(57)【要約】【課題】  抗ハプテンモノクローナル抗体とα型抗イディオタイプ抗体とβ型抗イディオタイプ抗体とを含むハプテン測定試薬において、従来とは異なる系を提供すること。【解決手段】  抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種と、α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種と、が異なるハプテン測定試薬により前記課題を解決する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ハプテンモノクローナル抗体とα型抗イディオタイプ抗体とβ型抗イディオタイプ抗体とを含む、ハプテン測定試薬であって、
抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種と、α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種とが異なる、前記測定試薬。
【請求項２】
α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体が、
α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種に対して抗ハプテンモノクローナル抗体を免疫して得られる抗血清と、抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いた動物種由来の抗体または血清と、を共存させた状態でスクリーニングして得られた抗体である、
請求項１に記載の測定試薬。
【請求項３】
抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種がウサギであり、α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種がマウスである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ハプテンがステロイドホルモンである、請求項１から３のいずれかに記載の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ハプテンモノクローナル抗体、α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を含むハプテン測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子化合物であるハプテンは、通常、競合法とよばれる免疫測定方法によって測定される。競合法は、試料中に含まれるハプテンと、放射性同位元素や酵素などで標識した標識ハプテンを、一定量の抗ハプテン抗体に対して競合的に反応させる方法である。試料中に含まれるハプテン量が多くなると、標識ハプテンの抗ハプテン抗体への結合量が低下することから、標識ハプテンの抗ハプテン抗体への結合割合より試料中に含まれるハプテン量を推定することができる。競合法における測定感度は、用いる抗ハプテン抗体の親和定数に依存する。そのため、ごく微量のハプテンを測定することは極めて困難であった（非特許文献１）。
【０００３】
前述した競合法による免疫測定の課題を解決し得る測定方法として、抗イディオタイプ抗体を用いた非競合型の免疫測定法が提案されている。抗イディオタイプ抗体を用いたハプテン測定系は以下に示す方法で行なわれ、試料中に含まれるハプテンを競合法によらず測定することができる。
（１）プレート等に固定化した抗ハプテンモノクローナル抗体にハプテンを含む試料を添加し、当該ハプテンを抗ハプテン抗体に捕捉させる。
（２）β型抗イディオタイプ抗体（β−Ｉｄ）を添加し、抗ハプテン抗体中の未反応のパラトープを飽和させる。
（３）酵素などで標識したα型抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄ）を添加する。α−Ｉｄはβ−Ｉｄの立体障害により、ハプテンを捕捉した抗ハプテン抗体の可変領域と選択的に結合する。そのため、試料中に含まれるハプテン量の増加に伴ったシグナル増幅が観測される。
【０００４】
抗イディオタイプ抗体を用いた非競合型の免疫測定法の具体例としては、マウス由来の３種の抗体（抗ハプテンモノクローナル抗体、α−Ｉｄ、β−Ｉｄ）を用いた、胆汁酸代謝物であるウルソデオキシコール酸７−Ｎ−アセチルグルコサミドの測定があげられる（非特許文献２および３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ぶんせき、５５１−５５２；２００４
【非特許文献２】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２４５、９５；２０００
【非特許文献３】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２７２、１；２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献２および３で開示の抗イディオタイプ抗体を用いた非競合型の免疫測定法では、３種類の抗体（抗ハプテンモノクローナル抗体、α−Ｉｄ、β−Ｉｄ）いずれもマウス由来の抗体を使用している。マウス由来のα−Ｉｄおよびβ−Ｉｄを取得する際、マウスに対してマウス由来の抗ハプテンモノクローナル抗体を免疫する必要がある。しかしながら、同一動物種由来のタンパク質を免疫することになるため異物として認識されず、抗体価が上昇しづらい問題があった。そのため、前記抗ハプテンモノクローナル抗体をキャリアタンパク質と結合させることで抗原性を与えた上でマウスに対し免疫する必要があった。
【０００７】
本発明の目的は、抗ハプテンモノクローナル抗体、α−Ｉｄおよびβ−Ｉｄを含む、ハプテン測定試薬において、従来とは異なる系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を鑑みてなされた本発明の第一の態様は、
抗ハプテンモノクローナル抗体とα型抗イディオタイプ抗体とβ型抗イディオタイプ抗体とを含む、ハプテン測定試薬であって、
抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種と、α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種とが異なる、前記測定試薬である。
【０００９】
また本発明の第二の態様は、
α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体が、
α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種に対して抗ハプテンモノクローナル抗体を免疫して得られる抗血清と、抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いた動物種由来の抗体または血清と、を共存させた状態でスクリーニングして得られた抗体である、
前記第一の態様に記載の測定試薬である。
【００１０】
また本発明の第三の態様は、抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種がウサギであり、α型抗イディオタイプ抗体およびβ型抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種がマウスである、前記第一または第二の態様に記載の抗体である。
【００１１】
また本発明の第四の態様は、ハプテンがステロイドホルモンである、前記第一から第三のいずれかに記載の測定試薬である。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
（１）測定対象ハプテン
本発明の試薬で測定可能なハプテンは、通常競合法により測定する、分子量の低い物質であれば特に限定はなく、一例として、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チロキシン（Ｔ４）、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン（Ｔ２）等の甲状腺ホルモンや、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、コルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）等のステロイドホルモンがあげられる。特にエストラジオール（Ｅ２）に代表されるステロイドホルモンが、本発明の試薬で測定するハプテンとして好ましい。
【００１４】
（２）抗イディオタイプ抗体
本発明の試薬で使用する抗イディオタイプ抗体は、特定抗体の可変領域と結合する特殊な抗体のことをいい、α型とβ型の二種に分類される。α型抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄ）は、前記特定抗体が認識する抗原と同時に結合可能な抗体である。一方β型抗イディオタイプ抗体（β−Ｉｄ）は、前記特定抗体のパラトープに結合する抗体であり、前記特定抗体が認識する抗原と競合する抗体である。
【００１５】
（３）動物種
本発明の試薬で使用する抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄおよびβ−Ｉｄ）を取得するのに用いる動物種は、本発明の試薬で使用する抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種と異なる動物種であればよい。抗ハプテンモノクローナル抗体または抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種としては、当業者が通常用いる、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギなどが例示でき、ハプテン測定試薬として要求する感度や特異性、抗体の取得容易性などを考慮し、適宜選択すればよい。好ましい一例として、抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種として、親和性の高い抗体の取得が可能なウサギを、抗イディオタイプ抗体を取得するのに用いる動物種として、抗体の取得が比較的容易なマウスを、それぞれ選択した系があげられる。
【００１６】
（４）抗イディオタイプ抗体の取得方法
本発明の試薬で使用する抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄおよびβ−Ｉｄ）は、抗ハプテンモノクローナル抗体を、当該抗体を取得するのに用いた動物種とは異なる動物種に対して免疫することで取得することができる。抗ハプテンモノクローナル抗体を免疫する動物種は、当該抗体を取得するのに用いた動物種とは異なるため、当該抗体を異物として認識する。そのため当該抗体に対する抗体価は容易に上昇する。免疫する抗体の構造はパラトープを含む構造であれば特に限定はなく、Ｉｎｔａｃｔ抗体を免疫してもよいし、Ｆａｂ化した抗体、Ｆ（ａｂ）’２化した抗体またはＳｃＦｖ化した抗体を免疫してもよい。なお抗体を免疫する際、フロイントアジュバンドなどのアジュバンドを併用してもよい。
【００１７】
（５）抗イディオタイプ抗体産生ハイブリドーマの作製
抗イディオタイプ抗体を産生するハイブリドーマは、前記（４）で免疫した動物種から脾臓細胞を採取し、それを骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と融合させることで得ることができる。細胞融合方法に特に限定はなく、通常一般的に行われている方法で融合すればよい。例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、電気融合法、センダイウイルスを用いる方法があげられる。
【００１８】
（６）抗イディオタイプ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
前記（５）で得られたハイブリドーマには、目的とする抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄまたはβ−Ｉｄ）を産生するハイブリドーマ以外に、抗ハプテンモノクローナル抗体のパラトープ近傍以外を認識する抗体（目的外の抗体）を産生するハイブリドーマも数多く存在する。当該目的外の抗体を発現するハイブリドーマは、スクリーニング時バッググラウンドを上昇させる要因となる。そこでスクリーニング時に、抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いた動物種由来の抗体または血清を共存させると、当該バッググラウンドを低減させることができる。これにより、抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄまたはβ−Ｉｄ）を産生するハイブリドーマのスクリーニングが容易に行なえるため、好ましい。抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いた動物種由来の抗体または血清の共存量としては、抗体を用いる場合は５μｇ／ｍＬ以上が好ましく、血清を用いる場合は反応液量に対し５％以上が好ましい。
【００１９】
（７）抗体性能の評価
得られた抗イディオタイプ抗体の評価には、当業者が通常用いる、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法やＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法などで行なえばよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、抗ハプテンモノクローナル抗体とα型抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄ）とβ型抗イディオタイプ抗体（β−Ｉｄ）とを含むハプテン測定試薬において、抗ハプテンモノクローナル抗体を取得するのに用いる動物種とα−Ｉｄおよびβ−Ｉｄを取得するのに用いる動物種とが異なることを特徴としている。従来の抗イディオタイプ抗体を用いた競合法によらないハプテン測定試薬は、前記３つの抗体を取得するのに用いる動物種が同一であったため、α−Ｉｄおよびβ−Ｉｄの取得が困難であったが、本発明の試薬は動物種が異なるため、α−Ｉｄおよびβ−Ｉｄの取得が容易である。そのため、競合法によらないハプテン測定試薬を従来より容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】５匹のマウス（マウスＮｏ．１からＮｏ．５）から得た抗血清をＥＬＩＳＡで評価した結果。横軸はエストラジオール（Ｅ２）濃度を、縦軸は蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を、それぞれ示す。
【図２】抗体産生細胞培養上清中に含まれる抗体をＥＬＩＳＡで評価した結果。Ｅ２−（抗Ｅ２モノクローナル抗体との反応性）に対するＥ２＋（抗Ｅ２モノクローナル抗体−Ｅ２複合体に対する反応性）が高かった８つ（Ｎｏ．１からＮｏ．８）と、Ｅ２＋に対するＥ２−が高かった８つ（Ｎｏ．９からＮｏ．１６）の結果を示している。縦軸には蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。
【図３】Ｉｄ−５またはＩｄ−１４の抗Ｅ２モノクローナル抗体−Ｅ２の複合体に対する反応性をＥＬＩＳＡで評価した結果。横軸はＥ２濃度を、縦軸は蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を、それぞれ示す。
【図４】Ｉｄ−５またはＩｄ−１４のウサギＩｇＧとの反応性をＥＬＩＳＡで評価した結果。横軸には固定化したウサギＩｇＧの濃度を、縦軸には蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。
【図５】抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体に対する、Ｉｄ−５またはＩｄ−１４とＥ２との競合性能をＥＬＩＳＡで評価した結果。横軸は培養上清希釈倍率を、縦軸には蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を、それぞれ示す。
【図６】Ｉｄ−５およびＩｄ−１４の認識部位をＥＬＩＳＡで評価した結果。横軸はＩｄ−１４濃度を、縦軸は蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を、それぞれ示す。
【図７】Ｉｄ−５、Ｉｄ−１４および抗Ｅ２モノクローナル抗体を用いて、Ｅ２測定を行なった結果。横軸はＥ２濃度を、縦軸は蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を、それぞれ示す。
【実施例】
【００２２】
以下、ハプテンとしてエストラジオール（Ｅ２）を用いたときの実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  動物への免疫
免疫動物としては、マウス（ＩＣＲ）の５週齢メス５匹（マウスＮｏ．１からＮｏ．５）を使用した。抗原溶液とアジュバントとを等量混合したエマルジョンを作製し、それをマウスに対し１週間間隔で４回免疫した。なお抗原溶液は、１ｍｇ／ｍＬの抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体と１ｍｇ／ｍＬのＥ２を含むＰＢＳ溶液を用いた。またアジュバントは、初回の免疫ではフロイント完全アジュバントを、二回目以降の免疫ではフロイント不完全アジュバントを、それぞれ用いた。
【００２４】
実施例２  抗体価の確認
以下に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）で抗体価の上昇を確認した。
（１）αＭｏｕｓｅ−ＩｇＧＦｃ（１μｇ／ｍＬ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）実施例１で免疫したマウスから採血した抗血清を、５％のウサギ血清を含んだ０．１％スキムミルク溶液で１０００倍に希釈後、プレートに添加して、プレート上に固定した抗体と反応させた。
（３）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識した抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体と、Ｅ２希釈系列（５００ｎｇ／ｍＬから２倍ずつ希釈）とを、あらかじめ５％のウサギ血清を含むＰＢＳ溶液中で混合後、プレートに添加して、プレート上に固定した抗体と反応させた。
（４）未反応のＡＬＰ標識抗Ｅ２抗体をＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離後、ＡＬＰの基質である４−メチルウンベリフェルリン酸（４−ＭＵＰ）をプレートに分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００２５】
結果を図１に示す。横軸にＥ２濃度、縦軸に蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をプロットし、抗血清の抗体価を比較した。マウスＮｏ．２およびＮｏ．５から得た抗血清において、Ｅ２濃度の上昇に伴い、蛍光強度が明らかに減少した。このことから、マウスＮｏ．２およびＮｏ．５の抗血清には、抗Ｅ２抗体のパラトープ付近を認識する抗体（抗イディオタイプ抗体）が含まれることが示唆された。
【００２６】
実施例３  抗体産生ハイブリドーマの作製
実施例２で選択したマウスから、以下に示す方法で抗体産生細胞を作製した。
（１）十分に抗体価の上昇したマウスＮｏ．５の脾臓を摘出し、定法に従い脾臓細胞を調製した。調製した脾臓細胞を定法（ＰＥＧ法）に従いマウスミエローマ細胞（Ｓｐ２／０）と融合させ、ハイブリドーマを作製した。
（２）融合後のハイブリドーマ浮遊液を１０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）と１×ＨＡＴを含むＥ−ＲＤＦ培地（極東製薬製）に懸濁後、マイクロタイタープレートにまいて１０日間培養し、培養上清を取得した。
【００２７】
実施例４  抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
実施例３で得られた抗体産生ハイブリドーマを、以下に示す２つのＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
（１）抗Ｅ２モノクローナル抗体との反応性（Ｅ２−）
（１−１）αＭｏｕｓｅ−ＩｇＧＦｃ（１μｇ／ｍＬ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（１−２）５％のウサギ血清を含むＰＢＳ溶液中で実施例３（２）の培養上清をプレート上で反応させた。
（１−３）反応後、ＡＬＰ標識抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体をプレート上で反応させ、Ｂ／Ｆ分離を行なった後、基質である４−ＭＵＰを分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
（２）抗Ｅ２モノクローナル抗体−Ｅ２複合体に対する反応性（Ｅ２＋）
（２−１）αＭｏｕｓｅ−ＩｇＧＦｃ（１μｇ／ｍＬ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２−２）５％のウサギ血清を含むＰＢＳ溶液中で実施例３（２）の培養上清をプレート上で反応させた。
（２−３）あらかじめＥ２（５００ｎｇ／ｍＬ）と混合したＡＬＰ標識抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を反応させ、Ｂ／Ｆ分離を行なった後、基質である４−ＭＵＰを分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００２８】
（１）および（２）の測定データを並べてグラフにした（図２）。図２は評価を行なった培養上清中、Ｅ２−（抗Ｅ２モノクローナル抗体に対する反応性）に対するＥ２＋（抗Ｅ２モノクローナル抗体−Ｅ２複合体に対する反応性）が高かった８つ（Ｎｏ．１からＮｏ．８）と、Ｅ２＋に対するＥ２−が高かった８つ（Ｎｏ．９からＮｏ．１６）の結果を示している。Ｅ２−に対するＥ２＋が高かった培養上清（Ｎｏ．１からＮｏ．８）の中からＮｏ．５を、Ｅ２＋に対するＥ２−が高かった培養上清（Ｎｏ．９からＮｏ．１６）の中からＮｏ．１４を、それぞれ選択し、それぞれを限界希釈により単クローン化することで、Ｎｏ．５由来のモノクローナル抗体Ｉｄ−５と、Ｎｏ．１４由来のモノクローナル抗体Ｉｄ−１４を単離した。
【００２９】
実施例５  モノクローナル抗体の評価
実施例４で単離したモノクローナル抗体（Ｉｄ−５、Ｉｄ−１４）の特性を以下の方法で評価した。
【００３０】
（１）抗Ｅ２モノクローナル抗体−Ｅ２複合体との反応性
実施例２に示したＥＬＩＳＡと同様の反応系を用いて、単離したモノクローナル抗体の評価を行なった。なおＥ２希釈系列は２５０ｎｇ／ｍＬから開始している。結果を図３に示す。横軸にはＥ２濃度を示し、縦軸には蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示す。Ｉｄ−５ではＥ２濃度の上昇に伴い蛍光強度が僅かに上昇した一方、Ｉｄ−１４ではＥ２濃度の上昇に伴い蛍光強度が大幅に減少した。この結果より、Ｉｄ−１４と抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体の反応は、Ｅ２により阻害されることがわかる。
【００３１】
（２）ウサギＩｇＧとの反応性
以下に示すＥＬＩＳＡで、ウサギＩｇＧとの反応性を評価した。
（２−１）Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ社製）の２倍希釈系列を作製後、当該希釈系列をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２−２）Ｉｄ−５またはＩｄ−１４を産生するハイブリドーマの培養上清を０．１％スキムミルクで１００倍希釈したものをプレートに添加し反応させた。なおポジティブコントロールとして、抗ウサギ抗体を発現する細胞の培養上清を０．１％スキムミルクで１００倍希釈したものをプレートに添加し反応させた。
（２−３）ＡＬＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体とプレート上で反応させた後、未反応のＡＬＰ標識抗体をＢ／Ｆ分離し、基質である４−ＭＵＰを分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００３２】
結果を図４に示す。横軸に固相化したＲａｂｂｉｔ  ＩｇＧの濃度、縦軸に蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をプロットした。ポジティブコントロールではＲａｂｂｉｔ  ＩｇＧとの反応性が確認されたが、Ｉｄ−５とＩｄ−１４ではＲａｂｂｉｔ  ＩｇＧに対する反応性を示さなかった。このことから、Ｉｄ−５とＩｄ−１４は抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体に対して特異的に反応する抗体であると考えられる。
【００３３】
（３）ＡＬＰ標識Ｅ２との競合能評価
以下に示すＥＬＩＳＡにより、Ｉｄ−５またはＩｄ−１４を発現する細胞の培養上清とＡＬＰ標識Ｅ２との競合性能を評価した。
（３−１）αＲａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１μｇ／ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（３−２）ＡＬＰ標識Ｅ２の濃度が一定の条件で、Ｉｄ−５またはＩｄ−１４を産生するハイブリドーマの培養上清希釈系列を作製し、抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体と同時にプレート上で反応させた。
（３−３）未反応のＡＬＰ標識Ｅ２をＢ／Ｆ分離後、基質である４−ＭＵＰを分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００３４】
結果を図５に示す。横軸に培養上清の希釈倍率、縦軸に蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をプロットした。Ｉｄ−１４が高濃度に存在すると、ＡＬＰ標識Ｅ２と抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体との結合が阻害されることが示唆された。
【００３５】
（４）Ｉｄ−５とＩｄ−１４の認識部位
以下に示すＥＬＩＳＡにより、Ｉｄ−５とＩｄ−１４の認識部位を評価した。
（４−１）αＲａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（１μｇ／ｍＬ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（４−２）抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を添加しプレート上で反応後、Ｉｄ−１４希釈系列を添加しプレート上で反応させた。
（４−３）ＡＬＰ標識Ｉｄ−５を添加しプレート上で反応後、Ｂ／Ｆ分離を行ない、基質である４−ＭＵＰを分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００３６】
結果を図６に示す。横軸にＩｄ−１４濃度、縦軸に蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をプロットした。Ｉｄ−１４の濃度が高くなるに伴い、Ｉｄ−５の抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体への結合が阻害されていることが分かる。この結果からＩｄ−５とＩｄ−１４は抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体の近接部位を認識していることが示唆された。
【００３７】
以上（１）から（４）の結果から、モノクローナル抗体Ｉｄ−５は抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体の可変領域に対して特異的に結合するα型イディオタイプ抗体（α−Ｉｄ）であることが示唆され、モノクローナル抗体Ｉｄ−１４は抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体のパラトープに結合してＥ２と競合するβ型抗イディオタイプ抗体（β−Ｉｄ）であることが示唆された。
【００３８】
実施例６  α型・β型抗イディオタイプ抗体を用いたＥ２測定系
α−ＩｄであるＩｄ−５、β−ＩｄであるＩｄ−１４、および抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体を用いて以下に示す方法でＥ２測定系を構築した。
（１）抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）Ｅ２の希釈系列をプレート上の抗体と反応させた後、Ｉｄ−１４をプレート上で反応させた。
（３）ＡＬＰ標識Ｉｄ−５をプレート上の抗体と反応させ、Ｂ／Ｆ分離後、基質である４−ＭＵＰを分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００３９】
結果を図７に示す。横軸にＥ２濃度、縦軸には蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をプロットした。Ｅ２濃度の増加に伴い、蛍光強度が増加していることがわかる。このことから、Ｉｄ−１４が未反応の抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体のパラトープ付近を認識し結合することで、Ｉｄ−５の抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体への結合を阻害したことが示唆された。
【００４０】
以上の結果から、ウサギから取得した抗Ｅ２モノクローナル抗体と、ウサギとは動物種の異なるマウスから取得した抗イディオタイプ抗体（α−Ｉｄおよびβ−Ｉｄ）とを用いることで、競合法によらないＥ２測定試薬を構築できることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2013137240.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013137240.tif 000009