(57)【要約】【課題】産業廃棄物である木質系廃材から抗菌物質を抽出する抗菌物質の抽出方法、抽出された抗菌物質、及び抗菌物質を含む医薬品等を提供する。【解決手段】この発明の抗菌物質の抽出方法は、木質系廃材を粉砕して粉砕粉末を得る粉砕工程と、粉砕粉末を亜臨界状態の有機溶媒に接触させる亜臨界処理工程とを含む方法である。また、この発明の抗菌物質は、この発明の抗菌物質の抽出方法によって得られた抗菌物質であり、この発明の医薬品等はこの発明の抗菌物質を含んでいるものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質系廃材を粉砕して粉砕粉末を得る粉砕工程と、
粉砕粉末を亜臨界状態の有機溶媒に接触させる亜臨界処理工程と、
を含む抗菌物質の抽出方法。
【請求項２】
木質系廃材が、梅種子の核である請求項１に記載の抗菌物質の抽出方法。
【請求項３】
有機溶媒が、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノールからなる群から選択される少なくとも１つのアルコールである請求項１に記載の抗菌物質の抽出方法。
【請求項４】
有機溶媒が、メタノールである請求項３に記載の抗菌物質の抽出方法。
【請求項５】
請求項１から請求項４に記載の抗菌物質の抽出方法によって得られる抗菌物質。
【請求項６】
請求項１から請求項５の何れかに記載の抗菌物質を含む医薬品。
【請求項７】
請求項１から請求項５の何れかに記載の抗菌物質を含む医薬部外品。
【請求項８】
請求項１から請求項５の何れかに記載の抗菌物質を含む化粧品。
【請求項９】
請求項１から請求項５の何れかに記載の抗菌物質を含む食品。
【請求項１０】
請求項１から請求項５の何れかに記載の抗菌物質を含む飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、梅種子の核などの木質系廃材から抗菌物質を抽出する抗菌物質の抽出方法、抗菌物質、及び抗菌物質を含む医薬品等に関する。
【背景技術】
【０００２】
和歌山県の梅の生産高は全国一位であり、収穫された梅の約70%は梅干に加工されている。そして、梅干の加工に際しては、３大廃棄物といわれる梅酢、調味廃液、塩分を含む種子が副産物として生じ、その処理が問題になっている。
【０００３】
このうち、塩分を含む種子は、梅干から梅肉を製造する際に大量に生じ、現在は脱塩処理をしたのち、大部分は乾燥して埋設・焼却処分され、その一部は粉砕して堆肥として利用されている。このように、塩分を含む梅種子の処理は多大な費用や手間が掛かるため、その有効利用が以前から検討されている。なお、脱塩処理をするのは、埋設地や農地が塩害を受けるのを防ぐため、又は焼却の際にダイオキシンが発生することを防ぐためである。
【０００４】
さて、梅種子は、同じ核果類に属する梅、さくらんぼ、杏、すもも、西洋すもも、桃等の種子と同様に、その胚乳（仁）が、内果皮が硬化した核（殻）によって包まれている。このうち、仁は、油分を豊富に含んでいるため、この油脂を抽出して食用に使用することが試みられている（特許文献１を参照。)。ただ、抽出過程が複雑であること、原料量が限られていること、油の性質に特徴がないこと、シアン配糖体などを含んでいること等の問題点があるため、その利用は極めて限定的であり、広く利用されないと考えられている。
【０００５】
一方、核は、木質成分(リグニン、セルロース、ヘミセルロース)から構成されており、多糖類であるセルロース、ヘミセルロースについては、他の木質系廃棄物と同様にバイオエタノールに変換して利用することが検討されている。また、桃や梅の種子が遺跡から腐敗せずに発見されることが多く、前記セルロース、ヘミセルロースは抗菌作用を備えていないため、核の抗菌作用はリグニンやその分解物が原因ではないかと考えられており、その利用が検討されている。
【０００６】
リグニンは高等植物の木化に関与する高分子のフェノール性化合物であり、木材の20-30%程度を占める重要な成分である。なお、核果類に含まれる梅や桃の核はリグニンの割合が40%程度あり、枝や茎、根と比べリグニンの割合が高いことが知られている(非特許文献１を参照。)。
【０００７】
また、リグニンは、自然界では、白色腐朽菌の出す酵素(リグニンペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7)、マンガンペルオキシダーゼ(EC 1.11.1.7)、ラッカーゼ(EC 1.10.3.2))でしか分解できないことが知られている（非特許文献２を参照。)。
【０００８】
一方、製紙事業やバイオエタノールの製造においては、木材や木質系廃材からリグニンを除去することは必須の課題であるが、高温の化学反応により分解して除去しているのが現状である。ただ、この方法は多大なエネルギーと処理薬剤と必要とするため、環境汚染の原因となるとともに、分解・除去されたリグニンの殆どは焼却処分されており、決して有効利用されているとはいえなかった。
【０００９】
そこで、木質系廃材に含まれるリグニンを利用するため、リグニンを過度に分解することなく、取り出すことが従来から検討されている。例えば、梅種子の核に含まれるリグニンを、高温高圧条件下でマイクロウエーブを使用して分解する方法（非特許文献３を参照。）、超臨界流体を使用する方法（非特許文献４を参照）が挙げられる。
【００１０】
しかし、高温高圧条件下でマイクロウエーブを使用して分解する方法は、リグニンをはじめとする木質成分が過分解され、フェノール性化合物までも分解されて別の物質に変わってしまうため、有用物質が得られないとの問題点があった。また、超臨界流体を使用する方法は、セルロースまで分解してしまうほど分解力が強いため、抗菌物質などの有用物質が得られないとの問題点があった。このように何れの方法も分解力が強すぎることが問題であり、より穏やかな条件で木質系廃材を分解できる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−２７９９８５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Mendu et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels 2011, 4:43
【非特許文献２】Annele Hatakka Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi: production and role from in lignin degradation. FEMS Microbiology Reviews Vol13, Issues 2-3, 1994, PP 125-135
【非特許文献３】Tubaki S, Ozaki Y, Azuma J, Microwave-assisted autohydrolysis of Prunus mume stone for extraction of polysaccharides and phenolic compounds. J Food Sci. 2010 Mar;75(2):C152-9
【非特許文献４】Eiji Minami Shiro Saka Comparison of the decomposition behaviors of hardwood and softwood in supercritical methanol  J Wood Sci (2003) 49:73-78
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
この発明は、産業廃棄物である木質系廃材から抗菌物質を抽出する抗菌物質の抽出方法、抽出された抗菌物質、及び抗菌物質を含む医薬品等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この発明の抗菌物質の抽出方法は、梅種子の核のような木質系廃材から有効成分を抽出する際に、木質系廃材を亜臨界状態の有機溶媒に接触させることを主な特徴とする。また、この発明の抗菌物質は、この発明の抗菌物質の抽出方法によって得られた抗菌物質であることを主な特徴とする。さらに、この発明の医薬品等はこの発明の抗菌物質を含んでいることを主な特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
この発明の抗菌物質の分解抽出法により、従来は廃棄物として費用を掛けて処分していた木質系廃材から抗菌物質を製造することができる。そのため、廃棄物処理に掛かっていた費用を減らすことができ、不法投棄による環境破壊を防ぐこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、溶媒の違いが亜臨界抽出の抽出量、残渣重量などに与える影響を調べた結果を示す。
【図２】図２は、亜臨界抽出物をHPLC分析した結果を示す。なお、図２（ａ）は水、図２（ｂ）は50%メタノール水溶液、図２（ｃ）は90%メタノール水溶液、図２（ｄ）はメタノール、図２（ｅ）は2-プロパノールを溶媒として使用した亜臨界抽出物の分析結果を示す。
【図３】図３は、亜臨界水抽出物、ヒドロキシメチルフルフラール標品、フルフラール標品をHPLC分析した結果を示す。なお、図３（ａ）は亜臨界水抽出物、図３（ｂ）はヒドロキシメチルフルフラール標品、図３（ｃ）はフルフラール標品の分析結果を示す。
【図４】図４は、亜臨界水抽出物のピークIをLC-MSによって分析した結果を示す。
【図５】図５は、ピークIIIを（ａ）1H-NMR分光法及び（ｂ）LC-MSにより分析した結果を示す。
【図６】図６は、ピークIVを（ａ）1H-NMR分光法及び（ｂ）LC-MSにより分析した結果を示す。
【図７】図７は、ピークVを（ａ）1H-NMR分光法及び（ｂ）LC-MSにより分析した結果を示す。
【図８】図８は、ピークVIを（ａ）1H-NMR分光法及び（ｂ）LC-MSにより分析した結果を示す。
【図９】図９は、抽出時間を1、3、6時間と変えることが、亜臨界メタノール抽出の抽出量、残渣重量などに与える影響を調べた結果を示す。
【図１０】図１０は、抽出時間の異なる亜臨界メタノール抽出物をHPLC分析した結果を示す。なお、図１０（ａ）は抽出時間が1時間の抽出物、図１０（ｂ）は抽出時間が3時間の抽出物、図１０（ｃ）は抽出時間が6時間の抽出物の分析結果を示す。
【図１１】図１１は、HPLC分析により生じた各ピークについて、そのピーク面積の時間変化を調べた結果を示す。
【図１２】図１２は、シナピルアルコール、コフェニルアルコールの標品、これらの亜臨界メタノール抽出物、核の亜臨界メタノール抽出物をHPLC分析した結果を示す。
【図１３】図１３は、核の亜臨界メタノール抽出物の腸内細菌8株に対する抗菌活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１.抗菌物質の抽出方法及び抽出物
この発明の抗菌物質の抽出方法は、（１）木質系廃材を粉砕して粉砕粉末を得る粉砕工程と、（２）粉砕粉末を亜臨界状態の有機溶媒に接触させる亜臨界処理工程とを含む方法である。また、この発明の抗菌物質は前記抗菌物質木質系廃材の抽出方法により得られたものである。そこで、以下に抗菌物質の抽出方法について詳説する。
【００１８】
（１）粉砕工程
粉砕工程は、木質系廃材を粉砕することによって、その表面積を増やし、亜臨界処理工程における抽出処理を容易にするための工程である。より詳しくは以下のとおりである。
【００１９】
（ａ）木質系廃材
木質系廃材は、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを主要な構成成分とするものであれば、梅種子を初めとする核果類の種子はもちろん、間伐材や樹皮などの林業廃棄物、建築廃材など、特に限定することなく使用できる。中でも、抗菌物質として利用可能な抽出物が高濃度で得られるため、リグニン濃度が高い核果類の核が好ましい。なお、核果類の種子を使用する場合には、核の粉砕の前に仁を除去しておくことが好ましい。
【００２０】
（ｂ）粉砕
木質系廃材は、できるだけ細かく粉砕するほうが好ましく、その粒径が0.2mm以下が好ましい。粉砕粒度が大きいとリグニンの可溶化に時間が掛かるからである。また、粉砕の効率を上げるため、木質系廃材は乾燥しているほうが好ましい。なお、粉砕は、公知の粉砕装置、例えば破砕機やカッターミル、ディスクミルなどを組み合わせて使用できる。
【００２１】
（２）亜臨界抽出工程
亜臨界抽出工程は、粉砕粉末を亜臨界状態の有機溶媒に接触させ、粉砕粉末中に含まれるリグニンを部分分解して、リグニンモノマーなどのリグニンの構成成分を可溶化する工程である。
【００２２】
（ａ）亜臨界状態
亜臨界状態とは、その物質の臨界点より温度・圧力の低い状態にあることをいう。このような亜臨界状態は、公知の超臨界流体装置により維持することができる。なお、臨界点とは、物質の気相-液相間の相転移が起こりうる温度及び圧力の範囲の限界を示す相図上の点であり、臨界点における温度を臨界温度、臨界点における圧力を臨界圧力という。
【００２３】
例えば、メタノールの臨界温度は512.6K、臨界圧力は8.09MPa、エタノールの臨界温度
は513.9K、臨界圧力は6.14MPa、1-プロパノール（n-プロパノール）の臨界温度は536.7K、臨界圧力は5.10MPa、2-プロパノール（イソプロパノール）の臨界温度は508.3K、臨界圧力は4.70MPaである。
【００２４】
（ｂ）有機溶媒
有機溶媒としては、ヒトや動物に有害なものでなければ特に問題なく使用できるが、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノールなどの低級アルコールが好ましく、中でもメタノールが好ましい。なお、有機溶媒はリグニンを過剰に分解しない程度、具体的には5〜15%程度の水を含んでいてもよい。また、有機溶媒の量は処理する木質系廃材の種類や量に応じて特に制限なく、自由に設定することができる。
【００２５】
２．医薬品など
この発明の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品及び飼料は、この発明の抗菌物質を含んでいるものである。なお、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品及び飼料における抗菌物質の含有量は、使用する抗菌物質の抗菌力やその用途等を勘案して自由に設定することができる。
【００２６】
（１）医薬品
医薬品とは、薬事法に規定されているものであって、医療用医薬品及び一般用医薬品（OTC）の何れをも含む。また、その対象となる疾患は従来からある抗菌物質を含む医薬品、例えば風邪薬、整腸剤などであれば、特に限定することなく使用できる。さらに、その形態については、例えば、丸薬剤、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル錠剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、懸濁液、エマルジョン剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤、坐剤、外用液剤、軟膏等の塗布剤等の非経口剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
なお、この発明の医薬品を経口剤として製造する場合には、公知の賦型剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤等とともに、公知の製造方法により製造すればよい。
【００２８】
また、この発明の医薬品を非経口剤として製造する場合には、注射用蒸留水、生理食塩水希釈剤、ブドウ糖水溶液等の希釈剤、公知の殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤とともに、公知の方法によって製造すればよい。
【００２９】
（２）医薬部外品
医薬部外品とは、薬事法に規定されているものであって、例えば、脱臭剤（デオドラント剤）、育毛剤、薬用化粧品類、栄養補給薬（サプリメント）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
（３）化粧品
化粧品とは、薬事法に規定されているものであって、例えば、口紅、ファンデーションなどのメークアップ化粧品、化粧水などの基礎化粧品、ヘアトニック、香水、歯磨き、シャンプー、リンス、身体を洗うための石鹸、入浴剤などのいわゆるトイレタリー製品が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
（４）食品
食品とは、ヒト用の一般食品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品などを意味している。食品として、具体的には、かまぼこ、ちくわ、はんぺん等の水産加工製品、ソーセージ、ハム、ウインナ−等の食肉加工製品、豆腐や油揚げ、コンニャク等の農産加工製品、洋菓子、和菓子、パン、ケ−キ、ゼリ−、プリン、スナック、クッキ−、ガム、キャンディ、ラムネ等の菓子類、生めん、中華めん、そば、うどん等のめん類、ソ−ス、醤油、ドレッシング、マヨネ−ズ、タレ、ハチミツ、粉末あめ、水あめ等の調味料、カレ−粉、からし粉、コショウ粉等の香辛料、ジャム、マーマレード、チョコレ−トスプレッド、漬物、そう菜、ふりかけや、各種野菜・果実の缶詰・瓶詰等の加工野菜・果実類、チ−ズ、バタ−、ヨ−グルト等の乳製品、果実ジュ−ス、野菜ジュ−ス、乳清飲料、清涼飲料、健康茶、薬用酒類等の飲料、その他、栄養補強（栄養補助）等を目的とする健康維持のための錠剤、飲料、顆粒等の健康志向の飲食品類などが例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
（５）飼料
飼料とは、ヒト以外の動物の餌のことである。ヒト以外の動物としては、例えば、イヌ、ネコなどの愛玩動物、カナリア、インコなど観賞用鳥類、キンギョ、熱帯魚などの観賞用魚類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜、ニワトリなどの家禽、ブリ、マダイ、ヒラメなどの養殖魚などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
以下、この発明について実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、この発明の特許請求の範囲は、以下の実施例によって、如何なる意味においても制限されない。
【実施例１】
【００３４】
１.抗菌物質の調製
2005年及び2006年度に採取した梅果実の種子から抗菌物質を、（１）粉砕工程及び（２）亜臨界抽出工程によって得た。以下にその詳細を示す。
【００３５】
（１）粉砕工程
梅果実を果肉と種子に分けたのち、種子の表面に付着している果肉を金属ブラシで磨き取った。種子をハンマーで叩き割って仁と核に分離した。核を-30℃で冷凍保存して、核をフリーズドライ（フリーズキャビン SF-021、大川原製作所）した。フリーズドライした核を、ミキサー（Wonder Blender WB-1、大阪ケミカル）で粉砕した。粉砕物を100メッシュの試験用ふるい（飯田製作所）にかけ、通過したものをサンプルとし、遮光ビンに入れて使用するまで室温で保存した。
【００３６】
（２）亜臨界抽出工程
まず、保存サンプルと適当量のヘキサンとを遠心管中で混和したのち、10分間常温で放置した。サンプルとヘキサンとを遠心分離により分け、サンプルを乾燥機に入れて溶媒を除去した。
【００３７】
ヘキサンで脱脂処理したサンプル2.5gと脱気した溶媒とを、超臨界装置の反応容器の8分目まで入れたのち、超臨界装置の温度制御装置で反応容器内の温度を190℃まで昇温した。脱気した溶媒を反応容器内に超臨界装置の送液ポンプによって送液し、10MPaまで加圧した時点から、3時間反応させた。反応終了から一晩静置し、反応容器を洗いながら内容物を取り出した。内容物をGA-100ガラスフィルターでろ過し、抽出液と残渣に分けた。抽出液は減圧して濃縮したのち、一晩凍結乾燥して重量を測定した。残渣は、温度が105℃に低下した時点で重量を測定した。
【００３８】
なお、溶媒は、水（精製水）、50％（v/v）メタノール水溶液、90％（v/v）メタノール水溶液、メタノール、2-プロパノールを使用した。また、使用したヘキサン、メタノール及び2-プロパノールは液体クロマトグラフィー用又は特級のものである。
【００３９】
また、超臨界装置は、超臨界装置反応容器（耐圧硝子工業）、超臨界装置温度制御装置（耐圧硝子工業）、超臨界装置反応液等送液ポンプ（PU-2080 plus、日本分光）、全自動圧力制御装置（SCF-Bpg、日本分光）から構成されているものを使用した。
【００４０】
表１及び図１に溶媒ごとの結果を示す。表１及び図１から、水-メタノール溶媒系では水の割合が高くなるほど、「分解など」の割合が増加することが分かった。なお、表１中の「分解など」は、「分解など＝試料量−(抽出量+残渣重量)」から計算した。
【００４１】
【表１】
2013209322.tif 000002
【実施例２】
【００４２】
２.抗菌物質の分析
実施例１で得られた抽出物の構成成分について調べた。具体的には、各抽出物をHPLC分析したのち、分取した各ピークに含まれる構成成分をLC-MS分析、1H-NMR分光法により同定した。具体的には、以下のようにして調べた。
【００４３】
（１）HPLCによる分析（その１）
水、50%メタノール、90%メタノール、亜臨界メタノール抽出物を250mLのメタノールで再溶解し、亜臨界2-プロパノール抽出物を100mLのメタノールで再溶解した。再溶解した抽出物をHPLCに掛け、溶出してきた各分画をフラクションコレクターにより回収した。
【００４４】
なお、HPLCによる分析は、HPLC装置:Prominence(島津製作所)、カラム:Thermo Hypersil GOLD 4.6mmI.D.×150mm (5μm)、流速:1ml/min、カラム温度:40℃、検出波長:280nm、移動相A:0.1%TFA水溶液、移動相B:メタノールにより行った。
【００４５】
その結果を図２に示す。ここで、図２（ａ）は水、図２（ｂ）は50%メタノール水溶液、図２（ｃ）は90%メタノール水溶液、図２（ｄ）はメタノール、図２（ｅ）は2-プロパノールを溶媒として使用した亜臨界抽出物の分析結果をそれぞれ示している。
【００４６】
図２（ａ）に示すように、亜臨界水抽出物では、溶出の初期、すなわち親水性の物質の溶出域である保持時間に数本のピークが存在した。そこで、これらをピークI〜IIIと命名した。また、図２（ｂ）〜（ｄ）から、溶媒中のメタノールの割合が高くなるにつれて、ピークI及びIIが減少し、ピークIII及びピークIVが増加するとともに、疎水性物質の溶出域である保持時間30分付近にピークV及びVIが出現・増加していることが分かった。さらに、図２（ｅ）から、亜臨界2-プロパノール抽出物はメタノールでは見られたピークV及びVIが検出されないことが分かった。
【００４７】
（２）HPLCによる分析（その２）
親水性物質であるピークI及びIIは、セルロース類の分解によって生じるヒドロキシメチルフルフラール、フルフラールである可能性が高いと考えた。そこで、亜臨界水抽出物、ヒドロキシメチル標品、フルフラール標品を同様にしてHPLC分析して比較した。その結果を図３に示す。なお、図３（ａ）は亜臨界水抽出物の結果、図３（ｂ）はヒドロキシメチルフルフラール標品の結果、図３（ｃ）はフルフラール標品の結果を示している。
【００４８】
図３から、亜臨界水抽出物のピークIはヒドロキシメチルフルフラール、ピークIIはフルフラールの保持時間とそれぞれ一致することが分かった。すなわち、ピークIはヒドロキシメチルフルフラールであり、ピークIIはフルフラールあることが分かった。
【００４９】
（３）LC-MSによる分析
亜臨界水抽出物のピークI及びIIについて、より確実に同定するため、LC-MSによって分析した。なお、LC-MSによる分析は、LC-MS装置:LTQ Orbitrap XL(Thrmo)、カラム:YMC Hydrosherer C18 4.6mmI.D.×250mm(5μm)、流速:1.0ml/min、カラム温度:30℃、検出波長:280nm、移動相：アセトニトリル/0.5%ギ酸水溶液混液(1:1)、イオン化：ESI、MS検出:Positiveモードにより行った。
【００５０】
その結果、図４に示すように、ピークIでm/z127.04[M+H]+のピークが検出され、ヒドロキシメチルフルフラール標品のMSスペクトルと一致することが分かった。一方、ピーク
IIはうまくイオン化できず、分子量イオンが得られなかったため、フルフラール標品との比較ができなかった。
【００５１】
（４）NMR分光法による分析
亜臨界メタノール抽出物を構成するピークIII〜VIを、1H-NMR分光法及びLC-MSにより分析した。なお、NMR分光法による分析は、NMR分析装置:（AVANCE400、Bruker Bioapin)、内部標準:TMS、溶媒:重アセトンにより行った。また、LC-MSによる分析は（３）と同様にして行った。
【００５２】
その結果を図５から図８に示す。なお、図５はピークIII、図６はピークIV、図７はピークV、図８はピークVIの分析結果を示している。また、各図の（ａ）は1H-NMR分光法による分析結果を示しており、（ｂ）はLC-MSによる分析結果を示している。これらの分析結果を以下に示す。
【００５３】
ピークIII:1H-NMR (400MHz, acetone-d6, TMS)δ: 9.82 (1H, s), 7.24 (2H, s) , 3.92 (6H, s), ESI-FTMS, m/z183.0653 [M+H]+
【００５４】
ピークIV：1H-NMR (400MHz, acetone-d6, TMS)δ:6.73 (2H, s), 6.49 (2H, dt, J=16Hz) , 6.25 (1H, dt, J=4, 16Hz) , 4.20 (2H, td, J=4Hz) , 3.84 (6H, s) , ESI-FTMS, m/z211.0967 [M+H]+
【００５５】
ピークV：1H-NMR (400MHz, acetone-d6, TMS)δ:7.66 (1H, brs), 7.09 (1H, d) , 6.89 (1H, dd, J=4, 4Hz) , 6.78 (1H, d, J=8Hz) , 6.52 (1H, dt) , 6.16 (1H, dt) , 4.01 (2H, dd, J=4, 4Hz) , 3.87 (3H, s) , 3.29 (3H, s) , ESI-FTMS, m/z193.0860 [M-OCH3+H]+
【００５６】
ピークVI：1H-NMR (400MHz, acetone-d6, TMS)δ:7.30 (1H, brs), 6.76 (2H, s) , 6.51 (1H, dt, J=16Hz) , 6.18 (1H, dt, J=4, 16Hz) , 4.01 (2H,dd, J=4, 4Hz) , 3.84 (6H, s) , 3.30 (3H, s) , ESI-FTMS, m/z247.0944 [M +Na]+
【００５７】
以上の結果から、ピークIIIは化学式（１）に示すシリンガアルデヒド、ピークIVは化学式（２）に示すシナピルアルコール、ピークVは化学式（３）に示すコニフェニルアルコールγメチルエステル体、ピークVIは化学式（４）に示すシナピルアルコールγメチルエステル体であることが分かった。
【００５８】
【化１】
2013209322.tif 000003
【００５９】
【化２】
2013209322.tif 000004
【００６０】
【化３】
2013209322.tif 000005
【００６１】
【化４】
2013209322.tif 000006
【実施例３】
【００６２】
亜臨界メタノール抽出に掛かる時間が、抽出量や抽出される成分に与える影響を調べた。具体的には、以下のようにして調べた。
【００６３】
（１）抽出時間が抽出量などに与える影響
実施例１と同様にして、抽出時間が1、3、6時間である亜臨界メタノール抽出物を調製したのち、抽出量、残渣重量など構成を調べた。その結果を図９に示す。図９から、抽出量と「分解など」が時間とともに増加することが分かった。
【００６４】
（２）抽出時間が抽出物の構成成分に与える影響
実施例２と同様にして、抽出物の構成成分をHPLC分析により調べた。その結果を図１０に示す。なお、図１０（ａ）は抽出時間が1時間の抽出物、図１０（ｂ）は抽出時間が3時間の抽出物、図１０（ｃ）は抽出時間が6時間の抽出物の分析結果を示している。
【００６５】
図１０から、時間が経つにつれて、ピークIIIとIVが減少するのに対して、ピークVとVIが増加していることが分かった。そこで、ピーク（化合物）ごとに、ピーク面積の時間変化を調べた。その結果を図１１に示す。
【００６６】
図１１から、シリンガアルデヒド（ピークIIIの化合物）は抽出1時間でプラトーに達し、その後やや減少したことが分かった。
【００６７】
また、図１１から、シナピルアルコール（ピークIVの化合物）は、約3時間でプラトーに達し、その後わずかに減少することが分かった。一方、シナピルアルコールγメチルエステル体（ピークVIの化合物）は、抽出時間に伴い増加することが分かった。このことは、シナピルアルコールが亜臨界メタノールによって抽出されたのち、メチル化している可能性が考えられる。
【００６８】
さらに、図１１から、コニフェニルアルコールγメチルエステル体（ピークVの化合物）は、約3時間でプラトーに達し、それ以降の増加は見られないことが分かった。そのため、コニフェニルアルコールγメチルエステル体の由来として、抽出する前からエステル体として存在していた、又は、コニフェニルアルコールとして亜臨界メタノールにより抽出されたのち、直ぐにγメチルエステル体にメチル化した、の両方の可能性が考えられる。
【００６９】
（３）亜臨界メタノールの反応性
亜臨界メタノールによって核から抗菌物質を抽出する際には、前記（２）のように化合物が化学反応によって他の化合物に変わっている可能性がある。そこで、この可能性について確認するため、シナピルアルコール及びコフェニルアルコールの標品を亜臨界メタノール抽出したのち、これら標品のメタノール抽出物、標品、核の亜臨界メタノール抽出物をHPLC分析により比較した。なお、亜臨界メタノール抽出及びHPLC分析は実施例１及び２と同様にして行った。
【００７０】
その結果を図１２に示す。なお、図１２(ａ)はシナピルアルコール、図１２(ｂ)はシナピルアルコールの亜臨界メタノール抽出物、図１２（ｃ）はコニフェニルアルコール、図１２（ｄ）はコニフェニルアルコールの亜臨界メタノール抽出物、図１２（ｅ）は核の亜臨界メタノール抽出物のHPLC分析結果である。
【００７１】
図１２（ａ）と（ｂ）の比較から、シナピルアルコール（ピークIVの化合物）が、亜臨界メタノール抽出によって、シナピルアルコールγメチルエステル体（ピークVIの化合物）に変化することが確認できた。
【００７２】
また、図１２（ｃ）と（ｄ）の比較から、コフェニルアルコールが、亜臨界メタノール抽出によって、コニフェニルアルコールγメチルエステル体（ピークVの化合物）に変化することが確認できた。なお、この際γメチルエステル体のピークとは別に、シリンガアルデヒド（ピークIIIの化合物）と同じ保持時間のピークも出現した。
【００７３】
これについては、コニフェニルアルコールがメチル化反応を受けた際に、シリンガアルデヒドを生成し、抽出1時間以降ほぼ一定になったと考えれば、前記のシリンガアルデヒドが抽出開始から1時間でプラトーに達しその後やや減少したことを説明できるかもしれない。
【実施例４】
【００７４】
４.抽出物の抗菌効果
抽出物の抗菌活性を、有害な腸内細菌の増殖量に基づいて調べた。具体的には、以下のようにして調べた。
【００７５】
（１）抗菌物質、試供菌株及び液体培地
実施例１で調製した亜臨界メタノール抽出物をDMSOに溶解して抗菌物質とした（DMSOの最終濃度は2％）。また、腸内細菌は、Citrobacter freundii（NBRC  NO. 12681）、Enterobacter aerogenes（NBRC  NO. 13534）、Enterobacter cloacae（NBRC  NO. 13535）、Escherichia coli（NBRC  NO. 15034）、Klebsiella oxytoca（NBRC  NO. 102593）、Proteus hauseri（NBRC  NO. 3851）、Proteus mirabilis（NBRC  NO. 10567）、Salmonella enterica（NBRC  NO. 105726）の8株を使用した。さらに液体培地は、カゼイン膵消化ペプトン5g（オリエンタル酵母社製）、酵母エキス2.5g（オリエンタル酵母社製）、ブドウ糖1gを脱イオン水1Lに溶解して、オートクレーブした標準培地を使用した。
【００７６】
（２）抗菌活性試験
各菌の保存斜面培養から一白金耳を液体培地に植え付けて12時間静置培養したのち、再度液体培地に植え継いで4時間前培養した。前培養によって得られた菌体懸濁液をOD630値が0.1になるように液体培地で希釈し、96well-plateの各wellに100μlずつ分注した。希釈菌体懸濁液の入った96well-plateの各wellに、各wellの最終濃度が0.625mg/mL、1.25mg/mL、2.5mg/mL、5.0mg/mLとなるように、液体培地で溶解した抗菌物質を100μLずつ加えた。なお、同じ抗菌物質濃度ごとに5穴ずつ調製した。また、抗菌物質の入っていない実験対照も同様にして調製した。
【００７７】
この96well-plateを37℃に調温した培養器で静置培養し、1時間ごとに10時間目までマイクロプレートリーダーでOD630値を測定した。そして、10時間後におけるOD630値の平均値を、コントロールを100％とする比率で換算し、増殖率とした。抗菌物質の濃度と増殖率の関係を図１３に示す。図１３から、抗菌物質は0.625〜5.0mg/mLという広い濃度範囲で、この実験で使用した腸内細菌8株すべての増殖を抑制することが確認できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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