(57)【要約】【課題】腫瘍細胞の細胞死誘導活性を有する新規な蛋白質−脂肪酸複合体及び薬剤を提供する。【解決手段】アポミオグロビン又はβ２ミクログロブリンと、不飽和脂肪酸とにより形成される蛋白質−脂肪酸複合体を提供する。また、アポミオグロビン又はβ２ミクログロブリンと不飽和脂肪酸とにより形成される蛋白質−脂肪酸複合体を有効成分として含有する薬剤を提供する。不飽和脂肪酸として好ましくはオレイン酸である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポミオグロビン又はβ２ミクログロブリンと不飽和脂肪酸とにより形成される、蛋白質−脂肪酸複合体。
【請求項２】
前記不飽和脂肪酸が、オレイン酸、ｃｉｓ−バクセン酸、パルミトオレイン酸、ペトロセリン酸、α−リノレン酸及びγ−リノレン酸からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の蛋白質−脂肪酸複合体。
【請求項３】
前記不飽和脂肪酸がオレイン酸である請求項１に記載の蛋白質−脂肪酸複合体。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の蛋白質−脂肪酸複合体を有効成分として含有する、腫瘍細胞の細胞死誘導薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛋白質−脂肪酸複合体、及びそれを有効成分として含む腫瘍細胞の細胞死誘導薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質−脂肪酸複合体としては、母乳に主に含まれるヒトαラクトアルブミンとオレイン酸との分子複合体（ＨＡＭＬＥＴ：Human α-lactalbumin made lethal to tumor cells）について報告がある（例えば、特許文献１や特許文献２参照）。ＨＡＭＬＥＴについては、腫瘍細胞の細胞死を選択的に誘導するアポトーシス誘導活性を有することが報告されており、このアポトーシス誘導活性を利用した医薬の創製が試みられている。また、これまでの研究において、ＨＡＭＬＥＴ中のヒトαラクトアルブミンは、天然型のフォールディング状態とは異なり、二次構造は保持されているが三次構造が失われた状態であるモルテン・グロビュール状態（ＭＧ状態）を形成していることが示されている。なお、蛋白質−脂肪酸複合体としては、ＨＡＭＬＥＴのほか、ウシ由来αラクトアルブミンとオレイン酸との複合体、立体構造がαラクトアルブミンに類似するリゾチームとオレイン酸との複合体について報告がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００１−５２４４９１号公報
【特許文献２】特表２００６−５００３２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
蛋白質−脂肪酸複合体としては、αラクトアルブミン様の立体構造を有する蛋白質を使用した例について報告はあるが、それ以外の蛋白質を用いた複合体については未だ報告されていない。
【０００５】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、腫瘍細胞の細胞死誘導活性を有する新規な蛋白質−脂肪酸複合体及び薬剤を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＨＡＭＬＥＴの構造的性質を解明するべく、２次元ＮＭＲを用いてＨＡＭＬＥＴのオレイン酸結合部位の特定を行った。その結果、オレイン酸の結合部位が、ヒトαラクトアルブミンにおいてＭＧ状態で構造形成されている領域と一致していることを確認した。このことから、オレイン酸は蛋白質の特異的な構造を認識しているのではなく、ＭＧ状態で形成される疎水的部分に結合している可能性があることが推測される。このような仮説の下、本発明者らは、αラクトアルブミンと同様にＭＧ状態を形成可能な別の蛋白質に着目し、当該別の蛋白質とオレイン酸との複合体形成能について検討した。その結果、αラクトアルブミン以外の特定の蛋白質においてオレイン酸と複合体を形成するとともに、その蛋白質−脂肪酸複合体が、腫瘍細胞に作用して腫瘍細胞の細胞死を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明により以下の蛋白質−脂肪酸複合体及び薬剤が提供される。
【０００７】
（１）アポミオグロビン又はβ２ミクログロブリンと不飽和脂肪酸とにより形成される、蛋白質−脂肪酸複合体。
（２）不飽和脂肪酸が、オレイン酸、ｃｉｓ−バクセン酸、パルミトオレイン酸、ペトロセリン酸、α−リノレン酸及びγ−リノレン酸からなる群より選択される少なくとも１種である上記（１）に記載の蛋白質−脂肪酸複合体。
（３）不飽和脂肪酸がオレイン酸である上記（１）に記載の蛋白質−脂肪酸複合体。
（４）上記（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の蛋白質−脂肪酸複合体を有効成分として含有する、腫瘍細胞の細胞死誘導薬。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、腫瘍細胞の細胞死誘導活性を有する新規な蛋白質−脂肪酸複合体を得ることができる。特に、本発明の蛋白質−脂肪酸複合体の蛋白質部分を構成するアポミオグロビン、β２ミクログロブリンは安価にかつ大量に入手可能であり、抗腫瘍剤を安価に製造可能な点や、安定供給が可能な点において優れている。また、アポミオグロビン、β２ミクログロブリンは哺乳動物の血中にも存在する蛋白質であり、血中に投与した場合にも安定性が高いものと推察される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】マウス白血病由来株化細胞（L1210）に対する細胞死誘導活性の結果を示す図。（Ａ）はアポミオグロビン−オレイン酸複合体について、（Ｂ）はβ２ミクログロブリン−オレイン酸複合体について示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の蛋白質−脂肪酸複合体は、アポミオグロビン又はβ２ミクログロブリンと不飽和脂肪酸とにより形成されている。以下、本発明の蛋白質−脂肪酸複合体について詳細に説明する。
【００１１】
［アポミオグロビン及びβ２ミクログロブリン］
本発明におけるアポミオグロビン及びβ２ミクログロブリン（以下、特定蛋白質とも言う。）は、いずれも球状蛋白質であり、一次構造と三次構造との間の中間構造として、蛋白質構造の少なくとも一部において三次構造は失われているが二次構造は安定に維持されている状態、所謂モルテン・グロビュール状態（ＭＧ状態）を形成する。ＭＧ状態と三次状態（天然型）とは可逆的であり、三次状態の蛋白質を熱や酸などで変性させることによりＭＧ状態が形成される。
【００１２】
上記の特定蛋白質としては、天然源から精製したものでもよいし、大腸菌や酵母等を用いて遺伝子工学的に発現させたものでもよい。蛋白質の由来についても特に限定せず、ヒト由来であっても、ヒト以外のその他の動物由来であってもよい。また、生物学的に活性で安定である限り、天然蛋白質のアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加及び挿入から選択されるいずれか、又はこれらを組み合わせた変異を有するものであってもよい。変異体である場合、相同性は少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。ここで、「生物学的に活性で安定である」とは、アポミオグロビン、β２ミクログロブリンのアミノ酸配列に変異が加えられた状態において、フォールディング状態が変異前と変わらない、より具体的には、ＭＧ状態の形成能を保持していることを意味する。
【００１３】
［不飽和脂肪酸］
本発明における不飽和脂肪酸としては、炭素数１６〜２０であって、少なくとも１つの二重結合を有するｃｉｓ型であることが好ましい。具体的には、例えばオレイン酸、ｃｉｓ−バクセン酸（ｃｉｓ−１１−オクタデセン酸）、パルミトオレイン酸、ペトロセリン酸（ｃｉｓ−６−オクタデセン酸）、α−リノレン酸、γ−リノレン酸などを挙げることができる。これらのうち、細胞死誘導活性を高くできる観点から、オレイン酸、ｃｉｓ−バクセン酸、ペトロセリン酸、リノレン酸などの炭素数１８の不飽和脂肪酸がより好ましく、オレイン酸、ｃｉｓ−バクセン酸、ペトロセリン酸などの炭素数１８のモノエン不飽和脂肪酸が更に好ましい。中でも、アポミオグロビンやβ２ミクログロブリンとの複合体の形成しやすさ、安定性、細胞死誘導活性などの観点からオレイン酸が特に好ましい。
【００１４】
［蛋白質−脂肪酸複合体の製造］
本発明における蛋白質−脂肪酸複合体を得るには幾つかの方法が考えられるが、例えば、三次構造が保持された特定蛋白質について、そのフォールディング状態を熱や酸等によって変化させ（変性工程）、続いてフォールディング変化した状態の特定蛋白質と不飽和脂肪酸とを混合する（混合工程）ことにより、本発明における蛋白質−脂肪酸複合体を得ることができる。
【００１５】
ここで、上記変性工程は、特定蛋白質のフォールディング状態を変化させることにより、好ましくは特定蛋白質にＭＧ状態を形成させる工程である。例えばｐＨ変化によるフォールディング変化の場合、そのｐＨとしては、アポミオグロビンについてはｐＨ３．５〜４．５が好ましく、ｐＨ４．０が特に好ましい。また、β２ミクログロブリンについてはｐＨ３．１〜４．２が好ましく、ｐＨ３．６が特に好ましい。特定蛋白質のフォールディング状態の変化は、好ましくは緩衝液中で行われ、例えば酢酸、クエン酸、リン酸等の緩衝液を用いることができる。また、ｐＨ変化によりフォールディング状態を変化させる際の温度は、常温でもよいし、加熱等により例えば３０〜６５℃にしてもよい。特定蛋白質のＭＧ状態において形成される疎水的部分と不飽和脂肪酸との結合（疎水結合）をより強くして、複合体形成を促進化かつ安定化させる観点からすると、高温下で複合体形成を行うことが好ましく、具体的には５０〜６０℃の温度下で行うことが好ましい。
【００１６】
本発明の蛋白質−脂肪酸複合体の形成に供される特定蛋白質と不飽和脂肪酸との混合割合は、特定蛋白質１モルに対して不飽和脂肪酸が１〜１００モルとなる割合が好ましく、1０〜５０モルとなる割合がより好ましい。特定蛋白質と不飽和脂肪酸とを混合する際の設定温度は、好ましくは２５〜６５℃であり、より好ましくは４０〜６０℃である。また、両者の混合後において、複合体形成のために設定する時間は、好ましくは５〜６０分であり、より好ましくは１０〜３０分である。このようにして本発明の蛋白質−脂肪酸複合体を含有する溶液が得られる。この溶液から当該複合体を単離するには常法に従って行うことができる。また、単離した蛋白質−脂肪酸複合体については、ゲルろ過、透析、膜分離、遠心分離などの通常用いられる方法で精製することができる。
【００１７】
［細胞死誘導薬］
本発明の細胞死誘導薬は、上述した本発明の蛋白質−脂肪酸複合体を有効成分として含有する。本発明の蛋白質−脂肪酸複合体は、腫瘍細胞に作用して腫瘍細胞の細胞死を誘導する。したがって、本発明の蛋白質−脂肪酸複合体は、特に腫瘍細胞の細胞死誘導薬の有効成分として、又は腫瘍細胞の細胞死誘導薬を製造するために使用することができる。上記細胞死誘導薬による治療の対象となる疾患としては、例えば大腸癌、肝臓癌、肺癌、腎臓癌、子宮癌などの固形腫瘍；白血病やリンパ腫などの血液悪性腫瘍；等が挙げられる。なお、本発明の細胞死誘導薬が対象とする疾患はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の細胞死誘導薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化の形態は特に限定せず、例えば錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、座薬などが挙げられる。製剤化する場合には、上記蛋白質−脂肪酸複合体を有効成分として含むほか、医薬上許容される添加物を含むものであってもよい。このような添加物としては特に限定しないが、例えば薬剤担体、賦形剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、等張剤、希釈剤、結合剤などが挙げられ、具体的には、例えば水、生理食塩水、医薬上許容される有機溶媒、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カゼイン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリン酸、医薬上許容される界面活性剤、生体内で許容される生理的ｐＨの緩衝液等が挙げられる。添加物は、剤型や使用部位に応じて上記の中から適宜選択され又はそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明の細胞死誘導薬には、本発明の蛋白質−脂肪酸複合体が、治療上有効な量含有される。好ましい範囲の有効成分量は剤型等によっても異なるが、例えば０．１重量％〜９５重量％の範囲にすることができる。
【００２０】
上記細胞死誘導薬の投与方法としては、剤型や使用部位に応じて、経口投与又は非経口投与、あるいはそれらの組み合わせとすることができる。非経口投与の経路としては、例えば静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、経鼻などが挙げられる。
【００２１】
上記細胞死誘導薬の有効投与量は、期待される治療効果が得られるように適宜設定すればよく、一般に、剤型、投与方法、患者の症状、年齢、体重、投与スケジュールなどを考慮して設定される。成人を対象とする場合の一日当たりの有効成分量としては、体重１ｋｇ当たり例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇとなるように設定することができる。投与の間隔は、例えば１日１回〜数回、数日で１回などとすることができる。なお、有効投与量及び投与間隔はこれらに制限されるものではない。投与対象としては、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【００２３】
［実施例１］
＜アポミオグロビン−オレイン酸複合体の作製＞
ウマ骨格筋由来のミオグロビン（市販品）水溶液に２−ブタノンを加えることにより結合ヘムを取り除いたアポミオグロビン１．５ｍｇを、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）５００μｌに溶解し、その溶液に５０ｍＭオレイン酸溶液を４μｌ添加して超音波処理を行った。なお、５０ｍＭオレイン酸溶液としては、エタノール１ｍｌにオレイン酸１６μｌを溶解し、このオレイン酸／エタノール溶液の２００μｌを超純水２００ｍｌに加えることにより調製したものを用いた。続いて、得られた溶液を５０℃で２０分静置した。なお、静置している間は１〜２分おきにボルテックスミキサーで溶液を攪拌した。溶液を室温まで冷ました後、５０ｍＭオレイン酸溶液を約１０ｍｌ加え、２５００Ｇ、２０℃、１０分の条件で遠心分離方式による限外ろ過を行った。この限外ろ過操作を４〜５回繰り返した後、今度は、２０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液を約１０ｍｌ加え、上記と同じ条件で遠心分離方式による限外ろ過を４〜５回繰り返し行った。限外ろ過フィルタ上の溶液を取り出し、アポミオグロビン−オレイン酸複合体を含む溶液を得た。
【００２４】
＜アポミオグロビン−オレイン酸複合体の活性評価＞
作製したアポミオグロビン−オレイン酸複合体の腫瘍細胞に対する細胞死誘導活性について評価した。評価は以下のようにして行った。まず、マウス白血病由来株化細胞（L1210）を１０％牛胎児血清添加培養液（RPMI1640、シグマ社製）で２×106細胞／ｍｌに調製し、９６ウェルプレートの１ウェル当たり９０μｌずつ分注した。プレートを５％ＣＯ２、３７℃の条件下に静置し、１時間培養した。アポミオグロビン−オレイン酸複合体をＰＢＳに溶解し、アポミオグロビン−オレイン酸複合体の最終濃度が２．５μＭになるように、培養終了後の９６ウェルプレートの各ウェルにアポミオグロビン−オレイン酸複合体含有溶液を添加した。その後、更に４時間、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。培養終了後、０．５％トリパンブルー染色液（ナカライテスク社製）を用いてアポトーシス誘導活性を測定した。活性測定は、トリパンブルーによる染色が観察された細胞数を計測することにより行った。また、アポミオグロビン−オレイン酸複合体の最終濃度をそれぞれ５μＭ、１０μＭとした場合について、上記と同様の方法によりアポトーシス誘導活性を測定した。それらの結果を図１（Ａ）に示す。なお、図１では、染色されていない細胞が生細胞であり、染色されている細胞が死細胞であることを示す。
【００２５】
＜結果＞
図１（Ａ）に示すように、L1210へのアポミオグロビン−オレイン酸複合体の添加により、L1210の細胞生存能を低下させた。このことから、アポミオグロビン−オレイン酸複合体はアポトーシス誘導活性を有することが確認された。また、アポミオグロビン−オレイン酸複合体のアポトーシス誘導活性は、添加量が多いほど（濃度が高いほど）顕著に発現されることが確認された。なお、比較対照のために、アポミオグロビン−オレイン酸複合体の代わりにＰＢＳを添加した点以外は上記と同様にしてL1210の培養を行い、これについても同様にアポトーシス誘導活性を測定したが、死細胞は全く観察されなかった。
【００２６】
［実施例２］
＜β２ミクログロブリン−オレイン酸複合体の作製＞
アポミオグロビンの代わりにヒト由来のβ２ミクログロブリンを用いた点、及び２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）の代わりに２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）を用いた点以外は、上記実施例１と同様の操作を行うことにより、β２ミクログロブリン−オレイン酸複合体を含む溶液を得た。
【００２７】
β２ミクログロブリンは以下の方法により得たものを使用した。まず、ヒト由来のβ２ミクログロブリンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミドベクターにより形質転換された大腸菌をＬＢ培地で培養し、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドにより誘導することにより発現させた。β２ミクログロブリンを発現させた大腸菌を超音波で破砕した際の不溶性画分を８モル尿素を含む緩衝液で溶解後、陰イオンクロマトグラフィーにより精製を行い、ヒト由来のβ２ミクログロブリンを得た。
【００２８】
＜β２ミクログロブリン−オレイン酸複合体の活性評価＞
作製したβ２ミクログロブリン−オレイン酸複合体の腫瘍細胞に対する細胞死誘導活性について、上記実施例１と同様の方法により評価した。その結果を図１（Ｂ）に示す。
＜結果＞
図１（Ｂ）に示すように、β２ミクログロブリン−オレイン酸複合体についても死細胞が観察され、アポトーシス誘導活性を有することが確認された。
【図１】
2013095684.tif 000002