(57)【要約】【課題】炎症反応惹起の後に投与しても炎症反応を遮断して炎症を治療することができる医薬組成物を提供する。【解決手段】Toll様受容体4 (TLR4)を認識し、かつ炎症反応惹起後の炎症を抑制する抗体又はその抗原結合性断片が、炎症反応を惹起した対象に投与されるように用いられることを特徴とする、前記抗体又はその抗原結合性断片を含有する炎症治療用医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Toll様受容体4 (TLR4)を認識し、かつ炎症反応惹起後の炎症を抑制する抗体又はその抗原結合性断片が、炎症反応を惹起した対象に投与されるように用いられることを特徴とする、前記抗体又はその抗原結合性断片を含有する炎症治療用医薬組成物。
【請求項２】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗体が、受託番号がNITE P-1320であるハイブリドーマにより産生されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗体が、受託番号がNITE P-1280であるハイブリドーマにより産生されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト抗体である、請求項１または2に記載の医薬組成物。
【請求項６】
炎症が、感染症に伴う炎症、外傷に伴う炎症、自己免疫疾患に伴う炎症、アレルギーに伴う炎症、及び腫瘍に伴う炎症からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症とは、発赤、熱感、腫瘤、疼痛、機能障害等の症状を示す局所の病理変化である。
炎症の原因としては、感染症、骨折などの外傷、関節リウマチなどの自己免疫疾患、アレルギー、腫瘍等の原因があるが、このうち、感染症が原因である事例が最も多い。
【０００３】
感染症の場合、感染症を引き起こす病原体が生体に侵入すると、侵入した病原体は、最初にマクロファージなどの細胞に発現しているToll様受容体（Toll-Like Receptor：TLR)という分子に認識される。
【０００４】
ここでTLRは、細胞外領域にロイシンリッチリピート(LRR)を有し、細胞内領域にToll/IL-1R相同領域(TIRドメイン)を有するI型膜貫通タンパク質である。TLRのうちTLR4は、病原体であるグラム陰性菌の細胞壁に特異的な糖脂質であるリポポリサッカライド(LPS)等のリガンドを認識する。
【０００５】
TLR4を介した炎症反応惹起のメカニズムは次のように考えられている。先ず、LPS等のリガンドがマクロファージ等の細胞のTLR4に結合すると、MyD88が細胞内のTIRドメインを介してTLR4と結合し、IRAKsを活性化する。IRAKsは、さらにTRAF6と相互作用し、IKK複合体を活性化させる。IKK複合体は、IκBαをリン酸化してプロテアソームによるIκBαの分解を誘導する。これにより、IκBによりマスクされていたNF-κBの核内移行シグナルが露出し、NF-κBが核内に移行する。NF-κBは、DNA上のκBモチーフと呼ばれる配列に結合し、TNF-α、IL-6、IL-12p40などの炎症性サイトカインの転写を活性化し、これらのサイトカインの産生誘導により、炎症反応を惹起する。このようにして炎症反応がいったん起こると自己増殖的にその反応が増強する。
【０００６】
外傷、自己免疫疾患、アレルギー、腫瘍等に伴って起こる炎症についても、感染症と同様に、TLR4を介した炎症反応惹起のメカニズムが関わっていることが知られている。
【０００７】
炎症を抑制するために種々の薬物が臨床応用されているが、それらの薬物のほとんどは、炎症反応により産生されたサイトカインの効果を抑制するものである。
【０００８】
しかしながら、炎症反応がいったん起こると自己増殖的にその反応が増強することから、炎症反応を抑制するには、炎症反応惹起のメカニズムの最初のステップ、つまり、TLR4による病原体認識を阻止するのがより効果的であると考えられる。そこで、製薬会社などを含む多くの研究機関が、TLR4による病原体認識を阻止する天然医薬品又は合成医薬品の開発を進めているが、まだそのような医薬品の臨床応用には至っていない（例えば、非特許文献１〜５）。
【０００９】
そのような医薬品の候補として、TLR4の機能を抑制する抗体が知られており、その有用性が期待されている。例えば、TLR4の機能を抑制する抗体として、TLR4分子のリガンド認識機能を阻害する抗体が報告されている（非特許文献６〜８等）。これらの抗体は、抗炎症作用を持つ抗ヒトTLR4抗体であったが、いずれも炎症反応惹起前に使用した場合にのみ抗炎症効果を示し、症反応惹起後に使用した場合には炎症抑制効果を示さず、使用態様が限られていた。
【００１０】
そして、炎症反応惹起後に使用した場合にも炎症抑制効果を示す抗ヒトTLR4抗体はこれまで報告されていない。
【００１１】
ここで、特許文献１には、CD44TLR4シグナル伝達の経路に関わる分子群、TLR4シグナル伝達を修飾する生理活性分子等を用いて炎症を治療することが記載されている。また、特許文献2には、メチマゾール誘導体及び／又は環状チオン誘導体を用いて炎症等を含むTLR4媒介性疾患を治療することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開2006-83122
【特許文献２】特表2008-545651
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】K Takashima et al. Br J Pharmacol 2009 157: 1250-62
【非特許文献２】T Kawamoto et al. Eur J Pharmacol 2008 584: 40-8
【非特許文献３】T Sha et al. Eur J Pharmacol 2007 571: 231-9
【非特許文献４】N Matsunaga et al. Mol Pharmacol 2011 79(1): 34-41
【非特許文献５】M Li et al. Mol Pharmacol 2006 69(4): 1288-95
【非特許文献６】S. Akashi et al. Biochem Biophys Res Commun. 2000 268(1):172-7
【非特許文献７】R Wang et al. Hybrid Hybridomics 2003 22: 357-65
【非特許文献８】I Dunn-Siegrist et al. J Biol Chem. 2007 282(48):34817-27
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、炎症反応惹起後の対象に投与しても炎症反応を遮断して炎症を治療することができる医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、特定の抗ヒトTLR4抗体を炎症反応惹起後のマクロファージに接触させた場合にマクロファージにおけるサイトカイン産生を抑制して炎症反応を遮断できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  Toll様受容体4 (TLR4)を認識し、かつ炎症反応惹起後の炎症を抑制する抗体又はその抗原結合性断片が、炎症反応を惹起した対象に投与されるように用いられることを特徴とする、前記抗体又はその抗原結合性断片を含有する炎症治療用医薬組成物。
［２］  抗体が、モノクローナル抗体である、上記［１］に記載の医薬組成物。
［３］  抗体が、受託番号がNITE P-1320であるハイブリドーマにより産生されるものである、上記［１］に記載の医薬組成物。
［４］  抗体が、受領番号がNITE AP-1280（受託番号がNITE- P1280）であるハイブリドーマにより産生されるものである、上記［１］に記載の医薬組成物。
［５］  抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト抗体である、上記［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［６］  炎症が、感染症に伴う炎症、外傷に伴う炎症、自己免疫疾患に伴う炎症、アレルギーに伴う炎症、及び腫瘍に伴う炎症からなる群から選択される少なくとも１つである、上記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［１Ａ］  Toll様受容体4 (TLR4)を認識し、かつ炎症反応惹起後の炎症を抑制する抗体又はその抗原結合性断片。
［２Ａ］  抗体が、モノクローナル抗体である、上記［１Ａ］に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［３Ａ］  抗体が、受託番号がNITE P-1320であるハイブリドーマにより産生されるものである、上記［１Ａ］に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［４Ａ］  抗体が、受領番号がNITE AP-1280（受託番号がNITE- P1280）であるハイブリドーマにより産生されるものである、上記［１Ａ］に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［５Ａ］  抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト抗体である、上記［１Ａ］または［２Ａ］に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［６Ａ］  炎症が、感染症に伴う炎症、外傷に伴う炎症、自己免疫疾患に伴う炎症、アレルギーに伴う炎症、及び腫瘍に伴う炎症からなる群から選択される少なくとも１つである、上記［１Ａ］〜［５Ａ］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の炎症治療用医薬組成物は、炎症反応惹起後の対象に投与しても炎症反応を遮断して炎症を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒト末梢血単核球(PBMC)をlipid A (10 ng/ml)で刺激した6時間後の培養液中のIL-6量を示すグラフである。
【図２】ヒト末梢血単核球(PBMC)をlipid A (10 ng/ml)で刺激した6時間後の培養液中のTNF-α量を示すグラフである。
【図３】ヒト末梢血単核球(PBMC)をlipid A (10 ng/ml)で刺激した24時間後の培養液中のIL-12p40量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明の抗体は、TLR4を認識し、かつ炎症反応惹起後の炎症を抑制する抗体又はその抗原結合性断片である。
本発明者は、ヒト末梢血単核球を用いた後述の実施例において、本発明の抗体を炎症反応惹起後の単球等に接触させた場合にも炎症性サイトカインの産生を抑制することを確認した。具体的には、ヒト末梢血単核球を病原体成分で刺激する前又は刺激した後に本発明の抗体を作用させ、培養液中の炎症性サイトカイン(TNF-α、IL-6、及びIL-12p40)量を測定した。その結果、病原体成分で刺激する前の単球等を本発明の抗体と接触させた場合だけでなく、病原体成分で刺激した後の単球等を本発明の抗体と接触させた場合にも、単球等における炎症性サイトカインの産生が抑制されることが判明した（図１〜３）。したがって、本発明の抗体は前投与によって炎症反応の惹起を抑制するだけでなく、一旦惹起した炎症反応を鎮静化する作用もある。これらのことから、本発明者は、本発明の抗体を炎症反応を惹起した対象に投与するように用いることで、炎症を治療し得ることを見出した。
以下、本発明の抗体及び該抗体を含む炎症治療用医薬組成物について説明する。
【００２０】
2. TLR4を認識する抗体
本発明の抗体は、Toll様受容体4 (TLR4)を認識し、かつ炎症反応惹起後の炎症を抑制する抗体又はその抗原結合性断片である。ここで、本明細書中において用語「抗体」には、特に断りのない限り、抗原結合性断片を含むものとする。
【００２１】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
【００２２】
本発明の抗体は、マウスTLR4を認識する抗体、ヒトTLR4を認識する抗体などであるが、ヒトTLR4を認識する抗体であることが好ましい。
【００２３】
本発明のより好ましい態様の抗体は、TLR4の細胞外領域を認識する抗体である。
【００２４】
本発明のさらに好ましい態様の抗体は、ヒトTLR4の細胞外領域を特異的に認識し、かつ炎症反応惹起後の炎症を抑制するモノクローナル抗体である。
【００２５】
本発明において使用される抗体には、キメラ抗体、ヒト型化抗体、又はヒト抗体が含まれ、これらを使用することも可能である。
【００２６】
「炎症反応惹起後の炎症を抑制する」とは、本発明の抗体が炎症性細胞（例えば、マクロファージ、単球、樹状細胞等）による炎症性サイトカインの分泌を抑制することを意味する。例えば、LPS等の病原体成分で刺激した後のマクロファージ等の細胞に本発明の抗体を接触させたときに、本発明の抗体がその細胞の炎症性サイトカインの分泌を抑制する。さらに、本発明の抗体は、LPS等の病原体成分で刺激する前のマクロファージ等の細胞に本発明の抗体を接触させ、その後その細胞をLPS等の病原体成分で刺激したときにも、その細胞の炎症性サイトカインの分泌を抑制することができるものが好ましい。
【００２７】
本発明の特に好ましい態様の抗体は、受託番号がNITE P-1320であるハイブリドーマにより産生されるHT4抗体である。本発明の別の好ましい態様の受領番号がNITE AP-1280（受託番号がNITE- P1280）であるハイブリドーマにより産生されるHT52抗体である。
【００２８】
このような本発明の抗体は、以下に説明する方法等に従って作製することができる。
【００２９】
3. TLR4を認識する抗体の作製
（１）抗原又は抗原産生細胞の調製
マウス及びヒトのTLR4のアミノ酸配列情報はGenBank(商標)等のデータベースから得ることが可能である。これらの全長のアミノ酸配列のうちの少なくとも一部（全部又は一部）を含むポリペプチド又はペプチドあるいはその組換えポリペプチド又はペプチド（単にペプチドともいう）を抗原として使用することができる。ペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌、昆虫細胞などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、これらは当業者に周知の方法を用いることができる。ペプチドを産生する細胞（抗原産生細胞）の作製方法は、ペプチド発現ベクターを哺乳類細胞に導入してペプチド安定発現哺乳類細胞を得る方法などが挙げられ、これらも当業者に周知の方法を用いることができる。
【００３０】
（２）ポリクローナル抗体の作製
上記の通り作製した抗原又は抗原産生細胞を、免疫のため哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定されものではなく、例えばラット、マウス、ウサギなどを挙げることができるがウサギが好ましい。
【００３１】
抗原又は抗原産生細胞の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。免疫は、主として静脈内、足蹠、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、1〜10回免疫を行う。そして、最終の免疫日から3〜7日後に酵素免疫測定法(ELISA又はEIA)、放射性免疫測定法(RIA)、フローサイトメトリー等で抗体価を測定し、所望の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３２】
その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。
【００３３】
（３）モノクローナル抗体の作製
(３−１)抗体産生細胞の採取
前記のように作製した抗原又は抗原産生細胞を、免疫のため哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。免疫手法は前記と同様である。そして、最終の免疫日から1〜60日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などが挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
【００３４】
(３−２) 細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞用培地中で、1×106〜1×107個／mlの抗体産生細胞と2×105〜2×106個／mlのミエローマ細胞とを混合する。次に、細胞融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコール）存在下で融合反応を行う。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００３５】
(３−３) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などに適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００３６】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、TLR4に反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、ELISA、EIA、RIAなどによってスクリーニングすることができる。
【００３７】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行う。TLR4に強い反応性を示す抗体をフローサイトメトリー等により判定し、これを産生するハイブリドーマを選択し、樹立する。
【００３８】
本発明の好ましい態様のハイブリドーマは、炎症反応を惹起した対象に投与した場合にも炎症反応を鎮静化する抗TLR4抗体を産生するハイブリドーマである。そのようなハイブリドーマは、例えば、次のようにしてスクリーニングすることができる。すなわち、LPS等の病原体成分で刺激した後のマクロファージ等の細胞にハイブリドーマ産生抗体を接触させて、そのマクロファージ等の細胞における炎症性サイトカインの産生量が抑制される抗体を産生するハイブリドーマを選択する。好ましくは、LPS等の病原体成分で細胞を刺激した後のマクロファージ等の細胞にハイブリドーマ産生抗体を接触させた時のマクロファージ等の細胞における炎症性サイトカインの産生量を、マクロファージ等の細胞にハイブリドーマ産生抗体を接触させない時と比較して、10%以上、20％以上、30％以上、40％以上、又は50%以上低下させる抗体を産生するハイブリドーマを選択する。炎症性サイトカインの産生量は、例えば、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。
【００３９】
本発明の好ましい態様のハイブリドーマは、「HT4」と称し、2012年4月18日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 NITEバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）に受託番号NITE P-1320として寄託した。寄託者は、国立大学法人佐賀大学（〒 840-8502  佐賀県佐賀市本庄町1番地）である。当該ハイブリドーマは、後述の実施例で使用したマウス抗ヒトTLR4モノクローナル抗体HT4を産生する。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様のハイブリドーマは、「HT52」と称し、2012年3月14日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 NITEバイオテクノロジー本部  特許微生物寄託センター）に受領番号NITE AP-1280（受託番号NITE- P1280）として寄託した。寄託者は、国立大学法人佐賀大学（〒840-8502  佐賀県佐賀市本庄町1番地）である。当該ハイブリドーマは、後述の実施例で使用したマウス抗ヒトTLR4モノクローナル抗体HT52を産生する。
【００４１】
(３−４) モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマを培養し、得られる培養物からモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法、又は腹水形成法等を採用することができる。「培養」とは、上記ハイブリドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させること、あるいは上記ハイブリドーマを動物の腹腔内で増殖させることを意味する。
【００４２】
例えば、細胞培養法においては、ハイブリドーマを10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃、5％CO2濃度）で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００４３】
また、腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物や免疫不全ラットの腹腔内にハイブリドーマを約1×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集する。
【００４４】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、カプリル酸沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４５】
（４）抗原結合性断片、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体
抗原結合性断片も本発明の抗体に含まれる。抗原結合性断片としては、前記ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはFab、F(ab’)2、Fv(variable fragment of antibody)等が挙げられる。
【００４６】
本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体等でもよい。
【００４７】
キメラ抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域(V領域)をヒト定常領域に連結する。キメラ抗体の作製法は、当分野において周知である。
【００４８】
ヒト型化抗体を作製する場合は、マウス抗体のV領域から相補性決定領域(complementarity determining region; CDR)をヒトV領域に移植して、フレームワーク領域(FR)はヒト由来のものを、CDRはマウス由来のものからなる再構成したV領域を作製する。次にこれらのヒト型化された再構成ヒトV領域をヒト定常領域に連結する。ヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である。
【００４９】
ヒト抗体は、一般にV領域の抗原結合部位である超過変領域(Hyper Variable region)、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。
【００５０】
４．医薬組成物又は治療方法
本発明の抗体は、炎症を治療するための医薬組成物の活性成分として有用である。
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を活性成分として含む。すなわち、本発明の医薬生物は、本発明の抗体が炎症反応を惹起した対象に投与されるように用いられることを特徴とする、本発明の抗体を含有する、炎症治療用医薬組成物である。本発明の好ましい態様の医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含む。
また、本発明は、炎症反応を惹起した対象に投与されるように用いられることを特徴とする炎症治療用医薬組成物の製造に用いるための本発明の抗体の使用を提供する。
【００５１】
「炎症反応を惹起した対象」とは、炎症の症状、すなわち、発赤、熱感、腫瘤、疼痛、機能障害等のうちの少なくとも１つの症状を発症している対象を意味する。対象が炎症反応を惹起したか否かは、当分野で公知の方法により判断することができる。
【００５２】
また、本発明は、炎症反応を惹起し炎症の治療を必要とする対象に、治療的有効量の本発明の抗体を投与することを含む、炎症の治療方法を提供する。
【００５３】
対象は、例えば、ヒト又はその他の哺乳動物（ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）であるが、好ましくは、ヒトである。
【００５４】
本発明の医薬組成物又は治療方法（以下、「本発明の医薬組成物」と記載する。）の適用の対象となる疾患は、炎症であり、例えば、感染症に伴う炎症、外傷に伴う炎症、自己免疫性疾患に伴う炎症、アレルギーに伴う炎症、及び腫瘍に伴う炎症などが挙げられ、これらの疾患は単独であってもよく、２つ以上が併発してもよい。本発明の好ましい態様の医薬組成物の適用の対象となる疾患は、感染症に伴う炎症である。本発明の医薬組成物により、炎症の症状、すなわち、発赤、熱感、腫瘤、疼痛、機能障害等のうちの少なくとも１つの症状を緩和することができる。
【００５５】
「薬学的に許容され得る担体」としては、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
【００５６】
本発明の医薬組成物の投与量又は治療的有効量は、患者の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される活性成分である本発明の抗体の種類などにより異なるが、通常成人一人当たり、一回につき5 mgから500mgの範囲で投与することができるが、この範囲に限定されるものではない。
【００５７】
例えば注射剤により投与する場合は、炎症を罹患している対象(例えば、ヒト)に対し、１回の投与において1kg体重あたり、100μg〜10 mgの量を、１日あたり１回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００５８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
方法
ヘパリン添加ヒト末梢血からFicoll-Paque PLUS (GE Healthcare)を用いて末梢血単核球(PBMC)を分画し、PBMCを、10% 牛胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地に1x106/mlの濃度で懸濁した。PBMC懸濁液100 μl (1x105個)を96-well microplateに播種し、各種抗体HT4, HT52, HT60, UT15 (10 μg/ml)の存在下、lipid A (10 ng/ml、ペプチド研究所)で37度、CO2incubator中で刺激した。
【００６０】
抗体はlipid A刺激10分前あるいは30分後に添加した。刺激後6時間(IL-6, TNF-α)あるいは24時間後(IL-12p40)に細胞培養液を回収し、測定まで-80度で冷凍保存した。培養液中のサイトカイン濃度は市販のELISA kit (IL-6, eBioscience; TNF-α, IL-12p40, BioLegend)を用いて測定した。測定値は平均+/-標準偏差(n=3)で示す。その結果を図1〜3に示した。図1〜3において、「10’ pre」は、lipid A刺激10分前に抗体を添加したケースを示し、「30’ post」は、lipid A刺激30分後に抗体を添加したケースを示す。また、「+」は、lipid A又は各種抗体を添加したケースを示し、「-」は、lipid A又は各種抗体を添加しなかったケースを示す。
【００６１】
モノクローナル抗体
HT4抗体： 抑制型マウス抗ヒトTLR4抗体(Mouse IgG2b)
HT52抗体： 抑制型マウス抗ヒトTLR4抗体(Mouse IgG1)
HT60抗体： マウス抗ヒトTLR4抗体(Mouse IgG1)
HT60抗体は、抑制作用を有さないヒトTLR4コントロール抗体である。
UT15抗体： マウス抗マウスTLR4抗体(Mouse IgG1)
UT15抗体は、アイソタイプコントロール抗体であり、ヒトTLR4に無反応である。
【００６２】
上記抗体のうちHT4抗体及びHT52抗体は、それぞれ、前記ハイブリドーマHT4及びHT52により産生される抗体である。
【００６３】
HT60抗体を産生するハイブリドーマを次のように作成した。ヒトTLR4(hTLR4)とC末端にFLAGタグを付与したヒトMD-2(hMD-2F)を安定発現するBa/F3トランスフェクタント細胞 (５×107個)をcompleteFreund’sadjuvant(Difco, Lawrence, KS, USA)とのエマルジョンとして、TLR4欠損マウス(大阪大学審良静男博士より供与、Hoshino, K., O. Takeuchi, T. Kawai, H. Sanjo, T. Ogawa, Y. Takeda, K. Takeda, and S. Akira. 1999. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol 162:3749-3752.)に腹腔内投与した。初回免疫10日後、1.5×107個の上記安定発現細胞をPBS懸濁液として腹腔内投与し、追加免疫を行った。追加免疫3日後、マウスより脾臓を摘出、polyethyleneglycol1500(RocheAppliedScience, Indianapolis, IN, USA)を使って脾臓細胞とSP2/Oミエローマを細胞融合させた。目的のTLR4抗体を産生するハイブリドーマを、96-wellplateに播種しHAT培地による選別の後、ｈTLR4とhMD-2Fを安定発現するHEK293細胞とHEK293親細胞に対するハイブリドーマ培養上清の反応性を指標にフローサイトメトリーでスクリーニングした。目的のハイブリドーマを含む陽性ウェルの細胞を限界希釈法によりクローン化し、同様の方法で目的のハイブリドーマシングルクローンを得た。このハイブリドーマが産生する抗体を用いた。
【００６４】
UT15抗体は、Hybridoma (Larchmt). 2007 26(6):393-9に記載の方法に従って入手することができる。
【００６５】
結果
Lipid A刺激によりPBMCからの炎症性サイトカイン(IL-6, TNF-α, IL-12p40)産生が認められ、HT4抗体とHT52抗体を刺激10分前に添加すると抑制された（図１〜３）。
また、lipid A刺激30分後にHT4抗体とHT52抗体を添加した場合でも、HT4抗体とHT52抗体を刺激10分前に添加した場合と同様にlipid Aによるサイトカイン産生が抑制された（図１〜３）。
【００６６】
一方、コントロール抗体であるHT60抗体とUT15抗体をlipid A刺激前後いずれに添加してもサイトカイン産生の顕著な抑制効果は認められなかった（図１〜３）。
【００６７】
考察
HT4抗体とHT52抗体をPBMCに前処置すると、これらの抗体はlipid AによるTLR4の活性化を抑制し、炎症性サイトカインの産生を抑制することが判明した。また、lipid A刺激30分後にこれら抗体を添加した場合でも、炎症性サイトカインの産生を抑制することができることも判明した。したがって、HT4抗体とHT52抗体は前投与によって炎症反応の惹起を抑制するだけでなく、一旦惹起した炎症反応を鎮静化する作用もある。
【００６８】
これらのことから、本発明の抗体は、炎症反応惹起後に投与してもサイトカインの産生を抑制して炎症反応を遮断できることが分かった。このため、本発明の抗体は、炎症治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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