(57)【要約】【課題】香辛料のタイムから簡易な方法で抽出できるキサンチンオキシダーゼ阻害物質を提供すること。【解決手段】タイムの乾燥粉末を水に浸漬し、１００℃の恒温槽で一晩抽出した熱水抽出液には、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が認められるｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅが含まれている。水を溶媒としてタイムからキサンチンオキシダーゼ阻害物質を抽出できるので、溶媒が扱い易く、抽出コストを抑制できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを含むことを特徴とするキサンチンオキシダーゼ阻害物質。
【請求項２】
請求項１において、
タイムの水抽出物であることを特徴とするキサンチンオキシダーゼ阻害物質。
【請求項３】
請求項２において、
ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを含むことを特徴とするキサンチンオキシダーゼ阻害物質。
【請求項４】
水を溶媒としてタイムから抽出することを特徴とするキサンチンオキシダーゼ阻害物質の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タイムから抽出したキサンチンオキシダーゼ阻害物質およびその抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内での尿酸の産生に関わる酵素としてキサンチンオキシダーゼが知られている。キサンチンオキシダーゼは、触媒として働き、プリン系核酸代謝の最終段階でキサンチンを尿酸へ変化させる。
【０００３】
尿酸の過剰産生は痛風などの発症の原因となる高尿酸血症などを引き起こすので、キサンチンオキシダーゼの活性を阻害するキサンチンオキシダーゼ阻害物質を薬として用いて尿酸の生産を抑制することが試みられている。特許文献１には、香辛料のタイムなどに含まれているルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）が、キサンチンオキシダーゼ阻害物質であることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−５２７４３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タイムに含まれるルテオリンとして従来から知られているものはアグリコン（糖がない状態）であり、水に溶けない。従って、タイムからキサンチンオキシダーゼ阻害物質を抽出する際には、エタノールを含む溶媒が用いられている。ここで、溶媒としてエタノールを用いると、溶媒の扱いや処理が煩雑となる。
【０００６】
かかる問題に鑑みて、本発明の課題は、タイムから簡易な方法で抽出できるキサンチンオキシダーゼ阻害物質を提供することにある。また、タイムからのキサンチンオキシダーゼ阻害物質の抽出方法を提案することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、実験・検討を重ねた結果、タイムに含まれるキサンチンオキシダーゼ阻害物質として、ＩＣ５０値（酵素活性を５０％阻害するのに必要な被験化合物の濃度）が２０μＭ以下の新たな物質を同定した。また、新たに同定した物質が配糖体であり水溶性であることから、水を溶媒としてタイムからキサンチンオキシダーゼ阻害物質を抽出できるという新たな知見を見出した。
【０００８】
本発明は、かかる新たな知見に基づくものであり、本発明のキサンチンオキシダーゼ阻害物質は、ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを含むことを特徴とする。ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅによるキサンチンオキシダーゼ阻害活性は、本発明者らによって初めて見出された。
【０００９】
本発明において、キサンチンオキシダーゼ阻害物質は、タイムの水抽出物であることを特徴とする。すなわち、ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅは水溶性なので、水を溶媒としてタイムから簡易に抽出できる。
【００１０】
この場合において、本発明のキサンチンオキシダーゼ阻害物質は、ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅを含むことを特徴とする。
【００１１】
次に、本発明のキサンチンオキシダーゼ阻害物質の抽出方法は、水を溶媒としてタイムから抽出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、キサンチンオキシダーゼ阻害物質は、水を溶媒とする簡易な抽出方法でタイムから取得できる。従って、溶媒が扱い易く、キサンチンオキシダーゼ阻害物質の抽出コストを抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】タイム熱水抽出液のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示すグラフである
【図２】キサンチンオキシダーゼ阻害物質の単離方法を示すチャートである。
【図３】ＨＰＬＣにより得られた第１画分における活性画分のクロマトグラフである。
【図４】化合物１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】化合物１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図６】化合物１のＨＭＢＣスペクトルである。
【図７】ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの構造図である。
【図８】ＨＰＬＣにより得られた第８画分における活性画分のクロマトグラフである。
【図９】化合物２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０】化合物２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１１】化合物２のＨＭＢＣスペクトルである。
【図１２】ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの構造図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、図面を参考にして本発明のキサンチンオキシダーゼ阻害物質を説明する。本発明は、発明者らが、タイム（Ｔｈｙｍｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｌ．）に含まれるキサンチンオキシダーゼ阻害物質としてＩＣ５０値が２０μＭ以下の新たな物質を同定したことに基づく。また、新たに同定した物質が配糖体であり水溶性があることから、水を溶媒としてタイムからキサンチンオキシダーゼ阻害物質を抽出できるという新たな知見を見出したことに基づく。
【００１５】
（キサンチンオキシダーゼ阻害物質の抽出方法）
本発明のキサンチンオキシダーゼ阻害物質は水を溶媒としてタイムから抽出される。キサンチンオキシダーゼ阻害物質は、例えば、以下の工程（１）〜（３）により得られるタイム熱水抽出液に含まれる。
【００１６】
（１）タイムの乾燥粉末１００ｇを水１Ｌに浸漬し、１００℃の恒温槽で一晩抽出し、熱水抽出液を得る。
（２）熱水抽出液の上清をデカンテーションで別の容器に移した後、残渣に水を加えて再度抽出する。すなわち、１００℃の恒温槽で一晩抽出し、再び、熱水抽出液を得る。
（３）この抽出を複数回繰り返し、得られた全ての熱水抽出液を合わせて、タイム熱水抽出液を得る。
【００１７】
本例において、試料として用いた乾燥粉末はスペイン産のタイムの地上部のものである。本例では、最初の工程（１）の抽出も含め、合計４回の抽出を行っている。
【００１８】
ここで、工程（１）〜（３）の後に、タイム熱水抽出液を濃縮して凍結乾燥することにより、粉末状のタイム熱水抽出物を得ることができる。
【００１９】
（タイム水抽出物のキサンチンオキシダーゼ阻害活性）
次に、タイムの水抽出物がキサンチンオキシダーゼ阻害物質を含むことを確認するために、キサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定試験を行った。
【００２０】
測定試験では、まず、工程（３）で得られたタイム熱水抽出液を１１画分に分画して画分毎にサンプル溶液を調製した。具体的には、タイム熱水抽出液（５０ｍｌ）を、あらかじめ水で充填しておいたスチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂カラム（三菱化学株式会社製ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）ＨＰ−２０カラム）に供し、溶出溶媒として水／メタノールの混合溶媒を用い、ステップワイズ式にその濃度勾配を変化させて１１画分（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．１１）に分画した。溶離液の組成は、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１００：０（第１画分Ｆｒ．１）、９０：１０（第２画分Ｆｒ．２）、８０：２０（第３画分Ｆｒ．３）、７０：３０（第４画分Ｆｒ．４）、６０：４０（第５画分Ｆｒ．５）、５０：５０（第６画分Ｆｒ．６）、４０：６０（第７画分Ｆｒ．７）、３０：７０（第８画分Ｆｒ．８）、２０：８０（第９画分Ｆｒ．９）、１０：９０（第１０画分Ｆｒ．１０）、０：１００（第１１画分Ｆｒ．１１）である。しかる後に、得られた各画分の一部（２０ｍｌ）を溶媒除去後、水（Ｈ２Ｏ）３ｍｌに溶解し、５０倍希釈のサンプル溶液とした。
【００２１】
次に、サンプル溶液（１００μｌ）、１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液（３７５μｌ）、および、酵素溶液（１００μｌ）を混合し、２５℃で１５分間プレインキュベートした。
【００２２】
ここで、１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液は、ＫＨ２ＰＯ４（Ｆｗ．１３６．０９）１．８１５ｇ（１．３３×１０−２ｍｏｌ）を２００ｍｌの蒸留水に溶解したものと、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（Ｆｗ．１７７．９９）５．９３９ｇ（３．３４×１０−２ｍｏｌ）を２００ｍｌの蒸留水に溶解したものを９：４１の割合で混合して総量を５００ｍｌとし、ｐＨ＝７．５に調整したものである。酵素溶液は、キサンチンオキシダーゼを１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液に溶かし、１８ｍＵ／ｍｌとしたものである。キサンチンオキシダーゼはシグマ社のＢｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ由来のものである。
【００２３】
その後、基質である０．１５ｍＭキサンチン溶液（３００μｌ）を加え、２５℃で３０分間酵素反応を行った。反応後、反応停止液（１２５μｌ）を加えて反応を停止させ、反応液を得た。反応はガラスチューブ（１３×１００ｍｍ）で行なった。
【００２４】
ここで、０．１５ｍＭキサンチン溶液は、キサンチン（Ｆｗ．１５２．１１）０．００２３ｇ（１．５×１０−４ｍｏｌ）を、１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液１００ｍｌに分散させ、湯浴（９０℃）上で加熱しながら溶解したものである。キサンチンはシグマ社のＢｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ由来のものを用いている。反応停止液は、１Ｎ塩酸液であり、濃塩酸（≒１２Ｎ）９ｍｌに蒸留水を加え、１００ｍｌにメスアップしたものである。
【００２５】
しかる後に、反応液（１ｍｌ）を石英セルに入れ、生成した尿酸量を２９０ｎｍの吸光度により測定した。サンプル溶液の代わりに１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液を添加したものをコントロールとした。阻害率は下式で表される。
【００２６】
【数１】
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【００２７】
Ａ３０は３０分後の吸光度であり、Ａ０は開始時（０分）の吸光度である。＋Ｉはサンプル溶液（阻害剤）を添加した状態を示し、−Ｉはサンプル溶液（阻害剤）を添加していない状態を示す。＋Ｅは酵素溶液を添加した状態を示し、−Ｅは酵素溶液を添加していない状態を示す。従って、（＋Ｉ＋Ｅ）は反応液を示し、（−Ｉ＋Ｅ）はコントロールを示す。（＋Ｉ−Ｅ）はサンプル溶液を示し、（−Ｉ−Ｅ）はブランクを示す。
【００２８】
図１はタイム熱水抽出液をカラム分画した各画分におけるキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示すグラフである。測定試験の結果、元のタイム熱水抽出液Ｔの阻害率は９９．５％であり、画分Ｆｒ５、９、１１を除く全ての画分にキサンチンオキシダーゼ阻害活性が認められた。特に、第１画分Ｆｒ１および第８画分Ｆｒ８について阻害率６５％以上の高い阻害活性が認められた。
【００２９】
（キサンチンオキシダーゼ阻害物質の単離）
次に、第１画分Ｆｒ１および第８画分Ｆｒ８に含まれるキサンチンオキシダーゼ阻害物質を単離した。図２はキサンチンオキシダーゼ阻害物質の単離方法を示すチャートである。
【００３０】
第１画分Ｆｒ１からのキサンチンオキシダーゼ阻害物質の単離では、まず、第１画分Ｆｒ１を乾固して乾固物（０．４ｇ）を得た。次に乾固物をＯＤＳカラム（４０ｇ）に供し、溶出溶媒として水／メタノール（Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ）の混合溶媒を用い、ステップワイズ式にその濃度勾配を変化させて分画した。溶離液の組成は、０．５％酢酸含有  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１００：０、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、０：１００であり、各３００ｍｌとした。その後、得られた各画分の一部（１００μｌ）を溶媒除去後、エタノール（ＥｔＯＨ）１００μｌに溶解し、この溶液に１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液９００μｌを加えて、１０倍に希釈したサンプル溶液を調製し、阻害活性測定を行った。
【００３１】
次に、阻害活性測定により最も高い阻害活性が認められた活性画分（本例では、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝５０：５０の画分）を乾固して乾固物（０．０８ｇ）を得た。また、この乾固物をＯＤＳカラム（８ｇ）に供し、溶出溶媒として水／メタノール（Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ）の混合溶媒を用い、ステップワイズ式にその濃度勾配を変化させて分画した。溶離液の組成は、１．０％酢酸含有  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝７０：３０、６５：３５、６０：４０とした。その後、得られた各画分の１６０ｍｌを流し、１０ｍｌずつ分取し、サンプル溶液として、阻害活性測定を行った。
【００３２】
その後、各画分についてＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣでは、カラムとして株式会社ケムコ製のＣＨＥＭＣＯＳＯＲＢ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｈ（４×１５０ｍｍ）を用い、０．５％酢酸含有  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝６５：３５の移動相で、カラム温度４０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍで分取を行った。また、リテンションタイム１２．６ｍｉｎのピークを分取して、主要な成分として、化合物１を得た。図３は、ＨＰＬＣにより得られた第１画分Ｆｒ１の活性画分のクロマトグラムである。
【００３３】
しかる後に、単離した化合物１について、１Ｈ−ＮＭＲ分析、１３Ｃ−ＮＭＲ分析およびＨＭＢＣ分析に基づく構造解析を行なった。図４は化合物１の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルであり、図５は化合物１の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルであり、図６は化合物１のＨＭＢＣスペクトルである。図４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより、化合物１がルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）の配糖体であることが示唆される。図５の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのシグナルの数から炭素数が２１であることが認められる。また、図５の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのシグナルのケミカルシフト値から糖はｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅであることが示唆される。図６のＨＭＢＣスペクトルより、１’’位のアノマー水素とＢ環の３’位の炭素に相関が認められる。以上より、化合物１はｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅであると同定される。ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅのキサンチンオキシダーゼ阻害活性は、本発明者らによって初めて見出されたものである。図７はｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの構造図である。
【００３４】
ここで、ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅのＩＣ５０値は、１７μＭである。ＩＣ５０値の算出方法は、まず、化合物１を５０μＭもしくは１００μＭとなるようにエタノール（ＥｔＯＨ）或いはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させて試料溶液を調製し、この試料溶液を１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液で適宜調製して各濃度における阻害活性を算出した。しかる後に、終濃度と阻害率の関係を対数グラフ上にプロットし、得られた直線グラフに基づいてＩＣ５０値を算出した。
【００３５】
また、ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅは、試料として用いたタイムの乾燥粉末を水／エタノール（Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ）の溶媒に浸漬し、得られたエタノール抽出液を濃縮後スプレードライして得られたエタノール抽出物１ｇあたりに０．２ｍｇ含まれる。タイムの乾燥粉末に対するエタノール抽出物の収量は１０％程度なので、タイムの乾燥粉末１ｇあたりでは、約０．０２ｍｇのｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅが含まれる。
【００３６】
次に、第８画分Ｆｒ８からのキサンチンオキシダーゼ阻害物質の単離では、まず、第８画分Ｆｒ８を乾固して乾固物（０．０３ｇ）を得た。次に乾固物をＯＤＳカラム（３ｇ）に供し、溶出溶媒として水／メタノール（Ｈ２Ｏ／ＭｅＯＨ）の混合溶媒を用い、ステップワイズ式にその濃度勾配を変化させて分画した。溶離液の組成は、０．５％酢酸含有  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝１００：０、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、０：１００であり、各１５ｍｌとした。その後、得られた各画分の一部（１００μｌ）を溶媒除去後、エタノール（ＥｔＯＨ）１００μｌに溶解し、この溶液に１／１５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ緩衝液９００μｌを加えて、１０倍に希釈したサンプル溶液を調製し、阻害活性測定を行った。
【００３７】
その後、阻害活性測定により最も高い阻害活性が認められた活性画分（本例では、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝５０：５０および４０：６０の画分）（０．０２ｇ）についてＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣでは、カラムとしてＣＨＥＭＣＯＳＯＲＢ（登録商標）５−ＯＤＳ−Ｈ（４×１５０ｍｍ）を用い、０．５％酢酸含有  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ＝６５：３５の移動相で、カラム温度４０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長２５４ｎｍで分取を行った。また、リテンションタイム２１．０ｍｉｎのピークを分取して、主要な成分として、化合物２を得た。図８は、ＨＰＬＣにより得られた第８画分Ｆｒ８の活性画分のクロマトグラムである。
【００３８】
しかる後に、単離した化合物２について、１Ｈ−ＮＭＲ分析、１３Ｃ−ＮＭＲ分析およびＨＭＢＣ分析に基づく構造解析を行なった。図９は化合物２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルであり、図１０は化合物２の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルであり、図１１は化合物２のＨＭＢＣスペクトルである。図９の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより、化合物２がアピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）の配糖体であることが示唆される。図１０の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのシグナルの数と、シグネルの強度から炭素数が２１であることが示唆される。また、図１０のシグナルのケミカルシフト値から糖がｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅであると示唆される。図１１のＨＭＢＣスペクトルより、１’’位のアノマー水素と７位の炭素に相関が認められる。以上より、化合物２はａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅであると同定される。図１２はａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの構造図である。
【００３９】
ここで、ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅのＩＣ５０値は３０μＭよりも大きな値である。また、ａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅは、試料として用いたタイムの乾燥粉末を水／エタノール（Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ）の溶媒に浸漬し、得られたエタノール抽出液を濃縮後スプレードライして得られたエタノール抽出物１ｇあたりに０．３ｍｇ含まれる。タイムの乾燥粉末に対するエタノール抽出物の収量は１０％程度なので、タイムの乾燥粉末１ｇあたりでは、約０．０３ｍｇのａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅが含まれる。
【００４０】
（作用効果）
本発明によれば、キサンチンオキシダーゼ阻害物質は、水を溶媒とする簡易な抽出方法でタイムから取得できる。従って、溶媒が扱い易く、キサンチンオキシダーゼ阻害物質の抽出コストを抑制できる。
【００４１】
なお、水とブタノールの混合溶媒を用いてタイムからの抽出を行った場合にも、キサンチンオキシダーゼの活性を阻害する主要な物質として、ｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅおよびａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅが抽出される。また、エタノールを含む混合溶媒を用いてタイム抽出液を得た場合にも、そのタイム抽出液にはｌｕｔｅｏｌｉｎ−３’−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅおよびａｐｉｇｅｎｉｎ−７−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅが含まれる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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