(57)【要約】      （修正有）【課題】ペリツェウス・メルツバッハ病治療方法及びそれに用いる治療剤の提供。【解決手段】下記式で例示される、Aktシグナル伝達系を阻害する、またはPI3Kタンパク質またはAktタンパク質のキナーゼ活性を阻害する、インヒビターを有効成分とするペリツェウス・メルツバッハ病治療剤。2013159571.tif 000019【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Aktシグナル伝達系を阻害するペリツェウス・メルツバッハ（Pelizaeus-Merzbacher）病治療剤。
【請求項２】
PI3Kタンパク質またはAktタンパク質のキナーゼ活性を阻害する、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
Aktシグナル伝達系阻害活性を有する化合物を有効成分とするペリツェウス・メルツバッハ（Pelizaeus-Merzbacher）病治療剤。
【請求項４】
前記化合物が、PI3Kタンパク質またはAktタンパク質のキナーゼ活性を阻害する、請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
前記化合物が、それぞれ以下の構造式を有するAkt inhibitor I、Akt inhibitor II、またはAkt inhibitor IIIである、請求項４に記載の治療剤。
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2013159571.tif 000017
2013159571.tif 000018
【請求項６】
ペリツェウス・メルツバッハ（Pelizaeus-Merzbacher）病治療薬の検定方法であって、
候補物質のAktシグナル伝達系阻害活性を測定する工程を含む、検定方法。
【請求項７】
Aktシグナル伝達系阻害活性がある場合、候補物質が前記治療薬になりうると判断し、
Aktシグナル伝達系阻害活性がない場合、候補物質が前記治療薬にならないと判断する工程、
をさらに含む、請求項６に記載の検定方法。
【請求項８】
ペリツェウス・メルツバッハ（Pelizaeus-Merzbacher）病治療薬の検定方法であって、
Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質が、PLP1遺伝子の欠陥によってオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、前記分化阻害を抑制するかどうかを調べる工程を含む、検定方法。
【請求項９】
前記オリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、
前記分化阻害を抑制する場合、候補物質が前記治療薬になりうると判断し、
前記分化阻害を抑制しない場合、候補物質が前記治療薬にならないと判断する工程、
をさらに含む、請求項８に記載の検定方法。
【請求項１０】
前記Aktシグナル伝達系阻害活性が、PI3Kタンパク質またはAktタンパク質のキナーゼ活性を阻害する活性である、請求項８または９に記載の検定方法。
【請求項１１】
ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬のスクリーニング方法であって、
候補物質のAktシグナル伝達系阻害活性を測定する工程と、
Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質を同定する工程と、を含むスクリーニング方法。
【請求項１２】
ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬のスクリーニング方法であって、
Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質が、PLP1遺伝子の欠陥によってオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、前記分化阻害を抑制するかどうかを調べる工程と、
前記分化阻害を抑制する物質を同定する工程と、を含むスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記Aktシグナル伝達系阻害活性が、PI3Kタンパク質またはAktタンパク質のキナーゼ活性を阻害する活性である、請求項１１または１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリツェウス・メルツバッハ病治療方法及びそれに用いる治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Pelizaeus-Merzbacher(ペリツェウス・メルツバッハ)病（PMD）は、先天性として知られている唯一の脳髄鞘形成不全疾病である。伴性劣性遺伝の形式をとり、発症頻度は20〜30万人にひとりの頻度で病因を有し、頭部の振戦、眼振、歩行時のふらつき、言語障害、視神経萎縮、進行性運動障害、精神運動発達退行などの症状が見られる。
【０００３】
とくに幼児期で発症すると重症化し、精神、言語、運動に強い障害がみられる。原因遺伝子は、Ｘ染色体上にあるプロテオ脂質蛋白質（proteolipid protein 1 (plp1)）であることが知られているが、plp1遺伝子異常の型は、遺伝子の重複（全体の50-75%）、変異（全体の15-20%）、欠失（全体の2%以下）など多様である。この３形式の遺伝子異常に該当しない、原因不明のPMD例も5-20%あるが、その変異箇所は特定されていない（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】宮本  幸、山内淳司  オリゴデンドロサイトの発生過程と中枢脱ミエリン疾患におけるCdk5の新しい役割  生化学  83巻4号  320-323頁（2011年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ペリツェウス・メルツバッハ病治療方法及びそれに用いる治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ病治療剤であって、Aktシグナル伝達系を阻害する治療剤である。特に、PI3Kタンパク質またはAkt1タンパク質のキナーゼ活性を阻害することが好ましい。
【０００７】
また、本発明のさらなる実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ病治療剤であって、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する。前記化合物は、PI3Kタンパク質またはAkt1タンパク質のキナーゼ活性を阻害してもよいが、以下の構造式を有するAkt inhibitor I、Akt inhibitor II、またはAkt inhibitor IIIであることが好ましい。
【０００８】
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【０００９】
さらに、本発明の一実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ病の治療方法であって、ペリツェウス・メルツバッハ病に罹患した患者において、Aktシグナル伝達系を阻害することを特徴とする。特に、PI3Kタンパク質またはAkt1タンパク質のキナーゼ活性を阻害することが好ましい。なお、前記患者の脳髄鞘形成細胞において、Aktシグナル伝達系を阻害することが好ましいが、前記脳髄鞘形成細胞は、オリゴデンドロサイト前駆細胞であってもよい。
【００１０】
また、本発明のさらなる実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ病の治療方法であって、ペリツェウス・メルツバッハ病に罹患した患者に対して、前記Aktシグナル伝達系阻害剤を投与することを特徴とする。前記Aktシグナル伝達系阻害剤は、PI3Kタンパク質またはAkt1タンパク質のキナーゼ活性を阻害することが好ましい。なお、前記患者の脳髄鞘形成細胞に対して、前記Aktシグナル伝達系阻害剤を投与することが好ましいが、前記脳髄鞘形成細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞であってもよい。
【００１１】
さらに、本発明の一実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ（Pelizaeus-Merzbacher）病治療薬の検定方法であって、治療薬候補物質のAktシグナル伝達系阻害活性を測定する工程を含む。Aktシグナル伝達系阻害活性がある場合、候補物質が前記治療薬になりうると判断し、Aktシグナル伝達系阻害活性がない場合、候補物質が前記治療薬にならないと判断する工程、をさらに含んでもよい。
【００１２】
また、本発明のさらなる実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ（Pelizaeus-Merzbacher）病治療薬の検定方法であって、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質が、PLP1遺伝子の欠陥によってオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、前記分化阻害を抑制するかどうかを調べる工程を含む。前記オリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、前記分化阻害を抑制する場合、候補物質が前記治療薬になりうると判断し、前記分化阻害を抑制しない場合、候補物質が前記治療薬にならないと判断する工程、をさらに含んでもよい。
【００１３】
さらに、本発明の一実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬のスクリーニング方法であって、候補物質のAktシグナル伝達系阻害活性を測定する工程と、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質を同定する工程と、を含む。
【００１４】
また、本発明のさらなる実施態様は、ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬のスクリーニング方法であって、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質が、PLP1遺伝子の欠陥によってオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、前記分化阻害を抑制するかどうかを調べる工程と、前記分化阻害を抑制する物質を同定する工程と、を含む。
【００１５】
なお、前記いずれのAktシグナル伝達系阻害活性も、PI3Kタンパク質またはAkt1タンパク質のキナーゼ活性を阻害する活性であってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、ペリツェウス・メルツバッハ病治療方法及びそれに用いる治療剤を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施例において、PLP1遺伝子を導入したオリゴデンドロサイト前駆細胞株に対し、ドミナント・ネガティブ変異型Akt1を強制発現させたときの、分化阻害の抑制を形態学的に解析した結果を示す写真である。VSは、特に矢印の先同士の写真を比較することの重要性を示している（以下の図も同様）。
【図２】図１で示した結果を定量的に解析した結果を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施例において、PLP1遺伝子を導入したオリゴデンドロサイト前駆細胞株に対し、ドミナント・ネガティブ変異型Akt1を強制発現させ、分化阻害の抑制を生化学的に解析した結果を示す写真である。
【図４】本発明の一実施例において、PLP1遺伝子を導入したオリゴデンドロサイト前駆細胞株に対し、Akt inhibitor Iを投与したときの、分化阻害の抑制を定量的に解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１９】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.; Juan S. Bonifacino (Bethesda, Maryland); Mary Dasso (Bethesda, Maryland); J. B. Harford, J. L-Schwartz, K. M. Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２０】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２１】
＝＝ペリツェウス・メルツバッハ（Pelizaeus-Merzbacher）病治療剤＝＝
本発明の一実施態様におけるペリツェウス・メルツバッハ病治療剤は、Aktシグナル伝達系阻害剤を含有する。なお、Aktタンパク質はAkt1〜3のアイソフォームを有するが、本明細書で、Aktを数字無しで記載したときは、これらのアイソフォームの総称であるとする。また、Aktを単独で表記した場合は、Aktタンパク質を意味するものとする。
【００２２】
本発明の一実施態様におけるペリツェウス・メルツバッハ病治療剤は、Aktシグナル伝達系を阻害し、結果として、Akt1の活性化を阻害する。従って、本発明の一実施態様におけるペリツェウス・メルツバッハ治療剤は、Akt1活性化阻害活性を有する化合物を有効成分として含有する。本明細書で、Aktシグナル伝達系とは、PI3Kを通って、最終的にAkt1を活性化するシグナル伝達系のことである。
【００２３】
Aktシグナル伝達系の阻害方法は特に限定されず、例えばAktシグナル伝達系の構成要素の活性化を阻害すればよいが、特に、PI3KかAktをターゲットにするのが好ましい。例えば、PI3K遺伝子またはAkt遺伝子の発現を抑制したり、PI3Kタンパク質やAktタンパク質のキナーゼ活性を阻害したりすることによって、Aktシグナル伝達系を阻害することができる。
【００２４】
従って、ペリツェウス・メルツバッハ病治療剤は、Aktシグナル伝達系阻害活性をゆする化合物を有効成分として含有してもよく、例えば、PI3K（PI3 kinase）またはAkt1〜3のいずれかのキナーゼ活性阻害活性を有する化合物であってもよい。具体的には、例えば、キノキサリン系化合物、API-2、Deguelin、KU0063794、LY294002、LY303511、Naltrindole Hydrochloride、1-O-Octadecyl-2-O-methyl-tac-glycero-3-phosphocholine、PI-103、PP242、Quercetin Dihydrate、SH-5、SH-6、SU4312、SU5416、AS605240、ZSTL474、IC486068、IC87114、GDC-0941、CAL-101、BKM-120、(+)-Wortmannin、Akt inhibitor I、 Akt inhibitor IIおよびAkt inhibitor III（Akt inhibitor I〜IIIは、いずれもMerck社、Hamburg, Germany）、 Akt1〜3のいずれかのドミナント・ネガティブ変異体（dnAkt）及びそのコーディング遺伝子、PI3K遺伝子またはAkt1〜3遺伝子のいずれかの遺伝子の発現抑制剤、Akt1〜3のいずれかの脱リン酸化剤などが例示できる。Aktシグナル伝達系阻害剤は、上記のようなAktシグナル伝達系の阻害物質を２つ以上含有していても良い。
【００２５】
なお、Akt inhibitor I〜IIIは、以下の構造式を有する。  
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【００２６】
また、キノキサリン系化合物は、例えば、以下の一般式で表される。  
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式（Ｉ）：［式中、Ｒ１は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）：
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からなる群から選択される置換されていてもよい環系であり；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、アリールアミノ、アシルアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、置換Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、アルキルカルボキシ、アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールシクロアルキル、置換アリールシクロアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアリールオキシから独立して選択され；ｎは、０〜２であり；Ｘは、ＣまたはＮであり；Ｙは、Ｃ、Ｏ、ＮまたはＳである］で示される化合物および／またはその医薬上許容される塩（
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ただし、式（Ｖ）〜（ＶＩＩＩ）の各々において、少なくとも１つのＹは炭素ではなく；また、式（ＶＩＩＩ）は少なくとも１つのオキソ基で置換されており；また、Ｒ１はイミダゾリジンジオンではなく、Ｒ１が４−ピリジニルである場合にはＲ２は置換アリール、チエニルまたは置換チエニルではない）。
【００２７】
好ましくは、Ｒ１が、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）からなる群から選択されるか、Ｒ１が、少なくとも１つの窒素を含有する置換されていてもよい６員ヘテロアリール環であるか、Ｒ１が、式（Ｖ）および（ＶＩ）からなる群から選択され、ここで、ＹがＣまたはＮであるか、Ｒ１が、式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）からなる群から選択されるか、Ｒ１が置換されていてもよいピリジニル環である。Ｒ３およびＲ４が水素であり、Ｒ２が、アリール、ヘテロアリール、置換アリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アミノ、置換アミノ、アリールアミノ、アシルアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、Ｃ１〜６アルキルおよび置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択されてもよい。
【００２８】
例えば、以下の一般式で表されるキノキサリン系化合物であってもよい。  
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［式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、アリールアミノ、アシルアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、置換Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、アルキルカルボキシ、アミノアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アリールシクロアルキル、置換アリールシクロアルキル、ヘテロアリールアルキル、置換ヘテロアリールアルキル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、アシルオキシおよびアリールオキシから独立して選択されるか；または、Ｒ５はＲ６であり、ここで、Ｒ６は−ＳＯ２ＮＲ８０または−ＮＳＯ２Ｒ８０であり、ここで、Ｒ８０は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいアリール、または５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され；ｎは０〜２であり、ｍは０〜２である］
【００２９】
さらに、以下の一般式で表されるキノキサリン系化合物であってもよい。  
2013159571.tif 000012
［式中、Ｒ２は、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アミノ、置換アミノ、アリールアミノ、アシルアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、アルコキシ、Ｃ１〜６アルキルおよび置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され；Ｒ３およびＲ４は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、置換Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、シアノ、ヒドロキシルおよびアルコキシから独立して選択され；Ｒ５は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、置換Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、ニトロから独立して選択されるか；またはＲ５はＲ６であり、ここで、Ｒ６は−ＳＯ２ＮＲ８０または−ＮＳＯ２Ｒ８０であり、ここで、Ｒ８０は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいアリール、または５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され；ｎは０〜２であり、ｍは０〜２である］
【００３０】
さらに、以下の一般式で表されるキノキサリン系化合物であってもよい。  
2013159571.tif 000013
［式中、Ｒ２は、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アミノ、置換アミノ、アリールアミノ、アシルアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ、アルコキシ、Ｃ１〜６アルキルおよび置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され；Ｒ３およびＲ４は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、置換Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、シアノ、ヒドロキシルおよびアルコキシから独立して選択され；Ｒ５は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜７シクロアルキル、置換Ｃ３〜７シクロアルキル、Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ３〜７ヘテロシクロアルキル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、ニトロから独立して選択され；Ｒ６は−ＳＯ２ＮＲ８０または−ＮＳＯ２Ｒ８０であり、ここで、Ｒ８０は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいアリール、または５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され；ｎは０〜２であり、ｍは０〜２である］
【００３１】
さらに、以下の一般式で表されるキノキサリン系化合物であってもよい。  
2013159571.tif 000014
［式中、Ｒ２は、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アミノ、置換アミノ、アリールアミノ、アシルアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノアルコキシ、Ｃ１〜６アルキルおよび置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され；Ｒ５は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシから独立して選択され；ｍは０〜１であり；Ｒ６は−ＮＳＯ２Ｒ８０であり、ここで、Ｒ８０は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいアリール、または５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され、ここで、ｎは０〜２である］
【００３２】
さらに、以下の一般式で表されるキノキサリン系化合物であってもよい。  
2013159571.tif 000015
［式中、Ｒ２は、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アミノ、置換アミノ、アリールアミノ、アシルアミノ、ヘテロシクロアルキルアミノ アルコキシ、Ｃ１〜６アルキルおよび置換Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され；Ｒ５は各々、水素、ハロゲン、アシル、アミノ、置換アミノ、Ｃ１〜６アルキル、置換Ｃ１〜６アルキル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシから独立して選択され；ｍは０〜１であり；Ｒ６は−ＳＯ２ＮＲ８０であり、ここで、Ｒ８０は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６ヘテロシクロアルキル、５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、置換アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいアリール、または５員環と縮合していてもよいかまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６シクロアルキル、ハロゲン、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシ、オキソもしくは−(ＣＨ２)nＣＯＯＨからなる群から選択される１〜５個の基で置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され、ここで、ｎは０〜２である］
【００３３】
dnAktとしては、Akt-K179A、Akt-T308A、Akt-S473A、などが例示できる。これらのdnAkt及びそのコーディング遺伝子の製造に用いるためのAktの由来となる動物種は、PI3K/Akt阻害剤の投与対象動物において効果がある限り、特に限定されないが、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。
【００３４】
PI3K遺伝子またはAkt遺伝子の発現抑制剤としては、PI3K遺伝子またはAkt遺伝子に対するsiRNA（RNAの一部はDNAであってもよい）、miRNA（RNAの一部はDNAであってもよい）、アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー（核酸アプタマー、ペプチドアプタマー）、などを例示できる。これらを設計するための特異的配列の由来となる動物種は特に限定されないが、Aktシグナル伝達系阻害剤の投与対象の動物と同じ動物種由来であることが好ましく、例えばヒトに投与する場合、ヒト由来であることが最も好ましい。なお、本願出願時の技術レベルでは、これらの発現抑制剤の設計は、当業者には容易である。
【００３５】
Aktの脱リン酸化剤としては、PP2A（タンパク質脱リン酸化酵素2A）、PHLPP (PH domain and Leucine rich repeat Protein Phosphatases)、CTMP（Carboxyl-terminal modulator protein）などが例示できる。
【００３６】
このようなAktシグナル伝達系阻害剤を含有するペリツェウス・メルツバッハ病治療剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、液剤などの剤形にしてもよい。また、これらの薬剤は、固形、液状、ゲル状、粉末状、ゼリー状、油状、ペースト状、泡状、クリーム状などの形状にしてもよい。この製剤化は、従来使用されている製剤添加物を用いて、常法で行うことができる。製剤添加物としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、矯味矯臭剤、溶剤、安定剤、基剤、湿潤剤、保存剤などの既存の添加物を用いることができる。
【００３７】
＝＝ペリツェウス・メルツバッハ病治療方法＝＝
本発明の一実施態様におけるペリツェウス・メルツバッハ病治療方法では、ペリツェウス・メルツバッハ病の患者において、Aktシグナル伝達系を阻害する。全身でAktシグナル伝達系を阻害してもよいが、少なくとも脳髄鞘形成細胞においてAktシグナル伝達系を阻害する必要があり、最も好ましくは、脳髄鞘形成細胞においてのみ、Aktシグナル伝達系を阻害することである。脳髄鞘形成細胞は、オリゴデンドロサイトであってもよいが、オリゴデンドロサイトに分化するオリゴデンドロサイト前駆細胞であればどの分化段階の細胞であってもよく、神経幹細胞でも構わない。
【００３８】
ペリツェウス・メルツバッハ病の患者において、Aktシグナル伝達系を阻害するには、例えば、その患者に対し、Aktシグナル伝達系阻害剤を投与すればよい。Aktシグナル伝達系阻害剤は、「ペリツェウス・メルツバッハ病治療剤」の項で記載したものを用いることができる。投与方法は、特に限定されず、それぞれのAktシグナル伝達系阻害剤に適した投与方法を用いればよい。例えば、低分子化合物の場合、経口投与してもよいし、腹腔内や静脈内への注射や点滴により非経口投与してもよい。核酸やタンパク質の場合、in vitroで合成した核酸やタンパク質を直接的に注入（inject）してもよいが、当該RNAやタンパク質を発現できる発現ベクターを構築し、その発現ベクターを、血液を通して、あるいは直接的に注入してもよい。その際、デリバリーシステムとして脂質などを用いることもできる。
【００３９】
＝＝ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬の検定方法＝＝
本発明の一実施態様では、ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬を検定するために、候補物質のAktシグナル伝達系阻害活性を測定する。そして、Aktシグナル伝達系阻害活性がある場合、候補物質がペリツェウス・メルツバッハ病治療薬になりうると判断し、Aktシグナル伝達系阻害活性がない場合、候補物質がペリツェウス・メルツバッハ病治療薬にならないと判断する。
【００４０】
Aktシグナル伝達系阻害活性の測定方法は特に限定されず、in vivoでもin vitroでも良い。一例として、in vitroでは、恒常的にAktシグナル伝達系が活性化しているヒト大腸癌細胞HC116などの腫瘍細胞や、IGF-1（insulin-like growth factor）を投与してAktシグナル伝達系を活性化させた培養細胞に対し、候補物質を適切な方法で投与し、その後、細胞の抽出物を調製し、非リン酸化Akt及びリン酸化Aktのそれぞれに対する特異的抗体を用いて、Aktシグナル伝達系の活性化が阻害されたかどうか調べることができる。なお、候補物質は、低分子化合物であれば培地に添加することによって、核酸分子であればトランスフェクションなどで細胞内に導入することによって、細胞に投与すればよい。
【００４１】
また、本発明の他の実施態様では、ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬を検定するため、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質が、PLP1遺伝子の変異によってオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、オリゴデンドロサイトへの分化阻害を抑制するかどうかを調べる。そして、オリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、分化阻害を抑制する場合、すなわち、オリゴデンドロサイト前駆細胞がオリゴデンドロサイトに分化するようになった場合、候補物質が前記治療薬になりうると判断し、分化阻害を抑制しない場合、すなわち、オリゴデンドロサイト前駆細胞がオリゴデンドロサイトに分化するようにならない場合、候補物質が治療薬にならないと判断する。
【００４２】
Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質がオリゴデンドロサイトへの分化阻害を抑制するかどうかを調べる方法は特に限定されず、in vitroの系でもin vivoの系でもかまわない。例えば、in vitroの系では、PLP1遺伝子の変異によってオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞は、PLP1遺伝子に自然に生じた突然変異または人為的に導入した突然変異を有する個体から単離してもよく、PLP1遺伝子に変異を有しないオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離し、in vitroで突然変異を導入しても構わない。そうして得られたオリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質が低分子化合物であれば培地に添加し、あるいは遺伝子に由来する核酸であれば細胞に導入し、その前駆細胞を分化条件におくことによって、その物質がオリゴデンドロサイトへの分化阻害を抑制または解除することができるかどうか調べることができる。また、in vivoの系では、PLP1遺伝子に自然に生じた突然変異または人為的に導入した突然変異を有する個体を用い、Akt阻害活性を有する物質が低分子化合物であれば、経口投与や静脈注射によって投与し、あるいは遺伝子に由来する核酸であればオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞に導入し、個体内で、オリゴデンドロサイトが分化できるかどうか調べることができる。
【００４３】
＝＝ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬のスクリーニング方法＝＝
本発明の一実施態様では、ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬をスクリーニングするため、まず、候補物質のAktシグナル伝達系阻害活性を測定する。Aktシグナル伝達系阻害活性の測定方法は、「ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬の検定方法」の項で上述した通りである。そして、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質を同定し、当該物質をペリツェウス・メルツバッハ病治療薬として選択する。
【００４４】
また、本発明の他の実施態様では、ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬をスクリーニングするため、Aktシグナル伝達系阻害活性を有する物質が、PLP1遺伝子の変異によってオリゴデンドロサイトへの分化阻害を生じているオリゴデンドロサイト前駆細胞に対し、オリゴデンドロサイトへの分化阻害を抑制するかどうかを調べてもよい。その方法は、「ペリツェウス・メルツバッハ病治療薬の検定方法」の項で上述した通りである。そして、分化阻害を抑制する物質を同定し、当該物質をペリツェウス・メルツバッハ病治療薬として選択する。
【実施例】
【００４５】
本実施例では、オリゴデンドロサイト前駆細胞株に対する、PLP1遺伝子導入による分化阻害と、PLP1遺伝子を導入した当該細胞株に対する、ドミナント・ネガティブ変異型Akt1の強制発現、またはAkt inhibitor Iの投与による、分化阻害の抑制を示す。
【００４６】
（１）形態学的解析
ヒト大脳のtotal RNA(ニッポンジーン社、東京)から、下記プライマーを用いて、RT-PCR法でPLP1を単離した。  
PLP1-S: ccgggatccaccatgggcttgttagagtgctgtg（配列番号１）
PLP1-AS: ccgggatcctcagaacttggtgcctcgg（配列番号２）
制限酵素（BamHI）で切断し、同酵素で切断したpRetroX-IRES-ZsGreen1（Takara Bio社、京都）のIRES下流に挿入し、PLP1と蛍光蛋白質ZsGreenを同時に発現するpRetroX-IRES-PLP1-ZsGreen1を作製した。  
また、同様に、下記プライマーを用いて、Akt1を単離した。  
Akt1-S: ccgggatccaccatgagcgacgtggctattgtgaag（配列番号３）
Akt1-AS:ccgggatcctcaggccgtgccgctg（配列番号４）
PCR法でドミナント・ネガティブ変異型（179番目のリジンをアラニンに置換、K179A）にしてpCMV5ベクターに挿入し、pCMV5-Akt1K179Aを作製した。まず、pCMV5-Akt1を鋳型に下記プライマーAkt1-K179AとAkt1-ASプライマーと用いて第一回目のPCR反応を行い、得られた溶液にAkt1-Sプライマーを加え、第二回目のPCR反応を行った。その最終PCR産物を同様にpCMV5ベクターに挿入した。  
Akt1-K179A: acaggccgctactacgccatggccatcctcaagaaggaagtc（配列番号５）
【００４７】
このようにして作製したpRetroX-IRES-PLP1-ZsGreen1及び／又はpCMV5-Akt1K179Aを、マウスのオリゴデンドロサイト前駆細胞株FBD-102bに対し、Lipofectamine Plus （Invitrogen 社、Carlsbad, CA, USA）を用いてリポフェクトし、PLP1とZsGreen1を同時に、一過的に発現させたなお、pRetroX-IRES-PLP1-ZsGreen1に対するコントロールベクターとして、pCMV5を用いた。
【００４８】
高血清条件（10%ウシ胎児血清）で培養していた各遺伝子導入細胞を低血清条件（1%ウシ胎児血清）にして、髄鞘突起をもつ成熟オリゴデンドロサイトに分化誘導した（Miyamoto et al. J. Cell Sci. 2007, Vol.120, pp4355-4366）。「細胞体から5本以上の髄鞘突起（または5個以上の髄鞘膜の突出構造）を有し、さらにその突起からも分岐した突起を有していること」を指標として、分化誘導の有無で、成熟オリゴデンドロサイトを観察し（図１）、その数を比較した（図２）。
【００４９】
図１に示すように、FBD-102b細胞にPLP1遺伝子を導入すると分化が阻害されたが（左から２列目下図）、PLP1遺伝子とAkt1K179A遺伝子を共導入すると分化能が回復した（左から４列目下図）。このように、PLP1遺伝子導入によって、分化阻害が生じるのであるが、優性抑制型Akt1の強制発現によって、分化阻害が抑制され、オリゴデンドロサイト前駆細胞がオリゴデンドロサイトに正常に分化できるようになる。
【００５０】
図２では、細胞をランダムに５０個観察し、そのうち分化したオリゴデンドロサイトの割合を示すことによって、PLP1遺伝子導入によって生じた分化阻害（左から４番目の棒グラフ）が、ドミナント・ネガティブ変異型Akt1の強制発現によって抑制される（最も右の棒グラフ）ことを定量的に示した。
【００５１】
（２）生化学的解析
次に、（１）と同じ細胞分化系で、髄鞘マーカーである髄鞘塩基性蛋白質（MBP）の発現を確認することによって、生化学的レベルで髄鞘分化を調べた。  
各遺伝子導入細胞のextractを抽出し、MBP抗体（SMI94、Covance社、Emeryville, CA, USA、1:100希釈）及びActin抗体（Ab-5、BD Pharmingen社、Franklin Lake, NJ, USA、1:500希釈）を用い、ウエスタンブロットでMBPの発現を調べた（図３）。なお、内部標準として、Actinの発現も同時に調べた。  
図３に示すように、PLP1遺伝子を導入するとMBPの発現が抑制されるが（左から６列目）、PLP1遺伝子とAkt1K179A遺伝子を共導入するとMBPの発現が回復する（左から８列目）。このように、生化学的解析の結果は、（１）の形態学的解析の結果と一致する。
【００５２】
（３）薬理学的解析
Akt1K179A遺伝子導入のかわりに、PI3Kに結合し (IC50 = 83 mM) PI3KのAktへの結合を阻害する、Akt inhibitor I （Merck社、Hamburg, Germany）を10 μM（最終濃度）で培養液に添加し、１２時間培養することによって、（１）と同様の実験を行い、分化細胞の数を測定した（図４）。  
図４に示すように、PLP1遺伝子を導入すると細胞の分化が阻害され（左から４列目）、PLP1遺伝子導入細胞をAkt inhibitor Iで処理すると、分化阻害が抑制された（左から８列目）。  
このように、PLP1による細胞の分化阻害活性の抑制はAkt1阻害に起因するものであって、PI3K阻害活性を有する低分子化合物でも、ドミナント・ネガティブ変異型Akt1と同様の結果が得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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