(57)【要約】      （修正有）【課題】体重減少又は肥満のコントロールを達成するために哺乳動物を治療するのに有用な医薬組成物の提供。【解決手段】ゲル排除クロマトグラフィにより測定したときの見掛け分子質量Ｍｒが６．０ｋＤａより大きく、特定配列を有するポリペプチド部分である。Ｚｎ−α２−糖タンパク質又はその断片の性質及び特性を有する療用生物活性脂質移動剤を含む医薬組成物並びに生物物質からの単離及び精製方法。さらに、上記物質の、診断剤の開発及び治療目的の脂肪分解活性のインヒビターの同定への使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせる方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に、配列番号１に示されるような配列を有するポリペプチド部分であるＺｎ−α２−糖タンパク質である脂質動員因子を、治療的に有効な投薬量投与することを含む方法。
【請求項２】
哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせる方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に、ゲル排除クロマトグラフィーにより決定される見かけの分子量が約６ｋＤａよりも大きく、配列番号１に示されるような配列を有するポリペプチド部分であるＺｎ−α２−糖タンパク質を酵素トリプシンで消化することにより得られる脂質動員因子を、治療的に有効な投薬量投与することを含む方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学及び医薬の分野に関し、とりわけ生物系において脂質移動性を示す、断片を含む一定の糖タンパク質の治療用途に関する。特に、一態様によれば、本発明は、このような糖タンパク質及びそれらの断片を哺乳動物の治療に使用して減量したり、肥満をコントロールすることを含む。また、本発明は、生物材料からのこのような糖タンパク質の単離及び精製に関する。また、本発明は、このような糖タンパク質の、診断剤及び治療用インヒビターの開発への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
便宜上、以下の説明に関するか、それに述べられている参考文献には、数字を附し、添付の参考文献一覧表に記載する。
【０００３】
本発明は、癌悪液質に関連して実施した研究に端を発する。癌悪液質は、数多くのヒト癌患者、とりわけ胃腸癌又は肺癌を患った患者に見られる一般的な状態であり、脂肪組織及び骨格筋質量の両方の損失から生じる、進行性衰弱、著しい体重の減り及びせきそうにより特徴付けられる。以前の調査により、体重及び体組織（脂肪及び筋肉）の特徴的な損失は、通常食品及び水の摂取の減少によっては簡単には説明することができず、その影響は、循環系に入る異化因子の腫瘍による産生に起因することが分かった。脂肪分解活性とタンパク質分解活性の両方が関与し、これらの活性、とりわけ脂肪組織の異化及びカーカス脂肪の減少を生じさせる脂質移動因子を生じる物質を単離及び精製する試みが極めて多数なされた。
【０００４】
ＧＢ２２１７３３０Ａにおいて、例えば、少なくとも一段のゲル濾過排除クロマトグラフィを含むクロマトグラフィを用いた推定上の単離及び精製が、ＭＡＣ１６と命名された悪液質誘発ネズミ腫瘍由来及び悪液質癌患者の尿由来の脂肪分解因子について記載され、脂肪分解効果を生じさせる５０００ダルトン未満の見掛け分子量を有するいくつかの関連分子種があることを示唆する結果が得られた。しかしながら、活性分子種を、治療用途に使用するのに必要とする程度に精製し、その化学構成の面で活性物質を十分に特性付けする試みにおいて、重大な問題に遭遇した。より最近では、１９９５年に、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｐｉｄ−ｍｏｂｉｌｉｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｃｈｅｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ（マウス及びヒトにおける悪液質誘発腫瘍に関連した脂質移動因子の精製及び特性付け）」と題するＴ．Ｍ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ等による論文が、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５５、１４５８−１４６３（参考文献１）に発表された。ここでは、見掛け相対分子質量Ｍｒが２４ｋＤａである物質が、イオン交換、サイズ排除及び疎水クロマトグラフィの組み合わせを含む単離精製方法を用いて、上記悪液質誘発ネズミ腫瘍ＭＡＣ１６と癌悪液質を患った患者の尿の両方から単離されたことが報告され、この物質が癌悪液質脂質移動因子の精製形態であるとの考えが示された。しかしながら、その後、この２４ｋＤａ物質は、実際には、Ｐ．Ｔｏｄｏｒｏｖ等、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３７９、７３９−７４２（参考文献２）によって報告されているように、骨格筋タンパク質の異化を誘発することにより、均質に精製すると非腫瘍担持マウスにおいて悪液質状態を生じるプロテオグリカンであることが判明した。したがって、この２４ｋＤａ物質はタンパク質分解因子であり、脂肪分解活性は別個で異なった脂肪分解因子での共精製による汚染に起因するものにちがいないと思われる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、悪液質誘発ネズミ腫瘍ＭＡＣ１６により産生され且つ癌悪液質患者の尿にも存在する真性脂肪分解又は脂質移動因子（ＬＭＦ）は、実際には、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に附したときの電気泳動移動度により測定した見掛け相対分子量が約４３ｋＤａであり、且つＺｎ−α２−糖タンパク質として知られている糖タンパク質と同じであるか極めて類似しているとともに特性が共通している、糖タンパク質であるとの知見に基づくものである。Ｚｎ−α２−糖タンパク質は、ヒト血漿中に見つけだされ、Ｂｕｒｇｉ及びＳｃｈｍｉｄ、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ（正常ヒト血漿のＺｎ−α２−糖タンパク質の調製及び性質）」（１９６１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３６、１０６６−１０７４（参考文献３）の論文に最初に報告されて以来知られている。この物質の性質及び生理的作用は十分には分かっていないけれども、この物質は、化学的性質及び物理化学的性質の面で高度に精製され、特性付けされた。さらに、完全なアミノ酸配列が、Ｔ．Ａｒａｋｉ等、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎｓ（ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質完全アミノ酸配列及びその組織適合抗原との相同性）」（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５、６７９−６８３（参考文献４）の論文に報告された。この文献では、この糖タンパク質は、３つの別個のドメイン構造（Ａ、Ｂ及びＣ）を有し、３つのグリコシル化部位にＮ結合グリカンといっしょに２つのジスルフィド結合を含む、２７６アミノ酸残基の単一ポリペプチド鎖からなるものとして示された。このポリペプチド成分のアミノ酸配列を、添付図面の図１に示す。以下に示す刊行物の一部は、ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質の組成は、異なる体液又は組織から単離したときに多少異なることがあるが、この物質の全ての試料は実質的に同じ免疫学的特性を有することを示した。Ｈ．Ｕｅｙａｍａ等（１９９１）「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｇｅｎｅ（ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質ｃＤＮＡのクローニング及びヌクレオチド配列並びにその遺伝子の染色体の割り当て）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７、６９６−７０３（参考文献５）により報告されているように、Ｚｎ−α２−糖タンパク質のｃＤＮＡが、ヒト肝臓及び前立腺ライブラリーから単離され、また、遺伝子が、Ｈ．Ｕｅｙａｍａ等（１９９３）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質用遺伝子の分子クローニング及び染色体割り当て）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２、１２９６８−１２９７６（参考文献６）に報告されているように単離された。また、Ｈ．Ｕｅｙａｍａ等は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）１１６、６７７−６８１（参考文献７）に、ラットとマウスの肝臓由来のＺｎ−α２−糖タンパク質ｃＤＮＡを、対応のｍＲＮＡにより発現される糖タンパク質と一緒に、配列決定し、ヒト物質と比較した研究についても記載した。詳細な差異は異なる種から予測されるであろうことが分かったが、対応のヒト配列と５０％超が同一（糖タンパク質のドメインＢ内では７０％超が同一）であるという高度のアミノ酸配列の相同性が判明した。ここでも、ヒト、ラット及びマウスのＺｎ−α２−糖タンパク質の間に共通の免疫学的性質が観察された。
【０００６】
カラムクロマトグラフィ分離の６つの工程を含む方法による新鮮なヒト血漿から精製Ｚｎ−α２−糖タンパク質を調製する方法が、Ｏｈｋｕｂｏ等、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質の精製及び特性付け）」（１９８８）Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８、４１３−４３０（参考文献８）の論文に記載された。この論文に記載の内容は、引用することにより本明細書に組み込まれたものとする。
【０００７】
本発明に関連して単離及び精製された４３ｋＤａ糖タンパク質脂肪分解又は脂質移動因子（ＬＭＦ）は、悪液質誘発ネズミ腫瘍ＭＡＣ１６と、癌悪液質を患った患者の尿の両方から、向上した単離精製方法を用いて実質的にタンパク質分解因子を含まないものが得られた。この場合も、イオン交換、排除及び疎水性クロマトグラフィ分離の組み合わせを用いたが、分離の選択性は以前に２４ｋＤａ悪液質因子を単離したときに使用したクロマトグラフィ分離の選択性とは異なり、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に附したときに約４３ｋＤａの見掛け相対分子量の単一バンドを示す生成物が得られた。既に示したように、ＭＡＣ１６腫瘍と癌患者の尿の両方からこのように単離した脂肪分解活性物質又は脂質移動因子（ＬＭＦ）は、ヒト血漿から単離したＺｎ−α２−糖タンパク質と共通又は同じ特性を有する糖タンパク質であることが分かった。したがって、このヒト及びマウスＬＭＦは、両方ともＺｎ−α２−糖タンパク質であるか、実質的な程度の配列の相同性及び実質的に同じ生物活性（とりわけ脂肪細胞についての脂肪分解活性に関して）を有するそれらの極めて類似した類似体であると結論した。したがって、これらは、Ｚｎ−α２−糖タンパク質型糖タンパク質と称することができる。
【０００８】
特に、以下のことが判明した：
ａ）上記源から単離したヒト及びマウス脂質移動因子は、両方とも、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１０％非変性ゲル上を真性のヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質といっしょに共泳動した；
ｂ）単離したヒト及びマウス脂質移動因子は、両方とも、真性Ｚｎ−α２−糖タンパク質と同様の方法で炭水化物について濃く染色した；
ｃ）ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質に対するポリクローナル抗体は、ヒト物質の脂質移動活性を検出でき且つこの活性を生体外で中和できた；
ｄ）また、真性ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質は、生体外脂質移動活性も示し、さらにアデニレートシクラーゼ活性を刺激する；
ｅ）ヒト及びマウス脂質移動因子及び真性ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質は、各々、同じキモトリプシン消化パターンを示し、同様な断片及び活性損失を生じる；
ｆ）単離したヒト脂質移動因子は、アミノ酸配列において真性ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質と相同性であり、両方とも、ＧＴＰ依存プロセスにおいてネズミ脂肪細胞形質膜におけるアデニレートシクラーゼの産生を刺激し、０．１μＭＧＴＰで最大刺激となることが分かった。
【０００９】
ここで、用語「真性Ｚｎ−α２−糖タンパク質」は、Ｏｈｋｕｂｏ等（参考文献８）により記載されている方法に実質的に準じて新鮮ヒト血漿から調製した精製Ｚｎ−α２−糖タンパク質を意味する。場合によっては、単離脂質移動因子の断片又は真性Ｚｎ−α２−糖タンパク質の断片を、脂肪分解又は脂質移動活性の損失なしに生成でき、また、実質的にこの活性に影響せずに種々の付加、欠失又は置換をおこなうことができる。しかしながら、治療用途に関する本発明のこの態様においては、高純度が一般的に得られ、且つ特に物質が実質的にタンパク質分解活性を有しないことが重要である。
【００１０】
一態様によれば、本発明は、ここで規定されている糖タンパク質脂質移動因子又は治療に有効なそれに由来する断片の、哺乳動物における太りすぎ又は肥満の状態の治療用医薬への使用に関する。
【００１１】
より詳細には、本発明によれば、ゲル排除クロマトグラフィにより測定した見掛け分子質量Ｍｒが６．０ｋＤａを超える、Ｚｎ−α２−糖タンパク質又はＺｎ−α２−糖タンパク質の断片の性質及び特性を有することを特徴とする治療に有用な生物活性脂質移動剤が提供される。好ましい実施態様によれば、この脂質移動剤は、ポリペプチド成分が以下のグループの一つから選択されるグリコシル化ポリペプチドであるとして定義できる：
（ａ）アミノ酸配列がＺｎ−α２−糖タンパク質であるポリペプチド；
（ｂ）（ａ）について、一つ以上のアミノ酸を欠いているポリペプチド；
（ｃ）（ａ）について、一つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸（単一又は複数）により置き換えられたポリペプチド；
（ｄ）（ａ）について、生物脂肪分解活性を妨害しないか、容易に除去できる複数の追加のアミノ酸があるポリペプチド；
（ｅ）（ａ）によるポリペプチドのアレリック誘導体であるポリペプチド。
【００１２】
また、本発明によれば、治療に使用される生物活性脂質移動剤は、ゲル排除クロマトグラフィにより測定したときの見掛け相対分子質量Ｍｒが６ｋＤａを超える、糖タンパク質又は前記糖タンパク質の断片から実質的に構成されている。この糖タンパク質は、ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）、又は生物系においてその脂質移動活性に実質的に影響しない付加、欠失又は置換により変更したその変異体と相同性であるポリペプチドアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１３】
本発明の少なくとも一部の実施態様によれば、脂質移動剤は、さらに、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に附したときのその電気泳動移動度により測定したときの見掛け相対分子質量Ｍｒが約４３ｋＤａであることにより特徴付けることができる。
【００１４】
したがって、本発明によれば、治療用精製生物活性脂質移動剤は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に附したときにその電気泳動移動度により測定したときの見掛け相対分子質量Ｍｒが約４３ｋＤａであり且つアミノ酸配列においてヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）と相同性を有する単一主成分を含むグリコシル化ポリペプチドから実質的に構成されていることも特徴としている。この脂質移動剤は、さらに、ある実施態様によれば、生物物質をイオン交換クロマトグラフィ工程、排除クロマトグラフィ工程、その後に疎水性相互反応クロマトグラフィ工程に順次附するプロセスにより得ることができ、前記生物物質が癌悪液質患者の体液、又は英国ウィルトシャー州ソールズベリー、ポートンダウンにあるＰｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）にブダペスト条約の規定に基づいてＭｉｃｈａｅｌ  Ｊｏｈｎ  Ｔｉｓｄａｌｃの名前で寄託番号第８９０３０８１６号で寄託されたＭＡＣ１６腫瘍細胞系の培養の抽出物であることを特徴付けることができる。
【００１５】
また、少なくともある実施態様によれば、本発明の脂質移動剤は、さらに、以下の特徴の一つ以上により特徴付けることができる：
（ａ）キモトリプシンによる消化に附したときに、断片化され、その脂質移動性が破壊される；
（ｂ）生体外において、ネズミ脂肪細胞形質膜とインキュベーションすると、グアニントリホスフェート（ＧＴＰ）依存プロセスにおいてアデニレートシクラーゼ活性を刺激する可能性がある；
（ｃ）ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質と実質的に同じ免疫学的性質を有する；
（ｄ）上記した４３ｋＤａ糖タンパク質又はグリコシル化ポリペプチドをトリプシンで消化することにより得られる糖タンパク質又はグリコシル化ペプチドの活性脂質移動断片である；
（ｅ）タンパク質分解活性を実質的に有していない；
（ｆ）ポリペプチド成分のポリペプチド鎖は、パイログルタメート残基によりブロックされたＮ末端を有する；
（ｇ）脂質移動活性は、過ヨウ素酸塩処理により破壊される。
【００１６】
また、本発明によれば、哺乳動物の治療、例えば、体重の減少又は肥満のコントロールに使用される、医薬組成物であって、活性成分として治療に有効な量のここで定義されているＺｎ−α２−糖タンパク質若しくは糖タンパク質脂質移動因子又はその脂肪分解活性断片を、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と一緒に含有する、医薬組成物が提供される。
【００１７】
また、本発明は、ここで定義されている脂質移動剤の、太りすぎ又は肥満の状態の治療のヒト用医薬に有用な薬剤の製造への使用を含む。
【００１８】
すなわち、本発明によれば、さらに、太りすぎ又は肥満の状態を治療するのに効果的な薬剤の製造に使用される、Ｚｎ−α２−糖タンパク質、とりわけヒトＺｎ−α２−糖タンパク質の性質及び特性を有する糖タンパク質脂質移動因子が提供される。また、このような薬剤は、筋肉の発生の刺激及び筋肉質量の増加にも有用であると思われる。
【００１９】
また、本発明によれば、Ｚｎ−α２−糖タンパク質の性質及び特性を有する脂肪分解活性糖タンパク質又は脂質移動剤、すなわち、Ｚｎ−α２−糖タンパク質型糖タンパク質の単離精製方法であって、悪液質誘発腫瘍の抽出物若しくは悪液質誘発腫瘍細胞系の培養の抽出物、又は悪液質誘発腫瘍を有する哺乳動物由来の尿若しくは他の体液の試料を、イオン交換、ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィ及び疎水性相互作用クロマトグラフィの組み合わせに附して、タンパク質分解活性を実質的に有していない、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により測定したときの見掛け分子量又は相対分子質量が４３ｋＤａである分子種の単一生成物を得る、方法が提供される。
【００２０】
また、本発明は、哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせる方法であって、前記哺乳動物にここに定義されている脂質移動剤を治療に効果的な投与量で投与することを含む、方法が提供される。一般的に、これは、タンパク質分解活性を実質的に有していない、ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質と同一又は相同性がある糖タンパク質、又は有効なその断片により提供される。
【００２１】
脂質移動糖タンパク質又はＺｎ−α２−糖タンパク質は、担体を薬学的に許容される注射ビヒクルの形態で含有する注射製剤として投与できる。
【００２２】
これらの治療用途に使用される糖タンパク質又はその断片は、さらに、例えば、参考文献７において公表されているＺｎ−α２−糖タンパク質についての公知のｃＤＮＡ配列におそらく基づいている当該技術分野において周知であるような組換えＤＮＡ法により製造できる。
【００２３】
また、本発明は、悪液質誘発腫瘍の存在の検出及び／又は例えば、抗腫瘍治療の過程でのこのような腫瘍の変化を監視するための方法であって、尿、血清又は他の体液の試料を採取すること、及び試験してここで定義されている脂質移動剤又はＺｎ−α２−糖タンパク質の存在の検出及び／又はその中の存在量を測定することを含む、方法が提供される。本方法を実施する際、Ｚｎ−α２−糖タンパク質に対するモノクローナル若しくはポリクローナル抗体又は他の生化学試薬を、以下で述べる診断検出剤として使用できる。
【００２４】
また、本発明の精製脂質移動因子又はＺｎ−α２−糖タンパク質を、抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体）の製造にも使用した後、その抗体を上記した診断検出剤として使用するか、治療において、癌患者において悪液質を生じる脂肪分解剤（単一又は複数）に対するインヒビター又はアンタゴニストとして使用できる。
【００２５】
ここで、抗体は、例えば、抗体全体又はそれらの断片でもよい。具体的な抗体断片には、抗体全体のタンパク質分解開裂により得られたもの、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片又はＦａｂ断片；又は組換えＤＮＡ法により得られる断片、例えば、Ｆｖ断片（国際特許明細書第ＷＯ８９／０２４６５号に記載されているもの）などでよい。本発明のさらなる態様によれば、このような抗体の一種以上を、悪液質関連癌及び／又は腫瘍の治療用医薬製剤又は薬剤の製造に使用する。
【００２６】
抗体又は抗体断片は、一般的にいずれかの免疫グロブリン類に属するものでよい。すなわち、例えば、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）抗体又は特に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体であることができる。この抗体又は断片は、動物由来、例えば、哺乳動物由来のものであっても、例えば、ネズミ、ラット又はヒト由来のものでもよい。また、天然抗体若しくはその断片、又は必要に応じて、組換え抗体若しくは抗体断片、すなわち、組換えＤＮＡ法を用いて生成した抗体若しくは抗体断片でもよい。
【００２７】
具体的組換え抗体又は抗体断片には、（１）少なくとも一部分が異なる抗体に由来する抗原結合部位を有するもの、例えば、一つの抗体の超可変又は相補決定領域が第二の異なる抗体の可変フレームワーク領域にグラフトされたもの（欧州特許明細書第２３９４００号に記載されているもの）；（２）非Ｆｖ配列が他の異なる抗体由来の非Ｆｖ配列により置換された組換え抗体又は断片（欧州特許明細書第１７１４９６号、第１７２４９４号及び第１９４２７６号に記載されているもの）；又は（３）実質的に天然免疫グロブリンの構造を有するが、蝶番部が天然免疫グロブリンに見られるのとは異なる数のシステイン残基を有するか、組換え抗体又は断片の表面ポケットにおける一つ以上のシステイン残基が天然免疫グロブリンに存在する別のアミノ酸残基の代わりにある、組換え抗体又は断片（それぞれ国際特許明細書第ＷＯ８９／０１９７４号及び第ＷＯ８９／０１７８２号に記載されているもの）などがある。
【００２８】
上記したように、抗体又は抗体断片は、ポリクローナルでもよいが、好ましくはモノクローナル由来のものである。これは、多特異的であってもよいが、好ましくは本発明の脂肪分解物質又はＺｎ−α２−糖タンパク質に対して単特異的のものである。
【００２９】
抗体全体を、抗原としてのいずれかの源から、精製活性脂肪分解物質又はＺｎ−α２−糖タンパク質を用いた周知の免疫学的方法を用いて調製できる。すなわち、例えば、いずれかの好適な宿主に脂肪分解物質を注射し、血清を集めて適当な精製及び／又は濃縮（例えば、アフィニティ媒体として免疫化脂肪分解物質を用いたアフィニティクロマトグラフィにより）をおこなって所望のポリクローナル抗体を得ることができる。別法として、脾細胞又はリンパ球を、注射した宿主から回収し、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ等、（１９７６）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．６、５１１（参考文献９）に記載の方法を用いて不朽化し、得られた細胞を分離して通常の方法でモノクローナル抗体を産生する単一の遺伝子系を得てもよい。
【００３０】
上記方法において、脂肪分解物質が宿主において好適な免疫応答を誘発しない大きさである場合には、たとえ脂肪分解物質が抗原性であって特異的抗体に結合できるとしても、脂肪分解物質を自体免疫原性である大きな担体分子に共有結合させ、得られた複合体化合物を、再び通常の方法［例えば、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（実験免疫学ハンドブック）」、３、第２版、ｐｐＡ２．１０−Ａ２．１１、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、オックスフォード、１９７３（参考文献１０）；及びＭ．Ｚ．Ａｔａｓｓｉ及びＡ．Ｆ．Ｓ．Ａ．Ｈａｂｅｅｂ、「Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質の免疫化学）」（Ｍ．Ｚ．Ａｔａｓｓｉ編）、２、ｐｐ１７７−２６４、ニューヨーク州Ｐｌｅｎｕｍ、１９７７（参考文献１１）参照］に準じて抗原として使用するのが好ましいと思われる。
【００３１】
抗体断片は、通常の方法、例えば、酵素的消化、例えば、ペプシンを用いた酵素的消化を用いて製造できる［Ｌａｎｏｙｉ及びＮｉｓｏｎｏｆｆ、（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、５６、２３５（参考文献１２）］。本発明により組換え抗体を製造することが望ましい場合には、例えば、上記特許明細書に記載されている一般的な方法を用いて製造できる。
【００３２】
また、本発明は、上記した診断方法を実施するための診断キットに関する。このようなキットは、体液試料を受け入れるための容器と、前記脂質移動剤又はＺｎ−α２−糖タンパク質を検出するための生化学試薬と、このキットの使用説明書とを備えている。
【００３３】
また、本発明の脂質移動剤は、抗悪液質又は抗腫瘍治療剤としての可能性を有する可能性のある脂肪分解活性阻害剤のスクリーニング及び同定並びに／又は研究の実施に使用することもできる。このスクリーニングは、前記脂質移動剤の試料に前記脂質移動剤に対する可能なアンタゴニスト又は活性のインヒビターの試料を添加した後、生体外で脂肪細胞の試料とインキュベーションし、アッセイに附して対照試料に対する脂肪分解活性レベルを求めることにより実施できる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例により、本発明の少なくとも一部の態様及びその開発についてより詳細に説明する。しかしながら、最初に、特記のない限りは、本発明の開発及び具体的実施例に一般的に使用された材料、方法及び手法の一部の概要及び要約を記載する。
【００３５】
動物：
純粋菌株ＮＭＲＩ及びｏｂ／ｏｂマウスを、既存のハウス内コロニーから繁殖させた；雄ＢＫＷマウス（４０〜５０ｇ）を、英国ハルにあるＢａｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｍａｎから購入した。これらの動物の側腹部に、Ｓ．Ａ．Ｂｅｃｋ等（１９８７）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｕｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃａｃｈｅｘｉａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ（宿主におけるネズミ腫瘍産生悪液質による脂肪分解及びタンパク質分解因子の産生）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７、５９１９−５９２３（参考文献１４）に記載されているトロカールにより、ＭＡＣ１６腫瘍の断片を移植した。体重損失が２５％に到達したときに、固形腫瘍をマウスから切除した。
【００３６】
被験者
１．３〜１０ｋｇ／月の確定した体重損失のある切除不可能な膵臓癌を患っている患者から、尿を採取した。これらの患者は、尿の採取時には治療を受けなかった。尿試料を、精製前に、保存剤の不存在下、−２０℃で凍結保存した。
【００３７】
クロマトグラフィ装置及び材料
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  ５／５アニオン交換樹脂、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）１２Ｈ  １０／３０ゲル排除及びＲｅｓｏｕｒｃｅ（商標）Ｉｓｏ疎水性クロマトグラフィカラムを、英国セントオールバンズにあるＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。Ａｑｕａｐｏｒｅ（商標）ＡＸ−３００ＤＥＡＥ−セルロースカラムを、カリフォルニア州にあるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。Ｒａｉｎｂｏｗ（商標）タンパク質分子量マーカー、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングシステム及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）−ＥＣＬオートラジオグラフィフィルムを、英国にあるＮｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｌｃ．から入手した。
【００３８】
他の材料
他の材料として、ドイツ国にあるＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製ＤＩＧグリカン検出キット、英国にあるＳｉｇｍａ  Ｄｏｒｓｅｔ社製タンパク質Ａペルオキシダーゼ複合体、カリフォルニアにあるＨｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製ニトロセルロース膜及び英国グロスターシャー州ストーンハウスにあるＡｍｉｃｏｎ社製Ａｍｉｃｏｎフィルター（ＹＭ１０）などを用いた。また、英国アビンドンにあるＲａｎｄ  ＤＳｙｓｔｅｍｓ社から購入した「Ｍｉｎｉ−Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｍａｋｅｒ」及びスポット・オンキット、並びにスコットランド国ペイズリーにあるＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）ＴＨ１１ＲＴ逆転写酵素も使用した。オリゴヌクレオチドを、英国サウサンプトンＯｓｗｅｌｌにより合成した。
【００３９】
ＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグラフィ
この手法を用いる典型例においては、活性脂質移動因子（ＬＭＦ）含有ホモジェネートを遠心分離し、上清を、ＤＥＡＥセルロースカラムを用い、塩勾配下で溶出するアニオン交換クロマトグラフィにより分画する。ＤＥＡＥセルロースカラムを、まず、物質試料を分画に附する前に、所要ｐＨの緩衝液で平衡化する。その後、物質を、例えば、同じ緩衝液に０〜０．２Ｍ  ＮａＣｌの直線塩勾配を用いてカラムから溶出させる。カラムからの溶出液を、小容積画分、例えば、５ｍｌ画分で集め、各画分の脂肪分解活性を、以下で説明する脂肪分解アッセイ法により測定する。
【００４０】
塩勾配下での溶出によるＤＥＡＥセルロースカラムの使用は、予備分離段階として少なくとも有用と思われるが、ゲル濾過排除クロマトグラフィの段階後及び疎水性相互作用クロマトグラフィの最終又は後での精製段階前のさらなる画分を得るのにとりわけ有用である。以下で述べるように、続いての段階（単一又は複数）において、疎水性相互作用クロマトグラフィは、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法と連結してＲｅｓｏｕｒｃｅ（商標）Ｉｓｏカラム等の選択された疎水性クロマトグラフィカラムを用いて実施できる。
【００４１】
血清代謝測定
非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）を、Ｗａｋｏ−ＡＳＣ−ＡＣＯＤキット（ドイツ国ＮｅｕｓｓにあるＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いて測定した。トリグリセリドを、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅキット（英国ＰｏｏｌｅにあるＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）及び定量酵素的測定キット（Ｓｉｇｍａ社製）による３−ヒドロキシブチレートを用いて測定した。グルコースを、グルコースアナライザー（カリフォルニア州ＩｒｖｉｎｅにあるＢｅｃｋｍａｎ社製）を用いて測定し、グリセロールを、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（酵素分析方法）」（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｕ．編）第３巻、ｐｐ１４０４−１４０９（１９７４年ロンドンのＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社より発行）（参考文献１３）に記載のＷｉｅｌａｎｄの方法を用いて酵素的に測定した。
【００４２】
脂肪分解アッセイ
白色脂肪細胞の単細胞懸濁液を、Ｓ．Ａ．Ｂｅｃｋ等（上記参考文献１４を参照）に実質的に記載された方法により、コラゲナーゼ消化を用いて、雄ＢＫＷマウスの細かく刻んだ精巣上体脂肪パッドから調製した。被アッセイ試料を、１０５〜２ｘ１０５脂肪細胞（血球計により測定）とともに、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ中３７℃で２時間インキュベーションした。放出されたグリセロール濃度を、上記したＷｉｅｌａｎｄの方法により酵素的に測定した（ＧＢ２２１７３３０Ａも参照）。脂肪細胞のみを含有する対照試料を分析して、自然グリセロール放出量を測定した。脂質移動活性は、放出グリセロールμｍｏｌ／脂肪細胞１０５／２時間で表した。
【００４３】
ヒト大網脂肪細胞の単離
ヒト大網脂肪組織を、一般的な麻酔下除去し、直ちに実験室に移した。組織の断片（一組のネズミ精巣上体脂肪パッドに大きさがほぼ等しい）を、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸塩緩衝液に４％ウシ血清アルブミンと、１ｇ／ｌグルコースと１．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼとを添加したものの１ｍｌアリコット中、この目的に振とう水浴を用いて、３７℃で３０分インキュベーションすることにより消化して、脂肪細胞の単細胞懸濁液を生成した。
【００４４】
マウス脂肪細胞形質膜の単離
典型的な手順で、白色脂肪細胞を、細胞を２５０ｍＭスクロース、２ｍＭエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’（ＥＧＴＡ）、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄した以外は上記したようにして、マウス精巣上体脂肪パッドから単離した。脂肪細胞を、上記緩衝液２０ｍｌに再懸濁し、Ｓｗｉｎｎｙフィルターを介して少なくとも１０回吸引することにより均質化した。次に、細胞ホモジェネートを、３００ｇで５分間遠心分離し、脂肪ケーキを、表面から除去し、残存するペレット及び下澄液を清浄な管に移した。これらを、３０，０００ｇ、４℃で１時間遠心分離し、形成した膜ペレットを、スクロース緩衝液（２００〜４００μｌ）に再懸濁した。形質膜を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）コロイドシリカ粒子の自己形成勾配により他のオルガネラ膜から分離した。成分は、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４：Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）及び２Ｍスクロース、８ｍＭ  ＥＧＴＡ、８０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を、膜懸濁液と一緒に３２：７：１の比で混合した（総容積８ｍｌ）。この混合物を、１０，０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。勾配を、０．７５ｍｌづつに分別し、各部分をスクシネートデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨ−シトクロム  ｃ  還元酵素、ラクテートデヒドロゲナーゼ及び５’−ヌクレオチダーゼの存在についてアッセイして、形質膜画分の所在位置をつきとめた。膜画分を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に再懸濁し、１０，０００ｇ、４℃で２分間遠心分離した。このプロセスを、２回反復した。次に、洗浄形質膜を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＥＧＴＡ及び４μＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（１〜２ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、液体窒素で手早く冷凍し、使用するまで−７０℃で保存した。
【００４５】
アデニレートシクラーゼアッセイ
使用したアデニレートシクラーゼアッセイは、Ｓａｌｏｍｏｎ等（参考文献１６）により開発されたアッセイを基礎とするものであった。簡単に述べると、水（陰性対照）、イソプレナリン（陽性対照）又はＬＭＦを、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭＭｇＣｌ２、ＧＴＰ（グアニントリホスフェート）、８ｍＭクレアチンホスフェート、１６単位／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン及び１ｍＭ［α−３２Ｐ］ＡＴＰを含有するアッセイ混合物（最終容積１００μｌ）に添加した（比活性２０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）。予備インキュベーションを、３０℃で５分間おこない、反応を、形質膜（典型的には、タンパク質５０μｇ）を添加することにより開始した。３０℃で１０分後、２％ドデシルスルホン酸ナトリウムと、４０ｍＭ  ＡＴＰと、１．４ｍＭサイクリックＡＭＰとを含有する溶液１００μｌを添加することにより、反応を終了させた。サイクリックＡＭＰ［δ−３Ｈ］の回収率を測定するために、アデノシン３’，５’−サイクリックホスフェート（水５０μｌ中１μＣｉ）を各管に添加した。［α−３２Ｐ］ＡＴＰなしで試料を試験することにより、バックグラウンド結合を測定し、試料対照を形質膜なしで調製した。
【００４６】
標識ヌクレオチド含有試料を、水で１ｍｌに希釈し、水１０ｍｌでプライミングしたＤｏｗｅｘ（商標）５０Ｗ８−４００イオン交換カラムにローディングした。水１ｍｌで２回洗浄した後、サイクリックＡＭＰを、水３ｍｌで１．５Ｍイミダゾール、ｐＨ７．２  ２００μｌを入れたポリプロピレン管に溶出させた。次に、得られた試料を、ＡｌｕｍｉｎａＷＮ−３カラム（０．１Ｍイミダゾール、ｐＨ７．５  ８ｍｌで予め洗浄したもの）に附し、溶出液を、Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ  ＨｉＳａｆｅ３（商標）で市販されているシンチレーション液を含有するシンチレーションバイアルに直接集めた。０．１Ｍイミダゾールを、カラムにさらに１ｍｌ添加し、溶出液を、ランスルーと混ぜた。放射活性を、Ｔｒｉ−ｃａｒｂ（商標）２０００Ａシンチレーションアナライザーを用いて測定した。
【００４７】
Ｚｎ−α２−糖タンパク質
Ｚｎ−α２−糖タンパク質試料を、単離した脂質移動因子を同定するのに使用した。使用したＺｎ−α２−糖タンパク質は、Ｏｈｋｕｂｏ等、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質の精製及び特性付け）」（１９８８）Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８、４１３−４３０（参考文献８）(この文献の内容は、引用することにより本明細書に組み込まれたものとする)に実質的に記載されている方法により、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、Ｚｎ−キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ、フェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００及びＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌカラムクロマトグラフィを組み合わせて用いて新鮮ヒト血漿から約６７０倍に精製した。
【００４８】
ゲル電気泳動
ゲルは、一般的にＬａｅｍｍｌｉ（参考文献１５）に記載の方法に準じて調製され、５％スタッキングゲルと、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解像ゲル（変性又は還元条件）又は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解像ゲル（非変性又は非還元条件）とからなるものであった。試料を、１〜５μｇ／レーンでローディングした。バンドを、ＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーＲ−２５０による染色か、銀により可視化した。０．０６２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー及び５％２−メルカプトエタノール中、１００℃で５分間加熱することにより、還元条件用試料を調製した。
【００４９】
免疫ブロッティングのために、ゲルを、ＰＢＳにＭａｒｖｅｌ  ５％、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１５％を添加したものにより４℃で一晩ブロッキングしたニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、室温で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したもので、一度１５分間、二度５分間洗浄した。免疫検出を、ポリクローナル抗血清を用いて、室温で１時間、ＰＢＳに１．５％Ｍａｒｖｅｌ、０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したものにＯｈｋｕｂｏ等（上記参考文献８参照）に記載の方法で調製したＺｎ−α２−糖タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）を添加して用いて実施した。上記したようにして３回洗浄した後、フィルターを、１：５００倍希釈したタンパク質Ａペルオキシダーゼ複合体とともに１時間インキュベーションした後、ＰＢＳに０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したもので、一回１５分間、４回５分間洗浄した。ＥＣＬ検出システムを使用し、ブロットを、等容積の検出試薬１及び２に室温で１分間懸濁させた（０．１２５ｍｌ／ｃｍ２）後、Ｓａｒａｎ  Ｗｒａｐ（商標）に包んだ。ブロットを、オートラジオグラフィフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（商標）ＥＣＬ）に、標的タンパク質の量に応じて３０秒〜１０分間暴露させた。
【００５０】
実施例１
ネズミＡｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＭＡＣ１６からの脂質移動因子の単離及び精製
本実施例で用いた手順を、本明細書の終わりに表１としてまとめて示す。本実施例では、ＤＥＡＥセルロースによる予備バッチ抽出及び／又はおそらく硫酸アンモニウムによるタンパク質沈殿を用いてＭＡＣ１６腫瘍から脂質移動因子（ＬＭＦ）を初期精製した後、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５アニオン交換カラムによるアニオン交換クロマトグラフィ及びＳｕｐｅｒｏｓｅ１２によるサイズ排除に附した。
【００５１】
より詳細には、固形腫瘍を、体重損失のあるマウスから切除し、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、腫瘍１ｇ当たり５ｍｌの濃度で均質化した。デブリを、低速遠心分離（ベンチトップ遠心分離機により４０００ｒｐｍで１５分間）によりホモジェネートから除去した。硫酸アンモニウム沈殿を用いるときに、硫酸アンモニウム溶液（３８％ｗ／ｖ）を、この段階で、４℃で攪拌しながら上清にゆっくり添加し、沈殿物を、遠心分離（４５００ｒｐｍで２０分間）により除去した。次に、上清を、膜フィルターを備えたＡｍｉｃｏｎ濾過セルを用いて濃縮した。この場合、最初の均質化緩衝液に対する分画分子量Ｍｒが１０，０００であった。
【００５２】
この段階でＤＥＡＥ−セルロースバッチ抽出が、Ｔ．Ｍ．ＭｃＤｅｖｉｔｔ等、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｐｉｄ−ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｃｈｅｘｉａ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ（マウス及びヒトにおける悪液質誘発腫瘍に関連する脂質移動因子の精製及び特性付け）」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、（１９９５）５５、１４５８−１４６３（参考文献１）に実質的に記載の方法で、好適に実施された。
【００５３】
次の工程で、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたアニオン交換クロマトグラフィをおこなった。使用したカラムは、タンパク質２０〜５０ｍｇのタンパク質容量を有するＭｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５アニオン交換カラムであった。このカラムを、使用前に均質化緩衝液で平衡化し、試料を、１３００ｒｐｍで１０分間遠心分離後５００μｌ注入してローディングした。最初の洗浄後、活性物質を、０〜０．２Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出させた。活性因子の存在は、上記した脂肪分解バイオアッセイに従ってネズミ脂肪細胞からのグリセロール放出量の測定を用いて測定した。活性画分を、Ａｍｉｃｏｎ濾過セルを用いて濃縮し、ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）（又はＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標））クロマトグラフィーの前に、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する５０ｍＭリン酸塩（ｐＨ８．０）０．５ｍｌに溶解した。この具体的実施例を実施するのに使用したカラムは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２プレパック１０／３０ゲル排除カラムであった。このカラムを、上記緩衝液で、０．２５ｍｌ／分、２時間の条件で平衡化した後、試料を２００μｌ注入ローディングした。３０の１．０ｍｌ画分を集め、上記した脂肪分解バイオアッセイにより脂質移動活性を検出した。
【００５４】
この時点までの手順は、上記した参考文献９のＭｃＤｅｖｉｔｔ等により説明される方法に厳密に準じたが、後者を次に、Ｃ８疎水性カラム及びアセトニトリル／ＴＦＡ勾配を用いたＨＰＬＣの最終工程に続けて附するのに対して、この場合には、Ｓｕｐｅｒｏｓｅカラムからの活性画分を、ＨＰＬＣシステムにＡｑｕａｐｏｒｅ（商標）ＡＸ−３００  ＤＥＡＥ−セルロースカラムを結合させて用い、０〜０．３Ｍ  ＮａＣｌの勾配により溶出させてさらに分画してから、「Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｓｏ」（商標）として市販されている疎水性カラムを用いて最終のＨＰＬＣ疎水性クロマトグラフィ段階を実施した。この変更により、以前に単離された生成物とは異なるはるかにもっと安定な生物活性生成物が単離できた。
【００５５】
すぐ上で述べたＡｑｕａｐｏｒｅ（商標）ＡＸ−３００  ＤＥＡＥ−セルロースカラムを用いたＨＰＬＣの段階においては、典型的には、成分Ａ（１０ｍＭ  Ｎａ−ホスフェート  ｐＨ５．３）と成分Ｂ（１０ｍＭ  Ｎａ−ホスフェート  ｐＨ５．３  ＋０．３Ｍ  ＮａＣｌ）とからなる溶媒系を用いて、流量０．２ｍｌ／分−１でおこなった。全ての溶媒を、使用前に脱気した。一つの特定の分離において、勾配を、以下のプロトコルに準じて変更した：０％Ｂ１０分、１００％Ｂ４０分、１００％Ｂ５０分及び０％Ｂ６０分。吸光度（Ａ２１４）を、２１４ｎｍで監視してタンパク質含量を求めた。溶出ピークの各々を、別個の画分として集めた。ＤＥＡＥ−セルロースカラムからのこれらの画分における塩を、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する脱イオン水に対する分画分子量Ｍｒが１０，０００（Ａｍｉｃｏｎ）である膜フィルターを含むＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）マイクロコンセントレータを用いた限外濾過により除去した。再び、脂肪分解バイオアッセイにより脂質移動活性を検出し、活性画分を、ＨＰＬＣ疎水性クロマトグラフィの前に、１．５Ｍ硫酸アンモニウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対してＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）マイクロコンセントレータを用いて濃縮した。
【００５６】
疎水性カラムＲｅｓｏｕｒｃｅ（商標）Ｉｓｏ、１ｍｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたこの精製法のＨＰＬＣ最終工程は、溶媒系Ｃ（５０ｍＭホスフェート  ｐＨ７．０  ＋１．５Ｍアンモニウムスルフェート）及びＤ（５０ｍＭホスフェート  ｐＨ７．０）を用いて、流量１ｍｌ／分−１で行った。全ての溶媒を、使用前に脱気した。典型的な勾配プロトコルは、０％Ｄ５分、１００％Ｄ２０分、１００％Ｄ３０分及び０％Ｄ３５分であった。再び、吸光度（Ａ２１４）を、２１４ｎｍで監視してタンパク質含量を求め、溶出したピークの各々を、別個の画分として集めた。限外濾過（０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含有する脱イオン水に対してＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）マイクロコンセントレータを用いて）により塩を除去後、脂質移動活性を、上記した脂肪分解バイオアッセイにより検出した。
【００５７】
実施例２
悪液質患者の尿由来の脂質移動因子の単離及び精製
体重損失のある癌患者から採取した尿を、ＭＡＣ１６腫瘍に使用したのと類似のスキームに準じて分画した。但し、尿のタンパク質含量がより低かったので、純粋な生成物を得るのに必要とする工程が少なかった（本明細書の終わりの表２の要約を参照）。第一段階において、尿を、８０％（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて沈殿させ、沈殿物を、分画分子量Ｍｒが１０，０００である膜フィルターを含むＡｍｉｃｏｎ濾過セルを用いて、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１０ｍＭ  ＤＴＴを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析した。次に、尿濃縮物を、Ａｑｕａｐｏｒｅ（商標）ＡＸ−３００（３０ｘ２１ｍｍ）ＤＥＡＥ−セルロースカラム（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、流量０．２ｍｌ／分−１）を用いたＨＰＬＣに附し、ここでは、直線０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌ勾配で３０分間流した。得られた画分のタンパク質含量及び生物活性を、それぞれ吸光度Ａ２１４の測定及び上記した標準脂肪分解アッセイを用いて精巣上体の脂肪細胞からのグリセロールの放出量の測定により求めた。このＤＥＡＥ−セルロース分別段階での典型的な分別の結果を、図２に示す。
【００５８】
次に、疎水性カラムＲｅｓｏｕｒｃｅ（商標）Ｉｓｏ（６．４ｘ３０ｍｍ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィの最終段階に附して、上記で実施例１に関連して説明したのと実質的に同様にしてＤＥＡＥ−セルロースカラムから得た活性物質を分別した。この最終段階は、典型的には最初の緩衝液として１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４含有５０ｍＭホスフェート（ｐＨ７．０）を使用し、カラムを、溶出緩衝液（５０ｍＭホスフェート（ｐＨ７．０）、流量１ｍｌ／分−１）の直線勾配に附した。図３に、この最終段階の疎水性クロマトグラフィの一例の結果を示す。
【００５９】
一連の癌患者及び正常被験者について実施例２の手順を反復したところ、例えば、本明細書の終わりの表３に示したように、体重損失を伴う癌患者は一般的に尿中にＬＭＦが存在したが、体重損失を伴わない癌患者の尿及び正常被験者の尿にはＬＭＦは存在しないことが分かった。
【００６０】
実施例１及び実施例２で単離した脂質移動因子（ＬＭＦ）の性質及び同一性
Ａ．分子量
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに附したときに、上記したようにして単離及び精製したヒトＬＭＦ及びマウスＬＭＦの両方とも、見掛け相対分子質量Ｍｒが４３ｋＤａの単一のタンパク質バンドを示した。これを、図４に示す。図４において、レーン１は分子量マーカーを示し、レーン３及びレーン４はヒトＬＭＦで得られたバンドパターンを示し、レーン５はマウスＬＭＦを用いて得られたバンドパターンを示す。
【００６１】
１０％非変性ＰＡＧＥで電気泳動したとき、精製ヒトＬＭＦと精製マウスＬＭＦの両方とも、見掛け分子量８４ｋＤａを示した。ヒトＬＭＦを用いて得られたバンドパターンを図５のレーン３に示す。図５では、レーン１は、ここでも分子量マーカーを示す。
【００６２】
Ｂ．構造及びＺｎ−α２−糖タンパク質との比較
ヒトＬＭＦ物質とマウスＬＭＦ物質の両方の配列を解析したところ、パイログルタメート残基によりブロックされたＮ末端を有するポリペプチド鎖を含むことが明らかとなった。ＨＣｌ又はパイログルタメートアミノペプチダーゼで処理してこの残基を除去するか、キモトリプシンでの開裂により、残基２〜６、５５〜７９及び１４６〜１６７においてヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質と相同性を有するペプチドが得られた（Ａｒａｋｉ等、参考文献４参照）。また、精製ヒトＬＭＦ及び精製マウスＬＭＦは、図４に示すように、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動に附したときに、Ｚｎ−α２−糖タンパク質といっしょに共泳動した。図４において、レーン２は真性ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質（参考文献８に記載の方法で調製した）を用いて得たバンドパターンを示す。また、精製ヒトＬＭＦ及び精製ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質は、１０％非変性ＰＡＧＥを求めたときに同じ分子量（８４，０００）を有していた（図５のそれぞれレーン３及び２を参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて炭水化物を検出したところ、ヒト物質及びマウス物質の両方とも、真性ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質と同様に濃く染色された。これを、図６に示す。図６において、レーン１はヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質の結果を示し、レーン２はヒトＬＭＦの結果を示し、レーン３及び４はマウスＬＭＦの結果を示し、レーン５はトランスフェリン（陽性対照）についての結果であり、レーン６はクレアチナーゼ（陰性対照）についての結果である。ゲルを、製造業者の取扱い説明書に準じてＤＩＧグリカン検出キットを用いて炭水化物について染色した。
【００６３】
また、真性ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質に対するポリクローナル抗体は、図７に示すように免疫ブロットによりヒトＬＭＦを検出でき、且つヒトの生体外脂質移動活性を中和できるが、マウス物質は中和できないことも分かった。後者を、表４に示す。表４から明らかなように、マウスＺｎ−α２−糖タンパク質は、アミノ酸配列において、対応のヒトアミノ酸配列とは５８．６％の同一性しかなかった（参考文献７参照）。
【００６４】
図８は、真性ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質及びＬＭＦに対するα−キモトリプシンの影響を示す。レーン１は分子量マーカーを示し、レーン２はヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質を示し、レーン３はヒトＬＭＦを示し、レーン４はＺｎ−α２−糖タンパク質＋α−キモトリプシンについての結果を示し、レーン５はヒトＬＭＦ＋α−キモトリプシンを表し、レーン６はα−キモトリプシン単独（対照）である。タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブリリアントブルーで染色した。ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質と単離ＬＭＦと精製ＬＭＦの両方とも、同じキモトリプシン開裂断片を示し、キモトリプシンはＬＭＦの生体外生物活性を破壊した。ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質もヒトＬＭＦも、以前にＬＭＦと共精製すると報告されたＭｒ２４ｋＤａタンパク質分解誘発因子（ＰＩＦ）を含有していなかった。
【００６５】
また、種々のネズミ腫瘍及び肝臓におけるＺｎ−α２−糖タンパク質の発現を、競争ＰＣＲにより定量化した。Ｚｎ−α２−糖タンパク質を発現することが知られている肝臓を、腫瘍の対照として使用した。評価したＭＡＣ腫瘍のうち、悪液質誘発ＭＡＣ１６のみがＺｎ−α２−糖タンパク質を発現することが分かった。
【００６６】
Ｃ．生物活性
Ｃ．１  生体外
実施例２と同様に体重損失を伴う癌患者の尿から単離したヒトＬＭＦ物質を、異なる投与量で、上記した脂肪分解アッセイを用いてグリセロール放出量を測定することにより、新鮮な単離ネズミ精巣上体の脂肪細胞に対する脂肪分解刺激効果について試験した。また、試験を、真性ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質を用いて反復したところ、真性Ｚｎ−α２−糖タンパク質とヒトＬＭＦ物質の両方が、類似の投与量−応答プロファイルでグリセロールの放出を刺激することが分かった。このことを、図９に示す。図９では、図Ａは異なる濃度でのヒトＬＭＦについての結果を示し、図Ｂは真性ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質についての結果を示す。
【００６７】
脂肪細胞における脂肪分解の誘発は、細胞内メディエイタサイクリックＡＭＰの上昇により介在されると思われ、さらなる試験において、ヒトＬＭＦとともにネズミ脂肪細胞形質膜をインキュベーションすると、ＧＴＰ依存プロセスでアデニレートシクラーゼ活性が刺激され、０．１μＭ  ＧＴＰで刺激が最大となることが分かった。また、アデニレートシクラーゼのこの活性化が、ＬＭＦ＞５μｇ／アッセイの濃度で飽和できることが分かった。ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質を用いた場合、これもＧＴＰ依存の方法においてネズミ脂肪細胞形質膜アデニレートシクラーゼを刺激し、この場合も０．１μＭＧＴＰで刺激が最大となることが分かった。ここでも、Ｚｎ−α２−糖タンパク質によるアデニレートシクラーゼの活性化は、＞５μｇ／アッセイの濃度で飽和できることが分かった。
【００６８】
ＬＭＦ及びＺｎ−α２−糖タンパク質についての類似の影響及び類似の投与量−応答プロファイルを示すデータは、Ｚｎ−α２−糖タンパク質に対するポリクローナル抗血清がヒトＬＭＦによる生体外脂肪分解を中和する能力、アミノ酸配列における相同性及びマーチング電気泳動移動度といっしょに、全て、単離精製したＬＭＦは、まさにＺｎ−α２−糖タンパク質であることを強力に示している。以前の報告では、Ｚｎ−α２−糖タンパク質は、アミノ酸配列及びドメイン構造において主要な組織適合複合体の抗原に密接に関連している接着性タンパク質であるとしているが、Ｚｎ−α２−糖タンパク質が脂肪分解を誘発する能力についての報告は以前にはなされていない。さらに、ヒト尿に存在するとの報告も以前にはなされていない。現在のところ、Ｚｎ−α２−糖タンパク質等の大きな酸性タンパク質がアデニレートシクラーゼを刺激できる機構は、分かっておらず、類似の役割を果たす他の公知の物質は小さく且つ塩基性ポリペプチドであるので、この事実は全く驚くべき事柄である。
【００６９】
Ｃ．２  生体内
実施例２と同様にヒト尿から単離した精製ＬＭＦが生体内で脂肪減少できるかどうかをみるために、このＬＭＦ物質（８μｇ）の試料を、７２時間にわたって、雄のブリーダー渡しＮＭＲＩマウスに注射した。ＬＭＦは、０時間目、１７時間目、２４時間目、４１時間目、４８時間目、６２時間目及び７２時間目に注射し、対照マウスには、同様に同じ時間で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射した。動物を、８９時間目に死亡させ、体組成及び血清代謝物レベルを測定した。図１０に示すように、ＬＭＦを投与した動物の体重が漸次減少し、処理の４１時間内で、ＰＢＳ処理した対照よりも顕著に低かった。体組成及び血清代謝物レベルの変化を、表５にまとめて示す。表５から、食物及び水の摂取を変更なしで、全８９時間にわたる実験中に、総体重が３．６ｇ減少したことが分かる。体組成分析から、ＬＭＦを投与したマウスの体脂肪含量が大きく減少し（４２％）、非脂肪質量が増加する傾向がある（特に顕著なレベルには達しないが）ことが分かった。それに関して、ＬＭＦが実際にタンパク質合成物を刺激し、筋肉の質量を増加させることを示すいくつかの証拠が実際に発見されている。脂肪動員にもかかわらず、マウスに投与したＬＭＦ中の非エステル結合型脂肪酸（ＮＥＦＡ）、グリセロールおよびグルコースのリンパ液濃度に顕著な減少が見られた。
【００７０】
図１１および表６のデータに示されるように、ヒト尿から単離したＬＭＦ（３５μｇ）の肥満ｏｂ／ｏｂマウスへの静脈内投与により類似の結果が得られた。全体重が減少し、これは最初の注入の２４時間以内に有意となり、１６０時間の実験の間、対照群よりも低かった。体組成分析により、重量減少は骨組脂肪の減少（対照では２６.０３±０.７０ｇ、ＬＭＦ処置動物では２１.０９±０.９９ｇ）から生じ、水分含量または非脂肪量は変化しないことが示された（表６参照）。血清中グリセロ−ルおよび３−ヒドロキシブチレートレベルは有意に増加したが、血中グルコースレベルは減少し、トリグリセリドまたはＮＥＦＡレベルには全く影響はなかった。
【００７１】
Ｄ．断片化
活性４３ｋＤａ糖タンパク質はトリプシンで消化でき、脂質動員剤として機能する生物活性を依然として保持した、見かけの分子量または相対分子量７ｋＤａ（セファデックス_５０カラムを使用してゲルろ過排除クロマトグラフィーにより決定）の断片が得られることも確立された。これは、単離ヒトＬＭＦのサンプルをトリプシンと共に３７℃で様々な時間インキュベートし、次いで、セファデックス−５０ゲル排除クロマトグラフィーおよび脂肪分解アッセイにより分析した、図１２に示した典型的な実験結果により説明される。この結果は明らかに、２.５から７.５画分内での活性断片の存在を示し、これらの断片の分子量は、検量曲線から推定したところ、図に示されるようにそれぞれ６ｋＤａ、７ｋＤａおよび８ｋＤａである。陽性および陰性対照を実施し、これは以下の通りであった：−ｖｅ＝０.０２７、＋ｖｅ＝０.２５２。
【００７２】
治療使用
全体的に、インビボ実験に関連した上記の第Ｃ.２章に関する結果により脂肪代謝の増加が確認され、これらのモデル系で、単離および精製ヒトＬＭＦは特に脂肪組織の枯渇により骨組重量の減少をもたらすことが示された。ヒトの肥満の処置におけるこの物質の使用可能性を最も明瞭に実証するのは、筋肉量に影響を及ぼすことなく脂肪組織を減少させる、Ｚｎ−α２−糖タンパク質と同一または近い類似体である、ヒトＬＭＦのこの特異な能力である。前記したように、このＬＭＦ物質は実際にタンパク質合成を刺激でき、よって筋肉発達の刺激に有用であり得ることを示唆する証拠もある。潜在的に、物質はまた、肥満の症例で起こり得るような、成人発病型糖尿病に感受性の高まったヒトの処置にも特に有用である。
【００７３】
この治療使用のために、特に、医学理由または美容理由の、ヒトの肥満の制御処置のために、治療的に有用で毒性のない量の本質的に純粋な活性物質、本明細書に記載のように単離および実質的に精製された脂質動員因子または等価な精製または合成Ｚｎ−α２−糖タンパク質、または後者から誘導した脂質分解活性断片からなる物質を、任意の適切な様式で投与する医薬製剤として作成できる。該製剤は、単位投与形で提示され得、医薬分野で公知の方法のいずれかにより調製された医薬組成物を含み得、ここで、活性脂肪分解性物質の調製物は、適合性の医薬的に許容される担体、希釈剤または添加剤を与える任意の他の適切な成分と密接に会合または混合して混ぜ合わせられている。製剤は、経口、直腸、局所および非経口（皮下、筋肉内および静脈内を含む）投与に適切なものを含む。非経口投与用に、製剤は、すぐに使用できるアンプルに含まれた前以て決定した量の活性脂質分解性物質の無菌液体調製物を含み得る。
【００７４】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、錠剤、またはトローチ剤などの分離した単位として、ここで各々は、前以て決定した量の活性化合物を粉末または顆粒の形で含み：またはシロップ剤、エリキシル剤、頓服水剤のエマルションなどの水性液体または非水性液体中活性化合物の懸濁液として提示され得る。活性化合物はまた、丸塊、し剤または泥膏として提示してもよい。
【００７５】
哺乳動物の肥満の処置に効果を示すに必要な活性化合物の量は勿論変化し、最終的には各特定の場合の哺乳動物を処置する医者または獣医の判断による。医者などの診療医が考慮する因子は、投与経路、医薬製剤の型、哺乳動物の体重、表面積、年齢および全身状態を含む。
【００７６】
診断適用
診断目的のために、ヒト患者での腫瘍の存在を検出または処置下での腫瘍の進行を監視するために、基本的に必要なのは単に、尿などの体液のサンプルを採取し（健康個体にはＺｎ−α２−糖タンパク質は通常存在しない）、次いで、これを本明細書に同定した糖タンパク質脂質動員剤または脂質分解因子（または等価なＺｎ−α２−糖タンパク質）の存在について試験することである。
【００７７】
実際、任意の簡便な方法を、サンプル中のこの活性脂質動員剤または脂質分解因子の検出および／または測定に使用し得、必要な装置および物質は有利には、適切な実施説明書と共に、直ちに使用できる必要なものが全部揃った診断キットの形で梱包および供給され得る。簡便かつ信頼性のある様式で活性脂質動員または脂質分解因子を検出および／または測定するに特に好ましい診断剤は、例えば、ヒトＺｎ−α２−糖タンパク質を特異的に認識して結合でき、次いで、例えば、会合した標識マーカー分子を使用した可視変化または特殊なスクリーニングにより、または当分野で公知の任意の他の適切な技法により同定できるモノクローナルまたはポリクローナル抗体などの生化学試薬である。
【００７８】
モノクローナル抗体
本発明のＺｎ−α２−糖タンパク質またはＺｎ−α２−糖タンパク質様脂質分解因子に対するモノクローナル抗体の産生は、当分野で一般的に使用する確立された慣用的な技法の使用により達成できる。該モノクローナル抗体は、一旦調製すると、適切な固体支持体（例えばカラム）に固定し得、次いで、アフィニティ精製に使用し、精製活性脂質分解因子の試験に必要であり得る任意のさらなる量を簡便な方法で腫瘍抽出物または体液から調製し得る。
【００７９】
しかし、診断剤としてのその使用以外の、該モノクローナル抗体の別の重要な用途は、ヒト癌患者での活性脂質分解因子の阻害剤またはアンタゴニストとしてのその特性に基づいた治療適用、並びに、悪液質の症候を処置および抑制および／または腫瘍増殖を予防または減少する薬剤としての結果として生じる治療価値であると考えられる。従って、この特性のために、それらは治療剤を提供でき、より具体的には、それらは哺乳動物の癌関連悪液質および／または悪性腫瘍の治療処置用の医薬調製物または医薬品の作成または製造に使用できる。
【００８０】
スクリーニング適用
上記に言及したモノクローナル抗体以外に、本発明のこの脂質動員または脂質分解因子の活性に拮抗するか、またはその阻害剤である任意の薬剤が少なくとも潜在的なヒト治療価値を有し得るようである。従って、本明細書に同定した精製または少なくとも部分的に精製した脂質分解因子（ＬＭＦ）の調製物は、本発明のさらなる態様に従って、治療に使用するための潜在的な抗悪液質および／または抗腫瘍剤を発見するための物質の簡便なインビトロのスクリーニング法の提供に使用するのに特に有用であり得る。マウス精巣上体脂肪組織由来の新しく調製した脂肪細胞を使用した本出願の典型的な例を下記に概略する：
実験は以下のように実施する：
【００８１】
１００μｌ精製ＬＭＦ調整物＋１ｍｌ脂肪細胞
スクリーニングする化合物＋１ｍｌ脂肪細胞
１００μｌＬＭＦ調整物及び化合物＋１ｍｌ脂肪細胞
各化合物は漸贈濃度で試験し、全サンプルを二重に調整および処理する。
【００８２】
サンプルに、２分間、９５％Ｏ２、５％ＣО２混合物のガスを供給し、混合し、
２時間３７℃でインキュベートする。２時間後、各サンプルの０．５ｍｌを次いで前記したようにグリセロール含量についてアッセイする。
【００８３】
有意な阻害度を示したようである化合物は次いで、さらなる評価の候補であり得る。
【００８４】
一般に、かかるインビトロ実験で観察された阻害効果は、インビボでも起こると期待でき、このスクリーニング法を使用して、癌関連悪液質および／または抗腫瘍剤の処置に有用な治療適用を有するさらなるアンタゴニストまたは阻害剤が発見されると予測される。
【００８５】
ＭＡＣ１６細胞系および精製
有用な量の精製または部分精製活性脂質動員または脂質分解因子を含む調製物を本明細書に記載のように、インビボで増殖させたＭＡＣ１６腺癌などの腫瘍の抽出物から、または癌悪液質患者の尿から、または合成法により産生することは完全に実行可能であるが、より簡便で好ましい別の起源が、腫瘍組織細胞培養物、特に前記したＭＡＣ１６細胞系の培養物の抽出物により提供され得る。
【００８６】
この細胞系の細胞は、空気中１０％ＣＯ２の雰囲気下で１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で簡便に増殖できる。脂肪細胞グリセロール放出アッセイ法でアッセイする場合、該培養増殖細胞は、インビボで相当する量の腫瘍が放出するよりも多い量のグリセロールを放出し得ることが判明した。
【００８７】
分かるように、本発明は、多くの異なる態様を提示し、それはその範囲内に本明細書に開示した全ての新規および本発明の特徴および態様を、明白にまたは暗に、単一でまたは互いに組合せて包含するとを理解する。また、多くの詳細な修飾が可能であり、特に本発明の範囲は、説明的実施例（群）により、または、記述的または説明的意味で単に本明細書に使用した用語および表現により制限されると解釈されない。また、「脂質動員因子（ＬＭＦ）」、「脂質動員剤」および「脂質分解因子」が本明細書で使用される限り、これらの用語は一般的に、同義語として捉え同じ意味を有する。
【００８８】
【表１】
2013177395.tif 000002
【００８９】
【表２】
2013177395.tif 000003
【００９０】
【表３】
2013177395.tif 000004
【００９１】
【表４】
2013177395.tif 000005
【００９２】
ＬＭＦ（ＰＢＳ中５μｇヒトまたは１０μｇマウス）を、一晩、ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質（ＰＢＳ中１０μｇ）に対するポリクローナル抗体（ｐＡｂ）と共に４℃で撹拌しながらインキュベートし、脂質動員活性を方法に記載した通り決定した。結果は、３つの決定の平均±標準誤差として表現し、実験は３回反復した。ｐＡｂの非存在下での数値からの差異は、スチューデント・ティー検定により決定した。
【００９３】
【表５】
2013177395.tif 000006
【００９４】
物質を図１０の計画に従ってマウスに投与した。数値は、１群あたり５匹の平均±標準誤差を示す。対照数値からの差異はスチューデント・ティー検定により決定した。
【００９５】
【表６】
2013177395.tif 000007
【００９６】
物質を図１１の計画に従ってマウスに投与した。数値は１群あたり５匹の平均±標準誤差を示す。対照数値からの差異はスチューデント・ティー検定により決定した。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】Ｔ．Ａｒａｋｉ等（１９８８）「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｃｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  Ｚｎ−α２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎｓ（ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質の完全アミノ酸配列及びその組織適合抗原との相同性）」（参考文献４）により公表されたヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質の完全アミノ酸配列（配列番号：１）を示す。
【図２】実施例２に記載のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムによるゲル濾過クロマトグラフィ分離の予備段階から得た活性脂肪分解画分に適用したＡｑｕａｐｏｒｅ（商標）ＡＸ−３００ＤＥＡＥカラムを用いたアニオン交換クロマトグラフィの段階で得られた画分の脂肪分解活性分布パターン及びタンパク質含量を示す。
【図３】主要活性ピークを含む、図２に示したＡｑｕａｐｏｒｅ（商標）ＡＸ−３００ＤＥＡＥ分別段階からの画分のＲｅｓｏｕｒｃｅ（商標）Ｉｓｏ疎水性カラムによるＨＰＬＣ疎水性相互作用クロマトグラフィのさらなる段階により得られた画分の脂肪分解活性分布パターン及びタンパク質含量を示す。
【図４】実施例１及び２と同様にして単離精製したヒトＬＭＦ及びマウスＬＭＦにより得られた電気泳動パターン、さらに１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質により得られたパターンを示す。
【図５】図４と同様であるが、但し、実施例２で調製したヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質（レーン２）及びヒトＬＭＦ（レーン３）について得られたバンドパターンを示す。
【図６】炭水化物の検出に用いられるＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて得られたさらなるバンドパターンを示す。
【図７】Ｚｎ−α２−糖タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いた１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質（レーン１）及びヒトＬＭＦ（レーン２）により得られたウエスタンブロットバンドパターンを示す。
【図８】ヒト血漿Ｚｎ−α２−糖タンパク質及び単離精製したヒトＬＭＦに対するα−キモトリプシンの影響を測定するためにおこなった実験で得られたさらなる電気泳動バンドパターンを示す。
【図９】ヒトＬＭＦ（Ａ）及びヒトＺｎ−α２−糖タンパク質（Ｂ）による新鮮単離ネズミ精巣上体の脂肪細胞の刺激を比較したチャートである。結果は、平均±ＳＥＭで表されている。脂肪細胞単独からのグリセロール放出値を、得られた値から差し引いた。データは、３つの別個の実験の典型例である。対照からの差を、スチューデントｔ検定で求め、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１及び＊＊＊ｐ≦０．００５で示されている。
【図１０】実施例２（ｏ）に記載の方法でヒト尿から単離したＬＭＦ（８μｇ）の静脈（ｉｖ）投与により産生されたブリーダー渡し雄ＮＭＲＩマウス（３０〜４０ｇ）の体重変化及び静脈注射（ｘ）によりＰＢＳを投与した対照マウスの体重変化を示す。
【図１１】図１０と同様な図であり、実施例２に記載したのと同様の方法によりヒト尿から単離したＬＭＦ（３５μｇ）の静脈投与により産生したｏｂ／ｏｂマウスの体重変化及び静脈注射によりＰＢＳを投与した対照マウス（ｘ）の体重変化を示す。ＬＭＦを、０時間目、１６時間目、２４時間目、４０時間目、４８時間目、６４時間目、７２時間目、９０時間目、９６時間目、１１３時間目、１２０時間目、１３７時間目及び１４４時間目に注射した。ＰＢＳを、上記と同じ時間に注射した。動物を、最初の注射をしてから１６０時間後に死亡させた。結果を、１グループ当たり５動物について平均±ＳＥＭで表してある。
【図１２】４３ｋＤａＬＭＦの生物活性に対する異なる時間（２時間、４時間及び８時間）についてのトリプシン消化の影響を示すグラフである。
【図１】
2013177395.tif 000008
【図２】
2013177395.tif 000009
【図３】
2013177395.tif 000010
【図４】
2013177395.tif 000011
【図５】
2013177395.tif 000012
【図６】
2013177395.tif 000013
【図７】
2013177395.tif 000014
【図８】
2013177395.tif 000015
【図９】
2013177395.tif 000016
【図１０】
2013177395.tif 000017
【図１１】
2013177395.tif 000018
【図１２】
2013177395.tif 000019
【配列表】
2013177395000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月22日(2013.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせるための医薬組成物の製造における脂質動員剤の使用であって、ここで、前記脂質動員剤は、そのポリペプチド部分が配列番号１に示される配列を有するＺｎ−α２−糖タンパク質であり、さらにここで、治療的に有効な投薬量の前記脂質動員剤がそのような処置を必要とする哺乳動物に投与される、前記使用。
【請求項２】
哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせるための医薬組成物の製造における脂質動員剤の使用であって、ここで、前記脂質動員剤は、ゲル排除クロマトグラフィーにより決定される見かけの分子量が約６ｋＤａよりも大きく、そのポリペプチド部分が配列番号１に示される配列を有するＺｎ−α２−糖タンパク質を酵素トリプシンで消化することにより得られ、さらにここで、治療的に有効な投薬量の前記脂質動員剤がそのような処置を必要とする哺乳動物に投与される、前記使用。
【請求項３】
哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせるための、脂質動員剤を含む医薬組成物であって、ここで、前記脂質動員剤は、そのポリペプチド部分が配列番号１に示される配列を有するＺｎ−α２−糖タンパク質であり、さらにここで、治療的に有効な投薬量の前記脂質動員剤がそのような処置を必要とする哺乳動物に投与される、前記医薬組成物。
【請求項４】
哺乳動物を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせるための、脂質動員剤を含む医薬組成物であって、ここで、前記脂質動員剤は、ゲル排除クロマトグラフィーにより決定される見かけの分子量が約６ｋＤａよりも大きく、そのポリペプチド部分が配列番号１に示される配列を有するＺｎ−α２−糖タンパク質を酵素トリプシンで消化することにより得られ、さらにここで、治療的に有効な投薬量の前記脂質動員剤がそのような処置を必要とする哺乳動物に投与される、前記医薬組成物。
【請求項５】
哺乳動物（ヒトを除く）を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせる方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に、そのポリペプチド部分が配列番号１に示される配列を有するＺｎ−α２−糖タンパク質である脂質動員因子を、治療的に有効な投薬量投与することを含む方法。
【請求項６】
哺乳動物（ヒトを除く）を治療して体重減少又は肥満の減少を生じさせる方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に、ゲル排除クロマトグラフィーにより決定される見かけの分子量が約６ｋＤａよりも大きく、そのポリペプチド部分が配列番号１に示される配列を有するＺｎ−α２−糖タンパク質を酵素トリプシンで消化することにより得られる脂質動員因子を、治療的に有効な投薬量投与することを含む方法。