(57)【要約】  【課題】  小型でかつより高効率にて細胞を自動培養可能な細胞培養器を提供する。  【解決手段】  本発明は、少なくとも一対の金属板１０，１０を対向して備える容器形状の細胞培養器２であって、当該一対の金属板１０，１０の少なくとも内側の面に、細胞を接着させる足場となる細胞培養面１８を形成して成る細胞培養器２に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一対の金属板を対向して備える容器形状の細胞培養器であって、
当該一対の金属板の少なくとも内側の面に、細胞を接着させる足場となる細胞培養面を形成して成る細胞培養器。
【請求項２】
前記細胞培養面の外側に樹脂シートまたはゴムシートを充填していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養器。
【請求項３】
前記一対の金属板の対向面以外の２つの面にそれぞれ培地の流入口および流出口を備える請求項１または請求項２に記載の細胞培養器。
【請求項４】
前記流入口から前記流出口までの間に内方広大の袋形状の培地流路を有し、
上記培地流路内に前記細胞培養面を形成していることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養器。
【請求項５】
前記細胞培養面の積層方向に前記金属板を３枚以上積層して成り、
最上面および最下面にある前記金属板の内側の面に前記細胞培養面を備え、
上記最上面および上記最下面を除く内部の前記金属板の両面に前記細胞培養面を備えることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養器。
【請求項６】
前記細胞培養面の積層方向に並ぶ前記一対の金属板の対向面以外の２つの面にそれぞれ培地の流入口および流出口を備え、当該積層方向に隣接する少なくとも２つの上記流入口または上記流出口を、当該積層方向に隣接させないように配置していることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養器。
【請求項７】
前記流入口および前記流出口を１つの前記金属板内の幅方向中央から同一の端側に形成し、
前記金属板の少なくとも内側の面において前記流入口から前記流出口との間に形成される培地流路は、前記流入口と前記流出口とを結ぶラインと、それと対向する側にふくらむラインとから構成される片袋形状の流路であることを特徴とする請求項６に記載の細胞培養器。
【請求項８】
前記細胞培養面は、アルミナ粒子を衝突させて形成される面であることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養器。
【請求項９】
さらに、振動手段の一部若しくは全部を接触させて成ることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養器。
【請求項１０】
前記振動手段は、超音波振動子と、その超音波振動子を振動させる振動発生装置とを含むことを特徴とする請求項９に記載の細胞培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地を循環しながら細胞を培養する細胞培養器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体外で培養した細胞を治療に用いる細胞療法に関する研究が積極的に行われている。例えば、肝炎の初期治療では、自己の肝細胞を用いて血液を浄化して肝機能の回復を行う例が報告されている。自己の細胞あるいはそれを用いて培養した細胞を治療に用いると、生体拒絶反応がほとんどなく、高い治癒効果が得られる。しかし、細胞療法に用いる細胞の培養は、手作業で行われることがほとんどであり、多くの患者に対応するのは困難である。一方、抗がん剤をはじめとする医薬の研究開発の場においてもその薬効を調べるには大量の細胞を必要とするため、手作業で細胞を培養する現状においては多大な時間とコストを要する。
【０００３】
このような細胞を用いる現場では、より多くの細胞をできるだけ短い期間に培養することが求められる。このようなニーズに応えるべく、細胞が接着する足場の性質を変化させることによって培養効率を高める手法が注目を浴び、これまでにも様々な足場材料の表面性状を変化させて細胞の挙動が調べられている。例えば、マイクロおよびナノオーダーの凹凸を形成した二酸化チタン表面上で骨芽細胞と線維芽細胞の培養を行い、骨芽細胞の増殖性が高まる一方で線維芽細胞の増殖性が変化しないという報告がある（非特許文献１を参照）。また、種々の表面粗さを有するシリコン上で、線維芽細胞と２種類の上皮細胞、内皮細胞を培養し、ある程度の粗さを有する表面上で細胞の増殖性が高まり、さらにはその好適な粗さは細胞種によって異なるという報告もある（非特許文献２を参照）。さらに、算術平均粗さ（Ｒａ）＝５．７０〜１．１２μｍのチタン金属表面上にラット由来骨芽細胞とヒト由来線維芽細胞を播種した結果、骨芽細胞はＲａ＝５．７０μｍの表面上で、線維芽細胞はＲａ＝１．１２μｍの表面上でそれぞれより良い増殖性を示すという報告もある（非特許文献３を参照）。これらの報告は、足場材料表面の凹凸と細胞の増殖性との関係を調べた一例に過ぎず、他にも多くの報告がある。
【０００４】
一方、細胞培養には、増殖性の向上に加え、増殖後の回収が容易であることも重要となる。この点に着目した技術として、例えば、光応答性材料を細胞接着性表面に形成した細胞培養器が知られている（例えば、特許文献１を参照）。しかし、この種の細胞培養器は、培養過程において照射される光を高度に制御する必要があると共に、細胞を剥離する過程においても光を照射する必要があるため、操作が煩雑となるという問題がある。また、生化学的手法を利用し、培養面にタンパク質を塗付した細胞培養器も知られているが、膜が剥離しやすく、長期の使用が困難であるという問題がある。
【０００５】
このような問題を解決するべく、例えば、ポリスチレン等の樹脂あるいはガラスのように透明性に優れ細胞に対する親和性に優れた材料にて構成され、細胞の培養効率が高く、培養した細胞を回収しやすくした細胞培養容器が知られている（例えば、特許文献２を参照）。また、本願発明に先立ち、本出願人の一部は、チタン合金等の金属の表面に微粒子ピーニング処理を施して、細胞を接着させやすい表面を形成せしめ、当該表面にて細胞を培養させた後、せん断応力を加えて当該細胞を容易に剥離させる細胞培養用金属体を発明した（特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３３９３７３号公報
【特許文献２】特開２００６−３２５５３２号公報
【特許文献３】特開２００９−０５５７９３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋ．Ｋｕｂｏ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｎ  ＴｉＯ２  ｎａｎｏｍｏｄｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏ−ｔｏ−ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ  ｍｏｄｅｌ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｏｌ．３０，  Ｎｏ．２９，  （２００９），  ５３１９−５３２９．
【非特許文献２】Ｆ．Ｇｅｎｔｉｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｇｒｏｗ  ｏｎ  ｒｏｕｇｈ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｏｌ．３１，  Ｎｏ．２８，  （２０１０），  ７２０５−７２１２．
【非特許文献３】Ｔ．Ｐ．Ｋｕｎｚｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．１３，  （２００７），  ２１７５−２１８２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献２に開示される細胞培養容器は、従来のペトリシャーレを用いる細胞培養と比して培養効率に優れるものの、バッチ式での培養に適するものに過ぎず、培地循環による細胞培養に用いるのには適していない。その点、上記特許文献３に開示される細胞培養用金属体を搭載した細胞培養用容器は、培地循環方式による細胞培養に適しており、細胞の培養効率および回収性に優れる。しかし、当該細胞培養用容器をさらに改良して、培地循環型の自動培養装置に組み込みやすく、かつ省スペースでかつより高い効率にて細胞を培養することが求められている。
【０００９】
本発明は、かかる要望に応えるべくなされたものであり、小型でかつより高効率にて細胞を自動培養可能な細胞培養器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を解決するための本発明の一形態は、少なくとも一対の金属板を対向して備える容器形状の細胞培養器であって、当該一対の金属板の少なくとも内側の面に細胞を接着させる足場となる細胞培養面を形成して成る細胞培養器である。
【００１１】
本発明の別の形態は、さらに、細胞培養面の外側に樹脂シートまたはゴムシートを充填してなる細胞培養器である。
【００１２】
本発明の別の形態は、また、一対の金属板の対向面以外の２つの面にそれぞれ培地の流入口および流出口を備える細胞培養器である。
【００１３】
本発明の別の形態は、さらに、流入口から流出口までの間に内方広大の袋形状の培地流路を有し、培地流路内に細胞培養面を形成してなる細胞培養器である。
【００１４】
本発明の別の形態は、また、細胞培養面の積層方向に金属板を３枚以上積層して成り、最上面および最下面にある金属板の内側の面に細胞培養面を備え、最上面および最下面を除く内部の金属板の両面に細胞培養面を備える細胞培養器である。
【００１５】
本発明の別の形態は、さらに、細胞培養面の積層方向に並ぶ一対の金属板の対向面以外の２つの面にそれぞれ培地の流入口および流出口を備え、当該積層方向に隣接する少なくとも２つの流入口または流出口を、当該積層方向に隣接させないように配置してなる細胞培養器である。
【００１６】
本発明の別の形態は、さらに、流入口および流出口を１つの金属板内の幅方向中央から同一の端側に形成し、金属板の少なくとも内側の面において流入口から流出口との間に形成される培地流路を、流入口と流出口とを結ぶラインと、それと対向する側にふくらむラインとから構成される片袋形状の流路とした細胞培養器である。
【００１７】
本発明の別の形態は、また、細胞培養面を、アルミナ粒子を衝突させて形成される面とする細胞培養器である。
【００１８】
本発明の別の形態は、また、振動手段の一部若しくは全部を接触させて成る細胞培養器である。
【００１９】
本発明の別の形態は、さらに、振動手段に、超音波振動子と、その超音波振動子を振動させる振動発生装置とを含む細胞培養器である。
【００２０】
また、本発明の一形態に係る細胞培養器を、少なくとも一対の金属板を対向して備える容器形状であって、当該一対の金属板の少なくとも内側の面に、細胞を接着させる足場となる細胞培養面を形成し、当該一対の対向面以外の２つの面にそれぞれ培地の流入口および流出口を備えても良い。
【００２１】
さらに、本発明の別の形態に係る細胞培養器を、流入口から流出口までの間に内方広大の袋形状の培地流路を有し、培地流路内に細胞培養面を形成してなる細胞培養器としても良い。
【００２２】
また、本発明の別の形態に係る細胞培養器を、培地流路の外側に樹脂シートまたはゴムシートを充填してなる細胞培養器としても良い。
【００２３】
また、本発明の別の形態に係る細胞培養器を、細胞培養面の積層方向に金属板を３枚以上積層して成り、最上面および最下面にある金属板の内側の面に細胞培養面を備え、最上面および最下面を除く内部の金属板の両面に細胞培養面を備える細胞培養器としても良い。
【００２４】
さらに、本発明の別の形態に係る細胞培養器を、積層方向に隣接する少なくとも２つの流入口または流出口を当該積層方向に隣接させないように配置してなる細胞培養器としても良い。
【００２５】
さらに、本発明の別の形態に係る細胞培養器を、流入口および流出口を１つの金属板内の幅方向中央から同一の端側に形成し、金属板の少なくとも内側の面において流入口から流出口との間に形成される培地流路を、流入口と流出口とを結ぶラインと、それと対向する側にふくらむラインとから構成される片袋形状の流路とする細胞培養器としても良い。
【００２６】
また、本発明の別の形態に係る細胞培養器を、細胞培養面としてアルミナ粒子を衝突させて形成した面を形成した細胞培養器としても良い。
【００２７】
また、本発明の一形態に係る細胞培養器を用いて培養した細胞を回収する方法としては、少なくとも一対の金属板を対向して備える容器形状を有し当該一対の金属板の少なくとも内側の面に細胞を接着させる足場となる細胞培養面を形成して成る細胞培養器を用いて培養した細胞を回収する細胞回収方法であって、タンパク質分解酵素の添加と、細胞培養器にその一部若しくは全部を接触させて成る振動手段からの振動との併用により細胞を回収する方法を採用することができる。
【００２８】
また、本発明の別の形態に係る細胞培養器を用いて培養した細胞を回収する方法としては、さらに、振動手段に、超音波振動子と、その超音波振動子を振動させる振動発生装置とを含む細胞回収方法とすることもできる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、小型でかつより高効率にて細胞を自動培養可能な細胞培養器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、第一の実施の形態に係る細胞培養器を組み込んだ状態の培地循環方式の自動培養システムの概略図を示す。
【図２】図２は、第一の実施の形態に係る細胞培養器の分解斜視図を示す。
【図３】図３は、図２中の金属板の内側の面（裏面）を示す。
【図４】図４は、図２に示す細胞培養器を使用して細胞を培養する好適な方法を説明する図を示す。
【図５】図５は、本発明の第二の実施の形態に係る細胞培養器の斜視図を示す。
【図６】図６は、図５に示す細胞培養器を上から二層目までを分解した一部分解斜視図を示す。
【図７】図７は、図６中の二層目を構成する金属板の片面の平面図を示す。
【図８】図８は、図７に示す金属板（８Ａ）およびその変形例（８Ｂ）の各平面図を示す。
【図９】図９は、実施例１にて用いた各種セラミックス粒子のＳＥＭ像（９Ａ）および当該各種セラミックス粒子の微粒子ピーニング処理（ＦＰＰ処理）によって形成された各細胞培養面のＳＥＭ像（９Ｂ）を示す。
【図１０】図１０は、ＦＰＰ処理後の各試験片表面のプロファイル（１０Ａ）および軟骨細胞を７２時間培養後に蛍光顕微鏡を用いて細胞と細胞外マトリックスの間に介在するビンキュリンを観察した結果（１０Ｂ）を、それぞれ示す。
【図１１】図１１は、各試験片表面において所定時間培養後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙにより細胞数を測定した結果（１１Ａ）と、７２時間培養後の各試験片表面への細胞の接着状況を示すＳＥＭ像および模式図（１１Ｂ）と、をそれぞれ示す。
【図１２】図１２は、実施例２において、反転時間を４水準で変化させたときの金属板の各面（Ａ面、Ｂ面）で細胞を回収した比率をグラフで示す。
【図１３】図１３は、実施例３において、細胞培養器およびフラスコ内から、それぞれ播種から６時間後、および３０時間後に回収した細胞数を比較したグラフを示す。
【図１４】図１４は、実施例４において、多層培養器およびフラスコ内からそれぞれ播種から６時間後、２４時間後および４８時間後にそれぞれ回収した細胞数を比較したグラフ（１４Ａ）および、多層培養器およびフラスコ内でそれぞれ４８時間培養した後における単位体積当たりの細胞数を比較したグラフ（１４Ｂ）を、それぞれ示す。
【図１５】図１５は、超音波刺激を与えるための金属製の細胞培養器を示す。
【図１６】図１６は、図１５の細胞培養器の裏側から見た斜視図を示す。
【図１７】図１７は、図１５の細胞培養器を含む超音波振動細胞培養システムの概略図を示す。
【図１８】図１８は、トリプシンの希釈率と、通常のトリプシン濃度に対する細胞回収率との関係を表したグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
次に、本発明に係る細胞培養器の各実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００３２】
＜第一の実施の形態＞
本発明の第一の実施の形態に係る細胞培養器は、細胞を培養する空間を１つのみ有し、２枚の金属板のそれぞれの内側の面に細胞培養面を形成したものである。
【００３３】
図１は、第一の実施の形態に係る細胞培養器を組み込んだ状態の培地循環方式の自動培養システムの概略図を示す。
【００３４】
この培地循環方式の自動培養システム１は、細胞培養器２と、培地３ａを入れた培地ボトル３と、ポンプ４と、ガス交換器５とを備え、これらの間をチューブ６で直列につないだ構成を有する。細胞培養器２は、予め細胞を播種しておき、一方から他方に（図１中の矢印方向に）培地３ａをフローさせて細胞を増殖させる機器である。より具体的には、細胞を含む培地３ａを、シリンジ等を用いて細胞培養器２内に注入し、３５〜４０℃、ＣＯ２濃度約５％の下で４〜８時間静置培養し、その後、細胞培養器２を自動培養システム１に繋いで、培地３ａを循環させるのが好ましい。培地ボトル３は、培地３ａを入れた容器であって、ポンプ４に接続する側のチューブ６を培地３ａ内に挿入する一方、細胞培養器２側のチューブ６を培地３ａに接触させないで構成される。培地３ａには、液体であれば、動植物の煮出し汁や土壌等の天然培地、精製化学薬品から調整される合成培地の他、合成培地に天然物を添加した半合成培地など公知の様々な培地を用いることができる。ポンプ４は、培地３ａを循環させるためのものであり、送液可能であれば、如何なる種類のものでも使用できる。ガス交換器５は、培地３ａのガス交換を行う機器であって、例えば、多くの中空糸を搭載する中空糸モジュール等を利用して構成することができる。自動培養システム１は、細胞培養器２と、培地ボトル３と、ポンプ４と、ガス交換器５とをつないだ１つの閉回路を形成し、かつ回路内を完全に密閉している。このため、培地３ａが直接外気と接触せず、コンタミネーションのリスクを非常に低くすることができる。
【００３５】
細胞は、一般に、浮遊して生存可能な浮遊性細胞と、何らかの物質に接着しなければ生存できない接着性細胞に大別される。自動培養システム１は、この実施の形態に係る細胞培養器２を備えることにより、細胞培養面の確保が難しくかつ細胞回収操作が複雑であるために従来困難であった接着性細胞の効率的な培養を実用化に導くものである。接着性細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば、骨芽細胞、線維芽細胞、樹状細胞、肝細胞、間葉系細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを好適に用いることができる。
【００３６】
図２は、第一の実施の形態に係る細胞培養器の分解斜視図を示す。
【００３７】
図２に示す細胞培養器２は、２枚（一対）の金属板１０，１０を対向して備える容器形状の培養器である。ここで、金属板１０の長さ方向は培地３ａの流れる方向である。また、金属板１０は、その長さ方向両端側であってその幅方向略中央に、各１個の突出部１０ａ，１０ｂを備える。金属板１０の材料には、毒性の低い金属であれば特に限定されず、ＳＵＳ；  チタン、鉄、タンタル、クロム、コバルト、タングステン、アルミニウムまたはそれらの１以上の合金を好適に用いることができ、特にＳＵＳをより好適に用いることができ、ＳＵＳの中でも、生体材料として広く用いられるオーステナイト系ステンレス鋼ＳＵＳ３１６Ｌを、さらに好適に用いることができる。
【００３８】
細胞培養器２は、金属板１０，１０の間にシリコーンゴム製のシート１１，１２を挟む構造を有する。シート１１，１２をシリコーンゴム製とするのは、シリコーンゴムがオートクレーブ滅菌を行う際に１００℃の加熱に十分耐えられると共に、安価かつ成形が容易な材料だからである。ただし、シート１１，１２の材料は、シリコーンゴムに限定されず、ウレタンゴム、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、フッ素ゴム、ニトリルゴム（ＮＢＲ）、天然ゴム等の他のゴム；  あるいはポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、フッ素系樹脂、ポリアミド系樹脂等の樹脂を用いることができる。シート１１およびシート１２は、金属板１０の面内幅方向両端側にそれぞれ配置され、金属板１０の面内略中央部分にスペースを形成する。シート１１は、突出部１０ａおよび突出部１０ｂの各面内片側にそれぞれ接する壁部１１ａおよび壁部１１ｂを有する。同様に、シート１２は、突出部１０ａおよび突出部１０ｂの各面内片側にそれぞれ接する壁部１２ａおよび壁部１２ｂを有する。２つの突出部１０ａ，１０ａ、壁部１１ａおよび壁部１２ａによって囲まれた開口部位は、細胞培養器２への培地３ａの流入口１６を構成する。同様に、２つの突出部１０ｂ，１０ｂ、壁部１１ｂおよび壁部１２ｂによって囲まれた開口部位は、細胞培養器２から培地３ａの流出口１７を構成する。
【００３９】
シート１１，１２の厚さ（＝２枚の金属板１０，１０の間の距離）としては、細胞培養器２の薄型化を図ることができ、かつ培地３ａのＣＯ２濃度の上昇を防止することができるのに十分な空間を確保できる限り、特定の厚さに限定されるものではないが、好適には５〜６ｍｍの範囲であり、さらに好適には５ｍｍである。細胞培養器２内に細胞を播種して６時間静置培養後の細胞数に着目し、シート１１，１２の厚さと静置培養後に回収した細胞数との関係を調べると、シート１１，１２の厚さが５〜６ｍｍの範囲で、フラスコ内にて培地量を種々変化させて細胞培養したときに得られる細胞数と比較して同等の細胞数が得られる。細胞培養器２の薄型化を図る観点では、シート１１，１２をより薄くするのが好ましいことから、シート１１，１２の厚さを５ｍｍとするのがより好ましい。
【００４０】
この実施の形態では、シート１１およびシート１２は、互いに線対称の形状を有する。シート１１は、壁部１１ａと壁部１１ｂとの間においてその長さ方向略中央の幅を狭くする略三日月形を有する。同様に、シート１２は、壁部１２ａと壁部１２ｂとの間においてその長さ方向略中央の幅を狭くする略三日月形を有する。培地３ａをフローさせる培地流路１３は、２枚の金属板１０，１０の両内面と、シート１１，１２の両内側端面とから構成され、平面視にて、流入口１６から流出口１７までの間に、金属板１０の幅方向両側に膨らむ内方広大の袋形状を有する。ただし、シート１１の形状とシート１２の形状とを異なるようにしても良い。例えば、一方のシート１１（または１２）を平面視にて略長方形とし、他方のシート１２（または１１）を平面視にて略三日月形としても良い。
【００４１】
金属板１０は、シート１１，１２に覆われる領域において、金属板１０の各幅方向端部に近い箇所に、その厚さ方向に貫通する４個の小貫通孔１０ｃを備える。シート１１およびシート１２も、また、当該小貫通孔１０ｃと同じ位置でかつ同じ大きさにて、それらの厚さ方向に貫通する小貫通孔１１ｃおよび小貫通孔１２ｃをそれぞれ備える。容器形状の細胞培養器２は、２枚の金属板１０，１０、シート１１およびシート１２の小貫通孔１０ｃ，１１ｃおよび小貫通孔１０ｃ，１２ｃにそれぞれボルト１４を挿入してナット１５にて締結することにより組み立てられる。なお、金属板１０，１０およびシート１１，１２の固定方式は、ボルト１４とナット１５の使用に限定されず、ネジあるいは六角ボルトを用いる方法、接着剤を用いる方法であっても良い。
【００４２】
図３は、図２中の金属板の内側の面（裏面）を示す。
【００４３】
金属板１０は、その内側の面に、細胞を接着させる足場となる細胞培養面１８を有する。細胞培養面１８は、微小の凹凸を多数形成した領域である。細胞培養面１８の形成方法は、後で例示する。金属板１０の面内のラインＡで囲まれた領域は、培地流路１３を示す。図３に示すように、この実施の形態では、細胞培養面１８は、培地流路１３の突出部１０ａ，１０ｂを除く領域に形成されている。培地流路１３をできるだけ有効に利用して、培養効率を向上させるためである。ただし、細胞培養面１８は、培地流路１３にも形成できる。さらには、細胞培養面１８は、培地流路１３の形状や大きさによらず、金属板１０の内側の面の全面（ただし、突出部１０ａ，１０ｂを除く）に形成しても良い。また、細胞培養面１８を、突出部１０ａ，１０ｂを含めて金属板１０の内側の面の全面に形成しても良い。
【００４４】
ここで、金属板１０の具体的な形態を例示する。ただし、金属板１０の形態は、下記に例示したものに限定されない。この実施の形態において、金属板１０の突出部１０ａから突出部１０ｂまでの好適な長さは１２０ｍｍで、好適な幅は５０ｍｍである。突出部１０ａ，１０ｂの好適な幅は１２ｍｍ、好適な長さは１０ｍｍである。小貫通孔１０ｃは、好適な直径が４．５ｍｍであって、好適には、２８ｍｍ間隔で金属板１０の長さ方向に配置される。金属板１０の厚さは、細胞培養器２の重量をできる限り軽くし、かつ細胞培養面１８の形成時に貫通しない程度の十分な厚さであれば特に限定されず、例えば、０．６〜１．５ｍｍ、さらには０．９〜１．２ｍｍに設定可能である。
【００４５】
図４は、図２に示す細胞培養器を使用して細胞を培養する好適な方法を説明する図を示す。
【００４６】
図４は、第一の実施の形態に係る細胞培養器２の断面から見た状況を模式的に示す。２枚の金属板１０の対向する内側の面には、細胞培養面１８が形成されている。培地３ａ中に存在する細胞２０は、細胞培養器２を所定時間（例えば、３〜８時間）静置すると、重力の作用を受けて、片方の細胞培養面１８に優先的に接着して増殖する。当該増殖の結果、片方の細胞培養面１８に接着する細胞が多くなった時点で、細胞培養器２を反転する。すると、細胞２０は、スペースの広いもう一方の細胞培養面１８に接着して増殖する。これにより、２つの細胞培養面１８上に細胞２０をより多く接着することができ、単位体積当たりの細胞培養効率を向上させることができる。
【００４７】
細胞培養面１８は、この実施の形態では、微粒子ピーニング処理（以後、「ＦＰＰ処理」という）によって形成される微小凹凸を有する面である。ＦＰＰ処理は、微粒子（投射粒子という）をターゲットに高速で衝突させて、その衝突面に微小の凹凸や皮を形成する方法である。ただし、細胞培養面１８の形成方法は、ＦＰＰ処理に限定されず、酸を金属板１０の内側の面の所定領域に塗布するウェットプロセスや、所望の表面粗さを形成するのに適した粒度を持つ研磨粒子を用いて研磨する方法等であっても良い。ただし、ＦＰＰ処理（ブラストおよびピーニングの処理）は、比較的低コストで簡便なドライプロセスであり、金属材料の表面改質処理を行うのに適しているので、より好適に用いることができる。接着性細胞は、細胞培養面１８に接着するに際し、微小の凹凸や皮の部位（細胞外マトリックスと称する）を足場として、細胞膜に存在するインテグリンという膜１回貫通型タンパク質を上記細胞外マトリックスに接着させて、生存および増殖する。このため、細胞の培養は、細胞培養面１８の面積のみならず、細胞培養面１８の表面性状にも大きく依存する。
【００４８】
細胞培養面１８の表面における算術平均粗さ（Ｒａ）としては、５０〜１０００ｎｍの範囲、さらには２００〜９００ｎｍの範囲、特に２００〜４００ｎｍの範囲が好ましい。また、同表面における輪郭曲線要素の平均長さ（平面視による凹部の平均径、Ｒｓｍ）としては、５０〜９００ｎｍの範囲、さらには１００〜８００ｎｍ、特に１００〜３００ｎｍの範囲が好ましい。また、細胞培養面１８の表面性状としては、微小の凹凸が連続形成されている状態が好ましい。
【００４９】
ＦＰＰ処理に用いる投射粒子としては、ガラス粒子、セラミックス粒子あるいは金属粒子を好適に用いることができる。ガラス粒子としては、石英ガラス、ソーダ石灰硼珪酸ガラス等の粒子を例示できる。セラミックス粒子としては、炭化ケイ素、炭化チタン、アルミナ、ジルコニア、酸化チタン、重質炭酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト等の粒子を例示できる。金属粒子としては、タンタル、金、白金、銀、パラジウム、鉄、チタン、ステンレス、炭素鋼、クロム、コバルト、タングステン、アルミニウム、スチール、亜鉛、スズ、銅、コバルトハイス鋼等の粒子を例示できる。金属板１０をターゲットとしてＦＰＰ処理を行う場合、上記の各種材料の内、好適には、ターゲットよりも硬質なガラス粒子またはセラミックス粒子を用いることができ、より好適には酸化チタンおよびアルミナを用いることができ、さらに好適にはアルミナを用いることができる。投射粒子の平均粒径（レーザー回折・散乱による粒度分布測定法によって測定されるＤ５０値）は、例えば、１〜２００μｍであり、好ましくは１〜１００μｍであり、より好ましくは１〜５０μｍである。
【００５０】
ＦＰＰ処理における投射の条件は、特に限定されない。例えば、投射材の噴出口から金属材料までの表面までの距離は、３０〜４００ｍｍとすることができ、好ましくは、７０〜１５０ｍｍである。また、投射圧力は、例えば、０．１〜２．０ＭＰａであり、好ましくは、０．２〜０．８ＭＰａである。投射の角度は、好ましくは、金属板１０の表面に対して垂直であるが、必要に応じて変化させることができる。投射時間は、金属材料の表面に必要な凹凸を形成させることができる時間であれば特に限定されないが、例えば、０．１秒〜３分間であり、好ましくは１０〜５０秒であり、より好ましくは、２０〜４０秒である。粒子供給量は、例えば、０．１〜２０ｇ／ｓｅｃ、好適には０．５〜８ｇ、さらに好適には０．７〜３ｇ／ｓｅｃに設定可能である。
【００５１】
＜第二の実施の形態＞
本発明の第二の実施の形態に係る細胞培養器は、細胞を培養する空間を２以上有し、３枚以上の金属板を所定間隔で積層し、各金属板の片面もしくは両面に細胞培養面を形成したものである。
【００５２】
図５は、本発明の第二の実施の形態に係る細胞培養器の斜視図を示す。図６は、図５に示す細胞培養器を上から二層目までを分解した一部分解斜視図を示す。
【００５３】
第二の実施の形態に係る細胞培養器３０は、最上面と最下面に同形の金属板４１，４１を配置して、金属板４１，４１の間に、所定間隔にて３枚の金属板４２，４２，４２を配置した多層構造を持つ容器形状の培養器である。金属板４１，４２の材料としては、第一の実施の形態における金属板１０と同様の材料を用いることができ、より好ましくはオーステナイト系ステンレス鋼ＳＵＳ３１６Ｌを用いることができる。ここで、金属板４１，４２の長さ方向は培地３ａの流れる方向である。金属板４１は、その長さ方向両端に各１個の突出部を備え、その幅方向中央から片側の端部に寄った同一の位置にそれぞれ突出部４１ａおよび突出部４１ｂを備える。一方、金属板４２は、その長さ方向両端に各２個の合計４個の突出部４２ａ，４２ａ，４２ｂ，４２ｂを備える、２個の突出部４２ａ，４２ａは、金属板４２の幅方向中央から略同一距離を隔てて配置されている。２個の突出部４２ｂ，４２ｂも同様である。突出部４２ａおよび突出部４２ｂは、好適には、金属板４２と金属板４１とを重ね合わせた際に突出部４１ａおよび突出部４１ｂとそれぞれ重なる位置にて、金属板４２に形成されている。
【００５４】
細胞培養器３０は、金属板４１と金属板４２の間、および金属板４２，４２同士の間に、シリコーンゴム製のシート５０，６０を挟む構造を有する。シート５０，６０の材料としては、第一の実施の形態におけるシート１１，１２と同様の材料を用いることができ、好適にはシリコーンゴムを用いることができる。シート５０は、金属板４１の突出部４１ａおよび突出部４１ｂを結ぶライン、および金属板４２の突出部４２ａおよび突出部４２ｂを結ぶラインにてそれぞれ分けられた金属板４１，４２の幅方向狭い側に配置される。一方、シート６０は、金属板４１および金属板４２における上述のラインにてそれぞれ分けられた金属板４１，４２の幅方向広い側に配置される。シート５０およびシート６０は、金属板４１，４２の面内幅方向両端側にそれぞれ配置され、金属板４１，４２の面内略中央部分にスペースを形成する。
【００５５】
シート５０は、突出部４１ａ，４２ａおよび突出部４１ｂ，４２ｂの各面内片側にそれぞれ接する壁部５０ａおよび壁部５０ｂを有する。同様に、シート６０は、突出部４１ａ，４２ａおよび突出部４１ｂ，４２ｂの各面内片側にそれぞれ接する壁部６０ａおよび壁部６０ｂを有する。突出部４１ａ，４２ａ、壁部５０ａおよび壁部６０ａによって囲まれた開口部位および突出部４２ａ，４２ａ、壁部５０ａおよび壁部６０ａによって囲まれた開口部位は、細胞培養器３０への培地３ａの流入口６６を構成する。また、突出部４１ｂ，４２ｂ、壁部５０ｂおよび壁部６０ｂによって囲まれた開口部位および突出部４２ｂ，４２ｂ、壁部５０ｂおよび壁部６０ｂによって囲まれた開口部位は、細胞培養器３０から培地３ａの流出口６７を構成する。細胞培養器３０は、４層構造であって、各層につき１個ずつの流入口６６および流出口６７を備える。積層方向に隣り合う２層の流入口６６，６６は、積層方向において隣接せず、金属板４２の幅方向に互いに違いに配置される。同様に、積層方向に隣り合う２層の流出口６７，６７も、積層方向において隣接せず、金属板４２の幅方向に互いに違いに配置される。このように、積層方向に隣り合う２つの流入口６６，６６および流出口６７，６７を積層方向に隣接させないように配置しているため、各流入口６６および各流出口６７へのチューブ６の取り付けおよび取り外しが容易になり、その結果として細胞培養器３０の薄型化を促進できる。シート５０，６０の厚さ（＝金属板４１，４２の間の距離および金属板４２，４２の間の距離）は、第一の実施の形態におけるシート１１，１２の厚さと同様の理由から、好適には５〜６ｍｍの範囲であり、さらに好適には５ｍｍである。なお、各層を同じ厚さとせずに、異なる厚さに設定しても良い。
【００５６】
シート５０は、壁部５０ａの内面と壁部５０ｂの内面とを直線的に繋ぎ、壁部５０ａ，５０ｂを除くと平面視にて略長方形状を有する。一方、シート６０は、シート５０と比べて大面積であって、壁部６０ａと壁部６０ｂとの間においてその長さ方向略中央の幅を狭くする平面視にて略三日月形を有する。培地３ａをフローさせる培地流路４３は、金属板４１，４２の両面とシート５０，６０の両内側端面とから、あるいは金属板４２，４２の両面とシート５０，６０の両内側端面とから構成され、平面視にて、流入口６６から流出口６７までの間に内方広大の袋形状を呈している。特に、この実施の形態では、流入口６６および流出口６７を１つの金属板４１または４２内の幅方向中央から同一の端側に形成しているので、流入口６６と流出口６７との間に形成される培地流路４３は、流入口６６と流出口６７とを結ぶラインと、それと対向する側にふくらむラインとから構成される片袋形状の流路となる。これによって、流入口６６および流出口６７が金属板４１または４２の幅方向片側に寄った位置に形成している場合でも、培地流路４３の面積を広く確保することができる。シート５０およびシート６０は、金属板４１と金属板４２の間および金属板４２同士の間において、積層方向に向かって、金属板４１，４２の幅方向左右交互に配置される。この結果、各層に形成される培地流路４３は、積層方向に向かって幅方向左右反転した向きで形成される。各層の流入口６６および流出口６７が金属板４２の幅方向左右に交互配置されているからである。
【００５７】
金属板４１および金属板４２は、それぞれシート５０，６０に覆われる領域において、金属板４１および金属板４２の各幅方向端部に近い箇所に、それらの厚さ方向に貫通する４個の小貫通孔４１ｃおよび小貫通孔４２ｃを備える。シート５０およびシート６０も、また、当該小貫通孔４１ｃ，４２ｃと同じ位置でかつ同じ大きさにて、それらの厚さ方向に貫通する小貫通孔５０ｃおよび小貫通孔６０ｃをそれぞれ備える。容器形状の細胞培養器３０は、２枚の金属板４１，４１、３枚の金属板４２，４２，４２、シート５０およびシート６０の小貫通孔４１ｃ，４２ｃ，５０ｃ，６０ｃにボルト４４を挿入してナットにて締結することにより組み立てられる。なお、第一の実施の形態と同様、ボルト４４とナットの使用以外に、ネジ、六角ボルトあるいは接着剤を用いても良い。
【００５８】
図７は、図６中の二層目を構成する金属板の片面の平面図を示す。
【００５９】
金属板４２は、その両面に、細胞を接着させる足場となる細胞培養面４８を有する。一方、金属板４１は、細胞培養器３０の最上面および最下面を構成することから、その内側の面にのみ細胞培養面４８を備える。細胞培養面４８は、第一の実施の形態における細胞培養面１８と同様、微小の凹凸を多数形成した領域である。細胞培養面４８の形成方法は、第一の実施の形態で説明した方法と同様である。金属板４２の面内のラインＢで囲まれた領域は、培地流路４３を示す。図７に示すように、この実施の形態では、細胞培養面４８は、培地流路４３の突出部４２ａ，４２ｂを除く領域を含むように形成されている。培地流路４３をできるだけ有効に利用して、培養効率を向上させるためである。また、細胞培養面４８は、金属板４２の両面に形成される２つの培地流路４３，４３（ただし、突出部４２ａ，４２ｂを除く）を包含する大きさで各面に形成されている。このため、金属板４２の表裏どちらの側を上に向けて使用しても良い。したがって、金属板４２の表裏を気にせず、細胞培養器３０を簡単に組み立てられる。ただし、細胞培養面４８の形状と大きさは、上記に限定されず、例えば、培地流路４３の一部に形成することもできる。さらには、細胞培養面４８は、培地流路４３の形状や大きさによらず、金属板４１，４２の全面（ただし、突出部４１ａ，４１ｂ，４２ａ，４２ｂを除く）に形成しても良い。また、細胞培養面４８を、突出部４１ａ，４１ｂ，４２ａ，４２ｂを含めて金属板４１，４２の全面に形成しても良い。
【００６０】
ここで、金属板４２の具体的な形態を例示する。ただし、金属板４２の形態は、下記に例示したものに限定されない。この実施の形態において、金属板４２の突出部４２ａから突出部４２ｂまでの好適な長さは１４０ｍｍで、好適な幅は４６ｍｍである。突出部４２ａ，４２ｂの好適な幅は１０ｍｍ、好適な長さは１０ｍｍである。小貫通孔４２ｃは、好適な直径が４．５ｍｍであって、好適には、３４ｍｍ間隔で金属板４２の長さ方向に配置される。金属板４２の厚さは、細胞培養器３０の重量をできる限り軽くし、かつ細胞培養面４８の形成時に貫通しない程度の十分な厚さであれば特に限定されず、例えば、０．６〜１．５ｍｍ、さらには０．９〜１．２ｍｍに設定可能である。金属板４１の形態については、金属板４２の１つの突出部４２ａとそれと長さ方向にて対向位置にある１つの突出部４２ｂを除外している点のみが金属板４２と異なる。
【００６１】
図８は、図７に示す金属板（８Ａ）およびその変形例（８Ｂ）の各平面図を示す。
【００６２】
図７に示す金属板４２に形成される培地流路４３（平面視にて、８Ａ中の斜線領域）は、突出部４２ａと突出部４２ｂとを結ぶラインと、それと対向する側にふくらむラインとから構成される片袋形状の流路である。しかし、培地流路は、上記形状の培地流路４３に限定されず、例えば、第一の実施の形態における培地流路１３のような幅方向両側に膨らむ袋形状の培地流路４３’（平面視にて、８Ｂ中の斜線領域）としても良い。ただし、培地流路４３’は、培地流路４３と比べて培地３ａの流路中に急激に屈曲する部位を含む。このため、培地３ａをスムーズにフローさせる観点では、培地流路４３のような形状の方が好ましい。
【００６３】
＜第三の実施の形態＞
この実施の形態では、本発明に係る細胞培養器を用いて、培養した細胞を回収する方法について説明する。
【００６４】
この細胞回収方法は、少なくとも一対の金属板を対向して備える容器形状を有し当該一対の金属板の少なくとも内側の面に細胞を接着させる足場となる細胞培養面を形成して成る細胞培養器を用いて培養した細胞を回収する細胞回収方法であって、タンパク質分解酵素の添加と、細胞培養器にその一部若しくは全部を接触させて成る振動手段からの振動との併用により細胞を回収する方法である。ここで、タンパク質分解酵素としては、トリプシン、アクターゼ、ＥＤＴＡなどを好適に用いることができ、特に、トリプシン含有溶液を好適に用いることができ、その一例として、トリプシンとＥＤＴＡのナトリウム塩との混合溶液を用いることができる。また、振動手段は、細胞培養器に振動を与えることができる手段であれば、特に制限なく用いることができ、その一例として、超音波振動子と、その超音波振動子を振動させる振動発生装置との組み合わせを採用することができる。その場合、細胞培養器の一部（例えば、底面）に超音波振動子を貼り付け、超音波振動子に接続される振動発生装置をオンにして、細胞培養器に振動を与えることができる。その他の振動手段として、空圧アクチュエータを用いた揺動手段（株式会社ツーセルの商品名「ゆりかご」）を用いることもできる。
【００６５】
このように、培養した細胞の回収に際し、トリプシン含有溶液のみならず、細胞培養器に振動を与えることにより、振動を与えない場合と比してトリプシン含有溶液のトリプシン濃度を低減することができる。トリプシンは、タンパク質を分解する作用を持つため、培養した細胞に損傷をあたえないようにするためには、できるだけその濃度が低い方が好ましい。このため、トリプシン含有溶液に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて、トリプシンの濃度を低くするのが好ましい。一方、単に、トリプシンの濃度を低くするだけでは、細胞培養面から細胞を剥離させる作用が弱まり、細胞回収率が低くなってしまう。このため、この実施の形態では、細胞培養器に超音波振動等に代表される振動を与え、トリプシン濃度を低くしても細胞回収率を低下させないようにしている。
【００６６】
＜その他の実施の形態＞
以上、本発明に係る細胞培養器の好適な実施の形態について説明したが、本発明に係る細胞培養器は、上記各実施の形態に限定されず、種々変更可能である。
【００６７】
例えば、細胞培養器２は、２枚の金属板１０，１０の間に各１枚のシート１１，１２を挟む構造を備える。また、細胞培養器３０は、２枚の金属板４１，４１の間に３枚の金属板４２を所定間隔で配置し、金属板４１，４２間および金属板４２，４２間に各１枚のシート５０およびシート６０を挟む構造を備える。しかし、細胞培養器３０は、少なくとも一対の金属板１０，１０を対向して備え、それらの少なくとも内側の面に、細胞を接着させる足場となる細胞培養面を形成するだけとし、流入口および流出口を備えなくても良い。また、細胞培養器２を流入口と流出口を１つずつ備える金属製の容器とし、シート１１，１２を備えない培養器としても良い。同様に、細胞培養器３０も、また、金属製の容器を多段に積層させた構造の培養器としても良い。かかる場合、細胞培養器２，３０は、３対の金属板を対向して備える容器形状の培養器となる。また、流入口および流出口の両方向に樹脂あるいはゴム製のシートを配置し、それ以外の４面に金属板を配置し、２対の金属板を対向して備える容器形状の培養器を構成しても良い。さらに、細胞培養器２，３０の各層を、２対以上の金属板を対向させた構造とする場合において、全ての対向面に細胞培養面１８，４８を形成しても良い。
【００６８】
また、培地流路１３，４３は、流入口と流出口の間において内方広大の袋形状に形成されているが、かかる形状の流路に限定されない。例えば、流入口から流出口までの間を曲がりくねるように連結する細い流路を形成するようにしても良い。また、細胞培養器３０を構成する金属板４１，４２を合計３枚若しくは４枚、あるいは６枚以上にしても良い。細胞培養面１８は、金属板１０の突出部１０ａ，１０ｂの各内側の面に形成することもできる。同様に、細胞培養面４８は、金属板４１の突出部４１ａ，４１ｂの各内側の面あるいは金属板４２の突出部４２ａ，４２ｂの両面に形成することもできる。
【実施例】
【００６９】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例の内容に限定されるものではない。
【００７０】
＜実施例１＞
−各種投射粒子を用いた細胞培養面の作製および評価−
（１）実験方法
試験片には、生体用金属材料として汎用されているＳＵＳ３１６Ｌ鋼を用いた。同片を直径１５ｍｍ、厚さ４ｍｍに機械加工し、一方の端面を、耐水エメリー紙（＃３２０〜＃１２００）を用いて研磨した後、凹凸を付与するためのＦＰＰ処理を施した。投射粒子には、平均粒径３０〜５０μｍの酸化チタン粒子（Ｔシリーズ）、シリカ粒子（Ｇシリーズ）およびアルミナ粒子（Ａｌシリーズ）を用いた。また、比較材として、コロイダルシリカ懸濁液を用いて鏡面研磨した試験片（Ｐシリーズ）も用意した。次に、株式会社不二製作所製の空気吸引式投射装置（ＳＫＦ−２Ｓ型）を用いて、上記３種の投射粒子をそれぞれ用いてＦＰＰ処理を行った。各投射粒子を用いたＦＰＰ処理は、以下のような条件で行った。粒子供給量は、１ｇ／ｓｅｃとした。投射圧力は、０．６ＭＰａとした。投射時間は、３０ｓｅｃとした。投射距離は、１００ｍｍとした。ＦＰＰ処理後の試験片の表面を、アセトンとエタノールを用いて超音波洗浄した後、１２０℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を施し、供試状態とした。
【００７１】
細胞懸濁液への浸漬は、２４ウェルプレートを用いて行った。用いた細胞は軟骨細胞とした。播種した細胞数は、２．０×１０４ｃｅｌｌｓとした。細胞には、仔ウシの膝関節から採取した後に３回継代し脱分化させた状態のものを用いた。培地には、Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２  ｗｉｔｈ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄにウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％加えたものを使用した。２４ウェルプレートに浸漬した試験片を、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベータ内で７２時間培養し、その細胞数をＭＴＴ  ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。また、各試験片上の細胞の骨格やビンキュリンは、蛍光顕微鏡と走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて観察した。細胞は、試験片上に接着する際、タンパク質であるビンキュリンを分泌する。ビンキュリンの発光が強いほど強い接着性を示すものと解釈できる。また、各試験片表面のプロファイルおよび表面粗さは、非接触三次元表面形状・粗さ測定機を用いて測定した。
【００７２】
（２）実験結果・考察
図９は、実施例１にて用いた各種セラミックス粒子のＳＥＭ像（９Ａ）および当該各種セラミックス粒子の微粒子ピーニング処理（ＦＰＰ処理）によって形成された各細胞培養面のＳＥＭ像（９Ｂ）を示す。
【００７３】
３種の投射粒子を用いてＦＰＰ処理を行った各試験片は、投射粒子に応じて異なる表面性状であることがわかった。酸化チタンの粒子を用いてＦＰＰ処理を行った表面（Ｔシリーズ）およびアルミナの粒子を用いてＦＰＰ処理を行った表面（Ａｌシリーズ）は、鋭利な凹凸を有する表面性状であるのに対し、シリカの粒子を用いてＦＰＰ処理を行った表面（Ｇシリーズ）は、ディンプル状の凹部を有する表面性状であった。
【００７４】
表１は、各種試験片表面の算術平均粗さ（Ｒａ）および輪郭曲線要素の平均長さ（Ｒｓｍ）を示す。図１０は、ＦＰＰ処理後の各試験片表面のプロファイル（１０Ａ）および軟骨細胞を７２時間培養後に蛍光顕微鏡を用いて細胞と細胞外マトリックスの間に介在するビンキュリンを観察した結果（１０Ｂ）を、それぞれ示す。
【００７５】
【表１】
2013255483.tif 000003
【００７６】
表１に示すように、ＲａおよびＲｓｍは、ともに、Ｔシリーズ＞Ｇシリーズ＞Ａｌシリーズであった。また、（１０Ａ）に示す各試験片表面のプロファイルを比較すると、ＴシリーズとＡｌシリーズは、ともに微小の凹凸を有する点で共通する。しかし、Ｔシリーズの表面は、大きな凹凸の中に微小の凹凸を有するのに対し、Ａｌシリーズの表面は、微小の凹凸のみを有する。一方、Ｇシリーズは、微小の凹凸の少ない表面であった。これは、表１に示す測定結果と矛盾しないものである。また、（１０Ｂ）に示す各試験片表面のビンキュリンの発光度を観察したところ、３種の投射粒子を用いてＦＰＰ処理を施した面は、比較材の研磨表面と比較して、ビンキュリンの蛍光領域（色の薄い部分）が多く存在していた。このことは、ＦＰＰ処理を施すことにより軟骨細胞の接着タンパク質が増加し、より接着が強固になることを示唆するものである。
【００７７】
図１１は、各試験片表面において所定時間培養後、ＭＴＴ  ａｓｓａｙにより細胞数を測定した結果（１１Ａ）と、７２時間培養後の各試験片表面への細胞の接着状況を示すＳＥＭ像および模式図（１１Ｂ）と、をそれぞれ示す。なお、（１１Ａ）において吸光度が大きいほど、細胞数が多いことを意味する。
【００７８】
（１１Ａ）に示すように、７２時間後に注目すると、ＦＰＰ処理を施したＴ、Ｇ、Ａｌシリーズは、未処理のＰシリーズと比較して、細胞数が増加していた。前述の（１０Ｂ）に示すビンキュリンの観察結果を考慮すると、ＦＰＰ処理を施した培養面では、細胞の試験片との接着性が向上し、その結果、細胞数が増加したものと考えられる。また、Ｔ、Ｇ、Ａｌシリーズ間で比較すると、Ａｌシリーズが最も細胞数が多いという結果であった。また、細胞の試験片表面への接着状況を観察すると、（１１Ｂ）に示すように、Ｐシリーズと比較して、ＦＰＰ処理を施したＴ、Ｇ、Ａｌシリーズの各表面における細胞の仮足（各ＳＥＭ像中の白色矢印で示す）は、よく伸展しており、試験片に強固に接着していることがわかった。特に、Ａｌシリーズ表面の細胞は，仮足も太く十分に伸展しており、他のシリーズと比較して、細胞が安定して試験片に接着している様子を確認できた。一方、Ｔシリーズの場合には、仮足の数は多いが他シリーズと比較して細く、また、仮足の先端と試験片との境界が確認できなかった。これは、細胞が試験片表面の凹凸内部に侵入しているためではないかと考えられる。かかる細胞の接着状況の差異が増殖性にどのような影響を及ぼすかを考察してみると、（１１Ｂ）中の模式図に示すように、Ａｌシリーズでは、その表面に微細な凹凸が多数存在するので、細胞は太い仮足を多数成長させ、凹凸表面に接着可能であったのではないかと考えられる。一方、Ｔシリーズでは、細胞が試験片表面の大きな凹部に埋まる形で存在するために、細胞がコンフレントの状態にあるものと自ら認識し、その結果、増殖率の低下につながったのではないかと考えられる。
【００７９】
＜実施例２＞
−細胞培養面を両面備える細胞培養器を用いた反転時間の評価−
（１）実験方法
細胞培養器には、第一の実施の形態で用いた細胞培養器２を用いた。金属板およびシートは、図３に示す形態とし、金属板には厚さ１ｍｍのものを用いた。細胞を培養する領域の面積は、金属板の片面当たり２５ｃｍ２に設定した。なお、実施例２は、当該領域にＦＰＰ処理を行わない条件で行った。シートには、厚さ５ｍｍのシリコーンゴム製のシートを用いた。４個の細胞培養器を組み立て後、オートクレーブ滅菌を行い、細胞培養器１個当たり５００×１０４  ｃｅｌｌｓの濃度で、Ｌ９２９線維芽細胞を播種した。細胞播種後、それぞれの細胞培養器を、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で、１０分、１５分、２０分、２５分の４水準の時間で静置培養した。その後、４個の細胞培養器を天地反転させ、継続して静置培養を行った。播種から６時間培養後、各細胞培養器に対して、トリプシンを用いて金属板の両細胞培養面から細胞を剥離させて回収し、回収した細胞数を測定した。
【００８０】
（２）実験結果・考察
図１２は、実施例２において、反転時間を４水準で変化させたときの金属板の各面（Ａ面、Ｂ面）で細胞を回収した比率をグラフで示す。ここで、グラフ中、Ａ面は最初に細胞が接着した培養面を指し、Ｂ面は反転後に細胞が接着した培養面を指す。
【００８１】
図１２のグラフに示すように、反転時間が増加するほど、Ａ面での回収率が増加する一方、Ｂ面の回収率が減少した。また、反転時間が１５分のときにＡ面とＢ面の各回収率が等しくなった。このことから、金属板の両面に対して均一に細胞培養するには、反転時間を１５分にするのが好ましいと考えられる。
【００８２】
＜実施例３＞
−細胞培養面を両面備える細胞培養器を用いた細胞培養評価−
（１）実験方法
実施例２と同じ細胞培養器を用いて、オートクレーブ滅菌を行った後、細胞培養器１個当たり１００×１０４  ｃｅｌｌｓの濃度で、Ｌ９２９線維芽細胞を播種した。細胞播種後、細胞培養器を、３７℃、ＣＯ２５％濃度の条件下で、１５分間、静置培養し、その後、細胞培養器を天地反転させ、６時間静置培養を行った。その後、図１に示す自動培養システム１に接続して、３７℃、ＣＯ２５％濃度の条件下で２４時間培養した。また、比較として、培養面積が２５ｃｍ２のフラスコを２個準備し、フラスコ１個当たり５０×１０４  ｃｅｌｌｓの濃度で、Ｌ９２９線維芽細胞を播種した。フラスコでの培養は、両フラスコとも、３７℃、ＣＯ２５％濃度の条件下で６時間静置培養し、その後、播種から３０時間に至るまで引き続き静置培養した。すなわち、細胞培養器およびフラスコ中にて、細胞播種から６時間、３０時間の２水準で培養したことになる。両水準で培養後、細胞培養器およびフラスコに対して、トリプシンを用いて細胞を剥離させて回収し、血球計算盤を用いて、回収した細胞数を測定した。
【００８３】
（２）実験結果・考察
図１３は、実施例３において、細胞培養器およびフラスコ内から、それぞれ播種から６時間後、および３０時間後に回収した細胞数を比較したグラフを示す。
【００８４】
図１３に示すように、細胞培養器およびフラスコで回収した細胞数は、播種から６時間後および３０時間後のいずれでも同等であった。これは、金属板の両面で細胞を培養した場合においても、従来の方式と同様、細胞の増殖能に影響を及ぼさないことを意味する。
【００８５】
＜実施例４＞
−細胞培養面を両面および多層に備える細胞培養器を用いた細胞培養評価−
（１）実験方法
細胞培養器には、第二の実施の形態で用いた細胞培養器３０を用いた。金属板、シートおよび細胞培養面は、それぞれ、図６および図７に示す形態とし、金属板には厚さ１ｍｍのものを用いた。また、最上面および最下面の金属板の内面と、内部の金属板の両面には、実施例１のＡｌシリーズの表面を形成する条件と同一条件にて微小の凹凸を有する細胞培養面を形成した。細胞培養面の面積は、金属板の片面当たり２５ｃｍ２に設定した。シートには、厚さ５ｍｍのシリコーンゴム製のシートを用いた。ＦＰＰ処理後の細胞培養面をエタノールおよびアセトンを用いて洗浄後、細胞培養器を組み立てた（以後、「多層培養器」と称する）。その後、多層培養器のオートクレーブ滅菌を行い、一層当たり６０×１０４  ｃｅｌｌｓの濃度で、Ｌ９２９線維芽細胞を播種した。細胞播種後、多層培養器を、３７℃、ＣＯ２５％濃度の条件下で、１５分間静置培養し、その後、天地反転させ、さらに６時間静置培養を行った。次に、図１に示す自動培養システム１に接続して、３７℃、ＣＯ２５％濃度の条件下で、１８時間、４２時間培養した。また、比較として、培養面積が２５ｃｍ２のフラスコを４個準備し、フラスコ１個当たり３０×１０４  ｃｅｌｌｓの濃度で、Ｌ９２９線維芽細胞を播種した。フラスコでの培養は、全フラスコとも、３７℃、ＣＯ２５％濃度の条件下で、６時間、２４時間、４８時間静置培養した。播種から６時間、２４時間および４８時間培養の後に、多層培養器およびフラスコに対して、トリプシンを用いて細胞を剥離させて回収し、血球計算播を用いて、回収した細胞数を測定した。
【００８６】
（２）実験結果・考察
図１４は、実施例４において、多層培養器およびフラスコ内からそれぞれ播種から６時間後、２４時間後および４８時間後にそれぞれ回収した細胞数を比較したグラフ（１４Ａ）および、多層培養器およびフラスコ内でそれぞれ４８時間培養した後における単位体積当たりの細胞数を比較したグラフ（１４Ｂ）を、それぞれ示す。
【００８７】
（１４Ａ）のグラフに示すように、多層培養器を用いて培養した細胞は、フラスコを用いた細胞と同様、良好に増殖していた。また、各培養時間において、多層培養器で回収できた細胞は、フラスコで回収したそれと比べて多い傾向が認められた。これは、多層培養器の最上面および最下面の金属板の内面および内部の金属板の両面にＦＰＰ処理を施して細胞培養面を形成したため、初期接着性が向上したためと考えられる。また、（１４Ｂ）のグラフに示すように、多層培養器の単位体積当たりの細胞数は、フラスコのそれと比較して約４倍であった。このことは、多層培養器がフラスコの約１／４のスペースで同量の細胞数を培養できることを意味する。
【００８８】
＜実施例５＞
−培養細胞の回収評価−
（１）実験方法
図１５は、超音波刺激を与えるための金属製の細胞培養器を示す。図１６は、図１５の細胞培養器の裏側から見た斜視図を示す。図１７は、図１５の細胞培養器を含む超音波振動細胞培養システムの概略図を示す。
【００８９】
図１５に示すように、この細胞培養器１００は、ステンレススチール（ＳＵＳ３１６Ｌ）製の矩形の金属板１０１と、中央に円形の貫通孔１０２を有するＳＵＳ３１６ＡＬで矩形の金属板１０３とを対向して備える。細胞培養器１００は、金属板１０１，１０３の間に、金属板１０１の貫通孔１０２と略同形態の貫通孔１０４を有するシリコーン樹脂１０５を挟み、金属板１０３の上からシリコーン樹脂製のカバー１０６を被せた構造を有する。金属板１０１の内面において貫通孔１０４で囲まれた領域は、細胞培養面１０７である。金属板１０１、シリコーン樹脂１０５および金属板１０３は、４本のネジ１０８によって固定されている。また、図１６に示すように、金属板１０１の裏面には、超音波振動子１１０を接着し、超音波振動子１１０から導電端子（ここでは、銅箔テープ）１１１を引き出した。超音波振動子１１０を金属板１０１に接着するに先立ち、細胞培養器１００をオートクレーブ滅菌（１２１℃，２０分，２気圧）した。図１７に示すように、超音波振動子１１０は、銅箔テープ１１１を介して、高速バイポーラ電源１２０に接続された。高速バイポーラ電源１２０は、ファンクションジェネレータ１２１に接続された。このような超音波振動細胞培養システムを構築し、細胞培養器１００に与える振動の周波数および振幅を種々変化可能とした。なお、細胞培養器１００は、細胞培養面１０７につながる流入口および流出口を有していない閉鎖系の培養器であるが、培地を循環するための流入口と流出口を設けても良い。
【００９０】
細胞培養器１００は、エタノールを用いて洗浄された後、仔ウシ関節由来軟骨細胞の培養に供した。細胞培養を７２時間行い、その後、細胞培養器１００に周波数１７ｋＨｚおよび振幅２μｍの振動を３分間与え、細胞の回収に対する振動の影響を調べた。その際、通常使用するトリプシン含有溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；  ０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ＋０．５３ｍＭＥＤＴＡ・４Ｎａ）の濃度に加え、ＰＢＳを用いてそれを７５％、５０％および２５％に希釈したものも用いた。回収後の細胞の状態は、位相差顕微鏡により確認した。
【００９１】
（２）実験結果・考察
図１８は、トリプシンの希釈率と、通常のトリプシン濃度に対する細胞回収率との関係を表したグラフを示す。図１８の縦軸は、通常濃度のトリプシンで回収した量で無次元化した数値を、同図の横軸は、トリプシンの希釈率を、それぞれ示す。
【００９２】
図１８に示すグラフから明らかなように、希釈率が５０％、７５％のトリプシン含有溶液に超音波振動を付与した系では、各々の濃度のトリプシンのみを用いた系と比較して、より多くの細胞を回収可能であることがわかった。これは、トリプシンによるタンパク質分解能力に加え、超音波振動による物理的な細胞剥離作用が、細胞培養面に接着する細胞に影響を及ぼしたためであると考えられる。この結果から、超音波振動を付与することにより、トリプシンの濃度を低減でき、培養した細胞に与えるダメージを低減でき、回収後の細胞が成長・増殖をするためによりよい状態にできると考えられる。
【００９３】
また、剥離した細胞を位相差顕微鏡で観察した結果、振動を与えない系で剥離した場合には、複数の細胞が密集した状態であったのに対して、超音波振動を付与した系で剥離した場合には、ほとんどの細胞が個々に剥離した状態で回収できることが明らかとなった。この結果から、超音波振動を付与した系には、次に細胞を播種した際に均等に細胞を播くことができる優位性があると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明の細胞培養器は、細胞培養を必要とする分野において利用可能である。
【符号の説明】
【００９５】
２    細胞培養器
３ａ  培地
１０    金属板
１１    シート（ゴムシートの一例）
１２    シート（ゴムシートの一例）
１３    培地流路
１６    流入口
１７    流出口
１８    細胞培養面
２０    細胞
３０    細胞培養器
４１    金属板
４２    金属板
４３    培地流路（片袋形状の流路）
４３’  培地流路
４８    細胞培養面
５０    シート（ゴムシートの一例）
６０    シート（ゴムシートの一例）
６６    流入口
６７    流出口
１００  細胞培養器
１０１  金属板
１０３  金属板
１０７  細胞培養面
１１０  超音波振動子（振動手段の一部）
１２０  高速バイポーラ電源（振動発生装置の一部）
１２１  ファンクションジェネレータ（振動発生装置の一部）
Ａ      ライン
Ｂ      ライン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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