(57)【要約】【課題】アグリカンの分解を抑制する、アグリカン分解抑制剤を提供する。【解決手段】エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、アグリカン分解抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、アグリカン分解抑制剤。
【請求項２】
アグリカナーゼの活性を阻害することでアグリカンの分解を抑制する、請求項１記載のアグリカン分解抑制剤。
【請求項３】
前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、請求項２記載のアグリカン分解抑制剤。
【請求項４】
エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、アグリカナーゼ活性阻害剤。
【請求項５】
前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、請求項４記載のアグリカナーゼ活性阻害剤。
【請求項６】
エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
【請求項７】
前記関節軟骨細胞外基質がアグリカンである、請求項６記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
【請求項８】
アグリカナーゼの活性を阻害することで前記アグリカンの分解を抑制する、請求項７記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
【請求項９】
前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、請求項８記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
【請求項１０】
エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とし、関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患を予防又は改善するための予防又は改善剤。
【請求項１１】
関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患が変形性関節症である、請求項１０記載の予防又は改善剤。
【請求項１２】
前記関節軟骨細胞外基質がアグリカンである、請求項１０又は１１記載の予防又は改善剤。
【請求項１３】
アグリカナーゼの活性を阻害することで前記アグリカンの分解を抑制する、請求項１２記載の予防又は改善剤。
【請求項１４】
前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、請求項１３記載の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアグリカン分解抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢者の健康寿命を損ねる要因の１つである骨関節疾患の罹患人口が近年増加している。骨関節疾患の多くは、加齢とともに発症者数が増加する傾向にあり、近年の高齢化に伴って、今後さらに罹患人口の急速な増加が予想される。
骨関節疾患の１つである変形性関節症（Osteoarthritis）は、関節軟骨の破壊、変性、消失を特徴とする進行性の疾患である。例えば、変形性膝関節症は、軟骨や半月板が徐々に磨り減り、関節の変形、痛みの発生、関節の曲げ伸ばしが困難になる疾患である。変形性膝関節症の日本全国の患者総数は約８００万人と推測されており、同じ骨関節疾患の１つである慢性関節リウマチとくらべてはるかに患者数が多い。
現在のところ、変形性関節症の薬物治療法は疼痛緩和を目的とした対症療法であり、疾患の進行そのものを抑える治療法はほとんど確立されていない。また、従来の治療薬には副作用等の問題があるものが多く、より安全で効果の高い予防・改善薬が望まれている。
【０００３】
変形性関節症は、軟骨組織の破壊が原因とされる。軟骨組織は軟骨細胞とそれを取り囲む細胞外基質から構成されており、関節軟骨細胞外基質（以下、単に軟骨基質ともいう）の主成分はII型コラーゲンとアグリカン（プロテオグリカン）である。コラーゲンは軟骨の形態維持に寄与する一方、アグリカンは軟骨の粘弾性に寄与する。健常人の軟骨組織では、コラーゲン及びアグリカンの産生と、軟骨基質分解酵素による軟骨基質分解との代謝バランスが適正に保たれている。これに対し、変形性関節症患者では、発症初期において関節軟骨基質の分解・変性が観察されることから、軟骨基質の代謝バランスが分解に傾いていると考えられている。
【０００４】
軟骨基質を分解する酵素としては、ＡＤＡＭＴＳ（A  Disintegrin  And  Metalloproteinase  with  ThoromboSpondin  motifs）ファミリーに属するメタロプロテアーゼ群や、及びＭＭＰ（Matrix  Metalloproteinase）ファミリーに属するメタロプロテアーゼ群が知られている。これらのファミリーには、アグリカンを分解する酵素アグリカナーゼや、コラーゲンとアグリカンを分解する酵素ＭＭＰが含まれる。
変形性関節症の発症及び進行は、アグリカンとコラーゲンを中心とする軟骨基質の分解を担うタンパク質分解酵素が関与していると考えられている。近年の研究で、軟骨基質の破壊は、まずアグリカンの酵素的分解と消失が先行して起こり、次いでコラーゲンの酵素的分解が起こること、アグリカンの存在によりコラーゲンの分解から守られることが示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。さらに、変形性関節症患者から採取した関節液中にはアグリカン分解産物が多く観察されることが報告されており、アグリカナーゼが骨関節疾患における軟骨破壊において重要な役割を果たしていると考えられるようになった（例えば、非特許文献２及び３参照）。変形性関節症軟骨でのアグリカン分解は、アグリカナーゼ阻害剤によって抑制されるが、ＭＭＰ阻害剤では抑制されないことも報告されている（非特許文献４参照）。
【０００５】
一方、これまでに、エラグ酸を有効成分とする関節炎予防剤又は改善剤が提案されている（例えば、特許文献１参照）。特許文献１では、細胞外基質を構成するコラーゲン（ゼラチン）を分解する酵素の１種であって、ヒト皮膚線維芽細胞が産生するゼラチナーゼに対するエラグ酸の阻害活性ついて報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−４７８１７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Linda  Troeberg，et  al.，Biochimica  et  Biophysica  Acta  1824，2012，p．133-145
【非特許文献２】Glasson  SS，et  al.，Nature，2005，vol．434，p．644-648
【非特許文献３】Stanton  H，et  al.，Nature，2005，vol．434，p．648-652
【非特許文献４】Ann-Marie，et  al.，THE  JOURNAL  OF  BIOLOGICAL  CHEMISTRY，2002，vol．277，p．22201-22208
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、アグリカンの分解を抑制する、アグリカン分解抑制剤の提供を課題とする。また、本発明は、アグリカナーゼ活性を阻害する、アグリカナーゼ活性阻害剤の提供を課題とする。また、本発明は、関節軟骨細胞外基質の分解を抑制する、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤の提供を課題とする。さらに、本発明は、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患を予防又は改善する、予防又は改善剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記課題に鑑み、アグリカン分解を抑制する新規素材の探索を行った。その結果、エラグ酸がアグリカン分解酵素であるアグリカナーゼの活性を阻害し、軟骨基質のアグリカン分解を効果的に抑制することを見出した。本発明はこの知見に基づいて完成されたものである。
【００１０】
本発明は、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、アグリカン分解抑制剤に関する。
また、本発明は、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、アグリカナーゼ活性阻害剤に関する。
また、本発明は、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、関節軟骨基質分解抑制剤に関する。
さらに、本発明は、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とし、関節軟骨細胞外基質の分解によって引き起こされる症状又は疾患を予防又は改善するための予防剤又は改善剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のアグリカン分解抑制剤は、アグリカンの分解を抑制することができる。また、本発明のアグリカナーゼ活性阻害剤は、アグリカナーゼ活性を阻害することができる。また、本発明の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤は、関節軟骨細胞外基質の分解を抑制することができる。また、本発明の予防又は改善剤は、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患を予防又は改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エラグ酸を含む試験食を摂取した変形性関節症疾患モデルの膝関節部の顕微鏡写真を示す。
【図２】エラグ酸を含まない試験食を摂取した変形性関節症疾患モデルの膝関節部の顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のアグリカン分解抑制剤及びアグリカナーゼ活性阻害剤は、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする。後述の実施例で示されるように、エラグ酸はアグリカナーゼ活性を有意に低下させ、アグリカナーゼによるアグリカン分解を抑制する。また、エラジタンニンは、体内でエラグ酸に加水分解され、吸収、代謝される。（例えば、Espin  J．C.，et  al.，JOURNAL  OF  AGRICULTURAL  AND  FOOD  CHEMISTRY，2007，vol．55，p．10476-10485参照）。したがって、エラジタンニンも同様の効果を奏する。
アグリカンは、関節軟骨の細胞外基質に存在する主要なプロテオグリカンであって、コアタンパク質とそれを修飾するコンドロイチン硫酸及びケラタン硫酸などのグリコサミノグリカンとからなる。アグリカナーゼは、アグリカンのコアタンパク質中の特定の部位を切断してアグリカンを分解する酵素である。代表的なアグリカナーゼとしてＡＤＡＭＴＳ−４及びＡＤＡＭＴＳ−５が挙げられ、これらは変形性関節症患者の軟骨中でタンパク質及び遺伝子発現が確認されている（非特許文献４参照）。特に、ＡＤＡＭＴＳ−５はアグリカン破壊において中心的な役割を担っていると考えられており、ＡＤＡＭＴＳ−５遺伝子欠損マウスでは軟骨基質破壊が大幅に抑制されることが報告されている（非特許文献２及び３参照）。
本発明の抑制剤及び阻害剤は、特にアグリカナーゼＡＤＡＭＴＳ−５の活性を好適に阻害する。
なお、前述の通り、軟骨基質の破壊は、まずアグリカンの酵素的分解と消失が先行して起こり、次いでコラーゲンの酵素的分解が起こることが示唆されている。したがって、本発明では、アグリカナーゼによるアグリカンの分解と、コラゲナーゼなどによるコラーゲンの酵素的分解とは、メカニズムの観点から全く異なるものとする。
【００１４】
さらに本発明は、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤を提供する。前述のように軟骨基質にはアグリカンが含まれる。エラグ酸の作用によりアグリカナーゼが関与するアグリカン分解を抑制することで、関節軟骨細胞外基質の分解を抑制することができる。さらに、本発明の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤によれば、分解に傾いていた軟骨組織内のアグリカンの代謝バランスを通常の状態に戻したり、減少した軟骨基質中のアグリカンを増加させ高い粘弾性を有する軟骨基質を取り戻すことができる。
エラグ酸が、アグリカン分解抑制作用、アグリカナーゼ活性阻害作用、及び関節軟骨基質分解抑制作用を有することは、従来全く知られておらず、本発明者等により今回新たに得られた知見である。
本明細書において「関節軟骨細胞外基質分解」とは、関節軟骨細胞外基質を構成するアグリカンが、軟骨基質分解酵素であるＭＭＰやアグリカナーゼによって分解されることを意味し、特にはアグリカンがＡＤＡＭＴＳ−５などのアグリカナーゼによって分解されることを特徴的に指す。
【００１５】
また本発明は、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とし、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する種々の症状又は疾患を予防・改善するための予防剤又は改善剤を提供する。エラグ酸の作用により過剰なアグリカン分解を抑制し、分解に傾いた軟骨基質の代謝バランスを通常の状態に戻したり、減少したアグリカンを増加させることで、軟骨基質を通常の状態にすることができる。
関節軟骨細胞外基質の分解によって引き起こされる症状又は疾患としては、種々の骨関節疾患が挙げられる。骨関節疾患の一例として、変形性関節症、慢性関節リウマチ、骨関節症、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、歯周疾患、骨粗頌鬆症等を挙げることができる。特に、本発明の予防剤又は改善剤は、変形性関節症の予防又は改善に用いることが好ましい。なお、変形性関節症とは、関節軟骨の変性、磨耗および軟骨下骨の硬化、増殖性変化を特徴とする疾患をいう。
【００１６】
本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤、及び予防又は改善剤において、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする。本発明において、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを有効成分とすることが好ましく、エラグ酸を有効成分とすることがより好ましい。
本明細書において、「エラジタンニン」とは、加水分解性タンニンの１種で、酸加水分解の際エラグ酸を生ずるタンニンの総称である。本明細書に用いられるエラジタンニンは、代謝によりエラグ酸を生じるものである限り特に制限はない。
【００１７】
本発明に用いるエラグ酸及びエラジタンニンは広く一般に入手できる。例えば、通常の合成方法により化学的に合成してもよいし、天然物から抽出してもよいし、市販のものを用いてもよい。
【００１８】
本発明において、前記有効成分を溶媒に溶解又は分散させ、アグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤としてもよい。本発明で用いることができる溶媒としては特に制限はなく、水、エタノール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキサイド等が挙げられる。本発明で用いることができる溶媒としては、水、エタノール、プロピレングリコール、及びジメチルスルホキサイドからなる群より選ばれる１種又は２種以上が好ましく、水及びエタノールからなる群より選ばれる１種又は２種がより好ましく、エタノールがさらに好ましい。
【００１９】
また、本発明は別の態様として、アグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、又は関節軟骨細胞外基質分解抑制剤としての、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種の使用を提供する。また、本発明はさらに別の態様として、アグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、又は関節軟骨細胞外基質分解抑制剤の製造のための、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種の使用を提供する。また、本発明はさらに別の態様として、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を、アグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤、又は関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状若しくは疾患を予防若しくは改善するための予防若しくは改善剤として使用する方法を提供する。また、本発明はさらに別の態様として、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状若しくは疾患の治療方法、又は関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状若しくは疾患の非医薬的な処置方法のために用いる、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を提供する。また、本発明はさらに別の態様として、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状若しくは疾患の予防若しくは改善剤の製造のための、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種の使用を提供する。また、本発明はさらに別の態様として、エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を用いる、アグリカン分解抑制方法、アグリカナーゼ活性阻害方法、関節軟骨細胞外基質分解抑制方法、及び関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状若しくは疾患の予防若しくは改善方法を提供する。
【００２０】
本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤は、医薬組成物、医薬部外品組成物、食品、飲料、又は飼料・ペットフード等の用途に適用することができる。さらに本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤の剤形に特に制限はなく、液状製剤（水剤、懸濁剤、乳剤等）、固形製剤（散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤等）、ペースト状製剤、ゲル状、パウダー状（粉末状）製剤、ペレット状製剤、スティック状製剤等、ヒトや非ヒト動物に適用されうる各種剤型をとることができる。
【００２１】
本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤を医薬組成物、医薬部外品組成物に適用する場合、必要により各種添加剤を配合し、前記有効成分を適量含有させて、各種剤形の医薬組成物又は医薬部外品組成物として調製することができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、腸溶剤、トローチ剤、ドリンク剤等の経口医薬として、又は、注射剤、坐剤、経皮吸収剤、外用剤等といった非経口医薬として調製することができる。これらの形態のうち、好ましい形態は経口医薬である。このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、各種添加剤を用いて常法に従って製造すればよい。使用する添加剤には特に制限はなく、通常用いられているものを使用することができる。その例としては、薬学的に許容される賦形剤（ソルビトール、グルコース、乳糖、デキストリン、澱粉等の糖類、酸化チタン、炭酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、ゴマ油、とうもろこし油、オリーブ油、菜種油等）、液体担体（蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、油性担体（各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ類等）、吸収促進剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、崩壊剤、滑沢剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、矯臭剤、細菌抑制剤等が挙げられる。
【００２２】
本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤を飲食品、飼料・ペットフード等に適用する場合、食用、飲料又は飼料・ペットフード用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して提供することができる。さらに、前記飲食品は、一般飲食品の他、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患の予防若しくは改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品又は特定保健用食品等の機能性飲食品の形態とすることができる。
【００２３】
飲食品の形態としては特に制限はなく、例えば、パン、麺類等に代表される小麦粉加工食品、お粥、炊き込みご飯等の米加工食品、ビスケット、ケーキ、ゼリー、チョコレート、せんべい、アイスクリーム等の菓子類、豆腐、その加工食品等の大豆加工食品、清涼飲料、果汁飲料、乳飲料、炭酸飲料等の飲料類、ヨーグルト、チーズ、バター、牛乳等の乳製品、醤油、ソース、味噌、マヨネーズ、ドレッシング等の調味料、ハム、ベーコン、ソーセージ等の蓄肉、蓄肉加工食品、はんぺん、ちくわ、魚の缶詰等の水産加工食品、調理油ならびにフライ用油等が挙げられる。また、錠剤（タブレット）、カプセル等の錠剤食、濃厚流動食、自然流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク栄養食等の経口経腸栄養食品、機能性食品等の形態としてもよい。
飼料の形態としては特に制限はなく、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
これらの飲食品は、例えば、甘味剤、着色剤、抗酸化剤、ビタミン類、香料、ミネラル等の添加剤、タンパク質、脂質、糖質、炭水化物、食物繊維等の食品原料を適宜組み合わせて用い、これと本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤とを含有させ、常法に従って各種飲食品の形態（例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト、液状）とすることにより調製することができる。
【００２４】
本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤はそのままで医薬組成物、医薬部外品組成物、食品又は飲料等として用いてもよいし、医薬組成物、医薬部外品組成物、食品又は飲料等の添加剤又は配合剤として用いてもよい。
【００２５】
本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤における前記有効成分の配合量はその使用形態により異なり、適宜設定することができる。例えば、前記有効成分の含有量は、固形分換算で、０．０００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましく、１００質量％以下が好ましく、８０質量％がより好ましい。あるいは、前記有効成分の含有量は、固形分換算で０．０００１〜１００質量％が好ましく、０．０１〜８０質量％がより好ましく、０．１〜８０質量％がさらに好ましい。
【００２６】
本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤の投与又は摂取量は、個体の状態、体重、性別、年齢、素材の活性、投与又は摂取経路、投与又は摂取スケジュール、製剤形態又はその他の要因に従って適宜選択、決定される。例えば、成人（６０ｋｇ）１日の投与又は摂取量としては、一般に０．００１ｇ／ｋｇ体重以上が好ましく、１０ｇ／ｋｇ体重以下が好ましい。また、本発明のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨基質分解抑制剤、又は予防若しくは改善剤は、１日１回〜数回に分け、又は任意の期間及び間隔で摂取・投与され得る。
【００２７】
上記医薬組成物、医薬部外品組成物、食品又は飲料の摂取又は投与対象として特に限定されないが、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患の予防又は改善又は改善を目的とするヒトや哺乳動物などの非ヒト動物が好ましい。なお、摂取又は投与対象には、関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患が認められるヒトやヒト以外の哺乳動物、及びそのおそれがあるヒトや非ヒト動物、その症状又は疾患の予防を期待するヒトや非ヒト動物も含まれる。
【００２８】
次に、アグリカナーゼ活性阻害試験及びアグリカン分解抑制試験の試験方法について説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
軟骨基質でのアグリカン分解は、アグリカンのコアタンパク質中の２箇所の特定部位が切断されることによって起こる。ここで、ヒトのアグリカンのアミノ酸配列を例に切断部位について説明する（ヒトのアグリカンの切断部位については、Torotorella  MD，et  al.，MATRIX  BIOLOGY，2002，vol．21，p．499-511参照）。この２箇所の切断部位は、第３４１番目のアスパラギン残基と第３４２番目のフェニルアラニン残基との間（以下、Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２部位と称する）と、第３７３番目のグルタミン酸残基と第３７４番目のアラニン残基との間（以下、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位と称する）であり、前者のＡｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２部位はＭＭＰファミリーに属するメタロプロテアーゼ群の１つであるＭＭＰ−３等によって切断され、後者のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位はＡＤＡＭＴＳファミリーに属するメタロプロテアーゼ群の１つであるアグリカナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５等）によって切断され、アグリカンが分解される。変形性骨関節疾患等の患者の関節液中のアグリカン分解産物を調べると、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位で切断された断片が特に多く含まれることから、アグリカナーゼが軟骨基質破壊において重要な役割を果たしていると考えられる。本明細書では、ＡＤＡＭＴＳ−５によって切断される部位がＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位のみである点に着目し、アグリカン分解抑制試験を行った。
【００２９】
アグリカナーゼ活性阻害試験及びアグリカン分解抑制試験の試験方法の詳細を以下に示す。しかし、本発明はこれに限定されるものではない。
酵素としてアグリカナーゼの１種であるＡＤＡＭＴＳ−５を、基質としてＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４を含む球間ドメイン（ＩＧＤ）領域のアグリカンを使用する。なお、アグリカンのコアタンパク質は、Ｎ末端側に２個の球状ドメインＧ１及びＧ２を、Ｃ末端側に球状ドメインＧ３を持ち、Ｇ１とＧ２の間に球間ドメイン（ＩＧＤ）を、Ｇ２とＧ３の間にグリコサミノグリカン結合領域を有する。なお、前記Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位は、球間ドメイン上に存在する。
まず、上記酵素と基質に抽出物試料を加えて酵素分解反応を行う。ＡＤＡＭＴＳ−５の作用によって、アグリカン中のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位で切断が行われ、２種類のアグリカン分解産物が産出する。このうち、一方はＣ末端にＧｌｕ３７３を、他方はＮ末端にＡｌａ３７４を持っている。これらの分解産物は、酵素活性の強度に応じて定量的に産出される。
次いで、アグリカン分解産物に特異的に結合する抗体（Ｎ末端Ａｌａ３７４に特異的に結合する抗体、Ｃ末端Ｇｌｕ３７３に特異的に結合する抗体、又はこれら抗体の両方）を用いて、アグリカン分解産物（Ｎ末端にＡｌａ３７４を持つアグリカン分解産物、Ｃ末端にＧｌｕ３７３を持つアグリカン分解産物、又はこれら分解産物の両方）を検出・定量する。あるいは、アグリカン分解産物に特異的に結合する抗体を１次抗体として使用し、さらに１次抗体に結合する２次抗体を用いて検出、定量を行うこともできる。
得られた結果を、被験試料を加えない系で得られた結果と比較することで、当該被験試料の添加によるアグリカン分解抑制効果及びアグリカナーゼ活性阻害効果を確認することができる。
【００３０】
前記試験方法で使用するアグリカンも上述のＩＧＤ領域に限定されるものではなく、用いるアグリカン分解酵素によって特異的に分解され、得られた分解産物が定量可能なものであればよい。また、前記試験方法で使用する抗体としては、アグリカン分解酵素により切断されたアグリカン分解産物を特異的に検出・定量することができれば特に限定されない。
なお、本明細書において「アグリカナーゼの活性を阻害する」とは、アグリカナーゼがアグリカンを分解する作用を阻害することを意味する。例えば、アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である場合、アグリカンのコアタンパク質のＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位の切断が阻害されること意味する。
【００３１】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のアグリカン分解抑制剤、アグリカナーゼ活性阻害剤、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤、予防又は改善剤、製造方法、及び使用を開示する。
【００３２】
＜１＞エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、アグリカン分解抑制剤。
【００３３】
＜２＞アグリカナーゼの活性を阻害することでアグリカンの分解を抑制する、前記＜１＞項記載のアグリカン分解抑制剤。
＜３＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜２＞項記載のアグリカン分解抑制剤。
＜４＞前記有効成分がエラグ酸である、前記＜１＞〜＜３＞項のいずれか記載のアグリカン分解抑制剤。
＜５＞膝関節の軟骨組織のアグリカンの分解を抑制する、前記＜１＞〜＜４＞項のいずれか記載のアグリカン分解抑制剤。
＜６＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜１＞〜＜５＞項のいずれか記載のアグリカン分解抑制剤。
【００３４】
＜７＞エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、アグリカナーゼ活性阻害剤。
【００３５】
＜８＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜７＞項記載のアグリカナーゼ活性阻害剤。
＜９＞前記有効成分がエラグ酸である、前記＜７＞又は＜８＞項記載のアグリカナーゼ活性阻害剤。
＜１０＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜７＞〜＜９＞項のいずれか記載のアグリカナーゼ活性阻害剤。
【００３６】
＜１１＞エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
【００３７】
＜１２＞前記関節軟骨細胞外基質がアグリカンである、前記＜１１＞項記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
＜１３＞アグリカナーゼの活性を阻害することで前記アグリカンの分解を抑制する、前記＜１２＞項記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
＜１４＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜１３＞項記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
＜１５＞前記有効成分がエラグ酸である、前記＜１１＞〜＜１４＞項のいずれか記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
＜１６＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜１１＞〜＜１５＞項のいずれか記載の関節軟骨細胞外基質分解抑制剤。
【００３８】
＜１７＞エラグ酸及びエラジタンニンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とし、関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患を予防又は改善するための予防又は改善剤。
【００３９】
＜１８＞関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患が変形性関節症である、前記＜１７＞項記載の予防又は改善剤。
＜１９＞前記関節軟骨細胞外基質がアグリカンである、前記＜１７＞又は＜１８＞項記載の予防又は改善剤。
＜２０＞アグリカナーゼの活性を阻害することで前記アグリカンの分解を抑制する、前記＜１９＞項記載の予防又は改善剤。
＜２１＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜２０＞項記載の予防又は改善剤。
＜２２＞前記有効成分がエラグ酸である、前記＜１７＞〜＜２１＞項のいずれか記載の予防又は改善剤。
＜２３＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜１７＞〜＜２２＞項のいずれか記載の予防又は改善剤。
【００４０】
＜２４＞アグリカン分解抑制剤としての、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの使用。
【００４１】
＜２５＞アグリカン分解抑制剤の製造のための、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの使用。
【００４２】
＜２６＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを、アグリカン分解抑制剤として使用する方法。
【００４３】
＜２７＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを用いる、アグリカン分解抑制方法。
【００４４】
＜２８＞アグリカナーゼの活性を阻害することでアグリカンの分解を抑制する、前記＜２４＞〜＜２７＞項のいずれか記載の使用又は方法。
＜２９＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜２８＞項記載の使用又は方法。
＜３０＞膝関節の軟骨組織のアグリカンの分解を抑制するための、前記＜２４＞〜＜２９＞項のいずれか記載の使用又は方法。
＜３１＞前記アグリカン分解抑制剤における、前記の、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜２４＞〜＜３０＞項のいずれか記載の使用又は方法。
【００４５】
＜３２＞アグリカナーゼ活性阻害剤としての、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの使用。
【００４６】
＜３３＞アグリカナーゼ活性阻害剤の製造のための、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの使用。
【００４７】
＜３４＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを、アグリカナーゼ活性阻害剤として使用する方法。
【００４８】
＜３５＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを用いる、アグリカナーゼ活性阻害方法。
【００４９】
＜３６＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜３２＞〜＜３５＞項のいずれか記載の使用又は方法。
＜３７＞前記アグリカナーゼ活性阻害剤における、前記の、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜３２＞〜＜３６＞項のいずれか記載の使用又は方法。
【００５０】
＜３８＞関節軟骨細胞外基質分解抑制剤としての、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの使用。
【００５１】
＜３９＞関節軟骨細胞外基質分解抑制剤の製造のための、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの使用。
【００５２】
＜４０＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを、関節軟骨細胞外基質分解抑制剤として使用する方法。
【００５３】
＜４１＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを用いる、関節軟骨細胞外基質分解抑制方法。
【００５４】
＜４２＞前記関節軟骨細胞外基質がアグリカンである、前記＜３８＞〜＜４１＞項のいずれか記載の使用又は方法。
＜４３＞アグリカナーゼの活性を阻害することで前記アグリカンの分解を抑制する、前記＜４２＞項記載の使用又は方法。
＜４４＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜４３＞項記載の使用又は方法。
＜４５＞関節軟骨細胞外基質分解抑制剤における、前記の、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜３８＞〜＜４４＞項のいずれか記載の使用又は方法。
【００５５】
＜４６＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを、関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患を予防又は改善するための予防又は改善剤として使用する方法。
【００５６】
＜４７＞関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患の予防又は改善剤の製造のための、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの使用。
【００５７】
＜４８＞エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを用いる、関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患の予防又は改善方法。
【００５８】
＜４９＞関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患が変形性関節症である、前記＜４６＞〜＜４８＞項のいずれか記載の使用又は方法。
＜５０＞前記関節軟骨細胞外基質がアグリカンである、前記＜４６＞〜＜４９＞項のいずれか記載の使用又は方法。
＜５１＞アグリカナーゼの活性を阻害することで前記アグリカンの分解を抑制する、前記＜５０＞項記載の使用又は方法。
＜５２＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜５１＞項記載の使用又は方法。
＜５３＞前記予防又は改善剤における、前記の、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンの含有量が固形分換算で０．０００１質量％以上１００質量％以下である、前記＜４６＞〜＜５２＞項のいずれか記載の使用又は方法。
【００５９】
＜５３＞関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患の治療方法のために用いる、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニン。
【００６０】
＜５４＞関節軟骨細胞外基質の分解に起因する症状又は疾患の非医薬的な処置方法のために用いる、エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニン。
＜５５＞前記エラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニンを食品又は飲料の形態で適用する、前記＜５４＞項記載のエラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニン。
【００６１】
＜５６＞関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患が変形性関節症である、前記＜５３＞〜＜５５＞項のいずれか記載のエラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニン。
＜５７＞前記関節軟骨細胞外基質がアグリカンである、前記＜５３＞〜＜５６＞項のいずれか記載のエラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニン。
＜５８＞アグリカナーゼの活性を阻害することで前記アグリカンの分解を抑制する、前記＜５７＞項記載のエラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニン。
＜５９＞前記アグリカナーゼがＡＤＡＭＴＳ−５である、前記＜５８＞項記載のエラグ酸、エラジタンニン、又はエラグ酸及びエラジタンニン。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６３】
調製例
濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるよう、ザクロエラグ酸（ザクロ果皮を溶媒抽出後、酸加水分解し、結晶成分をろ過精製したもの、サビンサジャパンコーポレーションより入手）をジメチルスルホキシドに溶解し、エラグ酸の試験サンプルを調製した。
【００６４】
試験例１
前記調製例で調製したエラグ酸の試験サンプルを用いて下記の操作を行った。
なお、以下の操作において、試験サンプル、基質、酵素及び反応停止液の希釈にはTris  Buffer（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ2）を用いた。
【００６５】
９６ｗｅｌｌの蛋白高結合マイクロプレート（CORNING社製、製品番号＃3361）の各ウェルに、基質としてアグリカン（商品名：RECOMBINANT  INTERGLOBULAR  DOMAIN  T331-G458（Aggrecan-IGD1）、CHEMICON社製）４０μＬ、アグリカン分解酵素としてＡＤＡＭＴＳ−５（商品名：RECOMBINANT  HUMAN  ADAMTS-5、CHEMICON社製）４０μＬ、前記調製例で調製したエラグ酸の試験サンプル２０μＬを添加混合した。基質アグリカンは終濃度０．０２５μＭ、酵素ＡＤＡＭＴＳ−５は終濃度１．５ｎＭとし、試験サンプルは終濃度０．０００３％（ｗ／ｖ）となるように調製した。３７℃で３時間反応後、ＥＤＴＡを５０μＬ／ウェル（３０ｍＭ）を加えて反応を停止し、４℃で一晩静置した。翌日、洗浄液としてＴＢＳ−Ｔ（BIO-RAD社製；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（pH7.6），０．８％ＮａＣｌ，０．１％Tween-20）を用いてプレートを３回洗浄し、ブロッキング液として１％ＢＳＡ（Bovine  Serum  Albumin、ROCKLAND社製）２５０μＬ／ウェルを添加した後、室温にて２時間静置させた。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、一次抗体として抗アグリカン抗体（商品名：Aggrecan  ARGxx  antibody［BC-3］、abcam社製）をブロッキング液（１％ＢＳＡ、ＴＢＳ−Ｔ）で５００倍に希釈したもの１００μＬ／ウェルを加え、室温で１．５時間反応させた。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（商品名：ECLTM  Anti-mouse  IgG，Horseradish  Peroxidase、GE  Healthcare  UK社製）をブロッキング液（１％ＢＳＡ、ＴＢＳ−Ｔ）で１０００倍に希釈したもの１００μＬ／ウェルを加えて室温で１．５時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、発色剤としてＴＭＢ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ（TMB-solution  Kit（BIO-RAD社製））１００μＬ／ウェルを添加し、暗所で３０分反応させた後、１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4  １００μＬ／ウェルを加えて反応を停止させた。
また、エラグ酸の試験サンプルを添加しない以外は上記と同様の操作を行ったコントロールサンプルを作製した。
さらに、エラグ酸の試験サンプルに代えて、アグリカナーゼ活性阻害剤として知られているアクチノニン（Actinonin）（ＳＩＧＭＡ製）を終濃度１０μＭとなるよう添加した以外は上記操作と同様にして、参考用サンプル（ポジティブコントロール）を作製した。
【００６６】
各サンプルについて、最大波長４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（BIO-RAD社製）で測定した。コントロールサンプルの吸光度を１００としたときの各サンプルの吸光度を相対値であらわし、アグリカン分解活性（ＡＤＡＭＴＳ−５酵素活性）とした。結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2013245168.tif 000002
【００６８】
表１に示すとおり、エラグ酸を添加した系ではコントロールと比べてアグリカン分解活性が非常に低かった。すなわち、エラグ酸がアグリカナーゼ活性を阻害し、アグリカン分解を抑制することがわかった。
【００６９】
試験例２
SDラット（雄性、７週齢）を体重により７群（１群１０匹）に分けた。このうち、６群にはＡＣＬＴ（前十字靭帯切断）手術を施し、変形性関節症疾患モデルを作製した。残る１群には擬似手術（皮膚のみ切開）を行い、シャム群とした。
前記SDラットに、表２に示す試験食を１日１８ｇ与え、制限給餌により１０週間飼育した。
【００７０】
【表２】
2013245168.tif 000003
【００７１】
前記SDラットの右肢を大腿部より摘出し、膝関節部を傷つけないよう余分な組織を取り除き、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。これを１０％ＥＤＴＡで脱灰し、パラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。前額断面で標本作製を行い、位置を揃えて４〜５μｍの厚さで３枚の連続切片を作製した。作製した薄切について、ヘマトキシリン−エオジン染色、及びサフラニン０染色をそれぞれ行い、光学顕微鏡による膝関節部の組織学的検査を実施し、Mankinスコアに基づいてスコア化を行った。
なお、Mankinスコアに基づく評価項目及び評価基準を下記に示す。
【００７２】
（１）軟骨組織
軟骨組織の破壊状態をスコア０〜６までの７段階で評価した。
スコア０：正常
スコア１：表面（Tangential  zone）が不規則
スコア２：パンヌス（Pannus）と表面が不規則
スコア３：表面への亀裂が見られる
スコア４：深層（Radial  zone）への亀裂が見られる
スコア５：石灰化層（Calcified  zone）への亀裂が見られる
スコア６：組織の完全に消失
（２）軟骨細胞
軟骨細胞の状態をスコア０〜３までの４段階で評価した。
スコア０：正常
スコア１：びまん性の細胞集合亢進
スコア２：細胞の分裂
スコア３：細胞集合の減少
（３）サフラニン０染色による基質染色性
サフラニン０染色により観察された、軟骨中プロテオグリカンの減少状態を０〜４までの５段階で評価した。
スコア０：正常
スコア１：わずかに減少
スコア２：中程度に減少
スコア３：重度に減少
スコア４：染色されず
（４）Tide  markの状態
関節軟骨のTide  markの状態を観察し、軟骨下骨側からの石灰化進行状態を０〜１までの２段階で評価した。
スコア０：無傷
スコア１：血管の交差
【００７３】
結果を表３に示す。また、エラグ酸群のSDラットの膝関節部の顕微鏡写真を図１に、コントロール群のSDラットの顕微鏡写真を図２（Ａ）及び（Ｂ）に、それぞれ示す。
【００７４】
【表３】
2013245168.tif 000004
【００７５】
表３の結果から明らかなように、エラグ酸群の変形性関節症疾患モデルは、Mankinスコアの値が低く、関節軟骨細胞外基質を構成するアグリカンの分解が抑制され、変形性関節症が改善されていることが分かる。
また、図２に示すようにコントロール群の変形性関節症疾患モデルでは軟骨表面への亀裂やサフラニンＯ染色による基質染色性の低下などが認められたのに対し、図１に示すようにエラグ酸群の変形性関節症疾患モデルではそれらの所見は認められなかった。
【００７６】
上記試験例より、エラグ酸、及び体内でエラグ酸に代謝されるエラジタンニンは、アグリカナーゼ活性を阻害してアグリカン分解を抑制し、関節軟骨細胞外基質の分解を抑制する。そのため、エラグ酸及びエラジタンニンは、関節軟骨細胞外基質の分解により引き起こされる症状又は疾患を予防又は改善するための予防又は改善剤に好適に用いることができる。
【００７７】
処方例
本発明の予防又は改善剤として、下記に示す組成の予防又は改善剤を常法により各々調製した。
【００７８】
１．軟カプセル剤の製造
下記の組成の軟カプセル剤皮の中に大豆油４００ｍｇとエラグ酸１００ｍｇを定法により充填し、軟カプセル剤を製造した。
（組成）                                （配合量）
ゼラチン                                  ７０．０質量％
グリセリン                                ２２．９質量％
パラオキシ安息香酸メチル                  ０．１５質量％
パラオキシ安息香酸プロピル                ０．５１質量％
水                                        ６．４４質量％
【００７９】
２．小麦粉食品（カップケーキ）の製造
下記の組成からなる生地をカップケーキ調製の要領で調製した後、１０個の型に分け、常法により焼成、製造し、風味良好なカップケーキを得た。
（組成）                                （配合量）
薄力粉                                    １００ｇ
鶏卵                                      １００ｇ
砂糖                                      １００ｇ
ショートニング                              ３５ｇ
マーガリン                                  ３５ｇ
ベーキングパウダー                        ２．５ｇ
洋酒                                          ６ｇ
エラグ酸                                    １５ｇ
水                                            適量
【００８０】
３．粉末飲料の製造
下記の組成からなる粉末を十分に混合した後１０ｇ分包にし、１日１回摂取用の水や湯に溶かして摂取する香味良好な粉末飲料を得た。
（組成）                                （配合量）
ブドウ糖                                ６０質量％
デキストリン                            １５質量％
クエン酸ナトリウム                        ５質量％
ビタミンＣ                                １質量％
エラグ酸                                １５質量％
香料（レモンフレーバー）                  ４質量％
【図１】
2013245168.tif 000005
【図２】
2013245168.tif 000006