(57)【要約】【課題】優れた上皮型ナトリウムチャネル発現抑制効果を有する上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤を提供する。【解決手段】ゴマペプチドを有効成分として含有する、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴマペプチドを有効成分として含有する、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤。
【請求項２】
ゴマペプチドを有効成分として含有する、腎ナトリウム再吸収抑制剤。
【請求項３】
ゴマペプチドを有効成分として含有する、腎機能改善剤。
【請求項４】
ゴマペプチドを有効成分として含有する、過活動膀胱炎改善剤。
【請求項５】
ゴマペプチドを有効成分として含有する、眼乾燥症改善剤。
【請求項６】
ゴマペプチドを有効成分として含有する、口腔乾燥症改善剤。
【請求項７】
ゴマペプチドを有効成分として含有する、乾皮症改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮型ナトリウムチャネル（epithelial  Na+  channel、以下、本明細書において「ENaC」ともいう）は、上皮細胞膜に局在するイオンチャネルで、ナトリウムイオンを選択的に透過し、生体内の体液調節に関与する。ENaCは、α、β、γの各サブユニットから構成され、特に、αサブユニット（以下、本明細書において「αENaC」ともいう）の発現が、ENaC活性には重要と考えられている。
【０００３】
ヒトの腎皮質集合管（腎遠位尿細管）は、結合尿細管と、皮質・髄質外層・髄質内層集合管とで構成されている。このうち、尿細管腔膜には、ENaCが発現している。ENaCの腎臓での生理機能として、腎皮質集合管においてナトリウムを再吸収することにより体内ナトリウム量を緻密に制御することが知られており、体液量、血漿浸透圧、血圧等の調節に非常に重要な役割を有するものである。特に、ENaCは腎皮質集合管細胞内へのナトリウム流入過程を担うものである。
【０００４】
一方、鉱質コルチコイドの１種で、副腎皮質球状層で合成・分泌されるアルドステロンは、血液中のナトリウムイオン及びカリウムイオンのバランスを制御する機能を有する。具体的には、アルドステロンは体液喪失により賦活化され、ENaC数を著明に増大させてナトリウムポンプを活性化することにより、ENaCを介して尿細管細胞に取り込まれたナトリウムイオンを基底膜側のナトリウムポンプで汲み出し、腎皮質集合管細胞へのナトリウムの再吸収を亢進し、尿中へのナトリウムの排泄を減少させる。また、ナトリウムの腎皮質集合管細胞内への流入は、尿細管腔側を電気的に陰性へ傾け、カリウムチャンネルを介したカリウムの分泌を促進する。したがって、ENaCの発現が過度に亢進し、腎ナトリウムの再吸収が促進されると、腎機能が悪化する場合がある（例えば、非特許文献１〜２参照）。
【０００５】
腎機能悪化以外にも、ENaCの過剰な発現（機能亢進型変異）による疾患として、過活動膀胱炎、眼乾燥症（ドライアイ）、口腔乾燥症、乾皮症等が知られている（例えば、特許文献１〜５、非特許文献３）。
このような背景から、ENaCの発現を抑制することで、上記のようなENaCを介して発症する症状の予防・改善効果が期待できると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５２６１１８号公報
【特許文献２】特表２００９−５２０７２９号公報
【特許文献３】特表２００５−５３０６９２号公報
【特許文献４】特開２００６−２３２６８４号公報
【特許文献５】特開２０１０−５９２１０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】F．R．Perez  et  al.，Hypertension，vol．53，p．1000-1007，2009
【非特許文献２】T．Nakayama  et  al.，Am．J．Physiol．Renal．Physiol.，vol．296，p．F317-F327，2009
【非特許文献３】武田正之ら、「過活動膀胱発症機序における上皮型ナトリウムチャネル(ENaC)の役割」、自律神経、日本自律神経学会、43(4)、p.309-314、2006-08-15
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、優れたENaC発現抑制効果を有するENaC発現抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ENaC発現を抑制する、腎ナトリウム再吸収抑制剤、腎機能改善剤、過活動膀胱炎改善剤、眼乾燥症改善剤、口腔乾燥症改善剤、及び乾皮症改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ゴマペプチドが、優れたENaC発現抑制作用を奏し、腎臓へのナトリウムの再吸収を抑制し腎機能の改善に有用であること、活動膀胱炎、眼乾燥症（ドライアイ）、口腔乾燥症及び乾皮症の予防・改善に有用であることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ゴマペプチドを有効成分として含有する、上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤に関する。
また、本発明は、ゴマペプチドを有効成分として含有する、腎ナトリウム再吸収抑制剤、腎機能改善剤、過活動膀胱炎改善剤、眼乾燥症（ドライアイ）改善剤、口腔乾燥症改善剤、及び乾皮症改善剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れたENaC発現抑制効果を有するENaC発現抑制剤を提供することができる。また、本発明によれば、ENaC発現を抑制する、腎ナトリウム再吸収抑制剤、腎機能改善剤、過活動膀胱炎改善剤、眼乾燥症改善剤、口腔乾燥症改善剤、及び乾皮症改善剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤、腎機能改善剤、過活動膀胱炎改善剤、眼乾燥症（ドライアイ）改善剤、口腔乾燥症改善剤、及び乾皮症改善剤は、ゴマペプチドを有効成分として含有する。
【００１３】
本発明で用いるゴマペプチドは、ゴマ種子をタンパク質分解酵素で処理することにより得られるゴマ種子タンパク質分解物である。
ゴマ種子はタンパク質を豊富に含み、このタンパク質を酵素分解することでゴマペプチドが得られる。ゴマペプチドには血圧降下作用や抗酸化作用があることが知られ（特許第２８２０８６８号公報等、参照）、またゴマを原料として製造されるため安全性も高いことから、各種のサプリメント等に配合されている。
【００１４】
本発明に用いるゴマペプチドは広く一般に入手できる。例えば、ゴマ種子から抽出してもよいし、市販のものを用いてもよい。
市販品の例としては、ＫＩＳＣＯ株式会社製のゴマペプチドKM-20、岸本産業株式会社製のゴマペプチド等が挙げられる。
【００１５】
ゴマペプチドをゴマ種子から抽出する場合は、抽出原料として、ゴマ科ゴマ属のゴマ（胡麻、学名：Sesamum indicum）の種子、アマ科のアカゴマ（亜麻仁、学名：Linum usitatissimum、別名アマ（亜麻）ともいう）の種子等を用いることができる。本発明は、原料のゴマ種子としてこれらの天然物から採取されたゴマ種子はもちろん、煎りゴマ、ゴマ油製造工程で生じる脱脂ゴマなどの加工されたものを用いてもよい。なかでも、脱脂ゴマを原料とすることが好ましい。
本発明においてはこれらを包括してゴマ種子と呼ぶ。
【００１６】
本発明で用いるゴマペプチドは、上述のゴマ種子からゴマタンパク質を抽出し、抽出されたゴマタンパク質を酵素反応により分解して得られる。
ゴマ種子からゴマタンパク質を抽出する方法は特に限定されず、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．４７，  ｐｐ．４５７−４６０  （１９８２）に記載の方法が挙げられる。当該方法によれば、原料ゴマ種子をヘキサンにより脱脂し、得られた脱脂ゴマからアルカリ溶液によりタンパク質を溶解抽出後、等電点沈澱法等により沈澱物としてゴマタンパク質を得ることができる。
【００１７】
ゴマタンパク質の分解に用いる酵素は特に限定されず、通常のタンパク質分解酵素を使用することができる。安全性の観点からは食品用タンパク質分解酵素を使用することが好ましく、例えば、アルカラーゼ（登録商標：ノボ・インダストリージャパン株式会社製造）、サモアーゼ（商品名：大和化成株式会社製造）、プロレザー（登録商標：天野製薬株式会社製造）、プロチンＦＡ（商品名：大和化成株式会社製造）等が使用できる。
【００１８】
タンパク質分解時の酵素反応の条件については、使用するタンパク質分解酵素の至適反応温度ならびに至適反応ｐＨを考慮して適宜設定すればよい。酵素の添加量ならびに反応時間についても同様である。タンパク質分解物の回収率等の観点から、好ましくは３％以上のペプチド結合分解率が得られる条件下であり、１５％以上のペプチド結合分解率が得られる条件とすることがより好ましい。
【００１９】
酵素反応の後、酵素反応液から目的のタンパク質分解物を回収するが、この方法も特に限定されない。例えば、未分解のゴマタンパク質および使用されたタンパク質分解酵素を除去する方法として、加熱処理あるいは等電点沈澱処理をした後に濾別する方法あるいは限外濾過等の方法などを適用できる。
得られたタンパク質分解物はそのまま本発明に使用してもよいし、希釈又濃縮したものを用いてもよい。また、凍結乾燥等の方法により適宜乾燥して、ペーストや粉末状にしたタンパク質分解物を用いることもできる。
【００２０】
後述の実施例で示すとおり、ゴマペプチドはENaC遺伝子の発現量を抑制することができる。そのため、ゴマペプチドは、ENaCを介して行われる生体機能の抑制のために、或いは、ENaC遺伝子の過剰発現によって生じる疾病や症状の予防・改善のために使用することができる。
ENaCを介して行われる生体機能の抑制の一例としては、ENaCを介して行われる腎皮質集合管細胞へのナトリウムの再吸収作用の抑制が挙げられる。また、NaC遺伝子の過剰発現によって生じる疾病や症状としては、ENaCの発現が過度に亢進して腎ナトリウムの再吸収が促進されることによる腎機能の悪化、ENaC遺伝子の過剰発現によって引き起こされる過活動膀胱炎、眼乾燥症（ドライアイ）、口腔乾燥症及び乾皮症（参考文献、特表２０１０−５２６１１８号公報、特表２００９−５２０７２９号公報、特表２００５−５３０６９２号公報、特開２００６−２３２６８４号公報、特開２０１０−５９２１０号公報、武田正之ら、「過活動膀胱発症機序における上皮型ナトリウムチャネル(ENaC)の役割」、自律神経43(4)，p.309-314，2006-08-15、等参照）が挙げられる。すなわち、ゴマペプチドは、これらの作用の抑制又は症状の予防、改善のために使用することができる。
上記使用は、治療的使用（即ち医療行為）であっても非治療的使用（非医療的な行為）であってもよい。また、上記使用の対象は、ヒト、非ヒト動物、又はそれらに由来する検体であり得る。
【００２１】
ゴマペプチドを有効成分として含有する上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤、過活動膀胱炎改善剤、眼乾燥症改善剤、口腔乾燥症改善剤、及び乾皮症改善剤は、上記使用の具体的態様の１つであり、治療的用途（医療用途）、非治療用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。その使用形態も、人や動物の皮膚、爪、粘膜、毛髪等に適用されうるすべての形態が含まれる。
具体的には、医薬品、医薬部外品、化粧料等としての使用が挙げられ、化粧料や医薬部外品、医薬品の場合は皮膚外用剤の形態で、医薬品の場合は投与形態で、使用することができる。また、これらの剤は、各種の飲食品やペットフード等に有効成分として配合することもできる。
【００２２】
本発明の上皮型ナトリウムチャネル発現抑制剤、腎ナトリウム再吸収抑制剤、腎機能改善剤、過活動膀胱炎改善剤、眼乾燥症改善剤、口腔乾燥症改善剤、及び乾皮症改善剤（以下、これらの剤を纏めて「本発明の剤」ともいう）は、有効成分であるゴマペプチドのみを含有するものであってもよいし、効果に影響を与えない範囲で他の成分を含有するものであってもよい。他の成分は、剤の形態や用途等に応じて適宜選択できる。
剤に他の成分を配合する場合、有効成分であるゴマペプチドの含有量は特に制限されないが、ゴマペプチドが剤中に、０．００１質量％以上含まれることが好ましく、０．０１質量％以上含まれることがより好ましく、０．１質量％以上含まれることがさらに好ましい。また、ゴマペプチドが剤中に、４０質量％以下含まれることが好ましく、２０質量％以下含まれることがより好ましく、１０質量％以下含まれることがさらに好ましい。
【００２３】
本発明の剤を医薬品としてヒトや動物に投与する形態で使用する場合、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、注射剤、外用剤、坐剤、経皮吸収剤等の非経口用製剤などの形態とすることができる。
これらの製剤を調製するに際しては、賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜配合することができる。
上記のような投与形態で使用する場合、剤中のゴマペプチドの配合量は、０．０１質量％以上が好ましく、０．１質量％以上がより好ましく、１質量％以上がさらに好ましい。また、配合量の上限は、４０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましく、４質量％以下がさらに好ましい。
【００２４】
本発明の剤を皮膚外用剤の形態で使用する場合、当該「皮膚外用剤」には、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚に適用されるものが含まれ、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。より具体的には、洗顔料、化粧水、ローション、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、マッサージ剤、ファンデーション、口紅、入浴剤、シャンプー、ヘアコンディショナー、ヘアトニック、軟膏、ペースト、シート状製品（サニタリー用品等の吸収性物品、おしり拭き、ウェットティッシュ等）等の形態が挙げられる。
また、これらの剤型とするにあたって、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等を適宜配合することができる。
皮膚外用剤中のゴマペプチドの配合量は、０．００１質量％以上が好ましく、０．１質量％以上がより好ましく、１質量％以上がさらに好ましい。また、配合量の上限は、４０質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましく、４質量％以下がさらに好ましい。
【００２５】
本発明の剤を飲食品、ペットフード等に有効成分として配合する場合、一般飲食品の他、ENaCの過剰な発現により発症し、ENaCの発現抑制が治療に有効な症状の予防若しくは改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品又は特定保健用食品等の機能性飲食品等に添加、配合することができる。
飲食品等の種類に特に制限はなく、例えば、果汁飲料、乳飲料、茶系飲料等の飲料類、キャンディ、ドロップ、ゼリー、クッキー、チョコレート、ケーキ、ヨーグルト、ガム等の菓子類、調味料、調理油、乳製品、パン類、麺類、加工米等が挙げられる。また、錠剤（タブレット）、カプセル、顆粒、シロップ等の美容食品、健康食品等としてもよい。
これらの飲食品等には、甘味剤、着色剤、抗酸化剤、ビタミン類、香料、ミネラル等の添加剤、タンパク質、脂質、糖質、炭水化物、食物繊維等の食品原料を適宜組配合することができる。
飲食品やペットフード等に配合する場合、ゴマペプチドの配合量は、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。また、配合量の上限は、２０質量％以下が好ましく、５質量％以下がより好ましく、１質量％以下がさらに好ましい。
【００２６】
本発明の剤を医薬品等の形態で使用する場合、又は本発明の剤を飲食品等に配合する場合、その使用量は、適用対象者の状態、体重、性別、年齢、又はその他の要因に従って変動し得る。成人（体重６０kg）の１日当りのゴマペプチドの投与又は摂取量が、０．０１ｍｇ以上であることが好ましく、０．１ｍｇ以上であることがより好ましく、１ｍｇ以上であることがさらに好ましく、１ｇ以下であることが好ましく、０．５ｇ以下であることがより好ましく、０．３ｇ以下であることがさらに好ましい。
本発明の剤は、１日に３回、１日に２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、又は任意の期間及び間隔で投与又は摂取され得る。
本発明の剤を皮膚外用剤の形態で使用する場合、当該皮膚外用剤の使用量は、剤中の有効成分の含有量により異なるが、皮膚面１ｃｍ２当たり０．００３ｇ以上、０．５ｇ以下とすることが好ましい。
【００２７】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法を開示する。
【００２８】
＜１＞  ゴマペプチドを含む飲食物を経口的に摂取させることを特徴とする、上皮型ナトリウムチャネルの発現抑制方法（医療行為を除く）。
＜２＞  ゴマペプチドを含む飲食物を経口的に摂取させることを特徴とする、腎ナトリウムの再吸収抑制方法（医療行為を除く）。
＜３＞  ゴマペプチドを含む飲食物を経口的に摂取させることを特徴とする、腎機能の改善方法（医療行為を除く）。
＜４＞  ゴマペプチドを含む飲食物を経口的に摂取させることを特徴とする、過活動膀胱炎の予防、改善方法（医療行為を除く）。
＜５＞  ゴマペプチドを含む飲食物を経口的に摂取させることを特徴とする、眼乾燥症の予防、改善方法（医療行為を除く）。
＜６＞  ゴマペプチドを含む飲食物を経口的に摂取させることを特徴とする、口腔乾燥症の予防、改善方法（医療行為を除く）。
＜７＞  ゴマペプチドを含む飲食物を経口的に摂取させることを特徴とする、乾皮症の予防、改善方法（医療行為を除く）。
＜８＞  ゴマペプチドを含む化粧料を皮膚に塗布することを特徴とする、乾皮症の予防、改善方法（医療行為を除く）。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３０】
実施例
１．ゴマペプチドの調製
ＫＩＳＣＯ株式会社製のゴマペプチド（KM-20）を用い、これをＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解して、ゴマペプチドサンプルとした。当該サンプル溶液を、下記２．において、ゴマペプチドの濃度が１０μｇ／ｍＬとなるよう系に添加した。
【００３１】
２．ENaC発現抑制作用の評価
培養液として、増殖因子添加培地（D-MEM/Ham’s  F-12(1:1、インビトロジェン社製)に10%ウシ胎児血清(FBS、インビトロジェン社製)及び１％ペニシリンストレプトマイシン溶液(インビトロジェン社製)を添加したもの）を用いた。マウス腎皮質集合管細胞（商品名：M-1、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を細胞数が１×１０4cells/wellとなるように24well細胞培養用マルチウェルプレート（平底、ファルコン社製）に播き、前記培養液で３日間培養した。その後、FBSを添加していないD-MEM/Ham’s  F-12(FBS(-))で１日培養し、培地交換を行った。
【００３２】
前記のように培養し、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）を介した経路でシグナル伝達が行われるという報告がされているM-1細胞に、ＧＲに作用し、ミネラロコルチコイドレセプター（ＭＲ）に作用するアルドステロンと同様にENaC発現促進作用を有するデキサメタゾン（５０ｎＭ）、及び前記で調製したゴマペプチドサンプルを終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、２４時間培養した。また、コントロールとして、同量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した以外は同様に試験を行った。
【００３３】
培養細胞を回収し、RNeasy（登録商標）mini  kit(キアゲン社)を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。さらに、得られたＲＮＡを鋳型として用い、Omniscript（登録商標）Reverse  Transcriptase（インビトロジェン社製）（RNase-free  water  １．６μＬ、５×First  strant  bffer  ４μＬ、０．１Ｍ  dTT  ２μＬ、１０ｍＭ  sNTP  Mix  １μＬ、0.5μｇ／μＬ  oligo(dT)  ０．４μＬ、２００unit／μＬ  M-MLVRT  １μＬ）を混合して逆転写反応を行い、ｃＤＮＡサンプルを合成した。合成したｃＤＮＡサンプルを鋳型とし、ENaCのαサブユニット（αENaC）の遺伝子発現量をTaqMan  Fast  Universal  PCR  Master  Mix（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解析した（試薬：TaqMan  Fast  Universal  PCR  Master  Mix、装置：ABIPRISM7500Sequence  Detector（商品名、アプライドバイオシステムズ社製））を用いた。αＥＮａＣ遺伝子の発現量は、内部標準として36B4（ハウスキーピング遺伝子）を用いて補正し、36B4の発現量に対する相対値とした。また、ＰＣＲプライマー及びTaqManプローブとして、TaqMan（登録商標）gene  expression  assays（商品番号：Mm00803386_m1（αENaC）、Mｍ99999223_gH（36B4））を用いた。得られた解析結果は、平均値±標準偏差を用いて示し、dunnettによりコントロール群に対する有意差検定を行った。
結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
表１の結果から明らかなように、αENaC遺伝子の発現量は、ゴマペプチドを添加した系において有意に抑制されていた。すなわち、ゴマペプチドはαENaC遺伝子の発現抑制作用を奏し、ENaCの発現を抑制するものであった。
したがって、ゴマペプチドを有効成分として配合する本発明の上皮型ナトリウムチャネル（ENaC）発現抑制剤は、優れたENaC発現抑制効果を奏する。また、ゴマペプチドを有効成分とすることで、ENaCを介した腎皮質集合管細胞へのナトリウムの再吸収を抑制し、さらには、ENaCの過度の発現亢進により腎ナトリウムの再吸収が促進されて生じる腎機能の悪化を改善することができるため、腎ナトリウム再吸収抑制剤及び腎機能改善剤の提供が可能となる。また、当該ゴマペプチドを有効成分とすることで、ENaCの過剰発現により引き起こされる各種の症状の予防・改善剤、すなわち、過活動膀胱炎改善剤、眼乾燥症改善剤、口腔乾燥症改善剤及び乾皮症改善剤の提供も可能となる。