(57)【要約】【課題】  既存の標準株などの菌株と比較して、芽胞形成能、増殖至適温度、増殖能および芽胞の耐熱性が高く、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化する一方で、マンニトールおよびＤ−アラビトールを資化しないといった特異な性質を有する、バチルスコアグランスの新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１およびそれを添加する工程を有する食品および飼料の製造方法を提供する。【解決手段】  芽胞形成能を有する菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１１０２）。【選択図】  図５
2013099300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芽胞形成能を有する菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１１０２）。
【請求項２】
４０℃で２４時間以上培養後の芽胞数がＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ標準株であるＮＢＲＣ１２５８３と比較して１０００倍以上である、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
増殖至適温度ｃが５０℃＜ｃ＜６０℃である、請求項１または請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
５０℃で６時間以上培養した後の菌量が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ標準株であるＮＢＲＣ１２５８３を５０℃で６時間以上培養した後の菌量と比較して大である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の菌株。
【請求項５】
１００℃で３０分間加熱後の菌株の生存率が４％以上である、請求項１から請求項４のいずれかに記載の菌株。
【請求項６】
Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化し、かつマンニトールおよびＤ−アラビトールを資化しない、請求項１から請求項５のいずれかに記載の菌株。
【請求項７】
食品または飼料の製造方法であって、請求項１から請求項６のいずれかに記載の菌株を添加する工程を有する前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芽胞形成能を有する新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１およびそれを添加する工程を有する食品または飼料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、代謝により乳酸を生成する細菌の総称であり、整腸作用を有することや発酵食品の製造に寄与することが知られている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルスコアグランス）は、バチルス属に属する乳酸菌であり、芽胞を形成することから、有胞子性乳酸菌とも呼ばれている。
【０００３】
芽胞は耐熱性や耐酸性に優れることから、バチルスコアグランスは、製品の加熱処理工程で死滅する虞が少ないこと、あるいは摂取すると胃酸や胆汁酸に耐えて生きた状態で生体の腸に届き、高い整腸作用を発揮することが期待される。そのため、これまでに種々のバチルスコアグランス菌株が発見かつ利用されており、例えば、バチルスコアグランスの一株であるラクボン菌が整腸剤に用いられている他、特許文献１には耐熱性に優れた芽胞を形成するバチルスコアグランスＣ１０１株が、特許文献２にはＬ（＋）−ラクテート生産性を有するバチルスコアグランスＳＩＭ−７ ＤＳＭ１４０４３株がそれぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−０７５８２９号公報
【特許文献２】特表２００４−５１９２４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、後述の実施例で示すように、ラクボン菌はマンニトールおよびＤ−アラビトールを資化する点、増殖至適温度が低い点および増殖能が低い点で、バチルスコアグランスＣ１０１株はマンニトールを資化する点で、バチルスコアグランスＳＩＭ−７ ＤＳＭ１４０４３株はラクトースを資化しない点で、いずれの菌株もＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１とは異なる。
【０００６】
本発明は、既存の標準株であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ＮＢＲＣ１２５８３（アクセッション番号ＮＲ＿０４１５２３．１）（以下、単に「標準株」という場合がある。）などの菌株と比較して、芽胞形成能、増殖至適温度、増殖能および芽胞の耐熱性が高く、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化する一方で、マンニトールおよびＤ−アラビトールを資化しないといった特異な性質を有する、バチルスコアグランスの新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１およびそれを添加する工程を有する食品および飼料の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、北海道旭川市に生育しているライラックの花から、既存の標準株などの菌株と比較して、芽胞形成能、増殖至適温度、増殖能および芽胞の耐熱性が高く、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化する一方で、マンニトールおよびＤ−アラビトールを資化しないといった特異な性質を有する、バチルスコアグランスの新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１（以下、単に「ｌｉｌａｃ−０１株」という場合がある。）を単離し、これを添加することにより、エネルギーや脂質、糖質を低減させるとともにビタミンＢ２などの機能成分を増加させた食品または飼料、あるいは多数の生きたｌｉｌａｃ−０１株が存在する食品または飼料を製造することができること、およびこれらの食品または飼料中に存在するｌｉｌａｃ−０１株は、生きた状態でヒトや動物の腸管に到達し、整腸効果を発揮することができることを見出し、下記の各発明を完成した。
【０００８】
（１）芽胞形成能を有する菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１１０２）。
【０００９】
（２）４０℃で２４時間以上培養後の芽胞数がＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ標準株であるＮＢＲＣ１２５８３と比較して１０００倍以上である、（１）に記載の菌株。
【００１０】
（３）増殖至適温度ｃが５０℃＜ｃ＜６０℃である、（１）または（２）に記載の菌株。
【００１１】
（４）５０℃で６時間以上培養した後の菌量が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ標準株であるＮＢＲＣ１２５８３を５０℃で６時間以上培養した後の菌量と比較して大である、（１）から（３）のいずれかに記載の菌株。
【００１２】
（５）１００℃で３０分間加熱後の菌株の生存率が４％以上である、（１）から（４）のいずれかに記載の菌株。
【００１３】
（６）Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化し、かつマンニトールおよびＤ−アラビトールを資化しない、（１）から（５）のいずれかに記載の菌株。
【００１４】
（７）食品または飼料の製造方法であって、（１）から（６）のいずれかに記載の菌株を添加する工程を有する前記方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るｌｉｌａｃ−０１株によれば、既存の標準株などの菌株と比較して芽胞形成能が高いことから、高温や低温、乾燥、酸性などの過酷な環境における生存率が高く、特に、摂取したヒトや動物の腸管に生きたまま到達することができる乳酸菌として利用することができる。また、本発明に係るｌｉｌａｃ−０１株によれば、増殖至適温度および増殖能が高いことから、食中毒菌などの雑菌が増殖する虞が小さい比較的高温において容易に大量増殖させることができる乳酸菌として利用することができる。また、本発明に係るｌｉｌａｃ−０１株によれば、芽胞形成能および芽胞の耐熱性が高く、３０℃での培養においてほとんど発芽しない芽胞を形成することから、香辛料や漬物などの非加熱食品のみならず、パンや菓子などの高温加熱食品においても大量に存在することができる乳酸菌として利用することができる。また、本発明に係るｌｉｌａｃ−０１株によれば、整腸効果が高く、かつ大量に摂取しても安全な乳酸菌として利用することができる。さらに、本発明に係るｌｉｌａｃ−０１株およびそれを添加する工程を有する食品または飼料の製造方法によれば、エネルギーや脂質、糖質などの生活習慣病の誘因となる成分を低減させるとともにビタミンＢ２などの機能成分を増加させた、健康的で安全な食品または飼料、あるいはｌｉｌａｃ−０１株が多数存在して、整腸効果を有し、長期保存をすることができる安全な食品または飼料を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１ａ】標準寒天培地における試験菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１と命名され、平成２３年５月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託される前のｌｉｌａｃ−０１株をいい、以下同じ。）のコロニーを示す図である。
【図１ｂ】ＢＣＰを添加した標準寒天培地における試験菌株のコロニーを示す図である。
【図１ｃ】試験菌株の菌の形態および芽胞を示す図である。
【図２】試験菌株と標準株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列相同性を示す図である。
【図３】４５℃、５０℃、５５℃および６０℃における試験菌株の増殖曲線を示す図である。
【図４】５０℃および５５℃における試験菌株、標準株およびラクボン菌の増殖曲線を示す図である。
【図５】５日間培養した場合の試験菌株および標準株の芽胞数を示す図である。
【図６】３０℃での培養開始時および５時間培養後において、ｌｉｌａｃ−０１株の芽胞を観察した結果を示す図である。
【図７】３０℃で５時間培養した場合のｌｉｌａｃ−０１株の芽胞数を示す図である。
【図８】ｌｉｌａｃ−０１株の菌液を７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃および１００℃で３０分間加熱した場合の芽胞数を示す図である。
【図９】ｌｉｌａｃ−０１株を乾燥させた状態で１００℃および１２０℃で３０分間加熱した場合の芽胞数を示す図である。
【図１０】ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉を１０日間摂取したヒトの糞便中の生菌数を計測した際に出現したコロニーを示す図（左図）および当該コロニーについて、バチルスコアグランスの特異的ＰＣＲを行った結果を示す図（右図）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係る新規の芽胞形成能を有する菌株ｌｉｌａｃ−０１株およびそれを用いる食品または飼料の製造方法について詳細に説明する。ｌｉｌａｃ−０１株は、後述の実施例に示すように、平成２３年５月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０２として寄託したため、この機関より入手することができる。
【００１８】
本発明において「芽胞形成能」とは、芽胞を形成する能力をいい、「芽胞形成能を有する」とは、任意の条件下において芽胞を形成することができる能力をいう。例えば、比較的に芽胞形成に適した条件として、生菌に適さない高温や乾燥環境、グルコースの欠乏、マンガンイオンの存在下、ｐＨ４．４以上、有酸素などの条件が知られている。なお、本発明において、「芽胞」は「（細菌の）胞子」や「内生胞子」と交換可能に用いられる場合がある。
【００１９】
ｌｉｌａｃ−０１株を４０℃で２４時間以上培養した後の芽胞数は、既存の標準株を同濃度かつ同条件で培養した後の芽胞数と比較して１０００倍以上であることから、ｌｉｌａｃ−０１株は既存の標準株と比較して芽胞形成能が高いことが分かる。なお、本発明において、菌株の芽胞形成能は、定法に従って確認することができ、そのような方法としては、例えば、上述の芽胞形成に適した条件下で菌株を一定時間培養した後、芽胞数を計測することにより行うことができる。また、芽胞は、定法に従い確認することができ、そのような方法としては、例えば、位相差顕微鏡を用いて輝点を確認する方法の他、Ｍｏｅｌｌｅｒ法やＷｉｒｔｚ法などの芽胞染色法を用いて行う方法を挙げることができる。また、芽胞数は、これらの方法により可視化した芽胞を数えることにより計測することができる。
【００２０】
次に、ｌｉｌａｃ−０１株の増殖至適温度は、５０℃＜ｃ＜６０℃であり、既存の標準株の増殖至適温度である５０℃（後述する実施例１参照）と比較して高いことが分かる。なお、本発明において、増殖至適温度は定法に従って求めることができ、例えば、菌株を様々な温度で培養して培養後の菌量を測定し、その菌量が最大となる温度を「増殖至適温度」とすることができる。また、菌量は、例えば、液体培地であれば波長６００ｎｍにおける吸光度（濁度）を、寒天培地であればコロニー数を、それぞれ計測することにより測定することができる。
【００２１】
次に、ｌｉｌａｃ−０１株は、既存の標準株の増殖至適温度である５０℃において、６時間以上培養した後の菌量が、既存の標準株を同濃度かつ同条件で培養した後の菌量と比較して大であることから、ｌｉｌａｃ−０１株は既存の標準株と比較して増殖能が高いことが分かる。
【００２２】
また、ｌｉｌａｃ−０１株は、１００℃で３０分間加熱後の菌株の生存率が４％以上であることから、芽胞の耐熱性が高いことが分かる。
【００２３】
また、ｌｉｌａｃ−０１株は、既存の標準株などの菌株とは異なり、下記（ａ）および（ｂ）の資化性を有する；
（ａ）Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化する、
（ｂ）マンニトールおよびＤ−アラビトールを資化しない。
【００２４】
次に、本発明は、ｌｉｌａｃ−０１株を添加する工程を有する食品または飼料の製造方法を提供する。本発明に係る食品または飼料の製造方法は、ｌｉｌａｃ−０１株を添加する工程を有する。なお、本発明に係る食品または飼料の製造方法において、上述したｌｉｌａｃ−０１株と同等または相当する構成については再度の説明を省略する。
【００２５】
ｌｉｌａｃ−０１株を添加する工程において、ｌｉｌａｃ−０１株を添加する段階（タイミング）はいずれでもよく、例えば、食品または飼料の原材料に添加してもよく、食品または飼料の製造途中や製造の最終段階において添加してもよい。
【００２６】
本発明に係る食品または飼料の製造方法は、本発明に係る食品または飼料の製造方法の特徴を損なわない限り他の工程を有していてもよく、そのような工程としては、例えば、ｌｉｌａｃ−０１株の前培養工程や培養工程、加熱工程、芽胞形成工程、攪拌工程、殺菌工程、滅菌工程、加熱工程、造粒工程などを挙げることができる。
【００２７】
以下、本発明に係る芽胞形成能を有する新規菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１およびそれを用いる食品または飼料の製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００２８】
＜実施例１＞菌株の単離および同定
（１）菌株の単離
北海道旭川市に生育しているライラックの花から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ（バチルスコアグランス）のコロニーおよび菌の形態を有する菌を単離し、これを試験菌株とした。具体的には、まず、ライラックの花を滅菌水に懸濁してライラック懸濁液を調製し、集積培養用培地に接種した後、５５℃で２日間培養した。続いて、芽胞形成菌を選択するために、培養後の集積培養用培地を９０℃で５分間加熱し、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）を添加した標準寒天培地（日水製薬社）に前記加熱後の集積培養用培地を塗抹して、５５℃で１日間培養した後、周囲が黄色を呈しているコロニーを選択して単離した。なお、ＢＣＰはｐＨ５．２〜６．８の指示薬であり、ｐＨが低下するにつれて、紫色から黄色へと呈色が変化することから、菌が酸を生成するか否かを確認することができる。
【００２９】
試験菌株を、標準寒天培地（日水製薬社）において５５℃で１日間培養した際のコロニーを図１ａに、ＢＣＰを添加した標準寒天培地（日水製薬社）において５５℃で１日間培養した際のコロニーを図１ｂにそれぞれ示す。また、菌の形態および芽胞の有無について、位相差顕微鏡を用いて４００倍で観察した結果を図１ｃに示す。なお、芽胞は光に対する屈折性が分裂増殖型の細菌細胞である栄養細胞と異なり、位相差顕微鏡の暗視野において白く光る点や球状あるいは円形状のもの（輝点）として観察される。
【００３０】
図１ａに示すように、試験菌株のコロニーは小さな白い光沢のあるコロニーであった。培養時間が長くなると、コロニーの色調はクリーム色となった（図示しない）。また、図１ｂに示すように、試験菌株のコロニーの周囲は黄色を呈しており、試験菌株は、酸を生成していた。また、図１ｃに示すように、菌の形態は棍棒状であり、輝点が観察されたことから、試験菌株は桿菌であり、芽胞を形成することが明らかになった。
【００３１】
すなわち、試験菌株が有するコロニーおよび菌の形態、ならびに酸生成能および芽胞形成能はバチルスコアグランスの性状と一致する（Ｌｏｇａｎ Ａ．ら、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、第３巻、第２１〜１２８頁、２００９年；Ｌｏｓａｄａ Ｍ．Ａ．ら、Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｈｅａｌｔｈｉｅｒ ｄｉｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎ：ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｏｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｈｅａｌｔｈ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．，第２２巻、第７１〜８４頁、２００２年；Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ、ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｂａｃｉｌｌｕｓ＿ｃｏａｇｕｌａｎｓ；中山大樹ら、日本農芸化学会誌、第２６巻、第１１７〜１２０頁、１９５２年）ことから、試験菌株はバチルスコアグランスに属する菌であることが示唆された。
【００３２】
（２）１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析
本実施例１（１）の試験菌株について、下記の試薬、装置およびプログラムを用いて、添付の仕様書に従い、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析を行った。
【００３３】
ＤＮＡ抽出；ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）
使用プライマー；１６Ｓ ｒＤＮＡユニバーサルプライマー
フォワードプライマー；２７Ｆ；５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号１）
リバースプライマー  ；１４９２Ｒ；５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’（配列番号２）
ＰＣＲに用いたＤＮＡポリメラーゼ；ＥＸ ＴａｑＨＳ（ＴａＫａＲａ社）
ＰＣＲ産物の精製；ＳＵＲＥＣ−ＰＣＲ（ＴａＫａＲａ社）
シークエンス；３１００Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
相同性検索；Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（ＮＣＢＩ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）
【００３４】
ＢＬＡＳＴによる相同性検索の結果、試験菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号３）１４６１ｂｐと１００％一致するものはなかった。ただし、配列番号３の配列における５‘末端のＣＣＣまたはＣＣＣＣは、試験菌株の１６Ｓ ｒＤＮＡ由来の塩基配列ではない可能性があることを付言する。一方、バチルスコアグランスの標準株であるＮＢＲＣ１２５８３（アクセッション番号ＮＲ＿０４１５２３．１）と１４５２ｂｐ中１４４１ｂｐ（スコア２６２１）の一致が見られた。その結果を図２に示す。以上の本実施例１（１）および（２）の結果から、試験菌株はバチルスコアグランスに属することが明らかになった。
【００３５】
（３）糖の資化性の比較
市販の整腸薬であるパンラクミン錠（第一三共ヘルスケア社）から、バチルスコアグランスの一株であるラクボン菌を単離した。本実施例１（１）の試験菌株、ラクボン菌および標準株について、ＡＰＩ５０ＣＨ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）を用いて各種の糖に対する資化性を確認して比較した。その結果を下記に示す。＋は陽性を、−は陰性をそれぞれ示す。なお、試験菌株においては、下記に示すいずれの糖からもガスの産生は認められなかった。
【００３６】
標準株    試験菌株  ラクボン菌
コントロール                                    −          −        −
グリセロール                                    ＋          ＋        ＋
エリスリトール                                  −          −        −
Ｄ−アラビノース                                −          −        −
Ｌ−アラビノース                                −          ＋        ＋
リボース                                        −          ＋        ＋
Ｄ−キシロース                                  −          ＋        ＋
Ｌ−キシロース                                  −          −        −
アドニトール                                    −          −        −
βメチルキシロシド                              −          −        −
ガラクトース                                    ＋          ＋        ＋
Ｄ−グルコース                                  ＋          ＋        ＋
Ｄ−フルクトース                                ＋          ＋        ＋
Ｄ−マンノース                                  ＋          ＋        ＋
Ｌ−ソルボース                                  −          −        −
ラムノース                                      −          ＋        ＋
ダルシトール                                    −          −        −
イノシトール                                    −          −        −
マンニトール                                    −          −        ＋
ソルビトール                                    −          −        −
α−メチル−Ｄ−マンノシド                      −          −        −
α−メチル−Ｄ−グルコシド                      −          ＋        ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン                        ＋          ＋        ＋
アミグダリン                                    −          ＋        ＋
アルブチン                                      −          ＋        ＋
エスクリン                                      −          ＋        ＋
サリシン                                        −          ＋        ＋
セロビオース                                    −          ＋        ＋
マルトース                                      ＋          ＋        ＋
ラクトース                                      −          ＋        ＋
メリビオース                                    −          ＋        ＋
スクロース                                      −          ＋        ＋
トレハロース                                    ＋          ＋        ＋
イヌリン                                        −          −        −
メレジトース                                    −          −        −
Ｄ−ラフィノース                                −          ＋        ＋
スターチ                                        ＋          ＋        ＋
グリコーゲン                                    −          −        −
キシリトール                                    −          −        −
βゲンチオビオース                              −          ＋        ＋
Ｄ−チュラノース                                −          −        −
Ｄ−リキソース                                  −          −        −
Ｄ−タガトース                                  −          −        −
Ｄ−フコース                                    −          −        −
Ｄ−アラビトール                                −          −        ＋
Ｌ−アラビトール                                −          −        −
グルコネート                                    ＋          ＋        ＋
２ケト−グルコネート                            −          −        −
５ケト−グルコネート                            −          −        −
【００３７】
上記に示すように、試験菌株は、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ラムノース、α−メチル−Ｄ−グルコシド、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、セロビオース、ラクトース、メリビオース、スクロース、Ｄ−ラフィノースおよびβゲンチオビオースを資化する点で標準株と、マンニトールおよびＤ−アラビトールを資化しない点でラクボン菌と、マンニトールを資化しない点で特許文献１に記載のバチルスコアグランスＣ１０１株と、ラクトースを資化する点で特許文献２に記載のバチルスコアグランスＳＩＭ−７ ＤＳＭ１４０４３株とそれぞれ異なっていた。
【００３８】
（４）培養可能温度、増殖至適温度および増殖能の比較
本実施例１（１）の試験菌株、本実施例１（３）のラクボン菌および標準株について、２０℃〜７０℃の間で５℃刻みの各温度において２４時間培養した。培養条件は、試験用培地｛ポリペプトン０．５％（ｗ／ｗ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｗ）、グルコース０．５％（ｗ／ｗ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．１％（ｗ／ｗ）｝、好気条件下での静置培養とした。培養開始時、ならびに培養開始から２、４、６、８および２４時間後に、分光光度計を用いて波長６００ｎｍにおける培地の吸光度（ＯＤ６００）を測定した。測定した吸光度（濁度）を菌量の指標として増殖曲線のグラフを作成した。４５℃、５０℃、５５℃および６０℃における、培養開始から８時間後までの試験菌株の増殖曲線を図３に示す。また、５０℃および５５℃における増殖曲線を、試験菌株、ラクボン菌および標準株の間で比較した結果を図４に示す。
【００３９】
その結果、いずれの菌株も、２０℃以下および６５℃以上ではＯＤ６００がほとんど上昇しなかったが、２５℃以上６０℃以下ではＯＤ６００が上昇した（図示しない）。この結果から、試験菌株、ラクボン菌および標準株のいずれも、培養可能温度は２５℃〜６０℃であることが明らかになった。
【００４０】
また、ラクボン菌および標準株では、８時間以上培養した場合において、５０℃におけるＯＤ６００が他の培養温度におけるＯＤ６００と比較して最も大きかった（図示しない）のに対し、図３に示すように、試験菌株では、２時間以上培養した場合において、５５℃におけるＯＤ６００が最も大きかった。すなわち、ラクボン菌および標準株のいずれも、増殖至適温度は５０℃であったのに対し、試験菌株の増殖至適温度ｃは５０℃＜ｃ＜６０℃であった。これらの結果から、試験菌株は他の菌株と比較して、増殖至適温度が比較的高温であることが明らかになった。
【００４１】
また、図４に示すように、ラクボン菌および標準株の増殖至適温度である５０℃において６時間以上培養した場合、および試験菌株の増殖至適温度である５５℃において４時間以上培養した場合のいずれにおいても、試験菌株のＯＤ６００は、ラクボン菌および標準株と比較して大きかった。この結果から、試験菌株は他の菌株と比較して比較的高温における増殖能が顕著に高いことが明らかになった。
【００４２】
（５）芽胞形成能の比較
本実施例１（１）の試験菌株および本実施例１（３）の標準株について、芽胞形成能を比較した。具体的には、まず、試験菌株および標準株を、５５℃、本実施例１（４）に記載の培養条件で前培養して前培養液を得た。また、本実施例１（４）の試験用培地にＭｎＳＯ４を終濃度５ｐｐｍとなるよう添加して芽胞用培地を調製した。次に、芽胞用培地に試験菌株および標準株の前培養液を、１％（ｖ／ｖ）となるようそれぞれ添加して、本培養として４０℃で５日間振盪培養した。本培養の培養日数が１日間、２日間および５日間の時点で、一定量の液を取って芽胞計測用液とし、芽胞数の計測を行った。その結果を図５に示す。なお、芽胞数の計測は、芽胞計測用液を９０℃で５分間加熱した後、滅菌生理食塩水を用いて希釈し、これを標準寒天培地（日水製薬社）で混釈して、好気条件下、５５℃で１日間培養して、出現したコロニー数を計測することにより行った。
【００４３】
図５に示すように、試験菌株の芽胞数は、本培養の培養日数が１日間では２．４×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、２日間では１．６×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、５日間では２．３×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった。これに対し、標準株の芽胞数は、本培養の培養日数が１日間では１．９×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、２日間では４．０×１０４ｃｆｕ／ｍＬ、５日間では４．０×１０４ｃｆｕ／ｍＬであった。
【００４４】
すなわち、本培養の培養日数がいずれの時点においても、試験菌株は標準株と比較して、およそ１０００倍以上多くの芽胞を形成していた。これらの結果から、試験菌株は他の菌株と比較して芽胞形成能が顕著に高いことが明らかになった。
【００４５】
以上の（１）〜（５）の結果から、試験菌株は、他の菌株と比較して増殖至適温度が高く、高温における増殖能が高く、芽胞形成能が顕著に高いといった特徴を有する、バチルスコアグランスの新規菌株であることが明らかになった。そこで、試験菌株をＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１と命名し、平成２３年５月２５日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０２として寄託した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ ｌｉｌａｃ−０１（以下「ｌｉｌａｃ−０１株」という。）の、上記以外の菌学的性状を以下にまとめて示す。
【００４６】
１．細胞形態                  桿菌（（０．８〜１．０）×（５．０〜９．０）μｍ）
２．運動性                    あり
３．グラム染色                陽性
４．カタラーゼ                陽性
５．通性嫌気性
６．生育可能ｐＨ（最適ｐＨ）  ｐＨ５．０〜９．０（ｐＨ５．０〜７．０）
【００４７】
＜実施例２＞ｌｉｌａｃ−０１株の芽胞についての試験
（１）芽胞の発芽性試験
ｌｉｌａｃ−０１株を、５５℃、実施例１（４）に記載の培養条件で前培養し、前培養液を得た後、標準寒天培地（日水製薬社）のプレートに塗抹し、３７℃で２日間培養した。出現したコロニーを掻き取って、実施例１（４）の試験用培地に懸濁することにより、芽胞液を調製した。続いて、芽胞液５００μＬをエッペンドルフチューブに入れたものを２つ用意し、ＡおよびＢとした。Ａのみ、ブロックヒーターを用いて９０℃で１０分間加熱することにより、発芽活性化処理を行った。その後、ＡおよびＢを、ブロックヒーターを用いて３０℃で５時間培養した。培養開始時および３０℃での培養中の１時間経過毎に、実施例１（５）に記載の方法により芽胞数を計測し、位相差顕微鏡を用いて４００倍で芽胞の観察を行った。培養開始時（発芽活性化処理を行う前）および５時間培養後のＡにおける芽胞の観察結果を図６に、芽胞数の計測結果を図７にそれぞれ示す。なお、一般に、芽胞の発芽は熱によって活性化されることが知られている（蜂須賀養悦、化学と生物、第７巻、第５０９〜５１６頁、１９６９年）。
【００４８】
図６に代表して示すように、ＡおよびＢにおいて、培養開始時および培養時間が１、２、３、４および５時間のいずれの時点においても、輝点が観察されたことから、芽胞が存在していたことが確認された。また、図７に示すように、Ａの芽胞数は、培養時間が０時間（培養開始時）〜２時間の間におよそ３／４に減少したものの、２時間〜５時間の間はほとんど変化しなかった。一方、Ｂの芽胞数は、培養時間が０時間〜５時間を通じてほとんど変化しなかった。培養開始時の芽胞数が２．５×１０８ｃｆｕ／ｍＬであったのに対して、５時間培養後の芽胞数は、Ａでは１．９×１０８ｃｆｕ／ｍＬであり、Ｂでは２．７×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった。すなわち、ＡおよびＢのいずれにおいても、芽胞はほとんど減少しなかった。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株の芽胞は、発芽活性化処理の有無に関わらず、３０℃で数時間培養してもほとんど発芽せず、その数がほとんど減少しないことが明らかになった。
【００４９】
（２）芽胞の耐熱性試験
［２−１］液体中における耐熱性
ｌｉｌａｃ−０１株を５５℃、実施例１（４）に記載の培養条件で前培養して前培養液を得た。前培養液を実施例１（５）に記載の芽胞用培地に接種して、好気条件下で４０℃で２日間振盪培養することにより菌液を調製し、芽胞数を計測した。この菌液をエッペンドルフチューブに１００μＬずつ入れたものを６つ用意し、ブロックヒーターを用いて７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃および１００℃で、それぞれ３０分間加熱した。加熱開始から１０分後および３０分後に一定量の菌液を取って芽胞数の計測を行った。なお、芽胞数の計測は、実施例１（５）に記載の方法により行った。その結果を図８に示す。
【００５０】
図８に示すように、３０分間加熱した後の芽胞数は、加熱前（加熱時間０分）と比較して、７０℃および８０℃で加熱した場合はほとんど変化がなく、８５℃および９０℃で加熱した場合はわずかに減少し、９５℃および１００℃で加熱した場合はおよそ１／１０に減少した。加熱前の芽胞数が１．７×１０８ｃｆｕ／ｍＬであったのに対して、３０分間加熱した後の芽胞数は、７０℃では２．１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ（生存率１００％）、８０℃では１．７×１０８ｃｆｕ／ｍＬ（生存率１００％）、８５℃では１．１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ（生存率６５％）、９０℃では８．５×１０７ｃｆｕ／ｍＬ（生存率５０％）、９５℃では１．４×１０７ｃｆｕ／ｍＬ（生存率８％）、１００℃では６．５×１０６ｃｆｕ／ｍＬ（生存率４％）であった。培養日数の短い未熟な芽胞は一般的に耐熱性が劣るが、ｌｉｌａｃ−０１株の芽胞は、培養日数が２日間と短いにもかかわらず、液体中において１００℃で３０分間加熱しても芽胞の減少率が１／１００程度に留まるほど耐熱性が高かった。これらの結果、および市販の株は１００℃より高い温度で３０分間加熱した場合に芽胞数が１／１０００００と大きく減少する（諏訪桃子、バイオインダストリー、第２４巻、第１７〜２２頁、２００７年）ことから、ｌｉｌａｃ−０１株の芽胞は他の菌株と比較して耐熱性が高いことが明らかになった。
【００５１】
［２−２］乾燥状態における耐熱性
普通寒天培地のプレートにｌｉｌａｃ−０１株を塗抹して、好気条件下、４０℃で２日間培養した。プレート上のコロニーを掻き取って滅菌水に入れて懸濁することにより、菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液５０μＬを小サイズのアルミケースに入れたものを１０用意し、５つずつ２群に分けて、１００℃群および１２０℃群とした。オーブン（アズワン社）を用いてこれらを６０℃で３０分間加熱することにより乾燥させた。その後、オーブンを用いて１００℃群は１００℃で、１２０℃群は１２０℃でそれぞれ３０分間加熱した。１００℃または１２０℃での加熱開始時、加熱開始から５分後、１０分後、２０分後および３０分後に各群からアルミケースを１つずつ取り出し、その中に滅菌生理食塩水を入れて懸濁し、その全量を標準寒天培地（日水製薬社）で混釈し、好気条件下、５５℃で１日間培養した後、コロニーの数を数えることにより生存した芽胞数を計測した。その結果を図９に示す。
【００５２】
図９に示すように、１００℃で加熱した場合の生存した芽胞数は、加熱開始時が３．３×１０５ｃｆｕであったのに対して、３０分間加熱後は２．２×１０４ｃｆｕ（生存率７％）であり、およそ１／１０に減少した。また、１２０℃で加熱した場合の生存した芽胞数は、加熱開始時が２．２×１０５ｃｆｕであったのに対して、３０分間加熱後は５．６×１０２ｃｆｕ（生存率０．３％）であり、およそ１／１０００に減少した。すなわち、ｌｉｌａｃ−０１株の芽胞は、乾燥状態においては、１００℃で３０分間加熱しても芽胞の減少が１／１０程度に留まり、１２０℃で３０分間加熱しても相当量の芽胞が残存しているほど耐熱性が高かった。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株の芽胞は耐熱性が高いことが明らかになった。
【００５３】
（３）ヒトにおける摂取試験
［３−１］ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉の製造
造粒したオカラ９００ｇを、ステンレス製カゴに入れてオートクレーブを用いて殺菌した。ここに、ｌｉｌａｃ−０１株を３．６×１０６ｃｆｕ／ｍＬを含む培養液０．９ｍＬを添加して、好気条件下、およそ５０℃で２６時間培養した後、乾燥機を用いて乾燥させ、粉末化して、これをｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉とした。ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉を一定量取って滅菌生理食塩水に希釈して希釈液とし、希釈液を標準寒天培地（日水製薬社）で混釈し、好気条件下、５５℃で１日間培養した後、コロニーの数を数えることにより生菌数を計測したところ、３．０×１０８ｃｆｕ／ｇであった。また、ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉の栄養分析を株式会社食環境衛生研究所に依頼して行った。ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉については得られた栄養分析値、オカラについては五訂増補日本食品標準成分表の値にそれぞれ基づいて、水分を０％とした値を算出して比較した。但し、イソフラボンの値はダイジン、グリシチン、ゲニスチンおよびそれらのアグリコン計６種類の総量の値とし、独立行政法人産業技術総合研究所北海道センターに依頼して得られた分析値に基づいた。その結果を表１に示す。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
表１に示すように、ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉では、オカラと比較して、脂質、糖質およびエネルギーが減少しており、ビタミンＢ２が増加していた。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株を添加することにより、エネルギー、脂質および糖質を低減させ、かつビタミンＢ２といった機能成分を増加させたオカラ粉を製造することができることが明らかになった。
【００５６】
［３−２］ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉の摂取および糞便中の菌数検査
健康な女性（４９歳）に、本実施例２（３）［３−１］のｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉１ｇ（ｌｉｌａｃ−０１株の菌数３．０×１０８ｃｆｕ）を、水と一緒に１日１回、１０日間摂取してもらった。摂取前、摂取開始から１０日間経過後（摂取１０日後）および摂取終了から６日間経過後（摂取終了６日後）に糞便を採取した。なお、試験期間中、食事制限は行わなかった。
【００５７】
採取した糞便の一定量を滅菌生理食塩水に希釈してサンプル液とし、このサンプル液について、本実施例２（３）［３−１］に記載の方法により生菌数を、実施例１（５）に記載の方法により芽胞数の計測を行った。一方、摂取１０日後のサンプル液については、生菌数計測の際にプレート上に出現したコロニーの観察およびバチルスコアグランスの特異的ＰＣＲを行った。
【００５８】
バチルスコアグランスについての特異的ＰＣＲは、次の手法により行った。まず、プレート上のコロニーを滅菌した爪楊枝で突き、１００μＬのＴＥ緩衝液に懸濁した。これを９５℃で１０分間インキュベートした後、氷冷することによりＤＮＡを熱抽出した。続いて、１００００ｒｐｍで２分間遠心分離を行って上清を回収し、ＤＮＡ液とした。このＤＮＡ液を鋳型として、既報（遠田昌人ら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓの１６Ｓ−２６Ｓ ｒＤＮＡ ＩＴＳ領域の多型解析、東洋食品工業短大・東洋食品研究所  研究報告書、第２２巻、第７７〜８３頁、２００９年）に従い、下記のプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件により、バチルスコアグランスの１６ＳｒＤＮＡと２３Ｓ ｒＤＮＡとの間のｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）領域を増幅した。ＰＣＲ産物は、１．５％（ｗ／ｗ）アガロースゲル、マーカーとしてＧｅｎｅ ｌａｄｄｅｒ １００（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）およびポジティブコントロールを用いて電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドを用いて染色し、ＵＶトランスイルミネーターを用いてバンドを確認した。なお、ポジティブコントロールは、ｌｉｌａｃ−０１株から同様の方法によりＤＮＡを抽出してバチルスコアグランスについての特異的ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を用いた。
【００５９】
フォワードプライマー；１０１−２２Ｆ；５’−ＣＧＡＣＴＧＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＧ−３’（配列番号４）
リバースプライマー  ；２６４−２１Ｒ；５’−ＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号５）
ＰＣＲ反応溶液組成；フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）  ２．５μＬ、リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ）  ２．５μＬ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）  ４μＬ、１０×ＰＣＲバッファー  ５μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（５Ｕ／μＬ；ＴａＫａＲａ社）  ０．２５μＬ、鋳型ＤＮＡ液  １μＬ、ｄＨ２０  ３４．７５μＬ
ＰＣＲ反応条件；９４℃で５分の反応の後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で２分の反応を行った。
【００６０】
生菌数と芽胞数の計測の結果を表２に、コロニーの観察結果を図１０左図に、特異的ＰＣＲの結果を図１０右図にそれぞれ示す。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
表２に示すように、摂取前および摂取終了６日後は、生菌数および芽胞数のいずれも検出限界（１０ｃｆｕ／ｇ）以下（ＮＤ）であったのに対し、摂取１０日後は、生菌数が４．９×１０７ｃｆｕ／ｇであり、芽胞数が２．０×１０７ｃｆｕ／ｇであった。また、図１０左図に示すように、摂取１０日後のサンプル液のコロニーは白く小さな白い光沢のあるコロニーであり、図１０右図に示すように、バチルスコアグランスのポジティブコントロールと同位置にバンドが検出された。これらの図１０の結果から、生菌数計測の際にプレート上に出現したコロニーは、バチルスコアグランスに属すること、すなわちｌｉｌａｃ−０１株であることが確認された。
【００６３】
すなわち、ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉を１０日間摂取したヒトの糞便中には多数のｌｉｌａｃ−０１株が検出された一方で、摂取終了から６日間経過後は検出されなかった。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株は生きた状態でヒトの腸管に到達すること、および摂取から６日間以上は腸内に残存しないことが明らかになった。また、１回の糞便量を２００ｇとすると、糞便全量中の生菌数は４．９×１０７ｃｆｕ×２００ｇ＝９．４×１０９ｃｆｕとなり、１日の摂取菌量である３．８×１０８ｃｆｕよりも多いことから、ｌｉｌａｃ−０１株はヒトの腸管において増殖することが示唆された。
【００６４】
＜実施例３＞ｌｉｌａｃ−０１入り食品の製造
（１）ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳
［１−１］ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳の製造
ｌｉｌａｃ−０１株を実施例１（４）に記載の条件下で前培養して前培養液を得た。また、２５０ｍＬの豆乳をバッフル付きフラスコに入れて、オートクレーブを用いて殺菌した。ここに、ｌｉｌａｃ−０１株の前培養液を０．１％（ｖ／ｖ）となるよう添加して、４０℃で２日間振盪培養することによりｌｉｌａｃ−０１入り豆乳を製造した。製造したｌｉｌａｃ−０１入り豆乳の栄養分析を財団法人日本食品分析センターに依頼して行った。その結果を表３に示す。また、ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳中の生菌数を実施例２（３）［３−１］に記載の方法により、芽胞数を実施例１（５）に記載の方法により、それぞれ計測したところ、生菌数が８．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬであり、芽胞数が４．９×１０８ｃｆｕ／ｍＬであった。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
［１−２］急性毒性試験
本実施例３（１）［１−１］に記載の方法により製造したｌｉｌａｃ−０１入り豆乳について、限度試験による急性毒性試験を財団法人日本食品分析センターに依頼して行った。具体的には、ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳（生菌数１．４×１０９ｃｆｕ／ｇ、芽胞数８．６×１０８ｃｆｕ／ｇ）を投与量２０００ｍｇ／ｋｇでマウスに１回投与した後、１４日間観察を行った。その結果、異常や死亡は認められなかったことから、ｌｉｌａｃ−０１株入り豆乳は安全であることが確認された。
【００６７】
（２）ｌｉｌａｃ−０１入りオカラ粉
オカラを造粒した後、乾燥機を用いて乾燥させて、乾燥オカラとした。この乾燥オカラ２００ｇに本実施例３（１）［１−１］のｌｉｌａｃ−０１入り豆乳５０ｍＬを添加して吸収させた後、乾燥機を用いて乾燥させ、粉末化して、これをｌｉｌａｃ−０１入りオカラ粉とした。ｌｉｌａｃ−０１入りオカラ粉の栄養分析を財団法人日本食品分析センターに依頼して行った。その結果を表４に示す。
【００６８】
【表４】
2013099300.tif 000006
【００６９】
（３）ｌｉｌａｃ−０１入りカボチャオカラクッキー
ゆでたカボチャを水に入れて懸濁したものを、実施例２（３）［３−１］のｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉に吸収させてｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラとした。続いて、乾燥機を用いて乾燥させて粉末化し、ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラ粉とした。次に、薄力粉２００ｇ、ベーキングパウダー６ｇ、ｌｉｌａｃ−０１入りカボチャオカラ粉１００ｇ、無塩バター１２０ｇ、砂糖１００ｇ、卵１個および塩少々を混ぜ合わせてｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラクッキー生地を調製した後、成形して、予熱をしていたオーブンを用いて１８０℃で１７分間焼成することによりｌｉｌａｃ−０１入りカボチャオカラクッキーを製造して検食した。製造途中において、ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラ、ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラ粉、ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラクッキー生地およびｌｉｌａｃ−０１入りカボチャオカラクッキーのそれぞれから一定量を取って滅菌生理食塩水に希釈した後、生菌数を実施例２（３）［３−１］に記載の方法により計測した。また、ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラ粉については、実施例１（５）に記載の方法により芽胞数も計測した。生菌数および芽胞数の計測結果を下記に示す。
【００７０】
（ｃｆｕ／ｇ）          生菌数        芽胞数
ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラ              １．１×１０９
ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラ粉            ６．６×１０９  １．８×１０９
ｌｉｌａｃ−０１カボチャオカラクッキー生地  ２．０×１０８
ｌｉｌａｃ−０１入りカボチャオカラクッキー  ４．７×１０６
【００７１】
検食した結果、ｌｉｌａｃ−０１入りカボチャオカラクッキーは、さくさくした食感であり、ほのかにカボチャの味がして美味しかった。また、生菌数を計測した結果、ｌｉｌａｃ−０１入りカボチャオカラクッキーには、生きたｌｉｌａｃ−０１株が多数存在することが示された。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株を添加することにより、整腸効果が期待できるクッキーを製造することができることが明らかになった。
【００７２】
（４）ｌｉｌａｃ−０１入りパンとｌｉｌａｃ−０１入りラスク
実施例２（３）［３−１］のｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉１５ｇ、強力粉１３５ｇ、西京味噌１２ｇ、ベーキングパウダー５ｇおよびバター１０ｇをフードプロセッサーに入れて混ぜ合わせた。続いて、混ぜながら１２０ｍＬの水を少しずつ入れて、一塊になるまで混ぜることによりｌｉｌａｃ−０１パン生地を調製した。ｌｉｌａｃ−０１パン生地を４等分して成形し、打ち粉をしてから切れ目を入れて、予熱をしていたオーブンを用いて１８０℃で２０分間焼成することによりｌｉｌａｃ−０１入りパンを製造して検食した。焼成後のｌｉｌａｃ−０１入りパンの表面温度および内部温度を、放射温度計を用いて測定したところ、表面温度は１０５℃であり、内部温度は７０℃であった。
【００７３】
次に、ｌｉｌａｃ−０１入りパンが冷えた後にスライスし、網にのせて、予熱をしていたオーブンを用いて１８０℃で３０分間焼成することによりｌｉｌａｃ−０１入りラスクを製造した。焼成後のｌｉｌａｃ−０１入りラスクは内部まで乾燥しており、放射温度計を用いて表面温度を測定したところ、１２５℃であった。ｌｉｌａｃ−０１入りパンおよびｌｉｌａｃ−０１入りラスクの製造途中において、ｌｉｌａｃ−０１パン生地、ｌｉｌａｃ−０１入りパンおよびｌｉｌａｃ−０１入りラスクのそれぞれから一定量を取って滅菌生理食塩水に希釈した後、生菌数を実施例２（３）［３−１］に記載の方法により、芽胞数を実施例１（５）に記載の方法によりそれぞれ計測した。その結果を下記に示す。
【００７４】
（ｃｆｕ／ｇ）      生菌数        芽胞数
ｌｉｌａｃ−０１パン生地                ６．８×１０８  １．３×１０８
ｌｉｌａｃ−０１入りパン                １．５×１０７  ７．６×１０６
ｌｉｌａｃ−０１入りラスク              ５．０×１０６  ６．６×１０６
【００７５】
検食した結果、ｌｉｌａｃ−０１入りパンは、膨らんでふわふわしており、通常のパンと同様の味と食感を呈していた。翌日も比較的柔らかい触感であった。また、生菌数および芽胞数を計測した結果、ｌｉｌａｃ−０１入りパンおよびｌｉｌａｃ−０１入りラスクのいずれにも、生きたｌｉｌａｃ−０１株が多数存在することが示された。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株を添加することにより、整腸効果が期待できるパンやラスクを製造することができることが明らかになった。
【００７６】
（５）ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳パン
本実施例３（１）［１−１］に記載の方法によりｌｉｌａｃ−０１入り豆乳（生菌数７．１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、芽胞数５．３×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）を調製し、水道水を用いて５倍に希釈した。これをパン生地に８０ベーカーズ％の割合で添加して、定法に従いパンを製造し、ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳パンとした。なお、焼成時のパン生地の大きさはおよそ１７ｃｍ×７ｃｍ×６ｃｍ、焼成条件は１７０℃で４５分とした。この製造途中におけるパン生地、ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳パンの端部および中心部のそれぞれから一定量を取って滅菌生理食塩水に希釈した後、生菌数を実施例２（３）［３−１］に記載の方法により、芽胞数を実施例１（５）に記載の方法によりそれぞれ計測した。その結果を下記に示す。
【００７７】
（ｃｆｕ／ｇ）      生菌数        芽胞数
パン生地                                ６．２×１０７  ２．２×１０７
ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳パン（端部）    １．３×１０６  ３．８×１０５
ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳パン（中心部）  １．１×１０７  ７．８×１０６
【００７８】
生菌数および芽胞数を計測した結果、ｌｉｌａｃ−０１入り豆乳パンの端部および中心部のいずれにも、生きたｌｉｌａｃ−０１株が多数存在することが示された。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株を添加することにより、整腸効果が期待できるパンを製造することができることが明らかになった。
【００７９】
（６）ｌｉｌａｃ−０１入り焼き菓子
本実施例３（１）［１−１］に記載の方法によりｌｉｌａｃ−０１入り豆乳（生菌数７．６×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、芽胞数６．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）を調製し、これを生地に２−３％（ｗ／ｗ）の割合で添加して、定法に従いオレンジパウンドケーキ、フルーツパウンドケーキ、バタークッキー、チョコクッキーおよびヘーゼルナッツクッキーを製造し、ｌｉｌａｃ−０１入り焼き菓子とした。但し、バタークッキーのみ焼成前に５０時間冷凍庫で保存した。ｌｉｌａｃ−０１入り焼き菓子から一定量を取って滅菌生理食塩水に希釈した後、生菌数を実施例２（３）［３−１］に記載の方法により、芽胞数を実施例１（５）に記載の方法によりそれぞれ計測した。ｌｉｌａｃ−０１入り焼き菓子の焼成条件、焼成時の大きさならびに生菌数および芽胞数の計測結果を表５に示す。
【００８０】
【表５】
2013099300.tif 000007
【００８１】
生菌数および芽胞数を計測した結果、オレンジパウンドケーキ、フルーツパウンドケーキ、バタークッキー、チョコクッキーおよびヘーゼルナッツクッキーのいずれにも、生きたｌｉｌａｃ−０１株が多数存在することが示された。焼成時間が短いほど、また、焼成時の大きさが大きいほど生菌数および芽胞数が大きい傾向であった。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１を添加することにより、整腸効果が期待できる焼き菓子を製造することができることが明らかになった。また、ｌｉｌａｃ−０１株は５０時間の冷凍にも耐えて生存することが明らかになった。
【００８２】
＜実施例４＞ｌｉｌａｃ−０１入り飼料の製造および摂取試験
（１）ｌｉｌａｃ−０１入り飼料の製造
日清丸紅印平牧米子豚、子豚育成用配合飼料｛可消化養分総量（Ｔｏｔａｌ Ｄｉｇｅｓｔｉｂｌｅ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ；ＴＤＮ）７７％以上、抗生物質無添加；日清丸紅飼料社｝に、実施例３（２）に記載の方法により製造したｌｉｌａｃ−０１入りオカラ粉（生菌数１．１×１０８ｃｆｕ／ｇ、芽胞数８．２×１０７ｃｆｕ／ｇ）を０．５％（ｗ／ｗ）となるよう添加することによりｌｉｌａｃ−０１入り飼料を製造した。また、コントロールとしてｌｉｌａｃ−０１入りオカラ粉を添加しない上記飼料を用意し、これを通常飼料とした。
【００８３】
（２）豚における摂取試験
北海道夕張郡長沼町の養豚農家において、母豚がランドレース×ダイヨークシャーであり、父豚がバークシャーである三元交雑種の１４〜１６週齢の子豚１腹１０頭を用意し、５頭ずつ２群に分けて試験群およびコントロール群とした。試験群には本実施例４（１）のｌｉｌａｃ−０１入り飼料を、コントロール群には本実施例４（１）の通常飼料を、それぞれ自由摂取させながら、２週間試験飼育を行った。試験飼育期間中の餌の摂取量は、試験群およびコントロール群のいずれも１頭あたりおよそ２ｋｇ／日であったことから、試験群におけるｌｉｌａｃ−０１株の芽胞摂取量は、１頭あたりおよそ１０８ｃｆｕ／日であった。
【００８４】
試験飼育後、試験群およびコントロール群の豚の糞便を採取して、一定量を滅菌生理食塩水に希釈してサンプル液とした。サンプル液について、実施例１（３）［３−２］に記載の方法により、生菌数および芽胞数の計測、コロニーの観察ならびにバチルスコアグランスの特異的ＰＣＲを行った。また、サンプル液をＸＭ−Ｇ寒天培地（日水製薬社）に塗抹して３７℃で２０時間培養した後、出現した青色ないし青紫色のコロニーを大腸菌として菌数の計測を行った。さらに、サンプル液についてＣｏｍｐａｃｔ ｐＨ ｍｅｔｅｒ  ＡＳ−２１１（アズワン社）を用いてｐＨを測定した。芽胞数および大腸菌数の計測結果ならびにｐＨの測定結果について、群毎に平均値を算出した。
【００８５】
その結果、生菌数および芽胞数は、コントロール群ではいずれも検出限界（１０ｃｆｕ／ｇ）以下であったのに対し、試験群では、生菌数が平均１．１×１０５ｃｆｕ／ｇ、芽胞数が平均１．７×１０５ｃｆｕ／ｇであった。なお、コロニーの観察およびチルスコアグランスの特異的ＰＣＲの結果から、生菌数計測の際にプレート上に出現したコロニーは、バチルスコアグランスに属すること、すなわちｌｉｌａｃ−０１株であることが確認された（図示しない）。また、大腸菌数は、コントロール群では平均１．７×１０７ｃｆｕ／ｇであったのに対し、試験群では平均１．１×１０６ｃｆｕ／ｇであった。また、サンプル液のｐＨは、コントロール群では平均ｐＨ６．０であったのに対し、試験群では平均ｐＨ５．５であった。
【００８６】
すなわち、ｌｉｌａｃ−０１入り飼料を２週間摂取した豚の糞便中には多数のｌｉｌａｃ−０１株が検出されたことから、ｌｉｌａｃ−０１入り飼料に含まれるｌｉｌａｃ−０１株は生きた状態で飼育動物の腸管に到達することが明らかになった。また、本実施例４（２）を実施した時期における豚の排泄量は１日あたりおよそ１ｋｇと推定されることから、１日の糞便全量中の芽胞数は１．７×１０５ｃｆｕ×１ｋｇ＝１．７×１０８ｃｆｕとなり、１日の摂取芽胞量であるおよそ１０８ｃｆｕとほぼ同数であったことから、摂取したｌｉｌａｃ−０１株は、ほぼ全量が生きた状態で飼育動物の腸管に到達すること、あるいは飼育動物の腸管において増殖することが示唆された。
【００８７】
さらに、ｌｉｌａｃ−０１入り飼料を２週間摂取した豚では、それを摂取しない豚と比較して、糞便のｐＨが低く、糞便中の大腸菌数が小さかったことから、ｌｉｌａｃ−０１入り飼料を摂取させることにより、飼育動物の腸内のｐＨを低下させて大腸菌数を減少させることができることが明らかになった。これらの結果から、ｌｉｌａｃ−０１株を添加することにより、悪玉菌の数を減少させるなどの整腸効果を有する飼料を製造することができることが明らかになった。
【００８８】
＜実施例５＞食品残渣を原料としたｌｉｌａｃ−０１入り飼料の製造
（１）食品残渣を原料としたｌｉｌａｃ−０１入り飼料の製造
弁当製造工場から排出する新鮮な食品残渣１ｋｇに対して、実施例２（３）［３−１］のｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉（生菌数１．１×１０８ｃｆｕ／ｇ、芽胞数８．２×１０７ｃｆｕ／ｇ）を０．５%（５ｇ）、さらに無添加のオカラ粉９．５％（９５ｇ）を添加し、８５℃、１分以上の熱処理を加えることによってｌｉｌａｃ−０１入り飼料を製造した。このようにして、実施例４と同等の整腸効果を有し、栄養価の高い飼料を作製することができた。また様々な食品残渣を原料とした飼料の製造を試みた結果、ｌｉｌａｃ−０１培養オカラ粉を０．１から１０％、無添加のオカラ粉を１０から１５％添加してよく粉砕混合することによって、同様に整腸効果を有し、栄養価の高い飼料を作製することが可能であることが明らかになった。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１ａ】
2013099300.tif 000015
【図１ｂ】
2013099300.tif 000016
【図１ｃ】
2013099300.tif 000017
【図６】
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【図１０】
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【配列表】
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