(57)【要約】【課題】本発明の目的は、新規な癌特異抗原を発見し、癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含む医薬組成物及び癌ワクチンを提供することである。【解決手段】前記課題は、癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを有効成分として含む医薬組成物であって、前記タンパク質又はペプチドが、（１）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチド、（２）前記タンパク質又は部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質又は変異ペプチド、（３）前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は（４）前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体ペプチド、である医薬組成物によって解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを有効成分として含む医薬組成物であって、前記タンパク質又はペプチドが、
（１）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチド、
（２）前記タンパク質又は部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質又は変異ペプチド、
（３）前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は
（４）前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体ペプチド、
である医薬組成物。
【請求項２】
前記部分ペプチドが、配列番号４〜６５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
癌の治療用である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、Ｔｈ細胞エピトープ及び／又はＴｃ細胞エピトープを含むペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを有効成分として含む癌ワクチンであって、
前記タンパク質又はペプチドが、
（１）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチド、
（２）前記タンパク質又は部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質又は変異ペプチド、
（３）前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は
（４）前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体ペプチド、
である癌ワクチン。
【請求項６】
前記ペプチドが、Ｔｈ細胞エピトープ及び／又はＴｃ細胞エピトープを含むペプチドである、請求項５に記載の癌ワクチン。
【請求項７】
配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるＨＰ１５タンパク質の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項８】
前記化合物が、
（１）ＨＰ１５タンパク質のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、若しくは前記ＤＮＡを含むベクター、又は
（２）ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡが、ＨＰ１５タンパク質のｍＲＮＡにおける、配列番号６９で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ領域、配列番号７０で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ領域、及び配列番号７１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ領域からなる群から選択されるｍＲＮＡ領域を、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡであって、
前記ｓｉＲＮＡが、
（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、
（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は
（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、
である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
癌の治療用である請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に対する免疫誘導活性を有するペプチド、若しくはＨＰ１５タンパク質の発現又は機能を抑制する化合物を含む医薬組成物、癌ワクチン、癌の検出方法、及び癌治療用化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、心疾患に次ぐ第２のヒトの死亡原因であり、全世界で数百万の人々が、毎年癌により死亡している。癌による死亡数は増加の傾向にあり、心疾患を抜いて、癌が第一の死亡原因になることが予測されている。
【０００３】
癌細胞は、生体の細胞の遺伝子に起きたなんらかの変化によって、生体細胞がコントロールを失って、無秩序に増殖するようになったものである。このような癌細胞の多くは、癌特異的な抗原を発現している。癌特異抗原（腫瘍特異抗原）としては、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ｐ１５、β−カテニン、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＣＥＡ、ｐ５３、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ａ４、及びｓｕｒｖｉｖｉｎなどが発見されてきた。これらの癌特異抗原は、成人の正常細胞には全く存在していないか、又は非常に低レベルで存在する抗原である。そのため、このような癌特異抗原を検出することにより、癌の診断が試みられている。
【０００４】
また癌特異抗原自体が、癌の無秩序な増殖に関与していることもある。このような場合、癌特異抗原の発現を抑制したり、又はその機能を抑制することにより、癌の増殖を抑え、癌を治療することが可能である。例えば、ハーセプチン（登録商標）は、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）に選択的に結合するヒト化モノクローナル抗体であり、乳癌の治療薬として用いられている。また、リツキサン（登録商標）は、正常及び悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対するキメラモノクローナル抗体であり、非ホジキンリンパ腫の治療薬として用いられている。すなわち、癌特異抗原を分子標的とする、治療薬の開発が期待されている。
【０００５】
更に、癌の治療法として、癌に対する免疫療法が行われている。癌の免疫療法は、癌患者自身の免疫機構が有する抗腫瘍免疫反応を利用して癌を治療するものである。この腫瘍免疫の標的分子として、癌特異抗原が期待されている。癌免疫療法は、具体的には、細胞傷害性Ｔ細胞が、ＨＬＡ抗原（白血球型抗原；Human Leukocyte Antigen）と、癌特異抗原のペプチドとの複合体を認識し、癌細胞を排除するものである。例えば、ＭＡＧＥ−Ａ４、及びｓｕｒｖｉｖｉｎの癌ペプチドを用いた免疫療法が行われている（非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「ブリティシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ」（英国）２００９年、第１００巻、ｐ．１１３５−１１４３
【非特許文献２】「キャンサー・サイエンス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（日本）２０１１年、第１０２巻、ｐ．３２４−３２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記のように癌特異抗原は、癌の診断及び治療において重要である。
本発明の目的は、新規な癌特異抗原を発見し、癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含む医薬組成物及び癌ワクチンを提供することである。また、本発明の別の目的は、新規な癌特異抗原の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含む医薬組成物を提供することである。本発明の別の目的は、新規な癌特異抗原又は新規な癌特異抗原の遺伝子を分析することによる、癌の検出方法を提供することである。更に本発明の別の目的は、新規な癌特異抗原を用いた癌治療用化合物のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、新規な癌特異抗原について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＨＰ１５タンパク質及びそれをコードする遺伝子が多くの種類の癌細胞に発現していることを見出した。また、ＨＰ１５タンパク質由来のペプチドが、癌に対する免疫誘導活性（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化、及びヘルパーＴ細胞の活性化）を有し、癌治療剤又は癌ワクチンとして有用であることを見出した。更に、ＨＰ１５のｍＲＮＡをｓｉＲＮＡにより破壊することにより、ＨＰ１５タンパク質の発現が低下し、癌の増殖を抑制することができることを見出した。すなわち、ＨＰ１５タンパク質又はその遺伝子の発現又は機能を抑制する化合物が、癌の治療剤として有用であることを見出した。更に、ＨＰ１５タンパク質が、多くの種類の癌に発現していることから、ＨＰ１５タンパク質、又はＨＰ１５遺伝子を検出することにより、癌を検出することができることを見出した。また、ＭＡＧＥ−Ａ４、又はｓｕｒｖｉｖｉｎによる癌の検出と組み合わせることにより、癌の検出率が上昇することを見出した。更には、ＨＰ１５タンパク質をマーカーとして、癌治療用化合物のスクリーニングが可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、
［１］癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを有効成分として含む医薬組成物であって、前記タンパク質又はペプチドが、（１）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチド、（２）前記タンパク質又は部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質又は変異ペプチド、（３）前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は（４）前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体ペプチド、である医薬組成物、
［２］前記部分ペプチドが、配列番号４〜６５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドである、［１］に記載の医薬組成物、
［３］癌の治療用である、［１］又は［２］に記載の医薬組成物、
［４］前記ペプチドが、Ｔｈ細胞エピトープ及び／又はＴｃ細胞エピトープを含むペプチドである、［１］〜［３］のいずれかに記載の医薬組成物、
［５］癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを有効成分として含む癌ワクチンであって、前記タンパク質又はペプチドが、（１）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチド、（２）前記タンパク質又部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質又は変異ペプチド、（３）前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は（４）前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体ペプチド、である癌ワクチン、
［６］前記ペプチドが、Ｔｈ細胞エピトープ及び／又はＴｃ細胞エピトープを含むペプチドである、［５］に記載の癌ワクチン、
［７］配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるＨＰ１５タンパク質の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含む、医薬組成物、
［８］前記化合物が、（１）ＨＰ１５タンパク質のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、若しくは前記ＤＮＡを含むベクター、又は（２）ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントである、［７］に記載の医薬組成物、
［９］前記ｓｉＲＮＡが、ＨＰ１５タンパク質のｍＲＮＡにおける、配列番号６８で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ領域、配列番号６９で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ領域、及び配列番号７０で表される塩基配列からなるｍＲＮＡ領域からなる群から選択されるｍＲＮＡ領域を、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡであって、
前記ｓｉＲＮＡが、（ａ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているｓｈＲＮＡ、（ｂ）二重鎖ＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチド、又は（ｃ）二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端に、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが結合し、突出末端を形成している二本鎖オリゴヌクレオチド、
である、［８］に記載の医薬組成物、又は
［１０］癌の治療用である［７］〜［９］のいずれかに記載の医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを含む医薬組成物によれば、癌患者において細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞を誘導することによって、患者の免疫機能を高め、癌を治療することができる。
本発明の癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質又はペプチドを含む癌ワクチンによれば、癌患者において、癌の予防、癌の進行の抑制、又は癌の退縮を起こすことができる。
本発明のＨＰ１５タンパク質の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含む、医薬組成物によれば、ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能を抑制することによって、癌の増殖を抑制することが可能であり、癌を治療することができる。
本発明の癌の検出方法によれば、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を分析することにより、癌を検出することができる。
本発明の癌治療用化合物のスクリーニング方法によれば、大量の被検化合物から、ＨＰ１５タンパク質を発現する癌の治療に有効な化合物を、容易にスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＨＰ１５タンパク質のアイソフォーム１（Ａ）、アイソフォーム２（Ｂ）、又はアイソフォーム３（２２ｋＤａ）（Ｃ）のアミノ酸配列を示した図である。
【図２】ＨＰ１５遺伝子をＨＭＶ−１細胞に発現させ、その機能を解析した結果を示す図である。ＨＰ１５遺伝子が発現したＨＭＶ−１  ＨＰ１５細胞のＭＭＰ２遺伝子、及びＯｃｔ３／４遺伝子の発現（Ａ）、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５細胞の移植された生体内での増殖（Ｂ）、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５細胞のリンパ節への転移（Ｃ）を示したものである。
【図３−１】ＨＰ１５タンパク質の７アミノ酸ずつオーバーラップさせた６１個の部分ペプチドの、１人の健常人ボランティア（Ａ）のＴ細胞のインビトロにおけるインターフェロン−γの産生能を示したグラフである。
【図３−２】ＨＰ１５タンパク質の７アミノ酸ずつオーバーラップさせた６１個の部分ペプチドの、２人の健常人ボランティア（Ｂ、Ｃ）のＴ細胞のインビトロにおけるインターフェロン−γの産生能を示したグラフである。
【図４】ＨＰ１５タンパク質の７アミノ酸ずつオーバーラップさせた６２個の部分ペプチドのうち、４人の健常人ボランティアにおいて、免疫誘導活性を示した部分ペプチドを模式的に示した図である。
【図５】ペプチド＃１９によるＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞）のＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩＩ拘束性を示したグラフである。
【図６】ペプチド＃１９によるＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ細胞）のＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ拘束性を検討した示したグラフである。
【図７】ｓｈＲＮＡ１導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃１）、ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃２）及びコントロールのｓｈＲＮＡ導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈｃｏｎｔ）におけるＨＰ１５の発現を確認したグラフである（Ａ）。ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃２）を、マウスに５×１０６個（Ｂ）、又は１×１０７個（Ｃ）皮内接種した場合の、腫瘍の増殖を示したグラフである。
【図８】ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃２）及びコントロールのｓｈＲＮＡ導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈｃｏｎｔ）を、マウスに皮内接種した場合の、腫瘍の増殖（Ａ及びＢ）及び所属リンパ節への転移（Ｃ及びＤ）を示した写真である。
【図９】ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈ＃２）を、マウスに５×１０５個皮内接種した場合の、腫瘍の増殖を示したグラフである（Ａ）。ｓｈＲＮＡ１導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈ＃１）、ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈ＃２）及びコントロールのｓｈＲＮＡ導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈｃｏｎｔ）におけるＨＰ１５の発現を確認したグラフ（Ｂ）及び写真（Ｃ）である。
【図１０】臨床検体におけるＨＰ１５遺伝子、ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子及びｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の陽性率を示したグラフである。
【図１１】ＨＰ１５遺伝子の発現を、健常人の各組織において解析した電気泳動の写真である。
【図１２】各種の癌における、ＨＰ１５遺伝子の測定値とＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子の測定値との相関、又はＨＰ１５遺伝子の測定値とｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の測定値との相関をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［１］ペプチドを含む医薬組成物
本発明のペプチド含有医薬組成物は、癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含み、前記ペプチドが（１）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又はその部分ペプチド、（２）前記タンパク質又は部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質又は変異ペプチド、（３）前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は（４）前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体ペプチドである。
【００１２】
（ＨＰ１５タンパク質）
ＨＰ１５タンパク質及び遺伝子は、ヒトの大腸癌、肺癌、胆嚢癌、頭頚部癌、又は泌尿器の癌などに発現しており（図１０）、精巣を除く正常組織には発現していない（図１１）新規な癌／精巣抗原である。また、Ｋ５６２（ヒト前骨髄性白血病由来細胞株）、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝癌由来細胞株）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ヒト肝癌由来細胞株）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ（ヒト肺腺癌由来細胞株）、及びＧ３６１（悪性黒色腫由来細胞株）において、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現が確認された。
ＨＰ１５遺伝子は染色体の第１６番染色体に存在し、オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）７３から、Ｃ１６ｏｒｆ７３と名付けられている。しかしながら、Ｃ１６ｏｒｆ７３遺伝子から翻訳されたタンパク質の機能は、同定されていない。
ＨＰ１５タンパク質には３つのアイソフォームが存在し、アイソフォーム１は４７１アミノ酸（配列番号１；図１Ａ）、アイソフォーム２は４４２アミノ酸（配列番号２；図１Ｂ）、アイソフォーム３（２２ｋＤａ）は１９８アミノ酸（配列番号３；図１Ｃ）からなっている。ＨＰ１５タンパク質のホモログは、チンパンジー、マウス、ラット、ニワトリ、ショウジョウバエ、及び蚊に存在している。
【００１３】
前記のようにＨＰ１５タンパク質は、特定の癌細胞に発現している。従って、ＨＰ１５タンパク質に対する宿主の免疫応答を誘導することによって、ＨＰ１５タンパク質が発現している癌細胞をヒトの体内から排除することが可能である。すなわち、ＨＰ１５タンパク質の中のＴ細胞エピトープに対する免疫を誘導することにより、癌特異抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞、又はヘルパーＴ細胞を誘導し、癌を治療することができる。従って、全長のＨＰ１５タンパク質は、本発明の医薬組成物に有効成分として含まれることができる。すなわち、全長のＨＰ１５タンパク質を有効成分として含む、本発明の医薬組成物は、癌の治療薬として有効である。
【００１４】
（ペプチド）
本発明の医薬組成物に、有効成分として含まれるペプチドは、癌に対する免疫誘導活性を有している。前記ペプチドの免疫誘導活性は、生体の免疫機能の活性化であれば特に限定されるものではないが、例えば樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）による抗原提示、Ｂ細胞による抗体産生、細胞傷害性Ｔ細胞（以下、Ｔｃ細胞と称することがある）の活性化、又はヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ細胞と称することがある）の活性化を挙げることができるが、癌の治療の観点からは、癌抗原特異的認識による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化、又はヘルパーＴ細胞の活性化が好ましい。細胞傷害性Ｔ細胞の活性化としては、細胞傷害性Ｔ細胞のサイトカイン（例えば、インターフェロン−γ）の産生、エフェクター分子（例えば、パーフォリン、グランザイム）の産生、又は癌細胞に対する細胞傷害活性を挙げることができる。またヘルパーＴ細胞の活性化としては、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、又はＩＬ−２）の産生、又はサイトカイン産生を介した効率的な細胞傷害性Ｔ細胞の分化、誘導、又は維持の補助を挙げることができる。
【００１５】
癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドは、樹状細胞等の抗原提示細胞により貪食され、リソソームで樹状細胞等の表面に提示することのできるペプチド（Ｔ細胞エピトープ）に分解される。Ｔ細胞エピトープは、組織適合性抗原（ＨＬＡ）と複合体を形成して、樹状細胞等の表面に提示されるが、ＨＬＡのタイプによって複合体を形成することのできるＴ細胞エピトープと、複合体を形成できないＴ細胞エピトープがあり、これをＨＬＡ拘束性と称する。従って、図４に免疫誘導活性を示したペプチドと、免疫誘導活性を示さなかったペプチドを記載したが、これらのデータは４人のＨＬＡの異なるリンパ球を用いて解析しており、この４人のＨＬＡ以外のリンパ球を用いた場合、免疫誘導活性を示さなかったペプチドも免疫誘導活性を示すことがある。
また、ＨＬＡは、細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるＨＬＡクラスＩ分子、及びヘルパーＴ細胞に認識されるＨＬＡクラスＩＩ分子があり、ＨＬＡクラスＩ分子は、すべての細胞、例えば単球、マクロファージ、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、皮膚のランゲルハンス細胞、樹状細胞、又は腫瘍組織内の癌細胞に発現しており、一方ＨＬＡクラスＩＩ分子は、樹状細胞等抗原提示細胞に発現している。
【００１６】
前記Ｔ細胞エピトープの長さは、特に限定されるものではないが、通常７〜３０アミノ酸であり、通常Ｔ細胞エピトープは直線状であり、特定の三次元構造を示さない。癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドはＴ細胞エピトープを少なくとも１つ以上を含む。従って、癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドの長さは、Ｔ細胞エピトープを含むことができる限りにおいて限定されるものではないが、下限は７アミノ酸以上が好ましく、上限は特に限定されるものではない。
また、Ｔ細胞エピトープは、細胞傷害性Ｔ細胞が認識することのできるＴｃ細胞エピトープと、ヘルパーＴ細胞が認識することのできるＴｈ細胞エピトープがある。本発明に用いるペプチドは、Ｔｃ細胞エピトープ又はＴｈ細胞エピトープを含んでいればよいが、Ｔｃ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープを含むペプチドが、癌の治療及び癌ワクチンの観点からは好ましい。Ｔｃ細胞の効率的な分化、誘導、又は生体内での維持にはＴｈ細胞の活性化が必要で、両方の細胞を活性化できるからである。
ペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、後述の実施例に示したように、数人の健常者のリンパ球を用いインターフェロン−γの産生を測定することにより、決定することができる。また、ペプチドのＨＬＡ拘束性も実施例に記載の抗体によるブロッキングアッセイ、又はＬＣＬアッセイにより、決定することができる。また、特定の長さのペプチドがインターフェロン−γの産生を誘導することができれば、そのペプチドを含む長いペプチドは、免疫誘導活性を有する。更に、細胞傷害活性もペプチドを感作したターゲット細胞を用い、通常のＣＴＬアッセイにより測定することができ、それによってペプチドが免疫誘導活性を有しているかを決定することができる。
【００１７】
細胞傷害性Ｔ細胞とは、表面にＣＤ８分子を発現しており、宿主にとって異物となる細胞（例えば、癌細胞、ウイルス感染細胞、又は移植細胞）を攻撃して排除するＴ細胞である。細胞傷害性Ｔ細胞は、細胞傷害物質であるパーフォリン及びグランザイムなどの放出、並びに標的細胞のＦａｓを刺激してアポトーシス起こさせることによって、標的細胞を排除する。
Ｔｃ細胞は、前述のようにＨＬＡクラスＩ分子により拘束されている。すなわち、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して、ＨＬＡクラスＩ分子及びペプチド（Ｔｃ細胞エピトープ）の複合体を認識する。ＨＬＡクラスＩ分子は、単球及びマクロファ−ジ以外にも、活性化Ｂ細胞、皮膚のランゲルハンス細胞、組織内の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）などにも発現しており、これらの細胞もＴｃ細胞に対してペプチド（Ｔｃ細胞エピトープ）を提示することができる。
【００１８】
ヘルパーＴ細胞とは、表面にＣＤ４分子を発現しており、そのサイトカインの産生パターンによりＴｈ１細胞、及びＴｈ２細胞に分けられていたが、更にＴｈ１７細胞が存在する。Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−１２存在下で分化し、インターフェロン−γを分泌し、細胞性免疫（例えば、自己免疫疾患又は遅延型アレルギー）に関与している。また、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４存在下で分化し、ＩＬ−４を分泌し、液性免疫に関与している。更にＴｈ１７細胞は、ＩＬ−６及びＴＧＦ−β存在下で分化し、ＩＬ−１７を分泌し、自己免疫疾患に関与していると考えられている。
Ｔｈ細胞は、前記のように樹状細胞等に発現しているＨＬＡクラスＩＩ分子により拘束されている。すなわち、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を介して、ＨＬＡクラスＩＩ分子及びペプチド（Ｔｈ細胞エピトープ）の複合体を認識する。ＨＬＡクラスＩＩ分子を介してペプチドにより刺激されたＴｈ１細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞又は樹状細胞を活性化して、細胞性免疫を活性化させる。また、ＨＬＡクラスＩＩ分子を介してペプチドにより刺激されたＴｈ２細胞は、Ｂ細胞及び抗原提示細胞に作用して、体液性免疫を活性化させる。
【００１９】
（部分ペプチド）
ＨＰ１５タンパク質の部分ペプチドは、配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の連続するアミノ酸配列からなるペプチドであり、且つ癌に対する免疫誘導活性を有する限り、限定されるものではない。本明細書において、「癌に対する免疫誘導活性を有する」とは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞を活性化することを意味する。すなわち、限定されるものではないが、少なくとも後述の実施例に示したように、健常者のリンパ球を用いインターフェロン−γの産生活性を有するペプチドは、癌に対する免疫誘導活性を有するものである。
部分ペプチドの長さは、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む限り、限定されるものではない。下限は７アミノ酸以上が好ましく、上限はアイソフォーム１のＨＰ１５タンパク質で４７１アミノ酸以下、アイソフォーム２のＨＰ１５タンパク質で４４２アミノ酸以下、アイソフォーム３のＨＰ１５タンパク質で１９８アミノ酸以下である。具体的には、部分ペプチドの長さは、好ましくは７〜２００アミノ酸であり、より好ましくは１０〜１００アミノ酸であり最も好ましくは２０〜６０アミノ酸である。より具体的には、部分ペプチドは、表１に記載の配列番号４〜６５のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなる部分ペプチドを挙げることができる。
【００２０】
【表１】
2013147464.tif 000002
【００２１】
なお、例えば配列番号２２の＃１９部分ペプチドは、図５及び６に示すように、ＨＬＡクラスＩ分子のＨＬＡ−Ａ型がＡ＊０２０１のＴｃ細胞、及びＨＬＡクラスＩＩ分子のＨＬＡ−ＤＲ型がＤＲＢ１＊０８０３を持つ抗原提示細胞に対して、免疫誘導活性が示されることから、このＨＬＡのタイプと複合体を形成し、免疫誘導活性を示すことが考えられる。
本発明に用いる部分ペプチドは、Ｔｃ細胞エピトープ又はＴｈ細胞エピトープを含んでいればよいが、Ｔｃ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープを含む部分ペプチドが、癌の治療及び癌ワクチンの観点からは好ましい。
【００２２】
（変異タンパク質及び変異ペプチド）
本発明に用いることのできる変異タンパク質は、前記ＨＰ１５タンパク質（配列番号１〜３のいずれか１つのＨＰ１５タンパク質）において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、且つ癌に対する免疫誘導活性を有するタンパク質である。
また、本発明に用いることのできる変異ペプチドは、前記部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、且つ癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドである。本明細書において、「アミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／若しくは付加されたアミノ酸」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００２３】
ここで、「保存的置換」とは、１若しくは数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００２４】
このような変異ペプチドは、アミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加が、前記Ｔ細胞エピトープ以外の部分であれば、本発明の医薬組成物に有効に用いることができる。また、アミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加がＴ細胞エピトープであっても、改変されたアミノ酸数が少なく、また保存的置換であれば、Ｔ細胞エピトープとして機能することが可能であり、本発明の医薬組成物に有効に用いることができる。
本発明に用いる変異ペプチドは、Ｔｃ細胞エピトープ又はＴｈ細胞エピトープを含んでいればよいが、Ｔｃ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープを含む変異ペプチドが、癌の治療及び癌ワクチンの観点からは好ましい。
【００２５】
（複合ペプチド）
本発明に用いることのできる複合ペプチドは、前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含み、且つ癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドであるが、２つ以上の部分ペプチド及び／又は変異ペプチドを含むものが好ましい。また、複合ペプチドは、部分ペプチド又は変異ペプチド以外のアミノ酸として、免疫誘導活性に影響しないアミノ酸配列を含んでもよく、好ましくはＮ末端又はＣ末端に免疫誘導活性に影響しない１〜数個アミノ酸を含んでもよい。また、２つ以上の部分ペプチド及び／又は変異ペプチドを含む場合、それらのペプチドを結合させるためにリンカー配列として、免疫誘導活性に影響しない数個のアミノ酸を含んでもよい。リンカーアミノ酸としては、例えばＧ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧ、及びＧＧＧＧＧＧＧＧを挙げることができる。
経験的に、Ｎ末端、Ｃ末端、又はリンカーアミノ酸は、Ｔ細胞エピトープとしては機能せず、また新たなエピトープを形成することも少ないため、前記複合ペプチドは、本発明の医薬組成物に有効に用いることができる。
また、本発明に用いる複合ペプチドは、Ｔｃ細胞エピトープ又はＴｈ細胞エピトープを含んでいればよいが、Ｔｃ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープを含むペプチドが、癌の治療及び癌ワクチンの観点からは好ましい。
【００２６】
（誘導体ペプチド）
本発明に用いることのできる誘導体ペプチドは、前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体であり、且つ癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドである。ペプチドの誘導体としては、例えば、ペプチドの安定性を向上させる各種修飾を施したペプチド誘導体を挙げることができる。前記修飾としては、例えばＬ体アミノ酸のＤ体化（例えば、Ｎ末端アミノ酸のＤ体化、Ｃ末端アミノ酸のＤ体化、Ｎ末端及びＮ末端アミノ酸以外のＤ体化）Ｎ末端アミノ基のアセチル化、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化、天然アミノ酸の（性質の類似した）非天然型アミノ酸への置換、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。
これらの修飾は、前記Ｔ細胞エピトープ以外の部分であれば、ペプチドの免疫誘導活性に影響を与えない可能性が高く、誘導体ペプチドは本発明の医薬組成物に有効に用いることができる。また、修飾がＴ細胞エピトープであっても、Ｔ細胞エピトープとして機能することが可能であり、本発明の医薬組成物に有効に用いることができる。
本発明に用いる誘導体ペプチドは、Ｔｃ細胞エピトープ又はＴｈ細胞エピトープを含んでいればよいが、Ｔｃ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープを含む誘導体ペプチドが、癌の治療及び癌ワクチンの観点からは好ましい。
【００２７】
（癌）
本発明の医薬組成物は、癌の治療用として用いることができる。治療される癌は、ＨＰ１５が発現されている癌である限り、限定されるものではないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍を挙げることができる。
【００２８】
前記ＨＰ１５タンパク質若しくはＨＰ１５変異タンパク質、又はペプチド（部分ペプチド、変異ペプチド、複合ペプチド又は誘導体ペプチド）は、癌（例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍）の治療用ペプチドとして用いることができる。
また、前記ＨＰ１５タンパク質若しくはＨＰ１５変異タンパク質、又はペプチド（部分ペプチド、変異ペプチド、複合ペプチド又は誘導体ペプチド）は、癌患者（例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍の患者）に投与することを含む癌の治療方法に用いることができる。
更に、前記ＨＰ１５タンパク質若しくはＨＰ１５変異タンパク質、又はペプチド（部分ペプチド、変異ペプチド、複合ペプチド又は誘導体ペプチド）は、癌（例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍）の治療薬の製造のために使用することができる。
【００２９】
本発明の別の態様においては、医薬組成物は前記ＨＰ１５タンパク質若しくはＨＰ１５変異タンパク質、又はペプチド（部分ペプチド、変異ペプチド、複合ペプチド又は誘導体ペプチド）によって感作された抗原提示細胞を含むことができる。また、医薬組成物はペプチドと感作された抗原提示細胞とを含むこともできる。癌患者自身、又は癌患者と同じＨＬＡを有するヒトの体内の抗原提示細胞を採取し、試験管内で前記ペプチドと混合することによって得られた抗原提示細胞を含む医薬組成物を癌患者に投与することによって、癌を治療することが可能である。
また、本発明の別の態様においては、医薬組成物は前記ＨＰ１５タンパク質若しくはＨＰ１５変異タンパク質、又はペプチド（部分ペプチド、変異ペプチド、複合ペプチド又は誘導体ペプチド）によって誘導された細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞を含むことができる。また、医薬組成物はペプチド及び誘導された細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞を含むことができ、ペプチド、感作された抗原提示細胞及び誘導された細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞を含むこともできる。癌患者自身、又は癌患者と同じＨＬＡを有するヒトの体内の細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞を採取し、試験管内で前記ペプチドにより誘導された細胞傷害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞を含む医薬組成物を癌患者に投与することによって、癌を治療することが可能である。
【００３０】
［２］ペプチドを含む癌ワクチン
本発明のＨＰ１５タンパク質若しくはＨＰ１５変異タンパク質、又はペプチドを含む癌ワクチンは、癌に対する免疫誘導活性を有するペプチドを有効成分として含み、前記ペプチドが、（１）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はその部分ペプチド、（２）前記タンパク質又は部分ペプチドにおいて、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質又は変異ペプチド、（３）前記部分ペプチド又は変異ペプチドの少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は（４）前記部分ペプチド、変異ペプチド、又は複合ペプチドの誘導体ペプチド、である。
本明細書において、癌ワクチンとは、癌の予防、癌の進行の抑制、又は癌の退縮を起こすことのできるものを意味する。
本発明の癌ワクチンに用いるこことのできるタンパク質としては、前記「［１］ペプチドを含む医薬組成物」に記載のＨＰ１５タンパク質を用いることができる。
【００３１】
（ペプチド）
本発明の癌ワクチンに用いることのできるペプチドとしては、部分ペプチド、変異ペプチド、複合ペプチド、及び誘導体ペプチドを挙げることができ、これらのペプチドは、前記「［１］ペプチドを含む医薬組成物」に記載のペプチドを用いることができる。
癌ワクチンに含まれるペプチドとしては、Ｔｈ細胞エピトープ及びＴｃ細胞エピトープを含むペプチドが好ましい。従って、部分ペプチド及び変異ペプチドは、Ｔｈ細胞エピトープ少なくとも１つ、及びＴｃ細胞エピトープを少なくとも１つを含む長さのペプチドが好ましい。また、複合ペプチドは、Ｔｈ細胞エピトープを少なくとも１つを含む部分ペプチド又は変異ペプチドと、Ｔｃ細胞エピトープを少なくとも１つを含む部分ペプチド又は変異ペプチドとが結合した複合ペプチドが好ましい。Ｔｈ細胞エピトープ及びＴｃ細胞エピトープを含むことによって、より効果的な抗腫瘍効果を発揮するために必要な両細胞を同時に活性化できるからである。
また、部分ペプチド、変異ペプチド、複合ペプチド、及び誘導体ペプチドのＴ細胞エピトープはＨＬＡと複合体を形成し、抗原提示細胞によって、Ｔｈ細胞及びＴｃ細胞に提示される。ＨＬＡは個人によってタイプが異なっているため、さまざまなＨＬＡと複合体を形成することのできる多くのＴ細胞エピトープを含むペプチドが、癌ワクチンの有効成分として好ましい。
【００３２】
（癌）
本発明の癌ワクチンは予防用として用いることも可能であるが、癌の進行の抑制、又は癌の退縮を目的としても用いることができる。癌の進行の抑制、又は癌の退縮を目的とする場合、癌はＨＰ１５が発現している癌である限り、限定されるものではないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍を挙げることができる。
【００３３】
［３］ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物を含む医薬組成物
本発明のＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物を含む医薬組成物は、配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分として含む。
【００３４】
（ＨＰ１５タンパク質）
ＨＰ１５タンパク質及び遺伝子は、前記のようにヒトの大腸癌、肺癌、胆嚢癌、頭頚部癌、又は泌尿器の癌などに発現している（図１１）。また、図２に示すように、ＨＭＶ−１細胞（ヒト悪性黒色腫由来細胞株）へ、ＨＰ１５遺伝子を導入し、ＨＰ１５タンパク質を強制発現させたところ、ＲＡＧ２−／−ｇｃ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウス生体内におけるＨＭＶ−１の増殖が亢進した。また、癌の悪性度に関連するＭＭＰ２遺伝子の発現の亢進、及び幹細胞のマーカーであるＯｃｔ３／４遺伝子の発現上昇が認められた。すなわち、ＨＰ１５遺伝子及びＨＰ１５タンパク質は、癌の増殖の亢進、又は悪性度と関連している可能性がある。従って、ＨＰ１５タンパク質及び遺伝子は、癌治療の標的分子の可能性が高く、ＨＰ１５タンパク質及び遺伝子を癌治療の標的分子として治療薬を開発できると考えられる。
【００３５】
前記ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物としては、ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能を抑制することができる限り、限定されるものではないが、例えば（１）ＨＰ１５タンパク質のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することのできるｓｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ、若しくは前記ＤＮＡを含むベクター、又は（２）ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントを挙げることができる。
【００３６】
（ｓｉＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡは、二重鎖のＲＮＡ部分を有し、ＨＰ１５遺伝子のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができる限り限定されるものではないが、ＨＰ１５遺伝子のｍＲＮＡである配列番号６９で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域１（GCAGACAAAUAUGGCUAAUCU）、配列番号７０で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域２（GGAUCAGAAAGGUACACUUUC）、配列番号７１で表される塩基配列からなる標的ｍＲＮＡ領域３（GCGAUGACAUGUUGGGAUAAU）において、ＲＮＡ干渉を介して開裂することができるｓｉＲＮＡが好ましい。標的ｍＲＮＡ領域としては、標的ｍＲＮＡ領域２が最も好ましい。標的ｍＲＮＡ領域２をターゲットとするｓｉＲＮＡは、アイソフォーム１及びアイソフォーム２のＨＰ１５のｍＲＮＡを、ＲＮＡ干渉を介して開裂させることができる。
【００３７】
二重鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１９〜２５塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。二重鎖ＲＮＡ部分には、そのままｓｉＲＮＡとして機能するものも含まれるが、細胞内でＤｉｃｅｒにより切断されて、ｓｉＲＮＡとしてＲＮＡ干渉を誘導することのできる二重鎖ＲＮＡ部分も含むことができる。
【００３８】
二重鎖ＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ配列は、ＨＰ１５のｍＲＮＡに細胞内でハイブリダイズできるものであれば、限定されず、前記標的ｍＲＮＡ領域の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡ部分（以下、標的相補ＲＮＡ部分と称する）の塩基配列において、１〜数個の塩基が置換されたものでもよい。また、アンチセンスＲＮＡ部分は、ｓｉＲＮＡの全体のＧＣ含量が７０％以下、好ましくは３０〜７０％、３０〜６０％程度となるように設計されるのが好ましい。
アンチセンスＲＮＡとしては、具体的には標的ｍＲＮＡ領域１におけるｓｉＲＮＡ１ａｓ（AGAUUAGCCAUAUUUGUCUGC（配列番号７２））、標的ｍＲＮＡ領域２におけるｓｉＲＮＡ２ａｓ（GAAAGUGUACCUUUCUGAUCC（配列番号７３））、及び標的ｍＲＮＡ領域３におけるｓｉＲＮＡ３ａｓ（AUUAUCCCAACAUGUCAUCGC（配列番号７４））を挙げることができる。
【００３９】
二重鎖ＲＮＡ部分のセンスＲＮＡ配列は、アンチセンスＲＮＡ配列と細胞内でハイブリダイズすることのできるＲＮＡであれば、限定されず、例えば、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなる塩基配列において１〜数個の塩基が置換されたＲＮＡ鎖であってもよいが、最も好ましくは、アンチセンスＲＮＡの塩基配列に完全に相補的な塩基配列からなるセンスＲＮＡ配列である。センスＲＮＡとしては、具体的には標的ｍＲＮＡ領域１におけるｓｉＲＮＡ１ｓ（GCAGACAAAUAUGGCUAAUCU（配列番号６９））、標的ｍＲＮＡ領域２におけるｓｉＲＮＡ２ｓ（GGAUCAGAAAGGUACACUUUC（配列番号７０））、及び標的ｍＲＮＡ領域３におけるｓｉＲＮＡ３ｓ（GCGAUGACAUGUUGGGAUAAU（配列番号７１））を挙げることができる。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分の末端が平滑である二本鎖ヌクレオチドも含まれ、このようなｓｉＲＮＡは十分なＲＮＡｉ活性を示す。
【００４１】
また、本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、突出末端を形成する二本鎖オリゴヌクレオチドも含まれる。前記オーバーハング部分は、それぞれ、５塩基以下の任意のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）であるが、２塩基のヌクレオチドが好ましい。ｓｉＲＮＡの３’側オーバーハングを構成するリボヌクレオチドとしては、例えば、ｕ（ウリジン）、ａ（アデノシン）、ｇ（グアノシン）、又はｃ（シチジン）のヌクレオチドを用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボヌクレオチドとしては、例えば、ｄｔ（チミジン）、ｄａ（デオキシアデノシン）、ｄｇ（デオキシグアノシン）、又はｄｃ（デオキシシチジン）のヌクレオチドを用いることができる。
【００４２】
前記オーバーハングとしては、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングがより好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、２塩基のｕ又はｄｔが付加されたオーバーハングが特に好ましい。更に、具体的なオーバーハングとしては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’などの塩基配列を挙げることができる。従って、オーバーハング二重鎖ｓｉＲＮＡとして、前記ｓｉＲＮＡ−１ｓ〜ｓｉＲＮＡ−８ｓの３’末端にｔｔ−３’が付加されたヌクレオチドと、前記ｓｉＲＮＡ−１ａｓ〜ｓｉＲＮＡ−８ａｓの３’末端にｔｔ−３’が付加されたヌクレオチドが、それぞれアニールしたオーバーハング二重鎖ｓｉＲＮＡを挙げることができ、具体的には、GCAGACAAAUAUGGCUAAUCUｔｔ及びAGAUUAGCCAUAUUUGUCUGCｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ１）、GGAUCAGAAAGGUACACUUUCｔｔ及びGAAAGUGUACCUUUCUGAUCCｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ２）、GCGAUGACAUGUUGGGAUAAUｔｔ及びAUUAUCCCAACAUGUCAUCGCｔｔのアニールしたもの（ｏｈ−ｓｉＲＮＡ３）、を挙げることができる。
【００４３】
本発明のｓｉＲＮＡの態様の１つとして、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する２つのＲＮＡ鎖が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合しているショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；以下、ｓｈＲＮＡと称する）が含まれる。ｓｈＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ部分を形成する前記センスＲＮＡ配列とアンチセンス配列が、ヘアピンループを形成することのできるＲＮＡ部分によって結合し、前記センスＲＮＡ配列とアンチセンス配列が二本鎖構造を形成している。ヘアピンループを形成するＲＮＡ部分の鎖長及び塩基配列は、ヘアピンループを形成することができるものである限り、限定されるものではないが、鎖長は好ましくは３〜２３であり、より好ましくは、３から１０であり、例えば、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ、ＣＣＡＣＣ、ＣＵＣＧＡＧ、ＣＣＡＣＡＣＣ、ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＡ、又はＵＵＣＧのＲＮＡを挙げることができる。具体的には、以下の表２に記載のｓｈＲＮＡを挙げることができる。
【００４４】
【表２】
2013147464.tif 000003
【００４５】
本発明の医薬組成物に用いることのできるｓｉＲＮＡは、公知の製造方法、例えば、化学合成、又は酵素合成法により製造することもできるし、あるいは、後述するように適当な発現ベクターに挿入し、遺伝子工学的に製造することもできる。
化学合成法としては、２’−ＡＣＥ（２’−ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）又は２’−ＴＢＤＭＳ（２’−ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｌｙｌ）等の保護基を用いた方法、酵素合成法としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼを使用する方法を挙げることができる。化学合成法又は酵素合成法により合成された２本鎖ＲＮＡは、安定化や標識化のために、化学修飾基により修飾することができる。
【００４６】
本発明の医薬組成物に用いることのできるＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡの形態で細胞内に導入され、細胞内でｓｉＲＮＡを生成することができるものである。特に限定されないが、例えば、前記二本鎖オリゴヌクレオチド又はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ部分の５’側に前記ＤＮＡの転写を制御することのできるプロモーターと、３’側にターミネーターとを含むＤＮＡを挙げることができる。更に、このようなＤＮＡをベクターに挿入し、本発明の医薬組成物に用いることのできるベクターを作製することができる。
【００４７】
前記ｓｈＲＮＡを生成することができるＤＮＡの場合、ｓｈＲＮＡの全長を発現することができるＤＮＡ、例えば、プロモーターの下流側にセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ヘアピンループをコードする配列、アンチセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ポリＴストレッチ配列、及びストップコドンからなる塩基配列を順番に有するＤＮＡを用いることができ、このＤＮＡをベクターに挿入することができる。
【００４８】
プロモーターとしては、恒常的に発現するためのプロモーターでもよく、特定の条件下で発現するためのプロモーターでもよく、特に限定されないが、例えば、ＲＮＡポリメラーゼIII（pol III）プロモーター（Brummerlkamp,T.R., et al., Science, 297, 1352-1354, 2002）、Ｕ６プロモーター（a） Lee NS. et al., Nature Biotech. 20, 500-505, 2002；b） Miyagishi M. & Taira K., Nature Biotech. 20, 497-500, 2002；c） Paul CP. et al., Nature Biotech. 20, 505-508, 2002）、Ｈ１プロモーター（Brummelkamp TR et al: Science 296, 550-553, 2002）、ｔＲＮＡプロモーター（Oshima K., et al., Cancer Research 63, 6809-6814, 15, 2003）などを挙げることができる。
【００４９】
前記ベクターは、哺乳動物細胞内でＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡの発現を抑制することのできるｓｉＲＮＡを発現させるためのベクターであり、前記細胞内で効率良くｓｉＲＮＡを発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターを挙げることができる。
【００５０】
本発明のｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ及びベクターは、ｓｉＲＮＡとして、又は後述の医薬組成物として、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、又はカチオン脂質法を用いて目的の組織、又は細胞内に導入することが可能である。骨格となるベクターとして、ウイルスベクターを用いる場合は、目的の細胞へのウイルスベクターの感染によってｓｉＲＮＡを導入することが可能である。
【００５１】
前記ＤＮＡ又はベクターは、細胞内においてｓｉＲＮＡを転写し、そのｓｉＲＮＡが作用するものである。細胞内におけるｓｉＲＮＡの発現は、一過的でも、安定的でも細胞内において有効に作用する。
【００５２】
（抗体）
本発明の医薬組成物に用いることのできる抗体は、ＨＰ１５に特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合部位を有する抗体フラグメントであって、且つＨＰ１５タンパク質の発現又は機能を抑制することができる限り、限定されるものではないが、マウスのモノクローナル抗体、又はそのキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、若しくはヒト型抗体が好ましい。
【００５３】
モノクローナル抗体は、免疫抗原としてＨＰ１５タンパク質を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えばＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作成することができる。免疫抗原であるＨＰ１５タンパク質は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを用いることができる。具体的には、生体試料から精製した抗原、遺伝子工学的に作成した組換え抗原、又は化学的に合成した部分ペプチドなどを用いることが可能である。大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤやＴｒｐＥとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、Ｈｉｓ−Ｔａｇなどを結合させて発現させることもできる。
【００５４】
キメラ抗体は、例えばマウスの重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインをコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域のポリペプチドをコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。キメラ化抗体に用いる重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメイン、並びに定常領域のポリペプチドの由来は、ヒトの抗体であれば特に限定されるものではなく、例えばマウスのＩｇＧの重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインとヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧの定常領域のポリペプチドとにより、キメラ抗体を得ることができる。
【００５５】
ＣＤＲグラフト化抗体は、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、例えばヒト抗体の相補性決定領域と入れ替え、移植したものである。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ＣＤＲグラフト化抗体に用いる相補性決定領域、並びにフレームワーク領域及び定常領域のポリペプチドの由来は、ヒトの抗体であれば特に限定されるものではなく、例えばマウスのＩｇＧの相補性決定領域とヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧのフレームワーク領域及び定常領域のポリペプチドとにより、ＣＤＲグラフト化抗体を得ることができる。また、マウスの相補性決定領域とヒトのＩｇＭ、又はＩｇＧフレームワーク領域とにより、ＣＤＲグラフト化抗体の抗原結合性断片を得ることができる。
【００５６】
また、本明細書において、「ヒト型抗体」は、ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物から得られる抗体、及びヒトの抗体産生細胞をミエローマ細胞と細胞融合させて得ることのできるモノクローナル抗体を意味する。
【００５７】
本発明のＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物を含む医薬組成物は、癌の治療用として用いることができる。治療される癌は、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子が発現している癌である限り、限定されるものではないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍を挙げることができる。
【００５８】
前記ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物は、癌（例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍）の治療用ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物として用いることができる。
また、ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物は、癌患者（例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍の患者）に投与することを含む癌の治療方法に用いることができる。
更に、ＨＰ１５タンパク質の発現又は機能抑制化合物は、癌（例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、頭頚部癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍）の治療薬の製造のために使用することができる。
【００５９】
［４］癌の検出方法
本発明の癌の検出方法では、前記ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を分析することにより、癌を検出する。
【００６０】
（ＨＰ１５タンパク質及び遺伝子）
ＨＰ１５タンパク質及びＨＰ１５遺伝子は、前記のようにヒトの大腸癌、肺癌、胆嚢癌、頭頚部癌、又は泌尿器の癌などの癌組織に発現しており（図１０）、またＫ５６２（ヒト前骨髄性白血病由来細胞株）、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト肝癌由来細胞株）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ヒト肝癌由来細胞株）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ（ヒト肺腺癌由来細胞株）、及びＧ３６１（悪性黒色腫由来細胞株）などの癌由来の細胞に発現している。また、精巣以外の健常人の組織では発現していない。従って、癌が疑われる組織のＨＰ１５タンパク質及びＨＰ１５遺伝子を分析し、ＨＰ１５タンパク質及びＨＰ１５遺伝子が発現している場合は、その患者が癌であると診断することが可能である。すなわち、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子は、癌患者の診断マーカーとして用いることができる。
【００６１】
本発明の癌の検出方法において、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を分析する方法としては、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＨＰ１５遺伝子のｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的分析方法、又は抗ＨＰ１５抗体若しくはその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）を挙げることができる。また、本発明の検出方法は、生体由来の被検試料をインビトロにおいて、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を分析する方法である。従って、ＨＰ１５遺伝子の全長の遺伝子、又はそのフラグメントを検出してもよく、ＨＰ１５タンパク質の全長のタンパク質又はそのペプチド断片を測定してもよい。
【００６２】
（分子生物学的分析方法）
ＨＰ１５遺伝子の分子生物学的分析方法としては、試料中の遺伝子、例えばｍＲＮＡ又はそれから得られたｃＤＮＡなどと、それらのヌクレオチドにハイブリダイズすることのできるプライマーやプローブとを用い、ハイブリダイズの原理を用いた方法で分析するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロット法、ノザンブロット法、及びＰＣＲ法を挙げることができ、好ましくはリバーストランスクリプション−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）であり、特にはリアルタイムＰＣＲ法を好適に用いることができる。
【００６３】
リアルタイムＰＣＲ法としては、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセットを用い、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩをＰＣＲの反応系に加えるインターカレーター法、並びに前記プライマーセットと、５’末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）とをＰＣＲの反応系に加えるＴａｑＭａｎ法等を挙げることができる。このようなリアルタイムＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、前記プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。
【００６４】
前記フォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、ＨＰ１５タンパク質をコードするヌクレオチドの塩基配列に基づいて作成することができる。具体的には、ＨＰ１５遺伝子のフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブは、配列番号６６〜６８のいずれか１つで表される塩基配列から、適当な塩基配列を選択し、作製することができ、例えば、フォワードプライマーとして５’−agtcgtcttttgcgatgaca−３’（配列番号７８）を、リバースプライマーとして５’−tgaggcaaatattactgtttctcg−３’（配列番号７９）のプライマーセット（＃４２プライマーセット）、又はフォワードプライマーとして５’−atcacacaggcacccttcat−３’（配列番号８０）を、リバースプライマーとして５’−attgcaagaaactcatgtaccg−３’（配列番号８１）のプライマーセット（＃７３プライマーセット）を挙げることができる。なお、配列番号８１のヌクレオチドの配列は、アイソフォーム１をコードするヌクレオチドのみに存在する配列であり、従って＃７３プライマーセットはアイソフォーム１をコードするヌクレトチドのみを増幅できるプライマーセットである。
プライマーの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、最も好ましくは、１９ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。プローブの長さは、特に限定する必要はないが、好ましくは、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、より好ましくは、１３ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであり、最も好ましくは、１４ｍｅｒ〜１８ｍｅｒである。
【００６５】
前記ＲＴ−ＰＣＲ法（特にはリアルタイムＰＣＲ法）は、
（１）生体由来の試料からｍＲＮＡを抽出する工程、
（２）抽出されたｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、
（３）プライマーセット、又はプライマーセット及びプローブを用いてＤＮＡを増幅する工程、及び
（４）増幅されたＤＮＡを検出する工程、
を含むことができる。
【００６６】
本発明の癌の検出方法においては、癌が疑われる患者の生体由来の試料中におけるＨＰ１５遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、測定し、健常者生体由来試料中のＨＰ１５のｍＲＮＡの発現量と比較することにより、前記患者が癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＨＰ１５のｍＲＮＡの発現量と比べて、前記患者のＨＰ１５のｍＲＮＡの発現量が有意に多い場合に前記患者は癌であると判定することができる。
【００６７】
（免疫学的分析方法）
ＨＰ１５タンパク質の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、ＨＰ１５タンパク質に対するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＨＰ１５タンパク質を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作成することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＨＰ１５のタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
【００６８】
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を取得するために用いることのできる免疫抗原は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを免疫抗原として用いることができる。具体的には、生体試料から精製した抗原、遺伝子工学的に作成した組換え抗原、又は化学的に合成した部分ペプチドなどを用いることが可能である。大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤやＴｒｐＥとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、Ｈｉｓ−Ｔａｇなどを結合させて発現させることもできる。
【００６９】
本発明の癌の検出方法において、前記分析は、好ましくはＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントと、被検試料とを接触させる工程；及びＨＰ１５タンパク質と前記抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントとの結合体を検出する工程を含む免疫学的分析方法である。この免疫学的分析法は、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等を含む。
【００７０】
免疫学的分析方法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体の抗原結合部位を有する抗体フラグメントなどを用いることができる。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。
なお、本明細書において、「ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体」は、ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体の抗原結合部位を有する抗体フラグメントを意味することがある。
【００７１】
本発明の検出方法では、ＨＰ１５タンパク質の存在の有無、あるいはＨＰ１５タンパク質の量を測定することにより、癌を検出することが可能である。例えば、被検試料として血液等を用いる場合、癌の疑いのある患者から血液を採取し、その中のＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子の量を測定し、健常者から採取した血液中のＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子の量と比較することにより、前記患者が癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子の量と比べて、前記患者のＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子の量が有意に多い場合に前記患者は癌であると判定することができる。
【００７２】
（被検試料）
本発明の癌の検出方法において、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子の分析に用いる被検試料としては、癌の疑いのある患者の被検試料であり、癌検診を受けた正常者の被検試料も含まれる。より具体的には、ＨＰ１５を含有する可能性のある生体由来の組織又は液体試料（例えば、尿、血液、血清、血漿、リンパ液、組織液、髄液、唾液、尿、汗等）を挙げることができる。
【００７３】
本発明の癌の検出方法は、癌の診断方法として、用いることができ、健康診断などにおいて、癌の早期発見に有効である。
【００７４】
（癌の検出用キット）
癌の検出用キットとしては、分子生物学的分析方法に用いるためのキット、及び免疫学的分析方法に用いるためのキットが含まれる。
【００７５】
分子生物学的分析方法用のキットは、例えばフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット、及び／又はプローブを含むことができる。キットの分析方法としては、特に限定されるものではないが、サザンブロット法、ノザンブロット法、又はＰＣＲ法の原理を用いた分析方法が挙げられる。プライマーセット及びプローブは、適用される測定原理に基づいて、修飾されてもよい。例えば、ＴａｑＭａｎ法の場合、ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾される。
【００７６】
疫学的分析方法用のキットは、ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせを含む。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体フラグメントとしては、ＨＰ１５タンパク質への特異的結合能を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
また、前記キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態でＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合部位を有する抗体フラグメントを含むことができる。例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。
【００７７】
癌の検出用キットは、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を標準物質として含むことができる。具体的には、生体試料から精製したＨＰ１５タンパク質、遺伝子工学的に作成した組換えＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子、又は化学的に合成したＨＰ１５タンパク質の部分ペプチド又はＨＰ１５遺伝子の部分オリゴヌクレオチドを挙げることができる。
癌の検出用キットは、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を分析することを特徴とする本発明の癌の検出方法に用いることができる。従って、キットには癌の検出用であることを明記した取り扱い説明書を含むことができる。包装容器に癌の検出用であることを明記することもできる。また、本発明の癌の検出用キットは、癌の診断に用いることができる。
【００７８】
前記ＨＰ１５遺伝子に特異的に結合するフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット、及び／又はプローブは、癌の検出用キットに使用することができる。また、ＨＰ１５遺伝子に特異的に結合するフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマーセット、及び／又はプローブは、癌の検出用キットの製造に使用することができる。
前記ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせは、癌の検出用キットに使用することができる。また、ＨＰ１５タンパク質に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせは、癌の検出用キットの製造に使用することができる。
【００７９】
（癌）
本発明の癌の検出方法によって検出される癌は、限定されるものではないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病、又は脳腫瘍を挙げることができ、特には、大腸癌、肺癌、胆嚢癌、頭頚部癌、泌尿器の癌、前骨髄性白血病、又は悪性黒色腫を挙げることができる。
【００８０】
［５］癌治療用化合物のスクリーニング方法
本発明の癌治療用化合物のスクリーニング方法は、（１）癌治療の標的分子と被検化合物とを接触させる工程であって、前記標的分子が、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質であって、且つ癌に対する免疫誘導活性を有する変異タンパク質、（ｃ）前記タンパク質、又は変異タンパク質を含む融合タンパク質、（ｄ）前記タンパク質若しくは変異タンパク質の部分ペプチド、部分ペプチド少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は部分ペプチド若しくは複合ペプチドの誘導体ペプチド、又は（ｅ）前記タンパク質（ａ）、変異タンパク質（ｂ）、融合タンパク質（ｃ）及びペプチド（ｄ）をコードする遺伝子、である接触工程；（２）前記標的分子と、被検化合物との結合を測定する工程；（３）前記標的分子と結合する被検化合物を選択する工程；を含む。
また、本発明の癌治療用化合物のスクリーニング方法の別の態様においては、（１）癌治療の標的分子が発現している細胞と被検化合物とを接触させる工程であって、前記標的分子が、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質であって、且つ癌に対する免疫誘導活性を有する変異タンパク質、（ｃ）前記タンパク質、又は変異タンパク質を含む融合タンパク質、（ｄ）前記タンパク質若しくは変異タンパク質の部分ペプチド、部分ペプチド少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は部分ペプチド若しくは複合ペプチドの誘導体ペプチド、又は（ｅ）前記タンパク質（ａ）、変異タンパク質（ｂ）、融合タンパク質（ｃ）及びペプチド（ｄ）をコードする遺伝子である接触工程；（２）前記標的分子の発現を測定する工程；及び（３）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記標的分子の発現レベルを変化させる化合物を選択する工程；を含む。
すなわち、（ａ）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１〜３のいずれか１つで表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる変異タンパク質であって、且つ癌に対する免疫誘導活性を有する変異タンパク質、
（ｃ）前記タンパク質、又は変異タンパク質を含む融合タンパク質、
（ｄ）前記タンパク質若しくは変異タンパク質の部分ペプチド、部分ペプチド少なくとも１つを含む複合ペプチド、又は部分ペプチド若しくは複合ペプチドの誘導体ペプチド、又は（ｅ）前記タンパク質（ａ）、変異タンパク質（ｂ）、融合タンパク質（ｃ）及びペプチド（ｄ）をコードする遺伝子は、癌治療用化合物スクリーニング用標的分子として用いることができる。
【００８１】
（ＨＰ１５タンパク質及びＨＰ１５遺伝子）
ＨＰ１５遺伝子をＨＭＶ−１細胞（ヒト悪性黒色腫由来細胞株）へ導入し、ＨＰ１５タンパク質を強制発現させたところ、ＲＡＧ２−／−ｇｃ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウス生体内におけるＨＭＶ−１の増殖が亢進した。従って、ＨＰ１５タンパク質及び遺伝子は、癌治療の標的分子となり得ると考えられる。このＨＰ１５タンパク質及び遺伝子を標的分子として、レンチウイスベクターによるｓｈＲＮＡをＨＭＶ−１細胞（ＨＰ１５遺伝子）に導入させることによって、ＨＰ１５遺伝子及びＨＰ１５タンパク質の発現が抑制された。すなわち、ＨＰ１５遺伝子を発現させたＨＭＶ−１細胞を、標的として癌治療用化合物をスクリーニングすることが可能であることが示された。
また、本発明には前記癌治療用化合物スクリーニング用標的分子を含むスクリーニングキットが含まれる。更に、本発明には前記スクリーニング方法により得られたスクリーニング結果物、及びスクリーニング結果物を含む医薬を含むことができる。
【００８２】
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術［Terrett, N. K. ら, Tetrahedron, 51, 8135-8137 (1995)］又は通常の合成技術によって得られた化合物群、ファージ・ディスプレイ法［Felici, F. ら, J. Mol. Biol., 222, 301-310 (1991)］などを応用して作成されたランダム・ペプチド群、ｓｉＲＮＡ、又はＨＰ１５遺伝子又はタンパク質に結合する抗体、を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
【００８３】
本発明のスクリーニング方法においては、前記癌治療用化合物スクリーニング用標的分子と試験物質とを接触させ、前記試験物質と、癌治療用化合物スクリーニング用標的分子との結合を分析することにより、試験物質をスクリーニングすることができる。
【００８４】
また、本発明のスクリーニング方法においては、前記癌治療用化合物スクリーニング用標的分子の発現した細胞と試験物質とを接触させ、標的分子の発現を分析することにより、試験物質をスクリーニングすることができる。
【００８５】
更に、本発明のスクリーニング方法においては、前記癌治療用化合物スクリーニング用標的分子と試験物質とを接触させ、前記試験物質の存在下における、標的分子の活性を分析することにより、前記試験物質が、標的分子の活性を修飾するか否かを判断することができる。試験物質の不在下における標的分子の活性と比較して、試験物質の存在下における標的分子の活性が減少する場合には、前記試験物質が、標的分子の活性を抑制又は阻害すると判断することができる。一方、標的分子の活性が上昇する場合には、前記試験物質が、標的分子の活性を促進すると判断することができる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００８７】
《実施例１》
本実施例では、ＨＰ１５遺伝子及びＨＰ１５タンパク質の細胞の癌化への関与を調べるため、ＨＭＶ−１細胞にＨＰ１５タンパク質を発現させ、その機能を解析した。
精巣由来ｃＤＮＡをテンプレートとしてＨＰ１５遺伝子をクローニングした。クローニングしたＨＰ１５遺伝子を、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターに挿入して、ＨＰ１５遺伝子とＧＦＰを共発現するベクター（ｐＭＸ−ＨＰ１５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を作製した。得られたベクターをパッケージ細胞ＰＬＡＴ−Ａにトランスフェクションし、ＨＰ１５遺伝子を含むレトロウイルスを産生させた。得られたレトロウイルスを用いて、ＨＰ１５遺伝子の発現の見られないＨＭＶ−１細胞（ヒト悪性黒色腫由来細胞株）へ、ＨＰ１５遺伝子を導入した。ＨＰ１５遺伝子の導入は、ＧＦＰの発現にて確認し、ＧＦＰ陽性細胞をセルソータで単離した。得られたＨＰ１５遺伝子導入ＨＭＶ−１細胞を、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５細胞と称する。また、コントロール細胞（ＨＭＶ−１  Ｍｏｃｋ細胞）はｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターを用いて、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５と同様に作製した。
【００８８】
ＨＭＶ−１  Ｍｏｃｋ細胞及びＨＭＶ−１  ＨＰ１５細胞に発現しているｍＲＮＡを解析した結果、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５細胞において、癌の悪性度に関連するＭＭＰ２遺伝子及び幹細胞に関連するＯｃｔ３／４遺伝子の発現上昇が認められた（図２Ａ）。
【００８９】
作製したＨＭＶ−１  ＨＰ１５とＨＭＶ−１  Ｍｏｃｋを、それぞれ３匹のＲＡＧ２−／−ｇｃ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスの左右の皮下へ接種した。１匹あたり５×１０４個、又は１×１０４個の条件で皮内接種し、腫瘍径の変化を２７日又は３４日間計測し、腫瘍形成能を検討した。その結果、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５の腫瘍形成能は、ＨＭＶ−１  Ｍｏｃｋと比較して増加していることが示された（図２Ｂ）。更に、１匹あたり５×１０４個の細胞株を担癌したマウスにおいて、接種から１０週後に所属リンパ節への転移を調べた。ＨＭＶ−１  Ｍｏｃｋは３匹中３匹の所属リンパ節への転移を示さなかった一方で、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５は３匹中３匹の所属リンパ節へ転移を示した（図２Ｃ）。
ＨＰ１５遺伝子及びＨＰ１５タンパク質は癌の悪性度に関与していると考えられ、ＨＰ１５タンパク質が発現することによって、癌の増殖速度が速くなり、また癌の転移を誘導する可能性がある。
【００９０】
《実施例２》
本実施例では、ＨＰ１５タンパク質の部分ペプチドの免疫誘導活性を、ペプチド刺激によるリンパ球のインターフェロン−γの産生によって測定した。
部分ペプチドとして、ＨＰ１５タンパク質の全アミノ酸を７アミノ酸ずつオーバーラップさせ、２０アミノ酸の長さの６２個の部分ペプチド（＃１〜＃６２）を調整した（配列番号４〜６５；表１）。
２人の健常人のボランティアの末梢単核球（ＰＢＭＣ）を取得し、ＰＢＭＣの付着細胞を抗原提示細胞として用い、非付着性細胞より単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞と前記ペプチドと１週間培養した。１週間後、更に、ボランティア由来の樹状細胞を再刺激の抗原提示細胞として用い、ペプチドと培養していたＣＤ４陽性Ｔ細胞と一緒に１週間培養した。２週間後に、ペプチドで２時間処理した樹状細胞を３回目の再刺激用の抗原提示細胞として用い、培養していたＣＤ４陽性Ｔ細胞と共に１週間培養した。３週間後、培養していたＣＤ４陽性Ｔ細胞と樹状細胞をペプチド存在下で２４時間培養し、得られた培養上清中の、インターフェロン−γをＥＬＩＳＡで測定した。
【００９１】
部分ペプチドとしては、まずペプチドを５つ混合したグループ（例えば、＃１〜＃５、又は＃６〜＃１０、最後のグループは＃５６〜＃６１）を用いて、インターフェロン−γの産生を測定した。その後、インターフェロン−γが産生されたグループの個別のペプチドについて、同様の実験を行い、免疫誘導活性を分析した。結果を図３に示す。多くのペプチドにおいて、抗原特異的インターフェロン−γ産生Ｔｈ細胞（Ｔｈ１細胞）を誘導することができた。抗原特異的Ｔｈ１細胞を誘導できたペプチドを、図４において、濃い色で表されたペプチドとして示す。
【００９２】
《実施例３》
本実施例では、免疫誘導活性が示されたペプチド＃１９による、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｔｃ細胞）の誘導と、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ拘束性を検討した。
健常人のボランティアよりＰＢＭＣを分離し、ＰＢＭＣからフローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した。同じボランティアのＰＢＭＣ付着細胞を抗原提示細胞として用い、ＯＫ４３２で２時間処理した抗原提示細胞と、前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞と、ペプチドとを１週間培養した。
７日後に、同じボランティアの樹状細胞を、未処理のまま再刺激の抗原提示細胞として用い、培養していたＣＤ８陽性Ｔ細胞と、ペプチドとを、更に１週間培養した。
１４日後に、同じボランティアの樹状細胞を、ペプチドで２時間処理し、３回目の再刺激の抗原提示細胞として用い、培養していたＣＤ４陽性Ｔ細胞と更に１週間培養した。ＩＬ−２は０日目より、１０Ｕ／ｍＬ添加して培養を行った。
【００９３】
得られたペプチド＃１９特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いて、ＬＣＬ  Ａｓｓａｙを行った。ＡｕｔｏのＨＬＡ−Ａ型がＡ＊０２０１／Ａ２４０２であったため、Ａ＊０２０１陽性、Ａ２４０２陽性、Ａ＊０２０１陰性／Ａ＊２４０２陰性の３パターンのＬＣＬに対する反応性を検討した。抗原提示細胞であるＬＣＬ（２×１０４個）と、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（１×１０４個）と、ペプチド（５μｇ／ｍＬ）とを２４時間培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡにてサイトカイン産生を解析した。その結果、Ａ２０１陽性のＬＣＬにのみ抗原特異的なサイトカイン（インターフェロン−γ）産生が見られた。ペプチド＃１９は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に拘束性であった（図５）。
【００９４】
《実施例４》
本実施例では、免疫誘導活性が示されたペプチド＃１９による、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ細胞）の誘導と、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩＩ拘束性を検討した。
健常人のボランティアよりＰＢＭＣを分離し、ＰＢＭＣからフローサイトメトリーによりＣＤ４陽性Ｔ細胞を分離した。同じボランティアのＰＢＭＣ付着細胞を抗原提示細胞として用い、ＩＦＮ−γで２時間処理した抗原提示細胞と、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞と、ペプチドとを１週間培養した。
７日後に、同じボランティアの樹状細胞を、ＯＫ４３２で２時間処理し、再刺激の抗原提示細胞として用い、培養していたＣＤ８陽性Ｔ細胞と、ペプチドとを、更に１週間培養した。
１４日後に、同じボランティアの樹状細胞を、ペプチドで２時間処理し、３回目の再刺激の抗原提示細胞として用い、培養していたＣＤ４と更に１週間培養した。ＩＬ−２は９日目より１０Ｕ／ｍＬを加え、１４日目から２０Ｕ／ｍＬとした。
【００９５】
得られたペプチド＃１９特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞について、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、及び抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体を用いたブロッキングアッセイを行った。抗原提示細胞（５×１０３個）と、ペプチド（５μｇ／ｍＬ）とを抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＰ抗体、又は抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体存在下で培養する。１時間後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（５×１０４個）を加え２４時間後の培養上清を回収、ＥＬＩＳＡにてサイトカイン産生を解析した。その結果、ペプチド＃１９特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束性であった。
【００９６】
更に得られたペプチド＃１９特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いて、ＬＣＬ  Ａｓｓａｙを行った。ＡｕｔｏのＨＬＡ−ＤＲ型がＤＲＢ１＊０８０３陽性／１５０４陽性であったので、ＤＲ＊０８０３陽性、ＤＲ＊１５陽性、ＤＲ＊＊０８０３陰性／１５０４陰性の３パターンのＬＣＬに対する反応性を検討した。抗原提示細胞であるＬＣＬ（２×１０４個）と、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（１×１０４個）と、ペプチド（５μｇ／ｍＬ）とを２４時間後培養した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡにてサイトカイン産生を解析した。その結果、ＤＲＢ１＊０８０３陽性のＬＣＬにのみ抗原特異的なサイトカイン産生が見られた。ペプチド＃１９はＨＬＡ−ＤＲ＊０８０３に拘束性であった（図６）。
【００９７】
《実施例５》
本実施例では、ＨＰ１５遺伝子に対するｓｈＲＮＡが、癌治療に有効であるかを検討した。
（１）ｓｈＲＮＡ導入細胞株の作製
ＨＰ１５遺伝子の塩基配列から、ｓｈＲＮＡ１（GCAGACAAATATGGCTAATCTcttcctgtcagaAGATTAGCCATATTTGTCTGC；配列番号７５）、ｓｈＲＮＡ２（GGATCAGAAAGGTACACTTTCcttcctgtcagaGAAAGTGTACCTTTCTGATCC；配列番号７６）、及びｓｈＲＮＡ３（GCGATGACATGTTGGGATAATcttcctgtcagaATTATCCCAACATGTCATCGC；配列番号７７）、を設計した。ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ２のＤＮＡをｐＳＩＨ１−Ｈ１−ｃｏｐＧＦＰ  ｓｈＲＮＡベクターに導入して、ｐＳＩＨ１−Ｈ１−ｓｉＨＰ１５ｓｈ＃１−ｃｏｐＧＦＰベクター（ｓｈＲＮＡ１）及びｐＳＩＨ１−Ｈ１−ｓｉＨＰ１５ｓｈ＃２−ｃｏｐＧＦＰベクター（ｓｈＲＮＡ２）を作製した。ｐＶＳＶ−Ｇ、ｐＰＡＣＫＨ１−ＧＡＧ、ｐＰＡＣＫＨ１−ＲＥＶと共に２９３ＴＮ細胞にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて導入し、レンチウイルスを回収した。回収したレンチウイルスをＰＥＧ６，０００を用いて濃縮し、ＨＰ１５遺伝子を内在的に発現しているＫ５６２細胞に、ポリブレンを架橋材として用いて感染させ、ｓｈＲＮＡを導入した。ｓｈＲＮＡ導入細胞株はＧＦＰの発現にて確認し、ＧＦＰ陽性細胞をセルソータで単離した。また、同様の方法でコントロール細胞株をｐＳＩＨ−Ｈ１−ｃｏｐＧＦＰベクターを用いて作製した。
【００９８】
（２）ｓｈＲＮＡ導入細胞株のＨＰ１５ｍＲＮＡの発現
作製したｓｈＲＮＡ１導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃１）、ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃２）、及びｓｈｃｏｎｔ導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈｃｏｎｔ）のＨＰ１５遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲにより解析した。フォワードプライマーとして５’−agtcgtcttttgcgatgaca−３’（配列番号７８）を、リバースプライマーとして５’−tgaggcaaatattactgtttctcg−３’（配列番号７９）のプライマーセット（＃４２プライマーセット）、又はフォワードプライマーとして５’−atcacacaggcacccttcat−３’（配列番号８０）を、リバースプライマーとして５’−attgcaagaaactcatgtaccg−３’（配列番号８１）のプライマーセット（＃７３プライマーセット）を用いて、ロッシュ社ライトサイクラー、ユニバーサルプローブを用いてＨＰ１５ｍＲＮＡの発現を解析した。図７Ａに＃７３プライマーセットを用いた場合の、ｍＲＮＡの発現の結果を示す。ｓｈＲＮＡ１及びｓｈＲＮＡ２を導入したＫ５６２細胞は、ＨＰ１５遺伝子の発現が抑制されていた（図７Ａ）。
【００９９】
（３）ｓｈＲＮＡ２導入細胞株のマウスへの移植
ｓｈＲＮＡ２導入細胞株をマウスに移植し、腫瘍形成能を解析した。
ＲＡＧ２−／−ｇｃ−／−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１匹あたり５×１０６個、又は１×１０７個の条件で、ｓｈｃｏｎｔ導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈｃｏｎｔ）及びｓｈＲＮＡ２導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃２）を皮内接種し、腫瘍径の変化を１９日間計測した。その結果、ｓｈＲＮＡ２導入細胞株の腫瘍形成能は、そのコントロール細胞株であるｓｈＲＮＡ導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈｃｏｎｔ）と比較して減少していた（図７Ｂ及びＣ）。
また、担癌から８週間後、１匹あたり１×１０７個の細胞株を担癌したマウスにおいて、コントロールのｓｈＲＮＡ導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈｃｏｎｔ）は、所属リンパ節及びその他の臓器への転移を示した（図８Ｃ）が、ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（Ｋ５６２  ｓｈ＃２）においてはその転移が抑制された（図８Ｄ）。
【０１００】
《実施例６》
本実施例では、ＨＰ１５を発現させたＨＭＶ−１細胞に、ｓｈＲＮＡを導入して、その効果を確認した。
Ｋ５６２細胞に代えて、実施例１で得られたＨＭＶ−１  ＨＰ１５を用いたことを除いては、実施例５（２）及び（３）の操作を繰り返した。なお、マウスへの移植細胞数は５×１０５／マウスである。
得られたｓｈＲＮＡ２導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈ＃２）及びコントロールのｓｈＲＮＡ導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈｃｏｎｔ）におけるＨＰ１５遺伝子の発現を＃７３プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ解析した結果、ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈ＃２ではＨＭＶ−１  ｓｈｃｏｎｔと比較してＨＰ１５遺伝子のｍＲＮＡ発現が抑制されていた（図９）。
【０１０１】
また、ｓｈＲＮＡ２導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈ＃２）の腫瘍形成能は、コントロールのｓｈＲＮＡ導入細胞株（ＨＭＶ−１  ＨＰ１５  ｓｈｃｏｎｔ）と比較して、明らかに減少していた（図９）。
【０１０２】
《実施例７》
本実施例では、癌組織におけるＨＰ１５遺伝子、ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子及びｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲ解析により評価した。癌組織からトータルＲＮＡを回収し、ＨＰ１５遺伝子の検出には、前記＃７３プライマーセットを用いてＨＰ１５遺伝子のｍＲＮＡを検出した。また、ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子及びｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の検出には、以下のプライマー及びRoche社ユニバーサルプローブセットを用いた。
ＭＡＧＥ−Ａ４
Ｌｅｆｔプライマー：５’−ggccctgtgaggagtcaag−３’（配列番号８２）
Ｒｉｇｈｔプライマー：５’−caggcagatcttctccttgg−３’（配列番号８３）
ユニバーサルプローブ＃８２
ｓｕｒｖｉｖｉｎ
Ｌｅｆｔプライマー：５’−cagtgtttcttctgcttcaagg−３’（配列番号８４）
Ｒｉｇｈｔプライマー：５’−cttattgttggtttcctttgcat−３’（配列番号８５）
ユニバーサルプローブ＃３６
【０１０３】
大腸癌１０検体においてはＨＰ１５遺伝子、ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子及びｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の陽性率は、それぞれ２０．０％、４０．０％、及び７０．０％、肺癌２８検体においては２８．６％、１０．７％、及び４６．４％、胆嚢癌７検体においては１４．３％、０．０％、及び２８．６％、頭頚部由来癌１５検体においては３３．３％、２６．７％、及び６０．０％、腎癌６５検体においては２４．６％、５５．４％、及び８１．５％であった（表３）。
なお、ＨＰ１５遺伝子の発現を、健常人の各組織において解析した。図１１に示すように、精巣以外の組織においては、ＨＰ１５遺伝子は発現していなかった。
【０１０４】
【表３】
2013147464.tif 000004
【０１０５】
図１２に、ＨＰ１５遺伝子の検出と、ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子又はｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の検出との相関をプロットした。ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子又はｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子と、ＨＰ１５遺伝子とが発現している癌も存在するが、ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子又はｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子と、ＨＰ１５遺伝子とが単独で発現している癌も存在する。従って、ＨＰ１５遺伝子及びＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子の検出を組み合わせること、ＨＰ１５遺伝子及びｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の検出を組み合わせること、又はＨＰ１５遺伝子、ＭＡＧＥ−Ａ４遺伝子、及びｓｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子の検出を組み合わせることによって、癌の検出率を上昇させることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、多くの癌の治療薬として用いることができる。本発明の癌ワクチンによれば、癌患者において、癌の予防、癌の進行の抑制、又は癌の退縮に有用である。本発明の癌の検出方法によれば、ＨＰ１５タンパク質又はＨＰ１５遺伝子を分析することにより、癌の診断に有用である。更に本発明の癌治療用化合物のスクリーニング方法は、大量の被検化合物からＨＰ１５タンパク質を発現する癌の治療に有効な化合物をスクリーニングすることができる。
【図１】
2013147464.tif 000005
【図３−１】
2013147464.tif 000006
【図３−２】
2013147464.tif 000007
【図４】
2013147464.tif 000008
【図５】
2013147464.tif 000009
【図６】
2013147464.tif 000010
【図７】
2013147464.tif 000011
【図１０】
2013147464.tif 000012
【図１２】
2013147464.tif 000013
【図２】
2013147464.tif 000014
【図８】
2013147464.tif 000015
【図９】
2013147464.tif 000016
【図１１】
2013147464.tif 000017
【配列表】
2013147464000001.app