(57)【要約】【課題】サルモネラのコロニーが明確に肉眼で検出でき、かつサルモネラに対する選択性の高いサルモネラ検出用培地を提供する。【解決手段】（ａ）マンニトール、（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上、（ｃ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）胆汁酸又はその塩、（ｆ）ニュートラルレッドを検出時の濃度として０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ、（ｇ）ノボビオシン又はその塩、並びに（ｈ）イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含有するサルモネラ検出用培地。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）マンニトール、（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上、（ｃ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）胆汁酸又はその塩、（ｆ）ニュートラルレッドを検出時の濃度として０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ、（ｇ）ノボビオシン又はその塩、並びに（ｈ）イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含有するサルモネラ検出用培地。
【請求項２】
ｐＨが７．０以上である請求項１記載のサルモネラ検出用培地。
【請求項３】
請求項１又は２記載の培地に、検体を接種して培養した後、当該培地上のコロニーの呈色を検出することを特徴とするサルモネラの検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品等に存在し、食中毒の原因となるサルモネラの選択的な検出用培地及び検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）はグラム陰性の無芽胞の桿菌であり、一般的に食中毒の原因となる細菌として知られている。サルモネラは食品だけでなくペットなど広範囲に分布しており、またサルモネラ食中毒は重篤化することがあることから、本細菌の制御は食品衛生及び安全の点からも重要である（非特許文献１）。
【０００３】
サルモネラの選択分離培地としてはＤＨＬ寒天培地やＭＬＣＢ寒天培地といったサルモネラの硫化水素産生能を指標とし培地上にて集落を黒色化させる培地が古くから用いられている（非特許文献２）。しかしサルモネラの中には硫化水素を産生しないものが存在し、これらの培地では硫化水素非産生のサルモネラを検出することが出来ない。一方で近年では発色酵素基質によりサルモネラに特異的な酵素を指標とし、硫化水素の産生能に拘らずサルモネラを検出できる培地が開発されている（非特許文献３）。
【０００４】
また、サルモネラ菌の同定法及び培地としてメリビオース、マンニトール、ソルビトールとβ−ガラクトシダーゼに対する発色性基質を併用した培地が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表平９−５１１９１７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】食品衛生検査指針  微生物編  厚生労働省監修  社団法人  日本食品衛生協会  180-191頁、2004年6月30日。
【非特許文献２】新細菌培地学講座  下II（第2版）株式会社近代出版  坂崎利一監修  125-127頁、295-296頁、1999年1月20日。
【非特許文献３】Difco & BBL Manual, Manual of Microbiological Culture Media 2003, Becton Dickinson and Company 146-147頁。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、この特許文献１記載の培地では培地色が使用時において赤身を帯びており、発色性基質の発色が不明瞭であると共に、サルモネラ以外の腸内細菌もサルモネラ様集落を形成することがあるという問題がある。
従って、本発明の課題は、サルモネラのコロニーが明確に肉眼で検出でき、かつサルモネラに対する選択性の高いサルモネラ検出用培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、サルモネラの選択性及びコロニーの検出性について種々検討した結果、マンニトールとメリビオース又はソルビトールの２種を併用し、β−ガラクトシダーゼの基質とβ−グルコシダーゼの基質、ノボビオシンに加えてイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド及び一定量のニュートラルレッドを組み合わせることにより、サルモネラ選択的であり、かつサルモネラのコロニーのみが明確に検出できるこを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に係るものである。
［１］（ａ）マンニトール、（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上、（ｃ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）胆汁酸又はその塩、（ｆ）ニュートラルレッドを検出時の濃度として０．００１〜０．００８ｇ／Ｌ、（ｇ）ノボビオシン又はその塩、並びに（ｈ）イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するサルモネラ検出用培地。
［２］ｐＨが７．０以上である［１］に記載のサルモネラ検出用培地。
［３］［１］又は［２］に記載の培地に、検体を接種して培養した後、当該培地上のコロニーの呈色を検出することを特徴とするサルモネラの検出法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地を用いれば、食中毒の原因となるサルモネラをピンク色のコロニーとして明確に検出でき、サルモネラ以外の腸内細菌によるサルモネラ様コロニーの形成を抑えることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のサルモネラ検出用培地は、（ａ）マンニトール、（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上、（ｃ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質、（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質、（ｅ）胆汁酸又はその塩、（ｆ）ニュートラルレッド、（ｇ）ノボビオシン又はその塩、並びに（ｈ）ＩＰＴＧを含有する。
【００１２】
本発明に用いられる（ａ）マンニトールと（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上とは、いずれもサルモネラが資化し得る糖又は糖アルコールである。これらの糖又は糖アルコールのうち、（ａ）マンニトールと（ｂ）メリビオース又はソルビトールから選ばれる１種以上とを併用することが、サルモネラを選択的に増殖させ、コロニーの呈色を良好にする上で重要である。メリビオース又はソルビトールは２種併用してもよいが、いずれか一方のみで十分である。（ａ）マンニトールは、サルモネラのコロニーの呈色性の点から、本発明培地中に検出時の濃度として１〜２０ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、５〜１５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。また、（ｂ）メリビオース及びソルビトールから選ばれる１種以上は、サルモネラのコロニーの呈色性の点から、本発明培地中に検出時の濃度として１〜２０ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、５〜１５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１３】
本発明の培地には、発色基質として（ｃ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−ガラクトシダーゼ基質及び（ｄ）青色の色原体化合物を遊離し得るβ−グルコシダーゼ基質を含有する。サルモネラ以外の腸内細菌の多くは、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼの両方あるいは一方を産生するので、検体中に成分（ａ）および成分（ｂ）を利用するサルモネラ以外の細菌が含まれれば、成分（ｃ）及び成分（ｄ）の両方あるいは一方の基質が分解され、青色の色原体化合物を遊離する。これらの基質に含まれる青色の色原体化合物としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール、５−ブロモ−３−インドール、６−ブロモ−２−ナフトール、２−メチル−３−インドール、６−クロロ−３−インドール等が挙げられる。また、β−ガラクトシダーゼ基質としては、β−ガラクトピラノシドが好ましく、β−グルコシダーゼ基質としては、β−グルコピラノシドが好ましい。成分（ｃ）の具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、１−メチル−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドなどが挙げられる。成分（ｄ）の具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、６−ブロモ−２−ナフチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、１−メチル−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどが挙げられる。
【００１４】
成分（ｃ）及び成分（ｄ）は、サルモネラのコロニーの呈色性の点から、本発明培地中にそれぞれ検出時の濃度として０．０１〜１ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１５】
本発明に用いられる（ｅ）胆汁酸又はその塩としては、コール酸、デオキシコール酸又はそれらの塩が挙げられる。塩としてはナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。胆汁酸又はその塩は、形成したコロニーの色を赤色系にすることにより、サルモネラのコロニーを検出しやすくする。（ｅ）胆汁酸又はその塩は、グラム陽性菌の抑制及びサルモネラのコロニーの色の検出性の点から、本発明培地中に検出時の濃度として１〜１０ｇ／Ｌ含有するのが好ましく、１〜８ｇ／Ｌ含有するのがより好ましい。
【００１６】
本発明に用いられる（ｆ）ニュートラルレッドは、胆汁酸又はその塩とともに形成したコロニーの色を赤色系にすることにより、サルモネラのコロニーを検出しやすくする。（ｆ）ニュートラルレッドは、サルモネラのコロニーの色の検出性の点から、検出時の濃度として０．００１〜０．００８ｇ／Ｌが好ましく、０．００１〜０．００６ｇ／Ｌがより好ましい。ニュートラルレッドの含有量が特許文献１記載のように０．０２ｇ／Ｌの場合には、培地全体が赤色系になってしまうため、コロニーの検出性が悪化する。
【００１７】
本発明に用いられる（ｇ）ノボビオシン又はその塩は、エドワジェラ、プロテウス、サルモネラを除くクレブジエラなどの腸内細菌等の発育を阻害して、本発明培地のサルモネラの選択性を向上させる成分である。ノボビオシン又はその塩の含有量は、サルモネラの選択性向上の点から、本発明培地中に検出時の濃度として０．０１〜０．１ｇ／Ｌが好ましく、０．０１〜０．０８ｇ／Ｌがより好ましい。
【００１８】
また、本発明の培地には、β−ガラクトシダーゼ等の酵素の発現を促進し、成分（ｃ）及び（ｄ）の基質による発色性を向上させる目的で、（ｈ）イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有させるのが好ましい。当該ＩＰＴＧの含有量は、本発明培地中に検出時の濃度として０．００１〜１ｇ／Ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｇ／Ｌがより好ましい。
【００１９】
本発明の培地には、上記成分の他、栄養成分、無機塩、ｐＨ調整剤等を配合することができる。
【００２０】
栄養成分としては、ペプトン、酵母エキス、獣肉エキス、魚肉エキス等が好ましい。無機塩類としては、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩；クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩等が挙げられる。
【００２１】
また、本発明培地は、形成したサルモネラのコロニーの呈色性及び検出のしやすさの点から、検出時のｐＨが７．０以上であるのが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０であるのがより好ましい。
【００２２】
本発明培地の形態は特に限定されず、通常の寒天培地の他、シート状簡易培地（（特開昭５７−５０２２００号）（特開平６−１８１７４１号）例えばメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開平９−１９２８２号、特開２０００−３２５０７２））とすることもできる。
【００２３】
本発明培地を用いて、被検体中のサルモネラを検出するには、当該培地に検体を接種して３５±２℃、２４〜４８時間培養した後に、コロニーの呈色を観察すればよい。なお、検出時には、所定量の水及び／又は検体液を添加して、本発明培地中の各成分の濃度が前記検出時の濃度になるように調整することができる。
【００２４】
本発明培地に適用される検体としては、魚介類等の生鮮食料品、海水、調理場、病院などのふき取り検体等が挙げられるが、これらの検体を予めトリプトソーヤブイヨン培地で培養した培養液やさらにこれを増菌用培地で培養した培養液も用いることができる。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
（１）培地の作製
各培地組成を表１に示した。
本発明培地は１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１００℃、２０分間加温溶解し、約５０℃になるまで冷却後、プラスチックシャーレ（９０φｍｍ）に２０ｍＬずつ分注して培地が固まるまで静置し本発明のサルモネラ検出用培地を作製した。また対照品として本発明培地よりＩＰＴＧ抜いたもの及びノボビオシンを抜いたものをそれぞれ同様に作製した。
陽性コントロールとしてトリプトソイ寒天培地（ＴＳＡ）は１リットル使用量を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌し良く撹拌後、プラスチックシャーレ（９０φｍｍ）に２０ｍＬずつ分注して培地が固まるまで静置した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（２）菌株の供試
供試菌株はトリプトソイブイヨンで２４時間前培養したものを菌原液として用い、これを１０μｌループを用いて画線塗抹により接種し、３５℃、２４時間培養後のコロニー色調を確認した。
結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
サルモネラを含む各供試菌株の発育を確認したところ、本発明培地は硫化水素の産生能に拘らずサルモネラのみが明瞭なピンク色集落として発育することを認め、一方ＩＰＴＧを併用しない場合には腸内細菌科に属するＣ．ｙｏｕｎｇａｅがサルモネラ様コロニーを形成し、ノボビオシンを併用しない場合にも腸内細菌科に属するＥ．ｈｏｓｈｉｎａｅがサルモネラ様コロニーを形成する。
従って、実施例においてメリビオース、マンニトール、ソルビトールとβ−ガラクトシダーゼにβ−グルコシダーゼを併用しても、ＩＰＴＧとノボビオシンを追加併用しないとサルモネラの検出精度が悪くなってしまうことから、特許文献１のようにメリビオース、マンニトール、ソルビトールとβ−ガラクトシダーゼに対する発色性基質のみを併用した場合にも同様にいくつかの菌においてサルモネラ様の偽陽性コロニーを生じるものと考えられる。
【００３１】
【表３】
2013039063.tif 000004
【００３２】
本発明培地のニュートラルレッド濃度を検討したところ、通常一般的に使用される濃度である０．０２ｇ／Ｌではサルモネラのコロニー性状は変わらないが、培地色調が赤色であるため、発育した菌のコロニー色調が見づらくなる。また本来無色のコロニーを形成するはずであるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのコロニーも培地色調の影響を受けピンク色に見える。一方、その約１０分の１量である０．００２５ｇ／Ｌまで低下させると培地色が透明であるにも拘らず、明瞭なサルモネラの集落の着色が認められた。０．００１ｇ／Ｌまで濃度を低下させるとサルモネラ集落の着色が薄くなることが認められた。従って、本発明培地のニュートラルレッド濃度を０．００２５ｇ／Ｌにすることで培地が無色透明となり同時に着色集落が明瞭に確認できることを見出した。
【００３３】
【表４】
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【００３４】
本発明培地に添加する糖アルコールの組み合わせを検討したところ、本発明培地に含まれる糖アルコールがマンニトールのみであった場合には一部のサルモネラのコロニーが偽陰性コロニー（無色）として発育することを認め、感度が悪くなってしまうことを認めた。一方、マンニトール及びソルビトール又はメリビオースのどちらか一方あるいは両方を併用することにより供試した全てのサルモネラが陽性コロニー（ピンク色）として検出できることを認め、十分な感度を持つことを認めた。従って、本発明培地のようにマンニトール及びソルビトール又はメリビオースのどちらか一方あるいは両方を併用することが望ましい。