(57)【要約】      （修正有）【課題】より実用的なグリオキサラーゼＩ阻害剤を提供。【解決手段】式（１）で表される化合物を含むグリオキサラーゼＩ阻害剤。2013159600.tif 000016（上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は水素原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキル基を、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される化合物を含むグリオキサラーゼＩ阻害剤。
【化９】
2013159600.tif 000013
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【請求項２】
Ｒ1〜Ｒ8、Ｒ10、Ｒ12及びＲ13は水素原子を表し、Ｒ9及びＲ11はメチル基を表す、請求項１に記載のグリオキサラーゼＩ阻害剤。
【請求項３】
以下の式（１）で表される化合物を含む抗腫瘍剤。
【化１０】
2013159600.tif 000014
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【請求項４】
Ｒ1〜Ｒ8、Ｒ10、Ｒ12及びＲ13は水素原子を表し、Ｒ9及びＲ11はメチル基を表す、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のグリオキサラーゼＩ阻害剤を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項６】
イソフラボノイド骨格を有する被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程、
を備える、グリオキサラーゼＩ阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
イソフラボノイド骨格を有する被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程、
を備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性を有することが肯定された前記被験化合物についてガン細胞に対する抗増殖活性を評価する工程、を備える、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性と抗増殖活性を有することが肯定された前記被験化合物について、当該被験化合物の存在下において前記ガン細胞の分泌するメチルグリオキサール量を評価する工程、を備える、請求項８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
以下の式（１）で表される被験化合物及びその誘導体から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
【化１１】
2013159600.tif 000015
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の開示は、グリオキサラーゼＩ阻害剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍活性を示す化合物として、例えば、グリオキサラーゼＩ阻害活性を有する、フラボン化合物が知られている（特許文献１）。グリオキサラーゼＩ（GLO I：Glyoxalase I）は、細胞内の嫌気的糖代謝過程で生じるメチルグリオキサール（MG：methylglyoxal）とグルタチオン（GSH：glutathione）からS-D-ラクトイルグルタチオン（S-D-lactoylglutathione）を生成させる酵素である。MGは解糖系の代謝副産物であるが、蓄積することでタンパク質、DNA、RNA等を非可逆的に修飾し、細胞死（アポトーシス）を誘発することが知られている。すなわち、ＭＧは細胞死誘導活性を有していると考えられている。
【０００３】
ガン細胞内は、一般に嫌気的環境であるため、エネルギー産生は嫌気的な解糖系に依存しており、このためＭＧが生成する。そして、ガン細胞では、こうして生成したＭＧを解毒するためのＧＬＯＩの発現が亢進している。正常細胞においてはＧＬＯＩ活性が低いため、ＧＬＯＩ阻害剤は、ガン細胞に特異的に作用して、ガン細胞におけるＭＧの蓄積を促進し、ガン細胞のアポトーシスを誘導することが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２１９３８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に開示されるフラボン化合物は、フラボノイドの一種である。フラボノイドは、広く植物界に分布するフェニルクロマン環に近い構造のＣ6−Ｃ3−Ｃ6炭素骨格からなる化合物であり、フラボン、イソフラボン、フラバノール等を始めとする多種多様な骨格及び置換様式を包含している。このため、フラボノイドの有する構造とＧＬＯＩ活性の相関は全く知られておらず、予測することも困難であった。したがって、フラボノイドに属する新たなＧＬＯＩ阻害剤は未だ提供されていない。
【０００６】
そこで、本明細書の開示は、より実用的なＧＬＯＩ阻害剤及びその利用を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、植物、特にマメ科植物に由来するイソフラボン化合物を対象として、ＧＬＯＩ阻害活性を指標とするスクリーニングを始めとする各種の検討を行ったところ、細胞内においてＧＬＯＩ阻害活性を有するイソフラボン化合物を見出した。本明細書の開示は、これらの知見に基づいて提供される。
【０００８】
本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される化合物及びこれらの薬学的に許容される塩から選択される１種以上を含むＧＬＯＩ阻害剤が提供される。
【化１】
2013159600.tif 000002
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【０００９】
また、本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される化合物及びその薬学的に許容される塩から選択される１種以上を含む抗腫瘍剤が提供される。
【化２】
2013159600.tif 000003
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【００１０】
本明細書の開示によれば、上記グリオキサラーゼＩ阻害剤を有効成分として含有する、医薬組成物が提供される。
【００１１】
本明細書の開示によれば、イソフラボノイド骨格を有する化合物である被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程、を備える、グリオキサラーゼ阻害剤のスクリーニング方法が提供される。
【００１２】
本明細書の開示によれば、イソフラボノイド骨格を有する被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程、
を備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法が提供される。
【００１３】
本明細書の開示によれば、以下の式（１）で表される被験化合物及びその誘導体から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
【化３】
2013159600.tif 000004
（上記式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表す。）
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１４種類のイソフラボン化合物およびＢＢＧの100 μMにおけるｈＧＬＯＩに対する阻害活性の結果を示す図である。
【図２】阻害剤候補化合物のヒト白血病細胞株ＨＬ−６０に対する抗増殖活性の評価結果を示す図である。
【図３】阻害剤候補化合物で処理したＨＬ−６０細胞の培養上清中のＭＧ量を測定した結果を示す図である。
【図４】阻害剤候補化合物１１で処理したＨＬ−６０細胞におけるアポトーシスの観察結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書の開示は、フラボノイドと総称される化合物群に包含されるイソフラボン骨格を有する化合物（以下、イソフラボン化合物という。）又はその薬学的に許容される塩を含有するＧＬＯＩ阻害剤及びその利用に関する。
【００１６】
本明細書に開示されるイソフラボン化合物（以下、本イソフラボン化合物という。）は、ＧＬＯＩ阻害活性を示すことができる。また、本イソフラボン化合物は、好ましくは、ガン細胞に対してＧＬＯＩ阻害活性に基づく抗増殖活性も示すことができる。ＧＬＯＩは正常細胞ではほとんど発現されていないのに対してガン細胞での過剰発現が認められることから、ＧＬＯＩ阻害剤は、ガン細胞に対して高い選択性で作用し細胞死を誘導することができる。
【００１７】
以下、本イソフラボン化合物を含むＧＬＯＩ阻害剤、抗腫瘍剤及び医薬組成物並びにＧＬＯＩ阻害剤のスクリーニング方法等について説明する。
【００１８】
（ＧＬＯＩ阻害剤）
本イソフラボン化合物は、以下の式（１）で表される。
【化４】
2013159600.tif 000005
【００１９】
式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表すことができる。
【００２０】
置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。こうしたアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、sec-ブチル基、tert−ブチル基、２，２−ジメトキシエチル基等が挙げられる。好ましくは、エチル基及びプロピル基であり、より好ましくはメチル基及びエチル基であり、さらに好ましくはメチル基である。置換基としては、水酸基、ヒドロキシアルキル基、アルキルエーテル基、アルキルカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、ニトリル基、ハロゲン原子が挙げられる。これら置換基におけるアルキル基は、炭素数１〜４であることが好ましく、より好ましくはメチル基である。
【００２１】
式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、これら１０個の置換基のうち、水素原子が５個以上であってもよく、６個以上であってもよく、７個以上であってもよく、８個以上であってもよく、９個以上であってもよく、全てが水素原子であってもよい。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12及びＲ13は、これら８個の置換基のうち、水素原子が５個以上であってもよく、６個以上であってもよく、７個以上であってもよく、全てが水素原子であってもよい。
【００２２】
また、式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ11、Ｒ12及びＲ13は、これら１０個の置換基のうち、メチル基が２個以上であってもよく、３個以上であってもよく、４個以上であってもよく、５個以上であってもよく、６個以上であってもよい。また、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ12及びＲ13は、これら８個の置換基のうち、水酸基が２個以上であってもよく、３個以上であってもよく、４個以上であってもよく、５個以上であってもよく、６個以上であってもよい。
【００２３】
式（１）において、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表すことができる。置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基については既に説明したとおりである。Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、これら３つの置換基のうち、上記アルキル基が１個以上であってもよく、２個以上であってもよく、全てが上記アルキル基であってもよい。また、Ｒ3、Ｒ6及びＲ10は、これら３つの置換基のうち、水素原子を１個以上３個以下とすることができる。
【００２４】
式（１）において、Ｒ1〜Ｒ8、Ｒ10、Ｒ12及びＲ13は水素原子を表し、Ｒ9及びＲ11はメチル基である化合物は、以下の式（２）で表される。この化合物は、マメ科植物であるErythrina variegataに属する植物の樹皮に存在する天然のイソフラボン化合物であり、ErythrininＣと称される。本イソフラボン化合物はこの天然のイソフラボン化合物ErythrininＣを含み、ErythrininＣの構造において、その水素原子部位の水酸基や炭素数１〜４のアルキル基等による置換によって一定範囲内で調節された化合物を包含している。
【００２５】
【化５】
2013159600.tif 000006
【００２６】
本イソフラボン化合物は、Erythrina variegataに属する植物の樹皮から取得する式（２）で表される化合物として得られるほか、当該化合物以外の態様は、当該化合物を有機合成的によりあるいは酵素的に適宜修飾して得ることができる。本イソフラボン化合物は、また、全合成によりあるいは天然由来の他の化合物を出発原料として半合成により取得することができる。
【００２７】
例えば、式（２）で表される化合物を、Erythrina variegataに属する植物の樹皮から得るには、以下の方法を採用できる。前記樹皮を細切し、アセトンにて冷浸し、その後、溶媒を減圧留去し油状物を得る。この油状物を、例えば、n−ヘキサンの疎水性溶媒で洗浄後、ジクロロメタン等の疎水性溶媒と水とで分配し、疎水性溶媒相を減圧留去して残渣を得る。この残渣を、クロロホルム−アセトン（1→10:1）等を用いシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲル500g, 10 x 13 cm）に付し、各フラクションを取得する。式（２）で表される化合物が含まれている可能性が高いことが推測されるフラクションをベンゼン−酢酸エチル (5:1) 等にて、繰り返しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲル150g, 4.5 x 24 cmを使用後にシリカゲル10g, 1.0 x 27cmに付す。）により精製することにより、式（２）で表される化合物を得ることができる。
【００２８】
本化合物の薬学的に許容される塩は、例えば薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。
【００２９】
薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、薬学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、薬学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、薬学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、薬学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。
【００３０】
本化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、公知の方法で測定することができるほか、後述の実施例に開示される方法で測定することができる。本化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、少なくともin vitroにおいて、通常程度に精製されたＧＬＯＩに対する阻害活性を意味している。その活性程度は特に限定しないが、後述する実施例に準じて得られるＩＣ50は、既知のＧＬＯＩ阻害剤であるＳ−ｐ−ブロモ−ベンジルグルタチオン（ＢＢＧ）（式（３）においてＲ＝Ｈである）の５０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。
【００３１】
【化６】
2013159600.tif 000007
【００３２】
また、本イソフラボン化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、さらに、ガン細胞の抗増殖活性を意味していてもよい。ガン細胞の抗増殖活性は、公知の方法を用いて評価できるほか、後述する実施例に準じてヒト白血病細胞株ＨＬ−６０に対する抗増殖活性として評価できる。この方法における抗増殖活性は、ＩＣ50が好ましくは２０μＭ以下、より好ましくは１５μＭ以下、さらに好ましくは１０μＭ以下、一層好ましくは５μＭ以下、より一層好ましくは３μＭ以下である。
【００３３】
本化合物は、ＧＬＯＩ阻害剤として使用できるほか、アポトーシス誘導剤（特にガン細胞の）や抗腫瘍剤としても用いることができる。特に、本化合物がＧＬＯＩ阻害活性の一態様としてガン細胞のアポトーシスを誘導し、抗増殖活性を有するときには抗腫瘍剤として有用である。
【００３４】
本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物は、有効成分である本イソフラボン化合物のほか、賦形剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、稀釈剤、担体、溶解助剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤、コーティング剤などの添加成分や水などを含むものであってもよい。
【００３５】
本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物は、経口投与、非経口投与いずれの投与方法をも採用することができ、それぞれに適した医薬製剤の形態とすることができる。医薬製剤としては、例えば、液剤、シロップ剤、注射剤、液状吸入剤、乳剤等の液状剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、軟膏剤、固形吸入剤、座剤等の固形剤などを挙げることができる。
【００３６】
本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物における本イソフラボン化合物の含有量は、用途、剤型、配合目的等によって異なるが、一般的には、組成物全量中1〜100質量％が好ましく、より好ましくは10〜50質量％である。
【００３７】
本発明の抗腫瘍剤及び医薬組成物本発明の医薬組成物等の投与量は、投与対象者の年齢、体重、投与方法などに応じて適宜決めればよい。例えば、通常成人１日、体重１ｋｇあたり、本イソフラボン化合物０．００１ｍｇ以上１００ｍｇ以下、好ましくは、０．０１ｍｇ以上１０ｍｇ以下を１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【００３８】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるＧＬＯＩ阻害剤のスクリーニング方法は、イソフラボン化合物である被験化合物のＧＬＯＩ阻害活性を評価する工程、を備えることができる。このスクリーニング方法によれば、イソフラボノイド骨格を有するイソフラボン化合物から有用なＧＬＯＩ活性阻害剤をスクリーニングできる。また、抗腫瘍剤のシード化合物をスクリーニングできる。なお、イソフラボン化合物は、天然由来の化合物のほか、合成によって取得されたものでもよい。天然由来の化合物は、マメ科植物を取得源とすることができる。取得源植物は、好ましくはErythrina variegata、Erythrina suberosa、Erythrina poeppigiana、Erythrina x bidwilliiなどのErythrina属植物であり、より好ましくはErythrina variegataである。
【００３９】
ＧＬＯＩ阻害活性は、公知の方法のほか、後述する実施例において開示する方法を採用して評価することができる。この評価工程において、ＧＬＯＩ阻害活性は、例えば、コントロールとしてのＢＢＧのＧＬＯＩ阻害活性と対比することで評価することができる。典型的には、ＢＢＧの５０％以上、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上のＧＬＯＩ阻害活性があれば、ＧＬＯＩ阻害活性を有すると肯定的に評価できる。
【００４０】
本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、イソフラボン化合物である被験化合物のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を備えることができる。ＧＬＯＩ阻害活性は、ＧＬＯＩ阻害活性に基づく抗腫瘍剤の基本的な活性である。このため、当該評価工程によれば、抗腫瘍剤として可能性のあるイソフラボン化合物（シード化合物）を広くかつ容易にスクリーニングできる。なお、本スクリーニング方法におけるＧＬＯＩ阻害活性は、ＧＬＯＩ阻害活性の評価工程と同様の態様で実施することができる。
【００４１】
本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、さらに、ＧＬＯＩ阻害活性を有することが肯定された被験化合物についてガン細胞に対する抗増殖活性を評価する工程を備えることができる。こうした評価工程を備えることで、より実用的な抗腫瘍剤又はそのシード化合物をスクリーニングすることができる。ガン細胞の抗増殖活性は、例えば、ガン細胞に対して被験化合物を供給し、一定時間培養母粒子の生細胞又は死細胞に関する指標を測定することによって行う。より詳細には、被験化合物の添加濃度を異ならせてＩＣ50を測定してもよい。この評価工程において、被験化合物のガン細胞の抗増殖活性を確認できる場合には、抗増殖活性を有すると肯定的に評価できる。
【００４２】
なお、本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、ＧＬＯＩ阻害活性とガン細胞抗増殖活性を有すると肯定された被験化合物について、当該被験化合物の存在下において前記ガン細胞の分泌するＭＧ量を評価する工程と、を備えることもできる。ＭＧ量評価工程を備えることで、ガン細胞におけるＧＬＯＩ阻害によってガン細胞の増殖が阻害されていることを確認できる。ＭＧ量の評価は、この種の化合物に対するＨＰＬＣなど公知の方法を採用することができる。例えば、ガン細胞の培養液に対してｏ−フェニレンジアミンを加えてＭＧを２−メチルキノキサリンに変換後、ＨＰＬＣに負荷して検出波長３１５ｎｍで検出することができる。
【００４３】
本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、式（１）で表される化合物（本イソフラボン化合物）及びその誘導体である被験化合物から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備えることができる。このスクリーニング方法によれば、式（１）で表される被験化合物及びその誘導体からシード化合物としてより有用な抗腫瘍剤（リード化合物）をスクリーニングできる。本スクリーニング方法は、既に記載した抗腫瘍剤のスクリーニング方法における各種態様を適用することができる。本イソフラボン化合物の誘導体の範囲は特に限定しないが、例えば、式（１）における各種Ｒにつき、式（１）で規定される以外の置換基への修飾を含むことができる。
【００４４】
（ＧＬＯＩ活性阻害剤、抗腫瘍剤の製造方法）
本明細書に開示されるＧＬＯＩ活性阻害剤又は抗腫瘍剤の製造方法は、Erythrina variegataに属する植物体又はその一部を原料とし、式（１）で表される化合物を分離する工程、を備えることができる。この製造方法によれば、植物体を原料として効率的に式（１）で表される化合物又はその原料を得ることができる。
【００４５】
前記植物体は、好ましくは、数ミリ程度の細片として原料とすることが好ましい。また、その部位は、樹皮であることが好ましい。式（１）で表される化合物の抽出分離は、当業者であれば適宜実施できるが、例えば、既述したように、アセトンにて冷浸後、溶媒を減圧留去して得た油状物から脂質を除去し、一般的な溶媒分配手法を用いて非極性化合物分画を得た後、シリカなどの極性充填材を用い疎水性移動相を用いる液体クロマトグラフィーを用いて当該分画をさらに分離分画する。さらに、式（２）で表される化合物が含まれている可能性が高いことが推測されるフラクションを繰り返しシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製することにより、式（２）で表される化合物を得ることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
（阻害剤候補化合物の取得）
本実施例では、マメ科のErythrina属植物から、１４種類のフラボノイド化合物を取得した。由来する植物名と化合物番号を以下に示し、化合物番号に対応する構造を以下に示す。
【００４８】
【表１】
2013159600.tif 000008
【００４９】
【化７】
2013159600.tif 000009
【００５０】
【化８】
2013159600.tif 000010
【００５１】
（阻害剤候補化合物Erythrinin C（化合物１１）の取得）
Erythrina variegataの樹皮(2.55 Kg)を細切し、アセトンにて冷浸し、アセトンを減圧留去し油状物(133.7 g)を得た。この油状物をn−ヘキサンで洗浄後、ジクロロメタンと水とで分配した。ジクロロメタン可溶部を減圧留去し、赤褐色の残渣(50 g)を得た。この残渣をクロロホルム−アセトン（1→10:1）を用いシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル500g, 10 x 13 cm）に付し、フラクション81個（A1-A81, 各200mL）を得た。フラクションA69-A70（褐色油状物：4.82g）はベンゼン−酢酸エチル (5:1) にて、繰り返しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１回目はシリカゲル150g, 4.5 x 24 cm、２回目はシリカゲル10g, 1.0 x 27cm）により精製して、Erythrinin C (167 mg) を得た。
【００５２】
（他の阻害剤候補化合物の取得）
また、他の化合物についても、Erythrinin Cに準じ、適宜クロマトグラフィー条件を変更してそれぞれ取得した。
【実施例２】
【００５３】
（精製ｈＧＬＯＩ酵素活性に対する阻害活性の評価）
本実施例では、実施例１で得た各種のフラボノイド化合物につき、ＧＬＯＩ阻害活性を測定した。すなわち、ジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解した阻害剤候補化合物を、ＧＬＯＩ酵素の基質等を含む反応液（後述する平衡後の反応液）に終濃度100 μMとなるように加え、次いでｈＧＬＯＩ精製酵素液5 μL (タンパク質量で1 μg) を加えて各々活性測定し比活性を求めた。その比活性を阻害剤であるBBG (controlとする) と比較し阻害作用の評価(% inhibition) を行った。
【００５４】
なお、ＧＬＯＩ活性は、Orayらの方法（Bedii Oray and Scott, J. Norton, Method in Enzymology, 90, 542-546(1982))を一部改変して行った。すなわち、基質であるＭＧは補酵素ＧＳＨの存在下、中間体のhemimercapatalを経て、ｈＧＬＯＩによってS-D-lactoylglutathioneへ変換されるため、酵素反応によって生成したS-D-lactoylglutathione (ε240nm＝3370M−1cm−1) の240 nmにおける吸光度の増加を測定し、酵素活性を算出した。
〈反応液〉
200 mM imidazole・HCl, 16 mM MgSO4(pH 7.0)  2.73 mL
100 mM methylglyoxal (MG)                    237μL
100 mM reduced glutathione (GSH)             30μL
Total                                          3.0 mL
【００５５】
反応液を各々調製して混合した後、確実に平衡化させるため25℃で90分間インキュベートした。平衡後、反応はhGLO I精製酵素液5 μL (タンパク質量で1μg) を3.0 mLの反応液に加えることで開始し、240 nmにおける吸光度の増加を25℃で2分間測定した。初速度は吸光度 対時間プロットにおける直線部の傾きによって決定した。なお、ブランクには酵素液の代わりに保存用bufferを5 μL加えたものを用いた。
【００５６】
得られた初速度ΔＡ240より酵素活性および比活性を以下の式より求めた。さらに、ＢＢＧ及び阻害剤候補の比活性からブランクに対する阻害率％を求めた。なお、ＢＢＧの酵素活性GLO I活性の1単位は上述の酵素活性測定条件において、１分間当たり１ μmolのS -D-lactoylglutathionの生成を触媒する酵素量と定義した。また、比活性を、タンパク質1 mg単位当たりの酵素活性と定義した。結果を図１及び表２に示す。
酵素活性＝ΔＡ240×３×１０3／ε
比活性＝酵素活性／タンパク質量（ｍｇ）
【００５７】
（IC50値の算出）
ＤＭＳＯに溶解した阻害剤候補化合物を、平衡後の反応液に終濃度５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭとなるように加えた。次いでｈＧＬＯＩ精製酵素液５μＬ（タンパク質量で１μｇ）を加えて上記と同様に各々活性測定し比活性を求めた。その比活性を阻害剤のｃｏｎｔｒｏｌであるＢＢＧと比較し、グラフ化（濃度対％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）することによりＩＣ５０値を求め阻害活性の濃度依存性評価を行った。結果を表３に示す。
【００５８】
図１及び表２に示すように、１４種類のイソフラボン化合物のうち、化合物１１を除いて、いずれもＢＢＧとほぼ同等またはそれ以上の阻害活性を示し、強力なＧＬＯＩ阻害活性を有することがわかった。また、表３に示すように、いずれの化合物もＢＢＧよりも低いIC50値を示し、強力なＧＬＯＩ阻害活性を有することが示された。
【００５９】
【表２】
2013159600.tif 000011
【００６０】
【表３】
2013159600.tif 000012
【００６１】
なお、ｈＧＬＯＩは以下のとおり調製した。
（１）ヒト肺cDNAライブラリーを鋳型として、ｈＧＬＯＩのアミノ酸コード領域（配列番号１）を増幅するため、開始コドンを含むセンスプライマーと終始コドンを含むアンチセンスプライマーの設計を行った。
【００６２】
sense primer:5’-TAGCATATG ATG GCAGAACCGCAGCCCCCGTC-3’（配列番号３）
Nde I  開始コドン
antisense primer:5’-CACGTCGACCTCACAGCA CTA CATTAAGGTTGCC-3’（配列番号４）                             Sal I                   終止コドン
【００６３】
（２）ヒト肺cDNAを鋳型として、開始コドンを含むセンスプライマーと、終始コドンを含むアンチセンセプライマーを用いて、アミノ酸コード領域を増幅するため以下の条件でPCRを行った。
〈反応混合液〉
cDNA（human lung cDNA）                              1 μL
10×LA buffer（Mg2+free）                            2.5 μL
2.5mM dNTP                                           4 μL
25mM MgCl2                                            2.5 μL
LA Taq DNA polymerase（5units/μL）                  0.25 μL
Sense primer（10μM）                                2.5 μL
Antisense primer（10μM）                            2.5 μL
QW                                                   9.75 μL
全量                                                 25μL
〈反応条件〉
装置：TaKaRa PCR Thermal Cycler SP
94℃で3min後、
94℃で45sec、58℃で1min、72℃で1minを３５サイクル行った後、72℃で3minとした。
【００６４】
（３）PCR産物をエチジウムブロミド（0.5μg/mL）存在下、1％アガロースゲル電気泳動し、目的とするバンド（アミノ酸コード領域；約580bp）をUV照射によって確認しながらゲルを切り取った。その後、常法によりDNAを精製した。このＤＮＡ断片を組み込んだｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ ＶｅｃｔｏｒをＮｄｅＩ及びＳａｌＩで処理後、ｈＧＬＯＩをHis-tagとの融合タンパク質として発現させるように、ｐET-Vector(Novagen社) を用いて発現ベクターを作製した。
【００６５】
（４）His-tag融合ｈＧＬＯＩタンパク発現用ベクターを、エレクトロポレーション法により大腸菌BL21 (DE3) 株に導入後、LA寒天平板培地に塗布して37℃で一晩培養し、His-tag融合hGLO Iタンパク質発現プラスミドを組み込んだコロニーを得た。このコロニーをLA培地2.5 mLに植菌し、37℃で一晩振とう培養した。次にこの培養液全量をLA培地250 mLに植菌し、37℃で4時間振とう培養した後、IPTG (終濃度1 mM) を添加して、さらに4時間振とう培養してタンパク質の発現誘導を行った。タンパク質発現誘導後の培養液を7,000 rpm、4℃で5分間遠心して集菌した後、Homogenize buffer (30mM Tris-HCl (pH7.5)、1 mM DTT) を加え、sonication (30秒×6回) を行った。その後、100,000 rpm、4℃で15分間遠心して得た上清をhGLO I粗酵素液とした。hGLO I粗酵素液をPD-10ゲルろ過カラム (GE Healthcare社) を用いて脱塩し、溶媒をBinding buffer (20 mM Na-PB、500 mM NaCl、20 mM Imidazol (pH7.4) )に置換した後、以下の条件でアフィニティークロマトグラフィーを行い、hGLO Iを精製した。回収したhGLO IをPD-10ゲルろ過カラムで脱塩し、溶媒を保存用buffer (50 mM Imidazol、20% glycerol、20 mM GSH、5 mM MgSO4 (pH 7.2) ) に置換し、精製酵素溶液とした。
【００６６】
〈測定条件〉
Column：HisTrapTMHP 5 mL (GE Healthcare社)
Controller：Gradi Frac (GE Healthcare社)
Detector：Optical Unit UV-1 (280 nm)
Mobile phase：
・Binding buffer (20 mM Na-PB、500 mM NaCl、20 mM Imidazol (pH7.4) )
・Elution buffer (20 mM Na-PB、500 mM NaCl、500 mM Imidazol (pH7.4) )
【実施例３】
【００６７】
（ヒト白血病細胞株HL-60に対する抗増殖活性の評価）
本例では、in vitroにおいて強力なＧＬＯＩ阻害作用を有することが示されたイソフラボン化合物のうち、化合物８、９および１４、さらに、ＢＢＧよりも弱いＧＬＯＩ阻害活性を示した化合物１１についても培養細胞における抗増殖活性を測定した。
【００６８】
なお、本実施例では、ＧＬＯＩの既知の阻害剤であるＢＢＧは細胞膜透過性が乏しく、培養液への添加では効果を示さないと考えられるため、細胞膜透過性を増大させるために、ＢＢＧのシクロペンチルエステル体であるＢＢＧＣを用いて培養細胞に対する効果を評価した。ＢＢＧＣは細胞膜透過後、細胞内でエステル基が加水分解され、ＢＢＧに変換されると考えられる。
【００６９】
ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０細胞を96ウェルプレート上に播種し (8.25×103 個、100μL / well) 、37℃にて24時間培養した。その後、各濃度に調製した阻害剤候補化合物及びBBGC (control) を培地に溶かし、80μL/well で添加し、48時間培養した。なお、化合物の溶解、希釈にはDMSOを用い、DMSO終濃度が0.2〜0.5%となるように薬液を調製した。
【００７０】
次いで、薬液処理後の96ウェルプレート中の細胞培養液に1wellあたり、MTS 試薬 (CellTiter 96 Aqueous One Solution reagent; Promega社) 30 μLと培地(10% FBS / RPMI )10 μLとなるように調製したものを添加し、継代培養条件下にて1.5時間インキュベートした。その後、生成したformazan色素の490 nmにおける吸光度をマルチラベルカウンター ( Wallac 1420 ARVOsx 、PerkinElmer社) により測定した。MTSは生細胞中のミトコンドリアに含まれるデヒドロゲナーゼによって還元されることによって褐色のformazanを生成するため、490 nmにおける吸光度は、生細胞数に比例する。結果を図２に示す。
【００７１】
図２に示すように、化合物９を除く化合物８，１１及び１４はいずれも細胞増殖抑制作用を有することが示された。ＨＬ−６０細胞の増殖に対する化合物８、１１および１４のＩＣ５０値はそれぞれ３３．５μＭ、２．２μＭおよび３５．３μＭであった。in vitroにおいてはＢＢＧよりも弱いＧＬＯＩ阻害活性しか示さなかった化合物１１がＢＢＧＣよりも強い細胞増殖抑制活性を示した。このことは化合物１１が水に溶けにくく、細胞膜を透過しやすい性質を反映していると考えられる。一方、in vitroにおいてＢＢＧよりも強力なＧＬＯＩ阻害活性を有することが示された化合物９が細胞増殖抑制活性を示さなかったことは、化合物９の細胞透過性が低いということが示唆された。
【実施例４】
【００７２】
（ＨＬ−６０細胞培養上清中のＭＧ量の評価）
本実施例では、イソフラボン化合物の細胞に対する抗増殖活性がＧＬＯＩ阻害作用に基づくものであることを確認するために、培養上清中のＭＧ量を評価した。
【００７３】
（阻害剤候補化合物への細胞の暴露）
ＨＬ−６０細胞を6 cmディッシュに播種し (2.8×105 個、5mL / dish ) 、37℃にて24時間培養後、各濃度に調製した阻害剤候補化合物とBBGC (control) を終濃度10 μMとなるよう添加し、さらに24時間培養した。なお、阻害剤候補化合物の溶解、希釈にはDMSOを用い、DMSO 終濃度が0.2〜0.5%となるように薬液を調製した。
【００７４】
（培養上清中のＭＧの測定）
薬液処理後の培養液を回収後、遠心して得た上清をサンプルとして使用した。回収した上清4.5 mLに60%過塩素酸 (PCA) 450μLを加え(終濃度0.45M )、10分間氷上でインキュベートした。その後、遠心(12000rpm 、15min )して得た上清をSep-Pak(R) Light tC18カートリッジ (Waters社) にアプライした。なお、tC18カートリッジは前処理としてアセトニトリル 6〜8 mLで洗浄後、10 mM KH2PO4(pH 2.5) を6〜8 mL流したものを使用した。この溶出液にPBSに溶解させたo-phenylenediamine (o-PD) および、内部標準としてQWに溶解させた5-methylquinoxaline (5-MQ) をそれぞれ終濃度25μM (125 nmol)、および0.5 μM (2.5 nmol) となるよう添加し、室温で3.5時間反応させた。o-PDは培養液中のMGと反応し、2-methylquinoxaline (2-MQ) を生成するため、2-MQならびに5-MQをHPLC / UV法によって定量した。
【００７５】
反応後のサンプルを再度tC18カートリッジを用いて、約1〜2 mL/minのスピードでアプライし、tC18 カートリッジに2-MQおよび5-MQを保持させた。次に、10mM KH2PO4 (pH 2.5) でtC18カートリッジを洗浄した後、2 mLのアセトニトリルで目的化合物を溶出した。この溶出液を約100μL程度まで濃縮し(SpeedVac SPD1010；ThermoFisher SCIENTIFIC社 ) 、PVDFメンブレンフィルター (0.45μm; MILLIPORE社) でろ過した後、以下の条件でHPLC / UV法によって定量した。結果を図３に示す。
〈測定条件〉
Column：Develosil C30-UG-5  4.6 mm i.d.×150 mm 
(Nomura Chemical社)
Controller：Jasco PU-980 (日本分光株式会社)
Detector：Jasco UV-1570 (315 nm; 日本分光株式会社)
Mobile phase：20% acetonitrile、80% 10 mM KH2PO4 (pH 2.5)
Flow rate：1.5 mL/min
Sample volume：50 μL
〈レコーダー条件〉
Recorder：クロマトパックC-R5A (Shimadzu社)
Chart speed：0.2 cm/ min
【００７６】
図３に示すように、コントロール(DMSOで処理した細胞) の培養上清中のＭＧ濃度は0.024 μMであったのに対し、ポジティブコントロールとして用いたＢＢＧＣは0.076±0.016 μMであった。また、化合物８および１４で処理した培養上清中では、それぞれ0.01±0.002 μMおよび0.016μMのＭＧが検出され、ＢＢＧＣと比較して10〜20%程度のＭＧしか検出されなかった。これに対し、化合物１１では0.352±0.012 μMのＭＧが検出され、ＢＢＧＣと比較して4倍以上ものＭＧが検出された。これらの結果から、化合物１１はＨＬ−６０細胞内のＧＬＯＩを阻害することにより、ＭＧの蓄積を引き起こし、その結果として細胞増殖抑制を誘導するものと考えられた。
【実施例５】
【００７７】
（化合物１１のアポトーシス誘導効果の確認）
本実施例では、化合物１１のアポトーシス誘導効果について確認した。
【００７８】
（化合物１１への細胞の暴露）
ＨＬ−６０細胞を24ウェルプレート上に播種し(4.0×104 個、500μL / well) 、化合物１１を終濃度10μMとなるようにメディウムに溶かし、100μL / wellで添加し、37℃にて12時間培養した。なお、天然化合物の溶解、希釈にはDMSOを用い、DMSO 終濃度が0.2~0.5%となるように薬液を調製した。
【００７９】
（核染色）
薬液処理後のＨＬ−６０細胞を1.5mLマイクロチューブに回収し、phosphate buffered saline (PBS) 1mLで2回洗浄した後、2% formaldehyde / PBSを1mL加え、20分間放置して固定した。次いで、100μg / mLのHoechst33342 (DOJINDO社)を20μL加え、転倒混和した後、40分間遮光しながら放置することで、核染色した。次いで、900 rpmで3分間遠心した後に上清を破棄し、再度PBS 1mLを加えることで細胞を洗浄し、この操作を3回行った。続いて、細胞懸濁液をスライドガラスに滴下しカバーガラスをかぶせ、マニキュアでカバーガラスの周囲を固定した。これをHSオールインワン蛍光顕微鏡(BZ-9000; KEYENCE社) で観察した。結果を図４に示す。
【００８０】
図４において、矢印が核断裂箇所を示している。図４に示すように、化合物１１で処理した細胞においては、アポトーシスに特徴的な核の断裂が認められた。化合物１１の抗増殖活性は、アポトーシスの誘導を介した細胞増殖抑制作用に基づくものであることがわかった。
【００８１】
以上、本発明の実施形態および実施例について詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
【００８２】
本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組合せによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組合せに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成し得るものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号３、４：プライマー
【図１】
2013159600.tif 000017
【図２】
2013159600.tif 000018
【図３】
2013159600.tif 000019
【図４】
2013159600.tif 000020
【配列表】
2013159600000001.app