(57)【要約】【課題】微生物の表層にてウラニルイオンを特異的に吸着することができるウラン吸着ペプチドを提供すること。【解決手段】本発明のウラン吸着ペプチドは、ニッケルイオン依存転写抑制因子（ＮｉｋＲ）のＣ末端ドメインの変異体の２量体を含み、微生物の表層に提示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニッケルイオン依存転写抑制因子（ＮｉｋＲ）のＣ末端ドメインの変異体の２量体を含み、微生物の表層に提示されているウラン吸着ペプチド。
【請求項２】
前記変異体が、
（Ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｂ）該（Ａ）のペプチドのアミノ酸配列との間において９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；
（Ｃ）該（Ａ）のペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列からなるペプチド
のいずれかであり、かつ該変異体のウラニルイオンに対する解離定数が１μＭ以下である、請求項１に記載のウラン吸着ペプチド。
【請求項３】
第１リンカーを介して前記表層に提示されている、請求項１または２に記載のウラン吸着ペプチド。
【請求項４】
前記２量体が、第２リンカーを介して形成されている、請求項１から３のいずれかの項に記載のウラン吸着ペプチド。
【請求項５】
前記第１リンカーの長さが３から１０残基である、請求項３に記載のウラン吸着ペプチド。
【請求項６】
前記第２リンカーの長さが３から２０残基である、請求項４に記載のウラン吸着ペプチド。
【請求項７】
前記微生物が酵母である、請求項１から６のいずれかの項に記載のウラン吸着ペプチド。
【請求項８】
酵母のＧＰＩアンカー型細胞壁タンパク質のアンカリングドメインを介して前記表層に提示されている、請求項７に記載のウラン吸着ペプチド。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかの項に記載のウラン吸着ペプチドを表層に提示している微生物。
【請求項１０】
請求項９に記載の微生物を用いてウランを回収する方法であって、
（１）ウラン含有物と該微生物とを混合処理する工程、
（２）工程（１）で処理された微生物を回収する工程、および
（３）工程（２）で回収された微生物からウランを脱着する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウラン吸着ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウランは原子力発電の燃料に使われ、原子力発電所の増設に伴ってその需要が増加しつつある。ウランの供給源としては、主に鉱山から産出される天然ウランが挙げられるが、今後の需要増加に応じて新たな供給源の確保や産生技術が求められる。ウランは鉱山以外にも海水中などの水圏に微量ながら広く存在していることが知られている。例えば、海水中には３．３ｐｐｂのウランが存在することが知られている。水圏からウランを吸着回収する技術を確立することができれば水圏がウランの新たな供給源として利用可能となる。
【０００３】
吸着回収する技術としては、物理化学的手法、生物学的手法が挙げられるが、特に低濃度の金属イオンの吸着に関しては、物理化学的手法よりも生物のもつ金属認識・吸着力を利用した吸着回収技術が期待される。しかし、これまでの生物学的吸着回収技術（バイオアドソープション）では細胞内蓄積型であるため、吸着した金属の脱着・回収が困難であるという点が問題となっていた。
【０００４】
特許文献１は、ウラニル形態（ＵＯ２２＋）のウラン（ＶＩ）を特異的にキレートできる薬剤として、カルモジュリンの４つのカルシウム結合部位（計１２残基）の１〜３残基の特定の中性残基への突然変異を含むカルモジュリンループの配列を含むへリックス−ループ−へリックス型構造を有するペプチドを開示している。しかしながら、特許文献１の方法では、ウランを吸着した後の脱着・回収が不十分である。
【０００５】
ところで、非特許文献１には、大腸菌のニッケルイオン（Ｎｉ２＋）依存転写抑制因子（ＮｉｋＲ）のＣ末端ドメインにある第７２位のバリンがセリンに置換され（Ｖ７２Ｓ）、第７６位のヒスチジンがアスパラギン酸に置換され（Ｈ７６Ｄ）、そして第９５位のシステインがアスパラギン酸に置換された（Ｃ９５Ｄ）変異体が、ウラニル形態（ＵＯ２２＋）のウラン（ＶＩ）を特異的に吸着できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５３７６９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. V. Wegnerら、Angew. Chem. Int. Ed.、2009年、第48巻、p. 2339-2341
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、微生物の表層にてウラニルイオンを特異的に吸着することができるウラン吸着ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ニッケルイオン依存転写抑制因子（ＮｉｋＲ）のＣ末端ドメインの変異体を、リンカーを介して２量体化し、微生物の表層に提示させることによって、ウラニルイオンを効率よく吸着回収できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明は、ウラン吸着ペプチドを提供し、該ペプチドは、ニッケルイオン依存転写抑制因子（ＮｉｋＲ）のＣ末端ドメインの変異体の２量体を含み、微生物の表層に提示されている。
【００１１】
１つの実施態様では、上記変異体は、（Ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）該（Ａ）のペプチドのアミノ酸配列との間において９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｃ）該（Ａ）のペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかであり、かつ該変異体のウラニルイオンに対する解離定数が１μＭ以下である。
【００１２】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、第１リンカーを介して前記表層に提示されている。
【００１３】
１つの実施態様では、上記２量体は、第２リンカーを介して形成されている。
【００１４】
１つの実施態様では、上記第１リンカーの長さは３から１０残基である。
【００１５】
１つの実施態様では、上記第２リンカーの長さは３から２０残基である。
【００１６】
１つの実施態様では、上記微生物は酵母である。
【００１７】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、酵母のＧＰＩアンカー型細胞壁タンパク質のアンカリングドメインを介して前記表層に提示されている。
【００１８】
本発明はまた、上記ウラン吸着ペプチドを表層に提示している微生物を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、上記微生物を用いてウランを回収する方法を提供し、該方法は、（１）ウラン含有物と該微生物とを混合処理する工程、（２）工程（１）で処理された微生物を回収する工程、および（３）工程（２）で回収された微生物からウランを脱着する工程を含む。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、微生物の表層にてウラニルイオンを特異的に吸着することができるウラン吸着ペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーの酵母表層提示を示す模式図である。
【図２】ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーを酵母表層に提示させるためのプラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーを示す模式図である。
【図３】ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーの酵母表層提示を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図４】酵母表層提示ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーによるウラン吸着量を示すグラフである。
【図５】酵母表層提示ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーによるウラン吸着量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明のウラン吸着ペプチドは、ニッケルイオン依存転写抑制因子（ＮｉｋＲ）のＣ末端ドメインの変異体の２量体を含む。
【００２３】
ＮｉｋＲの起源としては、特に限定されず、例えば、大腸菌が挙げられる。大腸菌のＮｉｋＲのアミノ酸配列は配列番号１で表される。
【００２４】
Ｃ末端ドメインとしては、特に限定されないが、例えば、配列番号１において、第４８位〜第１３３位（Ｃ末端）からなるドメインである。
【００２５】
変異体はウラン吸着活性を有し、変異体のウラニルイオン（ＵＯ２２＋）に対する解離定数は、好ましくは１μＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である。
【００２６】
変異体は、好ましくは、（Ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｂ）該（Ａ）のペプチドのアミノ酸配列との間において９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド；（Ｃ）該（Ａ）のペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドのいずれかである。
【００２７】
配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１において、第７２位のバリンがセリンに置換され、第７６位のヒスチジンがアスパラギン酸に置換され、そして第９５位のシステインがアスパラギン酸に置換されたアミノ酸配列の第４８位〜第１３３位（Ｃ末端）に相当する。
【００２８】
変異体の２量体は、第２リンカーを介して形成されている。第２リンカーを挟む２つの変異体のアミノ酸配列は同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００２９】
第２リンカーの長さとしては、特に限定されないが、好ましくは３から２０残基、より好ましくは３から１２残基である。第２リンカーのアミノ酸配列としては、特に限定されないが、好ましくは配列番号３、４で表されるアミノ酸配列である。
【００３０】
本発明のウラン吸着ペプチドは、微生物の表層に提示されている。好ましくは、第１リンカーを介して微生物の表層に提示されている。第１リンカーの長さとしては、特に限定されないが、好ましくは３から１０残基、より好ましくは３から６残基である。第１リンカーのアミノ酸配列としては、特に限定されないが、好ましくは配列番号３〜６で表されるアミノ酸配列である。
【００３１】
微生物としては、特に限定されないが、好ましくは酵母である。酵母としては、特に限定されないが、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
【００３２】
ウラン吸着ペプチドを微生物の表層に提示させる方法としては、特に限定されず、例えば、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカリングドメイン（特開平１１−２９００７８号公報）や糖鎖結合タンパク質ドメイン（国際公開第０２／０８５９３５号）を利用する方法が挙げられる。細胞表層局在タンパク質としては、特に限定されず、例えば、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０およびＦＬＯ１１）、アルカリホスファターゼが挙げられる。
【００３３】
ＧＰＩアンカリングドメインを利用する方法では、例えば、分泌シグナル配列をコードする遺伝子−ウラン吸着ペプチド（第２リンカーを含む）をコードする遺伝子−第１リンカーをコードする遺伝子−ＧＰＩアンカー型細胞壁タンパク質のアンカリングドメインをコードする遺伝子からなる組換えＤＮＡを用いる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌されたウラン吸着ペプチド−第１リンカーは、ＧＰＩアンカリングドメインを介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合する。ＧＰＩアンカリングドメインとしては、特に限定されず、例えば、酵母α−アグルチニンのＣ末端から３２０残基のアミノ酸配列からなるＧＰＩアンカリングドメインが挙げられる。
【００３４】
糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法では、例えば、分泌シグナル配列をコードする遺伝子−ウラン吸着ペプチド（第２リンカーを含む）をコードする遺伝子−第１リンカーをコードする遺伝子−糖鎖結合タンパク質ドメイン（凝集機能ドメイン）をコードする遺伝子からなる組換えＤＮＡを用いる。この組換えＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌されたウラン吸着ペプチド−第１リンカーは、凝集機能ドメインが有する複数の糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用を行うことによって細胞表層に留まる。凝集機能ドメインとしては、特に限定されず、例えば、レクチン、レクチン様タンパク質、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。
【００３５】
分泌シグナル配列としては、特に限定されない。例えば、ウラン吸着ペプチドを酵母の表層に提示する場合、グルコアミラーゼ、酵母のα−またはａ−アグルチニン、リパーゼの分泌シグナル配列が挙げられる。ウラン吸着ペプチドのウラン吸着活性を阻害しない限り、表層提示されているウラン吸着ペプチドのＮ末端に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部が残っていてもよい。
【００３６】
上記組換えＤＮＡを含む遺伝子発現ベクターを調製する方法としては、特に限定されない。当業者が通常用いる方法が挙げられる。
【００３７】
遺伝子発現ベクターはプラスミドの形態であることが好ましい。例えば、ウラン吸着ペプチドを酵母の表層に提示する場合、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ｏｒｉ）と大腸菌のＣｏｌＥ１複製起点とを有するプラスミドが好ましい。プラスミドは、プラスミドの調製および形質転換体の検出を容易にするため、好ましくは選択マーカーおよび大腸菌内の複製に必要な遺伝子を有する。選択マーカーとしては、特に限定されず、例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、タグが挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、特に限定されず、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）が挙げられる。栄養要求性遺伝子としては、特に限定されず、例えば、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）遺伝子、リンゴ酸β−イソプロピル脱水素酵素（ＬＥＵ２）遺伝子、イミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素（ＨＩＳ３）遺伝子、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４）遺伝子、ジヒドロオロト酸脱水素酵素（ＵＲＡ１）遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられる。タグとは、遺伝子発現産物であるタンパク質を検出するための標識をいう。タグとしては、特に限定されず、例えば、ＦＬＡＧタグ、ＨＡ（ヘマグルチニンエピトープ）タグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）、ｃ−Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓ（ヒスチジン）タグが挙げられる。プラスミドは、ウラン吸着ペプチドを表層に提示する微生物内で遺伝子を発現するため、好ましくはプロモーターおよびターミネーターを有する。例えば、ウラン吸着ペプチドを酵母の表層に提示する場合、プロモーターおよびターミネーターとしては、特に限定されず、例えば、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）、酵母のα−またはａ−アグルチニンのプロモーターおよびターミネーターが挙げられる。これらのプロモーターとターミネーターとの間にウラン吸着ペプチド（第２リンカーを含む）をコードする遺伝子−第１リンカーをコードする遺伝子を挿入する。プラスミドは、ウラン吸着ペプチド（第２リンカーを含む）をコードする遺伝子−第１リンカーをコードする遺伝子が、ウラン吸着ペプチドを表層に提示する微生物のゲノム染色体に組み込まれるため、好ましくは相同組換えに必要な遺伝子を有する。例えば、ウラン吸着ペプチドを酵母の表層に提示する場合、相同組換えに必要な遺伝子としては、特に限定されず、例えば、Ｔｒｐ１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３が挙げられる。
【００３８】
ウラン吸着ペプチドを微生物の表層に提示させるため、上記遺伝子発現ベクターを微生物に導入して微生物を形質転換する。遺伝子発現ベクターを微生物に導入する方法としては、特に限定されず、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法が挙げられる。導入された組換えＤＮＡは、微生物中でプラスミドの形態で存在してもよいし、微生物のゲノム染色体に組み込まれた形態で存在してもよい。
【００３９】
組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物を同定する方法としては、特に限定されないが、好ましくは選択マーカーを用いる方法である。例えば、選択マーカーがタグの場合、形質転換した微生物をタグに対する抗体に反応させて、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーなどで解析する。
【００４０】
以上のように作製されたウラン吸着ペプチドを表層に提示している形質転換微生物は、微生物に応じて適宜継代培養され、維持される。
【００４１】
本発明の上記ウラン吸着ペプチドを表層に提示している微生物は、ウラニルイオンを吸着回収するために用いられる。
【００４２】
本発明のウランを回収する方法は上記微生物を用い、（１）ウラン含有物と上記微生物とを混合処理する工程、（２）工程（１）で処理された微生物を回収する工程、および（３）工程（２）で回収された微生物からウランを脱着する工程を含む。
【００４３】
（１）ウラン含有物と上記微生物とを混合処理する工程
ウラン含有物としては、特に限定されず、例えば、ウランを含有する海水、鉱山廃液が挙げられる。ウラン含有物と上記微生物との混合処理としては、特に限定されず、例えば、バッチ式に混合する処理、上記微生物を担体に固定し、これを充填したカラムを作製し、これにウラン含有物を流す連続式処理が挙げられる。
【００４４】
（２）工程（１）で処理された微生物を回収する工程
回収するための手段としては、特に限定されず、例えば、上記（１）の工程がバッチ式混合処理の場合は、遠心分離、フィルター濾過が挙げられ、連続式処理の場合は、カラム担体として分離できる。
【００４５】
（３）工程（２）で回収された微生物からウランを脱着する工程
脱着するための手段としては、特に限定されず、例えば、キレート剤、タンパク質切断酵素、塩濃度変化、ｐＨ変化が挙げられる。
【００４６】
本発明の方法により回収されたウラニルイオンは、純度が高く、高品質である。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
（実施例）
（ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーを酵母表層に提示させるための遺伝子発現ベクターの構築）
大腸菌のニッケルイオン依存転写抑制因子（ＮｉｋＲ）のＣ末端ドメイン（ＮｉｋＲ−Ｃｔ）の遺伝子を、配列番号７および８で表される塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ法にて、大腸菌（ＤＨ５α株）のゲノムから単離し、プラスミドｐＵＬＤ１（Appl. Microbiol. Biotechnol.、2009年、第82巻、p. 713-719）の制限酵素ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位間にクローニングした（プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔの作製）。
【００４９】
プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔを鋳型として用い、配列番号９および１０で表される塩基配列からなるプライマー対、配列番号１１および１２で表される塩基配列からなるプライマー対、ならびに配列番号１３および１４で表される塩基配列からなるプライマー対を用いた部位特異的変異導入キット（Agilent Technologies社製）にて、ＮｉｋＲ−Ｃｔの第７２位のバリンがセリンに置換され（Ｖ７２Ｓ：配列番号９および１０で表される塩基配列からなるプライマー対）、第７６位のヒスチジンがアスパラギン酸に置換され（Ｈ７６Ｄ：配列番号１１および１２で表される塩基配列からなるプライマー対）、そして第９５位のシステインがアスパラギン酸に置換された（Ｃ９５Ｄ：配列番号１３および１４で表される塩基配列からなるプライマー対）変異体ペプチド（配列番号２）をコードする遺伝子を作製した（プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔ変異体ペプチドの作製）。
【００５０】
プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔ変異体ペプチドを鋳型として用い、以下の表１に記載の配列番号で表される塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ法にて、Ｎ末端側からＣ末端側にＮｉｋＲ−Ｃｔ変異体ペプチド（配列番号２）−第１リンカーの順で連結しているペプチドをコードする遺伝子断片を増幅し、５’末端側から３’末端側にＧＡＰＤＨプロモーター−グルコアミラーゼ分泌シグナル配列−ＦＬＡＧタグ−酵母α−アグルチニン３’側遺伝子の順で連結している遺伝子断片を含有するプラスミドｐＵＬＤ１のグルコアミラーゼ分泌シグナル配列とＦＬＡＧタグとの間に、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ部位を介して挿入した（プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔの作製）。
【００５１】
【表１】
2013216585.tif 000002
【００５２】
プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔ変異体ペプチドを鋳型として用い、表１に記載の配列番号で表される塩基配列からなるプライマー対を用いたＰＣＲ法にて、Ｎ末端側からＣ末端側にＮｉｋＲ−Ｃｔ変異体ペプチド（配列番号２）−第２リンカーの順で連結しているペプチドをコードする遺伝子断片を増幅し、プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔのグルコアミラーゼ分泌シグナル配列とＮｉｋＲ−Ｃｔ変異体ペプチドとの間に、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ／ＳａｌＩ部位を介して挿入した（プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーの作製、図２）。
【００５３】
（ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーの酵母表層提示）
酢酸リチウム法にて、プラスミドｐＵＬＤ１−ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーで酵母（ＢＹ４７４１ΔＳｅｄ１株）を形質転換し、形質転換酵母をウラシルマーカーにて選択した（ＳＤＣ＋ＨＭＬ（０．６７％酵母ニトロゲンベース，アミノ酸不含，２％グルコース，０．５％カザミノ酸，０．００２％ヒスチジン，０．００２％メチオニン，０．００３％ロイシン）寒天培地プレート）。コントロールとしてプラスミドｐＵＬＤ１を用いた。形質転換酵母の表層にＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーが提示されているかどうかを蛍光抗体染色法にて確認した。形質転換酵母に１次抗体としてマウスモノクローナル抗ＦＬＡＧタグ抗体（Sigma Chemical社）を反応させ、次いで２次抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Molecular Probes社）を反応させた。反応後の酵母を蛍光顕微鏡により観察した。結果を図３に示す。
【００５４】
図３より明らかなように、いずれのＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーも酵母表層に提示されていた。
【００５５】
（酵母表層提示ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーによるウラン吸着）
ウラン溶液（ＳＰＥＸ社製混合標準溶液、Ｂｅ，Ｂｉ，Ｃｏ，Ｉｎ，Ｕ：各１ｍｇ／Ｌ）を水で１０倍に希釈し（最終濃度１００ｐｐｂ）、５％硝酸にてｐＨを４または７に調整した（ウラン含有溶液の調製）。形質転換酵母を寒天培地プレート上のシングルコロニーより３０℃にて２４時間振盪培養し（ＯＤ（６００ｎｍ）＝１．０）、８００Ｇ（４℃）にて１０分間遠心分離して上清を除去し、沈殿の酵母に上記ウラン含有溶液１０ｍＬを添加し、混合した。混合液を室温にて１時間静置後、８００Ｇ（４℃）にて１０分間遠心分離して酵母を除去し、上清中に残存するウラニルイオンをＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析装置、Agilent Technologies社製）にて定量することによって、酵母が吸着したウラン量を求めた。上清４００μL、水３．６ｍＬおよび５％硝酸１ｍＬを混合してＩＣＰ−ＭＳ分析に供し、上記ウラン溶液を水で１００倍に希釈したもの（最終濃度１０ｐｐｂ）を検量線用にＩＣＰ−ＭＳ分析に供した。コントロールとして野生株の酵母（ＢＹ）を用いた。結果を図４に示す。
【００５６】
図４より明らかなように、ＮｉｋＲ−Ｃｔダイマーの変異体を表層提示している形質転換酵母は多くのウランを吸着し、中でも第１リンカーを６残基、第２リンカーを９残基にした組み合わせが最も多くのウランを吸着した。
【００５７】
ウラン含有溶液と形質転換酵母との混合液の静置時間として、上記の１時間に代えて、１〜６０分間の様々な時間とした以外は、上記と同様にして実験を行った。結果を図５に示す。
【００５８】
図５より明らかなように、ウラン吸着時間としては、１０分程度で十分であった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、微生物の表層にてウラニルイオンを特異的に吸着することができるウラン吸着ペプチドを提供することができる。本発明のウラン吸着ペプチドは、水圏からウランを吸着回収できる技術を提供し、水圏がウランの新たな供給源として利用可能となる。
【図１】
2013216585.tif 000003
【図２】
2013216585.tif 000004
【図３】
2013216585.tif 000005
【図４】
2013216585.tif 000006
【図５】
2013216585.tif 000007
【配列表】
2013216585000001.app