(57)【要約】【課題】α−リポ酸の新たな用途を提供する。【解決手段】α−リポ酸を有効成分として含有するβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤、セラミド産生増強剤及び皮膚バリア機能改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−リポ酸を有効成分として含有するβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤。
【請求項２】
α−リポ酸を有効成分として含有するセラミド産生増強剤。
【請求項３】
セラミドが、セラミド１、セラミド２、及びセラミド１０からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２に記載のセラミド産生増強剤。
【請求項４】
α−リポ酸を有効成分として含有する皮膚バリア機能改善剤。
【請求項５】
皮膚バリア機能改善効果が皮膚の水分保持機能向上効果である、請求項４に記載の皮膚バリア機能改善剤。
【請求項６】
皮膚バリア機能改善効果が肌荒れ改善効果である、請求項４に記載の皮膚バリア機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−リポ酸の新規用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−グルコセレブロシダーゼ（以下、「ＧＢＡ」と称する場合がある。）は、ラメラボディ（層板顆粒、ｌａｍｅｌｌａｒ  ｂｏｄｙ）に蓄えられたグルコシルセラミドを切断してセラミドへと変換する酵素であり、皮膚のバリア機能形成に必須の酵素である。
ＧＢＡ活性作用を有する物質として、特許文献１には、モノグリコシルスフィンゴ脂質が開示され、特許文献２には、ポリ［２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）−コーブチルメタクリレート（ＢＭＡ）］が開示されている。
【０００３】
α−リポ酸は、生体内に含まれ、糖の代謝及びＴＣＡサイクルに作用する補酵素の一種である。また、α−リポ酸は、抗酸化作用を有することが知られている（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平８−１１６９７１号公報
【特許文献２】特開２００２−０４７１８８号公報
【特許文献３】特開２０１１−６３６０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、α−リポ酸が、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用を有することについては、従来知られていない。
本発明の目的は、α−リポ酸の新たな用途を提供することである。
また、本発明の目的は、新規なβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤、及びβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用に基づく種々の新規な生理活性剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、詳細な検討をおこなった結果、α−リポ酸が細胞中のβ−グルコセレブロシダーゼ活性を増強するとの新たな知見を得た。また、本発明者らは、α−リポ酸により増強されたβ−グルコセレブロシダーゼが、セラミド産生を増強させ、且つ皮膚バリア機能を改善させるとの新たな知見を得た。本発明は、このような新しい知見に基づいて達成されたものである。
本発明は以下のとおりである。
［１］  α−リポ酸を有効成分として含有するβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤。
［２］  α−リポ酸を有効成分として含有するセラミド産生増強剤。
［３］  セラミドが、セラミド１、セラミド２、及びセラミド１０からなる群より選択される少なくとも１種である、［２］に記載のセラミド産生増強剤。
［４］  α−リポ酸を有効成分として含有する皮膚バリア機能改善剤。
［５］  皮膚バリア機能改善効果が皮膚の水分保持機能向上効果である、［４］に記載の皮膚バリア機能改善剤。
［６］  皮膚バリア機能改善効果が肌荒れ改善効果である、［４］に記載の皮膚バリア機能改善剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、α−リポ酸の新たな用途を提供することができる。
また、本発明によれば、新規なβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤、及びβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強に基づく種々の新規な生理活性剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１にかかる培養細胞の総タンパク量について示したグラフである。
【図２】実施例１にかかるβ−グルコセレブロシダーゼ活性について示したグラフである。
【図３】実施例１にかかるβ−グルコセレブロシダーゼ活性について示したグラフである。
【図４】実施例２にかかる培養細胞の総タンパク量について示したグラフである。
【図５】実施例２にかかるβ−グルコセレブロシダーゼ活性について示したグラフである。
【図６】実施例３にかかるウェスタンブロッティングの結果について示したグラフである。
【図７】実施例４にかかるセラミド産生量について示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤、セラミド産生増強剤及び皮膚バリア機能改善剤は、それぞれ、α−リポ酸を有効成分とした生理活性剤である。
本発明のβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤は、細胞に対して、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用を有し、且つβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用に基づくセラミド産生増強作用、及び皮膚バリア機能改善作用を有する。
なお、本発明では、特に断らない限り、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤、セラミド産生増強剤及び皮膚バリア機能改善剤を「生理活性剤」と総称する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００１０】
本発明にかかる生理活性剤において有効成分となるα−リポ酸（場合によって、「チオクト酸」と称される場合がある。）は、体内に存在し、好気性生物の代謝に関与する酵素の補助因子として欠かせない化合物である。α−リポ酸は、具体的には、クエン酸回路のピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ）の補因子としての役割を持つ化合物である。
α−リポ酸は、化学式Ｃ８Ｈ１４Ｏ２Ｓ２（分子量２０６．３）で表される化合物である。
【００１１】
【化１】
2013241398.tif 000002
【００１２】
α−リポ酸は、光学活性を示す化合物である。本発明にかかる生理活性剤においてα−リポ酸は、Ｒ，Ｓ−（＋／−）−α−リポ酸、Ｒ−（＋）−α−リポ酸又はＳ−（−）−α−リポ酸のいずれであってもよく、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用の観点よりＲ−（＋）−α−リポ酸を用いることが好ましい。
α−リポ酸は、酸の形態であってもよく、塩の形態であってもよい。
【００１３】
α−リポ酸は、一般的に用いられている合成物及び天然物成分由来の抽出物等を用いることができる。また、α−リポ酸は市販品を使用することができる。市販品としては例えば、α−リポ酸標準品（和光純薬工業（株）社）、ＤＬ−α−リポ酸（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社）、（＋）−α−リポ酸（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ，社）等を挙げることができる。
【００１４】
α−リポ酸は、粉末又は結晶の形態で存在するため、本発明にかかる生理活性剤は、粉体又は結晶の形態のα−リポ酸を使用してもよい。
【００１５】
本発明において細胞とは、ラメラボディ（層板顆粒、ｌａｍｅｌｌａｒ  ｂｏｄｙ）を有する細胞であればよく、皮膚細胞、小腸細胞又は腎臓細胞等が挙げられる。
本発明にかかる生理活性剤の効果発現という観点より、細胞は、皮膚細胞であることが好ましい。皮膚細胞には、表皮細胞（ケラチノサイト）、色素細胞（メラノサイト）、ランゲルハンス細胞、α樹状細胞及びメルケル細胞が含まれ、中でも表皮細胞（ケラチノサイト）が好ましい。細胞が表皮細胞であれば、α−リポ酸が表皮細胞中のβ−グルコセレブロシダーゼ活性を増強させることができ、更に表皮細胞間脂質のセラミド産生量を増加させることができることで、皮膚バリア機能の改善効果を得ることができる。
【００１６】
本発明にかかるβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤は、細胞中のβ−グルコセレブロシダーゼの活性を増強させることができる。これにより、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤は、細胞のセラミド産生を増強する作用及び皮膚バリア機能を改善する作用を有する。
また、本発明のβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤には、皮膚水分保持機能向上、皮膚ターンオーバーの改善、皮膚の乾燥防止、乾燥等による肌荒れの改善、乾癬の改善、角質増殖の改善又はゴーシェ病治療等の効果が期待できる。
【００１７】
β−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤は、細胞中のβ−グルコセレブロシダーゼの活性を、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤の無添加時に比べて、増加させることができる。
細胞内のβ−グルコセレブロシダーゼの測定方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。具体的には、直接酵素活性を測定する方法又はβ−グルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子を、ＰＣＲ法等を用いて測定する方法などが挙げられる。
また、細胞内のβ−グルコセレブロシダーゼの酵素活性を、直接的に測定する方法として、ミエルとファンデルフルクの方法（ブリチッシュ・ジャーナル・オブ・デルマトロジー、９５巻、頁２７１−２７４、１９７６年）がある。ミエルとファンデルフルクの方法に準じてβ−グルコセレブロシダーゼの酵素活性を測定する場合、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤の無添加時に比べて、本発明のβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤は、細胞中のβ−グルコセレブロシダーゼの活性を、１．０５倍〜３．００倍に増加させることが好ましく、１．１倍〜２．０倍に増加させることがより好ましく、１．２倍〜１．７倍に増加させることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明にかかるセラミド産生増強剤は、細胞においてセラミドの産生を増強させることができる。細胞におけるセラミドにはセラミド１（Ｃｅｒ［ＥＯＳ］）、セラミド２（Ｃｅｒ［ＮＳ］）、セラミド３（Ｃｅｒ［ＮＰ］）、セラミド４（Ｃｅｒ［ＥＯＨ］）、セラミド５（Ｃｅｒ［ＡＳ］）、セラミド６（Ｃｅｒ［ＡＰ］）、セラミド７（Ｃｅｒ［ＡＨ］）、セラミド８（Ｃｅｒ［ＮＨ］）、セラミド９（Ｃｅｒ［ＥＯＰ］）、セラミド１０（Ｃｅｒ［ＮＤＳ］）、セラミド１１（Ｃｅｒ［ＡＤＳ］）及びセラミド１２（Ｃｅｒ［ＥＯＤＳ］）が存在するが、本発明のセラミド産生増強剤は、セラミド１（Ｃｅｒ［ＥＯＳ］）、セラミド２（Ｃｅｒ［ＮＳ］）、及びセラミド１０（Ｃｅｒ［ＮＤＳ］）からなる群より選択される少なくとも１種において、特に優れた産生増強効果が得られる。
また、本発明のセラミド産生増強剤には、皮膚水分保持機能向上、皮膚ターンオーバーの改善、皮膚の乾燥防止、乾燥等による肌荒れの改善、細胞外セラミド量増加、細胞外脂質産生促進、アトピー性皮膚炎治療や改善、角質増殖改善又は魚鱗癬改善等の効果が期待できる。
【００１９】
本発明にかかるセラミド産生増強剤は、セラミド産生増強剤の無添加時に比べて、細胞内のセラミドの産生量を増加させることができる。
細胞内のセラミド産生量の測定方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。具体的には、培養細胞又は市販の三次元表皮モデルを用いた測定法、若しくは、薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）法、ジアシルグリセロールキナーゼ法、放射性同位体ラベル法又はクロマトグラフ法に、テープストリッピング等で採取したヒト角層からセラミドを抽出し、供する方法等が挙げられる。
また、細胞内のセラミド産生量を薄層クロマトグラフ法で測定した際に、セラミド産生増強剤の無添加時に比べて、本発明のセラミド産生増強剤は、細胞中のセラミド産生量を、１．０５倍〜３．００倍に増加させることが好ましく、１．２倍〜２．５倍に増加させることがより好ましく、１．５倍〜２倍に増加させることがさらに好ましい。
培養細胞として、例えばＰｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｃｅｌｌｓ（ライフテクノロジーズ社）、正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ社）等が挙げられる。
市販の三次元表皮モデルとしては、ＬａｂｏＣｙｔｅ  Ｅｐｉｍｏｄｅｌ（Ｊ−ＴＥＣ社）、ＥＰＩ−２００（クラボウ社）、ＴＥＳＴＳＫＩＮ（ＴＯＹＯＢＯ社）等が挙げられる。
【００２０】
本発明にかかる皮膚バリア機能改善剤は、皮膚のバリア機能を改善させることができる。なお、本発明において、皮膚のバリア機能とは、皮膚のバリアと同義であり、皮膚バリア機能改善剤は、皮膚バリア改善剤と同義である。
また、皮膚バリア機能改善剤には、皮膚水分保持機能向上、皮膚ターンオーバーの改善、皮膚の乾燥防止、乾燥等による肌荒れの改善、細胞外セラミド量増加、細胞外脂質産生促進、角層水分量向上、皮膚免疫向上、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症又は乾癬等の皮膚疾患の予防又は治療等の効果が期待できる。
【００２１】
皮膚バリア機能改善剤は、皮膚バリア機能改善剤の無添加時に比べて皮膚バリア機能を改善させることができる。
皮膚バリア機能改善は、具体的には、皮膚からの水分の蒸発量の測定又は角層水分量の測定等により評価することができる。
【００２２】
本発明にかかる生理活性剤は、細胞に対してβ−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用を有する。そのため、生理活性剤は、β−グルコセレブロシダーゼの活性に起因する疾患の治療又は予防に用いることができる。
β−グルコセレブロシダーゼの活性に起因する疾患としては、にきび、しわ、しみ、くすみ、肌荒れ、アレルギー（接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎）、湿疹、皮膚炎、皮膚そう痒症、老人性乾皮症、乾癬又はゴーシェ病等が挙げられる。
【００２３】
本発明における生理活性剤を細胞に接触させるときに、生理活性剤に含有されるα−リポ酸の量は、細胞のタンパク量１ｇ当たり０．０１ｍｇ〜１００００００ｍｇが好ましく、０．１ｍｇ〜１０００００ｍｇがより好ましく、１ｍｇ〜１００００ｍｇが特に好ましい。
【００２４】
本発明にかかる生理活性剤を組成物の形態で用いる場合、当該組成物におけるα−リポ酸の含有量は、剤型によって異なる。
一般に組成物の全質量に対して、好ましくは０．００００００１質量％〜５質量％であり、より好ましくは０．００００１質量％〜０．０２５質量％であり、特に好ましくは０．０００２質量％〜０．００２５質量％である。
【００２５】
本発明にかかる生理活性剤を使用する場合、生理活性剤の形態には特に制限はない。α−リポ酸の他、後述する他の成分（医薬や化粧品として許容可能な担体、又は必要に応じた他の任意成分）を含む組成物の形態としてもよい。
組成物の形態としては、オイル組成物、乳化組成物又は粉末組成物等が挙げられる。オイル組成物、乳化組成物、及び粉末組成物は、公知の方法に従い調製することができる。
【００２６】
本発明にかかる生理活性剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。β−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用の観点から、非経口的に投与することが好ましく、具体的には、α−リポ酸を直接皮膚細胞へ投与可能な局所投与が好ましく、経皮投与がより好ましい。
本発明にかかる生理活性剤の投与量としては、剤型等によって異なるが、一般に、１日あたり、体重ｋｇあたり、有効成分として１ｍｇ〜１５ｍｇとすることができ、好ましくは２ｍｇ〜１０ｍｇとすることができ、より好ましくは３ｍｇ〜５ｍｇとすることができる。
【００２７】
本発明にかかる生理活性剤を含む組成物に含有される他の成分は、本発明の組成物の形態、目的などに応じて適宜選択することができる。他の成分の好適な例としては、例えば、機能性油性成分、乳化剤、その他の添加成分などが挙げられる。
【００２８】
（機能性油性成分）
機能性油性成分としては、水性媒体に溶解せず、油性媒体に溶解する油溶性成分であれば、特に限定はなく、目的に応じた物性又は機能性を有するものを適宜選択して使用することができる。他の油性成分としては、通常、紫外線吸収剤、抗炎症剤、保湿剤、毛髪保護剤、美白剤、抗シミ剤、細胞賦活剤、エモリエント剤、角質溶解剤、帯電防止剤、脂溶性ビタミン類、メタボリックシンドローム改善剤、降圧剤又は鎮静剤等として使用されているものが挙げられる。
ここで、機能性油性成分とは、生物体内に存在した場合に生体において所望の生理学的作用の発揮が期待され得る油性成分を意味する。
【００２９】
（その他の添加成分）
上記成分の他、医薬品、機能性食品又は化粧品等の分野において通常用いられる添加成分を、本発明の組成物に、その形態に応じて適宜含有させることができる。他の添加成分は、その特性によって、油溶性又は水溶性の添加成分として、本発明の組成物に含有させることができる。
【００３０】
例えば、その他の添加成分としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール；グルコース、果糖、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ペクチン、カッパーカラギーナン、ローカストビーンガム、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアガム、キサンタンガム、カラヤガム、タマリンド種子多糖、アラビアガム、トラガカントガム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デキストリン等の単糖類又は多糖類；ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクトース、マルトトリイトール、キシリトールなどの糖アルコール；塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムなどの無機塩；カゼイン、アルブミン、メチル化コラーゲン、加水分解コラーゲン、水溶性コラーゲン、ゼラチン等の分子量５０００超のタンパク質；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリン等のアミノ酸及びそれらの誘導体；カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、酸化エチレン・酸化プロピレンブロック共重合体等の合成高分子；ヒドロキシエチルセルロース・メチルセルロース等の水溶性セルロース誘導体；などを挙げることができ、その機能に基づいて、例えば機能性成分、賦形剤、粘度調整剤又はラジカル捕捉剤等として含んでもよい。
その他、本発明においては、例えば、種々の薬効成分、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、着色剤など、通常、その用途で使用される他の添加物を併用することができる。
【００３１】
また、本発明にかかる前記生理活性剤は、医薬品、化粧料又は機能性食品等として用いることができる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は体積基準である。
【００３３】
［実施例１：ＧＢＡ活性試験  −単層モデル−］
正常ヒト新生児包皮表皮ケラチノサイト（角化細胞）（商品名Ｈｕｍａｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ；ＨＥＫｎ、ライフテクノロジー社、以下同じ）を、Ｅｐｉｌｉｆｅ培地（０．０６ｍＭ  Ｃａ２＋、０．２μｇ／Ｌ  上皮成長因子（ＥＧＦ）、２０ｍｇ／Ｌ  インスリン、１ｍｇ／Ｌ  ハイドロコーチゾン、４ｍｌ／Ｌ  ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、１００ｍｇ／Ｌ  ゲンタマイシン、１００μｇ／Ｌ  アンフォテリシン含有；クラボウ社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で８０％コンフルエントになるまで培養した。
培養後の細胞をトリプシン処理により剥離したのち、メディウム１５４（Ｈｕｍａｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＨＫＧＳ）含有；ライフテクノロジー社製）にて１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう再懸濁し、１２ｗｅｌｌプレート（ファルコン社製）に１ｍｌずつ播種した。
３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養したのち、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した被検物質（α−リポ酸（和光純薬社、以下同様））１０ｍＭ溶液を１％添加した培地（α−リポ酸終濃度１０μＭ溶液）に置換し、５％ＣＯ２下で４日間培養した。培地交換は１日おきに行った。
また、α−リポ酸終濃度が、０（コントロール）、３０μＭ及び１００μＭの各溶液を調製し、α−リポ酸終濃度１０μＭ溶液と同様にタンパク量の定量及び酵素活性の算出を行った。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて細胞を洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）含有０．０２％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを０．５ｍｌ／ｗｅｌｌずつ加え、細胞を剥離、回収した。
回収した細胞を４℃にて一晩静置後、水浴中で３０分間超音波処理し、細胞中のタンパク質を抽出した。その後、４℃、３０００×ｇ、１５分間遠心処理し、上清を回収した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｒａｐｉｄ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）にて、回収した上清中のタンパク量を定量した。
結果を図１に示す。図１中、タンパク相対値は、コントロール（ＤＭＳＯ）の総タンパク量に対する各総タンパク量の割合を示す。
図１の結果より、α−リポ酸を添加することによる細胞傷害性は問題のない範囲であることが明らかとなった。
【００３４】
９６ｗｅｌｌプレート（ＮＵＮＣ社製）に、回収した上清中のタンパクが含まれた溶液１０μｌ、０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ５．６）１００μｌ、１０ｍＭタウロコール酸ナトリウム溶液１００μｌを加え、３７℃、１０分間インキュベートした。
その後、５ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル−β−  Ｄ−グルクロニド（４ＭＵＧ）溶液を、インキュベート液に１０μｌ加え、さらに、３７℃、５時間インキュベートした。０．２Ｍ炭酸−重炭酸バッファーを２５０μｌ加えて反応を停止し、ＡＲＶＯにて励起波長（ｅｘ）３５５ｎｍ／蛍光波長（ｅｍ）４６０ｎｍの蛍光強度を測定した。
４−メチルウンベリフェリル（４ＭＵ）０〜５００μＭにて作成した検量線を用い酵素（β−グルコセレブロシダーゼ）活性を算出した。
結果を図２及び図３に示す。図２中、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を示す。
図２及び図３の結果より、α−リポ酸の添加によりβ−グルコセレブロシダーゼ活性が増強することが明らかになった。
以上の結果より、α−リポ酸は、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用を有することが明らかになった。
【００３５】
［実施例２：ＧＢＡ活性試験−３次元皮膚モデル−］
３次元培養表皮モデル（Ｊ−ＴＥＣ製）は付属のアッセイ培地で３７℃、５％ＣＯ２下にて１日間、前培養した。ＤＭＳＯに溶解した被検物質（α−リポ酸）１００ｍＭ溶液を１％添加したＰＢＳを角層側より５０μｌ、８時間／日、１４日間培養した。培地交換は毎日行った。
ＰＢＳにて洗浄後、皮膚組織を培養カップから剥離し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）含有０．０２％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ０．５ｍｌ／ｔｕｂｅを加えたマイクロチューブに回収した。
４℃にて一晩静置後、皮膚組織含有液を、ビーズ式破砕機にて２分処理し、細胞中のタンパク質を抽出した。その後、４℃、３０００×ｇ、１５分間遠心処理し、上清を回収した。
単層細胞、３次元培養表皮、それぞれから回収したタンパク質抽出液をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ−Ｒａｐｉｄ（ＤＯＪＩＮＤＯ社製）にて、回収した上清中の総タンパク量を定量した。結果を図４に示す。図４中、タンパク相対値は、コントロール（ＤＭＳＯ）の総タンパク量に対する各総タンパク量の割合を示す。
図４の結果より、単層培養細胞、３次元培養表皮モデル、いずれもα−リポ酸を添加することによる細胞傷害性は問題のない範囲であることが明らかとなった。
【００３６】
に記載の方法にてＧＢＡ活性試験を行った。結果を図５に示す。
図５の結果より、３次元皮膚モデルにおいてもα−リポ酸の添加によりβ−グルコセレブロシダーゼ活性が増強することが明らかになった。
以上の結果より、α−リポ酸は、β−グルコセレブロシダーゼ活性増強作用を有することが明らかになった。
【００３７】
［実施例３：ＧＢＡタンパクの発現量測定］
実施例１に記載の方法で回収したタンパク質抽出液を用い、抗ヒトＧＢＡ抗体（ａｂｃａｍ社）にてウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの結果を画像解析ソフト（富士フイルム社Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ）により数値化した。結果を図６に示す。
図６の結果より、単層培養細胞、３次元培養表皮モデル、いずれもα−リポ酸の添加によりβ−グルコセレブロシダーゼタンパクの発現量が増加することが明らかになった。
【００３８】
［実施例４：セラミド産生量の測定−３次元皮膚モデル−］
３次元表皮モデル（Ｊ−ＴＥＣ製）は付属のアッセイ培地で３７℃、５％ＣＯ２下にて１日間、前培養した。
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解した被検物質（α−リポ酸）５０ｍＭ溶液を１％添加した培地（α−リポ酸終濃度５０μＭ溶液）に置換し、５％ＣＯ２下で１４日間培養した。
培養した皮膚組織をＰＢＳ１００μｌにて２回洗浄した後、培養カップより剥離し、凍結乾燥を行い、乾燥重量を測定した。
乾燥後の皮膚組織にクロロホルム：メタノール＝２：１（体積比）を０．５ｍｌ／ｔｕｂｅを加え、内部標準としてＣ１７−Ｃｅｒ溶液（２．５ｕｇ／ｔｕｂｅ）を添加した。その混合物を、ビーズ式破砕機にて２分処理した。上清を回収し、シリンジフィルター（０．４５μｍ  ＰＴＦＥ；ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にて組織断片を除去した。そのろ過液を窒素雰囲気下で乾固し、セラミド粗精製物を得た。
得られたセラミド粗精製物をｎ−ヘキサン／２−プロパノール／蟻酸＝９５／５／０．１（ｖ／ｖ）を加えて超音波処理により溶解し、ＬＳ−ＭＳ測定に供し、セラミド（セラミド１、セラミド２、セラミド３、セラミド１０）を測定した。α−リポ酸を溶解させていないＤＭＳＯ液を用いて上記試験を同様に行いコントロールとした。結果を図７に示す。図中、横軸はセラミドの総炭素数を表す。
図７の結果より、セラミド１（炭素数６６）、セラミド２（炭素数４２、４４、４６、４８）、セラミド１０（炭素数３４、３６、３８、４０、４２）において、コントロールと比較し、有意にセラミドが増加することが明らかになった。図７中、「＊」は、ｐ＜０．０５を示す。
各炭素数におけるコントロールの積算セラミド量を１００％とし、結果を表１に示す。
表１にあるように、４種全てのセラミド量が向上していることを確認した。特にセラミド１、セラミド２、セラミド１０でより良い効果が得られた。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
［実施例５：バリア機能測定−３次元皮膚モデル−］
ヒト正常表皮細胞を重層培養して作製した３次元表皮モデル（Ｊ−ＴＥＣ製）を用い、
肌バリア機能改善効果を検証した。
３次元表皮モデルに被検物質（α−リポ酸）を含有する下記実施例７に記載の組成物を角層側に１日８時間、６日間適用した。
比較として、α−リポ酸を精製水に代替した組成物を用い、同様に適用した。
適用後、水分蒸散計（アサヒバイオメッド社製、ＡＳ−ＣＴ１）を用いて３次元表皮モデルの水分蒸散量を測定した。
その結果、比較例に比べ、実施例７を適用した３次元表皮モデルの水分量が良好に保持されていた。これによって、実施例７は、優れた皮膚バリア機能改善効果、及び皮膚の水分保持機能向上効果を有することが判明した。
【００４１】
［実施例６：バリア機能測定−ヒト皮膚−］
α−リポ酸を含有する下記実施例７に記載の組成物を調製し、下記の方法により経皮水分蒸散について測定評価した。
また、比較として、α−リポ酸を精製水に代替した組成物を用い、同様の測定評価を行った。
健常人１０人の前腕内側部（両腕）を洗浄後、アセトン／エーテル（１／１（体積比））処理により角質層細胞間脂質を取り除き、荒れ肌にした。
右腕側に実施例７に記載の組成物を、左腕側に比較用組成物を、それぞれ、１日２回３日間塗布し、翌日同部位を洗浄し、室温２０℃、湿度３０％で２０分安静にした後、経皮水分蒸散量をテヴァメーター（ＣＫ社製）にて測定した。
下記式に従い、経皮水分蒸散抑制効果を求めた。
本発明品の経皮水分蒸散抑制度＝基剤塗布部の経皮水分蒸散量−本発明品塗布部の経皮水分蒸散量（ｇ／ｍ２／ｈｒ）
その結果、比較例に比べ、実施例７を適用した皮膚の水分量が良好に保持され、更に荒れ肌が改善されていた。これによって、実施例７は、優れた皮膚バリア機能改善効果、及び肌荒れ改善効果を有することが判明した。
【００４２】
［実施例７］
以下の処方に従って、常法により化粧料を調製する。以下の数値は処方の全質量に対する質量％を意味する。
α−リポ酸                                                        １．００（％）グリセリン                                                        ５．００（％）１，３−ブチレングリコール                                        ６．５０（％）エタノール                                                        ３．００（％）カルボキシビニルポリマー                                          ０．２０（％）クエン酸ナトリウム                                                １．００（％）パラオキシ安息香酸メチル                                          ０．０５（％）水溶性コラーゲン                                                  ０．１０（％）加水分解コラーゲン                                                ０．１０（％）アセチルヒドロキシプロリン                                        ０．１０（％）精製水                                                                    残量
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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