(57)【要約】【課題】  イムノクロマトグラフィー法により微生物を簡便に検出することができる微生物の検出方法及びそのキットを提供する。【解決手段】  本発明の微生物の検出方法は、検出対象微生物に対する抗体を固相化した膜担体に対して、抗菌ペプチドに標識物質を結合させた標識化抗菌ペプチドと検出対象微生物を展開させ、前記抗体で微生物を捕捉し、その発色に基づいて微生物を検出することからなる微生物の検出方法である。従来のイムノクロマトグラフィー法による微生物の検出方法では、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を必要としていたが、本発明によれば１種類の抗体で行うことができるという特長を有する。【選択図】  図１
2013164414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の検出対象微生物を検出するイムノクロマトグラフィー法であって、検出対象微生物に対する抗体を固相化した膜担体に対して、抗菌ペプチドに標識物質を結合させた標識化抗菌ペプチドと検出対象微生物を展開させ、前記抗体で微生物を捕捉し、その発色に基づいて微生物を検出することを特徴とする微生物の検出方法。
【請求項２】
膜担体に、間隔を空けて、２種以上の微生物の抗体を固相化する、請求項１記載の微生物の検出方法。
【請求項３】
標識物質が、金属コロイド粒子又はラテックス粒子である、請求項１又は２記載の微生物の測定方法。
【請求項４】
検出対象微生物が、病原性細菌、病原性真菌又はエンベロープウイルスである、請求項１〜３のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項５】
抗菌ペプチドとして、アミノ酸残基数が１００以下の抗菌ペプチド、又はそのアミノ酸配列を改変したペプチドを使用する、請求項１〜４のいずれかに記載の微生物の検出方法。
【請求項６】
抗菌ペプチドが、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ２、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ３、Ｍａｇａｉｎｉｎ  １、Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２、Ｂｏｍｂｉｎｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７若しくはＣｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ  Ａ又はそれらのアミノ酸配列を改変したペプチドである、請求項５記載の微生物の検出方法。
【請求項７】
検出対象微生物を認識する抗体を固相化した膜担体と、標識物質と抗菌ペプチドとが結合した標識化抗菌ペプチドを少なくとも有するイムノクロマトグラフィー用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の検出方法に関する。より詳細には、抗菌ペプチドを用いた微生物の検出方法及びその方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、有害微生物による食中毒が頻発している。食品の安全性を確保する上からは、食品中の有害微生物の検査は極めて重要である。従来、食品などの検体中の微生物を検出する方法としては、培養法、ＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ法、免疫凝集法などの方法が知られている（特許文献１〜３等参照）。しかし、これらの方法は、検出結果を得るまでに長時間を要する、操作が煩雑である、特殊な装置が必要であるなどの問題があった。
このような問題から、簡便に微生物を検出する方法として、イムノクロマトグラフィー法（以下、イムノクロマト法と称する）が知られており、既に商品化されているものもある。
イムノクロマト法の一例を汎用されているサンドイッチ法で説明すると、まず検出対象微生物を認識し且つ抗原認識部位の異なる２種の抗体を用意する。その内の第一抗体は細長の膜担体の所定の個所に固相化し、微生物捕捉部位（テストライン）を形成する。一方、第二抗体には、金コロイドなどの発色（呈色）標識を施し、標識化第二抗体とする。そして、試料溶液を標識化第二抗体と混合した後に膜担体の一端に滴下し吸収させるか、凍結乾燥した標識化第二抗体を含有するチューブに試料溶液を混合した後に膜担体の一端に適下し吸収させるか、又は標識化第二抗体を含有するコンジュゲートパッドを膜担体の一端に設けてコンジュゲートパッドの近傍に試料溶液を滴下し吸収させる。試料溶液中に検出対象微生物が含まれていると、標識化第二抗体は当該微生物を認識し、標識−第二抗体―検出対象微生物の複合体を形成する。この複合体を含む試料溶液が、毛細管現象により膜担体中を展開し、上記のテストラインを通過すると第一抗体により捕捉され、標識−第二抗体―検出対象微生物−第一抗体の複合体が形成され、標識として金コロイドを用いた場合には赤紫色の発色が観察されて微生物が検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１４８６２９号公報
【特許文献２】特開２００７−９７５５１号公報
【特許文献３】特開２００４−１０１３６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のイムノクロマト法は、操作が簡便であり、特殊な装置を必要とせず且つ短時間で測定することができる方法であるが、抗原である検出対象微生物の異なる部位を認識する２種類の抗体が必要になる。特に、イムノクロマト法は測定感度が低いという問題があり、その問題を回避するために、性能の高い抗体が要求される。しかし、認識部位が異なり且つ性能の高い２種類の抗体を用意することは容易ではなかった。
本願発明者らは、上記の問題点を解決するために種々検討したところ、前記第二抗体に代えて、微生物の細胞膜に結合するという特性を有する抗菌ペプチドを使用すると問題が解消し得ることを見出した。
本発明は係る知見に基づくものであり、検出対象微生物に対する抗体が１種類で足り、測定感度の向上を図ることができる、イムノクロマト法による微生物の検出方法及びそれに使用されるキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の課題を解決するためになされた本発明は、試料中の検出対象微生物を検出するイムノクロマトグラフィー法であって、検出対象微生物に対する抗体を固相化した膜担体に対して、抗菌ペプチドに標識物質を結合させた標識化抗菌ペプチド（以下、検出プローブと称することもある）と検出対象微生物を展開させ、前記抗体で微生物を捕捉し、その発色に基づいて微生物を検出することを特徴とする微生物の検出方法である。
上記の膜担体には、間隔を空けて、２種以上の微生物の抗体を固相化し、２種以上の微生物を同時に検出する方法であってもよい。
また、標識物質としては、金属コロイド粒子又は有色ラテックス粒子が好適に使用される。
検出対象微生物としては有害微生物が挙げられ、例えば、病原性細菌（例えば、病原性大腸菌（Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１０４など）、サルモネラ菌、カンピロバクター菌、リステリア菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、エルシニア菌、赤痢菌、腸チフス菌、パラチフス菌、コレラ菌、肺炎球菌、淋菌、ジフテリア菌など）、病原性真菌（例えば、カンジダ菌、カビなど）、エンベロープウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなど）などが例示される。
抗菌ペプチドとしては、微生物への結合数を増やすことができるのでアミノ酸残基数が１００以下、好ましくは５０以下の抗菌ペプチドを使用するのが好ましく、特にＣｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ２、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ３、Ｍａｇａｉｎｉｎ  １、Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２、Ｂｏｍｂｉｎｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７又はＣｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ  Ａが好適に使用される。なお、係る抗菌ペプチドは、そのアミノ酸配列を改変したことにより機能が改善したペプチドであってもよい。
また、本発明は、上記検出方法に好適に使用されるイムノクロマト用キットであり、検出対象微生物を認識する抗体を固相化した膜担体と、標識物質と抗菌ペプチドとが結合した標識化抗菌ペプチドを少なくとも有するイムノクロマト用キットである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のイムノクロマト法による微生物の検出方法によれば、従来、抗原認識部位の異なる２種の抗体が必要であったが１種の抗体で足り、しかも抗原認識部位を意識せずに抗体を調製することができるので、使用する抗体の作製が極めて容易になる。また、検出プローブは、検出対象の微生物種に係わらず、共通に使用することができるので、膜担体に固相化する抗体を換えるだけで、様々な微生物の検出系を構築することができる。更に、抗菌ペプチドは抗体に比べて分子量が小さいので、検出対象微生物に結合する抗菌ペプチドの量を増加させることができ、測定感度の向上を図ることができる。加えて、検出プローブは、微生物の抗原認識部位とは無関係に複合体を形成し得るので、従来の標識化第二抗体と併用することにより、測定感度の向上を図ることができる。更に、抗菌ペプチドは抗体に比べて、短時間・低コストで製造することができ、また必要に応じて、アミノ酸配列を改変することにより、機能の改善を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明のイムノクロマト用キットの一例を模式的に示した図である。
【図２】実施例４の検査結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は前記の構成からなり、本発明のイムノクロマト法による微生物の検出方法は、標識化第二抗体の代わりに、検出プローブ（即ち、抗菌ペプチドに標識物質を結合させた標識化抗菌ペプチド）を使用する以外は、従来のイムノクロマト法による微生物の検出方法と同様にして行うことができる。
【０００９】
即ち、膜担体としては毛細管現象により液体が移動できる素材であれば足り、従来のイムノクロマト法で使用されている膜担体が使用でき、例えば、ストリップ状にカットされたセルロース膜、ニトロセルロース膜などが好適に使用される。
必要に応じて、ポリエチレン、ポリエステル、フッ素樹脂などのシート状プラスチック素材の上に膜担体を形成してもよい。
上記の膜担体の所定の位置には、検出対象微生物を捕捉するために、当該微生物を検出する抗体を固相化したテストラインを形成する。
【００１０】
本発明において、検出対象微生物としては、抗菌ペプチドと結合し得る微生物であれば特に限定されず、細菌、真菌、ウイルスなどが挙げられるが、本発明の目的である食中毒などの疾病の予防という点からは、検出対象微生物としては有害微生物が挙げられる。
有害微生物としては、病原性細菌（例えば、病原性大腸菌（Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１０４など）、サルモネラ菌、カンピロバクター菌、リステリア菌、ボツリヌス菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、エルシニア菌、赤痢菌、腸チフス菌、パラチフス菌、コレラ菌、肺炎球菌、淋菌、ジフテリア菌など）、病原性真菌（例えば、カンジダ菌、カビなど）、エンベロープウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなど）などが例示される。
【００１１】
検出対象微生物を認識する抗体は常法により調製することができ、例えば、検出対象微生物の断片化物、加熱及び酸、アルカリなどで処理した微生物成分や微生物成分精製物などを抗原として、ウサギ、マウスなどの動物に免疫して抗血清（ポリクローナル抗体）を得ることができる。また、上記の抗原をマウス又はラットに免疫したＢ細胞とミエローマ細胞を融合させて確立したハイブリドーマを、免疫動物の腹腔内に接種し産生された抗体やハイブリドーマの培養上清を精製することによりモノクローナル抗体を得ることができる。抗体として、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントであってもよい。
本発明においては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の何れも使用することができる。なお、微生物によっては、その抗体が既に市販されており、そのような市販抗体を使用してもよい。
【００１２】
膜担体への上記抗体の固相化は常法に準じて行うことができ、例えば、塗布法、化学的結合法などが例示される。例えば、膜担体の所定位置に抗体を塗布した後、乾燥させた後、必要に応じて、その膜担体をブロッキング剤溶液に浸漬し、次いで洗浄・乾燥することにより、テストラインを有する膜担体を調製することができる。
なお、膜担体のテストラインは１個所に限られず、異なる微生物の抗体のテストラインを複数設けてもよい。複数のテストラインを設けることにより、複数の微生物を同時に検出することができる。
【００１３】
本発明においては、従来のイムノクロマト法で使用される、標識化第二抗体の代わりに、抗菌ペプチドに標識物質を結合させた標識化抗菌ペプチド（検出プローブ）が使用される。
上記の抗菌ペプチドは抗菌性を有するペプチドを意味し、有害微生物の侵入・定着を防止するために、動物や植物が産生するペプチド、即ち生物の自然免疫系を担うペプチドである。極めて多数（１０００種以上）の抗菌ペプチドが既に知られており、その作用機構も明らかにされつつある（例えば、Ｎａｔｕｒｅ, Ｖｏｌ.４１５, ｐ３８９, ２００２など参照）。
抗菌ペプチドの一般的特徴としては、
・１０〜１００程度のアミノ酸残基からなり、分子中に多くの塩基性アミノ酸を有し、生理的条件下では正電荷を帯びる；
・疎水性条件下では、αへリックス構造などの二次構造をとる；
・細菌、真菌、ウイルスなどを認識し、その負に帯電している膜に結合し、膜に穴を空けて攻撃する。特に、リポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌表面物質を高い親和性で特異的に認識する；
などが挙げられ、上記のように抗菌ペプチドは微生物を認識し結合するという特性を有する。
本発明において、使用し得る抗菌ペプチドは特に限定されないが、検出対象微生物に対する結合量を増加することができることから、アミノ酸残基数が１００以下、好ましくは５０以下の抗菌ペプチドが好適に使用される。係る抗菌ペプチドとしては、例えば、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ２、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ３、Ｍａｇａｉｎｉｎ  １、Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２、Ｂｏｍｂｉｎｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７、Ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ  Ａ、ＴＥＷＰ、ＰＡＲＡＳＩＮ  Ｉ、ＳＭＡＰ−２９、Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ  Ｉ、Ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ−Ｓ３、Ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ−Ｂ５、Ｆｏｗｌｉｃｉｄｉｎ−１、ＬＬ−３７、ＣＭ１５などが挙げられ、二種以上を併用してもよい。特にＣｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ２、Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ３、Ｍａｇａｉｎｉｎ  １、Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２、Ｂｏｍｂｉｎｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７又はＣｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ  Ａが好適に使用される。
【００１４】
抗菌ペプチドに結合させる標識物質としては、従来のイムノクロマト法で使用される標識物質の何れも使用することができる。そのような標識物質としては、金属コロイド（例えば、金コロイド、銀コロイド、白金コロイドなどの貴金属コロイド）、有色ラテックス粒子（例えば、ポリスチレンラテックス、スチレン−スチレンスルホン酸ラテックスなど）が例示される。
特に、化学的安定性が高いことから金コロイドが好適に使用され、粒径が約１〜５００ｎｍが使用され、強い発色が得られることから５〜１００ｎｍが好ましい。なお、イムノクロマト用金コロイド液が既に市販されており、そのような市販品を使用することができる。
【００１５】
抗菌ペプチドと標識物質との結合は公知の方法に準じて行うことができ、例えば疎水結合を利用した物理吸着法、あるいは活性化させたカルボキシル基、アミノ基、チオール基等で共有結合させる化学結合法を用いることができる。
好ましい方法としては、強い親和性と特異性を有する物質の組合せ（以下、結合性物質体という）を用いた方法が挙げられる。結合性物質体は既に知られており、例えば、ビオチン−アビジン又はストレプトアビジン、コンカナバリンＡ−糖などの組合せが例示できる。例えば、ビオチンが結合した抗菌ペプチドと、ストレプトアビジンが結合した標識物質を混合すると、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して、抗菌ペプチドと標識物質を結合させることができる。
【００１６】
本発明において、試料としては、食品（例えば、食肉、食肉加工品、水産物、水産加工品、農産物、農産加工品、乳製品など）、飲料水などの水、生体試料（例えば、糞便、嘔吐物、血液、血漿、尿など）、それらの抽出物や処理物が例示される。なお、試料中の微生物は微生物に適した培地を用いて培養し、その培養液を使用してもよい。
【００１７】
本発明のイムノクロマト用キット及びそれを使用した本発明の微生物の検出方法を具体的に説明する。
図１は、本発明のイムノクロマト用キットの一例を模式的に示した図である。図１において、１は膜担体、２はコンジュゲートパッド、３はサンプルパッド、４は吸収パッド、５はテストラインである。この例においては、膜担体１には、抗Ｏ１５７抗体、抗Ｏ２６抗体及び抗Ｏ１１１抗体の３種の抗体で３つのテストライン５が形成されている。
コンジュゲートパッド２は、前記の標識化抗菌ペプチド溶液を、膜担体１と同様な素材に含浸させた後、乾燥したものである。
サンプルパッド３は、試験液を滴下する部位であり、膜担体１と同様な素材からなる。
吸収パッド４は、展開してきた試験液を吸収する部位であり、水分を吸収し得る素材であれば特に限定はなく、膜担体１と同様な素材、フエルト、不織布などからなる。
【００１８】
上記のキットの使用方法は、従来のイムノクロマト用キットと同様である。即ち、検出対象微生物を含有する試験液をサンプルパッド３に滴下する。滴下された試験液は毛細管現象により、図の右方向に展開する。試験液がコンジュゲートパッド２に達した際、試験液中に検出対象微生物が存在すると、コンジュゲートパッド２中の標識化抗菌ペプチドと結合し、標識−抗菌ペプチド−微生物の複合体が形成される。当該複合体は、液の展開に伴ってテストライン５に達すると、膜担体１に固相化されている抗体で捕捉され、標識−抗菌ペプチド−微生物−抗体の複合体が形成されて発色し、検出対象微生物が検出される。
【００１９】
なお、本発明は上記の例に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。例えば、膜担体１のテストライン５の下流側に、抗菌ペプチドを認識する抗体を結合することにより、標識化抗菌ペプチドを捕捉して発色するコントロールラインを設けてもよい。
コントロールラインの設定方法としては、抗菌ペプチドを認識する抗体を用いることの他に、標識化抗菌ペプチドの標識物質（例えば、ストレプトアビジン金コロイド等）と結合する抗体（例えば抗ストレプトアビジン抗体等）を用いることができる。あるいは末端配列にヒスチジン6残基からなる配列（His-tag配列）を付加した標識抗菌ペプチドであれば、抗His-tag抗体を用いることもできる。なお、抗ストレプトアビジン抗体や抗His-tag抗体は既に市販されており、そのような市販品を使用することができる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
病原性大腸菌Ｏ１５７検出
Ａ.プロトコル
１）メンブレンの作製
(1)抗大腸菌Ｏ１５７抗体をリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと記す。ｐＨ７．２）で希釈し、イムノクロマト塗布装置を用いてニトロセルロースメンブレンの所定位置に１ｍｇ／ｍＬで塗布する。
(2)メンブレンをデシケーターで一晩乾燥させる。
２）検出プローブ（金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１）の作製
(1)ビオチン標識したＣｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１をＰＢＳで３０μg/ｍＬに希釈する。
(2)上記(1)をストレプトアビジン金コロイド溶液と混合する（等量）。
(3)４℃で一晩静置させる。
(4)１０％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液を金コロイドと等量加えて、２５℃、１時間ブロッキングする。
(5)遠心分離（10000xg、２０分間、４℃）し、上清を除去する。
(6)１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を加え懸濁後、超音波装置で金コロイドを分散させる。
(7)遠心分離（10000xg、２０分間、４℃）し、上清を除去する。
(8)１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を加え懸濁後、超音波装置で金コロイドを分散させる。
(9)遠心分離（10000xg、20分間、4℃）し、上清を除去する。
(10)１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を金コロイドと等量加えて超音波装置で金コロイドを分散させ、金コロイド溶液とする。
(11)５３０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、１％トレハロース、１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を用いて１abs/μLへ希釈する。
【００２２】
３）イムノクロマト用ストリップの組み立て
(1)前記１）のメンブレンにサンプルパッド、吸収パッド、ラミネートシールを貼り付ける。
(2)イムノクロマト裁断機を用いて、５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマト用ストリップとして使用する。
４）菌液の作製
(1)Ｏ１５７菌体をトリプトソーヤブイヨンで４２℃、一晩培養する。
(2)生菌数を測定する。
(3)ＰＢＳを用いて１０倍希釈系列を作製し、試験用サンプルとする。
５）試験方法
(1)９６ウェルプレートに、金コロイド溶液（検出プローブ）３０μLと段階希釈した培養液１００μLを混合する。
(2)上記(1)にイムノクロマト用ストリップのサンプルパッド部を投下する。
(3)１５分後目視でラインの有無を判定する。
(4)判定基準は、＋（陽性：ラインあり）、Ｗ＋（弱陽性：薄いラインあり）、−（陰性：ラインなし）の3段階で判定する。
【００２３】
Ｂ.結果
上記の試験結果を表１に示した。なお、表１中、括弧内は菌数（ｃｆｕ／ｍｌ）である（以下同様）。表１に示されるように、検出プローブとして金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用したイムノクロマト法は、大腸菌Ｏ１５７の検出が可能であった。
【００２４】
【表１】
2013164414.tif 000003
【００２５】
実施例２
サルモネラ菌の検出
Ａ.プロトコル
１）メンブレンの作製
(1)抗サルモネラ菌抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈し、イムノクロマト塗布装置を用いてニトロセルロースメンブレンの所定位置に１ｍｇ／ｍＬで塗布する。
(2)メンブレンをデシケーターで一晩乾燥させる。
２）検出プローブ
実施例１で作製した金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用した。
３）イムノクロマト用ストリップの組み立て
(1)前記１）のメンブレンにサンプルパッド、吸収パッド、ラミネートシールを貼り付ける。
(2)イムノクロマト裁断機を用いて、５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマト用ストリップとして使用する。
４）菌液の作製
(1)サルモネラ菌（S. Typhimurium、S. Infantis）をトリプトソーヤブイヨンで４２℃、一晩培養する。
(2)生菌数を測定する。
(3)ＰＢＳを用いて１０倍希釈系列を作製し、試験用サンプルとする。
５）試験方法
(1)９６ウェルプレートに、金コロイド溶液（検出プローブ）３０μLと段階希釈した培養液１００μLを混合する。
(2)上記(1)にイムノクロマト用ストリップのサンプルパッド部を投下する。
(3)１５分後目視でラインの有無を判定する。
(4)判定基準は、＋（陽性：ラインあり）、Ｗ＋（弱陽性：薄いラインあり）、−（陰性：ラインなし）の3段階で判定する。
【００２６】
Ｂ.結果
上記の試験結果を表２に示した。表２に示されるように、検出プローブとして金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用したイムノクロマト法は、サルモネラ菌の検出が可能であった。
【００２７】
【表２】
2013164414.tif 000004
【００２８】
実施例３
腸炎ビブリオの検出
Ａ.プロトコル
１）メンブレンの作製
(1)抗腸炎ビブリオ抗体（テストライン用抗体）及び抗ストレプトアビジン抗体（コントロールライン用抗体）をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈し、イムノクロマト塗布装置を用いてニトロセルロースメンブレンの所定位置にそれぞれ１ｍｇ／ｍＬで塗布する。
(2)メンブレンをデシケーターで一晩乾燥させる。
２）検出プローブ
実施例１で作製した金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用した。
３）イムノクロマト用ストリップの組み立て
(1)前記１）のメンブレンにサンプルパッド、吸収パッド、ラミネートシールを貼り付ける。
(2)イムノクロマト裁断機を用いて、５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマト用ストリップとして使用する。
４）菌液の作製
(1)腸炎ビブリオをアルカリ性ペプトン水で３７℃、一晩培養する。
(2)生菌数を測定する。
(3)アルカリ性ペプトン水を用いて１０倍希釈系列を作製し、試験用サンプルとする。
５）試験方法
(1)９６ウェルプレートに、金コロイド溶液（検出プローブ）３０μLと段階希釈した培養液１００μLを混合する。
(2)上記(1)にイムノクロマト用ストリップのサンプルパッド部を投下する。
(3)１５分後目視でラインの有無を判定する。
(4)判定基準は、＋（陽性：ラインあり）、Ｗ＋（弱陽性：薄いラインあり）、−（陰性：ラインなし）の3段階で判定する。
【００２９】
Ｂ.結果
上記の試験結果を表３に示した。表３に示されるように、検出プローブとして金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用したイムノクロマト法は、腸炎ビブリオの検出が可能であった。
【００３０】
【表３】
2013164414.tif 000005
【００３１】
実施例４
複数の血清型の病原性大腸菌（Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１）の同時検出
Ａ.プロトコル
１）メンブレンの作製
(1)抗大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１抗体をそれぞれＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈し、それぞれの抗体をイムノクロマト塗布装置を用いてニトロセルロースメンブレンの所定位置に間隔を空けて１ｍｇ／ｍＬで塗布する。
(2)メンブレンをデシケーターで一晩乾燥させる。
２）検出プローブ
実施例１で作製した金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用した。
３）イムノクロマト用ストリップの組み立て
(1)上記１）のメンブレンにサンプルパッド、吸収パッド、ラミネートシールを貼り付ける。
(2)イムノクロマト裁断機を用いて、５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマト用ストリップとして使用する。
４）菌液の作製
(1)Ｏ１５７菌体、Ｏ２６菌体、Ｏ１１１菌体をそれぞれトリプトソーヤブイヨンで４２℃、一晩培養する。
(2)生菌数を測定する。
(3)ＰＢＳを用いて１０倍希釈系列を作製し、試験用サンプルとする。
(4)下記表４に示されるように、各種菌液を混合し、試験区１〜４を作製した。
【００３２】
【表４】
2013164414.tif 000006
【００３３】
５）試験方法
(1)９６ウェルプレートに、金コロイド溶液（検出プローブ）３０μLと段階希釈した培養液１００μLを混合する。
(2)上記(1)にイムノクロマト用ストリップのサンプルパッド部を投下する
(3)１５分後目視でラインの有無を判定する。
判定基準は、＋（陽性：ラインあり）、Ｗ＋（弱陽性：薄いラインあり）、−（陰性：ラインなし）の3段階で判定する。
【００３４】
Ｂ.結果
上記の試験結果を表５及び図２に示した。表５及び図２に示されるように、検出プローブとして金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用したイムノクロマト法は、大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６及びＯ１１１の同時検出が可能であった。
【００３５】
【表５】
2013164414.tif 000007
【００３６】
実施例５
抗菌ペプチドＭａｇａｉｎｉｎ  ２を使用した病原性大腸菌Ｏ１５７の検出
Ａ.プロトコル
１）メンブレンの作製
(1)抗大腸菌Ｏ１５７抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で希釈し、イムノクロマト塗布装置を用いてニトロセルロースメンブレンの所定位置に１ｍｇ／ｍＬで塗布する。
(2)メンブレンをデシケーターで一晩乾燥させる。
２）検出プローブ（金コロイド標識化Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２）の作製
(1)ビオチン標識したＭａｇａｉｎｉｎ  ２をＰＢＳで３０μｇ／ｍＬに希釈する。
(2)上記(1)をストレプトアビジン金コロイド溶液と混合する（等量）。
(3)４℃で一晩静置させる。
(4)１０％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液を金コロイドと等量加えて、２５℃、１時間ブロッキングする。
(5)遠心分離（10000xg、２０分間、４℃）し、上清を除去する。
(6)１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を加え懸濁後、超音波装置で金コロイドを分散させる。
(7)遠心分離（10000xg、２０分間、４℃）し、上清を除去する。
(8)１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を加え懸濁後、超音波装置で金コロイドを分散させる。
(9)遠心分離（10000xg、２０分間、４℃）し、上清を除去する。
(10)１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を金コロイドと等量加えて超音波装置で金コロイドを分散させ、金コロイド溶液とする。
(11)５３０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、１％トレハロース、１％ＢＳＡ、２ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８．０)を用いて１abs/μLへ希釈する。
３）イムノクロマト用ストリップの組み立て
(1)上記１）のメンブレンにサンプルパッド、吸収パッド、ラミネートシールを貼り付ける。
(2)イムノクロマト裁断機を用いて、５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマト用ストリップとして使用する。
４）菌液の作製
(1)Ｏ１５７菌体をトリプトソーヤブイヨンで４２℃、一晩培養する。
(2)生菌数を測定する。
(3)ＰＢＳを用いて１０倍希釈系列を作製し、試験用サンプルとする。
５）試験方法
(1)９６ウェルプレートに金コロイド溶液（検出プローブ）３０μLと段階希釈した培養液１００μLを混合する。
(2)上記(1)にイムノクロマト用ストリップのサンプルパッド部を投下する。
(3)１５分後目視でラインの有無を判定する。
(4)判定基準は、＋（陽性：ラインあり）、Ｗ＋（弱陽性：薄いラインあり）、−（陰性：ラインなし）の3段階で判定する。
【００３７】
Ｂ.結果
上記の試験結果を表６に示した。表６に示されるように、検出プローブとして金コロイド標識化Ｍａｇａｉｎｉｎ  ２を使用したイムノクロマト法は、前記金コロイド標識化Ｃｅｃｒｏｐｉｎ  Ｐ１を使用した場合と同様に、大腸菌Ｏ１５７を検出することが可能であった。
【００３８】
【表６】
2013164414.tif 000008
【符号の説明】
【００３９】
１  膜担体
２  コンジュゲートパッド
３  サンプルパッド
４  吸収パッド
５  テストライン
【図１】
2013164414.tif 000009
【図２】
2013164414.tif 000010