(57)【要約】【課題】脳梗塞の予後を簡便で効率よく検査することのできる方法を提供すること。【解決手段】被検動物より採取された血液試料中のIL-8蛋白質の蛋白質量を測定する工程を含む、該動物における脳梗塞の予後の予測のための検査方法。被検動物より採取された血液試料中のIL-8蛋白質の蛋白質量およびNIHSSを測定する工程を含む、該動物における脳梗塞の予後の予測のための検査方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検動物より採取された血液試料中のIL-8蛋白質の蛋白質量を測定する工程を含む、IL-8蛋白質量を指標として該動物における脳梗塞の予後を予測するための検査方法。
【請求項２】
被検動物より採取された血液試料が、脳梗塞様症状の発症後２日目から発症後２０日目の間のいずれかの時期において被検動物より採取されたものであることを特徴とする請求項１に記載の脳梗塞の予後の予測のための検査方法。
【請求項３】
被検動物より採取された血液試料中のIL-8蛋白質量及びNIHSSを測定する工程を含む、IL-8蛋白質量とNIHSSを指標として該動物における脳梗塞の予後を予測するための検査方法。
【請求項４】
被検動物より採取された血液試料が、脳梗塞様症状の発症後２日目から発症後２０日目の間のいずれかの時期において被検動物より採取されたものであることを特徴とする請求項３に記載の脳梗塞の予後の予測のための検査方法。
【請求項５】
IL-8蛋白質の蛋白質量を測定し得る試薬を含んでなる、脳梗塞検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳梗塞の予後の検査方法および脳梗塞の予後検査用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中とは、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血などの脳血管障害の総称である。これら脳卒中の病型のうち、最近では脳梗塞が相対的に増加してきている。脳梗塞急性期の薬物療法としては血栓溶解療法、抗凝固療法、抗血小板療法、脳保護薬投与などが用いられ、重篤な患者や出血性脳梗塞を起こした患者に対しては外科的手術が行われる。脳梗塞の症状は急性期にもっとも強く、その後徐々に改善していく。これは、壊死に陥った脳組織が腫脹して、周囲の脳組織も圧迫・障害していることによる。腫脹が引いていくとともに、周囲の組織が機能を回復して症状は固定していくのである。ただし、脳虚血部位から放出されるフリーラジカルは周囲の組織をも壊死させる働きがあるため急性期を過ぎても機能予後の向上につなげるため継続的な治療が必要とされている。
【０００３】
脳梗塞の臨床病型には、脳内小動脈が閉塞して発症するラクナ梗塞、脳内大動脈が粥腫で閉塞して発症するアテローム血栓性脳梗塞、心臓内の血栓が栓子となり脳内動脈を閉塞して発症する心原性脳塞栓症等がある。これらの臨床病型により急性期及び慢性期の適切な治療法が異なるため、脳梗塞患者の臨床病型を迅速に診断する方法が求められていた。
【０００４】
脳梗塞の臨床病型の分類方法としては、臨床症候の観察と心エコー、MRI、MRA、頚部血管エコー等を施行してTOAST分類に準拠した脳梗塞臨床診断のフローチャート（非特許文
献１）等により分類する方法や、分子マーカーを用いた方法、具体的には、CRP、D-Dimer、RAGE、MMP-9、S100B、BNP等の分子マーカーを脳梗塞発症24時間以内に同時測定した結
果、BNPとD-Dimerで、特定のカットオフ値を設定すると、心原性脳塞栓症を他病型と分類できること（非特許文献２）などが開示されているが、さらに迅速で確実な病型診断が可能となる分子マーカーが求められていた。
【０００５】
脳梗塞の予後は、発症後3ヶ月後ないしは1年後までの間にmodified Rankin Scale（非
特許文献３）、またはBarthel Index（非特許文献４）により日常生活における動作の障
害度を評価することで判断されている。予後を事前に予測することは、脳梗塞の治療方法を早期に決める上で重要である。予後は急性期の重症度に大きく左右されるため、重症度の評価指標である NIH Stroke Scale （NIHSS）（非特許文献６）などが参考になるが、
これ単独では十分でなく、あくまで参考程度に過ぎなかった。また、入院時に測定した血漿中のBNPで特定のカットオフ値を定めることにより死亡が予測できること（非特許文献
５）が開示されているが、生存した場合の障害の程度を予測する分子マーカーが求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lee,L.J. et al., Stroke , 1081-1089 (2000)
【非特許文献２】Montaner et al., Stroke, 2280-2287(2008)
【非特許文献３】van Swieten,J.C et al., Stroke, 604-607 (1988)
【非特許文献４】Mahoney,F.L et al., Maryland State Med J, 61-65 (1965)
【非特許文献５】Shibazaki,K et al., Inter Med, 1601-1604 (2009)
【非特許文献６】Lyden, P.D. et al., Stroke 1310-1317 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑み、脳梗塞患者などの血清や血漿等を用いて迅速かつ確実な脳梗塞の予後の検査を行う方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、患者血漿中の IL-8蛋白質
量が予後の異なる脳梗塞患者で異なるという知見を得、さらに、重症度の指標である NIHSS と組み合わせた時に予後の予測精度が上がるという知見を得、IL-8蛋白質の量およびNIHSSが脳梗塞の検査のための有用な指標となることを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下を要旨とする。
（１）被検動物より採取された血液試料中のIL-8蛋白質の蛋白質量を測定する工程を含む、IL-8蛋白質量を指標として該動物における脳梗塞の予後を予測するための検査方法。
（２）被検動物より採取された血液試料が、脳梗塞様症状の発症後２日目から発症後２０日目の間のいずれかの時期において被検動物より採取されたものであることを特徴とする（１）の脳梗塞の予後の予測のための検査方法。
（３）被検動物より採取された血液試料中のIL-8蛋白質量及びNIHSSを測定する工程を含
む、IL-8蛋白質量とNIHSSを指標として該動物における脳梗塞の予後を予測するための検
査方法。
（４）被検動物より採取された血液試料が、脳梗塞様症状の発症後２日目から発症後２０日目の間のいずれかの時期において被検動物より採取されたものであることを特徴とする（２）の脳梗塞の予後の予測のための検査方法。
（５）IL-8蛋白質の蛋白質量を測定し得る試薬を含んでなる、脳梗塞検査用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、脳梗塞患者の血漿中のIL-8蛋白質の濃度が、予後の異なる脳梗塞患者間で異なることを利用して、IL-8 蛋白質が脳梗塞検査用分子マーカーとして提供される
。IL-8蛋白質マーカーを単独で、あるいは重症度の指標である NIHSSと組み合わせた指標として用いることにより脳梗塞の迅速、確実な予後の予測を行うことが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１２】
（１）IL-8蛋白質マーカーによる脳梗塞検査方法
本発明の第１は、被検動物より採取された血液試料中の、IL-8蛋白質量を測定する工程を含む、被検者（動物）の脳梗塞の予後を予測するための検査方法である。
本明細書において、「脳梗塞」とは、脳動脈が血栓または塞栓によって閉塞し虚血状態となり、脳組織が壊死および障害される疾患であり、脳内小動脈が閉塞して発症するラクナ梗塞、脳内大動脈が粥腫で閉塞して発症するアテローム血栓性脳梗塞、心臓内の血栓が栓子となり脳内動脈を閉塞して発症する心原性脳塞栓症のいずれをも含む。また、脳梗塞でも急性期、亜急性期、回復期（慢性期）等のいずれをも含む。
【００１３】
本明細書において「IL-8蛋白質」とは、本発明の検査法において血液試料中の含有量を測定する対象であるIL-8 （Interleukin 8）蛋白質を意味し、被検動物に由来する蛋白質であればよいが、ヒト由来の蛋白質として具体的には、下述する特定のアミノ酸配列で示される蛋白質が例示される。さらに、これらと同様の機能を有する蛋白質の断片、誘導体、および変異体も包含される。
【００１４】
上記検査方法において、「被検動物」は、脳梗塞を発症している動物であれば如何なるものでもよく、具体的には、ヒト、サル、あるいはラット等のげっ歯類等が挙げられる。該被検動物が脳梗塞を発症していることは、如何なるものでもよく、その場合の脳梗塞の検査方法は、脳梗塞の疑いのあるヒト、あるいは脳梗塞発症後〜２０日後において特に好ましく行われる。
【００１５】
本発明の検査方法において、被検動物から血液試料を採取する時期は、脳梗塞発症２日後〜２０日後、また特に脳梗塞発症後３日〜１５日が特に好ましい。
【００１６】
また、上記被検動物から採取された「血液試料」としては、IL-8蛋白質を含有し、その濃度を測定できるものであれば特に制限はないが、具体的には、EDTA血漿、クエン酸血漿等の血漿、血清、全血の何れでもよいが、これらのうち、EDTA血漿が簡便に採取でき、保存が容易で且つ採取量が多いため好ましく用いられる。被検動物から該血液試料を採取するために採血するタイミングは、脳梗塞の予後の診断を行うタイミングであればいずれのタイミングでもよい。脳梗塞は、発症後刻々と症状や病態が変化するので、具体的には以下で詳述する。
【００１７】
本発明の検査法において、被検動物から採取した血液試料中の含有量を測定する対象であるIL-8蛋白質とは、ヒトの場合には、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のデータベースなどにおいてNP_000575.1で登録されているアミノ酸配列を有するものである。上記アミノ酸配列はヒトのものであるが、被検動物が異なる場合には、該動物由来のホモログ蛋白質が測定対象の蛋白質となる。
【００１８】
上記蛋白質の血液試料中の含有量の測定方法としては、該蛋白質の含有量が測定できる方法であれば特に制限はないが、例えば、該蛋白質の抗体を用いた既存の免疫測定法や、クロマトグラフィー技術と飛行時間型質量分析（TOF-MS）を組み合わせて、クロマト担体（例：カチオン交換体、アニオン交換体、疎水性クロマト担体、金属イオンなど）に一定条件下で捕捉されるすべての成分の質量を一括して測定する方法、二次元ゲル電気泳動法等が用いられる。免疫測定法としては、酵素免疫定量法に従い定量検出する方法や、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等で測定する方法等が好ましい。酵素免疫定量法は、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。また、イムノソルベントを用いる、enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 法を選択するのが、
特に好適である。また、ELISAのうちサンドイッチ法は、操作の簡便性、経済上の利便性
、とりわけ臨床検査における汎用性を考慮すると、特に好適な測定態様の一つとして挙げられる。これらの測定方法は、例えば、新生化学実験講座（日本生化学会編；東京化学同人）、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (2001))、Antibodies - A Laboratory Manual(E.Harlow, et al., Cold
Spring Harbor Laboratory(1988))等の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じて行うことができる。
【００１９】
上記測定を行う際に用いられる抗体等（抗体断片を含む）は、対象のIL-8蛋白質を抗原として公知の方法によって得ることができる。ただし、対象のIL-8蛋白質を抗原として製造されたものである必要はなく、該蛋白質と少なくとも交差反応性を示し、その含有量を測定することができるものであれば何れのものでもよい。このような免疫測定法としては、例えばHuman Map TM v.1.6法を用いての測定をRules Based社等に依頼して行う方法が
挙げられる。
【００２０】
本発明の方法で使用する血液試料は、被検動物から採取直後のものを上記測定に用いることが好ましいが、保存したものを用いてもよい。血液試料の保存方法としては、脳梗塞検査用分子マーカー量が変化しない条件であれば特に制限は無いが、例えば０〜１０℃の
凍結しない程度の低温条件、暗所条件および無振動条件下が好ましい。止むをえず凍結する場合には、深凍結などマーカー分子の分解や酸化反応等を避けられる方法が好ましい。
【００２１】
本発明の検査方法においては、被検動物から採取された血液試料（本明細書中では、これを「検体」と称することがある）中の上記IL-8蛋白質マーカーの含有量を測定して、これを指標として、脳梗塞の予後を検査することができる。また、臨床症候の観察と心エコー、MRI、MRA、頚部血管エコー等の結果とを関連付けた複合指標を用いることで、より的確に検査することが可能である。
【００２２】
（１−１）IL-8蛋白質マーカーを用いた脳梗塞の予後予測の検査方法
本発明のIL-8蛋白質マーカーを用いた被検者（動物）の脳梗塞の予後を予測するための検査方法の具体的な方法を説明する。脳梗塞の予後は、脳梗塞発症後、ある一定期間の後に、その患者の脳梗塞による障害の程度にて示される。障害の程度は、それ自体公知の既に確定している指標を用いて評価することができる。指標としては、例えば、日本版modified Rankin Scale（mRS）判定基準（篠原幸人らmRS信頼性研究グループ、modified Rankin Scaleの信頼性に関する研究−日本語版判定基準書および問診表の紹介、脳卒中 2007
；29：6-13）等が用いられる。
【００２３】
一定の期間後とは、発症後いつの時点でもよいが、被検者（動物）の社会復帰の状態を評価する観点から、例えば発症3ヶ月後から1年後までの間に評価するのが一般的である。予後の予測においては、予想方法の有用性を考慮して、発症後2日から20日の被検者から
取得した血液試料中のIL-8蛋白質の量で発症後３ヵ月後の該被検者の状態を予測する方法等が好ましい。
【００２４】
本発明の測定方法では、予め、予測目的時点で上記mRSをそれぞれ臨床的に判定された
患者の、測定目的時の血液試料中のIL-8蛋白質量を測定し、予測目的時点で区別したいｍRS間で、上述の方法で両mRS群を区別するカットオフ値を設定する。具体的に説明すると
、例えば、発症３ヵ月後のmRSが０〜１の患者と２〜５の患者を区別する場合には、発症
３ヵ月後（予測目的時）にｍRSが０〜５の患者の発症２〜２０日後、好ましくは３〜１５日後（測定目的時）の血液試料中のIL-8蛋白質量を測定し、３ヵ月後のｍRSが０〜１の患者の測定値と２〜５の患者の測定値との間にカットオフ値を設定する。この後、測定目的時の検体を採取し、検体中のIL-8蛋白質マーカーの含有量を測定して、この絶対値を、上記の方法で設定されたカットオフ値と比較することにより、予測目的時の該被検者（動物）の状態を予測することができる。
【００２５】
カットオフ値とは、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性、カットオフ値以上であれば陽性として、またはカットオフ値以下であれば陽性、カットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる（金井正光編、臨床検査法提要  金原出版株式会社）。
【００２６】
カットオフ値の臨床的有用性を評価する目的で用いられる指標としては、感度と特異度が挙げられる。ある母集団をカットオフ値を用いて判定し、疾病患者のうち、判定で陽性とされたものをａ（真陽性）、疾病患者でありながら判定で陰性とされたものをｂ（偽陰性）、疾病患者でないにも関わらず判定で陽性とされたものをｃ（偽陽性）、疾病患者でなく判定で陰性とされたものをｄ（真陰性）と表したときに、ａ／（ａ＋ｂ）で表される値を感度（真陽性率）、ｄ／（ｃ＋ｄ）で表される値を特異度（真陰性率）として表すことができる。
【００２７】
目的とするmRSとそれ以外のｍRSとなる検体との血液試料中のIL-8量の測定値の分布は
通常、一部重複する。したがって、カットオフ値を上下させることにより、感度と特異度は変化する。カットオフ値を下げることにより感度は高くなるが、特異度は低下し、カットオフ値を上げることにより感度は低くなるが、特異度は上がる。判定方法としては、感度と特異度の両者の値が高いほうが好ましい。また、感度と特異度の値が０．５を超えない判定方法は、有用とは認められない。
【００２８】
カットオフ値を設定する方法としては、非疾患群の分布の９５％を含む、中央からの両端のいずれかの値をカットオフ値として設定する方法、非疾患群の分布が正規分布を示す場合、平均値＋２倍の標準偏差（ＳＤ）または平均値−２ＳＤをカットオフ値として設定する方法等が挙げられる。
【００２９】
また、一般に、診断方法が有用かどうかを判定するためには、前述のように設定されたカットオフ値によって感度と特異度が変化するため、単純にあるカットオフ値での感度と特異度で評価するよりも、カットオフ値を上下させたときに感度や特異度が高く保たれるような指標、例えばＲＯＣ曲線のＡＵＣ値で評価するのが望ましい。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は感度と特異度が両方１００％になるようなカットオフ値が存在する場合に１になり、診断性能が良くない場合に０．５に近づく。したがって、ある診断方法の性能をＲＯＣ曲線のＡＵＣ値で判断する場合には０．７以上であれば該方法は診断方法として適当であると評価することが可能である。本発明に記載のIL-8蛋白質マーカーについても、ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値０．７以上であったので、後述する脳梗塞検査方法に用いられるものである。
【００３０】
本発明の予測方法で特に好ましくは、発症２〜２０日後、さらに好ましくは発症３〜１５日目の被検者から採取した検体中のIL-8蛋白質量を測定することにより、発症3ヵ月後
付近の該被検者のｍRSが２〜５となるか／１以下となるかを予測する方法等が挙げられる。
【００３１】
かくして、本発明の方法により脳梗塞の診断がついた被検者（動物）は、それぞれの疾患に適した治療法を受けることにより、予後の経過や治療効果が非常に良好となる。
【００３２】
（１−２）IL-8蛋白質マーカー及びNIHSSを用いた脳梗塞の予後予測の検査方法
本発明の第２は、被検動物より採取された血液試料中の IL-8蛋白質量及び重症度の指標であるNIHSSを測定する工程を含む、被検者（動物）の脳梗塞の予後を予測するための検
査方法である。IL-8蛋白質マーカーを用いるだけでなく、さらにNIHSSを組み合わせて用
いることにより、より被検動物の予後予測の診断が精度よく行うことができる。本方法において、被検動物、及び該動物から得られる血液試料は上述のIL-8を用いた検査方法と同様のものが用いられる。本発明の検査方法において、被検動物から血液試料を採取する時期は、脳梗塞発症２〜２０日後、また特に脳梗塞発症後３日〜１５日が特に好ましい。
【００３３】
本発明の検査法において、被検動物から採取した血液試料中の含有量を測定する対象であるIL-8蛋白質は上述のものである。また、NIHSSとは、定められた各項目の臨床症状の
程度を加えて算出される指標であり、脳卒中患者の重症度の評価に用いられる。測定されたIL-8蛋白質量及びNIHSSと、脳梗塞の予後は、ロジスティック回帰、k 近傍法、線形重
回帰分析などの公知の統計モデルに従って関連付けることができる。
上記蛋白質の血液試料中のIL-8蛋白質の含有量の測定方法としては、上述のものである。
【００３４】
本発明の予測方法で特に好ましくは、発症２〜２０日後、さらに好ましくは発症３〜１５日目の被検者から採取した検体中のIL-8蛋白質量及び同時期のNIHSSを測定することによ
り、発症3ヵ月後付近の該被検者のｍRSが２〜５となるか／１以下となるかを予測する方
法等が挙げられる。また、上記検体中のIL-8蛋白質量及び同時期のNIHSSを測定すること
により、発症3ヵ月後付近の該被検者のｍRSを具体的に予測する方法も挙げられる。
かくして、本発明の方法により脳梗塞の診断がついた被検者（動物）は、それぞれの疾患に適した治療法を受けることにより、予後の経過や治療効果が非常に良好となる。
【００３５】
（２）脳梗塞測定用キット
本発明は、さらに上記脳梗塞の予後予測を行うためのキットも含まれる。キットの内容は、機器または試薬の組み合わせにより構成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。試薬としては、例えば、免疫測定法によりIL-８蛋白質マーカーを測定する場合には、抗IL-８蛋白質マーカー抗体を含む。また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、標準物質なども含まれる。生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにＢＳＡやカゼインなどの蛋白質を含む水溶液などが挙げられる。
【００３６】
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、抗分子マーカー抗体またはそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等が挙げられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用方法等、公知の方法が挙げられる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体または抗体断片等を疎水固相化したものが挙げられる。
【００３７】
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を含む反応緩衝液が挙げられる。
【００３８】
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、本発明に用いられる抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝剤、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
【００３９】
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、４−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等が挙げられる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
［実施例１］  IL-8蛋白質マーカーを用いた脳梗塞の予後予測をするための検査方法の評価
脳梗塞の予後は、脳梗塞発症後、ある一定期間の後に、その患者の脳梗塞による障害の程度にて示される。脳梗塞発症3ヶ月後の障害の程度を、日本版modified Rankin Scale（
ｍRS）判定基準（篠原幸人らmRS信頼性研究グループ、modified Rankin Scaleの信頼性に関する研究−日本語版判定基準書および問診表の紹介、脳卒中 2007；29：6-13）を用い
て０〜５に分類した患者について、予後良好群79名 (mRS 0〜1) と予後不良群68名 (mRS 2以上)について、脳梗塞発症３日後（表中「3日」と記載されている）、7日後（表中「７日」と記載されている）、及び１４日後（表中「１４日」と記載されている）に採血を行い、EDTA血漿を取得した。
Human Map TM v.1.6法による測定をRules Based社に依頼して行った免疫測定法により
、EDTA血漿中のIL-８蛋白質濃度を測定した。具体的にはキットに付属の標準タンパク質
を用いて検量線を作成し、この検量線から血漿中のIL-8蛋白質の濃度を算出した。
また、コントロールとして、既に発症後1週間のピーク濃度が予後と関連することが知
られている（Smith CJ, et al. BMC Neurol 2004;4:2. [PubMed: 14725719]）IL-6蛋白質及びCRP蛋白質についても同様に測定した。
次に各採血時点において判別性能を評価するために、Fawcett, T. (2004) ROC Graphs:
Notes and Practical Considerations for Researchers に記載の方法に従い ROC 曲線
の AUC 値を算出した。その結果を表１に示す。
それぞれの採血時点において、0.7を上回ったものが脳梗塞患者の予後を判別するため
の検査方法として有用であることが示される。つまり、脳梗塞発症３日、７日、１４日のいずれも、EDTA血漿中のIL-8蛋白質の濃度を測定することにより、約３ヶ月後に日本版modified Rankin Scale（ｍRS）判定基準の０及び１と、２以上となる患者を判別すること
ができることがわかった。
【００４２】
【表１】
2013205242.tif 000002
【００４３】
［実施例２］  IL-8蛋白質マーカー及びNIHSSを用いた脳梗塞の予後予測をするための検
査方法の評価（１）
実施例１と同じく予後良好群79名 (mRS 0〜1) と予後不良群68名 (mRS 2以上)について、脳梗塞発症３日後（表中「3日」と記載されている）、7日後（表中「７日」と記載されている）、及び１４日後（表中「１４日」と記載されている）に採血を行い、EDTA血漿を取得し、実施例１と同様にして、EDTA血漿中のIL-８蛋白質、及び実施例１で示したIL-6
とCRP蛋白質の濃度を測定、算出した。また、採血と同時期に NIHSS も測定した。
次に各採血時点において判別性能を評価するために、NIHSS、IL-8、Il-6、及びCRP蛋白質およびいずれかの血中パラメータの１〜２変量を説明変数にし、予後を目的変数としてロジスティック回帰による予測を行った。NIHSSはゼロを含むために平方根変換を行い，
その他の蛋白質量については対数変換を行った。マーカー数による過学習の度合いを調整するために、5-fold クロスバリデーションの予測値で ROC 解析を行い、AUC 値を算出した。この結果を表２に示す。
それぞれの採血時点において、AUC値が0.7を上回ったものが脳梗塞患者の予後を判別するための検査方法として有用であることが示される。しかしながら、上記の蛋白質は、いずれも既に蛋白質マーカーとして単独で脳梗塞の予後予測に有効であることがわかっているので、単独で用いた場合に比べて、AUC値が向上したものが、その組み合わせにより脳
梗塞の予後予測マーカーの組み合わせとして有効であるので、脳梗塞発症３日、７日、１４日のいずれも、EDTA血漿中のIL-8蛋白質の濃度及びNIHSSを測定することにより、約３
ヶ月後に日本版modified Rankin Scale（ｍRS）判定基準の０及び１と、２以上となる患
者の判別が、単独で行う場合に比べて、その精度が向上し、有効な測定方法であることがわかった。
【００４４】
【表２】
2013205242.tif 000003
【００４５】
［実施例３］  IL-8蛋白質マーカー及びNIHSSを用いた脳梗塞の予後予測をするための検
査方法の評価（２）
実施例２では、変数を変換し、統計モデルにはロジスティック回帰を用いたが、変数変換法を同じまま統計モデルを k 近傍法（Belur V. Dasarathy, editor (1991) Nearest Neighbor (NN) Norms: NN Pattern Classification Techniques）とした以外は、実施例２と同様にして、NIHSS及びIL-8蛋白質マーカー量と脳梗塞の予後予測との関係を分析した
。この結果を表３に示す。
表３からも明らかなように、統計モデルをｋ近傍法としても、脳梗塞発症３日、７日、１４日のいずれも、EDTA血漿中のIL-8蛋白質濃度及びNIHSSを測定することにより、約３
ヶ月後に日本版modified Rankin Scale（ｍRS）判定基準の０及び１と２以上となる患者
の判別が、単独で行う場合に比べて、その精度が向上し、有効な測定方法であることが示された。
【００４６】
［実施例４］  IL-8蛋白質マーカー及びNIHSSを用いた脳梗塞の予後予測をするための検
査方法の評価（３）
実施例２では、変数を変換し、統計モデルにはロジスティック回帰を用いたが、変数変換を施さずに実施例２と同じロジスティック回帰を行った以外は、実施例２と同様にして、NIHSS及びIL-8蛋白質マーカー量と脳梗塞の予後予測との関係を分析した。この結果を
表３に示す。
表３からも明らかなように、変数交換を施さずにロジスティック回帰を行っても、脳梗塞発症３日、７日、１４日のいずれも、EDTA血漿中のIL-8蛋白質濃度及びNIHSSを測定す
ることにより、約３ヶ月後に日本版modified Rankin Scale（ｍRS）判定基準の０及び１
と、２以上となる患者の判別が、単独で行う場合に比べて、その精度が向上し、有効な測定方法であることが示された。
【００４７】
【表３】
2013205242.tif 000004
【００４８】
［実施例５］  IL-8蛋白質マーカー及びNIHSSを用いた脳梗塞の予後予測をするための検
査方法の評価（４）
日本版modified Rankin Scale（ｍRS）判定基準（篠原幸人らmRS信頼性研究グループ、modified Rankin Scaleの信頼性に関する研究−日本語版判定基準書および問診表の紹介
、脳卒中 2007；29：6-13）を用いて０〜５に分類した患者、すなわち、mRS０ 31名、ｍRS１ 48名、ｍRS２ 29名、ｍRS３ 17名、ｍRS４ 21名、及びｍRS５ 1名について、脳梗塞
発症３日後に採血を行い、EDTA血漿を取得した。続いて、実施例１と同様にしてNIHSS およびEDTA血漿中のIL-８蛋白質、CRP蛋白質、及びIL-6蛋白質濃度を測定した。
IL-８蛋白質量、NIHSS、CRP蛋白質量、及びIL-6蛋白質量の1〜2変量を説明変数とし、mRSを目的変数として線形重回帰分析（Annette J.Dobson「一般化線形モデル入門」共立出
版，2008）を行った。変数変換は実施例１と同様に行い、mRS は平方根変換を行った。次に、線形重回帰分析の予測値と、平方根変換した mRS との Spearman の順位相関の値を
算出した。
この結果を表４に示す。表４から明らかなように、NIHSSを単独で用いた場合に、発症
後３ヶ月程度後の該患者の予後を示すｍRSが予測できることが示された。また、NIHSSとCRP蛋白質、NIHSSとIL-6蛋白質、及びNIHSSとIL-8蛋白質マーカー を組み合わせた場合に
は、単独で用いる場合に比べて、その予測精度が向上したため、この組み合わせが発症後３ヶ月程度後の該患者の予後を示すｍRSを予測するのに有効であることが示された。
【００４９】
【表４】
2013205242.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の方法によれば脳梗塞の予後予測の検査を行うことができ、医療や診断の分野で有用である。