(57)【要約】【課題】  本発明は、予想を超えた治療効果を有する癌を治療するための効率的なツールを開発することを目的とする。【解決手段】  本発明の発明者らは、SLAMを選択的に認識しない組換えMV（rMV-SLAMblind）を作製し、そして癌細胞（乳癌細胞など）に対する新規な治療剤としてのその潜在能力について研究した。本発明において、本発明の発明者らは、麻疹ウイルスが、SLAMではなくPVRL4を介して癌細胞に入り、抗-癌性の腫瘍溶解作用を提供する能力を有することを見出し、併せてPVRL4に対する結合活性を有する麻疹ウイルスを含む癌を治療するための医薬組成物を提供することができることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
PVRL4との結合活性を保持する麻疹ウイルスを含む、癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
麻疹ウイルスが、SLAMとの結合活性およびCD46との結合活性を欠損している、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
麻疹ウイルスが組換えウイルスである、請求項1または2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
麻疹ウイルスが、麻疹ウイルスHL野生型株の全長DNAをコードするプラスミドpMV-HL（7+）であって、533番アミノ酸をアルギニンからアラニンへの置換させたものから、リバースジェネティクスにより作製されたものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
治療される癌が、SLAMを発現しない癌である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
治療される癌が、乳癌、卵巣癌、肺癌または大腸癌である、請求項5に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麻疹ウイルス（MV）-HL株を元にした組換え腫瘍溶解性ウイルスの発明に関し、そして腫瘍溶解性ウイルスを使用して癌を治療する方法の発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、乳房組織からもともと発生する癌の種類であり、女性の癌による死亡の最も多い原因である。乳癌は、ヒトおよびその他の哺乳動物の疾患であり、ヒトにおける症例の大多数は女性である。
【０００３】
卵巣癌は、卵巣組織が癌性に増殖するものである。90%以上の卵巣癌は、“上皮”型と分類されるものであり、そして卵巣組織の上皮から発生するものと考えられている。しかし、例えば、フェロピア管由来の癌、胚細胞由来の癌、あるいは支持細胞由来の癌などの卵巣癌のそれ以外の型もまた、当該技術分野において知られている。
【０００４】
大腸癌（結腸癌、直腸癌、および盲腸癌を総称的に呼ぶものである）は、結腸、直腸または盲腸における制御できない細胞増殖による癌である。症状には、典型的には、直腸出血および貧血が含まれ、しばしば体重の喪失および結腸直腸の状態の変化を伴う。
【０００５】
上述した癌などの癌の治療には、手術、薬剤の投与（ホルモン治療および化学療法が含まれる）、放射線治療、および／または免疫療法が含まれる。癌性組織を手術により除去することは、大きな利益をもたらす。ほとんどのタイプの化学療法は、体内において増殖している細胞に対して細胞死を引き起こす。放射線は、特に保存的な手術（乳癌にしばしば適用される）の後に必要とされ、そして実質的に局所的な癌の再発率を改善し、そして多くの事例において、全体的な生存も改善する。一般的に、当該技術分野において、治療成功率を向上させるため、これらの治療方法を組み合わせて使用することができる。
【０００６】
腫瘍溶解性ウイルス治療は、伝統的な治療方法と組み合わることができる、がん治療のための新しい戦略として、非常に有望である。現在のところ、多くのウイルス種由来の幅広いウイルスが、腫瘍溶解性薬剤として評価されている最中である（Vaha-Koskela MJ, et al., Cancer Lett 2007, 254: 178-216）。麻疹ウイルス（MV、Morbilliウイルス属、Paramyxoviridae科）は、膜を持つウイルスであり、分節化されていない（-）鎖のRNAゲノムを有する。レトロウイルスやいくつかのDNAと比較して、MVは完全に細胞質中で増殖し（Griffin DE.  Measles virus.  In: David M.  et al., (eds). Fields Virology, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia: 2006, pp. 1401-1586）、そしてウイルス配列が宿主の染色体DNA中に組み込まれるリスクはない。近年、生きたままの減弱化MV Edmonstonワクチン株が、様々な種類の癌に対する、可能性のある腫瘍溶解性ウイルスとして研究されている（Msaouel P, et al., Prostate 2009, 69: 82-91; Allen C, et al., Expert Opin Biol Ther 2008, 8: 213-220; McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184; and Blechacz B, et al., Hepatology 2006, 44: 1465-1477）。
【０００７】
これまでに、3種類の細胞タンパク質が、MVレセプターとして同定されている。シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocyte activation molecule；SLAM）は、免疫系の細胞上で主として発現されている（Sidorenko SP, and Clark EA. J Immunol 1993, 151: 4614-4624）。SLAMは、MVの野生型株およびMVのワクチン株の両方についてのレセプターとして機能する。CD46は、赤血球を除くすべてのヒト細胞上で遍在性に発現している（Dorig RE, et al., Cell 1993, 75: 295-305）。CD46は、MV EdmonstonなどのMVワクチン株に対してのみレセプターとして機能する。ポリオウイルスレセプター-関連4（PVRL4）は、MVの野生型株およびワクチン株の両方ともに対する上皮細胞レセプターとして、近年同定されたものである（Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240）。PVRL4は、免疫グロブリンスーパーファミリーの接着レセプターの構成分子であり、そして通常はカドヘリンとともに、接着結合部に局在している。この分子は、主として胎盤において発現しており、そして気管においてわずかに発現している（Reymond N, et al., J Biol Chem 2001, 276: 43205-43215）。近年の研究において、MVがRVRL4を標的として、気道中に出現することが示された（Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533）。さらに、この分子は、乳房癌、肺癌、および卵巣癌についての腫瘍細胞マーカーであると報告された（Takano A, et al., Cancer Res 2009, 69: 6694-6703; Derycke MS, et al., Am J Clin Pathol 2010, 134: 835-845; and Fabre-Lafay S, et al., BMC Cancer 2007, 7: 73）。
【０００８】
MVは、2種類のウイルス膜糖タンパク質、ヘモアグルチニン（H）タンパク質とフュージョン（F）タンパク質、を有する。Hタンパク質は、細胞レセプターと直接的に相互作用し、そしてFタンパク質が膜融合を生じるように誘引する。以前の研究において、そのレセプターとの相互作用のために必須なHタンパク質アミノ酸が同定され、そしてそれらの位置にアミノ酸置換を導入することにより、それぞれのレセプターを選択的に認識しない組換えMVを生成することができた。
【０００９】
ヒトの癌性疾患の検出ツールおよび治療方法における近年の改良にもかかわらず、転移が生じる場合には、従来の治療法によっては治療することが一般的に困難である。したがって、新たな治療戦略が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Vaha-Koskela MJ, et al., Cancer Lett 2007, 254: 178-216
【非特許文献２】Griffin DE.  Measles virus.  In: David M.  et al., (eds).  Fields Virology, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia: , 2006, pp.  1401-1586
【非特許文献３】Msaouel P, et al., Prostate 2009, 69: 82-91
【非特許文献４】Allen C, et al., Expert Opin Biol Ther 2008, 8: 213-220
【非特許文献５】McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184
【非特許文献６】Blechacz B, et al., Hepatology 2006, 44: 1465-1477
【非特許文献７】Sidorenko SP, and Clark EA. J Immunol 1993, 151: 4614-4624
【非特許文献８】Dorig RE, et al., Cell 1993, 75: 295-305
【非特許文献９】Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240
【非特許文献１０】Reymond N, et al., J Biol Chem 2001, 276: 43205-43215
【非特許文献１１】Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533;
【非特許文献１２】Takano A, et al., Cancer Res 2009, 69: 6694-6703
【非特許文献１３】Derycke MS, et al., Am J Clin Pathol 2010, 134: 835-845
【非特許文献１４】Fabre-Lafay S, et al., BMC Cancer 2007, 7: 73
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、癌を治療するための効率的なツールを開発することを目的とする。
【解決手段】
【００１２】
本発明において、本発明の発明者らは、野生型MV HL株が、感染細胞中で効率的に増殖し、その結果としてSLAMを発現しない様々な癌細胞株においても、効率的な細胞死を引き起こすことを見出した。MVがヒトに感染すると、しばしば重篤な疾患である麻疹を引き起こすが、麻疹発症には、MVがSLAM発現細胞であるリンパ系細胞に感染することが重要であることが解明されている。この知見に基づいて、本発明の発明者らは、SLAMを認識しない組換えMV（rMV-SLAMblind）を作製することにより上記の課題を解決し、そして癌細胞（乳癌細胞など）に対する新規な治療剤としてのその潜在能力について研究した。本発明において、本発明の発明者らは、CD46に結合能力のない麻疹ウイルス野外株から、SLAMへの結合力も欠損させることにより、ヒトへのMVによる病原性は失わせた上で、この組換え麻疹ウイルスがPVRL4を高発現する多くの癌細胞にPVR4を介して入り、抗-癌性の腫瘍溶解作用を提供する能力を有することを見出し、併せてPVRL4に対する結合活性を有する麻疹ウイルスを含む癌を治療するための医薬組成物を提供することができることを見出した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の癌を治療するための医薬組成物中に含まれる新規な組換え麻疹ウイルは、感染細胞中で効率的な増殖を示し、結果として様々な癌細胞株において効率的な細胞死を引き起こす。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1：（a）rMV-EGFPまたはrMV-EGFP-SLAMblindをMOI 0.01で細胞に感染させ、そして3 dpi（B95a細胞の場合）または5 dpi（その他の細胞の場合）に写真撮影をした。拡大率：100×。（b）SLAM-陽性B95a細胞および乳癌細胞におけるSLAM mRNAおよびGAPDH mRNAの発現レベルを、標準的なRT-PCRにより評価した。GAPDHは、ローディング対照として機能した。（c）細胞を抗-SLAM MAb（灰色のヒストグラム）またはアイソタイプ対照（白色のヒストグラム）とともにインキュベートし、その後Alexa-488-結合二次抗体と共にインキュベートし、そしてフローサイトメトリーにより解析した。（d）SLAMを認識しない組換えMVのスキーム図を示す。菱形は、R533A置換を示す。EGFP遺伝子またはホタルルシフェラーゼ遺伝子（luc）を、N遺伝子とP遺伝子の間に挿入した。（e）MCF7細胞を、それぞれMOI 0.01のrMV、rMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonにより感染させ、そして培養液中での感染力価（放出されたウイルス）および細胞中での感染力価（細胞結合型ウイルス）を、様々な時点で測定した。
【図２】図2：（a）乳癌細胞株におけるCD46およびPVRL4の表面発現を、フローサイトメトリーにより解析した。（左）細胞を、抗-CD46マウスMAb（灰色のヒストグラム）またはアイソタイプ対照（白色のヒストグラム）とともにインキュベートし、その後Alexa-488-結合ヤギ抗-マウス抗体とともにインキュベートした。（右）細胞を、抗-PVRL4ヤギポリクローナル抗体（灰色のヒストグラム）またはアイソタイプ対照（白色のヒストグラム）とともにインキュベートし、その後Alexa-488-結合ウサギ抗-ヤギ抗体とともにインキュベートした。（b）細胞を、抗-CD46または抗-PVRL4抗体により事前処理し、そしてそれぞれMOI 0.1のrMV-EGFP、rMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonにより感染させた。細胞を、抗体の存在下または非存在下で培養液中でインキュベートし、そして2 dpi（Vero細胞の場合）または3 dpi（その他の細胞の場合）に写真撮影した。rMV-Edmonstonに感染させた細胞を、抗-N MAbを使用して免疫染色した。拡大率：100×。（c）CHO-K1細胞を、pCAG-hCD46または空ベクター（pCAGGS）によりトランスフェクトした。2日後、それらを、それぞれMOI 1のrMV、rMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonに感染させ、融合阻害性ペプチドの存在下にてインキュベートした。2 dpiにおいて、細胞を固定し、抗-N MAbを使用して免疫染色し、そして感染細胞数をカウントした。pCAGGSでトランスフェクトさせた細胞における感染性を、100％とした。エラーバーは、標準誤差（SE）を示す。*p＜0.001 vs pCAGGS。（d）BHK細胞を、pCAG-hPVRL4またはpCAGGSによりトランスフェクトした。2日後に、それらをそれぞれMOI 0.1のrMV、rMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonに感染させ、そして融合阻害性ペプチドの存在下にてインキュベートした。2 dpiにおいて、感染性を（c）に示すように決定した。*p＜0.001 vs PCAGGS。
【図３】図3：（a）CD46、PVRL4およびSLAMのNHDF細胞における表面発現を、図1cおよび図2aに記載するように、フローサイトメトリーにより解析した。（bおよびc）それぞれMOI 1のrMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonに感染させたNHDF細胞を示す。（b）細胞を、3 dpiにおいて固定しそして抗-N MAbを使用して免疫染色した。拡大率：100×。（c）細胞生存率を、各時点においてWST-1アッセイにより測定した。
【図４】図4：細胞生存率を、各時点においてWST-1アッセイにより測定した。（a）B95a細胞を、それぞれMOI 1のrMV-SLAMblindまたはrMVに感染させた。（b）乳癌細胞を、MOI 1のrMV-SLAMblindに感染させた。（c〜e）乳癌細胞をそれぞれMOI 0.1のrMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonに感染させた。エラーバーは、SEを示す。*p＜0.05 vs rMV-SLAMblind。
【図５】図5：rMV-SLAMblind、rMV-Edmonstonまたは対照培養液を腫瘍内に注射した、皮下MCF7異種移植片（a）およびMDA-MB-453異種移植片（b）の腫瘍増殖曲線を示す。エラーバーは、SEを示す。*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.00001 vs rMV-SLAMblind。
【図６】図6：（a）皮下MDA-MB-453腫瘍を有するヌードマウスに、rMV-luc-SLAMblindを腫瘍内注射した。ルシフェラーゼシグナルを、2 dpiにBLIにより解析した。（b）培養液対照マウスのBLIは、2 dpiに解析した。（c）腫瘍をもたない対照マウスのBLIは、2 dpiに解析した。（d）ルシフェラーゼ発現のレベルを、それぞれの時点で測定した。（e）10 dpiのマウスにおけるBLIとMRIとの融合画像を示す。このパネル中、左から右に：写真画像上に重ねあわせたBLI、MRI、BLIとMRIとの混合の融合画像、およびBLIとMRIとを重ねあわせた融合画像、をそれぞれ示す。
【図７】図7：1頭のカニクイザルおよび2頭のアカゲザルに、106 TCID50のrMV-SLAMblindを皮下に接種した。（a）臨床的な兆候を観察し、そしてPBMCにおけるウイルスレベルをサルにおいて決定した。体重（b）および血液白血球数（c）を、各時点において測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
腫瘍溶解性ウイルスは、従来から使用されている治療方式と組み合わせて使用することができる癌の新たな治療剤として、非常に有望である。麻疹ウイルス（MV）は、免疫系の細胞上に発現されるシグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocyte activation molecule；SLAM）を使用して細胞に侵入することが知られている。ヒト癌細胞株（例えば、乳癌細胞株）はSLAMを発現しないが、本発明者らは、野生型MV（HL株）が様々な乳癌細胞株に対して効率的に感染し、そしてその中で増殖し、結果としてSLAMを発現しない様々な癌細胞株（例えば、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、など）の効率的な細胞死を引き起こすことを見出した。
【００１６】
このような知見に基づいて、本発明の発明者らは、リバースジェネティクス手法を使用して、SLAMを選択的に利用することができない組換えMV（rMV-SLAMblind）を作製し、癌細胞（例えば、乳癌細胞）に対する新規な治療剤としてのそしてその潜在能力を研究した。本発明の発明者らは、rMV-SLAMblindが、SLAM-陽性リンパ球系細胞に対する感染性を失っているため、SLAM-陽性リンパ球系細胞の細胞生存率に対しては影響を与えないが、その一方で、SLAM-陰性癌細胞（例えば、乳癌細胞）に対して腫瘍溶解活性を維持していることを示した。
【００１７】
本発明の発明者らは、当該技術分野において以前に報告されているMVワクチン株とは異なり、MV-SLAMblindは、癌細胞（例えば、乳癌細胞株）に対して感染するためのリポーターとしてPVRL4を使用することができ、そして遍在性に発現されているCD46を使用することができないため、CD46-陽性の正常ヒト細胞に対してはほとんど感染しないことを示した。
【００１８】
この知見と一致して、in vitroにおける腫瘍細胞でのEdmonston系列のワクチン株（rMV-Edmonston）の腫瘍溶解活性と比較して、rMV-SLAMblindは、顕著に高い腫瘍溶解活性を示した。一方、rMV-SLAMblindは、CD46-陽性の初代正常ヒト細胞に対しては細胞障害作用を引き起こさなかった。したがって、rMV-SLAMblindは、正常細胞に対しては感染しないが、癌細胞に対して特異的に感染することが示された。rMV-SLAMblindは、免疫欠損マウスにおけるヒト癌異種移植片（例えば、乳癌）に対して抗腫瘍活性を示し、そしてrMV-Edmonstonにより見出された作用と比較して、いくつかのがん細胞においてより高い作用が見出された。
【００１９】
さらに、in vivo安全性を評価するため、MVに対する抗体陰性である3匹のサルに、rMV-SLAMblindを接種したところ、臨床的な症状は何も記録されなかった。これらの結果に基づいて、rMV-SLAMblindは、癌（例えば、乳癌）の治療のための新規な腫瘍溶解性ウイルスとして、有望な候補となりうると考えられる。
【００２０】
本発明の一態様において、本発明の発明者らは、ポリオウイルスレセプター-関連4（PVRL4）に対する結合活性を有する麻疹ウイルスを含む、癌を治療すための医薬組成物の発明を提供する。本発明における麻疹ウイルスは、PVRL4に対する結合活性を利用して、細胞上に発現するPVRL4に結合し、そして侵入することができる。これまでの検討の結果、PVRL4は、癌細胞（例えば、乳癌細胞株、卵巣癌細胞株、肺癌細胞株、結腸直腸癌細胞株、など）の細胞表面において発現されていることがしばしば見出されている。
【００２１】
その一方で、本発明における麻疹ウイルスは、シグナル伝達リンパ球活性化分子（Signaling lymphocyte activation molecule；SLAM）に対する結合活性またはCD46に対する結合活性を欠損している、これらの分子、SLAMやCD46は、正常な免疫系の細胞の細胞表面で発現されることが知られている分子である。そのため、このウイルスは、細胞表面にSLAMやCD46を通常発現している正常な免疫系の細胞には結合することも侵入することもできない。
【００２２】
このような性質により、本発明のウイルスは、細胞上にPVRL4を発現する癌細胞に選択的に結合・感染し、感染された癌細胞に細胞死を誘導することができる、腫瘍溶解性ウイルスとして機能することが明らかになった。このウイルスが感染した癌細胞では、細胞内においてウイルスが増殖され、細胞を破壊してウイルスが放出されることにより、癌細胞に細胞死を誘導することができると考えられている。
【００２３】
たとえば悪性度が高い癌細胞が、原発巣にとどまらず、他の組織に転移することが知られている。これまでの治療方法では、一旦癌細胞が転移の能力を有してしまうと、リンパ節などの多数の部位にばら撒かれてしまうため、手術によって身体から癌細胞を完全に除去することは困難である。そのため、癌に対する特異性が低い化学療法剤を使用せざるを得なかった。
【００２４】
しかしながら、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、生体内のがん細胞に特異的に感染し，その中で増殖することができる。そのため、生体内にPVRL4を発現する細胞（すなわちがん細胞）が存在する場合には、感染し、増殖するというサイクルを繰り返すことができる。その結果、本発明のウイルスは、癌細胞が転移の能力を有した後であっても、細胞表面上にPVRL4を発現している限りは、転移巣においても癌細胞に結合・感染することができ、その結果として転移された癌細胞にも細胞死を誘導することができる。
【００２５】
上述したような本発明のウイルスは、PVRL4に対しては結合する能力を有するが、SLAMやCD46に対しては結合する能力を有さないものである限りにおいて、自然界において発生した変異体であっても、遺伝子組み換え技術を使用して作出されたウイルス株であってもよい。本発明において好ましくは、組換えウイルスを使用する。
【００２６】
上述した組換えウイルスを作製するために使用する親株の麻疹ウイルス株として、種々の麻疹ウイルス株を使用することができる。たとえば、野生型麻疹ウイルス（たとえば、MV-HL株、など）、既存の弱毒生ワクチン株（たとえば、MV Edmonstonワクチン株、Schwarz-FF8株、AIK-C株、田辺株、TD97株、など）などを使用することができる。
【００２７】
本発明の一態様において、これらの麻疹ウイルス株のHタンパク質に変異を生じさせることにより、SLAMやCD46に対しては結合する能力を欠損させることができる。このようにSLAMやCD46に対して結合する能力を欠損させることにより、SLAMやCD46を有するがPVRL4は有さない麻疹ウイルスの通常の標的細胞である免疫系の細胞などには、本発明の組換えウイルスは感染することができなくなるため、治療対象（すなわち特定の癌に罹患した患者）に対してこの組換えウイルスを投与した場合であっても、麻疹を発症させる危険性をなくすことができる。
【００２８】
一方で、本発明のウイルスは、SLAMやCD46は有さないがPVRL4を有する特定の癌細胞に感染して、その細胞中で増殖し、細胞を破壊し、体液中に子孫ウイルスを放出することができる。従って、生体内において標的となるPVRL4を有する特定の癌細胞が存在する限りにおいて、本発明のウイルスの感染、感染細胞の溶解を繰り返すことができる。また、血流に乗って移動することも可能であり、癌細胞が転移した場合でも、その細胞が転移後もPVRL4を有する限りは、本発明の組換えウイルスは、転移巣においてがん細胞に対して感染し、細胞を溶解することができる。
【００２９】
SLAMやCD46に対しては結合する能力を欠損させた、このようなHタンパク質における変異としては、Hタンパク質のアミノ酸配列の533番目アミノ酸残基を、野生型株などにおけるアルギニンから、アラニンに置換する変異や、194番目をイソロイシンからセリンに置換する変異などを例として挙げることができる。この様な組換えウイルスは、例えば、麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドpMV-HL（7+）を使用して、そのHタンパク質の533番目アミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換したベクター（pMV-SLAMblind）を調製し、pMV-SLAMblindベクターを利用してリバースジェネティクス手法により調製される。ここで使用される、533番目アミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換した麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAは、SEQ ID NO: 1に示される塩基配列を含んでおり、これが翻訳されることにより、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列からなるNタンパク質、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列からなるリンタンパク質、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列からなるMタンパク質、SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列からなるFタンパク質、SEQ ID NO: 6のアミノ酸配列からなるHタンパク質、SEQ ID NO: 7のアミノ酸配列からなるLタンパク質、がそれぞれ生成され、結果としてウイルスを生成することができる。
【００３０】
Hタンパク質の変異を生成させるもとのウイルス株は、上述した野生型MV-HL株以外の株であってもよいことから、本発明の組換えウイルスの態様は、上述のpMV-SLAMblindベクター（SEQ ID NO: 1）を利用したものには限定されない。たとえば、Edmonston Bワクチン株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドp（+）MV2A（GenBankアクセッションno. Z66517）に対して、Hタンパク質の533番目アミノ酸残基をアラニンに置換する変異を導入して作製した変異ベクターを利用してリバースジェネティクス手法により調製することによっても、組換えウイルスを生成することもできる。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、PVRL4に対する結合活性を有する麻疹ウイルスを必須の構成要素として含有するが、これ以外にどのような補助成分（例えば、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、免疫賦活剤など）を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３２】
実施例1：材料と方法
細胞
B95a細胞、CHO-K1細胞、Vero細胞および293細胞は、以前から記載されているものである（Watanabe A, et al., J Virol 2010, 84: 4183-4193；およびKobune F, et al., J Gen Viral 1991, 72（ Pt 3）: 687-692）。SKBR3ヒト乳癌細胞およびMCF7ヒト乳癌細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターthe Cell Resource Center for the Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University, Miyagi, Japanから入手した）を、5％ウシ胎児血清（FBS）を添加したRPMI培養液（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）中で維持した。MDA-MB-453ヒト乳癌細胞（ATCC, Manassas, VA, USA）を、5％FBSを添加したL-15培養液（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）中で維持した。BHK細胞を、5％FBSを添加したDulbecco改変Eagle培養液（Sigma-Aldrich）中で増殖させた。NHDF細胞を、Cell Systems（Kirkland, WA, USA）から購入し、そしてCSC増殖因子（Cell Systems）および5％FBSを添加したCS-C培養液（Cell Systems）中で維持した。
【００３３】
組換えMVの回収
pMV-HL（7+）プラスミドは、MV HL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードする（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376）。高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子およびホタルルシフェラーゼ（luc）遺伝子をコードする追加の転写ユニットを有するpMV-EGFPおよびpMV-LUCが、以前に報告された（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376; Watanabe A, et al., J Virol 2010, 84: 4183-4193）。R533A置換を部位特異的変異生成によりpMV-HL（7+）、pMV-EGFP、およびpMV-LUCに導入し、そして得られたプラスミドをそれぞれpMV-SLAMblind、pMV-EGFP-SLAMblind、およびpMV-luc-SLAMblindと命名した。pMV-SLAMblind、pMV-EGFP-SLAMblind、およびpMV-luc-SLAMblindのベクターのインサート構成は、図1dに概略を示す通りである。
【００３４】
プラスミドp（+）MV2A（M.A. Billeterから贈与を受けた）は、Edmonston Bワクチン株の全長アンチゲノムcDNAをコードする（Radecke F, et al., EMBO J 1995, 14: 5773-5784）。本発明の発明者らは、p（+）MV2Aが、Edmonston B株の報告された配列データ（GenBankアクセッションno. Z66517）から、以下のヌクレオチドの変化：A3310G、C3627T、C4708T、T5703A、A5737G、C6414T、A6477G、T6546C、T7023C、T8353C、A8721C、およびA8745G、を有することを見出した。これらの変化のうち5つにおいて、P（M502V）タンパク質、M（P64S）タンパク質、F（M97V）タンパク質およびH（N484TおよびE492G）タンパク質におけるアミノ酸変化を生じた。
【００３５】
組換えMV-HL（rMV）およびrMV-EGFPを、以前に記載されたように回収した（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376）。SLAM-blind組換えMVを回収するため、MCF7細胞を、ウイルスの限定的なレセプター利用に基づくウイルス増幅のために使用した。p（+）MV2Aから回収されたウイルスは、rMV-Edmonstonと命名した。rMV-Edmonstonを回収するため、Vero細胞をウイルス増殖のために使用した。
【００３６】
ウイルス力価
ウイルス力価を、Reed-Muench法（Reed LJ, et al., Am J Hyg 1938, 27: 493-497）により50％組織培養感染量（TCID50）として決定した。SLAM-blind組換えMVの力価は、レセプター使用制限によりPVRL4-発現細胞中でのみ測定することができ、そしてしたがって、MCF7細胞中でのみ力価を調べることができた。MCF7細胞におけるMV感染は、EGFPの蛍光により、または抗-Nタンパク質モノクローナル抗体（MAb）8G（Masuda M, et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2006, 29: 157-165）を一次抗体としてそしてAlexa-Fluor-488-結合抗-マウス抗体（Invitrogen）を二次抗体としてそれぞれ使用して免疫染色することにより間接的に、検出した。本発明の発明者らは、MCF7細胞中で測定されたrMVおよびrMV-EGFPの力価が、B95a細胞において測定された力価と同様であり、そしてMCF7細胞中で測定されたrMV-Edmonstonの力価が、Vero細胞中で測定された力価と同様であったことに注目している。
【００３７】
RT-PCR解析
全RNAを、ISOGEN（Nippon Gene, Tokyo, Japan）を使用して細胞から抽出し、そして2μgの全RNAをPrimeScript RTase（Takara, Shiga, Japan）を使用して、ランダムヘキサマープライミングにより逆転写した。得られたcDNAを、Thermo-start Taq DNAポリメラーゼ（ABgene, Epsom, UK）をSLAM mRNAに特異的なプライマー対またはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNAに特異的なプライマー対とともに用いて、PCR-増幅した。PCRアンプリコンを、アガロースゲル上で可視化した。
【００３８】
ウイルス増殖性試験
12-ウェルプレート中のMCF7細胞の単層を、MOI 0.01の組換えMVに感染させ、そして5％FCSを添加したRPMI培養液中でインキュベートした。様々な時点で、放出されたウイルスを培養上清から得て、そして細胞に結合したウイルスを凍結融解を3回繰り返すことにより感染細胞から回収した。ウイルス力価は、MCF7細胞中で測定した。
【００３９】
抗体を使用した感染阻害アッセイ
96-ウェルプレート中のMCF-7細胞、MDA-MB-453細胞、SKBR3細胞、およびVero細胞の単層を、10μg/mlの抗-ヒトCD46 MAb（クローンM177；HyCult Biotechnology, Uden, Netherlands）（Iwata K, et al., J Biol Chem 1995, 270: 15148-15152）または抗-ヒトPVRL4ヤギポリクローナル抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）を含有する培養液を用いて、37℃にて1時間、事前調製した。4種の細胞株の対照単層を、抗体を含まない培養液を用いて同様に処置した。
【００４０】
細胞を、それぞれMOI 0.1のrMV-EGFP、rMV-EGFP-SLAMblind、またはrMV-Edmonstonに感染させた。感染後、細胞を、抗体を含む培養液中または抗体を含まない培養液中でインキュベートした。rMV-Edmonstonに感染させた細胞は、抗-Nウサギポリクローナル抗体を使用した免疫染色により検出された。細胞を、2 dpi（Vero細胞の場合）または3 dpiに、蛍光顕微鏡の下で観察した。
【００４１】
CD46およびPVRL4を発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞に対するウイルス感染性の解析
ヒトCD46 cDNA（C2アイソフォーム）およびヒトPVRL4 cDNAを、それぞれ293細胞およびMCF7細胞由来の全RNAのRT-PCRにより得た。cDNAをpCAGGS（Niwa H, et al., Gene 1991, 108: 193-199）中にサブクローニングした。得られたプラスミドを、pCAG-hCD46およびpCAG-hPVRL4と命名した。
【００４２】
pCAG-hCD46のトランスフェクションに関して、CHO-K1細胞を6-ウェルプレートにまき、pCAG-hCD46またはpCAGGSのいずれかによりトランスフェクトした。一晩インキュベートした後、細胞をトリプシン処理によりプレートから剥がし、そして96-ウェルプレートにまいた。翌日、細胞を、MOI 1のrMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonを接種し、37℃で1時間感染させた。ウイルス接種物は、融合阻害性ペプチド（z-D-Phe-Phe-Gly；Sigma-Aldrich）を含有する培養液に置換し、細胞-細胞融合およびウイルス子孫による融合を防止した。
【００４３】
インキュベーションは、37℃にて2日間継続し、そして細胞を4％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、そして抗-N MAbを使用して免疫染色した。ウェルあたりの感染細胞の数を、蛍光顕微鏡の下でカウントした。pCAG-hCD46またはpCAGGSによりトランスフェクトした細胞における比感染性を、3回のカウントの平均を、pCAGGSによりトランスフェクトした細胞における3回のカウントの平均により割り算することにより計算した。
【００４４】
CHO-K1細胞はpCAG-hPVRL4によるトランスフェクションの後に死んでしまったため、本発明の発明者らは、BHK細胞を使用した。BHK細胞を、上述したようにpCAG-hPVRL4またはpCAGGSによりトランスフェクトし、MOI 0.1のrMV-SLAMblindまたはrMV-Edmonstonにより感染させた。pCAG-hPVRL4またはpCAGGSによりトランスフェクトした細胞における比感染性を、上述したように測定した。
【００４５】
WST-1アッセイ
細胞生存率を、WST-1細胞増殖キット（Takara）を使用して測定した。96-ウェルプレートにおける細胞の単層に、様々なMOIの組換えMVを感染させた。培養液を、3 dpi、5 dpiおよび7 dpiに交換した。細胞生存率を、マイクロプレートリーダーモデル450（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）上で450 nmの吸光度で測定した。ウイルスに感染させた細胞の生存率を、3回の吸光値の平均を、非感染細胞の3回の吸光値の平均により割り算して算出し、そして％で表示した。
【００４６】
in vivo腫瘍溶解活性の評価
すべての動物実験は、東京大学の実験動物委員会により承認を受けた。6週齢のメスSCIDマウスを、Clea Japan（Tokyo, Japan）から購入した。MCF7細胞（1.5×106）またはMDA-MB-453細胞（3×106）を、50μlのPBS中に懸濁し、そして懸濁物を50μlのMatrigel HC（BD Biosciences, San Diego, CA, USA）と混合し、その後皮下に注射した。MCF7群について、マウスに対して、105 TCID50のrMV-SLAMblind（n = 5）、rMV-Edmonston（n = 5）またはOpti-MEM（Invitrogen）（n = 5）を移植6日後に腫瘍内投与した。ウイルス投与を、3 dpiおよび19 dpiに繰り返した。MDA-MB-453群について、マウスに対して、106 TCID50のrMV-SLAMblind（n = 9）、rMV-Edmonston（n = 9）またはOpti-MEM（n = 8）を移植14日後に腫瘍内投与した。ウイルス投与を、14 dpiに繰り返した。腫瘍の直径を、キャリパーを用いて測定した。腫瘍の体積を、以下の式（幅×幅×長さ）／2に基づいて算出した。
【００４７】
組換えMVによるMDA-MB-453 異種移植片のin vivo感染の可視化
6週齢のメスBALB/cヌードマウスを、Clea Japanから購入した。11匹のマウスに対して、上述したようにMDA-MB-453細胞を皮下に移植した。5匹のマウスに対して、細胞-不含PBS／マトリゲル混合物（腫瘍不含対照）を注射した。移植後14日後に、マウスに対して、106 TCID50のrMV-luc-SLAMblindまたはOpti-MEM（培養液対照）の一回腫瘍内注射を投与した。In vivoBLIを、感染10時間後、1 dpi、2 dpi、4 dpi、7 dpi、14 dpi、および21 dpiに行った。それぞれのイメージングの前に、マウスに、200μlのPBSで希釈した3 mgのD-ルシフェリン（Gold Biotechnology, St.  Louis, MO, USA）を注射した(Inoue Y, et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging 2009, 36: 771-779)。
【００４８】
画像を、ルシフェリン投与の約15分後に、Xenogen Ivis 100 System（Xenogen/Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA）を使用して取得した。IVIS 100冷却CCDカメラシステムを、放射光取得のために使用した。ルシフェラーゼ活性を、Living Image Software（version 2.5; Xenogen）を使用して解析した。ホタルルシフェラーゼレベルは、光子・sec-1 cm-2で表した。BLIとMRIとの融合画像は、以前の報告と同様の方法で得た（Inoue Y, et al., Mol Imaging 2010, 9: 163-172）。
【００４９】
サルへのrMV-SLAMblindの接種
4歳齢のメスのカニクイザル（Macaca fascicularis）および2頭の15ヶ月齢のオスアカゲザル（Macaca mulatta）を、日本野生動物研究所（Japan Wild Animal Research, Kagoshima, Japan）から取得し、MVに対する血清中抗体価が陰性であることを確認した。サルに対して、106 TCID50のrMV-SLAMblindを皮下に接種した。
【００５０】
白血球数
100μlの末梢血を、様々な時点で回収し、白血球数を、自動化血液解析装置（モデルKX-21NV; Sysmex, Kobe, Japan）を使用してカウントした。白血球、好中球、好酸球、好塩基球および単球の割合を、ギムザ染色薄層血液スメア上で測定した。
【００５１】
末梢血単核球細胞（PBMC）中のウイルス排出量の検査
2 mlの末梢血を、2 dpi、4 dpi、7 dpi、14 dpi、および21 dpiに回収した。血液を、PBS中で10 mlに希釈し、3 mlの濃度勾配分離培地媒体（49.2％Percollおよび150mM NaCl）上に重層し、400 g、室温にて30分間遠心分離した。PBMCを界面から回収した。PBSにより2回洗浄した後、細胞を2 mlのRPMI培養液中に再懸濁した。ウイルス血症を、MCF7細胞との終点希釈共培養により定量した。PBMCの連続10倍希釈を、5％FBSを添加したRPMI培養液中で行った。PBMCの4つの複製物を、96-ウェルプレート中でMCF7細胞とともに共培養した。培養を、7日間維持し、そしてウイルス力価について抗-N MAbを使用して免疫染色した。
【００５２】
フローサイトメトリー
細胞を、2 mM EDTAを用いて剥ぎとり、その後200 gで遠心分離することによりペレットにした。ペレットにした細胞を、サンプルバッファー（1％ウシ血清アルブミンと0.02％NaN3とを含むPBS）中で再懸濁した。細胞（106）を100μlのサンプルバッファー中0.5μgの一次抗体を用いて、氷上で30分間、インキュベートした。以下の抗体を、一次抗体として使用した：抗-ヒトSLAM MAb（クローン7D4；Biolegend, San Diego, CA, USA）、抗-ヒトCD46 MAb、抗-PVRL4ヤギポリクローナル抗体（R&D Systems）、マウス対照IgG1（R&D Systems）、およびヤギ対照IgG（R&D Systems）。細胞を、PBSにより1回洗浄し、そして100μlのサンプルバッファー中0.1μgのAlexa-488-結合抗-マウス抗体または抗-ヤギ抗体（Invitrogen）を用いて、氷上で30分間インキュベートした。PBSにより2回洗浄した後、細胞を4％パラホルムアルデヒドにより固定化し、そしてBD FACSCalibur（BD Biosciences）上で解析した。
【００５３】
検討
潜在的な臨床的用途のための腫瘍溶解性MVを開発するため、本発明者らは、rMV-SLAMblindを生成した。サルにおいてそれは弱毒化されていた。患者および感染させたサルでの以前の研究からは、生体内でSLAM陽性細胞の分布がMV感染部位とよく相関することが示され（Yanagi Y, et al., Jpn J lnfect Dis 2006, 59: 1-5）、そしてSLAM-陽性のTリンパ球およびBリンパ球がMVの主要な標的であることが示された（de Swart RL, et al., PLoS Pathog 2007, 3: el78）。リンパ球減少症や免疫抑制を含むほとんどのMVの病理が、MV感染にSLAMが使用されていることにより説明することができることが示唆された。したがって、SLAMを使用することができない組換えMVは弱毒化されると考えられた。
【００５４】
rMV-SLAMblindに感染させたサルにおいて疾患の臨床的証拠が何も見出されなかったという結果により、この予想が確認され（図7）、SLAMを介した感染が、ウイルス毒性に必要であることがわかった。
【００５５】
Hタンパク質中にR533A置換を導入された組換え野生型MV IC-B株は、rhesus monkeysにおいて弱毒化されていたことが以前に報告されている（Leonard VH, et al., J Virol 2010, 84: 3413-3420）。低レベルのウイルス血症がわずか1例において検出されたが、SLAM-blind IC-Bウイルスは、接種した6頭のサルのいずれにおいても麻疹-様の症状を引き起こさなかった。
【００５６】
本発明のデータは、rMV-SLAMblindおよび親株であるMV-HL株（rMV）の両方ともがPVRL4をレセプターとして利用するが、CD46をレセプターとして利用しないことを示した。MV-HL株は、増殖させたマーモセットリンパ芽球様細胞であるB95a細胞を使用して、麻疹患者血液中の白血球から単離された、野生型株である。したがって、野生型MV株は、レセプターとしてCD46を使用することができず(Yanagi Y, et al., Jpn J lnfect Dis 2006, 59: 1-5）、PVRL4を使用することができる（Muhlebach MD, et al.,  Nature 2011, 480: 530-533）という以前の知見と一致している。
【００５７】
CD46は、腫瘍においてしばしば過剰発現されており（Jurianz K, et al., Mol Immunol 1999, 36: 929-939）、そしてMV Edmonstonワクチン株誘導体は、高密度のCD46を有する細胞を選択的に殺す（Anderson BD, et al., Cancer Res 2004, 64: 4919-4926）。したがって、そのワクチン株誘導体が、様々な腫瘍型に対する治療剤として研究された。
【００５８】
しかしながら、本発明の結果は、乳癌細胞株に対するrMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性のために、CD46を使用することは必要ではないことを示している。実際、CD46は、赤血球を除くすべての正常ヒト細胞により遍在性に発現されており（Liszewski MK, et al., Curr Top Microbiol Immunol 1992, 178: 45-60）、そして腫瘍溶解のために以前に使用されたMV Edmonston株は、NHDFに対して効率的に感染しそして殺すことが報告され（Allen C, et al., Cancer Res 2006, 66: 11840-11850）、結果的に合胞体を生成する。対照的に、rMV-SLAMblindは、NHDFに対しては最小限にしか感染しなかった（図3）。したがって、SLAMおよびCD46を両方とも認識しないrMV-SLAMblindは、PVRL4-陽性乳癌細胞に対する特異性を向上させる点で、重要な利点を有する。さらに、乳癌治療のために以前に報告されたMV Edmonston株（McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184）は、修飾されていないHタンパク質を有するが、これはすべての既知のMVレセプター：SLAM、CD46およびPVRL4と相互作用することができる。
【００５９】
以前の研究において、PVRL4は、乳腺由来の腫瘍において非常に発現していることが示された。PVRL4発現は、管腔-様マーカーと負の相関をしており、そして基底-様マーカーおよびHER2と正の相関を示した（Fabre-Lafay S, et al., BMC Cancer 2007, 7: 73; Athanassiadou AM, et al., Folia Histochem Cytobiol 2011, 49: 26-33）。さらに、PVRL4発現の増加は、病期の上昇、腫瘍サイズの増加、リンパ節浸潤の増加、そして生存の低下と強く相関した（Athanassiadou AM, et al., Folia Histochem Cytobiol 2011, 49: 26-33）。このように、rMV-SLAMblindは、様々な乳癌の中でも悪性型の癌に対して有効である可能性がある。さらに、肺癌、卵巣癌、および結腸直腸癌において、PVRL4が上方制御されているため（Takano A, et al., Cancer Res 2009, 69: 6694-6703; Derycke MS, et al., Am J Clin Pathol 2010, 134: 835-845）、rMV-SLAMblindもまた、それらの治療のために有用であると考えられる。
【００６０】
rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonが示すより高い腫瘍溶解活性を示した。MDA-MB-453細胞において、rMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性は、in vitroおよびin vivoにおいて高かった（図4dおよび図5b）。しかしながら、MCF7細胞において、rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonの細胞傷害性と同様のin vitro細胞傷害性を示したが、しかしin vivoでの腫瘍増殖抑制では、より高い有効性を示した（図4cおよび図5a）。このことは、in vitro培養条件と構造や周辺の生得的免疫系などの因子によりウイルスの広がりが潜在的に限定されうるin vivo環境との差に基づいているようであった。
【００６１】
野生型およびEdmonstonワクチン株の間の比較研究の結果、細胞内生得的免疫応答の回避（Naniche D, et al., J Virol 2000, 74: 7478-7484; Ohno S, et al., J Gen Virol 2004, 85: 2991-2999）およびウイルス複製の亢進（Takeda M, et al., J Virol 2008, 82: 11979-11984）を含む、野生型MVの重要な特性が示された。これらの因子は、rMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性の亢進の原因と考えられた。背景にあるメカニズムの解析は、現在のところ途上である。
【００６２】
本研究において使用されたrMV-Edmonstonは、乳癌治療のために以前使用されたEdmonston株誘導体（MV-CEA）（McDonald CJ, et al., Breast Cancer Res Treat 2006, 99: 177-184）と同一ではない。MV-CEAは、ウイルス遺伝子発現の追跡可能なマーカーである癌胎児性抗原（CEA）をコードする追加的な転写ユニットを有した。さらに、本発明の発明者らは、rMV-Edmonstonを誘導したもとであるプラスミドp（+）MV2Aが、Edmonston B株の感染性cDNAクローンの報告された配列データ（GenBankアクセッションno. Z66517）とは、12ヌクレオチドおよび5アミノ酸の差異を有することを見出した。したがって、腫瘍溶解活性に関して、本発明の発明者らは、本発明のデータをMV-CEAのデータと直接的に比較することはできない。しかしながら、これらの差異は、Edmonston系列のすべての株がCD46を使用することからrMV-SLAMblindが改善された腫瘍特異性を有するという本発明における結論に影響を及ぼさない。
【００６３】
MVに基づくベクターに関する主な障害は、治療効率を低下させる可能性がある患者体内において事前に存在する抗-MV抗体の存在である。腫瘍内に投与された場合に、腫瘍溶解性MVの効果は、マウスモデル中に受動的に移入させた抗-MV抗体の存在により損なわれないことが、以前の研究において示された（Grote D, et al., Blood 2001, 97: 3746-3754）。このことは、いったんウイルスが腫瘍に到達すると、抗体の存在下であっても退縮が生じうることを意味している。最終的な目標は、静脈内ウイルス投与により転移した癌細胞を消去することであるが、腫瘍内ウイルス投与により局在化した腫瘍を処理することが、論理的な第1の工程である。
【００６４】
本発明者は、腫瘍を移植したマウスに静脈内投与したrMV-SLAMblindが移植腫瘍部位に達して増殖することも確認した。また、本発明の発明者らは、既存の抗体により静脈内投与されたウイルスが中和されることを回避するストラテジーを検討中である。一つの可能性のあるストラテジーは、送達ビヒクルとしての細胞を使用することにより、ウイルス抗原を抗体から隠すことである（Willmon C, et al., Mol Ther 2009, 17: 1667-1676）。この戦略において、生体の細胞をin vitroで感染させ、そしてその後その細胞を全身性に戻し投与し、腫瘍細胞を標的とするための腫瘍溶解性ウイルスを保有するようにした。最近の研究により、腫瘍溶解性MVに感染させた細胞が、ウイルスを腫瘍部位に送達し、そして既存の抗-麻疹抗体により腫瘍を持つマウスの生存を延長することができることが示された（Mader EK, et al., Clin Cancer Res 2009, 15: 7246-7255; Liu C, et al., Mol Ther 2010, 18: 1155-1164）。
【００６５】
以前の研究において、PVRL4-発現細胞におけるウイルス複製および融合活性は、SLAMまたはCD46-依存性の細胞-細胞融合に影響を与えることなく、野生型IC-B株のHタンパク質中に単一のN48IF置換またはN481Y置換を導入することにより、亢進された（Tahara M, et al., J Viral 2008, 82: 4630-4637）。HL株のHタンパク質は、481番目にアスパラギンを有する。このように、同一の置換を導入することにより、本発明の発明者らは、そのレセプター利用に影響を与えることなく、rMV-SLAMblindの腫瘍溶解活性を更新することができる。さらに、Edmonston系列のMV株のHタンパク質は、481番目にチロシンをすでに有しており、従ってこの戦略は利用できない。
【００６６】
結論として、本発明において、rMV-SLAMblindを作成し、そしてrMV-SLAMblindが癌異種移植片（たとえば乳癌）に対して腫瘍溶解活性を有し、そしてサルにおいて弱毒化されていたことを示した。rMV-SLAMblindは、CD46とは相互作用せず、そしてrMV-Edmonstonの腫瘍溶解活性と比較して、高い腫瘍溶解活性を示した。これらの結果は、癌治療のための新規な腫瘍溶解性ウイルスとしてのrMV-SLAMblindの潜在能力を示しており、この株をさらに検討していく予定である。
【００６７】
実施例2：SLAM-非依存的なMVの感染と、rMV-SLAMblindの生成
野生型MV HL株は、MCF7細胞、MDA-MB-453細胞、およびSKBR3細胞を含む様々なヒト乳癌細胞株に効率よく感染しそしてそれを殺す（図1a、上パネル）。 野生型MVは、SLAMを主要なレセプターとして使用することが知られているが（Tatsuo H, et al., Nature 2000, 406: 893-897）、SLAMは免疫系の細胞において発現される。しかしながら、RT-PCRおよびフローサイトメトリー解析から、これらの乳癌細胞株は、SLAM-陰性であることが示された（図1bおよび図1c）。このように、MV感染は、SLAM-非依存的なメカニズムを介して生じるものである。
【００６８】
この知見から、組換えMVが、選択的にSLAMを使用することができないため、乳癌細胞に対する腫瘍溶解活性は維持しつつも、SLAM-陽性免疫細胞に対する細胞傷害性を喪失している可能性が示唆された。HL株についてのリバースジェネティクスシステム（Terao-Muto Y, et al., Antiviral Res 2008, 80: 370-376）を使用することにより、本発明において、一アミノ酸置換（R533A） (Vongpunsawad S, et al., J Virol 2004, 78: 302-313)をHタンパク質のORF（SEQ ID NO: 6）中に導入することにより、SLAM-blind組換えMVを生成した（図1d、SEQ ID NO: 1）。高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）遺伝子を含有するSLAM-blind組換えMV（rMV-EGFP-SLAMblind）は、SLAM-陽性B95a細胞に対して非常に低い効率で感染したが、一方rMV-EGFP-SLAMblindは、乳癌細胞株に対しては親rMV-EGFPと同程度の効率で感染した（図1a）。rMV-SLAMblindの増殖性を、MCF7細胞における親ウイルス（rMV）の増殖性およびEdmonston系列のワクチン株（rMV-Edmonston）の増殖性と比較した（図1e）。rMV-SLAMblindは、rMVよりもゆっくりと増殖したが、最大の力価は同程度であった。rMV-Edmonstonの増殖速度および最大力価は、rMV-SLAMblindの増殖速度および最大力価よりも低かった。
【００６９】
実施例3：rMV-SLAMblindによる乳癌細胞株の感染におけるPVRL4の関与
SLAMに加えて、CD46およびPVRL4がMVに対するレセプターとして同定されれいる。CD46は、MVワクチン株についてのみのレセプターである。PVRL4は、MV野生型およびMVワクチン株の両方についてのレセプターとして最近同定され（Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240; Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533）。両方の分子ともに、乳癌細胞株の表面に発現されている（図2a）。そこで、本発明の発明者らは、抗-CD46抗体および抗-PVRL4抗体を使用して感染阻害アッセイを行った（図2b）。抗-CD46抗体は、rMV-EGFPおよびrMV-EGFP-SLAMblindによる乳癌細胞の感染を阻害しなかったが、一方抗-PVRL4抗体は、ほぼ完全に感染を阻害した。rMV-Edmonstonによる乳癌細胞の感染は、いずれかの抗体のみによっては阻害されず、このことはMVワクチン株がCD46およびPVRL4の両方ともをレセプターとして使用するという事実と一致している。CD46-陽性かつPVRL4-陰性であるVero細胞（Noyce RS, et al., PLoS Pathog 2011, 7: e1002240; Muhlebach MD, et al., Nature 2011, 480: 530-533）は、rMV-Edmonstonにのみ効率的に感染し、そして感染は抗-CD46抗体によりほぼ完全に阻害された。さらに、MDA-MB-453細胞におけるrMV-Edmonstonの感染効率は、rMV-EGFPおよびrMV-EGFP-SLAMblindの感染効率よりも低かった。
【００７０】
CD46およびPVRL4が侵入用レセプターとして機能しているかどうかを調べるため、本発明の発明者らは、ヒトCD46をコードするプラスミド（pCAG-hCD46）またはヒトPVRL4をコードするプラスミド（pCAG-hPVRL4）をMVに対して非感受性な細胞（たとえば、CHOK1およびBHK細胞）にトランスフェクトした。rMV-Edmonstonの感染性は、空ベクター（pCAGGS）でトランスフェクトされた細胞と比較して、pCAG-CD46でトランスフェクトされた細胞においてより高く、しかしrMV-SLAMblindの感染性および親ウイルスの感染性は、2群のあいだで異ならなかった（図2c）。対照的に、すべてのウイルスは、対照細胞における感染性と比較して、pCAG-hPVRL4によりトランスフェクトされた細胞において高い感染性を示した（図2d）。これらの結果から、rMV-SLAMblindおよび親ウイルスは、PVRL4をレセプターとして使用するが、CD46は使用しないことが示された。
【００７１】
実施例4：CD46-陽性初代正常ヒト細胞の感染
CD46は、遍在性に発現されており、そして正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）などの正常ヒト細胞はCD46-陽性である（図3a）。rMV-Edmonstonおよび以前に報告された腫瘍溶解性MV Edmonston株による感染とは対照的に（Allen C, et al., Cancer Res 2006, 66: 11840-11850）、rMV-SLAMblindは、NHDF細胞に対してはほとんど感染せず、合胞体を生成せず、そしてその生存率に影響を与えなかった（図3bおよび図3c）。PVRL4およびSLAMは、NHDFにおいて発現していない（図3a）。従って、その限定的なレセプター利用のために、rMV-SLAMblindは、CD46-陽性正常ヒト細胞に非常に低い効率で感染する。
【００７２】
実施例5：rMV-SLAMblindのIn vitro細胞傷害性
本発明の発明者らは、B95a細胞をMOI 1のrMV-SLAMblindまたは親ウイルス（rMV）のいずれかにより感染させ、そして感染後の細胞生存率を測定した。rMVとは対照的に、rMV-SLAMblindは、B95a細胞の生存率に影響を与えなかった（図4a）。しかしながら、同じ用量でrMV-SLAMblindに感染させた乳癌細胞株の生存率は、感染後急速に低下した（図4b）。さらに、本発明の発明者らは、乳癌細胞株におけるMOI 0.1のrMV-SLAMblindおよびrMV-Edmonstonの細胞傷害性を比較した。rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonの場合と比較して、MDA-MB-453細胞の生存率をより効率的に低下させた（図4d）。このことは、おそらくはそれらの感染性の差異によるものと思われた（図2b）。MCF7細胞およびSKBR3細胞では、細胞生存率の同様の減少が、両方とものウイルスについて観察された（図4cおよび図4e）。
【００７３】
実施例6：rMV-SLAMblindのIn vivo腫瘍溶解活性
rMV-SLAMblindおよびrMV-Edmonstonを、皮下にMCF7異種腫瘍細胞移植片を有する重症複合型免疫不全（severe combined immune deficiency；SCID）マウスに対して、腫瘍内投与した。両方のウイルスの投与（105 TCID50の3回の投与）により、腫瘍増殖の抑制が引き起こされたが、rMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonの場合よりも、大幅な抑制を引き起こした（図5a）。MDA-MB-453異種移植片において、両方のウイルスの腫瘍内投与（106 TCID50の2回の投与）によってもまた、腫瘍増殖の抑制が引き起こされたが、しかしrMV-SLAMblindは、rMV-Edmonstonと比較して、最初は腫瘍増殖を抑制した（図5b）。SKBR3細胞は、マウスにおいて腫瘍を形成できなかった（データは示さず）。
【００７４】
実施例7：異種移植をしたマウスにおけるrMV-luc-SLAMblindの局在化
異種移植を受けたマウスにおけるウイルスの局在性を可視化するため、本発明の発明者らは、ホタルルシフェラーゼを発現するSLAM-blind組換えMV（rMV-luc-SLAMblind；図1d）を使用した。MDA-MB-453細胞を、11匹のヌードマウスの皮下に移植した。
【００７５】
6匹のマウスには、106TCID50のrMV-Iuc-SLAMblindの1回の腫瘍内投与を与え、そして5匹のマウスには、培養液のみを与えた（培養液対照）。さらに5匹のヌードマウスに対して細胞を含まないPBS／Matrigel混合物を移植し、そして同一の部位にウイルスを皮下的に投与した（腫瘍不含対照）。D-ルシフェリンを基質として使用して、本発明の発明者らは、生物発光画像法（BLI）を行った。少なくとも感染後21日（dpi）までに、強力で局所的な発光が、ウイルスを投与した異種移植したマウスにおいて検出された（図6a）（図6d）。対照群のいずれにおいても発光は検出されなかった（図6bおよび図6c）。さらに、本発明の発明者らは、以前に記載されたように、10 dpiにおいて生物発光と磁気共鳴画像法（MRI）とを組み合わせた（Inoue Y, et al., Mol Imaging 2010, 9: 163-172）。1匹のマウスのBLI/MRI融合画像を、図6eに示す。BLIで観察されたウイルス局在化を、MRIで観察された腫瘍局在化と重ね合わせた。これらの結果から、ウイルス複製が、腫瘍内で局在化されたことが示された。
【００７６】
実施例8：サルにおけるrMV-SLAMblindの安全性研究
in vivo安全性を評価するため、本発明においては、106 TCID50のrMV-SLAMblindをMVに対する血清抗体価陰性であることが確認された1頭のカニクイザルおよび2頭のアカゲザルに皮下的に接種した。接種後、カニクイザルを1ヶ月間モニタリングし、そしてアカゲザルを14日間モニタリングした。食欲不振、下痢、および発疹を含む麻疹の臨床症状は、いずれのサルにおいても検出されなかった（図7a）。体重に対する意味のある作用も見られなかった（図7b）。PBMCのウイルスレベルは、下限検出限界を下回っており（図7a）、そしてリンパ球数はウイルス接種後に減少しなかった（図7c）。好中球数の一過性の増加が0 dpiにカニクイザルにおいて見いだされたが、ウイルス接種前に血液が回収されたものであったため、無関係と考えられた。これらの結果は、感染させたサルに対して麻疹ウイルス血症およびリンパ球減少症を含む典型的な麻疹の臨床症状を引き起こす親野生型MV HL株およびその他の野生型MV株に関して報告された結果とは著しく異なっていた（Kobune F, et al., Lab Anim Sci 1996, 46: 315-320; Sato H, et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis 2008, 31: 25-35; Takeda M, et al., J Virol 2000, 74: 6643-6647; El Mubarak HS, et al., J Gen Virol 2007, 88: 2028-2034; Zhu YD, et al., Virology 1997, 233: 85-92）。これらの結果から、rMV-SLAMblindは、in vivoで弱毒化されていることが示された。このように、本発明のウイルスは、安全なウイルスであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、新規な組換え麻疹ウイルスから構成される腫瘍溶解性ウイルスを提供することができ、このウイルスは、様々な癌細胞株において効率的に増殖し、感染された細胞に対して効率的に細胞死を引き起こすことができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
SEQ ID NO: 1：HL野生型株の全長アンチゲノムcDNAのうち、Hタンパク質の533番目アミノ酸残基（SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号8867〜8869にコドンに対応）のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換した麻疹ウイルスrMV-SLAMblindの全塩基配列
SEQ ID NO: 2：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号108〜1685によりコードされるNタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号1807〜3330によりコードされるリンタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 4：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号3438〜4445によりコードされるMタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 5：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号5449〜7110によりコードされるFタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 6：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号7271〜9124によりコードされるHタンパク質のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 7：SEQ ID NO: 1のヌクレオチド番号9234〜15785によりコードされるLタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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