(57)【要約】【課題】  侵襲性が低く、客観的に判断することが可能な疾患の判定方法を提供する。【解決手段】  対象の体液より単離されたＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖において、Ｎ−アセチルガラクトサミンの結合数に基づき該対象が疾患に罹患しているか否かの判断を行う、疾患の判定方法を提供する。本発明の方法により判定可能な疾患としては、炎症性大腸炎、およびＩｇＡ腎症が例示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の体液より単離されたＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖において、Ｎ−アセチルガラクトサミンの結合数に基づき該対象が疾患に罹患しているか否かの判断を行う、疾患の判定方法。
【請求項２】
ＩｇＡヒンジ部当たりＮ−アセチルガラクトサミンが５結合している糖鎖構造を有するＩｇＡ（５Ｎ）および４結合している糖鎖構造を有するＩｇＡ（４Ｎ）それぞれの値を測定し、５Ｎと４Ｎの比（５Ｎ／４Ｎ）が予め定めた値より低い場合に疾患に罹患していると判定する、請求項１記載の疾患の判定方法。
【請求項３】
体液が唾液である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
体液が血液である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
疾患が炎症性腸疾患である請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
疾患がＩｇＡ腎症である請求項１〜４何れかに記載の方法。
【請求項７】
被験者の唾液よりＩｇＡを単離し、ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖構造を測定し、その結果により疾患の有無または重篤度を判定する、疾患の判定方法。
【請求項８】
疾患が炎症性腸疾患またはＩｇＡ腎症である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
疾患が炎症性腸疾患である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
対象の唾液中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖中に含まれるガラクトース（Ｇａｌ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）それぞれの存在数を調べ、そのＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ比が予め定めた値より低い場合に対象がＩｇＡ腎症に罹患しているか、あるいはその可能性が高いと判定する、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、侵襲性の低い疾患の判定方法を提供するものである。具体的には、本発明はＩｇＡＯ結合型糖鎖の構造の変化に基づき疾患の判定をする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＡ腎症およびクローン病や潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患は、いずれも厚生労働省により特定疾患（難病）に指定されている原因不明の疾患である。
【０００３】
ＩｇＡ腎症は慢性糸球体腎炎の中で最も頻度の高い疾患であり、本邦での現在治療中の患者数は約２〜３万人と推計されている。ＩｇＡ腎症は、検尿の際の蛋白尿や血尿により発見されることが多いが、その確定診断のためには腎生検が必要である。近年、ＩｇＡ腎症患者の糸球体に沈着するＩｇＡや血清ＩｇＡの糖鎖にガラクトース欠損が認められることが報告されている。かかる知見に基づき、血清中のＩｇＡ糖鎖を調べることによるＩｇＡ腎症の診断が提案されている（非特許文献１、特許文献１）。
【０００４】
ここで、ＩｇＡの構造を図１に示す。ＩｇＡ分子は２本の重鎖と２本の軽鎖から成り、図１に示すヒンジ部にＯ結合型糖鎖を有していることが知られている。ＩｇＡヒンジ部のＯ結合型糖鎖の一般的構造を図２に示す。ＩｇＡは消化管を含む粘膜において第一線の防御機構として働いていることが知られており、粘液中に含まれるＩｇＡは、生体に寄生あるいは感染する微生物と係わり、免疫学的な相互作用により種々の疾患の原因となっていると考えられている。ＩｇＡ腎症患者の血清中や糸球体に沈着するＩｇＡは、図３に示すようにヒンジ部のＯ結合型糖鎖においてガラクトースが欠損している例が多い。
【０００５】
一方潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、現在全国で約１２万人の患者が存在する難治性疾患として知られている。現在、ＩＢＤ患者の診断のためには内視鏡による検査が必須であり、患者への負担が非常に大きい。非侵襲的で客観的判断の可能な診断法が求められている。
【０００６】
本願発明者らの一部は炎症性腸疾患患者の血中ＩｇＧ糖鎖を調べ、炎症性腸疾患患者には高率にＩｇＧフコシル化糖鎖のガラクトース欠損が見られ、疾患活動性と関わっていることを報告した（非特許文献２）。また、炎症性腸疾患患者のうちでクローン病患者と潰瘍性大腸炎患者の鑑別診断を、血中ＩｇＧ糖鎖の相違に基づき行うことができることを見出した（特許文献２）。しかしながら炎症性腸疾患とＩｇＡ糖鎖との関連については知られていない。また、血液以外の体液より取得された免疫グロブリン糖鎖について解析された報告は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−１１１２９１号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／１３６００１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Moldoveanu Z, Wyatt RJ, Lee JY, Tomana M, Julian BA, Mestecky J, Huang WQ, Anreddy SR, Hall S, Hastings MC, Lau KK, Cook WJ, Novak J. Patients with IgA nephropathy have increased serum galactose-deficient IgA1 levels. Kidney Int 2007;71:1148-54.
【非特許文献２】Shinzaki S, Iijima H, Nakagawa T, Egawa S, Nakajima S, Ishii S, Irie T, Kakiuchi Y, Nishida T, Yasumaru M, Kanto T, Tsujii M, Tsuji S, Mizushima T, Yoshihara H, Kondo A, Miyoshi E, Hayashi N. IgG oligosaccharide alterations are a novel diagnostic marker for disease activity and the clinical course of inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol 2008;103:1173-81.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、侵襲性が低く、客観的に判断することが可能な疾患の判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは血中並びに唾液中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖構造が同一人間でほぼ同じであること、並びに該構造が疾患の有無や重篤度に対応することを見出し本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、下記に関する：
（１）  対象の体液より単離されたＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖において、Ｎ−アセチルガラクトサミンの結合数に基づき該対象が疾患に罹患しているか否かの判断を行う、疾患の判定方法。
（２）  ＩｇＡヒンジ部当たりＮ−アセチルガラクトサミンが５結合している糖鎖構造を有するＩｇＡ（５Ｎ）および４結合している糖鎖構造を有するＩｇＡ（４Ｎ）それぞれの値を測定し、５Ｎと４Ｎの比（５Ｎ／４Ｎ）が予め定めた値より低い場合に疾患に罹患していると判定する、（１）記載の疾患の判定方法。
（３）  体液が唾液である、（１）または（２）記載の方法。
（４）  体液が血液である、（１）または（２）記載の方法。
（５）  疾患が炎症性腸疾患である（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）  疾患がＩｇＡ腎症である（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（７）  被験者の唾液よりＩｇＡを単離し、ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖構造を測定し、その結果により疾患の有無または重篤度を判定する、疾患の判定方法。
（８）  疾患が炎症性腸疾患またはＩｇＡ腎症である、（７）記載の方法。
（９）  疾患が炎症性腸疾患である、（８）記載の方法
（１０）  対象の唾液中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖中に含まれるガラクトース（Ｇａｌ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）それぞれの存在数を調べ、そのＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ比が予め定めた値より低い場合に対象がＩｇＡ腎症に罹患しているか、あるいはその可能性が高いと判定する、（７）記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、非常に侵襲性の低い手段にて、患者の疾患を判定することができ、疾患の早期発見に寄与するものと考えられる。例えばＩｇＡ腎症や炎症性腸疾患など、現時点において確定診断のために腎生検や内視鏡検査などの侵襲的検査が必要である疾患について、本発明の方法を用いることによって侵襲的検査を要するか否かの判断を事前に行うことが可能であり、不必要な検査を排除できる。侵襲的検査の排除も可能かもしれない。特に両疾患とも発症年齢が低く、本発明の方法により小児患者に苦痛を強いることを避けることができるため、疾患の発見率の向上に寄与すると考えられる。早期診断に基づく早期治療を導入することにより、患者のQOLを改善し社会復帰させうるとともに、人工透析、腎移植、腸管切除など高額医療を要する患者の減少に寄与することが想定され、経済的、社会的効果は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＩｇＡと糖鎖の関係を示す。
【図２】ＩｇＡＯ結合型糖鎖の構造を示す。
【図３】ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖におけるガラクトースおよびGalNAc欠損の例を示す。
【図４】ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖構造の分析方法の模式図を示す。
【図５】健常者血清由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートの一例を示す。
【図６】健常者とクローン病患者それぞれの血清から単離したＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートの一例を示す。
【図７】ＩｇＡのヒンジ部（ＨＰ）あたりのＧａｌＮＡｃの付加数とその付加数を有するＩｇＡの存在比の健常者（ＨＶ）、疾患コントロール患者（ＤＣ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）、クローン病患者（ＣＤ），ＩｇＡ腎症患者（ＩｇＡＮ）における平均値を示す。
【図８】実施例１における５Ｎ／４Ｎ比の算出方法を説明する。
【図９】炎症性腸疾患患者と健常人並びに疾患コントロール血清由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の５Ｎ／４Ｎ比の平均値を示す。
【図１０Ａ】５Ｎ／４Ｎ比のＲＯＣ曲線（クローン病患者対健常人）を示す。
【図１０Ｂ】図１０ＡのＲＯＣ曲線より算出したカットオフ値で陽性／陰性を分けた場合の各疾患並びに健常人群の陽性率を示す。
【図１１Ａ】５Ｎ／４Ｎとクローン病活動指数（ＣＤＡＩ）との関係を示す。
【図１１Ｂ】５Ｎ／４Ｎと潰瘍性大腸炎活動指数（ＣＡＩ）との関係を示す。
【図１２】クローン病患者のインフリキシマブ治療前後の血清由来ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析チャートの例を示す。
【図１３】クローン病患者のインフリキシマブ使用前後での５Ｎ／４Ｎ比の変化を示す。
【図１４】健常人の血清、唾液および腸液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖それぞれのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析チャートの例を示す。
【図１５】クローン病患者の血清および唾液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖それぞれのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析チャートの例を示す。
【図１６】健常者、クローン病患者およびＩｇＡ腎症患者の血清由来、ならびにＩｇＡ腎症患者の唾液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖それぞれのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析チャートの例を示す。
【図１７】健常者、炎症性腸疾患患者並びにＩｇＡ腎症患者の血清由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の５Ｎ／４Ｎ比の平均を示す。
【図１８】健常者、炎症性腸疾患患者並びにＩｇＡ腎症患者の血清由来およびＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＧａｌ付加率の平均を示す。
【図１９】健常者血清由来、ＩｇＡ腎症患者血清由来ならびにＩｇＡ患者唾液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＧａｌ付加率の平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は対象の体液中に含まれるＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の構造に基づき、疾患を判定する方法に関する。本発明の方法において、体液としては血液、特に血清、唾液、腸液等が含まれるが、特に血液または唾液を用いること好適である。血液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の特定の構造と一部疾患の関連は既に知られているものもあるが（非特許文献１）、唾液などで糖鎖解析を行い疾患との関係を検討した報告は本願以前にはない。今回本発明者らは初めて、同一人の血清中と唾液中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖がいずれも同様の構造を有しており、血中ＩｇＡと同様、唾液中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖構造が疾患の判定に用いることができることを見出した。
【００１５】
また、本願発明者らは、対象の体液中に含まれるＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖と疾患の新たな関連性を見出した。
【００１６】
ＩｇＡのヒンジ部のＯ結合型糖鎖構造の相違は例えばヒンジ部あたりのＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、もしくはＮ−アセチルガラクトサミンとガラクトースのそれぞれの付加数に基づき数値化することによって、容易に疾患の判定基準として用いることができる。
【００１７】
疾患の判定を行うにあたっては、ＩｇＡヒンジ部のＯ結合型糖鎖結合構造の測定プロトコル並びに数値化方法を決定した後、該プロトコルにて、従来からの判定基準により判定の対象となる疾患を有する、あるいはその重篤度が診断されている患者の体液、および健常人の体液についてのデータ集積し、そのデータを例えばＲＯＣ曲線等の分析手法にて解析して判定基準を予め設定し、該基準に基づき対象の疾患の有無や重篤度を判定すればよい。
【００１８】
本発明の方法において体液中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の構造は、従来から知られた方法を組み合わせれば容易に測定可能である。
体液として唾液を採用する場合は被験者の唾液より抗ＩｇＡアフィニティゲルを用いてＩｇＡを単離する。単離されたＩｇＡをジチオスレイトール、ヨードアセトアミドにてタンパク質を還元およびアルキル化してＩｇＡの高次構造を解除する。次いで、トリプシン並びにリシルエンドペプチダーゼにてタンパク質をペプチドに分解する。有機溶媒中では糖質ポリマー（セファロース）と糖鎖の結合が強調されるため、この原理を用いて糖ペプチドを濃縮・分離選択する。これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにて質量分析を行い、糖鎖構造を同定すればよい。図４にその精製手順の模式図を示す。
【００１９】
体液として血液を用いる場合には、常法通りに採取した血液から血清を得、得られた血清から抗ＩｇＡアフィニティゲルを用いてＩｇＡを単離し、その後唾液の場合と同様にして糖ペプチドを単離し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにて質量分析を行えばよい。
【００２０】
本発明の好ましい態様においては、得られた糖ペプチドは酢酸で加熱してシアル酸を除去した上でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにて質量分析を行い、糖鎖構造の同定を行う。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによりヒンジ部当たりのガラクトース並びにＮ−アセチルガラクトサミンの結合数の分布を調べる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いることにより、ヒンジ部当たりのガラクトース（Ｇａｌ）およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮａｃ）の付加パターンを知ることができ、それぞれの相対比を得ることができる。図４に糖ペプチドの精製スキームを、図５に測定例を示す。図５は健常者血清中のＧａｌＮＡＣとＧａｌの付加パターンを調べた結果である。それぞれのＭＳスペクトラムの相対強度（ピークの高さ）が各付加パターンの数と相関する。
【００２１】
本発明にて提供されるＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の構造の相違を判定する指標のひとつとして、ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＧａｌＮＡｃ付加率が挙げられる。これは、ヒンジ部当たりのＧａｌＮＡｃの付加数を指標として判定を行うものである。このＧａｌＮＡｃの付加率の指標の一例としてＧａｌＮＡｃが５個付加されている（５Ｎ）ＩｇＡと４個付加されている（４Ｎ）ＩｇＡの比（５Ｎ／４Ｎ比）を用いることができる。
【００２２】
炎症性腸疾患患者においては、ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖におけるＧａｌＮＡｃ付加数が減少する。この減少はクローン病患者においてより顕著である。
【００２３】
従って本発明においては、ＧａｌＮＡｃ付加率を指標として疾患の判定を行う。このＧａｌＮＡｃの付加率の指標としてＧａｌＮＡｃが５個付加されたヒンジ部に対応するピークと４個付加されたヒンジ部に対応するピークの比（５Ｎ／４Ｎ比）を（５Ｎ２Ｈ＋５Ｎ３Ｈ＋５Ｎ４Ｈ＋５Ｎ５Ｈ）／（４Ｎ２Ｈ＋４Ｎ３Ｈ＋４Ｎ４Ｈ）の式を用いて算出する。
【００２４】
血中並びに唾液中のＩｇＡの５Ｎ／４Ｎの比を健常者と炎症性腸疾患患者の間で比較すると、炎症性腸疾患患者においては顕著に５Ｎ／４Ｎ比が低い。特にクローン病において５Ｎ／４Ｎ比の低下が顕著である。また、この５Ｎ／４Ｎ比は疾患活動指標と負の相関を示す。即ち、疾患活動指標が低いほど、５Ｎ／４Ｎ比は高くなり、疾患の重篤度を示す指標ともなる。また、治療により５Ｎ／４Ｎ比の上昇が認められることから、治療の有効性の判断にも用いることができる。
【００２５】
本態様において、対象の体液より取得されたＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖における５Ｎ／４Ｎ比が予め設定された値より低い場合に、炎症性腸疾患に罹患している、あるいはその可能性が高いと判定することができる。さらにその値が低いほど、重篤度が高いと判定することができる。
【００２６】
また、炎症性腸疾患に罹患している患者において、５Ｎ／４Ｎ比が予め設定された値より低い場合に、その炎症性腸疾患がクローン病であるとの鑑別判定も可能である。
【００２７】
ここで「予め設定された値」は、ＩｇＡヒンジ部のＯ結合型糖鎖結合パターンの測定プロトコルを決定した後、該プロトコルにて、従来からの判定基準により炎症性腸疾患を有すると診断されている患者、必要であればクローン病であるか、潰瘍性大腸炎であるかの診断がされている患者の体液、および健常人の体液についてのデータ集積した上で設定される値である。本態様において使用される体液としては、唾液または血清が例示される。
【００２８】
例えば、本願明細書に記載の実施例において用いた方法である、血清中ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖中の５Ｎ／４Ｎ比を用いる場合、５Ｎ／４Ｎの陰性／陽性のカットオフ値を例えば０．９０それより低い値を陽性とすることにより、高い確率で炎症性腸疾患患者の鑑別が可能となる。
【００２９】
さらに炎症性腸疾患患者において血中のＩｇＡヒンジ部のＯ結合型糖鎖における５Ｎ／４Ｎ比をモニタすることにより、疾患の重篤度や治療の有効性を判定することが可能である。
【００３０】
ＩｇＡヒンジ部のＯ結合型糖鎖の５Ｎ／４Ｎ比はまた、ＩｇＡ腎症患者においても減少する。従って本願発明は対象の体液より取得されたＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型の５Ｎ／４Ｎ比が予め設定された値より低い場合にＩｇＡ腎症に罹患している、あるいはその可能性が高いと判定がする方法を提供する。ここで体液としては血液、唾液が例示される。予め設定された値は、上記同様、測定プロトコルを決定した後、健常者並びに患者のデータを元に設定される値である。
【００３１】
本発明の別の態様においては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより得られるヒンジ部当たりのガラクトース（Ｇａｌ）およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の各付加数の相対比からガラクトース付加率を計算し、これを用いて患者の判定を行う。ガラクトース付加率としては、例えばＧａｌ付加数×ピーク高さをそれぞれのパターン毎に足し合わせ、これをＧａｌＮＡＣ付加数×ピーク高さをそれぞれのパターン毎に足し合わせたもので除した値を用いることができる。本明細書において、この値を「Ｇａｌ付加率」とする。
【００３２】
ＩｇＡ腎症患者の血清においてＧａｌ付加率が健常人と比較して有意に低い。これは従来技術で知られているＩｇＡ腎症患者の血清ＩｇＡ糖鎖がＧａｌ欠損であるとの報告と合致する。そして、ＩｇＡ腎症唾液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＧａｌ付加率においても、血清由来の糖鎖と同じく低下を示すことから、対象の唾液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＧａｌ付加率が予め定めた値より低い場合にＩｇＡ腎症に罹患している、あるいはその可能性が高いと判定する、ＩｇＡ腎症の判定方法が提供される。
【００３３】
本態様においても「予め定めた値」とは、唾液由来ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖結合パターンの測定プロトコルを決定した後、該プロトコルにて、従来からの判定基準によりＩｇＡ腎症であると診断されている患者の唾液、および健常人の唾液についてのデータを元に設定すればよい。
【００３４】
上記において炎症性腸疾患並びにＩｇＡ腎症を例にとって説明したが、本願発明の方法はその他のＩｇＡが関与する疾患について応用することが期待される。かかる疾患としては、口腔、歯科、耳鼻科、消化器、呼吸器、免疫、眼科、皮膚科領域等において粘液中に含まれるＩｇＡが病態に寄与する疾患が挙げられ、炎症性腸疾患およびＩｇＡ腎症の他、歯周病、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、角結膜炎等が例示される。
【００３５】
以下実施例を用いて本願発明をさらに詳細に説明する。実施例はいかなる意味においても本願を限定するために用いられるものではない。
【実施例１】
【００３６】
炎症性腸疾患患者並びに健常者の血液並びに唾液よりＩｇＡ糖鎖を単離し、そのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖中のガラクトース（Ｇａｌ）並びにＮ―アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の結合パターンを調べた。
【００３７】
表１に記載の健常人（ＨＶ）３０例、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）３０例、クローン病患者（ＣＤ）３２例、および疾患コントロール（ＤＣ）１７例、ＩｇＡ腎症患者（ＩｇＡＮ）９例の末梢血より常法により血清を得た。
【表１】
2013040771.tif 000002
【００３８】
血清からのＩｇＡの精製は、抗ヒトIgA抗体（MBL社）とHiTrap（商標） NHS-activated HP Columns（GE healthcare社）を用いてカラムのプロトコルに従い作成した抗ＩｇＡ  affinity gelを用いて行った。血清２０μLとgel２０μL、ＰＢＳ５００μＬをチューブ内で混和、２時間撹拌した。gelを洗浄した後、０．１Ｍグリシン（ｐＨ  ２．０）５０μＬにてＩｇＡを溶出した。
【００３９】
得られた糖ペプチドをVoyager DE（商標） Pro MALDI-TOF-MS（Applied Biosystems社）にて解析した。０．１から１ｐｍｏｌの精製糖ペプチドを１０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）にて溶解させ、１μＬをサンプルプレートに乗せて乾燥・結晶化させたのちに正イオンモードにて測定した。
【００４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によって、各ヒンジ部あたりのＧａｌおよびＧａｌＮＡｃそれぞれの結合パターン毎の相対量を得ることができる。図５に代表的な健常人血清中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖に含まれるＧａｌＮＡＣおよびＧａｌ結合パターンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートを示す。また、図６に健常者とクローン病患者間ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートを並べて示す。
【００４１】
各対象から得られたチャートよりヒンジ部毎のＧａｌＮＡｃの付加数とその付加数を示すＩｇＡの存在比を調べ、各患者及び健常者並びに疾患コントロール群それぞれにおける平均値を得た。結果を図７に示す。図７より、クローン病患者においてＧａｌＮＡＣが５結合している糖ペプチド存在比が顕著に低いことが判明した。
【００４２】
ＩｇＡヒンジ部当たりのＧａｌＮＡｃ付加個数を糖鎖変化の指数として採用した。各測定対象につきＧａｌ付加数に拘わらずＧａｌＮａｃ５個付加しているヒンジ部（５Ｎ）とＧａｌＮＡｃ４個付加しているヒンジ部（４Ｎ）の存在比、即ち５Ｎ／４Ｎ比を（５Ｎ２Ｈ＋５Ｎ３Ｈ＋５Ｎ４Ｈ＋５Ｎ５Ｈ）／（４Ｎ２Ｈ＋４Ｎ３Ｈ＋４Ｎ４Ｈ）として計算した。５Ｎ／４Ｎ比の算出方法について図８に図示する。また、各群の平均値を算出した。結果を図９に示す。
図９に示されるように、炎症性腸疾患患者において５Ｎ／４Ｎ比は健常人並びに疾患コントロールと比して有意に低い値を呈した。そしてこの低下は特にクローン病患者において顕著であった。
【００４３】
クローン病患者と健常人の５Ｎ／４Ｎ比と疾患の特異度との間でＲＯＣ曲線を作成した。ＲＯＣ曲線を図１０に示す。得られたＲＯＣ曲線より最区分点を得、０．９０をカットオフ値として算出した。０．９０を陽性率のカットオフ値とすると、ＣＤ患者の８７．５％が陽性群に含まれるが、健常人では６．７％しか陽性群とならず、両者の鑑別が十分可能であることがわかる（図１１）。
【００４４】
さらにクローン病（ＣＤ）患者並びに潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の５Ｎ／４Ｎ比と各患者の臨床パラメーターとの関係について検討した。疾患活動性は、クローン病患者についてはクローン病活動指数（ＣＤＡＩ）、潰瘍性大腸炎患者については潰瘍性大腸炎活動指数（ＣＡＩ）により決定した。各患者の疾患活動性を縦軸に、横軸に５Ｎ／４Ｎ比を取ったグラフを図１１に示す。
図１１より明らかなように、５Ｎ／４Ｎ値は負の相関を示し、５Ｎ／４Ｎ比は疾患の重篤度の判定にも用いうることが示された。
【実施例２】
【００４５】
クローン病患者５名について、インフリキシマブ(商品名：レミケード）による治療の前後で血液を採取し、血中ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の５Ｎ／４Ｎ比を測定した。
患者：年齢２７±７歳、男性３名、女性２名、ＣＲＰ ２．０±１．０、ＣＤＡＩ ２１８±７０（インフリキシマブ投与前）
治療：インフリキシマブ投与は５ｍｇ／Ｋｇを０、２、６週で投与し、以後は８週ごとの維持投与とした。血清はインフリキシマブ投与前および初回投与の６週後に採取した。
【００４６】
ＩｇＡの単離並びにヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる測定は実施例１と同じ手法を用いた。図１２に健常者、治療前後のクローン病患者の代表的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのチャートを、図１３にインフリキシマブ治療前後の５Ｎ／４Ｎ比の変化を示した。
【００４７】
図１３より明らかなように、５Ｎ／４Ｎ比はインフリキシマブ治療により上昇傾向を示した。従って５Ｎ／４Ｎ比は治療による疾患の程度の変化の指標として有用である。
【実施例３】
【００４８】
血中、唾液中並びに腸液中のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖構造の比較
健常人（３１歳、男性）の血液、唾液、並びに腸液よりＩｇＡを単離し、実施例１と同様の方法にてそのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートを作成した。
唾液および腸液１００μＬとaffinity gel ２０μＬ、ＰＢＳ ５００μＬを混和し２時間撹拌する。血清の場合と同様、遠心後に上清を採取することにより洗浄する。ＰＢＳ ５００μＬにて３回洗浄し、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）にて溶出し単離する。
結果を図１４に示す。血清、唾液、腸液より単離したＩｇＡの糖鎖構造の分布を示すチャートである。三者ほぼ同じ構造を有していることがチャートより明らかである。
【００４９】
得られたチャートに基づき５Ｎ／４Ｎ比を計算したところ、血清：１．０８、唾液：１．０８および腸液：１．０４であり、５Ｎ／４Ｎ比という観点からも唾液並びに腸液中のＩｇＡが血液中のＩｇＡとほぼ同じ糖鎖構造を有していることがわかる。
【００５０】
クローン病患者（４１歳女性、小腸大腸型）の血液並びに唾液よりＩｇＡを単離し、実施例１と同様の方法にてそのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートを得た。得られたチャートを図１５に示す。血清由来、唾液由来両者ほぼ同じ構造を有していることがチャートより明らかである。
【００５１】
得られたチャートに基づき５Ｎ／４Ｎ比を計算したところ、血清：０．７６および唾液：０．８５であり、唾液中のＩｇＡが血液中のＩｇＡとほぼ同じ糖鎖構造を有していることがわかる。従って、実施例１および２にて血液を用いて行った同じ試験を唾液を用いて行ったとしても、同様の結果が得られるものと推測される。
【実施例４】
【００５２】
ＩｇＡ腎症とＩｇＡヒンジ部Ｏ結合型糖鎖の関係について調べた。
腎生検にて確定診断されたＩｇＡ腎症患者（男性４例、女性５例、年齢３３．２±６．８歳、クレアチニン０．８２±０．１８）の検体を用いた。
【００５３】
ＩｇＡ腎症患者より血液および唾液を採取し、実施例１並びに実施例３と同じ方法にてＩｇＡを単離した。得られたＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるパターンを実施例１と同様の方法にて得た。代表的なＩｇＡ腎症患者の血清並びに唾液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートを図１６に示す。比較のため、実施例１で得た健常者並びにクローン病患者の血清由来ＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のチャートも同時に示す。
【００５４】
図１６により明らかなように、ＩｇＡ腎症患者の血清並びに唾液由来のＩｇＡヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のパターンはほぼ同じであった。このパターンは健常人やクローン病患者のチャートとは異なる挙動を示した。
【００５５】
各ＩｇＡ腎症患者血清由来ＩｇＡヒンジ部のＯ結合型糖鎖のＭＡＬＤ−ＴＯＦ  ＭＳチャートより５Ｎ／４Ｎ比を得、その平均値を得た。結果を図１７に示す。比較のため、実施例１で得たＨＶ、ＤＣ，ＵＣおよびＣＤの各データとともに示す。
図１７より明らかなように、ＩｇＡ腎症患者の血清由来ＩｇＡの５Ｎ／４Ｎ比は健常人および疾患コントロール群と比べ、有意に低下していた。
【００５６】
更に別の指標として、ガラクトース付加率を計算した。ガラクトース付加率はＧａｌ付加数×ピーク高さをそれぞれのパターン毎に足し合わせ、これをＧａｌＮＡＣ付加数×ピーク高さをそれぞれのパターン毎に足し合わせたもので除したものである。実施例１で得た健常者並びに疾患コントロール、クローン病および潰瘍性大腸炎患者より得たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートに基づき同様にガラクトース付加率を計算した。結果を図１８に示す。
【００５７】
クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者の血清より得たＩｇＡにおいてはガラクトース付加率は健常人（ＨＶ）並びに疾患コントロール（ＤＣ）群と差が無かったが、ＩｇＡ腎症患者の血清中ＩｇＡヒンジ部Ｏ結合型糖鎖においては明らかなガラクトース付加率の低下が認められた。
【００５８】
次いでＩｇＡ腎症患者の唾液由来のＩｇＡのヒンジ部Ｏ結合型糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳチャートからガラクトース付加率を算出した。サンプル数が少なく有意差はつかなかったが血液由来のＩｇＡとほぼ同じ値が得られた。結果を図１９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、炎症性腸疾患やＩｇＡ腎症等の難治性疾患を含む幅広い疾患の判定に用いられる侵襲性の低い疾患の判定方法を提供する。本発明により、簡便かつ患者への負担が非常に少ない疾患の判定方法が提供され、腎生検や内視鏡検査に代わる方法として、あるいは不必要な腎生検や内視鏡検査を避けるために有効に用いることができる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２】
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【図７】
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【図９】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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