(57)【要約】【課題】  アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、γ−アミノ酪酸（GABA））含量が増強された植物を提供すること。アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量が増強された植物を含む食品を提供すること。アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質の製造方法を提供すること。【解決手段】  異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させる方法。前記方法によりアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物。前記方法によりアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物からアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質を採取することを含む、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質の製造方法も提供される。【選択図】  図２
2013143920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させる方法。
【請求項２】
異種染色体が単子葉植物に由来する請求項１記載の方法。
【請求項３】
単子葉植物がオオムギである請求項２記載の方法。
【請求項４】
異種染色体がオオムギの７番染色体である請求項３記載の方法。
【請求項５】
異種染色体を導入する植物がグルタミン酸デカルボキシラーゼの遺伝子を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
異種染色体を導入する植物が単子葉植物である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
異種染色体を導入する植物がコムギである請求項６記載の方法。
【請求項８】
異種染色体がオオムギの７番染色体であり、異種染色体を導入する植物がコムギである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量が植物体の地上部及び／又は種子において増強する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
植物体の地上部が実生である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質が、γ−アミノ酪酸、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、ヒスチジン、フェニールアラニン、アルギニン、チロシン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、S−メチルメチオニン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン及びS-アデノシルLメチオニンからなる群より選択される請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質がγ−アミノ酪酸である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法によりアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法によりアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物からアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質を採取することを含む、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量改変植物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギは、３大穀物の一つであり世界的に広く栽培されている。小麦粉は、加工適性に優れ、パンやパスタ、うどん、菓子類など主食・嗜好品として利用されている。また、若葉が健康食品として利用されている。一方、オオムギは、機能性物質を多く含み、青汁若葉等に利用されているが、加工適性が悪く（例えば、オオムギでパンは焼けない）、利用範囲が限られている。
【０００３】
アミノ酸は、ヒトや動物の体を構成する栄養素であり、美肌、脂肪燃焼、疲労回復、記憶力・集中力の向上、筋力増強などの効果があることが報告されており、このような効果を期待して、アミノ酸の飲料やサプリメントが市販されている。
【０００４】
アミノ酸関連物質であるγ−アミノ酪酸（GABA）は「抑制性」の神経伝達物質として機能する物質である。GABAの摂取により、血圧上昇抑制効果、リラックス効果、ダイエット効果、糖尿病予防効果、悪酔い予防効果等があるといわれている。
【０００５】
コムギ、オオムギの実生・完熟種子いずれの組織においてもGABA含量は低い。
【０００６】
オオムギの染色体を１対ずつパンコムギに導入した系統は育成されていた（非特許文献１：Islam and Shepherd Theor. Appl. Genet. 83: 489-494, 1992）。しかし、この系統のコムギがいかなる機能性物質を有しているかについて、この論文の著者たちは検討していない。
【０００７】
【化１】
2013143920.tif 000003
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Islam and Shepherd Theor. Appl. Genet. 83: 489-494, 1992
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
コムギ、オオムギとも単独では、実生・完熟種子いずれの組織においてもGABA含量が低いが、GABA含量を増強させることができれば、日常食品あるいは健康食品としてGABAを摂取できると考えられる。ところが、そのようなコムギ・オオムギを作出することは、コムギ・オオムギそれぞれの系統のみを用いた汎用されている従来育種技術では困難であった。
【００１０】
本発明は、GABAをはじめとするアミノ酸・アミノ酸関連物質含量が増強された植物を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、GABAをはじめとするアミノ酸・アミノ酸関連物質含量が増強された植物を含む食品を提供することも目的とする。
【００１２】
さらにまた、本発明は、GABAをはじめとするアミノ酸・アミノ酸関連物質含量が増強された植物からGABAをはじめとするアミノ酸・アミノ酸関連物質を製造する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、コムギ、オオムギの異種ゲノム間の相互作用による相乗効果により、GABA含量が増強されるのではないかと予想し、オオムギ染色体導入コムギの実生、完熟種子においてGABA含量を精密測定した。その結果、オオムギ７番染色体を添加した染色体添加パンコムギ系統において、GABA含量が増強されることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、このオオムギ７番染色体添加パンコムギにおいては、GABAのみならず、他のアミノ酸やアミノ酸関連物質の含量も増強された。
【００１４】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させる方法。
（２）異種染色体が単子葉植物に由来する（１）記載の方法。
（３）単子葉植物がオオムギである（２）記載の方法。
（４）異種染色体がオオムギの７番染色体である（３）記載の方法。
（５）異種染色体を導入する植物がグルタミン酸デカルボキシラーゼの遺伝子を含む（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）異種染色体を導入する植物が単子葉植物である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）異種染色体を導入する植物がコムギである（６）記載の方法。
（８）異種染色体がオオムギの７番染色体であり、異種染色体を導入する植物がコムギである（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量が植物体の地上部及び／又は種子において増強する（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）植物体の地上部が実生である（９）記載の方法。
（１１）アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質が、γ−アミノ酪酸、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、ヒスチジン、フェニールアラニン、アルギニン、チロシン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、S−メチルメチオニン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン及びS-アデノシルLメチオニンからなる群より選択される（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質がγ−アミノ酪酸である（１１）記載の方法。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法によりアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物。
（１４）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法によりアミノ酸含量及び／又はアミノ酸関連物質を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物からアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質を採取することを含む、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）含量が増強された植物が提供される。この植物は、食品原料、例えば、血圧上昇抑制効果、リラックス効果、ダイエット効果、糖尿病予防効果、悪酔い予防効果を有する機能性食品原料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】オオムギ染色体導入コムギ系統の実生におけるアミノ酸およびアミノ酸関連物質含有量を示す。WB1〜WB7はオオムギ1Hから7H染色体導入コムギ系統をあらわす。WB8は、コムギ親系統であるパンコムギChinese Spring、WB9はオオムギBetzes系統をあらわす。各グラフの右端の棒は、WB1〜WB7の平均値をあらわす。SMM:S-メチルメチオニン、SAM:S−アデノシルメチオニン。
【図２】オオムギ染色体導入コムギ系統の完熟種子におけるアミノ酸およびアミノ酸関連物質含有量を示す。WB1〜WB7はオオムギ1Hから7H染色体導入コムギ系統をあらわす。WB8は、コムギ親系統であるパンコムギChinese Spring、WB9はオオムギBetzes系統をあらわす。各グラフの右端の棒は、WB1〜WB7の平均値をあらわす。
【図３】オオムギ染色体導入コムギ系統の実生および完熟種子におけるGABA含量を示す。(A)発芽後２週間の実生、（B)完熟種子におけるGABA含量。図１からGABA含量の図を抽出した。
【図４】オオムギ染色体導入コムギにおけるGABA代謝経路に関連する酵素遺伝子の発現パターンを示す。GABA代謝経路はKEGGより引用した。それぞれのステップを触媒する酵素をコードする遺伝子の発現量を親系統であるCSのそれと比較して視覚化した。各ボックスは、1H〜7H染色体導入コムギの各系統における遺伝子発現量をあらわす。塗りつぶされたボックスは、遺伝子発現の増加量（濃：増加量多い、薄：増加量少ない）、斜め線の入ったボックスは、抑制量をしめす。上段は、実生、下段は種子登熟過程における遺伝子発現量をあらわす。
【図５】GAD遺伝子の解析結果を示す。（A) オオムギ染色体導入コムギ系統の種子登熟過程における３種GAD遺伝子の発現パターンの解析。（B) アミノ酸配列に基づくムギ類GAD遺伝子の系統関係。
【図６】コムギ−オオムギ染色体の相乗効果による新規GABA蓄積システムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、異種染色体を植物に導入することを含む、植物におけるアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させる方法を提供する。
【００１９】
異種染色体は、いかなる植物に由来するものであってもよく、オオムギ、コムギ、イネ、トウモロコシ、キビ、ヒエ、アワなどの単子葉植物に由来するもの、トマト、シロイズナズナ、ナス、トウガラシ、ピーマン、キュウリ、ウリ、ダイズ、カンゾウなどの双子葉植物に由来するものなどを例示することができる。
【００２０】
異種染色体がオオムギ由来のものである場合、増強するアミノ酸に対応した特定の染色体を選択することが可能である。例えば、アミノ酸であるアラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、フェニールアラニン、アルギニン、チロシン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、アミノ酸関連物質であるGABA、SMMは、７番染色体を導入すると含量が増強される。
【００２１】
本発明者らは、オオムギ７番染色体を導入したコムギ系統では、GABAをはじめとするアミノ酸及びアミノ酸関連物質が増加していることを見出し、さらに、オオムギ７番染色体導入コムギ系統で３番染色体に座乗するGAD1(グルタミン酸デカルボキシラーゼ１)遺伝子がオオムギ７番染色体導入により発現が強く誘導されていることを確認した（後述の実施例を参照のこと）。このことから、オオムギ７番染色体導入により増強されるGABAをはじめとするアミノ酸及びアミノ酸関連物質含量は、合成遺伝子の増加による遺伝子効果ないしは、オオムギ７番染色体導入に座乗する制御因子により誘導される合成遺伝子の相乗的な働きによることが示唆される。それ故、異種染色体を導入される植物は、アミノ酸合成関連遺伝子（例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子）ばかりでなく、合成遺伝子の発現を誘導する発現制御遺伝子を有するものであることが好ましい。異種染色体を導入する植物は、オオムギ、コムギ、イネ、トウモロコシ、キビ、ヒエ、アワなどの単子葉植物、トマト、シロイズナズナ、ナス、トウガラシ、ピーマン、キュウリ、ウリ、ダイズ、カンゾウなどの双子葉植物などのいかなる植物であってもよいが、例えば、異種染色体がオオムギ由来である（例えば、オオムギの７番染色体である）場合、異種染色体を導入される植物はコムギであると効果が顕著である。コムギは、いかなる品種又は系統であってもよく、Chinese Spring、新中長、農林61号、ホクシン、チホクコムギ、春よ恋、キタノカオリ、ミナミノカオリ、ニシノカオリ、ふくほのか、ふくさやかなどの品種、WB系統、SH系統、CA系統などの系統を例示することができるが、これらに限定されることはない。オオムギもいかなる品種又は系統であってもよく、Betzes、はるな二条、アサカゴールド、ニシノチカラ、あまぎ二条などの品種、Holdeum chilense, Holdeum spontaneumなどの野生オオムギなどを例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００２２】
異種染色体導入は、従来の交雑育種法により行うことができる。例えば、オオムギ染色体導入コムギ系統の作出については、Islam and Shepherd 1992 (Theoretical and Applied Genetics 83: 489-494); Taketa and Takeda 2001(Breeding Science 51: 199-206)に記載されている。簡単に説明すると、まずコムギを母本、オオムギを花粉親として交配し、F1を作出する。これは不稔性を示すので、コルヒチン処理または母本となったコムギを花粉親として戻し交雑を行い、次世代系統を作出する。またはさらにコムギを花粉親として戻し交雑を複数回行った系統を作出する。またはH. bulbosum法により倍加半数体系統を作出する。これらの系統から、減数分裂期の花粉母細胞の染色体をゲノミックin situハイブリダイズ法(GISH)により観察し、目的のオオムギ染色体が導入されたコムギ系統を選抜する。
【００２３】
異種染色体を導入した植物を栽培し、育成した植物体からアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）を抽出し、定量し、異種染色体を導入していない植物の植物体のアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）含量と比較することにより、異種染色体導入植物におけるアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量（例えば、GABA）の増強を確認することができる。アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）の定量は、後述の実施例に記載の方法で行うことができる。
【００２４】
異種染色体導入によるアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量の増強は、植物体の実生（若葉）、成熟葉、茎、小穂などの地上部、根、地下茎、ストロンなどの地下部、種子、胚乳、ふすまなどいかなる部分で観察されてもよい。例えば、オオムギ７番染色体導入コムギ系統では、実生及び種子において、GABAをはじめとするアミノ酸・アミノ酸関連物質含量の顕著な増強効果が観察された（後述の実施例を参照のこと）。すなわち、実生、種子の両方で、GABA、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、ヒスチジン、フェニールアラニン、アルギニン、チロシン、トリプトファン、グリシン、メチオニン及びSMMの含量が増加し、実生では、グルタミンの含量が増加し、種子では、イソロイシン、ロイシン、SAMの含量が増加した。
【００２５】
異種染色体導入により植物における含量が増強するアミノ酸及びアミノ酸関連物質としては、GABA、アラニン、セリン、プロリン、バリン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、ヒスチジン、フェニールアラニン、アルギニン、チロシン、トリプトファン、グリシン、メチオニン、SMM、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、SAMなどを挙げることができる。
【００２６】
また、本発明は、異種染色体導入により、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物を含む食品組成物を提供する。
【００２７】
本発明の食品組成物に含まれる植物は、植物体の実生（若葉）、成熟葉、茎、小穂などの地上部、根、地下茎、ストロンなどの地下部、種子、胚乳、ふすまなどいかなる部分であってもよいし、また、植物体の全部であってもよい。例えば、オオムギ７番染色体導入コムギ系統では、実生及び種子において、GABAをはじめとするアミノ酸及びアミノ酸関連物質含量の顕著な増強効果が観察された（後述の実施例を参照のこと）ので、異種染色体がオオムギ由来のものであり、異種染色体が導入される植物がコムギである場合には、実生及び／又は種子が食品組成物に含まれることが好ましい。食品組成物に含まれる植物は、栽培した植物体の全部又はその一部を採取した後、適宜、洗浄、脱水・加熱、粉砕などの処理をして、粉末の形態にしてもよい。
【００２８】
本発明の食品組成物に含まれる抽出物は、植物体から抽出されたもので、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）を含有するものであればよい。抽出は、通常の植物成分の抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、後述の実施例に記載の方法で行うことができる。さらに、ＨＰＬＣなどにより精製してもよい。
【００２９】
本発明の食品組成物は、水、果汁などを添加して、青汁などの飲料として食することができる。あるいはまた、賦形剤などを添加し、粉末、顆粒、錠剤などの形態にして、食することもできる。その他、パン、麺類、パスタ類、菓子類などの食品として、あるいは食品に配合して、食することもできる。
【００３０】
本発明は、さらに、異種染色体導入により、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質含量を増強させた植物若しくはその子孫又はその抽出物からアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質を採取することを含む、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質の製造方法を提供する。抽出は、通常の植物成分の抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、後述の実施例に記載の方法で行うことができる。当業者であれば、これらの方法に適宜修正や改変を加えて、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）の大量生産に適した方法とすることが可能であろう。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例により、本発明を具体的に説明する。なお、これらの実施例は、説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
〔実施例１〕
[材料および方法]
アミノ酸の測定方法
実生のサンプルは、公立大学法人横浜市立大学木原生物学研究所内において人工気象室（温度22℃、湿度60%、16時間日照、小糸工業製）によりオオムギ染色体を1対ずつ導入したパンコムギ系統(Islam and Shepherd 1990)および親系統オオムギ（Betzes）、パンコムギ（Chinese Spring）を栽培した。播種後2週間の実生を採取し、粉砕した。
【００３３】
種子のサンプルは、公立大学法人横浜市立大学木原生物学研究所内の実験圃場においてオオムギ染色体を1対ずつ導入したパンコムギ系統（Islam and Shepherd 1990）および親系統オオムギ（Betzes）、パンコムギ（Chinese Spring）を栽培した。完熟した種子を採取し、乾燥後、4℃で保存した。種子5粒を粉砕した。
【００３４】
なお、オオムギ染色体を1対ずつ導入したパンコムギ系統、親系統オオムギ（Betzes）、パンコムギ（Chinese Spring）は、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  近畿中国四国農業研究センターより入手した。
【００３５】
粉砕物に80%メタノールを加え混合した。遠心をして沈殿物と液体を分離した。上清を取り、凍結乾燥させた。これに滅菌水を加え溶解した後、キャピラリー電気泳動で分離し、質量分析計で計測した（Agilent Technologies, G1600A）。
【００３６】
遺伝子発現量の測定方法
実生のサンプルは、公立大学法人横浜市立大学木原生物学研究所内において人工気象室（温度22℃、湿度60%、16時間日照、小糸工業製）によりオオムギ染色体を1対ずつ導入したパンコムギ系統（Islam and Shepherd 1990）および親系統オオムギ（Betzes）、パンコムギ（Chinese Spring）を栽培した。RNA抽出キットRNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) を用いて添付のプロトコールに従いトータルRNAを調製した。得られたトータルRNAに対してLow Input Quick Amp Labelling Kit（Agilent Technologies）により添付のプロトコールに従いCy3でラベルしたcRNAを、ナショナルバイオリソースプロジェクト・コムギによる遺伝子発現用マイクロアレイ（Agilent Technologies）にハイブリダイズし、遺伝子発現量を測定した。
【００３７】
種子のサンプルは、公立大学法人横浜市立大学木原生物学研究所内の実験圃場においてオオムギ染色体を1対ずつ導入したパンコムギ系統（Islam and Shepherd 1990）および親系統オオムギ（Betzes）、パンコムギ（Chinese Spring）を栽培した。開花後、0日、7日、14日、21日、28日の種子を採取した。RNA抽出試薬Plant RNA Isolation Reagent（Invitrogen）を用いて添付のプロトコールに従いトータルRNAを調整した。RNeasy Mini Kit (QIAGEN)で精製後、得られたトータルRNAに対してLow Input Quick Amp Labelling Kit（Agilent Technologies）により添付のプロトコールに従いCy3でラベルしたcRNAを、ナショナルバイオリソースプロジェクト・コムギによる遺伝子発現用マイクロアレイ（Agilent Technologies）にハイブリダイズし、遺伝子発現量を測定した。
【００３８】
コムギGAD遺伝子の同定
マイクロアレイを用いた遺伝子発現量の解析によりオオムギ7H染色体導入コムギ系統で発現量が上がっていたGAD遺伝子に該当するプローブを同定した。プローブ設計の元となったパンコムギのEST（Expressed Sequence Tag）からプライマーを設計した。
【００３９】
コムギGAD遺伝子に特異的なプライマーを設計し、コムギ3群染色体異数体系統を用いてPCRを行うことにより、これらのGAD遺伝子が3群染色体に座乗することを確認した。GAD遺伝子を識別するのに用いたPCR用プライマー配列を表1に示す。
【００４０】
【表１】
2013143920.tif 000004
【００４１】
[結果および考察]
実生におけるアミノ酸・アミノ酸関連物質含有量
オオムギ染色体導入系統、および親系統であるパンコムギChinese Spring (CS)系統、オオムギ（Betzes）系統の実生におけるアミノ酸・アミノ酸関連物質含量を測定した（図１）。測定したアミノ酸・アミノ酸関連物質は、いずれかのオオムギ染色体を導入した系統で親系統であるCSより有意に増強されていた。特に、機能性物質として知られるγ―アミノ酪酸（GABA）含量が、親系統であるパンコムギよりオオムギ6H染色体添加系統で約２倍、7H染色体添加系統で約2.5倍に増強されていた（図3A）。パンコムギの親系統では、オオムギの親系統よりそもそも３倍のGABA含量が検出された。6H、7H染色体導入系統以外では、GABA含量に関して有意な差はみられなかった。
【００４２】
完熟種子におけるアミノ酸・アミノ酸関連物質含有量
オオムギ染色体導入系統、および親系統であるパンコムギChinese Spring (CS)系統、オオムギ（Betzes）系統の完熟種子におけるアミノ酸・アミノ酸関連物質含量を測定した（図2）。測定したアミノ酸・アミノ酸関連物質は、グルタミン（Gln）を除き、いずれかのオオムギ染色体を導入した系統で親系統であるCSより有意に増強されていた。特に、機能性物質として知られるγ―アミノ酪酸（GABA）含量が、親系統であるパンコムギよりオオムギ6H染色体添加系統で約２倍、7H染色体添加系統で約３倍になっており、顕著に増強されていた。オオムギの親系統では、コムギの親系統の約２倍のGABA含量が検出された。完熟種子におけるGABA含量は、平均して実生の約２倍になっていた（図3B）。発芽玄米等、発芽後のGABA含量の増加は知られていたが、完熟種子におけるGABA含量の増強方法は、初めての知見である。
【００４３】
GABA代謝経路に関連する遺伝子の発現パターン
GABAは、グルタミンを経由するGABAシャント経路、メチオニンをスタートとするポリアミン経路を介して合成される（図4）。オオムギ染色体を導入したコムギで影響を受けるGABA生合成関連遺伝子を特定するために、実生および種子形成過程（受粉後28日目；DPA28）におけるそれぞれの代謝経路に関連する酵素をコードする遺伝子の発現パターンを、コムギcDNAマイクロアレイをもちいて網羅的に解析した（図4）。GABA生合成関連遺伝子のオオムギ座乗染色体は、Cho et al. (2006)の方法に拠り、決定した。結果を表2にまとめた。実生・完熟種子におけるGABA含量の増強結果とオオムギ染色体導入コムギ系統における遺伝子発現パターンを対応させると、オオムギ7H添加系統における種子GABA含量の増強は、GABAシャント経路のGABA合成酵素（GAD）遺伝子の発現の効果が最も顕著であったので、GAD遺伝子がGABA増強の候補としてあげられる。ムギ類のモデルとして位置付けられ、ゲノムの全塩基配列が決定されているブラキポディウムで検索すると、GAD遺伝子は、5種類存在し、多重遺伝子族を構成する。NCBIの発現遺伝子データベースを検索すると、ブラキポディウムの５種類のGAD遺伝子に相当するオオムギの発現遺伝子（完全長cDNA）を得ることができた（図5B）。さらに、ムギ類では、あらたに分化したGAD遺伝子グループを検出できた。従って、ムギ類では都合６種類のGAD遺伝子が存在する。また、パンコムギの網羅的遺伝子発現データベースを検索すると、オオムギに存在する６種類のGAD遺伝子のうち、４種類の完全長cDNA遺伝子をみいだすことができた。これらの遺伝子は、７群染色体以外の染色体に座乗していた。そこで、種子登熟過程における遺伝子の発現パターンを詳細に解析した（図5）。６つのGAD遺伝子のうち、３種類の遺伝子（GAD1, GAD3, GAD4）が種子登熟過程において特徴的な発現パターンを示した。GAD遺伝子は、ムギ類の２番、３番、４番染色体に２種類ずつ座乗していた。それぞれの種子登熟過程における発現パターンを個別に解析してみると、３番に座乗するGAD1遺伝子が7H染色体導入により発現が強く誘導されていた（図5）。7H染色体導入により増強されるGABA含量は、7H染色体に座乗する制御因子により誘導されるGAD1遺伝子のはたらきによることが強く示唆された。
【００４４】
【表２】
2013143920.tif 000005
【００４５】
GABA含量増強コムギの新規育成システム
7Hオオムギ染色体導入系統における種子のGABA含量の増強が顕著である（図１および図２）。GABAの蓄積に関わる遺伝子はいずれも７群以外に座乗している（表２）。従って３群に座乗するGAD1遺伝子は構造遺伝子だと考えられ、構造遺伝子の発現を制御する調節因子がオオムギ7H染色体に存在することが明らかになった。そこで、オオムギ7H染色体により小麦粉のGABA含量を増強するシステムを提案した（図6）。
【００４６】
（引用文献）
Cho S, Garvin DF, Muehlbauer GJ (2006) Transcriptome analysis and physical mapping of barley genes in wheat-barley chromosome addition lines. Genetics172 (2):1277-85
Islam AKMR, Shepherd KW (1990) Incorporation of barley chromosomes
in wheat. In YPS Bajaj, ed, Biotechnology in Agriculture and Forestry,
Vol 13. Springer-Verlag, Berlin, pp l28-151
【００４７】
〔コムギ若葉粉末製造例〕
コムギを種蒔きし、３ ０ 〜 ３ ５ ｃ ｍ に成長したところで、下部１ ０ ｃ ｍ 程度を残して刈り取り後、葉と葉軸を分離する。次に、水洗し土や異物を取り除き、これを９ ０ 〜 １ ０ ０ ℃ の熱風式棚式乾燥機にて乾燥する。乾燥した若葉は、ミキサーで軽く回転させ葉肉部分と葉脈部分を分離する。葉肉部分は、粉砕機（ アトマイザー） で粉砕し、目開き５ ０ ０ μ ｍ のスクリーン通過分が９ ０ 重量％ で、目開き３ ０ ０ μ ｍ のスクリーン未通過分が４ ８ 重量％の粗粉末を得る。この粗粉末を更に気流粉砕機（ 水平型ジェットミルＳ Ｔ Ｊ ； 株式会社セイシン企業） にて微粉砕して、粒度が１ ０ ０ μ ｍ 以下であり、かつ５ ０ μ ｍ 以下の割合が８ ０ 重量％ 以上（粒度範囲： ２ 〜 ６ ５ μ ｍ 、５ ０ 累積％ １ ３ ． ４ ５ μ ｍ ） のコムギ若葉粗粉末を得る。この粗粉末を更に気流粉砕機にて更に微粉砕に加工し、粒度５ ０ μ ｍ 以下（ 粒度範囲； １〜 ５ ０ μ ｍ 、５ ０ 累積％ ８ ． ３ １ μ ｍ ） のコムギ若葉粉末を得る。コムギ若葉粉末を少量のキサンタンガムを使用して造粒し、これを、３ ｇ ずつに分包し、ドリンク用顆粒を製造する。
【００４８】
〔小麦粉および小麦粉製品の製造例〕
小麦粉は、加工適性により強力粉、中力粉、薄力粉に分けられる。加工適性は主にコムギ種子のグルテンの性質による。グルテンには、コムギの貯蔵タンパク質であるグルテニンとグリアジンが含まれる。グルテニンが弾性を、グリアジンが粘性を支配している。それぞれの加工適性により、コムギの品種を選別する。精製機により小麦粒に混じっている夾雑物を取り除く。精製された小麦粒に水をかけねかせる。ねかせた小麦粒をロール式粉砕機にかけて粉砕する。これをふるい機（シフター）にかけて小麦粉とふすまにふるい分ける。ふるい分けの過程で小麦粉も１等粉、２等粉、３等粉、末粉に分別される。これらの工程は、通常工場で大規模な工業過程として行われる。１等粉から３等粉が食品として使用され、末粉、ふすまは主に飼料となる。強力粉は主にパン、中力粉は麺類、薄力粉は菓子類に利用される。小麦粒を粉砕後、小麦粉とふすまに分別せず、全粒粉として利用する方法もある。全粒粉は栄養価は高いが味覚的に落ちる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により、アミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）含量が増強された植物は、食品（例えば、パン、麺類、パスタ類、菓子類などの小麦粉製品、青汁飲料などの機能性食品）、ペット食品などの分野に利用可能である。また、産業レベルでのアミノ酸及び／又はアミノ酸関連物質（例えば、GABA）の大量抽出にも利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
＜配列番号１＞
TaGAD1-1、TaGAD1-2を標的とするフォワードプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号２＞
TaGAD1-1、TaGAD1-2を標的とするリバースプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号３＞
HvGAD_2H_NIASHv2030C22を標的とするフォワードプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号４＞
HvGAD_2H_NIASHv2030C22を標的とするリバースプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号５＞
HvGAD_2H_NIASHv3112A23を標的とするフォワードプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号６＞
HvGAD_2H_NIASHv3112A23を標的とするリバースプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号７＞
HvGAD_3HS_NIASHv1141D11を標的とするフォワードプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号８＞
HvGAD_3HS_NIASHv1141D11を標的とするリバースプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号９＞
HvGAD_3HL_NIASHv2146A12を標的とするフォワードプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号１０＞
HvGAD_3HL_NIASHv2146A12を標的とするリバースプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号１１＞
HvGAD_4H_AK252731を標的とするフォワードプライマーの配列(5’→3’)を示す。
＜配列番号１２＞
HvGAD_4H_AK252731を標的とするリバースプライマーの配列(5’→3’)を示す。
【図１】
2013143920.tif 000006
【図２】
2013143920.tif 000007
【図３】
2013143920.tif 000008
【図４】
2013143920.tif 000009
【図５】
2013143920.tif 000010
【図６】
2013143920.tif 000011
【配列表】
2013143920000001.app