(57)【要約】【課題】接着細胞の分離方法を提供する。【解決手段】接着細胞の分離方法は、表現型の異なる複数種類の接着細胞が固定されている基板を用意する工程と、基板上において、培養液を一方向に流しながら、固定されている接着細胞を培養し、接着細胞のうち少なくとも１種類を細胞分裂させる工程とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表現型の異なる複数種類の接着細胞が固定されている基板を用意する工程と、
前記基板上において、培養液を一方向に流しながら、固定されている前記接着細胞を培養し、前記接着細胞のうち少なくとも１種類を細胞分裂させる工程と、
を備える、接着細胞の分離方法。
【請求項２】
前記固定された接着細胞を培養する前に、前記接着細胞のうち少なくとも１種類の接着細胞と選択的に相互作用する特異的結合分子を前記基板上に配置する、請求項１に記載の接着細胞の分離方法。
【請求項３】
前記基板上の前記特異的結合分子を、前記培養液が流れる方向において濃度を勾配させて配置する、請求項２に記載の接着細胞の分離方法。
【請求項４】
前記特異的結合分子として、タンパク質及びその断片の少なくとも一方を用いる、請求項２または３に記載の接着細胞の分離方法。
【請求項５】
前記タンパク質として、細胞外マトリックス、膜タンパク質、抗体、及びケモカインからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いる、請求項４に記載の接着細胞の分離方法。
【請求項６】
前記基板上において、前記各接着細胞の位置を特定する工程をさらに備える、請求項１〜５のいずれか一項に記載の接着細胞の分離方法。
【請求項７】
前記各接着細胞の位置を特定した後、少なくとも１種類の接着細胞を、前記基板上から回収する工程をさらに備える、請求項６に記載の接着細胞の分離方法。
【請求項８】
前記接着細胞のうち少なくとも１種類として、ｉＰＳ細胞を用いる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の接着細胞の分離方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の接着細胞の分離方法を行うための分離装置であって、
前記表現型の異なる複数種類の接着細胞を配置するための前記基板と、
前記基板上において、前記培養液を一方向に流すためのポンプと、
を備える、接着細胞の分離装置。
【請求項１０】
前記ポンプが、電池で作動するものである、請求項９に記載の接着細胞の分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着細胞の分離方法及び接着細胞の分離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数種類の細胞の混合物から特定種類の細胞を分離する方法が知られている。例えば、特許文献１には、特定の細胞型との接着特性を有する分子でコートされた基板上において、細胞をローリングさせ、特定の細胞型を有する細胞を分離する方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５４５３７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載の方法で分離している細胞は、造血幹前駆細胞などの浮遊細胞である。浮遊細胞は、培養液などの媒体中に浮遊して存在する。このため、浮遊細胞をローリングさせて基板上を移動させることができる。
【０００５】
一方、繊維芽細胞などの接着細胞は、隣接する細胞または細胞外の物質と接着して存在している。このため、従来、接着細胞は、基板上をローリングしないものと考えられている。このような状況下、接着細胞を分離する方法が求められている。
【０００６】
本発明は、接着細胞の分離方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の接着細胞の分離方法は、表現型の異なる複数種類の接着細胞が固定されている基板を用意する工程と、基板上において、培養液を一方向に流しながら、固定されている接着細胞を培養し、接着細胞のうち少なくとも１種類を細胞分裂させる工程とを備える。
【０００８】
固定された接着細胞を培養する前に、接着細胞のうち少なくとも１種類の接着細胞と選択的に相互作用する特異的結合分子を基板上に配置してもよい。
【０００９】
基板上の特異的結合分子を、培養液が流れる方向において濃度を勾配させて配置してもよい。
【００１０】
特異的結合分子として、タンパク質及びその断片の少なくとも一方を用いることが好ましい。
【００１１】
タンパク質として、細胞外マトリックス、膜タンパク質、抗体、及びケモカインからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いることが好ましい。
【００１２】
基板上において、各接着細胞の位置を特定する工程をさらに備えることが好ましい。
【００１３】
各接着細胞の位置を特定した後、少なくとも１種類の接着細胞を、基板上から回収する工程をさらに備えることが好ましい。
【００１４】
接着細胞のうち少なくとも１種類として、ｉＰＳ細胞を用いてもよい。
【００１５】
本発明の接着細胞の分離装置は、上記の接着細胞の分離方法を行うための分離装置である。接着細胞の分離装置は、基板と、ポンプとを備える。基板は、表現型の異なる複数種類の接着細胞を配置するためのものである。ポンプは、基板上において、培養液を一方向に流すためのものである。
【００１６】
ポンプは、電池で作動するものであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、接着細胞の分離方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態に係る接着細胞の分離方法を示す概念図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る接着細胞の分離方法を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施した好ましい形態の一例について説明する。但し、下記の実施形態は、単なる例示である。本発明は、下記の実施形態に何ら限定されない。また、実施形態において参照する図面は、模式的に記載されたものである。
【００２０】
本実施形態に係る接着細胞の分離方法においては、まず、表現型の異なる複数種類の接着細胞が固定されている基板を用意する。
【００２１】
接着細胞は、固形組織由来の細胞であり、一般に、隣接する細胞または細胞外の物質と接着して存在している。接着細胞の具体例としては、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞などが挙げられる。
【００２２】
例えば、接着細胞に遺伝子を導入した場合、一般に、細胞ごとに遺伝子の導入効率・発現効率は異なる。よって、例えば、１種類の接着細胞に遺伝子を導入することにより、表現型の異なる複数種類の接着細胞が得られる。また、ｉＰＳ細胞誘導のような、人工的なリプログラミング操作において、繊維芽細胞などの接着細胞に対して、いわゆる山中４因子（Ｏｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃ）をトランスフェクションまたはインフェクションした場合、１種類の接着細胞が、複数種類の接着細胞に誘導され得る。誘導された複数種類の接着細胞には、例えば、元の接着細胞の性質を色濃く残す細胞、ｉＰＳ細胞へ誘導された細胞、ｉＰＳ細胞からさらに分化した細胞、癌化した細胞などが含まれる。これらの接着細胞は、種類によって細胞分裂の頻度や表面抗原などの表現型が異なる。
【００２３】
基板上には、以上のような表現型の異なる複数種類の接着細胞が固定されている。基板上に固定されている細胞は、遺伝子が導入されたものであってもよいし、遺伝子が導入されていないものであってもよい。また、基板上において、１種類の接着細胞を配置し、遺伝子を導入するなどして複数種類の接着細胞としてもよいし、複数種類の接着細胞を予め準備して基板上に配置してもよい。
【００２４】
表現型の異なる複数種類の接着細胞を基板に固定する方法としては、表現型の異なる複数種類の接着細胞を基板上に静置する方法が挙げられる。接着細胞は、細胞外マトリックスなどにより、隣接する細胞または細胞外の物質と接着するため、接着細胞を基板上に静置する方法によって、接着細胞は基板上に容易に固定される。例えば、接着細胞と培養液とを、培養液中の接着細胞の濃度が１×１０/ｍｌ〜１×１０4/ｍｌ程度となるようにして混合し、得られた混合液を基板上に乗せ、静置することにより、接着細胞を基板上に固定することができる。
【００２５】
接着細胞を基板上に静置して固定させるまでの時間は、接着細胞の種類などに応じて適宜調整できるが、３時間〜４８時間程度であることが好ましく、６時間〜２４時間程度であることがより好ましい。
【００２６】
基板上に固定されなかった接着細胞は、培養液で洗い流すことができる。
【００２７】
接着細胞が固定された基板上の位置は、顕微鏡などで確認しておくことが望ましい。また、基板の接着細胞を固定する表面とは反対側の表面には、基準線などを設けておくことが好ましい。接着細胞が固定された位置の記録には、市販の画像処理ソフトなどが使用できる。
【００２８】
接着細胞を固定する基板は、樹脂、ガラスなどの透明材料により構成されていることが好ましい。基板が透明材料により構成されている場合、顕微鏡での接着細胞の観察が容易となる。樹脂としては、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリル酸メチル樹脂などが挙げられる。なお、細胞毒性を軽減するために、樹脂に含まれる原料モノマーの含有量は、５００ｐｐｍ以下とすることが好ましい。
【００２９】
基板上には、固定された接着細胞を培養する前に、接着細胞のうち少なくとも１種類の接着細胞と選択的に相互作用する特異的結合分子を配置してもよい。特異的結合分子の種類は、接着細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００３０】
特異的結合分子としては、タンパク質及びその断片の少なくとも一方を用いることが好ましい。タンパク質としては、細胞外マトリックス、抗体、及びケモカインからなる群から選ばれる少なくとも一種を用いることが好ましい。
【００３１】
細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、テオイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリンなどが用いられる。
【００３２】
膜タンパク質としては、カドヘリン、インテグリン、ムチン様ファミリー、免疫グロビンスーパーファミリーなどが挙げられる。
【００３３】
抗体としては、例えば、がん細胞を含む接着細胞の表面抗原に対する抗体が挙げられる。抗体の具体例としては、Ｅｐ−ＣＡＭ抗体、Ｎ−カドヘリン抗体、ビメンチン抗体などの上皮がんに共通の表面抗原に対する抗体、ＨＥＲ２抗体などの乳がん特有の表面抗原に対する抗体、ＮＳ１９−９抗体などの大腸がん特有の表面抗原に対する抗体、ＣＤ４９、ＣＤ５４，ＣＤ５９抗体などの前立腺がん特有の表面抗原に対する抗体などが好ましく用いられる。
【００３４】
ケモカインは、遊走性を有する接着細胞を用いる場合などに好ましく用いられる。
【００３５】
特異的結合分子を基板上に配置する方法は、特に限定されない。特異的結合分子を基板上に配置する方法としては、例えば、基板のシラネートガラス面の−ＣＯＯＨ基を特異的結合分子の−ＮＨ２基と反応させて、共有結合を形成する方法、基板表面にアビジンタンパク質を固定し、このアビジンタンパク質と、ビオチングループを含む特異的結合分子と反応させる方法などが挙げられる。
【００３６】
特異的結合分子は、基板上の全面に配置してもよいし、一部にのみ配置してもよい。特異的結合分子は、基板上の接着細胞を固定する部分よりも、後述の培養液が流れる方向の下流側に位置する部分に配置してもよい。また、特異的結合分子を、培養液が流れる方向において濃度を勾配させて配置してもよい。例えば、特異的結合分子の濃度を、培養液が流れる方向に向かうに従って、徐々に低くしてもよい。また、特異的結合分子の濃度を、培養液が流れる方向に向かうに従って、徐々に高くしてもよい。また、特異的結合分子の濃度の高い部分と低い部分とが交互に位置するように、特異的結合分子を配置してもよい。このように、基板上の特異的結合分子に濃度勾配を設けることにより、高い濃度で全面処理を行う場合に比べて、基板上を移動する細胞の移動距離を延ばすことができ、細胞分別の精度をより高めることができる。
【００３７】
次に、基板上において、培養液を一方向に流しながら、固定されている接着細胞を培養し、接着細胞のうち少なくとも１種類を細胞分裂させる。
【００３８】
基板上において、培養液を一方向に流す方法は、培養液を特定の方向に流すことができる方法であれば、特に限定されない。培養液を一方向に流す方法としては、例えば、ポンプを用いる方法などが挙げられる。例えば、チューブポンプを用い、培養液を基板の一方側から供給し、他方側から吸引することによって、基板上において培養液を一方向に流すことができる。また、基板に傾斜をつけ、培養液を基板の一方側から供給して培養液を一方向に流してもよい。培養液の流れを安定させるために、基板に溝などを設けてもよい。
【００３９】
培養液の流速は、培養液を流す基板の幅にもよるが、例えば、幅が１５ｍｍの場合には、５ｃｃ／時間〜５０ｃｃ／時間程度であることが好ましく、１０ｃｃ／時間〜３０ｃｃ／時間程度であることがより好ましい。
【００４０】
基板上に固定されている接着細胞を培養する環境は、接着細胞が細胞分裂できる環境であれば、特に限定されない。例えば、接着細胞が動物細胞である場合、一般に、３７℃の温度下、二酸化炭素濃度が５％となるような環境で接着細胞を培養することができる。
【００４１】
従来、接着細胞は、隣接する細胞または細胞外の物質と強く接着しているため、培養液を流す程度では、基板上に固定された接着細胞を移動させることはできないと考えられる。
【００４２】
しかしながら、本発明者が検討した結果、培養液を一方向に流しながら、基板上に固定されている接着細胞を培養し、接着細胞を細胞分裂させることにより、基板上において、細胞分裂した接着細胞を選択的に培養液の流れの方向に移動させることができることが明らかとなった。基板上に固定された接着細胞が移動する機構の詳細は必ずしも明らかではないが、例えば、次のように考えることができる。すなわち、接着細胞は、通常、隣接する細胞または細胞外の物質と強く接着しているが、細胞分裂している間（細胞周期のＭ期）においては、接着細胞は、隣接する細胞または細胞外の物質と離れる。接着細胞が細胞外の物質などと離れている間は、接着細胞は、培養液の流れに沿って移動する。このため、基板上に固定された接着細胞を移動させることができると考えられる。基板上における接着細胞の移動速度と、培養液の流速とは、相関関係があると考えられる。
【００４３】
さらに、接着細胞の細胞分裂の頻度は、接着細胞の種類によって異なる。例えば、図１及び図２に示されるように、接着細胞１が、基板２上の位置Ａに固定されており、培養液を一方向（ｘ２側からｘ１側）に流しながら、固定されている接着細胞１を培養している状態で、接着細胞１を細胞分裂させるとする。図１に示されるように、接着細胞１が、時間Ｔ１の間に２回細胞分裂する細胞である場合、時間Ｔ１の間に、接着細胞１は、細胞分裂を２回行う。すなわち、細胞分裂が２回行われているＴ１の間に、接着細胞１は、培養液の流れに沿って基板上の位置Ｃまで移動する。一方、図２に示されるように、接着細胞１が、時間Ｔ１の間に３回細胞分裂する細胞である場合、同様にして、接着細胞１は、細胞分裂が３回行われているＴ１の間に、培養液の流れに沿って基板上の位置Ｄまで移動する。
【００４４】
このように、一定時間における細胞分裂の頻度が異なる複数種類の接着細胞を特定の位置に固定し、培養液を一方向に流しながら、接着細胞を細胞分裂させると、細胞分裂の頻度に応じて接着細胞の移動する距離が異なる。このため、各接着細胞の位置にずれが生じる。よって、表現型の異なる複数種類の接着細胞を分離することが可能となる。
【００４５】
接着細胞の細胞周期を接着細胞の種類ごとに揃えることにより、より精密な分離が可能となる。接着細胞の細胞周期を揃える方法としては、同調培養などの方法が挙げられる。例えば、細胞周期の各期に適応した阻害剤を用いることにより同調培養を行うことができる。このような阻害剤としては、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤であるアフィジコリン、Ｇ１Ｇ２の細胞周期に作用するトリコスタチンやレプトマイシン、分裂期に作用するコルヒチンなどが挙げられる。
【００４６】
接着細胞のうち少なくとも１種類の接着細胞と選択的に相互作用する特異的結合分子を基板上に配置することにより、特定の接着細胞を、特異的結合分子を配置した箇所に固定させることができる。このため、接着細胞の分離の精度を向上し得る。
【００４７】
特異的結合分子を基板上の接着細胞を固定する部分よりも、培養液が流れる一方向側に位置する部分に配置することにより、移動した接着細胞を途中で動きにくくしたり、固定したりできる。移動した接着細胞を途中で動きにくくすることにより、各接着細胞の移動速度に差を付けやすくなり、各接着細胞の移動距離の差を制御しやすくなる。また、移動した接着細胞を途中で固定することにより、基板上の任意の位置で接着細胞を固定することができる。よって、接着細胞の分離の精度を向上し得る。
【００４８】
基板上に培養液を流す時間は、接着細胞の種類などに応じて、適宜調整することができる。具体的には、基板上に培養液を流す時間は、各接着細胞の細胞分裂の頻度や細胞分裂に要する時間、接着細胞と特異的結合分子との相互作用の大きさなどに応じて調整することができる。基板上に培養液を流す時間は、５時間〜５日間程度であることが好ましく、１２時間〜４８時間程度であることがより好ましい。
【００４９】
基板上において、各接着細胞の位置を特定する工程をさらに設けてもよい。各接着細胞の基板上の位置の特定には、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、偏光顕微鏡、蛍光顕微鏡の他に共焦点顕微鏡などの顕微鏡を用いることができる。また、基板上における各接着細胞の位置の記録には、市販の画像処理ソフトを用いることができる。顕微鏡及び画像処理ソフトを用いることにより、培養液を流す前後における接着細胞の位置の変化から、各接着細胞の移動速度や分布などを解析したり、特定の位置に存在する接着細胞の均一性などを観察することができる。
【００５０】
各接着細胞の位置を特定した後、少なくとも１種類の接着細胞を、基板上から回収する工程をさらに設けてもよい。基板上から回収した接着細胞は、セルソーターなどを用いて詳細に観察することができる。なお、接着細胞を基板上から回収しなくてもよい。この場合、基板上の培養液の流れを止め、そのまま静置培養に切り替えて、各接着細胞を観察することができる。
【００５１】
以上のような接着細胞の分離方法を行うための分離装置は、上記の基板と、上記のポンプとを含む。基板は、表現型の異なる複数種類の接着細胞を配置するためのものである。ポンプは、基板上において、培養液を一方向に流すためのものである。
【００５２】
ポンプは、電池で作動するものであることが好ましい。電池で作動するポンプとしては、チューブポンプなどが挙げられる。ポンプが電池で作動することにより、分離装置が小型化でき、持ち運びが容易となる。分離装置の持ち運びが容易であると、クリーンベンチでの準備、インキュベータ内での培養、顕微鏡などでの接着細胞の観察などを容易に行うことができる。
【００５３】
以下、本発明について、具体的な実験例に基づいて、さらに詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実験例に何ら限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲において適宜変更して実施することが可能である。
【００５４】
（実験例１）
接着細胞として、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、シグマアルドリッチ社製品）を使用した。ＣＨＯ−Ｋ１は、３回継代後に、２５００個/ｍｌの濃度まで下記の培養液で希釈して、ＣＨＯ−Ｋ１の浮遊液とした。
【００５５】
培養液として、ＭＥＭα（製品番号１３５−１５１７５、和光純薬株式会社製）に対して、０．２μｍのフィルターでろ過したウシ胎児血清（ＦＢＳ、ｂｉｏｗｅｓｔ社製）を１０体積％添加したものを使用した。
【００５６】
基板として、２５ｃｍ２のフラスコ（コーニング社製  製品番号４３０６３９）の底面を用いた。基板に配置する特異的結合分子として、コラーゲン溶液（ＰＳＣ−１−１００−１００、株式会社ニッピ製）を用いた。コラーゲン溶液を５ｍＭの酢酸溶液で３００倍に希釈した後、基板表面に３０分間接触させ、次いで基板表面をリン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、乾燥させて、基板上にコラーゲンを配置した。
【００５７】
基板の裏側から、マジックで基準線（１５ｍｍ、直線状）を描いた。次に、ＣＨＯ−Ｋ１の浮遊液（約１０μｌ）を基準線の位置に配置した。フラスコを静かにインキュベータ内に移し、一晩培養を行うことで、ＣＨＯ−Ｋ１を基板上に接着させ、固定した。基板上に固定されなかったＣＨＯ−Ｋ１を培養液で洗い流した後、固定されたＣＨＯ−Ｋ１の基板上の位置を、位相差顕微鏡（オリンパス株式会社製のＣＫＸ４１）を用いて記録した。
【００５８】
培養液を流すポンプとして、自立式送液ポンプ（協和エンジニアリング株式会社製）を用いた。この自立式送液ポンプは、２台のチューブポンプが乾電池を電源としてブラシレス直流モーターで駆動するものである。送液用のチューブにはテフロンＰＦＡチューブ（外径２ｍｍ、内径１ｍｍ）を用いた。
【００５９】
次に、クリーンベンチ内において、ガスバーナーでステンレス棒（φ２ｍｍ）を加熱し、ステンレス棒の加熱された部分をフラスコの上部に押し当てて、ＰＦＡチューブを通すための孔をフラスコの前後２カ所に設けた。これらの孔にＰＦＡチューブをはめ込み、チューブポンプのスイッチを入れ培養液を一方向に流し始めた。送液量は、送液側、排液側ともに、１５ｃｃ／時間とした。ＰＦＡチューブからの培養液の送液は、滴下の状態となるが、底面に落ちてからは、吸い込み側に向かって約１５ｍｍの幅で安定的に液が移動するのを確認した。その後、フラスコをクリーンベンチから、温度３７℃、二酸化炭素濃度５％に設定されたインキュベータ内へ移し、そのまま４０時間、培養液を流し続けた。次に、フラスコをインキュベータから取り出し、位相差顕微鏡の側に移動させ、フラスコ内のＣＨＯ−Ｋ１の位置を確認した。その結果、ＣＨＯ−Ｋ１が、基準線から約２ｍｍ、灌流の方向へ移動していることが明らかとなった。
【符号の説明】
【００６０】
１…接着細胞
２…基板
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ…基板上の位置
【図１】
2013126396.tif 000003
【図２】
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