(57)【要約】【課題】ドコサヘキサエン酸（DHA）およびアラキドン酸（AA）比率を増加させる脂肪酸組成改良剤、およびこの脂肪酸組成改良剤を配合した脂肪酸組成改良用飲食品または飼料の提供。【解決手段】ホスファチジルエタノールアミンとスフィンゴミエリンを摂取することにより、植物性油脂由来のα-リノレン酸からDHAへの代謝が亢進され、生体内のDHA含量およびAA量が増加する。【選択図面】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルエタノールアミンおよび／またはスフィンゴミエリンを有効成分とする生体内脂質の脂肪酸組成改良剤。
【請求項２】
前記ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンが乳または乳素材から調製して得られる乳由来リン脂質であることを特徴とする請求項１に記載の脂肪酸組成改良剤。
【請求項３】
前記乳由来リン脂質が、全固形中10重量％以上のホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンを含有する組成物であることを特徴とする請求項１または２に記載の脂肪酸組成改良剤。
【請求項４】
前記乳または乳素材が、牛乳、バターセーラムまたはバターミルクの少なくとも１種以上であることを特徴とする請求項２または３に記載の脂肪酸組成改良剤。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の脂肪酸組成改良剤を配合した飲食品。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかに記載の脂肪酸組成改良剤を配合した飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンを有効成分とし、経口摂取により生体内の肝臓脂質の脂肪酸組成における、特にドコサヘキサエン酸（DHA、以下DHAという場合がある。）、および、アラキドン酸（AA、以下AAという場合がある。）比率を増加させる脂肪酸組成改良剤、およびこの脂肪酸組成改良剤を配合した脂肪酸組成改良用飲食品または飼料に関するものである。
【０００２】
多価不飽和脂肪酸とは分子内に不飽和結合を2個以上含む脂肪酸であり、飽和脂肪酸や一価不飽和脂肪酸と区別される。多価不飽和脂肪酸の1種であるリノール酸やα-リノレン酸は必須脂肪酸であり、生理活動に必要な脂肪酸である。脂質研究の進展により、多価不飽和脂肪酸の重要な役割が明らかになりつつある。例えば、多価不飽和脂肪酸であるγ-リノレン酸がアトピー性皮膚炎に対して治療効果を有することは知られており、また、同じくエイコサペンタエン酸(EPA、以下EPAという場合がある。)並びにドコサヘキサエン酸(DHA)が血小板凝集抑制作用、血中中性脂肪低下作用、血中VLDLおよびLDLコレステロール低下作用等を有しており、動脈硬化性疾患の予防、治療効果を有することも知られている。また、γ-リノレン酸から生合成されるジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸（AA）およびエイコサペンタエン酸（EPA）は、最近生理活性物質として注目されているプロスタグランジンの前駆体として重要であることが報告されている。これらの多価不飽和脂肪酸は、自然界において母乳、月見草種子、糸状菌（モルテイエレラ属、Mortierella）、魚油に存在している。
【０００３】
特にDHAに関しては、生体内では、母乳、脳、網膜、心筋、精子等の細胞膜リン脂質に存在しており、生命の発生段階やホメオスタシスの維持に重要であるといわれている。DHAはEPAと同様に、魚油中に多く含まれる脂肪酸である。DHAの機能としては、網膜や脳のような神経系の組織において、脳の固有な機能を保つのに重要な役割を果たす。このことから、DHAは記憶学習能を向上させる脂肪酸として、また神経系の発達が進む乳幼児期に特に重要な脂肪酸として理解されている。最近では、老人性痴呆症患者に対するDHA投与の臨床試験が行われ、DHAがその症状の改善をすることが報告されている。コレステロール低下作用も報告されており、作用機作としては、コレステロールの代謝および排泄量の増加であると推測されている。すなわち、EPAおよびDHAによって膜の流動性が増し、低密度リポタンパク質（LDL）レセプター活性が上昇するために、LDLの取り込みが増加し、LDLアポBの異性化率が上昇して、胆汁や糞便中へのステロイド排出が高まると考えられている。その他にも、制がん作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、抗糖尿病作用など、様々な機能が報告されている。
【０００４】
多価不飽和脂肪酸の生体内での代謝経路についても明らかになりつつある。不飽和脂肪酸の代謝には、リノール酸に代表されるn-6系脂肪酸とα-リノレン酸に代表されるn-3系脂肪酸に大別でき、n-6系とn-3系それぞれの多価不飽和脂肪酸は哺乳動物では相互に変換されることはない。n-3系多価不飽和脂肪酸の代謝は以下に示す流れにより行なわれる。α-リノレン酸からΔ6不飽和化酵素、鎖長延長酵素、Δ5不飽和化酵素の作用により、EPA(20:5)が生成する。EPAはドコサペンタエン酸(22:5n-3)を経て炭素数24まで鎖長延長された後、Δ6不飽和化酵素で不飽和化され、24:6n-3 となり、その後のβ酸化によりDHAとなる。一連の長鎖不飽和化反応の律速段階はΔ6不飽和化酵素である。この代謝経路は摂取するリノール酸およびα-リノレン酸の量により抑制され、EPAにもΔ6不飽和化酵素の阻害作用があるため、α-リノレン酸やEPAの摂取はDHAの効果的な増加につながらない。このように種々の合成阻止因子が存在することに鑑み、DHAの有する効果的な生理効果を期待して、生体内のDHAを効率的に増加させるためには、α-リノレン酸やEPAの摂取よりもDHAを直接摂取した方が良いと考えられている。このことは、ラットを用いた長期摂食実験でも裏付けられており、EPAを長期間摂取させても、生体内のDHA含量はDHAを直接摂取した場合よりもはるかに少ないことが判っている。また、DHAの長期摂取により脳内DHAを増やすことができることが実験で明らかとなっている。
【０００５】
そこで、認知症や動脈硬化症疾患などの予防を目的として、EPAやDHAが強化された食品や栄養補助食品が市販されている。特に、乳児期においては、上記不飽和化酵素活性が低いと考えられること、一方母乳中にはγ-リノレン酸、EPAおよびDHAが共に多く含まれていることを考慮すると、育児用粉乳による人工栄養で哺育する乳児では、これらの多価不飽和脂肪酸を含有することの重要性が指摘されている。また、幼児食、特に未熟児の食事にはDHAの添加が必要であると考えられている。
【０００６】
食品素材へDHAを利用するためには、魚介類もしくは魚から抽出した魚油を摂取する方法（特許文献１）や微生物代謝を利用した発酵法によりDHA、特にDHA含有リン脂質を産生させる方法（特許文献２）が提案されている。
【０００７】
一方で、多価不飽和脂肪酸であるDHAの摂取については、下記に示す課題が存在する。多価不飽和脂肪酸は、非常に酸化されやすく、空気中の酸素と反応して、パーオキサイド等の人体に有害な化合物を生成する。この酸化反応は、油脂や油脂含有食品中に含まれる微量の金属や、光等によって進行する。特に、魚臭や、酸化臭など異臭の発生による風味の劣化は、食品に魚油などを添加して多価不飽和脂肪酸強化食品を製造しようとする場合、最も重大な問題となる。特に、EPAやDHAを含有する魚油は非常に酸化されやすいため、酸化防止剤として大量のトコフェロールやソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)等の合成酸化防止剤の添加等、なんらかの酸化防止方法が必須であった。このように酸化防止を行わないと、微量の鉄や銅等の金属の存在により、油脂の自動酸化が進み、いわゆる戻り臭と呼ばれる悪臭の発生や、着色化等が発生する。また、このような現象が生じなくとも、過酸化物の生成が起こり、食用には好ましくない状態となる。
【０００８】
油脂または油脂含有食品の酸化防止方法としては、前述のような酸化防止剤の添加のほか、空気や光から遮断するために、遮光性密閉容器中に充填し、窒素ガス等の不活性ガスと空気を置換する方法、密閉容器と脱酸素剤を併用することで、油脂または油脂含有食品を長期保存する方法（特許文献３）、乳酸菌を利用した酸化防止方法（特許文献４）等が開示されている。
【０００９】
リン脂質にはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等があり、乳、大豆、卵黄中に存在する（油脂・脂質の基礎と応用  日本油化学会編  （財）日本油化学会）。リン脂質は生体膜の構成成分であり、細胞の形態を維持する役割を持つ。リン脂質一般やスフィンゴ糖脂質一般の機能性については多くの報告がある。例えば、スフィンゴ糖脂質の骨格であるスフィンゴイド塩基は、神経組織などの構成成分として重要である。スフィンゴ糖脂質の抗腫瘍活性 (Schmelz EM et al., Cancer Res 56:4936-4941 (1996))や、牛脳由来のスフィンゴ糖脂質のコレステロール低下作用(Imaizumi K et al., Nutr Res 17:111-114 (1997))についての報告もある。リン脂質については、脂質代謝改善作用や肝機能の改善効果が報告されている。血清中の総コレステロールおよびトリグリセリドを低下させる作用が報告されており、慢性肝疾患における肝機能改善、脂肪肝、高脂血症患者への投与が行なわれている。また、大豆中に含まれるホスファチジルコリンは神経伝達物質のアセチルコリンの前駆体として知られており、神経系の異常によって引き起こされる晩発性運動機能異常症に対してはホスファチジルコリンの改善効果が認められている（特許文献５）。
【００１０】
スフィンゴミエリンは牛乳中のリン脂質の約３０%を占めており、脳や神経組織に大量に存在することが開示されている（特許文献６）。また、卵黄等の食品中にも僅かに含まれることが報告されている。スフィンゴミエリンは、経口摂取した場合、小腸から血管に取り込まれることが報告されている（特許文献７）。皮膚顆粒層のスフィンゴミエリンは、スフィンゴミエリナーゼの作用により加水分解され角質層のセラミドとして供給されることが開示されている（特許文献８）。またスフィンゴミエリンは、それを含有する原料の摂取量が、セラミド類の原料よりも少量で、より優れた皮膚の保湿、保護作用や肌荒れ防止・改善、しわ防止等の美容効果を示すという報告がある（特許文献９）。
また、乳由来のリン脂質を食品に配合することによって、これを摂取した人の生体内におけるドコサヘキサエン酸（DHA）レベルを高めることが開示されている（特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第4012955号
【特許文献２】特許第4219831号
【特許文献３】特開昭５８−１８３４６６号公報
【特許文献４】特開平５−９１２６号公報
【特許文献５】特開２００９−１６７６４６号公報
【特許文献６】特開平１−２２８１０号公報
【特許文献７】特開平１１−１１３５３０号公報
【特許文献８】特開平２００５−２８１２５７号公報
【特許文献９】特開２００８−１８４４２８号公報
【特許文献１０】特開２００１−１２８６４２号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
しかしながら、特許文献２による微生物による発酵法により、食品へ利用可能な量を調製するためには、相応の規模の反応装置を準備する必要があり、初期投資が大きいことからコスト面で現実性が低い。日本人は通常の食事において、魚介類を摂取していることから、DHA源としては、魚油からの摂取が最も現実的とみられる。
また、特許文献３、４の方法では、多価不飽和脂肪酸の酸化と異風味の生成をある程度防止することは可能であるが、多様な食品形態全てに効果があるものではなく、必ずしも満足できるものではなかった。また、添加物の中には、大量摂取することが必ずしも好ましいものでないものも多い。
特許文献１０には、フォスファチジルコリン（PC、以下PCという場合がある）、
フォスファチジルエタノールアミン（PE）、およびスフィンゴミエリン（SPM）を含有する乳由来リン脂質（ミルクリン脂質）をラットに投与したとき、生体の脂質組成に及ぼす影響について開示されている。この結果をみると、対照である大豆リン脂質群に比べて、該ミルクリン脂質群における肝臓および大脳中のドコサヘキサエン酸（DHA）含量は高い値を示したが、アラキドン酸（AA）含量は両群間で差は認められなかった。一方、乳素材からホスファチジルエタノールアミン（PE）、スフィンゴミエリン（SPM）を精製し、該単独素材をラットに投与した本願発明では、PEおよびSPMの両方にて対照である大豆リン脂質群に比べて、ドコサヘキサエン酸（DHA）およびアラキドン酸（AA）の両方の増加が確認できた。つまり、特許文献１０では認められなかったアラキドン酸（AA）含量増加を達成したのである。この理由としては、特許文献１０の乳由来リン脂質に含まれるフォスファチジルコリン（PC）単独では、DHAおよびAA含量を増加させる効果が認められなかったことが影響していると考える（詳細は後述の実施例に記載する）。よって、本願発明は、特許文献１０では達成できなかったDHAおよびAAの両含量の増加を初めて達成することができたのである。
以上、まとめると、本発明者らは、各種有用な生理機能を有する生体内のDHAおよびAA含量を向上させる方法について検討を進めた結果、食品素材として非常に扱いづらい魚油を摂取することなく、ホスファチジルエタノールアミン（PEとスフィンゴミエリン（SPM）を摂取することにより、生体内のDHAおよびAA含量を増加させることが可能であることを発見し本発明とした。
【００１３】
本発明の態様は、以下の通りである。
（１）ホスファチジルエタノールアミンおよび／またはスフィンゴミエリンを有効成分とする生体内脂質の脂肪酸組成改良剤。
（２）前記ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンが乳または乳素材から調製して得られる乳由来リン脂質であることを特徴とする上記（１）に記載の脂肪酸組成改良剤。
（３）前記乳由来リン脂質が、全固形中10重量％以上のホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンを含有する組成物を前記乳由来リン脂質であることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の脂肪酸組成改良剤。
（４）前記乳または乳素材が、牛乳、バターセーラムまたはバターミルクの少なくとも１種以上であることを特徴とする上記（２）または（３）に記載の脂肪酸組成改良剤。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の脂肪酸組成改良剤を配合した飲食品。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の脂肪酸組成改良剤を配合した飼料。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の脂肪酸組成改良剤は、生体内脂質の脂肪酸組成改変に優れた効果を有する。また、乳または乳素材より調製するため、安全性にも優れている。さらに、本発明の脂肪酸組成改良剤を添加した飼料により生育させたマウスは、本発明の脂肪酸組成改良剤を添加していない飼料により生育させたマウスに比べて、肝臓中の総脂肪酸組成中のDHAおよびAA含有比率を高めることができる。本発明は、食品、サプリメント等のあらゆる経口物に利用してDHAおよびAA含有比率を高めるために優れた効果を得ることができ、健康市場において脂肪酸組成改良剤として非常に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に用いるホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンとしては、化学的合成品、大豆や卵黄由来品等も使用可能であるが、特に乳由来のものが好ましい。本発明に用いることができるホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンは、ウシ、ヤギ、ヒツジやヒト等の哺乳類の乳から調製したものが挙げられる。本発明における乳または乳素材としては、牛乳、バターセーラム、バターミルク等の乳由来原料が挙げられる。なお、バターセーラムとは、牛乳の遠心分離の操作により、脂肪分を40重量％以上としたクリーム画分を再度遠心分離等により脂肪分を上げて得られる脂肪分60重量％以上の高脂肪クリーム、あるいは、バターよりバターオイルを製造する際に得られる淡黄色の液体であり、前記高脂肪クリームあるいはバターを、遠心分離、加温あるいはせん断処理することにより得られる脂肪分51〜30重量％の水相画分をいう。また、バターミルクとは、脂肪分40重量％以上のクリームあるいは発酵クリームよりバターを製造する際に得られる液体であり、前記クリームあるいは発酵クリームに対してせん断処理を施すことによりバターを製造する際に排出される、脂肪分１〜15重量％の水相画分をいう。
【００１６】
本発明におけるホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンとは、乳または乳素材から調製して得られるホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンを含有する乳由来リン脂質、乳由来リン脂質含有組成物を用いることができる。例えば、全固形中10重量％以上のホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンを含有する組成物を乳由来リン脂質として使用可能であるが、以下のような方法等により調製することができる。乳または乳素材を精密濾過(MF)膜または限外濾過(UF)膜処理することにより、本発明のホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンを含有する組成物を得ることができる。この際に用いる精密濾過(MF)膜は、孔径0.1μm〜2.0μｍのものが好ましい。孔径が0.1μｍ未満となると、ホエータンパク質等の夾雑物が濃縮液側に残存するようになり、固形当たりの脂質含量が減少することにより脂肪酸組成改良剤としての効果が弱くなる。また、孔径が2.0μｍを超えると、脂肪球が膜を通過して透過液側に漏れるようになるため、脂肪酸組成改良効果を持つ脂質画分が濃縮画分から減少するために、脂肪酸組成改良剤としての効果が弱くなる。混入するタンパク質の量やリン脂質の回収率を考慮すると、孔径0.1〜2.0μｍ程度の精密濾過(MF)膜が最も好ましい。この孔径0.1〜2.0μｍの精密濾過(MF)膜としては、例えば、Membralox（SCT、Societie  Ceramics  Techniques社製）を使用することができる。また、限外濾過(UF)膜は、分画分子量５〜500ｋＤａのものが好ましい。５ｋＤａ未満となると、乳糖も濃縮され、脂質の割合が高くならないため好ましくなく、500ｋＤａは限外濾過(UF)膜の分画分子量の上限である。なお、精密濾過(MF)膜処理または限外濾過(UF)膜処理を行う前に、上記原料に対して酸を加えてｐＨを4.0〜5.0に調整し、カゼインタンパク質を等電点沈殿させて除去しておくことにより、膜処理における膜の汚れ付着を防止することができると同時に、得られる濃縮液中に含まれる固形当たりの脂質含量を高くすることが可能となり好ましい。さらに、ｐＨを4.0〜5.0に調整した後に塩化カルシウムを加えると、カゼインタンパク質の沈殿がより促進されるのでより好ましい。塩化カルシウムの添加量としては、全体の0.01〜0.05重量％が好ましい。また、ｐＨ調整の際に加える酸の種類は特に限定されないが、塩酸や硫酸等の無機酸等が好ましい。ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有組成物の回収方法は特に限定されないが、フィルタープレス、デカンター等を用いることが望ましい。膜処理で得られた濃縮液に関しては、特に方法は限定しないが、凍結乾燥、噴霧乾燥等の操作により粉体あるいはペースト状の乳由来組成物にしておくことが保存上好ましい。このようにして、全固形中10重量％以上のホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリンを含有する組成物を調製することができる。なお、この組成物中のその他の成分は特に限定されないが、上記したような方法によれば、全固形中、蛋白質を15〜50重量％、糖質10〜50重量％、灰分を5〜10重量％含有するものが得られる。また、組成物中の水分は５重量％以下である。
【００１７】
本発明の脂肪酸組成改良剤は、上記のホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン、もしくはその混合物をそのまま脂肪酸組成改良剤として用いる事も可能であるが、ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有する組成物の他に糖類、タンパク質、ビタミン類、ミネラル類やフレーバー等、他の飲食品や飼料に通常使用される原材料等を混合し、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。さらに、これらを製剤化した後に、これを栄養剤やヨーグルト、乳飲料、ウエハース等の飲食品や飼料に配合することも可能である。大豆油などの植物性油脂とを同時に摂取することで、油脂中に含まれるα-リノレン酸などをDHAに変換することとなる。
【００１８】
本発明の脂肪酸組成改良剤の有効量としては、後記するマウスを用いたモデル試験により、マウス体重１kg当たり、ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有組成物を1.5g以上経口摂取することにより、脂肪酸組成改良効果を有する。従って、外挿法によると、通常、成人一日当たり、ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有組成物を1.5g以上摂取することにより脂肪酸組成改良効果が期待できるので、この必要量を確保できるようにすればよい。
【００１９】
また、本発明の脂肪酸組成改良用飲食品は、通常の飲食品、例えばヨーグルト、乳飲料、ウエハースやデザート等に本発明の脂肪酸組成改良剤を配合すればよい。これらの脂肪酸組成改良用飲食品については、成人一人一日当たり、ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有組成物を1.5g以上摂取させるためには、飲食品の形態にもよるが飲食品100g当たりホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有組成物が1.5gとなるよう脂肪酸組成改良剤を配合することが好ましい。また、本発明の脂肪酸組成改良用飲食品は、通常の飼料、例えば家畜用飼料やペットフード等に本発明の脂肪酸組成改良剤を配合すればよい。これらの飼料については、一日当たり、ホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有組成物を1.5g以上摂取させるためには、飼料100g当たりホスファチジルエタノールアミンまたはスフィンゴミエリン含有組成物が1.5gとなるよう脂肪酸組成改良剤を配合することが好ましい。
【００２０】
以下に実施例を示し、本発明について詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
バターセーラムを出発原料として、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルコリン（PC）、スフィンゴミエリン（SPM）の高濃度画分を取得した。手順を下記に示す。
【００２２】
１）バターからの脂質の抽出
バターの加熱融解により、油層部と水層部の2層に分離した。バターセーラム粉末を抽出ビンに入れ、10倍量のエタノールを加え一晩浸漬した。その後、ろ液を回収した。残渣をエタノールに浸漬し抽出を行なった。ろ液をロータリーエバポレーターで濃縮した後、クロロホルム/メタノール/水（10:5:3、v/v/v）に溶解し、分液ロート中にて分離を確認した後、下層のクロロホルム層をナス型フラスコに回収し、再びエバポレーターで濃縮した。さらに減圧デシケーター内で溶媒を完全に除去してバターセーラム脂質を得た。
【００２３】
２）バターセーラム脂質からの中性脂質の除去および極性脂質の分離・分画
液液分配と溶媒抽出法を用いてバターセーラム脂質から中性脂質の除去および極性脂質の分離を行った。その後、極性脂質画分に、多量のジエチルエーテルを加え、-20℃で一晩静置した。その後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液を回収した。ろ紙上に残った画分はジエチルエーテルでよく洗浄し、その後クロロホルム/メタノール(2:1、v/v)でろ紙から溶出させ、ナス型フラスコに回収した後、ロータリーエバポレ―タ―で濃縮した。さらに減圧デシケーター内で溶媒を完全に除去し、グリセロリン脂質画分として回収した。ろ液はロータリーエバポレ―タ―で濃縮し、デシケーター内で完全に溶媒を除去し、スフィンゴ脂質画分として回収した。
得られたグリセロリン脂質に多量のエタノールを加え、-20℃で一晩静置した。その後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液を回収した。ろ液はロータリーエバポレ―タ―で濃縮し、デシケーター内で完全に溶媒を除去し、ホスファチジルコリン ( PC ) 画分として回収した。
得られたスフィンゴ脂質に多量のピリジンを加え、-20℃で一晩静置した。その後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液を回収した。ろ液はロータリーエバポレ―タ―で濃縮し、デシケーター内で完全に溶媒を除去し、スフィンゴミエリン ( SPM ) 画分として回収した。
【００２４】
３) オープンカラムによる極性脂質の分画
得られた極性脂質をクロロホルムに溶解してカラムに供した後、クロロホルムを流して不要な成分を溶出させた。その後クロロホルム/メタノール(9:1、v/v)にて溶出した画分を回収し、ホスファチジルエタノールアミン(PE)画分とした。
【００２５】
動物実験については、下記の手順により行なった。
１）実験動物と飼料の調製
実験動物には4週齢の雄のKK-Ayマウス（肥満・糖尿病モデルマウス）を用いた。実験飼料はAIN-93G組成（Reeves PG et al., J Nutr 123:1939-1951 (1993)）に従って調製した。コントロール群用試料が含有する大豆油は13.51%(w/w)とした。実験飼料は12.51%(w/w)大豆油含有の飼料に対して牛乳由来極性脂質画分が1%となるように調整した。飼料の組成は表1に示した。
【００２６】
【表１】
2013181024.tif 000002
【００２７】
２）飼育実験
1週間の予備飼育の後、AIN-93Gを基本組成とした実験飼料を4週間与えた。マウス各群7匹ずつ体重にばらつきがないように群分けした。コントロール群用試料に含有する大豆油は13.51%(w/w)とし、実験飼料は12.51%大豆油含有試料にPC,PE,SPMの画分をそれぞれ飼料に対して1%(w/w)となるように調製して与えた。
【００２８】
３）肝臓脂質の抽出と分析
Folch法（Folch J et al., J Biol Chem 226:497-509 (1957)）に従って肝臓から総脂質を抽出した。
【００２９】
４）肝臓中の脂肪酸分析
Prevot and Mordretの変法（Prevot AF and Mordret FX, Rev Fse Corps Gras, 23:409-423 (1976)）に従い、試料脂質のメチルエステル化を行った。内部標準として23:0を加え、脂肪酸メチルエステルを調製し、ガスクロマトグラフィーによる分析を行った。
表２にそれぞれの画分の脂質組成を示した。PE画分はほとんどPEのみであったが、PC画分にはPC以外に、PEが14.6%、SPMが8.2%、また、SPM画分には、PCが16.3%、PEが10.3%含まれていた。
【００３０】
【表２】
2013181024.tif 000003
【００３１】
表3に実験により得られたマウス肝臓脂質の脂肪酸組成を示した。脂肪酸組成でも牛乳由来PEとSPMの投与により、コントロール群と比較して違いが見られた。なお、PC投与群とコントロール群に肝臓脂肪酸組成にほとんど差は見られなかった。PE1%群では18:0と20:4n-6の増加、18:3n-3の減少が、SPM1%群では16:0と18:0の増加、18:2n-6と18:3n-3の減少が見られた。ここで、22:6n-3（DHA）の増大がPEとSPM投与に確認することができた。
本発明である脂肪酸組成改良剤を経口摂取することにより、植物性油脂由来のα-リノレン酸からDHAへの代謝が亢進され、かつ、n-6系の多価不飽和脂肪酸であるアラキドン酸を増加させる効果も確認できた。
【００３２】
【表３】
2013181024.tif 000004
【００３３】
表4に調製した４種類の飼料から抽出した脂質の脂肪酸組成を示した。牛乳極性脂質の添加量が１％であったため、脂質の脂肪酸組成に大きな違いは見られなかった。したがって、PEとSPM投与で得られたコントロール群との脂肪酸組成の違い（表３）は、PEとSPMそれ自体の脂肪酸組成に影響されたものではなく、これら極性脂質投与による生体内での脂肪酸代謝系への影響の結果と考えられた。
こうした代謝系への影響を考察する上で重要な点として、飽和脂肪酸（16:0と18:0）からのモノ不飽和脂肪酸（16:1と18:1）への代謝制御が考えられる。そこで、その指標として18-1n-9/18:0を計算したところ、コントロール群と比較してPE1%群では減少、SPM1%群でも減少することが明らかになった。生体内では、ステアリン酸CoA不飽和化酵素(SCD1)により、18:0から18:1n-9への合成が行われる。この結果はこの酵素の活性低下を示唆している。
【００３４】
【表４】
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【００３５】
SCD1は、単に18:0の不飽和化酵素として知られているだけでなく、その活性阻害が、肥満、インシュリン抵抗性、および脂質代謝異常の改善に有効なことが示され注目された。例えば、SCD1をノックアウトしたマウスでは、脂肪酸代謝や熱産生を亢進させ、さらにはインシュリン感受性をも向上させることが明らかにされた（Ntambi JM et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:11482-11486 (2002)）。こうしたノックアウトマウスでは、脂質合成系の鍵成分であるSREBP-1 とSREBP-1がコードするFASなどの脂肪酸合成酵素系の活性が低下する一方で、CPT-1などの脂肪酸分解系の酵素の活性が向上すること（Sampath H et al., J Biol Chem 282:2483-2493 (2007)）、また、コレステロール合成系の酵素活性が阻害されること（Miyazaki M et al., J Biol Chem 275:30132-30138 (2000)）も報告された。これらの結果などにより、SCD1は重要な代謝制御因子であると考えられている（Flower, MT and Ntambi JM, Curr Opin Lipidol 19:248-256 (2008))。
また、牛乳由来のPEとSPM投与で見られた肝臓脂肪酸組成（表３）の特徴として、20:4n-6（アラキドン酸）と22:6n-3（DHA）の増大が挙げられる。生体内のDHA含量、および、アラキドン酸含量を増加させる食品成分はこれまで見出されていない。よって、本発明により初めて達成することができた。
【００３６】
ヒト成人は、植物油由来のα-リノレン酸(18:3n-3)から体内でDHAを合成することができるが、その合成率は極めて低い。今日のように油脂、特に、畜肉油や植物油を多く摂取する機会が増えると、体内でのDHAなどのn-3系脂肪酸に対するn-6系脂肪酸の比率が必要以上に増大する。したがって、水産物の摂取が推奨されるわけだが、DHAなどの魚油の安定性の低さがこの障害となっている。ただ、体内でのα-リノレン酸からDHAへの変換反応が効率良く進めば、同時に摂取する大豆油などの植物油の脂肪酸組成への本発明による脂肪酸組成改良の作用により、DHA含量を増大させることも可能である。表3で見られた牛乳由来のPEとSPMの投与によるDHAの増大は、体内でのDHAへの変換反応を、これらの脂質成分が亢進することを示す。