(57)【要約】      （修正有）【課題】カロリー制限とは異なる手法による新たな抗老化アプローチとして、摂取して安全な寿命延長又は老化防止の作用を有する抗老化剤の提供。【解決手段】小豆エキスを有効成分として含有する抗老化関連遺伝子のｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
小豆エキスを有効成分として含有することを特徴とする転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤。
【請求項２】
請求項１記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のための予防・治療剤。
【請求項３】
請求項１記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のためのサプリメント。
【請求項４】
請求項１記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のための食品添加物。
【請求項５】
請求項１記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のための飼料添加物。
【請求項６】
請求項１記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を配合することを特徴とする寿命延長又は老化防止のための飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小豆エキスを有効成分とする転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤や、該活性化剤を含む寿命延長又は老化防止のための予防・治療剤、サプリメント、食品添加物、食品、飼料添加物、飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、先進諸国では、寿命の延長が顕著である。なかでも我が国は世界有数の長寿国である。しかし近年、運動量の減少、ストレスの増加、食事の欧米化によるカロリーの過剰摂取、栄養バランスの欠如等により健康寿命の延長には至っていない。
【０００３】
健康寿命の延長には抗老化が必要となっている。抗老化、換言すれば寿命を延長させる一つの手段として、カロリー制限が挙げられている。カロリー制限は、酵母、線虫、げっ歯類という幅広い生物種に対して寿命延長モデルとして確立している。さらに、アカゲザルを使ったカロリー制限に関する実験により、霊長類の新陳代謝に変化を及ぼし延命効果を高めるという、有力な証拠が提示された（非特許文献１）。
【０００４】
カロリー制限による寿命延長効果は、ヒトにも一定の効果があると考えられる。しかしながら、カロリー制限は、精神的ストレスを増加し、感染に対する抵抗性を低下させる可能性が考えられ、管理された条件下におけるアカゲザルでの結果がそのままヒトに当てはまらない可能性がある。従って、カロリー制限に替わる新たな抗老化法の開発が求められている。
【０００５】
抗老化物質をスクリーニングする方法としては、線虫（Caenorhabditis elegans、以下C.elegansとする）を用いた寿命測定試験や、各種動物の老化関連遺伝子の発現量解析が挙げられる。C.elegansは老化研究に適したモデル動物として広く知られている。その老化プロセスは遺伝子レベルでも研究が進められ、ヒトをはじめとする哺乳類の老化研究には欠かせないモデル系である（非特許文献２）。その平均寿命は遺伝的に制御され一定（２０℃でおよそ２０日）である上、加齢と共に細胞内及び組織の代謝活性が低下し、過酸化物が蓄積するなど高等動物と同様のプロセスを経て死に至る。即ち、C.elegansの寿命は細胞及び組織の老化の指標といえる。これらのことは、C.elegansの寿命を延ばすことが老化を抑制することに他ならないことを意味する。
【０００６】
ＦＯＸＯ１（フォークヘッド型クラスＯ１；Forkhead Box Class O1）はインスリンシグナルの下流で負に制御される転写因子であり、糖新生律速酵素の発現調節を介した血糖値の恒常性維持や、活性酸素除去酵素の発現誘導による抗酸化ストレスなどに寄与する。また線虫を用いた遺伝学的解析から、ＦＯＸＯ１の線虫オルソログであるｄａｆ−１６の活性が寿命と正の相関を示すことも報告されている。線虫の場合、Ｓｉｒ２オーソログであるｓｉｒ−２．１を人工的に発現させると約５０％寿命が延びることから、このＳｉｒ２の効果はインスリン／ＩＧＦ−Ｉ・シグナル伝達系に深く関与していることが明らかになっている。またｄａｆ−１６はインスリン／ＩＧＦ−Ｉ・シグナル伝達系の下流に位置する転写因子で、ｄａｆ−２はインスリン／ＩＧＦ−Ｉ・シグナル伝達系のはじめに位置するインスリン様因子受容体である。ｓｉｒ−２．１はｄａｆ−１６の上流でｄａｆ−２からのシグナルに反応する遺伝子を制御しているか、ｄａｆ−２のリガンドとなる因子あるいはその産生をコントロールする因子をコードする遺伝子を制御していると考えられている（図３）。
【０００７】
遺伝子発現量解析を用いて抗老化効果を測定する場合、指標となる抗老化関連遺伝子としてｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１を用い、ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１を活性化することが抗老化につながることが示されている（特許文献１）。ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１は、その欠損変異体では寿命延長効果が消失することなどから、ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１は老化を調整する遺伝子であるとされている（非特許文献３、４）。また、カロリー制限でもＮＡＤ依存的脱アセチル化酵素ｓｉｒ２−１がｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１を介して長寿命をもたらしていることが知られている（非特許文献５）。また、寿命延長効果のある物質としてレスベラトロール（非特許文献６）やスペルミジン（非特許文献７）が知られている。その他、小豆の塩漬け発酵抽出物を有効成分として含有する抗老化作用を有する化粧料組成物（特許文献２）や発芽小豆由来成分を含有する抗老化作用を有する皮膚外用剤（特許文献３）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−１２０７２６（Ｐ２００８−１２０７２６Ａ）
【特許文献２】特表２０１１−５２９８７４（Ｐ２０１１−５２９８７４Ａ）
【特許文献３】特開２００７−２１０９１５（Ｐ２００７−２１０９１５Ａ）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Science Vol. 325, Issue 5937
【非特許文献２】Journal of the American Geriatrics Society 40(9).1992. 936-945
【非特許文献３】Javier Apfeld & Cynthia Kenyon, Nature, 402, 804-809 (1999)
【非特許文献４】Journal of Visualized Experiments;(2011)
【非特許文献５】Nature. 2001 Mar 8;410(6825):227-30.
【非特許文献６】Nature 444, 337-342 (16 November 2006)
【非特許文献７】Nature Cell Biology 11, 1305 - 1314 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、カロリー制限とは異なる手法による新たな抗老化アプローチとして、摂取して安全な寿命延長又は老化防止の作用を有する抗老化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、抗老化関連遺伝子であるｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の遺伝子発現量を解析することは、カロリー制限と同様の抗老化効果をもつ物質のスクリーニングに非常に有効であると考え、天然の食品素材を標的としたスクリーニングを行い、小豆エキスが抗老化関連遺伝子のｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１を活性化して、老化形質を発現することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）小豆エキスを有効成分として含有することを特徴とする転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤や、（２）上記（１）記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のための予防・治療剤に関する。
【００１３】
また本発明は、（３）上記（１）記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のためのサプリメントや、（４）上記（１）記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のための食品添加物や、（５）上記（１）記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むことを特徴とする寿命延長又は老化防止のための飼料添加物や、（６）上記（１）記載の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を配合することを特徴とする寿命延長又は老化防止のための飼料に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、抗老化関連遺伝子の転写を促進する転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤や、該活性化剤を含む寿命延長又は老化防止のための予防・治療剤、サプリメント、食品添加物、食品、飼料添加物、飼料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】線虫を小豆エキス含有培地で培養したときの線虫生存率（平均生存日数を各サンプルそれぞれとコントロールで割った値）の測定結果を示す図である。
【図２】小豆エキス含有培地で培養した線虫におけるｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の遺伝子の発現量解析相対定量結果を示す図である。
【図３】ｄａｆ−１６遺伝子のシグナル伝達経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤としては、小豆エキスを有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、抗老化関連遺伝子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の転写を促進し、抗老化関連遺伝子のｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の発現量の増加を促進する作用を有するものである。
【００１７】
本発明の寿命延長又は老化防止のための、予防・治療剤やサプリメントや食品添加物や飼料添加物は、本発明の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を含むものであればよく、予防・治療剤やサプリメントは、ヒトの他に家畜・家禽やペット動物に適用される。また、本発明の寿命延長又は老化防止のための、食品や飼料は、本発明の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を配合したものであればよい。ここで、寿命延長とは、ヒトを含む動物の寿命を延ばすことをいい、また老化防止とは、ヒトを含む動物の身体的能力の低下、身体の機能の低下など身体に現れる老化現象を防止することをいう。
【００１８】
本発明における小豆エキスには、小豆そのものやその処理物が含まれる。その処理物としては、小豆の粉砕処理物、細断処理物、乾燥処理物、焙煎処理物、抽出処理物、超音波ホモジナイズ処理物、凍結処理物の他、抽出処理物を噴霧乾燥したもの等のこれらの処理の組み合わせにより得られる処理物を挙げることができる。また、小豆の種類としては、白小豆、大納言、小豆、ささげ等のマメ科アズキ属に属するものであれば特に制限されない。
【００１９】
本発明の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤、予防・治療剤、サプリメント、食品添加物、又は飼料添加物の剤型としては、粉剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤などを挙げることができ、通常経口的に投与される。また、これらの剤型は、従来から知られている通常の製剤方法で製造することができる。例えば、製剤の製造上許可される担体、賦形剤、香料、乳化剤、防腐剤、分散剤等と混合して成型する。また、必要に応じてさらに他の有効成分を配合することもできる。上記賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、セルロース、メチルセルロース、澱粉などがあげられる。
【００２０】
本発明の寿命延長又は老化防止のための食品の製法としては、本発明の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を食品又は食品素材に配合することにより製造することができる。例えば、小豆を細断したもの、あるいは、その乾燥物、小豆を液状にしたもの（ピューレ、ジュース等）、あるいはその乾燥物、小豆を粉末化したものを、製造工程又は製造後に食品や食品素材に添加・配合する方法を挙げることができる。また、上記食品又は食品素材としては、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、ラムネ菓子等などの錠菓、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類や、クラッカー、チップス等のスナック類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、チーズ、バターなどの乳製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ、スープ、シチュー等の各種総菜や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料などを具体的に例示することができる。
【００２１】
本発明の寿命延長又は老化防止のための飼料の製法としては、本発明の転写因子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の活性化剤を飼料又は飼料素材に配合することにより製造することができる。例えば、小豆を細断したもの、あるいは、その乾燥物、小豆を液状にしたもの（ピューレ、ジュース等）、あるいはその乾燥物、小豆を粉末化したものを、ブタ、ウシ、ニワトリ等の家畜・家禽用や、イヌ、ネコ等のペット用、養殖魚介類用の飼料又は飼料素材に製造工程又は製造後に添加・配合する方法を挙げることができる。
【実施例１】
【００２２】
小豆エキスの製造方法：
小豆２００ｇに水２５００ｍｌを加え２時間煮た後、煮汁を熱水抽出物として得、不溶物を濾過により取り除き、上清をスプレードライして試験用サンプルとした。
【００２３】
試料の調製：
試験用サンプルを滅菌水に溶解して、φ０．４５μｍフィルターでろ過滅菌を行った。終濃度が０μｇ／ｍｌ（コントロール）、１５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌとなるよう添加した。
【００２４】
培地及び緩衝液の調製：
１）Ｍ９バッファー組成１０００ｍｌ当たり
Ｎａ２ＨＰＯ４  ６０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ３０ｇ、ＮａＣｌ  ５０ｇ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  １ｍｌ、２％ゼラチン  １０ｍｌをイオン交換水１０００ｍｌに溶かし、１２１℃、２０分間滅菌。
２）Ｓ−Ｂａｓａｌバッファー組成１０００ｍｌ当たり
ＮａＣｌ  ５．８４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ６．８１ｇを、イオン交換数１０００ｍｌに溶解し、１２１℃、２０分間滅菌した。液温が６０℃程度になるまで放冷し、コレステロール／エタノール（５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加えた。
３）ＮＧＭ（Nematode growth medium）培地１０００ｍｌ当たり
ポリペプトン  ２．５ｇ、ＮａＣｌ  ３．０ｇ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  １ｍｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２  １ｍｌ、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．０）  ２５ｍｌ、コレステロール（５ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、寒天  １７．０ｇをイオン交換水９７２ｍｌに溶かし、１２１℃、２０分間滅菌。
４）Ｓ−液体培地１０００ｍｌ当たり
Ｓ−Ｂａｓａｌ  １Ｌ、１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．０）  １０ｍｌ、１Ｍ  ＣａＣｌ２  ３ｍｌ、１Ｍ  ＭｇＳＯ４  ３ｍｌ、Trace metal solution  １０ｍｌ（全て滅菌済みのものを使用）
５）Trace metal solution組成（１０００ｍｌ当たり）
ＥＤＴＡ・２Ｎａ  １．８６ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６９ｇ、ＭｎＣｌ２・４  Ｈ２Ｏ  ０．２０ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２９ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０２５ｇをイオン交換水１０００ｍｌに溶かし、１２１℃、２０分間滅菌。
【００２５】
C.elegansの培養方法：
ＮＧＭ培地上でEscherichia coli  OP50株（以下「ＯＰ５０」という）を１２〜１６時間培養後、C.elegansを植え継ぎ２０±２℃で飼育した。
【００２６】
寿命試験方法：
寿命試験を行うために、孵化が同じ日であるC.elegansが必要であり、このようなC.elegansを得るために同調培養を行った。具体的には、C.elegansを上記培養方法にて大量飼育し、ＮＧＭ培地から卵を抱えた線虫を、Ｍ９バッファーを用いて回収し、１５ｍｌ遠心管に移した。５〜１０分間静置し、遠心管の底に沈んだ線虫を残すように上清を除いた。新たにＭ９バッファーを１ｍｌ加え軽くピペッティングしながら混合し、１．５ｍｌマイクロチューブに移した。５分間静置し、チューブの底に沈んだ線虫を残すように上清を除いた。新たにＭ９バッファーを１ｍｌ加え、更に２６６μｌの次亜塩素酸ナトリウム、１３３μｌのＮａＯＨを加え、室温で約４〜４．５分間激しく転倒混合した。線虫が溶解しているのを確認し、８００ｇ、４℃の条件で５分間遠心分離し、卵を集めた。上清を捨て１．４ｍｌのＭ９バッファーを加え、８００ｇ、４℃の条件で５分間遠心分離する同様の操作を５回行い洗浄した。上清を捨て回収した卵に新たに１ｍｌのＳ−ｂａｓａｌバッファーを加えよく混合し、ピペットマンを用いて、混合液をＯＰ５０の塗布していないＮＧＭ培地に撒き、２０℃で、一晩静置して、孵化させた。孵化してきた幼虫を集め、さらにＯＰ５０を塗布したＮＧＭ培地上に移し、２４時間飼育し、同調培養とした。
【００２７】
線虫生存率の測定：
同調培養後群分けを行い各群に３０匹のC.elegansが入るようにした。使用する培地はＳ−液体培地にＯＰ５０と５−フルオロ−２′−デオキシウリジン（終濃度０．０４ｍＭ）、試験サンプルを添加したものを使用し、以後、マイクロピペットを用いて一日おきに新たに調製した同培地へ生存しているC.elegansを移動した。移動の際、生存しているC.elegans数をカウントした。培養初日の生存C.elegans数３０匹から、培養日数ごとに何割のC.elegansが生存し続けているかを計算し線虫生存率とした。試験は、実験の再現性を高めるため、同一試験サンプルにそれぞれ３群のC.elegansを用いた。尚、５−フルオロ−２′−デオキシウリジンは、ＤＮＡ合成阻害剤であり、寿命試験中に次世代のC.elegansが混入し生存しているC.elegans数が正しくカウントできなくなるのを防ぐための薬剤である。
【００２８】
線虫生存率の測定を行った結果（表１、図１）、コントロールに比べ小豆エキス摂取群の寿命が延長していた。また、小豆エキス摂取群は寿命延長効果のあるとされているレスベラトロールやスペルミジンに比べ寿命延長効果が高いことが分かった。さらに小豆エキスは濃度依存的に寿命を延長する傾向がみられた。
【００２９】
【表１】
2013253031.tif 000002
【実施例２】
【００３０】
遺伝子発現量解析：
次により詳しく調べるためコントロールと小豆エキス５０μｇ／ｍｌ摂取群のｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の遺伝子発現量解析を行うこととした。
同調培養が終了した線虫を、培養液と共に５０ｍｌ遠心管に移した。室温で数分放置し、遠心管の底に線虫を沈殿させた。上清を除去し、１群当たり、線虫匹数５，０００匹程度となるように群分けを行った。線虫を培養する培地は、Ｓ−液体培地にＯＰ５０と５−フルオロ−２′−デオキシウリジンを添加したものを用いた。７５ｃｍ２滅菌フラスコに、上記培地を２０ｍｌ加え、群分けした線虫を加えた。緩やかに混合し、２０℃±２のインキュベーター内に静置し、培養を開始した。その後、２日毎に培地の交換を行い、４日培養後、８日培養後に線虫を回収し、遺伝子発現解析用サンプルとした。遺伝子発現解析用サンプルからのtotal ＲＮＡの抽出は、乳鉢を用い液体窒素下で入念に線虫をすり潰し、QIAGEN RNeasy Midi/Maxi Handbook. Midi Kitを用いて行った。抽出したtotalＲＮＡをエタノール沈殿し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分）を行った。ピペットで上清を除去し、更に完全にエタノールを除くために、１０分間真空乾燥を行った。その後、１００μｌのRNase Free waterでtotalＲＮＡを溶解し、水で１０倍希釈を行ってから、２６０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度から、totalＲＮＡ量の計算を行った。計算値から、１μｇＲＮＡ／μｌとなるように濃度調製した。逆転写反応を用い、totalＲＮＡからｃＤＮＡを合成するため、滅菌済みマイクロチューブにtotalＲＮＡ溶液５μｌ（totalＲＮＡ重量として５μｇ）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー１μｌ（０．５μｌ／ｍｌ）及び、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌ、RNase Free Waterを６μｌ加えタッピングし、よく混合した。６５℃に設定した湯浴で５分加温後、氷上に１分間放置した。５×First Strand Buffer ４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μｌ、を加え混合し、Superscript(R)III  Reverse Transcriptase １μｌを加え５０℃で１時間酵素反応させた。その後、７０℃に設定した湯浴で１５分加温し、酵素反応を停止した。溶液が冷却した事を確認し、エタノール沈殿を行った。遠心分離後上清を捨て、真空乾燥機にて残ったエタノールを完全に揮発させ、精製ｃＤＮＡを得た。精製ｃＤＮＡを滅菌水で溶解し２６０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の値から算出したｃＤＮＡ量から、リアルタイムＰＣＲ時の検量線として、０．０００１μｇ／μｌ、０．００１μｇ／μｌ、０．０１μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌとそれぞれなるように濃度調整を行い、サンプルは０．０１μｇ／μｌとなるように調整した。リアルタイムＰＣＲ用９６穴プレート１穴当たり、上記濃度のｃＤＮＡ  １０μｌ、SYBR Green  １２．５μｌ、プライマー（Ｌ:tggaattcaatcgtgtggaa，配列番号１）０．１μｌ  、プライマー（Ｒ:atgaatatgctgccctccag，配列番号２）０．１μｌ、滅菌水  ２．３μｌを添加した。プライマーは、ＫＥＧＧ（http://www.genome.jp/kegg/）にて、遺伝子配列を検索し、Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/）を用いてプライマーをピックアップした。SIGMA-ALDRICHカスタムオリゴＤＮＡによるプライマー合成を行った。リアルタイムＰＣＲ条件は表２の条件で行った。
【００３１】
先の寿命延長効果のあった小豆エキスを摂取した線虫の遺伝子発現量解析を行った。その結果、抗老化関連遺伝子であるｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１の遺伝子発現量が増加することが認められた（表３、図２）。これらの結果から、小豆エキス摂取することは抗老化関連遺伝子ｄａｆ−１６／ＦＯＸＯ１遺伝子の発現量を促進し、抗老化効果をもたらしたものであると考えられる。
【００３２】
【表２】
2013253031.tif 000003
【図１】
2013253031.tif 000004
【図２】
2013253031.tif 000005
【図３】
2013253031.tif 000006
【配列表】
2013253031000001.app