(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト尿中トリプシンインヒビター（ｈＵＴＩ）と同等な生物学的活性を有するヒト尿中トリプシンインヒビターの組換えＦｃ融合タンパク質を提供する。【解決手段】ｈＵＴＩ、約２０個以下のアミノ酸の可動性ペプチドリンカー、およびヒトＩｇＧのＦｃまたはその変異体（ｖＦｃ）からなる組換えｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質および良好な発現レベルでの前記融合タンパク質を製造するための方法であって、ＩｇＧのＦｃ変異体は、好ましくは非溶解性であり、そして最小限の望ましくないＦｃにより媒介される副作用を示し、前記組換えｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、十分な生物学的活性および／または延ばされたもしくは延長された血清中半減期を示し、これにより改善された薬物動態および／または薬力学がもたらされることから、異なるまたはより少ない投与量を使用し得、および／またはより良好なまたは異なる治療効力を達成し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト尿中トリプシンインヒビター（ｈＵＴＩ）、ペプチドリンカー（Ｌ）およびヒトＩｇＧ Ｆｃを含むｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質であって、前記可動性ペプチドリンカーは、長さが約２０以下のアミノ酸を含み；そしてヒトＩｇＧ Ｆｃは、天然ＩｇＧ ＦｃおよびＦｃ変異体（ｖＦｃ）からなる群より選択される、前記ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項２】
ＩｇＧ Ｆｃ変異体が非溶解性であり、そして天然ＩｇＧ Ｆｃと比較してアミノ酸の突然変異を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項３】
ヒトＩｇＧ Ｆｃが、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ４からなる群より選択されたヒトＩｇＧのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、そしてＣＨ２ドメインが、２２８位、２３４位、２３５位および３３１位においてアミノ酸の突然変異を含む、請求項２の融合タンパク質。
【請求項４】
ＩｇＧ Ｆｃ変異体が、非溶解性であり；ヒトＩｇ Ｆｃが、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ４からなる群より選択されたヒトＩｇＧのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み；そしてＣＨ２ドメインが２２８位、２３４位、２３５位および３３１位においてアミノ酸の突然変異を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項５】
前記可動性ペプチドリンカーが、ｈＵＴＩとヒトＩｇＧ Ｆｃとの間に存在し、そして前記可動性ペプチドリンカーが、長さが２〜２０のアミノ酸を含む、請求項１の融合タンパク質。
【請求項６】
前記可動性ペプチドリンカーが、ｈＵＴＩとヒトＩｇＧ Ｆｃとの間に存在し、そして前記可動性ペプチドリンカーが、長さが２〜２０のアミノ酸を含み、そして前記アミノ酸が、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択される、請求項１の融合タンパク質。
【請求項７】
ヒト尿中トリプシンインヒビター（ｈＵＴＩ）、ペプチドリンカー（Ｌ）およびヒトＩｇＧ Ｆｃを含むｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質であって、前記可動性ペプチドリンカーは、ｈＵＴＩとヒトＩｇＧ Ｆｃとの間に存在し、そして長さが２〜２０のアミノ酸を含み、そしてグリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択され；Ｆｃは、天然ＩｇＧ Ｆｃと、非溶解性で天然ＩｇＧ Ｆｃと比較してアミノ酸の突然変異を含む変異体（ｖＦｃ）からなる群より選択され；ヒトＩｇ Ｆｃは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み；そしてヒトＩｇＧ Ｆｃは、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２、Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４、並びにＬｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１からなる群より選択される、前記ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項８】
ｈＵＴＩ、可動性ペプチドリンカー、並びにヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ Ｆｃを含む組換え融合タンパク質を製造するための方法であって、前記方法は、（ａ）ＣＨＯに由来する細胞株を生成する工程；（ｂ）組換え融合タンパク質が、２４時間の期間中に１００万（１０６）個の細胞あたり５０μgを超える量でその増殖培地中に発現および分泌される条件下で細胞株を増殖させる工程；そして（ｃ）工程ｂ）からの発現タンパク質を精製する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
細胞株が、工程（ｂ）において、組換え融合タンパク質が２４時間の期間中に１００万（１０６）個の細胞あたり５０μgを超える量でその増殖培地中に発現および分泌される条件下で増殖する、請求項８の方法。
【請求項１０】
ヒトＩｇＧ Ｆｃが、天然Ｆｃと、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２、Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４、並びにＬｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１からなる群より選択された非溶解性の変異体Ｆｃからなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧ Ｆｃが、天然Ｆｃと、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２、Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４、並びにＬｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１からなる群より選択された変異体Ｆｃからなる群より選択される、請求項８の方法。
【請求項１２】
前記可動性ペプチドリンカーが、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２〜２０個のアミノ酸を含む、請求項８の方法。
【請求項１３】
細胞株が、組換え融合タンパク質が、２４時間の期間中に１００万（１０６）個の細胞あたり５０μgを超える量でその増殖培地中に発現および分泌される条件下で増殖し；そして、前記組換え融合タンパク質は、モル基準でｈＵＴＩに類似した生物活性によって特徴付けられそしてこれを示し；可動性ペプチドリンカーは、ｈＵＴＩとＩｇＧ Ｆｃとの間に存在し；ヒトＩｇＧ Ｆｃは、天然Ｆｃと、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２、Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４、並びにＬｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１からなる群より選択された変異体Ｆｃからなる群より選択され；そして前記可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２〜２０個のアミノ酸を含む、請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
ウリナスタチンまたはビクニンとも呼ばれるヒト尿中トリプシンインヒビター（ヒトＵＴＩまたはｈＵＴＩ）は、２つのＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒビタードメインを含むグリコシル化タンパク質である。ヒトＵＴＩはヒト尿中および血中に見られ、分子量は約４０キロダルトン（ｋＤ）である。ヒトＵＴＩは、トリプシン、α−キモトリプシン、プラスミン、カテプシンＧおよび白血球エラスターゼを含むセリンプロテアーゼの活性に対する阻害効果などの、多くの生理的作用を有することが知られている。ヒトＵＴＩは、また、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）などの炎症誘発性サイトカインの放出をダウンレギュレーションすることで免疫調節効果を示す（例えば、Park, et al. J. Korean Med. Sci., 25: 128-34, 2010; Sato et al. Jpn. J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 48: 428-34, 2000; Park et al. Korean J. Anesthesiol., 58:334-337, 2010参照）。さらに、ｈＵＴＩは、ＰＤＧＦ−Ｄの活性二量体（ＰＤＧＦ−ＤＤ）／ＰＤＧＦ−ｂｂＲにより媒介されるシグナル伝達を中和することによって悪性中皮腫細胞の遊走を抑制し、そして、癌細胞の増殖を阻害しそしてＣＸＣＬ４およびＭＭＰ−９の発現をダウンレギュレーションすることによって乳癌異種移植ヌードマウスモデルにおける乳腺腫瘍を有意に減少させ（例えば、Yaguchi et al. Cancer Lett 288: 214-218, 2010; Sun et al. J. Int. Med. Res. 38: 967-976, 2010参照）、このことは癌療法におけるｈＵＴＩの可能性ある役割を示唆する。
【０００２】
さらに、ｈＵＴＩは、種々の組織上でのトリプシンのタンパク質分解作用を抑制するように作用し、そして局所的な抗炎症作用を奏功することが示されている。リスクの高い患者における全身麻酔の症例において使用する場合、ｈＵＴＩの静脈内注入は、多くの臓器に対する灌流を改善し、そして炎症応答を減少させることができる。それ故、ｈＵＴＩは、急性膵炎、全身性炎症反応症候群、循環機能不全、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および多臓器不全を含む、急性炎症性疾患に対して適応される（例えば、Jong In Han, Korean J. Anesthesiol., 58: 325-327, 2010参照）。
【０００３】
動物モデルの研究においては、ｈＵＴＩは、エンドトキシン誘発性ショック並びに肝虚血再灌流障害に対して防御作用を有することが報告されている（例えば、Inoue et al. Expert Opin. Investig. Drugs, 19:513-20, 2010; Wu et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 8:53-58, 2009参照）。臨床研究においては、ｈＵＴＩとチモシンα−１との組合せ使用により、重度の敗血症患者の生存率が増加した（例えば、Li et al. J. Intensive Care Med., 24:47-53, 2009参照）。別の臨床研究においては、ｈＵＴＩは、ＳＡＲＳウイルスによって誘発された急性肺損傷（ＡＬＩ）または急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置するのに効果的であることが示された（例えば、US Patent No. 7,470,666参照）。
【０００４】
ヒトの尿から精製されたｈＵＴＩに対する商標名である「Ｍｉｒａｃｌｉｄ」は、１９８５年に日本の持田製薬によって初めて市販された。「Ｍｉｒａｃｌｉｄ」は、急性膵炎およびショックによって引き起こされる急性循環不全の処置に対する薬物として臨床効力を実証した。他の類似した製品が、Techpool Biopharma、中国(「注射用ウリナスタチン」)、Han Lim Pharmaceutical、韓国(ウリスチン（Ulistin）)、Kolon Pharmaceutical、韓国(ウスタチン（Ustatin）)およびYu Young Pharmaceutical、韓国(スタチン（Statin）)によって製造されている。日本および中国においては、ｈＵＴＩは、急性膵炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）およびショック、例えば出血性ショック、敗血症ショック、外傷性ショックおよび熱傷ショックの処置のための薬物として広く使用されている。
【０００５】
市場におけるｈＵＴＩの製薬等級の製品は、ヒトの尿から精製される。この出発物質の供給は予測不可能であり得、そしてヒト病原体による可能性ある汚染は危険である。組換えＤＮＡ技術の使用により、ｒｈＵＴＩが酵母において産生され、そして精製された物質は、in vitroにおいてトリプシン阻害活性を有することが示された。酵母における組換えｈＵＴＩタンパク質の発現は、５５mg/Lという低いレベルであると報告されている（例えば、Jian-qiu Wang et al, Protein Expr. Purif.,60:127-31, 2008; USPatent No. 5,407,915参照）。さらに、酵母細胞において産生された組換えタンパク質は、異なる翻訳後修飾を受ける傾向があり、これによりin vivoにおける潜在的に減少した効力および／または治療タンパク質に対する免疫応答をトリガーするなどの望ましくない副作用がもたらされる。従って、酵母に由来するｒｈＵＴＩタンパク質は、生物学的治療薬のための良好な候補ではないだろう（Brooks SA, Mol. Biotechnol., 28:241-55, 2004）。
【０００６】
複雑な翻訳後修飾を行なえるということが、大半の生物学的治療薬が哺乳動物の細胞培養液において製造される主な理由である。実際に、アルブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）、Novozymes Biopharmaによって製造）および速効型インスリンアナログ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）、Eli Lillyによって製造）などのほんのわずかなバイオ医薬品タンパク質が簡単な修飾を受けるので、それらを酵母を使用して製造することができる。一般に、哺乳動物細胞において産生された組換えタンパク質は十分に折り畳まれそして適切にグリコシル化されている。しかしながら、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるｒｈＵＴＩの発現は、細胞培養液中において広範なタンパク質凝集物を生じることが報告され、結果として活性の低下につながる。タンパク質凝集物は、非天然のジスルフィド結合を通して共有結合的に架橋していることが示された（例えば、Seefeldt MB et al. Protein Sci., 13:2639-50, 2004参照）。
【０００７】
健康な志願者においては、注射から０から３時間後までの間の静注（ｉ．ｖ．）ｈＵＴＩの血漿中半減期は約３３分間であり、注射されたｈＵＴＩの約９０％の消失を占める。その後の４時間の間に、よりゆっくりとした第２相が観察され、半減期は約２時間であった。注射から７時間後、遊離ｈＵＴＩの僅か１％しか血漿中に留まらなかった（例えば、Jonsson-Berling et al. Scand. J. Clin. Lab. Invest., 51:549-57, 1991参照）。ラットにおける臓器組織分布研究は、腎臓がｈＵＴＩの分解および排泄のための主要な部位であることを示した。さらに、免疫組織化学的技術を使用した、正常および悪性のヒト組織におけるｈＵＴＩの分布および局在は、腎臓の近位尿細管におけるｈＵＴＩを見出した（例えば、Yoshida et al. Cancer, 64:860-9, 1989参照）。
【０００８】
ｈＵＴＩのクリアランスに関与する詳細な機序は依然として不明であるが、腎臓が、ｈＵＴＩ異化の主要な部位であるようである。循環中のｈＵＴＩの半減期を延長するために、ｈＵＴＩの分子量を増加させることにより、腎臓を通しての排出を減速させることができる。このようなアプローチは長時間作用型医薬品の設計においてとられており、例えばＥＰＯに余分なＮ−グリコシル化部位を付加（Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）、Amgenによって製造）、またはＧ−ＣＳＦにＰＥＧ分子を付加（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）、Amgenによって製造）などがある。ｈＵＴＩのＣ末端にヒトＩｇＧ Ｆｃまたはその変異体を付加することによって、得られたＵＴＩ−Ｆｃ分子はより大きな分子量を有するだけでなく、血漿中のヒトＩｇＧ Ｆｃに関するより長い半減期を示すだろう。
【０００９】
ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ヒト血液中において最も豊富なタンパク質の１つである。その循環半減期は２１日間もの長さに達し得る。融合タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域を、別のタンパク質のドメイン（例えば種々のサイトカインおよび可溶性レセプター）と組み合わせると報告されている（例えば、Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol.,14:52-60, 1996); U.S. Pat. Nos. 5,116,964および5,541,087参照）。融合タンパク質の原型は、ＩｇＧ Ｆｃのヒンジ領域におけるシステイン残基を通して連結されたホモダイマータンパク質であり、その結果として、ＣＨ１ドメインおよび軽鎖を含まないＩｇＧ分子に類似した分子が得られる。構造的相同性に因り、Ｆｃ融合タンパク質は、in vivoにおいて、類似のアイソタイプを有するヒトＩｇＧと同等な薬物動態プロファイルを示す。このアプローチは、いくつかの治療的に重要なサイトカイン、例えばＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、および可溶性レセプター、例えばＴＮＦ−ＲｃおよびＩＬ−５−Ｒｃに適用されている（例えば、US Patent Nos., 5,349,053および7,232,668参照）。それ故、本発明において開示または記載したようなヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）タンパク質のＦｃ部分に連結されたｈＵＴＩを含む融合タンパク質を製造することによって、ｈＵＴＩの循環半減期を延ばすもしくは改変するおよび／またはその生物学的活性を増加／改変することが望ましい。また、異なるおよび／またはより望ましい臨床特性および／または薬学的特性を示す、ｈＵＴＩに代わるこのような製品を生産することが望ましくそして本発明の一部である。
【００１０】
さらに、大半の報告されているＦｃ融合タンパク質分子において、ヒンジ領域が、Ｆｃ領域とアミノ末端のサイトカインまたは可溶性レセプターとの間のスペーサーとして作用し、よって分子のこれらの２つの部分が別々に機能することを可能とする（例えば、Ashkenazi et al., Current Opinion in Immunology,9:195-200, 1997参照）。それ故、このようなスペーサーとして作用する適切なリンカーを有することが望ましくそして本発明の一部であり、これにより両方のＵＴＩドメインが、セリンプロテアーゼと独立して相互作用することができる。
【００１１】
ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域は、病原体の排除のための免疫防御において重要な役割を果たす。ＩｇＧのエフェクター機能は、２つの主要な機序を通してＦｃ領域によって媒介される：（１）細胞表面Ｆｃレセプター（ＦｃγＲｓ）への結合により、食作用による病原体の摂取または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路を介したキラー細胞による溶解が起こり得るか、あるいは（２）第１補体成分Ｃ１のＣ１ｑ部分への結合により、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路が開始され、病原体の溶解が起こる。４つのヒトＩｇＧアイソタイプの中で、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が、ＦｃγＲへの結合において効果的である。ＦｃγＲへのＩｇＧ４の結合親和性は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３よりも約１ケタ低く、一方、ＦｃγＲへのＩｇＧ２の結合は検出未満である。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、また、Ｃ１ｑへの結合および補体カスケードの活性化においても効果的である。ヒトＩｇＧ２は補体と弱くしか結合せず、そしてＩｇＧ４は、補体カスケードを活性化する能力が極めて不十分であるようである（例えば、Jefferis et al., Immunol. Rev., 163:59-76, 1998参照）。治療使用においては、ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃが種々のプロテアーゼに結合する場合、融合タンパク質のＦｃ領域が、細胞表面に結合したプロテアーゼを有する細胞の溶解または除去を引き起こすエフェクター機能を媒介するかまたはしないかは決定的または重要ではないだろう。従って、ここで開示した本発明から、ｈＵＴＩ−ＦｃのＦｃ領域は、天然ＩｇＧ Ｆｃまたは非溶解性のＦｃ変異体であり得ることが明らかである。上で考察したように、天然ＩｇＧ Ｆｃは、種々のレベルのエフェクター機能を媒介する。これに対し、非溶解性のＦｃは、エフェクター機能をトリガーするためのＦｃγＲｓおよびＣ１ｑへの結合に関して不活性である。非溶解性Ｆｃを得るためには、天然Ｆｃ領域の特定のアミノ酸を、エフェクター機能の減弱化のために突然変異させなければならない。
【００１２】
ヒトおよびマウスのＩｇＧアイソタイプのアミノ酸配列を比較することによって、ＣＨ２ドメインのＮ末端近くのＦｃ部分が、ＩｇＧ ＦｃのＦｃγＲｓへの結合において役割を果たすことに関与している。２３４位から２３７位のモチーフの重要性が、遺伝子工学された抗体を使用して実証された（例えば、Duncan et al., Nature, 332:563-564, 1988参照）。アミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services, 1991)に記載のＥＵインデックスに従う。４つのヒトＩｇＧアイソタイプの中で、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３がＦｃγＲｓに最も良く結合し、そしてＬｅｕ２３４−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ２３７の配列を共有する（ＩｇＧ３は図１に示されていない）。より低い親和性でＦｃγＲｓに結合するＩｇＧ４においては、この配列は１つのアミノ酸置換、すなわち２３４位のＬｅｕに対してＰｈｅを含む。ＦｃγＲｓに結合しないＩｇＧ２においては、２つの置換と１つの欠失があり、Ｖａｌ２３４−Ａｌａ−Ｇｌｙ２３７となる（図１）。ＦｃγＲへのＦｃの結合を最小限にし、従ってＡＤＣＣ活性を最小限にするために、ＩｇＧ４におけるＬｅｕ２３５をＡｌａによって置換した（例えば、Hutchins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11980-11984, 1995参照）。ＩｇＧ１は、このモチーフにおいて、ＩｇＧ２からの配列であるＰｒｏ２３３−Ｖａｌ−Ａｌａ２３５を用いてＧｌｕ２３３−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ２３５を置換することによって改変された。この置換により、マウスにおいてターゲット細胞を枯渇させるＦｃγＲにより媒介される能力を欠失したＩｇＧ１変異体が得られた（例えば、Isaacs et al., J. Immunol., 161:3862-3869, 1998参照）。
【００１３】
ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの両方の結合に重要であると思われる第２の部分は、ヒトＩｇＧのＣＨ２ドメインのカルボキシ末端近くに位置している（例えば、Duncan et al., Nature,332:738-740, 1988参照）。４つのヒトＩｇＧアイソタイプの中で、この部分内で置換を示すのはただ２つのアミノ酸残基のみである：ＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３０およびＳｅｒ３３１は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３に存在するＡｌａ３３０およびＰｒｏ３３１に置き換わっている（図１）。Ｓｅｒ３３０の存在は、ＦｃγＲまたはＣ１ｑへの結合に影響を及ぼさない。ＩｇＧ１におけるＰｒｏ３３１をＳｅｒによって置換すると、ＩｇＧ１がＣ１ｑに結合する能力は実質的に消失し、一方、Ｓｅｒ３３１をＰｒｏによって置換すると、ＩｇＧ４の補体結合活性は部分的に回復した（例えば、Tao et al., J. Exp. Med.,178:661-667, 1993; Xu et al., J. Biol. Chem., 269:3469-3474, 1994参照）。
【００１４】
本発明者らは、天然ヒトＩｇＧ Ｆｃの他に、少なくとも３つの他のＦｃ変異体（ｖＦｃ）を、本発明のｈＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質の産生のために設計および／または使用することができることを発見した（図１）。ヒトＩｇＧ２ ＦｃはＦｃγＲに結合しないが、弱い補体活性を示す。Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を有するＦｃγ２変異体は、天然Ｆｃγ２よりも低い補体活性を有するはずであるが、依然としてＦｃγＲへは結合しない。ＩｇＧ４ Ｆｃは補体カスケードの活性化において不十分であり、そしてＦｃγＲへの結合親和性は、最も活性なアイソタイプであるＩｇＧ１よりも約１ケタ低い。Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を有するＦｃγ４変異体は、天然Ｆｃγ４と比較して最小のエフェクター機能を示すはずである。Ｌｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を有するＦｃγ１変異体もまた、天然Ｆｃγ１よりもはるかに低いエフェクター機能を示す。本発明者らは、また、これらのＦｃ変異体、並びにヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）からの天然Ｆｃは全て、ｈＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質の調製に適していることを発見する。循環半減期を損なうことなく、または望ましくないコンフォメーション変化を全く引き起こすことなく、非溶解性Ｆｃまたは天然Ｆｃの調製のために他の置換を導入し得ることも可能である。
【００１５】
本発明において、ｈＵＴＩの組換え融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から誘導された細胞株によって産生される。ｒｈＵＴＩ−Ｆｃ融合タンパク質は、類似の宿主細胞を使用してｒｈＵＴＩの細胞培養液中に存在すると報告されたタンパク質凝集物を含むことなく、細胞培養液から容易に精製される（例えば、Seefeldt MB et al. Protein Sci., 13:2639-50, 2004参照）。in vitroにおける生物学的活性に関してｈＵＴＩと比較した場合、ｈＵＴＩとＦｃ部分との間に適切なペプチドリンカーを有するｈＵＴＩ融合タンパク質（ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ）は、モル基準でｈＵＴＩと同等な活性を保持する。これらの分子のＦｃ部分は、長時間の血清中半減期を示すことが知られているので、この長時間作用型の医薬品の投与頻度計画を減少させることができ、より良好に管理することができ、そして／またはより望ましい血清中レベルが維持される。
【００１６】
本発明には多くの利点があり、これは、以下に開示および考察したように、特に当業者には明らかであろう。哺乳動物細胞培養液におけるｒｈＵＴＩと比較して、ｒｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃのより簡単な精製プロトコールおよびより高い産生収率は、製造コストを実質的に低下させることができる。血清中におけるｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の異なるおよび／または高い活性並びに異なるおよび／または延長された存在は、異なるまたは低い投与量、並びに異なるまたはより低頻度の注射をもたらし得る。血清中の薬物濃度の変動がより少ないことは、また、改善された安全性および耐容性を意味する。それ故、非溶解性Ｆｃ変異体または天然Ｆｃを含むｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、急性膵炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）およびショックに関連した種々の容態の管理に有意に貢献する。
【００１７】
発明の要約
本発明の１つの局面は、ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質に関する。このｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ｈＵＴＩ、ペプチドリンカー（Ｌによって示す）およびヒト天然ＦｃまたはＩｇＧ Ｆｃ変異体（両方共にＦｃによって示す）を含む。長さが約２０以下、より好ましくは約２〜２０アミノ酸の可動性ペプチドリンカーを使用することが好ましく、そして前記可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２つ以上のアミノ酸を含む。ＩｇＧ Ｆｃ変異体は非溶解性であり、そして天然ＩｇＧ Ｆｃと比較してアミノ酸の突然変異を含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、ヒトＩｇ Ｆｃが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４などのヒトＩｇＧのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むことである。好ましくは、ＣＨ２ドメインは、２２８位、２３４位、２３５位および３３１位（ＥＵナンバリングシステムによって定義）においてアミノ酸の突然変異を含む。これらのアミノ酸の突然変異は、Ｆｃのエフェクター機能を減弱するように作用すると考えられる。
【００１９】
本発明のさらに別の態様において、ＣＨＯに由来する細胞株などの哺乳動物細胞株からこのような組換え融合タンパク質を製造または産生するための方法を開示する。トランスフェクションされた細胞株を、組換え融合タンパク質が２４時間の期間中に１００万個の細胞あたり５０μg、好ましくは１００μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で増殖させる。これらのｒｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ｒｈＵＴＩと比べて、モル基準で、in vitroにおける高い生物学的活性、および望ましくない副作用を伴うことなく延長された血清中半減期によって特徴付けられそしてこれを示し、これにより改善された薬物動態および薬力学がもたらされ、従って、類似の効力を達成するためにより少ない投与量およびより少ない注射回数が必要となる。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、ｈＵＴＩ、可動性ペプチドリンカーおよびヒトＩｇＧ Ｆｃ（変異体形および天然形からなる群より選択される）を含む組換え融合タンパク質を製造するための方法を提供し、前記方法は、（ａ）ＣＨＯに由来する細胞株を生成する工程；（ｂ）組換え融合タンパク質が、２４時間の期間中に１００万（１０６）個の細胞あたり５０μg、好ましくは１００μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で細胞株を増殖させる工程；そして（ｃ）工程ｂ）からの発現タンパク質を精製する工程を含み、組換え融合タンパク質は、モル基準で、ｈＵＴＩと類似した、同じくらい高い、またはより高い生物学的活性によって特徴付けられそしてこれを示す。この場合、好ましくは、約２０個以下、しかし好ましくは２個より少なくはなく、より好ましくは２０から２個であるアミノ酸を含む可動性ペプチドリンカーが、ｈＵＴＩとヒトＩｇＧ Ｆｃ（変異形および天然形からなる群より選択される）との間に存在し；そして可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２つ以上のアミノ酸を含み；そしてヒトＩｇＧ Ｆｃ（天然形または変異形のいずれか）は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃの変異形は、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２、Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４、並びにＬｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその変異体のヒンジ領域およびＣＨ２領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。アミノ酸２２８位、２３４〜２３７位および３３０〜３３１位という３つの部分を比較する。変異体のアミノ酸の突然変異を太字のイタリック体で示す。アミノ酸残基についてはＥＵナンバリングシステムを使用する。
【図２】図２は、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸残基１〜１９のペプチドは、ｈＵＴＩのリーダーペプチドである。成熟タンパク質は、ｈＵＴＩ（アミノ酸残基２０〜１６２）、ペプチドリンカー（アミノ酸残基１６３〜１７８）およびＦｃγ２変異体（アミノ酸残基１７９〜４０１）を含む。
【図３】図３は、ｈＵＴＩ-Ｌ−ｖＦｃγ４のヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。アミノ酸残基１〜１９のペプチドはｈＵＴＩのリーダーペプチドである。成熟タンパク質はｈＵＴＩ（アミノ酸残基２０〜１６２）、ペプチドリンカー（アミノ酸残基１６３〜１７８）およびＦｃγ４変異体（アミノ酸残基１７９〜４０７）を含む。
【図４】図４は、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ１のヌクレオチド配列（配列番号５）および推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す。アミノ酸残基１〜１９のペプチドはｈＵＴＩのリーダーペプチドである。成熟タンパク質はｈＵＴＩ（アミノ酸残基２０〜１６２）、ペプチドリンカー（アミノ酸残基１６３〜１７８）およびＦｃγ１変異体（アミノ酸残基１７９〜４０５）を含む。
【図５】図５は、発現プラスミドＰＣＤＮＡ３−ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγの図解を示す。プラスミドは、示されているように、９，０６３ｂｐｓ長であり、ｈＣＭＶプロモーター−エンハンサー、融合タンパク質遺伝子、ＤＨＦＲおよびネオマイシン選択遺伝子などを含む。
【図６】図６は、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２融合タンパク質を分泌している組換え細胞株を使用した、振とうフラスコ中の細胞増殖および累積タンパク質濃度を示す。最終タンパク質濃度は、１５日目に３ｇ/Ｌに近づいた。
【図７】図７は、トリプシン阻害剤としてヒトの尿から精製されたｈＵＴＩ（Techpool）またはＣＨＯ細胞上清からのｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２融合タンパク質を使用した、in vitroにおける生物学的アッセイを示す。ｈＵＴＩのＩＣ５０は８１．５±６．０nMであり、そしてｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２のＩＣ５０は７０．９±１．５nMである。
【図８】図８は、セルレインにより誘発されたマウス急性膵炎モデルにおける、ｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃおよびｈＵＴＩの生物学的活性を示す。対照（グループＡ）と比較して、ｈＵＴＩは、１mg/kgの投与量で、血清中アミラーゼレベルの増加に対して全く効果を示さなかった（グループＢ）。４０mg/kg（または１μmol/kg）というはるかに高い投与量においては、ｈＵＴＩは血清中アミラーゼの増加に対して８％の阻害効果を示した（グループＣ）。３mg/kg（または０．０２７μmol/kg）においては、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃは、血清中アミラーゼの増加に対して２６％の阻害効果を示した（ｐ＜０．００５、グループＤ）。３０mg/kgにおいては、阻害は５３％とはるかに高くあり続けた（ｐ＜０．００１、グループＥ）。グループＤにおけるｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃの投与量は、グループＣにおけるｈＵＴＩより３０倍少なかったが、血清中アミラーゼレベルに対する阻害効果は有意により良好であった。
【図９】図９は、１０％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのヒトの尿から精製されたｈＵＴＩ（Techpool）および精製されたｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２融合タンパク質を示す。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、ｈＵＴＩ、ペプチドリンカー（Ｌ）およびヒトＩｇＧ Ｆｃ（天然形または変異体形のいずれか）を含む、ヒト尿中トリプシンインヒビター（ｈＵＴＩ）−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質に関する。この融合タンパク質において、可動性ペプチドリンカーは約２０以下のアミノ酸長を含み；そしてＦｃは、天然ヒトＩｇＧ ＦｃおよびＦｃ変異体（ｖＦｃ）から選択される。２から約２０アミノ酸長の可動性ペプチドリンカー（Ｌ）を使用することがより好ましく、そして可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２つ以上のアミノ酸からなるまたは含む。ＩｇＧ Ｆｃ変異体は非溶解性であり、そして天然ＩｇＧ Ｆｃと比較してアミノ酸の突然変異を含む。
【００２３】
本発明には多くの利点がある。血清中におけるｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の高い活性および／または延長した存在は、より少ない投与量並びにより低頻度の注射をもたらし得る。血清中の薬物濃度の変動がより少ないことは、また、改善された安全性および耐容性を意味する。それ故、非溶解性Ｆｃ変異体または天然Ｆｃを含むｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、急性膵炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）およびショックに関連した種々の容態の管理に有意に貢献する。
【００２４】
本発明者らは、天然ヒトＩｇＧ Ｆｃの他に、少なくとも３つのＦｃ変異体（ｖＦｃ）を、ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の産生のために使用し、ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質に取り込み、および／またはｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質の産生へと別様に設計することができることを見い出した（図１）。ヒトＩｇＧ２ ＦｃはＦｃγＲには結合しないが、弱い補体活性を示す。Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を有するＦｃγ２変異体は、天然Ｆｃγ２よりも弱い補体活性を有するはずであるが、依然としてＦｃγＲには結合しない。ＩｇＧ４ Ｆｃは補体カスケードを活性化するのには不十分であり、そしてＦｃγＲへのその結合親和性は、最も活性のあるアイソタイプであるＩｇＧ１よりも約１ケタ低い。Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を有するＦｃγ４変異体は、天然Ｆｃγ４と比較して最小のエフェクター機能を示すはずである。Ｌｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を有するＦｃγ１変異体もまた、天然Ｆｃγ１よりもはるかに低いエフェクター機能を示す。本発明者らは、これらのＦｃ変異体、並びにヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）からの天然Ｆｃは全て、ＵＴＩ融合タンパク質の調製に適していることを発見する。循環半減期を損なうことなく、または望ましくないコンフォメーション変化を全く引き起こすことなく、非溶解性Ｆｃまたは天然Ｆｃの調製のために他の置換を導入し得ることも可能である。
【００２５】
本発明により、ｈＵＴＩとヒトＩｇＧ Ｆｃとの間に存在する付加されたペプチドリンカーは、ｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ分子のin vitroにおける生物学的活性に２つの方法で貢献することが発見される：（１）ｈＵＴＩ上のプロテアーゼ結合部位からＦｃ領域を離しておく、および／または（２）一方のＵＴＩドメインを、他方のＵＴＩドメインから遠ざける。このようにして、両方のＵＴＩドメインがプロテアーゼと独立的に相互作用し得ることが可能である。本発明では、長さが約２０以下のアミノ酸の可動性ペプチドリンカー（Ｌ）が好ましい。より好ましくは、ペプチドリンカー（Ｌ）は少なくとも２アミノ酸長を有するべきである。さらに、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２つ以上のアミノ酸を含むペプチドリンカーを使用することがさらにより好ましい。
【００２６】
また本発明によると、ｈＵＴＩの組換え融合タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から誘導された細胞株によって産生された。マウス急性膵炎疾病モデルにおけるin vivoでの生物学的活性に関してｈＵＴＩと比較した場合、組換えｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃは、モル基準で、ｈＵＴＩよりもはるかにより効果的であるようであった。ラットにおいては、組換えｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃの半減期はｈＵＴＩよりもはるかに長いことが観察された。この長時間作用型の医薬品を製造することによって、投与頻度を減少させるおよび／または投与頻度を管理する選択肢を提供することが可能となり得、そして高い血清中レベルを維持し得る。
【００２７】
本発明のために、上で考察したＣＨＯ由来細胞株などの哺乳動物細胞株から本明細書において開示した組換え融合タンパク質を製造または産生するための方法を開示する。トランスフェクションされた細胞株を、組換え融合タンパク質が２４時間の期間中に１００万個の細胞あたり５０μgを超える量で、好ましくは１００μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で増殖させる。これらのｒｈＵＴＩ−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質は、ｈＵＴＩと比べて、モル基準で、in vitroにおける良好なおよび／または高い生物学的活性、並びに多くの望ましくない副作用を伴うことなく延ばされた血清中半減期によって特徴付けられそしてこれを示し、これにより改善された薬物動態および薬力学がもたらされる。従って、類似の効力を達成するためにより少ない投与量およびより少ない注射回数が必要となる。または代替的にもしくは組み合わせて、異なる投与計画および／または異なる注射管理の方法が可能となり得る。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、ｈＵＴＩ、可動性ペプチドリンカーおよびヒトＩｇＧ Ｆｃ（変異体形および天然形を含む）を含む組換え融合タンパク質を製造するための方法を提供し、前記方法は、（ａ）ＣＨＯに由来する細胞株を生成する工程；（ｂ）組換え融合タンパク質が、２４時間の期間中に１００万（１０６）個の細胞あたり５０μg、好ましくは１００μgを超える量でその増殖培地に発現および分泌される条件下で細胞株を増殖させる工程；そして（ｃ）工程ｂ）からの発現タンパク質を精製する工程を含み、組換え融合タンパク質は、モル基準で、ｈＵＴＩと同じくらい高い生物学的活性によって特徴付けられそしてこれを示す。この場合、好ましくは、約２０個以下であるが、しかし２個より少なくはないアミノ酸を含む可動性ペプチドリンカーが、ｒｈＵＴＩとヒトＩｇＧ Ｆｃ（変異体形および天然形を含む）との間に存在し；そして可動性ペプチドリンカーは、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２つ以上のアミノ酸を含み；そして、ヒトＩｇＧ Ｆｃ（天然形または変異体形のいずれか）は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃの変異体形は、Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ２、Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含むヒトＩｇＧ４、およびＬｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むヒトＩｇＧ１からなる群より選択される。
【００２９】
実施例１．ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２融合タンパク質をコードする遺伝子の調製
ヒトＵＴＩのリーダーペプチドおよび成熟タンパク質をコードする遺伝子を新規に合成した。得られた約５００ｂｐ長のＤＮＡフラグメントを、ｐＵＣ５７などのホールディングベクター（holding vector）のＥｃｏＲＶ制限酵素部位に挿入することにより、ｐｈＵＴＩプラスミドを得た。ｈＵＴＩ遺伝子の配列はＤＮＡシークエンスによって確認された。
【００３０】
リンカーペプチドおよびヒトＩｇＧ２のＦｃ変異体領域（Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を含むＦｃγ２）をコードする遺伝子を新規に合成した。得られたＦｃγ２のＤＮＡフラグメントは、リンカーペプチド、並びに、Ｆｃγ２ Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ変異体（ｖＦｃγ２）（Ｆｃγ２の３３１位のＰｒｏをＳｅｒを用いて置換した）を含むＩｇＧ２のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの配列を含んだ。リンカーペプチドは、１６アミノ酸のＧｌｙ−Ｓｅｒペプチドリンカーをコードする配列を含んだ。得られた約７００ｂｐ長のＤＮＡフラグメントをｐＵＣ１９などのホールディングベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入することによりｐＬ−ｖＦｃγ２プラスミドを得た。遺伝子の配列はＤＮＡシークエンスによって確認された。
【００３１】
ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２融合遺伝子を調製するために、ｈＵＴＩフラグメントをＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐｈＵＴＩプラスミドから切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動によって精製した。その後、精製されたフラグメントを、ｐＬ−ｖＦｃγ２プラスミド中のペプチドリンカーの５’末端に挿入することにより、ｐｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２プラスミドを得た。融合遺伝子は、ｈＵＴＩ、Ｇｌｙ−ＳｅｒペプチドリンカーおよびＦｃγ２変異体遺伝子を含む。
【００３２】
ｈＵＴＩとＦｃ部分との間の（およびその両方に化学的に結合した）ペプチドリンカー、好ましくは可動性リンカーの存在は、ｈＵＴＩドメインの可動性を増加させ、そしてその生物学的活性を増強する。本発明では、約２０以下のアミノ酸長のペプチドリンカーが好ましい。１つのアミノ酸も本発明の範囲内にあるが、約２０から約２のアミノ酸長の可動性ペプチドリンカーを有することが好ましい。グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群より選択された２つ以上のアミノ酸を含むペプチドリンカーを好ましくは使用することができる。ペプチドリンカーの例は、ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒなどのＧｌｙ−Ｓｅｒペプチド構築ブロックを含む。図２は、ｈＵＴＩ、１６アミノ酸ペプチドリンカー（GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer）およびＦｃγ２ Ｐｒｏ３３１Ｓｅｒ変異体をコードする配列を含む融合遺伝子と、その対応するアミノ酸配列を示す。図３は、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ４（Ｓｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を有するＦｃγ４）についての融合遺伝子および対応するアミノ酸配列を示す。図４は、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ１（Ｌｅｕ２３４Ｖａｌ、Ｌｅｕ２３５ＡｌａおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒ突然変異を有するＦｃγ１）についての融合遺伝子および対応するアミノ酸配列を示す。
【００３３】
実施例２．ｈＵＴＩ−Ｆｃのための発現ベクターの構築
その後、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ融合タンパク質をコードする完全遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）などの哺乳動物発現ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位に挿入した。図５に示したように、最終発現ベクタープラスミドｐＣＤＮＡ３−ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγは、哺乳動物細胞における高レベルの発現に必要とされるサイトメガロウイルス初期遺伝子プロモーター−エンハンサーを含む。前記プラスミドは、また、細菌におけるアンピシリン耐性、および哺乳動物細胞におけるＧ４１８耐性を付与するための選択マーカーを含む。さらに、この発現ベクターは、宿主細胞にＤＨＦＲ遺伝子発現が欠損している場合に、メトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下でｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ融合遺伝子およびＤＨＦＲ遺伝子の同時増幅を可能とするジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む（例えば、U.S. Pat. No. 4,399,216参照）。
【００３４】
実施例３．トランスフェクションされた細胞株における融合タンパク質の発現
ｐＣＤＮＡ３−ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ発現ベクタープラスミドを使用して哺乳動物宿主細胞株をトランスフェクションすることにより、融合タンパク質の発現を達成した。安定した高いレベルの発現のために好ましい宿主細胞株は、ＤＨＦＲ酵素を欠損したＣＨＯ細胞である（例えば、U.S. Pat. No. 4,818,679参照）。好ましいトランスフェクション法は電気穿孔法である。リン酸カルシウム共沈降法、リポフェクタミン２０００を含む他の方法も使用することができる。電気穿孔法のために、ＰｖｕＩを用いて鎖状化した２０μgのプラスミドＤＮＡを、電場２５０Ｖおよび静電容量９６０μＦｄに設定されたGene Pulserエレクトロポレーター（Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.）を使用してキュベット中の２〜５×１０７個の細胞に加えた。トランスフェクションから２日後、培地を、０．８mg/mlのＧ４１８を含む増殖培地と交換した。選択薬に対して耐性のあるトランスフェクション体を、抗ヒトＩｇＧ ＦｃＥＬＩＳＡを使用して融合タンパク質の分泌について試験した。発現された融合タンパク質の定量も、抗ｈＵＴＩ ＥＬＩＳＡによって行なわれた。高レベルのＦｃ融合タンパク質を産生するウェルを、９６ウェル組織培養プレート上での限界希釈によってサブクローニングした。
【００３５】
より高いレベルの融合タンパク質の発現を達成するために、ＭＴＸ薬物によって阻害され得るＤＨＦＲの遺伝子を使用することによって同時増幅を行なった。漸増濃度のＭＴＸを含む増殖培地中において、トランスフェクションされた融合タンパク質の遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子と同時増幅させた。１μg/mlまでのＭＴＸを含む培地中で増殖することのできるトランスフェクション体を、再度、限界希釈によってサブクローニングした。サブクローニングされた細胞株を、分泌率を測定することによってさらに分析した。２４時間あたり１００万個の細胞あたり１００μgを超える分泌率レベルを生じたいくつかの細胞株を、無血清増殖培地を使用して懸濁培養に適応させた。１つの細胞株を、１５日間かけて振とうフラスコを使用して１００ml中で増殖させた。図６は、約３ｇ/Ｌの融合タンパク質の累積濃度を示す。５から１０日目に、最大生存細胞密度は、１mlあたり約６００万個の細胞に留まった。これらの条件下で、分泌率は、２４時間あたり１００万個の細胞あたり約５０μgであると計算される。馴化培地を、融合タンパク質の精製のために使用した。
【００３６】
実施例４．融合タンパク質の精製および特徴付け
融合タンパク質を含む馴化培地を、１Ｎ ＮａＯＨを用いて滴定してｐＨ７〜８とし、そして０．４５ミクロンのニトロセルロースフィルターを通してろ過した。ろ液を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で平衡化したＰｒｏｓｅｐＡカラムにロードした。融合タンパク質をＰｒｏｓｅｐＡに結合させた後、素通り画分を廃棄した。カラムを、２８０nmにおけるＯＤが０．０１未満となるまでＰＢＳを用いて洗浄した。その後、結合した融合タンパク質をｐＨ３．７５の０．１Ｍクエン酸緩衝液を用いて溶出した。０．４容量の１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４を用いて中和した後、精製されたタンパク質を含む画分をプールし、そしてＰＢＳに対して透析した。その後、前記溶液を０．２２ミクロンのニトロセルロースフィルターを通してろ過し、そして−７０℃で保存した。１０％還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって示されているように（図９）、精製されたｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃタンパク質の分子量は、約５５ｋＤであると推定された。類似した条件下で、ヒトの尿から精製されたｈＵＴＩ（Techpool）の分子量は３８ｋＤであるようであった。融合タンパク質を、標準としてＢＳＡを使用してＢＣＡタンパク質アッセイによって定量した。
【００３７】
実施例５．in vitroにおける生物学的活性のアッセイ
トランスフェクション体の上清または精製されたタンパク質におけるＵＴＩの生物学的活性を、標準的な手順に従って残留トリプシン活性を決定することによってアッセイした（例えば、Kakade et al Cereal Chem., 46:518-526, 1969参照）。基質としてＢＡＰＮＡ（Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン４−ニトロアニリド塩酸塩、Sigma-Aldrich）および酵素としてブタトリプシン（Sigma-Aldrich）を使用することによって改変を行なった。２０μlの希釈されたｈＵＴＩタンパク質、精製されたｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ、またはトランスフェクション体の上清、５μlのトリプシン（２．９４ｇ/Ｌ ＣａＣｌ２を含む１mM ＨＣｌ中の１００mg/ml溶液）を含む反応混合物は、０．２Ｍトリエタノールアミン緩衝液で１２５μlの容量に調整された。混合物を振とうしながら３７℃で２０分間かけてインキュベーションした後、５μlのＢＡＰＮＡ（２５mgを最小容量のＤＭＳＯに溶解し、そして０．２Ｍトリエタノールアミン緩衝液を用いて１０mg/mlの最終濃度に調整した）を混合物に加え、そして３７℃で振とうしながらさらに２０分間かけてインキュベーションを続けた。その後、反応を、３０μlの３０％（ｖ/ｖ）氷酢酸の添加によって終了させた。ブランクおよびトリプシン対照を同時に行なった。４０５nmにおける吸光度を記録した。図７は、ｈＵＴＩ（Techpool）または精製されたｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ融合タンパク質の正規化された活性、対、ｈＵＴＩ（Techpool）または精製されたｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ融合タンパク質のモル（nM）濃度での濃度を示す。これらの条件下で、ＩＣ５０は、ｈＵＴＩについては８１．５±６．０nMであり、そして精製されたｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃγ２融合タンパク質については７０．９±１．５nMであると推定された。
【００３８】
実施例６．マウス疾病モデルにおけるin vivoでの生物学的活性
精製されたｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃタンパク質のin vivoでの生物学的活性を、セルレインを用いて誘発された広く受け入れられている急性膵炎マウスモデルを使用して試験した。セルレインを用いての注射から２４時間後に、マウスは、急性膵炎の生化学的、組織学的、および免疫組織化学的証拠を発達させる。血清中のアミラーゼ、リパーゼ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βなどの生化学的マーカーが上昇した。免疫組織化学的染色法を使用して、白血球接着分子、血管内皮増殖因子およびアポトーシス関連タンパク質のレベルが、これらのマウスにおいて増大することが判明した（例えば、Ding et al, Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9:645-650, 2010; Galuppo et al, Br J. Pharmacol.,162:1186-1201, 2011参照）。本発明者らの実験においては、血清中アミラーゼ活性を、急性膵炎の重度の指標として追跡した。
【００３９】
３０匹の８週令の雄Ｃ５７ＢＬ/６マウス（２０〜２２ｇ）（SLAC Laboratory, Shanghai）を、１群あたり６匹の５つの群に無作為に分けた。マウスを１５時間かけて断食させた後、各群に、１時間間隔で６回、５０μg/kgのセルレインを腹腔内注射した。上のようなセルレイン注射を受けたマウスにおいては、アミラーゼ濃度は最後の注射後に急速に増加し、３時間後にピークに達した。その後、レベルはゆっくりと減少し、そして２４時間後に基線に戻った。この観察は、最後のセルレインの注射から１時間後が、ｈＵＴＩまたはｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃによる処置の効力を評価する最善の時であることを示した。
【００４０】
セルレインの初回および５回目のそれぞれの注射後、マウスに、その尾静脈を通して、ヒトの尿から精製されたｈＵＴＩ（Techpool）またはｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃを注射した。図８に示したように、Ｂ群およびＣ群のマウスを、それぞれ、１mg/kgおよび４０mg/kgのｈＵＴＩを用いて処置し；Ｄ群およびＥ群のマウスを、それぞれ、３mg/kgおよび３０mg/kgのｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃを用いて処置した。Ａ群のマウスは、等容量の食塩水を受けた対照として作用した。セルレインの最後の注射後、２００μlの血液試料を、マウスからその眼窩を通して種々の時点で回収した。試料を１０分間かけて６０００rpmで遠心分離し、そして血清を、アッセイを実施するまで−７０℃で保存した。アッセイを製造業者の指示に従って日立７０６０自動化学分析装置（Hitachi 7060 Automatic Chemistry Analyzer）で実施した。アミラーゼの濃度を、１リットルあたりの国際単位で表現した。
【００４１】
対照（Ａ群）と比較して、ｈＵＴＩは、１mg/kgの投与量においては、血清中アミラーゼ濃度の増加に対して全く効果を示さなかった（Ｂ群）。４０mg/kgというはるかに高い投与量においては、ｈＵＴＩは、血清中アミラーゼの増加に対して８％の阻害効果を示した（Ｃ群）。しかしながら、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃを用いての処置は、対照（Ａ群）と比較して血清中アミラーゼ濃度を有意に減少させた。ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃは、３mg/kgにおいて、血清中アミラーゼの増加に対して２６％の阻害効果を示した（ｐ＜０．００５）。３０mg/kgにおいては、阻害は、５３％とはるかにより効果的であるようであった（ｐ＜０．００１）。単量体ｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃおよびｈＵＴＩの推定分子量をそれぞれ５５ｋＤおよび３８ｋＤとして使用することによってモル濃度をさらに計算した（図９）。それ故、４０mg/kgまたは１μmol/kgのｈＵＴＩは８％の阻害効果を有し、一方、３mg/kgまたは０．０２７μmol/kgのｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃは、血清中アミラーゼ濃度の増加に対して２６％の阻害効果を有した。モル基準で、ｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃの投与量は、ｈＵＴＩよりも３０倍少なく、しかしながら血清中アミラーゼに対する阻害ははるかにより効果的であった。これらの結果は、ｒｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃが、これらのマウスにおける急性膵炎を処置する上でｈＵＴＩよりもより効果的であることを確認した。
【００４２】
実施例７．ラットにおける血清中半減期
ＳＤラット（SLAC Laboratory, Shanghai）に、尾静脈を通して、精製されたｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃの１回投与量（２mg/kg）を注射した。種々の時間間隔で血液試料を回収し、そして６０００rpmで１０分間かけて遠心分離にかけた。アッセイを実施するまで血漿上清を−７０℃で保存した。血清中濃度を、ＥＬＩＳＡによって、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗ｈＵＴＩ抗体を使用して試験した。ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃの半減期は９１０分間と推定され、これに対してｈＵＴＩについては１８２分間であった。それ故、ｈＵＴＩ−Ｌ−ｖＦｃの半減期は、ラットにおいて、ｈＵＴＩと比較して有意に延長されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年7月12日(2013.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【外国語明細書】
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