(57)【要約】【課題】糖鎖固定化金ナノ粒子によって、糖鎖に特異的に結合するウイルス粒子表面の抗原タンパク質を分画し、それを直接抗ウイルス抗体の製造に利用するという新規方法を提供すること。【解決手段】独自開発したリンカー化合物を利用してウイルス結合性の高い硫酸化糖鎖を固定化した金ナノ粒子を用い、糖鎖とウイルス抗原の結合性を利用して、ウイルス粒子表面の抗原タンパク質を分画し、簡便かつ効率的に免疫抗原として使用して、抗体を得る。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭化水素誘導鎖を備えたリンカー化合物の一端に存在するアミノ基にて還元末端を有する硫酸化糖と結合し、該リンカー化合物の他端に存在する硫黄原子が金と結合している糖鎖固定化金ナノ粒子。
【請求項２】
前記硫酸化糖は、α１−６結合でグルコースが縮合した多糖であるデキストランの、主として２位、３位、４位が硫酸基に置換されたデキストラン硫酸であることを特徴とする請求項１記載の糖鎖固定化金ナノ粒子。
【請求項３】
前記デキストラン硫酸は、分子量約２５００であることを特徴とする請求項２記載の糖鎖固定化金ナノ粒子。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の糖鎖固定化金ナノ粒子が、ウイルス粒子表面のタンパク質に結合することを用いて、ウイルスを捕捉する工程を有するウイルス捕捉方法。
【請求項５】
請求項４記載のウイルス捕捉方法によって捕捉されたウイルスを破砕し、糖鎖固定化金ナノ粒子と結合しているウイルス粒子表面のタンパク質を分画する工程を有する分画方法。
【請求項６】
請求項５記載の分画方法によって分画されたウイルスのタンパク質と糖鎖固定化金ナノ粒子の結合体を動物の免疫抗原として使用する工程を有する免疫方法。
【請求項７】
請求項６の免疫方法によって免疫した動物から、ウイルス粒子表面の抗原タンパク質を認識する抗体を製造する工程を有する抗ウイルス抗体製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖を固定化した金ナノ粒子によるウイルス粒子表面の抗原タンパク質の捕捉、及び捕捉抗原に対する抗体製造の方法に関する技術である。
【背景技術】
【０００２】
病原性ウイルスの感染は多くの疾患の原因となる。ウイルス感染に対する対処法として、抗ウイルスワクチン・抗ウイルス性合成化合物・抗ウイルス抗体の投与等が挙げられる。抗ウイルスワクチンは弱毒性生ワクチン・不活化ワクチンがあり、前者では弱毒性ウイルスそのものを体内に投与し、後者では不活性化したウイルスまたはウイルスの断片混合物（スプリットワクチン）を投与する。これらワクチンの投与により体内での抗体産生を促進し、ウイルス感染を予防する。抗ウイルス性合成化合物の多くは直接的にウイルスを破壊する薬剤ではなく、主としてウイルス増殖を抑制する働きを示す。宿主細胞内からウイルス粒子が離脱するのを抑制するタミフルや、宿主細胞内でウイルス粒子が開裂するのを抑制するアマンタジンのように、宿主細胞へのウイルスの拡散を防ぐことで疾患を防ぐ。一方、抗ウイルス抗体は、抗体によるウイルス活性の抑制と宿主免疫の活性化を目的としており、現在市場で扱われているものに呼吸器感染性ＲＳウイルスに対するパリビズマブ（シナジス）がある。抗ウイルス抗体の多くは、現時点ではまだ臨床応用に至っていないものの、今後のウイルス感染症対策において重要な位置を占めると予想される（非特許文献１）。
【０００３】
抗ウイルス抗体のメリットとして、特異性が高い、生産・精製法の共通性が高い、診断薬として利用できる、が挙げられる。従来の抗ウイルス抗体作成の方法は、１．ウイルス粒子そのものを抗原として抗体を作成する、２．前記の方法で得た抗体を使ってウイルスから特定の抗原を精製し、その特定抗原に対する抗体を従来の動物免疫法、またはファージディスプレイ法により作成する、といった工程を踏まえる。そのため、デメリットとして、抗体の認識する抗原はウイルス粒子全ての構成分子となるため、抗体のスクリーニングと精製の作業が膨大になり、中和活性をもつような抗ウイルス薬として使用できる抗体の製造には、さらに時間・労力・コストがかかる。抗体作成に要する手順の簡便化・時間の短縮・コストの削減は、抗ウイルス抗体を開発する上で早急に対応すべき問題である。
【０００４】
ナノ粒子はライフサイエンス・医療診断・バイオテクノロジー等の様々な分野に応用されるマテリアルである。抗体等のタンパク質を固定化したナノ粒子は、抗原抗体反応による免疫染色や、抗原の検出、分離・精製に有用である。また、薬剤や遺伝子を固定化したナノ粒子を用いたドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）や、標識化ナノ粒子を用いた分析用マーカー、トレーサー等の分析用試薬も広く利用されている。本発明に使用するナノ粒子は糖鎖修飾を施した金ナノ粒子であるが、金ナノ粒子は化学修飾を施すことにより他金属・化学合成物・ペプチド・脂質・酵素等を表面加工することが可能である。金ナノ粒子を用いた高機能性マテリアルはこれまでにも広く生体工学分野に使用されており、核酸・タンパク質・糖鎖を検出する免疫センサーや腫瘍治療法等に利用されている（非特許文献２、３）。ウイルスに対して結合性の高い糖鎖を金ナノ粒子表面上に固定化し、ウイルスの捕捉・濃縮に利用する方法がすでに知られているが（特許文献１）、これを応用してウイルスの抗原タンパク質を効率よく分画し、抗ウイルス抗体の製造に直接用いることはまだ行われていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１４８２４６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｒｏｕｄｅ  ＪＷ、ＭＡｂｓ、３（６）、Ｅｐｕｂａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ、２０１１
【非特許文献２】Ｄａｎｉｅｌ  ＭＣ  ａｎｄ  Ａｓｔｒｕｃ  Ｄ、Ｃｈｅｍｒｅｖ、１０４、２９４−３４６、２００４
【非特許文献３】Ｍｉｔｓｕｎａｇａ  Ｍ、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１７、１６８５−１６９１、２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述の抗ウイルス抗体の開発時における、ウイルス粒子そのものを抗原として用いた際の、特定の抗原に対する抗体の製造に要する手順・時間・コストという問題点の解決のために考案されたものである。粒径が均一で高い分散性を持ち、容易に粒子表面に糖鎖を固定化することのできる金ナノ粒子によって、糖鎖に特異的な結合を示すウイルス抗原タンパク質を分画し、分画した抗原とナノ粒子の複合体を直接抗ウイルス抗体の製造に利用するという新規方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子は、金ナノ粒子表面に還元剤処理した水溶性の糖鎖リガンド複合体を添加することによって製造され、水溶液中で高い分散性を示す。この糖鎖固定化金ナノ粒子においては表面が糖鎖リガンド複合体で修飾されており、平均粒径が１―１０ｎｍであることが好ましい。また、本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子は、上記糖鎖リガンド複合体、つまり炭化水素誘導鎖を備えているリンカー化合物の一端に存在するアミノ基にて還元末端を有する糖鎖と結合し、当リンカー化合物の多端に存在する硫黄原子を含む炭化水素構造にて金粒子と結合している糖鎖固定化金ナノ粒子である。
【０００９】
本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子の糖鎖とは、硫酸化多糖である。特に分子量２５００程度のデキストラン硫酸が好ましい。即ち、α１−６結合でグルコースが縮合した多糖であるデキストランの主として２位、３位、４位が硫酸基に置換されたデキストラン硫酸のうち、分子量約２５００程度に調整されたデキストラン硫酸（ＤＳ２５）を示す。ＤＳ２５は多数の硫酸基により高度に負電荷を帯びており、インフルエンザ、ヘルペス等のウイルス粒子表面に対して強い結合性を示す。これにより、金ナノ粒子による糖鎖を介したウイルスの捕捉を可能とする。
【００１０】
ウイルスを捕捉したＤＳ２５固定化金ナノ粒子（ＤＳ２５−ＧＮＰ）は、特にウイルス粒子表層の抗原となりうるタンパク質に結合している。ウイルスを物理的に破壊してもＤＳ２５−ＧＮＰはウイルス抗原タンパク質と結合している。このＤＳ２５−ＧＮＰと抗原タンパク質の結合体を分画する。分画には超遠心による密度勾配遠心を利用し、ナノ粒子がその重さに応じて層を成して分離する性質を利用して、エンベロープタンパク質とナノ粒子の複合体とその他のタンパク質を分離する。
【００１１】
密度勾配遠心により分画した、ウイルス抗原タンパク質とＤＳ２５−ＧＮＰの結合体を直接動物に免疫することにより、ウイルス抗原タンパク質に特異的な抗体の産生を誘導することができる。これにより、標的ウイルスの粒子表層のタンパク質を抗原とする抗ウイルス抗体の製造が可能であり、ウイルス感染時の細胞への吸着（結合）を阻止する中和抗体として薬としての使用も可能な抗体が製造できる。この際、標的とするウイルスはＤＳ２５−ＧＮＰに対して結合性のあるウイルスならばどのような種類のウイルスでもよく、例えばインフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）など多種類のウイルスがあげられる。また、ウイルスに特異的に結合する糖鎖を利用すれば同様の方法でいかなる糖鎖結合性のウイルスにも適用でき、例えばノロウイルスや成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）やウシ下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）なども挙げられる。
【発明の効果】
【００１２】
以上のように、本発明に用いる糖鎖固定化金ナノ粒子は、還元剤処理した糖鎖リガンド複合体と金ナノ粒子を混和するだけで調製することができる。これにより、ウイルスに対して結合性の高い、硫酸基を有する糖鎖を固定化することができ、多数の糖鎖を固定化できることから、高い安定性を提供し得る効果を有する。また、この硫酸化糖鎖固定化金ナノ粒子を利用したウイルス粒子表面抗原タンパク質の分画は、ウイルスの物理破砕と密度勾配遠心を行うだけで短時間かつ簡便に行うことができ、ウイルス抗原タンパク質の精製ステップを簡略化することができる。また、これにより、ウイルス粒子表層の抗原タンパク質を特異的に認識する抗体を製造することが容易となる。
【００１３】
抗体はヒトを含む脊椎動物の体内においてＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、一般には特定抗原中の１つのエピトープを認識し、結合する。病原ウイルスに結合する抗体の働きには、食細胞を活性化するオプソニン作用、補体を活性化する補体活性化作用、感染性・毒性を減少させる中和作用があり、これらの作用によって病原ウイルスが引き起こす疾患に対する防御機能を呈する。また、抗体は治療薬としてだけではなく、病原ウイルスの簡易診断にも活用される。本発明によってウイルス抗原タンパク質の簡便な分画が実現することで、抗体製造やワクチン開発に要する時間・労力・費用の削減が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】デキストラン硫酸２５００（ＤＳ２５）及びリンカー化合物を含むリガンド複合体
【図２】デキストラン硫酸固定化金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真及び平均粒径
【図３】デキストラン硫酸固定化金ナノ粒子の動的光散乱測定値及び平均粒径
【図４】ウイルス―糖鎖固定化金ナノ粒子複合体の密度勾配遠心分離
【図５】密度勾配遠心分離で分けた各画分のポリアクリルアミド電気泳動図
【図６】画分２に含まれるタンパク質の質量分析
【図７】ウイルス−糖鎖固定化金ナノ粒子複合体をマウスに免疫した際のマウス血清中の抗体価
【図８】各スクリーニングにおけるハイブリドーマの培養液上清中の抗体価
【図９】ハイブリドーマ培養液上清から得られた抗体のクラス・サブクラス
【図１０】精製抗体の濃度依存的抗体価
【図１１】免疫沈降法によるウイルス抗原タンパク質−精製抗体間結合の確認
【図１２】抗体が結合したウイルス抗原タンパク質の質量分析
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施の形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。以下、本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子の製造方法、ウイルス抗原の分画方法、ウイルス抗原の同定方法、及び抗体の同定方法について詳述する。
【００１６】
［１．糖鎖固定化金ナノ粒子の製造法］
本発明は、糖鎖を固定化した金ナノ粒子の製造方法を利用している。この方法により製造された金ナノ粒子は水溶液中で分散する特徴を有している。すなわち、この製造方法は糖鎖固定化金ナノ粒子のコロイド溶液を調製する方法でもある。
【００１７】
本明細書において、「糖鎖固定化金ナノ粒子」とは、以下に詳述する糖鎖リガンド複合体と金ナノ粒子を結合させたものである。また、本明細書中において、「ナノ粒子」は水溶液中で分散してコロイド溶液を形成するものが意図される。よって、ナノ粒子の平均粒子径は、０．５−４００ｎｍの範囲内が好ましく、１−１０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。平均粒子径は０．５ｎｍ未満であっても良いが、そのような粒子の製造は高コストで実用的ではなく、また４００ｎｍを超えると粒子の分散安定性が経時的に変化しやすいため好ましくない。また、目標とするウイルス粒子よりもサイズの小さいナノ粒子を用いた場合に捕捉効率が飛躍的に大きくなるので、後述するように１−１０ｎｍの平均粒子径を持つナノ粒子が好ましい。
【００１８】
本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子の構成要素である糖鎖リガンド複合体は、任意の金ナノ粒子と結合することのできるリンカ―化合物と、捕捉対象となるウイルスのタンパク質と特異的に相互作用ができる糖鎖とから構成されている。そのため、上記糖鎖リガンド複合体は、タンパク質等の物質と疎水性に基づく非特異的な相互作用を形成しないことが必要とされる。
【００１９】
上記リンカー化合物は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えており、主鎖の一末端にアミノ基を有する。この末端アミノ基の存在により、糖鎖分子を簡便に導入することができる。なお、上記アミノ基は、修飾されているアミノ基（例えばアセチル基・メチル基・ホルミル基等で修飾されたアミノ基）や芳香族アミノ基であってもよいし、未修飾のアミノ基であってもよい。
【００２０】
上記リンカー化合物は、金−硫黄（Ａｕ−Ｓ）結合を容易に形成することが出来るという点で、Ｓ―Ｓ結合またはＳＨ基が含まれている炭化水素構造を主鎖の他端に備えている。これにより、上記リンカー化合物は金ナノ粒子上に糖鎖分子を集合化して配列することができる。ジスルフィド結合またはＳＨ基中の硫黄は、金ナノ粒子中のＡｕと金属−硫黄結合を形成し、金属との結合を強固にすることができる。
【００２１】
上記リンカー化合物と糖鎖の複合体である糖鎖リガンド複合体には、上記リンカー化合物のアミノ基において、還元末端を持つ糖鎖が導入されている。すなわち、上記糖鎖リガンド複合体は、上記リンカー化合物と還元末端を持つ糖鎖がアミノ基を介して結合している構造を示す。この糖鎖の導入は、上記リンカー化合物のアミノ基と糖鎖との還元アミノ化反応によって行うことができる。すなわち、平衡によって生じる糖鎖中のアルデヒド基またはケトン基と、上記リンカー化合物が持つアミノ基が反応する。この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、アミノ基に容易に糖鎖を導入することが可能である。
【００２２】
なお、上記の「還元末端を持つ糖鎖」とは、分子末端に還元性をもつケトンやアルデヒドが形成しうる糖類であり、特に上記の分子量約２５００のデキストラン硫酸（ＤＳ２５）を指す。デキストラン硫酸は、主としてα１−６結合で結合したグルコース骨格からなるポリ陰イオン性のデキストラン誘導体で、種々の高純度デキストラン分画から合成される。このデキストラン硫酸のうちＤＳ２５は、分子量を２５００程度に調整することで、ウイルスとの結合に必要な多数の硫酸基を保持するとともに、産物であるナノ粒子の粒径を１０ｎｍ前後に制御することを可能としている。なお、このＤＳ２５は市販もしくは天然の多糖鎖を分解して調整したものを用いることができる。
【００２３】
上記リンカー化合物とＤＳ２５を結合したリガンド複合体は、ＳＨ基の硫黄によって金ナノ粒子と強固に、かつ簡便に結合させることができる。このため、ＤＳ２５を金ナノ粒子表面に容易に固定化することができる。さらに、こうして金ナノ粒子上に結合したＤＳ２５の高い水和性によって、金ナノ粒子をコロイド状態で安定化することが可能となる。
【００２４】
上記リンカー化合物は、例えば以下に示す製造方法によって製造される。すなわち、上記リンカー化合物は、チオクト酸と芳香族アミノ基末端との縮合反応を行うことによって製造される。
【００２５】
上記チオクト酸と芳香族アミノ基との縮合反応により、チオクト酸のカルボキシル基と芳香族アミノ基とが縮合し、アミド結合が形成されることによって、上記のリンカー化合物を得ることができる。すなわち、本発明に利用可能なリンカー化合物としては、一般式（１）
【化１】
2013159567.tif 000003
が挙げられるが、これに限定されない。上記リガンド複合体は、このようにして作成されたリンカー化合物に、還元末端を持つ糖鎖が導入されたものである。
【００２６】
本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子は、金ナノ粒子を含む溶液と、還元剤処理した上記リガンド複合体との混和によって得ることができ、リガンド複合体のＳ−Ｓ結合の各Ｓ原子が、ナノ粒子上の金と金―硫黄結合によって結合する。具体的には、例えば、金ナノ粒子の溶液に還元剤処理した上記ＤＳ２５リガンド複合体を含む溶液を添加することによって、ＤＳ２５リガンド複合体のＳ−Ｓ結合を、ナノ粒子上の金属−硫黄結合に変換してＤＳ２５固定化金ナノ粒子を得ることができる。
【００２７】
なお、還元剤処理に用いられる還元剤としては、特に限定されるものではないが、例えば水素化ホウ素ナトリウム・シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の塩類及び陽イオン成分が異なる塩類等を挙げることができる。
【００２８】
金ナノ粒子及びリガンド複合体を含む溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、超純水・メタノール・エタノール・プロパノールやこれらの混合溶媒等を挙げることができる。また、上記混和によって得られた糖鎖固定化金ナノ粒子を遠心濾過し、低分子の塩等の成分を除くことにより、溶液状態で安定な糖鎖固定化金ナノ粒子を得ることができる。
【００２９】
糖鎖固定化金ナノ粒子を調整するために用いる金、上記リガンド複合体、還元剤の混合比は、特に限定されるものではないが、溶液中の金濃度が最終濃度で０．１−１ｍＭであることが好ましい。また、上記リガンド複合体の濃度は、溶液中の最終濃度で０．１−１ｍＭであることが好ましい。また、用いられる還元剤の濃度は、溶液中の最終濃度で１−１０ｍＭであることが好ましい。
【００３０】
［２．糖鎖固定化金ナノ粒子によるウイルス抗原の単離方法］
本発明に関わる、糖鎖固定化金ナノ粒子によるウイルス単離方法は、糖鎖固定化金ナノ粒子を含む溶液とウイルス粒子を含む溶液を相互作用させた後、その結合体を、比重の異なる数層からなる溶液を用いた密度勾配遠心によって分画し、分画するものである。
【００３１】
上記の「糖鎖固定化金ナノ粒子を含む溶液」とは、本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子が液体中に分散したコロイド溶液が意図される。糖鎖固定化金ナノ粒子を含んでいれば、他に塩等が含まれていても良い。上記液体としては、例えば超純水や緩衝液等を用いることができる。
【００３２】
また、上記の「ウイルス粒子を含む溶液」とは、本発明においてウイルス抗原を回収するために使用するウイルスが液体中に分散したコロイド溶液が意図される。またウイルスとは、本発明に関わる糖鎖固定化金ナノ粒子の糖鎖リガンド複合体に対して結合性を示すウイルスを意図する。このウイルス粒子の粒径としては１０−１００ｎｍであることが好ましい。ウイルス粒子を分散させる溶液の液体としては、糖鎖リガンド複合体とウイルス粒子との結合を阻害する可能性のある物質を含まない限り、超純水や緩衝液等を用いることができる。また、ウイルス粒子の溶液中濃度は、赤血球凝集を誘導するウイルスの場合、１００−１００００ＨＡＵ（赤血球凝集単位）であることが好ましい。
【００３３】
また、上記の「比重の異なる数層からなる溶液」とは、濃度の異なるショ糖溶液等を数層に重ねた多層の溶液で形成された溶液が意図されるが、これに限定されるものではない。また、上記の密度勾配遠心とは、超遠心を用いた遠心分離法によるものである。遠心分離による重力は３００００ｇ前後であることが好ましい。また、上記の分画とは、糖鎖固定化金ナノ粒子とウイルス粒子の結合体を密度勾配遠心した後に溶液中で分離されることを意図する。また、上記の単離とは、密度勾配遠心によって分離した溶液層のうち、糖鎖固定化金ナノ粒子が含まれる層を回収することを意図する。また、上記の精製とは、密度勾配遠心後に回収された溶液層を遠心濾過し、溶液層に含まれるショ糖等の低分子成分を除くことを意図する。
【００３４】
上記の工程で分画された画分を、ナノ粒子−ウイルス抗原結合体とする。
【００３５】
［３．ナノ粒子−ウイルス抗原結合体を利用した抗ウイルス抗体の作成方法］
本発明に関わるナノ粒子−ウイルス抗原結合体を利用した抗ウイルス抗体の作成方法は、上記の工程によって作成したナノ粒子−ウイルス抗原複合体を動物に免疫することで、動物体内で特定のウイルス抗原に対する免疫反応を起こし、これを利用してウイルス抗原を特異的に認識する抗体を回収する工程を含むものである。
【００３６】
上記免疫反応の誘導に使用する動物は、例えばマウス等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、動物にナノ粒子−ウイルス抗原複合体を投与する際の投与量は、特に限定されるものではないが、腹腔内投与であれば一回投与あたりナノ粒子量基準で１０−５０μｇ（＊ナノ粒子の分子量を約２０００００とすると、一回投与量あたり０．１−０．５ｎｍｏｌ）であることが好ましい。
【００３７】
上記のナノ粒子−ウイルス抗原複合体の投与を行う期間において、各投与日から３日後に、被投与動物から血清の回収を行う。例えば、被投与動物がマウスであれば、尾部からの血液採取等によって血清を回収する。回収した血清は、投与に使用したナノ粒子−ウイルス抗原結合体に含まれるウイルス抗原に対する結合性の判定、すなわち抗体価の測定に使用し、抗体価の上昇を確認した時点で下記に示す免疫組織の回収を行う。抗体価の確認にはＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ−Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ−Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等を使用した測定を行うが、これに限定されるものではない。
【００３８】
上記のナノ粒子−ウイルス抗原複合体の投与は、隔週で１ヶ月−２ヶ月継続的に行い、最終投与を行なった日から３日以内に、被投与動物を安楽死させて脾臓等の免疫組織を回収することが好ましい。被投与動物から得られた組織から、形質細胞等の抗体産生細胞を回収し、Ｂリンパ球骨随腫細胞との細胞融合を行う。特に限定されるものではないが、細胞融合に用いる骨随腫細胞は、自身の抗体産生能力を欠失した細胞株が好ましい。細胞融合により形成された細胞をハイブリドーマと称し、抗体産生を確認するまで継続的に培養を行う。
【００３９】
上記の工程でハイブリドーマを作成し培養する期間に、細胞の培養液上清を使用して、高い抗体価を示す細胞を選択するためのスクリーニングを行う。このスクリーニングでは前述のＥＬＩＳＡ等による評価を行うが、これに限定されるものではない。また、評価の結果高い抗体価を示した細胞を、限界希釈法等を用いて単一細胞にするための分別を行う。分別によって単一となった細胞について、前述の評価方法等を使用して、新たに２−３回のスクリ―ニングを行い、細胞の選抜を行う。
【００４０】
上記の細胞選抜を行なった後、結果的に得られる抗体価の高い細胞を抗体産生細胞とし、本発明に関わる、ウイルス抗原を認識する抗体を作るための細胞とする。
【００４１】
上記抗体産生細胞の培養液上清を使用して、本発明に関わるウイルス抗原を認識する抗体を回収する。回収時の分画には、抗体の定常領域に結合するＰｒｏｔｅｉｎＡタンパク質等を固定した磁気ビーズまたはカラム等を用いるが、これに限定されるものではない。分画した抗体は、単一細胞からなるモノクロ−ナル抗体であり、本発明に関わるウイルス抗原を特異的に認識する抗体である。
【００４２】
本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ウイルス捕捉に適した糖鎖固定化金ナノ粒子の調整、糖鎖固定化金ナノ粒子によるインフルエンザウイルスタンパク質の捕捉、糖鎖固定化金ナノ粒子とウイルス抗原タンパク質結合体による免疫誘導、糖鎖固定化金ナノ粒子で捕捉したウイルス抗原タンパク質に対する抗体の製造、の四ステップに分けて説明する。
【実施例１】
【００４３】
［ウイルス捕捉に適した糖鎖固定化金ナノ粒子の調整］
２０ｍＭの塩化金酸ナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液２６ｍｌに、平均分子量２５００のデキストラン硫酸から調製した糖鎖リガンド複合体（図１）５ｍＭの溶液９００μｌ及び３ｍｌの５０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を混合した。この混合溶液を遮光下にて撹拌して、糖鎖固定化金ナノ粒子の粗コロイド溶液を調製した。分子量３５００カットの透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂ社製）に溶液を入れ、超純水と０．０５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、ナカライテスク社製）を含むリン酸緩衝液による透析を行い、透析後の溶液を凍結乾燥した。乾燥後、金ナノ粒子を含む粉末を１０ｍｇ／ｍｌに調整し、その溶液を１０００００ｇ、３０ｍｉｎ、４°Ｃの条件で超遠心分離した。超遠心後の溶液を、沈殿した画分（サイズの大きな金ナノ粒子を含む画分）と沈殿しなかった画分（サイズの小さな金ナノ粒子を含む画分）に分け、沈殿した画分をＤＳ２５−ＧＮＰ−ｌａｒｇｅとした。沈殿しなかった画分の溶液をさらに、３０００００ｇ、５０ｍｉｎ、４°Ｃの条件で超遠心分離して沈殿させ、この画分をＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌとした。上記ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｌａｒｇｅ及びＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌを超純水に懸濁し、５ｍｇ／ｍｌとした。図２に、ＤＳ２５―ＧＮＰ−ｌａｒｇｅ及びＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌの透過型電子顕微鏡画像と各平均粒径を示す。また図３に、それらのナノ粒子を動的光散乱法で測定した際の平均粒径を示す。
【実施例２】
【００４４】
［糖鎖固定化金ナノ粒子によるインフルエンザウイルスタンパク質の捕捉］
上記糖鎖固定化金ナノ粒子ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｌａｒｇｅ及びＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌの５ｍｇ／ｍｌ溶液を用いてウイルス粒子の捕捉を行なった。ウイルスとして、Ａ型インフルエンザウイルスのＮｅｗ−Ｃａｌｅｄｏｎｉａ株（Ａ／Ｎｅｗ−Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９／Ｈ１Ｎ１）をリン酸緩衝液に懸濁した溶液（１５．４ＨＡＵ／μｌ）を使用した。糖鎖固定化金ナノ粒子溶液２５μｌとインフルエンザウイルス溶液２５μｌを混合し、遮光及び４°Ｃ下で一晩攪拌し、相互作用させた。相互作用させた溶液に６％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライテスク社製）を同容量加え、超音波による破砕を行なった。
【００４５】
破砕されたインフルエンザウイルスと糖鎖固定化金ナノ粒子を含む溶液を２０／３５／４０／５０％に調整したショ糖溶液上に乗せ、３００００ｇ、９０ｍｉｎ、１５°Ｃで超遠心によるショ糖密度勾配遠心分離を行った。図４に示すように、密度勾配遠心分離の結果、ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌを含むウイルス溶液では収束したナノ粒子の層が形成された。
【００４６】
密度勾配遠心後、インフルエンザウイルスを含む溶液を４つの画分に分け、それぞれについて１０ｋＤ（ｋｉｌｏ  Ｄａｌｔｏｎ）の限外濾過遠心フィルター（ミリポア社製）を用いて、低分子の除去及び溶液の濃縮を行なった。５０μｌに濃縮した溶液を、ドデシル硫酸ナトリウム―ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってアクリルアミドゲル上に展開した。この展開ゲルをクマシーブリリアントブルー染色液（ナカライテスク社製）または銀染色液（和光純薬製）によって染色し、各画分の電気泳動パタ―ンを検出した（図５）。
【００４７】
上記電気泳動パターンで得られた染色部分のうち、画分２の６０ｋＤ付近（図中矢尻）のタンパク質を含むゲルを回収し、タンパク質分解酵素トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲル内タンパク質の消化を行なった。ゲル内タンパク質の消化によって得られたペプチドを疎水性カラム（Ｚｉｐ−ｔｉｐＣ１６，ミリポア社製）で脱塩・精製した。得られたペプチドについて、イオントラップ型マトリックス支援レーザーイオン化−飛行時間型質量分析器（ＡＸＩＭＡ―ＱＩＴ、島津製作所製）による質量分析を行なった。質量分析により得られたデ―タを、タンパク質配列同定データベースＭＡＳＣＯＴで検索し、タンパク質の同定を行なった。質量分析で得られた質量ピーク、及びタンパク質同定の結果を図６に示した。デ―タ解析の結果、ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌによって捕捉されたインフルエンザ由来タンパク質は、主としてウイルス粒子表面タンパク質のヘマグルチニンであった。
【００４８】
以上から、糖鎖固定化金ナノ粒子ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌは、インフルエンザウイルス表面の抗原タンパク質であるヘマグルチニンを介してウイルスを捕捉しており、ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌを用いてヘマグルチニンを効率的に分画できることが分かった。
【実施例３】
【００４９】
［糖鎖固定化金ナノ粒子とウイルス抗原タンパク質結合体による免疫誘導］
上記の糖鎖固定化金ナノ粒子ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌとインフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンの結合体を含む画分（ＨＡ−ＧＮＰ画分）を免疫抗原として使用した。免疫実験にはマウスＢａｌｂ／ｃＮｓｅａ（６週齢、オス）を使用し、アジュバントは使用せず、抗原投与は腹腔内投与によって行なった。抗原は、ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌ量で換算して、一回あたり３０μｇの投与を行なった。一方、対象実験としてリン酸緩衝液のみ、またはＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌのみを抗原とした投与を、別のマウスについて行なった。各投与グループの動物数は、それぞれ４匹とした。抗原の投与は隔週で行い、計４回の投与を行なった。初回を除く２−４回目の投与から３日後に、マウスの尾部先端から採血を行い、血清の回収を行なった。
【００５０】
回収した各血清を用いてＥＬＩＳＡによる抗体価の測定を行い、抗体の有無を判断した。この際、ＥＬＩＳＡの抗原としては、インフルエンザウイルスをＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００及び超音波処理で破砕したタンパク質溶液を使用し、測定用９６穴プレート１ウェルあたり１ＨＡＵになるように調製した。また、対象実験としてＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌのみを抗原としたＥＬＩＳＡも行い、測定用９６穴プレート１ウェルあたり５μｇになるように調製した。投与期間中の各血清の抗体価をＥＬＩＳＡで測定した結果を図７に示す。インフルエンザウイルスの破砕タンパク質をＥＬＩＳＡの抗原とした測定では、４回目の投与後に、ＨＡ−ＧＮＰ画分を投与したグループの抗体価が上昇した（図７ａ）。一方、ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌのみをＥＬＩＳＡの抗原とした測定では、いずれのグループについても抗体価の上昇は見られなかった（図７ｂ）。
【００５１】
以上のことから、ＨＡ−ＧＮＰはマウス内において、インフルエンザウイルスに対する免疫を誘導した事が分かった。また一方で、ＤＳ２５−ＧＮＰ−ｓｍａｌｌ単独では免疫反応を誘導しないことが分かった。
【実施例４】
【００５２】
［糖鎖固定化金ナノ粒子が結合したウイルス抗原タンパク質に対する抗体の製造］
実施例３において、ＨＡ−ＧＮＰ画分を投与したグループのマウスから脾臓組織を回収した。このグループは、４回目の抗原投与後に、インフルエンザウイルス破砕タンパク質に対する抗体価が上昇したグループである。回収した脾臓組織から脾臓細胞を単離し、Ｂリンパ球骨随腫細胞（ミエローマ細胞）との細胞融合を行なった。ミエローマ細胞は抗体産生能力が無いＳＰ２／０−ＡＧ１４株を使用した。融合させた細胞は９６穴培養プレート中で培養し、順次ＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行なった（図８）。
【００５３】
まず、各ウェル中の細胞がコロニーを形成した時点で、インフルエンザウイルスの破砕タンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡを行なった（スクリーニング１）。この結果を図８ａに示す。次に、スクリーニング１で抗体価が任意の閾値を超えた細胞を回収し、限界希釈法による細胞の分割を行なった。これは、希釈によって溶液中の細胞密度を下げ、１ウェルあたりに細胞を１個だけ入れる方法である。各細胞が再びコロニーを形成した時点で、上記と同一の抗原によるＥＬＩＳＡを行なった（スクリーニング２）。この結果を図８ｂに示す。スクリーニング２で抗体価が任意の閾値を超えた細胞の中から、さらに１０種類の細胞コロニーを選抜して抗体産生ハイブリドーマとし、抗体の回収に使用した。
【００５４】
抗体の回収は、上記抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いて行なった。まず、培養上清を用いて免疫クロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体のアイソタイプ判定を行なった。この際、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定キット（Ｓｉｇｍａ）を使用した。その結果、得られた抗体は免疫グロブリンガンマの２ｂサブクラス、かつカッパークラス（ＩｇＧ２ｂ−ｋａｐｐａ）に属することが分かった（図９）。次に、培養上清を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体の精製を行なった。精製には、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。精製した抗体について限外濾過（１０ｋＤ）を行い、低分子の除去とバッファー交換を行なった。精製モノクロ−ナル抗体を用いて、インフルエンザウイルスの破砕タンパク質を抗原としたＥＬＩＳＡを行なったところ、濃度依存的な抗体価の上昇が見られた（図１０）。
【００５５】
上記の精製モノクロ−ナル抗体について、抗原に対する結合性を確認するために免疫沈降実験を行なった。抗体をＰｒｏｔｅｉｎＡ結合型磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合させた後、インフルエンザウイルスの破砕タンパク質を含む溶液中に混ぜ、作用させた後、磁気分離によって抗原−抗体複合体を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。銀染色してタンパク質を調べた結果、約６０ｋＤの位置に抗原タンパク質が見られた（図１１）。この抗原タンパク質部分のゲルを回収し、タンパク質分解酵素トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲル内タンパク質の消化を行なった。ゲル内タンパク質の消化によって得られたペプチドを疎水性カラム（Ｚｉｐ−ｔｉｐＣ１８，ミリポア社製）で脱塩・精製した。得られたペプチドについて、イオントラップ型マトリックス支援レーザーイオン化―飛行時間型質量分析器（ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ，島津製作所製）による質量分析を行なった。質量分析により得られたデータを、タンパク質配列同定データベースＭａｓｃｏｔで検索し、タンパク質の同定を行なった。質量分析で得られた質量ピーク、及びタンパク質同定の結果を図１２に示した。データ解析の結果、モノクロ−ナル抗体が結合したインフルエンザウイルスの抗原タンパク質はヘマグルチニンであった。以上から、糖鎖固定化金ナノ粒子−インフルエンザウイルス抗原タンパク質複合体を免疫することで得られた抗体は、インフルエンザウイルスの粒子表層のタンパク質であるヘマグルチニンに結合する抗体であることが明らかとなった。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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