(57)【要約】      （修正有）【課題】ＶＷＦ障害及びＧＰＩｂタンパク質障害に対して等しく鋭敏な、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を検出可能にするスクリーニング方法を提供する。【解決手段】ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を有する試料を見出すための方法であって、（ａ）試料を、単離ＧＰＩｂαタンパク質と、ＶＷＦタンパク質と、そして前記単離GＰＩｂαタンパク質に対して特異的な抗体と連結された固相と、接触させるステップ、及び（ｂ）ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び前記固相間の複合体の形成を判定するステップを含んでなる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を有する試料を見出すための方法であって、
（ａ）試料を、単離ＧＰＩｂαタンパク質と、ＶＷＦタンパク質と、そして前記単離ＧＰＩｂαタンパク質に対して特異的な抗体と連結された固相と、接触させるステップ、及び
（ｂ）ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び前記固相間の複合体の形成を判定するステップ
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記ＧＰＩｂαタンパク質が、ヒト野生型ＧＰＩｂαタンパク質又はその機能性断片であり、前記試料を、更に、リストセチン又はボトロセチンと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＧＰＩｂαタンパク質が、突然変異されており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比較して、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含有し、２３３、２３５及び２３９位のうちの少なくとも２か所のそれぞれにおいてＸａａ置換を有し、そして、前記試料をリストセチンともボトロセチンとも接触させない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記突然変異ＧＰＩｂαタンパク質が、Ｇ２３３Ｖ、Ｇ２３３Ｓ、Ｄ２３５Ｙ、Ｍ２３９Ｖ及びＭ２３９Ｓからなる群から選択される置換を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試料を、複合体形成を判定するアッセイ混合物中で、１．４μｇ／ｍＬ未満のＧＰＩｂαタンパク質、特に好ましくは０．７μｇ／ｍＬ未満のＧＰＩｂαタンパク質、の最終濃度が得られるような量のＧＰＩｂαタンパク質と接触させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料を、複合体形成を判定するアッセイ混合物中で、正常ＶＷＦ活性の０．１〜２０％、特に好ましくは正常ＶＷ活性の０．５〜１０％、の最終濃度が得られるような量のＶＷＦタンパク質と接触させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記固相が粒子状固相である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び前記固相間の複合体の形成が、前記粒子状固相の凝集に基づき判定される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記固相が、非粒子状固相、好ましくはマイクロタイタープレートの表面、である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び前記固相間の複合体の形成が、前記固相に結合されたＶＷＦタンパク質を決定することに基づき判定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
単離ＧＰＩｂαタンパク質を含有する第１試薬、ＶＷＦタンパク質を含有する第２試薬、及び前記単離ＧＰＩｂαタンパク質に対して特異的な抗体と連結された固相、好ましくは粒子状固相、を含有する第３試薬を、含んでなる、請求項１に記載の方法を実施するための試験キット。
【請求項１２】
リストセチン又はボトロセチンを含有する第４試薬を更に含む、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１３】
前記ＧＰＩｂαタンパク質が、ヒト野生型ＧＰＩｂαタンパク質又はその機能性断片である、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１４】
前記ＧＰＩｂαタンパク質が突然変異されており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比較して、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含有し、２３３、２３５、２３９位のうちの少なくとも２か所のそれぞれにおいてＸａａ置換を有する、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１５】
抗ＶＷＦ抗体を含有する第５試薬を更に含む、請求項１１に記載の試験キット。
【請求項１６】
試料中のグリコカリシンの濃度を決定するための方法であって、
（ａ）前記試料を、単離ＧＰＩｂαタンパク質と、ＶＷＦタンパク質と、そして前記単離ＧＰＩｂαタンパク質に対して特異的な抗体と連結された固相と、接触させるステップ、並びに
（ｂ）ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び前記固相間の複合体の形成を判定するステップ
を含んでなり、
前記試料を、複合体形成を判定するアッセイ混合物中で、少なくとも正常ＶＷＦ活性の５０％の、好ましくは正常ＶＷＦ活性の１００％を超える、最終濃度が得られるような量のＶＷＦタンパク質と接触させることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝固診断法の分野の発明であり、試料中のフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）及び／又はＧＰＩｂの相互作用障害を判定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ：Von Wi1lebrand factor）は、血漿中の高分子量の多量体糖タンパク質であり、一次止血の過程において重要な機能を有する。ＶＷＦは、とりわけ、コラーゲンに対する結合部位及び血小板の表面に配置された糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）に対する結合部位を有する。ＧＰＩｂは統合膜タンパク質であり、血小板膜中で、もう一つの統合膜タンパク質である糖タンパク質ＩＸ（ＧＰＩＸ）とともに、糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ−受容体複合体を形成する。ＧＰＩｂは、ジスルフィド結合により互いに結合された、見かけ分子量約１４５ｋＤａの重鎖（同義語：アルファ鎖又はＧＰＩｂα）及び見かけ分子量約２２ｋＤａの軽鎖（同義語：ベータ鎖又はＧＰＩｂβ）を含んでなる、２鎖分子である（非特許文献１）。グリコカリシンは、ＧＰＩｂα鎖の断片であり、血小板膜中の無傷の受容体からタンパク分解により除去される。グリコカリシンは、血漿中で検出可能である。遊離グリコカリシンの血漿中濃度の増加は、血小板機能の障害を示す（非特許文献２）。
【０００３】
血管損傷の場合には、コラーゲン表面が露出され、そこにＶＷＦが結合する。コラーゲンへの結合に起因して、また、コラーゲンに結合したＶＷＦに作用するせん断力の増加の影響により、ＶＷＦは、血小板膜のＧＰＩｂ−ＩＸ−受容体複合体中のＧＰＩｂ重鎖（ＧＰＩｂα）のアミノ末端に結合できるように、改変又は活性化される。このようにして、活性化されたＶＷＦは、通過する血小板を捕捉し、その結果、損傷部位においてＶＷＦ、コラーゲン及び血小板の一次凝集塊の形成をもたらす。続いて、血小板が活性化され、それによって、血漿の凝固も開始され、最終的には、多重増幅カスケード及び更なる血小板の付着の後、創傷の閉鎖がもたらされる。ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害は、出血傾向を増大させる。
【０００４】
質的な又は量的なＶＷＦ障害は、最も一般的な遺伝性出血症状の一つであるフォン・ヴィレブランド症候群（同義語：フォン・ヴィレブランド病、ＶＷＤ）として知られる症状を引き起こす。フォン・ヴィレブランド症候群を診断するための種々のスクリーニング方法、例えば、出血時間（ＢＴ）の決定、例えばＥＬＩＳＡアッセイ等のＶＷＦ抗原の濃度を決定する定量法（ＶＷＦ：Ａｇ）、及び、リストセチン誘起性血小板凝集反応（ＶＷＦ：ＲＣｏ）のようなＶＷＦ活性を判定するための方法等が利用可能である。
【０００５】
最新世代のＶＷＦ活性を判定するための機能アッセイ法は、ＧＰＩｂαに対するＶＷＦの結合能を判定することを伴う。
【０００６】
リストセチンの存在下で野生型ＧＰＩｂαを使用してＧＰＩｂαに対するＶＷＦの結合を判定することからなるアッセイ法が開示されている（特許文献１、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００７】
野生型ＧＰＩｂαタンパク質よりも、ＶＷＦに対する親和性が高くＶＷＦと一層強く相互作用することが知られているＧＰＩｂα「機能獲得型」変異を利用する他のアッセイ法が開示されている。これらのアッセイ法によれば、リストセチンの不存在下で、変異型ＧＰＩｂαへのＶＷＦの結合を判定することができる（特許文献２又は特許文献３）。
【０００８】
ＧＰＩｂタンパク質の欠損も、同様に、出血状態を引き起こす。ＧＰＩｂタンパク質の機能獲得型変異は、常染色体優勢遺伝性の出血状態である血小板型フォン・ヴィレブランド症候群（ＰＴ−ＶＷＤ）の原因である。ＧＰＩｂα鎖の２３９位におけるメチオニン残基のバリン残基による置換（Ｍ２３９Ｖ）が、ラッセル及びロス（非特許文献５）により述べられている。ＧＰＩｂα鎖の２３３位における突然変異も、また、ＰＴ−ＶＷＤを引き起こす場合がある（非特許文献６）。
【０００９】
患者の出血傾向が増大していると診断された場合、適切な治療を開始することができるように、障害の原因を検出する必要がある。臨床診断においては、出血傾向の増大を引き起こす可能性のある障害が多様であるため、凝固システムの或る部分の機能性を先ず調査できるようにするスクリーニングアッセイを利用可能にすることが、望まれている。こうしたスクリーニングアッセイの助けを借りて、障害のある箇所が突き止められた場合、正確な原因を特定するために具体的な個別のアッセイを実施すればよい。スクリーニングアッセイの助けを借りて或る部分に障害が見つからなかった場合は、具体的な個別のアッセイを実施する必要はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０１／０２８５３（Ａ２）号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００９／００７０５１（Ａ２）号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００９／０２６５５１（Ａｌ）号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ロペス（Lopez, J.A）ら，ヒト血小板糖タンパク質Ｉｂのα鎖のクローニング：ロイシンに富むα２糖タンパク質と相同性を有する膜透過性タンパク質(Cloning of the α chain of human platelet glycoprotein Ib: A transmembrane protein with homology to leucine-rich α2- glycoprotein)，米国科学アカデミー紀要（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），１９８７年，８４：ｐ５６１５〜５６１９
【非特許文献２】ビアー（Beer, J.H）ら、グリコカリシン：新規なアッセイ法−正常な血漿レベル及び選択された疾病におけるその有用可能性（Glycoca1icin: A New Assay - The Normal Plasma Levels And Its Potential Usefulness in Selected Diseases），ブラッド（Blood），１９９４年，８３（３），ｐ６９１〜７０２
【非特許文献３】ファンフーレルビーク（Vanhoorelbeke, K）ら、信頼性の高いフォン・ヴィレブランド因子：１型及び２型フォン・ヴィレブランド病を識別するためのリストセチン補因子酵素結合免疫吸着剤アッセイ（A reliable von Wil1ebrand factor: Ristocetin cofactor enzyme-1inked immunosorbent assay to differentiate between type 1 and type 2 von Wi1lebrand disease），セミナーズ  イン  トロンボシス  アンド  ヘモスタシス(Seminars in Thrombosis and Hemostasis)，２００２年，２８（２），ｐ１６１〜１６５
【非特許文献４】フェデリッチ（Federici, A.B）ら，低いフォン・ヴィレブランド因子レベルを有する患者の診断のための、組換え型糖タンパク質Ｉｂαを用いる鋭敏なリストセチンコファクター活性アッセイ（A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein Ibα for the diagnosis of patients with low von Willebrand factor levels），ヘマトロジカ（Haematologica），２００４年，８９（１），ｐ７７〜８５
【非特許文献５】ラッセル（Russell, S.D.）及びロス（Roth, G.J.），偽性フォン・ヴィレブランド病：高活性表面受容体と関連する血小板糖タンパク質Ｉｂα遺伝子における突然変異（Pseudo-von Willebrand Disease: A mutation in the platelet glycoprotein Ibα gene associated with a hyperactive surface receptor），ブラッド（Blood），１９９３年，８１（７），ｐ１７８７〜１７９１
【非特許文献６】マツバラ（Matsubara, Y）ら，血小板型フォン・ヴィレブランド病の日本人ファミリーにおける、血小板糖タンパク質Ｉｂαにおける２３３位残基でのＧｌｙからＳｅｒへの新規な点変異の同定（Identification of a novel point mutation in platelet glycoprotein Ibα, Gly to Ser at residue 233, in a Japanese family with platelet-type von Wi11ebrand disease），ジャーナル  オブ  トロンボシス  アンド  ヘモスタシス(Journal of Thrombosis and Hemostasis)，２００３年，１，ｐ２１９８〜２２０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、本発明が取り組む課題は、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を検出可能にするスクリーニング方法を提供することである。かかる方法は、ＶＷＦ障害及びＧＰＩｂタンパク質障害に対して等しく鋭敏でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害は、例えば、
ａ）ＶＷＦタンパク質の量的又は質的な障害：例えば、異常欠乏状態、巨大多量体の不存在、第ＶＩＩＩ因子結合能の欠如等、
ｂ）ＶＷＦ阻害物質：例えば、ＧＰＩｂへのＶＷＦの結合を阻止するＶＷＦに対する自己抗体、又はＶＷＦ結合部位を占領しこれによりＶＷＦ活性を減少させるグリコカリシンの血漿中濃度の増大、又は、例えばＶＷＦ結合アプタマーであるＡＲＣ１７７９若しくはヒト化モノクローナル抗ＶＷＦ抗体であるＡJＷ２００のような、ＶＷＦ阻害性治療薬（フィルバス（Firbas, C.）ら，フォン・ヴィレブランド因子及び血小板糖タンパク質Ｉｂ受容体の標的化（Targeting von Wi11ebrand factor and platelet glycoprotein Ib receptor），エクスパート  レヴューズ  オブ  カーディオバスキュラー  セラピー（Expert Reviews of Cardiovascular Therapy），２０１０年，８（１２），ｐ１６８９−１７０１）、又は治療薬として使用されるＧＰＩｂ断片（ヘナン（Hennan, J.K）ら、血小板ＶＷＦ−ＧＰＩｂα相互作用の薬理学的な阻害は冠動脈トロンボシスを防止する（Pharmacologic inhibition of platelet vWF-GPIbα interaction prevents coronary artery thrombosis），トロンボシス  アンド  ヘモスタシス（Thrombosis and Haemostasis），２００６年，９５，ｐ４６９〜４７５）、
ｃ）ＶＷＦ活性化剤、
ｄ）ＧＰＩｂタンパク質の質的障害：例えば、ＶＷＦに対し一層高い親和性を有し、それによりＶＷＦ分解を加速する機能獲得型変異、
ｅ）ＧＰＩｂ阻害物質：例えば、ＧＰＩｂへのＶＷＦの結合を阻害するＧＰＩｂに対する自己抗体、又は、例えばヒト化モノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体のＦａｂ断片であるＨ６Ｂ４−Ｆａｂ等の、治療薬（同様に、フィルバス（Firbas, C.）らの文献参照）、
ｆ）ＧＰＩｂ活性化剤（例えば、トロンビン）、
によって引き起こされ得る。
【００１４】
前記課題は、単離ＧＰＩｂαタンパク質、ＶＷＦタンパク質及びＧＰＩｂα特異性抗体と連結された固相を、患者からの試料と、接触させ、ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び固相間の複合体の形成を判定することにより、達成される。複合体形成が通常と比べ減少し又は増加した場合は、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害が起きている。このような試料は、次に、具体的な個別のアッセイの助けを借りて、ＶＷＦ障害及びＧＰＩｂ障害について、詳細に試験される。
【００１５】
従って、本発明は、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を有する試料を見出すための方法であって、
（ａ）試料を、ＧＰＩｂαタンパク質と、ＶＷＦタンパク質と、そして前記単離ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な抗体と連結された固相と、接触させるステップ、及び
（ｂ）ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び前記固相間の複合体の形成を判定するステップ
を含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の方法に基づくラテックス粒子凝集アッセイが種々のＶＷＦ活性に鋭敏であることを示す図である。
【図２】図２は、本発明の方法に基づくラテックス粒子凝集アッセイが種々のグリコカリシン濃度に鋭敏であることを示す図である。
【図３】図３は、アッセイ混合物に過剰のＶＷＦが添加されている場合には、本発明の方法に基づくラテックス粒子凝集アッセイが種々のＶＷＦ活性に感度を有さないことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
前記方法は、ＶＷＦ側及びＧＰＩｂ側の両方で、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を検出する。
【００１８】
用語「試料」は、血液、血漿又は血清等の生物学的流体、特にヒト及び動物からの生物学的流体、を含む。
【００１９】
本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、組換え技術により又は合成により製造されたＧＰＩｂαタンパク質であってもよい。既知の原核生物発現系又は真核生物発現系、例えば、細菌（例えば大腸菌）中、酵母（例えばサッカロマイセス  セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア  パストリス（Pichia pastoris））中、植物細胞、動物細胞若しくはヒト細胞培養物中での発現等、が、組換え型ＧＰＩｂαタンパク質を製造するのに好適である。合成ＧＰＩｂαタンパク質を作製するためには、既知のインビトロタンパク質合成技術、例えば、固相合成（例えば、メリフィールド合成（Merrifield synthesis））等、が適切である。本発明の方法で使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、好ましくは、ヒト細胞の培養物中、好ましくはヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）の培養物中、で生成された、組換え技術により製造された、ＧＰＩｂαタンパク質である。
【００２０】
アッセイ混合物中、１．４μｇ／ｍＬ未満、特に好ましくはアッセイ混合物中、０．７μｇ／ｍＬ未満、のＧＰＩｂαの最終濃度が得られるような量で、ＧＰＩｂαタンパク質をアッセイ混合物に加えることが好ましい。
【００２１】
本発明の方法で使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、Ｎ末端で、相同性ヒトＧＰＩｂαシグナル配列、ＭＰＬＬＬＬＬＬＬＬＰＳＰＬＨＰ（配列番号２、「アミノ酸残基−１６〜アミノ酸残基−１」ともいう。）、に融合されていてもよい。或いは、使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、Ｎ末端で、異種シグナル配列に、即ち、通常はヒトＧＰＩｂαポリペプチド中に存在しないが、選択された発現系において組換え発現されたＧＰＩｂαタンパク質の発現及び／又は分泌に有利な影響を与えるポリペプチドに、融合されていてもよい。適切な異種シグナル配列の例は、
ＭＰＬＱＬＬＬＬＬＩＬＬＧＰＧＮＳＬＱＬＷＤＴＷＡＤＥＡＥＫＡＬＧＰＬＬＡＲＤＲＲ（配列番号３）である。
【００２２】
本発明の方法において使用されるＧＰＩｂαタンパク質は、更に、Ｃ末端において、１つ又はそれ以上の親和性タグに融合されていてもよく、この親和性タグは、例えば組換え発現されたタンパク質が親和性担体に結合するのを可能にし、それにより、例えば、組換え発現されたＧＰＩｂαタンパク質を精製可能にする。アミノ酸長１２以下の小さい親和性タグが好ましい。Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ａｒｇタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ及びＳｔｒｅｐタグからなる群から選択される親和性タグが特に好ましい。親和性タグに対して高い親和性で結合する適切な親和性担体の例としては、特異抗体、固定化カチオン（例えば、Ｈｉｓタグに対する親和性を有するＮｉ２＋）又は他の種類の結合パートナー（例えば、Ｓｔｒｅｐタグに対する親和性を有するストレプトアビジン）がある。
【００２３】
本発明の方法の一態様では、単離ＧＰＩｂαタンパク質は、ヒト野生型ＧＰＩｂαタンパク質（配列番号１）又はその機能性断片である。ヒト野生型ＧＰＩｂαタンパク質又はその機能性断片を使用する場合、野生型ＧＰＩｂαタンパク質又はその断片への溶解されたＶＷＦの結合を、インビトロにおいて、誘発するために、リストセチン、ボトロセチン又はリストセチン等価物を、更に、アッセイ混合物に添加する。
【００２４】
別の態様では、単離GＰＩｂαタンパク質は、突然変異されており、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比較して、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、且つ２３３位、２３５位及び２３９位の内の少なくとも２か所のそれぞれにおいて少なくとも１種のＸａａ置換を含む。ＧＰＩｂα鎖の、２３３位のグリシン残基のＸａａ置換及び２３９位のメチオニン残基のＸａａ置換は、好ましくは、バリン残基（それぞれ、Ｇ２３３Ｖ及びＭ２３９Ｖ）又はセリン残基（それぞれ、Ｇ２３３Ｓ及びＭ２３９Ｓ）を含む。これら２か所において異なるＸａａ置換は、どのように組み合わされてもよい。特に好ましいのは、Ｇ２３３Ｖ／Ｍ２３９Ｖの組み合わせである。２３５位におけるアスパラギン酸残基のＸａａ置換のＸａａは、好ましくは、チロシン残基を含む（Ｄ２３５Ｙ）。前述した突然変異は、野生型ＧＰＩｂαタンパク質よりも、ＶＷＦに対して著しく高い親和性を有しＶＷＦと強く相互作用する、機能獲得型変異である。この種の変異を用いる場合には、リストセチンも、ボトロセチンもリストセチン等価物も、アッセイ混合物に添加されない。
【００２５】
本発明の方法で使用されるＶＷＦタンパク質は、単離された高分子多量体ＶＷＦであってもよい。インビボでは、初めにヒトＶＷＦモノマーが２８１３アミノ酸前駆体タンパク質によって、合成される。細胞内プロセシングによって、ＶＷＦ多量体が生成され、このものは、２０，０００ｋＤａより大きく成長し得る。これらの多量体は、直線状に配列されジスルフィド結合を介して互いに連結された、アミノ酸長２，０５０の２７５ｋＤａのＶＷＦモノマーからなる。ＶＷＦは、約５００ｋＤａ（ダイマー）から１５，０００ｋＤａ超の種々のサイズの球状多量体の形態で血漿中を循環する。本発明の方法で使用される単離ＶＷＦタンパク質は、ドナーの血漿から得られたものであっても、当業者には公知である方法を用いて組換え発現されたものであってもよい。或いは、ＶＷＦタンパク質は、また、天然形態で、例えば正常な血漿によって、アッセイ混合物に添加されてもよい。
【００２６】
ＶＷＦタンパク質は、好ましくは、アッセイ混合物中で正常ＶＷＦの最終濃度が０．１〜２０％となるような、特に好ましくは、アッセイ混合物中で正常ＶＷＦの０．５〜１０％となるような、量でアッセイ混合物に加えられる。
【００２７】
本発明の方法で使用される、単離ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な抗体は、アッセイ混合物中において使用されるＧＰＩｂαタンパク質を特異的に認識する任意の抗体でよい。原則として、適切な抗体は、ＧＰＩｂαタンパク質のエピトープに結合するＧＰＩｂα抗体である。親和性タグに融合された組換えＧＰＩｂαタンパク質を用いる場合、その親和性タグに特異的に結合する親和性タグ特異性抗体も、また、適切である。用語「抗体」には、完全な抗体と同じ抗原特異性を有する抗体断片も含まれる。
【００２８】
抗体は、固相と連結されている。用語「連結される」は、広義で用いられ、例えば、共有結合及び非共有結合、直接結合及び間接結合、表面への吸着並びに凹みへの包接を含む。共有結合においては、抗体は、化学結合を介して固相に結合される。非共有結合の例の一つは、表面吸着である。固相への直接結合の他に、抗体は、他の特異的結合パートナーとの特異的な相互作用、例えば他の抗体との特異的な相互作用、を介して、固相に間接的に結合されていてもよい。
【００２９】
用語「固相」は、本発明の目的では、多孔性及び／又は無孔性の非水溶性材料からなり非常に様々な形状を有し得る物体、例えば容器、管、マイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ビーズ、微粒子、ロッド、細片、ろ紙又はクロマトグラフ紙等、を含む。固相の表面は、通常は親水性であるが、親水性としたものであってもよい。固相は、非常に様々な材料、例えば、無機及び／又は有機材料、合成材料、天然産出材料及び／又は変性された天然産出材料から構成されていてよい。固相材料の例としては、例えば、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリレート又はナイロン等の高分子；ラテックス；セラミック；ガラス；金属、特に金、銀等の貴金属；マグネタイト；これらの混合物及び組み合わせがある。
【００３０】
固相は、例えば、固相への試料成分の非特異的な結合を抑制し若しくは防止するために、又は、例えば、粒子状固相の懸濁安定性、貯蔵安定性、設計安定性、若しくは紫外線、微生物若しくは他の破壊性薬剤に対する耐性を改善するために、１又はそれ以上の層の、例えばタンパク質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマー又はこれらの混合物の、コーティングを有していてもよい。
【００３１】
単離ＧＰＩｂαタンパク質を、ＶＷＦタンパク質と、そして前記単離ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な抗体と連結された固相と、接触させると、これら３成分から構成される複合体が形成される。正常な複合体形成と比較して改変された複合体形成は、患者の試料が、前記の複合体形成に影響を与える物質、例えば、ＧＰＩｂ阻害物質又はＶＷＦ阻害物質又は活性化物質又はグリコカリシンを含有する場合、或いは、その試料が、前記の複合体形成中に機能性の付加タンパク質と競合する機能障害ＧＰＩｂタンパク質又はＶＷＦタンパク質を含有する場合に、測定される。
【００３２】
本発明の方法の好ましい態様では、単離ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な抗体は、粒子状固相に、好ましくはラテックス粒子に、連結される。この場合、ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び固相間の複合体の形成は、前記の粒子状固相の凝集を測定することにより決定され得る。前記の複合体形成と、ひいては試料中のＧＰＩｂ活性及びＶＷＦ活性と、相関する凝集反応は、例えば、散乱光の強度を測定すること（比濁分析法）により、又は媒体の濁度を測定すること（濁度測定法）により、粒子凝集塊での光散乱を利用して、定量的に決定することができる。
【００３３】
本発明の方法の他の態様では、単離ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な抗体は、非粒子状固相、好ましくはマイクロタイタープレートの表面、と連結される。この場合、ＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び固相間の複合体形成は、複合体を介して固相に結合されたＶＷＦの量を測定することにより決定することができる。複合体を介して固相に結合されたＶＷＦの量は、例えば、直接的又は間接的に信号生成系の成分と連結され、従って、結合されたＶＷＦの量を定量可能にする、抗ＶＷＦ抗体を用いることにより決定することができる。
【００３４】
本発明は、また、本発明の方法を実施するための試験キットであって、単離ＧＰＩｂαタンパク質を含有する第１試薬、ＶＷＦタンパク質を含有する第２試薬、及び前記単離ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な抗体と連結された固相、好ましくは粒子状固相、を含有する第３試薬を、含んでなる試験キットに関する。
【００３５】
一つの態様では、第１試薬は、ヒト野生型ＧＰＩｂαタンパク質又はその機能性断片を含有する。他の態様では、第１試薬は、ヒトＧＰＩｂαタンパク質の野生型配列（配列番号１）と比較して、少なくともアミノ酸残基１〜２６８を含み、２３３、２３５及び２３９位のうちの少なくとも２か所のそれぞれにおいてＸａａ置換を有する、突然変異ＧＰＩｂαタンパク質を含有する。
【００３６】
本試験キットは、更に、リストセチン又はボトロセチンを含有する第４試薬を含んでいてもよい。
【００３７】
本試験キットは、更に、抗ＶＷＦ抗体を含有する第５試薬を含んでいてもよい。
【００３８】
試薬は、液体又は凍結乾燥形態で提供されてよい。試薬が凍結乾燥物である場合、試験キットは、更に、この凍結乾燥物を懸濁するために必要な溶媒、例えば蒸留水又は適切な緩衝液等、を含有していてもよい。
【００３９】
他の態様では、結果の標準化を改善するために正規化を行なってもよい。このためには、試料についての結果を正常血漿についての結果で割る。これにより、特に強いＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用は、１を上回る比で表され、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用の低下は、１未満の比により表される。更に、フォン・ヴィレブランド因子含有標準物質を用いた較正を行なうことも可能である。但し、試料中ではＧＰＩｂ−ＶＷＦ相互作用が検出されるため、結果は人工的な単位で表さなければならない。ＶＷＦ活性は正常なレベルに留まるけれども、ＧＰＩｂの阻害物質は、アッセイの結果を低下させる。
【００４０】
ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を有する試料が本発明の方法によって特定された場合は、その障害を一層詳しく決定するために、引き続くアッセイを実施すべきである。このアッセイには、本発明の方法の変形形態を実施することが含まれる。この変形形態は、ＧＰＩｂα及びＶＷＦのいずれか又はその両方の大過剰をアッセイ混合物に加えるステップを含む。大過剰のＧＰＩｂαが添加されると、アッセイはＶＷＦ活性障害のみに応答することになる。大過剰のＶＷＦが添加されると、アッセイは相互作用のＧＰＩｂ側における障害のみに応答することになる。ＧＰＩｂα及びＶＷＦの両方が大過剰に添加された場合、例えば、ＧＢＩｂαの結合を防止する、固相に結合された、捕捉抗体に対する自己抗体を検出することが可能である。
【００４１】
ＧＰＩｂ側において有り得る障害は、試料中におけるグリコカリシン濃度の増加又は減少である。大過剰のＶＷＦの存在下で、他の障害が排除できる場合、試料中のグリコカリシン含有量を決定するための方法（図２）を用いてもよいが、この方法はグリコカリシン標準物質を用いる較正を必要とする。大過剰のＶＷＦは、例えば、アッセイ混合物に対して１，０００又は２，０００％ＶＷＦ活性を有する試薬を２０μＬ添加して、正常の９９％又は１９７％のＶＷＦ活性を有するようにして、達成することができる。大過剰のＧＰＩｂαは、例えば、３５μｇ／ｍＬのＧＰＩｂαタンパク質を含有する試薬１３μＬを添加して、アッセイ混合物が２．２μｇ／ｍＬのＧＰＩｂαタンパク質を含有するようにして、達成することができる。
【００４２】
本発明は、従って、更に、試料中のグリコカリシンの濃度を決定するための方法であって、単離ＧＰＩｂαタンパク質と、ＶＷＦタンパク質と、そして前記単離ＧＰＩｂαタンパク質に特異的な抗体と連結された固相と、試料とを接触させるステップ並びにＶＷＦタンパク質、ＧＰＩｂαタンパク質及び固相間の複合体の形成を決定するステップを含んでなる方法にも関する。グリコカリシン濃度の決定には、正常の少なくとも５０％の、好ましくは１００％を超える、ＶＷＦ活性がアッセイ混合物中で得られるような量で、ＶＷＦタンパク質をアッセイ混合物に添加することが必要である。種々のグリコカリシン濃度を含有する標準物質を用いた較正を実施することが好ましい。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）
〔ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害を有する試料を見出すための本発明のスクリーニング方法〕
試料として、６人の異なるドナーからのヒトクエン酸血漿を使用した。試料６０μＬを、ＶＷＦ含有血漿（正常ＶＷＦの９１％、コントロール血漿Ｎ、シーメンス  ヘルスケア  ダイアグノスティクス  プロダクツ社（Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH）、ドイツ、マールブルク（Marburg）））２０μＬ、組換え機能獲得型ＧＰＩｂαタンパク質断片（アミノ酸置換Ｇ２３３Ｖ及びＭ２３９Ｖを有するアミノ酸残基１〜２８５、８．４μｇ／ｍＬ）を含有する溶液１３μＬ、及びＮａＣｌ緩衝液７０μＬと混合し、２分間インキュベートした。続いて、抗ＧＰＩｂα抗体で被覆したラテックス粒子を含有するラテックス粒子試薬４０μＬを、アッセイ混合物に加えた。
【００４４】
反応混合物の５７０ｎｍにおける吸光度を濁度測定法により測定した。ＧＰＩｂαへのＶＷＦの結合及びラテックス粒子へのＧＰＩｂαタンパク質の結合の結果、粒子凝集が起こる。この凝集は、吸光度の増大をもたらすので、この吸光度増大の最大速度を求める（ｍＵ／分）。
【００４５】
図１が示すように、本方法は種々のＶＷＦ活性に鋭敏である。血漿試料中のＶＷＦ活性が増大するほど、凝集速度は増大する。
【００４６】
別の実験では、試料として、ドナー血漿に代えてグリコカリシン溶液の種々の希釈液を使用した（０、１．２、２．５、及び５μｇ／ｍＬグリコカリシン）。グリコカリシン溶液は洗浄血小板をプラスミンで処理することによって調製した。
【００４７】
図２が示すように、本方法は種々のグリコカリシン濃度に鋭敏である。試料中のグリコカリシン濃度が減少するほど凝集速度は増大する。
【００４８】
別の実験においては、ドナー血漿に代えて、正常血漿プール(コントロール血漿Ｎ)を使用した。このプールは、種々の量の、ＶＷＦへのＧＰＩｂαの結合を阻害する抗ＧＰＩｂ抗体（抗体ＡＫ２；ハヤタ（Hayata, K）ら，固相ビオチニル化血小板を用いたフォン・ヴィレブランド因子及び糖タンパク質Ｉｂの新規な結合アッセイ（A new binding assay of von Wi1lebrand factor and glycoprotein Ib using solid-phase biotinylated platelets），ジャーナル  オブ  ファーマコロジカル  サイエンス（Journal of Pharmaco1ogical Science），２００８年，１０８，ｐ２１７〜２２１参照）で強化されている。更に、ＶＷＦ活性が僅かに減少したドナーからのクエン酸血漿を測定した。その結果を表１にまとめた。従って、本方法は、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ結合を阻害する因子に対して鋭敏である。試料中の阻害物質の量が増大するほど、凝集速度は減少する。
【００４９】
［表１］
試料                                              凝集速度（ｍＵ／分）
正常血漿プール                                    ６３３
正常血漿プール＋１０μｇ／ｍＬのＡＫ２抗体        ２６６
正常血漿プール＋２０μｇ／ｍＬのＡＫ２抗体        １３３
ＶＷＦ活性がやや減少した（６３．１％）血漿        ３４８
【００５０】
（実施例２）
〔後続のアッセイとして適切な、本発明のスクリーニング方法の変更形態〕
実施例１と同様に、５人の異なるドナーからのヒトクエン酸血漿を試料として使用した。但し、ＶＷＦ含有正常血漿（正常ＶＷＦの９１％）の代わりに、ＶＷＦ濃縮物の追加により正常の２，０００％のＶＷＦ活性を有する血漿（Ｈａｍａｔｅ，ＣＳＬベーリング（CSL Behring GmbH），ドイツ，マールブルグ（Marburg））２０μＬをアッセイ混合物に加えた。
【００５１】
図３が示すように、本方法は、大過剰のＶＷＦの存在に因って、もはやドナー試料における種々のＶＷＦ活性には感度を有さない。この種の方法は、ＧＰＩｂ側における、ＶＷＦ−ＧＰＩｂ相互作用障害のみに鋭敏である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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