(57)【要約】【課題】細胞障害作用を抑制し人体に対する安定性が高く、かつ、メラニンの生成を抑制することが可能な天然由来のメラニン生成抑制剤及びこれを含有する皮膚外用剤を提供する。【解決手段】  本発明は、カキドオシの抽出物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤、これを含有する皮膚外用剤及び美白用組成物に関するものである。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カキドオシの抽出物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤。
【請求項２】
前記カキドオシの抽出物がチロシナーゼ生成阻害作用を有する請求項１に記載のメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のメラニン生成抑制剤を含有する皮膚外用剤。
【請求項４】
カキドオシの抽出物を有効成分として含有する美白用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カキドオシの抽出物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤、これを含有する皮膚外用剤及び美白用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
日焼け後の色素沈着やシミ・ソバカスは、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常、又は遺伝的要素等によって、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化され、メラニン産生が亢進した結果生じるものと考えられている。従来の美白化粧料は、この様にして生体内で生合成されたメラニン色素に対して、メラニン色素白化作用により当該メラニン色素を還元して色素を薄くしたり、メラニン色素の産生を抑制することにより、美白効果を出している。前者のものとしては、ビタミンＣやハイドロキノン誘導体等を有効成分として配合したものが挙げられる。また、後者のものとしては、コウジ酸（非特許文献１）、アルブチン（非特許文献２）又はエラグ酸（非特許文献３）等を有効成分として配合したものが挙げられる。
【０００３】
しかしながら、従来の美白化粧料等の皮膚外用剤には、美白効果それ自体が必ずしも十分満足し得るものではないことに加えて、メラノサイトに対し毒性を示す等の副作用があるという問題点がある。そのため、美白化粧料の改良に対する需要が高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mishima Y. A post melanosomal era: control of melanogenesis andmelanoma growth. Pigment Cell Res 1992; 2: 3-16.
【非特許文献２】Maeda K, Fukuda M. Arbutin: Mechanism of its depigmenting action inhuman melanocyte culture. J Pharmacol Exp Ther 1996; 276: 765-769.
【非特許文献３】Ando H, Watabe H, Valencia JC, Yasumoto K, et al. Fatty acidsregulate pigmentation via proteasomal degradation of tyrosinase. J Biol Chem2004; 279: 15427-15433.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は前記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、細胞障害作用を抑制し人体に対する安定性が高く、かつ、メラニンの生成を抑制することが可能な天然由来のメラニン生成抑制剤、これを含有する皮膚外用剤及び美白用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者等は、前記従来の問題点を解決すべく、メラニン生成抑制剤、これを含有する皮膚外用剤及び美白用組成物について検討した。その結果、カキドオシの抽出物が細胞内でのチロシナーゼの産生そのものを抑制することによりメラニンの生成を抑制できることを見出して、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
即ち、本発明に係るメラニン生成抑制剤は、前記の課題を解決する為に、カキドオシの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【０００８】
メラニンの生成は、一連の酵素反応及び自然反応からなり、その前駆体はチロシンである。このプロセスには、チロシナーゼ並びにチロシナーゼ関連タンパク質１及び２（ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２）の３つの主要な酵素が関与している。チロシナーゼはチロシンをドーパに変換し、更にドーパをドーパキノンに変換する際に触媒として機能する。その後、メラニン形成に於いては、ユーメラニン又はフェオメラニンを形成することが可能な２つの合成経路が存在する。ドーパキノンのユーメラニンへの変換は、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２を含む一連の酸化反応を介して起こる。ユーメラニンは硫黄含量の低い褐色から黒色の色素に相当し、光保護を可能にする。フェオメラニンは、硫黄含量の高い分子がドーパキノンに取り込まれて、赤毛に見られる黄色から橙色の色素となる。
【０００９】
メラニン生成の生理学的刺激は、メラノサイトの増加、メラニンの新生、及びデンドリシティー（ｄｅｎｄｒｉｃｉｔｙ）の上昇とメラノソームのケラチノサイトへの輸送の増加を合わせたメラノサイトの形態変化をもたらす太陽光である。分子レベルでは、紫外線に曝されると、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の合成及び分泌が刺激される。α−ＭＳＨはメラノサイト内のｃＡＭＰ濃度を高め、転写因子ＭＩＴＦを活性化させ、これが次に、チロシナーゼをコードする遺伝子であるＴＲＰ−１とＴＲＰ−２の転写活性を刺激する。従って、前記ＭＩＴＦはメラノサイトの着色、増殖及び存続を調節するものと考えられている。
【００１０】
前記のようなメラニンの生成プロセスに於いて、本発明の前記カキドオシの抽出物から得られる有効成分は、ＭＩＴＦタンパク質を低減させることにより、前記ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２の発現を阻害しないが、チロシナーゼの発現を阻害することができる。また、当該カキドオシの有効成分は、体内に於いてのみチロシナーゼの発現を阻害する作用を示し、かつ、細胞障害作用を示さない。即ち、本発明のメラニン生成抑制剤は、カキドオシの抽出物から得られた有効成分を含有することにより、チロシンのドーパキノンへの変換を触媒するチロシナーゼの産生そのものを抑制し、その結果、細胞障害作用を示すことなくメラニン生成の抑制を可能にするものである。
【００１１】
また、本発明に係る皮膚外用剤は、前記の課題を解決する為に、前記に記載のメラニン生成抑制剤を含有するものであることを特徴とする。
【００１２】
前記の構成によれば、カキドオシの抽出物を有効成分として含むメラニン生成抑制剤は、細胞障害作用を示すことなく、ＭＩＴＦタンパク質を低減させてチロシナーゼの発現を阻害するので、メラノサイトに対し毒性を示す等の副作用がなく美白効果に優れた皮膚外用剤を提供することができる。
【００１３】
また、本発明に係る美白用組成物は、前記の課題を解決する為に、カキドオシの抽出物を有効成分として含有するものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、前記に説明した手段により、以下に述べるような効果を奏する。
即ち、本発明によれば、カキドオシの抽出物を有効成分として含有するメラニン生成抑制剤は、体内に於いて、ＭＩＴＦタンパク質を低減させることにより、細胞障害作用を生じることなくチロシナーゼの発現を阻害することができる。その結果、人体に対する安定性が高く、美白効果に優れた天然由来のメラニン生成抑制剤及びこれを含有する皮膚外用剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】チロシンからドーパキノンへの合成を説明するための説明図である。
【図２】メラニンの生合成を説明するための説明図である。
【図３】同図（ａ）はＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に於けるメラニン生成量に対するカキドオシ抽出物の濃度の影響を表すグラフであり、同図（ｂ）は前記細胞の生存率に対するカキドオシ抽出物の影響を表すグラフである。
【図４】同図（ａ）はカキドオシ抽出物の濃度とマッシュルームチロシナーゼ活性との関係を表すグラフであり、同図（ｂ）はカキドオシ抽出物の濃度とＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内に於けるチロシナーゼ活性との関係を表すグラフである。
【図５】Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内に於けるチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のそれぞれのタンパク質の発現の程度を表すウェスタンブロットである。
【図６】同図（ａ）はカキドオシ抽出物の濃度とβ−アクチンに対するチロシナーゼのタンパク質の強度との関係を表すグラフであり、同図（ｂ）はカキドオシ抽出物の濃度とβ−アクチンに対するＴＲＰ−１のタンパク質の強度との関係を表すグラフであり、同図（ｃ）はカキドオシ抽出物の濃度とβ−アクチンに対するＴＲＰ−２のタンパク質の強度との関係を表すグラフである。
【図７】ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内でのチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のそれぞれのｍＲＮＡの発現の程度を表すウェスタンブロットである。
【図８】同図（ａ）はカキドオシ抽出物の濃度とＧＡＰＤＨに対するチロシナーゼのｍＲＮＡの強度との関係を表すグラフであり、同図（ｂ）はカキドオシ抽出物の濃度とＧＡＰＤＨに対するＴＲＰ−１のｍＲＮＡの強度との関係を表すグラフであり、同図（ｃ）はカキドオシ抽出物の濃度とＧＡＰＤＨに対するＴＲＰ−２のｍＲＮＡの強度との関係を表すグラフである。
【図９】同図（ａ）はＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内でのＭＩＴＦ及びβ−アクチンのそれぞれのタンパク質の発現の程度を表すウェスタンブロットであり、同図（ｂ）はＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に於けるカキドオシ抽出物の濃度とβ−アクチンに対するＭＩＴＦタンパク質の強度との関係を表すグラフである。
【図１０】同図（ａ）はＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内でのＭＩＴＦ及びＧＡＰＤＨのそれぞれのタンパク質の発現の程度を表すウェスタンブロットであり、同図（ｂ）はＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に於けるカキドオシ抽出物の濃度とＧＡＰＤＨに対するＭＩＴＦタンパク質の強度との関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本実施の形態に係るメラニン生成抑制剤は、カキドオシの抽出物を有効成分として含有する。
【００１７】
前記カキドオシとはシソ科カキドオシ属（学名：Glechoma hederacea）の植物を意味し、具体的には、例えば、学名がGlechoma
hederacea var.grandis（別名がカントリソウ（疳取り草）、レンセンソウ（連銭草）又はカンナリソウ）の植物などを含むものである。
【００１８】
また、前記カキドオシの抽出物とは、カキドオシの植物体全体、又はその花、種子、根、茎、及び葉のうちの１つ以上から水又は水性溶媒などの溶媒により抽出して得られる抽出液又はその処理物（例えば濃縮液、ゲル、懸濁液、粉末等）を意味し、特定の部位からの抽出物に限定されるものではない。これらのうち大量に入手可能でチロシナーゼの産生を阻害する有効成分が比較的豊富に含まれている葉および茎を使用するのが好ましい。
【００１９】
尚、カキドオシの抽出物を「有効成分として含有する」とは、本実施の形態に係るカキドオシの抽出物が、メラニン生成抑制の生理活性を示す成分として含まれていることを意味し、他の有効成分を含有していてもよい。
【００２０】
カキドオシの抽出物の抽出方法については特に限定されず、種々の方法を採用することができる。例えば、水分が比較的内部に多く含まれる状態のとき（具体的には、早朝での採取など）にカキドオシの採取を行い、必要に応じて流水下等で洗浄して異物を取り除く。その後、そのまま又は後記の乾燥条件下で乾燥した上、必要に応じて細切或いは粉砕し、浸漬法、向流抽出法等の方法により抽出溶媒に接触させる。その後、任意の時間静置し、上澄み液を濾過して抽出してもよい。
【００２１】
尚、カキドオシを乾燥した後に抽出物を抽出する場合は、例えば２４時間程度、水に浸漬させた後に前記の抽出を行うのが好ましい。但し、浸漬時間はこれに限定されるものではない。また、乾燥条件についても特に限定されず、通常、乾燥温度は２０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３５℃の範囲内であり、乾燥時間は２４時間〜１２０時間、好ましくは４８時間〜９６時間の範囲内である。尚、カキドオシのメラニン生成抑効果や保存性、安定性、経済性の点を考慮した場合、成長期の新鮮なカキドオシを乾燥した後、粉末等にした抽出物を用いてもよい。
【００２２】
抽出の際に用いる抽出溶媒としては特に限定されず、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール）や、アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルム等の有機溶媒等が挙げられる。これらの溶媒のうち、抽出効率、安定性、簡便性の観点からは水が好ましい。また、これらの溶媒は単独で、又は２種類以上を任意に組み合わせて使用することができる。
【００２３】
また、前記溶媒として水を用いる場合、通常は、蒸留水や水道水を用いるが、水に少量の無機物や有機物が混入している溶媒を使用してもよい。水の温度は特に制限されないが、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、１０℃〜３０℃の範囲内がより好ましく、１０℃〜２５℃の範囲内が特に好ましい。また、得られたカキドオシの抽出物は、−３０℃〜２０℃の範囲で保存するのが好ましく、より好ましくは−３０℃〜１０℃、特に好ましくは−３０℃〜５℃である。
【００２４】
前記のようにして得られたメラニン生成抑制剤は、細胞内に於けるメラニンの生成に於いて以下のような機能を果たす。
先ず、メラニンの合成経路について説明すると、図１に示すように、血中から供給されたチロシンは銅含有酵素のチロシナーゼによって酸化され、ドーパに変換される。更にドーパは、当該チロシナーゼによりドーパキノンに変換される。チロシナーゼはこの２つの反応に対して触媒としての機能を果たす酵素であり、この代謝はメラニン生成に於ける律速反応として働く。
【００２５】
そしてメラニン生成に於いては、このチロシナーゼと、チロシナーゼ関連タンパク質１及び２（ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２）とが主要な酵素として関与する。チロシナーゼがチロシンをドーパキノンに変換した後は、図２に示すように、ユーメラニンとフェオメラニンを形成することが可能な２つの合成経路が存在する。ドーパキノンからフェオメラニンへの変換にはチロシナーゼのみが酵素として関与するが、ドーパキノンのユーメラニンへの変換にはＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２も酵素として関与する。同図から明らかな通り、ＴＲＰ−２はドーパクロムから５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボキシル酸（ＤＨＩＣＡ）への変換の際に酵素として関与している。また、ＴＲＰ−１は前記ＤＨＩＣＡからインドール−５，６−キノン−２−カルボン酸への変換の際に酵素として関与している。
【００２６】
ここで、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２の各酵素は、皮膚中の角化細胞が紫外線に曝されると、αメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）を合成し分泌する。α−ＭＳＨはメラノサイト内のｃＡＭＰ濃度を高め、転写因子であるＭＩＴＦを活性化させる。ＭＩＴＦは、チロシナーゼやＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２の遺伝子にあるＭ−ＢＯＸといわれる鍵穴に結合することにより、これらの酵素を発現させる。本実施の形態に係るカキドオシの抽出物は、このＭＩＴＦタンパク質を低減させることにより、チロシナーゼの発現そのものを抑制するものであり、チロシナーゼ生成阻害作用を有している。従って、ユーメラニン及びフェオメラニンの双方の生合成を防止することができ、美白効果を生じさせることができる。尚、理由は不明であるが、本実施の形態に係るカキドオシ抽出物はＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２の発現を抑制しない。
【００２７】
また、本実施の形態に係るメラニン生成抑制剤は、体内に於いてのみＭＩＴＦタンパク質を低減させ、チロシナーゼの生成を阻害するものである。更に、本実施の形態に係るメラニン生成抑制剤はメラノーマ細胞等に対する細胞障害作用がない。そのため、従来のコウジ酸等を用いた美白剤等の皮膚外用剤と比較して、メラノサイトに対し毒性を示す等の副作用も生じない。
【００２８】
本実施の形態に係る皮膚外用剤は、少なくとも前記メラニン生成抑制剤を含有するものである。
【００２９】
また、皮膚外用剤とは、皮膚又は毛髪に対し外用に投与される形態の組成物の総称を意味し、化粧料、皮膚外用医薬、皮膚外用雑貨等が含まれる。また、化粧料は、医薬部外品を包含する。皮膚外用剤の剤形は、通常皮膚外用剤に用いられる剤形であれば特に限定されず、例えば、ローション等の可溶化系、カラミンローション等の分散系、又はクリームや乳液等の乳化系として提供することができる。更に、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤又はパップ剤等の種々の剤型で提供することもできる。具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料又はメイクアップ化粧料等の各種化粧料；液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼付剤又はパップ剤等の様々な形態の化粧料、医薬部外品又は外用医薬品等が例示できる。
【００３０】
メラニン生成抑制剤の配合量は、全質量分に対し、１質量％〜１５質量％の範囲内が好ましく、２質量％〜５質量％の範囲内がより好ましい。メラニン生成抑制剤の配合量を１質量％以上にすることにより、チロシナーゼの発現抑制効果が低下し過ぎるのを抑制し、美白効果の維持が図れる。その一方、メラニン生成抑制剤の配合量を１５質量％以下にすることにより、過剰な原料の消費を抑制することができる。尚、細胞レベルでは、メラニン生成抑制剤の配合量が１質量％未満でもチロシナーゼの発現抑制効果が得られる。
【００３１】
また、前記皮膚外用剤に用いられる他の配合成分としては従来公知のものを採用することができる。具体的には、例えば油脂成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料等が必要に応じて適宜配合され、それら成分によってクリーム、乳液、ローション、軟膏、パック剤等適宜の剤型として用いられる。
【００３２】
前記油脂成分としては特に限定されず、例えばオリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、ミンク油等の油脂類：ミツロウ、カルナウバロウ、ラノリン等のロウ類：流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類：ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸等の脂肪酸類：ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類：ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル等の合成エステル類が挙げられる。これらの油脂成分は単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３３】
前記界面活性剤としては特に限定されず、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン性界面活性剤：脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤：第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルビリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ．Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤：Ｎ．Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ．Ｎ．Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ’Ｎ’−ジメチル−Ｎ’−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両イオン性界面活性剤等が挙げられる。これらの界面活性剤は単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３４】
前記保湿剤としては特に限定されず、例えばグリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１．３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、ピロリドンカルボン酸塩、ヒアルロン酸等のムコボリサッカライド、尿素等が挙げられる。これらの保湿剤は単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３５】
前記増粘剤としては特に限定されず、例えばトラガントガム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸及びその誘導体、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビーガム、メチルポリシロキサン、デキストラン等が挙げられる。これらの増粘剤は単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３６】
前記防腐殺菌剤としては特に限定されず、例えば尿素、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール等が挙げられる。これらの防腐殺菌剤は単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３７】
前記粉体成分としては特に限定されず、例えば酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、セリサイト、ナイロンパウダー、シルクパウダー等が挙げられる。これらの粉体成分は単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３８】
前記紫外線吸収剤としては特に限定されず、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル、パラメトキシ桂皮酸エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、２．４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル等が挙げられる。これらの紫外線吸収剤は単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３９】
前記他の配合成分の配合量は、それぞれ美白効果の有効性を損なわない範囲内で適宜設定することができる。
【００４０】
また、本実施の形態に係る皮膚外用剤には、美白効果の有効性を損なわない範囲で、他の美白剤をはじめ各種化粧料活性成分を更に配合し、併用することができる。具体的には、例えばコウジ酸及びその誘導体、アルブチン、アスコルビン酸及びその誘導体（Ｌ−アスコルビン酸−２−燐酸エステル塩、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド等）、エラグ酸、レゾルシノール誘導体（４−ｎ−ブチルレゾルシノール等）ソウハクヒ抽出液、ユキノシタ抽出液等の美白剤：ビタミンＥ及びその誘導体（ビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等）、ニコチン酸及びその誘導体（ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等）、α−ヒドロキシ酸類（乳酸、クエン酸、α−ヒドロキシオクタン酸等）、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸等の老化防止・肌荒れ改善剤等が挙げられる。これらの成分等の配合割合は適宜必要に応じて設定され得る。
【００４１】
尚、本発明は、前記カキドオシの抽出物を有効成分として含有する美白用組成物の態様としても適用可能である。この場合、美白用組成物に含まれるカキドオシの抽出物の配合量や配合可能なその他の成分の種類については、適宜必要に応じて、皮膚外用剤において述べたのと同様のものを用いることができる。
【実施例】
【００４２】
以下に、この発明の好適な実施例を例示的に詳しく説明する。但し、この実施例に記載されている材料や配合量等は、特に限定的な記載がない限りは、この発明の範囲をそれらのみに限定する趣旨ではない。
【００４３】
（カキドオシ（Ｇｌｅｃｈｏｍａ  ｈｅｄｅｒａｃｅａ）抽出物の準備）
カキドオシ抽出物の調製は次の通り行った。
先ず、カキドオシの採取は水分が比較的内部に多く含まれる状態のとき（具体的には、早朝に採取した）に行った。その後、カキドオシの根に付着している土や砂を取り除き、水で４〜５回洗浄することにより、枯葉や塵等を洗い流した。
【００４４】
続いて、カキドオシを２ｃｍ位に細かくきざみ、約３０ｍｌの水が入ったミキサー（２L用）に、当該ミキサーによる撹拌に支障がないように適時加え撹拌した。撹拌は約１分間とした。
【００４５】
撹拌後、溶液を静置して溶液分と固形分（粕など）に分離させ、当該固形分を捨てた。さらに、分離後の溶液分を一晩静置した。続いて、静置後の溶液分に気泡が発生していたので、当該溶液分を静かに撹拌することで気泡を取り除いた。撹拌作業は１日１度、定時に行い、かつ１週間続けた。その後、適温（約１６℃）にて溶液分を静置し、さらに固形分と分離させた。
【００４６】
分離後、サラシ袋で濾過することにより、上澄み液と固形分を濾別した。さらに、沈殿物を取り除くために上澄み液を再度濾過した。濾過後、１週間間静置し、上澄み液を透明な状態にした。
【００４７】
続いて、上澄み液にゴマ及び焼酎を添加することにより濁りを取り除き、一層透明な状態にした。尚、当該工程は必須ではない。その後、上澄み液を濾過し、カキドオシの抽出物を得た。当該カキドオシの抽出物は冷蔵庫にて温度４℃の環境下で保管した。
【００４８】
尚、濾液に於けるカキドオシの抽出物の濃度は、ロータリーエバポレータを用いて調整した。
【００４９】
（Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞の培養）
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、飽和湿度の環境下で、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマ社製）により培養した。ダルベッコ変法イーグル培地は、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（抗真菌性抗生物質；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたものを用いた。また、前記培地は２日ごとに新しい培地に変更した。
【００５０】
（メラニンの測定）
６ウェルカルチャープレートにつき５×１０４細胞／ウェルの密度で、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を播き、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。次に、培養後の前記細胞を、カキドオシの抽出物を含む培地（ＤＭＥＭ、フェノールレッドなし、シグマ社製）で、又はカキドオシの抽出物を含まない培地で７２時間処理した。
【００５１】
処理後、前記細胞を培養によりトリプシン／ＥＤＴＡに分離した。更に、前記細胞をテストチューブに集め、ＰＢＳにより２度洗浄した。続いて、洗浄後の前記細胞に２Ｍの水酸化ナトリウムを加えて、１００℃で３０分間加熱処理をし、メラニンを抽出した。メラニンの量は、写真測光法により分光光度計（商品名；Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００、テカン社製）を用いて測定した（波長：４０５ｎｍ）。
【００５２】
（細胞生死判別分析）
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞の生死判別は、改変３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）試験により行った。即ち、先ずＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞は、種々の濃度のカキドオシ抽出物を含む９６ウェルマイクロプレートで、又はカキドオシ抽出物を含まない９６ウェルマイクロプレートで７２時間培養をした。その後、前記細胞に、濃度５．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴから１０μｌを加え、温度３７℃の条件下で４時間培養をした。
【００５３】
抽出溶液（４０質量％のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２質量％のＣＨ３ＣＯＯＨ、２０質量％のナトリウム・ドデシルスルファート（ＳＤＳ）及び０．０３ＭのＨＣＬ）の９０μｌをそれぞれのウェルに添加し、室温下で一晩撹拌することにより、十分に混合させた。細胞の生死判別は、モデル５５０マイクロプレートリーダー（商品名、バイオラッドラボラトリー社製）を使用して、波長５７０ｎｍに於ける光学濃度を測定することにより行った。
【００５４】
（マッシュルームチロシナーゼ活性分析）
マッシュルームチロシナーゼ活性試験は９６ウェルマイクロプレートで行なった。また、Ｌ−ドーパのチロシナーゼの酸化活性は、前述の写真測光法により分光光度計を用いて行った。即ち、濃度５ｍＭのＬ−ドーパ（濃度１００ｍＭでｐＨ＝６．８のリン酸ナトリウム緩衝剤）１６０μｌと、試験サンプルを含む前記緩衝材又は当該試験サンプルを含まない前記緩衝材２０μｌを、９６ウェルマイクロプレートに添加した。更に、マッシュルームチロシナーゼ（２００ユニット／ｍｌ）２０μｌを、温度３７℃の下で３０分間混合した。その後、波長４７５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（商品名；Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００，テカン社製）を用いて測定した。
【００５５】
（Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞のチロシナーゼ活性分析）
チロシナーゼ活性の分析は、ドーパが酸化してドーパクロムに変換するのを分光光度法により行った。
即ち、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞（５×１０４細胞／ウェル）を直径６０ｍｍのプレートに入れ、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で２４時間培養した。続いて、培地を除去した後、カキドオシの抽出物を含む培地（ＤＭＥＭ、フェノールレッドなし、シグマ社製）に於いて、又はカキドオシの抽出物を含まない培地に於いて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で７２時間培養をした。培養後、前記細胞をＥＧＴＡ−トリプシン溶液（ＰＢＳ）で２度洗浄した。
【００５６】
更に、１％の界面活性剤（商品名；Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリエチレングリコールモノ−パラ−イソ−オクチルフェニルエステル、シグマ社製）、及び０．１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオロライド（ＰＭＳＦ）を含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ＝６．８）に溶解させた。その後、細胞を粉砕処理し、溶解物を４℃、２０分間、回転数１３，０００ｒｐｍの条件下で遠心分離によって分離させた。タンパク質の定量及びｌｙｓｉｓ（溶解用）緩衝剤を含んだタンパク質の濃度調整を行った後、各溶解物（それぞれ１００μｇのタンパク質を含む）１００μｌを、９６ウェルプレートに等分した。その後、プレート及び５ｍＭのドーパ１００μｌを、各々のウェルに添加した。添加後、温度３７℃で２時間培養し、更に波長４７５ｎｍに於ける吸光度をマイクロプレートリーダー（商品名；Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００、テカン社製）を用いて測定した。
【００５７】
（ウェスタンブロット分析）
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をカキドオシの抽出物と共に、又はカキドオシの抽出物なしの状態で、直径６０ｍｍのプレートにおいて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で７２時間培養をした。次に、前記細胞を緩衝剤に溶解させ、タンパク質を抽出した。緩衝剤としては、１％の界面活性剤（商品名；ＮＰ４０）、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム塩、１０％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ＝７．４）、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオロイド、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプステインＡを含むものを用いた。
【００５８】
続いて、前記のタンパク質（５０μｇ）を、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離させ、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写させた。ＰＶＤＦ膜は、４℃の冷凍装置内で一晩、ＴＢＳＴ緩衝剤（２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ＝７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）の５％スキムミルクでブロッキングしたものである。
【００５９】
ＴＢＳＴ緩衝剤による簡単な洗浄の後、第１抗体で３時間培養をした。第１抗体としては、ヤギ抗チロシナーゼ抗体（１：５００）、抗ＴＲＰ−１抗体（１：５００）、抗ＭＩＴＦ抗体（１：５００）、ウサギ抗ＴＲＰ−２抗体（１：５００）（サンタクルーズ・バイオテクノロジーインク）を用いた。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ緩衝剤により５回すすいだ。更に、第２抗体で２時間培養をした。第２抗体としては、抗ヤギＩｇＧ（１：５００００）、抗ウサギＩｇＧ（１：２０００）（シグマ社製、アメリカ）を用いた。更にその後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴ緩衝剤により５回すすいだ。
【００６０】
ローディングコントロールとしては抗β−アクチン抗体を用いて評価した。また、結合抗体としては、ＥＣＬ及びＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ）を用いた。バンドは透過／反射型デンシトメーター（商品名；ＧＳ−８００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によってスキャンした。また、バンド強度の濃度のスキャンニングは、画像解析ソフト（商品名；Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。
【００６１】
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ））
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をカキドオシの抽出物と共に、又はカキドオシの抽出物なしの状態で、直径６０ｍｍのプレートにおいて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で７２時間培養をした。培養後、全ＲＮＡをＲＮＡｉｓｏプラス（商品名、タカラバイオ（株）製）を用いて抽出した。ｃＤＮＡはスーパースクリプトＩＩＩファーストストランド  スーパーミックス（商品名、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）により、全ＲＮＡの１μｇを使用して合成した。
【００６２】
ｃＤＮＡ増幅は、下記のプライマーを用いて行った。
チロシナーゼの上流：５’−ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＡＴ−３’
チロシナーゼの下流：５’−ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣ−３’
ＴＲＰ−１の上流：５’−ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＴＣ−３’
ＴＲＰ−１の下流：５’−ＡＡＧ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＴＣＴ−３’
ＴＲＰ−２の上流：５’−ＧＧＡ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＧＣＣ−３’
ＴＲＰ−２の下流：５’−ＣＧＧ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ−３’
ＭＩＴＦの上流：５’−ＣＣＣ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴＣ  Ｇ
ＭＩＴＦの下流：５’−ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ
ＧＡＰＤＨの上流：５’−ＡＣＣＡＣＡ  ＧＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣ−３’
ＧＡＰＤＨの下流：５’−ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  Ｔ−３’
【００６３】
反応は、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間のサイクルを、チロシナーゼ及びＧＡＰＤＨに於いては２８サイクル行い、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２及びＭＩＴＦに於いてはそれぞれ３２サイクル行った。その後、ＰＣＲ作製物を１．５％のアガロースゲルと分離し、エチジウムブロマイドで染色した。
【００６４】
（実施例１〜４）
各実施例１〜４に於いては、カキドオシ抽出物の濃度をそれぞれ０．１、０．２、０．５、１ｍｇ／ｍｌにした。
【００６５】
（比較例１）
本比較例に於いては、カキドオシの抽出物を添加しなかったこと以外は、前記実施例１と同様にした。
【００６６】
（結果）
１．メラニンの生合成及び細胞障害作用に対するカキドオシ抽出物の影響
図３（ａ）に、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内に於けるメラニン生成量とカキドオシ抽出物の濃度との関係を表すグラフを示す。同図（ａ）の縦軸は、カキドオシ抽出物を添加しなかった場合のメラニン生成量に対する、カキドオシ抽出物を添加した場合のメラニン生成量の割合を表している。同図（ａ）から明らかな通り、実施例１〜４に於いては、カキドオシ抽出物を添加したことによりメラニンの合成を抑制できたことが示された。また、カキドオシ抽出物の濃度が増大するに従い、メラニン生成量の一層の低減が図れることも確認された。
【００６７】
また、図３（ｂ）に前記細胞の生存率に対するカキドオシ抽出物の影響を表すグラフを示す。同図（ｂ）の縦軸は、カキドオシ抽出物を添加しなかった場合の細胞の生存率に対する、カキドオシ抽出物を添加した場合の細胞の生存率の割合を表している。同図（ｂ）から明らかな通り、カキドオシ抽出物の濃度が増加しても、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞の生存率に大きな変化は見られなかった。即ち、カキドオシ抽出物は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞に対し細胞障害作用を示さないことが確認された。
【００６８】
２．マッシュルームチロシナーゼ活性及び細胞チロシナーゼ活性に対するカキドオシ抽出物の影響
図４（ａ）に、カキドオシ抽出物の濃度とマッシュルームチロシナーゼ活性との関係を表すグラフを示す。同図（ａ）の縦軸は、カキドオシ抽出物を添加しなかった場合のマッシュルームチロシナーゼ活性に対する、カキドオシ抽出物を添加した場合のマッシュルームチロシナーゼ活性の割合を表している。同図（ａ）から明らかな通り、カキドオシ抽出物を添加してもＬ−ドーパの酸化に対する阻害効果は示されず、マッシュルームチロシナーゼ活性を抑制できないことが確認された。
【００６９】
一方、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内に於いては、カキドオシ抽出物の添加によりＬ−ドーパの酸化に対する阻害効果は示されており、当該細胞内ではチロシナーゼ活性の低減が図れることが確認された。図４（ｂ）は、カキドオシ抽出物の濃度と前記細胞内に於けるチロシナーゼ活性との関係を表すグラフである。これにより、カキドオシ抽出物は細胞内に於いてチロシナーゼの産生を阻害できることが分かった。
【００７０】
３．チロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２タンパク質に対するカキドオシ抽出物の影響
図５にＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内に於けるチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のそれぞれのタンパク質の発現の程度を表すウェスタンブロットを示す。同図から明らかな通り、カキドオシ抽出物の濃度が増大するに従い、チロシナーゼに於いてはシグナル強度が小さくなる結果となった。その一方、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２に於いては、シグナル強度に大きな変化は観察されなかった。
【００７１】
このことは、図６（ａ）〜６（ｃ）に於いても示された。同図（ａ）はカキドオシ抽出物の濃度とチロシナーゼタンパク質の強度との関係を表すグラフであり、同図（ｂ）はカキドオシ抽出物の濃度とＴＲＰ−１タンパク質の強度との関係を表すグラフであり、同図（ｃ）はカキドオシ抽出物の濃度とＴＲＰ−２タンパク質の強度との関係を表すグラフである。各グラフの縦軸は、それぞれβ−アクチンの強度に対する相対的な値を示している。これらのグラフからも明らかな通り、カキドオシ抽出物を添加したことによりチロシナーゼタンパク質の発現を抑制できていることが示されている。特に、カキドオシ抽出物の濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ以上になるとチロシナーゼタンパク質の発現を顕著に抑制できることが確認された。
【００７２】
４．チロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２タンパク質の遺伝子発現に対するカキドオシの影響
図７に、ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内でのチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のそれぞれのｍＲＮＡの発現の程度を表すウェスタンブロットを示す。同図から明らかな通り、カキドオシ抽出物の濃度が増大するに従い、チロシナーゼに於いてはシグナル強度が小さくなる結果となった。その一方、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２に於いては、シグナル強度に大きな変化は観察されなかった。
【００７３】
このことは、図８（ａ）〜８（ｃ）に於いても示された。同図（ａ）はカキドオシ抽出物の濃度とチロシナーゼのｍＲＮＡの強度との関係を表すグラフであり、同図（ｂ）はカキドオシ抽出物の濃度とＴＲＰ−１のｍＲＮＡの強度との関係を表すグラフであり、同図（ｃ）はカキドオシ抽出物の濃度とＴＲＰ−２のｍＲＮＡの強度との関係を表すグラフである。各グラフの縦軸は、それぞれＧＡＰＤＨの強度に対する相対的な値を示している。これらのグラフからも明らかな通り、カキドオシ抽出物を添加したことによりチロシナーゼのｍＲＮＡの発現を抑制できていることが示されている。特に、カキドオシ抽出物の濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ以上になるとチロシナーゼのｍＲＮＡの発現を顕著に抑制できることが確認された。
【００７４】
５．ＭＩＴＦタンパク質に対するカキドオシの影響
図９（ａ）に、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内でのＭＩＴＦ及びβ−アクチンのそれぞれのタンパク質の発現の程度を表すウェスタンブロットを示す。また、同図（ｂ）に前記細胞に於けるカキドオシ抽出物の濃度とＭＩＴＦタンパク質の強度との関係を表すグラフを示す。図９（ａ）から明らかな通り、カキドオシ抽出物の濃度が増大するに従い、ＭＩＴＦタンパク質のシグナル強度が小さくなる結果となった。また、図９（ｂ）にも示す通り、カキドオシ抽出物の濃度が増加するに従い、ＭＩＴＦタンパク質の発現が抑制されることが示された。
【００７５】
これに対し、ＭＩＴＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現に対しては、カキドオシ抽出物を添加してもシグナル強度に顕著な変化は観察されなかった（図１０（ａ）参照）。図１０（ａ）は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞内でのＭＩＴＦ及びＧＡＰＤＨのそれぞれのｍＲＮＡの発現の程度を表すウェスタンブロットである。また、図１０（ｂ）にも示すように、カキドオシ抽出物の濃度が増加するに従い、ＧＡＰＤＨに対するＭＩＴＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現が抑制されることはなかった。従って、カキドオシ抽出物はＭＩＴＦタンパク質の発現に対して阻害効果を示すが、ＭＩＴＦ遺伝子のｍＲＮＡの発現に対しては阻害効果を示さないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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