(57)【要約】      （修正有）【課題】配向性のあるレスベラトロール・アフィニティ担体を提供する。【解決手段】レスベラトロールの４´位の水酸基を１級アミノ基に置換したレスベラトロール誘導体である4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbeneを、当該アミノ基とカップリング可能な官能基を有する不溶性担体、例えば活性化ＣＨセファロース（商品名）４Ｂ（５−カルボキシペンチル−セファロース４Ｂ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）とカップリングして、レスベラトロ−ル誘導体が不溶性担体に結合したレスベラトロール・アフィニティ担体を得る。【選択図】図１
2013148559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスベラトロールが有する何れか１つの水酸基が１級アミノ基に置換されたレスベラトロール誘導体が不溶性担体に結合したレスベラトロール・アフィニティ担体であって、レスベラトロール誘導体のアミノ基がカップリング反応により前記不溶性担体に結合していることを特徴とするレスベラトロール・アフィニティ担体。
【請求項２】
レスベラトロールの４'位の水酸基が１級アミノ基に置換されたことを特徴とする請求項１に記載のレスベラトロール・アフィニティ担体。
【請求項３】
前記不溶性担体が担体樹脂とリンカーからなり、前記リンカー末端に前記レスベラトロール誘導体がアミド結合でしていることを特徴とする請求項１又は２に記載のレスベラトロール・アフィニティ担体。
【請求項４】
前記担体樹脂がアガロース、架橋されたアガロース又はこれらの誘導体からなり、前記リンカーが末端にカルボニル基を備えた１〜１４個の原子からなる直鎖部分を有することを特徴とする請求項３に記載のレスベラトロール・アフィニティ担体。
【請求項５】
５−カルボキシペンチル−セファロース４Ｂ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbeneのカップリング反応により得られたレスベラトロール・アフィニティ担体。
【請求項６】
NHS-activated Sepharose 4FFと、4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbeneのカップリング反応により得られたレスベラトロール・アフィニティ担体。
【請求項７】
レスベラトロールに特異的に結合するタンパク質を分離・同定する方法であって、
目的とするタンパク質を含む試料を調製する工程と、
前記試料をレスベラトロール・アフィニティ担体にアプライする工程と、
試料をアプライした後のレスベラトロール・アフィニティ担体から目的とするタンパク質を溶出する工程を含み、
前記レスベラトロール・アフィニティ担体は、請求項１〜６に記載のレスベラトロール・アフィニティ担体であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レスベラトロール誘導体を坦持したクロマトグラフ用アフィニティ担体、及び当該アフィニティ担体を利用したレスベラトロールと相互作用するタンパク質、ないしレスベラトロールに結合するタンパク質の分離・精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レスベラトロール（3,4',5-trihydroxy-trans-stilbene）は、ブドウの果皮などに含まれるポリフェノールの１種である。レスベラトロールは心血管関連疾患の予防、寿命延長、抗がん作用、認知症予防などヒトの健康維持に有効であることが数多く報告されている。しかしながら、前記効果に関わる生体内における分子機構は不明であり、その解明が待たれるところである。
【０００３】
いわゆる生理活性物質の生体内での分子機構の解明には、当該物質と結合するタンパク質の分離と同定が必須である。当該タンパク質の探索には、対象物質に対する生体内タンパク質の親和性を利用したアフィニティクロマトグラムが利用される。例えば、非特許文献１や２には、アガロース樹脂をベースとする不溶性担体にレスベラトロールの水酸基がエステル結合して、レスベラトロールが固定化されたアフィニティ担体が開示されている。また、非特許文献３には、ペプチド・ファージ・ライブラリーのバイオパニングのためにビオチン化レスベラトロールをプレートに固定化したレスベラトロール・アフィニティ担体、及び当該担体を利用して得られたレスベラトロールと結合するそれぞれ１２アミノ酸からなる４種のペプチドが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Wang Z. et al., Identification and purification of resveratrol targeting proteins using immobilized resveratrol affinity chromatography., Biochem. Biophys. Res. Commun., 323, 743-749 (2004)
【非特許文献２】Hsieh, T.-C. et al., Identification of glutathione sulfotransferase- π (GSTP1) as a new resveratrol targeting protein (RTP) and studies of resveratrol-responsive protein changes by resveratrol affinity chromatography., Anticancer Res., 28, 29-36 (2008)
【非特許文献３】Feng L, et al., Analysis of the resveratrol-binding protein using phage-displayed random peptide library., Arch. Biochim. Biophys. Sin., 38, 342-348 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
レスベラトロールは１分子中に３つの水酸基を有するので、非特許文献１や２で開示されたアフィニティ担体では、不溶性担体と結合しているレスベラトロールの水酸基の部位（配向性）が特定されず、当該アフィニティ担体には異なる部位で不溶性担体と結合したレスベラトロールが混在している。また、１分子中の複数の水酸基がエステル結合により不溶性担体に結合していることも考えられる。従って、当該アフィニティ担体を用いて分離されたタンパク質がレスベラトロールに特異的に結合するとは断定できず、分離されたタンパク質との結合についてさらに詳細な探究が必要となる。
【０００６】
非特許文献３のアフィニティ担体ではレスベラトロールの結合様式は１つであるとされているが、ビオチン化された水酸基の位置が不明であり、分離されたペプチドとレスベラトロールとの結合様式の詳細は明らかでない。また、この文献には、当該アフィニティ担体を使って実際に細胞抽出液などからレスベラトロールと結合するタンパク質を分離したことの記載がなく、レスベラトロールに結合するタンパク質の分離・同定が可能であるかどうかも分からない。
【０００７】
このように、現在のところ、レスベラトロールが配向特異的に結合したアフィニティ担体の利用によりタンパク質が分離・同定された報告もなく、レスベラトロールと特異的に結合するタンパク質を分離・同定することが可能なツールとして、レスベラトロールの特定の水酸基の部位で不溶性担体に結合した配向特異的レスベラトロール・アフィニティ担体が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はレスベラトロールの配向性が特定されたアフィニティ担体を提供するものである。すなわち、本発明に係るレスベラトロール・アフィニティ担体は、レスベラトロールが有する何れか１つの水酸基が１級アミノ基に置換されたレスベラトロール誘導体が不溶性担体に結合したレスベラトロール・アフィニティ担体であって、レスベラトロール誘導体のアミノ基がカップリング反応により前記不溶性担体に結合していることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、レスベラトロール・アフィニティ担体中で、不溶性担体と結合しているレスベラトロールの水酸基の部位が特定されているので、レスベラトロールと特異的に結合するタンパク質の探索や分離・同定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は本発明に係るレスベラトロール・アフィニティ担体の構造の一例を示す模式図である。Ｍは不溶性担体を構成するベース樹脂である。
【図２】図２は本発明に係るレスベラトロール・アフィニティ担体を用いて分離されたレスベラトロール結合タンパク質の解析結果の一例を示すＳＤＳ-ＰＡＧＥ画像である。
【図３】図３はレスベラトロール及びその誘導体がＣＢＲ１の酵素活性に与える影響を示す図である。
【図４】図４はアンドロゲンレセプター（ＡＲ）の転写活性に及ぼすレスベラトロールの阻害効果を示す図である。
【図５】図５はレスベラトロール・アフィニティ担体へのＡＲの結合を示すウエスタンブロット像である。
【図６】図６はレスベラトロールによるＡＲ中のＮＴＤとＬＢＤの結合阻害を示す説明図である。（ａ）はＡＲのドメイン構造を示す図、（ｂ）は組換えタンパク質のＮＴＤとＬＢＤの模式図、（ｃ）はレスベラトロールがＮＴＤとＬＢＤの結合を阻害することを示す図である。
【図７】図７はレスベラトロールによるＡＲ中のＮＴＤとＬＢＤの結合を阻害する活性を示す図である。最下段は回収されたＡＲタンパク質のウエスタンブロット像である。
【図８】図８はレスベラトロールのＡＲ結合ドメインの解析結果を示すウエスタンブロット像である。
【図９】図９はｈｎＲＮＰ Ｋタンパクの抗体及びＣＢＲ１タンパク質の抗体を用いたレスベラトロール結合タンパクの解析結果を示すウエスタンブロット像である。
【図１０】図１０は本発明に係るレスベラトロール・アフィニティ担体を用いたレスベラトロール結合タンパク質の解析法を説明する図である。
【図１１】図１１は本発明に係るレスベラトロール・アフィニティ担体の構造の他例を示す模式図である。Ｍは不溶性担体を構成するベース樹脂である。
【図１２】図１２はＣＢＲ１タンパク質の抗体を用いたレスベラトロール結合タンパクの解析結果を示すウエスタンブロット像である
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図１は本発明のレスベラトロール・アフィニティ担体の構造の一例を示す模式図である。本発明のレスベラトロール・アフィニティ担体は、レスベラトロールが有する何れか１つの水酸基が１級アミノ基に置換されたレスベラトロール誘導体が不溶性担体に固定化された担体であって、前記レスベラトロール誘導体のアミノ基がカップリング反応により前記不溶性担体に結合した担体である。
【００１２】
レスベラトロールは３位、４´位、５位の位置にそれぞれ水酸基を有する。本発明で用いられるレスベラトロール誘導体は、これら３つの水酸基のうち、何れかの位置の水酸基のみがアミノ基に置換された化合物である。これら３つの化合物、つまり3-amino-4',5-dihydroxy-trans-stilbene、4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbene、5-amino-4',3-dihydroxy-trans-stilbeneのレスベラトロール誘導体のうち、いずれか１つのレスベラトロール誘導体が不溶性担体に結合される。これらのレスベラトロール誘導体が結合したアフィニティ担体はいずれもレスベラトロールの配向性が特定されているので、レスベラトロ−ルと特異的に結合するタンパク質の分離・精製が可能である。なお、本明細書において、レスベラトロールの配向性とはレスベラトロールの基本骨格（trans-stilbene）と不溶性担体の結合様式、すなわちレスベラトロールのどの水酸基の位置で不溶性担体と結合しているかを意味する。従って配向性が特定されたとはレスベラトロールの基本骨格との結合様式、すなわちレスベラトロールのどの水酸基の位置で不溶性担体と結合しているかが特定されていることを意味する。
【００１３】
本発明では、前記３つの化合物のうち、化１で示される4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbeneが好ましく用いられる。詳細な理由は不明であるが、4'位で不溶性担体と結合しているので３位及び５位の水酸基が不溶性担体から離れた位置に存在し、タンパク質との相互作用ないし結合が生じやすくなっていると考えられるからである。
【００１４】
【化１】
2013148559.tif 000003
【００１５】
前記レスベラトロール誘導体は公知の方法により製造され得る。例えば、4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbeneは、Sun Binらの方法（Sun Bin et al. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2010 , vol. 18, # 14 p. 5352 -5366）により製造され得る。
【００１６】
不溶性担体はレスベラトロール誘導体が結合されるリンカーとベース樹脂（担持用樹脂）を有する。ここにおいて、不溶性とはアフィニティ担体としての機能を維持できる限りにおいて水又は／及びアルコールなどの溶媒に溶解しないことを意味する。不溶性担体の選択はその使用目的により適宜選択される。ベース樹脂には、公知のアフィニティ担体に用いられる担持用の樹脂が用いられる。ベース樹脂は、例えば、アガロースであり、分子間で架橋されたアガロース、これらアガロースのカルボキシル基に置換基が導入されたアガロース誘導体、ポリヒドロキシメタクリレートであり得る。特に、セファロース（登録商標）として販売されているベース樹脂が好ましく用いられる。
【００１７】
リンカーはレスベラトロール誘導体をベース樹脂に結合させる機能を有する。レスベラトロール誘導体のアミノ基がリンカーの末端にカップリングする。従って、レスベラトロール誘導体が結合する以前のリンカーは、レスベラトロールのアミノ基とカップリングする官能基（官能基Ａ）をその末端に有するものが好ましい。リンカーはこのような機能を果たすものであれば特に限定されるものではない。また、リンカーは、レスベラトロール誘導体が担持用樹脂に近接することによって起こりうる立体障害による影響を低減する機能を有する。リンカーの長さは適宜調整される。リンカーは、例えば１〜１４の原子からなる直鎖部分を有するリンカーであり、分岐鎖を有するリンカーでもあり得る。当該原子は主として炭素原子であり、窒素原子や酸素原子でもあり得る。また、臭化シアン（ＣＮＢｒ）やカルボジイミドのようなカップリング試薬の使用により、レスベラトロール誘導体がベース樹脂に結合される場合がある。
【００１８】
官能基Ａは１級アミノ基と反応する官能基であれば特に限定されることがなく、例えば、ＮＨＳ（N-Hydroxysuccinimide）基、エポキシ基、カルボキシル基が例示される。また、官能基Ａがカルボキシル基の場合には、カルボジイミドなどのカップリング試薬によりレルベラトロール誘導体がカップリングされ得る。
【００１９】
上記の不溶性担体や官能基を有する不溶性担体には市販されている担体が用いられる。このような不活性担体として、HiTrap NHS-activated HP、NHS-activated Sepharose(登録商標)4FF、CNBr-activated Sepharose 4B、CNBr-activated Sepharose 4FF、ECH Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B（何れもGE Healthcare）、活性化ＣＨセファロース４Ｂ、エポキシ活性化セファロース６Ｂ、臭化シアン活性化セファロース４Ｂ（何れもSigma-Aldrich Co.）、BIOACT gel NHS5、BIOACT gel EPO5、BIOACT gel COO5 などが例示される。本発明においては、レスベラトロールに結合するタンパク質の分離の確実さなどの観点から、官能基ＡとしてＮＨＳ基を有する活性化ＣＨセファロース４Ｂ（５−カルボキシペンチル−セファロース４Ｂ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、NHS-activated Sepharose 4FFが好適である。
【００２０】
不溶性担体と１級アミノ基のカップリング方法は公知であり、不溶性担体が有する官能基やカップリング試薬に応じて適宜選択され得る。レスベラトロール誘導体と不溶性担体のカップリングは公知の方法に準じて行える。
【００２１】
本発明のレスベラトロール・アフィニティ担体は、レスベラトロールに親和性を示すタンパク質の分離・同定に用いられる。このアフィニティ担体はレスベラトロールの配向性が特定されているので、分離されたタンパク質のレスベラトロールに対する特異性が高いといえる。
【００２２】
タンパク質の分離・同定方法は公知である各種のアフィニティクロマトグラフィを用いる場合と同様である。本願発明に係るレスベラトロールに特異的に結合するタンパク質を分離する方法とは、目的とするタンパク質（標的タンパク質）を含む試料から当該タンパク質をレスベラトロール・アフィニティ担体に特異的に吸着させて分離する方法であり、同定する方法とは分離された当該タンパク質の同定、すなわち、分離したタンパク質が何であるか決定する方法である。分離方法は一般的には、レスベラトロールの生理作用やその作用を評価したい細胞又は組織から目的とするタンパク質（標的タンパク質）を含む試料を調製する工程と、調製した試料をレスベラトロール・アフィニティ担体にアプライして標的タンパク質を当該担体に吸着させる工程と、吸着後のレスベラトロール・アフィニティ担体から標的タンパク質を溶出する工程を含む。なお、ここで「アプライする」とは、レスベラトロール・アフィニティ担体と標的タンパク質を含む試料を、標的タンパク質がレスベラトロール・アフィニティ担体に相互作用ないし結合するまで接触させることを意味する。アプライする方法として、例えば、レスベラトロール・アフィニティ担体をカラムに充てんして、当該カラムに標的タンパク質を含む試料溶液を流す方法が挙げられる。また、レスベラトロール・アフィニティ担体を分注したプラスチック・ウェルに標的タンパク質を含む試料を加え、標的タンパク質が当該担体に相互作用ないし結合するのに十分な時間、接触させる方法も挙げられる。さらに具体的に言うと、細胞や組織から標的タンパク質を抽出する工程と、標的タンパク質を含む抽出物をレスベラトロール・アフィニティ担体と接触させて標的タンパク質をアフィニティ担体に吸着ないし結合させる工程と、アフィニティ担体に吸着ないし結合した標的タンパク質をアフィニティ担体からはずす工程とを含み、さらに必要に応じて、標的タンパク質を吸着ないし結合したアフィニティ担体を洗浄用緩衝液で洗浄して非吸着タンパク質を除くステップ、適度な濃度のレスベラトロールを含む溶出用緩衝液で非吸着タンパク質が除かれた後のレスベラトロール・アフィニティ担体から溶出された標的タンパク質を溶出用緩衝液に回収するステップを含む。洗浄用緩衝液や溶出用緩衝液は、当業者により適宜選択される。例えば、これらの緩衝液として、例えば非特許文献１や２に記載された溶液が例示される。また、細胞や組織からタンパク質を含む試料溶液を調製する方法も、当業者により適宜選択される。
【００２３】
レスベラトロールに特異的に結合するタンパク質は、レスベラトロールを結合してないコントロール担体を用いた同様の操作により回収されたタンパク質と、レスベラトロール・アフィニティ担体を用いた操作により回収されたタンパク質をそれぞれ電気泳動した後、両者の結果を対比することにより特定され得る。特定されたタンパク質は、質量分析機器などを用いた機器分析により同定される。ここにおいて、コントロール担体は、レスベラトロール誘導体をカップリングする際に使用した不溶性担体に、１級アミンを有する化合物（好ましくはアミノ酸のようなタンパク質に低親和性である低分子化合物）をカップリングにより固定化した担体である。
【００２４】
レスベラトロール・アフィニティ担体に吸着したタンパク質を回収する別法として、非特異的に吸着したタンパク質が除かれた後のレスベラトロール・アフィニティ担体を混合したＳＤＳ電気泳動のためのサンプル調製用緩衝液を加熱し、サンプル調製用緩衝液中にレスベラトロール・アフィニティ担体に強く結合したタンパク質を回収する方法もある。加熱条件は、当業者により適宜決定される。例えば９５℃で３分間の条件であり得る。ＳＤＳ電気泳動のためのサンプル調製用緩衝液も公知であり、当業者が適宜選択できる。
【００２５】
レスベラトロール・アフィニティ担体を利用したレスベラトロールに相互作用ないし結合するタンパク質の分離・同定方法として次の方法も例示される。まず、レスベラトロールの生理作用やその有効性を評価したい細胞又は組織のタンパク質抽出液の一部（例えばその半量）にレスベラトロールを、好ましくは終濃度で１ｍＭ程度となるように混合する（レスベラトロール添加サンプル）。タンパク質抽出液の一部又はその残部に、等量のレスベラトロール無添加溶液、すなわちレスベラトロールを溶解するのに用いた溶媒（例えばエタノール又はジメチルスルホキシド）を添加する（レスベラトロール無添加サンプル）。両サンプルにレスベラトロール・アフィニティ担体を加え、インキュベートする。インキュベート条件は当業者によって適宜定められるが、レスベラトロールと標的タンパク質の相互作用ないし結合に好適な条件、例えば３７℃の反応温度、３０分の反応時間であり得る。その後、インキュベートした担体を洗浄用緩衝液で洗浄した後、ＳＤＳ電気泳動用のサンプル調製用緩衝液を添加した液を加熱して、サンプル調製用緩衝液中に担体からはずれたタンパク質を回収する。レスベラトロールに特異的に結合するタンパク質は、レスベラトロール添加サンプルから回収されたタンパク質とレスベラトロール無添加サンプルから回収されたタンパク質をそれぞれ電気泳動した後、両者の結果を対比することにより特定される。特定されたタンパク質は、質量分析機器などを用いた機器分析により同定される。
【００２６】
この方法では、図１０に示すように、レスベラトロール添加サンプル中では、レスベラトロールに親和性を示す全てのタンパク質は添加したレスベラトロールに結合する結果、レスベラトロール・アフィニティ担体に結合するタンパク質はほとんど存在しない。一方、レスベラトロール無添加サンプル中では、レスベラトロールに特異的に親和性を示すタンパク質のみがレスベラトロール・アフィニティ担体に結合する。その結果、レスベラトロール無添加サンプルから、レスベラトロールに特異的に結合しうるタンパク質が回収される。
【００２７】
また、候補となるタンパク質が推定される場合には、レスベラトロール無添加サンプルとインキュベーションしたレスベラトロール・アフィニティ担体から回収したタンパク質のウエスタンブロッティングにおいて、当該タンパク質の抗体を用いることにより、当該タンパク質にレスベラトロールが直接的又は何らかのタンパク質を介して間接的に結合することが証明され得る。
【００２８】
このような方法により、レスベラトロールに対して特異的に親和性を示す、すなわちレスベラトロールに対して特異的に相互作用ないし結合するタンパク質の分離・同定が可能となる。
【００２９】
次に、本発明について実施例に基づいて具体的に説明すると共に、本発明のレスベラトロール・アフィニティ担体を用いて、レスベラトロールに対して特異的な親和性を示すタンパク質を分離・同定した結果について説明する。なお、下記の実施例はあくまでも例示であり、本発明は下記の実施例に限定されないのはいうまでもない。
【実施例１】
【００３０】
〔レスベラトロール・アフィニティ担体の調製〕
市販の活性化ＣＨセファロース４Ｂ（sigma-aldrich）１ｇを１ｍＭ ＨＣＬに懸濁して活性化させた。これに前記Sun Binらの方法により合成された4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbene１０ｍｇを溶解させたCoupling溶液（０.１M NaHCO3、０.５M NaCl、５０% EtOH）を加えて、４℃にて４時間、攪拌を行い反応させ、カップリング反応を行った。次いでCoupling溶液で数回洗浄した後、洗浄したレスベラトロール・アフィニティ担体に１M monoethanolamineを加えて４℃にて１時間反応させた。このようにして得られたレスベラトロール・アフィニティ担体をCoupling溶液で数回洗浄し、精製されたレスベラトロール・アフィニティ担体（図１参照）とした。
【００３１】
レスベラトロールが結合していないコントロール担体として、4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbeneの溶解していないCoupling溶液を用いた以外は上記と同様に調製したコントロール担体をレスベラトロール結合タンパク質（標的タンパク質）の分離のために調製した。
【実施例２】
【００３２】
〔レスベラトロール結合タンパク質の分離・同定１〕
調製されたレスベラトロール・アフィニティ担体を用いて、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７株の細胞抽出液からレスベラトロールに特異的に結合するタンパク質の分離・同定を行った。
【００３３】
１０％ＦＢＳを添加したDMEM-High Glucose（glucose 4.5g/l）を用いて、３７℃、５％ＣＯ2の条件にて培養したヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７株をホモジネートして細胞破砕液を得た。この細胞破砕液を遠心分離（100,000g×60min）して得られた上清を細胞抽出液（試料溶液）とした。この抽出液に前記の方法で調製したレスベラトロール・アフィニティ担体を加え、１６時間、４℃で攪拌することにより抽出液中のレスベラトロール結合タンパク質を当該担体に結合させた。担体を３ｍｌの洗浄溶液（20ｍＭ Hepes-NaOH（pH7.5)、500ｍＭ NaCl、１％ NP-40, １ｍＭ EDTA、１ｍＭ DTT、10％ glycerol）で３回洗浄した後、溶出液（20mM Hepes-NaOH（pH7.5）、150ｍＭ NaCl、１％ NP-40、１ｍＭ EDTA、１ｍＭ DTT、１０％ glycerol、１ｍＭ resveratrol）を用いて当該担体に結合したレスベラトロール結合タンパク質を溶出液中に回収した。また、同様にして、コントロール担体を用いて当該担体に非特異的に結合したタンパク質を回収した。
【００３４】
次に、それぞれのタンパク質回収液に、等量の２xＳＤＳ電気泳動用サンプル調製緩衝液（２００ｍＭ Tris-HCl（pH6.8）、４％SDS、２０％glycerol、０.０１％ bromophenol blue、１０％ 2-mercaptoethanol）を添加し、９５℃で３分間加熱した。サンプルを２５ｍＭ Tris、１９２ｍＭ Glycine、０.１％ ＳＤＳから構成される電気泳動用緩衝液を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色により出現したタンパク質の分離パターンをコントロールサンプルのそれと対比して解析した。また、タンパク質が結合した両担体を、１xＳＤＳサンプル調製緩衝液中で加熱した後に回収したタンパク質もＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。当該結果を図２に示す。図２に矢印で示されたスポットのタンパク質は、質量分析によりheterogeneous nuclear ribonucleoprotein K（ｈｎＲＮＰ Ｋ）とcarbonyl reductase 1（ＣＢＲ１）と同定された。
【００３５】
ＣＢＲ１は乳がん治療に使用される抗がん剤のドキソルビシンをドキシルビシノールに変換する酵素である。ドキソルビシノールはドキソルビシンに比べて抗がん作用は低く、心毒性を持つ化合物である。
【００３６】
次に、レスベラトロールとその誘導体によるＣＢＲ１活性に及ぼす影響を調べた。遺伝子組換え法により作製されたＣＲＢ１タンパク質を用いたが、組替えＣＢＲ１は、Takeshi Miuraらの方法(Takeshi Miura:Different functions between human monomeric carbonyl reductase 3 and carbonyl reductase 1(2008)Mol Cell Biochem 315:113-121)に準じて作製した。ＣＢＲ１の活性はRaynard L. Batemanらの方法(Raynard L.Bateman：Human Carbonyl Reductase 1 Is an S-Nitrosoglutathione Reductase (2008) Journal of Biological Chemistry Vol.283 No.51：35756-35762)により測定した。その結果を図３に示した。レスベラトロールと3,5-dihydroxy-4'-methoxy-trans-stilbeneは同様にＣＢＲ１活性を阻害したが、4'-hydroxy-3,5-dimethoxy-trans-stilbeneはＣＢＲ１活性を阻害しなかった。つまり、ＣＢＲ１活性阻害には３位と５位の水酸基が重要であるといえ、さらにスチルベン構造がＣＢＲ１活性阻害に必要であると推測される。この事実は、用いられたレスベラトロール・アフィニティ担体にはレスベラトロール誘導体が４´位で結合しており、３位と５位の水酸基がフリーであることと一致するものであり、レスベラトロールとレスベラトロールに親和性を示すタンパク質の相互作用ないし結合の様式を示すものといえる。この点は、従来のレスベラトロール・アフィニティ担体では得られなかった本願発明に係るアフィニティ担体の有利な効果である。
【実施例３】
【００３７】
〔アンドロゲン受容体の阻害効果〕
レスベラトロールは前立腺がん細胞の増殖抑制に有効であることも報告されている。前立腺がん細胞は男性ホルモン（アンドロゲン）に依存して増殖する。アンドロゲンであるテストステロンあるいはジヒドロテストステロンが転写因子であるアンドロゲン受容体（ＡＲ）に結合することでアンドロゲンはその機能を発揮する。（i）レスベラトロールはＡＲの転写活性を阻害する、（ii）レスベラトロールはＡＲタンパク質の細胞内での半減期を低下させる、（iii）核内で作用するＡＲは細胞質から核内に移行するためにＡＲ自身がアセチル化される必要があるがレスベラトロールはＡＲのアセチル化を阻害する、などの現象からレスベラトロールはＡＲの機能を阻害すると考えられている。しかし実際にレスベラトロールがＡＲに結合するのかは不明である。そこで、先ずレスベラトロールとその誘導体のＡＲ転写活性に及ぼす影響を検討した。その結果を図４に示す。
【００３８】
レスベラトロール及びその誘導体のＡＲ転写活性に及ぼす影響を、図４に示す化合物を被験物質として、Haradaらの方法（J. Nutr. Sci. Vitaminol. 53, 556-560, 2007）に準じて測定した。その結果、レスベラトロールと3,5-dihydroxy-4'-methoxy-trans-stilbeneは同様にＡＲの転写活性を阻害したが、4'-hydroxy-3,5-dimethoxy-trans-stilbeneはＡＲの転写活性を阻害しなかった。つまりＡＲの転写活性阻害にレスベラトロールの３位と５位の水酸基が重要であることがわかる。この事実も、用いられたレスベラトロール・アフィニティ担体に結合したレスベラトロール誘導体の３位と５位の水酸基はフリーであり、レスベラトロール結合タンパク質との結合に３位又は／及び５位の水酸基が重要であるという前記の結果と一致する。
【００３９】
そこでレスベラトロール・アフィニティ担体と前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ株の破砕液（タンパク質溶液）を用いて、ＡＲに対して親和性を示すタンパク質の検出を行った。１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０を用いて、３７℃、５％ＣＯ2の条件にて培養した前立腺がん細胞ＬＮＣａＰ株をホモジネートして細胞破砕液を得た。この細胞破砕液を遠心分離（100,000g×60min）して得られた上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液に上記で調製したレスベラトロール・アフィニティ担体を混合し、レスベラトロール結合タンパク質を結合させた。当該タンパク質を結合した該担体を前記洗浄溶液で洗浄後、電気泳動用の１xＳＤＳサンプル調製緩衝液を添加し、９５℃で３分間加熱して、当該担体からはずれてきたレスベラトロール結合タンパク質を遠心分離（10,000g×5min）して上清を回収した。コントロール担体を用いて同様に操作して、当該担体からはずれてきた非特異的結合タンパク質を回収した。
【００４０】
それぞれ回収したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動して、両者の電気泳動パターンを対比することにより、レスベラトロール・アフィニティ担体に特異的に結合したタンパク質のバンドを同定し、当該タンパク質をゲルから回収した。回収したタンパク質をさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、抗ＡＲ抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。その結果、レスベラトロール・アフィニティ担体を用いた場合にのみＡＲが検出された（図５参照）。つまり、この方法からレスベラトロールがＡＲに直接的あるは第３のタンパク質を介して間接的に相互作用ないし結合していることが判明した。
【００４１】
そこでＡＲの組換えタンパク質とレスベラトロール・アフィニティ担体を用いてＡＲが直接レスベラトロール・アフィニティ担体に結合しているかを評価した。次の方法によりその評価を行った。
【００４２】
ＡＲは大きく３つのドメイン構造（Ｎ末端側から順番に、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、そしてリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ））を有する。リガンド（テストステロンまたはジヒドロテストステロン）がＮ末端側に位置するＬＢＤに結合すると、ＬＢＤは構造変化を起こし、ＮＴＤと相互作用する（Ｎ−Ｃ相互作用）（図６参照）。ＡＲの転写活性化にはこのＮ−Ｃ相互作用が必須の事象である。レスベラトロールはＮ−Ｃ相互作用を阻害するので、ＮＴＤとＬＢＤの組換えタンパク質を作製して、リガンドに依存したＮＴＤとＬＢＤの相互作用に及ぼすレスベラトロールの影響を検討した。組換えタンパク質は、Ｃ末端側にヒスチジンが６つ連続したヒスチジンタグを融合したＮＴＤ（ＮＴＤ−ＨｉＳ）とＮ末端側にグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合したＬＢＤ（ＧＳＴ−ＬＢＤ）を作製した。
【００４３】
ＮＴＤの組換えタンパク質であるＮＴＤ−ＨｉＳとＬＢＤの組換えタンパク質であるGST-LBDはリガンド（ジヒドロテストステロン）の非存在下では結合しなかったが、リガンド存在下で結合した（図７参照）。しかし、レスベラトロールは５μＭ以上の濃度でリガンド（ジヒドロテストステロン）に依存したＮＴＤ（ＮＴＤ−ＨｉＳ）とＬＢＤ（ＧＳＴ−ＬＢＤ）の結合を阻害した（図７参照）。よってレスベラトロールがＮＴＤ又はＬＢＤのいずれかに結合してＮＴＤとＬＢＤの結合を阻害していると推測された。そこで、作製したＮＴＤ又はＬＢＤの組換えタンパク質のどちらのタンパク質がレスベラトロール・アフィニティ担体に結合するかを解析した。作製した組換えタンパク質を溶解した結合緩衝液（20ｍＭ Hepes-NaOH（pH7.5)、150ｍＭ NaCl、１％ NP-40, １ｍＭ EDTA、１ｍＭ DTT、10％ glycerol））に、レスベラトロール・アフィニティ担体を加えた後、上記と同様に操作を行い、１xＳＤＳサンプル調製緩衝液中にレスベラトロール結合タンパク質を回収した。回収したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、各組換えタンパク質に対する抗体を利用したウエスタンブロット解析を行った。その結果を図８に示した。ＡＲのＮ末端ドメインであるＮＴＤがレスベラトロール・アフィニティ担体に結合することが判明した。この結果から、ＡＲ（ＡＲのＮＴＤ）とレスベラトロールが直接結合することが明らかにされた。
【実施例４】
【００４４】
〔レスベラトロール結合タンパク質の解析〕
実施例２で同定されたｈｎＲＮＰ Ｋタンパク質及びＣＢＲ１タンパク質に対する抗体を用いて、レスベラトロールに親和性を示すタンパク質の解析を行った。実施例２と同様にして細胞抽出液を調製した。このタンパク抽出液の一部に終濃度が１ｍＭになるようにレスベラトロールを加えた（レスベラトロール添加サンプル）。また、その一部にレスベラトロールを溶解した溶媒であるエタノールを加えた（レスベラトロール無添加サンプル）。次いで、それぞれの液にレスベラトロール・アフィニティ担体を過剰量加え、４℃で１６時間インキュベートした。回収したレスベラトロール・アフィニティ担体を洗浄溶液（20ｍＭ Hepes-NaOH (pH7.5), 500ｍＭ NaCl,１％ NP-40, １ｍＭ EDTA, １ｍＭ DTT, １０％% glycerol）で洗浄後、実施例３と同様にして、１xＳＤＳサンプル調製緩衝液を加え、９５℃で３分間加熱して、担体からはずれてきたレスベラトロール結合タンパク質を回収した。それぞれ回収したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、ｈｎＲＮＰ Ｋ及びＣＢＲ１に対する抗体を利用したウエスタンブロット解析を行った。その結果を図９に示した。
【００４５】
図９に示すように、ｈｎＲＮＰ Ｋタンパク質又はＣＢＲ１タンパク質がレスベラトロール無添加サンプルでのみで検出された。この結果からレスベラトロールがｈｎＲＮＰ ＫタンパクまたはＣＢＲ１タンパクに直接的あるいは第３のタンパク質を介して間接的に相互作用ないし結合していることが判明した。
【実施例５】
【００４６】
市販のNHS-activated Sepharose(登録商標)4FF、１ｇを１ｍＭ ＨＣＬに懸濁して活性化させた。これに前記Sun Binらの方法により合成された4'-amino-3,5-dihydroxy-trans-stilbene１０ｍｇを溶解させたCoupling溶液（０.１Ｍ NaHCO3、０.５Ｍ NaCl、５０% EtOH）を加えて、４℃にて８時間、攪拌を行い反応させ、カップリング反応を行った。次いでCoupling溶液で数回洗浄した後、洗浄したレスベラトロール・アフィニティ担体に０.５M モノエタノールアミンと０.５Ｍ NaClの等量混合溶液を加えて４℃にて２時間反応させた。このようにして得られたレスベラトロール・アフィニティ担体をCoupling溶液で数回洗浄し、精製されたレスベラトロール・アフィニティ担体（図１１参照）を得た。
【００４７】
調製されたレスベラトロール・アフィニティ担体(NHS-activated Sepharose4FF)を用いて、ヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７株からレスベラトロールに特異的に結合するタンパク質の分離・同定を行った。実施例２で同定されたＣＢＲ１タンパク質に対する抗体を用いて、レスベラトロールに親和性を示すタンパク質の同定を行った。実施例２と同様にして細胞抽出液を調製した。当該細胞抽出液の一部に終濃度が１ｍＭになるようにレスベラトロールを加えたサンプル（レスベラトロール添加サンプル）とタンパク抽出液の一部にレスベラトロールを溶解した溶媒（エタノール）を加えたサンプル（レスベラトロ−ル無添加サンプル）を調製した。それぞれのサンプルにレスベラトロール・アフィニティ担体を過剰量加え、１６時間、４℃で攪拌することにより、タンパク質を担体に結合させた。当該タンパク質が結合した担体を３ｍｌの洗浄溶液（20ｍＭ Hepes-NaOH（pH7.5）、500ｍＭ NaCl、１％ NP-40, １ｍＭ EDTA、１ｍＭ DTT、10％ glycerol）で３回洗浄した後、当該樹脂に結合したタンパク質は、実施例３と同様にして１ｘＳＤＳサンプル調製緩衝液を加え、９５℃で３分間加熱して、担体からはずし、回収した。それぞれ回収したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、ＣＢＲ１に対する抗体を利用したウエスタンブロット解析を行った。図１２に示すように、NHS-activated Sepharose(登録商標)4FFにおいてもタンパク質ＣＢＲ１がレスベラトロール添加サンプルでのみ検出された。つまりActivated CH Sepharoseを利用したレスベラトロール・アフィニティ担体と同様に、NHS-activated Sepharose(登録商標)4FFを利用したレスベラトロール・アフィニティ担体でもタンパク質ＣＢＲ１が直接的あるいは第３のタンパク質を介して間接的に結合していることが解析できた。
【００４８】
以上説明したように、本発明に係るレスベラトロール・アフィニティ担体では、レスベラトロール誘導体は配向特異的に担体に結合しており、レスベラトロールに特異的に親和性を示し、レスベラトロールと相互作用ないし結合するタンパク質が吸着される。これにより、レスベラトロールに特異的に結合するタンパク質の分離・同定のみならず、分子レベルでのレスベラトロールの作用機序の解明ができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によると、配向特異性の有するレスベラトロール・アフィニティ担体が提供される。このレスベラトロール・アフィニティ担体は、レスベラトロールに親和性を示すタンパク質の分離・同定並びにレスベラトロールの作用機序の解明に寄与し、レスベラトロールを主成分とする医薬、健康食品の開発ツールとしての利用が期待される。
【図１】
2013148559.tif 000004
【図２】
2013148559.tif 000005
【図３】
2013148559.tif 000006
【図４】
2013148559.tif 000007
【図５】
2013148559.tif 000008
【図６】
2013148559.tif 000009
【図７】
2013148559.tif 000010
【図８】
2013148559.tif 000011
【図９】
2013148559.tif 000012
【図１０】
2013148559.tif 000013
【図１１】
2013148559.tif 000014
【図１２】
2013148559.tif 000015