(57)【要約】【課題】ＤＮＡ修飾酵素、該酵素タンパク質をコードする遺伝子及び該ＤＮＡ修飾酵素の製造方法を提供すること。【解決手段】ロドコッカス属細菌から得られるＤＮＡ修飾酵素。該特定のアミノ酸配列又は特定のアミノ酸配列を含むタンパク質、特定の塩基配列又は特定の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子。また該遺伝子組換ベクターを含む形質転換体によるＤＮＡ修飾酵素の製造方法。例えば、本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）により修飾されるＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、その両方の鎖の特定塩基を修飾する。ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）により修飾される特定塩基中の特定部位としては、アデニンのＮ６位、シトシンのＮ４位、又はシトシンのＣ５位が挙げられ、好ましくはシトシンのＣ５位である。【選択図】図１
2013223486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）から（Ｃ）いずれかに記載のタンパク質。
（Ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有し、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質
【請求項２】
少なくともアデニンのＮ６位、シトシンのＮ４位、又はシトシンのＣ５位のいずれかに対するメチル化酵素活性有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
二本鎖ＤＮＡ中の下記式（１）
【化１】
2013223486.tif 000009
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ａはアデニンを表す）で表される塩基配列に特異的であり、かつ、式１中の囲み文字で示した位置のＣ５位に対するメチル化酵素活性を有する請求項１又は２記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡと相同性が８０％以上の塩基配列からなり、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１又は３記載の塩基配列中において１又は数個の塩基の置換、欠失もしくは付加され、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
請求項４又は５に記載の遺伝子を含む組換ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換ベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項１から３のいずれかに記載の修飾酵素活性を有するタンパク質を、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より該修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ修飾酵素、該酵素タンパク質をコードする遺伝子及び該酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのメチル化修飾は、生物においてＤＮＡ配列を変化させることなく遺伝子機能を変化させ、細胞分裂を経てこれを伝達するエピジェネティック修飾において必須である。
【０００３】
その過程において、ＤＮＡ修飾酵素が主要な役割を果たしている。
【０００４】
ＤＮＡのメチル化修飾を触媒するＤＮＡ修飾酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニンを補因子としてアデニンのＮ６位、シトシンのＣ５位、Ｎ４位をメチル化するメチルトランスフェラーゼである。
【０００５】
細菌におけるＤＮＡのメチル化修飾の大部分は、細菌の持つ制限修飾系の一部を担っており、ファージ感染や環境中のＤＮＡの体内侵入、遺伝子の水平伝播などに対する細菌の防御機構であると考えられている。
【０００６】
この他、細菌におけるＤＮＡのメチル化修飾は、遺伝子発現調節、ＤＮＡ修復、細胞分裂周期等の多岐にわたる生化学的機能を持つことが知られている（非特許文献１）。また、高等生物におけるＤＮＡのメチル化修飾は発生や分化に必須の現象であるとともに、ＤＮＡのメチル化修飾により、細胞の種類に応じて遺伝子発現レベルやパターンが調節されている。このような調節により、高等生物は、各細胞のＤＮＡ配列が単一でありながら無数の特徴を形成することができる。
【０００７】
このように、ＤＮＡのメチル化修飾が様々な生命現象と直接関わっているという事情から、ＤＮＡメチル化修飾状態の解析手法の開発が多く進められている。代表的な解析手法には、ＤＮＡのバイサルファイト処理により非メチル化シトシンをウラシルに変換してメチル化シトシンと区別し、続いてＰＣＲ増幅とシークエンスによりメチル化シトシンを検出する方法などがある。
【０００８】
ＤＮＡ修飾酵素はこのような解析手法におけるポジティヴコントロール調製などに利用される。
【０００９】
二本鎖ＤＮＡ中の下記式（１）
【００１０】
【化１】
2013223486.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ａはアデニンを表す）で表される塩基配列を特異的に認識する修飾酵素は多数報告されているが、そのうち修飾塩基が同定されているものはほぼすべてアデニンのメチルトランスフェラーゼであり、式中に囲み文字で示した位置のシトシンＣ５位をメチル化するメチルトランスフェラーゼは１例が報告されているに過ぎない（非特許文献２，ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｌｂｅｒｔ  Ｊｅｌｔｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ.，（２００７）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ”Ａｐｐｌｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ.７５，１２３３−１２４０
【非特許文献２】Ｓ．Ｊｅｎｔｓｃｈ．，（１９８３）”Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ／Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢｓｕＭ，ＢｓｕＥ，ａｎｄ  ＢｓｕＦ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５６，Ｎｏ．２，８００−８０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、ＤＮＡ修飾酵素、該酵素タンパク質をコードする遺伝子及び該ＤＮＡ修飾酵素の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、ロドコッカス属に属する細菌からＤＮＡ修飾酵素を単離することにより本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）以下の（Ａ）から（Ｃ）いずれかに記載のタンパク質。
（Ａ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質
（２）少なくともアデニンのＮ６位、シトシンのＮ４位、又はシトシンのＣ５位のいずれかに対するメチル化酵素活性有する（１）のタンパク質。
（３）二本鎖ＤＮＡ中の下記式（１）
【化２】
2013223486.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ａはアデニンを表す）で表される塩基配列に特異的であり、かつ、式１中の囲み文字で示した位置のＣ５位に対するメチル化酵素活性を有する（１）又は（２）のタンパク質。
（４）（１）から（３）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
（５）以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１又は３記載の塩基配列からなるＤＮＡと相同性が８０％以上の塩基配列からなり、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１又は３記載の塩基配列中において１又は数個の塩基の置換、欠失もしくは付加され、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（６）（４）又は（５）の遺伝子を含む組換ベクター。
（７）（６）の組換ベクターを含む形質転換体。
（８）（７）の形質転換体を培養し、得られる培養物からＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
（９）（１）から（３）のいずれかの修飾酵素活性を有するタンパク質を、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より該修飾酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＤＮＡ修飾酵素および該酵素タンパク質をコードする遺伝子が提供される。本発明のＤＮＡ修飾酵素は、前記遺伝子を用いた組換え製造により、簡便かつ大量に生産することができる。
【００１８】
本発明のＤＮＡ修飾酵素は、ＤＮＡメチル化酵素活性を有するため、メチル化解析のポジティヴコントロール調製などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、プラスミドｐＫ４の構造を示す図である。
【図２】図２は、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株より抽出し、バイサルファイト処理したプラスミドｐＫ４のシークエンス解析結果を示す図である。
【図３】図３は、ロドコッカス属細菌の産生するＤＮＡ修飾酵素のホモロジー解析結果を示す図である。
【図４】図４は、プラスミドｐＭＲｈ００１の構造を示す模式図である。
【図５】図５は、Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ発現プラスミドｐＭＲｈ００１を含む組換大腸菌から調製したプラスミドのＸｈｏＩ消化結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．本発明のＤＮＡ修飾酵素
本発明のＤＮＡ修飾酵素は、ロドコッカス属細菌から発明者らにより初めて単離された。
【００２１】
本発明のタンパク質は配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
発明者らは、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ−１株から単離したこのＤＮＡ修飾酵素を「Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ」と命名した。
【００２３】
ロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株（以下、「Ｊ１菌」ともいう）はＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に昭和６２（１９８７）年９月１８日付けで国際寄託されている菌株である。
【００２４】
本明細書において、「ＤＮＡ修飾酵素活性」とは、核酸配列中の特定塩基中の特定部位をメチル化する酵素活性を意味する。
【００２５】
特定塩基中の特定部位としては、アデニンのＮ６位、シトシンのＮ４位又はシトシンのＣ５位が挙げられる。
【００２６】
例えば、本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）により修飾されるＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、その両方の鎖の特定塩基を修飾する。ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）により修飾される特定塩基中の特定部位としては、アデニンのＮ６位、シトシンのＮ４位、又はシトシンのＣ５位が挙げられ、好ましくはシトシンのＣ５位である。
【００２７】
本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）は、好ましくは、二本鎖ＤＮＡ中の下記式（１）
【００２８】
【化３】
2013223486.tif 000005
【００２９】
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ａはアデニンを表す）で表される塩基配列に特異的であり、かつ、式１中囲み文字で示した位置のＣ５位に対するメチル化酵素活性を示す。
【００３０】
本明細書中では、本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）が有するＤＮＡメチル化酵素活性を「ＤＮＡ修飾酵素活性（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素活性）」と記載する。
【００３１】
本明細書において、ＤＮＡ修飾酵素活性は、ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）をＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの修飾状態を測定することにより評価することができる。当業者であれば、基質ＤＮＡ、接触時の酵素量、温度、溶液組成又は接触時間などの条件は適宜設定することができる。ＤＮＡの修飾状態は、例えば基質ＤＮＡの重亜硫酸塩処理（以降「バイサルファイト処理」と表現することがある）とＰＣＲ法による増幅、シークエンスによって測定することができる。
【００３２】
本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）活性を有するタンパク質は配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を有する。本発明におけるＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）は、その遺伝子が２つの開始コドンを有するため、結果的に、Ｎ末端近傍の７アミノ酸残基の有無のみが異なる２種のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）が存在することが明らかになった。本発明において、両者（上記２種のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素））を区別して称するときは、最初の開始コドンから翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２）からなるＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を「Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ（１ｓｔ）」と称し、２番目の開始コドン（次に登場するメチオニン）から翻訳されたアミノ酸配列（配列番号４）からなるＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を「Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ（２ｎｄ）」と称することとし、これらはいずれも野生型ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）であるものとする。
【００３３】
本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）活性を有するタンパク質は、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質も本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）活性を有するタンパク質に含まれる。
【００３４】
上記の相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。  また、本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）タンパク質には、配列番号２又は４記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつＤＮＡ修飾酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
【００３５】
（ｉ）配列番号１又は３記載のアミノ酸配列において、１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１又は３記載のアミノ酸配列の１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１又は３記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号１又は３記載のアミノ酸配列に１〜２０個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
【００３６】
アミノ酸配列の１個又は数個のアミノ酸が置換する場合は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。例えばアミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニン又はバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
【００３７】
２．本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）
本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）は、上記したＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）タンパク質をコードする遺伝子である。本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）は、例えば配列番号１又は３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む。
【００３８】
本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）は上記配列に限定されるものではなく、配列番号１又は３記載の塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも、それがＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）としての機能（ＤＮＡ修飾酵素活性）を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００３９】
また、前述したアミノ酸配列の欠失、置換又は付加に対応して、配列番号１又は３記載の塩基配列において、数個の塩基に欠失、置換又は付加等の変異が生じた塩基配列も、それが本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）としての機能（ＤＮＡ修飾酵素活性（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素活性））を有するタンパク質をコードする限り、本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）に含まれる。なお、欠失、置換又は付加される塩基の個数は、３０個以下、好ましくは１５個以下、特に好ましくは６個以下である。
【００４０】
さらに、配列番号１又は３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがＤＮＡ修飾酵素活性（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素活性）を有するタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００４１】
ここで、ストリンジェントな条件としては、例えばＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ，クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このような緩衝液の塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。
【００４２】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））等を参照することができる。
【００４３】
以下に、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）を得る方法の一例を示すが、これに限定されるわけではない。
【００４４】
まず、適当な遺伝子源から得たＤＮＡを公知の方法に従ってプラスミドやファージベクターに接続してＤＮＡライブラリを作製する。このライブラリを適当な宿主に導入して得られる形質転換体をプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜にうつしとり、変性処理の後にＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ３２Ｐ等で標識したプローブを含む上記の組成の溶液中、上記のストリンジェントな条件で保温し、ハイブリダイゼーションを行う。プローブとしては、配列番号２又は４に記載したアミノ酸配列の全部又は一部をコードするポリヌクレオチドを使用することができる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションの終了後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィ等によりプローブとハイブリッドを形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成クローンが単離できるまで繰り返す。最後に、得られたクローンの中から、目的の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を選択する。遺伝子の単離は、アルカリ法等の公知のポリヌクレオチド抽出法により実施できる。
【００４６】
本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）は、当該酵素を発現する微生物から単離することもできる。例えば、ロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、既知のアミノ酸配列情報から遺伝子の縮重を考慮して設計したプライマーもしくはプローブ又は既知の塩基配列情報に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーション法により、前記微生物のゲノムから目的の遺伝子を単離することができる。
【００４７】
このように種々のＤＮＡが本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）の範囲内に含まれるのは、コドンの縮重に由来する。すなわち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類存在することが知られている。従って、あるアミノ酸配列をコードする遺伝子は多数存在しうる。
【００４８】
遺伝子は自然界において安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることは稀ではない。遺伝子上に起こった変異によっては、コードされるアミノ酸配列に変化を与えない変異（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする、異なる遺伝子が生じたと言える。従って、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができて行く可能性は否定できない。
【００４９】
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている。
【００５０】
このように、特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。従って、本発明中に開示された塩基配列と同一の遺伝子ではなくても、ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）と同等の活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡである限り、本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）に含まれる。
【００５１】
遺伝子に変異を導入し、人為的にアミノ酸配列を改変する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法や、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ，Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社）等を用いることができる。
【００５２】
ＤＮＡの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００５３】
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主がエシェリヒア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であれば試験管等で培養を行い、公知の方法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してＭ１３ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば前述のＴ．ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ等に記載されている。
【００５４】
得られた遺伝子が目的のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）をコードする遺伝子であるかどうかの確認は、決定された塩基配列を配列番号１又は３に記載の塩基配列と比較して行うことができる。あるいは決定された塩基配列より推定されるアミノ酸配列を配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列と比較して行うことができる。
【００５５】
３．本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子を含む組換えベクター
本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）を含む組換えベクターは、上述の酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／又はターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび／又はターミネーターを利用して、その間に当該酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。
【００５６】
本明細書において、プロモーターは、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
【００５７】
本明細書において、ターミネーターは、例えば、ｔｒｐオペロンターミネータをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
【００５８】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００５９】
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ，バクテリオファージＤＮＡ，レトロトランスポゾンＤＮＡ，人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）、ｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン）、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン）などを挙げることができる。また、必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
【００６０】
４．本発明のベクターを導入した形質転換体
本発明の組換えベクターを宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。
【００６１】
形質転換体に使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的のＤＮＡ修飾酵素を発現することができる限り、特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、大腸菌（エシェリヒア  コリ）、枯草菌（バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、ロドコッカス菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、放線菌などの細菌、酵母（サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。本発明において、宿主は好ましくは大腸菌である。
【００６２】
本発明において、大腸菌は、例えば、大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれらの野生株由来の派生株であるＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’）、Ｋ８０２株、Ｃ６００株などを挙げることができる。
【００６３】
宿主への組換えベクターの導入方法としては、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではなく、当業者であれば公知技術から適宜選択することができる。このような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００６４】
５．本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）の製造方法
５−１  細胞系による製造
本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）は、形質転換体を培養して、培養物中よりＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）の特徴（例えば、ＤＮＡ修飾酵素活性）を有する活性を有するタンパク質を採取することにより製造することができる。
【００６５】
本発明において「培養物」とは、菌体、培養液、無細胞抽出液、細胞膜などの培養により得られるものを意味する。無細胞抽出液は、培養後の菌体を、例えばリン酸ナトリウム緩衝液を加えてホモジナイザーなどで物理的に破砕した後、遠心（１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、破砕できない菌体（細胞）が存在しないように上清を回収して得ることができる。細胞膜は、上記遠心で得られたペレットとして得ることができ、また、ペレットを溶解バッファーで懸濁することにより得ることもできる。
【００６６】
本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）は、培養物をそのまま用いてもよいし、透析や硫安沈殿などの公知の方法、あるいは公知の方法を単独又は適宜組み合わせることによって、培養物から濃縮、精製したものを用いてもよい。この場合、酵素活性、分子量、等電点などを指標に濃縮、精製することができる。
【００６７】
たとえば、形質転換体の培養物からＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を採取するにあたっては、培養物より菌体を集菌後、超音波破砕、超遠心分離等により酵素を抽出し、ついで除核酸法、塩析法、アフィニティクロマトグラフィ法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ法等を組み合わせて精製すればよい。この方法により、ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を大量に得ることができる。
【００６８】
用いる発現系によっては、形質転換体中で発現された酵素タンパク質が不溶物［封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）］として蓄積される場合がある。この場合にはこの不溶物を回収し、穏和な変性条件、たとえば尿素等の変性剤存在下で可溶化した後に変性剤を除くことによって活性型のタンパク質を得ることができる。さらに上記のようなクロマトグラフィ操作を行って目的とする酵素タンパク質を精製することができる。
【００６９】
５−２  無細胞タンパク質合成系による製造
本発明においては、無細胞タンパク質合成系を用いて、本発明のＤＮＡ修飾酵素遺伝子（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素遺伝子）又は本発明のベクターから、ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を製造することも可能である。
【００７０】
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管等の人工容器内でタンパク質を合成する系である。すなわち、無細胞タンパク質合成系は、生物を用いた組換えタンパク質発現とは異なり、細胞を使用せずに試験管内で転写・翻訳という一連のタンパク質合成の流れを行う合成系であるため、細胞にとって毒性となるタンパク質を生産できるという利点がある。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系にはＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系も含まれる。
【００７１】
無細胞タンパク質合成系の細胞抽出液としては、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば小麦胚芽、大腸菌等の抽出液を使用することができる。これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
【００７２】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡）、ＲＴＳ（ロシュ  ダイアグノスティクス）等が挙げられる。
【００７３】
こうした細胞抽出液に代えて、タンパク質合成に関与するすべての因子を精製し、それらをリボソーム、ＡＴＰ、ｔＲＮＡ、アミノ酸などとともに再構成して作成された「再構成された無細胞タンパク質合成系」を用いることもできる。
【００７４】
通常の無細胞タンパク質合成系に用いられる細胞抽出液には、ＡＴＰを加水分解する酵素などの混在によりタンパク質合成以外に無駄に消費されるエネルギー量が多く、エネルギー効率が低く、また細胞抽出液中に存在するプロテアーゼやヌクレアーゼなどの阻害因子によりンパク質合成の効率が低下する場合がある。
【００７５】
「再構成された無細胞タンパク質合成系」は、こうした阻害的要因の問題がなく、また構成成分を自由に操作することができるため、目的や標的タンパク質に応じた自由なシステム設計が可能である。また系の自由度が高く、反応系を微小化したり、自動化装置と組み合わせてハイスループットにすることも可能である。
【００７６】
「再構成された無細胞タンパク質合成系」の一例としてＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）を挙げることができる。ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）は大腸菌から再構成されているが、無細胞タンパク質合成系で用いられる他の公知の細胞、昆虫細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球のいずれを用いても、同様の系は構成可能である。
【００７７】
上記のように無細胞タンパク質合成系によって得られる本発明のヌクレアーゼは前述のように適宜クロマトグラフィを選択して、濃縮、精製することができる。
【００７８】
６．ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）の解析
ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）の認識配列を調べるために、たとえば前述のような方法で配列番号１又は３に示される遺伝子を発現可能に組み込んだベクターで宿主細胞を形質転換する。この形質転換体をさらに各種の配列をもつ認識配列決定用プラスミドＤＮＡで形質転換し、培養した菌体を集めて定法に従いプラスミド抽出して認識配列決定用プラスミドを単離し、これを試料とする。この試料の適当量をバイサルファイト処理し、プラスミドＤＮＡ中でＣ５位にメチル化を受けていないシトシンをウラシルに変換してシークエンス用試料とする。このシークエンス用試料の適当量を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用し鋳型の特定領域を増幅する。増幅した断片を適当なクローニングベクターに連結し、そのインサート部分のシークエンス解析を行うと、Ｊ１菌のＤＮＡ修飾酵素によりＣ５位に修飾を受けた配列はシトシンとして検出され、Ｃ５位に修飾を受けていない配列はチミンとして検出される。
【００７９】
例えば、本発明のＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）の認識配列は、以下の二本鎖ＤＮＡ中の下記式（１）
【００８０】
【化４】
2013223486.tif 000006
【００８１】
（式中、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ａはアデニンを表す）で表される塩基配列である。ＤＮＡ修飾酵素活性（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素活性）としては、囲み文字で示した位置のＣ５位に対するメチル化酵素活性を示す。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。以下は本発明の例示であって本発明を限定する趣旨ではない。
【００８３】
［実施例１］
Ｊ１菌由来プラスミドＤＮＡの調製
（１）Ｊ１菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）の培養・コンピテントセルの作製
ＭＹＫＧ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ２ＰＯ４，０．２％Ｋ２ＨＰＯ４，１％グルコース）をΦ２４ｍｍ×１６５ｍｍ試験管に１０ｍｌ入れ、Ｊ１菌のコロニーを植菌して前培養した。３０℃，３５０ｒｐｍで１日培養した後、得られた前培養液３ｍｌをＭＹＫＧ−１０％Ｓｕｃｒｏｓｅ培地（５００ｍｌ三角フラスコ中の１００ｍｌ）に植菌し、３０℃、２３０ｒｐｍで２０時間本培養した。得られた本培養液の濁度（ＯＤ６３０）を測定後、全量５０ｍｌ容のチューブに移し、４５℃で１０分保温後に遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体を１０ｍｌのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４，１０％スクロース、ｐＨ８．３；以降ＥＢと省略することがある）で２回洗浄した後ＥＢに懸濁し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。ＥＢ量は、コンピテントセル−ＥＢ懸濁液のＯＤ６３０＝４０となるように、本培養液の濁度から算出した量とした。
【００８４】
（２）プラスミドｐＫ４を用いたＪ１菌の形質転換
実施例１（１）にて調製したコンピテントセル１０μｌに対してプラスミドｐＫ４（図１）を２μｌ，滅菌水を８μｌ加え、氷上で２０分間放置した。続いて、当該コンピテントセルの全量をギャップ１ｍｍのエレクトロポレーション用キュベットに移し、印加条件１．５ｋＶ，４００Ω，２５μＦにてエレクトロポレーションした。その後、氷上で１０分間放置し、続いて３７℃で１０分間放置した。キュベットにＭＹＫ液体培地０．５ｍｌを加えてよく混和し、懸濁液を全量Φ１０×１０５ｍｍワッセルマン試験管に移して３０℃，１８０ｒｐｍで一晩振盪し、回復培養を行った。回復培養後の培養液全量をＭＹＫ寒天培地（１０ｍｇ／ｌカナマイシン含有）に塗布し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育したコロニーをＪ１［ｐＫ４］として以降の実験に供した。
【００８５】
（３）Ｊ１菌由来プラスミドｐＫ４の調製
実施例１（２）にて調製したＪ１［ｐＫ４］のコロニーをＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ２ＰＯ４，０．２％Ｋ２ＨＰＯ４）に植菌し（Φ２４ｍｍ×１６５ｍｍ試験管中の１０ｍｌ）、３０℃，３５０ｒｐｍで１日培養した。得られた培養液の全量からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを回収し、０．７％アガロースによる電気泳動で約５．２ｋｂの環状ＤＮＡを検出した。
【００８６】
［実施例２］
Ｊ１菌由来プラスミドｐＫ４のメチル化状態の解析
（１）Ｊ１菌由来プラスミドｐＫ４のバイサルファイト処理
実施例１（３）にて調製したＪ１菌由来プラスミドｐＫ４の１μｇをバイサルファイト処理に供した。Ｊ１菌由来プラスミドｐＫ４水溶液の２６０ｎｍ，２８０ｎｍにおける吸光度を測定してＤＮＡ濃度を算出し、１μｇ分を量り取った。このＤＮＡ溶液を、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙＴＭ  Ｘｃｅｅｄ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ社製）を用い、添付のマニュアルにしたがってバイサルファイト処理して非メチル化シトシンをウラシルに変換したプラスミドｐＫ４の水溶液２０μｌを得た。
【００８７】
（２）バイサルファイト処理したＪ１菌由来プラスミドｐＫ４のＰＣＲ
プラスミドｐＫ４の２４４５番目から３６４９番目をターゲットとして配列番号５，配列番号６に示すプライマーを設計して一次ＰＣＲを行った。
【００８８】
反応液組成                                                            
鋳型ＤＮＡ（バイサルファイト処理済みｐＫ４水溶液）             １    μｌ
２×ＧｏＴａｑＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）     １２．５μｌ
１０μＭ  プライマーＲＣ−２３（配列番号５）                   ０．５μｌ
１０μＭ  プライマーＲＣ−１９（配列番号６）                   ０．５μｌ
滅菌水                                                １０．５μｌ    
総量                                                  ２５    μｌ
温度サイクル：９５℃：２分を１サイクル後、９５℃：１分、５０℃：２分および７２℃：２分の反応を３０サイクル
プライマー
ＲＣ−２３：５’−ＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号５）
ＲＣ−１９：５’−ＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＡＣＣ−３’（配列番号６）
ここで得られた一次ＰＣＲ産物を鋳型として、配列番号７，８に示すプライマーを用いて二次ＰＣＲを行った。
【００８９】
反応液組成                                                            
鋳型ＤＮＡ（一次ＰＣＲ産物）                                   ２    μｌ
２×ＧｏＴａｑＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）     １２．５μｌ
１０μＭ  プライマーＲＣ−２４（配列番号７）                   ０．５μｌ
１０μＭ  プライマーＲＣ−２５（配列番号８）                   ０．５μｌ
滅菌水                                                  ９．５μｌ    
総量                                                  ２５    μｌ
温度サイクル：９５℃：２分を１サイクル後、９５℃：１分、５０℃：２分および７２℃：２分の反応を３０サイクル
プライマー
ＲＣ−２４：５’−ＧＧＴＴＴＧＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号７）
ＲＣ−２５：５’−ＣＡＡＴＣＴＣＡＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＣ−３’（配列番号８）
【００９０】
ＰＣＲ終了後、反応液２μｌを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約１．２ｋｂｐのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  ＧｅｌＢａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００９１】
（３）−１  ＰＣＲ産物のクローニング
実施例２（２）で調製したＰＣＲ産物の４μｌを使用し、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ（Ｅａｓｙ）Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付のマニュアルに従いＰＣＲ産物をｐＧＥＭベクターに連結するライゲーション反応を行った。
【００９２】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ 培地（２０ ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ  Ａｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／ｌ，２％寒天を含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、１％ＮａＣｌ，０．５％バクトイーストエキス））に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を、１．５ｍｌのＬＢ  Ａｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収し、０．７％アガロースによる電気泳動で約４．２ｋｂの環状ＤＮＡを検出した。このようにして得られたプラスミドをｐＧＥＭ／ｐＫ４Ｃ−１〜６と命名した。
【００９３】
（３）−２  大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルの調製
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
【００９４】
大腸菌 ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍｌに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍｌをＳＯＢ培地４０ｍｌ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ （ｐＨ６．０），２００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を１３ｍｌ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍｌに懸濁し、０．２２ｍｌのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００９５】
（４）プラスミドｐＧＥＭ／ｐＫ４Ｃ−１〜６のインサート部分シークエンス解析
キャピラリーＤＮＡシークエンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用い、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているｐＫ４由来配列の確認を行った。図３は、プラスミドｐＫ４の１１０２番目から１１６１番目と、プラスミドｐＧＥＭ／ｐＫ４Ｃ−１〜６のインサート部分シークエンスのアライメントを示す図である。図３中、「ｐＫ４」はプラスミドｐＫ４の１１０２番目から１１６１番目の配列を表し、「１〜６」はプラスミドｐＧＥＭ／ｐＫ４Ｃ−１〜６のインサート部分シークエンスを表す。図２中の（１）（２）の囲み部分に示されるように、プラスミドｐＧＥＭ／ｐＫ４Ｃ−１〜６はすべて、
塩基配列
2013223486.tif 000007
【００９６】
の囲み文字で表されるシトシンがチミンに変換されずにシトシンとして検出されていることから、Ｊ１菌由来ｐＫ４の塩基配列
2013223486.tif 000008
【００９７】
の囲み文字で表されるシトシンは、そのＣ５位がメチル化されていることが示された。
【００９８】
［実施例３］
Ｊ１菌染色体ＤＮＡの調製
Ｊ１菌を１００ｍｌのＭＹＫＧ培地中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【００９９】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム４０ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
【０１００】
次に、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）（１０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ加えて３７℃で１時間振盪した。
【０１０１】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、攪拌後、遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【０１０２】
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【０１０３】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻き取り回収し、染色体ＤＮＡ標品を得た。
【０１０４】
［実施例４］
ＤＮＡ修飾酵素遺伝子のＰＣＲ
ＤＮＡ修飾酵素遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【０１０５】
図３はロドコッカス属細菌の産生するＤＮＡ修飾酵素のアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図１中でホモロジー解析を行ったＤＮＡ修飾酵素とその由来は以下のとおりである。
【０１０６】
Ａ：ＤＮＡ  （ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｉｖｏｒａｎｓ  ＡＫ３７）
Ｂ：ＤＮＡ  （ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  １０３Ｓ）
Ｃ：ＤＮＡ  （ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  ＰＤ６３０）
Ｄ：ＤＮＡ  （ｃｙｔｏｓｉｎｅ−５−）−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡ１）
Ｅ：ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｙｌａｓｅ  （Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４）
図３中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号９および配列番号１０のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例３で調製したＪ１菌ゲノムＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約１．１ｂのバンドの増幅が確認された。
【０１０７】
反応液組成                                        
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ，実施例３）       １μｌ
１０×Ｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）     １０μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０１（配列番号９）     １μｌ
１５０μＭプライマーＤＧ−０２（配列番号１０）  １μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                             ８μｌ
ＤＭＳＯ                                １０μｌ
滅菌水                                  １８μｌ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）１μｌ
総量                                    ５０μｌ
温度サイクル：９４℃：３０秒、６５℃：３０秒および７２℃：１分の反応を３０サイクル
プライマー
ＤＧ−０１：５’−ＡＴＧＧＴ（Ｃ／Ｇ）ＧＧＩＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＴ（Ｔ／Ｃ）ＧＣ（Ｃ／Ｇ）ＧＧＩＡＴＣ−３’（配列番号９）
ＤＧ−０２：５’−ＣＡＡ（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＣＣ（Ｇ／Ｃ）ＧＣＩＣＴ（Ｇ／Ｃ）ＧＣ（Ｔ／Ｃ）ＣＴ（Ｇ／Ｃ）ＧＣ−３’（配列番号１０）
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号１１に示す塩基配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のＤＮＡ修飾酵素との相同性が認められた。
【０１０８】
［実施例５］
ＤＮＡ修飾酵素遺伝子のクローニング
（１）ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
制限酵素ＸｂａＩ，ＳｐｅＩ，ＮｈｅＩ，ＮｄｅＩ，ＭｆｅＩそれぞれで消化したＪ１菌ゲノムＤＮＡに対し、以下の（１）−１の方法で調製したＤＮＡ修飾酵素のプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＭｆｅＩで消化した断片から、約４．１ｋｂの単一シグナルが得られた。
【０１０９】
（１）−１  ＤＮＡ修飾酵素のプローブ調製
実施例４で調製したＰＣＲ産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対してＡｌｋＰｈｏｓ    Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、ＤＮＡ修飾酵素のプローブとした。
【０１１０】
（２）コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩで分解して０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を使用して約４．１ｋｂの断片を回収した。得られた断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【０１１１】
反応液組成：
ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ（タカラバイオ社製）     ５μｌ
Ｊ１菌ゲノムＤＮＡ／ＭｆｅＩ切断断片                           ４μｌ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）／ＥｃｏＲＶ切断断片     １μｌ
総量                                                  １０μｌ
反応：１６℃，１時間
【０１１２】
上記ライゲーション産物の全量を、実施例２（３）−２に記載の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μｌに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ 培地（２０ ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１ｍｌ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μｌずつ、ＬＢ  ＡＩＸプレート（１００μｇ／ｌアンピシリン、１００μＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）に塗布し、３７℃で一晩放置した。プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいＬＢ  ＡＩＸプレートに、プレート１枚に付き９４個、プレート１０枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）で形質転換したＪＭ１０９株を２コロニー／プレート植菌した。コロニー単離したプレートを３７℃で一晩放置した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）膜にコロニーを写し取り、実施例５（１）−１の方法で調製したＤＮＡ修飾酵素のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１１３】
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号１２に示される塩基配列が得られた。配列番号１２に示される塩基配列中に、配列番号１および３に示す１．２ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）を見出した。このＯＲＦ１およびＯＦＲ２のコードするアミノ酸配列は、図３中に示したＡ〜Ｅのロドコッカス属細菌由来ＤＮＡ修飾酵素に対して８０％〜９９％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２はＤＮＡ修飾酵素をコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２のコードする修飾酵素をＭ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素と命名した。また、本実施例５（２）で得られたＯＲＦ１およびＯＦＲ２を含むプラスミドをｐＢＭＲｒｈＪ１ＩＩと命名した。
【０１１４】
［実施例６］
大腸菌組換体によるＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）の生産
（１）ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）発現プラスミドの構築
ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を得るために、実施例１で得られたＪ１菌染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１１５】
反応液組成                                                                   
鋳型ＤＮＡ（Ｊ１菌染色体ＤＮＡ）                                      １μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）２５μｌ
１０μＭプライマーＪＭ−１３８（配列番号１３）                        １μｌ
１０μＭプライマーＪＭ−１３９（配列番号１４）                        １μｌ
総量                                                                  ５０μｌ
温度サイクル：９８℃：１０秒、５５℃：１５秒および７２℃：７秒の反応を３０サイクル
プライマー
ＪＭ−１３８：５’−ａｇｇａａａｃａｇａｃｃａｔｇＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＧＧＡＡＣＡＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＴ−３’（配列番号１３）
ＪＭ−１３９：５’−ｇｃｔｔｇｃａｔｇｃｃｔｇｃａＴＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＧＣＧＧＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＴ−３’（配列番号１４）
反応終了後、反応液２μｌを０．７％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約１．２ｋｂのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液からＰＣＲ産物をＦａｖｏｒ  Ｐｒｅｐ  ＧＥＬ／ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ社）で精製した。得られたＰＣＲ産物を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いてベクターｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ／Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドをｐＭＲｈ００１と名づけた。図４はプラスミドｐＭＲｈ００１の構造を示す模式図である。
【０１１６】
このプラスミドで大腸菌ＨＳＴ０８（タカラバイオ社）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でコロニーを形成させた。得られた白色のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。その後、ＱＩＡＰｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用してプラスミドを回収し、シークエンス解析を行って目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。プラスミドｐＭＲｈ００１を保有する形質転換体をＨＳＴ０８／ｐＭＲｈ００１と命名した。
【０１１７】
（２）コントロールプラスミドの構築
ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）発現組換体の対照となる組換体を得るために、（１）で得られたプラスミドｐＭＲｈ００１を鋳型として使用し、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１１８】
反応液組成                                                                   
鋳型ＤＮＡ（ｐＭＲｈ００１）                                                 １μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）２５μｌ
１０μＭプライマーＰＣ−０１（配列番号１５）                                 １μｌ
１０μＭプライマーＰＣ−０２（配列番号１６）                                 １μｌ
総量                                                                  ５０μｌ
温度サイクル：９８℃：１０秒、５５℃：１５秒および７２℃：２７秒の反応を３０サイクル
プライマー
ＰＣ−０１：５’−ａｃａｇａｃｃｔｇＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＧＧＡＡＣＡ−３’（配列番号１５）
ＰＣ−０２：５’−ＣＧＡＣＧＴｃａｇｇｔｃｔｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇ−３’（配列番号１６）
反応終了後、反応液２μｌを０．７％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約５．２ｋｂのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液に制限酵素ＤｐｎＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１０μｌ添加し、３７℃，３時間インキュベートした後にＦａｖｏｒ  Ｐｒｅｐ  ＧＥＬ／ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆａｖｏｒｇｅｎ社）を用いてＰＣＲ産物を精製した。得られたＰＣＲ産物で大腸菌ＨＳＴ０８（タカラバイオ社）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１ｍＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でコロニーを形成させた。得られた白色のコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した後ＱＩＡＰｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用してプラスミドを回収し、シークエンス解析を行って目的のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。このプラスミドをｐＭＲｈ００２と命名し、プラスミドｐＭＲｈ００２を保有する形質転換体をＨＳＴ０８／ｐＭＲｈ００２と命名した。
【０１１９】
（３）ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を発現する大腸菌組換体の培養
ＬＢ  Ａｍｐ培地をワッセルマン試験管に１ｍｌずつ分注し、ＨＳＴ０８／ｐＭＲｈ００１および対照とするＨＳＴ０８／ｐＭＲｈ００２のコロニーを植菌した。３７℃、２１０ｒｐｍで約８時間培養した。その後、得られた各培養液の全量を、ＩＰＴＧを終濃度として０．１ｍＭ含むＬＢ  Ａｍｐ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ中の１００ｍｌ）に植菌し、３７℃，２１０ｒｐｍで１６時間培養した。得られた各培養液１０ｍｌから遠心分離（８０００ｒｐｍ，１０分間、４℃）により各菌体を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。
【０１２０】
（４）ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）を発現する大腸菌組換体由来プラスミドの制限酵素切断
（３）で得られた各プラスミドを制限酵素で切断し、切断パターンを確認した。
【０１２１】
反応液組成                                                  
基質ＤＮＡ（プラスミド液）                              ５    μｌ
制限酵素（ＸｈｏＩ又はＳｐｈＩ，タカラバイオ社）        ０．５μｌ
１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）                ２    μｌ
総量                                             ２０    μｌ
反応終了後、反応液１０μｌを０．７％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、切断パターンを確認した。
【０１２２】
結果を図５に示す。図５中、「Ａ」はＸｈｏＩで切断したサンプル、「Ｂ」はＳｐｈＩで切断したサンプル、「Ｃ」はネガティヴコントロール（酵素を含まない反応液でインキュベートしたサンプル）である。いずれのプラスミドもＳｐｈＩにより切断され約２．６ｋｂ，２．０ｋｂ，０．６ｋｂのバンドが生成した（図５「３」）．一方、プラスミドｐＭＲｈ００２はＸｈｏＩにより完全に切断され、約４．６ｋｂと約０．７ｋｂのバンドが生成したが（図５「２」），プラスミドｐＭＲｈ００１はＸｈｏＩにより部分的に切断されたのみであった（図５「１」）ことから、ＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）はＣＴＣＧＡＧを認識して修飾するＤＮＡ修飾酵素（Ｍ．ＲｒｈＪ１ＩＩ修飾酵素）活性を持つことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明のＤＮＡ修飾酵素およびその遺伝子は、遺伝子工学の分野で有用であり、メチル化シトシン解析におけるポジティヴコントロール調製などに利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】
配列番号５：プライマーＲＣ−２３
配列番号６：プライマーＲＣ−１９
配列番号７：プライマーＲＣ−２４
配列番号８：プライマーＲＣ−２５
配列番号９：プライマーＤＧ−０１
配列番号１０：プライマーＤＧ−０２
配列番号１３：プライマーＪＭ−１３８
配列番号１４：プライマーＪＭ−１３９
配列番号１５：プライマーＰＣ−０１
配列番号１６：プライマーＰＣ−０２
【図２】
2013223486.tif 000010
【図１】
2013223486.tif 000011
【図３】
2013223486.tif 000012
【図４】
2013223486.tif 000013
【図５】
2013223486.tif 000014
【配列表】
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