(57)【要約】【課題】天然由来の糸状菌であって、遺伝改良された糸状菌に劣らぬほどの優れたセルロース分解作用を有し、セルロースを酵素糖化・発酵処理の多糖原料として有効利用できるように変換可能な菌株を提供すること。【解決手段】セルロース糖化作用を有する糸状菌であって、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４）、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７５）、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７６）又はそれらの変異株から選択される新規糸状菌株。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース糖化作用を有する糸状菌であって、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４）、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７５）、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７６）又はそれらの変異株から選択される新規糸状菌株。
【請求項２】
請求項１記載の糸状菌から選択される少なくとも１種を、セルロースの存在下で培養する工程を含む、セルロース糖化方法。
【請求項３】
請求項１記載の糸状菌から選択される２種を、セルロースの存在下で培養する工程を含む、セルロース糖化方法。
【請求項４】
セルロースの存在下で培養する工程が、一方の糸状菌を用いて培養を行った後に、他方の糸状菌を用いて培養を行う工程である、請求項３に記載のセルロース糖化方法。
【請求項５】
セルロースの存在下で培養する工程が、２種の糸状菌を同時に用いて培養を行う工程である、請求項３に記載のセルロース糖化方法。
【請求項６】
前処理として、セルロースを低濃度のアルカリ溶液に浸漬する工程を含む、請求項２〜５のいずれかに記載のセルロース糖化方法。
【請求項７】
前処理として、セルロースを高圧熱工程および低濃度のアルカリ溶液に浸漬する工程を含む、請求項２〜５のいずれかに記載のセルロース糖化方法。
【請求項８】
前記糸状菌が、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４）とアスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７５）との組み合わせである、請求項３〜７のいずれかに記載のセルロース糖化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規セルロース糖化糸状菌及びそれを用いたセルロースの糖化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球温暖化問題や石油価格の高騰などを背景とし、バイオエタノールへの関心が高まっている。近年、トウモロコシやサトウキビを原料としたバイオエタノールの生産が実用化されている。しかしながら、トウモロコシやサトウキビ等は食料として流通しているために、バイオエタノールの生産が拡大することにより食糧問題が発生することが懸念されている。
【０００３】
このような懸念から、トウモロコシやサトウキビを原料とする代わりに、木質由来のセルロースを原料としたバイオエタノールの生産が広く検討されている。しかしながら、生産コストが高い点で、現時点では実用的ではない。セルロースをエタノールに変換するためには、セルロースの分解による糖化（グルコース化）のプロセスを経る必要がある。糖化は、セルロースを複数種のセルロース分解酵素（セルラーゼ）が関与する酵素反応によりグルコース等の単糖類にまで分解するプロセスである。木質由来のセルロースを糖化する場合においては、木材のセルロースはリグニンによって被覆されているために、そのままでは、セルラーゼの反応部位がセルロースに到達することが困難であるために糖化の効率が悪い。そのために、セルロースからリグニンを除去する前処理が必要である。さらに、糖化に用いられるセルラーゼは一般的に高価であるために、生産コストを高める一因になっている。なお、これまでに、セルロースを糖化する方法として、セルラーゼを生産するセルラーゼ生産菌を用いて行う手法が知られており、セルラーゼ生産菌の具体例としては、例えば、特許文献１に記載されているトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のようなトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等に属する糸状菌が報告されている。
【０００４】
一方、シイタケ、エノキタケ、マイタケなどの食用キノコの生産は、おが屑と小麦ふすまなどの栄養剤を混合した培地（菌床）を用いた栽培（菌床栽培）によって行われている。菌床はきのこの収穫後には廃棄物となるために、大量に発生する廃菌床の処理方法が問題になっており、有効利用できる方法が求められている。
【０００５】
これに対しては、廃棄物である木質由来のセルロースを含有するキノコ廃菌床をバイオエタノールの原料とする点で、キノコ廃菌床の処理問題に対応できるという報告がある（例えば、特許文献２）。具体的には、特許文献２には、木質由来のセルロースを含むキノコ廃菌床に由来するセルロースを糖化してグルコースを生産し、このグルコースをエタノール醗酵させるバイオエタノール生産のプロセスが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１６６８４８号公報
【特許文献２】特開２００６−２０６０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載されているような技術は、遺伝子に改良を加えた糸状菌が用いられている。確かに、遺伝子的改良を加えた微生物を用いれば、効率的にセルロース分解を行うことができると考えられるが、一方で、天然には存在しない組換え微生物をそのまま廃棄することが難しいといった環境的問題が生じるおそれがある。
【０００８】
また、特許文献２に記載のような方法では、セルロースを糖化するセルラーゼが高価である点から、コストの点で、トウモロコシやサトウキビを原料とするバイオエタノールの生産を充分に置き換えることは困難であると思われる。
【０００９】
そこで本発明は、天然由来の糸状菌であって、遺伝改良された糸状菌に劣らぬほどの優れたセルロース分解作用を有し、セルロースを酵素糖化・発酵処理の多糖原料として有効利用できるように変換可能な菌株を提供することを目的とする。更に、本発明は、上記菌株を使用して、効率的にセルロースを分解する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、これまで廃棄処理に困っていたキノコ廃菌床から採取された多種の菌株の中から、セルロースに対して優れた分解作用を有し、セルロースを酵素糖化・発酵処理の多糖原料として有効利用できるように変換可能な新規糸状菌を見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
【００１１】
即ち、本発明に係る糸状菌株は、セルロース糖化作用を有する糸状菌であって、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４）、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７５）、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７６）又はそれらの変異株から選択される新規糸状菌株である。
【００１２】
このような本発明の糸状菌を用いてセルロースを分解することによって、セルロースを効率よく糖化し、セルロースを有用物質の生産のための原料として有効利用することができる。また、本発明の糸状菌は天然由来であるため、廃棄等についても環境にやさしいという利点がある。さらに、本発明の糸状菌は、廃棄物であるキノコ廃菌床由来であり、コスト的にも非常に安価にセルロース糖化を行うことができる。従って、本発明の糸状菌を使用することによって、セルロース中の多糖の糖化を、安全かつ効率的に、低コストで実施することが可能になる。
【００１３】
さらに、本発明は、前記糸状菌から選択される少なくとも１種を、セルロースの存在下で培養する工程を含む、セルロース糖化方法を提供する。本発明に係るセルロース糖化方法は、安全かつ効率に優れているため、産業利用上非常に有用である。
【００１４】
また、前記セルロース糖化方法において、前記糸状菌から選択される２種を、セルロースの存在下で培養する工程を含むことがより好ましい。これにより、より効率的にセルロースの糖化を行うことができる。
【００１５】
さらに、前記セルロース糖化方法において、セルロースの存在下で培養する工程が、一方の糸状菌を用いて培養を行った後に、他方の糸状菌を用いて培養を行う工程であってもよい。より好ましくは、前記セルロース糖化方法において、セルロースの存在下で培養する工程が、２種の糸状菌を同時に用いて培養を行う工程であることが望ましい。そうすることにより、糖化のための培養時間を短縮することが可能であり、より効率的にセルロースの糖化を行うことができる。
【００１６】
また、前記セルロース糖化方法において、前処理として、セルロースを低濃度のアルカリ溶液に浸漬する工程を含むことが好ましい。このような工程を経ることにより、よりセルロース糖化の効率が上がる。
【００１７】
さらには、前処理として、セルロースを高圧熱工程および低濃度のアルカリ溶液に浸漬する工程を含むことがより好ましい。このような工程を経ることにより、よりセルロース糖化の効率が上がる。
【００１８】
また、前記２種の糸状菌が、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４）とアスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７５）との組み合わせであることが好ましい。このような２種の糸状菌を組み合わせることにより、より効率的にセルロースの糖化を行うことができると考えられる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の糸状菌を用いてセルロースを分解することによって、セルロースを効率よく糖化し、セルロースを有用物質の生産のための原料として有効利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例１における、各選択菌株とＱＭ９４１４菌株の糖化能力（グルコース濃度）を測定した結果を示す。
【図２】図２は、実施例２（１）において、ＫＦＡ−２菌株をアルカリ処理した各種セルロース資材の存在下で培養した後のグルコース濃度を示す。
【図３】図３は、実施例２（３）において、ＫＦＡ−２菌株をアルカリ処理・高圧熱処理した各種セルロース資材の存在下で培養した後のグルコース濃度を示す。
【図４】図４は、実施例３において、２種の菌株を用いてフラスコスケールで行った二段階糖化後のグルコース濃度を示す。
【図５】図５は、実施例４の２種の菌株を用いた二段階糖化（大容量）において、１段階目の糖化が終了した時のグルコース濃度を示す。
【図６】図６は、実施例４の２種の菌株を用いた二段階糖化（大容量）において、２段階目の糖化が終了した時のグルコース濃度を示す。
【図７】図７は、実施例５において、２種の菌株を用いて同時糖化（大容量）した後のグルコース濃度を示す。
【図８】図８は、実施例５における、２種の菌株を用いて同時糖化および二段階糖化（大容量）した後のグルコース濃度を示す。
【図９】図９は、実施例６において、同時糖化における糖化処理時間の影響を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を具体的な実施形態を示して詳細に説明する。
【００２２】
＜糸状菌＞
本実施形態における糸状菌は、セルロース糖化作用（セルロース分解作用）を有するものであり、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）ＫＦＡ−２菌株、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＫＴ−１０菌株、ペニシリウム・コミューン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）Ｋ１−２菌株又はそれらの変異株から選択される。前記各糸状菌は、いずれもキノコ廃菌床から得られた糸状菌であり、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株は、それぞれ、寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７５、ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７６として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託されている菌株である。
【００２３】
これら本実施形態に係る糸状菌及びそれらの変異株は、優れたセルロース分解能を有する。よって、本実施形態の糸状菌を用いてセルロースを分解することによって、セルロースを効率よく糖化し、セルロースを有用物質の生産のための原料として有効利用することができる。また、本実施形態の糸状菌は天然由来であるため、廃棄等についても環境にやさしいという利点がある。さらに、本実施形態の糸状菌は、廃棄物であるキノコ廃菌床由来であり、コスト的にも非常に安価にセルロースの分解による糖類の生産を行うことができる。従って、本実施形態の糸状菌を使用することによって、セルロースの糖化を、安全かつ効率的に、低コストで実施することが可能になる。
【００２４】
本実施形態の糸状菌は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β-グルコシターゼ等のセルロース分解酵素を産生するという特徴を備えている。
【００２５】
本実施形態の糸状菌のＩＴＳ領域の塩基配列は、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株については配列番号１、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株については配列番号２、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株については配列番号３に示す通りである。
【００２６】
本実施形態の各糸状菌は、それぞれ従来公知のトリコデルマ菌、アスペルギルス菌、ペニシリウム菌の場合と同様の培地及び培養条件で生育することができる。例えば、本実施形態におけるトリコデルマ菌は、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地上で、好気的条件下で培養温度２５〜３０℃、培養期間５〜１０日程度で良好に生育させることができる。
【００２７】
また、本実施形態におけるアスペルギルス菌もＰＤＡ培地上で、好気的条件下で培養温度２５〜３０℃、培養期間３〜７日程度で良好に生育させることができる。
【００２８】
さらに、本実施形態におけるペニシリウム菌についても、ＰＤＡ培地上で、好気的条件下で培養温度２５〜３０℃、培養期間７〜１２日程度で良好に生育させることができる。
【００２９】
なお、本実施形態の糸状菌を培養する培地としては、炭素源として滅菌処理されたキノコ廃菌床を含有している培地であることが好ましい。このように炭素源として廃棄物であるキノコ廃菌床を用いることにより、より安価にセルラーゼを生産することができる。
【００３０】
上記キノコ廃菌床を用いる場合は、細かく砕いたおが屑と、小麦ふすま等のキノコの栄養分とを混ぜ合わせ、さらに含水率を適宜調節した後滅菌したものを、袋やビンに詰めた培地（菌床）にきのこ菌糸を植付けて、所定の期間、袋栽培やビン栽培された商用キノコの子実体を収穫した後の、廃菌床であれば特に限定なく用いられる。きのこの種類も特に限定されず、具体的には、例えば、シイタケ、エノキタケ、マイタケ、ブナシメジ、エリンギ、エノキタケ、ヒラタケ等の廃菌床が適用可能である。なお、袋栽培やビン栽培されたキノコ廃菌床は、塊状で取り出されるために、培地調製時にはこれを崩して用いられる。
【００３１】
前記培地調製においては、はじめに、キノコ廃菌床をミキサー等を用いて細かく崩した後、乾燥機で乾燥させ、培養容器に収納した後、オートクレーブ滅菌する。オートクレーブ滅菌の条件としては、例えば、廃菌床の量に応じて温度１２１℃で、１５〜２０分間処理することが好ましい。
【００３２】
以下、本実施形態に係る糸状菌又はその変異株を含むキノコ廃菌床を、キノコ廃菌床培地とも称すことがある。
【００３３】
また、本実施形態に係る糸状菌には、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株の変異株も包含される。当該変異株は、例えば、前記糸状菌を公知の変異処理に供すること、又は本発明に係る糸状菌の経代培養による適応、自然変異等により作成され得る。
【００３４】
＜糸状菌の利用方法＞
本実施形態に係る上記糸状菌（トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株）又はその変異株を利用して、セルロースを糖化することができる。
【００３５】
（セルロース源）
本実施形態において、糖化対象となるセルロースとしては、例えば、針葉樹材、広葉樹材、非木材系セルロース等が挙げられる。具体的には、針葉樹材としては、スギ、エゾマツ、カラマツ、クロマツ、アカマツ、トドマツ、ヒメコマツ、モミ、サワラ、トガサワラ、アスナロ、ヒノキ、イチイ、イヌガヤ、トウヒ及びこれらの関連樹種等が例示される。また、広葉樹材としては、具体的には、クヌギ、コナラ、ミズナラ、アベマキ、アスベン、アメリカンブラックチェリー、イエローポプラ、ウォールナット、カバザクラ、ケヤキ、チーク、ハードメイプル、ヒッコリー、ピーカン、ホワイトアッシュ、及びこれらの関連樹種等が例示される。
【００３６】
更に、非木材系リグノセルロースとしては、具体的には、イネ、サトウキビ、ムギ、トウモロコシ、パイナップル等の農産物及びその廃棄物；新聞紙、チラシ、プリンター用紙、包装紙等の古紙；タケ、ササ等が例示される。
【００３７】
これらの原料セルロースの内、稲ワラ、プリンター用紙、包装紙等の古紙等が、本発明の糖化方法において好適な分解対象である。
【００３８】
糖化対象のセルロースの形状については、特に限定はされないが、例えば、粉末状、チップ状、角材状、丸太状、フレーク状、繊維状等の形状が挙げられる。効率的に前記糸状菌による糖化を行うという観点から、好ましくは粉末状、チップ状、フレーク状、繊維状のセルロースを用いる。
【００３９】
さらに前記セルロースは、必要に応じて、粉砕処理、マイクロ波照射、爆砕処理、蒸煮処理、放射線照射処理、高圧熱処理、化学処理（ソルボリシス処理、オゾン処理、アルカリ処理、酸処理、酸化剤処理、還元剤処理等）、菌処理、酸化酵素処理、及びこれらの複合処理等の各種前処理に供してもよい。なかでも好ましい前処理としては低濃度のアルカリ処理、高圧熱処理やこれらの併用処理等が挙げられる。
【００４０】
このようにセルロースを前処理することにより、リグニンやヘミセルロースが分解され、セルロースが酵素の作用を受け易い構造に変換されるため、後述のセルロース糖化がより効率よく行われる。
【００４１】
より具体的には、例えば、アルカリ処理は、セルロースを低濃度の水酸化ナトリウムのようなアルカリ溶液に浸漬することである。アルカリ溶液の濃度としては、例えば、１〜１０質量％、好ましくは、１〜５質量％程度が挙げられる。低濃度アルカリにより前処理を行った後は、同程度の濃度の酸性溶液（例えば、塩酸など）を用いて中和し、水で洗浄してから後述の糖化処理を行うことができる。
【００４２】
また、高圧熱処理とは、例えば、高圧滅菌器等を用いて、１２１℃、１．２気圧の条件で、１０〜２０分間程度、高圧熱にさらす処理をいう。
【００４３】
（セルロース糖化方法）
本実施形態におけるセルロース糖化方法は、上記糸状菌、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７４）、アスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７５）、ペニシリウム・コミューン  Ｋ１−２菌株（ＮＩＴＥ  Ｐ−１１７６）又はその変異株から選択される少なくとも１種を、セルロースの存在下で高温処理する工程を含む。
【００４４】
より好ましくは、上記糸状菌又はその変異株から選択される２種を組み合わせて用いると、さらに効率よくセルロースを糖化することができる。組み合わせる２種の糸状菌は、どのような組み合わせでもよいが、なかでも、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株とアスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株とを組み合わせると、より優れた糖化率を得ることができる。
【００４５】
本実施形態において、セルロースの糖化のための糸状菌の高温処理工程は、セルロースを添加した培地で行うのが好ましい。セルロースを添加する培地は液体でも固体でもよく、選択する糸状菌によって適宜決定することができるが、例えば、マンデルス培地等の最少培地、キノコ廃菌床及びそれらの組み合わせ等を使用することができる。好ましくは、本実施形態に係る糸状菌はキノコ廃菌床由来であり、糸状菌培養に用いるキノコ廃菌床をそのまま使用できるという観点から、マンデルス液体培地を添加したキノコ廃菌床培地を使用できる。
【００４６】
さらに、上記糸状菌又はその変異株によって生産されるセルラーゼが効率的に作用する環境にするために、通常、セルロース源以外に、上記培地にｐＨを調整した緩衝液溶液を添加することが望ましい。
【００４７】
糖化反応におけるセルラーゼの酵素活性を高める点から、緩衝液溶液のｐＨは４〜５程度に調製されていることが好ましい。このようなｐＨを維持するために、例えば、０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）等を用いることが好ましい。また、緩衝液溶液には、セルラーゼの酵素活性を高める点から、Ｔｗｅｅｎ  ２０，Ｔｗｅｅｎ  ４０，Ｔｗｅｅｎ  ６０，又はＴｗｅｅｎ  ８０のような非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。これらの中では、Ｔｗｅｅｎ  ８０が特に好ましい。
【００４８】
また、前記培地には、必要に応じて、糸状菌の生育に必要とされる窒素源及びビタミン、無機塩類などの栄養素となる栄養塩類等をさらに添加してもよい。
【００４９】
窒素源及び栄養塩類は特に限定されず、セルラーゼ生産菌の培地として従来から用いられているものが用いられうる。その中でも、例えば、ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・テクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第５４巻、第４号、第２６〜２８ページ、１９７６年に記載されたマンデルス培地またはそれを基礎として改良した培地が、培養効率に優れている点から特に好ましい。
【００５０】
マンデルス培地の具体例としては、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２．０ｇ、尿素（Ｕｒｅａ）０．３ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．３ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００５ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００１６ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１４ｇ、及び、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．００２ｇ、を蒸留水１０００ｍＬに溶解することにより得られる、ｐＨ５．５〜６．５のマンデルス培地が挙げられる。また、必要に応じて、ペプトン等を添加して栄養を補ってもよい。
【００５１】
このように調製した培地は、上記糸状菌又はその変異株の植菌に先だって、加熱殺菌（オートクレーブ）等の殺菌処理に供して、雑菌の繁殖を防止しておくことが望ましい。
【００５２】
セルロースに上記糸状菌又はその変異株を植菌する方法は、特に制限されず、通常の植菌方法に従って行うことができる。例えば、セルロースが粉末状又はチップ状の場合であれば、これらのセルロースの表面に種菌を降りかける方法や、これらのセルロースと種菌を混合する方法が例示できる。また、例えば、セルロースが角材状や丸太状の場合であれば、セルロースに適宜穴を開けて、その穴に種菌を詰める方法等が例示される。
【００５３】
植菌に使用する種菌としては、例えば液体種菌、穀粒種菌、おがくず種菌、寒天種菌などを使用することができる。
【００５４】
あるいは、上記種菌方法以外にも、糸状菌培養に用いた上記キノコ廃菌床培地をそのままセルロース糖化に用いることもできる。そうすることにより、より安価・簡便にかつ効率よくセルロースの糖化を行うことができる。
【００５５】
なお、この場合は、糸状菌を含むキノコ廃菌床培地に、栄養素等を含む培地（例えば、マンデルス液体培地）を添加し、培養を行う。
【００５６】
このようにキノコ廃菌床に栄養素を含む培地（例えば、マンデルス液体培地）を添加する場合には、キノコ廃菌床の乾燥重量５ｇに対して、マンデルス液体培地を１０〜１５ｇ程度添加することが好ましい。
【００５７】
セルロース糖化の為の糖化条件は特に限定されず、糸状菌や培地の種類に応じて適宜設定できるが、例えば、通常４０〜５０℃、好ましくは５０℃の温度条件下で、相対湿度を９５％以上に保持して好気的に行われる。
【００５８】
また、糖化時間は、使用するセルロースの種類や糖化条件等によって異なるが、通常２４〜７２時間、好ましくは４８〜７２時間、さらに好ましくは７２時間程度が例示される。
【００５９】
なお、２種の糸状菌を用いて糖化を行う場合は、一方の糸状菌を用いて糖化を行った後に、他方の糸状菌を用いて糖化を行ってもよいし（二段階糖化）、あるいは、２種の糸状菌を同時に用いて糖化を行ってもよい（同時糖化）。
【００６０】
二段階糖化の場合、菌株の糖化の順序や組み合わせは特に限定されないが、例えば、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株とアスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株とをこの順序で糖化することができる。それぞれの菌株の糖化時間は、４８〜７２時間程度であり、糖化条件は菌株１種を糖化する時と同様の条件で行うことができる。
【００６１】
また、同時糖化の場合も特に菌株の組み合わせは限定されないが、例えば、トリコデルマ・ロンギブラキアタム  ＫＦＡ−２菌株とアスペルギルス・ニガー  ＫＴ−１０菌株とを組み合わせて同時に糖化することができる。同時糖化は、糖化のための糖化時間を、二段階糖化の糖化時間の約半分に短縮できるという利点がある。具体的には、２４〜４８時間程度の糖化時間で糖化することができる。
【００６２】
上記で述べた糖化処理をすることにより、セルロースが低分子化されて単糖（グルコース）又はオリゴ糖が生成する。
【００６３】
この低分子化された糖については、炭素源として各種の発酵処理に供することにより、各種発酵産物を得ることができる。
【００６４】
ここで、発酵処理としては、有用物質を含む発酵産物が得られる発酵処理であることが望ましく、例えば、エタノール発酵、メタン発酵、水素発酵等の発酵処理が好適に例示される。これらの発酵処理に使用される微生物や発酵処理条件は公知のものを適宜使用できる。
【００６５】
また、当該発酵処理は、上記糖化処理の後に実施してもよく、また上記糖化処理と同時に実施してもよい。後者の発酵処理と糖化処理を同時に実施する方法については、例えば、糖化処理に要する酵素と、発酵処理に要する微生物を共存させて、該酵素と微生物の双方が有効に作用若しくは生育できる条件に設定してインキュベートすることにより実施される。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１）糸状菌株のスクリーニングと選択菌株のセルロースの糖化能力
日本国内のキノコ栽培現場から入手したキノコ廃菌床に生育した糸状菌（高セルロース分解活性を有する菌株）を候補菌株として、まず第１次スクリーニングを行って、セルロース分解作用が比較的強い８菌株を選択した。
【００６８】
なお、選択された８菌株にセルロース糖化作用があることの確認は、以下のようにして行った。
【００６９】
結晶セルロース粉末を炭素源とするマンデルス液体培地１００ｍｌを２００ｍｌの三角フラスコに入れ、オートクレーブ滅菌した。ＰＤＡ培地に培養した菌株から直径６ｍｍの培養菌糸片を抜き取って液体培地に接種し、２８℃、暗所の条件下で６日間１６０ｒｐｍで振とう培養した。培養液を採取し、１０，０００ ｒｐｍで５分間遠沈後、上清を凍結保存した。その後、培養液のＦＰＵ活性（濾紙分解酵素活性）、カルボキシメチルセルラーゼ活性（ＣＭＣａｓｅ活性）、β‐グルコシダーゼ活性の各種酵素活性を求めた。
【００７０】
次に、１次選抜した８菌株と、比較菌株としてトリコデルマ・リーゼイＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ２６９２１）とを、マンデルス液体培地（ｐＨ６．０、ペプトン１０ｇ／Ｌ添加）を１２ｍＬ加えたマイタケ廃菌床培地において７日間培養した。次に、濾紙５ｇとｐＨ４．８のクエン酸緩衝液溶液を１００ｍＬ加え、５０℃の温度条件で７２時間糖化処理を行った。
【００７１】
なお、トリコデルマ・リーゼイＱＭ９４１４は米軍キャンプの木綿製テントから分離培養された野生菌株トリコデルマ・リーゼイＱＭ６ａに対し、ＵＳ  Ａｒｍｙ  Ｎａｔｉｃｋ研究所において、変異処理が施され、セルラーゼ生産能が上昇したものである。本菌株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。
【００７２】
このようにグルコース濃度により各菌株の糖化能力を評価して、各糸状菌サンプルの中で、高い糖化率を示す糸状菌株として、ＫＦＡ−２菌株、ＫＴ−１０菌株、及びＫ１−２菌株を選択した。図１には、各選択菌株とのトリコデルマ・リーゼイＱＭ９４１４菌株のグルコース濃度を評価した結果を示す。
【００７３】
グルコース濃度は、７２時間の糖化処理後にろ液のグルコース濃度をグルコースCIIテストワコー（和光純薬）を用いて測定した。グルコース濃度が高いほど糖化が進んでいることを示す。なお、このグルコース濃度の測定方法は、以下の糖化試験においても同様に行っている。
【００７４】
なお、選択された３つの菌株は、ＤＮＡ解析により、ＫＦＡ−２菌株はトリコデルマ・ロンギブラキアタム、ＫＴ−１０菌株はアスペルギルス・ニガー、Ｋ１−２菌株はペニシリウム・コミューンであると同定された。具体的には、糸状菌のＩＴＳ領域（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ領域）と呼ばれる特異性の高い領域の塩基配列を比較することで同定を行った。
【００７５】
（実施例２）セルロース前処理の検討
（１）ＮａＯＨ溶液による前処理を行った稲ワラ、プリンター用紙を用いた糖化試験
１％、５％のＮａＯＨ水溶液を作製し、そこへ稲ワラとシュレッダー処理したプリンター用紙（それぞれ３ｇ）を１時間浸漬した。その後、１％、５％のＨＣｌ溶液に１時間浸漬して中和し、水洗した。
【００７６】
次に、手でほぐしたマイタケ廃菌床（乾燥重量５ｇ）にマンデルス液体培地（１２ｍＬ）を加えてオートクレーブ滅菌処理した培地に、あらかじめＰＤＡ平板培地で培養したＫＦＡ−２菌株を直径６ｍｍの円盤状に切り取って接種し、２８℃で７日間培養を行った後、上記において前処理した稲ワラとプリンター用紙をそれぞれ加えて、さらにｐＨ４．８のクエン酸緩衝溶液を１００ｍｌ加え、糖化処理を７２時間実施した。
【００７７】
その結果を図２に示す。図２より明らかなように、稲ワラでは、１％のＮａＯＨ水溶液よりも５％のＮａＯＨ水溶液で処理した場合に、グルコース濃度がより高まる傾向が認められた。一方、プリンター用紙では、前処理に用いたＮａＯＨ水溶液の濃度によって、得られるグルコース濃度には大きな変化が無かった。したがって、１％という低濃度のＮａＯＨ水溶液でも充分な前処理効果を有することが認められた。
【００７８】
（２）５％ＮａＯＨ溶液と高圧滅菌器による前処理を行った稲ワラ、古紙、プリンター用紙を用いた糖化試験
５％のＮａＯＨ水溶液を作製し、そこへ稲ワラ、シュレッダー処理したプリンター用紙と古紙（それぞれ５ｇ）を浸漬して、１２１℃、１．２気圧の条件で２０分間高圧熱処理を行った。その後、５％のＨＣｌ溶液に１時間浸漬して中和した後に水洗した。
【００７９】
次に、手でほぐしたマイタケ廃菌床（乾燥重量５ｇ）にマンデルス液体培地（１２ｍＬ）を加えてオートクレーブ滅菌処理した培地を用いて２８℃で７日間培養したＫＦＡ−２菌株に、前処理した稲ワラ、古紙、プリンター用紙をそれぞれ加えて、さらにＱＭ９４１４菌株には５ｇの濾紙を加えて、最後にｐＨ４．８のクエン酸緩衝溶液を１００ｍｌ加え、５０℃の温度条件下で振とう器を用いて１５０ｒｐｍの回転数で撹拌しながら糖化処理を７２時間行った。
【００８０】
その結果、プリンター用紙をセルロース資材とした場合には、ＫＦＡ−２菌株でＱＭ９４１４菌株と同等のグルコース濃度が得られることが示された（図３）。
【００８１】
（実施例３）ＫＦＡ−２菌株にＫＴ−１０菌株を組み合わせた糖化処理
ＫＦＡ−２菌株、ＫＴ−１０菌株およびＱＭ９４１４菌株を、マンデルス液体培地（ｐＨ６．０（ＫＦＡ−２菌株のみｐＨ６．０とｐＨ７．０の両方）、ペプトン１０ｇ／Ｌ添加）を１２ｍＬ加えたマイタケ廃菌床培地において７日間、２８℃で培養した。
【００８２】
次に、２種類のｐＨ条件で培養したＫＦＡ−２菌株（ｐＨ６．０および７．０）に濾紙３ｇ（ＱＭ９４１４菌株には５ｇ）とｐＨ４．８のクエン酸緩衝液を１００ｍＬ加えて、５０℃の温度条件で７２時間の糖化処理を行った。その後、ＫＦＡ−２菌株を用いた糖化処理溶液に、あらかじめ廃菌床培地で培養しておいたＫＴ−１０菌株に、濾紙３ｇを加えたものを投入して、再度同条件で糖化処理を行った。
【００８３】
その結果、ＱＭ９４１４菌株と同等か、あるいはそれ以上のグルコース濃度を得ることができた（図４）。
【００８４】
（実施例４）スケールアップした糖化試験（二段階糖化）
ＫＦＡ−２菌株、ＫＴ−１０菌株、Ｋ１−２菌株のうち２種を組み合わせた二段階糖化において、試験容量を１Ｌにスケールアップして培養・糖化試験を実施した。糖化処理温度については、いずれも５０℃で実施した。
【００８５】
各試験において、マイタケ廃菌床培地で培養したそれぞれの菌株にセルロース資材（濾紙）と緩衝液（ｐＨ４．８のクエン酸緩衝液）を５００ｍＬ加えて５０℃の温度条件下で実施する糖化試験については、２段階の糖化処理を行った。
【００８６】
二段階糖化では、１種類目の菌株を用いた、糖化処理期間は３日間（７２時間）とし、その後、グルコース濃度を確認した後、２種類目の菌株を投入して２回目の糖化処理（７２時間）を行った。
【００８７】
各菌株の試験条件については表１に、各菌株の廃菌床培地における培養日数については表２にまとめた。
【００８８】
【表１】
2013223453.tif 000003
【００８９】
【表２】
2013223453.tif 000004
１種目の糖化処理の結果を図５に、２種目の糖化処理の結果を図６に示す。
【００９０】
図より明らかなように、フラスコスケールの５倍にスケールアップした糖化試験において、２種の菌株を用いれば高いグルコース濃度が得られることがわかった。特に、ＫＦＡ−２菌株とＫＴ−１０菌株との組み合わせると、約２倍にグルコース濃度が上昇することがわかった。
【００９１】
（実施例５）同時糖化と二段階糖化の比較
供試するセルロース素材としては、５％ＮａＯＨ溶液による弱アルカリ処理と高圧滅菌器による高温高圧処理を行ったシュレッダーされたプリンター用紙と稲ワラを用いた。
【００９２】
供試する菌類としては、ＫＦＡ−２菌株とＫＴ−１０菌株を用いた。なお、試験容量は、１Ｌにスケールアップして培養・糖化試験を実施した。
【００９３】
マイタケ廃菌床培地で培養した菌株に前処理したセルロース素材と緩衝液（ｐＨ４．８のクエン酸緩衝液）を５００ｍＬ加えて５０℃の温度条件下で実施する糖化試験については、同時糖化処理のため７２時間の処理時間とした。二段階糖化については、実施例４と同様に行った。それぞれの試験条件については、表３にまとめた。
【００９４】
【表３】
2013223453.tif 000005
なお、セルロース素材の前処理方法については、５％ＮａＯＨ溶液に浸漬した状態で、１２１℃・１．２気圧の高温高圧処理を２０分間行い、その後、５％ＨＣｌ溶液に浸漬して中和処理を行い、流水で洗浄することにより行った。
【００９５】
同時糖化の結果を図７に、同時糖化と二段階糖化の比較を図８に示す。
【００９６】
その結果、図７および図８に示すように、ＫＦＡ−２菌株とＫＴ−１０菌株を用いて前処理されたプリンター用紙を同時糖化処理した場合において、最も高いグルコース濃度が検出された。また、稲ワラにおいても同時糖化処理を行うことで、高いグルコース濃度が検出された。同時糖化処理の場合には、糖化時間を７２時間に短縮できるため、二段階糖化の糖化処理（トータル１４４時間）に比べて、メリットが認められる。
【００９７】
（実施例６）同時糖化における培養時間の検討
供試菌株としては、同時糖化試験−１と同様にＫＦＡ−２菌株、Ｔ−１菌株、ＫＴ−１０菌株を用いた。また、対照としては、ＱＭ９４１４菌株を用いた。これらの菌株をマイタケ廃菌床培地で２８℃、７日間培養し、セルラーゼを誘導した廃菌床を作製した。
【００９８】
最後に、得られた廃菌床を１つの容器にまとめ、クエン酸緩衝液１００ｍＬと濾紙５ｇを加えて、５０℃の条件下で糖化処理を３日間（７２時間）の同時糖化処理を行った。糖化溶液のサンプリングは、２４時間毎に行い、１ｍＬのサンプルを採取した。
【００９９】
結果を図９に示す。図９より明らかなように、ＫＦＡ−２菌株とＫＴ−１０菌株を用いた同時糖化処理では、ＫＦＡ−２菌株による単独の糖化処理よりもグルコース濃度が増加することが確認された。また、その値は、ＱＭ９４１４菌株によるグルコース濃度（２．７％）よりも僅かに低い２．５％に糖化処理４８時間後にまで達した。
【０１００】
したがって、同時糖化処理を行うことで、４８時間後には、ＱＭ９４１４菌株によるグルコース濃度（２．７％）とほぼ同等のグルコース濃度が得られることが示された。
【０１０１】
（考察）
以上の試験により、本発明に係る新規菌株は人為的に改変された菌株（ＱＭ９４１４菌株）にも劣らぬ糖化処理能力を有する有益な菌株であることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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