(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内のコラーゲンの合成能を高めることによりコラーゲン量を増加させる、コラーゲン合成促進剤の提供。【解決手段】コラーゲンのmRNA発現を促進させる作用を有するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するヒコラーゲン合成促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤。
【請求項２】
コラーゲンのｍＲＮＡ発現促進剤として使用される請求項１に記載のコラーゲン合成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン合成促進剤に関する。より詳しくは、本発明は生体内のコラーゲンの合成能を高めることにより、コラーゲン量を増加させるコラーゲン合成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは生体タンパク質の約３０％を占める生体骨格の主たる構造タンパク質であり、生体の支持組織として構造維持に重要な役割を果たしているほか、ほとんどの組織に存在して細胞を保護し、細胞間因子として細胞の結合など重要な生理的役割を果たしている。このように、生体において重要な役割をもつコラーゲンも加齢に伴い減少し、老化の進行、病気の回復の遅延など、加齢変化に伴う様々な障害、疾病等を引き起こすと考えられており、対応策が望まれている。特に皮膚の老化は進行しやすく、老化の兆候も観察されやすい。皮膚老化を象徴するシワ及びタルミは皮膚の弾力性、柔軟性の低下が原因とされ、このような皮膚の老化はコラーゲンの減少に基づいている。
【０００３】
また、ヒアルロン酸は、皮膚、軟骨、関節液などに存在するムコ多糖類であり、その約半数が皮膚に存在する。ヒアルロン酸は、優れた保水力を有し、皮膚組織等においては、細胞外空間の構造維持、細胞への栄養供給物の拡散と老廃物の排出、さらには、細胞表面レセプタ−と相互作用し細胞分化などのシグナル伝達物質として働くことが知られている。また、ヒアルロン酸は、皮膚の弾力性又は粘弾性、保水性に深く関係し、加齢とともに減少することが知られている。ヒアルロン酸の減少は、乾燥肌となる原因とされ、皮膚のハリが衰え、シワやたるみなどの皮膚老化現象が起こりやすくなる。
【０００４】
このように、コラーゲンとヒアルロン酸は、皮膚をはじめ生体内で数多くの重要な役割を果たしているため、コラーゲンおよびヒアルロン酸の両者を生体内で増加させることができれば、１つの物質で上記の症状改善や予防・治療等に広く適用することができる。
【０００５】
従来、保湿成分としてのヒアルロン酸を補給する方法としては、特許文献１のほか、化粧料等の皮膚外用剤で外部から補給する方法が提案されている。
【０００６】
しかしながら、従来の化粧料は、皮膚表面における保湿効果を得られるだけであり、本質的に上記の皮膚老化現象などの症状改善をするには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１１−５１３４８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒアルロン酸を補給するとともに、生体内のコラーゲンの合成能を高めることによりコラーゲン量を増加させる、コラーゲン合成促進剤に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩が、コラーゲン合成を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするコラーゲン合成促進剤、
（２）コラーゲンのｍＲＮＡ発現促進剤として使用される（１）に記載のコラーゲン合成促進剤、
である。
【発明の効果】
【００１１】
上記コラーゲン合成促進剤によれば、ヒアルロン酸を補給するとともに、生体内のコラーゲンの合成能を高めることによりコラーゲン量を増加することができる。また、上記コラーゲン合成促進剤によれば、コラーゲンの遺伝子発現を促進することにより、コラーゲンの合成を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明のヒアルロン酸のコラーゲン合成促進作用の確認試験において、ヒアルロン酸を添加した細胞上清中のI型コラーゲンを検出したウエスタンブロットのバンドである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照しつつ、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。
【００１４】
１．コラーゲン合成促進剤
本発明のコラーゲン合成促進剤は、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１５】
１．１．ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩
本発明において、「ヒアルロン酸」とは、β−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類である。すなわち、ヒアルロン酸は、β−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものである。また、「ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩」としては、特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１６】
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、動物等の生体組織（例えば鶏冠、さい帯、皮膚、関節液等）から抽出されたものでもよく、あるいは、微生物、動物細胞または植物細胞を培養して得られたもの（例えばストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）、化学的または酵素的に合成されたもの等を使用することができる。
【００１７】
なお、本発明において使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の純度は、医薬品で使用できるレベルであればよく、好ましくは９０％以上であればよく、より好ましくは９５％以上であればよい。この純度は、カルバゾール硫酸法（例えば日本薬局方）にて測定されたグルクロン酸定量値から算出された値である。
【００１８】
カルバゾール硫酸法は、ホウ酸ナトリウム・硫酸溶液中にヒアルロン酸水溶液を加えて混和し、ヒアルロン酸を加熱分解した後冷却し、カルバゾール・エタノール溶液を加えて混和し、加熱後放冷した試料液の吸光度（５３０ｎｍ）を測定する方法である。同様に処理したＤ−グルクロノラクトンを用いて検量線を作成し、Ｄ−グルクロノラクトン換算値を算出した後、１．１０２を乗じてグルクロン酸定量値を求める。得られたグルクロン酸定量値に（ヒアルロン酸類の分子量／グルクロン酸の分子量）を乗じてヒアルロン酸類の含有量を算出する。
【００１９】
また、本発明のコラーゲン合成促進剤で使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、好ましくは１００万以下であり、より好ましくは９０万以下、さらに好ましくは２，０００〜８０万である。ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量が１００万を超えると、溶解しにくく、コラーゲン合成促進効果を十分に発揮できない場合がある。また、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量が２，０００未満であると、コラーゲンの合成を促進するのが困難になる場合がある。
【００２０】
なお、本発明で規定されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、以下の方法により測定される。
【００２１】
即ち、約０．０５ｇの精製ヒアルロン酸を精密に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液に溶かし、正確に１００ｍＬとした溶液及びこの溶液８ｍＬ、１２ｍＬ並びに１６ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液を加えて正確に２０ｍＬとした溶液を試料溶液とする。この試料溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液につき、日本薬局方（第十四改正）一般試験法の粘度測定法（第１法
毛細管粘度測定法）により３０．０±０．１℃で比粘度を測定し（式（１））、各濃度における還元粘度を算出する（式（２））。還元粘度を縦軸に、本品の換算した乾燥物に対する濃度（ｇ／１００ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線と縦軸との交点から極限粘度を求める。ここで求められた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（式（３））に代入し、平均分子量を算出する（T.C. Laurent, M. Ryan, A. Pietruszkiewicz,:B.B.A., 42, 476-485(1960)）。
（式１）
比粘度 ＝ {(試料溶液の所要流下秒数)/(0.2moｌ/L塩化ナトリウム溶液の所要流下秒数)}−1
（式２）
還元粘度 = 比粘度/(本品の換算した乾燥物に対する濃度（g/100mL）)
（式３）
極限粘度 ＝ ３．６×１０−４Ｍ０．７８
Ｍ：平均分子量
【００２２】
本発明のコラーゲン合成促進剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量は、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩が有効成分として機能しうる量であればよく、通常１質量％以上であり、好ましくは５〜９５質量％である。
【００２３】
１．２．コラーゲンの合成促進
本発明のコラーゲン合成促進剤は、ヒトまたはヒト以外の動物の体内でコラーゲンの合成を促進する。
【００２４】
コラーゲンは生体骨格の主たる構造タンパク質であり、生体の支持組織として構造維持に重要な役割を果たしている。また、コラーゲンは加齢に伴い減少し、老化の進行、病気の回復の遅延など、加齢変化に伴う様々な障害、疾病等を引き起こすと考えられており、特に、皮膚老化を象徴するシワ及びタルミは皮膚の弾力性、柔軟性の低下が原因とされ、このような皮膚の老化はコラーゲンの減少に基づいている。
線維を形成し、構造維持に寄与するコラーゲンとしては、I型〜III型コラーゲンが存在する。このうち、I型コラーゲンは、ヒトの生体内に最も多く存在するコラーゲンであり、皮膚の真皮にも非常に多く、皮膚の強さを生み出す働きがある。I型コラーゲンは、α1鎖（I型）2本とα2鎖（I型）1本が集まって形成される。
【００２５】
本発明のコラーゲン合成促進剤に使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩としては、皮膚中においてコラーゲン合成を促進するものであれば、特に限定されるものではないが、I型コラーゲンの合成を促進するものが好ましい。また、より好ましいものとしては、コラーゲンのmRNA発現を促進させる作用を有するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩が好ましい。
【００２６】
本発明のコラーゲン合成促進剤によるコラーゲンの合成促進を評価する方法としては、コラーゲン産生量を評価できる方法であれば、特段の限定なく使用することができる。真皮中のコラーゲンは、主にI型コラーゲンであるため、真皮におけるコラーゲン合成促進作用は、I型コラーゲン量を測定することにより代替することができる。本発明においては、コラーゲンタンパク質を測定する方法であれば、ウエスタンブロット法等、特段の限定なく使用することができるが、より好ましいものとしては、I型コラーゲンのmRNA発現量の変化を測定することにより、コラーゲン合成作用を測定する方法を使用することができる。また、I型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量を測定する方法としては、ポリメラ−
ゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR）を利用したPCR法が好ましい。
【００２７】
本発明のコラーゲン合成促進剤に使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩としては、皮膚組織に働きかけ皮膚のコラーゲン量を増加させるもの、または、経口摂取した場合に腸管上皮表面の受容体に結合し、それにより生じるサイトカイン等の情報伝達物質を介して間接的に作用し、皮膚のコラーゲン合成量を増加させる作用を有するものであれば、特段の限定なく使用することができる。
【００２８】
本発明のコラーゲン合成促進剤は、有効成分であるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の原料を含むことができる。そのような原料の例としては水、賦形剤、抗酸化剤、防腐剤、湿潤剤、粘稠剤、緩衝剤、吸着剤、溶剤、乳化剤、安定化剤、界面活性剤、滑沢剤、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、アルコール類等が挙げられる。
【００２９】
本発明のコラーゲン合成促進剤の剤形は特に限定されないが、本発明のコラーゲン合成促進剤を経口摂取する場合、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の液剤等の経口投与剤が挙げられる。
【００３０】
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は生体物質であるため、多量に摂取しても副作用がない、またはきわめて低いと考えられるが、本発明のコラーゲン合成促進剤として摂取するヒアルロン酸及び／またはその塩の量は、一日当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００〜５００ｍｇを目安とすることができる。投与回数は、皮膚の状態に応じて一日当たり一回もしくは複数回を選択できる。
【００３１】
２．コラーゲンのｍＲＮＡ発現促進剤
本発明のコラーゲン合成促進剤は、コラーゲンのｍＲＮＡ発現促進剤用途に好適に用いることができる。
本発明の一実施形態に係るコラーゲンのｍＲＮＡ発現促進剤に使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩としては、コラーゲンのｍＲＮＡの発現を促進するものであれば特に限定されるものではないが、I型コラーゲンのｍＲＮＡ発現を促進させる作用を有するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩が好ましい。皮膚におけるコラーゲンのｍＲＮＡ発現量を増加させることにより、皮膚におけるコラーゲン合成量を増加させることができる。
【００３２】
本発明の一実施形態に係るコラーゲンのｍＲＮＡ発現促進剤において、有効成分として含まれるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩としては、上記本発明に係るコラーゲン合成促進剤において有効成分として使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を使用することができる。また、本実施形態に係るコラーゲンのｍＲＮＡ発現促進剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量及び投与量ならびに他の成分もまた、上記本発明に係るコラーゲン合成促進剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量及び投与量と同様である。
【００３３】
３．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００３４】
３．１．実施例１（ヒト皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン合成促進作用（in vitro））
ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸によるコラーゲン合成促進作用を確認するため、ヒアルロン酸でヒト皮膚線維芽細胞を処理した場合における、I型コラーゲンの産生量およびI型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量の測定を以下の方法で行った。
【００３５】
３．１．１．試験方法
線維芽細胞は、正常ヒト新生児皮膚線維芽細胞（エーディア株式会社から入手、以下「hFB」という）を使用した。増殖用培地にはDMEM培地 (D6046、SIGMA社)/１０％  FBS（SIGMA社）/1％ PSN
Antibiotic Mixture(GIBCO社製))を使用した。添加用培地には、フェノールレッドを含まない無血清DMEM培地(Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium (GIBCO社製：31053)/4mM L-glutamine/1mM sodium pyruvate/1%
PSN Antibiotic Mixture))を使用する。細胞は5％ CO2、37℃で培養した。
【００３６】
次に、hFBを6 cm
dish(IWAKI社製)に1.0×104cell/cm2の濃度で播種し、増殖用培地下で培養した。細胞がdishに対して90〜100％の被覆率となるまで増殖させた後、増殖用培地の血清成分を取り除くためにPBS（-）
2 mlで2回洗浄した後、直ちに滅菌した精製水に希釈した試薬を含む培地を3 ml添加した。ヒアルロン酸を精製水に対して1.0
mg/mlとなるように溶解したものを、添加用培地に対して0.01％v/v（終濃度は1μg/mL）の割合で添加した。その後、5％CO2、37℃インキュベータ内で培養した。
【００３７】
３．１．２．I型コラーゲンのｍＲＮＡの発現量
培養７２時間後に細胞のｍＲＮＡを回収して、リアルタイムＰＣＲ機器（Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００、タカラバイオ株式会社)を用いたI型コラーゲンのｍＲＮＡの定量を行った。
まず、逆転写によってｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。すなわち、熱変性（９５°、５秒）およびアニーリング（６０℃、３０秒）を４０回繰り返す増幅反応を行い、定量を行った。
【００３８】
使用したヒアルロン酸の平均分子量は、３，０００および８，０００（いずれもキユーピー株式会社製）である。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１に示されるように、平均分子量が８，０００のヒアルロン酸を添加してから７２時間後のｈＦＢ中のコラーゲンのｍＲＮＡ量は、増加することが確認され、対照の１．１９倍であった。
【００４１】
３．１．３．I型コラーゲンのたん白質量
培養４８時間後、７２時間後に細胞のたん白質を回収して、ウエスタンブロット法を用いたI型コラーゲンの定量を行った。
ここで、ウエスタンブロット法とは、ゲル電気泳動によって分子量にしたがい分離したタンパク質を転写膜に写し取り、さらに特定のタンパク質に対する抗体を用いて転写膜上で抗原抗体反応によって特定のタンパク質を発色させてその存在を肉眼観察する方法をいい、蛍光試薬で発色させる方法や、酵素反応を利用して発色させる方法など、多くの周知の手法が適用可能である。今回、一次抗体として抗ブタ真皮由来I型コラーゲンウサギ抗血清を作製して一次抗体として使用し、二次抗体としてＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｇｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用した。結果をそれぞれ図１に示す。
【００４２】
図１に示すように、ウエスタンブロット法によりI型コラーゲンα１鎖のバンドが認められた。
平均分子量が３，０００のヒアルロン酸および平均分子量が８，０００のヒアルロン酸を添加してから４８時間後、７２時間後では、対照と比較してI型コラーゲンα１鎖のバンドが非常に強く検出され、ヒアルロン酸によるI型コラーゲンの合成促進作用が確認された。
また、平均分子量が８，０００のヒアルロン酸では、添加４８時間後の方が、添加７２時間後と比較してI型コラーゲンα１鎖のバンドが強く検出された。一方、平均分子量が３，０００のヒアルロン酸では、添加７２時間後の方が、添加４８時間後と比較してI型コラーゲンα１鎖のバンドが強く検出された。
【００４３】
以上のことから、本発明のコラーゲン合成促進剤の投与により、I型コラーゲンのｍＲＮＡの発現量を促進し、I型コラーゲンの合成を促進することが確認された。
【００４４】
３．２．実施例２
平均分子量８，０００のヒアルロン酸をコラーゲン合成促進剤として使用して、内容物が下記の配合であるソフトカプセルを製した。
【００４５】
［配合割合］
コラーゲン合成促進剤（平均分子量８，０００のヒアルロン酸）    ２０％
オリーブ油                                                    ５０％
ミツロウ                                                      １０％
中鎖脂肪酸トリグリセリド                                      １０％
乳化剤                                                        １０％
―――――――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【００４６】
３．３．実施例３
平均分子量３０万のヒアルロン酸をコラーゲン合成促進剤として使用して、下記の配合の散剤（顆粒剤）を製した。
【００４７】
［配合割合］
コラーゲン合成促進剤（平均分子量３０万のヒアルロン酸）    １０％
乳糖                                                      ６０％
トウモロコシデンプン                                      ２５％
ヒプロメロース                                              ５％
――――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【００４８】
３．４．実施例４
平均分子量８０万のヒアルロン酸をコラーゲン合成促進剤として使用して、下記の配合の錠剤を製した。
【００４９】
［配合割合］
コラーゲン合成促進剤（平均分子量８０万のヒアルロン酸）        ２５％
乳糖                                                          ２４％
結晶セルロース                                                ２０％
トウモロコシデンプン                                          １５％
デキストリン                                                  １０％
乳化剤                                                          ５％
二酸化ケイ素                                                    １％
――――――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【図１】
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