(57)【要約】【課題】  骨粗鬆症などの骨、関節又は歯異常症の治療に有効な物質を取得する手段を提供する。【解決手段】  PHB1、PHB2、ERα、Runx2、VDAC1、カプサイシン、プロスタグランジンJ2を利用した骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法、並びにカプサイシン、VDAC1遺伝子を発現するベクター、又はプロスタグランジンJ2を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療薬及びサプリメント。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質を骨芽細胞と共存させ、骨芽細胞中のPHB2を核内へ移行させる被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
被験物質をPHB2と接触させ、PHB2と結合する被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
被験物質をプロスタグランジンJ2の結合したVDAC1と接触させ、プロスタグランジンJ2とVDAC1を解離させる被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
カプサイシンを有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
【請求項５】
カプサイシンを有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療用サプリメント。
【請求項６】
VDAC1遺伝子を発現するベクターを有効成分して含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
【請求項７】
プロスタグランジンJ2を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
【請求項８】
プロスタグランジンJ2を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療用サプリメント。
【請求項９】
PHB1をコードする遺伝子、PHB2をコードする遺伝子、ERαをコードする遺伝子、Runx2をコードする遺伝子、及びOG2プロモーター下のレポーター遺伝子を細胞に導入し、前記４種類のタンパク質とレポータータンパク質を発現する細胞を作製し、この細胞を被験物質の存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現量を増大させた被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
被験物質を、ERα及びRunx2と共存させ、ERαとRunx2の結合性を評価し、この結合性を強化する被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
被験物質を、PHB2及びRunx2と共存させ、PHB2とRunx2の結合性を評価し、この結合性を強化する被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１乃至３、及び９乃至１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
【請求項１３】
請求項１乃至３、及び９乃至１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療用サプリメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法、並びに骨、関節又は歯異常症の治療薬及びサプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
寝たきり老人の原因の一つは骨粗鬆症である。骨は骨芽細胞により作られるため、骨芽細胞分化制御因子は、新たな骨粗鬆症治療薬の開発のために重要である。
【０００３】
最近、PHB2（prohibitin 2）とVDAC1（voltage dependent anionic channel 1）という二つのタンパク質について新たな知見が報告されている。即ち、PHB2は、通常、ミトコンドリア内膜に存在するが、カプサイシンと結合することにより、核内へ移動することが報告され（非特許文献１）、VDAC1は、プロスタグランジンJ2ファミリーの一つである15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジンJ2と結合することが報告されている（非特許文献２）。しかし、PHB2やVDAC1が骨芽細胞分化制御因子であるという報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】C. Kuramori et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 379 (2009) 519-525
【非特許文献２】N. Maekawa et al., Biomedical Chromatography 25 (2011) 466-471
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、骨粗鬆症などの骨、関節又は歯異常症の治療に有効な物質を取得する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、上述したPHB2やVDAC1が骨芽細胞分化制御因子であることを見出し、更に、PHB2は、PHB1及びERα（エストロジェン受容体α）と共に、OG2の転写因子であるRunx2と結合し、この四者の複合体がOG2の転写活性を増大させることを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１３）を提供するものである。
（１）被験物質を骨芽細胞と共存させ、骨芽細胞中のPHB2を核内へ移行させる被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
（２）被験物質をPHB2と接触させ、PHB2と結合する被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
（３）被験物質をプロスタグランジンJ2の結合したVDAC1と接触させ、プロスタグランジンJ2とVDAC1を解離させる被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
（４）カプサイシンを有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
（５）カプサイシンを有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療用サプリメント。
（６）VDAC1遺伝子を発現するベクターを有効成分して含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
（７）プロスタグランジンJ2を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
（８）プロスタグランジンJ2を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療用サプリメント。
（９）PHB1をコードする遺伝子、PHB2をコードする遺伝子、ERαをコードする遺伝子、Runx2をコードする遺伝子、及びOG2プロモーター下のレポーター遺伝子を細胞に導入し、前記４種類のタンパク質とレポータータンパク質を発現する細胞を作製し、この細胞を被験物質の存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現量を増大させた被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
（１０）被験物質を、ERα及びRunx2と共存させ、ERαとRunx2の結合性を評価し、この結合性を強化する被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
（１１）被験物質を、PHB2及びRunx2と共存させ、PHB2とRunx2の結合性を評価し、この結合性を強化する被験物質を選択することを特徴とする骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法。
（１２）（１）乃至（３）、及び（９）乃至（１１）のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られた物質を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療薬。
（１３）（１）乃至（３）、及び（９）乃至（１１）のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得られた物質を有効成分として含有することを特徴とする骨、関節又は歯異常症治療用サプリメント。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のスクリーニング方法は、新たに見出された骨芽細胞分化制御因子であるPHB2やVDAC1を利用するものなので、この方法から得られる骨、関節又は歯異常症の治療に有効な物質は、従来の有効物質とは異なる作用機序で治療効果を発揮すると考えられる。また、本発明の骨、関節又は歯異常症治療薬及びサプリメントも、PHB2やVDAC1を利用するものなので、従来の治療薬等とは異なる作用機序で治療効果を発揮すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】骨芽細胞内でのPHB2とVDAC1の作用を模式的に表した図。
【図２】（左上）骨芽細胞株MC3T3-E1へOG2-luciferase vectorを導入し、更にVDAC1 KD vectorを導入した（レーン3,4）。また、10μM プロスタグランジンJ2(PGJ2)を加えた（レーン2,4）。（中央上）骨芽細胞特異的VDAC1強制発現マウスの病理所見。HE染色（1,2）およびマイクロCT所見（3,4）。（右上）同マウスの新生児頭蓋骨由来の骨芽細胞初代培養におけるALP活性。（左下）同マウス由来骨芽細胞(0/0, tg/0, tg/0+10μM PGJ2)におけるPHB2核内移行細胞の割合。（中央下）同マウス由来骨芽細胞(0/0, tg/0, tg/0+10μM PGJ2)におけるOG2転写活性。（左下）同マウス由来骨芽細胞(0/0, tg/0, tg/0+PHB2ノックダウン)におけるOG2転写活性。
【図３】（左上）骨芽細胞株MC3T3-E1へ(1, 10, 100, 1000 μM)カプサイシンを加え、PHB1及びPHB2の核内移行を調べた。（中央上）骨芽細胞株MC3T3-E1へ(0.1, 1, 10, 100 μM)カプサイシンを加え、ALP活性を調べた。（右上）骨芽細胞株MC3T3-E1へ(10, 100, 1000μM)カプサイシンを加え、更に(0, 7, 20, 60 ng)PHB2発現ベクターを加えOG2転写活性を調べた。（左下）骨芽細胞株MC3T3-E1へ1000 μMカプサイシンを加え、更に(3, 10, 30 μM)PGJ2を加えてPHB1の核内移行を調べた。（中央下）芽細胞株MC3T3-E1へ100 μMカプサイシンを加え、更に(3, 10, 30 μM)PGJ2を加えてALP活性を調べた。（左下）芽細胞株MC3T3-E1へ1000 μMカプサイシンを加え、更に(3, 10, 30 μM)PGJ2を加えてOG2転写活性を調べた。
【図４】PHB1-PHB2-ERα-Runx2複合体に関する実験の結果を示す図。
【図５】PGJ2とOSE2との関係を調べる実験の結果を示す図。図中のP1はPGJ2投与、VeはPGJ2非投与をそれぞれ示し、OG2はOG2野生型プロモーター、ΔOSE2はOSE2欠損OG2プロモーターをそれぞれ示す。
【図６】VDAC1とOSE2との関係を調べる実験の結果を示す図。図中のOG2はOG2野生型プロモーター、ΔOSE2はOSE2欠損OG2プロモーターをそれぞれ示し、0/0は野生型初代培養骨芽細胞、tg/0は骨芽細胞特異的VDAC1強制発現初代培養骨芽細胞をそれぞれ示す。
【図７】カプサイシン（Cap）とRunx2とOSE2との関係を調べる実験の結果を示す図。図中のOG2はOG2野生型プロモーター、ΔOSE2はOSE2欠損OG2プロモーター、OG2+sh0.3は0.3ng/well Runx2ノックダウンベクター添加OG2野生型プロモーターをそれぞれ示す。
【図８】エストロジェン（E2）とOSE2との関係を調べる実験の結果を示す図。グラフの横軸はE2の濃度（M）を示す。VはE2無添加を示す。
【図９】E2とRunx2との関係を調べる実験の結果を示す図。グラフの横軸はE2の濃度（M）とRunx2ノックダウンベクターの添加量（ng/well）を示す。VはE2無添加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
最初に、PHB1、PHB2、ERα、Runx2、及びVDAC1の５種類のタンパク質と、骨芽細胞分化のマーカーであるOG2との関係を、図１を用いて説明する。
【００１２】
通常、PHB2は核内に存在するが（図１上）、PJ（プロスタグランジンJ2）と結合していないVDAC1の働きにより、核内へ移行する（図１中）。核内へ移行したPHB2は、PHB1とERαと共に、OG2の転写因子であるRunx2と結合し、PHB1-PHB2-ERα-Runx2複合体を形成し、OG2の転写活性を増大させる（図１中）。この複合体には、Cp（カプサイシン）、K2（ビタミンK2）、E2も結合する。一方、PJは、VDAC1に結合し、PJが結合したVDAC1は、PHB2の核内移行を阻害し、PHB1-PHB2-ERα-Runx2複合体形成を妨げ、OG2の転写活性を減少させる（図１下）。
【００１３】
以上のようなPHB1、PHB2、ERα、Runx2、VDAC1、カプサイシン、プロスタグランジンJ2の性質から、以下の（１）〜（４）の発明が提供される。
（１）骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニング方法
PHB2とVDAC1は生体内で骨芽細胞分化制御因子として働く。従って、これら二つのタンパク質を利用して、新たな骨、関節又は歯異常症の治療物質をスクリーニングすることが可能である。具体的には、以下の（１−１）〜（１−３）のスクリーニング方法が考えられる。
【００１４】
また、OG2の転写活性は、PHB1-PHB2-ERα-Runx2複合体の形成によって増大する。従って、この複合体を利用して、新たな骨、関節又は歯異常症の治療物質をスクリーニングすることも可能である。具体的には、以下の（１−４）及び（１−５）のスクリーニング方法が考えられる。
【００１５】
ここで、骨、関節又は歯異常症としては、例えば、骨粗鬆症、骨折、変形性関節症、永久歯の発達異常、鎖骨頭蓋骨異形成症などを挙げることができる。このスクリーニング方法において好適な骨、関節又は歯異常症としては、骨粗鬆症を挙げることができる。
（１−１）PHB2の核内移行性を利用したスクリーニング方法
PHB2の核内移行性の変化は、ALP活性の変化やOG2転写活性の変化と一致する（例えば、図２左下と図２中央下、図３左上と図３中央上、図３左下と図３中央下及び右下）。従って、PHB2の核内移行性を指標として、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。具体的には、被験物質を骨芽細胞と共存させ、骨芽細胞中のPHB2を核内へ移行させる被験物質を選択することで、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。
【００１６】
ここで、骨芽細胞としては、例えば、MC3T3-E1、ROS、マウス新生児頭蓋骨初代培養などを使用することができる。
【００１７】
PHB2が核内へ移行したがどうか確認する方法としては、例えば、C. Kuramori et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 379 (2009) 519-525記載の方法などを挙げることができる。Kuramori et alの方法では、抗PHB2抗体、ミトコンドリアマーカー（Mito Tracker）、核マーカー(DAPI)で三重染色を行っている。これにより、PHB2、ミトコンドリア、及び核が可視化され、PHB2が核内へ移行したがどうか確認することができるようになる。
【００１８】
被験物質を骨芽細胞と共存させる方法は、例えば、骨芽細胞を培養している培地中に被験物質を添加する方法などを挙げることができる。
【００１９】
被験物質はどのようなものでもよいが、カプサイシンはPHB2を核内へ移行させ、また、骨、関節又は歯異常症治療作用を持つと考えられる。従って、カプサイシンと類似した化学構造を持つ物質はカプサイシンと同様の作用を持つ可能性が高いので、そのような物質を被験物質とするのが好ましい。
（１−２）PHB2への結合性を利用したスクリーニング方法
カプサイシンはPHB2と結合することで骨芽細胞の分化を促進するので（図３）、カプサイシンと同様にPHB2と結合する物質は骨、関節又は歯異常症の治療物質の候補となる。従って、PHB2への結合性を指標として、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。具体的には、被験物質をPHB2と接触させ、PHB2と結合する被験物質を選択することで、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。
【００２０】
このスクリーニング方法は、例えば、ビーズなどの担体にカプサイシンを固定し、このカプサイシンにPHB2単独又はPHB2とPHB1複合体を結合させ、これに被験物質を接触させることにより、行うことができる。この際、被験物質がPHB2と結合するものであれば、PHB2はカプサイシンから遊離し、被験物質がPHB2と結合しないものであれば、PHB2はカプサイシンと結合したままである。また、遊離するPHB2の量を測定することにより、被験物質のPHB2に対する結合の強さも評価できる。このような方法以外にも、例えば、放射線標識した化合物との結合、遺伝子組換えタンパク質との結合、トリプシン部分消化法等によっても骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングは可能である。
【００２１】
被験物質は特に限定されないが、上記（１−１）の方法と同様に、カプサイシンと類似した化学構造を持つ物質が好ましい。
（１−３）VDAC1とプロスタグランジンJ2の結合阻害性を利用したスクリーニング方法
プロスタグランジンJ2と結合していないVDAC1は骨芽細胞の分化を促進する一方、プロスタグランジンJ2と結合したVDAC1は骨芽細胞の分化を抑制する（図２）。従って、プロスタグランジンJ2とVDAC1の結合を阻害する物質は、骨、関節又は歯異常症の治療物質の候補となる。よって、プロスタグランジンJ2とVDAC1の結合阻害性を指標として、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。具体的には、被験物質をプロスタグランジンJ2の結合したVDAC1と接触させ、プロスタグランジンJ2とVDAC1を解離させる被験物質を選択することで、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。
【００２２】
この方法は、例えば、ビーズなどの担体に、プルスタグランジンJ2の結合したVDAC1を固定し、これに被験物質を接触させ、遊離してくるプロスタグランジンJ2を検出することにより、行うことができる。この際、プロスタグランジンJ2が検出されれば、その被験物質は骨、関節又は歯異常症の治療物質の候補となり、プロスタグランジンJ2が検出されなければ、その被験物質は骨、関節又は歯異常症の治療物質の候補から除外される。
（１−４）人為的にPHB1-PHB2-ERα-Runx2複合体を形成できるようにした細胞を利用したスクリーニング方法
PHB1-PHB2-ERα-Runx2複合体が、OG2プロモーターのOSE2サイトに結合することにより、OG2の転写活性が増大する（図４〜９）。従って、元々PHB1、PHB2、ERα、Runx2を発現していない細胞に、これらのタンパク質をコードする遺伝子とOG2プロモーター下のレポーター遺伝子を導入し、発現させた細胞を利用して、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。具体的には、PHB1をコードする遺伝子、PHB2をコードする遺伝子、ERαをコードする遺伝子、Runx2をコードする遺伝子、及びOG2プロモーター下のレポーター遺伝子を細胞に導入し、前記４種類のタンパク質とレポータータンパク質を発現する細胞を作製し、この細胞を被験物質の存在下で培養し、レポーター遺伝子の発現量を増大させた被験物質を選択することで、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。
【００２３】
PHB1、PHB2、ERα、Runx2は公知のタンパク質であり、これらの遺伝子を細胞に導入して発現させる方法も当業者によく知られている。
【００２４】
レポーター遺伝子は、スクリーニング方法などに一般的に使用されるものでよく、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、βギャル遺伝子などを使用することができる。
（１−５）ERα-Runx2間又はPHB2-Runx2間の結合性を利用したスクリーニング方法
OG2の転写活性の増大には、PHB1-PHB2-ERα-Runx2複合体の形成が重要な役割を果たしている（図４〜９）。従って、この複合体を構成する各タンパク質間の結合、例えば、ERα-Runx2間の結合やPHB2-Runx2間の結合を強める物質は、骨、関節又は歯異常症の治療物質の候補となる。よって、ERα-Runx2間やPHB2-Runx2間の結合増強性を指標として、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。具体的には、被験物質を、ERα若しくはPHB2、及びRunx2と共存させ、ERα若しくはPHB2とRunx2の結合性を評価し、この結合性を強化する被験物質を選択することで、骨、関節又は歯異常症の治療物質のスクリーニングが可能である。
【００２５】
結合性の評価は、例えば、上記（１−２）又は（１−３）に記載されている方法と同様の方法で行うことができる。
（２）カプサイシンを利用した骨、関節又は歯異常症治療薬及びサプリメント
カプサイシンは骨芽細胞の分化を促進する作用を持つので（図３）、骨、関節又は歯異常症治療薬及びサプリメントとして利用することができる。この治療薬及びサプリメントにおいて好適な骨、関節又は歯異常症としては、骨粗鬆症を挙げることができる。
【００２６】
カプサイシンを骨、関節又は歯異常症の治療薬等として使用する場合、カプサイシンは公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化することができる。剤型は特に限定されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤などとすることができる。投与方法も特に限定されず、経口的又は非経口的（局所、直腸、静脈投与）に投与することができる。投与量は、投与対象、投与方法、疾患の種類などにより異なるが、例えば、成人に対して、経口的に投与する場合、１回当たり、カプサイシンの量が0.2〜2 gとなるように１日１〜数回に分けて投与することができる。
【００２７】
カプサイシンを利用した骨、関節又は歯異常症治療薬等は、ヒトに用いるものであるが、ヒト以外の動物に投与し、その動物の骨芽細胞の分化を促進させてもよい。対象となる動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サルなどを挙げることができる。
（３）VDAC1を利用した骨、関節又は歯異常症治療薬
VDAC1遺伝子を導入したマウスでは、骨芽細胞の分化が促進されている（図２）。従って、VDAC1遺伝子を発現するベクターは、骨、関節又は歯異常症治療薬として利用することができる。この治療薬において好適な骨、関節又は歯異常症としては、骨粗鬆症、骨折、鎖骨頭蓋骨異所形成症、変形性関節症等を挙げることができる。
【００２８】
VDAC1は既知のタンパク質であり、それをコードする遺伝子（VDAC1遺伝子）の塩基配列もNCBIやGenBankなどのデータベース上に公開されている。例えば、マウス由来のVDAC1遺伝子及びヒト由来のVDAC1遺伝子の塩基配列は、それぞれアクセッション番号NM_011694及びNM_003374として登録されている。使用するVDAC1タンパク質やVDAC1遺伝子は天然のものであってもよいが、天然のVDAC1のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、天然のVDAC1と同様に、プロスタグランジンJ2と結合しない状態で、骨芽細胞の分化促進作用を有する改変型のVDAC1やそれをコードする遺伝子を使用してもよい。
【００２９】
VDAC1遺伝子は、適当なプロモーターなどと共にベクターに挿入して使用される。プロモーターとしては、VDAC1遺伝子自体のプロモーターを用いてもよく、また、それ以外のプロモーターを用いてもよい。VDAC1遺伝子のプロモーター以外のプロモーターとしては、VDAC1遺伝子を骨芽細胞に発現させ得るものが好ましく、CMV, Actin, EF-1, OG2, ALP等のプロモーターなどを例示できる。
【００３０】
ベクターは遺伝子治療などに用いられるもの、例えば、ウイルスベクターなどを用いることができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、AAVベクター、SV40ベクターなどを例示できる。
【００３１】
VDAC1を利用した骨、関節又は歯異常症治療薬の投与方法は特に限定されず、一般的な遺伝子治療法で用いられている方法に従うことができる。例えば、皮内、腹腔内、静脈、動脈、又は脊髄液への注射又は点滴等によって投与することができる。
【００３２】
VDAC1を利用した骨、関節又は歯異常症治療薬の投与量は特に限定されず、投与形態、投与経路、投与対象の性質などに応じて適宜選択することができる。
【００３３】
VDAC1を利用した骨、関節又は歯異常症治療薬を注射又は点滴によって投与する場合は、注射液や点滴液に通常含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、液体担体（例えば、リン酸カリウム緩衝液、生理食塩水、リンゲル液、蒸留水、ポリエチレングリコール、植物性油脂、エタノール、グリセリン、ジメチルスルホキサイド、プロピレングリコールなど）、抗菌剤、局所麻酔剤（例えば、塩酸プロカイン、塩酸ジブカインなど）、緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、ヘペス緩衝液など）、浸透圧調節剤（例えば、グルコース、ソルビトール、塩化ナトリウムなど）を例示できる。
【００３４】
VDAC1を利用した骨、関節又は歯異常症治療薬は、ヒトに用いるものであるが、ヒト以外の動物に投与し、その動物の骨芽細胞の分化を促進させてもよい。対象となる動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サルなどを挙げることができる。
（４）プロスタグランジンJ2を利用した骨、関節又は歯異常症治療薬及びサプリメント
プロスタグランジンJ2は骨芽細胞の分化を抑制する作用を持つので（例えば、図２左上、中央下など）、骨、関節又は歯異常症治療薬及びサプリメントとして利用することができる。この治療薬及びサプリメントにおいて好適な骨、関節又は歯異常症としては、骨形成の異常な促進が原因であると考えられている骨硬化症（大理石病）を挙げることができる。また、Runx2の活性を抑制することから、軟骨の破壊を抑制し変形性関節症の治療及び／又は予防効果が期待できる。
【００３５】
プロスタグランジンJ2を骨、関節又は歯異常症の治療薬等として使用する場合、プロスタグランジンJ2は公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化することができる。剤型は特に限定されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤などとすることができる。投与方法も特に限定されず、経口的又は非経口的（局所、直腸、静脈投与）に投与することができる。投与量は、投与対象、投与方法、疾患の種類などにより異なるが、例えば、成人に対して、経口的に投与する場合、１回当たり、プロスタグランジンJ2の量が1g以下となるように１日１〜数回に分けて投与することができる。
【００３６】
プロスタグランジンJ2を利用した骨、関節又は歯異常症の治療薬等は、ヒトに用いるものであるが、ヒト以外の動物に投与し、その動物の骨芽細胞の分化を抑制させてもよい。対象となる動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サルなどを挙げることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
【００３８】
〔実験方法〕
(VDAC1, PHB2)ノックダウンは通常の方法で、shRNA発現ベクターを作製し、通常のトランスフェクション法にて、細胞導入を行った。OG2-luciferaseベクターも同様に作製した。
【００３９】
ALP活性は、反応溶液をアルカリ側にしてphosphotase活性を測定した。ALP活性の測定は、臨床検査会社に委託してもよい。抗ALP抗体を用いて、ELISAのようにALP発現量を測定することでもよい。ALPは骨芽細胞内に貯蔵されているものも、骨芽細胞外に分泌されているものも、その両方も測定することができる。
【００４０】
骨芽細胞特異的VDAC1強制発現マウスについては、OG2プロモーターにVDCA1 cDNAを連結したベクターを作製し、通常の方法でトランスジェニックマウスを作製した。外来遺伝子が骨以外では発現していないことをRT-PCRで確認した。骨芽細胞においては、ALP活性が有意に高いが、外来遺伝子（VDAC1タンパク質遺伝子など）の発現もRT-PCRで確認した。
【００４１】
PHB2の核内移行については、通常の免疫細胞染色法を行った。抗体はPHB2抗体を使用した。ミトコンドリア局在を調べるためにはミトコンドリアマーカー（例えばRhodamin 123染色や、Mitotracker染色が可能である）との二重染色により判断ができる。また、核局在を調べるためにはDapi等との二重染色により判断ができる。
【００４２】
〔実験結果〕
（１）コントロールの骨芽細胞では、PGJ2の添加により、骨芽細胞分化のマーカーであるOG2の転写活性が低下した（図２左上）。一方、VDAC1をノックダウンした骨芽細胞では、PGJ2の添加にかかわらず、OG2の転写活性は低かった（図２左上）。
（２）VDAC1を強制発現させたマウスでは、コントロールのマウスに比べ（図２中央上の１、３）、骨芽細胞及び骨が増加した（図２中央上の２、４）。
（３）VDAC1を強制発現させた骨芽細胞では、骨芽細胞分化のマーカーであるALPの活性が増大した（図２右上）。
（４）VDAC1を強制発現させた骨芽細胞では、核内へ移行するPHB2の量が増大した（図２左下）。しかし、PGJ2の添加により、移行するPHB2の量は減少した（図２左下）。
（５）VDAC1を強制発現させた骨芽細胞では、OG2の転写活性が増大した（図２中央下）。しかし、PGJ2の添加により、OG2の転写活性は減少した（図２中央下）。
（６）VDAC1を強制発現させた骨芽細胞では、OG2の転写活性が増大したが、VDAC1を強制発現させ、PHB2をノックダウンした骨芽細胞では、OG2の転写活性は、コントロールの骨芽細胞よりも低かった（図２右下）。
（７）PHB2は、カプサイシンの濃度に従って核内への移行量が増大した（図３左上）。一方、PHB1は、カプサイシンの濃度にかかわらず、ほぼ全量が核内に存在した（図３左上）。
（８）ALP活性は、カプサイシンの濃度に従って増大した（図３中央上）。
（９）OG2の転写活性は、カプサイシンの濃度に従って増大した（図３右上）。また、増大量は、PHB2発現ベクターの添加量に従って大きくなった（図３右上）。
（１０）核内へ移行するPHB2の量は、カプサイシンを添加することにより増大したが、プロスタグランジンJ2を添加することにより、その増大量は小さくなった（図３左下）。
（１１）ALP活性は、カプサイシンを添加することにより増大したが、プロスタグランジンJ2を添加することにより、その増大量は小さくなった（図３中央下）。
（１２）OG2の転写活性は、カプサイシンを添加することにより増大したが、プロスタグランジンJ2を添加することにより、その増大量は小さくなった（図３右下）。
（１３）骨芽細胞株MC3T3-E1細胞抽出液から抗ERα抗体、抗Runx2抗体を用いて免疫沈降を行い、その後、抗PHB1抗体・抗PHB2抗体でWestern blottingを行った。抗ERα抗体、抗Runx2抗体各々免疫沈降した画分に、PHB1及びPHB2が含まれていた（図４）。
（１４）G2野生型プロモーターおよびその中のOSE2サイト（１０塩基対程度）が欠損したものでルシフェラーゼアッセイを行った。OSE2欠損により転写量が大幅に減った（図５）。また、PGJ2投与により野生型は抑制されたが、OSE2サイト欠損型は変化がなかった（図５）。よって、PGJ2のターゲットはOSE2サイトにたどり着く。
（１５）野生型・OSE2欠損型OG2プロモーターと野生型・VDAC1骨芽細胞特異的強制発現初代培養骨芽細胞の組み合わせを行った。その結果野生型・VDAC1強制発現型ともにOSE2欠損によりOG2転写量が有意に下がった（図６）。よって、VDAC1シグナルの下流にOSE2サイトが存在することが明らかになった。
（１６）OG2野生型、OSE2欠損型、OG2野生型＋Runx2ノックダウンの３種類にカプサイシンを加えた。野生型OG2プロモーターのみカプサイシンによる転写促進が見られた（図７）。しかし、OSE2サイト欠損やRunx2ノックダウンの場合はカプサイシンによる影響が見られなかった（図７）。よって、カプサイシンのOG2転写促進はRunx2/OSE2を介する。
（１７）野生型（■）、OSE2欠損（○）、OSE2より上流約５００塩基対欠損型（△）のE2による転写活性化能を調べた。その結果E2によるOG2転写促進はOSE2を介する（図８）。
（１８）OG2野生型プロモーターでE2を加えた。その際Runx2ノックダウンしたところ、Runx2存在下ではE2による転写促進が見られた（図９）。しかし、Runx2ノックダウンによりE2による転写促進が消えた（図９）。よって、E2によるOG2転写促進はRunx2を介することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、骨、関節又は歯異常症治療薬などに関するものなので、製薬産業などに利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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