(57)【要約】【課題】  本発明は、高分離能を有する無機系多孔質連続体カラムを提供する。【解決手段】  本発明では、無機系多孔質連続体カラムとフィルター素子の間に0.05mm〜0.5mmの隙間を設けることにより、分離能、ピーク対称性の優れたカラムを得ることができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応溶液を相分離を伴うゾル−ゲル転移を起こさせて作製したシリカを主成分とする無機系多孔質連続体とその前後にフィルターを配したカラムであって、無機系多孔質連続体とフィルターとの間に0.05mm〜0.5mmの隙間を設けたことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラム。
【請求項２】
隙間の容積が、０．０００２５〜０．１５ｍLであることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用カラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、タンパク質、DNA等の成分を体液、培養液等の試料から分離するための液体クロマトグラフィー用カラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用カラムは、従来球状多孔質粒子をＳＵＳチューブ等の耐圧性、耐溶媒性を有するチューブ内に均一に充填した粒子充填型カラムが用いられてきた。粒子充填カラムの場合には、粒子の充填状態を維持するため、カラムの前後には粒子径より小さい開口径を有するフィルターが設置されている。このフィルターは充填粒子が漏れ出ることを防ぐとともに、配管から流入する液体をカラム開口部分で均一に広げる拡散板の役割もしている。
これに対して、マイクロメーターサイズの連続細孔とナノメーターサイズのメソ孔を有する無機系多孔質連続体を用いたHPLC用カラムが開発されている（例えば特許文献１）。
この無機系多孔質連続体を用いてカラムを作製するためには連続体の周囲に密着性良く耐圧性および耐薬品性を有する材料を配置しなければならない。無機系多孔質連続体の周囲にフッ素樹脂製の熱収縮チューブ、その周囲にエポキシ樹脂、その周囲に金属製チューブを配置したカラムが提案されている（特許文献２）。
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−２８７７９１号公報
【特許文献２】実用新案登録第３１４５５０５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般にHPLC用カラムでは、分離能の低下、クロマトグラムにおけるピークのテーリングが起きることから、フィルターと充填粒子の間に隙間を作ることは、不可能であると認識されていた。
これに対し、本発明は、むしろ積極的に特定の距離の隙間をフィルターと充填粒子の間に作ることにより、分離能（理論段数）が向上することを見出したのである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
すなわち、本発明は、無機系多孔質連続体カラムの前後にフィルターを配したカラムであって、無機系多孔質連続体とフィルターとの間に0.05mm〜0.5mmの隙間を設けることにより、分離能（理論段数）が向上することを見出したものである。
隙間を設けることにより、分離能が向上したのは、隙間部分で乱流が生じ、その結果物質輸送速度が上がるためと考えられる。
隙間はカラムの断面積にもよるが、断面積が０．０３〜３cm2の場合、０．０５mm〜０．５mmが好ましい。したがって、容積単位では、０．０００２５〜０．１５ｍLの隙間が好ましい。
0.05mm以下であれば分離能の向上は見られなかった。また、0.5mm以上であればかえって分離能が低下したり、クロマトグラムにおけるピーク形状にテーリングが生じ、分離を悪くするという現象が見られた。
フィルターとしてはSUS製の多孔体、シリカガラス多孔体、シリカゲル多孔体、PEEK樹脂多孔体などを用いることができるが、材質は限定されない。
【０００６】
無機系多孔質連続体は、相分離を利用したゾル―ゲル法によって調製することが好ましく、本発明における無機系多孔質連続体は、直径100nm〜10000nmのマクロ孔と骨格が共連続構造をした無機系多孔質連続体で、骨格には直径2nm〜100nmのメソ孔が存在する。
無機系多孔質連続体は、シリカを主成分とする反応溶液を相分離を伴うゾル-ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル−ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル−ゲル転移も、同様に利用することができる。
【０００７】
さらに具体的には、上記目的達成の手段は、水溶性高分子、熱分解する化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造することが好ましい。
【０００８】
ここで、水溶性高分子は、理論的には適当な濃度の水溶液と成し得る水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであれば良いが、具体的には高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン、あるいは中性高分子であって主鎖にエーテル結合を持つポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が好適である。また、有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、界面活性剤を用いてもよく、その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類が最適である。
【０００９】
加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド又はそのオリゴマーを用いることができ、これらのものは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。また、その金属としては、最終的に形成される酸化物の金属、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌが使用される。この金属としては1種又は2種以上であっても良い。一方オリゴマーとしてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には１０量体程度まで使用できる。
【００１０】
また、酸性水溶液としては、通常塩酸、硝酸等の鉱酸０．００１モル濃度以上のもの、あるいは酢酸、ギ酸等の有機酸０．０１モル濃度以上のものが好ましい。
【００１１】
相分離・ゲル化にあたっては、溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜５時間保存することにより達成できる。相分離・ゲル化は、当初透明な溶液が白濁してシリカ相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離・ゲル化で水溶性高分子は分散状態にありそれらの沈殿は実質的に生じない。
【００１２】
あらかじめ共存させる熱分解性の化合物の具体的な例としては、尿素あるいはヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等の有機アミド類を利用できるが、加熱後の溶媒のｐＨ値が重要な条件であるので、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であれば特に制限はない。
共存させる熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃で、加熱後の溶媒のｐＨ値は、６．０〜１２．０が好ましい。
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
【００１３】
上記方法では、水溶性高分子を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行うと、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。生成物（ゲル）が固化した後、適当な熟成時間を経た後、湿潤状態のゲルを加熱することによって、反応溶液にあらかじめ溶解させておいたアミド系化合物が熱分解し、骨格相の内壁面に接触している溶媒のｐＨが上昇する。そして、溶媒がその内壁面を浸食し、内壁面の凹凸状態を変えることによって細孔径を徐々に拡大する。
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
【００１４】
巨大空孔を持たず３次元的に束縛された細孔のみを持つゲルでは、平衡条件としては溶解し得る部分でも、溶出物質が外部の溶液にまで拡散できないために、元の細孔構造が相当な割合で残る。これに対して巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゲルにおいては、２次元的にしか束縛されていない細孔が多く、外部の水溶液との物質のやり取りが十分頻繁に起こるため、大きい細孔の発達に並行して小さい細孔は消滅し、全体の細孔径分布は顕著に広がることがない。
【００１５】
なお、加熱過程においては、ゲルを密閉条件下に置き、熱分解生成物の蒸気圧が飽和して溶媒のｐＨが速やかに定常値をとるようにすることが有効である。
【００１６】
溶解・再析出反応が定常状態に達し、これに対応する細孔構造を得るために要する、加熱処理時間は、巨大空孔の大きさや試料の体積によって変化するので、それぞれの処理条件において実質的に細孔構造が変化しなくなる、最短処理時間を決定することが必要である。
【００１７】
加熱処理を終えたゲルは、溶媒を気化させることによって、溝内において、管壁に密着した乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、適当な温度で熱処理を行い、有機物等を熱分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。なお、乾燥は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置して行い、熱処理は、２００〜８００℃程度で加熱する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
[実施例1]
フィルターとしては直径２．０mm、厚さ１．０mm、開口径２μmのSUS製フィルターを使用した。このSUS製フィルターの周囲にダイフロン製の厚さの異なるリングを配置したフィルター素子を作製した。ダイフロンリングは内径２．０mm、外径1/4インチで厚さは１．０mm、１．０３mm、１．０５mm、１．１mm、１．３mm、１．５mm、１．７mmとした。フィルター素子の構造を図１に示す。図1中、１がSUS製フィルター、２がダイフロンリングである。
無機系多孔質連続体カラムは直径２．０mm、マクロ細孔径１．０μm、メソ細孔径１２nmのシリカ多孔質連続体を用い、図２に示すようなＨＰＬＣカラムを作製した。無機系多孔質連続体３をＦＥＰ製の熱収縮チューブ（収縮前内径2.8mm）４内にいれ１１０℃で収縮させることにより熱収縮チューブとシリカを密着させた。ＦＥＰ製の熱収縮チューブは樹脂との密着性がよくなるように表面をあらかじめサンドブラスト処理を行っておいた。次に外径１／４インチ、内径２．７mmのＳＵＳ３１６チューブ内に熱収縮チューブ４で被覆したシリカ多孔質連続体をＳＵＳ３１６チューブ６の中央に来るように配置しその隙間にウレタン変性エポキシ樹脂（主剤：製品名アデカレジン  EPU-17T-6、硬化剤：製品名アデカハードナー  EH-3895）５を注入し２５℃で７日間硬化させた。
【００１９】
作製したものを長さ１００mmに切断し両端に配管が接続可能なエンドフィッティングを固定しＨＰＬＣカラムとしての性能を評価した。移動相としてアセトニトリル６０％・水４０％、試料としてナフタレンを用いた。移動相の流量は0.3ml/min.とした。ダイフロンリングの厚さを変えることにより無機系多孔質連続体とフィルターとの隙間の大きさを変えてカラムの理論段数と対称性の測定を行った。得られた理論段数と隙間の大きさとの関係を図３に、対称性と隙間の大きさとの関係を図４に示す。図３に示すように、無機系多孔質連続体とフィルターとの隙間がない場合の理論段数14,640段に対して、隙間が0.3mmの時に理論段数が最大の理論段数20,810段が得られ、隙間が0.7mmになると理論段数が16,845段と減少してしまう。また、図４に示すように、ピーク対称性は隙間がない場合の0.95に対して、隙間が0.3mmの時には1.02と改善され、0.7mmになると1.14と悪くなっている。
【００２０】
［実施例2］
フィルターとして直径8.8mm、厚さ2.0mm、開口径1.4μmのシリカゲル製フィルターを使用した。このシリカゲル製フィルターの周囲にダイフロン製の厚さの異なるリングを配置したフィルター素子を作製した。ダイフロンリングは内径8.8mm、外径12.7mmで厚さは2.0mm、2.1mm、2.3mm、2.8mmとした。無機系多孔質連続体カラムは直径9.0mm、マクロ細孔径1.4μm、メソ細孔径１２nmのシリカ多孔質連続体を用い、実施例1と同様の方法でＨＰＬＣカラムを作製した。ＳＵＳ３１６チューブ内は内径11.4mm、外径12.7mmを使用した。作製したものを長さ１００mmに切断し両端に配管が接続可能なエンドフィッティングを固定しＨＰＬＣカラムとしての性能を評価した。評価方法は実施例1と同じであるが、移動相の流量は5.0ml/min.とした。得られた結果は、ダイフロンの厚さが2.0mmの時(隙間がない)、理論段数が10,377段、対称性が0.94であった。ダイフロンの厚さが2.1mmの時(隙間が0.1mm)、理論段数が13,339段、対称性が1.01であった。ダイフロンの厚さが2.3mmの時(隙間が0.3mm)、理論段数が13,427段、対称性が1.04であった。ダイフロンの厚さが2.8mmの時(隙間が0.8mm)、理論段数が10,677段、対称性が1.12であった。理論段数は隙間が0.3mmの時に最もよくなり、対称性は隙間が0.1mmの時に最も1.00に近かった。隙間が0.8mmになると理論段数、対称性ともに低下した。
【００２１】
[実施例３]
フィルターとしては直径２．０mm、厚さ１．０mm、開口径２μmのSUS製フィルターを使用した。このSUS製フィルターの周囲にダイフロン製のリングを配置したフィルター素子を作製した。ダイフロンリングは内径２．０mm、外径1/4インチで厚さは１．０mmとした。無機系多孔質連続体カラムは直径２．０mm、マクロ細孔径１．０μm、メソ細孔径１２nmのシリカ多孔質連続体を用い、実施例１と同じようにカラムを作製した。無機系多孔質連続体カラムとフィルター素子との間に、外径1/4インチ、内径2.0mm厚さ0.2mmのPEEK樹脂製リングを配置してカラム特性の評価を行った。評価方法は実施例１と同じである。PEEK樹脂製リングを入れない場合（隙間がない）、理論段数が16,385段、対称性が0.94であった。PEEK樹脂製リングを1枚配置した時(隙間が0.2mm)、理論段数が20,106段、対称性が1.01であった。PEEK樹脂製リングを1枚配置した時(隙間が0.2mm)、理論段数が20、466段、対称性が1.01であった。PEEK樹脂製リングを2枚配置した時(隙間が0.4mm)、理論段数が20,106段、対称性が1.06であった。PEEK樹脂製リングを3枚配置した時(隙間が0.6mm)、理論段数が17,541段、対称性が1.11であった。ィルター素子と無機系多孔質連続体カラムの間にPEEK樹脂製リングを1枚（隙間が0.2mm）の時に理論段数、対称性共に最もよくなり、PEEK樹脂製リングを3枚（隙間が0.6mm）配置すると理論段数、対称性共に性能低下が起こった。
【産業上の利用分野】
【００２２】
本考案は、クロマトグラフィー用分離カラム、分取カラム、血液および血漿成分分離用カラム、あるいはリアクター用カラムとして利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】フィルター素子の概略図
【図２】無機系多孔質連続体カラムの構成図
【図３】無機系多孔質連続体カラムとフィルター素子との間の隙間の大きさと理論段数の関係を示した図である。
【図４】無機系多孔質連続体カラムとフィルター素子との間の隙間の大きさとピーク対称性の関係を示した図である。
【符号の説明】
【００２４】
１：SUSフィルター
２：ダイフロンリング
３：シリカ多孔質連続体
４：ＦＥＰ熱収縮チューブ
５：ウレタン変性エポキシ樹脂
６：ＳＵＳ３１６チューブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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