(57)【要約】      （修正有）【課題】抗菌活性や炎症抑制活性等の感染防御作用を有するイネ由来成分を見出し、新規な感染防御用組成物およびその用途を提供すること。【解決手段】以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする感染防御用組成物。（Ａ）特定の配列で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｂ）特定の配列で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする感染防御用組成物。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント
【請求項２】
前記（Ｃ）が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１５８位〜第１７０位、第２４１位〜第２５８位および第３０９位〜第３１８位から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むフラグメント、または該フラグメントにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の感染防御用組成物。
【請求項３】
感染防御作用が、有効成分の抗菌活性に基づくことを特徴とする請求項１または２に記載の感染防御用組成物。
【請求項４】
感染防御作用が、有効成分の炎症抑制活性に基づくことを特徴とする請求項１または２に記載の感染防御用組成物。
【請求項５】
炎症抑制活性が、エンドトキシン中和活性または炎症性サイトカイン産生抑制活性に基づくことを特徴とする請求項４に記載の感染防御用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の組成物を含有してなる飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品または飼料。
【請求項７】
以下の（ａ）または（ｂ）のペプチド。
（ａ）配列番号２〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）前記（ａ）のペプチドにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネ由来成分を含有する感染防御用組成物に関するものであり、詳細には、イネ由来のタンパク質またはそのフラグメントを有効成分とする感染防御用組成物およびその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人は、加齢とともに発音、咀嚼、嚥下、唾液分泌などの口腔機能が低下する。なかでも唾液分泌が低下すると、歯周病や口内炎、齲蝕（虫歯）、口臭といった口腔疾患が増大する。これは、一個人のみならず高齢化社会を迎える日本全体にとっても大きな問題である。
【０００３】
これまで、口腔ケア用品などに添加される抗菌成分や殺菌成分としてはエタノールなどの有機溶剤や抗生物質が使われてきた。しかしながら、抗生物質には、長期間の使用によって耐性菌が出現するという問題がある。また、エタノールなどの有機溶剤は、体質的に受け付けられない場合や乳幼児に使用できないという問題がある。
【０００４】
動物、植物、昆虫、酵母、乳酸菌などのさまざまな生物には、外界からの病原微生物の侵入に対して自己防御するための自己生体防御機構が本来備っており、アミノ酸が約１０〜５０個程度からなる抗菌ペプチドを生物自らが産生している。このような抗菌ペプチドは、抗生物質と比較して広範囲な抗菌活性を有し、耐性菌を生じにくいという特性を持つことから、抗菌剤としての利用が期待されている。
【０００５】
イネ由来抗菌タンパク質として、オリザシスタチンが知られている。しかしながら、オリザシスタチンは、歯周病菌Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのジンジパインを阻害することが知られているものの、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの菌体に対して抗菌活性を示さない。また、ディフェンシンなど既知の抗菌タンパク質のホモログがイネに存在することが知られているが、これらのイネの感染症防御に対する寄与については、未だ不明な点が多い。本発明者らは、イネ種子に由来し、歯周病の治療や予防に有効なジンジパインインヒビターおよび抗菌活性を有するタンパク質およびペプチドを報告している（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−８４１６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、抗菌活性や炎症抑制活性等の感染防御作用を有するイネ由来成分を見出し、新規な感染防御用組成物およびその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする感染防御用組成物。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント
［２］前記（Ｃ）が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１５８位〜第１７０位、第２４１位〜第２５８位および第３０９位〜第３１８位から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むフラグメント、または該フラグメントにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメントであることを特徴とする前記［１］に記載の感染防御用組成物。
［３］感染防御作用が、有効成分の抗菌活性に基づくことを特徴とする前記［１］または［２］に記載の感染防御用組成物。
［４］感染防御作用が、有効成分の炎症抑制活性に基づくことを特徴とする前記［１］または［２］に記載の感染防御用組成物。
［５］炎症抑制活性が、エンドトキシン中和活性または炎症性サイトカイン産生抑制活性に基づくことを特徴とする前記［４］に記載の感染防御用組成物。
［６］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物を含有してなる飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品または飼料。
［７］以下の（ａ）または（ｂ）のペプチド。
（ａ）配列番号２〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）前記（ａ）のペプチドにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するペプチド
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、イネ由来のタンパク質またはそのフラグメントを有効成分とする感染防御用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】米（イネ種子）由来抗菌タンパク質のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムを用いた４段階目の精製におけるタンパク質溶出画分１〜３９に対して抗菌活性試験を行った結果を示す図である。
【図２】米（イネ種子）由来抗菌タンパク質のＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムを用いた４段階目の精製におけるタンパク質溶出画分５〜１６をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする感染防御用組成物を提供する。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するタンパク質
（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）の一部からなり、かつ感染防御作用を有するフラグメント
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）種子に存在し、抗菌活性を有するタンパク質として本発明者らが見出したタンパク質であり、ＩＤ：Ｏｓ０３ｇ０２７７３００としてＲｉｃｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲＡＰ−ＤＢ、http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）に登録されている。
【００１２】
本発明の感染防御用組成物の有効成分は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されず、感染防御作用を有する限り配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質でもよい。また、感染防御作用を有する限りこれらのタンパク質の一部からなるフラグメントでもよい。
【００１３】
「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的変異法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下、特に好ましくは２個以下、最も好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質から単離精製したものであってもよい。タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該タンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、本技術分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。より好ましくは、保存性置換、欠失、または付加であり、特に好ましくは、保存性置換である。
【００１４】
本発明の感染防御用組成物の有効成分が上記（Ａ）または（Ｂ）のフラグメントである場合、フラグメントのサイズは特に限定されないが、総アミノ酸残基数が約１００以下であることが好ましい。より好ましくは約８０残基以下、さらに好ましくは約５０残基以下、特に好ましくは約３０残基以下、最も好ましくは約２０残基以下である。フラグメントのサイズが小さいほど取り扱いが簡便であり、製造効率が向上し、抗原性等の副作用が軽減される点で有利である。
【００１５】
本発明の感染防御用組成物の有効成分として好適なフラグメントとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１５８位〜第１７０位、第２４１位〜第２５８位、第３０９位〜第３１８位から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列を含むフラグメントが挙げられる。また、感染防御作用を有する限り、当該フラグメントにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。具体的には、例えば以下の配列番号２〜６のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
［配列番号２］Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｓｅr
［配列番号３］Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙs−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
［配列番号４］Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
［配列番号５］Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ
［配列番号６］Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
【００１６】
配列番号２は配列番号１の第１５８位〜第１７０位、配列番号３は配列番号１の第２４１位〜第２５８位、配列番号４は配列番号１の第３０６位〜第３１９位、配列番号５は配列番号１の第１５６位〜第１７１位、配列番号６は配列番号１の第３０９位〜第３１８位のアミノ酸配列からなるペプチドである。
本発明には、以下の（ａ）または（ｂ）のペプチドが含まれる。
（ａ）配列番号２〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）前記（ａ）のペプチドにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ感染防御作用を有するペプチド
【００１７】
本発明の感染防御用組成物の有効成分となるタンパク質またはそのフラグメントは、例えば、公知の遺伝子工学的手法により当該タンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子を単離または合成して組み換え発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞に導入して組み換えタンパク質として発現させることにより製造することができる。または、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系によって製造することができる。または、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）もしくは液相合成法により製造することができる。
得られたタンパク質またはそのフラグメントが感染防御作用を有することは、例えば、抗菌試験、抗炎症試験、エンドトキシン中和試験等の公知試験方法を用いて確認することができる。少なくとも、抗菌活性および抗炎症活性のいずれかを有していれば、感染防御作用を有すると判断できる。
【００１８】
本発明の感染防御用組成物の有効成分となるタンパク質またはそのフラグメントを構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されたものでもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基などが挙げられる。
本発明の感染防御用組成物の有効成分となるタンパク質またはそのフラグメントは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。
【００１９】
さらに、本発明の感染防御用組成物の有効成分となるタンパク質またはそのフラグメントは、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているものもでもよい。
【００２０】
本発明の感染防御用組成物の有効成分となるタンパク質またはそのフラグメントは、薬学的に許容される塩を形成していてもよく、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属との塩、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
【００２１】
本発明の感染防御用組成物における感染防御作用は、抗菌活性および炎症抑制活性の少なくとも１つの活性に基づくものであることが好ましい。抗菌活性の対象は特に限定されず、各種の細菌、真菌等が挙げられる。本発明の感染防御用組成物は、歯周病菌のPorphyromonas gingivalis、Fusobacterium nucleatum、Eikenella corrodens等に対する抗菌活性が確認されているので、歯周病の治療または予防用医薬、口腔ケア製品、口腔ケア用食品等の有効成分として有用である。また、本発明の感染防御用組成物は、ニキビ菌のPropionibacteium acnesや真菌のCandida albicansに対する抗菌活性が確認されているので、ニキビの治療または予防用医薬、ニキビケア用化粧品、カンジダ症の（例えば、口内炎、口角炎、外陰部膣炎、皮膚炎、爪（周囲）炎など）治療または予防用医薬等の有効成分として有用である。また、本発明の感染防御用組成物は、炎症抑制活性の１種であるエンドトキシン中和活性を有することが確認されていることから、本発明の感染防御用組成物が炎症性サイトカイン産生抑制活性を有することは自明である。したがって、本発明の感染防御用組成物は、抗菌用組成物、抗菌剤、抗炎症用組成物、抗炎症剤、エンドトキシン中和剤または炎症性サイトカイン産生抑制剤などと換言することができる。
【００２２】
本発明の感染防御用組成物における有効成分の配合割合は、所望の感染防御効果が得られるのに十分な量であれば特に限定されない。通常全組成物の約０．０００１〜２０質量％であり、好ましくは０．００１〜１０質量％、より好ましくは０．００１〜５質量％である。本発明の感染防御用組成物は有効成分の感染防御作用を妨げない範囲で有効成分以外の成分を含有してもよい。有効成分以外の成分はとくに限定されず、後述する用途に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
本発明の感染防御用組成物は、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料、食品添加剤、飼料添加剤等として用いることができる。なかでも、飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品または飼料に用いることが好ましい。
【００２４】
本発明の感染防御用組成物を含有してなる飲食品は、食品衛生上許容される添加剤を混合して、特別用途食品、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品、栄養補助食品、経腸栄養食品、飲料等に加工することができる。飲食品の形態は特に限定されず、固形食品、半固形食品、飲料を含む液状食品、その他の各種の形態の飲食品として提供することができる。飲料としては、具体的には、果汁飲料、清涼飲料、アルコール飲料等が挙げられる。また、摂取時に水等を用いて希釈して摂取される形態であってもよい。固形食品としては、例えば、飴、トローチ等を含む錠剤（タブレット）や糖衣錠の形態、顆粒の形態、粉末飲料、粉末スープ等の粉末の形態、ビスケット等のブロック菓子類の形態、カプセル、ゼリー等の形態等、種々の形態の食品が挙げられる。半固形食品としては、例えば、ジャム等のペーストの形態、チューイングガム等のガムの形態が挙げられる。
【００２５】
これらの飲食品には本発明の感染防御用組成物の他に、目的の効果が損なわれない範囲で、食品素材、食品添加物を配合することができる。食品素材とは、一般に食品の原材料として使用される素材のことであり、薬事法で規定される医薬品および医薬部外品と、食品衛生法で規定される食品添加物を除き、飲食に供される全てのものが含まれる。食品添加物とは、食品の加工または保存の目的で添加される物質のことである。
【００２６】
食品添加物の例としては、厚生労働省の「指定添加物リスト」、「既存添加物名簿収載品目リスト」、「天然香料基原物質リスト」、「一般に食品として飲食に供させている物であって添加物として使用される品目リスト」等に収載される食品添加物、ＪＥＣＦＡ等の国際機関で安全性が確認されたもの、米国・欧州等の諸外国で使用が認可されている食品添加物等が挙げられ、保存料・日持向上剤、酸化防止剤、甘味料、着色料・色素、乳化剤、増粘ゲル化剤、品質改良剤、調味料、酸味料、強化剤、香料、酵素等に分類される。
【００２７】
本発明の感染防御用組成物を含有してなる医薬品、医薬部外品は、当該感染防御用組成物以外に、薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００２８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射剤用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。注射剤用の油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００２９】
本発明の感染防御用組成物を含有してなる化粧品は、当該感染防御用組成物以外に、化粧品として一般に使用されている成分、例えば、界面活性剤、保湿剤、動植物由来油脂、シリコーン類、高級アルコール、低級アルコール、動植物由来抽出エキス、紫外線吸収剤、消炎剤、金属封鎖剤、ビタミン類、酸化防止剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤、着色剤、各種香料などを目的に応じて適宜配合することができる。さらに、例えばチョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム、コロイドシリカナトリウムポリアクリレート等の粉体；グリセロール、ソルビトール、２−ピロリドン−５−カルボキシレート、ジブチルフタレート、ゼラチン、ポリエチレングリコール等の湿潤剤；密ろう、オゾケライトワックス、パラフィンワックス等のワックス類；着色料等を必要に応じ適宜組合せて用いることができる。
【００３０】
本発明の感染防御用組成物を含有してなる化粧品の形態は特に限定されない。例えば、適当な基材中に当該感染防御用組成物を溶解または混合分散させて、クリーム状、ペースト状、ジェリー状、ゲル状、乳液状、液状の形状になされたもの（軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、スプレー剤など）、基材中に当該感染防御用組成物を溶解または混合分散させたものを支持体上に展延したもの（パップ剤など）、粘着剤中に当該感染防御用組成物を溶解または混合分散させたものを支持体に展延したもの（プラスター剤、テープ剤など）、不敷布に含ませたもの（マスクなど）などが挙げられる。最終形態としては、特には限定されないが、クリーム、ローション、ジェル、ミスト、マスク、パック、シャンプー、リンス等が挙げられる。
【００３１】
本発明の感染防御用組成物を含有してなる飼料としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ等の家禽用飼料、イヌ、ネコ等のペット用飼料などが挙げられる。本発明の飼料は、飼料中に本発明の感染防御用組成物を添加する以外、一般的な飼料の製造方法を用いて加工製造することができる。
【００３２】
本発明の感染防御用組成物の有効成分は、食経験の長い米（イネ種子）に存在する成分であり、細胞毒性が無いことが溶血性試験により確認されているため安全性が高く、作用がマイルドであり、長期間の摂取または使用が可能である。また、本発明の感染防御用組成物の有効成分は、感染防御に関する複数の作用を兼ね備えた多機能成分であり、他の抗菌剤や抗炎症剤と併用することにより、相加的または相乗的な効果の向上が期待できる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いて、実験を実施することができる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明がない場合、それらに添付のプロトコールを用いることができる。また、当業者であれば本明細書の記載および前記した標準的なプロトコール集などの記載から容易に本発明を再現することができる。
【００３４】
〔実施例１：米（イネ種子）由来抗菌タンパク質の精製・同定〕
最初に砕米２００ｇを２Ｌの超純水に加え、３０分間攪拌した。次に砕米を取り出し、新たに２００ｇの砕米を加えて再度３０分間攪拌した。この操作を砕米２ｋｇ分繰り返した後に、溶液を遠心分離（６，０００×ｇ、４℃、１０分間）して得られた上澄を米タンパク質抽出液として使用した。
【００３５】
米タンパク質抽出液から、抗菌タンパク質を以下の手順で精製した。全ての操作は０〜４℃で行った。透析の際に使用する透析膜として、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＭＷＣＯ１０００（SPECTRUM）を使用した。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍカラム（５×１０ｃｍ）（TOSOH）に米タンパク質抽出液を供し、同バッファーで洗浄した後、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］の溶出液の濃度勾配により、吸着タンパク質を溶出した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎ、溶出量は５００ｍＬに設定し、フラクションコレクターＳＦ−２１２０（ADVANTEC）を用いて１０ｍＬずつワッセルマン試験管に分取した。
【００３６】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する抗菌活性を示す画分を回収し、脱塩のため２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析した。以降に示す全てのクロマトグラフィー操作は、タンパク質精製システムＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（GE Healthcare）を使用して行い、ろ過フィルターＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ａｃｅｔａｔｅ ０．２０μｍ（ADVANTEC）を用いてサンプルの前処理を行った。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラム（１．６×１０ｃｍ）（GE Healthcare）に透析内液を供し、同バッファーで洗浄した後、０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）］の溶出液の濃度勾配により吸着タンパク質を溶出した。流速は４ｍＬ／ｍｉｎ、溶出量は２００ｍＬに設定し、３ｍＬずつ分取した。
【００３７】
抗菌活性を示したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ分画画分には、３０％飽和、５０％飽和、７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを段階的に加え、ステップごとに遠心操作（１２，０００×ｇ、４℃、１０分間）を行って沈殿物を回収した。各沈殿物は少量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再溶解させた。抗菌活性を含む３０〜５０％飽和硫酸アンモニウム画分を回収し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で透析を行った。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラム（１．６×６０ｃｍ）（GE Healthcare）に透析内液を供し、同バッファーで溶出した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎ、溶出量は１２０ｍＬに設定し、２ｍＬずつ分取した。抗菌活性を含む画分をＯｓＡｍｐＩＩ（仮称：Oryza Sativa Antimicrobial protein II）の粗精製物とした。
【００３８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Auto Flex-IIITM；BRUKER DALTONICS）を用いてＯｓＡｍｐＩＩの質量分析を行った。分析には、マトリックスとしてＳｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＳＡ）（BRUKER DALTONICS）を選択した。アセトニトリルとトリフルオロ酢酸の混合液（100％Acetonitrile : 0.1%Trifluoroacetic acid（TFA）= 1 : 2）にＳＡを溶解してＳＡ飽和溶液を調製した。サンプルチューブ内でサンプル溶液とＳＡ飽和溶液を１：１で混合して、混合溶液をＭＴＰ ３８４ ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｔｅ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔｅｅｌ ＴＦ（BRUKER DALTONICS）にスポットした後、完全に乾燥するまで静置した。キャリブレーションには、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＩ（BRUKER DALTONICS）を用いてサンプルと同様に調製とスポットを行った。Ａｕｔｏ Ｆｌｅｘ・ＩＩＩＴＭの操作には、制御ソフトｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌＴＭ（BRUKER DALTONICS）を使用し、得られたＭＳスペクトルからＯｓＡｍｐＩＩの分子量を決定した。
【００３９】
各精製段階で得られた画分の抗菌活性試験は、以下の手順で行った。変法ＧＡＭ培地（実施例２参照）に８０μＬのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ細胞懸濁液を播種した後、３７℃のインキュベーターに入れて２４時間培養した。その後新たな培地に植え継いで、さらに１２時間培養した。得られた前培養液を段階希釈することでＯＤ６５０＝５．０×１０−５の菌液を調製した。次に、リザーバーを用意して、各レーンに３００μＬの１．３３倍濃度の培地、１００μＬのサンプル溶液、１００μＬの希釈した菌液を添加してよく混合した。ＢｌａｎｋとＣｏｎｔｒｏｌにはサンプルの代わりに同量の滅菌水を添加し、Ｂｌａｎｋには培養液の代わりに１倍濃度の培地を同量添加した。混合液は９６穴培養プレート（Corning）に各ウェル１００μＬずつ分注した。その後嫌気ジャー（三菱ガス化学）を用いて３７℃で嫌気培養した。
【００４０】
抗菌活性は、生菌に由来するＡＴＰを定量することで評価した。生菌に由来するＡＴＰの定量は、ＢａｃＴｉｔｅｒ・ＧｌｏＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Promega）を用いたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光法により行った。まず、培養プレートの各ウェルに分注した１００μＬ菌懸濁液に対して１０μＬのルシフェールＡＴＰ消去試薬（Kikkoman）を添加し、１０分間攪拌することで生菌体外に存在するＡＴＰを分解消去させた。次に、あらかじめＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の各ウェルに分注した５０μＬのＡＴＰ発光試薬に、各細胞懸濁液を５０μＬ添加した。各ウェルの生菌に由来するＡＴＰ発光強度（発光波長５６０ｎｍ）は、マイクロプレートリーダー１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ ＡＲＶＯＴＭＭＸ（PerkinElmer）を用いてＲｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ（RLU）として測定した。抗菌活性は、抗菌成分を含まないＣｏｎｔｒｏｌのＲＬＵを指標とした相対値（％）で表した。１サンプルにつき２回測定を行い、測定はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの対数増殖期初期にあたる、培養後４８〜６０ｈに行った。
【００４１】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムで分画した際の、タンパク質溶出画分１〜３９に対して抗菌活性試験を行った結果を図１に示した。また、画分５〜１６をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色を行った結果を図２に示した。図１から明らかなように、画分９〜１１に強い抗菌活性が検出された。図２から、４０ｋＤａ付近に検出されたタンパク質バンドがＯｓＡｍｐＩＩであると推定された。
【００４２】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇ分画画分１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＣＢＢ染色）からバンドを切り取って、トリプシン消化断片を調製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるＰＭＦ解析に供した。その結果、ＯｓＡｍｐＩＩは、分子量７１，９３２Ｄａ、６５３アミノ酸残基（配列番号１）を有する機能不明タンパク質Ｏｓ０３ｇ０２７７３００の部分配列であると同定した。ＢＬＡＳＴ検索（http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）の結果、ＯｓＡｍｐＩＩはヒト由来の熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）のＮ末端領域と高い相同性（72% Identity）を示すことが分かった。
【００４３】
〔実施例２：ＯｓＡｍｐＩＩ由来ペプチドによる抗菌スペクトルの検討（１）〕
（１）ペプチド
実施例１で同定したタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて、タンパク質表面にあり、α−へリックス構造を取り、疎水性残基と塩基性残基をともに含んでいる部分を検索した結果、表１に記載の５種類のペプチドを合成して、抗菌スペクトルを検討した。各ペプチドは、ペプチド合成装置（Thuramed社製Tetras 106）を用いて合成し、カラム（Akzonobel社製Kromasil C18）を装着したＨＰＬＣ（SHIMADZU社製10A system）にて以下の精製条件で精製した。
＜精製条件＞
・溶媒Ａ：０．１質量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
・溶媒Ｂ：０．１質量％トリフルオロ酢酸を含む水
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・波長：２２０ｎｍ
・インジェクション容量：２０μＬ
・グラジエント条件：０．０１ｍｉｎ（溶媒Ａ１０％、溶媒Ｂ９０％）→２５．０ｍｉｎ（溶媒Ａ３５％、溶媒Ｂ６５％）→２５．１ｍｉｎ（溶媒Ａ１００％、溶媒Ｂ０％）→３０ｍｉｎ（ＳＴＯＰ）
【００４４】
【表１】
2013060416.tif 000002
【００４５】
（２）使用菌株
被験菌として、グラム陰性菌であるPorphyromonas gingivalis JCM 8525、W50、ATCC 33277、Escherichia coli K-12、Pseudomonas aeruginosa NBRC 13275、グラム陽性菌であるStreptococcus mutans JCM 5705、Staphylococcus aureus NBRC 12732、NBRC 100910、Propionibacteium acnes JCM 6473、および真菌類であるCandida albicans NBRC 1385を用いた。
【００４６】
（３）抗菌試験
各ペプチドを最終濃度０．１４５ｍＭとなるように培地に添加し、被験菌を培養した。
P. gingivalis JCM8525、W50、ATCC 33277は、変法ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン５．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン５．０ｇ、消化血清末１０．０ｇ、酵母エキス末２．５ｇ、肉エキス末２．２ｇ、肝臓エキス末１．２ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−トリプトファン０．２ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、Ｌ−アルギニン１．０ｇ、ビタミンＫ１０．００５ｇ、ヘミン０．０１ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、ｐＨ７．３）を用いて絶対嫌気条件下、３７℃で４８時間静置培養した。
E. coli K-12は、ＬＢ培地（１Ｌ中、トリプトン１０．０ｇ、酵母エキス５．０ｇ、塩化ナトリウム１０．０ｇ、ｐＨ７．０）またはＴＳＢ培地（１Ｌ中、カゼイン製ペプトン１７．０ｇ、ダイズ製ペプトン３．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、ブドウ糖２．５ｇ、リン酸水素二カリウム２．５ｇ、ｐＨ７．３）を用いて通性嫌気条件下、３７℃で４時間静置培養した。
P. aeruginosa NBRC 13275、S. aureus NBRC 12732、S. aureus NBRC 100910の培地には、上記のＴＳＢ培地を用いた。P. aeruginosa NBRC 13275は通性嫌気条件下、３０℃で１０時間静置培養した。S. aureus NBRC 12732は通性嫌気条件下、３７℃で１０時間静置培養した。S. aureus NBRC 100910は通性嫌気条件下、３７℃で６時間静置培養した。
S. mutans JCM 5705は、ＢＨＩ培地（１Ｌ中、豚脳エキス末４．０ｇ、豚ハートエキス末４．０ｇ、ペプトン１７．５ｇ、ブドウ糖２．０ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム２．５ｇ、ｐＨ７．２）を用いて通性嫌気条件下、３７℃で６時間静置培養した。
P. acnes JCM 6473は、ＧＡＭ培地（１Ｌ中、ペプトン１０．０ｇ、ダイズペプトン３．０ｇ、プロテオーゼペプトン１０．０ｇ、消化血清末１３．５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、肉エキス２．２ｇ、肝臓エキス１．２ｇ、ブドウ糖３．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、塩化ナトリウム３．０ｇ、溶性デンプン５．０ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩０．３ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．３ｇ、ｐＨ７．１）を用いて通性嫌気条件下、３７℃で２４時間静置培養した。
C. albicans NBRC 1385は、ＹＭ培地（１Ｌ中、グルコース１０．０ｇ、ペプトン５．０ｇ、酵母エキス３．０ｇ、麦芽エキス１．０ｇ、ｐＨ６．２）を用いて通性嫌気条件下、２５℃で２４時間静置培養した。
抗菌活性の評価は、実施例１と同様の方法で行った。すなわち、１００μＬの菌懸濁液を用いて生菌に由来するＡＴＰを定量することで評価した。
【００４７】
結果を表２に示した。表２において、抗菌活性の有無は％の値とＮＤで表示し、％の値が高いほど抗菌活性が強く、ＮＤは抗菌活性を示さないことを表す。また、表２中「−」は抗菌試験を実施していないことを表す。表２から明らかなように、Ｈｓｐ７０（１５８−１７０）、Ｈｓｐ７０（２４１−２５８）、Ｈｓｐ７０（３０６−３１９）、Ｈｓｐ７０（１５６−１７１）およびＨｓｐ７０（３０９−３１８）は、いずれもP. gingivalis JCM 8525、W 50、ATCC 33277に対して抗菌活性を示した。一方、これらのペプチドは、グラム陰性菌のE. coli K-12、P. aeruginosa NBRC 13275、グラム陽性菌のS. mutans JCM 5705、S. aureus NBRC 12732、S. aureus NBRC 100910に対して抗菌活性を示さなかった。Ｈｓｐ７０（２４１−２５８）はニキビ菌であるP. acnes JCM 6473に対して弱い抗菌活性を示し、日和見感染菌（真菌）のCandida albicans NBRC 1385に対して抗菌活性を示した。他のペプチドは、P. acnes JCM 6473およびCandida albicans NBRC 1385に対して抗菌活性を示さなかった。
【００４８】
【表２】
2013060416.tif 000003
【００４９】
〔実施例３：ＯｓＡｍｐＩＩ由来ペプチドによるエンドトキシン中和活性の検討〕
「エンドスペシーＥＳ−５０Ｍセット」（生化学バイオビジネス株式会社）および「エンドトキシン標準品ＣＳＥ−Ｌセット」（生化学バイオビジネス株式会社）を用いてエンドトキシン中和活性を評価した。
ペプチドには、表１に記載のＨｓｐ７０（２４１−２５８）を用いた。９６穴プレートの各ウェルにエンドトキシン標準品（０．１０ＥＵ／ｍＬ）２５μＬおよびペプチド溶液（最終濃度１μＭおよび１０μＭ）を加えて、３７℃で２０、２５、３０または３５分間浸透しながらインキュベーションした。続いて、ＬＡＬ試薬５０μＬを各ウェに添加し、３７℃で１０分間浸透しながらインキュベーションした。その後、マイクロプレートリーダー２０３０ ＡＲＶＯ Ｘ（Perkin Elmer）を用いて、波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。ペプチド溶液の代わりに蒸留水（エンドトキシンフリー）を添加したものをコントロールとし、コントロール（０μＭ）の吸光度を１００％とした時の相対値をエンドトキシン中和活性とした。
【００５０】
結果を表３に示した。表３から明らかなように、Ｈｓｐ７０（２４１−２５８）は濃度依存的にエンドトキシンを中和することが示された。
【００５１】
【表３】
2013060416.tif 000004
【００５２】
〔実施例４：ＯｓＡｍｐＩＩ由来ペプチドによる抗菌スペクトルの検討（２）〕
（１）ペプチド
Ｈｓｐ７０（２４１−２５８）、Ｈｓｐ７０（１５６−１７１）およびＨｓｐ７０（３０９−３１８）の３種類のペプチドを用いた（表１参照）。
（２）使用菌株
被験菌として、グラム陰性菌であるPorphyromonas gingivalis W 83、Aggregatibacter actinomycetemcomitans 310a、Fusobacterium nucleatum ATCC 25586、およびEikenella corrodens ATCC 23834を用いた。
（３）抗菌試験
各ペプチドを最終濃度０．１４５ｍＭとなるように培地に添加し、被験菌を培養した。
P. gingivalis W 83は、変法ＧＡＭ培地（実施例２参照）を用いて絶対嫌気条件下、３７℃で４８時間静置培養した。A. actinomycetemcomitans 310a、F. nucleatum ATCC 25586、およびE. corrodens ATCC 23834は、ＴＳＢ培地（実施例２参照）を用いて絶対嫌気条件下、３７℃で静置培養した。培養時間は、A. actinomycetemcomitans 310aが１４時間、F. nucleatum ATCC 25586が５時間、E. corrodens ATCC 23834が２０時間とした。
抗菌活性の評価は、実施例１と同様の方法で行った。すなわち、１００μＬの菌懸濁液を用いて生菌に由来するＡＴＰを定量することで評価した。
【００５３】
結果を表４に示した。表４において、抗菌活性の有無は％の値とＮＤで表示し、％の値が高いほど抗菌活性が強く、ＮＤは抗菌活性を示さないことを表す。また、表４中「−」は抗菌試験を実施していないことを表す。表４から明らかなように、Ｈｓｐ７０（２４１−２５８）、Ｈｓｐ７０（１５６−１７１）およびＨｓｐ７０（３０９−３１８）は、いずれもP. gingivalis W 83に対して抗菌活性を示した。一方、これらのペプチドは、A. actinomycetemcomitans 310aに対して抗菌活性を示さなかった。Ｈｓｐ７０（２４１−２５８）は、E. corrodens ATCC 23834に抗菌活性を示したが、F. nucleatum ATCC 25586にはほとんど抗菌活性を示さなかった。Ｈｓｐ７０（１５６−１７１）はF. nucleatum ATCC 25586およびE. corrodens ATCC 23834に弱い抗菌活性を示した。Ｈｓｐ７０（３０９−３１８）はF. nucleatum ATCC 25586およびE. corrodens ATCC 23834のいずれにも抗菌活性を示さなかった。
【００５４】
実施例２および４の結果から、実験に供したペプチドは、歯周病菌のP. gingivalis、F. nucleatumおよびE. corrodens、ならびに日和見感染菌（真菌）のCandida albicansに抗菌活性を示し、ニキビ菌のPropionibacteium acnesに弱い抗菌活性を示すことが明らかとなった。
【００５５】
【表４】
2013060416.tif 000005
【００５６】
〔実施例５：ＯｓＡｍｐＩＩ由来ペプチドの細胞毒性（溶血性試験）〕
０〜１ｍＭのＨｓｐ７０（１５８−１７０）、Ｈｓｐ７０（２４１−２５８）およびＨｓｐ７０（３０６−３１９）について溶血性試験を行い、ＯｓＡｍｐＩＩ由来ペプチドの細胞毒性を試験した。
（１）溶血性試験
(a) ２ｍｌ用マイクロテストチューブに４０μＬの緬羊脱繊維無菌血液（コスモバイオ）を分注した。
(b) さらに９６０μＬの０．８％塩化ナトリウム入りリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）をマイクロテストチューブに加え、血液濃度を４％（ｖ／ｖ）にした。
(c) 上記(b)の血液懸濁液を遠心分離した（５０００ｒｐｍ、５分間）。
(d) ピペットマンを用いて、上清液を廃棄した。
(e) (b)〜(d)を３回繰り返すことにより、遠心分離後の上清液が透明になったことを確認し、これを血液サンプルとした。
(f) ９６穴マイクロプレートに血液サンプルを各ウェルに５０μＬずつ分注した。
(g) 任意の濃度に希釈したペプチドとＰＢＳの合計が５０μＬになるように各ウェルに分注した。
(h) ３７℃にて１時間インンキュベートした。
(i) マイクロプレートごと遠心分離した（４０００ｒｐｍ、１０分間）。
(j) 新しい９６穴マイクロプレートを用意し、ＰＢＳを各ウェルに１５０μＬずつ分注した。
(k) 各サンプルの上清液を５０μＬずつ(j)のプレートに移した。
(l) 十分に混合した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５７】
０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（非イオン性界面活性剤）を用いて赤血球を破壊したときの溶血活性を１００％とし、ＰＢＳを添加したときの溶血活性を０％とした。ハチ毒に含まれるペプチドＭｅｌｉｔｔｉｎを陽性対照として用いた。
結果を表５に示した。表５から明らかなように、各ペプチドには溶血活性がなく、細胞毒性がないことが示された。
【００５８】
【表５】
2013060416.tif 000006
【００５９】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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