(57)【要約】【課題】冷却ゲル内拡散法を利用して、クリオグロブリン形成のメカニズムを解明し、Ｃ型慢性肝炎及びその合併症の改善剤として有用なクリオグロブリンの形成を阻害するペプチド化合物（クリオグロブリン形成阻害剤）を提供する。【解決手段】Ｌ−システインまたはその塩、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインまたはその塩、システインを含むジペプチド化合物またはその塩、及びシステインを含むトリペプチド化合物またはその塩から選択されるシステイン類似化合物を有効成分として含有することを特徴とするクリオグロブリン形成阻害剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン類似化合物を有効成分として含有することを特徴とするクリオグロブリン形成阻害剤。
【請求項２】
システイン類似化合物が、Ｌ-システインまたはその塩、Ｎ-アセチル-Ｌ-システインまたはその塩、システインを含むジペプチド化合物またはその塩、及びシステインを含むトリペプチド化合物またはその塩から選択される請求項１に記載のＬ-システインまたはその塩、Ｎ-アセチル-Ｌ-システインまたはその塩、システインを含むジペプチド化合物またはその塩、及びシステインを含むトリペプチド化合物またはその塩から選択される請求項１に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
【請求項３】
システインを含むジペプチド化合物がシステイニルグリシンである請求項２に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
【請求項４】
システインを含むトリペプチド化合物がグルタチオンである請求項２に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
【請求項５】
Ｃ型肝炎及び／またはその合併症緩和剤である請求項１〜４のいずれかに記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
【請求項６】
Ｃ型肝炎合併症が、ネフローゼ症、または血管炎である請求項５に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
【請求項７】
経口投与剤である請求項１〜６のいずれかに記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はクリオグロブリン形成阻害剤に関する。さらに詳しく言えば、クリオグロブリン形成阻害剤及びそれを有効成分とするＣ型慢性肝炎及びその合併症（ネフローゼ症（腎炎）、血管炎等）の改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は慢性化し、数十年後には高い確率で肝癌を発症する。また、他のウイルス性肝炎と違って、Ｃ型肝炎は高い割合でクリオグロブリン血症を合併することが知られている（Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2009;47(5)619-620；非特許文献１）。クリオグロブリン血症は、血清を３７℃以下に冷却した時に、ゲル化したり沈殿したりする熱不安定蛋白成分（クリオグロブリン）の生成に特徴付けられる疾患であり、クリオグロブリンの生成に伴い腎炎や血管炎を引き起こす。したがって、血清中におけるクリオグロブリンの生成を抑えることができれば、クリオグロブリンの形成に起因する各種疾患を改善できると考えられる。
【０００３】
クリオグロブリンの主成分はＩｇＭ型の免疫グロブリンで、これにさまざまなたんぱく質が結合していると考えられている（Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2009;47(9)1161-1163；非特許文献２）。
【０００４】
一方、クリオグロブリン構成たんぱく質の１つであるα２−ＨＳ−グリコプロテインは１２のシステイン残基を有しその半分が遊離型チオール基（ＳＨ型）であることが知られている（Diabetes Metab Res Rev 2002; 18:311-314；非特許文献３）。
【０００５】
また、Ｃ型肝炎患者血清たんぱく質は、健常者の血清たんぱく質に比べてより多く酸化反応を受けていることが知られている（生物試料分析 vol.33 70-71 (2010)；非特許文献４）。
【０００６】
さらに、Ｃ型肝炎の治療薬（処方せん医薬品）として使われている強力ネオミノファーゲンにはグルチルリチン酸塩（アンモニウム塩）のほかにＬ−システイン塩（塩酸塩）が含まれており、Ｌ−システイン塩によって、アルブミンのシステイン残基が酸化型から還元型に変化することが知られている（Hepatology Research 2011; 31, 1120-1125；非特許文献５）。
【０００７】
本発明者らは先にクリオグロブリンを鋭敏に検出できる冷却ゲル内拡散法を開発している（検査と技術，Vol.31 403-406 (2003)；非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2009;47(5)619-620
【非特許文献２】Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2009;47(9)1161-1163
【非特許文献３】Diabetes Metab Res Rev 2002; 18:311-314
【非特許文献４】生物試料分析 vol.33 70-71 (2010)
【非特許文献５】Hepatology Research 2011; 31, 1120-1125
【非特許文献６】検査と技術，Vol.31 403-406 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
クリオグロブリンが３７℃以下の温度で凝集するメカニズムは明らかではないが、本発明の課題は、本発明者らが開発した冷却ゲル内拡散法等を利用して、クリオグロブリン形成のメカニズムを解明することによってクリオグロブリンの形成を阻害するペプチド化合物（クリオグロブリン形成阻害剤）を提供すること、及びそのクリオグロブリン形成阻害剤を有効成分とする、慢性Ｃ型肝炎及びその合併症の改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、本発明者は、Ｃ型肝炎患者の血清たんぱく質であるα２−ＨＳ−グリコプロテインやその他の大分子量蛋白質分子中のシステイン残基（チオール基）が酸化されてＳ−Ｓ結合により巨大蛋白質粒子ができ、冷却によってゼータ電位の小さな巨大蛋白質粒子がファンデルワールス力で結合して凝集沈殿することを確認し、ジスルフィド結合を切断するＳＨ基を有する化学物質であって、かつクリオグロブリン（タンパク）に親和性があるペプチド結合を有する化学物質（ポリペプチド）である遊離型チオール基（ＳＨ型）を有するＬ-システイン類似化合物を存在させておくことによって、Ｓ−Ｓ結合による巨大タンパク質の形成が阻害されるとの知見を得て本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、血清たんぱく質のジスルフィド結合の形成を阻害するシステイン類似化合物を含有する下記のクリオグロブリン形成阻害剤を提供するものである。
［１］  システイン類似化合物を有効成分として含有することを特徴とするクリオグロブリン形成阻害剤。
［２］  システイン類似化合物が、Ｌ-システインまたはその塩、Ｎ-アセチル-Ｌ-システインまたはその塩、システインを含むジペプチド化合物またはその塩、及びシステインを含むトリペプチド化合物またはその塩から選択される前項１に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
［３］  システインを含むジペプチド化合物がシステイニルグリシンである前項２に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
［４］  システインを含むトリペプチド化合物がグルタチオンである前項２に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
［５］  Ｃ型肝炎及び／またはその合併症緩和剤である前項１〜４のいずれかに記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
［６］  Ｃ型肝炎合併症が、ネフローゼ症、または血管炎である前項５に記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
［７］  経口または静注投与剤である前項１〜６のいずれかに記載のクリオグロブリン形成阻害剤。
【発明の効果】
【００１２】
Ｃ型肝炎では高頻度でクリオグロブリン血症を合併するが、クリオグロブリン形成にはα２−ＨＳ−グリコプロテインのシステイン残基と酸化修飾された血清たんぱく質のシステイン残基のジスルフィド結合が関係する。本発明では、システイン類似化合物の投与によって酸化修飾された患者血清中のたんぱく質の酸化型のシステイン残基（ジスルフィド結合）を還元型に戻してやることによって、ジスルフィド結合の形成（クリオグロブリン形成）を阻害する。本発明によれば、クリオグロブリン形成が原因となるＣ型慢性肝炎に伴うさまざまな症状、例えば腎炎や血管炎の症状の改善が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】５６℃加熱処理、ジャカリン処理、またはプロテインＡ処理を行った、健常者血清試料及びＣ型肝炎患者血清試料、並びに無処理の健常者血清試料及びＣ型肝炎患者血清試料を用いたクリオグロブリン形成阻害試験の結果を示す写真（ａ）及びその模式図（ｂ）である。
【図２】ジャカリン反応性タンパク質の確認検査試験の説明図である。
【図３】図２のジャカリン反応性タンパク質の確認検査試験とそのＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。
【図４】クリオグロブリン形成の概念図である。
【図５】Ｌ−システイン類似化合物によるクリオグロブリン分解試験の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する
本発明者は、非特許文献６に記載の冷却ゲル内拡散法を用いて、冷却により凝集するクリオグロブリン粒子が如何なる成分によるものであるかについて検討した。
【００１５】
実施例の項に詳細に記載した通り、Ｃ型肝炎患者血清に非還元α−Ｄ−ガラクトシル基と反応するジャカリンレクチン（Ｊａｃａｌｉｎ）を添加することにより、クリオグロブリンの形成（サンプル注入孔と抗体注入孔との間にできるリング状の沈降線の形成）が阻害されたことから、クリオグロブリン形成には、非還元α−Ｄ−ガラクトシル基を持つたんぱく質とジスルフィド結合が必須であると考えた（図１〜図５）。まず、ジャカリンアフィニティカラムを用いてＣ型肝炎患者血清たんぱく質を精製し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後（図２）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）でα２−ＨＳ-グリコプロテインを同定した（図３）。α２−ＨＳ-グリコプロテインは、１２個のシステイン残基を有し、その半分は遊離型（ＳＨ型）であることが知られている（非特許文献４）。また、Ｃ型肝炎患者血清たんぱく質は健常者血清たんぱく質に比べてより多く酸化反応を受けていることが知られていることから（非特許文献５）、酸化修飾を受けたＣ型肝炎患者血清たんぱく質のシステイン残基のチオール基が、冷却によってα２−ＨＳ−グリコプロテインのシステイン残基と反応し、ジスルフィドを形成し、凝集するものと考えられる（図４）。Ｃ型肝炎患者血清の冷却ゲル内拡散法（非特許文献６）によって形成されたクリオグロブリンリングについて、Ｌ−システインやＮ−アセチル−Ｌ−システインを含むグリシン添加ダルベッコ緩衝液を寒天ゲル板の穴に注入したところ、５分後、クリオグロブリンリングの穴側から消失しはじめ、１０分後にはクリオグロブリンリングが完全に消えた（図５）。これは、穴に添加されたＬ−システインやＮ−アセチル−Ｌ−システインが寒天ゲル内に浸透し、クリオグロブリンのジスルフィドを切断し、クリオグロブリン塊をばらばらにしたためと考えられる。これらの結果に基づいて、含硫システイン類似化合物の投与によってその血中濃度を上げ、酸化によって生じたクリオグロブリン成分のジスルフィド結合を切断し、クリオグロブリン形成を阻害することができ、Ｃ型肝炎の慢性諸症状を緩和することが期待できる。因みに、Ｃ型肝炎の治療薬（処方せん医薬品）として使われている強力ミノファーゲン中のＬ−システインによって、アルブミンのシステイン残基が酸化型から還元型に変化することが知られている。
【００１６】
以上の知見によれば、当業者には血清たんぱく質のジスルフィド結合の形成を阻害するシステイン類似化合物はクリオグロブリン形成阻害剤として有用であることが明らかである。
システイン類似化合物としては、Ｌ−システインまたはその塩、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインまたはその塩、システインを含むジペプチド化合物またはその塩、及びシステインを含むトリペプチド化合物またはその塩が挙げられる。これらの中でもＮ−アセチル−Ｌ−システインナトリウム塩は溶解度が高く、血中で作用する製剤として好ましい。
【００１７】
本発明のクリオグロブリン形成阻害剤には毒性は認められず、十分安全に使用できる。本発明のクリオグロブリン形成阻害剤は経口または非経口で用いられるが、投与量は、年齢、体重、症状、目的とする治療効果、投与方法等により異なるが、通常、成人一人当り、一回につき、５０〜1000ｍｇの範囲である。本発明の製品を経口投与する際には、経口投与として一般に錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等、非経口投与として注射剤、塗布剤等として用いられる。造粒、錠剤化あるいはシロップ剤とする際には、必要により適宜の補助資材（澱粉類、デキストリン、甘味剤類、色素、香料等）を使用することもできる。
【００１８】
塩は、薬学的に許容されるものであればよい。例えばナトリウム塩、塩酸塩などが挙げられる。
本発明のクリオグロブリン形成阻害剤には、通常の薬学的製剤は各種の添加剤を含んでいてもよい。添加剤の例としては、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【実施例】
【００１９】
以下に、Ｃ型肝炎の合併症であるクリオグロブリン血症に見られるクリオグロブリンの生成が、ジスルフィド結合を切断するＳＨ基を有する化学物質であって、特にクリオグロブリンに親和性の遊離型チオール基（ＳＨ型）を有するＬ-システイン類似化合物の存在によって阻害されることを確認した試験結果について説明する。
【００２０】
試験例１：クリオグロブリン形成阻害試験
本発明者らが開発した冷却ゲル内拡散法（非特許文献６）を用いて、図１に示すように、５６℃加熱（Heating）処理、ジャカリン(Jacalin)処理、プロテインＡ(Protein A)処理によるクリオグロブリン形成阻害試験を実施した。因みに、ジャカリン及びプロテインＡはいずれも特異的糖鎖構造に反応するレクチンであり、ジャカリンはＩｇＡの糖鎖と反応し、プロテインＡはＩｇＧの糖鎖と反応することが知られている。試験の実施に先立って、まず、冷却ゲル内拡散法のための寒天ゲル板を以下のようにして作成した。５００ｍｌ三角フラスコ中のアガロース １．８ｇ、グリシン ２２．５g、アジ化ナトリウム ０．３gに、ダルベッコ緩衝液 ３００ｍｌを加え、スターラーで撹拌後、沸騰湯浴中で加温して寒天液を溶解した。撹拌と加温を数回繰り返した後、この寒天液を寒天ゲル板用の透明プラスチック容器に流し込み、室温にて固めた。寒天ゲル板にパンチャーで試料注入用の穴を７個あけ、実験に供した。7個の穴のうち、図中の番号１の穴には５６℃加熱処理、ジャカリン処理、プロテインＡ処理のいずれかの処理を行った健常者血清試料、２の穴には５６℃加熱処理、ジャカリン処理、プロテインＡ処理のいずれかの処理を行ったＣ型肝炎患者血清試料、３の穴には無処理のＣ型肝炎患者血清試料、４の穴には無処理の健常者血清試料をそれぞれ約２０μｌ注入し、４℃で４８時間に静置したところ、（ａ）の上段の写真に示す結果が得られた。これらの結果を模式的に（ｂ）に示す。（ａ）の上段の写真で出現した寒天ゲル板の穴の周囲に生じた白いリング状の沈降物は、（ａ）の下段の写真に示すように、３７℃に加温すると速やかに消失したことからクリオグロブリンと考えられる（クリオグロブリンは、冷却すると沈殿し加温すると再融解する異常タンパク質である。）。５６℃加熱処理、ジャカリン処理、プロテインＡ処理の結果をみると、無処理のＣ型肝炎患者血清で出現していたクリオグロブリンのリングがジャカリン処理で消失した。この結果から、クリオグロブリン形成にはジャカリン反応性のタンパク質の存在が必須であることが判明した。
【００２１】
試験例２：ジャカリン反応性タンパク質の確認試験
クリオグロブリン形成に必須であるジャカリン反応性タンパク質の確認のために、  図２に示すように、ジャカリン／アガロースを充填したミニカラム(Jacalin/Agarose column)（１）を用意し、健常者とＣ型肝炎患者血清（Serum）（２）のアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク精製を実施した。まず、血清（Serum）中のクリオグロブリンを融解させるため、健常者とＣ型肝炎患者血清を３７℃で予備加温した。この血清試料（２）３ｍｌを、３７℃の恒温器内に設置されたジャカリン／アガロースミニカラム(Jacalin/Agarose column)（１）に注入し、６時間静置した。カラムをグリシン添加ダルベッコ緩衝液で十分洗浄した後、メリビオース(Melbiose)最終濃度が０．１モルになるように調整されたグリシン添加ダルベッコ緩衝液でカラム吸着タンパク質を溶出させた。その溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、検出されたバンドについて液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を実施した。
【００２２】
図３（ａ）に示すように、あらかじめ冷却ゲル内拡散法（非特許文献６）でクリオグロブリンの有無を確認した陰性(Cryoglobulin negative)健常者血清および陽性(Cryoglobulin positive)Ｃ型肝炎患者血清について、ジャカリン/アガロースミニカラム(Jacalin/Agarose column)を用いてジャカリン吸着タンパク質を精製し、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施したところ、（ｂ）のようにそれぞれ２本のバンド１(Band 1)及びバンド２(Band 2)が認められた。バンド１はクリオグロブリン陰性例と陽性例で共通であったが、バンド２は、クリオグロブリン陽性例で一層明瞭であった。それぞれのバンドを切り出し、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で分析し、解析ソフトＭＡＳＣＯＴを用いて解析したところ、バンド１はＩｇＡのα鎖、バンド２はα２-ＨＳ-グリコプロテイン（alpha2-HS-glycoprotein）であることが判明したことから、クリオグロブリン形成には特にα２-ＨＳ-グリコプロテインが必須であると考えられる。
【００２３】
クリオグロブリン形成の概念図を図４に示す。クリオグロブリン形成に必須なα２−ＨＳ−グリコプロテインは燐酸カルシウム（calcium phosphate）と結合し、３０ｎｍ〜１５０ｎｍほどの粒子(calciprotein particle)を形成することが知られている。また、α２−ＨＳ−グリコプロテイン（alpha2-HS-glycoprotein）はシステイン残基を多く含み、そのうち６個がＳＨ基を有す（非特許文献４）。その結果、活性酸素等の暴露を受け、他のタンパク分子とＳ−Ｓ結合し、巨大分子を形成しやすくなり、低温で凝集すると考えられる。
【００２４】
試験例３：Ｌ−システイン類似化合物によるクリオグロブリン分解試験
寒天ゲル板の穴に３７℃に加温したクリオグロブリン陽性のＣ型肝炎患者血清を約２０μl注入した後、４℃で４８時間静置し、穴のまわりにクリオグロブリンリングが形成されているのを確認した(図５)。この寒天ゲル板の穴にＬ−システイン類似化合物のシステインまたはＮ−アセチル−Ｌ−システインの最終濃度が１０％になるように調整したグリシン添加ダルベッコ緩衝液を注入し、５分間隔で観察したところ、５分後、クリオグロブリンリングが穴側から消失しはじめ、１０分後にはクリオグロブリンリングが完全に消失した。
【符号の説明】
【００２５】
１  ジャカリン／アガロース  カラム
２  試料血清
３  ジャカリン／アガロース
４  メリビオース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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