(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＤＧＦＲαに対する抗体及びその利用の提供。【解決手段】ＰＤＧＦＲαの１０６番目から３１１番目のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体、Ｔ細胞による抗体依存性細胞傷害性活性（ＡＤＣＣ活性）が５０％以上である、抗ＰＤＧＦＲα抗体、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ活性）が１５％以上である、抗ＰＤＧＦＲα抗体等に関する。更に本発明は前記抗体をコードするＤＮＡ、及び前記抗体を有効成分として含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＧＦＲαの１０６番目から３１１番目のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項３】
Ｔ細胞による抗体依存性細胞傷害性活性（ＡＤＣＣ活性）が２５％以上である、抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項４】
２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有する抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項５】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ活性）が１０％以上である、抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項６】
更に、Ｔ細胞による抗体依存性細胞傷害性活性（ＡＤＣＣ活性）が２５％以上である、請求項４に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項７】
ＰＤＧＦＲαの１０６番目から３１１番目のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する、請求項３〜請求項５のいずれか１項に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項８】
配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する、請求項３〜請求項５のいずれか１項に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項９】
重鎖のＣＤＲ１が配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号５に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号７に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号８に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号９に記載されたアミノ酸配列を有する抗体。
【請求項１０】
（ｉ）重鎖の可変領域が、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される１のアミノ酸配列を有し：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列；及び／又は、
（ｉｉ）軽鎖の可変領域が、以下の（ｄ）〜（ｆ）から選択される１のアミノ酸配列を有する：
（ｄ）配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、
（ｅ）配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
（ｆ）配列番号１１のアミノ酸配列、
ＰＤＧＦαに結合可能な抗体。
【請求項１１】
ＰＤＧＦＲαと解離定数（Ｋｄ）７×１０−９以下で結合する、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか1項に記載の抗体を含有する、医薬組成物。
【請求項１３】
細胞増殖に基づく疾患の治療薬である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板由来成長因子受容体α（以下、「ＰＤＧＦＲα」という）を抗原として認識する抗体及びその利用に関する。本発明の一部は、ヒト化された抗ＰＤＧＦＲα抗体及びその利用に関する。本発明は、抗ＰＤＧＦＲα抗体をコードする遺伝子、及び抗ＰＤＧＦＲα抗体を産生する細胞を含む。当該抗体の利用は、特には、ＰＤＧＦＲαの活性、発現又は過剰発現が関係する疾患の治療及び診断への利用である。
【背景技術】
【０００２】
血小板由来成長因子（以下、「ＰＤＧＦ」という）は、細胞の成長、分化、遊走等を制御するタンパク質である。ＰＤＧＦには、Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤの４種類が存在し、ＰＤＧＦ−ＡとＰＤＧＦ−Ｂはジスルフィド結合により、ホモ又はヘテロの二量体構造をとることが知られている。
【０００３】
ＰＤＧＦ受容体のサブタイプの一つであるＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲ２、ＣＤ１４０ａともよばれる）は、チロシンキナーゼ関連型受容体である。ＰＤＧＦＲαは、ホモダイマーを形成するか、又は、構造的に類似するＰＤＧＦ受容体サブタイプであるＰＤＧＦＲβと共にヘテロダイマーを形成することができる。ＰＤＧＦ−ＡＡは、ＰＤＧＦＲααにのみ親和性を示し、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、及びＰＤＧＦ−ＣＣは、ＰＤＧＦＲαα及びＰＤＧＦαβの両方に親和性を示すことが知られている。また、ＰＤＧＦＲαは、例えば、腫瘍、間質細胞、血管などの細胞増殖が関連する疾患との関連が報告されている（非特許文献１参照）。例えば、グリベックは、ＰＤＧＦＲα遺伝子の突然変異を持つ消化管間質腫瘍に対して効果を発揮することが報告されている。また、ＰＤＧＦＲαを標的とする抗体や当該抗体を利用した癌治療薬が報告されている（特許文献１〜５、及び非特許文献２及び３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第１９９２／０１３８６７号パンフレット
【特許文献２】国際公開第１９９５／０００６５９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０４６３５６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６／１３８７２９号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００８／１１２００３号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．；６（７）：１９３２−１９４１（２００７）
【非特許文献２】Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．；４（３）：３６９−３７９（２００５）
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ；２４３：８００−８０４（１９８９）
【発明の概要】
【０００６】
しかし、これらの抗体が具体的に医薬品として利用可能となった例は無く、腫瘍、間質細胞、血管などの細胞増殖が関連する疾患のより高い治療効果を示し、また、毒性等の副作用が低い抗ＰＤＧＦＲα抗体が求められていた。
国際公開第１９９２／０１３８６７号パンフレット及び国際公開第２００４／０４６３５６号パンフレットは抗ＰＤＧＦＲα抗体の細胞増殖が関連する疾患との関連に言及しているものの、具体的にそのような疾患を治療可能な抗体を開示するものではなく、実際の治療に有用な抗体が求められていた。国際公開第１９９５／０００６５９号パンフレット、国際公開第２００６／１３８７２９号パンフレット、及び国際公開第２００８／１１２００３号パンフレットは、治療用抗体として完全ヒト抗体やアフィニティの高い抗体を作製することにより、治療用抗体を提供することが開示されている。このようにこれまで、抗ＰＤＧＦＲα抗体の中和活性による薬効を期待して、主にアフィニティに注目して治療効果の高い抗ＰＤＧＦＲα抗体を得ることが試みられてきた。しかし、実際の治療においては、アフィニティが高いだけでは臨床上十分な治療効果が得られてはいない。本発明者らは、適切なアフィニティと共に、優れたＴ細胞による抗体依存性細胞傷害性活性（以下、「ＡＤＣＣ活性」という）及び／又は補体依存性細胞傷害活性（以下、「ＣＤＣ活性」という）を有する抗体が臨床でも高い治療効果を発揮できると考え、そのような抗体の探索を行った。その結果、アフィニティに加えてＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性が優れる抗体を見出し、当該抗体がより優れた治療効果を発揮することを確認した。特に、本発明者らは、ＰＤＧＦＲαの２１３番目から３１１番目のアミノ酸配列（配列番号３）をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体が優れたＡＤＣＣ活性をもたらすことを見出した。
これまで、ＰＤＧＦＲαのエピトープとしては、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：８００−８０４（１９８９）において９５９−９７３番目及び１０７４−１０８９番目のアミノ酸が開示されている。また、国際公開第１９９５／０００６５９号パンフレットにおいて、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギと共通する領域でハムスター、ラットと共通しない領域、及び細胞外ドメインがエピトープとして有用であることが開示されている。しかし、本発明の抗体が認識するエピトープに関して開示した報告は無い。本発明は、より高い治療効果を発揮し、毒性等の副作用が低いことが期待される、新規の抗ＰＤＧＦＲα抗体のエピトープを見出したことに基づく。
【０００７】
従って、一態様において本発明は、ＰＤＧＦＲαの特定のエピトープを認識する抗体に関し、具体的にはＰＤＧＦＲαの１０６番目から３１１番目のアミノ酸配列（配列番号１）をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体に関し、特には、ＰＤＧＦＲαの１０６番目から２１３番目のアミノ酸配列（配列番号２）又はＰＤＧＦＲαの２１３番目から３１１番目のアミノ酸配列（配列番号３）をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体に関する。特に、ＰＤＧＦＲαの２１３番目から３１１番目のアミノ酸配列（配列番号３）をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体はＡＤＣＣ活性に優れることから、細胞増殖に起因する疾患（例えば、腫瘍）の治療に有益である。例えば、ＰＤＧＦＲαの２１３番目から３１１番目のアミノ酸配列（配列番号３）をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体は、更に、ＡＤＣＣ活性が２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％、又は５０％以上であってもよい。ＰＤＧＦＲαの２１３番目から３１１番目のアミノ酸配列（配列番号３）をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体は、２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有していてもよい。なお、本明細書の全体にわたって、ＰＤＧＦＲαの特定のエピトープを認識する抗体が認識するアミノ酸は、当該エピトープを構成するアミノ酸配列の一部であってもよい。例えば、抗体が認識するアミノ酸は、当該エピトープを構成するアミノ酸から選択される３アミノ酸又はそれ以上であってもよい。
【０００８】
別の態様において本発明は、ＡＤＣＣ活性に優れる抗ＰＤＧＦＲα抗体に関し、例えば、ＡＤＣＣ活性が２５％以上である抗ＰＤＧＦＲα抗体に関する。本発明の抗ＰＤＧＦＲα抗体が示すＡＤＣＣ活性は、３０％以上、３５％以上、４０％以上、又は４５％以上であることができ、より好ましくは５０％以上である。
【０００９】
また、ＡＤＣＣ活性に優れる抗ＰＤＧＦＲα抗体は、２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有する抗体であってもよい。本明細書において、「２４Ａ１抗体と同等のＡＤＣＣ活性を有する抗体」とは、被験抗体のコントロール抗体と比較したＡＤＣＣ活性（以下、「被験抗体のＡＤＣＣ活性（％）」という）が、２４Ａ１抗体のコントロール抗体と比較したＡＤＣＣ活性（以下、「２４Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）」という）の±２０％の範囲内に含まれる抗体のことである。また、本明細書において、「２４Ａ１抗体と同等以上のＡＤＣＣ活性を有する抗体」とは、被験抗体のＡＤＣＣ活性（％）が、２４Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）より大きい抗体のことである。コントロール抗体は、ＡＤＣＣ活性を示さないことが知られている抗体であれば限定されず、例えば、抗ＧＳＴ抗体であってもよい。２４Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）は、１００−｛（２４Ａ１抗体について得られたＡＤＣＣ活性の指標となる測定値）／（コントロール抗体について得られたＡＤＣＣ活性の指標となる測定値）｝×１００（％）により計算することができる。また、被験抗体のＡＤＣＣ活性（％）は、１００−｛（被験抗体について得られたＡＤＣＣ活性の指標となる測定値）／（コントロール抗体について得られたＡＤＣＣ活性の指標となる測定値）｝×１００（％）により計算することができる。「被験抗体のＡＤＣＣ活性（％）が、２４Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）の±２０％の範囲内に含まれる」とは、被験抗体のＡＤＣＣ活性（％）が２４Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）の０．８倍から１．２倍の間に含まれることをいう。好ましくは、２４Ａ１抗体と同等のＡＤＣＣ活性を有する抗体は、被験抗体のＡＤＣＣ活性（％）が、２４Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）の±１５％、±１０％、又は±８％の範囲内に含まれる抗体であり、より好ましくは、±５％の範囲内に含まれる抗体である。本明細書において±Ｘ％の範囲内に含まれるとは、−Ｘ％かそれよりも大きく、かつ、＋Ｘ％かそれよりも小さいことを意味する。よって、２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有する抗体は、例えば、被験抗体のＡＤＣＣ活性（％）が、２４Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）の−２０％以上、−１５％以上、−１０％以上、−８％以上、又は−５％以上の範囲内に含まれる抗体であることができる。また、ＡＤＣＣ活性に優れる抗ＰＤＧＦＲα抗体は、ヒト化２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有する抗体であってもよい。
【００１０】
更に、別の態様において本発明は、ＣＤＣ活性に優れる抗ＰＤＧＦＲα抗体に関し、例えば、ＣＤＣ活性が１０％以上である抗ＰＤＧＦＲα抗体に関する。本発明の抗ＰＤＧＦＲα抗体が示すＣＤＣ活性は、１５％以上、又は２０％以上であることができ、より好ましくは３０％以上である。
【００１１】
また、ＣＤＣ活性に優れる抗ＰＤＧＦＲα抗体は、２１Ａ１抗体と同等かそれ以上のＣＤＣ活性を有する抗体であってもよい。本明細書において、「２１Ａ１抗体と同等のＣＤＣ活性を有する抗体」とは、被験抗体のコントロール抗体と比較したＣＤＣ活性（以下、「被験抗体のＣＤＣ活性（％）」という）が、２１Ａ１抗体のコントロール抗体と比較したＣＤＣ活性（以下、「２１Ａ１抗体のＣＤＣ活性（％）」という）の±２０％の範囲内に含まれる抗体のことである。また、本明細書において、「２１Ａ１抗体と同等以上のＣＤＣ活性」とは、被験抗体のＣＤＣ活性（％）が、２１Ａ１抗体のＣＤＣ活性（％）より大きい抗体のことである。コントロール抗体は、ＣＤＣ活性を示さないことが知られている抗体であれば限定されず、例えば、抗ＧＳＴ抗体であってもよい。２１Ａ１抗体のＣＤＣ活性（％）は、｛（２１Ａ１抗体について得られたＣＤＣ活性の指標となる測定値）／（抗体未投与群について得られたＣＤＣ活性の指標となる測定値）｝×１００（％）により計算することができる。また、被験抗体のＣＤＣ活性（％）は、｛（被験抗体について得られたＣＤＣ活性の指標となる測定値）／（抗体未投与群について得られたＣＤＣ活性の指標となる測定値）｝×１００（％）により計算することができる。「被験抗体のＣＤＣ活性（％）が、２１Ａ１抗体のＣＤＣ活性（％）の±２０％の範囲内に含まれる」とは、被験抗体のＣＤＣ活性（％）が２１Ａ１抗体のＣＤＣ活性（％）の０．８倍から１．２倍の範囲内に含まれることをいう。好ましくは、２１Ａ１抗体と同等のＣＤＣ活性を有する抗体は、被験抗体のＣＤＣ活性（％）が、２１Ａ１抗体のＣＤＣ活性（％）の±１５％、±１０％、又は±８％の範囲内に含まれる抗体であり、より好ましくは、±５％の範囲内に含まれる抗体である。よって、２１Ａ１抗体と同等かそれ以上のＣＤＣ活性を有する抗体は、例えば、被験抗体のＣＤＣ活性（％）が、２１Ａ１抗体のＣＤＣ活性（％）の−２０％以上、−１５％以上、−１０％以上、−８％以上、又は−５％以上の範囲内に含まれる抗体であることができる。
【００１２】
好ましくは、ＣＤＣ活性に優れる抗ＰＤＧＦＲα抗体は、ＣＤＣ活性に加えて、適切なＡＤＣＣ活性を示す。このような抗体としては、例えば、ＣＤＣ活性が１０％以上であり、かつ、ＡＤＣＣ活性が２５％以上である抗ＰＤＧＦＲα抗体を挙げることができる。ＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性に優れる抗体における、ＣＤＣ活性としては、１０％以上、１５％以上、又は２０％以上であることができ、より好ましくは３０％以上である。また、ＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性に優れる抗体における、ＡＤＣＣ活性としては、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、又は４５％以上であることができ、より好ましくは５０％以上である。ＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性に優れる抗体は、２１Ａ１抗体と同等かそれ以上のＣＤＣ活性及びＡＤＣＣ活性を有する抗体であってもよい。ここで、対象となる抗体が２１Ａ１抗体と同等かそれ以上のＣＤＣ活性、及び２１Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有するか否かは、上述の方法に準じて決定することができる。
【００１３】
本明細書において、「２４Ａ１抗体」とは、重鎖が配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなり、軽鎖が配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなる抗体のことである。また、「ヒト化２４Ａ１抗体」とは、配列番号４、５、及び６の配列をそれぞれ重鎖の相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」という）１，２、及び３として有し、かつ、配列番号７、８、及び９の配列をそれぞれ軽鎖のＣＤＲ１，２、及び３として有する抗体のことである。好ましくは、「ヒト化２４Ａ１抗体」は、重鎖が配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなり、軽鎖が配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなる抗体である。また、「２１Ａ１抗体」とは、本明細書の実施例１において取得された２１Ａ１抗体を意味する。２４Ａ１抗体及び２１Ａ１抗体のＡＤＣＣ活性（％）及びＣＤＣ活性（％）は、当該抗体を作製して本明細書に記載された測定方法により測定することもできるし、本明細書（例えば、実施例）の記載を参照することにより決定することができる。
【００１４】
また、別の一態様において、本発明は、ＣＤＲのアミノ酸配列により特定される抗体に関する。具体的には、本発明は、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び、配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有する抗体に関する。また、本発明は、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号７、配列番号８、及び、配列番号９に記載されたアミノ酸配列を有する抗体に関する。好ましくは、本発明は、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び、配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３が配列番号７、配列番号８、及び、配列番号９に記載されたアミノ酸配列を有する抗体である。
【００１５】
一の態様において、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列が特定された抗体であり、以下の抗体を含む：
（ｉ）重鎖可変領域（以下、「ＶＨ」という）が、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体；
（ｉｉ）軽鎖可変領域（以下、「ＶＬ」という）が配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体；
（ｉｉｉ）（ｉ）のＶＨ及び（ｉｉ）のＶＬの両方を有する抗体；
（ｉｖ）ＶＨが、配列番号１０のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体；
（ｖ）ＶＬが、配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体；及び、
（ｖｉ）（ｉｖ）のＶＨ及び（ｖ）のＶＬの両方を有する抗体。
上記（ｉ）〜（ｖｉ）の抗体は、ＰＤＧＦＲαに結合する抗体であり、好ましくは、細胞増殖抑制活性を有する。これらの抗体のうち、最も好ましくは、重鎖が配列番号１０のアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖が配列番号１１のアミノ酸配列を有する抗体である。
【００１６】
本発明の抗体は、更に次の抗体を包含する：
以下の（Ａ）〜（Ｃ）の少なくとも１つを満たす抗ＰＤＧＦＲα抗体であって：
（Ａ）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つの配列番号に記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体；
（Ｂ）重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び、配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号７、配列番号８、及び、配列番号９に記載されたアミノ酸配列を有する抗体；又は
（Ｃ）前記（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれか一つに記載の抗体、
かつ、以下（ａ）〜（ｅ）から選択される１以上の特性を示す抗体：
（ａ）ＡＤＣＣ活性が２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％、又は５０％以上である；
（ｂ）２４Ａ１抗体又はヒト化２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有する；
（ｃ）ＣＤＣ活性が１０％以上、１５％以上、２０％以上、又は３０％以上である；
（ｄ）２１Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有する；又は、
（ｅ）解離定数（Ｋｄ）７×１０−９以下、６．５×１０−９以下、若しくは、６．２×１０−９以下でＰＤＧＦＲαに結合する。
【００１７】
上記において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法を挙げることができる。
【００１８】
例えば、本発明は、以下の（１）〜（１７）に関する。
（１）  ＰＤＧＦＲαの１０６番目から３１１番目のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（２）  配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（３）  Ｔ細胞による抗体依存性細胞傷害性活性（ＡＤＣＣ活性）が２５％以上である、抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（４）  ２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有する抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（５）  補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ活性）が１０％以上である、抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（６）  更に、Ｔ細胞による抗体依存性細胞傷害性活性（ＡＤＣＣ活性）が２５％以上である、（４）に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（７）  ＰＤＧＦＲαの１０６番目から３１１番目のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する、（３）〜（５）のいずれか１項に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（８）  配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸配列をエピトープとして認識する、（３）〜（５）のいずれか１項に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（９）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号４に記載されたアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号５に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、重鎖のＣＤＲ３が配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号７に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号８に記載されたアミノ酸配列を有し、及び、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号９に記載されたアミノ酸配列を有する抗体。
（１０）（Ｉ）重鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有し：
配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列；
配列番号１０のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１０のアミノ酸配列、及び／又は、
（ＩＩ）軽鎖の可変領域が、以下から選択される１のアミノ酸配列を有する：
配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
配列番号１１のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列；又は、
配列番号１１のアミノ酸配列、
ＰＤＧＦαに結合可能な抗体。
（１１）  ＰＤＧＦＲαと解離定数（Ｋｄ）７×１０−９以下で結合する、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（１２）  （１）〜（１１）のいずれか1項に記載の抗体を含有する、医薬組成物。
（１３）  細胞増殖に基づく疾患の治療薬である、請求項１２に記載の医薬組成物。
（１４）  配列番号１〜配列番号３のいずれか１つの配列番号に記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識し、かつ、ＡＤＣＣ活性が２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、又は５０％以上である抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（１５）  配列番号１〜配列番号３のいずれか１つの配列番号に記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識し、かつ、ＣＤＣ活性が１０％以上、１５％以上、２０％、又は３０％以上である抗ＰＤＧＦＲα抗体。
（１６）  配列番号１〜配列番号３のいずれか１つの配列番号に記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識し、かつ、ＡＤＣＣ活性が２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、又は５０％以上であり、かつ、ＣＤＣ活性が１０％以上、１５％以上、２０％、又は３０％以上である抗体。
（１７）  （１）〜（１６）のいずれか１項に記載の抗体をコードするＤＮＡ。
【００１９】
本明細書において、「抗体」は、非ヒト動物抗体、非ヒト動物抗体のアミノ酸配列とヒト抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物抗体のアミノ酸配列とヒト抗体のアミノ酸配列を有する抗体は、ヒト抗体の抗原結合ドメインＦｖを非ヒト動物モノクローナル抗体の抗原結合ドメインＦｖと入れ替えたヒト型キメラ抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲをヒト抗体のフレーム領域（以下、「ＦＲ」という）に組み込んだヒト化抗体を含む。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよい。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、本発明において「抗体」の語は、全長の抗体の他、抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ等、及び、ＣＤＲを含むペプチド）をも含む。
【００２０】
本明細書において、「細胞増殖に起因する疾患」とは、実質的には細胞増殖が起こることで発症し又は増悪する疾患のことであり、例えば、腫瘍（癌、肉腫）を挙げることができる。
【００２１】
また、本発明は上記抗体（抗体の断片を含む）をコードする核酸配列を有するＤＮＡ、当該ＤＮＡを有するベクター、及び当該ベクターを有する宿主細胞等をも包含するものである。例えば、本発明は、配列番号２３及び／又は２５、あるいは、配列番号２９及び／又は３１に記載の核酸配列を有するＤＮＡ、当該ＤＮＡを有するベクター、及び当該ベクターを有する宿主細胞等を包含する。また、本発明は、２３及び／又は２５、あるいは、配列番号２９及び／又は３１に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を有するＤＮＡ、当該ＤＮＡを有するベクター、及び当該ベクターを有する宿主細胞等を包含する。また、本発明は、２３及び／又は２５、あるいは、配列番号２９及び／又は３１に記載の核酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有する核酸配列を有するＤＮＡ、当該ＤＮＡを有するベクター、及び当該ベクターを有する宿主細胞等を包含する。
上記配列番号２９及び／又は３１に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を有するＤＮＡ、あるいは、２３及び／又は２５、あるいは、配列番号２９及び／又は３１に記載の核酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有する核酸配列を有するＤＮＡは、好ましくは、当該配列によりコードされる抗体がＰＤＧＦＲαに結合し、より好ましくは、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択される１以上の特性を示す：
（ａ）ＡＤＣＣ活性が２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％、又は５０％以上である；
（ｂ）２４Ａ１抗体又はヒト化２４Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性を有する；
（ｃ）ＣＤＣ活性が１０％以上、１５％以上、２０％以上、又は３０％以上である；
（ｄ）２１Ａ１抗体と同等かそれ以上のＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有する；又は、
（ｅ）解離定数（Ｋｄ）７×１０−９以下、６．５×１０−９以下、若しくは、６．２×１０−９以下でＰＤＧＦＲαに結合する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の抗体は、優れたＰＤＧＦＲα活性阻害作用を示すことができる。また、本発明の抗体は、ＡＤＣＣ活性及び／又はＣＤＣ活性に優れることから、ＰＤＧＦＲα発現細胞に対し、より優れた殺細胞効果を示すことができる。よって、本発明の抗体は、ＰＤＧＦＲαの変異又は発現が発症又は増悪に関与する疾患、特には細胞増殖に起因する疾患（腫瘍等）の治療薬又は予防薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の抗体の中和活性を測定するために、ウエスタンブロッティングによりＰＤＧＦ−ＡＡによるＰＤＧＦＲαのリン酸化を確認した写真である。検出抗体としては、ヒトＰＤＧＦＲαポリクローナル抗体Ｃ−２０（左写真）、及びリン酸化チロシン抗体４Ｇ１０（右写真）を用いた。各写真最上部の「ＩＰ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−ＰＤＧＦＲａ  １０Ａ１」は、抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体１０Ａ１により免疫沈降を行ったサンプルを指し、「ＴＮＥ  Ｌｙｓａｔｅ」は、細胞をＴＮＥ  ｂｕｆｆｅｒで溶解した細胞抽出液を指す。各写真の各レーンは、左から、正常マウスＩｇＧ（ネガティブ・コントロール）、モノクローナル抗体１Ａ１、５Ａ１、８Ａ１、９Ａ１、１０Ａ１、１８Ａ１、２１Ａ１、２２Ａ１、２４Ａ１、４０Ａ１添加後ＰＤＧＦ−ＡＡ投与細胞、およびＰＤＧＦ−ＡＡ未投与細胞、ＰＤＧＦ−ＡＡ投与細胞を示す。各写真の左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。
【図２】本発明の抗体のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸はＡＤＣＣ活性（％）を、横軸は各モノクローナル抗体のクローン番号を示す。
【図３】本発明の抗体のＣＤＣ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸はＣＤＣ活性（％）を、横軸は各モノクローナル抗体のクローン番号を示す。各モノクローナル抗体は、５μｇ／ｍＬ（黒）又は１μｇ／ｍＬ（白）で投与した。
【図４】ヌードマウスを用いて本発明の抗体の抗腫瘍効果を測定した結果を示すグラフである。縦軸は腫瘍サイズ（ｍｍ３）を、横軸は経過時間（週）を示す。横軸下の上向き矢印は、抗体を投与した時点を示す。各シンボルは以下の検体を示す：黒ひし形はモノクローナル抗体５Ａ１；黒四角はモノクローナル抗体８Ａ１；黒三角はモノクローナル抗体９Ａ１；バツ印はモノクローナル抗体１０Ａ１；アスタリスクはモノクローナル抗体１８Ａ１；黒丸はモノクローナル抗体２１Ａ１；プラス印はモノクローナル抗体２２Ａ１；小さい四角はモノクローナル抗体２４Ａ１；横長四角はモノクローナル抗体４０Ａ１；及び、白抜きひし形はモノクローナル抗体１４Ｃ１。
【図５】ヌードマウスを用いて本発明のモノクローナル抗体２４Ａ１の抗腫瘍効果の容量依存性を確認した結果を示すグラフである。縦軸は腫瘍サイズ（ｍｍ３）を、横軸は経過時間（週）を示す。横軸下の上向き矢印は、抗体を投与した時点を示す。各シンボルは以下の検体を示す：黒ひし形は１ｍｇ投与群；黒四角は０．４ｍｇ投与群；黒三角は０．１ｍｇ投与群；バツ印はコントロール抗体（４０Ｂ３）（０．４ｍｇ）投与群。
【図６】ドットブロットによるエピトープマッピングに使用したＰＤＧＦＲαの各欠失変異体とＦｃとの融合タンパク質の模式図である。
【図７】ドットブロットによるエピトープマッピングの結果を示す写真である。写真上部は使用した抗体を示し、写真左は使用したＰＤＧＦＲαの欠失変異体のＦｃ融合タンパク質又はコントロール（ｍＩｇＧ２ａＦｃ）を示す。
【図８】クローニングしたモノクローナル抗体２１Ａ１及び２４Ａ１の重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）の発現をウエスタンブロッティングにより確認した写真である。写真最上部の「Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ」は、細胞ペレットサンプルを指し、「Ｓｕｐ（×１０）」は、細胞培養上清を十倍に濃縮したサンプルを指す。Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ及びＳｕｐ（×１０）の各レーンは、左から、ｐｃＤＮＡベクター単独（ネガティブコントロール）、モノクローナル抗体２１Ａ１のＨｃ、モノクローナル抗体２１Ａ１のＬｃ、モノクローナル抗体２１Ａ１のＨｃ＋Ｌｃ、モノクローナル抗体２４Ａ１のＨｃ、モノクローナル抗体２４Ａ１のＬｃ、モノクローナル抗体２４Ａ１のＨｃ＋Ｌｃを示す。写真の左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。写真右のアロウヘッドは、Ｈｃ及びＬｃのタンパク質の分子量に該当する位置を示す。
【図９】モノクローナル抗体２４Ａ１、ヒト化２４Ａ１抗体、及びＩＧＨＶ４−３０−４のＨｃのアミノ酸配列を比較した図である。
【図１０】モノクローナル抗体２４Ａ１、ヒト化２４Ａ１抗体、及びＩＧＫＶ  １Ｄ−１２のＬｃのアミノ酸配列を比較した図である。
【図１１】作製したキメラ２４Ａ１抗体、及びヒト化２４Ａ１抗体の重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）の発現をウエスタンブロッティングにより確認した写真である。写真最上部の「Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ」は、細胞ペレットサンプルを指し、「Ｓｕｐ（×１０）」は、細胞培養上清を十倍に濃縮したサンプルを指す。Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ及びＳｕｐ（×１０）の各レーンは、左から、ｐｃＤＮＡベクター単独（ネガティブコントロール）、キメラ２４Ａ１抗体のＨｃ、キメラ２４Ａ１抗体のＬｃ、キメラ２４Ａ１抗体のＨｃ＋Ｌｃ、ヒト化２４Ａ１抗体のＨｃ、ヒト化２４Ａ１抗体のＬｃ、ヒト化２４Ａ１抗体のＨｃ＋Ｌｃを示す。写真の左の数字は分子量（ｋＤａ）を示す。写真右のアロウヘッドは、Ｈｃ及びＬｃのタンパク質の分子量に該当する位置を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の抗体は、以下の方法により得ることができる。まず、ＰＤＧＦＲαの全部若しくはその一部を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターを調製し、これを発現させて抗原を得る。モノクローナル抗体を作成する場合、この抗原を用い、モノクローナル抗体作製の公知の方法に従ってマウス、ラット、又はウサギ等の動物を免疫する。次いで、免疫した動物から得られた免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物からＰＤＧＦＲαのモノクローナル抗体を得ることができる。また、ポリクローナル抗体を作成する場合、上記と同様の抗原を利用し、ポリクローナル抗体作製の公知の方法に従って動物を免疫し、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清からＰＤＧＦＲαのポリクローナル抗体を得ることができる。
【００２５】
免疫原として使用するＰＤＧＦＲαは、哺乳動物のＰＤＧＦＲαであれば、特に限定は無いが、好ましくは、ヒトＰＤＧＦＲαである。例えば、ヒトＰＤＧＦＲαはその全アミノ酸配列（配列番号１３）、及び、ｃＤＮＡ配列（配列番号１２）が報告されている。また、ＰＤＧＦＲαの全部又は一部に一致するポリペプチドをコードするＤＮＡは、ほ乳類由来のＰＤＧＦＲαのＤＮＡをプローブとしてヒト腫瘍細胞株等のｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることによっても得ることができる。本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ＰＤＧＦＲα又はその一部をコードするＤＮＡを含む発現ベクター（例えば、ｐＧＥＸ（大腸菌用）、ｐｃＤＮＡ３.１（動物細胞発現用）等）を大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を適切な培地（例えば、ＬＢ培地等）で培養して発現させることにより得ることができる。
【００２６】
免疫原として、ＰＤＧＦＲαの一部を有するペプチドを使用する場合には、ＰＤＧＦＲαの一部を有するペプチドをそのまま使用することもできるし、１種類又は２種類以上のＰＤＧＦＲαの一部を有するペプチドを、リンカーを介して結合させて使用することもできる。ＰＤＧＦＲα又はその一部を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法又はＢｏｃ法等の公知の方法、又は自動ペプチド合成機を用いて作製することができる。免疫原としてＰＤＧＦＲαの一部を有するペプチドを使用する場合には、当該免疫原はＰＤＧＦＲαの細胞外領域を含み、好ましくは、配列番号１〜配列番号３のいずれか１つの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む。例えば、免疫源としては、例えば、ＰＤＧＦＲα細胞外領域（１−５１４アミノ酸）（配列番号１４）とマウスＩｇＧ２ａ定常領域融合タンパク質（ＰＤＧＦＲα−Ｆｃ）を抗原として使用することができる。
【００２７】
上記抗原を用いた動物の免疫は、上記抗原をリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）と共に、非ヒト哺乳動物又は鳥類に免疫することにより行われる。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができる。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を複数回（好ましくは、合計２〜５回）行うことができる。抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００２８】
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物の脾臓等から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）を挙げることができる。抗体は、ハイブリドーマをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物又は免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。抗体の精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。抗体のクラスが、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムで精製することができる。また、抗体のクラスによらず、ＰＤＧＦＲα固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー等を用いて精製することもできる。
【００２９】
（ヒト型キメラ抗体作製）
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＰＤＧＦＲαと結合する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）。
【００３０】
（ヒト化抗体の作製）
本発明のヒト化抗体は、ＰＤＧＦＲαと結合する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３，１９９１；Ｃｌａｒｋ  Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７−４０２，２０００参照）。
【００３１】
非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。好ましくは、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載されたアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７、配列番号８及び配列番号９に記載されたアミノ酸配列を有する。より好ましくは、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載されたアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７、配列番号８及び配列番号９に記載されたアミノ酸配列からなる。
【００３２】
また、ヒト抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域（以下、「Ｖ領域」という）がＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。選択したヒト抗体のＦＲを有するヒト化抗体のＶ領域が、ＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるか否かは、例えば、選択したヒト抗体のＦＲ及び非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲを含むＶ領域のＤＮＡ配列情報を基にコンピューターモデリングにより立体構造を予測し、ＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域の立体構造と比較することにより判断することができる。非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列は、上述の方法により得られたＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列及びＣＤＲのアミノ酸配列の情報より得ることができる。また、ヒト化抗体のＶ領域は、ヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に適宜変異をいれて設計することもできる。本発明の抗体は、好ましくは、重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として、それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８に記載されたアミノ酸配列を有する。また、本発明の抗体は、好ましくは、軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２に記載されたアミノ酸配列を有する。
【００３３】
使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。例えば、設計したＤＮＡを基に１００ｂｐ前後の長さのＤＮＡ断片を合成ＤＮＡとして化学合成し、当該ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅することによって得ることができる。また、当該１００ｂｐ前後のＤＮＡ断片をリガーゼ等の酵素を用いて結合させ、設計されたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列の両末端の配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲを行い、所望の長さのＤＮＡ断片を抽出することによっても得ることができる。更に、ＰＣＲ使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、ＣＤＲグラフティングとして知られる方法によっても得ることができる。また、使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、部位特異的変異によりＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体のＶ領域のＤＮＡに組み込むことによっても得ることができる。部位特異的変異は、例えば、ジーンテイラーサイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Ｇｅｎｅ  Ｔａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）（インビトロジェン社）、トランスフォーマ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ）部位特異的突然変異誘発キット（クローンテック社）、サイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）（タカラバイオ社）等を用いて、当該キットの説明に従うことにより行うことができる。好ましくは、ＶＨは、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、及び／又は、ＶＬは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
ヒト化抗体の作製において用いるヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のヒト化抗体を発現するベクターを作製することができる。
【００３５】
ヒト化抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーター又は非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２−ｇｐｔ（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４２２，１９８０）を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト化抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。
【００３６】
（ヒト抗体）
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７））。
【００３７】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジ社；メディカルリサーチカウンセル；ダイアックス社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント社；クルーセル社；モルホシス社）、及び、癌患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。
【００３８】
ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、ＰＤＧＦＲα又は本発明の抗体が認識するエピトープ配列を有するペプチドを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。
【００３９】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗ＰＤＧＦＲα抗体作製方法に準じて抗原（好ましくは、本発明の抗体が認識するエピトープ配列を有するペプチド）を免疫することにより、抗ＰＤＧＦＲαヒト抗体を得ることができる。
【００４０】
（抗体断片の作製）
Ｆ（ａｂ’）２断片（分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明のＩｇＧ抗体をペプシンで処理することにより、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断して得ることができる。Ｆａｂ’断片は、上述の方法により得られたＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明の抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡから得ることができる。Ｆａｂ断片（Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明の抗体をパパインで処理することにより、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断して得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明の抗体のＦａｂをコードするＤＮＡから得ることができる。ｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築することにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）又はその繰り返し配列である。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換し、当該システイン残基間をジスルフィド結合により結合させることにより得ることができる。Ｄｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築することにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を有するペプチドとして設計することにより得ることができる。
【００４１】
（ＡＤＣＣ活性測定）
本明細書において、「ＡＤＣＣ活性」は、ＡＤＣＣ活性を測定する方法として公知の方法であれば、どのような方法によっても測定することができるが、好ましくは以下の手順により測定された活性を意味する。適切な培地（例えば、１０％牛胎児血清を含む、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地）中、標的細胞株（例えば、ヒト骨肉腫細胞株）を、９６穴プレートに１×１０３〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃で１２〜４８時間培養する。被験抗体又はコントロール抗体（ＡＤＣＣ活性を示さないことが知られている抗体。例えば、抗ＧＳＴ抗体）を０．１〜１．０μｇ／ｗｅｌｌとなるように添加する。その後、予め調製したＴ細胞を各ｗｅｌｌに添加し、３７℃で８〜２４時間反応させる。反応後、各ｗｅｌｌを培養培地で洗浄し、新しい培地、及びＭＴＳ試薬を添加し、３７℃で１〜１２時間培養後、４９０ｎｍの吸光度を測定する。ＡＤＣＣ活性（％）は、得られた吸光度の数値を基に、１００−（（被験抗体の吸光度）／（コントロール抗体の吸光度））×１００（％）により計算する。本明細書において、「ＡＤＣＣ活性の指標となる測定値」とは、上記方法により測定された測定値を意味する。
【００４２】
（ＣＤＣ活性測定）
本明細書において、「ＣＤＣ活性」は、ＣＤＣ活性を測定する方法として公知の方法であれば、どのような方法によっても測定することができるが、好ましくは以下の手順により測定された活性を意味する。適切な培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＨａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地）で１０×１０３〜１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した標的細胞株（例えば、ヒト小細胞肺癌株ＳＹ）を播種し、被験抗体、又はコントロール抗体（例えば、抗ＧＳＴ抗体）を溶解させた適切な培地（例えば、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地）（抗体溶液）を０．００５〜０．１μｇ／ｗｅｌｌで添加する。また、コントロールとして、抗体未投与群には、培地のみを抗体溶液と同量添加する。ヌードマウスから採取した新鮮な抗血清を適切な培地（例えば、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地）で５０倍に希釈し、各ｗｅｌｌに添加する。３７℃で１〜２４時間反応後、培養上清を採取し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）測定試薬を用いて細胞障害の程度を測定する。ＣＤＣ活性（％）は、（各抗体投与群／抗体未投与群）×１００（％）により計算する。本明細書において、「ＣＤＣ活性の指標となる測定値」とは、上記方法により測定された測定値を意味する。
【００４３】
（解離定数の測定）
本明細書において、解離定数は、解離定数を測定する方法として公知の方法であれば、どのような方法によっても測定することができるが、好ましくは以下の方法により測定された数値を意味する。ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘ）のマニュアルに従い、ＣＭ５チップにＰＤＧＦＲα細胞外領域（１−５１４アミノ酸）とマウスＩｇＧ定常領域融合タンパク質（ＰＤＧＦＲα−Ｆｃ）を固定後、被験抗体を流し、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆを測定し、解離定数（ＫＤ値）を決定する。
【００４４】
（医薬組成物）
本発明の抗体は、抗体医薬の分野において当業者が通常用いる知識に基づき、医薬として使用することができる。例えば、本発明の抗体を医薬として使用する場合、投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができる。また、医薬組成物は、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤の製剤とすることができる。本発明の抗体は、単独で投与しても良いし、薬理学的に許容される単体と共に投与されてもよい。
【００４５】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００４６】
（実施例１）  ヒトＰＤＧＦＲαに対するモノクローナル抗体の作製
免疫用抗原として、ＰＤＧＦＲα細胞外領域（１−５１４アミノ酸）とマウスＩｇＧ２ａ定常領域融合タンパク質（ＰＤＧＦＲα−Ｆｃ）を使用した。これを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。マウスに４回免疫を行った後、免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３７２１−３７２８）記載の方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化したＰＤＧＦＲα−Ｆｃに反応する細胞を選択することにより行った。
【００４７】
（実施例２）ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ＦＡＣＳ、および解離定数の測定
作製したモノクローナル抗体について、以下の手順により、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ＦＡＣＳ、およびＢＩＡＣＯＲＥによる解離定数の測定を行った。
（１）ウエスタンブロッティング
常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従いウエスタンブロッティングを行った。なお、ウエスタンブロッティングには、ＰＤＧＦＲαの発現を確認した、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１４２７）を用いた。１０％牛胎児血清を含む、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で培養し、２×Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ６．８］，４％ＳＤＳ，２０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，０．０２％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ)で細胞溶解液を調製し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。ゲルをＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア，ＩＰＶＨ０００１０）に転写後、実施例１で得られた各抗体を反応させ、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７５０４）にて検出した。
結果を表１に示す。表中、×は反応性無しを示し、△は、弱陽性を示す。
【００４８】
（２）免疫沈降
常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い免疫沈降法を行った。なお、免疫沈降法には、ＰＤＧＦＲαの発現を確認したヒト小細胞肺癌株ＳＹ（愛知県がんセンターより供与，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６３，２４−２８参照）を用いた。１０％牛胎児血清を含むＨａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で培養後、細胞を回収し、ＴＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％［ｖ／ｖ］ＮＰ−４０）で
細胞抽出液を調製した。細胞抽出液をＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，１７−０６１８−０１）で非特異反応の吸収操作を行った後、実施例１で得られた各抗体を５μｇ反応させた。その後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，１７−０６１８−０１）を加え、抗体および抗体反応物を回収した。回収した抗体等をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動した。ゲルをＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア，ＩＰＶＨ０００１０）に転写後、ヒトＰＤＧＦＲαポリクローナル抗体Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−３３８）を反応させ、抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７５０２）にて検出した。結果を表１に示す。表中、○は、強陽性を示す。
【００４９】
（３）ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）
常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い、フロー・サイトメトリーを行った。なお、フロー・サイトメトリーには、ＰＤＧＦＲαの発現を確認したヒト小細胞肺癌株ＳＹ（愛知県がんセンターより供与，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６３，２４−２８参照）を用いた。１０％牛胎児血清を含むＨａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で培養した。細胞を染色用緩衝液（ＰＢＳ，０．１％ＮａＮ３，５％牛胎児血清，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）（以下、「ＳＢ」という）で２×１０６細胞数／ｍＬに調製後、予め５μｇ／ｍＬに調製した実施例１で得られた各抗体を５０μＬ分注した９６穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ，３５３０７７）に、５０μＬ添加した。４℃，３０分反応後、ＳＢにて洗浄し、抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７６２１）を加えた。４℃，３０分反応後、ＳＢにて洗浄し、１００μＬのＳＢに再懸濁し、ＦＡＣＳ装置（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ，ＦＡＣＳｏｒｔ）にて、検出した。結果を表１に示す。表中、○は、強陽性を示す。
【００５０】
（４）ＢＩＡＣＯＲＥによる解離定数の測定
作製したモノクローナル抗体のうち、クローン番号５Ａ１、８Ａ１、９Ａ１、１８Ａ１、２４Ａ１及び４０Ａ１について、当該抗体と抗原との解離定数（ＫＤ）をＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘ）を用いて測定した。ＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘ）のマニュアルに従い、ＣＭ５チップにＰＤＧＦＲα細胞外領域（１−５１４アミノ酸）とマウスＩｇＧ定常領域融合タンパク質（ＰＤＧＦＲα−Ｆｃ）を固定後、実施例１で作製した各ＰＤＧＦＲα抗体を流し、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆを測定し、ＫＤ値を決定した。結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
（実施例３）中和活性測定
ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１４２７）がＰＤＧＦＲαを発現することを確認した（結果は非図示）。ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３を用いて、実施例１で得られた抗体の中和活性測定を行った。１０％牛胎児血清を含む、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地中、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３を、６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ，３５０６）に２×１０５細胞数／ｗｅｌｌとなるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。その後、培地を除去し、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で１０μｇ／ｍＬに調整した実施例１で得られた各抗体、又はネガティブ・コントロールとして正常マウス血清（Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）（株式会社免疫生物研究所，１７３１４）を１ｍＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃で３０分間反応させた。反応後、抗体を含む培地を除去し、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で１００ｎｇ／ｍＬに調製したＰＤＧＦＲαのリガンドである、ＰＤＧＦ−ＡＡ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ，１００−１３Ａ）を１ｍＬ添加し、５％ＣＯ２、３７℃で１０分間反応させた。その後、細胞を回収し、ＴＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％［ｖ/ｖ］ＮＰ−４０）で細胞抽出液を調製し、実施例１で作製したＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体１０Ａ１を用いて試験例１−１（２）の記載に準じて免疫沈降を行い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルをＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア，ＩＰＶＨ０００１０）に転写後、ヒトＰＤＧＦＲαポリクローナル抗体Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−３３８）およびリン酸化チロシン抗体４Ｇ１０（株式会社ミリポア，０５−３２１）によりＰＤＧＦＲαを検出した。
【００５３】
結果を図１に示す。正常マウス血清（Ｎｏｒｍａｌ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）を投与した場合と比較し、実施例１で得られた各抗体はＰＤＧＦ−ＡＡによるＰＤＧＦＲαのリン酸化を抑制した。特に、クローン番号５Ａ１、２２Ａ１及び２４Ａ１の抗体は、そのリン酸化中和活性が顕著であった。実施例１で得られた各抗体は、ＰＤＧＦＲαに対する中和活性を有し、ＰＤＧＦＲαの下流のシグナル伝達を抑制することが示された。
【００５４】
（実施例４）ＡＤＣＣ活性測定
ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１４２７）を用いて、実施例１で得られた抗体のＡＤＣＣ活性測定を行った。
（ａ）Ｔ細胞の調整
ＡＤＣＣ活性測定において使用するＴ細胞を、以下の手順により調製した。ヌードマウス（日本チャールズ・リバー株式会社，９２３８３０１  ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ  （ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス)）より採取した脾臓細胞を、ナイロンウールを充填したカラム（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，２１７５９）を用いて分離した。得られた未吸着分画（Ｔ細胞分画）は、終濃度５μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｌ−１０００）を添加して３７℃で３時間刺激し、その後Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で１×１０６細胞数／ｍＬとなるよう調製した。調製されたＴ細胞を以下のＡＤＣＣ活性測定試験におけるＴ細胞として使用した。
【００５５】
（ｂ）ＡＤＣＣ活性測定
１０％牛胎児血清を含む、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地中、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１４２７）を、９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  ３５９８）に１×１０４細胞数／ｗｅｌｌとなるように播種し、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。その後、培地を除去し、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で０．４μｇ／ｍＬに調整した実施例１で得られた各抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加した。ネガティブ・コントロールとして、常法に従って作製し、０．４μｇ／ｍＬに調製した抗ＧＳＴ抗体１４Ｃ１を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加した。その後、予め調製したＴ細胞を各ｗｅｌｌに５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で１２時間反応させた。反応後、各ｗｅｌｌを培養培地で洗浄し、新しい同培地１００μＬ、及びＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ３５８０）２０μＬを添加し、３７℃で２時間培養後、４９０ｎｍ（参考波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。ＡＤＣＣ活性（％）は、１００−（各抗体投与群／ネガティブ・コントロール）×１００（％）により計算した。
【００５６】
結果を図２に示す。ネガティブ・コントロールである１４Ｃ１と比較すると、各ＰＤＧＦＲα抗体を投与は、抗体依存的なＡＤＣＣ活性を示した。特に、クローン番号１Ａ１、５Ａ１、８Ａ１、２２Ａ１、２４Ａ１及び４５Ａ１の抗体は、優れたＡＤＣＣ活性を示した。
【００５７】
（実施例５）ＣＤＣ活性測定
ＰＤＧＦＲαの発現を確認したヒト小細胞肺癌株ＳＹ（愛知県がんセンターより供与，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６３，２４−２８参照）を用いて、実施例１で得られた抗体のＣＤＣ活性測定を行った。
１０％牛胎児血清を含むＨａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で４×１０５細胞数／ｍＬとなるように調製したヒト小細胞肺癌株ＳＹ（愛知県がんセンターより供与，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６３，２４−２８参照）を、５０μＬ／ｗｅｌｌで９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，３５９８）に播種し、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で４μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍＬに調整した実施例１で得られた各抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌで、最終濃度が１μｇ／ｍＬ又は５μｇ／ｍＬとなるように添加した。ネガティブ・コントロールとして、常法に従って作製し、４μｇ／ｍＬ又は２０μｇ／ｍＬに調整した抗ＧＳＴ抗体４０Ｂ３を５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように添加した。また、コントロールとして、抗体未投与群には、Ｈａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。ヌードマウス（日本チャールズ・リバー株式会社，９２３８３０１  ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ（ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス））から採取した新鮮な抗血清をＨａｍ  Ｆ１２培地とＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地を等量で混合した培地で５０倍に希釈し、１００μＬ／ｗｅｌｌで各ｗｅｌｌに添加した。５％ＣＯ２、３７℃で５時間反応後、培養上清を採取し、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）測定試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ１７８０）を用いて細胞障害の程度を測定した。ＣＤＣ活性（％）は、（各抗体投与群／抗体未投与群）×１００（％）により計算した。
【００５８】
結果を図３に示す。実施例１で作製した抗体のうち、クローン番号１Ａ１、５Ａ１、８Ａ１、９Ａ１、１０Ａ１、１８Ａ１、２１Ａ１及び２２Ａ１の抗体を添加することにより、抗血清中の補体依存的な細胞障害活性が認められた。特に、クローン番号５Ａ１、８Ａ１、２１Ａ１及び２２Ａ１の抗体はＣＤＣ活性に優れることが示された。
【００５９】
（実施例６）抗腫瘍効果測定
ヌードマウス移植ヒト腫瘍モデル（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、実施例１で作製した抗体の抗腫瘍効果を確認した。
ヌードマウス(日本チャールズ・リバー株式会社，９２３８３０１  ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ（ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス)）の背部皮下に１×１０７個のＳＹ細胞（愛知県がんセンターより供与，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６３，２４−２８参照）を移植した。２週間後、腫瘍が形成されたことを確認し、各々４００μｇの実施例１で作製した抗体を尾静注により投与した。ネガティブ・コントロールとして、４００μｇのＧＳＴ抗体１４Ｃ１を用いた。各抗体は、５匹のヌードマウスに週１回投与した。抗腫瘍効果の測定は、週１回腫瘍サイズを測定することにより行った。
【００６０】
結果を図４に示す。抗体投与１週間後には、２２Ａ１を除くすべての実施例１で作製した抗体の投与群において、腫瘍の増殖抑制が認められた。抗体投与後２週間では、クローン番号５Ａ１、１０Ａ１、１８Ａ１及び４０Ａ１の抗体投与群において腫瘍の増殖が緩やかとなり、クローン番号８Ａ１、２１Ａ１及び２４Ａ１の抗体投与群において顕著な抗腫瘍効果が認められた。
【００６１】
抗腫瘍効果の高いクローン番号２１Ａ１及び２４Ａ１の抗体について、同様の抗腫瘍効果測定実験を再度行い、抗腫瘍効果について再現性を確認した。その結果、本実施例５と同様に再現性よく抗腫瘍効果を示すことが確認された（結果は非図示）。
【００６２】
（実施例７）抗腫瘍効果の投与抗体容量依存性測定
ヌードマウス(日本チャールズ・リバー株式会社，９２３８３０１  ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ（ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス））の背部皮下に１×１０７個のＳＹ細胞（愛知県がんセンターより供与，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９１），６３，２４−２８参照）を移植した。２週間後、腫瘍が形成されたことを確認し、各々１ｍｇ、４００μｇ、１００μｇの実施例１で作製したクローン番号２４Ａ１の抗体（以下、「２４Ａ１抗体」という）を尾静注により投与した。ネガティブ・コントロールとして、４００μｇのＧＳＴ抗体４０Ｂ３を用いた。各抗体は、５匹のヌードマウスに週１回投与した。抗腫瘍効果の測定は、週１回腫瘍サイズを測定することにより行った。
【００６３】
結果を図５に示す。２４Ａ１抗体を投与した群では、いずれも腫瘍増殖が抑制されていた。よって、２４Ａ１抗体は、０．１ｍｇ／匹の投与でも腫瘍抑制効果を有することが示された。また、２４Ａ１抗体の投与量が増加するに伴い腫瘍増殖の抑制効果が高かった。よって、２４Ａ１抗体は、容量依存的に腫瘍増殖を抑制することが確認された。
【００６４】
（実施例８）エピトープマッピング
実施例５及び実施例６において、抗腫瘍効果が確認された２４Ａ１抗体及び２１Ａ１抗体のエピトープを、ドットブロットを用いたエピトープマッピングにより決定した。
ヒトＰＤＧＦＲαの細胞外領域（１−５１４アミノ酸）（配列番号１４）をコードする遺伝子、及び当該領域のＣ末端から欠失させた各種欠失変異体をコードする遺伝子を作製した。作製した欠失変異体遺伝子は、ヒトＰＤＧＦＲαの１−１０６アミノ酸（ＰＤＧＦＲα１０６−Ｆｃ）、１−２１３アミノ酸（ＰＤＧＦＲα２１３−Ｆｃ）、１−３１１アミノ酸（ＰＤＧＦＲα３１１−Ｆｃ）、１−４０９アミノ酸（ＰＤＧＦＲα４０９−Ｆｃ）、又は１−５１４（ＰＤＧＦＲα−Ｆｃ）を含んでいる（図６参照）。これらの遺伝子を導入した発現ベクターをＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６５０）にトランスフェクションし、無血清のＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地（株式会社免疫生物研究所，３３２５２）で２日間培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清を１０倍濃度に限外濃縮し、ＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア，ＩＰＶＨ０００１０）にドットブロットした。２１Ａ１抗体又は２４Ａ１抗体と反応させた後、抗マウスＩｇκ鎖ＨＲＰ標識抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１０５０−０５）にて検出した。
【００６５】
結果を図７に示す。２１Ａ１抗体は、ＰＤＧＦＲαの１０６−２１３アミノ酸（配列番号２）領域に、２４Ａ１抗体は、２１３−３１１アミノ酸（配列番号３）領域にエピトープがあることが示された。
【００６６】
（実施例９）抗体配列決定
２４Ａ１抗体の遺伝子配列を決定するため、重鎖（以下、「Ｈｃ」という）及び軽鎖（以下、「Ｌｃ」という）のクローニングを行った。２４Ａ１抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製した。常法に従って、５’−Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ（５’−ＲＡＣＥ）を行い、Ｈｃ及びＬｃ遺伝子の５’末端の塩基配列を決定した。Ｈｃ、Ｌｃに特異的なプライマーを使用して、それぞれの全長ｃＤＮＡをクローニングした。決定されたＨｃ及びＬｃの遺伝子配列は、配列番号２９及び配列番号３１、アミノ酸配列は、配列番号３０及び配列番号３２にそれぞれ記載の通りであった。
【００６７】
クローニングした２４Ａ１抗体のＨｃ及びＬｃ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｖ７９０−２０）に組み込むことにより発現ベクターを作製し、一過性発現試験により発現を確認した。Ｈｃ発現ベクターのみ、Ｌｃ発現ベクターのみ、又は、Ｈｃ発現ベクター及びＬｃ発現ベクターの両方をＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６５０）にトランスフェクションした。無血清のＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地（株式会社免疫生物研究所，３３２５２）中で２日間培養後、培養上清及び細胞を回収した。培養上清は１０倍濃度に限外濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルをＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア，ＩＰＶＨ０００１０）に転写後、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７５０４）にて検出した。
【００６８】
結果を図８に示す。細胞ペレットにおいてＨｃ、Ｌｃ及びＨｃ＋Ｌｃの発現が確認された。また、２４Ａ１抗体のＨｃ＋Ｌｃが効率よく培養上清に分泌されることが確認された。
【００６９】
（実施例１０）抗原特異性試験
ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６５０）で一過性発現させた２１Ａ１抗体及び２４Ａ１抗体の遺伝子産物の結合活性及び抗原特異性を確認するため、ＥＩＡ法を行った。ヒトＰＤＧＦＲα−Ｆｃ融合タンパク質（ＰＤＧＦＲα細胞外領域[１−５１４アミノ酸]とマウスＩｇＧ２ａ定常領域融合タンパク質）及びヒトｃ−ｋｉｔ−Ｆｃ融合タンパク質（ｃ−Ｋｉｔ細胞外領域[１−５０４アミノ酸]とマウスＩｇＧ２ａ定常領域融合タンパク質）を９６穴プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋ．Ｋ．，４３０３４１）にそれぞれ固相化させた。２４Ａ１抗体のＨｃ及びＬｃを共発現させたＣＯＳ−１細胞培養上清を段階希釈し、各ウェルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応させた後、終濃度が０．０５％となるようにｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳで洗浄し、４００μｇ／ｍＬに調製したオルトフェニレンジアミン・２ＨＣｌ（ＯＰＤ）（ＳＩＧＭＡ，Ｐ８７８７）溶液１００μＬを添加して呈色させた。
【００７０】
結果を表２に示す。培養上清中の２１Ａ１抗体及び２４Ａ１抗体は、ＰＤＧＦＲα−Ｆｃ融合タンパク質のみと反応し、ｃ−ｋｉｔ−Ｆｃ融合タンパク質との反応は確認されなかった。よって、発現ベクターにより発現させた２１Ａ１抗体及び２４Ａ１抗体がＰＤＧＦＲαと結合すること及び当該結合が抗原特異的であることが示された。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
（実施例１１）２４Ａ１抗体のヒト化
実施例８にてクローニングを行った２４Ａ１抗体のヒト化を目的として遺伝子を改変した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＩｇＢＬＡＳＴで、２４Ａ１抗体のＨｃ及びＬｃ可変領域の遺伝子配列のそれぞれと相同性のあるヒトＨｃ及びＬｃ遺伝子を検索した。ＨｃはＩＧＨＶ４−３０−４（配列番号２７）、ＬｃはＩＧＫＶ１Ｄ−１２（配列番号２８）と最も高い相同性が得られた。この配列を基に２４Ａ１抗体のＨｃ及びＬｃ遺伝子を改変し、アミノ酸レベルでヒト化を行った。Ｈｃのアミノ酸配列の比較図を図９に、Ｌｃのアミノ酸配列の比較図を図１０に示す。ＫＡＢＡＴら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）の法則に従い、ＣＤＲを確定した。図９及び図１０において、各ＣＤＲを下線で示した。各ＣＤＲは以下のとおりである。
【００７３】
重鎖ＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ（配列番号４）
重鎖ＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号５）
重鎖ＣＤＲ３：ＲＤＹＲＹＧＹＷＹＦＤＶ（配列番号６）
軽鎖ＣＤＲ１：ＨＡＳＱＮＩＨＶＷＬＴ（配列番号７）
軽鎖ＣＤＲ２：ＫＡＳＮＬＨＴ（配列番号８）
軽鎖ＣＤＲ３：ＱＱＧＱＳＹＰＷＴ（配列番号９）
【００７４】
ＣＤＲ配列は、抗原特異性を決定する配列であり、その周辺のアミノ酸配列はＣＤＲを抗原に呈示する立体構造をとる上で重要な役割を果たすことから、ＣＤＲ近傍の５アミノ酸はマウス型のまま保持し、その他のフレームワーク領域（以下、「ＦＲ」という）をヒトのアミノ酸配列に置換した。各ＦＲは以下のとおりである。
【００７５】
重鎖ＦＲ１：ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＹＳＩＴ（配列番号１５）
重鎖ＦＲ２：ＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＶＧ（配列番号１６）
重鎖ＦＲ３：ＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号１７）
重鎖ＦＲ４：ＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＡＫ（配列番号１８）
軽鎖ＦＲ１：ＤＩＱＭＮＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＴＩＴＩＴＣ（配列番号１９）
軽鎖ＦＲ２：ＷＹＱＱＫＰＧＮＩＰＫＬＬＩＹ（配列番号２０）
軽鎖ＦＲ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＧＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（配列番号２１）
軽鎖ＦＲ４：ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２２）
【００７６】
図９及び図１０中において、置換後のアミノ酸配列を「Ｈｕ  ＰＤＧＦＲａ（２４Ａ１）」で示した。また、置換後の重鎖のアミノ酸配列を配列番号２４に、軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２６に示す。構築した配列を基に、ヒト化Ｈｃ可変領域及びヒト化Ｌｃ可変領域のアミノ酸配列に相当する遺伝子配列を作製した。作製した人工遺伝子Ｈｕ  ＰＤＧＦＲａ（２４Ａ１）Ｈｃ及びＨｕ  ＰＤＧＦＲａ（２４Ａ１）Ｌｃを、ヒト抗体定常領域発現ベクターＳＲＨ（ヒトＩｇＧ１定常領域）及びＳＲＬ−ｎｅｏ（ヒトＩｇκ鎖定常領域）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５７，Ｉｓｓｕｅ  ７：３１４８−３１５２）にそれぞれ組み込み、ヒト化抗ＰＤＧＦＲａ抗体（２４Ａ１）発現ベクターを作製した。
【００７７】
作製したヒト化抗ＰＤＧＦＲａ抗体（２４Ａ１）のＨｃ及びＬｃの発現を確認するため、一過性発現試験を行った。比較のため、マウス抗ＰＤＧＦＲα抗体（２４Ａ１抗体）のＨｃ及びＬｃ可変領域をそれぞれＳＲＨ及びＳＲＬ−ｎｅｏに組み込んだ発現ベクター（キメラ抗ＰＤＧＦＲａ抗体（２４Ａ１））を作製して発現させた。Ｈｃ、Ｌｃ単独又はＨｃ及びＬｃを混合して、ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−１６５０）にトランスフェクションした。無血清のＤｕｌｂｅｃｃｏ  ＭＥＭ培地（株式会社免疫生物研究所，３３２５２）中で２日間培養後、培養上清（Ｓｕｐ）及び細胞（Ｃｅｌｌ  Ｐｅｌｌｅｔ）を回収した。培養上清は１０倍濃度に限外濃縮し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルをＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア，ＩＰＶＨ０００１０）に転写後、抗ヒトＩｇＧ定常領域ＨＲＰ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７５０７）及び抗ヒトＩｇκ鎖ＨＲＰ標識抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ，ＡＨＩ１１８０４）にて検出した。
【００７８】
図１１に示すように、Ｃｅｌｌ  ＰｅｌｌｅｔでＨｃ、Ｌｃ、及び、ＨｃとＬｃの両方の発現が効率よく確認された。培養上清中には、効率が悪いながらも分泌が確認された。
【００７９】
（実施例１２）ヒト化抗ＰＤＧＦＲα抗体（２４Ａ１）の活性測定
ヒト化した抗ＰＤＧＦＲα抗体（２４Ａ１）の活性を確認するためＥＩＡを行った。ヒトＰＤＧＦＲα−Ｆｃ融合タンパク質（ＰＤＧＦＲα細胞外領域[１−５１４アミノ酸]とマウスＩｇＧ２ａ定常領域融合タンパク質）及びヒトＦＬＴ４−Ｆｃ融合タンパク質（ＦＬＴ４細胞外領域[１−７６６アミノ酸]とマウスＩｇＧ２ａ定常領域融合タンパク質）を９６穴プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋ．Ｋ．，４３０３４１）に固相化した。実施例１０の記載の方法に準じて、Ｈｃ及びＬｃ遺伝子を共発現させたＣＯＳ−１細胞培養上清を段階希釈し、各ｗｅｌｌに添加した。３７℃で２時間反応後、洗浄し、抗ヒトＩｇＧ定常領域ＨＲＰ標識抗体（株式会社免疫生物研究所，１７５０７）を反応させた。３７℃で３０分反応後、洗浄してｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（ＳＩＧＭＡ，Ｐ８７８７）により呈色させた。
【００８０】
結果を表３に示す。培養上清中のヒト化ＰＤＧＦＲａ抗体（２４Ａ１）及びヒトキメラＰＤＧＦＲａ抗体（２４Ａ１）は、ＰＤＧＦＲα−Ｆｃ融合タンパク質にのみ反応し、ＦＬＴ４−Ｆｃ融合タンパク質への反応は確認されなかった。これにより、ヒト化ＰＤＧＦＲα抗体（２４Ａ１）の抗原特異性が確認された。また、ヒト化ＰＤＧＦＲα抗体（２４Ａ１）は、マウス型の可変領域を持つヒトキメラＰＤＧＦＲα抗体（２４Ａ１）と同等の活性を有することが示された。
【００８１】
【表３】
2013177317.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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