(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓから単離されたポリペプチドを含む免疫原性組成物の提供。【解決手段】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び免疫原性組成物におけるそれらの使用。さらにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのポリペプチド及びポリヌクレオチドの免疫原性組成物を用いた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する、哺乳動物における免疫応答を引き起こす方法。さらに、生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを検出するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３、１７および２８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの感染に対する免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを感染させたウサギ血清中の抗体と免疫反応性である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが１以上のウサギ血清タンパク質と結合する、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
薬学上許容可能な担体をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
１以上のアジュバントをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来である、請求項１〜５のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが異種アミノ酸をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓから単離されたものである、請求項１〜９のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの中和エピトープを含む、請求項１〜１０のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドがリポタンパク質である、請求項１〜１１のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの多糖類抗原をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの多糖類抗原又はポリペプチド抗原をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物であって、前記ポリペプチドが、配列番号４５，４９および６０からなる群から選ばれるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる、免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来である、請求項１〜１５のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが異種ヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
配列番号４５，４９および６０からなる群から選ばれるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有し且つ発現ベクター中に含まれるポリヌクレオチドを含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの感染に対する免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記ベクターがプラスミドＤＮＡである、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが組換えポリヌクレオチドである、請求項１８又は１９のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来である、請求項１８〜２０のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが異種ヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドが、１以上の遺伝子発現調節エレメントと機能可能に連結されている、請求項１８〜２０のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの中和エピトープの前記発現を導く、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
トランスフェクション促進剤をさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか１項以上に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記トランスフェクション促進剤がブピビカインである、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓの感染を処置又は予防するための組成物であって、配列番号１３、１７および２８から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び薬学上許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが異種アミノ酸をさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
アジュバントをさらに含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項２７又は２８に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓの感染を処置又は予防するための組成物であって、配列番号４５、４９および６０からなる群から選ばれるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び薬学上許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項３３】
ベクターをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ベクターがプラスミドＤＮＡである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが組換えポリヌクレオチドである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドが異種ヌクレオチドをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが、１以上の遺伝子発現調節エレメントに機能可能に連結されている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３８】
アジュバントをさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３９】
トランスフェクション促進剤をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４０】
前記トランスフェクション促進剤がブピビカインである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの感染を処置又は予防するための組成物であって、配列番号１３、１７および２８から選ばれるアミノ酸配列を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチド配列を含む、組成物。
【請求項４２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの感染を処置又は予防するための組成物であって、配列番号４５、４９および６０からなる群から選ばれるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチド配列を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓから単離されたポ
リペプチドを含む免疫原性組成物に関する。本発明はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び免疫原性
組成物におけるそれらの使用に関する。さらに本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのポリペプチド及びポリヌクレオチドの免疫原性組成物を用い
た、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する、哺乳動物における免疫応答を引き起こす方法に関する
。本発明はまた、生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓを検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕ
ｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、皮膚及び粘膜上の正常なヒト微生物叢の主要成分であ
り、以前は感染患者からの培養を行う際の唯一の混入物質と考えられていた。非特許文献
１；非特許文献２参照。それは今や非常に重要な日和見病原体であり、また、院内血流感
染の主要原因であることが広く認められている。非特許文献３；非特許文献４；非特許文
献５参照。これらの感染は、静脈カテーテル、人工関節又は心臓弁等の内在する外来ポリ
マー体の存在に主として関連する。非特許文献１；非特許文献２参照。感染は、人工デバ
イスの挿入時に、ヒトの皮膚からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓが入り込む結果であると考えられる。コロニー形成及び続いて起こるバイオフィルム形
成は、細菌に体内のその他の部位へと拡がる造血性の波及力をもたらし得る。これらの感
染は、バイオフィルム内部の細菌が抗生物質によって殺菌されにくくなること、また、臨
床分離株において抗生物質耐性が増加することに起因して、しばしばその処置が困難であ
る。非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７参照。バンコマイシンに
対する感受性が低減したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが報告
されている。非特許文献８；非特許文献９参照。これらの感染処置が困難であるため、感
染予防手段としての免疫付与が余儀なくされる。
【０００３】
バイオフィルム形成は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染
に関する主要な毒性決定因子である。結果として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓ表面タンパク質の研究は、バイオフィルム形成に関与するそれらのタ
ンパク質に集中されてきた。これらのタンパク質は、バイオフィルム形成における２つの
主要なステップにおけるそれらの関与に基づき、グループに細分化されている：１）最初
の接触、ブドウ球菌表面タンパク質−１（ＳＳＰ−１）、オートリシン（ＡｔＩＥ）、Ｆ
ｂｅ（ＳｄｒＧ）及びＧｅｈＤ、及び２）細菌の細胞の蓄積、Ｂａｐホモロガスタンパク
質（Ｂｈｐ）、蓄積関連タンパク質（ＡＡＰ）及びオートリシン（ＡｔＩＥ）。非特許文
献２；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献
１４；非特許文献１５；及び非特許文献１６参照。宿主内で環境信号に曝される時に発現
される表面タンパク質の同定や、宿主寄生物の相互作用に関与するものの同定に対しては
、比較的取り組みがなされてきていない。
【０００４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、片利共生生物から病原体
への遷移を受けて、宿主内のその微小環境へと適合しなければならない。病原体へと遷移
するために、片利共生生物には、宿主組織への接近、環境における知覚変化、宿主による
防御を回避可能化するための異なる遺伝子の発現、宿主因子への結合及び吸着、異なる栄
養素及び宿主による防御の存在下での生育及び分裂を獲得することが必要である。細菌表
面上のタンパク質は、宿主内の新たな環境との最初の接触を形成する。これらのタンパク
質における多くの機能には、環境のセンシング、栄養分のスカベンジング及び輸送、宿主
免疫系に対する防御及び宿主タンパク質の結合が含まれる。表面に曝されたタンパク質は
また、接触時又は宿主免疫系による認識時に役割を果たし得、細菌に対する体液性免疫応
答のターゲットとなり得る。非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９。
【非特許文献１】Ｈｅｉｌｍａｎｎ，Ｃ及びＧ．Ｐｅｔｅｒｓ，「Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ｉｎ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ」，Ｖ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，編，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．２０００年，ｐ．４４２−４４９
【非特許文献２】ｖｏｎ  Ｅｉｆｆ，Ｃら，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００２年，第２巻，第１１号，ｐ．６７７−８５
【非特許文献３】Ａｍ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，１９９９年，第２７巻，ｐ．５２０−３２
【非特許文献４】Ｄｉｅｋｅｍａ，Ｄ．Ｊ．ら，ｌｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ，２００２年，第２０巻，第６号，ｐ．４１２−８
【非特許文献５】Ｅｄｍｏｎｄ，Ｍ．Ｂ．ら，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１９９９年，第２９巻，第２号，ｐ．２３９−４４
【非特許文献６】Ｌｅｗｉｓ，Ｋ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００１年，第４５巻，第４号，ｐ．９９９−１００７
【非特許文献７】Ｒａａｄ，Ｉ．ら，Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，１９９８年，第２６巻，第５号，ｐ．１１８２−７
【非特許文献８】Ｓａｎｙａｌ，Ｄ．及びＤ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３年，第３９巻，第３号，ｐ．２０４−１０
【非特許文献９】Ｓａｎｙａｌ，Ｄ．ら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９１年，第３３７巻，第８７３２号，ｐ．５４
【非特許文献１０】Ｖｕｏｎｇ，Ｃら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００３年，第１８８巻，第５号，ｐ．７０６−１８
【非特許文献１１】Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９６年，  第１７８巻，  第２号，ｐ．５３７−４１
【非特許文献１２】Ｒｕｐｐ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００１年，第１８３巻，第７号，ｐ．１０３８−４２
【非特許文献１３】Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．ら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，１９９７年，第６５巻，第２号，ｐ．５１９−２４
【非特許文献１４】Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｍ．ら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，１９９８年，第６６巻，第６号，ｐ．２６６６−７３
【非特許文献１５】Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１年，第２７６巻，第３０号，ｐ．２７７９９−８０５
【非特許文献１６】Ｂｏｗｄｅｎ，Ｍ．Ｇ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００２年，第２７７巻，第４５号，ｐ．４３０１７−４３０２３
【非特許文献１７】Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００１年，第１８４巻，第１２号，ｐ．１５７２−８０
【非特許文献１８】Ｓｗｉａｔｌｏ，Ｅ．ら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，２００３年，第７１巻，第１２号，ｐ．７１４９−５３
【非特許文献１９】Ｇｒｉｆａｎｔｉｎｉ，Ｒ．ら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２年，第２０巻，第９号，ｐ．９１４−２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
すなわち、免疫原性組成物中で用いるための、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓのセロタイプをもたらす疾患への免疫応答を引き起こす、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質における有望候補物の同定に関す
る差し迫ったニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、配列番号１〜配列番号３２、その生物学的均等物、又はその断片の１以上か
ら選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。特定
の実施形態において、このポリペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｄｉｓを感染させたウサギ血清中の抗体と免疫反応性である。別の実施形態におい
て、このポリペプチドは、１以上のウサギ血清タンパク質と結合する。
【０００７】
特定の実施形態において、免疫原性組成物は、薬学上許容可能な担体をさらに含む。そ
の他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物はまた、１以上のアジュバントをさら
に含む。さらに別の実施形態において、免疫原性組成物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの多糖類抗原をさらに含む。さらに別の実施形態において、
免疫原性組成物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの多糖類又はポリペプ
チド抗原をさらに含む。
【０００８】
本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓから単離されたポ
リペプチドからなる免疫原性組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、異種アミノ酸をさらに含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓポリペプチドからなる免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、ポ
リペプチドは融合ポリペプチドである。別の実施形態において、ポリペプチドは組換えポ
リペプチドである。さらに別の実施形態において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの中和エピトープを含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドからなる免疫原性組成物を提供する。特定の実施形
態において、ポリペプチドはリポタンパク質である。
【００１０】
本発明はさらに、配列番号３３〜配列番号６４又はその縮重改変体、又はその断片の１
つから選択されるヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドからなる免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態にお
いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチド配列は
、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号
５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５８、配列番号５９、及び
配列番号６２、又はその縮重改変体又はその断片からなる群から選択される。
【００１１】
本発明は、前記ポリヌクレオチドがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓ由来である免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、ポリヌクレオチ
ドは異種ヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは発現ベ
クターである。さらに別の実施形態において、発現ベクターはプラスミドＤＮＡである。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは組換えポリヌクレオチドである。別の実施
形態において、ポリヌクレオチドは１以上の遺伝子発現調節エレメントと動作可能に連結
されている。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチドはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの中和エピトープの発現を導く。
【００１２】
本発明はまた、トランスフェクション促進剤をさらに含み、ポリヌクレオチドによりコ
ードされるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドからな
る免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態において、このトランスフェクション促進
剤はブピビカインである。
【００１３】
本発明はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対する免疫
応答を引き起こす方法であって、配列番号１〜配列番号３２又はその生物学的均等物、又
はその断片の１以上から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び薬学上許容
可能な担体を含む、免疫原性となる量の組成物を、哺乳動物へ投与することを含む、前記
方法を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対する
免疫応答を引き起こす方法であって、配列番号３３〜配列番号６４、その縮重改変体又は
その断片の１以上から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び薬学
上許容可能な担体を含む、免疫原性となる量の組成物を、哺乳動物へ投与することを含む
、前記方法を提供する。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、配列番号３３〜配列番号６４、又はその縮重改変体、
又はその断片の１つから選択されるヌクレオチド配列を有し且つ発現ベクター中に含まれ
るポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。別の実施形態において、ポリヌク
レオチドはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来である。さらに
別の実施形態において、ポリヌクレオチドは異種ヌクレオチドを含む。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの検出及び／又は同定方法であって、以下の工程：（ａ）
前記サンプルを、配列番号３３〜配列番号６４、又はその縮重改変体、又はその断片の１
つから選択される前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプ
ローブと、ハイブリダイゼーションを可能にさせる条件下で接触させる工程；及び（ｂ）
前記サンプル中のハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程であって、ハイブ
リダイゼーション複合体が前記サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｄｉｓの存在を示す、前記工程、を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
その他の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに対する抗体の検出及び／又は同定方法であって、以下
の工程：（ａ）前記サンプルを、配列番号１〜配列番号３２、又はその生物学的均等物、
又はその断片の１つから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、免疫複合体形成
を可能にさせる条件下で接触させる工程；及び（ｂ）前記サンプル中の免疫複合体の存在
を検出する工程であって、免疫複合体が前記サンプル中のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在を示す、前記工程、を含む、前記方法を提供する。
【００１８】
特定の実施形態において、免疫原性組成物は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１
１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番
号２３、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号３０、その生物学的均等物、又はそ
の断片からなる群から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓポリペプチド配列を含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、配列番号４０、
配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５
１、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６２、又
はその縮重改変体、又はその断片からなる群から選択される、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕ
ｓに対する免疫応答を引き起こす方法であって、配列番号８、配列番号１０、配列番号１
１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番
号２３、配列番号２６、配列番号２７、及び配列番号３０、その生物学的均等物、又はそ
の断片からなる群から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓポリペプチド配列を含む、免疫原性となる量の組成物を、哺乳動物へ投与することを含
む、前記方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに
対する免疫応答を引き起こす方法であって、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３
、配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号
５５、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６２、又はその縮重改変体、又はその
断片からなる群から選択されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
ポリヌクレオチド配列を含む、免疫原性となる量の組成物を、哺乳動物へ投与することを
含む、前記方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
宿主の血流に曝される時、侵入細菌は新たな環境に対して特異的な環境信号に遭遇する
。これらの信号は細菌及び、細胞壁の精製タンパク質中に検出され得るタンパク質発現に
おけるシグナル適応変化によって検出される。細菌の細胞壁のタンパク質及び糖質糖質は
、細菌感染の処置又は予防のための免疫原性組成物中に含有させる候補物質となることが
よくある。アップレギュレートされたタンパク質が宿主と相互作用するか又は栄養素獲得
において役割を担うか否かは、細菌にとって重要であり、従って、細菌の生存及び発症に
おける役割を担う。体液（すなわち、血清、腹膜透析液、及び尿）中における細菌の増殖
は、宿主内で細菌が遭遇するシグナルのいくつかを模倣するモデル系として使用されてい
る。Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，  Ｍ．Ｄ．及びＳ．Ｊ．Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍ
ｍｕｎ，  ６９（８）：ｐ．５１９８−２０２  （２００１）；Ｓｈｅｐａｒｄ，  Ｂ．
Ｄ．及びＭ．Ｓ．Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  ７０（８）：ｐ．４
３４４−５２  （２００２）；Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｇ．ら，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ
，  ５９（２）：ｐ．６１７−２４  （１９９１）；ＭｃＤｅｒｍｉｄ，  Ｋ．Ｐ．ら，
Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  ６１（５）：ｐ．１７４３−９  （１９９３）参照。こ
れらの培養条件の１以上がエンテロコッカス・フェカリス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおける
遺伝子発現を変化させることが見出されており、改変された培養条件において発現が増大
することが示されているこれらのタンパク質は、様々な機能を有する様々な分類のタンパ
ク質に属することが見出された。Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，  Ｍ．Ｄ．及びＳＪ．Ｆｏｓｔｅ
ｒ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  ６９（８）：ｐ．５１９８−２０２  （２００１）
；Ｓｈｅｐａｒｄ，  Ｂ．Ｄ．及びＭ．Ｓ．Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕ
ｎ，  ７０（８）：ｐ．４３４４−５２  （２００２）参照。
【００２２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染に関する最も一般的な素
因は人工補装具の移植である。移植される人工補装具は、フィブリノーゲン、ビトロネク
チン、フォン・ヴィレブランド因子及びフィブロネクチン等のプラズマ及びマトリクスタ
ンパク質により被覆されている。ｖｏｎ  Ｅｉｆｆ，  Ｃら，．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，  １８（１２）：ｐ．８４３−６  （１９
９９）  参照。これらのタンパク質はしばしば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓ表面タンパク質に対するリガンドとして機能するため、細菌が人工補装
具へ結合しコロニーを形成することを可能にする。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、フィブリノーゲン、ビトロネクチン及びフィブロネクチンと結合
するタンパク質を発現することが知られている。Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｍ．  ら，  Ａ  ｆ
ｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  ６６（６），  ｐ．２
６６６−７３  （１９９８）；Ｄａｖｉｓ，  Ｓ．Ｌ．ら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，
２７６（３０），  ｐ．２７７９９−８０５  （２００１）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｒ
．Ｊ．ら，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，．  ７０（１２），  ｐ．６８０５−１０  （
２００２）；Ｈｅｉｌｍａｎｎ，  Ｃ．ら，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２４（５
），  ｐ．１０１３−２４  （１９９７）  参照。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓが共生菌から病原菌へと変化する時には、さらなる血清タンパク質と
結合することが予想されるのは合理的である。
【００２３】
以下に記載する本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの
セロタイプにより引き起こされる大部分又は全ての疾患を効率的に予防又は処置するＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ免疫原性組成物に対する必要性につ
いて取り組む。本発明はさらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ感染を診断する方法の必要性について取り組む。本発明は、抗原性ポリペプチドをコー
ドする、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓオープンリーディング
フレーム（以下、ＯＲＦ）を同定した。より特定的には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓＯＲＦは、免疫原性組成物中において潜在的な抗原性ポリペプ
チドとして機能するポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、本発明は、表
面に局在化された、曝露された、分泌された、又は膜に結合されたポリペプチド抗原をコ
ードするＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチドＯＲ
Ｆを含む。
【００２４】
その他の実施形態において、本発明は、ＯＲＦ配列を含むベクター及びこれらのベクタ
ーにより、形質転換された、トランスフェクトされた又は感染させられた宿主細胞又は動
物を含む。本発明はまた、微生物の成長を阻害又は抑制するために使用され得る、Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓＯＲＦｓの転写遺伝子産物、例えば、
ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイム分子等
を含む。本発明はまた、これらの核酸又はポリペプチドを検出する方法及びＳｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染を診断するためのキットに関する。本発
明はさらに、細菌感染、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
により引き起こされる又は悪化させられる感染の予防及び／又は処置のための免疫原性組
成物に関する。特定の実施形態において、この免疫原性組成物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにより引き起こされる又は悪化させられる全身性疾患
の処置又は予防のために使用される。その他の実施形態において、この免疫原性組成物は
、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにより引き起こされる又は悪
化させられる非全身性疾患の処置又は予防のために使用される。
【００２５】
（Ａ．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓＯＲＦポリヌクレオチ
ド及びポリペプチド）
単離・精製されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓＯＲＦポリ
ヌクレオチドが同定されており、これらは免疫原性組成物中に含有させるためのＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの製造において使用される
。より具体的には、特定の実施形態において、ＯＲＦは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ表面に局在化された、曝露された、膜と結合された又は分泌さ
れたポリペプチド、特に抗原性ポリペプチドをコードする。すなわち、一態様において、
本発明は、免疫原性組成物中に含有させるための、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓ表面に局在化された、曝露された、膜と結合された又は分泌されたポ
リペプチドをコードする単離・精製されたポリヌクレオチド（ＯＲＦ）を特定する。特定
の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡ分子であり、このＤＮＡはゲノ
ムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。別の実施形態にお
いて、ポリヌクレオチドは組換えポリヌクレオチドであり、これは配列番号１〜配列番号
３２又はその断片のうちの一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを
コードする。別の実施形態において、単離・精製されたＯＲＦポリヌクレオチドは、配列
番号３３〜配列番号６４、その縮重改変体、又はその相補体のＯＲＦヌクレオチド配列の
うちの一つと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態に
おいて、配列番号３３〜配列番号６４のうちの一つのＯＲＦポリヌクレオチドは、プラス
ミドベクター中に含まれ、原核宿主細胞中で発現される。
【００２６】
以下に使用する時、用語「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合により連結さ
れているヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、以下、５’から３’方向の
向きで表される。本発明のポリヌクレオチドは、約１０〜約数十万塩基対を含み得る。一
実施形態において、ポリヌクレオチドは約１０〜約３，０００塩基対含む。特定のポリヌ
クレオチドの例示的な長さを以下に説明する。
【００２７】
本明細書中に記載するポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、リボ核
酸（ＲＮＡ）分子、又はヌクレオチドアナログを用いて生成したＤＮＡ又はＲＮＡのアナ
ログであり得る。この核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖Ｄ
ＮＡである。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合、その分子は、遺伝子、ｃＤＮＡ
分子又はゲノムＤＮＡ分子であることができる。ヌクレオチド塩基は、以下、一文字略号
：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）及
びウラシル（Ｕ）により示される。
【００２８】
「単離された」とは、自然の状態から「人間の手によって」変化させられていることを
意味する。組成物又は物質が自然の状態で存在し、それが「単離された」と見なされるた
めには、そのもともとの環境から変化又は除去されているか、あるいは、その両方がなさ
れていなければならない。例えば、生きている動物に自然に存在するポリヌクレオチド又
はポリペプチドは「単離されていない」が、この用語を以下において使用する時、その自
然の状態で共存する物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離
されている」。
【００２９】
本明細書中で使用する時、「単離された」ポリヌクレオチドは、核酸が得られる生物の
ゲノムＤＮＡ中の核酸と自然に連結している配列（すなわち、この核酸の５’及び３’末
端に位置する配列）を含まない。例えば、各種実施形態において、単離されるＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ核酸分子は、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、
２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満の、核酸が得られる細胞のゲノムＤＮＡ
中の核酸分子と自然に連結しているヌクレオチド配列を含み得る。しかし、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ核酸分子は、他のタンパク質のコード配列又
は調節配列と融合させることができ、尚且つ依然として、単離されたと見なされ得る。
【００３０】
本明細書中に記載するＯＲＦポリヌクレオチド及びそのポリペプチドは、ｍＲＮＡに由
来するｃＤＮＡライブラリーからの標準的クローニング及びスクリーニング技法を用いて
得ることができる。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡライブラリー（例えば、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓライブラリー）等の自然の供給
源から得ることもでき、又は、良く知られ、市販されている技法を用いて合成することが
できる。
【００３１】
遺伝子コードの縮重により、配列番号３３〜配列番号６４に示されるヌクレオチド配列
（及びその断片）とは異なるが、配列番号３３〜配列番号６４に示されるヌクレオチド配
列によってコードされるものと同じＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓポリペプチドをコードする核酸分子も本発明に包含される。
【００３２】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチドのオーソロ
グ及びアレル改変体は、当技術分野において良く知られている方法を用いて容易に同定す
ることができる。このポリヌクレオチドのアレル改変体及び／又はオーソログは、配列番
号３３〜配列番号６４に示されるヌクレオチド配列、又はこれらのヌクレオチド配列の断
片に対して、典型的には少なくとも約７０〜７５％、より典型的には少なくとも約８０〜
８５％、及び最も典型的には少なくとも約９０〜９５％又はより相同であるヌクレオチド
配列を含み得る。かかる核酸分子は、配列番号３３〜配列番号６４に示されるヌクレオチ
ド配列、又はこれらのヌクレオチド配列の断片と、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし得るものとして容易に同定され得る。
【００３３】
さらに、このポリヌクレオチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓポリヌクレオチド又は遺伝子のコード領域の断片、例えば、配列番号３３〜配列番
号６４のうちの一つの断片のみを含むことができる。特定の実施形態において、かかる断
片は免疫原性断片をコードする。
【００３４】
本発明のこれらのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓＯＲＦポリ
ヌクレオチドは、免疫原性組成物中に含有させるためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの組換え産生のために使用され、このポリヌクレオ
チドは、成熟ポリペプチドのためのコード配列それ自体、又は、その他のコード配列、例
えば、リーダー又は分泌配列、プレ−又はプロ−又はプレプロ−タンパク質配列、又はそ
の他の融合ペプチド部分をコードしている配列と共に存在している、リーディングフレー
ム中の成熟ポリペプチドのためのコード配列を含み得る。例えば、融合ポリペプチドの精
製を容易にし得るマーカー配列をコード配列に連結し得る（Ｇｅｎｔｚら，  Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８６：８２１−８２４，  １９８９参照。参照
により以下、本明細書中にその全体を組み入れるものとする）。したがって、本発明にお
いては、発現産物のＨｉｓタグ精製を可能にする融合ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの調製が意図される。このポリヌクレオチドは、非コード５’及び３’配列、例
えば、転写、非翻訳配列、スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含んでも良い。
【００３５】
したがって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ以外の種、例え
ば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからのホモログ及び／又はオーソログ
等の本発明の免疫原性組成物中に含有させるためのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドは、配列番号３３〜配列番号６４、その断片のうちの一つの配列を有する標識プロ
ーブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリー
をスクリーニングする工程と、このポリヌクレオチド配列を含有する全長ｃＤＮＡ及びゲ
ノムクローンを単離する工程とを含む方法により得ることができる。かかるハイブリダイ
ゼーション技法は当業者に良く知られている。多くの場合、当業者であれば、ポリペプチ
ドをコードしている領域がｃＤＮＡの５’末端において短く切断されているという点にお
いて、単離されたｃＤＮＡ配列は不完全であり得るということを理解するであろう。この
ことは、「プロセシビティー」（重合反応中にテンプレートに結合したままでいる酵素の
能力の尺度）が本質的に低い酵素である逆転写酵素の、第１鎖のｃＤＮＡ合成中における
ｍＲＮＡテンプレートのＤＮＡのコピーを完了しないことの結果である。
【００３６】
したがって、特定の実施形態において、本明細書中において提供されるポリヌクレオチ
ド配列情報は、以下に開示される選択されたポリヌクレオチドの遺伝子配列と特異的にハ
イブリダイズする能力を有する比較的短いＤＮＡ（又はＲＮＡ）オリゴヌクレオチド配列
の調製を可能にする。以下に使用する時、用語「オリゴヌクレオチド」は、２以上のデオ
キシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、通常は３より多い、及び、通常は１０より
多く、１００まで又はそれ以上の分子（好ましくは２０〜３０の範囲であるが）として規
定される。正確な大きさは多くの因子に依存し、すなわち、オリゴヌクレオチドの最終的
な機能又は用途にし得る。したがって、特定の実施形態において、適当な長さの核酸プロ
ーブは、選択されるヌクレオチド配列、例えば、配列番号３３〜配列番号６４に示される
ような配列の検討に基づいて調製される。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする、
かかる核酸プローブの能力は、様々な実施形態における特定の用途に役立つ。最も重要な
ことは、このプローブは、所定のサンプルにおける相補的配列の存在を検出するための様
々なアッセイにおいて使用できるということである。
【００３７】
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーを使用することが有利である
。これらのプライマーは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、又はこれらの組み合わせ等を
含む任意の様式で生成させることができる。かかるプライマーの配列は、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）技法を用いて、原核細胞からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするＯＲＦポリヌクレオチドの規定された断片を検
出、増幅又は変異させるのに使用するために、本明細書中に記載するポリヌクレオチドを
用いて設計される。
【００３８】
特定の実施形態において、ハイブリッド形成を検出するための適当な標識と組み合わせ
て、本明細書中に記載するポリヌクレオチドを使用することは有利である。様々の適当な
標識が当技術分野において知られており、例えば、放射性リガンド、酵素性リガンド又は
アビジン／ビオチン等のその他のリガンドを挙げることができ、これらは検出可能なシグ
ナルを生じ得る。
【００３９】
配列番号３３〜配列番号６４又はその断片の１つを含むヌクレオチド配列と同一又は実
質的に同一であるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ及びゲノムｃＤＮＡのためのハイブリダ
イゼーションプローブとして、又は核酸増幅（ＰＣＲ）反応のためのプライマーとして、
本明細書中に記載するポリペプチドをコードする完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単
離するために、及び、配列番号３３〜配列番号６４に示されるポリヌクレオチド配列又は
その断片との高い配列類似性を有するその他の遺伝子（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ以外の種由来のホモログ及び／又はオーソログをコードする遺伝
子を含む）のｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するために使用することができる。典型
的には、これらのヌクレオチド配列は、参照ポリヌクレオチド配列の配列と少なくとも約
７０〜９５％同一である。プローブ又はプライマーは、通常、少なくとも１５ヌクレオチ
ドを含み、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、また、少なくとも５０ヌクレオチド
を有し得る。特に好ましいプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有するであろう。
【００４０】
全長ｃＤＮＡを得るため、又は、例えば、ｃＤＮＡ末端迅速増幅法（ＲＡＣＥ）に基づ
いて、短いｃＤＮＡを延長するためには、当業者に利用可能な良く知られたいくつかの方
法が存在する。Ｆｒｏｈｍａｎ  ら，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ
８５，  ８９９８−９００２，  １９８８  参照。例えば、ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ技法
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によって例示される最近の
技法の改変は、より長いｃＤＮＡの探索を著しく単純化している。ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ
技法において、ｃＤＮＡは、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡから調製され、各末
端に「アダプター」配列が連結されている。次に、オリゴヌクレオチドプライマーに特異
的な遺伝子及びオリゴヌクレオチドプライマーに特異的なアダプターの組み合わせを用い
て、ｃＤＮＡの「失われた」５’末端を増幅するために、核酸増幅（ＰＣＲ）が行われる
。次に、「ネスト化」プライマー、すなわち、増幅産物中でアニールするように設計され
ているプライマー（典型的には、アダプター配列中のさらなる３’にアニールするプライ
マーに特異的なアダプター及び既知の遺伝子配列中のさらなる５’にアニールするプライ
マーに特異的な遺伝子）を用いて、ＰＣＲ反応が反復される。次に、この反応の生成物は
、ＤＮＡ配列決定法によって、及び、存在するｃＤＮＡに直接この生成物を結合させて完
全な配列を得るか、又は５’プライマー設計のための新規配列情報を用いて別個の全長Ｐ
ＣＲを行うことによって構築された全長ｃＤＮＡによって分析することができる。
【００４１】
本発明による特定の利点をもたらすために、ハイブリダイゼーション研究又はアッセイ
のために使用される好ましい核酸配列は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓポリペプチドをコードする少なくとも１０〜約７０ヌクレオチド長の幅のポリ
ヌクレオチドに相補的なプローブ分子、例えば、配列番号３３〜配列番号６４のうちの一
つに示されるものを含む。少なくとも１０ヌクレオチド長の大きさというのは、その断片
が、安定且つ選択的な二本鎖分子の形成に十分な長さとなり得ることを確実にするのに役
立つ。ところが、ハイブリッドの安定性及び選択性を増大させ、それにより、得られる特
異的ハイブリッド分子の質及び程度を向上させるためには、１０塩基長よりも大きな幅の
相補的配列を有する分子が一般的には好ましい。２５〜４０ヌクレオチド、５５〜７０ヌ
クレオチド、又は、所望される場合にはさらに長いストレッチの相補的遺伝子を有する核
酸分子を設計することが通常は好まれる。かかる断片は、例えば、化学的手段による断片
の直接的合成により、（米国特許第４，６８３，２０２号、参照により以下、本明細書中
に組み入れるものとする）のＰＣＲ技術等の核酸再製技法の適用により、又は、適当なイ
ンサート及び適当な制限酵素部位を含む組換えプラスミドからの選択されたＤＮＡ断片を
切り出すことにより、容易に調製することができる。
【００４２】
別の実施形態において、単離・精製されたポリヌクレオチドは、配列番号３３〜配列番
号６４のうちの一つの少なくとも１０個の連続する塩基部分と同一又は相補的なヌクレオ
チド配列を含み、このポリヌクレオチドはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが意図
されている。好ましくは、単離・精製されるポリヌクレオチドは、配列番号３３〜配列番
号６４のうちの一つの少なくとも２５〜約７０個の連続する塩基部分と同一又は相補的な
塩基配列を含む。例えば、このポリヌクレオチドは、開示されているヌクレオチド配列の
４０個又は５５個の連続する塩基と同一又は相補的な塩基部分を含むことができる。
【００４３】
したがって、ポリヌクレオチドプローブ分子は、遺伝子の相補的ストレッチと二本鎖分
子を選択的に形成するその能力のために使用することができる。目的とする用途に応じて
、標的配列に対するプローブの選択性の程度を変化させ得るためにハイブリダイゼーショ
ン条件を変化させることを利用し得る（以下表１参照）。高度の選択性が要求される用途
のために、通常は、ハイブリッドを形成させるために比較的ストリンジェントな条件を使
用することが所望され得る。いくつかの用途に対しては、例えば、内在するテンプレート
に対してハイブリダイズする変異プライマー鎖を用いて変異体を調製しようとする場合、
又は、その他の細胞からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ相同ポ
リペプチドコード配列、機能的均等物等を単離しようとする場合、ストリンジェンシーの
より低いハイブリダイゼーション条件が、通常、ヘテロ二本鎖の形成を可能とするために
必要とされる（表１参照）。クロスハイブリダイズしている種は、それによって、対照の
ハイブリダイゼーションに対する陽性のハイブリダイズシグナルとして容易に同定される
。すなわち、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作され、通常は、所望の結果に応じ
た方法の選択となり得る。
【００４４】
いくつかの用途に対しては、例えば、内在するテンプレートに対してハイブリダイズす
る変異プライマー鎖を用いて変異体を調製しようとする場合、又は、その他の細胞から相
同するポリペプチドのコード配列、機能的均等物等を単離しようとする場合、ストリンジ
ェンシーのより低いハイブリダイゼーション条件が、通常、ヘテロ二本鎖の形成を可能と
するために必要とされる。クロスハイブリダイズしている種は、それによって、対照のハ
イブリダイゼーションに対する陽性のハイブリダイズシグナルとして容易に同定される。
いずれの場合においても、温度の上昇と同様にハイブリッド二本鎖を不安定化させるよう
に機能する、より多くの量のホルムアミドを添加することにより、条件がよりストリンジ
ェントなものとされることが通常は好ましい。したがって、ハイブリダイゼーション条件
は容易に操作され、通常は、所望の結果に応じた方法の選択となり得る。
【００４５】
さらに、ストリンジェンシーが低減された条件、より好ましくはストリンジェントな条
件、及び、最も好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、以下に記載するポリヌク
レオチドとハイブリダイズし得るポリヌクレオチドが本明細書中に記載される。ストリン
ジェンシー条件の例を以下の表１に示す：高度にストリンジェントな条件は、例えば、条
件Ａ〜Ｆと少なくとも同じストリンジェントな条件であり；ストリンジェントな条件は、
例えば、条件Ｇ〜Ｌと少なくとも同じストリンジェントな条件であり；低減されたストリ
ンジェントな条件は、例えば、条件Ｍ〜Ｒと少なくとも同じストリンジェントな条件であ
る。
【００４６】
（表１）
（ストリンジェンシー条件）
【００４７】
【表１−１】
2013121981.tif 000002
【００４８】
【表１−２】
2013121981.tif 000003
（ｂｐ）Ｉ：ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドのハイブ
リダイズ領域に対して予想される。未知の配列の標的ポリヌクレオチドに対してあるポリ
ヌクレオチドをハイブリダイズさせる時、ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズしてい
るポリヌクレオチドの長さであると推定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブ
リダイズさせる時、ハイブリッドの長さは、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適な
配列相補性を示す領域又は複数の領域を同定することにより決定することができる。
緩衝液Ｈ：ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ
４、及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーション及び
洗浄緩衝液において、ＳＳＣ（ＩｘＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエ
ン酸ナトリウムである）と変更し得る；洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後、１
５分間行われる。
ＴＢ〜ＴＲ：５０塩基対長よりも短いと予想されるハイブリッド形成のためのハイブリダ
イゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くあるべきで
あり、この場合、Ｔｍは次の等式に従って決定される。１８塩基対長よりも短いハイブリ
ッドに対しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１
８〜４９塩基対長のハイブリッドに対しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ
１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリ
ッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイ
オンの濃度（１×ＳＳＣの場合の［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。
【００４９】
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件のさらな
る例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  
Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ
，第９及び１１章、並びに、Ａｕｓｕｂｅｌら，  １９９５，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，編，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅ
ｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，  セクション２．１０及び６．３−６．４に示され、これ
らの文献は参照により以下、本明細書中に組み入れるものとする。
【００５０】
（Ｂ．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのポリヌクレオチド）
特定の実施形態において、本発明は、免疫原性組成物中において使用するための単離・
精製されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを提供
する。好ましくは、本発明の免疫原性組成物中において使用されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドは、組換えポリペプチドである。特定の
実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチ
ドは、配列番号１〜配列番号３２、その生物学的均等物、又はその断片のうちの一つのア
ミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５１】
本発明の免疫原性組成物において使用されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドは、１）配列番号１〜配列番号３２のうちの一つに示される
アミノ酸配列；２）配列番号１〜配列番号３２のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの機能的及び非機能的な天然の改変体又は生物学的均等物
；３）配列番号１〜配列番号３２のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓポリペプチドの組換え生産された改変体又は生物学的均等物；及び４）Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ以外の生物から単離されたポリペプチド（す
なわち、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドオーソロ
グ）を含むポリペプチドを包含する。
【００５２】
かかるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの生物学
的均等物又は改変体は、１）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓか
ら単離されたポリペプチド；及び２）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓポリペプチドと実質的な相同性を含むポリペプチドを包含する。
【００５３】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの生物学的均等物又は改変体
は、機能的及び非機能的の両方のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓポリペプチドを含む。機能的な生物学的均等物又は改変体は、対象における免疫反応又
は抗原反応を引き起こす能力を保持するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓポリペプチドの天然のアミノ酸配列改変体である。機能的改変体は、通常、配列
番号１〜配列番号３２のうちの一つの１以上のアミノ酸の保存的置換のみ、又はポリペプ
チドの（例えば、抗原決定基又は保護エピトープを含む領域ではない）非重要領域の非重
要残基の置換、欠失、又は挿入を含むであろう。
【００５４】
本発明はさらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチ
ドの非Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓオーソログを提供する。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドのオーソログは、
非Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ生物から単離され、Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの抗原性を有するポリペプ
チドである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドのオ
ーソログは、配列番号１〜配列番号３２のうちの一つと実質的に相同なアミノ酸配列を含
むものとして容易に同定し得る。
【００５５】
改変及び変更が本発明のポリペプチドの構造において可能であり、依然としてＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ抗原性を有する分子が得られる。例えば
、特定のアミノ酸は、抗原性を感知される程度に損失することなく、配列中でその他のア
ミノ酸と置換することができる。そのことがポリペプチドの生物学的機能活性を規定する
ポリペプチドの相互作用能力及び特徴であることから、ポリペプチド配列（すなわち、当
然、その根底となるＤＮＡコード配列）中で特定のアミノ酸配列の置換を行わせることが
でき、その場合でも同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００５６】
かかる変異を作製する時に、アミノ酸のハイドロパシー・インデックスを検討すること
ができる。ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシー・イ
ンデックスの重要性は、当技術分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅ及びＤｏ
ｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  １５７：ｐ．１０５−１３２，  １９８２
）。特定のアミノ酸を、同様のハイドロパシー・インデックス又はスコアを有するその他
のアミノ酸と置換することができ、その場合でも同様の生物学的活性有するポリペプチド
を生じることが知られている。各アミノ酸に、その疎水性及び荷電特性に基づき、ハイド
ロパシー・インデックスを付与した。それらのインデックスは：イソロイシン（＋４．５
）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；シス
テイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリ
シン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−
０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グ
ルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；
アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００５７】
アミノ酸残基における相対的なハイドロパシー特性が、得られるポリペプチドの二次及
び三次構造を決定し、いいかえれば、このポリペプチドとその他の分子、例えば、酵素、
基質、受容体、抗体、抗原等との相互作用を規定すると信じられている。アミノ酸は同様
のハイドロパシー・インデックスを有する別のアミノ酸と置換することができ、依然とし
て機能的に均等なポリペプチドが得られることが当技術分野において知られている。かか
る改変の場合、ハイドロパシー・インデックスが＋／−２の範囲にあるアミノ酸の置換が
好ましく、＋／−１の範囲にあるアミノ酸の置換が特に好ましく、＋／−０．５の範囲に
あるアミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
【００５８】
同様のアミノ酸の置換は親水性に基づいて行うこともでき、特に、それにより作製され
る生物学的機能が均等であるポリペプチド又はペプチドの免疫学的実施形態における使用
が意図される場合に、行うことができる。米国特許第４，５５４，１０１号（以下、参照
により本明細書中に組み入れるものとする）は、ポリペプチドの最大局所的平均親水性が
、その隣接するアミノ酸の親水性に支配される時、その免疫原性及び抗原性と、すなわち
、ポリペプチドの生物学的特性と、相関することを記載している。
【００５９】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸
残基に付与されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸
塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラ
ギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５±１
）；スレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システ
イン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８
）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）
；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は同様の親水性値を有する別のアミノ酸と置換
することができ、依然として生物学的に均等な、特に免疫学的に均等なポリペプチドが得
られることが理解される。かかる改変の場合、親水性値が±２の範囲にあるアミノ酸の置
換が好ましく、±１の範囲にあるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５の範囲にある
アミノ酸の置換がさらに特に好ましい。
【００６０】
上記に概説したように、アミノ酸置換は、したがって、通常、アミノ酸側鎖置換基の相
対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。上記の各種特
性が考慮された典型的な置換が当業者には良く知られており、例えば：アルギニンとリジ
ン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギ
ン；バリン、ロイシンとイソロイシンを挙げることができる（以下、表２参照）。したが
って本発明は、上記に示したようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓポリペプチドの機能的又は生物学的均等物を含む免疫原性組成物を意図する。
【００６１】
（表２）
（アミノ酸置換）
【００６２】
【表２】
2013121981.tif 000004
ポリペプチドの生物学的又は機能的均等物は、部位特異的突然変異誘発法を用いて調製
することもできる。部位特異的突然変異誘発法は、第２世代のポリペプチド、すなわち、
コードするＤＮＡの特異的な突然変異誘発によってその配列から得られる生物学的機能が
均等なポリペプチド又はペプチドの調製において有用な技法である。上記のように、アミ
ノ酸置換が望ましい場合に、かかる変異が望ましい場合がある。この技法はさらに、配列
改変体を容易に調製して調べることを可能にし、例えば、１以上のヌクレオチド配列の変
異をＤＮＡに導入することにより、１以上の上述した検討が取り込まれる。部位特異的突
然変異誘発法は、横断している欠失連結部の両側に安定した二本鎖を形成させるように十
分な大きさと配列複雑性を有するプライマー配列を提供するための、所望の変異のＤＮＡ
配列をコードする特異的なオリゴヌクレオチド配列の使用と、十分な数の隣接するヌクレ
オチドとを介して変異体の産生を可能にしている。通常は、配列連結部の両側の約５〜１
０残基が変異している、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。
【００６３】
一般的に、部位特異的突然変異誘発技法は当技術分野において良く知られている。理解
され得るように、この技法は通常、一本鎖及び二本鎖の両方の形態で存在し得るファージ
ベクターを使用する。通常、本発明に従う部位特異的突然変異誘発は、選択されたＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチド配列の全て又は一部をコ
ードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターをまず初めに得ることにより行わ
れる。所望の変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーが（例えば、合成的に）調
製される。次に、このプライマーを一本鎖ベクターにアニーリングし、そして、変異を含
む鎖の合成を終了させるために、酵素、例えば、大腸菌ポリメラーゼＩクレノー断片の使
用により伸長させる。したがって、一方の鎖が元々の変異されていない配列をコードし、
第二の鎖は所望の変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。次に、このヘテロ二本鎖ベク
ターを用いて、大腸菌等の適当な細胞を形質転換し、変異を有する組換えベクターを含む
クローンを選択する市販のキットは、オリゴヌクレオチドプライマーを除く必要な試薬の
全てを伴っている。
【００６４】
本発明の免疫原性組成物において使用されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓポリペプチド又はポリペプチド抗原は、配列番号１〜配列番号３２のうち
の一つのアミノ酸配列を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポ
リペプチドに対しての実質的な配列類似性、構造類似性及び／又は機能的類似性を含む任
意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドであると理解
される。さらに、かかるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペ
プチド又はポリペプチド抗原は特定の供給源に限定されない。したがって、本発明は、様
々な供給源からのポリペプチドの一般的な検出及び単離を可能にする。
【００６５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドは、さらなる構
造又は機能分析、又は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ関連ポ
リペプチド及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ特異的抗体等の
試薬の製造において使用するため都合が良いように切断してもよいということが本発明に
おいて意図される。このことは、エンドプロテイナーゼｇｌｕ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）等のペプチダーゼによる精製又は非精製Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの処置により達成すること
ができる。ＣＮＢｒによる処置は、ペプチド断片をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドから産生し得る別の方法である。組換え技法もまた、Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの特異的な断片を産
生させるために用いることができる。
【００６６】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの断片は、本発
明の免疫原性組成物中にも含まれる。断片とは、全てではないが、部分的にアミノ酸配列
が完全に同じであるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。この断片は、例えば、配
列番号１〜配列番号３２のうちの一つのアミノ酸配列の少なくとも７以上（例えば、８、
１０、１２、１４、１６、１８、２０、又はそれ以上）の連続するアミノ酸を含み得る。
断片は「独立」していてもよいし、又は、部分若しくは領域、最も好ましくは一つの連続
した領域を形成するより大きなポリペプチドに含まれてもよい。一実施形態において、断
片は成熟ポリペプチド配列の少なくとも一つのエピトープを含む。
【００６７】
「融合タンパク質」とは、２つの、無関係であることも多い、融合された遺伝子又はそ
の断片によってコードされたタンパク質又はポリペプチドを意味する。例えば、別のヒト
タンパク質又はその部分を伴う様々な割合の免疫グロブリン分子定常領域を含む融合タン
パク質又はポリペプチドについて記載されている。多くの場合において、融合タンパク質
又はポリペプチドの部分として免疫グロブリンＦｃ領域を使用することは、治療及び診断
における使用に関して有利であり、例えば、薬物動態学特性の向上をもたらす（例えば、
国際出願ＥＰ−Ａ  ０２３２  ２６２１号参照）。一方、いくつかの用途に対しては、融
合タンパク質又はポリペプチドが発現され、検出され、精製された後にＦｃ部分が取り除
かれ得るのが望ましい。
【００６８】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドは、Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓから単離されてもよいし、又は本明細書中
に記載されるようにして組換え調製されてもよいことが意図される。
【００６９】
（Ｃ．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのポリヌクレオチド及
びポリペプチド改変体）
次の用語を以下において使用する時、「改変体」とは、参照ポリヌクレオチド又はポリ
ペプチドとはそれぞれ異なるが本質的な特性を維持しているポリヌクレオチド又はポリペ
プチドである。典型的なポリヌクレオチド改変体は、ヌクレオチド配列が、別の参照ポリ
ヌクレオチドと異なる。改変体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによ
ってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させる場合も、又は変化させない場
合もある。ヌクレオチドの変異は、以下において議論するように、参照配列によってコー
ドされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、及び切断を生じ得る
。典型的なポリペプチド改変体は、アミノ酸配列が、別の参照ポリペプチドと異なる。一
般的に、参照ポリペプチドと改変体の配列は全体的に非常に類似しており、多くの領域に
おいては同一であるように、その違いは限られている。改変体と参照ポリペプチドとは、
アミノ酸配列が、任意の組み合わせの１以上の置換、付加、欠失により異なっていてもよ
い。置換される又は挿入されるアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされる一つで
あってもよいし、又はそうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの改変体
は天然のもの、例えば、アレル改変体であってもよいし、又は、天然に存在することが知
られていない改変体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在し
ない改変体は、突然変異誘発技法又は直接合成により作製することができる。
【００７０】
当技術分野において知られている「同一性」とは、配列同士を比較することにより決定
される、２以上のポリペプチド配列間又は２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である
。当技術分野において、「同一性」は、場合によっては、かかる配列の列同士の一致によ
り決定される、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列関係性の程度をも意味す
る。「同一性」及び「類似性」は既知の方法により容易に計算することができ、かかる方
法の例としては、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．，編，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ
：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ
，  Ｄ．Ｗ．，  編，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９
３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐ
ａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．，
編，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  
Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  ａｎｄ  Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．ａｎｄ  
Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  編，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙ
ｏｒｋ，  １９９１；  ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  
Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：  １０７３  （１９８８
）等に記載されるものを挙げることができる。同一性を決定する方法は、調べる配列間で
最大の一致が得られるように設計される。同一性及び類似性を決定する方法は、公に利用
可能なコンピュータプログラムとして体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似
性を決定するためのコンピュータプログラム方法としては、限定するものではないが、Ｇ
ＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７，  １９８４），  ＢＬＡＳＴＰ，  ＢＬＡＳＴＮ，
ＴＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．
２１５：４０３−４１０，  １９９０）を挙げることができる。ＢＬＡＳＴＸプログラ
ムは、ＮＣＢＩ及びその他の情報源から公に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ
，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．，  ら，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ
，  Ｍｄ．  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．  ２１
５：４０３−４１０，  １９９０．）。周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズ
ムも、同一性の決定のために使用することができる。
【００７１】
例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列は、配列番号３３〜配列番号６
４のうちの一つの参照配列と同一、すなわち１００％同一であってもよく、又は、参照配
列と比較した時に、特定の整数個までのヌクレオチドの変化を含んでもよい。かかる変化
は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、転移及び塩基転換を含む置換、又は挿入から
なる群から選択され、この変化は参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の位置、或い
は、これらの末端位置の間の任意の場所で生じることができ、参照配列中のヌクレオチド
間に個々に、又は、参照配列中の１以上の連続するグループ内に散在する。ヌクレオチド
の変化の数は、配列番号３３〜配列番号６４のうちの一つにおける総ヌクレオチド数を、
各パーセント同一性のパーセント数値（１００で割る）に掛けて、配列番号３３〜配列番
号６４のうちの一つにおける総ヌクレオチド数からその積を引くことにより決定される。
【００７２】
例えば、配列番号３３〜配列番号６４のうちの一つの核酸配列と少なくとも７０％の同
一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅ
ｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチド、その縮重改変体又はその断片は、このポリヌク
レオチド配列が、配列番号３３〜配列番号６４のうちの一つの核酸配列のポリヌクレオチ
ド領域全体にわたり最大ｎｎ個の核酸の変異を含み得、ｎｎが変異の最大数である場合、
次式により計算される：
ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
式中、ｘｎは配列番号３３〜配列番号６４のうちの一つの核酸の合計数であり、ｙは０．
７０の値を有し、この場合、ｘｎとｙの任意の非整数の積は、ｘｎからその積を引く前に
最も近い整数に端数が切り捨てられる。当然、ｙはまた、８０％に対しては０．８０、８
５％に対しては０．８５、９０％に対しては０．９０、９５％に対しては０．９５等の値
を有し得る。配列番号１〜配列番号３２のポリペプチドの一つをコードするポリヌクレオ
チドの変異は、このコード配列におけるナンセンス、ミスセンス又はフレームシフト変異
を生じ、それにより、かかる変異後のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
を変異させる。
【００７３】
同様に、本明細書中に記載されるポリペプチド配列は、配列番号１〜配列番号３２のう
ちの参照配列と同一、すなわち１００％同一であってもよく、又は、参照配列と比較した
時に、特定の整数個までのアミノ酸の変異を含んでもよく、％同一性は１００％未満であ
る。かかる変異は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、保存的及び非保存的置換を含む置
換、又は挿入からなる群から選択され、この変異は参照ポリペプチド配列のアミノ又はカ
ルボキシ末端の位置、或いは、これらの末端位置の間の任意の場所に生じることができ、
参照配列中のアミノ酸の間に個々に、又は、参照配列中の１以上の連続するグループ内に
散在していてもよい。所定の％同一性に対するアミノ酸の変異の数は、配列番号１〜配列
番号３２のうちの一つにおける総アミノ酸数を、各パーセント同一性のパーセント数値（
１００で割る）に掛けて、配列番号１〜配列番号３２のうちの一つにおける総アミノ酸数
からその積を引くことにより、すなわち、式：
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ）
式中、ｎａはアミノ酸の変異の数であり、ｘａは配列番号１〜配列番号３２のうちの一つ
のアミノ酸の合計数であり、ｙは、７０％に対しては０．７０、８０％に対しては０．８
０、８５％に対しては０．８５等であり、この場合、ｘａとｙの任意の非整数の積は、ｘ
ａからその積を引く前に最も近い整数に端数が切り捨てられる。
【００７４】
（Ｄ．ベクター、宿主細胞及び組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓポリヌクレオチド）
一実施形態において、本発明は、免疫原性組成物中に使用するためのＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするＯＲＦポリヌクレオチ
ドを含む、発現ベクターを提供する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉ
ｄｉｓ発現ベクターは、配列番号１〜配列番号３２のアミノ酸残基配列を含むＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコードする、ＯＲＦポリヌ
クレオチドを含む。あるいは、発現ベクターは、配列番号３３〜配列番号６４の１つのヌ
クレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。その他の実施形態において、本発明
の発現ベクターは、エンハンサー−プロモーターへと動作可能に連結されたポリヌクレオ
チドを含む。さらに別の実施形態において、発現ベクターは、原核生物プロモーターへと
動作可能に連結されたポリヌクレオチドを含む。あるいは、発現ベクターは、真核生物プ
ロモーターであるエンハンサー−プロモーターへと動作可能に連結されたポリヌクレオチ
ドを含む。発現ベクターは、カルボキシ末端アミノ酸の３’及びコードされたポリペプチ
ドの転写単位内に位置するポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００７５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質のいずれかを発現さ
せる構成的な又は誘導的なプロモーターを含有するベクターにより、Ｅ．ｃｏｌｉ中で最
もしばしば行われる。融合ベクターは、その中にコードされたタンパク質に対し、その組
換えタンパク質のアミノ末端に多数のアミノ酸を加える。そのような融合ベクターは通常
、３つの目的で役目を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加する；２）組換えタン
パク質の溶解性を向上させる；及び３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用
することにより、組換えタンパク質の精製を助ける。しばしば発現ベクターにおいては、
融合タンパク質の精製に続く、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするため
、原核生物の開裂部位が融合部分及び組換えタンパク質の結合部に導入される。このよう
な酵素、及びそれらの同族の認識配列は、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを
含む。
【００７６】
典型的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎ
ｃ；Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ，  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０，  １９８８）、ｐ
ＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ；  ＭＡ）及びｐ
ＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を含み、それらはグ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロ
テインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合する。
【００７７】
一実施形態において、Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＧＳＴ−トロンビン開裂部位−Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを含む融合タンパク質
をコードするベクターを創出するために、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓポリヌクレオチドのコード配列をｐＧＥＸ発現ベクターへとクローニングする
。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を用いたアフィニティークロマログ
ラフィーにより精製することができる。ＧＳＴへと融合されていない組換えＳｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドは、トロンビンを用いた融合タ
ンパク質の開裂によって回収することができる。
【００７８】
誘導性の非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの好適な例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ
ら，  Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５，  １９８８）、ｐＥＴ  ＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉ
ｅｒ  ら．  “Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”  Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  ６０−８９，  １９９０）、ｐＢＡＤ及
びｐＣＲＴ７が挙げられる。ｐＴｒｃベクター由来の標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔ
ｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ  
ＩＩｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウィルスＲＮＡポリメラーゼＪ７
ｇｎｌにより介在されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する
。このウィルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７ｇｎｌ
遺伝子を保持する耐性プロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（
ＤＥ３）によって供給される。
【００７９】
Ｅ．ｃｏｌｉ中での組換えタンパク質の発現を最大化するための１方策は、その組換え
タンパク質をタンパク質分解的に開裂させる能力を損なった宿主細菌中で、そのタンパク
質を発現させることである。別の方策は、各アミノ酸に関する個々のコドンが、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中へと挿入する核酸の核酸
配列を変えることである。本発明の核酸配列におけるこのような改変は、標準的なＤＮＡ
変異又は合成手法により実行可能である。
【００８０】
別の実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリ
ヌクレオチド発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに
おける発現用ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ  Ｉ（Ｂａｌｄａｒｉら，  Ｅｍｂｏ  
Ｊ，  ６：ｐ．  ２２９−２３４，１９８７）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋ
ｏｗｉｔｚ，  Ｃｅｌｌ，  ｐ．  ９３３−９４３，  １９８２）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃ
ｈｕｌｔｚ  ら．Ｇｅｎｅ，  ５４：  ｐ．  １１３−１２３，  １９８７）、及びｐＹ
ＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃ
Ａ）が挙げられる。
【００８１】
別の方法において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌク
レオチドは、例えば、バキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現させるこ
とができる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中でのタンパク質発現が可能なバキュ
ロウィルスベクターの例には、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉ
ｏｌ，  ３：ｐ．  ２１５６−２１６５，  １９８３）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌ
ｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １７０：ｐ．  ３１−３９，  １９８
９）が挙げられる。
【００８２】
さらに別の実施形態において、本発明の核酸は哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物
細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（ＮＡｔｕｒｅ，  ３
２９：ｐ．  ８４０，  １９８７参照）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ
Ｊ，  ６：ｐ．  １８７−１９５，  １９８７）が挙げられる。哺乳動物細胞中で用い
られる場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウィルスの調節エレメントにより提供
される。
【００８３】
以下に使用される時、プロモーターは通常、転写が開始する点（すなわち、転写開始点
）の前（上流）の約１００ヌクレオチド対の範囲内のＤＮＡ分子における領域である。こ
の領域は通常、異なる遺伝子中で類似する相対的な位置に配置されるいくつかのタイプの
ＤＮＡ配列エレメントを含む。以下に用いられるように、用語「プロモーター」は、プロ
モーター領域の上流、プロモーター領域、又は汎用の真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写ユ
ニットにおけるプロモーターであるとして技術的に称されるものを含む。
【００８４】
別のタイプの個別的な転写調節配列エレメントがエンハンサーである。エンハンサーは
、特定のコード領域（例えば、遺伝子）に関して、時間、部位及び発現レベルにおける特
異性を提供する。エンハンサーの主要な機能は、そのエンハンサーに結合した１以上の転
写因子を含む細胞中のコード配列における転写レベルを増加させることである。プロモー
ターとは異なり、エンハンサーは、プロモーターが存在している限り、転写開始点から様
々な距離で離れて配置された場合にも機能し得る。
【００８５】
以下に使用される時、語句「エンハンサー−プロモーター」は、エンハンサー及びプロ
モーターエレメントの両方を含む複合単位を意味する。エンハンサー−プロモーターは、
少なくとも１つの遺伝子産物をコードする、動作可能に連結されたコード配列である。以
下に使用される時、語句「動作可能に連結された」は、エンハンサー−プロモーターが、
コード配列の転写がこのエンハンサー−プロモーターによって制御及び調節されるような
方法によってコード配列へと連結されることを意味する。エンハンサー−プロモーターを
コード配列へと動作可能に連結するための手段は技術的に良く知られている。技術的に良
く知られているように、その調節が制御されるコード配列に関する正確な方向および配置
は、特に、そのエンハンサー−プロモーターの特異的な特性に依存する。すなわち、ＴＡ
ＴＡ  ｂｏｘ最小プロモーターは、典型的には転写開始部位の約２５〜３０塩基対上流に
位置し、上流プロモーターエレメントは、典型的には転写開始部位の約１００〜２００塩
基対上流に位置する。対照的に、エンハンサーは、転写開始部位の下流に、この部位から
かなり離れて配置され得る。
【００８６】
本明細書中に記載のベクター構築物中に使用されるエンハンサー−プロモーターは、ト
ランスフェクトされる細胞中における発現を推進させる任意のエンハンサー−プロモータ
ーであり得る。よく知られた特性を有するエンハンサー−プロモーターを利用することに
より、遺伝子産物の発現レベル及び発現パターンを最適化することができる。
【００８７】
例えば、一般的に用いられるプロモーターとしては、ポリオーマ、アデノウィルス２、
サイトメガロウィルス及びシミアンウィルス４０由来のものがある。原核及び真核細胞の
両方に関するその他の好適な発現系に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  “Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  ２ｎｄ，  ｅ
ｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓ
ｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉ
ｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９の１６章及び１７章を参照、参照により以下に
組み入れるものとする。
【００８８】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ（例えば、
核酸を発現させるために組織特異的な調節エレメントが用いられる）
において優先的に核酸を発現させることが可能である。組織特異的な調節エレメントは技
術的に知られている。好適な組織特異的なプロモーターの非限定的な例としては、アルブ
ミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ，  １：ｐ．２６
８−２７７，  １９８７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ及びＥａｔｏｎ
，  Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ４３：ｐ．２３５−２７５，  １９８８）、特に、Ｔ細
胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＥＭＢＯ  Ｊ，  ８
：ｐ．７２９−７３３，  １９８９）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら，  Ｃｅｌ
ｌ，  ３３：ｐ．７２９−７４０，  １９８３）、（Ｑｕｅｅｎ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ
，  Ｃｅｌｌ，  ３３：  ｐ．  ７４１−７４８，  １９８３）、神経細胞特異的プロモ
ーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ及びＲｕｄｄｌｅ，  ＰＮ
ＡＳ，  ８６：ｐ．５４７３−５４７７，  １９８９）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄ
ｌｕｎｄら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：  ｐ．  ９１２−９１６，  １９８５）、及
び乳腺特異的なプロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター；米国特許第４，８７
３，３１６号及び国際出願ＥＰ２６４，１６６号）が挙げられる。発達上調節を受けるプ
ロモーターもまた包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ及びＧｒ
ｕｓｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９：ｐ．３７４−３７９，  １９９０）及びα−フェ
トプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ及びＴｉｌｇｈｍａｎ，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ，
３：  ｐ．  ５３７−５４６，  １９８９）が挙げられる。
【００８９】
本明細書中において、アンチセンスの向きで発現ベクターへとクローニングされたＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするＤＮＡ分
子を含む組換え発現ベクターもまた提供される。すなわち、このＤＮＡ分子は（ＤＮＡ分
子の転写により）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓｍＲＮＡに対
しアンチセンスなＲＮＡ分子の発現を可能にするやり方で、調節配列へと動作可能に連結
される。アンチセンス方向でクローニングされ動作可能に連結された、各種の細胞タイプ
におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を方向づける調節配列を選択することが
できる。例えば、アンチセンスＲＮＡの恒常的、組織特異的又は細胞タイプ特異的な発現
を方向付けるウィルスのプロモーター及び／又はエンハンサー、又は調節配列を選択する
ことができる。アンチセンス発現ベクターは組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化
ウィルスの形態であることができ、その場合アンチセンス核酸は高性能調節領域の制御下
で産生され、その活性はベクターが導入される細胞タイプにより決定することができる。
【００９０】
本明細書中に記載の組換え発現ベクターは、任意の好適な宿主細胞へと挿入することが
できる。用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は以下、同義的に用いられる。このよ
うな用語は特定の検体細胞のみを称するものではなく、このような細胞の子孫又は潜在的
子孫をも称することが理解される。突然変異又は環境影響のいずれかにより、後世におい
てある種の修飾が生じ得る可能性があるため、このような子孫は実際に親細胞と同一では
ない場合があるが、その場合も、以下に用いられるようにこの用語の範囲内に包含される
。宿主細胞は任意の原核又は真核細胞であり得る。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌細胞、昆虫細胞（Ｓ
ｆ９、Ｓｆ２１等）、酵母又は哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ
）、ＶＥＲＯ、ニワトリ胚繊維芽細胞、ＢＨＫ細胞又はＣＯＳ細胞等）等において発現さ
れ得る。その他の好適な宿主細胞は当業者に知られている。
【００９１】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換、感染又はトランスフェクション手法を介して原核
又は真核細胞へと導入する。以下に用いるように、用語「形質転換」及び「トランスフェ
クション」は、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞へと導入するための技術的に知られ
た各種の手法を称することが意図され、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム又は共沈殿
、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、超音波又はエ
レクトロポレーション等を含む。宿主細胞の好適なトランスフォーメーション又はトラン
スフェクションの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ
：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  ２ｎｄ，  ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒ
ｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏ
ｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  
ＮＹ，  １９８９）及びその他のラボラトリーマニュアル中に見いだすことができる。
【００９２】
培養において、原核又は真核宿主細胞等の本明細書中に記載する宿主が、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを生産（すなわち、発現）する
ために使用される。従って、このような宿主細胞を用いたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの生産方法も本明細書中に記載される。一実施形
態において、この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリ
ペプチドが生産されるまで、好適な培地中で培養宿主細胞（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコードする組換え発現ベクターがその中へと
導入される）を培養することを含む。別の実施形態において、この方法は、培地又は宿主
細胞からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを単離す
ることをさらに含む。
【００９３】
発現ベクターのコード配列は、転写終了領域へと動作可能に連結される。ＲＮＡポリメ
ラーゼは、ポリアデニル化が生じる部位を経由して、コーディングＤＮＡ配列を転写する
。典型的には、ポリアデニル化部位から数百塩基対下流に配置されたＤＮＡ配列が、転写
を終了させる役割を果たす。それらのＤＮＡ配列を以下、転写終了領域と称する。それら
の領域は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の効率的なポリアデニル化のた
めに必要とされる。転写終了領域は当技術分野において良く知られている。このような転
写終了領域の例としては、ＳＶ４０及びプロタミン遺伝子のポリアデニル化シグナルが挙
げられる。
【００９４】
発現ベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリペプチドは、非Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド部
分から区別するために十分な長さを有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするヌクレオチド塩基配列を含むことが意図される。こ
のようなポリペプチドはまた、交換されるアミノ酸の相対ハイドロパシースコア等の考慮
に基づいて選択される変異等の変異アミノ酸配列を有する、生物学的機能を有するポリペ
プチド又はペプチドをコードすることもできる。これらの変異配列は、天然起源のものか
ら単離され、又は部位特異的突然変異等の突然変異手法を用いて、以下に開示される配列
において誘導されるものである。
【００９５】
特定の実施形態において、本明細書中に記載する発現ベクターは、配列番号１〜配列番
号３２のうち１つのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチ
ドを含む。発現ベクターは、任意の上述のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓポリペプチドにおける、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓポリペプチドのコード領域自身を含み得、あるいは、選択された変異を有するコーデ
ィング領域又はそのようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリ
ペプチドの塩基のコーディング領域における変化を含み得る。あるいは、このようなベク
ター又は断片は、塩基のコーディング領域を含むが、より大きな単数ポリペプチド又は複
数ポリペプチドをもコードし得る。いずれの事象においても、コドンの過剰性並びに生物
学的機能的な等価性によって、この態様が上述のポリペプチド配列に相当する特定のＤＮ
Ａ分子に限定されないことが理解されるべきである。
【００９６】
例示的なベクターには、ｐＣＭＶ６ｂ及びｐＣＭＶ６ｃ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，
Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ．）を含むｐＣＭＶファミリーの哺乳動物発現ベクターを
含む。ある種の場合において、また、これら個々の哺乳動物発現ベクターの場合に特異的
に、得られる構築物はｐＳＶ２ｎｅｏ等の選択可能なマーカーを含有するベクターを用い
た共トランスフェクションを必要とし得る。ＤＧ４４等のジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャ
イニーズハムスター卵巣細胞株への共トランスフェクションを介して、Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを発現するクローンを、このような
発現ベクターへと取り込まれるＤＮＡの効果によって検出することができる。
【００９７】
ＤＮＡ分子は、当技術分野において良く知られている数多くの手法によって、ベクター
へと取り込むことができる。例えば、ベクターｐＵＣ１８は、遺伝子のクローニング及び
発現において特別の価値があるものであることが示されている。同様に、関連するベクタ
ーであるＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９は、本発明特定の実施形態において、特に、
ジデオキシシーケンシングを行う際に使用され得る。
【００９８】
本明細書中に記載の発現ベクターは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓポリペプチドをコードするＤＮＡ自体を多量に調製する手段として、また、コー
ドされたポリペプチド及びペプチドを調製する手段としての両方に有用である。Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを組換え手法により作る場
合に、原核又は真核発現ベクターのいずれかをシャトルシステムとして利用できることが
意図される。
【００９９】
別の態様において、組換え宿主細胞は原核宿主細胞である。好ましくは、本発明の組換
え宿主細胞は大腸菌ＤＨ５α株の細菌細胞である。一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニ
ング及び本発明において有用なベクターを構築するためには原核生物が好ましい。例えば
、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株は特に有用である。使用可能なその他の微生物株としては、Ｅ
．ｃｏｌｉ  Ｂ及びＥ．ｃｏｌｉＸ１９７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）が挙げられ
る。これらの例は勿論、限定的なものではなく説明的なものであることが意図される。
【０１００】
前述の株ならびにＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３３２５）、Ｅ．
ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）又はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（又は米国特許第４，８３７，１５１号に記載される
ようなその他の弱毒化サルモネラ株）等のその他の腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉａｃｅａｅ）、又はセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａ
ｎｓ）及び各種の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種が使用可能である。
【０１０１】
通常、宿主細胞に適合した種に由来するレプリコン及び制御配列を含有するプラスミド
ベクターが、これらの宿主と結合して使用される。ベクターは通常、複製部位ならびに形
質転換した細胞中での表現形的な選択を提供可能なマーカー配列を保持する。例えば、Ｅ
．ｃｏｌｉはＥ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら，
１９７７）を用いて形質転換することができる。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含み、したがって形質転換された細胞の同定するための容易な手
段を提供する。ｐＢＲプラスミド又はその他の微生物プラスミド又はファージは、それ自
身のポリペプチドを発現するために微生物によって使用され得るプロモーターを含んでい
なくてはならず、あるいは含むように改変されなくてはならない。
【０１０２】
組換えＤＮＡ構築物中で最も通常的に使用されるそれらのプロモーターには、β−ラク
タマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら  １９７８；
Ｉｔａｋｕｒａら  １９７７，  Ｇｏｅｄｄｅｌら  １９７９；Ｇｏｅｄｄｅｌら  １９
８０）及びトリプトファン（ＴＲＰ）プロモーター系（欧州特許第００３６７７６号；Ｓ
ｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔら  １９８０）を含む。これらが最もよく使用される一方、その他
の微生物プロモーターが見いだされ、利用され、それらのヌクレオチド配列に関する詳細
が公表されて、熟練者が機能的プロモーターをプラスミドベクターへと導入することを可
能にしている（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔ，  ら  １９８０）。
【０１０３】
原核微生物に加えて、酵母等の真核微生物も使用することができる。多数のその他の株
が通常的に入手可能であるが、真核微生物の中では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はよく知られたパン酵母が最も通常
的に使用される。サッカロミセス中での発現のために、プラスミドＹＲｐ７が例えば通常
的に使用される（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら  １９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら  １９７９；
Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら  １９８０）。このプラスミドは、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４
０７６又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，  １９７７）等の、トリプトファン中で生育する
能力を欠く酵母の突然変異株に関する選択マーカーを提供するｔｒｐｌ遺伝子を既に含む
。酵母宿主細胞ゲノムにおける特徴としてのｔｒｐｌ欠損の存在は、その結果、トリプト
ファン非存在下での生育によって形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０１０４】
酵母ベクターにおける好適なプロモーター配列には、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
（Ｈｉｔｚｅｍａｎら  １９８０）、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキ
ナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ及びグルコキナーゼ等のその他の糖分解
酵素（Ｈｅｓｓら  １９６８；Ｈｏｌｌａｎｄら  １９７８）のプロモーターを含む。好
適な発現プラスミドを構築する際に、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び終止を提供するため
に、これらの遺伝子に関する終止配列もまた、発現ベクターの発現される配列の下流へと
導入される。生育条件により制御される転写において、好都合なさらなるその他のプロモ
ーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、
窒素代謝に関連した分解酵素、及び上述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素に関するプロモーター領域
がある。酵母に適合したプロモーター、複製基点又は複製及び終止配列を含有する任意の
プラスミドベクターが好適である。
【０１０５】
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として使用される。原理としては
、脊椎動物又は無脊椎動物培養物のいずれの由来であろうと、任意のそのような細胞培養
物が使用可能である。しかし、脊椎動物細胞において最大の関心が払われており、脊椎動
物細胞を培養物で増殖させること（組織培養）が近年は常法となっている。このような有
用な宿主細胞の例には、ＡｔＴ−２０、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＮＳＯ、ＰＥＲＣ６、チャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、及びＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳＭ６、ＣＯＳ
−７、２９３及びＭＤＣＫ細胞株がある。このような細胞に関する発現ベクターは本来、
（必要な場合）複製基点、任意の必要なリボソーム結合部位を伴って発現される遺伝子の
上流に配置されたプロモーター、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位及び転
写終結配列を含む。
【０１０６】
組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの発現が
所望され、真核生物宿主が意図される場合、真核生物の複製基点を取り込むプラスミドの
ようなベクターを利用することが最も望まれる。さらに、真核生物系での発現を目的とし
て、チャイニーズハムスター卵巣細胞と組み合わせて用いるプロモーター等の有効な真核
プロモーターに隣接してその制御下に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓをコードする配列を配置することが所望される。真核又は原核のいずれのもので
あろうと、コード配列をプロモーターの制御下に置くためには、ポリペプチドの適切な翻
訳リーディングフレームにおける翻訳開始領域の５’末端は、選択されるプロモーターに
対し、約１〜約５０ヌクレオチド３’側又は下流に配置されなければならない。さらに、
真核生物での発現が見込まれる場合は通常、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを転写ユニットへと取り込むこ
とが所望される。
【０１０７】
細胞をＤＮＡ分子等の外在性のポリヌクレオチドにより形質転換又はトランスフェクシ
ョンを行うための手段は当技術分野において良く知られており、リン酸カルシウム又はＤ
ＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレ
ーション、リポソーム介在トランスフェクション、直接マイクロインジェクション及びア
デノウィルス感染（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，
１９８９参照）等の手法を含む。
【０１０８】
最も広範に使用される方法は、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−デキストランのいずれ
かにより介在されるトランスフェクションである。そのメカニズムには不明な点も残るが
、トランスフェクトされたＤＮＡが細胞の細胞質へとエンドサイトーシスにより入り、核
へ輸送されることが信じられている。細胞のタイプに依存して、培養細胞の９０％までが
常に輸送され得る。この高い効率によって、外来ＤＮＡを多数の細胞において一時的に発
現させる必要がある実験に関し、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−デキストラン介在トラ
ンスフェクションが選択される方法となっている。リン酸カルシウム介在トランスフェク
ションはまた、通常ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌタンデムアレイに配置される外来ＤＮＡの
コピーを宿主細胞ゲノムへと統合する細胞株を構築するためにも用いられる。
【０１０９】
プロトプラスト融合法において、高コピー数の対象プラスミドを保持する細菌由来のプ
ロトプラストを、培養哺乳動物細胞と直接混合する。（通常ポリエチレングリコールによ
る）細胞膜の融合後、細菌の内容物は哺乳動物細胞の細胞質へと輸送され、プラスミドＤ
ＮＡは核へと輸送される。プロトプラスト融合は、一時的な発現アッセイに通常用いられ
る多くの細胞株に関するトランスフェクションほどには効率的でないが、ＤＮＡのエンド
サイトーシスが十分な効率で起こらない細胞株に関しては有用である。プロトプラスト融
合はしばしば、宿主染色体へとタンデムに統合された複数コピーのプラスミドＤＮＡをも
たらす。
【０１１０】
各種の哺乳動物及び植物細胞へと短い高電圧の電気パルスを適用することは、原形質膜
中にナノメートルサイズの孔を形成させる。これらの孔を通じて、又はその孔の閉鎖に伴
う膜成分の再分布の結果としてのいすれかによって、ＤＮＡは直接的に細胞質へと取り込
まれる。エレクトロポレーションは非常に効率的であり得、クローニングされた遺伝子の
一時的発現のため、及び対象遺伝子の取り込まれたコピーを担持する細胞株の構築のため
に使用することができる。エレクトロポレーションは、リン酸カルシウム介在トランスフ
ェクション及びプロトプラスト融合とは対照的に、１つ又は多くても数個の外来ＤＮＡの
取り込まれたコピーを担持する細胞株をしばしば生じる。
【０１１１】
リポソームトランスフェクションは、リポソーム内へのＤＮＡ及びＲＮＡのリポソーム
内への封入を伴い、次いで、リポソームと細胞膜とが融合される。ＤＮＡがどのように細
胞に送達されるのかのメカニズムは明らかではないが、トランスフェクション効率は９０
％の高さとなり得る。
【０１１２】
ＤＮＡ分子の核への直接的マイクロインジェクションは、低ｐＨエンドソーム等の細胞
画分にＤＮＡを曝露しないという利点を有する。従ってマイクロインジェクションは、対
象となるＤＮＡの集積されたコピーを有する細胞系を確立するための方法として、主とし
て用いられる。
【０１１３】
細胞トランスフェクションのためのベクターとしてのアデノウィルスの使用は、当技術
分野において良く知られている。アデノウィルスベクター介在性細胞トランスフェクショ
ンが各種細胞について報告されている（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら
，  １９９２）。
【０１１４】
トランスフェクトされた細胞は原核性又は真核性であることができる。好ましくは、本
発明の宿主細胞は原核宿主細胞である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓポリペプチドを製造することに関心が持たれている場合は、培養原核宿主細胞が
対象となる。
【０１１５】
さらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドを用いて、細胞の形質転換、トランスフェクション又は感染によ
って形質転換された宿主細胞を産生させる工程及び、ポリペプチドの発現のために十分な
生物学的条件下で形質転換された宿主細胞を維持する工程を含む、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドの製造プロセス又は方法が本発明におい
て意図される。特定の実施形態において、形質転換される宿主細胞は原核細胞である。あ
るいは、宿主細胞は真核細胞である。より特定的には、原核細胞は大腸菌ＤＨ５−α株の
細菌細胞である。あるいは、形質転換細胞中へトランスフェクトされるポリヌクレオチド
は、配列番号３３から配列番号６４のうちの１つの核酸配列を含む。さらに、トランスフ
ェクションは、上記に開示された発現ベクターを用いて達成される。本方法において使用
される宿主細胞は、機能的な組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓポリペプチドを発現し得る。
【０１１６】
トランスフェクションの次に、細胞は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓポリペプチドの発現のために十分な期間、培養条件下で維持される。培養条件
は当技術分野において良く知られており、イオン組成及び濃度、温度、ｐＨ等が含まれる
。通常、トランスフェクトされた細胞は培養培地中の培養条件下で維持される。様々な細
胞型のための好適な培地が当技術分野において良く知られている。特定の実施形態におい
て、培養温度は、約２０℃〜約５０℃、より好ましくは約３０℃〜約４０℃、及び、さら
により好ましくは約３７℃である。
【０１１７】
ｐＨは、好ましくは約６．０の値〜約８．０の値、より好ましくは約６．８の値〜約７
．８の値、及び、最も好ましくは約７．４である。重量オスモル濃度は、好ましくは１リ
ットル当たり約２００ミリオスモル（ｍｏｓｍ／Ｌ）〜約４００ｍｏｓｍ／Ｌ、及び、よ
り好ましくは約２９０ｍｏｓｍ／Ｌ〜約３１０ｍｏｓｍ／Ｌである。コードされるタンパ
ク質のトランスフェクション及び発現に必要とされるその他の生物学的条件は当技術分野
において良く知られている。
【０１１８】
トランスフェクトされた細胞は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓポリペプチドの発現にとって十分な期間維持される。好適な時間は特に使用される細
胞型に依存し、当業者によって容易に決定され得る。通常は、維持時間は約２〜約１４日
間である。
【０１１９】
組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドは、トラ
ンスフェクトされた細胞又はそれらの細胞が培養されている培地のいずれかから回収又は
収集される。回収はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチ
ドの単離及び精製を含む。ポリペプチドのための単離及び精製技法は当技術分野において
良く知られており、例えば、沈殿、濾過、クロマログラフィー、電気泳動等の手順が挙げ
られる。
【０１２０】
（Ｅ．免疫原性組成物）
本発明は、以下の実施例に記載するような、選択される１以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチド及び薬学上許容可能な担体からなる免疫
原性組成物を提供する。特定の実施形態において、この免疫原性組成物は、配列番号１〜
３２の１以上のアミノ酸残基配列からなる１以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを含む。その他の実施形態において、本発明の免疫原性
組成物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド及び薬学上許容可能な担体を含む。例えば、本発明の免疫原性組
成物は、配列番号１〜３２の１以上のアミノ酸残基配列を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを含む。別の方法において、この免疫原性組
成物は、配列番号３３〜６４の１以上のアミノ酸残基配列を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを含む。
【０１２１】
各種試験は、本発明のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの免疫原性を調べるために使用
した。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細胞、問題のポ
リペプチドに対し特異的な抗体を含有する熱失活ヒト血清、及び外因性成分源の混合物を
インキュベートすることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏオプソニンアッセイを行う。オプソニン
の食作用は、新鮮な単離されたヒト多核白血球（ＰＭＮ）、及び抗体／相補体／ブドウ球
菌細胞混合物のインキュベーションの間に進展する。抗体及び相補体で覆われた細菌細胞
はオプソニン食作用の際に死滅させられる。オプソニン食作用から逃れて生き残った細菌
のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を、アッセイ混合物のプレーティングによって調べる。力
価は、アッセイ対照と比較することにより調べた時に≧５０％の細菌の死滅を与える最も
高い希釈率の逆数として示される。試験された最も低い血清希釈率（１：８）において５
０％未満の死滅を示す検体を、ＯＰＡ力価４を有するとして示す。試験した最も高い希釈
率は１：２５６０である。最も高い希釈率において≧５０％の死滅を示すサンプルを、よ
り高い開始希釈率から繰り返す。上記の方法はＧｒａｙの方法（Ｇｒａｙ，  Ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，  ｐ．６９４−６９７，  １９９
０）の変法である。
【０１２２】
個々の血清に関し、試験血清に細菌細胞及び不活化成分を加えて含む試験用血清対照が
含まれる。この対照は、抗生物質又はその他の血清成分の存在が細菌株を直接的に（すな
わち相補物又はＰＭＮ非存在下で）死滅させることができるかどうかを調べるために用い
られる。オプソニン力価がわかっているヒト血清を陽性ヒト血清対照として用いる。未知
の各血清に関するオプソニン抗体力価を、血清非存在下での対象と比較して５０％のｃｆ
ｕ減少を与える血清の開始希釈率の逆数として算出する。
【０１２３】
全細胞ＥＬＩＳＡアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性及びポリペプチド抗原の表面
露出を調べるためにも用いられ、そこにおいて、対象の細菌株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は９６穴プレート等のプレート上にコートされ、免疫
化された動物由来の試験血清が細菌細胞と反応する。試験ポリペプチド抗原に特異的な何
らかの抗体が表面に露出したエピトープと反応性である場合、それは当業者に知られた標
準的な方法により検出され得る。
【０１２４】
所望のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す任意のポリペプチドを、次いでｉｎ  ｖｉｖｏ動物
攻撃モデルにおいて試験する。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、当業者に知
られた免疫化方法および経路（例えば、鼻腔内、非経口の、経口の、直腸内の、経膣的な
、経皮的な、腹腔内の、皮下的な、等の）による動物（例えば、マウス）の免疫化に使用
される。特定のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ免疫原性組成物
で動物を免疫化後に、この動物をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓで攻撃し、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染に対する耐性
に関し分析する。
【０１２５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチド及びポリペ
プチドは、例えばヒト等の対象への投与に好適な免疫原性組成物へと取りこまれる。この
ような組成物は通常、薬学上許容可能な担体と共に核酸分子又はタンパク質を含む。以下
に用いるように、用語「薬学上許容可能な担体」は、薬学的な投与に適合する任意かつ全
ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗生剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む
ことが意図される。このような薬学的に活性な物質に関する溶媒及び剤の使用は技術的に
よく知られている。任意の従来の溶媒又は剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、こ
のような溶媒は本発明の組成物において使用することができる。追加的な活性化合物もま
た、この組成物へと取り込むことが可能である。
【０１２６】
本発明の免疫原性組成物は、意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与
経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮下、腹腔内）、経粘膜（例えば、
経口、直腸内、鼻腔内、経膣、吸入）及び経皮（局所）等が挙げられる。腹腔内、皮内又
は皮下への適用について用いられる溶液又は懸濁液には以下の成分を含む：注射液などの
滅菌希釈剤、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロ
ピレングリコール又はその他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗
菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸
等のキレート剤；  酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝液、及び塩化ナトリウム又
はデキストロース等の等張化調整剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基
を用いて調整することができる。非経口調製物はアンプル、使い捨て注射器、又はガラス
又はプラスチック製の複数回投与のバイアル中に封入することができる。
【０１２７】
注射用途に好適な薬学的組成物には、水系溶液（水溶性の場合）又は分散液及び滅菌注
射液又は分散液をその場で調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与のための好適な担
体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬTM（ＢＡＳＦ，  Ｐａｒｓｉｐ
ｐａｎｙ，  ＮＪ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合にお
いて、この組成物は滅菌されていなければならず、注射可能な範囲の液量である必要があ
る。それは製造条件下及び保存条件下で安定でなくてはならず、細菌及び菌類等の微生物
による汚染から守られなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール
（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）
を含有する溶媒又は分散媒体またはそれらの好適な混合物であってもよい。好適な流動性
は、例えば、レクチン等のコーティングの使用により、分散剤の場合は必要とされる粒子
サイズにより、また界面活性剤の使用によって保たれ得る。微生物からの保護は、例えば
、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸等の各種の抗生物質及び抗
菌剤により達成可能である。多くの場合、等張剤には、例えば、組成物中の糖類、マンニ
トール、ソルビトール等のポリアルコール、塩化ナトリウムを含む。注射可能な組成物の
持続的吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム
及びゼラチンを含むことによりもたらし得る。
【０１２８】
滅菌された注射可能な溶液は、活性化合物（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチド又は抗Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｄｉｓ抗体）を、適切な溶媒中に、必要とされる量で、１種又は上記に列挙された
成分と組み合わせて取り込むことによって調製することができ、必要に応じて続いて濾過
滅菌することができる。分散液は通常、活性化合物を、基本的な分散溶媒及び上記に列挙
された必要とされるその他の成分を含む滅菌ビヒクルへと取り込むことによって調製され
る。滅菌された注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、活性成分に対して予め
滅菌濾過した任意の付加的な所望成分の溶液由来の成分を加えたものの粉末を得る好まし
い調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１２９】
経口組成物は通常、不活性な希釈剤又は可食性担体を含む。それらはゼラチンカプセル
中に封入することができ、又は錠剤へと圧縮することができる。経口的治療的投与のため
には、活性化合物を賦形剤と共に取り込んで、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で使用
することができる。経口組成物はまた、うがい薬等の用途に関する流体担体を用いて調製
することもでき、その場合、流体担体中の化合物は経口的に適用され、局所使用され、吐
き出されるか又は飲み込まれる。薬学上適合性を有する結合剤、及び／又はアジュバント
物質は、組成物の一部として包含され得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等な任意の
以下の成分又は類似の特性を有する成分を含むことができる：微結晶セルロース、トラガ
カントガム又はゼラチン等の結合剤；デンプン又は乳酸等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉ
ｍｏｇｅｌ、又はコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏ
ｔｅｓ等の滑剤；コロイド状２酸化ケイ素等の流動促進剤；シュークロース又はサッカリ
ン等の甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料等の香料。
【０１３０】
吸入による投与に関しては、化合物は、例えば二酸化炭素等の好適なガスを含有する圧
縮容器又はディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で、送達される。経粘膜的又
は経皮的な手段による全身的な投与もあり得る。経粘膜的又は経皮的な投与に関しては、
浸透させたいバリアに対し好適な浸透剤が組成中に使用される。このような浸透剤は一般
的に技術的に公知であり、例えば、経粘膜的な投与のためには、界面活性剤、胆汁塩及び
フシジン酸誘導体を含む。経粘膜的な投与には、鼻腔スプレー又は座薬の使用を伴い得る
。経皮的投与に関しては、活性成分は技術的に公知の軟膏、ゲル又はクリームの形態へと
製剤化される。
【０１３１】
化合物はまた、（例えば、カカオバター及びその他のグリセリド等の従来の座剤ベース
と共に）座薬の形態に、又は直腸内輸送のための停留浣腸の形態に調製され得る
一実施形態において、活性化合物は、体内からの迅速な排出に対抗して化合物を保護す
るであろう、インプラント及びマイクロカプセル輸送系等を含む放出制御製剤等の担体と
共に調製される。
【０１３２】
エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン及びポ
リ乳酸等の、生分解性の、生物学的適合性を有するポリマーが使用され得る。このような
組成物の調製方法は当業者に明らかであろう。材料はＡｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．から購入可能である。リポ
ソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を伴う感染細胞を標的とするリ
ポソームを含む）もまた、薬学上許容可能な担体として使用することができる。これらは
、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の、当業者に公知の方法に従って調製
することができ、参照により以下に組み入れるものとする。
【０１３３】
経口又は非経口組成物を投与量単位で製剤化することは、投与を容易にし、投与量の均
一にすることに関し、特に都合が良い。投与量単位製剤は、以下に用いられるような、処
置される対象に対し単回投与するのに好適な物理的に別個の単位をいう；各単位は、必要
とされる薬学上の担体を伴って所望の治療効果をあげるように計算された、予め定められ
た量の活性化合物を含有する。本発明の投与量単位形態の仕様は、活性化合物の固有の特
性及び達成されるべき特定の治療効果、及び個体の処置に関してこのような活性成分を混
合する技術に固有の制約に直接的に依存して決定される。
【０１３４】
免疫原性組成物の組み合わせは、本発明の２以上のポリペプチドを含ませることにより
、並びに、本発明の１以上のポリペプチドを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅ
ｕｓポリペプチド等の、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのもの
ではない１以上の公知のポリペプチドと組み合わせることにより、提供される。
【０１３５】
以下の１２種のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチド
配列である、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２
７、及び配列番号３０は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のホモログ
と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド配列を有する。従ってこれら１２のポ
リペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する免疫原性組成物中
にも使用することができる。さらに、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓホモ
ログに対し少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする以下の１２のＳ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリヌクレオチド配列もまた、免
疫学的組成物中に使用することができる：配列番号４０、配列番号４２、配列番号４３、
配列番号４４、配列番号４６、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５
５、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６２、又はその縮重改変体又はその断片
。
【０１３６】
その他の実施形態において、本発明の１以上のポリペプチドを１以上の公知のＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ多糖類又は多糖類−タンパク質コンジュ
ゲートと組み合わせることにより、免疫原性組成物の組み合わせが提供される。例えば、
ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｏｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
ａｄｈｅｓｉｎ，  ＰＮＳＧ，  ｐｏｌｙ−Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ  ｂｅｔａ−１−６
Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（ＰＩＡ，  ＰＳ／Ａ，  ＰＮＡＧとして
も知られる）参照。Ｍｃｋｅｎｎｅｙ，  Ｄ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６６：
４７１１  （１９９８）及びＭｃｋｅｎｎｅｙ，  Ｄ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：
１５２３  （１９９８）参照、その開示の全体を参照により本明細書中に組み入れるもの
とする。
【０１３７】
その他の実施形態において、本発明の１以上のポリペプチドを１以上の公知のＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ多糖類又は多糖類−タンパク質コンジュゲートと組
み合わせることにより、免疫原性組成物の組み合わせが提供される。例えば、Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓにおける１２の公知のカプセルセロタイプのうち、セ
ロタイプ５（ＣＰ５）及びセロタイプ８（ＣＰ８）が全ての臨床分離株の約８５−９０％
を占める。ほとんどのメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ分離
株はＣＰ５を発現する。ＣＰ５及びＣＰ８に対する抗体は、ヒト多形核好中球によるタイ
プ特異的なオプソニン食作用的な殺菌を誘導し、動物における防御を与える［Ｋａｒａｋ
ａｗａ，  Ｗ．Ｗ．，  Ｓｕｔｔｏｎ，  Ａ．ら，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５６（
５）：１０９０−１０９５  （１９８８）；Ｆａｔｔｏｍ，  Ａ．Ｉ．，  Ｓａｒｗａｒ
，  Ｊ．ら，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６４（５）：１６５９−  
１６６５  （１９９６）］。いくつかの研究室が、タンパク質に共有結合的に連結された
ＣＰ５及びＣＰ８からなる免疫原性のコンジュゲートを合成している。
【０１３８】
これらのコンジュゲートはマウス及びヒトにおいて高度に免疫原性であり、食作用に関
し、マイクロカプセル化されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓをオプソニ
ン化する抗体を誘導する［Ｆａｔｔｏｍ，  Ａ．，  Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ，  Ｒ，  ら
，  Ｉｎｆｅｃｔ  ｌｍｍｕｎ  ６１（３）：  １０２３−  １０３２  （１９９３）；
Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｆ．Ｂ．，  Ｐｏｕｔｒｅｌ，  Ｂ．，  ら，  Ｖａｃｃｉｎｅ  
１２（４）：３６９−３７４  （１９９４）；  Ｒｅｙｎａｕｄ−Ｒｏｎｄｉｅｒ，  Ｌ
．，  Ｖｏｉｌａｎｄ，  Ａ．ら，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  
３（４）：１９３−１９９  （１９９１）］。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎ
ｏｓａの組換えエクソトキシンＡへとコンジュゲートされたＣＰ５を含有する一価の免疫
原性組成物は免疫原性であり、健康な成人及び末期の腎疾患患者において良好に容認され
ている［Ｗｅｌｃｈ，  Ｐ．Ｇ．，  Ｆａｔｔｏｍ，  Ａ．，  Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．Ｊｒ
．ら，  Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．  ７：２４７−２５３  ［Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ］  （１９９６）］。血液透析を受けている末期の腎疾患患者に関する二重盲検テスト
において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの組換えエクソトキシンＡへ
と共通結合的に結合されたＣＰ５及びＣＰ８からなる２価のコンジュゲートワクチンは、
抗体レベルの減少として防御が減少した後に、約４０週間の間、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ菌血症に対する部分的な免疫力を与えた［Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ，
Ｈ．，  Ｂｌａｃｋ，  Ｓ．ら，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  ／Ｗｅαｆ  ３４６（７）：４
９１−４９６  （２００２）］。この試験の結果は、より広くより完全な防御に貢献し得
るであろう、向上した免疫原性組成物へのニーズを示唆する。
【０１３９】
上述のように、特定の実施形態において、免疫原性組成物の組み合わせは、本発明の１
以上のポリペプチドを、１以上の公知の、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
多糖類−タンパク質コンジュゲートと組み合わせることにより提供される。糖質−タンパ
ク質コンジュゲートにおける「タンパク質成分」は、担体タンパク質として知られる。一
群としての用語「担体タンパク質」は、好ましくは非毒性かつ非反応性であり、十分な量
及び純度で得ることのできるタンパク質である。担体タンパク質は標準的なコンジュゲー
ト手法に適応できるものである必要がある。本発明の特定の実施形態においては、ＣＲＭ
１９７が担体タンパク質として使用される。ＣＲＭ１９（訳注：文字不明）（Ｗｙｅｔｈ
，  Ｓａｎｆｏｒｄ，  ＮＣ）は、カザミノ酸及び酵母エキスをベースとする培地中で生
育させたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｃ７株の培養物から
単離したジフテリア毒素の非毒性の改変体（すなわちトキソイド）（β１９７）である。
ＣＲＭ１９７は限外濾過、硫安沈殿、及びイオン交換クロマログラフィーを介して精製さ
れる。その他のジフテリアトキソイドも担体タンパク質として好適である。免疫原性組成
物はさらに、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム及び塩酸アルミニウム等のアジュバ
ントを含む。
【０１４０】
その他の好適な担体タンパク質には、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラト
キソイド、（例えば、国際特許出願第ＷＯ２００４／０８３２５１号［３８］に記載のよ
うに）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅ
ｒｕｇｉｎｏｓａ由来のエクソトキシンＡ等の不活性化した細菌毒素を含む。外膜複合体
ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺剥離、肺炎球菌表面タ
ンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）又はＨａｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ等の細菌外膜タンパク質も使用する
ことができる。オブアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）又は精製したツベルクリン（ＰＰＤ）のタンパク質誘導体等のそ
の他のタンパク質も、担体タンパク質として使用可能である。
【０１４１】
ポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物は、各種のベクター及び発現系によってレシピ
エントへと輸送される。このような系には、特に、染色体、エピソーム及びウィルス由来
の系、例えば、サルモネラ等の弱体化した細菌（米国特許第４，８３７，１５１号）細菌
のプラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来
、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ワクシニア及びその他のポックスウ
ィルス、アデノウィルス、バキュロウィルス、ＳＶ４０等のパポバウィルス、鶏痘ウィル
ス、仮性狂犬病ウィルス及びレトロウィルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス（米国特
許第５，６４３，５７６号）等のアルファウィルス、シンドビスウィルス及びセミリキフ
ォレストウィルス（ｓｅｍｉｌｉｋｉ  ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎ウィ
ルス（米国特許第  ６，１６８，９４３）等の非セグメント化ネガティスストランデッド
ＲＮＡウィルス（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ）等の
ウィルス由来、及び、コスミド及びファージミド等の、プラスミド及びバクテリオファー
ジ遺伝子エレメント由来のベクターの組み合わせに由来するベクターが含まれる。発現系
は、プロモーター及びその他の調節エレメント（ポリアデニル化シグナルのような）等の
発現を調節し、ならびに発現を起こさせる調節領域を含んでいる必要がある。通常、宿主
中でポリペプチドを生産させるためのポリヌクレオチドを維持し、増殖させ、発現させる
ために適した任意の又はベクターを使用することができる。好適なヌクレオチド配列を、
よく知られた任意の多様な定常的な手法によって、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ら，  ”Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  ２
ｎｄ，  ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃ
ｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９に記載されるように、発現系へと挿
入することができる。
【０１４２】
薬学上許容可能なビヒクルは、薬学的な又は免疫原性の組成物へと導入される化合物又
は化合物の組み合わせが、例えば、活性な化合物の投与を可能にするため、体内での寿命
及び／又はその効果を増加させるため、溶液中での溶解性を向上させるため、又は別の方
法においてはその保存性を向上させるために、副作用を引き起こさずにそれらを可能にす
るように設計されるものと理解される。これらの薬学上許容可能なビヒクルは、よく知ら
れ、選択される活性化合物の特性及び投与形態に従って、当業者により適合わせられるで
あろう。
【０１４３】
以下に定義する時、「アジュバント」は、「抗原」又は配列番号１〜配列番号３２のう
ちの一つから選択されるアミノ酸配列を有する１以上のポリペプチド抗原を含む免疫原性
組成物の抗原性を増大させるように機能する物質である。したがって、アジュバントは、
免疫応答を増大又は変化させるために与えられることが多く、当業者に良く知られている
。本発明において意図されるアジュバントの例としては、限定されるものではないが、リ
ン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム等のアルミニウム塩（ａｌｕｍ）、ヒト型結核
菌、細菌性リポ多糖類、アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、又はその
誘導体又は類似体を挙げることができ、これらはＣｏｒｉｘａ［Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｍ
Ｔ］から入手可能であり、又、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている；  か
かるＡＧＰの一例が、２−［［Ｒ］−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミ
ノ］エチル  ２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［［Ｒ］−３−テトラデカノイ
オキシテトラデカノイル］−２−［［Ｒ］−３−テトラデカノイオキシテトラデカノイル
アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは５２９としても知られており（以前
はＲＣ５２９として知られていた）、又、水性形態として又は安定したエマルジョンとし
て製剤化されている、米国特許第４，９１２，０９４号に記載されるＭＰＬＴＭ（３−Ｏ
−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ）（Ｃｏｒｉｘａ）、ＣｐＧモチーフを含有するオリ
ゴヌクレオチド等の合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）、ポリペ
プチド、米国特許第５，０５７，５４０号に記載されるＱｕｉｌ  Ａ又はＳＴＩＭＵＬＯ
ＮＴＭ  ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，  Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ）等のサポニン、百日咳毒素（ＰＴ）、又は大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、
特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９；例えば、国
際公開第ＷＯ９３／１３３０２号及び第ＷＯ９２／１９２６５号参照、コレラ毒素（野生
型又は変異体型のいずれかの形態、例えば、変異体型の場合、アミノ酸位置２９のグルタ
ミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジン、と置換されており、このことは国際公開
第ＷＯ００／１８４３４号に一致）。同様のコレラ毒素変異体が国際公開第ＷＯ０２／０
９８３６８号に記載されている（この場合、アミノ酸位置１６のイソロイシンが、別のア
ミノ酸と単独で又はアミノ酸位置６８のセリンと別のアミノ酸との置換と合わせて置換さ
れており、且つ／又は、アミノ酸位置７２のバリンが別のアミノ酸と置換されている）。
その他のコレラ毒素変異体が国際公開第ＷＯ０２／０９８３６９号に記載されている（こ
の場合、アミノ酸位置２５のアルギニンが別のアミノ酸と置換されており；且つ／又は１
つのアミノ酸がアミノ酸位置４９に挿入されており；且つ／又は２つのアミノ酸がアミノ
酸位置３５及び３６に挿入されている）。
【０１４４】
各種サイトカイン及びリンホカインがアジュバントとしての使用のために適当である。
かかるアジュバントの一例は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）
であり、これは米国特許第５，０７８，９９６号に記載されるようなヌクレオチド配列を
有する。ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを含有するプラスミドを大腸菌に入れて形質転換し、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），  １０８１  Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９に
寄託番号３９９００として寄託した。サイトカインであるインターロイキン−１２は別の
アジュバントであり、これは米国特許第５，７２３，１２７号に記載されている。その他
のサイトカイン又はリンホカインが免疫調節活性を有することが示されており、限定する
ものではないが、例えば、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、
１０、１３、１４、１５、１６、１７及び１８、インターフェロン−α、β及びγ、顆粒
球コロニー刺激因子、並びに腫瘍壊死因子α及びβがアジュバントとしての使用に適して
いる。
【０１４５】
本発明の組成物は、通常、所望の場合には、標準的な、良く知られた、非毒性の生理学
的に許容可能な担体、アジュバント、及びビヒクルを含有する単位投与剤形で非経口的に
投与される。
【０１４６】
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性又は油性懸濁液は、適当な分散剤又
は湿潤剤及び懸濁剤を用いて既知の技術に従って製剤化される。無菌の注射可能調製物は
、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール
の溶液として、無菌の注射可能な溶液又は懸濁液であることができる。
【０１４７】
許容可能なビヒクル及び溶媒の中で、使用し得るものは水、リンゲル液、及び等張塩化
ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油が通常、溶媒又は懸濁媒体として使用
される。この目的のために、合成のモノ−又はジ−グリセリドを含む任意のブランドの不
揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸等の脂肪酸は注射用物質の調製に
おける用途を見出し得る。
【０１４８】
好ましい担体は、リン酸塩、乳酸塩、Ｔｒｉｓ等で緩衝化された中性塩溶液を含む。当
然、ウィルスベクターを投与する時には、ベクター構築物を投与された個体において望ま
しくない任意の反応を引き起こさないように、望ましくない汚染物質、例えば、欠陥干渉
するアデノウィルス粒子又はエンドトキシン及びその他の発熱物質を実質的に含まないよ
うにするために十分ベクターを精製する。ベクターを精製する好ましい手段には、浮遊密
度勾配、例えば、塩化セシウム勾配遠心分離の利用が含まれる。
【０１４９】
担体はリポソームであることもできる。送達ビヒクルとしてリポソームを用いる手段は
当技術分野において良く知られている（例えば、Ｇａｂｉｚｏｎら，  １９９０；  Ｆｅ
ｒｒｕｔｉら，  １９８６；  及びＲａｎａｄｅ，  １９８９参照）。
【０１５０】
本発明の免疫原性組成物はまた、遺伝子発現を制御する調節配列と動作可能に結合した
本発明のポリヌクレオチド配列を含む。対象のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡの発現を
促進し得る調節エレメント、すなわち、プロモーター及び／又はエンハンサーエレメント
の制御下、プラスミド等の発現ベクター中に遺伝子工学的に入れられる。好ましい実施形
態において、ヒトサイトメガロウィルス前初期プロモーター／エンハンサーが使用される
（米国特許第５，１６８，０６２号）。プロモーターは細胞特異的であってもよく、所定
の細胞においてのみポリヌクレオチドの実質的な転写が可能となる。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡ（米国特許第５，５８０，８５９号）又
は、促進剤、例えば、ブピビカイン及びその他の局所麻酔薬（米国特許第５，５９３，９
７２号）並びにカチオン性ポリアミン（米国特許第６，１２７，１７０号）と一緒の組成
物として製剤化されて、宿主に直接導入される。これらの文献は参照によりその全体を本
明細書中に組み入れるものとする。
【０１５２】
このポリヌクレオチド免疫化手法において、本発明のポリペプチドはｉｎ  ｖｉｖｏに
おいて一過性に発現され、遺伝物質は宿主染色体中に全く挿入又は集積されない。この手
法は遺伝子治療と区別され、その目標は、染色体中へと対象の遺伝子素材を挿入又は統合
することである。免疫化によって投与されたポリヌクレオチドが宿主における形質転換さ
れた表現形をもたらさないことを確認するために、分析を行った（米国特許第６，１６８
，９１８号）。
【０１５３】
（Ｈ．本発明の用途及び方法）
本明細書中に記載するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのポリ
ヌクレオチド、ポリペプチド及びポリペプチドホモログは、免疫化の方法において使用さ
れる。単離されたポリヌクレオチドは、（例えば、宿主細胞中の組換え発現ベクターを介
して、又はポリヌクレオチド免疫化用途において）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓポリペプチドを発現するために使用される。
【０１５４】
本明細書中の実施例中に詳細に記載されるように、全身性の細菌感染にとって重要であ
り得る細菌の細胞壁におけるタンパク質及び糖質の発現を刺激するために、血清存在下で
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを生育させた。結果として、７
０％の血清中で生育させた時にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
により発現される３２のポリペプチド及び相当するポリヌクレオチドが同定された。加え
て、これらのタンパク質のうち２４が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍ
ｉｄｉｓを感染させたウサギ由来の免疫血清と反応性であることが見出された。
【０１５５】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを血清中で生育させた時に発
現されるタンパク質に相当する遺伝子が、そのタンパク質を組換え的に発現させるために
クローニングされた。この組換えタンパク質はマウスを免疫化するために用いられ、２６
のタンパク質のうち２５が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの
全溶菌液と反応する抗体を誘導した。さらに、これらの血清のうち１８が、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの全溶菌液とも反応した。最終的に、免疫化されたマウ
スがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにより攻撃された時、タン
パク質のうち１１のものが、攻撃後に脾臓中に見いだされる検出可能な細菌の量を低減す
る抗体を誘導した。
【０１５６】
本発明はさらに、配列番号１〜配列番号３２、又はその生物学的均等物又はその断片の
１以上から選択されるアミノ酸配列を有する、まさに記載の１以上のポリペプチドを含む
免疫原性組成物を提供する。この免疫原性組成物は薬学上許容可能な担体をさらに含む。
特定の実施形態において、この免疫原性組成物は１以上のアジュバントを含むであろう。
【０１５７】
別の実施形態において、本発明は、配列番号３３〜配列番号６４の１以上から選択され
るアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供し、このポリヌクレオ
チドは組換え発現ベクター中に含まれる。好ましくはこのベクターはプラスミドＤＮＡで
ある。このポリヌクレオチドはさらに異種ヌクレオチドを含むことができ、例えば、ポリ
ヌクレオチドは１以上の遺伝子発現調節エレメントと動作可能に連結され、かつ、さらに
１以上のアジュバントを含み得る。好ましい実施形態において、免疫原性のポリヌクレオ
チド組成物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおける１以上
の中和エピトープの発現を方向付ける。
【０１５８】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染に対する宿主の免疫化方
法もまた提供される。好ましい実施形態において、宿主はヒトである。すなわち、宿主又
は対象は、配列番号１〜配列番号３２又はその生物学的均等物又はその断片の１以上から
選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び薬学上許容可能な担体を含む、免疫
原性となる量の組成物を投与される。免疫原性組成物の免疫原性となる量は、免疫原性組
成物の量を徐々に増やしながら対象を免疫化する投与量応答試験を実行することにより決
定し、最適投与量を決定するために免疫応答を分析する。試験開始点は動物モデルにおけ
る免疫化データから推測される。投与量は固体に特有の条件に依存して変化し得る。その
量は当業者に知られた方法により定常的な試験において決定される。
【０１５９】
免疫学的に有効量の免疫原性組成物を、適切な投与回数で、免疫応答を誘発しようとす
る検体に投与する。本明細書中で使用する免疫学的有効量とは、少なくとも処置される固
体の免疫系に細菌感染の臨床的影響を低減させる応答を引き起こさせるのに十分な量の、
単回投与又は連続的な投与の一部としてのいずれかにおいて哺乳動物宿主（好ましくはヒ
ト）に対し投与される量を意味する。理想的には、処置される固体はＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
感染のより重篤な臨床的徴候を示すことがないであろう。投与量は年齢や体重等の固体に
特有の条件に依存して変化し得る。この量は当業者に知られた方法により定常的な試験に
おいて決定することができる。
【０１６０】
本明細書中に引用される全ての特許及び出版物は参照により本明細書中に組み入れるも
のとする。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例は、別途詳細が記載されたものを除き、当業者によく知られた定型的な標
準的技法を用いて実行された。すべての化学物質は、別途記載しない限りＳｉｇｍａ社（
Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）のものを使用し
た。以下の実施例は説明目的のために示され、本発明の範囲を何ら限定するような解釈が
なされるべきではない。
【０１６２】
（実施例１）
（７０％血清中での細菌増殖）
以下の実施例は、臨床分離株のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ０−４７を用いて実行された。この分離株に関する、機能の注釈付けがされていないゲ
ノム配列はＩｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ
から入手できた。Ｈｅｉｌｍａｎｎ，  Ｃら，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，  ６４（１
）：ｐ．２７７−８２  （１９９６）参照。臨床的に病原性に関係し得るタンパク質の発
現を刺激するために、細菌培養物を、１００％のトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）又
は７０：３０のウサギ血清：ＴＳＢのいずれかの中で、振盪（２００ｒｐｍ）しながら一
晩３７°Ｃで生育させた。ウサギ血清はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤより入手した。一晩培養した細菌をＯＤ６００〜０．１となるまで
希釈し、培養し、対数期中期まで４時間生育させた。対数期中期に、細胞を遠心分離によ
り回収し、さらに以下の実施例記載のように処理した。
【０１６３】
（実施例２）
（２次元電気泳動のための細胞壁画分の調製）
実施例１記載のように生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ０−４７の細胞壁を単離し、２次元電気泳動用に調製した。細菌のペレットをＯＤ６
００〜２０となるよう再懸濁し、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、２０ｍＭのＴｒｉｓ
、ｐＨ  ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を用いて、１５分間、４°Ｃにて振動させて２
度洗浄した。細菌の表面に結合した血清タンパク質を、１ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍ
ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を用いて１５分間、４°Ｃにて洗浄することにより除去した。
ＴＳＢ中で生育させた細菌を、血清中で生育させた細菌と同様の方法で処置した。この細
菌を再度遠心分離によりペレット化した。プロトプラストを調製するために、この細菌を
次いで、３０％のシュークロース、１００μｇ／ｍｌのリソスタフィン、１０μｇ／ｍｌ
のＤＮａｓｅ、１μｇ／ｍｌのＰｅｆａｂｌｏｃｋ  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）、１０μｇ／ｍｌのリゾチーム及び１
００単位／ｍｌのムタノリシンを含有するＴＢＳ中にＯＤ６００〜４０となるよう再懸濁
し、３７℃、１時間インキュベートした。得られたプロトプラストを５０００ｒｐｍ、１
０分間の遠心分離によりペレット化し、細胞壁物質を含有する上清をデカンテーションし
た。デカンテーションされた細胞壁物質含有上清に、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ｐｒ
ｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を添加し、１０，０００ｋＤのＭＷＣＯ透
析膜（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，
ＩＬ）を用いて、水に対して４°Ｃ、一晩透析した。透析後、細胞壁画分を−２０℃で
凍結した。
【０１６４】
単離に続いて、細胞壁画分サンプルを以下のように２次元電気泳動のために調製した：
凍結させた細胞壁抽出物を溶解し、氷上の７０％アセトンを用いて４時間かけて沈殿させ
た。このタンパク質沈殿物をペレット化し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａ
ｎｔ，  Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，  ＮＹ）中で乾燥させ、５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、２％
（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、２％（ｗ／ｖ）のＳＢ  ３−１０、４０ｍＭのＴｒｉｓ及び０
．２％のＢｉｏ−Ｌｙｔｅ  ３／１０を含有するＲｅａｄｙＰｒｅｐ  （ＢｉｏＲａｄ）
ＳＥＱＵＥＮＴＩＡＬ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＲＥＡＧＥＮＴ  ３を用いて可溶化し
た。
【０１６５】
調製した細胞壁画分サンプルを、室温で一晩インキュベートする間に各サンプルがゲル
を再水和させるようにして、１１ｃｍの固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、ｐＨ４−
７（ＢｉｏＲａｄ）上へ載せた。サンプル量は総容量２００μｌ中に２５０μｇとした。
一晩のインキュベーションの間、蒸発を防ぐために、このストリップをミネラルオイル（
ＢｉｏＲａｄ）で被覆した。ストリップの再水和完了後、過剰なミネラルオイルを水で飽
和したブロッティングペーパー上へと除去し、再水和したストリップを次いでｐＨａｓｅ
ｒ等電点電気泳動（ＩＥＦ）装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ａ
ｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｌ）上に載せた。ストリップを、５０ｍＡ／ストリップの電流制限
の下、電圧を２５０Ｖ〜５，０００Ｖへと徐々に増加させながら予備泳動した。次いで電
圧を５，０００Ｖの定圧で、合計５０ｋＶｈ（〜１６ｈ）に設定した。２次元目のＳＤＳ
−ＰＡＧＥを、１２．５％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎプレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ）を用
いて実行した。質量分析のために、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙプロテインゲルステイン（Ｂｉ
ｏＲａｄ）を使用し、製造者の説明書に従ってゲルを染色した。
【０１６６】
ＴＳＢ又は７０％のウサギ血清中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓ由来の細胞壁関連タンパク質における２次元（２Ｄ）ゲルのプロファイ
ルを比較した。図１参照。７０％のウサギ血清中の生育によって、２Ｄゲルの蛍光染色さ
れた転写物中に容易に検出される、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ由来の由来の細胞壁関連タンパク質におけるタンパク質発現プロファイル中の変化を
もたらした（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０１６７】
８つのタンパク質が、ＴＳＢ中又はウサギ血清存在下で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓから得られるものの間で異なる調節を受けることが
、蛍光染色により確認された。表３及び図１参照。最も注目すべきは、７０％の血清中で
生育させた細胞における、２５ｋＤａ〜３７ｋＤａ間の３つのタンパク質における、蛍光
染色線の増強である（図１Ｂ、スポットｅ、ｇ及びｈ）。
【０１６８】
（表３）
（同定されたスポットのリスト）
【０１６９】
【表３−１】
2013121981.tif 000005
【０１７０】
【表３−２】
2013121981.tif 000006
ａ免疫血清との反応性又は血清成分への結合により２Ｄブロット上で検出されたスポット
のリスト。
ｂ１以上のタンパク質を含有するいくつかのスポット。
ｃニトロセルロースへの転写後にスポットを検出した方法、感染ウサギ由来の反応性免疫
血清、Ｉ、又は結合血清成分、Ｓ。
ｄＮＧＩＤ＝データベース上に遺伝子が存在しない。
【０１７１】
（実施例３）
（免疫血清及びビオチン化血清タンパク質の細胞壁タンパク質に対する結合）
電気泳動の１次元目及び２次元目が完了後、ゲル中のタンパク質成分を、結合アッセイ
のためニトロセルロース上へと転写した。具体的には、ゲル中のタンパク質成分を、セミ
ドライブロッティング装置（Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｏｒ
ｔｓｍｏｕｔｈ、ＮＨ）を用いて１２Ｖ、１時間、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）
へとエレクトロブロッティングした。ニトロセルロース膜を含有するタンパク質（ブロッ
ト）を次いで、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙプロテインブロットステイン（ＢｉｏＲａｄ）を用
いて、製造者の説明書に従って染色し、ＦｌｕｏｒＳ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）中
で可視化した。各ブロットをブロッキング緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び５％
のドライミルクを含有するＰＢＳ）と共に１０分間、室温でインキュベートし、次いで、
１：２０００に希釈した免疫血清（ウェスタンブロット）又は４０μｇ／ｍｌのビオチン
化血清タンパク質（以下参照）のいずれかと共に、室温で一晩インキュベートした。一晩
のインキュベーション後、ブロットを洗浄緩衝液（０．５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓ）で３度洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｂｉｏ
ｓｏｕｒｃｅ  ＩｎｔｅＲＮＡｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）又はストレプ
トアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）のいずれかと
共に、２時間、室温で、ブロッキング緩衝液中でインキュベートした。ブロットを再度洗
浄緩衝液で３度洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ膜ホスファターゼ基質システム（ＫＰＬ、Ｉｎ
ｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて可視化した。ＦｌｕｏｒＳ中で画像を
取得した。全ての２Ｄゲルの分析は、Ｍｅｌａｎｉｅ  ３．０ソフトウェアを用いて行っ
た。
【０１７２】
タンパク質濃度は、ＢｉｏＲａｄプロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて
分析した。
【０１７３】
細胞壁結合タンパク質のタンパク質発現プロファイル中の変化は、２Ｄゲルから転写さ
れたタンパク質を含有するニトロセルロース膜のウェスタンブロットを考察することによ
り、より明確化できた。ウェスタンブロットにおいて、ニトロセルロース膜を、Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７を繰り返し感染させたウサギ由
来のプール免疫血清と共にインキュベートした。図１Ｃ及び１Ｄ参照。これらのアップレ
ギュレートされたタンパク質は強い免疫反応性でもあり、ウサギの感染の間にそれらが発
現されることを示す。血清で生育させた細胞由来の５種のその他の免疫反応性の線又はス
ポットは、ＴＳＢで生育させた細胞においてはより低い発現であるか、又は検出されない
レベルであった。図１、スポットａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｆ参照。
【０１７４】
（実施例４）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ細胞壁結合タンパク質と相
互作用する血清タンパク質の分析）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからの血清タンパク質の溶
出）
７０％ウサギ血清中、３７°ＣでＯＤ６００〜０．８となるまで生育させたＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７をペレット化した。この細胞をＯ
Ｄ６００〜２０となるよう再懸濁し、４℃で震盪させながらＴＢＳで２度洗浄した。結合
している血清タンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌ、１．０ＭのＮａＣｌ又は４．０Ｍの尿
素のいずれかを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で順に、４℃、１時間震盪させ
ながら溶出した。細菌を次いで遠心分離により除去し、上清を回収した。この上清は細菌
表面から溶出された血清タンパク質を含んでいた。異なる条件下で溶出したタンパク質を
、４−２０％のグラジェントＴｒｉｓ−グリシンゲル（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ、  ＭＥ）を用いたＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１７５】
（血清タンパク質のビオチン化）
溶出した血清タンパク質をＰＢＳに対し４°Ｃで一晩透析した。プロテインＧセファロ
ース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用い
て４°Ｃで一晩インキュベーションすることによりＩｇＧ’を失わせた。溶出画分中の平
均タンパク質分子量を５０ｋＤａと推定して、このタンパク質を、１５モル濃度過剰量の
ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）を用いて１．５時間、４℃で標識した。反応を過剰量のグリシンによって停止
し、ＰＢＳに対し一晩透析（１０，００００  ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ）した。
【０１７６】
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの表面に結合した血清タン
パク質の同定）
これらの条件下で細菌から溶出した血清タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、正
常ウサギ血清、及びＴＳＢ中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒ
ｍｉｄｉｓから溶出した細菌タンパク質と比較した。図３参照。０．５のＮａＣｌ、１Ｍ
のＮａＣｌ及び４Ｍの尿素を含有する各緩衝液で、細菌細胞から結合した血清タンパク質
を溶出した。これらの溶出された血清タンパク質は、血清タンパク質に富む細菌表面から
溶出したタンパク質プールにあたる。いくつかの細菌タンパク質がこのプール中に存在す
る傾向を有しているが、ＴＳＢ中で生育させた細菌から溶出させたものにおいては、プロ
テインアッセイによって細菌タンパク質が検出されなかった。銀染色によって検出された
いくつかの偽タンパク質バンドが、ＴＳＢ中で生育させた細菌から溶出されはしたが、そ
れらは血清中で生育させた細菌表面から溶出された、より強く染色されたタンパク質に相
当するものではなかった。１ＭのＮａＣｌを用いた溶出は、ほとんどのタンパク質が溶出
する最も弱い変性条件であり、以下の実施例でタンパク質を溶出させるために使用した。
【０１７７】
結合血清成分中に含まれる細胞壁関連タンパク質を同定するため、２Ｄゲルから転写さ
れニトロセルロースに結合した細胞壁タンパク質と共にインキュベートすることによって
２Ｄ転写物を調査するために、ビオチン標識血清タンパク質を使用した。Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと結合する血清タンパク質を単離するために、
７０％のウサギ血清中で生育させた細菌を１ＭのＮａＣｌにより洗浄した。溶出された血
清タンパク質を回収し、ＰＢＳに対し透析した。次に、溶出された血清タンパク質中に存
在する天然の免疫ＩｇＧを、プロテインＧセファロースと共にインキュベーションするこ
とにより失わせた。ＩｇＧの除去は宿主抗体と反応性のタンパク質を同定する可能性を減
少させる。次いで、溶出した血清タンパク質を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉ
ｄｅｒｍｉｄｉｓの細胞表面タンパク質の２Ｄブロットを調査するため上述のようにビオ
チン標識した。図４Ａ及び４Ｂ参照。３４のスポット及び領域がこの方法で可視化され、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの宿主血清タンパク質との相互
作用に関与すると考えられる。血清成分と相互作用することが恒常的に見いだされた３４
のスポットのうち、４つを除いては、感染ウサギ由来の免疫血清と反応することが見出さ
れた。図２及び表３参照。
【０１７８】
血清中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、０．
５Ｍ及び１ＭのＮａＣｌにより溶出される細菌表面タンパク質に結合した血清タンパク質
を有していた。同様の条件下で、ＴＳＢ中で生育させた細菌から溶出されたブドウ球菌の
タンパク質はほとんどなく、一方、血清中でのみ発現されるブドウ球菌のタンパク質は高
濃度の塩処置によって溶出される可能性が存在する。
【０１７９】
（実施例５）
（アップレギュレートされた血清タンパク質の質量分析による同定）
血清中で生育させる間に検出される変化が、宿主内の環境信号への応答において細菌に
よって発生する遺伝子発現の変異をより正確に反映し得るであろうという仮定の下、７０
％の血清中で生育させた細菌を、続いて行うプロテオーム実験及び分析に使用した。以下
の質量分析試験において、２Ｄゲル電気泳動分離におけるスポットから単離したタンパク
質を最初に飛行時間質量分析に供した。陽性の、明確な同定が得られた場合、次いでさら
なる質量分析は実施しなかった。表４参照。複数のタンパク質が２Ｄゲル上の同じスポッ
ト中に分離される等、飛行時間質量分析後になんらかの曖昧性が残る場合には、次いで、
曖昧な部分を分離するためにエレクトロスプレー質量分析を実行した。表４参照。
【０１８０】
（表４）
（質量分析により同定されたタンパク質）
【０１８１】
【表４】
2013121981.tif 000007
（サンプルの調製）
質量分析の実行前に、標的タンパク質スポットを、ゲル中でのトリプシン消化に供した
。ゲルからタンパク質スポットを切り出し、〜１ｍｍの細片に切断した。このゲル細片を
５０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｍｕｓｋ
ｅｇｏｎ，  Ｍｉ）を含む１０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ＪＴ．Ｂａｋｅｒ，  Ｐｈｉ
ｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，  ＮＪ）溶液０．２ｍｌを用いて、１５分間、時々旋回攪拌しなが
ら３回洗浄した。ゲル細片をアセトニトリルで５分間脱水し、凍結乾燥し、−２０℃で凍
結保存した。次いでゲル中のタンパク質を、５０μｌの１２ｎｇ／ｍｌのシーケンシング
用グレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｄｉｓ
ｏｎ，  Ｗｌ）を用いて、一晩３７℃で消化した。トリプシン溶液を次いで除去し、ゲル
を再び５０μｌアセトニトリル中で脱水した。ペプチドを含有するアセトニトリルを次い
で除去し、ゲル細片を、５％のギ酸（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ，  Ｓｅｅｌｚｅ，
Ｇｅｒｍａｎｙ）５０μｌ中、１５分間室温にて、バスソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ
Ｃｌｅａｎｉｎｇ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｓｈｅｌｔｏｎ，  ＣＴ）中で洗
浄した。このペプチド含有上清を除去し、最初のアセトニトリル洗浄液と合わせた。ゲル
を再度アセトニトリル中で洗浄し、上清を先の２回の抽出ステップで得られたものと合わ
せＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ）中で〜１０μｌまで乾燥させ、次い
で０．１％（ｖ／ｖ）の水性ギ酸を用いて１００μｌに希釈した。このサンプルを次いで
Ｚｉｐ−ＴｉｐＣ１８  Ｐ１０カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍｉ
ｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）上に載せ、５０μｌの５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸中で溶
出させた。サンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ装置（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）ガラスナノスプレーチップ（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃ．，  Ｗｏ
ｂｕｒｎ，  ＭＡ）上での質量フィンガープリンティング分析のために、イオントラップ
質量分析装置のオリフィス中にスプレーするために、テフロン（登録商標）コーティング
ステンレス鋼製の９６ウェルプレート（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，  ＭＡ）２枚に移した。
【０１８２】
（ＴｏＦ質量分析を用いたペプチド質量フィンガープリンティング）
α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を薄層状に適用したテフロン（登録商標）コーティ
ングステンレス鋼製の９６ウェルプレート２枚に各サンプルを入れた。このサンプルを室
温で乾燥させた。ディレイド・エクストラクション技術及び反射器を備えたＶｏｙａｇｅ
ｒ  ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析装置（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）上で質量分析データを得た。この質量分析装置は３３７ｎｍにおける窒素
レーザー及び３Ｈｚのレーザー速度を備えていた。加速電圧は２０ｋＶ、操作モード（反
射）、抽出モード（ディレイド）、極性（陽性）、格子電圧（６５％）、ミラー電圧速度
（１．１２）、抽出ディレイタイム（２００ｎｓｅｃ）、質量範囲（８００−３５００Ｄ
ａ）及びスペクトル当たりのレーザーショット数（２００）に設定した。
【０１８３】
（静電ナノスプレーイオントラップ質量分析）
ナノエレクトロスプレーインタフェースを備えたＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣ
Ｑ四重極イオントラップ質量分析装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏ
ｓｅ，  ＣＡ）上で質量スペクトルデータを得た。ナノエレクトロスプレーインタフェー
スは、外径／内径１２０／６９μｍ、オリフィス径２μｍの、長さが〜２７ｍｍのシリカ
製スプレーニードル（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃ．）からなる。質量分析装置
の検出器前部に配置された基部に設けられたｘ、ｙ、ｚ軸ホルダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎ
ｎｉｇａｎ）中にガラス製チップを載せた。静電ナノスプレープローブ（ＴｈｅｒｍｏＦ
ｉｎｎｉｇａｎ）上の金属接触を通じたエレクトロスプレーインタフェースとの電気的な
接触を供給するために、ガラス製チップの標準的なコーティングに対し電流を適用した。
ナノスプレーは２０−８０ｎｌ／ｍｉｎの速度で送達した。
【０１８４】
トリプシン消化物の２〜５マイクロリットルを、質量分析器のオリフィスへと直接スプ
レーするナノスプレーガラスチップを用いて分析した。ペプチド分析は、〜１ｋＶの可変
スプレー電圧において、２００℃に加熱されたキャピラリー温度を用いて、ＬＣＱ−ＤＥ
ＣＡイオントラップ質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ）上で行った。装置に
付随のデータ取得ソフトウェアを用いて、自動ＭＳ／ＭＳモードでデータのセットを得た
。取得方法には、１つのＭＳスキャン（４００−１８００ｍ／ｚ）に次いでそのＭＳスキ
ャン中で最も量の多い３つのイオンのＭＳ／ＭＳスキャンが行われることを含む。分析さ
れるペプチドイオンの数を増やすために動的除外機能を採用した（設定：３ａｍｕ＝除外
幅、０．５分間＝除外持続時間）。電流試験はサンプル群において、手動にて分析された
。
【０１８５】
質量フィンガープリントデータの自動分析は、ＭＳＦＩＴ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｏｒ）及びＩｎｃｙｔｅ社製ＰａｔｈｏＳｅｑ（ｃ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７データベースを用いたＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉ
ｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）ソフトウェアデータベース検索エンジンを用いて行った。得られた
スペクトルは、検索エンジン利用前にベースライン補正、ノイズ除去、及び脱アイソトー
プ処理を行った。データベース検索パラメータは以下のレベルに設定した：ＭＷ（１００
０−１５０ｋＤａ）、ｐＩ（３−１０）、消化（トリプシン）、開裂しそこねた部位の最
大数（２）、開裂しそこねた部位のｐファクター（０．４）、静電的修飾（アクリルアミ
ド修飾されたシステイン）、Ｎ末端（水素）、Ｃ末端（遊離の酸）、可変性変形（メチオ
ニンの酸化、Ｎ末端アセチル化、セリン、スレオニン及びチロシンのリン酸化）、質量（
モノアイソトピック）、３００ｐｐｍの質量トレランスを伴うマッチングに必要とされる
ペプチドの最小数（４）、及び１５ｐｐｍの質量トレランスを伴う反復較正（Ｉｎｔｅｌ
ｃａｓｔ）の適用。タンパク質の同定は、ＭＯＷＳＥスコア及びＭＳ−ＦＩＴ及びＭＡＳ
ＣＯＴのそれぞれによる９５％の信頼性により決定した。
【０１８６】
Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓデータ分析パッケージ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉ
ｇａｎ）に組み込まれたＳＥＱＵＥＳＴを用いて、ＭＳ／ＭＳデータの自動分析を行った
。Ｅｎｇ，  Ｊ．Ｋ．ら、Ａｍｅｒ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ、５（１１）：ｐ．９
７６−８９  （１９９４）参照。ソフトウェアにおいて以下の多様な修飾形が許容された
：システインアクリルアミド修飾及びメチオニンの酸化。検索パラメータを以下の指定で
設定した：質量範囲（４００〜３５００Ｄａ）、低強度ＭＳシグナル（１ｅ  ＋５）ペプ
チドトレランス（２．０Ｄａ）、断片イオンの最小数（１５）、１グループ中の最小スキ
ャン数（１）及び開裂しそこねた開裂の最大数（２）。全てのタンパク質の同定は正確を
期すためマニュアルで検証した。
【０１８７】
（質量分析によるタンパク質の同定）
７０％の血清中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
由来の蛍光及び免疫染色転写物上に恒常的に検出されたスポットを、質量分析による同定
のために配置し、標識した。図２Ａ及び２Ｂ参照。全部で４０の免疫反応性のスポットを
切り出し、同定のため質量分析に供した。表４参照。完全長タンパク質の配列を配列リス
ト（配列番号：１〜３２）中に示す。タンパク質を含有するゲルのスポットをゲルから切
り出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦと、それに次ぐ、相当するコーディング領域に関するＩｎｃ
ｙｔｅ社製ＰａｔｈＳｅｑ（ｃ）  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄ
ｉｓ０−４７データベース検索を用いた質量フィンガープリント分析により同定した。表
４参照。複数のタンパク質がヒットした又は疑わしいシグナルを伴うスポットを、静電ナ
ノスプレーを用いてさらに分析した。全部で３２タンパク質を同定し、いくつかのスポッ
トは１以上のタンパク質を含有していた。表３及び４参照。同定されたタンパク質の２４
のものは免疫反応性であり、２６のものは血清成分に結合しており、タンパク質のうち２
０のものは免疫反応性且つ血清に結合していた。血清因子との結合に関与するＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ表面上のほとんどのタンパク質が免疫応答
を誘導すると考えられ得るため、この大きなオーバーラップは予測どおりであった。
【０１８８】
６つのタンパク質が免疫染色したブロット中に恒常的に存在したが、蛍光染色された転
写物上に相当するスポットは視覚的に存在しなかった。図２Ｂの白色の円及び矢印参照。
これらのタンパク質は感染の間発現されて免疫応答を導くと考えられるが、それらは、こ
れらの実験に使用された条件下での蛍光タンパク質染色によって、それらの検出が可能と
なるレベルでは発現していない。
【０１８９】
（実施例６）
（タンパク質の機能の予測）
タンパク質の予測される機能を、ＡＴＣＣ１２２２８由来の完全ゲノムホモログとの比
較により決定した。Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．Ｑ．ら，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ４９
（６），  ｐ．１５７７−９３（２００３）参照。表５に示す予測される機能は、特異的
なタンパク質を含む先の出版物により、又はその他の生物において生じる先に特徴付けら
れたタンパク質とのホモロジーによって、個別のＯＲＦに割り当てられる。
【０１９０】
（表５）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質の予測される機
能）
【０１９１】
【表５−１】
2013121981.tif 000008
【０１９２】
【表５−２】
2013121981.tif 000009
ａタンパク質の予測される機能は、ＡＴＣＣ１２２２８由来の完全ゲノムホモログとの比
較により決定した。
ｂニトロセルロースへの転写後にスポットを検出した方法、感染させたウサギ由来の反応
性免疫血清をＩ、又は結合血清成分をＳで示す。
【０１９３】
上記に論じられたように、７０％のウサギ血清中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７由来の細胞壁関連タンパク質における発現プロ
ファイルを、２Ｄゲル電気泳動により分析した。血清中の全体としての発現は、ＴＳＢ中
での生育後に生じるものと顕著に異なっていることがわかった。血清中での生育の間に上
方調節された多数のタンパク質を、質量分析及び、配列比較により予測されるそれらの機
能によって同定した。表５参照。栄養素獲得に関与することが予測された３種のタンパク
質３０５、１４５０及び１７０３は全て顕著に増加した。表４及び表５参照。３種のタン
パク質全てはゲルを横切る線を形成する。図４参照。理論上は結合されることはなく、こ
れは複数の荷電アイソマーの結果であるか、又はそれらの予測されるリポタンパク質組成
に関連している可能性がある。さらに、３つのタンパク質全ては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７を感染させたウサギ由来の免疫血清に高度に
反応性であり、これらのタンパク質が、感染中の宿主中においても発現することを示唆し
た。図２及び表５参照。全部でこれら２４のタンパク質が、感染させたウサギ由来の免疫
血清と反応性であることが同定された。これらのタンパク質は、血清中で生育する間に発
現するのみならず、感染させた動物中の免疫応答をも導いた。実施例８参照。合わせて考
えると、これらのデータは、これらの抗原が全て感染中に発現されることを示唆する。感
染マウスの血流内におけるこれらのＯＲＦに由来する転写物の発現が、同定されたタンパ
ク質の全てに関するＲＴ−ＰＣＲにより確認された（データ非掲載）。
【０１９４】
（実施例７）
（組換えタンパク質のクローニング及び発現）
遺伝子は、発現されたタンパク質の質量分析及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７のデータベースにより同定されたタンパク質に基づいて設計
されたプライマーを用いてクローニングされた。個々の遺伝子を、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  ＪｏＩＩａ、ＣＡ）を用いたポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、過剰量のアデニンをＴａｑ  ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共に加えた。反応産物を、製造者の説明書
に従ってｐＣＲＴ７／ＮＴ−ＴＯＰＯ又はｐＢＡＤ／ＴＯＰＯＴｈｉｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へとクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフォームした。陽性クローンをＲｅｄｄｙＭｉｘ  Ｐ
ＣＲ  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ  （ＡＢｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いたコロ
ニーＰＣＲにより検出し、偽変異を生じていないことを確認するために配列決定した。Ｔ
７ポリメラーゼを用いた発現のためにｐＣＲＴ７クローン由来のプラスミドを精製し、Ｅ
．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとトランスフォームした。
タンパク質は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＨｙＳｏｙ  ｂｒｏｔｈ（１
％のＨｙＳｏｙ、Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｌ、Ｓｔｏｃｋｂｒｉｄｇｅ、ＧＡ）、０．５％の
酵母エキス、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−Ｈ２Ｏ、４０ｍＭのＮ
ａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）中で、３７℃、振盪（２００ｒｐｍ）下、ＯＤ６００が〜１．０
となるまで陽性クローンを生育させることにより発現させた。タンパク質の発現は、１ｍ
ＭのＩＰＴＧ（ｐＣＲＴ７）又は０．２％のアラビノース（ｐＢＡＤ）のいずれかにより
誘導し、培養物をさらに３時間生育させた。細胞を遠心分離により回収し、発現を全細胞
溶菌液のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１９５】
（組換えタンパク質の精製）
細胞ペレットを１００ｍｌのＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭの
ＮａＣｌ）中に再懸濁し、Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ（ＳＬＭ−Ａｍｉ
ｎｃｏ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ）の一通路を通すことにより溶菌させた。サンプル
を次いで、１０，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により可溶性画分又は不溶性ペレット
へと分離した。組換えタンパク質の局在をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。組換えタンパ
ク質が可溶性画分中にある場合、次いでタンパク質を、Ｎｉ２＋で荷電したイミノ２酢酸
アガロース樹脂上に載せた。表６参照。次に、カラムを３０ｍＭのイミダゾールを含むＴ
ＢＳで洗浄した。結合したタンパク質を、３００ｍＭのイミダゾールのＴＢＳ溶液を用い
て溶出した。さらなる精製ステップが必要とされる場合には、このタンパク質を５０ｍＭ
のＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に対し透析し
、ＰＯＲＯＳ−Ｑ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉ
ｔｙ，  ＣＡ）を充填したカラムへと載せた。結合したタンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉ
ｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ中、５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌのグラジェント
により溶出した。対象のタンパク質を含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、−
２０℃で凍結した。
【０１９６】
組換えタンパク質が不溶性画分中に見出される場合には、次いでこの不溶性画分を、１
００ｍｌのＴＢＳに溶解した１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により４時間、４°Ｃで処
理した。表６参照。この不溶性タンパク質を遠心分離によりペレット化し、上清を廃棄し
た。不溶性ペレットを、次いで、８Ｍの尿素を含む１００ｍｌのＴＢＳにより少なくとも
８時間、室温で抽出した。不溶性の破片をペレット化し、全ての緩衝液が２Ｍの尿素を含
む以外は上記のようにして、タンパク質を精製した。精製に続いて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−
１００を終濃度０．１％となるよう添加した。次いで、このタンパク質を０．１％のＴｒ
ｉｔｏｎを含有するＴＢＳへと透析し、−２０℃で凍結した。
【０１９７】
全ての液体クロマログラフィーは、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ
−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて実
行した。全てのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４−２０％のグラジェントＴｒｉｓ−グリシンゲル
（Ｃａｍｂｒｅｘ）を用いて行った。
【０１９８】
（表６）
（組換えタンパク質の溶解性）
【０１９９】
【表６】
2013121981.tif 000010
Ｘは、その画分にタンパク質が見出されたことを示す。ＮＴは試験なしを示す。
【０２００】
（実施例８）
（組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質を用いた
免疫原性組成物）
４週齢のメスのＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）を、０、３及び６週間目に、２０μｇのＳ
ＴＩＭＵＬＯＮTM  ＱＳ−２１中、１０μｇの組換えタンパク質を皮下注射することによ
り免疫化した。このマウスを、最初の免疫化の０週前及び８週目に採血した。最後の採血
から２日後、コロンビアソルトアガー（１×コロンビアアガー、０．１％のグルコース、
１％の酵母エキス、０．５％のＮａＣｌ）上で一晩生育させた５×１０８ｃｆｕのＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを腹腔内投与することにより、マウス
を攻撃した。攻撃から２４時間後、マウスを犠牲にし、脾臓及び血液中の細菌を計数した
。
【０２０１】
（組換えタンパク質を用いたマウスの能動免疫化）
血清結合性又は免疫反応性のタンパク質のいずれかをコードする２４のｏｒｆを、Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７からクローニングし、組換
えタンパク質を、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグは簡便のために用いた；本発明の免
疫原性組成物はＨｉｓタグなしに発現されるタンパク質を包含するものとする）を用いて
、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。表７参照。イオン交換クロマログラフィーに続いてＮｉ
２＋キレートカラムを使用することにより、これらのタンパク質を精製した。残る３つの
クローニングされたｏｒｆ（２００６、２９７５及び２９０７）は、クローニングはされ
たが、精製のために十分な量で発現されなかった。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、個々の組換え
タンパク質を用いて０、３及び６週間目に免疫化した。この動物を０及び８週目に採血し
、８週目にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７を用いて攻
撃（腹腔内）した。攻撃から２４時間後、血中及び脾臓中に存在する細菌を計数した。多
数のタンパク質のスクリーニングを可能にするために、免疫原性組成物候補のこの最初の
スクリーニングを５匹の動物の群において実行した。得られたデータは統計学的に有意で
はないが、それらは多数の候補における免疫原性組成物の可能性に関する有益な情報を提
供した。２７の組換えタンパク質のうち８つが、脾臓及び／又は血液から回収した細菌数
を１桁以上低減した。表７参照（ＮＴ＝試験なし）。
【０２０２】
（表７）
（免疫化後の細菌数の減少）
【０２０３】
【表７】
2013121981.tif 000011
ＮＴは試験なしを示す。
【０２０４】
免疫マウスから得た血清を、細菌タンパク質への抗体反応性について評価した。表８参
照。ウサギ血清中で対数期中期まで生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄ
ｅｒｍｉｄｉｓの全細胞溶解物のウェスタンブロットにより調べた時、試験した２４の血
清中２３が天然のタンパク質と反応した。表８参照（ＮＴ＝試験なし）。
【０２０５】
（表８）
（ブドウ球菌タンパク質に対する抗体の反応性）
【０２０６】
【表８】
2013121981.tif 000012
ＮＴは試験なしを示す。
【０２０７】
表８に示すように、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ抗原で免
疫された多くの動物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに応答する抗体も
生成した。従って、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ抗原に対す
る免疫原性組成物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓならびにＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの処置又は予防において効果的であり得る
。表８参照。
【０２０８】
上記免疫原性組成物中に用いられる組換えタンパク質のサブセットを、より大きな群の
マウスを免疫するために使用した。１０匹のメス（４週齢）のＢａｌｂ／Ｃマウスの群を
、生理食塩水又はアジュバントとしての１０μｇの抗原を、２０μｇのＳＴＩＭＵＬＯＮ
TM  ＱＳ−２１と共に皮下注射することにより免疫した。最後の免疫から２週間後、この
マウスを、腹腔内注射によって、〜５×１０８ｃｆｕのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７で攻撃した。攻撃から２４時間後、細菌を血中及び脾臓
中で計数した。表９参照。生理食塩水中にＳＴＩＭＵＬＯＮTM  ＱＳ−２１を含んだ対照
と比較して、ｌｏｇ  ＣＦＵの減少が見られた。データは、＊０．０５又は＊＊０．０１
のＰ値を伴うスチューデントｔ検定により分析した。
【０２０９】
（表９）
（免疫原性組成物中に用いられるタンパク質）
【０２１０】
【表９】
2013121981.tif 000013
＊Ｐ−値＜０．０５
＊＊Ｐ−値＜０．０１
表９に示すＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質は、攻
撃に続いて起こる細菌感染の重篤性を低減する免疫原性組成物中に用いられた場合に、最
大の効果を示した。
【０２１１】
（実施例９）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓタンパク質を用いた免疫化
後のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの攻撃からの防御）
実施例８（表８）における抗体結合データによって示唆されるように、Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ抗原に対する免疫原性組成物は、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの処置又は予防において効果的であり得る。従って、Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ抗原の免疫原性組成物を用いた免
疫化に続いて、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる攻撃を行った。
【０２１２】
４週齢のメスのＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）を、０、３及び６週間目に、２０μｇのＳＴＩ
ＭＵＬＯＮTM  ＱＳ−２１中、１０μｇの組換えタンパク質を皮下注射することにより免
疫化した。このマウスを、最初の免疫化の０週前及び８週目に採血した。最後の採血から
２日後、コロンビアソルトアガー（１×コロンビアアガー、０．１％のグルコース、１％
の酵母エキス、０．５％のＮａＣｌ）上で一晩生育させた３×１０８ｃｆｕのＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓＲｅｙｎｏｌｄｓを腹腔内投与することにより、マウ
スを攻撃した。攻撃から２４時間後、マウスを犠牲にし、腎臓中の細菌を計数した。
【０２１３】
（表１０）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる攻撃）
【０２１４】
【表１０】
2013121981.tif 000014
表１０に示すように、ある種のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ抗原は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを認識し、そこに結合する抗体
を誘導する効果を示した。さらに、誘導された抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  
ａｕｒｅｕｓの攻撃後に計数される細菌のレベルを低減させる有益な効果を有していた。
【０２１５】
配列番号１〜配列番号３２のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
ポリペプチド抗原におけるアミノ酸配列のパーセント同一性を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のそれらのホモログと比較した。結果を表１１に示す。
【０２１６】
（表１１）
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの間の同一性）
【０２１７】
【表１１】
2013121981.tif 000015
相同性はポリペプチド配列の間で決定した。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、ＴＳＢ（１Ａ及び１Ｃ）又は７０％ウサギ血清（１Ｂ及び１Ｄ）中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７から得た細胞壁画分のタンパク質発現プロファイルを、２次元ゲル電気泳動により比較したものを表す。タンパク質は、１次元目にｐＨ４−７のＩＰＧ５ストリップ上で、次いで２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースへと転写して、蛍光染色により検出した（１Ａ及び１Ｃ）。免疫反応性のタンパク質を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７を感染させたウサギ由来の免疫血清（１Ｂ及び１Ｄ）により可視化した。分子量マーカーを左側に標識する。
【図２】図２は、１次元目をｐＨ４−７のＩＰＧストリップ上で分離し、２次元目をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した、７０％のウサギ血清中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７から得た細胞表面画分の蛍光染色ブロット（２Ａ）及びイムノブロット（２Ｂ）を表す。スポット中のタンパク質は質量分析によって同定した。
【図３】図３は、ＴＳＢ又は７０％のウサギ血清中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ０−４７の表面から、ＮａＣｌ濃度を増加させて、又は４．０Ｍの尿素により溶出したタンパク質を表す。アスタリスクは、血清存在下で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの表面から溶出した、富化されたタンパク質を示す。細菌をＴＢＳで３回洗浄し、次いで０．５Ｍ、１．０ＭのＮａＣｌ、及び４．０Ｍの尿素で順に３回洗浄した。タンパク質濃度を各サンプルについて調べ、０．７５μｇを４−２０％のグラジェントゲル上で泳動した。ＴＳＢで生育させた細菌表面から溶出させたサンプル中には、プロテインアッセイによりタンパク質は検出されなかったため（ｌａｎｅｓ  ２−５）、２５μｌをゲル上に載せた。レーン１、ウサギ血清；レーン２及び６−０．１５ＭのＮａＣｌ溶出物；レーン３及び７−０．５ＭのＮａＣｌ溶出物、レーン４及び８−１．０ＭのＮａＣｌ溶出物；レーン５及び９−４．０Ｍの尿素溶出物。
【図４】図４は、７０％のウサギ血清中で生育させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓから溶出したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来細胞表面タンパク質の２Ｄ転写物における、タンパク質の蛍光染色（４Ａ）及びビオチン化血清タンパク質による検出（４Ｂ）を表す。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いてスポットを可視化した。スポット中のタンパク質を質量分析により同定した。
【図１】
2013121981.tif 000016
【図２】
2013121981.tif 000017
【図３】
2013121981.tif 000018
【図４】
2013121981.tif 000019
【配列表】
2013121981000001.app