(57)【要約】【課題】発毛・育毛を促進し、種々の脱毛症に有効な育毛剤の提供。【解決手段】シャク及びタイワンハマオモトから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする育毛剤、ＤＡＣＨ１の発現又は機能抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャク及びタイワンハマオモトから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする育毛剤。
【請求項２】
シャク及びタイワンハマオモトから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＤＡＣＨ１の発現又は機能抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養毛・育毛効果を発揮する育毛剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
男性型脱毛症、円形脱毛症などの脱毛症の多くは、未だその発症機序の詳細が不明である。従来これらの脱毛症の治療には、経験的に、血行促進剤、免疫抑制剤、代謝促進剤、ビタミン剤、抗男性ホルモン剤等の薬剤が用いられている。
【０００３】
しかしながら、これらの薬剤は、症状や体質によっては効果が異なる場合が多く、その効果も未だ満足できるものではない。また、多量に使用すると適応部位に不快な刺激感を与えたり、継続使用により皮膚炎が発生するといった場合もある。
【０００４】
一方、セリ科シャク属の植物であるシャクは、その茎葉が食用にされ、また消化不良、滋養強壮、頻尿に対して民間薬として使用され、更に過剰栄養吸収抑制剤として使用できることが報告されている（特許文献１）。また、ヒガンバナ科ハマオモト属の植物であるタイワンハマオモトは、古くから民間薬として使用され、また、保湿効果、美白効果、中性脂肪蓄積抑制効果があることが報告されている（特許文献２）。
【０００５】
しかしながら、シャクやタイワンハマオモトに育毛作用があることはこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−２１７６８９号公報
【特許文献２】特開２０００−２１５５６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、発毛・育毛を促進し、種々の脱毛症に有効な育毛剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、毛髪組織における毛球部上部でＤＡＣＨ１（ＤＡＣＨＳＨＵＮＤ， ＤＲＯＳＯＰＨＩＬＡ，  ＨＯＭＯＬＯＧ  ＯＦ， １）のタンパク質発現が認められ、且つＤＡＣＨ１発現部位では毛母細胞の増殖が抑制されていることを見出した。すなわち、ＤＡＣＨ１は毛髪組織において毛母細胞の増殖を負に制御しており、ＤＡＣＨ１の発現や機能を抑制する物質が、毛成長促進作用を有することを見出した。そして更に検討し、シャク及びタイワンハマオモトにＤＡＣＨ１の機能を低下させる作用があり、これらが育毛剤となり得ることを見出すに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の１）〜２）に係るものである。
１）シャク及びタイワンハマオモトから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とする育毛剤。
２）シャク及びタイワンハマオモトから選ばれる植物又はその抽出物を有効成分とするＤＡＣＨ１の発現又は機能抑制剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の育毛剤を頭皮等に適用することにより、適用部位において、優れた発毛・養毛・育毛作用が発揮される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＤＡＣＨ１の毛髪組織での発現部位を示す免疫組織染色所見。
【図２】ＤＡＣＨ１過剰発現による培養細胞の増殖抑制作用を示すグラフ。ＤＡＣＨ１（−）：ＤＡＣＨ１過剰発現しない場合。ＤＡＣＨ１（＋）：ＤＡＣＨ１過剰発現する場合。
【図３】ＤＡＣＨ１過剰発現によるＡＰ−１転写活性抑制作用を示すグラフ。
【図４】シャク及びタイワンハマオモト抽出物のＤＡＣＨ１機能阻害作用を示すグラフ。ＤＡＣＨ１（−）：ＤＡＣＨ１過剰発現しない場合。ＤＡＣＨ１（＋）：ＤＡＣＨ１過剰発現する場合。
【図５】シャク抽出物のヒト毛伸長促進効果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、「シャク」は、セリ科シャク属のＡｎｔｈｒｉｓｃｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ（Ｌ．）Ｈｏｆｆｍ．を意味し、「タイワンハマオモト」は、ヒガンバナ科ハマオモト属のＣｒｉｎｕｍ  ａｓｉａｔｉｃｕｍ  Ｌ．ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍ  Ｂａｋ．を意味する。
【００１３】
本発明の植物は、全草、葉、茎、芽、花、蕾、根、根茎、種子、若しくは果実等、又はこれらを組み合わせて使用することが可能であるが、シャクについては根を、タイワンハマオモトについては葉をそのまま又は粉砕して用いるのが好ましい。斯かる植物は、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
【００１４】
抽出物としては、植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等公知の抽出方法により得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられる。
公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。
【００１５】
当該抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、これらは単独又は混合物として用いることができる。このうち、特に水、アルコール系（アルコール類及び／又は多価アルコール類）溶剤、及び水−アルコール系混合溶剤を用いるのが好ましく、水−アルコール系混合溶剤が好ましい。さらに、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール（好ましくはイソプロパノール）、ブタノール（好ましくは１−ブタノール）がより好ましく、エタノールがさらに好ましい。また、多価アルコール類としてはブチレングリコール（好ましくは１，３−ブチレングリコール）がより好ましい。
【００１６】
本発明の植物抽出物は、例えば、植物体１質量部に対して１〜５０質量部の抽出溶剤を用い、４〜１００℃にて０．５時間〜３０日間抽出することにより行うことができる。より具体的には、抽出溶剤として水を用いる場合には、植物体１質量部に対して５〜３０質量部、４０〜１００℃にて１時間〜１日間が好ましい。また、抽出溶剤として水−エタノール混合溶剤を用いる場合には、植物体１質量部に対して５〜３０質量部、室温〜還流下で１時間〜２０日間が好ましい。また、これらの作業を繰り返し行っても良い。
【００１７】
上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。
【００１８】
また、本発明の植物又はその抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。また、抽出物は、前記抽出処理物の他、市販品を用いても良い。
【００１９】
また、上記抽出物は、さらに液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の公知の技術によって不活性な夾雑物を除去して用いることが好ましい。このとき用いる溶剤は、上記の抽出溶剤の例示のものを用いてもよい。また、これらは、必要により公知の方法により脱臭、脱色等の処理を施してから用いてもよい。また、抽出物をさらに精製する際には、当該公知の技術及び方法を用いてもよい。
【００２０】
後記実施例で示すとおり、本発明の植物抽出物は、ＤＡＣＨ１の機能を低下させる作用があり、ヒト毛包器官培養系において毛伸長促進効果を有する。後述の参考例に示すように、ＤＡＣＨ１は、毛髪組織の毛球部上部で発現が認められ、細胞増殖マーカーであるＫｉ６７の陽性部位ではＤＡＣＨ１陰性である（図１）。また、ＤＡＣＨ１を過剰発現させた場合、ヒト培養細胞（２９３Ａ（ヒト腎）細胞）の増殖が抑制される（図２）。したがって、ＤＡＣＨ１はその発現が豊富な毛髪組織において、毛母細胞の増殖を負に制御していると考えられる。
故に、ＤＡＣＨ１遺伝子の発現やＤＡＣＨ１の発現又は機能を抑制（阻害を含む）することによって、毛成長を促進することができる（実施例１及び２）
よって、本発明の植物又はその抽出物は、育毛剤、或いはＤＡＣＨ１の発現又は機能抑制剤（「育毛剤等」と称する）となり得、また、育毛剤等を製造するために使用することができる。すなわち、ヒトに適用して、育毛、或いはＤＡＣＨ１の発現又は機能抑制のために使用することができる。
【００２１】
当該育毛剤等は、それ自体、育毛、或いはＤＡＣＨ１の発現又は機能抑制のための、化粧品、医薬品部外品、医薬品であってもよく、又は当該化粧品、医薬部外品、医薬品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
【００２２】
尚、ここで、「育毛」とは、例えば、育毛、発毛の促進および脱毛の予防の少なくとも一つを意味し、発毛、毛成長（伸長）促進、或いは養毛を含む概念である。
また、ＤＡＣＨ１の発現抑制とは、ＤＡＣＨ１遺伝子又はＤＡＣＨ１の発現レベルを抑制することが挙げられ、ＤＡＣＨ１の機能抑制とは、例えば、ｃ−Ｊｕｎ（ＡＰ−１複合体の構成要素の一つ）に結合してＡＰ−１の転写活性を阻害し、下流の遺伝子発現を抑制するという機能（Wu K, et al. Mol Cell Biol. 26:7116-7129.（2006）.、Wu K, et al. Mol Biol Cell. 18:755-767.（2007）.、Nan F, et al. Cancer Biol Ther. 8:1534-1539.（2009）.）を抑制することが挙げられる。
【００２３】
本発明の育毛剤等を化粧品、医薬部外品又は医薬品等として使用する場合は、皮膚外用剤の形態で、具体的には、軟膏、乳化化粧料、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール等の種々の形態で用いることができるが、とりわけヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアトリートメント、ヘアローション、ヘアパック、ヘアクリーム、コンディショニングムース、ヘアムース、ヘアスプレー、シャンプー、リーブオントリートメント等の形態とすることが好ましい。
斯かる上記製剤は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの化粧品、医薬部外品又は医薬品等には、それぞれの製剤に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００２４】
当該化粧品、医薬部外品又は医薬品等中の本発明の植物又はその抽出物の含有量は、一般的に固形分濃度として０．０００５〜５０ｗｔ％とするのが好ましく、０．００１〜２０ｗｔ％とするのがより好ましい。
【００２５】
上記化粧品、医薬部外品又は医薬品の投与量は、効果が得られる量であれば特に限定されず、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、本発明の植物又はその抽出物（乾燥物換算）として、例えば０．０１〜１５００ｍｇとするのが好ましく、更に０．０３〜６００ｍｇとするのが好ましい。また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
また、上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用対象者としては、それを必要としていれば特に限定されないが、育毛を目的とするヒトが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００２７】
参考例１  ＤＡＣＨ１の毛髪組織での発現部位及び細胞増殖抑制作用
（１）ＤＡＣＨ１の毛髪組織での発現部位の特定
包埋剤を用いて包埋し凍結させたヒト頭皮組織を、ミクロトームで７μｍの厚さに薄切りし、ＭＡＳコートのスライドグラス上に並べた。その後、アセトンで固定し、下記抗体を用いて免疫組織染色を行った。
・一次抗体：
DACH1 ：Anti-DACH1 antibody produced in rabbit＜SIGMA-ALDRICH, HPA012672＞ 1/200
Ki-67 ：Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen （Clone : MIB-1）＜DAKO, IS626＞ 原液
・二次抗体
rabbit ：Alexa Fluor 488 Goat Anti-rabbit IgG（highly cross-adsorbed）＜Invitrogen, A-11034＞ 1/200
mouse ：Alexa Fluor 546 Goat Anti-mouse IgG（highly cross-adsorbed）＜Invitrogen, A-11030＞ 1/200
結果を図１に示す。
毛球部上部で陽性像が観察された（図１）。尚、ＤＡＣＨ１発現部位ではＫｉ６７（増殖マーカー）陰性、Ｋｉ６７陽性部位ではＤＡＣＨ１陰性であった。
【００２８】
（２）ＤＡＣＨ１の過剰発現と細胞増殖との関係
２９３Ａ細胞を１×１０4／ｗｅｌｌとなるようにＤＭＥＭ培地で希釈し、９６ｗｅｌｌ プレートに１００μｌずつまいた。一晩インキュベートした後、ヒトＤＡＣＨ１発現ベクターのトランスフェクションを行い、その６時間後に培地交換を行った。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、取扱説明書に従った。
尚、２９３Ａ（ヒト腎）細胞は、１０ｖｏｌ％非動化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｖｏｌ％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）含有のＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。
また、ヒトＤＡＣＨ１発現ベクターは、ヒト毛髪毛根部ｃＤＮＡをテンプレートにして増幅させたＤＡＣＨ１  ＰＣＲ産物（２１２１ｂｐ：配列番号１）をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入して作製した。ここで、ヒト毛髪毛根部ｃＤＮＡは、ヒト頭髪抜去毛毛根部からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写反応を行って合成した。作製したヒトＤＡＣＨ１発現ベクターは配列解析を行った後、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製し、実験に用いた。
【００２９】
トランスフェクション後、２４、４８、７２時間後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ） １０μｌを各ｗｅｌｌに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。その後に、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を測定し、生細胞数を計測した。測定時間は各ｗｅｌｌあたり０．５秒とした。
得られた数値は平均値±標準偏差で示し、各時間におけるＤＡＣＨ１（−）とＤＡＣＨ１（＋）の数値データに関して、ｎｏｎ−ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ法で有意差検定を行った。
尚、ＤＡＣＨ１（−）：ＤＡＣＨ１過剰発現しない場合、ＤＡＣＨ１（＋）：ＤＡＣＨ１過剰発現する場合を示す。
結果を図２に示す。ＤＡＣＨ１過剰発現によりヒト培養細胞（２９３Ａ（ヒト腎）細胞）の増殖が抑制されることが確認された（図２）。
【００３０】
参考例２  ＡＰ−１転写活性を指標としたＤＡＣＨ１機能の測定
ＤＡＣＨ１はｃ−Ｊｕｎ（ＡＰ−１複合体の構成要素の一つ）に結合してＡＰ−１の転写活性を阻害し、下流の遺伝子発現を抑制するという公知情報(前記非特許文献４，５，６)を利用し、ＤＡＣＨ１制御剤探索系を構築した。
実際に、ＤＡＣＨ１過剰発現がＡＰ−１転写活性を阻害するかを確認するために、２９３Ａ（ヒト腎）細胞に、ヒトＤＡＣＨ１過剰発現ベクターとＡＰ−１結合部位が挿入されたルシフェラーゼベクターを同時にトランスフェクションし、ＤＡＣＨ１過剰発現がＡＰ−１転写活性に与える影響をルシフェラーゼアッセイにより解析した。
その結果、ＤＡＣＨ１濃度依存的なＡＰ−１転写活性抑制作用を確認することができた（図３）。
【００３１】
製造例１  植物抽出物の製造
（１）シャク抽出物の製造
シャク（Ａｎｔｈｒｉｓｃｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ  （Ｌ．）  Ｈｏｆｆｍ．）の乾燥根２００ｇに５０％エタノール水溶液１．５Ｌを加え８５℃で２時間浸漬した。これをろ過し、再度、ろ物を５０％エタノール水溶液１．５Ｌに８５℃で１時間浸漬した。これらのろ液を合わせて、シャク抽出液を得た。このシャク抽出液を濃縮したところ、その固形分は３９ｇであった。この固形物を５０％エタノールにて希釈し、１ｗｔ％の溶液とした。
（２）タイワンハマオモト抽出物の製造
タイワンハマオモト（Ｃｒｉｎｕｍ ａｓｉａｔｉｃｕｍ  Ｌ．  ｖａｒ．ｓｉｎｉｃｕｍ  Ｂａｋ．）の葉２００ｇに５０％エタノール水溶液１．５Ｌを加え８５℃で２時間浸漬した。これをろ過し、再度、ろ物を５０％エタノール水溶液１．５Ｌに８５℃で１時間浸漬した。これらのろ液を合わせて、タイワンハマオモト抽出液を得た。このタイワンハマオモト抽出液を濃縮したところ、その固形分は２８ｇであった。この固形物を５０％エタノールにて希釈し、１ｗｔ％の溶液とした。
【００３２】
実施例１  ＤＡＣＨ１機能抑制の評価
製造例１で調製したシャク抽出物及びタイワンハマオモト抽出物について、ＤＡＣＨ１によるＡＰ−１転写活性抑制作用を指標としてＤＡＣＨ１機能阻害作用を評価した。
２９３Ａ細胞を１．６×１０4／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ プレートにまき（１００μｌ／ｗｅｌｌ）、翌日にヒトＤＡＣＨ１発現ベクター、ＡＰ−１転写活性測定用のｐＡＰ１−Ｌｕｃベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、内部標準用のｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／Ｔｋ］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のトランスフェクションを行った。
トランスフェクションの２４時間後に、試験物質（製造例１で調製したシャク抽出物（０．０１ｖｏｌ％）、タイワンハマオモト抽出物（０．０５ｖｏｌ％））を添加し、さらにその２４時間後にＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてデュアルルシフェラーゼアッセイを行った。
デュアルルシフェラーゼアッセイは、培地を除去した後、ＰＢＳで２倍希釈したＤｕａｌ−Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅａｇｅｎｔを加えて攪拌し、２０分後にホタルルシフェラーゼ活性をマイクロプレートリーダーにより測定した。その後、等量のＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ  ｒｅａｇｅｎｔを加えて攪拌した後に、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。尚、双方のルシフェラーゼ活性測定時間は１秒とした。結果を図４に示す。
その結果、シャク抽出物及びタイワンハマオモト抽出物には、ＤＡＣＨ１機能阻害作用が認められた（図４）。
【００３３】
実施例２  毛伸長促進効果の評価
製造例１で調製したシャク抽出物について、ヒト毛包器官培養系での評価を行った。
ヒト毛包は実体顕微鏡下でメス及びピンセットを用いて単離し、Ｗｉｌｌｉａｍ' ｓ  Ｅ培地（１ｖｏｌ％ ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｎg／ｍＬ ヒドロコーチゾン（ＳＩＧＭＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍＬ  インスリン含有）中で３７℃、５％ＣＯ2下で浮遊培養（２４ｗｅｌｌプレート）を行った。試験物質（シャク抽出物（０．００１ｖｏｌ％））の添加は毛包単離当日（Ｄａｙ０）に行い、培地交換は１〜２日おきに行った。
毛包の伸長量測定は、実体顕微鏡下でＣＣＤカメラを用いて撮影した写真（１〜２日おき）を用い、写真から毛の長さを画像解析ソフトウェアにより測定し、Ｄａｙ０から差し引きして算出した。結果を図５に示す。
その結果、シャク抽出物には、毛伸長促進効果があることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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