(57)【要約】【課題】プラズモン増強場を利用したセンシングにおいて、同一試料内の複数の測定箇所に対して短時間且つ高感度なセンシングを可能にする。【解決手段】センシング装置１は、励起光Ｌ１、Ｌ２が照射されることにより試料接触面１０ｓにプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体１０と、励起光Ｌ１を照射する励起光照射光学系２０と、試料Ｓに励起光を含む測定光Ｌ２を照射する測定光照射光学系３０と、測定光Ｌ２の照射により試料接触面１０ｓ上の試料Ｓから発せられ、且つ、該照射により試料接触面１０ｓに生じたプラズモン増強場により増強された信号光Ｌ３の物理特性を検出する物理特性検出系４０とを備えてなり、測定光Ｌ２を試料Ｓの複数の測定点に照射して、該複数の測定点における物理特性を検出するものであり、励起光照射光学系２０は、試料接触面１０ｓの少なくとも２つの測定点を含む領域を同時に照射可能な励起光Ｌ１を照射するものである。【選択図】図１
2013113655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被測定物質を含む試料が接触される試料接触面を有し、該試料接触面に励起光が照射されることにより該試料接触面にプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体と、
前記励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記試料に前記励起光を含む測定光を照射する測定光照射光学系と、
前記測定光の照射により前記試料接触面上の試料から発せられ、且つ、該照射により前記試料接触面に生じたプラズモン増強場により増強された信号光の物理特性を検出する物理特性検出系とを備えてなり、
前記測定光を前記試料の複数の測定点に照射して、該複数の測定点における前記物理特性を検出するものであり、
前記励起光照射光学系は、前記試料接触面の少なくとも２つの前記測定点を含む領域を同時に照射可能な前記励起光を照射するものであることを特徴とするセンシング装置。
【請求項２】
前記励起光照射光学系は、前記試料接触面の全ての前記測定点を含む領域を同時に照射可能な前記励起光を照射するものであることを特徴とする請求項１に記載のセンシング装置。
【請求項３】
前記試料接触面における前記励起光の強度が略均一であることを特徴とする請求項１又は２に記載のセンシング装置。
【請求項４】
前記励起光及び前記測定光が直線偏光であり、前記励起光の偏光方向と前記測定光の偏光方向とが略同一であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセンシング装置。
【請求項５】
前記励起光及び前記測定光が円偏光であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセンシング装置。
【請求項６】
前記試料から発せられる信号光が、蛍光、ラマン散乱光、コヒーレントアンチストークス散乱光、第二次高調波光、第三次高調波光のいずれかであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のセンシング装置。
【請求項７】
前記励起光の波長が、７００ｎｍ〜１６００ｎｍであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のセンシング装置。
【請求項８】
励起光が照射されることによりプラズモン増強場を生じる試料接触面に被測定物質を含む試料を接触させる試料接触工程と、
該試料に前記励起光を照射して、該励起光照射部分の前記試料接触面にプラズモン増強場を生じさせて、該プラズモン増強場により前記被測定物質の少なくとも一部を前記試料接触面に吸着させる吸着工程と、
該吸着工程後に、前記試料接触面上の該試料に前記励起光を含む測定光を照射して、該照射により前記試料接触面にプラズモン増強場を生じさせるとともに、前記試料から発せられる信号光の物理特性を検出する測定工程とを有するセンシング方法であって、
前記測定工程は、前記試料の複数の測定点に対して該測定点毎に実施されるものであり、
前記吸着工程において、少なくとも２つの前記測定点を含む領域に前記励起光を同時に照射することを特徴とするセンシング方法。
【請求項９】
前記吸着工程において、全ての前記測定点を含む領域に前記励起光を同時に照射することを特徴とする請求項８に記載のセンシング方法。
【請求項１０】
前記吸着工程において、前記プラズモン増強場により前記被測定物質の少なくとも一部を前記試料接触面上に配向させて吸着させることを特徴とする請求項８又は９に記載のセンシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被測定物質を含む試料を、励起光が照射されプラズモン増強場を生じさせるプラズモン活性基体と接触させた状態で、活性基体表面の被測定物質の特性を検出するセンシング装置および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光照射によりプラズモン増強場を生じうる金属微細凹凸構造等を表面に備えたプラズモン活性基体を利用して、ラマン散乱光や蛍光等の信号光を感度良く検出するセンサデバイスやそれらを用いたセンシング装置の研究開発が活発に行われている。
【０００３】
プラズモン増強場は、プラズモン増強場を生じる表面（センシング面）上が最も強く、該面からの距離に対して指数関数的にその強度が減少することが知られており、センシング時に、被測定物質がセンシング面の近くにあればあるほど高感度なセンシングを行うことができる。従って、プラズモン増強場を利用するセンシングにおいては、試料溶液中の被測定物質のセンシング面近傍における濃度をできるだけ高くすることが重要な課題の１つとなっている。
【０００４】
プラズモン活性基体のセンシング面近傍において、被測定物質濃度を高くする方法としては、例えば、センシング面上に被測定物質と特異結合するリガンドを固定しておき、リガンドに被測定物質を結合させる方法があげられる。これによりセンシング面近傍に試料中の被測定物質が固定され、高感度なセンシングを行うことできる。
【０００５】
また、特許文献１には、電気泳動法により金属膜上に被測定物質を集めることにより金属膜上における被測定物質濃度を高めて、表面プラズモン共鳴の測定を行う装置として、試料溶液中に複数の電極を設置して、この複数の電極への印加電圧を制御することにより測定箇所での被測定物質の濃度を上昇させる構成の誘電泳動検出装置が開示されている。
【０００６】
特許文献２及び特許文献３には、プラズモン増強場を生じるセンシング面に、試料溶液中の被測定物質を光捕捉効果により捕捉させる捕捉光を照射する、光捕捉光照射光学系を備えたセンシング装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2005-195397号公報
【特許文献２】特開2009-42112号公報
【特許文献３】特開2009-222484号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、リガンドを利用して被測定物質をセンシング面に固定させる方法では、リガンドと被測定物質との反応を充分に待たなければ、充分な量の結合量を確保できず、測定を迅速に実施することが難しい。しかも、リガンドと結合する物質は限られており、被測定物質の種類が限定されてしまう。
【０００９】
また、特許文献１に記載の装置では、溶液中に配置した複数の電極に対して印加電圧を制御する必要があり、また試料毎に印加電圧を調整しなければ基体表面での被測定物質濃度を高めることができないという問題がある。また、印加電圧をかける場合、被測定物質に対して電荷をチャージする必要があり、電荷をチャージすることで被測定物質の物性が変化する恐れもある。
【００１０】
特許文献２や特許文献３のように、光捕捉効果を用いて捕捉光により被測定物質をセンシング面に捕捉させてからセンシングを行う場合、被測定物質の種類の限定や印加電圧の付与をすることなくセンシング面における被測定物質の濃度を高めてセンシングを実施することができる。しかしながら、かかる方法では、複数の測定点におけるセンシングをする場合には、各測定点毎に被測定物質の光捕捉を行う必要があり、測定点の数に比例してその測定時間が増加する。従って、大面積の試料に対して面内で一様にセンシングを行う場合や、データ信頼性向上を目的として同一試料に対して光照射箇所を変えて測定を実施して複数のデータを取る場合には莫大な時間を要することになり実用的でない。
【００１１】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、光照射によりプラズモン増強場を生じうるプラズモン活性基体を利用して、ラマン散乱光や蛍光等の信号光を感度良く検出するセンシング装置において、同一試料内の複数の測定箇所に対して短時間且つ高感度に被測定物質のセンシングが可能なセンシング装置及びそれを用いたセンシング方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のセンシング装置は、被測定物質を含む試料が接触される試料接触面を有し、該試料接触面に励起光が照射されることにより該試料接触面にプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体と、
前記励起光を照射する励起光照射光学系と、
前記試料に前記励起光を含む測定光を照射する測定光照射光学系と、
前記測定光の照射により前記試料接触面上の試料から発せられ、且つ、該照射により前記試料接触面に生じたプラズモン増強場により増強された信号光の物理特性を検出する物理特性検出系とを備えてなり、
前記測定光を前記試料の複数の測定点に照射して、該複数の測定点における前記物理特性を検出するものであり、
前記励起光照射光学系は、前記試料接触面の少なくとも２つの前記測定点を含む領域を同時に照射可能な前記励起光を照射するものであることを特徴とするものである。
【００１３】
本明細書において、「測定点」とは、１回のセンシングを実施する任意の測定光照射面における点であり、１回のセンシングで測定光が照射されるスポットを意味する。
【００１４】
前記励起光照射光学系は、前記試料接触面の全ての前記測定点を含む領域を同時に照射可能な前記励起光を照射するものであることが好ましい。
【００１５】
本発明のセンシング装置において、前記励起光及び前記測定光は略同一方向の偏光を有していることが好ましく、偏光は直線偏光又は円偏光であることが好ましい。
【００１６】
また、前記励起光は、前記試料接触面における強度が略均一であることが好ましく、波長が７００ｎｍ〜１６００ｎｍであることが好ましい。ここで、「強度が略均一である」とは、試料接触面における励起光の照射領域において、強度の自乗平均平方根粗さ（ＲＭＳ）が９０％超であることを意味する。
【００１７】
本発明のセンシング装置は、前記試料から発せられる信号光が、蛍光、ラマン散乱光、コヒーレントアンチストークス散乱光、第二次高調波光、第三次高調波光のいずれかである場合に好適に用いることができる。
【００１８】
本発明のセンシング方法は、励起光が照射されることによりプラズモン増強場を生じる試料接触面に被測定物質を含む試料を接触させる試料接触工程と、
該試料に前記励起光を照射して、該励起光照射部分の前記試料接触面にプラズモン増強場を生じさせて、該プラズモン増強場により前記被測定物質の少なくとも一部を前記試料接触面に吸着させる吸着工程と、
該吸着工程後に、前記試料接触面上の該試料に前記励起光を含む測定光を照射して、該照射により前記試料接触面にプラズモン増強場を生じさせるとともに、前記試料から発せられる信号光の物理特性を検出する測定工程とを有するセンシング方法であって、
前記測定工程は、前記試料の複数の測定点に対して該測定点毎に実施されるものであり、
前記吸着工程において、少なくとも２つの前記測定点を含む領域に前記励起光を同時に照射することを特徴とするものである。
【００１９】
前記吸着工程において、全ての前記測定点を含む領域に前記励起光を同時に照射することが好ましい。また、前記プラズモン増強場により前記被測定物質の少なくとも一部を前記試料接触面上に配向させて吸着させることがより好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のセンシング装置は、プラズモン活性基体上の試料の複数の測定点においてプラズモン増強場により増強された信号光を検出してセンシングを行うものであり、プラズモンを励起する励起光照射光学系と、試料に励起光を含む測定光を照射する測定光照射光学系とをそれぞれ備え、励起光照射光学系を、試料接触面の少なくとも２つの測定点を含む領域を同時に照射可能なものとしている。かかる構成によれば、複数の測定点において同時にプラズモン増強場を生じさせて被測定物質を試料接触面に吸着させることができる上、試料接触面に被測定物質を吸着させた後に、測定光を照射して、該照射により被測定物質から発せられ、且つ、該照射により試料接触面に生じたプラズモン増強場により増強された信号光の物理特性の検出を行うことができる。従って、本発明によれば、同一試料内の複数の測定箇所に対して、短時間且つ高感度に被測定物質のセンシングを行うことができる。また、同時に照射可能な面積を大きくすることにより、大面積の試料におけるセンシングを効率的かつ高感度に実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る一実施形態のセンシング装置の概略構成図
【図２】プラズモン活性基体の好適な態様を示す厚み方向断面図
【図３】マイクロウェルプレート状のプラズモン活性基体の態様を示す厚み方向断面図
【発明を実施するための形態】
【００２２】
「センシング方法」
本発明のセンシング方法について詳述する。
【００２３】
本発明のセンシング方法は、プラズモン増強場により増強された信号光を検出するセンシング方法において、試料の複数箇所におけるセンシングを行う際に、プラズモン増強場を高効率に発生させることにより、短時間に高感度なセンシングを実現するものである。
【００２４】
本発明のセンシング方法は、励起光が照射されることによりプラズモン増強場を生じる試料接触面に被測定物質を含む試料を接触させる試料接触工程と、
該試料に励起光を照射して、励起光照射部分の試料接触面にプラズモン増強場を生じさせて、該プラズモン増強場により被測定物質の少なくとも一部を試料接触面に吸着させる吸着工程と、
該吸着工程後に、試料接触面上の試料に励起光を含む測定光を照射して、該照射により試料接触面にプラズモン増強場を生じさせるとともに、試料から発せられる信号光の物理特性を検出する測定工程とを有するセンシング方法であって、
測定工程は、試料の複数の測定点に対して該測定点毎に実施されるものであり、
吸着工程において、少なくとも２つの測定点を含む領域に励起光を同時に照射することを特徴としている。
【００２５】
プラズモン増強場は、プラズモンが励起されている面からの距離に対して指数関数的にその強度が減少する。従って、効果的に信号光を増強するためには、より被測定物質をプラズモン励起される試料接触面に近づけておく必要がある。
【００２６】
本発明では、測定工程の前に、被測定物質をプラズモン増強場の電場勾配により試料接触面に引き寄せ、少なくとも一部を試料接触面に吸着させる吸着工程を実施し、この吸着工程を少なくとも２つの複数の測定点において同時に実施する。
【００２７】
被測定物質の試料接触面における吸着は、物理吸着、化学吸着、静電吸着のいずれであってもよい。被測定物質が、試料接触面に吸着しにくい物質である場合は、被測定物質及び／又は試料接触面に官能基を付与する修飾等を施せばよい。
【００２８】
吸着態様が物理吸着である場合は、吸着工程後、測定工程を実施する際に、吸着させた被測定物質が吸着状態でなくなることもあるが、一度吸着した被測定物質であれば、測定工程における測定光照射により生じるプラズモン増強場による電場増強効果を充分に受けられる領域に存在した状態で測定工程を実施することができる。
【００２９】
より強固な吸着状態とするには、化学吸着させることが好ましい。被測定物質が試料接触面を構成する物質と化学反応性を有する場合（例えば、試料接触面の金属がＡｕであり、被測定物質が試料中においてＳ２−を有する場合等）は、化学吸着となりうるが、そうでない場合は、試料接触面及び／又は被測定物質に化学結合可能な表面修飾を施しておけばよい。しかしながら、物理吸着や静電吸着であっても、本発明のセンシング方法においては充分に高感度なセンシングを実施することができる。
【００３０】
被測定物質が非対称性を有する場合は、励起光として直線偏光を用いることによりプラズモン増強場により被測定物質を試料接触面上に配向させて吸着させることができる。かかる態様とし、測定光として励起光と同じ偏光方向の直線偏光を用いることで、より高感度なセンシングが可能となる。
【００３１】
ただし、ラマン分光法によるセンシング等、配向によりスペクトル内のピークが特異的に変化してしまう場合は、被測定物質が配向して吸着されないように、例えば、励起光及び測定光として円偏光を用いる等工夫することが好ましい。
【００３２】
上記のとおり、吸着工程を複数の測定点において同時に実施するが、より大面積な測定領域に対して高感度なセンシングを短時間に実施するためには、吸着工程において全ての測定点を含む領域に励起光を同時に照射することが好ましい。
【００３３】
測定領域が広く、同時に励起光を照射することが難しい場合は、同時に励起光照射可能な領域において吸着工程を実施した後、励起光照射位置を吸着工程未実施領域に移動させて同様に吸着工程を実施し、測定領域全体において吸着工程が完了した後に測定工程を実施することが好ましい。
【００３４】
励起光は、試料接触面における強度が略均一であることが好ましく、また、波長７００ｎｍ〜１６００ｎｍの光であることが好ましい。
【００３５】
吸着工程は、試料中の被検出物質の少なくとも一部が、プラズモン活性基体の試料接触面に吸着されるまで、励起光を試料に照射すればよいが、測定精度の向上の観点から、できるだけ広い領域において多くの被検出物質が吸着されるまで実施することが好ましい。
【００３６】
吸着に要する時間は、例えば、信号光がラマン散乱光である場合は、被検出物質のラマン誘導放出断面積や濃度によって変わるため、これらの数値、及び、使用する光源の出力、ビーム径等を考慮して吸着時間は調整する必要がある。最大出力３００ｍＷ、ピーク波長８０８ｎｍのシングルモード半導体レーザを用いて、直径約１０ｍｍにビーム径を拡大した後、拡散板にてビーム面内強度を一様化した励起光により吸着工程を実施する場合は、２〜５分程度照射すればよい。
【００３７】
測定工程は、吸着工程後に、試料接触面上の試料に励起光を含む測定光を照射して、該照射により試料接触面にプラズモン増強場を生じさせるとともに、試料から発せられる信号光の物理特性を検出するものである。
【００３８】
本発明のセンシング方法では、複数の測定点においてセンシングを行うものであり、測定工程は、試料の複数の測定点に対して測定点毎に実施する。
【００３９】
測定工程において、検出する信号光及びその物理特性は特に制限されない。信号光としては、例えば、ラマン散乱光、蛍光、コヒーレントアンチストークス光、レイリー散乱光、ミー散乱光、第２高調波光、第３次高調波光等が挙げられ、本発明のセンシング方法は、信号光に応じた物理特性を検出するセンシングに適用することができる。例えば、信号光がラマン散乱光である場合は、ラマン散乱光から得られるラマンスペクトル（物理特性）から物質固有の波長シフトを検出することにより被測定物質を特定することができる。
【００４０】
以下に、本発明のセンシング方法に好適な、本発明のセンシング装置について、信号光がラマン散乱光であるラマン分光装置を例に説明する。
【００４１】
「センシング装置」
図面を参照して本発明に係る一実施形態のセンシング装置について説明する。図１は、本実施形態のセンシング装置（ラマン分光装置）の概略構成図である。本明細書の図面において、各構成要素の縮尺は、視認しやすくするため適宜変更して示してある。
【００４２】
ラマン分光装置（センシング装置）１は、被測定物質Ｒを含む試料Ｓが接触される試料接触面１０ｓを有し、励起光Ｌ１が照射されることにより試料接触面１０ｓにプラズモン増強場を生じるプラズモン活性基体１０と、励起光Ｌ１を照射する励起光照射光学系２０と、試料Ｓに励起光を含む測定光Ｌ２を照射する測定光照射光学系３０と、測定光Ｌ２の照射により試料接触面１０ｓ上の試料Ｓから発せられ、且つ、該照射により前記試料接触面に生じたプラズモン増強場により増強された信号光（ラマン散乱光）Ｌ３の物理特性を検出する物理特性検出系４０とを備えてなり、測定光Ｌ２を試料Ｓの複数の測定点に照射して、複数の測定点におけるラマン散乱光Ｌ３のラマンスペクトル（物理特性）を検出するものである。ラマン分光装置１において、励起光照射光学系２０は、試料接触面１０ｓの少なくとも２つの測定点を含む領域を同時に照射可能な励起光Ｌ１を照射するものである。
【００４３】
図１に示されるラマン分光装置１は、プラズモン活性基体１０の試料接触面１０ｓ上に裁置された試料Ｓに対して、励起光照射光学系２０を用いて上記本発明のセンシング方法における吸着工程を実施した後に、励起光Ｌ１の照射を解除し、測定光照射光学系３０により励起光を含む測定光Ｌ２を照射して、該照射により試料接触面１０ｓにおいてプラズモン増強場を生じさせるとともに、試料Ｓから発せられるラマン散乱光Ｌ３のラマンスペクトル（物理特性）を物理特性検出系３０により検出する測定工程を実施するものである。
【００４４】
図１に示されるラマン分光装置１では、励起光照射光学系２０が試料接触面１０ｓの全ての測定点を含む領域を同時に照射可能な励起光Ｌ１を照射し、上記本発明のセンシング方法における吸着工程を実施する態様を示してあるが、プラズモン活性基体１０を図示ｘ軸方向に相対的に移動させることができる走査手段を備えておくことにより、同時に全ての測定点を含む領域を照射できない場合であっても、励起光Ｌ１の照射位置を変えて吸着工程を実施することにより、測定工程前に、全ての測定点を含む領域の吸着工程を実施することができる。走査手段としては、例えば、ガルバノミラー等の励起光Ｌ１を走査させるものであってもよいし、プラズモン活性基体１０をｘ方向に可動とするものであってもよい。
【００４５】
なお、図１において、個々の測定点については図示していないが、測定光Ｌ２が試料接触面１０ｓにて集光している点が１つの測定点である。
【００４６】
また、ラマン分光装置１は、プラズモン活性基体１０の裏面からラマン散乱光を検出する構成としている。かかる構成とすることにより、試料Ｓ中に細胞のような大きな検体を配し、検体からしみだす被検出物質Ｒを検出するような場合に、試料接触面１０ｓと被検出物質Ｒとの界面で最も強く生じる増強ラマン散乱光が検体自身により遮蔽されることなく基体１０の裏面側から検出することができる。
【００４７】
以下、ラマン分光装置１の各構成要素について説明する。
【００４８】
本実施形態において、試料Ｓを裁置するプラズモン活性基体１０は、試料接触面１０ｓが、励起光Ｌ１によりプラズモンが励起されうる基体であり、基体１０の裏面側から測定光Ｌ２の照射及びラマン散乱光Ｌ３の検出を実施可能なものであれば特に制限されない。
【００４９】
プラズモンは、金属の自由電子が光の電場に共鳴して振動することで励起されるものであり、微細な凹凸構造を有する金属層等では、凸部の自由電子が光の電場に共鳴して振動することで凸部周辺に強い電場を生じ、局在プラズモン共鳴が効果的に起こるとされている。
【００５０】
図２は、プラズモン活性基体１０の好適な態様の一例を示す厚み方向断面図である。図２に示されるように、プラズモン活性基体１０は、透明基板１１と、透明基板１１の表面に備えられた微細凹凸構造１２と、その微細凹凸構造１２表面に形成された金属膜１３とからなる。金属膜１３が微細凹凸構造１２に沿って形成されて金属の微細凹凸構造を構成するものとなり、表面に金属微細凹凸構造を備えた、局在プラズモン共鳴による光電増強効果を得ることが可能な光電場増強デバイスとして機能するものである。
【００５１】
本実施形態のように、試料接触面１０ｓの裏面側から励起光Ｌ１又は測定光Ｌ２の照射、あるいはラマン散乱光Ｌ３の検出を実施する場合、プラズモン活性面各光に対して透光性を有する必要がある。ここでいう透光性は、励起光Ｌ１であればプラズモン励起が可能な強度、測定光Ｌ２であれば高感度検出が可能なラマン散乱光の励起が可能な強度、そしてラマン散乱光Ｌ３であれば、光検出部４１において高感度な検出が可能な強度を、基体１０から出射後にそれぞれ有するような透光性とする。
【００５２】
このように、プラズモン活性基体１０に透明基板１１を用いることにより、金属膜１３の表面側、あるいは透明基板１１の裏面側のいずれからでも光を照射することができ、また、この光の照射により試料から生じた光についても、金属膜１３の表面側あるいは透明基板１１の裏面側のいずれからでも検出することができる。そのため、被検出物質の種類、サイズ等に応じて、励起光Ｌ１、測定光Ｌ２の照射、ラマン散乱光Ｌ３の検出を金属膜１３の表面側あるいは透明基板１１の裏面側のいずれからでも行うことができるので、測定における自由度が高く、より高いＳ／Ｎで検出することが可能となる。
【００５３】
透明基板１１としては特に制限されず、ガラスや透明樹脂等から選択することができる。
【００５４】
微細凹凸構造１２は、この微細凹凸構造１２表面に金属膜１３が形成されて構成される金属微細構造の表面においてプラズモンを生じうる構造であればよいが、凹凸の凸部の平均的な大きさおよび平均ピッチが励起光の波長より短いものとなる程度の微細な凹凸構造であることが好ましい。特には、微細凹凸構造１２は、凸部頂点から隣接する凹部の底部までの平均深さが２００ｎｍ以下、凹部を隔てた最隣接凸部の頂点同士の平均ピッチが２００ｎｍ以下であることが望ましい。凹凸の平均ピッチは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により撮影された表面画像を、画像処理により２値化して統計的処理によって求めるものとする。
【００５５】
かかる微細凹凸構造１２としては、上記透光性を有していればその材質及びその製造方法は特に制限されないが、ベーマイト層や陽極酸化アルミナ層が好ましい。また、微細凹凸構造１２は透明基板１１と異なる材料により構成されたもののみならず、透明基板本体の表面を加工することにより基板本体と同一の材料により構成されていてもよい。例えば、ガラス基板の表面をリソグラフィーとドライエッチング処理することにより、表面に微細凹凸構造を形成して用いてもよい。
【００５６】
特に、製造が容易で低コストであることから、微細凹凸構造１２はベーマイト層がより好ましい。ベーマイトとは、アルミニウムの水和物である。透明基板１１上へのベーマイト層１２の形成は、例えば、純水洗浄した透明基板１１を用意し、その表面にスパッタ法によりアルミニウムを数十ｎｍ程度成膜した後、純水を沸騰させた中に、アルミニウム付き透明基板１１を浸水させ、数分（５分程度）後に取り出す（煮沸処理（ベーマイト処理））ことにより実施することができる。
【００５７】
金属膜１３は、励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じうる金属からなるものであればよいが、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ａｌ、Ｐｔ、およびこれらを主成分とする合金からなる群より選択される少なくとも１種の金属からなるものである。特には、ＡｕあるいはＡｇが好ましい。ここで主成分とは、含量９０質量％以上の成分を意味する。
【００５８】
金属膜１３の膜厚は、微細凹凸構造１２の表面に形成されたときに、金属微細凹凸構造として励起光の照射を受けて局在プラズモンを生じうる凹凸形状を維持することができる程度の厚みであれば特に制限はないが、１０〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００５９】
金属膜１３は、微細凹凸構造１２上に蒸着等により成膜すればよい。
【００６０】
プラズモン活性基体１０は、図３に示されるようなマイクロウェルプレートの態様としてもよい。かかる態様とすることにより、複数のウェルに注入された試料Ｓに対して同時に吸着工程を実施し、短時間に高感度なセンシングを実施することができる。
【００６１】
一般的なマイクロウェルプレートは、例えば上面視面積１００ｍｍ×５０ｍｍ程度の大きさを有し、ウェル数９６個のもの等が挙げられることから、本発明を適用することにより測定効率を劇的に向上させることができる。
【００６２】
マイクロウェルプレート状プラズモン活性基体１０は、例えば、透明基板１１とその上に配された微細凹凸構造１２及び金属膜１３を備えた構成となっている。マイクロウェルプレート状プラズモン活性基体１０では、金属微細凹凸構造は試料接触面となる各ウェルの表面にのみ形成されていればよい。
【００６３】
励起光照射光学系２０は、励起光源２１と、励起光源２１から出射された励起光Ｌ１をプラズモン活性基体１０方向に導くミラー２２と、励起光Ｌ１のビーム径を拡げて試料Ｓ全体に同時に励起光Ｌ１を照射可能にするビームエクスパンダー２３と、ビームエクスパンダー２３によりビーム径が拡大された励起光Ｌ１の、試料接触面１０ｓにおける強度を均一化する拡散板２４とから構成されている。
【００６４】
ビームエクスパンダー２３は、所望のビーム径となるように拡大可能な構成であれば特に制限されないが、例えば曲率の異なる２種のレンズにより構成することができる。特に、上記マイクロウェルプレート状のプラズモン活性基体に適用する場合等の拡大率が大きい場合は、曲率の異なる２種類のシリンドリカルレンズを用いて、ビーム形状の一軸を拡大してビーム形状を楕円化することが好ましい。
【００６５】
励起光源２１としては、プラズモン活性基体１０の試料接触面１０ｓにプラズモンを励起可能な波長を含む光を射出する光源であれば特に制限されない。プラズモンを励起するのに好適な波長は、プラズモン活性基体１０において、プラズモンを励起する金属の種類に応じて異なることから、金属の種類に応じて、好適な波長の光源を選択することが好ましい。被測定物質Ｒが生体物質である場合は、できるだけダメージを与えない方が好ましいことから、エネルギーの比較的低い７００ｎｍ〜２μｍの可視〜近赤外光であることが好ましい。
【００６６】
測定光照射光学系（ラマン散乱励起光照射光学系）３０は、励起光を含む測定光（ラマン散乱励起光）Ｌ２を射出する光源３１と、光Ｌ２をプラズモン活性基体１０の試料接触面１０ｓへ導くミラー３２〜３４と、ミラー３４により反射された光Ｌ２をプラズモン活性基体１０の試料Ｓが載置された領域に集光するレンズ３５とを備えている。
【００６７】
なお、ミラー３３（４３）は、測定光Ｌ２を反射し、且つ、測定光Ｌ２の照射により試料Ｓの被検出物質Ｒから生じ増強されたラマン散乱光Ｌ３を含むプラズモン活性基体１０側からの光を光検出部（分光器）４１側へ透過するダイクロイックミラーとなっている。
【００６８】
ラマン分光法において、測定光Ｌ２の光源３１は、特定波長の光を射出するレーザ等の単波長光源であり、分布帰還型（ＤＦＢ）半導体レーザ等を好ましく用いることができる。
【００６９】
測定光Ｌ２の照射により、プラズモン活性基体１０の試料接触面１０ｓにはプラズモンが励起され、プラズモン増強場を生じると共に、被測定物質Ｒが含まれる試料Ｓにおいてラマン散乱光Ｌ３が含まれる光（散乱光等）を生じる。ラマン散乱光Ｌ３を含む光は、生じたプラズモン増強場により増強されたものとなる。
【００７０】
ラマン分光装置１は、複数の測定点に対して測定を実施するものである。ラマン分光装置１において、測定点（測定光Ｌ２の試料接触面１０ｓにおける集光位置）の移動を、手動により実施する態様としてもよいが、図示ｘ方向に相対的に移動させることができる走査手段を備えていることが好ましい。走査手段としては、例えば、ガルバノミラー等の測定光Ｌ２を走査させるものであってもよいし、プラズモン活性基体１０をｘ方向に可動とするものであってもよい。
【００７１】
物理特性検出系４０は、被測定物質Ｒ由来のラマン散乱光を含む、試料Ｓから発せられたラマン散乱光Ｌ３を含む光をダイクロイックミラー４３へ導くレンズ４５及びミラー４４と、ダイクロイックミラー４３から透過してきたラマン散乱光Ｌ３を含む光のうち、測定光Ｌ２の波長の光を吸収し、それ以外の光を透過するノッチフィルタ４６と、ノイズ光を除去するためのピンホールを備えたピンホール板４８と、ノッチフィルタ４６を透過したラマン散乱光Ｌ３を含む光をピンホール板４８のピンホールに集光するためのレンズ４７と、ピンホールを通ってきたラマン散乱光Ｌ３を平行光化して光検出部（分光器）４１へ導くレンズ４９と、ラマン散乱光Ｌ３を分光してラマンスペクトルを得る光検出部（分光器）４１とを備えている。
【００７２】
図１において、わかりやすくするためにラマン散乱光Ｌ３を含む光をＬ３と表示し、ラマン散乱光Ｌ３を含む光と測定光Ｌ２の経路を同じで表示したが、実際、ラマン散乱光Ｌ３を含む光には、測定光Ｌ２の反射光、試料Ｓにおけるラマン散乱光、レイリー散乱光、ミー散乱光等の様々な光が含まれているため、ラマン散乱光Ｌ３を含む光は、レンズ４５に図示されている角度よりも幅広い角度で入射される。従って、ダイクロイックミラー４３にて、全ての測定光Ｌ２と同じ波長の光を反射することはできない。
【００７３】
ノッチフィルタ４６は、ダイクロイックミラー４３を透過してきた測定光Ｌ２と同じ波長の光（反射光、レイリー散乱光、ミー散乱光等）をカットするものである。励起光とは波長が異なる光（ラマン散乱光）はノッチフィルタ４６を透過し、レンズ４７で集光され、ピンホール４８を通り、再度レンズ４９により平行光化され、分光器４１へ入射され、ラマンスペクトル（物理特性）の検出がなされる。
【００７４】
以上のように、ラマン分光装置（センシング装置）１は構成されている。
【００７５】
ラマン分光装置（センシング装置）１は、プラズモン活性基体１０上の試料Ｓの複数の測定点においてプラズモン増強場におより増強された信号光Ｌ３を検出してセンシングを行うものであり、プラズモンを励起する励起光照射光学系２０と、試料Ｓに励起光を含む測定光Ｌ２を照射する測定光照射光学系３０とをそれぞれ備え、励起光照射光学系２０を、試料接触面１０ｓの少なくとも２つの測定点を含む領域を同時に照射可能なものとしている。かかる構成によれば、複数の測定点において同時にプラズモン増強場を生じさせて被測定物質Ｒを試料接触面１０ｓに吸着させることができる上、試料接触面１０ｓに被測定物質Ｒを吸着させた後に、該照射により被測定物質Ｒから発せられ、且つ、該照射により試料接触面１０ｓに生じたプラズモン増強場により増強されたラマン散乱光（信号光）Ｌ３のラマンスペクトル（物理特性）を検出することができる。従って、本発明によれば、同一試料内の複数の測定箇所に対して、短時間且つ高感度に被測定物質のセンシングを行うことができる。また、同時に照射可能な面積を大きくすることにより、大面積の試料におけるセンシングを効率的かつ高感度に実施することができる。
【００７６】
「設計変更」
上記実施形態では、信号光がラマン散乱光であるラマン分光装置について説明したが、信号光は、ラマン散乱光に限定されず、蛍光、コヒーレントアンチストークス光、レイリー散乱光、ミー散乱光、第２次高調波、第３次高調波光等とし、それに応じた物理特性を検出する装置に適用することができる。例えば、蛍光の場合はその蛍光に合わせたフィルターを用い、検出器として冷却ＣＣＤや光電子増倍管（ＰＭＴ）等を用いることで、シンプルな光学系でセンシングを行うことができる。
【００７７】
また、上記実施形態では、試料接触面にプラズモンを励起する励起光が、試料が裁置されている試料接触面全体を同時に照射可能な態様について説明したが、少なくとも２つの複数の測定点を同時照射する態様とするだけでも本発明の効果を得ることができる。その際は、全ての測定点において吸着工程を実施した後に測定工程を実施してもよいし、１回の吸着工程の後に測定工程を実施し、測定工程終了後に励起光照射領域をずらして該領域の吸着工程及び測定工程を実施してもよい。
【００７８】
また、上記実施形態では、プラズモン活性基体の試料接触面とは逆側（プラズモン活性基体の裏面）から励起光及び測定光を入射し、ラマン散乱光（信号光）を検出する態様について説明したが、試料接触面側から励起光、測定光の入射及び／又はラマン散乱光の検出を行う態様としてもよい。
【符号の説明】
【００７９】
１  センシング装置（ラマン分光装置）
１０  プラズモン活性基体
１０ｓ  試料接触面
１１  基板（透明基板）
１２  微細凹凸構造（ベーマイト層）
１３  金属膜
２０  励起光照射光学系
３０  測定光照射光学系
４０  物理特性検出系
Ｓ  試料
Ｒ  被測定物質
Ｌ１  励起光
Ｌ２  測定光
Ｌ３  信号光（ラマン散乱光）
【図１】
2013113655.tif 000003
【図２】
2013113655.tif 000004
【図３】
2013113655.tif 000005