(57)【要約】【課題】新たな免疫療法を行うことのできる免疫療法剤の提供。【解決手段】（Ａ）一般式（１）2013209359.tif 000004（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）で表されるピロリドン類を有効成分とする免疫賦活剤と、（Ｂ）抗原とを組み合わせてなる免疫療法剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）一般式（１）
【化１】
2013209359.tif 000003
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
で表されるピロリドン類を有効成分とする免疫賦活剤と、（Ｂ）抗原とを組み合わせてなる免疫療法剤。
【請求項２】
前記（Ａ）免疫賦活剤と前記（Ｂ）抗原とが別製剤である請求項１記載の免疫療法剤。
【請求項３】
前記ピロリドン類が、Ｎ−メチルピロリドン又はＮ−エチルピロリドンである請求項１又は２記載の免疫療法剤。
【請求項４】
前記（Ａ）免疫賦活剤の剤形が、経皮投与剤である請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項５】
前記（Ｂ）抗原の剤形が、経皮投与剤である請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項６】
前記（Ｂ）抗原の剤形が、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤またはスプレー剤である請求項５に記載の免疫療法剤。
【請求項７】
前記（Ｂ）抗原の剤形が、貼付剤である請求項５に記載の免疫療法剤。
【請求項８】
前記（Ｂ）抗原の剤形が、マイクロニードル、無針注射、イオントフォレーシス、ソノフォレーシスまたはエレクトロポレーションである請求項５に記載の免疫療法剤。
【請求項９】
前記（Ａ）免疫賦活剤を投与し、次いで（Ｂ）抗原を投与するものである請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項１０】
前記（Ａ）免疫賦活剤を経皮投与し、次いで（Ｂ）抗原を経皮投与又は注射するものである請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項１１】
前記（Ａ）免疫賦活剤と、前記（Ｂ）抗原と、（Ｃ）角質剥離用粘着シートと、（Ｄ）前記（Ａ）免疫賦活剤を所定部位に適用すること、次いで、前記（Ｃ）角質剥離用粘着シートを前記所定部位に適用して角質を剥離すること、次いで、前記（Ｂ）抗原を前記所定部位に適用することを指示する指示事項を記載した説明書と、を備えた免疫療法用キットの形態である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項１２】
前記（Ａ）免疫賦活剤と、前記（Ｂ）抗原と、（Ｃ）角質剥離用粘着シートと、（Ｄ）前記（Ｃ）角質剥離用粘着シートを所定部位に適用して角質を剥離すること、次いで、前記（Ａ）免疫賦活剤を前記所定部位に適用すること、次いで、前記（Ｂ）抗原を前記所定部位に適用することを指示する指示事項を記載した説明書と、を備えた免疫療法用キットの形態である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【請求項１３】
前記（Ａ）免疫賦活剤と、前記（Ｂ）抗原と、（Ｄ）前記（Ａ）免疫賦活剤を所定部位に適用すること、次いで、前記（Ｂ）抗原を前記所定部位に適用することを指示する指示事項を記載した説明書と、を備えた免疫療法用キットの形態である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常ワクチンやガンペプチドなどの抗原投与の際は、その効果を高めるためにアジュバント（抗原性補強剤）が使用される。最も多い方法としては、アジュバントと抗原を同時に皮下投与する方法である（特許文献１）。しかしこの方法では、アジュバントが注射部位のごく小さな部位（直径１ｃｍ以下）に局所的に作用し、その部位で非特異的な免疫活性化が続く状態となり、浮腫などの皮膚刺激がしばしばおこることが知られている。これに対し、経皮でのワクチン投与についても検討がなされている（特許文献２、３）。特に特許文献３においては、あらかじめアジュバント成分の経皮適用によって、免疫活性を高めたのちに抗原を投与することで、少量の抗原で効果が得られ、さらに免疫活性の低い対象に対しても効果が得られるとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００２−５１０６５１号公報
【特許文献２】特表２００２−５３５３５０号公報
【特許文献３】特表２００９−２９２８３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これら従来の免疫療法の効果は十分ではなく、さらに優れた免疫療法が望まれていた。
従って、本発明の課題は、新たな免疫療法を行うことのできる免疫療法剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、ワクチン等の抗原の免疫性を向上させることのできる免疫賦活成分を探索したところ、全く意外にもピロリドン類に強い免疫賦活作用があることを見出し、さらに、これと抗原とを併用することにより抗原の免疫性が顕著に向上し、ヒトを含む動物に対する安全で有効な免疫療法剤が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、（Ａ）下記一般式（１）
【０００７】
【化１】
2013209359.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒは、水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
で表されるピロリドン類を有効成分とする免疫賦活剤と、（Ｂ）抗原とを組み合わせてなる免疫療法剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、免疫活性が顕著に発現誘導された状態で免疫療法を効果的に行うことのできる優れた免疫療法剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】群１、群２及び群３による抗原特異的免疫誘導効果を示す図である。
【図２】群１、群２及び群３による抗原特異的免疫誘導効果を示す図である。
【図３】群４、群５及び群６による抗原特異的免疫誘導効果を示す図である。
【図４】群４、群５及び群６による抗原特異的免疫誘導効果を示す図である。
【図５】試験３、試験４及び試験５の腫瘍細胞増殖抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の免疫療法剤は、前記（Ａ）免疫賦活剤と（Ｂ）抗原とを組み合わせてなるものである。当該（Ａ）免疫賦活剤の有効成分である一般式（１）で表されるピロリドン類である。一般式（１）中、Ｒとしては炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましい。Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられるが、メチル基、エチル基が特に好ましい。すなわち、ピロリドン類（１）としては、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドンが特に好ましい。
【００１２】
ピロリドン類（１）は、抗原の免疫性を顕著に増強させる作用を有し、免疫賦活剤として有用である。このことは、後記実施例に示すように、本発明の免疫療法剤の投与後において、抗原提示細胞（表皮ランゲルハンス細胞、真皮内樹状細胞等の樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等）を含む限られた免疫系細胞にのみ発現するＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子及びその表面活性化分子のリンパ節移行の割合、並びに投与された抗原（癌由来ペプチド）を捕獲したＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子（ペプチド陽性細胞）の割合を、フローサイトメータを使用して測定することにより確認された。また、（Ａ）免疫賦活剤には、ピロリドン類（１）以外に、例えば他の免疫賦活剤（サポニン、クレスチン等）、免疫調節剤、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＴＬＲ賦活剤（イミキモド、リポポリサッカライド、ＰｏｌｙＩＣ、ＣｐＧヌクレオチド等）、抗悪性腫瘍剤（ピシバニール、レンチナン等）等を含有させることができる。
【００１３】
（Ａ）免疫賦活剤の剤形は、注射用剤または経皮投与剤であることが好ましく、経皮投与剤であることがより好ましい。経皮投与剤は、注射用剤と比較して、非侵襲的であること、また操作が塗る、貼るなどの単純な作業になるため、医療従事者である必要がなく、患者自身によっても作業可能である点で優れている。経皮投与剤としての免疫賦活剤の剤形は、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、スプレー剤等の他、パップ剤、テープ剤等の貼付剤などが挙げられる。これらの中でも貼付剤であることがより好ましく、角質剥離機能を有する貼付剤であることが特に好ましい。
角質剥離機能を有する貼付剤の剥離により、皮膚表皮角質層を物理的に破壊させることができ、通常免疫賦活剤の適用後に適用される抗原の経皮吸収性を向上させることが出来るうえ、角質剥離機能を有する貼付剤の剥離による皮膚表皮角質層の破壊により皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化が引き起こされる。すなわち、免疫賦活成分による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮樹状細胞など）の活性化と、皮膚表皮角質層の破壊による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化の両方を一つの貼付剤で行うことができる。
【００１４】
（Ａ）免疫賦活剤の経皮投与剤中のピロリドン類の含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。
【００１５】
また、（Ａ）免疫賦活剤には、希釈剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤；水等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１６】
（Ａ）免疫賦活剤の剤形としては、ピロリドン類（１）を粘着層に含有する貼付剤がより好ましい。当該粘着層中のピロリドン類（１）の含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。
【００１７】
粘着層は水系でも非水系でもよい。水系の粘着層を形成するための水系粘着剤としては、従来公知の水性ジェルを用いることができる。また、非水系の粘着層を形成するための非水系粘着剤としては、例えば、ゴム系粘着剤、アクリル系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ウレタン系粘着剤等が挙げられる。これらの中でも、粘着力の制御が容易である点で、ゴム系粘着剤およびアクリル系粘着剤が好ましい。
【００１８】
また、（Ａ）免疫賦活剤（剤形が貼付剤の場合）の粘着層には、可塑剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
常温で液状又はペースト状の成分は、粘着層全体の質量に基づいて合計で、好ましくは１〜４０質量％、さらに好ましくは５〜３５質量％の範囲内で適宜配合される。
【００１９】
粘着層の坪量は、粘着層が水系粘着剤で形成されている場合には、１００〜３０００ｇ／ｍ2であることが好ましく、２００〜２０００ｇ／ｍ2であることがより好ましい。また、粘着層が非水系粘着剤で形成されている場合には、１０〜５００ｇ／ｍ2であることが好ましく、２０〜１００ｇ／ｍ2であることがより好ましい。
【００２０】
（Ａ）免疫賦活剤（剤形が貼付剤の場合）は、支持基材を有していることが好ましい。
支持基材は、粘着層を支持する機能を有する。かかる支持基材は、可撓性（柔軟性）を有し、貼付時における曲面追従性をもち、加工時における裁断または打ち抜き等に適したものが好ましい。
このような支持基材としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）等のポリオレフィン、ポリアリレート、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリスルホン、ナイロン、ポリ乳酸、レーヨン、アクリル等の樹脂からなるプラスチックフィルム、織物、編物および不織布を用いることが可能である。さらに、プラスチックフィルムと、プラスチックフィルム、織物、編物、不織布および紙等とのラミネートシートや金属蒸着を施したプラスチックフィルムを用いることが可能である。
支持基材の平均厚さは、２〜４０００μｍであるのが好ましく、１０〜３００μｍであるのがより好ましい。
【００２１】
（Ａ）免疫賦活剤（剤形が貼付剤の場合）は、剥離シートを有していることが好ましい。
剥離シートは、貼付剤の保管時（未使用時）において、粘着層の貼付面を保護する機能を有するとともに、有効成分の拡散を防止する機能を有している。
【００２２】
このような剥離シートとしては、例えば、ポリエチレンラミネート紙、ポリプロピレンラミネート紙等のラミネート紙類；ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系フィルム、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン系フィルム等の合成樹脂フィルム等が使用できる。また、剥離シートは、必要に応じてこれらの材料の片面または両面にシリコーン樹脂等により剥離処理が施されたものを使用してもよい。
また、剥離シートの平均厚さは、１０〜２００μｍであることが好ましく、１５〜１００μｍであることがより好ましい。
【００２３】
（Ｂ）抗原としては、免疫応答を引き起こすことができる分子であれば、特に制限はないが、例えばペプチドまたはタンパク質が挙げられる。ペプチドとしては、天然由来のペプチドまたは合成ペプチドのいずれでもよく、３〜２５のアミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。タンパク質としては、天然由来のタンパク質または合成タンパク質のいずれでもよい。具体的には、癌抗原（腫瘍抗原）、種々のウイルス由来抗原、感染原因菌由来抗原、種々のアレルギー原因抗原等が挙げられる。上記腫瘍抗原としては、自己の腫瘍細胞を無毒化して得られる自己腫瘍抗原であってもよい。
【００２４】
（Ｂ）抗原は、そのまま投与してもよいが、その剤形は注射用剤または経皮投与剤であることが好ましく、経皮投与剤であることがより好ましい。この理由は、皮下注射された抗原は投与された局所から拡散するのに時間がかかり、皮膚下層中に点在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮内樹状細胞等）に捕獲される効率が低くなるためである。これに対して、経皮投与の場合には、表皮角質層が皮膚透過のバリアとなってしまい、抗原の経皮吸収性が低いことが問題となるが、上記のように、皮膚表皮角質層を破壊することで劇的に抗原の経皮吸収性が高まるうえ、皮下注射に比べて皮膚表皮の比較的広い範囲に抗原が投与されるため、皮膚下層中に点在する抗原提示細胞に捕獲される効率が高くなるという利点を有する。
【００２５】
（Ｂ）抗原の経皮投与剤としての剤形は、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、スプレー剤等の他、パップ剤、テープ剤等の貼付剤などが挙げられる。また、抗原の剤形は、マイクロニードル、無針注射、イオントフォレーシス、ソノフォレーシスまたはエレクトロポレーション等の装置を備えるものであってもよい。液剤で塗布する場合、液だれを防ぐ目的で不織布や織布などにしみこませ適用すると良い。これらの中でも貼付剤であることがより好ましい。抗原をこのような経皮投与剤にするにあたっては、前記（Ａ）免疫賦活剤の場合と同様の添加剤、基剤等を使用することができる。経皮投与剤及び注射用剤中の抗原の含有量は、抗原の種類、安全性などにより相違するが、０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜１０質量％がより好ましく、０．００１〜５質量％がさらに好ましい。
【００２６】
また、（Ａ）免疫賦活剤及び（Ｂ）抗原を経皮投与する場合には、これらの製剤に加えてさらに（Ｃ）角質剥離用粘着シートを備えていてもよい。角質剥離用粘着シートは、例えば特開２００７−２８９６７２号公報、特開２００８−２０１６９８号公報、特開２０１１−１６８５４２号公報、特開２０１１−１７７２７４号公報に記載のものが使用できる。
角質剥離用粘着シートの剥離により、皮膚表皮角質層を物理的に破壊させることができ、免疫賦活剤及び抗原の経皮吸収性を向上させることが出来るうえ、角質剥離用粘着シートの剥離による皮膚表皮角質層の破壊により皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化が引き起こされる。すなわち、免疫賦活剤による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮内樹状細胞等）の活性化と、皮膚表皮角質層の破壊による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化の両方を行うことができる。
【００２７】
本発明の免疫療法剤は、（Ａ）免疫賦活剤と（Ｂ）抗原とを組み合わせて投与できればよく、同時投与であっても、逐次投与であってもよいが、（Ａ）免疫賦活剤投与後、次いで（Ｂ）抗原を投与するのがより好ましい。また、（Ａ）免疫賦活剤と（Ｂ）抗原とは、投与経路が同一でも、互いに異なっていてもよい。より好ましい形態は、（Ａ）免疫賦活剤の製剤と、（Ｂ）抗原の製剤（抗原投与剤）とを組み合わせた免疫療法用キットである。このようなキットの場合、それぞれの剤形は、（Ａ）免疫賦活剤が経皮投与剤が好ましく、（Ｂ）抗原投与剤は経皮投与剤又は注射用剤が好ましい。
【００２８】
本発明の免疫療法剤の投与順序は、まず（Ａ）免疫賦活剤を投与し、次いで（Ｂ）抗原を投与するのが好ましい。さらには、（Ａ）免疫賦活剤を経皮投与し、次いで（Ｂ）抗原を経皮投与又は注射するのがより好ましい。
【００２９】
本発明の免疫療法剤は、（Ａ）免疫賦活剤と（Ｂ）抗原とを別製剤とした免疫療法用キットとするのが好ましい。当該免疫療法用キットには、前記の角質剥離用粘着シート及び／又は使用法を記載した説明書を含めることができる。
【００３０】
前記の角質剥離用粘着シートを備えた免疫療法用キットは、（Ａ）免疫賦活剤と、（Ｂ）抗原と、（Ｃ）角質剥離用粘着シートと、（Ｄ）前記（Ａ）免疫賦活剤を所定部位に適用すること、次いで、前記（Ｃ）角質剥離用粘着シートを前記所定部位に適用して角質を剥離すること、次いで、前記（Ｂ）抗原を前記所定部位に適用することを指示する指示事項を記載した説明書と、を備えたものであることが好ましい。
また、角質剥離用粘着シートの適用順序を変えて、（Ｄ）前記（Ｃ）角質剥離用粘着シートを所定部位に適用して角質を剥離すること、次いで、前記（Ａ）免疫賦活剤を前記所定部位に適用すること、次いで、前記（Ｂ）抗原を前記所定部位に適用することを指示する指示事項を記載した説明書を備えたものであってもよい。
【００３１】
本発明の免疫療法用キットは、（Ａ）免疫賦活剤と、（Ｂ）抗原と、（Ｄ）前記（Ａ）免疫賦活剤を所定部位に適用すること、次いで、前記（Ｂ）抗原を前記所定部位に適用することを指示する指示事項を記載した説明書と、を備えたものである。
【００３２】
免疫賦活剤を適用した後に抗原を適用する際、その間隔は、免疫賦活剤の適用直後〜９６時間後であることが好ましく、３０秒後〜７２時間後であることがより好ましく、１分後〜４８時間後であることが特に好ましい。
【００３３】
本発明の免疫療法用キットには、免疫療法の手順を記載した説明書を備えており、記載された手順に従って治療を行うことで、免疫療法を正確に行うことができる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００３５】
実施例
（１）免疫賦活剤Ａの作製
アクリル系ポリマー溶液（アクリル酸−２−エチルヘキシル；２ＥＨＡ／Ｎ−ビニルピロリドン；ＶＰ／ヘキサンジオールジメタクリレート；ＨＤＤＭ  共重合体＝７８／２２／０．０３［ｍｏｌ％］、Ｍｗ＝約８５万、固形分３５質量％）１００質量部に対して、免疫賦活成分としてＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）１０質量部を溶解して粘着剤組成物を調製した後、剥離シートとしての剥離処理ポリエステルフィルム（商品名「ＳＰ−ＰＥＴ３８１０３１」、リンテック社製）上に、上記粘着剤組成物をアプリケーターで塗布し、８０℃で乾燥して坪量２５ｇ／ｍ2の粘着層を形成した後、支持基材としての厚さ５０μｍのポリエチレンテレフタレートフィルムを粘着層面にラミネートして、支持基材／粘着層／剥離シートの構成からなる免疫賦活剤Ａ（テープ剤、粘着層中にＮＭＰ８質量％含有）を得た。
【００３６】
（２）抗原投与剤Ａの作製
ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯという）３質量部とリン酸緩衝液（以下ＰＢＳという、ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」カタログＮｏ．：２００１２０５０）９７質量部とを混合して溶液Ａを調製し、溶液Ａ０．５ｍＬに対して、抗原として蛍光色素ＦＩＴＣ修飾されたマウス皮膚癌由来ペプチドＴＲＰ−２（アミノ酸配列ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ：配列番号１）１００μｇを溶解し、フロイント不完全アジュバンド（以下ＦＩＡという、Ｓｉｇｍａ社製、商品名「Ｆｒｅｕｎｄ'ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ」カタログＮｏ．：Ｆ５５０６）０．５ｍＬとを混合して抗原投与剤Ａ（注射用液剤）を得た。
【００３７】
（３）抗原投与剤Ｂの作製
ＤＭＳＯ３質量部とＰＢＳ９７質量部とを混合して溶液Ｂを調製し、溶液Ｂ０．５ｍＬに対して、抗原として蛍光色素ＦＩＴＣ修飾されたマウス癌由来ペプチドＷＴ−１（アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ：配列番号２）１００μｇを溶解し、ＦＩＡ０．５ｍＬとを混合して抗原投与剤Ｂ（注射用液剤）を得た。
【００３８】
（４）抗原投与剤Ｃの作製
ＤＭＳＯ３質量部とオレイン酸９７質量部とを混合して溶液Ｃを調製し、溶液Ｃ０．５ｍＬに対して、抗原として蛍光色素ＦＩＴＣ修飾されたマウス癌由来ペプチドＷＴ−１（アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ：配列番号２）１００μｇを溶解して抗原投与剤Ｃ（経皮投与剤；液剤）を得た。
【００３９】
（５）抗原投与剤Ｄの作製
マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０7個を、ＮＭＰ１００μｌに溶解し、そこから５μｌ採取し９５μｌオレイン酸で希釈することで、抗原投与剤Ｄを調製した。
なお、ＮＭＰに溶解されたマウス腫瘍細胞の生細胞率は０％であった。
また、マウス腫瘍細胞の生細胞率は、７−ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）を標識として、フローサイトメータにより測定した。
【００４０】
（６）免疫療法用キット１の作製
免疫賦活剤Ａと、抗原投与剤Ａとを含む免疫療法用キット１を作製した。
【００４１】
（７）免疫療法用キット２の作製
免疫賦活剤Ａと、抗原投与剤Ｂとを含む免疫療法用キット２を作製した。
【００４２】
（８）免疫療法用キット３の作製
免疫賦活剤Ａと、抗原投与剤Ｃとを含む免疫療法用キット３を作製した。
【００４３】
（９）免疫療法用キット４の作製
免疫賦活剤Ａと、抗原投与剤Ｄとを含む免疫療法用キット４を作製した。
【００４４】
〔試験１〕
８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス背部をあらかじめ除毛したマウスを３群（群１〜３）に分けた。
群１は、そのままとした。
群２は、抗原投与剤Ａを抗原量が２０μｇ／匹となるように投与した。
群３は、免疫療法用キット１の免疫賦活剤Ａを適用（免疫賦活剤Ａの剥離シートを剥離除去して皮膚に貼付）し、２４時間後に剥離し、剥離部分に対して、抗原投与剤Ａを抗原量が２０μｇ／匹となるように適用（皮下注射）した。
それぞれ４８時間経過後、群１〜３のマウスのそけいリンパ節中のＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子及びその表面活性化分子（ＣＤ４０／ＣＤ５４／ＣＤ８０／ＣＤ８６）の割合をフローサイトメータを使用して測定した。
その結果を図１に示した。
さらに、そけいリンパ節内の投与された抗原（癌由来ペプチド）を捕獲したＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子（ペプチド陽性細胞）の割合についてもフローサイトメータで測定した。
その結果を図２に示した。
【００４５】
〔試験２〕
８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス背部をあらかじめ除毛したマウスを３群（群４〜６）に分けた。
群４は、そのままとした。
群５は、免疫療法用キット２の免疫賦活剤Ａを適用（皮膚に貼付）し、２４時間後に剥離し、剥離部分に対して、抗原投与剤Ｂを抗原量が２０μｇ／匹となるように適用（皮下注射）した。
群６は、免疫療法用キット３の免疫賦活剤Ａを適用（皮膚に貼付）し、２４時間後に剥離し、剥離部分に対して、抗原投与剤Ｃを抗原量が２０μｇ／匹となるように適用（皮膚に塗布）し、適用部位をセルロース系不織布で被覆し、サージカルテープで固定した。
それぞれ４８時間経過後、群４〜６のマウスのそけいリンパ節中のＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子及びその表面活性化分子（ＣＤ４０／ＣＤ５４／ＣＤ８０／ＣＤ８６）の割合をフローサイトメータを使用して測定した。
その結果を図３に示した。
さらに、そけいリンパ節内の投与された抗原（癌由来ペプチド）を捕獲したＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子（ペプチド陽性細胞）の割合についてもフローサイトメータで測定した。
その結果を図４に示した。
【００４６】
図１〜４より、免疫賦活成分としてピロリドン類を含む免疫賦活剤を適用した後に、抗原を適用することにより、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。
【００４７】
〔試験３〕
８〜１０週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束）背部をバリカンで除毛後、免疫療法用キット４の免疫賦活剤Ａを剥離シートを剥離除去して貼付した。貼付から２４時間後に免疫賦活剤Ａを剥離し、免疫療法用キット４の抗原投与剤Ｄを１００μｌ塗布した。上記操作を再度２週間後に実施した。２回目の抗原投与剤Ｄの投与から１０日後に、マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０5個をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）１００μｌに懸濁した液を皮内注射した。
次いで、マウス腫瘍細胞の移植から１２、１５、２０、２５日目に腫瘍径を測定し、球体として体積換算した。
なお、試験はｎ＝３で実施し、腫瘍体積の平均値を測定値とした。
結果を図５に示す。
【００４８】
〔試験４〕
８〜１０週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束）背部をバリカンで除毛後、免疫療法用キット４の免疫賦活剤Ａを剥離シートを剥離除去して貼付した。貼付から２４時間後に免疫賦活剤Ａを剥離し、免疫療法用キット４の抗原投与剤Ｄを１００μｌ塗布した。上記操作を再度２週間後に実施した。２回目の抗原投与剤Ｄの投与から１０日後に、マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０5個をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）１００μｌに懸濁した液を皮内注射した。
次いで、マウス腫瘍細胞の移植から１２、１５、２０、２５日目に腫瘍径を測定し、球体として体積換算した。
また、マウス腫瘍細胞の移植から７、１４、２１日目に免疫賦活剤Ａを剥離シートを剥離除去して貼付した。貼付から２４時間後に免疫賦活剤Ａを剥離し、抗原投与剤Ｄを１００μｌ塗布した。
なお、試験はｎ＝３で実施し、腫瘍体積の平均値を測定値とした。
結果を図５に示す。
【００４９】
〔試験５〕
８〜１０週齢オスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束）背部をバリカンで除毛後、マウス腫瘍細胞〔Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）〕の細胞株１×１０5個をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）１００μｌに懸濁した液を皮内注射した。
次いで、マウス腫瘍細胞の移植から１２、１５、２０、２５日目に腫瘍径を測定し、球体として体積換算した。
なお、試験はｎ＝３で実施し、腫瘍体積の平均値を測定値とした。
結果を図５に示す。
図５より、抗原投与剤非投与群である試験５に比べて、試験３及び試験４は優れた腫瘍細胞の増殖抑制効果が認められた。特に、定期的に免疫賦活剤Ａと抗原投与剤Ｄを投与した試験例４では、移植した腫瘍細胞の増殖抑制効果が顕著に認められた。
上記の結果より、本発明の免疫療法剤によれば、腫瘍細胞の増殖が抑制できるため、腫瘍に直接適用することや、腫瘍切除手術後の再発を防止するために適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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