(57)【要約】【課題】従来公知の抗酸化ストレス剤に代替しうる新規な抗酸化ストレス剤、およびその用途を提供する。【解決手段】明細書に記載の化合物１および／または化合物２を有効成分として含有する抗酸化ストレス剤と、これを含有する薬剤組成物や皮膚外用剤組成物（化粧品など）、飲食品により、上記課題は解決されうる。【選択図】図３
2013194007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化合物１および／または化合物２：
【化１】
2013194007.tif 000006
を有効成分として含有する、抗酸化ストレス剤。
【請求項２】
抗酸化ストレス剤の作用発現が抗酸化タンパク質の発現増強作用である、請求項１に記載の抗酸化ストレス剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗酸化ストレス剤と、製薬上許容されうる担体とを含有し、酸化ストレスが関連する疾患または病態の予防および／または治療に用いられる、薬剤組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の抗酸化ストレス剤と、製薬上許容されうる担体とを含有する、皮膚外用剤組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の皮膚外用剤組成物からなる、化粧品。
【請求項６】
請求項１または２に記載の抗酸化ストレス剤を含有する、飲食品。
【請求項７】
請求項１または２に記載の抗酸化ストレス剤を有効量含有する飲食品であって、
神経変性疾患、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、炎症性腸疾患、および／または眼疾患を予防および／または改善する機能を有し、その機能表示が付された、飲食品。
【請求項８】
健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、または病者用食品である、請求項７に記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化ストレス剤およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸素を利用してエネルギーを得る生体では、常に活性酸素種（reactive oxygen species；ＲＯＳ）が産生される。ＲＯＳは反応性が高く、タンパク質、脂質、ＤＮＡ等の機能分子を修飾して、細胞機能障害を惹起する。細胞はＲＯＳに対する防御機構を備えているが、過剰のＲＯＳが蓄積すると酸化ストレスが生じ、神経変性疾患、虚血性脳血管障害等の酸化ストレスが関連する疾患の発症や症状が進展すると考えられている。
【０００３】
異物代謝や酸化ストレス応答において重要な役割を果たす転写因子であるNF-E2 related factor 2（Ｎｒｆ２）は、薬物代謝第２相酵素や抗酸化タンパク質などの遺伝子の上流に存在する抗酸化剤応答配列（antioxidant response element；ＡＲＥ）に結合することで、これらの遺伝子の発現を調節している。
【０００４】
Ｎｒｆ２は刺激のない状態ではシステインに富むタンパク質Ｋｅａｐ１と結合して細胞質内に局在している。しかし、Ｋｅａｐ１に内在するシステイン残基が親電子性物質やＲＯＳなどにより酸化的修飾を受けると、Ｋｅａｐ１のコンフォメーション変化が起こり、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から解離し、核内に移行する。核内に移行したＮｒｆ２は、小Ｍａｆ群転写因子とヘテロダイマーを形成してＡＲＥに結合することで、ＨＯ−１（ヘムオキシゲナーゼ１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＮＱＯ１などの抗酸化タンパク質の発現を亢進させる。
【０００５】
このように、Ｎｒｆ２の活性化は一群の抗酸化タンパク質の発現を亢進させることから、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路は酸化ストレスに対する生体防御機構において中心的な役割を担っていると考えられている。ドーパミン受容体アゴニストであるアポモルフィン（Ａｐｏ）は酸化ストレスに対する神経細胞保護作用を有しているが、Ａｐｏのこの保護作用にＮｒｆ２−ＡＲＥ経路が関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。
【０００６】
一方、リノール酸誘導体である９−オキソ−１０Ｅ，１２Ｚ−オクタデカジエン酸や１３−オキソ−９Ｚ，１１Ｅ−オクタデカジエン酸が、Ｎｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化することが非特許文献２において報告されており、これらのリノール酸誘導体が、薬物代謝第２相酵素や抗酸化タンパク質の発現誘導を介して、酸化ストレスにより惹起される組織の損傷を低減させる可能性が示唆されている。しかしながら、他のリノール酸誘導体がＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化しうることや、これによって酸化ストレスが軽減されることについては知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】原 宏和、YAKUGAKU ZASSHI 127(8)1199-1205(2007)
【非特許文献２】Wang et al., Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. Author Manuscript; available in PMC 2010 July 1.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来公知の抗酸化ストレス剤に代替しうる新規な抗酸化ストレス剤、およびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上述したような従来技術の現状に鑑み、鋭意検討を行なった。その過程で、驚くべきことに、非特許文献２に開示されているのとは異なるリノール酸誘導体がＮｒｆ２−ＡＲＥ経路を活性化すること、そして、これによってＨＯ−１等の抗酸化タンパク質の発現の増強を介して抗酸化ストレス作用を示しうることを見出した。そしてこの知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の一形態によれば、下記の化合物１および／または化合物２：
【００１１】
【化１】
2013194007.tif 000003
【００１２】
を有効成分として含有する、抗酸化ストレス剤が提供される。なお、上記抗酸化ストレス剤の作用発現は、抗酸化タンパク質の発現増強作用であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明の他の形態によれば、上記抗酸化ストレス剤と、製薬上許容されうる担体とを含有し、酸化ストレスが関連する疾患または病態の予防および／または治療に用いられる、薬剤組成物もまた、提供される。
【００１４】
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記抗酸化ストレス剤と、製薬上許容されうる担体とを含有する、皮膚外用剤組成物が提供される。当該皮膚外用剤組成物からなる化粧品もまた、提供される。
【００１５】
また、本発明のさらに他の形態によれば、上記抗酸化ストレス剤を含有する飲食品もまた、提供される。
【００１６】
さらに、本発明のさらに他の形態によれば、上記抗酸化ストレス剤を有効量含有する飲食品であって、神経変性疾患、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、炎症性腸疾患、および／または眼疾患を予防および／または改善する機能を有し、その機能表示が付された、飲食品もまた、提供される。当該飲食品は、好ましくは、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、または病者用食品である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来公知の抗酸化ストレス剤に代替しうる新規な抗酸化ストレス剤、およびその用途が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例において、ＨＰＬＣ条件１により化合物を単離した際に得られたクロマトグラムである。
【図２】実施例において、ＨＰＬＣ条件２により化合物を単離した際に得られたクロマトグラムである。
【図３】実施例において、アーティチョークの可食部から単離した化合物のＡＲＥエンハンサー活性を、レポーターアッセイにより評価した結果を示すグラフである。
【図４】実施例において、アーティチョークの可食部から単離した化合物のＨＯ−１タンパク質の発現に対する効果を、ウェスタンブロットにより評価した結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための具体的な形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の具体的な形態のみに限定されるわけではない。
【００２０】
本発明の一形態は、下記の化合物１および／または化合物２：
【００２１】
【化２】
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【００２２】
を有効成分として含有する、抗酸化ストレス剤である。
【００２３】
本形態に係る抗酸化ストレス剤の有効成分である化合物１および化合物２については、市販品が存在する場合には当該市販品を入手したものを用いてもよいし、自ら合成したものを用いてもよい。また、場合によっては、天然物から抽出・精製したものを用いてもよい。後述する実施例に記載のように、本発明者らは、キク科チョウセンアザミ属の多年草であるアーティチョーク（Cynara scolymus）の可食部から、上記化合物１および化合物２を抽出した。したがって、後述する実施例に記載の手法を用いて、またはこれを一部改変した手法を用いて、上記化合物１または化合物２を得ることも可能である。
【００２４】
上述した化学式１で表される化合物は、化合物自体であってもよいし、適用可能である限り、当該化合物製薬上許容されうる塩、プロドラッグおよび溶媒和物を含む。例えば、カチオンと、化学式１で表される化合物上の負荷電基との間でも塩が形成されうる。適当なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびテトラメチルアンモニウムイオン等のアンモニウムカチオンが挙げられる。本化合物には、第４級窒素原子を含むこれらの塩もまた含まれる。プロドラッグの例としては、エステルや他の製薬上許容されうる誘導体が挙げられ、これらは対象への投与によって活性な化合物を提供することができる。溶媒和物とは、活性化合物と製薬上許容されうる溶媒との間で形成される複合体を意味する。製薬上許容されうる溶媒としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられる。
【００２５】
上述したように、本発明の一形態によれば抗酸化ストレス剤が提供されるが、「酸化ストレス」とは、酸化反応と抗酸化反応のバランスが崩れ、前者に傾くことにより生じる生体にとって好ましくない状態のことである。生体内の抗酸化システムで処理しきれなくなったＲＯＳ等が生じた場合、生体の構造や機能を担っている脂質、タンパク質、酵素、および遺伝情報を担う遺伝子ＤＮＡが酸化されて損傷を受け、生体の構造や機能が乱される。その結果、多岐にわたる疾患が誘発され、老化が促進されるとともに、がんや生活習慣病にも羅患しやすくなる。
【００２６】
「抗酸化ストレス剤」とは、上述したような生体での酸化反応と抗酸化反応のバランスが崩れた状態を修復し、生体の構造や機能を回復させる剤である。このような機能を有する抗酸化ストレス剤は、酸化ストレスが関連する疾患または病態（例えば、神経変性疾患、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、炎症性腸疾患、眼疾患および／または関節リウマチなど）を予防および／または治療するために用いられうる。ここで、上記で例示した酸化ストレスが関連する疾患または病態について、神経変性疾患としてはアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、プリオン病などが例示される。また、虚血性脳血管障害としては、脳梗塞、一過性脳虚血発作などが例示される。さらに、虚血性心疾患としては、狭心症、心筋梗塞などが例示される。炎症性腸疾患としては、潰瘍性大腸炎、クローン病などが例示される。眼疾患としては、網膜症、白内障、緑内障、加齢黄斑変性などが例示される。
【００２７】
本発明の一形態による抗酸化ストレス剤は、上述した化合物１および／または化合物２を有効成分として含む。これらの双方を有効成分として含んでももちろんよい。ここで、「有効成分として含む」とは、本発明に係る抗酸化ストレス剤が、所望の抗酸化ストレス効果を発揮するのに充分な量（すなわち、有効量）の化合物１および／または化合物２を含有することを意味する。
【００２８】
したがって、化合物１および／または化合物２を、そのまま抗酸化ストレス剤として用いてもよいが、このような有効量で有効成分を含み、かつ抗酸化ストレス効果を損なわない限りにおいて、本発明に係る抗酸化ストレス剤は、所望の製品形態に応じた製薬上許容されうる担体や、他の添加剤などとともに組成物を構成してもよい。また、本発明に係る抗酸化ストレス剤は、賦形剤などの添加剤と混合して非経口投与、経口投与または外部投与に適した、医薬品、医薬部外品などの薬剤組成物のほか、食品、化粧品などの形で使用することができる。例えば、本発明の好ましい一実施形態によれば、上述した化合物１および／または化合物２を有効成分として含む抗酸化ストレス剤と、製薬上許容されうる担体とを含有する、皮膚外用剤組成物が提供される。当該皮膚外用剤組成物は、医薬品である場合には、皮膚組織における酸化ストレスが関連する疾患または病態の予防および／または治療に用いられうる。また、当該皮膚外用剤組成物は、化粧品である場合には、皮膚組織における酸化ストレスが関連する疾患または病態の予防および／または改善に用いられうる。
【００２９】
本発明の抗酸化ストレス剤を医薬品として利用する場合の投与量は、患者の年齢、症状等により大きく変動するが、一般には、経口投与の場合、乾燥重量として１〜２０００ｍｇ／日の範囲であることが望ましい。食品に配合する場合は、その効果や添加した際の香り、色調の点から考え、０．０１〜５０質量％の濃度範囲とすることが好ましい。
【００３０】
医薬品に使用する場合、治療的有効量の上記化合物（化合物１および／または化合物２）が、１つまたは複数の製薬上許容されうる担体（添加剤）および／または希釈剤とともに処方される。以下で詳細に説明するように、本発明に係る薬剤組成物は固体または液体での投与のために具体的に処方することができる。経口投与として、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末薬、顆粒剤、舌に塗布するためのペーストが例示される。非経口投与としては、例えば、滅菌溶液もしくは懸濁液として例えば皮下、筋内もしくは静脈内注射のための製剤、あるいは、局所用として、または、膣内または直腸内へ投与するための剤形へと製剤化されうる。特に、皮膚外用剤とする場合、その形態は特に限定されず、医薬品であれば、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチなどの形態が例示される。また、化粧品であれば、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリーム、化粧用ゲル、美容液、パック剤、ファンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、洗顔剤、ボディソープ、ハンドクリーム、シャンプー、リンス、整髪料等のスキンケア用品またはメイクアップ用品の形態が例示される。なかでも、広範囲の部位に適用できる点で、化粧水、化粧用ゲル、化粧用乳液、化粧用クリーム、美容液が好ましく、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリームがより好ましい。
【００３１】
「治療的有効量」とは、いずれの医療にも適用可能な妥当な便益／リスク比で、何らかの所望の治療効果を生じるために有効な作用物質または組成物の量を意味する。例えば、本発明に係る抗酸化ストレス剤の投与量は、対象疾患、投与対象、投与経路などにより差異はあるが、アルツハイマー病の治療目的で本発明の抗酸化ストレス剤を経口投与する場合、用量は対象となる者の体重等の条件によって容易に変動しうるため、当業者によって適宜選択されうる。
【００３２】
「製薬上許容されうる」とは、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題や合併症なしに、ヒトおよび動物の組織に接触しての使用に好適な、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために使用される。
【００３３】
「製薬上許容されうる担体」とは、体の一器官または一部から体の別の器官または一部へ本発明の抗酸化ストレス剤を運搬または輸送することに関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、補形薬、溶剤またはカプセル化材料のような、製薬上許容されうる材料、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、剤形の他の成分と適合し、患者に有害でないという意味で「許容されうる」ものでなければならない。製薬上許容されうる担体として機能しうる材料のいくつかを以下に例示すると、ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖；トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンのようなデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロースおよびその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような補形薬；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油のような油脂；プロピレングリコールのようなグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのようなポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩液；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに薬物処方で使用される他の非毒性の適合物質を含む。いくつかの実施形態では、薬物製剤は非発熱性である。すなわち、患者の体温を上昇させないものが好ましい。
【００３４】
その他、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、被覆剤、甘味料、香味剤および香料、保存料および酸化防止剤もまた組成物中に存在してもよい。
【００３５】
製薬上許容されうる酸化防止剤の例には以下のものがある：アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性酸化防止剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性酸化防止剤；ならびにクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤も必要に応じて含有させることができる。
【００３６】
経口投与に好適な本発明の剤形は、カプセル、カシェ、丸薬、錠剤、ロゼンジ（味付けされた主薬、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント、を用いる）、粉末、顆粒、の形態でもよく、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水液体乳剤として、またはエリキシルもしくはシロップとして、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムのような不活性基剤を用いる）および／または含嗽剤等としてでもよく、それぞれ活性成分として所定量の本発明の化合物を含む。本発明の作用物質は、巨丸剤、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。
【００３７】
経口投与のための本発明の固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末薬、顆粒剤等）では、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムのような１つまたは複数の製薬上許容されうる担体、および／または以下のもののいずれかと混合される：デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸のような充填剤または増量剤；例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムのような粘結剤；グリセロールのような保湿剤；寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤；パラフィンのような溶解遅延剤；４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤；タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物のような潤滑剤；ならびに着色剤。カプセル、錠剤および丸薬の場合、薬物組成物は緩衝剤を含んでもよい。同様の種類の固体組成物が、ラクトースまたは乳糖のような補形薬と、高分子量ポリエチレングリコール等とを用いたソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル内の充填剤としても使用可能である。
【００３８】
錠剤は、圧縮または成形によって、随意に１つまたは複数の副成分とともに、作製されうる。圧縮された錠剤は、粘結剤（例えば、ゼラチンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤（例えば、グリコール酸ナトリウムデンプンもしくは架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製されうる。成形タブレットは、不活性液体希釈剤で湿潤化された粉末化合物の混合物を好適な機械で成形することによって作製されうる。
【００３９】
糖衣錠、カプセル、丸薬および顆粒剤のような、本発明に係る薬剤組成物の錠剤等の固体投薬形態は、随意に、刻み目を付けられ、または薬物調剤分野において周知の腸溶性被膜等の被膜および殻を用いて調製されてもよい。それらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための種々の比率でのヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて、内部の活性成分の緩徐なまたは制御された放出を提供するように調剤されてもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用直前に滅菌水等の滅菌注射可能媒質に溶解することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌してもよい。これらの組成物は、随意に乳白剤を含んでもよく、胃腸管のある特定の部分のみで、またはそこで優先的に、随意に遅延したやり方で、１つまたは複数の活性成分を放出する組成であってもよい。使用可能な埋込み組成物の例として、ポリマー物質およびワックスがある。活性成分は、適当であれば１つまたは複数の上記の補形薬とともに、マイクロカプセル化された形態であってもよい。
【００４０】
本発明の化合物の経口投与のための液体投薬形態としては、製薬上許容されうる乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルがある。液体投薬形態は、活性成分に加えて、例えば水や他の溶媒のような当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１、３−ブタジエングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルのような可溶化剤および乳化剤、およびそれらの混合物を含んでもよい。
【００４１】
不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味剤、着色剤、香料および保存剤のような補助薬を含んでもよい。
【００４２】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物のような懸濁剤を含んでもよい。
【００４３】
直腸または膣投与のための本発明の薬物組成物の剤形は、坐薬として提示されうる。この坐薬は、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチル酸塩を含む１つまたは複数の好適な非刺激性補形薬または担体と、本発明の１つまたは複数の作用物質を混合することによって調製することが可能であり、室温で固体であるが、体温では液体であるため、直腸または膣腔で融解し、活性化合物を放出することになる。
【００４４】
膣投与に好適な本発明の剤形はまた、当技術分野で適当であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡またはスプレー剤形も含む。
【００４５】
本発明の１つまたは複数の抗酸化ストレス剤を局所的または経皮的投与の投薬形態は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬を含む。活性作用物質は、薬学的に許容し得る基材と、および必要であれば保存料、緩衝液、または推進剤と、滅菌条件下で混合してもよい。
【００４６】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本発明の活性化合物に加えて、動物脂または植物脂、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物のような補形薬を含んでもよい。
【００４７】
粉末およびスプレーは、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物のような補形薬を含んでもよい。スプレーは、塩化フッ化炭化水素や、ブタンおよびプロパンのような揮発性非置換炭化水素のような通例の高圧ガスをさらに含んでもよい。
【００４８】
経皮的パッチは、本発明の抗酸化ストレス剤を、体に制御して配送するという更なる利点を有する。このような投薬形態は、適当な媒質に本発明の抗酸化ストレス剤を溶解または分散させることによってなされうる。吸収増進剤を用いて、皮膚を横切る本発明の抗酸化ストレス剤を含有する物質のフラックスを上昇させることも可能である。このようなフラックスの速さは、速さ制御膜を設けるか、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に化合物を分散させるかのいずれかによって制御することができる。
【００４９】
非経口投与に好適な本発明の抗酸化ストレス剤を有する薬剤組成物は、本発明の１つまたは複数の活性化合物とともに、１つまたは複数の製薬上許容されうる滅菌等張水溶液または非水溶液、分散剤、懸濁液もしくは乳剤、または使用直前に滅菌注射可能溶液または分散剤中で戻すことが可能な滅菌粉末を含み、これは酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、調剤を目的レシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは濃縮剤を含みうる。
【００５０】
本発明の抗酸化ストレス剤を有する薬剤組成物において使用可能な好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油のような植物油、ならびにオレイン酸エチルのような注射可能有機エステルがある。固有の流動性は、例えば、レシチンのような被覆材料の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【００５１】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤のような補助薬を含んでもよい。微生物の活動の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤の含有によって確保し得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めると好ましい。さらに、注射可能薬物形態の持続性吸収が、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる作用物質の含有により引き起こされうる。
【００５２】
本発明によれば、上述した抗酸化ストレス剤を含有する飲食品もまた、提供される。ここで、当該飲食品は、抗酸化ストレス剤の有効成分を有効量含むように、当該抗酸化ストレス剤を適切な量で含むことが好ましい。ここで「有効成分を有効量含む」とは、個々の飲食品を通常喫食される量摂取した結果、有効成分としての効果を発揮しうるような量で有効成分を含有することを意味する。本発明に係る飲食品には、本発明に係る有効成分をそのまま、または上述したような抗酸化ストレス剤の形態で、飲食品に配合してもよい。また、本発明に係る飲食品は、本発明に係る有効成分に安定剤等の慣用の添加成分を加えて飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を、それらにさらに配合して調製したもの、液状、半液体状もしくは固体状にしたもの、ペースト状にしたもの、または、一般の飲食品へ有効成分を添加したものであってもよい。
【００５３】
本発明において、「飲食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が経口摂取可能な形態のものであれば特に制限はなく、その形態も液状物（溶液、懸濁液、乳濁液など）、半液体状物、粉末、または固体成形物のいずれのものであってもよい。このため飲食品は、例えば飲料の形態であってもよく、また、サプリメントのような栄養補助食品の錠剤形態であってもよい。
【００５４】
飲食品として具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品などの水産加工品；畜肉ハム・ソーセージなどの畜産加工品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、漬け物、煮豆、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品；栄養食品などが挙げられる。
【００５５】
本発明に係る飲食品は、上述したような酸化ストレスが関連する疾患に罹患しているか、または罹患していることが疑われる者、あるいは当該疾患への罹患のリスクが高い者に対して好適に使用することができる。ここで、当該疾患への罹患のリスクが高い者としては、例えば、体組成や食生活をはじめとする各種の指標を考慮して、または、健康診断等の診断・診察から、当該リスクが高いと判断された者や、そのようなリスクが高いと本人または周囲の者から認識されるに至った者が含まれる。
【００５６】
本発明において「飲食品」には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、疾病リスク低減表示が付された食品、または、病者用食品のような分類のものも包含される。さらに「飲食品」という用語は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、飼料を含む意味で用いられうる。ここでいう特定保健用食品とは、高血圧症の予防および／または改善等を目的として食品の製造または販売等を行う場合に、保健上の観点から、各国（例えば我が国）において法上の何らかの制限を受けることがある食品をいう。このような食品は、食品が疾病リスクを低減する可能性があること表示した食品、すなわち、疾病リスク低減表示を付した食品であってもよい。ここで、疾病リスク低減表示とは、疾病リスクを低減する可能性のある食品の表示であって、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会（コーデックス委員会）の定める規格に基づいて、またはその規格を参考にして、定められた表示または認められた表示でありうる。
【００５７】
本発明の飲食品においては、上述した有効成分に加えて、他の機能を有する成分をさらに添加してもよい。また例えば、日常生活で摂取する食品、健康食品、機能性食品、サプリメント（例えば、カルシウム、マグネシウム等のミネラル類、ビタミンＫ等のビタミン類を１種以上含有する食品）に本発明の有効成分を配合することにより、本発明による効果に加えて、他の成分に基づく機能を併せ持つ飲食品を提供することができる。
【００５８】
本発明の他の形態によれば、上述した抗酸化ストレス剤を含有する飲食品であって、神経変性疾患、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、炎症性腸疾患、および／または眼疾患を予防および／または改善する機能を有し、その機能表示が付された飲食品が提供される。ここで飲食品に付される機能表示は、例えば、製品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに付することができる。
【００５９】
本発明による飲食品の製造にあたっては、通常の飲食品の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤、安定剤などを適宜添加することができる。飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術を参照して実施することができる。本発明に係る飲食品は様々な形態を取ることができ、公知の医薬品の製造技術に準じて本発明に係る飲食品を製造してもよい。その場合には、本発明に係る抗酸化ストレス剤や薬剤組成物の製造の項目において述べたような担体や添加剤を用いて製造することができる。また、製造段階において、本発明における機能以外の機能を発揮する他の成分または他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
【００６０】
本発明に係る薬剤組成物および飲食品を投与または摂取する場合、本発明に係る有効成分の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定されうる。本発明においては、少なくとも抗酸化ストレス効果を得るために必要な１日あたりの有効成分の量を投与または摂取できるように、１日あたりの組成物または飲食品の投与量または摂取量を考慮し、組成物または飲食品中の含有量を適宜設定することが好ましい。
【００６１】
したがって、本発明による薬剤組成物または飲食品は、好ましくは、有効成分である化合物１および／または化合物２を、当該有効成分換算で成人一人に１日あたり好ましくは３０〜６０００ｍｇ、より好ましくは５０〜２０００ｍｇ、さらに好ましくは１００〜１０００ｍｇの範囲で提供される量含む。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を用いて本発明の好適な実施形態についてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例のみに限定して解釈されるべきではない。
【００６３】
≪アーティチョークからの化合物１および化合物２の抽出・精製≫
乾燥させたアーティチョークの可食部600 gに酢酸エチル2300 mLを加え、80℃にて2時間抽出した。抽出液をろ過した後、溶媒を減圧除去し、アーティチョークの酢酸エチル抽出物17.5 gを得た。同様の抽出を再度行い、合計32.3 gの抽出物を得た。得られた抽出物32.3 gを酢酸エチル10 mLに溶解後、シルカゲル30 gを加え、エバポレーターで減圧乾燥し、試料層を調製した。シリカゲル700 gをクロマト管に詰め、先に調製した試料層を積層し、乾式カラムクロマトを作製した。ヘキサン：酢酸エチル混合溶媒（混合比率、2:3）で溶出を開始し、1画分当たり1400 mLずつ溶出液を捕集し、4個の画分に分離した。続いて2番目の画分を乾式カラムクロマトにて、ヘキサン：酢酸エチル：酢酸混合溶媒（混合比率、80:20:1）、ヘキサン：アセトン：メタノール（混合比率、40:8:1）で順次分画し、粗分画物300 mgを得た。続いて、得られた粗分画物約300 mgをジクロロメタン2.0 mLに溶解し、次いでアセトニトリル2.0 mLを加えた。溶液を0.45μmメンブランフィルターにてろ過し、以下のHPLCによる分離操作に付した。
【００６４】
（HPLC条件１）
カラム：Capcell Pak C18カラム（UG80, 250 × 10 mm i.d., 株式会社資生堂）
溶媒：アセトニトリル−0.1%ギ酸  70：30
流速：4.0 mL/min
温度：40℃
検出波長：254 nm
負荷量：0.4 mg
本条件で得られたクロマトグラムを図１に示す。図１に示すように、粗分画物には主要ピークが３本観察された。以下、これらをそれぞれピーク１（Rt 10.9）、ピーク２（Rt 11.8）およびピーク３（Rt 12.5）と称する。
【００６５】
続いて、上記の３本の主要ピークについて分取操作を行った結果、各ピークの精製に至った（ピーク１ 45 mg；ピーク２ 22.9 mg；ピーク３ 22.1 mg）。
【００６６】
さらに、上記で得られたピーク１を、以下のHPLCによる分離操作に付すことにより精製した。
【００６７】
（HPLC条件２）
カラム：Cosmosil cholester（250 × 10 mm i.d., ナカライテスク株式会社)
溶媒：メタノール−アセトニトリル−0.1%ギ酸  65 : 12 : 23 
流速：3.5 mL/min
温度：40℃
検出波長：254 nm
負荷量：1.0 mg
本条件で得られたクロマトグラムを図２に示す。図２から明らかなように、ピーク１は混合物であることが判明し、主要ピークが２本観察された。以下、これらをそれぞれピーク１−１（Rt 19.8）およびピーク１−２（Rt 22.1）と称する。
【００６８】
続いて、上記のピーク１−１およびピーク１−２について分取操作を行った結果、各ピークの精製に至った（ピーク１−１ 19.5 mg；ピーク１−２ 17.2 mg）。
【００６９】
≪単離化合物のＡＲＥエンハンサー活性（レポーターアッセイ）≫
ホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を制御するチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターの上流にＡＲＥ（antioxidant response element）を配置したＡＲＥレポーター遺伝子と、チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターによりウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の発現が制御されるコントロール遺伝子を、TransIT-LT1（Mirus Bio社製）を用いて、神経細胞のモデル細胞の１種であるラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞に導入した。
【００７０】
ＰＣ１２細胞の培養には５％ウシ胎児血清および１０％ウマ血清添加ＤＭＥＭ培地を用いた。ＡＲＥレポーター遺伝子およびコントロール遺伝子を導入した細胞を２４ウェル培養プレートに播種して２４時間培養後、試験試料（上記で単離されたピーク１−２の化合物またはピーク３の化合物）を最終濃度２０μＭの濃度で添加した。コントロールとしては、溶媒のＤＭＳＯのみを添加した。２４時間後に、Dual Luciferase Assay System（Promega社製）とルミノメーターを用いてルシフェラーゼの活性を測定することにより、ホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性の値としてＡＲＥエンハンサー活性を評価した。結果を図３に示す。
【００７１】
図３に示す結果から、上記で単離されたピーク１−２の化合物（化合物１）およびピーク３の化合物（化合物２）は、いずれも優れたＡＲＥエンハンサー活性を示すことがわかる。
【００７２】
≪機器分析による化合物の同定≫
上記で優れたＡＲＥエンハンサー活性を示したピーク１−２の化合物（化合物１）およびピーク３の化合物（化合物２）を、以下のとおり機器分析により同定した。
【００７３】
【化３】
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【００７４】
≪単離化合物のＨＯ−１タンパク質の発現に対する効果（ウェスタンブロット）≫
ＰＣ１２細胞を５％ウシ胎児血清および１０％ウマ血清添加ＤＭＥＭ培地で培養し、ヒト正常真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）を１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地で培養して、それぞれ１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、試験試料（化合物１または化合物２）を最終濃度２０μＭで処理した。コントロールとしては、溶媒のＤＭＳＯのみで処理した。この細胞をプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma社製）を添加したＲＩＰＡバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 7.5、1% NonidetP-40、0.1% Sodium deoxycholate、0.1% SDS、150 mM NaCl、1 mM EDTA）で溶解し、１５，０００×ｇ、４℃、１５分間の条件で遠心分離後、その上清を細胞溶解タンパク質試料とした。このタンパク質試料各１０ｍｇを常法に従って１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により展開後、ゲルからセミドライ型転写装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写し、ウェスタンブロッティングを行った。洗浄液としては０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ）を用い、ブロッキング液としては５％スキムミルクＴＢＳ−Ｔ溶液を用い、一次抗体としてはウサギ由来抗ＨＯ−１ポリクローナル抗体（Stressgen社製）を１，０００倍希釈にて用い、二次抗体としてはヒツジ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＲＰ標識、GE Healthcare社製）を３，０００倍希釈にて用いた。検出はECL Plus Western Blotting Detection System（GE Healthcare社製）を用いた化学発光法で行った。結果を図４に示す。図４に示す「ＰＣ１２」はＰＣ１２細胞におけるＨＯ−１タンパク質の発現を示す結果であり、「ＨＤＦ」はヒト正常真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）におけるＨＯ−１タンパク質の発現を示す結果である。
【００７５】
図４に示す結果から、化合物１および化合物２は、上記で示されたＡＲＥエンハンサー活性を介して、少なくともＰＣ１２細胞およびヒト正常真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）を含む広範な細胞において、抗酸化タンパク質の１種であるＨＯ−１タンパク質の発現を増強することがわかる。
【００７６】
以上のことから、本発明に係る抗酸化ストレス剤は、化合物１または化合物２を有効成分として含有することで、優れた抗酸化ストレス作用を示すことが立証された。そして、この本発明に係る抗酸化ストレス剤は、酸化ストレスが関連する神経変性疾患、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、炎症性腸疾患、眼疾患および／または関節リウマチなどの予防および／または治療に用いられうる、非常に優位性の高いものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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