(57)【要約】【課題】本発明は、血管新生抑制効果を有するタンパク質及びペプチドの提供、並びに、癌細胞の増殖を抑制するペプチドの提供を目的とする。【解決手段】  本発明は、Ｓ１００Ａ１２又はＳ１００Ａ１２の部分ペプチドを含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤、並びに、Ｓ１００Ａ１２又はＳ１００Ａ１２の部分ペプチドをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターを含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤を提供することにより課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１００Ａ１２タンパク質及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
Ｓ１００Ａ１２タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクター及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチド及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤。
（ａ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するペプチド
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチドをコードする核酸を含む組換えベクター及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞胞増殖抑制剤。
（ａ）配列番号７、配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号７、配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するペプチド
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の血管新生抑制及び細胞胞増殖抑制剤を含んでなる血管新生に起因する疾患の治療剤。
【請求項６】
前記血管新生に起因する疾患が、糖尿病性血管障害、加齢黄斑変性症、尋常性乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、角膜血管新生である請求項５に記載の治療剤。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の血管新生抑制及び細胞胞増殖抑制剤を含んでなる抗癌剤。
【請求項８】
前記癌が、肺癌、悪性中皮腫、胃癌又は膵臓癌である請求項８に記載の抗癌剤。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチド。
（ａ）配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生及び細胞増殖の抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は日本人の死因の約３割を占めており新規の癌治療法の開発は社会的に望まれている。これまでに、多くの抗癌剤が研究開発され、癌治療の進展に貢献してきた。ただ、癌あるいは腫瘍といっても、その種類は多様で、腫瘍毎に有効な薬剤が異なると言っても過言ではない。そのため、今後も癌の治療に有効な治療法及び治療剤の開発は不可欠である。
近年、癌あるいは腫瘍の治療と関連して、Ｓ１００タンパク質ファミリーが注目されている。Ｓ１００タンパク質は、ＥＦハンドモチーフを持つカルシウムイオン結合タンパク質で、２０種類以上のファミリーから構成されている。Ｓ１００タンパク質は、細胞内において、カルシウムイオンの恒常性の維持、細胞増殖、分化やアポトーシスの調節に関連して機能していることが知られている。また、急性、慢性のアレルギー性炎症部位においてその発現が確認されており、肥満細胞や単球などを誘引することも報告されている（非特許文献１）。
Ｓ１００ファミリータンパク質は、二価の陽イオン（カルシウム、亜鉛、銅イオン）と結合し、ダイマー化することで、生理活性に重要な役割を果たしていると考えられている。当初、Ｓ１００タンパク質は、ＲＡＧＥ（Receptor for advanced glycation end products）に結合するものとして同定されたが、近年、一部のＳ１００ファミリータンパク質の中には、ＲＡＧＥと相互作用しないことが示唆されているものも存在する。
【０００３】
Ｓ１００タンパク質ファミリーの一員であるＳ１００Ａ１２  （ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ｃ，  ＥＮ−ＲＡＧＥ）は、ヘリックスループヘリックスのカルシウムイオン結合のＥＦハンドモチーフを持ち（非特許文献２）、ＲＡＧＥのＣドメインと相互作用するＲＡＧＥリガンドとして知られている（非特許文献３）。Ｓ１００Ａ１２のＲＡＧＥ結合ドメインは、アンフォテリンのＲＡＧＥ結合ドメイン（アミノ酸１５３−１８０残基）と類似たアミノ酸配列を持つ（非特許文献４）。また、Ｓ１００Ａ１２は、ホモダイマーとして存在し、カルシウムイオンや亜鉛イオン存在下ではテトラマー、ヘキサマー化することが知られている。生体内において、Ｓ１００Ａ１２は、分裂能のない好中球に多く存在し、全細胞質タンパク質の約５％を占めている。特に急性、慢性のアレルギー性炎症部位において発現が見られる。
これまでに、発明者らは、Ｓ１００Ａ１２がＬＫ−２ヒト肺癌細胞の増殖及び遊走能を抑制することを明かにしており（非特許文献５）、抗癌剤の開発を行う上で、Ｓ１００Ａ１２の癌細胞増殖抑制作用を有する因子としての有用性に期待が集まっている。
しかしながら、Ｓ１００Ａ１２の細胞、あるいは、生体に及ぼす影響の詳細については、不明な部分が多く残されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｙａｎら，（２００８）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３，１３０３５−１３０４３
【非特許文献２】Ｄｅｌｌａｎｇｅｌｉｃａら，（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９，２８９２９−２８９３６
【非特許文献３】Ｘｉｅら，（２００７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８２，４２１８−４２３１
【非特許文献４】Ｈｅｉｚｍａｎｎら，（１９９８）  Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ  １１，３８３−３９７
【非特許文献５】日本癌転移学会１９回大会  要旨集（ｐ．４２）金沢  ２０１０年６月１６日〜１７日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明者らは、Ｓ１００Ａ１２が血管新生抑制効果をも有することを、初めて見出した。さらに、Ｓ１００Ａ１２に由来するペプチドが癌細胞増殖抑制効果及び血管新生抑制効果を併せもつことを明かにした。
そこで、本発明は、癌細胞の増殖を抑制するペプチドの提供を目的とする。
さらに、本発明は、血管新生抑制効果を有するタンパク質及びペプチドの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願の発明者らは、Ｓ１００Ａ１２由来のペプチド（配列番号７、配列番号９及び配列番号１０）が、肺癌細胞、悪性中皮腫細胞、胃癌細胞の増殖を有意に抑制することを見出した。
さらに、発明者らは、Ｓ１００Ａ１２及びＳ１００Ａ１２由来のペプチドがヒト血管内皮細胞の増殖を抑制すること、及び血管新生促進因子であるＶＥＧＦによる血管内皮細胞の増殖促進効果を有意に抑制すること、さらに、血管内皮細胞の遊走能、管腔形成能を阻害することを見出した。
以上の知見に基づいて、本発明は完成されるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）に関するものである。
（１）Ｓ１００Ａ１２タンパク質及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤。
（２）Ｓ１００Ａ１２タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクター及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤。
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチド及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤。
（ａ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するペプチド
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチドをコードする核酸を含む組換えベクター及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞胞増殖抑制剤。
（ａ）配列番号７、配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号７、配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するペプチド
（５）上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の血管新生抑制及び細胞胞増殖抑制剤を含んでなる血管新生に起因する疾患の治療剤。
（６）前記血管新生に起因する疾患が、糖尿病性血管障害、加齢黄斑変性症、尋常性乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、角膜血管新生である上記（５）に記載の治療剤。
（７）上記（３）又は（４）に記載の血管新生抑制及び細胞胞増殖抑制剤を含んでなる抗癌剤。
（８）前記癌が、肺癌、悪性中皮腫、胃癌又は膵臓癌である上記（７）に記載の抗癌剤。
（９）以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるペプチド。
（ａ）配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列万能９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するペプチド
【発明の効果】
【０００８】
本発明で開示されるＳ１００Ａ１２由来のペプチドを含んでなる薬剤を用いることで、癌の治療、特に、肺癌、悪性中皮腫、胃癌の治療を効果的に行うことができる。
【０００９】
本発明のＳ１００Ａ１２及びＳ１００Ａ１２由来のペプチドを含んでなる薬剤を用いることで、血管新生を抑制することができる。さらには、血管新生の亢進に起因する疾患、例えば、糖尿病性血管障害（網膜症）、加齢黄斑変性症、癌、尋常性乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、角膜血管新生の治療を効果的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒト肺癌細胞（ＬＫ２）及びヒト悪性中皮腫細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）への抗腫瘍効果について検討した結果である。左側のグラフは腫瘍体積の変化を示し、右側のグラフはコントロールとＳ１００Ａ１２投与群の腫瘍重量を示す。
【図２】配列番号３のペプチドが、ヒト肺癌細胞株ＬＫ２の増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｐ＜０．０１
【図３】配列番号９（peptide B）及び配列番号１１（peptide C）のペプチドが、ヒト肺癌細胞株ＬＫ２の増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｓ１００Ａ１２は１００μｇ／ｍｌ、ペプチドは４５０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。Ｐ＜０．０１
【図４】配列番号３のペプチドが、ヒト悪性中皮腫細胞株Ｅ１０の増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｐ＜０．０１
【図５】配列番号３のペプチドが、ヒト悪性中皮腫細胞株Ｅ１の増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｐ＜０．０１
【図６】配列番号３のペプチドが、ヒト悪性中皮腫細胞株Ａ−ＭＥＳＯの増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｐ＜０．０１
【図７】配列番号３のペプチドが、ヒト悪性中皮腫細胞株Ｙ−ＭＥＳＯの増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｐ＜０．０１
【図８】配列番号３のペプチドが、ヒト膵臓がん細胞株ＫＰ２の増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｐ＜０．０１
【図９】配列番号３のペプチドが、ヒト胃癌細胞株ＭＫＮ４５の増殖に及ぼす影響を調べた結果である。縦軸は、細胞増殖の程度を相対値で示した。Ｐ＜０．０１
【図１０】Ｓ１００Ａ１２の腫瘍中の血管内皮細胞への影響を調べた結果である。図１で示した腫瘍内投与の実験での投与後の腫瘍内血管数を解析したデータである。血管内皮細胞特異的なCD31抗体で血管を染色した結果である。左のグラフは、顕微鏡の視野あたりの血管数をまとめたグラフで、右の顕微鏡像は、典型的な血管の免疫染色画像を示す。
【図１１】Ｓ１００Ａ１２のインビボでの血管内皮細胞への影響を調べた結果である。マトリゲルのパライフィンブロックをＨＥ染色、ＤＡＰＩ染色及びＣＤ３１による免疫染色を行った。
【図１２】Ｓ１００Ａ１２のインビボでの血管内皮細胞への影響を調べた結果である。図１１に示される細胞の数をカウントした結果である。
【図１３】Ｓ１００Ａ１２ペプチド（ＫＥＬＡＮＴＩＫＮＩＫＤＫＡＶＩ（配列番号７）のインビボでの血管内皮細胞への影響を調べた結果である。マトリゲルのパラフィンブロックをＨＥ染色、ＤＡＰＩ染色及びＣＤ３１による免疫染色を行った。
【図１４】Ｓ１００Ａ１２ペプチド（ＫＥＬＡＮＴＩＫＮＩＫＤＫＡＶＩ（配列番号７））のインビボでの血管内皮細胞への影響を調べた結果である。図１３に示される細胞の数をカウントした結果である。
【図１５】ＨＵＶＥＣ細胞の増殖活性への影響について調べた結果である（ＨｕＭｅｄｉａを使用）。上段はＶＥＧＦによるＨＵＶＥＣ細胞の増殖促進効果を、中段はＦＧＦによるＨＵＶＥＣ細胞の増殖促進効果を、下段はＨＵＶＥＣ細胞の増殖自体を、各々、Ｓ１００Ａ１２が濃度依存的に抑制することを示す。縦軸は、Ｓ１００Ａ１２の代わりにＰＢＳを加えたコントロールの細胞群の細胞数に対する相対値を示す。
【図１６】ＨＵＶＥＣ細胞の遊走能への影響について調べた結果である（ＨｕＭｅｄｉａを使用）。左のグラフは、ＶＥＧＦの存在下における遊走能に対するＳ１００Ａ１２の影響を示す。右の図は、スクラッチした領域への細胞の遊走状況を示す顕微鏡写真である。
【図１７】ＨＵＶＥＣ細胞の管腔形成能を解析した結果である。左のグラフは、管腔形成部を撮影した画像から、管腔掲載部の面積を数値化したものである。右の図は、管腔形成部の顕微鏡写真である。
【図１８】Ｓ１００Ａ１２による血管新生抑制作用のメカニズムに関する検討結果。Ａは、実験の概要を示す。Ｂは、図中に示す遺伝子産物のリン酸化物についてウェスタンブロット解析を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、Ｓ１００Ａ１２又はＳ１００Ａ１２の部分ペプチドを含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤に関する。さらに、本発明には、Ｓ１００Ａ１２又はＳ１００Ａ１２の部分ペプチドをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターを含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤にも関する。そして、Ｓ１００Ａ１２又はＳ１００Ａ１２の部分ペプチドを含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤、並びに、Ｓ１００Ａ１２又はＳ１００Ａ１２の部分ペプチドをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターを含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤には、他に、Ｓ１００Ａ１２若しくはＳ１００Ａ１２の部分ペプチド又はこれらを発現するための発現ベクターが生体内において到達すべき部位（細胞増殖の抑制を行うべき生体内の組織、又は、該組織中の細胞内）へ到達するために必要な担体等を含んでいてもよい。
【００１２】
ここで「Ｓ１００Ａ１２」とは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質のことである。「実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するか若しくはＲＡＧＥ（Receptor for advanced glycation end products）と相互作用するタンパク質である。
あるいは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するか若しくはＲＡＧＥと相互作用するタンパク質でもよい。
【００１３】
また、「Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチド」とは、Ｓ１００Ａ１２を構成するアミノ酸配列の一部からなるペプチドのことで、例えば、配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列をからなるペプチドのことである。「実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチド」とは、配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するか若しくはＲＡＧＥと相互作用するペプチドである。
あるいは、配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるペプチドは、配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するか若しくはＲＡＧＥと相互作用するペプチドでもよい。
なお、配列番号７のアミノ酸配列からなるペプチドは、肥満細胞及び単球の誘引物質としてその配列は公知であるが（非特許文献１）、このペプチドが血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有することは、本発明によって初めて開示される知見である。
【００１４】
Ｓ１００Ａ１２又はその塩は、Ｓ１００Ａ１２を発現している動物（例えば、ヒト、ラット、マウスなど）由来の培養細胞又は組織から、当該分野における通常の技術により抽出・分離することができる。あるいは、Ｓ１００Ａ１２をコードするＤＮＡを発現可能な状態で含む形質転換体を培養することにより、該培養物から抽出・分離することによっても調製することができる。動物の組織又は細胞から調製する場合、組織または細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行ない、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。
【００１５】
また、Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチド合成法によって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法など、当業者に公知のいずれによってもよい。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。合成反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを単離精製することができる。また、ペプチド合成を行う業者等に合成を依頼し、取得してもよい。
あるいは、Ｓ１００Ａ１２と同様に、Ｓ１００Ａ１２部分ペプチドをコードするＤＮＡを発現可能な状態で含む形質転換体を培養することにより、該培養物から抽出・分離することによっても調製することができる。
【００１６】
また、本発明におけるＳ１００Ａ１２又はその部分ペプチドのＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。Ｓ１００Ａ１２又はその部分ペプチドがＣ末端以外にもそのペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明のＳ１００Ａ１２又はその部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明のＳ１００Ａ１２又はその部分ペプチドのＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のＳ１００Ａ１２又はその部分ペプチドに含まれる。
【００１７】
本発明において、「Ｓ１００Ａ１２をコードする核酸」とは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列を含むタンパク質、又は配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸のことである。このような核酸としては、例えば、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表される塩基配列を挙げることができ、また、配列番号２、配列番号４又は配列番号６で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、血管新生抑制活性及びは細胞増殖抑制活性を有するか若しくはＲＡＧＥと相互作用するタンパク質をコードする核酸も挙げることができる。
さらに、本発明において、「Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチドをコードする核酸」とは、配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸からなるペプチドをコードする核酸のことである。このような核酸としては、例えば、配列番号７をコードする配列番号８で表される塩基配列からなる核酸を挙げることができ、また、配列番号８で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するか若しくはＲＡＧＥと相互作用するペプチドをコードする核酸も挙げることができる。
【００１８】
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸とは、ハイブリダイズすべき核酸の相補鎖（例えば、配列番号２の核酸配列をもつ核酸分子）の塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％の核酸配列相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者であれば容易に決定することができるハイブリダイゼーション条件のことで、一般に、ハイブリダイズすべき核酸の長さに応じた、洗浄温度、及び塩濃度などの条件のことである。一般に、ハイブリダイズすべき核酸が長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、短くなると温度は低くなる。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが挙げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高い核酸を得ることができる。
【００１９】
また、Ｓ１００Ａ１２タンパク質又はその部分ペプチドをコードする核酸は、ｃＤＮＡなどが好ましいが、生体内で適切なスプライシング等を受けるようにデザインされた発現ベクター中に該核酸を組み込む場合には、該核酸には、イントロンなどが含まれていてもよい。つまり、適当な発現用ベクターを用いれば、生体内の所望の部位において、Ｓ１００Ａ１２タンパク質又はその部分ペプチドを発現することができるような構造を有する核酸であれば、いかなるものであっても使用可能である。
【００２０】
Ｓ１００Ａ１２をコードする核酸は、公知の配列情報をデータベースなどから取得し、その配列情報に基づいて、所望の組織または動物種由来のＳ１００Ａ１２コード化核酸を得ることも可能である。Ｓ１００Ａ１２をコードする核酸のクローニングは、当該技術分野における通常の知識に基づいて行うことができる。Ｓ１００Ａ１２をコードする核酸は、例えば、該核酸が含まれる細胞から、ｃＤＮＡライブラリー等を調製し、又は、市販のｃＤＮＡライブラリー等を使用して、常法のスクリーニング方法により取得することができる。あるいは、該核酸を発現している細胞から、ＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、該核酸配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを調製してｃＤＮＡを増幅させることにより該ｃＤＮＡを取得してもよい。
【００２１】
本発明における「細胞」とは、癌細胞、又は正常細胞であってもよく、例えば、正常細胞の場合には、血管内皮細胞などであってもよい。本発明の「細胞」が血管内皮細胞の場合、Ｓ１００Ａ１２又はその部分ペプチドは、血管内皮細胞の増殖を直接抑制するか、あるいは、血管新生促進因子であるＶＥＧＦ又はその他の増殖因子（例えば、ＦＧＦなど）による血管内皮細胞増殖促進効果を抑制することによって、血管内皮細胞の増殖を抑制することができる。
「細胞」の動物種は特に限定されず、例えば、動物細胞、好ましくは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、イヌ、ネコなど由来の細胞であり、特に好ましくはヒト由来の細胞である。
【００２２】
本発明の第１の実施形態は、Ｓ１００Ａ１２タンパク質及び薬剤的に許容される担体を含んでなる血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤である。例えば、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び／又は細胞増殖抑制活性を有するタンパク質、若しくは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＡＧＥと相互作用するタンパク質及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤である。
また、本発明の第２の実施形態は、配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又は配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、血管新生抑制活性及び細胞増殖抑制活性を有するペプチド、若しくは、配列番号７、配列番号９又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入をもつアミノ酸配列からなり、かつ、ＲＡＧＥと相互作用するペプチドである。さらに、該ペプチド及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤である。
【００２３】
上記アミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加は、単離した天然に存在するＳ１００Ａ１２又はその部分ペプチドのアミノ酸配列中に存在していてもよく、あるいは、Ｓ１００Ａ１２又はその部分ペプチドをコードする遺伝子（又はｃＤＮＡ）を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット等を使用し、例えば、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法その他の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって達成することができる。
【００２４】
本発明の第３の実施形態は、Ｓ１００Ａ１２タンパク質をコードする核酸を含む組換えベクター及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤である。
本発明の第４の実施形態は、Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチドをコードする核酸を含む組換えベクター及び薬剤的に許容される担体を含んでなる、血管新生抑制及び細胞増殖抑制剤である。
【００２５】
Ｓ１００Ａ１２及びその部分ペプチドは、細胞の増殖を効果的に抑制することができるため、癌の治療、特に、肺癌、悪性中皮腫、胃癌、膵臓癌などの治療に効果的に用いることができる。
また、Ｓ１００Ａ１２及びその部分ペプチドは、血管内皮細胞の増殖を抑制し、あるいは、ＶＥＧＦによる血管新生の促進効果を阻害し、血管内皮細胞の遊走能を抑制し、若しくは、血管内皮細胞による管腔形成を抑制することで、血管新生を抑制することができる。従って、Ｓ１００Ａ１２及びその部分ペプチドは、血管新生の亢進に起因する疾患、例えば、糖尿病性血管障害（網膜症）、加齢黄斑変性症、尋常性乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、角膜血管新生などの治療に効果的に用いることができる。
そこで、本発明には、他の実施形態として、Ｓ１００Ａ１２及びその部分ペプチド、あるいは、Ｓ１００Ａ１２若しくはその部分ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター含んでなる、抗癌剤、並びに、血管新生に起因する疾患の治療剤又は予防剤が含まれる。
【００２６】
本発明の細胞増殖抑制剤、抗癌剤及び血管新生に起因する疾患の治療剤などの医薬の有効成分とし該医薬に含まれる、Ｓ１００Ａ１２、Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチド、又は、Ｓ１００Ａ１２若しくはＳ１００Ａ１２の部分ペプチドをコードする核酸からなる発現ベクターは、生理学的に許容されるその塩であってもよい。塩としては、例えば、酸性基が多く含まれる場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ− ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が多く含まれる場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。
【００２７】
本発明の上記医薬は、有効成分であるＳ１００Ａ１２、Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチド、又は、Ｓ１００Ａ１２若しくはＳ１００Ａ１２の部分ペプチドをコードする核酸、薬理学的に許容されるその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物自体を投与してもよいが、一般的には、有効成分である上記物質と１又は２以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。本発明の医薬の有効成分としては、上記の物質の２種以上を組み合わせて用いることができ、上記医薬組成物には、各種癌、あるいは、血管新生に起因する疾患の治療及び／又は予防に対する他の医薬の有効成分を配合することも可能である。
【００２８】
医薬組成物の種類は特に限定されず、その剤型は、静注、筋注などの注射剤若しくは点滴剤、坐剤、経皮投与剤、経粘膜投与剤などの非経口投与に適した剤型の他、場合によっては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液剤などの経口投与に適した剤型であってもよい。ただし、経口投与に適した剤型を用いる場合には、プロテアーゼ又はペプチダーゼによる分解を抑制するような組成を特に考慮することが望ましい。
注射剤や点滴剤などの液体製剤にあっては、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形体であってもよく、また、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、さらに、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００２９】
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質、あるいは、固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００３０】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００３１】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００３２】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００３３】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸− メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００３４】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は０．０１〜１０００ｍｇ（有効成分重量）程度であり、一日１回又は数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１〜１００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。
【００３５】
本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００３６】
本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
【００３７】
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からなるキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００３８】
さらに、本発明は、Ｓ１００Ａ１２又はその部分ペプチドを含んでなる医薬若しくは医薬組成物を患者に投与することを含む、疾患の治療方法を提供する。
本発明の治療方法には、各種癌及び血管新生に起因する疾患の治療方法が含まれる。
ここで「治療」とは、疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、此れによって該疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００３９】
次に本発明を具体例によって説明するがこれらの例によって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
１．Ｓ１００Ａ１２の腫瘍内投与
Ｓ１００Ａ１２の腫瘍内投与が、インビボで、ヌードマウス担癌系（皮下移植ヒト肺癌細胞ＬＫ２とヒト悪性中皮腫ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞）で、有意に癌増殖を抑制することが分かった。
１−１．ヒト肺癌細胞ＬＫ２への抗腫瘍効果
培養ヒト肺癌細胞ＬＫ２を、２×１０７細胞、ヌードマウス１２匹（ＢＡＬＢＣ  ＮＵ／ＮＵ  オス４−５週令、日本ＳＬＣより購入）（コントロールマウス６匹、Ｓ１００Ａ１２投与マウス６匹）の背部皮下に接種した。接種後７日−１４日で腫瘍を確認後、Ｓ１００Ａ１２（配列番号１、以下同じ）の腫瘍内投与を開始した。隔日で、１回／日（２５０μｇ／１００μｌＰＢＳ）腫瘍内に投与した。コントロールマウスには、１００μｌのＰＢＳを腫瘍内に投与した。
経時的に、腫瘍体積（ｍｍ３）をｌｗ２／２（ｌ：長さ，ｗ：幅、単位ｍｍ）で算出し、２８日目に腫瘍を摘出して重量を秤量した。
１−２．ヒト悪性中皮腫細胞への抗腫瘍効果
培養ヒト悪性中皮腫ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を、２×１０７細胞、ヌードマウス１４匹（ＢａｌｂＣ  ｎｕ／ｎｕ  オス４−５週令、日本ＳＬＣ）（コントロールマウス７匹、Ｓ１００Ａ１２投与マウス７匹）の背部皮下に接種した。接種後７日−１４日で腫瘍を確認後、Ｓ１００Ａ１２の腫瘍内投与を開始した。毎日、１回／日（３００μｇ／１００μｌＰＢＳ）を腫瘍内に２４日間投与した。コントロールマウスには、１００μｌのＰＢＳを腫瘍内に投与した。
経時的に、腫瘍体積（ｍｍ３）をｌｗ２／２（ｌ：長さ，ｗ：幅、単位ｍｍ）で算出し、２４日目に腫瘍を摘出して重量を秤量した。
【００４１】
図１に、ヒト肺癌細胞ＬＫ２及びヒト悪性中皮腫細胞への抗腫瘍効果についてまとめた。上のパネルには、ヒト悪性中皮腫ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（Ｎ＝７）、下のパネルには、ヒト肺癌細胞ＬＫ２（Ｎ＝６）での抗腫瘍効果を示す。パネル左図には経時的腫瘍抑制効果を、パネル右図には、摘出した腫瘍重量を示す。
いずれも有意にＳ１００Ａ１２は腫瘍を抑制した（Ｐ値は、図中に示した）。
【００４２】
２．  Ｓ１００Ａ１２の増殖抑制に関与する活性部位の同定。
Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチドである、ＫＥＬＡＮＴＩＫＮＩＫＤＫＡＶＩ（配列番号７）、ＫＥＬＡＮＴＩＫＮＩＫＤＫＡＶ（配列番号９）及びＥＬＡＮＴＩＫＮＩＫＤＫＡＶＩ（配列番号１０）は、ヒト肺癌細胞ＬＫ２、ヒト悪性中皮腫Ｅ１０細胞、ヒト悪性中皮腫Ｅ１細胞、ヒト悪性中皮腫Ａ−ＭＥＳＯ細胞、ヒト悪性中皮腫Ｙ−ＭＥＳＯ細胞及びヒト胃癌ＭＫＮ４５細胞の増殖をインビトロで有意に抑制した。
まず、Ｓ１００Ａ１２の増殖抑制に関与する活性部位を同定するため、幾つかの部分ペプチドを合成し、その増殖抑制効果について、培養ＬＫ２細胞を用いて検討した。ポシティブコントロールとして、リコンビナントＳ１００Ａ１２タンパク質を用いた。
【００４３】
ＬＫ−２細胞の培養は、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリンＢを含有するＲＰＭＩ培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。その他のヒト癌培養細胞も同様に培養した。用いた細胞は、ヒト胃癌ＭＫＮ４５、ヒト膵臓がんＫＰ２は、細胞バンクより購入し、ヒト悪性中皮腫Ａ−ＭＥＳＯとヒト悪性中皮腫Ｙ−ＭＥＳＯは、愛知がんセンターの関戸博士より供与頂いた。また、ヒト悪性中皮腫Ｅ１０とヒト悪性中皮腫Ｅ１は、愛媛大学内科の濱田博士より供与頂いた。
細胞の増殖測定は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。この細胞増殖測定法は、生細胞内の脱水素酵素活性を指標とする測定法で、テトラゾリウム塩であるＷＳＴ−８［２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノソジウム塩］が還元されて、ホルマザンが生成されることに基づいて生細胞数の測定を行うものである。３．０×１０３個のＬＫ−２細胞を９６ウェルプレートに播種し、１ウェルあたり１００μｌのＲＰＭＩ培地にて培養した。リコンビナントＳ１００Ａ１２を添加し４８時間培養した。その後、１ウェルあたり１０μｌのＷＳＴ−８溶液を入れ３７℃で４時間培養した。ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＪＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定し、リファレンスには６９０ｎｍの吸光度を使用した。
【００４４】
リコンビナントＳ１００Ａ１２タンパク質は、大腸菌で発現させた後、発現産物を精製して使用した。大腸菌（ＢＬ２１）をｐＥＴ２８ａ−Ｓ１００Ａ１２ベクターで形質転換し、得られた過剰発現大腸菌を５０ｍｌのＬＢ培地にて、３７℃の条件下、１５時間培養した。培養した５０  ｍｌＬＢ培地を１ＬのＬＢ大腸菌液に入れ、さらに、３７℃で培養を行った。３時間培養後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度１ｍＭとなるように添加し、５時間培養した。５時間後、得られたＬＢ培地を８，０００  ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を得た。その沈殿を、１２．５ｍｌのＰＢＳ（−）に再懸濁し、ソニケーターＵＰ−５０Ｈ（ｄｒ．ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で破砕した。１２，０００ｒｐｍで、３０分間、４℃で遠心し、上清を得た。その上清に、３ｍｌの５０％  Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（ＰＢＳ（−）で平衡化）を加えて、４℃、３０  分間、ローテートし、２，８００ｒｐｍで１０分間遠心した。Ｎｉ−ＮＴＡ（タンパク質が結合したもの）を１０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ（−）で５回洗浄し、カラムに充填した。Ｓ１００Ａ１２タンパク質を、段階的（５０ｍＭ，１００ｍＭ，２５０ｍＭ，５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳ（−））に溶出した。各フラクションをフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｄｒｉｖｅｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ）にて滅菌した。バクテリア由来のエンドトキシンは、ＥｎｄｏＴｒａｐ  ｂｌｕｅ  １／１を用いてリコンビナントタンパク質から除去した。リコンビナントタンパク質は、３００μｌずつ分注し、−２０℃にて保存した。タンパク質の濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。
なお、Ｓ１００Ａ１２の部分ペプチドは、東京大学医科学研究所内で合成を行った。
実験の結果、配列番号７（ペプチドＡとする）、配列番号９（ペプチドＢとする）及び配列番号１０（ペプチドＣとする）の配列からなる部分ペプチドが、ヒト肺癌細胞ＬＫ２に対し、顕著な増殖抑制効果を示した（図２及び図３）。さらに、ペプチドＡは、その他の癌細胞に対しても、有意な増殖抑制効果を示した（図４〜図９）。
【００４５】
３．Ｓ１００Ａ１２及びＳ１００Ａ１２ペプチドの血管内皮細胞への影響
３−１．Ｓ１００Ａ１２の腫瘍中の血管新生に対する抑制効果
まず、Ｓ１００Ａ１２の血管新生抑制効果について、インビボにおいて、検討を行った。
Ｓ１００Ａ１２を投与したＬＫ２腫瘍（腫瘍については、上記１−１の記述を参照のこと）及びコントロール腫瘍をホルマリン固定して、パラフィンブロックを作製した。スライス標本を作製後、血管内皮細胞に発現するＣＤ３１抗原の抗体（抗ＣＤ３１ウサギ抗体）を用いて、血管の免疫組織染色を行なった。顕微鏡１視野あたりの血管数をカウントして統計処理した。
【００４６】
免疫染色は以下のように行った。
パラフィン固定した試料をキシレンに５分間、３回浸した後、エタノールで洗浄（１００％、９０％、８０％の順で３回洗浄）し、最後は流水で洗浄した。脱パラフィン処理した試料は、１０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ６）でオートクレーブ処理（１２１℃、１０分間）し、抗原の賦活化を行った。クエン酸バッファーの温度が室温となったら、ＰＢＳで３回洗浄し、３％過酸化水素に５分間浸して脱ペルオキダーゼ処理を行った。過酸化水素を流水で洗浄後、さらにＰＢＳで洗浄を行い、非特異反応ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ）で１０分間ブロッキングを行った。ブロッキング後、試料を１次抗体であるウサギポリクローナルＣＤ３１抗体（ab28365；Ａｂｃａｍ）原液と反応（４℃、１６時間）させた。ＰＢＳで１次抗体を３回洗浄した後、２次抗体であるＥｎｖｉｓｉｏｎ−Ｒａｂｂｉｔ（Ｄａｋｏ）と室温で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し、血管内皮細胞が茶褐色に染色されるまでＤＡＢで反応させ、流水で洗浄した。洗浄後、ヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）でカウンター染色を行った。
【００４７】
ＣＤ３１抗体で免疫染色した各腫瘍切片において、染色された血管を５視野ずつ顕微鏡で撮影（５０倍）した。撮影した各視野における血管の数を計測し、５視野の平均血管数を計算し、各腫瘍の１視野あたりの血管数とした。この各腫瘍の１視野あたりの血管数より、３つの腫瘍の１視野あたりの平均血管数、標準偏差、またコントロール群とＳ１００Ａ１２投与群間におけるＰ−ＶａｌｕｅをＴ−ＴＥＳＴにより算出し評価した。
図１０（左パネル）に示すようにＳ１００Ａ１２投与で新生血管がｃｏｎｔｒｏｌに比して、有意に減少した（ｐ＝０．０１）。図１０右パネルは、典型的な血管の免疫染色画像を示す。
【００４８】
３−２．Ｓ１００Ａ１２のインビボにおける血管新生抑制効果
Ｓ１００Ａ１２のインビボにおける血管新生への影響をマトリゲルプラグアッセイにより検討した。
マトリゲルプラグアッセイは、血管新生誘引因子（ＶＥＧＦ）及び試験物質（Ｓ１００Ａ１２ペプチド）を混合したマトリゲルをマウスの皮下へ注入し、マトリゲル内に形成された血管を観察することにより血管新生を評価する方法である。
まず、氷上において、Ｓ１００Ａ１２（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌとＶＥＧＦ（１０００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを、マトリゲル４００μｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し、混合物（５００μｌ）をＣ５７ブラックマウス（５週齢オス）の背部皮下に注入した。注入から２１日後にマトリゲルを採取し、ホルマリン固定後、パラフィンブロックを作成し、その切片をＨＥで染色して血管新生の状態を解析した。血管新生は、血管内皮細胞に特異的に発現しているＣＤ３１を免疫組織染色法で解析した。
免疫組織染色は以下のように行った。
脱パラフィン処理
パラフィン固定した試料をキシレンに５分間、３回浸した後、エタノールで洗浄（１００％、９０％、８０％の順で３回洗浄）し、最後は蒸留水で洗浄した。
抗原の賦活化
脱パラフィン処理した標本は、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６）でオートクレーブ処理（１２１℃、１０分間）し、抗原を賦活化した。クエン酸バッファーの温度が室温となった後、ＰＢＳで３回洗浄した。
ブロッキング
５％ＢＳＡ溶液で３０分間ブロッキングを行った。
一次、二次抗体、及びＤＡＰＩの反応
ウサギポリクローナルＣＤ３１抗体（ab28365；Ａｂｃａｍ社）原液と反応（４℃、１６時間）させた。ＰＢＳで一次抗体を３回洗浄した後、二次抗体、抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１／２００希釈）（SC-2012；サンタクルーズ社）と室温で３０分間反応させた。ＰＢＳで一次抗体を１回洗浄した後、ＤＡＰＩ溶液（１／５００）と５分間反応させ、反応後、ＰＢＳで３回洗浄した。
Ｓ１００Ａ１２を添加すると、ＶＥＧＦの添加によって増大した血管内皮細胞密度は（図１１中段、図１２）、顕著に減少した（図１１下段、図１２）。以上のことから、インビボにおいてＳ１００１２Ａは有意に血管新生を抑制することが明かとなった。なお、図１１におけるＤＡＰＩ染色では、カラーでは、濃紺に染色されているが、白黒図面では、白く染色されている。同様に、ＣＤ３１もカラーでは、緑色に染色されているが、白黒図面では、白く染色されている。Ｍｅｒｇｅは、ＤＡＰＩ染色と、ＣＤ３１染色を重ね合わせた図であるが、白黒図面では、白く染色されている。
【００４９】
３−３．Ｓ１００Ａ１２ペプチドのインビボにおける血管新生抑制効果
Ｓ１００Ａ１２ペプチド（配列番号７）のインビボにおける血管新生への影響をマトリゲルプラグアッセイにより検討した。
まず、氷上において、Ｓ１００Ａ１２ペプチド（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌとＶＥＧＦ（１０００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌを、マトリゲル４００μｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し、混合物（５００μｌ）をＣ５７ブラックマウス（５週齢オス）の背部皮下に注入した。注入から２１日後にマトリゲルを採取し、ホルマリン固定後、パラフィンブロックを作成し、その切片をＨＥで染色して血管新生の状態を解析した。血管新生は、血管内皮細胞に特異的に発現しているＣＤ３１を免疫組織染色法で解析した。
免疫組織染色については、Ｓ１００Ａ１２の場合と同様に行った。
Ｓ１００Ａ１２ペプチドを添加すると、ＶＥＧＦの添加によって増大した血管内皮細胞密度は（図１３中段、図１４）、顕著に減少した（図１３下段、図１４）。なお、図１１と同様に、図１３におけるDAPI染色では、カラーでは、濃紺に染色されているが、白黒図面では、白く染色されている。同様に、CD31もカラーでは、緑色に染色されているが、白黒図面では、白く染色されている。Mergeは、DAPI染色と、CD31染色を重ね合わせた図であるが、白黒図面では、白く染色されている。
以上のことから、インビボにおいてＳ１００１２Ａペプチドは有意に血管新生を抑制することが明かとなった。
【００５０】
３−４．Ｓ１００Ａ１２の血管内皮細胞の増殖能、遊走能、管腔形成に及ぼす影響
次に、Ｓ１００Ａ１２の血管内皮細胞の増殖能、遊走能、管腔形成に及ぼす影響について、インビトロにおいて検討を行った。
本実施例で使用した細胞は、初代臍帯静脈由来細胞（凍結ＨＵＶＥＣ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｏ．  ６２０７６０；クラボウ）である。培地は、主として、  ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２（クラボウ）を用いた。増殖への影響については、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（Ｍ１９９；ＳＩＧＭＡ）を用いた実験も行なった。また、添加因子として、クラボウの増殖因子セット（ＦＢＳ、ｈＥＧＦ（１０μｇ／ｍｌ）、ハイドロコーチゾン（１ｍｇ／ｍｌ）、抗菌剤（ゲンタマイシン５０ｍｇ／ｍｌ、アンフォテリンＢ  ５０μｇ／ｍｌ）、ｈＦＧＦ（５μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（１０ｍｇ／ｍｌ））を使用した。ＦＢＳは、ＨｕＭｅｄｉａの１／５０量、その他の因子はＨｕＭｅｄｉａの１／１０００量を加えて使用した。また、Human VEGF recombinant は、和光純薬工業から購入した。
【００５１】
まず、凍結細胞溶液を３７℃ウォーターバスで温め、少し細胞凍結片が残った状態まで解凍し、容器を７０％エタノールで消毒した後、１ｍｌピペット緩やかにピペッティングし完全に解凍した。細胞溶液１０μｌを取り、細胞数を血球計算盤によりカウントした。同時に、残りの細胞溶液を４倍量の増殖因子セット添加ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２と混合した。細胞数をカウントした後、２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上となるように増殖因子セット添加ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２で調整して、プレートに播種した。その後、増殖因子セットを加えたＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２を用い６ｃｍディッシュで細胞培養を行い、クラボウの継代試薬セットを用いて継代培養を行った。
細胞の継代は、次ぎのように行った。培養液を除去後、１ｍｌＨＥＰＥＳ緩衝液で一度洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを１ｍｌ加えた。加えたトリプシン／ＥＤＴＡはディッシュ全体に馴染ませた後に取り除き、室温に１〜３分間静置後、顕微鏡で観察し細胞が剥がれていることを確認した。細胞が剥がれたことを確認した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液を１ｍｌ加えてピペッティングし、１５ｍｌチューブに分注しておいたトリプシン中和液１ｍｌと混合して、１，５００ｒｐｍ（卓上小型遠心機２４２０  ＫＵＢＯＴＡ）で３分間遠心した。遠心後、上清を吸引し、沈殿した細胞に２ｍｌの新しい培地を加えてピペッティングした。ピペッティングによりバラバラになった細胞を血球計算盤で細胞をカウントし、２，５００  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度となるように新しい培地で調整し細胞を播種した。
【００５２】
３−４−１．ＨＵＶＥＣ細胞の増殖活性解析
６ｃｍディッシュを用い、増殖因子セット添加ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２で培養した細胞を回収し、フレッシュなＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２（増殖因子セット含有）で、２，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように細胞濃度を調製後、９６ｗｅｌｌプレートへ調製後の細胞懸濁液を１００μｌ播種した。２４時間後、所望の濃度（０，１０，２５，５０，１００μｇ／ｍｌ）となるようにＳ１００Ａ１２を添加した１％ＦＢＳ添加ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２で、培地交換を行った。培地交換１時間後、ＶＥＧＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＢＳの何れかを添加した。４８時間後、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔにより細胞数を測定した。
【００５３】
その結果、Ｓ１００Ａ１２（５０，１００μｇ／ｍｌ）は濃度依存的にＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の増殖効果を抑制した（図１５上段）。また、Ｓ１００Ａ１２（２５，５０，１００μｇ／ｍｌ）は濃度依存的にＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の増殖効果を抑制した（図１５中段）。さらに、Ｓ１００Ａ１２（１０，２５，５０，１００μｇ／ｍｌ）のＨＵＶＥＣ細胞の増殖への影響を解析したところ、Ｓ１００Ａ１２依存的に、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖を抑制した（図１５下段）。
【００５４】
３−４−２．ＨＵＶＥＣ細胞の遊走能の評価(スクラッチアッセイ)
６ｃｍディッシュを用い、増殖因子セット添加ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２で培養した細胞を回収し、フレッシュなＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２（増殖因子セット含有）で、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ以上となるように細胞濃度を調製後、１２ｗｅｌｌプレートへ調製後の細胞懸濁液を１ｍｌ播種した。細胞がコンフレントな状態となったら、所望の濃度（２５，５０，１００μｇ／ｍｌ）となるようにＳ１００Ａ１２を添加した１％ＦＢＳ添加ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２で、培地交換を行った。培地交換１４時間後、細胞が層状になっているプレートの細胞層をイエローチップ（ＢＭｂｉｏ）で傷を付けた後、各濃度のＳ１００Ａ１２を含むフレッシュなＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２（１％ＦＢＳ）で培地交換を行い、さらにＶＥＧＦ（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。１０時間後ホルマリン固定を行い、ＣＢＢで細胞を染色した。傷をつけた直後とホルマリン固定後に顕微鏡で撮影を行い、その画像からＩｍａｇｅＪにて細胞が存在しない領域の面積を測定し、遊走率を求めた。
結果を図１６に示す。Ｓ１００Ａ１２（５０，１００μｇ／ｍｌ）は、濃度依存的に有意にＨＵＶＥＣ細胞の遊走を抑制した。
【００５５】
３−４−３．ＨＵＶＥＣ細胞の管腔形成能の解析
氷上で２４ｗｅｌｌプレートにマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１ｗｅｌｌ当たり３００μｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベーションした。６ｃｍディッシュを用い、増殖因子セット添加ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２で培養した細胞を回収し、フレッシュなＨｕＭｅｄｉａ−ＥＢ２（１％ＦＢＳ含有）で、４×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように細胞濃度を調製後、調製後の細胞懸濁液を５００μｌ播種した。播種の際、ＶＥＧＦとＳ１００Ａ１２を添加した。１４時間後、ホルマリン固定を行い、顕微鏡観察を行った。撮影した画像は、ＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔにて管腔形成部を黒色に色づけ、ＩｍａｇｅＪで黒色部分の面積を計測した（図１７）。
その結果、図１７に示すように、Ｓ１００Ａ１２（１００μｇ／ｍｌ）は、有意にＨＵＶＥＣ細胞の管腔形成を抑制した。
【００５６】
３−５．Ｓ１００Ａ１２による血管新生抑制作用のメカニズム
次に、Ｓ１００Ａ１２による血管新生抑制作用のメカニズムを調べるため、ＶＥＧＦによる情報伝達系に関与する遺伝子産物のリン酸化状態について、ウェスタンブロット解析により検討を行った。
増殖因子セットを添加したＨｕＭｅｄｉａ中で細胞を培養した後、培地を１％ＦＢＳ−ＨｕＭｅｄｉａ  ＥＢ２に交換した。培地交換の５時間後、Ｓ１００Ａ１２又はＰＢＳを添加し、その１時間後にＶＥＧＦ又はＰＢＳを添加した。ＶＥＧＦ又はＰＢＳを添加した５分後及び１５分後にタンパク質を回収した（図１８Ａを参照のこと）。
【００５７】
実験の結果、Ｓ１００Ａ１２は、ＶＥＧＦによる情報伝達系に関与する因子のリン酸化（ｐ−ＶＥＧＦＲ２，ｐ−ｐ３８，ｐ−Ａｋｔ，ｐ−Ｅｒｋ，ｐ−ＪＮＫ（ｐ−は、図１８Ｂに示すアミノ酸がリン酸化されていることを示す））を抑制することが明らかとなった。この実験には、ｐ−ＶＥＧＦＲ２，ｐ−ｐ３８，ｐ−Ａｋｔ，ｐ−Ｅｒｋ，ｐ−ＪＮＫの特異的抗体（ＣＳＴジャパン株式会社から購入）を用いてウェスタンブロット法で行った。
ＶＥＧＦ添加５分後では、Ｓ１００Ａ１２は、ｐ−ＶＥＧＦＲ２，ｐ−ｐ３８，ｐ−Ａｋｔ，ｐ−Ｅｒｋ，ｐ−ＪＮＫの発現レベルを、それぞれ、５６％、５４％、５５％、６３％、６１％にまで抑制していた。さらに、ＶＥＧＦ添加１５分後において、Ｓ１００Ａ１２は、ｐ−ＶＥＧＦＲ２，ｐ−ｐ３８，ｐ−ＪＮＫの発現レベルを、それぞれ、４２％、５２％、４８％にまで抑制していた。発現レベルの定量はＧＡＰＤＨの発現レベルで補正した。
以上の結果は、Ｓ１００Ａ１２による血管新生抑制作用をよく説明する。特にｐ−ＶＥＧＦＲ２のリン酸化は、血管内皮細胞の管腔形成に密接に関与することが知られているが、Ｓ１００Ａ１２によりｐ−ＶＥＧＦＲ２のリン酸化の抑制が起こることから、生体内における管腔形成へのＳ１００Ａ１２の関与が強く示唆される。
なお、コントロールとして行なったＧＡＰＤＨの発現量にはＳ１００Ａ１２は影響を及ぼさなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、癌、あるいは、血管新生の亢進に起因する疾患の治療剤の開発及び治療法の確立に大いに貢献するものである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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