(57)【要約】      （修正有）【課題】高屈折率などの優れた光学特性を有し、生体親和性の高い新規タンパク質及びその製造方法を提供する。【解決手段】特定な配列からなる複数のアミノ酸配列の群より選ばれるアミノ酸配列（１）において、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は挿入されてなり、前記アミノ酸配列（１）に対するアミノ酸配列同一性が５０〜９９．５％の範囲であること以外には、前記アミノ酸配列（１）と同等なアミノ酸配列を有することを特徴とする新規タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれ配列番号１〜配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列（１）において、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は挿入されてなり、前記アミノ酸配列（１）に対するアミノ酸配列同一性が５０〜９９．５％の範囲であること以外には、前記アミノ酸配列（１）と同等なアミノ酸配列を有することを特徴とする新規タンパク質。
【請求項２】
前記アミノ酸配列（１）が、
マウス水晶体タンパク質のαＡ、βＡ１、βＢ２又はγＥであることを特徴とする請求項１記載の新規タンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸配列（１）と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、アミノ末端アミノ酸から５番目のアミノ酸までの間に結合性ペプチドのアミノ酸配列が挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、２５℃、ｐＨ７．４の緩衝液１ｍｌに当該タンパク質１ｍｇが溶解することによる当該緩衝液における５８９ｎｍの光の屈折率変化が０．０００２０以上の増加である請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
前記アミノ酸配列（１）と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、アミノ末端アミノ酸とアミノ末端から２番目のアミノ酸との間に結合性ペプチドのアミノ酸配列が挿入されたアミノ酸配列を有する請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
結合性ペプチドが５個から１５個のアミノ酸からなるペプチドである請求項３又は４記載のタンパク質。
【請求項６】
結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９のいずれかで示されるアミノ酸配列である請求項３〜５のいずれか記載のタンパク質。
【請求項７】
前記アミノ酸配列（１）において、アミノ酸番号１及びアミノ酸番号２の間に、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列が挿入されていること以外には、前記アミノ酸配列（１）と同等なアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の新規タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の新規タンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項８記載のＤＮＡ又は請求項５記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換体を培養する工程を有する新規タンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今の医療・ヘルスケア分野の発展に伴い、生体親和性高機能材料の必要性が増すと考えられる。しかしながら、上記分野で用いられている材料は、生体親和性は高いが機能性が低いもの、高機能性であるが生体親和性が疑問視されているものが主流であるのが現状である。例えば、人工水晶体などに用いられる光学材料においては、親水性材料であるコンニャクマンナンゲルや多糖類マトリックス共重合体を用いた例が知られている（特許文献１、２参照）が、生体親和性の高いタンパク質等を適用した例はこれまで何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平５−１９４６０３号公報
【特許文献２】特開平１０−９５８１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の目的は、高屈折率などの優れた光学特性を有し、生体親和性の高い新規タンパク質及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、このような状況下、鋭意検討を行った結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、以下の発明を含む。
〔１〕それぞれ配列番号１〜配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列（１）において、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は挿入されてなり、前記アミノ酸配列（１）に対するアミノ酸配列同一性が５０〜９９．５％の範囲であること以外には、前記アミノ酸配列（１）と同等なアミノ酸配列を有することを特徴とする新規タンパク質。
〔２〕前記アミノ酸配列（１）が、
マウス水晶体タンパク質のαＡ、βＡ１、βＢ２又はγＥであることを特徴とする〔１〕記載の新規タンパク質。
〔３〕前記アミノ酸配列（１）と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、アミノ末端アミノ酸から５番目のアミノ酸までの間に結合性ペプチドのアミノ酸配列が挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、２５℃、ｐＨ７．４の緩衝液１ｍｌに当該タンパク質１ｍｇが溶解することによる当該緩衝液における５８９ｎｍの光の屈折率変化が０．０００２０以上の増加である〔１〕記載のタンパク質。
〔４〕前記アミノ酸配列（１）と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、アミノ末端アミノ酸とアミノ末端から２番目のアミノ酸との間に結合性ペプチドのアミノ酸配列が挿入されたアミノ酸配列を有する〔３〕記載のタンパク質。
〔５〕結合性ペプチドが５個から１５個のアミノ酸からなるペプチドである〔３〕又は〔４〕記載のタンパク質。
〔６〕結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９のいずれかで示されるアミノ酸配列である〔３〕〜〔５〕のいずれか記載のタンパク質。
〔７〕前記アミノ酸配列（１）において、アミノ酸番号１及びアミノ酸番号２の間に、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列が挿入されていること以外には、前記アミノ酸配列（１）と同等なアミノ酸配列を有することを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれか記載の新規タンパク質。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれか記載の新規タンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とするＤＮＡ。
〔９〕〔８〕記載のＤＮＡを含有することを特徴とするベクター。
〔１０〕〔８〕記載のＤＮＡ又は〔９〕記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）。
〔１１〕前記宿主細胞が、大腸菌であることを特徴とする〔１０〕記載の形質転換体。
〔１２〕〔１１〕記載の形質転換体を培養する工程を有する新規タンパク質の製造法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、高屈折率であり、生体親和性の高い新規タンパク質及びその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１のＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクターのプラスミドマップの概要を示す図である。
【図２】実施例２のＰＣＲ反応後のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】実施例３、５及び６のタンパク質の発現・精製を示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと記すこともある。）結果の写真である。
【図４】実施例４のＦＬＡＧ−Ｃｒｙａａタンパク質の発現・可溶化を示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動結果の写真である。
【図５】実施例７、８及び９の変異株作成、タンパク質発現確認を示すドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動結果の写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に記載される発明は記載されている特定の方法論、プロトコ−ル、及び、試薬に限定されず、可変であると考えられる。また、本明細書で用いる用語は単に特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと考えられる。
特に断りの無い限り、本明細書で用いる全ての技術用語、及び、化学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を持つ。本発明を実施又は試験する上で、本明細書に記載されているものと同様又は同等の方法、及び、材料のいずれを用いてもよいが、以下、好ましい方法、装置、及び、材料を記載する。
【０００９】
以下、更に詳細に本発明を説明する。
【００１０】
本発明の新規タンパク質（以下、場合により「本タンパク質」という。）は、それぞれ配列番号１〜配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列（１）に対し、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は挿入されてなり、アミノ酸配列（１）に対するアミノ酸配列同一性が５０〜９９．５％の範囲であること以外は、アミノ酸配列（１）と同等なアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１１】
配列番号１〜配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（野生型タンパク質）としては例えば、マウス水晶体タンパク質のαＡ、βＡ１、βＢ２又はγＥなどを挙げることができる。かかる野生型タンパク質は例えば、上記アミノ酸配列をコードするＤＮＡをＭｏｕｓｅ  Ｅｙｅ  ｃＤＮＡ（Ｚｙａｇｅｎ社製）から取得し発現させることにより入手できる。
【００１２】
本タンパク質は、上記アミノ酸配列（１）において１つ以上のアミノ酸変異（例えば、１以上３０以下のアミノ酸変異、好ましくは４以上２０以下のアミノ酸変異）を含むことができる。かかるアミノ酸変異としては、例えば、
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｃｒｙｇｅ）において、８４番目から８７番目のセリン、セリン、セリン、ヒスチジンがアラニン四分子に置換されるアミノ酸変異、
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｃｒｙｇｅ）において、８４番目から８７番目のセリン、セリン、セリン、ヒスチジンを欠損させるアミノ酸変異、及び
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｃｒｙｇｅ）において、８５番目のセリンと８６番目のセリンの間にアラニン四分子を挿入するアミノ酸変異、又は
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｃｒｙｂａ１）において、４２番目のグルタミンがアラニンに、４５番目のアルギニンがアラニンに、９０番目のアルギニンがアラニンに、９２番目のグルタミン酸がアラニンに、９５番目のアルギニンがアラニンにそれぞれ置換されるアミノ酸変異、
を挙げることができる。
【００１３】
本タンパク質としては、例えば、
上記アミノ酸配列（１）と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、アミノ末端アミノ酸から５番目のアミノ酸までの間に結合性ペプチドのアミノ酸配列が挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、２５℃、ｐＨ７．４の緩衝液１ｍｌに当該タンパク質１ｍｇが溶解することによる当該緩衝液における５８９ｎｍの光の屈折率変化が０．０００２０以上の増加である本タンパク質
を挙げることもでき、より具体的には、
上記アミノ酸配列（１）と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、アミノ末端アミノ酸とアミノ末端から２番目のアミノ酸との間に結合性ペプチドのアミノ酸配列が挿入されたアミノ酸配列を有する本タンパク質
を挙げることができる。
「９０％以上の配列同一性」としては、例えば９０、９５、９８、または９９％以上の配列同一性が挙げられる。
「結合性ペプチド」とは、他の分子に結合可能なペプチドであり、例えば５個から１５個のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。結合性ペプチドとしては、具体的には、抗体に結合可能な抗原ペプチド、チタンに結合可能なペプチド、酸化チタンに結合可能なペプチド、カーボンナノチューブ（以下、ＣＮＴと記すこともある。）に結合可能なペプチド、又は、C60フラーレン（以下、Ｃ６０と記すこともある。）に結合可能なペプチド等を挙げることができ、より具体的には、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。
２５℃、ｐＨ７．４の緩衝液１ｍｌに本タンパク質１ｍｇが溶解することによる当該緩衝液における５８９ｎｍの光の屈折率変化が０．０００２０以上の増加であることは、例えば、後述の実施例に記載の方法で確認することができる。
【００１４】
本タンパク質としては、より具体的には、
上記アミノ酸配列（１）において、アミノ酸番号１及びアミノ酸番号２の間に、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列が挿入されていること以外には、上記アミノ酸配列（１）と同等なアミノ酸配列を有する本タンパク質を挙げることができ、さらに具体的には、
配列番号１〜配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１及びアミノ酸番号２の間に、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列が挿入されているアミノ酸配列を有する本タンパク質を挙げることができる。
【００１５】
以下、配列番号１〜配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１及びアミノ酸番号２の間に、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９でそれぞれ示されるアミノ酸配列が挿入されてなる本タンパク質の製造方法を簡単に説明する。
【００１６】
まず、本タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、場合により「本ＤＮＡ」という。）を取得する。本ＤＮＡを取得するには、例えば、以下の方法を用いればよい。
【００１７】
野生型タンパク質（配列番号１〜配列番号４のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（以下、場合により「野生型ＤＮＡ」という。）を取得する。野生型ＤＮＡは、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリングハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年、等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じて、マウス水晶体から取得することができる。具体的には、マウス水晶体のｍＲＮＡから「新  細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年）に記載された方法に準じてｃＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、且つ、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１５で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することにより、野生型ＤＮＡを調製する。また、上記の鋳型としては、場合により、市場から容易に入手できるＤＮＡを用いることもできる。例えば、Ｚｙａｇｅｎ社から入手できるｃＤＮＡを用いることができる。
同様にして、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１７で示される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、または、配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡを調製する。
【００１８】
次いで、部位特異的変異導入法に基づき、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８で示される塩基配列を有するポリヌクレオチドに特定の部位特異的変異を導入することにより、本ＤＮＡを調製することができる。
ここで「部位特異的変異導入法」としては、例えば、Ｏｌｆｅｒｔ  Ｌａｎｄｔ  ら（Ｇｅｎｅ  ９６  １２５−１２８  １９９０）、Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３  １  Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ  Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｖｌａｓｕｋら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｉｎｏｕｙｅ，Ｍ．：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｈｏｓ．Ｎ．Ｈｕｎｔら（Ｇｅｎｅ  ７７  ５１  １９８９）等の方法や、Ｍｕｔａｎ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（タカラバイオ社製）、ＴａＫａＲａ  Ｌａ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等の市販キットの利用を挙げることができる。 
【００１９】
具体的には例えば、Ｏｌｆｅｒｔ  Ｌａｎｄｔら（Ｇｅｎｅ  ９６  １２５−１２８  １９９０）の方法を用いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号１及びアミノ酸番号２の間に、特定のアミノ酸を挿入するアミノ酸変異を含むこと以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを調製するには、配列番号１５で示される塩基配列を有するＤＮＡを鋳型として用いることができる。また、ＰＣＲクローニングキットとして市販されているものを用いることもできる。このような市販のＰＣＲクローニングキットとしては例えば、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が挙げられる。
【００２０】
市販のＰＣＲクローニングキットを用い、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸番号１及びアミノ酸番号２の間に、配列番号５で示されるアミノ酸配列が挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを片側のプライマーとして用い、所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行う。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて２分間保温した後、９４℃にて１５秒間、次いで５０℃にて３０秒間、更に６８℃にて３５秒間保温する処理を３５サイクル行い、最後に６８℃で７分間保温する条件を挙げることができる。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、例えば、制限酵素ＮｄｅＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った塩基配列を有するポリヌクレオチド（野生型遺伝子）が組み込まれたベクター（ＤＮＡ）とライゲーション反応を行うことにより、目的とする本ＤＮＡを得ることができる。
配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１０で示される塩基配列を挙げることができる。
配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１１で示される塩基配列を挙げることができる。
配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１２で示される塩基配列を挙げることができる。
配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１３で示される塩基配列を挙げることができる。
配列番号９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号１４で示される塩基配列を挙げることができる。
【００２１】
本タンパク質を取得するには、本ＤＮＡを微生物等の宿主細胞中で発現させることができるベクター（以下、「本ベクター」という。）を調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより形質転換体を作製する。次いで作製された形質転換体を通常の細胞培養方法に従い培養すればよい。このようにして、本タンパク質を大量に製造し、取得することができる。
【００２２】
本ベクターは、本ＤＮＡを含有する。本ベクターの調製は、本ＤＮＡを、本ＤＮＡが導入される宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖でき、宿主細胞からの単離、精製が可能であり、検出可能なマ−カ−を持つベクター（以下、「基本ベクター」と記すこともある。）に通常の遺伝子工学的手法に準じて、組み込むことにより構築すればよい。
ここで「基本ベクター」としては、大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＥＴ−３ａ−ｃ、ｐＥＴ−１１ａ−ｄ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−４１ａ−ｃ（＋）、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＦＬＡＧ、ｐＵＣ１８、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−３０−３２、ｐＱＥ４０（ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。また、出芽酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
【００２３】
本ＤＮＡを微生物等の宿主細胞中で発現させることができる本ベクターは、本ＤＮＡの上流に、微生物等の宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合させ、これを上記のような基本ベクターに組み込むことにより調製すればよい。
ここで、「機能可能な形で結合させ（る）」とは、本ＤＮＡが導入される微生物等の宿主細胞において、プロモーターの制御下に本ＤＮＡが発現されるように、当該プロモーターと本ＤＮＡとを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、導入される宿主細胞内でプロモーター活性を示すＤＮＡを挙げることができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（ｌａｃＰ）、トリプトファンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）、アルギニンオペロンのプロモーター（ａｒｇＰ）、ガラクトースオペロンのプロモーター（ｇａｌＰ）、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、λファ−ジのプロモーター（λ−ｐＬ、λ−ｐＲ）等を挙げることができる。また、宿主細胞が動物細胞や分裂酵母である場合には、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）の初期又は後期プロモーター、マウス乳頭腫ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター等を挙げることができる。
また、宿主細胞が出芽酵母である場合には、例えば、ＡＤＨ１プロモーター（尚、ＡＤＨ１プロモーターは、例えば、ＡＤＨ１プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターｐＡＡＨ５  〔Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｕｎｄａｔｉｏｎ  から入手可能、Ａｍｍｅｒｅｒ  ら、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１  ｐａｒｔ（ｐ．１９２−２０１）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。）等を挙げることができる。
【００２４】
また、宿主細胞において機能するプロモーターを予め保有する基本ベクターを使用する場合には、前記プロモーターと本ＤＮＡとが機能可能な形で結合するように、上記のプロモーターの下流に本ＤＮＡを挿入すればよい。例えば、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ等である場合には、動物細胞で機能可能なプロモーターの下流にクローニング部位が設けられている。当該クローニング部位に本ＤＮＡを挿入することにより得られるベクターを動物細胞へ導入することにより、当該動物細胞において本ＤＮＡを発現させることができる。これらのベクターには予めＳＶ４０の自律複製起点（ｏｒｉ）が組み込まれているため、ｏｒｉを欠失したＳＶ４０ゲノムで形質転換された培養細胞、例えば、ＣＯＳ細胞等に当該ベクターを導入すると、細胞内でベクターのコピ−数が非常に増大し、結果として当該ベクターに組み込まれた本ＤＮＡを大量発現させることもできる。また上記の酵母用ベクターｐＡＣＴ２はＡＤＨ１プロモ−タ−を有しており、当該ベクター又はその誘導体のＡＤＨ１プロモーターの下流に本ＤＮＡを挿入すれば、本ＤＮＡを、例えば、ＣＧ１９４５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等の出芽酵母内で大量発現させることが可能なベクターが構築できる。
【００２５】
宿主細胞としては、微生物の場合には、例えば、真核生物、原核生物等を挙げることができる。好ましくは、例えば、大腸菌等を挙げることができる。当該宿主細胞に、通常の遺伝子工学的方法により、上記のようなベクターを導入することにより、宿主細胞を形質転換することができる。
本ベクターを宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用すればよい。大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；「モレキュラー  クローニング  第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コ−ルドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等の通常の方法を挙げることができる。また、酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）等で用いられるリチウム法の通常の方法を挙げることができる。また、哺乳類動物細胞又は昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等の通常の方法を挙げることができる。
【００２６】
形質転換体を選抜するには、例えば、本ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養すればよい。例えば、マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該選抜薬剤が添加された培地を用いて、本ベクターが導入された宿主細胞を培養すればよい。薬剤耐性を付与する遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、カナマイシン耐性付与遺伝子とカナマイシンとの組み合わせ、テトラサイクリン耐性付与遺伝子とテトラサイクリンとの組み合わせ、ブラストサイジンＳ耐性付与遺伝子とブラストサイジンＳとの組み合わせ等をあげることができる。また、マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養要求性に対応する栄養素を含まない最少培地を用いて、本ベクターが導入された細胞を培養すればよい。また本ＤＮＡを宿主細胞で発現させることが可能な本ベクターを導入した場合には、本タンパク質が含有する結合性ペプチドの結合能に基づく検出方法を用いることもできる。
【００２７】
本ＤＮＡが宿主細胞の染色体内に位置する本発明形質転換体を取得するには、例えば、まず本ベクターと同時にマーカー遺伝子が導入された宿主細胞を、マーカー遺伝子の性質に応じた方法によって培養した後、導入されたマーカー遺伝子の性質に基づき目的とする形質転換体を選抜し取得すればよい。また、例えば、まず上記のような選抜薬剤を付与する遺伝子をマーカー遺伝子として有する本ベクターを前述の方法によって宿主細胞に導入する。次いで当該細胞を選抜薬剤が添加された培地で、所定期間、継代培養した後、コロニー状に生き残った選抜薬剤耐性クローンを純化培養することにより、本ＤＮＡが宿主細胞の染色体に導入されてなる本発明形質転換体を選抜し取得することもできる。
導入された本ＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれたことを確認するには、当該細胞のゲノムＤＮＡを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムＤＮＡから、導入された本ＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーやプローブとしたＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション等の方法を利用して、前記本ＤＮＡの存在を検出すればよい。当該形質転換体は、凍結保存が可能であり必要に応じて起眠して使用することができるので、実験毎の形質転換体作製の手間を省くことができ、また、あらかじめ性質や取扱い条件の確認された形質転換体を用いて本タンパク質の製造を実施することが可能となる。
【００２８】
本ＤＮＡ又は本ベクターを含有する形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、通常の細胞培養方法によって行えばよい。
形質転換体が微生物である場合には、例えば、当該形質転換体は、一般微生物における通常の培養に使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いて培養することができる。
【００２９】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３０】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ  Ｓｔｅｅｐ  Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３１】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３２】
更に、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター及びｌａｃプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本ＤＮＡとが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本タンパク質の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００３３】
形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行えばよい。例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養及び固体培養が挙げられる。
培養温度は、当該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５℃〜約４０℃である。培地のｐHは約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日間〜約５日間が好ましい。
【００３４】
形質転換体の培養物から本タンパク質を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用すればよい。例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００３５】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、タンパク質を精製することができる。アフィニティーカラムクロマトグラフィーとしては、本タンパク質が含有する結合性ペプチドの結合能を利用するアフィニティーカラムクロマトグラフィーを挙げることができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（東ソ−社製）、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ社製）等が挙げられる。
なお、本タンパク質を含む画分を選抜するには、例えば、ＵＶ吸収スペクトルを測定することにより選抜してもよい。
【００３６】
かくして得られた本タンパク質は、種々の機能材料及びデバイスの製造用材料として用いることができ、例えば、人工水晶体、生体親和性光電変換装置、又はプロテインメモリの製造用材料として期待される。
【実施例】
【００３７】
実施例１（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクターの作成）
マウス水晶体（マウス眼）のｃＤＮＡ（Ｚｙｅａｇｅｎ社製）を鋳型とし、配列番号２５、配列番号２６でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いてＰＣＲ反応（酵素：ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、温度サイクル：９４℃２分間保持した後、９４℃１５秒間、次いで５０℃３０秒間、次いで６８℃３５秒間の保温を３５サイクル実施し、さらに６８℃７分間保持）を行い、Ｃｒｙｇｅタンパク質のアミノ酸番号１とアミノ酸番号２との間に配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるＦＬＡＧペプチドが導入されたタンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した。
得られたクローニング断片と、大腸菌でのタンパク質発現用ベクターｐＥＴ４１ａ（＋）をそれぞれ制限酵素（ＮｄｅＩ、ＡｖｒＩＩ（ともにタカラバイオ製）、３７℃１２時間）にて消化したのち、アガロースゲル電気泳動にて単離後、ＱｉａＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した。精製後の消化済みクローニング断片３μＬと、発現用ベクター１μＬをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）４μＬと混和して、ライゲーション（１６℃８時間）した。ライゲーション溶液１μＬと、ＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）３０μＬと混ぜ、４２℃にて３０秒保持することで形質転換を行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ寒天培地にて形質転換体を培養（３７℃１５時間）し、形質転換体のセレクションを行い、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクターをＬａｂｏＰａｓｓ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｏｓｍｏ  ＧＥＮＥＴＥＣＨ社製）にて抽出した。得られたベクターの遺伝子配列は、文献（「Ａ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７（７３５−７３９））記載の方法により確認した。
【００３８】
実施例２（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現宿主への形質転換）
実施例１にて得られたＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクター溶液１μＬを、タンパク質発現用大腸菌宿主株ＢＬ−２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に導入し、２−メルカプトエタノール５μＬ添加後、４２℃にて３０秒間保持することで形質転換を行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ寒天培地にて形質転換体を培養（３７℃１５時間）し、形質転換体のセレクションを行い、コロニーを配列番号２７、配列番号２８でそれぞれ示されるプライマーを用いたＰＣＲ反応（酵素：ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ製）、温度サイクル：９４℃２分間保持した後、９８℃１０秒間、次いで４８℃３０秒間、次いで６８℃２０秒間の保温を３５サイクル実施し、さらに６８℃７分間保持）に供することで形質転換体への導入の確認を行った。
【００３９】
実施例３（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質の発現・精製）
実施例２にて得られたＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現株を２５μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ培地（以下ＬＢＫ培地）５ｍＬ、４０ｍＬ、４００ｍＬに順次継代培養（それぞれ３７℃１５時間）後、４Ｌ（１Ｌ×４）ＬＢＫ培地に植え継いだ。３７℃にて１時間培養後、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように加え３０℃にて２４時間培養を継続した。培養後、菌体を回収し、微生物用プロテアーゼインヒビターカクテル（ＳＩＧＭＡ社製）を添加後、超音波にて細胞を破砕した。破砕液を遠心分離（６５００ｇ、１５分）し、沈殿物と上清をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇに供し、タンパク質の発現を確認した。分子量約２４ｋＤのバンド、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ（ＨＲＰ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製））Ｐｏｓｉｔｉｖｅのバンドが確認された。得られた上清をＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ社製）５０ｍＬと混ぜ、目的タンパク質をＦＬＡＧ−ｔａｇ部位でＧｅｌに結合させた。ＴＢＳバッファーにて洗浄後、ｐＨ３．５に調製した０．２ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ溶液２５ｍＬにて目的のＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質を溶出し、これを溶出液中のタンパク質濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ以下になるまで繰り返した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにてタンパク質の発現および精製物を確認した。目的タンパク質の存在する溶出液を回収し、１．０Ｍ、ｐＨ８．０Ｔｒｉｓバッファー溶液を添加してｐＨ７．５〜８．０にしたのち、限外濾過フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ，Ｕｌｔｒａｃｅｌ  １０Ｋ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製））にて濃縮ならびにＰＢＳバッファーへのバッファー置換を行った（８０００ｘｇ、２０分間を４回実施）。最終タンパク質濃度約２．５ｍｇ／ｍＬの精製物溶液が約１０ｍＬ取得された。
【００４０】
実施例４（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙａａタンパク質の取得）
実施例１、２に記載した手法と同手法によりＦＬＡＧ−Ｃｒｙａａタンパク質発現株を構築した。クローニングＰＣＲには、配列番号１９、２０でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いた。続いて、実施例３に記載した手法と同手法により、目的タンパク質を大腸菌株ＢＬ−２１（ＤＥ３）にて発現させ、集菌、破砕後、発現の確認を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量約１９ｋＤのバンド、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ（ＨＲＰ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製））Ｐｏｓｉｔｉｖｅのバンドが確認された。ＦＬＡＧ−Ｃｒｙａａは不溶化したため、沈殿を再構築カラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｓｅｔ  ＃０８（ＰｒｏＦｏｌｄｉｎ社製））にて溶解後、再構築し可溶化した。再構築カラムのフロースルー液をＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ社製）５０ｍＬと混ぜ、再構築したＦＬＡＧ−Ｃｒｙａａタンパク質をＧｅｌに結合させ、引き続き実施例３に記載の手法にてタンパク質精製を行った。最終タンパク質濃度約１．０ｍｇ／ｍＬの精製物溶液が約５ｍＬ取得された。
【００４１】
実施例５（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１タンパク質の取得）
実施例１、２、３に記載した手法と同手法により、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１タンパク質発現株を構築し、目的タンパク質の発現の確認及び精製を行った。クローニングＰＣＲには配列番号２１、２２でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量約２６ｋＤのバンド、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ（ＨＲＰ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製））Ｐｏｓｉｔｉｖｅのバンドが確認された。最終タンパク質濃度約２．５ｍｇ／ｍＬの精製物溶液が約１０ｍＬ取得された。
【００４２】
実施例６（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂｂ２タンパク質の取得）
実施例１、２、３に記載した手法と同手法により、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂｂ２タンパク質発現株を構築し、目的タンパク質の発現の確認及び精製を行った。クローニングＰＣＲには配列番号２３、２４でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分子量約２６ｋＤのバンド、Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ（ＨＲＰ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製））Ｐｏｓｉｔｉｖｅのバンドが確認された。最終タンパク質濃度約２．０ｍｇ／ｍＬの精製物溶液が約７ｍＬ取得された。
【００４３】
実施例７（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ−ｄｅｌタンパク質発現株の構築）
実施例１にて作成したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクターを鋳型とし、配列番号２９、３０でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（酵素：ＰｆｕＵｌｔｒａＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、温度サイクル：９５℃２分間保持した後、９５℃３０秒間、次いで５０℃３０秒間、次いで７２℃５分３０秒間の保温を２０サイクル実施し、さらに７２℃１０分間保持）によりＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ中のＣｒｙｇｅの８４番目から８７番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列を欠損させた。得られたＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、ＤｐｎＩにて消化（３７℃、１５時間）した。
続いて、消化反応溶液５μＬをＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）３０μＬと混ぜ、４２℃にて３０秒保持することで形質転換を行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ寒天培地にて形質転換体を培養（３７℃１５時間）し、形質転換体のセレクションを行い、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ−ｄｅｌタンパク質発現ベクターを、ＬａｂｏＰａｓｓ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｏｓｍｏ  ＧＥＮＥＴＥＣＨ社製）にて抽出した。得られたベクターの遺伝子配列は文献（「Ａ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７（７３５−７３９））記載の方法で確認したのち、実施例２、実施例３と同様の手法にて、タンパク質発現用大腸菌宿主株の形質転換を行い、目的タンパク質の発現を確認した。
【００４４】
実施例８（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ−ｒｅｐタンパク質発現株の構築）
配列番号３１、３２でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用い、実施例７と同様の手法にて、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ中のＣｒｙｇｅの８４番目から８７番目の四アミノ酸をアラニン四残基に置換したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ−ｒｅｐタンパク質の発現ベクターを獲得し、目的タンパク質の発現を確認した。
【００４５】
実施例９（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ−ｉｎｓタンパク質発現株の構築）
配列番号３３、３４でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用い、実施例７、８と同様の手法にて、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ中のＣｒｙｇｅの８５番目と８６番目のアミノ酸の間にアラニン四残基を挿入したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅ−ｉｎｓタンパク質の発現ベクターを獲得し、目的タンパク質の発現を確認した。
【００４６】
実施例１０（ＴｉＯ２−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現株の構築）
実施例１にて作成したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクターを鋳型とし、配列番号２６、３５でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いてＰＣＲ法（酵素：ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ製）、温度サイクル：９４℃２分間保持した後、９４℃１５秒間、次いで５０℃３０秒間、次いで６８℃３５秒間の保温を３５サイクル実施し、さらに６８℃７分間保持）にてＴｉＯ２−Ｃｒｙｇｅ遺伝子をクローニングした。併せて、大腸菌でのタンパク質発現用ベクターｐＥＴ４１ａ（＋）を鋳型として、配列番号３７、３８でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う（酵素：ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ製）、温度サイクル：９４℃２分間保持した後、９４℃１５秒間、次いで５０℃３０秒間、次いで６８℃５分間の保温を４０サイクル実施し、さらに６８℃７分間保持）ことで、線状化した。ＰＣＲ産物をそれぞれエタノールにより沈殿させ、アガロースゲル電気泳動にて単離後、ＱｉａＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した。精製したリニアベクター２．５μＬと挿入する目的遺伝子断片２．５μＬを混和し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にて挿入反応を行った（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素反応５０℃１５分間）。反応液２μＬをＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）３０μＬと混ぜ、４２℃にて３０秒間保持することで形質転換を行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ寒天培地にて形質転換体を培養（３７℃１５時間）し、形質転換体のセレクションを行い、選抜された形質転換体からＴｉＯ２−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクターをＬａｂｏＰａｓｓ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｏｓｍｏ  ＧＥＮＥＴＥＣＨ社製）にて抽出した。得られたベクターの遺伝子配列を、文献（「Ａ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７（７３５−７３９））記載の方法により確認したのち、実施例２、実施例３と同様の手法にて、タンパク質発現用大腸菌宿主株の形質転換を行い、目的タンパク質の発現を確認した。
【００４７】
実施例１１（Ｃ６０−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現株の構築）
配列番号２６、３６でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いて、実施例１０記載の手法にてＣ６０−Ｃｒｙｇｅタンパク質発現ベクターを取得し、宿主株の形質転換を行い、目的タンパク質の発現を確認した。
【００４８】
評価例１〜３及び比較評価例１〜２
（ｐＨ７．４での屈折率評価）
タンパク質を、緩衝液（ｐＨ７．４）に表１に示す濃度でそれぞれ溶解し、測定温度２５℃、測定波長５８９ｎｍにて屈折率を測定した。測定には、デジタル屈折率計ＲＸ−５０００（ＡＴＡＧＯ製）を用いた。タンパク質を溶解する前の前記緩衝液（ｐＨ７．４）の屈折率は、1.3342であった。なお、測定に供したタンパク質は以下のとおりである。結果を表１に示す。
評価例１    ：実施例５で取得したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１タンパク質
評価例２    ：実施例６で取得したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂｂ２タンパク質
評価例３    ：実施例３で取得したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質
比較評価例１：Ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ
比較評価例２：ｂｅｔａ−Ｃａｓｅｉｎ
【００４９】
【表１】
2013223490.tif 000002
【００５０】
（屈折率のｐＨ依存性）
それぞれのタンパク質を、更に異なるｐＨの緩衝液に溶解し、タンパク質濃度と屈折率変化量の相関を評価した。結果を表２に示す。
評価例１    ：実施例５で取得したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１タンパク質
評価例２    ：実施例６で取得したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂｂ２タンパク質
評価例３    ：実施例３で取得したＦＬＡＧ−Ｃｒｙｇｅタンパク質
比較評価例１：Ｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ
比較評価例２：ｂｅｔａ−Ｃａｓｅｉｎ
【００５１】
【表２】
2013223490.tif 000003
ここで屈折率変化Δｎとは、タンパク質溶解後の溶液の屈折率と、タンパク質溶解前の緩衝液の屈折率との差分を表す。
【００５２】
実施例１２（ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１−Ｑ４２Ａ，Ｒ４５Ａ，Ｒ９０Ａ，Ｅ９２Ａ，Ｒ９５Ａタンパク質発現株の構築）
実施例５に記載の方法にて作成した、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１タンパク質発現ベクターを鋳型とし、配列番号３９、配列番号４０でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（酵素：ＰｆｕＵｌｔｒａＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、温度サイクル：９５℃２分間保持した後、９５℃３０秒間、次いで５０℃３０秒間、次いで７２℃５分３０秒間の保温を２０サイクル実施し、さらに７２℃１０分間保持）により、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１中の４２番目のグルタミンをコードする塩基配列をアラニンをコードする塩基配列に、４５番目のアルギニンをコードする塩基配列をアラニンをコードする塩基配列にそれぞれ置換した。得られたＰＣＲ産物を、ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製し、ＤｐｎＩにて消化（３７℃、１５時間）した。
続いて、消化反応溶液５μＬをＤＨ５αコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製）３０μＬと混ぜ、４２℃にて３０秒間保持することで形質転換を行った。２５μｇ／ｍＬのカナマイシン含有ＬＢ寒天培地にて形質転換体を培養（３７℃１５時間）し、形質転換体のセレクションを行い、選抜された形質転換体から、ＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１−Ｑ４２Ａ，Ｒ４５Ａタンパク質発現ベクターを、ＬａｂｏＰａｓｓ  Ｍｉｎｉ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｏｓｍｏ  ＧＥＮＥＴＥＣＨ社製）にて抽出した。得られたベクターの遺伝子配列は文献（「Ａ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９７（７３５−７３９））記載の方法で確認したのち、配列番号４１、配列番号４２でそれぞれ示される遺伝子配列のプライマーを用いて、上記と同様の手法にてＦＬＡＧ−Ｃｒｙｂａ１−Ｑ４２Ａ，Ｒ４５Ａ中の９０番目のアルギニンをコードする塩基配列をアラニンをコードする塩基配列に、９２番目グルタミン酸をアラニンに、９５番目のアルギニンをコードする塩基配列をアラニンをコードする塩基配列にそれぞれ置換して、目的のプラスミドを得た。得られたプラスミドを用いて実施例２、実施例３と同様の手法にて、タンパク質発現用大腸菌宿主株の形質転換を行い、タンパク質の発現を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の新規タンパク質は例えば、高屈折率と、高い生体親和性とが要求される物品、例えば、人工水晶体等の製造に有用である。
［配列表フリ−テキスト］
【００５４】
配列番号：１に記載されるアミノ酸配列は、天然型（野性型）クリスタリン−α−ＡＣｒｙａａのアミノ酸配列
配列番号：２に記載されるアミノ酸配列は、天然型クリスタリン−β−Ａ１Ｃｒｙｂａ１のアミノ酸配列
配列番号：３に記載されるアミノ酸配列は、天然型クリスタリン−β−Ｂ２Ｃｒｙｂｂ２のアミノ酸配列
配列番号：４に記載されるアミノ酸配列は、天然型クリスタリン−γ−ＥＣｒｙｇｅのアミノ酸配列
配列番号：５に記載されるアミノ酸配列は、天然型タンパク質に挿入されるアミノ酸配列（ＦＬＡＧペプチド）
配列番号：６に記載されるアミノ酸配列は、天然型タンパク質に挿入されるアミノ酸配列（Ｔｉバインディングペプチド）
配列番号：７に記載されるアミノ酸配列は、天然型タンパク質に挿入されるアミノ酸配列（ＴｉＯ２バインディングペプチド）
配列番号：８に記載されるアミノ酸配列は、天然型タンパク質に挿入されるアミノ酸配列（ＣＮＴバインディングペプチド）
配列番号：９に記載されるアミノ酸配列は、天然型タンパク質に挿入されるアミノ酸配列（Ｃ６０バインディングペプチド）
配列番号：１０に記載される塩基配列は、配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１１に記載される塩基配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１２に記載される塩基配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１３に記載される塩基配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１４に記載される塩基配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１５に記載される塩基配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１６に記載される塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１７に記載される塩基配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１８に記載される塩基配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号：１９〜４２に記載される塩基配列は、ＰＣＲ用プライマーの塩基配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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