(57)【要約】      （修正有）【課題】定量的にイカ又はタコの頭足類、特にスルメイカの健康状態を判定することができ、比較的簡易、迅速かつ安価に頭足類の健康状態を判定できる頭足類の健康状態評価方法を提供する。【解決手段】頭足類の血リンパ液中のグルコース濃度、ヘモシアニン濃度を測定する工程を含み、グルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ未満の値、ヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ未満の値であるときに前記頭足類の健康状態が悪化していると評価、判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
頭足類の血リンパ液中のグルコース濃度を測定して前記頭足類の健康状態を判定することを特徴とする頭足類の健康状態測定方法。
【請求項２】
前記頭足類はイカ又はタコであることを特徴とする請求項１に記載の頭足類の健康状態測定方法。
【請求項３】
前記頭足類はスルメイカであることを特徴とする請求項１又は２に記載の頭足類の健康状態測定方法。
【請求項４】
前記グルコース濃度がより低いものを健康状態が悪化していると評価することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の頭足類の健康状態測定方法。
【請求項５】
前記グルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ未満の値であるときに前記頭足類の健康状態が悪化していると評価することを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の頭足類の健康状態測定方法。
【請求項６】
頭足類の血リンパ液中のヘモシアニン濃度を測定する工程を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の頭足類の健康状態測定方法。
【請求項７】
前記ヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ未満の値であるときに前記頭足類の健康状態が悪化していると評価することを特徴とする請求項６に記載の頭足類の健康状態測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タコやイカ等の頭足類の健康状態を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イカやタコ等の頭足類をはじめとする魚介類は、食材として用いられ、その中でも活魚介類としての需要は大きい。一般に、イカ等の頭足類は漁獲後の日数に応じて健康状態が著しく悪化するため、活魚介類として利用するためには漁獲後に迅速に食材に供することが要求される。
【０００３】
イカ等の頭足類を活魚介類として利用するには、このように迅速に食材に供することが最善であるが、漁獲後の蓄養や輸送がどうしても必要な場合があり、このような場合、蓄養や輸送に要する時間を考慮して健康状態を把握し、健康状態を失う前の適切なタイミングで食材に供する必要がある。しかしながら、イカ等の頭足類は、健康状態の悪化に個体差があり、同じ日数の蓄養や輸送を行っても健康なままの個体と健康ではなくなる個体とがどうしても存在する。このため、これらイカ等の頭足類の健康状態を蓄養や輸送の時間を基準として把握することは非常に困難である。また、イカ等の頭足類の健康状態を知るには、目視による生存の確認、さらに、遊泳できるか否かで健康か健康ではないかを判断するしか方法がなく、これら目視による健康状態の確認は、客観性と定量性を欠いていた。そのため、イカ等の頭足類の健康状態について、客観的にかつ正確に評価する技術が求められている。
【０００４】
本願発明者らは、イカ等において、頭足類の血リンパ液中の酸素運搬体であるヘモシアニンの生理機能と含有量が健康状態に関係することを見出しており、既に提案している（例えば、非特許文献１）。漁獲後のスルメイカの蓄養実験で、ヘモシアニンの分子構造が変化して生理機能の低下が起こり、さらにヘモシアニンが分解することで体液である血リンパ液中のヘモシアニン含有量が減少するという知見について記載されている。ヘモシアニンの生理機能と含有量が失われた結果、酸素の体内取り込みや体内の酸素運搬に障害が起こり循環不全をきたし、この循環不全による酸欠のために鰭・足・表皮等の末端組織の壊死が起こり、全身状態が悪化して死亡に至る。
【０００５】
ところで、特許文献１には、魚類の眼球付近に存在する粘膜内部の間質液中のグルコース濃度を測定する装置について記載されている。この装置は、魚類ではストレスを感じると血液中のグルコース濃度が上昇することから、魚類の生体内のグルコース濃度を長時間測定しようとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２３７３３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】加藤早苗、Ｍｄ．  Ｒａｆｉｑｕｌ  Ｉｓｌａｍ  Ｋｈａｎ、吉岡武也、蓄養スルメイカ血リンパ内で起こるヘモシアニンの性情変化、平成２３年度日本水産学会秋季大会  講演要旨集、平成２３年９月２９日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、非特許文献１に開示されたヘモシアニンの含有量及び酸素結合量とイカの健康状態の関係は、イカ等の健康状態の判定方法として確立するには至っていない。ヘモシアニンの含有量の測定については、本発明者らの研究によると、頭足類の健康状態の悪化の初期には、ヘモシアニンの含有量は低下していないがその生理機能は既に低下している状態が存在する。この状態については、ヘモシアニンの含有量の測定のみによっては判定することできない。活イカ等を輸送したり蓄養したりする場合には、輸送中および蓄養中の健康状態悪化とその進行を防ぐために、さらに確実に健康な個体を選別して使用することが求められるが、ヘモシアニンの含有量の測定のみでは、確実に健康な状態を判定することは困難である。
【０００９】
ヘモシアニンの酸素結合能の測定によって、ヘモシアニンの生理機能の低下した状態を判定することができるが、この測定については、波長可変式分光光度計をはじめとする高価な精密機器が必須であるとともに、技術と労力および数ｍＬもの多量の試料を要するため、ルーチンな判定方法には不向きであり、測定と結果解析には半日以上を要するために、イカ等の健康状態を判定しこのイカ等が衰弱する前に食材として提供するには間に合わないことが考えられる。
【００１０】
特許文献１の技術は、魚類のストレスを検出するためのものである。イカ等の頭足類では、血中のグルコース濃度の向上がストレスの向上をあらわすという知見は得られていない。脊椎動物である魚類は、ストレスを感じると副腎皮質ホルモンの濃度上昇に伴って血中および間質液中のグルコース濃度が上昇する。しかし、イカ等の頭足類は動物軟体動物門頭足網に属する無脊椎動物であり、その内分泌系は脊椎動物のように高度には発達しておらず、また脊椎動物との共通点はほとんどなく、イカ等の頭足類において、副腎皮質ホルモンを介して体液中のグルコース濃度が上昇するとは考えられない。また、魚類の血中および間質液中のグルコース濃度に比較して、健康な状態のスルメイカの血リンパ液中のグルコース濃度は数倍〜１０倍も低い値を示し、健康状態の悪化に伴いその濃度はさらに低下する。そのため、魚類のための技術である特許文献１の装置をもとに試行錯誤でイカ等の健康状態を判定しようとしても、検出限界以下となり測定できないことが容易に予想される。これらの背景により、イカ等の健康状態を判定する確実かつ迅速な方法はいまだ見出されていない。
【００１１】
本願発明者らは、頭足類の健康状態が悪化するプロセスを解明すべく、その健康状態にヘモシアニンが関与及び影響する経路について主に研究を重ねた。その過程で、頭足類の血リンパ液中の成分、例えばｐＨ値や含有タンパク質などを探索した結果、頭足類のヘモシアニンの機能低下および減少が、その頭足類の血リンパ液中のグルコース濃度の減少と相関関係を有することを見出した。そこで、そのグルコース濃度と健康状態との関連についてさらに研究を行い、グルコース濃度の測定によって健康状態を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明はこのような背景に基づいてなされたものであり、その目的は、定量的にイカ等の頭足類の健康状態を判定することのできる頭足類の健康状態測定方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、比較的簡易、迅速かつ安価に頭足類の健康状態を判定できる頭足類の健康状態測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の頭足類の健康状態測定方法は、頭足類の血リンパ液中のグルコース濃度を測定してこの頭足類の健康状態を判定する。
【００１５】
血リンパ液中のグルコース濃度は頭足類の健康状態と関連性を持ち、定量的に測定することができるので、頭足類の健康状態を定量的に判定することができる。また、血リンパ液中のグルコース濃度はセンサにより比較的容易に測定することができ、迅速に測定が行える。さらに、個体ごとに健康状態を選別することができるので、生簀等による蓄養中に衰弱した個体を隔離することができ、水質悪化を防いで生簀等の効率的な管理が可能となり、健康な個体のみを蓄養することができる。さらにまた、輸送の前及び輸送中に健康な個体を選別することができるので、輸送の効率化もはかることができる。また、グルコース濃度の測定は高価な機器や試薬等を必要とせず、使用する血リンパ液も数μＬで充分であるため、比較的簡易、迅速かつ安価に頭足類の健康状態を判定することができる。
【００１６】
頭足類はイカ又はタコであることが好ましい。特に、頭足類はスルメイカであることが好ましい。活イカとして提供すべき需要が特に高いスルメイカについて健康状態を判定することができる。
【００１７】
グルコース濃度がより低いものを健康状態が悪化していると評価することが好ましい。頭足類の一種であるスルメイカにおいてグルコース濃度が高いものは健康状態が維持されるため、グルコース濃度がより低いものを健康状態が悪化していると評価することができる。
【００１８】
グルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ未満の値であるときに頭足類の健康状態が悪化していると評価することが好ましい。グルコース濃度の数値をもとに健康状態を判定することで、頭足類の健康状態を定量的、客観的に評価することができる。
【００１９】
頭足類の血リンパ液中のヘモシアニン濃度を測定する工程を含むことが好ましい。特に、ヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ未満の値であるときに頭足類の健康状態が悪化していると評価することが好ましい。ヘモシアニン濃度の高さは頭足類の健康状態の良さと相関するため、グルコース濃度とヘモシアニン濃度の両方を測定し、両方の値を参照することで、より高い精度で健康状態を判定することができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、以下の効果を得ることができる。
（１）血リンパ液中のグルコース濃度は頭足類の健康状態と関連性を持ち、定量的に測定することができるので、頭足類の健康状態を定量的に判定することができる。
（２）血リンパ液中のグルコース濃度はセンサにより比較的容易に測定することができ、迅速に測定が行える。個体ごとに健康状態を選別することができるので、生簀等による蓄養中に衰弱した個体を隔離することができ、水質悪化を防いで生簀等の効率的な管理が可能となり、健康な個体のみを蓄養することができる。
（３）輸送の前及び輸送中に健康な個体を選別することができるので、輸送の効率化もはかることができる。
（４）グルコース濃度の測定は高価な機器や試薬等を必要としないため、比較的簡易、迅速かつ安価に頭足類の健康状態を判定することができる。また、測定に要する血リンパ液試料は数μＬと少量なので、試料採取や動物への負担も少なくて済む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施例における血リンパ液中のグルコース濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施例における血リンパ液中のヘモシアニン濃度を測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施例における飼育実験前後における血リンパ液中のグルコース濃度とヘモシアニン濃度の相関について示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例における鰓のプロテオーム解析の蛋白質スポットを示す写真図である。
【図５】本発明の一実施例における血リンパ液中のヘモシアニン濃度と酸素結合能を測定した結果を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施例におけるヘモシアニン分子の電子顕微鏡像を示す写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（第１の実施形態）
本発明の実施形態において、健康状態を評価する対象である頭足類は、軟体動物門頭足網に属し、イカ、タコやオウムガイ等が含まれる。これらの頭足類は、体は外套膜につつまれた胴部、頭部及び足に分かれている点、血管系は閉鎖循環系である点、血管系を循環する体液は血リンパ液で血液とは異なり血球成分をもたない点、酸素運搬体である呼吸色素として血リンパ液に直接溶けた状態で存在するヘモシアニンを有する点などで共通している。本発明は特に、一般に食用とされるイカやタコについて適用される。イカは十腕形上目の生物でスルメイカ（開眼目）、ヤリイカ（閉眼目）等に適用でき、特にスルメイカ種（スルメイカ属）の測定に好適に用いられる。
【００２３】
血リンパ液は頭足類からは公知の採集手段及び機器を用いて採取できる。一般的な注射筒および注射針や血糖測定用穿刺針を用いて、静脈もしくは動脈血リンパ管から直接採取できる。血リンパ液からグルコース濃度を測定する手段は、公知の血糖値測定用などのグルコース濃度測定手段、機器やキット類、例えば、糖尿病患者専用の血糖測定センサや体外診断用医薬品グルコース測定キットなどが使用できる。採血と血糖値の測定の双方を行う機器やキットについても、適宜応用することができる。
【００２４】
本実施形態では、グルコース濃度がより低いものを健康状態が悪化していると評価する。本願発明者らが見出したイカ等の頭足類における、健康状態の悪化に伴う血リンパ液中のグルコース濃度の低下は、魚類のストレス応答における血中および間質液中グルコース濃度の上昇とは全く逆の現象である。これらは、全く異なるメカニズムによるものであることが示唆される。イカ等の頭足類において、脊椎動物と共通する内分泌を介したストレス応答が起こることは考えられず、魚類のようにストレスに応じて副腎皮質ホルモンを介して体液中のグルコース濃度が上昇するといったメカニズムによるとは考えられないためである。
【００２５】
本実施形態では、テルモシリンジ  ツベリクリン用１ｍＬ（テルモ）とニプロ注射針２３Ｇ（ニプロ）を用いてスルメイカから血リンパ液を採取し、体外診断用医薬品  グルコースキット  グルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬）、および血糖測定用グルコース分析装置ニプロスタットストリップＸＰ（ニプロ）を用いてグルコース濃度を測定している。
【００２６】
頭足類の健康状態が悪化していると判定できる血リンパ液内のグルコース濃度は１８ｍｇ／ｄＬ未満である。漁獲直後の健康な個体のうち９３％が、グルコース濃度１８ｍｇ／ｄＬ以上に含まれるためである。又、ヘモシアニンの酸素結合能が低下しているが濃度が低下していない健康状態悪化初期のものは１８ｍｇ／ｄＬ未満である。そのため、グルコース濃度１８ｍｇ／ｄＬ未満を健康状態が悪化していると判定すれば、確実に不健康な個体及び健康状態の悪化初期の個体を判別し、取り除くことができる。さらには、グルコース濃度が２５ｍｇ／ｄＬ以上のものを特に健康状態が良好と判定することが好ましい。２５ｍｇ／ｄＬ以上の範囲内ではヘモシアニンの酸素結合能が低下した個体が認められないので、２５ｍｇ／ｄＬ以上を抽出することで、又は２５ｍｇ／ｄＬ未満の個体を除外しその残りについて、健康維持に必要であるヘモシアニンの生理機能および含有量を保持した、確実に健康な個体を抽出できる。
【００２７】
本実施形態では、ヘモシアニン濃度の測定を行うこともできる。ヘモシアニンは、頭足類の酸素運搬体であり、血リンパ液に直接溶けた状態で存在する呼吸酵素である。ヘモシアニン濃度の測定はＬｏｗｒｙ法、ビウレット法等の一般的なタンパク質濃度測定法が利用できる。ヘモシアニン濃度は８０ｍｇ／ｍＬ未満のものを健康状態が悪化していると判定することが好ましい。漁獲直後の健康な個体の９６％及び漁獲後に飼育した後も遊泳できる個体の９５％がヘモシアニン濃度８０ｍｇ／ｍＬ以上に含まれる。さらには、ヘモシアニン濃度を１００ｍｇ／ｍＬ以上のものを健康状態が良好と判定することが好ましい。同様に漁獲直後の健康な個体の９３％及び漁獲後に飼育した後も遊泳できる個体の７７％がヘモシアニン濃度１００ｍｇ／ｍＬ以上に含まれるので、１００ｍｇ／ｍＬ未満の個体を除去することで、その残りについて特に健康な個体を抽出できる。
【００２８】
本実施形態では、グルコース濃度とヘモシアニン濃度の両方の値で健康状態を評価することができる。例えば、グルコース濃度が２５ｍｇ／ｄＬ以上、かつヘモシアニン濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上の個体を最も健康なものと評価してもよい。また、いずれか一方がこの条件を満たさないものをより健康状態が劣るもの、さらに、グルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ未満でかつヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ未満の個体を最も健康状態が劣るものとする等、何段階かに分けて評価してもよい。
【実施例】
【００２９】
（飼育実験）
本発明の一実施例として、飼育実験を行った。３００Ｌ容量の恒温実験水槽に人工海水を満たし、一定温度に保ち、溶存酸素を飽和に保つように空気を供給した。この恒温実験水槽に漁獲直後のスルメイカを入れ、１〜３日間の飼育実験に供した後に、血リンパ液を採取した。採取した血リンパ液のグルコース濃度、ヘモシアニン濃度、酸素結合能を測定した。漁獲直後の個体から血リンパ液を採取し、飼育実験前の対照区とした。
【００３０】
飼育実験の前後における各個体の血リンパ液中のグルコース濃度を図１に示す。飼育実験に供した個体の血リンパ液中のグルコース濃度は、対照区の個体と比べて低下していた。
【００３１】
飼育実験の前後における各個体の血リンパ液中のヘモシアニン濃度を図２に示す。飼育実験に供した個体の血リンパ液中のヘモシアニン濃度は、対照区の個体と比べて低下していた。
【００３２】
なお、ヘモシアニン濃度８０ｍｇ／ｍＬの範囲には、漁獲直後の健康な個体の９６％、および本実施例によると漁獲後に飼育した後も遊泳できる個体の９５％が含まれる。また、ヘモシアニン濃度１００ｍｇ／ｍＬ以上の範囲には、同様に漁獲直後の健康な個体の９３％、および漁獲後に飼育した後も遊泳できる個体の７７％が含まれる。そのため、ヘモシアニン濃度８０ｍｇ／ｍＬ未満を健康状態が悪化した状態、１００ｍｇ／ｍＬ以上を特に健康状態が良好な状態と判定するのが望ましいことが示された。
【００３３】
グルコース濃度とヘモシアニン濃度の相関を図３に示す。両者には相関関係があり、健康状態の悪化によってヘモシアニン濃度とグルコース濃度がともに低下することが示された。中にはヘモシアニン濃度が高くてもグルコース濃度が低下しているケースも見られたことから、グルコース濃度低下に遅れてヘモシアニン濃度低下が起こることが示唆された。また、水槽内での遊泳能を目視し、健康か衰弱しているかの判定を行った。その結果、衰弱している個体のうち８６．９％でグルコース濃度が低下し、４９．２％がヘモシアニン濃度とグルコース濃度がともに低下していた。
【００３４】
なお、漁獲直後の健康な個体の９３％はグルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ以上であり、また健康状態が悪化してヘモシアニン濃度が低下した個体の８１％はグルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ未満である。また、グルコース濃度１８ｍｇ／ｄＬ未満である個体の中にはヘモシアニン濃度が低下していない個体も４３％含まれるが、これらの中には後述するヘモシアニンの酸素結合能が低下したものが認められたので、健康状態悪化の初期にある個体が含まれていることとなる。このため、グルコース濃度１８ｍｇ／ｄＬ未満であれば、確実に不健康な個体および健康状態の悪化初期の個体も取り除くことができる。さらに、２５ｍｇ／ｄＬ以上の範囲にはヘモシアニンの酸素結合能が低下した個体は認められないので、この範囲を特に健康状態が良好な状態と判定するのが望ましいことが示された。グルコース濃度２５ｍｇ／ｄＬ未満の個体を取り除くことで、ヘモシアニン濃度が低下した個体を完全に除くことができる。
【００３５】
グルコース濃度及びヘモシアニン濃度の測定値によって健康状態評価を段階的に行うこともできる。例えば、図３に示すように、グルコース濃度が２５ｍｇ／ｄＬ以上でヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ以上の個体を「５：極めて良好」、グルコース濃度が１８〜２５ｍｇ／ｄＬでヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ以上の個体を「４：良好」、グルコース濃度が１８〜２５ｍｇ／ｄＬでヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ未満の個体を「３：良」、グルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ未満でヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ以上の個体を「２：不良」、グルコース濃度が１８ｍｇ／ｄＬ未満でヘモシアニン濃度が８０ｍｇ／ｍＬ未満の個体を「１：極めて不良」と判定することもできる。
【００３６】
目視での遊泳能により、衰弱していない（遊泳群）及び衰弱している（静止群）ことを判定した個体数と、グルコース濃度との関係を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2013174564.tif 000002
【００３８】
（ヘモシアニン分解）
目視による遊泳能から衰弱していると判断した個体についてプロテオーム解析を実施したところ、図４に示すように鰓からヘモシアニン分解物由来のペプチドスポットを検出した。遊泳能により衰弱していない（遊泳群）及び衰弱している（静止群）ことを判定した個体数と、スポットを検出した個体数との相関を表２に示す。
【００３９】
【表２】
2013174564.tif 000003
【００４０】
これらの結果により、衰弱とヘモシアニンの分解の間には相関関係が見られた。衰弱した個体は、健康状態の悪化に伴ってヘモシアニンが低分子のペプチドに分解され、血リンパ液中のヘモシアニン濃度が減少していると考えられる。ヘモシアニンの低分子のペプチドへの分解状態の検出を他の検出手段と組み合わせることで、サンプル採取時点での健康状態を詳細に判定することができると考えられる。
【００４１】
また、飼育後にグルコース濃度が低下したものの、ヘモシアニン濃度は飼育実験前の対照と同レベルを維持した個体があった。これらの個体について、ヘモシアニンの酸素結合能を差スペクトル測定により測定した。酸素を充分に添加して酸素結合型としたヘモシアニンのスペクトルから、二酸化炭素を添加し酸素非結合型としたヘモシアニンのスペクトルを差し引いて、得られた差スペクトルのピークである５８０ｎｍの吸光値の高さからヘモシアニンの酸素結合能を算出した。結果を図５に示す。これらの個体は、対照と比べてヘモシアニンの酸素結合能の低下が見られた。
【００４２】
これらの個体についてヘモシアニン分子を電子顕微鏡で観察した結果を図６に示す。観察は酢酸ウランによるネガティブ染色後に透過型電子顕微鏡で行った。ヘモシアニン分子は１０個の蛋白質のサブユニットが結合したシリンダー状の分子構造を有し、長方形（平面形状）又はドーナツ状（側面形状）に染色されて観察される。飼育実験前の対照ではシリンダー状の構造を保つヘモシアニン分子を認めたが、飼育実験後には分子構造を保つ像は顕著に少なくなり、代わりにヘモシアニン分子から解離したサブユニットと思われる像を多く認めた。このため、血リンパ液中のヘモシアニンの含有量は維持されていても、その分子構造の変化が起こっており、生理機能が低下していることが明らかとなった。換言すると、健康状態が悪化してヘモシアニンの分子構造が変化しているがヘモシアニンの含有量（濃度）が維持されている場合がある。以上の結果から、グルコース濃度はヘモシアニン濃度よりも鋭敏な健康指標となることが示唆された。
【００４３】
以上述べた実施形態は全て本発明を例示的に示すものであって限定的に示すものではなく、本発明は他の種々の変形態様及び変更態様で実施することができる。従って本発明の範囲は特許請求の範囲及びその均等範囲によってのみ規定されるものである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は水産業における漁獲、養殖や輸送、食品業や外食産業での食材の提供のほか、魚介類を対照とする試験研究、水族館など幅広い分野に役立つものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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