(57)【要約】【課題】より高い治療効果を有するアポトーシス誘導剤及び癌治療薬を提供する。【解決手段】Ｙボックス結合タンパク質１遺伝子の所定の部分配列を標的配列とするｓｉＲＮＡは、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導する。前記ｓｉＲＮＡは、血管内皮細胞による管腔形成を阻害する。また、前記ｓｉＲＮＡは、血管の新生を阻害し、血管を退縮させる。前記ｓｉＲＮＡは、腫瘍部位等における異常な血管の新生を抑制することができる。また、前記ｓｉＲＮＡは、過度に形成された新生血管を破壊することができる。このため、前記ｓｉＲＮＡは、難治性腫瘍や増殖性血管疾患に対してより高い治療効果を有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙボックス結合タンパク質１遺伝子の発現を抑制する物質を含む、
血管内皮細胞のアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
前記物質は、
配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｍｉＲＮＡ又は配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
前記物質は、
配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡを発現するベクター、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｍｉＲＮＡを発現するベクター又は配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸を発現するベクターを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
前記物質は、
配列番号２で示される塩基配列と配列同一性９０％以上の塩基配列であるＲＮＡ、及び配列番号３で示される塩基配列と配列同一性９０％以上の塩基配列であるＲＮＡを含むｓｉＲＮＡである、
ことを特徴とする請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
前記物質は、
血管内皮細胞による管腔形成を阻害する、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
前記物質は、
血管の新生を阻害する、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
前記物質は、
血管を退縮させる、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載のアポトーシス誘導剤を有効成分として含む、
癌治療薬。
【請求項９】
前記有効成分を高分子ミセルに内包する、
ことを特徴とする請求項８に記載の癌治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘導剤及び癌治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在臨床で使用されているベバシズマブ等の血管新生阻害剤は、病的な血管に対する選択性が乏しい。このため、正常な血管に対する副作用が知られている。さらに、癌治療において単剤での治療効果は得られていない。そこで、病的な血管に対する選択性が高く、かつ癌等の疾患に対してより高い治療効果を発揮する薬剤が望まれている。
【０００３】
特許文献１には、腫瘍細胞の増殖等に寄与する転写因子Ｙボックス結合タンパク質１（ＹＢ‐１）遺伝子のＮ末端から５９４番目から２５塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡが開示されている。当該ｓｉＲＮＡは、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制することによって、血管内皮細胞の増殖を抑制する。ＹＢ‐１は、腫瘍血管に特異的に高発現する転写因子である。このため、腫瘍血管に対する選択性が期待できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１‐８８８７６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｈａｎｎｕｎ  ＹＡ，  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｉｌｅｍｍａ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｂｌｏｏｄ  ８９，  １８４５−１８５３，  １９９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、増殖を抑制された細胞では、ＤＮＡの修復が行われることによって、増殖抑制に耐性を示すことがある（例えば、非特許文献１参照）。このため、上記特許文献１に開示されたｓｉＲＮＡでは、増殖抑制に対する耐性に起因する薬剤耐性によって治療効果が限定される可能性がある。また、血管内皮細胞の増殖抑制では、既に形成された腫瘍血管を構成する細胞を排除できない。このため、上記特許文献１に開示されたｓｉＲＮＡでは、血管内皮細胞の増殖を抑制するのみなので、既に形成された腫瘍血管を破壊する効果は期待できない。
【０００７】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、より高い治療効果を有するアポトーシス誘導剤及び癌治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、ＹＢ‐１遺伝子に対する新規のｓｉＲＮＡを血管内皮細胞に導入することで、血管内皮細胞のアポトーシスが誘導されることを見出した。また、当該ｓｉＲＮＡは、血管内皮細胞による管腔形成を抑制した。さらに、当該ｓｉＲＮＡが標的とする塩基配列に対して設計したｍｉＲＮＡを癌モデルマウスに投与すると、癌細胞の増殖が抑制され、癌モデルマウスの生存期間が延長した。また、当該ｍｉＲＮＡによって、腫瘍間質の腫瘍血管密度が低下した。以上の結果から本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明の第１の観点に係る血管内皮細胞のアポトーシス誘導剤は、
Ｙボックス結合タンパク質１遺伝子の発現を抑制する物質を含む。
【００１０】
この場合、前記物質は、
配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｍｉＲＮＡ又は配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸を含む、
こととしてもよい。
【００１１】
また、前記物質は、
配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡを発現するベクター、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｍｉＲＮＡを発現するベクター又は配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸を発現するベクターを含む、
こととしてもよい。
【００１２】
また、前記物質は、
配列番号２で示される塩基配列と配列同一性９０％以上の塩基配列であるＲＮＡ、及び配列番号３で示される塩基配列と配列同一性９０％以上の塩基配列であるＲＮＡを含むｓｉＲＮＡである、
こととしてもよい。
【００１３】
また、前記物質は、
血管内皮細胞による管腔形成を阻害する、
こととしてもよい。
【００１４】
また、前記物質は、
血管の新生を阻害する、
こととしてもよい。
【００１５】
また、前記物質は、
血管を退縮させる、
こととしてもよい。
【００１６】
本発明の第２の観点に係る癌治療薬は、
上記のアポトーシス誘導剤を有効成分として含む。
【００１７】
この場合、前記有効成分を高分子ミセルに内包する、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、より高い治療効果を有するアポトーシス誘導剤及び癌治療薬が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１における血管内皮細胞でのＹＢ‐１遺伝子のｍＲＮＡの発現量の相対値を示す図である。
【図２】図２（Ａ）は、実施例１におけるＨＵＶＥＣでのＹＢ‐１の定量結果を示す図である。図２（Ｂ）は、実施例１におけるＨＰＡＥＣでのＹＢ‐１の定量結果を示す図である。
【図３】実施例２におけるＨＰＡＥＣの細胞数の経時変化を示す図である。
【図４】実施例２におけるｓｉＲＮＡの導入７２時間後の細胞数を示す図である。
【図５】実施例３におけるｓｉＲＮＡ導入４８時間後のＨＵＶＥＣの顕微鏡画像を示す図である。図５（Ａ）は、コントロール群の顕微鏡画像を示す図である。図５（Ｂ）はＹＢ３３０群の顕微鏡画像を示す図である。図５（Ｃ）は、ＹＢ７４１群の顕微鏡画像を示す図である。
【図６】実施例３におけるｓｉＲＮＡ導入後の細胞数の相対値を示す図である。
【図７】実施例３における細胞周期解析の結果を示す図である。図７（Ａ）は未処理群の結果を示す図である。図７（Ｂ）はコントロール群の結果を示す図である。図７（Ｃ）はＹＢ７４１群の結果を示す図である。
【図８】実施例３における細胞分画比率を示す図である。
【図９】実施例４における蛍光顕微鏡画像を示す図である。図９（Ａ）は、ＨＵＶＥＣの蛍光顕微鏡画像を示す図である。図９（Ｂ）は、ＨＰＡＥＣの蛍光顕微鏡画像を示す図である。
【図１０】実施例５における顕微鏡画像を示す図である。
【図１１】実施例５において定量した管腔領域の大きさを示す図である。
【図１２】実施例６におけるＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現量を示す図である。
【図１３】実施例６におけるＶＥＧＦＲ２遺伝子の発現量を示す図である。
【図１４】実施例６におけるＴｉｅ‐１遺伝子の発現量を示す図である。
【図１５】実施例６におけるＴｉｅ‐２遺伝子の発現量を示す図である。
【図１６】実施例６におけるＥＧＦＲ遺伝子の発現量を示す図である。
【図１７】実施例６におけるＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ‐２遺伝子の発現量を示す図である。
【図１８】実施例７におけるｓｉＲＮＡ投与前に対する腹膜播種の相対量を示す図である。
【図１９】実施例７におけるマウスでの腹膜播種の範囲を示す図である。
【図２０】実施例８におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプラスミドＤＮＡ導入前に対する細胞数の相対値の経時変化を示す図である。
【図２１】実施例８におけるマウスでの腹膜播種の範囲を示す図である。
【図２２】実施例８におけるマウスの生存日数を示す図である。
【図２３】実施例９におけるＹＢ‐１染色及びＣＤ３１染色の画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（実施の形態１）
実施の形態１に係るアポトーシス誘導剤は、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質を含む。ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制するとは、ＹＢ‐１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡが翻訳されてタンパク質が合成されるのを抑制することである。ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、例えば、ＹＢ‐１遺伝子に含まれる所定の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）又はアンチセンス核酸等である。ここで、標的配列とは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸等の核酸分子がハイブリダイズする塩基配列である。ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質としてのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、例えば、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするのが好ましい。
【００２１】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、例えば、ＹＢ‐１をコードするｍＲＮＡの塩基配列又はその塩基配列に含まれる連続する１８塩基以上の標的配列に相補的な塩基配列のＲＮＡとその相補鎖とからなる２本鎖のＲＮＡである。
【００２２】
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によって遺伝子の発現を抑制する。ＲＮＡ干渉では、ｓｉＲＮＡの２本のＲＮＡがその塩基配列に相補的な塩基配列を有する標的のｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって、標的のｍＲＮＡが分解される。ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の抑制は、配列特異性が非常に高く、標的の遺伝子の発現を選択的に抑制することができる。
【００２３】
標的配列とｓｉＲＮＡにおける標的配列に相補的な塩基配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの塩基配列においては、標的配列と完全に相補的でなくても、完全に相補的な塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性が維持される塩基の変異、付加、欠損が許容される。特に、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置の塩基の変異、付加、欠損であれば、ＲＮＡ干渉による標的のｍＲＮＡの分解活性が完全に消失せずに分解活性が残る。一方、ｓｉＲＮＡの中央又は中央付近に位置する塩基の変異の場合、その影響が大きく、ＲＮＡ干渉による標的のｍＲＮＡの分解活性が極度に低下する。
【００２４】
例えば、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡは、５’末端から３’末端に向かってＵＡＧＵＡＡＧＧＵＧＧＧＡＡＣＣＵＵＣＧＣ（配列番号２）の塩基配列のＲＮＡ及び５’末端から３’末端に向かってＧＣＧＡＡＧＧＵＵＣＣＣＡＣＣＵＵＡＣＵＡ（配列番号３）の塩基配列のＲＮＡを含む。
【００２５】
また、上記のようにｓｉＲＮＡの塩基配列においては、標的配列と完全に相補的でなくても、完全に相補的な塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性が維持されば、ＲＮＡ干渉による標的のｍＲＮＡの分解活性が得られる。よって、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡは、配列番号２で示される塩基配列と配列同一性９０％以上の塩基配列であるＲＮＡ、及び配列番号３で示される塩基配列と配列同一性９０％以上の塩基配列であるＲＮＡを含むとしてもよい。
【００２６】
また、ＲＮＡ干渉による標的のｍＲＮＡに対するより高い分解活性を得るために、配列番号１で示される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡは、配列番号２で示される塩基配列と配列同一性９５％以上の塩基配列であるＲＮＡ、及び配列番号３で示される塩基配列と配列同一性９５％以上の塩基配列であるＲＮＡを含むとしてもよい。
【００２７】
ｓｉＲＮＡの標的配列の長さは、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する限り、特に限定されない。標的配列の長さは、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは１９塩基以上、さらに好ましくは２１塩基以上の長さである。ただし、ｓｉＲＮＡの長さが２３〜２６塩基以上の場合には、ｓｉＲＮＡが細胞内のプロセッシングによって分解されることがある。さらに、ｓｉＲＮＡの合成の容易さ、抗原性の問題、生体内組織への輸送を考慮すると、ｓｉＲＮＡの標的配列の長さは、例えば、５０塩基以下、好ましくは２５塩基以下がよく、好ましくは１９塩基以上２５塩基未満、より好ましくは２１塩基以上２３塩基未満である。
【００２８】
ｓｉＲＮＡは、塩基対を形成しない付加的な塩基を、５’末端及び３’末端に有してもよい。付加的な塩基の長さは、ｓｉＲＮＡがＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する限り特に限定されないが、５塩基以下、例えば２塩基以上４塩基以下である。付加的な塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができる。このような付加的な塩基の配列としては、例えばｕｇ‐３’、ｕｕ‐３’、ｔｇ‐３’、ｔｔ‐３’、ｇｇｇ‐３’、ｇｕｕｕ‐３’、ｇｔｔｔ‐３’、ｔｔｔｔｔ‐３’、ｕｕｕｕｕ‐３’等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、ＹＢ‐１をコードするｍＲＮＡの塩基配列又はその塩基配列に含まれる連続する１８塩基以上の標的配列に相補的な塩基配列のＲＮＡとその相補鎖とがヘアピンループ部分を介して連結された１本鎖のＲＮＡであるｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、ヘアピンループ構造をとることにより２本鎖構造を形成する。ヘアピンループ部分の長さは、ｓｈＲＮＡがＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する限り特に限定されないが、例えば５塩基以上２５塩基以下である。
【００３０】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制するｍｉＲＮＡは、例えば、ＹＢ‐１をコードするｍＲＮＡの塩基配列又はその塩基配列に含まれる連続する２０塩基以上の標的配列に相補的な塩基配列を有する１本鎖ＲＮＡである。
【００３１】
ｍｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様に、標的配列を有するＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する。より詳細には、ｍｉＲＮＡは、複数のタンパク質と複合体を形成し、ＹＢ‐１遺伝子が転写されたｍＲＮＡに相互作用して、遺伝子の発現を抑制する。
【００３２】
標的配列とｍｉＲＮＡにおける標的配列に相補的な塩基配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、ｍｉＲＮＡの塩基配列においては、標的配列と完全に相補的でなくても、完全に相補的な塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性があればよい。
【００３３】
ｍｉＲＮＡの標的配列の長さは、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する限り、特に限定されない。標的配列の長さは、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２０塩基以上の長さである。ｍｉＲＮＡの標的配列の長さは、例えば、５０塩基以下、好ましくは３０塩基以下がよく、好ましくは２０塩基以上２５塩基未満である。
【００３４】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制するアンチセンス核酸は、例えば、ＹＢ‐１をコードするｍＲＮＡの塩基配列又はその塩基配列に含まれる連続する２０塩基以上の標的配列に相補的な塩基配列を有する核酸である。アンチセンス核酸は、ＹＢ‐１をコードするｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズし、その発現を抑制する。
【００３５】
標的配列とアンチセンス核酸における標的配列に相補的な塩基配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、アンチセンス核酸の塩基配列においては、標的配列と完全に相補的でなくても、完全に相補的な塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の配列同一性があればよい。
【００３６】
なお、アンチセンス核酸を構成する核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても、これらのハイブリッドであってもよい。
【００３７】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、既知の方法で合成することができる。ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、例えば、固相ホスホルアミダイト法等の任意の核酸合成法により化学的に合成される。また、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、トリエステル法でも合成できる。また、種々の自動核酸合成装置が市販されており、オリゴヌクレオチドは、当該自動核酸合成装置で合成することもできる。また、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。
【００３８】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、ＹＢ‐１遺伝子の塩基配列に基づいて標的配列を決定し、これに相補的な塩基配列の核酸を合成することにより調製できる。例えば、ｓｉＲＮＡは、標的配列に相補的な塩基配列のＲＮＡとその相補鎖とを自動核酸合成装置でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分間程度保持することで変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製できる。
【００３９】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、天然型の核酸から合成できるが、天然型の核酸では、細胞中の核酸分解酵素によってリン酸ジエステル結合が分解されることがある。このため、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸は、分解酵素に対して安定なチオリン酸型や２'‐Ｏ‐メチル型等の修飾核酸を用いて合成してもよい。
【００４０】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、ＹＢ‐１遺伝子の所定の塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡを発現するベクター、ＹＢ‐１遺伝子の所定の塩基配列を標的配列とするｍｉＲＮＡを発現するベクター又はＹＢ‐１遺伝子の所定の塩基配列を標的配列とするアンチセンス核酸を発現するベクターを含むとしてもよい。この場合の標的配列は、例えば、配列番号１で示される塩基配列である。
【００４１】
ベクターでは、上記のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸が、血管内皮細胞等の哺乳動物等の細胞内でプロモータ活性を発揮するプロモータに連結される。使用されるプロモータは、細胞内で機能し得るものであれば特に限定されない。プロモータは、例えば、ｐｏｌ１系プロモータ、ｐｏｌ２系プロモータ、ｐｏｌ３系プロモータ等である。より具体的には、プロモータは、ＳＶ４０由来の初期プロモータ、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウィルスプロモータ、β‐アクチン遺伝子プロモータ等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモータ及びｔＲＮＡプロモータ等のＲＮＡプロモータ等である。
【００４２】
ｓｉＲＮＡを発現させる場合、プロモータとして、ｐｏｌ３系プロモータが好ましい。ｐｏｌ３系プロモータは、例えば、Ｕ６プロモータ、Ｈ１プロモータ、ｔＲＮＡプロモータ等である。
【００４３】
また、ヒト等の哺乳動物への投与を考慮すると、ベクターとして、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、センダイウィルス、ヘルペスウィルス等のウィルスベクターが好適である。アデノウィルスは、遺伝子導入の効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入できる等の利点を有する。アデノウィルスは、導入した遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、導入した遺伝子の発現は一過性で、通常数週間程度しか持続しない。これに対し、持続性を考慮すれば、遺伝子導入の効率が比較的高く、非分裂細胞にも導入でき、かつ逆位末端繰り返し配列を介して染色体に組み込まれるアデノ随伴ウィルスもベクターとして好ましい。
【００４４】
上記ベクターは、好ましくは上記のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネータ領域を含有する。さらに、上記ベクターは、形質転換された細胞を選択するためのマーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでもよい。
【００４５】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、後述の実施例４に示すように、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導する。ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質が血管内皮細胞のアポトーシスを誘導するか否かを確認するには、例えば、下記の実施例４のように、当該物質に暴露した血管内皮細胞又は当該物質を導入した血管内皮細胞におけるアポトーシスのマーカー、例えばＡｎｎｅｘｉｎ‐Ｖの発現の有無を調べればよい。この他、当該物質に暴露した血管内皮細胞又は当該物質を導入した血管内皮細胞を電子顕微鏡下で観察し、アポトーシス小体等のアポトーシスに固有の形態的特徴の有無を調べればよい。
【００４６】
また、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、後述の実施例５に示すように、血管内皮細胞による管腔形成を阻害する。管腔とは、血管等の管状構造体の内腔である。ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質が血管内皮細胞による管腔形成を阻害するか否かを確認するには、例えば、当該物質に暴露した血管内皮細胞又は当該物質を導入した血管内皮細胞を電子顕微鏡下で観察し、管腔の有無を調べればよい。
【００４７】
上記のようにＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導するため、血管を退縮させる。また、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、新生血管の形成を抑制するため、血管の新生を阻害する。当該物質が血管の新生を阻害するか否か、又は当該物質が血管を退縮させるか否かは、当該物質を投与した坦癌マウス等の組織切片等を電子顕微鏡等で観察することによって確認できる。この際、免疫学的組織染色等を用いることで血管の新生を阻害又は血管を退縮させるか否かをより明確に確認できる。
【００４８】
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質は、血管内皮細胞の異常な増殖の抑制、新生血管の形成の抑制及び既に形成された腫瘍血管等の破壊が可能である。このため、当該物質によって治療効果が期待できる疾患は、病的な血管が認められる疾患、例えば、癌、黄班変性症、緑内障、翼状片症、変形関節炎、関節リウマチ、血管異常、血管腫、リンパ管腫及び乾癬等である。癌は、固形癌である限り特に限定されない。例えば、癌は、膵臓癌、膠芽腫、食道癌、胃癌、結腸癌、肺癌、腎癌、甲状腺癌、耳下腺癌、頭頚部癌、骨・軟部肉腫、尿管癌、膀胱癌、子宮癌、肝癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、卵管癌等である。ここで列挙した疾患は、例示であり、これらの他、ＹＢ‐１遺伝子の発現が高く、病的な血管が形成される各種疾患に対して治療効果が期待できる。
【００４９】
アポトーシス誘導剤は、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質と薬理的に許容される担体とが配合された合剤であってもよい。合剤の剤形は、例えば、注射剤、点滴剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤及び経口投与剤等が好ましい。ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質が上記ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである場合は、水溶性及び細胞膜透過性を高めるために、リポソームやマイクロスフィア等を担体として使用してもよい。
【００５０】
アポトーシス誘導剤が合剤の場合、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する物質が合剤の全組成物の重量に対して、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜１重量％含有されていればよい。
【００５１】
薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、液状製剤においては例えば、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、薬理的に許容される担体は、固形製剤においては例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００５２】
アポトーシス誘導剤の投与量は、患者の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。静脈注射の場合、投与量は、成人一日あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇである。この場合、アポトーシス誘導剤は、１回、あるいは複数回に分けて投与されてもよく、複数回の投与においては、連続して投与されてもよい。また、経口投与の場合、投与量は、成人一日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ乃至１０００ｍｇ／ｋｇである。この場合、アポトーシス誘導剤は、１回、あるいは複数回に分けて投与されてもよい。なお、必要に応じて、上記の範囲外の量を用いることもできる。
【００５３】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るアポトーシス誘導剤は、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導する。このため、血管内皮細胞の単なる増殖抑制とは異なり、新生血管の形成の抑制及び既に形成された血管の破壊等により、血管の形成に異常を認める疾患に対してより高い治療効果が得られる。また、上記アポトーシス誘導剤は、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導するため、増殖抑制に対してみられるＤＮＡの修復による耐性の影響を受けない。このため、上記アポトーシス誘導剤は、増殖抑制に対する耐性に起因する薬剤耐性による治療効果の低下を防ぐことができる。
【００５４】
また、本実施の形態に係るアポトーシス誘導剤は、血管内皮細胞による管腔形成を阻害するため、生体内における新生血管の異常な形成を阻害できる。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、血管内皮細胞による管腔形成の阻害を確かめることができるので、スクリーニングにおいて候補物質の生体内での効果を予想しやすいという利点もある。
【００５５】
また、本実施の形態に係るアポトーシス誘導剤は、血管の新生を阻害する作用及び血管を退縮させる作用を有する。このため、生体内における新生血管の異常な形成を阻害することができ、既に形成された血管を破壊できる。これにより、病態が進行して血管が過剰に形成された難治性疾患に対してもより高い治療効果が得られる。
【００５６】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。実施の形態２に係る癌治療薬は、上記実施の形態１におけるアポトーシス誘導剤を有効成分として含む。上記癌治療薬は、薬理的に許容される担体と配合された合剤であってもよい。合剤の剤形は、例えば、注射剤、点滴剤、直腸坐剤、膣坐剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経肺吸収剤、口腔内吸収剤及び経口投与剤等が好ましい。有効成分として含むアポトーシス誘導剤が上記ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである場合は、水溶性及び細胞膜透過性を高めるために、リポソームやマイクロスフィア等を担体として使用してもよい。
【００５７】
当該癌治療薬は、有効成分として上記実施の形態１におけるアポトーシス誘導剤を高分子ミセルに内包してもよい。高分子ミセルは、例えば、疎水性ポリマーで形成される内核と親水性ポリマーで形成される外殻との二層構造を有している。疎水性ポリマーは、例えば、ポリアミノ酸誘導体等である。親水性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール等である。内核は、アポトーシス誘導剤等の薬剤を物理的あるいは化学的に封入する。外殻は、その物理化学的な性質によって、内核に封入された薬剤を所定の生体組織に分布させる。より詳細には、高分子ミセルは、脂質二重膜からなる細胞膜の表面に結合し、エンドサイトーシスによって細胞膜ごと細胞内に入り込むことができる。高分子ミセルには、例えば、ｂｌｏｃｋ‐ｐｏｌｙｍｅｒ等を利用することもできる。
【００５８】
アポトーシス誘導剤を高分子ミセルに内包することによって、腫瘍血管の血管内皮細胞に選択的にアポトーシス誘導剤を輸送できる。これは、いわゆるＥＰＲ効果によるものである。腫瘍では血管新生が速いため、血管壁に、正常組織の血管にはない隙間が形成されている。高分子ミセルは、正常組織の血管では血管壁から組織に移行せず、腫瘍血管の血管壁から腫瘍に移行する。このため、腫瘍部位特異的にアポトーシス誘導剤の濃度を上げることができる。さらに、腫瘍部位はリンパ管が未発達なため、アポトーシス誘導剤を効率よく排出できず、アポトーシス誘導剤を腫瘍部位に長時間残存させることができる。
【００５９】
癌治療薬が合剤の場合、アポトーシス誘導剤が合剤の全組成物の重量に対して、０．０１〜１０重量％、好ましくは、０．１〜１重量％含有されていればよい。
【００６０】
薬理的に許容される担体は、製剤素材として用いられる各種の有機担体物質又は無機担体物質である。薬理的に許容される担体は、上記実施の形態１と同様に液状製剤において、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等、固形製剤において、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の添加物を用いることもできる。
【００６１】
癌治療薬の投与量は、患者の性別、年齢、体重、症状等によって適宜決定される。経口投与、静脈注射及び経鼻投与等において、投与量、投与回数等は、上記実施の形態１と同様に決定される。
【００６２】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る癌治療薬は、上記実施の形態１のアポトーシス誘導剤を有効成分として含む。このため、血管内皮細胞の単なる増殖抑制とは異なり、腫瘍における新生血管の形成の抑制及び既に形成された腫瘍血管の破壊等の作用により、癌に対してより高い治療効果が得られる。
【００６３】
また、本実施の形態に係る癌治療薬は、血管内皮細胞による管腔形成を阻害するアポトーシス誘導剤を有効成分として含む。このため、生体内の腫瘍部位等における新生血管の異常な形成を阻害できる。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、血管内皮細胞による管腔形成の阻害を確かめることができるので、スクリーニングにおいて候補物質の生体内での薬効を予想しやすいという利点もある。
【００６４】
また、本実施の形態に係る癌治療薬は、血管の新生を阻害する作用及び血管を退縮させる作用を有するアポトーシス誘導剤を有効成分として含む。このため、生体内の腫瘍組織等における新生血管の異常な形成を阻害することができ、既に形成された腫瘍血管等を破壊できる。これにより、ステージが進んだ癌や難治性癌に対してもより高い治療効果が得られる。
【００６５】
また、本実施の形態では、癌治療薬は、アポトーシス誘導剤を高分子ミセルに内包してもよいこととした。このため、高分子ミセルを利用したドラッグデリバリシステムによって、患者に対して適切な吸収、分布、代謝、排泄のプロファイルを得ることができる。また、適切な吸収、分布、代謝、排泄のプロファイルによって、さらに高い治療効果が得られ、毒性を回避できる。
【００６６】
なお、上記実施の形態１におけるアポトーシス誘導剤及び上記実施の形態２における癌治療薬を合剤とする場合に配合される担体として次のものが挙げられる。溶剤においては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール等である。溶解補助剤においては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等である。懸濁化剤においては、界面活性剤、親水性高分子等であって、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等である。
【００６７】
また、等張化剤においては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ‐マンニトール等である。緩衝剤においては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩の緩衝液等である。無痛化剤においては、例えば、ベンジルアルコール等である。
【００６８】
また、賦形剤においては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ‐マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等である。滑沢剤においては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等である。結合剤においては、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ‐マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等である。崩壊剤においては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等である。
【００６９】
なお、防腐剤においては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等である。抗酸化剤においては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等である。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００７１】
（実施例１：血管内皮細胞におけるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制）
配列番号１に表される塩基配列を標的とするｓｉＲＮＡを血管内皮細胞に導入して、ＹＢ‐１遺伝子の発現抑制を評価した。
【００７２】
配列番号１に表される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ（以下、「ＹＢ７４１」とする）として、塩基配列が５’末端から３’末端に向かってＵＡＧＵＡＡＧＧＵＧＧＧＡＡＣＣＵＵＣＧＣ（配列番号２）及び５’末端から３’末端に向かってＧＣＧＡＡＧＧＵＵＣＣＣＡＣＣＵＵＡＣＵＡ（配列番号３）の２本鎖ＲＮＡを合成した。また、既に報告（ｖａｎ  Ｒｏｅｙｅｎ  ＣＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｙ−ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ＰＤＧＦ−Ｂ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｅｓａｎｇｉｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．，  １６，  ２９８５−２９９６  ２００５）されているＹＢ‐１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（以下、「ＹＢ３３０」とする）として塩基配列が５’末端から３’末端に向かってＡＡＡＡＣＣＵＵＣＧＵＵＧＣＧＡＵＧＡＣＣ（配列番号４）及び５’末端から３’末端に向かってＧＧＵＣＡＵＣＧＣＡＡＣＧＡＡＧＧＵＵＵＵ（配列番号５）の２本鎖ＲＮＡを対照用に合成した。また、他の遺伝子の塩基配列に一致せず、遺伝子発現を抑制しないコントロール用ｓｉＲＮＡ（以下、「コントロール」とする）を合成して用いた。
【００７３】
実験に用いた細胞は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣ）及び正常ヒト肺動脈内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ＨＰＡＥＣ）の２種類である。いずれの細胞も血管内皮用培地ブレットキットＥＧＭ−２（三光準薬社）で維持した。
【００７４】
ｓｉＲＮＡを加えない未処理群、コントロールで処理するコントロール群、ＹＢ３３０で処理するＹＢ３３０群及びＹＢ７４１で処理するＹＢ７４１群の各群について、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの濃度で細胞を播いた。各群につき３ウェルを調製した。
【００７５】
細胞培養装置を用いて細胞を播いたプレートを３７℃で一晩維持し、３０〜５０％のコンフルエントを確認した。続いて、細胞の培地を、抗生物質を含まない培地に交換して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用いて、最終濃度が２０ｎＭになるようにｓｉＲＮＡを細胞に導入した。
【００７６】
ｓｉＲＮＡの導入後、４時間、２４時間及び４８時間で培地を交換した。ｓｉＲＮＡの導入から４８時間後にコントロール群における蛍光色素による導入効率を確認して、ＰＢＳで細胞を洗浄した後に細胞をプレートから剥がし、ｍＲＮＡの定量用に細胞を回収した。また、ｓｉＲＮＡの導入から７２時間後にＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で細胞を洗浄した後に細胞をプレートから剥がし、タンパク質の定量用に細胞を回収した。
【００７７】
回収した細胞からのＲＮＡの抽出には、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ社）を用いた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ロシュ社）を用いて、１μｇの抽出したＲＮＡから２０μｌのｃＤＮＡ溶液を合成した。９６ウェルプレートの各ウェルに、脱イオン蒸留水：７μｌ、ハウスキーピングプライマー：０．４μｌ、ハウスキーピングプローブ：０．４μｌ、ターゲットプライマー  Ｒｔ(２０μＭ)：０．４μｌ、ターゲットプライマー  Ｌｔ(２０μＭ)：０．４μｌ、ターゲットプローブ：０．４μｌ、マスターミックス：０．４μｌの用量で分注し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＲ  ４８０を用いて、ｑＲＴ‐ＰＣＲを行った。ｑＲＴ‐ＰＣＲは、９５℃で１０分間のステップと、９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１秒間を１サイクルとして４５サイクル繰り返すステップと、４０℃で３０秒間のステップで行った。ｍＲＮＡの定量は、ハイブリダイゼーション法で行った。データ解析は、相対的定量法であるＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  （Ｅ）‐Ｍｅｔｈｏｄで行った。
【００７８】
タンパク質としてのＹＢ‐１の定量はウェスタンブロッティング法で行った。前処理として、タンパク質は、製造者の推奨するプロトコールに従ってプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を添加したＭ‐ＰＥＲ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ試薬（サーモサイエンティック社）を用いて細胞から抽出した。各群について抽出したタンパク質をサンプル緩衝液に加えて、タンパク質の濃度が２５μｇとなるようにサンプルを調製した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）の４〜１２％  Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（インビトロジェン社）を用いて、得られたサンプルについて２００Ｖの電圧で２５分間の電気泳動を行った。タンパク質がゲル内を移動したことを確認し、タンク式の転写装置にセットして、３０Ｖの電圧で６０分間かけてＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。ウェスタンブロッティングでは、一次抗体には、１５００倍に希釈した抗ＹＢ‐１抗体（ＧＥヘルスケア社）を用いた。一次抗体の反応時間は６０分間であった。標識二次抗体には、２００００倍に希釈した抗ウサギＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いた。標識二次抗体の反応時間は６０分間であった。発光は、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア社）を用いて５分間行った。発光バンドの検出には、Ｌｉｇｈｔ‐Ｃａｐｔｕｒｅ２（アトー社）を使用した。
【００７９】
（結果）
図１は、ハウスキーピング遺伝子βマイクログロブリン２のｍＲＮＡの発現量を基準とするＹＢ‐１遺伝子のｍＲＮＡの発現量のＣｐ値処理による相対値を示す。ＨＵＶＥＣ及びＨＰＡＥＣにおいて、ＹＢ７４１群は、未処理群及びコントロール群に対してｍＲＮＡの発現を抑制した。このことから、ＹＢ７４１は、ＹＢ‐１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現を抑制することが示された。
図２（Ａ）は、ＨＵＶＥＣにおけるＹＢ‐１のタンパク質の量の相対値及びウェスタンブロッティングの発光バンドを示す。相対値は、未処理群におけるβアクチンのタンパク質の量に対するＹＢ‐１のタンパク質の量を１としたときの値である。発光バンドは、左から未処理群、コントロール群、ＹＢ７４１群、ＹＢ３３０群である。上段の発光バンドはＹＢ‐１に対応し、下段の発光バンドはβアクチンに対応する。ＹＢ‐１のタンパク質の量は、βアクチンのタンパク質の量で補正した。図２（Ａ）中のＹＢ７４１群は、未処理群及びコントロール群と比較してＹＢ‐１の量が少なかった。また、ＹＢ７４１群では、ＹＢ３３０群よりもＹＢ‐１の量が約５０％少なかった。図２（Ｂ）は、ＨＰＡＥＣにおけるＹＢ‐１のタンパク質の量の相対値及びウェスタンブロッティングの発光バンドを示す。発光バンドは、図２（Ａ）と同様に上段の発光バンドがＹＢ‐１に対応し、下段の発光バンドがβアクチンに対応する。ＹＢ７４１群は、未処理群及びコントロール群と比較してＹＢ‐１の量が少なかった。また、ＹＢ７４１群では、ＹＢ３３０群と比較してＹＢ‐１の量が約７５％であった。このことから、ＹＢ７４１は、血管内皮細胞においてＹＢ‐１の発現をタンパク質レベルで抑制することが示された。さらに、ＹＢ７４１は、ＹＢ３３０よりもＹＢ‐１の発現をタンパク質レベルでの発現をより強く抑制することが示された。
【００８０】
（実施例２：血管内皮細胞におけるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制）
ＹＢ７４１を血管内皮細胞に導入して、血管内皮細胞の増殖能への影響を評価した。
【００８１】
ＹＢ３３０に加え、引用文献１に記載された、塩基配列が５’末端から３’末端に向かってＵＧＧＡＵＡＧＣＧＵＣＵＡＵＡＡＵＧＧＵＵＡＣＧＧ（配列番号６）及び５’末端から３’末端に向かってＣＣＧＵＡＡＣＣＡＵＵＡＵＡＧＡＣＧＣＵＡＵＣＣＡ（配列番号７）の２本鎖ＲＮＡを対照のｓｉＲＮＡ（以下、「ＹＢ５９４」とする）として合成した。
【００８２】
実験に用いた細胞は、ＨＰＡＥＣである。ＹＢ５９４で処理するＹＢ５９４群に加え、上記未処理群、コントロール群、ＹＢ３３０群及びＹＢ７４１群の各群について、２４ウェルプレートに４×１０４細胞／ウェルの濃度で細胞を播いた。各群につき３ウェルを調製した。
【００８３】
細胞培養装置を用いて細胞を播いたプレートを３７℃で一晩維持し、３０〜５０％のコンフルエントを確認した。続いて、細胞の培地を、抗生物質を含まない培地に交換して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用いて、最終濃度が２０ｎＭになるようにｓｉＲＮＡを細胞に導入した。
【００８４】
ｓｉＲＮＡの導入後、４時間、２４時間及び４８時間で培地を交換した。ｓｉＲＮＡの導入から４８時間後にコントロール群における蛍光色素で導入効率を確認して、ＰＢＳで細胞を洗浄した後にＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞をプレートから剥がし、回収した。次に、細胞を含むＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを培地で２倍希釈して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＣｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）を用いて細胞数を計測した。
【００８５】
（結果）
図３は、各群におけるＨＰＡＥＣの細胞数の経時変化を示す。ＹＢ７４１群では、０時間から７２時間後まで通してＨＰＡＥＣの細胞数が未処理群及びコントロール群よりも少なかった。また、ＹＢ７４１群では、ＹＢ３３０群及びＹＢ５９４群よりも０時間から７２時間後まで通してＨＰＡＥＣの細胞数が少なかった。特に、ＹＢ７４１は２４時間後の時点で未処理群及びコントロール群よりも細胞数が大きく低下していた点で、２４時間後の時点での細胞数が未処理群及びコントロール群と同程度であったＹＢ３３０群及びＹＢ５９４群と異なる。
図４は、ｓｉＲＮＡ導入７２時間後の細胞数を比較した図である。ＹＢ７４１群では、コントロール群と比較してｐ＝０．０００１５の有意差、ＹＢ３３０群と比較してｐ＝０．０２３の有意差、ＹＢ５９４群と比較してｐ＝０．０１７の有意差をもって細胞数が少なかった。このことから、ＹＢ７４１は、血管内皮細胞の増殖を抑制することが示された。また、ＹＢ７４１は、既知のＹＢ３３０及びＹＢ５９４よりも血管内皮細胞の増殖をさらに強く抑制することが示された。
【００８６】
（実施例３：ＹＢ‐１遺伝子の発現抑制による血管内皮細胞の細胞周期への影響）
ＹＢ７４１を血管内皮細胞に導入して、血管内皮細胞の細胞周期を評価した。
【００８７】
６ウェルプレートにＨＵＶＥＣを２×１０５細胞／ウェルの濃度で播いた。細胞培養装置を用いて細胞を播いたプレートを３７℃で一晩維持し、３０〜５０％のコンフルエントを確認した。続いて、細胞の培地を、抗生物質を含まない培地に交換して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用いて、最終濃度が２０ｎＭになるようにｓｉＲＮＡを細胞に導入した。
【００８８】
ｓｉＲＮＡの導入４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞をプレートから剥がし、回収した。回収した細胞を含む溶液を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をＰＢＳで洗浄した。続いて、７０％エタノールを加え、４℃で２時間固定した。細胞をＰＢＳで洗浄後、ＲＮＡ  溶液を１００μｌ添加し、３７℃で３０分間反応させた。次に、ＰＩ（ヨウ化プロピジウム）溶液を４００μｌ添加し、３７℃で３０分間反応させた。細胞をＰＢＳで洗浄後、Ｆａｃｓ  Ｃａｎｔｏ（登録商標）２を用いて、ＰｅｒＣＰ‐Ｃｙ５．５領域を検出した。なお、検出では、ダブレットを形成した細胞を除去した。
【００８９】
（結果）
図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれコントロール群、ＹＢ３３０群、ＹＢ７４１群における４８時間後の顕微鏡画像を示す。ＹＢ７４１は、コントロール群と比較して細胞数が少なく、各細胞が小さい傾向が視認された。図６は、ｓｉＲＮＡ導入後における、各群の導入時を基準とする細胞数の相対値の経時変化を示す。コントロール群、ＹＢ３３０群は、細胞数が増加しているのに対し、ＹＢ７４１群は、細胞数がやや減少している。
図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ未処理群、コントロール群、ＹＢ７４１群における細胞周期解析の結果を示す。未処理群及びコントロール群に比較して、ＹＢ７４１群では、より多くの細胞がＧ１期に分布していた。図８は、細胞周期ごとの細胞分画比率を示す。未処理群及びコントロール群に比較して、ＹＢ７４１群では、Ｇ１期の細胞分画比率が有意に高かった。
これらのことから、ＹＢ７４１によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制は、血管内皮細胞のＧ１期での静止を誘導することが示された。
【００９０】
（実施例４：ＹＢ‐１遺伝子の発現抑制による血管内皮細胞のアポトーシス誘導）
ＹＢ７４１を血管内皮細胞に導入して、血管内皮細胞におけるアポトーシス及びネクローシスの誘導を検討した。
【００９１】
２４ウェルプレートにＨＵＶＥＣ又はＨＰＡＥＣを４×１０４細胞／ウェルの濃度で播いた。細胞培養装置を用いて細胞を播いたプレートを３７℃で一晩維持し、３０〜５０％のコンフルエントを確認した。続いて、細胞の培地を、抗生物質を含まない培地に交換して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用いて、最終濃度が２０ｎＭになるようにｓｉＲＮＡを細胞に導入した。
【００９２】
ｓｉＲＮＡの導入１６〜２０時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した。インキュベーション緩衝液１００μｌに蛍光標識したＡｎｎｅｘｉｎ‐Ｖを２μｌ及びＰＩを２μｌ加えた溶液を調製し、この溶液をウェルに添加して室温で１５分静置した。ＰＢＳで洗浄後、インキュベーション緩衝液１００μｌを添加した。蛍光顕微鏡を用いて、ＦＩＴＣ領域でＡｎｎｅｘｉｎ‐Ｖの有無を観察した。また、Ｃｙ３領域でＰＩの有無を観察した。
【００９３】
（結果）
図９は、コントロール群及びＹＢ７４１群における蛍光顕微鏡画像を示す。図９（Ａ）は、ＨＵＶＥＣの蛍光顕微鏡画像を示し、図９（Ｂ）は、ＨＰＡＥＣの蛍光顕微鏡画像を示す。図９（Ａ）、（Ｂ）それぞれにおいて、上段がコントロール群の蛍光顕微鏡画像、下段がＹＢ７４１群の蛍光顕微鏡画像である。ＹＢ７４１は、ＨＵＶＥＣ及びＨＰＡＥＣにおいてＡｎｎｅｘｉｎ‐Ｖの発色が検出された。Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖは、アポトーシスの初期に現れる、構造が変化した細胞膜に結合するため、Ａｎｎｅｘｉｎ‐Ｖの発色が検出されたことは、ＹＢ７４１群においてＨＵＶＥＣ及びＨＰＡＥＣのアポトーシスが誘導されたことを示す。一方、ＰＩの発色は検出されなかった。ＰＩは、生細胞内やアポトーシス初期の細胞膜を透過できないがネクローシスにおいて細胞膜が不安定化することで細胞内に移行する。すなわち、ＰＩの発色が検出されなかったことは、ＨＵＶＥＣ及びＨＰＡＥＣのネクローシスはみられなかったということである。以上のことから、ＹＢ７４１によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制は、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導することが示された。なお、画像を示してないが、ＹＢ３３０群、ＹＢ５９４群ではアポトーシスの誘導を認めなかった。すなわち、ＹＢ７４１は、既知のＹＢ３３０及びＹＢ５９４では得られない、血管内皮細胞のアポトーシス誘導能を有することがわかった。
【００９４】
（実施例５：ＹＢ‐１遺伝子の発現抑制による血管内皮細胞の管腔形成能）
ＹＢ７４１を血管内皮細胞に導入して、血管内皮細胞の管腔形成能を評価した。
【００９５】
未処理群、コントロール群、ＹＢ３３０群、ＹＢ７４１群の各群について、６ウェルプレートにＨＵＶＥＣを２×１０５細胞／ウェルの濃度で播いた。各群につき６ウェルを調製した。
【００９６】
細胞培養装置を用いて細胞を播いたプレートを３７℃で一晩維持し、３０〜５０％のコンフルエントを確認した。続いて、細胞の培地を、抗生物質を含まない培地に交換して、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ＲＮＡｉＭａｘ（インビトロジェン社）を用いて、最終濃度が２０ｎＭになるようにｓｉＲＮＡを細胞に導入した。
【００９７】
ｓｉＲＮＡの導入４時間後、抗生物質を含む培地に交換した。ｓｉＲＮＡの導入２４時間後にコントロール群における蛍光色素で導入効率を確認して、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞をプレートから剥がし、回収した。
【００９８】
一方、４℃に保温しておいたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ、ＢＤバイオサイエンス社）を均一になるように氷上で混合し、氷上に静置した４８ウェルプレートに１５０μｌ／ウェルで分注した。プレートを３７℃で３０分間静置してウェル内の溶液をゲル化させた。
【００９９】
溶液のゲル化を確認後、回収したＨＵＶＥＣを４×１０４細胞／５００μｌとなるようにゲル上に播いた。この際、培地としてＥＢＭ‐２に０．５％  ＦＢＳ（ロンザ社）を添加したものを用いた。また、この時点で、各群について２系列調製し、一方の系列に２０ｎｇ／ｍｌの組み換えＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄシステム社）を添加した。そして、プレートを３７℃に維持し、細胞を培養した。
【０１００】
培養開始から７時間後にコントロール群における管腔構造を確認した上で細胞を、５分間の２．５％グルタルアルデヒド処理で固定し、顕微鏡下での撮影を行った。続いて、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）を用いて、撮影した画像を解析した。撮影画像における３視野で管腔領域を特定し、特定された領域に対応するピクセル数を合計することで形成された管腔を定量した。
【０１０１】
（結果）
図１０は、組み換えＶＥＧＦを添加したコントロール群、ＹＢ３３０群及びＹＢ７４１群における顕微鏡画像を示す。顕微鏡画像の観察所見では、ＹＢ３３０群では、形成された管腔の大きさ、数ともにコントロール群と同程度であった。一方、ＹＢ７４１群では、コントロール群と比べて管腔が乏しく、管腔の形成が抑制されていた。図１１は、定量した管腔領域の大きさを示している。ＹＢ７４１群では、組み換えＶＥＧＦの有無に関わらず、コントロール群と比較して、形成された管腔の領域の大きさが有意に低下した。また、ＹＢ７４１群では、組み換えＶＥＧＦの有無に関わらず、ＹＢ３３０群と比較しても形成された管腔の領域の大きさが低下した。このことから、ＹＢ７４１によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制は、血管内皮細胞の管腔形成能を低下させることが示された。また、ＹＢ７４１によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制は、ＹＢ３３０によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制と比較して、血管内皮細胞の管腔形成能をさらに低下させることが示された。
【０１０２】
（実施例６：ＹＢ‐１遺伝子の発現抑制による血管内皮細胞における血管新生関連因子の遺伝子発現）
ＹＢ７４１を血管内皮細胞に導入して、血管内皮細胞における血管新生関連因子の遺伝子発現を評価した。
【０１０３】
未処理群、コントロール群、ＹＢ３３０群、ＹＢ７４１群の各群について、上記実施例１と同様にｑＲＴ‐ＰＣＲを用いて血管新生関連因子の各種遺伝子の発現量を定量した。定量した遺伝子は、ＶＥＧＦＲ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）１、ＶＥＧＦＲ２、Ｔｉｅ‐１、Ｔｉｅ‐２、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ‐２である。
【０１０４】
（結果）
図１２は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現量の未処理群に対する相対値を示す。ＨＵＶＥＣ及びＨＰＡＥＣにおいて、ＹＢ７４１群は、コントロール群に比較してＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現を抑制した。また、ＹＢ７４１群は、ＶＥＧＦＲ１遺伝子の発現をＹＢ３３０群よりも強く抑制した。図１３、図１４、図１５、図１６及び図１７は、それぞれＶＥＧＦＲ２遺伝子、Ｔｉｅ‐１遺伝子、Ｔｉｅ‐２遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子及びＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ‐２遺伝子の未処理群に対する発現量を示す。ＶＥＧＦＲ１遺伝子と同様に、ＨＵＶＥＣ及びＨＰＡＥＣにおいて、ＹＢ７４１群は、コントロール群に比較して各遺伝子の発現を抑制した。また、ＹＢ７４１群は、各遺伝子の発現をＹＢ３３０群よりも強く抑制した。
ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２は、血管内皮細胞の増殖、遊走等の促進に関与している。ＥＧＦＲは、血管内皮細胞の分化、増殖に関与している。Ｔｉｅ‐１及びＴｉｅ‐２は、血管内皮細胞の統合性に寄与することが示唆されている因子である。Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ‐２は、血管内皮細胞と壁細胞の接着を促進することで新生された血管の安定化に寄与する因子である。ＹＢ７４１は、これら血管新生に重要な因子の発現を抑制することによって、血管内皮細胞による管腔形成を阻害していることが示唆された。
【０１０５】
（実施例７：膵臓癌モデルマウスにおけるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制による腹膜播種の抑制）
ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制するｍｉＲＮＡを膵臓癌モデルマウスの腹腔内に発現させ、腹膜播種の抑制を評価した。
【０１０６】
癌細胞としてＳｕｉｔ２‐ｌｕｃを用いた。Ｓｕｉｔ２‐ｌｕｃは、ヒト膵臓癌細胞であるＳｕｉｔ２を遺伝子改変してルシフェラーゼを安定して発現する細胞である。マウスはＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（６週齢）を各群３匹ずつ用いた。群構成は、生理食塩水を投与した群（Ｓａｌｉｎｅ）、ＹＢ３３０と同じ塩基配列を標的配列とするｍｉＲＮＡ（以下、「ｍｉＹＢ３３０」とする）を導入したｍｉＹＢ３３０群及び配列番号１に示される塩基配列を標的配列とするｍｉＲＮＡ（以下、「ｍｉＹＢ７４１」とする）を導入したｍｉＹＢ７４１群である。ｍｉＹＢ３３０の導入では、トップ鎖として塩基配列が５’末端から３’末端に向かってＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＣＧＡＴＧＡＣＣＧＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＡＧＧＴＴＴＴ（配列番号８）と、ボトム鎖として塩基配列が５’末端から３’末端に向かってＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＧＴＣＧＡＴＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＧＧＴＣＡＴＣＧＣＡＡＣＧＡＡＧＧＴＴＴＴＣ（配列番号９）の合成オリゴを用いた。また、ｍｉＹＢ７４１の導入では、トップ鎖として塩基配列が５’末端から３’末端に向かってＴＧＣＴＧＴＡＧＴＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＧＣＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＧＣＧＡＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡ（配列番号１０）と、ボトム鎖として塩基配列が５’末端から３’末端に向かってＣＣＴＧＴＡＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＣＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＣＧＣＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡＣＣＴＴＡＣＴＡＣ（配列番号１１）の合成オリゴを用いた。ｍｉＹＢ３３０及びｍｉＹＢ７４１は、ＹＢ‐１遺伝子の発現を抑制する機能を有する。
【０１０７】
マウスの腹腔内にＳｕｉｔ２‐ｌｕｃを２×１０５細胞／匹で播種した。１週間後に腹膜播種をＩＶＩＳイメージングで確認後、ｍｉＹＢ３３０又はｍｉＹＢ７４１を発現するプラスミドＤＮＡ（５０μｇ；Ｎ／Ｐ比＝１０）を内包させたｂｌｏｃｋ‐ｐｏｌｙｍｅｒからなる高分子ミセルを腹腔内に投与した。投与後、経時的にＩＶＩＳイメージングにて腹膜播種の量を定量した。
【０１０８】
（結果）
図１８は、投与前（０日）の腹膜播種の量に対する各群における腹膜播種の相対量の経時変化を示す。ｍｉＹＢ７４１群は、Ｓａｌｉｎｅ群と比較して、腹膜播種を抑制した。また、ｍｉＹＢ７４１群は、ｍｉＹＢ３３０群と比較して、投与後２８日間で腹膜播種の増加量を約１／１０に抑制した。
図１９は、ＩＶＩＳイメージングによるマウスの画像を示す。投与前（０日）のｍｉＹＢ３３０群の２匹のマウスにおけるシグナル強度は、４．６×１０８及び７．８×１０８であったのに対し、２８日後のｍｉＹＢ３３０群の２匹のマウスにおけるシグナル強度は、７．５×１０１０及び３．８×１０１０であった。一方、投与前（０日）のｍｉＹＢ７４１群の２匹のマウスにおけるシグナル強度は、４．３×１０８及び２．２×１０８であったのに対し、２８日後のｍｉＹＢ７４１群の２匹のマウスにおけるシグナル強度は、２．８×１０９及び１．４×１０９であった。画像においても投与後２８日目におけるｍｉＹＢ７４１群における腹膜播種の範囲は、ｍｉＹＢ３３０群における腹膜播種の範囲よりも小さいことを確認した。これらのことから、ｍｉＹＢ７４１は、ｉｎ  ｖｉｖｏで膵臓癌の腹膜播種を抑制することが示された。また、その抑制効果は、ＹＢ３３０よりも優れていた。
【０１０９】
（実施例８：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ耐性膵臓癌におけるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制による腹膜播種の抑制）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてｍｉＹＢ７４１による増殖抑制効果を認めない膵臓癌細胞に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｉＹＢ７４１による腹膜播種の抑制を評価した。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、膵臓癌細胞であるＭｉａＰａＣａ２を用いた。６ウェルプレートにＭｉａＰａＣａ２を２×１０４細胞／ウェルで播き、一晩３７℃で培養後、ｍｉＹＢ７４１群にｍｉＹＢ７４１を発現するプラスミドＤＮＡを、コントロール群にＧＦＰコントロールプラスミドを導入した。プラスミドＤＮＡの導入には、Ｘ‐ｆｅｃｔを用いた。プラスミドＤＮＡの導入後、細胞数を経時的に計測した。
【０１１１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、膵臓癌細胞であるＭｉａＰａＣａ２を遺伝子改変してルシフェラーゼを安定して発現するＭｉａＰａＣａ２‐ｌｕｃを用いた。マウスはＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（６週齢）を各群６匹ずつ用いた。マウスの腹腔内にＭｉａＰａＣａ２‐ｌｕｃを２×１０５細胞／匹で播種した。１週間後に腹膜播種をＩＶＩＳイメージングで確認後、ｍｉＹＢ７４１を発現するプラスミドＤＮＡ（５０μｇ；Ｎ／Ｐ比＝１０）を内包させたｂｌｏｃｋ‐ｐｏｌｙｍｅｒからなる高分子ミセルを腹腔内に投与した。投与後、経時的にＩＶＩＳイメージングにて腹膜播種を定量した。
【０１１２】
（結果）
図２０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、プラスミドＤＮＡ導入前の細胞数に対する各群における細胞数の相対値の経時変化を示す。ｍｉＹＢ７４１群は、コントロール群と同様に細胞数が経時的に増加した。このことから、ｍｉＹＢ７４１には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭｉａＰａＣａ２に対する増殖抑制効果が認められなかった。
図２１は、ＩＶＩＳイメージングによるマウスの画像を示す。投与後２１日後において、ｍｉＹＢ７４１群における腹膜播種の範囲は、コントロール群における腹膜播種の範囲よりも小さいことが確認できた。これらのことから、ｍｉＹＢ７４１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて耐性である膵臓癌細胞の腹膜播種をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制することが示された。
図２２は、マウスの生存曲線を示す。コントロール群は、全てのマウスが４０日後までに死亡したのに対し、ｍｉＹＢ７４１群のマウスは、半数が６０日後まで生存し、１割が１００日以上生存した。このため、ｍｉＹＢ７４１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて耐性であった膵臓癌細胞で作製された膵臓癌モデルマウスの生存を延長することが示された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで耐性であったＭｉａＰａＣａ２の腹膜播種をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制したのは、上記実施例４に示されたＹＢ７４１による血管内皮細胞のアポトーシス誘導と、上記実施例５で示されたＹＢ７４１による血管内皮細胞における管腔形成の強い抑制によって、生体組織における血管新生が抑制され、播種の拡がりが抑制されているからであると考えられる。
【０１１３】
（実施例９：皮下腫瘍モデルマウスにおけるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制の腫瘍間質に対する影響）
皮下腫瘍モデルマウスにｍｉＹＢ７４１を発現するプラスミドＤＮＡを局所投与した場合の免疫学的組織染色を検討した。
【０１１４】
癌細胞は、ヒト胆嚢癌細胞であるＧＢｄ１５を用いた。マウスはＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（６週齢）を各群２匹ずつ用いた。ｍｉＹＢ７４１を発現するプラスミドＤＮＡは、高分子ミセル用基材と混合して高分子ミセルとした。マウスの両側大腿付着部にＧｂｄ１５を５×１０６細胞／匹で注射した。注射してから１週間後、マウスの右大腿付着部に形成された皮下腫瘍に高分子ミセルを、ＤＮＡの投与量が１匹あたり５０μｇとなるように注射した。高分子ミセルの注射から３日後に、皮下腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍を、適当な大きさの腫瘍片に切り分けて、ＰＢＳで洗浄した。病理検査用キットであるＴｉｓｓｕｅ‐Ｔｅｋ（登録商標、サクラファインテックジャパン社）に含まれるクリオモルド３号のＯ．Ｃ．Ｔ  Ｃｏｍｐｕｎｄ内に腫瘍片を沈め、アセトンで腫瘍片を急速冷却固定した。固定した腫瘍片を−８０℃で保存し、下記のように免疫組織学的染色を行った。
【０１１５】
腫瘍片をＰＢＳで洗浄し、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールと室温で３０分間反応させて内因性ペルオキシダーゼを除去した。腫瘍片をＰＢＳで洗浄後、３％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＰＢＳで１０分間ブロッキングした。１０００倍希釈の抗ＹＢ‐１抗体と５０倍希釈の抗ＣＤ３１抗体（日本ベクトン・ディッキンソン社）を腫瘍片に添加し、４℃で一次抗体反応を行った。ＰＢＳで洗浄後、４００倍希釈のビオチン標識された抗ウサギＩｇＧ抗体（ベクター社）及び２５０倍希釈のビオチン標識された抗ラットＩｇＧ抗体（ベクター社）を腫瘍片に添加し、室温で３０分間、二次抗体反応を行った。ＰＢＳで洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄキットに含まれるストレプトアビジン‐ＨＲＰ複合体を腫瘍片に添加し、室温で５分間反応させた。続いて、ＰＢＳで洗浄し、ペルオキシダーゼを用いてジアミノベンジジンと反応させるＤＡＢ反応を室温で１０分間行った。ＰＢＳで洗浄後、ヘマトキシリン染色を１５秒間行い、１分間ほど流水で洗浄した。続いて、７０％、８０％、９０％アルコールの順に腫瘍片を数回暴露し、無水アルコールに１分間浸けて脱水した。次に、腫瘍片をキシレンに５分間暴露することを３回繰り返し、ソフトマウント（和光純薬工業社）を用いて腫瘍片を封入し、光学顕微鏡で観察した。
【０１１６】
（結果）
図２３は、上段にＹＢ‐１染色の画像、下段にＣＤ３１染色の画像を示す。ＧＢｄ１５を注射しなかったノーマル群は、ＹＢ‐１の発現及び腫瘍血管のマーカーであるＣＤ３１の発現を認めなかった。ＧＢｄ１５を注射し、ｍｉＹＢ７４１を発現するプラスミドＤＮＡを投与しなかったコントロール群は、ノーマル群と比較して、ＹＢ‐１の発現上昇及びＣＤ３１の発現を認めた。これに対し、ＧＢｄ１５を注射し、ｍｉＹＢ７４１を発現するプラスミドＤＮＡを局所投与したｍｉＹＢ７４１群は、コントロール群と比較して、ＹＢ‐１の発現を抑制した。また、ｍｉＹＢ７４１群は、コントロール群と比較して、ＣＤ３１の発現も抑制した。このことから、ＹＢ‐１遺伝子の発現抑制によって、腫瘍間質における腫瘍血管の密度が低下することが示された。
【０１１７】
以上の各実施例により、配列番号１に表される塩基配列を標的配列とするｓｉＲＮＡであるＹＢ７４１によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制は、既知のＹＢ‐１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ等よりもＹＢ‐１遺伝子の発現を強く抑制した。また、ＹＢ７４１によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制は、血管内皮細胞の増殖を抑制すること、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導すること、血管内皮細胞による管腔形成能を大きく低下させることが示された。さらに、ＹＢ７４１によるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制は、血管新生関連因子の発現を抑制し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける強力な抗腫瘍活性を示した。この抗腫瘍活性は、生体組織における血管新生の抑制によるものと考えられ、腫瘍間質の血管密度が低下することによって優れた抗腫瘍活性が得られたと考えられる。これにより、本発明に係るアポトーシス誘導剤及び癌治療薬は、難治性腫瘍や増殖性血管疾患に対してより高い治療効果を有すると考えられる。
【０１１８】
ｓｉＲＮＡによるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制により、癌細胞のアポトーシスが誘導されることが知られている（例えば、Ｃａｔｈｙ  Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＹＢ‐１  ｉｎ  ＨＥＲ‐２  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｍＴＯＲ／ＳＴＡＴ３  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６８，  ８６６１‐８６６６，  ２００８参照）。癌細胞では、細胞周期制御因子であるｐ５３やｐ１６−ｃｙｃＤ１−Ｃｄｋ４−ｐＲｂに関連する経路に異常が多くみられ、アポトーシスの誘導に密接に関与する細胞周期が血管内皮細胞等の通常の細胞と大きく異なる。このため、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、癌細胞におけるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制によるアポトーシス誘導とは異なる作用機序で血管内皮細胞のアポトーシスを誘導していると考えられる。また、血管内皮細胞等の接着性細胞では、他の細胞や細胞外基質と接着できないとアポトーシスが誘導されるアノイキスという現象が知られている。細胞の接着性に関連する因子であるアクチンやチュブリンは、ＹＢ−１との関連が示唆されている。このため、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、ＹＢ‐１遺伝子の発現抑制に起因するアクチンやチュブリンの異常、機能低下によるアノイキスによって、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導する可能性が考えられる。一方、癌細胞は、種々の分子機構によりアノイキスに対する抵抗性を獲得している。この点においても、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、癌細胞におけるＹＢ‐１遺伝子の発現抑制によるアポトーシスの誘導とは異なる機序で血管内皮細胞にアポトーシスを誘導すると考えられる。
【０１１９】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本発明は、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤及び癌治療薬に好適である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２３】
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【配列表】
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