(57)【要約】【課題】安全性が高い、美白剤、メラニン生成抑制剤及びドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供すること。【解決手段】褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【請求項２】
褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項３】
褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚美白剤。
【請求項４】
褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤、メラニン生成抑制剤又はドーパオキシダーゼ活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
美容上、色素沈着や、シミ、ソバカスの少ない白い肌が好まれる傾向にある。長期間使用しても安全性の高い皮膚美白作用を有する物質が望まれている。
この色素沈着やシミ、ソバカス等は、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常又は遺伝的要素等によって、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されてメラニン生成が亢進した結果生じるものと考えられている。メラニン生成亢進のメカニズムとして、これまでに、メラニンは酵素チロシナーゼの作用により生合成されること、チロシナーゼ活性の一つであるドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与していることが知られている（非特許文献１）。
上記メラニン生成メカニズムの因子を標的とした皮膚美白剤が開発されている。例えば、酵素チロシナーゼの活性を抑制してメラニン産生を抑制する作用を有する皮膚美白剤として、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸等が報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
ドーパオキシダーゼ活性を抑制し、皮膚美白作用を有する植物エキスが報告されている。例えば、トウセンダン（Melia toosendan Sieb. et Zucc.）、ソウカ（Amomum tsao-ka Crevost et Lemaire）、セネシオ・グラシリス（Senecio gracilis）及びコクリロ（Veratrum nigrum L.）（特許文献１）、セイヨウトウキ（Angelica archangelica）、ハナミズキ（Benthamidia florida）、カンスイ（Euphorbia kansui Liou）、ヌルデ（Rhus chinensis Mill.）、オカゼリ（Cnidium monnieri（L.）Cuss.）、キンミズヒキ（Agrimonia pilosa Ledeb.）、ロウロ（Diuranthera minor（C.H.Wright）Hemsl.）及びセイヨウメギ（Berberis aristata）（特許文献２）、イヌカラマツ、タイワンコマツナギ及びチョウセンアサガオ（特許文献３）、ならびにザクロ（Punica granatum）花（特許文献４）が知られている。
【０００４】
シソ科アキギリ属の植物Salvia przewalskii var. mandarinorumは、褐毛丹参とも称され、東洋医学で鎮痛、抗炎症、抗菌等のために使用されている。しかし、この植物が皮膚美白作用、メラニン生成抑制作用又はドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有していることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１９５７３２号公報
【特許文献２】特開２０１０−１９５７３１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１５９２２１号公報
【特許文献４】特開２００６−２２５２８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta 1247, 1-11(1995)
【非特許文献２】美白戦略（南江堂）ＩＶ.，美白剤の薬理と臨床，p95-116
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性が高く、ドーパオキシダーゼ活性を抑制することができ、化粧料や医薬等として有用な美白剤、メラニン生成抑制剤及びドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、皮膚美白作用やメラニン生成抑制作用等を有する天然由来の物質について調べた。当該研究の中で、本発明者は、褐毛丹参がドーパオキシダーゼ活性抑制作用を有し、メラニン過剰生成に伴う皮膚の褐色化やシミ・ソバカス等の予防、改善、治療等に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供する。
また本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供する。
また本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚美白剤を提供する。
また本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚外用剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、皮膚美白剤、又は皮膚外用剤を用いれば、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け等の色素沈着、シミ、ソバカスの予防、改善又は治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】褐毛丹参抽出物によるドーパオキシダーゼ活性抑制。
【図２】褐毛丹参抽出物によるメラニン産生抑制。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処置行為を含まない概念である。
【００１３】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患、症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１４】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１５】
本発明における褐毛丹参とは、シソ科アキギリ属植物のSalvia przewalskii var. mandarinorumを意味する。本発明に用いられる褐毛丹参は、当該植物の任意の部位、例えば全草、葉（葉身、葉柄等）、果実（成熟、未熟等）、種子、花（花弁、子房等）、茎、根等を、そのまま、又は切断、破砕、粉砕若しくは搾取して用いるか、又はそれらをさらに乾燥若しくは粉末化したものであり得る。用いる部位としては、根が好ましい。
褐毛丹参の抽出物としては、特に限定されない限り、上記部位のいずれかからの抽出物であればよいが、根の抽出物が好ましい。抽出物は、上記植物の部位から直接抽出されたものでもよく、あるいは、当該植物の部位を切断、破砕、粉砕、搾取、乾燥若しくは粉末化等の処理、又はそれらの組み合わせに供した後、得られた材料を抽出処理にかけ、抽出物を調製してもよい。
【００１６】
上記抽出物としては、市販されているものを利用してもよく、又は常法により得られる各種溶媒抽出物、又はその希釈液、その濃縮液、その乾燥末、ペースト若しくはその活性炭処理したものであってもよい。一例として、本発明における抽出物は、上記植物を室温若しくは加温下にて抽出するか、又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得ることができる。
【００１７】
抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等の１価アルコール類；１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、グリセリン等の２価若しくは多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ならびにこれらの混合物が挙げられる。上記アルコール類としては、炭素数１以上１０以下のものが好ましく、炭素数１以上４以下のものがより好ましい。
【００１８】
上記に挙げた溶媒のうち、水、１価アルコール類、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水−アルコール混合液が好ましく、エタノール水溶液がより好ましい。抽出溶媒が水−アルコール混合液である場合、液中のアルコール濃度は、９５質量％未満の範囲であればよく、好ましくは９０質量％またはそれ未満であり、より好ましくは８０質量％またはそれ未満であり、さらに好ましくは７０質量％またはそれ未満である。
【００１９】
本発明で用いられる抽出物を得るための抽出条件については、使用する溶媒によって異なり得、特に制限はない。
抽出物を得る抽出手段の具体的な例としては、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、煎出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌、遠心抽出等の手段が挙げられる。これらの手段は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。抽出においては、バッチ式抽出器やソックスレー抽出器等を用いてもよい。また、抽出は、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、非酸化的雰囲気下で行ってもよい。
抽出条件としては、特に限定されないが、抽出温度は、好ましくは０℃以上１００℃以下、より好ましくは１０℃以上９０℃以下、さらに好ましくは２０℃以上９０℃以下であり、抽出期間は、好ましくは１分間以上３０日間以下、より好ましくは１時間以上１０日間以下、さらに好ましくは１時間以上３日間以下である。
また、上記溶媒の使用量は、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、好ましくは１質量部以上１００質量部以下、より好ましくは１質量部以上５０質量部以下、さらに好ましくは５質量部以上４０質量部以下である。
【００２０】
抽出手順の一例として、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、４０容量％以上６０容量％以下のアルコール水溶液（好ましくは炭素数１以上３以下の１価アルコール類又は炭素数３以上５以下の２価アルコール類含有）５質量部以上４０質量部以下を用いて、２０℃以上９０℃以下で、１時間以上３日間以下の期間抽出する手順が挙げられる。
【００２１】
上述のようにして得られた褐毛丹参抽出物は、そのまま用いることもできるが、さらに希釈、濃縮若しくは凍結乾燥等して、又はさらに液状、粉末状若しくはペースト状に調製して用いることもできる。
【００２２】
後記実施例に示すように、褐毛丹参又はその抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性を強く抑制するという優れたドーパ−オキシダーゼ活性抑制作用を有し、且つ細胞毒性も低い。したがって、褐毛丹参又はその抽出物は、長期間使用しても安全性の高い皮膚美白作用を有している。
ドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与する（非特許文献１）ことから、ドーパオキシダーゼ活性を抑制すれば、メラニン生成抑制効果、及び皮膚美白作用や紫外線被爆等による皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善又は治療する効果を得ることができる。褐毛丹参又はその抽出物によるメラニン生成抑制作用もまた、後記実施例に示されている。
すなわち、褐毛丹参又はその抽出物は、ドーパ−オキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、又は皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するために使用することができ、あるいはこれらの効果のいずれかを発揮する皮膚外用剤として使用することができる。
これらの使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する組織、器官、細胞における使用であり得る。またこれらの使用は、治療的使用であってもよく、又は美容目的での使用を含む非治療的使用であってもよい。
【００２３】
従って、本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤を提供する。
また本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供する。
また本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚美白剤を提供する。
また本発明は、褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚外用剤を提供する。
あるいは、本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、皮膚美白剤、又は皮膚外用剤の製造のための褐毛丹参又はその抽出物の使用に関する。
さらに本発明は、ドーパオキシダーゼ活性抑制のための褐毛丹参又はその抽出物の使用を提供する。
さらに本発明は、メラニン生成抑制のための褐毛丹参又はその抽出物の使用を提供する。
さらに本発明は、皮膚美白のための褐毛丹参又はその抽出物の使用を提供する。
さらに本発明は、皮膚外用剤としての褐毛丹参又はその抽出物の使用を提供する。
さらに本発明は、皮膚外用剤として使用するための褐毛丹参又はその抽出物を提供する。
さらに本発明は、皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防、改善、若しくは治療において使用するための褐毛丹参又はその抽出物を提供する。
上記剤は、褐毛丹参又はその抽出物から本質的に構成されていてもよい。
一態様において、上記皮膚外用剤は、皮膚美白のため、または皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等を予防、改善、若しくは治療するために使用され得る。別の態様において、上記皮膚外用剤は、皮膚美白のため、または皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等を非治療的に予防若しくは改善するために使用され得る。
【００２４】
褐毛丹参又はその抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するための組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等に素材として配合することができ、あるいはそれらの製造のために使用することができる。当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等もまた、本発明の範囲内である。
【００２５】
上記組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等は、ヒト又は非ヒト動物用として製造され、又は使用され得る。褐毛丹参又はその抽出物は、当該組成物、医薬、医薬部外品、外用剤、化粧料、飲食品、飼料、又は飲食品若しくは飼料の原料等に配合され、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、あるいは皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するための有効成分であり得る。
【００２６】
上記医薬又は医薬部外品は、褐毛丹参又はその抽出物を、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、あるいは皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するための有効成分として含有する。
当該医薬又は医薬部外品は、任意の投与形態で投与され得る。投与は経口でも非経口でもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形投薬形態、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、輸液、局所、外用剤、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、ボーラス、貼布剤等が挙げられる。好ましくは、当該医薬又は医薬部外品は、皮膚外用剤の形態であり得る。より好ましくは、当該医薬又は医薬部外品は、ドーパオキシダーゼ活性抑制、メラニン生成抑制、皮膚の色素沈着予防改善等のための皮膚外用剤であり得る。
【００２７】
上記化粧料は、褐毛丹参又はその抽出物を、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、あるいは皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善するための有効成分として含有する。
化粧料の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧料に使用され得る任意の形態が挙げられ、特に限定されない。好ましくは、上記化粧料は皮膚美白用化粧料であり、また好ましくは、皮膚外用化粧料であり得る。より好ましくは、上記化粧料は皮膚美白用の皮膚外用化粧料であり得る。
【００２８】
上記医薬、医薬部外品又は化粧料は、褐毛丹参又はその抽出物を単独若しくは組み合わせて含有していてもよく、又は薬学的に又は化粧料として許容される担体と組み合わせて含有していてもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、被膜剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、香料、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。
さらに、上記医薬、医薬部外品又は化粧料は、褐毛丹参又はその抽出物のドーパオキシダーゼ活性抑制作用が失われない限り、他の有効成分、薬理成分又は化粧成分を含有していてもよい。例えば、上記化粧料は、褐毛丹参又はその抽出物以外に、保湿剤、他の美白剤、紫外線保護剤、細胞賦活剤、洗浄剤、角質溶解剤、メークアップ成分（例えば、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、チーク、口紅、アイメーク、アイブロウ、マスカラ、その他）等を含有し得る。
【００２９】
上記医薬、医薬部外品又は化粧料は、褐毛丹参又はその抽出物から、あるいは必要に応じて上記担体及び／又は他の有効成分や、薬理成分、化粧成分等を組みあわせて、常法により製造することができる。
例えば、上述した皮膚外用剤である医薬若しくは医薬部外品又は皮膚外用化粧料は、褐毛丹参又はその抽出物を、単独で、又は外用剤、外用医薬品、医薬部外品若しくは皮膚化粧料に通常配合される、油又は油状物質（油脂類、ロウ類、高級脂肪酸類、精油類、シリコーン油類等）、保湿剤（グリセロール、ソルビトール、ゼラチン、ポリエチレングリコール等）、粉体（チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム等）、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、他の植物抽出物（生薬、漢方薬、ハーブ類）、アルコール類、多価アルコール類、無機酸（重炭酸塩、炭酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等）、有機酸（コハク酸、グルタル酸、フマル酸、グルタミン酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸等）、ビタミン類（ビタミンＡ類、ビタミンＥ類、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、葉酸等）、水溶性高分子、アニオン性界面活性剤（アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等）、カチオン性界面活性剤（アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等）、両性界面活性剤（アルキル基を有するイミダゾリン系、カルボベタイン系等）等と組み合わせることにより調製することができる。
【００３０】
上記医薬、医薬部外品又は化粧料における褐毛丹参又はその抽出物の含有量は、例えば、皮膚外用剤として調製する場合、抽出物の乾燥質量として、医薬又は医薬部外品では０．００００１質量％以上２０質量％以下が好ましく、０．０００１質量％以上１０質量％以下がより好ましく、また化粧料では０．０００１質量％以上２０質量％以下が好ましく、０．０００１質量％以上１０質量％以下がより好ましい。
【００３１】
上記飲食品や飼料は、ドーパオキシダーゼ活性抑制、メラニン生成抑制、皮膚美白、又は皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状の予防、改善若しくは治療等の機能を得ることを企図し、当該機能を必要に応じて表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用飲食品、ペットフード等であり得る。
【００３２】
上記飲食品の種類は特に限定されない。飲料としては、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等、あらゆる飲料が挙げられる。食品の形態は、固形、半固形、液状等の任意の形態であってもよく、また錠剤形態、丸剤形態、タブレット、カプセル形態、液剤形態、シロップ形態、粉末形態、顆粒形態等であってもよい。例えば、食品としては、パン類、麺類、パスタ、ゼリー状食品、各種スナック類、ケーキ類、菓子類、アイスクリーム類、スープ類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、その他加工食品、調味料、サプリメント等が挙げられる。上記飼料の種類も特に限定されず、任意の動物のための飼料であってよく、その形態も上記食品の場合と同様に任意の形態であり得る。
【００３３】
上記飲食品、飼料、又はそれらの原料は、褐毛丹参又はその抽出物を単独で含有していてもよく、又は他の食材や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等の添加剤を組み合わせて含有していてもよい。当該飲食品若しくは飼料中の褐毛丹参又はその抽出物の含有量は、抽出物の乾燥質量として、０．０００１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．０００１質量％以上５質量％以下がより好ましく、０．００１質量％以上１質量％以下がさらに好ましい。
【００３４】
また本発明は、細胞のドーパオキシダーゼ活性を抑制する方法を提供する。当該方法は、チロシナーゼ発現能を有し且つドーパオキシダーゼ活性を抑制したい細胞に、褐毛丹参又はその抽出物を添加する工程を含む。
また本発明は、細胞のメラニン生成を抑制する方法を提供する。当該方法は、メラニン生成能を有し且つメラニン生成を抑制したい細胞に、褐毛丹参又はその抽出物を添加する工程を含む。
【００３５】
本発明においてドーパオキシダーゼ活性又はメラニン生成を抑制する「細胞」は、天然又は遺伝子工学的に改変されたチロシナーゼ発現能又はメラニン生成能を有する細胞であれば特に限定されない。細胞としては、好ましくは色素細胞（メラノサイト、網膜色素上皮細胞等）が挙げられ、より好ましくはメラノサイトが挙げられる。
あるいは、当該「細胞」は、上記で挙げた細胞の細胞片または細胞分画物であってもよく、あるいは上記で挙げた細胞を含む組織又は上記で挙げた細胞に由来する培養物であってもよい。細胞が細胞培養物の場合、好ましくは、当該細胞は、褐毛丹参又はその抽出物の存在下で培養される。
添加される褐毛丹参又はその抽出物の濃度は、細胞が細胞培養物の場合、培養物中での最終濃度として、抽出物の乾燥重量換算で、０．００００１％（ｗ/ｖ）以上２％（ｗ/ｖ）以下であり、好ましくは０．００００５％（ｗ/ｖ）以上０．５％（ｗ/ｖ）以下であり、より好ましくは０．０００１％（ｗ/ｖ）以上０．１％（ｗ/ｖ）以下である。
【００３６】
また本発明において、褐毛丹参又はその抽出物は、ドーパオキシダーゼ活性抑制のため、メラニン生成抑制のため、皮膚美白のため、あるいは皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療するために、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取され得る。当該投与又は摂取は、健康増進又は美容目的により非治療的に行われてもよい。
投与又は摂取の対象としては、ドーパオキシダーゼ活性の抑制を必要とする動物が挙げられる。あるいは、投与又は摂取の対象としては、メラニン生成抑制や皮膚美白を所望する動物、又は皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状の予防、改善、若しくは治療することを所望する動物が挙げられる。動物は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３７】
上記褐毛丹参又はその抽出物は、好ましくは、上記対象の皮膚に局所投与される。好ましい投与又は摂取量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与又は摂取の用量、経路、間隔、及び摂取の量や間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、褐毛丹参又はその抽出物の投与量は、抽出物の乾燥重量換算で、成人（６０ｋｇ）１人当たり、０．００１ｍｇ／日以上１ｍｇ／日以下とすることが好ましく、０．０１ｍｇ／日以上０．１ｍｇ／日以下がより好ましい。
【００３８】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の用途を開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００３９】
＜１＞褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするドーパオキシダーゼ活性抑制剤。
【００４０】
＜２＞褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【００４１】
＜３＞褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚美白剤。
【００４２】
＜４＞褐毛丹参又はその抽出物を有効成分とする皮膚外用剤。
【００４３】
＜５＞ドーパオキシダーゼ活性抑制のための褐毛丹参又はその抽出物の使用。
【００４４】
＜６＞メラニン生成抑制のための褐毛丹参又はその抽出物の使用。
【００４５】
＜７＞皮膚美白のための褐毛丹参又はその抽出物の使用。
【００４６】
＜８＞皮膚外用剤としての褐毛丹参又はその抽出物の使用。
【００４７】
＜９＞非治療的使用である上記＜５＞〜＜８＞のいずれか１に記載の使用。
【００４８】
＜１０＞ドーパオキシダーゼ活性抑制に使用するための褐毛丹参又はその抽出物。
【００４９】
＜１１＞メラニン生成抑制に使用するための褐毛丹参又はその抽出物。
【００５０】
＜１２＞皮膚の色素沈着、シミまたはソバカスの予防または改善に使用するための褐毛丹参又はその抽出物。
【００５１】
＜１３＞皮膚外用剤として使用するための褐毛丹参又はその抽出物。
【００５２】
＜１４＞ドーパオキシダーゼ活性抑制方法であって、それを必要とする対象に褐毛丹参又はその抽出物を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
【００５３】
＜１５＞メラニン生成抑制方法であって、それを必要とする対象に褐毛丹参又はその抽出物を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
【００５４】
＜１６＞皮膚美白方法であって、それを必要とする対象に褐毛丹参又はその抽出物を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
【００５５】
＜１７＞皮膚の色素沈着、シミ、ソバカス等の症状を予防、改善、若しくは治療する方法であって、それらを必要とする対象に褐毛丹参又はその抽出物を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
【００５６】
＜１８＞非治療的方法である上記＜１４＞〜＜１７＞のいずれか１に記載の方法。
【００５７】
＜１９＞ドーパオキシダーゼ活性抑制剤、メラニン生成抑制剤、皮膚美白剤、又は皮膚外用剤の製造のための褐毛丹参又はその抽出物の使用。
【００５８】
＜２０＞上記褐毛丹参が褐毛丹参の根である、上記＜１＞〜＜１９＞のいずれか１に記載の剤、方法、使用、または褐毛丹参もしくはその抽出物。
【００５９】
＜２１＞上記抽出物を抽出するための溶媒が、水、１価アルコール類、プロピレングリコール、ブチレングリコール、および水−アルコール混合液からなる群より選択され、好ましくはエタノール水溶液である、上記＜１＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の剤、方法、使用、または褐毛丹参もしくはその抽出物。
【００６０】
＜２２＞上記水−アルコール混合液中のアルコール濃度が、９５質量％未満、好ましくは９０質量％またはそれ未満、より好ましくは８０質量％またはそれ未満、さらに好ましくは７０質量％またはそれ未満である、上記＜２１＞に記載の剤、方法、使用、または褐毛丹参もしくはその抽出物。
【００６１】
＜２３＞上記抽出物を抽出するための抽出温度が、０℃以上１００℃以下、好ましくは１０℃以上９０℃以下、より好ましくは２０℃以上９０℃以下であり、且つ抽出期間が、１分間以上３０日間以下、好ましくは１時間以上１０日間以下、より好ましくは１時間以上３日間以下である、上記＜１＞〜＜２２＞のいずれか１に記載の剤、方法、使用、または褐毛丹参もしくはその抽出物。
【００６２】
＜２４＞上記抽出物を抽出するための溶媒の使用量が、上記褐毛丹参１質量部（乾燥物換算）に対して、１質量部以上１００質量部以下、好ましくは１質量部以上５０質量部以下、より好ましくは５質量部以上４０質量部以下である、上記＜１＞〜＜２３＞のいずれか１に記載の剤、方法、使用、または褐毛丹参もしくはその抽出物。
【００６３】
＜２５＞上記抽出物を抽出するための溶媒が、４０容量％以上６０容量％以下のアルコール水溶液であり、ここで、該アルコールは炭素数１以上３以下の１価アルコール類又は炭素数３以上５以下の２価アルコール類を含み；当該溶媒の使用量が、上記褐毛丹参１質量部（乾燥物換算）に対して５質量部以上４０質量部以下であり；且つ、当該抽出物を抽出するための抽出温度が２０℃以上９０℃以下で、抽出期間が１時間以上３日間以下である、上記＜１＞〜＜２４＞のいずれか１に記載の剤、方法、使用、または褐毛丹参もしくはその抽出物。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６５】
製造例１  褐毛丹参抽出物の調製
褐毛丹参の根１００ｇに、５０％エタノール２０００ｍＬを加え、８５℃３時間で抽出後、濾過して粗抽出液を得た後、濃縮乾固して抽出固形分９．６ｇを得た。この抽出固形分を蒸発残分１．０ｗ／ｖ％となるよう５０％エタノールに溶解し、褐毛丹参５０％エタノール抽出物を調製した。
【００６６】
実施例１  褐毛丹参抽出物によるドーパオキシダーゼ活性抑制
【００６７】
（１）細胞培養
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）を９６ウェルプレートに１×１０4細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2下にて培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ  ２５４を用いた。
３日間培養した後、それぞれ培地中終濃度で１ｎＭになるように調整したＥｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ＥＴ−１）、ＳＣＦ、α−ＭＳＨ、Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ＰＧＥ2とともに、上記製造例１に従って調製した蒸発残分１．０ｗ／ｖ％の褐毛丹参５０％エタノール抽出物を表１に記載の終濃度となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養を行った。コントロールとしては、同量の５０％エタノール水溶液を添加した。
（２）ドーパオキシダーゼ活性の測定
培養終了後、アラマーブルー（インビトロジェン社）試薬を２０μＬ／ウェルで添加し、２〜３時間インキュベートした後、培地の蛍光強度を測定して細胞呼吸活性を測定した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、抽出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１％  ＮＰ−４０、０．０１％ＳＤＳ、１００μＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍアプロチニン）を２０μＬ／ウェル、Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（４％ジメチルホルムアミド、１００ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ（ｐＨ７．１））を２０μＬ／ウェル添加し、４℃、３時間で細胞を可溶化し、ドーパオキシダーゼ活性の測定を行った。ドーパオキシダーゼ活性測定は、ＭＢＴＨ法（Winder A. et al., 1991, Eur.J. Biochem. 198:317-326）を参考に、以下の方法で行った。
可溶化した細胞溶液の各ウェルに、上記Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを８０μＬ、２０．７ｍＭ  ＭＢＴＨ（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン）溶液を６０μＬ、基質として５ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン）溶液を４０μＬ、それぞれ加え、３７℃で３０〜６０分反応させた後、その呈色反応を４９０ｎｍの吸光度で測定した（Ｎ＝３）。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
【００６８】
（３）結果
結果を表１及び図１に示す。褐毛丹参の５０％エタノール抽出物によってドーパオキシダーゼ活性がエキス添加濃度依存的に抑制された。アラマーブルー法による細胞呼吸活性の測定から、表１に示す濃度の抽出物が細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した。
【００６９】
【表１】
2013253020.tif 000002
【００７０】
実施例２  褐毛丹参抽出物によるメラニン産生抑制
ＥＴ−１とＳＣＦを終濃度１０ｎＭで添加したＥＰＩ−１００−ＮＭＭ１１３培地を用いて、三次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ３００Ａ）を３７℃、５％ＣＯ2条件下にて培養した。培養初日より、上記製造例１に従って調製した蒸発残分１．０ｗ／ｖ％の褐毛丹参５０％エタノール抽出物を、終濃度が０．１ｖ／ｖ％（エキス分終濃度０．００１ｗ／ｖ％）になるように添加した。コントロールとしては、同量の５０％エタノールを添加した。培地交換は３日に一度行った。１４日後に、アラマーブルー試薬を用いて実施例１と同様に細胞呼吸活性を測定した。続いて三次元培養皮膚を培養支持体であるカップごとＰＢＳで洗浄し、ピンセットで皮膚シートを剥離してチューブに移し、さらにＰＢＳで３回洗浄した。５０％エタノールで３回、１００％エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩放置して完全に乾燥させた。最終的に２Ｍ  ＮａＯＨを２００μＬ加えた後で１００℃にて溶解させ、遠心分離によって得られた上清について４０５ｎｍの測定波長で吸光度を測定し、メラニン量を算出した。測定値をコントロールの結果に対する相対値として表した。
【００７１】
１４日培養後の三次元培養皮膚モデルの写真及びメラニン量測定結果を図２に示す。褐毛丹参抽出物添加により、細胞の黒化抑制効果が視覚的に認められ（図２Ａ）、細胞のメラニン量が７０％以上減少した（図２Ｂ）。また、アラマーブルー法による細胞呼吸活性測定の結果、この濃度の抽出物が細胞毒性を示さないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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