(57)【要約】【課題】優れた精度で大腸癌の予後を予測することができる大腸癌マーカー、およびこの大腸癌マーカーを用いて大腸癌の予後を予測する予測方法を提供すること。【解決手段】本発明の大腸癌マーカーは、外科的切除後大腸癌における大腸癌患者の予後の予測に用いられ、大腸癌細胞に発現したＨＳ６ＳＴ２タンパク質である。また、本発明の予後の予測方法は、大腸癌患者の外科的切除後の大腸癌細胞におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する検査工程と、前記検査工程の検査結果に基づいて、前記大腸癌患者の予後を予測する予測工程とを有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外科的切除後大腸癌における大腸癌患者の予後の予測に用いられ、
大腸癌細胞に発現したＨＳ６ＳＴ２タンパク質であることを特徴とする大腸癌マーカー。
【請求項２】
前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質は、前記大腸癌細胞の細胞質内に発現する請求項１に記載の大腸癌マーカー。
【請求項３】
大腸癌患者の外科的切除後の大腸癌細胞におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する検査工程と、
前記検査工程の検査結果に基づいて、前記大腸癌患者の予後を予測する予測工程とを有することを特徴とする予後の予測方法。
【請求項４】
前記検査工程において、前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質を特異的に認識する抗ＨＳ６ＳＴ２抗体を用いた免疫学的方法により、前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する請求項３に記載の予後の予測方法。
【請求項５】
前記免疫学的方法は、免疫組織化学法である請求項４に記載の予後の予測方法。
【請求項６】
前記予測工程において、前記大腸癌細胞の細胞質内に前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められなかったときに陰性とし、前記細胞質内に前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められる前記大腸癌細胞が全体の２５％未満であったときに一部陽性とし、前記細胞質内に前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められる前記大腸癌細胞が全体の２５％以上であったときに陽性とする請求項５に記載の予後の予測方法。
【請求項７】
前記予測工程において、前記陰性と判定された前記大腸癌患者を予後良好として予測し、前記一部陽性または前記陽性と判定された前記大腸癌患者を予後不良として予測する請求項６に記載の予後の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌マーカー、および予後の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大腸癌による死亡者が、増加している。
大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第２番目に多い癌である（１９９９年度癌死統計）。
【０００３】
また、２０１５年の癌患者推計では、男女ともに第１位になると推計されており、二次的な予防、すなわち大腸癌患者の予後の予測を含めた総合的な大腸癌対策が求められている。
【０００４】
癌治療において、寛解率を向上させるための１つの要因として、重要で早期に癌を発見し、早期に治療を開始することが求められるが、癌の有無を検査する検査方法として、癌の存在に起因して発現するタンパク質や遺伝子をマーカーとして検出する方法が知られおり、大腸癌についても、このようなマーカーに関する報告がなされている（例えば、特許文献１、２参照。）。
【０００５】
また、これとは異なるマーカーの利用方法として、患者の予後を予測し、この予測結果に基づいて、術後の治療方針を決定することも挙げられるが、大腸癌の発現に関連し、かつ大腸癌の予後の予測に使用することができるマーカーは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２５２７８７号公報
【特許文献２】特開２０１０−２７１９６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、優れた精度で大腸癌の予後を予測することができる大腸癌マーカー、およびこの大腸癌マーカーを用いて大腸癌の予後を予測する予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような目的は、下記（１）〜（７）に記載の本発明により達成される。
（１）  外科的切除後大腸癌における大腸癌患者の予後の予測に用いられ、
大腸癌細胞に発現したＨＳ６ＳＴ２タンパク質であることを特徴とする大腸癌マーカー。
【０００９】
（２）  前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質は、前記大腸癌細胞の細胞質内に発現する上記（１）に記載の大腸癌マーカー。
【００１０】
（３）  大腸癌患者の外科的切除後の大腸癌細胞におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する検査工程と、
前記検査工程の検査結果に基づいて、前記大腸癌患者の予後を予測する予測工程とを有することを特徴とする予後の予測方法。
【００１１】
（４）  前記検査工程において、前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質を特異的に認識する抗ＨＳ６ＳＴ２抗体を用いた免疫学的方法により、前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する上記（３）に記載の予後の予測方法。
【００１２】
（５）  前記免疫学的方法は、免疫組織化学法である上記（４）に記載の予後の予測方法。
【００１３】
（６）  前記予測工程において、前記大腸癌細胞の細胞質内に前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められなかったときに陰性とし、前記細胞質内に前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められる前記大腸癌細胞が全体の２５％未満であったときに一部陽性とし、前記細胞質内に前記ＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められる前記大腸癌細胞が全体の２５％以上であったときに陽性とする上記（５）に記載の予後の予測方法。
【００１４】
（７）  前記予測工程において、前記陰性と判定された前記大腸癌患者を予後良好として予測し、前記一部陽性または前記陽性と判定された前記大腸癌患者を予後不良として予測する上記（６）に記載の予後の予測方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の大腸癌マーカーによれば、優れた精度で大腸癌の予後を予測することができる。
【００１６】
したがって、かかる大腸癌マーカーを用いた予後の予測方法により、優れた精度で大腸癌の予後を予測することができ、さらに、その予測結果に基づいて、術後の治療方針を決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】陰性、一部陽性および陽性と判定された検体の光学顕微鏡写真である。
【図２】ＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無と、患者の生存日数との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の大腸癌マーカー、および予後の予測方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【００１９】
＜大腸癌マーカー＞
プロテオグリカンは、糖鎖（グリコサミノグリカン）とタンパク質とが共有結合してできる糖タンパク質である。
【００２０】
グリコサミノグリカンには、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等が知られている。これらの中で、ヘパラン硫酸が結合したプロテオグリカンは、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（heparan sulfate proteoglycan; ＨＳＰＧ）と呼ばれ、細胞膜上に発現するものとしてシンデカン（syndecan）、グリピカン（glypican）等が知られ、基底膜（basement membrane）に分泌されるものとしてパーレカン（perlecan）、アグリン（agrin）等が知られている。
【００２１】
ヘパラン硫酸は、マウスにおいては肺や腎臓で多く発現し、骨格筋、肝臓、皮膚、脳では発現が少ないことが報告されている。
【００２２】
また、ＨＳＰＧは、増殖因子の活性に影響し、細胞の増殖や分化に関わっていることが知られ、例えば、fibroblast growth factor、heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor、amphiregulinは、ヘパラン硫酸と結合しながら、各増殖因子の受容体を介して細胞内にシグナルを伝達することが報告されている。さらに、ＨＳＰＧは、各種癌において、癌細胞の増殖や転移に関与していることが報告されている。
【００２３】
以上のようなヘパラン硫酸において、このものを構成するグルコサミンの６−０位に硫酸基を付加する酵素として、Heparan sulfate 6-0-sulfotransferase 2（ＨＳ６ＳＴ２タンパク質）が知られている。
【００２４】
ＨＳ６ＳＴ２タンパク質は、II型膜タンパク質であり、細胞内のゴルジに存在して、酵素として機能するものであり、さらに、細胞内ばかりでなく細胞外に分泌されることが示唆されている。なお、細胞外に分泌されたＨＳ６ＳＴ２タンパク質は、硫酸基のドナーである3'-phosphoadenosine 5'-phosphsulfateが血中では速やかに分解されるため、細胞外では酵素として機能しないと推察されている。
【００２５】
このようなＨＳ６ＳＴ２タンパク質は、その立体構造を解明するまでは至っていないが、６糖鎖以下のヘパラン硫酸の部分配列を認識し結合すると考えられている。なお、細胞外に分泌されたＨＳ６ＳＴ２タンパク質も、細胞膜上のヘパラン硫酸に結合し得ると考えられる。
【００２６】
このＨＳ６ＳＴ２タンパク質に、本発明者は着目し、まず、ヒトの正常組織において、このＨＳ６ＳＴ２タンパク質が何れの組織で発現しているかについて検査した。その結果、胃、小腸、大腸（結腸）、肝臓、腎臓、副腎、気道、乳腺、卵巣、子宮および皮膚において発現し、大脳、小脳、心臓、食道、膵臓、肺、脾臓、リンパ節、前立腺、精巣、骨格筋、横紋筋および脂肪おいて発現しておらず、このことから、ヒトの正常組織のうち、消化器系の組織の細胞内において高確率にＨＳ６ＳＴ２タンパク質が発現していることが判ってきた。
【００２７】
そして、これらの中でも、本発明者は、大腸に着目し、健常者の大腸ではなく、大腸癌患者の大腸（大腸細胞）におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現について検査した。その結果、大腸癌患者では、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現が認められない陰性例、細胞質の一部において選択的にＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現が認められる一部陽性例、細胞質の全体においてＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現が認められる陽性例の３群に分類できることが判った。
【００２８】
そこで、陰性例を陰性群とし、一部陽性例と陽性例とを陽性群とする二群に分類したところ、陽性群において死亡割合が高く、さらに、これら二群間における術後生存期間を解析した結果、陽性群が予後不良となる傾向を示す結果が得られることを見出した。
【００２９】
すなわち、本発明者は、外科的切除後の大腸（大腸癌）におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査することで、その大腸癌患者の予後を予測することができることを見出し、本発明を完成するに至った。このように大腸癌患者におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の検査により、その予後を予測することができるようになるため、その予想結果に基づいて、その大腸癌患者に応じた、治療方針を決定することができる。すなわち、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質を、外科的切除大腸癌における予後の予測を行え得る大腸癌マーカーとして用いることができる。
【００３０】
＜予後の予測方法＞
大腸癌患者におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の検査に基づく、その予後の予測（本発明の予後の予測方法）は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００３１】
すなわち、本発明の予後の予測方法は、大腸癌患者の外科的切除後の大腸（大腸癌細胞）におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する検査工程と、この検査結果に基づいて、大腸癌患者の予後を予測する予測工程とを有している。
【００３２】
［１］まず、大腸癌患者の外科的切除後の大腸（大腸癌）におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する（検査工程）。
【００３３】
本工程において、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する方法、すなわち、大腸細胞中におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質の検出方法としては、特に限定されないが、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質を特異的に認識する抗ＨＳ６ＳＴ２抗体を用いた免疫学的方法により検出する方法が好ましく用いられる。
【００３４】
免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）法、免疫沈降（ＩＰ）法、免疫比濁（ＴＩＡ）法、ウエスタンブロット（ＷＢ）法、免疫拡散（ＳＲＩＤ）法および免疫組織化学（ＩＨＣ；免疫染色）法等が挙げられ、これらの中でも、免疫組織化学法を用いるのが好ましい。免疫組織化学法は、外科的切除後の大腸（大腸癌）から得られた細胞を固定化した切片上で、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質を検出することができるため、細胞内におけるＨＳ６ＳＴ２タンパク質を直接的に観察することができることから好ましく用いられる。
【００３５】
また、抗ＨＳ６ＳＴ２抗体としては、例えば、ＷＯ２０１０／０７４０４９号公報に記載のものを用いることができる。
【００３６】
なお、免疫組織化学法を用いた場合、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質を認識した抗ＨＳ６ＳＴ２抗体を可視化する必要があるが、この可視化する方法としては、特に限定されず、例えば、オートラジオグラフィー法、金コロイド法、蛍光抗体法および酵素抗体法等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
［２］次に、検査工程における検査結果に基づいて、大腸癌患者の予後を予測する（予測工程）。
【００３８】
ここで、検査工程において、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無を検査する方法として、免疫組織化学法を用いた場合、本明細書中では、以下の基準に基づいて、陰性、一部陽性または陽性と判定することとした。
【００３９】
すなわち、大腸癌細胞において細胞質内にＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められなかったときに「陰性」とし、細胞質内にＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められる大腸癌細胞が全体の２５％未満であったときに「一部陽性」とし、さらに細胞質内にＨＳ６ＳＴ２タンパク質が認められる大腸癌細胞が全体の２５％以上であったときに「陽性」とした。
【００４０】
そして、陰性であった大腸癌患者（陰性群）を、予後良好として予測し、一部陽性または陽性であった大腸癌患者（陽性群）を、予後不良として予測する。
【００４１】
このように、本発明によれば、ＨＳ６ＳＴ２タンパク質の発現の有無の検査結果に基づいて、大腸癌患者の予後を予測することができるため、その予測結果に基づいて、術後の治療方針を決定することができる。
【００４２】
以上、本発明の大腸癌マーカー、および予後の予測方法を実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
例えば、本発明の予後の予測方法には、必要に応じて任意の工程が追加されてもよい。
【実施例】
【００４３】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
１．  対象症例
近畿大学病院外科において、２００５年に外科的切除された大腸癌患者１０２例を対象とした。なお、本明細書に記載の実験は、全ての対象患者から文書でインフォームドコンセントを得ている。
【００４４】
２．  大腸癌細胞の染色方法
（１）パラフィン包埋
まず、各症例における外科的切除した大腸癌組織を、それぞれ、パラフィン包埋して、ダイヤモンドカッターで切片を作製、スライドガラス上に組織切片を貼りつけた。
【００４５】
（２）脱パラフィン
次に、スライドガラス上に貼り付けられた組織切片を、キシレン槽に５分間浸漬を３回繰り返した。次いで、無水アルコール槽、９５％アルコール槽、８０％アルコール槽、７０％アルコール槽に、それぞれ５分間ずつ順に浸した。その後、スライドグラスを水道水で洗浄しアルコール成分を除去した後、イオン交換水に入れた。
【００４６】
（３）賦活化
次に、スライドグラスを１２０℃で２０分間オートクレーブ処理し、賦活化した。
【００４７】
（４）過酸化水素処理
次に、スライドガラスを水平な場所に置き、０．３％の酸化水素水を充分量滴下して組織切片全体を覆った。次いで、室温で３０分間インキュベートした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスし、さらに、スライドをＰＢＳの入った洗浄槽に２分間静置した。
【００４８】
（５）ブロッキング
次に、５％牛血清アルブミン溶液にスライドガラスを１０分間浸漬し、ブロッキングした。
【００４９】
（６）一次抗体反応
次に、ビオチン化抗ＨＳ６ＳＴ２抗体溶液を、スライドグラスの上に滴下し、これにより切片全体を覆った。次いで、４℃で一晩(１２−１６時間)インキュベートした後、ＰＢＳでリンスし、さらに、スライドガラスをＰＢＳの入った洗浄槽に２分間静置した。
【００５０】
（７）抗体検出
次に、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  Ｋｉｔ（ＶＥＣＯＲ社製、「PK-6100」）を用いて、ビオチン化抗ＨＳ６ＳＴ２抗体をペルオキシダーゼで標識した。次いで、ペルオキシダーゼ染色用ＤＡＢ  ｋｉｔを用いてビオチン化抗ＨＳ６ＳＴ２抗体を染色した。
【００５１】
（８）ヘマトシリン染色
次に、Mayer'sヘマトキシリンをアプライして組織切片を覆い、その後、５分間染色した後に、蒸留水でリンスした。
【００５２】
（９）脱水、封入
次に、グリセロールゼラチンを用いて組織切片（検体）をマウントした後、光学顕微鏡観察を行った。
【００５３】
３．  検体の判定方法
各症例の光学顕微鏡観察した検体について、それぞれ、大腸癌細胞において細胞質内に染色が認められなかったときに「陰性」と判定し、細胞質内に染色が認められる大腸癌細胞が全体の２５％未満であったときに「一部陽性」と判定し、さらに細胞質内に染色が認められる大腸癌細胞が全体の２５％以上であったときに「陽性」と判定した。
【００５４】
その結果、大腸癌患者１０２例中、陰性、一部陽性および陽性と判定された患者は、それぞれ、表１に示す通りとなった。
なお、陰性、一部陽性および陽性と判定した検体の一例を図１に示した。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
４．  予後の判定
陰性と判定された患者を陰性群とし、一部陽性または陽性と判定された患者を陽性群とする２群に分けて、これら各群における予後を調査した。その結果を、表２に示す。
【００５７】
【表２】
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【００５８】
追跡不能であった２０例を除く８１例について、陰性群および陽性群の生存曲線を描き、Ｌｏｇｒａｎｋ検定にて２群間の有意差を検討した。その結果を図２に示す。Ｐ値が０．０９７であったが、陽性群の生存曲線は明らかに陰性群を上回っており、細胞質内にＨＳ６ＳＴ２タンパク質が発現すると予後不良となる結果であった。
【図１】
2013205362.tif 000005
【図２】
2013205362.tif 000006