(57)【要約】【課題】本発明は、不安定プラークへの選択的集積性に優れる化合物を提供する。【解決手段】  式（１）［式中、Ａ１は酸素またはＮＨ基であり、Ｒ１およびＲ２は水素または放射性ハロゲン置換基であり、ただしＲ１およびＲ２のいずれか一方のみが放射性ハロゲン置換基であり、Ｒ３は水素またはメトキシ基である］で表される化合物またはその塩：2013256491.tif 000016【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2013256491.tif 000013
［式中、Ａ１は酸素またはＮＨ基であり、
Ｒ１およびＲ２は水素または放射性ハロゲン置換基であり、ただしＲ１およびＲ２のいずれか一方のみが放射性ハロゲン置換基であり、
Ｒ３は水素またはメトキシ基である］
で表される化合物またはその塩。
【請求項２】
Ａ１がＮＨ基であり、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が放射性ハロゲン置換基であり、Ｒ３がメトキシ基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａ１が酸素であり、Ｒ１が放射性ハロゲン置換基であり、Ｒ２およびＲ３が水素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
放射性ハロゲン置換基が１８Ｆ，１２３Ｉ，１２４Ｉ，１２５Ｉまたは１３１Ｉである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含む、不安定プラークを画像化するための放射性医薬組成物。
【請求項６】
下記式（２）：
【化２】
2013256491.tif 000014
［式中、Ａ２は酸素またはＮＨ基であり、
Ｒ4およびＲ５は、水素、または非放射性ハロゲン置換基、ニトロ基、アルキル鎖の炭素
数が１〜４であるトリアルキルアンモニウム基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルスタニル基もしくはトリフェニルスタニル基から選択される官能基であり、ただしＲ4およびＲ５のいずれか一方のみが該官能基であり、
Ｒ６は水素またはメトキシ基である］
で表される、化合物またはその塩。
【請求項７】
Ａ２がＮＨ基であり、Ｒ４が水素であり、Ｒ５が非放射性ハロゲン置換基、ニトロ基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルアンモニウム基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルスタニル基またはトリフェニルスタニル基から選択される官能基であり、Ｒ６がメトキシ基である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ａ２が酸素であり、Ｒ４が非放射性ハロゲン置換基、ニトロ基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルアンモニウム基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルスタニル基またはトリフェニルスタニル基から選択される官能基であり、Ｒ５およびＲ６が水素である、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載された化合物又はその塩と、放射性ハロゲンイオンとを反応させ、下記式（１）：
【化３】
2013256491.tif 000015
［式中、Ａ１は酸素またはＮＨ基であり、
Ｒ１およびＲ２は水素または放射性ハロゲン置換基であり、ただしＲ１およびＲ２のいずれか一方のみが放射性ハロゲン置換基であり、
Ｒ３は水素またはメトキシ基である］
で表される化合物またはその塩を合成する工程、
を含むことを特徴とする、放射性ハロゲン標識有機化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不安定プラークへの選択的集積性に優れる新規化合物およびその製造方法、特に心筋梗塞や不安定心筋症を初めとする急性冠動脈症候群の診断において、病巣部位における不安定プラークの検出に有効な、生体組織中の不安定プラークの検査試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の食生活をはじめとする生活習慣の変化や社会の高齢化に伴い、心筋梗塞や脳梗塞の発症率は増加の一途をたどっており、これら疾患の早期発見・早期治療への関心が高まっている。
【０００３】
心筋梗塞や脳梗塞の主要な原因の一つとしてアテローム性動脈硬化症が挙げられる。
アテローム性動脈硬化症は、心臓を始め頸動脈や四肢の動脈内膜壁が部分的に肥厚して弾力性がなくなる疾患である。この内膜肥厚性の病変はプラークと呼ばれる。プラーク内には、コレステロールやリン脂質などの脂肪沈着物が蓄積し、またこれらの蓄積によって血管内膜が損傷するため、マクロファージやＴ細胞などの炎症細胞や、平滑筋組織、コラーゲンや弾性繊維のような結合組織、あるいは血栓やカルシウム沈着が認められる。プラークの安定性はこれら脂質、炎症細胞、平滑筋組織、結合組織、血栓やカルシウム沈着という組成物の相対比率に影響される。巨大な脂質コアを有し、かつ繊維性被膜のきわめて薄いプラークは不安定プラークとして知られ、機械的、血行動態学的な力によって容易に破綻し、血栓形成を誘発し血管を閉塞することで、心筋梗塞や脳梗塞を発症させる（非特許文献１）。
【０００４】
したがって、不安定プラークを明確に検出することができれば、その破綻前に治療することができ、心筋梗塞や脳梗塞の発症を防ぐことができると考えられる。近年、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、ＭＲＩなどの画像診断装置が著しく普及したことに伴い、不安定プラークの画像描出が試みられている。このような画像診断装置を用いた不安定プラークの描出には、不安定プラークの組成物あるいは不安定プラーク生成に関する様々な生体内因子に親和性を有する化合物を用いることが検討されている（非特許文献２）。しかしながら、不安定プラークを明確に検出できる手法は未だ確立されていない。
【０００５】
近年、不安定プラークの生成に関する生体内因子の一つとして、細胞内脂質代謝に関与する脂肪酸結合タンパク質（Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ; 以下ＦＡＢＰ）のサブタイプであるＦＡＢＰ４に注目が集まっている。ＦＡＢＰ４は、１〜９のサブタイプを有する脂肪酸結合タンパク質スーパーファミリーの一つであり、マクロファージおよび脂肪細胞に特異的に発現している分子量１５，０００前後のタンパク質である。そのアミノ酸配列は公知であり、公開されたデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）にＣＡＧ３３１８４として登録されている。ＦＡＢＰ４はマクロファージにおいて脂質誘因と炎症活性促進とを調節していることが報告されており（非特許文献３）、また頸動脈硬化症患者において、血漿内ＦＡＢＰ４発現量と予後とに相関があることが報告されている（非特許文献４）。そこで、不安定プラークの予防および治療を目的として、［３−［２−（３，４−ジフェニル−５−エチル−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）フェニル］フェノキシ］酢酸（ＢＭＳ３０９４３）をはじめ、ＦＡＢＰ４を標的とする選択的阻害剤が開発されている（非特許文献５）。しかしながら、生体内、特にアテローム性プラーク内のＦＡＢＰ４を選択的に検出するための有用な化合物は未だ見出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ”  ，Ｎａｔｕｒｅ，  ２００８，  ４５１，  ９５３−９５７
【非特許文献２】Ｓａdｅｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  Ｐｌａｑｕｅ”  ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０，５１，５（Ｓｕｐｐｌ），  ５１ｓ−６５ｓ
【非特許文献３】Ａｇａｒｄｈ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４／ａＰ２  ｉｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｑｕｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｒｏｔｉｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ”  ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ，２０１１，２６９（２），  ２００−２１０
【非特許文献４】Ｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｃａｒｏｔｉｄ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｃｕｔｅ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｓｔｏｒｋｅ”  ，ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  ｏｎｌｉｎｅ，２０１１，６，ｅ２８７８５
【非特許文献５】Ｆｕｒｕｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．， “Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｆａｔｔｙ−ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａＰ２”  ，Ｎａｔｕｒｅ，  ２００７，  ４４７，  ９５９−９６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、不安定プラークへの選択的集積性に優れる化合物を提供する。
また、本発明は、不安定プラークを検出するための診断剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、ＦＡＢＰ４に高い選択性および高い親和性を有する化合物を見出し、当該化合物が不安定プラークへの選択的集積性に優れることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、一側面によれば、下記式（１）：
【化１】
2013256491.tif 000002
で表される化合物またはその塩を提供する。
【００１０】
式（１）中、Ａ１は酸素またはＮＨ基であり、Ｒ１およびＲ２は水素または放射性ハロゲン置換基であり、ただしＲ１およびＲ２のいずれか一方のみが放射性ハロゲン置換基であり、Ｒ３は水素またはメトキシ基である。
【００１１】
本発明の一つの好ましい態様において、Ａ１がＮＨ基であり、Ｒ１が水素であり、Ｒ２が放射性ハロゲン置換基であり、Ｒ３がメトキシ基である、式（２）で表される化合物を提供する。
【００１２】
【化２】
2013256491.tif 000003
【００１３】
また別の好ましい態様において、Ａ１が酸素であり、Ｒ１が放射性ハロゲン置換基であり、Ｒ２およびＲ３が水素である、式（３）で表される化合物を提供する。
【００１４】
【化３】
2013256491.tif 000004
【００１５】
式（１）〜（３）中のＲ１およびＲ２の放射性ハロゲンとしては種々の核種を用いることができ、好ましくは１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いることができ、より好ましくは１８Ｆ、１２３Ｉまたは１２５Ｉを用いることができる。
【００１６】
また本発明は上記式（１）〜（３）で表される化合物またはその塩を含む、放射性医薬組成物を提供するものである。
【００１７】
上記式（１）〜（３）の化合物は新規化合物であり、本発明は、別の一側面によると、下記式（４）：
【化４】
2013256491.tif 000005
で表される化合物またはその塩を提供する。
【００１８】
式（４）中、Ａ２は酸素またはＮＨ基であり、Ｒ4およびＲ５のいずれか一方は、非放射性ハロゲン置換基、ニトロ基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルアンモニウム基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルスタニル基またはトリフェニルスタニル基から選択される官能基であり、他方は水素である。Ｒ６は水素またはメトキシ基である。
【００１９】
本発明の一つの好ましい態様において、Ａ２がＮＨ基であり、Ｒ4が水素であり、Ｒ５が非放射性ハロゲン置換基、ニトロ基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルアンモニウム基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルスタニル基またはトリフェニルスタニル基から選択される官能基であり、Ｒ６がメトキシ基である、式（５）で表される化合物を提供する。
【００２０】
【化５】
2013256491.tif 000006
【００２１】
また別の好ましい態様において、Ａ２が酸素、Ｒ４が非放射性ハロゲン置換基、ニトロ基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルアンモニウム基、アルキル鎖の炭素数が１〜４であるトリアルキルスタニル基またはトリフェニルスタニル基から選択される官能基であり、Ｒ５およびＲ６が水素である、式（６）で表される化合物を提供する。
【００２２】
【化６】
2013256491.tif 000007
【００２３】
上記式（４）〜（６）中のＲ4およびＲ５の非放射性ハロゲン置換基としては、放射性フッ素を用いた求核置換反応における標的となりうる非放射性ハロゲン、または放射性ヨウ素との同位体交換反応の標的となりうる非放射性ハロゲンを用いる事ができ、好ましくはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素を用いることができる。
【００２４】
トリアルキルスタニル基としては、アルキル鎖の炭素数が１〜４である種々のアルキル置換基を用いることができ、好ましくはトリメチルスタニル基およびトリブチルスタニル基を用いることができる。
【００２５】
また本発明は、上記式（４）〜（６）で表される化合物またはその塩から、上記式（１）〜（３）で表される化合物またはその塩を製造する方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、不安定プラークへの選択的集積性に優れる化合物を提供することができる。
【００２７】
また、本発明によれば、不安定プラークを検出するための放射性医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は５−（（３−[１２５Ｉ]ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（放射性ＴＡＰ１）の合成方法を示す。
【図２】図２は５−（（３−ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（非放射性ＴＡＰ１）の合成方法を示す。
【図３】図３はＦＡＢＰ３，４，及び５に対する非放射性ＴＡＰ１濃度−蛍光曲線を示す。
【図４】図４は放射性ＴＡＰ１のＨＰＬＣによる分析結果を示す。
【図５】図５は固相化ＦＡＢＰ４を用いた、ＦＡＢＰ４に対する放射性ＴＡＰ１のインビトロ飽和実験の結果を示す。（Ａ）放射性ＴＡＰ１濃度−放射能カウント曲線（黒丸：全放射性結合カウント（［１２５Ｉ］−ＴＡＰ１）、黒四角：非特異的結合（［１２５Ｉ］−ＴＡＰ１＋ＴＡＰ１））。（Ｂ）解離定数（Ｋｄ）。
【図６】図６は固相化ＦＡＢＰ４ならびにＦＡＢＰ３および５を用いた、各ＦＡＢＰに対する放射性ＴＡＰ１のインビトロ飽和実験の結果を示す。
【図７】図７は放射性ＴＡＰ１のヒト単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１細胞）取り込み実験の結果を示す。（Ａ）非放射性ＴＡＰ１の存在下、ＴＨＰ−１細胞の放射性ＴＡＰ１の取り込み結果を示す。（Ｂ）非放射性ＴＡＰ１およびＢＭＳ３０９４０３を用いた、ＴＨＰ−１細胞の放射性ＴＡＰ１の取り込み阻害実験の結果を示す。（Ｃ）非放射性ＴＡＰ１濃度とＴＨＰ−１細胞の放射性ＴＡＰ１の取り込み量（％）との関係を表す曲線を示す。
【図８】図８は正常マウス血漿中における放射性ＴＡＰ１のインビトロ安定性を示す、ＨＰＬＣによる解析結果を示す。
【図９】図９は正常マウスに投与された放射性ＴＡＰ１の体内分布結果を示す。
【図１０】図１０はＣ６ラットグリオーマ細胞移植マウスに投与された放射性ＴＡＰ１の体内分布結果を示す。
【図１１】図１１はＣ６ラットグリオーマ細胞移植マウスに放射性ＴＡＰ１を投与後、摘出した腫瘍組織を用いた、オートラジオグラフィ（ＡＲＧ）による腫瘍での投与された放射性ＴＡＰ１の分布結果（Ａ）ならびに免疫染色によるＦＡＢＰ４の発現分布結果（Ｂ）を示す。（Ａ）において四角で囲まれた領域（ｅ、ｆ）は放射性ＴＡＰ１の強いシグナルを示す。
【図１２】図１２はウェスタンブロッティングによる、培養下にあるＣ６ラットグリオーマ細胞およびＲＴ４細胞（ポジティブコントロール）におけるＦＡＢＰ４の発現解析結果を示す。
【図１３】図１３はウェスタンブロッティングによる、摘出された腫瘍組織におけるＦＡＢＰ４の発現解析結果を示す。レーン１及び２は摘出された腫瘍組織より調整したサンプル、レーン３は筋肉組織より調整したサンプル（ネガティブコントロール）、レーン４は脂肪組織より調整したサンプル（ポジティブコントロール）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。
本発明にかかる放射性ハロゲン標識化合物は、上記の通り、式（１）〜（３）で表される化合物またはその塩であるが、特に好ましい実施形態によれば、例えば下記式（７）で表される５−（（３−［１２３Ｉ］ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンとすることができる。
【００３０】
【化７】
2013256491.tif 000008
【００３１】
本発明にかかる放射性ハロゲン標識化合物は、上記式（１）〜（３）で表される化合物が塩を形成する場合もあり、かかる塩が製薬学的に許容される塩である限りにおいて本発明に包含される。
【００３２】
本明細書において「塩」には無機または有機の酸または塩基から誘導されるものが挙げられる。具体的には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、トルエン−ｐ−スルホン酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、マロン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アミン塩およびアンモニウム塩等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３３】
本発明にかかる放射性ハロゲン化合物は、上記式（４）〜（６）で表される化合物またはその塩を標識前駆体として用いることによって製造することができる。
【００３４】
本明細書において、「標識前駆体」とは放射性同位元素である放射性ヨウ素、放射性フッ素、放射性臭素および放射性塩素を導入する工程の原料となる化合物である。
【００３５】
以下、５−（（３−[１２５Ｉ]ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを例に取り、本発明にかかる放射性ハロゲン標識化合物の合成方法について説明する。
【００３６】
（標識前駆体の製造方法）
以下、５−（（３−[１２５Ｉ]ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンの好ましい態様における標識前駆体化合物である、２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを合成する場合を例にとり、標識前駆体化合物の製造方法について説明する。
【００３７】
好ましい態様において、２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンの合成は、図１のＳｔｅｐ１〜５に記載した方法にて行う事ができる。まずピリジンと水酸化ナトリウムの存在下、重炭酸アミノグアニジンと塩化ベンゾイルとを反応させ、Ｎ−ベンズアミドグアニジンを得る（図１，Ｓｔｅｐ１）。続いて得られたＮ−ベンズアミドグアニジンを水中で加熱乾留させ精製することで、３−フェニル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−アミンを得る（図１，Ｓｔｅｐ２）。
【００３８】
次に、得られた３−フェニル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−アミンを酢酸溶媒下、４−クロロアセト酢酸エチルと反応させ、５−塩化メチル−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを得る（図１，Ｓｔｅｐ３）。ついで、得られた５−塩化メチル−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンと３−ブロモフェノールをジメチルホルムアミド下で加熱反応させた後、溶媒を留去しクロマトグラム生成を行い、５−（（３−ブロモフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを得る（図１，Ｓｔｅｐ４）。
【００３９】
次に、得られた５−（（３−ブロモフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンをジメチルホルムアミドに溶解し、トリエチルアミンを加えた後ビストリブチルスズおよび触媒量のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）を添加し、加熱還流した後溶媒を留去しクロマトグラム生成を行い、目的の標識前駆体である２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを得る（図１，Ｓｔｅｐ５）。
【００４０】
なお、３位の置換基をトリブチルスタニル置換基以外のトリアルキルスタニル置換基とした化合物を得る場合は、Ｓｔｅｐ４でビストリブチルスズを用いる代わりに、目的に応じた種々のビストリアルキルスズを用いればよい。例えば３位の置換基をトリメチルスタニル置換基とした化合物を合成する場合には、ビストリメチルスズを用いて上記と同様の反応を行えばよい。
【００４１】
また３位の置換基を非放射性ハロゲン置換基とした化合物を得るためには、非放射性ハロゲン置換基が臭素である化合物を得る場合にはＳｔｅｐ３で得られた化合物をそのまま用いればよく、３位の非放射性ハロゲン置換基がフッ素、塩素およびヨウ素である化合物を得る場合については、Ｓｔｅｐ３において、それぞれ３−フルオロフェノール、３−クロロフェノール、３−ヨードフェノールをそれぞれ用い、Ｓｔｅｐ３と同様の反応を行えばよい。
【００４２】
（放射性ハロゲン標識体の合成）
得られた２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを標識前駆体として、５−（（３−[１２５Ｉ]ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを製造する方法について説明する。
【００４３】
まず標識に供する放射性ハロゲンイオンとして[１２５Ｉ]ヨウ化ナトリウム溶液を得る。[１２５Ｉ]ヨウ素は、例えばキセノンガスをターゲットとして中性子照射を行うといった、公知の方法で得ることができる。この[１２５Ｉ]ヨウ素は公知の方法を用いて[１２５Ｉ]ヨウ化ナトリウム溶液とし、標識に用いる。
【００４４】
次に標識前駆体である２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを不活性有機溶媒に溶解し、酸及び酸化剤と共に[１２５Ｉ]ヨウ化ナトリウム溶液を加え反応させ、目的物である５−（（３−[１２５Ｉ]ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを得る（図１, Ｓｔｅｐ６）。
【００４５】
前駆体を溶解させる不活性有機溶媒としては標識前駆体および[１２５Ｉ]ヨウ化ナトリウムとの間で反応性を有しない種々の溶媒を用いることができ、好ましくはメタノールを用いることができる。
【００４６】
なお、５−（（３−[１２３Ｉ]ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを合成する場合には、上記同様２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを標識前駆体として用い、[１２５Ｉ]ヨウ化ナトリウム溶液の代わりに[１２３Ｉ]ヨウ化ナトリウム溶液を用いて上記同様に反応させればよい。また、ヨウ素以外の放射性ハロゲン標識体は、合成目的に応じた標識前駆体を、目的に応じた放射性ハロゲンで標識することによって合成することができる。例えば、５−（（３−[１８Ｆ]フルオロフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを合成する場合には、標識前駆体として５−（（３−フルオロフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンを用い、相関移動触媒と炭酸カリウムの存在下で[１８Ｆ]フッ化物イオンと反応させればよい。
【００４７】
（本発明にかかる検出試薬の使用方法及び調製方法）
本発明にかかる化合物は、ＦＡＢＰ４に対して高い選択性および高い親和性を有する。
【００４８】
本発明にかかる化合物がＦＡＢＰ４に対して「高い選択性を有する」とは、その化合物が少なくともＦＡＢＰ４以外のＦＡＢＰサブタイプ（例えば、ＦＡＢＰ１，２，３，５，６，７，８および９、好ましくはＦＡＢＰ３および５）よりも、ＦＡＢＰ４に対して高い親和性で結合することを意味する。また、本発明にかかる化合物がＦＡＢＰ４に対して「高い親和性を有する」とは、その化合物が当技術分野で公知の方法によって、ＦＡＢＰ４を少なくともＦＡＢＰ４以外のＦＡＢＰサブタイプ（上記）から区別して検出することが可能な程度に高い親和性で結合することを意味し、典型的には、阻害定数（Ｋｉ）が１×１０−４ｍｏｌ／Ｌ〜１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ未満、および／または解離定数（Ｋｄ）が１×１０−５ｍｏｌ／Ｌ〜１×１０−７ｍｏｌ／Ｌ未満であるような結合親和性を示すことを意味する。阻害定数（Ｋｉ）および解離定数（Ｋｄ）は下記実施例にて詳述するような、ＦＡＢＰ４に対する結合阻害実験および飽和結合実験により求めることができる。
【００４９】
本発明にかかる化合物は、不安定プラークを検出および可視化するための放射性医薬組成物としてインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で使用する試薬として使用することができる。本明細書において「放射性医薬組成物」とは、上記式（１）〜（３）で表される化合物またはその塩を生体内への投与に適した形態で含む処方物であると定義することができる。この放射性医薬組成物は、本発明にかかる化合物に加えて、薬学的に許容される適当なキャリア、希釈剤、エマルジョン、賦形剤、増量剤、結合剤、浸潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、着色料、香味剤、および安定化剤などの追加成分を含んでいてもよい。
【００５０】
この放射性医薬組成物は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、注射による局所投与、腹腔または胸腔への投与、皮下投与、筋肉内投与、舌下投与、経皮吸収または直腸内投与など）の投与方法に使用することができる。また、この放射性医薬組成物は投与経路に応じて適当な剤形とすることが可能であるが、好ましくは、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射および皮下注射用の注射剤（例えば溶液、乳剤、懸濁剤）の方法で用いる水溶液である。この水溶液は本発明にかかる化合物を、水、生理食塩液、またはリンゲル液等に溶解させることで調製することができる。
【００５１】
この場合における本化合物の濃度は、配合された本化合物の安定性が得られる濃度以下とする必要がある。本化合物の投与量は、投与された本化合物の分布を画像化するために十分な量であれば特に限定する必要はない。例えば、[１２３Ｉ]放射性ヨウ素標識化合物および[１８Ｆ]放射性フッ素標識化合物の場合には、体重６０ｋｇの成人一人あたり５０〜６００ＭＢｑ程度を、静脈投与または局所投与して使用することができる。投与された上記化合物の分布は、公知の方法にて画像化することができ、例えば[１２３Ｉ]放射性ヨウ素標識化合物の場合はＳＰＥＣＴ装置、[１８Ｆ]放射性フッ素標識化合物の場合はＰＥＴ装置を用いて画像化することができる。
【００５２】
本発明に関する化合物を投与する被験体は、特に限定されるものではなく、ヒトをはじめとする哺乳動物の他、家畜（ウシ、ブタなど）、愛玩動物（イヌ、ネコなど）、実験動物（マウス、ラット、サルなど）などが挙げられる。特に、プラークの存在が疑われる被験体に使用することが好ましい。
【実施例】
【００５３】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、これらの実施例によって制限されるものではない。
【００５４】
なお、本実施例においては特に断りのない限り、以下の装置を用いて分析・測定を行った：
ＮＭＲ装置：ＪＮＭ−ＥＣＳ４００  日本電子株式会社製
ＬＣ−ＭＳ装置：ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ  島津製作所製
ＥＳＩ−ＭＳ装置：ＬＣＭＳ−２０１０ＥＶ  島津製作所製。
【００５５】
（実施例１）５−（（３−ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンの合成
５−（（３−ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンの合成は、図２に示す合成方法に従って行った。
【００５６】
ピリジン（１１２ｍＬ）に重炭酸アミノグアニジン（１１．６ｇ、８５．４ｍｍｏｌ）を氷冷下で加え、ここに塩化ベンゾイル（１０ｇ、７１．１ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。混合溶液を室温で２０時間攪拌後、溶媒を減圧留去し、残渣に水５８ｍＬと２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（４６ｍＬ）を加え、室温で２４時間攪拌した。反応終了後、得られた析出物を吸引濾過により回収し、Ｎ−ベンズアミドグアニジン（４．７６ｇ，２６．７ｍｍｏｌ；収率３７．６％）を得た。
【００５７】
得られたＮ−ベンズアミドグアニジンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：なし）は以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（共鳴周波数４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６）：１０．２５（ｂｒ、ｓ、１Ｈ）、７．９３−７．９１（ｍ、２Ｈ）、７．２６−７．２５（ｍ、３Ｈ）、６．８２（ｂｒ、ｓ、２Ｈ）、６．６９（ｂｒ、ｓ、２Ｈ）
【００５８】
続いて、得られたＮ−ベンズアミドグアニジン（４．７６ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）を水４０ｍＬに加え、１１０℃で６時間加熱還流した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、３−フェニル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−アミン（３．０ｇ，１８．７ｍｍｏｌ；収率７０．１％）を得た。
【００５９】
得られた３−フェニル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−アミンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：なし）は以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（共鳴周波数４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６）：１２．１１（ｂｒ、ｓ、１Ｈ）、７．８８−７．８６（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７８Ｈｚ）、７．４０−７．３６（ｍ、２Ｈ）、７．３３−７．２９（ｍ、１Ｈ）、６．０５（ｂｒ、ｓ、２Ｈ）
【００６０】
次に、得られた３−フェニル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−アミン（０．９５ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）を酢酸１５ｍＬに溶解し、４−クロロアセト酢酸エチル（１．０７ｇ、６．５２ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で一晩攪拌した。反応終了後、析出物を吸引濾過し、５−塩化メチル−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（１．０ｇ，３．８６ｍｍｏｌ；収率６５．１％）を得た。
【００６１】
得られた５−塩化メチル−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンのＮＭＲ測定結果（内部標準物質：なし）は以下の通りであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（共鳴周波数４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．１２（ｓ、２Ｈ）、８．１２−８．１０（ｍ、２Ｈ）、７．５５−７．５３（ｍ、３Ｈ）、６．２０（ｓ、１Ｈ）、４．６８（ｓ、２Ｈ）
【００６２】
続いて、ジメチルホルムアミド（７ｍＬ）に３−ヨウ化フェノール（０．３４ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（０．２１ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）を加え、３−ヨウ化フェノール溶液を作製した。ジメチルホルムアミド３ｍＬに上記で得られた５−塩化メチル−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．２０ｇ、０．７６７ｍｍｏｌ）を加え攪拌し溶解した後、３−ヨウ化フェノール溶液に加え、８５℃で１９時間攪拌した。反応後溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、抽出した酢酸エチルに無水硫酸ナトリウムを加えて脱水後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取クロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム：メタノール＝１０：１（体積比））により精製し、目的とする５−（（３−ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．１１ｇ，０．２５ｍｍｏｌ；収率３１．９％）を得た。以下、当該化合物を「非放射性ＴＡＰ１」と記載する。
【００６３】
得られた非放射性ＴＡＰ１のＮＭＲ測定結果（内部標準物質：なし）およびＬＣ−ＭＳ測定結果は以下のとおりであった。
１Ｈ−ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．１２−８．１０（ｍ、２Ｈ）、７．５４−７．４６（ｍ、３Ｈ）、７．４３−７．４２（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１．８３２Ｈｚ）、７．３６−７．３３（ｄｔ、１．３７４、７．３２７Ｈｚ、１Ｈ）、７．１３−７．０６（ｍ、２Ｈ）、５．９６（ｓ、１Ｈ）、５．０５（ｓ、２Ｈ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ４４５（ｐｏｓ）、４４３（ｎｅｇ）。
【００６４】
（実施例２）５−（（１―ヨード−４−メトキシ−５−フェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンの合成
ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）に実施例１に記載の方法で作製した５−塩化メチル−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．４０ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）と５−ヨード−２−メトキシアニリン（０．７６５ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．９６５ｇ、７．６５ｍｍｏｌ）を加え攪拌し溶解した後、１５０℃で４時間加熱還流した。反応後溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出し、抽出した酢酸エチルに無水硫酸ナトリウムを加えて脱水後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を中圧分取クロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム：メタノール＝２０：１）により精製し、目的とする５−（（１―ヨード−４−メトキシ−５−フェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．１０ｇ，０．２２ｍｍｏｌ；収率１４．４％）を得た。
【００６５】
以下、当該化合物を「非放射性Ｐ５」と記載する。
得られた非放射性Ｐ５のＮＭＲ測定結果（内部標準物質：なし）およびＬＣ−ＭＳ測定結果は以下のとおりであった。
１Ｈ−ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．１３−８．１０（ｍ、２Ｈ）、７．５４−７．４６（ｍ、３Ｈ）、７．４３−７．４２（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１．８３２Ｈｚ）、７．３６−７．３３（ｄｔ、１．３７４、７．３２７Ｈｚ、１Ｈ）、７．１３−７．０６（ｍ、２Ｈ）、５．９６（ｓ、１Ｈ）、５．０５（ｓ、２Ｈ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４７４（ｐｏｓ）、４７２（ｎｅｇ）。
【００６６】
（実施例３）競合阻害実験
実施例１で得られた非放射性ＴＡＰ１と実施例２で得られた非放射性Ｐ５について、ＦＡＢＰ３、４及び５の各サブタイプに対する結合親和性（非放射性Ｐ５については、ＦＡＢＰ３及びＦＡＢＰ４に対する結合親和性のみ）を確認するため、ＦＡＢＰ３、４及び５に特異的に結合する蛍光性化合物である８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（１，８−ＡＮＳ）（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６；２３３：１９７−２０４）を競合リガンドとして用いて競合阻害実験を行った。
【００６７】
非放射性ＴＡＰ１をジメチルスルホキシドに溶解し、濃度の異なる１０種のＴＡＰ１−ジメチルスルホキシド溶液を調製した（濃度１．１５、０．２９、０．０７３、０．０１８、０．００４５、０．００２３、０．００１１、０．０００５６、０．０００１４、０．００００３５ｍｇ／ｍＬ）。ＦＡＢＰ３リン酸緩衝溶液（０．００９５ｍｇ／ｍＬ）、ＦＡＢＰ４リン酸緩衝溶液（０．００９５ｍｇ／ｍＬ）またはＦＡＢＰ５リン酸緩衝溶液（０．００９ｍｇ／ｍＬ）各０．０７５ｍＬにリン酸緩衝溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）０．１２ｍＬをそれぞれ加えた後、０．２％エタノール含有１，８−ＡＮＳリン酸緩衝溶液（０．００７２ｍｇ／ｍＬ）０．０７５ｍＬを加え、３つのＦＡＢＰサブタイプをそれぞれ含有するＦＡＢＰ反応溶液０．２７ｍＬを作成した。
【００６８】
これらのＦＡＢＰ反応溶液に、上記の濃度の異なる１０種の非放射性ＴＡＰ１−ジメチルスルホキシド溶液を各々０．０３ｍＬ加え、室温で１０分静置し反応させた。反応後、それぞれの反応溶液から０．０９ｍＬずつ３分量を分取し、９６穴プレート（住友ベークライト社製）に注入した。各プレート穴の蛍光強度をＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて測定し（励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４７５ｎｍ）、３分量の蛍光強度の平均から各ＦＡＢＰサブタイプに対する非放射性ＴＡＰ１濃度−蛍光曲線を作成し、阻害定数Ｋｉを公知の手法に基づいて算出した。
【００６９】
各ＦＡＢＰサブタイプに対する非放射性ＴＡＰ１濃度−蛍光曲線を図３に示す。
この結果、非放射性ＴＡＰ１のＦＡＢＰ３，４，及び５に対する阻害定数Ｋｉはそれぞれ２．２μｍｏｌ／Ｌ、０．０４μｍｏｌ／Ｌおよび６．４μｍｏｌ／Ｌであることが示された。これにより、非放射性ＴＡＰ１はサブタイプＦＡＢＰ４に対し、高い選択性および高い親和性を有することが示された。
【００７０】
また、実施例２で得られた非放射性Ｐ５を用い、上記の方法でＦＡＢＰ３および4に対する阻害定数Ｋｉを算出したところ、それぞれ２．９μｍｏｌ／Ｌおよび０．１μｍｏｌ／Ｌであった。これにより、非放射性Ｐ５はＦＡＢＰ４に対し、高い選択性および高い親和性を示すことが明らかとなった。
【００７１】
（実施例４）５−（（３−［１２５Ｉ］ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンの合成
５−（（３−［１２５Ｉ］ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンの合成は、図１のＳｔｅｐ１〜６に示す合成方法に従って行った。
【００７２】
ジメチルホルムアミド（７ｍＬ）に３−ブロモフェノール（０．３４ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（０．２１ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）を加え、３−ブロモフェノール溶液を作製した。実施例１に記載の方法で作製した５−塩化メチル−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．２０ｇ、０．７６７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３ｍＬに溶解し、３−ブロモフェノール溶液に加え、８５℃で１９時間攪拌した。反応後、溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルで抽出した。抽出した酢酸エチルに無水硫酸ナトリウムを加えて脱水後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣を中圧分取クロマトグラフィー（溶出溶媒  クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、５−（（３−ブロモフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．１２ｇ，０．３１４ｍｍｏｌ；収率４０．９％）を得た（図１Ｓｔｅｐ１〜４）。
【００７３】
得られた５−（（３−ブロモフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンのＥＳＩ−ＭＳの結果は以下の通りであった。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ３９７（ｐｏｓ）、３９５（ｎｅｇ）
次に、得られた５−（（３−ブロモフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．０５ｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、トリエチルアミン２．５ｍＬを加えた後ビストリブチルスズ（０．１３ｇ、０．２２６ｍｍｏｌ）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．０１３ｇ、０．０１１３ｍｍｏｌ）を加え、１００℃で４時間加熱還流した。反応後溶媒を減圧留去後、残渣にクロロホルムを加え溶解し、中圧分取クロマトグラフィー（溶出溶媒  クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製後、更に薄層クロマトグラフィー（展開溶媒  クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製を行い、２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（０．０１６ｇ，０．０２６ｍｍｏｌ；収率２３．１％；ＴＡＰ１標識前駆体）を得た（図１Ｓｔｅｐ５）。得られた２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンのＥＳＩ−ＭＳの結果は以下の通りであった。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ６０７（ｎｅｇ）
【００７４】
得られた２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（１ｍｇ，０．００１６ｍｍｏｌ）の放射性ハロゲン標識は、図１Ｓｔｅｐ６に示す方法に従って行った。
【００７５】
すなわち、２−フェニル−５−（（３−トリブチルスタニルフェノキシ）メチル）−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オンに１体積％酢酸含有メタノール０．４ｍＬ、Ｎ−クロロスクシンイミド２．４ｍｇおよびメタノール４．８ｍＬを加え、ＴＡＰ１標識前駆体溶液を調製した。ＴＡＰ１標識前駆体溶液０．１６３ｍＬに、メタノールに溶解したＮ−クロロスクシンイミド（０．５ｍｇ／ｍＬ）０．０４４ｍＬ、３７ＭＢｑの［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム水溶液０．０２ｍＬを添加し、室温で３０分攪拌した。反応液に飽和亜硫酸ナトリウム水溶液０．０１ｍＬを添加して反応を終了させ、溶媒を留去後、酢酸エチル０．５ｍＬ、水０．５ｍＬを添加し分液操作を行った。酢酸エチル相を回収後、硫酸ナトリウム２．５ｇを加え脱水後、溶媒を減圧留去した後、メタノール０．１５ｍＬを添加し、メタノール溶液とした。
【００７６】
得られたメタノール溶液をＨＰＬＣ（島津製作所製総液ユニットＬＣ２０−Ａ，カラム５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  移動相０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル：０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液＝６３：３７、流速１．５ｍｌ／分）にかけ、保持時間３６．０８分のピークを目的とする５−（（３−［１２５Ｉ］ヨードフェノキシ）メチル）−２−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７（４Ｈ）−オン（以下、「放射性ＴＡＰ１」と記載）の画分として同定し、分取した。
【００７７】
分取溶液に酢酸エチル０．５ｍＬを加え分液操作を行い、酢酸エチル相を回収後、硫酸ナトリウム２．５ｇを加えて脱水後、溶媒を減圧留去し、メタノール０．２ｍＬを加えメタノール溶液として放射性ＴＡＰ１溶液を作製した。
【００７８】
得られた放射性ＴＡＰ１の純度を確認するために、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標、ナカライテスク株式会社）（５Ｃ１８−ＡＲＩＩ  １０×２５０  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  室温
溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、Ｂ液：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル
移動相  Ａ／Ｂ：３７／６３
流速  １．５  ｍＬ／ｍｉｎ
検出器  ＲＩＤＥＴＥＣＴＯＲ  ＵＳ−３０００Ｔ（ユニバーサル技研）
注入量  ２００μＬ
溶媒メタノール
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １７．８ｍｉｎ，純度  ９９％
【００７９】
結果、放射性ＴＡＰ１の標識収率は放射化学的収率２４％であり、放射化学的純度は９９％以上であった（図４）。
【００８０】
（実施例５）放射性ＴＡＰ１を用いた固相化ＦＡＢＰ４飽和実験
実施例４で作製した放射性ＴＡＰ１のＦＡＢＰ４に対する解離定数を測定するため、固相化ＦＡＢＰ４を用いて、ＦＡＢＰ４に対する放射性ＴＡＰ１のインビトロ飽和実験を行った。
【００８１】
エッペンドルフチューブにＰｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ＝８）０．５ｍＬ、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ社製、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓ）２０μＬおよび、ＦＡＢＰ４溶液（溶媒  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール含有５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２：０．７５ｍｇ／ｍＬ）２μＬを添加し、室温で１時間静置した後、上清を除去し、１％ＢＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡ含有Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を添加してさらに室温で３０分間静置し、ＦＡＢＰ４反応槽を作製した。ＦＡＢＰ４反応槽の上清を除去後、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４，３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．００５％  Ｔｗｅｅｎ，ｐＨ８）で段階希釈した放射性ＴＡＰ１と非放射性ＴＡＰ１との混合溶液０．０５ｍＬ（混合溶液中の放射性ＴＡＰ１の放射能量と非放射性ＴＡＰ１濃度の組合せは、それぞれ（０．０１２ＭＢｑ，１．７８μｇ／ｍＬ）、（０．００６ＭＢｑ，０．８９μｇ／ｍＬ）、（０．００３ＭＢｑ，０．４４μｇ／ｍＬ）、（０．００１５ＭＢｑ，０．２２μｇ／ｍＬ）、（０．０００７５ＭＢｑ，０．１１μｇ／ｍＬ）、（０．０００３７５ＭＢｑ，０．０５６μｇ／ｍＬ）となるよう調製した）をＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．４ｍＬと共に各ＦＡＢＰ４反応槽に添加し、室温で２時間静置し、反応させた。対照群として設定した非特異的結合群は、上記の放射性ＴＡＰ１と非放射性ＴＡＰ１との混合溶液を添加したＦＡＢＰ４反応槽に、非放射性ＴＡＰ１溶液（９０μｇ／ｍＬ、１０％ＤＭＳＯ／Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、反応槽内濃度１．１３μｍｏｌ／Ｌ）０．０５ｍＬを添加することで作製した。
【００８２】
反応終了後、各ＦＡＢＰ４反応槽から上清を除去し、５％エタノール緩衝液（５％エタノール含有Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した後、各反応槽の放射能カウントをＡＬＯＫＡ社製オートウェルガンマカウンタ（Ａｕｔｏ  Ｗｅｌｌ  Ｇａｍｍａ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＲＣ−３８０ＣＬ、ＡＲＣ−２０００）を用いて測定し、放射性ＴＡＰ１濃度−放射能カウント曲線を作成した（図５（Ａ）黒丸：全放射性結合カウント（［１２５Ｉ］−ＴＡＰ１）、黒四角：非特異的結合（［１２５Ｉ］−ＴＡＰ１＋ＴＡＰ１））。
【００８３】
続いて、放射性ＴＡＰ１濃度−放射能カウント曲線から、放射性ＴＡＰ１のＦＡＢＰ４への結合量［Ｂ］と非結合量［Ｆ］を求め、スキャッチャードプロットを作成して解離定数（Ｋｄ）を求めた（図５（Ｂ））。その結果、放射性ＴＡＰ１のＦＡＢＰ４に対する解離定数（Ｋｄ）は５４．２ｎｍｏｌ／Ｌであり、ＦＡＢＰ４に対して高い親和性を有することが示された。
【００８４】
（実施例６）放射性ＴＡＰ１を用いた固相化ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４および５結合実験
実施例５と同様に、放射性ＴＡＰ１の他のＦＡＢＰサブタイプに対する解離定数を測定するため、固相化ＦＡＢＰ３、固相化ＦＡＢＰ４および固相化ＦＡＢＰ５を用いて、放射性ＴＡＰ１のインビトロ飽和実験を行った。
【００８５】
ＦＡＢＰ３溶液（溶媒  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール含有５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２：０．５０ｍｇ／ｍＬ）３μＬ、ＦＡＢＰ４溶液（溶媒  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール含有５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２：０．７５ｍｇ／ｍＬ）２μＬまたはＦＡＢＰ５溶液（溶媒１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール含有５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．２：０．７０ｍｇ／ｍＬ）２μＬを用い、実施例５と同じ方法でＦＡＢＰ３反応槽、ＦＡＢＰ４反応槽およびＦＡＢＰ５反応槽をそれぞれ作成した。各ＦＡＢＰサブタイプ反応槽に放射性ＴＡＰ１（０．０１ＭＢｑ）溶液を添加した特異的結合群と、放射性ＴＡＰ１（０．０１ＭＢｑ）溶液と非放射性ＴＡＰ１溶液（９０μｇ／ｍＬ、１０％ＤＭＳＯ／Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、濃度１．１３μｍｏｌ／Ｌ）０．０５ｍＬとを添加した非特異的結合群（対照群）をそれぞれ作製し、実施例５と同様の操作後、各反応槽の放射能カウントをガンマカウンタで測定し求め、反応槽に添加した全放射能カウントに対する各反応槽の放射能カウントを１００分率として算出し、放射性ＴＡＰ１結合量の指標とした。
【００８６】
その結果、ＦＡＢＰ４に対する放射性ＴＡＰ１の結合量はＦＡＢＰ３およびＦＡＢＰ５に対する結合量に比べ有意に高く、放射性ＴＡＰ１がＦＡＢＰ４に対し高い選択性を有することが示された（図６）。
【００８７】
（実施例７）オクタノール抽出法を用いた分配係数の測定
細胞内への透過性を判断する指標である、オクタノール抽出法をもちいた分配係数ＬｏｇＰを測定した。
【００８８】
ダルベッコリン酸緩衝溶液（以下ＰＢＳ（−））３．０ｍＬ、オクタノール３．０ｍＬに放射性ＴＡＰ１メタノール溶液（０．０２４ＭＢｑ）２０μＬを加え、３０秒間攪拌した。混合液を遠心分離機（久保田商事株式会社  ユニバーサル冷却遠心機  ＭＯＤＥＬ  ５９２２）にて遠心分離（１０００ｇ×５分）した後、オクタノール相、水相それぞれから０．５ｍＬずつ計１．５ｍＬ分取した。更に残りのオクタノール相１ｍＬに、オクタノール２ｍＬ、ＰＢＳ（−）３ｍＬを加え、３０秒間攪拌した。混合液を遠心分離機（久保田商事株式会社  ユニバーサル冷却遠心機  ＭＯＤＥＬ  ５９２２）にて遠心分離（１０００ｇ×５分）した後、再びオクタノール相と水相それぞれから、０．５ｍＬずつ計１．５ｍＬ分取した。
【００８９】
分取した全オクタノール相および全水相の放射能カウントをガンマカウンタで計測した。得られた放射能カウントにつき、以下の数式（１）を用いて放射性ＴＡＰ１のＬｏｇＰを測定した。
【００９０】
【数１】
2013256491.tif 000009
【００９１】
結果、放射性ＴＡＰ１のＬｏｇＰ値は２．７であった。一般に細胞膜を透過する化合物はＬｏｇＰの値は１−３の間を取ることが知られており（Ｅｕｒ  Ｊｏｕｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  １９９８；６：３１３−３１９）、本実験により放射性ＴＡＰ１は細胞膜を透過することが示唆された。
【００９２】
（実施例８）放射性ＴＡＰ１の細胞内ＦＡＢＰ４結合試験
合成した放射性ＴＡＰ１の細胞内ＦＡＢＰ４に対する結合性を確認するため、ヒト単球性白血病細胞（以下、「ＴＨＰ−１細胞」と記載）の培養細胞を用いて、放射性ＴＡＰ１の細胞内ＦＡＢＰ４結合試験を行った。
【００９３】
ＴＨＰ−１細胞は前処理としてＰｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）含有ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地中で２４時間培養したものを使用した。エッペンドルフ（登録商標）チューブを反応槽とし、５％スキムミルク液（２ｇスキムミルク／４０ｍＬ  ＰＢＳ（−）、ｐＨ＝７．４）を添加し、４℃にて３０分間静置して、反応槽表面のブロッキング操作を行った。静置後、５％スキムミルク液を除去し、ＴＨＰ−１細胞溶液（１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ  ＲＰＭＩ）０．４ｍｌと放射性ＴＡＰ１（０．０１ＭＢｑ）エタノール溶液０．０５ｍＬを添加し、４℃にて３時間静置させた。静置後上清を除去し、遠心分離機（久保田商事株式会社  ユニバーサル冷却遠心機  ＭＯＤＥＬ  ５９２２）にて遠心分離（３５００ｒｐｍ，５分）し、さらに上清を除去後、０．５％エタノール緩衝液（０．５％エタノール含有ＰＢＳ（−）、ｐＨ＝７．４）０．５ｍＬで細胞の洗浄操作を行った。上記の遠心分離から洗浄操作までを２回繰り返し、反応槽に残存した放射能カウントをガンマカウンタにて測定し、ＴＨＰ−１細胞内ＦＡＢＰ４に結合した放射性ＴＡＰ１の放射能量を求めた。
【００９４】
また、陽性対照となる放射性ＴＡＰ１取り込み阻害群として、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ（−）溶液に非放射性ＴＡＰ１をそれぞれ濃度０．０４４，０．０８９，０．２２ｍｇ／ｍＬとなるよう調整した非放射性ＴＡＰ１溶液０．０５ｍＬ、もしくはＦＡＢＰ４選択的阻害剤として知られるＢＭＳ３０９４０３（Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ２００７；１７：３５１１−３５１５）を濃度０．２４μｇ／ｍＬとなるよう調整した１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ（−）溶液０．０５ｍＬを、放射性ＴＡＰ１添加時と同時にそれぞれ添加し、上記と同様の操作を行って、ＴＨＰ−１細胞内ＦＡＢＰ４に結合した放射性ＴＡＰ１の放射能量を測定した。また陰性対照としてＴＨＰ−１細胞を加えない反応槽を用い、上記と同様の方法で反応槽の放射能量を測定した。
【００９５】
反応槽上のタンパク質の量は、放射性ＴＡＰ１の放射能量を求めた後の各反応槽に１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ  ０．２ｍＬを加え、一晩静置後、タンパク定量（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、測定Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ社製））を行い求めた。
【００９６】
各反応槽における放射性ＴＡＰ１の放射能量とタンパク質の量から以下の数式（２）により％Ｄｏｓｅ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎを算出した。
【００９７】
【数２】
2013256491.tif 000010
【００９８】
結果を図７に示す。放射性ＴＡＰ１のＴＨＰ−１細胞への取り込みは、陰性対照群に比べて明らかに高かった（図７（Ａ））。また阻害剤ＢＭＳ３０９４０３により放射性ＴＡＰ１の取り込みは阻害され、さらに非放射性ＴＡＰ１の存在によって放射性ＴＡＰ１の取り込みが阻害されることが確認された（図７（Ｂ）、（Ｃ））。これらの結果から、放射性ＴＡＰ１が細胞内ＦＡＢＰ４に特異的に結合している事が示唆された。
【００９９】
（実施例９）正常マウスにおける血漿中の安定性
放射性ＴＡＰ１の正常マウス血漿中のインビトロ安定性の評価を行った。
正常マウス（ｄｄｙ雄マウス、７週齢）から分取した血漿０．１ｍＬに対し、放射性ＴＡＰ１（０．０７０ＭＢｑ）０．０１ｍＬを添加し、３７℃にて６０分間または１２０分間保温した。保温後、メタノール０．２ｍＬを添加し血漿中の代謝酵素を失活させた後、メンブランフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＬＨ  ０．４５μｍ）にて血漿中のタンパク質をろ別し、ろ液を下記のＨＰＬＣ条件にて分析し、放射性ＴＡＰ１の血漿中の安定性を測定した。コントロールは、放射性ＴＡＰ１（０．０７０  ＭＢｑ）０．０１ｍＬを生理食塩水０．１ｍＬ、メタノール０．２ｍＬに添加して作製した。
【０１００】
ＨＰＬＣ分析条件：
カラム  ＣＯＳＭＯＳＩＬ（登録商標、ナカライテスク株式会社）（５Ｃ１８−ＡＲＩＩ  １０×２５０  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）
カラム温度  室温
溶離液  Ａ液：０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、Ｂ液：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル
移動相  Ａ／Ｂ：３７／６３
流速  １．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長  ２２０、２５４  ｎｍ
注入量  ２００μＬ
溶媒メタノール
分析結果：
ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  １７．８  ｍｉｎ，純度  ９９  ％
【０１０１】
結果を図８に示す。マウス血漿中から得られた放射性ＴＡＰ１の画分は、コントロールと一致するリテンションタイムにピークが得られ、その他の溶出時間点で検出されるピークの存在が無いことから、ＴＡＰ１は血漿中では少なくとも２時間は安定であることが示された。
【０１０２】
（実施例１０）正常マウスにおける体内分布
正常マウスにおける放射性ＴＡＰ１の体内放射能分布を臓器摘出法により求めた。正常マウス（ｄｄｙ  雄マウス、５週齢）に放射性ＴＡＰ１のエタノール溶液（１０％エタノール、５％ＤＭＳＯ含有）０．１ｍＬ（放射能量０．０３５ＭＢｑ相当）を尾静脈から投与した。投与後５、１５、３０、６０、１２０分の各時間点（各頭数３−４匹）にて麻酔下において屠殺し、直後各臓器を摘出し、臓器重量および臓器放射能量の測定を行った。放射能測定はガンマカウンタを用いた。投与放射能量に対する各臓器の放射能分布率を算出し、放射性ＴＡＰ１の体内放射能分布を求めた。
【０１０３】
結果を図９に示す。各時間点において放射性ＴＡＰ１の胃、甲状腺への放射能集積は低いことから、生体内脱ヨウ素反応に対する安定性が示唆された。また、動脈硬化巣のイメージングの際にバックグラウンドとなる正常大動脈への放射能集積も低いことが示された。
【０１０４】
（実施例１１）正常ウサギおよび動脈硬化モデルウサギにおける大動脈への集積
動脈硬化部位への放射性ＴＡＰ１の集積を確認するため、正常ウサギおよび動脈硬化症モデル動物であるＷＨＨＬＭＩウサギにおける体内分布の実験を行い、大動脈血管への放射能集積の比較を行った。
【０１０５】
正常ウサギは日本白色種（ＪＷ）の雄（３月齢、２．１ｋｇ）、動脈硬化症モデルはＷＨＨＬＭＩ種の雄（１４月齢、３．０ｋｇ）を用いた（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １９９２；９６：４３−５２）。それぞれのウサギ耳静脈から放射性ＴＡＰ１のエタノール溶液（１０％エタノール、５％ＤＭＳＯ含有）１．０ｍＬ（放射能量１３．９−１４．５ＭＢｑ）投与し、１時間後麻酔下にて屠殺し、胸腹部大動脈を摘出した。摘出した胸腹部大動脈の重量および放射能量の測定を行った。放射能測定はガンマカウンタを用いて実施した。投与放射能量に対する胸腹部大動脈の放射能分布率を算出し、放射性ＴＡＰ１の胸腹部大動脈への放射能分布を求めた。
【０１０６】
表１に正常および動脈硬化症モデルのウサギ上行大動脈における放射能集積を示す。放射性ＴＡＰ１のＷＨＨＬＭＩウサギ上行大動脈への放射能集積による大動脈／血液比は、正常ウサギ大動脈のそれと比べ２倍程度増加しており、大動脈／筋肉比は３倍以上の増加が認められた。
この結果から、放射性ＴＡＰ１は、動脈硬化を起こした血管に集積性を示す可能性が高いことが示された。
【０１０７】
【表１】
2013256491.tif 000011
【０１０８】
（実施例１２）放射性ＴＡＰ１の生体内ＦＡＢＰ４結合試験
マウス腫瘍モデルを用いて、放射性ＴＡＰ１の生体内におけるＦＡＢＰ４に対する結合性を評価した。
【０１０９】
（１）マウス腫瘍モデルを用いた放射性ＴＡＰ１の生体内ＦＡＢＰ４結合性の確認
正常マウス（ｄｄｙ  雄マウス、５週齢）にＣ６ラットグリオーマ細胞（２．０×１０６個、ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手）をマウス右下肢部位の皮下に注入して移植し、細胞移植から２週後にマウス腫瘍モデル（以下、「Ｃ６腫瘍細胞移植マウス」と記載する）として実験に供した。
【０１１０】
放射性ＴＡＰ１のエタノール溶液（１０％エタノール、５％ＤＭＳＯ含有）０．１ｍＬ（放射能量０．０４４ＭＢｑ相当）を尾静脈投与した。投与後５、３０、６０、１２０、１８０分の各時間点（各頭数３−４匹）にて麻酔下において屠殺し、直後各臓器および腫瘍部位を摘出し、各臓器と腫瘍重量および各臓器と腫瘍の放射能量の測定を行った。放射能測定はガンマカウンタ（１４８０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｗｉｚａｒｄ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて実施した。投与放射能量に対する各臓器の放射能分布率を計算し求め、放射性ＴＡＰ１の体内放射能分布を求めた。
【０１１１】
結果を図１０および表２に示す。図１０および表２から、移植した腫瘍部位に放射性ＴＡＰ１が投与後早期に取り込まれ、滞留することが確認された。また表２に示すように、筋肉または血液に対する腫瘍への放射性ＴＡＰ１の集積比は経時的に上昇する傾向が確認された。
【０１１２】
【表２】
2013256491.tif 000012
【０１１３】
（２）放射性ＴＡＰ１の生体内分布とＦＡＢＰ４発現領域の一致性の確認
マウス腫瘍モデルを用いて、ＦＡＢＰ４の免疫染色と、放射性ＴＡＰ１のオートラジオグラフィ（ＡＲＧ）を行い、放射性ＴＡＰ１の腫瘍内分布とＦＡＢＰ４の発現分布を評価した。
【０１１４】
上記と同様の手法により得られたＣ６腫瘍細胞移植マウスに対して放射性ＴＡＰ１のエタノール溶液（１０％エタノール、５％ＤＭＳＯ含有）０．１ｍＬ（放射能量０．５３ＭＢｑ相当）を尾静脈より投与した。
【０１１５】
放射性ＴＡＰ１の投与１５０分後にて、麻酔下においてマウスを屠殺し移植した腫瘍を摘出し、液体窒素（もしくはドライアイス・アセトン）にて急速冷凍した。その冷凍腫瘍組織を１０μｍ厚にてスライスし、凍結切片を作製した。連続切片を、ＡＲＧおよび免疫染色に供した。
【０１１６】
ＡＲＧは富士フイルム株式会社製イメージングプレート（ＢＡＳ-ＭＳ）に対して凍結切片中の放射性ＴＡＰ１を７２時間感光させた後、富士フイルム株式会社製画像解析装置（ＢＡＳ２５００）にて画像化および解析を行った。
【０１１７】
免疫染色は、一次抗体として抗ヒトＦＡＢＰ４に対するポリクローナル抗体ＡＦ３１５０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、二次抗体としてシンプルステインＭＡＸ  ＰＲＯ（Ｇ）（ニチレイ社製）を用いて行った。
【０１１８】
結果を図１１に示す。図１１（Ａ）が摘出腫瘍の凍結切片のＡＲＧであり、図９（Ｂ）が隣接凍結切片のＦＡＢＰ４免疫染色である。図１１（Ａ）中、四角で示した部位ｅおよびｆが放射能集積の高い部位であり、同一部位が図１１（Ｂ）でも好染部位である。（１）で示すように放射性ＴＡＰ１が腫瘍に集積すること、およびＡＲＧにより確認された放射性ＴＡＰ１の腫瘍内局在と、免疫染色により確認されたＦＡＢＰ４の腫瘍内局在が一致していることが示されることから、放射性ＴＡＰ１がＦＡＢＰ４の生体内分布を反映することが可能な化合物であることが確認された。
【０１１９】
（３）ＦＡＢＰ４の発現の確認
培養下にあるＣ６ラットグリオーマ細胞、およびＣ６腫瘍細胞移植マウスより摘出された腫瘍組織におけるＦＡＢＰ４の発現をウェスタンブロッティングにより評価した。
【０１２０】
培養下にある細胞のウェスタンブロッティング用サンプルは以下のように調整した。ディッシュ上で培養したＣ６ラットグリオーマ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手）、及びポジティブコントロールのヒト膀胱癌由来培養細胞ＲＴ４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）をスクレイパーで回収後、ＰＢＳ（−）１０ｍＬを加え、遠心分離（１０００ｇ、５分）し、上清除去後、５×Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）：Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（製品名：Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｘｔｒａｃｔｓ、Ｓｉｇｍａ社製）：ＰＢＳ（−）を２０：１：７９の比（質量比）で混合して得られた溶液（以下「溶液Ａ」と記載する）を１ｍＬ加えた。超音波破砕後、遠心分離（１３２００ｒｐｍ、３０分）し、上清を回収した。タンパク質定量後、溶液Ａをさらに加えて、Ｃ６ラットグリオーマ細胞およびＲＴ４細胞をそれぞれタンパク質量にして２．５ｍｇ／ｍＬ、および１．２５ｍｇ／ｍＬに調整し、さらに５×ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（還元）（０．２５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ６．８）２５ｍＬ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２ｇ、スクロース５ｇ、精製水２５ｍＬ）を加えて、それぞれタンパク質量にして２ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬに希釈してウェスタンブロッティング用サンプルとした。
【０１２１】
摘出された腫瘍組織のウェスタンブロッティング用サンプルは以下のように調整した。上記と同様の手法により得られたＣ６腫瘍細胞移植マウスに対して放射性ＴＡＰ１のエタノール溶液（１０％エタノール、５％ＤＭＳＯ含有）０．１ｍＬ（放射能量０．５３ＭＢｑ相当）を尾静脈投与した。投与１５０分後にて麻酔下において屠殺し移植した腫瘍を摘出し、溶液Ａ０．５ｍＬを加え、超音波破砕後、遠心分離し（１３２００ｒｐｍ、３０分）、上清を回収した。タンパク質定量後、さらに溶液Ａを加えて、タンパク質量にして１．２５ｍｇ／ｍＬに調整した。この溶液に５×ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（還元）を加えて、タンパク質量にして１ｍｇ／ｍＬに希釈してウェスタンブロッティング用サンプルとした。腫瘍組織のサンプルは２サンプル用意した。ポジティブコントロールとして脂肪組織、ネガティブコントロールとして筋肉組織を同様に調整した。
【０１２２】
ウェスタンブロッティングは上記で作製した各サンプルを１００℃にて５分加熱後、ＰＡＧＥＬゲル（Ｅ−Ｔ５２０Ｌ、アトー社）を用いて電気泳動した（９０分、４００Ｖ、４０ｍＡ）。泳動後、ゲルよりタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｎｂｒａｎｅｓ）に転写した（４５分、２０Ｖ、５００ｍＡ）。
【０１２３】
転写後、ＰＶＤＦ膜を０．０５体積％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）入りＰＢＳ（−）（以下「ＴＰＢＳ」と記載する）で３０分洗浄後、Ｂｌｏｃｋ  Ｏｎｅ（ナカライテスク社）を加えて３０分間室温でインキュベートする事でブロッキングを行った。このＰＶＤＦ膜に一次抗体として抗マウスＦＡＢＰ４ウサギモノクローナル抗体（Ｄ２５Ｂ３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を５体積％ＢＳＡ含有ＴＰＢＳで１０００倍希釈した溶液を１ｍＬ加え、一晩冷蔵でインキュベートした。一方、βアクチン用一次抗体として、抗βアクチンマウスモノクローナル抗体（Ａ５４４１、ＳＩＧＭＡ社）を同じく１０００倍希釈して用いた。ＴＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（＃７０７４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）およびＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１（ＳＴＡＲ８１Ｐ、Ｓｅｒｏｔｅｃ社）をそれぞれ用いた。二次抗体と４５分、室温でインキュベート後、ＴＰＢＳで洗浄した。発色試薬としてＣｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉ  Ｏｎｅ  Ｓｕｐｅｒ（ナカライ社）を用い、ゲル撮像装置（ＣｈｅｍＤｏｃ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で撮像した。
【０１２４】
結果を図１２および図１３に示す。培養下にあるＣ６ラットグリオーマ細胞においてはＦＡＢＰ４の発現は確認されなかった（図１２）。一方、放射性ＴＡＰ１投与後にＣ６腫瘍細胞移植マウスにから摘出した腫瘍組織においては、ポジティブコントロールの脂肪組織（図１３、レーン４）と同様、ＦＡＢＰ４の発現が確認され（図１３、レーン１および２）、ネガティブコントロールの筋組織ではその発現が見られなかった（図１３、レーン３）。マクロファージはＦＡＢＰ４を発現することから（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；２００８；７（６）：４８９−５０３）、摘出された腫瘍にて確認されたＦＡＢＰ４の発現は腫瘍内に浸潤したマクロファージに由来するものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明によれば、閉塞性動脈硬化症（ＡＳＯ）、心筋梗塞、脳卒中等の疾患で特徴的なプラーク病変のうち、生命予後を不良とする因子と考えられている不安定プラークへの選択的集積性に優れる化合物を提供することができる。当該化合物は不安定プラークを検出および診断するための薬剤の主成分として利用することができ、当該薬剤の製造分野において大いに貢献することが期待される。
【図１】
2013256491.tif 000017
【図２】
2013256491.tif 000018
【図３】
2013256491.tif 000019
【図４】
2013256491.tif 000020
【図５】
2013256491.tif 000021
【図６】
2013256491.tif 000022
【図７】
2013256491.tif 000023
【図８】
2013256491.tif 000024
【図９】
2013256491.tif 000025
【図１０】
2013256491.tif 000026
【図１１】
2013256491.tif 000027
【図１２】
2013256491.tif 000028
【図１３】
2013256491.tif 000029