(57)【要約】      （修正有）【課題】速やかな傷の治癒に有用なケラチノサイト遊走促進剤、または創傷を治癒するのに有用な外用剤組成物又は医薬品組成物の提供。【解決手段】ヒュウガナツ（日向夏）抽出物、ヒュウガナツ抽出物の水溶性成分、またはヒュウガナツ抽出物よりゲル濾過クロマトグラフィーにて得られる分子量2000〜20万の画分を有効成分とするケラチノサイト遊走促進剤、またはケラチノサイト遊走促進剤を含有する外用剤組成物若しくは医薬品組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒュウガナツ抽出物を有効成分とするケラチノサイト遊走促進剤。
【請求項２】
ヒュウガナツ抽出物に含まれる水溶性成分を有効成分とするケラチノサイト遊走促進剤。
【請求項３】
ヒュウガナツ抽出物よりゲル濾過クロマトグラフィーにて得られる分子量2000〜20万の画分を有効成分とするケラチノサイト遊走促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３記載のケラチノサイト遊走促進剤を含有する外用剤組成物。
【請求項５】
請求項１〜３記載のケラチノサイト遊走促進剤を含有する医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチノサイトの遊走を刺激することによるケラチノサイト遊走促進剤、又、それに伴い、創傷した皮膚組織の治癒を促進する外用剤組成物又は医薬品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
創傷治癒の過程は、炎症反応期-増殖期-組織再構築期の３つに分けることができる。
（炎症反応期）受傷組織に数時間以内に炎症細胞が浸潤する。数分でまず好中球が、続いて単球とリンパ球が到達し、プロテアーゼや活性酸素を産生して微生物による汚染を防ぐ。また、これらの細胞が壊死組織片を貪食作用により取り込むと、成長因子やサイトカインを放出し、増殖期への移行を促進する。
（増殖期）炎症反応から肉芽組織が形成され、上皮化する時期である。血管内皮細胞は血液凝固部に遊走・増殖し、血管を新生する。線維芽細胞の遊走は、受傷後48時間後位から開始され、炎症期に生じたフィブリン網を足場として傷部に移動する。炎症細胞から放出されたPDGF、TGF-α、TGF-β、FGFにより、線維芽細胞は遊走し、細胞増殖を行う。活性化された線維芽細胞は、ヒアルロン酸やコラーゲンなどを生成し、細胞外マトリックスを形成する。新しくできた組織は肉芽組織と呼ばれる。
（組織再構築期）創傷治癒の最終段階にあたり、細胞増殖やコラーゲン産生は徐々に沈静化し、創部の強度が増大する。細胞外マトリックスの再編成が行われ、肉芽組織は成熟した瘢痕組織となる（非特許文献１参照）。
【０００３】
創傷治癒の遅延は肥厚性瘢痕の形成要因となるため、傷を早く治すことは目立たない傷跡にする第一歩と考えられる。これまでに、創傷治癒に関わる細胞の活性化として、線維芽細胞の増殖またはコラーゲン産生に作用する物質はいくつか確認されている。また、ミカン属に属する植物の花の水蒸気蒸留水、果汁からは、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）が得られることも知られている。VEGFは線維芽細胞ではなく、血管内皮細胞を標的とする増殖因子である（特許文献１、特許文献２参照）。
【０００４】
しかし、いずれにおいても増殖や細胞外マトリックスの産生を刺激するものであり、傷部への細胞遊走を促進する作用については触れられていない。また、皮膚の創傷治癒には、「上皮化」、「真皮層の修復」、そして「血管新生」が正確に調和して働くことが必要である。「上皮化」は傷の閉鎖に関与しており、上皮化が遅れると、傷の治癒遅延につながる。最終的には「上皮化」はケラチノサイトの遊走、増殖、分化の能力に依存していることから、ケラチノサイトの傷口への遊走促進は、創傷治癒に有益と考えられる（非特許文献２参照）。現在、ケラチノサイト遊走促進効果を有する化合物がいくつか報告されているが（特許文献３、特許文献４参照）、柑橘類より抽出したエキスの遊走促進効果に関する文献は見当たらなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Sabine Werner et al.  Physiol Rev. VOL 83, JULY 2003
【非特許文献２】Shirakata et al. Journal of Cell Science 118 (11) Feb. 2005
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５０４９３３
【特許文献２】特開２００３−３１３１３６
【特許文献３】特開２０１２−５６８５７
【特許文献４】特開２０１２−６２２６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、新規で速やかな傷の治癒に有用なケラチノサイト遊走促進剤又は、創傷を治癒するのに有用な外用剤組成物又は医薬品組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以上の知見より、本発明者は天然であり且つ安全な植物を開発のテーマとし、様々な植物抽出物を調査し、鋭意検討を重ねた。
【発明の効果】
【０００９】
その結果、本発明者らはヒュウガナツ抽出物にケラチノサイト遊走促進作用を有することを見い出した。そして、ヒュウガナツ抽出物を有効成分とするケラチノサイト遊走促進剤、又はケラチノサイト遊走促進剤を含有する外用剤組成物又は医薬品組成物を提供することをもって、本発明を完成するに至った。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】コントロールのケラチノサイト遊走促進作用を示す図である。
【図２】本発明のヒュウガナツ抽出液のケラチノサイト遊走促進作用を示す図である。
【図３】本発明のヒュウガナツ抽出物のゲルろ過クロマトグラフィー分析で得られたチャート図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明で使用する「ヒュウガナツ(日向夏)」とは、ミカン科（Rutaceae）、ミカン属（Citrus）の植物：ヒュウガナツ（Citrus tamurana Hort.ex Tanaka）の果実、果皮、果肉、種子、種皮、蔕を用いる。
【００１２】
尚、本発明で使用するヒュウガナツ抽出物とは、各種使用部位をそのまま又は粉砕後搾取したもの。又は、そのまま或いは粉砕後、溶媒で抽出したものである。
【００１３】
本発明で用いるヒュウガナツ抽出物を得るための抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール或いは含水低級アルコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、1,2-ブチレングリコール、1,4-ブチレングリコール、1,5-ペンタンジオール、1,2-ペンタンジオール、1,3-ペンタンジオール、1,4-ペンタンジオール、1,3,5-ペンタントリオール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量100〜10万）等の多価アルコール或いは含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノール、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等）やアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）の中から選ばれる１種もしくは２種以上の混液が挙げられ、特に水、エタノール及び1,3-ブチレングリコールから選ばれる１種又は２種以上を選択することが好ましい。但し、用途により溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用するか、或いは抽出後に溶媒を除去しやすい、揮発性の高い溶媒を用いて抽出を行い、溶媒除去後水等に溶解させるといった方法も可能である。
【００１４】
抽出方法については、その溶媒の温度や原料に対する溶媒の重量比率、又は抽出時間についても、種々の原料及び使用する溶媒に対しそれぞれを任意に設定することができる。溶媒の温度としては−４℃から１００℃の範囲で任意に設定できるが、原料中に含まれる成分の安定性の点から、１０〜４０℃付近が好ましい。又、原料に対する溶媒の重量比率も、例えば原料：溶媒が、４：１〜１：１００の範囲内で任意に設定することができ、特に１：１〜１：２０の重量比率が好ましい。
【００１５】
本発明で用いるヒュウガナツ抽出物は、溶媒抽出後、更に適宜精製操作を施すことも可能であり、精製操作としては、酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、有機酸等）又はアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）添加による分解、微生物による発酵又は代謝変換、イオン交換樹脂や活性炭、ケイ藻土等による成分吸着、種々の分離モード（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等）を有するクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等が例示でき、これらを任意に選択し組合わせた処理を行うことが可能である。
【００１６】
本発明のケラチノサイト遊走促進剤、外用剤組成物又は医薬品組成物の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状等いずれの形状でも良く、本発明を実施する上で最適な形状を任意に選択することができる。
【００１７】
本発明のケラチノサイト遊走促進剤、外用剤組成物又は医薬品組成物におけるヒュウガナツ抽出物の含有量としては、効果が確認できる範囲であれば特に制限はないが、一般的には０．０１ｍｇ／ｇ〜２００ｍｇ／ｇ（分母は製剤の重量を示す）の範囲に設定される。好ましくは０．１ｍｇ／ｇ〜２０ｍｇ／ｇの範囲が良い。
【００１８】
尚、外用剤組成物としては、例えば、各種の外用製剤類（動物用に使用する製剤も含む）全般において利用でき、具体的には、アンプル、カプセル、丸剤、錠剤、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の1)医薬品類、2)医薬部外品類、3)局所用又は全身用の皮膚用化粧品類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、4)頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、5)浴湯に投じて使用する浴用剤、6)その他、腋臭防止剤や消臭剤、防臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ、歯磨き類、口中清涼剤、含嗽剤、食器洗浄剤等にも使用することができる。
【００１９】
又、 医薬品組成物としての適用方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。又、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、張化剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
【００２０】
尚、本発明のケラチノサイト遊走促進剤、外用剤組成物又は医薬品組成物には、必須な有効成分である本発明のヒュウガナツ抽出物の他、本発明の効果を損なわない範囲内で、一般的に使用される成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができ、更に多種の機能性を有する付加することが可能である。製剤中における含有量は、特に限定されないが、通常0.0001〜50％の濃度範囲が好ましい。
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。
【実施例】
【００２２】
（製造例１）
ヒュウガナツの果実及び果皮100gを精製水（約10〜60℃）にて約30分間抽出し、濾過して抽出液を約2.0kg得る。
【００２３】
（製造例２）
ヒュウガナツの果実及び果皮100gを30％エタノールにて約30分間抽出し、濾過して抽出液を約2.0kg得る。
【００２４】
（試験１）ケラチノサイト遊走促進作用試験
「試験方法および評価方法」
ヒト新生児包皮由来角化細胞  NHEK、(NHEK、KURABO)の前培養および本試験にはケラチノサイト増殖培地  KG2（KURABO）を用い、培養は５％CO2、３７℃の条件下で行った。
細胞の遊走評価は、Ibidi社のInstruction Manualに従い操作を行った。３〜７×105個/ml のNHEKをカルチャーインサートに７０μl/wellフ゜レートで播種し、２４時間前培養した。培養後、インサートを取り外し、試料を含む培地に置換して写真撮影（図１又は図２中、右側面の端又は左側面の端より黒い実線までは、０時間目の細胞間隙を表す）を行った。次に、ヒュウガナツ抽出液又はコントロールを添加し、１７時間培養後、写真撮影を行うと共に、数１より、ヒュウガナツ抽出液添加による間隙被覆率を求め、その変化をケラチノサイト遊走促進作用として評価を行った。尚、結果を表１及び図１〜２に示した。
「試料」
尚、ケラチノサイト遊走促進作用試験の試料は、1,3-ブチレングリコール（終濃度：０.１％）に調整したものをコントロールとし、本発明の製造例１で得られたヒュウガナツ抽出液（終濃度：０.３３％）に調整したものを試験に供した。
【００２５】
（数１）
間隙被覆率(％) = (１−Ｓ１／Ｓ０）×１００
Ｓ０：０時間目の平均細胞間距離、Ｓ１：１７時間培養後の平均細胞間距離
【００２６】
【表１】
2013241383.tif 000002
【００２７】
（試験結果）
結果は表１及び図１〜２に示した通り、本発明のヒュウガナツ抽出液を添加した後はコントロールに比べ、間隙被覆率が高くなっており、よって、ヒュウガナツ抽出液はケラチノサイト遊走促進作用を有することが確認できた。又、本発明の製造例１で得られたヒュウガナツ抽出液は精製水による抽出液であり、水溶性成分にケラチノサイト遊走促進作用を有することも確認できた。又、創傷治癒促進剤としても利用可能である。
【００２８】
（試験２）分子量の測定
【００２９】
「試験方法」
本発明の製造例１で得られたヒュウガナツ抽出液をエタノールにて脱脂した。脱脂したヒュウガナツ抽出液を精製水で１時間撹拌抽出し、得られた抽出液をゲルろ過クロマトグラフィー用担体のSephadex G-25 Coarse（GEヘルスケア・ジャパン株式会社社製）で分画し、結果を図３に示した。
「試料」
本発明の製造例１で得られたヒュウガナツ抽出液を試験に供した。
【００３０】
（試験結果）
結果は図３の通り、得られた分布曲線は保持時間が１５分〜２２分の範囲にあり、且つ、ピークを示す保持時間が１６.１分と２１.４分であった。検量線から、実施例１において得られたヒュウガナツ抽出液は分子量の範囲が２.０×１０3〜２.０×１０5であり、ピークを示す分子量が９.０×１０4と２.７×１０3にあることが確認でき、本発明のヒュウガナツ抽出液に含まれる水溶性成分の分子量範囲は、2000〜20万の分子量の範囲であった。
【００３１】
（処方例）各種組成物の製造
本発明による様々な剤形の製剤を製造した。以下にその処方例を示すが、各処方例は各製品の製造における常法により製造したもので良く、配合量のみを示した。本発明はこれらに限定されるわけではない。
【００３２】
（処方例１）乳液
重量％
1.スクワラン                                           5.0
2.オリーブ油                                           5.0
3.ホホバ油                                             5.0
4.セタノール                                           1.5
5.グリセリンモノステアレート                           2.0
6.ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル                 3.0
7.ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレート         2.0
8.1，3−ブチレングリコール                             1.0
9.グリセリン                                           2.0
10.リンゴ酸ナトリウム                                   1.0
11.製造例１のヒュウガナツ抽出液                         5.0
12.防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル）                 適量
13.香料                                                 適量
14.精製水                                               残余
【００３３】
（処方例２）錠剤
組成：本発明の実施例１のヒュウガナツ抽出液の濃縮物30mg、ヒドロキシプロピルセルロース20mg、軽質無水ケイ酸3mg、乳糖 8mg、結晶セルロース9mg、タルク10mg、ジアシルグリセロール20mgを定法に従って１錠100mgの錠剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、ヒュウガナツ抽出物を有効成分とするケラチノサイト遊走促進剤、更に、ケラチノサイト遊走促進剤を含有する外用剤組成物又は医薬品組成物を提供することができる。
【図３】
2013241383.tif 000003
【図１】
2013241383.tif 000004
【図２】
2013241383.tif 000005