(57)【要約】【課題】多価抗体・２重特性性抗体を得ることができる多価分子の作製により、ヒトアルブミンに対して、結合力を向上させた分子を提供することを目的とする。【解決手段】ヒトアルブミンに対し特異的に結合する第一の分子と、前記第一の分子とは異なるヒトアルブミン分子表面に対し特異的に結合する第二の分子をバーナーゼ変異体、バースターを結合モジュールとした多価分子により、ヒトアルブミンに対する親和性を向上することができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアルブミンに対し特異的に結合する少なくとも一つの結合部とＲＮＡ分解酵素バーナーゼの変異体を連結させた第一の分子と、
上記第一の分子とは異なるヒトアルブミン分子表面に対し特異的に結合する少なくとも一つの結合部とバーナーゼの酵素活性部位に特異的に結合するタンパク質バースターを連結させた第二の分子からなるヒトアルブミン結合分子。
【請求項２】
請求項１に記載の結合分子が抗体分子由来のアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項１に記載のヒトアルブミンに結合する分子。
【請求項３】
上記ＲＮＡ分解酵素バーナーゼの変異体がＲＮＡ分解酵素活性を持たないことを特徴とする請求項１〜２に記載のヒトアルブミンに結合する分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、資料中の特定成分を免疫測定法によって分析するための抗体試薬に関し、より特定的には、血液や尿中等のヒトアルブミンを免疫測定方法によって分析するための抗体試薬の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
それぞれの抗原結合部位が異なる抗原に結合する抗体を２重特異性抗体という．例えば，癌細胞抗原とエフェクター細胞抗原を認識する２重特異性抗体は，これら細胞を効果的に接触させることで抗腫瘍作用の増強が期待され現在臨床評価が行われている。近年、抗体分子を結合部位に持つ２重特異性抗体に関する研究が活発化され、その簡易的な作製方法が次々と開発されている。その一例として、特許文献１に記載の作製方法は、バーナーゼ及びバースターそれぞれにｓｃＦｖ（一本鎖抗体）を連結させた融合タンパク質を発現させ、バーナーゼ、バースターの高い親和性（Ｋｄ＝１０＾−１４）を利用することで、多価抗体及び２重特異性抗体を作製することを特徴としている。
【０００３】
さらに、従来の検査用ヒトアルブミン結合タンパク質として、分子量約１５０ｋＤａの抗体分子、或いは単鎖Ｆｖを利用している（特許文献１、２）。しかしながら、従来の方法では一価結合型の抗体を複数混合することによるアビディティ効果に依存している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３３５９７８号公報
【特許文献２】特開２００９−１４５３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のバーナーゼはＲＮＡ分解活性を有し、バーナーゼｓｃＦｖ融合タンパク質発現の際には、そのインヒビターであるバースターを共発現することで、その酵素活性を妨害させていた。しかしながら、上述のようにバーナーゼ、バースターの親和性は極めて高く、共発現させたバースターを除去するために、６Ｍグアニジン塩酸塩にて両タンパク質を変性させた後、巻き戻しを行うことで活性のあるバーナーゼｓｃＦｖ融合タンパク質を取得していた。そのため、目的とする多価抗体あるいは２重特異性抗体の取得には、膨大な時間と工数が必要であるという課題があった。
【０００６】
また、複数の抗体を混合することによるアビディティ効果による場合、混合する抗体の配合比を調整する工程が必要であるという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記従来の課題を解決するために、本発明の多価結合分子の作製方法は、ヒトアルブミンに対し特異的に結合する少なくとも一つの結合部とＲＮＡ分解酵素バーナーゼの変異体を連結させた第一の分子を作製する工程と、上記第一の分子とは異なるアルブミン分子表面に対し特異的に結合する少なくとも一つの結合部とバーナーゼ特異的に結合するタンパク質バースターを連結させた第二の分子を作製する工程と、上記ＲＮＡ分解酵素バーナーゼの変異体とバーナーゼ特異的に結合するタンパク質バースターを介し、第一の分子と第二の分子を連結させる工程からなることを特徴とする。
【０００８】
本発明の多価結合分子の作製方法は、バーナーゼの変異体がＲＮＡ分解酵素活性を持たないことを特徴とする。
【０００９】
本発明の多価結合分子の作製方法は、ＲＮＡ分解酵素バーナーゼの変異体がバーナーゼ特異的に結合するタンパク質バースターと結合する領域のみから構成されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＲＮＡ分解酵素バーナーゼ変異体は、ＲＮＡ分解酵素活性をもたないために単独での発現が可能であるために、インヒビターであるバースターを共発現させる工程を減らすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】バーナーゼ変異体と第一の抗アルブミンscFv抗体融合タンパク質発現の遺伝子構成を示す図
【図２】バースターと第二の抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質発現の遺伝子構成を示す図
【図３】バーナーゼ変異体と第一の抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質の構成を示す図
【図４】バースターと第二の抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質の構成を示す図
【図５】多価結合分子の構成を示す図
【図６】野生型及び多価分子のカイネティクス解析結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（実施の形態１）
以下に本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されない。
【００１３】
以下に、ヒトアルブミン抗原に対し、異なるエピトープに結合し得る多価結合分子を作製する例を示す。抗原結合部位の分子形態には、ｓｃＦｖを選択する例を示す。バースターでありＲＮＡ分解酵素活性を失うようにアミノ酸変異を加えたものを用いる例を示す。
１）抗ヒトアルブミン抗体の遺伝子単離とscＦｖ遺伝子の作製する工程。
２）バースターと抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質発現プラスミドの構築する工程。
３）バースターと抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質発現プラスミドの構築する工程。
４）バーナーゼ変異体と抗アルブミンscFv抗体融合タンパク質の発現する工程。
５）バースターと抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質の発現する工程。
６）多価結合分子の作製と精製する工程。
７）工程６）にて得られた多価分子のカイネティクス解析を行い、結合定数の向上を評価する工程。
【００１４】
（１）抗ヒトアルブミン抗体の遺伝子単離とscＦｖ遺伝子の作製する工程
抗アルブミン抗体の取得には、例えばHSAをBALB/ Cマウスなどに免疫し、脾臓細胞とミエローマとをポリエチレングリコールを用いる通常の方法で細胞融合させ、抗原への反応性を確認した後に、限界希釈法によりクローニングを行い、抗モノクローナル抗体を作製することができる。また、ファージディスプレイ法やイーストディスプレイ法など、DNAライブラリーを用いたスクリーニング法により、アルブミンに特異的に結合し得る抗体遺伝子を取得する方法もある。異なるエピトープに対するクローンの選択には、例えば、得られた複数の抗体をサンドイッチELISA法や、SPRを用いることにより、複数の抗体が同時に一つの抗原に結合し得るか否かを実験的に評価することで選別することができる。
【００１５】
上記のようにして、得られるモノクローナル抗体より抗体可変領域をコードする遺伝子を抽出し、scＦｖ（一本鎖抗体）の遺伝子配列の作製方法を以下に示す。まず、モノクローナル抗体を、RPMI１６４０などの培地中で１×１０＾６個程度まで培養する。次に、TRIZOL（インビトロジェン製）により全RNAを抽出し、市販のmRNA抽出キット（タカラバイオ製）により、mRNAを抽出し、常法に従ってcDNAを調製することできる。得られたcＤＮＡを鋳型とし、例えば、Mouse ScFv Module/Recombinant Phage Antibody System（アマシャム）のオリゴヌクレオチオドプライマーや、既存のサブクラスの抗体可変領域を増幅するためのプライマーを用い、PCR反応を行うことによって、抗体のH鎖及びL鎖のV領域をコードするDNA断片を増幅することができる。得られたH鎖及びL鎖のV領域をコードするDNA断片を市販のクローニング用ベクターに、制限酵素処理にて結合させ、L鎖V領域をコードする遺伝子と、H鎖V領域をコードする遺伝子配列の間に、配列番号１などのリンカー配列を持たせることで、scＦｖの遺伝子配列を構築することができる。
【００１６】
このようにして、２種のヒトアルブミン上の異なるエピトープに同時に結合し得る第一のscＦｖ遺伝子及び第二のscＦｖ遺伝子を得ることができる。
【００１７】
（２）バースターと抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質発現プラスミドの構築する工程
バースター変異体発現のための遺伝子は、既存の人工遺伝子合成技術を用い作製・取得することができる。上記のようにして得られた第1のscＦｖ遺伝子と、バースター遺伝子配列の間に、例えば、配列番号１や抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列など適当なアミノ酸をリンカーとして選択し、発現に用いるベクター上にて、常法を用いて連結させる。また、融合タンパク質発現後の精製のため、バーナーゼ遺伝子配列の３‘側にヒスチジンタグなどの遺伝子配列を挿入しても良い。また、必要に応じてscＦｖ遺伝子の５’側に、pelＢなど
のシグナル配列を挿入しておくと、目的のタンパク質がペリプラズムへ運ばれるため好ましい。scFv特性によっては、シグナル配列を含まなくても良い。発現ベクターに用いるプロモーターとしては、T7、tac、lac、ｔｒｃプロモーターなどが挙げられるが、発現させるscＦｖの特性によって、適宜・適切に選択することが好ましい。また、ベクターにはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどに対する耐性遺伝子を有することが好ましい。以下では、発現ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を有している場合の例について示す。
【００１８】
（３）バースターと抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質発現プラスミドの構築
バースター発現のための遺伝子は、既存の人工遺伝子合成技術を用い作製・取得することができる。上記のようにして得られた第1のscＦｖとは異なるエピトープを認識する第二のｓｃFv遺伝子と、バースター遺伝子配列の間に、例えば、配列番号１や抗体ヒンジ領域のアミノ酸配列など適当なアミノ酸をリンカーとして選択し、発現に用いるベクター上にて、常法を用いて連結させる。また、融合タンパク質発現後の精製のため、バーナーゼ遺伝子配列の３‘側にヒスチジンタグなどの遺伝子配列を挿入しても良い。また、必要に応じてscＦｖ
遺伝子の５’側に、pelＢなどのシグナル配列を挿入しておくと、目的のタンパク質がペリプラズムへ運ばれるため好ましい。scFv特性によっては、シグナル配列を含まなくても良い。発現ベクターに用いるプロモーターとしては、T7、tac、lac、ｔｒｃプロモーターなどが挙げられるが、発現させるscＦｖの特性によって、適宜・適切に選択することが好ましい。また、ベクターにはアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどに対する耐性遺伝子を有することが好ましい。以下では、発現ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を有している場合の例について示す。
【００１９】
また、バーナーゼ変異体と第一のscＦｖを連結させるリンカーやバースターと第二のscＦｖを結合させるリンカーのアミノ酸の種類や数は、第一のscＦｖ及び第二のscＦｖのエピトープの位置に応じて適宜選択すれば良い。
【００２０】
（４）バーナーゼ変異体と抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質の発現する工程
上記のようにして得られたバーナーゼ変異体と抗アルブミンscFv抗体融合タンパク質発現のためのプラスミドをタンパク質大腸菌発現用の宿主に形質転換する。形質転換を行う宿主としては、BL21由来のものが好ましいが、その他発現可能な宿主があれば、適宜・適切に選択することができる。形質転換後の溶液を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むLBプレート培地にまき、３７℃にて１６時間培養する。次に形成されたシングルコロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５mＬの２YT培地を用い、３７℃、２５０ｒｐｍにて５時間培養する。次に、培養後の大腸菌を含む培地５ｍLを１Lの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むLB培地に添加し、３７℃、２５０ｒｐｍにて培地の中心波長600nmのO.Dが０．４〜０．９になるまで培養する。次に、培養液中の0.1ｍＭ〜1mＭ程度のIPTGを加え、さらに３７℃、２５０ｒｐｍにて約４〜２０時間培養する。また、融合タンパク質の特性によっては、IPTG添加後の培養温度を１６〜３０℃に設定するのが好まし
い。培養後の溶液を、５０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心する。発現ベクターにpelBなどのペリプラズムへのシグナル配列を組み込んだ場合には、遠心後の上澄みを除去し、３０mＬの３０mＭ  Tris-HCl pH8.0、２０％スクロース及び６０μｌの０．５M EDTAｐH８．０を加え、スタラーなどを用い室温にてゆっくりと１０分間攪拌する。次に、溶液を４℃、１００００ｇにて１０分間遠心し、上澄みを除去する。次に、３０mＬの氷上にて冷却しておいた５mＭの硫酸マグネシウムを加え再懸濁し、氷上にて１０分間、ゆっくりと攪拌する。攪拌後の溶液を４℃、１００００ｇにて１０分間遠心する。得られた上澄みをゲルろ過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、予めアルブミンを固定化したアフィニティカラムなどを通し、常法に従って、目的の融合タンパク質を精製することができる。得られるタンパク質の構成を図３に示す。また、ペリプラズムでの発現が低い、あるいは発現していない場合には、遠心後の沈殿物を３０ｍM Tris-HCｌpH8.0、０．１M NaClなどに再懸濁し、大腸菌を超音波にて破砕することで細胞質内の可溶性タンパク質を得ても良い。また、不溶性のタンパク質を既存の希釈法・透析法などを用い、巻き戻しを行っても良い。また、大腸菌を育成した培養液中から、精製が必要になる場合もある。精製方法や手順・試薬の組成などは、タンパク質の特性によって、適宜・適切に選択されることが好ましい。
【００２１】
（５）バースターと抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質の発現する工程
上記のようにして得られたバースターと抗ヒトアルブミンscFv抗体融合タンパク質発現のためのプラスミドをタンパク質大腸菌発現用の宿主に形質転換する。形質転換を行う宿主としては、BL21由来のものが好ましいが、その他発現可能な宿主があれば、適宜・適切に選択することができる。形質転換後の溶液を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むLBプレート培地にまき、３７℃にて１６時間培養する。次に形成されたシングルコロニーをピックアップし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５mＬの２YT培地を用い、３７℃、２５０ｒｐｍにて５時間培養する。次に、培養後の大腸菌を含む培地５ｍLを１Lの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むLB培地に添加し、３７℃、２５０ｒｐｍにて培地の中心波長600nmのO.Dが０．４〜０．９になるまで培養する。次に、培養液中の0.1ｍＭ〜1mＭ程度のIPTGを加え、さらに３７℃、２５０ｒｐｍにて約４〜２０時間培養する。また、融合タンパク質の特性によっては、IPTG添加後の培養温度を１６〜３０℃に設定するのが好ましい。培養後の溶液を、５０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心する。発現ベクターにpelBなどのペリプラズムへのシグナル配列を組み込んだ場合には、遠心後の上澄みを除去し、３０mＬの３０mＭ  Tris-HCl pH8.0、２０％スクロース及び６０μｌの０．５M EDTAｐH８．０を加え、スタラーなどを用い室温にてゆっくりと１０分間攪拌する。次に、溶液を４℃、１００００ｇにて１０分間遠心し、上澄みを除去する。次に、３０mＬの氷上にて冷却しておいた５mＭの硫酸マグネシウムを加え再懸濁し、氷上にて１０分間、ゆっくりと攪拌する。攪拌後の溶液を４℃、１００００ｇにて１０分間遠心する。得られた上澄みをゲルろ過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、予めヒトアルブミンを固定化したアフィニティカラムなどを通し、常法に従って、目的の融合タンパク質を精製することができる。得られるタンパク質の構成を図４に示す。また、ペリプラズムでの発現が低い、あるいは発現していない場合には、遠心後の沈殿物を３０ｍM Tris-HCｌpH8.0、０．１M NaClなどに再懸濁し、大腸菌を超音波にて破砕することで細胞質内の可溶性タンパク質を得ても良い。また、不溶性のタンパク質を既存の希釈法・透析法などを用い、巻き戻しを行っても良い。また、大腸菌を育成した培養液中から、精製が必要になる場合もある。精製方法や手順・試薬の組成などは、タンパク質の特性によって、適宜・適切に選択されることが好ましい。
【００２２】
（６）多価結合分子の作製と精製する工程
上記のようにして、得られたバーナーゼ変異体と第一の抗ヒトアルブミンscＦｖ抗体融合タンパク質とバースターと第二の抗ヒトアルブミンsvＦｖ抗体融合タンパク質を例えば、モル比１：１で混合させ、ゲル濾過クロマトグラフィなど所望の精製法にて分離・精製することで、図５に示すような多価結合分子を取得することができる。
（７）（６）にて得られた多価分子のカイネティクス解析を行い、結合速度定数の向上を評価する工程。
【００２３】
次に、BiacoreT100（GEヘルスケア）を用い、２種ｓｃＦｖ抗体のカイネティクス解析を行った。測定用センサチップには、CM5（GEヘルスケア）を用いた。ヒトアルブミン（ＳＩＧＭＡ）をアミドカップリング法にて、約１０００RUをCM5チップ上のフローセル２に固定化させた。また、フローセル１をEDC／NHSで活性後、エタノールアミンで処理し、リファレンスセルとした。
【００２４】
次に、上記工程で得られた２種ｓｃＦｖ抗体、および多価分子をPD-１０（GEヘルスケア）カラムを用い、HBS-EPバッファー（ＧＥヘルスケア）に置換した。それぞれの溶液を、HBS-EPバッファー（ＧＥヘルスケア）にて希釈し、アナライト溶液とした。
ランニングバッファーにはHBS-EPバッファー(ＧＥヘルスケア)を用い、２５℃、流速６０μｌ／ｍin、結合時間１２０秒、解離時間１２００秒にて結合実験を行った。また、再生溶液には、ｐＨ２．０のグリシン溶液（ＧＥヘルスケア）を用い、３０秒間フローセルに流した。得られたセンサグラムをBiacore Ｔ１００evaluation software（GEヘルスケア）  にて解析した結果、それぞれ図６に示すカイネティクス結果が得られた。多価分子は野生型に対し、明らかに結合性が向上した。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明に係るバーナーゼ変異体及びバースターを用いた多価分子の作製方法は、体液中に含まれる抗原に特異的に結合し得る多価結合分子の作製方法として有用である。
【符号の説明】
【００２６】
１  第一の抗ヒトアルブミンｓｃFv抗体
２  バーナーゼ変異体
３  リンカー
４  第２の抗ヒトアルブミンｓｃFv抗体
５  バースター
６  リンカー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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