(57)【要約】【課題】  光検出の検出精度が良好なマイクロチップ及びその製造方法を提供すること。【解決手段】  複数の基板から構成され、反応の反応場となる反応領域と、該反応領域の外周部分に内部を大気圧に対して負圧とされた外周路を設け、該外周路を貼り合わせる基板表面の少なくとも片側に配設するマイクロチップ；反応場となる反応領域の外周部分に外周路が基板表面に形成された基板層を、大気圧に対して負圧下で貼り合わせ、前記外周路を気密に封止すること、を含むマイクロチップの製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の基板から構成され、
反応の反応場となる反応領域と、該反応領域の外周部分に内部を大気圧に対して負圧とされた外周路を設け、
該外周路を貼り合わせる基板表面の少なくとも片側に配設するマイクロチップ。
【請求項２】
前記外周路の断面形状が、光検出に不要な光を遮蔽する曲面をもつ形状である請求項１記載のマイクロチップ。
【請求項３】
前記外周路が、反応領域が形成されている基板の両表面に設けられている請求項２記載のマイクロチップ。
【請求項４】
前記外周路が断熱性を有する請求項３記載のマイクロチップ。
【請求項５】
前記外周路は、切欠部を有する請求項３記載のマイクロチップ。
【請求項６】
前記外周路のそれぞれを連通流路にて接続し、該連通流路から各外周路に流体を流入させる請求項３記載のマイクロチップ。
【請求項７】
核酸増幅反応である請求項３記載のマイクロチップ。
【請求項８】
反応場となる反応領域の外周部分に外周路が基板表面に形成された基板層を、大気圧に対して負圧下で貼り合わせ、前記外周路を気密に封止すること、を含むマイクロチップの製造方法。
【請求項９】
前記外周路の断面形状を、光検出に不要な光を遮蔽する曲面に形成すること、を含む請求項８記載のマイクロチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、マイクロチップ及びマイクロチップの製造方法に関する。より詳しくは、基板に配設された反応場である反応領域の化学的及び生物学的分析等を行うためのマイクロチップ等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体産業における微細加工技術を応用し、シリコンやガラス製の基板上に化学的及び生物学的分析を行うためのウェルや流路を設けたマイクロチップが開発されている。
このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（Micro-Total-Analysis-System）やラボ・オン・チップ、バイオチップ等と称され、化学的及び生物学的分析の高速化や高効率化、集積化又は分析装置の小型化を可能にする技術として注目されている。
【０００３】
μ−ＴＡＳは、少量の試料で分析可能なことや、マイクロチップのディスポーザブルユーズ（使い捨て）が可能なことから、特に貴重な微量試料や多数の検体を扱う生物学的分析への応用が期待されている。
【０００４】
μ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された複数の領域内に物質を導入し、該物質を光学的に検出する光学検出装置がある。このような光学検出装置としては、マイクロチップ上の流路内で複数の物質を電気泳動により分離し、分離された核物質を光学的に検出する電気泳動装置や、マイクロチップ上のウェル内で複数の物質間の反応を進行させ、生成する物質を光学的に検出する反応装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）等がある。
【０００５】
例えば、特許文献１には、検出時のノイズとなる乱反射を抑え、精度の良い分析を行うことができる生体サンプル測定用プレートが開示されている。具体的には、生体サンプル判別用プレートには、流路、液だめ、基板を貫通した空孔が形成されている。カバーは励起光を透過させる材料でできており、空孔以外の部分を覆うように貼り付けられて、生体サンプル判別用プレートとカバーとの間に流路と液だめが形成されている。励起光は流路を照射し、充填された液体試料に含まれる蛍光標識が蛍光を発生させる。ここで、基板を貫通した空孔によって、生体サンプル判別用プレート内に迷光が発生せず、隣接する液だめから蛍光は発生しないという作用が得られている。
【０００６】
また、特許文献２には、少なくとも、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基板と、該ＰＤＭＳ基板と貼り合わせされる対面基板とからなるマイクロチップの製造方法が提案されている。このマイクロチップの製造方法は、以下の第１〜第３ステップで構成されている。第１ステップで、ＰＤＭＳ基板の貼り合わせ両側の外周縁寄り部分に負圧用管路が連続した環状に形成する。第２ステップで、ＰＤＭＳ基板の負圧用管路内の空気を排気吸引することによりＰＤＭＳ基板を対面基板に密着させる。第３ステップで、ＰＤＭＳ基板の負圧用管路内の空気を排気吸引することによりＰＤＭＳ基板を対面基板に真空接着させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−２９２４０８号公報
【特許文献２】特開２００５−２４９５４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、光検出の検出精度が良好なマイクロチップ及びその製造方法が種々望まれている。
そこで、本開示は、光検出の検出精度が良好なマイクロチップ及びその製造方法を提供することを主目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本開示は、複数の基板から構成され、反応の反応場となる反応領域と、該反応領域の外周部分に内部を大気圧に対して負圧とされた外周路を設け、該外周路を貼り合わせる基板表面の少なくとも片側に配設するマイクロチップを提供する。
従来のマイクロチップでは、前記反応領域に入射する光が散乱し、アドレスしていない隣接の反応領域に漏れ込む光や散乱光等により光検出の検出精度を低下させる不要な光が生じる。しかし、本開示のように前記外周路を配設することにより、光検出の検出精度を低下させる光検出に不要な光を所望の方向に導くこと（例えば、屈折や反射させること）が可能となる。これにより、光検出に不要な光が光検出系に侵入しないように遮蔽することが可能となるので、光検出の精度を良好にすることができる。
【００１０】
また、前記外周路の断面形状が、光検出に不要な光を遮蔽する曲面をもつ形状であるのが好適である。曲面を持つことにより、光検出に不要な光を屈折や反射させることが容易となり、所望の方向に光を導くことが容易となる。そして、光検出に不要な光が、ウェルや光検出系に侵入するのを防ぐことが可能となる。
また、前記外周路が断熱性を有するのが好適である。これにより、各反応領域の側壁の外周部分を囲うため、各反応領域からの熱の放出や各反応領域への熱の侵入を防ぐことが可能となる。よって、それぞれの反応領域内の反応温度の温度制御が容易となる。
また、前記外周路のそれぞれを連通流路にて接続し、該連通流路から各外周路に流体（液体、気体）を流入させるのが好適である。流入させる流体を適宜選択することにより、光遮蔽性や断熱性等を向上させることが可能となる。
【００１１】
また、前記外周路が、反応領域が形成されている基板の両表面に設けられているのが好適である。両表面に外周路が存在することにより、より光検出に不要な光を遮蔽することが可能となる。また、前記外周路の内部を大気圧に対して負圧とすることで、反応領域を有する基板をそれぞれの対面基板に、より強く吸着させることが可能となる。また、外周路内部を負圧とすると恒久接着等を使用しなくともよいため、マイクロチップの使用後の基板同士の剥離も容易である。
また、前記外周路は、切欠部を有するのが好適である。前記切欠部を設けることで、前記外周路の内部分に配設されている各反応領域に繋がる流路を形成し易くなる。この流路を利用して、反応試薬やサンプル液を各反応領域に短時間で容易に導入させることが可能となる。
【００１２】
反応場となる反応領域の外周部分に外周路が基板表面に形成された基板層を、大気圧に対して負圧下で貼り合わせ、前記外周路を気密に封止すること、を含むマイクロチップの製造方法。
前記外周路を設けることにより、基板の貼り合わせが容易に行える。また、マイクロチップ使用後の分別処理や再使用も可能となる。
前記外周路の断面形状を、光検出に不要な光を遮蔽する曲面に形成すること、を含むのが好適である。
【発明の効果】
【００１３】
本開示は、光検出の検出精度が良好なマイクロチップ及びその製造方法を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本開示に係わるマイクロチップＡの平面模式図である。
【図２】（ａ）貼り合わせる基板ａ１表面の片側に外周路２を設けた本開示に係わるマイクロチップＡの断面模式図（図１：Ｐ１−Ｐ２断面）である。（ｂ）貼り合わせる基板ａ１表面の両側に外周路２を設けた本開示に係わるマイクロチップＡの断面模式図（図１：Ｐ１−Ｐ２断面）である。なお、励起光は何れの面からでも入射させることは可能である。
【図３】本開示の（ａ）第一実施形態、（ｂ）第二実施形態、（ｃ）第三実施形態に係わるマイクロチップＡの入射光Ｌの不要な光を遮断することを説明するための概略図である。なお、反応領域を有する基板ａ１に対面する基板ａ２，ａ３は省略している。また、光をウェル１の下方から入射させているもので便宜上説明するが、ウェル１の上方から入射させることも可能である。（ａ）入射光方向に第１外周路２ａを設けた場合。（ｂ）出射方向に第２外周路２ｂを設けた場合。（ｃ）入射方向及び出射方向の両方に第１外周路２ａ，第２外周路２ｂを設けた場合。
【図４】本開示に係わる外周路２の例示の平面模式図である。
【図５】本開示に係わるマイクロチップＡ２の平面模式図である。
【図６】本開示に係わるマイクロチップＡ３の平面模式図である。
【図７】本開示に係わるマイクロチップＡ及び従来のマイクロチップを光学検出装置に使用した場合の計算モデルに使用する光学検出装置の構成図である。
【図８】本開示に係わるマイクロチップＡ及び従来のマイクロチップを光学検出装置に使用した場合の計算モデルに使用する光学検出装置及びマイクロチップの構成図である。
【図９】計算モデルにおける光線１００本、１０００本、１００００本の光の流れを示す図である。
【図１０】計算モデルにおいて、光源からチップ底面までの距離を０〜２０ｍｍに調整した場合、本技術のマイクロチップ及び従来のマイクロチップでの光の流れを示す図である。
【図１１】計算モデルにおける漏れ光の周囲の３ＰＤ合計到達量（光源出射光量を１００％とした場合）の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序により行う。
１．マイクロチップ
（１）反応領域
（２）外周路
（３）基板
（４）マイクロチップの他の実施形態
２．マイクロチップの製造方法
３．マイクロチップを使用した光検出方法
【００１６】
＜１．マイクロチップ＞
本開示に係わるマイクロチップＡの平面模式図を図１に示し、断面模式図を図２及び図３に示す。図２及び３は、図１中Ｐ１−Ｐ２断面に対応するものであり、マイクロチップＡの断面模式の例示の図である。
また、図３（ａ）〜（ｃ）は、本開示に係わるマイクロチップＡの入射光Ｌの不要な光を遮断することを説明するための概略図である。
なお、本開示にて説明する図面では、説明の便宜上、構成等を簡略化して示していることもある。
【００１７】
図１及び２に示すように、本開示のマイクロチップＡは、少なくとも２又は３以上の複数の基板から構成されている。
前記マイクロチップＡは反応の反応場となる反応領域１（以下、「ウェル１」ともいう）及び該反応領域１ごとの外周部分に外周路２を有する基板ａ１と、これに貼り合わせる少なくとも１以上の対面基板から構成されている。
また、前記外周部２の内部を大気圧に対して負圧とするのが好適である。また、前記対面基板は、基板ａ２，基板ａ３のように２枚でもよいし、１枚でもよい。
本開示のマイクロチップＡを用いれば、後述のように、反応領域の化学的及び生物学的分析における光検出の検出精度を向上させることが可能である。
【００１８】
（１）反応領域（ウェル）
図１及び２に示すように、ウェル１は、各種反応の反応場となるエリアであり、前記基板ａ１には、単数又は複数配置されているもの（領域）である。
前記ウェル１の形状は、特に限定されず、例えば、楕円柱状、円柱状、円錐台形状、角柱形状、多面体形状等が挙げられる。また、この内部にテーパが付いていてもよい。また、検出のための光が入出する面は平面とするのが望ましい。
なお、前記ウェル１では、化学的及び生物学的分析を行うための反応が行われる。このため、目的の分析に対応して検出目的物質及びこの検出反応に必要なものを適宜配設してもよい。これらとしては、例えば、生体由来の検出対象物、合成オリゴ（オリゴヌクレオチド、核酸様合成物質等）、蛍光色素等を修飾した合成オリゴ、酵素、緩衝溶液、塩類、ワックス等の固形化剤、抗体、光源、水等の溶媒等が挙げられる。また、ＰＣＲ法や等温増幅法（ＬＡＭＰ法等）で使用されるｄＮＴＰ類、色素や他の物質等も適宜配設してもよい。
【００１９】
（２）外周路
前記ウェル１ごとの外周部分に内部を大気圧に対して負圧とされた外周路２を、対面基板に貼り合わせる基板ａ１の表面の少なくとも片側に配設するのが好適である。外周路２内部の負圧により、該基板ａ１は、対面基板である基板ａ２及び／又は基板ａ３と貼り合わさっている状態とすることが可能となる。
本開示の外周路２をウェル１ごとの外周部分に設けることで、光検出に不要な光（漏れ光、散乱光等）を遮蔽することが可能となる。これにより、光検出に不必要な光を、Ｓ／Ｎ比的に影響しない程度まで減少させることが可能となる。
よって、本開示のマイクロチップを使用すれば、光検出の検出精度が良好となる。また、光学検出装置等の測定装置自体やそれの測定調整ではなく、マイクロチップのような簡便なものにて光検出の検出精度が向上することは、コストや作業効率の点でも有利である。
【００２０】
上述の如く、本開示の外周路２は、内部を大気圧に対して負圧としているのが望ましい。外周路２の内部が負圧であるため、光の屈折率が高くなっているので、不必要な光はウェルの外側を通過することになる。外周路２の内部が大気圧であっても負圧であってもＰＤＭＳ樹脂の屈折率と外周路２内部の屈折率差によってできた界面で光が反射させられる。反応領域となるウェルの直径をはみ出した放射状光束において外周部の不必要な光がチップを透過、もしくはチップ内部を導波して近隣の反応領域（ウェル）、光検出部に漏れこまないように外周路界面で不必要な光を散乱させてウェルに入り込まないようにする。そして、反応領域や光検出系への不要な光の侵入を低減することが可能となる。
また、前記外周路２の内部が負圧とすることにより、ウェル１の外周部分の基板面ａ１と、その面に接触している対面基板ａ２及び／又はａ３の基板面とを、しっかり減圧吸着させることが可能となっている。このため、各ウェル１を対面基板ａ２，ａ３にて密閉させることが可能となっている。各ウェル１の内部を減圧状態とし、このウェル内部にこの減圧を利用してサンプル液を注入しても、前記外周路２の内部の負圧にて基板同士の貼り合わせ状態を維持することが可能である。
【００２１】
また、前記外周路２内部を負圧の状態にする際には、この外周路２を有する基板ａ１と対面基板ａ２及び／又はａ３とを減圧状態での貼り合わせを行うことで可能である。このような基板の貼り合わせを行うことで、前記外周路２内の流体（気体、流体）を同時に排気吸引されているマイクロチップを得ることが可能である。このときのマイクロチップＡは貼り合わせ後の大気中では基板ａ１と対面基板ａ２，ａ３とが真空吸着されている構造となっている。
このことにより、使用する基板の種類に拘らず、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の基板を、恒久的接着に依らなくとも、負圧による自己吸着だけでより強い貼り合わせ強度を十分に維持することができる。
また、ウェル１内で加熱反応が進行した際にウェル内部の溶液が加熱されることで、ウェル１内部の内圧が上昇する場合がある。このような際に、前記外周路２内部が負圧であることにて、本開示のマイクロチップＡの基板同士の貼り合わせが強く密閉性が高いため、ウェル１からの反応液の液漏れ等が生じにくい。
【００２２】
また、本開示の外周路２は、マイクロチップＡの各ウェル１の温度（加熱・冷却）制御に関与させることができ、特に断熱性を有する。
前記外周路２内部を負圧状態にすることで、マイクロチップＡの加熱や冷却時に、各ウェル１周囲（外周部分）の水平方向（垂直方向）を断熱させやすいので、前記外周路２の内部を負圧にすることは好適である。これにより、ウェル１の内部からの放熱を低減でき、また各ウェル１の周辺からの熱の侵入を低減することとなる。
よって、光学的検出装置の加熱制御部（図示せず）にて反応領域１の反応温度を調整する際でも、反応領域１内の反応温度の温度制御が行い易くなる。これにより、ウェル１ごとの反応温度制御の精度が高くなり、ウェル１ごとの反応条件のバラツキも少なくなる。斯様なことから、本開示のマイクロチップを使用すると、各ウェル１において精度の高い反応を進行させることが可能となるので、光検出の検出精度を高くすることが可能である。
【００２３】
前記外周路２は、図２に示すように、基板ａ１を入射出射方向に貫通するような空孔でなく、未貫通のものである。未貫通とすることで、図２（ａ）（ｂ）に示すように、前記外周路２の内面に、光を反射や屈折させるための湾曲を設けることも可能となる。また、未貫通とすることで、光遮蔽性に加えて、ウェル１内の断熱性や対面基板ａ２，ａ３への吸着性等の良好な効果も得ることが可能となる。
【００２４】
図３（ａ）〜（ｃ）は、本開示に係わるマイクロチップＡの入射光Ｌの光検出に不要な光を遮断することを説明するための概略図である。
なお、図３（ａ）は、入射光方向に第１外周路２ａを設けた場合の本開示の第一実施形態に係わるマイクロチップＡである。
また、図３（ｂ）は、出射方向に第２外周路２ｂを設けた場合の本開示の第二実施形態に係わるマイクロチップＡである。
また、図３（ｃ）は、入射方向及び出射方向の両方に第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂを設けた場合の本開示の第三実施形態に係わるマイクロチップＡである。
ここで、基板ａ１を基準としたときに、光が入射する方向を「入射方向」といい、光が出射する方向を「出射方向」という（図３参照）。この入射方向及び出射方向を、「入射出射方向」といい（例えば、図１のＰ１−Ｐ２の断面の図２参照）、この入射出射方向に対する垂直方向を、「垂直方向」という。
また、入射方向に配設する外周路２を「第１外周路２ａ」ともいい、出射方向に配設する外周路２を「第２外周路２ｂ」ともいう。
なお、反応領域を有する基板ａ１に対面する基板ａ２，ａ３は省略している。また、光をウェル１の下方から入射させている図３で便宜上説明するが、前記外周路２はウェル１の上方から入射させても同様の効果を得ることが可能である。
【００２５】
本開示のマイクロチップＡの基板ａ１に設けられる外周路２は、図２（ａ）及び図３（ａ）（ｂ）に示すように、基板ａ１の少なくとも片側の表面に配設する。このうち、入射光Ｌの不要な光を効率良く排除できる点で、第１外周路２ａとするのが好適である。
【００２６】
前記外周路２の入射出射方向での断面形状（例えば、図１のＰ１−Ｐ２の断面）は、内面が湾曲しているものが好適である。内面を湾曲させることで、光検出に不要な光をより多く反射させたり、屈折させることができる（例えば図３参照）。これにより、光検出系にてコンタミネーションしないように、光検出に不要な光（例えば、漏れ光や散乱光等のＬ２，Ｌ３）を遮蔽することが可能となる。
この外周路２の断面形状は、光学検出に不要な光を遮蔽するような曲面をもつ形状が好適である。このような断面形状として、二次曲線的な曲面をもつ形状、さらに放物曲線的な曲面をもつ形状が、好ましい。
そして、外周路２の断面形状を曲面とすることで、上述の如く光遮蔽性がより効率良く行うことが可能である。これにより、隣接するウェルからの不要な光が各光検出系に侵入するのを防ぎ、コンタミネーションが低減できるので、各ウェルの光検出の精度が向上する。
【００２７】
前記外周路２の内面には、前記基板ａ１を対面基板ａ２及び／又は対面基板ａ３に吸着させて、これらを貼り合わせるための開口部２０が設けられている。この開口部２０は入射光方向又は出射方向に向いているのが好ましい。開口部２０の面と対面基板の面とが密接するように開口部２０が基板に形成されているのが好適である。
【００２８】
前記外周路２の高さ（深さ）は、該外周路２が未貫通であるため、ウェル１基板の厚み（入射出射方向）を１としたときに、１未満であればよい。光遮蔽性等の作用効果の点から、好ましくは０．５〜０．１、より好ましくは０．４〜０．２程度である（例えば図３（ａ）参照）。また、前記外周路２の高さ（深さ：Ｈ）を１としたときの開口部２０の幅（最大長径：Ｗ）は、０．３〜０．７とするのが好ましく、より０．４〜０．６とするのが好ましい。なお、「高さ（深さ）」は、外周路２の「開口部２０」から「頂（底）」までである。
また、前記外周路２とウェル１外壁との間隔（垂直方向）は、特に限定されないが、近接するのが望ましい。近接することで、光検出系への不要な光の侵入を低減しやすく、また断熱性や吸着性等の効果も有利に働きやすい。
【００２９】
前記外周路２の路は、対面基板と接する基板ａ１の少なくとも何れか１方の表面に形成される。
前記基板ａ１に形成される外周路２の路の形状は、ウェル１の外周部分に、略楕円形の環状（好適には略円形環状）；３〜２０角等の多角形の環状（好適には正多角形環状）等が挙げられる。
前記外周路２の入射出射方向での断面形状を、ウェル１（好適には底面）の中心を回転軸として回転することで形成される路（立体形状）とすることが好適である。
また、前記外周路２の環状の一部に、単数又は複数の切欠部２９を配設してもよい。これにより、例えば図５及び６に示すように、切欠部２９を通過し、ウェル１に接続する分岐流路６を設けることが可能となる。この分岐流路６にて主流路５からのサンプル液等をウェル１内部に流入させることが可能となる。
【００３０】
そして、図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、本開示のマイクロチップＡの基板ａ１の表面に、少なくとも前記第１外周路２ａ又は第２外周路２ｂをウェル１の外周部分に配設する。
さらに、図３（ｃ）に示すように、前記第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂは、組み合わせてウェル１の外周部分に配設することが可能である。前記外周路２が、ウェル１が形成されている基板ａ１の両表面に設けられているのが、好適である。第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂを配設することにより、ウェル１の側壁部分を外周路にて囲うことが容易となる。
基板ａ１の両表面に外周路２が存在することにより、より光検出に不要な光を遮蔽することが可能となる。また、前記外周路２の内部を大気圧に対して負圧とすることで、ウェル１を有する基板ａ１をそれぞれの対面基板ａ２，ａ３に、より強く吸着させることが可能となる。また、外周路２内部を負圧とすると恒久接着等を使用しなくともよいため、マイクロチップの使用後の基板同士の剥離も容易である。また、ウェル１の側壁部分を外周路２によって囲うことが可能となるため、ウェル１内からの熱の放出やウェル１内への周辺ウェルからの熱の侵入を抑制することが可能となる。よって、光遮蔽性、断熱性等の作用効果が発揮し易くなる。
また、垂直方向における第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂの両者の位置関係は、目的とする光遮蔽性、断熱性等の作用効果に合わせて適宜調整することが可能である。このうち、第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂを入射出射方向に並列配置するのが好適である（例えば、図２（ｂ）及び図３（ｃ）参照）。
【００３１】
以下に、より詳細に本開示の（ａ）第一実施形態、（ｂ）第二実施形態、（ｃ）第三実施形態に係わるマイクロチップＡの入射光Ｌの不要な光を遮断することを説明する。
図３（ａ）に示すように、入射光方向に第１外周路２ａが配設されている場合、入射光Ｌの漏れ光や散乱光等のＬ２は、第１外周路２ａの曲面部分にて入射光方向に反射する。また、隣接するウェル（図示せず）からの拡散光Ｌは、ウェル１の外周路２の曲面部分にて入射光方向に反射する。これにより、光検出に不必要な光とウェル１からの検出光Ｌ１との、コンタミネーションが低減する。よって、光検出に不必要な光が、光学検出系に到達するのを防ぎ、第１外周路２ａにて遮蔽することが可能である。なお、該光学検出系は、ウェル１からの検出光Ｌ１を検出するためのものである。
また、図３（ｂ）に示すように、出射光方向に第２外周路２ｂが配設されている場合、入射光Ｌの散乱光やウェル１から漏れ光、隣接するウェル（図示せず）からの拡散光等の光検出に不要な光Ｌ２，Ｌ３が、ウェル１の外側方向に屈折する。これにより、光検出に不必要な光とウェル１からの検出光Ｌ１との、コンタミネーションが低減する。よって、光検出に不必要な光が、光学検出系に到達するのを防ぎ、第２外周路２ｂにて遮蔽することが可能である。なお、該光学検出系は、ウェル１からの検出光Ｌ１を検出するためのものである。
【００３２】
また、図３（ｃ）に示すように、入射方向及び出射方向の両方に外周路２ａ，２ｂを設けるのが好適である。上述のように光検出に不要な光の反射や屈折等にて、漏れ光や拡散光等の光検出に不必要な光とウェル１からの検出光Ｌ１との、コンタミネーションがより低減する。よって、第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂの両方にて、光検出に不必要な光が、ウェル１からの検出光Ｌ１を検出するための光学検出系に到達するのを防ぐことが可能となる。この構成を採用することで、より効率的に遮蔽することが可能である。
【００３３】
なお、第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂの何れか一方の内部を大気圧に対して負圧とすることで、より光遮蔽性が高まるので、好適である。さらに、両方の内部を大気圧に対して負圧とすることで、さらに光遮蔽性が高まるので、より好適である。
また、外周路２内部を負圧とすることで、ウェル１を有する基板ａ１の２枚の対面基板ａ２，ａ３を強く張り合わせることが可能となる。これにより、接着剤や恒久的接着等による基板の接着を行わなくともよく、マイクロチップ使用後分別し、基板洗浄して再使用することも可能である。また、これにより、接着剤等の使用が不可能か困難な対面基板であっても、貼り合わせることが可能となる。
【００３４】
また、本開示の外周路２に、光遮断性の材料を含ませてもよい。これにより、光遮断性をより高めることが可能となるので、より検出精度が向上する。なお、該材料の状態は、固体（膜状等）、液体、気体等の何れでもよい。
光遮断性の材料としては、例えば、光を屈折率させるための材料や光を反射させるための材料等が挙げられる。
【００３５】
前記光反射材料は、光の反射率が高い材料であればよい。この材料としては、例えば、銀、金、アルミニウム及びロジウム等から選ばれる１種又は２種以上の金属膜材料が挙げられ、このうち銀や銀を主成分とするものが好適である。そして、この材料を用いたイオンスパッタリング法により、外周路２内面に反射膜を形成することができる。前記金属膜の厚さは、特に制限はないが、３０〜２００ｎｍ程度であればよく、金属膜１層当たり３０〜７０ｎｍ程度であればよい。
【００３６】
前記光屈折材料としては、特に限定されず、純水の屈折率と同等かそれ以上（より好適には屈折率ｎＤ（２０℃）１．５〜１．８）の高屈折率液体を使用するのが望ましい。前記光屈折液体としては、例えば、シリコーンオイル、光学オイル（イマージョンオイル）、イオン液体、フォトリソグラフ用高屈折率液体等が挙げられる。これらを１種又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
前記シリコーンオイルとして、市販品を使用すればよく、屈折率が１．３〜１．６程度の範囲で選択すればよい。例えば、ジメチルシリコーンオイル（屈折率：１．３〜１．４）、メチルフェニルシリコーンオイル（屈折率：１．４〜１．５）、メチルハイドロジェンシリコーンオイル（屈折率：１．３〜１．４）等が挙げられる。
また、ジメチルシリコーンオイルの市販品としてＫＦ９６（信越化学工業）、メチルフェニルシリコーンオイルの市販品としてＫＦ５０、ＫＦ５４（信越化学工業）、メチルハイドロジェンシリコーンオイルの市販品としてＫＦ９９（信越化学工業）等が挙げられる。
これらを１種又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００３８】
前記イマージョンオイルとして、市販品を使用すればよく、屈折率が１．５〜１．８程度のものが好適である。イマージョンオイルの市販品としては、ＴｙｐｅＡ、ＴｙｐｅＢ、ＴｙｐｅＮＶＨ、ＴｙｐｅＯＶＨ、Ｔｙｐｅ３７、Ｔｙｐｅ３００、ＴｙｐｅＤＦ、ＴｙｐｅＦＦ（カーギル標準屈折液：モリテックス）等が挙げられる。
ここで、ＴｙｐｅＡのオイルはテルフェニルや水素化テルフェニル、ポリブタン、炭化水素などを混合した短焦点観察用の低粘度合成オイルであり、ＴｙｐｅＢのオイルは医療機器レンズ用の中粘度合成オイルであり、ＴｙｐｅＮＶＨやＴｙｐｅＯＶＨは長距離観察用の高粘度合成オイルである。
これらを１種又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
前記イオン液体としては、特に限定されず、例えば、ジカチオン性イオン液体及びジアニオン性イオン液体が挙げられる。このうちジカチオン性液体が好ましい。
前記ジカチオン性液体としては、脂肪族アンモニウムジカチオン性液体及び芳香族アンモニウムジカチオン性液体等が挙げられる。前記アニオンとしては、例えば、カルボキシラート、スルホナート及びスルファートアニオンが挙げられる。ジカルボン酸ジアニオンの例としては、コハク酸、ノナン二酸及びドデカン二酸が挙げられるが、それらに限定されない。ジイオン種（一般的な架橋基を含むジアニオン及びジカチオン）の他の非限定的な例としては以下のもの（化学式１〜５）が挙げられる。プロトン化３級アミン系（化学式１）、テトラヒドロチオフェニウム系（化学式２）、イミダゾリウム系（化学式３）、ピロリジニウム系（化学式４）、ホスホニウム系（化学式５）。これらのアルキル基部分の単数又は複数の水素原子を、直鎖又は分岐鎖の炭素数１〜５アルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等）及びベンゼン環を有するアルキル基（例えばベンジル基等）で置換してもよい。また、ｎ＝１〜５が好ましい。
【００４０】
【化１】
2013113679.tif 000003
【００４１】
さらに、イミダゾリウム系ジカチオンイオン液体及びピロリジニウム系ジカチオン液体が好適である。さらに、以下の化学式６〜１１が好適である。Ａは塩を示し、Ａとしては、例えば、Ｂｒ−、Ｃｌ−、I−、ＮＴｆ２−、ＢＦ４−、ＰＦ６−等が挙げられる。
【００４２】
【化２】
2013113679.tif 000004
【００４３】
これらを１種又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
前記フォトリソグラフ用高屈折率液体としては、水中に分散させたときに、屈折率が１．５以上となるように、体積平均粒径が１００ｎｍ以下である無機微粒子（Ａ）を１種又は２種以上組み合わせて調整したフォトリソグラフ用高屈折率液体無機粒子が挙げられる。このフォトリソグラフ用高屈折率液体について、例えば特開２００７−２３４６８２号公報を参照することが可能である。無機粒子の重量％及び体積平均粒径は、ＪＩＳ  Ｒ１６２９−１９９７ファインセラミックス原料のレーザ回折・散乱法による粒子径分布測定方法に準拠して測定すればよい。
前記フォトリソグラフ用高屈折率液体無機粒子は、粒径１００ｎｍ以下の範囲に存在する粒子が全体の９０重量％以上であるのが好ましい。さらに、前記無機粒子（Ａ）としては、例えば、金属酸化物微粒子、無機酸金属塩微粒子（硫酸塩・炭酸塩・リン酸塩等）、金属ハロゲン化物微粒子、金属窒化物微粒子、金属炭化物微粒子、金属ホウ化物微粒子、金属微粒子及びセラミック微粒子等が挙げられ、２種以上を併用してもよい。
具体的には、金属酸化物としては、アルミナ、酸化スズ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、三酸化二鉄、酸化アンチモン、酸化マグネシウム、酸化クロム、および酸化ケイ素等が挙げられる。無機酸金属塩としては、硫酸カルシウム、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、および塩化カリウム等が挙げられる。金属窒化物としては、窒化チタン、窒化アルミニウム、窒化ジルコニウム、窒化クロム、窒化タングステン、および窒化ケイ素等が挙げられる。金属炭化物としては、炭化チタン、炭化ジルコニウム、炭化タングステン、炭化クロム、炭化ニオブ、および炭化ケイ素等が挙げられる。金属ホウ化物としては、ホウ化チタン、ホウ化ジルコニウム、ホウ化タングステン、ホウ化クロム、およびホウ化モリブデン等が挙げられる。金属としては、銀、および銅等が挙げられる。これらの２種以上を併用しても差し支えない。
また、状況に応じ表面処理等の加工が実施されたものでもよい。これらの中で屈折率として２〜３を有するアルミナ、酸化スズ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化ジルコニウム、酸化セリウム、三酸化二鉄、酸化アンチモンが好ましい。さらに屈折率と粒径の観点から、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化セリウムが特に好ましい。高屈折率１．５以上であるためには固形分は５重量％以上が好ましい。
これらを１種又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００４５】
前記外周部２に光遮断性の材料を使用する際の一例を以下に挙げるがこれに限定されるものではない。例えば、本開示の外周路２の面（好適には内面）に、光反射材料を付着させること；本開示の外周路２の内部に光屈折材料を注入すること等が挙げられる。
【００４６】
また、本開示の外周路２に、断熱性の材料を含ませてもよい。
これにより、断熱性をより高めることが可能となるので、各ウェル１の温度制御の精度が高くなり、より検出精度が向上する。なお、該材料の状態は、固体（膜状等）、液体、気体等の何れでもよい。
前記断熱性材料としては、特に限定されず、ヒートカット塗料に使用されるセラミックビーズ分散液等が挙げられる。このとき、上述の光遮蔽性を低下させないものが望ましい。
【００４７】
また、本開示の外周路２には、他の外周路２と連通するための連通流路８を設けてもよい。連通流路８を設けることで、この流路８を経て前記外周路２内部に、光遮断性、断熱性や密着性等の機能を向上させる流体（液体、気体）を流入させることが可能となる。
また、外周路２のさらに外周部分に補助路３を一重に又は多重に設けてもよい。補助路３を用いることにより、対面基板の密着性の向上、内周のウェル１の断熱性の向上等が挙げられる。
【００４８】
本開示の外周路２には、切欠部２９を設けてもよい。前記切欠部２９を設けることで、前記外周路２の内部分に配設されている各ウェル１に繋がる流路（主流路５，分岐流路６等）を形成し易くなることで、好ましい。この流路を利用して、反応試薬やサンプル液を各ウェル１に短時間で容易に導入させることが可能となる。
【００４９】
図４は、マイクロチップＡに形成される外周路２の例示の平面図である。また、図４は、ウェル１と外周路２との位置関係を示す平面図である。
図４（ａ）は、外周路２１がウェル１の外周部分に略円形状の環状として形成されている場合を示す図である。図４（ｂ）は、外周路２２がウェル１の外周部分に四角形状の環状として形成されている場合を示す図である。図４（ｃ）は、外周路２３がウェル１の外周部分に多角形状（六角形状）の環状として形成されている場合を示す図である。このうち、略円形状の環状が、光遮断性や断熱性等が良好であるので、好適である。
なお、ウェル１には分岐流路６を連通させてもよく、このとき外周路２に切欠部２９を設けてもよい。また、外周路２には連通流路８を、連通させてもよい。
【００５０】
図４（ｄ）は、外周路２４がウェル１の外周部分に環状として形成され、該外周路２４に流体を流入させる連通流路８を設けた場合を示す図である。さらに、その外周路２４の外周部分に切欠部２９を有するＣ型の補助路３を設け、該切欠部２９は前記連通流路８が通過できるように形成されてる場合も示す図である。そして、連通流路８にて遮光性、断熱性等を有する流体を流すことが可能である。また、補助路３の負圧にて対面基板ａ２，ａ３を強く貼り合わせることが可能である。
また、切欠部２９及び連通流路８を設けず、補助路３の両端が連通していてもよい。
また、外周路２４に、分岐流路６とウェル１とを連通させるために、切欠部２９を設けてもよい。
【００５１】
図４（ｅ）は、複数の切欠部２９を有する外周路２５がウェル１の外周部分に形成されている場合を示す図である。図４（ｆ）は、単数の切欠部２９を有する外周路２６がウェル１の外周部分にＣ型形状として形成されている場合を示す図である。切欠部２９を設けることで、ウェル１にサンプル液等を流入させるための流路を設けることが可能となる。また、切欠部２９に加熱制御部のような配線等を通すことも可能である。
【００５２】
（３）基板
前記マイクロチップの基板（基板層ａ１，ａ２，ａ３）は、ガラスや各種プラスチック（ＰＰ、ＰＣ、ＣＯＰ、ＰＭＤＳ等）により形成できる。マイクロチップの材質は、光学検出部から照射される測定光に対して透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいため光学誤差が少ない材質とすることが望ましい。
マイクロチップの基板ａ１へのウェル１、外周路２、各流路の成形は、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板のナノインプリントや射出成形、機械加工によって行うことが可能である。
マイクロチップは、ウェル１、外周路２、各流路等を形成した基板ａ１を、同じ材質又は異なる材質の基板ａ２，ａ３で封止することで形成することが可能である。ここで、各流路は、特に限定されず、上述の主流路５、分岐流路６、導入口４、排出口７、連通流路８、入出口８０等を含む。
【００５３】
（４）本開示のマイクロチップの他の実施形態
以下に、本開示のマイクロチップの他の実施形態を説明する。
図５は、本開示に係わるマイクロチップＡ２の平面模式図である。
各ウェル１１，１２，１３は、それぞれの分岐流路６を介して１つの主流路５に接続されている。分岐流路６を有するウェル１１，１２，１３ごとの外周部分に、切欠部２９を有するＣ型形状の外周管路２６１，２６２，２６３が配設されている。前記分岐流路６は前記切欠部２９を通過するように形成されている。各ウェル１１，１２，１３には、反応試薬が収容されている。
本開示のマイクロチップＡ２の導入口４にサンプル液を注入することで、各ウェル１１，１２，１３にサンプル液が流入し、反応試薬と混合する。温度制御等を行い、反応を終了させた後又は反応中に、各ウェル内で発生する光成分（例えば蛍光）について、光検出を行う。
このとき、本開示の外周路２６１，２６２，２６３にて、光検出に不要な光を遮蔽することが可能である。また、断熱性が良好である。また、本開示の外周路２６１，２６２，２６３に、切欠部２９を設けることで、流路にてサンプル等をウェル内に移送できるので、作業効率性もよい。
なお、反応試薬は、各ウェル１１，１２，１３に収容されていなくともよい。
よって、本開示のマイクロチップＡ２を用いれば、反応領域の化学的及び生物学的分析における光検出の検出精度を向上させることが可能である。
【００５４】
図６には、本開示に係わるマイクロチップＡ３の平面模式図である。
各ウェル１１，１２，１３は、分岐流路６を介して１つの主流路に接続されている。各分岐流路６を有するウェル１１，１２，１３の外周部分に切欠部２９を有するＣ型形状の外周管路２６１，２６２，２６３が配設されている。前記分岐流路６は前記切欠部２９を通過するように形成されている。各外周管路群２６１，２６２，２６３は、それぞれ連通流路８１，８２，８３にて連通し、各外周管路群２６１，２６２，２６３の端部には流体を流入させる入出口８０が配設されている。
本開示のマイクロチップＡ３の導入口４にサンプル液を注入することで、各ウェル１１，１２，１３にサンプル液が流入し、反応試薬と混合する。温度制御等を行い、反応を終了させた後又は反応中に、各ウェル内で発生する光成分（例えば蛍光）について、光検出を行う。
このとき、本開示の外周路２６１，２６２，２６３にて、光検出に不要な光を遮蔽することが可能である。
【００５５】
さらに、マイクロチップＡ３における連通流路８１，８２，８３及びその端部の入出口８０を使用することが可能である。光遮断性材料、断熱性材料等を含む流体を入出口８０から注入することで、連通流路８１，８２，８３を経てそれぞれの外周路２６１，２６２，２６３に前記流体が流入する。これにより、さらに光遮蔽性及び断熱性等を向上させることが可能となる。
また、本開示の外周路２６１，２６２，２６３に、切欠部２９を設けることで、流路にてサンプル等をウェル内に移送できるので、作業効率性もよい。
また、連通流路８１，８２，８３が各群として独立することで、ウェル１１，１２，１３の各ウェル群に応じて、光遮断性、断熱性等を高めることが可能である。また、連通流路８１，８２，８３それぞれをつなぐ連通流路を設けることで、流体を１回のインジェクションにて、外周路２６１，２６２，２６３の各外周路に流入させることが可能となるので作業効率性が向上する。
なお、反応試薬は、各ウェル１１，１２，１３に収容されていなくともよい。
よって、本開示のマイクロチップＡ３を用いれば、反応領域の化学的及び生物学的分析における光検出の検出精度をより向上させることが可能である。
【００５６】
＜２．マイクロチップの製造方法＞
本開示のマイクロチップの製造方法は、反応場となる反応領域１の外周部分に外周路２が基板ａ１表面に形成された基板層を、大気圧に対して負圧下で貼り合わせ、前記外周路を気密に封止すること、を含むものである。
反応領域１と外周路２は、何れを先に基板ａ１表面に形成してもよく、同時に形成してもよい。また、外周路２は、少なくとも何れか１方の基板ａ１表面に形成すればよい。
このとき、前記外周路の断面形状を、光検出に不要な光を遮蔽する曲面に形成すること、を含むものである。この断面形状として、好適には２次曲線的な曲面、より好適には放物線的な曲面である。また、形成する外周路の（入射出射方向に対する）垂直方向の（断面又は平面）形状は、上述のとおりであるが、例えば図４の例示図が挙げられる。また、このとき各外周路を連通し、流体を移送するための連通流路や入出口を形成してもよい。また、この基板に反応領域に連通する主流路及び分岐流路を形成してもよい。
なお、上述の如くして得られた反応領域及び外周路を有する基板に対面する基板の形成は、上述の如く、エッチングや射出成形等で行うことが可能である。
【００５７】
前記反応領域１に反応試薬を入れ、真空乾燥や凍結乾燥等の乾燥にて、反応試薬を固着化した反応領域１を形成してもよい。このとき反応領域１の表面はＤＰアッシング等にて親水化するのが好適である。また、外周路２、連通流路８、主流路５、分岐路６等の流体が流入や移送可能な箇所は親水化しておくのが好適である。
【００５８】
さらに、上述で形成した基板を貼り合わせる際には、大気圧に対して負圧下（例えば、１／３０気圧以下）で行ってもよい。これにより、ウェル１、外周路２、各流路等の内部が大気圧に対して負圧となるよう機密に封止される。さらに、基板層同士の貼り合わせは真空下（例えば、１／１００気圧以下）で行うのが、強固に貼り合わせるために、好適である。これにより、外周路２内が負圧になっているため、上述の如く、光検出に不要な光を遮蔽しやすくなる。
このとき、外周路２が基板ａ１表面の１方にのみ形成されている基板ａ１を使用する場合には、外周路２が基板表面に形成されていない側の基板ａ１の表面を接着剤等にて、基板ａ２又は基板ａ３を貼り合わせればよい。これにより、マイクロチップを形成する。
また、外周路２が基板ａ１の表面の両方に形成されている場合には、大気圧に対して負圧下にて、基板ａ２及び基板ａ３を別々に又は同時に貼り合わせてもよい。また、反応試薬をウェル１に固着化する場合には、固着化前にウェル１と非接触の基板ａ３を貼り合わせるのが望ましい。このとき、固着化した後にウェル１を密封するため、基板ａ２を張り合わせてマイクロチップを形成する。
なお、上述で形成した基板の貼り合わせは、公知の接着方法（恒久接着等）にて行ってもよいが、マイクロチップの再使用等の点からは、上述の外周路内の負圧を利用した貼り合わせが好適である。
【００５９】
ところで、従来のマイクロチップでは、ウェルの配置やチャネル構造が微細化する傾向にある。そして、従来のマイクロチップでは、ウェル内の反応を光検出するために、透過光学系で光を外部からウェル内に照射すると、光検出の精度が低下することがある。これは、微細化するにつれて、ウェル内をプローブするための透過光、反射光をアドレスしたウェルに照射すると、マイクロチップ内部、周辺環境で複雑に光が散乱する。例えば、ウェルに入射する光が拡散し、アドレスしていない隣接のウェルに漏れ込む光が発生することとなる。この漏れ光が隣接のウェルに流れ込むこととなるので、評価したいウェルの光成分（情報）以外の光（情報）を検出してしまう。このようにして得た光成分の強度が情報として出力されるため、シグナルのコンタミネーションが起きることとなる。このコンタミネーションをゼロにするのは比較的困難であるので、光学検出装置等の調整等にて、そのＳ／Ｎ比を上げることが重要とされていたという問題があった。
【００６０】
これに対し、本開示のマイクロチップＡは、上述の如く本開示の外周路２をマイクロチップＡの外周部分に設けることで、この漏れ光等の光検出に不要な光を遮蔽することが可能となる。これにより、上記の問題を解決することが可能となる。
【００６１】
また、従来のマイクロチップは、合成樹脂等の材料からなる基板にチャネルが形成されており、このチャネルの一端には入出力ポートとなるべきウェルが形成されて基板の下面側に不透明又は透明な素材からなる対面基板が接着されている。ここで素材には、例えばガラスや合成樹脂フィルム等が挙げられる。この対面基板の存在により、ウェル及びチャネルの底部が封止される。
ここで、エラストマータイプのシリコン樹脂であるＰＤＭＳ基板と対面基板とを貼り合わせるマイクロチップ製造方法として、例えば、特許文献２が挙げられる。このＰＤＭＳはチャネル等の微細構造を有するマスター（鋳型）に対する良好なモールド転写性、透明性、対薬品性、生体適合性等を有し、マイクロチップの構成素材としては特に優れた特徴を有している。
さらに、ＰＤＭＳ製マイクロチップの製造上の更なる利点は、ＰＤＭＳ基板と対面基板との貼り合わせに、いわゆる恒久接着（パーマネント・ボンディング）が利用できることである。恒久接着とは、ある種の表面改質を行うだけで、接着剤無しでＰＤＭＳ基板と対面基板とを相互に接着することができる性質のことである。これにより、管路、容器及び／又はポート等の微細構造の良好な封止性を発揮させることができる。ＰＤＭＳ基板の恒久接着では、貼り合わせ面を適宜表面改質した後、両方の基板の貼り合わせ面を密着して重ね合わせ、一定時間放置することで、容易に接着が行えるものである。
【００６２】
しかし、実際には、以下のような場合には、必ずしも恒久接着が好ましくないことがあり、また、恒久接着でなくＰＤＭＳの有する自己吸着性を利用して対面基板を張り合わせただけで使用することの方が好ましいこともある。
ＰＤＭＳの有する自己吸着性を利用して対面基板を貼り合わせただけの従来のマイクロチップでは、用途によっては、貼り合わせ強度が不足して注入した液体試薬や検体が微細流路から漏洩するという問題があった。
また、従来のマイクロチップにおいて、減圧吸着を強くするために、マイクロチップの外周付近に環状管路を形成することも考えられるが、チップが大型化してしまうという問題があった。
【００６３】
これに対し、本開示のマイクロチップＡは、各ウェルの外周部分に負圧の外周路２を設けることにより、貼り合わせ強度を強くすることが可能となる。このため、流体の漏洩がほとんどなく、またチップを大型化する必要もない。さらに、前記外周路２は、第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂのように、ウェル１が形成されている基板ａ１の両表面に設けることが可能であるので、対面基板ａ２，ａ３を強く貼り合わせることが可能となる。また、前記外周路２の外周にさらに１層又は多層の補助路３を設けることが可能であるので、より強い貼り合わせ強度を得ることが可能である。
【００６４】
また、マイクロチップの試薬反応には、反応制御を行うため、おおよそ加熱機構が必要とされ、さらに、マイクロチップの加熱及び冷却機構も必要とされる場合もある。この際のウェルへの熱伝導性は、マイクロチップの均一熱制御が非常に重要である。なぜならば、チップ周囲から放熱していくためチップ中心部とチップ外周部の温度差が顕著化するためであり、斯様な問題があった。チップの直近に加熱部を配置する場合、光学系がおおよそ離れた位置より照射されることがあるが、この際は、上記の漏れ光が増大し、Ｓ／Ｎ比は悪化するという問題があった。
【００６５】
これに対し、本開示のマイクロチップＡは、各ウェルの外周部分に負圧の外周路２を設けることにより、ウェル１からの熱の放出や隣接するウェルからの熱の侵入を低減することが可能となる。さらに、前記外周路２は、第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂのように、ウェル１が形成されている基板ａ１の両表面に設けることが可能である。この断熱性を有する外周路２ａ，２ｂにより、ウェル１の側面部分を出射方向及び入射方向から囲うことが可能となる。これにより、チップ周囲からの放熱するのを防ぐことが可能となる。しかも、前記外周路２の外周にさらに１層又は多層の補助路３を設けることが可能であるので、より断熱効果を高めることが可能である。
本開示のマイクロチップＡは、このように簡便に断熱効果を得ることができるので、チップ直近に加熱部を配置する必要がなく、この配置によって生じる光検出の精度の低下を防止することが可能となる。
【００６６】
また、従来のマイクロチップは、恒久接着するには、前処理としてＰＤＭＳ基板に対して適切な表面改質処理を必ず施さなければならない。表面改質処理は、例えば、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）装置による酸素プラズマ処理を行うことからなる。従って、このような処理を行うことによりマイクロチップの製造コストが増大する。
これに対して、本開示のマイクロチップＡは、この処理（製造工程）を省略することが可能となるので、製造コストを大幅に軽減することが可能である。
【００６７】
また、従来のマイクロチップでは、恒久接着等の接着が不可能か又は非常に困難な対面基板を使用する場合がある。
例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）は透明性の高い普及品の樹脂であり、ポリカーボネイト（ＰＰＣ）は耐熱性に優れ、ＤＮＡ増幅方法の一つであるＰＣＲ等で化学反応に高い温度が必要な場合に有利である。また、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）は、各種の試薬に対し高い耐薬品性を有する。
しかしながら、これら樹脂製対面基板とＰＤＭＳ基板とは、恒久接着を行うことができないという問題がある。
【００６８】
また、ポリエチレン（ＰＥ）やポリスチレン（ＰＳ）は恒久接着が可能であるが、その接着方法は、以下の理由から非常に困難であるとう問題がある。
例えば、これら合成樹脂製の対面基板はガラス等に比べると、一般的に恒久接着のための表面改質処理に対する耐性が低い。しかも、恒久接着が良好に行われる処理強度が小さい上に、許容範囲が極めて狭い。例えば、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）装置による酸素プラズマ処理を用いた場合、ガラスに対しては処理強度としてＲＦ出力１５０Ｗ、照射時間１５秒を超えると、恒久接着が行われ難くなる。一方、ポリエチレン樹脂に対しては僅かに２５Ｗ、１０秒を超えると恒久接着が困難になる。
また、微弱なＲＦ出力で、極短時間のプラズマを安定的に発生させることは難しく、処理強度のバラツキが起こり易いため、合成樹脂製基板とＰＤＭＳ基板とが安定的に接着させることが難しい。このため処理強度のバラツキが起こりやすいために、合成樹脂製基板とＰＤＭＳ基板とが再現性良く恒久接着し難い一因であるとも考えられる。
【００６９】
これに対し、本開示のマイクロチップは、前記外周路２の負圧により基板同士を強く貼り合わせることが可能となる。よって、ＰＤＭＳ基板と、ＰＭＭＡ、ＰＰＣ、ＰＥ、ＰＳから選ばれる１種又は２種以上の基板とを使用しても、良好に貼り合わせることが可能となる。
【００７０】
また、恒久接着している従来のマイクロチップを使用した後に、プラスチックのＰＤＭＳ基板と無機物であるシリコン基板やガラス基板とを分別して、廃棄処分する場合、手間暇がかかるという問題がある。
【００７１】
これに対し、本開示のマイクロチップは、前記外周路２の負圧を利用して基板同士を貼り合わせているので、恒久接着の場合と比較して、剥離させることがはるかに容易であるので、作業効率がよい。
【００７２】
恒久接着している従来のマイクロチップでは、基板同士を剥離し難く、剥離しても基板に損傷が生じる可能性が高いので、マイクロチップ使用後に基板を洗浄して再使用することは困難であり、コスト低減が行いにくいという問題がある。
【００７３】
これに対し、本開示のマイクロチップは、前記外周路２の負圧を利用して基板同士を貼り合わせているので、恒久接着の場合と比較して、剥離させることがはるかに容易である。しかも、剥離の際に基板を損傷させることもないので、作業効率がよく、コスト低減が行い易い。
剥離することにより、基板内の微細構造部分の洗浄が行い易くなるばかりか、十分な洗浄効果が得られる。洗浄後の基板は、他の基板と貼り合わせて再使用することも可能である。
【００７４】
また、従来のマイクロチップにおいて、例えば、ガラス基板に電極や電熱ヒーター、温度センサ等の配線パターンを形成したり、シリコン基板にＭＥＳＭ技術によりマイクロバルブやマイクロポンプ等を形成する場合がある。この制作には、非常なコストがかかるため、１回限りの使用で廃棄することは極めて不経済的である。
【００７５】
これに対し、本開示のマイクロチップでは、対面基板ではなく、ウェルを有する基板に前記外周路２を形成している。このため、対面基板に複雑な加工を施したガラス基板やシリコン基板を前記外周路２の負圧にて貼り合わせているので、対面基板を損傷させることなく、剥離することが可能である。剥離後、複雑な加工を施した対面基板等を洗浄して再使用することも可能である。高価な基板を洗浄して再使用することにより、コスト低減を図ることが可能となる。よって、コスト低減を図ることが可能である。
【００７６】
本開示のマイクロチップは、後記実施例（図７〜１０参照）に示す通り、通常の光学検出装置において、従来のマイクロチップと比較して、非常に良好な結果が得られている。
すなわち、本発明者らは、全く意外にも、光検出の精度の非常に良好という、際立って顕著な効果を有する本開示のマイクロチップを完成させることができ、これを確認できた。このときの光源と本開示のマイクロチップの入射方向の面との距離は、好ましくは０〜２０ｍｍ、より好ましくは０〜１５ｍｍである。なお、この距離は、通常の光学検出装置で設定されている数値である。
よって、本開示のマイクロチップ（好適には、図２（ｂ）参照）を光学検出装置に搭載した際に、光学検出装置の光検出の調整を特に行わなくとも、光検出に不要な光（漏れ光等）をより良好に遮蔽することが可能となる。
【００７７】
＜光学検出装置＞
本開示のマイクロチップは、光学検出装置に搭載して使用することが可能である。この光学検出装置（図示せず）は、各種反応（例えば、核酸増幅反応）を行うことが可能なものが望ましい。例えば、導光板、反射板、照射系（部）、励起フィルタ、蛍光フィルタ及び光検出系（部）を備えるのが望ましい。光の流れを調整する導光部材や反応温度を制御する加熱制御部を配設してもよい。また、光量や光成分等を調整するためや各系（部）を支持するため、ピンホール、各種フィルタ、集光レンズ、支持台を適宜配設してもよい。
また、これら各種動作（例えば、光制御、温度制御、核酸増幅反応、検出制御、検出光量算出やモニタリング等）を制御する制御部（ＣＰＵ等）が備えられているのが好適である。
【００７８】
前記光源系としては、例えば、レーザー光源、白色又は単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）、水銀灯、タングステンランプ等が挙げられる。
なお、前記レーザー光源としては、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Kr）レーザー等を出射する光源であればよい。該レーザー光源は、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
【００７９】
前記検出系は、反応領域２の他端（具体的には底面）から出射する光の光量を検出することが可能な機構であればよい。当該検出系には、光学検出器が少なくとも備えられている。
前記光学検出器としては、特に限定されず、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）アレイ、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサ等のエリア撮像素子、小型光センサ、ラインセンサースキャン、ＰＭＴ（光電子倍増管）等が挙げられ、これらを適宜組み合わせてもよい。
なお、励起フィルタ及び検出フィルタは、各種反応に対応したものを使用すればよい。市販品を使用すればよい。
【００８０】
＜核酸増幅反応＞
本開示のマイクロチップは、光学的検出を目的とする各種化学反応に使用することが可能であり、例えば、核酸増幅反応用、還元性糖（例えば麦芽糖、果糖、ブドウ糖等）検出用（例えば、ベネジクト試薬等による反応等）に使用することが可能である。
【００８１】
本開示において「核酸増幅反応」として、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法や「等温増幅反応」が挙げられる。この「反応試薬」には、核酸増幅反応において、増幅核酸鎖を得るために反応に必要な物質が含まれている。この「反応に必要な物質」には、核酸増幅反応において増幅核酸鎖を得るために必要な物質である。具体的には、標的核酸鎖に相補的な塩基配列とされたオリゴヌクレオチドプライマー、核酸モノマー（ｄＮＴＰ）、酵素、反応緩衝液（バッファー）溶質などが含まれる。  
【００８２】
ＰＣＲ法は、（１）熱変性、（２）アニーリング、（３）伸長反応の３つのステップからなる温度サイクルを繰り返すことによって、鋳型となる核酸鎖の増幅を行うものである。このとき、この反応は前記反応領域１のそれぞれにおいて行われる。
ステップ（１）の熱変性は、鋳型核酸鎖を二本鎖から一本鎖に解離させるためのステップである。熱変性時の反応温度は通常９４℃前後とされる。ステップ（２）のアニーリングは、一本鎖に解離した鋳型核酸鎖にオリゴヌクレオチドプライマーを結合させるためのステップである。アニーリング時の反応温度は、通常５０〜６０℃程度とされる。ステップ（３）の伸長反応は、ＤＮＡポリメラーゼによって、オリゴヌクレオチドプライマーが結合した部分を起点として一本鎖部分と相補的なＤＮＡを合成するステップである。伸長反応時の反応温度は、通常７２℃前後とされる。
ＤＮＡ複製反応の際に生成されたｄｓ（double-standed）−ＤＮＡには、例えばＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の蛍光色素がインターカレートする。インターカレートしたｄｓ−ＤＮＡに励起光が照射されることで励起して蛍光を発する（例えば、励起光４９７ｎｍ：発光波長５２０ｎｍ）。蛍光フィルタで所望の蛍光成分にし、この蛍光の発光量を前記温度サイクルごとに蛍光検出系で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する蛍光量との相関関係に基づいて遺伝子発現量として初期のｃＤＮＡ量を求めることもできる。
なお、ＰＣＲ法については、濁度物質を用いても核酸を定量することが可能である。
【００８３】
また、本開示において「核酸等温増幅反応」には、温度サイクルを伴わない各種増幅反応が含まれる。等温増幅反応としては、例えば、ＬＡＭＰ(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法やＳＭＡＰ(SMartAmplification Process)法、ＮＡＳＢＡ(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法、ＩＣＡＮ(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法（登録商標）、ＴＲＣ(transcription-reverse transcription concerted)法、ＳＤＡ(strand displacement amplification)法、ＴＭＡ(transcription-mediated amplification)法、ＲＣＡ(rolling circle amplification)法等が挙げられる。この他、「核酸増幅反応」には、核酸の増幅を目的とする等温による核酸増幅反応が広く包含されるものとする。また、これらの核酸増幅反応には、リアルタイム（ＲＴ）−ＬＡＭＰ法などの核酸鎖の増幅とともに増幅された核酸鎖の定量を伴う反応も包含される。
【００８４】
核酸増幅反応の一例として、ＬＡＭＰ法を挙げ、このＬＡＭＰ法における濁度物質にて核酸を定量する場合について、以下に説明する。このとき、この反応は前記反応領域１のそれぞれにおいて行われる。
一定温度（６０〜６５℃）になるように設定することで、核酸が増幅されてゆく。尚、このＬＡＭＰ法では、二本鎖から一本鎖への熱変性が必要なく、この等温条件下、プライマーのアニーリングと核酸伸長とが繰り返り行われる。
この核酸増幅反応の結果、ピロリン酸が生成され、このピロリン酸に金属イオンが結合して不溶性又は難溶性の塩が形成され、この塩が濁度物質となる（測定波長３００〜８００ｎｍ）。この濁度物質に入射光が照射されることで、散乱光となる。蛍光フィルタを透過して、この散乱光の散乱光量をリアルタイムに蛍光検出系で測定し、定量化する。また、透過光量からも定量化することは可能である。
なお、ＬＡＭＰ法については、蛍光物質を用いても核酸を定量することが可能である。
【実施例】
【００８５】
以下に、具体的な実施例等を説明するが、本技術はこれに限定されるものではない。
【００８６】
＜実施例１＞
実験材料
・ＰＤＭＳ製の表裏に放物曲線的な曲面を有するリング溝形成し、９ウェルを形成した基板ａ１を使用した。
・ＬＡＭＰ反応溶液を使用した。
・蛍光色素としてSYBR Green I（SG：Molecular Probes Inc.）を使用した。
【００８７】
本開示のマイクロチップＡ２の製造方法及びこれを使用した試験方法
ＰＤＭＳ樹脂を型に入れて成形した流路５，６付のマイクロウェル１を備えた透明チップａ１を作製した。
さらに、流路５，６と試薬を固相化させるウェル１周囲の各々に放物曲線的な曲面を有する形状のＣ形管路２６の溝を基板ａ１表面に作製し、その裏面にもウェル１周囲に同様に放物曲線的な曲面を有する形状のＣ形管路２６の溝を作製した。
これを以下に使用するＰＭＤＳ基板ａ１とした。
【００８８】
ＰＭＤＳ基板ａ１の底部の貼り合わせについて以下に説明する。
ＰＤＭＳ基板ａ１をＯ２：１０ｃｃ  １００Ｗ  ３０ｓｅｃでＤＰアッシングして表面を親水化させ真空中でカバーガラスａ３と貼り合せた。ガラスａ３側を下にして試薬固相化用のウェル１がある面を表側にひっくり返した。
【００８９】
標的（鋳型）核酸のＬＡＭＰ用プライマーを含むＬＡＭＰ反応溶液を調整した。
予めマイクロチップウェル１にＬＡＭＰ反応を起こすためにＢＳＴ酵素とプライマー溶液０．１μＬをウェル１毎に分注し、真空乾燥にて固着させた。ＢＳＴ酵素：原液、ＬＡＭＰ用プライマー：６液混合（ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、ＬＢ）。微量分注機にてプライマーをウェル１底辺に固着し、凍結乾燥させた。
【００９０】
ＰＭＤＳ基板ａ１の上部の貼り合わせについて以下に説明する。流路５，６側を、上述と同様にＯ２：１０ｃｃ  １００Ｗ  ３０ｓｅｃでＤＰアッシングして表面を親水化させ減圧中（１／１００気圧以下）でカバーガラスａ２と貼り合せた。
これにより、本開示のマイクロチップＡ２の変形例を得た。
【００９１】
なお、以下に本開示のマイクロチップＡ２の変形例を使用する手順を説明する。光学検出装置は、特に限定されず、光検出が下に配置されているものである。
注入：インターカレーター蛍光体を混ぜた検体前処理溶液を無痛針によってＰＤＭＳを貫通させチップ内の試薬配置側流路５，６に導入する。流路５，６内は減圧しているため大気圧で押された液が針を伝って流路内に短時間で充填される。
【００９２】
増幅反応モニター：水を注入した後は素早く蛍光検出部を備えている加熱蛍光検出装置にチップをセットし核酸増幅反応をモニターする。この装置はマイクロチップの加熱と同時にＬＥＤからなる励起光をマイクロチップ基板の各々ウェル１上方から照射して、反応領域１を透過した蛍光を検出する構成となっている。励起光は反応領域内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射され蛍光を発する。この蛍光は励起光源の光軸上に配置されたマイクロチップ基板の反応領域１の下方に設けられた蛍光検出フォトディテクターで検出・測定される。
なお、本開示のマイクロチップは、マイクロチップの底部から励起光を入射し、ウェル１によって発生した蛍光を上部の蛍光検出器にて検出する装置でも、上述の装置と同様に検出・測定することが可能である。
【００９３】
＜実施例２＞
図７及び８は、本開示に係わるマイクロチップＡを光学検出装置に使用した場合の計算モデルに使用する光学検出装置の構成図である。このときのマイクロチップのウェルは、直径２．０ｍｍφ、深さ０．６ｍｍ、３ｍｍピッチである。そして、本開示のマイクロチップには、ウェル１の外周部分に、第１外周路２ａ及び第２外周路２ｂを設けた。従来のマイクロチップには、外周路（トーラスリング）を設けなかった。
図９に、計算モデルにおける光線１００本、１０００本、１００００本の光の流れを示す図である。
図１０に、計算モデルにおいて、光源からチップ底面までの距離を０〜２０ｍｍに調整した場合、本技術のマイクロチップ及び従来のマイクロチップでの光の流れを示す図である。
図１１に、計算モデルにおける漏れ光の周囲の３ＰＤ合計到達量（光源出射光量を１００％とした場合）の結果を示したグラフである。
図７〜１１に示す通り、本開示のマイクロチップは、通常の光学検出装置において、従来のマイクロチップと比較して、非常に良好な結果が得られている。
すなわち、本発明者らは、全く意外にも、光検出の精度の非常に良好という、際立って顕著な効果を有する本開示のマイクロチップを完成させることができ、これを確認できた。このときの光源と本開示のマイクロチップの入射方向の面との距離は、好ましくは０〜２０ｍｍ、より好ましくは０〜１５ｍｍである。なお、この距離は、通常の光学検出装置で設定されている数値である。
よって、本開示のマイクロチップＡ（好適には、図２（ｂ）参照）を光学検出装置に搭載した際に、光学検出装置の光検出の調整を特に行わなくとも、光検出に不要な光（漏れ光等）をより良好に遮蔽することが可能となる。
【００９４】
なお、本技術は、以下のような構成も取ることができる。
〔１〕複数の基板から構成され、反応の反応場となる反応領域と、該反応領域の外周部分に内部を大気圧に対して負圧とされた外周路を設け、該外周路を貼り合わせる基板表面の少なくとも片側に配設するマイクロチップ。或いは、複数の基板から構成され、反応の反応場となる反応領域の外周部分に、内部を大気圧に対して負圧とされた外周路を、貼り合わせる基板表面の少なくとも片側に配設するマイクロチップ。
〔２〕前記外周路が、反応領域が形成されている基板の両表面に設けられている前記〔１〕記載のマイクロチップ。
〔３〕前記外周路の断面形状が、光検出に不要な光を遮蔽する曲面をもつ形状である前記〔１〕又は〔２〕記載のマイクロチップ。
〔４〕前記外周路が断熱性を有する前記〔１〕〜〔３〕のいずれか記載のマイクロチップ。
〔５〕前記外周路は、切欠部を有する前記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載のマイクロチップ。
〔６〕前記外周路のそれぞれを連通流路にて接続し、該連通流路から各外周路に流体を流入させる前記〔１〕〜〔５〕のいずれか記載のマイクロチップ。
〔７〕  核酸増幅反応である前記〔１〕〜〔６〕のいずれか記載のマイクロチップ。
【００９５】
〔８〕反応場となる反応領域の外周部分に外周路が基板表面に形成された基板層を、大気圧に対して負圧下で貼り合わせ、前記外周路を気密に封止すること、を含むマイクロチップの製造方法。
〔９〕前記外周路の断面形状を、光検出に不要な光を遮蔽する曲面に形成すること、を含む前記〔８〕記載のマイクロチップの製造方法。
〔１０〕前記〔１〕〜〔７〕のいずれか記載のマイクロチップの製造方法。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本技術のマイクロチップは、反応場である反応領域の化学的及び生物学的分析等に使用することが可能である。また、光検出装置の光検出の精度を向上させるための調整を行わなくとも、光検出の検出精度が良好である。
【符号の説明】
【００９７】
Ａ，Ａ１，Ａ２  マイクロチップ；１  ウェル；２  外周路；２ａ  第１外周路；２ｂ  第２外周路；２０  開口部；２９  切欠部；連通流路  ８；入出口  ８０
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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