(57)【要約】      （修正有）【課題】非常に安全であり、毎日の服用も可能である、脂肪肝の抑制剤の提供。【解決手段】ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣またはその抽出物を有効成分として含む、脂肪肝の抑制剤。ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）とは、ウリ科ニガウリ属の植物であり、主にベトナムなどの東南アジア、中国の南部、台湾、インドなどで自生や栽培されている。ｇａｃの種子は、漢方においてはモクベツシと呼ばれ、外用剤として消炎剤や解毒剤などとして利用されているものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣を有効成分として含むことを特徴とする脂肪肝抑制剤。
【請求項２】
ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣の乾燥物を含む請求項１に記載の脂肪肝抑制剤。
【請求項３】
ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣の抽出物を有効成分として含むことを特徴とする脂肪肝抑制剤。
【請求項４】
予防的に用いるものである請求項１〜３のいずれかに記載の脂肪肝抑制剤。
【請求項５】
１日当たり１ｍｇ／ｋｇ体重以上、２０ｇ／ｋｇ体重以下投与するものである請求項１〜４のいずれかに記載の脂肪肝抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪肝を抑制するものであり且つ安全な薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食餌に由来するエネルギーが消費エネルギーを上回った場合、余分なエネルギーは中性脂肪などとして体内に蓄えられ、空腹時など、需要に応じて血液中に放出される。中性脂肪は、主に腸間膜や皮下脂肪組織に蓄積されるほか、肝臓にも貯蔵される。脂肪肝は肝細胞に中性脂肪が異常に蓄積した状態をいい、明確な定義はないが、一つの基準としては、肝細胞の３０％以上に中性脂肪がたまった状態を脂肪肝という。
【０００３】
従来、脂肪肝は良性の肝疾患であると考えられていたが、メタボリックシンドロームや動脈硬化の発症や進展と直接関係することが明らかになりつつあり、また、肝炎や肝硬変、さらには肝がんへ進行する場合もあることも分かってきた。
【０００４】
例えば、通常、インスリンの作用により血中のブドウ糖は肝臓に取り込まれ、過血糖状態が抑制される。しかし脂肪肝になると、膵臓からインスリンが分泌されているにもかかわらずその作用が減弱した状態、いわゆるインスリン抵抗性があらわれ、血糖値が十分に制御できなくなる。インスリン抵抗性があらわれると、インスリンの分泌が過剰になり、脂肪合成促進作用、血圧上昇作用、動脈硬化促進作用など、インスリン由来の副作用が顕著なものとなる。
【０００５】
このように脂肪肝は、肥満、高血圧、糖尿病、高脂血症などと関係しつつ、特に高カロリー食や運動不足などにより、関連疾患と共に悪化の一途を辿るという問題がある。
【０００６】
また、脂肪性肝炎はアルコールの過剰摂取との関係が深いと一般的には理解されていたが、近年では、アルコール以外の要因でも発症することが明らかにされている。かかる脂肪性肝炎は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と呼ばれ、脂肪肝から進行すると考えられ、炎症を伴わない脂肪肝よりもインスリン抵抗性が顕著に現れ、肝線維化や肝硬変、さらには肝がんまで進行し得る。
【０００７】
その一方で、肝臓は沈黙の臓器といわれるように、特に各疾患の初期にはほとんど自覚症状がない。脂肪肝の場合も初期には自覚症状がなく、進行に従って、疲れ易い、体がだるい、食欲不振といった肝臓疾患の一般的症状があらわれるが、肝臓疾患と自覚することは少なく、風邪などと勘違いして放置することによりさらに悪化させることも多い。
【０００８】
よって脂肪肝は、普段の生活習慣からその予防に努めることも重要であるし、また、初期段階で改善することが好ましい。
【０００９】
脂肪肝の治療剤としては、インスリン抵抗性や糖尿病の治療用の薬剤が利用されることが多い。例えば特許文献１には、脂肪肝の治療剤としてＰＰＡＲα（ペルオキソーム増殖因子活性化レセプターα；Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）活性化剤が開示されている。ところがこのような薬剤は、糖尿病自体の治療などにも使われる合成医薬品であり副作用も強いと考えられ、予防的な用途には適さない。
【００１０】
一方、特許文献２〜５には、脂肪肝の予防剤や治療剤として、トリグリセライドや微生物に由来する成分が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−２２０３４５号公報
【特許文献２】特開平６−２７９２７８号公報
【特許文献３】特開２００１−１４５４９８号公報
【特許文献４】特開２００８−２４６８０号公報
【特許文献５】特開２０１１−２０１８０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、近年、脂肪肝対策に注目が集まっており、様々な治療剤などが開発されている。しかし、脂肪肝は予防が特に重要であることから、毎日の服用も可能であるような食品由来の予防剤や治療剤が好ましい。
【００１３】
そこで本発明は、非常に安全であり毎日の服用も可能である脂肪肝の抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、東南アジアでは一般的に栽培されているが、日本では知名度の低いｇａｃの果実の中で、種子を被覆している種衣が脂肪肝の抑制に極めて有効であることを見出して、本発明を完成した。
【００１５】
本発明に係る脂肪肝抑制剤は、ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１６】
なお、本発明における「抑制」の語には、脂肪肝の発生の抑制、即ち「予防」と、発生した脂肪肝の軽減、即ち「治療」の両方の概念が含まれる。従って、本発明の脂肪肝抑制剤は、脂肪肝の発生前から予防的に用いてもよいし、脂肪肝の発生後に治療的に投与してもよい。
【００１７】
上記のｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣は、乾燥物であることが好ましい。ｇａｃ種衣の乾燥物は、取扱性や保存性の面で優れている。
【００１８】
また、本発明に係る脂肪肝抑制剤としては、ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣の抽出物を有効成分として含むものも好ましい。本発明者らによる実験的知見により、かかる抽出物が、優れた脂肪細胞分化誘導作用を示し、脂質代謝異常などを改善することが明らかにされている。
【００１９】
本発明に係る脂肪肝抑制剤は、予防的に用いることが好ましい。近年、高脂肪食が常態化しており、脂肪肝のリスクが高まっているのに対して、本発明に係る脂肪肝抑制剤は非常に安全であることから、恒常的な摂取や服用も可能であるので、普段から高脂肪食を嗜好しているヒトにおいても脂肪肝を有効に予防することができる。なお、本発明において予防的な使用とは、中性脂肪からなる油滴を有する肝細胞の割合が、全肝細胞に対して３０％未満である段階の使用をいうものとする。
【００２０】
本発明に係る脂肪肝抑制剤の投与量は、１日当たり１ｍｇ／ｋｇ体重以上、２０ｇ／ｋｇ体重以下とすることが好ましい。当該投与量が１ｍｇ／ｋｇ体重以上であれば、脂肪肝をより十分確実に抑制することが可能になる。一方、当該投与量が多過ぎても効果が飽和するので、当該投与量としては２０ｇ／ｋｇ体重以下が好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る脂肪肝抑制剤は、食用にも用いられているｇａｃの種衣を有効成分とするものであることから非常に安全であり、毎日の摂取や服用も可能である。また、本発明に係る脂肪肝抑制剤は、脂肪肝の予防作用や治療作用に極めて優れている。よって本発明は、近年における食生活の欧米化などにより問題になっていた脂肪肝を抑制できるものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｇａｃ果実の断面を示す写真である。
【図２】図２は、通常飼料を与えた通常食群、高脂肪飼料を与えた対照食群、ｇａｃ種衣を含む高脂肪飼料を与えたｇａｃ食群のラットの肝臓におけるコレステロールとトリグリセライドの総量を比較するためのグラフである。
【図３】図３は、通常食群、対照食群、ｇａｃ食群のラットの肝臓における組織の変化を示す拡大写真である。
【図４】図４は、通常食群、対照食群、ｇａｃ食群のラットの糞便１日分中に排出されるコレステロールとトリグリセライドの量を比較するためのグラフである。
【図５】図５は、通常食群、対照食群、ｇａｃ食群のラットの血中コレステロール濃度を比較するためのグラフである。
【図６】図６は、通常食群、対照食群、ｇａｃ食群のラットの血中トリグリセライド濃度を比較するためのグラフである。
【図７】図７は、通常食群、対照食群、ｇａｃ食群のラットの一般的な内臓脂肪の量を比較するためのグラフである。
【図８】図８は、ｇａｃ種衣抽出物の脂肪細胞分化促進作用を試験した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に係る脂肪肝抑制剤は、ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣を有効成
分として含むことを特徴とする。
【００２４】
ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）はウリ科（Cucurbitaceae）ニガウリ属（Momordica Linn.）の植物であり、主にベトナムなどの東南アジア、中国の南部、台湾、インドなどで自生や栽培されており、花期は通年である。その果実は７〜１０ｃｍほどの卵形または球形であり、表皮に多数の小棘を有し、熟したものは桃色から赤色になる。果実の断面は図１のとおりであり、果皮の内側に果肉があり、そのさらに内側に種衣に包まれた種子がある。ｇａｃの種子は、漢方においてはモクベツシと呼ばれ、外用剤として消炎剤や解毒剤などとして利用されている。また、種衣の色は真紅であり、東南アジアでは食べ物の着色などに利用されている。
【００２５】
本発明では、ｇａｃの種衣を有効成分として利用する。上記のとおりｇａｃの種子は漢方薬の材料などとして利用されているが、種衣については着色以外に十分な利用はされておらず、従来、その生理作用の報告はない。しかし、食べ物の着色に用いられていることからもその安全性は高く、その服用や摂取により副作用が生じる可能性は無いか、極めて少ないと考えられる。
【００２６】
ｇａｃの種衣は、ｇａｃ果実から種子と共に取り出した後、種子を分離除去して得ることができる。
【００２７】
本発明においては、ｇａｃの種衣はそのまま摂取してもよい。しかし、香味などの問題から、製剤化したり、食物や飲料などに添加することが好ましい。そのため、取扱性や保存安定性の問題から、ｇａｃ種衣は乾燥物とすることが好ましい。
【００２８】
ｇａｃ種衣の乾燥物は、ｇａｃ種衣を常法により乾燥することにより得ることができる。例えば、ｇａｃ種衣を常温で風乾してもよいが、腐敗などを防ぐために凍結乾燥や加熱乾燥することが好ましい。また、加熱乾燥は常圧で行ってもよいが、減圧下で行ってもよい。
【００２９】
ｇａｃ種衣は、粉砕してもよい。例えば、ｇａｃ種衣をそのまま湿式粉砕したり、乾燥後、乾式粉砕してもよい。粉砕の程度は適宜調整すればよいが、例えば、粒子径が２ｍｍ以下になるまで粉砕すればよい。当該粒子径としては、１ｍｍ以下がより好ましく、５００μｍ以下がさらに好ましい。一方、下限は特に制限されないが、過剰な粉砕は製造効率を低下させるおそれがあり得るので、１０μｍ以上とすることが好ましい。かかる粒子径は厳密なものではなく、例えば、目開き１ｍｍの篩で篩い分けされるものであれば、その粒子径は１ｍｍ以下ということができる。
【００３０】
本発明に係る脂肪肝抑制剤は、ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の種衣の抽出物を有効成分として含むものであってもよい。
【００３１】
抽出に用いる溶媒は特に制限されないが、水混和性溶媒、水と水混和性溶媒との混合溶媒、または水が好ましい。ここで、水混和性溶媒は、常温で水と１：１（容量比）で混合した場合に二層に分離しないものをいうものとする。かかる水混和性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓ−ブタノール、ｔ−ブタノールのＣ1-4アルコールを挙げることができ、Ｃ1-2アルコールが好ましい。また、ここでいう水の種類は特に制限されず、蒸留水、純水、超純水、精製水、水道水などいずれも用いることができる。水と水混和性溶媒との混合溶媒における水と水混和性溶媒との割合は、適宜調整すればよいが、例えば、全体に対する水混和性溶媒の濃度で５０ｖ／ｖ％以上とすることができ、６０ｖ／ｖ％以上が好ましく、７０ｖ／ｖ％以上がより好ましく、８０ｖ／ｖ％以上がさらに好ましく、９０ｖ／ｖ％以上が特に好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、９９ｖ／ｖ％以下とすることができる。
【００３２】
抽出に用いるｇａｃの種衣は、果実から取り出して種子を分離したものであってもよいし、その乾燥物、さらにはこれらの粉砕物であってもよい。
【００３３】
抽出溶媒の使用量は特に制限されず、適宜調整すればよい。例えば、ｇａｃの種衣の乾燥粉末に対して、０．１Ｌ／ｋｇ以上、１０Ｌ／ｋｇ以下程度とすることができる。
【００３４】
抽出温度も適宜調整することができ、例えば、１０℃以上、１００℃以下とすることができる。なお、溶媒の沸点以上で抽出する場合には、抽出容器を密閉するか、加圧することが好ましい。また、抽出溶媒を加熱還流してもよい。さらに、抽出温度は段階的に変更してもよい。
【００３５】
抽出時間も適宜調整することができ、例えば、合計で１時間以上、２００時間以下程度とすることができる。
【００３６】
抽出後の混合液は、そのまま用いることができるが、通常の後処理を行ってもよい。例えば、抽出残渣と抽出溶媒を濾過や遠心分離などにより分離したり、また、分離した抽出液を、加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥などを適宜組み合わせて乾燥してもよい。
【００３７】
本発明に係る脂肪肝抑制剤の剤形は特に問わない。例えば、上述したようにｇａｃ種衣そのものや抽出液そのものであってもよい。また、注射剤としての投与を志向して、溶液やエマルション製剤などの液状製剤とすることも考えられる。しかし、後記の実施例のとおり、本発明に係る脂肪肝抑制剤は経口投与で高い効果を示すことから、摂取や服用のし易さからも経口剤とすることが好ましい。
【００３８】
経口製剤としては、特に制限されないが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤などを挙げることができる。本発明に係る脂肪肝抑制剤には、剤形に合わせ、薬学上許容される添加剤を用いてもよい。かかる添加剤としては、例えば、賦形剤、基剤、防腐剤、助剤、安定化剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、着色剤、甘味料などを挙げることができる。また、溶液や分散液として飲料にしてもよいし、一般的な食餌に添加してもよい。
【００３９】
その他、糠の代わりにｇａｃ種衣の粉末を用いて漬け床とし、野菜、魚、肉などを漬けてもよい。例えば、ｇａｃ種衣に対して１質量％以上、２０質量％以下程度の食塩を用意し、ｇａｃ種衣の１倍質量以上、５倍質量以下程度の水に溶解する。乾燥したｇａｃ種衣粉末をかき混ぜながら少量ずつ食塩水を加える。そこへ、漬物の原料となる野菜などを加えればよい。かかる態様により、ｇａｃ種衣の有効成分が浸透した漬物とすることができ得る。このような漬物も、本発明に係る脂肪肝抑制剤に含まれるものとする。
【００４０】
本発明に係る脂肪肝抑制剤の投与頻度や投与量は、予防的な使用か治療的な使用かや、脂肪肝の重篤度、患者の年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよい。後述する実験データによれば、ラットの体重（ｋｇ）当たり、１日３．６〜５．５ｇのｇａｃ種衣投与で十分な脂肪肝抑制効果が確認された。かかる結果より、ヒトに対する投与量は、１日当たりｇａｃ種衣で１ｍｇ／ｋｇ体重以上、２０ｇ／ｋｇ体重以下程度とすることが好ましい。当該投与量としては、１００ｍｇ／ｋｇ体重以上がより好ましく、４００ｍｇ／ｋｇ体重以上がさらに好ましく、また、５ｇ／ｋｇ体重以下がより好ましく、２ｇ／ｋｇ体重以下がさらに好ましい。また、一日当たりの投与回数としては、１回以上、５回以下が好ましく、１回以上、３回以下がより好ましく、１回以上、２回以下がさらに好ましい。また、ｇａｃ種衣の投与頻度や投与量も、同様とすることができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４２】
実施例１
（１）  ｇａｃ種衣粉末の調製
ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の果実を切断し、種衣部分を取り出し、種子を分離した。得られた種衣を凍結乾燥し、粉末を得た。
【００４３】
得られた粉末の栄養成分の分析を財団法人日本食品分析センターに依頼した。結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2013241407.tif 000002
（２）  飼料の調製
ＡＩＮ−９３Ｇ（米国国立栄養研究所によるマウス・ラットの栄養研究のための標準飼料組成）を基礎として表２に示す組成の通常飼料を調製した。
【００４５】
さらに古市幸夫，「ラット脂質代謝に及ぼす食用きのこの作用」，日本食品科学工学会誌，第５３号，第６１２〜６１８頁（２００６年）を参照し、ラード１５質量％とコレステロール０．５質量％を添加した高脂肪食である対照飼料を調製した。
【００４６】
さらに、対照飼料へ上記（１）で得たｇａｃ種衣粉末を５質量％または１０質量％加えた本発明飼料を調製した。その際、上記に示したｇａｃ種衣粉末の栄養組成に従って、ミネラル分、セルロース、大豆油、カゼインの量を低減し、エネルギー量を同様のものとした。
【００４７】
【表２】
2013241407.tif 000003
実施例２
（１）  飼育
７週齢雄性ラット（体重２１０〜２３０ｇ）３２匹を日本ＳＬＣ株式会社より購入し、上記通常飼料と水を自由摂取させつつ７日間予備飼育した。これらを任意に８匹ずつ４群に分け、それぞれの群に、通常飼料、対照飼料（高脂肪飼料）、５％ｇａｃ飼料または１０％ｇａｃ飼料と、水とを自由摂取させつつ４週間飼育した。最後の２日間では糞便を採取した。１日毎に飼料の摂取量と各ラットの体重を測定したが、群間に有意差は認められなかった。
【００４８】
次いで、１ｍｇ／１００ｇ体重のネンブタールを腹腔内注射して麻酔した後に開腹し、腹部大動脈より採血した。また、生理食塩水で肝臓を灌流した後、肝臓、腎臓および副睾丸を摘出した。また、腸間膜脂肪も摘出した。
【００４９】
（２）  肝臓に含まれる脂質分析
摘出した肝臓（２ｇ）に、７．５容量倍の容量比２：１のクロロホルム：メタノール混合液を加え、２０００ｒｐｍで１５秒間ホモジナイズした。得られた懸濁液を４℃で一晩静置した後、濾過した。得られた濾液に上記混合液を加えて容量を１００ｍＬとした。得られた希釈液（２０μＬ）を減圧濃縮した後、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬社製，１．５ｍＬ）を用い、６００ｎｍの波長光強度を測定することにより肝臓中のコレステロール総量を求めた。また、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬社製，１．５ｍＬ）を用い、肝臓中のトリグリセライド総量を求めた。トリグリセライドの結果を図２（１）に、コレステロールの結果を図２（２）に示す。なお、図２中、異なるアルファベット間は、Ｔｕｋｅｙ検定において危険率ｐ＜０．０５で有意差があることを示す。例えば、ａとａｂとの間に有意差は無いが、ａとｂ間およびａとｃ間には有意差がある。
【００５０】
図２のとおり、高脂肪飼料を与えた対照食群では、通常食群に対して肝臓コレステロールと肝臓トリグリセライドの濃度が有意に高まっていた。しかし、ｇａｃ種衣を与えたｇａｃ食群では、対照食群と同様に高脂肪飼料を摂取しているにもかかわらず、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセライド共に、対照食群と比べてその濃度がｇａｃ種衣の添加量に応じて有意に低減されていた。かかる結果より、ｇａｃ種衣は肝脂肪を抑制できることが明らかとなった。
【００５１】
（３）  肝臓組織の変化
摘出した肝臓をＯＴＣコンパウンドに−８０℃で包埋し、−２５℃でスライスして厚さ１０μｍの凍結切片とした。
【００５２】
得られた凍結切片をＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏで染色した。具体的には、凍結切片を２０％ホルマリンに５分間浸漬した後、６０％イソプロピルアルコールで洗浄した。次いで、Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色液に３７℃で１０分間浸漬した。６０％イソプロピルアルコールで洗浄した後、マイヤーのヘマトキシリン染色液に２０分間浸漬した。次に、切片を封入剤に封入した。
【００５３】
また、得られた凍結切片をヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）した。具体的には、凍結切片を２０％ホルマリンに１０分間浸漬した後、マイヤーのヘマトキシリン染色液に１分間浸漬した。次いで、１％エオジン液に１０秒間浸漬し、脱水と透徹を行った後、封入剤に封入した。
【００５４】
結果を図３に示す。Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏは脂肪細胞に触れると細胞内脂質であるトリグリセライドに溶け込むので、細胞内トリグリセライドを検出することができる。図３（１）〜（４）のとおり、通常食群の肝臓はＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏではほとんど染色されないが、対照食群では肝臓全体にわたりトリグリセライドが分布していることが分かる。それに対してｇａｃ種衣を摂取した場合、飼料内のｇａｃ種衣濃度に応じて肝臓内トリグリセライドが抑制されていた。
【００５５】
また、ＨＥ染色ではオルガネラなどが染色されるが、油滴は染色されない。図３（５）〜（８）のとおり、通常食群に対して対照食群では、細胞内における油滴の顕著な増加が見られた。それに対して、ｇａｃ種衣を摂取した場合、飼料内のｇａｃ種衣濃度に応じて油滴が低減されていた。
【００５６】
（４）  脂質排泄の分析
２日分の糞便（約０．５ｇ）に、容量比２：１のクロロホルム：メタノール混合液を６０容量倍加え、１分間混合した。得られた懸濁液を４℃で一晩静置した後、濾過した。得られた濾液に上記混合液を加えて容量を１００ｍＬとし、糞便の抽出液とした。さらに、肝臓抽出液の希釈液（２０μＬ）の代わりに糞便抽出液の希釈液（４００μＬ）を用いた以外は上記実施例２（２）と同様にして、１日の糞便中へのコレステロール排泄量とトリグリセライド排泄量を求めた。トリグリセライドの結果を図４（１）に、コレステロールの結果を図４（２）に示す。なお、図４中のアルファベットの意味は図２と同様であり、各群間の有意差の有無を示す。
【００５７】
図４のとおり、ｇａｃ種衣を与えたｇａｃ食群では、糞便中へのコレステロールとトリグリセライドの排泄量が、通常食群と対照食群に対して顕著に増加している。この結果は、ｇａｃ種衣が、食餌中に含まれる脂質の体外への排出を積極的に促進することを示している。
【００５８】
（５）  血中脂質量の分析
採取した血液を常温で３０分以上静置することで血清と血球に分けた。４℃、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清（血清）を新しい１．５ｍＬ容サンプリングチューブに加えた。さらにＨＤＬ−コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いた以外は上記実施例２（２）と同様にして、血中のコレステロール濃度とトリグリセライド濃度を測定した。総コレステロール濃度の結果を図５（１）に、ＨＤＬコレステロール濃度の結果を図５（２）に、ＬＤＬコレステロール濃度の結果を図５（３）に、トリグリセライド濃度の結果を図６に示す。
【００５９】
図５と図６のとおり、血中におけるＬＤＬとトリグリセライドの濃度には、各群間で有意差は認められなかった。しかし、いわゆる善玉コレステロールであるＨＤＬに関しては、対照食群ではその濃度が有意に低いのに対して、ｇａｃ種衣を摂取した場合には飼料内のｇａｃ種衣濃度に応じて高くなり、飼料中にｇａｃ種衣を１０％含む場合には、血中ＨＤＬ濃度は対照食群に対して有意に高くなった。かかる結果より、ｇａｃ種衣は、血中ＨＤＬ濃度を高めて血中コレステロールの肝臓への運搬を促進すると考えられる。さらに上記実施例２（２）〜（４）の結果をあわせて検討すれば、ｇａｃ食群では肝臓へ運搬されたコレステロールは肝臓に蓄積することなく排泄されると考えられるので、脂肪肝のリスクは非常に低いといえる。
【００６０】
（６）  内臓脂肪重量の変化
上記実施例２（２）〜（４）の結果により、ｇａｃ種衣を摂取した場合には高脂肪食に由来する脂肪は肝臓に蓄積せず、体外に排出されることが明らかにされたが、他の臓器での脂肪重量も調べた。
【００６１】
摘出した腎臓と副睾丸の周囲に蓄積している脂肪分を分離し、その重量を測定した。また、腸間膜に付着した脂肪分を分離し、同じくその重量を測定した。これら臓器における脂肪の合計量を図７の（１）に、副睾丸周囲の脂肪量を（２）に、腎臓周囲の脂肪量を（３）に、腸間膜における脂肪量を（４）に示す。
【００６２】
図７のとおり、通常食群、対照食群、ｇａｃ食群において、これらの臓器における脂肪量はほとんど変化しないことが分かった。このように、高脂肪食の摂取により脂肪は主に肝臓に蓄積するが、本発明の脂肪肝抑制剤を摂取または服用すれば、体重や一般の内臓脂肪を低減することはないが、特に肝臓の脂肪分を顕著に低減できることが証明された。
【００６３】
なお、以上の結果とｇａｃ食群が摂取した食餌量を考慮すれば、１日当たり３．６〜５．５ｇ／ｋｇ体重のｇａｃ種衣の摂取により高い脂肪肝抑制効果が得られることが分かった。
【００６４】
実施例３
一般的に、脂肪肝の発症には内臓脂肪の蓄積が伴うが、上記実施例２の結果のとおり、本発明の脂肪肝抑制剤によれば、肝臓以外の臓器での脂肪量に影響を与えることなく、肝臓のみにおいて脂肪成分を低減することができる。その作用機序につき検討を行った。
【００６５】
（１）  ｇａｃ種衣のメタノール抽出物の調製
ｇａｃ（Momordica cochinchinensis）の果実を切断し、種衣部分を取り出し、種子を分離した。得られた種衣（７００ｇ）をメタノール（５Ｌ）に加え、常温で７日間抽出した。次いで、不溶分を濾別し、得られた濾液を減圧濃縮することにより、ｇａｃ種衣のメタノール抽出物（６０ｇ）を得た。
【００６６】
（２）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
９６ｗｅｌｌマイクロプレートに、１０％ＢＣＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬社製）を２００μＬずつ加え、さらにマウス前駆脂肪細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より入手）を１×１０4／ｗｅｌｌの割合で添加し、３７℃で３日間前培養した。
【００６７】
次いで、培地を分化誘導培地（イソブチルキサンチンを０．５ｍＭ、インスリンを１０μｇ／ｍＬ、デキサメタゾンを０．２５μＭ含む）１５０μＬに交換し、３７℃で２日間培養した。
【００６８】
別途、インスリンを１０μｇ／ｍＬ含む分化誘導培地を調製し、上記（１）で得たｇａｃ種衣のメタノール抽出物を、その終濃度が７２〜５８３３ｍｇ／Ｌとなるように加えた。培地を当該培地と交換し、３７℃で２日間培養した。また、比較のために、分化誘導培地を用いず培養した例、ｇａｃ種衣抽出物を添加しない以外は同様の例（ネガティブコントロール）、およびｇａｃ種衣抽出物の代わりにＰＰＡＲγ活性化剤であるロジグリタゾン１μＭを添加した例（ポジティブコントロール）を設けた。
【００６９】
その後、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地に培地を交換し、３７℃で２日間培養する操作を２回繰り返した。さらに３７℃で１日間培養した。
【００７０】
上記培養後、産業用ワイピングクロス（日本製紙クレシア社製，「キムタオル」）を用いて培地を完全に除去し、各ｗｅｌｌに１０％ホルマリンを１００μＬ加え、常温で１時間固定した。別途、脂肪細胞を染色できるＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏをイソプロパノールに溶解して０．５％溶液とし、当該溶液を２／３容量の蒸留水とよく混合した後、有機溶剤耐性０．４５μｍフィルターを使って濾過した。上記ホルマリンを上記と同様にして完全に除去した後、各ｗｅｌｌに上記Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ溶液を７０μＬ加え、常温で３０分間染色した。次に、染色液をピペットマンで除去し、２００μＬ／ｗｅｌｌの６０％イソプロパノールで洗浄し、２００μＬ／ｗｅｌｌの蒸留水を加えた。さらに２００μＬ／ｗｅｌｌの７０％エタノールで洗浄した後、１００μＬ／ｗｅｌｌの１００％イソプロパノールで細胞を溶解し、プレートリーダーを用いて波長５２０ｎｍの光の強度を測定した。結果を図８に示す。
【００７１】
（３）  結果の考察
図８のとおり、本発明に係るｇａｃ種衣抽出物の濃度が６４８ｍｇ／Ｌ以上の培地を用いた場合、ＰＰＡＲγ活性化作用を有する合成薬であるロジグリタゾンと同様に、ネガティブコントロールに比べて脂肪細胞への分化を有意に促進することが実証された。
【００７２】
近年、脂肪細胞にも種類があり、肥満動物の大型脂肪細胞や肥大脂肪細胞はＴＮＦαやＰＡＩ−１などを放出し、脂肪組織の慢性炎症を誘発し、動脈硬化やインスリン抵抗性などの原因となる一方で、栄養過多などにより肥大化する前の小型脂肪細胞はレプチンやアディポネクチンを放出し、インスリン感受性を高めたり脂肪酸のβ酸化を促進するなどして、成人病などを抑制することが明らかにされている。小型脂肪細胞としては前駆脂肪細胞から分化したての脂肪細胞が挙げられるが、例えばヒトでは、思春期以後、脂肪細胞への分化はほとんど起こらない。
【００７３】
しかし上記結果のとおり、本発明に係るｇａｃ種衣抽出物は、前駆脂肪細胞を脂肪細胞へ分化誘導することができる。この結果は、本発明に係るｇａｃ種衣抽出物が体重や内臓脂肪の量を低減しない一方で、脂質代謝異常を改善し、肝臓や血中での脂質量を低減できることと良く一致している。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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