(57)【要約】【課題】血管内皮細胞の新生、成長、増殖を抑制し、それらが原因となる光老化や創傷、癌の増殖や転移、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、加齢性黄斑変性、慢性気管支炎、粥状動脈硬化症、心筋梗塞等の疾患の治療及び予防に有効な薬剤を提供する。【解決手段】クロマメノキエキスを含有するトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）産生誘導剤及び血管新生阻害剤。【選択図】図１
2013177333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマメノキエキスを含有することを特徴とする、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）産生誘導剤。
【請求項２】
クロマメノキエキスを含有することを特徴とする、血管新生阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴＳＰ−１産生誘導活性を示すクロマメノキ（Vaccinium uliginosum）エキスを含有するＴＳＰ−１産生誘導剤及び血管新生阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは、血管が新たに形成される現象をいう。血管は、組織又は器官においてタンパク質分解酵素の働きにより血管の基底膜が分解されることで血管内皮細胞が遊走し、増殖して細胞外マトリックスに接着し、その血管内皮細胞が分化して血管腔を形成することにより新たに形成される。血管新生は、創傷治癒過程のような正常反応の他に、癌の増殖や転移、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、乾癬、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、加齢性黄斑変性症、慢性気管支炎、粥状動脈硬化症、心筋梗塞等の様々な疾患の病因、又は病態の悪化に関与していることでも知られる。
【０００３】
血管新生因子のうち、血管内皮増殖因子「ＶＥＧＦ」は、血管内皮細胞の増殖誘導と生存維持、血管透過性の亢進、血圧の調節、血小板による遊走、マクロファージに対する走化性などをはじめとして、血管新生のみならず、血管・血液・凝固系など多彩に機能している。血管内皮細胞のＶＥＧＦの発現又は活性を阻害する化合物は血管新生阻害剤として、上記癌、糖尿病性網膜症、各種関節炎をはじめとする様々疾患の治癒や予防、あるいは皮膚老化の予防、改善のための薬剤として期待される。
【０００４】
ＶＥＧＦとは対照的に、正常皮膚における血管新生抑制因子として主要な役割を演じているのは細胞外マトリックスタンパク質のトロンボスポンジン（ＴＳＰ）ファミリーの二種、ＴＳＰ−１とＴＳＰ−２である。ＴＳＰは、基底層のケラチノサイトを含む数種の皮膚の細胞により発現していて、真皮―表皮間の基底膜領域に堆積し、表皮の血管新生を防ぐ自然の抗血管新生バリアーとして働く。また、血管新生と血管の退行の間でＴＳＰの発現が調節されていることも判明している。
【０００５】
ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２等の血管新生抑制因子ノックアウトモデル、又は皮膚において血管新生促進因子ＶＥＧＦや血管新生抑制因子を過剰発現するトランスジェニックモデルを用いた in vivo の研究により、これらの血管新生促進因子や血管新生抑制因子のレベルの調節が、紫外線による損傷と皮膚のしわの程度、刺激性の皮膚反応、そして皮膚損傷の修復に著しい影響を及ぼすことが示されている（米国特許公開公報２００５−２８１７６１）。
【０００６】
尚、クロマメノキの抽出物には、サイトカインの分泌に起因する皮膚の色素沈着およびシワ防止作用を有することが知られているが（特許文献２）、このようなクロマメノキエキスにおいては、これまで血管新生能に関する効果は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公開公報２００５−２８１７６１
【特許文献２】特願２００７−５５１１９２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kim et al., J.Med. Food., 12, 885-892
【非特許文献２】Kim et al., 応用薬理, 80, 65(2011)
【非特許文献３】Zu et al., Chin. Med., J., 123, 2714-2719
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、血管内皮細胞の新生の抑制に有効な薬剤を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は鋭意検討の結果、クロマメノキエキスがＴＳＰ−１誘導活性を示すことを見出した。
【００１１】
従って、本発明は、クロマメノキエキスを含有することを特徴とする、ＴＳＰ−１産生誘導剤を提供する。
本発明はさらに、クロマメノキエキスを含有することを特徴とする、血管新生阻害剤を提供する。また、本発明は血管内皮細胞の新生、成長及び／又は増殖阻害するクロマメノキエキスを含有することを特徴とする、血管新生阻害剤を提供する。
別の態様において、本発明はクロマメノキエキスを適用することによりＴＳＰ−１の産生を誘導する方法を提供する。
さらなる別の態様において、本発明は血管新生阻害を必要とする対象者、具体的には血管内皮細胞の新生、成長、増殖が原因となる光老化や創傷、癌の増殖や転移、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、乾癬、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、加齢性黄斑変性、慢性気管支炎、粥状動脈硬化症、心筋梗塞等の疾患を患う対象者に有効量のクロマメノキエキスを適用することにより、血管新生を阻害する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
血管新生の病態は、糖尿病性の血管増殖性疾患や、腫瘍の増殖、リュ−マチ様関節炎などで解明されている。これらの病的な血管新生を阻害する治療法の開発が進行中であり、活用が期待できる。特に、血管新生阻害剤により腫瘍血管新生を阻害して、腫瘍の発育や転移を抑制することが可能になると考えられている。本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び血管新生阻害剤は、血管内皮細胞に対して静細胞的に作用するために抗がん剤と比較して副作用が強くなく、標的が正常細胞であるために、薬剤耐性が生じにくいという利点を有するものと考えられる。特に、現在使用されている血管新生阻害薬のほとんどはVEGF-VEGFRシステムを遮断するものであるが、副作用として高血圧、腎機能障害、出血、骨髄抑制、消化管窄孔などもたらすものが多い。その点、クロマメノキエキスは古来より食されており、長期間摂取による重篤な副作用は報告されていない点、有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】クロマメノキのＴＳＰ−１産生誘導効果の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ＴＳＰ−１の産生を誘導する薬剤のスクリーニングは、下記の実験において詳細に記載の通り、HaCaT細胞に各種候補薬剤を前もって作用させた後、紫外線を照射し、更に候補薬剤を作用させた細胞を回収した。TSP-1産生促進作用は、細胞中のTSP-1遺伝子の発現量をリアルタイムRT-PCR法で測定することにより評価し、TSP-1遺伝子の発現量を増強させる薬剤を有効薬剤として選定することで行った。
【００１５】
その結果、クロマメノキエキスがＴＳＰ−１の産生を誘導できることを見出した。クロマメノキエキスについては抗酸化作用（Kim et al., J.Med. Food., 12, 885-892）、コラーゲン産生促進作用、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（MMP-1）産生抑制作用（Kim et al., 応用薬理, 80, 65(2011)）、抗腫瘍作用（Zu et al., Chin. Med., J., 123, 2714-2719）などが知られているが、その作用メカニズムの詳細は十分には解明されていない。ましてや、それがＴＳＰ−１産生誘導活性や、血管新生阻害効果を示すなどは全く知られていない。
【００１６】
クロマメノキ（Vaccinium uliginosum）は、ツツジ科スノキ属の植物であり、日本では別名アサマブドウ, コウザンブドウと呼ばれ、英名ではbog bilberry, great bilberryとも呼ばれている。果実は美しい紫黒色で、美味である。クロマメノキは、平均気温が低い北半球の寒帯に広く分布し、冬季は厳寒の標高800〜1,500mの地域に自生している植物である。日本では高山地帯である長野県などに自生し、高山植物としても有名であり、果実が主にジャムとして摂取されている。クロマメノキは中国では果実収穫時に産地近辺で食される習慣があり, 古来より身体に良いベリー系食品として食されている。最近では中国でジュースが滋養強壮飲料として飲まれている。
【００１７】
クロマメノキエキスは常法により得ることができ、例えばクロマメノキ全体又はその一部、例えばその果実を抽出溶媒とともに常温で又は加熱して浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。溶媒抽出の前に、抽出部位を乾燥させてもよい。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等、あるいは水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を、それぞれ単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、溶媒として、水、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコールから選ばれる１種または２種以上が好適に使用される。
【００１８】
上記溶媒で抽出して得られた抽出物をそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。
【００１９】
クロマメノキエキスを含有する本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び／又は血管新生阻害剤は、ＴＳＰ−１の産生を誘導することで、血管内皮細胞の新生、成長、増殖を原因とする老化や様々な疾患の予防、抑制するのに極めて有効であると考えられる。
【００２０】
血管内皮細胞の新生、成長、増殖を原因とする老化とは、皮膚傷害や紫外線に対する暴露による光老化等を意味する。本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び／又は血管新生阻害剤は特に光老化の防止、抑制に有効であると考えられる。光老化とは、一般に日光に対する被曝が繰り返された結果として認められる皮膚の外見及び機能の変化を意味する。日光の構成要素である紫外線（ＵＶ）、特に中間ＵＶ（ＵＶＢと呼ばれる、波長２９０−３２０nm）が主として光老化を引き起こす。光老化を引き起こすのに必要なＵＶＢの被曝量は現在のところ知られていない。しかしながら、紅斑や日焼けを引き起こすレベルでのＵＶＢに対する繰り返しの被曝が、通常光老化に結びつく。臨床的には、光老化は肌荒れ、しわの形成、斑の着色、土色化、たるみの形成、毛細管拡張症の発症、ほくろの発生、紫斑病の発症、傷つき易くなる、萎縮、繊維症的色素除去領域の発生、前悪性腫瘍及び悪性腫瘍の発症等として特定され得る。光老化は普通、顔、耳、頭、首、と手のような、日光に習慣的に曝される皮膚に起こる。
【００２１】
また、本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び／又は血管新生阻害剤は、創傷治癒の促進、血管内皮細胞の新生、成長、増殖が関与する癌の増殖や転移、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、乾癬、リウマチ様関節炎、変形性関節炎、加齢性黄斑変性症、慢性気管支炎、粥状動脈硬化症、心筋梗塞等の疾患の治療及び予防等に有効な食品、医薬品又は化粧品として利用できる。
【００２２】
本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び／又は血管新生阻害剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び／又は血管新生阻害剤の投与形態は、経口、非経口、外用等であってよい。剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤を挙げることができる。
【００２３】
本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び／又は血管新生阻害剤のクロマメノキエキスの配合量は、当該剤全量中、乾燥物として0.0001〜20.0質量％、好ましくは0.0001〜10.0質量％である。
【００２４】
また、本発明に係るＴＳＰ−１産生誘導剤及び／又は血管新生阻害剤には、クロマメノキエキス以外に、その用途に応じ、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等、あるいは通常の食品や医薬品に使用される成分、例えば賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料等、を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２５】
その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンA類なども適宜配合することができる。
【実施例】
【００２６】
次に実験によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。配合量は質量％である。
【００２７】
実験方法
クロマメノキ果汁のTSP-1産生促進作用の評価
使用したクロマメノキエキスは冷凍保管しておいた中国産クロマメノキ果実を解凍し、搾汁後、濃縮して調製した濃縮果汁とした。
HaCaT細胞をDMEM/F12（Invitrogen）（10%FBS含有）培地に懸濁して６穴プレートに1穴あたり1×105細胞となるように播種し、80%コンフルエントになるまで培養した。その後、FBSを含有しない培地にクロマメノキ果汁を最終濃度0.1%になるように培養液に添加し12時間プレインキュベーションした。更に、クロマメノキ果汁無添加の培養液に換え、UVB（６0mJ/cm2）を照射した。再度、クロマメノキ果汁を添加した培養液に換え、４時間培養後、培養上清液を除去し細胞をPBSで洗浄し、細胞を回収した。TSP-1産生促進作用は、細胞中のTSP-1遺伝子の発現量をＴａｑＭａｎプローブ（Hs00962908_m1、Applied Biosystems）によるリアルタイムRT-PCR法で測定することにより評価した。また、β-アクチンの発現量により補正して相対的な発現量を算出した。β-アクチンのＴａｑＭａｎプローブとプライマーは以下のとおり。（forward primer 5’-TCACCGAGCGCGGCT-3’（配列番号１）, reverse primer 5’-TAATGTCACGCACGATTTCCC-3’（配列番号２））、probe（5’-FAM-CAGCTTCACCACCACGGCCGAG -TAMRA-3’（配列番号３））.
コントロールは、クロマメノキ果汁に代わりに水を作用させたものである。結果を図１に示す。その結果、クロマメノキ果汁は、UVB照射によって低下したTSP-1遺伝子の発現を亢進させ、TSP-1産生促進作用を有することが明らかになった。
【００２８】
［配合例１：錠剤］
ショ糖エステル                                 70mg
結晶セルロース                                 74mg
メチルセルロース                               36mg
グリセリン                                     25mg
コラーゲンペプチド                            390mg
ハトムギ抽出物（乾燥重量）                    100mg
TSP-1産生促進剤：クロマメノキエキス           100mg
（乾燥重量）
N-アセチルグルコサミン                        180mg
ヒアルロン酸                                  150mg
ビタミンE                                      30mg
ビタミンB6                                     20mg
ビタミンB2                                     10mg
α-リポ酸                                      20mg
コエンザイムQ10                                40mg
セラミド（コンニャク抽出物）                   55mg
L-プロリン                                    200mg
（合計）       1500mg
【００２９】
［配合例２：ドリンク剤（50mL）］
血管新生阻害剤：クロマメノキエキス            100mg
（乾燥重量）
ハトムギ抽出物（乾燥重量）                    100mg
還元麦芽糖水飴                                 28mg
エリスリトール                                  8mg
クエン酸                                        2mg
香料                                            1.3mg
N-アセチルグルコサミン                          1mg
ヒアルロン酸                                    0.5mg
ビタミンE                                       0.3mg
α-リポ酸                                       0.2mg
コエンザイムQ10                                 1.2mg
水                                             残余
【００３０】
［配合例３：美容液］
（配合成分）                                 （質量％）
（Ａ相）
９５％エチルアルコール                         10.0
ＰＯＥ（20）オクチルドデカノール                1.0
パントテニルエチルエーテル                      0.1
血管新生阻害剤：クロマメノキエキス（乾燥重量）   1.5
メチルパラベン                                  0.15
（Ｂ相）
水酸化カリウム                                  0.1
（Ｃ相）
グリセリン                                      5.0
ジプロピレングリコール                         10.0
亜硫酸水素ナトリウム                            0.03
カルボキシビニルポリマー                        0.2
精製水                                         残余
【図１】
2013177333.tif 000003
【配列表】
2013177333000001.app