(57)【要約】【課題】抗真菌剤として有用な化合物の提供。【解決手段】本発明者らは、微生物の生産する化合物について検討するため、パエニバシルス(Paenibacillus)属の微生物を採取し、その培養液からデプシペプチド化合物またはその塩を単離した。本発明のデプシペプチド化合物が抗真菌作用を有することを確認し、本発明を完成した。本発明のデプシペプチド化合物またはその塩は、抗真菌作用を有し、真菌症の予防および／または治療剤として使用しうる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(1)の化合物またはその塩。
【化５】
2013147429.tif 000012
（式中、
R1は、C1-6アルキルであり、
R2は、-Hまたは-OHであり、
R3は、-Hまたは-OHである。）
【請求項２】
R1が、C3-6アルキルである請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
R1、R2、およびR3が下記表に示す組み合わせである、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【表７】
2013147429.tif 000013
【請求項４】
請求項１に記載の化合物またはその塩、および製薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項５】
寄託番号がFERM BP-10803であるパエニバシルス（Paenibacillus）属の菌株。
【請求項６】
パエニバシルス属の菌株の培養液から、精製して単離することを含む、式(1)の化合物またはその塩の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物またはその塩を含有する真菌症の予防用若しくは治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬組成物、殊に、真菌症治療用医薬組成物の有効成分として有用なデプシペプチド化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌症は、消化管など内臓に寄生する真菌が原因となる深在性真菌症と、表在性角質組織の真菌が原因となる表在性真菌症に分類される。
深在性真菌症は、抗生物質を患者に長期間投与した場合に、標的としている病原菌は除かれるが、抗生物質の効かない真菌が増加する、いわゆる菌交代現象により発症するか、または、高齢患者、手術後の患者、または抗がん剤や免疫抑制剤を投与された患者において、生体防御機能が抑制されている為に真菌に感染し易くなり、その真菌が増殖して発症すると考えられている。
深在性真菌症の治療薬としては、(1)真菌のDNA合成阻害作用をメカニズムとする核酸塩基系薬剤であるフルシトシンや、(2)真菌の細胞膜の合成阻害作用をメカニズムとするポリエンマクロライド系薬剤であるアンホテリシンB、イミダゾール系薬剤であるミコナゾール、そしてトリアゾール系薬剤であるフルコナゾール等の抗真菌剤がある。
表在性真菌症は、真菌が表在性角質組織に存在するため、外用薬が主に用いられる。表在性真菌症の治療薬としては、チトクロームP-450の阻害作用をメカニズムとするイミダゾール系薬剤であるミコナゾールやクロトリマゾール等が用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Bergey’s Manual of Synthematic Bacteriorigy, 2nd. Ed., Vol.1, 1986年.
【非特許文献２】Bergey’s Manual of Synthematic Bacteriorigy, 2nd. Ed., Vol.2, 2005年.
【非特許文献３】Manual for Identification of Medical Bacteria, 2nd. Ed., 1974年.
【非特許文献４】Phylogenic analysis of immunosupressant FK506-producing streptomycete strains. Actinomycetologia, 2005年, 19, p33-39.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
医薬組成物、真菌症治療用医薬組成物の有効成分として有用な化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、微生物の培養物から抗真菌剤を見出すべく鋭意検討した結果、パエニバシルス(Paenibacillus)属の未同定菌No.530603株の培養液から抗真菌活性を有するデプシペプチド化合物が生産されることを見出した。
即ち、本発明は、式(1)の化合物またはその塩、並びに、式(1)の化合物またはその塩、および賦形剤を含有する医薬組成物に関する。
【０００６】
【化１】
2013147429.tif 000002
（式中、
R1は、C1-6アルキルであり、
R2は、-Hまたは-OHであり、
R3は、-Hまたは-OHである。）
なお、特に記載がない限り、本明細書中のある化学式中の記号が他の化学式においても用いられる場合、同一の記号は同一の意味である。
【０００７】
また、本発明は、式(1)の化合物またはその塩を含有する真菌症治療用医薬組成物、即ち、式(1)の化合物またはその塩を含有する真菌症治療剤に関する。
また、本発明は、真菌症治療用医薬組成物の製造のための式(1)の化合物またはその塩の使用、並びに、式(1)の化合物またはその塩の有効量を患者に投与することからなる真菌症治療方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
式(1)の化合物またはその塩は、抗真菌作用を有し、真菌症等の予防および／または治療剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】化合物Aの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図２】化合物Aの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図３】化合物Bの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図４】化合物Bの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図５】化合物Cの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図６】化合物Cの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図７】化合物Dの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図８】化合物Dの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図９】化合物Eの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図１０】化合物Eの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図１１】化合物Fの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図１２】化合物Fの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図１３】化合物Gの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図１４】化合物Gの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図１５】化合物Iの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OH)である。
【図１６】化合物Iの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OH)である。
【図１７】化合物Jの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OH)である。
【図１８】化合物Jの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OH)である。
【図１９】化合物Kの1H-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【図２０】化合物Kの13C-NMRスペクトル(測定溶媒はCD3OD)である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、
「C1-6アルキル」とは、直鎖又は分枝状の炭素数が１から６のアルキル、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル等である。別の態様としては、C3-6アルキルである。
【００１１】
本発明のある態様を以下に示す。
(1)R1がC3-6アルキルである化合物。
(2)R1が表２のいずれかの基である化合物。
【００１２】
【表１】
2013147429.tif 000003
(3)R2が-Hである上記(1)又は(2)の化合物。
(4)R2が-OHである上記(1)又は(2)の化合物。
(5)R3が-Hである上記(1)から(4)の化合物。
(6)R3が-OHである上記(1)から(4)の化合物。
【００１３】
本発明のさらに別の態様を以下に示す。
R1がイソブチルであり、R2が-Hであり、R3が-Hまたは-OHである化合物。
【００１４】
本発明に包含される具体的化合物の例として、以下の化合物が挙げられる。
【００１５】
【化２】
2013147429.tif 000004
【００１６】
【化３】
2013147429.tif 000005
【００１７】
（菌株）
本発明化合物を生産する菌株としては、例えば、青森県十和田湖周辺土壌から希釈平板法により分離されたパエニバシルス属の未同定菌No.530603株を挙げることができる。本菌株の菌学的性状は後述の通りである。
分類学的研究は、文献に従った(非特許文献1、2、3)。16SrDNA解析は村松らの方法に従った(非特許文献4)。
【００１８】
細胞はグラム陽性、桿菌、単一または短鎖状で、細胞末端に内生胞子を形成した。LB寒天培地において、30℃で3日間培養した後のコロニーは直径７mm、半透明、低い凸面隆起の不規則状、光沢が有り、円滑表面、周囲は一続きであった。セルサイズは0.5-0.8 ｘ 2.5-15μmで、好気性、ただし嫌気条件下でもわずかに生育し、運動性有り、膨張胞子嚢の中に内生胞子を形成し、胞子形成の位置は末端部、胞子の形は卵型〜円筒型、胞子のサイズは0.5-1.2 x 1.5-2.5μm、オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性、グルコースからの生酸性は陽性であった。16S rDNA全長解析の結果、パエニバシルス属(Int., J. Syst. Bacterol. 1997,47,289-298)と99.0%の相同値を示した。上記の形態、生理的性質も同属の性質と一致しており、本菌株がパエニバシルス属に属することを示した。同属の中ではP.dendritiformusと最も近縁であり99.0%の相同値を示した。基準株T168T株(Paenibacillus dendritriformis sp.:Int., J.Syst. Bacteriol. 1999,49,p239-246)と比較対照試験を行った結果を表3にまとめる。
【００１９】
No.530603株においては、T168T菌の典型的な特徴である先端分岐（tip-splitting）型やchiral型コロニー形態は観察できなかった。その他、形態ではセルサイズがT168Tに比べ小さかった。胞子形成位置はT168Tが中心に近い末端に対し、本菌株は完全な末端であった。生育温度、食塩耐性、炭素源の生酸性などで異なる点も多く、同種とは判定しがたかった。ただし、新種の可能性ついて論じるには、更に詳細な試験が必要と考えられた。以上の結果から、現時点では本菌株はパエニバシルス属の未同定菌種Paenibacillus sp.と同定した。本菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託番号FERM BP-10803 (受託日2007年3月22日)として寄託されている。表3にNo.530603株とP.dendritiformis T168T株の特徴比較を示す。
【００２０】
【表２】
2013147429.tif 000006
【００２１】
本発明化合物は、その生産能を有するパエニバシルス属の微生物を培養して得られる。培養は一般微生物の培養方法に準じて行うことができる。
【００２２】
培地としては、No.530603株の場合、No.530603株が利用する栄養源を含有する培地であればよく、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる。培地の組成は、例えば炭素源としてはL-アラビノース、D-キシロース、D-グルコース、D-フラクトース、シュークロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラフィノース、D-マンニトール、マンノース、メリビオース、ラクトース、D-ガラクトース、マルトース、トレハロース、サリシン、キサンチン、キチン、デンプン、ブドウ糖、デキストリン、グリセリン、植物油等が、窒素源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実粕、大豆粉、落花生粉、魚粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵母、酵母エキス、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿酸その他の有機、無機の窒素源が用いられる。また、金属塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、コバルトなどの硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、リン酸塩などが必要に応じて添加される。さらに、必要に応じてメチオニン、システイン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの生成促進物質または消泡剤を添加することもできる。
【００２３】
培養条件としては好気的条件下で培養するのが一般的に有利で、培養温度は14〜44℃の範囲、好ましくは25〜30℃付近で行われる。培地のpHは約4.5〜8.5好ましくは約6.0〜7.5の範囲に調整すると好結果が得られる。培養期間は培地の組成、温度条件に応じて適宜設定されるが、通常1〜30日程度、好ましくは2〜5日程度である。
【００２４】
培養物より本発明化合物を単離精製するには通常の微生物の培養物より生理活性物質を単離精製する方法が適用される。培養物から適当な有機溶媒で抽出し、その抽出物を精製し、有効物質を単離する。すなわち、抗真菌活性を指標として、適当な溶剤に対する溶解性および溶解度の差等を利用する一般の生理活性物質の製造に用いられる手段によって、分離、精製される。これらの方法は必要に応じて単独に用いられ、または任意の順序に組合せ、反復して適用できる。
【００２５】
式(1)の化合物には、幾何異性体が存在しうる。本明細書中、式(1)の化合物が異性体の一形態のみで記載されることがあるが、本発明は、それ以外の異性体も包含し、異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
【００２６】
また、式(1)の化合物は、不斉炭素原子を有し、これに基づく光学異性体が存在しうる。本発明は、式(1)の化合物の光学異性体の分離されたもの、あるいはそれらの混合物も包含する。
【００２７】
さらに、本発明は、式(1)で示される化合物の製薬学的に許容されるプロドラッグも包含する。製薬学的に許容されるプロドラッグとは、加溶媒分解によりまたは生理学的条件下で、カルボキシル基等に変換されうる基を有する化合物である。プロドラッグを形成する基としては、例えば、Prog. Med., 5, 2157-2161(1985)や、「医薬品の開発」（廣川書店、1990年）第7巻  分子設計163-198に記載の基が挙げられる。
【００２８】
また、式(1)の化合物の塩とは、式(1)の化合物の製薬学的に許容される塩であり、置換基の種類によって、酸付加塩または塩基との塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
【００２９】
さらに、本発明は、式(1)の化合物およびその塩の各種の水和物や溶媒和物、および結晶多形の物質も包含する。また、本発明は、種々の放射性または非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。
【００３０】
式(1)の化合物は、遊離化合物、その塩、水和物、溶媒和物、あるいは結晶多形の物質として単離され、精製される。式(1)の化合物の塩は、常法の造塩反応に付すことにより製造することもできる。
単離、精製は、抽出、分別結晶化、各種分画クロマトグラフィー等、通常の化学操作を適用して行われる。
各種の異性体は、適当な原料化合物を選択することにより製造でき、あるいは異性体間の物理化学的性質の差を利用して分離することができる。例えば、光学異性体は、キラルカラム等を用いたクロマトグラフィー等により得ることもできる。
【００３１】
式(1)の化合物またはその塩の１種または２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、または、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【００３２】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、1種または2種以上の有効成分を、少なくとも1種の不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、および／またはメタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等のような崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤または丸剤は必要により糖衣または胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
【００３３】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤またはエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水またはエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
【００３４】
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤または乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水または生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコールまたはオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、またはポリソルベート80（局方名）等がある。このような組成物は、さらに等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、または溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解または懸濁して使用することもできる。
【００３５】
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性または非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏またはローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
【００３６】
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体または半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入または吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独でまたは処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液または懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回または多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末または粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカンまたは二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【００３７】
通常経口投与の場合、1日の投与量は、体重当たり約0.001〜100 mg/kg、好ましくは0.01〜10 mg/kgが適当であり、これを1回であるいは2回〜4回に分けて投与する。静脈内投与される場合は、1日の投与量は、体重当たり約0.001〜100 mg/kgが適当で、1日1回〜複数回に分けて投与する。また、経粘膜剤としては、体重当たり約0.001〜100 mg/kgを1日1回〜複数回に分けて投与する。投与量は症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【００３８】
式(1)の化合物は、前述の式(1)の化合物が有効であると考えられる疾患の種々の予防剤または治療剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別々に製剤化されていてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づき、式(1)の化合物の単離法をさらに詳細に説明する。なお、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。また、式(1)の化合物の単離法は、以下に示される具体的実施例の製造法のみに限定されるものではなく、式(1)の化合物は当業者に自明である方法によっても製造されうる。
【００４０】
また、実施例および後記表中において、以下の略号を用いることがある。MeCN=アセトニトリル、MeOH=メタノール、TFA=トリフルオロ酢酸、HR ESI-MS=高分解能ESI-MS、Ex=実施例。
【００４１】
実施例１
（化合物AからJの培養生産）
生産培地(100 mL)を三角フラスコ(500 mL)に分注し、オートクレーブで滅菌(120 ℃で20分間)した。この生産培地に、No.530603株を、ブイヨン寒天培地から接種し、30 ℃で2日間、振とう培養(200回転／分)した。
この培養液にアセトン(1 L)を添加し、攪拌した後、濾過した。濾液を減圧濃縮して、アセトンを除去した。残留溶液をダイヤイオンHP20(三菱化学株式会社製）カラムクロマトグラフィーに流し、蒸留水(0.1 L)および80% MeOH水溶液(0.1 L)で洗浄した後、MeOH(0.1 L)で溶出した。この溶出液を減圧濃縮してMeOHを除去した後、残渣を、ODS-B（ダイソー株式会社）カラムクロマトグラフィー[MeCN:水:TFA=45:55:0.1(v/v)]で精製し、活性を示したフラクションを分取し、減圧濃縮した。残渣を、ODS HPLC[L-column ODS;20 i.d. x 250 mm, 化学品検査協会製；MeCN:水:TFA=42:58:0.1(v/v)]で精製し、活性を示したフラクションを分取し、減圧濃縮することにより、化合物AからJ(A:10 mg, B:1 mg, C:10 mg, D:1 mg, E:1 mg, F:2 mg,G:1 mg, I:1 mg, J:1 mg, K:5 mg)を単離した。
【００４２】
【表３】
2013147429.tif 000007
【００４３】
本発明化合物の物理化学的性質
上記の手法で抽出、精製および単離した化合物Aは、下記の物理化学的性質を示した。
【００４４】
【表４】
2013147429.tif 000008
【００４５】
上記の物理化学的性質から、化合物Aの構造を以下に示すように決定した。
【００４６】
【化４】
2013147429.tif 000009
【００４７】
化合物BからKの構造および物理化学データを以下に示す。
【００４８】
【表５】
2013147429.tif 000010
【００４９】
実施例2
（抗真菌活性）
本発明化合物の抗真菌活性は以下の方法で確認した。
下記検定菌に対する抗真菌活性は、微量液体希釈法（久米光、山崎敏和 著、臨床と微生物、21巻5号、573-580頁、1994年）を用いて測定した。例えば、化合物Aは以下に示す活性を示した。表7に化合物Aの最小生育濃度（MIC）を示す。
【００５０】
【表６】
2013147429.tif 000011
【００５１】
実施例3
（細胞傷害性）
細胞障害性は、EL-4細胞に試験薬剤を各種濃度で添加し、CO2インキュベーターで30 ℃、72時間培養した後、セルカウンティングキット(和光純薬工業株式会社製)で細胞数を測定し、IC50値を算出して評価した。その結果、例えば化合物Aは、EL-4細胞に対して100 μg/mLの濃度においても細胞障害性を示さなかった。
【００５２】
上記試験の結果、式(1)の化合物は、抗真菌作用を有し、かつ、細胞障害性を示さないことが確認された。従って、真菌症、すなわち、深在性真菌症；表在性真菌症、特に皮膚真菌症；敗血症；肺炎等の治療に使用でき、かつ、副作用が少ない可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のデプシペプチド化合物またはその塩は、抗真菌作用を有し、真菌症の予防および／または治療剤として使用しうる。
【図１】
2013147429.tif 000014
【図２】
2013147429.tif 000015
【図３】
2013147429.tif 000016
【図４】
2013147429.tif 000017
【図５】
2013147429.tif 000018
【図６】
2013147429.tif 000019
【図７】
2013147429.tif 000020
【図８】
2013147429.tif 000021
【図９】
2013147429.tif 000022
【図１０】
2013147429.tif 000023
【図１１】
2013147429.tif 000024
【図１２】
2013147429.tif 000025
【図１３】
2013147429.tif 000026
【図１４】
2013147429.tif 000027
【図１５】
2013147429.tif 000028
【図１６】
2013147429.tif 000029
【図１７】
2013147429.tif 000030
【図１８】
2013147429.tif 000031
【図１９】
2013147429.tif 000032
【図２０】
2013147429.tif 000033