(57)【要約】【課題】  特定の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを皮膚の内部、さらには細胞内の標的ｍＲＮＡまで効率的に到達させ、表皮に塗布して効果を十分に発揮させる美白剤組成物を提供する。【解決手段】（Ａ）界面活性剤および水を含むリオトロピック液晶と、（Ｂ）前記リオトロピック液晶の水相に封入されている非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するチロシナーゼのｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する美白剤組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）界面活性剤および水を含むリオトロピック液晶と、
（Ｂ）前記リオトロピック液晶の水相に封入されている一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するチロシナーゼのｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する美白剤組成物。
【化１】
2013256453.tif 000007
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基又は
−Ｐ（Ｒ３）Ｒ４
［式中、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、炭素数１乃至５個のシアノアルコキシ基又は炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基を示す］を示し、Ａは、炭素数１乃至４個のアルキレン基を示し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基又は下記α群から選択される置換基を有する置換プリン−９−イル基若しくは置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基を示す。］で表わされる化合物及びその塩。
（α群）
水酸基、保護された水酸基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基、及び、ハロゲン原子。
【請求項２】
請求項１のチロシナーゼのｍＲＮＡに対する非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号１〜３に記載された塩基配列であるチロシナーゼのｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドからなる請求項1記載の美白剤組成物。
【請求項３】
請求項１または２記載の美白剤組成物を含有する美白化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ａ）界面活性剤と水を含むリオトロピック液晶とそのリオトロピック液晶の水相部に、（Ｂ）チロシナーゼをコードするｍＲＮＡの特定部位にハブリダイズする特定の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する美白剤組成物およびそれを含有する美白化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラニンの生成機構は複雑で多岐にわたるが、概略としては、チロシンがチロシナーゼに酸化されることにより生成したドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）が、さらにチロシナーゼにより酸化されることによりドーパキノンが生成した後、数段階の反応を経てメラニンが生成するという経路が明らかになりつつある。
【０００３】
この経路において、チロシナーゼはメラニン生成の重要な役割を果たしていることから、皮膚のシミ、ソバカス等の予防または治療を目的として、チロシナーゼの活性を阻害することにより、メラニン生成を抑制する物質が種々提案されている。
【０００４】
具体的には、アスコルビン酸およびその誘導体（特許文献１）、ハイドロキノン誘導体（特許文献２）、コウジ酸類（特許文献３）、プラセンターエキス等の胎盤抽出物（特許文献４）、アセチルカルニチン（特許文献５）、マンゴスチン果皮抽出物（特許文献６）等を配合した化粧料が提案されている。しかしながら、これらの技術は効果が不十分であった。
【０００５】
メラニンの生成機構にかかわる反応シリーズに含まれることが知られる酵素は、本質的にチロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）である。
【０００６】
これらの酵素は、チロシンのドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換の反応およびドーパのドーパキノンへの変換の反応を特に触媒し、メラニン色素形成を導く。これらの必須酵素の産出に関与するチロシナーゼ、ＴＲＰ−１をコードするｍＲＮＡの発現を調節するために、該ｍＲＮＡに対し向けられたオリゴヌクレオチドを美白化粧料に使用する技術も公開されている（特許文献７）。
【０００７】
しかしながら、親水性分子である当該オリゴヌクレオチドを実際に皮膚外用剤に適用した場合、皮脂及び角質層の細胞間隙を充填する細胞間脂質により皮膚浸透が十分でなく、分解を受けやすい等の問題があり、培養細胞で発現した様な美白効果は実際の皮膚外用剤において得られていない。
【０００８】
即ち、現在に至るまで充分満足できる美白剤及びそれを含有する皮膚用組成物は開発されていない。
【０００９】
一方リオトロピック液晶を有効成分として含む経皮吸収促進剤の技術が開示されている（特許文献８）。特許文献８には、活性成分の物理化学的特性に依存せず、様々な活性成分を経皮吸収させることができるとの記載があり、活性成分にはオリゴヌクレオチドの記載もある。
【００１０】
また、安定で優れたアンチセンス若しくはアンチジーン活性、又は、特定遺伝子の検出薬（プローブ）若しくは増幅開始の為のプライマーとして優れた活性を有する、新規非天然型オリゴヌクレオチド及びその製造中間体である非天然型ヌクレオシドの技術も開示されている（特許文献９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００６−０５２１７６号公報
【特許文献２】特開２００５−３０６７９７号公報
【特許文献３】特開２００５−１２００２３号公報
【特許文献４】特開２００５−３３６１２７号公報
【特許文献５】特開２０００−１７８１６６号公報
【特許文献６】特開平４−２４４００４号公報
【特許文献７】特表２００３−５２１９２９号公報
【特許文献８】国際公開第２００６／１１８２４６号公報
【特許文献９】特許第３４２０９８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、特定の非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを皮膚の内部、さらには細胞内の標的ｍＲＮＡまで効率的に到達させ、表皮に塗布して効果を十分に発揮させる美白剤組成物及びそれを含有する美白化粧料組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記問題を解決すべく鋭意検討の結果、特定の非天然型ヌクレオシドを導入することによって得られるチロシナーゼにハイブリダイズする特定の非天然型オリゴヌクレオチドを界面活性剤と水を含むリオトロピック液晶とそのリオトロピック液晶の水相部に含有させた美白剤組成物が上記問題点を解決することを見出し、この美白剤組成物を使用した美白化粧料が、表皮に塗布して効果を十分に発揮する美白化粧料であることを見出し本発明を完成した。
【００１４】
即ち本発明は、
（Ａ）界面活性剤および水を含むリオトロピック液晶と、
（Ｂ）前記リオトロピック液晶の水相に封入されている一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するチロシナーゼのｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する美白剤組成物に関する。
【００１５】
【化１】
2013256453.tif 000002
【００１６】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基又は
−Ｐ（Ｒ３）Ｒ４
［式中、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、炭素数１乃至５個のシアノアルコキシ基又は炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基を示す］を示し、Ａは、炭素数１乃至４個のアルキレン基を示し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基又は下記α群から選択される置換基を有する置換プリン−９−イル基若しくは置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基を示す。］で表わされる化合物及びその塩。
（α群）
水酸基、保護された水酸基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基、及び、ハロゲン原子。
【００１７】
特にチロシナーゼのｍＲＮＡに対する非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号１〜３に記載された塩基配列であるチロシナーゼのｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい
配列1       5’   TTCTGCATCTCTCCAATCCC      3’
配列2       5’   TCATCTGTGCAAATGTCACA      3’
配列3       5’   GTACTCATCTGTGCAAATGTCACA        3’
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、表皮に塗布して効果を十分に発揮する美白化粧料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】メラニン色素の陽性部位を示すマウス皮膚断面写真。
【図２】メラニン色素の陽性部位を示すマウス皮膚断面写真。
【図３】メラニン色素の陽性部位を示すマウス皮膚断面写真。
【図４】メラニン色素の陽性部位を示すマウス皮膚断面写真。
【図５】メラニン色素の陽性部位を示すマウス皮膚断面写真。
【図６】メラニン陽性部位の強度を画像解析により算出したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２１】
本発明の第一成分であるリオトロピック液晶（ｌｙｏｔｒｏｐｉｃ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｒｙｓｔａｌ）とは、界面活性剤（分子内に親水性部分と疎水性（親油性）部分を有する両親媒性分子）と水との共存系において、両者の混合比率と温度によって液晶状態（結晶のようにその分子配列に一定の規則性を保ちながら液体のような流動性を兼ね備えた状態）を形成するものを意味する。
【００２２】
リオトロピック液晶は、原理的には、疎水性部分（アルキル基などの疎水性基）同士を向け合った結晶構造をとる固体状態の界面活性剤に所定の温度範囲で水を加えていくと、当該部分が熱運動により規則性を失って液体状態となるが、今度は親水性部分が水素結合により作用しあって長周期を維持して会合構造（ヘキサゴナル構造やラメラ構造など）をとるものと理解することができる（必要であれば「鈴木敏幸、液晶、第２巻、１９４頁−２０１頁、１９９８年」を参照のこと）。
【００２３】
リオトロピック液晶は、その構成成分となる界面活性剤や水を、所定の温度において所定の比率で混合することにより調製することができる。必要に応じて構成成分を混合前や混合後に一時的に加温するといった操作を行ってもよい。
【００２４】
リオトロピック液晶を構成する界面活性剤は、特に限定されないが、各種の界面活性剤の中でも非イオン性界面活性剤が好ましく、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値は、８以上が好ましく、１０以上がより好ましく、１２以上が特に好ましい。
【００２５】
好適例としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキル(アルケニル)エーテル等があげられる。
【００２６】
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、酸化エチレンの平均付加モル数が５〜１００のものが好ましく、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０が特に好ましい。
【００２７】
ポリオキシエチレンアルキル(アルケニル)エーテルとしてはポリオキシエチレン分枝アルキルエーテルが好ましく、ポリオキシエチレン（20）オクチルドデシルエーテルが特に好ましい。
【００２８】
リオトロピック液晶中の界面活性剤の割合は、５〜８０重量％の範囲内が好ましく、７〜７０重量％の範囲内がより好ましく、１０〜６５重量％の範囲内が特に好ましい。
リオトロピック液晶を構成する水は、特に限定されず、純水や蒸留水などであればよい。また、水には、水と相溶性のあるエタノールやイソプロパノールなどの有機溶媒が含まれていてもよい。
【００２９】
リオトロピック液晶中の水の割合は、５〜８０重量％の範囲内が好ましく、１０〜６０重量％の範囲内がより好ましく、１３〜５０重量％の範囲内が特に好ましい。
【００３０】
本発明の美白剤組成物に含まれるリオトロピック液晶は、さらに油分を含んでいてもよい。油分を含ませることで、リオトロピック液晶の液晶構造を角質層の細胞間脂質が形成するラメラ構造に近似させることができる。
【００３１】
このようにリオトロピック液晶の液晶構造をラメラ構造に近似させることで、細胞間脂質の構造の相転移を起こさせやすくすることができ、水溶性ヌクレオチドを皮膚から吸収させやすくすることができる。
【００３２】
リオトロピック液晶に含まれる油分の例には、小麦胚芽油やトウモロコシ油、ヒマワリ油、ヒマシ油、大豆油などの植物油；シリコーン油；イソプロピルミリステートやグリセリルトリオクタノエート、ジエチレングリコールモノプロピレンペンタエリスリトールエーテル、ペンタエリスリチルテトラオクタノエートなどのエステル油；スクワラン；スクワレン；流動パラフィン；ポリブテンが含まれる。油分は、単一のものを単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。
【００３３】
リオトロピック液晶中の油分の割合は、１〜８０重量％の範囲内が好ましく、５〜７０重量％の範囲内がより好ましく、１０〜６５重量％の範囲内が特に好ましい。
【００３４】
また、本発明美白剤に含まれるリオトロピック液晶は、さらに多価アルコールを含んでいてもよい。多価アルコールを含ませることで、液晶構造の形成容易化（相領域の拡大）や安定化を図ることができる。多価アルコールの例には、ポリエチレングリコールやポリアルキレングリコールなどのポリアルキレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、２−ブテン−１，４−ジオール、ペンタン−１，５−ジオール、２，２−ジメチルプロパン−１，３−ジオール、３−メチルペンタン−１，５−ジオール、ペンタン−１，２−ジオール、２，２，４−トリメチルペンタン−１，３−ジオール、２−メチルプロパン−１，３−ジオール、ヘキシレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールが含まれる。多価アルコールは、単一のものを単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。リオトロピック液晶中の多価アルコールの割合は、１〜５５重量％の範囲内が好ましく、３〜５２重量％の範囲内がより好ましく、５〜５０重量％の範囲内が特に好ましい。
【００３５】
また、本発明の皮膚外用剤に含まれるリオトロピック液晶は、補助界面活性剤としてコレステロールなどをさらに含んでいてもよい。補助界面活性剤を含ませることで、多種多様の界面活性剤を用いた場合でも界面膜曲率の低減化を図ることができ、液晶構造の形成容易化や安定化を図ることができる。リオトロピック液晶中の補助界面活性剤の割合は、０.０１〜１０重量％の範囲内が好ましい。
【００３６】
本発明の第二成分である一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するチロシナーゼのｍＲＮＡに対する非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
【化２】
2013256453.tif 000003
【００３８】
［式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基又は
−Ｐ（Ｒ３）Ｒ４
［式中、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なって、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、炭素数１乃至５個のシアノアルコキシ基又は炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基を示す］を示し、Ａは、炭素数１乃至４個のアルキレン基を示し、Ｂは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基又は下記α群から選択される置換基を有する置換プリン−９−イル基若しくは置換２−オキソ−ピリミジン−１−イル基を示す。］で表わされる化合物及びその塩。
（α群）
水酸基、保護された水酸基、炭素数１乃至４個のアルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、炭素数１乃至４個のアルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基で置換されたアミノ基、炭素数１乃至４個のアルキル基、及び、ハロゲン原子。
【００３９】
本発明における「非天然型ヌクレオシド」は一般式（１）で示される糖構造を有するヌクレオシドを示す。
【００４０】
より好ましくは、一般式（１）においてＢが配列記号Ａに対応するアデニン、配列記号Ｇに対応するグアニン、配列記号Ｃに対応する5-メチルシトシン、配列記号Ｔに対応するチミンからなる塩基であり、Ａがメチレン基であり、Ｒ１は、水酸基の保護基（特に、メトキシ基で置換されていてもよいトリチル基）を示し、Ｒ２は、ホスホニル基、後述するモノ置換−クロロ（アルコキシ）ホスフィン類又はジ置換−アルコキシホスフィン類を反応することにより形成される基を示す非天然型ヌクレオシドが好ましい
【００４１】
【化３】
2013256453.tif 000004
【００４２】
「非天然型ヌクレオチド」は、異なるまたは同一の一般式（１）の非天然型ヌクレオシド類をリン酸ジエステル結合で２乃至５０個結合した非天然型ヌクレオチド構造からなるヌクレオチド及び、非天然型ヌクレオチド構造を一部含有するヌクレオチドを示す。
【００４３】
そのような非天然型オリゴヌクレオチドとしては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル結合部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体を挙げることができ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体及びリン酸ジエステル結合部分がチオエート化されたチオエート誘導体を挙げる事が出来る。
【００４４】
所望の配列の非天然型オリゴヌクレオチドは、必要な市販のホスホロアミダイト試薬等を使用して、通常の方法により、例えばパーキンエルマー社のホスホロアミダイト法によるモデル３９２などを用いて文献（Nucleic AcidsResearch, 12, 4539(1984)）記載の方法に準じて合成することが出来る。
【００４５】
本発明に使用する非天然型オリゴヌクレオチドは、核酸の糖部分の2’位と4’位を架橋した構造を有する特徴を有しておりフラノース環の構造が安定化し、ｍＲＮＡとの安定な相補鎖形成能が高い性能を有する。
【００４６】
一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するとは、特定配列のオリゴヌクレオチドを構成するすべてのヌクレオシドを一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシド類縁体で構成しても良いし、その一部を構成しても良い。より好ましくは、特定配列のオリゴヌクレオチドの3’末端から２〜４個及び、5’末端から２〜４個のヌクレオシドを一般式（１）の非天然型ヌクレオシドで置換した非天然型ヌクレオチドである。
【００４７】
本件発明者は、チロシナーゼをコードするｍＲＮＡの特定部位にハブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を決定すべくマウスチロシナーゼ由来のコードを策定しマウス細胞を使用してスクリーニングした。及びマウス チロシナーゼに最も効果的であった配列１のハイブリダイズする部位の近傍のうちでヒトのチロシナーゼｍＲＮＡの配列中で相同的な配列をもつ部位を対象として新たに配列２〜３を設計した。（配列２及び配列３は、配列１とは異なる配列となった。）
更に配列２〜３の有用性をヒトメラノーマ細胞（HMV-II細胞）を使用したチロシナーゼｍＲＮＡの発現量を測定することにより効果を確認した。
【００４８】
本発明の美白剤組成物の製造は、例えば、第一成分であるリオトロピック液晶の調製過程や調製後に、第二成分である一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するチロシナーゼのｍＲＮＡに対する非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを液晶内に溶解させることで行うことができる。
【００４９】
リオトロピック液晶に配合する一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するチロシナーゼに対するｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドの配合量は、美白剤組成物全体に対して０．０００１%〜０．２%配合することが好ましい。０．０００１%を下回る添加量では、美白効果が認められない場合があり好ましくなく、０．２%を超えて添加しても問題はないが、リオトロピック液晶に溶解できず析出する為、過剰に加えたチロシナーゼのアンチセンスオリゴヌクレオチド類縁体による本発明の効果を得られない。
【００５０】
本発明の美白化粧料組成物は、前述した本発明の美白剤組成物を美白化粧料に配合することにより調整される。美白剤組成物の配合量は、美白化粧料組成物の剤形にもよるが１〜３０重量％の範囲内が好ましく、より好ましくは１〜１０%である。
【００５１】
本発明の皮膚外用剤中にリオトロピック液晶が含まれていることは、本発明の美白化粧料組成物を偏光顕微鏡で観察することで確認することができる。
【実施例】
【００５２】
次に、参考例、実施例および処方例によって本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明は、これらの実施例等によって何ら限定されるものではない。なお、下記において特に言及しない限り、各成分の配合量は重量％で示されるものとする。
【００５３】
オリゴヌクレチドの準備及びチロシナーゼｍＲＮＡ発現量の測定
実施例に使用したオリゴヌクレオチド／非天然オリゴヌクレオチドの配列及びそれらの表１に示す。
【００５４】
本実験群においては、非天然型ヌクレオシドとして一般式（１）のＡがメチレンで、Ｂがアデニニル、グアニニル、5-メチルシトシニル、チミニルである2’-O,4’-C-エチレン架橋ヌクレオシドを使用した。
【００５５】
表１のコードに対して使用しヌクレオシド及びヌクレオシド間結合の構造が各コードの右に記載してある。これらのオリゴヌクレオチド／非天然オリゴヌクレオチドの合成は
シグマ・ジェノシス(sigma genosys)と日本バイオサービスに依頼して合成した。
【００５６】
また後述の方法により各オリゴヌクレオチドがラット由来の細胞（※は人由来の細胞）のチロシナーゼｍＲＮＡ発現量をコントロールに対してどの程度抑制したかの測定を行った。
【００５７】
【表１】
2013256453.tif 000005
【００５８】
比較実験例１及び実験例１〜２のコードは同一で、マウスのチロシナーゼのｍＲＮＡにハイブリダイズする様に設計されたコードである。比較実験例１の糖基本構造がリボースでヌクレオシド連結がリン酸ジエステル構造であり、天然型オリゴヌクレオチドであることを示す。実験例１及び２は比較実験例１と同じコードの5’末端および3’末端から4塩基ずつ糖基本構造が一般式（１）で示される非天然ヌクレヤシドから構成されるヌクレオチドである非天然型ヌクレオチドである。
更に実験例２〜４については、非天然型ヌクレオシド間の結合がリン酸ジエステル結合の酸素原子1つをイオウに置換（ホスホロチエート）したもので、脂溶性が増加し、細胞膜透過性に優れているとされている。比較実験例１と実験例１〜２を比較すると、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは
（Ａ）チロシナーゼｍＲＮＡへハイブリダイズできる特定のコードを有すること
（Ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチドが一般式（１）のヌクレオシドを含有する非天然型ヌクレオチドである。
という２つの条件が必要であることが分かる。
【００５９】
更に連結基がホスホロチオエートであることがより好ましい。
【００６０】
実験例３及び４の配列は、ヒトのチロシナーゼのｍＲＮＡの発現をターゲットにしたシリーズである。この実験例３及び４の配列は、マウス チロシナーゼのmRNA発現量に効果のあった実験例１のハイブリダイズする部位の近傍のうちでヒトのチロシナーゼｍＲＮＡの配列中で相同的な配列をもつ部位を対象として新たに設計した。（実験例３及び実験例４は、実験例１とは異なる配列となった。）
実験例３及び４は理化学研究所バイオリソースセンターより入手したヒト由来メラノーマ細胞であるHMV-II細胞を使用し後述の方法に従ってチロシナーゼのｍＲＮＡ発現量のControl０２に対する結果を記載している。実験例３及び４はいずれも優れた性能を示した。
【００６１】
尚Control群は、各使用細胞においてトランスフェクトされた際、細胞の遺伝子発現に影響を与えない配列を選択した。
【００６２】
ｍＲＮＡ発現量の抑制効果の検証
比較実験例１、実験例１、実験例２、Control０１で準備した天然／非天然オリゴヌクレオチドのｍＲＮＡ発現量の抑制効果を以下の手順で測定した。
【００６３】
メラニン産生細胞の培養及び本発明のメラニン産生抑制剤の導入処理
マウスメラノーマ由来のB16F0細胞(DSファーマバイオメディカル)は、DMEM培地(Gibco)に10%(v/v)のウシ胎仔血清（SIGMA）及びペニシリン  100 単位/ml（終濃度）、ストレプトマイシン 100μg/ml（終濃度）を添加した培地中に撒種した。培養は、湿度を飽和した条件下で5%の二酸化炭素を含む大気中、37℃で行なった。
【００６４】
培養細胞をトリプシン(Gibco)で処理して培養容器から剥離、培養培地への懸濁、遠心分離し、上清を取り除いた細胞ペレットを低血清培地であるOpti-MEM I (GIBCO)に再懸濁した。この細胞懸濁液中の細胞をウェルあたり100,000細胞の割合で12ウェルマイクロプレートに撒種した。
【００６５】
試験するオリゴヌクレオチドをそれぞれ200 p molとLipofectamine 2000(Invitrogen)を1 μlを100μlの低血清培地Opti-MEM I中で混合した。これを１ウェルあたり900μlの Opti-MEM Iを加えてあるB16F0細胞に添加した。このときのオリゴヌクレオチドの最終濃度は200nＭである。
【００６６】
オリゴヌクレオチドを培地中に添加した３〜６時間後にオリゴヌクレオチドを含む培地を取り除き、あらたなDMEM培地を添加した。更に12〜48時間の培養の後に培地を取り除き細胞をリン酸緩衝性生理食塩水で洗浄した。
【００６７】
更に細胞をセルスクレーパーを用いて培養容器から剥がし取り、1.5mlマイクロチューブに移した。2000rpmにて１０分間遠心分離した後に上清を取り除いた。この細胞ペレットは、タンパク質の発現量の解析やmRNA発現量の解析に用いるまで-80℃にて保存した。
【００６８】
RT-PCRによる遺伝子発現解析
回収した細胞にフェノール及びグアニジンイソチオシアネートを含むTrizol試薬（invitrogen社製）を500ul加え、ボルテックスミキサーで撹拌、溶解させた。室温で５分インキュベートした後に100ulのクロロホルムを添加、ボルテックスミキサーで混合、室温で５分インキュベートした。これを４℃で20400 xgにて20分間遠心分離した。上層を新しいチューブに移し、250ulのイソプロパノールを添加、混合した後に氷上で30分間冷却した。その後４℃で20400 xgにて20分間遠心分離した。上清を除去した後に75%エタノール水溶液(v/v)を500ul加えてペレットを洗浄した。４℃で20400 xgにて20分間遠心分離し、上清を除去した。このペレット洗浄を２回行った。上清を取り除き、チューブをデシケーター内で減圧下にて乾燥させた。RNAペレットをDEPC処理水（RNase-free-water）を30-50ul加えて、65℃、10分間加熱して溶解させた。 RNAの収量は、260nmの吸光度から算出した。
【００６９】
RNA 1ugをとりこれに300pmolのrandom primerと混合、DEPC処理水で全量を10ulに調整した。70℃にて５分加熱したあとに氷上で急冷した。これにPrimeScript 1ststrand cDNA合成キット（TaKaRa製）に付属の5xbuffer 4ul , RNase Inhibitior 0.5ul, PrimeScript RTase 1ulを添加、DEPC処理水で全量20ulに調整した。30℃で２０分反応させてcDNA合成を行なった。その後、95℃にて２分間加熱してRTaseを失活させた。cDNA に滅菌水80ulを加えて全量を100ulとした。
【００７０】
このcDNAにつきEx Taq-Hot start version（TaKaRa bio製）を用いて下記の条件でPCRを行い、電気泳動した。泳動結果をデジタルカメラで撮影し、Image Jによるデンシトメーター解析からmRNAの発現量変化を確認した。
【００７１】
実験例３、実験例４、Control０１で用意した天然／非天然型オリゴヌクレオチドは、前述方法でマウスメラノーマ由来のB16F0細胞に変えてヒト由来メラノーマ細胞であるHMV-II細胞で同様に実施した。
【００７２】
以上の結果
配列1 5’   TTCTGCATCTCTCCAATCCC    3’
配列2 5’   TCATCTGTGCAAATGTCACA    3’
配列3 5’   GTACTCATCTGTGCAAATGTCACA      3’
のコードを有する非天然型オリゴヌクレオチドがチロシナーゼのアンチセンスオリゴとして作用して、チロシナーゼのｍＲＮＡの発現量を抑制することが確認された。
【００７３】
本発明は、実験例１〜４に例示される一般式（１）で示される非天然型ヌクレオシドを構成単位として含有するチロシナーゼのｍＲＮＡの非天然型アンチセンスオリゴヌクレオチドを界面活性剤および水を含むリオトロピック液晶の水相に封入されている美白剤組成物及びそれを含有する美白化粧料組成物に関するものである
以下の実施例及び比較例により美白剤組成物に関してその効果を動物皮膚におけるメラニン産生の抑制試験により説明する。
【００７４】
塗布サンプルの調整
【００７５】
実施例１  アンチセンスオリゴヌクレオチド（AON）／リオトロピック液晶の調製  
（Ａ）バイアル瓶に
水                                              632μl、
ポリオキシエチレン（20）オクチルドデシルエーテル      1.51g、
グリセリン                                      2.16g、
スクワラン                                      756mg
に配合し80℃にて加熱混合した。
（Ｂ）別容器に
実験例２の非天然型オリゴヌクレオチド                  327OD（10.9mg 1.69μmol）
10mM Tris・HCl (pH7.4)及び EDTA 1mM を含む緩衝液   340ulに溶解した。
Ａを70℃に加熱、Ｂを加え十分に混合し室温まで冷却しAON／リオトロピック液晶の調製を調整した。
【００７６】
比較例１  blank／リオトロピック液晶の調整  
（Ａ）バイアル瓶に
水                                              972μl、
ポリオキシエチレン（20）オクチルドデシルエーテル      1.51g、
グリセリン                                      2.16g、
スクワラン                                      756mg
を配合し80℃にて加熱混合、冷却した。
【００７７】
比較例2  α-アルブチン/リオトロピック液晶の調整
（Ａ）バイアル瓶に
水                                              1.7ml
ポリオキシエチレン（20）オクチルドデシルエーテル      2.8g、
グリセリン                                         4.0g、
スクワラン                                      1.4
を配合し８０℃に
に配合し80℃にて加熱混合した。
（Ｂ）別容器に
alpha-arbutin                                     100mgを
10mM Tris・HCl (pH7.4)及び EDTA 1mM を含む緩衝液   340ulに溶解した。
Ａを70℃に加熱、Ｂを加え十分に混合し室温まで冷却しAON／リオトロピック液晶の調製を調整した。
【００７８】
動物皮膚におけるメラニン産生の抑制試験
体幹の表皮にメラノサイトを有するヘアレスマウスであるHRM2（星野実験動物）を用いた。
【００７９】
HRM2マウス(♂、7週齢)の背部皮膚に1.6MEDのUVBおよびUVAを照射した。
【００８０】
さらにUV照射1時間後に1匹当たり45mgの試験製剤を塗布した。
【００８１】
この操作を週に5回行った。5週間後にマウスの背部の皮膚を採取し、4%パラホルムアルデヒド溶液での固定ののちにパラフィン包埋した。パラフィンブロックから5μmの切片を薄切し、スライドガラスに貼り付けた。４０℃にて伸展し、脱パラフィン、親水処理した。スライドをフォンタナマッソン染色し、脱水、キシレン置換した後にエンテランニュー(メルク社製、非水系封入剤)を用いて封入した。顕微鏡にてメラニン色素陽性部位の観察を行った。
【００８２】
【表２】
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得られた映像データの
メラニン陽性部位について、その強度をImage -Jによる画像解析により算出した。その結果をグラフ（図６）に示す。解析は、画像をグレースケールに変換ののちにメラニン陽性の黒色部位の強度を算出し、その値を基底層の長さで割った値をそれぞれの実験群で比較した。グラフの表記名称は表２の右欄に記載してある。
【００８３】
この結果、AON含有製剤を塗布した実験群でメラニン産生量の低下が認められ、基剤のみを塗布した実験群とAON含有製剤を塗布した実験群とで有意差が認められた。
【００８４】
一方、この実験系では、既知の美白成分であるα-アルブチン含有製剤はメラニン産生の抑制効果がみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明により、メラニン産生を抑制する美白剤組成物が得られ、美白化粧料として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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