(57)【要約】      （修正有）【課題】酵母の発酵力の低下をもたらす原因となっている環境ストレスの一つである、高ショ糖ストレス耐性に優れた酵母、および、その製造方法、さらに該酵母の食品製造への利用方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードする、もしくは特定の塩基配列を有するポリヌクレオチドからなるＰＯＧ１遺伝子を高発現する、高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母、上記ポリヌクレオチドを導入する工程を含む該酵母の作製方法、および高ショ糖ストレス耐性となったパン酵母を用いた、高ショ糖パン生地、パンおよび菓子類の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＯＧ１遺伝子を高発現する、高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母。
【請求項２】
ＰＯＧ１遺伝子が以下のいずれかからなることを特徴とする、請求項１に記載の酵母：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記酵母はパン酵母である、請求項１〜請求項２のいずれかに記載の酵母。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の酵母を用いる、高ショ糖パン生地の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の酵母を用いる、パンの製造方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載の酵母を用いる、菓子類の製造方法。
【請求項７】
以下のいずれかに記載のポリヌクレオチドを導入する工程を含む高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母の作製方法：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、さらに、前記ポリヌクレオチドを導入した変異型酵母と、変異を有さない酵母とを、ショ糖ストレス耐性について比較する工程、を包含する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、さらに、高ショ糖ストレス耐性の向上した変異型酵母を選択する工程、を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母育種の分野に関する。さらに、本発明は、高ショ糖ストレスに対する耐性に優れたパン酵母、該酵母を用いるパン生地、パン、および、菓子類等の製造方法、ならびに、これら製造方法によって生産された製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
パンは、その製品の製造過程でパン酵母の発酵による生地膨張を行う必要があるが、一定した品質のパンを提供するためには、パン酵母、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の発酵の綿密な制御が必要となる。パン酵母細胞は、製パン過程において、凍結、乾燥、高温、および高浸透圧などの多くの環境ストレスに曝されている(非特許文献１)。これらの環境ストレスが酵母の発酵力の低下をもたらすことから、環境ストレスに対する高度な耐性を有する酵母株の作出技術の確立が望まれている。菓子パン製造において用いられるパン生地には、３０％（対小麦粉比）を超える高い濃度のショ糖が含有され、ショ糖に由来する高浸透圧により酵母の発酵力が制限される。そこで、ショ糖を高濃度で含有するパン生地で高い発酵力を維持できるパン酵母株の開発が期待されている。
【０００３】
製パン業界及びイースト製造業界では、製パン時にパン酵母に負荷され発酵を制限する環境ストレスに対する取り組みを行ってきた。特に、冷凍生地製パン法において負荷される冷凍ストレス及び菓子パン製造において負荷される高ショ糖ストレスに対する取り組みが進められた。その多くは、これら環境ストレスに対する耐性を有するパン酵母の作出によって問題解決を試みている。高糖生地製パンに最適な高ショ糖耐性酵母についても、各イーストメーカーにより開発及び販売が行われてきた。
【０００４】
一方、ストレス耐性機構に対する知見の蓄積に伴い、耐性関連遺伝子を改変することにより耐性を増強する試みもなされている。
特許文献１は、アミノ酸の１つであるプロリンが、冷凍や乾燥・酸化等のストレスから酵母を防御する性質を有することを開示し、特許文献２は、変異型のγ-グルタミルキナーゼをコードするＰＲＯ１遺伝子を発現し、プロリンオキシダーゼをコードするＰＵＴ１遺伝子を破壊した酵母株が細胞にプロリンを蓄積することでエタノール耐性となることを開示する。
特許文献３は、酸性トレハラーゼをコードするＡＴＨ１遺伝子の破壊株で、冷凍生地ストレス耐性及び高ショ糖ストレス耐性が高まることを開示する。
特許文献４は、アルギナーゼをコードするＣＡＲ1遺伝子の破壊株で、細胞内に極性の高いアミノ酸が著量蓄積され、冷凍ストレス耐性が高まることを開示する。
非特許文献２から４は、Ｎ-アセチルトランスフェラーゼＭｐｒ１が、酵母を、熱ショック、過酸化水素処理、エタノール、および冷凍などの酸化ストレスから防御していることを、特許文献５は、変異型Ｍｐｒ１を効率よく発現させた、乾燥および高温耐性を有する形質転換パン酵母を開示する。
非特許文献５は、ＰＭＲ１遺伝子またはＳＮＦ５遺伝子の破壊により、冷凍ストレス耐性が損なわれることを開示する。
非特許文献６は、ＣＢＳ２遺伝子の欠損により、乾燥ストレスに対して感受性になることを開示する。
非特許文献７は、ＤＢＦ２遺伝子の破壊により、ソルビトールストレスに対して高感受性になることを開示する。
非特許文献８は、芳香族アミノ酸合成関連の遺伝子（ＡＲＯ１など）の破壊により、高ショ糖ストレス耐性が著しく損なわれること、ＢＵＤ２３、ＧＯＮ７、ＳＰＴ２０の遺伝子破壊株で高ショ糖ストレスに高い感受性を示すことを開示する。
特許文献６は、リン酸タンパク質の脱リン酸化を基質とするホスファターゼをコードするＯＣＡ１遺伝子またはＯＣＡ２遺伝子、あるいはＡＬＤ２遺伝子の破壊株で高ショ糖ストレス耐性が高まることを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平９−２３４０５８号公報
【特許文献２】特開２００６−６７８０６号公報
【特許文献３】特開平１１−１６９１８０号公報
【特許文献４】特開２００１−２３８６６５号公報
【特許文献５】特開２０１０−１８３８８７号公報
【特許文献６】特開２００８−１４８６８８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Attfield, Nat. Biotechnol. 15:1351-1357 (1997)
【非特許文献２】Du and Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. 75:1343-1351 (2007)
【非特許文献３】Du and Takagi, J. Biochem. 138:391-397 (2005)
【非特許文献４】Nomura and Takagi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:12616-12621 (2004)
【非特許文献５】Ando et al., FEMS YeastRes. 7:244-253 (2007)
【非特許文献６】Shima et al., Yeast 25:179-190(2008)
【非特許文献７】Makrantoni et al.,Microbilogy 153:4016-4026 (2007)
【非特許文献８】Ando et al., FEMS YeastRes. 6:249-267 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ストレス耐性を有するパン酵母の探索はいまだ十分とはいえない。このためにストレス耐性に関与する遺伝子を見出し、より優れたストレス耐性を有する酵母または、そのような酵母の育種法の開発が強く求められている。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、菓子パン製造などにおける酵母発酵の環境ストレスである高ショ糖環境においても十分に発酵力を維持できる酵母、すなわち、十分に高いショ糖ストレス耐性を有する酵母を提供すること、および、そのような酵母の育種法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、そのような酵母を用いる、パン生地、パン、菓子類の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＰＯＧ１遺伝子に着目した。ＰＯＧ１遺伝子の過剰発現株は塩化リチウム耐性の表現型を示すことが実験室酵母株で知られている
(Demae et al., FEMS Microbiol. Lett., 277, 70-78 (2007))。本発明者らは、酵母においてＰＯＧ１遺伝子の発現を増大することによって酵母の高ショ糖ストレス耐性能を増強できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は以下の構成からなるものである。
【００１０】
（１）ＰＯＧ１遺伝子を高発現する、高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母。
（２）ＰＯＧ１遺伝子が以下のいずれかからなることを特徴とする、上記（１）記載の酵母：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（３）前記酵母はパン酵母である、上記（１）〜（２）のいずれかに記載の酵母。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母を用いる、高ショ糖パン生地の製造方法。
（５）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母を用いる、パンの製造方法。
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の酵母を用いる、菓子類の製造方法。
（７）以下のいずれかに記載のポリヌクレオチドを導入する工程を含む高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母の作製方法：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（８）上記（７）に記載の方法であって、さらに、前記ポリヌクレオチドを導入した変異型酵母と変異を有さない酵母とをショ糖ストレス耐性について比較する工程、を包含する方法。
（９）上記（８）に記載の方法であって、さらに、高ショ糖ストレス耐性の向上した変異型酵母を選択する工程、を包含する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、高ショ糖ストレスに対し、より耐性を有する酵母株を容易に得ることできる。さらに、本発明によって、所定の酵母株を簡便に高ショ糖ストレス耐性株とすることも可能である。このため本発明の酵母は、高ショ糖濃度の菓子パン生地などの製造に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＰＯＧ１遺伝子増強株の作製法を示す図である。
【図２】図２は、ストレス条件（３０％ショ糖濃度）における発酵力を比較した結果を示す図である。Ｗｉｌｄは野生株、ＰＯＧ１はＰＯＧ１遺伝子高発現酵母株、Δｐｏｇ１はＰＯＧ１遺伝子破壊酵母株をそれぞれ示す。
【図３】図３は、ストレス条件（３０％ショ糖濃度）における発酵力を比較した結果を示す図である。野生株（Ｗｉｌｄ）の炭酸ガス発生量を１００とし、ＰＯＧ１遺伝子高発現酵母株（ＰＯＧ１）およびＰＯＧ１遺伝子破壊酵母株（Δｐｏｇ１）の炭酸ガス発生量との相対比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。
【００１４】
また、本明細書中で使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。また、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）を変更してもよい。勿論、同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、遺伝子は、タンパク質をコードするものであれば、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
【００１５】
＜１．用語の定義＞
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「酵母」とは、大部分の生活環を単細胞で経過する菌類をいう。代表的な酵母としては、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属に属する酵母、特にSaccharomyces cerevisiae、Saccharomyces
ludwigii、およびSchizosaccharomyces pombeが挙げられる。
【００１６】
本明細書において「パン酵母」とは、パンの製造に使用される、Saccharomyces
cerevisiaeに属し、パンの製造に使用される酵母をいう。好ましくは、パン酵母は二倍体のものである。二倍体の酵母は一倍体と比較して発酵速度が速い。
【００１７】
本明細書において「ショ糖濃度（％）」とは、特に単位を記載しない限り、発酵する材料中の小麦粉に対するショ糖の相対濃度をいい、より具体的には、小麦粉１００ｇに対して添加されるショ糖のグラム数をいう。
【００１８】
本明細書において「高ショ糖ストレス耐性」とは、ショ糖濃度が高い環境下において、野生型酵母と比較してより高い発酵力を示す酵母の特性をいう。代表的には、変異型酵母が「高ショ糖ストレス耐性」を有するか否かについては、３０％ショ糖濃度下における発酵力を酵母が発生する炭酸ガスの発生量を指標として決定する。
【００１９】
本明細書において「発酵力」とは、酵母を培養した場合に、糖質を無酸素的に分解した代謝産物を生じる能力をいう。酵母の発酵には、代表的には、アルコール発酵、グリセロール発酵などが挙げられるが、これらに限定されない。発酵力を示す指標としては、例えば、パン生地中の酵母から生じる炭酸ガス量を測定するファーモグラフという機械を使用することで、パン生地の発酵力を測定する方法が使用可能である。その単位としては、例えば、ＯＤ６００が１００である酵母が発生する炭酸ガス量をｍｌ／１００
ＯＤ６００として用いることができるが、これに限定されない。上記以外の指標としては、例えば、低糖条件における発酵力（Ｆ１０）、高糖状態における発酵力（Ｆ４０）、およびマルトース発酵力（Ｆｍ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書において「生地」とは、パン類の発酵に供される材料のみならず、パン類の生地に添加される「種生地」をも含む。本明細書において使用する場合、「種生地」とは、パン生地の発酵を行うために添加される種（スタータ）であって、発酵に必要な菌および配合原材料の少なくとも一部を含む生地をいう。
【００２１】
本明細書において「発酵」とは、配合原材料中の物質の少なくとも一部が、菌によって分解される現象をいう。
【００２２】
本明細書において「高ショ糖パン生地」とは、ショ糖を高濃度（限定されることはないが、例えば、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、および、６０％）で含有するパン生地をいう。
【００２３】
本明細書において「菓子類」とは、小麦粉を主体として、ショ糖を含み、発酵過程を経て製造される食品をいう。
【００２４】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。一例を示すと、０．２５Ｍ
Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，７%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，１%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。例えば、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook and Russell,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Woodbury, NY (2001)）等を参照することにより、こうした遺伝子を容易に取得することができる。
【００２５】
本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の「同一性」とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べ得る。アミノ酸配列および塩基配列の同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールである、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
【００２６】
＜２．高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母＞
本発明における酵母では、ＰＯＧ１遺伝子を高発現する。ＰＯＧ１遺伝子は、ＤＮＡ配列から推定すると、分子量約３９ｋＤａのタンパク質Ｐｏｇ１をコードしている。これまで転写因子として酵母の細胞周期制御に関わるという報告があるが（Maria, A. et al., Genetics, 151, 531-543 (1999)）、アミノ酸配列上に転写因子の特徴であるＤＮＡ結合モチーフは見出されず、実際に遺伝子の転写を制御しているという報告もないため、その機能は未だに不明のままである。またこれまでに、推定アミノ酸配列レベルで相同性のある遺伝子は、酵母のみならず、すべての生物種で見つかっていない。ＰＯＧ１遺伝子は酵母ユビキチンリガーゼＲｓｐ５変異株のストレス感受性を相補するマルチコピーサプレッサーとして取得され、同遺伝子の過剰発現株が塩化リチウム耐性の表現型を示すことが実験室酵母株で知られているが
(Demae et al., FEMS Microbiol. Lett., 277, 70-78 (2007)) 、ＰＯＧ１遺伝子の発現増強によって高ショ糖ストレス耐性の向上が得られたことは全く予想外であった。
【００２７】
ＰＯＧ１遺伝子は、上記のように定義づけされるものであれば、特に限定しないが、好ましくは以下のいずれかのポリヌクレオチドからなる：
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ高ショ糖ストレス糖耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２８】
上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と一定以上の相同性を有し、かつ高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を有しているものである。一定以上の相同性とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上である。
【００２９】
上記（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、高ショ糖ストレス耐性を増強させる活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入法により欠失、置換、若しくは付加できる程度の数をいう。通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、最も好ましくは５アミノ酸以内（例えば、５，４，３，２，１アミノ酸）である。変異を導入したタンパク質が酵母に所望の形質を付与するかどうかは、そのタンパク質をコードする遺伝子を発現させ、その酵母の高ショ糖ストレス耐性が向上しているかどうか調べることにより判断できる。また、ここでいう「変異」は、主には部位特異的突然変異誘発法等により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００３０】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる。さらに、例えば、変異マトリクス（mutational matrix）によってアミノ酸を分類することも周知である（Taylor
1986, J. Theor. Biol. 119, 205-218; Sambrook and Russell, Molecular Cloning 3rd
ed., A7.6-A7.9, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。この分類を以下に要約すると、脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ）、芳香族アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ）、荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ）、正荷電アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、負荷電アミノ酸（Ｄ、Ｅ）、疎水性アミノ酸（Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｋ）、極性アミノ酸（Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）、小型アミノ酸（Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｄ）、微小アミノ酸（Ａ、Ｇ、Ｓ）及び大型（非小型）アミノ酸（Ｑ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ）が挙げられる。なお、上記括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す。0
【００３１】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、標的アミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異させることがより好ましい。
【００３２】
また、上記（ｅ）のポリヌクレオチドは、上記（ｄ）のポリヌクレオチド（配列番号２に記載の塩基配列）と相同性において少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列の同一性を有することが好ましい。
【００３３】
本酵母は、好ましくは、ＰＯＧ１遺伝子を高発現可能な状態で保持している。かかる酵母におけるＰＯＧ１遺伝子の保持形態には、各種形態が挙げられる。例えば、酵母が本来的に有する内在性ＰＯＧ１遺伝子の発現を増強するには、強力な誘導的プロモーターや構成的プロモーターの制御下に内在性ＰＯＧ１遺伝子を連結する構成を遺伝子組換えにより酵母に保持されていることが好ましい。また、適当なプロモーターの制御下に内在性ＰＯＧ１遺伝子を連結する構成のＤＮＡ断片の複数コピーが遺伝子組換えにより酵母に保持されていてもよい。このような構成のＤＮＡ断片を複数コピーが導入されて保持されていてもよい。また、外来性のＰＯＧ１遺伝子を酵母内で発現させることにより、ＰＯＧ１遺伝子の発現を増強する場合には、適当なプロモーター、好ましくは、強力な誘導的又は構成的プロモーターの制御下に外来性のＰＯＧ１遺伝子を連結した構成が遺伝子組換えにより酵母に保持されていることが好ましい。酵母は、遺伝子組換えにより内在性と外来性の双方のＰＯＧ１遺伝子の発現が増強されていてもよい。このようなＤＮＡ断片は、相同組換え技術により酵母の染色体上に組み込まれていてもよいし、プラスミド等の染色体外ＤＮＡとして保持されていてもよいし、これらの双方であってもよい。かかる遺伝子組換えは、例えば、SambrookとRussellの実験書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。また、細胞の種類に応じて適切なプロモーターも適宜選択される。
【００３４】
たとえば、ＰＯＧ１遺伝子を高発現する酵母としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ等を適当なプロモーター制御下に連結されたＤＮＡ構築物を染色体外あるいは染色体外に導入し保持させた酵母が挙げられる。酵母は、好ましくはパン酵母であり、さらに好ましくは二倍体パン酵母である。
【００３５】
このような酵母は、実施例において示すように、高ショ糖ストレス耐性を有し、高ショ糖の存在下において、ＰＯＧ１遺伝子が発現していないか、発現が増強されていない場合と比較して、発酵力が向上されている。
【００３６】
＜３．高ショ糖耐性が増強された酵母の作製方法＞
本発明の高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母の作製方法は遺伝子組換え技術を用いて、内在性または外来性のＰＯＧ１遺伝子を誘導的または構成的なプロモーターの制御下に連結して酵母に導入することによって、ＰＯＧ１遺伝子の発現量を増大させた酵母を得る工程を含む。
【００３７】
本発明の酵母への遺伝子の導入は、対象となる酵母に応じて従来公知の方法のいずれを用いてもよく、特に限定されない。酵母に遺伝子を導入する方法は、例えば「バイオマニュアルシリーズ１０
酵母による遺伝子実験法」（羊土社）、及び「生物化学実験法３９ 酵母分子遺伝子実験法」（学会出版センター）等の教科書の記載に順じて行えばよい。
【００３８】
具体的には、ＰＯＧ１遺伝子のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)をＰＣＲ法等の公知の方法によって調製し、これを酵母で発現可能なプロモーターの下流に連結して遺伝子カセットを作製し、酵母細胞内で発現するためのベクターとすればよい。
【００３９】
かかるベクターは、例えばＰＣＲにより調製された遺伝子の両端に適切な制限酵素サイトを付加し、当該制限酵素で切断し、これを別途適切な制限酵素で切断したプラスミドベクターにＤＮＡリガーゼを用いて挿入することによって構築できる。プラスミドに挿入されたＤＮＡは大腸菌を用いることによって容易に増幅、単離、精製が可能である。
【００４０】
プロモーターとしては、酵母における発現に用いることが知られているものであれば、いずれのプロモーターを用いてもよく、例えばＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＰＨＯ５、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＯＸ１、ＴＤＨ３等の酵母由来の遺伝子のプロモーターが挙げられる。特に高発現プロモーターが好ましく、例えば、ＴＤＨ３が挙げられる
【００４１】
かかるベクターは、複製開始点、例えば２μｍＤＮＡ由来のもの、選択マーカー、例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３，ＴＲＰ１等を含んでいることが好適であり、さらに必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル配列等を含んでいてもよい。酵母用ベクターとして、種々の市販品があり、宿主となる酵母に応じて適宜選択すれすればよい。
【００４２】
酵母が内在性のＰＯＧ１遺伝子あるいはそのホモログを有している場合には、内在性のＰＯＧ１あるいはそのホモログ遺伝子と共存させてもよい。内在性のＰＯＧ１遺伝子あるいはそのホモログと共存させる場合、もしくは酵母がＰＯＧ１遺伝子あるいはそのホモログを有していない場合には、自律複製するプラスミドベクターを用いて形質転換を行えばよい。自律複製するプラスミドベクターとしては、例えばｐＡＤ４（ＬＥＵ２マーカー）やｐＹＥＳ２（ＵＲＡ３マーカー）等の２μｍプラスミド由来の複製開始点を有しているベクターが挙げられる。
【００４３】
本発明の高ショ糖ストレス耐性が増強された酵母の作製方法は遺伝子組換え技術であれば限定されないが、本発明によるパン酵母は、すべて酵母の遺伝子からなり、外来遺伝子を一切含まないセルフクローニング技術で作製されることが好ましい。セルフクローニング技術で作製された酵母は、通常の食品微生物と同様に扱うことが出来るためである。このとき、挿入するＵＲＡ３や他のマーカー遺伝子は、セルフクローニングを達成するために、Saccharomyces cerevisiae、特にパン酵母のものが好ましい。
【００４４】
本発明に係る酵母は好ましくは二倍体である。ＰＯＧ１遺伝子の二倍体ホモ接合型変異株を作製する方法としては、例えば、（１）ＰＯＧ１遺伝子の一倍体変異株を異なる接合型の一倍体より作製し、それらの一倍体変異株を交雑して二倍体変異株を作製する方法、および、（２）異なる２つの選択マーカーを用い、第一の選択マーカーを用いて第一の対立遺伝子に変異を導入し、その後、その変異株を用いて、第二の選択マーカーを用いて第二の対立遺伝子に変異を導入する方法、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
＜４．高ショ糖パン生地の製造方法、パンの製造方法＞
本発明の酵母は、ＰＯＧ１遺伝子の発現が増強されており、高ショ糖ストレス耐性、特に高ショ糖濃度のパン生地における高ショ糖ストレス耐性に極めて優れている。したがって、本発明に係るパン酵母は、菓子パン生地など高ショ糖濃度のパン生地において、高ショ糖ストレスによく耐え、発酵させた時にその能力を発揮し、これを焼き上げた時に、美味な各種パンを得ることができる。本発明に係る高ショ糖パン生地は、ＰＯＧ１遺伝子の発現が増強された高ショ糖ストレス耐性パン酵母を使用するほかは、定法にしたがって製造すればよく、パンの製造もＰＯＧ１遺伝子の発現が増強された高ショ糖ストレス耐性パン酵母を使用するほかは、定法にしたがって行えばよい。
【００４６】
＜５．菓子類の製造方法＞
本発明の酵母は、ＰＯＧ１遺伝子の発現が増強されており、高ショ糖ストレス耐性、特に高ショ糖濃度の菓子生地における高ショ糖ストレス耐性に極めて優れている。したがって、本発明に係る酵母は、高ショ糖濃度の菓子生地などで、高ショ糖ストレスによく耐え、発酵させた時にその能力を発揮し、これを焼き上げた時に、美味な各種菓子類を得ることができる。菓子類の製造はＰＯＧ１遺伝子の発現が増強された高ショ糖ストレス耐性パン酵母を使用するほかは、定法にしたがって行えばよい。
【００４７】
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、明細書に記載した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
（１）実用酵母を用いる、ＰＯＧ１遺伝子高発現二倍体酵母の作製：
ＰＯＧ１遺伝子高発現二倍体パン酵母株の作製法を図１に示す。ＰＯＧ１プロモーターの一部の配列増幅のために、正方向プライマーとして核酸配列（TCCGCACGTAGTGTTTTC：配列番号３）を有するプライマー１、および逆方向プライマーとして核酸配列（AATATGGCATCCACTTTGATTT：配列番号４）を有するプライマー２を用いた。また、ＰＯＧ１遺伝子の一部の配列増幅のために、正方向プライマーとして核酸配列（ATGAAGCAGGAGCCACATA：配列番号５）を有するプライマー５、および逆方向プライマーとして核酸配列（GATCTATATCTTCTATGGCCTCG：配列番号６）を有するプライマー６を用いた。S. cerevisiaeの染色体ＤＮＡを鋳型としてこれらプライマー対を用いて、ＰＯＧ１遺伝子のプロモーター配列の一部とＰоｇ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列の一部を増幅した。また、栄養要求性マーカーであるＵＲＡ３遺伝子発現カセットとＰＯＧ１遺伝子の高発現に使用するＴＤＨ３遺伝子のプロモーターを連結した配列を含むプラスミド（pTAC-URA3-PTDH3）を鋳型にして、ＰＯＧ１遺伝子のプロモーター配列の一部を付加したプライマー3（GAAATTGAAAAAAAATAAGTAAAGACGAAAATCAAAGTGGATGCCATATTcagggtccataaagcttttc：配列番号７）とＰＯＧ１遺伝子の一部を付加したプライマー4（CCTTTCGGCTTCTCTTTTTCTTCGGATTGTCTATGTGGCTCCTGCTTCATtttgtttgtttatgtgtgtt：配列番号８）を用いてＰＣＲによって増幅した。得られた３つのＤＮＡ断片を混合し、プライマー１とプライマー６を用いてＰＯＧ１遺伝子高発現株作製用ＤＮＡ断片を増幅した。
増幅断片をパン酵母一倍体ウラシル要求性株（３３４６ ｕｒａ３−、３３４７ ｕｒａ３−）に形質転換し、ＰＯＧ１遺伝子高発現株を、ウラシル非要求性を指標に単離した。ＰＯＧ１遺伝子高発現株が作製されたことを、ＰＯＧ１チェックフォワードプライマー（ACGGTAGGTATTGATTGTAATTCTG：配列番号９）およびＰＯＧ１チェックリバースプライマー（CCTGTCTCAACTTCTGAC：配列番号１０）を用いるＰＣＲによって確認した。
ａ型とα型それぞれの一倍体において作製したＰＯＧ１遺伝子高発現株同士を接合させることにより二倍体株を作製した。二倍体株が作製出来たことは、胞子形成培地上（０．０５％グルコース、０．１％酵母エキス、１％酢酸カリウム、２％寒天）での胞子形成により確認した。
【００４９】
（２）ＰＯＧ１遺伝子高発現二倍体酵母の高ショ糖ストレス耐性の評価：
実施例１において作製した変異株の高ショ糖ストレス耐性の評価を行った。野生株、ＰＯＧ１遺伝子高発現株、およびＰＯＧ１遺伝子破壊株を、市販のパン酵母製造プロセスを模倣する廃糖蜜培地（５．８８％廃糖蜜、０．２１４％尿素、０．０５１％リン酸二水素カリウム）で定常期まで培養した後、培養した細胞を、磁器乾燥版（ニッカトー株式会社）を使用して、含水量が６８％になるまで脱水した。この酵母をパン生地用小麦粉１００ｇに対して３０ｇのショ糖、０．５ｇの塩化ナトリウム、水５５ｍＬを含む高糖パン生地に６ｇ加えた。これら混合物をスワンソンタイプミキサー（National Mfg. Co., Ltd.）を用いて１００ｒｐｍで３分間攪拌した後、４０ｇずつに小分けし、スクリューキャップボトルに封をして入れ、３０℃、１２０分間発酵を行い、炭酸ガス発生量をファーモグラフII（アトー株式会社）にて測定した。結果を図２、図３および表１に示す。
【００５０】
表１  本発明のＰＯＧ１遺伝子高発現株の野生株に対する発酵力の比
2013118851.tif 000002
【００５１】
その結果、ＰＯＧ１遺伝子を高発現する実用パン酵母二倍体株では、高濃度ショ糖を含むパン生地中での発酵力が野生株と比較して約１２％有意に向上した。一方、ＰＯＧ１遺伝子を破壊した実用パン酵母二倍体株の発酵力は、野生株に比べて同等かわずかに低下する傾向にあった。このことから、ＰＯＧ１遺伝子高発現は高ショ糖ストレス耐性実用パン酵母の作製に適する方法であることが示された。
【００５２】
その結果、ＰＯＧ１遺伝子発現増強株は極めて優れた高ショ糖ストレス耐性を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の酵母を用いることによって、高ショ糖環境であっても高い発酵力を発揮する酵母を単離することが可能となる。そのような酵母を用いることによって、従来、十分な発酵を行うことが困難であった菓子類製造などにおける高ショ糖環境での発酵の効率を高めることが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００５４】
配列番号３〜１０:プライマー
【図１】
2013118851.tif 000003
【図２】
2013118851.tif 000004
【図３】
2013118851.tif 000005
【配列表】
2013118851000001.app