(57)【要約】【課題】美白剤などの皮膚外用剤に好適に用いることができるサルオガセ（Usnea）属地衣類抽出物の製造方法を提供する。【解決手段】サルオガセ属地衣類を、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて抽出する、ウスニン酸低含有サルオガセ属地衣類抽出物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルオガセ（Usnea）属地衣類を、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて抽出する、ウスニン酸低含有サルオガセ属地衣類抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記アルコール水溶液がエタノール水溶液又は1,3-ブタンジオール水溶液である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記サルオガセ属地衣類がナガサルオガセ（Usnea longissima）又はヨコワサルオガセ（Usnea diffracta  Vain.）である、請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して、低温保存処理、加水処理、活性炭処理、ヘキサン洗浄処理及び加熱処理からなる群より選ばれる１種以上の処理によりウスニン酸の低減処理を行う、請求項１〜３のいずれか記載の製造方法。
【請求項５】
水系溶媒を用いて前記サルオガセ属地衣類を処理し、処理したサルオガセ属地衣類に対して前記アルコール水溶液を用いた抽出を行う、請求項１〜４のいずれか記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を有効成分とする、エンドセリン作用抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を有効成分とする、美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サルオガセ（Usnea）属地衣類抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリンは、内皮細胞由来のペプチドホルモンで、受容体を通して種々の細胞や組織に作用する。例えば、血管平滑筋細胞等において細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。
近年、エンドセリンが表皮メラノサイト（メラニン細胞）に対し細胞内カルシウム濃度上昇を促し、細胞内のシグナル伝達系を介して細胞増殖を促進するとともに、メラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼの活性を増強することが報告されている（非特許文献２参照）。また、エンドセリンは表皮角化細胞（ケラチノサイト）が産生するメラノサイト活性化因子の１つであること（非特許文献３）、紫外線誘導性色素沈着や老人性色素斑形成の重要な要因であることが報告されている（非特許文献４、５）。
このようなエンドセリンの生体作用から、エンドセリンの作用を抑制しうる物質は、メラニン生成や色素沈着等を抑制し、美白剤として有用である。
【０００３】
一方、ウメノキゴケ（Parmeliaceae）科サルオガセ属の地衣類の抽出物がメラニン生成阻害作用を有することが知られている（特許文献１〜３、並びに非特許文献６参照）。なお、特許文献１〜３には、メラニン生成阻害物質の製造方法として、地衣類を培養し、その培養物を凍結乾燥した後０℃〜１５℃の温度で溶媒抽出することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平４−２８２３１９号公報
【特許文献２】特開平４−２８２３２０号公報
【特許文献３】特開平４−２８２３２１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hirata  Y．et  al.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，1988，vol．154，p．868-875
【非特許文献２】Yada  Y．et  al.，J．Biol．Chem.，1991，vol．266，p．18352-18357
【非特許文献３】Imokawa  G．et  al.，J．Biol．Chem.，1992，vol．267，p．24675-24680
【非特許文献４】Imokawa  G．et  al.，J．Invest．Dermatol.，1995，vol．105，p．32-37
【非特許文献５】Kadono  S．et  al.，J．Invest．Dermatol.，2001，vol．116，p．571-577
【非特許文献６】Moo-Sung  Kim  et  al.，J．Microbiology，2007，vol．45，p．578-582
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、美白剤などの皮膚外用剤に好適に用いることができるサルオガセ属地衣類抽出物の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑み、サルオガセ属地衣類抽出物に含まれる成分の検討を行った。その結果、抽出方法によっては、サルオガセ属地衣類抽出物に下記式で表されるウスニン酸が高濃度で含まれることを見出した。
【０００８】
【化１】
2013253059.tif 000002
【０００９】
前記ウスニン酸は、肝毒性物質として知られている（例えば、Frankos  VH（January  2005），"NTP  nomination  for  usnic  acid  and  Usnea  barbata  herb"，National  Toxicology  Program，http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/htdocs/Chem_Background/ExSumPdf/UsnicAcid.pdf参照）。したがって、サルオガセ属地衣類抽出物がメラニン生成阻害作用を有していたとしても、ウスニン酸の含有量が高いと、安全性の観点から美白剤などの皮膚外用剤に用いることに問題がある。
【００１０】
サルオガセ属地衣類は、ウスニン酸を含有することが知られている（例えば、Phytochemistry，1987，vol．26，No．12，p．3181-3185；Bull．Kochi．Gakuen  College.，1992，vol．23，p．687(9)-697(19)参照）。
そこで、本発明者らは、美白剤などの皮膚外用剤に好適に用いることができる、ウスニン酸の含有量を低減した、サルオガセ属地衣類の抽出条件について検討を行った。その結果、アルコール含有率の高いアルコール水溶液を抽出溶媒として用いてサルオガセ属地衣類を抽出するとウスニン酸の濃度が上昇するのに対し、アルコール含有率が一定範囲のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いてサルオガセ属地衣類を抽出するとウスニン酸の濃度が低減できることを見出した。
さらに、アルコール含有率が一定範囲のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて抽出したサルオガセ属地衣類抽出物は、エンドセリンの作用によって引き起こされるメラノサイト内のカルシウム（イオン）濃度上昇の抑制効果を有することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１１】
すなわち、本発明は、サルオガセ属地衣類を、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて抽出する、ウスニン酸低含有サルオガセ属地衣類抽出物の製造方法に関する。
また、本発明は、前記製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を有効成分とする、エンドセリン作用抑制剤に関する。
さらに、本発明は、前記製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を有効成分とする、美白剤に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物は、肝毒性物質であるウスニン酸の含有量が低減されている。したがって、本発明の製造方法は、エンドセリン作用抑制剤、メラニン生成阻害剤、美白剤などの皮膚外用剤に好適に用いることができるサルオガセ属地衣類抽出物を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のウスニン酸低含有サルオガセ属地衣類抽出物の製造方法において、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いてサルオガセ属地衣類を抽出する。
当該方法により、肝毒性物質であるウスニン酸の含有量が低いサルオガセ属地衣類抽出物が得られる。このようにして得られるサルオガセ属地衣類抽出物は安全性に優れ、エンドセリン作用抑制効果、メラニン生成阻害効果、美白効果などを発揮し得る医薬品、医薬部外品、化粧料等に好適に用いることができる。
【００１４】
本明細書において、「ウスニン酸低含有サルオガセ属地衣類抽出物」とは、同条件で抽出を行った場合、本発明で規定する抽出溶媒を用いて得られるサルオガセ属地衣類抽出物中のウスニン酸含有量が、本発明で規定する抽出溶媒よりもアルコール含有率の高い抽出溶媒を用いて得られる抽出物中のウスニン酸含有量よりも少ないことを意味し、同一の溶媒種を用い同条件で抽出した場合にアルコール含有率を変化させたときの抽出物中のウスニン酸濃度を比較したものである。
【００１５】
本発明で用いるサルオガセ属地衣類は、ウメノキゴケ（Parmeliaceae）科の地衣類の１種である。本発明では、天然に存在するサルオガセ属地衣類を採取して用いてもよいし、市販品を入手して用いてもよい。本発明に用いられるサルオガセ属地衣類としては特に制限はなく、ナガサルオガセ（Usnea longissima）、ヨコワサルオガセ（Usnea diffracta  Vain.）、フジサルオガセ（Usnea trichodeoides）、ニセフジサルオガセ（Usnea pseudomontis-fuji）、クシノハサルオガセ（Usnea pectinata）などが挙げられる。本発明で用いる前記サルオガセ属地衣類としては、ナガサルオガセ、ヨコワサルオガセ、フジサルオガセ、ニセフジサルオガセ及びクシノハサルオガセからなる群より選ばれる１種又は２種以上が好ましく、ナガサルオガセ及びヨコワサルオガセからなる群より選ばれる１種又は２種がより好ましく、ナガサルオガセ又はヨコワサルオガセがさらに好ましい。
本発明において、前記サルオガセ属地衣類の全ての任意の部位（全体、地衣体、仮根、シリア、臍状体（さいじょうたい）等）を用いることができ、各部位を複数組み合わせて用いてもよい。また地位培養細胞（菌細胞、藻細胞、又は両者の混在した未分化共生培養組織）を用いることもできる。本発明において、サルオガセ属地衣類を抽出するには、地衣体を用いるのが好ましい。
本発明に用いるサルオガセ属地衣類は、天然に存在するそのままの状態でもよいが、抽出効率を高めるために、乾燥、凍結乾燥、細断、粉砕などの処理を施したものを用いるのが好ましい。
【００１６】
本発明の製造方法において、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いる。
本発明において抽出溶媒として用いるアルコール水溶液としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール等の低級アルコール類（好ましくは、炭素数１〜４の低級アルコール類）の水溶液、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール等の多価アルコール類の水溶液が挙げられる。本発明では、これらの溶媒を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明においては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、2,3-ブタンジオール等の水溶液を用いるのが好ましく、メタノール、エタノール1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール又は2,3-ブタンジオールの水溶液を用いるのがより好ましく、エタノール又は1,3-ブタンジオール水溶液水溶液がさらに好ましい。
本発明において抽出溶媒として用いるアルコール水溶液のアルコール含有率は７０体積％以下が好ましく、６０体積％以下がより好ましい。
【００１７】
サルオガセ属地衣類の抽出条件については特に制限はなく、使用する抽出溶媒によって適宜設定できる。例えば、抽出温度は、０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、５０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましく、２０℃以下がさらに好ましい。あるいは、０〜５０℃が好ましく、５〜４０℃がより好ましく、５〜２０℃がさらに好ましい。抽出時間は、１時間以上が好ましく、１日以上がより好ましく、２０日以下が好ましく、７日以下がより好ましい。あるいは、１時間〜２０日間が好ましく、１〜７日間がより好ましい。抽出効率を上げるため、抽出の際に攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。なお、抽出溶媒の使用量に特に制限はないが、抽出原料のサルオガセ属地衣類に対し質量比で１倍量以上であることが好ましく、５倍量以上であることがより好ましく、５０倍量以下であることが好ましく、３０倍量以下であることがより好ましい。あるいは、１〜５０倍量であることが好ましく、５〜３０倍量であることがより好ましい。
【００１８】
上記溶媒で抽出して得られた抽出物はそのまま使用してもよいが、必要に応じて更に適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留等により活性の高い画分を分画してもよい。あるいは、得られた抽出物の溶媒を別の溶媒（例えば、アルコール水溶液）に置換してもよい。本発明の製造方法により得られる抽出物には、このようにして得られた各種抽出物、その希釈液、その濃縮液、その精製物又はそれらの乾燥末等が包含される。
【００１９】
抽出溶媒としてアルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて得られるサルオガセ属地衣類抽出物を皮膚外用剤に用いることを考慮して、サルオガセ属地衣類抽出物に対してさらなるウスニン酸の低減処理を施すことが好ましい。
ウスニン酸の低減処理としては特に制限はなく、低温保存処理、加水処理、活性炭処理、ヘキサン洗浄処理、加熱処理などがあげられる。本発明では、これらの処理工程を単独で用いてもよいし、２種以上を組合わせて用いてもよく、これらの処理工程を繰返し行ってもよい。
【００２０】
ウスニン酸の低減処理としての低温保存について説明する。
ウスニン酸は結晶性が高く、水溶液に対する溶解性が低く、低温では析出しやすい。そのため、本発明の方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を低温保存すると、ウスニン酸が溶けにくくなりウスニン酸の結晶が析出する。このようにして析出したウスニン酸を常法により除去することで、サルオガセ属地衣類抽出物からのウスニン酸の低減が可能となる。
サルオガセ属地衣類抽出物の保存温度としては−１０℃以上が好ましく、−５℃以上がより好ましく、５℃以下が好ましい。あるいは、−１０〜５℃が好ましく、−５〜５℃がより好ましい。また、ナガサルオガセ抽出物の保存時間としては１時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましく、１４日以下が好ましく、５日以下がより好ましい。あるいは、１時間〜１４日間が好ましく、６時間〜５日間がより好ましい。
【００２１】
ウスニン酸の低減処理としての加水処理について説明する。
ウスニン酸は結晶性が高く、水溶液に対する溶解性が低い。そのため、本発明の方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を含水率の高い溶液中で保存すると、ウスニン酸が溶けにくくなりウスニン酸の結晶が析出する。このようにして析出したウスニン酸を常法により除去することで、サルオガセ属地衣類抽出物からのウスニン酸の低減が可能となる。
サルオガセ属地衣類抽出物に対する加水量としては特に制限はなく、加水後のアルコール含有率が２５体積％以上となるように加水するのが好ましく、３０体積％以上となるように加水するのがさらに好ましく、４５体積％以下となるように加水するのが好ましく、４０体積％以下となるように加水するのがさらに好ましい。あるいは、加水後のアルコール含有率が２５〜４５体積％となるように加水するのが好ましく、３０〜４０体積％となるように加水するのがさらに好ましい。
【００２２】
ウスニン酸の低減処理としての活性炭処理について説明する。
分子サイズ及び化合物の物性（極性）の違いから、サルオガセ属地衣類抽出物に含まれる成分のうち、ウスニン酸は活性炭に特に吸着されやすい。したがって、本発明の方法で得られるサルオガセ属地衣類抽出物に活性炭処理を施すことで、抽出物中のウスニン酸を除去することができる。
活性炭の使用量に特に制限はないが、サルオガセ属地衣類抽出物の固形分に対して、１重量％以上が好ましく、１０重量％以上がより好ましく、５０重量％以上がさらに好ましく、２００重量％以下が好ましく、１５０重量％以下がさらに好ましい。あるいは、１〜２００重量％が好ましく、１０〜２００重量％がより好ましく、５０〜１５０重量％がさらに好ましい。また、処理時間にも特に制限はないが、１０分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、２４時間以下が好ましく、１時間以下がより好ましい。あるいは、１０分〜２４時間が好ましく、３０分〜１時間がより好ましい。活性炭処理を行う際、サルオガセ属地衣類抽出物と活性炭とを混合して撹拌してもよい。本発明において、活性炭としては通常のものでよく、市販のものを用いることができる。
【００２３】
ウスニン酸の低減処理としてのヘキサン洗浄処理について説明する。
サルオガセ属地衣類抽出物に含まれる成分のうち、ウスニン酸は特にヘキサンに溶解しやすい。そのため、サルオガセ属地衣類抽出物に対してヘキサン洗浄処理し、ヘキサン層を分離することで、サルオガセ属地衣類抽出物中のウスニン酸を除去することができる。
ヘキサン洗浄処理の方法に特に制限はなく、サルオガセ属地衣類抽出物及びヘキサン、並びに必要によりエタノールなどのアルコール溶液と混合して、２層に分離し、サルオガセ属地衣類抽出物を含む層を常法により回収すればよい。また、ヘキサン洗浄処理を繰返し行ってもよい。
【００２４】
ウスニン酸の低減処理としての加熱処理について説明する。
サルオガセ属地衣類抽出物に対して加熱処理を行うことで、サルオガセ属地衣類抽出物中の他の成分とウスニン酸とが反応し、ウスニン酸の分解等が起こり、ウスニン酸の含有量が低下すると考えられる。
サルオガセ属地衣類抽出物の加熱温度としては５０℃以上が好ましく、６０℃以上がさらに好ましく、１００℃以下が好ましく、９０℃以下がより好ましく、８０℃以下がさらに好ましい。あるいは、５０℃〜１００℃が好ましく、５０℃〜９０℃がより好ましく、６０℃〜８０℃がさらに好ましい。また、サルオガセ属地衣類抽出物の加熱時間は加熱温度により適宜設定でき、１時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましく、７日以下が好ましく、３日以下がより好ましい。あるいは、１時間〜７日間が好ましく、６時間〜３日間がより好ましい。
【００２５】
本発明において、抽出溶媒としてアルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて得られるサルオガセ属地衣類抽出物に対して、低温保存処理、加水処理、活性炭処理、ヘキサン洗浄処理及び加熱処理からなる群より選ばれる１種以上の処理によりウスニン酸のさらなる低減処理を行うことが好ましく、より好ましいウスニン酸の低減処理方法としては、下記のものが挙げられる。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
（１）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに加水処理及び低温保存処理を行う。
（２）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに低温保存処理を行う。
（３）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに低温保存処理、加水処理及び低温保存処理をこの順で行う。
（４）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに加水処理及び低温保存処理をこの順で行う。
（５）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに加水処理、低温保存処理及び活性炭処理をこの順で行う。
（６）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに加水処理、低温保存処理及びヘキサン洗浄処理をこの順で行う。
（７）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに低温保存処理及び活性炭処理をこの順で行う。
（８）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに低温保存処理及びヘキサン洗浄処理をこの順で行う。
（９）抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対してさらに加水処理、低温保存処理及び加熱処理をこの順で行う。
【００２６】
本発明の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物において、ウスニン酸の絶対量に特に制限はないが、ウスニン酸含有量は１５０ｐｐｍ以下であることが好ましく、１２０ｐｐｍ以下であることがさらに好ましい。
【００２７】
本発明において、前記アルコール水溶液を用いてサルオガセ属地衣類の抽出を行う前に水系溶媒を用いてサルオガセ属地衣類を処理し、前記水系溶媒を除去して得られるサルオガセ属地衣類の残渣に対して前記アルコール水溶液を用いた抽出を行ってもよい。水系溶媒を用いてサルオガセ属地衣類を処理することによりサルオガセ属地衣類に含まれる水溶性成分を除去することができ、不純物が少ないサルオガセ属地衣類抽出物又はエンドセリン作用抑制剤を製造することができる。
【００２８】
本明細書において「水系溶媒」とは、サルオガセ属地衣類に含まれる水溶性成分を除去するだけの含水率を含む溶媒であれば特に制限はなく、水、アルコール水溶液（例えば、メタノール水溶液、エタノール水溶液、プロパノール水溶液、イソプロパノール水溶液）等が挙げられる。このうち、水、又は、アルコール含有率が１０体積％以下、好ましくは５体積％以下、より好ましくは１体積％以下、のアルコール水溶液が好ましい。
【００２９】
前記水系溶媒を用いたサルオガセ属地衣類の処理方法については特に制限はなく、水系溶媒にサルオガセ属地衣類を浸漬させる方法、水系溶媒でサルオガセ属地衣類を洗浄する方法、などが挙げられる。
水系溶媒にサルオガセ属地衣類を浸漬させる場合は、サルオガセ属地衣類に含まれる水溶性成分を除去する効率を上げるため、処理の際に攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。
【００３０】
水系溶媒を用いたサルオガセ属地衣類の処理条件については特に制限はなく、使用する溶媒によって適宜設定できる。例えば、処理温度は、０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、５０℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。あるいは、０〜５０℃が好ましく、０〜３０℃がより好ましい。処理時間は、５時間以上が好ましく、１日間以上がより好ましく、１０日間以下が好ましく、７日間以下がより好ましい。あるいは、５時間〜１０日間が好ましく、１〜７日間がより好ましい。
【００３１】
本発明において、前記アルコール水溶液を用いてサルオガセ属地衣類の抽出を行う前にヘキサン等の疎水性有機溶媒を用いてサルオガセ属地衣類を処理し、ウスニン酸等の疎水性物質を除去して得られるサルオガセ属地衣類の残渣に対して前記アルコール水溶液を用いた抽出を行っても良い。疎水性有機溶媒を用いてサルオガセ属地衣類を処理することによりサルオガセ属地衣類に含まれる疎水性成分を除去することができ、不純物が少ないサルオガセ属地衣類抽出物又はエンドセリン作用抑制剤を製造することができる。
【００３２】
本明細書において「疎水性有機溶媒」とは、サルオガセ属地衣類に含まれる疎水性成分を除去できれば特に制限はなく、n-ペンタン、シクロペンタン、n-ヘキサン、シクロヘキサン、n-ヘプタン、シクロヘプタン、オクタン等の直鎖又は環状の常温、常圧で液体のアルカンが挙げられ、このうちn-ヘキサンが好ましい。
【００３３】
前記疎水性有機溶媒を用いたサルオガセ属地衣類の処理方法については特に制限はなく、疎水性有機溶媒にサルオガセ属地衣類を浸漬させる方法、疎水性有機溶媒でサルオガセ属地衣類を洗浄する方法、などが挙げられる。
疎水性有機溶媒にサルオガセ属地衣類を浸漬させる場合は、サルオガセ属地衣類に含まれる疎水性物質を除去する効率を上げるため、処理の際に攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。
【００３４】
疎水性有機溶媒を用いたサルオガセ属地衣類の処理条件については特に制限はなく、使用する溶媒によって適宜設定できる。例えば、処理温度は、０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、５０℃以下が好ましく、３０℃以下がより好ましい。あるいは、０〜５０℃が好ましく、０〜３０℃がより好ましい。処理時間は、５時間以上が好ましく、１日間以上がより好ましく、１０日間以下が好ましく、７日間以下がより好ましい。あるいは、５時間〜１０日間が好ましく、１〜７日間がより好ましい。
【００３５】
後述の実施例で示すように、前記抽出工程により、肝毒性物質であるウスニン酸の含有量が低いナガサルオガセ抽出物を得ることができる。したがって、ナガサルオガセ抽出物はメラニン生成阻害作用や後述の実施例で示すエンドセリン作用抑制作用を有するため、本発明の製造方法で得られるウスニン酸低含有サルオガセ属地衣類抽出物は安全性が高く、エンドセリン抑制剤、メラニン生成阻害剤など、美白効果を奏する皮膚外用剤に好適に用いることができる。なお、本明細書において「美白（作用）」とは、メラニン色素生成や色素沈着を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【００３６】
本発明により得られるサルオガセ属地衣類抽出物は、そのままエンドセリン作用抑制剤又は美白剤として用いてもよい。また、本発明により得られるサルオガセ属地衣類抽出物と、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤とを混合して用いてもよい。さらには、その他のエンドセリン作用抑制剤、その他の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、色材種、油性物質、高分子化合物、防腐剤、粉体、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等、通常の美白剤に用いられる成分と混合して用いてもよい。
【００３７】
本発明のエンドセリン作用抑制剤及び美白剤は、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚等に適用することができ、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ローション、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
【００３８】
本発明のエンドセリン作用抑制剤及び美白剤におけるサルオガセ属地衣類抽出物の含有量に特に制限はなく、適宜設定することができる。
また、本発明のエンドセリン作用抑制剤及び美白剤の使用量に特に制限はなく、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ2当たり０．１μｇ以上が好ましく、５μｇ以下が好ましい。あるいは、皮膚面１ｃｍ2当たり０．１〜５μｇが好ましい。液状製剤の場合、皮膚面１ｃｍ2当たり０．１μｇ以上が好ましく、１０μｇ以下が好ましい。あるいは、皮膚面１ｃｍ2当たり０．１〜１０μｇが好ましい。
【００３９】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の抽出物の製造方法、エンドセリン作用抑制剤、美白剤、方法及び使用を開示する。
【００４０】
＜１＞サルオガセ属地衣類を、アルコール含有率が８０体積％以下、好ましくは７０体積％以下、より好ましくは６０体積％以下、のアルコール水溶液を用いて抽出する、ウスニン酸低含有サルオガセ属地衣類抽出物の製造方法。
【００４１】
＜２＞前記アルコール水溶液がエタノール水溶液又は1,3-ブタンジオール水溶液である、前記＜１＞項記載の製造方法。
＜３＞前記サルオガセ属地衣類がナガサルオガセ、ヨコワサルオガセ、フジサルオガセ、ニセフジサルオガセ及びクシノハサルオガセからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記＜１＞又は＜２＞項記載の製造方法。
＜４＞前記サルオガセ属地衣類がナガサルオガセ又はヨコワサルオガセである、前記＜１＞〜＜３＞項のいずれか記載の製造方法。
＜５＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して、低温保存処理、加水処理、活性炭処理、ヘキサン洗浄処理及び加熱処理からなる群より選ばれる１種以上の処理によりウスニン酸の低減処理を行う、前記＜１＞〜＜４＞項のいずれか記載の製造方法。
＜６＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して加水処理及び低温保存処理を施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜７＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して低温保存処理を施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜８＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して低温保存処理、加水処理及び低温保存処理をこの順で施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜９＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して加水処理及び低温保存処理をこの順で施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜１０＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して加水処理、低温保存処理及び活性炭処理をこの順で施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜１１＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して加水処理、低温保存処理及びヘキサン洗浄処理をこの順で施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜１２＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して低温保存処理及び活性炭処理をこの順で施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜１３＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して低温保存処理及びヘキサン洗浄処理をこの順で施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜１４＞抽出したサルオガセ属地衣類抽出物に対して加水処理、低温保存処理及び加熱処理をこの順で施して前記ウスニン酸の低減処理を行う、前記＜５＞項記載の製造方法。
＜１５＞水系溶媒（好ましくは水、又はアルコール含有率が１０体積％以下（好ましくは５体積％以下、より好ましくは１体積％以下）のアルコール水溶液（好ましくは、メタノール水溶液、エタノール水溶液、プロパノール水溶液、又はイソプロパノール水溶液））を用いて前記サルオガセ属地衣類を処理し、処理したサルオガセ属地衣類に対して前記アルコール水溶液を用いた抽出を行う、前記＜１＞〜＜１４＞項のいずれか記載の製造方法。
＜１６＞疎水性有機溶媒（好ましくはn-ペンタン、シクロペンタン、n-ヘキサン、シクロヘキサン、n-ヘプタン、シクロヘプタン及びオクタンからなる群より選ばれる少なくとも１種の疎水性有機溶媒、より好ましくはn-ヘキサン）を用いて前記サルオガセ属地衣類を処理し、処理したサルオガセ属地衣類に対して前記アルコール水溶液を用いた抽出を行う、前記＜１＞〜＜１５＞項のいずれか記載の製造方法。
【００４２】
＜１７＞前記＜１＞〜＜１６＞項のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を有効成分とする、エンドセリン作用抑制剤。
＜１８＞前記＜１＞〜＜１６＞項のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を有効成分とする、美白剤。
【００４３】
＜１９＞エンドセリン作用抑制剤又は美白剤としての、前記＜１＞〜＜１６＞項のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物の使用。
＜２０＞エンドセリン作用抑制剤又は美白剤の製造のための、前記＜１＞〜＜１６＞項のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物の使用。
＜２１＞前記＜１＞〜＜１６＞項のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を、エンドセリン作用抑制剤又は美白剤として使用する方法。
＜２２＞前記＜１＞〜＜１６＞項のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を用いる、エンドセリン作用抑制方法。
＜２３＞前記＜１＞〜＜１６＞項のいずれか記載の製造方法により得られるサルオガセ属地衣類抽出物を用いる、美白方法。
＜２４＞メラノサイト内のカルシウムイオン濃度の上昇を抑制してエンドセリン作用を抑制する、前記＜１９＞〜＜２３＞項のいずれか記載の使用又は方法。
＜２５＞前記サルオガセ属地衣類抽出物を化粧料の形態で適用する、前記＜１９＞〜＜２４＞項のいずれか記載の使用又は方法。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
参考例１  ナガサルオガセ抽出物の調製
ナガサルオガセの地位体（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１９９．６９ｇ（蒸発残分０．２９８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４６】
参考例２  ヨコワサルオガセ抽出物１の調製
ヨコワサルオガセの地位体（ハイケム社より入手）５ｇと、５０体積％エタノール水溶液１００ｍＬとを混合して、４０℃で８日間抽出後濾過し、ヨコワサルオガセ抽出物１（７８．２６ｇ）を得た（蒸発残分０．５６％）。
【００４７】
参考例３  ヨコワサルオガセ抽出物２の調製
ヨコワサルオガセの地位体（ハイケム社より入手）５ｇと、８０体積％1,3-ブタンジオール水溶液１００ｍＬとを混合して、４０℃で８日間抽出後濾過し、ヨコワサルオガセ抽出物２（８７．０７ｇ）を得た（蒸発残分０．１４％）。
【００４８】
参考例  ジャーマンカミツレ抽出物の調製
ジャーマンカミツレ（和名：カミツレ、新和物産社より入手）の花部４０ｇと、５０体積％エタノール含有水溶液４００ｍＬとを混合して、室温で１４日間抽出後ろ過し、ジャーマンカミツレ抽出物（２２１ｍＬ）を得た（蒸発残分２．６３％）。
【００４９】
試験例  エンドセリン作用抑制効果の検証
ナガサルオガセ抽出物、ヨコワサルオガセ抽出物及びジャーマンカミツレ抽出物について、下記の評価系を用いてエンドセリン作用抑制効果を検証した。なお、エンドセリンはメラノサイトに作用してカルシウム濃度を上昇させ、メラニン産生を増加させることが知られており（Yada  Y．et  al.，J．Biol．Chem.，1991，vol．266，p．18352-18357；Imokawa  G．et  al.，J．Biol．Chem.，1992，vol．267，p．24675-24680など参照）、エンドセリンの当該作用を抑制する物質は美白成分として有用である。
【００５０】
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社製）を、蛍光検出用の９６穴プレートに３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で播種し、５％ＣＯ2下にて３７℃で培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ  ２５４を用いた。
３日間培養後、培養プレートからデカントで培地を除去し、細胞内Ｃａ2++測定試薬Fluo4-AMを含むアッセイバッファーに置換し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＦＤＳＳ（Functional  Drug  Screening  System）機器において測定開始２０秒後に所定濃度のナガサルオガセ抽出物のエタノール溶液、ヨコワサルオガセ抽出物のジメチルスルホキシド溶液又はジャーマンカミツレ抽出物で１分間前処理した後、リガンドであるエンドセリン（ＥＴ−１、終濃度１００ｎＭ）を添加し、Fluo4-AMの蛍光をＥｘ．４８０ｎｍ／Ｅｍ．５４０ｎｍの測定波長で測定開始から５分後まで経時的に検出した。
コントロールにおけるFluo4-AMの蛍光増加比（Max．ratio-Min．ratio）を１００とした場合の相対値（％）で、各抽出物における、エンドセリン刺激による細胞内カルシウム（カルシウムイオン）濃度上昇率（％）を算出し、エンドセリン作用抑制効果を評価した。なお、コントロールとして、５０体積％エタノール水溶液又はジメチルスルホキシドを添加したものを用いた。
その結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2013253059.tif 000003
【００５２】
ジャーマンカミツレ抽出物は、エンドセリンの作用によるメラノサイトのＣａ濃度上昇を抑制し、メラニン産生を抑制することが知られている（例えば、Pigment  Cell  Res.，1997，vol．10，p．218-228参照）。表１から明らかなように、ジャーマンカミツレ抽出物を添加した系では、濃度依存的なカルシウム濃度上昇抑制作用が確認された。特に濃度が１ｖ／ｖ％の系では、２０％以上もカルシウム濃度上昇が抑制され、優れたエンドセリン抑制作用が確認された。
これに対して、表１から明らかなように、ナガサルオガセ抽出物又はヨコワサルオガセ抽出物を添加した系では、エンドセリン刺激によるメラノサイト内のカルシウム濃度上昇が抑制された。すなわち、ナガサルオガセ及びヨコワサルオガセなどのサルオガセ属地衣類の抽出物は、公知の美白成分であるジャーマンカミツレ抽出物と同等またはそれ以上の、優れたエンドセリン抑制作用を有し、美白成分として有用であることがわかる。
【００５３】
実施例１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２０７．３５ｇ（蒸発残分０．２０２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５４】
実施例２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して３０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２０６．５９ｇ（蒸発残分０．２６６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５５】
実施例３
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２０８．２６ｇ（蒸発残分０．２８０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５６】
実施例４
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと２０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２０１．４９ｇ（蒸発残分０．１７２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５７】
実施例５
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと３０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１９９．９０ｇ（蒸発残分０．１４６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５８】
実施例６
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと４０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２００．７０ｇ（蒸発残分０．１９０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５９】
実施例７
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して５℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２０１．６７ｇ（蒸発残分０．１７８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６０】
実施例８
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して１５℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２０２．５７ｇ（蒸発残分０．１９２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６１】
実施例９
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１９９．６９ｇ（蒸発残分０．２９８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６２】
実施例１０
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して３０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物２００．５４ｇ（蒸発残分０．２５８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６３】
実施例１１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１９９．４９ｇ（蒸発残分０．３１６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６４】
実施例１２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと６０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１９８．６９ｇ（蒸発残分０．２４２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６５】
実施例１３
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと７０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１９５．１ｇ（蒸発残分０．２３２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６６】
実施例１４
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと８０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８５．６ｇ（蒸発残分０．２１６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６７】
比較例１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８３．４ｇ（蒸発残分０．１９２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６８】
比較例２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して５℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８４．２４ｇ（蒸発残分０．１２８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００６９】
比較例３
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して１５℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８４．０ｇ（蒸発残分０．１５４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００７０】
比較例４
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８４．２２ｇ（蒸発残分０．１７４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００７１】
比較例５
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して３０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８６．４２ｇ（蒸発残分０．２１８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００７２】
比較例６
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８５．０６ｇ（蒸発残分０．２６６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００７３】
比較例７
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）２５ｇと９９．５体積％エタノール水溶液５００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物３６８．０ｇ（蒸発残分０．１５８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００７４】
ウスニン酸含有量の測定
上記実施例１〜１４及び比較例１〜７で得られた各ナガサルオガセ抽出物中のウスニン酸含有量を、ＨＰＬＣを用いて下記の条件で分析した。測定に用いた装置及び測定条件は下記のとおりである。
測定機器(HPLC)：Agilent  Technologies  Open  LAB  CDS  LC02-1260、オートサンプラーG1329B  1260  ALS、カラムオーブンG1316A  1260  TCC、検出器G1315D  1260  DAD  VL、ポンプG1312B  1260  Bin  pump、G1379B  1260  μ-Degasser
＜HPLC分析条件＞
流速：０．７５ｍＬ/ｍｉｎ
使用したカラム：Inertsil  ODS-3  ５μｍ(GL  Science)、3.0I.D.×１５０ｍｍ
検出波長：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
移動相：
Ａ：0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液、Ｂ：0.1%トリフルオロ酢酸含有メタノール
０〜１０分：70%Ｂ
１０〜１５分：70％Ｂ→100%Ｂ
１５〜２０分：100％Ｂ
結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
2013253059.tif 000004
【００７６】
表２の結果から明らかなように、本発明の方法によれば、ウスニン酸の含有量が十分に低いナガサルオガセ抽出物を得ることができる。
これに対して、アルコール含有率の高すぎる抽出溶媒を用いてナガサルオガセを抽出すると、ウスニン酸含有量が上昇した（比較例１〜７）。
【００７７】
以上のように、サルオガセ属地衣類をアルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて抽出することで、ウスニン酸低含有のサルオガセ属地衣類抽出物を製造することができる。ウスニン酸は肝毒性を有するので、本発明によれば、安全性に優れ、エンドセリン作用抑制剤等の皮膚外用剤に好適に用いることができるサルオガセ属地衣類抽出物を製造することができる。
【００７８】
実施例１４
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して２０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物８５８．５ｇ（蒸発残分０．３７４（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られた抽出物を−５℃で１２日間保存後ろ過し、低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物８３３．４ｇ（蒸発残分０．３６０（ｗ／ｖ）％）を得た。
低温保存処理前後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2013253059.tif 000005
【００８０】
表３の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、低温保存処理を行なうことにより、ウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【００８１】
実施例１６
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して２０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物８５２．８ｇ（蒸発残分０．２６８（ｗ／ｖ）％）を得た。得られた抽出物を−５℃で１３日間保存後、ろ過することにより、ナガサルオガセ抽出物処理前品８３７．２ｇ（蒸発残分０．２５６（ｗ／ｖ）％）を得た。
次に、ナガサルオガセ抽出物処理前品１０ｍＬと蒸留水２．５ｍＬとを混合してエタノールの体積が４０％となるよう希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を−５℃で４日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１１．１ｇ（蒸発残分０．１３０（ｗ／ｖ）％）を得た。
ナガサルオガセ抽出物処理前品、加水処理後のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表４に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表４に示す。
【００８２】
【表４】
2013253059.tif 000006
【００８３】
表４の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、低温保存処理、加水処理及び低温保存処理をこの順で行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【００８４】
実施例１７
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物８３８．５ｇ（蒸発残分０．２１８（ｗ／ｖ）％）を得た。
次に、加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物８００ｍＬと蒸留水２００ｍＬとを混合してエタノールの体積が４０％となるよう希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を−５℃で７日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物９１６．２ｇ（蒸発残分０．１３０（ｗ／ｖ）％）を得た。
加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表５に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表５に示す。
【００８５】
【表５】
2013253059.tif 000007
【００８６】
表５の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、加水処理及び低温保存処理を行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【００８７】
実施例１８
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物（活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物）５ｍＬ（固形分６．５ｍｇ）と９９．５体積％エタノール水溶液４５ｍＬとを混合して希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）０．６５ｍｇ（抽出物中固形分に対して１０重量％）を添加し、室温で４５分間撹拌後、ろ過することにより活性炭１０ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で５ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．０８（ｗ／ｖ）％））。その結果を表６に示す。
【００８８】
実施例１９
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物（活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物）５ｍＬ（固形分６．５ｍｇ）と９９．５体積％エタノール水溶液４５ｍＬとを混合して希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）３．２５ｍｇ（抽出物中固形分に対して５０重量％）を添加し、室温で４５分間撹拌後、ろ過することにより活性炭５０ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で５ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．０７（ｗ／ｖ）％））。その結果を表６に示す。
【００８９】
実施例２０
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物（活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物）５ｍＬ（固形分６．５ｍｇ）と９９．５体積％エタノール水溶液４５ｍＬとを混合して希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）６．５０ｍｇ（抽出物中固形分に対して１００重量％）を添加し、室温で４５分間撹拌後、ろ過することにより活性炭１００ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で５ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．０７（ｗ／ｖ）％））。その結果を表６に示す。
【００９０】
実施例２１
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物（活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物）５ｍＬ（固形分６．５ｍｇ）と９９．５体積％エタノール水溶液４５ｍＬとを混合して希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）９．７５ｍｇ（抽出物中固形分に対して１５０重量％）を添加し、室温で４５分間撹拌後、ろ過することにより活性炭１５０ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で５ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．０７（ｗ／ｖ）％））。その結果を表６に示す。
【００９１】
実施例２２
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物（活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物）５ｍＬ（固形分６．５ｍｇ）と９９．５体積％エタノール水溶液４５ｍＬとを混合して希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）１３．０ｍｇ（抽出物中固形分に対して２００重量％）を添加し、室温で４５分間撹拌後、ろ過することにより活性炭２００ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で５ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．０７（ｗ／ｖ）％））。その結果を表６に示す。
【００９２】
【表６】
2013253059.tif 000008
【００９３】
表６の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、加水処理、低温保存処理及び活性炭処理を行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【００９４】
実施例２３
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物（ヘキサン洗浄処理前抽出物）５０ｍＬにヘキサン５０ｍＬ及び９９．５体積％エタノール水溶液５ｍＬを加え、分液ロートを使用して２層に分離後、下層を回収し（ヘキサン洗浄１回品）、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した。その結果を表７に示す。
【００９５】
実施例２４
実施例２３で得られたナガサルオガセ抽出物５０ｍＬに、再度ヘキサン５０ｍＬ及び９９．５体積％エタノール水溶液５ｍＬを加え、分液ロートを使用して２層に分離後、下層を回収し（ヘキサン洗浄２回品）、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した。その結果を表７に示す。
【００９６】
実施例２５
実施例２４で得られたナガサルオガセ抽出物４５ｍＬに、再度ヘキサン４５ｍＬを加え、分液ロートを使用して２層に分離後、下層を回収し（ヘキサン洗浄３回品）、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した。その結果を表７に示す。
【００９７】
【表７】
2013253059.tif 000009
【００９８】
表７の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、加水処理、低温保存処理及びヘキサン洗浄処理を行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【００９９】
実施例２６
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して２０℃で３日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物８５８．３ｇ（蒸発残分０．４６０（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られたナガサルオガセ抽出物を−５℃で１２日間保存後、ろ過することにより活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物８４９．２ｇ（蒸発残分０．３６０（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られた活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表８に示す。
【０１００】
実施例２７
実施例２６で得られた活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物３ｍＬ（固形分１０．８ｍｇ）に９９．５体積％エタノール水溶液２７ｍＬを加え、希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）１．０８ｍｇ（抽出物中固形分に対して１０重量％）を添加し、室温で３０分間撹拌後、ろ過することにより活性炭１０ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で３ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．２８０（ｗ／ｖ）％））。その結果を表８に示す。
【０１０１】
実施例２８
実施例２６で得られた活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物３ｍＬ（固形分１０．８ｍｇ）に９９．５体積％エタノール水溶液２７ｍＬを加え、希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）５．４０ｍｇ（抽出物中固形分に対して５０重量％）を添加し、室温で３０分間撹拌後、ろ過することにより活性炭５０ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で３ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．２８０（ｗ／ｖ）％））。その結果を表８に示す。
【０１０２】
実施例２９
実施例２６で得られた活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物３ｍＬ（固形分１０．８ｍｇ）に９９．５体積％エタノール水溶液２７ｍＬを加え、希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）１０．８０ｍｇ（抽出物中固形分に対して１００重量％）を添加し、室温で３０分間撹拌後、ろ過することにより活性炭１００ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で３ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．２７０（ｗ／ｖ）％））。その結果を表８に示す。
【０１０３】
実施例３０
実施例２６で得られた活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物３ｍＬ（固形分１０．８ｍｇ）に９９．５体積％エタノール水溶液２７ｍＬを加え、希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）１６．２０ｍｇ（抽出物中固形分に対して１５０重量％）を添加し、室温で３０分間撹拌後、ろ過することにより活性炭１５０ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で３ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．２７０（ｗ／ｖ）％））。その結果を表８に示す。
【０１０４】
実施例３１
実施例２６で得られた活性炭処理前のナガサルオガセ抽出物３ｍＬ（固形分１０．８ｍｇ）に９９．５体積％エタノール水溶液２７ｍＬを加え、希釈した後、活性炭（商品名：白鷺Ｍ、日本エンバイロケミカルズ社製）２１．６０ｍｇ（抽出物中固形分に対して２００重量％）を添加し、室温で３０分間撹拌後、ろ過することにより活性炭２００ｗｔ％処理後品を得た。得られた活性炭処理品は活性炭処理時の希釈前品と同容量とすべく減圧下で溶媒を留去した後で３ｍＬの５０体積％エタノール水溶液に溶解し、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．２７０（ｗ／ｖ）％））。その結果を表８に示す。
【０１０５】
【表８】
2013253059.tif 000010
【０１０６】
表８の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、低温保存処理及び活性炭処理を行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【０１０７】
実施例３２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して２０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物８５５．８ｇ（蒸発残分０．２７０（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られたナガサルオガセ抽出物を−５℃で１３日間保存後、ろ過することによりヘキサン洗浄処理前のナガサルオガセ抽出物８３９．５ｇ（蒸発残分０．３６０（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られたヘキサン洗浄処理前のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表９に示す。
【０１０８】
実施例３３
実施例３２で得られたヘキサン洗浄処理前のナガサルオガセ抽出物５０ｍＬにヘキサン５０ｍＬ及び９９．５体積％エタノール水溶液５ｍＬを加え、分液ロートを使用して２層に分離後、下層を回収し（ヘキサン洗浄１回品）、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した。その結果を表９に示す。
【０１０９】
実施例３４
実施例３３で得られたナガサルオガセ抽出物５０ｍＬに、再度ヘキサン５０ｍＬ及び９９．５体積％エタノール水溶液５ｍＬを加え、分液ロートを使用して２層に分離後、下層を回収し（ヘキサン洗浄２回品）、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した。その結果を表９に示す。
【０１１０】
実施例３５
実施例３４で得られたナガサルオガセ抽出物５０ｍＬに、再度ヘキサン５０ｍＬ及び９９．５体積％エタノール水溶液５ｍＬを加え、分液ロートを使用して２層に分離後、下層を回収し（ヘキサン洗浄３回品）、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した（蒸発残分０．２８６（ｗ／ｖ）％）。その結果を表９に示す。
【０１１１】
【表９】
2013253059.tif 000011
【０１１２】
表９の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、低温保存処理及びヘキサン洗浄処理を行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【０１１３】
実施例３６〜４３
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１０ｍＬを６０℃で静置保存し、表１０に示した各保存時間後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸の含有量を測定した。その結果を表１０に示す。
【０１１４】
【表１０】
2013253059.tif 000012
【０１１５】
実施例４４〜４７
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１５０ｍＬを７０℃で表１１に示した時間で攪拌を行い、得られたナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸の含有量を測定した。その結果を表１１に示す。
【０１１６】
【表１１】
2013253059.tif 000013
【０１１７】
実施例４８〜５０
実施例１７で得られた加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１５０ｍＬを８０℃で表１２に示した時間で攪拌を行い、得られたナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸の含有量を測定した。その結果を表１２に示す。
【０１１８】
【表１２】
2013253059.tif 000014
【０１１９】
表１０〜１２の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、加水処理、低温保存処理及び加熱処理を行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【０１２０】
実施例５１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７５．６２ｇ（蒸発残分０．２９０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１２１】
実施例５２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して３０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７４．２５ｇ（蒸発残分０．３４０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１２２】
実施例５３
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７７．５７ｇ（蒸発残分０．４１０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１２３】
実施例５４
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと８０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７８．１９ｇ（蒸発残分０．２６０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１２４】
実施例５５
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと８０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して３０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７９．８２ｇ（蒸発残分０．３００（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１２５】
実施例５６
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと８０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８２．１４ｇ（蒸発残分０．３８０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１２６】
比較例８
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して２５℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８２．５５ｇ（蒸発残分０．１２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１２７】
ウスニン酸含有量の測定
上記実施例５１〜５６及び比較例８で得られた各ナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した。その結果を表１３に示す。
【０１２８】
【表１３】
2013253059.tif 000015
【０１２９】
表１３の結果から明らかなように、本発明の方法によれば、ウスニン酸の濃度が十分に低いナガサルオガセ抽出物を得ることができる。
これに対して、アルコール含有率の高すぎる抽出溶媒を用いてナガサルオガセを抽出すると、ウスニン酸含有量が上昇した（比較例８）。
以上のように、サルオガセ属地衣類をアルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて抽出することで、ウスニン酸低含有のサルオガセ属地衣類抽出物を製造することができる。ウスニン酸は肝毒性を有するので、本発明によれば、安全性に優れ、エンドセリン作用抑制剤等の皮膚外用剤に好適に用いることができるナガサルオガセ抽出物を製造することができる。
【０１３０】
実施例５７
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で７日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７７．６ｇ（蒸発残分０．４２０（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られた抽出物１０ｍＬを−５℃で５日間保存後ろ過し、低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物８．９ｇ（蒸発残分０．３８０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１３１】
低温保存処理前後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表１４に示す。
【０１３２】
【表１４】
2013253059.tif 000016
【０１３３】
表１４の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、低温保存処理を行なうことにより、ウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【０１３４】
実施例５８
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で７日間抽出後ろ過し、加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物１７７．６ｇ（蒸発残分０．４２０（ｗ／ｖ）％）を得た。
次に、加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物１０ｍＬと蒸留水１ｍＬとを混合することにより希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物９．５ｍＬを−５℃で５日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物８．６ｇ（蒸発残分０．３５０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１３５】
加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物、加水処理後のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。加水処理後のナガサルオガセ抽出物中のウスニン酸の含有量の測定は、抽出物の一部をろ過後に測定した。その結果を表１５に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表１５に示す。
【０１３６】
【表１５】
2013253059.tif 000017
【０１３７】
実施例５９
実施例５８と同様にして調製した加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物１０ｍＬと蒸留水２．５ｍＬとを混合することにより希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物１２ｍＬを−５℃で５日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１０．５ｇ（蒸発残分０．３００（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１３８】
加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物、加水処理後のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。加水処理後のナガサルオガセ抽出物中のウスニン酸の含有量の測定は、抽出物の一部をろ過後に測定した。その結果を表１６に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表１６に示す。
【０１３９】
【表１６】
2013253059.tif 000018
【０１４０】
実施例６０
実施例５８と同様にして調製した加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物１０ｍＬと蒸留水５ｍＬとを混合することにより希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物１４ｍＬを−５℃で５日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１２．６ｇ（蒸発残分０．２４０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１４１】
加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物、加水処理後のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。加水処理後のナガサルオガセ抽出物中のウスニン酸の含有量の測定は、抽出物の一部をろ過後に測定した。その結果を表１７に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表１７に示す。
【０１４２】
【表１７】
2013253059.tif 000019
【０１４３】
実施例６１
実施例５８と同様にして調製した加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物１０ｍＬと蒸留水７．５ｍＬとを混合することにより希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物１６ｍＬを−５℃で５日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１４．１ｇ（蒸発残分０．２００（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１４４】
加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物、加水処理後のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。加水処理後のナガサルオガセ抽出物中のウスニン酸の含有量の測定は、抽出物の一部をろ過後に測定した。その結果を表１８に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表１８に示す。
【０１４５】
【表１８】
2013253059.tif 000020
【０１４６】
実施例６２
実施例５８と同様にして調製した加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物１０ｍＬと蒸留水１０ｍＬとを混合することにより希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物のうち１８ｍＬを−５℃で５日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物１５．９ｇ（蒸発残分０．１７０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１４７】
加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物、加水処理後のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。加水処理後のナガサルオガセ抽出物中のウスニン酸の含有量の測定は、抽出物の一部をろ過後に測定した。その結果を表１９に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表１９に示す。
【０１４８】
【表１９】
2013253059.tif 000021
【０１４９】
表１５〜１９の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、加水処理及び低温保存処理をこの順で行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【０１５０】
実施例６３
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと１０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で５日間抽出後ろ過し、ヨコワサルオガセ抽出物１７０．２４ｇ（蒸発残分０．３４８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１５１】
実施例６４
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で５日間抽出後ろ過し、ヨコワサルオガセ抽出物１５６．７９ｇ（蒸発残分０．４０２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１５２】
実施例６５
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で４日間抽出後ろ過し、ヨコワサルオガセ抽出物１６２．１８ｇ（蒸発残分０．３４８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１５３】
実施例６６
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと５０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で５日間抽出後ろ過し、ヨコワサルオガセ抽出物１６６．６１ｇ（蒸発残分０．２５０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１５４】
実施例６７
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと８０体積％1,3-ブタンジオール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で５日間抽出後ろ過し、ヨコワサルオガセ抽出物１７６．５５ｇ（蒸発残分０．２３０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１５５】
比較例９
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で４日間抽出後ろ過し、ヨコワサルオガセ抽出物１４６．４５ｇ（蒸発残分０．４０２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１５６】
比較例１０
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で４日間抽出後ろ過し、ヨコワサルオガセ抽出物１４３．９５ｇ（蒸発残分０．２８８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１５７】
ウスニン酸含有量の測定
上記実施例６３〜６７及び比較例９〜１０で得られた各ヨコワサルオガセ抽出物中のウスニン酸含有量を、前記と同様の方法により測定した。その結果を表２０に示す。
【０１５８】
【表２０】
2013253059.tif 000022
【０１５９】
表２１の結果から明らかなように、本発明の方法によれば、ウスニン酸の含有量が十分に低いヨコワサルオガセ抽出物を得ることができる。
これに対して、アルコール含有率の高すぎる抽出溶媒を用いてヨコワサルオガセを抽出すると、ウスニン酸含有量が上昇した（比較例９〜１０）。
【０１６０】
以上のように、サルオガセ属地衣類をアルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて抽出することで、ウスニン酸低含有のサルオガセ属地衣類抽出物を製造することができる。ウスニン酸は肝毒性を有するので、本発明によれば、安全性に優れ、エンドセリン作用抑制剤等の皮膚外用剤に好適に用いることができるサルオガセ属地衣類を製造することができる。
【０１６１】
実施例６８  実施例６４で得られた抽出物（加水・低温保存処理前のヨコワサルオガセ抽出物）８８．５７ｇを−５℃で３日間保存後、ろ過することにより低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物８１．６８ｇ（蒸発残分０．３９０（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られた低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物８０ｍＬと蒸留水２０ｍＬとを混合してエタノールの体積が４０％となるよう希釈し、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物を−５℃で４日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物８６．１２ｇ（蒸発残分０．３２８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１６２】
加水・低温保存処理前のヨコワサルオガセ抽出物、低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表２１に示す。なお、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表２１に示す。
【０１６３】
【表２１】
2013253059.tif 000023
【０１６４】
実施例６９  実施例６４で得られたヨコワサルオガセ抽出物（加水・低温保存処理前のヨコワサルオガセ抽出物）４０ｍＬと蒸留水１０ｍＬとを混合してエタノールの体積が４０％となるよう希釈し、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物を−５℃で３日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物４１．０３ｇ（蒸発残分０．２８６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１６５】
加水・低温保存処理前のヨコワサルオガセ抽出物、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表２２に示す。なお、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表２２に示す。
【０１６６】
【表２２】
2013253059.tif 000024
【０１６７】
実施例７０
ヨコワサルオガセ（ハイケム社より入手）１０ｇと５０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で４日間抽出後ろ過し、加水・低温保存処理前のヨコワサルオガセ抽出物１６２．１８ｇ（蒸発残分０．３４８（ｗ／ｖ）％）を得た。
得られた加水・低温保存処理前のヨコワサルオガセ抽出物８０ｍＬと蒸留水２０ｍＬとを混合してエタノールの体積が４０％となるよう希釈し、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物を得た。
さらに、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物を−５℃で２日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物８６．９４ｇ（蒸発残分０．３２８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１６８】
加水・低温保存処理前のヨコワサルオガセ抽出物、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のヨコワサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表２３に示す。なお、加水処理後のヨコワサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表２３に示す。
【０１６９】
【表２３】
2013253059.tif 000025
【０１７０】
表２１〜２３の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるヨコワサルオガセ抽出物について、加水処理及び低温保存処理を行なうことにより、ヨコワサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量をさらに低減することができる。
【０１７１】
実施例７１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと５体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して２０℃で２９時間処理した後ろ過し、ろ液９６１．９８ｇ（蒸発残分０．０８０（ｗ／ｖ）％）を分離した。次に、ろ液から溶媒を分離して、ナガサルオガセの残渣を得た。
前記ナガサルオガセの残渣３２．４８ｇと６０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で５日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７８．４４ｇ（蒸発残分０．１７０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１７２】
実施例７２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して２０℃で２９時間処理した後ろ過し、ろ液９５９．０１ｇ（蒸発残分０．０７６（ｗ／ｖ）％）を分離した。次に、ろ液から溶媒を分離して、ナガサルオガセの残渣を得た。
前記ナガサルオガセの残渣３５．４７ｇと６０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で５日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１８０．０３ｇ（蒸発残分０．１５２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１７３】
実施例７３
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと蒸留水１Ｌとを混合して２０℃で２９時間処理した後ろ過し、ろ液９５０．０１ｇ（蒸発残分０．０８０（ｗ／ｖ）％）を分離した。次に、ろ液から溶媒をを分離して、ナガサルオガセの残渣を得た。
前記ナガサルオガセの残渣３２．７５ｇと６０体積％エタノール水溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で５日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７９．０３ｇ（蒸発残分０．１４４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１７４】
上記実施例７１〜７３で得られた各ナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりＨＰＬＣでウスニン酸含有量を測定した。その結果を表２４に示す。
【０１７５】
【表２４】
2013253059.tif 000026
【０１７６】
表２４の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を用いて抽出を行う前に、水系溶媒を用いてサルオガセ属地衣類を処理することにより、ウスニン酸含有量が特に低いサルオガセ属地衣類抽出物を得ることができる。
【０１７７】
実施例７４
実施例７１で得られた抽出物（加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物）８０ｍＬと蒸留水２０ｍＬとを混合してエタノールの体積が約４０〜５０％となるよう希釈して澱出しを行い、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を得た。さらに、加水処理後のナガサルオガセ抽出物を−５℃で４日間保存後ろ過し、加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物８４．３３ｇ（蒸発残分０．１４０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【０１７８】
加水・低温保存処理前のナガサルオガセ抽出物、加水処理後のナガサルオガセ抽出物、及び加水・低温保存処理後のナガサルオガセ抽出物について、前記と同様の方法によりウスニン酸含有量を測定した。その結果を表２５に示す。なお、加水処理後のナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量の理論値も併せて表２５に示す。
【０１７９】
【表２５】
2013253059.tif 000027
【０１８０】
表２５の結果から明らかなように、アルコール含有率が８０体積％以下のアルコール水溶液を抽出溶媒として用いて得られるナガサルオガセ抽出物について、加水処理及び低温保存処理を行なうことにより、ナガサルオガセ抽出物に含まれるウスニン酸含有量を選択的に低減することができる。
【０１８１】
（処方例）
前記実施例で得られた抽出物を有効成分とする、下記に示す組成のローション、乳液、美容液及びクリームの形態の美白剤を常法により各々調製出来る。
【０１８２】
１．ローションの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
1,3-ブチレングリコール                                              ８．０
グリセリン                                                          ５．０
エタノール                                                          ３．０
実施例９で得られたナガサルオガセ抽出物                              ３．０
カミツレエキス                                                      ３．０
キキョウエキス                                                      １．０
チョウジエキス                                                      １．０
キサンタンガム                                                      ０．１
ヒアルロン酸                                                        ０．１
リン酸二ナトリウム                                                  ０．１
リン酸二水素ナトリウム                                              ０．１
アスコルビン酸2-グルコシド                                          ２．０
精製水                                                              残部
香料                                                                適量
防腐剤                                                              適量
【０１８３】
２．乳液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例１０で得られたナガサルオガセ抽出物                            １．０
カミツレエキス                                                      １．０
キキョウエキス                                                      １．０
アルテアエキス                                                      ２．０
スクワラン                                                          ３．０
オリブ油                                                            ３．０
グリセリン                                                          ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40）１．０
カルボキシビニルポリマー                                            ０．２
水酸化カリウム                                                      ０．１
キサンタンガム                                                      ０．２
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０２
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
【０１８４】
３．美容液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例１１で得られたナガサルオガセ抽出物                            １．０
カミツレエキス                                                      １．０
キキョウエキス                                                      １．０
チョウジエキス                                                      １．０
カルボキシビニルポリマー                                            ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                            ０．２
水酸化カリウム                                                      ０．２
キサンタンガム                                                      ０．１
ヒアルロン酸                                                        ０．２
クエン酸ナトリウム                                                  ０．１５
クエン酸                                                            ０．０３
グリセリン                                                          １０．０
1,3-ブチレングリコール                                              ５．０
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
香料                                                                適量
【０１８５】
４．美容液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例６で得られたナガサルオガセ抽出物                              ３．０
カミツレエキス                                                      １．０
チョウジエキス                                                      １．０
キキョウエキス                                                      １．０
キサンタンガム                                                      ０．２
カルボキシメチルセルロース                                          ０．２
カルボキシビニルポリマー                                            ０．２
水酸化カリウム                                                      ０．１
クエン酸                                                            ０．０３
クエン酸ナトリウム                                                  ０．１５
グリセリン                                                          ５．０
プロピレングリコール                                                ３．０
ポリエチレングリコール（分子量１５００）                            １．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール                              ０．５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
【０１８６】
５．クリームの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例１２で得られたナガサルオガセ抽出物                            ３．０
カミツレエキス                                                      ２．０
キキョウエキス                                                      ２．０
チョウジエキス                                                      ２．０
メチルポリシロキサン                                                ３．０
スクワラン                                                          ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール                                  ３．０
ステアリルアルコール                                                １．５
セタノール                                                          １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60）０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                            ０．３
水酸化カリウム                                                      ０．１５
キサンタンガム                                                      ０．１
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
香料                                                                適量