｉｉ）配列番号：２６で表される塩基配列のうち１０個以上の連続したヌクレオチドを含むプライマーを含むプライマーセット；から選択される一つ以上のプライマーセットと、をハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含んでもよい。また、増幅された核酸配列と、配列番号：９、２４、２７のヌクレオチド配列からなる群から選択される一つ以上のヌクレオチド配列を含むプローブと、をハイブリダイゼーションさせる段階をさらに含んでもよい。好適には、標的核酸配列を増幅させる段階と、増幅された標的核酸配列を検出する段階と、を含み、前記検出は、増幅された核酸配列を、配列番号：９、２４、２７のヌクレオチド配列から選択される一つ以上のヌクレオチド配列を含むプローブとハイブリダイゼーションさせることによって行う。
【００６７】
検出に用いられる試料としては、糞便、綿棒で採取した試料、体液または組織切片などが挙げられる。また、試料として直接核酸試料を用いてもよい。試料から抽出精製してゲノムＤＮＡを得る前処理を行ってもよい。前処理方法としては、例えば、試料を溶菌酵素、界面活性剤、アルカリ等で処理する方法が挙げられる。なお、必要に応じて、試料を適当な培地中で培養してからゲノムＤＮＡを調製してもよい。
【００６８】
用語「ハイブリダイゼーション（hybridization）」は、用語「アニーリング（annealing）」と同義である。ハイブリダイゼーションは、１つの核酸と異なる核酸が、塩基対形成相互作用によって、デュプレックス、トリプレックス（triplex）、または他の高次元構造の形成を引き起こすことを意味する。塩基対形成相互作用は、例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃのように、ワトシン／クリック（Watson/Crick）およびフーグスティーン類型（Hoogsteen-type）の水素結合による塩基特異的な塩基対形成でもある。また、塩基スタッキング（base-stacking）および疎水性相互作用がデュプレックス安定性に寄与することができる。
【００６９】
本発明の検出方法は、標的核酸配列を増幅させる段階を含む。標的核酸配列は、ＤＮＡ増幅によって標的になる核酸を意味する。標的核酸配列は、ＰＣＲ反応等で、増幅のためのテンプレートとして提供される。標的核酸配列は、天然分子および合成分子を含んでもよい。標的核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡでもありうる。
【００７０】
好適には、プライマーセットにより増幅された標的核酸配列の大きさは、４０ｂｐないし１００ｂｐである。標的核酸配列が比較的短いため、増幅および検出に最小限の時間しかかからず、早い検出が可能である。
【００７１】
増幅は、例えば、ＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅でもある。増幅方法は、熱循環（thermal cycling）を必要とするもの、または等温で遂行されるものでもある。増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ＮＡＳＢＡ：nucleic acid sequence-based amplification法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ligase chain reaction）法、ＳＤＡ：strand displacement amplification法、ＲＣＡ：rolling circle amplification法などが挙げられる。増幅とは、標的核酸配列またはそれに相補的な配列のコピー数を増加させることでもある。「ＰＣＲ」は、重合酵素を利用して、標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅する方法でもある。前記ＰＣＲは、当業界で周知である。例えば、ＰＣＲ過程は、１）試料を前処理して核酸抽出物を得る段階、２）酵素、バッファ、ｄＮＴＰ、およびオリゴヌクレオチド・プライマーを含む水性溶液を添加して混合物を得る段階、３）混合物を、２つまたは３つの温度間で熱循環（例えば、９０℃ないし９６℃、３７℃ないし６５℃および７２℃）する段階、および場合によって４）増幅ＤＮＡを検出する段階を含むことができる。ＰＣＲは、ポリプロピレンチューブ、９６ウェルプレートまたはシリコンベースのマイクロＰＣＲチップで行われる。
【００７２】
また、増幅は、マルチプレックスＰＣＲで行うことができる。マルチプレックスＰＣＲ（multiplex ＰＣＲ）法は、複数個のプライマーセットに対して、同一のチャンバで同時にＰＣＲを行うことをいう。好適には、プライマーセット（ａ）または（ｂ）のいずれか一、およびプライマーセット（ｃ）〜（ｅ）の少なくとも一の組み合わせでマルチプレックスＰＣＲを行うことが好ましい。かような方法により、高感度で迅速な検出を行うことができる。具体的には、プライマーセット（ａ）または（ｂ）は全ての株に共通して検出されるため、検出感度が向上し、さらにプライマーセット（ｃ）〜（ｅ）を用いることにより、各プライマーセットに対応した特定の毒性株を特異的に検出することができる。また、各毒性株を同時に検出することも可能である。
【００７３】
マルチプレックスＰＣＲを行った後の増幅物の検出方法としては、増幅された標的核酸配列について電気泳動を行うことによって検出できる。例えば、ＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースなどを使用した慣用のゲル電気泳動に付し、泳動後のＤＮＡ断片を臭化エチジウム染色、蛍光試薬などで検出する方法が例示され、増幅されたＤＮＡ断片の存在およびその長さを確認できる。
【００７４】
本発明の検出方法は、増幅された標的核酸配列を検出する段階を含む。検出方法としては、増幅された標的核酸配列について電気泳動を行う方法、標識プライマーを用いたＰＣＲを行って得られた増幅物の標識を測定する方法、リアルタイムＰＣＲ法などが挙げられる。
【００７５】
増幅物の標識を測定する方法は、検出可能な標識から発生する信号を検出器で測定することを意味する。例えば、前記検出可能な標識から発生する磁気的信号、電気的信号、蛍光、ラマンなどの発光信号、散乱光信号、および放射能信号からなる群から選択される信号を測定することができる。検出する段階は、標的配列に標識された検出可能な標識から発生する信号を検出するものでもある。例えば、検出する段階は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）によって発生する信号を検出し、標的核酸の存在いかんを検出することができる。
【００７６】
本発明の好適な一実施形態は、検出する段階は、リアルタイム（real time）で増幅される核酸配列を、リアルタイムで検出するものである。これにより、短時間で標的核酸配列を検出することができる。
【００７７】
リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第５５３８８４８号）、ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ法（例えば米国特許第５，８０１，１５５号）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ法（例えば米国特許第５９２５５１７号）、ＬＵＸ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ−ＰＣＲ（ＱＰ）法（例えば米国特許第６，４９２，１２１号）などが挙げられる。
【００７８】
この際に用いられるプローブとしては、例えば、５'末端が、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＣＹ３、ＣＹ５、ＲＯＸ、ＲＥＤ６１０、ＴＥＸＡＳＲＥＤ、ＲＥＤ６７０およびＮＥＤから構成された群から選択された一つ以上の蛍光マーカーで標識されたり、あるいは３'末端が、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１，２，３およびＭＧＢＮＦＱ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｎｏｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）から構成された群から選択された一つ以上の蛍光クエンチャ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）で標識されたプローブが挙げられる。
【００７９】
上記のリアルタイムＰＣＲ法の原理は以下の通りである。
【００８０】
すなわち、５’末端を蛍光色素（レポーター）で、３’末端をクエンチャー色素で標識
した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャー色素によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からDNAポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。DNAポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが5'端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。
【００８１】
リアルタイムＰＣＲ法に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常のリアルタイムＰＣＲで用いられているものを用いればよく、リアルタイムＰＣＲの手法は、本発明のプライマーおよびプローブを用いる以外は、リアルタイムＰＣＲの一般的なプロトコルに従って行えばよい。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００８３】
実施例１
クロストリジウム・ディフィシルの検出用プライマーおよびプローブの設計およびリアルタイムＰＣＲ評価
クロストリジウム・ディフィシル菌を検出するための２種のプライマーセット、およびリアルタイムＰＣＲ検出用プローブを、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のデータベースを元にデザインし、相互作用性を分析および検証した。
【００８４】
（１）プライマーセットおよびプローブ：
順方向プライマー：５'−GCTGCATTAGAAAACTCTATAAC−３'（配列番号：１）、
逆方向プライマー：５'−CAGCCTCTGGAGTAGTTG−３'（配列番号：２）、
プローブ：５'−CCATTAGCAGCTCACAA−３'（下線は、ＬＮＡ）（配列番号：３）である。
【００８５】
（２）プライマーセットおよびプローブ：
順方向プライマー：５'−GCTGAATCTATAAAAGCTAAATTAG−３'（配列番号：４）、
逆方向プライマー：５'−CCTCTTTCAGCAAATACTTC−３'（配列番号：５）、
プローブ：５'−TAGTTGGTCCATTAGCAGCCTCACA−３'（配列番号：６）
リアルタイムＰＣＲのプローブとしては、５’末端にレポーター色素ＦＡＭを、３'末
端にレポーター消光体のＢＨＱ１を結合させた標識オリゴヌクレオチドプローブ（ＴａｑＭａｎ(登録商標）プローブ）を用いた。
【００８６】
最終反応濃度各１μＭのプライマー、４００ｎＭの蛍光標識プローブ、０．０２５ｕｎｉｔ／μｌのＴＡＫＡＲＡ社製リアルタイムｚ−ｔａｑＰＣＲ用試薬を混合し、反応液とした。
【００８７】
クロストリジウム・ディフィシルは、Ａ＋／Ｂ＋毒性を有するＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１３８２株を利用し、ＡＴＣＣ機関での標準化方法による手続きによって、ＱＣ基準ＯＤ２６０／ＯＤ２８０：１．６  ｔｏ  ２．０に準ずるＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１３８２Ｄ−５  ｇＤＮＡを購入し、吸光度を利用して定量した後、実験に使用した。
【００８８】
反応液にクロストリジウム・ディフィシルのＤＮＡ試料を加え、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応は、９５℃で２秒間、６０℃で１０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を６０℃で８秒ポイントでＦＲＥＴによってＦＡＭ色素シグナルを測定した。
【００８９】
クロストリジウム・ディフィシルをリアルタイムＰＣＲ分析した結果を、（１）のプライマーセットおよびプローブについては図１Ａに、（２）のプライマーセットおよびプローブについては図１Ｂに示した。図における増幅曲線においては、ＰＣＲのサイクル数をｘ軸に、レポーター色素の発光量（Ｒｕ、ｙ軸）にプロットした。
【００９０】
配列番号：１および２のプライマーセットによってＰＣＲ増幅されるｇｌｕＤ遺伝子の大きさは、９７ｂｐであり、配列番号：４および５のプライマーセットによってＰＣＲ増幅されるｇｌｕＤ遺伝子の大きさは、８５ｂｐである。プライマーセットによって、１コピー（copy）以上のｇｌｕＤ遺伝子検出が可能であった。従って、上記プライマーセットおよびプローブによれば、クロストリジウム・ディフィシル菌株を、短時間かつ高感度で検出することができる。
【００９１】
実施例２
クロストリジウム・ディフィシル菌株の毒素Ａ検出用プライマーおよびプローブの設計およびリアルタイムＰＣＲ評価
クロストリジウム・ディフィシルの毒性を誘発する毒素Ａを検出することにより、毒性のあるクロストリジウム・ディフィシルを検出することができる。
【００９２】
クロストリジウム・ディフィシルの毒素Ａ遺伝子であるｔｃｄＡを特異的に増幅するためのプライマーセットおよびリアルタイムＰＣＲ検出用プローブを、ＮＣＢＩのデータベースを元にデザインした。
【００９３】
（３）プライマーセットおよびプローブ：
順方向プライマー：５'−GCGGAGTATATTTAGATGTTG−３'（配列番号：７）、
逆方向プライマー：５'−ACGGTCTAGTCCAATAGA−３'（配列番号：８）、
プローブ：５'−ATGCTTCCAGGTATTCACT−３'（配列番号：９）である。
【００９４】
上記プライマーセットおよびプローブを用いたこと、および毒素Ａを排出する菌株を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。図２Ａに増幅曲線、図３Ａに電気泳動図を示した。
【００９５】
比較例として、下記プライマーセットによってｔｃｄＡ遺伝子を増幅した（de Boer ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８３：５９−６５（２０１０））参照）。
順方向プライマー：５'−TTGTATGGATAGGTGGAGAAGTCAGT−３'（配列番号：１０）
逆方向プライマー：５'−AATATTATATTCTGCATTAATATCAGCCCAT−３'（配列番号：１１）
プローブ１：５'−ＦＡＭ−ATATTGCTCTTGAATACATAAA−ＮＦＱ−ＭＧＢ−３'（配列番号：１２）
プローブ２：５'−ＦＡＭ−TATTGTTCTTGAATACATAAAAC−ＮＦＱ−ＭＧＢ−３'（配列番号：１３）
上記プライマーセットおよびプローブを用いたこと、および毒素Ａを排出する菌株を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。図２Ｂに増幅曲線、図３Ｂに電気泳動図を示した。
【００９６】
配列番号：７および８のプライマーセットによってＰＣＲ増幅される産物の大きさは、９２ｂｐである。また、配列番号１１および１２のプライマーセットを用いた場合に比べ、配列番号：７および８のプライマーセットを用いた場合の方が核酸の増幅が速く、また大きかった。このことから、配列番号１１および１２のプライマーセットを用いた場合、ｔｃｄＡによる毒性のあるクロストリジウム・ディフィシル菌株を、短時間かつ高感度で検出することができる。
【００９７】
実施例３
クロストリジウム・ディフィシルの毒素Ｂ検出用プライマーおよびプローブの設計およびリアルタイムＰＣＲ評価
クロストリジウム・ディフィシルの毒性を誘発する毒素Ｂを検出することにより、毒性のあるクロストリジウム・ディフィシルを検出することができる。
【００９８】
ｔｃｄＢ遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーセットおよびリアルタイムＰＣＲ検出用プローブを、ＮＣＢＩのデータベースを元にデザインして、相互作用性を分析および検証した。
【００９９】
（４）プライマーセットおよびプローブ：
順方向プライマー：５'−GGTGGTATGTATTTAGATGTTGA−３'（配列番号：１４）、
逆方向プライマー：５'−TCCACTGTTACTGAACTAGG−３'（配列番号：１５）、
プローブ：５'−CCAGGAATACAACCAGACT−３'（配列番号：１６）。
【０１００】
上記プライマーセットおよびプローブを用いたこと、および毒素Ｂを排出する菌株を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。図４Ａに増幅曲線、図５Ａに電気泳動図を示した。
【０１０１】
比較例として、下記プライマーセットを用いてｔｃｄＢ遺伝子を増幅した（de Boer ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８３：５９−６５（２０１０））参照）。
順方向プライマー：５'−GAAACAGGATGGACACCAGGTT−３'（配列番号：１７）または５'−AAGAGGATGGACGCCAGGTT−３'（配列番号：１８）、
逆方向プライマー：５'−ACGGTCTAACAGTTTTGTGCCA−３'（配列番号：１９）または５'−CTGCCCTTCATAATGATCTCTTATACG−３'（配列番号：２０）、
プローブ：５'−ＦＡＭ−AAGAAGCTTAGAAAATG−ＮＦＱ−ＭＧＢ−３'（配列番号：２１）。
【０１０２】
上記プライマーセットおよびプローブを用いたこと、および毒素Ｂを排出する菌株を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。図４Ｂに増幅曲線、図５Ｂに電気泳動図を示した。
【０１０３】
配列番号：１４および１５のプライマーセットによってＰＣＲ増幅される産物の大きさは、８９ｂｐである。また、配列番号１７〜２０のプライマーセットを用いた場合に比べ、配列番号：１４および１５のプライマーセットを用いた場合の方が、核酸の増幅が速く、また大きかった。このことから、配列番号１４および１５のプライマーセットを用いた場合、ｔｃｄＢによる毒性のあるクロストリジウム・ディフィシル菌株を、短時間かつ高感度で検出することができる。
【０１０４】
実施例４
クロストリジウム・ディフィシルの二元毒素検出用プライマーおよびプローブの設計およびリアルタイムＰＣＲ評価
クロストリジウム・ディフィシルの毒性を誘発する二元毒素を検出することにより、毒性のあるクロストリジウム・ディフィシルを検出することができる。
【０１０５】
二元毒素遺伝子であるｃｄｔＡおよびｃｄｔＢ遺伝子を、特異的に増幅するためのプライマーセットおよびリアルタイムＰＣＲ検出用プローブを、ＮＣＢＩのデータベースを元にデザインして、相互作用性を分析および検証した。製作されたプライマーセットおよびリアルタイムＰＣＲ検出用プローブは、それぞれの遺伝子で固有デザインを適用した。
ＰＣＲによって増幅されるｃｄｔＡアンプリコンおよびｃｄｔＢアンプリコンの大きさは、それぞれ９９ｂｐおよび７２ｂｐである。
【０１０６】
（５）ｃｄｔＡ遺伝子についてプライマーセットおよびプローブ：
順方向プライマー：５'−GCATCTGTTGTAAGTAGTCTTG−３'（配列番号：２２）、
逆方向プライマー：５'−AGGTGTTAATTTATTACTCCAATCATTA−３'（配列番号：２３）、
プローブ：５'−AATTTGCTTTACCCCAAGAGTCCCC−３'（配列番号：２４）
（６）ｃｄｔＢ遺伝子についてプライマーセットおよびプローブ：
順方向プライマー：５'−ACTCCCAAACAATGGATTA−３'（配列番号：２５）、
逆方向プライマー：５'−GGTGCCATTAATTTTAAATCTTTA−３'（配列番号：２６）、
プローブ：５'−AGTGCTCATCTGTGAAATAATATCCCA−３'（配列番号：２７）
上記プライマーセットおよびプローブを用いたこと、および二元毒素を排出する菌株を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。ｃｄｔＡ遺伝子についての結果を図６Ａに増幅曲線として、図７Ａに電気泳動図として示した。ｃｄｔＢ遺伝子についての結果を図６Ｂに増幅曲線として、図７Ｂに電気泳動図として示した。
【０１０７】
ＰＣＲによって増幅されるｃｄｔＡ増幅生成物およびｃｄｔＢ増幅生成物の大きさは、それぞれ９９ｂｐおよび７２ｂｐである。上記プライマーセットによって、それぞれ１コピー以上のｃｄｔＡまたはｃｄｔＢ遺伝子検出が可能であった。従って、二元毒素による毒性のあるクロストリジウム・ディフィシル菌株を、短時間、高感度で検出することができる。
【０１０８】
実施例５
クロストリジウム・ディフィシルの高度毒性（hypervirulent）検出用プライマーおよびプローブの設計およびリアルタイムＰＣＲ評価
クロストリジウム・ディフィシルのΔ１１７ ＳＮＰを含むｔｃｄＣは、シプロフロキサシンおよびレボフロキサシンなど、フルオロキノロン抗生物質耐性がある高毒性菌株に現われる。Δ１１７ ＳＮＰを含むｔｃｄＣを検出することにより、強毒性のクロストリジウム・ディフィシルを検出することができる。
【０１０９】
強毒性を誘発するクロストリジウム・ディフィシルを検出するために、Δ１１７ ＳＮＰを含むｔｃｄＣ遺伝子を、特異的に増幅するためのプライマーセットおよびリアルタイムＰＣＲ検出用プローブをＮＣＢＩのデータベースを元にデザインし、相互作用性を分析および検証した。
【０１１０】
製作されたプライマーセットおよびリアルタイムＰＣＲ検出用プローブは、対立形質（allel）であり、特異的デザインとして、対立形質特異的な配列を１つのプライマーセットとして、さらなるプライマーおよびプローブなしにも、強毒性を有するクロストリジウム・ディフィシルを検出可能にするようにデザインした。
【０１１１】
（７）プライマーセットおよびプローブ：
順方向プライマー：５'−GCACAAAGGATATTGCTCTA−３'（配列番号：２８）、
逆方向プライマー：５'−CCTCATGGTCTTCAGAAC−３'（配列番号：２９）、
プローブ：５'−TGGCATTTATTTTGGTGTGTTTTTTG−３'（配列番号：３０）
上記プライマーセットおよびプローブを用いたこと以外は、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。図８Ａに増幅曲線を、図９Ａに電気泳動図を示した。また、上記プライマーセットおよびプローブを用いたこと、およびΔ１１７ ＳＮＰを含むｔｃｄＣ遺伝子を有する菌株を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。図８Ｂに増幅曲線を、図９Ｂに電気泳動図を示した。
【０１１２】
上記プライマーセットは、野生型のクロストリジウム・ディフィシルはほとんど増幅しないのに比べて、Δ１１７ ＳＮＰを含むｔｃｄＣ遺伝子を有する株のｔｃｄＣ遺伝子は効率的に増幅した。従って、上記プライマーセットを用いれば、強毒性のクロストリジウム・ディフィシル菌株を、短時間かつ高感度をもって検出することができる。
【０１１３】
実施例６
クロストリジウム・ディフィシルを検出するためのマルチプレックスＰＣＲ実施
マルチプレックスＰＣＲの方法
５つのマルチプレックスＰＣＲを行った。
【０１１４】
試料は、ＡＴＣＣ−１３８２、高毒性を有するＡＴＣＣ−１８０３菌株を、ＡＴＣＣから分譲され、抗生物質耐性菌株銀行から、ＱＣされたｇＤＮＡを購入して使用した。試料各１μｌを利用して、４個の複数反応器を有する１つのチップで反応させた。滅菌蒸溜水２０μｌ、１０×反応用緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１７．５ｍＭ塩化マグネシウム）１０μｌ、ｄＮＴＰ溶液８μｌ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物；最終濃度２．５ｍＭ）、プライマーセット各１．０μｌ（２０μＭ）、及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５ｕｎｉｔ／μｌ；ＴａＫａＲａ社））２μｌを加え、総量５０μｌの２×反応液を調製した。また、ｇｌｕＤの増幅用としては、配列番号１及び２のプライマーセット、ｔｃｄＡ遺伝子増幅用としては、配列番号７及び８のプライマーセット、ｔｃｄＢ遺伝子増幅用としては、配列番号１４及び１５のプライマーセット、ｃｄｔＡ遺伝子増幅用としては、配列番号２２及び２３のプライマーセット、ｃｄｔＢ遺伝子増幅用としては、配列番号２５及び２６のプライマーセット、Δ１１７ｔｃｄＣ遺伝子増幅用としては、配列番号２８及び２９のプライマーセットを利用した。
【０１１５】
反応条件：（熱変性）９５℃、２秒、（重合反応）６０℃、１０秒。熱変性から重合反応に至る過程を、１サイクルにし、これを４５サイクル遂行した。増幅ＤＮＡの検出は、リアルタイム蛍光シグナルを検出して測定した。反応液以外に、分子量マーカーの電気泳動も同時に実施し、相対的移動性を比較し、ヌクレオチド断片の大きさを計算して増幅産物を確認した。
【０１１６】
結果を図１０Ａ〜Ｃに示す（ＡＴＣＣ−１３８２（図１０Ａ）、ＡＴＣＣ−１３８２（図１０Ｃ）、高毒性を有するＡＴＣＣ−１８０３菌株（図１０Ｃ））。マルチプレックスＰＣＲはターゲットＤＮＡのコピー数を変化させて行った。
【０１１７】
さらに、一つ以上のプライマーセット（例えば、２以上、３以上、４以上または５以上のプライマーセット）を組み合わせ、一つ以上の標的核酸配列を検出するマルチプレックスＰＣＲを、下記表の組み合わせとして実施した。
【０１１８】
【表１】
2013255492.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明のクロストリジウム・ディフィシル菌株検出用プライマーセットおよびそのキット、ならびにこれらを利用した検出方法は、例えば、クロストリジウム属菌関連疾病治療関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【図１Ａ】
2013255492.tif 000004
【図１Ｂ】
2013255492.tif 000005
【図１Ｃ】
2013255492.tif 000006
【図１Ｄ】
2013255492.tif 000007
【図２Ａ】
2013255492.tif 000008
【図２Ｂ】
2013255492.tif 000009
【図３】
2013255492.tif 000010
【図４Ａ】
2013255492.tif 000011
【図４Ｂ】
2013255492.tif 000012
【図５】
2013255492.tif 000013
【図６Ａ】
2013255492.tif 000014
【図６Ｂ】
2013255492.tif 000015
【図７】
2013255492.tif 000016
【図８Ａ】
2013255492.tif 000017
【図８Ｂ】
2013255492.tif 000018
【図９】
2013255492.tif 000019
【図１０Ａ】
2013255492.tif 000020
【図１０Ｂ】
2013255492.tif 000021
【図１０Ｃ】
2013255492.tif 000022
【配列表】
2013255492000001.app