(57)【要約】【課題】培養動物細胞に対して増殖促進効果を有する植物由来成分を見出し、当該成分を含有する細胞増殖促進剤、培地添加剤および細胞培養用培地を提供すること。【解決手段】植物由来の米糠抽出物は、優れた細胞増殖促進作用を有し、人体への安全性が高いので、細胞増殖促進剤や培地添加剤の有効成分として有用である。米糠抽出物を含有する培地で培養した細胞は、タンパク質医薬生産、再生医療、細胞治療への応用が可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
米糠抽出物を有効成分として含有することを特徴とする細胞増殖促進剤。
【請求項２】
米糠抽出物がタンパク質を５０質量％以上含有することを特徴とする請求項１に記載の細胞増殖促進剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の細胞増殖促進剤を含むことを特徴とする培地添加剤。
【請求項４】
請求項１または２に記載の細胞増殖促進剤を含むことを特徴とする細胞培養用培地。
【請求項５】
細胞が動物細胞である請求項４に記載の培地。
【請求項６】
動物細胞が哺乳動物細胞である請求項５に記載の培地。
【請求項７】
哺乳動物細胞が、ハイブリドーマ、組み換えタンパク質産生細胞または幹細胞である請求項６に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米糠由来の細胞増殖促進剤、当該細胞増殖促進剤を含む培地添加剤および細胞培養用培地に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命科学の分野では、細胞培養技術を用いて目的物質を産生する細胞を大量培養し、有用物質を工業的規模で生産することが重要になっている。例えば、抗体医薬やタンパク質性のバイオ医薬品は、いわゆる翻訳後修飾の理由で哺乳類細胞培養によって生産されている。また、培養皮膚などの再生医療や、ガンに対する養子免疫療法といった細胞治療の分野では、細胞そのものが生産物ないし生産物の一部として利用される。とくに幹細胞技術では、ある幹細胞から分化誘導された細胞や組織が利用されることとなる。これらの分野では、単離された有用細胞を体外で増幅・分化誘導・活性化し、さらにプロセッシングを経て製品化する。このような目的で実施される細胞培養では、培養効率が高いことは当然のこととして、感染の懸念のない安全性が何より重視される。
【０００３】
一般に動物細胞を培養する場合、アミノ酸、ビタミン、無機塩および糖類等からなる基礎培地に、細胞増殖因子を添加した培養培地を使用する。細胞増殖因子としては、通常、ウシ胎児血清、子ウシ血清、ウシ血清アルブミン、トランスフェリンなどの動物由来因子が利用されている。しかしながら動物由来因子の利用は、ＢＳＥなど人畜共通感染症が懸念されるため、忌避されるべきであるとされている。一方、安全性の高い無血清培地や無タンパク質培地では細胞の増殖能が劣ること、さまざまなストレスが誘因となって細胞死滅が生じやすいことなど解決すべき課題が残っている。
【０００４】
哺乳動物由来でない動物細胞増殖因子としてセリシンが知られている（例えば特許文献１、２参照）。セリシンは、昆虫カイコの繭（絹）由来であり、絹糸は手術糸として永年
の利用実績があることから、人体に対して安全性が高いと考えられている。また、特許文献３には、植物由来の動物細胞増殖因子としてフルクタンが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０２／８６１３３号
【特許文献２】特開２０１１−１３６９５２号公報
【特許文献３】特開２００８−２２８５８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、培養動物細胞に対して増殖促進作用を有する植物由来成分を見出し、当該成分を含有する細胞増殖促進剤、培地添加剤および細胞培養用培地を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］米糠抽出物を有効成分として含有することを特徴とする細胞増殖促進剤。
［２］米糠抽出物がタンパク質を５０質量％以上含有することを特徴とする前記［１］に記載の細胞増殖促進剤。
［３］前記［１］または［２］に記載の細胞増殖促進剤を含むことを特徴とする培地添加剤。
［４］前記［１］または［２］に記載の細胞増殖促進剤を含むことを特徴とする細胞培養用培地。
［５］細胞が動物細胞である前記［４］に記載の培地。
［６］動物細胞が哺乳動物細胞である前記［５］に記載の培地。
［７］哺乳動物細胞が、ハイブリドーマ、組み換えタンパク質産生細胞または幹細胞である前記［６］に記載の培地。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、米糠抽出物を有効成分とする細胞増殖促進剤を提供することができる。米糠抽出物は植物由来であり人体への安全性が高いので、当該細胞増殖促進剤を添加した培地で培養した細胞は、タンパク質医薬生産、再生医療、細胞治療への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）について、マウスハイブリドーマの細胞増殖に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図２】マウスハイブリドーマに対する細胞増殖促進効果に関し、タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）の最適濃度を検討した結果を示す図である。
【図３】タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）のマウスハイブリドーマに対する細胞増殖促進効果を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の細胞増殖促進効果と比較した結果を示す図である。
【図４】マウスハイブリドーマに対する細胞増殖促進効果に関し、タンパク質含量７４％の米糠抽出物（ＲＢＰ７４）の最適濃度を検討した結果を示す図である。
【図５】タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）のマウスハイブリドーマに対するモノクローナル抗体生産に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図６】分子量分画したタンパク質含量７４％の米糠抽出物（ＲＢＰ７４）について、マウスハイブリドーマの細胞増殖に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図７】分子量分画したタンパク質含量７４％の米糠抽出物（ＲＢＰ７４）をさらに高圧蒸気滅菌処理したものについて、マウスハイブリドーマの細胞増殖に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図８】タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）について、ＣＨＯ細胞の細胞増殖に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図９】タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）のＣＨＯ細胞に対する組み換えタンパク質生産に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図１０】タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）について、ＨｅｐＧ２細胞の細胞増殖に対する効果を検討した結果を示す図である。
【図１１】タンパク質含量５５％の米糠抽出物（ＲＢＰ５５）について、間葉系幹細胞の分化能力に対する効果を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の細胞増殖促進剤は、米糠抽出物を有効成分として含有するものであればよい。米糠抽出物を得るための原料となる米糠は、玄米を精米することにより得ることができる。米糠は、白米部分の含量が少ないことが好ましい。好ましくは精米歩合が８５％以上の精米により得られる米糠であり、より好ましくは精米歩合が９０％以上の精米により得られる米糠であり、さらに好ましくは精米歩合が９５％以上の精米により得られる米糠である。また、米糠には脱脂米糠が含まれ、米糠から米油を抽出した残渣である脱脂米糠は、本発明において米糠抽出物の原料として好適に用いることができる。
【００１１】
米糠抽出物は米糠由来のタンパク質（以下「米糠タンパク質」という。）を含有することが好ましい。このような米糠抽出物は、米糠を原料として水または有機溶剤で抽出することにより取得することができる。抽出に用いる溶媒としては、例えば、水（例えば、精製水、蒸留水、水道水等）、塩類（例えば、塩化ナトリウム等）溶液、食品素材調製用に使用可能な中性乃至弱アルカリ性溶液、食品素材調製用に使用可能な有機溶剤（例えば、エタノール等）、これらを適宜組み合わせた溶媒などが挙げられる。好ましくは希塩類溶液、中性乃至弱アルカリ性溶液、または約５〜９０容量％のエタノール含有中性乃至弱アルカリ性溶液であり、より好ましくは中性乃至弱アルカリ性溶液である。中性乃至弱アルカリ性溶液のｐＨは約６．５〜１２が好ましく、約６．５〜１１がより好ましく、約７．０〜１１がさらに好ましく、約７．５〜１０がさらに好ましく、約７．５〜９が特に好ましい。アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。中性乃至弱アルカリ性溶液は水溶液が好ましい。
【００１２】
抽出方法は特に限定されず、公知の抽出方法から適宜選択して使用することができる。例えば、米糠と溶媒を混合し混合液を得、一定時間後に米糠と抽出液を分離する。得られた抽出液は、そのまま米糠抽出物として使用してもよいし、公知の方法で抽出物を濃縮してから使用してもよい。
【００１３】
米糠と溶媒との配合割合は特に限定されないが、通常米糠１質量部に対して溶媒約５〜５０質量部であり、好ましくは米糠１質量部に対して溶媒約５〜２０質量部、さらに好ましくは米糠１質量部に対して溶媒約８〜１５質量部程度である。米糠タンパク質を例えば中性乃至弱アルカリ性水溶液で抽出する場合、米糠と上記ｐＨに調整した中性乃至弱アルカリ性水溶液とを前記配合割合で混合してもよく、米糠と水とを前記配合割合で混合した後に、約１０〜３０質量％程度の濃度の水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液等を添加して上記ｐＨに調整してもよい。米糠と溶媒との混合は、米糠を均一に混合するため攪拌、振とう等を行なうことが好ましい。
【００１４】
米糠と溶媒との混合液から米糠と米糠抽出液を分離する方法は特に限定されず、例えば遠心分離法、ろ過法、減圧膜ろ過法、加圧膜ろ過法、静置デカント法などが挙げられる。好ましくは、遠心分離法である。得られた米糠抽出液には米糠タンパク質、食物繊維、糖質などが含まれる。米糠抽出液はそのままでも本発明の細胞増殖促進剤の有効成分として利用可能であるが、所望により、例えば酸沈殿、アルコール沈殿、塩析、膜分離、クロマ
ト分離等の各手法を用いてタンパク質濃度を高めることが好ましい。
【００１５】
酸沈殿としては、米糠抽出液に、例えば塩酸、硫酸等の無機酸；またはトリクロロ酢酸、スルホサリチル酸等の有機酸を添加して抽出液のｐＨを弱酸性に調整し、米糠タンパク質を沈殿させて、沈殿を分離し取得する方法等が挙げられる。酸添加によるｐＨは約２．５〜５．５とするのが好ましい。アルコール沈殿としては、米糠抽出液に、例えばエタノールを約５０〜７０容量％となるように添加して米糠タンパク質を沈殿させて、沈殿を分離し取得する方法等が挙げられる。また、アルコール沈殿と同様に、例えばアルコールに変えてアセトン等の有機溶媒を加えて米糠タンパク質を沈殿させてもよい。また、塩析としては、例えば硫酸アンモニウム等を、米糠抽出液に添加することよって米糠タンパク質を沈殿させる方法等が挙げられる。好ましくは酸沈殿法である。
【００１６】
得られた沈殿は、米糠タンパク質含量が高い米糠抽出物であり、そのまま本発明の細胞増殖促進剤の有効成分として使用することができる。さらに得られた沈殿をアルコール、酸性溶液、各種塩類を含む水溶液等で洗浄することにより、糖質やフィチンが除去でき、より高濃度の米糠タンパク質を含有する米糠抽出物を得ることができる。さらに、これを凍結保存し使用に際して解凍して米糠抽出物として使用することができる。また、得られた沈殿を公知の乾燥方法によって粉末化し、保存性を高めることができる。
【００１７】
沈殿を分離する方法としては、例えば、遠心分離法、膜ろ過法、ろ過助剤を用いるろ過法等が挙げられる。工業的にはスクリューデカンタ、バスケット型遠心分離機、シャープレス型遠心分離機、ディスク型遠心分離機などを用いてバッチ式あるいは連続式に遠心分離処理を行うことにより沈殿分別を行うのが好ましい。膜ろ過法により沈殿を分離する場合は、セルロース膜や限外ろ過膜等を用いて、圧力差によりろ別することができる。またセライト等のろ過助剤を用いてろ別することもできる。乾燥方法としては、自然乾燥、加熱乾燥、減圧常温乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、スプレードライ等が挙げられる。好ましくは、凍結乾燥またはスプレードライである。
【００１８】
膜分離法としては、例えば限外ろ過膜等によって米糠抽出液に含まれる米糠タンパク質を濃縮する方法が挙げられる。クロマト分離法としては、例えば分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。
【００１９】
本発明の細胞増殖促進剤の有効成分である米糠抽出物は、分子量分画したものであってもよい。分子量分画の方法は特に限定されず、公知の方法を用いて行うことができる。例えば市販の限外ろ過膜、ゲルろ過クロマトグラフィー等を好適に用いることができる。分子量分画後の米糠抽出物を細胞増殖促進剤の有効成分として用いる場合、約３ｋＤａ以下の画分または約１０ｋＤａ以上の画分を用いることが好ましい。
【００２０】
本発明の細胞増殖促進剤の有効成分である米糠抽出物におけるタンパク質の含有量は特に限定されないが、米糠抽出物（乾燥質量）に対するケルダール法によるタンパク質量は、約５０質量％以上が好ましく、約６０質量％以上がより好ましく、約７０質量％以上がさらに好ましい。
本発明の細胞増殖促進剤の有効成分である米糠抽出物は、加熱処理することも可能である。加熱処理には、オートクレーブ滅菌条件も含まれる。
【００２１】
本発明の細胞増殖促進剤は、米糠抽出物のみから構成されていてもよく、米糠抽出物以外の成分を含んでいてもよい。米糠抽出物以外の成分は、細胞増殖に悪影響を及ぼさない限り特に限定されない。例えば、タンパク質、糖類、核酸、脂質、無機塩類等が挙げられる。
【００２２】
本発明の細胞増殖促進剤は、細胞増殖促進作用を有しているので、細胞培養用の培地に添加するための培地添加剤として好適に用いることができる。本発明の培地添加剤は、培地に添加し、溶解して使用できるものであればどのような形態であってもよい。例えば、液体状、粉末状、顆粒状、錠剤状などの形態で実施することができる。本発明の培地添加剤を添加して使用する培地は、細胞培養用の培地であれば特に限定されない。公知の基礎培地や完全培地に本発明の培地添加剤を添加することにより、これらの培地を用いて培養する細胞の増殖を促進することができる。基礎培地としては、例えば、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、これらの混合培地などが挙げられる。完全培地としては、無血清培地、幹細胞培養用培地、多能性幹細胞培養用培地などが挙げられる。
【００２３】
また、本発明の細胞増殖促進剤を予め基礎培地に添加して調製した細胞培養用培地も本発明に含まれる。すなわち、本発明は、上記本発明の細胞増殖促進剤を含有する細胞培養用培地を提供する。本発明の培地には、通常細胞培養用培地に使用されるタンパク質やポリペプチド、ホルモン、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、糖類、浸透圧調節剤、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤などの各成分が含まれていてもよい。
【００２４】
培養対象の細胞は特に限定されない。細胞としては、例えば、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞などが挙げられる。なかでも、動物細胞が好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギなど）、鳥類（ニワトリ、ダチョウなど）、は虫類（ワニなど）、両生類（カエルなど）、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカなど）などの脊椎動物、昆虫（カイコ、ガ、ショウジョウバエなど）などの非脊椎動物などの細胞が挙げられる。より好ましくは、哺乳動物細胞である。
【００２５】
本発明者らは、本発明の培地を用いることにより、ハイブリドーマにおけるモノクローナル抗体生産量が増加すること、組み換えタンパク質産生細胞における組み換えタンパク質生産量が増加すること、幹細胞の分化能力が維持されることを確認している（実施例参照）したがって、本発明の培地は、特にハイブリドーマ、組み換えタンパク質産生細胞および幹細胞の培養に用いることが好ましい。幹細胞は自己複製能と多分化能を持った細胞を意味し、体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞などが挙げられ、多能性幹細胞としては、間葉系幹細胞や造血幹細胞などに加えて、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）などが挙げられる。
【００２６】
本発明の培地は、細胞の凍結保存用培地として用いれば、凍結保存中の細胞の死滅および凍結操作に伴う細胞死滅を抑制し、細胞の生存率を高めることができる。すなわち、本発明の培地添加剤は、凍結保護剤として用いることができる。本発明の培地を凍結保存用培地として用いる場合には、５〜２０容積％のＤＭＳＯまたはグリセリンを添加することが好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
〔実施例１：米糠抽出物の調製〕
脱脂米糠３ｋｇに水３０Ｌを加え、２５Ｗ／Ｖ％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ８．５に調整しながら室温で１時間撹拌した。その後、遠心分離（１,５００ｒｐｍ×３０秒間）で抽出液と残渣に分離した。分離した抽出液に６０容量％硫酸を加えてｐＨ３．０に調整し、室温にて１時間撹拌した。その後、遠心分離（３,０００ｒｐｍ×１分間）にて沈澱を分離し、酸沈澱（分離）タンパク質を回収し、フリーズドライ法にて乾燥した。前記乾燥物の収量は２３０ｇで、収率は７．７％であった。ケルダール法によるタンパク質含量は５５％であり、高濃度の米糠タンパク質を含有する米糠抽出物を得た。得られたタンパク質含量５５％の米糠抽出物を「ＲＢＰ５５」と称する。
【００２９】
「ＲＢＰ５５」１０ｇを６０容量％含水エタノール６０ｍＬに懸濁し、５分間撹拌した。攪拌後に遠心分離（３,０００ｒｐｍ×１０分間）にて沈澱を回収した。その沈殿を更に９９．５％エタノール３００ｍＬに懸濁し、５分間攪拌した後に遠心分離（３，０００ｒｐｍ×１０分間）にて沈殿を回収し、フリーズドライ法にて乾燥した。得られた精製米糠タンパク質を含有する米糠抽出物の収量は８．２ｇで、収率は８２％（脱脂米糠換算：６．３％）であった。ケルダール法によるタンパク質含量は７５．０％であった。得られたタンパク質含量７４％の米糠抽出物を、以下「ＲＢＰ７４」と称する。
【００３０】
〔実施例２：マウスハイブリドーマに対する効果の検討〕
細胞にはマウスハイブリドーマ細胞２Ｅ３−Ｏ株（F. Makishima, S. Terada, T. Mikami and E. Suzuki “Interleukin-6 is Antiproliferative to a Mouse Hybridoma Cell Line and Promotive for its Antibody Productivity” Cytotechnology 10. 15-23. 1992）を用い、培地にはＡＳＦ１０４培地（味の素株式会社、無血清培地）を用いた。細胞を２４ウェルプレートに１×１０４個／ｍＬ／ウェルで播種し、定法に従い数日間培養した後に細胞数をカウントした。
【００３１】
（２−１）ＲＢＰ５５の細胞増殖に対する効果
濃度が０．１、０．３、１、３および１０ｇ／Ｌとなるように培地ＲＢＰ５５を添加した。陰性対照（ＮＣ）としてＲＢＰ５５無添加群を、陽性対照としてセリシン（１ｇ／Ｌ）群を設けた。各群ともｎ＝５とした。各群とも播種後３日目に細胞数をカウントした。
結果を図１に示した。図１から明らかなように、ＲＢＰ５５は１ｇ／Ｌ以上の濃度で細胞毒性を示し、細胞がほとんど死滅した。しかしながら、０．１ｇ／Ｌの添加では強い増殖促進効果が見られ、その効果はセリシンを大きく上回った。Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｔｅｓｔでは、５％の水準でＮＣとセリシン、ＮＣとＲＢＰ５５（０．１ｇ／Ｌ）との間に有意差があり、さらに、セリシンとＲＢＰ５５（０．１ｇ／Ｌ）との間にも有意差が認められた。すなわち、セリシンおよびＲＢＰ５５とも細胞培養に有効だが、ＲＢＰ５５の方がより有効であることが明らかとなった。
【００３２】
（２−２）ＲＢＰ５５の最適濃度の検討
ＲＢＰ５５の濃度を０．０２５、０．０５、０．１および０．２ｇ／Ｌとし、無添加およびセリシン（１ｇ／Ｌ）を対照として、播種後３日目に細胞数をカウントした。
結果を図２に示した。図２から明らかなように、０．２ｇ／Ｌ以下の濃度ではいずれもセリシンより有効であった。最適濃度は０．１ｇ／Ｌであると判明した。
【００３３】
（２−３）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）との比較
ＡＳＦ１０４培地にＢＳＡを１ｇ／Ｌとなるように添加すると大幅に細胞の増殖が改善することが知られている。そこで、ＲＢＰ５５およびＢＳＡをいずれも０．１ｇ／Ｌ添加した培地を調製し、播種後２日間培養した後に細胞数をカウントした。
結果を図３に示した。図３から明らかなように、ＲＢＰ５５を０．１ｇ／Ｌまたは０．３ｇ／Ｌ添加することにより、ＢＳＡを１ｇ／Ｌ添加した場合と同等の効果が認められた。両者を同一濃度で比較すると、ＲＢＰ５５は少ない量でＢＳＡと同等以上の効果を発揮することが示された。一方、ＢＳＡの最適濃度である１ｇ／Ｌでは、ＲＢＰ５５は過剰量となり、阻害に働くことが示された。
【００３４】
（２−４）ＲＢＰ７４の最適濃度の検討
ＲＢＰ７４の濃度を０．０２５、０．０５、０．１および０．２ｇ／Ｌとし、無添加およびセリシン（１ｇ／Ｌ）を対照として、播種後３日目に細胞数をカウントした。
結果を図４に示した。図４から明らかなように、０．１ｇ／Ｌおよび０．２ｇ／Ｌではセリシンより有効であった。最適濃度は０．２ｇ／Ｌであると判明した。ＲＢＰ５５の最適濃度よりＲＢＰ７４の最適濃度のほうが高いことから、細胞増殖を促進させる米糠抽出物中の成分の一部は、タンパク質ではないことが示唆された。
【００３５】
（２−５）モノクローナル抗体生産に対する効果の検討
細胞の培養上清を回収し、その抗体濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。住友ベークライト製の９６ウェルアッセイプレートに、まず抗マウスＩｇＧ抗体をコートした後、５％スキムミルクでブロッキングした。洗浄後、培養上清サンプルと標準となるマウスＩｇＧ抗体を１％スキムミルク溶液で適宜希釈したものを添加し、インキュベートした。その後、ペロキシダーゼ酵素を修飾された抗マウスＩｇＧ抗体を添加し、インキュベートした。洗浄後に、二塩酸オルトフェニレンジアミンを過酸化水素とともに添加し、呈色量で抗体濃度を評価した。
結果を図５に示した。図５から明らかなように、ＲＢＰ５５を０．３ｇ／Ｌ（３００μｇ／ｍＬ）の濃度で添加すると、ＲＢＰ５５無添加と比較してモノクローナル抗体生産量が増加傾向を示した。
【００３６】
（２−６）高圧蒸気滅菌処理した米糠抽出物による細胞増殖促進効果の検討
高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、１５分）したＲＢＰ７４を０．２ｇ／Ｌ添加した培地を用い、播種後３日目に細胞数をカウントした。対照としてＲＢＰ７４無添加培地および高圧蒸気滅菌していないＲＢＰ７４を０．２ｇ／Ｌ添加した培地を用いた。
結果を表１に示した。表１から明らかなように、高圧蒸気滅菌処理を行ってもＲＢＰ７４の細胞増殖促進活性は維持された。この結果から、細胞増殖促進を有する有効成分はタンパク質ではないこと、および実施例１の米糠抽出物は、培地に添加した後に高圧蒸気滅菌可能な添加剤として有用性が高いことが明らかになった。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
（２−７）分子量分画した米糠抽出物による細胞増殖促進効果の検討
限外ろ過膜（アミコンウルトラ、ミリポア社製）を用いて、ＲＢＰ７４を分子量に基づいて分画した。３ｋＤａの膜を用いて３ｋＤａ以下の画分（以下「３Ｋ以下」と記す）と３ｋＤａ以上の画分（以下「３Ｋ以上」と記す）を得た。また、１０ｋＤａの膜を用いて１０ｋＤａ以下の画分（以下「１０Ｋ以下」と記す）と１０ｋＤａ以上の画分（以下「１０Ｋ以上」と記す）を得た。
無添加および未分画ＲＢＰ７４を対照とした。濃度は未分画ＲＢＰ７４を０．２ｇ／Ｌとし、各分画サンプルは未分画ＲＢＰ７４を０．２ｇ／Ｌに含まれる量を含むように培地に添加した。播種後３日目に細胞数をカウントした。
【００３９】
結果を図６に示した。図６から明らかなように、３Ｋ以下および１０Ｋ以上が有効であり、未分画より効果が高いことが示された。
【００４０】
（２−８）分子量分画および高圧蒸気滅菌処理した米糠抽出物による細胞増殖促進効果の検討
上記（２−５）で未分画より高い効果を示した３Ｋ以下および１０Ｋ以上について、高圧蒸気滅菌処理により細胞増殖促進効果が変化するかを検討した。無添加および未分画ＲＢＰ７４を対照とし、３Ｋ以下、高圧蒸気滅菌処理３Ｋ以下、１０Ｋ以上、高圧蒸気滅菌処理１０Ｋ以上を培地に添加して、播種後３日目に細胞数をカウントした。濃度は（２−５）と同様に、未分画ＲＢＰ７４を０．２ｇ／Ｌとし、各分画サンプルは未分画ＲＢＰ７４を０．２ｇ／Ｌに含まれる量を含むように培地に添加した。
【００４１】
結果を図７に示した。図７から明らかなように、３Ｋ以下は高圧蒸気滅菌処理することにより効果が消失したが、１０Ｋ以上は高圧蒸気滅菌処理することにより効果が高まることが示された。
【００４２】
〔実施例３：ＣＨＯ細胞に対する効果の検討〕
（３−１）ＲＢＰ５５の細胞増殖に対する効果
細胞にはＣＨＯ−ＤＰ１２（ATCC No. CRL-12445）を用い、培地にはＡＳＦ１０４培地（味の素）を用いた。細胞を４×１０４個／ｍＬの濃度で播種し、定法に従い数日間培養した後に細胞数をカウントした。
【００４３】
ＲＢＰ５５の濃度を０（対照）、０．００１、０．０３、０．１、０．３および１ｇ／Ｌとし、播種後３日目に細胞数をカウントした。
結果を図８に示した。図８から明らかなように、０．１および０．３ｇ／Ｌの濃度において対照群と比較して有意に増殖が促進された。一方、１ｇ／Ｌでは細胞毒性が認められた。
【００４４】
（３−２）組み換えタンパク質生産に対する効果の検討
細胞の培養上清を回収し、その抗体濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。住友ベークライト製の９６ウェルアッセイプレートに、まず抗ヒトＩｇＧ抗体をコートした後、５％スキムミルクでブロッキングした。洗浄後、培養上清サンプルと標準となるヒトＩｇＧ抗体を１％スキムミルク溶液で適宜希釈したものを添加し、インキュベートした。その後、ペロキシダーゼ酵素を修飾された抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、インキュベートした。洗浄後に、二塩酸オルトフェニレンジアミンを過酸化水素とともに添加し、呈色量で抗体濃度を評価した。
結果を図９に示した。図９から明らかなように、ＲＢＰ５５を０．１ｇ／Ｌ（１００μｇ／ｍＬ）または０．３ｇ／Ｌ（３００μｇ／ｍＬ）の濃度で添加すると、ＲＢＰ５５無添加と比較して組み換えタンパク質生産量が有意に増加した。
【００４５】
〔実施例４：ＨｅｐＧ２細胞に対する効果の検討〕
細胞にはＨｅｐＧ２（ATCC No. HB-8065）を用い、培地にはＡＳＦ１０４培地（味の素）を用いた。細胞を６×１０４個／ｍＬの濃度で播種し、定法に従い数日間培養した後に細胞数をカウントした。
【００４６】
ＲＢＰ５５の濃度を０（対照）、０．１、０．３および１ｇ／Ｌとし、播種後３日目に細胞数をカウントした。
結果を図１０に示した。図１０から明らかなように、０．３ｇ／Ｌの濃度において対照群と比較して有意に増殖が促進された。
【００４７】
〔実施例５：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対する効果の検討〕
ＳＴＫ１（株式会社ツーセル）という間葉系幹細胞用の無血清培地が知られている。しかしながらこの培地は、血清を含む培地を用いる場合と比較すると、早期に分化能力を喪失する。そこで、米糠抽出物の添加により分化能力を維持することが可能か検討した。
【００４８】
（１）実験方法
ウイスター系ラット（３週齢、雄）から定法に従い、ＭＳＣを調製した。９６ウェルプレートに３００個／ウェルずつ、以下の条件で播種した。ＲＢＰ５５を１００μｇ／ｍＬ含むＳＴＫ１とＲＢＰ５５を含まないＳＴＫ１を１００μＬ／ウェル添加した。ポジティブコントロールとしてＲＢＰ５５を１００μｇ／ｍＬ含む１５％ウシ胎児血清含有αＭＥＭ、およびＲＢＰ５５を１００μｇ／ｍＬ含まない１５％ウシ胎児血清含有αＭＥＭをそれぞれ１００μＬ／ウェル添加した。各群ともｎ＝３とした。この培養条件で２回継代した後、分化実験を行うこととした。ポジティブコントロールとＲＢＰ５５を含まないＳＴＫ１での培養は、細胞が接着しており、細胞密度がコンフルエントになった時点で骨分化を誘導した。ＲＢＰ５５を含むＳＴＫ１での培養では集合体を形成しており、集合体を形成した後に骨分化を誘導した。分化誘導期間は２１日間とし、３日ごとに培地交換した。骨分化の評価はアリザリンレッド染色により行った。
【００４９】
（２）結果
結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、ＳＴＫ１にＲＢＰ５５を添加することにより、分化能力を維持することが可能であることが示された。
【００５０】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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