(57)【要約】【課題】  本発明では、前培養培地中のL. fermentumの増殖性を向上させると共に、発酵乳製品中のエタノール産生能を増強させることを課題とする。【解決手段】  発酵乳製品用のスターターの前培養培地として、窒素源及び／又は２価の金属イオンを添加した乳原料培地を用いて、L. fermentumを培養するエタノール産生能の増強方法である。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵乳製品用のスターターの前培養培地として、窒素源及び／又は２価の金属イオンを添加した乳原料培地を用いて、L. fermentumを培養することを特徴とする、前記のスターター及び／又はL.
fermentumのエタノール産生能の増強方法。
【請求項２】
乳原料培地が、固形分濃度が8〜12％の脱脂乳、脱脂濃縮乳、還元脱脂乳からなることを特徴とする、請求項１に記載のエタノール産生能の増強方法。
【請求項３】
窒素源が、酵母エキス及び／又は乳由来のペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載のエタノール産生能の増強方法。
【請求項４】
２価の金属イオンが、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+の少なくとも１種又は２種以上であることを特徴とする、請求項１に記載のエタノール産生能の増強方法。
【請求項５】
請求項１〜４のエタノール産生能の増強方法によってエタノール産生能が増強されたL. fermentumを含有する発酵乳製品用のスターター。
【請求項６】
請求項５に記載のスターターを原料乳に接種して培養、発酵及び／又は熟成することを特徴とする、エタノール含量を増加させる発酵乳製品の製造法。
【請求項７】
請求項６に記載の発酵乳製品の製造法によって製造されたエタノール含量の高い発酵乳製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵乳製品用のスターターのエタノール産生能の増強方法に関し、特にファーメンタム菌（Lactobacillus fermentum）のエタノール産生能の増強方法に関する。具体的には、発酵乳製品用のスターターの前培養培地として、窒素源及び／又は２価の金属イオンを添加した乳原料培地を用いて、L.
fermentumを培養するエタノール産生能の増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌などの微生物は発酵食品や発酵乳製品に利用され、発酵食品や発酵乳製品の風味や食感（舌触りなど）を決定する要素として重要であると共に、発酵食品や発酵乳製品を摂取した人体の腸内などに作用するなどして、健康の維持や増進に役立つ要素として重要である。
【０００３】
発酵乳製品（ナチュラルチーズ、ヨーグルト（発酵乳）、乳酸菌飲料、発酵バターなど）は乳酸発酵により製造され、通常では、その用途に応じた乳酸菌を選抜して、あらかじめ発酵乳製品用のスターター（スターターとも称する）を調製することとなる。つまり、一般的に、各種の乳酸菌を、それぞれの前培養培地に接種して培養し、発酵乳製品用のスターターを調製する。そして、その発酵乳製品用のスターターを、それぞれの発酵乳製品用の原料に添加して発酵し、発酵乳製品を製造している。このとき、この前培養培地には、乳原料培地として、脱脂乳、固形分濃度が10%程度の脱脂濃縮乳や還元脱脂乳などが用いられている。一方、この前培養培地には、主に乳酸菌を研究する目的から、合成培地として、GYP培地やMRS培地などが用いられている。
【０００４】
近年では、発酵乳製品の多様化に伴い、人体の腸内で活動して、健康の維持や増進に有益な菌種や、風味の向上に有効な菌種などの特性に特徴のある微生物をターゲット（標的）として、スクリーニング（選抜）し、その微生物を発酵乳製品の製造に利用する手法が採用されている。
【０００５】
当初に目的とした特性により、微生物を選抜する際には、合成培地を用いることが多い。しかしながら、合成培地では、その配合成分が高価であるため、発酵乳製品の製造費が増大するなどの理由から、実際の発酵乳製品の製造には利用されていないのが現状である。このとき、合成培地では、スターターを調製する上で、実際に選抜した微生物の増殖性が良くても、その微生物の栄養要求性や生育環境面の条件が限定されてしまうことがある。一方、乳原料培地では、スターターを調製する上で、実際に選抜した微生物の増殖性が悪くなると共に、当初に目的とした特性が十分に発揮されないこともある。
【０００６】
上記の問題に対して、例えば特許文献１では、Streptococcus lactis subsp. diacetylactis やLeuconostoc cremoris といったクエン酸醗酵能を有する乳酸菌において、クエン酸を含有する培養基質に、鉄、銅、モリブデンの１種または２種以上を無機塩類や有機塩類として添加することで、当該乳酸菌の増殖性が高まり、当該乳酸菌から生成される芳香物質（ジアセチル）を増強できたことが開示されている。また、例えば特許文献２では、乳（乳成分）を窒素源および炭素源とする培地に、炭酸カルシウムやリン酸カルシウム及び可溶性マグネシウム塩を添加することで、乳酸発酵に伴うpHの低下を抑制しつつ、乳酸菌の増殖を促進できたことが開示されている。
【０００７】
ところで、本発明者らは、ナチュラルチーズ中のエタノール含量を高め、パイナップル様のフルーティーな香りを増強する目的から、エタノール高産生能を有する乳酸菌として、L.
fermentum OLL203697（受託番号：FERM BP-11433）及びL. fermentum OLL203731（受託番号：FERM BP-11434）を見出し、特許出願した（特願2011-237762）。そして、ナチュラルチーズ中のエタノール含量が0.01w/w%以上であれば、熟成中などにおいて、微生物の作用によるエステル産生量が多くなり、パイナップル様のフルーティーな香りを増強できることも見出した。これらの乳酸菌をスターターとして、ナチュラルチーズを製造するため、前培養培地（スターター用培地）で培養し、ナチュラルチーズを製造したところ、前培養培地としてMRS培地で培養した菌体と、前培養培地として還元脱脂乳培地（固形分濃度：約10重量%）で培養した菌体では、接種したL.
fermentum菌数に差異がなかったにも関わらず、ナチュラルチーズ中のエタノール産生量に差異があったという問題が生じた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６３−２０２３９０号公報
【特許文献２】特開平８−１１６８７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明では、前培養培地中のL. fermentumの増殖性を向上させると共に、発酵乳製品中のL. fermentumのエタノール産生能を増強させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、発酵乳製品用のスターターとしてのL. fermentumを培養する、前培養培地として、乳原料培地に窒素源及び／又は２価の金属イオンを添加して培養することで、乳原料培地中の菌数が増加するだけでなく、ナチュラルチーズ中のエタノール産生量が増加することを見出した。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
［１］発酵乳製品用のスターターの前培養培地として、窒素源及び／又は２価の金属イオンを添加した乳原料培地を用いて、L. fermentumを培養することを特徴とする、前記のスターター及び／又はL.
fermentumのエタノール産生能の増強方法。
［２］乳原料培地が、固形分濃度が8〜12％の脱脂乳、脱脂濃縮乳、還元脱脂乳からなることを特徴とする、前記［１］に記載のエタノール産生能の増強方法。
［３］窒素源が、酵母エキス及び／又は乳由来のペプチドであることを特徴とする、前記［１］に記載のエタノール産生能の増強方法。
［４］２価の金属イオンが、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+の少なくとも１種又は２種以上であることを特徴とする、前記［１］に記載のエタノール産生能の増強方法。
［５］前記［１］〜［４］のエタノール産生能の増強方法によってエタノール産生能が増強されたL. fermentumを含有する発酵乳製品用のスターター。
［６］前記［５］に記載のスターターを原料乳に接種して培養、発酵及び／又は熟成することを特徴とする、エタノール含量を増加させる発酵乳製品の製造法。
［７］前記［６］に記載の発酵乳製品の製造法によって製造されたエタノール含量の高い発酵乳製品。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、発酵乳製品中のL. fermentumのエタノール産生量が増加されるため、ナチュラルチーズをはじめとして、エタノール含量の高い発酵乳製品を提供できる。そして、その結果として、ナチュラルチーズをはじめとして、パイナップル様のフルーティーな香りを増強した発酵乳製品を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】酵母エキスとマンガン酵母を組合せて添加したSM培地で培養したL. fermentumOLL203697（受託番号FERM BP-11433）のスターターにおけるL. fermentumの菌数を示すグラフである。グラフ中の横軸の数値は、酵母エキスを0、0.05、0.1、0.25、0.5重量%になるよう添加し、かつマンガン酵母を0.2重量%の濃度となるように添加したSM培地で培養したスターターを意味する。
【図２】酵母エキスとマンガン酵母を組合せて添加したSM培地で培養したL. fermentumOLL203697（受託番号FERM BP-11433）のスターターにおけるL. fermentumの菌数を示すグラフである。グラフ中の横軸の数値は、マンガン酵母を0.05、0.1、0.2重量%の濃度となるように添加し、かつ酵母エキスを0.25重量%になるよう添加したSM培地で培養したスターターを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下に述べる個々の形態に限定されない。
【００１４】
本発明のエタノール産生能の増強方法では、発酵乳製品用のスターターとして、L. fermentumを用いると共に、発酵乳製品用のスターターの前培養培地として、乳原料培地を用いることを特徴とする。本発明における、「乳原料培地」とは、牛や羊、ヤギなどの獣乳を原料とする培地であれば、いずれも用いることができるが、脱脂乳、脱脂濃縮乳、還元脱脂乳などを主成分として含む培地、それらを単独で配合した培地、それらを組合せて配合した培地を望ましく用いることができる。このとき、脱脂乳、脱脂濃縮乳、還元脱脂乳からなる培地では、固形分濃度として8〜12重量％が好ましく、9〜12重量％がより好ましく、9〜11重量％がさらに好ましい。
【００１５】
本発明のエタノール産生能の増強方法では、発酵乳製品用のスターターとして、L. fermentumを用いると共に、スターターの前培養培地として、窒素源を添加（配合）した乳原料培地を用いることを特徴とする。ここで、乳原料培地中の窒素源を強化する目的から、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、非タンパク態窒素などを用いることができるが、酵母エキス及び／又は乳由来のペプチドを望ましく用いることができる。このとき、窒素源として、酵母エキスには、食品用や医薬品用として入手できるものであれば、いずれも用いることができるが、例えば、酵母エキス協和Ｃ（商標）、酵母エキス協和Ｈ（商標）、酵母エキス協和Ｌ（商標）、酵母エキス協和Ｗ（商標）、酵母エキス武田ＨＲ（商標）、酵母エキス武田ＳＬ−Ｗ（商標）、酵母エキスＪＴ−２１Ａ（商標）などを用いることができる。ここで、乳原料培地に添加（配合）する酵母エキスとして、実際に培養するL.
fermentumのエタノール産生能を増強できる有効量や有効濃度を用いれば、特に限定されず、アミノ酸などの他の窒素源と併用することもできる。ただし、L.
fermentumのエタノール産生能を効果的に増強する観点に加えて、風味の悪影響を防止や抑制する観点や、製造費を低減する観点などから、この乳原料培地に添加（強化）する酵母エキスの濃度として、0.05重量％以上1重量％以下が好ましく、0.1重量％以上0.8重量％以下がより好ましく、0.2重量％以上0.7重量％以下がさらに好ましく、0.25重量％以上0.6重量％以下がとくに好ましい。
【００１６】
また、窒素源として、乳由来のペプチドを用いることができ、ホエー、ホエータンパク質濃縮物（WPC）、ホエータンパク質単離物（WPI）を酵素分解（加水分解）して得られる酵素分解ホエー、酵素分解WPC、酵素分解WPIや、ホエータンパク質を酵素分解（加水分解）して得られるホエータンパク質分解物、カゼインを酵素分解（加水分解）して得られるカゼイン分解物などが挙げられ、これらを少なくとも１種又は２種以上で用いることができる。尚、本発明における、「乳由来のペプチド」とは、牛や羊、ヤギなどの獣乳、及び、豆乳などの植物乳に由来するペプチドであればいずれも用いることができる。ここで、前培養培地である乳原料培地に添加（配合）する量としては、実際に培養するL.
fermentumのエタノール産生能を増強できる有効量や有効濃度を用いれば、特に限定されず、酵母エキスなどの他の窒素源と併用することもできる。例えば、カゼインの加水分解物（アミノ酸とペプチドの混合物）を添加する場合では、その濃度として、0.05重量％以上1重量％以下が好ましく、0.1重量％以上0.8重量％以下がより好ましく、0.2重量％以上0.7重量％以下がさらに好ましく、0.25重量％以上0.6重量％以下がとくに好ましい。なお、他の窒素源として、例えば、アミノ酸を用いてもよい。アミノ酸には、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンなどであれば、いずれも用いることができ、これらを少なくとも１種又は２種以上で用いることができる。
【００１７】
本発明のエタノール産生能の増強方法では、発酵乳製品用のスターターとして、L. fermentumを用いると共に、発酵乳製品用のスターターの前培養培地として、２価の金属イオンを添加（配合）した乳原料培地を用いることを特徴とする。このとき、２価の金属イオンとして、食品用や医薬品用として入手できるものであれば、無機塩類と有機塩類のいずれも用いることができ、これらを少なくとも１種又は２種以上で用いることができる。ここで、この乳原料培地に添加（強化）する２価の金属イオンとして、L.
fermentumのエタノール産生能を効果的に増強する観点に加えて、風味の悪影響を防止や抑制する観点や、製造費を低減する観点などから、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+
が好ましく、Ca2+、Mg2+、Mn2+ がより好ましく、Mg2+、Mn2+
がさらに好ましく、Mn2+ がとくに好ましい。そこで、例えば、鉄酵母、銅酵母、亜鉛酵母、硫酸マグネシウム、マグネシウム酵母、マンガン酵母などの形態で用いることが望ましく、これらは単独で用いても良いし、複数種を組合せて用いても良い。そして、前記の観点と同様の観点から、この前培養培地としての乳原料培地に添加（強化）する２価の金属イオンの総濃度（２価の金属イオンを２種以上で用いる場合には、それらの２価の金属イオンの合計の濃度）として、0.03mM以上2mM以下が好ましく、0.08mM以上1.5mM以下がより好ましく、0.15mM以上1mM以下がさらに好ましく、0.3mM以上0.8mM以下がとくに好ましい。
【００１８】
本発明のエタノール産生能の増強方法では、発酵乳製品用のスターターの培養法として、嫌気条件と好気条件のいずれでも用いることができ、静置培養法、攪拌培養法、振盪培養法のいずれでも用いることができる。このとき、発酵乳製品用のスターターに含まれる、必要な微生物（乳酸菌など）が良好に生育する条件であれば、特に限定されないが、好気条件の静置培養法又は嫌気条件の静置培養法が好ましい。そして、この培養温度として、L.
fermentumのエタノール産生能を効果的に増強する観点などから、20〜50℃が好ましく、30〜45℃がより好ましく、35〜45℃がさらに好ましく、37〜45℃がとくに好ましい。
また、この培養時間として、前記の観点と同様の観点から、3〜30時間が好ましく、4〜20時間がより好ましく、5〜15時間がさらに好ましく、6〜10時間がとくに好ましい。
【００１９】
本発明のエタノール産生能が増強されたL. fermentumを含有する発酵乳製品用のスターターでは、それをメインスターターとして通常や従来と同様に用いることができる。このとき、本発明のエタノール産生能が増強されたL.
fermentumでは、その菌種を単独で用いることもできるし、ナチュラルチーズやヨーグルトなどの目的とする発酵乳製品用の通常や従来のメインスターターに含有されている微生物（乳酸菌など）と組合せて用いることもできる。この組合せるメインスターターとして、例えば、ナチュラルチーズであれば、L.
delbrueckii subsp. bulgaricus種、L.
delbrueckii subsp. lactis種、L.
helveticus種、Lactococcus lactis subsp. cremoris種、Lc. lactis subsp. lactis種、S. thermophilus種、Leuconostoc属などが挙げられ、ヨーグルトであれば、L. delbrueckii
subsp. bulgaricus種やS. thermophilus種などが挙げられる。また、本発明のエタノール産生能が増強されたL.
fermentumを含有する発酵乳製品用のスターターでは、それをメインスターターとして用いるだけでなく、発酵乳製品の風味や品質を変化（増強など）させる目的から、アジャンクトスターターとして用いることもできる。このとき、本発明のエタノール産生能が増強されたL.
fermentumでは、その菌種を単独で用いることもできるし、ナチュラルチーズやヨーグルトなどの目的とする発酵乳製品用の通常や従来のアジャンクトスターターに含有されている微生物（乳酸菌など）と組合せて用いることもできる。この組合せるアジャンクトスターターとして、例えば、L.
casei種、L. plantarum種、L. rhamnosus種、L. zeae種などが挙げられる。
【００２０】
本発明のエタノール含量を増加させる発酵乳製品の製造法では、発酵乳製品用のスターターとして、本発明のエタノール産生能が増強されたL. fermentumを用いると共に、そのスターターを原料乳に接種して培養、発酵及び／又は熟成することを特徴とする。ここで、エタノール含量の高い発酵乳製品を提供することができるが、その結果として、パイナップル様のフルーティーな香りを増強した発酵乳製品を提供することができることとなる。本発明における、「原料乳」とは、牛や羊、ヤギなどの獣乳、及び、豆乳などの植物乳を主原料とした、通常や従来の発酵乳製品用の原料乳であれば、いずれも用いることができるが、生乳、脱脂乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、全脂粉乳、脱脂粉乳、クリーム、バターなどを配合成分として含む原料乳を望ましく用いることができる。このとき、原料乳では、固形分濃度として8〜20重量％が好ましく、9〜15重量％がより好ましく、10〜12重量％がさらに好ましい。
【００２１】
本発明のエタノール産生能が増強されたL. fermentumを含有する、発酵乳製品用のスターターを用いて製造された発酵乳製品では、通常や従来と同様の発酵乳製品が対象となり、例えば、ナチュラルチーズ、ヨーグルト（発酵乳）、乳酸菌飲料、発酵バターなどが挙げられる。
【００２２】
また、本発明は、本発明のエタノール産生能が増強されたL. fermentumを含有する、発酵乳製品用のスターターを原料乳に接種して、培養及び／又は発酵することを特徴とする、発酵乳製品のエタノール含量の増加方法でもある。そして、本発明の発酵乳製品のエタノール含量の増加方法では、発酵乳製品用のスターターとして、本発明のエタノール産生能が増強されたL.
fermentumを用いると共に、スターターを原料乳に接種して培養及び／又は発酵することを特徴とする。ここで、エタノール含量の高い発酵乳製品を提供することができるが、その結果として、パイナップル様のフルーティーな香りを増強した発酵乳製品を提供することができることとなる。
【００２３】
さらに、本発明は、本発明の発酵乳製品のエタノール含量の増加方法によってエタノール産生能が増強されたL. fermentumを含有する発酵乳製品でもある。そして、本発明の発酵乳製品のエタノール含量の増加方法によってエタノール産生能が増強されたL.
fermentumを含有する発酵乳製品では、通常や従来と同様の発酵乳製品が対象となり、例えば、ナチュラルチーズ、ヨーグルト（発酵乳）、乳酸菌飲料、発酵バターなどが挙げられる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これにより限定されるものではない。また、実施例において用いている、L. fermentum OLL203697は、2011年10月5日付（受託日）で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1  つくばセンター  中央第６）に各々、受託番号でFERM
BP-11433として、ブタペスト条約に基づき、国際寄託されている乳酸菌である。
【００２５】
［試験例１］
スターター中のL. fermentum OLL203697（受託番号FERM BP-11433）の増殖性及びモデルチーズ中のL.
fermentumのエタノール産生能に対する酵母エキスの影響について検討した。
【００２６】
（方法）
1.  L. fermentumスターターの調製
SM培地（還元脱脂乳培地（固形分濃度：約10重量%））及びYE培地（MRS培地と同様に酵母エキスを0.5重量%の濃度になるように添加したSM培地）を調製した。そして、MRS培地で賦活培養したL.
fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）の培養液を各々に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で対数増殖期の後期まで培養して、SMスターター及びYEスターターを調製した。また、前記のL.
fermentum OLL203697の培養液をMRS培地に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で一晩培養して、MRSスターター（陽性対照）を調製した。このとき、各々のスターター中のL.
fermentumの菌数を測定すると共に、各々のスターターをモデルチーズの製造に供した。
【００２７】
2.  モデルチーズの製造
チーズ用の原料乳を模擬した還元脱脂乳（固形分濃度：約10重量%）に、市販のチーズ製造用スターターを接種すると共に、各々、前記のMRSスターター、SMスターター、YEスターターを接種した。ここで、MRSスターターでは、1重量%で接種し、SMスターター、YEスターターでは、MRSスターターの1重量%とL.
fermentum OLL203697の菌数が同等になるような濃度で接種した。そして、各々のスターターを接種した後に、市販のスターターに適した温度（37℃程度）でpHが5.0になるまで発酵させた。この発酵が終了してから、遠心分離処理により、ホエーを除去した後に、食塩を2重量%になるように添加して、18℃で2週間熟成させ、モデルチーズのMRSチーズ（陽性対照）、SMチーズ、YEチーズを製造した。また、L.
fermentumを添加していないモデルチーズのControlチーズ（陰性対照）も製造した。このとき、この熟成の開始日と終了日において、エタノール含量を測定し、エタノール産生量（＝エタノール増加量＝熟成の終了日のエタノール含量−熟成の開始日のエタノール含量）を算出した。なお、モデルチーズの試料名とスターターの組合せなどは、表１の通りである。
【表１】
2013223491.tif 000002
【００２８】
（結果）
各々の培地で培養して調製したスターターを接種して製造したモデルチーズ1kg中のエタノール産生量(g)を表２に示した。SMチーズとYEチーズの比較から、モデルチーズ中のエタノール産生量が3倍程度で増加することがわかった。以上より、酵母エキスは、スターター中のL.
fermentumの増殖性を向上させると共に、そのスターターを用いて製造したモデルチーズ（発酵乳製品）中の（L.
fermentumの）エタノール産生能を増強させることがわかった。ただし、モデルチーズ中のL. fermentumに、エタノールを0.5g/kg以上で産生させるためには、酵母エキスを乳原料培地に添加（配合）するだけでは不十分であることも明らかになった。
【表２】
2013223491.tif 000003
【００２９】
［試験例２］
スターター中のL. fermentum OLL203697（受託番号FERM BP-11433）の増殖性に対するMRS培地の構成成分の代替成分の影響について検討した。
【００３０】
（方法）
MRS培地の構成成分には、例えば、ビーフエキス、Tween 80、マグネシウム塩、マンガン塩がある。これらの構成成分について、実際に発酵乳製品を製造する上で適用できる代替成分（素材）で置換し、その代替成分を乳原料培地へ添加（配合）した。具体的には、魚肉エキス（Fish）、Tween 80（Tw80）、塩化マグネシウム（Mg）、マンガン酵母（Mn）を各々、前記のYE培地に添加した。ここで、ALL培地（Fish、Tw80、Mg、Mnの4成分の全部を添加したYE培地）、ΔFish培地（Fishを除くTw80、Mg、Mnの3成分を添加したYE培地）、ΔTw80培地（Tw80を除くFish、Mg、Mnの3成分を添加したYE培地）、ΔMg培地（Mgを除くFish、Tw80、Mnの3成分を添加したYE培地）、ΔMn培地（Mnを除くFish、Tw80、Mgの3成分を添加したYE培地）を調製した（Fish、Tw80、Mg、Mnの4成分から各1成分ずつを除いたYE培地を「Δ"成分名"」培地と表現した）。そして、MRS培地で賦活培養したL.
fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）の培養液を各々に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で対数増殖期の後期まで培養して、ALLスターター、ΔFishスターター、ΔTw80スターター、ΔMgスターター、ΔMnスターターを調製した。このとき、各々のスターター中のL. fermentumの菌数を測定すると共に、次式を適用して、ALL培地におけるL.
fermentumの菌数と、「Δ"成分名"」培地におけるL. fermentumの菌数を比較することで、L. fermentumの増殖性に対する各々の成分の寄与率を算出した。
寄与率（％）＝［1−（「Δ"成分名"」培地との菌数）÷（ALL培地の菌数）］×100
なお、各々の培地名とYE培地へ添加した代替成分（素材）の組合せなどは、表３の通りである。尚、表３のうち、成分名の%は重量%を示し、表中の「○」はその成分を使用したことを示し、「−」は不使用であることを示す。
【表３】
2013223491.tif 000004
【００３１】
（結果）
L. fermentumの増殖性に対する各々のMRS培地の構成成分の代替成分の寄与率を表４に示した。ここで、Fish、Tw80、Mg、Mnの4成分のうち、Fish（魚肉エキス）とTw80（Tween
80）の寄与率が同等で大きく、Mn（マンガン塩）の寄与率が最大であることがわかった。なお、ALL培地で培養したL.
fermentumの菌数は、SM培地で培養したL. fermentumの菌数よりも多く、MRS培地で培養したL.
fermentumの菌数と同程度であることから、Fish、Tw80、Mg、Mnの4成分がL. fermentumの増殖性に寄与していることがわかった。
【表４】
2013223491.tif 000005
【００３２】
［試験例３］
スターター中のL. fermentum OLL203697（受託番号FERM BP-11433）の増殖性に対する酵母エキスの濃度の影響について検討した。
【００３３】
（方法）
酵母エキスの濃度を様々に変えて、前記のMn培地（マンガン酵母を0.2重量%の濃度になるように添加したSM培地）に添加した。ここで、酵母エキスを0、0.05、0.1、0.25、0.5重量%の濃度になるように、Mn培地に添加して、それぞれの酵母エキス濃度のYE&Mn培地を調製した。そして、MRS培地で賦活培養したL.
fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）の培養液を各々に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で対数増殖期の後期まで培養し、それぞれのYE&Mnスターターを調製した。このとき、各々のスターター中のL. fermentumの菌数を測定した。
【００３４】
（結果）
各々の培地で培養して調製したスターター中のL. fermentumの菌数を図１に示した。ここで、酵母エキスの濃度が減少するに伴い、L.
fermentumの菌数が低下した。一方、酵母エキスの濃度が0.25重量%の場合に、0.5重量%の場合と、L.
fermentumの菌数が同程度であり、酵母エキスの濃度が0.25重量%以上で、L. fermentumの菌数が同水準で推移することを予測できた。なお、L. fermentumの菌数の曲線から、酵母エキス濃度が0.2重量%以下の場合に、その菌数が1×109
cfu/g以下になることが示された。
【００３５】
［試験例４］
スターター中のL. fermentum OLL203697（受託番号FERM BP-11433）の増殖性に対するマンガンの濃度の影響について検討した。
【００３６】
（方法）
マンガンとしてマンガン酵母の濃度を様々に変えて、前記のYE培地（MRS培地と同様に酵母エキスを0.25重量%の濃度になるように添加したSM培地）に添加した。ここで、マンガン酵母を0、0.05、0.1、0.2重量%の濃度になるように、YE培地に添加して、それぞれのYE&Mn培地を調製した。そして、MRS培地で賦活培養したL. fermentum
OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）の培養液を各々に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で対数増殖期の後期まで培養し、それぞれのマンガン濃度のYE&Mnスターターを調製した。このとき、各々のスターター中のL. fermentumの菌数を測定した。
【００３７】
（結果）
各々の培地で培養して調製したスターター中のL. fermentumの菌数を図２に示した。ここで、マンガン酵母の濃度が減少するに伴い、L.
fermentumの菌数が低下した。一方、マンガン酵母の濃度が0.05重量%の場合に、0.1重量%の場合や、0.2重量%の場合と、L.
fermentumの菌数が同水準で推移することを予測できた。なお、L. fermentumの菌数の曲線から、マンガン酵母の濃度が0.05重量%未満の場合に、その菌数が1×109
cfu/g以下になることが示された。
【００３８】
［試験例５］
スターター中のL. fermentum OLL203697（受託番号FERM BP-11433）の増殖性に対する酵母エキスおよびマンガン酵母の影響について検討した。
【００３９】
（方法）
酵母エキスとマンガン酵母を様々な組合せで、前記のSM培地に添加した。ここで、SM培地に加えて、YE培地（MRS培地と同様に酵母エキスを0.5重量%の濃度になるように添加したSM培地）、YE&Mn培地（酵母エキスを0.5重量%とマンガン酵母を0.2重量%の濃度になるように添加したSM培地）、Mn培地（マンガン酵母を0.2重量%の濃度になるように添加したSM培地）を調製した。そして、MRS培地で賦活培養したL.
fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）の培養液を各々に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で対数増殖期の後期まで培養して、SMスターター、YEスターター、YE&Mnスターター、Mnスターターを調製した。このとき、各々のスターター中のL.
fermentumの菌数を測定した。なお、各々の培地名とSM培地へ添加した成分（素材）の組合せなどは、表５の通りである。尚、表５のうち、成分名の%は重量%を示し、表中の「○」はその成分を使用したことを示し、「−」は不使用であることを示す。
【表５】
2013223491.tif 000006
【００４０】
（結果）
各々の培地で培養して調製したスターター中のL. fermentumの菌数を表６に示した。SMスターターとMnスターターの比較から、マンガン酵母の単独を所定濃度で乳原料培地に添加（配合）しても、L. fermentumの増殖性は向上されないことがわかった。一方、SMスターターとYE&Mnスターターの比較から、酵母エキスとマンガン酵母を同時に所定濃度で乳原料培地に添加（配合）すると、L.
fermentumの増殖性は向上され、酵母エキスとマンガン酵母の併用による相乗効果が得られることがわかった。
【表６】
2013223491.tif 000007
【００４１】
［試験例６］
マンガン酵母添加によるスターター中のL. fermentum OLL203697（受託番号FERM
BP-11433）の増殖性に対する個別成分（マンガンと酵母）の影響について検討した。
【００４２】
（方法）
L. fermentumの増殖性に対するマンガン酵母の影響に関して、その個別成分であるマンガンと酵母の影響について検討した。ここで、前記のYE&Mn培地、YE&無機Mn培地（酵母エキスを0.5重量%と、マンガン酵母で0.2重量%に相当するマンガン濃度になるように硫酸マンガンを添加したSM培地）を調製した。そして、MRS培地で賦活培養したL.
fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）の培養液を各々に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で対数増殖期の後期まで培養して、YE&Mnスターター、YE&無機Mnスターターを調製した。このとき、各々のスターター中のL.
fermentumの菌数を測定した。
【００４３】
（結果）
各々の培地で培養して調製したスターター中のL. fermentumの菌数を比較したところ、YE&MnスターターとYE&無機Mnスターターの両者で菌数に差異はなかった。つまり、L.
fermentumの増殖性に対するマンガン酵母の影響が酵母ではなくマンガンに基づくものであることを確認できた（データ非掲載）。
【００４４】
［試験例７］
モデルチーズ中のL. fermentumのエステル産生能に対するマンガン酵母の影響を検証した。
【００４５】
（方法）
1.  L. fermentumスターターの調製
SM培地（還元脱脂乳培地（固形分濃度：約10重量%））、Mn培地（マンガン酵母を0.2重量%の濃度になるように添加したSM培地）、YE培地（MRS培地と同様に酵母エキスを0.5重量%の濃度になるように添加したSM培地）、および、YE&Mn培地（酵母エキスを0.5重量%とマンガン酵母を0.2重量%の濃度になるように添加したSM培地）を調製した。そして、MRS培地で賦活培養したL.
fermentum OLL203697（受託番号 FERM BP-11433）の培養液を各々に1重量%で接種し、好気条件下に37℃で対数増殖期の後期まで培養して、SMスターター、Mnスターター、YEスターター、及び、YE&Mnスターターを調製した。このとき、各々のスターター中のL.
fermentumの菌数を測定すると共に、各々のスターターをモデルチーズの製造に供した。
【００４６】
2.  モデルチーズの製造
チーズ用の原料乳を模擬した還元脱脂乳（固形分濃度：約10重量%）に、市販のチーズ製造用スターターを接種すると共に、SMスターター、Mnスターター、YEスターター、及び、YE&Mnスターターのそれぞれを接種した。ここで、これらの接種量は、L.
fermentum OLL203697の菌数が同等になるような比率で接種した。そして、各々のスターターを接種した後に、市販のスターターに適した温度（37℃程度）でpHが5.0になるまで発酵させた。この発酵が終了してから、遠心分離処理により、ホエーを除去した後に、食塩を2重量%になるように添加して、18℃で2週間熟成させ、モデルチーズのSMチーズ、Mnチーズ、YEチーズ、及び、YE&Mnチーズを製造した。このとき、この熟成の開始日（熟成０日目）と終了日（熟成２週間後）におけるモデルチーズ中のL.
fermentum菌数を測定し、スターターの組成の違いによる増殖率の違いを比較した。またさらに、パイナップル様のフルーティーな香りの指標として、熟成２週間後における酪酸エチルの含有量を測定した。酪酸エチル量の測定方法は次の通りである。
試料0.5gをバイアル瓶に採取し飽和食塩水4.5gを加え密栓した後、60℃、40分間保持し、ヘッドスペースに揮発した酪酸エチルを固相マイクロファイバ(SUPELCO,
Stable Flex (DVB/Carboxen/PDMS;50/30μ\ochm))に抽出した。ファイバをGC/MSに導入し、Scanモード測定に供した。得られたクロマトグラムよりm/z88イオンのピーク面積を検出量とした。
【００４７】
（結果）
各々のスターターを接種して製造したモデルチーズ中の、熟成0日目（熟成開始時）と熟成2週間後のL. fermentum
OLL203697の菌数とその増殖倍率を表７に示し、熟成2週間後のモデルチーズ中のエタノール量、酪酸エチル量（面積値）、L. fermentum OLL203697の一定菌数あたり産生されるエタノール量、酪酸エチル量比を表８に示した。モデルチーズの熟成期間中でのL.
fermentum OLL203697の増殖倍率は、いずれのモデルチーズでも増殖倍率は２倍程度であり、YE&Mnチーズは2.1倍と他のモデルチーズよりも低い増殖倍率であった。しかしながら、YE&Mnチーズにおけるエタノール産生量や酪酸エチル量（面積値）は他のモデルチーズよりも顕著に高く、一定菌数あたりの産生量比も顕著に高かった。このことから、酵母エキスとマンガン酵母を同時に所定濃度で乳原料培地に添加（配合）すると、モデルチーズ中のL.
fermentumの１菌体あたりのエタノール産生能は大幅に増強され、チーズの芳香に関与するエステル（酪酸エチル）も大幅に増加するという顕著な効果が明らかとなった。
【表７】
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【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明によれば、発酵乳製品中のL. fermentumのエタノール産生量が増加されるため、ナチュラルチーズをはじめとして、エタノール含量の高い発酵乳製品を提供できる。そして、その結果として、ナチュラルチーズをはじめとして、パイナップル様のフルーティーな香りを増強した発酵乳製品を提供できる。
【図１】
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【図２】
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