(57)【要約】【課題】試料由来のラマン散乱光をより高感度に検出するためのラマン散乱光測定方法の提供。【解決手段】容器内に配された該容器と異なる材質のシート部材上の試料に励起光を照射してラマン散乱光を検出する検出手順を含む、ラマン散乱光測定方法を提供する。このラマン散乱光測定方法においては、試料が収容されている容器由来のラマン散乱光の検出が低減され、試料由来のラマン散乱光の測定を、より高感度に行うことが可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内に配された該容器と異なる材質のシート部材上の試料に励起光を照射してラマン散乱光を検出する検出手順を含む、
ラマン散乱光測定方法。
【請求項２】
前記検出手順の前に、前記容器の底面に、該底面の基材と異なる材質の前記シート部材を設ける設置手順を含む、
請求項１記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項３】
前記試料が生細胞である、請求項１記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項４】
前記生細胞を前記シート部材表面で培養する、試料の収容手順を含む、
請求項３記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項５】
前記シート部材が、ベンゼン環を含まない、アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂、シリコン系樹脂、から選択される少なくとも１種類以上の樹脂からなる、
請求項２記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項６】
前記シート部材が、多糖類、糖鎖又は脂質から選択される少なくとも１種類以上の物質を含む、
請求項２記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項７】
前記シート部材がゲル状物質である、請求項２記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項８】
前記ゲル状物質が細胞外基質を構成するタンパク質である、
請求項７記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項９】
前記シート部材の厚みが０．５ｍｍ以上である、請求項５記載のラマン散乱光測定方法。
【請求項１０】
試料を収容する空間を有し、該空間の底面に該底面の基材と異なる材質のシート部材が設けられた、
ラマン散乱光測定試料用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、ラマン散乱光の測定方法に関する。より詳しくは、試料由来のラマン散乱光を感度良く検出可能とするラマン散乱光の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質に光を照射すると、照射光と同じ波長の散乱光の他に、照射光の波長と異なる波長の光が生じる。これは、物質に含まれる分子が照射光により振動励起状態に励起されることによって、照射光のエネルギーの一部が分子に移り、照射光の波長が変化したためである。照射光と異なる波長に変化した散乱光を「ラマン散乱光」と言う。ラマン散乱光における波長のシフトの程度は、光を照射された物質に含まれる分子の固有の振動に基づくため、ラマン散乱光を検出し、波長ごとに強度を測定して、得られたラマンスペクトルを解析することによって、物質に含まれる分子や、物質の状態を同定することが可能である。
【０００３】
ラマンスペクトルを利用した分析方法における分析対象は、高分子材料や金属化合物、半導体等、多岐に渡る。近年では、ヒト由来の組織や細胞といった、生体試料に対してもラマン散乱光を利用した解析が行われている。
【０００４】
ラマンスペクトルによる生体試料の解析としては、例えば、臨床診断に利用するための技術が開示されている。特許文献１においては、ヒトの癌組織及び正常組織から得られたラマンスペクトルのデータを集め、各々の組織について標準データを作成し、標準データに基づき、癌の診断が行われる。
【０００５】
また、臨床診断の他にも、生体試料として培養細胞における分析にラマンスペクトルを利用する技術も開示されている。例えば特許文献２においては、細胞分裂やアポトーシスなど、培養細胞に生じる変化について、各々の培養細胞由来のラマンスペクトルを分析し、細胞内での変化を解析している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３００６１１号公報
【特許文献２】特表２００５−５３２５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本技術は、試料由来のラマン散乱光をより高感度に検出するためのラマン散乱光測定方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題解決のため、本技術は、容器内に配された該容器と異なる材質のシート部材上の試料に励起光を照射してラマン散乱光を検出する検出手順を含む、ラマン散乱光測定方法を提供する。前記検出手順の前に、前記容器の底面に、該底面の基材と異なる材質の前記シート部材を設ける設置手順を含む、ラマン散乱光測定方法であっても良い。また、前記試料は生細胞であっても良く、前記生細胞を前記シート部材表面で培養する、試料の収容手順を含む、ラマン散乱光測定方法であっても良い。
【０００９】
前記シート部材が、ベンゼン環を含まない、アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂、シリコン系樹脂、から選択される少なくとも１種類以上の樹脂からなる、ラマン散乱光測定方法とすることもできる。また、前記シート部材が、多糖類、糖鎖又は脂質から選択される少なくとも１種類以上の物質を含む、ラマン散乱光測定方法とすることもできる。その他、前記シート部材がゲル状物質である、ラマン散乱光測定方法であっても良い。また、前記ゲル状物質が細胞外基質を構成するタンパク質とすることもできる。更に、前記シート部材の厚みは、０．５ｍｍ以上とすることもできる。
【００１０】
本技術はまた、試料を収容する空間を有し、該空間の底面に該底面の基材と異なる材質のシート部材が設けられた、ラマン散乱光測定試料用容器を提供する。本技術に係るラマン散乱光測定方法及びラマン散乱光測定試料用容器によって、容器に収容された試料の測定において、ラマン散乱光がより高感度に検出される。
【発明の効果】
【００１１】
本技術により、高い感度で試料由来のラマン散乱光を測定可能なラマン散乱光測定方法及びラマン散乱光測定試料用容器が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本技術に係るラマン散乱光測定方法の手順を説明するためのフローチャートである。
【図２】容器の底面へのシート部材の設置手順について説明するための模式図である。
【図３】試料の容器への収容手順について説明するための模式図である。
【図４】試料の励起手順について説明するための模式図である。
【図５】試料から放出されるラマン散乱光の検出手順を説明するための模式図である。
【図６】試料用容器由来のラマン散乱光の測定結果を示す図面代用グラフである（実施例１）。
【図７】シート部材（コラーゲンゲル）の設置による試料用容器由来ラマン散乱光の強度変化を示す図面代用グラフである（実施例２）。
【図８】シート部材（コラーゲンゲル）設置後の試料用容器における試料のラマン散乱光の測定結果を示す図面代用グラフである（実施例３）。
【図９】シート部材（ＰＤＭＳ）の設置による試料用容器由来ラマン散乱光の強度変化を示す図面代用グラフである（実施例４）
【図１０】シート部材（ＰＤＭＳ）設置後の試料用容器における試料のラマン散乱光の測定結果を示す図面代用グラフである（実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．本技術に係るラマン散乱光測定方法における試料の準備
（１−１）シート部材の設置
（１−２）試料の収容
２．本技術に係るラマン散乱光測定方法における試料の測定
（２−１）試料の励起
（２−２）ラマン散乱光検出
【００１４】
１．本技術に係るラマン散乱光測定方法における試料の準備
本技術に係るラマン散乱光測定方法について、図１に示すフローチャートに則して説明する。図１に示す手順Ｓ１からＳ４は、試料の準備と試料の測定という２段階に分けることができる。先ず、試料の準備としての手順である、シート部材の設置（Ｓ１）及び試料の収容（Ｓ２）について説明する。
【００１５】
（１−１）シート部材の設置
図１中、符号Ｓ１は、ラマン散乱光の測定対象の試料を測定時に収容する容器である、ラマン散乱光測定試料用容器（以下、試料用容器、とも称する）の底面にシート部材を設置する手順である。図２に、本技術に係るラマン散乱光測定方法において使用する試料用容器を示す。符号１で示す試料用容器は、内部に試料を収容するための空間Ｅを有している。手順Ｓ１においては、空間Ｅに接する容器底面１１に、容器底面１１の基材と異なる材質のシート部材２を設置する。
【００１６】
シート部材２は、後述するラマン散乱光の検出のため、光透過性を有していることが好ましい。また、シート部材２は、試料由来のラマン散乱光をより高感度に検出するために、放出するラマン散乱光の強度が試料由来のラマン散乱光に比して高くない、又は放出するラマン散乱光のスペクトルが、試料由来のラマンスペクトルと重ならない材質から構成されていることが好ましい。
【００１７】
シート部材２の材質としては、例えば、合成樹脂からなるものであっても良い。合成樹脂としては、ベンゼン環等、ラマン散乱光が放出される構造を有していない材質が好適である。このような特徴を有する合成樹脂としては、アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂、シリコン系樹脂等が挙げられ、具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリジメチルシロキサンなどである。特に、ポリジメチルシロキサンが好適である。また、シート部材２には、弾性を有する材質を用いても良い。
【００１８】
シート部材２の材質としては、例えば、測定対象が生体試料である場合、アミドを含まない材質からなるものであることが好ましい。シート部材２にアミドが含まれないことによって、シート部材２由来のラマンスペクトルと試料由来のラマンスペクトルが重ならず、試料由来のラマンスペクトルをより高感度で測定することが可能となる。アミドを含まない材質としては、例えば、多糖類、糖鎖、脂質であり、具体的には、アガロース、セルロース、ヒアルロン酸等である。
【００１９】
シート部材２の材質としては、上記の材質の他、ゲル状物質も好適である。ラマン散乱光は、放出する物質の構造に規則性があるほど、構造を反映した各々の波長のラマン散乱光にスペクトルが収れんし、強度が高く測定される。つまり、分子の結合状態に規則性が少ないゲル状態の物質の方が、ラマンスペクトルで示される各々の波長の強度が低下し、試料由来のラマン散乱光の測定の阻害が低減される。
【００２０】
ゲル状物質は、液体成分とそれを保持するためのゲル化成分とから構成されるが、シート部材２に含まれるゲル化の成分としては、合成高分子であるポリアクリル酸や、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外基質を構成するタンパク質、アガロース等の多糖類が挙げられる。
【００２１】
本技術に係るラマン散乱光測定方法においては、アモルファスの状態のシート部材２を用いることも好ましい。本技術において、アモルファスとは、固体を構成する原子や分子等が三次元的に規則性が少なく、結晶構造を有していない状態と定義する。アモルファス状態の材料も含め、上述したゲル状の材料、又は膨潤した状態にある材料、弾性を有する材料のように、分子構造の対称性や規則性が崩れた材質のものをシート部材２に用いることが好ましい。
【００２２】
本技術に係るラマン散乱光測定方法におけるシート部材２の材質は、上述した特徴を有するものの中から、試料用容器１内に収容する試料に合わせて選択すれば良い。例えば、試料が接着性の培養細胞である場合は、シート部材表面２１と細胞の接着性等の理由から、シート部材２として、コラーゲンなどの細胞外基質を構成するタンパク質を選んでも良い。また、合成樹脂からなるシート部材２と細胞との接着性を高めるために、シート部材表面２１に細胞外基質を構成するタンパク質を積層しても良い。
【００２３】
上記の何れの材質で構成されるシート部材２であっても、試料用容器１由来のラマン散乱光の検出を低下させるためには、シート部材２の厚みｔは、０．５ｍｍ以上であることが好ましい。また、ラマン散乱光の測定以外に、試料を光学的に観察する必要がある場合、試料用容器１の容器底面１１を構成する基材の厚みとシート部材２の厚みの合計が、対物レンズ４（図４参照）に備えられた補正環の補正範囲を超えない程度とすることが好ましい。シート部材２が上記範囲より薄い場合、後述する試料用容器１由来のラマン散乱光の低減が困難になる。一方、試料用容器１の容器底面１１を構成する基材の厚みとシート部材２の厚みの合計が、補正環の補正範囲を超えた場合、試料の観察において球面収差が生じ、得られる観察画像が不鮮明となる。
【００２４】
シート部材２が設置される試料用容器１は、少なくもシート部材２が設置される容器底面１１が光透過性を有する材質で構成されていれば良く、ガラス、合成樹脂等、広く一般的に容器に用いられる材質を利用することができる。例えば、生体試料を測定する場合、病原菌等の感染の懸念から、ディスポーザブルユーズ（使い捨て）として使用し易い合成樹脂からなる試料用容器１が好適である。
【００２５】
なお、図２に示す試料用容器１では、試料を収容する空間Ｅは１つであるが、本技術に係るラマン散乱光測定試料用容器は、これに限定されず、一の試料用容器１に複数の空間Ｅが設けられた構成であっても良く、各々の容器底面１１には異なる材質で構成されたシート部材２が設置されても良い。
【００２６】
シート部材２の容器底面１１への設置は、シート部材２の塗布によって行うことができる。コラーゲン等の細胞外基質を構成するタンパク質をシート部材２として用いる場合は、タンパク質を含む溶液を空間Ｅに滴下するなどして流し入れ、試料用容器１を静置し、シート部材２を容器底面１１に接着させても良い。また、ＰＤＭＳ等の合成樹脂をシート部材２として用いる場合は、空間Ｅで合成樹脂を重合し、容器底面１１に積層しても良い。その他、別体としてシート部材２を作製し、空間Ｅへ嵌め込むなどして、設置しても良い。シート部材２の設置方法は、選択したシート部材２と試料用容器１の材質に合わせ、公知の方法から選択すれば良い。
【００２７】
（１−２）試料の収容
図１中、符号Ｓ２は、試料用容器１内の空間Ｅに、試料を収容する手順である。図３は、手順Ｓ２によって試料Ｓが試料用容器１に収容された状態を示す。
【００２８】
図３に示すように、試料用容器１には、手順Ｓ１で設置されたシート部材２が容器底面１１の上に積層されている。ラマン散乱光の測定対象である試料Ｓは、試料用容器１の空間Ｅに収容され、試料Ｓはその一部がシート部材表面２１に接している。この結果、試料Ｓについて、シート部材２の厚みｔ（図１参照）だけ、試料用容器１の容器底面１１から離れた位置でラマン散乱光を測定することが可能となる。
【００２９】
本技術に係るラマン散乱光測定方法における試料Ｓは、有機物、又は無機物の何れであっても良い。試料Ｓの状態についても、固体、液体、又は固体と液体の混合の何れであっても良い。測定対象としては、例えば生体試料が好適であり、特に培養細胞が好適である。
【００３０】
試料Ｓが培養細胞の場合、本技術に係るラマン散乱光測定方法の手順Ｓ２の収容手順として、シート部材表面２１に細胞を播種し、試料用容器１の空間Ｅで培養を行う。図３においては省略されているが、細胞の培養のために、空間Ｅが培養液で満たされていても良い。ラマン散乱光を測定する時期になった細胞は、測定試料用容器１で培養されているため、容器を替えることなく、ラマン散乱光の測定が可能である。すなわち、試料用容器１を用いて、生細胞におけるラマン散乱光を測定することができる。
【００３１】
本技術に係るラマン散乱光測定方法において、測定対象とする細胞は、接着細胞、浮遊細胞の何れであっても良く、試料用容器１内での培養方法は、公知の手法を用い、各々の培養細胞に適した培養液や培養温度等を選択すれば良い。図３においては省略されているが、培養細胞等の試料Ｓを試料用容器１に収容した後、培養細胞への汚染防止等の目的で、試料用容器１に蓋を施しても良い。
【００３２】
なお、本技術に係るラマン散乱光測定方法は、図１に示す手順Ｓ１を省略して、予めシート部材２が設置された試料用容器１を入手し、手順Ｓ２からとすることも可能である。
【００３３】
２．本技術に係るラマン散乱光測定方法における試料の測定
次に、図１に示す試料の測定のための手順である、試料の励起（Ｓ３）とラマン散乱光検出（Ｓ４）について説明する。
【００３４】
（２−１）試料の励起
図１中、符号Ｓ３は、試料用容器１に収容された試料Ｓに励起光Ｌ１を照射し、試料Ｓを励起する手順である。図４は、手順Ｓ３によって、光源３から発せられる、矢印で示す励起光Ｌ１が対物レンズ４を透過して試料Ｓに照射され、試料Ｓが励起された状態を示している。本技術に係るラマン散乱光測定方法においては、試料Ｓは、試料用容器１に収容された状態で測定に用いられる。照射する励起光Ｌ１の波長及び出力は何れであっても良く、試料Ｓの性質や光源３の性能に合わせて設定すれば良い。
【００３５】
（２−２）ラマン散乱光検出
図１中、符号Ｓ４は、試料用容器１に収容された試料Ｓから発せられるラマン散乱光を検出する手順である。図５は、手順Ｓ４において試料Ｓから放出されるラマン散乱光Ｌ２の、検出器７による検出を示している。
【００３６】
本技術に係るラマン散乱光測定方法において、試料Ｓから放出されるラマン散乱光Ｌ２は、試料Ｓが収容された試料用容器１に設けられたシート部材２と容器底面１１を経て、対物レンズ４に入射する。この時、対物レンズ４の焦点は、試料Ｓに合わせてある。入射したラマン散乱光Ｌ２は、対物レンズ４で集光され、ビームスプリッタ５において反射し、分光器６に入射する。分光器６は、回折格子やプリズムなどの分光素子を備え、入射したラマン散乱光Ｌ２をその波長に応じて分光させる。波長ごとに分光されたラマン散乱光Ｌ２は、検出器７に入射する。検出器７では、分光されたラマン散乱光Ｌ２を検出し、ラマンスペクトルを得る。なお、図４及び図５においては、励起光Ｌ１を試料用容器１の底側から照射し、試料用容器１の底側から放出されたラマン散乱光Ｌ２を検出しているが、本技術に係るラマン散乱光測定方法では、励起光Ｌ１を試料用容器１の上側から試料Ｓに照射し、試料用容器１の上側から放出される試料Ｓ由来のラマン散乱光Ｌ２を検出しても良い。
【００３７】
本技術に係るラマン散乱光測定方法では、上述したように、シート部材２を用いて、試料Ｓを容器底面１１から離した位置に保持した状態で、試料Ｓを測定する。対物レンズ４の焦点を試料Ｓに合わせると、シート部材２の設置によって、焦点の位置がシート部材２を設けていない場合に比べ、試料用容器１から離れる。このため、試料用容器１の容器底面１１が対物レンズ４の焦点近くから離れ、試料用容器１由来のラマン散乱光の検出の強度が低下する。
【００３８】
更に、試料用容器１において、容器底面１１に替わって試料Ｓと接するシート部材２は、試料Ｓ由来のラマン散乱光の検出を阻害しない材質で構成されている。シート部材２の材質が、例えばベンゼン環を含まない合成樹脂であれば、強度の高いラマン散乱光が放出され難い。多糖、糖鎖又は脂質からなるシート部材２であれば、試料Ｓが生体試料等の場合、試料Ｓ由来のラマンスペクトルと重なるラマンスペクトルが測定されにくい。また、シート部材２をゲル状物質とした場合も、強度の高いラマン散乱光が放出され難い。このような材質からなるシート部材２からは、試料用容器１に比して低い強度でしかラマン散乱光が放出されない。或いは、解析対象とするラマンスペクトルと重なるスペクトルが、シート部材２では測定されない。この結果、本技術に係るラマン散乱光測定方法においては、試料用容器１由来のラマン散乱光の強度が低減し、試料Ｓ由来のラマン散乱光Ｌ２がより高感度に検出されることとなる。
【００３９】
培養細胞の培養状態での観察においては、細胞が培養液中に維持されているため、一般的に細胞が収容されている容器の底面側からの発光を観察する倒立顕微鏡が使用されている。本技術に係るラマン散乱光測定方法は、倒立顕微鏡と同じように、培養状態の培養細胞から放出されたラマン散乱光を、培養容器の底面側から検出する場合に、特に好適である。
【００４０】
なお本技術は、以下のような構成もとることができる。
（１）容器内に配された該容器と異なる材質のシート部材上の試料に励起光を照射してラマン散乱光を検出する検出手順を含む、ラマン散乱光測定方法。
（２）前記検出手順の前に、前記容器の底面に、該底面の基材と異なる材質の前記シート部材を設ける設置手順を含む、上記（１）記載のラマン散乱光測定方法。
（３）前記試料が生細胞である、上記（１）又は（２）記載のラマン散乱光測定方法。
（４）前記生細胞を前記シート部材表面で培養する、試料の収容手順を含む、（３）記載のラマン散乱光測定方法。
（５）前記シート部材が、ベンゼン環を含まない、アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂、シリコン系樹脂、から選択される少なくとも１種類以上の樹脂からなる、上記（１）から（４）の何れかに記載のラマン散乱光測定方法。
（６）前記シート部材が、多糖類、糖鎖又は脂質から選択される少なくとも１種類以上の物質を含む、上記（１）から（４）の何れかに記載のラマン散乱光測定方法。
（７）前記シート部材がゲル状物質である、上記（１）から（４）の何れかに記載のラマン散乱光測定方法。
（８）前記ゲル状物質が細胞外基質を構成するタンパク質である、上記（７）記載のラマン散乱光測定方法。
（９）前記シート部材の厚みが０．５ｍｍ以上である、上記（５）から（７）の何れかに記載のラマン散乱光測定方法。
（１０）試料を収容する空間を有し、該空間の底面に該底面の基材と異なる材質のシート部材が設けられた、ラマン散乱光測定試料用容器。
【実施例】
【００４１】
＜実施例１＞  
１．試料用容器由来のラマン散乱光の測定
本実施例において、試料用容器由来のラマン散乱光の測定を行い、対物レンズと試料用容器の底面との距離の変化におけるラマンスペクトルの強度について検証した。試料用容器としては、細胞培養実験等で一般的に使用されているポリスチレン製容器を用いた。対物レンズの焦点を容器底面（０ｍｍ）から０．５ｍｍ刻みで、２．０ｍｍまで設定し、各々の位置で、波長７８５ｎｍの励起光を照射し、容器底面から放出されるラマン散乱光を測定した。
【００４２】
本実施例において測定された試料用容器由来のラマスペクトルを図６（Ａ）に示す。図６（Ａ）の横軸は、測定された光の波長（ラマンシフト）を示し、縦軸には、各々の波長におけるラマン散乱光の強度を示している。図６（Ｂ）及び（Ｃ）は、ラマンスペクトルの波長１００１．３６ｃｍ−１における強度を縦軸に、対物レンズの焦点の位置を横軸に示している。
【００４３】
試料用容器由来のスペクトル（図６（Ａ）参照）において、最も強度が高く測定された１００１．３６ｃｍ−１では、図６（Ｂ）に示すように、対物レンズの焦点が容器底面（０ｍｍ）から０．５ｍｍに移動すると、ラマン散乱光の強度が３分の１程度に低下した。更に焦点が１．０ｍｍに移動すると、ラマン散乱光の強度は５分の１程度まで低下した。本実施例において、試料用容器と対物レンズの焦点が離れることで、測定される試料用容器由来のラマン散乱光の強度が低下することが示された。また、容器底面との距離と、１００１．３６ｃｍ−１におけるラマン散乱光の強度との関係は、距離の二乗に反比例していることが明らかとなった（図６（Ｃ）参照）。
【００４４】
＜実施例２＞
２．シート部材（コラーゲンゲル）の設置による試料用容器由来ラマン散乱光の強度変化
実施例１において、対物レンズの焦点が試料用容器の底面から離れる程、測定される容器由来のラマン散乱光の強度が低下することが示された。そこで、試料用容器の底面から離れた、好適な対物レンズの焦点の位置に試料を保持するための、容器底面に設置するシート部材について検討した。
【００４５】
本実施例において、試料用容器は実施例１と同一のポリスチレン製容器を使用し、シート部材には、コラーゲンゲルを用いた。コラーゲン溶液を、０．５ｍｌ，１ｍｌ，２ｍｌ（形成されるゲルの厚みは、各々、約０．５ｍｍ，約１．０ｍｍ，約２．０ｍｍ）の各量で試料用容器に滴下し、コラーゲンゲルを試料用容器に接着させた。波長７８５ｎｍの励起光をシート部材に照射し、ラマン散乱光を測定した。対物レンズの焦点は、何れの厚みのコラーゲンゲルであっても、コラーゲンゲル表面（シート部材表面）に合わせた。すなわち、コラーゲンゲル表面から対物レンズまでの距離は、本実施例において一定である。
【００４６】
本実施例の結果を、図７に示す。図７（Ａ）は、各試料用容器において測定されたラマンスペクトルを示す。図７（Ａ）の横軸は、測定された光の波長（ラマンシフト）を示し、縦軸には、各々の波長におけるラマン散乱光の強度を示している。図７（Ｂ）には、波長１００１ｃｍ−１におけるラマン散乱光の強度を縦軸に、コラーゲンゲル量を横軸に示す。
【００４７】
コラーゲンゲルを設けていない試料用容器では（図７（Ａ）中、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ０ｍｌ）、実施例１と同様に、波長１００１ｃｍ−１において高い強度が認められた。一方、コラーゲンゲルを０．５ｍｌ（ゲルの厚みは、約０．５ｍｍ）設けた容器においては、波長１００１ｃｍ−１でのラマン散乱光の強度は、コラーゲンゲルを設けていない場合に比べ、１０分の１程度まで低下した（図７（Ｂ）参照）更にコラーゲンゲルを１．０ｍｌ用いた場合は、ラマン散乱光の強度は、コラーゲンゲルを設けていない場合に比べ、５０分の１程度まで低下した。この結果から、試料用容器底面にコラーゲンゲルを設け、試料用容器底面の替わりにコラーゲンゲルからなるシート部材の表面に対物レンズの焦点を合わせると、シート部材の厚みに応じて、試料用容器由来のラマン散乱光の強度が低下することが示された。
【００４８】
＜実施例３＞
３．シート部材（コラーゲンゲル）設置後の試料用容器における試料のラマン散乱光の測定
実施例２において認められたシート部材の設置による試料用容器由来のラマン散乱光の強度の低下が、試料由来のラマン散乱光の測定において有効であるか検証した。試料用容器には、実施例１及び２と同様にポリスチレン製の容器を使用した。シート部材には、実施例２と同様にコラーゲンゲルを使用し、ゲルの厚みは、約０．５ｍｍとした。試料には、肝細胞を用い、公知の手法を用いてシート部材上で培養した。比較対象として、コラーゲンゲルを積層していない試料用容器も用意し、容器底面（ポリスチレン製基材上）で肝細胞を培養した。ラマン散乱光の測定は、肝細胞を培養している状態で行った。測定時、波長７８５ｎｍの励起光を各々の容器で培養された肝細胞、又は各々の容器内で細胞が存在していない部分に照射し、対物レンズの焦点は、肝細胞に合わせた。
【００４９】
図８に、本実施例の結果を示す。図８（Ａ）及び（Ｂ）の横軸は、測定された光の波長（ラマンシフト）を示し、縦軸には、各々の波長におけるラマン散乱光の強度を示している。図８（Ａ）は、コラーゲンゲルを積層していない試料用容器における、細胞由来と試料用容器底面由来の各々のラマンスペクトルのパターンを示す。破線で示す細胞が存在しない部分（細胞なし）のラマンスペクトルは、実線で示す細胞が存在する部分（細胞あり）のラマンスペクトルと一致していた。これは、試料用容器底面で細胞を培養してラマン散乱光を測定した場合、細胞由来のラマン散乱光が感度良く測定されないことを示している。一方、図８（Ｂ）に示すように、コラーゲンゲルが積層された試料用容器においては、細胞が存在する部分のラマン散乱光を測定した場合（細胞あり）、細胞が存在していない部分（細胞なし）のラマンスペクトルとは異なるパターンが測定され、細胞が存在する部分を測定した場合にのみ認められるラマン散乱光があった（図中、矢印）。すなわち、細胞由来のラマン散乱光である。以上の結果から、コラーゲンゲルをシート部材として容器の底面に使用した場合、容器由来のラマン散乱光の検出が抑えられ、シート部材からのラマン散乱光によって妨げられることなく、試料由来のラマン散乱光が高感度で測定可能であることが示された。
【００５０】
＜実施例４＞
４．シート部材（ＰＤＭＳ）の設置による試料用容器由来ラマン散乱光の強度変化
実施例２及び３においては、シート部材としてコラーゲンゲルを使用したが、他の材質からなるシート部材についても検討した。本実施例においては、合成樹脂の一つであるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をシート部材に用いた。試料用容器には、前述の実施例１から３と同様にポリスチレン製の容器を使用し、容器内でＰＤＭＳを重合し、容器底面にシート部材として積層した。ＰＤＭＳを積層していない試料用容器と、０．４ｍｍから２．８４ｍｍまでの６段階の厚みのＰＤＭＳが積層された試料用容器の各々について、波長７８５ｎｍの励起光を照射し、ラマン散乱光を測定した。対物レンズの焦点は、ＰＤＭＳ表面（シート部材表面）に合わせた。すなわち、ＰＤＭＳ表面（シート部材表面）から対物レンズまでの距離は、本実施例において一定である。
【００５１】
図９に、本実施例において測定されたラマンスペクトルを示す。図９の横軸は、測定された光の波長（ラマンシフト）を示し、縦軸には、各々の波長におけるラマン散乱光の強度を示している。ＰＤＭＳの厚みが増すほど、容器が対物レンズの焦点から離れるため、実施例１及び２と同様に、容器由来のラマンスペクトルの強度は低下した。一方、シート部材としてＰＤＭＳを用いた容器においては、ＰＤＭＳ由来のラマンスペクトルが測定された。しかし、試料用容器由来のラマンスペクトルに比べ、ＰＤＭＳ由来のラマンスペクトルの強度は低く、例えば、波長１４００ｃｍ−１付近に測定されるラマン散乱光の強度は、２００００ａ．ｕ．程度であった。本実施例の結果から、ＰＤＭＳについてもコラーゲンゲルと同様に、ラマン散乱光測定において、試料用容器に設置するシート部材として有効であることが示された。
【００５２】
＜実施例５＞
５．シート部材（ＰＤＭＳ）設置後の試料用容器における試料のラマン散乱光の測定
実施例４において認められたシート部材の設置による試料用容器由来のラマン散乱光の強度の低下が、試料由来のラマン散乱光の測定において有効であるか検証した。試料用容器は、実施例４と同様にポリスチレン製の容器を使用した。シート部材には、ＰＤＭＳを使用し、その厚みは、約０．８２ｍｍとした。試料には、ヒトの毛髪（以下、白髪と記す）を使用した。対物レンズの焦点は、白髪の表面に合わせ、波長７８５ｎｍの励起光を容器に収容された白髪に照射し、ラマン散乱光を測定した。
【００５３】
図１０に本実施例の結果を示す。図１０（Ａ）に示すラマンスペクトルは、ＰＤＭＳからなるシート部材を設置していない試料用容器（ポリスチレン、Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）おける測定結果である。試料である白髪を置いた状態であっても、試料を置かない状態で測定されたラマンスペクトルと同じパターンが測定された。一方、図１０（Ｂ）に示すように、シート部材を設置した試料用容器においては、試料を置いて測定した場合のラマンスペクトルは、試料用容器のみで測定したラマンスペクトルとパターンが異なり、試料の測定時に特異的なピークが測定された（図中、矢印）。本実施例の結果から、ＰＤＭＳについても、シート部材として容器の底面に使用した場合、容器由来のラマン散乱光の検出が抑えられ、シート部材由来のラマン散乱光によって妨げられることなく、試料由来のラマン散乱光が高感度で測定可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本技術に係るラマン散乱光測定方法においては、容器に収容された試料由来のラマン散乱光を高感度で検出することが可能である。そのため、培養状態にある細胞など、容器に収容した状態でしか測定に用いることができない試料の測定に利用され得る。培養状態の細胞の解析は、例えば、幹細胞からの分化の程度を確認することができるなど、再生医療において重要である。
【符号の説明】
【００５５】
Ｅ：空間、Ｌ１：励起光、Ｌ２：ラマン散乱光、Ｓ：試料、ｔ：シート部材の厚み、１：ラマン散乱光測定試料用容器、１１：容器底面、２：シート部材、２１：シート部材表面、３：光源、４：対物レンズ、５：ビームスプリッタ、６：分光器、７：検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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