(57)【要約】【課題】効率的かつ高精度に試料中から３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離することができる方法、及び該試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分析することができる方法を提供する。【解決手段】試料を、超臨界流体クロマトグラフィーにかけることにより試料から３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離することを含む、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分析方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、試料から３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離する方法。
【請求項２】
超臨界流体が二酸化炭素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
逆相系カラムを用いる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
逆相系カラムの炭素量が９〜２８重量％である請求項１乃至３いずれか記載の方法。
【請求項５】
超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分析方法。
【請求項６】
超臨界流体が二酸化炭素である請求項５記載の方法。
【請求項７】
逆相系カラムを用いる請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
逆相系カラムの炭素量が９〜２８重量％である請求項５乃至７いずれか記載の方法。
【請求項９】
質量分析器を用いる請求項５乃至８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
揮発性イオン化補助剤を用いる請求項９記載の方法。
【請求項１１】
揮発性イオン化補助財がギ酸アンモニウムである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜４何れか１項に記載の方法により３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離除去する、油脂の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を含む試料中から３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離する方法及び該試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類は精製食用油脂中のプロセスコンタミナントとして報告されたが、近年の研究によりこれらの生成物が食用油脂精製プロセス中の高温脱臭ステップで主に形成されることが明らかにされた。非特許文献１には、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類が人体で脱エステル化され、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオールになった場合の毒物を評価した結果、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオールの最大耐容１日摂取量は、体重あたり２μｇであった旨記載されている。そして、これを上回る３−モノクロロプロパン−１，２−ジオールを長年にわたって摂取した場合、腎臓に悪影響を与える可能性がある旨記載されている。精製食用油脂は、様々な食品に使用されていることから、食用油脂中に含まれるこれら化合物を正確に測定することのできる分析法の開発が必要とされている。
【０００３】
これまでに、数種の食用油脂中３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステルの分析法が報告されている（非特許文献２，３，４，５，６）。これら報告の中で、German Society of Fat Science'sが開発した手法が，現在一般的に使用されている。本手法は，加水分解により遊離の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオールを得、フェニルボロン酸による誘導体化しＧＣ−ＭＳにより３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール量を定量する方法である。よって本分析法では、油脂中の遊離の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオールとエステル体を区別することができない。さらに３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分子種をそれぞれ分析することが出来ないため、食用油脂中で３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステルがどのような形で存在しているのか把握できない場合がある。
【０００４】
一方、逆相液体クロマトグラフィーを、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分析法に適用した例もある（非特許文献７）。この場合、食用油脂を有機溶媒に希釈し分析器に供する。操作が簡便な反面、大量の夾雑物も分析に供するため、マトリクス効果による検出感度の低下が大きい。さらに、移動相にジクロロメタンを使用しており、液体クロマトグラフィー部でのターゲットと夾雑物の分離が不十分である場合がある。
【０００５】
超臨界流体クロマトグラフィーを用いた分離、分析技術には、大豆中の脂質のプロファイリングや、植物油からトリグリセリドを分離する方法が提案されている（特許文献１）。しかしながら、これまで食用油脂中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分離、分析に超臨界流体クロマトグラフィーが適用できていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０６−２９３８９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】European Commission Health and Consumer Protection Directorate-General (accessed April 2011), http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out91_en.pdf
【非特許文献２】Racamonde I, Gonzalez P, Lorenzo RA, Carro AM., J Chromatogr A. 2011, 1218, 6878-83.
【非特許文献３】Gonzalez P, Racamonde I, Carro AM, Lorenzo RA., J Sep Sci. 2011, 19, 2697-704.
【非特許文献４】Kusters M, Bimber U, Reeser S, Gallitzendorfer R, Gerhartz M. J Agric Food Chem., 2011, 59, 6263-70.
【非特許文献５】Deutsche Gesellschaft fur Fettwissenschaft e.V. (accessed November 2011), http://www.dgfett.de/methods/c_vi_17_(10)_englisch.pdf
【非特許文献６】R. Weishaar, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2008,110, 183.
【非特許文献７】T.D. Haines, K.J. Adlaf, R.M. Pierceall, I. Lee, P. Venkitasubramanian, M.W. Collison, J. Am. Oil Chem. Soc., 2011, 88, 1.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、簡便な方法により、効率的かつ高精度に試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離することができる方法、及び該試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の量及び種類等を分析することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の吸着媒体を用いた超臨界流体クロマトグラフィーと質量分析計により、試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を高精度に分離、分析することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、試料から３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離する方法
（２）超臨界流体が二酸化炭素である（１）記載の方法
（３）逆相系カラムを用いる（１）又は（２）記載の方法
（４）逆相系カラムの炭素量が９〜２８重量％である（１）乃至（３）いずれか記載の方法
（５）超臨界流体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする、試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分析方法
（６）超臨界流体が二酸化炭素である（５）記載の方法
（７）逆相系カラムを用いる（５）又は（６）記載の方法
（８）逆相系カラムの炭素量が９〜２８重量％である（５）乃至（７）いずれか記載の方法
（９）質量分析器を用いる（５）乃至（８）いずれか記載の方法
（１０）揮発性イオン化補助剤を用いる（９）記載の方法
（１１）揮発性イオン化補助剤がギ酸アンモニウムである（１０）記載の方法。
（１２）（１）〜（４）何れかに記載の方法により３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離除去する、油脂の製造方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を簡便に効率良く、高精度に分離する方法、及び該試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分析する方法が提供できる。本発明の方法によれば、食用油脂製品から３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を効率良く分離、除去することができる。また、食用油脂製品中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の量及び種類等を迅速かつ正確に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例で分析対象とした３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の構造式を示す図である。
【図２】本発明の実施例で用いた超臨界流体クロマトグラフィーによる分離・及び分析する装置を示す図である。
【図３】実施例で行った、試料の主要成分の分析結果を示すトータルイオンクロマトグラムである。
【図４】実施例で行った、各３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分析結果を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明の方法により分離、分析される「３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類」とは、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオールに各脂肪酸が１つないし２つ結合したものの総称を意味する。
【００１５】
本発明の方法が適用できる試料としては、菜種油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、パーム精製油等の各種食用油脂およびそれらを使用した食品を挙げることができる。本発明の方法によると、これらの試料中に含まれる３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離し、又はこれらの試料中に含まれる３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の量及び種類等を分析することができる。なお、本明細書において、「分析」とは定量及び分子種等の特定を意味するものである。
【００１６】
本発明の方法において、超臨界流体クロマトグラフィーとは、超臨界状態にある流体を移動相として用いるクロマトグラフィーであり、超臨界状態にある流体は臨界温度と圧力を超えた領域の物質で、気体様の拡散性と液体様の溶解性を併せ持つ。
超臨界流体は低粘性、高拡散性というクロマトグラフィーの移動相として好適な性質を有しており、高流速分析においても高い分離能を示す。
【００１７】
本発明の方法において、移動相としては、二酸化炭素、メタン、エタン、プロパン、エチレン、アンモニア等を用いることができ、これらに限定されるものではない。これらの媒体は、超臨界状態で用いられるが、温度及び／又は圧力が臨界温度及び／又は臨界圧力よりも僅かに下回る亜臨界状態の流体も用いることができる。従って、本発明の方法において、「超臨界流体クロマトグラフィー」とは、超臨界流体と同様に用いることができる亜臨界状態にある流体を用いたクロマトグラフィーも含まれる。
【００１８】
本発明の方法において、超臨界流体として二酸化炭素を用いることが好ましく、二酸化炭素は臨界温度３１．１℃，臨界圧力７．３８ＭＰａで容易に超臨界状態にすることができ、無毒性、無反応性、取り扱いの簡便さ、コストの安さのためクロマトグラフィーの移動相や抽出媒体として好適である。さらに、超臨界流体二酸化炭素は、極性がヘキサンに近い為、低極性化合物の分析に適しており、液体クロマトグラフィーでは困難であった低極性化合物の高速分離が可能となる。加えて、ガスクロマトグラフィーでは出来なかった３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分子種を特定するといった分析をも行うことができる。
【００１９】
クロマトグラフィーは、移動相が超臨界状態又は亜臨界状態になる温度及び圧力において行われる。移動相として用いられる各物質の臨界温度及び臨界圧力は公知であるので、超臨界状態を達成するために必要な温度及び圧力は、それぞれの移動相について容易に設定可能である。例えば、二酸化炭素を移動相として用いる場合、クロマトグラフィー実施時の温度は１０℃〜８０℃程度が好ましく、さらに好ましくは３５℃〜４５℃程度であり、また、圧力は、８ＭＰａ〜３５ＭＰａ程度が好ましく、さらに好ましくは１０ＭＰａ〜２５ＭＰａ程度である。温度、圧力が適正範囲内でなければ、移動相を安定して超臨界状態に維持出来ず、クロマトグラフィーを実施することが出来ない。なお、最適な温度及び圧力は、分離する３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステルの種類等に応じて、下記実施例に記載するような方法により、ルーチンな実験により容易に適切な条件を設定することができる。また、移動相として用いられる高圧ガスに、本発明の効果を損なわない程度の量だけ、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール等の脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等の脂肪族ケトン；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、ジメチルフォルムアミド等の芳香族溶媒；及び／又はフルオロアルキルエーテル、フルオロエーテル等の界面活性剤等の添加剤を加えることができる。このような添加剤は、好ましくはメタノールを使用し、その量は、通常、超臨界又は亜臨界流体の量に対して５〜３０重量％である。
【００２０】
本発明の方法では、超臨界クロマトグラフィーの吸着媒体として、多孔性の表面修飾粒子を用いる。ここで、表面修飾粒子としては、アミノ基、アルキル基及び／又は水酸基を表面に有する粒子が好ましく、特にアルキル基の表面修飾基を有するシリカ粒子が好ましい。なお、アルキル基の炭素数としては、特に限定されないが、通常、３〜３０、好ましくは８〜１８である。粒子の粒径は、特に限定されないが通常、３μｍ〜３０μｍ、好ましくは３μｍ〜５μｍであり、また、多孔性の程度は、特に限定されないが、単位重量当たりの表面積で表して通常、３５０ｍ２／ｇ〜５５０ｍ２／ｇ、好ましくは４００ｍ２／ｇ〜４８０ｍ２／ｇである。
【００２１】
本発明の方法において、超臨界クロマトグラフィーの吸着媒体として、逆相系カラムを用いることが好ましい。逆相系カラムの炭素量が９〜２８重量％、さらに好ましくは、逆相系カラムの炭素量が１０〜２０重量％である逆相系カラムを用いることにより、試料と３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類をより良好に分離することができる。
【００２２】
さらに本発明の方法において、使用する吸着媒体（充填剤）の量や、超臨界流体の流速は、クロマトグラフィーにかける試料の量に応じて適宜設定することができる。なお、例えば、食用油脂に含まれる３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を除去して３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を含まない食用油脂を製造する等、工業的に本発明の方法を実施する場合には、吸着媒体の量を多くした分離カラムを用いて容易にスケールアップすることが可能であることは言うまでもない。
【００２３】
超臨界流体クロマトグラフィー自体は、例えば特開平９−５９１７０号公報に記載されているような、公知のシステムを用いて行うことができ、さらに、超臨界流体クロマトグラフィーを行うことができるいかなる装置も用いることができる。要するに、超臨界流体が流れている分離カラムに試料を注入すると、試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類とそれ以外の成分の、吸着媒体に対する吸着能の相違に基づき、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類が分離されて流出してくる。下記実施例において具体的に示されるように、好ましい実施例においては、両者の滞留時間は全く重複していないので、両者を高精度に分離することができる。
【００２４】
本発明の方法は、上記の方法により分離された３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分析する方法をも提供する。これは、クロマトグラフィーからの流出分画について、市販の質量分析計等を用いて定量及び検出することにより行うことができる。
【００２５】
本発明の方法により、試料中の３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分析することができるが、検出器としては紫外／可視吸光度検出器やフォトダイオードアレイ検出器、蒸発光散乱検出器、円二色性検出器、質量分析計等を用いることができる。これらの中でも、検出器として質量分析器を用いることが好ましく、特に三連四重極型等のタンデム質量分析計を用いることが好ましい。
【００２６】
本発明の方法において、質量分析器での検出感度を向上させるため、イオン化補助剤として質量分析計が汚染されない揮発性のイオン化補助剤を使用することが好ましい。揮発性のイオン化補助剤には、ギ酸、酢酸、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、トリフルオロ酢酸などがあるが、特にギ酸アンモニウムを使用することが好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
【００２８】
（超臨界流体クロマトグラフィー装置）
超臨界流体クロマトグラフィーは，SFC Method Station(Waters, Milford, Massachusetts, USA)を使用した。
【００２９】
（カラム）
以下のカラムを使用した
（１）順相系カラム
LC column,4.2mm i.d.×250mm,5μm,Inartsil CN-3(GL science co.ltd., MA, USA)
（２）逆相系カラム
LC column,4.2mm i.d.×250mm,5μm,Inartsil ODS-SP(GL science co.ltd., MA, USA)（炭素量８．５重量％）
（３）逆相系カラム
LC column,4.2mm i.d.×250mm,5μm,Inartsil ODS-4(GL science co.ltd., MA, USA)（炭素量１１重量％）
（４）逆相系カラム
LC column,4.2mm i.d.×250mm,5μm,Inartsil ODS-P(GL science co.ltd., MA, USA)（炭素量２９重量％）
カラムオーブンの温度は、３５℃に設定した。インジェクション量は５μｌであった。
【００３０】
（移動相）
移動相には二酸化炭素を用いた。流速は３ｍｌに設定した。バックプレッシャーは１０ＭＰａとなるように設定した。
モディファイヤーは０．１％ギ酸アンモニウムを含むメタノール及びイソプロパノールを使用した。化合物の分離はモディファイヤーのグラジエントを増加させることで行った。
グラジエントは以下の通り
分析メソッド（モディファイヤー：０．１％ギ酸アンモニウムを含むメタノール）：５％（０−２ｍｉｎ），５−３０％（２−７ｍｉｎ），３０％（７−８．２ｍｉｎ），
洗浄メソッド（モディファイヤー：イソプロパノール）：３０％（８．２−１４ｍｉｎ），
平衡化メソッド（モディファイヤー：０．１％ギ酸アンモニウムを含むメタノール）：５％（１４−１６ｍｉｎ）
【００３１】
（質量分析器）
質量分析器はXevo TQ(Waters, Milford, Massachusetts, USA)を使用した。イオン化法には，エレクトロスプレー・イオン化法（ＥＳＩ）を選択し，ポジティブイオンモードで分析を行った。ＥＳＩイオンソースの分析条件を以下に示す
:desolvation gas(N2) temperature,800°C
;desolvation gas flow,7L/min
;capillary voltage,3.0kV
;Corn voltage,30V
;Desolvation temp.,600℃
;Desolvation gas flow,800L/hr.
;Corn gas flow,60L/hr.
全てのデータはMass Lynx(Waters, Milford, Massachusetts, USA)を用いて解析を行った。
【００３２】
（試料の調製）
食用油脂と３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類の分離、分析に用いた油脂は、菜種油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、液体パーム精製油、固体パーム精製油の６点である。
液体油脂は以下のように調製した。
１００ｍｇを秤量し、アセトンを１ｍｌ添加した。この時、内部標準物質を最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。続いてアセトンを用いて１０倍希釈した後、メタノールにて１０倍希釈したものを、分析サンプルとした。
固体油脂は以下のように調製した。
１００ｍｇを秤量し、クロロホルムを１ｍｌ添加した。この時、内部標準物質を最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した。続いてアセトンを用いて１００倍希釈したものを、測定サンプルとした。
【００３３】
（１）のカラムを使用すると、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸ジエステル類の保持が弱く、それぞれの化合物の溶出時間に差がないため、ピークトップ分離を行うことが出来ず、分析は困難であった。
【００３４】
（２）のカラムを使用すると、ターゲット化合物の溶出時間は短くなるが，３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸モノエステル類を良好に分離することができず、分析は困難であった。
【００３５】
（３）のカラムを使用して得られた、３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類と食用油脂の主要成分の分離結果を図２に示す。３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類および食用油脂の主要成分のリテンションタイムは、それぞれ２−８分および１０分以降であり、完全に食用油脂の主要成分と３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類を分離することができた。
【００３６】
（４）のカラムを使用すると、ターゲット化合物の中で最も長い炭素鎖の飽和脂肪酸を２つ側鎖に持つ化合物の溶出ピークがブロードしたため、分析は困難であった。
【００３７】
また、各３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル類は８分以内に分離でき、検出限界は約１０ｐｐｔであった。以上の結果、ＬＣ−ＭＳを使用した既存の分析法では約２０分要していた分離時間を、８分まで短縮することが出来た。今回の検討で準備した各３−モノクロロプロパン−１，２−ジオール脂肪酸エステル標準品の分析結果を表１に示す。
【００３８】
表１
2013250186.tif 000003
【符号の説明】
【００３９】
１  ＣＯ２
２  有機溶媒
３  送液ポンプ
４  オートサンプラー
５  カラムオーブン
６  分離カラム
７  背圧制御装置
８  質量分析計
【図１】
2013250186.tif 000004
【図２】
2013250186.tif 000005
【図３】
2013250186.tif 000006
【図４】
2013250186.tif 000007