(57)【要約】【課題】ＰＧＤ２受容体アンタゴニストとロイコトリエン受容体アンタゴニストを併用することにより、より強力な薬理作用を示す喘息治療剤を提供すること。【解決手段】式（Ｉ）：2013177351.tif 000009で表される化合物、又はその医薬上許容される塩と、モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストからなる群より選択される少なくとも一つの化合物、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物とを組み合わせることを特徴とする喘息治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2013177351.tif 000007
で表される化合物、又はその医薬上許容される塩と、
モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストからなる群より選択される少なくとも一つの化合物、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物
とを組み合わせることを特徴とする喘息治療剤。
【請求項２】
喘息が、気管支喘息、または急性気管支炎もしくは慢性気管支炎である、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
経口投与剤である、請求項１又は２記載の治療剤。
【請求項４】
式（Ｉ）：
【化２】
2013177351.tif 000008
で表される化合物、又はその医薬上許容される塩と、
モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストからなる群より選択される少なくとも一つの化合物、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物
からなる喘息治療用合剤。
【請求項５】
喘息が、気管支喘息、又は急性気管支炎もしくは慢性気管支炎である、請求項４記載の治療用合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、喘息治療剤に関する。さらに詳しくは、特定のＰＧＤ２受容体アンタゴニストと特定のロイコトリエン受容体アンタゴニストとを組み合わせることを特徴とする喘息治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アラキドン酸代謝のシクロオキシゲナーゼ回路の生成物であるプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）は、強力な気管支収縮作用を有し、血管透過性の亢進や好酸球などの炎症細胞の遊走を惹起するため、ＰＧＤ２受容体アンタゴニストが、アレルギー性疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎など）の治療に有用であることが知られている。
【０００３】
例えば、本件出願人は、ＰＧＤ２受容体の一つであるＤＰ受容体にアンタゴニスト活性を有するスルホンアミド誘導体をアレルギー性疾患治療剤として報告している（特許文献１参照）。
【０００４】
また、特許文献２には、ＰＧＤ２受容体アンタゴニストと、同じくアラキドン酸代謝の５−リポキシゲナーゼ経路の生成物であるロイコトリエン（ＬＴ）受容体アンタゴニストを併用し、喘息に対して異なる作用メカニズムを示す成分を併用することにより、抗喘息に対する相乗効果が発揮されることが報告されている。
【０００５】
特許文献３には、ＰＧＤ２受容体アンタゴニストと、ヒスタミンＨ１受容体アンタゴニスト及び／又はＬＴＤ４受容体アンタゴニストとの併用がアレルギー性鼻炎に有用であることが報告され、抗ヒスタミン剤としてはメピラミンが用いられている。一方、抗ＬＴ剤としては、モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストが例示されている。
【０００６】
喘息の治療には、ＬＴ受容体アンタゴニスト（例えば、モンテルカストナトリウム、ザフィルルカスト、プランルカスト水和物）、ＬＴ合成阻害薬（例えばジリュートン）、ＰＤＥ ＩＶ抑制剤（例えば、ロフルミラスト）、キサンチン誘導体（例えば、テオフィリン）、コルチコステロイド（例えば、フルチカゾン）、β２アゴニスト（例えば、サルメテロール）、抗ＩｇＥ抗体製剤（例えば、オマリズマブ）、Ｔｈ２サイトカイニン阻害剤（例えば、アイピーディー）、ヒスタミンＨ１受容体アンタゴニスト（例えば、ロラタジン）等が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０３７１８７号パンフレット
【特許文献２】ＷＯ２００６／１１８１６９号パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００１／０７８６９７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ＰＧＤ２受容体アンタゴニストとＬＴ受容体アンタゴニストを併用することにより、より強力な薬理作用を示す喘息治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特許文献１に記載のＰＧＤ２受容体アンタゴニストのうち特定の化合物（化合物ＩＩ−７４）と、特定のＬＴ受容体アンタゴニストとを組み合わせることにより、それぞれ単剤で投与する場合に比べてより強力な喘息症状を抑制することを新たに見出した。
【００１０】
即ち、本発明は、
（１）  式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
2013177351.tif 000002
【００１２】
で表される化合物又はその医薬上許容される塩と、
モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストからなる群より選択される少なくとも一つの化合物、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物
とを組み合わせることを特徴とする喘息治療剤、に関する。
【００１３】
さらに詳しくは、以下の（２）〜（８）に関する。
（２）喘息が、気管支喘息、又は急性気管支炎もしくは慢性気管支炎である、上記（１）記載の治療剤。
（３）  経口投与剤である、上記（１）又は（２）記載の治療剤。
（４）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を１０〜２００ｍｇと、モンテルカスト又はその医薬上許容される塩を２．５〜１０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（５）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を５０〜１００ｍｇと、モンテルカスト又はその医薬上許容される塩を４〜１０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（６）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を１０〜２００ｍｇと、ザフィルルカスト又はその医薬上許容される塩を５〜４０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（７）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を５０〜１００ｍｇと、ザフィルルカスト又はその医薬上許容される塩を１０〜４０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（８）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を１０〜２００ｍｇと、プランルカスト、その医薬上許容される塩、又はそれらの水和物を７〜４５０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（９）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を５０〜１００ｍｇと、プランルカスト、その医薬上許容される塩、又はそれらの水和物を１０〜４５０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の治療剤。
（１０）  式（Ｉ）：
【００１４】
【化２】
2013177351.tif 000003
【００１５】
で表される化合物、又はその医薬上許容される塩と、
モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストからなる群より選択される少なくとも一つの化合物、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物
からなる喘息治療用合剤。
（１１）喘息が、気管支喘息、又は急性気管支炎もしくは慢性気管支炎である、上記（１０）記載の治療用合剤。
（１２）  経口投与剤である、上記（１０）又は（１１）記載の喘息治療用合剤。
（１３）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を１０〜２００ｍｇと、モンテルカスト又はその医薬上許容される塩を２．５〜１０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の喘息治療用合剤。
（１４）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を５０〜１００ｍｇと、モンテルカスト又はその医薬上許容される塩を４〜１０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の喘息治療用合剤。
（１５）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を１０〜２００ｍｇと、ザフィルルカスト又はその医薬上許容される塩を５〜４０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の治療用合剤。
（１６）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を５０〜１００ｍｇと、ザフィルルカスト又はその医薬上許容される塩を１０〜４０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の治療用合剤。
（１７）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を１０〜２００ｍｇと、プランルカスト、その医薬上許容される塩、又はそれらの水和物を７〜４５０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の治療用合剤。
（１８）  式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬上許容される塩を５０〜１００ｍｇと、プランルカスト、その医薬上許容される塩、又はそれらの水和物を１０〜４５０ｍｇとを組み合わせることを特徴とする上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の治療用合剤。
【発明の効果】
【００１６】
式（Ｉ）で表されるＰＧＤ２受容体アンタゴニストとロイコトリエン受容体アンタゴニストを併用することにより、喘息に対し相乗的な治療効果を発揮し、安全性も高いことから、両剤の併用または合剤は、喘息の治療および／または予防剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ラット気道慢性炎症モデルにおいて、気道通気圧を示す図である。
【図２】ラット気道慢性炎症モデルにおいて、気道肺胞洗浄液中の細胞数を示す図である。
【図３】ラット気道慢性炎症モデルにおいて、気道肺胞洗浄液中のムチン量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の喘息治療剤は、有効成分として
（Ａ）式（Ｉ）：
【００１９】
【化１】
2013177351.tif 000004
【００２０】
で表される化合物、又はその医薬上許容される塩と、
（Ｂ）モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストからなる群より選択される又は少なくとも一つの化合物、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物
とを併用することを特徴とする。
【００２１】
（Ａ）ＰＧＤ２受容体アンタゴニスト
本発明で用いられるＰＧＤ２受容体アンタゴニストは、式（Ｉ）で表される化合物、その医薬上許容される塩、又はそれらの溶媒和物である。
【００２２】
式（Ｉ）で表される化合物は、［２−（Ｏｘａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（４−｛４−［（ｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）ｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ｝ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ］ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄであり、ＰＧＤ２受容体の一つであるＤＰ受容体にアンタゴニスト活性を有する。
【００２３】
式（Ｉ）で表される化合物は、公知の方法、例えば、ＷＯ２００７／０３７１８７号パンフレット、又はＷＯ２００８／１２３３４９号パンフレットに記載の方法に従って合成することができる。
【００２４】
（Ｂ）ＬＴ受容体アンタゴニスト
本発明で用いられるＬＴ受容体アンタゴニストとしては、モンテルカスト、ザフィルルカスト、プランルカスト等が挙げられる。
【００２５】
モンテルカストは、ＪＰ２，５０１，３８５、又はＵＳ５，５６５，４７３に記載されており、医薬上許容される塩を形成していてもよい。好ましい医薬上許容される塩として、モンテルカストナトリウム、（＋）−１−［［［（Ｒ）−３−［（Ｅ）−２−（７−Ｃｈｌｏｒｏ−２−ｑｕｉｎｏｌｙｌ）ｖｉｎｙｌ］−α−［２−（１−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｙｌ］ｔｈｉｏ］ｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔが挙げられる。モンテルカスト単独では、モンテルカストナトリウムとして、成人一日あたり１０ｍｇを一日１回就寝前に投与される。
【００２６】
ザフィルルカストは、ＪＰ１，９５５，８１０、又はＵＳ４，８５９，６９２に記載されており、Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌ  ３−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−［｛２−ｔｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ｝ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｂｅｎｚｙｌ）−１−ｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｅ−５−ｃａｒｂａｍａｔｅが挙げられる。医薬上許容される塩を形成していてもよい。ザフィルルカスト単独では、ザフィルルカストとして、成人１回あたり２０ｍｇを一日２回投与される。
【００２７】
プランルカストは、ＪＰ１，７４１，４６６、又はＵＳ４，７８０，４６９に記載されており、４−Ｏｘｏ−８−［４−（４−ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｏｘｙ）ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ］−２−（ｔｅｔｒａｚｏｌ−５−ｙｌ）−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ  ｈｅｍｉｈｙｄｒａｔｅが挙げられる。医薬上許容される塩を形成していてもよい。プランルカスト単独では、プランルカスト水和物として、成人一日あたり４５０ｍｇを一日２回に分けて投与される。
【００２８】
ＬＴ受容体アンタゴニストは、公知の方法に従って合成しても、市販品を用いてもよい。
【００２９】
本明細書において「医薬上許容される塩」としては、塩基性塩として、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩等のアルカリ土類金属塩；亜鉛塩、鉄塩等の遷移金属塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、エチレンジアミン塩、メグルミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等のヘテロ環芳香族アミン塩；テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。酸性塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マンデル酸塩、グルタル酸塩、リンゴ酸塩、安息香酸塩、フタル酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００３０】
溶媒和物は、任意の数の有機溶媒分子を配位する有機溶媒和物及び任意の数の水分子を配位する水和物を包含する。本明細書における「溶媒和物」としては、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその医薬上許容される塩の溶媒和物、モンテルカスト、ザフィルルカスト、及びプランルカストからなる群より選択される１又はそれ以上の化合物の溶媒和物、又はその医薬上許容される塩の溶媒和物を意味し、例えば、一溶媒和物、二溶媒和物、一水和物、二水和物等が挙げられる。特に、プランルカストの水和物が挙げられる。
【００３１】
なお、医薬上許容される塩及び溶媒和物は、公知の方法に従って合成することができる。
【００３２】
本発明の喘息治療剤は、上記（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせたものであれば特に限定はなく、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の有効成分を含有することができる。例えば、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト（例えば、ロイコトリエンＢ４受容体拮抗薬）、ロイコトリエン合成阻害薬（例えばジリュートン）、ＰＤＥ ＩＶ抑制剤（例えば、テオフィリン、シロミラスト、ロフルミラスト）、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、フルチカゾン、ブデソニド、シクレソニド）、β２アゴニスト（例えば、サルブタモール、サルメテロール、フォルメテロール）、抗ＩｇＥ抗体製剤（例えば、オマリズマブ）、ヒスタミンＨ１受容体アンタゴニスト（例えば、セチリジン、フェキソフェナジン、ロラタジン、クロルフェニラミン）、免疫抑制薬（例えば、プロトピック、シクロスポリン等）、トロンボキサンＡ２受容体拮抗薬（例えば、ラマトロバン）、ケモカイン受容体（特に、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３）拮抗薬、他のプロスタノイド受容体拮抗薬（例えば、ＰＧＤ２受容体アンタゴニスト、ＣＲＴＨ２アンタゴニスト）、接着分子拮抗薬（例えば、ＶLＡ−４拮抗薬）、サイトカイン拮抗薬（例えば、抗ＩＬ−４抗体、抗ＩＬ−３抗体）、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、プロピオン酸誘導体；イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン等、酢酸誘導体；インドメタシン、ジクロフェナク等、サリチル酸；アセチルサリチル酸等、シクロオキシゲナーゼ２阻害薬；セレコキシブ、エトリコキシブ等）との併用又は合剤として使用されうる。さらに、鎮咳薬（例えば、コデイン、ヒドロコデイン等）、コレステロール低下薬（例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン等）、抗コリン薬（例えば、チオトロピウム、イプラトロピウム、フルトロピウム、オキシトロピウム等）が挙げられる。これらの含有量は特に限定されない。
【００３３】
また、その他の製剤原料として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味剤、防腐剤、キレート剤、抗酸化剤、清涼化剤、コーティング剤、安定化剤、流動化剤、粘稠剤、溶解補助剤、増粘剤、緩衝剤、香料、着色剤、吸着剤、湿潤剤、防湿剤、帯電防止剤、可塑剤、消泡剤、界面活性剤、乳化剤等の添加剤を含有してもよい。具体的には、結合剤（例えば、トウモロコシでん粉等）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース等）、崩壊剤（例えば、でん粉グリコール酸ナトリウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）等が挙げられる。これらの含有量は特に限定されない。
【００３４】
本発明の喘息治療剤は、上記（Ａ）成分と（Ｂ）成分を組み合わせたものであれば特に限定はなく、当業者に公知の方法に従って、調製することができる。また、治療剤の形状や大きさも特に限定はないが、経口用製剤が好ましく、なかでも固形製剤がより好ましい。固形製剤の剤形としては、錠剤（口腔内速崩解錠、咀嚼可能錠、発泡錠、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、トローチ剤、顆粒剤、丸剤、散剤（細粒剤を含む）、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤を含む）等を例示できる。またこれらを調製するにあたり、造粒を実施してもしなくてもよく、公知の方法によってコーティング処理を行ってもよい。
【００３５】
本発明の喘息治療剤が錠剤である場合、例えば、上記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分に所望の製剤原料を加えて混合することにより得られた混合物を、そのまま、或いは公知の方法に従って造粒後に、打錠機に投入して成型加工する方法により調製することができる。
【００３６】
本発明の喘息治療剤は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を有効成分として組み合わせることを特徴とするのであって、その使用形態としては、（Ａ）成分と（Ｂ）成分それぞれについて別途調製された単剤を同時に使用する態様と、（Ａ）成分と（Ｂ）成分それぞれについて別途調製された単剤を別々に使用する態様と、（Ａ）成分と（Ｂ）成分を一緒に処方して調製された製剤（合剤）として使用する態様とが挙げられる。本発明においては、患者のＱＯＬ（Ｑｕｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）の観点から、合剤として使用する態様が挙げられる。
【００３７】
喘息治療剤として用いる場合の（Ａ）成分と（Ｂ）成分の投与量は、投与形態、患者の症状、年令、体重、性別、あるいは他の併用される薬物（あるとすれば）などにより異なり、最終的には医師の判断に委ねられる。例えば、（Ｂ）成分がモンテルカストの場合、成人１日あたり、（Ａ）成分を１０〜２００ｍｇ及び（Ｂ）成分を２．５〜１０ｍｇ経口投与する態様が挙げられる。さらに、（Ａ）成分を５０〜１００ｍｇ及び（Ｂ）成分を５〜１０ｍｇ経口投与する態様が挙げられる。
【００３８】
例えば、（Ｂ）成分がザフィルルカストの場合、成人１日あたり、（Ａ）成分を１０〜２００ｍｇ及び（Ｂ）成分を５〜４０ｍｇ経口投与する態様が挙げられる。さらに、（Ａ）成分を５０〜１００ｍｇ及び（Ｂ）成分を１０〜４０ｍｇ経口投与する態様が挙げられる。
【００３９】
例えば、（Ｂ）成分がプランルカストの場合、成人１日あたり、（Ａ）成分を１０〜２００ｍｇ及び（Ｂ）成分を７〜４５０ｍｇ経口投与する態様が挙げられる。さらに、（Ａ）成分を５０〜１００ｍｇ及び（Ｂ）成分を１０〜４５０ｍｇ経口投与する態様が挙げられる。
【００４０】
なお、かかる投与量は、一度に投与しても分割して投与してもよい。
【００４１】
本発明の治療剤は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分の相乗効果により喘息症状を抑制する効果に優れているが、喘息症状の予防のために予防剤として投与することができる。なお、本明細書において、「喘息治療剤」とは、気管支喘息、気管支炎又は気道過敏症に治療又は／及び予防効果を有する薬剤であり、気管支拡張剤、気道過敏性亢進抑制剤、粘液分泌抑制剤、又は気道炎症性細胞浸潤抑制剤が挙げられる。また、「相乗効果」とは、２種類以上（通常は２種類）の薬剤の併用効果が、それぞれ薬剤の単独効果の和よりも有意に大きい場合を意味する。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００４３】
試験例１  ラット気道炎症モデルを対象とした気道過敏性試験
雄性ラット（ＢＮ／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールズリバー社製）に以下の方法により気道炎症を惹起して、ラットの慢性的な気道炎症モデルを作製した。具体的には、初日（ｄａｙ０）に、ラットに１ｍｇ／ｍＬの水酸化アルミニウム溶液で０．１  ｍｇ／ｍＬとなるよう調製したＯＶＡ溶液を１ｍＬずつ腹腔内投与した。１２、１９、２６及び３３日後（ｄａｙ１２、１９、２６及び３３）に、１％  ＯＶＡ溶液を調製し、３０分間ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１７、Ｏｍｒｏｎ）にてチャンバー中のラットを自然吸入させ、抗原刺激を行うことにより、気道炎症が惹起されたラット気道炎症モデルを作製した。なお、対照となるＣｏｎｔｒｏｌ群は、ＯＶＡ溶液を腹腔内投与する代わりに生理的食塩水を腹腔内投与して作製した。
【００４４】
得られたラット気道炎症モデルを以下の表１に示す群に群分けした。即ち、群１：Ｃｏｎｔｒｏｌ群（気道炎症が惹起されていないモルモットに媒体のみ投与する群）、群２：Ｖｅｈｉｃｌｅ群（気道炎症モデルに媒体のみ投与する群）、群３：式（Ｉ）で表される化合物０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、、群４：モンテルカスト（Ｍｏｎｔ）１０ｍｇ／ｋｇ投与群、群５：式（Ｉ）０．１ｍｇ／ｋｇおよびＭｏｎｔ１０ｍｇ／ｋｇ投与群を準備した。
【００４５】
次いで、３３、３４及び３５日目（ｄａｙ３３、３４及び３５）に、表１に示す被検物質を０．５％  メチルセルロース（ＭＣ）溶液を媒体に用いて１日一回経口投与した。なお、３３日目（ｄａｙ３３）の投与は、ＯＶＡ曝露の１時間前に行った。
さらに気道収縮の測定とアセチルコリンの投与の準備として、３６日目（ｄａｙ３６）にラットをｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  （８０  ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，  ｉ．ｐ．，  大日本住友製薬）で麻酔後、気道と内頸静脈にカニュレを装着した。毎分６０回、１回３ｍＬの空気を送気する人工呼吸器（ＳＮ−４８０−７、シナノ製作所）を接続し、吸入パイプの側枝からオーバーフローする空気圧を圧トランスジューサー（ＴＰ−４００Ｔ、日本光電)よりひずみ圧力アンプ（ＡＰ−６０１Ｇ、日本光電）を介して熱書記録器（ＷＴ−６４５Ｇ、日本光電）に記録した。この空気圧を気道通気圧とし、気道過敏性の評価は、アセチルコリンを５分後毎に用量を上げながら投与（３．９、７．８、１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０及び５００μｇ／ｋｇ）した際の、気道通気圧の用量反応曲線下面積から行った。ここで用いたアセチルコリンは、市販のアセチルコリン（ナカライテスク）を生理食塩水で５００μｇ／ｍＬとなるよう調製したものを、気道反応性の測定前にさらに２倍系列の希釈を行い調製したものを用いた。
また、群間比較は片側ｔ検定により行ない、群２（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）に対する抑制率は、下記式：
抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ−Ｃ）×１００
Ａ：群２の気道通気圧の用量反応曲線下面積
Ｂ：被験物質を投与した群の気道通気圧の用量反応曲線下面積
Ｃ：群１の気道通気圧の用量反応曲線下面積
を用いて算出した。結果を図１に示す。
【００４６】
【表１】
2013177351.tif 000005
【００４７】
図１より、式（Ｉ）（０．１ｍｇ／ｋｇ）とモンテルカスト（１０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与群（群５）は、８１％抑制を示し、式（Ｉ）０．１ｍｇ／ｋｇ単剤投与群（群３）の抑制率とモンテルカスト単剤投与群（群４）の抑制率の和である６３％（３６％と２７％の和）よりも強い抑制を示した。
【００４８】
試験例２  ラット気道炎症モデルを対象とした気道肺胞洗浄液中の細胞数測定試験
気道過敏性測定後のラットを用いて試験を行った。すなわち、気道過敏性測定後のラットに対してペントバルビタールを過剰量腹腔内投与し、安楽死させた。その後、ラットの気道内腔を、冷やした生理食塩水５ｍＬで３回洗浄を行った。これを気道肺胞洗浄液（ＢＡＬ）とし、チュルクで染色し、血球計を用いて細胞数を顕微鏡でカウントした。結果を図２に示す。また、浸潤した細胞数の群２（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）に対する抑制率（％）を、試験１と同様の方法を用いて算出した。
さらにＣｙｔｏｓｐｉｎ  ３  （Ｓｈａｎｄｏｎ）を用いて細胞をスライドガラス上に固定した後、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色を行い、細胞の種類を見分けた。細胞の種類ごとに、群２（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）に対する抑制率（％）を、試験１と同様の方法を用いて算出した。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
図２より、式（Ｉ）（０．１ｍｇ／ｋｇ）とモンテルカスト（１０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与群（群５）は、４６％抑制を示し、式（Ｉ）０．１ｍｇ／ｋｇ単剤投与群（群３）の抑制率とモンテルカスト単剤投与群（群４）の抑制率の和である１７％（２０％と−３％の和）よりも強い抑制を示した。また、細胞別においても、マクロファージ、好酸球、好中球およびリンパ球のいずれにおいても、併用による効果は単剤の抑制の和以上であった（表２）。
【００５１】
試験例３  ラット気道炎症モデルを対象とした気道肺胞洗浄液中のムチン量測定試験
試験例２で得られたＢＡＬ液を１０００ｒｐｍ、４°Ｃ（８８００、Ｋｕｂｏｔａ）で１０分間遠心した後、上清を回収し、ムチン結合レクチンであるｊａｃａｌｉｎを用いてムチン量を定量した。すなわち、９６穴プレートにＢＡＬ液またはムチンスタンダード（Ｓｉｇｍａ）をコートし、２時間３７℃で放置後、Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ（大日本住友製薬）でブロッキングを行った。その後、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むリン酸バッファーで洗浄し、２．５μｇ／ｍＬ  ビオチン化ｊａｃａｌｉｎ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えて１時間３７°Ｃ処置した。再度プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むリン酸バッファーで洗浄後、１／１０００に希釈したｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ結合ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、３０分間室温で反応させた。さらにプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含むリン酸バッファーで洗浄後、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （Ｓｉｇｍａ）を加えた後に、３Ｎ水酸化ナトリウムを加え、反応を停止させた。４０５  ｎｍにおける吸光度をｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｒｅａｄｅｒ  （ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ２１０３，  Ｗａｌｌａｃ）で測定し、ムチンスタンダードによる検量線から気道肺胞洗浄液中のムチン量を算出した。また、群２（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）に対する抑制率（％）を、試験１と同様の方法を用いて算出した。結果を図３に示す。
【００５２】
図３より、式（Ｉ）（０．１ｍｇ／ｋｇ）とモンテルカスト（１０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与群（群５）は、７０％抑制を示し、式（Ｉ）０．１ｍｇ／ｋｇ単剤投与群（群３）の抑制率とモンテルカスト単剤投与群（群４）の抑制率の和である−３％（３％と−６％の和）よりも強い抑制を示した。
【００５３】
以上の結果から、プロスタグランジンＤ２受容体拮抗薬である式（Ｉ）とＬＴ受容体拮抗薬であるモンテルカストとの併用は喘息治療に対し、それぞれの単剤治療よりも有効性が増すことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の喘息治療剤の効果は、喘息に対しそれぞれの薬剤を単独で投与した効果の和を超えることから、強力な薬理効果を有する喘息治療剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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