(57)【要約】【課題】膵臓癌の特異的検出及び予後の予測の方法等の膵臓癌及び予後マーカー、及び使用方法を提供すること。【解決手段】予後良好及び予後不良の膵臓癌組織、並びに対照となる正常膵管組織のＦＦＰＥ標本からタンパク質を抽出して可溶化し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、それぞれの組織において発現するタンパク質を計１２２９種同定した。次に、統計解析やスペクトラム・カウンティング解析、遺伝子オントロジー解析により、計１７０種類のタンパク質を膵臓癌マーカータンパク質候補として選択しＭＲＭ法で解析した。ＭＲＭ法の解析結果を精査し、最終的に、Ａ群〜Ｃ群の膵臓癌マーカータンパク質を同定した。これらの膵臓癌マーカータンパク質を用いることによって、膵臓癌を特異的に検出し、予後を予測することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓組織における、膵臓癌の有無を判定し、かつ予後を予測する方法であって、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を備えたことを特徴とする方法。
（ａ）被験者より採取された判定用試料における、膵臓癌マーカーの発現量を定量する定量工程であって、前記膵臓癌マーカーが以下の各群のマーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡである定量工程；
［Ａ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
（ｂ）前記判定用試料における前記膵臓癌マーカーの発現量と、対照となる健常試料における前記膵臓癌マーカーの発現量とを比較する比較工程；
（ｃ）発現量の比較結果に基づいて、以下の［ｉ］〜［iii］のいずれかの基準により評価をする評価工程；
［ｉ］判定用試料におけるＡ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の膵臓組織中に予後不良の膵臓癌組織が存在すると評価する；
［ii］判定用試料におけるＢ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の膵臓組織中に予後良好の膵臓癌組織が存在すると評価する；
［iii］判定用試料におけるＣ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、増加している場合に被験者の膵臓組織中に予後不良又は予後良好の膵臓癌組織が存在すると評価する；
【請求項２】
［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる以下の［Ａ’群マーカータンパク質］から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
［Ａ’群マーカータンパク質］
ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ
【請求項３】
判定用試料が、組織、体液、又は組織の浸漬液であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
体液が、血液、膵液、リンパ液、胆汁、尿、唾液、汗、精液であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
定量工程が、液体クロマトグラフィー質量分析法又は免疫学的測定法により、膵臓癌マーカータンパク質の発現量を定量する工程であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
以下の各群のマーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡを膵臓癌マーカーとして使用する方法。
［Ａ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
【請求項７】
［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる以下の［Ａ’群マーカータンパク質］から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
［Ａ’群マーカータンパク質］
ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ
【請求項８】
膵臓癌マーカーとして使用するための、以下の各群のマーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡ。
［Ａ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
【請求項９】
［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる以下の［Ａ’群マーカータンパク質］から選択されることを特徴とする請求項８記載の１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡ。
［Ａ’群マーカータンパク質］
ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓組織における膵臓癌の有無及び膵臓癌の予後を判定する方法や、該方法に用いるための膵臓癌及び予後の予測マーカー等に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、膵液と呼ばれる消化酵素を含む液体を分泌し、それを膵管により消化管に送り込む外分泌腺であるとともに、膵臓組織に無数に散らばるランゲルハンス島と呼ばれる球状に小さな細胞の集塊がインスリン、グルカゴンなどのホルモンを血液中に分泌する内分泌腺としての機能も有する。独立行政法人国立がん研究センターがん対策情報センターによれば、２００９年の日本国内における癌の部位別死亡者数の統計では膵臓癌は第５位であるが、膵臓癌の罹患数は死亡数とほぼ等しく、１９９３〜１９９６年の部位別がん患者の５年相対生存率は最も低い。すなわち、膵臓癌は、診断、治療ともに困難で、消化器系悪性腫瘍の中で最も予後不良な癌である。長期生存を得るための唯一の治療法は根治的外科切除であるが、膵臓癌は、早期には自覚症状がなく進行が非常に早いため進行がんで発見されることが多く切除率は約３０％にとどまる。また、根治切除後の再発率も極めて高く、切除例の５年生存率は１０％程度にすぎない。膵臓癌の予後を改善するためには、早期診断のみならず、手術や化学療法などの有効性を評価した上での的確な治療方針の確立が重要である。
【０００３】
現在のところ、膵臓癌の診断用マーカーとして、癌胎児性抗原ＣＥＡや糖鎖抗原ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２、ＳＰａｎ−１等が知られているが、これらはいずれも膵臓癌に特異的なマーカーではなく擬陽性が多い、またその一部は膵臓癌と膵炎とを区別できないものがあるなどにより、膵臓癌の早期診断には有効でないと考えられている（非特許文献１）。実際、ＣＥＡは膵臓癌だけでなく、結腸直腸癌、胃癌、胆道癌、乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌を有する患者の血清中でも増加することや（非特許文献２）、初期の癌患者の血清中では増加しないことも報告されている（非特許文献３〜５）。ＣＥＡと同様に、ＣＡ１９−９は、消化系の癌、特に膵臓がんに特異性の高い腫瘍マーカーであり、膵臓癌を特異的に検出するために適当なマーカーとは言えない。膵臓癌発癌過程における詳細な癌関連分子の発現変動に関する検討も行われているが、検体量が少ない場合にｍＲＮＡの定量解析がうまくいかないこと、膵臓癌の種類によっては検出できない、あるいは膵臓癌だけでなく膵炎でも検出されるなど、問題があり実用化には至っておらず（非特許文献６、特許文献１〜３）、特許文献４及び５には癌の予後予測のマーカーが記載されているが、特定の癌を判別することはできず、膵臓癌における予後は、生死の結果からの判定を待つのが現状である。以上のように、膵臓癌を特異的に検出するためのマーカーや、膵臓癌の予後を予測するためのマーカーや、まして膵臓癌の検出及び予後予測のためのマーカーは未だ存在しておらず、その開発が急がれている。
【０００４】
他方、ホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed paraffin embedded）は、手術等で摘出された組織を保存するための最も一般的な方法であり、多くの病院や研究機関では、病理診断等を行った後のホルマリン固定パラフィン包埋組織（以下、「ＦＦＰＥ組織」という場合がある）が大量に保存されている。これらのＦＦＰＥ組織は、患者の治療成績・予後等臨床情報が明らかであることから、バイオマーカー検索や創薬ターゲット探索のために非常に有効であると考えられている。しかし、ＦＦＰＥ組織では、ホルマリン固定よって組織内のタンパク質が架橋されているため、タンパク質を抽出することは困難であり、さらに、ホルマリン固定によって高分子が断片化されていることから、ＦＦＰＥ組織を、プロテオーム解析に用いることは不可能であると考えられていた。しかし、ごく最近になり、ＦＦＰＥ組織からのタンパク抽出法が開発され（特許文献６及び７）、ＦＦＰＥ組織を用いたプロテオーム解析が可能になりつつある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５００９４８号公報
【特許文献２】特表２００６−５２６１４０号公報
【特許文献３】特表２００９−５１３１６１号公報
【特許文献４】特表２０１１−５１６０７７号公報
【特許文献５】特表２００７−５３２１１３号公報
【特許文献６】特許第４５７９２３４号公報
【特許文献７】特表２０１０−５３０９８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】CLINICIAN, No.476, 104:1118-1123 (1998)
【非特許文献２】J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57: 11-22 (1976)
【非特許文献３】Dis. Colon. Rectum. 42: 921-929 (1999)
【非特許文献４】Ann. Surg. 183: 5-9 (1976)
【非特許文献５】N. Engl. J. Med. 299: 448-451 (1978)
【非特許文献６】膵臓 25:23-27 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、膵臓癌の有無を判定し、かつ予後を予測する方法や、膵臓癌マーカーの使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、過去１０年間（１９９８年〜２００７年）の浸潤性膵管癌手術症例１５６症例から、既知の予後因子（ステージ、分化度、術後腫瘍マーカー値、補助化学療法）が同一であるにも関わらず、予後に差がある２群（各４例）を予後良好群、予後不良群として抽出した。正常膵管組織（５例）、並びに予後良好群及び予後不良群の膵臓癌細胞において発現するタンパク質をＦＦＰＥ組織から抽出し、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析計）で解析し、合計１２２９種のタンパク質を同定した。予後不良群で同定した９２４種及び予後良好群で同定した８４５種の計１０９９種のタンパク質から比較定量解析（スペクトラルカウント）、統計解析（Ｇ検定）、遺伝子オントロジー解析及び文献検索によって、予後不良群で高発現するタンパク質をグループ１、及び予後良好群で高発現するタンパク質をグループ２として計１０６種、各群５３種のタンパク質を分類した。また、６４種のタンパク質を正常膵管細胞と膵臓癌細胞で発現に差があるグループ３として分類した。以上のDiscovery stepで得られた計１７０種類のタンパク質すべてをＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring）解析に供し、Validation stepを行った。その結果グループ１の１３種、グループ２の４種、グループ３の１８種の計３５種類のタンパク質を、膵臓癌マーカー候補として同定した。さらに、これら計３５種のＭＲＭ解析結果を精査し、その結果（１）１８種類のタンパク質（ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ）が予後不良の膵臓癌において発現量が高いこと、（２）４種類のタンパク質（ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ）が予後良好の膵臓癌において発現量が高いこと、（３）１３種類のタンパク質（ＡＳＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ６＿ＨＵＭＡＮ、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ）が、予後不良及び予後良好の膵臓癌において発現量が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、［１］膵臓組織における、膵臓癌の有無を判定し、かつ予後を予測する方法であって、
（ａ）被験者より採取された判定用試料における、膵臓癌マーカーの発現量を定量する定量工程であって、前記膵臓癌マーカーが以下の各群のマーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡである定量工程；
［Ａ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
（ｂ）前記判定用試料における前記膵臓癌マーカーの発現量と、対照となる健常試料における前記膵臓癌マーカーの発現量とを比較する比較工程；
（ｃ）発現量の比較結果に基づいて、以下の［ｉ］〜［iii］のいずれかの基準により評
価をする評価工程；
［ｉ］判定用試料におけるＡ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の膵臓組織中に予後不良の膵臓癌組織が存在すると評価する；
［ii］判定用試料におけるＢ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の膵臓組織中に予後良好の膵臓癌組織が存在すると評価する；
［iii］判定用試料におけるＣ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、増加している場合に被験者の膵臓組織中に予後不良又は予後良好の膵臓癌組織が存在すると評価する；
の（ａ）〜（ｃ）の工程を備えたことを特徴とする方法や、［２］［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる
［Ａ’群マーカータンパク質］
ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ
から選択されることを特徴とする前記［１］記載の方法や、［３］判定用試料が、組織、体液、又は組織の浸漬液であることを特徴とする前記［１］又は［２］記載の方法や、［４］体液が、血液、膵液、リンパ液、胆汁、尿、唾液、汗、精液であることを特徴とする前記［３］記載の方法や、［５］定量工程が、液体クロマトグラフィー質量分析法又は免疫学的測定法により、膵臓癌マーカータンパク質の発現量を定量する工程であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか記載の方法からなる。
【００１０】
また本発明は、［６］
［Ａ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
の各群のマーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡを膵臓癌マーカーとして使用する方法や、［７］［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる
［Ａ’群マーカータンパク質］
ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ
から選択されることを特徴とする前記［６］記載の方法や、［８］膵臓癌マーカーとして使用するための、
［Ａ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
の各群のマーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡや、［９］［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる
［Ａ’群マーカータンパク質］
ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ
から選択されることを特徴とする前記［８］記載の１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡからなる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、膵臓癌の早期検出を行うことや、膵臓癌の予後を予測することが可能となり、膵臓癌の治療を行う上で極めて有用な情報を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】解析に使用する予後不良群及び予後良好群のサンプルの選択の方法を示す図である。
【図２】本発明における、実験の概要（ディスカバリーステージ）を示す図である。
【図３】本発明における、実験の概要（バリデーションステージ）を示す図である。
【図４】スペクトラルカウントの結果の１例を示す図である。
【図５】予後不良群で高発現するタンパク質、及び予後良好群で高発現するタンパク質１０６種をグループ１、２として選択した方法の概略を示す図である。
【図６】正常膵管組織と膵臓癌組織で発現量に差のあるタンパク質６４種をグループ３として選択した方法の概略を示す図である。
【図７】本発明の膵臓癌マーカー候補を選択した方法の概略を示す図である。グループ１〜３のタンパク質を定量ＭＳ解析（ＭＲＭ法）で解析し、正常膵管組織と比較して発現量が高いタンパク質を本発明の膵臓癌マーカー候補とした。
【図８】定量ＭＳ解析（ＭＲＭ）法結果を精査することにより得た、Ａ群〜Ｃ群の膵臓癌マーカータンパク質を示す図である。グラフは、各組織サンプル群におけるＡ群〜Ｃ群のタンパク質発現量のＭＲＭ定量値をアクチンベータ（ＡＣＴＮＢ＿ＨＵＭＡＮ）タンパク質のＭＲＭ定量値で割った正規化された値の結果の一例を示す。
【図９】本発明の膵臓癌マーカーのうちＡ群、すなわち正常膵管組織と比較して予後不良膵臓癌組織において特異的に発現量が高いタンパク質の発現量を示す図である。グラフは左から正常膵管群、予後良好群、予後不良群におけるタンパク質のＭＲＭ定量値をアクチンベータ（ＡＣＴＮＢ＿ＨＵＭＡＮ）タンパク質のＭＲＭ定量値で割った正規化された値を示す。カッコ書きは、膵臓癌における発現が報告されているタンパク質を表す。
【図１０】本発明の膵臓癌マーカーのうちＢ群、すなわち正常膵管組織と比較して予後良好膵臓癌組織において特異的に発現量が高いタンパク質の発現量を示す図である。グラフは左から正常膵管群、予後良好群、予後不良群におけるタンパク質のＭＲＭ定量値をアクチンベータ（ＡＣＴＮＢ＿ＨＵＭＡＮ）タンパク質のＭＲＭ定量値で割った正規化された値を示す。カッコ書きは、膵臓癌における発現が報告されているタンパク質を表す。
【図１１】本発明の膵臓癌マーカーのうちＣ群、すなわち正常膵管組織と比較して予後不良及び予後良好膵臓癌組織において特異的に発現量が高いタンパク質の発現量を示す図である。グラフは左から正常膵管群、予後良好群、予後不良群におけるタンパク質のＭＲＭ定量値をアクチンベータ（ＡＣＴＮＢ＿ＨＵＭＡＮ）タンパク質のＭＲＭ定量値で割った正規化された値を示す。取り消し線は、膵臓癌における発現が報告されているタンパク質を表す。
【図１２】定量ＭＳ解析（ＭＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、正常膵管組織、予後不良膵臓癌組織及び予後良好膵臓癌組織における、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（下段）及び染色した結果（上段）を示す図である。
【図１３】定量ＭＳ解析（ＭＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、正常膵管組織、予後不良膵臓癌組織及び予後良好膵臓癌組織における、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（下段）及び染色した結果（上段）を示す図である。
【図１４】定量ＭＳ解析（ＭＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、正常膵管組織、予後不良膵臓癌組織及び予後良好膵臓癌組織における、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（下段）及び染色した結果（上段）を示す図である。
【図１５】定量ＭＳ解析（ＭＲＭ）法及び免疫組織化学染色（ＩＨＣ）法により、正常膵管組織、予後不良膵臓癌組織及び予後良好膵臓癌組織における、ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮの発現量を解析した結果（下段）及び染色した結果（上段）を示す図である。
【図１６】３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ［上段左図］、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ［上段右図］及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ［下段左図］）の発現が検出された症例（陽性群１［実施例２参照］）と検出されなかった症例（陰性群１［実施例２参照］）における、膵臓癌治療後の生存率を、カプラン・マイヤー（Kaplan-Meier）法を用いて解析した結果を示す図である。各グラフにおいて陽性群１の結果を実線で示し、陰性群１の結果を点線で示す。横軸は膵臓癌手術後の経過時間（月）を示し、縦軸は生存率（全生存率）を示す。
【図１７】３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）すべての発現が検出された症例（陽性群２［実施例２参照］）とかかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち少なくとも１のものの発現が検出されなかった症例（陰性群２［実施例２参照］）における、膵臓癌治療後の生存率を、カプラン・マイヤー法を用いて解析した結果を示す図である。各グラフにおいて陽性群２の結果は実線で示し、陰性群２の結果は点線で示す。横軸は膵臓癌手術後の経過時間（月）を示し、縦軸は生存率（全生存率）を示す。
【図１８】３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）のうち２以上のものの発現が検出された症例（陽性群３［実施例２参照］）とかかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち２以上のものの発現が検出されなかった症例（陰性群３［実施例２参照］）における、膵臓癌治療後の生存率を、カプラン・マイヤー法を用いて解析した結果を示す図である。各グラフにおいて陽性群３の結果は実線で示し、陰性群３の結果は点線で示す。横軸は膵臓癌手術後の経過時間（月）を示し、縦軸は生存率（全生存率）を示す。
【図１９】３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）のうち少なくとも１つのものの発現が検出された症例（陽性群４［実施例２参照］）とかかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質すべての発現が検出されなかった症例（陰性群４［実施例２参照］）における、膵臓癌治療後の生存率を、カプラン・マイヤー法を用いて解析した結果を示す図である。各グラフにおいて陽性群４の結果は実線で示し、陰性群４の結果は点線で示す。横軸は膵臓癌手術後の経過時間（月）を示し、縦軸は生存率（全生存率）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、前記のＡ群〜Ｃ群のマーカータンパク質からなる群から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡ（以下、これらを総称して「本件マーカー物質」ということがある）を膵臓癌マーカーとして使用する方法に関し、本発明において「膵臓癌マーカー」とは、膵臓癌の有無を判定し、かつ予後良好及び／又は予後不良の予後予測のためのマーカーである。かかる方法には、後述する膵臓癌の有無を判定し、かつ予後良好及び／又は予後不良を予測する方法の他、膵臓癌の有無の判定及び予後予測のためのデータを収集する方法や、膵臓癌治療薬の有効性を判定する方法や、膵臓癌治療薬をスクリーニングする方法が含まれる。収集されたデータは、予後の予測に基づいて膵臓癌の治療法を選択するために利用することもできる。また本発明は、膵臓癌マーカーとして使用するための本件マーカー物質に関する。
【００１４】
本発明の膵臓組織における、膵臓癌の有無を判定し、かつ予後を予測する方法としては、（ａ）被験者より採取された判定用試料における、膵臓癌マーカーの発現量を定量する定量工程であって、前記膵臓癌マーカーが以下の各群のマーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質、又はそれらタンパク質をコードするｍＲＮＡである定量工程；（ｂ）前記判定用試料における前記膵臓癌マーカーの発現量と、対照となる健常試料における前記膵臓癌マーカーの発現量とを比較する比較工程；（ｃ）発現量の比較結果に基づいて、以下の［ｉ］〜［iii］のいずれかの基準により評価をする評価工程；を順次含む方法であれば特に制限されないが、判断基準［ｉ］〜［iii］から選択される２以上の評価を組み合わせて総合評価することが好ましい。膵臓癌マーカーとしては、以下Ａ群〜Ｃ群のマーカータンパク質を挙げることができ、この中でも［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる以下の［Ａ’群マーカータンパク質］から選択されるものを好適に例示することができる。
［Ａ群マーカータンパク質］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
［Ｂ群マーカータンパク質］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９）
［Ｃ群マーカータンパク質］
ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
［Ａ’群マーカータンパク質］
ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ
【００１５】
上記［Ａ群マーカータンパク質］に含まれる以下の［Ａ’群マーカータンパク質］から選択される膵臓癌マーカーとしては、［Ａ’群マーカータンパク質］から選択される少なくとも１つのものであればよく、例えば［Ａ’群マーカータンパク質］から２以上のものを選択することもでき、２以上を選択する場合の組合せとしては、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮとＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮとの組合せや、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮとＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮとの組合せや、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮとＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮとの組合せや、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮとＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮとＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮとの組合せを具体的に挙げることができる。
なお、上記比較工程（ｂ）における対照となる健常試料における前記膵臓癌マーカーの発現量は、サンプルと同時に測定して得られたものでも、サンプル測定とは別途測定された正常膵管組織における膵臓癌マーカーの発現量でもよい。前記膵臓癌の有無を判定するためのデータを収集する方法や膵臓癌治療の予後を予測するためのデータを収集する方法は、上記定量工程（ａ）と比較工程（ｂ）を実施した後、発現量の比較結果をデータとして収集する工程が含まれる。
【００１６】
［ｉ］〜［iii］の基準は以下の通りである。
［ｉ］判定用試料におけるＡ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の膵臓組織中に予後不良の膵臓癌組織が存在すると評価する。
［ii］判定用試料におけるＢ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して増加している場合、被験者の膵臓組織中に予後良好の膵臓癌組織が存在すると評価する。
［iii］判定用試料におけるＣ群マーカータンパク質から選択される１若しくは２以上のタンパク質又はそれらのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量が、健常試料における発現量と比較して、増加している場合に被験者の膵臓組織中に予後不良又は予後良好の膵臓癌組織が存在すると評価する。
【００１７】
本発明の膵臓組織における、膵臓癌治療薬の有効性を判定する方法や膵臓癌治療薬をスクリーニングする方法としては、（Ａ）膵臓癌に罹患したモデル動物に被検薬剤又は被検物質を投与する投与工程；（Ｂ）前記モデル動物より採取された判定用試料における、本件マーカー物質のオーソログ（タンパク質やｍＲＮＡ）の発現量を定量する定量工程：（Ｃ）前記判定用試料における本件マーカー物質のオーソログの発現量と、対照となる被検薬剤又は被検物質を未投与の場合における本件マーカー物質のオーソログの発現量とを比較する比較工程；（Ｄ）発現量の比較結果に基づいて、前記［ｉ］〜［iii］のいずれかの評価基準により評価する工程；を順次含む方法であれば特に制限されず、Ａ群〜Ｃ群の複数の本件マーカー物質のオーソログについて工程（Ａ）〜（Ｄ）を行い、［ｉ］〜［iii］から選択される２以上の評価を組み合わせて総合評価することがより好ましい。また、工程（Ａ）において、膵臓癌罹患前の動物に被検薬剤又は被検物質を投与した後、モデル動物に膵臓癌を誘導することにより、膵臓癌予防薬をスクリーニングすることもできる。本件マーカー物質のオーソログ遺伝子の遺伝情報は、ＥＭＢＬ−ＥＢＩ（http://www.ebi.ac.uk/）やＵｎｉＰｒｏｔ（http://www.uniprot.org/）、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等のデータベースを検索し、適宜入手することができる。
【００１８】
上記膵臓癌に罹患したモデル動物としては、膵臓癌を自然に罹患したモデル動物であってもよいし、癌遺伝子の過剰発現や発癌物質で膵臓癌を誘導したモデル動物であってもよく、発癌物質で膵臓癌を誘導したモデル動物としては、例えば発癌物質ＢＯＰ（N-Nitrosobis (2-oxopropyl) amine）によって膵臓癌を誘導したハムスター（Pour PM, Wilson RB. Experimental tumors of the pancreas.In: Moosa AR, ed. Tumors of the pancreas. Baltimore:Williams and Wilkins, 1980: 37-159.）や、発癌物質azaserine、4-hydroxyaminoquinoline-1-oxide（４−ＨＡＱＯ）等を投与して腺房細胞癌を発生させたラットや、7,12-dimethylbenz (a) anthracene（ＤＭＢＡ）を直接膵内に埋没し、腺癌を発生させて膵臓癌を誘導したラット（林裕造，高橋道人．７膵癌：Ｂ．動物．太田邦夫，山本正，杉村隆，菅野晴夫編．癌の科学．第４巻ヒトの癌と動物モデル．東京：南江堂，1979：258-70.）などの膵臓癌モデル動物を挙げることができる。また、癌遺伝子の過剰発現で膵臓癌を誘導したモデル動物としては、例えばヒト変異型Ｋ−ｒａｓ（Ｋ−ｒａｓＶ１２）遺伝子をコンディショナルに発現するトランスジェニックマウス（ＷＯ２００９／０３７９５０号公報）を挙げることができる。上記モデル動物としてマウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物モデルを例示することができる。
【００１９】
本発明の膵臓癌の有無を判定し、かつ予後を予測する方法により、予後不良の膵臓癌の有無や、予後良好の膵臓癌の有無や、予後不良及び予後良好の膵臓癌の有無を判定することができる。ここで、「予後不良の膵臓癌」とは、治療後２年以内の再発及び死亡を意味し、「予後良好の膵臓癌」とは、治療後５年の生存を意味する。
【００２０】
また、膵臓癌としては、膵臓組織にできる癌であればいかなる癌であってもよく、具体的には、膵管に由来し膵管がんや通常型膵癌とも呼ばれる浸潤性膵管癌（invasive ductal carcinoma）、膵内分泌腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ）、腺房細胞癌、Solid-pseudopapillary carcinoma、未分化癌、漿液性嚢胞腺癌、転移性膵癌等を挙げることができ、膵臓癌の約９０％以上が膵管がんであることから、好ましくは膵管がんを挙げることができる。
【００２１】
本発明の膵臓癌の有無を判定する方法（治療薬のスクリーニング方法）等に用いる判定用試料としては、被験者（モデル動物）より採取された膵臓由来の細胞、組織、器官等の非液性試料や、血液、膵液、リンパ液、胆汁、尿のほか、唾液、汗、精液等の体液や、非液性試料を浸漬させた保存液等の液性試料を例示することができる。例えば上記膵臓組織は、膵臓の組織、膵管、腺房、内分泌腺であるランゲルハンス島等の組織であってもよい。さらに膵臓組織は、被験者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、前記病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。また、血液、膵液、リンパ液、胆汁、尿、などの液性試料も適宜防腐剤や防カビ剤などを添加することも、特定の成分のみを分離あるいは除去することもできる。さらに液性試料として例示する組織の浸漬液としては、非液性試料を浸漬させた保存液や可溶化液等の溶液を挙げることができ、被験者から採取された膵臓組織を凍結組織とするための上記凍結処理や、病理組織とするための上記病理組織学的処理を施す過程で、一時的または恒久的な保存を目的として膵臓組織を浸漬させた溶液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ホルマリン溶液、アルコール溶液等を例示することができる。
【００２２】
また、前記判定用試料における、本件マーカー物質の発現量を定量する定量方法としては、膵臓癌マーカータンパク質の一部又は全部、あるいは、膵臓癌マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの一部又は全部を、特異的且つ定量的に検出することができる定量方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、膵臓癌マーカータンパク質の定量方法として、液体クロマトグラフィー質量分析法や免疫学的測定法を挙げることができ、免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロット法等を好適に例示することができ、膵臓癌マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの定量方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法や、リアルタイムＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等を好適に例示することができるが、液体クロマトグラフィー質量分析法又は免疫学的測定法であることが特に好ましい。
【００２３】
本発明の膵臓癌の有無を判定し、かつ予後を予測する方法に用いる健常試料としては、健常者や非膵臓癌患者由来の上記非液性試料や液性試料、膵臓癌患者由来の当業者が通常用いる基準に照らして明らかにがん化していないと判断される非液性試料等を例示することができる。また、これら健常試料は、採取された後に、前記判定用試料と同様の処理が施された健常試料であることが好ましい。また、比較工程においては、前記判定用試料及び前記健常試料における同一の本件マーカー物質の発現量を、同一の定量方法により定量し、得られた発現量のデータを比較することが好ましい。健常試料における前記膵臓癌マーカーの発現量は、サンプルと同時に測定して得られたものでも、サンプル測定とは別途測定された健常試料における膵臓癌マーカーの発現量でもよい。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
［サンプル］
過去１０年間（１９９８年〜２００７年）に東北大学病院肝胆膵外科にて膵切除を行い、組織学的に浸潤性膵管癌と診断された１５６症例から、既知の予後因子（組織学的根治度、術後腫瘍マーカー値、術前化学療法の有無、ステージ、分化度、補助化学療法）が同一であるにも関わらず、予後に差がある症例を抽出し、ほぼ５年生存の予後良好群（４例）及び２年以内に再発死亡の予後不良群（４例）に分類した（図１）。表１に予後不良群及び予後良好群の症例背景を示す。
【００２６】
【表１】
2013027387.tif 000002
【００２７】
これらのＦＦＰＥ標本（ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本）を用いて、膵臓癌及び予後予測のマーカーとなるタンパク質の検索を行った。実験の概要は、図２及び図３に示す通りである。
【００２８】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析用サンプルの調製］
１．ＦＦＰＥ組織切片の作製
前記ＦＦＰＥ組織を、ミクロトームを用いて薄切し、１０μｍの切片を作製した。この切片を、エネルギートランスファーコーティングスライドグラス（DIRECTOR（商標）レーザーマイクロセクションスライド；Expression Pathology社製）のコーティング側に直接のせて伸展させた。キシレン及びエタノール浸潰により組織切片の脱パラフィン処理を行った後に、ヘマトキシリン染色を行い、タンパク質抽出用プレパラートを作製した。
【００２９】
２．レーザーマイクロダイセクション
Leica LMD 6000レーザーマイクロダイセクションシステムを用いて、目的とする細胞特異的なダイセクションを行った。Leica LMD 6000レーザーマイクロダイセクションシステムは、重力落下方式により高精度且つ完全なコンタミフリーの条件下で、ＵＶレーザーによるダイセクションが可能なシステムである。かかるレーザーマイクロダイセクションシステムを用いて、前記ＦＦＰＥ組織から膵臓癌組織のみを採取した。
【００３０】
３．タンパク質の可溶化及び断片化
レーザーマイクロダイセクションにより採取された膵臓癌組織を、Liquid Tissue（登録商標）MS Protein Prep Kit（Expression Pathology社製）を用いて処理し、タンパク質を可溶化した。続いて、トリプシンを用いて可溶化タンパク質を断片化した。これらの処理により、３０，０００個の細胞（厚さ１０μｍのＦＦＰＥ切片においては、約２×４ｍｍの範囲に相当する）から、約２〜４μgのタンパク質が得られた。これは、後述のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析を、１０回行うことができるタンパク質量に相当する。
【００３１】
［膵臓癌マーカータンパク質の検索］
１．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析
上記の方法により調製したサンプルを、０．１％ＴＦＡ／２％Acetonitrile／蒸留水（ｐＨ２〜３）で再溶解し、nano flow ＥＳＩ−イオントラップ型ＬＣ／ＭＳ（ZAPLOUS Discovery ＬＣ／ＭＳシステム）により分析を行った。分析は同一サンプルを３回測定した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの条件の詳細は以下の通りである。
Autosampler：   ＨＴＣ−ＰＡＬ（CTC Analytics社製）
ＨＰＬＣ：     Paradigm MS4（Michrom BioResources社製）
Column：       MAGIC C18AQ、３μ、１００オングストローム、０．１ｍｍＩＤｘ１５
０ｍｍ（Michrom BioResources社製）
Ion source： ADVANCE Nano Spray Source（Michrom BioResources社製）
ＭＳ：       FinniganLXQ（Thermo Fisher Scientific社製）
Ａ液：       ２％アセトニトリル／０．１％ギ酸
Ｂ液：       ９０％アセトニトリル／０．１％ギ酸
Flow rate：     ５００ｎＬ／ｍｉｎ
Gradient：      ５〜４５％Ｂ  ｉｎ  １００ｍｉｎ
ＥＭＳ voltage：１．４〜１．６ｋＶ
Mass range：    ４５０〜２０００
【００３２】
２．タンパク質の同定
タンパク質の同定のためのソフトウエアとしてＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science社製）を、データベースとしてSwissProt 57.13を用い、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析データよりタンパク質を同定した。３回のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析により得られたデータから、それぞれタンパク質をリストアップし、最終的に統合した。その結果、図５に示すように、予後不良群の膵臓癌組織サンプルからは９２４種類の、予後良好群の膵臓癌組織サンプルからは８４５種類の、対照となる正常膵管組織からは７３０種類のタンパク質を同定することができた（膵臓癌組織：１０９９種類、全体：１２２９種類）。
【００３３】
３．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータの解析
各群でのタンパク質発現を、ＳＣＡＦＦＯＬＤソフトウエア（Matrix Science社製）を用いて解析し、さらに、タンパク質アイソフォーム、サブセットを識別・グループ化し、遺伝子オントロジー解析を行った。具体的には以下のような解析を行った。スペクトラルカウント法（図４）：半定量法として下記の計算式を用いた比較定量及び統計検定（Ｇ検定）を実施して、群特異的な発現タンパク質の同定を同時に行った。
（１）相対変化量：Abundance ratio for each protein（Ｒｓｃ）
Ｒｓｃ＝ｌｏｇ２［（ｎ２＋ｆ）／（ｎ１＋ｆ）］＋ｌｏｇ２［（ｔ１−ｎ１＋ｆ）／（ｔ２−ｎ２＋ｆ）］
ｎ１、ｎ２：あるタンパクを同定するのに使用したペプチドの数
ｔ１、ｔ２：タンパク同定に使用したペプチドの総数
ｆ：correction factor＝１．２５
（２）相対発現量：Normalized Spectral Abundance Factor for each protein（ＮＳＡＦ）
ＮＳＡＦｋ＝［ＳｐＣｋ／Ｌｋ］／ＳＵＭ［ＳｐＣｋ／Ｌｋ］
ＳｐＣｋ：あるタンパクを同定するのに使用したペプチド数
Ｌｋ：同定したタンパクのアミノ酸数
（３）スペクトラル・インデックス：Spectral Index for Group Comparison（ＳｐＩ）
ＳｐＩ＝［ＳＡｋａｖ／（ＳＡｋａｖ＋ＳＢｋａｖ）×ＮＤＡ／ＮＴＡ］−［ＳＢｋａｖ／（ＳＡｋａｖ＋ＳＢｋａｖ）×ＮＤＢ／ＮＴＢ］
ＳＡｋａｖ：（Ａ群であるタンパク質ｋを同定するのに使用したペプチドの総数）／（Ａ群のサンプル数）
ＳＢｋａｖ：（Ｂ群であるタンパク質ｋを同定するのに使用したペプチドの総数）／（Ｂ群のサンプル数）
ＮＤＡ、ＮＤＢ：ある群の中で該当タンパクが同定されたサンプル数
ＮＴＡ、ＮＴＢ：ある群の中のサンプル数
【００３４】
４．膵臓癌マーカータンパク質の検索
前記ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析によって同定されたタンパク質発現量から、前記の相対発現量（ＮＳＡＦ）、相対変化量（Ｒｓｃ）、スペクトラル・インデックス（ＳｐＩ）を算出し、かかる値に基づき、以下の方法で予後不良群で高発現するタンパク質をグループ１、予後良好群で高発現するタンパク質をグループ２、正常膵管細胞と膵臓癌細胞で発現に差があるタンパク質をグループ３を抽出した。グループ１及び２は、予後不良群及び予後良好群から検出された１０９９種のタンパク質から、統計検定（Ｇ検定；Sokal, R. R.; Rohlf, F. J. Biometry, 3rd ed.; W. H. Freeman and Company: New York, 1995参照）のＧ＞３．８４１を基準として計１８６種を抽出した。続いて、予後不良群ではＲｓｃ＞１を基準に、予後良好群ではＲｓｃ＜−１を基準に計１６３種のタンパク質を抽出し、その中から、各群において４症例中２症例以上で発現しているタンパク質を計１２０種を抽出した。さらに、遺伝子オントロジー解析及び文献検索から、構造タンパク質やハウスキーピングタンパク質など膵臓癌に特異的でないと考えられるタンパク質を除外することによって、予後不良群及び予後良好群で有意に高発現している計１０６種、各群５３種のタンパク質をグループ１及び２として同定した（図５）。グループ３は、群膵臓癌組織及び正常膵管群で発現が同定された計１２２９種のタンパク質から、以下の方法で分類した。すなわち、まず予後良好群及び正常膵管群の１０２５種のタンパク質から統計検定Ｇ＞３．８４１を基準として３５１種のタンパク質を抽出し、次に正常膵管組織と比べ膵臓癌組織において高発現であることを意味するＲｓｃ＞１に基づき２０５種を抽出し、さらにＳｐＩ＜−０．４に基づき１３８種を抽出した。また、予後不良群及び正常膵管群の１１０１種のタンパク質から統計検定Ｇ＞３．８４１を基準として３９９種を抽出し、次に正常膵管組織と比べ膵臓癌組織において高発現であることを意味するＲｓｃ＞１に基づき２３９種を抽出し、さらにＳｐＩ＜−０．４に基づき１６１種を抽出した。これらの計１３８種及び１６１種のタンパク質から、さらに遺伝子オントロジー解析及び文献検索から膵臓癌に特異的でないと考えられるタンパク質を除外し、計６４種のタンパク質をグループ３として同定した（図６）。
【００３５】
前記までのDiscovery stageで同定された計１７０種類のタンパク質すべてについて、
β-actinを内部標準として用いて三連四重極型ＭＳを用いた定量ＭＳ解析（ＭＲＭ：Multiple Reaction Monitoring）による定量フォーカスプロテオミクスを実施した（Validation stage）。ＭＲＭ法においては、ＡＣＴＢのＳＲＭtransition（４８８．７／６３０．３）のピークエリアを適用し、以下の計算式により標準化した。
Normalized peak area = Each of peak area x (500,000 / peak area of 488.7/630.3)
まずＭＲＭによる測定に適したペプチドデザインが可能なタンパク質をグループ１から３４種、グループ２から３９種、グループ３から５０種の、計１２３種のタンパク質を抽出し、ＭＲＭテスト測定を行った。これら計１２３種類タンパク質は以下の通りである。［グループ１］Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＦＬ＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ２２Ｅ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ、Ｐ５ＣＳ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＺＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＩＦ４Ａ３＿ＨＵＭＡＮ、ＮＮＴＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＡＢ３Ｄ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＡＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯ６Ａ３＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰ１Ｇ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＢ２＿ＨＵＭＡＮ、ＴＣＰＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＨＩＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＮＤＫＡ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ、ＰＳＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＣＰＧ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＯＳＴＮ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＰＧ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＣＲＵ＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＰ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ
［グループ２］
ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＲＡＢ２Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＬＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨＢ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＩＬＥＵ＿ＨＵＭＡＮ、ＮＩＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ、ＬＵＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＦＨＤ２＿ＨＵＭＡＮ、ＰＨＢ＿ＨＵＭＡＮ、ＧＳＴＫ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＤＰＹＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ、ＭＹＯＦ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＡＢ１４＿ＨＵＭＡＮ、ＰＧＭ１＿ＨＵＭＡＮ、ＱＯＲ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＨＮＫ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＲＥＬＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＨＧ０１＿ＨＵＭＡＮ、ＬＣ７Ｌ２＿ＨＵＭＡＮ、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ、ＣＴＮＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＩＭＭＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＰＳ３５＿ＨＵＭＡＮ、ＰＭＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＡＬＤＯ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＮＤＰ２＿ＨＵＭＡＮ、ＤＤＸ５＿ＨＵＭＡＮ、ＮＮＭＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＭＤＨＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＡＳＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＣＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＬＯＴ１＿ＨＵＭＡＮ、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮ、ＰＬＩＮ３＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸＡ６＿ＨＵＭＡＮ
［グループ３］
ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＦＬＮＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＲＡＢ５Ｃ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＴＦＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＹ１＿ＨＵＭＡＮ、ＲＯＡＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＭＰＬ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ６＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＳＯＤＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＩＤＨＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、Ｇ３ＢＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＣＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＴＬ１＿ＨＵＭＡＮ、ＭＤＨＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＥＧ３＿ＨＵＭＡＮ、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＱＲＤ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＳＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＩＴＢ４＿ＨＵＭＡＮ、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＹＴＢ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＹＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＵＲＰ２＿ＨＵＭＡＮ、ＵＢＰ５＿ＨＵＭＡＮ、ＱＣＲ２＿ＨＵＭＡＮ、ＡＲＰＣ５＿ＨＵＭＡＮ、ＴＰＤ５４＿ＨＵＭＡＮ、ＰＲＤＸ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＹＢ５Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、Ａ１ＡＧ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＴＰＤ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ、ＣＫＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ、ＭＯＥＳ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＦ１Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＣＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＣ２３Ｂ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ
【００３６】
前記ＭＲＭテスト測定結果に基づき、グループ１から３２種、グループ２から３７種、グループ３から４２種の、計１１１の種タンパク質についてＭＲＭ本測定を行った。ＭＲＭ測定結果を解析し、前記のマーカー候補タンパク質の中から、膵臓癌組織における発現量が正常膵管組織と比較して２倍以上ある、グループ１の１３種、グループ２の４種、グループ３の１８種の計３５種類のタンパク質を、膵臓癌マーカー候補として同定した（図７）。これら計３５種類タンパク質は以下の通りである。
［グループ１］
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ
［グループ２］
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ
［グループ３］
ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ、ＡＳＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１０Ａ６＿ＨＵＭＡＮ、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ
【００３７】
以上のＭＲＭ解析結果を再度精査し、膵臓癌マーカータンパク質を以下のＡ群〜Ｃ群に分類した（図８）。図９〜図１１にＡ群〜Ｃ群のタンパク質のＭＲＭ法により解析した結果を示す。
Ａ群：予後不良の膵臓癌において特異的に発現量が高いタンパク質であり、膵臓癌かつ予後不良マーカーである（図９）。
ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７５１）、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７９２）、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１３６４５）、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０４２６４）、ＬＹＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６２６）、ＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１６４）、ＰＬＢＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６Ｐ４Ａ８）、Ｓ１０Ａ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５１０９）、Ｓ１０Ａ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０２）、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪＺ１）、ＴＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０７２）、ＴＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｙ４９０）、ＴＳＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０７９９６）、ＡＮＸ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＪ７２）、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１３０１１）、ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ６ＵＸ０６）、ＥＦＴＵ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９４１１）、ＳＥＲＰＨ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４５４）
Ｂ群：予後良好の膵臓癌において特異的に高発現するタンパク質であり、膵臓癌かつ予後良好マーカーである（図１０）。
ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９１）、ＧＴＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１１１６６）、ＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５１４９）、ＰＵＲ９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３１９３９）
Ｃ群：予後不良及び予後良好の膵臓癌において特異的に高発現するタンパク質であり、膵臓癌かつ予後不良及び予後良好のマーカーである（図１１）。
ＡＳＣ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＬＺ３）、ＣＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１５１８）、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４０１９９）、ＣＨ１０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６１６０４）、ＣＩＳＹ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５３９０）、ＥＲＯ１Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９６ＨＥ７）、ＬＧ３ＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０８３８０）、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２５８１５）、Ｓ１０Ａ６＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７０３）、ＳＨ３Ｌ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ２９９）、ＳＳＢＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０４８３７）、ＴＡＧＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１９９５）、ＶＤＡＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２１７９６）
【００３８】
文献検索の結果、上記のＡ群〜Ｃ群のタンパク質のうち、Ａ群のＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＲＩＬ＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ１Ｃ１０＿ＨＵＭＡＮ、Ｋ２Ｃ１＿ＨＵＭＡＮ、及びＰＥＲＭ＿ＨＵＭＡＮや、Ｂ群のＰＬＥＣ１＿ＨＵＭＡＮや、Ｃ群のＡＳＣ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＡＰ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＥＡＭ６＿ＨＵＭＡＮ、Ｓ１００Ｐ＿ＨＵＭＡＮ、及びＳ１０Ａ６＿ＨＵＭＡＮは膵臓癌において高い発現が確認された報告が存在することが確認された。前記Ａ群のタンパク質を「Ａ群マーカータンパク質」、前記Ｂ群のタンパク質を「Ｂ群マーカータンパク質」、前記Ｃ群タンパク質群から膵臓癌において高い発現が確認されているタンパク質を除いたタンパク質群のタンパク質を「Ｃ群マーカータンパク質」とした。
【００３９】
５．免疫組織化学染色
上記において同定された、３５種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち、Ａ群のタンパク質ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ、並びにＢ群のタンパク質ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮについて、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）を行った。正常膵管組織、予後良好膵臓癌組織、及び予後不良膵臓癌組織のＦＦＰＥ組織を抗ＯＬＦＭ４抗体、抗ＳＴＭＬ２抗体、抗ＥＣＨ１抗体、及び抗ＡＬＤＨ２抗体を１次抗体として用いて染色し、ＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ＤＡＫＯ社製）を用いて発色させ、観察した。免疫組織化学染色（ＩＨＣ）の結果及びＭＲＭ解析による発現量を図１２〜図１５に示す。Ａ群のタンパク質ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮは、定量ＭＳ解析（ＭＲＭ）法による解析結果と同様に、正常膵管組織及び予後良好膵臓癌組織と比較して、予後不良膵臓癌組織において有意に発現が高いことが示された（図１２〜１４）。またＢ群のタンパク質ＡＬＤＨ２＿ＨＵＭＡＮも、定量ＭＳ解析（ＭＲＭ）法による解析結果と同様に、正常膵管組織及び予後不良膵臓癌組織と比較して、予後良好膵臓癌組織において有意に発現が高いことが示された（図１５）。
【実施例２】
【００４０】
［本発明の膵臓癌マーカータンパク質を用いた膵臓癌治療後の生存率の解析］
本発明の膵臓癌マーカータンパク質の発現量と膵臓癌治療後の生存率との関連性について調べた。解析に用いる症例として、図１に示した「術前化学療法の有無：施行せず」９６例を選択し、かかる症例の膵臓癌サンプルを上記実施例１に記載の方法で調製し、調製した膵臓癌サンプルにおける３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）の発現量を、上記実施例１に記載の免疫組織化学染色法により検出した。かかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質の発現が検出された癌細胞の割合が、１０％以上の症例を陽性群（Positive group）１に分類し、また１０％未満の症例を陰性群（Negative group）１に分類し、陽性群１及び陰性群１それぞれにおける膵臓癌手術後の経過時間と生存率（全生存率）との関係を、カプラン・マイヤー法を用いて解析した（図１６）。その結果、上記３種類の膵臓癌マーカータンパク質のいずれを用いた場合において、陰性群１よりも陽性群１の方が膵臓癌手術後の生存率が悪く、またその違いには統計学的有意差があることが示された（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ；Ｐ＝０．０４５５、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ；Ｐ＝０．０４１０、ＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ；Ｐ＝０．０２３２）。この結果から、膵臓組織に含まれる癌細胞中の３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）の発現レベルを検出し、かかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質の発現が検出される癌細胞の割合が多かった場合、膵臓癌治療後の生存率が悪いと予測できることが明らかとなった。
【００４１】
次に３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）すべての発現が検出された症例、すなわちかかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質すべてにおいて、陽性群１に分類された症例（ｎ＝３２）を陽性群２に分類し、それ以外の症例（上記３種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち少なくとも１つのものにおいて陰性群１に分類された症例）（ｎ＝６４）を陰性群２に分類し、陽性群２及び陰性群２それぞれにおける膵臓癌手術後の経過時間と生存率（全生存率）との関係を、カプラン・マイヤー法を用いて解析した（図１７）。その結果、陰性群２よりも陽性群２の方が膵臓癌手術後の生存率が悪く、またその違いには統計学的有意差があることが示された（Ｐ＝０．０４４）（図１７）。この結果から、膵臓組織に含まれる癌細胞中の３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）の発現レベルを検出し、かかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質全ての発現が検出される癌細胞の割合が多かった場合、膵臓癌治療後の生存率が悪いと予測できることが明らかとなった。
【００４２】
また、３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）のうち２以上のものの発現が検出された症例、すなわちかかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち２以上のものにおいて、陽性群１に分類された症例（ｎ＝６１）を陽性群３に分類し、それ以外の症例（上記３種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち２以上のものにおいて陰性群１に分類された症例）（ｎ＝３５）を陰性群３に分類し、陽性群３及び陰性群３それぞれにおける膵臓癌手術後の経過時間と生存率（全生存率）との関係を、カプラン・マイヤー法を用いて解析した（図１８）。その結果、陰性群３よりも陽性群３の方が膵臓癌手術後の生存率が悪く、またその違いには統計学的有意差があることが示された（Ｐ＝０．０１６２）。この結果から、膵臓組織に含まれる癌細胞中の３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）の発現レベルを検出し、かかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち任意の２つ以上のものの発現が検出される癌細胞の割合が多かった場合、膵臓癌治療後の生存率が悪いと予測できることが明らかとなった。
【００４３】
さらに、３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）のうち少なくとも１つの発現が検出された症例、すなわちかかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質の少なくとも１つにおいて、陽性群１に分類された症例（ｎ＝８４）を陽性群４に分類し、それ以外の症例（上記３種類の膵臓癌マーカータンパク質すべてにおいて陰性群１に分類された症例）（ｎ＝１２）を陰性群４に分類し、陽性群４及び陰性群４それぞれにおける膵臓癌手術後の経過時間と生存率（全生存率）との関係を、カプラン・マイヤー法を用いて解析した（図１９）。その結果、陰性群４よりも陽性群４の方が膵臓癌手術後の生存率が悪く、またその違いには統計学的有意差があることが示された（Ｐ＝０．０１２４）。この結果から、膵臓組織に含まれる癌細胞中の３種類の膵臓癌マーカータンパク質（ＯＬＦＭ４＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＭＬ２＿ＨＵＭＡＮ及びＥＣＨ１＿ＨＵＭＡＮ）の発現レベルを検出し、かかる３種類の膵臓癌マーカータンパク質のうち少なくとも１つのものの発現が検出される癌細胞の割合が多かった場合、膵臓癌治療後の生存率が悪いと予測できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、膵臓癌及び膵臓癌予後の予測、検査の分野において好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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