(57)【要約】【課題】ヒト高脂血症の病態を十分に再現することができる高脂血症モデル動物を取得することや、かかるモデル動物を利用した高脂血症治療・予防薬のスクリーニング方法を提供することにある。【解決手段】発明者らが作製したＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスが通常食では高脂血症を示さないことから、ＬＤＬＲ遺伝子単独のノックアウトでは通常食では高脂血症を示さないだろうという予測に反して、通常食でも高脂血症の症状を示した。また、血漿中コレステロールの組成（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）において、ヒト家族性高脂血症を十分に再現し得たことから、発明者のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは従来のげっ歯類等の高脂血症モデル動物よりも優れた高脂血症モデル動物であるという確証を得て、本発明を完成するに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させた、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示すことを特徴とする高脂血症モデルブタ。
【請求項２】
高コレステロール血症が、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの濃度がコントロールと比べて高いことを特徴とする、請求項１に記載の高脂血症モデルブタ。
【請求項３】
高コレステロール血症が、IIｂ型遺伝性高脂血症であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の高脂血症モデルブタ。
【請求項４】
採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ＬＤＬＲ遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核を注入することで得られる体細胞核移植クローン動物又はその子孫であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の高脂血症モデルブタ。
【請求項５】
ＬＤＬＲ遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核が、ＬＤＬＲ遺伝子エクソン４の一部をネオマイシン耐性遺伝子で置換したブタ体細胞核であることを特徴とする、請求項４に記載の高脂血症モデルブタ。
【請求項６】
体細胞核移植クローン動物の子孫が、体外受精及び人工授精の手法を組み合わせて作製されたことを特徴とする、請求項４又は５に記載の高脂血症モデルブタ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の高脂血症モデルブタに由来するブタ臓器又は細胞。
【請求項８】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を備えたことを特徴とする、高脂血症の予防又は治療剤のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に、被検物質を投与する工程；
（ｂ）工程（ａ）の被検対象のＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる工程；
（ｃ）工程（ｂ）においてＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防又は治療剤の候補薬剤として選択する工程；
【請求項９】
ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタを、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ：low-density lipoprotein receptor）遺伝子ノックアウトブタやその作製方法、その高脂血症モデルとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症（高コレステロール血症）は生活習慣病のひとつであり、血中総コレステロール値の調節にＬＤＬＲが重要な働きをしていることが知られている。日本人の家族性（遺伝性）高コレステロール血症（ＦＨ：Familial Hypercholesterolemia）患者においても、血中コレステロール量と、ＬＤＬＲ遺伝子における少なくとも４つの変異との関連が知られている（非特許文献１）。高脂血症は症状が長引くと動脈硬化症を引き起こす。動脈硬化症は日本人の３大死亡原因の中でも、心疾患及び脳血管疾患の原因となる。したがって高脂血症及びそれに起因する動脈硬化症は治療法や予防法の開発が求められる重要な疾患の一つであり、高脂血症や動脈硬化症のモデル動物は、その治療法及び予防法の研究開発において非常に有用である。
【０００３】
しかしながら、ヒト高脂血症の病態を十分に再現する、高脂血症や動脈硬化症のモデル動物は得られていなかった。実験動物として広く用いられているマウスは動脈硬化発症に対する抵抗性が強く、例えばＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスは、高コレステロール食を与えた条件では顕著に高い血中総コレステロール値を示したが、通常食を与えた条件では顕著な血中総コレステロール値の上昇は示さなかった（非特許文献２）。また、ＬＤＬＲ遺伝子に加えアポリポ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子をノックアウトしたマウスは、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスよりは高い血中総コレステロール値を示したが、ＡｐｏＥ遺伝子ノックアウトマウスと同程度の血中総コレステロール値を示したにすぎなかった（非特許文献３）。ニューロメジンＵ（ＮＭＵ）遺伝子及びＡｐｏＥ遺伝子を両方欠損したマウスは、通常食を与えた条件で高い血中低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：Low Density Lipoprotein）及び超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ：very low density lipoprotein）コレステロール値を示すが（特許文献１）、神経ペプチドであるＮＭＵをノックアウトしたマウスは過食、肥満、高インスリン血症、高血糖等の症状をも呈するため、ＮＭＵ遺伝子及びＡｐｏＥ遺伝子のダブルノックアウトマウスにおける高脂血症は複合的な症状のひとつに過ぎないと考えられ、ＬＤＬＲとの関係も不明である。そもそも、健常時におけるマウスの血中ＬＤＬコレステロール及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ：High Density Lipoprotein）コレステロールの組成は、ヒトの血中ＬＤＬコレステロール及びＨＤＬコレステロールの組成と大きく異なるため、マウスは高脂血症等についてのモデル動物に適さないという問題もある。したがって、ヒト高脂血症や動脈硬化症の病態を再現できるモデルマウスは存在しないのが現状である。
【０００４】
また、高脂血症のウサギを育種選抜した結果得られたＷＨＨＬウサギ（渡辺ラビット）及びその類縁系統ウサギは、ヒトＦＨに最も近い病態を示す高脂血症モデル動物として研究開発等に利用されてきた。後にＷＨＨＬウサギはＬＤＬＲ機能低下突然変異の遺伝子型を有することが明らかにされたが、育種選抜により得られたためＬＤＬＲ遺伝子変異以外の要素がＷＨＨＬウサギの表現型に強く寄与している可能性もある。ＷＨＨＬウサギはコントロールウサギと比較して血中ＬＤＬコレステロール濃度の上昇が顕著であり、それに伴い血中ＨＤＬコレステロール濃度が大幅に減少する（非特許文献４、５）。それに対し、ＬＤＬコレステロール値の上昇を示すヒトＦＨ患者において、ＷＨＨＬウサギに見られるような顕著なＨＤＬの減少はみられない。したがって、ＷＨＨＬウサギをはじめとする高脂血症モデルウサギも、ヒトのＦＨの病態の再現について十分とはいえない。さらに、ウサギは短命であることに加えて草食動物であるため、食生活と密接に関連するヒトの高脂血症のモデル動物には適さない。例えば、１９１３年にロシアの病理学者ニコライ・アニチコワがウサギに卵を与えたところ高脂血症ならびに動脈硬化症が引き起こされたことを発表し、ヒトにおいても卵が高脂血症や動脈硬化症の直接的な原因となるとの説が流布したものの、後にこれは草食動物であるウサギを実験に用いて通常は餌としない卵を食べさせたために引き起こされた症状であり、前記の説は誤りであることが明らかになっている。このことからもわかるとおり、そもそも草食であるウサギは、ヒトの食生活やライフスタイルと密接に関連する疾患、高脂血症や動脈硬化症のモデル動物には適さないという問題がある。
【０００５】
ブタの血中コレステロール上昇の表現型を引き起こす劣性の遺伝子型（ＦＨ−ｒ）として、第二染色体のセントロメア付近が示唆され、ＬＤＬＲ遺伝子のリガンド結合領域における一塩基ミスセンス変異が同定されているが、かかる変異遺伝子型と表現型との直接の関係は明らかではない（非特許文献６）。マウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Embryonic Stem cell）の樹立により、遺伝子標的組換え（ジーンターゲッティング）が可能となった。様々な遺伝子機能解析が進められ、その技術を応用して種々のヒト疾患モデルマウスが作製されている。しかし、マウスのような寿命が短い小動物での試験は、長期間の治療実験や、外科的治療試験等への利用が困難であること等の問題がある。そこで、発明者らは、寿命が長く、体も大きい、ブタを用いた疾患モデル動物を作出することに着想し、ブタのＥＳ細胞が樹立されていないという問題を克服して、核移植による体細胞クローンブタ作出技術を開発し（特許文献２、３）、かかる技術を応用することにより、ブタにおいてもジーンターゲッティングを行うことを可能とした（特許文献４、５）。特許文献６はあくまでＡｐｏＥ遺伝子及び／又はＬＤＬＲ遺伝子に変異を有するブタをアテローム性動脈硬化症の研究のためのモデルとするアイデアが記載されているだけであり、特許文献７もＬＤＬＲ遺伝子の一部を薬剤耐性遺伝子で置換したブタ細胞の作製方法が記載されているにとどまる。非特許文献７には、ミニブタにおいてＬＤＬＲ遺伝子のジーンターゲッティングによる破壊を行ったことが記載され、高コレステロール血症の症状が観察されたことが記載されているが、その詳細は明らかではない。ミニブタは、ランドレース等の通常の食肉豚に比べて、体が小さく平均産子数が少ないため、系統作製には多くの時間と手間がかかる点や、得られるモデルブタの数や組織等の量が限られる点等に問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４７３４５２３号公報
【特許文献２】特許第４０３６３５６号公報
【特許文献３】特許第４０３６６０８号公報
【特許文献４】特開２００８−２２０２２２号公報
【特許文献５】特開２０１０−１１０２５４号公報
【特許文献６】ＷＯ２００８／１０６９８２号公報
【特許文献７】ＷＯ２０１１／１００５０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bujyo H. et al., J. Atheros. Thromb., 11, 146-151 (2004)
【非特許文献２】Ishibashi S. et al., J. Clin. Invest., 92, 883-893 (1993)
【非特許文献３】Ishibashi S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 4431-4435 (1994)
【非特許文献４】Tanzawa K. et al., FEBS Letter, 118, 81-84 (1980)
【非特許文献５】Rosenfeld ME et al., Arteriosclerosis, 8, 338-347 (1988)
【非特許文献６】Hasler-Rapacz J. et al., American Journal of Medical GeneticsVolume 76, Issue 5, 379-386 (1998)
【非特許文献７】Davis B. et al., Swine in Biomedical Research Conference 2011, S2-9 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ヒト高脂血症の病態を十分に再現することができる高脂血症モデル動物を提供することや、かかる高脂血症モデル動物を利用した高脂血症治療・予防薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、体が大きく寿命が長い、雑食の動物としてブタに着目し、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトクローンブタを作製し、血漿中コレステロール画分及び中性脂肪画分の組成を調べた。ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトマウスが通常食では高脂血症を示さないことから、ＬＤＬＲ遺伝子の単独ノックアウトでは、通常食では高脂血症を示さないだろうという予測に反して、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは通常食でも高脂血症の症状を示した。また、血漿中コレステロール画分の組成（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）において、ヒトの家族性高脂血症を十分に再現し得たことから、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは従来のげっ歯類等の高脂血症モデル動物よりも優れた高脂血症モデル動物であるという確証を得て、本発明を完成するに至った。本発明は、プライムテック株式会社及び独立行政法人農業生物資源研究所の共同研究の成果である。
【００１０】
すなわち、本発明は〔１〕ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させた、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示すことを特徴とする高脂血症モデルブタや、〔２〕高コレステロール血症が、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの濃度がコントロールと比べて高いことを特徴とする、前記〔１〕に記載の高脂血症モデルブタや、〔３〕高コレステロール血症が、IIｂ型遺伝性高脂血症であることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の高脂血症モデルブタに関する。
【００１１】
また、本発明は〔４〕採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ＬＤＬＲ遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核を注入することで得られる体細胞核移植クローン動物又はその子孫であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の高脂血症モデルブタや、〔５〕ＬＤＬＲ遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたブタ体細胞核が、ＬＤＬＲ遺伝子エクソン４の一部をネオマイシン耐性遺伝子で置換したブタ体細胞核であることを特徴とする、前記〔４〕に記載の高脂血症モデルブタや、〔６〕体細胞核移植クローン動物の子孫が、体外受精及び人工授精の手法を組み合わせて作製されたことを特徴とする、前記〔４〕又は〔５〕に記載の高脂血症モデルブタや、〔７〕前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の高脂血症モデルブタに由来するブタ臓器又は細胞に関する。
【００１２】
また、本発明は〔８〕（ａ）前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に、被検物質を投与する工程；（ｂ）工程（ａ）の被検対象のＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる工程；（ｃ）工程（ｂ）においてＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防又は治療剤の候補薬剤として選択する工程；の工程（ａ）〜（ｃ）を備えたことを特徴とする、高脂血症の予防又は治療剤のスクリーニング方法や、〔９〕ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタを、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ及びその子孫を提供することができ、高脂血症モデルブタとして使用することができる。また、かかるＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタを用いた高脂血症治療薬や予防薬のスクリーニング方法を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】LDLRex4TVベクターの構築及び標的組換えの検出ためのＰＣＲ反応とサザンブロットのデザインを示す。ターゲッティングベクターの５’及び３’側相同領域のために使用した野生型ＬＤＬＲ遺伝子座（上段）と相同組換え後のターゲット遺伝子座（下段）を示している（エクソン；ソリッドボックス、イントロン及び隣接領域；太線）。LDLRex4TVベクターは、５’側相同領域は、５’側エクソン４隣接領域約１ｋｂ、３’側相同領域はエクソン４から９にかかる約９ｋｂで作製した（中段）。標的組換え特異的なＰＣＲ増幅のために使用したプライマーの位置は、短い矢印で示した。サザンブロットのために使用したプローブの位置は、ショートバーで示し、HindIIIもしくはSphＩ消化によるサザンブロットのバンドの予想されるサイズを野生型及びターゲット遺伝子座の両方について示した。
【図２】（Ａ、Ｂ）ＬＤＬＲ ＫＯ細胞を用いて核移植並びに胚移植した結果得られた胎児と、（Ｃ）誕生したＬＤＬＲ ＫＯリクローンブタの写真を示す。
【図３】ＬＤＬＲ ＫＯクローンブタの血中コレステロール分画パターン（破線）を示す。
【図４】ＬＤＬＲ ＫＯブタＦ２世代の血中コレステロール及び中性脂肪の４分画解析結果を示す。ａ−ｃの異符号間に有意差が有る（Ｐ＜０．０５）。
【図５】ＬＤＬＲ ＫＯブタＦ２世代の血中コレステロール（Ａ、Ｂ）及び中性脂肪（Ｃ、Ｄ）の２０分画解析結果を示す。ａ−ｃの異符号間に有意差が有る（Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の高脂血症モデルブタとしては、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたトランスジェニックブタであって、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示すＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ又はその子孫であればよく、ブタの性別、年齢、品種も特に制限されない。本明細書において単に高脂血症モデルブタもしくはＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタといった場合、これらの後代の子孫をも含む。本発明においてコントロールとは、普通食、すなわち一般的脂肪含量の通常飼料を与えられた野生遺伝子型のブタ等の、高脂血症を発症していないブタにおける測定値をいう。普通食（通常飼料）は、市販品を購入することができ、この通常飼料における一般的脂肪含量としては脂肪含量２〜５％を挙げることができる。ブタＬＤＬＲ遺伝子としては、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）等のデータベースにおいてGene ID：396801として登録されており、またＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号NC_010444.3、バージョンGI:347618792としてＤＮＡ配列を取得することも、そのｍＲＮＡ配列やアミノ酸配列等の情報を入手することもできる。また、これらの配列に基き、ＤＮＡやアミノ酸の性質ならびにタンパク質ドメイン構造の類似性等を指標に、別のデータベースを用いて適宜ＬＤＬＲ遺伝子のＤＮＡ配列やアミノ酸配列を入手することも、ブタの異なる品種のＬＤＬＲ遺伝子を同定することも、エクソン構造やＳＮＰ（一塩基多型）等の各種情報を得ることもできる。本発明においてＬＤＬＲ遺伝子としては、前記Gene ID：396801の他、タンパク質のドメイン構造や先行文献からＬＤＬＲ遺伝子として認められる遺伝子を挙げることができる。
【００１６】
本発明においてＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させる方法としては特に制限されず、ゲノム上のブタＬＤＬＲ遺伝子のプロモーター等の制御配列又はＬＤＬＲ遺伝子の一部又は全部を、欠失あるいは別のＤＮＡ配列で置換することにより、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を可逆的又は非可逆的に抑制する方法を挙げることができ、それにより、機能的なＬＤＬＲ遺伝子の発現を抑制又は阻害することや、野生型よりも機能が低い又は野生型のドミナントネガティブ型変異体ＬＤＬＲタンパク質を発現させること等の効果を得ることができ、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させることができる。これらは複数を組み合わせて用いてもよく、ＬＤＬＲ遺伝子の一部を薬剤耐性遺伝子と置換する方法を好適に例示することができ、かかる遺伝子変異はホモ型であっても、ヘテロ型であってもよい。
【００１７】
ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能の欠失は、ＬＤＬＲタンパク質の発現や、細胞や組織におけるＬＤＬＲタンパク質の局在、ＬＤＬのエンドサイトーシス等を調べるにより、評価することができる。ＬＤＬＲタンパク質の発現は、ＬＤＬＲ遺伝子のｍＲＮＡの発現を定量ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の常法により調べることができ、ＬＤＬＲ遺伝子のｍＲＮＡの複数箇所の領域についてｍＲＮＡ量を調べることが好ましい。かかる方法に使用するプライマーやプローブは、ＬＤＬＲ遺伝子のＤＮＡ配列に基いて適宜設計して作製することも、市販品を入手することもできる。また、ＬＤＬＲタンパク質の発現を抗ＬＤＬＲ抗体を用いて検出することもでき、ウェスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法等の分子生物学的常法により調べることができる。抗ＬＤＬＲ抗体は、ブタＬＤＬＲタンパク質を認識できればよく、ブタＬＤＬＲ遺伝子のアミノ酸配列に基いてペプチドを設計し抗体を作成することも、市販品を入手することもできる。ＬＤＬＲタンパク質の局在は、細胞や組織を用いて、抗ＬＤＬＲ抗体を用いた蛍光免疫染色や免疫組織染色等の観察用サンプルを作製し、細胞や組織におけるＬＤＬＲタンパク質の局在を共焦点蛍光顕微鏡等で観察する等の分子生物学的常法により調べることができる。ＬＤＬのエンドサイトーシスは、細胞や組織等を４℃に保って蛍光標識したＬＤＬを添加し、細胞表面上のＬＤＬＲに蛍光標識ＬＤＬを結合させてから細胞や組織等を３７℃にすることによりエンドサイトーシスを開始させ、ＬＤＬＲや蛍光標識ＬＤＬの細胞内への取り込みを、蛍光顕微鏡で観察する等の分子生物学的常法により調べることができる。また、前記のＬＤＬＲやＬＤＬのリアルタイムでの振る舞いを、タイムラプス機能を備えた共焦点蛍光顕微鏡を用いて観察することもできる。
【００１８】
前記のＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させる遺伝子変異は、ゲノムＤＮＡに遺伝子変異を有する体細胞核を、除核した未受精卵にインジェクションして、体細胞クローンブタを作製することも、受精卵の核内ゲノムＤＮＡにおいて遺伝子変異を引き起こして、トランスジェニックブタを作製することもでき、体細胞クローンブタを作製する方法を好適に例示することができる。これらの体細胞クローンブタやトランスジェニックブタを用いて後代を得ることができ、その際に通常の交配の他、体外受精や人工授精等の手段を用いることもできる。相同組み換えが起こったゲノムＤＮＡからは、標的遺伝子の野生型タンパク質は発現せず、前記標的遺伝子の機能は損なわれると考えられる。
【００１９】
前記ゲノム上のブタＬＤＬＲ遺伝子のプロモーター等の制御配列又はＬＤＬＲ遺伝子の改変は、遺伝子ターゲッティング法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ法等を用いて行うことができ、その確認はサザンブロット解析やＰＣＲ反応、制限酵素反応、ミスマッチ特異的ヌクレアーゼによる処理や電気泳動法等の遺伝子工学的常法を用いて行うことができる。遺伝子ターゲッティング法は、細胞内にターゲッティングベクターＤＮＡを導入し、ゲノムＤＮＡとターゲッティングベクターＤＮＡとの相同組み換えにより、標的遺伝子の一部の配列を耐性遺伝子等の配列に置換して正常な標的遺伝子配列を破壊するとともに、かかる耐性遺伝子の機能を指標に相同組み換え体を検出する方法である。ターゲッティングベクターはゲノム上の標的遺伝子における標的部位の５’末端側のＤＮＡ配列（５’側相同領域）と、薬剤耐性遺伝子発現カセットと、ゲノム上の標的遺伝子における標的部位の３’末端側のＤＮＡ配列（３’側相同領域）とを順に備えたものであればよく、他にベクターとして機能するために必要な配列を備えていてもよい。また標的部位は特に制限されず、エクソンであることが好ましく、中でもエクソン４であることが好ましい。５’側相同領域及び３’側相同領域の長さも、相同組み換えが起こる限り特に制限されず、好ましくは１００塩基（ｂ；base）〜２０キロ塩基（ｋｂ）、更に好ましくは２００ｂ〜１５ｋｂ、最も好ましくは５００ｂ〜１０ｋｂである。ターゲティングベクターは制限酵素処理等により線状化したＤＮＡとして細胞内に導入してもよく、かかる細胞内への導入方法はリン酸カルシウム法、リポフェクション法、電気穿孔法や市販のトランスフェクション試薬などを適宜使用することができる。
【００２０】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ法では、キメラ・ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、ゲノムＤＮＡの標的遺伝子に二本鎖切断（ＤＳＢ；Double Strand Break）を起こさせることにより、ゲノム配列の編集を容易に行う事ができ、標的遺伝子の欠損、挿入、改変（置換）が生じた細胞・生物を得ることができる（特表２００５-５１９６３１号公報、特表２００６-５１８３７２号公報、特表２００９-５３８１４１号公報等参照）。すなわち、ＤＳＢが誘導されると、その後のＤＮＡの修復過程で変異が導入されて、あるいは相同組換えが高効率で誘導され標的遺伝子の一部の配列が耐性遺伝子等の配列に置換されて、正常なタンパク質発現が損なわれる。ここで前記キメラ・ジンクフィンガーヌクレアーゼとは、ＤＮＡ結合能を有するジンクフィンガータンパク質とII型制限酵素FokＩのヌクレアーゼドメインが融合したキメラタンパク質であり、標的遺伝子のＤＳＢ標的部位に応じてジンクフィンガータンパク質を適宜設計することができる。ヌクレアーゼFokＩはヘテロダイマーを形成してＤＮＡを切断するため、ゲノムＤＮＡのＤＳＢ標的部位近傍に、それぞれの相補鎖にジンクフィンガーの標的配列を設定して、対として機能するキメラ・ジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる。かかるキメラ・ジンクフィンガーヌクレアーゼはｍＲＮＡや発現ベクターとして細胞に導入することができ、細胞への導入方法はリン酸カルシウム法、リポフェクション法、電気穿孔法や市販のトランスフェクション試薬などを適宜使用することができる。キメラ・ジンクフィンガーヌクレアーゼは、遺伝子組み換え技術を用いて作製することも、CompoZr（商標登録） Zinc Finger Nuclease（Sigma-Aldrich社製）等の市販品を入手することもできる。
【００２１】
また、ＬＤＬＲ遺伝子のノックアウトは、受精卵や発生初期段階から生じていても、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系等を用いて時期や部位特異的に誘導されて発生途中や成長後に生じたものでもよいが、ターゲッティングベクターを用いて、相同組み換えによりゲノム上のＬＤＬＲ遺伝子のエクソン４をネオマイシン耐性遺伝子に置換することによりＬＤＬＲ遺伝子機能を欠損させた体細胞核を用いて体細胞クローンを作製する、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトを好適に例示することができる。前記の相同組み換えを行うためのターゲッティングベクターとしては、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットの５’側にゲノムＬＤＬＲ塩基配列のエクソン４の５’側領域を含む５’側相同領域を、３’側にエクソン４の３’側領域を含む３’側相同領域を備えている例が好ましく、これらの相同領域の位置、長さは適宜調節することができ、ネオマイシン耐性遺伝子発現カセットの５’側にゲノムＬＤＬＲ塩基配列のエクソン３からエクソン４にかかる約１ｋｂの５’側相同領域を、３’側にエクソン４から９にかかる約９ｋｂの３’側相同領域を備えている例が好ましい。
【００２２】
本発明の高脂血症モデルブタとしては、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト染色体をヘテロあるいはホモでもつ遺伝子型のいずれでもよく、ホモのＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト遺伝子型であることが好ましい。また、前記ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは、採取したブタの卵子から除核し、該除核された卵子に、ＬＤＬＲ遺伝子の一部あるいは全部を改変又は欠失させたゲノムＤＮＡを有するブタ体細胞核を注入することで、体細胞核移植クローン動物として作製することができる。かかる体細胞核移植クローンブタは、通常程度の繁殖能力を有する場合は野生型又は前記体細胞核移植クローンブタ等と交配させて後代を得ることができ、同様にして、通常の繁殖方法で系統を維持し後代の子孫を得ることができる。また、前記体細胞核移植クローンブタの健康状態が好ましくなく、通常の方法での繁殖に適さない場合は、前記体細胞核移植クローンブタから採取した配偶子、好ましくは精子を用いて体外受精及び人工授精の手法を組み合わせてクローンブタの後代を得て、前記ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタを作製することもできる。本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症も出るブタの系統は、前記体外受精及び人工授精の手法で維持することも、通常の繁殖方法によって系統を維持して後代の子孫を得ることができ、いずれもＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたトランスジェニックブタである限りはその後代の子孫も同様に、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに含まれる。
【００２３】
本発明における高コレステロール血症としては、血中総コレステロール濃度がコントロールに比べて高ければよく、高脂血症ブタの血中総コレステロール濃度がコントロールの１．５倍以上、好ましくは３倍以上、更に好ましくは４倍以上である例を挙げることができる。また、血中コレステロール濃度に加えて、高脂血症ブタの血中総中性脂肪濃度もコントロールよりも高いことが好ましい。本発明において高コレステロール血症と高脂血症が意味するところは本質的に同一である。ヒト高脂血症は血中の脂質成分量からＩ、IIａ、IIｂ、III、IV、Ｖ型に分類することができ、IIｂ型はＶＬＤＨコレステロール濃度とＬＤＬコレステロール濃度が健常者よりも高く、ＨＤＬコレステロール濃度が健常者と同程度の高脂血症である。本発明の高脂血症モデルブタは、ＶＬＤＨコレステロール濃度とＬＤＬコレステロール濃度がコントロールよりも高く、ＨＤＬコレステロール濃度がコントロールと同程度でありIIｂ遺伝性高脂血症と同様の血中脂肪成分組成を示すことから、IIｂ型遺伝性高脂血症のモデルブタとすることもできる。
【００２４】
本発明において、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、又はＶＬＤＬコレステロールの濃度は、血漿や血清等の血液由来サンプルのコレステロール区分におけるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ濃度として測定することができ、同様にＨＤＬトリグリセライド、ＬＤＬトリグリセライド、又はＶＬＤＬトリグリセライドの濃度としては、血漿や血清等の血液由来サンプルのトリグリセライド（中性脂肪）区分におけるＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ濃度として測定することができる。血中の脂質の測定は適宜常法を用いることができ、測定業者に試料を提供してデータを得ることも、測定用機器を用いて測定することもできる。血中の脂質の測定には全血を用いても、適宜血清サンプルや血漿サンプル、さらに分画したサンプルを使用してもよく、これらは測定を阻害しない限りヘパリン等の抗凝固剤、防腐剤、防カビ剤、ｐＨ調整剤や緩衝液等を適宜添加することもできる。例えば、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬの各成分を定量する場合には、血清サンプルをまず各成分に分画し、それぞれの画分についてデタミナーL TCIIやデタミナーTC-555（協和メデックス株式会社製）、アクアオートカイノスＴ−ＣＨＯ試薬（株式会社カイノス製）等酵素法用キットを使用して酵素法による定量を行うことができる。また、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、及びＨＤＬの各成分を分画するためには、血清中のリポタンパク質を分析可能なゲル濾過カラム、例えばTSKgel LipopropakXL、TSKgel Lipopropak（東ソー株式会社製）等を用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により解析することもできる。
【００２５】
本発明において、本発明の高脂血症モデルブタの血液中ＨＤＬコレステロールの濃度はコントロールと同程度であればよく、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタの血漿中コレステロール区分におけるＨＤＬ濃度が、コントロールの０．７〜１．５倍、好ましくは０．８〜１．３倍、より好ましくは０．９〜１．２倍であることが好ましい。また、本発明の高脂血症モデルブタのＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの濃度はコントロールと比べて高ければよく、血漿中コレステロール区分においてＬＤＬ及びＶＬＤＬの濃度がコントロールの１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、更に好ましくは４倍以上であることを好適に例示することができる。本発明の高脂血症モデルブタの血中の総コレステロール、総中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロール等の他の血中脂質成分濃度や血液組成物については特に制限されないが、本発明の高脂血症モデルブタの血中ＬＤＬトリグリセライドが、コントロールに比べて高い例を好適に例示することができる。また、これらの血中コレステロール値は、年齢、飼育環境、餌の種類により変化し、加齢や高コレステロール食等の給餌や運動制限等により高脂血症の症状が進行する。したがって、本発明の高脂血症モデルブタは、たとえ出生直後や成長過程で高脂血症を示していなくとも、血液中のコレステロール測定時に高コレステロール血症であればよく、好ましくは測定時に血液中ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度である、より好ましくは、測定時に血液中ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、かつＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの測定時に高コレステロール血症を示している例を挙げることができる。
【００２６】
本発明においてブタの通常食とは、一般的にブタが飼育される際に与えられる通常飼料であればよく、市販品を購入することができ、例えば飼料名「えつけ」や「はつらつ」（ＪＡ全農製）、飼料名「フレンドＵ」や「マザーブリード」（清水港飼料株式会社製）等を挙げることができ、脂肪含量が０．０１〜８％、より好ましくは０．１〜７％、さらに好ましくは１〜５％の飼料を挙げることができる。それに対し高コレステロール食としては、通常食よりも高い脂肪含量であれば特に制限されず、通常食にラード、高脂肪食油や油脂等をコレステロールとして混入して作製することもできる。高コレステロール食のコレステロール含量としては、好ましくは０．５〜５％、より好ましくは２％を挙げることができ、脂肪含量としては１３〜５０％、より好ましくは１４〜３０％、さらに好ましくは１５〜２５％を挙げることができる。通常食を与えられたブタは、血中の総コレステロール値が５０〜１００ｍｇ／ｄｌであるに対し、高コレステロール食を与えられたブタは血中の総コレステロール値が５００〜８００ｍｇ／ｄｌの高脂血症となることが報告されている（Dixon JL. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999, 19:2981-2992；M. Michael Swindle, Swine in the Laboratory second edition, 314-315, CRC Press参照）。
【００２７】
本発明の一態様として、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタを、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法とすることができる。本発明のＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタを、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法としては特に制限されず、高脂血症や高脂血症に起因する疾患、例えば動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞等の判定や、それらの治療技術の開発並びに習得に使用する練習台としての使用を好適に例示することができる。
【００２８】
本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタは、普通食を与えられた条件下でも動脈硬化や心筋梗塞を発症しやすく、これらの症状を誘発するために適宜高コレステロール食を与えることもできる。また、かかる症状が発症しやすいためにブタを加齢させることもできる。普通食又は高コレステロール食を与えられた本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタは、高脂血症の判定や、動脈硬化や心筋梗塞の有無の判定や、動脈硬化や心筋梗塞の手術法や手術用器具の開発並びに手術技術の練習のための、練習用モデルブタとして使用することができる。前記手術法としては特に制限されないが、ステント留置術、バイパス手術、カテーテル手術、頸動脈内膜切除術（ＣＥＡ）等の高脂血症に起因する心筋梗塞や脳梗塞等の疾患の治療において行われる手術を挙げることができ、手術用器具としてはステントやカテーテル等を挙げることができる。練習用ブタの個体、並びにその血液、血管及び組織を用いて、高脂血症並びに動脈硬化や心筋梗塞の有無の判定の練習を行うことができる。例えば、練習用モデルブタについて心拍数、脈拍数、血圧等の測定結果、並びに、血糖値、赤血球値、白血球値、血中ＬＤＬコレステロール値、血中ＨＤＬコレステロール値、及び血中ＶＬＤＬコレステロール値等の血液検査結果や、超音波検査法（エコー）や磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）などの検査結果から、高脂血症並びに動脈硬化や心筋梗塞の有無を判定する練習を行うことができる。また、かかる練習用モデルブタから採取された、血液等の体液や、血管、心臓等の組織についても、血液検査や解剖、組織化学染色等を行い、高脂血症や動脈硬化、心筋梗塞の判定の練習を行うことができる。また、動脈硬化や心筋梗塞を発症した本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタは、動脈硬化モデルブタや心筋梗塞モデルブタとして使用することができ、ブタ個体並びに動脈硬化を起こした血管やかかる血管を有する組織、心筋梗塞を起こした心臓を用いてヒトにおいてかかる判定を行う練習に利用することができる。また、同様にして高脂血症や高脂血症に起因する疾患の判定方法や治療法、手術法の開発を行うことができる。
【００２９】
また、本発明のＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタを、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であり、通常食においても高コレステロール血症を示す高脂血症モデル動物として使用する方法として、ＬＤＬＲ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタを薬効評価動物として使用する例を挙げることもできる。普通食又は高コレステロール食を与えられた本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに、高脂血症や高脂血症に起因する疾患の治療薬候補薬剤を投与し、血中コレステロール値や動脈硬化、心筋梗塞の病状の改善、又はそれらが悪化しないことを指標として、前記治療薬候補薬剤の薬効を調べることができ、また同時にその副作用を調査することもできる。
【００３０】
本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレステロールの濃度がコントロールと比べて高く、ＨＤＬコレステロールの濃度がコントロールと同程度であること、また通常食においても高コレステロール血症を示すことから、ヒトIIｂ型遺伝性高脂血症の病態をよく再現しており、IIｂ型遺伝性高脂血症のモデル動物として有用である。また、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに由来する臓器又は細胞としては、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタや高脂血症モデルブタに由来する生体試料であればよく、頭部、頸部、胸部、腹部、脚、における生体組織、例えば臓器、骨、体液等の他、細胞を挙げることができ、かかる細胞としては上皮細胞や肝細胞、線維芽細胞、腎臓細胞等の体細胞や、神経細胞、免疫細胞、ＥＳ細胞、原始生殖細胞、精子や卵子を挙げることができ、これらの細胞の初代培養細胞や細胞由来の細胞株、すなわちこれらの細胞から増殖した細胞をも含む。
【００３１】
本発明の高脂血症の予防又は治療剤のスクリーニング方法としては、
（ａ）前記ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に、被検物質を投与する工程；
（ｂ）工程（ａ）の被検対象のＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる工程；
（ｃ）工程（ｂ）においてＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防又は治療剤の候補薬剤として選択する工程；
の工程（ａ）〜（ｃ）を備えていればよく、他の工程を含んでもよい。また、適宜野生型ブタ等のコントロールを併用することもできる。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法の工程（ａ）は、被検対象である本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞に被検物質を投与する工程であればよく、被検物質は適宜選択することができる。被検物質としては、化学物質、タンパク質、ペプチド、ステロイド等を挙げることができ、これらは合成や抽出等により作製することも市販品を購入することもでき、市販のライブラリーを使用することもできる。また本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ又はＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞への被検物質の投与方法も適宜選択することができ、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタへは経口、注射、点滴、塗布等の方法を挙げることができ、ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞へは、細胞培養液への添加やトランスフェクション試薬やエレクトロポレーション法を用いた細胞内への投与方法を挙げることができる。被検物質の投与期間や投与回数、投与量も投与対象の大きさ、年齢、性別、症状等によって適宜選択することができる。被検対象のブタの飼育環境や年齢、被検対象の細胞の培養条件等は適宜選択することができる。被検対象のブタの飼料としてコレステロール食を給餌してもよいが、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは普通食において高脂血症を呈するという特性を有することから、通常食を給餌することができる。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）の被検対象ブタの高脂血症の程度を調べることができればよく、血漿中コレステロール区分におけるＬＤＬあるいはＶＬＤＬの濃度、又は動脈硬化症の有無を調べる例を挙げることができ、これらを組み合わせても、他に血漿中の総コレステロール濃度やコレステロール区分におけるＨＤＬ等の濃度、総中性脂肪濃度や中性脂肪区分におけるＬＤＬ、ＨＤＬ、ＶＬＤＬの濃度等も合わせて調べても、また、他の検査項目、例えば血糖値や赤血球量、白血球量等を調べてもよい。また、動脈硬化症は、超音波検査法（エコー）や磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）等によって、あるいは被検対象から血管組織サンプル等を採取して組織化学的に調べることもできる。被検対象がＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞である場合には、その増殖速度や代謝速度、細胞内のＬＤＬコレステロールやＶＬＤＬコレステロール量等を生化学的、細胞生物学的に一般的な手法により調べることができる。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法の工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得た測定結果からＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度が増加しない、又は動脈硬化症を発症しないことを指標に、被検物質を高脂血症の予防及び／又は治療剤の候補薬剤として選択する工程であればよく、被検対象の健康状態や他の検査項目の結果等も参考とすることもできる。特に、ＬＤＬコレステロールあるいはＶＬＤＬコレステロールの濃度が減少した場合は、高脂血症の予防及び／又は治療剤の候補薬剤として有望であると判断することができる。
【００３５】
また、本発明のスクリーニング方法の別の様態として、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の組織や細胞を、適宜目的に応じたスクリーニングに利用することも可能である。すなわち、従来の系統育種により選抜され表現型と遺伝子型との因果関係が明らかではない高脂血症モデルＷＨＨＬウサギ由来の細胞や組織では信頼性に足るスクリーニングやデータを得ることは困難であり、またウサギはＨＤＬからＬＤＬへの変換酵素がない等ヒトと異なる問題があるが、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタは、ＬＤＬＲ遺伝子のみに変異を有するため、ＬＤＬＲ遺伝子に着目したスクリーニングや、ＬＤＬＲや細胞機能の解析等の医学・生物学的研究等において有用である。例えば、本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞を用いて解析対象のシグナル因子の変動を指標としてスクリーニングを行うことができ、具体的には、（ａ’）本発明のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタ由来の細胞又は組織に、被検物質を投与する工程；（ｂ’）工程（ａ’）の被検対象におけるシグナル因子の変化を調べる工程；（ｃ’）工程（ｂ’）におけるシグナル因子の変化がコントロールと異なる被検物質を選択する工程；の工程（ａ’）〜（ｃ’）を備えたスクリーニングを行うこともでき、適宜他の工程を含んでもよい。ＬＤＬＲやリポタンパク質代謝の関与する生命現象に関わる因子や、シグナル因子の制御物質をスクリーニングにより同定することができる。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
＜方法：ＬＤＬＲ ＫＯクローンブタの作出＞
１）ＬＤＬＲターゲッティングベクターの構造（ベクター名：LDLRex4TV）
LDLRex4TVベクターの作製のためのＬＤＬＲゲノム領域（ACCESSION No. NC_010444）、62049795から62063187のゲノム領域を、ブタＬＷＤ（ランドレース×大ヨークシャー×デュロック）三元交雑種のゲノムＤＮＡより分離した。LDLRex4TVベクターは、図１に示したように、ゲノムＬＤＬＲ塩基配列のエクソン３からエクソン４にかかる約１Ｋｂの５’側相同領域及びエクソン４から９にかかる約９ｋｂの３’側相同領域を、pKJ2（Boer, P.H. et al. Polymorphisms in the coding and noncodingregions of murine Pgk-1 alleles. Biochemical genetics 28, 299-308 (1990)）から得られたPGK-neo-p(A)カセットの両側に連結し、さらに５’側相同領域の外側に、pMC1-Dtp-(A)（Taniguchi, M. et al. Disruption of semaphorinIII/D gene causes severe abnormality in peripheral nerve projection. Neuron 19, 519-530 (1997)）から切り出したMC1-DTA-p(A)カセットを配置したものである。５’側相同領域は、ＰＣＲプライマー名：LDLRex3F2：5'- TCAGCAGGACTGCGAGAATG -3'及びLDLRex4R3：5'- CATCTTGGGAGCACGTCTTG -3'を用いてＰＣＲ増幅した。また、３’側相同領域は、プライマー名LDLRex4F1：5'- AAGTCTGACGAGGAGAACTG -3'及びLDLRR3：5'- AGAAGAGGTAGGCGATGGTG -3'を用いてＰＣＲ増幅した。このターゲッティングベクター（ベクター名：LDLRex4TV）はエレクトロポレーションによる遺伝子導入の前にNotＩ制限酵素消化で直線化した。
【００３８】
２）胎児線維芽細胞の採取
ランドレース（Ｌ）雌×ランドレース（Ｌ）雄で交配後、妊娠６８日目の胎児（Ｌ）及び妊娠６２日目の胎児（ＬＷ）を採取した。採取した胎児は、ハサミで筋肉組織を採取し、細切した。細切した胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌの０．２５％トリプシン＋０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液に懸濁し、一晩冷蔵した（４℃）。遠心処理（１５００ｒｐｍ、５分）により上清を除去した後、３７℃に保温したウォーターバスにて２０−３０分間処理した。保温処理後、胎児組織１ｇ当たり１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加えてピペッティングし、セルストイレーナーにて濾過した。濾過液を遠心後、上清を除去し、沈殿物に１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを添加して再懸濁した。細胞数を計測し、適当量になるようＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて調整した後、７５ｃｍ２細胞培養用フラスコに播いた。その播いた細胞は、３７℃で５％ＣＯ２でコンフルエントになるまで培養し、以下のエレクトロポレーションによる遺伝子導入に用いた。
【００３９】
３）遺伝子導入とＧ４１８薬剤選択（ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞の作出）
分離及び増殖した胎児線維芽細胞は、０．２５％トリプシン−０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液で剥離させ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにて懸濁した。細胞懸濁液を遠心処理（１５００ｒｐｍ、５分）した後、上清を除去し、冷ＨＢＳに再懸濁した。再懸濁液は、再度遠心処理を行って上清を除去した。細胞数が２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＨＢＳにて調整した。キュベットに細胞溶液０．４ｍｌ（１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と１００μｌの調製済みＤＮＡ液（５ｎＭの直線化したターゲッティングベクターを添加、図１）を加えた後、良く混和した。遺伝子導入には、電気穿孔法装置を３００Ｖ、９５０μＦ、抵抗∞の条件のパルスにて行った。パルス付加後、１０分間室温にて静置した。静置した細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁後、３枚の１０ｃｍシャーレに分けて培養した。パルス後４８時間目に８００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇ４１８）を培養液に添加し、Ｇ４１８耐性細胞株を選別した。７−１２日間薬剤選択後、Ｇ４１８耐性細胞コロニーを濾紙ディスクにより分離させ、２４穴細胞培養用ディッシュに移した。移した細胞がコンフルエントに達した後、トリプシン処理により剥離させた。剥離させた細胞の半分をＰＣＲ分析に用い、残りはそのまま残して培養した。
【００４０】
４）ＰＣＲ解析によるターゲッティングの検出
細胞を、２００ｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ（proteinase K）を含む５０μｌの超純水に再懸濁し、５５℃で３時間保温した後、９５℃１０分間加熱してプロテナーゼを失活させた。ＰＣＲ分析は、２０μｌ量の反応液中に消化した５０μｌのサンプルから鋳型として１μｌを採取してAmpliTaqGold（登録商標）（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。ＰＣＲサイクルのパラメーターは、最初に９４℃を１０分間後、９４℃を３０秒、６０℃を２５秒、７２℃を１分１５秒の１サイクルを３５サイクルで行い、最後に７２℃で７分間処理した。プライマーはFP2（5'- ACCAAATTAAGGGCCAGCTC -3'）及びLDLRex3F4（5'- GCAAGATAGGGGACTTTAGC -3'）を用いた。このプライマーセットにより、１．１ｋｂの変異アレル特異的な産物が増幅される。精製したＤＮＡに対するＰＣＲは、鋳型として１００ｎｇの精製ＤＮＡを使用した点を除いて同様に実施した。
【００４１】
５）ホルモン処理による採卵方法
ランドレース（Ｌ）及びランドレース、大ヨークシャー（Ｗ）、デュロック（Ｄ）の三元交雑種（ＬＷＤ）の生後１６０〜１９４日齢の春期発動前の雌ブタを用いた。供試ブタにｅＣＧ（ピーメックス、三共製薬株式会社製）を１５００ＩＵ投与し、その７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共製薬株式会社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４８時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。また、性成熟に達した雌豚からの採卵は、予め発情時に雄希釈精液を用いて人工授精を行い、妊娠２１−５０日後に流産処置し行った。核移植予定５日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田製薬株式会社製：２ｍｌ量）を臀部筋肉内に投与した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共製薬株式会社製）を臀部筋肉内に１５００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共製薬株式会社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与４６時間後に屠殺し、卵巣、卵管、子宮の結合組織を摘出した。
【００４２】
６）体内成熟卵子の準備
摘出した卵巣、卵管、子宮の結合組織を直ちに実験室に持ち帰り、灌流液（ＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含、TAKARA社製）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma社製、Cat. No. A-4503）＋１００ｍｌあたり１ｍｌの添加抗生物質（Antibiotic, Antimycotic、Sigma社製、Cat. No. A-7292））で卵管を灌流し、卵子を採取した。得られた卵子は０．１％ヒアルロニダーゼを含む、灌流液を用いて卵丘細胞を裸化し、卵細胞質の均一な卵子を選抜した後、ヒアルロニダーゼを含まない灌流液中で洗浄した。その後、ＰＺＭ−３液を用いてインキュベーター（３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２）内で供試するまで体外培養を行った。
【００４３】
７）屠場卵巣由来卵胞卵子の採卵方法
屠場にて食肉用として屠殺された春機発動前の未経産雌ブタより卵巣を採取し、ＰＢＳ（−）液にて３５℃保温下で研究室に持ち帰った。持ち帰った卵巣は直ちに、３７℃に保温したＰＢＳ（−）にて洗浄し、卵巣結合組織を除去した後、採卵作業を行った。直径３−６ｍｍの卵胞を選び、１６Ｇ注射針付き１０ｍｌシリンジで吸引した。吸引した卵胞液は、５０ｍｌディスポチューブに回収し、５分以上室温放置後、上清を除去した。卵子が含まれる沈殿物に対し、ＴＡＬＰ−Ｈｅｐｅｓ液を加えて懸濁後、沈殿物がチューブの底に溜まったのを確認し、沈殿物を吸引しないよう、パスツールピペットにて上清を除去した。この洗浄操作を２−３回繰り返した。卵丘細胞が３層以上密に付着した卵丘細胞卵子複合体（ＣＯＣ）とＣＯＣに壁側顆粒層細胞が付着した壁側顆粒層細胞−卵丘細胞卵子複合体（ＧＣＯＣ）を選別・採卵をした。
【００４４】
８）体外成熟培養
採取したＣＯＣ及びＧＣＯＣは、約１５〜２０個／穴で改変ＮＣＳＵ３７を１００μｌ分注し、１００μｌ流動パラフィンオイルカバーした６穴ディッシュを用いて成熟培養した。改変ＮＣＳＵ−３７は、１０％ブタ卵胞液、０．６ｍＭシステイン、５０μＭ βメルカプトエタノール、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ、１０ＩＵ／ｍｌ ＰＭＳＧ（ピーメックス；１０００ＩＵ、三共製薬株式会社製）、１０ＩＵ／ｍｌ ｈＣＧ（プペローゲン；１５００ＩＵ、三共製薬株式会社製）を添加して作製した。２０〜２２時間まで培養後、ホルモン及びジブチリルｃＡＭＰ無添加改変ＮＣＳＵ３７に移して供試時まで培養した。成熟培養は３９℃、気相条件は、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の条件で実施した。成熟培養時間は、４２−４４時間で行い、成熟卵子（第一極体放出卵子）のみを試験に使用した。
【００４５】
９）卵子核の除去操作（除核操作）
除核操作前に、屠殺採卵した未受精卵子を、サイトカラシンＢ（Sigma社製：Cat. No. C-6762）が５μｇ／ｍｌ濃度含むＰＺＭ３液に移し、１５分間以上処理した。除核操作も同濃度のサイトカラシンＢが含まれるＰＺＭ３液で作製したドロップ内（１０ｃｍプラスチックシャーレの中心付近に５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）で行った。卵子は、第一極体が、１２時から３時方向の位置になるようにホールディングピペットで保定した。ピエゾマイクロマニピュレータ（プライムテック社製）に取り付けた除核用ピペット（外径２５−３０μｍ、先端を３０〜４５度の角度で研磨）により、第一極体ごと細胞質を１／４〜１／３量程吸引した。除核用ピペットの操作性が悪くなった場合は、２０％ＰＶＰ液（Sigma社製：Cat. No. PVP-360）ドロップにて、吸引・排出を繰り返し、洗浄を行った。除核操作終了後、直ちにサイトカラシンＢが含まれないＰＺＭ３液に移し、洗浄を行う。洗浄には、ＰＺＭ３液が３ｍｌ入った３５ｍｍディッシュ（Falcon 1008）で２回以上、丁寧に洗浄し、サイトカラシンＢを除去した。その後、注入操作まで、ＰＺＭ３液ドロップ（３５ｍｍディッシュ：Falcon 3001に１００μｌのドロップを作製し、４ｍｌミネラルオイルで被った）に移し、インキュベーター内で培養した。
【００４６】
１０）ドナー組換え体細胞の準備
ＰＣＲ解析によりＬＤＬＲ遺伝子がノックアウトされていると判定した雄胎児の線維芽細胞を核移植ドナー細胞として用いた。培養液にはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを用い、植え継ぎ回数は０〜５回の細胞を用いた。核移植予定日に合わせて、植え継ぎを行った後、コンフルエント状態から培養液の交換を行わず、３〜１４日間放置し、細胞周期をＧ１／Ｇ０期に同調した。核移植に用いる約１時間前にドナー体細胞の準備を行った。細胞処理は、培養容器の培養液を除去した後に、ＰＢＳ（−）にて３回以上洗浄を行い、０．２５％トリプシン＋０．０４％ＥＤＴＡ−２Ｎａ液にて細胞剥離処理を行った。剥離した細胞に１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭを加え、懸濁した後、遠心処理（１，５００ｒｐｍ、５分、室温）を行った。遠心処理後、上清を除去し、ＰＺＭ３液を適量加えて懸濁し、核移植に用いるまで室温で放置した。体細胞核注入操作時に、適当な細胞数を注入操作用チャンバーのドロップに添加して使用した。
【００４７】
１１）体細胞核の注入操作
注入用チャンバー（１０ｃｍシャーレにＰＺＭ３液５０μｌでドロップを作製し、ミネラルオイル２０ｍｌで被った）のドロップに適量のドナー細胞を添加し、除核済み卵子５０〜１００個を入れて操作した。注入操作には、ピエゾマイクロマニュピレーターに体細胞核注入用ピペット（外径７−１０μｍ、鈍端）を用いた。注入用ピペットをピエゾマイクロマニュピレーターに取り付ける前に、ピペット後端より５ｍｍの位置にフロリナートを３−５ｍｍ幅になるように、充填して使用した。そのピペットをピエゾに取り付けて使用する時は、先端より培養液、フロリナート、空気、ミネラルオイルの順で満たされている状態にして操作した。注入操作を行う前に、必ず２０％ＰＶＰ液ドロップ内で注入用ピペットを洗浄（ピペッティングやＰＶＰドロップへのピペット先端の出し入れ）した。浮遊している体細胞を吸引し、数回ピペッティングを行い、細胞膜を壊し、ホールディングピペットにて保定した除核済み卵子細胞質内へ注入した。体細胞核を注入した卵子は、活性化処理時間までインキュベーターで培養を行った（１−３時間）。
【００４８】
１２）卵子の活性化処理
体細胞核を注入した卵子の活性化処理は直流パルス刺激（SSH-2、島津製作所製）を、１．５ｋＶ／ｃｍ １００μ秒×１回の条件にて行った。チャンバーには２ｍｍ幅のステンレスワイヤー電極を用い、電気刺激用の電解質溶液には０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ ＭｇＳＯ４ならびに０．０２％ＢＳＡを含む０．２８Ｍマンニトール溶液を用いた。
【００４９】
１３）活性化卵子の第２極体放出抑制処理
活性化処理卵子は５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Sigma社製：Cat. No. C-6762）を含むＰＺＭ３液で２時間培養し、第２極体の放出を抑制させる処理を行った。
【００５０】
１４）活性化卵子の体外培養
活性化後２倍体処理をした卵子は、ＰＺＭ３液にて体外培養を行い、活性化処理後２日目に分割胚のみ胚移植に用いた。
【００５１】
１５）ホルモン処理による仮腹の同期化と胚移植方法
仮腹の同期化は妊娠豚を人工流産処置することで行った。また、仮腹の発情は、採卵豚のものより、１日遅れるように発情同期化処置を行った。供試予定の雌ブタは、発情時に、雄豚希釈精液を用いて人工授精を行い妊娠させた。妊娠後２１−５０日目の妊娠豚を用いた。核移植予定６日前にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロール約０．２ｍｇ（プラネート、武田製薬株式会社製：２ｍｌ量）を臀部に注射した。その２４時間後に、同様にＰＧＦ２α類縁体クロプロステロールを注射し、同時にｅＣＧ（ピーメックス、三共製薬株式会社製）を１０００ＩＵ投与した。ＰＧＦ２α＋ｅＣＧ投与７２時間後にｈＣＧ（プペローゲン、三共製薬株式会社製）を５００ＩＵ投与した。ｈＣＧ投与、約６８時間目に仮腹へケタラール投与後、ハロセン麻酔下で外科的に胚移植手術を行った。胚移植はＰＰカテーテル（富士平工業株式会社製）を卵管へ挿入して行った。
【００５２】
１６）組み換えクローン胎児の採取及び細胞分離作業
同定したＰＣＲ陽性コロニーは、非相同組換え細胞が、様々な割合で含まれている可能性があり、体細胞核移植技術を用いた効率的な相同組換え動物の作出の妨げとなりうることが予想された。そこで、単一な相同組換え細胞のみの集団を得るため、妊娠した雌ブタの３９〜７２日目に胎児を採取した。採取した胎児は、３）と同様に細胞を分離すると同時にゲノムＤＮＡを採取し、相同組み換え個体であるか４）と同様の条件でＰＣＲ解析した。ＰＣＲ解析にて陽性であった胎児細胞を用いて再核移植を実施し、胚移植によりＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトクローン個体の作出に供した。
【００５３】
１７）サザンブロット解析
ゲノムＤＮＡは、クローン胎児もしくはクローン産子より採取した細胞又は組織（耳）から抽出した。その細胞及び細切した組織断片は、lysis buffer（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ プロテナーゼＫ）で５５℃にて一晩処理し、溶解した。ＤＮＡは、フェノールとフェノール／クロロホルムにより処理した後、エタノール沈殿により抽出した。サザンブロッティング用に、子豚及び胎児細胞より抽出したゲノムＤＮＡ１０μｇを、HindIIIもしくは、SphＩにて切断した後、別々に０．８％アガロースゲルにて電気泳動後、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレンにブロッティングした。HindIIIにて処理したゲノムＤＮＡをブロッティングしたメンブレンは５’プローブ、SphＩにて処理したゲノムＤＮＡをブロッティングしたメンブレンは３’プローブを、それぞれ用いて、ハイブリダイゼーションを行った。５’プローブは５’側相同領域の外側にある５’隣接領域に相当するイントロン１の一部、エクソン２、イントロン２を含む領域を、ＰＣＲ法（プライマー；LDLRint1F1：5'- ATCCTCCACGATGTTGTTGG -3'及びLDLRint2R2：5'- GGAGGGCCATTAAAGGAAAG -3'）で増幅することにより作製した。また、3’プローブは、３’側相同領域の外側にある３’隣接領域に相当するイントロン１０の一部、エクソン１１、イントロン１１の一部を含む領域を、ＰＣＲ法（プライマー；LDLRint10F3：5'- CCAGTCCTCACACTGGAATG -3'及びLDLRint11R3：5'- GCAAGGCAGCTCAGTTTGGG -3'）で増幅することにより作製した。プローブは、HighPrime（Roche社製）を用いたランダムプライミング法により、［α３２−Ｐ］ｄＣＴＰを用いて標識した。そのメンブレンは、３２Ｐ標識したプローブを用いてハイブリダイズし、Imaging Plate（富士フイルム社製）上で一晩感光させ、FLA-3000G image analyzer（富士フイルム社製）を用いて解析した。
【００５４】
１８）誕生したクローンブタのＰＣＲ判定
誕生したクローンブタから採取可能な組織（耳、臍帯組織）や血液等からＤＮＡを抽出し、５）に準じてＰＣＲ解析を行った。
【００５５】
１９）クローンブタの後代の作出
ほとんどのクローンブタが、呼吸過多や体温上昇の症状により起立不能となり、死亡し、一部生存していた個体においても精液採取は行えず後代が得られなかったことから、クローンブタの死亡時に死体から精巣上体精子を回収し、体外受精及び人工授精により後代を作出した。体外受精は、Kikuchiらの方法（Biol Reprod. 2002 Apr;66(4):1033-41）に準じて行った。人工授精は、３７℃に保温したモデナ液により希釈した精巣上体精子を用いて豚人工授精用スパイラルカテーテルを用いて、発情開始した雌豚に対して、発情終了時まで、朝夕の２回ずつ２〜３日間実施した。
【００５６】
２０）ホモ型・ヘテロ型の判定
ＰＣＲ法による判定は、変異アレル及び野生型アレルについて、それぞれを特異的に検出することにより行った。変異アレルの検出は、４）に準じた方法で行い、野生型アレルの検出は、プライマーとして、LDLRex3F4（5'- GCAAGATAGGGGACTTTAGC -3'）及びLDLRex4R1（5'- GAGTCACAGACAAACTTTGG -3'）を用いる以外は、同様の方法で行った。検出されたアレルの組み合わせにより、ホモ型・ヘテロ型を判定した。また、サザンブロットによる判定は、１７）に準じた方法で行った。検出されたバンドのサイズにより、変異型アレルと野生型アレルを判別し、その組み合わせにより、ホモ型・ヘテロ型の判定を行った。
【００５７】
２１）血液検査（血漿の分離）
へパリン採血管により、ブタ静脈より、血液を採取し、２０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により、血漿を分離した。分離した血漿は、Okazakiら（Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005, 25:578-584）のＨＰＬＣ法により、コレステロール及び中性脂肪の４分画及び２０分画値を解析した。
【００５８】
２２）飼料
ブタの飼料としては、以下の脂肪含量（日本標準飼料成分表に基づく）の通常飼料（普通食）を使用した。
３〜４週齢：脂肪含量４．０％（飼料名：えつけ）
５週齢〜５カ月：脂肪含量３．５％（飼料名：はつらつ、フレンドＵ）
５カ月以降：脂肪含量２．５％（飼料名：マザーブリード）
【実施例２】
【００５９】
＜研究成績の概要：LDLRex4TVターゲッティングベクターによる相同組換え細胞作出試験＞
（１）ブタＬ胎児雄（６８日齢）より細胞を採取し、LDLRex4TVターゲッティングベクター（図１）によりエレクトロポレーションを４回行い、ネオマイシン４００μｇ／ｍｌで薬剤選択を約１週間行い、その２−３日後にコロニーをピックアップした。ＰＣＲ解析を行った総コロニー数は１２６０クローン、その内５クローンが陽性の結果となった（表１）。
【００６０】
（２）ブタＬＷ胎児雄（６２日齢）より細胞を採取し、LDLRex4TVターゲッティングベクターによりエレクトロポレーション１回を行い、ネオマイシン４００μｇ／ｍｌで薬剤選択を約１週間行い、その２−３日後にコロニーをピックアップした。ＰＣＲ解析を行った総コロニー数は４１３クローン、その内１クローンが陽性の結果となった（表１）。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
（３）（１）で得られたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞Ｎｏ．９１を用いて核移植試験１６回（体内成熟卵子３回、体外成熟卵子１３回）行い、分割胚３４０１個（体内成熟卵子由来１７０個、体外成熟卵子由来３２３１個）が得られた（表２）。
【００６３】
（４）（３）で得られた分割胚を１６頭の仮腹へ移植した結果、５頭が妊娠し、それら仮腹を屠殺したところ、６頭のクローン胎児が得られた。得られた胎児全て、非組換え体であることが確認された（表２）。
【００６４】
（５）（２）で得られたＬＤＬＲ遺伝子ノックアウト細胞のＮｏ．１−１６を用いて核移植試験６回（vivo卵子１回、vitro卵子５回）行い、分割胚１２９０個（in vivo卵子由来７０個、in vitro卵子由来１２２０個）が得られた（表２）。
【００６５】
（６）（５）で得られた分割胚を６頭の仮腹へ移植した結果、２頭が妊娠し、それら仮腹を屠殺したところ、９頭のクローン胎児が得られた（図２Ａ、Ｂ）。得られた胎児の内、７頭が相同組換え体であることが確認された（表２）。相同組換え胎児より大量に細胞分離を行うことに成功した。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
（７）さらに、（６）で得られたＬＤＬＲ ＫＯクローン胎児由来細胞を用いて、核移植・胚移植試験を７例実施した。４７４２個の体外成熟卵子を用いて核移植を実施し、３８１２個の卵子が生存（生存率８０．４％）し、１８８９個が分割した（分割率４９．６％、表３）。分割胚１８８９個を７頭の仮腹に胚移植することにより、７頭全てが妊娠し、合計３８頭のクローンブタが誕生し、内２９頭が生存産子だった。
【００６８】
【表３】
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【００６９】
（８）ＰＣＲ解析の結果、全ての産子においてＬＤＬＲ遺伝子のノックアウトが確認された。誕生したクローンは、生後の死亡が相次ぎ、特に生後１ヶ月以内及び４〜５ヶ月齢時の死亡例が多かった。７ヶ月齢を越した生存個体は２頭に過ぎなかった（表４）。多くのクローンにおいて急な呼吸過多と体温上昇が観察され、ひどい場合に起立不能になり死に至った点は、他のノックアウトブタ作製の先行研究等からは予期しなかった事象であり、死亡原因は病理検査の結果からも不明であった。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
（９）誕生したＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトクローン（ヘテロ型）の、４〜５ヶ月齢時における血漿中のコレステロール各分画（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）濃度を測定した。その結果、総コレステロール値が対照区よりも２倍以上高くなり、その原因としてＶＬＤＬ及びＬＤＬの各分画における高い値が影響していることが明らかになった（表５及び図３）。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
（１０）生存産子２９頭のＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトクローンブタの内、７ヶ月齢以降の性成熟に達したのは、２頭のみであった。しかし、７ヶ月齢以降においても、２頭から射出精液を採取することはできなかった。２頭の内１頭は１１ヶ月齢時に突然死し、死体の精巣上体尾部よりを活力のある精子を採取した。また残る１頭も１２ヶ月齢時に起立不能になったため、安楽死させ、同様に精巣上体尾部より活力ある精子を採取した。これらの精巣上体精子を用い、体外受精と人工授精を行った。２回の体外受精により得られた体外受精胚を４頭の仮親に移植した結果、４頭全てが妊娠し、３５頭の生存産子及び１頭の死産産子が誕生した。また人工授精した２頭も妊娠し、１９頭の生存産子及び４頭の死産子が得られた（表６）。
【００７４】
【表６】
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【００７５】
離乳に至った５１頭の産子の遺伝子型を調べた結果、ヘテロ型ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタが２１頭（雄６、雌１５）、野生型が３０頭（雄１６、雌１４）と判定された（表７）。誕生した後代では、クローンで多発した突然死もなく、順調に発育した。また、一部のノックアウトブタにおいて、血漿中コレステロールの各分画（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）濃度を測定した結果、Ｆ０となるクローン同様、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの濃度が野生型の２〜３倍高いことが明らかになった（データは示していない）。
【００７６】
【表７】
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【００７７】
（１１）さらに、Ｆ１世代同士の雌雄を、４例交配することにより、Ｆ２世代３８頭を得ることに成功した（表８）。Ｆ２世代産子の遺伝子型を調べた結果、ホモ型ＬＤＬＲ遺伝子ノックアウトブタが１２頭（雄７、雌５）、ヘテロ型が１８頭（雄９、雌９）、野生型が８頭（雄３、雌５）と判定された（表８）。
【００７８】
【表８】
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【００７９】
（１２）Ｆ２世代の３週齢と７週齢で、血漿中コレステロールの４分画（ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）濃度を測定した結果、ホモ型が、野生型及びヘテロ型に比べて、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの濃度が、有意に高いことが明らかになった（図４Ａ、Ｂ）。３カ月齢時の血中の総コレステロール値は、ホモ型ノックアウトで６４５ｍｇ／ｄＬ、コントロール（野生型）で１３７ｍｇ／ｄＬであった。また、７カ月齢時の血中の総コレステロール値は、ホモ型ノックアウトで５９８ｍｇ／ｄＬ、コントロール（野生型）で１１３ｍｇ／ｄＬであった。
【００８０】
（１３）Ｆ２世代の７週齢において、血漿中コレステロールの４分画のＶＬＤＬ及びＬＤＬ濃度を測定した結果、ヘテロ型が、野生型に比べて、有意に高いことが明らかになった（図５Ｂ、Ｐ＜０．０５）。
【００８１】
（１４）同様に、Ｆ２世代の３週齢と７週齢で、血漿中コレステロールの２０分画濃度を測定した結果、ホモ型が、野生型及びヘテロ型に比べて、Ｇ３分画を除く、Ｇ４〜Ｇ７分画のＶＬＤＬ及びＧ８〜１３分画のＬＤＬの濃度が、有意に高いことが明らかになった（図５Ａ、Ｂ、Ｐ＜０．０５）。
【００８２】
（１５）また、Ｆ２世代の７週齢で、血漿中コレステロールの２０分画濃度を測定した結果、ヘテロ型が、野生型に比べて、Ｇ８〜Ｇ１１及びＧ１３分画のＬＤＬの濃度が、有意に高いことが明らかになった（図５Ｂ、Ｐ＜０．０５）。
【００８３】
（１６）コレステロールのＨＤＬ値は、４分画で測定した結果、ホモ型が低い傾向にあったが、有意差は認められなかった。さらに、詳細に２０分画濃度で解析した結果では、Ｇ１５分画にてホモ型は他よりもＨＤＬ値が有意に高かった（図５Ａ、Ｂ、Ｐ＜０．０５）。一方、７週齢時のＧ１７分画では、ホモ型は他よりもＨＤＬ値が有意に低かった（図５Ｂ、Ｐ＜０．０５）。
【００８４】
（１７）３週齢及び７週齢の４分画で解析した総ＴＧ（中性脂肪：トリグリセライド）値は、ホモ型が高い傾向にあり、ヘテロとの間で有意に高かった（図４Ｃ、Ｄ、Ｐ＜０．０５）。特にＬＤＬは、ホモ型は、ヘテロ型及び野生型よりも有意に高い値を示した（図４Ｃ、Ｄ、Ｐ  ＜０．０５）。一方、７週齢の中性脂肪のＨＤＬにおいてヘテロ型が、ホモ型及び野生型に比べて有意に高い値を示した（図４Ｄ、Ｐ＜０．０５）。
（１８）さらに、詳細に２０分画で、３週齢及び７週齢のＴＧ（中性脂肪：トリグリセライド）を解析した結果、ＬＤＬのＧ１０〜Ｇ１３分画で、ホモ型は他に比べて有意に高くなった（図５Ｃ、Ｄ、Ｐ＜０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明は、高脂血症の研究の分野や、疾患モデル動物の分野や、高脂血症の治療薬あるいは予防薬開発の分野に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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