(57)【要約】【課題】酸化鉄を有する粒子は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳと略すことがある）中に添加すると、時間がたつにつれて、粒径が大きくなることがわかった。PBSは生体の血液と同じ成分を含むため、この粒子を生体に付与すると、生体の血液中で同様の現象が生じる可能性がある。血液中で粒径が増大すると、血管がつまるといった問題が生じる可能性がある。【解決手段】酸化鉄を有する粒子において、前記粒子の表面にアルブミンが非共有結合していることを特徴とする粒子。【選択図】図１
2013121926.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化鉄を有する粒子において、前記粒子の表面にアルブミンが非共有結合していることを特徴とする粒子。
【請求項２】
前記粒子は、マトリックス材が前記酸化鉄を被覆した構成を有することを特徴とする請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記マトリックス材は、疎水性のポリマーであることを特徴とする請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
アルブミンは前記疎水性のポリマーに疎水性相互作用で結合していることを特徴とする請求項３に記載の粒子。
【請求項５】
前記粒子の表面に界面活性剤を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項６】
前記粒子の表面に２種またはそれ以上の界面活性剤を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の粒子。
【請求項７】
前記界面活性剤として、少なくともポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルとリン脂質のうちいずれか一方の界面活性剤が用いられることを特徴とする請求項５又は６に記載の粒子。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の粒子及び分散媒を有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【請求項９】
検体内の粒子を検出する工程を含む光音響イメージング方法であって、
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の粒子が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程と、
前記検体内に存在する前記粒子から発生する音響波を検出する工程とを有することを特徴とする光音響イメージング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子、前記粒子を有する光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化鉄を有する粒子は、造影剤として用いることができることが知られている。リゾビスト（登録商標）は、複数の酸化鉄粒子を多糖類のデキストランでコーティングした粒子であり、MRI用の造影剤として用いられる。また、リゾビスト（登録商標）に光を照射すると、音響波を発生することが知られている（非特許文献１）。そのため、リゾビスト（登録商標）は光音響イメージング用造影剤として用いることができると考えられる。
【０００３】
ここで、光音響イメージング用造影剤とは、光音響イメージング法で用いられる造影剤である。光音響イメージング法は、生体などの検体に光を照射することで検体から発せられる音響波の強度と発生位置を測定することにより、検体内部の物質分布の画像を得る方法である。光音響イメージング用造影剤が検体内の特定のターゲット部位に蓄積しやすい場合、光音響イメージング用造影剤を検体に付与した後に、光音響イメージング法によって画像を得ると、その画像における、その特定のターゲット部位とそれ以外の部位とのコントラストが上がる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍｅｄ  Ｔｅｃｈ  ２００９；  ５４：ｐｐ．８３−８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、酸化鉄を有する粒子について鋭意検討した結果、次のような課題を見出した。すなわち、酸化鉄を有する粒子は、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline、以下、ＰＢＳと略すことがある）中に添加すると、時間がたつにつれて、粒径が増大することがわかった。PBSは生体の血液と同じ成分を含むため、この粒子を生体に付与すると、生体の血液中で同様の現象が生じる可能性がある。血液中で粒径が増大すると、血管がつまるといった問題が生じる可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決する手段としての本発明は、酸化鉄を有する粒子において、前記粒子の表面にアルブミンが非共有結合していることを特徴とする粒子に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る、酸化鉄を有する粒子は、粒子の表面にアルブミンを非共有結合させることで、PBS中で時間がたつにつれて生じる粒径の増大を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態に係る粒子の模式図。
【図２】本実施形態に係る粒子を製造する工程の一例を示す図。
【図３】実施例１で調製した粒子をＰＢＳ中で、３７℃で０日、１日、２日、３日間静置した際の粒径の変化を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施形態について説明する。ただし、個々に開示する実施形態は一例であり、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【００１０】
本実施形態に係る粒子は、酸化鉄を有する粒子において、前記粒子の表面にアルブミンを有することを特徴とする。この粒子は、酸化鉄のみからなる粒子であってもよいし、ポリマーなどのマトリックス材で酸化鉄が被覆されてなる粒子であってもよい。
【００１１】
実施例で後述するように、酸化鉄を有する粒子は、PBS中では時間がたつにつれて粒径が大きくなる。その理由は次のように考えられる。
【００１２】
まず、酸化鉄を有する粒子が、酸化鉄のみからなる粒子である場合を考える。酸化鉄のみからなる粒子は疎水性であり、PBS中では、疎水性相互作用により凝集する。時間がたつにつれて凝集が繰り返され、その結果粒径が大きくなる。
【００１３】
次に、酸化鉄を有する粒子が、ポリマーなどのマトリックス材で酸化鉄が被覆されてなる粒子である場合について説明する。酸化鉄がマトリックス材で被覆されている場合、マトリックス材が親水性であれば凝集はしにくい。しかし、PBS中には血液と同じ成分、例えば、リン酸イオン、塩化物イオン、ナトリウムイオンなどが存在するため、時間がたつにつれて、マトリックス材で被覆された酸化鉄が、マトリックス材の外部のPBS中の各種イオンと相互作用する回数が増える。酸化鉄は、これらのイオンと相互作用すると、マトリックス材で被覆された状態から、マトリックス材とPBSとの境界部分へと出た状態へと変化してしまうと考えられる。前記したように、酸化鉄は疎水性であり、同じように、マトリックス材とPBSとの境界部分へと酸化鉄が出てきてしまった粒子同士が、凝集を起こし、結果的に粒径が大きくなると考えられる。
【００１４】
一方、本実施形態に係る粒子は、粒子の表面に存在するアルブミンが酸化鉄粒子と外部に存在するイオンとの相互作用を物理的に阻害するため、酸化鉄と別の酸化鉄との相互作用、酸化鉄とPBS中の各種イオンとの相互作用を抑制できると考えられる。その結果、粒径の増大を抑制することができる。
【００１５】
本実施形態に係る粒子は、マトリックス材が酸化鉄を被覆した構成を有することが好ましい。ここでマトリックス材とは、酸化鉄を被覆するものであればどのようなものでもよく、例えば疎水性のポリマー、親水性のポリマー、多糖類などが挙げられる。マトリックス材を有することで、酸化鉄同士の凝集を抑制することができる。
【００１６】
また、本実施形態に係る粒子は、粒子の表面に界面活性剤を有することが好ましい。界面活性剤を有することで、粒子がPBS中に分散しやすくなり、粒子の凝集を抑制できる。粒子は１種類のみの界面活性剤を有していてもよいし、２種またはそれ以上の界面活性剤を有していてもよい。２種以上の界面活性剤を用いることにより、分散性を上げる以外の効果を粒子にもたらすことができる。例えば、Tween20とDSPE-PEG-OMeの2種類の界面活性剤を併用すると、Tween20による分散性向上の効果に加えて、DSPE-PEG-OMeによる粒子に対する血中タンパク質の非特異吸着防止の効果が期待できる。
【００１７】
このように粒子の表面にアルブミンと界面活性剤の両者が存在する場合、両者の割合を適切に選択することが好ましい。なぜなら、アルブミンが少ない場合、上記の通り、酸化鉄がPBS中の各種イオンと接触する可能性が増え、その結果、凝集が生じる可能性が高くなる。一方、アルブミンが多い場合、粒子の表面に存在するアルブミンとその隣のアルブミンとの距離が近くなり、アルブミンの有する疎水性の部位同士の距離が近くなり、アルブミン同士が集まって、粒子から分離してしまう可能性がある。粒子からアルブミンが離れてしまうと、酸化鉄がPBS中の各種イオンと接触する可能性が増える問題や、アルブミンが離れてしまうことによる、粒子のサイズ変化といった問題が生じる可能性がある。
【００１８】
本実施形態に係る粒子において、アルブミンは粒子の表面に非共有結合していることが好ましい。ここで、アルブミンは、血中の主要成分であるため、血中で異物と判断されにくいという性質を有する。一方、アルブミンの構造が変わる場合、例えば、アルブミンの有する官能基の一部が共有結合により別の物質に結合する場合、アルブミンが本来有する、生体内で異物と判断されにくい、という性質がなくなる、あるいは、弱まる可能性がある。したがって、アルブミンが粒子の表面に非共有結合したものは、共有結合したものに比べて、血中で異物と判断されにくいと考えられ、その結果、血中で安定して存在すると考えられる。非共有結合としては、疎水性相互作用、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力による結合などが挙げられる。酸化鉄のみからなる粒子の表面にアルブミンを結合させる場合、酸化鉄の有する正の電荷とアルブミンの負に帯電している部分との間のイオン結合を用いることができる。ポリマーなどのマトリックス材で酸化鉄が被覆されてなる粒子の表面にアルブミンを結合させる場合、ポリマーの有する疎水性部位とアルブミンの疎水（性）ポケットと呼ばれる疎水性の高い部位との間の疎水性相互作用などを用いることができる。
【００１９】
また、粒子の表面に非共有結合でアルブミンを固定する場合、ＮＨ２基やＳＨ基などの官能基を粒子表面に導入する必要がないため、粒子作製の手間を減らすことができることが期待できる。また、官能基の導入による粒子表面の電荷などの状態の変化による粒子の性質の変化を回避できること、アルブミンの変性を回避できることなどが期待できる。
【００２０】
本実施形態に係る粒子の一例について、図１を用いて説明する。本実施形態に係る粒子１は、酸化鉄２がマトリックス材としての疎水性のポリマー３に被覆された構成を有しており、粒子の表面にアルブミン６を有している。粒子はさらに、その表面に２種類の界面活性剤４，５を有している。なお、以下の実施形態においては２種類の界面活性剤４及び界面活性剤５を用いた態様について説明するが、粒子１の使用の目的によっては界面活性剤を用いなくてもよいし、１種類または３種類以上の界面活性剤を用いてもよい。
【００２１】
（粒径）
本実施形態における粒子は、目的とする用途に対して粒径を制御することが可能であり、例えば、腫瘍組織の造影に用いる場合は、その粒径は１０ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。これは、この範囲の粒径であればＥＰＲ（Enhanced Permeation and Retention）効果があると考えられるからである。腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性が高いため、粒子などが血管より流出しやすい。さらに、この流出した粒子は腫瘍組織に到達して蓄積する。腫瘍組織の持つこのような特性をＥＰＲ効果という。
【００２２】
なお、粒径を求める方法としては、ＴＥＭ（Transmission Electron Microscope）画像を取得して、その画像から粒径を測定することにより求める方法や、動的光散乱法を用いて求める方法などがある。動的光散乱法によって粒径を求める方法として例えば、動的光散乱解析装置（大塚電子（株）製、ＤＬＳ−８０００）を用いる方法が挙げられる。なお、上記の方法を用いて粒径を複数回測定し、その平均の値を粒径とすることができる。
【００２３】
また、本実施形態に係る粒子１は、粒子内に高濃度のＩＣＧを含有させることによって、１．０×１０９Ｍ−１ｃｍ−１以上の大きなモル吸光係数を有し、光音響イメージング用造影剤や蛍光イメージング用造影剤として好適に利用することができる。
【００２４】
（酸化鉄）
本実施形態における酸化鉄は、特に限定されないが、６００乃至１３００ｎｍの近赤外波長領域に吸収をもつことが好ましい。酸化鉄は通常粒子状で存在する。酸化鉄粒子として具体的には、Ｆｅ３Ｏ４（マグネタイト）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（マグヘマイト）、またはこれらの混合物などが挙げられる。特に好ましくは、マグネタイトである。マグネタイトは、マグヘマイトより近赤外波長領域におけるモル吸光係数が高いことが知られており、したがって光を照射したときに発生する音響波も大きくなると考えられる。
【００２５】
本実施形態における酸化鉄粒子がオレイン酸で被覆されている場合には、酸化鉄同士の凝集を防ぎ、より小さいサイズの粒子にすることが可能となる。
【００２６】
さらに、本実施形態における酸化鉄粒子がオレイン酸で被覆されている場合には、オレイン酸で被覆された酸化鉄粒子とアルブミンとが疎水性相互作用で結合することにより、酸化鉄の粒子外への漏出をさらに防ぐことが可能になると考えられる。アルブミンは疎水（性）ポケットと呼ばれる疎水性の高い部位を有するため、疎水性の高い部分や疎水性の高い物質と結合する性質を持つ。この疎水性の高い部分がオレイン酸の疎水性の高い部分であるアルキル鎖部分と疎水性相互作用により結合するためである。
【００２７】
また、本実施形態における酸化鉄粒子は、単結晶、多結晶、非晶質（アモルファス）のいずれの結晶状態でもよい。
【００２８】
本実施形態における酸化鉄粒子は市販のものを用いてもよいし、以下の方法で得たものを用いてもよい。例えば、ＦｅＣｌ３とＦｅＣｌ２を水に溶解させて溶解液とし、この溶解液を攪拌しながらアンモニア水を加えて、酸化鉄粒子を得る方法である。
【００２９】
本実施形態における酸化鉄粒子は、種々のサイズを利用することが可能である。例えば、粒径が、５ｎｍ（鉄原子濃度１．４５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度１０ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−０５、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、１０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度４．３ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−１０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、１５ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度１．２５ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−１５、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、２０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度０．５５ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−２０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、５０ｎｍ（鉄原子濃度５ｍｇ／ｍｌ、酸化鉄粒子濃度０．０３４ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＳＨＰ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及び１００ｎｍ（後に記載の実施例１０の粒子）である酸化鉄微粒子などを利用することが可能である。
【００３０】
（マトリックス材）
上記のマトリックス材とは、酸化鉄を被覆するものであればどのようなものでもよく、例えば疎水性のポリマー、親水性のポリマー、多糖類などが挙げられる。
【００３１】
（疎水性のポリマー）
本実施形態における疎水性のポリマーは、疎水性で、酸化鉄粒子を含有させるバインダーとしての機能をもつポリマーであればどのようなものでもよい。ポリマーが疎水性であることにより、含有する酸化鉄粒子が流出しにくい。
【００３２】
例えば、後述するナノエマルジョン法を用いて本実施形態における粒子を製造する場合は、後述する第一液体に溶解させてナノエマルジョンを形成した後、第一液体を留去して固体になるようなポリマーであればよい。このようなポリマーの例としては、ヒドロキシカルボン酸を有する炭素数６以下のモノマーからなるホモポリマー若しくは２種類以上の前記モノマーからなるコポリマーなどが挙げられる。本実施形態における酸化鉄粒子はこれらのポリマーのうち少なくともいずれか１つで被覆されていることが好ましい。
【００３３】
本実施形態に係る造影剤を生体内に投与する場合、長期にわたって造影剤が生体内に残らないように、疎水性ポリマーとしては、ヒドロキシカルボン酸を有する炭素数６以下のモノマーからなるポリマーを用いることが好ましい。これは、ヒドロキシカルボン酸を有する炭素数６以下のモノマーからなるポリマーは、生体内の酵素によって切断させるエステル結合を有するからである。エステル結合を切断されたポリマーは代謝させやすいため、生体内に残りにくい。
【００３４】
ヒドロキシカルボン酸を有する炭素数６以下のモノマーからなるポリマーとしては、ポリ乳酸（polylactic acid、ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（Polyglycolic acid、ＰＧＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（poly(lactide-co-glycolide) copolymers、ＰＬＧＡ）などが挙げられる。
【００３５】
疎水性のポリマーは、親水性の部分を有していてもよい。例えば、ポリメタクリル酸メチル、ポリメタクリル酸エチル、ポリメタクリル酸ブチル、ポリメタクリル酸イソブチルなどが挙げられる。
【００３６】
上記疎水性のポリマーの重量平均分子量は２０００乃至１００００００であることが好ましく、１００００乃至６０００００であることがさらに好ましい。
（多糖類）
本実施形態における多糖類としては、デキストラン、ヒアルロン酸、プルランなどが挙げられる。
【００３７】
（粒子の安定性）
本明細書における粒子の安定性に関して、「粒子が安定である」とは「内包した酸化鉄粒子の漏出、粒子の崩壊、粒子の凝集や非特異的なタンパク質の吸着による粒径の増大などを抑制できる」ことなどを指す。例えば、ＰＢＳなどの、ＮａＣｌ濃度が高く生体内に近い条件下においては、ＮａＣｌの電荷的な作用により粒子に内包した酸化鉄粒子の漏出や粒子表面の電荷状態などの変化による粒子の崩壊や凝集などの変化が起こると考えられる。アルブミンを粒子表面に非共有結合で固定化し、粒子表面をアルブミンで覆うことで、このような漏出や、電荷状態などの変化を抑制することができる。
【００３８】
（アルブミン）
本実施形態におけるアルブミンは、ヒトに投与する場合、ヒト由来の血清アルブミンが好ましい。アルブミンは分子量約６７ｋＤａのタンパク質であり、血中に豊富に存在するタンパク質である。アルブミンを粒子表面に固定化することで、他の血中に存在するタンパク質が粒子表面に非特異吸着することを防ぐ効果、アルブミンで粒子を覆うことによる粒子の親水性の向上の効果、それらに伴う粒子の安定性の向上の効果などが得られると考えられる。また、アルブミンはマーカー捕捉分子やポリエチレングリコールなどのポリマーを粒子表面に固定化する際に利用することも可能である。
【００３９】
（アルブミンの粒子表面への固定方法）
本実施形態におけるアルブミンの粒子表面への固定化方法は、主にアルブミンと疎水性のポリマーとの疎水性相互作用などの非共有結合的な力による。非共有結合であることの利点として、粒子表面に共有結合のためのＮＨ２基やＳＨ基などの官能基の導入が不要であるため、作製の手間を減らすことができること、官能基の導入による粒子表面の電荷などの状態の変化による粒子の性質の変化を回避できること、アルブミンの変性を回避できることなどが挙げられる。非共有結合としては、疎水性相互作用の他に、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス力などを利用することが可能である。
【００４０】
（界面活性剤）
本実施形態における界面活性剤４及び界面活性剤５としては、アルブミンと粒子との結合を妨げるものでなければ特に限定されることはなく、また粒子のエマルジョンを形成することができればいかなるものでもよい。例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等を使用することができる。これらの界面活性剤は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。
【００４１】
上記本実施形態における界面活性剤に使用する非イオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（商標）６０、Ｔｗｅｅｎ（商標）８０及びＴｗｅｅｎ８５等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Ｂｒｉｊ（商標）３５、Ｂｒｉｊ（商標）５８、Ｂｒｉｊ（商標）７６、Ｂｒｉｊ（商標）９８、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０、Ｉｇｅｐａｌ（商標）ＣＯ５３０、Ｉｇｅｐａｌ（商標）ＣＯ６３０、Ｉｇｅｐａｌ（商標）ＣＯ７２０並びにＩｇｅｐａｌ（商標）ＣＯ７３０等を挙げることができる。
【００４２】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するアニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等を挙げることができる。
【００４３】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するカチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を挙げることができる。
【００４４】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用する高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール及びゼラチン等を挙げることができる。
【００４５】
また、上記本実施形態における界面活性剤に使用するリン脂質としては、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基のいずれかの官能基を有するホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。また、界面活性剤に使用するリン脂質はＰＥＧ（Polyethylene glycol）鎖を含むものであってもよい。
【００４６】
官能基が水酸基、メトキシ基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基でありＰＥＧ鎖を含むような界面活性剤に使用するリン脂質としては、例えば、化学式１で示される1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[poly(ethylene glycol)] （DSPE-PEG-OH）、化学式２で示されるPoly(oxy-1,2-ethanediyl),α-[7-hydroxy-7-oxido-13-oxo-10-[(1-oxooctadecyl)oxy]-6,8,12-trioxa-3-aza-7-phosphatriacont-1-yl]-ω-methoxy- （DSPE-PEG-OMe）、化学式３で示されるN-(aminopropyl polyethyleneglycol)-carbamyl distearoylphosphatidyl-ethanolamine（DSPE-PEG-NH2）、化学式４で示される3-(N-succinimidyloxyglutaryl) aminopropyl polyethyleneglycol-carbamyl distearoylphosphatidyl-ethanolamine（DSPE-PEG-NHS）、化学式５で示されるN-(3-maleimide-1-oxopropyl) aminopropyl polyethyleneglycol-carbamyl distearoylphosphatidyl-ethanolamine（DSPE-PEG-MAL）等のリン脂質を挙げることができる。なお、化学式１乃至５において、ｎは５以上５００以下の整数である。
【００４７】
【化１】
2013121926.tif 000003
【化２】
2013121926.tif 000004
【化３】
2013121926.tif 000005
【化４】
2013121926.tif 000006
【化５】
2013121926.tif 000007
【００４８】
（マーカー捕捉分子）
本実施形態における粒子には、マーカー捕捉分子を固定することが可能である。マーカー捕捉分子とは、標的分子と特異的に結合することのできる化合物を意味する。また、ここでいう「特異的に結合」とは、標的分子との解離定数ＫＤ（値が低いほど結合親和性は高い）が１μＭ以下であると定義されている。前記マーカー捕捉分子としては、標的分子に対して１μＭ以下の解離定数を有する化合物であれば特に限定されず、酵素、抗体、受容体、サイトカイン、ホルモン、血清タンパク等が挙げられる。本発明のマーカー捕捉分子として、解離定数の低さ、分子の構造安定性の観点から、特に抗体が好ましい。ここでいう「抗体」とは、特定の抗原又は物質に応答して免疫系により誘発されるイムノグロブリンファミリーのタンパク質の総称であり、特定の標的分子を認識し、かつこの標的分子に結合することができる物質である。前記抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体であり得、または他の種から由来し得る。また、前記抗体は、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体とのいずれでもよい。さらに、前記抗体の一部分であり、当該抗体よりも低分子化された、標的分子結合能を有するそれらの誘導体である抗体フラグメントであってもよい。前記抗体フラグメントとしてはＦａｂフラグメント（以下「Ｆａｂ」と略すことがある）、Ｆａｂ ’フラグメント（以下「Ｆａｂ ’」と略すことがある）、Ｆ(ａｂ’)、Ｆ（ａｂ ’）２、重鎖可変（ＶＨ）ドメイン単独、軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン単独、ＶＨとＶＬの複合体、あるいはラクダ化ＶＨドメイン、または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチド等がある。
【００４９】
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、上記の本実施形態に係る粒子と分散媒とを有する。上記の分散媒は、本実施形態に係る酸化鉄粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、ＰＢＳなどが挙げられる。本実施形態に係る造影剤は、上記本実施形態に係る酸化鉄粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る酸化鉄粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００５０】
上記の本実施形態に係る粒子は、生理食塩水や注射用蒸留水、ＰＢＳ等の溶媒中に分散して使用することができる。また、必要に応じて薬理上許容できる添加物を適宜添加しても良い。これら光音響イメージング用造影剤は、静脈注射あるいは皮下注射によって体内に導入することができる。
【００５１】
（光音響イメージング方法）
本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下の各工程を有する。
（ｉ）上記の光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｉｉ）前記検体内に存在する前記造影剤から発生する音響波を検出する工程
ここで、光を照射する装置としては特に限定されないが、チタンサファイアレーザ（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）など用いることができる。
また、音響波を検出する装置としては特に限定されないが、超音波探触子などを用いることができる。
【００５２】
（粒子の製造方法）
粒子を得る方法としては、限定されるものではないが、例えばナノエマルジョン法を挙げることができる。
【００５３】
図１で示される二種類の界面活性剤を用いた粒子１を製造する工程の一例を図２に示す。具体的には、以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程により図１で示される粒子１の水分散液を得ることができる。なお、１種類、又は三種類以上の界面活性剤を用いた粒子も、同様の工程によって製造することができる。
（Ａ）酸化鉄を含む組成物２、及びポリマー３を有機溶媒に溶解させて得られる第一液体７を、界面活性剤４と界面活性剤５とアルブミン６とを溶解させた水溶液である第二液体８に加えて混合液を得る工程。
（Ｂ）前記混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン９を得る工程。
（Ｃ）前記エマルジョン９の分散質から第一液体７を留去する工程。
ここで、酸化鉄を含む組成物２とは、酸化鉄粒子単独、オレイン酸に被覆された酸化鉄粒子などを指す。
【００５４】
（第一液体）
上記ナノエマルジョン法に用いる第一液体７の溶媒として使用する有機溶媒としては、水への溶解性がないか又は溶解性が小さく、且つ、酸化鉄を含む組成物２及びポリマー３を溶解することができるものであればいかなる有機溶媒をも使用することが可能である。ただし、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
【００５５】
このような有機溶媒としては、限定されるものではないが、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、及び芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等を用いることができる。これらの有機溶媒は単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。
【００５６】
（第二液体）
上記ナノエマルジョン法に用いる第二液体８は、界面活性剤４と界面活性剤５とアルブミン６を溶解した水溶液である。第二液体８に界面活性剤４、界面活性剤５及びアルブミン６をあらかじめ含ませておくと、第一液体７と混合した際にエマルジョンを安定化させることができる。但し、本実施形態においては第一液体７と第二液体８とを混合した分散液に界面活性剤４、界面活性剤５及びアルブミン６を含ませることができればよく、界面活性剤４、界面活性剤５及びアルブミン６は必ずしも第二液体に予め溶解されている必要はない。
【００５７】
また、第二液体８に含まれる界面活性剤４又は界面活性剤５の好ましい濃度は、用いる界面活性剤の種類及び第一液体７との混合比にもよる。例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を用いたときは、第二液体８中の濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。また、例えば、ＰＥＧ鎖を含むリン脂質を界面活性剤として用いたときは、第二液体８中の濃度を０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。
また、第二液体８に含まれるアルブミン６の濃度は、０．１ｍｇ〜５ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。
【００５８】
また、界面活性剤４として非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を、界面活性剤５としてＰＥＧ鎖を含むリン脂質を用いた場合の界面活性剤４と界面活性剤５との構成比は、モル比で１００：１〜１：１の範囲が好ましい。界面活性剤５の構成比がこの範囲を超えると、粒子の形成が困難になる為、好ましくない。
【００５９】
（エマルジョン）
上記ナノエマルジョン法におけるエマルジョン９は、本発明の目的を達成可能であればいかなる物性のエマルジョンでもよいが、１ピークの粒径分布を有するエマルジョンであることが好ましい。
【００６０】
このようなエマルジョン９は、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機及びタービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、並びにコロイドミル法、ホモジナイザー法及び超音波照射法等の従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。これらの方法は単独で用いてもよいし、あるいは２種以上の方法を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョン９は１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本発明の目的を達成できる範囲においてこれらの手法に限定されるものではない。
【００６１】
エマルジョン９は、第二液体８に第一液体７を加えて得られる混合液から調製される水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンである。ここで、第一液体７と第二液体８の混合とは、第一液体７と第二液体８とを空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることを意味し、必ずしも互いに混和することを要さない。
【００６２】
混合液における第一液体７と第二液体８との割合は、水中油（Ｏ／Ｗ）型のエマルジョンを形成することができれば特に限定されることはないが、好ましくは、第一液体７と第二液体８との重量比が、１：２〜１：１０００となる範囲で混合することが好ましい。
【００６３】
（留去）
上記ナノエマルジョン法における留去とは、エマルジョン９の分散質から第一液体７を除去する操作である。即ち、酸化鉄を含む組成物２、ポリマー３、第一液体７（有機溶媒）を含む分散質から第一液体７を除去することである。
【００６４】
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを維持できれば特に限定されないが、好ましい温度は０℃から８０℃の範囲である。但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する粒子が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００６６】
（実施例１  粒子の合成と特性評価）
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等、同様な機能、効果を有する粒子が得られる範囲で自由に変えることができる。
【００６７】
（実施例１  アルブミンを表面に含有する粒子の合成と特性評価）
オレイン酸に被覆された５０ｎｍ酸化鉄粒子３０ｍｇ（ＳＯＲ−５０、Ｏｃｅａｎ  ＮａｎｏＴｅｃｈ社製）、及びＰＬＧＡ２７．６ｍｇ（乳酸：グリコール酸のモル比＝１：１、Ｍ.Ｗ.２００００、和光純薬工業（株）製）をクロロホルム（３ｍｌ）に加えて、超音波バスで１０分間照射し、クロロホルム溶液を調製した。
【００６８】
０．５ｗｔ％  Ｔｗｅｅｎ（商標）２０水溶液３６ｍｌとリン脂質２１．９ｍｇ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＯＭｅ、日油（株）製）を溶解した水溶液を調製した。前記Ｔｗｅｅｎ（商標）２０とリン脂質の水溶液を１２ｍｌずつに分け、それぞれにヒト血清アルブミン（カルビオケム）を０ｍｇ、５．２ｍｇ、５２ｍｇ添加して、アルブミンを０ｍｇ、５．２ｍｇ、５２ｍｇ含有したＴｗｅｅｎ（商標）２０とリン脂質の水溶液を調製した。
【００６９】
この３種類の水溶液１２ｍｌに、前記クロロホルム溶液を１ｍｌずつ加えて混合液とした。その後、超音波分散機で４分間処理することによって、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００７０】
次に、前記エマルジョンをロータリーエバポレーター（４０℃で２時間）で減圧し、分散質からクロロホルムを留去することによって、粒子の表面がＴｗｅｅｎ（商標）２０とリン脂質で保護され、且つＰＬＧＡ中に前記酸化鉄粒子を含む粒子の水分散液、もしくはＴｗｅｅｎ（商標）２０とリン脂質、およびアルブミンで保護され、且つＰＬＧＡ中に前記酸化鉄粒子を含む粒子の水分散液を得た。次に、得られた水分散液を５マイクロメーターフィルター、次に１．２マイクロメーターフィルターでろ過した。
【００７１】
次に、得られた上記水分散液を純水２Ｌへ透析することを３回繰り返した後、５マイクロメーターフィルター、次に１．２マイクロメーターフィルターでろ過して、粒子溶液とした。以後、アルブミンを０ｍｇ、５．２ｍｇ、５２ｍｇ含有したＴｗｅｅｎ（商標）２０とリン脂質の水溶液を用いて作製した酸化鉄微粒子を有する粒子をそれぞれ、ＰＮＰ−Ｆｅ、ＰＮＰ−Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｌ、ＰＮＰ‐Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｈと略す。
【００７２】
ＰＮＰ−Ｆｅ、ＰＮＰ−Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｌ、ＰＮＰ−Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｈの粒径を動的光散乱解析装置（大塚電子（株）製、ＤＬＳ−８０００）で分析したところ、流体力学的直径（キュムラント値）はそれぞれ、ＰＮＰ‐Ｆｅは２０２ｎｍ、ＰＮＰ−Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｌは３３４ｎｍ、ＰＮＰ−Ａｌｂ−Ｈは３３１ｎｍであった。
【００７３】
（実施例２  粒子のＰＢＳ中での安定性の評価）
ＰＮＰ−Ｆｅ、ＰＮＰ−Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｌ、ＰＮＰ−Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｈをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）で、３７℃で０日、１日、２日、３日間静置した際の粒径を経時的に測定することにより、各粒子のＰＢＳ中での安定性を評価した。図３に示すように、ＰＮＰ‐Ｆｅでは経時的に粒径が増大するのに対して、ＰＮＰ‐Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｌ、ＰＮＰ‐Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｈでは粒径の増大が抑えられていた。以上より、ＰＮＰ‐Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｌ、ＰＮＰ‐Ｆｅ−Ａｌｂ−Ｈは、ＰＢＳ中で安定に存在することを確認した。
【符号の説明】
【００７４】
１  粒子
２  酸化鉄
３  疎水性のポリマー
４  界面活性剤１
５  界面活性剤２
６  アルブミン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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