(57)【要約】【課題】アレル特異的プライマーを用いたＳＮＰ判別方法において、非特異的な増幅反応を抑制し、より明確なＳＮＰ判別を可能とする方法を提供する。【解決手段】二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、  第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−５’末端からなり、  前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第３非増幅配列（７ａ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第４非増幅配列（７ｂ）−３’末端からなり、前記二本鎖標的配列（１）をＡＳＰを用いたＰＣＲ法で増幅する工程において、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応のための起点として作用せず、前記第３非増幅配列（７ａ）の一部と相補的である、第１ブロック核酸（２０）を混合する方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）中に含まれるＳＮＰ塩基種（８）を、アレル特異的プライマ−を用いて判別するＳＮＰ判別法であって、
前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、
前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−５’末端からなり、
前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第３非増幅配列（７ａ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第４非増幅配列（７ｂ）−３’末端からなり、
前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、第３非増幅配列（７ａ）、および第４非増幅配列（７ｂ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、および第２非増幅配列（６ｂ）と相補的であり、
ＤＮＡポリメラ−ゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、第１のプライマ−（４）、第２のプライマ−（５）、および第１ブロック核酸（２０）を混合し、ポリメラ−ゼ連鎖反応を用いて前記二本鎖標的配列（１）を増幅する工程Ａを含み、
ここで、
前記第１のプライマ−（４）および前記第２のプライマ−（５）は、いずれも、前記ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応のための起点として作用し、
前記ＳＮＰ塩基種（８）は、第一の一本鎖ＤＮＡ（６）上の前記第１のプライマ−（４）が結合する領域内に存在し、
前記第１のプライマ−（４）は、ＳＮＰの塩基（８）に相補的な配列である、アレル特異的プライマ−であって、
前記第１のプライマ−（４）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列の部分に相補的であり、
前記第２のプライマ−（５）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の部分の配列に相補的であり、
前記第１ブロック核酸（２０）は、前記ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応のための起点として作用せず、
前記第１ブロック核酸（２０）は、前記第３非増幅配列（７ａ）の一部と相補的である、ＳＮＰ判別方法。
【請求項２】
前記第１ブロック核酸（２０）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオ−ル基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項１に記載のＳＮＰ判別方法。
【請求項３】
前記第１ブロック核酸（２０）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオ−ル基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載のＳＮＰ判別方法。
【請求項４】
前記第１ブロック核酸（２０）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項１に記載のＳＮＰ判別方法。
【請求項５】
前記工程Ａにおいて、前記ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応のための起点として作用せず、かつ前記第２非増幅配列（６ｂ）の一部と相補的である第２ブロック核酸（３０）も混合される、請求項１に記載のＳＮＰ判別方法。
【請求項６】
前記第２ブロック核酸（３０）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオ−ル基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＤＮＡからなる、請求項５に記載のＳＮＰ判別方法。
【請求項７】
前記第２ブロック核酸（３０）は、３’末端に位置するヌクレオチドに含まれる糖の３位のＯＨ基が、水素、リン酸基、アミノ基、ビオチン基、チオ−ル基、またはこれらの誘導体によって置換または修飾されているＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項５に記載のＳＮＰ判別方法。
【請求項８】
前記第２ブロック核酸（３０）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄからなる、請求項５に記載のＳＮＰ判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲを利用したＳＮＰ判別方法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
近年、体外診断薬を含む分子診断市場は急速な伸びを示しており、医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。
【０００３】
遺伝子検査は、遺伝子の病気と言われるようになった癌領域だけではなく、感染症や、アルツハイマ−病、生活習慣病の発症リスクや、薬物治療に対する効果や安全性を調べる用途にも利用することができることから医療分野での注目が集まっている。その中でも特に塩基配列中の一塩基対での違いを示す一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）は、このわずかな違いにより病気のかかりやすさや薬効に個人差が生まれることが明らかとなってきているため、ＳＮＰ検査を行なう重要性は高まっている。例えば、分子標的治療剤として日本で承認された薬剤であるゲフィニチブは、ＥＧＦＲ遺伝子に存在するＳＮＰの違いによって治療効果が異なることが報告されている。このようにＳＮＰを判別する重要性が高まる中、様々な分析手法が開発されてきている。
【０００４】
遺伝子検査において、検体中に存在するＤＮＡのコピ−数が少ない場合、目的とする遺伝子の領域を増幅して感度を高める方法がある。一般的な核酸増幅法であるＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法は鋳型ＤＮＡ中の目的とする配列領域（以下、標的配列と表記）をその両端の配列に相補的な一対のプライマ−及びＤＮＡポリメラ−ゼを用いて、３段階の温度変化をｎサイクル繰り返すことによって２ｎ倍に増幅する手法である。３段階の各工程は二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性する工程と、一本鎖ＤＮＡ中の標的配列にプライマ−をハイブリダイゼ−ションさせる工程、ＤＮＡポリメラ−ゼによるＤＮＡの伸長反応を行う工程よりなる。１サイクルで標的配列の濃度は２倍になり、理論的にはｎサイクルの反応で標的配列は２ｎ倍に増幅される。実際には１００万倍程度に増幅することができる技術である。
【０００５】
このＰＣＲ法を改良し、ＳＮＰを判別する手法が開発されている。代表的な方法として、アレル特異的プライマ−（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ；ＡＳＰ）を用いたＳＮＰ判別方法がある。ＡＳＰとはＳＮＰ塩基がある特定の塩基種の場合にのみ効率よく伸長反応が起こるように設計されたプライマ−のことを言う。代表的なＡＳＰとして非特許文献１が報告されている。
【０００６】
非特許文献１ではＡＳＰとしてプライマ−の３’末端の塩基が標的のＳＮＰ塩基と対応するように設計されたプライマ−を用いてＳＮＰ判別を行なっている。３’末端塩基がＳＮＰ塩基に対して相補的であれば、伸長反応が効率良く起こるが、非相補的である場合は、伸長反応が進まない、あるいはその効率が低下する。したがって、ＡＳＰを用いてＰＣＲを行い、その結果得られるＰＣＲ産物量や、あるいはＰＣＲの反応効率を解析することで、標的のＳＮＰ塩基の塩基種を知ることができる。ＰＣＲ産物量を解析する方法としては、電気泳動法や、リアルタイムＰＣＲ法、ポリメラ−ゼ伸長反応時に副産物として生成されるピロリン酸を光学的あるいは電気化学的に測定する手法が知られている。
【０００７】
しかしながら、上記ＡＳＰを用いたＳＮＰ判別方法は、３’末端の一塩基のみで伸長反応を制御するものであるので、特異的かつ厳密に制御することは難しい。その結果、ＡＳＰのミスハイブリダイゼ−ションにより、擬陽性を生じる場合があった。そこで、擬陽性を抑えるため、新たなＡＳＰの開発が行なわれている。
【０００８】
例えば、ＡＳＰは、３’ 末端塩基がＳＮＰ対応塩基となるように設計され、かつその５’側上流の３番目の塩基を、鋳型に対して意図的に非相補的になるように設計する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００９】
また、ＡＳＰは、３’末端から２番目の塩基がＳＮＰ対応塩基になるように設計され、かつその５’側に一つ上流の塩基を、鋳型に対して意図的に非相補的な配列になるように設計がなされている（特許文献２）。
【００１０】
また、ＡＳＰは、３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基となるように設計され、かつその５’側上流２番目と３番目の塩基が、鋳型に対して意図的に非相補的な配列となるように設計され、鋳型の配列に応じて特異性の高い塩基配列を選定している（特許文献３）。
【００１１】
上述の新規に開発されたＡＳＰは、ＳＮＰ対応塩基以外に、鋳型に対して非相補的な塩基を意図的に導入することにより、ＳＮＰ対応塩基がＳＮＰ塩基に対して非相補的である場合、結合能をより弱くし、擬陽性を抑制する点で優れている。
【００１２】
しかしその一方で、プライマ−への非相補的な塩基の導入は、プライマ−の標的配列への特異性を低くし、標的配列とは異なる配列に対して非特異的に結合する場合があった。その結果、ＡＳＰを用いてＰＣＲを行うと、標的配列とは異なるＤＮＡ配列が増幅される場合があった。このような非特異的な増幅は、ピロリン酸を測定する手法においては、バックグラウンドとなるため重要な課題である。また、ＡＳＰを用いてリアルタイムＰＣＲを行った場合、ＳＮＰの塩基種が違っていても増幅曲線の立ち上がりの差が小さく、明確にＳＮＰ判別をすることができない場合があった。
【００１３】
そこで、プライマ−の非特異的な結合を防ぐ方法が報告されている。この方法では、プライマ−が非特異的に結合する可能性のある配列を予め網羅的に調べ予測し、それらの配列と完全に相補的な配列を有する競合核酸を反応液中に添加することで、プライマ−の非特異的な結合が起こらないようにすることを特徴としている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／００４９６２８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１４８３０１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／０１９７８０３号明細書
【特許文献４】特開２００４−１９４６１９号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７，２５０３−２５１６（１９８９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、非特異に結合する可能性を予め完全に予測することは難しく、この方法により非特異的な結合反応を完全に防ぐことには限界があった。
【００１７】
本発明は、前記従来の課題を解決するために、ＡＳＰを用いたＰＣＲにおいて、プライマ−の反応特異性の低下によって引き起こされる、非特異的な増幅反応を抑制し、より明確なＳＮＰ判別を可能とする方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記従来の課題を解決するために、本発明のＳＮＰ判別方法は、第１一本鎖ＤＮＡ（６）および第２一本鎖ＤＮＡ（７）からなる二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖標的配列（１）中に含まれるＳＮＰの塩基種（８）を、アレル特異的プライマ−を用いて判別するＳＮＰ判別法であって、前記二本鎖標的配列（１）は、一本鎖標的配列（１ａ）および相補的一本鎖標的配列（１ｂ）からなり、前記第１一本鎖ＤＮＡ（６）は、３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−前記一本鎖標的配列（１ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−５’末端からなり、前記第２一本鎖ＤＮＡ（７）は、５’末端−第３非増幅配列（７ａ）−前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第４非増幅配列（７ｂ）−３’末端からなり、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）、第３非増幅配列（７ａ）、および第４非増幅配列（７ｂ）は、それぞれ、前記一本鎖標的配列（１ａ）、前記第１非増幅配列（６ａ）、および第２非増幅配列（６ｂ）と相補的であり、ＤＮＡポリメラ−ゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸、前記二本鎖ＤＮＡ（６・７）、第１のプライマ−（４）、第２のプライマ−（５）、および第１ブロック核酸（２０）を混合し、ポリメラ−ゼ連鎖反応を用いて前記二本鎖標的配列（１）を増幅する工程Ａを含み、ここで、前記第１のプライマ−（４）および前記第２のプライマ−（５）は、いずれも、前記ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応のための起点として作用し、前記ＳＮＰ塩基種（８）は、第一の一本鎖ＤＮＡ（６）上の前記第１のプライマ−（４）が結合する領域内に存在し、前記第１のプライマ−（４）は、ＳＮＰの塩基（８）に相補的な配列である、アレル特異的プライマ−であって、前記第１のプライマ−（４）は、前記一本鎖標的配列（１ａ）に含まれる３’末端側の配列の部分に相補的であり、前記第２のプライマ−（５）は、前記相補的一本鎖標的配列（１ｂ）に含まれる３’末端側の部分の配列に相補的であり、前記第１ブロック核酸（２０）は、前記ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応のための起点として作用せず、前記第１ブロック核酸（２０）は、前記第３非増幅配列（７ａ）の一部と相補的である、ことを特徴としたものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ＡＳＰを用いたＰＣＲにおいて、非特異的な増幅を抑制することができ、より明確なＳＮＰ判別が可能なＳＮＰ判別法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】従来のＰＣＲを示す図
【図２】本発明に係るＰＣＲを示す図
【図３】実施例１におけるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフ
【図４】実施例１における野生型を鋳型に用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図５】実施例１における変異型を鋳型に用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図６】比較例１におけるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフ
【図７】比較例１における野生型を鋳型に用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図８】比較例１における変異型を鋳型に用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図９】実施例１における増幅産物の総和を比較したグラフ
【図１０】比較例１における増幅産物の総和を比較したグラフ
【図１１】実施例２におけるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフ
【図１２】実施例２における野生型を鋳型に用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図１３】実施例２における変異型の鋳型を用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図１４】比較例２におけるリアルタイムＰＣＲの増幅曲線を示すグラフ
【図１５】比較例２における野生型を鋳型に用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図１６】比較例２における変異型の鋳型を用いた場合の電気泳動時の結果を示すグラフ
【図１７】実施例２における増幅産物の総和を比較したグラフ
【図１８】比較例２における増幅産物の総和を比較したグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明に係わるＳＮＰ判別法の具体的な実施の形態を説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。本実施の形態では、図１および図２を用い、第１のプライマ−（４）がＡＳＰである場合を例にとって説明する。
【００２２】
従来のＰＣＲでは、図１に示すように、第１一本鎖ＤＮＡ６は３’末端−第１非増幅配列（６ａ）−一本鎖標的配列（１ａ）−第２非増幅配列（６ｂ）−５’末端からなり、第２一本鎖ＤＮＡ７は５’末端−第３非増幅配列（７ａ）−相補的一本鎖標的配列（１ｂ）−第４非増幅配列（７ｂ）−３’末端からなる。第１のプライマ−（４）は一本鎖標的配列（１ａ）の３’末端部分（６ｃ）に相補的に結合する。ＳＮＰ塩基（８）は第１一本鎖ＤＮＡ（６）の鎖上に存在し、かつ第１のプライマ−（４）が結合する領域内に存在する。一方、第２のプライマ−（５）は、相補的一本鎖標的配列（１ｂ）の３’末端部分に相補的に結合する。
【００２３】
したがって、第１のプライマ−（４）と第２のプライマ−（５）からＤＮＡ伸長反応が良好におこり、ＰＣＲが行なわれると、得られる増幅二本鎖ＤＮＡ配列は、望まれる増幅二本鎖ＤＮＡ配列２が得られる。しかし、背景技術でも記したとおり、ＡＳＰのようなプライマ−を用いた場合はそれ以外の非特異的な増幅により望まれない産物が得られる場合があった。これを解決するのが本発明である。
【００２４】
ここで、本発明におけるブロック核酸（２０）について図２を用いて説明する。本発明の特徴は、背景技術に記載のＡＳＰを用いたＰＣＲにおけるＳＮＰ判別法にブロック核酸を加えることである。具体的にはＤＮＡポリメラ−ゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、鋳型ＤＮＡ、第１のプライマ−および第２のプライマ−を含むＰＣＲ反応溶液にブロック核酸を共存させてＰＣＲを行なう。第１のプライマ−及び、第２のプライマ−はフォワ−ドプライマ−とリバ−スプライマ−の関係にあって、両プライマ−の３’末端より伸長反応が進み、標的配列を増幅する。本実施の形態では、第１のプライマ−か第２のプライマ−の何れかはＡＳＰである。好ましくは上記反応溶液にＤＮＡポリメラ−ゼが安定に働くための緩衝液、塩類を加えても良い。
【００２５】
ブロック核酸（２０）は、ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応のための起点として作用せず、第３非増幅配列(７ａ)の一部と相補的である。本発明におけるブロック核酸（３０）は、ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応のための起点として作用せず、第２非増幅配列（６ｂ）の一部と相補的である。
【００２６】
本発明のＰＣＲにおいては上記ブロック核酸（２０）とブロック核酸（３０）の少なくともいずれか一方、好適には両ブロック核酸が反応溶液中に加えられる。
【００２７】
また上述の通り、ブロック核酸はＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応の起点とならない合成オリゴ核酸である。したがってブロック核酸としては、例えば、３’末端にＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応の起点とならない修飾が施されているＤＮＡか、もしくはＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ(ＬＮＡ)が挙げられる。修飾の種類としては好適には、リン酸化、アミノ化、蛍光修飾、ビオチン等が含まれるが、これに限るものではない。またブロック核酸は、３’末端のヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドであるＤＮＡやＬＮＡであっても良い。またブロック核酸は、伸長反応の起点とならない核酸類似体であってもよい。伸長反応の起点とならない核酸類似体としては、例えばＰｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）などが挙げられる。
【００２８】
本発明におけるブロック核酸は標的配列（１）の近傍に結合するように設計されることが望ましい。ここでいう近傍とは標的配列（１）から数塩基から数千塩基以内の領域である。ブロック核酸の配列は、好ましくはプライマ−のＴｍ値と同等以上になるように設計される。反応溶液中におけるブロック核酸の濃度は、プライマ−の濃度より大きいことが好ましい。例えばプライマ−が０．１μＭ〜１μＭの濃度範囲であれば、ブロック核酸はその５倍以上の濃度で加えられることが好ましい。
【００２９】
本発明に用いられるＤＮＡポリメラ−ゼは、一例として、Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどが挙げられるが、これに限定されるものではなく、ＰＣＲで使用可能なものであれば、どのようなものでも使用することができ、適宜用途に合わせて選択すればよい。
【００３０】
ただし、鎖置換型の活性を持ったポリメラ−ゼは使用することができない。ＤＮＡポリメラ−ゼの濃度は通常、０．５〜２．５Ｕｎｉｔ／１００μＬで使用されることが望ましい。緩衝液は上記ＤＮＡポリメラ−ゼが反応するために適切な溶媒であれば何でもよく、一般的にはＴｒｉｓ−ＨＣｌが使用され、ｐＨは７〜１０、濃度は１０ｍＭ〜１００ｍＭで調製されることが望ましい。塩類は好適には塩化マグネシウムが使用されており、１ｍＭ〜５ｍＭで添加され、好適な範囲は１．５ｍＭ〜３ｍＭである。
【００３１】
デオキシヌクレオシド三リン酸は４種類（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）よりなり、通常、各々が等量で２０μＭ〜２００μＭで含まれる。
【００３２】
本発明における標的配列とは、背景技術で説明したようにＳＮＰ塩基を含み、一対のプライマ−で囲まれ、ＰＣＲで増幅される領域を示す。
【００３３】
また、本発明におけるプライマ−とは、ＤＮＡポリメラ−ゼによる伸長反応の起点となる合成オリゴ核酸である。プライマ−の長さは、伸長反応のためのプライマ−として働くのに十分な長さであればよく、通常、１５ｂｐ〜５０ｂｐの範囲で設計される。より好ましくは、２０ｂｐ〜２５ｂｐで設計される。また、Ｔｍ値によって規定することもできる。通常、Ｔｍ値が４５℃〜７５℃、より好ましくは５５℃〜７０℃の間になるように設計される。
【００３４】
本発明に使用されるＡＳＰとは、背景技術に記載したように、ＳＮＰ塩基が特定の塩基種の場合にのみ効率良く伸長反応が起こるように設計されたプライマ−のことである。第１のプライマ−、もしくは第２のプライマ−のいずれか一方がＡＳＰとなるように設計される。
【００３５】
本発明におけるＡＳＰを用いたＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡの熱変性、プライマ−のハイブリダイゼ−ション、ならびにＤＮＡポリメラ−ゼによるＤＮＡの伸長反応が行われる任意の条件下で実施される。二本鎖ＤＮＡの熱変性は通常、９４℃〜１００℃で１秒から１００秒の間で行われる。ハイブリダイゼ−ション条件は、通常、Ｔｍ値から約５℃下げた温度条件で、５０〜７０℃で１秒から１００秒間で行われる。ポリメラ−ゼによる伸長反応は、酵素が最適に反応する条件を考慮して条件が設定される。Ｔａｑポリメラ−ゼが使用される場合、通常、６５〜７４℃で反応時間は１秒〜３分程度で実施される。アニ−ル工程と伸長工程を同一温度で行うサイクルの場合でもよく、その場合通常、６０〜７０℃で１秒〜３分程度で行われる。また、上記反応サイクルの前後に、ＤＮＡの変性工程や、ポリメラ−ゼの伸長反応を付加する工程を適宜加えても良い。
【００３６】
（実施の形態１）
以下に本発明におけるＡＳＰ−ＰＣＲ法の実施例を示すが、以下の実施例で本発明の内容が限定されるものではない。
【００３７】
実施例１：
本実施例では、ヒトのアセトアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の第１２エクソンの１１４番目のＳＮＰ塩基を判別する例を示す。ＡＬＤＨ２は、飲酒した際に生成されるアセトアルデヒドを分解する酵素である。ＡＬＤＨ２の４８７番目のアミノ酸を決める塩基配列の違いにより、３つの遺伝型に分かれる。すなわち、ＡＬＤＨ２の対立遺伝子に見られる第１２エクソンの１１４番目の塩基がいずれもグアニンであるＧ／Ｇタイプ（野生型）と片方がグアニンで他方がアデニンであるＧ／Ａタイプ、そしていずれもがアデニンであるＡ／Ａ（変異型）である。
【００３８】
本実施例で用いた第１のプライマ−（以下、ＡＬＤＨ２−Ｆと表記）と第２のプライマ−（以下、ＡＬＤＨ２−Ｗｔ−Ｒと表記）の配列を表１に示す。これらの内、ＡＬＤＨ２−Ｗｔ−ＲがＡＳＰに該当し、ＡＬＤＨ２−Ｗｔ−Ｒは、上記ＳＮＰ塩基が野生型の場合にＤＮＡ伸長反応が起こるように設計されている。具体的には、ＡＬＤＨ２−Ｗｔ−Ｒの３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基である。またＡＬＤＨ２−Ｗｔ−Ｒの３’末端から２番目および３番目の二塩基は、鋳型に対して非相補的になるように設計されている（表１、下線部）。
【００３９】
【表１】
2013022003.tif 000003
【００４０】
また、ＡＬＤＨ２−ＦとＡＬＤＨ２−Ｗｔ−Ｒは、アセトアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ２遺伝子中の１４４ｂｐの標的配列がＰＣＲにより増幅されるように設計されている（ただし上記ＳＮＰ塩基が変異型の場合は、ＡＬＤＨ２−Ｗｔ−ＲからのＤＮＡ伸長反応効率は極めて悪いため、この標的配列は増幅されない。）。
【００４１】
ブロック核酸(以下、ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ１と表記)の配列を表２に示す。
【００４２】
【表２】
2013022003.tif 000004
【００４３】
ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ１は標的配列から３塩基上流に結合する実施の形態に記載のブロック核酸（２０）に相当し、２２塩基からなる。ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ１の３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖はリン酸化によって修飾されている。
【００４４】
鋳型ＤＮＡは、上記ＳＮＰ塩基が野生型のホモである被験者および変異型のホモである被験者の血液１００μＬからＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを１０ｎｇ／μＬになるように調製して得た。検体の遺伝子型はシ−ケンス解析により確認した。ＰＣＲの反応溶液は以下の通りであった。
【００４５】
１×ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）
０．２５Ｕ／１０μＬ  ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）
１μＭ  ＡＬＤＨ２−Ｆ
１μＭ  ＡＬＤＨ２−Ｒ
０．５ｎｇ／μＬの野生型ＤＮＡもしくは変異型ＤＮＡ、および
１０μＭ  ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ
１／１００００ ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（ＴａＫａＲａ社製）
全量：１０μＬ
ＰＣＲの反応条件は以下のとおりであった。すなわち、まず９８℃で２分間処理した。その後、９８℃で１秒間（熱変性工程）、５５℃で１秒間（アニ−リング工程）、６８℃で２８秒間（ＤＮＡ伸長反応工程）からなるサイクルを６０サイクル行った。
【００４６】
ＰＣＲ反応をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った。リアルタイムＰＣＲの増幅曲線の結果を図３に示す。図３の縦軸にＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩの蛍光強度、横軸に時間を示す。図３から明らかなように、野生型を鋳型に用いた場合のみ効率的な増幅が起こっている。
【００４７】
さらにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、ＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図４に野生型を鋳型に用いたＰＣＲの電気泳動の結果を、図５に変異型を鋳型に用いたＰＣＲの電気泳動結果を示す。図４と図５の縦軸は増幅産物の濃度に比例した蛍光強度を示しており、横軸は時間を示している。図４と図５を比較すると、野生型を鋳型とした場合は１４４ｂｐからなる標的配列のみが特異的に増幅されていた。一方、変異型を鋳型とした場合では増幅産物は全く検出されなかった。図４、図５中のＭａｒｋｅｒは電気泳動キットに付属されているＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒである。また図５中の標的配列以下のピ−クはプライマ−ダイマ−(以下、ＰＤと記載)である。
【００４８】
比較例１：
本比較例１では、実施例１における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例１と同様のＰＣＲ反応を実施した。図６に比較例１のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線の結果を示す。図６の縦軸はＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩの蛍光強度を、横軸は時間を示している。また、図７に野生型を鋳型に用いた場合のＰＣＲの電気泳動結果を、図８に変異型を鋳型に用いた場合のＰＣＲの電気泳動結果を示す。図７と図８の縦軸は増幅産物の濃度に比例した蛍光強度を示しており、横軸は時間を示している。
【００４９】
まず、図６より、野生型を鋳型に用いた場合と変異型を鋳型に用いた場合において、前者の増幅曲線の方が後者に比べ早く立ち上がっていることが分かる。しかしながら、その差はわずか２．５分でしかなかった。
【００５０】
ここで、実施例１におけるリアルタイムＰＣＲ結果を示す図３と比較すると、ブロック核酸を用いた実施例１では変異型の増幅を抑え、立ち上がりの差が明らかに広がっていることがわかる。このことは第１のブロック核酸２０が明確なＳＮＰ判別を行なうことに寄与していることを示す。
【００５１】
また図７より、野生型を鋳型とした場合では１４４ｂｐの標的配列が増幅産物だけでなく、３３０ｂｐと６１２ｂｐのＤＮＡが非特異的に増幅されていることが分かる。また、図８においても、変異型を鋳型とした場合では標的配列の増幅は起こっていないが、それ以外の３２４〜６１０ｂｐのＤＮＡが増幅されており、非特異的な増幅が起こっている。
【００５２】
実施例１における図４と図５では、このような非特異的な増幅は全く起こっていない。このことから第１のブロック核酸２０が非特異的な増幅を抑制する効果に寄与していることが示された。
【００５３】
図７、図８中のＭａｒｋｅｒは電気泳動キットに付属されているＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒである。また図８中の標的配列以下のピ−クはＰＤである。
【００５４】
アジレント電気泳動の解析結果から算出された増幅産物の濃度の総和を示す実施例１におけるグラフを図９に、比較例１におけるグラフを図１０に示した。図１０の比較例１では野生型、変異型とも標的配列以外の非特異的な増幅が起こっているため、増幅産物の濃度の総和が野生型で７５．４７ｎｇ／μＬであるのに対し、変異型は６０．４７ｎｇ／μＬであり、有意な差がない。一方、ブロック核酸を加えた実施例１の野生型では、標的配列のみの特異的な増幅が起こっている。変異型では全く何の増幅も起こっていない。その結果、増幅産物の濃度の総和は野生型で５７．６９ｎｇ／μＬであるのに対し、変異型では０ｎｇ／μＬであり、完全にバックグラウンドを抑制することができた。すなわち、非特異的な増幅の抑制効果は、ＰＣＲの反応副産物として得られるピロリン酸濃度を指標としてＳＮＰ塩基を判別する検出手法においても、ＳＮＰ塩基種の違いによる差を明確にし、有用であることがわかる。
【００５５】
以上のように、ブロック核酸を用いることでリアルタイムＰＣＲにおいては、野生型と変異型で立ちあがり時間の差が拡大し、明確なＳＮＰ判別が可能となった。さらに、ブロック核酸は非特異的な増幅を抑制しており、これは、ピロリン酸を検出する検出手法においてもバックグラウンドを抑え、明確な判別を可能にする効果に寄与することを示す。
【００５６】
実施例２：
本実施例では、ヒトのアセトアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ２遺伝子の第１２エクソンの１１４番目のＳＮＰ塩基を判別する例において、ＳＮＰ塩基が変異型の場合、増幅可能なＡＳＰを用いた例を示す。第１のプライマ−（以下、ＡＬＤＨ２−Ｆと表記）と第２のプライマ−（以下、ＡＬＤＨ２−Ｍｔ−Ｒと表記）の配列を表３に示す。本実施例では第２のプライマ−がＡＳＰに該当し、ＡＬＤＨ２−Ｗｔ−Ｒは、上記ＳＮＰ塩基が変異型の場合にＤＮＡ伸長反応が起こるように設計されている。具体的には、ＡＬＤＨ２−Ｍｔ−Ｒの３’末端塩基がＳＮＰ対応塩基である。またＡＬＤＨ２−Ｍｔ−Ｒの３’末端から２番目および３番目の二塩基は、鋳型に対して非相補的になるように設計されている（表３、下線部）。
【００５７】
【表３】
2013022003.tif 000005
【００５８】
また、ＡＬＤＨ２−ＦとＡＬＤＨ２−Ｍｔ−Ｒは、アセトアルデヒドデヒドロゲナ−ゼ２遺伝子中の１４４ｂｐの標的配列がＰＣＲにより増幅されるように設計されている（ただし上記ＳＮＰ塩基が野生型の場合は、ＡＬＤＨ２−Ｍｔ−ＲからのＤＮＡ伸長反応効率は極めて悪いため、この標的配列は増幅されない）。
【００５９】
ブロック核酸(以下、ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ１とＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ２と表記)の配列を表４に示す。
【００６０】
【表４】
2013022003.tif 000006
【００６１】
ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ１は標的配列から３塩基上流に結合する実施の形態に記載のブロック核酸（２０）に相当し、２２塩基からなる。ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ２は標的配列から６塩基下流に結合する実施の形態に記載のブロック核酸（３０）に相当し、１９塩基からなる。ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ１とＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ２の３’末端のヌクレオチドに含まれる３位の糖はリン酸化によって修飾されている。
【００６２】
鋳型ＤＮＡは、上記ＳＮＰ塩基が野生型のホモである被験者および変異型のホモである被験者の血液１００μＬからＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出したゲノムＤＮＡを１０ｎｇ／μＬになるように調製して得た。検体の遺伝子型はシ−ケンス解析により確認した。
【００６３】
ＰＣＲの反応溶液は以下の通りである。
【００６４】
１×ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社製）
０．２５Ｕ／１０μＬ  ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）
１μＭ  ＡＬＤＨ２−Ｆ
１μＭ  ＡＬＤＨ２−Ｒ
０．５ｎｇ／μＬの野生型ＤＮＡもしくは変異型ＤＮＡ、および
１０μＭ  ＡＬＤＨ２−Ｂｌｏｃｋ
１／１００００ ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（ＴａＫａＲａ社製）
全量：１０μＬ
ＰＣＲ増幅を、以下のサ−マルプロファイル：９８℃で２分間を１サイクル、９８℃で１秒間（変性のため）と５５℃で１秒間（アニ−ルのため）と６８℃で２８秒間（ＤＮＡ伸長のため）を６０サイクル、で行った。
【００６５】
ＰＣＲ反応をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲシステムを用いてモニタリングした。図１１はリアルタイムＰＣＲの増幅曲線の結果を示す。図１１の縦軸はＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩの蛍光強度を、横軸は時間を示している。
図１１から明らかなように、変異型を鋳型に用いた場合のみ効率的な増幅が起こっている。
さらにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて、ＰＣＲ反応物を電気泳動に供した。図１２に変異型を鋳型に用いたＰＣＲの電気泳動の結果を、図１３に野生型を鋳型に用いたＰＣＲの電気泳動結果を示す。図１２と図１３の縦軸は増幅産物の濃度に比例した蛍光強度を示しており、横軸は時間を示している。図１２と図１３を比較すると、変異型を鋳型とした場合は１４４ｂｐの塩基対からなる標的配列のみが特異的に増幅されていた。一方、野生型を鋳型とした場合は８１ｂｐの非特異的な増幅が見られるが、標的配列より短く、ＰＣＲの反応副産物として得られるピロリン酸濃度を指標としてＳＮＰ塩基を判別する検出手法においても、ほとんど問題にならない。図１２、図１３中のＭａｒｋｅｒは電気泳動キットに付属されているＤＮＡ  Ｍａｒｋｅｒである。また図１２、図１３中の標的配列以下のピ−クはＰＤである。
【００６６】
比較例２：
本比較例２では、実施例２における反応溶液のブロック核酸を蒸留水に置換したこと以外は、実施例２と同様のＰＣＲ反応を実施した。図１４に比較例１のリアルタイムＰＣＲの増幅曲線の結果を示す。また、図１５に変異型を鋳型に用いた場合のＰＣＲの電気泳動結果を、図１６に野生型を鋳型に用いた場合のＰＣＲの電気泳動結果を示す。図１４の縦軸はＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩの蛍光強度を、横軸は時間を示している。図１５と図１６の縦軸は増幅産物の濃度に比例した蛍光強度を示しており、横軸は時間を示している。
【００６７】
まず、図１４より、変異型を鋳型に用いた場合と野生型を鋳型に用いた場合において、前者の増幅曲線の方が後者に比べ早く立ち上がっていることが分かる。しかしながら、その差は５．６分でしかなく、有意な差ではなかった。
【００６８】
ここで、実施例２におけるリアルタイムＰＣＲ結果を示す図１１と比較すると、ブロック核酸を用いた実施例２では明らかに立ち上がりの差が広がっていることがわかる。このことは第１のブロック核酸２０と第２のブロック核酸３０が明確なＳＮＰ判別を行なうことに寄与していることを示す。
【００６９】
また、図１５の変異型を鋳型とした場合では１４４ｂｐの標的配列が増幅産物だけでなく、３０３ｂｐの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。図１６の野生型を鋳型とした場合では１４４ｂｐの標的配列の増幅は起こっていることから、ＡＳＰの機能を果たせていないことが示唆され、さらにそれ以外の３００ｂｐと３５１ｂｐの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡが非特異的に増幅されている。
【００７０】
実施例２における図１２と図１３では、このような非特異的な増幅は全く起こっていない。このことから第１のブロック核酸２０と第２のブロック核酸３０が非特異的な増幅を抑制する効果に寄与していることが示された。
【００７１】
アジレント電気泳動の解析結果から算出された増幅産物の濃度の総和を示す実施例２におけるグラフを図１７に、比較例２におけるグラフを図１８に示した。図１８の比較例２では変異型、野生型とも標的配列以外の非特異的な増幅が起こっているため、増幅産物の濃度の総和が比較例２では変異型の６８．８６ｎｇ／μＬに対して、野生型では９４．４６ｎｇ／μＬであり、標的配列より塩基対の大きな非特異的な増幅が多いことが原因となり、野生型の方が産物量の総和は大きくなってしまっている。これは、ピロリン酸を測定する検出手法においては、間違った判別結果を導く恐れがある。それに対し、ブロック核酸を加えた実施例２では変異型では標的配列のみの特異的な増幅が起こっている。野生型でもわずかに非特異的な増幅が見られるものの、各々の濃度の総和は変異型では、６４．３４ｎｇ／μＬであるのに対し、野生型ではわずか４．７９ｎｇ／μＬであり、有意な差を得ることができている。すなわち、非特異的な増幅の抑制効果は、ＰＣＲの反応副産物として得られるピロリン酸濃度を指標としてＳＮＰ塩基を判別する検出手法においても、ＳＮＰ塩基種の違いによる差を明確にし、有用であることがわかる。
【００７２】
以上のように、ブロック核酸を用いることでリアルタイムＰＣＲにおいては、野生型と変異型で立ちあがり時間の差が拡大し、明確なＳＮＰ判別が可能となった。さらに、ブロック核酸は非特異的な増幅を抑制しており、これは、ピロリン酸を検出する検出手法においてもバックグラウンドを抑え、明確な判別を可能にする効果に寄与することを示す。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上のように、本発明は、一般的なＰＣＲ反応に利用可能である。また、臨床検査用途を目的としたＰＣＲにも利用できる。
【符号の説明】
【００７４】
１  二本鎖標的配列
１ａ  一本鎖標的配列
１ｂ  相補的一本鎖標的配列
２  望まれる増幅二本鎖ＤＮＡ配列
４  第１のプライマ−
５  第２のプライマ−
６  第１一本鎖ＤＮＡ
６ａ  第１非増幅配列
６ｂ  第２非増幅配列
６ｃ  一本鎖標的配列１ａの３’末端部分
６ｇ  増幅一本鎖標的配列
６ｋ  第４複製配列
７  第２一本鎖ＤＮＡ
７ａ  第３非増幅配列
７ｂ  第４非増幅配列
７ｇ  増幅相補的一本鎖標的配列
７ｋ  相補的第４複製配列
８  ＳＮＰ塩基
２０  第１ブロック核酸
３０  第２ブロック核酸
【図１】
2013022003.tif 000007
【図２】
2013022003.tif 000008
【図３】
2013022003.tif 000009
【図４】
2013022003.tif 000010
【図５】
2013022003.tif 000011
【図６】
2013022003.tif 000012
【図７】
2013022003.tif 000013
【図８】
2013022003.tif 000014
【図９】
2013022003.tif 000015
【図１０】
2013022003.tif 000016
【図１１】
2013022003.tif 000017
【図１２】
2013022003.tif 000018
【図１３】
2013022003.tif 000019
【図１４】
2013022003.tif 000020
【図１５】
2013022003.tif 000021
【図１６】
2013022003.tif 000022
【図１７】
2013022003.tif 000023
【図１８】
2013022003.tif 000024
【配列表】
2013022003000001.app