(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ簡易な操作により電極への抗体付着による電流低下、およびレドックスサイクリング効率低下に起因する電流値の低下を抑制するくし型電極を用いたレドックス種修飾抗体の電気化学測定感度向上の方法を提供する。【解決手段】電極系表面に水溶性高分子化合物を塗布し乾燥すること形成されたくし型電極１０１を採用することで、抗体の付着による電流低下およびレドックスサイクリング効率低下を防止でき、大きな電流値を得ることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体とレドックス種を接合した複合体のレドックス種を測定対象とする電気化学測定方法であって、くし型電極に水溶性高分子化合物を被覆し、前記くし型電極を用いて前記複合体のレドックス種を測定する電気化学測定方法。
【請求項２】
前記水溶性高分子化合物がカルボキシメチルセルロース（CMC）であることを特徴とする請求項１に記載の電気化学測定方法。
【請求項３】
前記レドックス種がフェロセン誘導体であることを特徴とする請求項１記載の電気化学測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、免疫反応測定抗体とこれを用いる電気化学的測定方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野において、抗原−抗体反応を利用して生理活性物質の微量測定に有用な、操作性に優れた高感度の免疫反応の電気化学的測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体濃度を測定する方法としては、電気化学的な方法として特許文献１に開示の技術がある。この方法では、レドックス活性高分子で化学修飾された抗体 (レドックス種修飾抗体) を用いて電気化学的に測定し、この測定値より抗原量を定量する。抗原−抗体反応の進行に必要な時間保持後、Ｇ電極の電位をレドックス活性高分子が酸化する電位、Ｃ電極の電位をこれをもとに還元する電位とし、Ｇ電極及びＣ電極に流れる電流量を計測する。このときの電流値は、抗原−抗体反応によって生成した免疫複合体の濃度および拡散係数に比例するため、抗原量の直接の定量が可能となる。しかしながら、上記方法は抗原−抗体複合体の形成を必要とするため、測定時間が30分以上と長い(特許文献１の実施例)。さらに、拡散係数は物質の大きさに依存するため、抗原または抗体の種類によって拡散係数が異るため、抗原または抗体の種類を変えるごとに最適な測定条件を見出すための条件検討が必要となる。したがって、抗原-抗体複合体濃度に比例して電流値が上昇するような、レドックス種修飾抗体濃度の電気化学測定法が求められる。上記電気化学測定方法は、抗原―抗体複合体と抗原が結合していない抗体とを分離できる特許文献２の技術と組み合わせることで、抗体の種類に依存しない汎用性の高い抗体濃度測定法を提供することが可能である。しかしながら、抗体濃度に比例して電流値が上昇する上記電気化学測定法をレドックス種修飾抗体に適用すると抗体自身が順次電極に付着し、本来電極に接近できるはずのレドックス活性基が電極に接近できず電流値が低下してしまうという課題がある。また、レドックス活性基は、二つのくし型電極がかみあった構造のため、一方のＧ電極の電位をレドックス活性基が酸化するような電位、もう一方のＣ電極の電位を、酸化されたレドックス活性基が還元されてもとに戻るような電位に保持すると、何回も繰返し酸化／還元のサイクルを繰り返すことになる。この化学増幅効果（レドックスサイクリング）によって高感度検出が可能になる。
【０００３】
しかしながら、レッドクス種修飾抗体が電極に付着し、Ｇ電極/Ｃ電極間の移動効率が低下すると、レドックスサイクリングによる高感度検出が期待できないという課題がある。
【０００４】
これら上記課題を解決する方法として、特許文献３が開示されている。
【０００５】
特許文献３では、抗体または抗体フラグメントとレドックス種をリンカーにより接合した複合体を含む被検試料を導入する工程１と、前記工程１の後に前記リンカーを開裂させる工程２と、前記工程２の後にたんぱく質を吸着する工程３と、前記工程３の後に前記工程２により開裂された前記レドックス種の濃度を電気化学的手法により測定する工程４とを備えることにより、電気化学的手法により測定する前に抗体を除去でき、電極近傍に抗体を接近させなくしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９−２５７７９３号公報
【特許文献２】国際公開第２００７／１２２９４３号
【特許文献３】特開２０１０−１６００４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の構成でも目的の効果を期待できるが、繁雑な多段の操作工程を必要とするため測定技術習得には熟練を要する場合がある。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、簡便かつ簡易な操作により電極への抗体付着による電流低下、およびレドックスサイクリング効率低下に起因する電流値の低下を抑制することを目的としたくし型電極を用いたレドックス種修飾抗体の電気化学測定感度向上の方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明のくし型電極を用いたレドックス種修飾抗体の電気化学測定感度向上の方法は、くし型電極に水溶性高分子化合物を被覆し、前記くし型電極を用いて前記抗体のレドックス種を測定する電気化学測定を行う。
【００１０】
本構成によって、簡便かつ簡易な操作で電極への抗体付着による電流低下、およびレドックスサイクリング効率低下に起因する電流値の低下を抑制することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のくし型電極を用いたレドックス種修飾抗体の電気化学測定感度向上の方法によれば、簡便かつ簡易な操作で電極への抗体付着による電流低下、およびレドックスサイクリング効率低下に起因する電流値の低下を抑制することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の電極形状の一例を示す平面図
【図２】本発明の電極を用いた実施例１のフェロセン修飾抗体に対する反応電流値の時間変化を示す図
【図３】本発明の電極を用いた比較例１のフェロセン修飾抗体に対する反応電流値の時間変化を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について図を参照しながら説明する。
【００１４】
図１において、電極１０１は、基板１０２と、基板１０２上に形成された一対のくし型電極１０３、１０４と、参照電極１０７と、対向電極１０９とを有している。
【００１５】
基板１０２は、電極１０１による抗体濃度の測定に悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、例えば、ガラス基板が挙げられる。
【００１６】
基板１０２の形状は矩形である。ただし、基板１０２の形状は、基板１０２上に各電極を形成でき、それら電極上に試料溶液等を滴下して抗体濃度を測定できる形状であれば特に限定されない。基板１０２の大きさも特に限定されず、抗体濃度の測定が可能な大きさであればよい。
【００１７】
くし型電極１０３、１０４は、相互に対応するくし型の形状を有する電極である。
くし型電極１０３、１０４は、公知の電極を用いることができ、例えば、銅、アルミニウム、金、銀、塩化銀、白金、クロム、ニッケル、鉄、炭素からなる電極が挙げられる。
【００１８】
くし型電極１０３、１０４は、数多くの平行電極が並列につながった電極であるため、装置を小型に保ったまま電流密度を増加させることができる。そのため、単なる平行電極を用いる場合に比べて得られる電流値が大きくなり、感度を高くすることができる。
【００１９】
くし型電極１０３の電極部分の幅ｄ1、間隔ｄ2は、大きな電流が得られるため小さければ小さいほど好ましいが、従来のフォトリソグラフィー技術で作製が可能という点で、０．５〜１０μｍであることが好ましい。
【００２０】
くし型電極１０４は、くし型電極１０３に対応する形状であればよく、前記幅及び間隔が同程度のものが好ましい。
【００２１】
図1のカルボキシメチルセルロース (CMC) １１１は、水に溶解した０．５wt%のカルボキシメチルセルロース水溶液５μLを４mm2のくし型電極１０３, １０４上に、参照電極１０７及び対極１０９に触れないように滴下し、室温で一晩風乾させた。乾燥後、ＣＭＣ１１１を超純水で洗浄した電極を準備する。
【００２２】
電気化学測定に用いる被検試料は、抗体とレドックス種をリンカーにより接続した複合体を含むものを準備する。これは、たとえばフェロセンモノカルボン酸とＩｇＧをアミドカップリングにより接合したものがある。
【００２３】
このようにすることによって、電極に印加した電位を制御することにより酸化還元反応を起こすことができ、電流値として濃度を測定できる。特にＧ電極の電位をレドックス活性基が酸化する電位、Ｃ電極の電位をこれをもとに還元する電位とし、Ｇ電極及びＣ電極に流れる電流量を計測するとレドックスサイクルによる電流増幅効果を得ることができ、見かけ上さらに大きな電流を得ることができてより好ましい。
【００２４】
抗体への化学修飾については、抗体タンパク質のアミノ酸残基中のアミノ基との間がアミド結合により修飾される。
【００２５】
レドックス種修飾抗体は、電極１０１により電気化学的にレドックス種の測定を行う。電極１０１は４本の電極から構成され、電極は、長手方向の長さを２ｍｍとし短手方向の長さ(d１)を５μｍ、厚さが数ｎｍの短冊形の金電極を電極同士のギャップ(d2)を５μｍとして並べた２つのくし型電極１０３，１０４として作製し、リード線１０５，１０６により外部からそれぞれ異なる電位を印加できるようになっている。また、これとは別に参照電極１０７及び対極１０９として金電極を作製し、リード線１０８, １１０により電位を印加できるようにする。参照電極の被検試料との接触面にはＡｇ／ＡｇＣｌを塗布し、参照電極とする。
【００２６】
くし型電極の一方の対１０３には参照電極１０７の電位を基準電位として０−０．６Ｖを、もう一方の対１０４には０Ｖを印加しておく。これらの電位は、フェロセンカルボン酸の酸化電位（約０．３７Ｖ：対Ａｇ／ＡｇＣｌ）および還元電位（約０．３０Ｖ：対Ａｇ／ＡｇＣｌ）を内包する電位の範囲であればこれに限らない。このように両電極に電位を印加することで、抗体に接合したフェロセンカルボン酸分子が、隣接するくし型電極１０３，１０４間でレドックスサイクルを起こし、大きな電流値を得ることができる。このようにして、レドックス種の濃度に伴う電流値を測定することで抗体の濃度を知ることができる。
【００２７】
なお本実施の形態において、水溶性高分子とは水に可溶もしくは水に膨潤する性質をもつ、繰り返し単位をもつ化合物のことを言い、合成物であっても天然物であってもよい。具体的に例示すると、親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、キトサン、カラギーナン、グルコマンナン、さらには、CMCなどの多糖類が挙げられる。これらの中でも最も好ましいのは、CMCである。
【００２８】
なお本実施の形態において、用いられるレッドクス種で修飾される抗体は特に限定されるものではなく、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体のいずれを用いてもよい。また、抗体の抗原結合部位を有するフラグメントや一本鎖抗体を用いることも可能である。
【００２９】
なお本実施の形態において、用いられるレドックス種は特に限定されるものではなく、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体のいずれかを用いる可能である。
【００３０】
（実施例１）
以下、本発明の測定対象物質としてフェロセン修飾抗体を用いた実施例を示し、更に詳しく説明する。
【００３１】
試料は、リン酸緩衝液 (ＰＢＳ溶液) 内にフェロセン修飾抗体をあらかじめ１０-5Ｍに調製したものを用いた。電極は、長手方向の長さを２ｍｍとし短手方向の長さを５μｍ、厚さが数ｎｍの短冊形の金電極を電極同士のギャップを５μｍとして並べた２つのくし型電極を用いた。なお、参照電極はＡｇ／ＡｇＣｌを塗布して作成した電極を用い、対極は金電極を用いた。
【００３２】
上記電極を用い、フェロセン修飾抗体のPBS溶液をくし型電極、参照電極及び対極とを覆うように２０μL添加した。添加後、くし型電極を０−０．６Ｖ（ｖｓ． Ａｇ ／ ＡｇＣl）の範囲を０．０１Ｖ／ｓで１サイクルで掃引するサイクリックボルタンメトリーを用いて、酸化電流値 (２０１) 及び還元電流値 (２０２) を求めた。そのときの反応電流値の時間変化を図２に示す。
【００３３】
（比較例１）
くし型電極表面を０．５wt％ＣＭＣで被覆する以外は実施例１と同様にフェロセン修飾抗体の反応電流を測定した。そのときの反応電流値の時間変化を図３に示す。
【００３４】
比較例１の場合、図３より、ＣＭＣで被覆したくし型電極の０．４Vにおいてフェロセンの酸化電流値（３０３）及び還元電流値（３０４）は、実施例１の酸化電流値（３０１）及び還元電流値（３０２）より高いことが判る。これは、ＣＭＣで電極を覆うことより、フェロセン修飾抗体の電極表面への付着を抑制し、レドックスサイクリング効率が向上したことが原因であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明に係る測定方法は、簡便かつ簡易な方法で抗体分子の電極付着を抑制し、レドックス種を電気化学的手法により測定できることから、電流低下及びレドックスサイクリング効率の低下を引き起こすことなく抗体濃度の定量を目的とする方法として有用である。また、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野で使用される小型で簡便なバイオセンサー開発技術として有用である。
【符号の説明】
【００３６】
１０１  電極
１０２  基盤
１０３  くし型電極
１０４  くし型電極
１０５  リード線
１０６  リード線
１０７  参照電極
１０８  リード線
１０９  対極
１１０  リード線
１１１  カルボキシメチルセルロース
２０１〜３０４ サイクリックボルタモグラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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