(57)【要約】【課題】分離、分析する対象に対して高い保持力を有する、十分な対象の吸着容量を有する、高い分離能を有する、機械強度を有する、低操作圧である、そしてアルカリ安定性である液体クロマトグラフィー用アニオン交換体を提供する提供する。【解決手段】非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが固定されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用アニオン交換体により、前記課題を解決する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが固定されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用アニオン交換体。
【請求項２】
非多孔性粒子が、単官能性ビニルモノマーと多官能性ビニルモノマーの共重合体からなり、その粒径が５μｍ以下である、請求項１記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体。
【請求項３】
ポリアリルアミンの分子量が３，０００以上、１５，０００以下であることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体。
【請求項４】
ポリアリルアミンの導入量が、非多孔性粒子の３０重量％以下であることを特徴とする請求項１乃至３に記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体を充填して成る液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが導入されていることを特徴とするアニオン交換体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アニオン交換クロマトグラフィー用アニオン交換体には、（１）試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、タンパク質等の対象物質（以下単に「対象」ということがある）に対して高い「保持力」を有すること、（２）微量成分の分離性能を保つために十分な対象の「吸着容量」を有すること、（３）分離・分析精度向上のために高い「分離能」を有すること、（４）分離・分析時間短縮のために速い操作流速で使用できること（速い操作流速に伴う高圧に耐えるための「機械強度」を有すること）、（５）操作流速の低下を招かないこと（「低操作圧」であること）、そして、対象をイオン解離させる目的で中性から弱アルカリ性の溶離条件を使用するため、（６）弱アルカリ性条件下にて安定であること（「アルカリ安定性」）が要求される。
【０００３】
従来、上記（３）の改善を目的として、粒子内拡散が無い非多孔性の粒子を使用すること（非特許文献１）や粒径１０μｍ程度のアニオン交換体を使用することが提案されており、粒径については近年、更に微粒子化が進み、粒径５μｍ以下の交換体が実用化されている。アニオン交換体の微粒子化に伴い、操作圧を高圧化しないと分離・分析時間は長時間化するが、操作圧を高圧化するにあたり、アニオン交換体には１００ＭＰａに耐えうる機械的強度も求められている。
【０００４】
合成ポリマーを骨格とする非多孔性の粒子（合成ポリマー粒子）を用いたアニオン交体は、上記（３）の改善要求にこたえることが可能（非特許文献１）であり、同時に上記（４）や（６）をも満足し得るものであるが、合成ポリマー粒子にアニオン交換基を導入するにあたり、一般的なリガンド（アミノ基）導入法（特許文献１、特許文献２、特許文献３）を適用すると、上記（１）又は（２）の点で十分なアニオン交換体を提供することは困難である。
【０００５】
すなわち合成ポリマーは、通常、後に粒子表面にイオン交換基を導入するための官能基を有したモノマーと、粒子の機械的強度を高めるための、多官能不飽和架橋性モノマーの共重合体を用いることが一般的である。粒子の機械的強度を高くするために多官能不飽和架橋性モノマーを多く使用すると粒子表面の官能基量が減ってしまい、結果的に粒子表面に十分な量のイオン交換基を導入することができなくなって粒子表面のイオン交換基密度が下がり、保持力が十分ではなく（上記（１）が達成できない）、さらに非多孔性であるがゆえの小表面積に起因して特にタンパク質や核酸等の生体高分子に対する吸着容量を大きくできず、上記（２）が損なわれ、結果的に対象の溶出ピークがブロード化してしまうという課題がある。
【０００６】
上記（１）や（２）の改善方法として、例えばイオン交換能を有するビニルポリマー鎖を粒子表面にグラフとして担持させる方法等が提案されている（特許文献４から７）。しかし、グラフト結合によってポリマー鎖を粒子表面に導入すると、操作圧が高くなり、上記（５）に反して操作流速の低下を招くという課題がある。また細孔内に水溶性ポリマーを固定化する方法も提案されている（特許文献８）が、非多孔性粒子には適用することができない。
【０００７】
上記（２）と（５）を改善する目的で、粒子表面にポリエチレンイミン等を固定したアニオン交換体（特許文献９）、粒子表面に緩く架橋したイオン交換膜を作製したアニオン交換体（特許文献１０、１１）、粒子表面とポリマー鎖等をポリオールのグリシジル付加物を介して結合したアニオン交換体（特許文献１２）も提案されている。しかし、ポリエチレンイミンを固定したものではｐＨによるアニオン交換基の解離度変化が小さい四級アミノ基を導入することが困難であるほか、いずれの提案も、上記（３）の改善を目的として微粒子化された粒子に適用すると、操作圧が高くなり、上記（５）に反して操作流速の低下を招くという課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許３９０５９５４
【特許文献２】米国特許３５７３２７７
【特許文献３】特表８−５０３１６１
【特許文献４】米国特許５４５３１８６
【特許文献５】米国特許３７２３３０６
【特許文献６】特公昭５７−２３６９４
【特許文献７】特公昭５７−５８３７３
【特許文献８】特開２００８−２３２７６４
【特許文献９】特開２００２−２１０３７７
【特許文献１０】特開２００２−２１９３６７
【特許文献１１】特開２００９−１１３０３４
【特許文献１２】特開平５−６４７４８
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ，    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  Ｖｏｌｕｍｎ３９８，  １９８７，  Ｐａｇｅ  ３２７−３３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、上記（１）から（６）の要請に応え、対象に対して高い保持力を有する、十分な対象の吸着容量を有する、高い分離能を有する、機械強度を有する、低操作圧である、そしてアルカリ安定性である液体クロマトグラフィー用アニオン交換体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するためになされた本発明の液体クロマトグラフィー用アニオン交換体は、非多孔性粒子の表面に、四級アミノ基が導入されたポリアリルアミンが導入されていることを特徴とするものである。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明のアニオン交換体は、上記（３）の分離能の向上のため、非多孔性粒子を基材とするものである。本発明における「非多孔性」とは、微孔が存在しない粒子のみならず、アニオン交換体を用いて分離等しようとする対象が入り込めないサイズの孔がある粒子をも意味する。なお、粒子の孔のサイズを制御する方法は、例えばＵＳ４３８２１２４等、従来から公知である。
【００１３】
非多孔性粒子は、例えば無機基材（例えば、シリカ、ジルコニア、アルミナ等）や、有機基材（例えば、架橋多糖や、アクリルアミド、アクリルステル、スチレン等のビニルモノマー架橋体）であれば良い。粒子は、例えば特公昭５８−０５８０２６や特開昭５３−０９０９９１に開示されたような、単官能ビニルモノマー（グリシジルメタクリレート、ビニルベンジルグリシジルエーテル等）と、多官能ビニルモノマー（エチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、グリセンポリメタクリレート、ジビニルベンゼン等）を組み合わせた混合液の懸濁重合により製造する方法、例えば特開２００１−００２７１６に記載されたようなシード重合により製造する方法によって製造することができる。
【００１４】
非多孔性粒子としては、上記（６）のアルカリ安定性（中・弱アルカリ性のｐＨ領域で安定であること）の達成、および、上記（４）の機械的強度の確保という観点から、非多孔性粒子は有機基材であることが好ましく、特にアクリルアミド、アクリルエステル及びスチレン等のビニルモノマー架橋体が好ましい。特に、単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーの共重合体を好適な基材として例示できるが、当該共重合体において単官能性ビニルモノマー由来の構造単位が下記式（１）で示されるものが特に好ましい（式中、Ｒ１は水素原子又はＣＨ３を表す。Ｒ２は、ポリオキシアルキレン結合を介して、又は直接導入されたポリアリルアミンへの結合を表す）。
【００１５】
【化１】
2013216821.tif 000002
単官能ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーの共重合体を基材とする場合、多官能ビニルモノマーの割合は５重量％以上とすることが好ましい。また、後述するように、ポリアリルアミンを非多孔性粒子に固定するために非多孔性粒子は官能基を有していることが必要であるが、かかる官能基を十分に確保するために、多官能性ビニルモノマーの割合は５０重量％以下とすることが好ましい。例えば前記したビニルモノマー架橋体である場合には、エポキシ部位を加水分解して開環し、水溶性の多価アルコール等で親水化を行うことにより、表面に水酸基を有する粒子を得ることが可能であり、グリシジルメタクリレート等のエポキシ基を有する単官能性ビニルモノマーと多官能ビニルモノマーとの共重合体であればエポキシ基を直接利用する使用することが可能であり、また水酸基を有する非多孔性粒子であれば、例えばエピクロルヒドリン、エチレングリコールジグリシジルエーテル等の多官能エポキシ化合物などを既知の方法でエポキシ基を導入することが可能である。
【００１６】
本発明のアニオン交換体では、上記（３）の分解能を更に向上するために、粒子径が５μｍ以下の非多孔性粒子を使用することが好ましい。
【００１７】
本発明のアニオン交換体は、アニオン交換基として四級アミノ基を導入したポリアリルアミンを固定化したものであるが、ポリアリルアミンは、好ましくはその構造単位が、下記式（２）で示されるものを例示できる（［式中、ｎはポリアリルアミン主鎖の繰り返し数を表す）。
【００１８】
【化２】
2013216821.tif 000003
本発明に使用するポリアリルアミンは、上記（２）の吸着容量確保の観点や、非多孔性粒子に固定するためのアミノ基と四級アミノ基を導入するためのアミノ基の両者を十分量提供するためには高分子量のものが好ましい一方で、上記（５）の低操作圧を達成する観点からは低分子量のものが好ましい。従って、両者を比較考量して決定すれば良いが、分子量３，０００から１５，０００のものが特に好ましい。このような分子量を有するポリアリルアミンは、従来から市販されているものを使用することができる。なお、従来から市販されているポリアリルアミンはポリアリルアミンアミド硫酸塩重合体など、多種多様であるが、後述する四級アミノ基の導入のため、アリルアミン塩酸塩重合体又はアリルアミンホモ重合体を用いることが好ましい。
【００１９】
非多孔性粒子に対するポリアリルアミンの導入量としては、上記（５）の低操作圧を達成する観点から上記したように分子量３，０００から１５，０００の範囲のものを使用する場合には非多孔性粒子の３０重量％以下とすることが好ましく、さらに好ましくは０．４から１０重量％である。
【００２０】
本発明のアニオン交換体は、まずポリアリルアミンのアミノ基の一部に四級アミノ基を導入し、次に非多孔性粒子に固定する方法や、まずポリアリルアミンを非多孔性粒子に固定し、次に固定されたポリアリルアミン中に残存する未反応のアミノ基に四級アミノ基を導入する方法のいずれを用いても製造することができる。しかし、上記（５）の低操作圧の達成のためには、非多孔性粒子とポリアリルアミンをまず結合させ、残存するポリアリルアミンのアミノ基に四級アミノ基を導入することが好ましい。
【００２１】
ポリアリルアミンに四級アミノ基を導入する方法としては、アルキル化剤（ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ブロモメタン、ブロモエタン、ブロモエタノール、クロロエタン、クロロエタノール等のハロゲン化アルキルや硫酸ジメチル等）を用い、ポリアリルアミンの有するアミノ基を直接アルキル化することにより四級アミノ化する方法、四級アミノ基を有する反応性化合物（例えば、グリシジルトリメチルアンモニウム、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルアンモニウム等）をポリアリルアミンのアミノ基に導入する方法を例示できる。四級アミノ基を有する反応性化合物を用いる方法は、反応溶媒として水を用いることができることや、水酸化ナトリウム等をもちいて弱アルカリ性とすることで簡単に反応を進行させることが可能なこと、使用する薬剤の毒性が低いこと、使用する薬剤の沸点が高く取扱いが容易であること、疎水性の上昇を抑えられること、等から、本発明のアニオン交換体を製造する方法として特に好ましい。
【００２２】
非多孔性粒子にポリアリルアミンを固定した後に四級アミノ基を導入する場合も、前記と同様の方法を使用することができるが、この場合には、多孔性粒子に固定したポリアリルアミンに含まれるアミノ基に対し、過剰量の薬剤を使用すれば良い。
【００２３】
非多孔性粒子にポリアリルアミンを固定するためには、非多孔性粒子表面にポリアリルアミンが有するアミノ基と結合する官能基を導入し、両者を結合すれば良い。アミノ基と結合し得る官能基としては、カルボン酸基、ホルミル基、ハロゲン化アルキル基、エポキシ基等を例示できる。ビニルモノマー架橋体を基材とする非多孔性粒子であれば、前述したようにエポキシ部位を加水分解して開環し水溶性の多価アルコール等で親水化を行うことで水酸基を導入することが可能であり、他の官能基についても公知の方法によって導入することが可能である。カルボン酸基であれば加熱又は水溶性カルボジイミド等の縮合剤を用いアミド結合を生成させることにより、ホルミル基であればシアノ水素化ホウ素ナトリウムやピリジンボラン等の還元剤で処理することでアルキルアミノ基として、ハロゲン化アルキル基やエポキシ基であれば弱塩基性条件化でアルキルアミノ基又はヒドロキシアルキルアミノ基として、ポリアリルアミンを非多孔性粒子に固定できる。非多孔性粒子に対して導入しやすいことや、特別の触媒を必要とせず、温和な条件下水溶媒で固定可能なエポキシ基を利用してポリアリルアミンを非多孔性粒子に導入することが特に好ましい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のアニオン交換体は、非多孔性粒子を基材とするから、分離・分析精度向上のため高い分離能を達成することができる。特に５μｍ以下という微粒子を基材とする場合には更に高い分離能を実現でき、ビニルモノマー架橋体を基材とする場合には１００ＭＰａに耐えうる機械強度とともに、弱アルカリ条件下での安定性も実現できる。
【００２５】
本発明のアニオン交換体は、基材に直接リガンドを導入したものではなく、ポリアリルアミンを介してリガンドを導入したものであるため、前記したビニルモノマー架橋体を基材とした場合にも、対象に対する高い保持力と十分な吸着容量を達成すると同時に、低操作圧をも達成できる。
【００２６】
このように本発明のアニオン交換体は、（１）試料中に含まれる塩濃度の影響を受けにくくするために、対象に対して高い保持力を有し、（２）微量成分の分離性能を保つために十分な対象の吸着容量を有し、（３）分離・分析精度向上のために高い分離能を有し、（４）分離・分析時間短縮のために速い操作流速で使用でき（速い操作流速に伴う高圧に耐えるための機械強度を有し）、（５）操作流速の低下を招かず（低操作圧であり）、そして、（６）弱アルカリ性条件下にて安定で（アルカリ安定性）対象をイオン解離させる目的で中性から弱アルカリ性の溶離条件を使用することができる、という、従来からの要求に応えることのできるアニオン交換体である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１、比較例２及び比較例３のタンパク質分離性能検討におけるクロマトグラムを示した図である。
【図２】実施例１、比較例２及び比較例３のタンパク質分離性能検討における試料注入量と溶出ピークの分離性能の関係を示した図である。
【図３】実施例１から１６のタンパク質分離性能検討における、ポリアリルアミン被覆量と溶出ピークの分離性能の関係を示した図である。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により、本発明の充填剤の製造法を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（非多孔性基材の作成）
特開２００１−００２７１６記載のシード重合法により基材を作成した。
【００２９】
（シード粒子の作成）
ベンジルメタクリレート（和光純薬）２０ｇ及びメルカプト酢酸２−エチルヘキシル（和光純薬）０．９５ｇを５００ｍＬ三つ口フラスコに入れ混合し、イオン交換水２００ｇ投入した。マグネティック撹拌子を入れ、８５度に設定したオイルバスに取り付け、窒素導入管を設置し、１５０ｒｐｍで撹拌した。これとは別に５０ｍＬ容器に過硫酸カリウム０．６ｇ及びイオン交換水２０ｇを計り取り溶解した。３０分経過後、三つ口フラスコに設置したゴム栓から、過硫酸カリウム水溶液を注射器で投入した。回転数を３００ｒｐｍとしてソープフリー乳化重合を実施した。２時間重合を継続後、凝集分を取り除いてシード溶液を回収した。シード溶液の固形分含有率は、６．９８％であり、粒子径は電子顕微鏡による測定で０．３９μｍであった。
【００３０】
（非多孔性基材の作成）
メタクリル酸２，３−エポキシプロピル（和光純薬）６４ｇ、二メタクリル酸エチレン（広島和光）１６ｇ、Ｖ−６５（商品名（和光純薬））０．２ｇ及びドデシル硫酸ナトリウム０．２ｇを３００ｍＬフラスコに計量し、撹拌子を入れ、マグネティックスタラーで混合した。イオン交換水を１００ｍＬ加え、マグネティックスタラーで撹拌しながら、超音波ホモジナイザーで乳化した。シード溶液１０．９０ｇ（固形分量０．７６０ｇ）及び５０ｍＬの４％濃度のポリビニルアルコール（和光純薬）水溶液をモノマー乳化液に加え、１分間よく撹拌し、静置した。室温下で３０分放置後、６０度に設定した水浴に静置し、２時間重合を行った。得られた重合液をガラスフィルターでろ過し、温水、アセトン、温水の順で洗浄した。得られた非多孔性粒子を５００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、イオン交換水を３００ｍＬ加え、９０度に設定したオイルバスに設置し、撹拌しながら２４時間加熱することにより、エポキシ基の加水分解を行った。得られた非多孔性粒子は電子顕微鏡観察により粒子径１．８μｍの粒子径の揃った粒子であった。得られた非多孔性粒子１００ｇ（水サクションドライ）、エピクロロヒドリン（キシダ化学）１０３ｇ及びイオン交換水１００ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、４５度に設定した水浴に設置し撹拌した。これとは別に４８％水酸化ナトリウム水溶液を８８ｇ計量し、ディスポーザブル注射器に入れ、シリンジポンプに設置し、０．５ｍＬ／ｍｉｎの速度でセパブルフラスコに撹拌しながら投入した。投入後反応を２時間継続し、反応物をガラスフィルターでろ過し、水、アセトン順で洗浄し、通風乾燥し、エポキシ化非多孔性粒子を得た。
【実施例１】
【００３１】
エポキシ化非多孔性粒子４．０ｇ、ＰＡＡ−ＨＣＬ−０１（ポリアリルアミン  日東紡商品名、分子量１，６００）０．６０６ｇ（非多孔性粒子重量の５．０％）及びイオン交換水１０ｇを５０ｍＬ遠心管に入れよく撹拌した。４８％水酸化ナトリウム水溶液１８７μＬを加えさらによく撹拌後、５０度に設定した水浴中で１時間振盪した。得られた反応物を遠心し、上澄み除去し、これにイオン交換水１０ｍＬを加えよく分散し、さらに遠心分離した。この操作を３回繰り返し、上澄みを除去した。遠心管にイオン交換水４．３ｇ、グリシジルトリメチルアンモニウム水溶液（四日市合成（株）、７２％濃度）５．０ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液１５０μＬを入れよく撹拌した。５０度に設定した水浴中で２時間振盪した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｎ塩化水素水溶液、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。
得られたアニオン交換体を１０％のイオン交換水分散液として、４．６ｍｍ内径ｘ５０ｍｍ長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填した。
得られたカラムを下記に記載した条件で、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。
［塩濃度グラジエント液体クロマトグラフィー条件］
溶離液Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液  （ｐＨ８．５）
溶離液Ｂ：０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ  ｉｎ  ２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
グラジエント：０〜１００％Ｂ液直線グラジエント、１０分
流速  ：  ０．４ｍＬ／分
試料  ：  ２ｇ／Ｌ卵白由来アルブミン、２ｇ／Ｌ大豆由来トリプシンインヒビター混合液
注入量  ：  ３，５，７，１０，２０，３０，５０μＬ
［操作圧測定条件］
塩濃度グラジエントで使用した、溶離液Ａ及びＢを流速０．４ｍＬ／分で送液した時の操作圧
タンパク質分離性能と試料注入量の関係を図１に、クロマトグラムを図２に示す。また試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離性能であり保持力が強いことがわかった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２０．９ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１８．０ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例２】
【００３２】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１を０．０４０ｇ（非多孔性粒子重量の０．３３％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を７０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１８．７ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１７．１ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例３】
【００３３】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１を０．０８０ｇ（非多孔性粒子重量の０．６６％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を７６μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１８．１ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１５．６ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例４】
【００３４】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１を０．１６０ｇ（非多孔性粒子重量の１．３％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を９３μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１７．７ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１４．３ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例５】
【００３５】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１を０．３２０ｇ（非多孔性粒子重量の２．６％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１２７μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１７．０ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１３．８ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例６】
【００３６】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１を０．３６４ｇ（非多孔性粒子重量の３．０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１３６μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１８．５ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１６．２ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例７】
【００３７】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１を０．８４８ｇ（非多孔性粒子重量の７．０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を２３８μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１９．８ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１６．４ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例８】
【００３８】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０１を１．２１２ｇ（非多孔性粒子重量の１０．０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を３１４μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１８．４ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１４．８ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例９】
【００３９】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０３（ポリアリルアミン  日東紡商品名、分子量３，０００）量を０．０４０ｇ（非多孔性粒子重量の０．４０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を７０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１５．１ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１２．９ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１０】
【００４０】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０３量を０．０８０ｇ（非多孔性粒子重量の０．８０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を８０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１５．５ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１４．０ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１１】
【００４１】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０３量を０．１６ｇ（非多孔性粒子重量の１．６％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１００μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２０．０ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１７．６ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１２】
【００４２】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０３量を０．３２ｇ（非多孔性粒子重量の３．２％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１４１μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１９．５ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１７．２ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１３】
【００４３】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０５（ポリアリルアミン  日東紡商品名、分子量５，０００）量を０．０４０ｇ（非多孔性粒子重量の０．４０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を７０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２０．０ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１７．２ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１４】
【００４４】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０５を０．０８０ｇ（非多孔性粒子重量の０．８０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を８０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２０．０ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１８．２ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１５】
【００４５】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０５を０．１６０ｇ（非多孔性粒子重量の１．６％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１００μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１８．４ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１４．８ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１６】
【００４６】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−０５を０．３２ｇ（非多孔性粒子重量の３．２％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１４１μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２４．６ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時２２．４ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１７】
【００４７】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌ（ポリアリルアミン  日東紡商品名、分子量１５，０００）を０．０３２ｇ（非多孔性粒子重量の０．４０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を７０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２０．９ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１６．４ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１８】
【００４８】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌを０．０６４ｇ（非多孔性粒子重量の０．８０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を８０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２４．４ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１９．０ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例１９】
【００４９】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌを０．１２８ｇ（非多孔性粒子重量の１．６％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１００μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時３０．３ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時２２．８ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
【実施例２０】
【００５０】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−３Ｌを０．２５６ｇ（非多孔性粒子重量の３．２％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を１４１μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。試料を１０μＬ注入した時の分離能を図３に示す。実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。良好な分離能であることが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、３４．１ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時２４．０ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
（比較例１）
【００５１】
ポリアリルアミン導入時のＰＡＡ−ＨＣＬ−１０Ｌ（ポリアリルアミン  日東紡商品名、分子量１５０，０００）を０．０１６ｇ（非多孔性粒子重量の０．４０％）、及び４８％水酸化ナトリウム量を７０μＬ変更した以外は、実施例１と同様に実施し、四級アミノ基を有するポリアリルアミンが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、４．６ｍｍ内径ｘ５０ｍｍ長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填したが、操作圧が溶離液Ａ通液時に６０ＭＰａ以上の高圧となり分離性能を測定できなかった。
（比較例２）
【００５２】
エポキシ化非多孔性粒子３０ｇ、４８％水酸化ナトリウム水溶液５９ｇ及びイオン交換水２０ｇを３００ｍＬセパラブルフラスコに入れ、４０度に設定したオイルバスにセットし、撹拌した。エピクロロヒドリン  ７０ｇ、ジエチルアミノエタノール７０ｇを個別に計量し、ペリスターポンプを用いそれぞれ４時間かけて滴下した。滴下終了後、６時間反応を継続した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｎ塩化水素水溶液、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、ＤＥＡＥ化アニオン交換体を得た。
【００５３】
実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。タンパク質分離性能と試料注入量の関係を図１に、クロマトグラムを図２に示す。保持力が弱く、分離能の試料負荷量依存性も悪いことが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、１８ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１８ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
（比較例３）
【００５４】
エポキシ化非多孔性粒子４．０ｇ、イオン交換水４．３ｇ、グリシジルトリメチルアンモニウム水溶液（四日市合成（株）、７２％濃度）５．０ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液１５０μＬを入れよく撹拌した。５０度に設定した水浴中で２時間振盪した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｎ塩化水素水溶液、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、四級アミノ基が導入されたアニオン交換体を得た。
【００５５】
実施例１と同様に、タンパク質の分離性能及び操作圧を測定した。タンパク質分離性能と試料注入量の関係を図１に、クロマトグラムを図２に示す。保持力が弱く、分離能の試料負荷量依存性も悪いことが分かった。操作圧は溶離液Ａ通液時、２２．８ＭＰａ、溶離液Ｂ通液時１８．６ＭＰａであり、低操作圧であることがわかった。
（比較例４）
【００５６】
エポキシ化非多孔性粒子４ｇ、デキストラン３ｇ（和光純薬分子量６０，０００）、イオン交換水７ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液６０ｕＬを４０ｍＬ遠心管に入れ、５０度に設定した水浴中で１６時間振盪した。得られた反応物を遠心し、上澄み除去し、これにイオン交換水１０ｍＬを加えよく分散し、さらに遠心分離した。この操作を３回繰り返し、上澄みを除去した。遠心管にイオン交換水４．３ｇ、グリシジルトリメチルアンモニウム水溶液（四日市合成（株）、７２％濃度）５．０ｇ及び４８％水酸化ナトリウム水溶液１５０μＬを入れよく撹拌した。５０度に設定した水浴中で２時間振盪した。得られた反応液をガラスフィルターでろ過し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｎ塩化水素水溶液、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、イオン交換水の順で洗浄し、四級アミノ基を有するデキストランが導入されたアニオン交換体を得た。実施例１と同様に、４．６ｍｍ内径ｘ５０ｍｍ長さの液体クロマトグラフィー用カラムにスラリー充填したが、操作圧が溶離液Ａ通液時に６０ＭＰａ以上の高圧となり分離性能を測定できなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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