(57)【要約】      （修正有）【課題】心血管病予防薬又は治療薬の提供。【解決手段】例えば次式（２）2013133322.tif 000013で代表される化合物からなる組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
【化１】
2013133322.tif 000010
（式中、Ｒ1〜Ｒ4はＨ又は−ＣＨ3、Ｒ5〜Ｒ8はＨ、−ＯＨ又は−ＯＣＨ3であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一の基であっても、或いは異なった基でもよく、Ｒ5〜Ｒ8はそれぞれ同一の基であっても、或いは異なった基でもよい。）
で示されるフラボノイド没食子酸エステルと２価の遷移金属イオン化合物とを含有する酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物。
【請求項２】
前記式（１）において、Ｒ1、Ｒ4がＨである請求項１記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物。
【請求項３】
前記フラボノイド没食子酸エステルが下記式（２）：
【化２】
2013133322.tif 000011
で示されるエピカテキンガレート及び／又は下記式（３）：
【化３】
2013133322.tif 000012
で示されるカテキンガレートである請求項１又は２記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物。
【請求項４】
前記２価の遷移金属イオン化合物を構成する金属イオンが、鉄イオン又は銅イオンである請求項１〜３いずれかに記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物。
【請求項５】
請求項１〜４いずれかに記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物を含有する心血管病予防又は治療薬。
【請求項６】
請求項１〜４いずれかに記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物を含有する食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体であるＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害する薬剤組成物、及び該酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物を含有する食品組成物、並びに心血管病又は癌の予防又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本をはじめとする東アジアでは急激な社会の高齢化が進んでいる。さらに、医療技術の向上、国民の長寿化に伴い、医療費の中心は従来の急性疾患より、慢性疾患の治療へとシフトしつつある。
【０００３】
日本国厚生労働省の最近の人口動態統計によると、日本における疾患別死亡者の１位が悪性新生物（腫瘍及び癌）、２位が心疾患、３位が脳血管疾患となっているが、心疾患と脳血管疾患による死亡者の合計は全体の約２７％であり、これは悪性新生物の死亡者割合である約３０％にほぼ匹敵する（平成２０年（２００８年））。悪性新生物の対処方法に関しては、その発症プロセスから考慮すると早期発見・早期治療が重要であり、臨床学的なアプローチが望ましいとされる。一方、心疾患・脳血管疾患については、生活習慣病に起因する、慢性的な疾患である肥満症・動脈硬化症の下流に位置する疾患であり、その治療も長期間わたるものである。つまり、先に述べたように医療出費の中心が慢性疾患の治療へとシフトしていることが統計的にも現れている。
【０００４】
慢性的な疾患に対しては治療法として、長期投薬による治療と日常生活習慣への指導という形での対処法が一般的であるが、疾患の特性から、日常的に摂取可能な形態を用いる食品からの予防学的なアプローチが可能なプロセスであり、むしろ、このようなプロセスでの対処方法が望ましい。
【０００５】
心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患の危険因子として、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が知られている。元来ＬＤＬは血漿脂質の運搬に必要な脂質蛋白質複合体であるが、酸化を受け易い不飽和脂肪酸を多く含み、容易に酸化的修飾を受ける。この酸化型のＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）が血管内皮細胞の機能変化を引き起こし、病的生理活性を担う重要な因子であることが近年わかりつつある。
【０００６】
酸化ＬＤＬによる血管内皮細胞への作用を媒介する受容体として、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体（ＬＯＸ−１）が本発明者の一人である沢村  達也氏により血管内皮細胞より初めて分離同定された（非特許文献１）。その後の研究により、ＬＯＸ−１は内皮細胞のみならず、マクロファージ、血小板、血管平滑筋細胞などにおいても発現が確認されている（非特許文献２〜４）。
ＬＯＸ−１の発現は、糖尿病、高血圧、高脂血症などで増加しており、また、沢村  達也氏により作成された抗ＬＯＸ−１抗体（抗ヒトＬＯＸ−１マウスモノクローナル抗体ＴＳ９２）は酸化ＬＤＬとＬＯＸ−１との結合を阻害することにより酸化ＬＤＬによる内皮依存性弛緩反応の低下を回復し、さらに、心筋梗塞後の梗塞巣の形成やバルーン傷害後の血管内膜肥厚を抑制する。血栓の形成や、エンドトキシン起因性炎症作用、脳卒中の発症にもＬＯＸ−１の関与が示唆されており、ＬＯＸ−１が心血管病の発症において様々なレベルで関与していることが想定されている（非特許文献２、５〜１０）。
【０００７】
例えば、ＬＯＸ−１へのリガンドの結合を阻害することを目的とした発明は本発明者の一人である沢村  達也氏より酸化ＬＤＬ受容体に対する抗体を利用した医薬組成物が報告されている（特許文献１）。
【０００８】
一方、慢性疾患の一つである動脈硬化症に対する効能を主張する化合物について、これまでに報告がされている。例えば、特許文献２ではプロアントシアニジンを含む血栓形成抑制剤又は血小板凝集抑制剤を報告しており、また、本発明者の一人である沢村達也氏もＬＯＸ−１アンタゴニスト活性を有するポリフェノールとしてプロアントシアニジンを報告している（特許文献３）が、プロアントシアニジンは複数のフラボノイド単位が重合した縮合型タンニンであり、分子量が比較的大きいものである。これら高分子化合物は効能が見られたとしても特に経口からの摂取では有効成分の吸収面において非常に効率が悪く、事実、確実なに効果を発現するには、実施例のマウスの結果から換算して、成人男性６０ｋｇに対しては一日２４ｇの有効成分を含む血栓形成抑制剤又は血小板凝集抑制剤を摂取し続ける必要がある。また、プロアントシアニジンについては血糖若しくは血圧の上昇を抑制する効果、血中アディポネクチン濃度上昇効果などの報告もなされている（特許文献４，５）。また、動脈硬化症において発生の見られる線維性肥厚を防ぐ目的で没食子酸エステルの有効量を含む線維化抑制剤の報告も存在する（特許文献６）。しかしながら、特許文献６には没食子酸とフラボノイドとのエステルについて記載されているものの、この化合物とＬＯＸ−１との関連については記載がなく不明である。
【０００９】
また、フラボノイドの一種であるカテキンやエピカテキンによる血管系機能改善も報告されている（特許文献７）が、特許文献７において言及されているカテキンやエピカテキンの没食子酸エステル化合物についてはＬＯＸ−１との関連性について詳細な検討が実施されていない。加えて、フラボノイドは鉄イオンや銅イオンなどの金属イオンとキレートを形成することでラジカルの形成やその伝播を抑制する（非特許文献１１、１２）ことが知られているが、キレートを形成したフラボノイドが受容体へ作用する報告は見られない。
【００１０】
その他、没食子酸エステルを含有する物としての緑茶の抽出物と動脈硬化に関する報告がいくつかなされているが、ＬＯＸ−１との関連性については一切の検討がなされていない。例えば、血清コレステロール値を低下させる効果を特許文献８〜１１などで報告されているが、いずれも、腸管でのコレステロールの吸収を阻害することを目的としており、そもそも、ヒトを含む動物は自身にコレステロール合成経路を持ち合わせる中、腸管でのコレステロールの吸収を阻害することでの動脈硬化効果は非常に限定的であると推測される。
【００１１】
加えて、近年、血中コレステロール値と動脈硬化の因果関係について、日本脂質栄養学会が従来の見解と異なった新たなガイドラインを発表するなど（非特許文献１３）、必ずしも血中コレステロール値の低下が動脈硬化の予防、更には心血管病の根源的な予防の効果があるとは言い切れていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１０−１８０２１２号公報
【特許文献２】特開２００４−２３８２８９号公報
【特許文献３】特開２０１１−００６３２６号公報
【特許文献４】特開２００３−２１２７８３号公報
【特許文献５】特開２００６−１８２７０６号公報
【特許文献６】特開平５−２７１０６７号公報
【特許文献７】特表２００９−５０１１６１号公報
【特許文献８】特開昭６０−１５６６１４号公報
【特許文献９】特開昭６２−３０７１１号公報
【特許文献１０】特許第２８１２６８２号公報
【特許文献１１】特開２００４−２６２９２７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３８６：７３  ‐７７，（１９９７）
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅ  ｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ２８２：１５３‐１５８  （２００１）
【非特許文献３】Ｋａｔａｏｋａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈ  ｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，  ２１：９５５‐９６０（２００１）
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３３４：  ９‐１３（１９９８）
【非特許文献５】Ｍｅｈｔａ  ＪＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒ  Ｒｅｓ  １００（１１）１  ６３４‐１６４２（２００７）
【非特許文献６】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ，  ３０２：６０１‐６０５（２００２）
【非特許文献７】Ｈｉｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，  ６  ９：２６３‐２７１（２００６）
【非特許文献８】Ｋａｋｕｔａｎｉ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａ  ｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ９７：３６０‐３６４（２０００）
【非特許文献９】Ｈｏｎｊｏ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓ  ｃｉ  ＵＳＡ．  １００：１２７４‐１２７９（２００３）
【非特許文献１０】Ｉｎｏｕｅ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．  ２０１０    Ａｐｒ；５６（４）：５５０‐５５８
【非特許文献１１】Ｐｉｅｔｔａ  ＰＧ，Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．  ２０００，  ６３，  １  ０３５−１０４２
【非特許文献１２】Ｈｅａｔｈｅｒ  Ａ．  Ｈｉｒｓｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ    Ｃｅｌｌ，  １７，  ３４８‐３６１（２０１０）
【非特許文献１３】長寿のためのコレステロールガイドライン２０１０年度版  中日出版社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記の背景技術を鑑みてなされたものであり、心血管病の根源的な予防、治療を目標とし、血管内皮細胞、マクロファージなどで発現されている酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ-１と酸化ＬＤＬ及びその他ＬＯＸ−１とリガンドとの結合を阻害する、安全性が高い薬剤組成物、該組成物を含有する心血管病予防薬又は治療薬及び食品組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために、様々な天然物よりＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合能を阻害する成分を鋭意探索した。その結果、フラボノイド没食子酸エステルの中より、本目的の作用の強い化合物を発見し、さらに、２価の遷移金属イオン化合物がフラボノイド没食子酸エステルの結合阻害活性の強化に必須であることを見出し、本発明が完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕下記式（１）：
【００１７】
【化１】
2013133322.tif 000002
【００１８】
（式中、Ｒ1〜Ｒ4はＨ又は−ＣＨ3、Ｒ5〜Ｒ8はＨ、−ＯＨ又は−ＯＣＨ3であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一の基であっても、或いは異なった基でもよく、Ｒ5〜Ｒ8はそれぞれ同一の基であっても、或いは異なった基でもよい。）
で示されるフラボノイド没食子酸エステルと、２価の遷移金属イオン化合物とを含有する酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物、
〔２〕前記式（１）において、Ｒ1、Ｒ4がＨである前記〔１〕記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物、
〔３〕前記フラボノイド没食子酸エステルが下記式（２）：
【００１９】
【化２】
2013133322.tif 000003
【００２０】
で示されるエピカテキンガレート（ＥＣｇ）び／又は下記式（３）：
【００２１】
【化３】
2013133322.tif 000004
【００２２】
で示されるカテキンガレート（Ｃｇ）である前記〔１〕又は〔２〕記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物、
【００２３】
〔４〕前記２価の遷移金属イオンが、鉄イオン又は銅イオンである前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物、
〔５〕前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物を含有する心血管病予防又は治療薬、
〔６〕前記〔１〕〜〔４〕いずれかに記載の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物を含有する食品組成物、
に関する。
【００２４】
なお、本発明において、酸化ＬＤＬ結合阻害作用は、レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体であるＬＯＸ-１への酸化ＬＤＬの結合を阻害する作用を意味し、具体的には、後述の実施例に記載のような方法で酸化ＬＤＬ結合阻害作用を評価する。
【００２５】
また、本発明において、心血管病としては、心臓・血管における疾患を意味しており、例えば、脳卒中、心筋梗塞、血栓症疾患、炎症性疾患などが挙げられる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物を用いることで、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害して、ＬＯＸ−１を介した酸化ＬＤＬの血管内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞などの細胞内への取り込みを阻害することができる。また、酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物の有効成分である式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルの優れた加工適性から食品組成物や医薬品への応用が容易であり、安価且つ安全にＬＯＸ−１を介した心血管病を治療又は予防するという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、実施例１における、ＥＣｇ及び各金属イオンの存在下のｈＬＯＸ−１タンパク質（ヒト由来組換え型ＬＯＸ−１タンパク質）に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の結果を示すグラフである。縦軸は化合物未添加の場合の酸化ＬＤＬ結合能を１００とした場合の、各化合物が有する酸化ＬＤＬ結合阻害能の相対値を示す。相対値が低いほど酸化ＬＤＬ結合阻害能が高いことを示す。
【図２】図２は、実施例２におけるＥＣｇ及び２価遷移金属イオンの存在下でのｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の結果を示すグラフである。
【図３】図３は実施例３における２価の遷移金属イオン存在下でのＥＣｇ又はＣｇのｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の結果を示すグラフである。
【図４】図４は実施例４における各フラボノイド没食子酸エステル及び２価遷移金属イオン存在下でのｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物は、有効成分として式（１）：
【００２９】
【化４】
2013133322.tif 000005
【００３０】
（式中、Ｒ1〜Ｒ4はＨ又は−ＣＨ3、Ｒ5〜Ｒ8はＨ、−ＯＨ又は−ＯＣＨ3であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一の基であっても、或いは異なった基でもよく、Ｒ5〜Ｒ8はそれぞれ同一の基であっても、或いは異なった基でもよい。）
で示されるフラボノイド没食子酸エステルと、２価の遷移金属イオン化合物とを含有する組成物である。
【００３１】
前記フラボノイド没食子酸エステルは、フラボノイドと、没食子酸とのエステル化合物である。
【００３２】
本発明では、前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルを有効成分として用いることで、例えば、プロアントシアニンのような重合体に比べると、単量体であるため、投与されたヒトや非ヒト動物の体内に吸収されやすいという利点がある。
【００３３】
前記式中、Ｒ1〜Ｒ4は、Ｈ又は−ＣＨ3であり、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ同一の基であっても、異なった基であってもよい。また、Ｒ5〜Ｒ8は、Ｈ、−ＯＨ又は−ＯＣＨ3であり、Ｒ5〜Ｒ8はそれぞれ同一の基であっても、異なった基であってもよい。
中でも、前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルとしては、強い酸化ＬＤＬ結合阻害作用を発現する観点から、Ｒ1、Ｒ4がＨであることが好ましく、Ｒ1〜Ｒ4がＨ、Ｒ5〜Ｒ8がＨ又は−ＯＨであることがより好ましい。中でも、酸化ＬＤＬ結合阻害作用を顕著に有する観点から、下記式（２）：
【００３４】
【化５】
2013133322.tif 000006
【００３５】
で示されるＥＣｇ及び／又は下記式（３）：
【００３６】
【化６】
2013133322.tif 000007
【００３７】
で示されるＣｇであることが好ましい。
【００３８】
前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルの多くはカメリア  シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（茶）をはじめ幅広い植物中に見出される。カメリア  シネンシスは、日本を含む世界中において古くから飲料及び食品の原料として様々な形態で長く食されているため、前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルは、安全性の点で、問題はない。
【００３９】
ただし、前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルはいずれも前記カメリア  シネンシス中における含有量が少ない。例えば、天然界で比較的存在量の多いとされるＥＣｇにおいてすら、前記カメリア  シネンシスに含まれる全主要フラボノイド類中の約１０％程度に過ぎない（例えば、村松敬一郎著，茶の科学，朝倉書店，ｐ８８）。したがって、前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルはいずれも、カテキンなどの他のフラボノイドに比べると、これまで作用の検討が見過ごされてきた化合物群である。
【００４０】
前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルは、そのまま酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物の有効成分として用いることが好ましいが、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物では、前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルに加えて、２価の遷移金属イオン化合物を混合する。
【００４１】
前記２価の遷移金属イオン化合物とは、水溶液中で、金属イオンを放出することができる化合物である。前記２価の遷移金属イオン化合物を構成する金属イオンとしては、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、コバルトイオン、マンガンイオン、銀イオンなどが挙げられるが、酸化ＬＤＬ結合阻害作用に優れる観点から、鉄イオン、銅イオンが好ましい。
前記イオン性化合物としては、具体的には、前記２価の遷移金属の硫酸塩、硝酸塩、塩化物、硫化物、水酸化物などが挙げられるが特に限定はない。
本発明において、前記２価の遷移金属イオン化合物は、イオン性化合物を前記フラボノイド没食子酸エステルと混合すればよい。
【００４２】
前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステル及び２価の遷移金属イオン化合物の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物中における量は、有効成分として作用効果が奏される量であればよく、前記２成分のみで調製されていてもよく、他の成分を含有していてもよく、特に限定はない。
【００４３】
また、酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物中における前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステルと２価の遷移金属イオンとのモル比は、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合阻害作用を奏する観点から、１００：１〜１：１０の範囲であることが好ましい。
なお、前記２価の遷移金属イオン化合物のモル比は、使用するイオン性化合物中の遷移金属の量を換算して算出すればよい。
【００４４】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物は、前記前記式（１）で示されるフラボノイド没食子酸エステル及び２価の遷移金属イオン化合物以外にも必要に応じて他の成分を配合してもよい。
前記の成分としては、例えば、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施してもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤、乳化剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることなどが挙げられる。
【００４５】
また、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物は、食品、医薬品などの組成物に、公知の技術を用いて、配合することができる。この場合、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物をそのまま用いてもよいが、各種基材に配合してもよい。基材の種類は特に限定されるものではなく、適時設定すればよいが、例えば、錠剤、カプセル、飴、グミあるいはドリンクなどの経口投与基材が、食品などに簡易に配合できる観点から好ましい。
【００４６】
食品組成物としては、一般食品として、種々の食品原料に前記酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物の所望量を加え、通常の製造方法により加工することにより、また、健康食品、機能性食品として、食べ易い状態にして使用することができる。
【００４７】
医薬品組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤、液剤などが挙げられ、これらは増量剤、賦形剤、潤沢剤、崩壊剤、結合剤、矯味矯臭剤などと共に通常の方法に従って製剤すればよい。これらの医薬品組成物は、心血管病の予防薬又は治療薬として使用される。
【００４８】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物の１日あたりの投与量は、症状、身長、体重、年齢などにより異なるが、成人１人あたりの摂取量が、１〜２０００ｍｇ／ｋｇ・日、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇ・日となるように、１回ないし数回に分けてヒトや非ヒト動物などの被検体に投与するのがよい。
【００４９】
本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物は、ヒトや非ヒト動物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ウサギ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、モルモットなどの哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウなどの鳥類）に投与することで、心血管病を予防／治療することが期待できる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の主旨はこれらによって制限されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
各種の２価の遷移金属イオン存在下でのＥＣｇの酸化ＬＤＬ結合阻害作用を組換えｈＬＯＸ−１タンパク質を用いて評価を行った。
【００５２】
２価の遷移金属イオン化合物としては、ＦｅＳＯ4、ＣｕＳＯ4、ＮｉＳＯ4、ＺｎＳＯ4、ＣｏＣｌ2及びＭｎＳＯ4を使用した。
【００５３】
組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は、ヒト由来ＬＯＸ−１の細胞外ドメインである。ｈｕｍａｎ  ＬＯＸ−１  ｃＤＮＡ（ジーンバンク：ＮＭ００２５４３）のうち、細胞外ドメイン（ｅｘ−ｈＬＯＸ−１）をコードする領域（６１〜２７３番目の塩基配列）を、定法に従い発現、精製し得たものを使用した。組換えｈＬＯＸ−１タンパク質は酸化ＬＤＬに対する結合能力を有していることを確認し、以下のＥＬＩＳＡによる試験用ＬＯＸ−１標品として用いることにした。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）は、マキシソープ・イムノプレート（９６ウェルタイプ、ＮＵＮＣ製）を用いて行った。上記のように精製した組換えｈＬＯＸ−１タンパク質を５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）バッファーで調整し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１晩静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、２０％イムノブロックを含むＰＢＳ（−）バッファー３００μＬを各ウェルにアプライした。２５℃で２時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×２回で洗浄し、２μＭ  ＥＣｇ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌバッファーで各遷移金属イオン濃度が３μＭとなるように調整した各精製サンプルを５０μＬずつ各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、１μｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＢＳＡで調整した酸化ＬＤＬを各ウェルにアプライした。４℃で１時間静置した後に、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ａｎｔｉ−ＡｐｏＢ  ＨＵＣ２０抗体を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×３回で洗浄し、Ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ抗体を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＢＳＡで適当量希釈し、５０μＬずつ各ウェルにアプライした。室温で１時間の静置後、ＰＢＳ（−）バッファーで各ウェルを４００μＬ×５回で洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンヂジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ−酵素免疫測定（ＥＩＡ）−基質−キット試薬（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を５０μＬずつ各ウェルにアプライした。適当な反応時間後に、０．５Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を５０μＬずつ各ウェルにアプライして反応を停止させた。最終的に４５０ｎｍで検出を行い、酸化ＬＤＬ結合阻害活性（ＬＯＸ‐１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害率）を定量した。図１に結果を示す。
【００５５】
その結果、図１に示すように、酸化ＬＤＬの結合率が１００％である場合（図中、「１００％ｂｉｎｄｉｎｇ」）と比べると、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン存在下でＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合阻害活性が見いだされた。中でも、鉄イオン存在下に最も優れた酸化ＬＤＬ結合阻害活性が見いだされた。これは金属イオン化合物無添加時（図中「ｎｏ  ｍｅｔａｌ」）よりも優れた活性である。同様に、銅イオンにおいても優れた酸化ＬＤＬ結合阻害活性が見いだされた。このことから鉄イオン及び銅イオンの存在がＥＣｇの酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物として有用であることが示された。
【００５６】
なお、前記ＥＣｇのかわりに、Ｃｇを用いた場合でも、鉄イオン、銅イオンの存在下で、酸化ＬＤＬ結合阻害作用が確認された。
【００５７】
（実施例２）
ＥＣｇ及び２価遷移金属イオンの存在下でのｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の評価を行った。
【００５８】
評価方法では、２価の遷移金属イオンとして０．１μＭ〜１００μＭの２価の鉄又は銅イオンが存在するように調整した以外は、実施例１と同様に行った。結果を図２に示す。
【００５９】
図２の結果より、２μＭのＥＣｇを用いる場合、鉄イオン０．１μＭ〜１００μＭ存在下で、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合阻害活性が示されることが見出された。また、２μＭのＥＣｇを用いる場合、銅イオン０．１μＭ〜１００μＭ存在下、特に１μＭ〜１０μＭで、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合阻害活性が示されることが見出された。
また、２μＭのＥＣｇを用いる場合、銅イオン３μＭ〜１０μＭ存在下で、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合阻害活性が示されることが見出された。
したって、金属イオンの種類により、少しずれがあるものの、フラボノイド没食子酸エステルと２価の金属イオンとのモル比は、鉄イオンの場合、２０：３〜２：１０が好ましく、２：３〜２：１０が好ましいことがわかる。
【００６０】
（実施例３）
２価の遷移金属イオン存在下でのＥＣｇ又はＣｇのｈＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害能の評価を行った。
【００６１】
評価方法は、２価の遷移金属イオンとして２価の鉄イオンを用い、ＥＣｇ又はＣｇを０．０３μＭ〜１０μMの濃度で用いた以外は実施例１に準じて行った。結果を図３に示す。
【００６２】
図３の結果より、ＥＣｇ及びＣｇは、０．１μＭ以上の濃度で優れた阻害活性を示すことが見出された。
【００６３】
（実施例４）
ＥＣｇ類縁体によるＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合阻害作用を以下のようにして調べた。
下記フラバン骨格：
【００６４】
【化７】
2013133322.tif 000008
【００６５】
において、Ｃ環に没食子酸エステル構造を持つ、フラボノイド没食子酸エステルであるＥＣｇ及びＥＣｇの類縁体４種（式：
【００６６】
【化８】
2013133322.tif 000009
【００６７】
で表されるＥＣｇ３’−Ｏ−Ｍｅ、ＥＣｇ４’−Ｏ−Ｍｅ、ＥＣｇ３’’−Ｏ−Ｍｅ、ＥＣｇ４’’Ｏ−Ｍｅ）のＬＯＸ−１に対する酸化ＬＤＬ結合阻害作用を評価した。
なお、評価方法では、金属イオンとして２価の鉄イオンを用いた以外は、実施例１に準じて行った。結果を図４に示す。
【００６８】
図４の結果より、ＥＣｇ３’’−Ｏ−Ｍｅにも鉄イオン存在下で優れた酸化ＬＤＬ結合阻害作用が見いだされた。ＥＣｇ３’’−Ｏ−Ｍｅの酸化ＬＤＬ結合阻害作用はＥＣｇに比べると低いものの、ＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬ結合阻害作用を有すると考えられる。このことからＥＣｇ３’’−Ｏ−Ｍｅが酸化ＬＤＬ結合阻害物質として有用であることが示された。
【００６９】
また、前記非特許文献２〜１０にはＬＯＸ−１が心血管病の発症に関連していることが示されていることから、ＬＯＸ−１の作用を阻害できる酸化ＬＤＬ結合阻害剤が動物における心血管病の予防・治療薬として使用できることは十分予想される。
したがって、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物も、上記のように、酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−１への酸化ＬＤＬの結合を阻害する作用に優れ、かつ安全性が高いことから、本発明の酸化ＬＤＬ結合阻害剤組成物をヒトや非ヒトの哺乳動物などの被検体に継続的に摂取させることにより、血管内皮細胞などの心血管病に関連する細胞への酸化ＬＤＬの結合が継続的に阻害されて、ヒト、非ヒト動物における心血管病の関連疾患の発症を抑える予防薬、又は疾患の症状を緩和したりする治療薬として使用することができる。
【図１】
2013133322.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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