(57)【要約】【課題】  穏和な条件で容易に低分子量化された水溶性多糖類を製造する方法を提供すること。【解決手段】  水性媒体に溶解又は分散させた水溶性多糖類を、通流させながら加圧及び加熱処理することを特徴とする、低分子量化水溶性多糖類の製造方法。加圧及び加熱処理が、１０Ｘ＋４０≦Ｙ≦１０Ｘ＋６０（Ｙは温度（℃）を示す。Ｘは圧力を示し、８ＭＰａ≦Ｘ≦１８ＭＰａである。）を満たす条件で行なわれることが好ましく、また、水溶性多糖類としてはヒアルロン酸等が好ましい。【選択図】図１
2013209594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体に溶解又は分散させた水溶性多糖類を、通流させながら、下記式（イ）を満たす条件下で加圧及び加熱処理することを特徴とする、低分子量化水溶性多糖類の製造方法。
【数１】
2013209594.tif 000006
（Ｙは温度（℃）を示す。Ｘは圧力を示し、８ＭＰａ≦Ｘ≦１８ＭＰａである。）
【請求項２】
水溶性多糖類がヒアルロン酸及び／又はその塩である請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水溶性多糖類の製造方法に関する。より詳細には、本発明は低分子量化水溶性多糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多糖類とは、単糖分子がグリコシド結合によって多数重合した糖のことであり、水に対する溶解度を有する水溶性多糖類、水に不溶性の不溶性多糖類に分類される。
【０００３】
水溶性多糖類の一種であるヒアルロン酸は、化粧品、医薬品、食品等様々な分野において用いられている。しかしながら、ヒアルロン酸は極めて高分子の多糖類であり高い粘度を有するため、取扱いが困難な場合がある。一方、低分子量ヒアルロン酸が老化防止等の細胞活性に有用であることが知られてきており、注目されている。
【０００４】
ヒアルロン酸の低分子量化技術としては、ヒアルロン酸をヒアルロニダーゼ等の酵素で分解する方法（例えば、特許文献１参照）、塩酸等の酸で分解する方法（例えば、特許文献２及び３参照）、マイクロ波やγ線を照射して分解する方法（例えば、特許文献４）等が知られている。
【０００５】
また、多糖類を低分子化する方法として、セルロース等の多糖類を、酸化剤の存在下にバッチ式で加熱及び加圧して分解する方法（例えば、特許文献５）、加熱及び加圧下でセルロースに酸含有水溶液を通水させて分解する方法（例えば、特許文献６）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−３３９３９３号公報
【特許文献２】特開２００９−２５６６８３号公報
【特許文献３】特開２００６−２６５２８７号公報
【特許文献４】特開２００８−１７９７１０号公報
【特許文献５】特開２００７−２０５５５号公報
【特許文献６】特開２０１１−２０６０４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ヒアルロン酸を酵素で分解する方法には、酵素成分が生成物中に残留するため純度が低下するという問題点がある。ヒアルロン酸を塩酸等の酸で処理する方法は、酵素で分解する方法に比べて反応系は単純であるが、酸除去工程等を必要とし時間もかかる。マイクロ波照射による分解は温度制御が難しく、マイクロ波が均一に照射されないため、分解の制御が困難である等の問題がある。γ線照射による分解は、残留放射線による健康への影響が問題となる。
バッチ式で加熱及び加圧して分解する方法は、温度と圧力を独立制御することが困難であり、また時間やコストがかかる。更に、金属塩等の酸化剤を使用しているので、除去工程が必要であり、残存酸化剤の人体への影響が懸念される。
【０００８】
加熱及び加圧下でセルロースに酸含有水溶液を通水させて分解する方法では、固体原料に酸含有水溶液を通過させグルコースなどの単糖成分に分解して抽出している。この方法で固体原料をヒアルロン酸粉末にした場合、溶媒に溶解する部分としない部分が生じて均一に分解（低分子量化）されないと考えられる。また、特許文献６の実施例に記載された圧力５ＭＰａ、温度２６０℃という条件では、ヒアルロン酸のような熱に弱い多糖類は褐変反応を起こしてしまう。
【０００９】
従って、本発明の主な目的は、穏和な条件で容易に低分子量化された水溶性多糖類を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、従来技術の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の方法で水溶性多糖類を加熱及び加圧処理することにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の低分子量化水溶性多糖類の製造方法に係る。水性媒体に溶解又は分散させた水溶性多糖類を、通流させながら、下記式（イ）を満たす条件下で加圧及び加熱処理することにより低分子量化することを特徴とする、低分子量化水溶性多糖類の製造方法。
【００１２】
【数１】
2013209594.tif 000003
（Ｙは温度（℃）を示す。Ｘは圧力を示し、８ＭＰａ≦Ｘ≦１８ＭＰａである。）
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、穏和な条件でも、短時間で容易に分子量分布の狭い低分子量化水溶性多糖類を得ることができる。低分子量化された水溶性多糖類は、粘度が低いので取扱いが容易である。本発明の方法で得られた水溶性多糖類は分子量分布が狭いので、高い性能又は効果を有する。
【００１４】
また、本発明の方法では、酸や酸化剤等の添加剤を使用しなくても水溶性多糖類を低分子量化することができる。従って、本発明の方法は、脱酸や脱酸化剤工程を必要としないのでコストの低減化が可能となる。さらに、残存する酸や酸化剤の人体への影響を考慮しなくて済むので、得られた低分子量化水溶性多糖類は安心して使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明を実施するために使用される装置の一例を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（１）水性媒体に溶解又は分散させた水溶性多糖類
（１−１）水溶性多糖類
本発明で使用する水溶性多糖類は、デンプン、グリコーゲン、ヒアルロン酸、アガロース、ペクチン、キサンタンガム、グァーガム、ローカストビーンガム、タラガム等を挙げることができ、これらの塩も含む。上記水溶性多糖類は１種を単独で使用することもできるし、２種以上を使用することもできる。これらの中でも、本発明ではヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩等が好ましい。
【００１７】
ヒアルロン酸は、グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンの２糖を反復構成単位とする多糖類である。ヒアルロン酸の塩としては、特に限定されないが、例えばナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。
【００１８】
本発明で使用するヒアルロン酸の種類や由来等は限定されない。本発明で使用するヒアルロン酸としては、公知のヒアルロン酸、例えば、鶏冠等の生体組成由来のもの、乳酸菌を初めとするヒアルロン酸を生産することができる微生物を培養して得られるもの（例えば、特開昭６３−２７３４９０号公報、特開昭６３−２７３４９０号公報等）を使用することができ、必要に応じてこれらを精製したものも使用することができる。
【００１９】
（１−２）水性媒体
本発明で使用する水性媒体は、水又は水と水に溶解する有機溶媒とを含む混合溶媒である。ここで使用する有機溶媒としては、アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）等を使用することができる。
【００２０】
水性媒体としては水を使用することが好ましい。混合溶媒を使用する場合は、水性媒体中の水の含有量を１０容量％以上とすることが好ましく、４０容量％以上とすることがより好ましい。水性媒体中の水の含有量を１０容量％以上とすることにより、ヒアルロン酸が沈殿することを避けることができ、均一な状態で反応を行うことができる。
【００２１】
（１−３）溶解又は分散
溶解又は分散方法は、特に限定されず、水性媒体に水溶性多糖類を添加しても良く、水溶性多糖類に水性媒体を添加しても良い。例えば、水性媒体を撹拌しながら、水溶性多糖類を少量ずつ添加して溶解又は分散させることができる。
【００２２】
水性媒体中に水溶性多糖類を添加する量は特には限定されず、水溶性多糖類の種類や後で行う実験の条件等に応じて適宜選択することができる。例えば、ヒアルロン酸を使用する場合は、その濃度を０．０１〜３０ｗ／ｖ％、好ましくは０．０５〜２０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５〜１０ｗ／ｖ％とすることができる。水溶性多糖類の添加量を０．０１ｗ／ｖ％以上とすることにより、十分な量の低分子量化水溶性多糖類を得ることができる。水溶性多糖類の添加量を３０ｗ／ｖ％以下とすることにより、水性媒体中に水溶性多糖類を均一に溶解又は分散することができる。
【００２３】
水溶性多糖類を水性媒体に溶解又は分散させるときの水性媒体の温度も特には限定されず、水溶性多糖類の種類や添加量等に応じて適宜選択することができる。例えば、水性媒体の温度は、好ましくは４〜６０℃、より好ましくは６〜５０℃とすることができる。４℃以上とすることにより、水溶性多糖類を溶解することができる。６０℃以下とすることにより、水溶性多糖類の分解を避けて水性媒体に溶解又は分散させることができる。
【００２４】
（２）加圧及び加熱処理
本発明では、（１）で得られた水性媒体に溶解又は分散した水溶性多糖類を、流通させながら加圧及び加熱処理に供する。より詳細には、装置中の反応器を通過するときに加圧及び加熱処理を行えばよい。
【００２５】
例えば、ヒアルロン酸のように熱に弱い水溶性多糖類を加熱する場合、単に高温にするとその水溶性多糖類は褐変反応を起こしてしまう。しかしながら、流通させながら加圧及び加熱処理を行うことにより、加圧下ではある程度高温にしても褐変反応を起こさずに水溶性多糖類を分解することができる。しかも、流通させながら加圧及び加熱処理を行うことにより、圧力と温度を独立して（別々に）制御することができる。
【００２６】
更に、流通させながら加圧及び加熱処理を行うことにより、高温下で水溶性多糖類を分解することができるだけでなく、圧力を一定にして温度を変化させることにより分子量を調整することができ、また、温度を一定にして圧力を変化させることにより分子量分布を調整することができる。分子量分布が狭い水溶性多糖類は、比較的均質なため、当該水溶性多糖類の有する効果をより鋭く（効率良く）発揮することができる。
本発明における加圧及び加熱処理を行う条件は、圧力「Ｘ」が８〜１８ＭＰａの範囲で、温度Ｙ（℃）が下記式（イ）を満たす条件で行う。  
【００２７】
【数２】
2013209594.tif 000004
当該式を満たす条件下で加圧及び加熱処理を行うことにより、十分に低分子量化することができ、しかも分子量分布も小さい水溶性多糖類を得ることができる。
【００２８】
圧力を８ＭＰａ以上とすることにより、低分子量化効率が良くなる。圧力を１８ＭＰａ以下とすることにより、分子量分布の調整を行いやすくなる。圧力のより好ましい範囲は、８．５〜１６ＭＰａとすることができる。
【００２９】
例えば、圧力が８ＭＰａ未満で温度が１５０℃以下の場合は、分解反応率が低いか又は分子量分布が広くなるおそれがある。一方、圧力が８ＭＰａ未満で温度が１５０℃以上の場合は、過分解が起きたり、褐変反応を生じたりするおそれがある。また、圧力が１５ＭＰａ以下でも温度が１２０℃未満の場合は、分解反応率が低く分解に時間を要する傾向にある。
【００３０】
反応時間（加熱及び加圧処理時間）は特に限定されず、反応器の容量、低分子量化させる水溶性多糖類の種類や量等に応じて適宜選択することができる。例えば、水溶性多糖類としてヒアルロン酸又はその塩を使用する場合、反応時間は０．１〜２０分間が好ましく、０．５〜１０分間がより好ましい。０．１分間以上とすることにより、効率良く水溶性多糖類を低分子量化することができる。２０分間以下とすることにより、過剰な分解を抑制することができる。
また、通流速度は、反応器の容量、低分子量化させる水溶性多糖類の種類や量等に応じて適宜選択することができる。例えば、水溶性多糖類としてヒアルロン酸又はその塩を使用し、５ｍＬ容量の反応器を用いる場合、通流速度は０．５〜２０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、１〜１０ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上とすることにより、過剰な分解を抑制することができる。２０ｍＬ／ｍｉｎ以下とすることにより、効率良く（十分に）水溶性多糖類を低分子量化することができる。
【００３１】
通流速度は特に限定されず、反応器の容量、低分子量化させる水溶性多糖類の種類や量等に応じて適宜選択することができる。例えば、水溶性多糖類としてヒアルロン酸又はその塩を使用し、５ｍＬ容量の反応器を用いる場合、０．５〜２０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、１〜１０ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上とすることにより、効率良く水溶性多糖類を低分子量化することができる。２０ｍＬ／ｍｉｎ以下とすることにより、低分子量化されない水溶性多糖類の量を抑制することができる。
【００３２】
このようにして得られた水溶性多糖類は回収しても良いし、更なる他の反応に供することもできる。水溶性多糖類の回収方法は、特に限定されない。例えば、水溶性多糖類を含む水性媒体に有機溶媒を添加することにより、水溶性多糖類を沈殿させた後、ろ過、遠心分離したり、スプレードライ法を用いたりすることができる。得られた水溶性多糖類は、必要に応じて更に精製を行っても良い。
【００３３】
以下に、図１を用いて本発明の一実施態様について説明する。
【００３４】
水溶性多糖類の溶液又は分散液（原料分散液）２は、原料分散液槽１から送液ポンプ３により送液され、熱交換器４を通過し、反応管（反応器）５に入ることができる。反応管５は、温度制御された加熱装置６により加熱され得る。圧力は、装置下流に設けられた背圧弁９により調整でき、圧力を一定に維持することができる。すなわち、温度と圧力を独立して（別々に）制御することができる。
【００３５】
反応管５から処理後の液は、冷却装置７によって冷却することができる。これにより処理後の液が、瞬時に冷却され、余熱により副反応物が生成するのを防ぐことができる。冷却された処理液１１は、処理液受槽１０で回収され得る。
【００３６】
このような連続通流式は、所定の温度まで急速昇温、反応後も速やかに冷却でき、精密な反応時間、温度の制御により、目的分子量の低分子量化水溶性多糖類を得ることができる。連続で処理することができるので、量産性が高く、バッチ式よりもコストがかからず、工業化の実現性が高い。
【実施例】
【００３７】
本発明における水溶性多糖類の平均分子量（重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ））及び分子量分布は、ＧＰＣ装置（東ソー製ＧＰＣ８０１０）にゲルろ過カラム（商品名：Shodex OHpak SB-G +Shodex Ohpak SB-806M HQ、昭和電工社製）を接続して、下記の条件で、ＧＣＰ分析することにより測定した。
【００３８】
カラム温度：４０℃
流速      ：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
試料注入量：５０μＬ
移動相    ：０．２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液  
検出器    ：ＲＩ
標準試料  ：プルラン（昭和電工社製）
試料濃度  ：未処理ヒアルロン酸は移動相で４倍希釈、実施例１〜３で得られた試料は移動相で２倍希釈
分子量分布は、重量平均分子量（Ｍｗ）の数平均分子量（Ｍｎ）に対する割合（比）で求められ、これが１に近いほど分子量分布が狭いことを示す。
【００３９】
＜実施例１＞
エムアールシーポリサッカライド株式会社製のヒアルロン酸ナトリウムＲＨＡ−０３０（プルラン換算分子量約８５０万）１ｇをガラス容器中の脱気済み超純水１０００ｍＬに撹拌しながら溶解して、０．１％（ｗ／ｖ）ヒアルロン酸水溶液を調製し、株式会社東洋高圧製「小型超臨界水廃液処理装置」を用いて、流通速度５ｍＬ／ｍｉｎで容量５ｍＬの反応管に通流させながら（１分間の反応時間）、加熱温度を１５０℃、圧力を１０ＭＰａで処理し、処理したヒアルロン酸ナトリウムを得た。
【００４０】
得られたヒアルロン酸ナトリウムの分子量と分子量分布の結果は、併せて表１に示す。得られたヒアルロン酸ナトリウムは十分に低分子量化されており、分子量分布は非常に小さかった。
【００４１】
＜実施例２＞
加熱温度を２１０℃、圧力を１６ＭＰａにした以外は実施例１と同様の操作を実施して、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。得られたヒアルロン酸ナトリウムの分子量と分子量分布の結果は、併せて表１に示す。得られたヒアルロン酸ナトリウムは十分に低分子量化されており、分子量分布は非常に小さかった。
【００４２】
＜比較例１＞
加熱温度を１００℃、圧力を５ＭＰａにした以外は実施例１と同様の操作を実施して、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。得られたヒアルロン酸ナトリウムの分子量と分子量分布の結果は、併せて表１に示す。得られたヒアルロン酸ナトリウムはあまり低分子量化されておらず、しかも分子量分布は大きかった。
【００４３】
＜比較例２＞
加熱温度を１００℃、圧力を１０ＭＰａにした以外は実施例１と同様の操作を実施して、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。得られたヒアルロン酸ナトリウムの分子量と分子量分布の結果は、併せて表１に示す。得られたヒアルロン酸ナトリウムはあまり低分子量化されていなかった。
【００４４】
＜比較例３＞
加熱温度を１５０℃、圧力を５ＭＰａにした以外は実施例１と同様の操作を実施して、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。得られたヒアルロン酸ナトリウムの分子量と分子量分布の結果は、併せて表１に示す。得られたヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布は大きかった。
【００４５】
＜比較例４＞
ヒアルロン酸の溶解液を０．１ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸水溶液にし、加熱温度１８０℃、圧力１０ＭＰａにした以外は実施例１と同様の操作を実施して、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。当該ヒアルロン酸ナトリウムは着色がみられた。
【００４６】
＜比較例５＞
加熱温度を２００℃、圧力を５ＭＰａにした以外は実施例１と同様の操作を実施して、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。当該ヒアルロン酸ナトリウムは褐変していた。
【００４７】
＜比較例６＞
加熱温度を２４０℃、圧力を７ＭＰａにした以外は実施例１と同様の操作を実施して、ヒアルロン酸ナトリウムを得た。当該ヒアルロン酸ナトリウムは褐変していた。
【００４８】
【表１】
2013209594.tif 000005
【符号の説明】
【００４９】
１      原料分散液槽
２      原料分散液
３      送液ポンプ
４      熱交換器
５      反応管
６      加熱装置
７      冷却装置
８      圧力メーター
９      背圧弁
１０    処理液受槽
１１    処理液
【図１】
2013209594.tif 000007