(57)【要約】【課題】大腸菌に由来するβ-グルクロニダーゼとの親和性及び特異性が極めて高い、抗β-GUS抗体等を提供する。【解決手段】本発明に係る抗体は、β-グルクロニダーゼに対する抗体であって、抗原抗体反応を利用した抗原検出法（ELISA法や表面プラズモン共鳴法）に用いたときに100 ppbのβ-グルクロニダーゼを検出可能とする抗体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-グルクロニダーゼに対する抗体であって、抗原抗体反応を利用した抗原検出法に用いたときに100 ppbのβ-グルクロニダーゼを検出可能とするものである、前記抗体。
【請求項２】
抗原抗体反応を利用した抗原検出法が、表面プラズモン共鳴法及び／又はELISA法である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ダイレクトELISA法に用いたときに100 ppbのβ-グルクロニダーゼを検出可能とするものである、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１２〜１４で示されるアミノ酸配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１６〜１８で示されるアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１２〜１４で示されるアミノ酸配列であり、かつ、抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１６〜１８で示されるアミノ酸配列である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
抗体のＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１１で示されるアミノ酸配列である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
抗体のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１５で示されるアミノ酸配列である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体のＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１１で示されるアミノ酸配列であり、かつ、抗体のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１５で示されるアミノ酸配列である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
遺伝子組換え抗体が、キメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体に由来する抗体断片。
【請求項１４】
配列番号１２〜１４で示されるアミノ酸配列、及び／又は、配列番号１６〜１８で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１３記載の抗体断片。
【請求項１５】
配列番号１１で示されるアミノ酸配列、及び／又は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１３又は１４記載の抗体断片。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１７】
請求項１６記載のハイブリドーマを生体内又は生体外で培養し、その体液又は培養物から請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体を採取することを特徴とする、β-グルクロニダーゼに対する抗体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体、及び／又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片と、被験試料とを反応させて、当該試料中のβ-グルクロニダーゼを検出する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体、及び／又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片と、被験試料とを反応させて当該試料中のβ-グルクロニダーゼを検出し、得られた検出結果を指標として前記試料の大腸菌汚染度を評価する方法。
【請求項２０】
表面プラズモン共鳴法又はELISA法を利用して前記検出を行う、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
被験試料が、飲食品又はその原料若しくは中間原料である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
表面プラズモン共鳴法を利用したバイオセンサーに用いるセンサーチップであって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体、及び／又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片がチップ上に固定化されたものである、前記センサーチップ。
【請求項２３】
ELISA法に利用する抗体固定化プレートであって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体、及び／又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片がプレート上に固定化されたものである、前記抗体固定化プレート。
【請求項２４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片が標識化されてなる、標識化抗体又は抗体断片。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体、及び／又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片を含む、β-グルクロニダーゼ検出用キット。
【請求項２６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体、及び／又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗体断片を含む、大腸菌汚染度の評価用キット。
【請求項２７】
さらに、請求項２２記載のセンサーチップ、請求項２３記載の抗体固定化プレート及び請求項２４記載の標識化抗体又は抗体断片のうちの少なくとも１種を含む、請求項２５又は２６記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌において特異的に発現している酵素であるβ-グルクロニダーゼ（β-D-グルクロニダーゼともいう。以下、β-GUSと略することがある。）に対する抗体、その抗体断片、当該抗体を産生するハイブリドーマ、並びに当該抗体及び抗体断片の用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲料水はもとより、食品製造ライン及び食品の安全確保のためには、糞便汚染の指標細菌である大腸菌を確実に検出する必要がある。しかしながら、従来の培養法による検出法では、検出に24〜48時間を要する。食品業界においては、通常、自社製品の安全性を自主検査により確認し、安全性を確認した後に出荷を行うため、生産効率の向上及び保管費用の削減のために、迅速かつ高感度な微生物検出法の開発が望まれている。
【０００３】
β-D-グルクロニダーゼ（β-D-glucuronidase）は、大腸菌において特異的に発現される酵素であり、大腸菌全体の95％が本酵素を持っている（非特許文献１）。このため、本酵素を指標とした大腸菌の検出は広く受け入れられており、4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide等の本酵素の基質を添加した培地で試料を培養し、基質の分解産物を測定する検出法（非特許文献２）も開発されており、簡便化及び迅速化に役立っている。しかしながら、当該検出法は、酵素の基質特異性に依存する方法であるため、食品成分等によっては偽陰性の結果が出ることも憂慮されている（非特許文献３及び４）。このため、β-GUSそのものを検出するELISA法も開発されている。しかしながら、当該ELISA法を利用した場合でも、市販抗体を含む現状公知の抗体では、β-GUSの検出感度がまだ十分とはいえない。
【０００４】
ところで、近年、バイオセンサーを用いた微生物の迅速検査法が盛んに開発されている（非特許文献５及び６）。その一つである表面プラズモン共鳴法（Surface Plasmon Resonance；以下、SPR法と略することがある。）を利用したバイオセンサーは、センサーチップ上に抗体を固定化し、フローセルと呼ばれる微小な流路に測定試料を添加し、チップ上で生じた抗原抗体反応による重量変化を屈折率の変化として測定する光学系のバイオセンサーであり、試料を標識することなくリアルタイムかつ迅速に測定することができる。
【０００５】
ELISA法は、例えば抗体を固定化したプレートに抗原を添加し、1〜2時間静置して抗原と抗体とを反応させる静置系であるのに対して、SPR法では流速30μl/min程度の速度で緩衝液を流し、測定試料を添加するフロー系であり、試料添加時間も5〜10分程度である。このため、SPR法に使用する抗体は、親和性が特に高いものであることが必須となる。しかしながら、市販抗体は、抗原との反応性がELISA法の結果のみで保証されているに過ぎないものであるため、全ての抗体がSPR法で使用できるとは限らない。β-GUSに対する抗体についても例外ではなく、従来、フロー系であるSPR法において使用できる程度の高親和性のものはなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ram, J.L. et al., 2004. Sequence-based source tracking of Escherichia coli based on genetic diversity of beta-glucuronidase. J. Environ. Qual. 33, 1024-1032.
【非特許文献２】Venkateswaran, K. et al., 1996. Comparison of commercially available kits with standard methods for the detection of coliforms and Escherichia coli in foods. Appl. Environ. Microb. 62, 2236-2243.
【非特許文献３】Mariscal, A. et al., 1998. Interference by carbohydrate substrates, flavonoids, and monosaccharide derivatives on bacterial beta-D-glucuronidase assays. Arch. Environ. Con. Tox. 35, 588-593.
【非特許文献４】Fricker, C.R. et al., 2010. Understanding the cause of false negative beta-d-glucuronidase reactions in culture media containing fermentable carbohydrate. Lett. Appl. Microbiol. 50, 547-551.
【非特許文献５】Subramanian, A. et al., 2006. A mixed self-assembled monolayer-based surface plasmon immunosensor for detection of E. coli O157 : H7. Biosens. Bioelectron. 21, 998-1006.
【非特許文献６】Waswa, J.W. et al., 2006. Rapid detection of Salmonellaenteritidis and Escherichia coli using surface plasmon resonance biosensor. J. Food. Process. Eng.29, 373-385.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況下において、大腸菌に由来するβ-グルクロニダーゼ（抗原）との親和性及び特異性が高く、抗原抗体反応を利用した抗原検出法（例えばSPR法やELISA法等）において従来にない高感度な抗原検出を可能とする、抗β-グルクロニダーゼ抗体の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、β-グルクロニダーゼに対する抗体、当該抗体に由来する抗体断片、当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該抗体の製造方法、被験試料中のβ-グルクロニダーゼの検出方法及び検出用キット、被験試料の大腸菌汚染度の評価方法及び評価用キット、SPR法を利用したバイオセンサーに用いるセンサーチップ、ELISA法に利用する抗体固定化プレート等を提供するものである。
【０００９】
（１）β-グルクロニダーゼに対する抗体であって、抗原抗体反応を利用した抗原検出法に用いたときに100 ppbのβ-グルクロニダーゼを検出可能とするものである、前記抗体。
ここで、抗原抗体反応を利用した抗原検出法は、例えば、表面プラズモン共鳴法及び／又はELISA法が挙げられる。
【００１０】
上記(1)の抗体は、例えば、ダイレクトELISA法に用いたときに100 ppbのβ-グルクロニダーゼを検出可能とするものが挙げられる。
上記(1)の抗体は、例えば、モノクローナル抗体が挙げられる。
上記(1)の抗体は、例えば、抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１２〜１４で示されるアミノ酸配列であるもの、または、抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１６〜１８で示されるアミノ酸配列であるもの、あるいは、抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１２〜１４で示されるアミノ酸配列であり、かつ、抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１６〜１８で示されるアミノ酸配列であるものが挙げられる。
【００１１】
上記(1)の抗体は、例えば、抗体のＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１１で示されるアミノ酸配列であるもの、または、抗体のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であるもの、あるいは、抗体のＨ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１１で示されるアミノ酸配列であり、かつ、抗体のＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列が配列番号１５で示されるアミノ酸配列であるものが挙げられる。
上記(1)の抗体は、例えば、遺伝子組換え抗体であるものが挙げられ、具体的にはキメラ抗体、ヒト型化抗体又はヒト抗体が挙げられる。
【００１２】
（２）上記(1)の抗体に由来する抗体断片。
上記(2)の抗体断片は、例えば、配列番号１２〜１４で示されるアミノ酸配列、及び／又は、配列番号１６〜１８で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
上記(2)の抗体断片は、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列、及び／又は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
（３）上記(1)の抗体を産生するハイブリドーマ。
（４）上記(3)のハイブリドーマを生体内又は生体外で培養し、その体液又は培養物から上記(1)の抗体を採取することを特徴とする、β-グルクロニダーゼに対する抗体の製造方法。
【００１３】
（５）上記(1)の抗体、及び／又は上記(2)の抗体断片と、被験試料とを反応させて、当該試料中のβ-グルクロニダーゼを検出する方法。
（６）上記(1)の抗体、及び／又は上記(2)の抗体断片と、被験試料とを反応させて当該試料中のβ-グルクロニダーゼを検出し、得られた検出結果を指標として前記試料の大腸菌汚染度を評価する方法。
上記(5)及び(6)の方法は、例えば、表面プラズモン共鳴法又はELISA法を利用して前記検出を行う方法が挙げられる。
上記(5)及び(6)の方法は、例えば、被験試料が、飲食品又はその原料若しくは中間原料である方法が挙げられる。
【００１４】
（７）表面プラズモン共鳴法を利用したバイオセンサーに用いるセンサーチップであって、上記(1)の抗体、及び／又は上記(2)の抗体断片がチップ上に固定化されたものである、前記センサーチップ。
（８）ELISA法に利用する抗体固定化プレートであって、上記(1)の抗体、及び／又は上記(2)の抗体断片がプレート上に固定化されたものである、前記抗体固定化プレート。
（９）上記(1)の抗体、及び／又は上記(2)の抗体断片が標識化されてなる、標識化抗体又は抗体断片。
【００１５】
（１０）上記(1)の抗体、及び／又は上記(2)の抗体断片を含む、β-グルクロニダーゼ検出用キット。
（１１）上記(1)の抗体、及び／又は上記(2)の抗体断片を含む、大腸菌汚染度の評価用キット。
上記(10)及び(11)のキットは、例えば、さらに、上記(7)のセンサーチップ、上記(8)の抗体固定化プレート、及び上記(9)の標識化抗体又は抗体断片のうちの少なくとも１種を含むものが挙げられる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、大腸菌に由来するβ-グルクロニダーゼとの親和性及び特異性が極めて高い、抗β-グルクロニダーゼ抗体等を提供することができる。
本発明の抗体は、抗原抗体反応を利用した抗原検出法（例えばSPR法やELISA法等）において極めて高い感度でβ-グルクロニダーゼを検出することができ、特に飲食品の大腸菌汚染（糞便汚染）の有無を確実に判断することできる点で、極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本実施例で得られたクローン768、607及び21の各抗体の重鎖可変領域（H鎖V領域（VH））及び軽鎖可変領域（L鎖V領域（VL））のアミノ酸配列（推定アミノ酸配列）を示す図である。  各VH及びVLのアミノ酸配列中、CDR1配列は一重下線を付したアミノ酸配列、CDR2配列は二重下線を付したアミノ酸配列、CDR3配列は破線下線（点線下線）を付したアミノ酸配列である。  具体的には、クローン768のVHのアミノ酸配列中、CDR1は第59〜67番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR2は第108〜114番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR3は第134〜142番目のアミノ酸残基からなる配列であり、クローン768のVLのアミノ酸配列中、CDR1は第47〜53番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR2は第88〜92番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR3は第113〜119番目のアミノ酸残基からなる配列である。  また、クローン607のVHのアミノ酸配列中、CDR1は第62〜69番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR2は第111〜116番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR3は第137〜147番目のアミノ酸残基からなる配列であり、クローン607のVLのアミノ酸配列中、CDR1は第57〜68番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR2は第103〜107番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR3は第128〜134番目のアミノ酸残基からなる配列である。  また、クローン21のVHのアミノ酸配列中、CDR1は第43〜51番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR2は第92〜97番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR3は第118〜124番目のアミノ酸残基からなる配列であり、クローン21のVLのアミノ酸配列中、CDR1は第66〜74番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR2は第109〜112番目のアミノ酸残基からなる配列、CDR3は第133〜138番目のアミノ酸残基からなる配列である。
【００１８】
【図２−１】クローン21抗体のH鎖V領域のアミノ酸配列（全長；1〜169番目のアミノ酸）と、既知のアミノ酸配列との相同性を示した図である（相同性81％）。既知のアミノ酸配列は、後述する実施例１中の「結果及び考察」の4.項を参照（以下、図2-2〜2-6の説明中の「既知のアミノ酸」についても同様。）。
【図２−２】クローン21抗体のL鎖V領域のアミノ酸配列（一部；58〜209番目のアミノ酸）と、既知のアミノ酸配列との相同性を示した図である（相同性95％）。
【図２−３】クローン607抗体のH鎖V領域のアミノ酸配列（一部；35〜207番目のアミノ酸）と、既知のアミノ酸配列との相同性を示した図である（相同性81％）。
【図２−４】クローン607抗体のL鎖V領域のアミノ酸配列（一部；29〜206番目のアミノ酸）と、既知のアミノ酸配列との相同性を示した図である（相同性99％）。
【図２−５】クローン768抗体のH鎖V領域のアミノ酸配列（一部；36〜206番目のアミノ酸）と、既知のアミノ酸配列との相同性を示した図である（相同性80％）。
【図２−６】クローン768抗体のL鎖V領域のアミノ酸配列（一部；49〜201番目のアミノ酸）と、既知のアミノ酸配列との相同性を示した図である（相同性94％）。
【００１９】
【図３−１】クローン768、607及び21の各抗体のH鎖V領域のアミノ酸配列の相同性を示した図である。
【図３−２】クローン768、607及び21の各抗体のL鎖V領域のアミノ酸配列の相同性を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
なお、本明細書及び図面等においては、各々の抗体産生ハイブリドーマクローンにより産生される抗体を、「クローン抗体」又は単に「クローン」ということがある（例えば、「クローン607抗体」又は「クローン607」）。
【００２１】
１．本発明の概要
本発明者は、大腸菌β-D-グルクロニダーゼ（β-GUS）との親和性及び特異性が極めて高く、例えばSPR法を用いたバイオセンサーへの利用が可能な、マウス抗大腸菌β-GUSモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
具体的には、新規に作製した抗体（10種類）を、SPR法用のセンサーチップの金膜上に固定化し、種々の濃度の市販β-GUSを添加して、SPR法により抗原抗体反応を測定した結果、10種中7種のクローンにおいてSPRシグナルが有意に上昇した。特に、クローン21やクローン768を固定化したセンサーチップを用いた場合は、極めて感度が高くβ-GUS濃度が50 ppb以上での検出が可能であった。これに対して、ELISA法によるβ-GUSとの反応性が保証されている市販抗体5種をそれぞれ同様にSPR用センサーチップ金膜上に固定化し、種々の濃度の市販β-GUSを添加した結果、1種類の抗体のみSPRシグナルが有意に上昇したが、その検出感度はβ-GUS濃度が10〜100 ppmと低かった。新規に作製したモノクローナル抗体（特にクローン21及びクローン768）の大腸菌β-GUS検出感度は、従来の市販抗体の200〜1,000倍高い結果であった。
【００２２】
次に、種々の濃度のβ-GUSを固定化したマイクロプレートを用いたELISA (ダイレクトELISA)法により、各抗体の性能を評価した結果、前記10種中、クローン607が、固定化β-GUS濃度が100 ppb以上での検出が可能であった。残りの9種の抗体のβ-GUS検出感度は、クローン768が5 ppmであり、残り8種の抗体は5 ppmでも検出できなかった。また、サンドイッチELISA法により、各抗体の検出感度及び特異性を評価した結果、クローン21とクローン768との組合せは、β-GUS濃度が50 ppbで検出可能（固相化抗体及び標識化抗体の選択によっては10 ppbでも検出可能）で、極めて高感度であり、また類縁菌の菌体抽出物との交差反応性も示さなかった。これらの結果より、SPR法（SPR法を用いたバイオセンサー）及びサンドイッチELISA法を利用した抗原検出法において高感度かつ特異的に大腸菌β-GUSの検出が可能な抗体（特にクローン21とクローン768）、並びにダイレクトELISA法を利用した抗原検出法において高感度かつ特異的に大腸菌β-GUS の検出が可能な抗体（特にクローン607）が作製できたことが確認された。
【００２３】
さらに、上記クローン21、607及び768について抗体分子中の重鎖及び軽鎖並びにそれらの可変領域の解析を行った結果、これら抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は、すべて互いに異なっており、しかも既存のアミノ酸配列とはいずれも一致しなかった。
以上のことから、本発明者は、大腸菌β-GUSを高感度かつ特異的に検出するために有用な、新規な抗β-GUS抗体が作製できたことを確認し、本発明を完成した。
【００２４】
２．抗β-GUS抗体の作製
(１) 抗原の調製
大腸菌β-D-グルクロニダーゼ（β-GUS）のアミノ酸配列（配列番号２）の情報は、例えばNCBI（GenBank）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に「Accession number：NP 414878」として公表されている。なお、β-GUSのアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号１）の情報は、同ウェブサイトに「Accession number：NC 000913」として公表されている（但し、当該公表されている染色体のゲノム配列中の第362455番目〜第365529番目の塩基からなる塩基配列を、配列番号１として示す。）。
【００２５】
抗原としては、β-GUSのアミノ酸配列の全長、あるいは当該アミノ酸配列の少なくとも一部（全部又は一部）を含むポリペプチド又はペプチド（単にペプチドともいう）を使用することができる。ここで、抗原に用いるペプチドにつき、上記「アミノ酸配列の少なくとも一部」とは、長さは特に限定されるわけではない。
抗原とするペプチドの作製方法は、化学合成でも、大腸菌などを用いる遺伝子工学的手法による合成でもよく、当業者に周知の方法を用いることができる。もちろん、抗原となるβ-GUSとしては、市販のβ-GUSタンパク質を用いることもでき、必要に応じ適宜精製等して使用することができる。
【００２６】
ペプチドの化学合成を行う場合は、ペプチドの合成の周知方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：PSSM-8など）を使用してもよい。
ペプチドを遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするDNAを設計し合成する。当該設計及び合成は、例えば、全長β-GUS遺伝子を含むベクター等を鋳型とし、所望のDNA領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、PCR法により行うことができる。そして、上記DNAを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Sambrook J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。
【００２７】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（COS細胞、CHO細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、(ａ)培養上清、(ｂ)培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
【００２８】
培養後、目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりペプチドを抽出する。また、目的ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、目的のペプチドを単離精製することができる。
本発明においては、無細胞合成系を用いたin vitro翻訳により抗原となるペプチドを得ることもできる。この場合は、RNAを鋳型にする方法とDNAを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。無細胞合成系としては、市販のシステム、例えばExpresswayTM in vitroタンパク質合成システム（インビトロジェン社）、TNTシステム(登録商標)（プロメガ社）等を用いることができる。
【００２９】
上記のごとく得られた抗原ペプチドは、適当なキャリアタンパク質、例えば牛血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ヒトチログロブリン、ニワトリガンマグロブリン等に結合することも可能である。
また抗原は、β-GUSのアミノ酸配列（配列番号２）又は前述したその部分配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。例えば、β-GUSのアミノ酸配列又はその部分配列のうち１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜10個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が欠失しており、１又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば１個〜10個、さらに好ましくは１個〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されており、あるいは、１又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば１個〜10個、さらに好ましくは１個〜５個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドを使用することもできる。
【００３０】
本発明において、細胞等に導入するための遺伝子としては、β-GUSタンパク質若しくはその部分断片又はこれらの変異型のタンパク質又は断片をコードする遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその部分配列を有するものを使用することができる。
また、細胞等に導入するための遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つβ-GUS活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、又はその部分配列を使用することも可能である。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄時の条件であって、バッファーの塩（ナトリウム）濃度が10〜500mMであり、温度が42℃〜72℃、好ましくは、上記塩濃度が50〜300mMであり、温度が55〜68℃での条件をいう。
【００３１】
遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばGeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Prime STAR(登録商標) Mutagenesis Basal kit、Mutan(登録商標)-Super Express Km等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
【００３２】
(２) ポリクローナル抗体の作製
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物に投与する。哺乳動物は特に限定はされず、例えばラット、マウス及びウサギなどを挙げることができ、なかでもマウスが好ましい。
【００３３】
抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、足蹠、皮下、腹腔内等に注入することにより行うことができる。また、免疫の間隔については、特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１週間間隔で、１〜10回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から３〜７日後に、酵素免疫測定法（ELISA又はEIA）や放射性免疫測定法（RIA）等で抗体価を測定し、所望の抗体価を示した日に採血して、抗血清を得ることができる。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をELISA法などで測定する。
【００３４】
(３) モノクローナル抗体の作製
(3-1) 抗体産生細胞の採取
本発明の抗β-GUS抗体は、限定はされないが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
調製した抗原を、免疫のため哺乳動物、例えばラット、マウス及びウサギなどに投与する。抗原の動物一匹あたりの投与量は、アジュバントの有無により適宜設定することができる。アジュバントとしては上記と同様である。免疫手法も前記と同様である。そして、最終の免疫日から１〜60日後、好ましくは１〜14日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞及び末梢血細胞などが挙げられるが、なかでもリンパ節細胞及び脾臓細胞が好ましい。
【００３５】
(3-2) 細胞融合
ハイブリドーマ（抗体産生細胞株）を得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。用いる細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。
ミエローマ細胞としては、例えば、P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63-Ag8.U1(P3U1)、P3/NS I/1-Ag4-1(NS1) 及びSp2/0-Ag14(Sp2/0)等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。ミエローマ細胞の選択は、抗体産生細胞との適合性を適宜考慮して行うことができる。
【００３６】
次いで、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDMEM及びRPMI-1640培地などの動物細胞用培地中で、1×106〜1×107個／mLの抗体産生細胞と2×105〜2×106個／mLのミエローマ細胞とを混合する。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比（抗体産生細胞：ミエローマ細胞）は、限定はされないが、通常、１：１〜１０：１とすることが好ましく、より好ましくは３：１である。次に、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。細胞融合促進剤として、例えば、平均分子量1,000〜6,000ダルトン(D)のポリエチレングリコールなどを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００３７】
(3-3) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などに適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に播き、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、14日前後から生育してくる細胞をハイブリーマとして得ることができる。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、β-GUSに反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定はされない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、ELISA、EIA及びRIAなどによってスクリーニングすることができる。
【００３８】
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行うことができる。β-GUSに強い反応性を示す抗体をフローサイトメトリー等により判定し、これを産生するハイブリドーマを選択し、クローンとして樹立する。
【００３９】
(3-4) モノクローナル抗体の採取及び製造
樹立したハイブリドーマを生体外又は温血動物の生体内で培養し、得られる培養物又は体液からモノクローナル抗体を採取し製造する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。「培養」とは、具体的には、ハイブリドーマを培養皿又は培養ボトル中で生育させること、あるいはハイブリドーマを下記のように動物の腹腔内で増殖させることを意味する。
細胞培養法においては、ハイブリドーマを10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃、５％CO2濃度）で７〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。
腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１x107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、２〜３週間後に腹水を採取することが好ましい。
【００４０】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４１】
(3-5) β-GUSとの親和性及び特異性が高いクローンの選別
本発明の抗β-GUS抗体は、β-GUSとの親和性及び特異性が高い抗体であり、具体的には、抗原抗体反応を利用した抗原検出法に用いたときに100 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体である（要するに、β-GUSの検出限界濃度が100 ppbである。）。ここで、抗原抗体反応を利用した抗原検出法としては、限定はされず、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法に基づく公知の各種抗原検出法が挙げられるが、具体的には、表面プラズモン共鳴法及びELISA法が好ましい。また、ELISA法としては、限定はされず、サンドイッチELISA法（サンドイッチ法）、競合法、ダイレクトELISA法（直接吸着法）といった公知の手法が挙げられるが、中でもサンドイッチELISA法及びダイレクトELISA法が好ましい。
【００４２】
本発明の抗β-GUS抗体の好ましい態様としては、例えば、サンドイッチELISA法に用いたときに50 ppb（より好ましくは10 ppb）のβ-GUSを検出可能とする抗体、表面プラズモン共鳴法（SPR法）に用いたときに50 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体、又は、表面プラズモン共鳴法及びサンドイッチELISA法のいずれに用いたときにも50 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体が挙げられる。なお、サンドイッチELISA法に用いる場合は、プレートに固定化しておく一次抗体であってもよいし、標識化された二次抗体であってもよい。
同様に、本発明の抗β-GUS抗体の他の好ましい態様としては、例えば、ダイレクトELISA法に用いたときに100 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体が挙げられる。
【００４３】
表面プラズモン共鳴法（SPR法）及びELISA法（サンドイッチELISA法、ダイレクトELISA法）を用いて、所望の抗体のβ-GUSの検出限界濃度を測定及び確認することは、公知のSPR法及びELISA法における手法及び測定条件等を採用して行うことができるが、例えば、後述する実施例に記載のSPR法及びELISA法の手法及び測定条件等を採用して行うことができる。
本発明の抗β-GUS抗体の一態様（例えばクローン768）としては、例えば、H鎖V領域（VH）のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号４〜６で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、L鎖V領域（LH）のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号８〜１０で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該H鎖V領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列が好ましく、当該L鎖V領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７で示されるアミノ酸配列が好ましい。
【００４４】
また、本発明の抗β-GUS抗体の他の態様（例えばクローン607）としては、例えば、H鎖V領域（VH）のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１２〜１４で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、L鎖V領域（LH）のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号１６〜１８で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該H鎖V領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列が好ましく、当該L鎖V領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１５で示されるアミノ酸配列が好ましい。
【００４５】
同様に、本発明の抗β-GUS抗体の他の態様（例えばクローン21）としては、例えば、H鎖V領域（VH）のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２０〜２２で示されるアミノ酸配列であり、及び／又は、L鎖V領域（LH）のCDR1〜3のアミノ酸配列が、それぞれ順に、配列番号２４〜２６で示されるアミノ酸配列であるものが、好ましく挙げられる。当該H鎖V領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１９で示されるアミノ酸配列が好ましく、当該L鎖V領域のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２３で示されるアミノ酸配列が好ましい。
【００４６】
(3-6) 抗β-GUS抗体の特性
本発明の抗β-GUS抗体は、前述の通り、β-GUSとの親和性及び特異性が高い抗体であり、具体的には、抗原抗体反応を利用した抗原検出法に用いたときに100 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体であり、好ましくは、サンドイッチELISA法及び／又はSPR法に用いたときに50 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体（さらに好ましくは、サンドイッチELISA法に用いたときには10 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体）、あるいは、ダイレクトELISA法に用いたときに100 ppbのβ-GUSを検出可能とする抗体である。
【００４７】
さらに、本発明の抗β-GUS抗体は、解離定数（Kd値）が1.0×10-10 M以下であることが好ましく、より好ましくは1.0×10-11 M以下であり、さらに好ましくは1.0×10-12 M以下である。ここで、抗体の結合能（親和性）は、例えば、スキャッチャード解析やBiacoreと呼ばれる表面プラズモン共鳴センサーにより、解離定数(Kd値)、解離速度定数(Kdiss [1/Sec])、結合速度定数(Kass [1/M.Sec])として測定することができる。Biacore装置としては、例えばBiacore 3000、Biacore 2000、Biacore X、Biacore J、Biacore Q（いずれもBiacore社）などが挙げられる。抗体は、解離定数（Kd値）が小さい値であるほど結合能（親和性）が高いという点で好ましい。Kd値は、Kdiss及びKassの２つのパラメーターにより決定され、例えば、式：Kd[M]＝Kdiss/Kass により表すことができる。
【００４８】
(４) 遺伝子組換え抗体、及び抗体断片
(4-1) 遺伝子組換え抗体
本発明の抗β-GUS抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体 及びヒト抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、公知の遺伝子組換え技術によって構築できる。
【００４９】
ヒト型化抗体（ヒト化抗体ともいう）を作製する場合は、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（CDR）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（FR）はヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する（いわゆるCDRグラフティング（CDR移植））。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の一般的な作製法は、当分野において周知である（Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；特表平4-502408号公報（特許第2828340号公報；クイーンら）等を参照）。
【００５０】
ヒト抗体（完全ヒト化抗体ともいう）は、一般にV領域の抗原結合部位である超可変領域（Hyper Variable region）、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であってもよい。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖及びL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3), 427-431 等を参照）により取得することができる。
【００５１】
(4-2) 抗体断片
本発明の抗β-GUS抗体の断片（部分断片）も、本発明の抗体に含まれる。ここで、本発明の抗体断片は、本発明の抗β-GUS抗体と同様に、β-GUSに対する結合活性を有するもの（すなわちβ-GUSに結合し得るもの）である。
当該抗体の断片としては、抗β-GUSポリクローナル抗体又は抗β-GUSモノクローナル抗体の一部分の領域（すなわち、本発明の抗β-GUS抗体に由来する抗体断片）を意味し、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（H鎖、L鎖、H鎖V領域、及びL鎖V領域等）、scFv、diabody（scFv二量体）、dsFv（ジスルフィド安定化V領域）、並びに、相補性決定領域（complementarity determining region：CDR）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
【００５２】
Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFabをコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することもできる。
F(ab')2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、前述したFabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて、作製することもできる。
【００５３】
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。また、抗体のFab'断片をコードするDNAを、原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させ、Fab'を製造することもできる。
scFvは、１本のH鎖V領域（VH）と１本のL鎖V領域（VL）とを適当なペプチドリンカー（P）を用いて連結した、VH-P-VL又はVL-P-VHポリペプチドであり、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
【００５４】
diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片であって、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。diabodyは、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
dsFvは、VH及びVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、Reiterらにより示された方法（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。
【００５５】
例えば、CDRを含むペプチドは、VHのCDR（CDR1〜3）及びVLのCDR（CDR1〜3）の中の少なくとも１領域以上を含んで構成され、VHのCDRをすべて含むもの、及びVLのCDRをすべて含むものがより好ましく、VH及びVLのCDR（計6領域）をすべて含むものが特に好ましい。CDRのアミノ酸配列としては、例えば、前述した配列番号４〜６及び８〜１０に示されるアミノ酸配列（クローン768由来）、配列番号１２〜１４及び１６〜１８に示されるアミノ酸配列（クローン607由来）、並びに配列番号２０〜２２及び２４〜２６に示されるアミノ酸配列（クローン21由来）が好ましく挙げられる。複数のCDRを含むペプチドは、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体のVH及びVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００５６】
また、V領域を含むペプチドは、VH及びVLの中の少なくとも１領域以上を含んで構成され、VH及びVLを共に含むものが特に好ましい。VH及びVLのアミノ酸配列としては、例えば、前述した配列番号３及び７に示されるアミノ酸配列（クローン768由来）、配列番号１１及び１５に示されるアミノ酸配列（クローン607由来）、並びに配列番号１９及び２３に示されるアミノ酸配列（クローン21由来）が好ましく挙げられる。VH及びVLを共に含むペプチドは、VHとVLとを直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。V領域を含むペプチドは、抗体のVH及びVLをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、V領域を含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
以下、本明細書中の説明においては、上述した各種抗体断片も、本発明の抗β-GUS抗体に含まれるものとする。
【００５７】
３．β-GUSの検出方法、大腸菌汚染度の評価方法
本発明のβ-GUSの検出方法は、前記本発明の抗β-GUS抗体と、被験試料とを反応させて、当該試料中のβ-GUSを検出する方法である。より具体体には、前記反応により当該試料中のβ-GUSと反応した抗β-GUS抗体のシグナルを検出することにより、当該試料中のβ-GUSを検出することを特徴とする方法である。
ここで、上記抗体のシグナルは、被験試料中の抗原量（すなわちβ-GUS量）の指標となる。本発明の抗体を用いたβ-GUSの検出は、まず被験試料と本発明の抗体とを抗原抗体反応によって結合させる。次いで、結合した抗体量の測定結果に基づいて、被験試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。
【００５８】
当該測定は、例えば、公知の免疫学的手法を用いた測定法に従って行うことができ、限定はされず、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法、表面プラズモン共鳴法（SPR法）などを用いることができる。標識免疫測定法では、抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液の値を基準にして生体試料中の抗体シグナルを相対的に表してもよい。標識免疫測定法としては、例えばELISA法、EI法、RIA法、蛍光免疫測定(FIA)法、化学発光免疫測定法(Luminescence immunoassay)等が挙げられる。
【００５９】
なかでも、前記測定法としては、SPR法やELISA法が、簡便かつ高感度という点で好ましい。ここで、ELISA法としては、サンドイッチELISA法（サンドイッチ法）又はダイレクトELISA法（直接吸着法）を利用することが好ましい。両ELISA法を行う場合は、前記本発明の抗体又は抗体断片が標識物質を結合させること等により標識化された、標識化抗体又は抗体断片を用いる。抗体の標識物質は、限定はされないが、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等の既知の標識物質が採用できる。また、サンドイッチELISA法を行う場合は、前記本発明の抗体又は抗体断片がプレート上に固定化された、抗体固定化プレートを用いる。他方、SPR法を利用したバイオセンサーに用いる装置としては、限定はされないが、例えば、ビアコア社のBiacoa(登録商標)シリーズ（例えば、BIACORE J等）を好ましく用いることができる。SPR法で抗原（β-GUS）を検出する場合は、前記本発明の抗体又は抗体断片がチップ上に固定化されたセンサーチップを用いる。
【００６０】
前述したように、β-GUSは大腸菌において特異的に発現することが確認されているものであるため、当該検出方法は、被験試料における大腸菌の有無及び汚染度の評価の評価に好適に用いることができる。特に、糞便汚染等による大腸菌汚染が重要な検査事項となる飲食品分野では、その製造ラインにおける原料及び中間原料、並びに製造後の製品の安全性（すなわち大腸菌汚染の有無）を確実に把握することが最重要課題の一つである。当該課題を解決するものとして、本発明は、前記β-GUSの検出方法により得られた検出結果を指標として被験試料（例えば、飲食品又はその原料若しくは中間原料等）の大腸菌汚染度を評価する方法も提供することができる。ここで、大腸菌汚染度の評価基準は、特に限定はされず、β-GUSの検出結果（定量結果）に基づいて所定の基準値を適宜設定することもできるが、基本的には、大腸菌汚染が僅かでも有るか全く無いかという評価結果を、β-GUSが検出されたか全く検出されなかったかの２つの基準に基づいて判断することが好ましい。
【００６１】
４．各種キット
本発明の抗β-GUS抗体は、β-グルクロニダーゼ検出用キットや大腸菌汚染度の評価用キットの形態で提供することができる。本発明のキットは、抗β-GUS抗体を含むものであるが、その他に、標識物質、あるいは抗体又はその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物質とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物及び化学発光化合物等によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素のほか、本発明の検出方法等を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。また、各種バッファー、滅菌水、各種細胞培養容器、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、ブロッキング剤（Bovine Serum Albumin (BSA), Skim milk, Goat血清等の血清成分）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、アジ化ナトリウム等の防腐剤、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよい。さらに、本発明のキットは、前記３.項で述べたSPR法用のセンサーチップや、ELISA法に用いる抗体固定化プレート及び標識化抗体又は抗体断片などを含んでいてもよい。
【００６２】
本発明のキットは、前述した本発明にβ-GUSの検出方法や大腸菌汚染度の評価方法を行うために有効に用いることができるものであり、有用性が高いものである。
【００６３】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
＜材料及び方法＞
1. SPR 装置関連
SPRセンサー装置は、BIACORE J (GE Healthcare Japan Corp., Tokyo, Japan)を使用した。送液緩衝溶液には、HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA及び0.005% surfactant P-20；GE healthcare Japan) を使用し、測定温度は25℃に設定した。SPRセンサーチップは、Sensor chip CM 5 (GE Healthcare Japan)を使用した。
【００６５】
2. 市販抗体
i) ウサギ抗E. coliβ-GUS ポリクローナル抗体 7S (Nordic Immunological Laboratories, Tilburg, Nehtherland)
ii) ウサギ抗E. coli β-GUS ポリクローナル抗体 PAb (Nordic Immunological Laboratories)
iii) マウス抗E. coliβ-GUS モノクローナル抗体 (Biogenesis Inc., NJ, USA)
iv) ヤギ抗ヒトβ-GUS ポリクローナル抗体 N-17 (Santa Cruz Inc., CA, USA)
v) ヤギ抗マウスβ-GUS ポリクローナル抗体 M-16 (Santa Cruz Inc.)
【００６６】
3. 新規作製抗体
新規抗体は、市販β-Glucuronidase Type IX-A from Escherichia coli (β-GUS；Sigma-Aldrich Japan)をイオン交換クロマトグラフィーにより純度90％以上に精製したものを抗原として、BALB/cマウスを約2週間ごとに8回免疫した後、マウス脾臓をミエローマ細胞と融合させる常法により、抗体産生ハイブリドーマを作製した。抗原固相化ELISAにより、大腸菌β-GUSとの反応性が高い抗体生産ハイブリドーマのスクリーニングを行い、得られたハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングし、β-GUSとの反応性が高い10クローン、すなわちclone 21、401、607、768、792、1017、1317、1457、1569及び1680を樹立した。
【００６７】
4. SPRによる抗体のβ-GUS検出感度評価
4.1 抗β-GUS抗体の固定化
センサーチップCM5に対してアミンカップリング法により抗体の固定化を行った。BIACORE JにセンサーチップCM5をセットし、Fc1に対して30μL/minで、0.1 M N-ヒドロキシサクシニミド(NHS, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan)／0.4 M N-エチル-N’-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC, Sigma-Aldrich)等量混合液を12分間添加し、チップ上に導入されているカルボキシル基を活性化した。次に、10 mM 酢酸バッファー(pH 5.0, GE healthcare Japan)で希釈して調製した100μg/mLのそれぞれの抗体溶液を6分間で4回繰り返して添加し、固定化を行った。最後に1 Mエタノールアミン塩酸塩-NaOH(pH 8.5, Sigma-Aldrich Japan)を6分間添加し、未反応の活性化領域のブロッキングを行った。また、Fc2については、同様に活性化後、ブロッキングのみを行った。
【００６８】
4.2 市販β-GUSの検出
上記で作製したそれぞれのSPRセンサーチップに対して、0.001〜100μg/mLとなるようにβ-Glucuronidase Type IX-A from Escherichia coli (β-GUS, Sigma-Aldrich Japan)をHBS-EPで希釈し、Fc1、Fc2に対して30μL/minで2分間添加した。また、10 mM Glycine-HCl (pH 2.0)によって再生し、複数回測定を行った。試料添加前30秒目のSPRシグナルをベースラインとし、試料添加終了後60秒目のシグナルを固定化した抗体と添加した試料の相互作用によるシグナルとした。
【００６９】
5. ダイレクトELISAによる新規抗体のβ-GUS検出感度評価
C96 MAXISORP CERT. NUNC-IMMUNO PLATE (Thermo Fisher Scientific K.K., Yokohama, Japan)に、5 ppm、1 ppm、500 ppb及び100 ppbのβ-GUS溶液並びにPBS (137 mM NaCl, 8.1 mM NaHPO4, 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4 pH 7.4)を100μL添加し、室温で一晩静置した。溶液を捨て、360μL PBST (0.05% Tween 20 含PBS)で3回洗浄後(以下「洗浄」と表記)、ブロックエース（雪印乳業株式会社）溶液200μLを添加し、室温で2時間静置した。洗浄後、100μLの1μg/mLビオチン標識新規作製抗体溶液を添加し、室温で1.5時間静置した。洗浄後、1 : 2500 ECL Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate (GE healthcare Japan)溶液を100μL添加し、室温で1時間静置した。洗浄後、基質溶液を100μL添加し、遮光下、30分間静置した。静置後、Model 680 Microplate Reader (Bio-Rad Japan K.K, Tokyo, Japan)にて405 nmにおける吸光度を測定した。
【００７０】
6. サンドイッチELISAによる新規抗体のβ-GUS検出感度評価
C96 MAXISORP CERT. NUNC-IMMUNO PLATEに、10μg/mLの新規作製抗体(clone 21、401及び768)の抗体溶液を添加し、4℃にて一晩静置した。PBST 360μLで3回洗浄後、ブロックエース溶液200μLを添加し、室温で2時間静置した。洗浄後、種々の濃度のβ-GUS溶液を50μL添加し、室温で1時間静置した。洗浄後、10μg/mLビオチン標識化新規作製抗体の抗体溶液を50μL添加し、室温で1時間静置した。洗浄後、1 : 2500 ECL Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate溶液を50μL添加し、室温で1時間静置した後、洗浄した。基質溶液を50μL添加し、遮光下、30分反応させた後、Model 680 Microplate Readerにて405 nmにおける吸光度を測定した。
【００７１】
7. サンドイッチELISA による新規抗体の特異性評価
7-1. 細菌の菌体破砕液の調製
大腸菌群に属するEnterobacter aerogenes IFO 13534 (大阪発酵研究所より購入)、Klebsiella pneumoniae JCM 1162 (理化学研究所微生物系統保存施設より購入)、重要な食中毒細菌であるSalmonella Enteritidis IFO 3313 (大阪発酵研究所より購入)をtryptic soy broth (TSB; Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 5 mLに一白金耳接種し、37℃、130 rpmで一晩培養した。各々の培養液をマイクロチューブに1 mLずつ分注後、室温にて5000×gで5分間遠心し、上清を捨て、PBS 1 mLにて2回菌体の洗浄を行い、最終的にPBS 300μLに懸濁した。懸濁液をあらかじめ-20℃で冷却しておいたFastPROTEIN BLUE Kit (MP biomedicals LLC., OH, USA)に添加し、FastPrep-24 Instrument (MP biomedicals)にセットして振動速度4.0 m/s、20秒間ビーズ破砕処理を行った。菌体破砕後、-20℃に冷却しておいたPBS 700μLを添加し、4℃、15000×gで10分間遠心し、上清を回収した。
【００７２】
Escherichia coli IFO 3301 (大阪発酵研究所より購入)は、一白金耳をTSB 5 mLに接種、37℃、130 rpmで一晩培養後の培養液を100 CFU/mLとなるように20 mM メチル-β-D-グルクロニドナトリウム塩(MetGlu, Tront Research Chemicals Inc., ON, Canada)を添加したmTSB (Gluc-) (TSBの組成からグルコースを除き、これに0.1% ピルビン酸ナトリウム、0.1% L-アスパラギン、0.05% カザミノ酸及び0.1% yeast extractをそれぞれの終濃度となるように添加) 10 mLに接種し、44.5℃、100 rpmで12時間培養し、β-GUSを誘導した。この培養液1 mLから上記の方法にて、菌体を破砕し、β-GUSを含む大腸菌菌体破砕液を調製した。
【００７３】
7-2. サンドイッチELISA による新規作製抗体の評価
C96 MAXISORP CERT. NUNC-IMMUNO PLATEに、10μg/mLの新規作製抗体(clone 21、401及び768)の抗体溶液を添加し、4℃にて一晩静置した。PBST 360μLで3回洗浄後、ブロックエース溶液200μLを添加し、室温で2時間静置した。洗浄後、上記7-1.で調製した菌体破砕液をそれぞれ50μL添加し、室温で1時間静置した。洗浄後、10μg/mLビオチン標識化新規作製抗体の抗体溶液を50μL添加し、室温で1時間静置した。洗浄後、1 : 2500 ECL Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate溶液を50μL添加し、室温で1時間静置した。洗浄後、基質溶液を50μL添加し、遮光下、30分静置した。静置後、Model 680 マイクロプレートリーダーにて405 nmにおける吸光度を測定した。
【００７４】
8. clone 21、607及び768の重鎖及び軽鎖可変領域の解析
8-1. 5’ RACE法による可変領域の解析
clone 21、607及び768のハイブリドーマから、RNAiso plus (タカラバイオ株式会社)を用いて、total RNAを抽出し、DNase I処理を行い解析サンプルとした。次に、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (タカラバイオ)を用いて、各解析サンプルの5’RACE解析を行った。上記で調製したtotal RNAを鋳型にマウス抗体 (IgG)重鎖特異的なプライマー(5’-TCCAKAGTTCCA-3’)（配列番号27）を用いてcDNAの合成を行った。同様に、軽鎖特異的なプライマー(5’-GCTGTCCTGATC-3’)（配列番号28）によりcDNAを合成した。それぞれのcDNAを鋳型として、重鎖特異的なプライマーをリバースプライマーとし、上記Kit (タカラバイオ)に含まれるUniversal primer mix (UPM)をフォワードプライマーとして、RACE PCRを行った。得られたPCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により確認し、断片の大きさを確認後ゲルより精製し、クローニングプラスミドpMD20-Tにライゲーションした。ライゲーション反応物は常法により形質転換を行い、クローンを取得した。取得したクローンは、プラスミド領域の片側から塩基配列解析用プライマーを用いて解析した。シークエンス反応は、Big Dye Terminators v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI社)を使用し、付属プロトコルに従いABI13730 Sequencer (ABI社)により行った。得られた塩基配列は、SEQUENCHERTM (Gene Codes社)ソフトウエアにより、コンセンサス配列を取得した。
【００７５】
各クローン抗体の重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）のコンセンサス配列は、clone 768のVHが配列番号29、VLが配列番号30に示されるものであり、clone 607のVHが配列番号31、VLが配列番号32に示されるものであり、clone 21のVHが配列番号33、VLが配列番号34に示されるものである。
【００７６】
8-2. 相同性検索
上記で得たclone 21、607及び768の重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）の塩基配列について、blastx (GenBank, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)を用いて相同性検索を行い、推定されるアミノ酸配列を得た。
また、得られた推定アミノ酸配列（VH及びVL）のblastp検索を行い、それぞれのクローンと相同性の高い既知のアミノ酸配列（後述する「結果及び考察」の4.項を参照）を得た。
さらに、clone 21、607及び768の各々のVH及びVLのアミノ酸配列について、clustal Wソフトウエア(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) を用いて相同性の検索を行った。
【００７７】
＜結果及び考察＞
1. SPRによる抗体の評価
市販抗体について、ウサギ抗 E. coli β-GUSポリクローナル抗体 7S、ウサギ抗E. coliβ-GUSポリクローナル抗体 PAb、マウス抗E. coli β-GUSモノクローナル抗体、ヤギ抗ヒトβ-GUSポリクローナル抗体、ヤギ抗マウスβ-GUSポリクローナル抗体固定化チップについて検討したが、精製β-GUSが検出可能であったのは、ウサギ抗E. coli β-GUSポリクローナル抗体PAbのみであり、その検出下限は10〜100 ppmであった(表１)。この原因としては、抗体のβ-GUSとの親和性が弱く、フロー系では抗原と抗体が結合できなかったためであると考えられた。
【００７８】
【表１】
2013177336.tif 000002
【００７９】
一方、新規作製抗体については、clone 21, 50 ppb; clone 401, 1 ppm; clone 768, 50 ppb; clone 1317, 10 ppm; clone 1457, 10 ppm; clone 1569, 10 ppm; 1680, 1 ppmであった(表２)。検出下限が50 ppbであったclone 21及び768は、β-GUSとの親和性が特に強いと考えられた。clone 607、792及び1017については、100 ppmでも有効なシグナルが得られなかった。
【００８０】
【表２】
2013177336.tif 000003
【００８１】
2. ダイレクトELISAによる新規作製抗体の評価
下記表３に、ダイレクトELISAによる新規作製抗体の評価結果を示した。clone 607については、100 ppb以上で、clone 768に関しては、5 ppm以上で有為なシグナルを確認したが、その他のクローンでは5 ppm以上でも有為なシグナルの上昇は確認できなかった。一般に、ダイレクトELISAでは、抗原をプレートに固定化するために、抗体のエピトープを介して抗原がプレートに固定化されたため、その他のクローンでは抗原抗体反応が阻害されたと考えられた。
【００８２】
【表３】
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【００８３】
3. サンドイッチELISAによる新規作製抗体の評価
各測定値からブランク(PBS)の測定値を差し引いた値が0.1以上となった濃度、又は、複数回試験したものに対しては、Tukey-Kramer法を用いて検定を行い、危険率が5%以下となった濃度を検出下限とした。その結果を表4-1に示した。clone 401とclone 768の組み合わせ（clone 401-768）、及びclone 21とclone 768の組み合わせ（clone 21-768）の検出下限は10 ppbであり、clone 768とclone 21の組み合わせ（clone 768-21）の検出下限は50 ppbであった。ELISAに使用したプレートは、抗体がFc部位を介して固定化されるよう表面が修飾されており、効率的に抗原抗体反応がおこったために、ダイレクトELISAに比べ検出感度が向上したと考えられた。
【００８４】
【表４−１】
2013177336.tif 000005
【００８５】
次に、β-GUSを誘導した大腸菌、大腸菌群に属するKlebsiella pneumonia、Enterobacter aerogenes、及び食中毒細菌であるSalmonella Enteritidisの菌体破砕液との反応性をサンドイッチELISAにより評価した結果、どの抗体の組み合わせでもβ-GUSを誘導した大腸菌以外の菌体破砕液とは反応しないことが確認された。
【００８６】
【表４−２】
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【００８７】
4. clone 21、607及び768の重鎖及び軽鎖可変領域の解析、並びに相同性検索
clone 21、607及び768のそれぞれの重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）の推定アミノ酸配列を図1に示した（配列番号3, 7, 11, 15, 19, 23も参照）。また、当該推定アミノ酸配列について、blastpによる既知アミノ酸との相同性結果を図2-1〜2-6に示した。
【００８８】
まず、clone21について、VHは、免疫グロブリンVH（immunoglobulin heavy chain variable region）[Mus musculus] (GenBank: CAB76381.1)との相同性が高く、アミノ酸配列の一致率は138/171 (81%)であった(図2-1)。VLは、マウス抗ヒト ヴォン・ヴィレブランド因子A3ドメイン抗体(軽鎖)（Chain L, Crystal Structure And Paratope Determination Of 82d6a3, An Antithrombotic Antibody Directed Against The Von Willebrand Factor A3-Domain）(PDB: 2ADF L)との相同性が高く、アミノ酸配列の一致率は、145/152 (95%)であった(図2-2)。
次に、clone 607について、VHは、免疫グロブリン重鎖タンパク質（Igh protein）[Mus musculus] (GenBank: AAH18535.1)と相同性が高く、相同性が高い領域でのアミノ酸配列の一致率は、143/178 (79%)であった(図2-3)。VLは、抗ヒトCD19モノクローナル抗体 4G7 免疫グロブリンκ鎖（anti-human CD19 monoclonal antibody 4G7 immunoglobulin kappa light chain）[Mus musculus] (GenBank: CAD88204.1)との相同性が高く、相同性が高い領域での一致率は、176/178 (99%)であった(図2-4)。
【００８９】
さらに、clone 768について、VHは、免疫グロブリン重鎖タンパク質（Igh protein）[Mus musculus] (GenBank: AAH18535.1)との相同性が高く、アミノ酸配列の一致率は、141/176 (80％)であった(図2-5)。VLは、マウス抗SARSコロナウイルスレセプター結合ドメイン抗体(軽鎖)（Chain L, X-Ray Crystal Structure Of The Sars Coronavirus Spike Receptor Binding Domain In Complex With F26g19 Fab）(PDB: 3BGF L)との相同性が高く、アミノ酸配配列の一致率は、144/153 (94%)であった(図2-6)。
以上のことから、本実施例で作製した各クローン抗体の全ての重鎖及び軽鎖の可変領域は、既知の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列と相同性を示したが、完全には一致せず、作製した各抗体が新規のアミノ酸配列を有する抗体であることが確認された。
さらに、本実施例で作製した抗体のアミノ酸配列はいずれも互いに異なり(図3-1、3-2)、3種の新規な抗β-GUSモノクローナル抗体が作製できたことも確認された。
【００９０】
＜まとめ＞
新規な抗β-GUSモノクローナル抗体の作製を試みた結果、抗原である大腸菌β-GUSとの親和性及び特異性が極めて高い抗体を生産するハイブリドーマの樹立に成功した。clone 21及び768は、それぞれ単独でSPRに用いるとβ-GUS検出感度は、50 ppbであり、組合せてサンドイッチELISAに用いるとβ-GUS検出感度は50 ppbや10 ppbと高くなり、さらに類縁菌からの菌体抽出物とは反応しないことも確認された。clone 607は、バイオセンサーでの利用には不向きであったが、ダイレクトELISAでの検出感度が100 ppbであり、従来の抗体よりも検出感度が高かった。また、今回作製した3種のモノクローナル抗体の抗原認識部位のアミノ酸配列は、すべて新規の配列であることが確認された。以上のことから、これらの新規モノクローナル抗体を用いることにより、β-GUSを指標とした大腸菌の迅速、高感度かつ特異的な検出が可能であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明によれば、大腸菌β-GUSとの親和性及び特異性が極めて高い、抗β-GUS抗体等を提供することができる。本発明の抗体は、抗原抗体反応を利用した抗原検出法（例えばSPR法やELISA法等）において極めて高い感度でβ-GUSを検出することができ、特に飲食品の大腸菌汚染（糞便汚染）の有無を確実に判断することできる点で、極めて有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号２７：合成DNA
配列番号２８：合成DNA
【図１】
2013177336.tif 000007
【図２−１】
2013177336.tif 000008
【図２−２】
2013177336.tif 000009
【図２−３】
2013177336.tif 000010
【図２−４】
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【図２−５】
2013177336.tif 000012
【図２−６】
2013177336.tif 000013
【図３−１】
2013177336.tif 000014
【図３−２】
2013177336.tif 000015
【配列表】
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