(57)【要約】      （修正有）【課題】パーキンソン病の診断に関する。【解決手段】被験者由来の被験試料におけるニューレグリン１のアイソタイプIII（neuregulin1,NRG1）を測定する工程を含み、測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者がパーキンソン病を罹患している可能性があると判断する、パーキンソン病を罹患している可能性がある被験者の選別方法、およびＮＲＧ１タイプIIIβを特異的に認識する抗体を含有する、パーキンソン病の診断に使用するためのキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の被験試料におけるＮＲＧ１タイプIIIの濃度を測定する工程を含み、その測定値をパーキンソン病を罹患していることの指標とする、パーキンソン病を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
【請求項２】
前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者がパーキンソン病を罹患していると判断とする、請求項１記載の選別方法。
【請求項３】
被験試料が血液である請求項１または２記載の選別方法。
【請求項４】
前記測定がＮＲＧ１タイプIIIと特異的に結合する抗体または抗体断片を用いて行うものである請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの方法に使用するためのキット。
【請求項６】
ＮＲＧ１タイプIIIのパーキンソン病診断マーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病の診断に関する。詳細には、本発明は、ニューレグリン１（neuregulin 1, ＮＲＧ１）タイプIIIを分子マーカーとするパーキンソン病の診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、脳内物質であるドーパミンの分泌量が減少することにより起こる神経変性疾患の１つであり、典型例では振戦、筋強剛、動作緩慢、姿勢反射障害などの症状が見られる。パーキンソン病は４０歳以降症状が出始め、５０歳〜６０歳で発症率および有病率が高くなる。
【０００３】
パーキンソン病の診断は、自覚症状や神経所見のほか、ＣＴやＭＲＩなどの画像所見で特異的な異常が認められないこと、Ｌ−ドーパの投与で症状が改善することなどにより行われている。場合によっては、脳脊髄液中のドーパミン代謝産物を調べることによって、パーキンソン病の診断が行われる。しかし、パーキンソン病だけを特異的に診断できる方法はない。
【０００４】
非特許文献１では、パーキンソン病患者の脳脊髄液中のＤＪ−１やα−シヌクレインが減少しているという報告がなされたが、パーキンソン病患者の血液中のこれらの蛋白濃度の変化については報告がない。
【０００５】
非特許文献２では、パーキンソン病患者の脳脊髄液および血清において8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)や8-hydroxyguanosine(8-OHG)が上昇することが報告されているが、8-OHdG濃度はアルツハイマー病や筋萎縮性側索硬化症といった他の神経変性疾患でも上昇することが知られており、パーキンソン病特異的な診断方法ではない。
【０００６】
非特許文献３では、123I-metaiodobenzylguanidine(MIBG)を用いた心筋シンチグラフィーにおいて、パーキンソン病患者ではMIBGの選択的取り込みが減少することが報告されている。この方法は本態性振戦や多系統萎縮症といった他の神経変性疾患とパーキンソン病との判別に寄与する方法ではあるものの、放射性医薬の投与という被験者への負担があり、またSPECT等の特殊な機器を必要とすることから、簡易診断にはなじまない。
【０００７】
以上、簡便な手段で、パーキンソン病を特異的に診断するための方法はこれまでなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Honq Z. et al. Brain, 2010, Vol.133, 713-126
【非特許文献２】Kikuchi A. et al. Neurobiology of Disease, 2002, Vol.9, 244-248
【非特許文献３】Orimo S. et al. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 1999, Vol.67, 189-194
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
簡便な方法で、パーキンソン病を診断するための手段・方法を開発することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、末梢血中のＮＲＧ１のアイソタイプIII（以下「ＮＲＧ１タイプIII」という）をマーカーにすることで、パーキンソン病を診断できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）被験者由来の被験試料におけるＮＲＧ１タイプIIIの濃度を測定する工程を含み、その測定値をパーキンソン病を罹患していることの指標とする、パーキンソン病を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
（２）前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者がパーキンソン病を罹患している可能性があると判断する、（１）記載の選別方法。
（３）被験試料が血液である（１）または（２）記載の方法。
（４）前記測定がＮＲＧ１タイプIIIと特異的に結合する抗体または抗体断片を用いて行うものである（１）〜（３）記載の方法。
（５）（１）〜（４）のいずれかの方法に使用するためのキット。
（６）ＮＲＧ１タイプIIIを特異的に認識する抗体を含有することを特徴とする、（５）記載のキット。
（７）ＮＲＧ１タイプIIIのパーキンソン病診断マーカーとしての使用。
（８）被験者由来の被験試料におけるＮＲＧ１タイプIIIβの濃度を測定する工程を含み、その測定値をパーキンソン病を罹患していることの指標とする、パーキンソン病を罹患している可能性がある被験者の選別方法。
（９）前記測定値が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者がパーキンソン病を罹患している可能性があると判断する、（８）記載の選別方法。
（１０）被験試料が血液である（８）または（９）記載の方法。
（１１）前記測定がＮＲＧ１タイプIIIβと特異的に結合する抗体または抗体断片を用いて行うものである（８）〜（１１）記載の方法。
（１２）（８）〜（１１）のいずれかの方法に使用するためのキット。
（１３）ＮＲＧ１タイプIIIβを特異的に認識する抗体を含有することを特徴とする、（１２）記載のキット。
（１４）ＮＲＧ１タイプIIIβのパーキンソン病診断マーカーとしての使用。
などを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、簡単にパーキンソン病を診断することができ、しかも被験者の負担が少なくて済むことを特徴としている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＮＲＧ１の各アイソフォームを模式的に表した図である。
【図２】図２は、対照群（Control）と多系統萎縮症群（ＭＳＡ）と筋萎縮性側索硬化症群（ＡＬＳ）とパーキンソン病群（ＰＤ）の末梢血中のＮＲＧ１タイプIIIβ濃度分布をボックスプロットで示したものである。  箱の中の太線は中央値を示す。箱の下端及び上端は、第１四分値（Ｑ１）及び第３四分値（Ｑ３）を示す。箱から伸びる棒の下端及び上端は、最小値及び最大値を示す。  但し、ＭＳＡ群及びＰＤ群については、第３四分位値＋１．５×四分位範囲よりも大きな値があったので、それらは個々の点としてプロットし、両群の箱から伸びる棒の上端は、第３四分位値＋１．５×四分位範囲の値を示している。  なお、四分位範囲とは、第３四分位値から第１四分位値を引いた値を意味している。
【図３】図３は、対照群とパーキンソン病群でのＲＯＣ曲線を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、１の態様において、被験者がパーキンソン病に罹患している可能性の有無を判断する方法を提供する。該方法は、被験者由来の被験試料におけるＮＲＧ１タイプIIIの濃度を測定する工程を含み、その測定値をパーキンソン病を罹患していることの指標とする、パーキンソン病を罹患している可能性がある被験者の選別方法に関するものである。また、本発明は、被験者由来の被験試料におけるＮＲＧ１タイプIIIの濃度を測定する工程を含み、ここで、被験試料におけるＮＲＧ１タイプIIIの濃度が、基準値よりも小さくなる場合、前記被験者がパーキンソン病を罹患している可能性があると判断する、パーキンソン病を罹患している可能性がある被験者の選別方法に関するものである。
【００１５】
本発明の上記方法の特徴は、被験者由来の被験試料中のＮＲＧ１タイプIIIのタンパク質の濃度を分子マーカーとして用いることである。被験者から採取する被験試料は、尿、全血、血漿、血清、または血液に由来するものが含まれるが、簡便性の観点から末梢血が好ましい。末梢血は被験者のいずれの部位から採取してもよいが、静脈からの採取が一般的である。例えば、腕静脈から末梢血を採取することにより、本発明を簡便かつ被験者への負担を少なくして実施できる。好ましくは、採取した末梢血から血漿を分離し、血漿中のＮＲＧ１タイプIIIの濃度を測定する。
【００１６】
図１に示すとおり、神経栄養因子であるＮＲＧ１には少なくとも６つのタイプがあり（タイプI−VI）、３１種以上のアイソタイプが存在する。本発明のマーカーとして用いるＮＲＧ１タイプIIIにはα、βおよびγのアイソタイプが存在し、いずれのアイソタイプであっても本発明に用いることができる。好ましくはアイソタイプβのもの（ＮＲＧ１タイプIIIβと称す）をマーカーとして用いる。
【００１７】
また、NRG1 Isoform SMDFは、NRG1タイプIIIβにリンカー配列３が付加された構造を持つアイソフォームのことを意味する。
【００１８】
ＮＲＧ１と神経変性疾患との関連性は知られておらず、ＮＲＧ１をパーキンソン病の診断マーカーとして利用しようとする点で、本発明は画期的である。
【００１９】
また、ＮＲＧ１タイプIIIは他のタイプのＮＲＧ１とは異なり、細胞膜から血中へは遊離しにくいと考えられており、これを疾病の診断マーカーに用いる試みは皆無であったが、本発明はそのようなＮＲＧ１タイプIIIをパーキンソン病の診断マーカーとして用いる点で意外性があり、画期的である。
【００２０】
ＮＲＧ１タイプIIIの被験試料中の濃度の測定には公知の方法を用いることができる。好ましくはＮＲＧ１タイプIIIに対する抗体を用いることによって、ＮＲＧ１タイプIIIの被験試料中の濃度を測定することができる。このような測定には、抗体を用いるウェスタンブロットやＥＬＩＳＡなどの公知の手段を用いることができる。抗体には検出・定量可能な標識を付すことが好ましい。標識としては放射性標識、蛍光標識などが知られており、適宜選択して用いることができる。検出の利便性から、ビオチン化された抗体などが好ましい。
抗体の作製方法も公知であり、例えば、ＮＲＧ１のタイプIIIのタンパク質（Accession No. NP_039253）やその断片を抗原として用いて抗体を作製することなどもできる。また、市販されている抗体もあるので、調製や入手は容易である。
他のタイプのＮＲＧ１との交差反応を減少させ検出感度を高めるために、ＮＲＧ１タイプIIIの被験試料中の濃度の測定の際に２種以上の抗体を組み合わせて用いてもよい。
【００２１】
次いで、被験者から得られた被験試料中のＮＲＧ１タイプIIIの濃度を基準値と比較し、
基準値よりも小さくなる場合、前記被験者がパーキンソン病を罹患している選別されることになる。基準値は、当業者であれば目的に応じて別の基準値を設定することが出来る。
例えば、統計学上有意となるような適切な数の対照者の被験試料中のＮＲＧ１タイプIIIの濃度の平均値や中央値なども基準値として用いることができる。対照者は、パーキンソン病に罹患していない被験者であり、好ましくは健康な被験者である。
被験試料として末梢血中を用い、ＮＲＧ１タイプIIIβをマーカーとして用いる場合には、本発明の実施例１で得られた、対照群の平均値である約１１．３６ｎｇ／ｍｌという値を基準値として用いてもよいし、対照群の中央値である約３．９６ｎｇ／ｍｌという値を基準値として用いてもよい。また、被験試料として末梢血を用い、ＮＲＧ１タイプIIIβをマーカーとして用いる場合には、実施例２に示す結果および図３のＲＯＣ曲線より、例えば、１１．３ｎｇ／ｍｌ、３．５ｎｇ／ｍｌ、２．６ｎｇ／ｍｌ又は１．９ｎｇ／ｍｌを基準値として用いてもよい。
いずれにしても、当業者であれば目的に応じて、適宜適当な基準値を設定することが出来る。
【００２２】
被験者がパーキンソン病に罹患している可能性とは、被験者が検査時にパーキンソン病に罹病している可能性がある場合のことを意味する。
【００２３】
本発明は、もう１つの態様において、被験者由来の被験試料におけるＮＲＧ１タイプIIIの濃度を測定する工程を含み、その測定値をパーキンソン病を罹患していることの指標とする、パーキンソン病を罹患している可能性がある被験者の選別方法に使用するキットを提供する。
【００２４】
具体的には、ＮＲＧ１タイプIIIを特異的に認識する抗体を含有することを特徴とするキットを提供する。このようなキットは、更に一般的にアッセイを実行するために必要な１つ以上の構成要素を含む。構成要素は、標準品、試薬（希釈液、緩衝液など）、容器及び／又は装置であり得る。
【００２５】
キットに含まれる抗ＮＲＧ１タイプIII抗体は、当業者に公知の任意の支持材料（例えば、マイクロタイタープレートにおけるウェルやニトロセルロースなどの適切な膜）に付着されて提供され得る。このようなキットはまた、抗体結合の直接的検出又は間接的検出に適切な種々の物質により標識され得る。
【００２６】
本発明者らは、末梢血中のパーキンソン病分子マーカーの検索を以下のようにして行った。すなわち、末梢血で定量可能な分子マーカー候補として、パーキンソン症候群を呈した多系統萎縮症について、片方のみ発現している一卵性双生児、患者、健常対照者の白血球を分離し、トランスクリプトーム解析を行った。
その結果、一卵性双生児間および非血縁患者と健常対照群で比較して患者群においてＮＲＧ１の遺伝子の発現が２倍異なるので、マーカー候補となると考えて、ＮＲＧ１に着目することとした。
【００２７】
次に、本発明者らは、末梢血中のＮＲＧ１タイプI及びタイプIIをマーカーとして用いるパーキンソン病の診断可能性について検討した。
ＮＲＧ１のＩｇＧドメインを認識する抗体を使用するＥＬＩＳＡのキットDuoSet ELISA human NRG1-β１/HRG-β1(R＆D社製)を用いて、パーキンソン症候群と対照群との間において、ＮＲＧ１タイプI及びタイプIIがマーカーとなりうるのかを検討したが、両群間において有意差は認められなかった。
そこで、本発明者らは、他のＮＲＧ１のタイプがパーキンソン病のマーカーにならないかを検討することとした。
【００２８】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２９】
実施例１：末梢血中のＮＲＧ１タイプIIIβを分子マーカーとして用いるパーキンソン病の診断
パーキンソン病における新規マーカーとしてのＮＲＧ１の性能を調べるために、血漿中のＮＲＧ１濃度を対照者群及び各疾患の患者群間で比較した。
【００３０】
対象は北海道大学病院神経内科を中心に、一部関連病院において通院加療している患者であった。診断と重症度の判定は国際診断基準に準拠した。対照群は神経疾患に罹患していない成人を中心とし、特異性検証を目的として筋萎縮性側索硬化症や多系統萎縮症などの他の神経変性疾患も比較対照に含めた。この実験は北海道大学医学部の医の倫理委員会および北海道大学病院の自主臨床研究審査委員会の審査承認を得て行った。血液は文書で同意を得て採血、分注して−８０℃にて凍結保存した。採血時の臨床情報、重症度はインターネットに連結していないデータベースに保管管理した。
【００３１】
被験者の末梢血中のＮＲＧ１タイプIIIβの濃度は、本発明者らが市販の抗体２つ（１次抗体(Anti-human NRG1 Isoform SMDF Antibody(Goat IgG)(R＆D社製))、２次抗体（Anti-human NRG1-β1/HRG1-β1 Extracellular Domain biotilated Antibody (Goat IgG(R＆D社製))を組み合わせた独自のＥＬＩＳＡの系を用いて定量した。前述したとおり、ＳＭＤＦはＮＲＧ１タイプIIIβにリンカー配列３が付加された構造を持つアイソフォームであり、ＳＭＤＦとＮＲＧ１−β１／ＨＲＧ１−β１  Extracellular DomainとはＥＧＦ様ドメインを共通構造として有することから、両抗体の組み合わせによりＮＲＧ１タイプIIIβの定量が可能となったのである。
以下、本発明者らが、末梢血中のＮＲＧ１タイプIIIβの濃度を定量するために使用したＥＬＩＳＡの系を具体的に示す。
【００３２】
最初に、Maxi-Sorp Black Microwell SH plate(NUNC社製) に、0.7μg/ml にＰＢＳで希釈した１次抗体(Anti-human NRG1 Isoform SMDF Antibody(Goat IgG)(R＆D社製))100μl を各well に入れて4℃ にて１晩反応させた。
各well を400μl のWash buffer(0.05% Tween20入りのPBS)で4 回洗浄した後、Blocking Buffer(1%BSA入りのWash Buffer) 300μl を各well に入れて4℃ で１晩反応させた。
各wellのBlocking Bufferを捨てて、各対象からの血液検体をBlocking Bufferで5 倍希釈し、100μl づつ各well に入れ4 ℃で１晩反応させた。各well を400μl の Wash bufferで4 回洗浄し、Blocking Buffer にて 0.15μg/ml に稀釈した２次抗体（Anti-human NRG1-β1/HRG1-β1 Extracellular Domain biotilated Antibody (Goat IgG(R＆D社製)）を100μlずつ、各well に加えて室温で3 時間インキュベートした。
各well を400μl Wash buffer で4 回洗浄し、Blocking Buffer で10,000 倍に希釈したStrept-βGal を各Well に加え室温で3 時間インキュベートした。
各well を400μl PBS で4 回洗浄し、200μM MUG(10mM MgCl2, 50mM NaPO4 , pH7.3)を各Well に100μl 加え、室温で2 時間反応させた後に、Varioskan Flash (Thermo Fisher)を使用してEX365nm, EM450nm で蛍光を測定した。
【００３３】
その結果を図２のボックスプロットにまとめた。
パーキンソン病では、対照群との間で、有意差が認められた（Ｐ＜０．０４４）。一方、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症では、対照群との間で、有意差を認めなかった（ぞれぞれ、Ｐ＞０．９１、Ｐ＞０．７３）。
なお、対照群において、年齢・性別と末梢血中のＮＲＧ１タイプIIIβの量に相関は認められなかった。
【００３４】
また、パーキンソン病のHoehn&Yahrの重症度分類、UPDRSスコア、罹病期間など臨床的指標と末梢血中のＮＲＧ１タイプIIIβの量の間にも相関は認められなかった。
以上からすれば、本発明によれば、パーキンソン病の初期段階の患者でも効率的に診断できるというメリットがある。
【００３５】
実施例２：対照群とパーキンソン病群でのＲＯＣ曲線を用いた解析
【００３６】
被験者をパーキンソン病と診断するための基準値の候補となる閾値を求めるために、モデルに対するＲＯＣ曲線を作成した（図３）。図３から末梢血中のＮＲＧ１タイプIIIβ量の閾値として、１１．３４ｎｇ／ｍｌ、３．５４ｎｇ／ｍｌ、２．６２ｎｇ／ｍｌ又は１．８９５ｎｇ／ｍｌが算出された。
それぞれを閾値とした場合における感度特異度をまとめた表を、表１〜表４に示す。
【表１】
2013181823.tif 000002
【表２】
2013181823.tif 000003
【表３】
2013181823.tif 000004
【表４】
2013181823.tif 000005
【００３７】
以上より、ＮＲＧタイプIIIβは末梢血で定量可能なパーキンソン病の分子マーカーとして使用可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、医薬品の分野、特に診断薬や診断キットの分野において利用可能である。
【図１】
2013181823.tif 000006
【図２】
2013181823.tif 000007
【図３】
2013181823.tif 000008