(57)【要約】      （修正有）【課題】実験データ発現解析を精度良く実施し、生物学的な評価を的確に行うことができる遺伝子セットの作成方法を提供する。【解決手段】検討したい内容に即し、複数の群を構成できるように用意した実験セットから遺伝子の発現実験データを得る第１のステップと、複数の群間の発現実験データを比較するために統計学的検定を行う第２のステップと、統計学的検定による検定統計量に対して有意な遺伝子を選択するための基準値を設定する第３のステップと、第３のステップにより有意な遺伝子を抽出する第４のステップとで構成される、遺伝子セットの作成方法。【選択図】図１
2013123420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検討したい内容に即し、複数の群を構成できるように用意した実験セットから遺伝子の発現実験データを得る第１のステップと、
前記複数の群間の発現実験データを比較するために統計学的検定を行う第２のステップと、
前記統計学的検定による検定統計量に対して有意な遺伝子を選択するための抽出条件を設定する第３のステップと、
前記第３のステップにより有意な遺伝子を抽出して遺伝子セットを作成する第４のステップとを備えていることを特徴とする遺伝子セット作成方法。
【請求項２】
前記第３のステップは、各実験セット毎に有意な遺伝子を選択するための抽出条件を設定して第１次遺伝子セットを抽出するステップと、前記第１次遺伝子セットに発現の有意な上昇を示す抽出条件と発現の有意な下降を示す抽出条件を設定するステップとで構成されていることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子セット作成方法。
【請求項３】
前記複数の群は２群を構成し、前記実験セットは複数の種類で構成されていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の遺伝子セット作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイデータの解析法の一つである、Ｕ検定や順位和検定、さらに発現値を考慮した順位和検定であるGSEA法や、正確確率検定であるFisherのなどの統計処理で利用する遺伝子セット作成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発現データ解析法は、t検定やクラスター解析のほか、Ｕ検定や順位和検定、さらに発現値を考慮した順位和検定であるGSEA法や、正確確率検定であるFisherExactテスト法のなどの統計処理を実施しているのが現状である。
【０００３】
これらの検定で共通に利用されるのが遺伝子のグループである。つまり、あらかじめ遺伝子のグループを構成しておき、入力とした遺伝子のリストがどのグループに対して有意かを算出する。特に、GSEA法では発現変動比を考慮するＵ検定なので、よく発現解析の分野で利用される方法である。
【０００４】
通常、ここでいうグループを構成する遺伝子セットで代表的なものに、Gene Ontologyがある。このほか、疾患に関連する遺伝子セット、治療薬を含む化合物に関連する遺伝子セット、シグナルパスウエイに含まれる遺伝子セットなどがよく利用される。
【０００５】
このGene Ontologyは、遺伝子の機能を表すもので、各遺伝子を「細胞増殖」や「細胞接着」などの分子機能で分類したデータベースをいう。これらは、ホームページで公開されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Subramanian et al., PNAS October 25 2005 vol. 102 no. 43 15549Gene setenrichment analysis: A knowledge based approach for interpreting genome-wideexpression profiles
【非特許文献２】Haiyan Huang et al., PNAS A Bayesian Approach to Transforming PublicGene Expression Repositories into Disease Diagnosis Databases
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これらはあらかじめ文献情報から作成されたり、公共データベースに公開している遺伝子機能分類であったり、既知のシグナルパスウエイであったで、これらのほとんどは、公知のデータを再加工して作ったものである。
【０００８】
このように、データセットは、公知のデータに基づいて作成されているため、発現解析が精度良く実施できないという問題があった。また、従来のように、公共データベースや相互作用のデータベースを用いて評価しても、生物学的な評価の意味が正確にわからない。
【０００９】
本発明は、上述した課題を解決するために創案されたものであり、実験データ発現解析を精度良く実施し、生物学的な評価を的確に行うことができる遺伝子セットの作成方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明の遺伝子セット作成方法は、検討したい内容に即し、複数の群を構成できるように用意した実験セットから遺伝子の発現実験データを得る第１のステップと、前記複数の群間の発現実験データを比較するために統計学的検定を行う第２のステップと、前記統計学的検定による検定統計量に対して有意な遺伝子を選択するための抽出条件を設定する第３のステップと、前記第３のステップにより有意な遺伝子を抽出して遺伝子セットを作成する第４のステップとを備えていることを主要な特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、検討したい内容に即して実験セットを作成することができ、この発現実験データをもとに遺伝子セットを構成することができる。このため、公知の情報に頼らず、より実験によって検証されたデータを利用して判別できるので、より確実な遺伝子群の挙動が把握できるほか、実験に基づく遺伝子の分類が可能となる。
【００１２】
また、本発明によれば、それぞれの生物学的な評価の意味を正確に表現することができる。
【００１３】
さらに、Gene Ontologyやシグナルパスウェイに代表される、既知の情報に基づいて作成された遺伝子セットを用いた研究者の発現データの解釈方法に、実験データという実績のあるデータに基づき、既知の情報に基づかずに作成された遺伝子セットにより発現データの新しい解釈方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の遺伝子セット作成方法のフローチャートを示す図である。
【図２】実験セットとこの実験セットから作成される遺伝子セットとの関係を示す図である
【図３】図２に示される実験セットに使用されたサンプルを示す図である。
【図４】図２の各グループＩＤに含まれる遺伝子ＩＤとプローブ数の例を示す図である。
【図５】作成された遺伝子セットを保存する場合のデータ形式の一例を示す図である。
【図６】作成された遺伝子セットを保存する場合のデータ形式の一例を示す図である。
【図７】比較検討したいアレイデータの発現比情報を示す図である。
【図８】ＧＳＥＡ分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明の一実施形態を説明する。図１は本発明の遺伝子セット作成方法のフローチャートを示す。
【００１６】
まず、本発明において、遺伝子と言う場合は、遺伝子でなくとも、発現マイクロアレイのプローブでも、発現現象が確認されたゲノム上の位置でもよく、ゲノム上で遺伝子発現を行っている位置を含む意味である。遺伝子と発現マイクロアレイのプローブの関係は、ゲノム上に点在する一つの遺伝子にｎ個のプローブが割り当てられている関係となる。また、これらの遺伝子セットは、GSEAだけでなくFisher検定などの統計処理に利用できる。
【００１７】
具体的な遺伝子セットの作成方法を以下に説明する。まず、検討したい内容に即し、複数の群を構成できるように実験セットを準備する（Ｓ１）。
【００１８】
検討したい内容とは、本実施例では、次のようなものとする。例えば、新たに実験した血管新生有無のマイクロアレイを用いた発現データを、６つのグループで評価し、最終的にはどのグループに属する遺伝子が有意な評価をされるかを求める。そこで、評価に利用するモデルデータセットを、図２に示すように、以下の６つのグループに分類する。
（１）血管新生因子VEGFの投与の有無の比較でアップレギュレート、ダウンレギュレートする２つのグループ。
（２）乳癌における転移性癌と非転移性癌の間の比較でアップレギュレート、ダウンレギュレートする２つのグループ。
（３）ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞とヒト線維芽細胞間の比較でアップレギュレート、ダウンレギュレートする２つのグループ
基本的に、上記６つグループを用いて、新たに実験した血管新生有無のマイクロアレイ発現データを評価することを考える。
【００１９】
また、本実施例では統計検定で、２群間で比較を行う。２群比較の場合は、例えば、コントロールとトリートメント、あるいは、コントロールと疾患、もしくはコントロールとタイムコースの一点などの実験セットに編集することができる。これにより、作成された実験セットを図２に示す。
【００２０】
図２に示すように、２群比較できるように、血管新生因子VEGFの投与の有無間で血管内皮細胞において発現変動する遺伝子を観察したアレイ実験(GSE19098)、乳癌における転移性癌と非転移性癌の間で発現に差のある遺伝子を観察したアレイ実験(GSE32531)、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞とヒト線維芽細胞間で差のある遺伝子を観察したアレイ実験(GSE25970)の３種類を準備した。
【００２１】
なお、本実施例では、２群比較としたが、３群比較や４群比較等のように、より多群間の比較ができるように実験セットを準備しても良い。
【００２２】
ここで、(GSE19098)血管新生因子VEGFの投与の有無比較はコントロールとトリートメントの比較で、VEGFの投与にて有意な遺伝子が判定される。(GSE32531)乳癌における転移性癌と非転移性癌比較は、コントロールと疾患に分類され、転移性に関する遺伝子を有意判定する。(GSE25970)ＥＳ細胞及びiPS細胞とヒト線維芽細胞間比較１、(GSE25970)ＥＳ細胞及びiPS細胞とヒト線維芽細胞間比較２は、コントロールと表現型に分類され、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞と線維芽細胞で有意な遺伝子を見る。
【００２３】
図３は、図２のグループＩＤの１〜８の実験に実際に使用したサンプル名（ＩＤ）を示す。例えば、図３（ａ）は、アレイ実験(GSE19098)において、血管新生因子VEGFの投与が無いというサンプルを３サンプル（GSM473032、GSM473033、GSM473034）、血管新生因子VEGFの投与が有るサンプルを３サンプル（GSM473035、GSM473036、GSM473037）用いていることを示す。
【００２４】
図３（ｂ）は、アレイ実験(GSE32531)において乳癌における非転移性癌のサンプルを1１サンプル（GSM805892〜GSM805902）、乳癌における転移性癌のサンプルを１６サンプル（GSM805903〜GSM805918）用いていることを示す。
【００２５】
図３（ｃ）は、アレイ実験(GSE25970)においてＥＳ細胞のサンプルを１７サンプル（GSM637758〜GSM637774）、ヒト線維芽細胞のサンプルを６サンプル（GSM637790〜GSM637795）用いていることを示す。
【００２６】
図３（ｄ）は、アレイ実験(GSE25970)においてｉＰＳ細胞のサンプルを１２サンプル（GSM637778〜GSM637789）、ヒト線維芽細胞のサンプルを６サンプル（GSM637790〜GSM637795）用いていることを示す。
【００２７】
上記のように、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞とヒト線維芽細胞間で差のある遺伝子を観察したアレイ実験(GSE25970)については、２群比較用のデータセットで利用できる組み合わせが２種類存在していることを示す。
【００２８】
ここで、図３からわかるように、実験には最低でも３サンプル使用しているが、これは、後述するように、Ｐ値を算出するために必要であり、Ｐ値を用いる必要がなければ、最低、各グループＩＤについて、１サンプルとしても良い。
【００２９】
次に、実験終了後、各グループＩＤの各実験により得られたマイクロアレイデータについて、複数の群間で比較するために、統計学的検定を行う（Ｓ２）。本実施例では２群間比較であるので、２群間比較のための統計学的検定を行った。なお、Ｓ２〜Ｓ６の各処理は、コンピュータにより行われる。
【００３０】
まず、血管新生因子VEGFの投与の有無間で、血管内皮細胞において発現変動する遺伝子を観察したアレイ実験(GSE19098)、乳癌における転移性癌と非転移性癌の間で発現に差のある遺伝子を観察したアレイ実験(GSE32531)、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞とヒト線維芽細胞間で差のある遺伝子を観察したアレイ実験(GSE25970)のそれぞれの実験で有意な遺伝子セットを求めるために、統計計算（統計学的検定）を行う。
【００３１】
ここでは、各遺伝子の発現値を利用し、Welch t検定を行い、Ｐ値を求めると同時に、２群間の各プローブの平均の比を計算した。実験ごとの分母分子の別は以下のように設定した。
【００３２】
これらの実験セットでは、１遺伝子に複数プローブが対応しているために、プローブ単位で計算した。なお、本実施例においては、プローブ数＝遺伝子数とした。図４に、遺伝子（遺伝子ＩＤ）とこれに対応するプローブ数を示す。
【００３３】
有意変動遺伝子を得るためにカットオフ条件を設定する。カットオフ条件は、上述したWelch t検定を行って求めたＰ値と２群間の各プローブの平均の比との両方の値の論理和を取り、Ｐ値＜0.01かつ発現変動比≧2.0かつ発現変動比≦0.5の条件を満たすプローブを選択するのが基本条件だが、本条件によって、1グループ中のプローブ数が多いと、後のGSEA計算に不向きなために、カットオフ条件は実験ごとに変更した、実験ごとの条件を以下に示す
GSE32531:
P<0.01 かつ 2fold UP or 0.5fold DOWN
GSE19098:
P<0.01 かつ 2fold UP or 0.5fold DOWN
GSE25970-1（比較１）:
P<0.0001 かつ 2fold UP or 0.5fold DOWN
GSE25970-2（比較２）;
P<0.0001 かつ 2fold UP or 0.5fold DOWN
ここで、「2fold UP or 0.5fold DOWN」は、２倍以上のアップレギュレーション又は０．５倍以下のダウンレギュレーションであることを示す。この意味は、上述したように、各遺伝子の発現値を利用し、Welch t検定を行い、Ｐ値を求めると同時に、２群間の各プローブの平均の比を計算しているが、このときの２群間の各プローブの平均の比の２倍以上又は０．５倍以下を意味する。
【００３４】
上記のカットオフ条件により、プローブを抽出する。これにより、有意な変動を示す第１次遺伝子セットが作成される（Ｓ３）。第１次遺伝子セットで選択されたプローブを、さらにアップレギュレーションとダウンレギュレーションの２つのグループに分割する（Ｓ４）。具体的には、Ｐ値＜0.01かつ発現変動比≧2.0を有意な上昇を示すアップレギュレーションと、Ｐ値＜0.01かつ発現変動比≦0.5の条件を満たすプローブを有意な下降を示すダウンレギュレーションと定義した。
【００３５】
ここで、発現変動比は、健常組織や正常細胞などの対象群における遺伝子の発現値を分母とし、興味対象となっている病理組織や特殊な処理を施した細胞(幹細胞や遺伝子操作細胞)を分子とした場合に算出される比、又は、遺伝子の発現値が対数で表現される場合は、引き算により算出される対数比で表される。
【００３６】
なお、２群比較のために統計学的検定を行う場合は、Ｐ値及び発現変動比の両者が必ずしも必要とはならず、発現変動比のみ、Ｐ値のみ、もしくは発現比の順位のみをもとに遺伝子セットを作成することもできる。
【００３７】
Ｐ値と発現変動比は通常上記の値が推奨されるが、場合によっては選択された遺伝子やプローブの数が多すぎたり少なすぎたりする。その時は本閾値を調整し、好ましくは、１００〜１５００程度の遺伝子やプローブを有意と判断できると、本遺伝子もしくはプローブセットを用いたGSEA解析の結果が正確に判断される。
【００３８】
アップレギュレーションとダウンレギュレーションの２つのグループにより作成された最終の遺伝子セットにどのようなものかという説明をつけ、ファイル、もしくはデータベースに保存する（Ｓ５）。図２〜図４で構成されるデータ形式が、リレーショナルデータベースを用いた時のデータ構造で、図５または図６に示す例が、ファイルに保存した例である。なお、図４、５は、ファイルの内容の一部を示しており、各列に記載されている数字は遺伝子ＩＤを示す。図２、３は各グループの条件を格納し、図４にその実際のデータを格納する。図２、３と図４は、グループＩＤで連結する。これらは、リレーショナルデータベースでなくとも、ファイルでもよい。
【００３９】
検討したい内容に即した実験セット、すなわちGSE19098、GSE32531、GSE25970の実験セットすべてについて、Ｓ２〜Ｓ５の処理が行われていない場合（Ｓ６ NO）は、Ｓ２に戻り、Ｓ２〜Ｓ５の処理が行われた場合（Ｓ６
YES）は、遺伝子セットの作成を終了する。
【００４０】
この例でできた遺伝子セット（プローブセット）は、GSE19098が２つ、GSE32531が２つ、GSE25970が４つの合計８セットとなる。すなわち、血管新生因子VEGFの投与の有無の比較でアップレギュレート、ダウンレギュレートする２つのセット、乳癌における転移性癌と非転移性癌の間の比較でアップレギュレート、ダウンレギュレートする２つのセット、ＥＳ細胞及びiPS細胞とヒト線維芽細胞間の比較でアップレギュレート、ダウンレギュレートする２つのセットである。
【００４１】
なお、上記実施例では、各実験セットに対して、最終的な遺伝子セットとして、アップレギュレート、ダウンレギュレートの２セットを作成したが、これに限定されるものではなく、各実験セットについて有意な変動を示す遺伝子セットを１つだけ作成しても良いし、また、３つ以上作成しても良い。
【００４２】
次に、上記８個の遺伝子セットを利用することで、それぞれの生物学的な評価が以下のように的確に行われる。これは、従来の公共データベースや相互作用のデータベースを用いて評価するところと大きく異なる点である。
【００４３】
（Ａ）上記GSE19098の実験セットから作成されたアップレギュレート、ダウンレギュレートの２つの遺伝子セットを用いて、新たに実験した血管新生有無のマイクロアレイ発現データを評価すると以下のようなことがわかる。この実験からは、血管新生因子により誘導される血管新生に関わる遺伝子セットを得ることができる。この遺伝子セットと、ユーザーの遺伝子発現情報の類似性をGSEA及びフィッシャーの正確確率検定で解析することで、VEGFによる血管新生に関わる遺伝子との重複を明らかにすることができ、ユーザーの実験において血管新生の誘導が発生しているか否かを推定することが可能となる。
【００４４】
（Ｂ）上記GSE32531の実験セットから作成されたアップレギュレート、ダウンレギュレートの２つの遺伝子セットを用いて、新たに実験した血管新生有無のマイクロアレイ発現データを評価すると以下のようなことがわかる。転移の有無は癌の悪性度に強く関与する臨床像であり、転移の有無間で発現の異なる遺伝セットは腫瘍の悪性度を表す指標と考えられる。
【００４５】
この実験より得た遺伝子セットと、新たに実験して得た遺伝子発現情報の類似性をGSEA及びフィッシャーの正確確率検定で解析することで、転移に関わる遺伝子との重複を明らかにすることができ、ユーザーの実験において腫瘍転移の誘導が発生しているか否かを推定することが可能となる。
【００４６】
（Ｃ）上記GSE25970の実験セットから作成されたアップレギュレート、ダウンレギュレートの４つの遺伝子セットを用いて、新たに実験した血管新生有無のマイクロアレイ発現データを評価すると以下のようなことがわかる。幹細胞の性質を持つ癌細胞は腫瘍の進展・抗癌剤耐性に関わることが報告されており、この実験により得た遺伝子セットと、新たに実験して得た遺伝子発現情報の類似性をGSEA及びフィッシャーの正確確率検定で解析することで、癌幹細胞の形成に関わる遺伝子との重複を明らかにすることができ、ユーザーの実験において悪性度の高い癌細胞が存在するか否かを推定することが可能となる。
【００４７】
このように、実際の実験データから有意に変動している遺伝子を取り出した遺伝子セットを作成し、GSEAやFisher
testに利用することの利点は、これまでGene Ontologyやシグナルパスウェイに代表される「既知の情報に基づいて作成された遺伝子セット」を用いた研究者の発現データの解釈方法に、実績のある手法を用いて「既知の情報に基づかずに作成された遺伝子セット」を用いた発現データの新しい解釈方法を提供する点にある。
【００４８】
これにより、例えば、公共アレイデータにおいて高グレードの癌細胞で発現上昇している遺伝子と研究者実験データの重複をみることで、機能未知の遺伝子が含まれていたとしても、実験データの裏付けに基づく類似性を観察でき、研究対象となっているサンプルが対象群に比べて「高悪性度」な腫瘍組織と類似した性質を持っていることが推察される。本発明は、「細胞増殖」や「細胞接着」などのGene Ontologyに基づく解釈では、実験対象のサンプルが持つ性質を疾患や表現系と結び付けることが困難な場合に、特に有用である。
【００４９】
また、ここから高グレードの癌細胞で発現上昇していた遺伝子と、研究者実験データの重複遺伝子を抽出することで、着目する遺伝子を絞り込むフィルターの機能を持たせることも可能である。
【００５０】
また一例として、分子標的や作用メカニズムの既知の医薬品を投与した際に発現の変化する遺伝子セットを作成しておき、機能・メカニズム未知の薬品・食品の発現プロファイルとの重複を本法により観察することで、その作用メカニズムを推定する用途が想定される。
【００５１】
次に、上述した図５又は図６のように作成された遺伝子セットを利用して、GSEA解析を行った例を以下に示す。
【００５２】
（GSEA実施方法）
図１の遺伝子セット作成方法にて得られた遺伝子セットを対象に、DU145による移植癌モデルゼブラフィッシュにおける血管新生の有無間で発現を観察したアレイデータ「Agilent Human array
Median Normalized Data.txt」における発現比情報を使用してGSEAを実施した。
【００５３】
この実験データは、前立腺癌細胞DU145をゼブラフィッシュに移植後、ゼブラフィッシュの体内にて血管新生を誘導した細胞株と、誘導しなかった細胞株を、移植癌モデルゼブラフィッシュよりそれぞれ個別に回収し、マイクロアレイ実験を行ったデータである。
【００５４】
GSEA解析の結果を図８に示す。図８の横方向の欄に記載された項目は、以下の内容を示す。SIZEは遺伝子セットと実験データ(発現データ)に共通して存在した遺伝子の数、ESはkolmogorov-smirnovの検定統計量を示す。NESは標準化されたkolmogorov-smirnovの検定統計量、すなわちリサンプリングにより算出したESの分布に基づいて正規化を実施したESを表す。これは、異なった遺伝子セットに由来するESどうしを比較することはできないため、遺伝子セット間の比較のために正規化されたNESを算出している。
【００５５】
NOM p-valはESをもとに算出したＰ値を示す。FDR q-valはNESをもとに算出した偽陽性率(FDR)を示す。RANK AT MAXは、kolmogorov-smirnov検定時に、実験データの遺伝子を発現比で順位付け後にESを算出する過程において、ESが最大値を取った際の実験データにおける該当遺伝子の順位を示す。
【００５６】
Median Changeは、実験データにおいて遺伝子セットを構成する遺伝子集団に含まれる遺伝子の発現比の中央値を示す。なお、発現比の中央値が1以下の場合逆数にしてマイナスを付与している。Median Change of
Leading Edgeは、遺伝子セット中でRank AT MAX より上位に位置する遺伝子についての実験データにおける発現比の中央値を示す。発現比の中央値が１以下の場合逆数にしてマイナスを付与している。
【００５７】
図８には、GSE32531の実験セットから作成されたアップレギュレートの遺伝子セットのうち、０．５倍以下のダウンレギュレーションの遺伝子、２倍以上のアップレギュレーションの遺伝子との関係が示されている。また、GSE19098の実験セットから作成されたダウンレギュレートの遺伝子セットのうち、０．５倍以下のダウンレギュレーションの遺伝子、２倍以上のアップレギュレーションの遺伝子との関係が示されている。さらに、GSE25970の実験セットから作成されたダウンレギュレートの遺伝子セットのうち、０．５倍以下のダウンレギュレーションの遺伝子、２倍以上のアップレギュレーションの遺伝子との関係が示されている。なお、GSE25970の実験セットは２種類あるので、データはそれぞれの種類について記載されている。
【００５８】
図８の結果から、遺伝子セットの構成遺伝子が発現変動遺伝子の上位に来ている有意確率FDR q-valに基づき、血管新生誘導能をもつ前立腺癌細胞株にて発現が低下する遺伝子には、ＥＳ細胞で線維芽細胞に比較して発現が低下している遺伝子が統計的有意に集積している傾向が認められた。
【００５９】
以上の結果は、ES細胞の分化抑制に関わる遺伝子発現の特徴が、血管新生の誘導能をもつ癌細胞においても同様の特徴を持っていることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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