(57)【要約】【課題】本発明は、低濃度のタンパク質でも高い密度で固定化することのできるＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、支持体と、前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層とを少なくとも含む物質固定化用担体であって、前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖と、被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基とを含む、物質固定化用担体に関する。【選択図】図１
2013205159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含む物質固定化用担体であって、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖と、
被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。
【請求項２】
支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
被固定化物質と
を少なくとも含む物質固定化担体であって、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と前記被固定化物質とが、共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。
【請求項３】
請求項２の物質固定化担体の製造方法であって、
請求項１の物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、物質固定化工程
を含む方法。
【請求項４】
前記溶液が、イオン強度が０．１００以下である水溶液に、前記被固定化物質を溶解して調製された溶液である、請求項３の方法。
【請求項５】
前記物質固定化工程後に、前記物質固定化担体と、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と共有結合を形成可能な官能基および更なる親水性基を有する低分子化合物とを接触させる工程を更に含む、請求項３又は４の方法。
【請求項６】
免疫アッセイにより標的物質を測定する方法であって、
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、請求項２の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程
を含む、前記方法。
【請求項７】
免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットであって、
前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基が、標的物質と結合する抗原又は抗体と共有結合を形成可能な官能基である、あるいは標的物質と共有結合を形成可能な官能基である、請求項１の物質固定化用担体
を含む、前記キット。
【請求項８】
免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットであって、
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、請求項２の物質固定化担体
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫アッセイでの利用に適した物質固定化用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定法の一種である酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、以下ＥＬＩＳＡ）は、創薬、診断、環境計測、食品を含む幅広い分野で利用されている。典型的なＥＬＩＳＡは、（１）抗体または抗原の固定化（固相化）、（２）標的物質の結合、（３）酵素標識抗体の結合、（４）酵素反応、（５）光学的検出（吸光、蛍光、発光）、の５つの工程からなる。標識用酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどが用いられる。ＥＬＩＳＡは数ある免疫測定法のなかでも特に感度が高いと言われているが、実際には固相担体へのタンパク質の非特異吸着が原因で期待する感度が得られないことも多い。特に酵素標識抗体のような複合体は固相担体に非特異的に吸着しやすく、これがＥＬＩＳＡにおける非特異シグナルの原因の１つとなっている。このような非特異吸着を防ぐためにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるブロッキング処理が試みられるが、その効果は限定的である。そこで、タンパク質の非特異吸着を効果的に防ぐポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ）の利用が検討されている。
【０００３】
特許文献１には、ＰＥＧ鎖を介して抗体を金表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、金表面に非イオン性官能基を導入し、ここにヘテロ二官能性ＰＥＧの片末端を連結し、別の末端にタンパク質を結合させる。これによって表面プラズモン共鳴法におけるバックグラウンドノイズが有意に低減されることが記載されている。
【０００４】
特許文献２には、ＰＥＧ鎖を介しタンパク質をガラス表面に固定化する方法が開示されている。具体的には、ＰＥＧ鎖を有するシラン化合物を合成し、これをガラス表面に適用した後、ＰＥＧ鎖の末端にタンパク質を結合させる。これによってバイオチップのＳ／Ｎ比（感度）が改善されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−１６４３４８号公報
【特許文献２】特開２００６−１４３７１５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体は、タンパク質の固定化効率が低いという課題があった。高濃度（１ｍｇ／ｍｌ以上）のタンパク質を用いることによってある程度改善されるが、貴重なタンパク質では現実的な方法とは言えない。
【０００７】
本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、低濃度のタンパク質でも高い密度で固定化することのできるＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、物質固定化用担体に含まれるＰＥＧ鎖の数平均分子量が数平均分子量が１７６以上１０３２以下という範囲にある場合に、低濃度のタンパク質でも高密度に固定化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と
を少なくとも含む物質固定化用担体であって、
前記親水性ポリマー層が、
数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖と、
被固定化物質と共有結合を形成可能な、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と
を含む、物質固定化用担体。
（２）支持体と、
前記支持体の表面に配置された親水性ポリマー層と、
被固定化物質と
を少なくとも含む物質固定化担体であって、
前記親水性ポリマー層が、数平均分子量が１７６以上１０３２以下であるポリエチレングリコール鎖を含み、
前記ポリエチレングリコール鎖と前記被固定化物質とが、共有結合を介して連結されている、物質固定化担体。
（３）（２）の物質固定化担体の製造方法であって、
（１）の物質固定化用担体と、前記被固定化物質を溶解した溶液とを接触させる、物質固定化工程
を含む方法。
（４）前記溶液が、イオン強度が０．１００以下である水溶液に、前記被固定化物質を溶解して調製された溶液である、（３）の方法。
（５）前記物質固定化工程後に、前記物質固定化担体と、前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基と共有結合を形成可能な官能基および更なる親水性基を有する低分子化合物とを接触させる工程を更に含む、（３）又は（４）の方法。
（６）免疫アッセイにより標的物質を測定する方法であって、
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、（２）の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程
を含む、前記方法。
（７）免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットであって、
前記ポリエチレングリコール鎖に連結された官能基が、標的物質と結合する抗原又は抗体と共有結合を形成可能な官能基である、あるいは標的物質と共有結合を形成可能な官能基である、（１）の物質固定化用担体
を含む、前記キット。
（８）免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットであって、
前記被固定化物質が標的物質と結合する抗原又は抗体である、あるいは標的物質である、（２）の物質固定化担体
を含む、前記キット。
【発明の効果】
【０００９】
低濃度のタンパク質であっても高密度に固定化できるＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の物質固定化用担体の一実施形態を示す模式図である。
【図２】本発明の物質固定化用担体の製造方法を示す化学反応式である。
【図３】ＩｇＧ抗体溶解液のリン酸濃度とＩｇＧ抗体固定化量の関係である。
【図４】ＩｇＧ抗体溶解液の塩濃度とＩｇＧ抗体固定化量の関係である。
【図５】ＩｇＧ抗体濃度とＩｇＧ抗体固定化量の関係である。
【図６】リゾチーム溶解液のリン酸濃度とリゾチーム固定化量の関係である。
【図７】リゾチーム溶解液の塩濃度とリゾチーム固定化量の関係である。
【図８】リゾチーム濃度とリゾチーム固定化量の関係である。
【図９】抗リゾチーム抗体を定量するための検量線である（間接ＥＬＩＳＡ）。
【図１０】ＩＬ−１βを定量するための検量線である（サンドイッチＥＬＩＳＡ）。
【図１１】本発明の物質固定化用担体の製造方法の一例の概略である。
【図１２】本発明の物質固定化用担体の実施形態の一例である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（支持体）
本発明における支持体の材料及び形状は、免疫アッセイにおける固相の支持体として利用可能な材料及び形状であれば特に限定されない。支持体の材料としてはプラスチック、ガラス、石英、シリコン、金属等が挙げられる。プラスチックは成型が容易であること、輸送及び廃棄における問題が小さいことから免疫アッセイ用担体の支持体の材料として特に好ましい。すなわち本発明において好ましい支持体は、その全部又は少なくとも一部にプラスチックを含む。支持体の、後述する親水性ポリマー層が形成される側の表面がプラスチックを含むことが好ましく、該表面がプラスチックからなることがより好ましい。プラスチックの具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。予め支持体表面にプラズマ処理やコロナ処理などの親水化処理が施されていてもよい。支持体は、免疫アッセイにおける固相として利用可能な表面を有している支持体であればよく、全体の形状は特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は有用である。
【００１２】
（親水性ポリマー層）
支持体の表面には、親水性ポリマー層が配置される。親水性ポリマー層はポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）を少なくとも含む。「ポリエチレングリコール鎖（又はＰＥＧ鎖）」とは次式：
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。驚くべきことに、親水性ポリマー層におけるＰＥＧ鎖の数平均分子量が免疫アッセイの感度に影響を与える。十分に高感度の免疫アッセイを行うためにはＰＥＧ鎖の数平均分子量は１７６以上（ｍが４以上）であることが好ましく、より好ましくは３６２以上である。ＰＥＧ鎖の数平均分子量が上記の下限よりも小さい場合には実施例で確認されている通り十分な感度が達成できない場合がある。ＰＥＧ鎖の数平均分子量は１０３２以下であることが好ましく、６１２以下であることがより好ましい。ＰＥＧの数平均分子量が上記の上限を上回る場合には、実施例で確認されている通り十分な固定化密度を達成できない場合がある。ここで、ＰＥＧ鎖の数平均分子量は、原料として用いられるＰＥＧ又は担体から解離させたＰＥＧ：
ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−Ｈ
（ｍは重合度を示す正の整数である）
の数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＰＥＧ数平均分子量は蒸気圧浸透圧法または膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
【００１３】
固定化前の物質固定化用担体におけるＰＥＧ鎖の一端には、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基が直接的又は間接的に連結されていることが好ましい。このような官能基としては、被固定化物質と共有結合を形成することが可能な、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＰＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＰＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＰＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。被固定化物質との反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基が好ましい。これらの官能基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。
【００１４】
親水性ポリマー層には官能基が付加されていないＰＥＧ鎖や、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００１５】
（親水性ポリマー層の形成方法）
支持体の、免疫アッセイにおける固相として利用される位置の表面に親水性ポリマー層が形成される。親水性ポリマー層は、支持体表面に化学的又は物理的に固定された官能基との共有結合により支持体に固定化される。
【００１６】
本発明の物質固定化担体は、図１１に概略を示すとおり、プライマー層又はカップリング剤を用いて支持体の表面に官能基を導入する工程Ｓ１１０１と、前記官能基にＰＥＧ鎖を連結させる工程Ｓ１１０２と、ＰＥＧ鎖末端へ官能基を連結する工程Ｓ１１０３とを含む方法により製造することができる。
【００１７】
（プライマー層による官能基の導入）
支持体が表面にプラスチックを含む支持体である場合、該表面にはプライマー層が形成され、該プライマー層の表面に親水性ポリマー層が形成されていることが好ましい。このとき、プライマー層のポリシロキサンの側鎖上の官能基が、ＰＥＧ鎖末端と共有結合を形成する。この場合の、本発明の物質固定化用担体の実施形態の概要を、図１２を参照して説明する。
【００１８】
物質固定化用担体１２０は、表面Ｓにプラスチックを含む支持体１２１と、表面Ｓ上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層１２２と、プライマー層１２２上に配置された、ＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層１２３とを備える。
【００１９】
親水性ポリマー層１２３のＰＥＧ鎖−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−はプライマー層１２２を構成するポリシロキサンの側鎖Ａと共有結合を介して連結されている。ここで側鎖Ａは、後述する式１のシラノール化合物が有する、Ｒ１に由来する基であり、Ｒ１上の官能基又は該官能基から誘導された官能基がＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基と共有結合を形成して形成された二価の基を指す。ケイ素原子に結合する基Ｘは式１のシラノール化合物のＲ１（ｐ＝２の場合）、Ｒ２（ｐ＋ｑ＝３の場合）、又はヒドロキシル基（ｑ＝３の場合）に由来する基である。プライマー層１２２中のポリシロキサンは直鎖状であってもよいし、分岐鎖状又は網目状の構造を有していてもよいが、好ましくは分岐鎖状又は網目状の構造を有する。ポリシロキサンが分岐鎖状又は網目状の構造を有するとき、Ｘは、他の繰り返し単位（図示していない）のケイ素原子と結合する架橋基である。架橋基としてのＸとしては、式１のシラノール化合物のヒドロキシル基に由来するエーテル基（−Ｏ−）が挙げられる。ポリシロキサンが直鎖状の構造を有するとき、Ｘは、式１に定義するＲ１又はＲ２、未反応のヒドロキシル基、加水分解されずに残存した式２に定義する基Ｙ等の一価の基である。ＰＥＧ鎖の両端のうち、ポリシロキサンと連結されていない側の端部には、被固定化物質と共有結合を形成可能な官能基Ｒ３が、直接的に、或いは必要に応じてリンカーを介して間接的に連結されていることが好ましい。図１２においてＱは結合、又はリンカーを示す。
【００２０】
図１２に示す本実施形態において、支持体１２１は、少なくとも表面Ｓにプラスチックを含む。ポリシロキサンを含むプライマー層１２２は支持体１２１の表面Ｓに物理吸着により結合することができる。物理吸着はファンデルワールス力または疎水性相互作用により生じると考えられる。プライマー層１２２と支持体１２１の表面Ｓとの間には共有結合等の化学結合が形成される必要はないため、表面Ｓがポリスチレン等の、反応性官能基を含まないプラスチックからなる場合であっても、プライマー層１２２を結合させることができる。
【００２１】
プライマー層は、少なくともポリシロキサンを含む層により形成することができる。ここで、ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーであり、シラノール化合物の縮合重合によって得ることができる。シラノール化合物の縮合はシラノール化合物の分子間で起こる反応である。支持体表面のプラスチック分子が反応性の官能基を有してない場合には、シラノール化合物と支持体表面のプラスチック分子との間では反応は起こらない。すなわち、シラノール化合物及び形成されたポリシロキサンは支持体表面のプラスチック分子とは化学的に反応せずに、単に物理的に吸着しているだけである。この点は、ガラスを支持体とする場合とは大きく異なる。このようなシラノール化合物のプラスチック表面への物理吸着力は、モノマーでは極めて弱いが、ある程度縮合が進み、ポリマー（ポリシロキサン）となれば強くなる。シラノール化合物を適度に縮合することによって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が形成される。
【００２２】
（シラノール化合物）
本発明で用いられるシラノール化合物は、シラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）に加えて、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有する。この有機基はポリシロキサンの側鎖となる。シラノール化合物は典型的には式１で表される構造を有する：
【化１】
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【００２３】
（ｐは１又は２であり、ｑは２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４であり、Ｒ１は、独立に、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基であり、Ｒ２はケイ素原子に直結した炭素原子を含む有機基である）。ｐ＝１かつｑ＝２又は３であることが好ましく、ｐ＝１かつｑ＝３であることがより好ましい。ｐ＋ｑ＝４である場合、Ｒ２は存在しない。
【００２４】
Ｒ１は、好ましくは、水素原子が、１つ以上（好ましくは１つ）の官能基により、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換されている、炭素数が１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０、特に好ましくは１〜６の炭化水素基である（ただし、前記炭化水素基の全部又は一部がビニル基である場合のように、前記炭化水素基自体が官能基である場合は官能基により置換されている必要はない）。前記炭化水素基は、直鎖又は分岐鎖或いは環構造を有する、飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基（アルキル基、炭素数２以上のアルケニル基、又は炭素数２以上のアルキニル基）であってもよいし、単環又は多環の炭素数６以上の芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記脂肪族炭化水素基によって置換された前記芳香族炭化水素基であってもよいし、１つ以上の前記芳香族炭化水素基によって置換され前記脂肪族炭化水素基であってもよい。前記炭化水素基では、炭素−炭素結合が、１又は２個の、酸素、窒素及び硫黄から選択される同一又は異なる原子により中断されていてもよい。炭化水素基の例としては好ましくはプロピル基、エチル基が挙げられる。
【００２５】
Ｒ１における、前記炭化水素基の１つ以上の水素を、必要に応じて適当なリンカー構造を介して、置換する官能基としては、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基、又はＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換可能な官能基であれば特に限定されないが、典型的には、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基、イソシアネート基、マレイミド基等が挙げられ、なかでも、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。グリシジル基又はエポキシ基は、それ自体がＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成可能であるが、特開２００９−１５６８６４号公報に記載されている方法に従って、グリシジル基又はエポキシ基をアルデヒド基に変換し、形成されたアルデヒド基と、ＰＥＧが有するヒドロキシル基とを反応させてもよい。これらの官能基は、前記炭化水素基の水素原子を直接置換してもよいし、適切なリンカー構造を介して置換してもよい。リンカー構造としては、例えば炭素の数が０〜３個、窒素、酸素及び硫黄から選択される同一又は異なるヘテロ原子の数が０〜３個である二価の基が挙げられ、例えば、炭化水素基が左側に、官能基が右側にそれぞれ結合するとしたとき、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）Ｓ−、−Ｓ（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−、−（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−（Ｎ＝Ｃ＝Ｎ）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｏ−Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、−（Ｏ＝Ｓ＝Ｏ）−で表される構造が挙げられる。
【００２６】
Ｒ１の特に好ましい態様としては３−グリシドキシプロピル基、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル)エチル基が挙げられる。
【００２７】
Ｒ２は、好ましくは、置換基により置換されていないという点を除いてＲ１について上述したものと同様の（ただしＲ１とは独立して選択される）炭化水素基であり、なかでも、炭素数が１〜６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が好ましく、メチル基又はエチル基が特に好ましい。
【００２８】
（加水分解によりシラノール化合物を生成するケイ素化合物）
前記シラノール化合物は、加水分解によりシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）を生成可能な基を有するケイ素化合物を、加水分解することにより生成することができる。このようなケイ素化合物は式２で表される構造を有する：
【化２】
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（Ｙは、独立に、加水分解によりシラノール基を生成可能な基であり、ｐ、ｑ、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれシラノール化合物に関して定義したとおりである）。
【００２９】
Ｙとしては、アルコキシ基、ハロゲン原子、アリールオキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアルコキシ基、アルコキシ基又はアリールオキシ基により置換されたアリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基等が好ましい。Ｙとしては特に、炭素数１〜６のアルコキシ基（特にメトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基）、炭素数１〜６の、アルコキシ基により置換されたアルコキシ基（例えばメトキシエトキシ基）、炭素数１〜６のアルキルカルボニルオキシ基（例えばアセトキシ基）、塩素原子が好ましい。
【００３０】
式２のケイ素化合物としては、シランカップリング剤として市販されている化合物を好適に使用することができ、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン又は３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランが特に好ましい。
【００３１】
（プライマー層の形成方法）
ポリシロキサンを含むプライマー層は、支持体の表面上において式１のシラノール化合物を重合させる工程（プライマー層形成工程）を含む方法により形成可能である。該工程は、好ましくは、式２のケイ素化合物を以下のように加水分解し、式１のシラノール化合物を生成する工程と、生成したシラノール化合物と塩基とがアルコール中に溶解された溶液を前記支持体の表面上に接触させる工程とを含む。加水分解の条件は特に限定されないが、例えば次の方法が可能である。まず、式２のケイ素化合物に希塩酸を添加し、基Ｙを加水分解する。希塩酸のｐＨは２．０〜３．０に調整するのが望ましい。ケイ素化合物に対する水分子のモル比は２〜４とする。この操作によって基Ｙはシラノール基へ変換され、式１のシラノール化合物が生成する。
【００３２】
次いでシラノール化合物を支持体表面に適用し、縮合重合によりポリシロキサンを形成する。式１のシラノール化合物は、塩基とともにアルコールに溶解する。シラノール化合物の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。塩基はトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどを用いることができるが、これらに限定されない。塩基の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲で調整することが望ましい。アルコールはエタノール、２−プロパノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等を用いることができるが、これらに限定されない。このシラノール化合物溶液を支持体のプラスチック表面に接触させ、１０分〜２４時間放置する。反応温度は４〜８０℃の範囲で設定できるが、特に室温（２０〜２５℃）が好ましい。以上の操作によって、プラスチック表面にポリシロキサンを含むプライマー層が物理吸着によって形成される。プライマー層の被覆密度は、シラノールや塩基の濃度、あるいはシラノール溶液をプラスチック表面に接触させる時間によって制御可能である。プライマー層の被覆密度が高ければ高いほど、次の工程で共有結合させるＰＥＧ鎖の結合密度も高くなる。
【００３３】
形成されたポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を誘導体化して他の官能基に変換する場合には、プライマー層形成後に引き続き、ポリシロキサンの側鎖上のシラノール化合物からの官能基を、ＰＥＧのヒドロキシル基と反応して共有結合を形成することができる官能基に変換する誘導体化工程を行う。
【００３４】
（シランカップリング剤による官能基の導入）
支持体が表面にガラス、石英またはシリコンを含む支持体である場合、該表面に、シランカップリング剤の加水分解により生成される、ケイ素原子に直結した炭素原子を含み且つ官能基を有する有機基を有するシラノール化合物を結合させることにより、或いは、更に、必要に応じて該官能基をＰＥＧと共有結合を形成することができる他の官能基に変換する誘導体化により、支持体表面にＰＥＧと共有結合を形成することができる官能基を導入することができる。該官能基とＰＥＧの一端との反応によりシランカップリング剤と親水性ポリマー層のＰＥＧ鎖とを共有結合により連結することができる。
【００３５】
シラノール化合物としては、プライマー層に関して上述した式１のシラノール化合物と同様のものを使用することができる。
【００３６】
シランカップリング剤としては、プライマー層に関して上述した式２のケイ素化合物と同様のものを使用することができる。
【００３７】
この実施形態では、支持体表面に導入された、シラノール化合物又はシランカップリング剤に由来する有機基上の官能基又は該官能基から誘導された他の官能基がＰＥＧ末端のヒドロキシル基と共有結合を形成するために用いられる。
【００３８】
（親水性ポリマー層の形成）
プライマー層、シランカップリング剤等により官能基が導入された支持体表面に、ＰＥＧを反応させてＰＥＧ鎖を形成する（Ｓ１１０２）。このとき触媒量の濃硫酸を含むＰＥＧを接触させる。ここで、数平均分子量が１０００を超えるＰＥＧはあらかじめ加熱融解しておく。必要に応じて、ＰＥＧをｔｅｒｔ−ブチルアルコールなどで希釈して用いてもよい。このＰＥＧ溶液をプラスチック表面に接触させ、加熱する。加熱温度は６０〜９０℃の範囲で設定できるが、プラスチックの耐熱性を加味すると８０℃前後（７５℃〜８５℃）が好ましい。加熱時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定できるが、加熱温度が８０℃前後の場合は３０〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、プライマー層にＰＥＧ鎖が共有結合する。このとき、ＰＥＧ鎖の結合密度はプライマー層の被覆密度に依存する。
【００３９】
最後に、ＰＥＧ鎖の一端に、被固定化物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる（Ｓ１１０３）。官能基の導入方法は特に限定されない。(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基及びスクシンイミジルオキシカルボニル基を、ＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として導入する方法の好ましい実施形態は次の通りである。一端がプライマー層、シランカップリング剤等を介して支持体表面に固定されたＰＥＧ鎖の他端に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（以下ＣＤＩ）または炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（以下ＤＳＣ）を以下のように反応させる。
【００４０】
【化３】
2013205159.tif 000005
【００４１】
上記の反応は、水分をほとんど含まない有機溶媒中で実施される必要がある。一般にプラスチックは有機溶剤に対する耐性が低いため、支持体がプラスチックを含む場合には、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、又はこれらの有機溶媒を適当な割合で混合した混合溶媒を利用することが好ましい。これらの有機溶剤の水分含有率は０．１％以下であることが望ましい。ＣＤＩまたはＤＳＣの終濃度は０．０１〜１Ｍの範囲で設定できるが、室温以下で反応させる場合は０．１Ｍ以上であることが望ましい。支持体がプラスチックを含む場合には、プラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分間〜２４時間の範囲で設定することが好ましく、ＣＤＩ濃度が０．５Ｍ前後（０．４〜０．６Ｍ）のときは２０分間〜６０分間が好ましい。以上の操作によって、官能基が共有結合されたＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層が形成される。
【００４２】
（被固定化物質）
本発明の物質固定化用担体には、目的に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。免疫アッセイに用いるための本発明の物質固定化用担体および物質固定化担体では、「被固定化物質」が、「標的物質と結合する抗原又は抗体」又は「標的物質」であることが好ましい。
【００４３】
後述するサンドイッチ法又は直接競合法による免疫アッセイに用いるための本発明の物質固定化用担体では、被固定化物質として「標的物質と結合する抗原又は抗体」が固定化される。この実施形態において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。
【００４４】
後述する間接競合法による免疫アッセイに用いるための本発明の物質固定化用担体では、被固定化物質として「標的物質」が固定化される。この実施形態において固定化される標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。
【００４５】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（DNA、RNA）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００４６】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。
【００４７】
被固定化物質は、ＰＥＧ鎖が有する官能基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシド、２級アミン、３級アミン、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、ＰＥＧ鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００４８】
（被固定化物質の固定化）
被固定化物質は例えば以下のように固定化される。まず、被固定化物質を適宜ｐＨ調整された水溶液に溶解する。このとき、アミノ基成分を含まない水溶液を用いることが好ましい。ｐＨ調整された水溶液としては緩衝液が好ましい。緩衝液の具体例としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液などが挙げられる。これらは被固定化物質の種類によって適宜撰択される。被固定化物質を溶解する前の状態での水溶液のイオン強度は０．１００以下であることが望ましい。イオン強度が０．１００を超える場合、詳細なメカニズムは不明であるが、タンパク質の固相化が阻害される場合がある。被固定化物質を溶解するための水溶液の、より好ましいイオン強度は、被固定化物質の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、被固定化物質が抗体である場合には、被固定化物質を溶解するための水溶液のイオン強度は０．０６０以下であることが好ましく、０．０５０以下であることが特に好ましい。被固定化物質が抗体以外のタンパク質である場合には、被固定化物質を溶解するための水溶液のイオン強度は０．１００以下であることが好ましく、０．０７０以下であることがより好ましく、０．０２０以下であることが特に好ましい。
【００４９】
ここで、イオン強度は次式：
【数１】
2013205159.tif 000006
（ｍ１〜ｎは水溶液中に存在する各イオンのモル濃度、ｚ１〜ｎは各イオンの電荷量を表す正または負の整数）
で求められる物理量である。例えば、０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液の場合は、主要イオン種がＮａ＋とＣｌ−となるため、
【数２】
2013205159.tif 000007
となる。また、０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）の場合は、主要イオン種がＮａ＋とＨ２ＰＯ４−となるため、
【数３】
2013205159.tif 000008
となる。さらに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の場合は、主要イオン種がＮａ＋、Ｈ２ＰＯ４−、ＨＰＯ４２−の３種で、[Ｈ２ＰＯ４−]≒[ＨＰＯ４２−]と近似できるため、
【数４】
2013205159.tif 000009
となる。
【００５０】
被固定化物質を溶解するための水溶液は、典型的には、水溶性塩等の水溶性成分が水中に溶解された溶液である。当該水溶液としては、多くの場合、水溶性成分の濃度が１０ｍＭ前後の水溶液であれば問題なく用いることができる。適切な水溶液（好ましくは、適切なｐＨに調整された緩衝液）であれば、従来の１００分の１から１０００分の１の濃度でタンパク質を高密度に固定化することができる。例えば、被固定化物質がタンパク質である場合、前記イオン強度を有する水溶液に１ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌの濃度となるように前記タンパク質を溶解させた液を、本発明の物質固定化用担体に接触させることにより、十分な密度で前記タンパク質を固定化することが可能である。
【００５１】
水溶液中にトレハロースやスクロースなどの糖類、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０などの非イオン性界面活性剤が含まれていてもよく、これらの添加剤は被固定化物質の固定化を阻害しない。反応温度は４〜３７℃、接触時間は１分〜２４時間の範囲で適宜選択される。適切な条件下であれば、被固定化物質に含まれるアミノ基等の官能基がＰＥＧ鎖に連結された官能基と反応し、アミド結合、ウレタン結合等の共有結合が形成される。
【００５２】
所望の被固定化物質をＰＥＧ鎖に結合させた後は、ＰＥＧ鎖に連結された未反応の官能基を、該未反応の官能基と共有結合を形成可能な官能基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該官能基を反応性のより低い官能基に変換してもよい。これによって、免疫アッセイに関与する物質が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。前記低分子化合物が有する官能基としては、典型的にはアミノ基が挙げられる。この操作は、ＰＥＧ鎖に連結された官能基の反応性が高い場合に特に必要性が高い。ただし、官能基を前記低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異吸着を抑制する効果をもつからである。このためには、前記低分子化合物として、ＰＥＧ鎖に連結された官能基と結合を形成する官能基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。更なる親水性基としては水酸基が挙げられる。このような低分子化合物の例としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。これらの低分子化合物を水溶液として調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、所望の被固定化物質を固定化した基材と接触させる。低分子化合物の濃度は１〜１０００ｍＭ、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化するとよい。
【００５３】
（免疫アッセイ）
本発明はまた、本発明の物質固定化担体を用いて標的物質を測定する工程を含む免疫アッセイに関する。本発明において「標的物質を測定する」とは、測定対象試料中の標的物質の存在の有無、及び／又は、測定対象試料中の標的物質の量を測定することを指す。免疫アッセイは、具体的には、本発明の物質固定化担体と、測定対象試料とを、該担体上の被固定化物質に、該測定対象試料中の標的物質の量に相関した量の抗原又は抗体（ここで該抗原又は抗体とは、測定対象試料中の標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能標的物質、必要に応じて抗原抗体反応系に添加された検出可能抗原又は検出可能抗体等を指す）が抗原抗体反応により結合する条件において接触させる工程と、前記工程において被固定化物質に結合した抗原又は抗体を検出する工程とを含む。
【００５４】
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイは公知の方法で実施することができ、サンドイッチ方式、直接競合方式、間接競合方式等の任意の態様とすることができる。
【００５５】
サンドイッチ方式の免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、該被固定化物質と非競合的に標的物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。
【００５６】
サンドイッチ方式の免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質との抗原抗体反応を行う、一次反応工程と、
一次反応工程の後に、前記物質固定化担体と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体とを接触させ、被固定化物質に結合した標的物質と、前記検出可能抗原又は検出可能抗体との抗原抗体反応を行う、二次反応工程と、
二次反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程と
を少なくとも含む。
【００５７】
一次反応工程及び二次反応工程では、抗原抗体反応後に、担体に固定化されていない成分を洗浄除去する洗浄工程を適宜含む。
【００５８】
二次反応工程に用いられる「検出可能抗原又は検出可能抗体」は、被固定化物質と競合しない位置において標的物質と結合する。検出可能抗原又は検出可能抗体は、検出可能な標識物質と連結された標識抗原又は標識抗体（直接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよいし、検出可能な標識物質と、更なる反応によって連結されて標識されうる抗原又は抗体（間接的に検出可能な抗原又は抗体）であってもよい。後者の例としては、検出可能な標識物質と連結された二次抗体と結合可能な抗原又は抗体や、ビオチン−アビジン（又はビオチン−ストレプトアビジン）結合対の一方と連結された標識物質と結合可能な、前記結合対の他方と連結された抗原又は抗体等が挙げられる。
【００５９】
直接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質と結合する抗原又は抗体が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と競合的に前記被固定化物質と結合する、直接的又は間接的に検出可能な標的物質である、検出可能標的物質とが少なくとも用いられる。
【００６０】
直接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能標的物質と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応と、検出可能標的物質と前記被固定化物質との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、直接競合反応工程と、
直接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した検出可能標的物質を検出する、検出工程と
を少なくとも含む。
【００６１】
直接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能標的物質とを洗浄除去する工程が適宜含まれる。
【００６２】
直接競合方式による免疫アッセイにおいて、標的物質は抗原又は抗体であり、検出可能標的物質は対応する検出可能抗原又は検出可能抗体である。検出可能標的物質としては、測定対象試料中の標的物質とは独立して検出することができるものである限り、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体において、抗原又は抗体として標的物質が用いられたものが使用可能である。
【００６３】
間接競合方式による免疫アッセイでは、通常、標的物質が被固定化物質として固定化された物質固定化担体と、測定対象試料中の標的物質と被固定化物質とが競合的に結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体である、検出可能抗原又は検出可能抗体とが少なくとも用いられる。
【００６４】
間接競合方式による免疫アッセイは、典型的には、
測定対象試料と、検出可能抗原又は検出可能抗体と、前記物質固定化担体とを接触させ、測定対象試料中の標的物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応と、前記被固定化物質と前記検出可能抗原又は検出可能抗体との間の抗原抗体反応とを競合的に行う、間接競合反応工程と、
間接競合反応工程の後に、前記物質固定化担体に結合した前記検出可能抗原又は検出可能抗体を検出する、検出工程と
を少なくとも含む。
【００６５】
間接競合反応工程では、抗原抗体反応後に担体に結合していない標的物質と検出可能抗原又は検出可能抗体とを洗浄除去する工程が適宜含まれる。
【００６６】
検出可能抗原又は検出可能抗体としては、サンドイッチ法に関して上述した検出可能抗原又は検出可能抗体と同様のものが使用できる。
【００６７】
本発明の物質固定化担体を用いた免疫アッセイにおいて抗原又は抗体を検出する手段は特に限定されず、任意の標識物質により直接的又は間接的に標識された抗原又は抗体を用いることができる。標識物質としては、酵素（ＥＬＩＳＡ法）、核酸（イムノＰＣＲ）、電気化学発光物質（電気化学発光法）、蛍光物質、化学発光物質、放射性物質等の、増幅された検出シグナルを生成することができる標識物質が挙げられる。本発明の免疫アッセイは、安全性及び簡便性を考慮すると、標識物質として酵素を用いる、酵素活性に基づいて検出を行う酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であることが好ましい。標識物質として用いることができる酵素は特に限定されないが、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼが挙げられる。酵素活性による検出の方法としては、酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等を用いた検出方法が挙げられ、なかでも化学発光基質を用いた検出方法が好ましい。一般に、化学発光基質を用いた検出は発色基質を用いた検出よりも感度が高いため、酵素反応に要する時間を短縮することができる。特に、フェムトグラムのレベルの微量な標的物質の検出に使用される高感度な化学発光基質を用いれば、感度の点で相乗効果を得ることができる。このような化学発光基質としてはＥＣＬＴＭＡｄｖａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア）、ＥＣＬＴＭＰｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）、イムノスター（登録商標）ＬＤ（和光純薬）、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＣＳＰＤ（登録商標）（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）が挙げられ、そのための酵素としては西洋わさびペルオキシダーゼ等のペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。化学発光を検出するための検出器としては、発光プレートリーダーやＣＣＤイメージャーを用いることができる。これらの検出器はダイナミックレンジが広いという点でも都合がよい。すなわち、本発明の物質固定化担体と化学発光基質とを組み合わせれば、迅速かつ高感度でダイナミックレンジの広いＥＬＩＳＡを達成できる。
【００６８】
（免疫アッセイ用キット）
本発明の物質固定化用担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分としては、免疫アッセイの種類に応じて、被固定化物質に抗原抗体反応により結合した標的物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体や、被固定化物質と抗原抗体反応により結合する、直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体（直接的又は間接的に検出可能な標的物質を含む）が例示できる。更に、免疫アッセイに必要な成分としては、間接的な検出に用いるための、前記間接的に検出可能な抗原又は抗体と結合可能な標識物質や、検出用試薬（例えば標識物質が酵素である場合には酵素活性により化学発光する化学発光基質、酵素活性により発色する発色基質、酵素活性により化学蛍光を発する化学蛍光基質等）が挙げられる。「直接的又は間接的に検出可能な抗原又は抗体」及び「直接的又は間接的に検出可能な標的物質」は上記「免疫アッセイ」の欄にて説明したのと同様のものが使用できる。該キットは更に、被固定化物質（標的物質と結合する抗原又は抗体、或いは、標的物質であることができる）や、被固定化物質を物質固定化用担体に固定化するために用いられる試薬（例えば被固定化物質を溶解するための緩衝液等の水溶液や、当該水溶液を作成するための水溶性成分）を含んでもよい。
【００６９】
本発明の物質固定化担体は、免疫アッセイにより標的物質を測定するためのキットを構成することができる。該キットは更に免疫アッセイに必要な成分を含むことができる。免疫アッセイに必要な成分の具体例は上記の通りである。
【００７０】
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
【００７１】
［実施例１］
図１は物質固定化用担体に関する本発明の一実施形態を表す。ポリスチレン製９６穴マイクロプレート１１の表面にポリシロキサンを含むプライマー層１２が形成されている。プライマー層１２の側鎖にはＰＥＧ鎖１３の片末端が共有結合を介して連結されている。ＰＥＧ鎖１３の別の末端には（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）カルボニル基１４が連結されている。ＰＥＧ鎖の数平均分子量は１７６〜１０３２の範囲にある。
【００７２】
［実施例２］
図２は実施例１の担体の製造方法を表す。まず、１．６５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）に０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加し、続けて０．５ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。この溶液をポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、室温で１３５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ（関東化学）を各ウェルに１００μｌずつ分注し、８０℃で４５分間加熱した。その後、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。次に、脱水アセトニトリル（関東化学）と脱水ジメチルスルホキシド（関東化学）の等重量混合溶媒を用いて終濃度０．５ＭのＣＤＩ（東京化成）溶液を調製した。この溶液を各ウェルに４０μｌずつ分注し、室温で３０分間放置した。最後に、ウェル内を純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。
【００７３】
［実施例３］
担体に含まれるＰＥＧ鎖の数平均分子量とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、表１に示す数平均分子量を有する各種ＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を実施例２にしたがって作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液にＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を溶解し、５μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗体溶液を調製した。これを上記担体に分注し、室温で１０分間放置した。その後、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を分注し、室温で１０分間放置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含むリン酸緩衝液を分注し、室温で１０分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１０３２以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体であっても高密度に固定化できることがわかった（表１）。
【００７４】
【表１】
2013205159.tif 000010
【００７５】
［実施例４］
ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、様々な濃度（１．６〜２００ｍＭ）のリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）にＩｇＧ抗体を溶解し、５μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗体溶液を調製した。リン酸二水素ナトリウム水溶液の濃度とイオン強度の関係は表２に示した通りである。その後の操作は実施例３と同様に行なった。その結果、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度が０.０５０以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体であっても高密度に固定化できることがわかった（図３）。
【００７６】
【表２】
2013205159.tif 000011
【００７７】
［実施例５］
ＩｇＧ抗体溶液の塩濃度とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）に塩化ナトリウムを添加し、様々な塩濃度（０〜２００ｍＭ）の水溶液を調製した。これらにＩｇＧ抗体を溶解し、イオン強度の異なる様々なＩｇＧ抗体溶液（５μｇ／ｍｌ）を調製した。塩濃度とイオン強度の関係は表３に示した通りである。その後の操作は実施例３と同様に行なった。その結果、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度が０.０６０以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体であっても高密度に固定化できることがわかった（図４）。
【００７８】
【表３】
2013205159.tif 000012
【００７９】
［実施例６］
ＩｇＧ抗体の濃度とＩｇＧ抗体の固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）にＩｇＧ抗体を溶解し、様々な濃度（０．８〜１００μｇ／ｍｌ）のＩｇＧ抗体溶液を調製した。表３によれば、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度は０.０１０である。その後の操作は実施例３と同様に行なった。その結果、ＩｇＧ抗体溶液のイオン強度が０.０１０の場合は、約２０μｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ抗体の固定化密度が最大になることがわかった（図５）。
【００８０】
［実施例７］
リゾチーム溶液のイオン強度とリゾチームの固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、様々な濃度（１．６〜２００ｍＭ）のリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に卵白リゾチーム（和光純薬）を溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。リン酸緩衝液の濃度とイオン強度の関係は表４に示した通りである。これを上記担体に分注し、室温で１０分間放置した。次に、１μｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分注し、室温で１０分間放置した。その後、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を分注し、室温で１０分間放置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含むリン酸緩衝液を分注し、室温で１０分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、リゾチーム溶液のイオン強度が０.１００以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のリゾチームであっても高密度に固定化できることがわかった（図６）。
【００８１】
【表４】
2013205159.tif 000013
【００８２】
［実施例８］
リゾチーム溶液の塩濃度とリゾチームの固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に塩化ナトリウムを添加し、様々な塩濃度（０〜２００ｍＭ）の水溶液を調製した。これらにリゾチームを溶解し、イオン強度の異なる様々なリゾチーム溶液（５μｇ／ｍｌ）を調製した。塩濃度とイオン強度の関係は表５に示した通りである。その後の操作は実施例７と同様に行なった。その結果、リゾチーム溶液のイオン強度が０.０７０以下の場合に、低濃度（５μｇ／ｍｌ）のリゾチームであっても高密度に固定化できることがわかった（図７）。
【００８３】
【表５】
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【００８４】
［実施例９］
リゾチームの濃度とリゾチームの固定化量の関係を次のように求めた。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にリゾチームを溶解し、様々な濃度のリゾチーム溶液（０．８〜１００μｇ／ｍｌ）を調製した。表５によれば、リゾチーム溶液のイオン強度は０.０２０である。その後の操作は実施例７と同様に行なった。その結果、リゾチーム溶液のイオン強度が０.０２０以下の場合は、１μｇ／ｍｌの濃度でリゾチームの固定化密度が最大になることがわかった（図８）。
【００８５】
［実施例１０］
本発明の物質固定化用担体を用いて抗リゾチーム抗体の検出感度を以下のように求めた（間接ＥＬＩＳＡ）。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に卵白リゾチームを溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。表５によれば、リゾチーム溶液のイオン強度は０．０２０である。これを上記担体に分注し、室温で１０分間放置した（固相化）。次に、１Ｍの２−（２−アミノエトキシ）エタノール水溶液（ｐＨ９．６）を分注し、室温で１０分間放置した。その後、０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体を分注し、室温で６０分間放置した。次に、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を分注し、室温で３０分間放置した。０．０５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含むリン酸緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、抗リゾチーム抗体（Ａｎｔｉ−Ｌｙｚ）の検出感度は０．０６ｎｇ／ｍｌであった（図９）。
【００８６】
（比較例１）
実施例１０の比較例として、市販されているＥＬＩＳＡ用プレートを用いて抗リゾチーム抗体の検出感度を次のように求めた。まず、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に卵白リゾチームを溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。これを上記プレートに分注し、３７℃で３０分間放置した（固相化）。次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを分注し、室温で３０分間放置した（ブロッキング）。その後、０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体を分注し、室温で６０分間放置した。次に、１μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体を分注し、室温で３０分間放置した。０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、抗リゾチーム抗体の検出感度は３．９ｎｇ／ｍｌであった（図９）。すなわち、本発明の物質固定化用担体は市販品の約６５倍の検出感度を示した。
【００８７】
［実施例１１］
本発明におけるアミノ基を有する低分子化合物の効果を以下のように検証した。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖（原料ＰＥＧ４００）を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を作製した。次に、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液（ｐＨ４．４）に抗ＩＬ−１β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を溶解し、５μｇ／ｍｌの抗体溶液を調製した。表３によれば、抗体溶液のイオン強度は０．０１０である。これを上記担体に分注し、室温で３０分間放置した（固相化）。次に、１Ｍの２−（２−アミノエトキシ）エタノール水溶液（ｐＨ９．６）を分注し、室温で１０分間放置した。一方で、このような低分子化合物と接触させていない担体も用意した。その後、０〜２５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１β（和光純薬）を分注し、室温で６０分間放置した。次に、２μｇ／ｍｌのビオチン標識抗ＩＬ−１β抗体を分注し、室温で３０分間放置した。続いて、０．２５μｇ／ｍｌのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を分注し、室温で３０分間放置した。０．０５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００含むＰＢＳで担体を３回洗浄した後、発色基質ＳＡＴ−３と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で発色反応を停止し、吸光プレートリーダーを用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、２−（２−アミノエトキシ）エタノールと接触させたときのＩＬ−１βの検出感度は０．１５ｐｇ／ｍｌ、接触させなかったときの検出感度は１９．５ｐｇ／ｍｌであった（図１０）。すなわち、本発明の物質固定化担体は、２−（２−アミノエトキシ）エタノールと接触させることによって検出感度が著しく改善されることがわかった。
【００８８】
［実施例１２］
ＰＥＧ鎖の数平均分子量と抗リゾチーム抗体の検出感度の関係を以下のように求めた。なお、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１０３２を超えるものについてはＩｇＧ抗体を十分な密度で固定化できなかったので検討から除外した。まず、実施例２にしたがってＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体（９６穴マイクロプレート）を７種類作製した。ＰＥＧ鎖の原料および数平均分子量は表６に示した通りである。次に、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に卵白リゾチームを溶解し、５μｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を調製した。表５によれば、リゾチーム溶液のイオン強度は０．０２０である。その後の操作は実施例１０と同様に行なった。その結果、ＰＥＧ鎖の数平均分子量が１７６以上１０３２以下のときに高い検出感度（０．０３μｇ／ｍｌ）を示すことがわかった（表６）。
【００８９】
【表６】
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【符号の説明】
【００９０】
１０  ＰＥＧ鎖を含む物質固定化用担体
１１  ポリスチレンからなる支持体
１２  ポリシロキサンを含むプライマー層
１３  数平均分子量１７６〜１０３２のＰＥＧ鎖
１４  (１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基
１２０  物質固定化用担体
１２１  表面Ｓにプラスチックを含む支持体
１２２  表面Ｓ上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層
１２３  プライマー層上に配置された、ＰＥＧ鎖を含む親水性ポリマー層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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