(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるＶＬ鎖およびＶＨ鎖から構成されるトロポニンＩ結合タンパク質であり、前記結合タンパク質の分子形態が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖであるトロポニン結合蛋白質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列でコードされるＶＬ鎖とＶＨ鎖配列を含む、トロポニンＩ結合タンパク質。
ＶＬ鎖配列（配列番号：５６）：
DVVLTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFNGDGDGTDFTLDISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLEIKR
ＶＨ鎖配列（配列番号：５７）：
QLQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMNWVKQRPEQGLEWIGWIDPANGDTAYAPRFQVKATMTADKSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNADLPMDQWGQGTSVTVSS
【請求項２】
請求項１に記載の結合タンパク質の分子形態が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖからなることを特徴とするトロポニンＩ結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロポニンＩに結合する組み換えタンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞は医学的突発事故の代表であり、世界的に死亡および心臓血管罹病の主な原因である。血管形成術などの新しい治療手段により、冠動脈循環を迅速に回復させることが可能になり、梗塞領域の大きさを制限し、死亡率および罹病率を低下させることが可能になった。これらの治療器具は、臨床的発現開始後のより早い時期に用いられるほど、より有効である。トロポニンは、トロポニンＣ、ＩおよびＴの３種類のタンパク質からなる筋原線維タンパク質複合体である。心臓トロポニンＩは、心筋にのみ存在する収縮タンパク質である。その生理学的役割は、カルシウムの不在下、アクチン−ミオシン複合体のＡＴＰａｓｅ活性を阻害することであり、筋肉収縮を予防することである。心臓を供給する動脈（冠動脈）の１つの閉塞による梗塞の間、虚血に続いて、心筋壊死が出現し、心筋細胞の破壊および心臓トロポニンＩの血液中への放出を生じる。したがって、トロポニンＩは、心筋梗塞に対して非常に特異的であるマーカーであり、トロポニンＩのアッセイは、近年、心筋梗塞の早期診断のために推奨されている。非特許文献１および非特許文献２は、心筋由来トロポニンＩの濃度が、急性心筋梗塞に罹患した患者の血液中で急速に高くなることを開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Aleksei G. Katrukha et. al., "Troponin I is released in bloodstream of patients with acute myocardial infarction not in free form but as complex", Clinical Chemistry, Vol. 43, Issue 8, p.p. 1379-1385 (1997)
【非特許文献２】Till Keller et. al.,."Sensitive Troponin I Assay in Early Diagnosis of Acute Myocardinal Infarction", The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE, Vol. 361, pages 868-877 (2009)
【非特許文献３】Jun Kamishikiryo et. al., "Molecular Basis for LLT1 Protein Recognition by Human CD161 Protein (NKRP1A/KLRB1)", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL. 286, NO. 27, p.p. 23823-23830.
【非特許文献４】G.Kohler et al., Nature, 256, 495(1975)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる組み換えタンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は上記の課題を解決するものであり、以下のアミノ酸配列でコードされるＶＬ鎖とＶＨ鎖配列を含む、トロポニンＩ結合タンパク質であることを特徴とし、
ＶＬ鎖配列（配列番号：５６）：
ＤＶＶＬＴＱＳＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤ
ＲＦＮＧＤＧＤＧＴＤＦＴＬＤＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲ
ＶＨ鎖配列（配列番号：５７）：
ＱＬＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＳＧＡＳＶＫＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＤＹＹＭＮＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＷＩＤＰＡＮＧＤＴＡＹＡＰＲＦＱ
ＶＫＡＴＭＴＡＤＫＳＳＮＴＡＹＬＱＬＳＳＬＴＳＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＤＬＰＭＤＱＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
また、前記結合タンパク質の形態は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖからなることを特徴とする組み換えタンパク質である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、心筋梗塞特異的なマーカーであるトロポニンＩの測定のために、有用なトロポニンＩ結合タンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】抗体の模式図
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書で用いる用語を説明する。図１は、抗体を示す。広く知られているように、抗体１は「Ｙ」文字の形状を有する。抗体１は２つのＦａｂ領域および１つのＦｃ領域からなる。抗体１は、２本の重鎖２および２本の軽鎖３からなる。各重鎖２は、重鎖定常領域１（２２）、重鎖定常領域２（２３）、重鎖定常領域３（２４）、および重鎖可変領域２１からなる。各軽鎖３は、軽鎖可変領域３１および軽鎖定常領域３２からなる。各Ｆａｂ領域は、１つの重鎖可変領域２１、１つの重鎖定常領域１（２２）、１つの軽鎖可変領域３１、および１つの軽鎖定常領域３２からなる。軽鎖３はリンカ４により重鎖２に連結されている。重鎖２は先端に１つの重鎖可変領域２１を有している。軽鎖３は先端に１つの軽鎖可変領域３１を有している。抗体１には抗原が特異的に結合する。より詳細には、抗原は重鎖可変領域２１および軽鎖可変領域３１からなるＦｖ領域に特異的に結合する。本明細書においては、抗原はヒト心筋由来のトロポニンＩである。
【０００９】
本実施形態に係る組み換えタンパク質は、配列番号：５６によって表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域３１および配列番号：５７によって表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域２１を具備する。本組み換えタンパク質は、ヒト心筋由来のトロポニンＩに特異的にかつ速やかに結合する。
【００１０】
本組み換えタンパク質は、抗体または抗体フラグメントのいずれかである。
【００１１】
抗体は、図１に示される「Ｙ」文字状の形状を有する。抗体に含まれる軽鎖可変領域３１および重鎖可変領域２１は、それぞれ、配列番号：５６および配列番号：５７によって表されるアミノ酸配列からなる。図１に示されるように、抗体において、軽鎖可変領域３１は重鎖可変領域２１にリンカ４を介して連結している。
【００１２】
抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【００１３】
Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つのＦａｂ領域からなる。言い換えれば、Ｆａｂ抗体フラグメントは、１つの軽鎖可変領域３１（配列番号：５６）、１つの重鎖可変領域２１（配列番号：５７）、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（２２）、およびリンカ４からなる。軽鎖定常領域３２は、リンカ４を介して重鎖定常領域１（２２）に連結している。
【００１４】
Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメントは、２つのＦａｂ領域からなる。上記の通り、各Ｆａｂ領域は、１つの軽鎖可変領域３１（配列番号：５６）、１つの重鎖可変領域２１（配列番号：５７）、１つの軽鎖定常領域３２、１つの重鎖定常領域１（２２）、およびリンカ４からなる。これらの２つのＦａｂ領域は、他のリンカを介して互いに連結されている。好ましくは、一方の重鎖定常領域１（２２）が、他のリンカを介して他方の重鎖定常領域１（２２）に連結している。
【００１５】
ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、軽鎖可変領域３１（配列番号：５６）、重鎖可変領域２１（配列番号：５７）、およびリンカからなる。軽鎖可変領域３１（配列番号：５６）は、リンカ（図示せず）を介して重鎖可変領域２１（配列番号：５７）に連結している。
【００１６】
組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、リンカは特に限定されない。リンカの例は５〜２０のアミノ酸からなるペプチドである。より具体的なリンカの例として、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：５８）により表されるアミノ酸配列がある。
【００１７】
組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、軽鎖可変領域３１（配列番号：５６）のＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。Ｃ末端もまた、修飾され得る。
【００１８】
組み換えタンパク質がヒト心筋由来トロポニンＩに特異的かつ速やかに結合できる限り、重鎖可変領域２１（配列番号：５７）のＮ末端はアミノ酸配列によって修飾され得る。Ｃ末端もまた、修飾され得る。重鎖可変領域２１（配列番号：５７）のＣ末端を修飾するアミノ酸配列の例は、ＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号：５９）である。
【００１９】
本組み換えタンパク質は、一般的なタンパク質発現技術を用いて産生され得る。より具体的には、まず、本組み換えタンパク質をコードする遺伝子配列を具備するベクターを用意する。ベクターの例は、プラスミドである。次に、このベクターを用いて細胞（例えば、大腸菌）が形質転換される。この細胞は培養され、本組み換えタンパク質を産生する。
【００２０】
ｓｃＦｖ抗体フラグメントを効率的に得るためには、本組み換えタンパク質は、リフォールディング法により産生されることが好ましい。非特許文献３は、リフォールディング法を開示している。
【００２１】
（実施例）
本実施例では、ヒト心筋由来のトロポニンＩに結合し得るｓｃＦｖ抗体分子を作製するために以下の工程を行った。
【００２２】
表１、表２、表３、および表４は、実施例１において用いられたプライマーを示す。  
【００２３】
表１は、軽鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー１〜２１、配列番号：０１〜配列番号：２１）を示す。
【００２４】
表２は、重鎖可変領域を増幅させるためのフォワードミックスプライマー（プライマー２２〜４４、配列番号：２２〜配列番号：４４）を示す。
【００２５】
表３は、軽鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー４５〜４９、配列番号：４５〜配列番号：４９）を示す。
【００２６】
表４は、重鎖可変領域を増幅させるためのリバースミックスプライマー（プライマー５０〜５５、配列番号：５０〜配列番号：５５）を示す。
【００２７】
【表１】
2013177338.tif 000002
【００２８】
【表２】
2013177338.tif 000003
【００２９】
【表３】
2013177338.tif 000004
【００３０】
【表４】
2013177338.tif 000005
【００３１】
（１）トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能なハイブリドーマ（マウス脾臓由来）の調製
下記配列のヒト心筋由来のトロポニンＩに含有されるポリペプチド（シグマアルドリッチジャパン株式会社から購入）をsulfo-SMCCクロスリンカー（サーボフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）を用いて、ヒト血清アルブミン（シグマ・アルドリッチから購入）に連結した。
【００３２】
トロポニンＩポリペプチド：
RPAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKKKSKISASRKLQLKTLLLQIAK（配列番号：６１）
sulfo-SMCCクロスリンカー（０．５ｍｇ）を１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、第１水溶液とした。この第１水溶液を５０℃の温度下で１０分、放置した。
【００３３】
ヒト血清アルブミン（１０ｍｇ）を１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、第２水溶液とした。第１水溶液と第２水溶液を混合し、３０分間、静置することでヒト血清アルブミンsulfo-SMCCクロスリンカーを結合した。この混合物からの未反応のsulfo-SMCCクロスリンカーの除去は、カラム（ＧＥヘルスケアより商品名：ＰＤ１０として入手）を用いて行った。
【００３４】
上記ポリペプチド１．５ｍｇをジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯという）で溶解し、sulfo-SMCCクロスリンカーを結合したヒト血清アルブミン１ｍＬ（２ｍｇ／ｍｌ）に添加した。これを一晩、放置し、ヒト血清アルブミンにsulfo-SMCCクロスリンカーを介して、ポリペプチドを修飾した。以下、このヒト血清アルブミンは「トロポニン修飾ＨＳＡ」という。
【００３５】
完全フロイトアジュバント（和光純薬工業株式会社から購入）およびトロポニン修飾ＨＳＡを混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（アルビノマウスの一種）に注入した。ＢＡＬＢ／ｃマウスとは、アルビノマウスの一種である。
【００３６】
２週間後、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という）およびトロポニン修飾ＨＳＡの混合物をＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。さらにこれを繰り返した。このように、トロポニン修飾ＨＳＡにより免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスを得た。免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓が摘出された。非特許文献４に記載された細胞融合法に従って、ハイブリドーマを得た。その後、ハイブリドーマは培養液中で培養された。培養の後のハイブリドーマ（細胞）の数は、およそ５×１０6であった。このようにして得られたハイブリドーマは、ヒト心筋由来トロポニンＩに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生可能であった。
【００３７】
（２）  ハイブリドーマ細胞からの全マウスＲＮＡの抽出
培養したハイブリドーマ培養液に１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン株式会社より入手）を添加し、充分に攪拌した。次に、０．２ｍＬのクロロホルム液（純度：９９．９％）を添加し、充分に攪拌した。この培養液を１１７６００ｍ／ｓ2の重力加速度で、４℃下、１５分間、遠心分離を行い、上清（５００μＬ）を得た。この上清にイソプロパノール（５００μＬ）を添加し、室温下、１０分間、静置した。これを再度、同条件で遠心分離を行い、ＲＮＡの沈殿物を得た。沈殿物に７５％エタノール水溶液（１ｍＬ）を添加し、再度、７３５００ｍ／ｓ2の重力加速度で、５分間、遠心分離を行った。上清を除去した後、沈殿物を乾燥し全マウスＲＮＡを得た。
【００３８】
（３）  全マウスＲＮＡからのｍＲＮＡの抽出
ＯｌｉｇｏｔｅｘTM−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （タカラバイオ株式会社から購入）を用いて、工程（２）において得られた全マウスＲＮＡからｍＲＮＡの抽出を行った。方法はキットプロトコルに従って行った。
【００３９】
（４）  ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写
得られたｍＲＮＡを、逆転写酵素（商品名：Ｐｒｉｍｅｒｓｒｉｐｔ、タカラバイオ株式会社から購入）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡを含む溶液を得た。
【００４０】
（５）  ｃＤＮＡを用いた、軽鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡから、フォワードプライマー１〜２１、およびリバースプライマー１〜５を用いて、抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片（以下、「ＶＬ遺伝子断片」という）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲに用いたポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ株式会社から購入）を用いた。ＰＣＲ反応の温度サイクルは、９６℃で３０秒間、５２℃で１分間、６８℃にて１分間を３５回繰り返し、さらに、６８℃にて４分間とした。
【００４１】
ＶＬ遺伝子断片の確認および精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供した。
【００４２】
（６）  ｃＤＮＡを用いた、重鎖可変領域をコードする遺伝子の増幅
溶液に含まれるｃＤＮＡ、フォワードプライマー２２〜４４、およびリバースプライマー６〜１１を用いて、抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片（以下、「ＶＨ遺伝子断片」という）を増幅した。ＰＣＲ法のプロトコールは、ＶＬ遺伝子断片のプロトコールと同一とした。
【００４３】
ＶＨ遺伝子断片の確認および精製のために、得られたＰＣＲ溶液は、２重量％の濃度を有するアガロースを含有するゲルを用いた電気泳動に供された。
【００４４】
（７）  ＶＬ遺伝子断片およびＶＨ遺伝子断片の連結
精製されたＶＨ遺伝子断片は、精製されたＶＬ遺伝子断片にオーバーラップエクステンションＰＣＲ法によって連結された。このようにして、上記モノクローナル抗体のｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子断片（以下、「ｓｃＦＶ遺伝子断片」という）を得た。得られたｓｃＦｖ遺伝子フラグメンの５末端および３末端は、制限酵素サイトＮｃｏ１およびＮｏｔ１によって修飾されていた。
【００４５】
（８）  遺伝子のベクターへの導入
ｓｃＦｖ遺伝子断片のタンパク質発現用ベクター（商品名：ｐＥＴ２２ｂ（＋）、タカラバイオ株式会社より購入）への組換えを行った。ｓｃＦｖ遺伝子断片およびタンパク質発現用ベクターをそれぞれ、制限酵素Ｎｃｏ１およびＮｏｔ１（いずれもタカラバイオ株式会社より購入）によって制限酵素処理した。これらを電気泳動により分離、精製し、ｓｃＦｖ遺伝子断片およびタンパク質発現用ベクターを含有する水溶液をそれぞれ得た。ｓｃＦｖ遺伝子断片およびタンパク質発現用ベクターを混合し、ライゲース（東洋紡株式会社より商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２として購入）を添加した後、１６℃下で２時間インキュベーションすることで、ｓｃＦｖ遺伝子断片とタンパク質発現用ベクターの連結反応を行った。
【００４６】
scFV遺伝子断片を組換えたタンパク質発現用ベクターを大腸菌（商品名：ＤＨ５αコンピテントセル、タカラバイオ株式会社より入手）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート培地上に塗布し、１６時間、インキュベートした。インキュベートの後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーをピックアップし、シークエンスによりベクター配列の確認を行った。さらに、ｐＥＴ２２ｂ（＋）のシグナル配列を除くことでｓｃＦＶ遺伝子フラグメントおよびＣ末配列の修飾配列以外の不要な配列を除去し、ｓｃＦｖ抗体フラグメントのアミノ酸配列（配列番号：６０）を含むベクター発現ベクターを得た。
【００４７】
（９）  ベクターを用いた蛋白質の取得
（８）で得たベクターを用いて、大腸菌（タカラバイオ株式会社より購入、商品名：ＢＬ２１（ＤＥ３））が形質転換した。この大腸菌を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレート培地に塗布し、３７℃下、１６時間インキュベートした。インキュベート後、ＬＢプレート培地上に形成されたシングルコロニーをピックアップし、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（５００ｍＬ）を含有するＬＢ液体培地での培養を行った。波長６００nmでの吸光度が０．５になるまで大腸菌を培養した後、終濃度1mＭとなるようにイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加した。その後、３７℃の温度下で５時間、振盪しながらインキュベートした。このように得られた大腸菌培養液を、４９０００ｍ／ｓ2の重力加速度、４℃の温度下、５分間、遠心分離し、大腸菌の沈殿を回収した。この沈殿をリン酸緩衝生理食塩水（５０ｍＬ）に再度懸濁し、超音波処理により大腸菌を破砕した。破砕された大腸菌を含有する溶液を、９８０００ｍ／ｓ2の重力加速度、４℃、３０分間、遠心分離して沈殿物を回収した。この沈殿物を、４％ＴｒｉｔｏｎX-100（和光純薬工業株式会社）を含有するリン酸緩衝生理食塩水を用いて２回洗浄し、さらに、界面活性剤を含有しないリン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄した。この沈殿物に、表５に示される試薬を含有する水溶液Ａ（１０ｍＬ）を添加し、４℃で１８時間インキュベートすることで沈殿物を溶解した。この溶解物を、０．４５μｍのフィルター（Sartoriusより入手、商品名：Minisart）に通し残渣を除去した。この溶解物１ｍＬに表６に示される試薬を含有する水溶液Ｂ（２ｍＬ）を滴下し、３ｍLの水溶液を得た。
【００４８】
【表５】
2013177338.tif 000006
【００４９】
【表６】
2013177338.tif 000007
【００５０】
この水溶液（３ｍＬ）を１Ｌの水溶液Ｂに滴下し、４℃の温度下で９６時間、攪拌することでｓｃＦｖ抗体フラグメント溶液を得た。
【００５１】
続いて、濾過ユニット（VIVAFLOW50、Sartoriusより入手）を用いて、ｓｃＦｖ抗体フラグメント溶液は１０ｍＬまで濃縮し、カラム（商品名：HiLoad 26/60 Superdex 75 pg、ＧＥヘルスケア社製）を用いて、溶液に含まれるｓｃＦｖ抗体フラグメントを精製した。
【００５２】
ｓｃＦｖ抗体フラグメントのアミノ酸配列（配列番号：６０）の詳細を以下に記述する。
ｓｃＦｖ抗体フラグメントのアミノ酸配列（配列番号：６０）：
DVVLTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFNGDGDGTDFTLDISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQLQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMNWVKQRPEQGLEWIGWIDPANGDTAYAPRFQVKATMTADKSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNADLPMDQWGQGTSVTVSSAAALEHHHHHH
軽鎖可変領域（配列番号：５６）：
DVVLTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFNGDGDGTDFTLDISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPLTFGAGTKLEIKR
リンカ（配列番号：５８）：
GGGGSGGGGSGGGGS
重鎖可変領域（配列番号：５７）：
QLQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMNWVKQRPEQGLEWIGWIDPANGDTAYAPRFQVKATMTADKSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNADLPMDQWGQGTSVTVSS
重鎖可変領域のＣ末端に修飾されたアミノ酸配列：AAALEHHHHHH（配列番号：５９）
（１０）  ｓｃＦｖ抗体フラグメントのアフィニティ測定
分子間相互作用解析装置Biacore 3000（ＧＥヘルスケア社より購入）を用いて、ｓｃＦｖ抗体フラグメントのアフィニティ測定を行った。
【００５３】
測定用センサチップにはＣＭ５を用いた。ヒト心筋由来のトロポニンＩ（フナコシ）をアミドカップリング法にて約１０００ＲＵをＣＭ５チップ上に固定化させ、Biacore3000に設置した。ｓｃＦｖ抗体フラグメントをＨＢＳ−ＥＰにて８４ｎＭ，４２ｎＭ，２１ｎＭ，１０．５ｎＭ，５．２５nＭに希釈し、アナライト溶液とした。ランニングバッファーにＨＢＳ−ＥＰを用い、流速３０μｌ／ｍｉｎ、結合時間１８０秒、解離時間１８０秒にて結合実験を行った。また、再生溶液には、ｐＨ２．０のグリシン溶液を用いた。得られたセンサグラムをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア）  にて解析した結果、ｓｃＦｖ抗体のアフィニティ（ＫＤ（Ｍ）＝８．８Ｅ−９）が決定された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明のトロポニンＩ抗体分子は、トロポニンＩ検出に係る測定装置、測定キットへの応用が可能であり有用である。
【符号の説明】
【００５５】
１：抗体
２：重鎖
２１：重鎖可変領域
２２：重鎖定常領域１
２３：重鎖定常領域２
２４：重鎖定常領域３
３：軽鎖
３１：軽鎖可変領域
３２：軽鎖定常領域
４：リンカ
【図１】
2013177338.tif 000008
【配列表】
2013177338000001.app