(57)【要約】【課題】アルツハイマー病などGAPDHの凝集に起因する種々の疾病の改善に寄与しうる新規薬剤を提供する。【解決手段】本発明のペプチドはGAPDHの活性中心であるCys-156を含みかつCys-156を他のアミノ酸に置換した１０〜２０のアミノ酸から構成されるペプチドであって、GAPDH凝集抑制作用を有するペプチドである。このペプチドは、GAPDHの凝集体（GAPDH-Seeds）の生成を抑制し、アルツハイマー病の起因因子であるアミロイドβやパーキンソン病の起因因子であるα-シヌクレインの凝集・蓄積を防止する。当該ペプチドの投与によりアルツハイマー病やパーキンソン病の発症予防、進行の抑制、症状の改善が期待される。【選択図】図１
2013241402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GAPDH凝集阻害効果を有するペプチドであって、
配列番号１で示されたアミノ酸配列を含む１０〜２０アミノ酸からなるペプチド。但し、配列番号１におけるＸaaは、システイン以外の天然アミノ酸である。
【請求項２】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２の何れかに示されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４】
アミロイド化に起因する脳神経変性疾患の発症予防・進行抑制・症状改善のための請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記脳神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病の何れかである請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）の凝集阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、脳神経変性疾患の中でも最も罹患率が高く、認知障害を主徴とする疾患であり、大脳基底核のコリン作動性神経細胞の活動低下と細胞死が主因とされている。著明な脳委縮を伴い、βシート構造を有するアミロイドβが蓄積・凝集した老人斑と微小管結合タンパク質であるタウが凝集・蓄積した原形質繊維変化が病理学的特徴である。
【０００３】
アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の１から４０番目までのアミノ酸からなるアミロイドβ（Ａβ1-40）及び同じく１から４２番目までのアミノ酸からなるアミロイドβ（Ａβ1-42）が神経細胞内に蓄積・凝集することが、アルツハイマー病発症の主要な原因であるとされている。すなわち、アルツハイマー病の発症メカニズムは、（１）ＡＰＰがβ−セクレターゼ及びγ−セクレターゼにより切断されてアミロイドβを生成する、（２）生成されたアミロイドβが脳内でアミロイド線維を形成して神経細胞死を誘導することにあると考えられる。しかしながら、その詳細なメカニズムについては未だ不明である。
【０００４】
パーキンソン病はアミロイド繊維が蓄積・凝集したレビー小体と呼ばれる構造物（封入体）の形成がその病理学的特徴である。パーキンソン病においては、α−シヌクレインのアミロイド化が主要な原因の一つであると考えられている。α−シヌクレインのアミロイド化した繊維が、神経細胞死を誘導することは広く知られているが、その詳細な発症メカニズムも未だ不明である。また、ハンチントン病においては、ハンチンチンと呼ばれるタンパク質の凝集による神経細胞死が主要な原因と考えられており、ハンチントン病を発症した神経細胞では、アミロイド化したハンチンチン・タンパク質の蓄積・凝集が見られる。
【０００５】
アミロイドβの凝集を阻害することで、アルツハイマー病の発症予防やその進行を抑制しようとする試みがなされている。例えば、特許文献１（特表２００４‐５１３８７３号公報）には、β−シート構造を壊すペプチドであるβ−シート・ブレーカーペプチドの化学修飾により設計されたβ−シート・ブレーカーペプチド類縁物質であって、アミロイドβペプチドにおけるβ−プリーツシート形成を阻害するアミロイドβ凝集阻害剤が開示されている。特許文献２（特開２００７−０５５９０７号公報）には、アミロイドβの中央部にある疎水性ドメインと結合するペプチドからなる結合ドメインと、前記結合ドメインのＣ末端側に付加され、親水性高分子からなる阻害ドメインを備えたアミロイドβ凝集阻害剤が開示されている。特許文献３（特開２００４−１４９４２９号公報）には、β−セクレターゼを阻害してアミロイドβの凝集を抑制するインドール誘導体が、特許文献４（特表２０１２−５０８１８０号公報）や特許文献５（特表２０１０−５３５７６１号公報）には、γ−レダクターゼを阻害してアミロイドβの凝集を抑制するアミロイドβ凝集阻害剤が、それぞれ開示されている。
【０００６】
また、アルツハイマー病に対してアミロイドβワクチン療法などの免疫学的アプローチも注目を集めている。ワクチン治療は、アミロイドβタンパク質をワクチン（抗原）として投与することにより、体内で産生されたアミロイドβタンパク質に対する抗体が老人斑を除去し、さらに神経細胞内でアミロイドβタンパク質の凝集・沈着を抑制しようとする療法である。
【０００７】
しかしながら、上記アミロイドβ凝集阻害剤ではアミロイドβの沈着・抑制に十分な効果が得られない。ワクチン療法では、アミロイドβの生理的機能を阻害することによると思われる髄膜脳炎などの副作用がある。また、βセクレターゼ阻害剤やγ−セクレターゼ阻害剤はアミロイドβの生理的作用を阻害する懸念があるなどの観点から、さらに有効性に優れた副作用のない抗アツルハイマー治療薬が求められている。
【０００８】
ところで、近年、アルツハイマー病の老人斑や原形質線維変化といったアミロイドが細胞内に凝集・沈着する病態を示す疾患（アミロイドーシス）において、解糖系酵素であるグリセロアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素（GAPDH）も同時に凝集・沈着していることが示され、アルツハイマー病などのアミロイドーシスの発症とGAPDHのアミロイド化との関連性が注目されている。GAPDHは、１１のαへリックスと１６のβシートからなる球状タンパク質で、ホモテトラマーとして解糖系のグリセロアルデヒド‐３‐リン酸の脱水素反応を触媒している。酵素の活性中心はアミノ酸１５２番目のシステイン残基（Cys-152）であり、Cys-152がホモテトラマーの中心に向き合うように配位することで脱水素反応を効率的に触媒すると考えられている。哺乳類のGAPDHに存在するシステイン残基は、霊長類では３個、霊長類以外では４〜５個存在するが、何れのGAPDHにおいても分子内ジスルフィド結合は存在しない。
【０００９】
本願発明者らは、幾つかの脳神経変性疾患の神経細胞内において、GAPDHがアミロイド様繊維として不溶化して存在することに注目し、酸化ストレスによりGAPDH自身がアミロイド様線維（以下「GAPDH-seeds」と記す場合がある。）を形成し、神経細胞死を誘導することを報告している（非特許文献１〜３）。すなわち、一酸化窒素などの酸化ストレス処理により、GAPDHのシステイン152（Cys152）が酸化されると分子間ジスルフィド結合が形成され、GAPDHはオリゴマー化する。また、酸化GAPDHはβ−シート構造の増加とそれによるコンフォメーション変化を生じる。そして、活性中心であるシステイン152（Cys152）をアラニン（Ala）に置換したC152A-GAPDH変異体酵素を発現している細胞では、野生型のGAPDHを発現している細胞で観察されたアミロイド様凝集体形成と細胞死は観察されなかった（非特許文献２、３）。
【００１０】
アミロイドβによるアミロイド繊維の形成速度は極めて緩慢である（試験管内で数日〜数ヶ月、生体内では年単位）とされているのに対し、GAPDH-seedsの形成速度はそれに比べて著しく速く、また、GAPDH-seedsがＡβ1-40のアミロイド化を促進し、アミロイドβ神経細胞死モデルとして汎用されているPC12細胞において、GAPDH-Seedsによりアミロイド化が促進したＡβ1-40は、Ａβ1-40単独の場合と比較してＡβ1-40誘発性細胞死を強く促進することが本願発明者らによって報告されている（瀬見、中嶋ら、第５４回日本神経化学会大会、２０１１年９月）。これらのことから、GAPDH-seedsは、アミロイドβ促進因子の「シーズ（Seeds）」として機能して、アミロイドβの凝集・沈着を促進し、それによって神経細胞死を加速させる可能性が高く、アルツハイマー病の発症に深く関与していることが疑われる。さらに、GAPDH-seedsとアルツハイマー病との関連性を示唆する報告も幾つかある（例えば、非特許文献４）。
【００１１】
また、アルツハイマー病以外でも、幾つかの神経変性疾患の原因タンパク質、例えばパーキンソン病におけるα−シヌクレイン（α-synuclein）やハンチントン病におけるハンチンチン（huntingtin）などもGAPDHと相互作用してアミロイド化が促進されることが報告されている（非特許文献５、６）。これらのアミロイド化した原因タンパク質は小胞体ストレスやミトコンドリア膜電位を低下させることで神経細胞死を惹起することから、GAPDHはパーキンソン病やハンチントン病などの神経変性疾患の病態形成にも関与している可能性が示唆される。
【００１２】
しかしながら、GAPDH-seedsと病態との因果関係は未だ十分に解明されたとは言えず、GAPDH-seedsと病態との関連性を明確にするためには、GAPDHの凝集を選択的に阻害する化合物を用いた研究が有効である。ところが、GAPDHは生存に必須の解糖系酵素として機能しているので、遺伝子ノックアウト等によって当該機能を消失させるような研究手法は用いることができない。生存に必須の解糖系酵素であるGAPDHの場合、GAPDH凝集阻害剤による治療応用を指向した創薬には、GAPDHの凝集のみを選択的に阻害するが、GAPDHの酵素活性には影響のない選択的な低分子化合物（GAPDH凝集選択的阻害剤）の創製が必須となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００４‐５１３８７３号公報
【特許文献２】特開２００７−０５５９０７号公報
【特許文献３】特開２００４−１４９４２９号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】中嶋秀満ら、2010、解糖系酵素glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) の多機能性と酸化ストレス性細胞死における役割、放射線生物研究、45(2)、127-139
【非特許文献２】Nakajima H., et al.、2007、The active site cysteine of the proapoptotic protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is essential in oxidative stress-induced aggregation and cell death、J. Biol. Chem.、282(36)、26562-26574
【非特許文献３】Nakajima H., et al.、2009、GAPDH aggregate formation participates in oxidative stress-induced cell death、J. Biol. Chem.、284(49)、34331-34341
【非特許文献４】Wang Q, et al., Proteomic analysis of neurofibrillary tangles in Alzheimer disease identifies GAPDH as a detergent-insoluble paired helical filament tau binding protein., FASEB J. 2005 May;19(7):869-71
【非特許文献５】Tsuchiya K. et al.、2005、Pro-apoptotic protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promotes the formation of Lewy body-like inclusions.、Eur J Neurosci.、21、317-26
【非特許文献６】Bae BI.et al.、2006、Mutant huntingtin: nuclear translocation and cytotoxicity mediated by GAPDH.、Proc Natl Acad Sci U S A.、103、3405-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このような状況下において、選択的なGAPDH凝集阻害剤を探究していたところ、特定のアミノ酸配列を有するペプチドがGAPDH凝集を著しく阻害することが見出された。このペプチドはGAPDH酵素活性や、他のアミロイド分子（Ａβ1-42）のアミロイド化にも影響を与えないことが示され、当該ペプチドはGAPDH凝集に対する選択的阻害作用を有することが確認された。
【００１６】
本発明の目的は、GAPDH自身の凝集によるアミロイド化を選択的に阻害し、アミロイド化したGAPDHによる原因タンパク質のアミロイド化促進を阻害することによって、当該原因タンパク質のアミロイド化に起因する種々のアミロイドーシス、例えばアルツハイマー病の発症の予防、進行の抑制、症状の改善に寄与する新規な化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係るGAPDH凝集阻害剤は、配列番号１に示されたアミノ酸配列を含む１０〜２０のアミノ酸で構成されるペプチドからなる。但し、配列中のアミノ酸Ｘaaはシステイン以外のアミノ酸である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、アルツハイマー病などGAPDHの凝集によって促進される他のタンパク質のアミロイド化に起因する種々の疾病の改善に寄与しうる新規薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はGAI-1ペプチドの有するGAPDHアミロイド様凝集に対する濃度依存的阻害効果を示すグラフである。
【図２】図２はGAI-1ペプチドとシステインの酸化ストレス誘発アミロイド様凝集との比較を示す図である。
【図３】図３は各種GAIペプチドのGAPDH凝集阻害活性を示すグラフである。
【図４】図４は各種GAIペプチドのGAPDH凝集阻害活性の比較を示すグラフである。
【図５】図５はGAI-1ペプチドがGAPDH活性に与える影響を示す図である。
【図６】図６はGAI-1ペプチドがアミロイドβの凝集に与える影響を示す図である。
【図７】図７はGAI-1ペプチドがＡβ1-40誘発PC12細胞死に対する細胞保護効果を示す図である。
【図８】図８はGAPDH-Seedsがα−シヌクレインの凝集に与える影響を示す図である。
【図９】図９はGAPDH-Seedsがα−シヌクレインの凝集に与える影響を示す画像であって、ＡはGAPDH-Seeds非存在下における場合を、ＢはGAPDH-Seeds存在下における場合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明に係るペプチドは、配列番号１で示されたアミノ酸配列（SNASCTTNXL）を含む１０〜２０アミノ酸からなるペプチドであって、GAPDH凝集阻害効果を有するペプチドである。ただし、配列番号１中におけるアミノ酸Ｘaaはシステイン以外のアミノ酸である。
【００２１】
本明細書において、アミノ酸は天然のＬ−アミノ酸であり、修飾基を有するＬ−アミノ酸でもあり得る。
【００２２】
本発明に係るペプチドは、GAPDHを構成するアミノ酸配列のうち、１４８番目のアミノ酸であるセリン（Serine-148）から１５７番目のアミノ酸であるロイシン（Leucine）までの１０個のアミノ酸配列を含み、１５６番目のアミノ酸であるシステイン（Cys-156）をシステイン（修飾基を有するシステインを含む。以下同じ。）以外のアミノ酸に置換したペプチドである。
【００２３】
本発明に係るペプチドは、上記１０個のアミノ酸配列を核として、GAPDHの活性中心であるCys-152を保持している。核となる１０個のアミノ酸配列からなるペプチドはGAPDHの相当する部分のアナログであり、１５６番目のアミノ酸残基を除いては、ヒトGAPDHのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。また、活性中心に近い位置にあるCys-156はシステイン以外のアミノ酸残基に置換されている。システインから置換されるアミノ酸残基はシステイン残基以外の任意のアミノ酸残基であり、例えば、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン酸、フェニルアラニンのアミノ酸残基であり得る。
【００２４】
本発明に係るペプチドを構成するアミノ酸残基の数は少なくとも１０個である。９個以下であればGAPDH凝集阻害効果を発揮できないおそれがある。また、アミノ酸残基の数は２０個までである。２０個よりも多いアミノ酸残基から構成されるペプチドも、GAPDHの凝集阻害効果を発揮し得るが、２０個よりも多いアミノ酸残基から構成されるペプチドは細胞膜の透過性が低下する可能性や経時的に凝集阻害効果が低下する傾向にある。核となるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列は任意のアミノ酸配列であり、好ましくはGAPDHのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列である。また、GAPDHのアミノ酸配列のうち、そのうちの１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列も好適である。GAPDHを構成するアミノ酸残基と置換されるアミノ酸残基は任意のアミノ酸残基であり、好ましくはシステイン残基以外のアミノ酸残基である。システイン残基が含まれると、酸化ストレス等の負荷によってジスルフィド結合が形成され、GAPDHのオリゴマー化が進む可能性があるからである。
【００２５】
本発明に係るペプチドは、核となるペプチドのＣ末側にアミノ酸が結合したペプチド又は核となるペプチドのＮ末側にアミノ酸が結合したペプチドであり、また、核となるペプチドのＣ末側及びＮ末側の双方にアミノ酸が結合したペプチドであるとも言える。Ｃ末側及びＮ末側の双方にアミノ酸が結合したペプチドの場合、Ｃ末側に結合するアミノ酸残基の数とＮ末側に結合するアミノ酸残基の数は同数でもよく、異数でもよい。
【００２６】
本発明に係るペプチドは、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。これらのペプチドのうち、１０個のアミノ酸残基を有する配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号７に示されるアミノ酸配列、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、配列番号１１に示されるアミノ酸配列、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが好ましい。
【００２７】
本発明に係るペプチドはGAPDHの凝集阻害作用を有する。GAPDHの凝集体（GAPDH-Seeds）は、アミロイドβのアミロイド化を促進し、前記のとおりアミロイド繊維の形成に関与していると考えられている。また、α−シヌクレインのアミロイド化を促進し、アミロイド繊維の形成に関与すると考えられる。従って、GAPDH凝集阻害剤として作用する本発明のペプチドはGAPDHの凝集によるアミロイド化を防止して、アミロイド化に起因する各種の脳神経変性疾患の発症を防ぎ、それらの症状の進行を抑制し、さらにはそれら症状を改善し得る。脳神経変性疾患は、当業者が用いる通常の意味で用いられる。脳神経変性疾患は、脳神経疾患の一つであり、中枢神経系の特定の神経細胞が細胞死に至る疾病である。例えば、該疾患は、アルツハイマー病であり、パーキンソン病であり、ハンチントン病であり得る。
【００２８】
本発明に係るペプチドはGAPDH凝集阻害剤として利用されうるが、通例、医薬組成物として提供される。本発明に係る医薬組成物は、有効量の本発明に係るペプチドと、製剤化に必要な補助剤を含む。補助剤は、賦形剤であり、崩壊剤であり、滑沢剤であり、コーティング剤であり、安定剤であり、ｐＨ調整剤であり、着色剤であり得る。投与方法は経口又は非経口のいずれでもあり、医薬組成物の剤型も限定されず、当業者により適宜選択される。その剤型は例えば錠剤であり、散剤であり、顆粒剤であり、液剤であり、注射剤であり得る。
【００２９】
本発明に係るペプチドの投与量は、人種や性別、年齢、体重、疾患、症状、投与方法等に応じて、適宜治療効果を発揮するように当業者により決定される。投与量は例えば０.０００１μg／dayであり、０.００１μg／dayであり、０.０１μg／dayであり、０.１μg／dayであり、１．０μg／dayであり、１０μg／dayであり、０.１mg／dayであり、１.０mg／dayであり、１０mg／dayであり、１００mg／dayであり得る。
【実施例１】
【００３０】
〔GAIペプチドによるGAPDH凝集阻害作用〕
表１に示すGAIペプチドを合成し、GAIペプチドがGAPDHの凝集阻害に与える影響を調べた。ペプチドの合成はすべてSIGMA社に委託した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
（ヒトGAPDHの発現と精製）
GAPDHタンパク質の発現誘導を次のように行った。ヒトGAPDH野生型遺伝子を導入した大腸菌W3CGを、50μg/mLのAmpicillin Sodium Salt（Amp）及び15μg/mLのTetracycline Hydrochloride（Tet）を含む２ＬのＭ−６３培地で振とう培養し、0.2％のL-(+)Arabinoseを添加することでGAPDHの発現を誘導した。３７℃で一晩振とう培養後、培養液を4,000rpm（5,000×g）、４℃の条件で１０分間遠心分離機（RS-205，TOMY）を用いて遠心して得られた沈殿物（菌体）に、Lysis Bufferを加えて氷上で超音波破砕機（VP5S，TAITEC）を用いて粉砕した。粉砕物を15,000rpm（12,000×g）、４℃の条件で２０分間遠心分離して得られた上清に、300μL Ni-NTA（50％スラリー）を添加して９０分間室温で振とうした。反応物をEcono Column（Econo-Pac（商標名）、Disposable Chromatography Columns、BIO-RAD）に添加し、20mLのWash Bufferで５回洗浄後、500μLのElute Bufferで５回溶出した。溶出液に500μM Nicotinamide adenine dinucleotide（NAD+）、1mM EDTA/2Na、1mM Dithiothreitol（DTT）を添加して４℃で一晩還元反応を行った。
【００３３】
還元反応を行った溶出液をBuffer G2で平衡化したPD-10 Column（Amersham）に添加し、3.5 mLの同Bufferで溶出した。溶出液をVIVA SPIN 4（Vivascience）に回収し、3,000 rpm（1,100×g）で数回遠心分離して濃縮を行い、精製したヒトGAPDHを得た。
【００３４】
Ｍ−６３培地や各種Bufferの組成を下記に示す。
（Ｍ−６３培地）
100mM KH2PO4
15mM (NH3)2SO4
2.5mg/mL Casamino acid
25mM Malate
30mM Vitamine B1
1mM MgCl2
0.14％ Glycerol
1.8μM FeSO4
【００３５】
（Lysis Buffer）
50mM NaH2PO4-Tris (pH8.0)
300mM NaCl
30mM Imidazole
10％ Glycerol
2mM 2-ME
【００３６】
（Wash Buffer）
50mM NaH2PO4-Tris (pH8.0)
300mM NaCl
50mM Imidazole
10％ Glycerol
2mM 2-ME
【００３７】
（Elute Buffer）
50mM NaH2PO4-Tris (pH8.0)
300mM NaCl
300mM Imidazole
10％ Glycerol
2mM 2-ME
【００３８】
（Buffer G2）
50mM Tris-HCl (pH7.4)
150mM NaCl
5％ Glycerol
1mM Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid、disodium salt、dehydrate（EDTA/2Na）
【００３９】
（GAPDH凝集阻害）
GAPDHアミロイド様凝集を次の方法で測定した。５μM精製ヒトGAPDHをBuffer G2に溶解した溶液の200μLを、96wellプレートにてGAIペプチド存在下または非存在下において３７℃で３−４日間インキュベートした。溶液の濁度を、４０５nmを吸光波長としてマイクロプレートリーダー（VersaMax，Molecular Devices）を用いて経時的に測定した。また、GAI-1ペプチドの濃度依存的阻害効果を測定すると共に、システインの酸化ストレス誘発（２００μMのS-Nitrosoglutathione（GSNO））によるアミロイド様凝集作用との比較を調べた。これらの試験結果を図１〜４に示す。
【００４０】
GAI-1ペプチドは約５０％の凝集阻害活性を示し、０.１〜１０μMの範囲において濃度依存的にGAPDHの凝集を阻害した（図１）。また、システインを含むことから、システイン単独での作用を検討したところ、GAIペプチドと同濃度では効果を発揮しなかったことから（図２）、GAIペプチドは、そのペプチド配列及び立体構造に起因して作用を発揮することが確認された。
【００４１】
また、活性中心であるCys-152を保持し、Cys-156を他のアミノ酸に置換したGAI-1、GAI-2、GAI-3、GAI-4、GAI-6、GAI-8、GAI-9、GAI-10はGAPDHの凝集を抑制したが、Cys-152が他のアミノ酸に置換されて活性中心を失ったGAI-5やGAI-7（Cys-156は保持されている。）はGAPDHの凝集を抑制しなかった。GAPDHの凝集抑制を示したGAIペプチドのうち、２０アミノ酸から構成されるGAI-2、GAI-3、GAI-4では反応開始４８時間程度では優れた凝集抑制効果を示すが、それ以降では凝集抑制効果が緩和される傾向にあった（図３）。また、１０のアミノ酸から構成されるGAI-8、GAI-9、GAI-10は、２０個のアミノ酸から構成されるGAI-2、GAI-3、GAI-4よりやや劣るものの、ほぼそれと同様の凝集抑制効果を示した。
【００４２】
これらのことから、活性中心を維持した状態でCys-156を他のアミノ酸に置換することにより、GAPDHの凝集が阻害されることが理解された。また、上記凝集抑制効果からCys-152を含みかつCys-156がシステイン以外のアミノ酸である１０〜２０のアミノ酸から構成されるペプチドがGAPDH凝集阻害剤として好ましいと言える。
【００４３】
（GAIペプチドのGAPDH酵素活性に及ぼす影響）
精製GAPDHのタンパク質濃度はBradfordの方法に従い、色素結合法にて測定した。50mM Trietanolamine-HCl（pH8.9）と0.2mM EDTA/2Na、50mM K2HPOを含む反応溶液に1mMNAD+、精製GAPDH（0.01μM）、10μMのGAI-1ペプチドをそれぞれ添加し、２５℃で１分間インキュベートした後、2mM GAP（Glyceraldehyde-3-Phosphate：Roche Applied Science）を加えて、プレートリーダー（VERSA max、Molecular Devices）を用いて340nmの吸光度変化を測定した。その結果を図５に示した。モル比で１０００倍濃度のGAIペプチドは、GAPDHの酵素活性に影響を与えなかった。
【００４４】
（GAIペプチドのアミロイド化に及ぼす影響）
250μMのGAI-1ペプチド存在下及び非存在下において、25μMのＡβ1-42を含む溶液を３７℃で２０分間インキュベートした。得られた溶液を氷上で超音波破砕機（VP5S，TAITEC）を用いて均一にした溶液をサンプルとした。
【００４５】
2mLのThioflavinT（ThT）solution（10μMのThTを含む50 mM Glycine-NaOH（pH8.0)）に10μLのサンプルを添加して混和した後、蛍光光度計（RF-1500，SHIMADZU）を用いて、蛍光強度を励起長４５０nm、蛍光波長４８２nmにより測定し、アミロイド凝集（Aggregation）として評価した．その結果を図６に示した。モル比で１０倍濃度のGAIペプチドは、Ａβ1-42のアミロイド化には影響を与えなかった。
【００４６】
（Ａβ1-40誘発PC12細胞死に対するGAI-1ペプチドの細胞保護効果）
ラット神経芽腫であるPC12細胞を、ポリ-L-リジンでコーティングした96wellプレートに播種し、Ａβ1-40（５０μM）単独又はＡβ1-40（５０μM）とGAI-1ペプチド（５０μM）を同時に添加して、３７℃、５％Ｃ０２の条件下で２日間培養した。その後、Cell Viability Kit (Promega社)で細胞生存率を測定した。その結果を図７に示した。Ａβ1-40（５０μM）単独で認められた細胞死は、GAI-1（５０μM）の同時添加により、有意に抑制され、GAI-1ペプチドの細胞保護効果が認められた。
【実施例２】
【００４７】
次に、GAPDH-seedsによるα−シヌクレインのアミロイド化促進作用について調べた。GAPDH-seedsがα−シヌクレインのアミロイド化促進作用を発揮すれば、GAPDH-seeds（GAPDH凝集体）の形成阻害により、アルツハイマー病の発症の予防や進行の抑制、症状の改善が期待される。
【００４８】
〔α−シヌクレインのアミロイド化測定〕
（GAPDH-seedsの調製）
0.6mg/mL GAPDH（上記Buffer G2溶液）に100μM NOR3（4-Ethyl-2-hydroxyimino-5-nitro-3-hexenamide）を添加し、３７℃で３日間インキュベートしてGAPDHを完全に凝集させた。15,000rpm（20,400×g）、２５℃の条件で３０分間、遠心分離機（MX-305，TOMY）を用いて遠心して得られた沈殿物（GAPDH凝集物）に、20mM Tris-HCl (pH7.4)、100mM NaCl、1mM MgCl2を含むGAPDH-seeds Bufferを加えた。その懸濁液を氷上で超音波破砕機（VP5S，TAITEC）を用いて粉砕したものをGAPDH-seedsとした。
【００４９】
（GAPDH-seedsによるアミロイド化促進）
モル比10％ GAPDH-seeds存在下又は非存在下において1mg/mLのα−シヌクレイン（ATGEN）を含む溶液を1,000 rpmで撹拌しながら３７℃で１０日間インキュベートした溶液をサンプルとした。2mLのThT溶液（同上）に10μLのサンプルを添加して混和した後、蛍光光度計（RF-1500，SHIMADZU）を用いて、蛍光強度を励起波長４５０nm、蛍光波長４８２nmにより測定してアミロイド凝集（Aggregation）として評価した。また、得られたサンプルのアミロイドを原子力間顕微鏡ＡＦＭ（MultiMode AFM，Digital Instruments）を用いて観察した。その結果を図８及び図９に示した。
【００５０】
モル比で１０％のGAPDH-seedsを添加することにより、α−シヌクレインのアミロイド化の経時変化について明確な促進（左方移動）が認められた（図８）。また、GAPDH-seedsの添加によりα−シヌクレインのアミロイド化が構造的に確認された（図９）。
【００５１】
本願発明者らは、既にGAPDH-seedsがアミロイドβのアミロイド化を促進することを報告しており（前述）、これと同様にGAPDH-seedsはα−シヌクレインのアミロイド化を促進することが確認された。また、α−シヌクレイン過剰発現神経芽腫細胞では、GAPDH-siRNAによる内在性凝集GAPDHのノックダウンで細胞死が抑制された（データは示さず。）。このように、GAPDH-Seedsがα−シヌクレインのアミロイド化や細胞死に関与することが示され、GAPDHの凝集阻害がパーキンソン病の発症予防や症状の進行抑制、症状の改善に寄与することが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によると、新規なGAPDH凝集阻害剤が提供される。これにより、アルツハイマー病やパーキンソン病など脳内におけるアミロイド化に起因する疾病の発症の予防、発症の予防、進行の抑制、改善に寄与することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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