(57)【要約】【課題】シリビン配糖体を配合する皮膚外用組成物等を開発する【解決手段】シリビン配糖体を含有する皮膚外用組成物【選択図】図２
2013040218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリビン配糖体を含有する皮膚外用組成物。
【請求項２】
シリビン配糖体が式（１）のシリビンラクトシドまたは式（２）のシリビンマルトシドであることを特徴とする請求項１記載の皮膚外用組成物。
【化１】
2013040218.tif 000013
式（１）
【化２】
2013040218.tif 000014
式（２）
【請求項３】
シリビン配糖体を有効成分とするシワ形成抑制剤。
【請求項４】
シリビン配糖体を有効成分とする表皮角化細胞分化抑制剤。
【請求項５】
シリビン配糖体を有効成分とするＩ型コラーゲン産生促進剤。
【請求項６】
シリビン配糖体を有効成分とする日焼けによる肌荒れ改善剤。
【請求項７】
シリビン配糖体が式（１）のシリビンラクトシドまたは式（２）のシリビンマルトシドであることを特徴とする請求項３〜６の何れかに記載の剤。
【化３】
2013040218.tif 000015
式（１）
【化４】
2013040218.tif 000016
式（２）
【請求項８】
水を溶媒として、シリビン配糖体を０．０００８〜５．０重量％含有することを特徴とする請求項２記載の皮膚外用組成物又は請求項７記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリビンを主成分として含有するシリマリンは皮膚の老化を防ぐのに有用であり、紅斑、火傷、皮膚又は粘膜のジストロフィー状態、皮膚炎等の治療における治癒を促進し、外部環境からの刺激（放射線、風、太陽等）から皮膚を保護するのに有用であることが知られている（特許文献１：特開平１−１００１３２号公報参照）。また、シリビンの表皮角化細胞の分化抑制効果（特許文献２：特開２００４−９１３９７号公報参照）、シリビンを主成分として含有するシリマリンのＩ型コラーゲン産生促進作用（特許文献３：ＷＯ２００４／８５４２９号公報参照）が知られている。
【０００３】
一方、シリビンは、水、油にはほとんど溶解しないため、水系の組成物には配合し難いという課題点を有しており、シリマリンを分散させた飲料の技術（特許文献４：特開２００２−３４５０５号公報参照）、シリマリンをリン脂質錯体とすることにより生体適性を有利にする技術（特許文献１：特開平１−１００１３２号公報参照）、マイクロエマルジョン組成物にして生体利用率を向上させる技術（特許文献５：特表２００３−５０３４４１号公報参照）、シクロデキストリン誘導体を用いてシリビンの封入錯体を製造する技術（特許文献６：特開平３−２０６０９０号公報参照）が開示されている。
しかしながら、これらの技術を用いても必ずしもシリビンの析出を十分に抑制できない場合があり、シリビンの析出を抑制できたとしても、処方設計上の制約がある。
【０００４】
シリビンのグルコース配糖体、ガラクトース配糖体、ラクトース配糖体、マルトース配糖体が抗酸化作用を有し、シリビンと比べて水溶性に優れることが知られているが（非特許文献１：Kosina P.et al.,Phytother. Res. 16,S33-S39(2002)参照） 、シリビン配糖体を含有する皮膚外用組成物、シリビン配糖体のシワ形成抑制効果、表皮角化細胞分化抑制効果、Ｉ型コラーゲン産生促進効果は知られていない。
【０００５】
【特許文献１】特開平１−１００１３２号公報
【特許文献２】特開２００４−９１３９７号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／８５４２９号公報
【特許文献４】特開２００２−３４５０５号公報
【特許文献５】特表２００３−５０３４４１号公報
【特許文献６】特開平３−２０６０９０号公報
【非特許文献１】Kosina P.et al.,Phytother. Res. 16,S33-S39(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、シリビン配糖体を有効成分とする皮膚外用組成物等を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、シリビン配糖体を用いることにより本発明を完成した。
すなわち、本発明の主な構成は、次のとおりである。
【０００８】
（１）シリビン配糖体を含有する皮膚外用組成物。
（２）シリビン配糖体が式（１）のシリビンラクトシドまたは式（２）のシリビンマルトシドであることを特徴とする（１）記載の皮膚外用組成物。
【化５】
2013040218.tif 000003
式（１）
【化６】
2013040218.tif 000004
式（２）
（３）シリビン配糖体を有効成分とするシワ形成抑制剤。
（４）シリビン配糖体を有効成分とする表皮角化細胞分化抑制剤。
（５）シリビン配糖体を有効成分とするＩ型コラーゲン産生促進剤。
（６）シリビン配糖体を有効成分とする日焼けによる肌荒れ改善剤。
（７）シリビン配糖体が式（１）のシリビンラクトシドまたは式（２）のシリビンマルトシドであることを特徴とする（３）〜（６）の何れかに記載の剤。
【化７】
2013040218.tif 000005
式（１）
【化８】
2013040218.tif 000006
式（２）
（８）水を溶媒として、シリビン配糖体を0.0008〜5.0重量％含有することを特徴とする（２）記載の皮膚外用組成物又は（７）記載の剤。
【発明の効果】
【０００９】
１．溶解性の高いシリビン配糖体を用いることにより、シリビンの作用機序を向上させた皮膚外用組成物、シワ形成抑制剤、表皮角化細胞分化抑制剤、老化防止用皮膚外用組成物、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、日焼けによる肌荒れ改善剤を提供することが可能となった。特に、水溶解性が高く、安全性、低刺激性、使用範囲が向上する。
２．特に、シリビン配糖体として、化学式（１）に示されるシリビンラクトシド又は化学式（２）に示されるシリビンマルトシドが有効である。
３．本発明で用いるシリビン配糖体は水溶性が高く、水溶液タイプの剤型として利用できる。化粧水、乳液、クリーム、パック等の皮膚外用組成物、メイクアップベースローション、メイクアップクリーム、乳液状又はクリーム状のファンデーションといったメイクアップ皮膚外用組成物、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション等の身体用皮膚外用組成物、入浴剤等とすることができる。
４．本発明で用いるシリビン配糖体は、0.0008〜5.0重量％を水に溶解させることができる。乳液などでも、水性部分に高配合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】表皮角化細胞分化抑制試験結果を示す図。
【図２】表皮角化細胞増殖維持試験結果を示すグラフ。
【図３】Ｉ型コラーゲン産生促進試験結果を示す図。
【図４】図３に示されるバンド強度をイメージ処理して数値化して示したグラフ。
【図５】紫外線照射試験を行ったマウスの水分蒸散量を測定した値を示すグラフ。
【図６】紫外線照射試験を行ったマウスの皮膚レプリカ表面のしわ体積率示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
シリビン（Ｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２２８８８−７０−６）は、キク科マリアアザミ（学名シリバム・マリアナムＳｉｌｉｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ Ｇａｅｒｔｎ、別名オオアザミ、オオヒレアザミ、ミルクアザミ；ＣＡＳ Ｎｏ．８４６０４−２０−６）から抽出されるフラボノリグナンの一種である。マリアアザミから抽出されるフラボノリグナンはシリマリン（Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．６５６６６−０７−１）の総称で呼ばれ、シリビン以外に、シリジアニン（Ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．２９７８２−６８−１）、シリクリスチン（Ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．３３８８９−６９−９）、イソシリビン（Ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ；ＣＡＳ Ｎｏ．７２５８１−７１−６）などが含まれている。
シリビンはシリマリンからクロマトグラフィーを用いて単離することが可能であり、また、試薬を購入して入手することが可能である。
【００１２】
シリビン配糖体は文献（Kren V. et al., J.Chem.Soc.,Perkin Trans 1,2467-2474(1997)）に従って、ルイス酸を触媒として、シリビンにアセチル基で水酸基を保護した糖を結合し、脱アセチル化することにより調製できる。この反応系ではシリマリンの第一級アルコールの水酸基に糖が選択的にグリコシド結合する。
シリビンに、ルイス酸を触媒として、パーアセチルラクトースを反応させてグリコシド結合を生成し、脱アセチル化することにより、式（１）のシリビンラクトシドが得られる。
【化９】
2013040218.tif 000007
式（１）
【００１３】
シリビンに、ルイス酸を触媒として、パーアセチルマルトースを反応させてグリコシド結合を生成し、脱アセチル化することにより、式（２）のシリビンマルトシドが得られる。
【化１０】
2013040218.tif 000008
式（２）
【００１４】
本発明に用いるシリビン配糖体は水溶性に優れ、シリビンラクトシド、シリビンマルトシドは水に約５％溶解することができる。従って、シリビンを配合することができなかった化粧水類にもシリビン配糖体であれば配合することができる。
【００１５】
本発明の皮膚外用組成物には、本発明の効果を損なわない範囲内で、油剤、界面活性剤、防腐剤、多価アルコール、エタノール、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、保湿剤、香料、ｐＨ調整剤等を含有させることができる。また、ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【００１６】
本発明は、本発明に用いるシリビン配糖体は水溶性に優れており、シリビンラクトシド、シリビンマルトシドは水に約５％溶解することができる。従って、シリビンを配合することが困難であった化粧水類にもシリビン配糖体を配合することができる。
本発明のシリビン配糖体を有効成分とするシワ形成抑制剤としては、化粧水、乳液、クリーム、パック等のシワ改善用皮膚外用組成物、シワ改善用の医薬部外品、シワ改善用医薬が挙げられる。乳液であっても、水性部分にシリビン配糖体を高濃度で配合することができる。
【００１７】
本発明のシリビン配糖体を有効成分とする表皮角化細胞分化抑制剤は、表皮角化細胞の分化を抑制し、増殖を維持し、ターンオーバーの遅延を予防、防止、改善し、加齢や紫外線照射により引き起こされる表皮の偏平化を防ぎ、老化した皮膚を再生する作用を有するので、老化防止用皮膚外用組成物として用いることができる。
本発明の、シリビン配糖体を有効成分とするＩ型コラーゲン産生促進剤は、皮膚のはりや弾力性を向上させ、しわやたるみを予防、防止、改善することが期待できるので、老化防止用皮膚外用組成物として用いることができる。
【００１８】
〔シリビンラクトシドの合成〕
Ｈｅｌｆｅｒｉｃｈの方法に従ってシリビンラクトシドを合成した。
シリビン（3.0ｇ、6.2ｍｏｌ）とオクタ-O-アセチル-D-ラクトース（6.3ｇ、9.2ｍｏｌ）とを180 ｍｌのジクロロメタン−アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）の溶媒中で、三ふっ化ほう素ジメチルエーテル錯体（1.14ｍｌ、12.4ｍｍｏｌ）を窒素存在下、室温で 19時間攪拌反応させた。反応終了後、氷冷しながら飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、150ｍｌジクロロメタンで２回抽出処理し、無水硫酸ナトリウム処理後に抽出溶媒をエバポレーターにて除去した。
トリエチルアミン−メタノール−水（１：８：１）を35℃30時間反応させたのち、エバポレーターにより溶媒を除去した。BONDESIL-C18(Varian)を用いて精製を行い、シリビンラクトシド（1.0 g, 収率20%）を得た。得られたシリビンラクトシドをＭＳスペクトルで確認し、［Ｍ＋Ｈ］＋：807.5のピークを検出した。
【００１９】
〔シリビンマルトシドの合成〕
Ｈｅｌｆｅｒｉｃｈの方法に従ってシリビンマルトシドを合成した。
シリビン（3.0ｇ、6.2mol）とオクタ-O-アセチル-D-マルトース（6.3ｇ、9.2ｍｏｌ）とを180ｍｌのジクロロメタン−アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）の溶媒中で、三ふっ化ほう素ジメチルエーテル錯体（1.14ｍｌ、12.4ｍｍｏｌ）を窒素存在下、室温で 19時間攪拌反応させた。反応終了後、氷冷しながら飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、150ｍｌジクロロメタンで２回抽出処理し、無水硫酸ナトリウム処理後に抽出溶媒をエバポレーターにて除去した。
トリエチルアミン−メタノール−水（１：８：１）を35℃30時間反応させたのち、エバポレーターにより溶媒を除去した。BONDESIL-C18(Varian)を用いて精製を行い、シリビンマルトシド（1.0ｇ, 収率20％）を得た。得られたシリビンラクトシドをＭＳスペクトルで確認し、［Ｍ＋Ｈ］＋：807.5のピークを検出した。
【実施例１】
【００２０】
水溶性試験
１．実験方法
シリビン、シリビンラクトシド、シリビンマルトシド（以下、シリビンをＳＢ、シリビンラクトシドをＳＢＬ、シリビンマルトシドをＳＢＭと記載することがある）を1.5mlチューブに適量はかりとり、そこに精製水を各濃度になるように加え、外観の透明性、また室温で遠心分離（15000rpm、５min）した際に沈殿として析出するかどうかを目視で判定した。またＳＢについては、非常に水溶性が悪いためビーカー内に少量はかりとり、水を加えてスターラーで約１時間かき混ぜ、混合操作を止めて１時間後に沈殿物が認められないものを溶解したと判定した。
【００２１】
【表１】
2013040218.tif 000009
【００２２】
実験の結果、ＳＢと比較してＳＢＬ、ＳＢＭの両者は劇的な水溶性の向上が認められ、約5000倍以上に水溶性が改善した。ＳＢＬ、ＳＢＭ間での溶解性の優劣は検出することはできなかった。ＳＢ濃度0.01ｍＭは0.0005％（ｗ／ｖ）に相当する。ＳＢＬ及びＳＢＭの濃度50ｍＭ、60ｍＭは、それぞれ4.1％（ｗ／ｖ）、4.9％（ｗ／ｖ）に相当する。従って、ＳＢとＳＢＬ、ＳＢＭの溶解性を質量／容量％で比較すると、ＳＢＬ、ＳＢＭの溶解性は、ＳＢと比べて約10,000倍改善している。水溶性タイプの皮膚外用組成物などの剤では、ＳＢでは、0.0005％（ｗ／ｖ）の濃度で含有させることも難しかったが、ＳＢＬでは、4.1％（ｗ／ｖ）の濃度で含有させることが可能であり、ＳＢＭでは、5.0％（ｗ／ｖ）の濃度で含有させることが可能である。尚、ＳＢＬ、ＳＢＭの濃度0.01ｍＭは0.0008％（ｗ／ｖ）に相当する。
【実施例２】
【００２３】
表皮角化細胞分化抑制試験・増殖維持作用
１．実験材料 
１．１ ヒト正常表皮角化細胞
ヒト正常表皮角化細胞NHEK（旭テクノグラス）を表皮角化細胞用培地：KGM（旭テクノグラス）で37℃-５％CO2インキュベーターにて培養した。本実験には経代数が３〜５代の細胞を利用した。
１．２ KGM（表皮角化細胞用培地）
KGMは表皮角化細胞基礎培地にヒト上皮細胞増殖因子（0.1ng/ml）、インシュリン（5.0μg/ml）、ハイドロコルチゾン（0.5μg/ml）、ゲンタマイシン（50μg/ml）、アンフォテリシンB（50μg/ml）、牛脳下垂体抽出液（２ml）を添加したものである。シリビン配糖体ははじめとするサンプルを細胞に添加する場合には、牛脳下垂体抽出液のみを除いた、KGM培地を用いて実験を行った。
１．３ 添加サンプル
シリビン（ＳＢ）、シリビンマルトシド（ＳＢＭ）、シリビンラクトシド（ＳＢＬ）をDMSO（ジメチルスフフォキシド：和光純薬）に溶解し、各種濃度にて添加した。
【００２４】
２．実験方法 
２．１ 表皮角化細胞分化抑制試験
NHEKをKGMで５×104/mlになるように懸濁し、４ml/ウエルで６穴プレートに播種し、24時間培養して、プレートに細胞を接着させた。各化合物を添加した牛脳下垂体抽出液を除いたKGMを４ml/ウエルで処理し、２日毎に培地交換しながら、８〜10日間培養した。毎日顕微鏡で形態観察を行い、DMSO処理したコントロール細胞が分化様の形態変化（扁平化）を示した時点で、写真撮影を行い、培養を終了した。
２．２ 表皮角化細胞増殖維持試験
上記実験で得られた細胞をトリプシン処理によりプレートからはがした後に、KGM中で2.5×104/mlとなるように懸濁した。細胞懸濁液を2ml/ウエルで24穴プレートに播種し、２日ごとに培地交換しながら、８日間培養した。培養後、NHEKをトリプシン処理によりプレートからはがし、コールカウンター（ベックマン・コールター）により細胞数を測定した。
３．実験結果
３．１ 表皮角化細胞分化抑制試験
得られた実験結果を図１に示す。この図は、細胞の顕微鏡写真である。
DMSOを処理した比較対照群であるControl並びにＳＢ ３μM（シリビンを３μM添加した培地で培養）では、表皮角化細胞は扁平化し、分化様の形態変化を示した。それに対して、ＳＢＭ３μＭ、ＳＢＬ３μＭでは分化様の形態は認められなかった。ＳＢ、ＳＢＬ、ＳＢＭをそれぞれ１０μＭ添加した培地で培養した場合には、全て、表皮角化細胞の分化が抑制された。ＳＢ、ＳＢＬ、ＳＢＭは表皮角化細胞の分化抑制作用を有するが、ＳＢＭ、ＳＢＬはＳＢに比べて表皮角化細胞分化抑制効果に優れている。
【００２５】
３．２ 表皮角化細胞増殖維持試験
上記の表皮角化細胞分化抑制試験において、分化が抑制されていれば細胞は増殖能を維持し、継代作業をすることで順次増殖するはずである。分化誘導された細胞は分化が付加逆的な反応であるため増殖することはできない。
そこで上記試験で得られた細胞を継代し、維持されている増殖能を増殖した細胞の数を測定することで調べた。
【００２６】
その結果を図２に示す。試料濃度３μＭでは、ＳＢを添加したものについて細胞増殖能は殆ど維持されていないが、ＳＢＭは試料無添加と比べて１．８倍、ＳＢＬは試料無添加と比べて1.4倍に細胞数が増加し、細胞増殖能の維持効果が認められた。試料濃度10μＭでは、ＳＢ、ＳＢＭ、ＳＢＬともに細胞数が増加し、ＳＢは試料無添加と比べて1.5倍、ＳＢＭは試料無添加と比べて2.1倍、ＳＢＬは試料無添加と比べて1.8倍に細胞数が増加し、細胞増殖能の維持効果が認められた。ＳＢと比べて、ＳＢＭ、ＳＢＬの細胞増殖能の維持効果が高いことがわかる。
【実施例３】
【００２７】
I型コラーゲン産生促進作用
１．実験材料
１．１ ヒト皮膚繊維芽細胞
ヒト皮膚繊維芽細胞CCD1074SK（大日本住友製薬）をD-MEM中で37℃-５％ CO2インキュベーターにて培養した。本実験には経代数が10〜15代の細胞を利用した。
１．２ D-MEM
D-MEMは、D-MEM基礎培地（GIBCO）に牛胎児血清（Hyclone）を10％になるよう添加して用いた。またサンプルを処理する際には、牛胎児血清を入れないD-MEMを用いて実験を行った。
２．実験方法
ヒト皮膚繊維芽細胞CCD1074SKを10％牛胎児血清を含むD-MEM培地で３×105/mlになるように懸濁し、10cmシャーレに１ml播種し、24時間培養し、プレートに細胞を接着させた。培地をDMSOに溶解させた各サンプルを各濃度で添加した牛胎児血清を入れないD-MEM培地に交換した。培地交換48時間後に細胞培養液を回収し、限外ろ過装置を用いて培養液を濃縮した。約500ml以下に濃縮後、タンパク質定量を行い、タンパク質量をそろえた後に、細胞培養液濃縮サンプルとしてウエスタンブロティングに使用した。
１レーン当り10μｇのタンパク質をアプライし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離後、ニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液（スキムミルクを５％の濃度になるように0.1％のポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳで溶解した溶液）に浸し、４℃で一昼夜ブロッキングした。洗浄液｛0.1％のポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ｝で洗浄後、一次抗体｛洗浄液で500ｎｇ／ｍｌに調製したＩ型コラーゲンに対するポリクローナル抗体（ロックランド）｝に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、二次抗体（洗浄液で250ｎｇ／ｍｌに調製したホースラディッシュパーオキシダーゼ標識化抗ウサギイムノグロブリンＧ）に浸し、室温で１時間反応させた。洗浄後、ＥＣＬプラスウエスタンプロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて検出した。
【００２８】
実験結果
実験の結果、ＳＢと同様にＳＢＬ、ＳＢＭの両者にもI型コラーゲン産生促進作用が認められた。実験結果を図３に示す。
【００２９】
得られたバンドの強度をプログラムソフトImage Jにより数値化した結果を表２に示し、DMSO処理時のI型コラーゲンの産生量を１とした際の比較産生量を図４として示す。
【００３０】
【表２】
2013040218.tif 000010
【００３１】
ＳＢ、ＳＢＭ、ＳＢＬともにＩ型コラーゲン産生促進作用を示した。ＳＢと比べて、ＳＢＭ、ＳＢＬはＩ型コラーゲン産生促進効果が強い。特に、試料濃度10μＭでは、ＳＢＭ、ＳＢＬの作用効果が大きく、高濃度での顕著な作用効果が認められる。
【実施例４】
【００３２】
紫外線照射による水分蒸散抑制作用シワ形成抑制作用
１．実験材料・器具
実験動物ヘアレスマウスHos;HR１ ♀ 5週齢 (星野実験材料)
１．２ 紫外線照射装置
紫外線Ａ波（ＦＬ32ＳＢＬ／ＤＭＲ：（株）クリニカルサプライ製）
紫外線Ｂ波（ＦＬ32ＳＥ／ＤＭＲ：（株）クリニカルサプライ製）
１．３ 経皮水分蒸散量測定装置
Vapometer（キーサイエンス社製）
１．４ レプリカ採取器具およびレプリカ解析システム
(有)アサヒバイオメッド製の反射型レプリカ採取キット及びレプリカ解析システムASA‐03RXD
【００３３】
２．実験方法
２．１ 飼育環境
25℃±２℃、湿度50％±５％、食餌は飼料MR、水道水をそれぞれ自由摂取できるコンベンショナルな飼育環境で飼育した。
一群につき５匹を群分けし同一ケージにて飼育した。
日照は午前７時〜午後７時までの12時間ごとに昼夜を設定した。
２．２ 紫外線照射
へアレスマウスHos;HR１を１週間馴化したのち紫外線照射を開始した。紫外線照射時は、ヘアレスマウスを専用のケージに移し、１群ずつUVB20mJ/cm2およびUVA10J/cm2の紫外線を照射した。照射は月、水および金の週３日サイクルで10週間実施し、合計30回紫外線を照射した。
【００３４】
２．３ 群設定
紫外線照射後30分以内にＳＢ、ＳＢＬ、ＳＢＭメタノール溶液又は溶媒（メタノール）をマウス背部皮膚全面に100μＬ処理した。ＳＢ、ＳＢＬ、ＳＢＭ塗布の濃度設定をそれぞれ1.0％、0.3％、0.1％の３点設定し、これら全群については紫外線照射を行った。溶媒であるメタノールのみを塗布するものについて、紫外線未照射及び紫外線照射の群を設けた。溶媒にメタノールを用いたのはＳＢを溶解するためである。メタノール中において、ＳＢＭ、ＳＢＬは１％濃度においても完全に溶解していたが、ＳＢは0.1％のみが完全に溶解しているが、0.3％は若干析出が認められ、１％においては不溶物が認められた。ＳＢメタノール溶液に不溶物が認められた場合も、そのまま実験に用いた。
【００３５】
２．４ 経皮水分蒸散量の測定
経皮水分蒸散量の測定は、VapoMeter（キーストン サイエンティフィック社製）を用い、背部の尾付け根より首に向かい２cm、腰椎から右側に0.5cm部位を3回測定して平均を求めた。測定端末の開口部はNailモード（開口部を狭くすることで、マウス皮膚の狭い範囲に対応した）を用い、1回ごとの測定時間に約19秒を要した。測定日は、紫外線照射10週間後に行った。
【００３６】
２．５ レプリカ画像解析
シワの形成を正確に把握するためレプリカを採取した。レプリカ画像解析は反射用レプリカ解析システムASA‐03RXD（(有)アサヒバイオメッド製）を使用して行った。ASA‐03RXDを用いて、採取したレプリカに角度27度からの平行光（LED光源）を照射する事により得られるシワの形状に応じた陰影画像をCCDカメラで撮像し、コンピュータに取り込み画像処理することでレプリカ表面のしわ体積率（μｍ３／ｍｍ２／100）を計測した。
【００３７】
２．６ 統計解析
試験結果は平均値±標準偏差（S.D.）で表し、有意差検定は等分散性の検定をバートレット検定により行った。等分散性の仮定が棄却されなかった時はDunnettの多重検定を行い、等分散性の仮定が棄却された時は参考データとしてDunnettの多重検定を行った。
【００３８】
３．試験結果
３．１ 体重変動、外観観察
10週間照射終了後、各群間で体重変遷に目立った違いは無かった。重篤な病変を示したマウスもいなかった。
マウス皮膚の外観を観察した結果、群２の紫外線照射メタノール処理群ではシワ形成が認められるのにたいし、群４の0.3％シリビン塗布群、群６〜群８の全てのＳＢＭ塗布群、群９〜群11の全てのＳＢＬ塗布群においてシワ抑制作用が認められた。
【００３９】
３．２ 経皮水分蒸散量
肌荒れの指標として、紫外線照射10週間後にVapoMeterを用いて各群の水分蒸散量を測定した。結果を表３と図５に示す。
群１紫外線未照射群に比べて群2の紫外線照射群では経皮水分蒸散量が高くなる。群３〜群11のシリビン（ＳＢ）、シリビン配糖体（ＳＢＭ、ＳＢＬ）塗布群では、危険率１％以下で有意に経皮水分蒸散量の上昇が抑制されていた。
【００４０】
１群（紫外線非照射、メタノール塗布）の水分蒸散量を０％、２群（紫外線照射、メタノール塗布）の水分蒸散量を100％としたとき、３〜５群（紫外線照射、ＳＢ0.1〜１％塗布）の水分蒸散量は26〜76％、６〜８群（紫外線照射、ＳＢＭ0.1〜１％塗布）の水分量は11〜21％、９〜11群（紫外線照射、ＳＢＬ0.1〜１％塗布）の水分量は24〜27％となり、ＳＢ、ＳＢＭ、ＳＢＬを添加することにより水分蒸散量の上昇が抑制された。特に、シリビン配糖体であるＳＢＭ、ＳＢＬの水分蒸散量の上昇抑制効果が高い。つまり日焼けによる肌荒れを改善する効果がある。
【００４１】
【表３】
2013040218.tif 000011
【００４２】
３．３ シワ体積率
10週間照射終了後、シワの形成を正確に把握するためレプリカを採取し、画像解析によりレプリカ表面のしわ体積率（μｍ３／ｍｍ２／100）を計測した。結果を表４、図６に示す。
【００４３】
Dunnettの有意差検定を実施した結果、群２（紫外線照射メタノール塗布）に対して、群１（紫外線未照射メタノール塗布）、群４（紫外線照射 ＳＢ0.3％塗布）、群７（紫外線照射 ＳＢＭ0.3％塗布）、群１１（紫外線照射 ＳＢＬ1.0％塗布）は、それぞれ危険率５％以下で有意にシワ体積が抑制された。
【００４４】
【表４】
2013040218.tif 000012
【００４５】
〔処方例１ 化粧水〕
質量％
１．シリビンラクトシド                               ０．３
２．ジグリセリン                                     ５．０
３．１，３−ブチレングリコール                       ２．０
４．ジプロピレングリコール                           ３．０
５．水酸化カリウム                                   適量
６．クエン酸                                         適量
７．精製水                                           残余
（製法）
７に１〜６を溶解した。
【００４６】
〔処方例２ 乳液〕
質量％
１．シリビンマルトシド                               ０．３
２．水素添加大豆リン脂質                             ０．７
３．ステアリン酸デカグリセリル（HLB１２）            ２．０
４．グリセリン                                       ８．０
５．オリーブ油                                       ８．０
６．ベヘニルアルコール                               １．０
７．ジプロピレングリコール                           ８．０
８．カルボキシビニルポリマー                         ０．１
９．キサンタンガム                                   ０．２
１０．水酸化カリウム                                 適量
１１．クエン酸                                       適量
１２．精製水                                         残余
（製法）
１〜４及び７〜１２を８０℃で加温溶解する。これに、約８０℃に加温した５、６を加え、ホモミキサーで攪拌混合し、３０℃まで冷却し、乳液を得た。
【００４７】
〔処方例３ モイスチャー美容液〕
質量％
１．シリビンラクトシド                               ０．２
２．水素添加大豆リン脂質                             ０．６
３．モノオレイン酸デカグリセリル（HLB１２）          １．５
４．グリセリン                                       ７．０
５．１，３−ブチレングリコール                       ５．０
６．ポリエチレングリコール４０００                   ０．１
７．スクワラン                                       ５．０
８．シリコーン                                       ０．５
９．ラウロイルグルタミン酸ジ(フィトステリル/オクチルドデシル) 
０．２
１０．キサンタンガム                                 ０．３
１１．水酸化カリウム                                 適量
１２．クエン酸                                       適量
１３．精製水                                         残余
（製法）
１及び１１〜１３を攪拌溶解し、４〜６、１０を添加後約８０℃に加温溶解する。
これに、約８０℃に加温した２、３、７〜９を加え、３０℃まで冷却し、モイスチャー美容液を得た。
【００４８】
〔処方例４ エモリエントクリーム〕
質量％
１．シリビンマルトシド                               ０．５
２．ジグリセリン                                   １０．０
３．ジプロピレングリコール                           ８．０
４．１，２−ペンタンジオール                         ０．５
５．Ｌ−セリン                                       ０．０１
６．ジステアリン酸デカグリセリル（HLB９．５）        ０．５
７．モノミリスチン酸デカグリセリル（HLB１４）        １．５
８．オリーブ油                                     １０．０
９．マカデミアナッツ油                               １．０
１０．ベヘニルアルコール                             １．５
１１．シリコーン                                     ２．０
１２．ホホバ油                                       ３．０
１３．トコフェロール                                 ０．００１
１４．ＳＩＭＵＬＧＥＬ ＮＳ（ＳＥＰＰＩＣ社製）      ２．０
１５．キサンタンガム                                 ０．１
１６．水酸化カリウム                                 適量
１７．クエン酸                                       適量
１８．精製水                                         残余
（製法）
１及び１６〜１８を攪拌溶解し、２〜５を添加後約８０℃に加温溶解する。これに、約８０℃に加温した６〜１４を加え、３０℃まで冷却し、エモリエントクリームを得た。
【００４９】
〔処方例５ ボディ用乳液〕 
質量％
１．シリビンラクトシド                                 ０．２
２．PEG-60水添ヒマシ油（HLB１４）                      １．５
３．グリセリン                                         ９．０
４．ジプロピレングリコール                             ７．０
５．ヒアルロン酸Ｎａ                                   ０．００１
６．流動パラフィン                                   １０．０
７．シリコーン                                         ３．０
８．オクチルドデカノール                               ４．０
９．(アクリル酸/アクリル酸アルキル(C10-30))コポリマー  ０．２
１０．水酸化カリウム                                   適量
１１．クエン酸                                         適量
１２．精製水                                           残余
１３. エタノール                                       ２．５
（製法）
１及び１０〜１２を攪拌溶解し、２〜５、９を添加後約８０℃に加温溶解する。これに、約８０℃に加温した６〜８を加え、３０℃まで冷却、１３を添加し、ボディ用乳液を得た。
【００５０】
〔処方例６ マッサージクリーム〕
質量％
１．シリビンマルトシド                                ０．０５
２．グリセリン                                      １０．０
３．ジグリセリン                                      ２．０
４．プロピレングリコール                              ７．０
５．モノステアリン酸デカグリセリル（HLB１２）         １．０
６．エチルヘキサン酸セチル                          １２．０
７．ベヘニルアルコール                                ２．０
８．ステアリン酸                                      ０．５
９．セピノブ EMT10（ＳＥＰＰＩＣ社製）                ０．５
１０．香料                                            適量
１１．フェノキシエタノール                            ０．３
１２．水酸化カリウム                                  適量
１３．クエン酸                                        適量
１４．精製水                                          残余
（製法）
１及び１１〜１４を攪拌溶解し、２〜４を添加後約８０℃に加温溶解する。これに、約８０℃に加温した５〜９を加え、３０℃まで冷却、１０を添加し、マッサージクリームを得た。
【００５１】
〔処方例７ 乳化型ファンデーション〕
質量％
１．シリビンラクトシド                               ０．１
２．グリセリン                                     １０．０
３．ジプロピレングリコール                           ８．０
４．１，２−ペンタンジオール                         １．０
５．キサンタンガム                                   ０．３
６．トリイソステアリン酸ポリグリセリル-2             １．０
７．シクロメチコン                                   ８．０
８．シリコーン                                       ５．０
９．ネオペンタン酸イソステアリル                     ５．０
１０．イソステアリン酸                               １．５
１１．ベヘニルアルコール                             ０．５
１２．パルミチン酸デキストリン                       １．０
１３．タルク                                         ３．０
１４．二酸化チタン                                   ５．０
１５．ベンガラ                                       ０．５
１６．黄酸化鉄                                       １．４
１７．黒酸化鉄                                       ０．１
１８．水酸化カリウム                                 適量
１９．クエン酸                                       適量
２０．精製水                                         残余
（製法）
１及び１８〜２０を攪拌溶解し、２〜５を添加後約７０℃に加温溶解する。次に、よく粉砕した１３〜１７を添加し、攪拌混合する。これに、約８０℃に加温した６〜１２を加え、３０℃まで冷却し、乳化型ファンデーションを得た。
【図１】
2013040218.tif 000017
【図２】
2013040218.tif 000018
【図３】
2013040218.tif 000019
【図４】
2013040218.tif 000020
【図５】
2013040218.tif 000021
【図６】
2013040218.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月12日(2012.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）のシリビンラクトシドまたは式（２）のシリビンマルトシドを有効成分とするシワ形成抑制剤。
【化１】
2013040218.tif 000023
式（１）
【化２】
2013040218.tif 000024
式（２）
【請求項２】
経皮水分蒸散抑制を伴う請求項１記載のシワ形成抑制剤。
【請求項３】
Ｉ型コラーゲン産生促進を伴う請求項１記載のシワ形成抑制剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
（１）式（１）のシリビンラクトシドまたは式（２）のシリビンマルトシドを有効成分とするシワ形成抑制剤。
【化５】
2013040218.tif 000025
式（１）
【化６】
2013040218.tif 000026
式（２）
（２）経皮水分蒸散抑制を伴う（１）記載のシワ形成抑制剤。
（３）Ｉ型コラーゲン産生促進を伴う（１）記載のシワ形成抑制剤。