(57)【要約】【課題】  体内活性酸素の測定は、従来から行なわれており種々の方法がある。しかしながら、これらの従来法では、装置が高価かつ大型であったり、スピントラップ剤による煩雑な前処理を必要とするなどの欠点がある。更に、採血が必要であるかプローブを穿刺して生体内に入れて血液等の体液に接触させる必要があるなど観血的または侵襲的な手法である。そこで、本発明は非侵襲的かつ簡便に生体内の活性酸素量を推定する方法を提供する。【解決手段】 レーザー光源、サンプリングした体表ガスが導入され、そこにレーザー光を照射する反応室、レーザー光によって発生した光子信号を検知増幅する光電子増倍管、レーザー誘起蛍光信号解析システムを有するものであって、該反応室は測定時体表に直接密着させるための開口部を有する装置。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー光源、サンプリングした体表ガスが導入され、そこにレーザー光を照射する反応室、レーザー光によって発生した光子信号を検知増幅する光電子増倍管及びレーザー誘起蛍光信号解析システムを有するものであって、該反応室は測定時体表に直接密着させるための開口部を有することを特徴とする体表ガス中の活性酸素測定装置。
【請求項２】
レーザー光源、標準ガスが導入可能な体表ガスサンプリング室、サンプリングした体表ガスが導入され、そこにレーザー光を照射する反応室、レーザー光によって発生した光子信号を検知増幅する光電子増倍管及びレーザー誘起蛍光信号解析システムを有するものであって、該サンプリング室は測定時、体表に直接密着されるか人体の一部を挿入して用いるものであり、該反応室にはサンプリング室から体表ガスを反応室に吸引するための吸引装置が接続されていることを特徴とする体表ガス中の活性酸素測定装置。
【請求項３】
該反応室に反応の距離を増やすためのミラーを備えるものである請求項１または２記載の体表ガス中の活性酸素測定装置。
【請求項４】
該体表ガスサンプリング室は、合成樹脂製であるか、又はその内壁の一部又は全部が合成樹脂コーティングされているものである請求項２または３記載の体表ガス中の活性酸素測定装置。
【請求項５】
体表ガスをサンプリングし、該サンプリングガスを反応室に導き、該反応室内においてレーザー光を照射し、発生する光子を測定し、それによって定量することを特徴とする体表ガス中の活性酸素の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体表ガス中の活性酸素測定装置及び測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
体内における活性酸素の発生は、近時の研究により人体に大きな影響を与えることが判明してきている。活性酸素自体は人体において必然的に発生するものであり、発生をゼロにすることはできない。活性酸素はその反応性の高さにより、細胞等に損傷を与え、種々の病気や老化の原因となる。
【０００３】
この活性酸素の発生量は個人により、また運動や食生活、その他によって異なるものである。そこで、この活性酸素量を測定し、健康状態、その他種々の病気の有無や状況の判断指標とすることが望ましい。
【０００４】
この体内活性酸素の測定は、従来から行なわれており、周知の電子スピン共鳴法（ＥＳＲ）、活性酸素と反応して光を発する化学物質を添加して発光量から活性酸素量を計測する方法（特許文献１）、蛍光を利用した方法（特許文献２及び３）、活性酸素を捕捉するために錯体を用いる方法（特許文献４及び５）、生体内に穿刺し血液等の体液に接触させて測定する方法（特許文献６）などが考案され特許出願もされている。
【０００５】
また間接的な方法として水素水摂取後の呼気水素計測によるヒト全身の活性酸素種推定法も考案されている（特許文献７）
【０００６】
しかしながら、これらの従来法では、ＥＳＲはスペクトルから活性酸素種の同定ができ、強度から濃度の測定ができる反面、装置が高価かつ大型であるために導入が容易ではない。また、寿命の短い活性酸素を固定するためにスピントラップ剤による煩雑な前処理を必要とするなどの欠点がある。その他、発光や蛍光を利用した活性酸素計測手法においても、試薬の反応の場が液体を原則としているために、採血が必要であるかプローブを穿刺して生体内に入れて血液等の体液に接触させる必要があるなど観血的または侵襲的な手法である。
【０００７】
更に、これらの方法は、活性酸素との反応生成物を観測するものであり、直接活性酸素を測定するものではなかった。
【０００８】
また、体表ガスの１つである皮膚ガスには活性酸素が含まれていることが種々の実験により判明した。この活性酸素が体内活性酸素と相関関係があると想像されるが、完全に実験で確かめたものではない。ここでいう皮膚ガスとは、人の皮膚から放出される気体である。
【０００９】
体表ガスの測定は従来から行なわれている。例えば、特許文献８には皮膚ガスの収集装置と測定装置が記載されている。しかし、このような方法では、活性酸素のような微量成分は検出できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ０３／０３８４２９
【特許文献２】特開平１０−３３２６６７
【特許文献３】ＷＯ２００５／１０３２８２
【特許文献４】ＷＯ２００４／０７４８２８
【特許文献５】ＷＯ０３／０５４５３６
【特許文献６】特開２００２−０５５０７８
【特許文献７】特開２０１０−２３５７７１
【特許文献８】特開２００２−１９５９１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明は非侵襲的かつ簡便に体表ガスの活性酸素量を測定する方法を提供する。それによって生体内の活性酸素量を求める（推定する）ことが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以上のような現状に鑑み本発明者等は、鋭意研究の結果本発明活性酸素測定装置及び方法を完成したものであり、その特徴とするところは、装置にあっては、レーザー光源、サンプリングした体表ガスが導入され、そこにレーザー光を照射する反応室、レーザー光によって発生した光子信号を検知増幅する光電子増倍管及びレーザー誘起蛍光信号解析システムを有するものであって、該反応室は測定時体表に直接密着させるための開口部を有する点にあり、また他の態様装置では、置にあっては、レーザー光源、標準ガスが導入可能な体表ガスサンプリング室、サンプリングした体表ガスが導入され、そこにレーザー光を照射する反応室、レーザー光によって発生した光子信号を検知増幅する光電子増倍管及びレーザー誘起蛍光信号解析システムを有するものであって、該サンプリング室は測定時、体表に直接密着されるか人体の一部を挿入して用いるものであり、該反応室にはサンプリング室から体表ガスを反応室に吸引するための吸引装置が接続されている点にあり、方法にあっては、体表ガスをサンプリングし、該サンプリングガスを反応室に導き、該反応室内においてレーザー光を照射し、発生する光子を測定し、それによって定量する点にある。
【００１３】
本発明装置及び方法は、その微量成分測定において、レーザー誘起蛍光法（ＬＩＦ）を使用するものである。よって、その原理を簡単に説明する。
ここで、活性酸素としてＯＨラジカルを測定するとする。
まず、ＯＨラジカルにレーザー光が照射されると、そのエネルギーを吸収し励起状態に遷移する。そして、０．７マイクロ秒程度の寿命の後、光を放出しエネルギーを失う。この放出された光を検出して測定するものである。これが、レーザー分光法でよく用いられるレーザー誘起蛍光法という検出手法であり、分子の検出感度は通常の質量分析法などに比べ数万倍高い。
【００１４】
本発明でいう体表ガスは、前記したとおり皮膚、その他眼球結膜、唇、爪など体の一部から放出されるガスをいう。
本発明でいう活性酸素は、前記したＯＨラジカル（ヒドロシキラジカル）だけでなく、スーパーオキシド、過酸化水素等一般的に活性酸素と呼ばれるものを含む。
【００１５】
まず最初請求項１に記載の発明について、その語句の意味から説明する。
レーザー光源は通常のパルスレーザーでよく、波長は検出する活性酸素の種類によって選択すればよい。ヒドロキシラジカルの場合、周知のように約３０８ｎｍである。このレーザー光が強すぎると、散乱光による迷光や多光子過程により不要な分子が生成しノイズが発生する。また、弱すぎると十分な信号強度が得られない。よって、レーザー光を適度な強度に調整する必要がある。
ここでは、５０〜１００μＪ程度が好適である。この調整には、光量調整フィルターを用いるのがよい。
【００１６】
また、レーザー光の波長分解能は、通常の色素レーザーの発振で得られる波長分解能があれば十分である。例えば、０．１〜０．５ｃｍ-1程度で十分である。後述する実施例では、０．２ｃｍ-1のものを使用した。
【００１７】
反応室は、導入された体表ガス中の活性酸素にレーザー光が照射されるチャンバーである。この反応室には、体表ガスを取り込むための開口部が設けられている。この開口部は、測定時に体表と密着できる構造になっている。例えば、開口部の周囲に弾性体のパッキンが設けられているもの、開口の形状が腕の局面に沿った形状のもの、その他である。
この反応室には、反応距離を増やすためのミラーを設けてもよい。これは請求項２の発明も同様である。
【００１８】
光電子増倍管は、光エネルギーを電気エネルギーに変換するものであり、電流増幅機能をも有するものである。通常のレーザー誘起蛍光法で使用するもの等でよい。また、増倍管の前に偏向フィルターを設けてもよい。反応室出側から光電子増倍管までは検出部ともいうべき部分である。この光電子増倍管は、一分子計測が可能なものが望ましい。この光電子増倍管からの信号は直接又は増幅器を介してフォトカウンターにより計測する。
フォトカウンターは、十分に速い応答速度を有するものが望ましい。例えば、分解能が１００〜５００ＭＨｚ程度である。実験で用いたものは、３００ＭＨｚであった。
【００１９】
レーザー誘起蛍光信号解析システムは、前記光電子増倍管からの電気エネルギー（電気信号）を解析（濃度変換その他）し、記憶し、可視化するものでコンピューターで行なうものである。これも通常のレーザー誘起蛍光法で用いるものでよい。
【００２０】
請求項１記載の発明は、反応室を直接体表に当てて測定するものであって、被検者は腕等を出すだけでよい。反応室が直接サンプリングするため、装置が簡単である。測定は反応室を体表に当てて、装置をスタートさせるだけである。
【００２１】
次に請求項２に記載の発明について説明する。特別に説明しない限り、同一の用語は請求項１と同様である。
【００２２】
本発明でいう標準ガスとは、アルゴン等のイナートガス、高純度空気、その他活性酸素と反応しない気体をいう。
【００２３】
体表ガスサンプリング室とは、人体がアクセス可能（接触又は挿入可能）なもので大気開放口、標準ガス導入口、後述する反応室との連絡口を有するチャンバーである。大きさとしては指が入る程度のものから平面視３０ｃｍ×３０ｃｍ程度のものまで可能である。大きいものは腹や背に密着させて使用できる。
【００２４】
この体表ガスサンプリング室は、活性酸素と反応しないものが望ましい。即ち、金属では活性酸素と直ちに反応し活性酸素が消滅する可能性があるためである。よって、活性酸素との反応性がほとんどないテフロン（登録商標）等の合成樹脂で内部をコーティングすることが好ましい。勿論、全体を合成樹脂製にしてもよい。
【００２５】
体表ガスサンプリング室は、体表から放出されたガスを集めるチャンバーであり、ここから後述する反応室へ送られる。構造としては、体表と接触密着できるか又は体の一部が挿入できる開口、標準ガスが導入される標準ガス入口、反応室へ繋がる送出口が設けられている。
また、危険防止の観点から、体表留置付近にはメッシュ状の網を設けることや、誤挿入防止用のシャッター等を設けてもよい。
【００２６】
標準ガスの導入方法はどのような方法でもよいが、ボンベから圧力調整弁を介してサンプリング室に導入するのが簡単である。導入する圧は低くてよく、大気が流入しない程度の圧があればよい。限定はしないが、例えば、１００〜５００ｍｍ水柱程度である。
この標準ガスは、測定中に大気の流入を防止するだけでなく、前回の測定の体表ガスをパージし、前回の体表ガスとの混合を防止するためと、サンプリング室内の体表ガス以外のガスに活性酸素が含まれないようにするためにも用いられるものである。
測定の１例を示すと、測定開始前、手をサンプリング室に入れ、標準ガスを流し始め、且つ、後述する吸引ポンプを稼動し、数分放置し，体表ガスが装置内に充満したのち測定を開始する等である。勿論、稼動の順は自由である。
【００２７】
請求項２の発明の反応室は、サンプリング室から導入された体表ガス中の活性酸素にレーザー光が照射されるチャンバーである。サンプリングガスが導入され、それが排出される排出口があり、レーザー光が通過する構造となっている。
また、レーザー光の通過路や活性酸素から放出された光の通過路には 光バッフルを設けるのがよい。
【００２８】
この反応室の排出口は、反応室のガスを吸引するための吸引ポンプと接続されている。この吸引力によって、サンプリング室から反応室へガスが導入されるとも言える。また、このポンプの吸引によって、不純物である大気を吸引しないようにする。即ち、前記した標準ガスがサンプリング室に導入される量以上に吸引しないようにするということである。これも流量調整弁等で簡単にできる。
【００２９】
手等の体表ガス放出部から、この反応室のレーザー光通過部分との間で、活性酸素が何らかの反応で消滅すると誤差になることは明らかである。勿論、そのような反応が起こらないように標準ガスを使用したり、各壁面を合成樹脂コーティングする等のことが考えられるが、基本的にこの距離が短ければその可能性が減少することも当然のことである。また、体表放散による拡散希釈もある。よって、その距離をできるだけ短くするように装置を設計することも重要である。例えば、体表表面から、１ｃｍ以内のところをレーザー光が通過する等である。
勿論、レーザー光による人体への影響があるため、人体（指等）はレーザー光の通過路には入れることができない構造にする等である。
また、レーザー散乱によるバックグラウンドが問題になるため、反応室等の寸法とレーザー光強度を調整しながらＳ／Ｎの改善を図ることもよい。これらのことは請求項１の装置も同様である。
【発明の効果】
【００３０】
以上説明した本発明には次のような効果がある。
（１）  非侵襲で、体表ガスの活性酸素が測定できる。
（２）  検出にレーザー誘起蛍光法を用いているため、活性酸素の検出感度がフェムトmol／min／ｍ2、時間分解能１００msecが可能になる。これは、従来の体表ガス測定装置では不可能な数値である。
（３）  体表から放出される活性酸素が超高感度・簡便・迅速かつ安全に検出できることとなり、それも１〜１０分以内で可能である。
（４）  種々の酸化ストレス疾患に関連する未病の予防や早期診断・早期治療，治療効果判定などを健診や外来，ベッドサイドなどの医療現場で幅広く利用可能となる。
（５）  非侵襲的に活性酸素を直接計測可能にすることにより、従来活性酸素により化学的修飾を受けた代謝産物から間接的にみていた酸化ストレスマーカに代わり、その根源となる活性酸素のその場計測による健康診断が可能になる。
（６）  体表の活性酸素測定による厳密な臨床的意義付けは、本システムが臨床普及した段階での大規模臨床試験を待たなければならないが、本開発装置による臨床データが蓄積されることにより、活性酸素が関与する種々の生活習慣病（肥満、高血圧、高脂血症、糖尿病、高尿酸血症、がんなど）、アレルギー性疾患・感染症・免疫性疾患などのきわめて多くの疾患の早期診断とそれを活用した早期予防・治療効果の判定が可能となる。
（７）  脳梗塞、心筋梗塞、狭心症などに伴う虚血性再灌流性障害は臨床的にきわめて重要な克服すべき課題であり、活性酸素生成のモニタリングや治療効果の判定に応用可能になれば救急救命をはじめとした種々の臨床現場にも活用できる可能性がある。
（８）  健康の維持増進を目的とする栄養摂取・身体活動・睡眠・余暇など生活習慣の指導・管理指標としても活用できる。
（９）  さらに運動に伴うラジカル生成量からスポーツ医学分野や健康維持のための運動処方が可能となる。
（１０）  超小型安価な製品化が可能になれば，在宅でもできる自己診断機器として発展できる可能性がある。
（１１）  システム構成のうち、サンプリング室の形状・大きさを変えることにより、被検体は体表のみならず、ヒトの全身のみならず有機・無機・生命体の表面から放出されるガス中の活性酸素種の検知も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明装置の１例の概略断面図である。
【図２】本発明装置の他の例の概略断面図である。
【図３】本発明装置を用いて測定した体表ガスのスペクトラムのグラフである。
【図４】本発明装置を用いて測定した体表ガスの他のスペクトラムのグラフである。
【図５】本発明装置を用いて測定した体表ガスのＬＩＦ信号強度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下図面に示す実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、発明をこれに限定するものではない。
図１は、請求項１に記載の本発明装置１の１例を示す概略断面図である。
装置１は、反応室２、レーザー光源（図示せず）、検出部３、コンピューター４及び電源５から構成されている。反応室２には、レーザー光源からのレーザー光が通過する貫通孔６が設けられ、その貫通孔６を含むように光通過管７が取り付けられている。この検出部３には、偏光フィルター８と光電子増倍管９が設けられている。光通過管７や検出部３は光が通過する部分であり、ここには光バッフル１０を設けている。また、安全のためレーザー光が外に漏れないようにするダンパー２０が設けられている。
【００３３】
この反応室２には、測定時体表に直接密着させるための開口部１１があり、その周囲は弾性体（ゴム）で構成されている。この図は、腕１２にこの開口部１１を押し当てているところである。
【００３４】
測定は、この図の状態で少し待ち（１〜５分程度）、レーザー光源やその他の装置をスタートさせるだけでよい。
【００３５】
図２は、請求項２に記載の発明の１例を示す断面図である。図１と同じものは原則として同じ番号を付している。
体表ガスサンプリング室１３には、手を挿入する開口１４、標準ガスを導入する標準ガス入口１５、及び反応室２に繋がる送出口１６が設けられている。この体表ガスサンプリング室１３の内壁はテフロン（登録商標）コーティングされている。
【００３６】
標準ガス（ここでは高純度空気）は、ガスボンベ１７から、減圧弁１８及び流量調整弁１９を通りサンプリング室１３に導入される。送出口１６は反応室２に接続している。反応室２は、図１と同様レーザー光源（図示せず）からのレーザー光が通過する貫通孔６が設けられ、その貫通孔６を含むように光通過管１０が取り付けられている。また、安全のためレーザー光が外に漏れないようにするダンパー２０が設けられている。
【００３７】
反応室２には、検出部３が接続されている。図１と同様この検出部３には、偏光フィルター８と光電子増倍管９が設けられている。光通過管７や検出部３は光が通過する部分であり、ここには光バッフル１０を設けている。
【００３８】
この検出部３にはガスを吸引する吸引ポンプ２１が、流量調整弁２２を介して接続されている。光電子増倍管９には電源５が接続され、からコンピューター４へ信号配線が接続されている。
【００３９】
測定方法は、まず被検者の手をサンプリング室１３に挿入し（標準ガスの導入後でもよい）、次いで標準ガスをサンプリング室１３に導入する。吸引ポンプ２０を稼動し（最初から稼動していてもよい）、数分経過（時間は限定しない）、計測を開始するだけでよい。データの解析やグラフ化、その他はコンピューター４によって行なわれる。
【００４０】
図２のシステムを用いてレーザー波長を変化させた場合の手掌から放出される体表ガスのスペクトラムを測定した。測定は各波長で５００ショットの積算を行い、２０回の繰り返しで、全体で１００００ショットの平均をプロットした。５００ショットごとにバックグラウンドの信号を測定し、その差分をプロットすることで手掌から放出されている体表ガスの同定を試みた。その結果を図３に示す。図中の実線はシミュレーションにより得られたものであり、ピークの位置から、この成分はヒドロキシラジカルのＯＨ（Ａ2Σ←Ｘ2Π）遷移におけるＱ1（１）の回転線に相当することが分かった。
【００４１】
本システムを用いて被験者３名の手掌ヒドロキシルラジカル計測を行った結果を図４に示した．ブランク５分→手掌（１０分）→ブランク５分→手掌（１０分）→ブランク５分の順に実施した。ブランクは遮光用布地をカバーした状態、手掌はサンプリング室に手を挿入した状態である。手を挿入すると明らかにＬＩＦ信号が再現性よく上昇することが分かる。
【００４２】
ビタミンＣとビタミンＥは強力な抗酸化剤である。ビタミンＣはスーパーオキサイド、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルなどほぼ全ての活性酸素種を消去する作用があり、ビタミンＥはヒドロキシラジカルに対して強力な消去作用がある。本発明装置を用いてそれらの体表から放出されるヒドロキシルラジカルを消去するか否かを検討した。下記の実験は3日以上の間隔を空けて行った。
【００４３】
本発明装置を用いて予め内服前の手掌ヒドロキシルラジカルを計測した。計測終了後直ちにビタミンＣ２ｇ含有の水溶液５０ｍＬを服用した後、同様の計測を２時間後に実施した。手掌ＬＩＦカウント／バックグラウンドカウントの比率は、内服前が１．１６±０．０４（平均±標準偏差、以下同様）であったのが、ビタミンＣ内服後は１．０３±０．０３と統計的に有意に低下した（危険率ｐ＝０．００９）。図５（ａ）に示す。
【００４４】
同様にして、内服前の手掌ヒドロキシルラジカル計測を行い、次いでビタミンＥ（１００ｍｇカプセル）３カプセル＋水５０ｍＬを内服後、２時間後に同様の実験を実施した。ＬＩＦの手掌カウント／バックグラウンドカウントの比率は、内服前が１．１４±０．０９であったのが、ビタミンＣ内服後は１．００±０．０４となり統計的に有意に低下した（危険率ｐ＝０．０１３）。図５（ｂ）に示す。
【００４５】
以上のように本発明システムを用いることで体表からヒドロキシルラジカルが放出されていることを証明できた。
【符号の説明】
【００４６】
１  本発明装置
２  反応室
３  検出部
４  コンピューター
５  電源
６  貫通孔
７  光通過管
８  偏光フィルター
９  光電子増倍管
１０  光バッフル
１１  開口部
１２  腕
１３  体表ガスサンプリング室
１４  開口
１５  標準ガス入口
１６  送出口
１７  ガスボンベ
１８  減圧弁
１９  流量調製弁
２０  ダンパー
２１  吸引ポンプ
２２  流量調整弁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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