(57)【要約】【課題】粒子の大きさのばらつきに由来する変動をうけずに検出値の再現性を向上させることができるようなクロマトグラフ方法を提供すること。【解決手段】被験物質と、該被験物質に対する第一の結合可能物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合可能物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識物質を捕捉した後、金属を含む化合物及び金属イオンのための還元剤を用いて増幅を行うクロマトグラフ方法であって、反応部位の単位面積当たりの増幅後の標識粒子数を計測して被験物質を検出する、上記のクロマトグラフ方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質と、該被験物質に対する第一の結合可能物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合可能物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識物質を捕捉した後、金属を含む化合物及び金属イオンのための還元剤を用いて増幅を行うクロマトグラフ方法であって、反応部位の単位面積当たりの増幅後の標識粒子数を計測して被験物質を検出する、上記のクロマトグラフ方法。
【請求項２】
増幅後の不溶性担体に、不溶性担体を透明化するための溶媒を浸透させる、請求項１に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項３】
不溶性担体を透明化するための溶媒と不溶性担体との屈折率差Δnが−０．１以上０．１以下である、請求項２に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項４】
不溶性担体を透明化するための溶媒と不溶性担体との屈折率差Δnが−０．０２以上０．０２以下である、請求項２又は３に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項５】
銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いて増幅を行う、請求項１から４の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項６】
増幅後の標識粒子をレンズを用いた光学機器で検出して、反応部位の単位面積当たりの標識粒子数を計測する、請求項１から５の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【請求項７】
レンズを用いた光学機器が、顕微鏡、スキャナー、カメラ又はルーペである、請求項１から６の何れか１項に記載のクロマトグラフ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出感度を高めるためのシグナル増幅操作を行うクロマトグラフ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定方法の中でもイムノクロマトグラフ法は、操作が簡便であり、短時間で測定可能であることから、一般的によく利用されている。イムノクロマトグラフ法で用いられている免疫反応としては、競合的反応又はサンドイッチ型反応が広く使われている。その中でも、イムノクロマトグラフ法ではサンドイッチ型反応が主流であり、その典型例においては、試料中の抗原よりなる被験物質を検出するために、以下のような操作が行われる。まず、被験物質である抗原に対する抗体により感作させた微粒子を固相微粒子としてクロマトグラフ担体に固定化することにより、あるいはこの抗体そのものをクロマトグラフ担体に直接固定化することにより、反応部位を有するクロマトグラフ担体を調製する。一方、標識微粒子に被験物質と特異的に結合可能な抗体を感作させて感作標識微粒子を調製する。この感作標識微粒子を試料と共に、クロマトグラフ担体上でクロマトグラフ的に移動させる。以上の操作により、クロマトグラフ担体に形成された反応部位において、固定化された抗体が固定化試薬となり、これに被験物質である抗原を介して感作標識微粒子が特異的に結合する。その結果、感作標識微粒子が反応部位に捕捉されることになり、それにより生ずるシグナルの有無または程度を目視で判定することにより、試料中の被験物質の存在の有無または量を測定することができる。
【０００３】
イムノクロマトグラフ法の中には、感度が低いために抗原が検出されない(偽陰性)問題を回避するために、検出シグナルを増幅させる方法が行われる場合がある。シグナル増幅の方法として、標識としてアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を用いる場合があるが、金属コロイド標識及び金属硫化物標識からなる群から選んだ標識に銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を用いて増感すること(銀増幅)によって検出を行う場合もある。上記のような増幅を用いたイムノクロマトグラフは、特許文献１などに記載されている。一方、生化学の分野において金属粒子などの標識を光学顕微鏡で検出することは知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２０２３０７号公報
【特許文献２】特開２００７−１７８４３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載のイムノクロマト法においては、高感度化のために増幅して標識粒子を大きくした後、目視により、あるいは、反射光を適当な測定装置（例えば、反射光測定装置又はスキャナー等）で分析することによって標識粒子を検出する。しかし、その粒子の大きさがばらつくため粒子が遮蔽する光の量もばらつき、光学濃度の検出結果の再現性が悪くなるという問題があった。
【０００６】
本発明は、粒子の大きさのばらつきに由来する変動をうけずに検出値の再現性を向上させることができるようなクロマトグラフ方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、シグナル増幅操作を行うクロマトグラフ方法において、増幅後の粒子の数を計測することで測定を行うことによって検出値の再現性を向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、被験物質と、該被験物質に対する第一の結合可能物質で修飾した金属を含む標識物質とをこれらの複合体を形成させた状態で不溶性担体上において展開し、該被験物質に対する第二の結合可能物質を有する不溶性担体上の反応部位において該被験物質と該標識物質を捕捉した後、金属を含む化合物及び金属イオンのための還元剤を用いて増幅を行うクロマトグラフ方法であって、反応部位の単位面積当たりの増幅後の標識粒子数を計測して被験物質を検出する、上記のクロマトグラフ方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、増幅後の不溶性担体に、不溶性担体を透明化するための溶媒を浸透させる。
好ましくは、不溶性担体を透明化するための溶媒と不溶性担体との屈折率差Δnが−０．１以上０．１以下である。
好ましくは、不溶性担体を透明化するための溶媒と不溶性担体との屈折率差Δnが−０．０２以上０．０２以下である。
【００１０】
好ましくは、銀を含む化合物及び銀イオンのための還元剤を含む増幅液を用いて増幅を行う。
好ましくは、増幅後の標識粒子をレンズを用いた光学機器で検出して、反応部位の単位面積当たりの標識粒子数を計測する。
好ましくは、レンズを用いた光学機器は、顕微鏡、スキャナー、カメラ又はルーペである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のクロマトグラフ方法によれば、増幅後の粒子の数を計測することで測定を行うことによって検出値の再現性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例で使用したデバイスを示す。
【図２】図２は、実施例で使用したデバイスのうちの第２デバイス部品を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．粒子の検出及び粒子数の計測
本発明のクロマトグラフ方法では、反応部位の単位面積当たりの増幅後の標識粒子数を計測して被験物質を検出することを特徴とする。
不溶性担体上の反応部位における粒子を検出するための手段としては、観察対象を拡大することができるレンズを用いた光学機器（例えば、顕微鏡、スキャナー、カメラ又はルーペなど）を用いることが好ましい。スキャナー、カメラ又はルーペの場合、観察対象である微小の粒子を検出できるような高解像度のものが好ましい。顕微鏡の場合、粒子を検出できる限りその種類は特に限定されず、例として実体顕微鏡、光学顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、電子顕微鏡などを使用することができる。しかし、電子顕微鏡のように空気中の浮遊物により測定感度が低下する場合には、前処理として真空乾燥を行わねばならず、測定本数が限られるという制約がある。サンプルの前処理の必要がなく簡便に短時間で測定できるという観点から、本発明では、光学顕微鏡を使用することが特に好ましい。
【００１４】
本発明においては、金属を含む化合物及び金属イオンのための還元剤を用いて増幅を行う。このように増幅により肥大化した粒子は、倍率約１０倍から粒子の検出が容易となる。従って、顕微鏡、スキャナー、カメラ又はルーペを用いる場合の倍率は、好ましくは１０倍以上であればよく、その上限は特に制限されない。従って、電子顕微鏡などで利用可能な８００，０００倍でも構わない。しかし、倍率が高くなると撮影範囲が狭くなるために測定に必要な面積を撮影するのに時間がかかる。より短時間で測定を行うために倍率は１０倍から１０００倍が好ましく、１０倍から１００倍がより好ましく、１０倍から５０倍がさらに好ましく、１０倍から３０倍が特に好ましい。
【００１５】
粒子の数を計測（カウント）する方法としては、画像解析による粒子数の計測がある。例えば、顕微鏡、スキャナー又はカメラで撮影した画像を、粒子数計測用ソフト(Image J、NIH Image (Scion Image)、又はUTHSCSA Image Toolなど)で読み込み、自動で粒子数を計測することができる。ただし粒子を計測できるのであれば目視で計測するような方法でもよく、画像解析法による自動計測を使用することに限定されるものではない。例えば、ルーペを利用して目視で粒子の数を計測してもよい。
【００１６】
２．不溶性担体の透明化
本発明の好ましい態様によれば、粒子数を計測する前に不溶性担体を透明化する手段を講じることができる。これにより、不溶性担体の厚み方向全域に存在する粒子の検出がより容易となる。不溶性担体を透明化する手段としては、増幅後の不溶性担体に、不溶性担体を透明化するための溶媒（以下、担体透明化溶媒とも言う）を浸透させることが挙げられる。
また、上記溶媒を浸透させる代わりに、不溶性担体の厚さを薄くすることによっても上記の溶媒を浸透させた場合と同様の効果を達成することができる。但し、不溶性担体の厚さを薄くすると、被験物質の展開量も制約されることになり、測定上の制約を受けることになる。
【００１７】
一般にイムノクロマト法においては、不溶性担体としては空隙径、糸径とも０．１μｍ〜数μｍ程度の比較的屈折率の高いニトロセルロース（屈折率 １．４８）繊維を束ねたメンブレンが用いられることが多い。ニトロセルロースメンブレン(屈折率１．４８)ではメンブレン内の空隙を満たしている空気や溶媒(水の場合、屈折率１．３３)との間の屈折率の差が大きいため、光が一部散乱して不透明になり検出できない部分が生じている。そこで、ニトロセルロースメンブレンに近い屈折率を持つ溶媒(担体透明化溶媒)を浸透させることにより光の散乱を無くして透明化し、検出可能な領域を増やすことができる。なお本発明で言う屈折率とは、２０℃で５８９nmにて測定した値である。
【００１８】
１ｍｍ厚の不溶性担体において最下層にある標識物から散乱された光が数百回程度、空隙と繊維との界面で散乱を受けて上方に透過してくる際の透過率について、不溶性担体材質と空隙に充填された媒質との屈折率差Δｎ依存性をシミュレーションした結果から、８０％以上の透過率を得るためには、屈折率差Δｎが−０．１≦Δｎ≦０．１、９０％以上の光透過率を得るためには−０．０７≦Δn≦０．０７となるような屈折率の不溶性担体と、溶媒との組み合わせを選ぶことが必要となることが知られている。また、不溶性担体と溶媒との屈折率差Δｎが小さいほど透過率１００％に近づき、不溶性担体の屈折率と溶媒の屈折率とが同等となる−０．０２≦Δn≦０．０２ではほぼ透過率１００％の優れた目視性を得ることができる（特開２００９−２５７８１９号公報を参照）。
【００１９】
即ち、不溶性担体に近い屈折率を持つ溶媒の条件としては、不溶性担体との屈折率差Δnが−０．１≦Δn≦０．１となるものであり、好ましくは−０．０７≦Δn≦０．０７であり、更に好ましくは−０．０２≦Δn≦０．０２である。
【００２０】
担体透明化溶媒としては、沸点が７０℃以上の溶媒が好ましく、沸点が９０℃以上の溶媒がより好ましい。
担体透明化溶媒として用いることのできる溶媒としては、そのような屈折率を持つ溶媒としてジメチルスルホキシド（屈折率１．４８）、グリセリン(屈折率１．４５)及びその水溶液、ベンゼン（屈折率約１．５）及び類似化合物(例えばベンジルアルコール（屈折率１．５４）)、パラフィン油（屈折率１．４８）などが挙げられる。
【００２１】
担体透明化溶媒を選択する際には、不溶性担体の屈折率から計算して−０．１≦Δn≦０．１となるように溶媒を選択することもできるし、予め、不溶性担体に上記のような溶媒を浸透させてみて、担体が透明化する溶媒を選択することもできる。
ここでいう不溶性担体の透明化とは、可視光を用いた透過率測定装置による測定で不溶性担体の透過率が８０％以上となること、または不溶性担体を通して、不溶性担体と不溶性担体を乗せた透明な基板(例えばスライドガラスのような)の間に配置した1μm以上の大きさの金属粒子が配置した個数分だけ識別できることのいずれかを意味する。
ニトロセルロースメンブレンを不溶性担体として用いた場合の担体透明化溶媒としては特にジメチルスルホキシド溶液が好ましい。
【００２２】
不溶性担体に担体透明化溶媒を浸透させるとき、親水的な溶媒であれば増幅後の水溶液を置換することで浸透させることができる。疎水的な溶媒であれば、不溶性担体中の水溶液を洗浄により除去し乾燥させたのちに浸透させることもできる。ただし、不溶性担体内に担体透明化溶媒を浸透させることができればどのような方法でもよく、これらの方法に限定されるものではない。
【００２３】
３．変動係数の低下
本発明のクロマトグラフ方法によれば、増幅後の粒子の数を計測することによって測定を行うことによって検出値の再現性を向上させることができる。ここで測定値のばらつきの指標として、変動係数を用いることができる。変動係数とは標準偏差を平均値で割ったものであり、相対的なばらつきを示すものである。
【００２４】
ばらつきが小さいことは精度良い測定ができることを意味し、精度良い測定ができるということはインフルエンザ検査キットを用いるような診断において陽性/陰性の判定をより精度よく行えることを意味する。そのためにばらつきが小さいということは診断において有利な要因となる。
【００２５】
４．クロマトグラフ
一般に、クロマトグラフ方法とは以下のような手法で被験物質を簡便・迅速・特異的に判定・測定する手法である。すなわち、被験物質と結合可能な固定化試薬（被験物質に対する第二の結合物質、又は下記の第一の結合物質に対する結合物質に相当するもの；具体的には抗体、抗原等）を含む少なくとも１つの標識物質捕捉領域を有するクロマトグラフ担体を固定相として用いる。このクロマトグラフ担体上で、被験物質に対する第一の結合物質によって修飾された標識物質を含む液を移動層として前記クロマトグラフ担体中をクロマトグラフ的に移動させると共に、前記被験物質と標識物質とが特異的に結合しながら、標識物質捕捉領域まで到達する。標識物質捕捉領域において、被験物質と標識物質の複合体が前記固定化試薬に特異的結合することにより、被分析液中に被験物質が存在する場合にのみ、前記固定化試薬に標識物質が濃縮されることを利用し、それらを目視または適当な機器を用いて被分析液中に被験物質が存在することを定性および定量的に分析する手法である。
【００２６】
本発明におけるクロマトグラフ方法を行うキットや装置は、金属を含む化合物及び金属イオンのための還元剤を内蔵していてもよく、前記固定化試薬に結合した前記被験物質と標識物質の複合体を核として増幅反応によって、シグナルを増幅し、結果として高感度化を達成することができる。本発明によれば、迅速な高感度クロマトグラフを行うことができる。
【００２７】
５．被験試料
本発明のクロマトグラフ方法で分析することのできる被験試料としては、被験物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。被験物質としては、例えば、天然物、毒素、ホルモン、農薬等の生理活性物質、環境汚染物質、ウイルス、抗原、抗体などが挙げられる。 
【００２８】
６．被験試料の前処理
本発明のクロマトグラフ方法では、前記被験試料をそのままで、あるいは、前記被験試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、前記抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは前記抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。前記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、前記溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
【００２９】
７．構成
本発明のクロマトグラフ方法において使用することのできるクロマトグラフ用ストリップとしては、通常のクロマトグラフ法に用いることができるクロマトグラフ用ストリップである限り、特に限定されるものではない。
クロマトグラフ用ストリップとしては、展開方向の上流から下流に向かって、試料添加パッド、標識物質保持領域を有する標識物質保持パッド（例えば金コロイド抗体保持パッド）、クロマトグラフ担体（例えば、標識物質捕捉領域を有する抗体固定化メンブレン）、及び吸収（吸水）パッドをこの順に、粘着シート上に配置することができる。前記クロマトグラフ担体は、被験物質と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した領域などである標識物質捕捉領域を有し、所望により、コントロール用抗体又は抗原を固定化した領域であるコントロールゾーン（コントロール領域と記載することもある）を更に有していてもよい。
【００３０】
前記標識物質保持パッドは、標識物質を含む懸濁液を調製し、その懸濁液を適当な吸収パッド（例えば、グラスファイバーパット）に塗布した後、それを乾燥することにより調製することができる。
【００３１】
前記試料添加パッドとしては、例えばグラスファイバーパットを用いることができる。
【００３２】
７−１．標識物質
検出用の標識物質は、免疫凝集反応に用いられている着色粒子を使用することができる。例えば、金属コロイドのような金属等を用いることができる。担体粒子（又はコロイド）の平均粒径は、０．００１〜１μｍの範囲が好ましい。色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も着色粒子として使用することができる。従来公知の着色金属コロイドはいずれも標識用着色粒子として使用することができる。例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、鉄コロイド、水酸化アルミニウムコロイド、およびこれらの複合コロイドなどが挙げられ、好ましくは、金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、およびこれらの複合コロイドである。特に、金コロイドと銀コロイドが適当な粒径において、金コロイドは赤色、銀コロイドは黄色を示す点で好ましい。金属コロイドの平均粒径としては、約１ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、１〜５０ｎｍがさらに好ましく。１〜１５ｎｍが特に好ましい。金属コロイドと特異結合物質との結合は、従来公知の方法（例えばＴｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｐｐ６９１−６９６，（１９８２））に従い、行うことができる。すなわち、金属コロイドと特異結合物質（例えば抗体）を適当な緩衝液中で室温下５分以上混合する。反応後、遠心分離により得た沈殿を、ポリエチレングリコ−ル等の分散剤を含む溶液中に分散させることにより、目的の金属コロイド標識特異結合物質を得ることができる。金属コロイドとして金コロイド粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．  Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．２４１，２０，（１９７３）等）により金コロイド粒子を調製することができる。
【００３３】
本発明によれば、検出用標識物として金属コロイド標識又は金属硫化物標識、その他金属合金標識（以下、金属系標識と称することがある）、また金属を含むポリマ−粒子標識を用いるクロマトグラフにおいて、前記金属系標識の信号を増幅させることができる。具体的には、被験物質と検出用標識物の複合体の形成後に、無機銀塩や有機銀塩などの銀を含む化合物から供給される銀イオンおよび銀イオンのために還元剤を接触させ、還元剤によって銀イオンを還元して銀粒子を生成させると、その銀粒子が前記金属系標識を核として前記金属系標識上に沈着するので、前記金属系標識が増幅され、被験物質の分析を高感度に実施することができる。従って、本発明のクロマトグラフ方法では、還元剤による銀イオンの還元作用により生じた銀粒子を用いて、免疫複合体の標識に沈着させる反応を実施し、こうして増幅された信号を分析することを除けば、それ以外の点では従来公知のクロマトグラフ法をそのまま適用することができる。
【００３４】
本発明のクロマトグラフ方法では、被験物質（抗原又は抗体）と特異的に結合する抗体若しくは抗原、又は標準化合物を標識するのに用いる標識として、金属コロイド標識又は金属硫化物標識を用いる。前記金属コロイド標識又は金属硫化物標識としては、通常のクロマトグラフ方法に用いることができる標識である限り、特に限定されるものではなく、金属コロイド標識としては、例えば、白金コロイド、金コロイド、パラジウムコロイド、又は銀コロイドそして、それらの混合物を挙げることができ、金属硫化物標識としては、例えば、鉄、銀、パラジウム、鉛、銅、カドミウム、ビスマス、アンチモン、錫、又は水銀の各硫化物を挙げることができる。本発明のクロマトグラフ方法では、これらの金属コロイド標識及び／又は金属硫化物標識の１又はそれ以上を標識として用いることができる。
【００３５】
７−２．結合物質
本発明では、標識物質は、被験物質に対する第一の結合物質で修飾されている。第一の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。
【００３６】
本発明のクロマトグラフキットにおける標識物質捕捉領域は、（ａ）被験物質に対する第二の結合物質、又は（ｂ）上記第一の結合物質に対する結合物質を有している。該被験物質に対する第二の結合物質とは、例えば該被験物質（抗原）に対する抗体、該被験物質（抗体）に対する抗原、該被験物質（たんぱく質、低分子化合物等）に対するアプタマーなど、該被験物質に対して親和性を持つ化合物であればなんでもよい。また、第二の結合物質と第一の結合物質とは異なるものでも良いし、同一のものでもよい。第一の結合物質に対する結合物質とは、被験物質そのものでも良いし、第一の結合物質が認識する部位を持つ化合物でもよく、たとえば被験物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などがそれにあたる。
【００３７】
好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、及び／または第二の結合物質が抗体である。
より好ましくは、第一の結合物質が抗体であり、第二の結合物質が第一の結合物質と結合する抗体である。
【００３８】
本発明のクロマトグラフ方法では、被験物質に対して特異性を有する抗体として、特に限定されるものではないが、例えば、その被験物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被験物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。
【００３９】
７−３．クロマトグラフ担体
クロマトグラフ担体としては、多孔性担体が好ましい。特に、ニトロセルロース膜（屈性率１．４８）、セルロース膜（屈折率１．４９）、アセチルセルロース膜（屈性率１．４７）、ポリスルホン膜（屈折率１．６３）、ポリエーテルスルホン膜（屈折率１．６５）、ナイロン膜（屈性率約１．５３）、ガラス繊維（屈折率１．４３〜２．１４）、不織布（屈折率は素材による）、布（屈折率は素材による）、または糸（屈折率は素材による）等が好ましい。
【００４０】
通常、クロマトグラフ担体の一部に、被験物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質を固定化させて標識物質捕捉領域を作製する。被験物質に対する第二の結合物質又は上記第一の結合物質に対する結合物質は、クロマトグラフ担体の一部に物理的または化学的結合により直接固定化させてもいいし、あるいはラテックス粒子などの微粒子に物理的または化学的に結合させ、この微粒子をクロマトグラフ担体の一部にトラップさせて固定化させてもいい。なお、クロマトグラフ担体は、検出用物質を固定化後、不活性蛋白による処理等により非特異的吸着防止処理をして用いるのが好ましい。
【００４１】
７−４．試料添加パッド
試料添加パッドの材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、及び綿布等の均一な特性を有するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試料添加部は、添加された被験物質を含む試料を受入れるだけでなく、試料中の不溶物粒子等を濾過する機能をも兼ねる。また、分析の際、試料中の被験物質が試料添加部の材質に非特異的に吸着し、分析の精度を低下させることを防止するため、試料添加部を構成する材質は、予め非特異的吸着防止処理して用いることもある。試料添加パッドは、次に述べる標識保持パットを兼ねていてもよい。
【００４２】
７−５．標識物質保持パッド
標識物質保持パッドの素材としては、例えば、セルロース濾紙、グラスファイバー、及び不織布等が挙げられ、前述のように調製した標識物質を一定量含浸し、乾燥させて作製する。
【００４３】
７−６．吸収（吸水）パッド
吸収パッドは、添加された試料がクロマト移動により物理的に吸収されると共に、クロマトグラフ担体の検出部に不溶化されない未反応標識物質等を吸収除去する部位であり、セルロ−ス濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等吸水性材料が用いられる。添加された試料のクロマト先端部が吸収部に届いてからのクロマトの速度は、吸収材の材質、大きさなどにより異なるので、その選定により被験物質の測定に合った速度を設定することができる。
【００４４】
８．検査の方法
以下、本発明のクロマトグラフ方法について、その具体的な実施態様であるサンドイッチ法及び競合法について説明する。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体及び第２抗体を、先に述べた方法により予め調製しておく。また、第1抗体を、予め標識化しておく。第2抗体を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定し、被験物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に被験物質が存在する場合には、抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。前記抗原抗体反応と同時又は反応後に、過剰量の標識化第1抗体を更に接触させると、被検試料中に被験物質が存在する場合には、固定化第2抗体と被験物質（抗原）と標識化第1抗体とからなる免疫複合体が形成される。
【００４５】
サンドイッチ法では、固定化第2抗体と被験物質（抗原）と第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、例えば、第一の不溶性担体における固定化第2抗体を固定した領域をそのまま観察しその標識物を検出、または定量し、被検試料中の被験物質の有無判定または量を測定することができる。本発明においては、例えば、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅し検出する。
【００４６】
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質の分析を実施することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。まず、被験物質（抗原）に対して特異性を有する第１抗体を予め調製しておく。また、第1抗体を、予め金属コロイドなどで標識化しておく。第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物を、適当な第一の不溶性担体（例えば、ニトロセルロ−ス膜、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜等）上に固定しておく。被験物質（抗原）を含む可能性のある被検試料（又はその抽出液）と接触させると、その被検試料中に被験物質が存在しない場合には、標識化された第一抗体と、第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物とにより、第一の不溶性担体上の抗原抗体反応が起きる。一方、被験物質が存在する場合には、標識された第1抗体に被験物質（抗原）が結合するため、その後の第一抗体に対して結合性を有する、被験物質そのもの、または被験物質と類似な部位を持ち被験物質と同様の第一抗体に対するエピトープを持つ化合物との、第一の不溶性担体上の抗原抗体反応が阻害され、抗原抗体反応による結合が起こらない。
【００４７】
第一抗体に対して結合性を有する固定化物と標識化された第1抗体との反応が終了した後、前記免疫複合体を形成しなかった標識化第1抗体を除去し、続いて、例えば、第一の不溶性担体における第一抗体に対して結合性を有する物質をそのまま観察しその標識物量を検出、または定量し、被検試料中の被験物質の有無判定または量を測定することができる。本発明においては、固定した領域に、例えば、金属イオン及び還元剤を供給することにより、前記免疫複合体を形成した標識化第1抗体の標識からの信号を増幅して検出する。
【００４８】
９．増幅液
増幅液は、含まれる薬剤が標識物質や被験物質の作用により、触媒的に反応することで、着色した化合物や発光などを生じ、シグナルの増幅を起こすことができる溶液である。例えば、金属標識上で、物理現像により金属銀の析出を起こす銀イオン溶液などが挙げられる。ただし、金属標識上で、物理現像により金属を析出できるものであれば、銀イオン以外の金属イオン（例えば、白金イオン、金イオンなど）を含む溶液を用いることもできる。
【００４９】
詳細には、写真化学の分野での一般書物（例えば、「改訂写真工学の基礎-銀塩写真編-」（日本写真学会編、コロナ社）、「写真の化学」（笹井明、写真工業出版社）、「最新処方ハンドブック」（菊池真一他、アミコ出版社））に記載されているような、いわゆる現像液を用いることができ、液中に銀イオンを含み、液中の銀イオンが現像の核となるような金属コロイド等を中心に還元される、いわゆる物理現像液であれば、特に限定されることなく増幅溶液として用いることができる。
【００５０】
本発明では、標識物質捕捉領域に捕捉された標識物質のシグナルを増幅するために使用する２種の増幅試薬のうち、第１の増幅試薬を第１液に、第２の増幅液を第２液に含有させておき、第１液および第２液を順次、添加することにより増幅を行うことが好ましい。第１液は、標識物質保持パッドおよび試料添加パッドよりも上流に位置する、還元剤溶液を送液するためのパッドに添加することが好ましい。
【００５１】
増幅液の具体例としては、金属イオン（例えば、銀イオン）のための還元剤を含む第１液、及び、金属イオン（例えば、銀イオン）を含む化合物を含む第２液の組み合わせを用いることができる。
【００５２】
以下、第１液に含まれる銀イオンのための還元剤と第２液に含まれる銀イオンを含む化合物等について説明する。
【００５３】
（銀イオンを含む化合物）
銀イオン含有化合物としては、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物であり、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
【００５４】
無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として一般に0.001モル／ｍ2〜0.2モル／ｍ2、好ましくは0.01モル／ｍ2〜0.05モル／ｍ2含有されることが好ましい。
【００５５】
（銀イオンのための還元剤）
銀イオンのための還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。
無機還元剤としては、Fe2+、V2+、Ti3+、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Fe2+を還元剤として用いる系では、クエン酸やEDTAを用いて酸化物であるFe3+の錯体を形成し、無害化することができる。本系ではこのような無機還元剤を用いることが好ましく、より好ましくはFe2+の金属塩が好ましい。
【００５６】
なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３−ピラゾリドン類、ｐ−アミノフェノール類、ｐ−フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第6,020,117号に記載されている材料も用いることができる。
【００５７】
還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸と類似物、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ−またはＬ−アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ−ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（またはＬ−エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩または当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ−ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ−アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
【００５８】
１０．その他の助剤
増幅液のその他の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤を含む場合がある。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらのどれかの塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを添加剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら添加剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ9Ｈ19-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈである。
【００５９】
増幅試薬をクロマトキットに点着する方法としては、還元剤溶液(第１液)を、還元剤溶液を送液するためのパッドに点着し、銀イオン溶液（第２液）を標識物質捕捉領に上から点着する方法が好ましい。
２種の増幅試薬をクロマトキットに内蔵する方法としては、各増幅試薬を含む溶液を含むポットを、各増幅試薬を点着する部位の上部に配置する方法が挙げられる。還元剤溶液(第１液)を、還元剤溶液を送液するためのパッドの上部に置き、銀イオン溶液（第２液）を含むポットを銀イオン溶液充填孔のすぐ上部に設置することが好ましい。このように配置することにより、それぞれのポットを押すことで液が流れ、所定の部位に点着することができる。
【００６０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
(１）インフルエンザウィルス抗原検出イムノクロマトキットの作成
（1-1）抗インフルエンザA型抗体修飾金コロイドの作成
直径50 nm金コロイド溶液（EM.GC50、BBI社）9 mLに50 mM KH2PO4バッファー（pH 7.5）1mLを加えることでpHを調整した金コロイド溶液に、160 μg / mLの抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5  7307、Medix Biochemica社）溶液1 mLを加え攪拌した。10分間静置した後、1%ポリエチレングリコール（PEG Mw.20000、品番168-11285、和光純薬）水溶液を550 μL加え攪拌し、続いて10 %牛血清アルブミン（BSA FractionV、品番A-7906、SIGMA）水溶液を1.1 mL加え攪拌した。この溶液を8000×ｇ、４ ℃、30分遠心（himacCF16RX、日立）した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散した。この後、20 mLの金コロイド保存液（20 mM Tris-HClバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 150 mM NaCl, 1 % BSA）に分散し、再び8000×ｇ、４℃、30分間遠心した後、1 mL程度を残して上清を取り除き、超音波洗浄機により金コロイドを再分散し、抗体修飾金コロイド（50 nm）溶液を得た。
【００６２】
（1-2）抗インフルエンザA型抗体修飾金コロイド保持パッドの作成
（1-1）で作成したインフルエンザA型抗体修飾金コロイドを、金コロイド塗布液（20 mM Tris-Hclバッファー(pH 8.2), 0.05 % PEG（Mw.20000）, 5 % スクロース）及び水で希釈し、520 nmのODが0.04となるように希釈した。この溶液を、8 mm×150 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）1枚あたり0.8 mLずつ均一に塗布し、一晩減圧乾燥して金コロイド抗体保持パッドを得た。  
【００６３】
(1-3）抗インフルエンザA型抗体及び抗マウスIgG抗体固定化メンブレン（クロマトグラフ担体）の作成
25 mm×300 mmに切断したニトロセルロースメンブレン（プラスチックの裏打ちあり、HiFlow Plus HF180、ミリポア社）（屈折率１．４８）に関し以下のような方法により抗体を固定し抗体固定化メンブレンを作成した。メンブレンの長辺を下にし、下から10 mmの位置に、1.5 mg / mLとなるように調製した抗インフルエンザA型モノクローナル抗体（Anti-Influenza A SPTN-5  7307、Medix Biochemica社）溶液をライン状に塗布した。さらに下から15 mmの位置に、0.2 mg / mLとなるように調製した抗マウスIgG抗体（抗マウスIgG(H+L),ウサギF(ab')2, 品番566-70621、和光純薬）溶液をライン状に塗布した。塗布したメンブレンは、温風式乾燥機で50℃、30分間乾燥した。ブロッキング液（0.5 w%カゼイン（乳由来、品番030-01505、和光純薬）含有50 mMホウ酸バッファー(pH 8.5)）500 mLをバットに入れ、そのまま30分間静置した。その後、同様のバットに入れた洗浄・安定化液（0.5 w%スクロースおよび0.05 w%コール酸ナトリウムを含む50 mM Tris-HCl（pH 7.5）バッファー）500 mLに移して浸し、そのまま30分間静置した。メンブレンを液から取り出し、室温で一晩乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。
【００６４】
（1-4）イムノクロマトグラフストリップの作製
バック粘着シート（ARcare9020、ニップンテクノクラスタ社）に、（1-3）で作成した抗体固定化メンブレンを貼り付けた。その際メンブレン長辺側のうち、テストライン側を下側とする。抗体固定化メンブレンの下側に約2 mm重なるように2で作成した金コロイド抗体保持パッドを貼り付け、約4 mm重なるようにして金コロイド抗体保持パッド下側に試料添加パッド（18 mm×250 mmに切ったグラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社））を重ねて貼り付けた。さらに、抗体固定化メンブレンの上側には約5 mm重なるように吸収パッド（80 mm×250 mmに切ったセルロースパッド（CFSP223000、ワットマン社））を重ねて貼り付けた。これら重ね張り合わせた部材（イムノクロマト本体部材）を、部材の長辺側を7 mm幅になるように短辺に平行にギロチン式カッター（CM4000、ニップンテクノクラスタ社）切断していくことで、7 mm×55 mmのイムノクロマト用ストリップを作成した。
【００６５】
（1-5）銀増幅液の作成 
(1-5-1）還元剤溶液の作製
水290gに、硝酸鉄(III)九水和物（和光純薬、095-00995）を水に溶解して作製した１mol/lの硝酸鉄水溶液23.6ml、クエン酸（和光純薬、038-06925）13.1gを溶解させた。全て溶解したら、スターラーで攪拌しながら硝酸（10重量%）を36ml加え、硫酸アンモニウム鉄（II）六水和物（和光純薬、091-00855）を60.8g加えこれを還元剤溶液とした。
【００６６】
(1-5-2）銀イオン溶液の作製
水66ｇに、硝酸銀溶液８ｍl（10ｇの硝酸銀を含む）と１mol/lの硝酸鉄水溶液24mlを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（10重量%）5.9ml、ドデシルアミン（和光純薬、123-00246）0.1g、界面活性剤Ｃ12Ｈ25-Ｃ6Ｈ4-Ｏ-（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）50Ｈ  0.1gをあらかじめ47.6ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを銀イオン溶液とした。
【００６７】
(1-6) アッセイ用デバイスの作製
図１に示す第１のデバイス部品（射出成形によるポリプロピレン製）に、図１で示すようにイムノクロマトグラフ用のテストストリップを装填した。次に、図２に示すように第２の不溶性担体および第３の不溶性担体として、グラスファイバーパッド（Glass Fiber Conjugate Pad、ミリポア社）を装填した。図１の洗浄液貯蔵ポットには上記(1-5-1)で作製した還元剤溶液185 μLを入れ、アルミラミシート（NewADM、サンライズ社）で熱ラミネートにより封止し、第２のデバイス部品を第１のデバイス部品に嵌め合わせた。なお、図１に示したポット受け部には、上記（1-5-2）で作製した銀イオン溶液95 μLを入れ、アルミラミシートで封止した液体貯蔵ポットを装填した。
【００６８】
（2）評価
（2-1）点着
模擬陽性検体(BD FluエグザマンコントロールA+B- (ベクトン・ディッキンソン社))を抽出液(1% BSA含有PBS)で128倍、または512倍に希釈して、検体注入孔に140 μL点着し10分間静置した。
【００６９】
(2-2) 第２、第３の不溶性担体の押し付け
検体液を10分間展開した後、第２のデバイス部品の押し付け部位を10Ｎの力で押し、第２のデバイス部品をたわませることで、送液用不溶性担体（第２、第３の不溶性担体）をメンブレンに押し付けた。この際の、押し付け量は第１のデバイス部品の部材と第２のデバイス部品が接触することで制限されている。イムノクロマトグラフ用ストリップのメンブレン表面と、第２のデバイス部品によって送液用不溶性担体のメンブレンに接触する部位が0.2mmに潰されるように部材の高さを調整した。また、イムノクロマトグラフ用ストリップのメンブレン表面と第２のデバイス部品のリブ部材の間にある押付け面とのクリアランスが0.005mmとなるように、第２のデバイス部品の突起部の形状を調整した。
【００７０】
（2-3）洗浄
送液用不溶性担体を押し付けてから30秒経過したところで、第２のデバイス部品の洗浄液貯蔵ポットを上から押してアルミシートを突き破り、洗浄用不溶性担体に還元剤溶液を染みこませた。こうして還元剤溶液をイムノクロマトグラフストリップに展開させ３分間送液した。この工程によりイムノクロマトグラフストリップが還元剤溶液に浸され、さらに特異的に吸着していない材料が洗浄された。
【００７１】
（2-3）増幅溶液によるシグナル増幅
第２のデバイス部品に装填したポット受け部にはめ込んである液体貯蔵ポットを押し込み、突起部位により封止を突き破り銀イオン溶液を液体貯蔵ポットから排出させて注入孔に注ぎ込ませた。銀イオン溶液がメンブレン表面と第２のデバイス部品の突起部位とのクリアランスに満たされ、検出ラインに吸着された金コロイド標識を１分間増幅した。増感処理が終了したイムノクロマトグラフストリップのメンブレン部分を切り出し、よく水洗した。
【００７２】
（3）検出
(3-1)＜比較例＞  光学濃度読み取り法
水洗後の抗インフルエンザA型抗体固定化メンブレンを白色版の上にのせてLAS-4000(FUJIFILM)で撮影した。ライン部とバックグラウンド部の吸光度差(ΔO.D.、単位mABS)を求め、検出値とした。
【００７３】
(3-2)＜実施例＞粒子数計測法
水洗後の抗インフルエンザA型抗体固定化メンブレンをジメチルスルホキシド（屈折率１．４８）に浸して30分置いた。スライドガラス上にメンブレンを乗せてカバーガラスで蓋をした後、倒立型電動リサーチ顕微鏡 IX81(オリンパス)にて撮影した。粒子数カウントソフトImage Jにて算出したライン部とバッググラウンド部の銀粒子数の差(単位 個/0.05mm２)を検出値とした。
【００７４】
(3-3)変動係数の算出
抗原を各倍率に希釈した液を用いて10回ずつ測定を行い、増幅処理後イムノクロマトグラフストリップを用意した。増幅処理後のストリップをそれぞれの方法で検出して各検出値の平均値、標準偏差から変動係数を求めた。結果を表１に示す。実施例は比較例に対して変動係数が低く抑えられたため、それぞれの抗原濃度において再現性が良好になることが実証された。
【００７５】
【表１】
2013181935.tif 000002
【図１】
2013181935.tif 000003
【図２】
2013181935.tif 000004