(57)【要約】【課題】副作用の少ない、新たな歯周炎治療薬の提供。【解決手段】ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする、副作用の少ない、新たな歯周炎治療薬を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤がＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体チロシンキナーゼ阻害剤である請求項１に記載の歯周炎治療薬。
【請求項３】
チロシンキナーゼ阻害剤がＮ−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅである請求項１または２に記載の歯周炎治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬に関する。さらに詳しくは、血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；以下、ＶＥＧＦと示す場合がある）受容体チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周炎は歯周病の一つの症状であり、炎症が歯根膜および歯槽骨まで及んだ状態のものを言う。従来、この歯周炎の治療には、抗生物質をはじめとする抗菌薬や抗炎症薬が主に使用されてきた。しかし、これらの投与はあくまでも対症療法でしかなく、抗菌薬の投与による耐性菌の出現や、胃腸炎等の副作用が生じる問題もあり、長期的に使用できなかった。
【０００３】
歯周炎のうち、若年性歯周炎や急性進行性歯周炎において、強度の血管新生を伴う病変が認められることが確認されており、近年、血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）に対する抗体を含む製剤を、歯周炎も対象とする歯周病の治療薬として提供することが開示されている（特許文献１）。
また、慢性破壊性成人歯周炎に対しては、主な病原体とされるポルフィロモナス・ジンジバリス等を含む、ポルフィロモナスの種を標的とする分子標的薬剤（ＴＭＡ）が開示されている（特許文献２）。
しかし、これらの治療薬は、抗体を有効成分とするものや、病原体となる微生物自体を標的とするものであり、副作用の少ない治療薬として、十分に治療に用いることができるとはいえず、より効果的な歯周炎治療薬の提供が望まれていた。
【０００４】
このような歯周炎治療薬のひとつとして、本発明者らは、歯周炎の原因のひとつとされる歯周組織のコラーゲン分解に着目し、コラーゲン分解阻害能を有するホスホジエステラーゼ阻害剤が歯周炎治療剤の有効成分となり得ることを開示している（特許文献３、参照）。
歯周組織のコラーゲン分解は、代謝が変化した歯周組織構成細胞によって起こることを本発明者らは見出しており、本発明において、このような細胞を特異的な標的として作用する、新たな歯周炎治療薬の提供を試みた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−９７１５７号公報
【特許文献２】特表２００８−５０５９３６号公報
【特許文献３】特開２０１１−１６２４５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、副作用の少ない、新たな歯周炎治療薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、歯周組織のコラーゲン分解を起こす、代謝が変化した歯周組織構成細胞（悪玉線維芽細胞）を用いた生体外歯周炎モデル（コラーゲンゲルを用いた三次元培養法）において、Ｆｌｔ−１（Ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  １；以下、Ｆｌｔ−１と示す場合がある）が高発現していることを確認した。Ｆｌｔ−１は、チロシンキナーゼ型受容体である血管内皮細胞増殖因子受容体分子のひとつである。
本発明者らは、この生体外歯周炎モデルにおいてＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤を作用させたところ、コラーゲンゲルの分解が顕著に阻害されたことから、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤が、チロシンキナーゼ型受容体を特異的な標的とする歯周炎分子標的治療薬の有効成分となり得ることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（３）の歯周炎治療薬等に関する。
（１）チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とする歯周炎治療薬。
（２）チロシンキナーゼ阻害剤がＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）受容体チロシンキナーゼ阻害剤である上記（１）に記載の歯周炎治療薬。
（３）チロシンキナーゼ阻害剤がＮ−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅである上記（１）または（２）に記載の歯周炎治療薬。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の歯周炎治療薬は、チロシンキナーゼ型受容体を特異的な標的として作用する分子標的治療薬であるため、歯周炎に関わらない正常細胞にはほとんど影響を与えない、副作用の低い薬として利用することが可能である。また、本発明において、有効成分とされるチロシンキナーゼ型受容体阻害剤は、すでに複数の物質が提供されていることから、これらの中から歯周炎の治療において特に有用なものを選択し、より有効な薬を提供することも容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】歯周炎治療薬の濃度依存的な効果を示した図である（実施例１）。
【図２】歯周炎治療薬の濃度依存的な効果（残存コラーゲン量）を示した図である（実施例１）。
【図３】ＨＥ染色により、歯周炎治療薬によるコラーゲン分解阻害の有無や程度を確認した図である（実施例１）。
【図４】ウイルスの感染効率、ノックダウン効率を示した図である（試験例）。
【図５】リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示した図である（試験例）。
【図６】Ｆｌｔ-１の発現がノックダウンされた細胞を含むコラーゲンゲルにおける、コラーゲンゲルの収縮の程度を示した図である（試験例）。
【図７】Ｆｌｔ-１の発現がノックダウンされた細胞を含むコラーゲンゲルにおける、残存コラーゲン量を示した図である（試験例）。
【図８】ＨＥ染色により、Ｆｌｔ-１の発現がノックダウンされた細胞におけるコラーゲン分解能を確認した図である（試験例）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の「歯周炎治療薬」は、チロシンキナーゼ阻害剤を有効成分とするものであって、歯周炎の予防または治療に有用な薬のことをいう。有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤のみからなるものであってもよく、その他薬学的に許容される他の成分を含むものであってもよい。
【００１２】
本発明の「歯周炎治療薬」の有効成分であるチロシンキナーゼ阻害剤は、歯周炎の予防または治療に利用できるものであればいずれのものでもあっても良いが、特に、歯周組織のコラーゲン分解を起こす、代謝が変化した歯周組織構成細胞（悪玉線維芽細胞）に特異的に作用して、歯周組織におけるコラーゲンの分解を阻害することで、歯周炎の予防または治療に利用できるものであることが好ましい。
【００１３】
このようなチロシンキナーゼ阻害剤として、例えば、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤等が挙げられる。本発明の「歯周炎治療薬」の有効成分として用いる受容体チロシンキナーゼ阻害剤としては、例えばＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるＮ−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ等が挙げられる。これはメルク社の製品番号６７６４８１（ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ）等、市販のものであってもよい。
また、これらの化合物の生理学的に許容される塩、例えば塩酸塩も受容体チロシンキナーゼ阻害剤として、本発明の歯周炎治療薬の有効成分に含むことができる。
【００１４】
本発明の「歯周炎治療薬」の対象となる歯周炎としては、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、遺伝疾患に伴う歯周炎等が挙げられる。
本発明の「歯周炎治療薬」は、液状、固形状、半固形状等のどのような形状であっても良く、塗布剤、チューイングガム、歯磨き剤、うがい薬またはシリンジで投与する歯周ポケット内貼薬等として用いることができる。また、内服薬、歯肉や歯根膜への注射剤として用いることもできる。
【００１５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
１．歯周炎治療薬
受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるＮ−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅとして、メルク社の製品番号６７６４８１（ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ）をそのまま歯周炎治療薬として用いた。
【００１７】
２．コラーゲンゲルの調製
１）細胞の調製
歯周外科手術の際に切除され不要となった歯肉片より組織を経て細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行ったヒト歯肉線維芽細胞（ＧＦ：Ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を、コラーゲン分解能を有する細胞として得た。
本発明においては、このようにして得られたヒト歯肉線維芽細胞をコラーゲンゲルの中に混和し、その上に初代培養ヒト歯肉上皮細胞を播種した三次元培養において、コラーゲン分解能が特に高いことが確認されたヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）であるＧＦ００、ＧＦ３２−４またはＧＦＡ９を用いた。これらは、それぞれ異なる歯肉片を由来とするヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）であった。
次に、歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片をＤｉｓｐａｓｅ処理した後、結合組織部分から剥離した上皮組織を細切後、組織片をプレートの底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として継代培養を行ったヒト歯肉上皮細胞（ＧＥ：Ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）ＧＥｅ１２またはＧＥＡ７を、コラーゲン分解能を高める細胞として得た。
【００１８】
２）コラーゲンゲルの構築
セルマトリックスｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼラチン）、５×ＤＭＥＭ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン）を混合し、コラーゲン混合溶液を作成した。このコラーゲン混合溶液に、上記１．の歯周炎治療薬を０．４μＭ、２μＭ、１０μＭまたは２０μＭとなるようにそれぞれ加えた。比較としてとして、歯周炎治療薬をまったく加えないものも作成した（以下、０μＭと示す場合がある）。
これらに上記１）で調製したコラーゲン分解能を有する細胞（ＧＦ００、ＧＦ３２−４またはＧＦＡ９）を懸濁した後、６穴プレート内に播種して３０分間硬化（ゲル化）させ、コラーゲン分解能を有する細胞を含むコラーゲンゲルを構築した。
次に、このコラーゲンゲル上に、上記１）で調製したコラーゲン分解能を高める細胞（ＧＥｅ１２またはＧＥＡ７）をトリプシンで分散させた後播種し、コラーゲン分解能を高める細胞の単層を形成させ、コラーゲン分解能を有する細胞とコラーゲン分解能を高める細胞とを含むコラーゲンゲルを構築した。
【００１９】
２．コラーゲン分解阻害効果の判定法
上記で構築した被験物質を含むコラーゲンゲルを、２４時間後にプレートの底から浮かせ、コラーゲンゲル浮遊培養を開始した。浮遊培養開始時点に、再度被験物質を加えた。浮遊培養開始後５日目（培養開始後６日目）にコラーゲンゲルの収縮レベルを調べ、その後、各ゲル中の残存コラーゲン量を定量することで、各濃度の歯周炎治療薬添加によるコラーゲン分解阻害の有無や程度を調べた。
さらに、同様に浮遊培養したゲルをメッシュ上に載せ、ゲル表面が空気に曝される状態でさらに５日間培養を行い、回収したゲル（培養開始後１１日目）をＨＥ染色し、コラーゲンの分解によって現れる線維芽細胞周囲の空胞を観察することで、歯周炎治療薬添加によるコラーゲン分解阻害の有無や程度を調べた。
【００２０】
３．結果
コラーゲン分解能を有する細胞としてＧＦ００、ＧＦ３２−４またはＧＦＡ９を用い、コラーゲン分解能を高める細胞としてＧＥｅ１２を用いた場合のコラーゲンゲルの収縮レベルを図１に示した。
また、コラーゲン分解能を有する細胞としてＧＦ００、ＧＦ３２−４またはＧＦＡ９を用い、コラーゲン分解能を高める細胞としてＧＥｅ１２を用いた場合の各ゲル中の残存コラーゲン量を調べ、各例における残存コラーゲン量の平均と標準偏差を図２に示した。
図１および図２に示されるように、歯周炎治療薬として添加したＮ−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅとして、メルク社の製品番号６７６４８１（ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ）の添加濃度に依存して、コラーゲンゲルの分解が抑制されることが確認できた。とくに１０μＭ以上添加すると、コラーゲンゲルの分解の抑制が顕著であった。また、２０μＭ添加した場合でも、細胞が死滅することなく、コラーゲンの分解を阻害できることが確認できた。
【００２１】
また、コラーゲン分解能を有する細胞としてＧＦ００またはＧＦ３２−４を用い、コラーゲン分解能を高める細胞としてＧＦＡ９を用い、歯周炎治療薬を１０μＭ加えた場合、または比較としてまったく加えない場合のＨＥ染色の結果を図３に示した。
その結果、歯周炎治療薬をまったく加えない場合（図３、Ｃｏｎｔｒｏｌ）では、コラーゲンの分解によって線維芽細胞周囲に空胞が観察されるのに対し、歯周炎治療薬を加えた場合（図３、ＶＥＧＦＲ  ｉｎ）では、細胞の周囲に空胞が観察されず、コラーゲンの分解が顕著に阻害されていることが確認できた。
【実施例２】
【００２２】
＜歯周炎治療薬＞
実施例１において製造した、Ｎ−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−［（ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅを有効成分とする歯周炎治療薬を製造した。
【００２３】
［試験例］
Ｆｌｔ−１の発現がノックダウンされた細胞におけるコラーゲン分解能の検討
１．Ｆｌｔ−１ノックダウン細胞の作製
次の１）〜７）の工程により、チロシンキナーゼ型受容体である血管内皮細胞増殖因子受容体分子のひとつであるＦｌｔ−１の発現がノックダウンされた細胞を得た。
１）ｍｉＲＮＡ配列の設計
ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商品名）  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ（ＦＬＴ１：ＡＦ０６３６５７．２）に挙げられているＦｌｔ−１遺伝子のｍＲＮＡを入力し、ｍｉＲＮＡ配列を設計した。
設計したｍｉＲＮＡ配列の４種類において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにてノックダウン効率を比較して最終的に、表１に示されるものを選択した。
【００２４】
【表１】
2013216589.tif 000002
【００２５】
２）ｐｃＤＮＡ６．２ベクターへの組み込み
ｐｃＤＮＡ６．２ベクターへの組み込みは、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＥｍＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。
まず、センス鎖とアンチセンス鎖を最終濃度５０μＭになるように調整し、９５℃、４分間にてアニーリング反応をさせた後、１０分間室温で放置した。次に、ｐｃＤＮＡ（商品名）  ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲを５ｎｇ、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを０．５Ｕと、上記で得られたアニーリング産物溶液が最終的に２ｎＭになるように調整し、室温で５分間ライゲーション反応をさせた。
上記で得られたライゲーション産物溶液２μＬとＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．Ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２５μＬを混合し、氷上にて３０分間培養した。その後４２℃にて３０秒間熱処理を行い、すぐさま氷上に戻した後２分間培養し、トランスフォーメーションを行った。
これに４５０μＬのＳ．Ｏ．Ｃ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を入れ、３７℃  ２００ｒｐｍにて水平に振盪培養した。その後、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含むＬＢ固形培地にプレーティングを翌朝まで培養した。コロニーをピックアップし翌朝までＬＢ液体培地にて培養し、得られた大腸菌からＱｕｉｃｋＬｙｓｅ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にてプラスミドＤＮＡを抽出・精製した。キットに付属のＥｍＧＦＰ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列表配列番号３）を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにてシークエンシングを行い、目的の配列が挿入されていることを確認した。
【００２６】
３）ドナーベクターの組み込み（ＢＰ反応）
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）  ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商品名）  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを使用した。また本実験のｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとしてキットに付属のｐｃＤＮＡ  ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ−ｎｅｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｌａｓｍｉｄを使用した。このベクターは通常のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとしてヘアピン構造を形成するが、いずれの脊椎動物特異的遺伝子をターゲットとしないとされている。
上記のＭｉｎｉｐｒｅｐの産物、またはｐｃＤＮＡ  ６．２−ＧＷ／ＥｍＧＦＰ−ｍｉＲ−ｎｅｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｌａｓｍｉｄを１５０ｎｇとｐＤＯＮＲ（商品名）  ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１５０ｎｇ、Ｇａｔｅｗａｙ  ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを２μＬ加えてピペッティングを行った後に２５℃で１時間培養しＢＰ反応を行わせた。
ＢＰ反応産物１μＬをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．Ｃｏｌｉに、上記と同様にトランスフォーメーションし、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ固形培地にプレーティングし、翌朝まで培養した。ピックアップしたコロニーを翌朝までＬＢ液体培地にて培養し、得られた大腸菌からＱｕｉｃｋＬｙｓｅ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ＫｉｔにてプラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００２７】
４）デスティネーションベクターへの組み込み（ＬＲ反応）
Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ（商品名）  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを使用した。またデスティネーションベクターとしてＥＦ−１αプロモーターを発現するＣＳＩＩ−ＥＦ−ＲｆＡを選択した。
上記のＭｉｎｉｐｒｅｐの産物  １５０ｎｇ、ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＲｆＡ  １５０ｎｇと、さらにＧａｔｅｗａｙ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを２μＬ加えてピペッティングを行った後に、２５℃で１時間培養しＬＲ反応を行わせた。プロテアーゼＫを１μＬ加えて３７℃で１０分間培養し、ＬＲ反応を停止させた。
ＬＲ反応産物１μＬをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｓｔｂｌ３  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．Ｃｏｌｉ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に上記と同様にトランスフォーメーションし、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ固形培地にプレーティングし翌朝まで培養した。ピックアップしたコロニーを翌朝までＬＢ液体培地にて培養し、得られた大腸菌からＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にてプラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００２８】
５）レンチウイルスの作成
次の（ａ）および（ｂ）の２種類の混合液を各々作成し、５分間室温で静置した後、（ａ）と（ｂ）を混合して２０分間室温で静置した。
（ａ）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）  １．２５ｍＬ、ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ  ２．５μｇ、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ  ２．５μｇ、レンチウイルス発現ベクター  ４．５μｇ
（ｂ）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）  １．２５ｍＬ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名）  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）  ３０μＬ
次に、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）＋１０％  ＦＢＳで１．２×１０6／ｍＬの濃度で懸濁液を作成した。
上記の（ａ）と（ｂ）の混合溶液と細胞懸濁液４ｍＬを混合し、１００ｍｍ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｄｉｓｈ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ）（ＩＷＡＫＩ社）にて一晩培養した。翌日、２９３ＦＴ細胞の増殖培地６ｍＬに培地交換して培養を続け、２日後、細胞上清を回収し３０００ｒｐｍ・５分で遠心し、培養上清を回収した。回収した培養上清は、５００μＬずつ分注し−８０℃で保存した。
【００２９】
６）レンチウイルス感染
ヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）であるＧＦ００、またはＧＦ３２−０４を１ｘ１０5個ずつエッペンドルフチューブに分注し３０００ｒｐｍ  ３分で遠心し、上清を除去した。これに上記５）で調製した５００μＬのウイルス液を加えてピペッティングし、さらに増殖培地５００μＬを加えてピペッティングし、６ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈにまき一晩培養した。翌日に通常の増殖培地２ｍＬに培地交換した。
ウイルスの感染効率は、感染後７２時間後にフローサイトメトリーにてＧＦＰ陽性細胞を検出することによって行った（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ；Ｃｏｕｌｔｅｒ社）。またノックダウン効率はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した（Ｍｘ−３０００Ｐ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）。なお、内部コントロールとしてＧＡＰＤＨを用い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーは表２に示した。
【００３０】
【表２】
2013216589.tif 000003
【００３１】
７）結果
ＧＦ００におけるウイルスの感染効率、ノックダウン効率を図４に示した。どちらのヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）においてもウイルスの感染効率は７０−８０％であった。
また、図５に示したように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいてもＧＦ００において、ＦＬＴ１の発現が４０％程度に減少していることが確認できた。なお、図５における“００ｎｏｒｍａｌ”は、未処理のＧＦ００のことを指し、“００ｎｔｃ”は何もコードしていないランダムな配列を挿入したコントロールベクターを導入したＧＦ００のことを指し、“００ｆｌｔ”は、ＦＬＴ−１のｍｉＲＮＡをコードする遺伝子を導入したＧＦ００のことを指している。
【００３２】
２．Ｆｌｔ−１の発現がノックダウンされた細胞におけるコラーゲン分解能の検討
上記１．にて作成したＦｌｔ−１の発現がノックダウンされた細胞（ＧＦ００またはＧＦ３２−４）を用い、コラーゲン分解能を高める細胞としてＧＥＡ７を用い、実施例１、１．と同様の方法によってコラーゲンゲルを構築した。
構築したコラーゲンゲルを、２４時間後にプレートの底から浮かせ、コラーゲンゲル浮遊培養を開始した。浮遊培養開始後５日目（培養開始後６日目）に、コラーゲンゲルの収縮レベルを調べた後、各ゲル中の残存コラーゲン量を定量した。
さらに、同様に浮遊培養したゲルをメッシュ上に載せ、ゲル表面が空気に曝される状態でさらに５日間培養を行い、回収したゲル（培養開始後１１日目）をＨＥ染色し、コラーゲンの分解によって線維芽細胞周囲に空胞が観察されるか否かを確認することにより、Ｆｌｔ−１の発現がノックダウンされた細胞におけるコラーゲン分解能を調べた。
【００３３】
コラーゲンゲルの収縮レベルを図６に示し、各ゲル中の残存コラーゲン量を図７に示した。図６および図７において、“ＦＬＴ１”としてＦｌｔ−１の発現がノックダウンされた場合、“ＮＴＣ（ｎｏｎ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）”としてＦｌｔ−１の発現がノックダウンされていない場合（コントロール）の結果を示している。これらに示されるように、ＧＦ００、ＧＦ３２−４のいずれにおいても、Ｆｌｔ−１の発現がノックダウンされたことにより、コラーゲンの分解が顕著に阻害されていることが確認できた。
さらに、Ｆｌｔ−１の発現がノックダウンされた細胞（ＧＦ００）におけるＨＥ染色の結果を図８に示した。その結果、Ｆｌｔ−１の発現がノックダウンされた細胞を用いたコラーゲンゲルにおいては、線維芽細胞周囲に空胞が観察されず、コラーゲンの分解が顕著に阻害されていることが確認できた。
したがって、これらの結果より、ヒト歯肉線維芽細胞（悪玉線維芽細胞）等におけるチロシンキナーゼ型受容体を特異的な標的として、その発現を阻害することにより、コラーゲンの分解を抑制し、これによって、歯周炎の治療を行うことが可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の歯周炎治療薬の提供により、歯周炎に関わらない正常細胞にはほとんど影響を与えない、副作用の低い新たな歯周炎治療薬を提供することが可能となる。
【図４】
2013216589.tif 000004
【図１】
2013216589.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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