(57)【要約】【課題】  公知のβ−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体以外の、新たな適合溶質及びそれを用いた生体分子の保護方法を提供する。【解決手段】  適合溶質として、グリセリン酸又はグリセリン酸骨格を含有する糖誘導体(ただし、β−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体を除く)を用いることにより、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子を環境ストレスにより生じる熱やラジカル等の因子から保護する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリセリン酸又はグリセリン酸骨格を含有する糖誘導体(ただし、β−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体を除く)を主成分とする生体分子保護剤。
【請求項２】
前記グリセリン酸骨格を含有する糖誘導体が、グリコシルグリセリン酸である請求項１に記載の生体分子保護剤。
【請求項３】
核酸分子の損傷を保護する機能を有する請求項１又は２に記載の生体分子保護剤。
【請求項４】
タンパク質分子の熱変性を保護する機能を有する請求項１又は２に記載の生体分子保護剤。
【請求項５】
適合溶質として、グリセリン酸又はグリセリン酸骨格を含有する糖誘導体(ただし、β−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体を除く)を用いることを特徴とする生体分子の保護方法。
【請求項６】
前記グリセリン酸骨格を含有する糖誘導体が、グリコシルグリセリン酸である請求項５に記載の生体分子の保護方法。
【請求項７】
前記保護が、核酸分子の損傷からの保護である、請求項５又は６に記載の保護方法。
【請求項８】
前記保護が、タンパク質分子の熱変性からの保護である、請求項５又は６に記載の生体分子の保護方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子保護剤及び生体分子の保護方法に関し、特に、適合溶質としてグリセリン酸含有化合物を用いた生体分子保護剤及び生体分子の保護方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物や植物は、乾燥や浸透圧変化に適応するため、細胞内にトレハロースやシュクロース等の糖類、グリセリン、マンノシルグリセリン酸やグルコシルグリセリン酸(ＧＧＡ)等の糖誘導体、グルタミン等のアミノ酸、ジグリセリルリン酸等のリン誘導体などの低分子化合物群を蓄積することが知られている。これらの化合物は、適合溶質と呼ばれる。特に、極限環境(高温、高塩濃度等)に生息する微生物細胞内に蓄積される適合溶質は、極限環境下における生命活動維持のため、適合溶質を過剰に細胞内に存在させることによって、生体を構成する核酸やタンパク質等の生体分子を外部環境ストレスから保護する作用があると考えられている。
【０００３】
中でも、Ｄ−グリセリン酸(Ｄ−ＧＡ)は、植物体内で発見された天然に産出する有機酸の一種であり、種々の生理作用が報告されている(非特許文献１〜３)また、最近では、アルコール代謝の促進作用が報告されている(特許文献１、非特許文献４)。
適合溶質としてグリセリン酸骨格を有する化合物として、これまでにβ−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体が、環境の影響に対する皮膚の保護のため及び皮膚の再生能力を向上させるための化粧用もしくは皮膚科学用製剤、或いは消化器疾患およびアミロイド病の予防および治療用の薬剤として知られている(特許文献２、３)。
しかしながら、上記の機能性が、グリセリン酸骨格に由来するかどうか、また、異なる単糖を構成成分とするグリセリン酸誘導体において同様の機能性が発揮されるかどうかは、これまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００６−５０７２６８号公報
【特許文献２】特表２００４−５０６６７５号公報
【特許文献３】得表２００８−５３７７３４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Science，123，415(1956)
【非特許文献２】Nature，184，819(1959)
【非特許文献３】Fitoterapia，57，307(1986)
【非特許文献４】Metabolism，56，895(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、公知のβ−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体以外の、新たな適合溶質及びそれを用いた生体分子の保護方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、グリセリン酸骨格を含むＧＧＡが、ＤＮＡやタンパク質等の生体分子を環境ストレスにより生じる熱やラジカル等の因子から保護する機能があることを見出した。また、このような効果がＧＡのみでも発揮されることを見出した。
【０００８】
本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］グリセリン酸又はグリセリン酸骨格を含有する糖誘導体(ただし、β−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体を除く)を主成分とする生体分子保護剤。
［２］前記グリセリン酸骨格を含有する糖誘導体が、グリコシルグリセリン酸である[１]に記載の生体分子保護剤。
［３］核酸分子の損傷を保護する機能を有する[１]又は[２]に記載の生体分子保護剤。
［４］タンパク質分子の熱変性を保護する機能を有する[１]又は[２]に記載の生体分子保護剤。
［５］適合溶質として、グリセリン酸又はグリセリン酸骨格を含有する糖誘導体(ただし、β−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体を除く)を用いることを特徴とする生体分子の保護方法。
［６］前記グリセリン酸骨格を含有する糖誘導体が、グリコシルグリセリン酸である請求［５］に記載の生体分子の保護方法。
［７］前記保護が、核酸分子の損傷からの保護である[５]又は[６]に記載の保護方法。
［８］前記保護が、タンパク質分子の熱変性からの保護である［５］又は［６］に記載の生体分子の保護方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、核酸分子のラジカル損傷保護機能やタンパク質の熱変性抑制効果などの生体分子の保護機能が、グリセリン酸骨格に由来するものであることが明らかにすることができ、グリセリン酸及びグリセリン酸骨格を有する糖誘導体を用いた生体分子の保護方法を提供することが可能となった、また、グリセリン酸及びグリセリン酸骨格を有する
糖誘導体の生体保護機能利用した、化粧品、皮膚用治療剤をはじめとする種々の薬剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒドロキシラジカルによるＤＮＡの構造変化を電気泳動にて検討した図
【図２】ヒドロキシラジカルによるＤＮＡ損傷におけるＧＧＡ添加効果を示した図
【図３】ヒドロキシラジカルによるＤＮＡ損傷における糖質またはＧＡの添加効果を示した図
【図４】卵白の熱変性凝集におけるＧＧＡの添加効果を示すグラフ。
【図５】卵白の熱変性凝集における糖質およびＧＡの添加効果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、核酸やタンパク質等の生体分子を外部環境ストレスから保護する適合溶質(以下、「生体分子保護剤」ということもある)として、グリセリン酸又はグリセリン酸骨格を含有する糖誘導体(ただし、β−マンノシルグリセリン酸およびそのアミド誘導体を除く)を用いることを特徴とするものである。
【００１２】
公知の適合溶質の１つであるβ−マンノシルグリセリン酸は、フィロインとも称され、下記の構造を有する化合物である。
【化１】
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【００１３】
本発明者らは、その適合溶質としての機能が、マンノース以外の単糖を構成成分とするグリセリン酸誘導体においても同様に発揮されるかどうか、或いは、その機能がそのグリセリン酸骨格に由来するかどうかを調べるために、グリコシルグリセリン酸(ＧＧＡ)、グルコース、シュクロース、トレハロース、及びグリセリン酸(ＧＡ)塩を用いて、その核酸分子(ＤＮＡ)のラジカル損傷に対する保護効果、及びタンパク質の熱による凝集変性抑制効果について検討した。
【００１４】
核酸分子のラジカル損傷に対する保護効果については、環状ＤＮＡを用い、Ｈ2Ｏ2、塩化鉄(III)およびアスコルビン酸ナトリウムによりヒドロキシラジカルを発生させた系中に共存させ、所定時間インキュベートした後、反応後の溶液中のＤＮＡを精製し、電気泳動により分離して、開環状のＤＮＡ量をその泳動パターンから判断した。
また、タンパク質の熱による凝集変性抑制効果については、タンパク質として鶏卵卵白を用い、その希釈液を加熱して、その濁度の経時変化を測定した。
【００１５】
その結果、グリコシルグリセリン酸(ＧＧＡ)が、核酸やタンパク質等の生体分子を外部環境ストレスから保護する機能を有すること、さらには、ＧＧＡにおける該保護機能が、グリセリン酸(ＧＡ)骨格に由来するものであり、ＧＡのみでも効果を発揮できることが明らかになった。
【００１６】
グリセリン酸(ＧＡ)としては、Ｄ体、Ｌ体もしくはそれらの混合物があるが、本願発明においては、これらのいずれであってもよく、混合物としては、Ｄ体及びＬ体を任意の比率で配合したもの、及び単離前のラセミ混合物も含まれる。
また、グリセリン酸塩としては、一価又は二価の塩があるが、適合溶質としては、水溶性であることが望ましく、本発明においては、具体的には、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩またはカリウム塩等が好ましく用いられる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
(実施例１)ＧＡおよびＧＧＡによるＤＮＡのラジカル損傷に対する保護効果
環状ＤＮＡ：pUC118(タカラバイオ)を、１ｍＭＨ2Ｏ2、０.１ｍＭ塩化鉄(III)および０.１ｍＭアスコルビン酸ナトリウム(以上、すべて和光純薬社製)によりヒドロキシラジカルを発生させた系中に共存させ、３７℃で３０分間インキュベートした。
反応後の溶液からNucleoSpin Extract II(MACHEREY-NAGEL社製)を用いてＤＮＡを精製し、１ｗｔ％アガロースを用いて電気泳動(１００Ｖ、４０分)により分離、エチジウムブロマイド染色後、ＵＶ照射(３０５ｎｍ)により泳動パターンを確認した。
上記の結果を図１に示す。図中、Ｍは、分子量マーカー、１は、Ｈ2Ｏ2を添加しないで３０分間インキュベートしたＤＮＡ、２は、Ｈ2Ｏ2を添加して３０分間インキュベートしたＤＮＡ、である。
図１から明らかなように、Ｈ2Ｏ2存在下では、非存在下と比較して環状ＤＮＡの１本鎖が切断された開環状ＤＮＡの量が有意に上昇し、上記条件によって環状ＤＮＡが系中で発生したヒドロキシラジカルにより損傷を受け、構造が変化することを確認した。
【００１８】
次に上記条件において、５０〜２００ｍＭのＧＧＡを添加し、同様に３０分間３７℃でインキュベート後、電気泳動で構造変化を確認した。
結果を図２に示す。図中、Ｍは、分子量マーカー、１は、Ｈ2Ｏ2添加なし、２は、Ｈ2Ｏ2のみ添加、３は、Ｈ2Ｏ2＋５０ｍＭＧＧＡを添加、４は、Ｈ2Ｏ2＋１００ｍＭＧＧＡを添加、５は、Ｈ2Ｏ2＋２００ｍＭＧＧＡを添加、を示す。
この結果、ＧＧＡの濃度依存的に開環状ＤＮＡの量が減少することが明らかになり、ＧＧＡはヒドロキシラジカルによるＤＮＡ損傷を保護する機能があることが明らかになった。
【００１９】
さらに、上記機能がＧＧＡの構成成分であるグルコースや他の糖質類、また、グリセリン酸に由来する機能であるかどうかを調べるため、上記条件において２００ｍＭの各糖質類(グルコース、シュクロース、トレハロース、以上和光純薬社製)およびＧＡナトリウム塩(東京化成社製４０％ＤＬ−ＧＡ水溶液をＮａＯＨにて中和して使用)を共存させ、同様に構造変化を確認した。
結果を図３に示す。図中、Ｍは、分子量マーカー、１は、Ｈ2Ｏ2添加なし、２は、Ｈ2Ｏ2のみ添加、３は、Ｈ2Ｏ2＋ＧＧＡを添加、４は、Ｈ2Ｏ2＋トレハロースを添加、５は、Ｈ2Ｏ2＋シュクロースを添加、６は、Ｈ2Ｏ2＋グルコースを添加、７は、Ｈ2Ｏ2＋ＧＡを添加、を示す。
その結果、糖質類を共存させた系では、開環状ＤＮＡが糖質類非存在下での場合と同程度生成しており、ＧＧＡに見られたＤＮＡ損傷保護機能はないと考えられた。
一方で、ＧＡカルシウム塩を共存させた倍には、ＧＧＡと同様に開環状ＤＮＡの生成が抑制されており、ＧＧＡにおけるＤＮＡのラジカル損傷保護機能は、ＧＡ骨格に由来することが示唆された。
【００２０】
(実施例２)ＧＡおよびＧＧＡによる卵白の熱による凝集変性抑制効果
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.４)中に２ｖｏｌ％となるように鶏卵卵白を希釈し、１ｃｍプラスチックキュベットを用いて紫外可視分光光度計(日本分光社製、Model: V-530)およびセル加熱モジュール(日本分光社製、Model: EHC-477)を用いて７０℃に加熱して、７２０ｎｍの濁度の時間変化を測定した。
その結果、７０℃で加熱開始後４００秒付近において急激に濁度変化が生じ、卵白中のタンパク質が熱により凝集変性したことで溶液が白濁することを確認した。
次に、上記条件において１および５ｗｔ％となるようにＧＧＡナトリウム塩を溶解させ、同様に加熱による濁度変化を測定した。結果を図４に示す。
その結果、ＧＧＡの濃度依存的に濁度の上昇が抑制され、加熱によるタンパク質の凝集変性を抑制する効果があることが明らかになった。
【００２１】
続いて、ＧＧＡの上記機能性が、構成成分であるグルコースやグリセリン酸に由来する機能性であるかどうか、および他の糖質類においても同様の効果が見られるかどうかを確認するため、上記の条件において１ｗｔ％となるように糖質類(グルコース、シュクロース、トレハロース、ソルビトール、以上すべて和光純薬社製)およびＧＡナトリウム塩を添加し、加熱による濁度変化を測定した。結果を図５に示す。
その結果、糖質類においても若干の濁度上昇の抑制が見られるものの、ＧＧＡによる抑制効果が有意に大きく、さらに、ＧＡによる濁度上昇の抑制効果が大きいことが明らかになった。また、ＧＡとＧＧＡの分子量の差を考慮すると、ＧＧＡにおけるタンパク質の熱変性抑制効果は、ＧＡ骨格に由来することが示唆され、ＧＧＡによるタンパク質の熱変性抑制効果は、分子中のＧＡ骨格に由来する機能であり、ＧＡのみで効果を発揮できることも明らかになった。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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