(57)【要約】【課題】支持体とプライマー層とエチレングリコール鎖を含む親水性層とを備える基材の従来の製造方法では、プライマー層の形成工程と親水性層の形成工程とを別の工程として行う必要があった。【解決手段】ポリシロキサンを形成可能なケイ素化合物と、エチレングリコール鎖を含む親水性化合物とを予め混合した混合物を、支持体表面に接触させることにより、支持体表面において、ポリシロキサンを含むプライマー層と、プライマー層に結合したエチレングリコール鎖を含む親水性層とを、実質的に同時に形成することができる。【選択図】図１
2013205161.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と
前記支持体の表面上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層と、
前記プライマー層のポリシロキサン側鎖に、共有結合を介して連結された、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を含む親水性層と
を含む、親水性層を有する基材の製造方法であって、
次式：
【化１】
2013205161.tif 000022
（式中、Ｘは、官能基Ｘ１を少なくとも一部に含む有機基を表し、
Ｒは水素原子、メチル基、エチル基、又はアセチル基を表し、
ｎは０又は１を表す）
で表されるケイ素化合物と、
次式：
【化２】
2013205161.tif 000023
（式中、ｍは１以上の整数を表し、
Ｙ１は、水素、又は、Ｘ１と共有結合を形成可能な官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基を表し、
Ｙ２は、Ｙ１とは独立に、メチル、水素、又は、Ｘ１と共有結合を形成可能な官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基を表す）
で表される親水性化合物とを少なくとも含む混合物を、前記支持体に接触させる工程を含む、
前記基材の製造方法。
【請求項２】
以下の条件１〜３：
（条件１）
Ｘ１がエポキシ基またはアルデヒド基であり、
Ｙ１が水素であり、且つ、
Ｙ２が、メチル又は水素である；
（条件２）
Ｘ１がアミノ基であり、
Ｙ１が、Ｙ３として(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基又はグリシジル基を少なくとも一部に含む有機基であり、
Ｙ２が、メチル、或いは、Ｙ１と同一の有機基である；
（条件３）
Ｘ１がヒドロキシル基であり、
Ｙ１が、Ｙ３としてグリシジル基を少なくとも一部に含む有機基であり、
Ｙ２が、メチル、或いは、Ｙ１と同一の有機基である；
のいずれかを満足する、請求項１の方法。
【請求項３】
前記混合物が酸触媒または塩基触媒を更に含む、請求項１又は２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的分析や細胞培養などに用いるための親水性層を有する基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、親水性層を有する基材は、タンパク質の吸着や細胞の接着を抑制するため、生化学的分析や浮遊系細胞培養に有用である。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する基材が上記目的に適している。また、ＰＥＧ鎖を介して抗体や抗原を固定化した基材は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫アッセイで感度の高い測定を可能にする。
【０００３】
特許文献１には、核酸を固定化するためのＰＥＧ鎖を有する基材の製造方法が開示されている。具体的には、アミノシランを適用してアミノ基を導入したガラス表面にＰＥＧ鎖の片末端を連結し、別の末端に核酸を連結する。
【０００４】
特許文献２には、細胞接着を抑制するためのＰＥＧ鎖を有する基材の製造方法が開示されている。具体的には、エポキシシランを適用してエポキシ基を導入したガラス表面にＰＥＧ鎖の片末端を連結する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−５０９２０１号公報
【特許文献２】特開２００７−３１２７３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の、ＰＥＧ鎖を有する基材の製造方法は、支持体表面にポリシロキサンを含むプライマー層を形成する工程を初めに行い、その後に、プライマー層へＰＥＧ鎖を結合させて親水性層を形成する工程を行う方法であった。これら二つの工程を同時に行うことができないため、従来の方法は工程数が多いという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、縮重合によりポリシロキサンを形成可能なケイ素化合物と、１つ以上のエチレングリコール単位を含む親水性化合物とを予め混合した混合物を、支持体表面に接触させることにより、ポリシロキサンを含むプライマー層と、エチレングリコール鎖を含む親水性層とを、実質的に同時に形成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明群を包含する。
（１）支持体と
前記支持体の表面上に配置された、ポリシロキサンを含むプライマー層と、
前記プライマー層のポリシロキサン側鎖に、共有結合を介して連結された、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖を含む親水性層と
を含む、親水性層を有する基材の製造方法であって、
次式：
【化１】
2013205161.tif 000003
（式中、Ｘは、官能基Ｘ１を少なくとも一部に含む有機基を表し、
Ｒは水素原子、メチル基、エチル基、又はアセチル基を表し、
ｎは０又は１を表す）
で表されるケイ素化合物と、
次式：
【化２】
2013205161.tif 000004
（式中、ｍは１以上の整数を表し、
Ｙ１は、水素、又は、Ｘ１と共有結合を形成可能な官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基を表し、
Ｙ２は、Ｙ１とは独立に、メチル、水素、又は、Ｘ１と共有結合を形成可能な官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基を表す）
で表される親水性化合物とを少なくとも含む混合物を、前記支持体に接触させる工程を含む、
前記基材の製造方法。
（２）以下の条件１〜３：
（条件１）
Ｘ１がエポキシ基またはアルデヒド基であり、
Ｙ１が水素であり、且つ、
Ｙ２が、メチル又は水素である；
（条件２）
Ｘ１がアミノ基であり、
Ｙ１が、Ｙ３として(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基又はグリシジル基を少なくとも一部に含む有機基であり、
Ｙ２が、メチル、或いは、Ｙ１と同一の有機基である；
（条件３）
Ｘ１がヒドロキシル基であり、
Ｙ１が、Ｙ３としてグリシジル基を少なくとも一部に含む有機基であり、
Ｙ２が、メチル、或いは、Ｙ１と同一の有機基である；
のいずれかを満足する、（１）の方法。
（３）前記混合物が酸触媒または塩基触媒を更に含む、（１）又は（２）の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、支持体の表面にポリシロキサンを含むプライマー層を介してエチレングリコール鎖を含む親水性層が形成された、親水性層を有する基材の製造において、プライマー層の形成と親水性層の形成を実質的に同時に行うことが可能である。このためプライマー層を形成させた後の洗浄と乾燥を省くことができるなど、手順の簡略化が実現される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ポリスチレンを支持体とする本発明の一実施形態である。
【図２】ポリスチレンを支持体とする本発明の一実施形態で、ＰＥＧ鎖の自由末端に被固定化物質と共有結合可能な官能基が連結される。
【図３】ガラスを支持体とする本発明の一実施形態である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（支持体）
本発明における支持体の材料は、生化学的分析や細胞培養の支持体として利用可能なものであれば特に限定されない。具体的には、プラスチック、ガラス、石英、シリコン、金属等が挙げられる。プラスチックは成型が容易であること、輸送及び廃棄上の問題が小さいことから上記用途に特に好ましい。プラスチックの具体例としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、環状ポリオレフィン、アクリル樹脂、ポリエチレンテレフタラートなどが挙げられる。
【００１１】
本発明における支持体の形態は、上記用途に利用可能であれば特に限定されない。例えばマイクロウェルプレート（複数の凹部が形成された板状体）、シャーレ、フラスコ、粒子、スライド、チューブ、キャピラリー、マイクロ流路などの形態の支持体を用いることができる。特にマイクロウェルプレート、とりわけポリスチレン製のマイクロウェルプレートの形態の支持体は有用である。
【００１２】
支持体の表面にはプライマー層が物理的又は化学的な結合により配置される。プライマー層の接着性を向上させる目的で支持体表面に適当な前処理を施しても良い。具体的には、プラズマ照射、コロナ放電、ガンマ線照射、紫外線照射、酸化剤処理、酸処理、アルカリ処理などが挙げられる。
【００１３】
（有機基を含むケイ素化合物）
支持体表面と親水性層との間に介在するプライマー層は、下記のケイ素化合物が縮重合したポリシロキサンを含む。
【００１４】
有機基を含むケイ素化合物は、次式：
【化３】
2013205161.tif 000005
で表される。ここで、Ｘは、官能基Ｘ１を少なくとも一部に含む有機基を表す。Ｒは水素原子、メチル基、エチル基、アセチル基のいずれかを表す。ｎは０又は１を表す。
【００１５】
ここで、官能基Ｘ１は、親水性層を構成するための後述する親水性化合物が有する官能基Ｙ１と共有結合を形成可能な官能基であれば特に限定されない。官能基Ｘ１としてはエポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、シアノ基、イソシアネート基、スルホニル基などが例示でき、好ましくは、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基又はヒドロキシル基である。
官能基Ｘ１は、有機基Ｘの全体であってもよいし一部であってもよい。
【００１６】
Ｘ１がエポキシ基である有機基Ｘの例としては、３−グリシドキシプロピル、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルが挙げられる。これらの有機基Ｘは次のような構造Ｓ１をもつ。
【００１７】
【化４】
2013205161.tif 000006
（式中、＊はケイ素原子への結合を表す）。
【００１８】
Ｘ１がエポキシ基である有機基Ｘを含むケイ素化合物の例としては、３−グリシドキシプロピルトトリメトキシシランおよびその加水分解物、３−グリシドキシプロピルトトリエトキシシランおよびその加水分解物、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシランおよびその加水分解物、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシランおよびその加水分解物、２−(３，４−エポキシシクロヘキシル)エチルトリメトキシシランおよびその加水分解物などが挙げられる。
【００１９】
Ｘ１がヒドロキシル基である有機基Ｘの例としては、上記のエポキシ基を含む有機基Ｘのエポキシ基を加水分解した基が挙げられる。すなわち、有機基Ｘは次のような構造Ｓ２をもつ。
【００２０】
【化５】
2013205161.tif 000007
（式中、＊はケイ素原子への結合を表す）。
【００２１】
Ｘ１がヒドロキシル基である有機基Ｘを含むケイ素化合物の例としては、上記のエポキシ基を含む有機基Ｘを有するケイ素化合物を加水分解した化合物が挙げられる。より具体的には、Ｘ１がエポキシ基である有機基Ｘを含むケイ素化合物として上記した化合物において、３−グリシドキシプロピル又は２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルが上記構造Ｓ２で表される有機基Ｘにより置換された化合物が挙げられる。
【００２２】
Ｘ１がアルデヒド基である有機基Ｘの例としては、上記のヒドロキシル基を含む有機基Ｘを過ヨウ素酸ナトリウムなどで酸化開裂した基が挙げられる。すなわち、有機基Ｘは次のような構造Ｓ３をもつ。
【００２３】
【化６】
2013205161.tif 000008
（式中、＊はケイ素原子への結合を表す）
【００２４】
Ｘ１がアルデヒド基である有機基Ｘを含むケイ素化合物の例としては、上記のヒドロキシル基を含む有機基Ｘを過ヨウ素酸ナトリウムなどで酸化開裂した化合物が挙げられる。より具体的には、Ｘ１がヒドロキシル基である有機基Ｘを含むケイ素化合物として上記した化合物において、上記構造Ｓ２で表される有機基Ｘが上記構造Ｓ３で表される有機基Ｘにより置換された化合物が挙げられる。
【００２５】
Ｘ１がアミノ基である有機基Ｘの例としては、３−アミノプロピル、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルが挙げられる。これらの有機基Ｘは次のような構造Ｓ４をもつ。
【００２６】
【化７】
2013205161.tif 000009
（式中、＊はケイ素原子への結合を表す）
【００２７】
Ｘ１がアミノ基である有機基Ｘを含むケイ素化合物の例としては、３−アミノプロピルトリメトキシシランおよびその加水分解物、３−アミノプロピルトリエトキシシランおよびその加水分解物、３−アミノプロピルメチルジメトキシシランおよびその加水分解物、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシランおよびその加水分解物、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルトリエトキシシランおよびその加水分解物、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルメチルジメトキシシランおよびその加水分解物、などが挙げられる。
【００２８】
（官能基を含む親水性化合物）
親水性層を形成するための親水性化合物は、以下の式：
【化８】
2013205161.tif 000010
で表される。
式中、ｍは１以上の整数を表す。
【００２９】
本発明では前記親水性化合物における次式：
【化９】
2013205161.tif 000011
（ｍは重合度を示す１以上の整数である）
で表される構造を、「１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖」、或いは、「ＥＧ鎖」と呼ぶことがある。「ＥＧ鎖」には複数のエチレングリコール単位からなるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖も包含される。
【００３０】
ＥＧ鎖の数平均分子量は、最終的に製造される基材を浮遊系細胞培養に用いる場合は４４以上であることが好ましく、ＥＬＩＳＡに用いる場合は１７６以上であることが好ましい。ＥＧ鎖の数平均分子量に上限はないが、数平均分子量が大きくなるほど粘度が増すため取扱いが難しくなること、及び、ＥＧ鎖の高密度での配置が難しいことから、２５０００以下であることが好ましく、１００００以下であることがより好ましい。ここで、ＥＧ鎖の数平均分子量は、親水性化合物として用いられるエチレングリコール（ＥＧ）、ＥＧ誘導体、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はＰＥＧ誘導体、或いは、最終的に製造される基材から解離させたＥＧ又はＰＥＧ：
【化１０】
2013205161.tif 000012
（ｍは重合度を示す１以上の整数である）
の数平均分子量からＨ２Ｏの分子量（１８．０１５）を控除することにより求めることができる。ＥＧ又はＰＥＧの数平均分子量は蒸気圧浸透圧法又は膜浸透圧法によって求められる。蒸気圧浸透圧法はＥＧ又はＰＥＧの数平均分子量が１００，０００未満のときに使用することができる。膜浸透圧法はＰＥＧの数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００のときに使用することができる。
【００３１】
前記親水性化合物において、Ｙ１は、水素、又は、Ｘ１と共有結合を形成可能な官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基を表す。
【００３２】
Ｙ１が水素である場合、酸素原子と一体となって、Ｘ１と共有結合を形成可能なヒドロキシル基を形成する。
【００３３】
Ｙ１は、Ｘ１と共有結合を形成可能な官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基であることができる。この実施形態において、官能基Ｙ３は、有機基Ｙ１の全体であってもよいし一部であってもよい。
【００３４】
有機基Ｙ１に含まれる官能基Ｙ３としてはヒドロキシル基、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、グリシジル基等が挙げられる。有機基Ｙ１は、官能基Ｙ３のみからなるものであることが好ましい（ただしその場合、Ｙ３がヒドロキシル基であることはない）。全体が、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、または、グリシジル基である有機基Ｙ１は、それぞれ以下の構造（各式中、＊は酸素原子への結合を表す）を有する。
【００３５】
【化１１】
2013205161.tif 000013
【化１２】
2013205161.tif 000014
【化１３】
2013205161.tif 000015
【００３６】
前記親水性化合物において、Ｙ２は、Ｙ１とは独立に、メチル、水素、又は、Ｘ１と共有結合を形成可能な官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基を表す。「官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基」は、Ｙ１に関して上述したものと同様の構造を有することができる。特に好ましい実施形態では、Ｙ２はメチルである、或いは、Ｙ２は、Ｙ１と同一の、水素、又は、前記官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基である。
【００３７】
Ｙ１及びＹ２がともに水素である前記親水性化合物は、エチレングリコール（ＥＧ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。これらの化合物は容易に入手可能である。
【００３８】
Ｙ１が水素であり、Ｙ２がメチルである前記親水性化合物は、モノメトキシＥＧ又はモノメトキシＰＥＧである。これらの化合物は容易に入手可能である。
【００３９】
Ｙ１及びＹ２の少なくとも一方が、官能基Ｙ３を少なくとも一部に含む有機基である親水性化合物は、ＥＧ、ＰＥＧ、モノメトキシＥＧ、モノメトキシＰＥＧなどを出発原料として適宜誘導体化することによって製造することができる。例えば以下の具体例が挙げられる。
【００４０】
Ｙ１及びＹ２がともに(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基である親水性化合物は、ＥＧ又はＰＥＧに１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を反応させることによって得られる。
【００４１】
Ｙ１が (１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基であり、Ｙ２がメチルである親水性化合物は、モノメトシキＥＧ又はモノメトシキＰＥＧにＣＤＩを反応させることによって得られる。
【００４２】
Ｙ１及びＹ２がともにＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル基である親水性化合物は、ＥＧ又はＰＥＧに炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（ＤＳＣ）を反応させることによって得られる。
【００４３】
Ｙ１が Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基であり、Ｙ２がメチルである親水性化合物は、モノメトシキＥＧ又はモノメトシキＰＥＧにＤＳＣを反応させることによって得られる。
【００４４】
Ｙ１及びＹ２がともにグリシジル基である親水性化合物は、ＥＧ又はＰＥＧにエピクロロヒドリンを反応させることによって得られる。
【００４５】
Ｙ１がグリシジル基であり、Ｙ２がメチルである親水性化合物は、モノメトシキＥＧ又はモノメトシキＰＥＧにエピクロロヒドリンを反応させることによって得られる。
【００４６】
（プライマー層と親水性層の形成方法）
プライマー層と親水性層の形成は、例えば以下のように行なわれる。まず、上記ケイ素化合物と上記親水性化合物を少なくとも含む混合物を調製する。ここで、上記ケイ素化合物に含まれる官能基Ｘ１と、上記親水性化合物に含まれる化学構造Ｙ１（又はＹ１−Ｏ−）とが、共有結合を形成可能な組合せとなるように選択される。上記親水性化合物は溶媒としても機能するため、他の溶媒を添加しなくとも、前記混合物は溶液の形態をとることができる。
【００４７】
前記混合物全量あたりの前記ケイ素化合物の終濃度は０．１〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲が適当である。
【００４８】
前記混合物には、更に、酸や塩基などの触媒が添加されていることが好ましい。酸触媒としては、硫酸やパラトルエンスルホン酸などを用いることができるが、不揮発性の硫酸が好ましい。塩基触媒としては、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、トリエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンなどを用いることができるが、不揮発性のＤＭＡＰが好ましい。これらの触媒は、ケイ素化合物の重縮合反応およびケイ素化合物に含まれる官能基Ｘ１と前記親水性化合物との結合を促進する。前記混合物全量あたりの触媒の濃度は０．０１〜１％（ｗ／ｗ）の範囲で調製すればよい。
【００４９】
次に、前記混合物を支持体表面に所定時間接触させる。接触時間は１分〜２４時間の範囲が好ましい。支持体を加熱して反応を促進させてもよい。加熱温度は、支持体がガラスの場合は８０〜１２０℃、プラスチックの場合は６０〜８０℃が適当である。最後に、支持体を純水やアルコールでよく洗浄し、乾燥する。
【００５０】
プライマー層と親水性層が実質的に同時に形成されるメカニズムは以下のように推定される。まず、前記親水性化合物の系中でケイ素化合物の縮重合反応が起こり、ポリシロキサンを含むプライマー層が支持体表面に物理的または化学的に結合する。支持体の表面がプラスチックの場合は、プライマー層は該表面に物理的に結合する。ここで「物理的に結合する」とは、イオン結合、水素結合、分子間力、疎水性相互作用などの非共有結合性の相互作用により結合することを意味する。支持体の表面がガラスや石英の場合は、プライマー層は共有結合により結合する。このようなプライマー層の形成と同時に、プライマー層のポリシロキサン側鎖に存在する官能基Ｘ１と前記親水性化合物が有するＹ１（又はＹ１−Ｏ−）とが反応し、共有結合が形成される。これにより、プライマー層の上部にＥＧ鎖を含む親水性層が形成される。ケイ素化合物の縮重合によるポリシロキサンの生成反応は、ポリシロキサン側鎖と前記親水性化合物との共有結合形成よりも反応速度が速いと考えられる。反応系中ではプライマー層の形成が先に進み、次いで親水性層が形成されているために、一段階の操作により、プライマー層と親水性層とを順に支持体表面に形成することが可能となると推定される。
【００５１】
親水性層においてＥＧ鎖の一端が自由末端の形態である場合には、親水性層を形成させた後に、該自由末端に、被固定化物質と共有結合可能な官能基を連結させてもよい。このような官能基としては、例えば(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等）、ハロゲン化カルボニル基（塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基）等が挙げられる。これらの官能基は、ＥＧ鎖の末端のヒドロキシル基の水素を置換する置換基として、ＥＧ鎖に直接的に連結されていてもよいし、ＥＧ鎖の末端に結合したリンカー構造に結合した官能基として、ＥＧ鎖に間接的に連結されていてもよい。被固定化物質への反応性と、保存安定性のバランスを考慮すると、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基が好ましい。これらの官能基は被固定化物質が有するアミノ基等の官能基と反応して共有結合を形成することができる。
【００５２】
例えば、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基の連結は、ＥＧ鎖と１，１’−カルボニルジイミダゾール（以下ＣＤＩ）を以下のように反応させる。
【００５３】
【化１４】
2013205161.tif 000016
【００５４】
Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基の連結は、ＥＧ鎖と炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（以下ＤＳＣ）を以下のように反応させる。
【００５５】
【化１５】
2013205161.tif 000017
【００５６】
エポキシ基の連結は、ＥＧ鎖とエチレングリコールジグリシジルエーテル（以下ＥＧＤＧＥ）を以下のように反応させる。
【００５７】
【化１６】
2013205161.tif 000018
【００５８】
ＣＤＩを用いて(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基を導入する上記反応およびＤＳＣを用いてＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル基を導入する上記反応は、水分をほとんど含まない有機溶媒中で実施する必要がある。支持体がプラスチックを含む場合は、有機溶剤に対する耐性が低いため、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、又はこれらの有機溶媒を適当な割合で混合した混合溶媒を利用することが好ましい。これらの有機溶剤の水分含有率は０．１％以下であることが望ましい。ＣＤＩまたはＤＳＣの終濃度は０．０１〜１Ｍの範囲で設定できるが、室温以下で反応させる場合は０．１Ｍ以上であることが望ましい。支持体がプラスチックを含む場合には、プラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分〜２４時間の範囲で設定することが好ましい。
【００５９】
ＥＧＤＧＥを用いてエポキシ基を導入する上記反応は、ＤＭＡＰを含むＥＧＤＧＥ溶液を、ＥＧ鎖を含む基材と接触させる。ＤＭＡＰの濃度は０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）であることが望ましい。支持体がプラスチックを含む場合には、プラスチックへのダメージを避けるために反応温度を４〜２５℃の範囲で設定することが望ましい。反応時間は１０分〜２４時間の範囲で設定することが好ましい。
【００６０】
（製造された基材のプライマー層の特徴）
本発明の方法により製造される基材では、支持体の表面にポリシロキサンを含むプライマー層が、上記の通り物理的または化学的に結合している。
【００６１】
プライマー層は、前記ケイ素化合物が縮重合して形成されたポリシロキサンを少なくとも含む。ポリシロキサンとはシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）の繰り返し単位からなるポリマーである。ポリシロキサンはプライマー層の骨格を成し、プライマー層の機械的強度を高める。ポリシロキサンは直鎖状、分岐鎖状、網目状の構造をとり得るが、特に、前記ケイ素化合物においてｎ＝０の場合に形成され得る、分岐鎖状又は網目状の構造が好ましい。ケイ素化合物の官能基Ｘ１を含む有機基Ｘは、ポリシロキサンの側鎖として親水性層中のエチレングリコール鎖と共有結合を形成する。
【００６２】
（製造された基材の親水性層の特徴）
プライマー層のポリシロキサン側鎖には、親水性化合物に由来する、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖が共有結合を介して連結されている。親水性層は少なくともエチレングリコール鎖を含むが、他の親水性化合物が更に含まれていてもよい。
【００６３】
ＥＧ鎖の、ポリシロキサン側鎖と結合していない側の自由末端には、後述の被固定化物質と共有結合可能な、少なくとも１つの官能基が直接的又は間接的に連結されていてもよい。
【００６４】
（被固定化物質）
製造される基材を免疫アッセイ用固相担体として用いる場合には、目的とする免疫アッセイの態様に応じて、標的物質と結合する抗原又は抗体や、標的物質が固定化される。本発明ではこれらの固定化の対象物質を「被固定化物質」と呼ぶ。「標的物質と結合する抗原又は抗体」が被固定化物質である実施形態（サンドイッチ法又は直接競合法）において、被固定化物質と標的物質との組合せは、抗原抗体反応に基づく特異的な結合が可能な組合せであれば特に限定されない。例えば、標的物質が抗原（ハプテンを含む）である場合には、被固定化物質は抗体（抗体断片を含む）であることができ、標的物質が抗体（抗体断片を含む）である場合には、被固定化物質は抗原（ハプテンを含む）であることができる。「標的物質」が被固定化物質である実施形態（後述する間接競合法）では、標的物質は抗原（ハプテンを含む）又は抗体（抗体断片を含む）である。
【００６５】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗原は、抗体との特異的な抗原抗体反応性を示す物質であれば特に限定されない。代表的な抗原として、タンパク質、ペプチド、糖類、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質、補酵素、細胞、ウイルス、細菌、これらの複合体等の天然抗原や、天然抗原の誘導体や、人為的に合成されたハプテン、人工抗原等が挙げられる。
【００６６】
被固定化物質及び／又は標的物質としての抗体は、ある抗原に対して特異的な抗原抗体反応性を示す免疫グロブリン及びその断片を指し、必要に応じて化学修飾等が施されていてもよい。
【００６７】
被固定化物質は、ＥＧ鎖が有する官能基と反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミノ基、アジド基、シアノ基等も包含される。なお、固定化しようとする物質に、アミノ基等の、ＥＧ鎖に連結された官能基との反応で共有結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００６８】
（被固定化物質の固定化）
本発明により製造される基材への被固定化物質の固定化は、例えば以下のように行われる。まず、被固定化物質を緩衝液に溶解する。ここで、被固定化物質との競合反応を避けるため、アミノ基成分を含まない緩衝液を用いることが好ましい。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液の種類、緩衝液のｐＨおよび被固定化物質の終濃度は、被固定化物質の種類に応じて適宜選択される。多くの場合、緩衝液のｐＨは４．０〜１０．０、被固定化物質の終濃度は１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲で最適化すればよい。この被固定化物質溶解液を基材と所定時間接触させる。接触時間と温度も被固定化物質の種類に応じて適宜選択される。多くの場合、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化すればよい。適切な条件下であれば、被固定化物質に含まれるアミノ基等の官能基がＥＧ鎖に連結された官能基と反応し、アミド結合やウレタン結合等の共有結合が形成される。その結果、被固定化物質はＥＧ鎖を介して基材表面に固定化される。
【００６９】
ＥＧ鎖に連結された官能基と被固定化物質が有する官能基との組合せによっては固定化反応が十分進行しないことがある。そのような場合は、被固定化物質を乾燥濃縮するとよい。これによって被固定化物質の反応系中での濃度が高まるため、被固定化物質の固定化反応が著しく促進される。被固定化物質が少量しか準備できない場合は溶液中の被固定化物質の濃度を高めることは困難であるが、このような場合でも、比較的低濃度の被固定化物質溶解液を基材に接触させ、次いで乾燥濃縮することにより、被固定化物質の反応系中での濃度を高めることができ、固定化反応を促進することができる。この場合も、緩衝液の種類、緩衝液のｐＨ、被固定化物質の終濃度、接触時間、温度などを、被固定化物質の種類に応じて最適化することが望ましい。
【００７０】
被固定化物質が抗原、抗体等のタンパク質である場合は、乾燥によってタンパク質が変性することがある。乾燥に伴うタンパク質の変性を防ぐためには、被固定化物質溶解液にトレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース等の糖類を添加することが好ましい。糖類のなかでもトレハロースは、適度な保湿性を有していること、溶液の乾燥濃縮が容易であること、並びに、乾燥濃縮時に粗大な結晶が形成されにくく均質な乾燥濃縮が可能であることから好ましい。糖類の終濃度は１〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲で最適化すると良い。
【００７１】
被固定化物質溶解液を基材の広範囲に渡って接触させたい場合は、被固定化物質溶解液にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０などの非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。非イオン性界面活性剤の使用により、被固定化物質溶解液が基材表面に薄く濡れ広がるため、被固定化物質の使用量を節約できるだけでなく、乾燥濃縮に要する時間を短縮することができる。被固定化物質溶解液中の非イオン性界面活性剤の終濃度は０．０１〜０．１％（ｖ／ｖ）の範囲で最適化するとよい。
【００７２】
所望の被固定化物質をＥＧ鎖に結合させた後は、ＥＧ鎖に連結された未反応の官能基を、アミノ基を有する低分子化合物と反応させることにより、当該官能基を反応性のより低い官能基に変換してもよい。この操作により、免疫アッセイに関与する物質が不本意に基材表面に結合するのを防ぐことができる。この操作は、当該官能基の反応性が高い場合に特に必要性が高い。ただし、官能基を前記低分子化合物と反応させた後の基材表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の例としては、２−アミノエタノールや２−（２−アミノエトキシ）エタノールなどが挙げられるが、特に２−（２−アミノエトキシ）エタノールが好ましい。これらの低分子化合物を水溶液として調製し、必要に応じてｐＨを調整した後、所望の被固定化物質を固定化した基材と接触させる。低分子化合物の濃度は１〜１０００ｍＭ、接触時間は１分〜２４時間、温度は４〜３７℃の範囲で最適化するとよい。
【００７３】
以下、図面と具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
【００７４】
［実施例１］
図１はポリスチレンを支持体とする本発明の一実施形態である。まず、５０ｇのメトキシＰＥＧ３５０（シグマ・アルドリッチ）に５００μｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＳ、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ）を添加した。ここに塩基触媒として０．５ｇのＤＭＡＰ（和光純薬）を添加し、室温で１０分間攪拌した。この溶液を、ポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）に分注し、８０℃のオーブンで１５分間加熱した。純水でプレートを洗浄した後、８０℃のオーブンで１５分間乾燥した。
【００７５】
上記プレートがＩｇＧ抗体の吸着を抑制することを次のような手順で確かめた。まず、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、上記プレートと、未処理のポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ネガティブコントロール）に分注した。室温で１０分間放置した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳでプレートを３回洗浄した。次に、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１０分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、未処理のプレートが１．０８１であったのに対し、上記プレートは０．０１１であった（表１）。すなわち、本発明のプレートはＩｇＧ抗体の吸着を極めてよく抑制することが示された。
【００７６】
（比較例１）
比較例として、プライマー層と親水性層を段階的に形成させる方法を検討した。まず、１．６５ｍｌのＧＰＴＭＳに０．３５ｍｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学）に添加し、続けて０．５ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）を添加した。この溶液をポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）に分注し、室温で１３５分間放置した。プレートを純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＰＥＧ４００（関東化学）をプレートに分注し、８０℃で４５分間加熱した。プレートを純水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。
【００７７】
上記プレートを実施例１と同様に評価したところ、実施例１のプレートとほぼ同じ測定値（０．００９）であった。すなわち、実施例１の方法（本発明）により、プライマー層と親水性層を段階的に形成させる比較例１の方法と同等の基材を製造できることが示された。
【００７８】
【表１】
2013205161.tif 000019
【００７９】
［実施例２］
図２はポリスチレンを支持体とする本発明の一実施形態で、ＰＥＧ鎖の自由末端に被固定化物質と共有結合可能な官能基が連結される。まず、５０ｇのＰＥＧ４００（関東化学）に５００μｌのＧＰＴＭＳを添加した。ここに塩基触媒として０．５ｇのＤＭＡＰ（和光純薬）を添加し、室温で１０分間攪拌した。この溶液を、ポリスチレン製９６穴マイクロプレート（ベクトン・ディッキンソン）に分注し、８０℃のオーブンで１５分間加熱した。純水でプレートを洗浄した後、８０℃のオーブンで１５分間乾燥した。次に、０．５％のＤＭＡＰを含むＥＧＤＧＥ溶液をプレートに分注し、室温で４５分間反応させた。イソプロピルアルコールと純水でプレートを洗浄した後、８０℃のオーブンで１５分間乾燥した。
【００８０】
上記プレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。まず、卵白リゾチーム（和光純薬）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、上記プレートと、市販のＥＬＩＳＡ用プレート（ネガティブコントロール）に分注し、室温で１時間放置した（固相化）。市販品は１％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングし、上記プレートは２−(２−アミノエトキシ)エタノールで残存活性基を失活させた。その後、０〜５００ｎｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を分注し、室温で６０分間放置した。次に、ＨＲＰ標識２次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を分注し、室温で３０分間放置した。その後、発色基質ＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素を含む緩衝液を分注し、室温で１５分間発色させた。最後に、１Ｍの硫酸で酵素反応を停止し、吸光プレートリーダー（モレキュラーデバイス）を用いて吸光度（４７４ｎｍ）を測定した。その結果、市販品の抗リゾチーム抗体の検出感度は３．９０ｎｇ／ｍｌであったの対し、上記プレートの検出感度は０．５０ｎｇ／ｍｌであった（表２）。すなわち、上記プレートはＥＬＩＳＡで高い検出感度を実現できることが示された。
【００８１】
（比較例２）
比較例として、プライマー層と親水性層を段階的に形成させる方法を検討した。まず、比較例１と同様にＰＥＧ鎖を有するプレートを製造し、実施例２と同様にＰＥＧ鎖の自由末端にエポキシ基を連結した。このプレートを用いて実施例２と同様にＥＬＩＳＡを実施したところ、抗リゾチーム抗体の検出感度は実施例２と同等（０．２５ｎｇ／ｍｌ）であった。すなわち、実施例２の方法（本発明）は、プライマー層と親水性層を段階的に形成させる比較例２の方法と同等の基材を製造できることが示された。
【００８２】
【表２】
2013205161.tif 000020
【００８３】
［実施例３］
図３はガラスを支持体とする本発明の一実施形態である。まず、５０ｇのＰＥＧ４００（関東化学）に５００μｌのＧＰＴＭＳを添加した。ここに２５μｌの硫酸（関東化学）をさらに添加し、室温で５分間攪拌した。この溶液にアルカリ洗浄したスライドガラスを浸漬し、８０℃のオーブンで１５分間加熱した。純水でプレートを洗浄した後、８０℃のオーブンで１５分間乾燥した。水接触角を測定したところ、３０．５°であった（表３）。
【００８４】
（比較例３）
比較例として、プライマー層と親水性層を段階的に形成させる公知の方法（特開２００７−３１２７３６号公報）を検討した。まず、３９ｇのトルエン（関東化学）に１ｍｌのＧＰＴＭＳを添加した。ここに２ｍｌのトリエチルアミン（和光純薬）をさらに添加し、室温で５分間攪拌した。この溶液にアルカリ洗浄したスライドガラスを浸漬し、室温で１６時間放置した。エタノールでスライドガラスを洗浄した後、８０℃のオーブンで１５分間乾燥した。次に、触媒量の濃硫酸を含むＰＥＧ４００（関東化学）にスライドガラスを浸漬し、８０℃のオーブンで３０分間加熱した。純水でスライドガラスを洗浄した後、８０℃のオーブンで１５分間乾燥した。水接触角を測定したところ、３１．１°であった（表３）。すなわち、実施例３の方法（本発明）により、プライマー層と親水性層を段階的に形成させる比較例３の方法と同等の基材を製造できることが示された。
【００８５】
【表３】
2013205161.tif 000021
【図１】
2013205161.tif 000024
【図２】
2013205161.tif 000025
【図３】
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