(57)【要約】  【課題】刺激による痛みの軽減に有効なＴＲＰＡ１活性抑制剤の提供。  【解決手段】下記式（１）：【化１】2013256473.tif 000007〔式中、Ｒ1〜Ｒ5及びＲ8は独立して水素原又はメチル基を示し、Ｒ6及びＲ7は水素原子、水酸基又はメチル基を示す（但し、Ｒ6及びＲ7のいずれか一方は水酸基である）。〕で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＡ１活性抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2013256473.tif 000006
〔式中、Ｒ1〜Ｒ5及びＲ8は独立して水素原又はメチル基を示し、Ｒ6及びＲ7は水素原子、水酸基又はメチル基を示す（但し、Ｒ6及びＲ7のいずれか一方は水酸基である）。〕
で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＡ１活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰＡ１活性を抑制するＴＲＰＡ１活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
感覚は、外部から受けた刺激が電気信号に変換され、神経細胞を通じて脳に伝達されることで生じる。外部刺激を電気信号に変換するには、その外部刺激を感知する受容体の存在が必要である。
ＴＲＰＡ１は、一過性受容器電位（ＴＲＰ）イオンチャネルのスーパーファミリーに属する非選択性陽イオンチャネルであり、侵害受容ニューロンにおいて低温受容器（17℃）として見出された（非特許文献１）。その後、ＴＲＰＡ１は、マスタードオイルやそれに含まれるアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、シナモン、ガーリック、メチルサリチレート、オイゲノール等に反応する化学受容体であること、更には低温と機械刺激、化学刺激に応答する痛み受容体であることが報告されている（非特許文献２及び３)。
【０００３】
また、最近では、ＴＲＰＡ１がパラベン類やアルカリ剤に応答し、ＴＲＰＡ１を形質導入させた細胞を用いてパラベン類やアルカリ剤の刺激を抑制する物質をスクリーニングできること（特許文献１及び２）が報告されている。
【０００４】
斯様に、ＴＲＰＡ１は皮膚や粘膜の侵害受容器であり、様々な刺激によって活性化されることから、ＴＲＰＡ１の活性を抑制することは、様々な刺激による痛みなどの違和感の軽減に有効であると考えられている（特許文献３）。
【０００５】
一方、イソボルネオール、フェンチルアルコール、ボルネオール及びメチルフェンコールに代表される後述の式（１）で表される化合物は合成香料として知られているが、これらにＴＲＰＡ１活性抑制作用や痛み軽減作用があることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−７９５２８号公報
【特許文献２】特開２００９−８２０５３号公報
【特許文献３】特表２００９−５２８９９８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Story et al. 2003, Cell 112, 819-829
【非特許文献２】Kwan et al. 2006, Neuron 50, 277-289
【非特許文献３】日本薬理学雑誌、第１２４巻、第２１９頁−第２２７頁、２００４年、社団法人  日本薬理学会発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、様々な刺激による痛みの軽減に有効なＴＲＰＡ１活性抑制剤を提供することに関する。
【０００９】
本発明者らは、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する素材について検討したところ、一般式（１)で表される化合物にＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制する作用があることを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、下記式（１）：
【００１１】
【化１】
2013256473.tif 000002
〔式中、Ｒ1〜Ｒ5及びＲ8は独立して水素原子又はメチル基を示し、Ｒ6及びＲ7は水素原子、水酸基又はメチル基を示す（但し、Ｒ6及びＲ7のいずれか一方は水酸基である）。〕
で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＡ１活性抑制剤に係るものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＴＲＰＡ１活性抑制剤は、ＴＲＰＡ１の活性化を効果的に抑制するという作用を有する。したがって、本発明のＴＲＰＡ１活性抑制剤は、ＴＲＰＡ１を介して生ずる刺激感や痛みを緩和するために有用である。具体的には、皮膚や鼻腔内における刺激感を抑制することにより、皮膚トラブルの原因であるピリピリ感やアンモニア製剤の使用に伴う刺激臭を抑制することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一般式（１）で表される化合物（以下、「本発明化合物」とも称する）のうち、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が共に水素原子、或いは共にメチル基であるもの、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ7及びＲ8が共にメチル基であるものが好ましく、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が共に水素原子で且つＲ5及びＲ6が共にメチル基であるもの、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が共にメチル基で且つＲ5が水素原子であるもの、Ｒ1及びＲ2が共に水素原子で且つＲ3、Ｒ5、Ｒ7及びＲ8が共にメチル基であるものがより好ましい。
更に、下記式で示されるイソボルネオール（エキソ−１，７，７−トリメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）、フェンチルアルコール（１，３，３−トリメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）、ボルネオール（エンド−１，７，７−トリメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）、メチルフェンコール（エンド−１，２，３，３−テトラメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）が好ましい。
【００１４】
【化２】
2013256473.tif 000003
【００１５】
本発明化合物には、光学異性体、立体異性体が存在するが、本発明においてはそれらの何れのものも包含する。
これらは、其々を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００１６】
本発明化合物は、公知の方法によって化学合成することができ、また市販品を使用することもできる。市販品は、例えば、イソボルネオール（エキソ−１，７，７−トリメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）及びボルネオール（エンド−１，７，７−トリメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）は東京化成工業社より、フェンチルアルコール（１，３，３−トリメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）はＳＩＧＭＡ−ＡｌＤＲＩＣＨ社より、メチルフェンコール（エンド−１，２，３，３−テトラメチルビシクロ（２，２，１）ヘプタン−２−オール）は高砂香料工業社より入手可能である。
【００１７】
本発明化合物は、後記実施例に示すように、ＴＲＰＡ１刺激物質であるアリルイソチオシアネートと共に、ＴＲＰＡ１を形質導入した細胞（ＴＲＰＡ１発現細胞）に接触させた場合に、アリルイソチオシアネートによる細胞内の陽イオン量の流入を抑制するというＴＲＰＡ１活性抑制作用を有する（実施例）。
したがって、本発明化合物はＴＲＰＡ１活性抑制剤となり得る。
【００１８】
ここで、「ＴＲＰＡ１の活性抑制」とは、受容体であるＴＲＰＡ１の活性を抑制すること、具体的には例えばＴＲＰＡ１刺激物質（アゴニスト）がＴＲＰＡ１に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を抑制或いは阻害することを云う。
ここで、ＴＲＰＡ１刺激物質としては、皮膚や粘膜に対して刺激感を与える可能性がある化学物質（「刺激感原因物質」という）が挙げられ、例えば、アリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）、アンモニア、ブラジキニン、シンナムアルデヒド、４−ヒドロキシノネナール、アリシン、アクロレイン、メントール、メチルサリチレート、オイゲノール、パラベン類、フェノキシエタノール、ブチルカルバミン酸ヨウ化プロピニル（ＩＰＢＣ）、トリクロサン、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
【００１９】
尚、本発明化合物によるＴＲＰＡ１の活性抑制効果は、例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞を用い、当該化合物の存在下にＴＲＰＡ１刺激物質（例えばＡＩＴＣ）と接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度と、化合物の非存在下でＴＲＰＡ１刺激物質と接触させたＴＲＰＡ１発現細胞内におけるカルシウムイオン濃度との差異を比較すること等によって評価することができる。
【００２０】
本発明のＴＲＰＡ１活性抑制剤は、例えば、上述した刺激感原因物質を含有する組成物（皮膚洗浄剤、頭髪洗浄剤、メイクアップ剤、入浴剤、パーマネントウェーブ用剤、染毛剤、石鹸類、台所用洗剤、洗濯用洗剤、歯磨類等の化粧品、医薬部外品、医薬品、生活用品等）に配合すること、或いは組み合わせること例えば、刺激感原因物質を含有する組成物と別個に調製して同時或いは順次組み合わせることにより使用され、それにより当該刺激感原因物質により引き起こされる感覚刺激を緩和できる。
【００２１】
ＴＲＰＡ１活性抑制剤は、本発明化合物を単独で用いるものであってもよく、あるいは油分、色素、香料、防腐剤、キレート剤、顔料、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、甘味料、調味料、保存料、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、被膜剤、担体、希釈剤等の、医薬品、化粧品、医薬部外品、生活用品等の各種製剤に用いられる添加剤や賦形剤等と組み合わせた組成物であってもよい。またそれらの形態も特に限定されず、例えば溶液、エマルジョン、サスペンジョン、ゲル、固形、粉体、粒体、エアゾールなど、任意の形態に調製できる。
【００２２】
本発明のＴＲＰＡ１活性抑制剤を、刺激感原因物質を含有する組成物と共に用いる場合、ＴＲＰＡ１活性抑制剤の使用量は、ＴＲＰＡ１活性抑制効果を有する限り特に限定されないが、例えば、刺激感原因物質１質量部に対し、本発明化合物を０．０１質量部以上、好ましくは０．０５質量部以上、更に好ましくは０．１質量部以上、そして１００質量部以下、好ましくは５０質量部以下、更に好ましくは１０質量部以下とすることが挙げられ、また、０．０１〜１００質量部、好ましくは０．１〜１０質量部とすることができる。
【００２３】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞  下記式（１）：
【００２４】
【化３】
2013256473.tif 000004
【００２５】
〔式中、Ｒ1〜Ｒ5及びＲ8は独立して水素原又はメチル基を示し、Ｒ6及びＲ7は水素原子、水酸基又はメチル基を示す（但し、Ｒ6及びＲ7のいずれか一方は水酸基である）。〕
で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＡ１活性抑制剤。
【００２６】
＜２＞ＴＲＰＡ１活性抑制剤を製造するための、上記式（１）で表される化合物の使用。
＜３＞ＴＲＰＡ１活性抑制に使用するための上記式（１）で表される化合物。
＜４＞上記式（１）で表される化合物を、刺激感原因物質を含有する組成物と共に用いる、当該刺激感原因物質により引き起こされる感覚刺激の緩和方法。
【実施例】
【００２７】
実施例１  ＴＲＰＡ１活性抑制作用
（１）ヒトＴＲＰＡ１安定発現株の作製
ヒトＴＲＰＡ１遺伝子は、その全長をOpen biosystems社よりｐENTR２２３．１に挿入された状態で購入した。購入したエントリーベクターよりTRPA1遺伝子を発現用ベクターｐｃDNA３．２−Ｖ５／ＤＥＳＴ（インビトロジェン社）へサブクローニングし、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）によりＨＥＫ２９３細胞へ形質導入した。形質導入された細胞をＧ−４１８（４５０μｇ／ｍｌ；プロメガ社）を含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させることにより選抜した。なおＨＥＫ２９３細胞は内在性ＴＲＰＡ１を発現しないため、ＴＲＰＡ１形質導入株に対する対照（コントロール）として使用できる。
【００２８】
（２）カルシウムイメージング
蛍光カルシウムイメージング法を用いてＨＥＫ２９３細胞へ形質導入したＴＲＰＡ１活性の測定を行った。まず培養したＴＲＰＡ１発現細胞をポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ウェルプレート（ＢＤファルコン社）に播種（３００００細胞／ウェル）し、３７℃で一晩、インキュベートした後、培養液を除去し、リンガー液に溶解させたＦｌｕｏ４−ＡＭ（２μｇ／ｍｌ；同仁化学社）を添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。その後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ液を除去し、ウェルにリンガー液を添加して蛍光プレートリーダー（ＦＤＳＳ３０００；浜松ホトニクス社）にセットした。装置庫内温度２４℃にした状態で励起波長４８０ｎｍで励起させたときの蛍光イメージを検出波長５２０ｎｍにてＣＣＤカメラで検出した。測定は１秒毎に４分間行い、測定開始１５秒後にＦＤＳＳ３０００内蔵の分注器によりＴＲＰＡ１刺激物質であるアリルイソチオシアネートおよび本発明化合物をそれぞれ終濃度５．０μＭおよび０．０１％で添加し、その後の蛍光強度の変化によりＴＲＰＡ１活性を評価した。ＴＲＰＡ１活性は刺激物質添加後の蛍光強度のピーク（Ｆpeak）を刺激物質添加前の蛍光強度（F0）で除算した蛍光強度比（Ratio；Fpeak／F0）で表した。対照としてＴＲＰＡ１を形質導入していないＨＥＫ２９３細胞に同様の物質を添加し、その際の蛍光強度比（Ratio293）を算出し、刺激物質による活性のピークがＴＲＰＡ１活性化に由来することを確認した。
本発明化合物として、「（＋）／（−）−ｉｓｏｂｏｒｎｅｏｌ」（東京化成工業）、「（−）−ｂｏｒｎｅｏｌ」（東京化成工業）、「ｆｅｎｃｈｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ」（SIGMA-AlDRICH）、「ｍｅｔｈｙｌ  ｆｅｎｃｈｏｌ」（高砂香料工業）を使用した。
【００２９】
（３）ＴＲＰＡ１活性抑制評価
アリルイソチオシアネートによるＴＲＰＡ１活性化に対する各化合物の効果を検証するため、アリルイソチオシアネート（５．０μＭ）およびエタノール（０．０１％；溶媒コントロール）を添加した際のＴＲＰＡ１活性に対する各化合物の抑制作用（活性抑制率；％）を評価した。アリルイソチオシアネート（刺激物質）（５．０μＭ）と化合物（０．０１％）を混合し添加することによるＴＲＰＡ１活性抑制作用は下記の式により算出した。
〔数１〕
TRPA1活性抑制率（％）＝（１−（（刺激物質＋化合物添加によるRatio）−（刺激物質＋化合物添加によるRatio293））／（（刺激物質＋エタノール添加によるRatio）−（刺激物質＋エタノール添加によるRatio293）））×１００
【００３０】
（４）ＴＲＰＡ１活性化抑制作用
アリルイソチオシアネート５.０μＭによるＴＲＰＡ１活性化に対する本発明化合物の効果（活性抑制率）を表１に示す。本発明化合物は、公知のＴＲＰＡ１活性抑制素材であるｄ−カンファーと比して効果の強いＴＲＰＡ１活性抑制素材であることが示された。
【００３１】
【表１】
2013256473.tif 000005