(57)【要約】【課題】少量の摂取で骨密度を増加させることができ、特に閉経後の女性の急激な骨密度の低下を防止し、骨粗鬆症を予防することができる骨形成促進剤およびそれを配合した香料、飲食品、動物用飼料、或いは医薬品又は医薬部外品を提供する。【解決手段】チモキノン、またはブラッククミン種子の溶媒抽出物、種子油、精油を有効成分とすることにより、優れた抗骨粗鬆症効果を示す骨形成促進剤およびそれを配合した香料組成物、飲食品、動物用飼料、或いは医薬品又は医薬部外品を得ることができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チモキノンを有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。
【請求項２】
チモキノンが、ブラッククミンの種子粉砕物、ブラッククミン種子の溶媒抽出物、種子油、又は精油に由来するものであることを特徴とする請求項１に記載の骨形成促進剤。
【請求項３】
さらに、イソフラボン、ビタミンＫ２、ビタミンＤ、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸化合物から選ばれる抗骨粗鬆症剤又は骨形成促進剤の１種又は２種以上を含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の骨形成促進剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨形成促進剤を含有することを特徴とする香料組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨形成促進剤又は請求項４に記載の香料組成物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨形成促進剤又は請求項４に記載の香料組成物を含有することを特徴とする動物用飼料。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨形成促進剤又は請求項４に記載の香料組成物を含有することを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてチモキノンを含有する、或いはブラッククミン種子の粉砕物、ブラッククミン種子の溶媒抽出物、種子油、精油のいずれかを含有する骨形成促進剤（抗骨粗鬆症）、及びそれらを配合してなる香料組成物、飲食品、動物用飼料、医薬品又は医薬部外品に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、体の支持組織としての役割だけでなく、カルシウム代謝や細胞の分化成熟を担う組織であり、骨吸収と骨形成による動的な平衡状態を保っている。すなわち、古い骨組織が破骨細胞によって吸収されたあと、骨芽細胞によって新しい骨組織が形成される。
骨量は、これらの細胞のバランスによって一定に維持されている。このように骨が吸収と形成を繰り返している現象をリモデリング（骨改造現象）という（非特許文献１）。
【０００３】
骨粗鬆症は、上述の骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスが崩れ、骨吸収が骨形成を上回る状況になり、それが続いた時に骨密度が減少し、骨が折れやすくなる疾患である。主な原因としては閉経や加齢が挙げられるが、ほかにも食習慣やアルコール摂取などの生活習慣関連因子もある。骨粗鬆症は、自覚症状の無いまま進行していく場合が多く、発症した際には骨塩量の減少から腰椎や大腿骨の骨折を引き起こし、寝たきりになる等、著しいQOLの低下をもたらす。
【０００４】
高齢化社会の進展に伴い、老齢化とともに骨密度が減少し骨折しやすくなる骨粗鬆症が非常に問題となっている。現在、骨粗鬆症患者数は1,000万人といわれ、なかでも原発性骨粗鬆症に分類される閉経後骨粗鬆症は、50歳以上の更年期を過ぎた女性に高頻度に発症し、骨粗鬆症患者数の90％以上を占めることから、糖尿病に代表される生活習慣病と同様、現代社会において重要視されている疾患となっている。最近では、ダイゼインやゲニステインなどの大豆イソフラボン（非特許文献２参照）、ビタミンK2、カルシウム（＋マグネシウム）を配合したサプリメント剤、高産生納豆菌なども利用されている。
【０００５】
骨粗鬆症の予防には、若年期からの骨量を増加させることが大切で、そのためには適度な運動や日常摂取する食品に注意する必要がある。食事に際しては、カルシウムを多く含む乳製品や魚類などを多く摂取することが重要である。
【０００６】
骨粗鬆症の治療法としては、女性ホルモンのエストロゲンによるホルモン補充療法があるが、副作用があるため、長期使用が制限されている。すなわち、閉経後骨粗鬆症の治療に汎用されているエストロゲン製剤は、６ヶ月以上にわたる長期投与の間に顔面紅潮、乳房痛、子宮や膣からの不正性器出血などの副作用が高頻度で発生し、黄体ホルモン製剤（プロゲステロン）を併用しないと、子宮体ガンや乳ガン発症の危険性があることから、安全性の面で問題が指摘されている（特許文献１参照）。
【０００７】
その他の骨粗鬆症治療薬としては、カルシウム製剤、ビタミンD3製剤、ビタミンK製剤、カルシトニン製剤、ビスホスホネート製剤、イプリフラボン、あるいは選択的エストロゲン受容モジュレーター（SERM）が知られている（非特許文献３、４参照）が、これら臨床で使用されている骨粗鬆症治療薬は、有効性が高いものほど安全域と中毒域の差が狭く、投与量の調節が困難である。特にビスホスホネート製剤は、投薬・休薬のプロトコールの設定が難しく、時には骨形成に重要な骨構成成分の石灰化を抑制することで、症状の悪化を引き起こすこともあるといわれている。また最近では、顎骨壊死との関連性も指摘されており、その安全性に懸念がもたれている（非特許文献５）。加えて、骨粗鬆症治療薬として開発されたものの多くは、治療に時間がかかり莫大な医療費がかかるという問題もある。
【０００８】
そこで、安全でかつ安価な予防食品素材の開発が期待されている。
例えば、特許文献１には、数種のハーブから選ばれた植物抽出物を有効成分とする閉経後骨粗鬆症の予防又は治療剤が報告されている。
また、特許文献２及び非特許文献６には、クズ（葛；Pueraria  lobata）の茎からイソフラボン類等を抽出した抽出物からなる骨粗鬆症治療・治療剤および破骨細胞抑制剤が報告されており、特許文献３には、葛根粉末を含有してなる骨粗鬆症治療剤又は組成物が報告されている。
また、特許文献４は、温州ミカン果実、果皮及びじょうのう膜の溶媒抽出物を含有することを特徴とする骨粗鬆症予防効果を有する食品組成物又は医薬品組成物が報告されており、特許文献５には、温州ミカンなどのかんきつ類から果汁を絞った後の残渣の酵素反応液を遠心分離し乾燥することにより得られるカロテノイドとフラボノイド及び／又はその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする抗骨粗鬆症組成物及びそれらを含有する飲食品、医薬品又は飼料が報告されている。
また、特許文献６には、リン酸化デキストリン、リン酸化多糖、リン酸化澱粉、リン酸化還元デキストリンなどの、重合度が１１以上のリン酸化糖類に、カルシウム及びマグネシウムを含有する骨密度減少抑制組成物が報告されている。  
また、特許文献７には、オリーブに含まれる成分であるオレウロペイン及び／又はその分解物であるヒドロキシチロソールを有効成分として含有する骨形成促進剤が報告されている。
さらに、特許文献８、９には、ヒジキの抽出物を含有する抗骨粗鬆症組成物又は破骨細胞形成抑制組成物、並びに該組成物を含有する飲食品又は医薬品又は飼料が報告されている。しかしながら、その成分については、なんら明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−５３５７６号公報
【特許文献２】特開２０１０−２１５６０７号公報
【特許文献３】特開２００３−９５９７１号公報
【特許文献４】特開２００６−８３１５１号公報
【特許文献５】特開２００６−１０４０９０号公報
【特許文献６】特開２０１０−１５０１４４号公報
【特許文献７】特開２００９−２２７６１６号公報
【特許文献８】特開２０１０−９００９７号公報
【特許文献９】特開２０１０−２２２３３４号公報
【特許文献１０】特開２０１１−１６８５５４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】知地英征、一般財団法人 食と健康財団 平成16年度調査研究報告書、初代細胞培養系におけるラット破骨細胞の形成および骨芽細胞の分化誘導に対する有効成分の研究、hhtp://www.hokkaido-fst.or.jp/ke_tyo_6a.html
【非特許文献２】奥村紀子、吉川隆章、飯田仁、市島國雄、高倉義典、イソフラボンの骨形成促進効果の検討―in vitro―、大豆たん白質研究、６、１２８−１３４（２００３）
【非特許文献３】揖場和子、骨吸収抑制薬、CLINICALCALCIUM、２（１）、９６-１００（１９９２）
【非特許文献４】能登谷浩平、武冨滋久、総説 骨粗鬆症薬イプリフラボンによる骨形成促進作用および骨吸収抑制作用の作用機構、武田研究所報、５７、１−５７（１９９８）
【非特許文献５】社団法人 日本口腔外科学会監修、ビスホスホネート系薬剤と顎骨壊死〜理解を深めて頂くために〜、http: //www.jsoms.or.jp/pdf2/bone_bisphos.pdf
【非特許文献６】田中照佳、鈴木佐和子、内山貴裕、唐漢軍、鵜澤有希、森山達哉、河村幸雄、骨粗鬆症モデルマウスの骨吸収に及ぼすクズ蔓抽出物の作用、Trace NutrientsResearch、２７、３５−３８（２０１０）
【非特許文献７】日本香料工業会編、「天然香料基原物質の解説」−食品香料ハンドブック・改訂増補版−、株式会社食品化学新聞社、平成１１年８月２５日発行、第３８９〜３９０頁
【非特許文献８】白水裕子、後藤元信、広瀬勉、「日本食品工学会年次大会講演要旨集」、第４回、２００３年、第５９頁、超臨界二酸化炭素によるニゲラ種子からの抗酸化物質の抽出
【非特許文献９】長島万弓、樋口沙耶子、八木彩野、福田靖子、「日本調理科学会大会研究発表要旨集」、２００５年、第６頁、ブラッククミンの活性酸素消去能について
【非特許文献１０】S. Machmudah, Y. Shiramizu,M. Goto, M. Sasaki, T. Hirose, Separation Science and Technology, 40,1267-1275（2005）; Extraction of Nigella sativa L. using Supercritical CO2：A Study ofAntioxidant Activity of the Extract.
【非特許文献１１】L.Kokoska, J. Havlik, et al., J. Food Protection, 71（12）,2475-2480（2008）
【非特許文献１２】E. A. Aboutabl, A.A. El-Azzouny, et al., Progressin Ess. Oil Res.,Walter de Gruyter & Co.（Berlin）,（1986）p.p. 49-55
【非特許文献１３】F.Benkaci-Ali, A. Baaliouamer, et al., Chromatographia, 64（3/4）,227-231（2006）
【非特許文献１４】H.Rchid, R. Nmila, et al., J. Ess. Oil Res., 16, 585-587（2004）
【非特許文献１５】武田薬品工業株式会社、日本薬局方イプリフラボン錠 “オステン錠200 mg「タケダ」”製品説明書、２０１０年５月改訂（第８版）
【非特許文献１６】日医工株式会社、骨粗鬆症治療剤“イプリプラスト錠200mg”製品説明書、２００７年９月改訂（第３版）p.1-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
現在までに少量の摂取で有効的に骨密度を減少させ、骨粗鬆症を予防するような食品素材はまだ開発されていない。また大量に摂取すればある程度の効果が期待できる素材もあるが、大量に摂取することによる副作用の危険性が考えられるため、有効量に満たない摂取量で摂取しているのが現状であると考えられる。すなわち、副作用などの危険性が考えられない摂取量で、骨粗鬆症の予防ができ、骨密度を減少させることができる食品などの開発が望まれていた。
【００１２】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであって、少量の摂取で骨密度を増加させることができ、特に閉経後の女性の急激な骨密度の低下を防止し、骨粗鬆症を予防することができる食品素材を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、上記目的を達成すべく、鋭意検討を重ねた結果、ブラッククミン種子の溶媒抽出物又は精油に含有されるチモキノンが、非常に高い抗骨粗鬆症効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、これらの知見に基づいて完成に至ったものであり、以下のとおりのものである。
〈１〉チモキノンを有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。
〈２〉チモキノンが、ブラッククミンの種子粉砕物、ブラッククミン種子の溶媒抽出物、種子油、又は精油に由来するものであることを特徴とする〈１〉に記載の骨形成促進剤。
〈３〉さらに、イソフラボン、ビタミンＫ２、ビタミンＤ、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸化合物から選ばれる抗骨粗鬆症剤又は骨形成促進剤の１種又は２種以上を含有することを特徴とする〈１〉又は〈２〉に記載の骨形成促進剤。
〈４〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の骨形成促進剤を含有することを特徴とする香料組成物。
〈５〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の骨形成促進剤又は〈４〉に記載の香料組成物を含有することを特徴とする飲食品。
〈６〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の骨形成促進剤又は〈４〉に記載の香料組成物を含有することを特徴とする動物用飼料。
〈７〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の骨形成促進剤又は〈４〉に記載の香料組成物を含有することを特徴とする医薬品又は医薬部外品。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、チモキノンを有効成分とすることを特徴とし、食経験豊富な調味料であるブラッククミン種子由来の溶媒抽出物、種子油、精油を用いることにより、副作用の少ない安全・安心な骨形成促進剤を提供することが可能となる。また、本発明の骨形成促進剤は、従来調味料として用いられているブラッククミンに由来するものであり、極微量で効果を発揮するものであるため、本発明の骨形成促進剤を香料の形で提供できるほか、飲食品、動物用飼料に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】供試試料Ａ〜Ｃの細胞毒性試験の結果を示すグラフ
【図２】供試試料Ａ〜ＣのALPase活性に及ぼす影響を示したグラフ
【図３】供試試料Ａ（チモキノン）の石灰化物形成試験の結果を示すウェルプレートの写真
【図４】供試試料Ａ（チモキノン）のＩ型コラーゲン（上段）およびBSP（下段）の遺伝子発現に及ぼす影響を示したグラフ
【図５】実施例６で得られたブラッククミン精油のガスクロマトグラムを示す図
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ブラッククミン種子（の溶媒抽出物および精油）に含有されるチモキノンが、非常に高い抗骨粗鬆症効果を示すという知見に基づくものである。
【００１８】
ブラッククミンは、学名が、Nigella sativa L.、和名が、クロタネソウ、英名が、ブラッククミン（Black Cumin）であり、ブラックキャラウェイ、ニゲラ、カロンジなどの別名でも呼ばれる植物であり、地中海沿岸原産で、食用に中東やインドで広く栽培されている。キンポウゲ科に属し、高さ２０〜３０ｃｍになる一年草で、花期は６〜７月、羽状葉と灰青色の花をつけ、花後に黒い種子入りの朔果をつける（上記非特許文献７参照）。
【００１９】
ブラッククミンの種子は、長さ３ｍｍ、径１．５ｍｍ、厚さ１ｍｍで、芳香が強く、辛味があり、調味料として用い、インド、エジプト、ギリシャ、トルコ料理でよく使用される。パンやケーキに風味をつけ、インドでは、ガラムマサラの原料として用いられ、カレーや野菜料理の香味づけに利用される。
また、ブラッククミン種子は、伝承薬として、喘息、咳、気管支炎、頭痛、リューマチ、熱、湿疹の治療に用いられるほか、利尿薬、催乳剤、駆虫剤として使用される。最近では、抗菌作用、抗酸化作用、抗炎症作用、平滑筋弛緩効果、抗腫瘍、鎮痛作用などを有することが知られている（上記非特許文献８〜１０等）。
【００２０】
ブラッククミン種子の精油成分としては、チモキノン、チモール、カルバクロール、チモヒドロキノン等が報告されている（上記非特許文献１１〜１４）。
このブラッククミン種子に含有される成分であるチモキノンを有効成分とする消臭剤が、酸性〜中性〜弱塩基性の、幅広いpH領域で、高い消臭効果を有することも報告されている（上記特許文献１０）。
【００２１】
本発明において、その骨形成促進効果を見いだしたチモキノンは、前述のブラッククミン種子に含有される精油成分のひとつであって、下記の式で表される、２−イソプロピル−５−メチル−１，４−ベンゾキノンであって、分子量１６４．２０、沸点２３０〜２３２℃、融点４５〜４７℃（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社  ２００９−２０１０版カタログ  第２３７７頁参照）の化合物である。
【００２２】
【化１】
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そして、前述のとおりブラッククミン種子は古くから食用や伝承薬に用いられており、その精油成分の１つであるチモキノンの高い安全性を示すものである。
【００２３】
本発明における骨形成促進剤の有効成分であるチモキノンは、化学的合成品を使用することができるが、チモキノンを含有するブラッククミン等の植物又はそれを処理して得られるものからも取得することもできる。
すなわち、本発明における骨形成促進剤としては、ブラッククミン種子の粉砕物、又は、ブラッククミン種子の溶媒抽出物、種子油又は精油等のブラッククミン種子から得られるチモンキノン含有品、或いはチモキノン高純度品等を適宜使用することができる。
【００２４】
ブラッククミン種子の粉砕物としては、ブラッククミンの種子を粉砕ミルにかけて粉砕した後、適当なサイズのメッシュを通して作製した粉末を使用することが出来る。
また、ブラッククミン種子からチモキノン含有品を得るための方法は特に限定されないが、各種溶媒による抽出、超臨界炭酸ガス抽出、水蒸留、水蒸気蒸留、マイクロウエーブ抽出法、圧搾法（コールドプレス法）などにより得ることができ、これらの方法は適宜組み合わせて利用される。抽出に用いる溶媒は、極性溶媒、非極性溶媒のいずれでもよく、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ｎ−ヘキサン等およびそれらの混合液を用いることが出来るが、より好ましくはメタノール、含水メタノール、エタノール、含水エタノール、アセトン、酢酸エチルが使用される。また上記抽出溶媒に有機および無機の酸を添加した酸性溶媒や有機および無機の塩基を添加した塩基性溶媒も使用することが出来る。
【００２５】
本発明の骨形成促進剤の有効成分であるチモキノンは、より好ましくは、（１）種子の粉砕品に水蒸気を通じて蒸留液を得、その浮油を採取する方法、（２）（１）の蒸留液にｎ−ヘキサンや酢酸エチル等の有機溶媒を加えて分液操作を行った後に得られた有機相を濃縮する方法、（３）種子の極性または非極性溶媒抽出物に水蒸気を通じて蒸留した後にｎ−ヘキサンや酢酸エチル等の有機溶媒を加えて分液操作、さらにこの有機相を濃縮する方法等により得たチモキノン含有量を高めた精油を使用することができる。
【００２６】
また、本発明の骨形成促進剤の有効成分であるチモキノンに天然品を用いる場合、前記のブラッククミン以外にチモキノン（ＴＱ）を含有する植物として、オレガノ（学名：Origanum vulgare）、タイム（学名：Thymus  vulgaris  L．）ウィンターセーボリー（学名：Satureja montana L.）などが用いられる。
【００２７】
また、本発明の骨形成促進剤の有効成分はそれ単独で用いてもよく、他の抗骨粗鬆症剤又は骨形成促進剤の有効成分と組み合せて用いてもよく、例えば、本発明の骨形成促進剤に、抗骨粗鬆症又は骨形成促進効果を有する、ダイゼインやゲニステインなどの大豆イソフラボン、ビタミンＫ２、ビタミンＤ、カルシウム、マグネシウム、リン酸化合物などの骨形成促進剤又は抗骨粗鬆症剤をさらに添加することができる。
【００２８】
本発明の骨形成促進剤は、種々の剤型に調製し得る。
例えば、本発明の骨形成促進剤の有効成分であるチモキノンを適宜な溶媒に溶解した溶液状のもの、或いはペースト状、粉粒状、ブロック状、更にはマイクロカプセル状など、所望の形態に調製したものを使用し得る。
【００２９】
本発明のチモキノンを有効成分とする骨形成促進剤は、従来調味料として用いられているブラッククミンに由来するものであり、微量で効果を発揮するものであるため、本発明の骨形成促進剤を香料の形で提供できるほか、飲食品、動物用飼料に使用できる。例えば、本発明の骨形成促進剤を、所定の割合で、カルシウムを配合したサプリメント錠剤やビタミンＤ３やＫを配合したカプセル製剤、大豆イソフラボンを配合した健康食品等、さらには骨粗鬆症予防を目的としたペットフードや競走馬や家畜用の飼料等に添加し、常法に従って加工することにより製造することができる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明について説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３１】
まず、本発明に係わる抗骨粗鬆症試験法について説明する。
骨芽細胞は、高いアルカリフォスファターゼ(ALPase)活性を有し、Ｉ型コラーゲンや骨シアロタンパク(BSP)などの細胞外マトリックスタンパクを多く産生し、骨形成において中心的な役割を演じている。ALPaseは、アルカリ性下で有機リン酸エステル化合物のエステル結合を水解する酵素であり、骨形成の石灰化過程において重要であり、ピロリン酸やATPなどの石灰化阻害物質を水解するだけでなく、ヒドロキシアパタイト結晶形成に必要な局所のリン酸濃度の押し上げにも深く関与している。また、I型コラーゲンは、骨芽細胞がヒドロキシアパタイト結晶を形成する際の足場として機能している。一方、BSPやオステオカルシン、オステオポンチンなどの非コラーゲン性マトリックスタンパクは、コラーゲンとともにヒドロキシアパタイト結晶核形成やその成長に関与することが知られている。
実施例では、細胞増殖、骨芽細胞のALPase活性、石灰化物形成及びBSPおよびＩ型コラーゲンの発現に及ぼす各供試試料の影響を検討した。
【００３２】
＜供試試料＞
Ａ：チモキノン
Ardrich社製の試薬を入手して実験に供した。
Ｂ：アルファルファ抽出物
アルファルファ乾燥葉（生活の木社製）５０ｇを７０％（ｗ／ｗ）エタノール４５０ｇに浸漬し、７０℃付近で１時間抽出した。次に抽出液を吸引濾過（濾紙ADVANTEC TOYO No.2）した後、濾液を減圧濃縮することにより、濃緑色ペースト状のアルファルファ抽出物16.49 gを得、比較用として実験に供した。
Ｃ：イプリフラボン
比較用として、和光純薬製の試薬を入手して実験に供した。
イプリフラボン（化学名：7-Isopropoxyisoflavone）は、ムラサキウマゴヤシ（アルファルファ）に含まれるイソフラボン誘導体の一種であり、白色〜帯黄白色の結晶または結晶性の粉末である。骨吸収抑制作用を有することが知られており、骨粗鬆症における骨量減少の改善に用いられる。分子式C18H16O3、分子量280.32をもつ（非特許文献１５、１６参照）。
【００３３】
＜供試細胞＞  
骨芽細胞としてラット骨肉腫由来の株化細胞 (ROS17/2.8細胞)
を用いた。
ROS17/2.8細胞の培養は１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン‐ストレプトマイシン溶液添加のα-minimal essential medium (α-MEM)を培養液として用い、37℃、５％炭酸ガス存在下で行った。
【００３４】
＜実験方法および結果＞
（実施例１：細胞増殖試験）
抗骨粗鬆症効果について評価するに先立ち、供試試料が供試細胞に対する影響を調べる目的で細胞毒性試験を実施した。
具体的には、96 well培養プレートに播種されたROS17/2.8細胞を、無添加(コントロール)及び１０−６Ｍの各試料を添加した培地で１０日間培養後、培養３、５、７及び１０日目に細胞増殖を調べた。細胞増殖はcell-counting kit（同仁化学）を用いて、細胞数を調べた。結果を図１に示す。
ROS17/2.8細胞の増殖には、１０日間の培養期間を通してＡ、Ｂ及びＣグループのいずれの試料とも添加の影響（細胞毒性）は認められなかった。
【００３５】
（実施例２：アルカリフォスファターゼ（ALPase）活性試験）
ALPaseは、培養５日目に、前記の培養プレート上で直接その活性を測定した。すなわち、培養プレートの各well内の細胞をPBSで洗浄後、８ｍＭパラニトロフェニルリン酸，１０ｍＭ塩化マグネシウムおよび０．１ｍＭ塩化亜鉛を含む０．１ＭグリシンＮａＯＨ緩衝溶液（pH１０．５）１００μｌを加えて、３７℃で１０分間酵素反応を行った。その後、０．２Ｍ水酸化ナトリウム溶液１００μｌを加えて酵素反応を停止し、この間に生成したパラニトロフェニール量を、マイクロプレートリーダーを用いて波長４０５ｎｍでの吸光度で測定した。ALPase活性値は、３７℃で１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェニルリン酸を加水分解する酵素量を１Ｕとし、細胞数１０４個当たりのmUnitに換算した。結果を図２に示す。
ROS17/2.8細胞のALPase活性は、Ａ試料の添加では顕著に増加した。一方、Ｂ試料及びＣ試料の添加では、ALPase活性は変化しない、もしくは低下する傾向が認められた。
以上の結果から、本発明の骨形成促進剤において、チモキノンの含有量は、好ましくは１０−１８〜５．０モルであり、より好ましくは１０−１５〜０．４モルであると予測される。
【００３６】
（実施例３：石灰化物形成の観察）
24well培養プレートに播種されたROS17/2.8細胞を、１０ｍＭβ-glycerophospahteおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む石灰化誘導培地に、無添加(control)、１０−１１及び１０−１０MのＡ試料を添加して１０日間培養した。なお、β-glycerophospahteおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含まない培地で培養したものをnegative controlに、β-glycerophospahteおよび５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む培地に各種抽出物を加えて培養したものをpositive controlとした。培養３、５及び７日目に細胞層を４％中性ホルマリン溶液で固定し、１％アリザリン赤（シグマ）溶液で石灰化物を染色した。結果を図３に示す。
【００３７】
ContorolおよびＡ試料を添加した条件におけるROS17/2.8細胞のalizarine  redの染色性は，培養3日目に比べて培養5および7日で増加する傾向が認められた。
また，negative controlにおける染色性は、controlに比べて著しく低下した。培養７日目のROS17/2.8細胞の染色性は、controlに比べてＡ試料を添加した条件で増加した。
以上の結果から、Ａ試料（チモキノン）には、骨芽細胞の石灰化物形成能を増加させる作用があることが示唆された。
【００３８】
（実施例４：骨基質タンパク発現の検索）  
ROS17/2.8細胞を無添加(control)、１０−１１及び１０−１０MのＡ試料を添加した培地で5日間培養後、細胞からRNAを抽出し、Ｉ型 コラーゲンおよびbone sialoprotein
(BSP)の遺伝子発現をreal-time  PCR法でmRNAレベルで調べた。すなわち、細胞から全RNAを抽出後、逆転写酵素でmRNAからcDNAを作成し、SYBER-GreenＩを用いてreal-time  PCRを行って調べた。遺伝子の増幅は、Smart  Cycler II systemを用いて９５℃で５５秒間、６０℃で２０秒間を１サイクルとし、３５サイクル行った。結果の解析はSmart Cycler softwareを用いて、あらかじめ作成した検量線をもとに遺伝子の増幅量を求め、グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素の増幅量で補正した値をmRNA発現量とした。すべての実験は３回繰り返し、平均値と標準偏差で表した。結果を図４に示す。
Ｉ型コラーゲンおよびBSPの遺伝子発現は、Ａ試料の添加によって、培養5日目に増加した。
【００３９】
（実施例５：ブラッククミン種子の溶媒抽出）
ブラッククミン種子は、インド産のものをArjuna社（インド、ケララ州）より入手し
て実験に供した。
未粉砕種子１０００ｇをメタノール２０００ｇに浸漬し、約60℃に加温して３時間攪拌抽出した後、吸引濾過（ADVANTEC  TOYO No.2濾紙を使用）して濾液と残渣に分けた。残渣は、再度メタノール２０００ｇで同様に抽出、吸引濾過した。つぎに両濾液をあわせ、常圧下で濃縮した後、ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒臭がなくなるまで濃縮した。得られたブラッククミン種子のメタノール抽出濃縮物の２２．８８ｇに水蒸気を通じ、留液が３０００ｇに達するまで蒸留した。得られた蒸留液を酢酸エチル４００ｍｌで分配（２回反復）し、酢酸エチル相を常圧濃縮後、ロータリーエバポレーターにて減圧下で濃縮し、精油分を得た。
【００４０】
上記の精油につき、ＧＣ分析に供して、精油中のチモキノンについて検出確認した。
成分分析法
＜ＧＣ分析条件＞
〔装置〕  ＧＣ： HP 5890 Series 2 
〔カラム〕  ＧＬ Sciences TC-1：３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μm
〔温度条件〕  初期温度５０℃→３℃昇温／ｍｉｎ→３００℃（２０分間保持）
〔キャリアガス〕  Ｈｅ
〔流量〕  ０．７ｍｌ／ｍｉｎ
〔注入口温度〕  ３００℃
〔注入量〕  ・各溶媒抽出物：１０％（ｗ／ｗ）エタノール溶液を１．０μｌずつ注
入した。
・各蒸留精油：０．１μｌずつ注入した。
図５にガスクロマトグラムを示す。該図において矢印で示すピークがチモキノンである。
【００４１】
（実施例６：抗骨粗鬆症香料の処方例）
以下にチモキノン又はブラッククミン種子溶媒抽出物（＊）を配合した香料の処方例
を示す。
【００４２】
＜ミント香料＞
2013194031.tif 000004
【００４３】
＜バナナ香料＞
2013194031.tif 000005
【００４４】
＜グレープ香料＞
2013194031.tif 000006
【００４５】
＜ストロベリー香料＞
2013194031.tif 000007
【００４６】
＜パイナップル香料＞
2013194031.tif 000008
【００４７】
＜ローズ香料＞
2013194031.tif 000009
【００４８】
＜ジャスミン香料＞
2013194031.tif 000010
【００４９】
＜ラベンダー香料＞
2013194031.tif 000011
【００５０】
＜グリーンアップル香料＞
2013194031.tif 000012
【００５１】
（実施例７：抗骨粗鬆症香料の処方例）
以下にチモキノン又はブラッククミン種子溶媒抽出物（＊）を配合した飲食品、動物用飼料、口腔用製品の処方例を示す。
【００５２】
＜シュガーレスガムの処方例＞
ガムベース                              ２５        （質量％）
粉末マルチトール                        ４０
粉末キシリトール                        １９
粉末エリスリトール                        ８
マルチトールシロップ                      ６
スクラロース                              ０．０２
アセスルファムカリウム                    ０．０５
ＭＣＴ                                    ０．２
ブラッククミン種子抽出物                  １．０（＊）
香料                                      ０．７３    
合      計                        １００．０
【００５３】
＜シュガーレスキャンディーの処方例＞
還元パラチノース                        ９７．９  （質量％）
クエン酸                                  ０．７
アスパルテーム                            ０．３
香料                                      ０．２
色素                                      ０．１
ブラッククミン種子精油                    ０．８（＊）
合      計                        １００．０
【００５４】
＜キャンディーの処方例＞
グラニュー糖                            ４２．０  （質量％）
水飴                                    ５７．０
クエン酸                                  ０．７
ミント香料（含ブラッククミン種子精油）    ０．２（＊）
色素                                      ０．１
合      計                        １００．０
【００５５】
＜グミ＞
還元麦芽糖水飴                                ５０．０  （質量％）      
グラニュー糖                                  ３０．０
ゼラチン                                        ５．０
水                                              ９．２７
パイナップル果汁                                ５．０
パイナップル香料（含ブラッククミン種子精油）    ０．７（＊）
色素                                            ０．０３                
合      計                            １００．０
【００５６】
＜果汁飲料＞
温州みかん濃縮果汁                        ８．０  （質量％）
ブドウ糖液糖                            １０．０
L-アスコルビン酸                          ０．０２
水                                      ８２．３８
ブラッククミン種子抽出物                  ０．５（＊）
香料                                      ０．１                        
合      計                        １００．０
【００５７】
＜清涼飲料＞
グレープ果汁                            ０．５  （質量％）
果糖ブドウ糖液糖                      １４．０
クエン酸                                ０．２
グレープ香料（含ブラッククミン種子精油）０．５（＊）
水                                    ８４．８                          
合      計                      １００．０
【００５８】
＜ヨーグルト＞
牛乳                                        ４４．０  （質量％）
脱脂粉乳                                      ６．０
砂糖                                          ８．０
寒天                                          ０．１５
ゼラチン                                      ０．１
乳酸菌                                        ０．００５
ストロベリー香料（含ブラッククミン種子精油）  ０．３（＊）
水                                            残部                      
合      計                            １００．０
【００５９】
＜ビスケット＞
強力粉                                      ２７．７  （質量％）
薄力粉                                      ２７．７
上白糖                                        ８．３
粉糖                                        １１．１
ショートニング                              ２７．７
重曹                                          ０．１７
全脂粉乳                                      １．１１
水                                            ５．５５
ブラッククミン種子抽出物                      ０．０６（＊）              
合      計  （出来上がり重量）        １００．０      
【００６０】
＜錠菓＞
還元パラチノース                            ８９．３（質量％）
キシリトール                                  ５．０
ショ糖脂肪酸エステル                          ２．０
クエン酸                                      １．０
微粒二酸化ケイ素                              ０．５
アスパルテーム                                ０．３
アラビアガム                                  ０．１
バナナ香料（含ブラッククミン種子精油）        １．０（＊）
色素                                          ０．１                      
合      計                            １００．０
【００６１】
＜錠剤＞
ドロマイト                              ８６．０  （質量％）
結晶セルロース                            ５．７
麦芽糖                                    ３．７
グリセリン脂肪酸エステル                  １．５
カルボキシメチルセルロースＮａ            １．７
アラビアガム                              ０．２
ショ糖                                    ０．２
ミント香料（含ブラッククミン種子精油）    １．０（＊）                    
合      計                        １００．０
【００６２】
＜ソフトカプセル＞
サフラワー油                            ８３．０  （質量％）    
グリセリン脂肪酸エステル                  ６．０
大豆レシチン                              ２．０
ミツロウ                                  ４．０
ブラッククミン種子油                      ５．０（＊）                  
合      計                        １００．０    
【００６３】
＜飼料＞
トウモロコシ                            ２６．０  （質量％）
大豆粕                                  ２６．０
大豆タンパク質                          １８．０
小麦粉                                  １５．０
えん麦                                    ３．０
アルファルファ                            ２．０
魚粉                                      ２．０
コーングルテン                            ６．０
脱脂粉乳                                  ０．５
ブラッククミン種子抽出物                  １．５（＊）                  
合      計                        １００．０
【００６４】
＜練り歯磨き＞
水酸化アルミニウム                            ４３．０  （質量％）
グリセリン                                    ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム            ２．０
ソジウムラウリルサルフェート                    ２．０
香料                                            １．０
サッカリンナトリウム                            ０．１
ブラッククミン種子抽出物                        ０．５（＊）
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム              ０．２
水                                            ３１．２                    
合        計                            １００．０    
【００６５】
＜口腔用軟膏＞
流動パラフィン                                １５．０（質量％）
セタノール                                    １０．０
グリセリン                                    ２０．０
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル      ５．０
サッカリンナトリウム                            ０．１
香料                                            ０．５
ブラッククミン種子精油                          ０．３（＊）
水                                            ４９．１                  
合      計                              １００．０
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、チモキノンを有効成分とすることを特徴とし、食経験豊富な調味料であるブラッククミン種子由来の溶媒抽出物、種子油、精油を用いることにより、副作用の少ない安全・安心な骨形成促進剤を提供することが可能となる。また、本発明の骨形成促進剤は、従来調味料として用いられているブラッククミンに由来するものであり、極微量で効果を発揮するものであるため、本発明の骨形成促進剤を香料の形で提供できるほか、飲食品、動物用飼料、医薬品、医薬部外品等に使用できる。
【図１】
2013194031.tif 000013
【図５】
2013194031.tif 000014
【図２】
2013194031.tif 000015
【図３】
2013194031.tif 000016
【図４】
2013194031.tif 000017