(57)【要約】【課題】表皮の老化形質を処置する。【解決手段】リンゴ幼果抽出物を有効成分とする、表皮幹細胞性維持剤を提供する。本発明の剤により、表皮の幹細胞性が維持される。また、本発明により、表皮幹細胞の機能維持により改善されうる皮膚の老化形質、例えば、細胞のターンオーバーの遅延、表皮生細胞層の菲薄化、それに伴うしわの形成、等が処置できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ幼果抽出物を有効成分とする、表皮幹細胞性維持剤。
【請求項２】
リンゴ幼果抽出物を有効成分とする、皮膚の老化形質処置剤。
【請求項３】
老化形質が、表皮に関連する、請求項2に記載の剤。
【請求項４】
表皮に関連する老化形質が、ターンオーバーの遅延、それに伴う表皮生細胞層の菲薄化若しくはしわの形成、皮膚の乾燥又はキメの乱れのいずれかである、請求項3に記載の剤。
【請求項５】
皮膚のキメを整えるための、請求項1に記載の剤。
【請求項６】
皮膚のうるおいを保つための、請求項1に記載の剤。
【請求項７】
リンゴ幼果抽出物を皮膚へ適用し、それにより表皮幹細胞性を維持して皮膚のキメを整える、美容方法。
【請求項８】
リンゴ幼果抽出物を皮膚へ適用し、それにより表皮幹細胞性を維持して皮膚のうるおいを保つ、美容方法。
【請求項９】
リンゴ幼果抽出物、及びアスコルビン酸又は化粧品として許容可能なその誘導体を含む、表皮適用用組成物。
【請求項１０】
表皮基底層へ適用するための、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
皮膚のキメを整える、または皮膚のうるおいを保つ、美容方法であって、表皮細胞の幹細胞性を維持する活性を有する物質を皮膚に適用することを含み、該物質がリンゴ幼果抽出物である、美容方法。
【請求項１２】
老化形質を処置する美容方法であって、表皮細胞の幹細胞性を維持する活性を有する物質を皮膚に適用することを含み、該物質がリンゴ幼果抽出物である、美容方法。
【請求項１３】
老化形質を処置するための物質のスクリーニング方法であって、準備した被験物質を表皮細胞に供与し、表皮細胞の幹細胞性を維持する活性の有無又は程度を指標として被験物質が老化形質を処置するのに有用であるかどうかを判定する工程を含む、方法（ただし、ヒト個体での実施を除く。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンゴ幼果抽出物を有効成分とする表皮幹細胞性維持剤、及びそれを含有する皮膚外用組成物に関する。本発明は、化粧品分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
1日1個のリンゴは医者を遠ざける (An apple a day keeps the doctor away.)という諺があるように、リンゴ果実は栄養価が高いものとして食されている。その一方で、リンゴ栽培においては、商品価値の高い果実を収穫するため、結実した果実を間引くことが行われ、多くの果実が未熟な状態で摘み取られる（摘果）が、未成熟なリンゴは、酸味が強く、渋いことから、食用には適さない。
【０００３】
リンゴ果実は、化粧品や外用剤の原料としても検討されており、例えば、特許文献1は、リンゴ抽出物を有効成分とする細胞間接着剤を提供する。また、特許文献2は、リンゴの未熟果実より搾汁および／または抽出された画分の精製物からなり、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害作用を有するポリフェノール画分を有効成分とする血圧降下剤を提案する。また、特許文献3及び4は、リンゴ抽出物、より特定するとリンゴ由来ポリフェノールを有効成分とする、脳ナトリウム利尿ペプチド（BNP）産生調節剤、及びトロンボキサンチンB 2（TXB2）調節剤をそれぞれ提案する。これらにおいては、より多くのポリフェノール化合物を含有すること、及び広範な生理作用を有する各種活性成分を多量に含むことから、リンゴ果実としては、幼果を用いることが好ましいとされている。さらに特許文献5は、心臓・筋肉特異的ＭｎＳＯＤ欠損マウスに、リンゴ幼果抽出物を投与した群が対照群と比べ、生存率が上昇したとの実験結果に基づき、リンゴ由来ポリフェノールを有効成分として含有してなることを特徴とする寿命延長剤、及びそれを含有する飲食品、食品添加物、医薬、及び香粧品を提案する
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2011-219454
【特許文献２】特開2002-047196（特許4142859号）
【特許文献３】特開2007-008837
【特許文献４】特開2007-008838
【特許文献５】特開2007-197374
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、表皮の老化形質の原因解明に向けた多くの研究を行ってきた。とりわけ、基底層に存在する細胞の中でも最も増殖能力に寄与していると考えられている表皮幹細胞の質に着目し、その機能維持に関する研究を進めてきた。その中で、今回、リンゴ幼果抽出物に表皮幹細胞に対する高い活性があることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、以下を提供する。
[1]  リンゴ幼果抽出物を有効成分とする、表皮幹細胞性維持剤。
[2]  リンゴ幼果抽出物を有効成分とする、皮膚の老化形質処置剤。
[3]  老化形質が、表皮に関連する、[2]に記載の剤。
[4]  表皮に関連する老化形質が、ターンオーバーの遅延、それに伴う表皮生細胞層の菲薄化若しくはしわの形成、皮膚の乾燥又はキメの乱れである、[3]に記載の剤。
[5]皮膚のキメを整えるための、[1]に記載の剤。
[6]皮膚のうるおいを保つための、[1]に記載の剤。
[7]リンゴ幼果抽出物を皮膚へ適用し、それにより表皮幹細胞性を維持して皮膚のキメを整える、美容方法。
[8]リンゴ幼果抽出物を皮膚へ適用し、それにより表皮幹細胞性を維持して皮膚のうるおいを保つ、美容方法。
[9]  リンゴ幼果抽出物、及びアスコルビン酸又は化粧品として許容可能なその誘導体を含む、表皮適用用組成物。
[10]表皮基底層へ適用するための、9記載の組成物。
[11]皮膚のキメを整える、または皮膚のうるおいを保つ、美容方法であって、表皮細胞の幹細胞性を維持する活性を有する物質を皮膚に適用することを含み、該物質がリンゴ幼果抽出物である、美容方法。
[12]老化形質を処置する美容方法であって、表皮細胞の幹細胞性を維持する活性を有する物質を皮膚に適用することを含み、該物質がリンゴ幼果抽出物である、美容方法。
[13]老化形質を処置するための物質のスクリーニング方法であって、準備した被験物質を表皮細胞に供与し、表皮細胞の幹細胞性を維持する活性の有無又は程度を指標として被験物質が老化形質を処置するのに有用であるかどうかを判定する工程を含む、方法（ただし、ヒト個体での実施を除く。）。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の剤により、表皮の幹細胞性が維持される。また、本発明により、表皮幹細胞の機能維持により改善されうる皮膚の老化形質、例えば、細胞のターンオーバーの遅延、表皮生細胞層の菲薄化、それに伴うしわの形成、等が処置できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図1Aは、コロニー形成試験において、リンゴ幼果抽出液と成熟果抽出液との効果を比較した写真である。
【図１Ｂ】図1Bは、コロニー形成試験において、リンゴ幼果抽出液と成熟果抽出液との効果を比較したグラフである。
【図２】図2は、コロニー形成試験における、リンゴ幼果抽出液とアスコルビン酸誘導体の相乗効果を示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、「〜」はその前後の数値を含む範囲を意味するものとする。また、%で表記する数値は、特に記載した場合を除き、質量を基準にした値である。
【００１０】
本発明の表皮幹細胞性維持剤（以下、「本発明の剤」ということがある。）は、バラ科リンゴ属植物である、リンゴ（学名：Malus pumila）の幼果の抽出物を有効成分とする。
【００１１】
本発明で「果実」、「幼果」又は「未熟果」というときの「果実」又は「果」は、特に記載した場合を除き、リンゴ果実の、全体又はその一部を指す。「その一部」には、果皮、果肉、ピュレ、果汁、種子が含まれる。本発明へは、果実の全部を用いることができる。
【００１２】
本発明でリンゴ果実に関し「幼果」というときは、特に記載した場合を除き、リンゴ果実であって、結実以後成熟に至る前のいずれかの段階にある未成熟の果実を指す。摘果は通常5月〜6月の期間に、結実後20〜45日程度を目安に行われ、摘み取られる幼果は直径2〜5cm程度の大きさであるが、本発明においてはこのような幼果を好適に用いることができる。
【００１３】
本発明で「リンゴ」というときは、特に記載した場合を除き、品種に限定はなく、いずれの品種であってもよく、また、早生種、中生種、及び晩生種のいずれであってもよい。品種の例は、ふじ、つがる、王林、ジョナゴールド、北斗、陸奥、千秋、デリシャス系、紅玉、さんさ、秋映、陽光、シナノスイート、世界一、旭、印度、グラニースミス、国光、スターキング、津軽及びハックナイン等である。
【００１４】
本発明の抽出原料としてのリンゴ幼果は、生のものであってもよく、加工物であってもよい。摘果後直ちに用いてもよく、また腐敗が進んでいない限り、摘果してしばらくたってからのものを用いてもよい。抽出工程に供する前に、抽出が効率的に行われるように、裁断・粉砕等の前処理を行ってもよい。
【００１５】
本発明で「抽出物」というときは、特に記載した場合を除き、リンゴ幼果を抽出溶媒に浸漬して得られた液から固形物を除いたものそのものであってもよく、該液を、濃縮、乾燥等したものであってもよい。抽出物の形態は、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等いずれでもあり得る。また、リンゴ幼果果汁そのものであってもよく、該果汁を、濃縮、乾燥等したものであってもよい。固体状又は粉末状とするためには、液状物を、乾燥工程に供し、乾固させて固体状としてもよく、スプレードライにより乾燥させて粉末としてもよい。
【００１６】
本発明に用いるリンゴ幼果抽出物は、一般的な方法で調製することができる。例えば、リンゴ幼果を、溶媒に浸漬することにより調製することができる。抽出溶媒としては特に限定されないが、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール等）、多価アルコール類（グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール（BG）等）、ケトン類（アセトン、メチルケトン等）、エーテル類（ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、酢酸エチル等のエステル類；ヘキサン等からなる群より選択される一種又は二種以上を用いることができる。中でも使用性、安全性の点で水、低級アルコール類、多価アルコール類が好ましい。抽出のための条件は、当業者であれば適宜設計することができるが、例えば、リンゴ幼果を室温又は加温下で、溶媒中に1時間〜数か月の期間浸漬することによって実施できる。原料リンゴ幼果と溶媒との比は、当業者であれば適宜設計することができるが、例えば、リンゴ幼果原料1質量部に対する溶媒量は、原料が十分に浸漬できる量であればよく、0.5質量部以上であることが好ましく、1質量部以上であることがより好ましく、2質量部以上であることがより好ましい。溶媒量の上限は、経済的な観点から定めることもでき、原料1質量部に対する溶媒量として、例えば、100質量部以下とすることができ、50質量部以下とすることが好ましく、10質量部以下とすることがより好ましい。抽出温度及び期間もまた、当業者であれば適宜設計でき、室温又は加温下で、溶媒中に1時間〜数か月の期間浸漬することによって実施できる。抽出はまた、水蒸気蒸留の方法に拠ってもよい。
【００１７】
リンゴ幼果又は抽出物が幼果果汁である場合、その果汁は一般的な方法で調製することができる。例えば、洗浄した原料をpH3.2〜4.6、好ましくはpH3.5〜4.3で破砕し、得られた破砕物をペクチナーゼ処理して清澄化を行い、固形物を除くことによる。
【００１８】
本発明は、リンゴ幼果抽出物を、表皮幹細胞性維持剤の有効成分として用いる。表皮幹細胞性維持剤とは、皮膚の表皮細胞に、幹細胞性を維持させるために適した剤の意である。
【００１９】
本発明で「幹細胞性」というときは、特に記載した場合を除き、自己複製能及び多分化能を有し、増殖性であることをいう。また、本発明で「表皮幹細胞」というときは、特に記載した場合を除き、表皮に存在して、自己複製能を有し、かつ表皮に見られる主要な特化細胞に分化する能力を有し、増殖性である細胞をいう。
【００２０】
ある成分が、表皮幹細胞性維持剤の有効成分たり得るか否かは、表皮細胞を用いたコロニー形成試験により、評価し、判断することができる。表皮幹細胞を用いたコロニー形成試験は、典型的には、下記の方法御呼び判断基準による。
【００２１】
〔方法〕
細胞培養用ディッシュに、培養に適した培地に懸濁した表皮細胞(ケラチノサイト)を、5×103 cells／cm2となるように播種する。
一日後、試験対象成分を適切な段階の濃度で含む培地と、播種の際の培地とを交換する（試験対象成分を含まない通常の培地に交換した後、適切な濃度となるように、試験対象成分を添加してもよい。以下同じ。）。これを培養第1日目とする。
以後、2日おきに、試験対象成分を同じ濃度となるように添加した培地と交換する。
培養第8日目に、固定し（例えばフォルマリン固定し）、染色し（例えば、クリスタルバイオレットにて染色し）、観察する。
【００２２】
〔判断基準〕
対照として、同じ表皮細胞について試験対象成分を含まない培地を用いた系を準備する。
そして、コロニーの数をカウントし、対照より増加し、かつ濃度依存的に増加した場合に、幹細胞性を維持させるために適した成分であると判断する。コロニー数は、直径6mm未満のものと直径6mm以上のものとに分けてカウントしてもよい。
【００２３】
発明の剤の有効成分として十分な効果が得られうるとの観点からは、化粧品として許容可能な濃度で用いた場合（例えば、本明細書の実施例で示した方法で得た固形分濃度0.3%の抽出液としては、0.1%の濃度で用いた場合）に、コロニー数が対照と比較して、50%以上増加していることが好ましく、75%以上増加していることがより好ましい。また、より長い期間において幹細胞性を維持しうるとの観点からは、直径6mm以上のコロニーの数が対照より増加し、かつ濃度依存的に増加していることが好ましく、化粧品として許容可能な濃度で用いた場合（例えば、本明細書の実施例で示した方法で得た固形分濃度0.3%の抽出液としては、0.1%の濃度で用いた場合）に、直径6mm以上のコロニーの数が対照と比較して、50%以上増加していることがより好ましく、75%以上増加していることがさらに好ましい。
【００２４】
なお、本発明で「幹細胞性維持」というときは、特に記載した場合を除き、「コロニー形成能維持」、「幹細胞分化抑制」、又は「幹細胞賦活」と言い換えることができる。また、表皮幹細胞は、皮膚の表皮の主として基底層に存在することから、本発明の剤を、「基底層処置剤」、「基底層改善剤」と言い換えることができる。
【００２５】
本発明者らの検討によると、表皮の幹細胞性が失われると、老化した形質として現れる、各種表皮生理機能の低下が生じる。より具体的にはターンオーバーの遅延、それに伴う表皮生細胞層の菲薄化、それに伴うしわの形成が生じうる。しわは、真皮に関連した原因により生じる場合もあるが、表皮が薄くなることにより形成される可能性も考えられる。一方、表皮幹細胞性が維持され、各種表皮機生理機能が維持又は改善されると、皮膚のキメ、水分・油分の保持、柔軟性、はり、ツヤ、滑らかさ、白さ等の点で、好ましい現象が生じうる。したがって、本発明の剤は、老化形質処置剤として用いることができ、また表皮に関連する種々の老化形質、ターンオーバーの遅延、それに伴う表皮生細胞層の菲薄化若しくはしわの形成の処置のために、また表皮幹細胞性維持により改善される状態の処置のため（例えば皮膚のキメを整えるため、皮膚のうるおいを保つため）、またこれらのいずれかを目的とした美容方法においてにも用いうる。
【００２６】
なお、本発明で「処置」というときは、特に記載した場合を除き、予防、改善及び進行を遅らせることを含む。また、本発明で「美容方法」というときは、特に記載した場合を除き、ヒトに対する医療行為を含まない。また「皮膚」又は「肌」というときは、特に記載した場合を除き、その場所は限定されず、頭皮を含む体表面のあらゆる皮膚を含む。
【００２７】
本発明で「剤」というときは、特に記載した場合を除き、リンゴ幼果抽出物自体であることもあり、抽出物に、希釈剤、安定化剤、酸化防止剤、防腐剤等の添加物を添加した、抽出物と添加物とかなるものであることもある。本発明の剤には、既存の外用組成物は含まれない。
【００２８】
本発明の剤は、リンゴ幼果抽出物を、本明細書の実施例で示した方法で得た固形分濃度0.3%の抽出液としては、好ましくは0.001％以上含むことができ、0.01％以上含むことがより好ましく、0.1％以上含むことがさらに好ましい。より長い期間において幹細胞性を維持しうるとの観点からは、0.3％以上含むことが好ましく、1％以上含むことがさらに好ましい。異なる固形分濃度の抽出液を用いる場合、固形分を基準に、本明細書の実施例で示した方法で得た固形分濃度0.3%の抽出液に当するする量が計算できる。なお、本発明で成分含量に関し、％で表すときは、特に記載した場合を除き、質量％（全量100質量g当たりの成分質量の率）である。
【００２９】
本発明の剤は、皮膚外用組成物、及び皮膚外用組成物の内、特に表皮への適用に適した表皮適用組成物に添加して用いることができる。
本発明で「皮膚外用組成物」、及び「表皮適用組成物」というときは、特に記載した場合を除き、少なくとも有効成分と他の成分とを含んでおり、皮膚表面又は表皮へ、内服又は注射以外の方法により外用するのに適した形態の組成物をいう。なお皮膚表面又は表皮への適用のための具体的な方法としては、局部に塗布、噴霧又は貼付等することが挙げられるが、マイクロニードルアレイ、イオントフォレーシス等の各種経皮送達促進方法又はそれらを組み合わせた方法としてもよい。
【００３０】
本発明の組成物は、化粧料組成物（化粧品又は医薬部外品）又は医薬組成物（医薬品）の形態でありうる。
【００３１】
本発明の組成物に、上述したような本発明の剤が含有される場合、その含量は、適宜とすることができる。例えば、本明細書の実施例で示した方法で得た固形分濃度0.3%の抽出液としては、0.0001％以上含むことができ、0.001％以上含むことが好ましく、0.01％以上含むことがより好ましい。より長い期間において幹細胞性を維持しうるとの観点からは、0.03％以上含むことが好ましく、0.1％以上含むことがさらに好ましい。また、いずれの場合であっても、20％以下とすることができ、10％以下とすることが好ましく、5％以下とすることがより好ましい。
【００３２】
本発明の好ましい態様においては、有効成分としてのリンゴ幼果抽出物は、アスコルビン酸又は化粧品として許容可能なその誘導体と併用される。併用とは、一緒に用いることであり、典型的には、一の剤又は組成物中に双方を含んだものを用いることであるが、それぞれを別剤（又は別組成物）として、同時に、又は順に使用することを含む。本発明者らの検討によると、併用により、目的の効果が相乗的に増すことが分かっている。
【００３３】
本発明でアスコルビン酸に関し、「誘導体」というときは、特に記載した場合を除き、アスコルビン酸の、塩、エステル、又は配糖体を含み、水溶性であっても油溶性であってもよい。アスコルビン酸誘導体の化粧品として許容可能な例は、6-ステアリン酸アスコルビル、6-パルミチン酸アスコルビル、2,6-ジパルミチン酸アスコルビル、2,3,5,6-テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、アスコルビル／トコフェリル）リン酸K、アスコルビン酸-2-硫酸2Na、アスコルビン酸Na、アスコルビン酸-2-リン酸Mg、アスコルビン酸-2-リン酸Na、アスコルビル-2-グルコシドである。本発明には、アスコルビン酸誘導体としては、化粧品として許容可能な任意のものを用いることができる。好ましい例の一つは、アスコルビン酸-2-リン酸Mg （magnesium L-ascorbyl-2-phosphate）である。
【００３４】
併用の際の2成分それぞれの使用量や比は、当業者であれば適宜設定できる。併用の場合、リンゴ抽出物の濃度は、本明細書の実施例で示した方法で得た固形分濃度0.3%の抽出液としては、として、0.0005％以上含むことができ、0.005％以上含むことがより好ましく、0.05％以上含むことがさらに好ましい。より長い期間において幹細胞性を維持しうるとの観点からは、0.015％以上含むことが好ましく、0.05％以上含むことがさらに好ましい。また、いずれの場合であっても、10％以下とすることができ、5％以下とすることが好ましく、2.5％以下とすることがより好ましい。
【００３５】
またアスコルビン酸誘導体の濃度は、アスコルビン酸-2-リン酸Mg を用いる場合、0.25μg/ml以上含むことができ、2.5μg/ml以上含むことがより好ましく、25μg/ml以上含むことがさらに好ましい。また、いずれの場合であっても、250,000μg/ml以下とすることができ、好ましくは25,000μg/ml以下であり、より好ましくは2,500μg/ml以下である。他の誘導体を用いる場合はそれと同じか、又はモル濃度としてそれに相当する濃度範囲で用いることができる。なお、アスコルビン酸誘導体は、上述したコロニー形成試験において、陽性対象として用いることもできる。ここの試験におけるアスコルビン酸誘導体の濃度は、適宜とすることができるが、典型的には、magnesium L-ascorbyl-2-phosphateを用いる場合は、250 μg/mlである。
【００３６】
併用の場合の、リンゴ幼果抽出物とアスコルビン酸誘導体との比は、リンゴ幼果抽出物固形分（本明細書の実施例で示した方法で得た乾燥物に相当する量）1質量部に対し、0.0025〜25,000質量部とすることができ、0.025〜2,500質量部とすることが好ましく、0.25〜250質量部とすることがより好ましい。
【００３７】
本発明の組成物（なお、本発明で「組成物」というときは、特に記載した場合を除き、併用のための組成物も包含する。）は、本発明の剤の効果を損なわない範囲で、化粧料又は医薬として許容される成分であって、皮膚に対して効果を有する成分を含んでいてもよい。このような成分の例は、美白剤、紫外線防御剤、抗菌剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、活性酸素除去剤、保湿剤、皮膚を清浄にする成分、ニキビ、アセモを防ぐ成分である。
【００３８】
本発明の組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、本発明の剤以外に、化粧料又は医薬として許容される、種々の添加物を配合することができる。この例は、水（精製水、温泉水、海洋深層水等）、界面活性剤（乳化剤、懸濁化剤、安定剤等）、酸化防止剤、防腐剤、ゲル化剤、アルコール類、皮膜形成剤、着色料、香料、消臭剤、塩類、ｐＨ調整剤、清涼剤、キレート剤、角質溶解剤、酵素、ビタミン類等がある。
【００３９】
本発明の組成物はまた、その使用目的に応じて、固形剤、半固形剤、液剤等の各種剤形の組成物に調製することができる。より具体的には、本発明の組成物は、スキンケア化粧品として、クレンジング、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、マッサージ製品、パック製品、美容液・ジェル、リップケア製品等；ベースメーク化粧品として、ファンデーション、フェイスパウダー、化粧下地、コンシーラー等；ポイントメーク化粧品として、口紅、リップグロス・ライナー、チーク製品、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ、アイブロウ製品等；ボディケア化粧品として石鹸、液体洗浄料、日焼け止めクリーム、入浴剤等；ヘアケア化粧品としてシャンプー、リンス、ヘアトリートメント、整髪料、ヘアトニック、育毛剤、スキャルプトリートメント等とすることができる。また、硬膏剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、塗布剤、貼付剤、エアゾール剤（スプレー薬）とすることができる。また、マイクロニードルアレイ用組成物、イオントフォレーシス用組成物とすることができる。
【００４０】
本発明の組成物はまた、キット又はコマーシャルパッケージとすることができる。これらの態様は、本発明の組成物以外に、使用方法や上述したような目的の効果・効能が記載されたもの（例えば、箱、容器、ラベル、使用説明書、タグ）を含んでもよい。
【００４１】
本発明はまた、リンゴ幼果抽出物を組成物に添加する工程を含む、皮膚における及びリンゴ幼果抽出物を用いることを特徴とする、皮膚における表皮細胞の幹細胞性を維持する方法を提供する。本発明で「リンゴ幼果抽出物を組成物に添加する工程」というときは、組成物の商業的な製造において、リンゴ幼果抽出物を原料として用いることを含む。また本発明で「リンゴ幼果抽出物を用いることを特徴とする」というときは、リンゴ幼果抽出物を有効成分として含有する組成物を用いることを含む。本発明の方法は、目的の処置のために他人に対して実施する場合を含む。本発明の方法は、医師以外の者、例えば、化粧品又は医薬品の製造者、販売者、メイクアップ・アーティスト、美容スタッフ、又はエステシャン等が行うことができる。
【００４２】
本発明はまた、老化形質を処置するための物質のスクリーニング方法を提供する。この方法においては、準備した被験物質を表皮細胞に供与し、表皮細胞の幹細胞性を維持する活性の有無又は程度を指標として被験物質が老化形質を処置するのに有用であるかどうかを判定する工程を含む。本発明のこの方法は、動物由来の培養細胞のほか、動物個体を用いた系として構築することができるが、動物個体としては、ヒト以外（例えば、マウス、ラット等）とすることができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【００４４】
［実施例1：リンゴ幼果抽出物の調製］
次のようにしてリンゴ幼果抽出物を得た。
ハックナイン種の、果径20ｍｍ以内であって、落花後1ヶ月以内の幼果（未熟果）に対し、13倍量の20％(w/w)1,3-ブチレングリコール（1,3-Butylene Glycol）水溶液を加え、室温にて2日間抽出した。溶媒を除去した固形分濃度は0.3％であった。
【００４５】
［実施例2：コロニー形成試験］
上記で調製した抽出液について、下記の手順で、コロニー形成試験を実施した。
(1)ヒト由来ケラチノサイト前駆細胞を、60 mmの細胞培養用ディッシュに播種する。
・使用細胞：ヒト由来ケラチノサイト前駆細胞（CELLnTEC Advanced Cell Systems AG (Bern, Switzerland)）
・使用培地：CnT-57 growth medium (CELLnTEC)
・播種量：  1×105 cells／60 mm dish (21.3 cm2)
(2) サンプル（実施例1のリンゴ幼果抽出液、及び同様に抽出したリンゴ成熟果抽出液）を準備する。
(3) 培養一日後より、サンプルを添加する。CnT-57 growth medium (CELLnTEC)
(4) 2日置きに培養液交換する。同時にサンプルも添加する。
(5)培養8日後にディッシュを回収し、フォルマリン固定後クリスタルバイオレットにて染色する。
(6)観察及び／又は写真撮影する。
【００４６】
結果を図1A、B及び下表に示した。
【００４７】
【表１】
2013209302.tif 000002
【００４８】
図1A、B及び上表に示した結果から、リンゴ幼果抽出液を添加した系は、成熟果抽出液を添加した系に比較して、コロニーが多く形成されていた。また、コロニー数は、濃度依存的であった。
【００４９】
［実施例3：アスコルビン酸誘導体との相乗効果］
アスコルビン酸誘導体として、リン酸L-アスコルビルマグネシウム（magnesium L-ascorbyl-2-phosphate）をリンゴ幼果抽出物と一緒に供しするほかは実施例2と同様にして、コロニー形成における相乗効果を評価した。
【００５０】
結果を図2に示した。
アスコルビン酸誘導体（分子量278.39）のみを250 μg/mlで供した場合、コロニー形成がほとんど見られなかったが、1％のリンゴ幼果抽出液と併用した場合には、1％リンゴ幼果抽出液のみを供した場合に比較してより多くのコロニーが形成された。これは、リンゴ幼果抽出液とアスコルビン酸誘導体との併用による相乗的な効果であると考えられた。
【００５１】
［実施例4：処方例］
［化粧水1］
（製法）
Ａ.下記成分（1）〜（8）を混合溶解する。
Ｂ.下記成分（9）〜（15）を混合溶解する。
Ｃ.ＢにＡを加え混合し、化粧水を得る。
（成分）（質量％）
（1）メドウホーム油  0.1
（2）ホホバ油  0.05
（3）香料  適量
（4）フェノキシエタノール  0.1
（5）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（20Ｅ.Ｏ.）ソルビタン  0.5
（6）イソステアリン酸ポリオキシエチレン（50Ｅ.Ｏ.）硬化ヒマシ油  1.0
（7）エタノール  8.0
（8）トコフェロール  0.05
（9）グリチルリチン酸ジカリウム  0.1
（10）グリセリン  5.0
（11）1，3−ブチレングリコール  5.0
（12）ポリエチレングリコール1500  0.1
（13）リンゴ幼果抽出液（＊1）  0.1
（14）加水分解コラーゲン  0.001
（15）精製水  残量
（＊1）実施例1により調製されたもの
【００５２】
［化粧水2］
（製法）
Ａ.下記成分（1）〜（8）を混合溶解する。
Ｂ.下記成分（9）〜（12）を混合溶解する。
Ｃ.ＡにＢを加え混合し、化粧水を得た。
（成分）（質量％）
（1）クエン酸  0.05
（2）クエン酸ナトリウム  0.2
（3）ピロリドンカルボン酸ナトリウム（50％）水溶液  0.5
（4）アスコルビン酸グルコシド  0.3
（5）リンゴ幼果抽出液（＊2）  0.1
（6）グリセリン  3.0
（7）1，3−ブチレングリコール  8.0
（8）精製水  残量
（9）エタノール  10.0
（10）カテキン  0.0001
（11）香料適量
（12）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（20Ｅ.Ｏ.）ソルビタン  0.5
（＊2）実施例1により調製されたもの
【００５３】
［乳液］
（製法）
Ａ.下記成分（11）の一部を加熱し、70℃に保つ。
Ｂ.下記成分（1）〜（10）を加熱混合し、70℃に保つ。
Ｃ.ＢにＡを加えて混合し、均一に乳化する。
Ｄ.Ｃを冷却後、下記成分（12）〜（16）と（11）の残部を混合してから加え、均一に混合して乳液を得た。
（成分）（質量％）
（1）ポリオキシエチレン（10Ｅ.Ｏ.）ソルビタンモノステアレート  1.0
（2）ポリオキシエチレン（60Ｅ.Ｏ.）ソルビタントリオレエート  0.5
（3）グリセリルモノステアレート  1.0
（4）ステアリン酸  0.5
（5）ベヘニルアルコール  0.5
（6）スクワラン  8.0
（7）エタノール  5.0
（8）パルミチン酸レチノール  0.1
（9）グリチルレチン酸ステアリル  0.1
（10）フェノキシエタノール  0.1
（11）精製水  残量
（12）カルボキシビニルポリマー  0.2
（13）水酸化ナトリウム  0.1
（14）ヒアルロン酸  0.1
（15）リンゴ幼果抽出液（＊3）  0.03
（16）香料適量
（＊3）実施例1により調製されたもの
【００５４】
［リキッドファンデーション（水中油型クリーム状）］
（製造方法）
Ａ：成分（6）〜（11）を分散する。
Ｂ：Ａに成分（12）〜（17）を加え70℃で均一に混合する。
Ｃ：成分（1）〜（5）を70℃で均一に混合する。
Ｄ：ＣにＢを加え乳化し、室温まで冷却する。
Ｅ：Ｄに成分（18）、（19）を添加し均一に混合して水中油型クリーム状リキッドファンデーションを得た。
（成分）（質量％）
（1）アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合（注1）  0.5
（2）トリエタノールアミン  1.5
（3）精製水  残量
（4）グリセリン  5
（5）パラオキシ安息香酸エチル  0.1
（6）1，3ブチレングリコール  5
（7）水素添加大豆リン脂質  0.5
（8）酸化チタン  5
（9）ベンガラ  0.1
(10)黄酸化鉄  1
(11)黒酸化鉄  0.05
(12)ステアリン酸  0.9
(13)モノステアリン酸グリセリン  0.3
(14)セトステアリルアルコール  0.4
(15)モノオレイン酸ポリオキシエチレン（20Ｅ.Ｏ.）ソルビタン  0.2
(16)トリオレイン酸ポリオキシエチレン（20Ｅ.Ｏ.）ソルビタン  0.2
(17)パラメトキシケイ皮酸2―エチルヘキシル  5
(18) リンゴ幼果抽出液（＊4）  1
(19)香料  0.02
（＊4）実施例1により調製されたもの
（注1）ペミュレンＴＲ−2（ＮＯＶＥＯＮ社製）
【００５５】
［日焼け止め化粧料（油中水型クリーム状）］
（製造方法）
Ａ：成分（1）〜（7）を均一に分散する。
Ｂ：成分（8）〜（12）を均一に分散する。
Ｃ：Ｂを攪拌しながら徐々にＡを加えて乳化し、油中水型クリーム状日焼け止め化粧料を得た。
（成分）（質量％）
（1）モノラウリン酸ポリオキシエチレン（20Ｅ.Ｏ.）ソルビタン  0.2
（2）ＰＯＥ（60）硬化ヒマシ油  0.1
（3）精製水  残量
（4）ジプロピレングリコール  10
（5）硫酸マグネシウム  0.5
（6) リンゴ幼果抽出液（＊5）  0.05
（7）アスコルビルリン酸マグネシウム  3
（8）ＰＥＧ−9ポリジメチルシロキシエチルジメチコン（注2）  3
（9）デカメチルシクロペンタシロキサン  20
（10）イソノナン酸イソトリデシル  5
(11)パラメトキシケイ皮酸2−エチルヘキシル  8
（12)ジメチルステアリルアンモニウムヘクトライト  1.2
（＊5）実施例1により調製されたもの
（注2）ＫＦ−6028（信越化学工業社製）
【００５６】
［軟膏剤］
（製造方法）
Ａ.成分（5）、（6）及び（9）の一部を加熱混合し、75℃に保つ。
Ｂ.成分（1）〜（4）を加熱混合し、75℃に保つ。
Ｃ.ＡにＢを徐々に加え、これを冷却しながら成分（9）の残部で溶解した（7）(8)を加え、軟膏剤を得た。
（成分）（質量％）
（1）ステアリン酸  18.0
（2）セタノール  4.0
（3）酢酸ｄｌ−α―トコフェロール（注3）  0.2
（4）パラオキシ安息香酸メチル  0.1
（5）トリエタノールアミン  2.0
（6）グリセリン  5.0
（7）グリチルリチン酸ジカリウム（注4）  0.5
（8）リンゴ幼果抽出液（＊6）0. 1
（9）精製水  残量
（＊6）実施例1により調製されたもの
（注3）エーザイ社製
（注4）和光純薬工業社製
【００５７】
［ローション剤］
（製造方法）
Ａ.成分（4）〜（7）を混合溶解する。
Ｂ.成分（1）〜（3）を混合溶解する。
Ｃ.ＡとＢを混合して均一にし、ローション剤を得た。
（成分）（質量％）
（1）グリセリン  5.0
（2）1，3−ブチレングリコール  6.5
（3）精製水  残量
（4）ポリオキシエチレン（20Ｅ.Ｏ.）ソルビタンモノラウリン酸エステル  1.2
（5）エチルアルコール  8.0
（6）リンゴ幼果抽出液（＊7）  0.1
（7）パラオキシ安息香酸メチル  0.2
（＊7）実施例1により調製されたもの
【００５８】
［養毛剤］
（製造方法）
Ａ.成分（1）〜（5）を混合溶解する。
Ｂ.成分（6）〜（10）を混合溶解する。
Ｃ.ＡとＢを混合して均一にし、養毛剤を得た。
（成分）（質量％）
（1）エチルアルコール  50.0
（2）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（80Ｅ.Ｏ）  0.5
（3）メントール  0.05
（4）カンファ  0.01
（5）フェノキシエタノール  0.05
（6）精製水  残量
（7）リンゴ幼果抽出液（＊7）  1
（8）オタネニンジン抽出物（注5）  0.5
（9）パントテニルアルコール（注6）  0.1
（10）グリセリン  5.0
（＊8）実施例1により調製されたもの
（注5）一丸ファルコス社製
（注6）関東化学社製
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、天然物由来の、表皮幹細胞性維持剤、並びにそれらを含む皮膚外用組成物を提供することができる。本発明の剤又は組成物は、化粧品として用いることができる。
【図１Ａ】
2013209302.tif 000003
【図１Ｂ】
2013209302.tif 000004
【図２】
2013209302.tif 000005