(57)【要約】      （修正有）【課題】生存率が高い乳酸菌を含み、生きた乳酸菌を多く摂取できる飲食品を提供する。【解決手段】乳酸菌が増殖しない条件で保存することによって、乳酸菌にとってストレスの高い条件下であっても生存率が高い乳酸菌を得ることにより、該乳酸菌を含み、生きた乳酸菌を多く摂取できる飲食品を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
【請求項２】
次の１）〜１５）から選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の発現が抑制されたラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
【請求項３】
前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）が、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８６）、ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６３９）、ＪＣＭ１１３１Ｔ、前記ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）がＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２４）、ＪＣＭ２０１０Ｔのいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
【請求項４】
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
【請求項５】
前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が、次の１）〜１５）から選ばれるいずれか１種以上の遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする請求項４に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
【請求項６】
前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）が、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３））、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８６）、ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６３９）、ＪＣＭ１１３１Ｔ、前記ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）がＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２４）、ＪＣＭ２０１０Ｔのいずれかであることを特徴とする請求項４または５に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を含有させることを特徴とする飲食品。
【請求項８】
前記飲食品が乳製品であることを特徴とする請求項７に記載の飲食品。
【請求項９】
前記乳製品が発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、または乳酸菌飲料であることを特徴とする請求項８に記載の飲食品。
【請求項１０】
次の１）および２）の工程を含むことを特徴とする飲食品の製造方法。
１）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存し、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を製造する工程。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
２）上記１）の工程によって保存した乳酸菌を、飲食品または飲食品の原料に添加する工程。
【請求項１１】
前記飲食品が乳製品である請求項１０に記載の飲食品の製造方法。
【請求項１２】
前記乳製品が発酵乳または乳酸菌飲料である請求項１１に記載の飲食品の製造方法。
【請求項１３】
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したことを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を向上させる方法。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌、乳酸菌の製造方法、該乳酸菌を含む飲食品等に関する。さらに詳しくは、生存率が高い乳酸菌を含む飲食品、または該飲食品の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
健康への意識の高まりから、プロバイオティクス乳酸菌入りの飲食品が各種製造・販売されている。プロバイオティクスとは、宿主の腸内菌叢のバランスを改善することにより宿主にとって有益な作用をもたらす生きた微生物のことであり、整腸作用、免疫賦活作用、メタボリックシンドロームの改善作用等の幅広い効果が期待されるようなってきた。
【０００３】
プロバイオティクスとされる乳酸菌（以下、単に乳酸菌と示す場合がある）には、様々な菌が知られており、乳酸桿菌に限定して列挙した場合でも、ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、等の複数の菌が挙げられる。これらの菌の機能については、多くの知見が得られている。
【０００４】
このようなプロバイオティクス乳酸菌の一つである、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）やラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、ヒト腸内の常在細菌として知られており、小腸からの検出例が報告されている。
【０００５】
中でもラクトバチルス・ガセリＳＢＴ２０５５株は、生きて腸内に届き、腸管内で長く留まることから、多面的・長期的な効果が期待できると考えられる。
【０００６】
このようなプロバイオティクス乳酸菌を含む飲食品において、製品中の菌数を維持することが重要であり、流通段階や家庭での保存期間において飲食品中の菌数が減少することは、その飲食品が示し得る健康効果の低下に繋がり問題となる。
【０００７】
飲食品にプロバイオティクス乳酸菌を添加する場合は、製品中の菌数を高めるため、凍結濃縮菌体や濃縮乾燥菌体を製品に直接添加する方法や、前培養工程を設けて菌体を増やした後にその培養物を添加する方法、また製品中で菌体を増殖させる方法等が考えられる。
前培養工程を設ける場合には、乳酸菌を増殖させるために、窒素源やビタミン・ミネラル、糖類等の炭素源を含んだ培地で培養することが必要とされる。例えば、脱脂乳に酵母エキスを添加したものや、食品添加物で構成されたものを培地とし、必要に応じて好適なｐＨを維持しながら、嫌気条件で培養する。この培養によって増殖した乳酸菌が、必要に応じて洗浄や濃縮工程を経た後、飲食品に添加される。
添加された乳酸菌は、飲食品中に炭素源や窒素源が好適に含まれ、温度条件が合致した場合に、さらに増殖する。しかし、この増殖に伴い、乳酸菌自身が乳酸や酢酸を生成し、飲食品のｐＨを下げたり、溶存酸素や酸素由来のスーパーオキシドイオン、過酸化水素またはヒドロキシラジカルを生成したりする。これによって、乳酸菌がストレスを受け、耐性の弱い菌株については保存中に減少してしまうことが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００８】
以上のように、プロバイオティクス乳酸菌は、製品の製造・保存中の環境ストレスにより減少することが知られているが、糖を含んだ飲食品中でも代謝による酸生成や浸透圧等の強いストレスを受けることが知られている。そのため、このようなストレス条件下において、プロバオイティクス乳酸菌の生存率を向上させる方法が望まれている。
そこで、プロバイオティクス乳酸菌を含む食品において、生存率を高めるための様々な技術が、これまでに数多く報告されている。例えば、発酵乳製品中のプロバイオティクス乳酸菌の生存率を高める方法として、パーオキシダーゼを添加して保存中の酸度上昇を抑制する方法（特許文献１）、カテキン類及び／またはトコフェロール類を添加する方法（特許文献２）、ビフィズス菌と共生関係を持つ乳酸菌を添加する方法（特許文献３）、着色フィルムにより遮光性を高める方法（特許文献４）等がある。また、摂取後の生体内での生存率を高める方法については、乳酸菌を腸溶性カプセルに封入することで胃酸の影響を抑えて腸内に到達させる方法（特許文献５）が報告されている。また、乳酸菌が資化できる炭素源が存在しない環境下におかれた乳酸菌は、凍結や凍結乾燥工程において生存率が高まることが知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許３６４５９８６号
【特許文献２】特開平８−３２２４６４号
【特許文献３】特許３０６９７４９号
【特許文献４】特許３７１７３８２号
【特許文献５】特開平１１−１９９４９４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】日本乳酸菌学会誌，  Ｖｏｌ．  ２１  （２０１０）  Ｎｏ．  １  ｐｐ．３−９
【非特許文献２】日本食品微生物学会雑誌，  Ｖｏｌ．  ２６  （２００９）  Ｎｏ．  ２  ｐｐ．８１−８５
【非特許文献３】Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，  Ｖｏｌ．６８，  Ｎｒ．８，２００３  ｐｐ．２５３８−２５４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１〜３は、乳酸菌の生存率を向上させるために添加物を必要とするため、添加方法の煩雑さの点で課題があり、また、添加物による風味への影響も問題となる場合がある。
非特許文献１，２には、乳酸菌の生存率に影響する要因が開示されているが、乳酸菌自身がストレス源を生成してしまうため、飲食品に含まれる乳酸菌の死滅を完全に防ぐことは難しく、死滅を抑制する方法は開示されていない。
また、非特許文献３には、乳酸菌が資化できる炭素源が存在しない環境下におかれた乳酸菌は、凍結や凍結乾燥工程において生存率が高まることが開示されているが、糖を含む飲食品中において乳酸菌の生存率が向上することについての示唆や記載はない。
よって、本発明者らは、糖等によるストレス条件下で生存率が高い乳酸菌を含み、生きた乳酸菌を多く摂取できる飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（１３）に示される乳酸菌、乳酸菌の製造方法、該乳酸菌を含む飲食品、飲食品の製造方法および乳酸菌の生存率を向上する方法等に関する。
（１）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
（２）次の１）〜１５）から選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の発現が抑制されたラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
（３）前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）が、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８６）、ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６３９）、ＪＣＭ１１３１Ｔ、前記ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）がＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２４）、ＪＣＭ２０１０Ｔのいずれかであることを特徴とする上記（１）または（２）に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）。
（４）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
（５）前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が、次の１）〜１５）から選ばれるいずれか１種以上の遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする上記（４）に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
（６）前記ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）が、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８６）、ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６３９）、ＪＣＭ１１３１Ｔ、前記ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）がＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２４）、ＪＣＭ２０１０Ｔのいずれかであることを特徴とする上記（４）または（５）に記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法。
（７）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を含有させることを特徴とする飲食品。
（８）前記飲食品が乳製品であることを特徴とする上記（７）に記載の飲食品。
（９）前記乳製品が発酵乳または乳酸菌飲料であることを特徴とする上記（８）に記載の飲食品。
（１０）次の１）および２）の工程を含むことを特徴とする飲食品の製造方法。
１）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存し、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以内であることを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を製造する工程。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
２）上記１）の工程によって保存した乳酸菌を、飲食品または飲食品の原料に添加する工程。
（１１）前記飲食品が乳製品である上記（１０）に記載の飲食品の製造方法。
（１２）前記乳製品が発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、または乳酸菌飲料である上記（１１）に記載の飲食品の製造方法。
（１３）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を下記条件で保存したことを特徴とするラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を向上させる方法。
条件；ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、乳酸菌がストレスを受けうる飲食品においても、生菌数を維持できる乳酸菌を得ることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】増殖する条件または増殖しない条件において保存した後の培養倍率を示した図である（実施例１）。
【図２】糖溶液中に保存した後の生存率を示した図である（実施例１）。
【図３】増殖する条件または増殖しない条件において保存した後の培養倍率を示した図である（実施例２）。
【図４】糖溶液中に保存した後の生存率を示した図である（実施例２）。
【図５】糖溶液中に保存した後の生存率を示した図である（実施例３）。
【図６】糖溶液中に保存時間を変えて保存した後の生存率を示した図である（実施例４）。
【図７】糖濃度を変えて保存した後の生存率を示した図である（実施例５）。
【図８】ＭＲＳ（糖無し）培地で保存したラクトバチルス・ガセリにおけるＭＲＳ（グルコース）培地で保存したラクトバチルス・ガセリに対する各遺伝子の転写レベルの相対比較値を示した図である（実施例６）。
【図９】ＭＲＳ（糖無し）培地で保存した後、糖水溶液中で５日間保存したラクトバチルス・ガセリと、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存した後、糖水溶液中で５日間保存したラクトバチルス・ガセリにおける、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存したラクトバチルス・ガセリに対する各遺伝子の転写レベルの相対比較値を示した図である（実施例７）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明におけるラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）（以下、「ラクトバチルス・ガセリ」という場合がある。）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）（以下、「ラクトバチルス・ジョンソニー」という場合がある。）の保存条件とは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存することをいう（以下、本保存条件を「増殖しない条件」という場合がある）。
この保存条件における保存培地とは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が資化できる炭素源を含まない培地や生理食塩水、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、水等をあげることができる。また、例えば、市販のＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ製）の組成において、グルコース等のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が資化できる炭素源を除いたものや、ＰＢＳ（−）等のバッファーにパン酵母エキスもしくはビール酵母エキス等の酵母エキス、当該乳酸菌が資化しない糖類等の炭素源、ペプトン、ミネラル、ビタミン、アミノ酸等を一種または二種以上、それぞれ０．１％〜２０％等、適宜添加したものも、本発明の保存培地として用いることができる。
ここで、添加する酵母エキスは、メーカーや規格を特に指定するものではなく、食品に利用できるものであれば限定されず、いずれの物を用いてもよい。ペプトンに関しても、原料や処理方法を限定するものではなく、食品に利用できるものであれば限定されず、いずれの物を用いてもよい。当該乳酸菌が増殖しない糖類等の炭素源、ミネラル、ビタミン、アミノ酸等についても同様に食品に利用できるものであれば限定されず、いずれの物を用いてもよい。
【００１６】
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、上記のような保存培地で２０〜４５℃で１〜１６時間保存したときに、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍以である菌株を選択することにより得ることができる。本発明の保存条件（増殖しない条件）における保存温度および保存時間は、２０〜４５℃で１〜１６時間であればよい。２０℃〜４５℃で１時間以上保存することが好ましく、同温度で１時間〜１６時間保存することがより好ましく、同温度で４時間〜１６時間保存することがさらに好ましい。また、３０℃〜４２℃で１時間以上保存することが好ましく、同温度で１時間〜１６時間保存することがより好ましく、同温度で４時間〜１６時間保存することがさらに好ましい。３７℃で１６時間保存することが、さらにより好ましい。
この保存は、例えば、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）等の乳酸菌を０．１％〜１０％、保存培地に接種することで行うことができる。なお、本発明の保存条件（増殖しない条件）において、保存後の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）が保存前の菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）の１０倍を超えてしまうと、保存後の菌体の生存率が向上しないため、該範囲が１０倍以内であることが本発明において重要である。
【００１７】
上述した保存条件で保存することにより、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を高めることができる。ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）菌体自体の生存率が向上するし、通常の組成物や飲食品中における生存率も向上する。
例えば、保存条件（増殖しない条件）で保存した後の乳酸菌を、糖を含む組成物、その一例として糖濃度が０．０１〜６０％の飲食品中に保存した場合でも、乳酸菌の生存率を大きく低下させる要因として知られる糖を含む条件下であるにもかかわらず、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を高めることができる。
糖を含む組成物や飲食品としては、例えば、グルコースを０．０１％〜６０％のいずれかに該当する濃度で含有する組成物、上白糖等の糖質を含む乳原料に乳酸菌スターターを加えて発酵させた発酵乳、および、これにフルーツプレザーブ等を混合したフルーツ入り発酵乳の組成物等を例示することができる。
本発明で述べる「生存率」とは、乳酸菌にとって高ストレスの環境下で保存した場合において、保存開始時の菌数に対し、死滅せずに生き残っている菌数の割合のことをいう。
本発明において、上述した保存条件（増殖しない条件）で保存されたラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、例えば、糖濃度が０．０１〜６０％の飲食品に添加され、添加後１０℃で１０日間保存された場合に、増殖しない条件で保存されない菌と比較して、保存前の菌数に対して１０倍以上、好ましくは３０倍以上生存率の向上が認められるものであることが好ましい。
【００１８】
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、上述した保存条件（増殖しない条件）で保存することにより、次の１）〜１５）から選ばれるいずれか一種以上の遺伝子の発現が抑制されたラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）となる。
１）ａｔｐＤ、２）ｃｆａ、３）ｃｌｐＣ、４）ｄｎａＫ、５）ｆｔｓＨ、６）ｇｒｏＥＬ、７）ｈｓｐ２０、８）ｌｄｈ、９）ｍｓｃＬ、１０）ｎｐｒ、１１）ｏｐｕＡ、１２）ｐｔｓＨ、１３）ｒｐｏＳ、１４）ｔｒｘ、１５）ｕｖｒＡ
ここで、遺伝子の発現が抑制されたとは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を通常用いる培地で保存した場合の遺伝子の発現量に比べて、その遺伝子の転写レベルが１０分の１から１０，０００分の１程度に低下していることをいう。
例えば、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を本発明の保存条件（増殖しない条件）で保存した場合の上記遺伝子の発現が、ＭＲＳ培地で３７℃、１６時間保存した場合と比べて、その転写レベルにおいて１０分の１から１０，０００分の１程度に低下している時に、本発明において遺伝子の発現が抑制されたという。
【００１９】
本発明におけるラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）は、いずれの菌株を用いてもよく、例えば、ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）、ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３８）、ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８６）ＳＢＴ１０２３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６３９）もしくはＪＣＭ１１３１Ｔから選ばれるいずれか一種以上の菌株等をあげることができるが、特に限定されるものではない。
また、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）もいずれの菌株を用いても良く、例えば、ＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３４）、ＳＢＴ２０５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２４）もしくはＪＣＭ２０１０Ｔから選ばれるいずれか一種以上の菌株等をあげることができるが特に限定されるものではない。
【００２０】
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を上述した保存条件（増殖しない条件）で保存することにより、生存率の向上したラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を製造することができる。
この製造方法は、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）が増殖しない条件で保存する工程以外に、本発明の乳酸菌の製造にあたり必要とされるその他の工程を含んでいても良い。
また、このようなラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の製造方法には、一般的な乳酸菌の培養や製造に利用できる機器であれば、従来知られるいずれの機器を用いても良い。
【００２１】
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）は、飲食品等に含有させることもできる。飲食品としては、発酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、チーズ、バター、クリーム等の乳製品、乳清飲料、乳入り飲料、清涼飲料等の飲料等をあげることができるが特に限定されるものではない。例えば、市販の乳酸菌スターターを添加して発酵させることによって得られた発酵乳、乳酸菌飲料等の乳製品に本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を添加することができる。
本発明のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を発酵乳や乳酸菌飲料に含有させた場合、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の飲食品中での生存率が高く、これによって、生きた乳酸菌を多く摂取することが可能な発酵乳等の飲食品を製造することが可能となる。
【００２２】
本発明におけるラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率を向上させる方法とは、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）を保存培地で２０〜４５℃、１〜１６時間保存することを特徴とする。
本方法により、飲食品中のラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生菌数を高く維持することができるため、長期保存後も高い健康効果が期待できる。
【００２３】
以下に、本発明の実施例等をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の飲食品中での生存率向上効果を確認するために、モデルとして異性化糖溶液を用いたが、これに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
１．試料の調製
１）保存培地の調製
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の保存培地として、グルコースを含まないＭＲＳ培地（以下、「ＭＲＳ（糖無し）培地」とする場合がある）を調製した。表１に示した各成分を１Ｌの水に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した後、放冷して用いた。
また、対照として、乳酸菌が増殖する保存培地として、グルコースを含む通常のＭＲＳ培地（以下、「ＭＲＳ（グルコース）培地」とする場合がある）を調製した。表１に示した各成分を１Ｌの水に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した後、放冷して用いた。
【００２５】
【表１】
2013192470.tif 000002
【００２６】
２）使用した乳酸菌株
ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）に属する以下の菌株を使用した。
（１）ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）
（２）ＪＣＭ  １１３１Ｔ
（３）ＳＢＴ２０５６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３８）
（４）ＳＢＴ１０２４１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８６）
また、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）に属する以下の菌株も使用した。
（１）ＪＣＭ２０１０Ｔ
【００２７】
上記の乳酸菌株をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ製）に接種し、３７℃で１６時間、２回継代培養を行なった後、試験に用いた。培養液を遠心分離して菌体を回収した後、ＰＢＳ（−）溶液（ニッスイ製）で２回洗浄し、初発の培養液と等量のＰＢＳ（−）溶液に再懸濁した。これを菌体懸濁液１として試験に用いた。この菌体懸濁液１をＰＢＳ（−）で段階希釈し、１．５％寒天入りＭＲＳプレートに適量塗抹して、３７℃でアネロパック嫌気（三菱化学製）を用いて３日間、嫌気培養した。生育したコロニーを計測し、懸濁液中の菌数を算出した（以下、菌数の測定は同様に行った）。
【００２８】
３）糖組成物の調製
異性化糖溶液（王子コンスターチ製）３５０ｇに、イオン交換水６５０ｍｌを添加し、１２１℃で１５分間滅菌した。その後、溶液中の糖濃度をＢｒｉｘ計（デジタル糖度計、アタゴ製）で測定したところ、糖濃度は２６．５％であった。
【００２９】
２．増殖しない条件での保存（以下、「保存（１）」という場合がある。）
乳酸菌を以下の工程により、保存した。
１）上記１．２）で調製した菌体懸濁液１を、上記１．１）で調製したＭＲＳ（糖無し）培地に１％（ｖ／ｖ）接種した。この時の保存前の培地中の乳酸菌数（菌体懸濁液１の１／１００）を初発菌数１（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
２）上記１）の乳酸菌を接種した培地を３７℃のインキュベーター内で１６時間保存した。その後、菌数を測定し、到達菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
上記と同様に、上記１．１）で調製したＭＲＳ（グルコース）培地を用いて（増殖する条件）乳酸菌を保存した。
【００３０】
３．増殖しない条件での保存（保存（１））後の乳酸菌の菌数の確認
上記２．にて測定した、初発菌数１に対する到達菌数の割合を、到達菌数／初発菌数１として算出し、増殖しない条件、または増殖する条件での保存後の乳酸菌の割合を培養倍率としてそれぞれ調べた。
その結果、図１に示したように、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）のいずれの菌株も、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合、菌数が３０倍以上に増加した。一方、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合は、いずれの菌株においても菌数の増加は１０倍以内であった。また、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＪＣＭ２０１０Ｔ株についても同様の結果が得られた。
【００３１】
４．糖溶液での保存（以下、「保存（２）」という場合がある。）
上記２．にて保存した各乳酸菌を、以下の工程により、糖濃度２６．５％溶液に保存した。
１）上記２．２）において、到達菌数を測定した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）して上清を廃棄した。その後、等量のＰＢＳ（−）溶液を添加し、十分に攪拌した後、再度遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行ない、上清を廃棄した。この操作を再度繰り返した後、等量のＰＢＳ（−）溶液に菌体を懸濁し、菌体懸濁液２として菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。
２）上記１．３）において調製した糖水溶液９０ｍｌに、上記１）の菌体懸濁液２を１０ｍｌ添加し、十分に攪拌して保存液とした。この時の保存液中の乳酸菌数（菌体懸濁液２の１／１０）を初発菌数２（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
３）上記２）の保存液を１０℃のインキュベーター内に入れ、１０日間保存した。保存開始から１０日後の保存液の菌数を測定し、保存後の生残菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）とした。
【００３２】
５．糖溶液での保存（保存（２））後の乳酸菌の菌数の確認
上記４．にて測定した、初発菌数２に対する生残菌数の割合（生残率）を、保存後の生残菌数／初発菌数２として算出し、糖溶液での保存後の乳酸菌の生存率を求めた。
その結果、図２に示したように、ラクトバチルス・ガセリのいずれの菌株も、保存（１）においてＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合と比較して、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合の方が、保存（２）における乳酸菌の生存率は１００倍以上高かった。ラクトバチルス・ジョンソニーのＪＣＭ２０１０Ｔ菌株についても同様の結果が得られた。
増殖しない条件で保存したことにより、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）および／またはラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の生存率が向上し、よって、乳酸菌にとってストレス環境である糖溶液における乳酸菌の生存率が向上することが明らかとなった。
【実施例２】
【００３３】
菌種の検討
以下の１）〜４）の乳酸菌を用いて、実施例１と同様の試験を行った。
１）ラクトバチルス・アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＪＣＭ  １１３２Ｔ
２）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）  ＪＣＭ  １１７３Ｔ
３）ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）  ＪＣＭ  １１２０Ｔ
４）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）  ＪＣＭ  １１３１Ｔ
【００３４】
保存（１）後の乳酸菌の菌数の割合を培養倍率として図３に示した。図３に示されるように、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカスおよびラクトバチルス・ガセリのいずれの菌株も、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合、菌数が３０倍以上に増殖した。
一方で、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合には、ラクトバチルス・ファーメンタムの菌数が２０倍まで増加したが、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ヘルベティカスおよびラクトバチルス・ガセリの菌数の増加は１０倍以内であった。
【００３５】
また、糖溶液での保存（保存（２））後の乳酸菌の生存率を図４に示した。図４に示したように、ラクトバチルス・ガセリでは、増殖しない条件での保存（保存（１））においてＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した場合と比較して、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した場合に、保存（２）における乳酸菌の生存率が１０，０００倍以上と大きく向上した。
一方、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ファーメンタム、およびラクトバチルス・ヘルベティカスでは、保存（１）においてＭＲＳ（グルコース）培地で保存した場合も、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存した場合も、保存（２）における乳酸菌の生存率に大きな変化は見られなかった。
【００３６】
したがって、この結果より、ラクトバチルス・アシドフィラス，  ラクトバチルス・ファーメンタムおよびラクトバチルス・ヘルベティカスにおいては、乳酸菌が増殖しない条件で保存することにより、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存した場合の乳酸菌の生存率に影響を与えない（保存（１）により保存（２）の生存率が向上しない）ことが明らかとなった。
一方で、ラクトバチルス・ガセリおよびラクトバチルス・ジョンソニーにおいては、実施例１に示されたように、該乳酸菌が増殖しない条件で保存することにより、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存した場合の乳酸菌の生存率に影響を与える（保存（１）により保存（２）の生存率が顕著に向上する）ことから、このような特性は菌種に依存することが示唆された。
【実施例３】
【００３７】
保存培地の検討
１．保存培地の調製
ラクトバチルス・ガセリ  ＪＣＭ１１３１Ｔを用いて、表２に示した保存培地を調製し、実施例１と同様の試験を行った。
ＰＢＳ（−）に、表２に示した各成分（グルコース、プロテオース  ペプトンＮｏ．３および酵母エキス）を添加し、１２１℃で１５分間滅菌した後、放冷したものを保存培地１〜３および保存培地５として調製した。また、乳酸菌が資化できる炭素源を含まない培地として、ＭＲＳ（糖無し）培地を実施例１のとおり調製し、保存培地４とした。
【００３８】
【表２】
2013192470.tif 000003
【００３９】
糖濃度が２６．５％の組成物中で保存した後（保存（２）後）の乳酸菌の生存率を図５に示した。図５に示されるように、保存培地１（ＰＢＳ（−）に何も添加していない培地）においては、保存培地４のＭＲＳ（糖無し）培地と同等の生存率を示した。また、プロテオース  ペプトンＮｏ．３のみを添加した保存培地２、酵母エキスのみを添加した保存培地３も同等の生存率であった。一方、グルコースのみを添加した保存培地５では、著しく低い生存率を示した。これは、実施例１において示したＭＲＳ（グルコース）培地の結果と同様の傾向を示した。
したがって、これらの結果から、保存培地として、ＰＢＳ（−）のみの培地、ＰＢＳ（−）にプロテオース  ペプトンＮｏ．３、または、酵母エキスを添加した溶液を保存培地として用いることができることが分かった。
また、この結果において、プロテオース  ペプトンＮｏ．３、酵母エキスを添加した場合でも、ラクトバチルス・ガセリの生存率が高まることから、飲食品の製造工程において必要な成分を、食品添加物等として添加することが可能であることも確認できた。
【実施例４】
【００４０】
保存（１）の保存条件の検討
１．試料の調製
ラクトバチルス・ガセリ  ＪＣＭ  １１３１Ｔおよびラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）を用いて、実施例１の保存（１）の保存時間を０，４，８，１２，１６時間とする以外は実施例１と同様に試験を行った。
【００４１】
結果を図６に示した。保存０時間の生存率は、１×１０-7（ＣＦＵ／ｍｌ）と低い値であったが、増殖しない条件で４時間以上保存を行った場合、その後の該乳酸菌の生存率は著しく向上することが明らかとなった。
【実施例５】
【００４２】
保存（２）における糖濃度条件の検討
１．各糖濃度組成物の調製
ラクトバチルス・ガセリ  ＪＣＭ１１３１Ｔを用いて、実施例１の１．３）の糖組成物の糖濃度を変えた以外は、実施例１と同様の試験を行った。なお、糖濃度を変えた糖組成物は以下のように調製した。
異性化糖溶液（王子コンスターチ製）に、イオン交換水を表３に示した所定の濃度となるように添加し、十分混合した後、１２１℃で１５分間滅菌した。その後に溶液中の糖濃度をＢｒｉｘ計（デジタル糖度計、アタゴ製）で測定したところ、表３に示したように、Ｂｒｉｘ濃度は設定濃度とほぼ一致した。これらの糖水溶液を、糖濃度が０．０％〜３５％の組成物として用いた。
【００４３】
【表３】
2013192470.tif 000004
【００４４】
結果を図７に示した。
図には示していないが、保存（１）においてＭＲＳ（グルコース）培地で保存したラクトバチルス・ガセリ  ＪＣＭ１１３１Ｔを糖濃度が２６．５％の組成物中で保存した場合は、生存率が１．０×１０-6以下であった。
これに対し、保存（１）においてＭＲＳ（糖無し）培地で保存したラクトバチルス・ガセリ  ＪＣＭ１１３１Ｔを用いた場合、糖濃度が０．０％〜３５％のいずれの組成物中で保存した場合でも生存率が１．０×１０-3以上であった。
したがって、この結果より、保存（１）においてＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存した乳酸菌は、保存（２）において、いずれの糖濃度の組成物中で保存された場合でも、生存率が１，０００倍以上に向上することが確認できた。
【実施例６】
【００４５】
乳酸菌の遺伝子発現特性の検討
実施例１の２．と同様の方法で、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存したラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）について、次の１、２の工程により、菌体からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によって遺伝子の転写量を調べた。対照として、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存したラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）についても同様に、遺伝子の転写量を調べた。
【００４６】
１．保存（１）後のＭＲＳ（糖無し）培地、またはＭＲＳ（グルコース）培地の各２ｍｌを回収し、それぞれ８ｍｌの氷冷したＰＢＳ（−）を添加して混合した後、遠心分離（４℃、５０００Ｇ、１分間）した。その後、ＴＲＩ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ製）および菌体破砕機（Ｍｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ  ｓｈｏｃｋｅｒ，  安井器械製）を用い菌体破砕、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ製）を用いて菌体からｍＲＮＡを取得し、ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＴＭ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ，  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）によりｃＤＮＡを合成した。
２．調製したｃＤＮＡと表４に示したラクトバチルス・ガセリ用のプライマーセット、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ  ＴＭ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン製）にて定量的ＰＣＲを行った。１６ＳｒＲＮＡの発現量を内部標準とした。
【００４７】
【表４】
2013192470.tif 000005
【００４８】
【表５】
2013192470.tif 000006
【００４９】
表５に、各遺伝子がコードするタンパク質および機能を示した。また、図８に、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存されたラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルを１として、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存されたラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルの相対比較値を示した。
その結果、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存された場合と比較して、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存されたことにより、遺伝子の転写レベルが、いずれの遺伝子も１０分の１から１０，０００分の１まで、著しく低下することが確認できた。
【実施例７】
【００５０】
糖溶液中で保存した前後のガセリ菌体の遺伝子発現状態の比較
実施例１の２．と同様の方法で、ＭＲＳ（糖無し）培地（増殖しない条件）で保存（保存（１））した後、さらに、実施例１の４．と同様の方法で、糖濃度が２６．５％の組成物で、１０℃で５日間保存したラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）について、実施例６の２と同様の工程において、ｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ｑＰＣＲ法を用いることにより、遺伝子の転写量を調べた。
対照として、ＭＲＳ（グルコース）培地（増殖する条件）で保存した後、さらに、実施例１の４．と同様の方法で、糖濃度が２６．５％の組成物で、１０℃で５日間保存したラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）についても遺伝子の転写量を調べた。
【００５１】
その結果、図９に示したように、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存（保存（１））された後、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存（保存（２））したラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルは、ＭＲＳ（グルコース）培地で保存（保存（１））されたものと同等か、やや高かった。
一方で、ＭＲＳ（糖無し）培地で保存（保存（１））され、糖濃度が２６．５％の組成物中でさらに保存（保存（２））したラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）の遺伝子の転写レベルは、ＭＲＳ（グルコース）培地で培養された（保存（１））ものと比較して著しく低く、これは保存（２）の前の各種遺伝子の発現レベルの状態を維持していると考えられた。
これらの結果より、乳酸菌が増殖しない条件で保存されたラクトバチルス・ガセリは、糖濃度が高い組成物中で保存した後も、各種遺伝子の発現レベルが保存前の低い状態で維持されていた。従って、この結果より、これらの遺伝子の発現を調べることにより、乳酸菌の生存率が向上した状態で保存されたことを確認できることが示唆された。
【実施例８】
【００５２】
乳酸菌を含有する飲食品の製造（１）
１）９５℃で９０分殺菌した発酵ミックス（１６％脱脂粉乳＋３％グルコース）１０ｇにラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）基準株ＪＣＭ  ８１３０のスターターを３％添加し、３０℃で７６時間発酵した。
２）上記１）にて得られた発酵物１０ｇ、異性化糖１０ｇおよびイオン交換水を３５ｇ、実施例１と同様の方法で０．８９％生理食塩水で保存した（保存（１））ラクトバチルス・ガセリ  ＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）を５ｇ添加して、ＢＲＩＸ  １５％の乳製品乳酸菌飲料を製造した。
３）この乳製品乳酸菌飲料を１０℃で１０日間保存したところ、１０日間保存後のラクトバチルス・ガセリの菌数は、７．５×１０6（ＣＦＵ／ｍｌ）と高い値を示し、生存率は２．５×１０-1であった。
【実施例９】
【００５３】
乳酸菌を含有する飲食品の製造（２）
１）脱脂粉乳９．５ｋｇ、無塩バター３ｋｇ、上白糖１０．５ｋｇ、水７７ｋｇをホモミキサーで混合し、原料ミックスを調製した。
この原料ミックスを５０℃まで加温し、８０ｋｇ／ｃｍ2  で均質処理した後、プレート式殺菌機で９０℃、１０分間加熱殺菌し、プレート式熱交換機で４２℃まで冷却した。そして、発酵乳製造用の市販乳酸菌スターター４重量％を添加した後、  １００ｍｌ容の容器に充填し、４２℃で発酵を行い、乳酸酸度が０．７５％になったところで５℃まで冷却して発酵乳を得た。
２）上記１）にて調製した発酵乳６８ｇ、実施例１と同様の方法で２．５％酵母エキス溶液で保存した（保存（１））ラクトバチルス・ジョンソニー  ＳＢＴ１８３９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３４）２ｇとフルーツプレザーブ１２ｇとを混合してフルーツ入り発酵乳を製造した。
３）このフルーツ入り発酵乳を１０℃で１０日間保存したところ、１０日間保存後のラクトバチルス・ジョンソニーの菌数は５．３×１０5（ＣＦＵ／ｍｌ）と高い値を示し、生存率は７．２×１０-1であった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
乳酸菌にとってストレスの高い環境下においても生存でき、乳酸菌が死滅しやすい飲食品においても、生菌数を維持できる乳酸菌を製造することにより、この乳酸菌を含む飲食品を、高い健康効果が期待される、プロバイオティクス乳酸菌入り飲食品として提供することが可能となる。
【受託番号】
【００５５】
［寄託生物材料への言及］
（１）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＳＢＴ２０５５
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成８年３月２７日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３
（２）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＳＢＴ２０５６
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
上記（１）に同じ
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
昭和６１年４月２２日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０３８
（３）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＳＢＴ１０２４１
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１２年３月１５日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７８６
（４）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＳＢＴ１０２３９
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成１０年２月１７日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６３９
（５）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＳＢＴ１８３９
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成８年３月２７日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１５５３４
（６）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＳＢＴ２０５０
イ  当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
工業技術院生命工学技術研究所
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）
ロ  イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成７年３月１４日
ハ  イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ  Ｐ−１４８２４
【図１】
2013192470.tif 000007
【図２】
2013192470.tif 000008
【図３】
2013192470.tif 000009
【図４】
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【図５】
2013192470.tif 000011
【図６】
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【図７】
2013192470.tif 000013
【図８】
2013192470.tif 000014
【図９】
2013192470.tif 000015
【配列表】
2013192470000001.app