(57)【要約】【課題】蛍光波長が長波長か短波長かを問わず量子収率に優れる蛍光色素、この蛍光色素を含む蛍光試薬、この蛍光試薬を用いる生体患部の診断方法、標的細胞の特定方法及び標的物質の検出方法を提供する。【解決手段】キサントン骨格の片側のみにベンゼン環を１つ付加した構造のベンゾキサントン類、及び、キサントン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のジベンゾキサントン類は、キサンテン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のナフトフルオレセイン類及びナフトローダミン類のうち直線型の化合物よりも概して量子収率が高いので、前記ベンゾキサントン類及び前記ジベンゾキサントン類の少なくとも１つを含む蛍光色素を用いることにより、生体患部の画像診断では生体組織の状態観察が良好に行え、フローサイトメトリー等の機器測定では標的細胞や標的物質の分析精度の向上が図られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示される化合物又はそのラクトン環が開環した互変異性体と、下記一般式（ＩＩ）で示される化合物と、下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物と、下記一般式（ＩＶ）で示される化合物と、下記一般式（Ｖ）で示される化合物とからなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物を含む蛍光色素。
【化１】
2013245290.tif 000017
［式中、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のそれぞれに破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のうち少なくともいずれか１つにおいて破線で示した３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の各ベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ３、Ｚ４は、それぞれ独立して、水素原子、ＮＲ２Ｒ３、ＯＲ４、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）で置換されたもしくは無置換のアルキル基、アシル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）である。前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。］
【化２】
2013245290.tif 000018
［式中、キサントン様骨格の２つのベンゼン環のそれぞれに破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、キサントン様骨格の２つのベンゼン環のうち少なくともいずれか１つにおいて破線で示した３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサントン様骨格の各ベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）である。前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。］
【化３】
2013245290.tif 000019
［式中、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環に破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、いずれも縮環していないか又は３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；キサンテン様骨格の他方の共役６員環に破線で示された相互に異なる位置で縮環する２つの６員環は、いずれか１つが縮環していることを示しており；Ａは、酸素原子又はＮ＋Ｒ２Ｒ３であり；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｒ５は、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基又は一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアリール基である。前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。］
【化４】
2013245290.tif 000020
［式中、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環に破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、いずれも縮環していないか又は３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ａは、酸素原子又はＮ＋Ｒ２Ｒ３であり；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｒ５は、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基又は一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアリール基である。前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。］
【化５】
2013245290.tif 000021
［式中、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のそれぞれに破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のうち少なくともいずれか１つにおいて破線で示した３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の各ベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）であり；Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアリール基、ホルミル基、下記構造式（ａ）もしくは下記構造式（ｂ）又はＲ６とＲ７とを合せて下記構造式（ｃ）もしくは下記構造式（ｄ）である。前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。］
【化６】
2013245290.tif 000022
【化７】
2013245290.tif 000023
【化８】
2013245290.tif 000024
【化９】
2013245290.tif 000025
【請求項２】
特定の生体組織、標的細胞又は標的物質と反応することにより蛍光を発するようになる、請求項１に記載の蛍光色素。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の蛍光色素を含む蛍光試薬。
【請求項４】
請求項３に記載の蛍光試薬を用いる生体患部の画像診断方法。
【請求項５】
請求項３に記載の蛍光試薬をフローサイトメトリー等の機器測定に用いる標的細胞の特定又は標的物質の検出方法。
【請求項６】
励起波長が相互に近接しており、蛍光波長が相互に離間している複数種類の蛍光色素を組み合せて用いる、請求項４又は５に記載の画像診断、特定又は検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素、この蛍光色素を含む蛍光試薬、この蛍光試薬を用いる生体患部の診断方法、標的細胞の特定方法及び標的物質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、フルオレセインやローダミン等、光のエネルギーを吸収して励起状態となり、基底状態に戻るときに蛍光を発する蛍光色素を含む蛍光試薬は、例えば標識試薬として用いられ、これにより、生体患部の画像診断をはじめ、フローサイトメトリー等の機器測定における腫瘍細胞等の標的細胞の特定やダイオキシン等の標的物質の検出等を行うことができる。
【０００３】
特許文献１には、フルオレセインのキサンテン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加して共役系を延ばし、蛍光波長を長波長側へシフトさせた蛍光色素が開示されている。これによれば、蛍光色素の蛍光波長と生体の自家蛍光の蛍光波長との重なりを回避でき、蛍光色素を生体イメージングツールとして良好に使用できる。
【０００４】
本出願人は、キサンテン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のナフトフルオレセイン類及びナフトローダミン類のうち、ベンゼン環の縮合位置がキサンテンの［ｂ、ｉ］である直線型の化合物に関する発明について、すでに特許出願をしたところである（特願２０１１−９０１０９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３９５５６３８号公報（請求項７、第１２頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、蛍光試薬を標識試薬として用いる場合、蛍光波長が長波長か短波長かを問わず、蛍光色素の量子収率が高く、蛍光が明るいことが重要なファクタであり、これにより、生体患部の画像診断では標的とする生体組織の状態観察が良好に行え、フローサイトメトリー等の機器測定では標的細胞や標的物質の分析精度の向上が図られる。
【０００７】
また、１つの波長の光で複数の蛍光波長の蛍光色素が励起されるマルチカラーイメージングの技術に適用可能なことが好ましく、これにより、１波長で励起させるだけで複数の蛍光試薬がそれぞれ異なる色で発光するので、同時に多種類の標的を画像診断、特定又は検出することができる。
【０００８】
さらに、通常は蛍光を発しないが、特定の生体組織、標的細胞又は標的物質と反応することにより蛍光を発するようになる、いわゆる蛍光オフから蛍光オンへのスイッチ機能を具備することも好ましく、これにより、それまで蛍光を発しなかった領域が蛍光を発するのを観察することで、特定の生体組織、標的細胞又は標的物質が確かに存在していることを精度よく確認することができる。
【０００９】
そこで、本発明は、蛍光波長が長波長か短波長かを問わず、量子収率に優れる蛍光色素を提供することを主たる目的とし、マルチカラーイメージングの技術に適用可能な蛍光色素を提供すること及び蛍光オフから蛍光オンへのスイッチ機能を具備する蛍光色素を提供することを他の目的とする。また、本発明のさらに他の目的は、前記蛍光色素を含む蛍光試薬、この蛍光試薬を用いる生体患部の診断方法、標的細胞の特定方法及び標的物質の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記一般式（Ｉ）で示される化合物又はそのラクトン環が開環した互変異性体と、下記一般式（ＩＩ）で示される化合物と、下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物と、下記一般式（ＩＶ）で示される化合物と、下記一般式（Ｖ）で示される化合物とからなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物を含む蛍光色素である。
【００１１】
【化１】
2013245290.tif 000002
【００１２】
なお、式中、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のそれぞれに破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のうち少なくともいずれか１つにおいて破線で示した３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の各ベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ３、Ｚ４は、それぞれ独立して、水素原子、ＮＲ２Ｒ３、ＯＲ４、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）で置換されたもしくは無置換のアルキル基、アシル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）である。また、前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。
【００１３】
【化２】
2013245290.tif 000003
【００１４】
なお、式中、キサントン様骨格の２つのベンゼン環のそれぞれに破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、キサントン様骨格の２つのベンゼン環のうち少なくともいずれか１つにおいて破線で示した３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサントン様骨格の各ベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）である。また、前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。
【００１５】
【化３】
2013245290.tif 000004
【００１６】
なお、式中、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環に破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、いずれも縮環していないか又は３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；キサンテン様骨格の他方の共役６員環に破線で示された相互に異なる位置で縮環する２つの６員環は、いずれか１つが縮環していることを示しており；Ａは、酸素原子又はＮ＋Ｒ２Ｒ３であり；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｒ５は、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基又は一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアリール基である。また、前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。
【００１７】
【化４】
2013245290.tif 000005
【００１８】
なお、式中、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環に破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、いずれも縮環していないか又は３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ａは、酸素原子又はＮ＋Ｒ２Ｒ３であり；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の一方のベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、下記構造式（ａ）又は下記構造式（ｂ）であり；Ｒ５は、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基又は一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアリール基である。また、前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。
【００１９】
【化５】
2013245290.tif 000006
【００２０】
なお、式中、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のそれぞれに破線で示された相互に異なる位置で縮環する３つのベンゼン環は、キサンテン様骨格の２つのベンゼン環のうち少なくともいずれか１つにおいて破線で示した３つのベンゼン環のうちいずれか１つが縮環していることを示しており；Ｘは、酸素原子であり；Ｙ１、Ｙ２（Ｙ２は、キサンテン様骨格の各ベンゼン環において破線で示した３つのベンゼン環が全て縮環していない場合に置換基となる。）は、それぞれ独立して、ＯＨ、ＯＲ１又はＮＲ２Ｒ３であり；Ｚ１は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＮＲ２Ｒ３で置換されたもしくは無置換のアルキル基、炭素数が１〜５の一部もしくは全部がＯＲ４で置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｚ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ）であり；Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアリール基、ホルミル基、下記構造式（ａ）もしくは下記構造式（ｂ）又はＲ６とＲ７とを合せて下記構造式（ｃ）もしくは下記構造式（ｄ）である。また、前記において、Ｒ１は、それぞれ独立して、炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基、ホルミル基、アシル基、糖残基又は芳香族化合物であり；Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基であり；Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数が１〜５の一部もしくは全部が置換されたもしくは無置換のアルキル基である。
【００２１】
【化６】
2013245290.tif 000007
【００２２】
【化７】
2013245290.tif 000008
【００２３】
【化８】
2013245290.tif 000009
【００２４】
【化９】
2013245290.tif 000010
【００２５】
前記蛍光色素においては、特定の生体組織、標的細胞又は標的物質と反応することにより蛍光を発するスイッチ機能を具備することが好ましい。
【００２６】
また、本発明は、前記蛍光色素を含む蛍光試薬である。
【００２７】
また、本発明は、前記蛍光試薬を用いる生体患部の画像診断方法である。
【００２８】
また、本発明は、前記蛍光試薬をフローサイトメトリー等の機器測定に用いる標的細胞の特定又は標的物質の検出方法である。
【００２９】
前記画像診断、特定又は検出方法においては、励起波長が相互に近接しており、蛍光波長が相互に離間している複数種類の蛍光色素を組み合せて用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、蛍光波長が長波長か短波長かを問わず、量子収率に優れる蛍光色素、この蛍光色素を含む蛍光試薬、この蛍光試薬を用いる生体患部の診断方法、標的細胞の特定方法及び標的物質の検出方法が提供される。そのため、生体患部の画像診断では生体組織の状態観察が良好に行え、フローサイトメトリー等の機器測定では標的細胞や標的物質の分析精度の向上が図られる。
【００３１】
また、本発明によれば、マルチカラーイメージングの技術に適用可能な蛍光色素、この蛍光色素を含む蛍光試薬、この蛍光試薬を用いる生体患部の診断方法、標的細胞の特定方法及び標的物質の検出方法が提供される。そのため、１波長で励起させるだけで、同時に多種類の標的を画像診断、特定又は検出することができる。
【００３２】
また、本発明によれば、蛍光オフから蛍光オンへのスイッチ機能を具備する蛍光色素、この蛍光色素を含む蛍光試薬、この蛍光試薬を用いる生体患部の診断方法、標的細胞の特定方法及び標的物質の検出方法が提供される。そのため、それまで蛍光を発しなかった領域が蛍光を発するのを観察することで、特定の生体組織、標的細胞又は標的物質が確かに存在していることを精度よく確認することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明者等は、キサントン骨格の片側のみにベンゼン環を１つ付加した構造のベンゾキサントン類、及び、キサントン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のジベンゾキサントン類が、キサンテン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のナフトフルオレセイン類及びナフトローダミン類のうち直線型の化合物よりも概して量子収率が高いことを見出した。
【００３４】
また、本発明者等は、キサンテン骨格の片側のみにベンゼン環を１つ付加した構造のナフトフルオレセイン類及びナフトローダミン類、及び、キサンテン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のナフトフルオレセイン類及びナフトローダミン類のうち非直線型の化合物が、キサンテン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のナフトフルオレセイン類及びナフトローダミン類のうち直線型の化合物よりも量子収率が高いことを見出した。
【００３５】
本発明は、以上の知見に基き完成されたものであり、前記一般式（Ｉ）で示される化合物又はそのラクトン環が開環した互変異性体と、前記一般式（ＩＩ）で示される化合物と、前記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物と、前記一般式（ＩＶ）で示される化合物と、前記一般式（Ｖ）で示される化合物とからなる群より選ばれる少なくとも１つの化合物を含む蛍光色素、この蛍光色素を含む蛍光試薬、この蛍光試薬を用いる生体患部の画像診断方法、標的細胞の特定方法及び標的物質の検出方法をその趣旨とするものである。
【００３６】
一般式（Ｉ）で示される化合物はキサンテン様骨格を有し、そのうち、Ｙ１、Ｙ２がＯＨのものは、ナフトフルオレセイン類であり、Ｙ１、Ｙ２がＮＲ２Ｒ３のものは、ナフトローダミン類である。
【００３７】
Ｚ１〜Ｚ４が構造式（ａ）又は構造式（ｂ）のものは、一般式（Ｉ）で示される化合物のタンパク質への導入が促進される。
【００３８】
一般式（Ｉ）で示される化合物のラクトン環が開環した互変異性体のうち、ナフトフルオレセイン類の場合は、Ｙ１の「−ＯＨ」が「＝Ｏ」となり、共役系が延びることによって、一般式（Ｉ）で示される化合物よりも蛍光波長がさらに長波長側へシフトする。
【００３９】
一般式（Ｉ）で示される化合物のラクトン環が開環した互変異性体のうち、ナフトローダミン類の場合は、Ｙ１の「−ＮＲ２Ｒ３」が「＝Ｎ＋Ｒ２Ｒ３」となり、共役系が延びることによって、一般式（Ｉ）で示される化合物よりも蛍光波長がさらに長波長側へシフトする。
【００４０】
一般式（ＩＩ）で示される化合物は、一般式（Ｉ）で示される化合物のラクトン環部分を「＝Ｏ」に置換したものである。
【００４１】
一般式（ＩＩ）で示される化合物はキサントン様骨格を有し、そのうち、Ｙ１、Ｙ２がＯＨのものは、フルオレセイン型のナフトキサントン類であり、Ｙ１、Ｙ２がＮＲ２Ｒ３のものは、ローダミン型のナフトキサントン類である。
【００４２】
一般式（ＩＩ）で示される化合物のうち、キサントン様骨格の片側のみにベンゼン環を１つ付加した構造のものはベンゾキサントン類であり、キサントン様骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のものはジベンゾキサントン類である。
【００４３】
Ｚ１〜Ｚ２が構造式（ａ）又は構造式（ｂ）のものは、一般式（ＩＩ）で示される化合物のタンパク質への導入が促進される。
【００４４】
一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で示される化合物は、一般式（ＩＩ）で示される化合物の「＝Ｏ」を「−Ｒ５」に置換し、共役系が一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）で示される化合物よりも延びたものである。そのため、一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）で示される化合物よりも蛍光波長がさらに長波長側へシフトする。
【００４５】
一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で示される化合物のうち、Ａが酸素原子のものは、フルオレセイン型のナフトキサントン類誘導体であり、ＡがＮ＋Ｒ２Ｒ３のものは、ローダミン型のナフトキサントン類誘導体である。
【００４６】
Ｚ１〜Ｚ２が構造式（ａ）又は構造式（ｂ）のものは、一般式（ＩＩＩ）又は一般式（ＩＶ）で示される化合物のタンパク質への導入が促進される。
【００４７】
一般式（Ｖ）で示される化合物は、一般式（ＩＩ）で示される化合物の「＝Ｏ」を「−Ｒ６、−Ｒ７」に置換したものである。
【００４８】
一般式（Ｖ）で示される化合物のうち、Ｙ１、Ｙ２がＯＨのものは、フルオレセイン型のナフトキサントン類誘導体であり、Ｙ１、Ｙ２がＮＲ２Ｒ３のものは、ローダミン型のナフトキサントン類誘導体である。
【００４９】
Ｒ６、Ｒ７が構造式（ａ）又は構造式（ｂ）のものは、一般式（Ｖ）で示される化合物のタンパク質への導入が促進される。
【００５０】
Ｒ６、Ｒ７が例えばフェニル基とホルミル基との組合せである場合、構造式（ｃ）である場合、又は構造式（ｄ）である場合等は、特定の生体組織、標的細胞又は標的物質と反応することにより、容易にＲ６及びＲ７の一方が脱離反応を起こし、Ｙ１の「−ＯＨ」が「＝Ｏ」となり、又はＹ１の「−ＮＲ２Ｒ３」が「＝Ｎ＋Ｒ２Ｒ３」となって、共役系が一般式（Ｖ）で示される化合物よりも延びた誘導体が得られる。この誘導体は、一般式（Ｖ）で示される化合物よりも蛍光波長がさらに長波長側へシフトする。あるいは、一般式（Ｖ）で示される化合物が通常は蛍光を発しない場合に、この誘導体は蛍光を発するようになる。すなわち、Ｒ６、Ｒ７は、蛍光をオフからオンにするスイッチとして機能する。
【００５１】
本実施形態に係る蛍光色素は、蛍光波長が長波長か短波長かを問わず、量子収率に優れている。そのため、本実施形態に係る蛍光色素を用いることにより、生体患部の画像診断では生体組織の状態観察が良好に行え、フローサイトメトリー等の機器測定では標的細胞や標的物質の分析精度の向上が図られる。
【００５２】
例えば、本実施形態に係る蛍光色素を含む薬剤（蛍光試薬）を被検者に投与し、特定の波長帯域を有する励起光を生体内に照射し、その際に生体内で前記蛍光色素を含む薬剤が発する蛍光の像を撮り、この蛍光画像を観察することによって、生体内の正常部位及び病変部位を判別する状態観察（生体患部の画像診断）が実現する。
【００５３】
また、本実施形態に係る蛍光色素を含む標識試薬（蛍光試薬）をフローサイトメトリー等の機器測定に用いることにより、腫瘍細胞等の標的細胞の特定やダイオキシン等の標的物質の検出等を精度よく行うことができる。
【００５４】
本実施形態に係る蛍光色素のうち、励起波長が相互に近接しており、蛍光波長が相互に離間している複数種類の蛍光色素を組み合せて用いることにより、１つの波長の光で複数の蛍光波長の蛍光色素が励起されるマルチカラーイメージングの技術にも適用できる。１波長で励起させるだけで、複数の蛍光試薬がそれぞれ異なる色で発光するので、同時に多種類の標的を画像診断、特定又は検出することができる。また、励起の光源も小さくて済むという利点もある。
【００５５】
本実施形態に係る蛍光色素のうち、通常は蛍光を発しないが、特定の生体組織、標的細胞又は標的物質と反応することにより蛍光を発するようになる、いわゆる蛍光オフから蛍光オンへのスイッチ機能を具備する蛍光色素を用いることにより、それまで蛍光を発しなかった領域が蛍光を発するのを観察することで、特定の生体組織、標的細胞又は標的物質が確かに存在していることを精度よく確認することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を通して、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。
【００５７】
＜ベンゾキサントン類又はジベンゾキサントン類の合成＞
まず、合成スキーム（Scheme 1., Scheme 2-1., Scheme 2-2., Scheme 3.）を以下に示す。出発物質はScheme 1.に示した化合物１，３，５，７であり、目的物質はScheme 3.に示した化合物、すなわち（ジ）ベンゾキサントン類２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３である。なお、「ＭＯＭ」はメトキシメチル基（ＣＨ３ＯＣＨ２−）を表す。
【００５８】
【化１０】
2013245290.tif 000011
【００５９】
【化１１】
2013245290.tif 000012
【００６０】
【化１２】
2013245290.tif 000013
【００６１】
【化１３】
2013245290.tif 000014
【００６２】
［Scheme 1.：アルデヒド体２，４，６，８の合成］
（アルデヒド体２の合成）
窒素雰囲気下、化合物１（19.0 g, 68.6 mmol）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（600 mL）に溶解し、−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）（1.6 M ｎ−ヘキサン溶液, 50.8 mL, 82.3 mmol）を滴下した。−７８℃で４５分間攪拌した後、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（8.0 mL, 102.8 mmol）を滴下した。１８時間攪拌を続け、自然に昇温し、室温に戻した。反応液を0.1 M 塩酸水と酢酸エチルに注ぎいれ、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）にて精製し、アルデヒド体２（12.5 g）を８１％の収率で得た。
【００６３】
（アルデヒド体４の合成）
化合物１を化合物３に変え、アルデヒド体２の合成と同様にして、アルデヒド体４を合成した。収率は６４％であった。
【００６４】
（アルデヒド体６の合成）
化合物１を化合物５に変え、アルデヒド体２の合成と同様にして、アルデヒド体６を合成した。収率は９３％であった。
【００６５】
（アルデヒド体８の合成）
化合物１を化合物７に変え、アルデヒド体２の合成と同様にして、アルデヒド体８を合成した。収率は８１％であった。
【００６６】
［Scheme 2.：ヒドロキシ体９，１１，１３，１５，１７，１９，２２，２４を経由したケトン体１０，１２，１４，１６，１８，２０，２３，２５の合成］
（ヒドロキシ体９の合成）
窒素雰囲気下、化合物３（1.85 g, 5.65 mmol）を無水ＴＨＦ（50 mL）に溶解し、−７８℃に冷却し、ｎ−ＢｕＬｉ（1.6 M ｎ−ヘキサン溶液, 3.9 mL, 6.17 mmol）を滴下した。−７８℃で１時間攪拌した後、アルデヒド体２（1.16 g, 5.14 mmol）の無水ＴＨＦ溶液（8 mL）を滴下した。５時間攪拌を続け、自然に昇温し、室温に戻した。反応液を0.1 M 塩酸水と酢酸エチルに注ぎいれ、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）にて精製し、ヒドロキシ体９（2.30 g）を９７％の収率で得た。
【００６７】
（ヒドロキシ体１１の合成）
化合物３を化合物５に変え、ヒドロキシ体９の合成と同様にして、ヒドロキシ体１１を合成した。収率は８１％であった。
【００６８】
（ヒドロキシ体１３の合成）
化合物３を化合物７に変え、ヒドロキシ体９の合成と同様にして、ヒドロキシ体１３を合成した。収率は８６％であった。
【００６９】
（ヒドロキシ体１５の合成）
アルデヒド体２をアルデヒド体４に変え、ヒドロキシ体９の合成と同様にして、ヒドロキシ体１５を合成した。収率は８４％であった。
【００７０】
（ヒドロキシ体１７の合成）
アルデヒド体２をアルデヒド体６に変え、ヒドロキシ体９の合成と同様にして、ヒドロキシ体１７を合成した。収率は９５％であった。
【００７１】
（ヒドロキシ体１９の合成）
アルデヒド体２をアルデヒド体８に変え、ヒドロキシ体９の合成と同様にして、ヒドロキシ体１９を合成した。収率は９３％であった。
【００７２】
（ヒドロキシ体２２の合成）
化合物３を化合物７に変え、且つアルデヒド体２をアルデヒド体６に変えて、ヒドロキシ体９の合成と同様にして、ヒドロキシ体２２を合成した。収率は９６％であった。
【００７３】
（ヒドロキシ体２４の合成）
化合物３を化合物７に変え、且つアルデヒド体２をアルデヒド体８に変えて、ヒドロキシ体９の合成と同様にして、ヒドロキシ体２４を合成した。収率は８６％であった。
【００７４】
（ケトン体１０の合成）
ヒドロキシ体９（1.85 g, 3.90 mmol）を塩化メチレン（80 mL）に溶解し、二酸化マンガン（14.8 g, 17.0 mmol）を加え、室温で１３時間撹拌した。反応液をセライト濾過し、濾液を濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）にて精製し、ケトン体１０（1.34 g）を７３％の収率で得た。
【００７５】
（ケトン体１２の合成）
ヒドロキシ体９をヒドロキシ体１１に変え、ケトン体１０の合成と同様にして、ケトン体１２を合成した。収率は９４％であった。
【００７６】
（ケトン体１４の合成）
ヒドロキシ体９をヒドロキシ体１３に変え、ケトン体１０の合成と同様にして、ケトン体１４を合成した。収率は８７％であった。
【００７７】
（ケトン体１６の合成）
ヒドロキシ体９をヒドロキシ体１５に変え、ケトン体１０の合成と同様にして、ケトン体１６を合成した。収率は７８％であった。
【００７８】
（ケトン体１８の合成）
ヒドロキシ体９をヒドロキシ体１７に変え、ケトン体１０の合成と同様にして、ケトン体１８を合成した。収率は９６％であった。
【００７９】
（ケトン体２０の合成）
ヒドロキシ体９をヒドロキシ体１９に変え、ケトン体１０の合成と同様にして、ケトン体２０を合成した。収率は７２％であった。
【００８０】
（ケトン体２３の合成）
ヒドロキシ体９をヒドロキシ体２２に変え、ケトン体１０の合成と同様にして、ケトン体２３を合成した。収率は８８％であった。
【００８１】
（ケトン体２５の合成）
ヒドロキシ体９をヒドロキシ体２４に変え、ケトン体１０の合成と同様にして、ケトン体２５を合成した。収率は９０％であった。
【００８２】
［Scheme 2.：ケトン体２１の合成］
（ケトン体２１の合成）
窒素雰囲気下、化合物５（400 mg, 1.23 mmol）を無水ＴＨＦ（3 mL）に溶解し、−７８℃に冷却し、ｎ−ＢｕＬｉ（1.6 M ｎ−ヘキサン溶液, 0.799 mL, 1.28 mmol）を滴下した。−７８℃で１時間攪拌した後、反応液を炭酸ジメチル（47.9 mg, 0.53 mmol）の無水ＴＨＦ溶液（1.5 mL)に滴下した。４時間攪拌を続け、自然に昇温し、室温に戻した。反応液を水と酢酸エチルに注ぎいれ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）にて精製し、ケトン体２１（162.2 mg）を５８％の収率で得た。
【００８３】
［Scheme 3.：メトキシメチル基の脱保護による脱保護体２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２の合成及び環化反応による（ジ）ベンゾキサントン類２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３の合成］
（脱保護体２６の合成）
ケトン体１０（900.0 mg, 1.90 mmol）を１，４−ジオキサン（10 mL）に溶解し、室温下、4 M 塩酸−１，４−ジオキサン（14.3 mL, 57.1 mmol）を加え、１１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、脱保護体２６（558.0 mg）を９９％の収率で得た。
【００８４】
（脱保護体２８の合成）
ケトン体１０をケトン体１２に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体２８を合成した。収率は８６％であった。
【００８５】
（脱保護体３０の合成）
ケトン体１０をケトン体１４に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体３０を合成した。収率は９４％であった。
【００８６】
（脱保護体３２の合成）
ケトン体１０をケトン体１６に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体３２を合成した。収率は９６％であった。
【００８７】
（脱保護体３４の合成）
ケトン体１０をケトン体１８に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体３４を合成した。収率は９８％であった。
【００８８】
（脱保護体３６の合成）
ケトン体１０をケトン体２０に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体３６を合成した。収率は９６％であった。
【００８９】
（脱保護体３８の合成）
ケトン体１０をケトン体２１に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体３８を合成した。収率は９７％であった。
【００９０】
（脱保護体４０の合成）
ケトン体１０をケトン体２３に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体４０を合成した。収率は１００％であった。
【００９１】
（脱保護体４２の合成）
ケトン体１０をケトン体２５に変え、脱保護体２６の合成と同様にして、脱保護体４２を定量的に合成した。
【００９２】
（ベンゾキサントン類２７の合成）
耐圧容器に脱保護体２６（11.0 mg, 0.037 mmol）、炭酸カリウム（5.1 mg, 0.037 mmol）、蒸留水（6 mL）を加え、１５０℃に加温した。２．５時間後、室温に戻し、1 M 塩酸水（0.3 mL）を加え、酢酸エチル−メタノールにて抽出した。さらに水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、溶媒を減圧留去し、ベンゾキサントン類２７を定量的に得た。
【００９３】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３５８ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：４８０ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：６％であった。
【００９４】
ベンゾキサントン類２７： 1H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ 10.96 (s, 1H), 10.45 (s, 1H), 8.50 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.05 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.29 (dd, J = 8.9 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.94 (dd, J = 8.9 Hz, 2.4 Hz, 1H).
【００９５】
（ベンゾキサントン類３１の合成）
脱保護体２６を脱保護体３０に変え、ベンゾキサントン類２７の合成と同様にして、ベンゾキサントン類３１を合成した。収率は７８％であった。
【００９６】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３６０ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：４１３ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：１７％であった。
【００９７】
ベンゾキサントン類３１： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.94 (s, 1H), 10.44 (s, 1H), 8.52 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.95 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 174.6, 163.6, 159.1, 157.3, 153.5, 138.4, 127.8, 124.8, 122.8, 121.5, 119.4, 117.1, 114.9, 114.7, 114.6, 110.2, 102.7.
【００９８】
（ジベンゾキサントン類４３の合成）
脱保護体２６を脱保護体４２に変え、ベンゾキサントン類２７の合成と同様にして、ジベンゾキサントン類４３を定量的に合成した。
【００９９】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３６２ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：４２１ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：１４％であった。
【０１００】
ジベンゾキサントン類４３： IR (KBr) 3114, 1618, 1473, 1248, 858, 777, 733 cm-1; 1H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ 10.60 (s, 2H), 8.84 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.41 (dd, J = 8.6 Hz, 2.2 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 2.2 Hz, 2H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 175.0, 159.3, 153.0, 138.4, 124.9, 123.5, 121.3, 119.7, 117.3, 115.6, 110.3.
【０１０１】
（ベンゾキサントン類２９の合成）
耐圧容器に脱保護体２８（522.3 mg, 1.76 mmol）、炭酸カリウム（24.4 mg, 0.17 mmol）、蒸留水（10 mL）を加え、１５０℃に加温した。２７時間後、室温に戻し、1 M 塩酸水（1 mL）を加え、固体を濾過し、ベンゾキサントン類２９（246.6 mg）を５０％の収率で得た。
【０１０２】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３５５ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：４９３ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：６３％であった。
【０１０３】
ベンゾキサントン類２９： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.96 (s, 1H), 10.35 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.20 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 6.86 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 2.4 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 175.5, 164.4, 158.4, 158.2, 152.6, 138.6, 131.9, 128.5, 127.6, 124.6, 119.6, 118.5, 113.7, 113.6, 111.0, 107.4, 102.3.
【０１０４】
（ジベンゾキサントン類３３の合成）
脱保護体２８を脱保護体３２に変え、ベンゾキサントン類２９の合成と同様にして、ジベンゾキサントン類３３を合成した。収率は１００％であった。
【０１０５】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３８０ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：４８０ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：０．０１％であった。
【０１０６】
ジベンゾキサントン類３３： 1H-NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ 10.21 (s, 2H), 9.49 (s, 2H), 8.23 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.95 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.6 Hz, 2H); 13C-NMR (68 MHz, DMSO-d6) δ 179.3, 158.7, 155.8, 136.0, 132.1, 130.4, 124.4, 117.4, 114.2, 113.6, 109.3.
【０１０７】
（ジベンゾキサントン類３５の合成）
脱保護体２８を脱保護体３４に変え、ベンゾキサントン類２９の合成と同様にして、ジベンゾキサントン類３５を合成した。収率は８６％であった。
【０１０８】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３７４ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：５３２ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：２％であった。
【０１０９】
ジベンゾキサントン類３５： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.38 (s, 1H), 10.27 (s, 1H), 9.40 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.24 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 178.2, 159.4, 158.5, 158.3, 151.4, 138.3, 137.3, 132.9, 131.9, 130.7, 127.5, 125.0, 124.3, 119.9, 119.8, 117.4, 114.5, 111.9, 110.7, 109.5, 107.4.
【０１１０】
（ジベンゾキサントン類３７の合成）
脱保護体２８を脱保護体３６に変え、ベンゾキサントン類２９の合成と同様にして、ジベンゾキサントン類３７を合成した。収率は９２％であった。
【０１１１】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３７０ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：４７６ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：３％であった。
【０１１２】
ジベンゾキサントン類３７： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.47 (s, 1H), 10.24 (s, 1H), 9.48 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.58 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.27 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 177.2, 159.1, 157.4, 151.9, 138.2, 136.4, 132.6, 130.6, 124.7, 124.6, 123.3, 121.6, 119.4, 117.8, 116.8, 116.8, 114.5, 113.4, 110.3, 109.5 (one peak overlapped).
【０１１３】
（ジベンゾキサントン類３９の合成）
脱保護体２８を脱保護体３８に変え、ベンゾキサントン類２９の合成と同様にして、ジベンゾキサントン類３９を合成した。収率は３１％であった。
【０１１４】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３７４ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：５２９ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：１０％であった。
【０１１５】
ジベンゾキサントン類３９： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.42 (s, 2H), 8.77 (s, 2H), 8.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.80 (s, 2H), 7.22 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 7.13 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 2H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 176.8, 158.5, 152.5, 138.9, 131.8, 127.9, 124.1, 119.1, 117.8, 110.3, 107.2.
【０１１６】
（ジベンゾキサントン類４１の合成）
脱保護体２８を脱保護体４０に変え、ベンゾキサントン類２９の合成と同様にして、ジベンゾキサントン類４１を合成した。収率は９３％であった。
【０１１７】
励起波長及び蛍光波長は、λｅｘ：３６０ｎｍ（ＭｅＯＨ）、λｅｍ：４９４ｎｍ（ＭｅＯＨ）であった。量子収率は、φ：４５％であった。
【０１１８】
ジベンゾキサントン類４１： 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.52 (s, 1H), 10.42 (s, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.56 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H); 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 176.1, 159.4, 158.5, 154.0, 152.2, 138.9, 138.5, 132.0, 127.3, 125.0, 122.4, 121.7, 119.9, 119.4, 118.8, 117.1, 114.1, 111.5, 110.4, 107.5 (one peak overlapped).
【０１１９】
本実施例で合成した（ジ）ベンゾキサントン類２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３をまとめると表１のようになる。
【０１２０】
【表１】
2013245290.tif 000015
【０１２１】
＜直線型ナフトフルオレセインとの量子収率の比較＞
キサンテン骨格の両側にベンゼン環を１つずつ付加した構造のナフトフルオレセイン類のうち直線型の化合物（下記構造式（ｅ））の量子収率は、φ：０．１７％であった。
【０１２２】
【化１４】
2013245290.tif 000016
【０１２３】
したがって、本発明に係る化合物である前記（ジ）ベンゾキサントン類２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３は、ジベンゾキサントン類３３を除き、蛍光波長が長波長か短波長かを問わず、前記構造式（ｅ）の化合物よりも、量子収率に優れている。そのため、本発明に係る蛍光色素を用いることにより、生体患部の画像診断では生体組織の状態観察が良好に行え、フローサイトメトリー等の機器測定では標的細胞や標的物質の分析精度の向上が図られる。
【０１２４】
＜マルチカラーイメージング技術への適用＞
本発明に係る化合物である前記（ジ）ベンゾキサントン類２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３のうち、例えば、ベンゾキサントン類２７、ベンゾキサントン類２９、ベンゾキサントン類３１、ジベンゾキサントン類４１及びジベンゾキサントン類４３は、励起波長が相互に近接しており（λｅｘ：３５５〜３６２ｎｍ）、蛍光波長が相互に離間している（λｅｍ：４１３ｎｍ，４２１ｎｍ，４８０ｎｍ，４９３ｎｍ，４９４ｎｍ）。したがって、これらを組み合せて用いることにより、１つの波長の光（例えばλｅｘが３５８〜３５９ｎｍ近傍の光）で複数の蛍光波長（λｅｍが４１０〜４２０ｎｍ台の光と４８０〜４９０ｎｍ台の光との２種）の蛍光色素が励起されるマルチカラーイメージングの技術に適用できる。１波長で励起させるだけで、複数の蛍光試薬がそれぞれ異なる色で発光するので、同時に多種類の生体組織、標的細胞又は標的物質を画像診断、特定又は検出することができる。また、励起の光源も少なくて済み、小さくて済むという利点がある。