(57)【要約】【課題】ＭＲＳＡを正確、迅速かつ簡便に検出するための方法を提供する。【解決手段】試料中のＭＲＳＡを検出する方法であって、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子領域を特異的に増幅するプライマー対を用意し、被検核酸および該核酸プライマー対を含む反応液によって被検核酸を増幅し、得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめ、得られた複合体を検出する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＭＲＳＡを検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、ＭＲＳＡの検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号３で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号４で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
【請求項２】
請求項１に記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載の核酸プライマー対が、配列番号１で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対である、請求項１に記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号７、８、９、１０、のいずれかで示される塩基配列である請求項１または請求項２に記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号１１、１２、１３、１４のいずれかで示される塩基配列である請求項１または請求項２に記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号２４、２５のいずれかに示される核酸配列からなる核酸プローブである、請求項１〜請求項４のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブである、請求項５に記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行う、請求項１〜６のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、さらに、以下の（Ｂ）に示す工程により試料中のメチシリン耐性遺伝子由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、ＭＲＳＡの検出方法。
（Ｂ）
（５）配列番号２と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（ＩＩＩ）フォワードプライマーが、配列番号５で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＶ）リバースプライマーが、配列番号６で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（６）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（７）工程（６）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（８）工程（７）で得られた複合体を検出する工程。
【請求項９】
請求項８に記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ｂ）（ＩＩＩ）に記載のフォワードプライマーが配列番号１５、１６、１７、１８、１９のいずれかで示される塩基配列である請求項８に記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ｂ）（ＩＶ）に記載のリバースプライマーが配列番号２０、２１、２２、２３のいずれかで示される塩基配列である請求項８に記載のＭＲＳＡの検出方法。
【請求項１１】
試料中のＭＲＳＡを検出するためのプライマーセットであって、配列番号３で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号４で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーから構成されるプライマーセット。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプライマーセットが、配列番号７、８、９、１０、のいずれかで示される塩基配列であるフォワードプライマー、および、配列番号１１、１２、１３、１４のいずれかで示される塩基配列であるリバースプライマーから構成される、請求項１１に記載のプライマーセット。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載のプライマーセットに加えて、さらに、配列番号５で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号６で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーから構成されるプライマーセットを含む、請求項１１または請求項１２に記載のプライマーセット。
【請求項１４】
請求項１１または請求項１２に記載のプライマーセットに加えて、さらに、配列番号１５、１６、１７、１８、１９のいずれかで示される塩基配列であるフォワードプライマー、および、配列番号２０、２１、２２、２３のいずれかで示される塩基配列であるリバースプライマーから構成されるプライマーセットを含む、請求項１３に記載のプライマーセット。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかに記載のプライマーセットを含む、ＭＲＳＡ検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（メチシリン・レジスタント・スタヒロコッカス・アウレウスと同義である。本明細書では、以下ＭＲＳＡとも表記する。）を検出するためのプライマーおよびプローブ、ならびに、それらを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＲＳＡは、メチシリン耐性に係わる遺伝子ｍｅｃＡを獲得した黄色ブドウ球菌であり、幅広い抗生物質に対する耐性を示す。
黄色ブドウ球菌を検出する方法としては、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子（熱安定性ヌクレアーゼをコードしている遺伝子）を検出する方法が知られている（非特許文献１）。
メチシリン耐性を試験する方法としては、培養による薬剤感受性試験、ｍｅｃＡがコードするＰＢＰ−２’を抗ＰＢＰ−２’抗体を用いたイムノアッセイで検出する方法、ｍｅｃＡ又はｍｅｃＡと連鎖するＤＮＡをＰＣＲで増幅して検出する方法などが実施されている（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００３】
培養試験およびイムノアッセイ法は検査の前段階として被験者から得られた黄色ブドウ球菌を培養する必要がある。このため培養に要する時間も含めると検査には一日以上を要する。
【０００４】
これに対してＰＣＲなどの核酸増幅による検査では、培養した黄色ブドウ球菌以外にも、鼻腔スワブや膿などの臨床サンプル中に存在する黄色ブドウ球菌を検出することが可能である（非特許文献４）。
【０００５】
核酸増幅を用いた方法では核酸増幅産物をどのようにして検出するかが問題となる。最も古典的な検出方法としてはアガロースゲル電気泳動よって増幅産物を視認する方法がある。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
【０００６】
上記問題点を改善する方法としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎや蛍光色素標識プローブを用いた検出法が広く用いられている。しかし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎは塩基配列非特異的に二本鎖ＤＮＡに結合するため、核酸増幅の正確性が低い場合は誤った核酸を検出する偽陽性の可能性がある。これに対し、蛍光色素標識プローブの場合には非特異的核酸配列は検出しにくいため偽陽性の可能性は低くなる。しかし、核酸増幅の正確性が低い場合は試料中に検出対象の核酸が含まれていても誤増幅による偽陰性の可能性があり、いずれの方法でも正確な検査のためには核酸増幅過程での高い正確性が求められる。
【０００７】
感染症治療および感染拡大防止のためには感染者に対し早急に適切な治療を施すことが必須であり、早期治療のためには正確性のみならず迅速性に優れた感染症検査が必要である。核酸増幅を用いる遺伝子検査は一般的に培養検査よりも迅速性に優れる。しかし同じ遺伝子検査でも核酸増幅方法あるいはＤＮＡポリメラーゼなどの核酸合成酵素の性能により検査速度は大きく左右される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Clinical Microbiology, July 1992, p.1654-1660
【非特許文献２】Journal of Clinical Microbiology, July 1992, p.1685-1691
【非特許文献３】Journal of Clinical Microbiology, July 2000, p.2170-2173
【非特許文献４】German Medical Science, July, 2009, 7:Doc06
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
臨床現場においては、診断、治療及び予防を目的として、簡便・迅速かつ正確なＭＲＳＡの検出が望まれてきた。本発明はこの問題点を解決しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅する１対のプライマーを用いることにより、従来技術よりも正確にＭＲＳＡを検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１１】
［項１］
試料中のＭＲＳＡを検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、ＭＲＳＡの検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号３で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号４で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
［項２］
項１に記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載の核酸プライマー対が、配列番号１で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対である、項１に記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項３］
項１または項２のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号７、８、９、１０、のいずれかで示される塩基配列である項１または項２に記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項４］
項１または項２のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号１１、１２、１３、１４のいずれかで示される塩基配列である項１または項２に記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項５］
項１〜項４のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号２４、２５のいずれかに示される核酸配列からなる核酸プローブである、項１〜項４のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項６］
項５に記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブである、項５に記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項７］
項１〜６のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行う、項１〜６のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項８］
項１〜７のいずれかに記載のＭＲＳＡの検出方法において、さらに、以下の（Ｂ）に示す工程により試料中のメチシリン耐性遺伝子由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、ＭＲＳＡの検出方法。
（Ｂ）
（５）配列番号２と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（ＩＩＩ）フォワードプライマーが、配列番号５で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＶ）リバースプライマーが、配列番号６で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（６）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（７）工程（６）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（８）工程（７）で得られた複合体を検出する工程。
［項９］
項８に記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ｂ）（ＩＩＩ）に記載のフォワードプライマーが配列番号１５、１６、１７、１８、１９のいずれかで示される塩基配列である項８に記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項１０］
項８に記載のＭＲＳＡの検出方法において、工程（Ｂ）（ＩＶ）に記載のリバースプライマーが配列番号２０、２１、２２、２３のいずれかで示される塩基配列である項８に記載のＭＲＳＡの検出方法。
［項１１］
試料中のＭＲＳＡを検出するためのプライマーセットであって、配列番号３で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号４で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーから構成されるプライマーセット。
［項１２］
項１１に記載のプライマーセットが、配列番号７、８、９、１０、のいずれかで示される塩基配列であるフォワードプライマー、および、配列番号１１、１２、１３、１４のいずれかで示される塩基配列であるリバースプライマーから構成される、項１１に記載のプライマーセット。
［項１３］
項１１または項１２に記載のプライマーセットに加えて、さらに、配列番号５で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号６で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーから構成されるプライマーセットを含む、項１１または項１２に記載のプライマーセット。
［項１４］
項１１または項１２に記載のプライマーセットに加えて、さらに、配列番号１５、１６、１７、１８、１９のいずれかで示される塩基配列であるフォワードプライマー、および、配列番号２０、２１、２２、２３のいずれかで示される塩基配列であるリバースプライマーから構成されるプライマーセットを含む、項１３に記載のプライマーセット。
［項１５］
項１１〜１４のいずれかに記載のプライマーセットを含む、ＭＲＳＡ検出キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＭＲＳＡの検出を簡便・迅速かつ正確に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。
【図３】実施例１の結果を示す図である。
【図４】実施例１の結果を示す図である。
【図５】実施例１の結果を示す図である。
【図６】実施例１の結果を示す図である。
【図７】実施例１の結果を示す図である。
【図８】実施例１の結果を示す図である。
【図９】実施例１の結果を示す図である。
【図１０】実施例１の結果を示す図である。
【図１１】実施例２の結果を示す図である。
【図１２】実施例２の結果を示す図である。
【図１３】実施例２の結果を示す図である。
【図１４】実施例２の結果を示す図である。
【図１５】実施例２の結果を示す図である。
【図１６】実施例２の結果を示す図である。
【図１７】実施例２の結果を示す図である。
【図１８】実施例２の結果を示す図である。
【図１９】実施例３の結果を示す図である。
【図２０】実施例３の結果を示す図である。
【図２１】比較例１の結果を示す図である。
【図２２】比較例２の結果を示す図である。
【図２３】実施例４の結果を示す図である。
【図２４】実施例４の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＭＲＳＡの検出方法
本発明のＭＲＳＡの検出方法は、試料中のＭＲＳＡを検出する方法であって、ある特定の工程により試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する方法、を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明のＭＲＳＡの検出方法において、試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を検出する方法としては、以下の（１）〜（４）の工程を例示することができる。
（１）黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅する１対のプライマー対を用意する。
（２）被検核酸および該核酸プライマー対を含む反応液によって被検核酸を増幅する。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する。
【００１６】
［１］黄色ブドウ球菌由来の核酸を増幅するプライマー対
本発明のＭＲＳＡの検出方法において、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅する１対のプライマー対は、配列番号１で示されるｎｕｃ遺伝子と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対である。
上記において、配列番号１との核酸配列の相同性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号１そのもの）である。
【００１７】
［核酸配列の相同性］
なお、本願明細書において、核酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸソフトで比較した値を意味する。
ＧＥＮＥＴＹＸソフトは、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ  ＷＩＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用できる。
また、本願明細書において、「相同性」の用語は、「同一性」の意味で用いている。
【００１８】
上記のプライマー対は、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号３で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号４で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
【００１９】
ここで、配列番号３は、配列番号１の３２６番目から３４５番目の部分である。また、配列番号４は、配列番号１の４８３番目から５０２番目の部分の相補鎖である。
【００２０】
核酸増幅においては増幅産物長が短いほど増幅に要する時間は短くなる。発明者らはＤＮＡ鎖伸長反応を１サイクルあたり５秒以内で完了させるためには増幅産物長が４００塩基未満であることが望ましいことを見出した。
配列番号３はｎｕｃ遺伝子のセンス鎖に由来する配列であり、配列番号４はアンチセンス鎖に由来する配列である。
上記のプライマー対は（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当すれば特に限定されるものではないが、センス鎖に由来する配列とアンチセンス鎖に由来する配列の組合せでなければならない。
【００２１】
これらのプライマー対を選択することにより、従来と比較して短時間でも正確に黄色ブドウ球菌を検出する効果がある。
【００２２】
このようなプライマー対として、特に、フォワードプライマーとして配列番号７、８、９、１０のいずれかで示される塩基配列、および／または、リバースプライマーとして配列番号１１、１２、１３、１４のいずれかで示される塩基配列、の組合せが好ましい。
【００２３】
［２］被検核酸の増幅
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００２４】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、黄色ブドウ球菌の血液培養試料や生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。
【００２５】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、血液などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００２６】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述のプライマー対を用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００２７】
本発明のＭＲＳＡの検出方法における核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００２８】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００２９】
本発明プローブが含まれる反応系でｎｕｃ遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のｎｕｃ遺伝子またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にｎｕｃ遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００３０】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−  ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるｎｕｃ遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００３１】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００３２】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製、商標）を用いることが好ましい。
【００３３】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績製、登録商標）」、「ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、商標）」、「ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
【００３４】
［ＤＮＡ合成活性］
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００３５】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：  ４０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ          塩化マグネシウム
１５ｍＭ          ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ：  ２μｇ／μｌ      活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：  １．５ｍＭ        ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：  ２０％            トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：  １μｇ／μｌ      キャリアーＤＮＡ
【００３６】
［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８  ａｔ  ２５℃），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  ６ｍＭ  硫酸アンモニウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．００１％  ＢＳＡ，５  μｇ  トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００３７】
［３］黄色ブドウ球菌由来の核酸増幅産物とプローブとの複合体形成
本発明のＭＲＳＡの検出方法においては、工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
【００３８】
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００３９】
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００４０】
本発明のＭＲＳＡの検出方法において、配列番号２４で示される、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を検出するためのプローブは、ｎｕｃ遺伝子の３８６〜４０５位に相補的な配列で構成されている。
配列番号２５で示される本発明のプローブも、ｎｕｃ遺伝子の３５８〜３７６位に相補的な配列で構成されている。
【００４１】
上記のプローブは、配列番号２４または２５に示される核酸配列が好ましいが、ｎｕｃ遺伝子と相補的な連続した１０塩基以上３０塩基以下の核酸配列またはこれに相補的な核酸配列であれば、特に限定されない。
【００４２】
上記のプローブは、後述の融解曲線解析によってｎｕｃ遺伝子の塩基配列中に変異の有無があるかを識別することができる。
本発明プローブは野生型ｎｕｃ遺伝子と完全に相補的な塩基配列であるため、ｎｕｃ遺伝子中の本発明プローブが結合する部分領域の野生型と変異型とを識別することができる。
【００４３】
発明者らはｎｕｃ遺伝子の４０２位にしばしば置換変異が現れることを見出した。４０２位の塩基はチミンであるが、黄色ブドウ球菌の中にｎｕｃ遺伝子の４０２位がしばしばシトシンに置換された株が散見された。配列番号２４で表される本発明プローブは４０２位を含む部分領域と相補的であるため、４０２位の変異を検出することが可能である。
ｎｕｃ遺伝子の４０２位はチミンでもシトシンでもアミノ酸には変化が無い。従って、上記変異は黄色ブドウ球菌の形質には影響を与えないものと考えられる。
【００４４】
上記のような遺伝子変異はしばしば株の識別に利用できる。例えば、特定の地域や施設で流行した黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子４０２位が置換変異型であった場合、新たに黄色ブドウ球菌に感染した患者から採取した黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子の４０２位を調べることで、当該患者が保有する黄色ブドウ球菌が過去に流行した株と同一である可能性を探ることができる。
【００４５】
［４］核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出
上記で得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、融解曲線分析による方法が挙げられる。
【００４６】
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００４７】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のＭＲＳＡの検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
【００４８】
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
【００４９】
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００５０】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００５１】
本発明のＭＲＳＡの検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００５２】
得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００５３】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００５４】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００５５】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００５６】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５７】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００５８】
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００５９】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６０】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【００６１】
［５］メチシリン耐性遺伝子由来の核酸を検出する手段
また、本発明のＭＲＳＡの検出方法においては、さらに、試料中のメチシリン耐性遺伝子由来の核酸を検出する手段として、以下の（５）〜（８）の工程を含ませることができる。これにより、黄色ブドウ球菌由来の核酸と、メチシリン耐性遺伝子由来の核酸とを、同時に検出することができ、正確な検査結果をより迅速に臨床現場に提供することが可能になる。
（５）ＭＲＳＡのメチシリン耐性遺伝子の領域を特異的に増幅する１対のプライマー対を用意する。
（６）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する。
（７）工程（６）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
（８）工程（７）で得られた複合体を検出する。
【００６２】
本発明のＭＲＳＡの検出方法において、メチシリン耐性遺伝子由来の核酸領域を特異的に増幅する１対のプライマー対は、配列番号２で示されるｍｅｃＡ遺伝子と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対である。
上記において、配列番号２との核酸配列の相同性は、好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは１００％（すなわち配列番号２そのもの）である。
【００６３】
上記のプライマー対は、以下の（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれか１つ以上に該当する。
（ＩＩＩ）フォワードプライマーが、配列番号５で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＶ）リバースプライマーが、配列番号６で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
【００６４】
ここで、配列番号５は、配列番号２の３６６番目から３８５番目の部分である。また、配列番号６は、配列番号２の５２４番目から５４３番目の相補鎖の部分である。
配列番号５ｍｅｃＡ遺伝子のセンス鎖に由来する配列であり、配列番号６はアンチセンス鎖に由来する配列である。
上記のプライマー対は（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれか１つ以上に該当すれば特に限定されるものではないが、センス鎖に由来する配列とアンチセンス鎖に由来する配列の組合せでなければならない。
【００６５】
これらのプライマー対を選択することにより、従来と比較して短時間でも正確にメチシリン耐性遺伝子を検出する効果がある。また、これらのプライマー対で検出されるメチシリン耐性遺伝子はＭＲＳＡ由来のメチシリン耐性遺伝子には限定されず、表皮ブドウ球菌などのメチシリン耐性遺伝子も検出することができる。従って本発明のプライマー対はＭＲＳＡ以外の菌由来のメチシリン耐性遺伝子の検出に使用してもよい。
【００６６】
このようなプライマー対として、特に、フォワードプライマーとして配列番号１５、１６、１７、１８、１９のいずれかで示される塩基配列、および／または、リバースプライマーとして配列番号２０、２１、２２、２３のいずれかで示される塩基配列、の組合せが好ましい。
【００６７】
メチシリン耐性遺伝子由来の核酸を増幅する工程に用いられる具体的な核酸増幅方法は特に限定されず、本書の上記［２］で記載された方法を用いることができる。黄色ブドウ球菌由来の核酸と、メチシリン耐性遺伝子由来の核酸とで同じ増幅法を用いることが好ましい。また、試料中のメチシリン耐性遺伝子由来の核酸を増幅する工程は、試料中の黄色ブドウ球菌由来の核酸を増幅する工程と、別々に行っても良いし、同時に行っても良い。
【００６８】
上記メチシリン耐性遺伝子由来の核酸を検出する手段においては、工程（６）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
【００６９】
その工程で用いるプローブは、前述のように、ｍｅｃＡ遺伝子の変異の検出に使用することができる。複合体の形成方法は、何ら制限されず、被検核酸と前記プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。
【００７０】
本発明のＭＲＳＡの検出方法において、メチシリン耐性遺伝子に特異的なｍｅｃＡ遺伝子の領域を検出するためのプローブは、ｍｅｃＡ遺伝子と相補的な連続した１０塩基以上３０塩基以下の核酸配列またはこれに相補的な核酸配列であれば特に限定されるものではないが、配列番号２６または配列番号２７で示される塩基配列を有するものが例示できる。
【００７１】
上記で得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、本書の上記［４］で記載された方法を用いることができる。融解曲線分析による方法が挙げられる。
【００７２】
［６］プライマーセット
本発明のプライマーセットは、上記のＭＲＳＡ検出方法に用いることが出来る。
その一態様は、黄色ブドウ球菌に特異的なｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅することができる、配列番号３で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号４で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーから構成されるプライマーセットである。
ｎｕｃ遺伝子の領域を特異的に増幅することができるプライマーセットとして、好ましくは、配列番号７、８、９、１０、のいずれかで示される塩基配列であるフォワードプライマー、および、配列番号１１、１２、１３、１４のいずれかで示される塩基配列であるリバースプライマーから構成される、項１１に記載のプライマーセットである。
【００７３】
本発明のプライマーセットは、上記のプライマーセットに加えて、さらに、メチシリン耐性遺伝子由来の核酸領域を特異的に増幅することができる、配列番号５で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマー、および、配列番号６で示される塩基配列を含む２０塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーから構成されるプライマーセットを含んでいてもよい。
メチシリン耐性遺伝子由来の核酸領域を特異的に増幅することができるプライマーセットとして、好ましくは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９のいずれかで示される塩基配列であるフォワードプライマー、および、配列番号２０、２１、２２、２３のいずれかで示される塩基配列であるリバースプライマーから構成されるプライマーセットである。
［７］ＭＲＳＡ検出キット
本発明のＭＲＳＡ検出キットは、上記のプライマーセットのうちいずれかを含み、上記のＭＲＳＡ検出方法に用いることが出来る。該キットは、核酸プローブと、ＤＮＡポリメラーゼとを含み、そのほかに、反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００７５】
〔実施例１：ＭＲＳＡ由来ＤＮＡからのｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ  ＡＵＲＥＵＳ  （ｍｅｃＡ＋）  ＤＮＡ  ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１００（コピー／μｌ）に調製し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりｎｕｃ遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７６】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、核酸プライマーの組み合わせについては表１に記載した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号７、８、９、１０のいずれか１本）０．２μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１１、１２、１３、１４のいずれか１本）０．４μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２４、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料３μｌ
【００７７】
【表１】
2013048619.tif 000002
【００７８】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５０℃・５秒
６３℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００７９】
結果
図１は、表１の組み合わせＮｏ．１で示されるプライマー対を用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１より明らかなように、黄色ブドウ球菌の遺伝子が検出されている。なお、本実施例では増幅開始から検出終了まで約４５分で完了しており、非特許文献４に記載の各方法よりもさらに迅速性に優れる検査方法である。
また、図２から図１０は、それぞれ表１の組み合わせＮｏ．２から１０で示されるプライマー対を用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでも黄色ブドウ球菌のｎｕｃ遺伝子が検出されており、本発明のｎｕｃ遺伝子検出用核酸プライマーはいずれもｎｕｃ遺伝子の迅速検出に有効であることが示された。
【００８０】
〔実施例２：ＭＲＳＡ由来ＤＮＡからのｍｅｃＡ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００８１】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、核酸プライマーの組み合わせについては表２に記載した。
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１５、１６、１７、１８、１９のいずれか１本）０．４μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号２０、２１、２２、２３のいずれか１本）０．２μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２６、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料３μｌ
【００８２】
【表２】
2013048619.tif 000003
【００８３】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００８４】
結果
図１１は、表１の組み合わせＮｏ．１で示されるプライマー対を用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１１より明らかなように、ｍｅｃＡ遺伝子が検出されている。また、図１２から図１８は、それぞれ表１の組み合わせＮｏ．２から９で示されるプライマー対を用いて、同様の実験を行った結果である。いずれの組み合わせでも黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子が検出されており、本発明のｍｅｃＡ遺伝子検出用核酸プライマーはいずれもｍｅｃＡ遺伝子の迅速検出に有効であることが示された。
【００８５】
〔実施例３：異なる核酸プローブを用いたＭＲＳＡ由来ＤＮＡからのｎｕｃ遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例１と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００８６】
試薬
以下の試薬を含む溶液を調製した。なお、核酸プライマーの組み合わせについては表３に記載した。
１０μＭ核酸プライマー（配列番号７、９のいずれか１本）０．４μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号１１、１２のいずれか１本）０．２μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２５、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．４μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
試料３μｌ
【００８７】
【表３】
2013048619.tif 000004
【００８８】
結果
図１９は組み合わせＮｏ．１、図２０は組み合わせＮｏ．２で示されるプライマー対を用いて核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。いずれのプライマー対でもｎｕｃ遺伝子が検出されており、配列番号２５で示される核酸プローブもｎｕｃ遺伝子検出に適していることが示される。
【００８９】
〔実施例４：ＭＲＳＡ由来ＤＮＡからのｎｕｃ遺伝子およびｍｅｃＡ遺伝子の同時検出〕
上記の実施例１における組み合わせ番号１と、実施例２における組み合わせ番号１のプライマーセットおよびプローブを用いて核酸増幅を行い、ｎｕｃ遺伝子およびｍｅｃＡ遺伝子の同時検出を行った。
（１）資料の調製
血液培養ボトルにて培養された黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）からフェノールクロロホルム抽出法によって抽出したＤＮＡ（約１００コピー／μｌ）を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００９０】
試薬
ｎｕｃ遺伝子検出用試薬は実施例１と、ｍｅｃＡ遺伝子検出用試薬は実施例２と同じ。
【００９１】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００９２】
結果
本実施例の融解曲線解析の結果を図２３および図２４に示した。図のＲｅｓｕｌｔは検出結果を示しており、ｎｕｃのｍは４０２位に変異が入った変異型ｎｕｃ遺伝子が検出されたことを、Ｗは野生型のｎｕｃ遺伝子が検出されたことを示す。ｍｅｃＡの−はｍｅｃＡ遺伝子が検出されなかったことを、ＲはｍｅｃＡ遺伝子が検出されたことを示す。また、ＰｅａｋＴｍ１は検出ピークが現れた時の温度を、ＰｅａｋＦ１はピークの蛍光微分値を示している。
図２３ではｎｕｃ遺伝子がｍ、ｍｅｃＡが−であり、試料であるＭＳＳＡ  ＤＮＡはメチシリン耐性遺伝子を持っておらず、なおかつｎｕｃ遺伝子が変異型であることが明らかとなった。図２４ではｎｕｃ遺伝子がＷ、ｍｅｃＡがＲであり、試料であるＭＲＳＡＤＮＡはｎｕｃ遺伝子とｍｅｃＡ遺伝子の両方を有することが明らかになった。
以上から、本発明のプライマー・プローブを用いてｎｕｃ遺伝子とｍｅｃＡ遺伝子を同時に調べることでＭＳＳＡとＭＲＳＡの識別を容易に行うことが可能である。また、ｎｕｃ遺伝子については４０２位の変異を検出できることが示唆された。
【００９３】
〔比較例１：ｎｕｃ遺伝子検出における増幅産物長限定効果〕
（１）試料の調製
ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ  ＡＵＲＥＵＳ  （ｍｅｃＡ＋）  ＤＮＡ  ＣＯＮＴＲＯＬ（Ｖｉｒｃｅｌｌ社製）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で２５コピー／μｌに調製し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００９４】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。核酸プライマーは本発明に記載の核酸プライマー（配列番号７、１１）および発明効果比較用核酸プライマー（配列番号２８、２９）を用いた。
［試薬組成１］
１００μＭ核酸プライマー（配列番号７）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１１）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２４、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
水０．２５μｌ
試料  １μｌ
［試薬組成２］
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
１００μＭ核酸プライマー（配列番号２８）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号２９）０．３μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２４、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
水０．２５μｌ
試料  １μｌ
【００９５】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００９６】
結果
本比較例は核酸増幅産物長がｎｕｃ遺伝子検出に及ぼす影響を見たものである。核酸プライマー７、１１による核酸増幅では増幅産物長は１８８ｂｐとなる。一方、核酸プライマー２８、２９による核酸増幅では増幅産物長は５０９ｂｐとなる。
本比較例の結果は図２１で表される。増幅産物長が短くなるよう設計した核酸プライマーを含む試薬組成１で核酸増幅および検出を行うと、２５コピーのＤＮＡからｎｕｃ遺伝子を検出した。しかし、増幅産物長が長くなるよう設計した核酸プライマーを含む試薬組成２で核酸増幅および検出を行うと、２５コピーのＤＮＡからｎｕｃ遺伝子を検出することはできなかった。以上から、増幅産物長を短く限定すると遺伝子検査の感度が向上することが示された。
【００９７】
〔比較例２：ｍｅｃＡ遺伝子検出における増幅産物長限定効果〕
（１）試料の調製
比較例１と同じ
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【００９８】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。核酸プライマーは本発明に記載の核酸プライマー（配列番号１５、２０）および発明効果比較用核酸プライマー（配列番号３０、３１）を用いた。
［試薬組成１］
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１５）０．３μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号２０）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２６、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
水０．２５μｌ
試料  １μｌ
［試薬組成２］
１０μＭ核酸プライマー（配列番号３０）０．３μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号３１）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号２６、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
水０．２５μｌ
試料  １μｌ
【００９９】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例１と同じ。
【０１００】
結果
本比較例は核酸増幅産物長がｍｅｃＡ遺伝子検出に及ぼす影響を見たものである。核酸プライマー１５、２０による核酸増幅では増幅産物長は２０５ｂｐとなる。一方、核酸プライマー３０、３１による核酸増幅では増幅産物長は４１８ｂｐとなる。
本比較例の結果は図２２で表される。増幅産物長が短くなるよう設計した核酸プライマーを含む試薬組成１で核酸増幅および検出を行うと、２５コピーのＤＮＡからｍｅｃＡ遺伝子を検出した。しかし、増幅産物長が長くなるよう設計した核酸プライマーを含む試薬組成２で核酸増幅および検出を行うと、２５コピーのＤＮＡからｍｅｃＡ遺伝子を検出することはできなかった。以上から、ｎｕｃ遺伝子検査の場合（比較例１）と同様に、ｍｅｃＡ遺伝子検査においても増幅産物長を短く限定すると遺伝子検査の感度が向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明を黄色ブドウ球菌の遺伝子検査に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度に黄色ブドウ球菌を検出することができる。さらに、メチシリン耐性の有無を適切に識別できる。また、黄色ブドウ球菌以外の菌のメチシリン耐性遺伝子の有無も識別できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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