(57)【要約】【課題】ＡＴＬＬ（成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫）、特に高悪性型（急性型もしくはリンパ腫型）ＡＴＬＬの発症を早期に高感度・高精度に診断することを可能にする手段を提供すること。【解決手段】健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下「（活性化）ＣＤ４陽性Ｔ細胞等」と表記する）、ＨＴＬＶ−Ｉ（ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型）キャリアー由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等、くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等、あるいはＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株またはＡＴＬＬ非腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量を基準としたときに、くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞等、急性型もしくはリンパ腫型ＡＴＬＬ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞等、あるいはＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量の当該基準に対する比率が、２倍以上または０．５倍以下であるｍｉＲＮＡおよびこれらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量するステップを有することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＨＴＬＶ−Ｉ（ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型）キャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ（成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫）患者由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、あるいはＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株またはＡＴＬＬ非腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量を基準としたときに、
くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者から採取した末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、急性型もしくはリンパ腫型ＡＴＬＬ患者から採取した末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、あるいはＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量の当該基準に対する比率が、２倍以上または０．５倍以下であるｍｉＲＮＡおよびこれらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種の定量対象ｍｉＲＮＡについて、
サンプル中の発現量を定量するステップを有することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。
【請求項２】
前記定量対象ｍｉＲＮＡが、
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183、hsa-miR-23a、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-525*、hsa-miR-124a、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-768-5p；
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-365、hsa-miR-490、hsa-miR-550、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-155、hsa-let-7a；および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡである、請求項１に記載のデータ取得方法。
【請求項３】
前記定量対象ｍｉＲＮＡが、
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-525*、hsa-miR-124a、hsa-miR-342；
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-9*、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9；および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡである、請求項１に記載のデータ取得方法。
【請求項４】
前記定量対象ｍｉＲＮＡが、
hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-486、hsa-miR-124a、hsa-miR-525*、hsa-miR-150、hsa-miR-363；
hsa-miR-296、hsa-miR-15b、hsa-miR-484、hsa-miR-16、hsa-miR-195、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-550、hsa-miR-422b；および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡである、請求項１に記載のデータ取得方法。
【請求項５】
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183およびhsa-miR-23aからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、あるいはそのモデルとしてのＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、０．５倍以下であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項１に記載のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。
【請求項６】
hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-34a、hsa-miR-525*、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-124a、hsa-miR-34b、hsa-miR-125a、hsa-miR-342、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-625、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-660、hsa-let-7b、hsa-miR-582、hsa-miR-22、hsa-miR-26aおよびhsa-miR-768-5pからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、０．５倍以下であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項１に記載のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。
【請求項７】
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186およびhsa-miR-769-5pからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、２倍以上であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項１に記載のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。
【請求項８】
hsa-miR-9*、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-490、hsa-miR-196b、hsa-miR-550、hsa-let-7c、hsa-miR-571、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-320、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-296、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-301、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-152、hsa-miR-155およびhsa-let-7aからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、２倍以上であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、請求項１に記載のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。
【請求項９】
前記ＡＴＬＬの診断のためのデータが、少なくとも急性型ＡＴＬＬの診断のためのデータを含むものである、請求項１〜８のいずれかに記載のデータ取得方法。
【請求項１０】
hsa-miR-34aについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、０．５倍以下であるかどうかを判定するステップを有し、
急性型ＡＴＬＬ、くすぶり型ＡＴＬＬまたはその両方の診断のためのデータを取得することを特徴とする、
請求項１に記載のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。
【請求項１１】
hsa-miR-99aまたはhsa-miR-125bについて、
サンプル中の発現量を定量するステップ、および
健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、２倍以上であるかどうかを判定するステップを有し、
急性型ＡＴＬＬ、くすぶり型ＡＴＬＬまたはその両方の診断のためのデータを取得することを特徴とする、請求項１に記載のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法。
【請求項１２】
前記定量対象ｍｉＲＮＡを定量ＲＴ−ＰＣＲ法により定量する、請求項１〜１１のいずれかに記載のデータ取得方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のデータ取得方法において定義される前記定量対象ｍｉＲＮＡを定量するためのキットであって、少なくとも当該定量対象ｍｉＲＮＡを増幅するためのプライマーを内容物に含むことを特徴とする、ＡＴＬＬ診断用キット。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載のデータ取得方法において定義される前記定量対象ｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量する定量手段と、
前記ｍｉＲＮＡについての基準となる発現量および発現量比率の条件を記録した記録手段と、
前記定量手段により得られた定量対象ｍｉＲＮＡの発現量の測定データを、前記記録手段に記録された定量対象ｍｉＲＮＡの発現量の基準データと比較し、当該定量対象ｍｉＲＮＡの発現量比率の条件を満たす場合、前記サンプルはくすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来のもの、または急性型もしくはリンパ腫型ＡＴＬＬ患者由来のものであると判定し、それ以外の場合には、前記サンプルは健常者、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー、または前記の型以外のＡＴＬＬ患者由来のものであると判定する判定手段と、
前記判定手段の判定結果を出力する出力手段と
を備えることを特徴とする、ＡＴＬＬ診断システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（human T-cell leukemia virus I、ＨＴＬＶ−Ｉ）キャリアーが成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（Adult T cell leukemia/lymphoma, ＡＴＬＬ）、特に高悪性型ＡＴＬＬを発症するのを早期に診断するためなどに有用な、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法、および当該方法を実施するためのキットおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＬＬは、その原因ウイルスであるＨＴＬＶ−Ｉのキャリアーの中から日本で年間約７００例が発症、キャリアー１０００人あたりの年間ＡＴＬＬ発症率は男性で１.０〜１．５人、女性で０．５〜０．７人、３０歳以上のキャリアーで生涯発症率は男性で４〜７％、女性で２％台となる難治性の白血病・リンパ腫である。現在日本で約１０８万人、世界で約２０００万人のキャリアーが存在する。
【０００３】
ＡＴＬＬは、ＨＴＬＶ−ＩがＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染し、細胞−細胞間で感染し、長い潜伏期間の中で免疫機構から逃れたクローンが遺伝子異常、染色体異常、エピジェネティックな異常などを集積して、細胞を腫瘍化させることで発症すると考えられている。ＨＴＬＶ−Ｉのキャリアーの３〜５％が、ＨＴＬＶ−Ｉ感染後４０〜６０年してＡＴＬＬを発症する。また、感染経路は主として母乳感染、輸血、性交である。
【０００４】
ＡＴＬＬには、くすぶり型、慢性型、リンパ腫型および急性型の４つの病型が存在し、急性型およびリンパ腫型は治療抵抗性で、予後は極めて不良であるといわれている。実際、図１はある研究者により作成されたＡＴＬＬ患者の臨床病型別生存曲線であるが、この図を見ればわかるように、急性型およびリンパ腫型ＡＴＬＬの患者の生存率は、観察開始から１年以内に５０％以下にまで低下する。
【０００５】
このような難治性のＡＴＬＬの従来の診断方法は、患者の末梢血における腫瘍細胞の同定の他、リンパ節腫脹、肝脾腫、高カルシウム血症などＡＴＬＬに特異的な臨床症状を基準とするものである。しかし、このような方法では、特に急性型やリンパ腫型ＡＴＬＬでは、発症し、症状が出始めた段階にならなければ診断ができず、それゆえ早期にこれらを診断することができないため、治療が手遅れになってしまう可能性がある。
【０００６】
ここで、特許文献１に示されるように、本発明者は、ＡＴＬＬの予後を推定するためのデータの収集において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の特定の遺伝子群について、それらの遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ島のメチル化状態を測定することにより、前記遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ島のメチル化プロファイルを作成するとともに、予後因子としてＣＩＭＰを算出し、メチル化遺伝子、メチル化遺伝子数及びＣＩＭＰ値から算出されるＡＴＬＬ発症・進展危険度スコアによる危険度の階層化および／または特定の遺伝子のメチル化状態を表示することにより、ＨＴＬＶ-Ｉのキャリアーの発症またはindolent型（緩徐進行型)であるくすぶり型および慢性型ＡＴＬＬがaggressive型（高悪性型）である急性型およびリンパ腫型ＡＴＬＬへの進展を予測することを可能とするＡＴＬＬ予後推定用データを作成する方法を開発している。
【０００７】
ところで、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とは、１９〜２５塩基程度のタンパク質をコードしないＲＮＡであり、ｍＲＮＡの３'非翻訳領域に結合し、リボソームにおける翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡを直接切断して、翻訳を阻害する。現在８５１種類のｍｉＲＮＡがヒトで同定されており、１つのｍｉＲＮＡが１００個以上の遺伝子（由来のｍＲＮＡ）を標的としている。
【０００８】
このようなｍｉＲＮＡは、通常細胞では適切な量が作られており、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、幹細胞の維持、細胞増殖や発生・分化、細胞死といった細胞の生命現象を適切に制御していると考えられている（非特許文献１参照）。実際、あるｍｉＲＮＡが大腸癌に関連することが知見されている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２５４３５７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Esquela-Kerscher A & Slack F.J.Nature Reviews Cancer (6): 259-269, (2006)
【非特許文献２】Tazawa et al., PNAS 2007, vol.104, No.39, 15472-15477
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＨＴＬＶ-ＩのキャリアーのＡＴＬＬの発症、特に高悪性型ＡＴＬＬの発症を早期に高感度・高精度に診断したり、さらにはＡＴＬＬの治療効果の判定や、ＡＴＬＬの再発の兆候（高悪性型ＡＴＬＬの発症には至らない程度の腫瘍細胞の再増殖）を早期に発見し、再発を予防したりすることを可能とする手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、特定のｍｉＲＮＡの発現量とＡＴＬＬの発症、特に高悪性型ＡＴＬＬの発症との間に関連があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＨＴＬＶ−Ｉ（ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型）キャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、あるいはＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株またはＡＴＬＬ非腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量を基準としたときに、くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者から採取した末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、急性型もしくはリンパ腫型ＡＴＬＬ患者から採取した末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、あるいはＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量の当該基準に対する比率が、２倍以上または０．５倍以下であるｍｉＲＮＡおよびこれらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種の定量対象ｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量するステップを有することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法を提供する。
【００１４】
前記定量対象ｍｉＲＮＡとしては、たとえば、
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183、hsa-miR-23a、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-525*、hsa-miR-124a、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-768-5p；
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-365、hsa-miR-490、hsa-miR-550、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-155、hsa-let-7a；および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００１５】
このうち、好ましい定量対象ｍｉＲＮＡとしては、たとえば、
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-525*、hsa-miR-124a、hsa-miR-342；
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-9*、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9；および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００１６】
さらに、特に好ましい定量対象ｍｉＲＮＡとしては、たとえば、
hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-486、hsa-miR-124a、hsa-miR-525*、hsa-miR-150、hsa-miR-363；
hsa-miR-296、hsa-miR-15b、hsa-miR-484、hsa-miR-16、hsa-miR-195、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-550、hsa-miR-422b；および
これらの変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００１７】
上記のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法は、より具体的には、次のような実施形態をとることができる。
【００１８】
第１の実施形態として、hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183およびhsa-miR-23aからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量するステップ、およびＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞、あるいはそのモデルとしてのＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、０．５倍以下であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法が挙げられる。
【００１９】
第２の実施形態として、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-34a、hsa-miR-525*、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-124a、hsa-miR-34b、hsa-miR-125a、hsa-miR-342、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-625、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-660、hsa-let-7b、hsa-miR-582、hsa-miR-22、hsa-miR-26aおよびhsa-miR-768-5pからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量するステップ、および健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、０．５倍以下であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法が挙げられる。
【００２０】
第３の実施形態として、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186およびhsa-miR-769-5pからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量するステップ、およびＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、２倍以上であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法が挙げられる。
【００２１】
第４の実施形態として、hsa-miR-9*、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-490、hsa-miR-196b、hsa-miR-550、hsa-let-7c、hsa-miR-571、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-320、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-296、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-301、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-152、hsa-miR-155およびhsa-let-7aからなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量するステップ、および健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、２倍以上であるかどうかを判定するステップを有することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法が挙げられる。
【００２２】
このようなＡＴＬＬの診断のためのデータは、少なくとも急性型ＡＴＬＬの診断のためのデータを含むものであることが好ましい。
さらに具体的な実施形態として、hsa-miR-34aについて、サンプル中の発現量を定量するステップ、および健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、０．５倍以下であるかどうかを判定するステップを有し、急性型ＡＴＬＬ、くすぶり型ＡＴＬＬまたはその両方の診断のためのデータを取得することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法が挙げられる。
【００２３】
また、hsa-miR-99aまたはhsa-miR-125bについて、サンプル中の発現量を定量するステップ、および健常者由来の末梢血、末梢血単核球または活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中の発現量に対する、前記サンプル中の発現量の比率が、２倍以上であるかどうかを判定するステップを有し、急性型ＡＴＬＬ、くすぶり型ＡＴＬＬまたはその両方の診断のためのデータを取得することを特徴とする、ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法も挙げられる。
【００２４】
これらの定量対象ｍｉＲＮＡを定量するための方法としては、定量ＲＴ−ＰＣＲ法が好適である。
また、本発明は上述したようなデータ取得方法を実施することのできる高悪性型ＡＴＬＬ診断用キットとして、上述したようなデータ取得方法において定義される前記定量対象ｍｉＲＮＡを定量するためのキットであって、少なくとも当該定量対象ｍｉＲＮＡを増幅するためのプライマーを内容物に含むことを特徴とする、ＡＴＬＬ診断用キットを提供する。
【００２５】
さらに本発明は、上述したようなデータ取得方法を実施し、高悪性型ＡＴＬＬの診断を行うことができる高悪性型ＡＴＬＬ診断システムとして、上述したようなデータ取得方法において定義される前記定量対象ｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量する定量手段と、前記定量対象ｍｉＲＮＡについての基準となる発現量および発現量比率の条件を記録した記録手段と、前記定量手段により得られた定量対象ｍｉＲＮＡの定量データを、前記記録手段に記録された定量対象ｍｉＲＮＡの発現量の基準データと比較し、当該定量対象ｍｉＲＮＡの比率の条件を満たす場合、前記サンプルはくすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来のもの、または急性型もしくはリンパ腫型ＡＴＬＬ患者由来のものであると判定し、それ以外の場合には、前記サンプルは健常者、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー、または前記の型以外のＡＴＬＬ患者由来のものであると判定する判定手段と、前記判定手段の判定結果を出力する出力手段とを備えることを特徴とする、ＡＴＬＬ診断システムを提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、ＡＴＬＬ、特に高悪性型ＡＴＬＬの発症の早期診断、治療効果の判定、および再発の予防を行う上で有用なデータを取得することができるようになる。なお、ｍｉＲＮＡは比較的安定であり、塩基長も短いため、特定のｍｉＲＮＡの定量を通じて実施する本発明は、遺伝子を取り扱う特許文献１に記載の方法よりも操作に熟練を要せず、より簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＡＴＬＬ患者の臨床病型別生存曲線を示す（かっこ内の数値は観察した患者数を表す）。
【図２】図２は、実施例の（４）マイクロアレイ解析における、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来培養細胞株（縦軸：ATL）およびＨＴＬＶ−１感染させ不死化した培養感染株（横軸：HTVL-I immortal-1）の各ｍｉＲＮＡの発現量（シグナル）を比較した散布図である。
【図３】図３は、上記図２に対応する、各ｍｉＲＮＡの、ＨＴＬＶ−１感染させ不死化した培養感染株中の発現量に対する高悪性型ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来培養細胞株の発現量の比率（横軸）とそのＰ値（縦軸）を表す散布図である（網掛け部分は上記比率が１／２倍以下の範囲である）。
【図４】図４は、実施例の（５）Real-Time RT-PCR解析における、培養細胞株についてのhsa-miR-34aの発現量を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例の（５）Real-Time RT-PCR解析における、患者検体についてのhsa-miR-34aの発現量を示すグラフである。
【図６】図６は、（ａ）同一患者がくすぶり型ＡＴＬＬから急性型ＡＴＬＬに進展した症例における臨床データ（WBC：白血球数、Abnorm lymph：異形リンパ球、sIL2R：可溶性IL2R、LDH：LDH値）および（ｂ）Real-Time RT-PCR解析による各時点でのhas-miR-34aの発現量を示すグラフである。
【図７】図７は、くすぶり型ＡＴＬＬおよび急性型ＡＴＬＬにおける、has-miR-125bおよびhas-miR-99aの発現量（TaqMan miRNA assayによる定量PCR）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明のＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法、ＡＴＬＬ診断用キットおよびＡＴＬＬ診断システムの順に説明する。
−（高悪性型）ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法−
本発明の（高悪性型）ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法（以下単に「本発明のデータ取得方法」ともいう）は、診断対象者（患者）から採取されたサンプル中の、特定のｍｉＲＮＡ（本発明において「定量対象ｍｉＲＮＡ」と称する。）の発現量を定量するステップを含む。
【００２９】
サンプルは、末梢血（全血）であってもよいし、末梢血から分離した末梢血単核球（ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞を含有する混合物）であってもよいし、末梢血または末梢血単核球から分離した、あるいは末梢血等以外のサンプルから分離したＣＤ４陽性Ｔ細胞であってもよい。すなわち、定量対象ｍｉＲＮＡは、末梢血（全血）に含まれる量を定量しても、末梢血単核球に含まれる量を定量しても、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に含まれる量を定量してもよいが、前者２つの定量値は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に含まれる量とほぼ同量とみなすことができる。以下の説明において、上記のように末梢血（全血）、末梢血単核球または（活性化）ＣＤ４陽性Ｔ細胞の形態をとりうるサンプルを「（活性化）ＣＤ４陽性Ｔ細胞等」と総称する。
【００３０】
［定量対象ｍｉＲＮＡ］
後述する実施例から明らかなように、（高悪性型）ＡＴＬＬの発症時には特定のｍｉＲＮＡの発現量が大きく変化する（典型的には２倍以上に増加するまたは０．５倍以下に減少する）ため、これを検出することにより（高悪性型）ＡＴＬＬの診断をすることができる。
【００３１】
診断の対象とするＡＴＬＬは、低悪性型（くすぶり型もしくは慢性型）ＡＴＬＬであってもよいし、高悪性型（急性型もしくはリンパ腫型）ＡＴＬＬであってもよい。たとえば、後述する実施例に示すように、くすぶり型ＡＴＬＬおよび急性型ＡＴＬＬを診断の対象とすることができる。本発明では高悪性型、特に急性型ＡＴＬＬを診断の対象とすることが好適である。そのため、本明細書の記載において用語「ＡＴＬＬ」の前に括弧書きで「高悪性型」と付記する場合があるが、その記載事項は「低悪性型」のものにも同様に適用可能である。
【００３２】
本発明のデータ取得方法における定量ステップを実施する際の、発現量を定量する対象となるｍｉＲＮＡ（定量対象ｍｉＲＮＡ）を選択する上で、あらかじめ上記のような発現量の変化を起こすｍｉＲＮＡを決定しておく必要がある。
【００３３】
定量対象ｍｉＲＮＡを決定するためには、まず、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞等、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー（ＨＴＬＶ−Ｉに感染はしているがＡＴＬＬを発症していないものを指す。）、くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等、あるいはＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株またはＡＴＬＬ非腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量を定量し、そのデータ（Ａ）を取得する。
【００３４】
一方で、くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞等、急性型もしくはリンパ腫型ＡＴＬＬ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞等、あるいはＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量を定量し、そのデータ（Ｂ）を取得する。
【００３５】
そして、データ（Ａ）における発現量を基準としたときに、データ（Ｂ）における発現量の当該基準に対する比率が一定の値以上または一定の値以下であるｍｉＲＮＡを、定量対象ｍｉＲＮＡとして決定することができる。
【００３６】
定量対象ｍｉＲＮＡを決定する際のｍｉＲＮＡの定量手段は、後述する「定量ステップ」に用いるような手段、たとえばｍｉＲＮＡのマイクロアレイを用いた定量法や定量ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）法を用いればよい。それぞれの一般的なプロトコールに従い、たとえばマイクロアレイを用いる場合はトータルＲＮＡを揃えて標準化したり、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いる場合は内在性コントロールに基づき定量したりすればよい。
【００３７】
この際、データ（Ａ）および（Ｂ）の平均値を単純に算出して比較し、たとえばデータ（Ｂ）の平均値がデータ（Ａ）の平均値の２倍以上であるｍｉＲＮＡを判定基準比率（詳細は後述する。）を２倍とする定量対象ｍｉＲＮＡとして選択することができるが、データ（Ｂ）の平均値がデータ（Ａ）の平均値の１０倍以上であるｍｉＲＮＡ、あるいは統計学的な処理により一定の有意水準（たとえばｐ＜０．０５）においてデータ（Ｂ）の平均値がデータ（Ａ）の平均値の２倍以上であることが示されたｍｉＲＮＡを定量対象ｍｉＲＮＡとして選択することが好ましい。
【００３８】
データ（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれとして何を選択するかは、診断の目的や定量対象ｍｉＲＮＡの種類を考慮しながら、それぞれ適切なものを選択することができる。データ（Ａ）として「くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等」またはそのモデルとなる「ＡＴＬＬ非腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株」を選択した場合に、それと組み合わせるデータ（Ｂ）として、それと等しい「くすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等」を組み合わせることが不適切であることは自明である。
【００３９】
なお、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞が、何十年もかけて染色体異常を含む遺伝子構造異常、エピジェネティック異常（ＨＴＬＶ−Ｉ感染と関係のない異常も含まれる）を蓄積しているのに対し、ＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株（たとえば、後記実施例で用いられているIWA-1、MT4）は、純粋にＨＴＬＶ−Ｉ感染により引き起こされる異常を反映していると考えられるが、後者は前者のモデルとして扱うことができる。急性型ＡＴＬＬ患者由来で非腫瘍細胞（非白血病細胞）由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株（たとえば、後記実施例で用いられているATL16T、ATL35T、ATL45T、ED50823）は、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアーまたは低悪性型（くすぶり型または慢性型）ＡＴＬＬのモデルとして扱うことができる。また、急性型ＡＴＬＬ腫瘍細胞（白血病細胞）由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株（たとえば、後記実施例で用いられているATL43Tb、ATL55T、ED40515）は、高悪性型ＡＴＬＬ患者から採取したＣＤ４陽性腫瘍性Ｔ細胞のモデルとして扱うことができる。
【００４０】
たとえば、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアーが高悪性型ＡＴＬＬを発症していない状態（無症状）から高悪性型ＡＴＬＬを発症した状態に移行したかどうかを診断する場合は、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等またはＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量と比較して、高悪性型ＡＴＬＬ患者から採取したＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量が上昇しているｍｉＲＮＡを定量対象ｍｉＲＮＡとして選択することが適切である。
【００４１】
上記のようにして決定される定量対象ｍｉＲＮＡは、ＡＴＬＬ発症前、つまり健常者、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー、または診断対象以外の型のＡＴＬＬ患者における発現量を基準としたときに、この基準に対するＡＴＬＬ発症時の発現量の比率（以下「発症時比率」と称する。）が所定の比率以上または所定の比率以下であると推定されるものである。たとえば、急性型ＡＴＬＬについての定量対象ｍｉＲＮＡとしては、健常者、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー、またはくすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者における発現量を基準としたときに、急性型ＡＴＬＬ患者における発現量が所定の比率以上または所定の比率以下になるｍｉＲＮＡを選択することが適切である。一方、くすぶり型ＡＴＬＬについての定量対象ｍｉＲＮＡとしては、健常者またはＨＴＬＶ−Ｉキャリアーにおける発現量を基準としたときに、くすぶり型ＡＴＬＬ患者における発現量が所定の比率以上または所定の比率以下になるｍｉＲＮＡを選択することが適切である。
【００４２】
本発明では基本的に、２倍または０．５倍を「判定基準比率」とし、サンプル中の定量対象ｍｉＲＮＡの発現量が基準に対して２倍以上または０．５倍以下である場合に当該判定基準を満たすものとして取り扱うようにするが、必要に応じて上記判定基準比率を変更する（たとえば１０倍または０．１５倍）に変更することも可能である。
【００４３】
後記実施例に示すように、本発明では、発症時比率が２倍以上であると推定されるｍｉＲＮＡ（本発明において「ｍｉＲＮＡ群（Ｕ１）」と称する。）、および発症時比率が０．５倍以下であると推定されるｍｉＲＮＡ（本発明において「ｍｉＲＮＡ群（Ｄ１）」と称する。）が具体的に見いだされており、これらはそれぞれ、判定基準比率を２倍または０．５倍とする定量対象ｍｉＲＮＡとして利用することができる。これらのｍｉＲＮＡには、発症時比率が１０倍以上と推定されるｍｉＲＮＡ（本発明において「ｍｉＲＮＡ群（Ｕ２）」と称する。）および０．１５倍以下と推定されるｍｉＲＮＡ（本発明において「ｍｉＲＮＡ群（Ｄ２）」と称する。）も含まれており、これらを定量対象ｍｉＲＮＡとすることにより検出精度の向上を期待することができる。また、これらのｍｉＲＮＡには、Ｐ値が０．０５未満の確率をもって発症時比率が２倍以上であると推定されるｍｉＲＮＡ（本発明において「ｍｉＲＮＡ群（Ｕ３）」と称する。）および同じくＰ値が０．０５未満の確率をもって発症時比率が０．５倍以下であると推定されるｍｉＲＮＡ（本発明において「ｍｉＲＮＡ群（Ｄ３）」と称する。）も含まれており、これらを定量対象ｍｉＲＮＡとすることにより診断の信頼性を向上させることができる。上記ｍｉＲＮＡ群Ｕ１およびＵ２ならびにｍｉＲＮＡ群Ｄ１およびＤ２には、サンプル数等の関係によりＰ値が０．０５未満とはならなかったかもしれないものの、実用上有用な指標となり得るｍｉＲＮＡが含まれている可能性がある。
【００４４】
さらに、これらのｍｉＲＮＡには、進化の過程や個人差として形成された変異型（遺伝子多型）が存在しうるため、必要に応じて変異型のｍｉＲＮＡも定量対象ｍｉＲＮＡに含めることができる。
【００４５】
定量対象ｍｉＲＮＡとしては、上記の群から選ばれるいずれか一種を用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
なお、本発明に用いられる定量対象ｍｉＲＮＡの塩基配列は、その変異型も含めて、たとえばSanger miRBase database（http://www.mirbase.org/index.shtml）に公開されている。
【００４６】
また、本発明において使用することのできる定量対象ｍｉＲＮＡは、以下に具体的に記載する（後記実施例を通じて決定された）ｍｉＲＮＡに限定されるものではなく、同等の作用効果を奏する範囲において、他のｍｉＲＮＡを使用することが可能である。以下に具体的に記載するｍｉＲＮＡは、特に、高悪性型（急性型等）ＡＴＬＬの診断、すなわち無症状（健常者またはＨＴＬＶ−Ｉキャリアー）から高悪性型ＡＴＬＬの発症への変遷があったかどうかの判断のために有用である。しかしながら、これらのｍｉＲＮＡの中には、たとえばhsa-miR-34aなどのように、低悪性型（くすぶり型等）ＡＴＬＬの診断、すなわち無症状から低悪性型ＡＴＬＬの発症への変遷があったかどうかの判断のために有用であるものも含まれている。
【００４７】
（ｍｉＲＮＡ群Ｕ１）
ＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株（ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のモデル）中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株（高悪性型ＡＴＬＬ患者由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のモデル）中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が２倍以上であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の２７種類（Ｕ１ａ群）が挙げられる：
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186、hsa-miR-769-5p。
【００４８】
また、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が２倍以上であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の３５種類（Ｕ１ｂ群）が挙げられる：
hsa-miR-9*、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-490、hsa-miR-196b、hsa-miR-550、hsa-let-7c、hsa-miR-571、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-320、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-296、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-301、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-152、hsa-miR-155、hsa-let-7a。
【００４９】
したがって、これらのｍｉＲＮＡを、それぞれＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者と比較したときの高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が２倍以上と推定されるｍｉＲＮＡ群（Ｕ１）として取り扱うことができる。
【００５０】
上に挙げたｍｉＲＮＡ（Ｕ１）のうち、hsa-let-7c、hsa-miR-100、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-186、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-196b、hsa-miR-296、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-571、hsa-miR-7、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-9、hsa-miR-9*、hsa-miR-92b、hsa-miR-99aの１８種類は、ＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者のどちらと比較したときにも共通して、高悪性型ＡＴＬＬ患者における比率が２倍以上と推定されるｍｉＲＮＡである。
【００５１】
（ｍｉＲＮＡ群Ｕ２）
上記ｍｉＲＮＡ群Ｕ１に属するｍｉＲＮＡのうち、ＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が１０倍以上であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の３種類が挙げられる：
hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152。
【００５２】
また、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が１０倍以上であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の８種類が挙げられる：
hsa-miR-9*、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9。
【００５３】
したがって、これらのｍｉＲＮＡを、それぞれＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者と比較したときの高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が１０倍以上と推定されるｍｉＲＮＡ群（Ｕ２）として取り扱うことができる。
【００５４】
上に挙げたｍｉＲＮＡ（Ｕ２）のうち、hsa-miR-99a、hsa-miR-125bの２種類は、ＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者のどちらと比較したときにも共通して、高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が１０倍以上と推定されるｍｉＲＮＡである。
【００５５】
（ｍｉＲＮＡ群Ｕ３）
上記ｍｉＲＮＡ群Ｕ１に属するｍｉＲＮＡのうち、ＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が２倍以上であり、かつそのＰ値が０．０５未満であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の６種類が挙げられる：
hsa-miR-296、hsa-miR-15b、hsa-miR-484、hsa-miR-16、hsa-miR-195、hsa-miR-769-5p。
【００５６】
また、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が２倍以上であり、かつそのＰ値が０．０５未満であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の３種類が挙げられる：
hsa-miR-550、hsa-miR-422b、hsa-miR-769-5p。
【００５７】
したがって、これらのｍｉＲＮＡを、それぞれＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者と比較したときの高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が比較的高い確率で２倍以上であると推定されるｍｉＲＮＡ群（Ｕ３）として取り扱うことができる。
【００５８】
上に挙げたｍｉＲＮＡ（Ｕ３）のうち、hsa-miR-769-5pは、ＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者のどちらと比較したときにも共通して、比較的高い確率で高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が２倍以上であると推定されるｍｉＲＮＡである。
【００５９】
なお、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ１）等に分類されるｍｉＲＮＡは、細胞の腫瘍化あるいは悪性化を直接的または間接的に促進する働きを有すると考えられ、高悪性型ＡＴＬＬではこのｍｉＲＮＡの発現量が増加しているため、細胞の腫瘍化あるいは悪性化が通常よりも強く促進され、腫瘍化あるいは悪性化が進行していると考えられる。
【００６０】
（ｍｉＲＮＡ群Ｄ１）
ＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株（ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のモデル）中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株（高悪性型ＡＴＬＬ患者由来の末梢血、末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞のモデル）中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が０．５倍以下であるｍｉＲＮＡ（Ｄ１ａ群）としては、たとえば次の２６種が挙げられる：
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183、hsa-miR-23a。
【００６１】
また、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が０．５倍以下であるｍｉＲＮＡ（Ｄ１ｂ群）としては、たとえば次の２３種が挙げられる：
hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-34a、hsa-miR-525*、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-124a、hsa-miR-34b、hsa-miR-125a、hsa-miR-342、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-625、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-660、hsa-let-7b、hsa-miR-582、hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-768-5p。
【００６２】
したがって、これらのｍｉＲＮＡを、それぞれＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者と比較したときの高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が０．５倍以下と推定されるｍｉＲＮＡ群（Ｄ１）として取り扱うことができる。
【００６３】
上に挙げたｍｉＲＮＡ（Ｄ１）のうち、hsa-let-7b、hsa-miR-125a、hsa-miR-146a、hsa-miR-146b、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-342、hsa-miR-34a、hsa-miR-34b、hsa-miR-582、hsa-miR-625、hsa-miR-660の１２種は、ＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者のどちらと比較したときにも共通して、高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が０．５倍以下と推定されるｍｉＲＮＡである。
【００６４】
（ｍｉＲＮＡ群Ｄ２）
上記ｍｉＲＮＡ群Ｄ１に属するｍｉＲＮＡのうち、ＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が０．１５倍以下であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の１２種が挙げられる：
hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182。
【００６５】
また、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が０．１５倍以下であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の１２種が挙げられる：
hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-34a、hsa-miR-525*、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-124a、hsa-miR-34b、hsa-miR-125a、hsa-miR-342。
【００６６】
したがって、これらのｍｉＲＮＡを、それぞれＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者と比較したときの高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が０．１５倍以下と推定されるｍｉＲＮＡ群（Ｄ２）として取り扱うことができる。
【００６７】
上に挙げたｍｉＲＮＡ（Ｄ２）のうち、hsa-miR-363、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-34b、hsa-miR-125aの７種類は、ＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者のどちらと比較したときにも共通して、高悪性型ＡＴＬＬ患者における比率が０．１５倍以下と推定されるｍｉＲＮＡである。
【００６８】
（ｍｉＲＮＡ群Ｄ３）
上記ｍｉＲＮＡ群Ｄ１に属するｍｉＲＮＡのうち、ＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が０．５倍以下であり、かつそのＰ値が０．０５未満であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の５種が挙げられる：
hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-486。
【００６９】
また、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のｍｉＲＮＡの発現量に対する、ＡＴＬＬ腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中のｍｉＲＮＡの発現量の比率が０．５倍以下であり、かつそのＰ値が０．０５未満であるｍｉＲＮＡとしては、たとえば次の６種が挙げられる：
hsa-miR-125a、hsa-miR-34b、hsa-miR-124a、hsa-miR-525*、hsa-miR-150、hsa-miR-363。
【００７０】
したがって、これらのｍｉＲＮＡを、それぞれＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者と比較したときの高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が比較的高い確率で０．５倍以下であると推定されるｍｉＲＮＡ群（Ｄ３）として取り扱うことができる。
【００７１】
上に挙げたｍｉＲＮＡ（Ｄ３）のうち、hsa-miR-125a、hsa-miR-34bの２種類は、ＨＴＬＶ−１キャリアーおよび健常者のどちらと比較したときにも共通して、比較的高い確率で高悪性型ＡＴＬＬ患者における発現量の比率が０．５倍以下であると推定されるｍｉＲＮＡである。
【００７２】
なお、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ１）等に分類されるｍｉＲＮＡは、細胞の腫瘍化あるいは悪性化を直接的または間接的に抑制する働きを有すると考えられ、高悪性型ＡＴＬＬではこのｍｉＲＮＡの発現量が低下しているため、細胞の腫瘍化あるいは悪性化が十分に抑制されず、腫瘍化あるいは悪性化が進行していると考えられる。
【００７３】
上記の各群に属するｍｉＲＮＡは高悪性型ＡＴＬＬ（急性型ＡＴＬＬ等）の診断にとって有用であるが、たとえばＤ１（Ｄ１ａおよびＤ１ｂの両方）に分類されているhsa-miR-34aや、Ｕ１（Ｕ１ａおよびＵ１ｂの両方）に分類されているhsa-miR-99a、hsa-miR-125bは、後記実施例２に示すように、低悪性型ＡＴＬＬ（くすぶり型ＡＴＬＬ等）の診断にとっても有用である。
【００７４】
［定量ステップ］
定量ステップでは、上記のようにして決定された定量対象ｍｉＲＮＡについて、診断対象者（キャリアー、患者）から採取したサンプル中の発現量を定量する。
【００７５】
診断対象者から採取するサンプルと、前記定量対象ｍｉＲＮＡが含まれる、健常者、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー、低悪性型（くすぶり型もしくは慢性型）ＡＴＬＬ患者、および高悪性型（急性型もしくはリンパ腫型）ＡＴＬＬ患者から採取するサンプルは、一致させることが望ましい。たとえば、診断対象者から採取した末梢血（全血）をサンプルとする、つまりその末梢血に含まれるあるｍｉＲＮＡの全量を当該ｍｉＲＮＡの発現量として定量することが予定されている場合は、基準とする健常者等から同じく末梢血（全血）をサンプルとし、その末梢血に含まれるあるｍｉＲＮＡの全量を当該ｍｉＲＮＡの発現量として定量することにより、前記定量対象ｍｉＲＮＡを決定しておくことが望ましい。
【００７６】
ｍｉＲＮＡの定量のために診断対象者から採取するサンプルの例としては、扁桃腺、骨髄、リンパ節、消化器、呼吸器、脾臓、肝臓、感覚器、中枢神経系、運動器、皮膚、末梢血などの器官ないし組織から採取された細胞含有検体、あるいは喀痰、尿、肺洗浄液、胃洗浄液、糞便などの細胞含有検体が挙げられる（定量対象ｍｉＲＮＡを決定するために採取するサンプルも同様である）が、末梢血あるいはそこから分離した末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞が好適である。このようなサンプルは、生検材料などとして採取される場合の一般的な手順に従って採取、分離すればよい。
【００７７】
続いて、一般的なｍｉＲＮＡの抽出・精製キットなどにより、当該サンプル中に含まれるｍｉＲＮＡを抽出・精製して、ｍｉＲＮＡの定量に供する。末梢血単核球またはＣＤ４陽性Ｔ細胞をサンプルとしてそれらの細胞が含有するｍｉＲＮＡを定量する場合は、末梢血を採取した後、それらの細胞を分離する処理を行えばよい。
【００７８】
ｍｉＲＮＡ量を定量する方法としては、定量の正確性および操作の簡便さの観点から定量ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）法が好ましいが、その他のＲＴ−ＰＣＲ法やｍｉＲＮＡのマイクロアレイを用いた定量法等を用いてもよい。
【００７９】
（定量ＲＴ−ＰＣＲ法）
定量ＲＴ−ＰＣＲ法では、ｍｉＲＮＡに応じた適切なフォワードおよびリバースプライマーを使用して、当該ｍｉＲＮＡの逆転写および増幅をおこない、蛍光シグナルによる増幅産物の定量を通じて当初のｍｉＲＮＡの量（すなわちサンプル中の発現量）を定量する。前述したように、定量対象ｍｉＲＮＡの塩基配列の情報は公開されているので、たとえば市販されているソフトウェアを使用して前記の適切なプライマーの設計が可能であるが、公知の（市販されている）プライマーを利用することもできる。相対定量の標準として、実験条件下での変動の小さい、安定した内在性コントロールを用いることが適切である。
【００８０】
［判定ステップ］
上述したような定量ステップにより取得したｍｉＲＮＡの発現量は、さらに、基準とするｍｉＲＮＡの発現量に対する比率を算出するステップ、およびこの算出比率が前述したような判定基準比率の条件を満たすか否かを判定するステップを経ることにより、高悪性型ＡＴＬＬの診断のためのデータとして利用することができるようになる。
【００８１】
上記「基準とするｍｉＲＮＡの発現量」としては、定量対象ｍｉＲＮＡを決定する際の基礎とされた、一定数のサンプルについて測定されたｍｉＲＮＡの発現量の平均値を用いることができるが、あらかじめ診断対象者自身が健常者またはＨＴＬＶ−Ｉキャリアーの状態であるときに採取したサンプルについて測定されたｍｉＲＮＡの発現量を用いることも可能である。
【００８２】
判定ステップにおいて算出された比率が判定基準比率の条件を満たす場合、たとえば定量対象ｍｉＲＮＡとして判定基準比率が２倍であるものを選択した場合に、算出がされた比率が２倍以上である場合には、診断対象者が（高悪性型）ＡＴＬＬを発症している患者である（より具体的には、（高悪性型）ＡＴＬＬの腫瘍細胞がサンプル中に存在する）と診断することができる。
【００８３】
また、上記のような情報は、診断対象者が（高悪性型）ＡＴＬＬを発症しているかどうかの診断だけでなく、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアーが（高悪性型）ＡＴＬＬを発症する以前に（高悪性型）ＡＴＬＬの腫瘍細胞が末梢血中に微量に存在していることの検出（末梢血中などに微量に（高悪性型）ＡＴＬＬ腫瘍細胞が存在している、（高悪性型）ＡＴＬＬの発症予備軍とも呼ぶべき状態にあるといえる）、（高悪性型）ＡＴＬＬを治療中の患者の治療効果のモニター（治療が奏功していれば定量対象ｍｉＲＮＡの発現量は基準値の２倍以上でも０．５倍以下でもなくなると考えられる）、寛解した（高悪性型）ＡＴＬＬの再発の兆候の早期発見などのための情報にも役立てることができ、それにより発症ないし再発の予防を行うことができる。すなわち、本発明における「（高悪性型）ＡＴＬＬの診断のためのデータ」には、上述したような、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアーの（高悪性型）ＡＴＬＬ発症前診断、（高悪性型）ＡＴＬＬ療養中の患者の治療効果のモニター、寛解した（高悪性型）ＡＴＬＬの再発の兆候の早期発見などのためのデータも含まれるものと解釈される。
【００８４】
［その他のステップ］
本発明のデータ取得方法において、前記定量ステップで得られたデータに加えて、たとえば特許文献１に記載の方法により得られるデータを併せて検討することによって、より（高悪性型）ＡＴＬＬの診断精度が高まると期待される場合には、そのような他の方法に係るデータを取得するためのステップおよび得られたデータを加えて診断等に関する情報を取得するためのステップを加えてもよい。
【００８５】
−（高悪性型）ＡＴＬＬ診断用キット−
上述したような（高悪性型）ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法を実施し、測定対象ｍｉＲＮＡを定量するために好適な、本発明の（高悪性型）ＡＴＬＬ診断用キットは、前記データ取得方法において定義されるｍｉＲＮＡ、すなわち前記定量対象ｍｉＲＮＡを定量するための試薬を内容物に含むものである。
【００８６】
上記試薬には、少なくとも、定量対象ｍｉＲＮＡを増幅するためのプライマー、具体的には、本発明のデータ取得方法の説明においてｍｉＲＮＡ群（Ｕ１）〜（Ｕ３）およびｍｉＲＮＡ群（Ｄ１）〜（Ｄ３）として挙げたｍｉＲＮＡおよびその変異型からなる群より選ばれる少なくとも一種のｍｉＲＮＡを増幅することのできるフォワードおよびリバースプライマーのプライマーセットが含まれる。前述のように、本発明のデータ取得方法に用いられる定量対象ｍｉＲＮＡの塩基配列の情報は公開されているので、それらを増幅するためのプライマーの設計は容易である。定量対象ｍｉＲＮＡの定量方法として蛍光を利用した方法（たとえばリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ）を採用する場合には、前記プライマーセットにはさらに、たとえばTaqMan（登録商標）miRNAプローブのように蛍光物質およびクエンチャーが結合したプローブ、あるいはドナーまたはアクセプターが結合したペアのＦＲＥＴプローブなどのように、ｍｉＲＮＡの相補鎖の伸長反応に伴って蛍光を発するようになるものが含まれる。
【００８７】
定量対象ｍｉＲＮＡを定量するためのその他の試薬の例としては、ｍｉＲＮＡを抽出・精製するための試薬や、定量方法に応じた試薬、たとえばリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを行う場合は（耐熱性ポリメラーゼ、塩化マグネシウム等の塩、ｄＮＴＰ，特異的プライマー、対照用プライマー、ＰＣＲ用バッファー等）が挙げられる。さらに、ｍｉＲＮＡの定量が、一枚のプレート上に設けられた複数のウェルのそれぞれにおいて複数のｍｉＲＮＡについて一括して処理することのできる、マイクロアレイ形式で行われる場合は、そのようなマイクロアレイのプレートを本発明のキットの内容物に含めておくことができる。
【００８８】
なお、本発明のデータ取得方法において、前記特許文献１に記載の方法を組み合わせて実施する場合、そのためのキットにはさらに、その方法を実施するのに必要な、検体を溶解するための溶解液、重亜硫酸塩含有試薬およびメチル化検出増幅試薬が含まれていてもよい。
【００８９】
−（高悪性型）ＡＴＬＬ診断システム−
上述したような（高悪性型）ＡＴＬＬの診断のためのデータ取得方法を実施し、（高悪性型）ＡＴＬＬの診断を行うために好適な、本発明の（高悪性型）ＡＴＬＬ診断システムは、所定の以下に述べるような定量手段、記録手段、判定手段および出力手段を備えたものである。
【００９０】
［定量手段］
前記定量手段は、本発明のデータ取得方法において実施される定量ステップを実施するための手段であって、前記定量対象ｍｉＲＮＡについて、サンプル中の発現量を定量する手段である。たとえば、ｍｉＲＮＡを定量するための方法としてＲＴ−ＰＣＲを採用する場合は、それを実施するためのＰＣＲサイクラー、ｍｉＲＮＡを増幅するためのプライマーやその他の試薬とサンプルを混合し、前記ＰＣＲサイクラーに供給する機器、増幅されたｍｉＲＮＡからの蛍光や放射能を測定する機器などから構成される。
【００９１】
なお、ｍｉＲＮＡの定量は、一つのサンプルについて複数回行い（通常はサンプルを一定数に等分する）、その平均値を求めるというかたちで行うことが、データの客観性や信頼性など統計学的な観点から好ましいので、定量手段はそのような複数回の定量が行えるような態様とすることが好ましい。
【００９２】
［記録手段］
前記記録手段は、定量対象ｍｉＲＮＡについての、前述したようなデータ取得方法において定義される前記基準となる発現量、すなわち、健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞等、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等、またはくすぶり型もしくは慢性型ＡＴＬＬ患者由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞等、あるいはＨＴＬＶ−Ｉ感染し不死化したＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株またはＡＴＬＬ非腫瘍細胞由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養株中の発現量と、その発現量比率の条件、すなわち測定された定量対象ｍｉＲＮＡの発現量が基準に対してどのような比率である場合に（高悪性型）ＡＴＬＬであると判定するかという条件を記録している。これらのデータは、少なくとも前記定量手段により実際に定量されるｍｉＲＮＡについて記録しておけばよいが、定量対象ｍｉＲＮＡを変更しても対応できる汎用的な記録手段とするため、他のｍｉＲＮＡについても記録しておくことが好ましい。
【００９３】
［判定手段］
前記判定手段は、まず、前記定量手段により得られた、診断対象者（患者）のサンプル中の定量対象ｍｉＲＮＡの発現量の測定データと、前記記録手段に記録された、定量対象ｍｉＲＮＡの発現量の基準データとを比較する処理を行う。具体的には、たとえばｍｉＲＮＡ群（Ｕ１）に属するｍｉＲＮＡを定量対象ｍｉＲＮＡとする場合は、前記測定データの数値が前記基準データの数値の２倍以上か否かを判定する。そして、当該定量対象ｍｉＲＮＡの発現量比率の条件を満たす場合、前記サンプルはくすぶり型もしくは慢性型（低悪性型）ＡＴＬＬ患者由来のもの、または急性型もしくはリンパ腫型（高悪性型）ＡＴＬＬ患者由来のものである、つまり診断対象者はそのようなＡＴＬＬ患者であると判定し、それ以外の場合には、前記サンプルはそのようなＡＴＬＬ患者由来のものではない、つまり診断対象者はそのようなＡＴＬＬ患者ではなく、健常者、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアー、または前記の型以外のＡＴＬＬ患者であると判定する処理を行う。このような処理を行う判定手段は、一般的な情報処理手段を用いて構築することができる。
【００９４】
［出力手段］
前記出力手段は、前記判定手段の判定結果を出力する手段であり、判定結果をデータとして他のコンピュータに出力する手段、ディスプレイなどに表示する手段、紙媒体などに印刷する手段等が、その例として挙げられる。
【００９５】
システムの利便性の観点からは、本発明のシステムにおける前記記録手段、判定手段及び出力手段は、１つのコンピュータおよびディスプレイによって一体的に構成されており、さらに当該コンピュータは前記定量手段と制御可能な状態で接続されていることが好ましい。
【実施例】
【００９６】
［実施例１］
［材料及び方法］
（１）培養細胞株
HTLV-1感染し不死化した培養感染細胞株：HTLV-1キャリアーのモデル細胞株として、HTLV-1産生培養細胞株あるいはATLL患者末梢血との混合培養により、HTLV-1感染させ、不死化させたT細胞培養株であるIWA-1、MT4を用いた。
【００９７】
高悪性型ATLL患者由来の非ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株：HTLV-1キャリアーまたはくすぶり型/慢性型ATLLのモデル細胞株として、高悪性型ATLL患者由来であるが、T細胞受容体（TCR）の遺伝子再構成様式とHTLV-1遺伝子の染色体への挿入部位の解析からATLL腫瘍細胞由来培養細胞株ではないことが確認されている、ATL16T、ATL35T、ATL45T、ED50823を使用した。
【００９８】
高悪性型ATLL患者由来培養腫瘍細胞株：高悪性型ATLLのモデル細胞株として、T細胞受容体（TCR）の遺伝子再構成様式とHTLV-1遺伝子の染色体への挿入部位の解析とからATLL腫瘍細胞由来培養細胞株であることが確認されている、ATL43Tb、ATL55T、ED40515を使用した。
【００９９】
高悪性型ATLL患者由来培養細胞株：高悪性型ATLL患者由来であるがcDNA発現アレイの解析の結果ATLL非腫瘍細胞由来であることが示唆されている（HTLV-1感染により不死化しているが未だ腫瘍化にまでは進展していない状態に対応する）培養細胞株として、MT1、SALT3を用いた。
【０１００】
非HTLV-1感染急性リンパ性T細胞白血病株：ヒトT細胞白血病由来培養細胞株として非HTLV-1感染急性リンパ性T細胞白血病株（T細胞性ALL）であるJurkatを用いた。
以上の細胞株の培養培地は、RPMI1640培地(Nissui Pharm, Tokyo, Japan)に10%FCS、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンを添加したものである。なお、ATL55TおよびED50823はIL2依存細胞株であるため、これらの細胞株の培養培地にはさらに、20U/ml rIL-2(PEPROTECH, London, UK)を添加した。全ての細胞培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件下で行った。
【０１０１】
（２）採取した細胞（分離及び活性化法）
急性型ATLLの患者、くすぶり型ATLLの患者、HTLV-1キャリアーおよびHTLV-1(-)健常者の末梢血よりFicoll/Hypaque法により末梢血単核球を分離した。これらの患者、キャリアーおよび健常者の末梢血検体は、出願人の学内倫理委員会に於いて承認された方法により採血が行われたものを使用した。
【０１０２】
分離した急性型ATLLの患者、くすぶり型ATLLの患者、HTLV-1キャリアーおよび健常者の末梢血単核球（CD4陽性Ｔ細胞およびCD8陽性Ｔ細胞が混在している）は、EasySep Human CD4陽性 T-Cell Enrichment Kit (StemCell Technologies, Vancouver, BC)を用いて、そのマニュアルに記載の操作に従って、CD4陽性T細胞をネガティブセレクションにより分離した。
【０１０３】
また、健常者から分離した末梢血単核球は、CD3/CD28Tcell Expander (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway )を用いて、そのマニュアルに記載の操作に従って、Short Term Stimulation of Human T cells (1-3 days)の条件によって処理して、健常者由来活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を調製した。
【０１０４】
（３）RNA抽出
上記培養細胞株からのmiRNA抽出は、miRNeasy Minikit(QIAGEN, Tokyo, Japan)を用いておこなった。また急性型ATLL患者、HTLV-1キャリアーおよび健常者の末梢血からのmiRNA抽出は、PAXgene Blood miRNA Kit(QIAGEN, Tokyo, Japan)を用いておこなった。
【０１０５】
（４）マイクロアレイ解析
「HTLV-1感染し不死化した培養感染株」、「ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株」、「健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞」等について、Human miRNA Microarray Kit（G4470A; Agilent Technology,Tokyo, Japan）を用いて、添付のプロトコールに従い、miRNA マイクロアレイ解析（miRNAの定量）を行った。なお、当該Kitの利用者に対してプローブ（ProbeUID）の塩基配列の情報は公開されている。さらに、Subio microarray analysis software (Subio Japan, Tokyo, Japan)を用いて、各サンプル間の同一のmiRNAの発現量について、比較解析をおこなった。
【０１０６】
（５）Real-Time RT-PCR解析
上記miRNAマイクロアレイのクラスタリング解析において、「HTLV-1感染し不死化した培養感染株」と「ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株」とを比較したときに後者で発現量が低下しているmicroRNAの中から、著しく変化が大きかったhsa-miR-34aについて改めて、培養細胞株および患者検体の各サンプルにおける発現量をReal-Time RT-PCRにより解析した。
【０１０７】
各サンプルの全RNAをTaqMan-MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foste City, CA)を用いて逆転写した。成熟miRNA検出はTaqMan-MicroRNA Detectio kit (Applied Biosystems, Foste City, CA)を用いてReal time RT-PCRを行い、2-ΔΔCt法を用いて解析した。hsa-miR-34a、hsa-miR-99aおよびhsa-miR-125bのプライマー及びプローブは Applied Biosystems, Foste City, CA社製を用た。miRNA内在性コントロールとしてRNU6B(Applied Biosystems, Foste City, CA; P/N 4373381)を使用した。
【０１０８】
［結果］
（４）マイクロアレイ解析について
「HTLV-1感染し不死化した培養感染株」（HTVL-1 immortal）に対する「ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株」（ATL）中の発現量の比率（ATL vs HTVL-1 immortal）を表１〜４に示し、「健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞」（Norm）に対する「ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株」（ATL）中の発現量の比率（ATL vs Norm）を表５〜８に示す。また、「ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株」（ATL）と「HTLV-1感染し不死化した培養感染株」（HTVL-I immortal）における発現量の比較解析の結果を図２および図３に示す。「ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株」（ATL）と「健常者由来の活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞」（Norm）における発現量の比較解析についても類似する散布図が得られた。
【０１０９】
表１には、上記比率（ATL vs HTVL-1 immortal）が０．５以下かつＰ値が０．０５未満であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ３）に該当する、５種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-486）が含まれる。
【０１１０】
【表１】
2013188208.tif 000002
【０１１１】
表２には、上記比率（ATL vs HTVL-1 immortal）が２以上かつＰ値が０．０５未満であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ３）に該当する、６種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-296、hsa-miR-15b、hsa-miR-484、hsa-miR-16、hsa-miR-195、hsa-miR-769-5p）が含まれる。
【０１１２】
【表２】
2013188208.tif 000003
【０１１３】
表３には、上記比率（ATL vs HTVL-1 immortal）が０．５以下であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ１）に該当する２６種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182、hsa-miR-660、hsa-let-7b、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-342、hsa-miR-148a、hsa-miR-133b、hsa-miR-210、hsa-miR-486、hsa-miR-362、hsa-miR-210、hsa-miR-27a、hsa-miR-551b、hsa-miR-625、hsa-miR-183、hsa-miR-23a）が含まれる。このうち、hsa-miR-34a、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-146a、hsa-miR-34b、hsa-miR-205、hsa-miR-146b、hsa-miR-193a、hsa-miR-582、hsa-miR-483、hsa-miR-125a、hsa-miR-182の１２種類は、上記比率（ATL vs HTVL-1 immortal）が０．１５以下である、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ２）に該当するｍｉＲＮＡである。また、これらの中には、表１に示した、Ｐ値が０．０５未満である、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ３）に該当するｍｉＲＮＡも包含されている。
【０１１４】
【表３】
2013188208.tif 000004
【０１１５】
表４には、上記比率（ATL vs HTVL-1 immortal）が２以上であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ１）に該当する２７種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152、hsa-miR-490、hsa-miR-100、hsa-miR-571、hsa-miR-296、hsa-miR-9*、hsa-miR-196a、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-15b、hsa-miR-10a、hsa-miR-484、hsa-let-7c、hsa-miR-16、hsa-miR-193b、hsa-miR-15a、hsa-miR-301、hsa-miR-320、hsa-miR-196b、hsa-miR-107、hsa-miR-195、hsa-miR-103、hsa-miR-186、hsa-miR-769-5p）が含まれる。このうち、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-152の３種類は、上記比率（ATL vs HTVL-1 immortal）が１０以上である、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ２）に該当するｍｉＲＮＡである。また、これらの中には、表２に示した、Ｐ値が０．０５未満である、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ３）に該当するｍｉＲＮＡも包含されている。
【０１１６】
【表４】
2013188208.tif 000005
【０１１７】
表５には、上記比率（ATL vs norm）が０．５以下かつＰ値が０．０５未満であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ３）に該当する、６種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-125a、hsa-miR-34b、hsa-miR-124a、hsa-miR-525*、hsa-miR-150、hsa-miR-363）が含まれる。
【０１１８】
【表５】
2013188208.tif 000006
【０１１９】
表６には、上記比率（ATL vs norm）が２以上かつＰ値が０．０５未満であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ３）に該当する、３種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-550、hsa-miR-422b、hsa-miR-769-5p）が含まれる。
【０１２０】
【表６】
2013188208.tif 000007
【０１２１】
表７には、上記比率（ATL vs norm）が０．５以下であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ１）に該当する２３種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-34a、hsa-miR-525*、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-124a、hsa-miR-34b、hsa-miR-125a、hsa-miR-342、hsa-miR-200c、ebv-miR-BART20-3p、hsa-miR-625、hsa-miR-630、hsa-miR-223、hsa-miR-660、hsa-let-7b、hsa-miR-582、hsa-miR-22、hsa-miR-26a、hsa-miR-768-5p）が含まれる。このうち、hsa-miR-150、hsa-miR-363、hsa-miR-34a、hsa-miR-525*、hsa-miR-146b、hsa-miR-146a、hsa-miR-222、hsa-miR-221、hsa-miR-124a、hsa-miR-34b、hsa-miR-125a、hsa-miR-342の１２種類は、上記比率（ATL vs norm）が０．１５以下である、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ２）に該当するｍｉＲＮＡである。また、これらの中には、表５に示した、Ｐ値が０．０５未満である、ｍｉＲＮＡ群（Ｄ３）に該当するｍｉＲＮＡも包含されている。
【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
表８−１および８−２には、上記比率（ATL vs norm）が２以上であり、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ１）に該当する３５種類のｍｉＲＮＡ（hsa-miR-9*、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9、hsa-miR-7、hsa-miR-92b、hsa-miR-490、hsa-miR-196b、hsa-miR-550、hsa-let-7c、hsa-miR-571、hsa-miR-183、hsa-miR-182、hsa-miR-320、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-296、hsa-miR-663、hsa-miR-422b、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-301、hsa-miR-345、kshv-miR-K12-8、hsa-miR-96、hsa-miR-193a、hsa-let-7d、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-339、hsa-miR-152、hsa-miR-155、hsa-let-7a）が含まれる。このうち、hsa-miR-9*、hsa-miR-99a、hsa-miR-125b、hsa-miR-193b、hsa-miR-196a、hsa-miR-365、hsa-miR-100、hsa-miR-9の８種類は、上記比率（ATL vs norm）が１０以上である、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ２）に該当するｍｉＲＮＡである。また、これらの中には、表６に示した、Ｐ値が０．０５未満である、ｍｉＲＮＡ群（Ｕ３）に該当するｍｉＲＮＡも包含されている。
【０１２４】
【表８−１】
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【０１２５】
【表８−２】
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【０１２６】
（５）Real-Time RT-PCR解析について
培養細胞株についてのhsa-miR-34aの発現量および患者検体についてのhsa-miR-34aの発現量を、それぞれ図４および図５に示す。
【０１２７】
図４に示されるように、全体的にマイクロアレイ解析と同じ傾向が見られ、HTLV-1感染し不死化した培養感染株でmiR-34aの発現量が高く、ATLL腫瘍細胞由来培養細胞株で低いことが明らかになった。
【０１２８】
そして、図５に示されるように、キャリアーの患者検体ではHTLV-1感染し不死化した培養感染株と同様にhsa-miR-34aの発現量が高くなり、高悪性型ATLLの患者検体ではATLL腫瘍細胞由来培養細胞株と同様にhsa-miR-34aの発現量が低くなることが明らかになった。
【０１２９】
［実施例２］
同一患者がくすぶり型（smoldering）ＡＴＬＬから急性型（acute）ＡＴＬＬに進展した症例において、臨床データ（白血球数およびそれに占める異形リンパ数の割合、可溶性ＩＬ２Ｒ、ＬＤＨ値）を測定すると共に、各時点における末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のhsa-miR-34aの発現量を、前記実施例１の（５）Real-Time RT-PCR解析についてと同様の手順で測定した。結果を図６（ａ）および（ｂ）に示す。くすぶり型および急性型ＡＴＬＬが発症すると、hsa-miR-34aの発現量が健常者と比べて明らかな低下が検出された。
【０１３０】
また、各時点における末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のhsa-miR-125bおよびhsa-miR-99aの発現量も、前記実施例１の（５）Real-Time RT-PCR解析についてと同様の手順で測定した。結果を図７に示す。くすぶり型および急性型ＡＴＬＬが発症すると、hsa-miR-125bおよびhsa-miR-99aの発現量が健常者と比べて明らかな上昇が検出された。
以上の結果から、本発明の高悪性型ATLLの診断に対する有用性が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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