(57)【要約】【課題】  本発明は、脂肪酸を含有する培地を用いて酢酸菌を培養する工程、及び/又は、反応液に脂肪酸を添加して反応する工程を含むことを特徴とするアルドン酸の製造方法を提供するものである。【解決手段】ステアリン酸やオレイン酸などの脂肪酸を含有する培地、及び/又は、反応液中に脂肪酸を添加することで、効率的にアルドン酸を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸を含有する培地を用いて培養する工程、及び/又は、反応液に脂肪酸を添加して反応する工程、を含むことを特徴とするヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化する能力を有する酢酸菌を用いるアルドン酸の製造方法。
【請求項２】
酢酸菌が、アセトバクター属(Acetobacter)、グルコナセトバクター属(Gluconacetobacter)、グルコノバクター属(Gluconobacter)から選択される１種である請求項１に記載の製造方法。  
【請求項３】
培地中の脂肪酸の濃度が０．１重量％〜５重量％である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
反応液中の脂肪酸の濃度が０．５重量％〜５重量％である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
脂肪酸の炭素数が８〜２０である請求項１〜４の何れかに記載の製造方法。
【請求項６】
脂肪酸がパルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸から選択される１種である請求項１〜５の何れかに記載の製造方法。
【請求項７】
脂肪酸がパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸から選択される１種である請求項１〜６の何れかに記載の製造方法。
【請求項８】
ヘミアセタール水酸基を有する糖が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、及びラクトースからなる群から選択される少なくとも一つの糖である請求項１〜７の何れかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸を含有する培地を用いて酢酸菌を培養する工程、及び/又は、反応液に脂肪酸を添加して反応する工程を含むことを特徴とするアルドン酸の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康増進を目的とした種々の健康食品素材が開発されている。中でもアルドン酸は、カルシウムや鉄などの金属との塩を形成した場合、水に容易に溶解することから、ミネラル補強剤として注目されている。特に、オリゴ糖を酸化して得られるアルドン酸は、オリゴ糖のヘミアセタール水酸基が酸化されており、体内の分解酵素の影響を受けにくく、摂取した際に分解されることなく腸内に到達でき、ビフィズス菌増殖を誘発する因子として利用することが可能である。このような特性を有するため、各種の糖からアルドン酸を製造する方法が検討されている。
【０００３】
アルドン酸を製造する方法として、ヘミアセタール水酸基を有する糖を臭素ナトリウムとともに電気を印加することによって酸化させる方法や、微生物転換・醗酵法として、アシネトバクター属やブルクホルデアリ属などの微生物をヘミアセタール水酸基を有する糖に作用し、酸化させる製造方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、アルドン酸の合成品は、法例上食品として用いることができない。また、上記記載の製造方法では、培養で得られる微生物の活性が低く、反応において十分な反応効率が得られなかった。アルドン酸を容易にかつ安全性の担保された方法で製造することが特に望まれていたが、活性が不十分であり、効率のよい製造方法は確立されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１‐２４５６５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、脂肪酸を含有する培地を用いて酢酸菌を培養する工程、及び/又は、反応液に脂肪酸を添加して反応する工程を含むことを特徴とするアルドン酸の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を達成するために、鋭意研究を重ねた結果、培地成分に脂肪酸を添加することにより、酢酸菌の菌体活性が向上することを見出した。また、反応液中に脂肪酸を添加することにより、アルドン酸の反応効率が向上することを見出した。本発明は、これらの知見に基づき完成されたものであり、本発明は、脂肪酸を含有する培地を用いて酢酸菌を培養する工程、及び/又は、反応液に脂肪酸を添加して反応する工程を含むことを特徴とするアルドン酸の製造方法を提供する。
【０００７】
項１．脂肪酸を含有する培地を用いて培養する工程、及び/又は、反応液に脂肪酸を添加して反応する工程、を含むことを特徴とするヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化する能力を有する酢酸菌を用いるアルドン酸の製造方法。
項２．酢酸菌が、アセトバクター属（Acetobacter）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）から選択される１種である項１に記載の製造方法。  
項３．培地中の脂肪酸の濃度が０．１重量％〜５重量％である項１又は２に記載の製造方法。
項４．反応液中の脂肪酸の濃度が０．５重量％〜５重量％である項１又は２に記載の製造方法。
項５．脂肪酸の炭素数が８〜２０である項１〜４の何れかに記載の製造方法。
項６．脂肪酸がパルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸から選択される１種である項１〜５の何れかに記載の製造方法。
項７．脂肪酸がパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸から選択される１種である項１〜６の何れかに記載の製造方法。
項８．ヘミアセタール水酸基を有する糖が、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、及びラクトースからなる群から選択された少なくとも一つの糖である項１〜７の何れかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化する能力を有する酢酸菌を用いて、効率的にアルドン酸を製造することができる。酢酸菌を用いたアルドン酸の製造方法において、菌体活性を向上させる培地成分、及び反応効率を向上させる成分はこれまで限定させていない。しかしながら、本発明によれば、酢酸菌を培養する培地に脂肪酸を添加することにより、菌体の活性を上昇させることができる。また、反応液中に脂肪酸を添加することにより、反応効率を向上させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
本発明において用いられるヘミアセタール水酸基を有する糖とは、その還元末端がアルデヒドである糖をいう。具体例としては、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノースなどの単糖、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、ラクトースなどのオリゴ糖があげられる。中でも、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、セロビオース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、メリビオース、及びラクトースなどが好ましく、ラクトースが特に好ましい。
【００１１】
本発明においてアルドン酸とは、単糖であるアルドースのヘミアセタール水酸基が酸化されたもののほか、還元末端にアルドース構造を有する二糖以上の糖のヘミアセタール水酸基が酸化されたものも含み、さらにこれらの塩の形態も含むものをいう。
【００１２】
したがって、本発明は、上記したヘミアセタール水酸基を有する糖を対応するアルドン酸に変換する方法である。具体的には、Ｄ−グルコースをグルコン酸に、Ｄ−マンノースをマンノン酸に、Ｄ−ガラクトースをガラクトン酸に、Ｄ−リボースをリボン酸に、Ｄ−キシロースをキシロン酸に、Ｌ−アラビノースをアラボン酸に、セロビオースをセロビオン酸に、マルトースをマルトビオン酸に、マルトトリオースをマルトトリオン酸に、マルトテトラオースをマルトテトラオン酸に、マルトペンタオースをマルトペンタオン酸に、メリビオースをメリビオン酸に、ラクトースをラクトビオン酸に変換する方法である。中でも、ラクトースからラクトビオン酸に変更する方法に好適に用いることができる。
【００１３】
本発明に用いるヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化する能力を有する酢酸菌としては、アセトバクター属（Acetobacter）、アシディフィラム属（Acidiphilium）、アシディスファエラ属（Acidisphaera）、アシドセラ属（Acidocella）、アシドモナス属（Acidomonas）、アサイア属（Asaia）、クラウロコッカス属（Craurococcus）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、コザキア属（Kozakia）、ムリコッカス属（Muricoccus）、パラクラウロコッカス属（Paracraurococcus）、ロドピラ属（Rhodopila）、ロゼオコッカス属（Roseococcus）、ルブリテピダ属（Rubritepida）、ステラ属（Stella）、テイココッカス属（Teichococcus）、ザヴァルジニア属（Zavarzinia）などを例示することができる。中でも、アセトバクター属（Acetobacter）、グルコナセトバクター属（Gluconacetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）が好ましい。
【００１４】
本発明で用いるヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化する能力を有する酢酸菌は、自然界から分離した酢酸菌を用いることもできるが、独立行政法人製品評価技術基盤機構の様に、いずれの人の要求に対しても分譲できるような公的な寄託機関によって保存されている酢酸菌を使用してもよい。具体的には、例えば、アセトバクター  アセチ(Acetobacter   aceti)ＮＢＲＣ１４８１８、アセトバクター  シジギ (Acetobacter  syzygii)ＮＢＲＣ１６６０４、アセトバクター  シビノジェシス(Acetobacter  cibinongensis)ＮＢＲＣ１６６０５、アセトバクター  インドネシエンシス(Acetobacter  indonesienscis)ＮＢＲＣ１６４７１、グルコノアセトバクター  キシナス(Gluconacetobacter  xylinus)ＮＢＲＣ１６６７０、グルコノアセトバクター  リフンファシエンス(Gluconacetobacter  liquefaciens)ＮＢＲＣ１２３８８、グルコノアセトバクター(Gluconacetobacter  sp.)ＮＢＲＣ３２６１、グルコノバクター  セリナス(Gluconobacter  cerinus)ＮＢＲＣ３２６７、グルコノバクター  フラトゥリ(Gluconobacter  fraturii)ＮＢＲＣ３２６０、グルコノバクター  オキシダンス(Gluconobacter  oxydans)ＮＢＲＣ３２８５などを例示することができる。なお、本発明は上記菌株に限るものではない。
【００１５】
本発明のアルドン酸の製造方法において、第一の態様として、脂肪酸を含有する培地を用いて酢酸菌を培養する工程を含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明の培養工程の培地に用いられる脂肪酸としては、本発明の効果に影響を与えない限り、特に制限なく用いることができるが、炭素数８〜２０の脂肪酸であり、１４〜２０の脂肪酸が好ましく、１６〜１８の脂肪酸がより好ましい。
【００１７】
本発明の培地に用いられる脂肪酸としては、具体的には、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコセン酸などの単独脂肪酸、牛脂脂肪酸、ヤシ油脂肪酸などの混合脂肪酸、回収油由来の脂肪酸およびこれらの脂肪酸の２種以上の混合物を例示することができ、高い活性を有する菌株が得られる点で、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸が好ましく、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸がより好ましい。上述した脂肪酸は１種を単独で、又は２種以上を混合したものを用いてもよい。
【００１８】
本発明の培地に用いられる脂肪酸は、脂肪酸誘導体の形で培地中に含まれていてもよい。例えば、グリセロールや高級アルコールなどとのエステルである油脂や、脂肪酸を分子骨格にもつ界面活性剤などの脂肪酸誘導体も、本発明における脂肪酸に含まれるものとする。
【００１９】
本発明の培地に用いられる油脂としては、例えば、ヤシ油、パーム油、オリーブ油、大豆油、菜種油、アマニ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ヒマシ油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油、綿実油などの植物油、豚脂、牛脂および魚油などの動物油のほか、これらの油脂の硬化油、半硬化油、さらにこれら油脂の精製油や精製工程で副生する回収油などの油脂を例示することができる。これらを単独で用いても良く、これら油脂の２種以上を混合して用いても良い。また、これら油脂１種類以上と上記脂肪酸１種類以上を混合して用いても良いが、上記油脂の構成脂肪酸の中でパルミチン酸、ステアリン酸、またはオレイン酸のいずれか１種が主な脂肪酸であることが望ましい。
【００２０】
本発明における培地中の脂肪酸濃度は、ヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化する能力を有する酢酸菌が、正常に生育する濃度であれば特に限定されないが、０．０１〜１０重量％が好ましく、０．１〜５重量％がより好ましい。培地中の脂肪酸濃度が０．０１重量％未満では酢酸菌の菌体活性に対して十分な効果が得られない。また、脂肪酸濃度は１０重量％を超えて添加しても効果はあまり変わらず、コスト的に好ましくない。また、脂肪酸の培地への添加のタイミングは、培地調製時でも培養開始後でもよく、添加回数は、１回でも２回以上であっても良い。さらには、培地調製時に最終添加量の一部を添加し、培養開始後の残りの量を添加してもよい。
【００２１】
本発明のアルドン酸の製造方法に用いられる培地としては、脂肪酸を添加すること以外は、通常の酢酸菌と同様の培地を用いて培養することができる。酢酸菌が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものを用いることができる。
【００２２】
上記炭素源としては、グルコース、果糖などの単糖類、ショ糖、麦芽糖などのオリゴ糖類、デンプンなどの多糖類又はデンプン加水分解物、糖蜜、糖アルコール、グリセロールなどを例示することができ、一般的な炭水化物としては、トウモロコシ澱粉、モルトなどがあり、さらには、オリーブ油、コーン油、などの植物油も炭素源に含まれる。また、ＣＳＬ（コーンスティーブリカー）や、大豆フレークを用いてもよい。
【００２３】
上記窒素源としては、無機、有機どちらの窒素を用いてもよく、無機の窒素としてはアンモニアガス、アンモニア塩、硝酸体などを例示することができ、有機窒素としては、アミノ酸、たんぱく質または尿素などを例示することができる。天然由来の窒素源として、ＣＳＬ、大豆や大豆フレーク、ピーナッツミール、綿花ミール、可溶性物質添加湿潤蒸留穀物残渣、カゼイン水解物、屠殺場廃棄物、魚粉、酵母エキス、肉エキス及び各種醗酵菌体消化物などを用いてもよい。
【００２４】
上記ビタミンとしては、天然由来の炭素源、窒素源を用いることで酢酸菌の生育に必要なビタミン類を十分に補給できるが、必要に応じて、適宜、パントテン酸カルシウムや、ビオチン、ビタミンＢ１などを添加してもよい。
【００２５】
上記ミネラルとしては、マグネシウム、リン酸、カリウム、硫酸、カルシウム、塩素、コバルト、銅、鉄、マンガン、モリブデン、亜鉛などの成分が挙げられる。具体的には、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び、炭酸カルシウムなどを培地に用いることができる。また、培養中のｐＨ制御のために、アンモニアや、苛性ソーダ、塩酸、硫酸などを添加してもよい。
【００２６】
本発明の酢酸菌の培養は、使用する菌株の最適培養条件で行うことが好ましく、培養温度としては、２０〜３５℃であり、培養中のｐＨとしては、ｐＨ５〜８であり、塩酸、水酸化ナトリウム水溶液や炭酸カルシウムなどに維持することが好ましい。
【００２７】
本発明の酢酸菌の培養方法としては、静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養などを例示することができる。なお、大量培養の場合、回分法、逐次添加培養法、連続培養法を用いた深部通気撹拌培養で行なうことができ、培養時間は、１５〜１２０時間で十分な量の酢酸菌を得ることができる。
【００２８】
本発明のアルドン酸の製造方法において、第二の態様として、反応液に脂肪酸を添加して反応する工程を含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明の反応工程の反応液に添加する脂肪酸としては、上述した培養工程に用いるものと同様の脂肪酸を用いることができる。なお、反応液に添加する脂肪酸は、培地中に添加したものと同様の脂肪酸を添加してもよく、別の脂肪酸を添加してもよい。また、脂肪酸は１種を単独で、又は２種以上を混合したものを用いてもよい。反応液中の脂肪酸濃度は、反応効率の点で０．５〜５重量％が好ましく、１〜３重量％がより好ましい。
【００３０】
本発明の反応工程に用いられる反応液としては、脂肪酸を添加すること以外は、通常、反応に用いるものと同様の反応液を用いて反応することができる。反応液には、基質（ヘミアセタール水酸基を有する糖）、上記培養方法において調整した酢酸菌体、ｐＨ調整剤、ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。また、反応液に用いる反応溶媒としては、水道水、イオン交換水、蒸留水、純水、滅菌水、超純水などの精製水、又は酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などの水溶性溶媒が好ましい。
【００３１】
本発明の反応工程においては、上記培養方法によって、得られた酢酸菌の菌体を含む培養液をそのまま反応に用いてもよく、遠心ろ過などによって菌体回収したものを用いてもよい。なお、回収した菌体を反応に用いる場合、菌体のまま若しくは滅菌水などで洗浄したものを用いてもよく、以下に記載する方法により処理を行なった菌体処理物を用いてもよい。
【００３２】
酢酸菌の菌体処理物としては、アセトン、第四アンモニウム化合物、硫酸ラウリルソーダ、ｔｗｅｅｎまたは、微生物の細胞壁の特異的な結合を分解する酵素などで薬剤処理した菌体、凍結した菌体を減圧下で水分を昇華することで得られる凍結乾燥菌体、ホモジナイザーやガラスビーズを用い、物理的に破砕した菌体破砕物、さらには菌体破砕物の上清である無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素液などを例示することができる。
【００３３】
さらに、酢酸菌の菌体あるいは菌体処理物は、担体などに固定化したものを用いてもよい。例えば、セルロース担体、セラミック担体、ガラスビーズ担体のような物質に吸着させる方法や、格子構造を持つゲル状物質、たとえば寒天、アルギン酸カルシウム、カラギーナンや、公知のポリマーに包括する方法などを例示することができる。上記方法を用いることで、酢酸菌を繰り返し使用することが可能となる。
【００３４】
本発明の反応工程におけるヘミアセタール水酸基を有する糖の酸化反応は、基質となるヘミアセタール水酸基を有する糖を反応溶媒に溶解し、上述した方法によって得られた酢酸菌の培養液、菌体、又は菌体処理物などを添加し、反応を行う。なお、反応に用いる培養液、菌体、又は菌体処理物の使用量、反応液中の基質濃度や菌体活性に応じて適宜調整すればよい。反応液中の菌体の添加量としては、菌体湿重量で０．５〜５重量％程度であれば十分な反応効率が得られる。
【００３５】
反応方法としては、静置、振とう、深部通気撹拌などを例示することができる。反応時間については、特に制限はないが、使用する菌体量、基質濃度に応じて適宜調整すればよいが、通常６〜１００時間、好ましくは６〜７２時間で反応が終了することが好ましい。反応ｐＨは、用いる酢酸菌の酵素の至適ｐＨに依存するが、通常、ｐＨ４〜８の範囲であり、５〜７が好ましい。また、反応温度は酵素が失活しない温度であればよく、通常、２０〜６０℃であり、３０〜４５℃が好ましい。
【００３６】
反応液のｐＨを調整するために用いるｐＨ調整剤として、通常、反応に用いられるｐＨ調整剤を用いることができ、例えば、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、コハク酸二ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウムなどを例示することができる。
【００３７】
上述した方法により得られた反応液からのアルドン酸の精製方法は、抽出、カラム分離などの一般的な分離方法を用いることによりできる。例えば、エタノールを反応液に添加して、アルドン酸を沈殿させて回収する方法、活性炭や、多孔性有機樹脂粒子を用いた吸着クロマトグラフィーや、ゲルろ過、イオン交換樹脂クロマトグラフィーなどを用いて単離する方法を例示することができる。
【００３８】
本発明の製造方法においては、上述した培養工程、及び反応工程の両方を含んでいてもよく、どちらか一方の工程を含んでいれば、本発明の効果が十分に得られる。
【００３９】
本発明の方法により製造されたアルドン酸は、整腸作用、脂質代謝改善作用、ミネラル吸収促進作用、卵殻強化作用を示し、医薬品、食品や、飼料として有用である。上記アルドン酸を医薬品として用いる場合は、当該分野で常套的に用いられている賦形剤、潤沢剤、希釈剤、ｐＨ調製剤、防腐剤、甘味剤、芳香剤、乳化散剤などを用いて錠剤、粉剤、水和剤、乳剤として経口的にまたは非経口的に投与することができる。また、上記アルドン酸を食品や、飼料として用いる場合、そのままで、または他の食品や飼料に添加もしくは混合して使用することができる。
【実施例】
【００４０】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４１】
アルドン酸の測定方法
実施例において、反応液中あるいは培養液中のアルドン酸の生成量の定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、以下の条件により行なった。
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
カラム；Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ-５０（Ｓｈｏｄｅｘ社製）
溶離液；アセトニトリル：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）＝４０：６０（体積比）
条件温度：４０℃
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出器： 示差屈折計
【００４２】
また、菌体の培養は以下の方法で調製した。
実施例１  培地への脂肪酸添加による効果
〔前培養〕
５００ｍｌフラスコに、ラクトース０．５重量％、グルコース０．５重量％、酵母エキス０．５重量％、硫酸マグネシウム０．１重量％（ｐＨ６．０）を含む培地１００ｍｌを分注し、１２１℃で２０分間殺菌した。グルコノバクター  セリナス(Gluconobacter  cerinus)ＮＢＲＣ３２６７を植菌し、２５℃で１日間振とう培養（１０５ｒｐｍ）した。
〔本培養〕
５Ｌジャーファーメンターに、グルコース２重量％、グリセリン２重量％、酵母エキス１重量％、硫酸マグネシウム０．１重量％、オレイン酸０．１重量％（ｐＨ６．０）を含む培地２．５Ｌを１２１℃で２０分間滅菌した。その後、上述した前培養液を２５ｍｌ植菌し、２４時間深部撹拌培養（３０℃、５００ｒｐｍ、０．５ｖｖｍ）を行った。培養後、培養液を遠心分離で上清と沈殿とに分離し、沈殿を滅菌水に再懸濁し、湿菌体として、以下の反応に用いた。
[反応]
３００ｍｌフラスコに、ラクトース２０重量％、炭酸カルシウム１０重量％を加え、水で５０ｍｌにメスアップし、反応液を調製した。その後、上述した方法で調製したグルコノバクター  セリナス(Gluconobacter  cerinus)ＮＢＲＣ３２６７菌体を湿重量で１．５重量％、２．５重量％となるようにそれぞれ加え、最終液量６０ｍｌとし酸化反応をおこなった。４０℃で４４時間インキュベーションし、反応液中のラクトビオン酸濃度を測定した。結果を表１に示す。なお、ラクトビオン酸の生産量を脂肪酸無添加の値を１００としたときの相対値で示す。
【００４３】
2013123426.tif 000002
【００４４】
実施例２  反応液への脂肪酸添加による効果
実施例１に記載した方法で培地に脂肪酸を添加しない以外は、同様の方法により、調製した湿菌体を用いておこなった。３００ｍｌフラスコに、ラクトース２０重量％、炭酸カルシウム１０重量％、各種脂肪酸（パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸）１．５重量％を加え、水で５０ｍｌにメスアップし、反応液を調製した。その後、上述した培養方法で脂肪酸を添加しない培地で調整したグルコノバクター  セリナス (Gluconobacter  cerinus)ＮＢＲＣ３２６７菌体を湿重量で２．５重量％になるように加え、最終液量６０ｍｌとし酸化反応をおこなった。４０℃で７２時間インキュベーションし、反応液中のラクトビオン酸濃度を測定した。脂肪酸無添加のラクトビオン酸生成量を１００として計算した。結果を表２に示す。
【００４５】
2013123426.tif 000003
【００４６】
実施例３  酢酸菌における脂肪酸添加効果
３００ｍｌフラスコに、ラクトース２０重量％、炭酸カルシウム１０重量％、各種脂肪酸（ステアリン酸、オレイン酸）１．５重量％を加え、水で５０ｍｌにメスアップし、反応液を調製した。その後、実施例１に記載した方法で脂肪酸を添加しない培地で調整した酢酸菌グルコノバクター  セリナス(Gluconobacter  cerinus)ＮＢＲＣ３２６７、又はアセトバクター  アセチ(Acetobacter  aceti)ＮＢＲＣ１４８１８菌体を湿重量で２．５重量％になるように加え、最終液量６０ｍｌとし反応をおこなった。４０℃で７２時間インキュベーションし、反応液中のラクトビオン酸濃度を測定した。脂肪酸無添加のラクトビオン酸の生成量を１００として計算した。結果を表３に示す。
【００４７】
2013123426.tif 000004
【００４８】
実施例４  反応液中への脂肪酸添加量の検討
３００ｍｌフラスコに、ラクトース２０重量％、炭酸カルシウム１０重量％、オレイン酸０、０．６４、２．１３、６．４重量％を加え、水で５０ｍｌにメスアップし、反応液を調製した。その後、実施例１に記載した方法で脂肪酸を添加しない培地で調整したグルコノバクター  セリナス(Gluconobacter  cerinus)ＮＢＲＣ３２６７菌体を湿重量で２．５重量％になるように加え、最終液量６０ｍｌとし反応をおこなった。４０℃で７２時間インキュベーションし、反応液中のラクトビオン酸を測定した。オレイン酸無添加のときの生成量を１００として計算した。結果を表４に示す。
【００４９】
2013123426.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、ヘミアセタール水酸基を有する糖を酸化する能力を有する酢酸菌を用いて、効率的にアルドン酸を製造することができる。本発明によれば、酢酸菌を培養する培地に脂肪酸を添加することにより、菌体の活性を上昇させることができる。また、反応液中に脂肪酸を添加することにより、反応効率を向上させることができる。