(57)【要約】【課題】新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤を提供する。【解決手段】ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧから選ばれる１種以上の核酸物質と、下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなる免疫賦活剤。2013180972.tif 000004（式中、Ｒは水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧから選ばれる１種以上の核酸物質と、下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなる免疫賦活剤。
【化１】
2013180972.tif 000003
（式中、Ｒは水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す）
【請求項２】
前記核酸物質と前記ピロリドン類とが一の製剤中に含まれるものである請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
前記ピロリドン類が、Ｎ−メチルピロリドン又はＮ−エチルピロリドンである請求項１又は２記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
剤形が、経皮投与製剤である請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫賦活剤を含む免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活剤及び免疫療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、元来生体が有している外来抗原排除という免疫応答を利用することによる療法であり、免疫系を賦活させることで種々の疾患を治療するものである。免疫療法には、皮下、皮内、経皮投与法などがあり、抗原と免疫賦活剤を順次に或いは同時に投与することで、投与抗原に対する高い免疫応答を期待している。
【０００３】
免疫賦活剤の中で、最も研究の進んでいるものの１つとしてトールライクレセプター（ＴＬＲｓ）に結合するリガンド群が挙げられる。現在の所、ヒトで１０種類、マウスで１２種類のＴＬＲｓが確認されており、ＴＬＲ１〜９はヒト及びマウスの何れの種でも存在する。ＴＬＲｓにリガンドが結合することで自然免疫系は活性化され、抗原特異的免疫応答である、獲得免疫系への橋渡しをしている。これまでに各ＴＬＲｓに結合するリガンドの同定が行われており、バクテリアリポペプチド（ＴＬＲ１，２）、マイコプラズマリポペプチド（ＴＬＲ２，６）、ＲＮＡ（ＴＬＲ３、７、８）、リポポリサッカライド（ＴＬＲ４）、フラジェリン（ＴＬＲ５）、バクテリアＤＮＡ（ＴＬＲ９）などが同定されている（特許文献１）。また、ＴＬＲ７に結合するイミキモドのように、化学合成により得られた化合物がリガンドとなる場合もある（特許文献２）。ＴＬＲの中で核酸分子を認識するのはＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９である。これらのＴＬＲｓは細胞内の小胞体、エンドリソソームに局在し、宿主細胞に感染したウイルス、細菌由来の核酸分子の共通配列を認識して、宿主に対して免疫応答を惹起させる。 ＴＬＲ３はＲＳウイルス、脳心筋炎ウイルス、ウエストナイルウイルスなど、ＲＮＡウイルスのｄｓＲＮＡを認識する（特許文献３）。また、ＴＬＲ９はＤＮＡ上の非メチル化ＣｐＧモチーフを認識して宿主細胞を活性化させる。ＣｐＧは化学合成が容易なことから、がんワクチンや感染症ワクチン投与時の免疫賦活剤として利用されている（特許文献４、特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−０２４６１９号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１０００１号公報
【特許文献３】特表２００７−５０５８２７号公報
【特許文献４】特表２００６−５１２３９１号公報
【特許文献５】特表２００９−５１９２３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これら従来の免疫賦活剤の効果は十分ではなく、さらに優れた免疫賦活剤及びそれを用いた免疫療法剤が望まれていた。
従って、本発明の課題は、新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、種々の成分を用いて脾臓細胞から産生される液性因子の産生誘導能を指標として免疫賦活作用を検討してきたところ、下記ピロリドン類は、単独で液性因子の産生を増大させない濃度において、ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧの液性因子産生作用を顕著に増大させ、当該ＰｏｌｙＩＣ又はＣｐＧとピロリドン類の組み合わせが強い免疫賦活能を有し、免疫療法剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧから選ばれる１種以上の核酸物質と、下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなる免疫賦活剤を提供するものである。
また、本発明は、上記の免疫賦活剤を含む免疫療法剤を提供するものである。
【０００８】
【化１】
2013180972.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒは水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す）
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、脾臓細胞から放出される液性因子の割合が顕著に増大されるので、優れた免疫賦活剤が提供できるとともに、その免疫賦活剤を含む免疫療法剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧから選ばれる核酸物質とピロリドン類とのＩＬ−１α及びＩＦＮ−γ産生に及ぼす作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の免疫賦活剤は、ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧから選ばれる１種以上の核酸物質と、上記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなるものである。
【００１３】
ＰｏｌｙＩＣとは、ＰｏｌｙｉｎｏｓｉｎＩＣ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌＩＣ  ａｃｉｄの略で、ＴＬＲ３に認識されるリガンドである。
ＣｐＧとは、非メチル化ＣｐＧ（Ｃｙｔｉｄｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｏｓｉｎｅ）の略で、ＴＬＲ９に認識されるリガンドである。
本発明において、これらの核酸物質は、ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧをそれぞれ単独で使用してもよいし、これらを併用してもよい。
【００１４】
ピロリドン類を示す一般式（１）中、Ｒとしては炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましい。Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられるが、メチル基が特に好ましい。すなわち、ピロリドン類（１）としては、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドンが特に好ましい。
【００１５】
前記の核酸物質とピロリドン類（１）とを組み合わせて用いれば、後記実施例に示すように、脾臓細胞から産生される液性因子であるＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの産生量を増大させる作用を有することから、これらの組み合わせは、ヒトを含む哺乳動物の免疫賦活剤として有用であり、免疫療法剤として有用である。
【００１６】
本発明の免疫賦活剤は、前記核酸物質とピロリドン類（１）とを組み合わせて投与できればよく、同時投与であっても、互いに逐次投与であってもよい。また、前記核酸物質とピロリドン類（１）とは、投与経路が同一でも、互いに異なっていてもよい。
【００１７】
本発明の免疫療法剤は、上記の免疫賦活剤を含むものであり、好ましくはさらに抗原を含むものである。本発明の免疫療法剤は、免疫賦活剤および抗原を含む１つの製剤としてもよいし、免疫賦活剤および抗原を別体の製剤として含むキットであってもよい。また、抗原、他の免疫賦活剤、免疫調節剤、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、他のＴＬＲ賦活剤（イミキモド等）等と併用してもよい。
【００１８】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤の投与方法としては、経皮投与、経粘膜投与、経口投与、皮下注射、皮内注射等が挙げられるが、経皮投与がより好ましい。本発明の免疫賦活剤と抗原を併用して投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。抗原の投与は、本発明の免疫賦活剤と抗原とを同時に投与してもよく、また本発明の免疫賦活剤を投与した後に抗原を投与してもよい。
上記抗原としては、免疫応答を引き起こすことができる分子であれば、特に制限はないが、例えばペプチドまたはタンパク質が挙げられる。ペプチドとしては、天然由来のペプチドまたは合成ペプチドのいずれでもよく、３〜２５のアミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。タンパク質としては、天然由来のタンパク質または合成タンパク質のいずれでもよい。具体的には、癌抗原（腫瘍抗原）、種々のウイルス由来抗原、感染原因菌由来抗原、種々のアレルギー原因抗原等が挙げられる。
【００１９】
本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤は、前記のように経皮投与製剤とするのが好ましい。経皮投与製剤の剤形としては、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤等の他、パップ剤、テープ剤等の貼付剤が挙げられる。これらの経皮投与製剤中のピロリドン類（１）の含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。また、これらの経皮投与製剤中の前記核酸物質の含有量は、０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。さらに、ピロリドン類（１）と前記核酸物質との含有質量比（ピロリドン類：核酸物質）は、１００：１〜１：１０が好ましく、１００：１〜１：１がより好ましい。
【００２０】
また、本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤には、希釈剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤；水等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２１】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤の剤形としては、ピロリドン類（１）及び／又は前記核酸物質を粘着層に含有する貼付剤がより好ましい。当該粘着層中のピロリドン類（１）の含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。また当該粘着層中の前記核酸物質の含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。
【００２２】
粘着層は水系でも非水系でもよい。水系の粘着層を形成するための水系粘着剤としては、従来公知の水性ジェルを用いることができる。また、非水系の粘着層を形成するための非水系粘着剤としては、例えば、ゴム系粘着剤、アクリル系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ウレタン系粘着剤等が挙げられる。これらの中でも、粘着力の制御が容易である点で、ゴム系粘着剤およびアクリル系粘着剤が好ましい。
【００２３】
また、本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）の粘着層には、可塑剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
常温で液状又はペースト状の成分は、粘着層全体の質量に基づいて合計で、好ましくは１〜４０質量％、さらに好ましくは５〜３５質量％の範囲内で適宜配合される。
【００２４】
粘着層の坪量は、粘着層が水系粘着剤で形成されている場合には、１００〜３０００ｇ／ｍ2であることが好ましく、２００〜２０００ｇ／ｍ2であることがより好ましい。また、粘着層が非水系粘着剤で形成されている場合には、１０〜５００ｇ／ｍ2であることが好ましく、２０〜１００ｇ／ｍ2であることがより好ましい。
【００２５】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）は、支持基材を有していることが好ましい。
支持基材は、粘着層を支持する機能を有する。かかる支持基材は、可撓性（柔軟性）を有し、貼付時における曲面追従性をもち、加工時における裁断または打ち抜き等に適したものが好ましい。
このような支持基材としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）等のポリオレフィン、ポリアリレート、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリスルホン、ナイロン、ポリ乳酸、レーヨン、アクリル等の樹脂からなるプラスチックフィルム、織物、編物および不織布を用いることが可能である。さらに、プラスチックフィルムと、プラスチックフィルム、織物、編物、不織布および紙等とのラミネートシートや金属蒸着を施したプラスチックフィルムを用いることが可能である。
支持基材の平均厚さは、２〜４０００μｍであるのが好ましく、１０〜３００μｍであるのがより好ましい。
【００２６】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）は、剥離シートを有していることが好ましい。
剥離シートは、貼付剤の保管時（未使用時）において、粘着層の貼付面を保護する機能を有するとともに、有効成分の拡散を防止する機能を有している。
【００２７】
このような剥離シートとしては、例えば、ポリエチレンラミネート紙、ポリプロピレンラミネート紙等のラミネート紙類；ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系フィルム、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン系フィルム等の合成樹脂フィルム等が使用できる。また、剥離シートは、必要に応じてこれらの材料の片面または両面にシリコーン樹脂等により剥離処理が施されたものを使用してもよい。
また、剥離シートの平均厚さは、１０〜２００μｍであることが好ましく、１５〜１００μｍであることがより好ましい。
【００２８】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）は、生体の皮膚表面に貼付することにより、経皮で免疫賦活剤である前記核酸物質及び／又はピロリドン類（１）を生体に投与することができる。
免疫療法剤として、免疫賦活剤と併用して抗原を投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。
抗原を経皮で投与する場合には、上記貼付剤の剥離直後または剥離後約９６時間以内に、好ましくは剥離後約７２時間以内に、特に好ましくは剥離後約４８時間以内に、上記貼付剤を貼付したところと同じ表皮表面に、抗原を塗布するか、抗原を含む別の貼付剤を貼付することにより行うことができる。
また、粘着層の粘着力をＪＩＳ  Ｚ０２３７に準拠した測定方法（対ベークライト板）で、３〜２０Ｎ／２５ｍｍ程度に調整すると、上記貼付剤の剥離により皮膚表皮角質層を物理的に破壊させることができ、皮膚表皮角質層の破壊により抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化が引き起こされる。
【実施例】
【００２９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００３０】
実施例１：精製水に対して、ＰｏｌｙＩＣとＮＭＰとを、濃度がＰｏｌｙＩＣ：１００μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤１を調製した。
なお、ＰｏｌｙＩＣは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（ｔｌｒｌ−ＰＩＣ）より購入した。
実施例２：精製水に対して、ＰｏｌｙＩＣとＮＭＰとを、濃度がＰｏｌｙＩＣ：１００μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１０μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤２を調製した。
実施例３：精製水に対して、ＰｏｌｙＩＣとＮＭＰとを、濃度がＰｏｌｙＩＣ：１００μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１００μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤３を調製した。
実施例４：精製水に対して、ＣｐＧとＮＭＰとを、濃度がＣｐＧ：１０μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤４を調製した。
なお、ＣｐＧ配列は、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）であり、ＩＭＧＥＮＥＸ社（ＩＭＧ−２２０９Ｍｐｔ）より購入した。
実施例５：精製水に対して、ＣｐＧとＮＭＰとを、濃度がＣｐＧ：１０μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１０μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤５を調製した。
実施例６：精製水に対して、ＣｐＧとＮＭＰとを、濃度がＣｐＧ：１００μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１００μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤６を調製した。
【００３１】
比較例１：精製水に対して、ＰｏｌｙＩＣを、１００μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤１を調製した。
比較例２：精製水に対して、ＣｐＧを、１０μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤２を調製した。
比較例３：精製水をそのまま比較用製剤３とした。
比較例４：精製水に対して、ＮＭＰを、１μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤４を調製した。
比較例５：精製水に対して、ＮＭＰを、１０μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤５を調製した。
比較例６：精製水に対して、ＮＭＰを、１００μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤６を調製した。
【００３２】
試験例１
８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を取り出し、ピンセットで単一細胞化した。これらの細胞を１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２４ウェルプレートに１×１０6／ｍｌで播種した。播種した細胞に対して、実施例１〜６の免疫賦活剤１〜６および比較例１〜６の比較用製剤１〜６をそれぞれ添加し、７２時間培養後に細胞上清を回収した。
回収した細胞上清に含まれる液性因子（ＩＬ−１α、ＩＦＮ−γ）量を、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。結果を図１に示す。
【００３３】
実施例１〜６及び比較例１〜６の条件で７２時間培養を実施したマウス脾臓細胞上清を使用して、ＩＬ−１α、ＩＦＮ−γの含有量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＰｏｌｙＩＣ単独刺激群（比較例１）、又はＣｐＧ単独刺激群（比較例２）と比較して、ＮＭＰとの併用添加群（実施例１〜６）でＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの両液性因子産生の増大が観察された。
また、ＰｏｌｙＩＣ単独刺激群（比較例１）、又はＣｐＧ単独刺激群（比較例２）と比較して、精製水のみ（比較例３）またはＮＭＰ添加のみ（比較例４〜６）の場合には、ＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの両液性因子産生の増大は観察されなかった。
すなわち、ＮＭＰは、単独では両液性因子を増大させない濃度において、ＰｏｌｙＩＣ及びＣｐＧの両液性因子を顕著に増大させる作用を有することがわかる。
【図１】
2013180972.tif 000005
【配列表】
2013180972000001.app