(57)【要約】      （修正有）【課題】前立腺がんの検出試薬や、前立腺がんを判定する方法や、前立腺がんへの標的指向性を有するリポソーム輸送体を提供すること。【解決手段】ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前記がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を見いだし、かかる作用を利用して、前立腺がんの検出試薬や、前立腺がんを判定する方法を完成するに至った。また、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前記がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用して、リポソーム表面がＢＰＡ又はＭＰＡに修飾され、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）又はオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）を含む前立腺がんの検出試薬。
【請求項２】
ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前記がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする前立腺がん判定方法。
（ａ）請求項１記載の検出試薬と検体とを接触させ、検体中の前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖の有無を検出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖が検出された場合、前立腺がんと判定する工程；
【請求項３】
検体が、尿又は血清であることを特徴とする請求項２記載の前立腺がん判定方法。
【請求項４】
ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、リポソーム表面がＢＰＡ又はＭＰＡにより修飾され、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とするリポソーム輸送体。
【請求項５】
血液中で用いることを特徴とする請求項４記載のリポソーム輸送体。
【請求項６】
ヒト及びマウスの赤血球を凝集させないことを特徴とする請求項４又は５記載のリポソーム輸送体。
【請求項７】
薬物が内封されていることを特徴とする請求項４〜６記載のリポソーム輸送体。
【請求項８】
薬物が抗がん剤であることを特徴とする請求項７記載のリポソーム輸送体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＰＡ（ムラサキモクワンジュレクチン）及びＭＰＡ（オサジオレンジレクチン）が前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、ＢＰＡ又はＭＰＡを含む前立腺がんの検出試薬や、かかる検出試薬を利用した前立腺がんの判定方法や、ＢＰＡ及びＭＰＡが前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、リポソーム表面がＢＰＡ又はＭＰＡに修飾され、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とするリポソーム輸送体に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺がんは欧米人に発生率の高いがんであり、米国では２０１０年の新規男性がん患者のうち約２８％が前立腺がんと診断され、男性の罹患率はがんの中で第１位となっている（非特許文献１）。日本では２００５年のがん統計の結果、男性の前立腺がん罹患者数は、肺がん、胃がんに次ぐ第３位となっている（非特許文献２）。欧米と比較すると日本における前立腺がん患者数は少ないが、リスクの一つと考えられている食生活の欧米化に伴い日本でも罹患率が上昇傾向にある。そして前立腺がんは将来的には罹患者数だけでなく、男性がん死亡者数でも他のがんを抑えて上位となることが予想されており、その検査方法、治療方法の開発など対策が求められる疾患である。
【０００３】
前立腺がんの診断は、主にＰＳＡ（Prostate Specific Antigen；前立腺特異抗原）検
査、直腸診、生検、画像検査などの検査により行われ、中でも、前立腺がんの発見の糸口になるのが、ＰＳＡ検査である。ＰＳＡは前立腺から分泌されるセリンプロテアーゼ（セリン蛋白分解酵素）であり、健常男性で血液中にＰＳＡが浸出することは稀であるが前立腺の疾患では血中へＰＳＡが浸出することが知られており、血中ＰＳＡを測定することにより前立腺の疾患を検査することがある。しかしながら、加齢などによっても血中ＰＳＡ値が上がることもある点、具体的にどのような前立腺の病気であるか判定するには別の検査が必要である点などに、課題がある。直腸診は、触診により前立腺の疾患を発見する検査であるが、触診が直腸側に限られ、前立腺がんの初期には正確に診断できないなどの問題がある。他に、経腹的超音波断層検査や経直腸的超音波断層検査などの画像検査を行うこともできるが、検査結果の画像の評価に熟練を要するなどの問題がある。これらの検査により前立腺がんの疑いがある場合に、前立腺がんの診断を確定するためには、生体の病変組織を採取して癌細胞の有無を調べる生検が必要である。しかし、生検は侵襲性の検査である上、１回目の生検でがん細胞が発見されない場合も、ある程度の期間を空けて２回目の生検を行う必要があり、患者にとって負担が大きい検査といえる。このように、前立腺がんの診断には複数の手法を用い、最終的には身体的負担の大きな生検による検査が必要となるため、身体的負担が少なく、容易で確実性の高い検査方法が求められている。
【０００４】
前立腺がんは一般に早期発見が困難ながんである。進行がんは尿中や血中にがん細胞が検出されることが知られており、非特許文献３には様々な癌患者の尿中のがん細胞を観察し、前立腺がん細胞を識別する試みがなされている。しかしながら、尿中の細胞の形態から前立腺がん細胞とそれ以外のがん細胞を見分けて診断することは困難であることから、簡便で判断が容易な前立腺がんの検出及び判定方法が求められている。
【０００５】
糖鎖とは、各種の糖がグリコシド結合によって樹状に連なった化合物であり、糖鎖は糖同士だけでなく、タンパク質や脂質に結合する。タンパク質の糖鎖修飾は、タンパク質の安定性や細胞内選別輸送、細胞接着、細胞分化、サイトカインへの応答性など、多彩な生理機能への関与が知られている。細胞膜に存在するタンパク質や脂質も糖鎖修飾されているものが多く、各種ホルモンや生理活性物質との相互作用により細胞間の情報伝達や、細胞分化、細胞接着などにも糖鎖が関与している。がん化した細胞では、細胞表面タンパク質の糖鎖構造が正常細胞と異なることが知られており、がん細胞特異的な糖鎖を腫瘍マーカーとしてがん診断に使用する試みもなされている。特許文献１には、ヒトハプトグロビンのアミノ酸配列のＮ末端より１８４番目のアスパラギン又は／及び２１１番目のアスパラギンに結合している、フコシル化糖鎖を検出することを特徴とする膵臓癌判定方法が開示されている。
【０００６】
近年、薬物の持続的な放出（徐放）や、薬物を目的とする細胞や標的組織、その近傍にのみ送達することを目的としたドラッグデリバリーシステム（Drug Delivery System：ＤＤＳ）が盛んに研究されている。特にがん治療においては、元来患者本人の細胞であった癌細胞を抑制する抗がん剤は、正常な細胞に対しても強い毒性を有し重篤な副作用を引き起こすことが問題となっている。従来の薬剤投与では、標的の患部に到達する薬剤が全投与量の数％に満たないことも報告されており、ＤＤＳによって抗がん剤を癌細胞近傍に送達し、効果的にがん細胞を抑制するとともに副作用を軽減する技術に高い期待が寄せられている。
【０００７】
レクチンは糖鎖に親和性を示すタンパク質の総称である。レクチンが認識する糖鎖構造はそれぞれのレクチンで異なり、糖鎖認識特異性も様々であるが、糖鎖認識特異性の高いレクチンは特定の糖鎖の精製や、疾患に関連した糖鎖の検出のためのプローブ分子などとして幅広い研究分野で用いられている（特許文献２）。また細胞膜に存在するタンパク質や脂質は糖鎖修飾されているものが多く、レクチンはそれらの様々な糖鎖構造を認識・結合し、細胞の成長や分裂の引き金となることも報告されている（非特許文献４）。さらにがん細胞などの異常細胞ではその正常細胞と比較して構造の違う糖鎖を発現していることが次第に明らかにされつつあり、疾患の判定や、癌細胞の識別への応用が期待されている。特許文献３には、イヌエンジュレクチン（ＭＡＡ）及びニワトコレクチン（ＳＮＡ）を用いてＰＳＡを測定することによる前立腺癌と前立腺肥大との識別診断法が開示され、特許文献４には、血液試料中のヘモグロビン結合タンパク質ハプトグロビン糖鎖Ｎｅｕα２−６量を測定することによる前立腺がんの判定及び悪性度の判別方法が開示されている。また、非特許文献５には、レクチンの細胞表面の糖鎖を認識する機能を利用して、レクチン標識したベクターを細胞へ送達する方法が開示されている。特許文献５には、ベシクルの表面にハイマンノース型糖鎖を認識するキリンサイ属由来のレクチンが固定化されている標的指向性を有するベシクルが、ヒト大腸がん細胞やヒト乳腺がん細胞の増殖を抑制することが記載されているが、前立腺がん細胞への指向性については全く明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１６８４７０号公報
【特許文献２】特開２００４−２３１５５５号公報
【特許文献３】特開２００２−５５１０８号公報
【特許文献４】特開２０１１−４７８４６号公報
【特許文献５】特開２００１−１８１２１３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】A. Jemal, et al., CA Cancer J Clin, 60, 277-300 (2010)
【非特許文献２】T. Matsuda, et al., Jpn J Clin Oncol, 41, 139-147 (2010)
【非特許文献３】夏目園子, et al., J. Jpn. Soc. Clin. Cytol. 33(3), 458-462 (1994)
【非特許文献４】N. Sharon, J. Biol. Chem., 282, 2753-2764 (2007)
【非特許文献５】R.K. Batra et al., Gene Ther., 1, 255-260 (1994)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、前立腺がんの検出試薬や前立腺がん判定方法や、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とするリポソーム輸送体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が、前立腺がん組織及び細胞に対し特異的な親和性を示すことを見いだし、ＢＰＡ及びＭＰＡが前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、ＢＰＡ及びＭＰＡを含む前立腺がんの検出試薬を開発するに至った。さらに、同様にＢＰＡ及びＭＰＡが前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用して、ＢＰＡによって修飾され、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とするリポソーム輸送体を開発した。
【００１２】
すなわち、本発明は［１］ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）又はオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）を含む前立腺がんの検出試薬や、［２］ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前記がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、（ａ）前記［１］記載の検出試薬と検体とを接触させ、検体中の前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖の有無を検出する工程；（ｂ）工程（ａ）で前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖が検出された場合、前立腺がんと判定する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を備えたことを特徴とする前立腺がん判定方法や、［３］検体が、尿又は血清であることを特徴とする前記［２］記載の前立腺がん判定方法に関する。
【００１３】
また、本発明は［４］ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、リポソーム表面がＢＰＡ又はＭＰＡにより修飾され、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とするリポソーム輸送体や、［５］血液中で用いることを特徴とする前記［４］記載のリポソーム輸送体や、［６］ヒト及びマウスの赤血球を凝集させないことを特徴とする前記［４］又は［５］記載のリポソーム輸送体や、［７］薬物が内封されていることを特徴とする前記［４］〜［６］記載のリポソーム輸送体や、［８］薬物が抗がん剤であることを特徴とする前記［７］記載のリポソーム輸送体に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が、前立腺がん細胞の糖鎖に結合する作用を利用した、ＢＰＡ又はＭＰＡを含む前立腺がんの検出試薬を用いて、前立腺がんを検出することができる。また、かかる検出試薬を用いて、前立腺がんを判定することができる。さらに、ＢＰＡ及びＭＰＡが前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用して、リポソーム表面がＢＰＡ又はＭＰＡに修飾され、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とするリポソーム輸送体を作製することができ、かかる輸送体を用いて前立腺がんへ薬物を送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＢＰＡ（ムラサキモクワンジュレクチン）及びＭＰＡ（オサジオレンジレクチン）が前立腺がん組織へ特異的に結合することを示す図である。正常検体及び前立腺がんの組織切片をレクチン（ＢＰＡ、ＭＰＡ、ＡＢＡ（マッシュルームレクチン）、又はＰＮＡ（ピーナッツレクチン））を用いて染色した結果を示す。矢印は、ＢＰＡ及びＭＰＡによって染色されたがん細胞領域を示す。Ｇはがんの悪性度を示すgleason score（tumor malignancy）である。
【図２】ＢＰＡ（ムラサキモクワンジュレクチン）が前立腺がん細胞ＬＮＣａＰに結合することを示す図である。
【図３】ＢＰＡ修飾リポソームの調製方法の概要を表す図である。
【図４】ＢＰＡ修飾リポソームの血清中での安定性を示す図である。
【図５】ＢＰＡ修飾リポソームが（ａ）ウサギ赤血球に対して赤血球凝集活性をもつが、（ｂ）マウス赤血球及び（ｃ）ヒト赤血球に対しては赤血球凝集活性をもたないことを示す図である。
【図６】蛍光強度測定法によって、（ａ）３７℃培養条件下のＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞への高い結合性を示す図、（ｂ）４℃培養条件下のＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞への高い結合性を示す図、及び（ｃ）３７℃培養条件下のＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＤＵ１４５細胞への高い結合性を示す図である。グラフは細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１（ｔ検定）を表す。
【図７】蛍光顕微鏡観察によって、（ａ）３７℃及び（ｂ）４℃培養条件下のＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞への高い結合性を示す図である。ＤｉＩ染色（左カラム）はリポソームを、ＤＡＰＩ染色（中央カラム）は核の染色を示す。
【図８】細胞培養液へのＢＰＡ添加による、ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞への結合阻害を示す図である。グラフの白いカラムはＢＰＡ添加なし、黒いカラムはＢＰＡ添加における、細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示し、＊＊はｐ＜０．０１（ｔ検定）を表す。
【図９】（ａ）細胞培養液へのガラクトース添加による、ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞への結合阻害を示す図である。グラフの白いカラムはガラクトース添加なし、黒いカラムはガラクトース添加における、細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示し、＊＊はｐ＜０．０１（ｔ検定）を表す。（ｂ）細胞培養液へのガラクトース添加による、ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＤＵ１４５細胞への結合阻害を示す図である。グラフのグレーのカラムはグルコース添加、白いカラムはガラクトース添加における、細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示し、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１（ｔ検定）を表す。
【図１０】（ａ）ＦＢＳ存在下のＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞への高い結合性を示す図である。グラフの白いカラムはＦＢＳ添加なし、黒いカラムはＦＢＳ添加における細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示す。（ｂ）ＦＢＳ存在下のＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＤＵ１４５細胞への高い結合性を示す図である。グラフの黒いカラムはＰＥＧ修飾リポソーム（ＰＥＧ−ｌｉｐｏ）、グレーのカラムはＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）における細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１（ｔ検定）を表す。
【図１１】ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞への特異的結合を示す図である。３７℃培養条件下のＢＰＡ修飾リポソームの（ａ）前立腺がん細胞ＤＵ１４５細胞、（ｂ）正常上皮細胞ＨＵＶＥＣ細胞への結合性を示す。グラフは細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示し、＊＊はｐ＜０．０１（ｔ検定）を表す。
【図１２】不活性化ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞ＤＵ１４５細胞への結合性を示す図である。黒いカラムはＰＥＧ修飾リポソーム（ＰＥＧ−ｌｉｐｏ）、グレーのカラムはＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）、白のカラムは不活性化ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ―ｌｉｐｏ（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ））における細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１（ｔ検定）を表す。
【図１３】薬物封入ＢＰＡ修飾リポソームを用いた前立腺がんの治療効果を示す図である。ＤＯＸを封入したＢＰＡ修飾リポソームは、前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞の生存を抑制することが示された。グラフは細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１、＊＊はｐ＜０．０１（ｔ検定）を表す。
【図１４】薬物封入ＢＰＡ修飾リポソームを用いた前立腺がんの治療効果を示す図である。白いカラムはフリーのＤＯＸ（Ｆｒｅｅ  ＤＯＸ）、黒いカラムはＤＯＸを封入したＰＥＧ修飾リポソーム（ＰＥＧ−ＤＯＸ）、グレーのカラムはＤＯＸを封入したＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ＤＯＸ）を示す。ＤＯＸを封入したＢＰＡ修飾リポソームは、前立腺がん細胞ＤＵ１４５細胞の生存を抑制することが示された。グラフは細胞に結合したＤｉＩ標識リポソームの蛍光強度測定法による測定値（平均値±標準偏差）を示し、＊はｐ＜０．０５（ｔ検定）を表す。
【図１５】生体に対するＢＰＡ修飾リポソームの投与結果を示す図である。担がんマウスに３Ｈ標識ＢＰＡ修飾リポソームを投与し、３時間（ａ），（ｃ）、２４時間（ｂ），（ｄ）後に血液を回収し、各臓器(心、肺、肝臓、脾臓、腎臓、前立腺)及びがんを摘出し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した
【図１６】ＤＯＸ内封ＢＰＡ修飾リポソームの治療効果を示す図である。（−◆−）：ＰＢＳ、（−■−）：ＤＯＸを封入したＰＥＧ修飾リポソーム（ＰＥＧ−ＤＯＸ）、（−▲−）：ＤＯＸを封入したＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ＤＯＸ）を担がんマウスに投与し、（ａ）腫瘍堆積、（ｂ）体重変化を測定したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明においてムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）やオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）の入手方法は特に制限されず、市販品を購入することも、以下の方法で得ることもできる。ＢＰＡは、ムラサキモクワンジュ（学名Bauhinia purpurea）より抽出される
レクチンである。ＢＰＡは、ムラサキモクワンジュの種子等から得ることができる。具体的には、入村らの方法（Arch Biochem Biophys. 1972 Aug;151(2)）に従いＢＰＡを得る
ことができる。また、ＭＰＡは、オサジオレンジ（学名Maclura pomifera）より抽出されるレクチンである。ＭＰＡは、オサジオレンジの種子等から得ることができる。具体的には、Ulevitchらの方法（Prep Biochem. 1974;4(3)）に従いＭＰＡを得ることができる。
【００１７】
本発明のＢＰＡ又はＭＰＡを含む前立腺がんの検出試薬としては、ＢＰＡ又はＭＰＡを含むものであれば特に制限されず、他に固定液や洗浄液、ブロッキング試薬、染色試薬や染色用の容器など、他の構成を含んでもよい。また、ＢＰＡやＭＰＡは標識物質で標識されていてもよく、かかる標識物質はＢＰＡやＭＰＡの存在の検出を可能にするために用いられる物質であればよく、ビタミン、タンパク質、脂質、酵素、蛍光物質、化学発光物質あるいは放射性同位体等を挙げることができる。具体的には、ビタミンとしてはビオチン等、タンパク質としてはアビジン等、ステロイドとしてはジゴキシゲニン（Digoxigenin：ＤＩＧ）等を挙げることができ、蛍光色素標識としてはフルオレセインやＦＩＴＣなどのフルオレセイン誘導体、アミノクマリン酢酸、Rhodamineなどのテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）等を挙げることができ、酵素標識としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。
【００１８】
本発明の前立腺がん判定方法としては、ＢＰＡ及びＭＰＡが前立腺がん細胞を認識して前記がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用した、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えていれば特に制限されず、実施の一形態として以下の工程（ａ）及び（ｂ）を備えた前立腺がんの診断のためのデータを収集する方法を例示することもできる。
（ａ）本発明の前立腺がんの検出試薬と検体とを接触させ、検体中の前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖の有無を検出する工程；
（ｂ）工程（ａ）で前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖が検出された場合、前立腺がんと判定する工程；
前記工程（ａ）及び（ｂ）によって収集される前立腺がんの診断のためのデータは、治療効果を評価するためのデータや、予後を予測するためのデータとして利用することもできる。
【００１９】
本発明の前立腺がん判定方法における検体は特に制限されず、例えば前立腺組織、尿又は血清を挙げることができ、検体採取の際に侵襲性の低い尿又は血清を好適に例示することができる。検体の由来は男性のヒトや雄の哺乳動物であればよく、哺乳動物としてはサル、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ラット、マウスなどを挙げることができ、前立腺がんの診断のためのデータを収集する方法の場合はヒトの男性由来を好適に例示することができる。採取したサンプルは、前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖が破壊されることを防ぐために、ＢＰＡ又はＭＰＡによる結合が阻害されない限りは検体を安定化させるために適宜パラホルムアルデヒドによる固定処理や防腐剤の添加等があってもよく、血液は、抗凝固剤の添加や血清の採取や等の処理を施されてもよい。
【００２０】
上記検体中の前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖の有無を検出する工程（ａ）において用いるＢＰＡ又はＭＰＡは、標識されていてもよいし、標識されていなくてもよく、標識されていないＢＰＡやＭＰＡは、抗ＢＰＡ抗体や抗ＭＰＡ抗体を用いて検出することができ、これら抗ＢＰＡ抗体や抗ＭＰＡ抗体は標識物質により標識されていてもよいし、標識されていない場合は標識物質で標識された二次抗体を用いて検出することができる。
【００２１】
本発明の前立腺がん判定方法において、組織切片の検体を用いた場合のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖の有無を検出する工程（ａ）は、常法により行うことができる。例えば、蛍光標識を用いて検出する場合は検体の前立腺がん細胞を、蛍光標識されたＢＰＡやＭＰＡや、蛍光標識された抗ＢＰＡ抗体又は抗ＭＰＡ抗体や、抗ＢＰＡ抗体又は抗ＭＰＡ抗体と結合した蛍光標識された二次抗体を用いて、蛍光顕微鏡で観察して検出することができる。また、例えばビオチン標識を用いて検出する場合は検体の前立腺がん細胞を、ビオチン標識されたＢＰＡ又はＭＰＡや、ビオチン標識された抗ＢＰＡ抗体又は抗ＭＰＡ抗体や、抗ＢＰＡ抗体又は抗ＭＰＡ抗体と結合したビオチン標識された二次抗体を、ビオチンとストレプトアビジンの強い親和性を利用して、ストレプトアビジン標識蛍光色素をビオチンに反応させて蛍光顕微鏡で観察する方法や、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（horse radish peroxidase）を反応させてＤＡＢ（ジアミノベンチジン）発色法を用いて検出し顕微鏡で観察する方法で検出することができる。また、尿や血清を検体とする場合は、検体中の前立腺がん細胞を、標識されたＢＰＡ又はＭＰＡや、標識された抗ＢＰＡ抗体又は抗ＭＰＡ抗体や、抗ＢＰＡ抗体又は抗ＭＰＡ抗体と結合した標識された二次抗体によって、ＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖の有無を標識することによって検出することができる。かかる標識された細胞は常法によって検出することができ、例えば蛍光色素を標識物質として用いてＥＬＩＳＡ法やセルソーターにて検出することができる。
【００２２】
本発明の前立腺がんの検出試薬を利用して、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を備えた前立腺がん治療薬のスクリーニングを行うこともできる。
（Ａ）検体中から前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖が検出された、非ヒト前立腺がんモデル動物に、被検物質を投与する工程
（Ｂ）検体中の前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖の有無を検出する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖が検出されない場合や、被検物質を投与していない対照と比べて糖鎖の検出が低下した場合、被検物質を前立腺がん治療薬の候補物質として選択する工程；
【００２３】
上記非ヒト前立腺がんモデル動物としては、前立腺がんを患う動物でもよく、また異所的に前立腺がん細胞を移植された動物でもよく、非ヒト動物としてはサル、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ラット、マウスを用いることができるが、ラット及びマウスを好適に例示することができる。具体的には、例えば、前立腺癌発生モデルラット（特開２００１−２３１４０２号公報）や、局所的に進行した、または転移性のヒト前立腺ガン異種移植片を有する免疫欠損マウス（特表２００１−５０２５３７号公報）などを用いることができる。さらに、異所的に前立腺がん細胞を移植する前に被検物質を投与しておくと、前立腺がん予防薬のスクリーニングを行うこともできる。
【００２４】
本発明のリポソーム輸送体としては、ＢＰＡ及びＭＰＡが前立腺がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用し、リポソーム表面がＢＰＡ又はＭＰＡに修飾されたリポソームであり、前立腺がんへの標的指向性を有するものであれば特に制限されず、上記リポソームとしては、いかなる構成脂質を用いてもよく、脂質の炭素数や脂質の相転移温度、リポソームのサイズも特に制限されず、リポソーム表面側に直接又は間接的にＢＰＡ又はＭＰＡが付加されていればよく、かかるＢＰＡ又はＭＰＡは標識されていてもよい。このリポソーム輸送体は、リポソーム内部に薬物を内封することができ、生体内で薬物を輸送することができる。また、ＢＰＡ又はＭＰＡの他に標識物質等がリポソーム輸送体表面に直接的又は間接的に付加されていてもよい。ＢＰＡ又はＭＰＡが効率よく前立腺がん細胞表面のＢＰＡ又はＭＰＡが結合する糖鎖を認識する観点からは、ＢＰＡ又はＭＰＡがリポソーム表面に埋もれないことが好ましく、ＢＰＡ又はＭＰＡはリンカーを介して間接的にリポソームに結合した例を好適に例示することができる。かかるリンカーとしては、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）誘導体を例示することができ、具体的にはＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（[1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[poly (ethyleneglycol)] -hydroxy succinamide, PEG M 3400]）を挙げることができる。
【００２５】
本発明のリポソーム輸送体の前立腺がんへの標的指向性は、前立腺がん細胞由来の培養細胞に対する本発明のリポソーム輸送体の結合性が、修飾されていないリポソームと比べて高いことを常法により調べることにより確認することができる。例えば、前立腺がん細胞に標識された本発明のリポソーム又は標識されたリポソームを添加した後、洗浄し、標識を検出することにより前立腺がん細胞に結合したリポソーム量を定量し、前立腺がん細胞に対する本発明のリポソーム輸送体の結合性を調べることができる。また本発明のリポソーム輸送体は生体内に投与して使用することができ、投与方法は特に制限されず、血管または前立腺近傍の組織への注射による投与方法を好適に例示することができる。
【００２６】
本発明のリポソーム輸送体はリポソーム内部に薬物を内封することができ、薬物の種類は特に制限されず、種々の治療薬剤や蛍光物質や放射性物質などを挙げることができ、好ましくは抗がん剤を例示することができる。蛍光物質や放射性物質を封入した本発明のリポソーム輸送体を用いて生体内において前立腺がん細胞を可視化することができ、また放射性物質や抗がん剤によってがん細胞の増殖を抑制し治療することができる。
【実施例１】
【００２７】
１．レクチンを用いた前立腺がんの染色
前立腺正常組織及び前立腺がん組織の病理切片を、ビオチン標識されたレクチン（ＢＰＡ（ムラサキモクワンジュレクチン）、ＭＰＡ（オサジオレンジレクチン）、ＡＢＡ（マッシュルームレクチン）、又はＰＮＡ（ピーナッツレクチン）（株式会社Ｊ−オイルミルズ社より入手））を用いて以下の方法で染色した。脱パラフィン操作を行ったヒト前立腺組織アレイスライド（病理切片）（Acuumax社またはSuperBioChips社製）を、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて常温３０分間でブロッキング操作を行った。かかる病理切片に、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに溶解した５０μｇ／ｍＬの４種のビオチン標識レクチンをそれぞれ用いて、常温で１時間反応させ、洗浄後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳに溶解した５μｇ／ｍＬストレプトアビジン−ＨＲＰ（horse radish peroxidase）を用いて常温で３０分間反応させた。ＤＡＢ（ジアミノベンチジン）発色キット（シグマアルドリッチ社製）を用いて約５分間反応させ、呈色の度合いを見て水に置換して反応を停止させた。結果を図１に示す。前立腺の組織切片をＢＰＡ及びＭＰＡを用いて染色すると、正常組織では染色されず前立腺がん組織だけが染色された。それに対し、ＡＢＡを用いた場合は正常組織も前立腺がん組織も両方染色され、ＰＮＡを用いた場合は正常組織も前立腺がん組織もどちらも染色されなかった。
【００２８】
また、前立腺がん由来の細胞株ＬＮＣａｐの細胞へのＢＰＡの結合性を調べた。
（ＬＮＣａＰ細胞の培養）
ＬＮＣａＰ細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマアルドリッチ社製）にペニシリン−ストレプトマイシン溶液（和光純薬工業社製）およびＦＢＳ（ウシ胎児血清）（５６℃で３０分間非働化処理、最終濃度５〜１０％）を添加した培地中で、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。コンフルエント時には０．０２５％trypsin／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）／ＰＢＳ溶液を用いて細胞を剥離し、継代を行った。
【００２９】
（蛍光顕微鏡による観察）
１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＬＮＣａｐ細胞を１００μｌ／ｗｅｌｌの細胞培養用培地ＲＰＭＩ−１６４０（シグマアルドリッチ社製）を用いて親水性シラン（ＭＡＳ）コート済み高撥水性８穴スライドガラス（松浪硝子工業株式会社製）の上で約３０分間培養し、ガラスに接着させた。続いて細胞培養用培地（ＲＰＭＩ−１６４０）に溶解した１０μｇ／ｍＬの蛍光（ＦＩＴＣ：緑）標識ＢＰＡ又はＦＩＴＣ−ＢＳＡを用いて３７℃で１時間染色した。洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を１００μｌ／ｗｅｌｌずつウェルに滴下し、４℃にて６時間反応させ、細胞を固定した。洗浄後、ＤＡＰＩ（4',6-ジアミジノ−２−フェニルインドール）入り封入剤（ベクター社製）を適当量添加して核を青く染色し、カバーガラスを上にかぶせて蛍光顕微鏡観察へ供した。また、Ｄ−（＋）−ガラクトースによる競合実験の場合は、０．２ＭガラクトースをＦＩＴＣ標識ＢＰＡ染色液に添加して用いた。サンプルは、蛍光顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス社製）により、ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩを蛍光観察した。
【００３０】
結果を図２に示す。ＦＩＴＣ−ＢＰＡを添加しないサンプルやＦＩＴＣ−ＢＳＡを用いたサンプルでは細胞は染色されなかったが、ＦＩＴＣ−ＢＰＡが前立腺がん細胞に吸着していることがわかった。また、ＢＰＡはＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃへの特異性を有することからＢＰＡの阻害糖の一つである、Ｄ−（＋）−ガラクトース０．２Ｍを添加することで、ＢＰＡの前立腺がん細胞への結合性がなくなったことから、ＢＰＡは細胞表面の糖鎖を認識することによって前立腺がん細胞に特異的に結合していることが示された。すなわち、これらのレクチンは前立腺がんの病理診断に有効であることが示された。
【実施例２】
【００３１】
１．ＢＰＡ修飾リポソームの調製
ＢＰＡが前立腺がん細胞に特異的に結合することから、前立腺がん部位だけを標的とすることができることが示唆され、前立腺がんへ特異的に薬物を輸送する「輸送体」としてＢＰＡ修飾リポソームを作製した。
【００３２】
リポソームの調製は以下の方法で行った。ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン、日本精化株式会社製）及びコレステロール（日本精化株式会社製）をそれぞれクロロホルム（和光純薬工業株式会社製）に溶解（１００ｍＭ）した。これらのＤＰＰＣ溶液及びコレステロール溶液をＤＰＰＣ／コレステロール（Ｃｈｏ）のモル比が２０／１０の組成となるようにナス型フラスコに分取し、適量のクロロホルムと混合した。ロータリーエバポレーターを用いて減圧下でクロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。６０℃の条件下でＤＰＰＣ最終濃度が４０ｍＭとなるようにＰＢＳを加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。次に、バス型ソニケーター（1510J-MTH、ヤマト科学株式会社製）で１０分間処置後、６０℃に加温したExtruder（Lipex Biomembranes, Inc. 製）を用い、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Nucleopore Track-Tech Membrane, Whatman Ltd. 製）に通すことによりサイズを調整した。
【００３３】
次に以下で述べる＜１＞または＜２＞の方法によりＢＰＡ修飾リポソームの調製を行った。
（ＢＰＡ修飾リポソームの調製）
０．１Ｍ  Borate buffer（ホウ酸緩衝液）は、Ｈ３ＢＯ３（和光純薬工業株式会社製
）０．２５ｇ及びＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ（和光純薬工業株式会社製）１．５３ｇを超純水に溶解して２００ｍＬとし、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ＝８．３に調整して使用した。
＜１＞ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−ＮＨＳ（日油株式会社製）（ＤＰＰＣに対して最終濃度２．５ｍｏｌ％）およびＢＰＡ（ＤＰＰＣに対して最終濃度０．０２５ｍｏｌ％）を０．１Ｍ  borate bufferに溶解し、室温で一晩攪拌した。その反応溶液と作製したリポソーム溶液を等量混合し、５０℃で１５分間反応させた後、氷冷した。超遠心機（himac CS120GXL、日立工機株式会社製）で遠心操作（４５３，０００ｇ、４℃、１５分間）を３回行い、沈殿をＰＢＳで再懸濁し、ＢＰＡ修飾リポソーム溶液とした（図３）。
＜２＞ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＤＰＰＣに対して最終濃度２．５ｍｏｌ％）を作製したリポソーム溶液に溶解し、６０℃で１５分間反応させた後、氷冷した。その反応溶液と０．１Ｍ  borate bufferに溶解したＢＰＡ溶液（ＤＰＰＣに対して最終濃度０．０２５ｍｏｌ％）を等量混合し、室温で一晩攪拌した。超遠心機で遠心操作（４５３，０００ｇ、４℃、１５分間）を３回行い、沈殿をＰＢＳで再懸濁し、ＢＰＡ修飾リポソーム溶液とした。３Ｈ標識ＢＰＡ修飾リポソームは、ＤＰＰＣおよびコレステロールをナス型フラスコに加える際に［３Ｈ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｅｔｈｅｒを最終濃度３７０ｋＢｑ/ｍＬとなるように加え、その後の操作は前記と同様の方法により作製した。
また、対照のリポソームとして未修飾コントロールリポソーム（Ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ）とＢＳＡ修飾リポソーム（ＢＳＡ−ｌｉｐｏ）も同様の方法により作製した。ＰＥＧ修飾リポソームは、作製したリポソーム溶液にＤＳＰＥ-ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）（日本精化株式会社製）を溶解し、６０℃で１５分間反応させて作製した。不活性ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）は、８０℃で３０分反応させて赤血球凝集活性を不活性化させたＢＰＡを用いて作製した。ＢＳＡ−ｌｉｐｏ若しくはＢＰＡ−ｌｉｐｏ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄは、ＢＰＡ−ｌｉｐｏで加えたＢＰＡと等モル量のＢＳＡ、若しくは不活性化ＢＰＡをそれぞれ使用して調製した。ＰＥＧ−ｌｉｐｏはＢＰＡ−ｌｉｐｏを調製した際に用いたＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳと等モル量のＤＳＰＥ−ＭＰＥＧを反応させることで調製した。
【００３４】
（ＢＰＡ修飾リポソームの性質）
得られたリポソーム溶液の粒子径とゼータ電位をZetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments Ltd.製）を用いて測定した（表１）。
【００３５】
【表１】
2013156245.tif 000002
【００３６】
ＢＰＡ−ｌｉｐｏはいずれも対照のリポソームと同様の粒子径を示し、ゼータ電位はほぼ中性であった。
【００３７】
また、１０％ＳＤＳを添加して最終濃度２％ＳＤＳに調整したリポソーム溶液を、８０℃で１５分間加温してＨＰＬＣ測定用サンプルとし、以下の条件で修飾の定量を行った。＜１＞と＜２＞の方法において得られたリポソームへのＢＰＡ修飾量をそれぞれ示した（表２）。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：              TSK-gel G3000 SWXL（東ソー社製）
移動相：              ０．２Ｍ  Phosphate buffer（リン酸緩衝液）／０．１％ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）
インジェクション量：  ５０μＬ
流速：                ０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：          ３０℃
検出器：              ＵＶ（２８０ｎｍ）
測定時間：            ３０分間
【００３８】
【表２】
2013156245.tif 000003
【００３９】
以上より、＜１＞よりも＜２＞の調製法にて、リポソームへ効率よくＢＰＡ修飾することができた。ＢＰＡは５０℃で３時間までは活性が保たれることがこれまでの検討からわかっているが、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳをリポソームに修飾する際に、脂質の相転移温度以上の熱を加えて膜の流動性を向上させなければならない。しかし方法＜１＞の場合、相転移温度が高い脂質を用いると、熱によりレクチンの活性が失われてしまうこととなる。そこで今回は相転移温度が４１℃であるＤＰＰＣを用いてリポソームの作製を行うこととし、これにより方法＜１＞でリポソーム表面にＢＰＡを修飾する際のレクチン失活を防ぐことができた。方法＜２＞では先にリポソーム上にＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳを修飾するためにＢＰＡに熱を加える工程はなく、ＢＰＡの活性への影響を考えることなく調製することが可能である。
【００４０】
２．ＢＰＡ修飾リポソームの血清中での安定性検討
多くのレクチンは赤血球凝集活性を持つことが広く知られており、ＢＰＡはウサギ赤血球に対して凝集活性を持つが、ヒツジ赤血球に対しては持たないことが知られている。ＢＰＡ修飾リポソームを生体内で使用する際には、血中での安定性が重要となる。そこで、以下の方法で血清中での安定性及び、ＢＰＡのウサギ、マウス、ヒトの赤血球凝集活性について調べた。
【００４１】
作製したＢＰＡ修飾リポソームとＦＢＳ等量混合し、３７℃で攪拌した。０，３，６，１２，２４時間後にサンプルを一部回収し、Zetasizer Nano-ZSを用いてＢＰＡ修飾リポソームのサイズを測定した。その結果、ＢＰＡ修飾リポソームは対照のリポソームと同様に血清存在下２４時間においても粒子径が変わらず、血清中で安定であることが示された（図４）。
【００４２】
次に、ＰＢＳに溶解した３０μｇ／ｍＬ  ＢＰＡレクチン溶液または作製したリポソーム溶液を４，３７，８０℃でそれぞれ３０分間加温後氷冷し、サンプル溶液とした。マウス赤血球懸濁液はマウス頸動脈を切断し、予めヘパリン処理したシリンジで血液をコニカルチューブに採取し、ＰＢＳを加えて遠心機（himac CF15RX、日立工機株式会社製）で遠心操作（２０００ｒｐｍ，４℃，５分間）を３回行い、沈殿をＰＢＳで２％（ｖ／ｖ）となるように再懸濁して調製した。またウサギ、ヒト赤血球懸濁液はウサギ保存血液又はヒト血液をコニカルチューブに採取し、ＰＢＳを加えて超遠心機で遠心操作を３回行い、沈殿をＰＢＳで２％（ｖ／ｖ）となるように再懸濁して調製した。９６穴タイタープレート（Ｕ底）に、赤血球懸濁液と、ＢＰＡ濃度１５μｇ／ｍＬを希釈率１として５１２まで倍々希釈したサンプル溶液とを、１：１の割合で混合し、室温で約６０分間放置後、赤血球凝集活性を観察した（図５）。
【００４３】
ＢＰＡは枠で示した１〜１６倍希釈濃度においてウサギ赤血球を凝集させるが、ＢＰＡ修飾リポソームも８〜５１２倍希釈濃度において強いウサギ赤血球凝集活性を示し（図５）、リポソーム体にあるＢＰＡも赤血球凝集活性を有することから、リポソーム調製過程による変性等はほぼないことが示唆された。またマウス及びヒトの赤血球ではＢＰＡ修飾リポソームは赤血球凝集性を示さなかったことから、ＢＰＡ修飾リポソームを生体内に投与した際、赤血球と凝集してしまい、体内動態制御さらにはがん組織への送達能力が低下することはなく、ヒトに本発明のＢＰＡ修飾リポソームが血中投与された場合に、ヒトの血液の流れに悪影響を及ぼさないことが示唆された。
【００４４】
３．ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がんへの標的性
ＢＰＡが結合する糖鎖を発現するヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ細胞及びＤＵ１４５細胞を用いて、ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がんへの標的性について、以下の方法で調べた。
【００４５】
（ＤｉＩ標識リポソームの調製）
組成：ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤｉＩＣ１８＝２０／１０／０．２（モル比）１００ｍＭとなるようにクロロホルムに溶解したＤＰＰＣ溶液及びコレステロール溶液、１ｍＭクロロホルムに溶解したＤｉＩＣ１８（オクタデシル（Ｃ１８）インドカルボシアニン、インビトロジェン社製）溶液を上述した組成となるようにナス型フラスコに分取し、適量のクロロホルムと混合して、上記＜２＞の方法にて対照リポソームのＤｉＩ標識リポソーム及びＤｉＩ標識ＢＳＡ修飾リポソーム、並びにＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソームを調製した。
【００４６】
（リポソーム結合実験：ＬＮＣａＰ細胞）
ＬＮＣａＰ細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにポリリジンコート２４穴プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて３０分間ブロッキングを行った後ＰＢＳにより洗浄し、調製したＤｉＩ標識リポソームをＤＰＰＣ最終濃度２ｍＭとなるようにＲＰＭＩ−１６４０（serum free）で希釈して添加後、３７℃又は４℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄後、０．１％ＳＤＳ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−塩酸緩衝液）２００μＬで可溶化した。
【００４７】
（リポソーム結合実験：ＤＵ１４５細胞）
ＤＵ１４５細胞を８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにポリリジンコート２４穴プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて３０分間ブロッキングを行った後ＰＢＳにより洗浄し、調製したＤｉＩ標識リポソームをＢＰＡ最終濃度１μg／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１６４０（serum free）で希釈して添加後、３７℃で３、１２、２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄後、０．１％ＳＤＳ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−塩酸緩衝液）２００μＬで可溶化した。
【００４８】
（蛍光強度測定法）
作製した細胞可溶化液を蛍光測定用９６穴プレート（Thermo Fisher Scientific社製）に各１００μＬずつ加え、マルチプレートリーダー（Infinite M200，Tecan社製）を用いて励起波長５４９ｎｍ、蛍光波長５９２ｎｍの条件で蛍光強度測定を行った。また添加リポソームの１００倍希釈液についても同様に測定を行った。ＤＰＰＣ濃度２ｍＭまではＢＰＡ修飾リポソームの濃度依存的なＬＮＣａＰ細胞への結合が保たれていることを確認していたので、結合性（％）は、以下の式にて算出した。
結合性＝細胞溶解液の蛍光強度／添加リポソームの蛍光強度×１００（％）
【００４９】
（共焦点レーザースキャン顕微鏡観察）
ＬＮＣａＰ細胞を、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように高撥水性４穴スライドガラス（松浪硝子工業株式会社製）に播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて３０分間ブロッキングを行った後ＰＢＳにより洗浄し、ＤｉＩ標識リポソームの各サンプルをＤＰＰＣ最終濃度２ｍＭとなるようにＲＰＭＩ−１６４０（serum free）で希釈して添加、３７℃または４℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄後、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを加え、室温で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡ／０．１％saponin／ＰＢＳを加えて室温で３０分間インキュベート後、１０μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ／３％ＢＳＡ／０．１％saponin（シグマアルドリッチ社製）／ＰＢＳを加え、１５分間インキュベートした。その後細胞をＰＢＳにより洗浄し、マウント剤Permafluor（Thermo Fisher Scientific社製）を加えてマウントし、カバーガラスをかけて暗所で１時間以上放置した。共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM 510 META, Carl Zeiss, Inc. 製）によりリポソームの分布を観察した。
【００５０】
３−１．ＬＮＣａＰ細胞及びＤＵ１４５細胞への結合性（蛍光強度測定法）
ＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）の前立腺がんへの結合を、蛍光強度測定法により調べた結果を図６に示す。対照のリポソームとして、ＤｉＩ標識未修飾コントロールリポソーム（Ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ）とＤｉＩ標識ＢＳＡ修飾リポソーム（ＢＳＡ−ｌｉｐｏ）を用いて、ＬＮＣａＰ細胞へのＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソームの結合性を調べた。リポソームは、３７℃においてはエンドサイトーシスによりリポソームは細胞内に取り込まれ、４℃においてはエンドサイトーシスが停止するために細胞表面に接着するものと考えられる。そのため、図６（ａ）はＤｉＩ標識リポソームのＬＮＣａＰ細胞への結合及び取り込みを、図６（ｂ）はＤｉＩ標識リポソームのＬＮＣａＰ細胞への結合を表す。対照のリポソームと比較して、ＢＰＡ修飾リポソームはＬＮＣａＰ細胞に対して有意に高く結合することがわかった。同様に、ＤＵ１４５細胞において、対象のリポソームとしてＤｉＩ標識ＰＥＢ修飾リポソーム（ＰＥＧ−ｌｉｐｏ）を用いて、ＤＵ１４５細胞へのＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソームの結合性を調べた。図６（ｃ）はＤｉＩ標識リポソームのＤＵ１４５細胞への結合及び取り込みを表す。ＢＰＡ修飾リポソームはＤＵ１４５細胞に対して有意に高く結合することがわかった。また、図５及び図６に示す結果より、ＢＰＡ修飾リポソームは、赤血球凝集活性は低いが前立腺がんに発現している糖鎖には高い結合性を示すリポソームということがわかった。
【００５１】
３−２．ＬＮＣａＰ細胞への結合性（共焦点レーザースキャン顕微鏡観察）
ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がんへの結合を、蛍光顕微鏡観察により調べた結果を図７に示す。３７℃（図７（ａ））と４℃（図７（ｂ））のどちらの条件下でも、対照リポソームのＤｉＩ標識未修飾コントロールリポソーム（Ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ）及びＤｉＩ標識ＢＳＡ修飾リポソーム（ＢＳＡ−ｌｉｐｏ）と比較して、ＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）を用いた場合は、前立腺がん細胞にＤｉＩの強い蛍光が確認できた。また３７℃条件下ではＢＰＡ−ｌｉｐｏが細胞膜に結合、一部細胞内に取り込まれている結果が得られたのに対し、４℃条件下ではＢＰＡ−ｌｉｐｏが細胞膜に結合している様子が観察された。
【００５２】
３−３．ＬＮＣａＰ細胞への結合の特異性の確認
次に、上記のＢＰＡ修飾リポソームのＬＮＣａＰ細胞への高い結合性がリポソーム表面上のＢＰＡを介するものかを確認するために、以下の競合阻害実験を行った。ＬＮＣａＰ細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにポリリジンコート２４穴プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した後、ＢＰＡ（１００μｇ／ｍＬ）又はＤ−（＋）−ガラクトース（１００ｍＭ）の含有又は非含有ＲＰＭＩ−１６４０（serum free）に置換し、ＤｉＩ標識リポソームを添加して３７℃で３時間インキュベートした。ＬＮＣａＰ細胞へのＤｉＩ標識リポソームの結合性を蛍光強度測定により調べた結果を図８及び図９に示す。ＢＰＡの添加は対照リポソームのＤｉＩ標識未修飾コントロールリポソーム（Ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ）及びＤｉＩ標識ＢＳＡ修飾リポソーム（ＢＳＡ−ｌｉｐｏ）のＬＮＣａＰ細胞への結合性には影響を与えなかったが、ＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）のＬＮＣａＰ細胞への結合は阻害された（図８）。すなわち、ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がん細胞への高い親和性がＢＰＡ由来であり、ＢＰＡ修飾リポソームは前立腺がん細胞を特異的に認識することが強く示唆された。また、同様にＤ−（＋）−ガラクトースの添加は対照リポソームのＬＮＣａＰ細胞への結合性には影響を与えなかったが、ＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）のＬＮＣａＰ細胞への結合は阻害された（図９（ａ））。ＢＰＡはＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃへの特異性を有することからＢＰＡの阻害糖の一つである、Ｄ−（＋）−ガラクトースが過剰量存在しているとＢＰＡリポソームのＬＮＣａＰ細胞への結合が抑えられたことから、ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がんへの結合は、前立腺がんの細胞表面に特異的に存在している糖鎖の認識を介して起こっていることを示している。
【００５３】
さらに、阻害糖鎖の末端糖であるガラクトースが過剰に存在する際のＢＰＡ修飾リポソームのＤＵ１４５細胞への結合性を調べた。ＤＵ１４５細胞を８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにポリリジンコート２４穴プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０を加えて３０分間ブロッキングを行った後ＰＢＳにより洗浄し、調製したＤｉＩ標識リポソームをＢＰＡ最終濃度１μg／ｍＬとなるように０．１,１,１０,５０,１００ｍＭ  Ｄ−（＋）−グルコースおよびＤ−（＋）−ガラクトース含有ＲＰＭＩ−１６４０（serum free）で希釈して添加後、３７℃で６時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄後、０．１％ＳＤＳ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス−塩酸緩衝液）２００μＬで可溶化した。ＤＵ１４５細胞へのＤｉＩ標識リポソームの結合性を蛍光強度測定により調べた結果を図９（ｂ）に示す。その結果、ＢＰＡ修飾リポソームのＤＵ１４５細胞への結合はガラクトースの濃度に依存して低下することが確認された。Ｄ−（＋）−ガラクトースが過剰量存在しているとＢＰＡリポソームのＤＵ１４５細胞への結合が抑えられたことから、ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がんへの結合は、前立腺がんの細胞表面に特異的に存在している糖鎖の認識を介して起こっていることを示している。また、ガラクトースに対する対照として用いたグルコースでは濃度による集積の差は確認されなかった。このことから、末端にガラクトースを有する糖鎖に対して、より結合性を示すことが明らかとなった。
【００５４】
次に、血清存在下においてもＢＰＡ修飾リポソームが前立腺がん細胞へ高い結合性を得られるか調べるために、以下の実験を行った。ＬＮＣａＰ細胞を４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるようにポリリジンコート２４穴プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した後、１０％ＦＢＳ含有又は非含有ＲＰＭＩ−１６４０に置換し、ＤｉＩ標識リポソームを添加して３７℃で３時間インキュベートした。ＬＮＣａＰ細胞へのＤｉＩ標識リポソームの結合性を蛍光強度測定により調べた結果を図１０（ａ）に示す。ＦＢＳの存在下においても、ＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）はＤｉＩ標識未修飾コントロールリポソーム（Ｃｏｎｔ−ｌｉｐｏ）及びＤｉＩ標識ＢＳＡ修飾リポソーム（ＢＳＡ−ｌｉｐｏ）と比較して有意に高いＬＮＣａＰ細胞への結合性を示した。同様にＤＵ１４５細胞についても行った（図１０（ｂ））。ＤＵ１４５細胞を８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように２４穴プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ-１６４０中で５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩培養した。１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ-１６４０を加えて３０分間ブロッキングを行った後ＰＢＳにより洗浄し、調製した各サンプルをＢＰＡ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ-１６４０で希釈して添加後、３７℃で３, １２,２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄後、０．１％  ＳＤＳ／１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ  ２００μＬで可溶化した結果を図１０（ｂ）に示す。ＦＢＳの存在下においても、ＤｉＩ標識ＢＰＡ修飾リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ）はＤｉＩ標識ＰＥＧ修飾リポソーム（ＰＥＧ−ｌｉｐｏ）と比較して有意に高いＤＵ１４５細胞への結合性を示した。このことから生体内においてもＢＰＡ修飾リポソームは前立腺がん細胞への結合性をもち、前立腺がんを標的とすることができることを示唆している。
【００５５】
３−４．前立腺がん細胞への結合の特異性の確認
ＬＮＣａＰ細胞以外のヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ１４５細胞を、正常細胞として正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：Human umbilical vein endothelial cells）を用い、上記と同様の方法でＢＰＡ修飾リポソームの細胞への結合性を調べた結果を図１１に示す。ＤＵ１４５細胞ではＬＮＣａＰ細胞の際と同様に対照リポソームと比較してＢＰＡ修飾リポソームが細胞に強く結合したが（図１１（ａ））、正常細胞としてＨＵＶＥＣを用いた場合は、コントロールとでは結合性に差は見られなかった（図１１（ｂ））。したがってＢＰＡ修飾リポソームは、様々な種類の前立腺がん細胞に対して特異的に結合することが示唆された。
【００５６】
３−５．不活性化ＢＰＡ修飾リポソームのＤＵ１４５細胞への結合性
ＢＰＡを８０℃で３０分間反応させることで、赤血球凝集活性が消失することが知られている。そこで熱により不活化させたＢＰＡ集積リポソーム（ＢＰＡ−ｌｉｐｏ（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）を用いＤＵ１４５細胞への結合実験を行ったところ、不活性化ＢＰＡ修飾リポソームの細胞への結合はＰＥＧ修飾リポソーム（ＰＥＧ−ｌｉｐｏ）と同程度となり、ＤＵ１４５細胞への有意な集積は見られなかった（図１２）。
【００５７】
４．薬物封入ＢＰＡ修飾リポソームの前立腺がんの治療効果
以上より、ＢＰＡ修飾リポソームは前立腺がん細胞に対して有意に高い結合性を示すことが明らかとなった。そこでＢＰＡ修飾リポソームを用いた前立腺がんの治療への適用を検討し、薬物封入ＢＰＡ修飾リポソームを作製した。
（ＤＯＸ封入リポソームの調製）
ＤＰＰＣ（日本精化株式会社製）及びコレステロール（日本精化株式会社製）をそれぞれクロロホルム（和光純薬工業株式会社製）に溶解（１００ｍＭ）した。これらのＤＰＰＣ溶液及びコレステロール溶液をＤＰＰＣ／コレステロールのモル比が２０／１０の組成となるようにナス型フラスコに分取し、適量のクロロホルムと混合した。ロータリーエバポレーターを用いて減圧下でクロロホルムを留去し、１時間以上真空ポンプにて減圧乾固した。６０℃条件下でＤＰＰＣが最終濃度４０ｍＭとなるように０．３Ｍ  citric acid solution（Ｃ６Ｈ８Ｏ７・Ｈ２Ｏ（和光純薬工業株式会社製）６．３ｇを超純水に溶解して１００ｍＬにし、５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ＝４．０に調整）を加えて水和後、液体窒素を用いて凍結融解を３回行った。次に、バス型ソニケーター（1510J-MTH、ヤマト科学株式会社製）で１０分間処置後、６０℃に加温したExtruder（Lipex Biomembranes, Inc. 製）を用い、１００ｎｍ孔径のポリカーボネート膜（Nucleopore Track-Tech Membrane, Whatman Ltd. 製）に通すことによりサイズを調整した。この調製したリポソーム１ｍＬと、０．５Ｍ  sodium carbonate（Ｎａ２ＣＯ３（和光純薬工業株式会社製）５．３ｇを超純水に溶解して１００ｍＬにし、５Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ＝１１．５に調整）０．７８ｍＬ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）０．２２ｍＬを混合した。その溶液に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに溶解した５ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＸ（ドキソルビシン；和光純薬工業株式会社製）溶液１ｍＬを加え、６５℃で１時間攪拌した。超遠心機（himac CS120GXL、日立工機株式会社製）で遠心操作（１００，０００ｒｐｍ，４℃，１５分間）を３回行い、沈殿をＰＢＳで再懸濁し、ＤＯＸ封入リポソームとした。
【００５８】
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（日油株式会社製）（ＤＰＰＣに対して最終濃度２．５ｍｏｌ％）およびＢＰＡ（ＤＰＰＣに対して最終濃度０．０２５ｍｏｌ％）を０．１Ｍ  borate bufferに溶解し、室温で一晩攪拌した。この反応溶液と作製したＤＯＸ封入リポソームに溶解し、５０℃で１５分間反応させた後、氷冷した。その反応溶液と０．１Ｍ  borate bufferに溶解したＢＰＡ溶液（ＤＰＰＣに対して最終濃度０．０２５ｍｏｌ％）を等量混合し、室温で一晩攪拌した。超遠心機（himac CS120GXL、日立工機株式会社製）で遠心（４５３，０００ｇ、４℃、１５分）を３回行い、沈殿をＰＢＳで再懸濁し、ＢＰＡ修飾ＤＯＸ封入リポソーム溶液とした。また、対照のリポソームとして未修飾ＤＯＸ封入コントロールリポソームとＢＳＡ修飾ＤＯＸ封入リポソームも同様の方法により作製した。ＢＳＡ修飾ＤＯＸ封入リポソームの調製では、ＢＰＡ修飾ＤＯＸ封入リポソームで加えたＢＰＡと等モル量のＢＳＡを使用し、同様に調整した。
【００５９】
以下の方法でリポソームへの封入率を調べた。ＤＯＸを各０，０．１，０．５，１，５，１０，５０，１００μｇ／ｍＬになるように、１％Triton X-100（シグマアルドリッチ社製）を含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（和光純薬工業株式会社製）溶液にて希釈し、６０℃で１０分間加温し、検量線作成用サンプルとした。また、調製したＤＯＸ封入リポソーム溶液５０μＬに２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを４００μＬ、１０％Triton X-100を５０μＬ加え、６０℃で１０分間加温し、測定用サンプルを調製した。マルチプレートリーダー（Infinite M200，Tecan社製）により吸光度を測定し（測定波長４８４ｎｍ）、ＤＯＸ定量のための検量線を作成し、検量線からリポソームに内封されたＤＯＸ濃度を求めた結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
９６穴プレートにＬＮＣａＰ細胞を播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０中で、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した後、ＲＰＭＩ−１６４０（血清無添加条件下）に置換し、ＤＯＸ封入標識リポソーム１μｇ／ｍＬを添加し、３７℃で３時間インキュベートした。洗浄後、生細胞測定用試薬TetraColor One（生化学工業株式会社製）を添加し、３７℃で３時間インキュベートした後、吸光度を測定し（測定波長４５０ｎｍ）、生細胞数を測定した。リポソームを添加していないサンプルの細胞数を１００％とし、各修飾リポソームを添加した場合の生細胞の割合（％）として、結果を図１３に示す。前立腺がんの治療薬の１つであるドキソルビシン（ＤＯＸ）を封入したＢＰＡ修飾リポソームは、他のＤＯＸ封入修飾リポソームと比較して封入したＤＯＸ量が少ないにもかかわらず、最も強く有意にＬＮＣａＰ細胞の増殖を抑えた。またＤＯＸを内封していないＢＰＡ封入リポソームは、ＬＮＣａＰ細胞の増殖抑制の効果がほとんど見られなかった。
【００６２】
また、Ｄ１４５細胞を用いて同様の実験を行った（図１４）。ＤＯＸ封入リポソームの調製については、ＬＮＣａＰ細胞の場合と同様に行った。ただし、加えたＤＯＸ（ドキソルビシン；和光純薬工業株式会社製）溶液の濃度は２ｍｇ／ｍＬとした。ＤＯＸ封入リポソームの調製を調整後、ＤＵ１４５細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６穴プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ-１６４０中で５％ＣＯ２存在下、３７℃で一晩培養した。ＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳに溶解したＤＯＸおよび調製したＤＯＸ内封リポソームをＤＯＸ最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ-１６４０（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）にて希釈して添加後、３７℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳにより洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ-１６４０中３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルに１０％ＣＣＫ-８含有ＲＰＭＩ１６４０（serum free）を加えて３７℃で２時間程度インキュベート後、マルチプレートリーダーを用いて吸光度を測定し (測定波長４５０ｎｍ／対照波長６３０ｎｍ)、生細胞数を測定した。図１４に示すように、ＤＯＸ内封ＢＰＡ修飾リポソームは、ＤＯＸ内封ＰＥＧ修飾リポソームと比較してＤＵ１４５細胞の増殖を有意に抑制した。これらの実験からＤＯＸ内封ＢＰＡリポソームは前立腺がんを標的とし、内封する抗がん剤のドキソルビシンにより前立腺がん細胞を抑制することができることが示された。
【００６３】
５．生体に対するＢＰＡ修飾リポソームの投与
リポソームを生体内に投与した際に、その後の体内動態並びにがん組織への送達がどうなるかを以下の手法により調べた。培養したＤＵ１４５細胞を、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ-１６４０培地とＢＤマトリゲル（１：１）に懸濁して細胞懸濁液を調製し、５週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雄性ヌードマウス（日本ＳＬＣ社製）の左腹側部皮下に０．１ｍＬ（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）投与することで、担がんマウスを作製した。次に、体内分布の測定を以下のとおりに行った。がん移植から５週間後の担がんマウスに、調製した３Ｈ標識リポソームを７４ｋＢｑ／０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅとなるように尾静脈投与した。投与から３,２４時間後、エーテル麻酔下で脱血し、血液を回収後、頸椎脱臼によりマウスを屠殺し、さらに各臓器(心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、前立腺)およびがんを摘出し、重量を測定した。採取した血液は３，０００ｒｐｍ、５分間遠心（ＭＲＸ１５０,Ｔｏｍｙ社製）し、回収した血清のうち５０μＬを測定用サンプルとして用いた。また、肝臓は全重量を測定後、１００ｍｇ程度に切り分け、重量を測定したものを測定用サンプルとして用いた。さらに投与したリポソーム溶液２０μＬについても測定用サンプルとして、以降の操作を行った。各サンプルにＳｏｌｖａｂｌｅ  １ｍＬを加え、５０℃で一晩インキュベートした。次にＩｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ  ０．５ｍＬを加えた後、Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ０．５ｍＬを加え、室温で一晩静置した。さらにＨｉｏｎｉｃ  Ｆｌｕｏｒ  １０ｍＬを加え、よく振った後、暗所に一晩静置した。その後、サンプルの放射活性を液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ-７４００,Ａｌｏｋａ社製）で測定した（図１５）。その結果、ＢＰＡ修飾リポソームはＰＥＧ修飾リポソームと集積がほとんど変わらなかったため、ＢＰＡ修飾リポソームは抗原性が低いことが示された。またがん組織への集積についてもＰＥＧ修飾リポソームと同等となった。ＰＥＧ修飾リポソームは細胞との相互作用が低いことが大きく薬理（抗がん）効果に影響するが、ＢＰＡを修飾することにより、細胞との相互作用ならびに細胞内への薬物の送達も上昇するため、たとえ同程度集積していても、薬理効果の面で大きなメリットが得られると考えられる。
６．ＤＯＸ内封ＢＰＡ修飾リポソームの治療効果
培養したＤＵ１４５細胞を、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ-１６４０培地とＢＤマトリゲル（１：１）に懸濁して細胞懸濁液を調製し、５週齢のＢＡＬＢ／ｃ系雄性ヌードマウス（日本ＳＬＣ社製）の左腹側部皮下に０．１ｍＬ（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）投与することで、担がんマウスを作製した。治療効果の検討は以下のように行った。がん移植から３６,４３,５０日経過後の担がんマウスにＰＢＳもしくは調製したＤＯＸ内封リポソームを０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ（ＤＯＸ濃度として２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）となるように尾静脈内投与した。がん移植３６日後から腫瘍体積および体重変化を測定し、治療効果の評価を行った。腫瘍体積はがんの短径および長径を測定し、以下に示す式に従って算出した。
腫瘍体積＝０．４×ａ×ｂ２（ａ；直径、ｂ；短径）
担がんマウスの固形がんの体積および体重変化について、結果を図１６に示した。がんの体積については、投与開始日のがんの体積を１００％とし、その後の体積の変化率（％）として示した。この結果、ＰＢＳ投与群においてはがんの増大が見られたのに対しＤＯＸ内封ＰＥＧ修飾リポソーム投与群およびＤＯＸ内封ＢＰＡ修飾リポソーム投与群はがんの増大を示すことが確認された。さらにＤＯＸ内封ＢＰＡ修飾リポソーム投与群については、がんの大きさを縮小することも同時に確認された。また、副作用の指標として測定した体重において、ＤＯＸ内封ＢＰＡ修飾リポソーム投与群において大きな体重の減少は見られなかった。
【００６４】
以上の結果より、ＢＰＡ修飾リポソームのＤＵ１４５細胞への集積はリポソーム上のＢＰＡと細胞上の糖鎖を介した特異的な接着であることが示唆された。また、インビボでの治療効果の検討において、有意な差がみられたことよりＢＰＡ修飾リポソームは前立腺がん治療に用いるドラッグデリバリーツールとして有用であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前記がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用して、前立腺がんを検出することができ、前立腺がんの判定の分野において好適に利用することができる。また、ムラサキモクワンジュレクチン（ＢＰＡ）及びオサジオレンジレクチン（ＭＰＡ）が前記がん細胞表面の糖鎖に結合する作用を利用して、リポソーム表面がＢＰＡ又はＭＰＡに修飾され、前立腺がんへの標的指向性を有することを特徴とするリポソーム輸送体を提供することができ、かかるリポソーム輸送体はドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）などの分野に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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