(57)【要約】      （修正有）【課題】癌細胞、特に悪性腫瘍におけるTRAIL抵抗性の克服。【解決手段】癌細胞のTRAIL抵抗性を克服するためにミトコンドリア分裂阻害剤が利用できることを見出した。ミトコンドリア分裂阻害剤をTRAILと併用することにより、TRAIL抵抗性を示す腫瘍においてTRAIL誘導性アポトーシスを増強することができる。薬剤及び方法は、TRAIL抵抗性の癌細胞を効果的に殺すのに対し、正常細胞に対する細胞傷害性を全く示さないか又は僅かしか示さない。従って、当該薬剤又は方法を用いることにより、癌患者の予後を改善し、また、TRAIL療法被験者のQOLを向上させることができる。【選択図】図１
2013142070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のミトコンドリア分裂阻害剤を含む、癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスを増加させるための医薬:
ここで、当該医薬はTRAILポリペプチドと同時に又は逐次的に投与される。
【請求項２】
前記ミトコンドリア分裂阻害剤が下記一般式で表される、請求項1に記載の医薬:
【化１】
2013142070.tif 000013
ここで、R1はCl及びCF3からなる群から選択され、
R2はH及びClからなる群から選択され、
R3はH、OCH3、及びOCH(CH3)2からなる群から選択され、
R4はH及びCH3からなる群から選択され、かつ、
R5はH及びClからなる群から選択される。
【請求項３】
前記ミトコンドリア分裂阻害剤がmdivi-1である、請求項1に記載の医薬。
【請求項４】
前記癌細胞が、非肺小細胞癌、グリオブラストーマ、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、又は神経芽細胞腫由来の癌細胞である、請求項1から3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項５】
前記投与が、塗布、静注、筋注、又は経口による投与である、請求項1から4のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項６】
前記TRAILポリペプチドのアミノ酸配列が、ヒト由来のTRAILポリペプチドと同一である、請求項1から5のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項７】
有効量のTRAILポリペプチドを更に含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項８】
以下の構成要素を含む、癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスを増加させるための医薬のキット:
有効量のミトコンドリア分裂阻害剤、及び、
TRAILポリペプチドとの同時又は逐次的投与により、前記癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスが増加する旨を記載した説明書。
【請求項９】
前記ミトコンドリア分裂阻害剤が下記一般式で表される、請求項8に記載のキット:
【化２】
2013142070.tif 000014
ここで、R1はCl及びCF3からなる群から選択され、
R2はH及びClからなる群から選択され、
R3はH、OCH3、及びOCH(CH3)2からなる群から選択され、
R4はH及びCH3からなる群から選択され、かつ、
R5はH及びClからなる群から選択される。
【請求項１０】
前記ミトコンドリア分裂阻害剤がmdivi-1である、請求項8に記載のキット。
【請求項１１】
前記癌細胞が、非肺小細胞癌、グリオブラストーマ、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、又は神経芽細胞腫由来の癌細胞である、請求項8から10のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１２】
前記投与が、塗布、静注、筋注、又は経口による投与である、請求項8から11のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１３】
前記TRAILポリペプチドのアミノ酸配列が、ヒト由来のTRAILポリペプチドと同一である、請求項8から12のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１４】
有効量のTRAILポリペプチドを更に含む、請求項8から13のいずれか1項に記載のキット。
【請求項１５】
以下の工程を含む、癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスを増加させる方法:
in vivo又はex vivoにおいて有効量のミトコンドリア分裂阻害剤を当該癌細胞に接触させる工程;
ここで、当該癌細胞はTRAILポリペプチドにより同時に又は逐次的に処理される。
【請求項１６】
前記ミトコンドリア分裂阻害剤が下記一般式で表される、請求項15に記載の方法:
【化３】
2013142070.tif 000015
ここで、R1はCl及びCF3からなる群から選択され、
R2はH及びClからなる群から選択され、
R3はH、OCH3、及びOCH(CH3)2からなる群から選択され、
R4はH及びCH3からなる群から選択され、かつ、
R5はH及びClからなる群から選択される。
【請求項１７】
前記ミトコンドリア分裂阻害剤がmdivi-1である、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌細胞が、非肺小細胞癌、グリオブラストーマ、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、又は神経芽細胞腫由来の癌細胞である、請求項15から17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触させる工程が、塗布、静注、筋注、又は経口による投与である、請求項15から18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記TRAILポリペプチドのアミノ酸配列が、ヒト由来のTRAILポリペプチドと同一である、請求項15から19のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本件発明は、TRAILを含有する抗癌剤に対する感受性を増強させる医薬の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)、別名APO-2L)は腫瘍壊死因子スーパーファミリーの一員であり、種々多様な癌細胞に対して抗腫瘍活性を示し、かつ、ほとんどの正常細胞及び組織に対して細胞傷害性を示さないことから近年注目されている(非特許文献1)。TRAILはデスリガンド(death ligand)の一員であり、標的細胞上のデスレセプター(death receptor)に結合し、所謂デスレセプター経路(death receptor pathway)を介して標的細胞のアポトーシスを誘導する。TRAILが特異的に結合するデスレセプターとして、デスレセプター4(death receptor 4 (DR4)、別名TRAIL-R1;TNFRSF10A)とデスレセプター5(death receptor 5 (DR5)、別名TRAIL-R2;TNFRSF10B)が同定されている。
【０００３】
しかし、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、神経芽細胞腫などの悪性腫瘍は、DR4又はDR5が発現しているにも拘らずTRAIL抵抗性(TRAIL resistance / resistance to TRAIL)を示すことが知られている。また、TRAILタンパク質を継続的に投与すると、TRAIL抵抗性の癌細胞が選択されて増幅し、やがて被験者はTRAIL抵抗性を獲得することが知られている(非特許文献2)。従って、これらの癌細胞のTRAIL抵抗性の克服は、TRAILの臨床応用上非常に重要な課題となっている。
【０００４】
TRAIL抵抗性を克服するための薬剤として、DNA架橋剤オキサリプラチン(oxaliplatin)(非特許文献3)、PI3K阻害剤PI103(非特許文献4)、プロテアソーム阻害剤MG132(非特許文献5)、DNA架橋剤シスプラチン(cisplatin)(非特許文献6)、マングローブ由来の化合物(非特許文献7)、HDAC阻害薬MS-275(非特許文献8)、Rafキナーゼ阻害薬ソラフェニブ(sorafenib)(非特許文献9)、植物フェニルプロパノイド系中間二次代謝産物ナリンゲニン(naringenin)(非特許文献10)、プロテアソーム・NF-κB阻害剤ボルテゾミブ(bortezomib)(非特許文献11)、ヒストンアセチル化酵素p300阻害剤ガルシノール(Garcinol)(非特許文献12)、アデノシン受容体A3アゴニストCl-IB-MECA(非特許文献13)、HDAC阻害薬トリコスタチンA(trichostatin A)(非特許文献14)、hedgehogシグナル特異的阻害剤KAAD-シクロパミン(KAAD-Cyclopamine)(非特許文献15)、HDAC阻害薬アピシジン(apicidin)(非特許文献16)、HDAC阻害薬KD5170(非特許文献17)、抗生物質タウロリジン(taurolidine)(非特許文献18)、フリゴカンジダ由来化合物Fuligocandin B(非特許文献19)、プロテアソーム阻害薬ベンジルオキシカルボニルロイシルロイシルロイシンアルデヒド(benzyloxycarbonylleucyl-leucyl-leucine aldehyde, MG-132)(非特許文献20)、HDAC阻害薬バルプロ酸(valproic acid)(非特許文献21)、黄金花(Scutellaria baicalensis)由来のフラボノイドであるオウゴニン(Wogonin)(非特許文献22、非特許文献23)、カレー色素クルクミン(curcumin)(非特許文献24)、BIRドメイン結合オリゴペプチド(BIR Domain Binding oligopeptide)(特許文献1)が報告されている。
【０００５】
DNA架橋剤、HDAC阻害薬、プロテアソーム阻害剤などの抗癌剤は、正常細胞及び組織に対する副作用を有するが、TRAILと同時投与することにより相乗作用を示し、容認可能な程度の副作用をもって制癌作用を発揮できる可能性がある。しかし、これらの化合物によるTRAIL感受性増強作用は癌細胞に対する選択性が低く、理想的なTRAIL感受性増強剤とは言えない。
【０００６】
Fasらは、オウゴニンが、Jurkat株化細胞(ヒト白血病T細胞株)においてTRAIL誘導性アポトーシスを増強するのに対し、新鮮に単離された末梢血T細胞においてはTRAIL誘導性アポトーシスを増強しないことを示した(非特許文献22)。また、Leeらは、LNCaP細胞(ヒト前立腺癌細胞由来培養細胞株)及びYPEN株化細胞(ラット前立腺内皮細胞由来)を用いた系において、同様の癌細胞選択的な効果を報告している(非特許文献23)。Leeらは、更に、オウゴニンとTRAILの同時投与が誘導型カスパーゼであるカスパーゼ8及びカスパーゼ9、並びに、実行型カスパーゼ(executioner caspase)であるカスパーゼ3の切断を導くこと、オウゴニンが活性酸素種の産生を誘導すること、当該活性酸素種がDNA損傷を引き起こすこと、及び当該DNA損傷によりp53が上方制御されることを示唆している(非特許文献23)。
【０００７】
上記のデスレセプター経路は外因性アポトーシス・プログラム(extrinsic apoptotic program)又は受容体活性化アポトーシス経路(receptor-activated apoptotic pathway)と呼ばれ、2つの主要なアポトーシス経路の一つである。他方の経路は内因性アポトーシス・プログラム(intrinsic apoptotic program)又はストレス活性化アポトーシス経路(stress-activated apoptotic pathway)と呼ばれ、ミトコンドリア外膜透過処理(mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP)を介したミトコンドリア膜間腔から細胞質へのチトクロムc(cytochrome c)の放出を伴う。細胞質のチトクロムcは、Apaf-1及びカスパーゼ9と共にアポプトソーム(apoptosome)を形成し、実行型カスパーゼであるカスパーゼ3、6、7を活性化する。
【０００８】
これらの外因性及び内因性のアポトーシス経路は、デスレセプターによるカスパーゼ8の活性化、これに続く実行型カスパーゼ及びBIDの活性化を通じて互いにクロストークすることが知られている。
【０００９】
Cassidy-Stoneらは、ミトコンドリア分裂阻害剤のmdivi-1がミトコンドリア分裂ダイナミンDrp1を選択的に阻害すること、及びmdivi-1はBax/Bak依存性のMOMPを阻害することによりアポトーシスを減弱させることを示した。(非特許文献25)。このアポトーシス抑制効果により、脳卒中、心筋梗塞、神経変性疾患などの異常な細胞死が関与する疾患の治療薬として注目されている。
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、アポトーシス抑制効果を有するmdivi-1が、TRAILと併用することにより癌細胞のTRAIL誘導性アポトーシスを増強することを見出した。TRAILとmdivi-1を併用した場合、デスレセプター経路を介したアポトーシスの特徴であるカスパーゼ8の活性化は観察されず、小胞体ストレスならびに小胞体結合カスパーゼ12の活性化が惹起され、小胞体経路を介して経路を介してアポトーシスが誘導されていることが示唆される(本発明者らの未発表データ。データを示さず。)。
【００１１】
[略号の説明]
TRAIL:tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand
APO-2L:Apo-2 ligand、TRAILの別名
DR4:death receptor 4
DR5:death receptor 5
TRAIL-R1:TNF-related apoptosis inducing ligand receptor 1; TRAIL receptor 1、DR4の別名
TRAIL-R2:TNF-related apoptosis inducing ligand receptor 2; TRAIL receptor 2、DR5の別名
TNFRSF10A:tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A、DR4の別名
TNFRSF10B:tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B、DR5の別名
HDAC:histone deacetylase
QOL:quality of life
MOMP:mitochondrial outer membrane permeabilization
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本件発明が解決しようとする課題は、癌細胞、特に悪性腫瘍におけるTRAIL抵抗性を克服することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、癌細胞のTRAIL抵抗性を克服するためにミトコンドリア分裂阻害剤が利用できることを見出した。ミトコンドリア分裂阻害剤をTRAILと併用することにより、TRAIL抵抗性を示す腫瘍においてTRAIL誘導性アポトーシスを増強することができる。
【００１４】
具体的には、本件発明の態様には以下のものが含まれる。
[実施態様1]
有効量のミトコンドリア分裂阻害剤を含む、癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスを増加させるための医薬:
ここで、当該医薬はTRAILポリペプチドと同時に又は逐次的に投与される。
[実施態様2]
前記ミトコンドリア分裂阻害剤が下記一般式で表される、実施態様1に記載の医薬:
【化１】
2013142070.tif 000003
ここで、R1はCl及びCF3からなる群から選択され、
R2はH及びClからなる群から選択され、
R3はH、OCH3、及びOCH(CH3)2からなる群から選択され、
R4はH及びCH3からなる群から選択され、かつ、
R5はH及びClからなる群から選択される。
[実施態様3]
前記ミトコンドリア分裂阻害剤がmdivi-1である、実施態様1に記載の医薬。
[実施態様4]
前記癌細胞が、非肺小細胞癌、グリオブラストーマ、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、又は神経芽細胞腫由来の癌細胞である、実施態様1から3のいずれか1項に記載の医薬。
[実施態様5]
前記投与が、塗布、静注、筋注、又は経口による投与である、実施態様1から4のいずれか1項に記載の医薬。
[実施態様6]
前記TRAILポリペプチドのアミノ酸配列が、ヒト由来のTRAILポリペプチドと同一である、実施態様1から5のいずれか1項に記載の医薬。
[実施態様7]
有効量のTRAILポリペプチドを更に含む、実施態様1から6のいずれか1項に記載の医薬。
[実施態様8]
以下の構成要素を含む、癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスを増加させるための医薬のキット:
有効量のミトコンドリア分裂阻害剤、及び、
TRAILポリペプチドとの同時又は逐次的投与により、前記癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスが増加する旨を記載した説明書。
[実施態様9]
前記ミトコンドリア分裂阻害剤が下記一般式で表される、実施態様8に記載のキット:
【化２】
2013142070.tif 000004
ここで、R1はCl及びCF3からなる群から選択され、
R2はH及びClからなる群から選択され、
R3はH、OCH3、及びOCH(CH3)2からなる群から選択され、
R4はH及びCH3からなる群から選択され、かつ、
R5はH及びClからなる群から選択される。
[実施態様10]
前記ミトコンドリア分裂阻害剤がmdivi-1である、実施態様8に記載のキット。
[実施態様11]
前記癌細胞が、非肺小細胞癌、グリオブラストーマ、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、又は神経芽細胞腫由来の癌細胞である、実施態様8から10のいずれか1項に記載のキット。
[実施態様12]
前記投与が、塗布、静注、筋注、又は経口による投与である、実施態様8から11のいずれか1項に記載のキット。
[実施態様13]
前記TRAILポリペプチドのアミノ酸配列が、ヒト由来のTRAILポリペプチドと同一である、実施態様8から12のいずれか1項に記載のキット。
[実施態様14]
有効量のTRAILポリペプチドを更に含む、実施態様8から13のいずれか1項に記載のキット。
[実施態様15]
以下の工程を含む、癌細胞の選択的なTRAIL誘導性アポトーシスを増加させる方法:
in vivo又はex vivoにおいて有効量のミトコンドリア分裂阻害剤を当該癌細胞に接触させる工程;
ここで、当該癌細胞はTRAILポリペプチドにより同時に又は逐次的に処理される。
[実施態様16]
前記ミトコンドリア分裂阻害剤が下記一般式で表される、実施態様15に記載の方法:
【化３】
2013142070.tif 000005
ここで、R1はCl及びCF3からなる群から選択され、
R2はH及びClからなる群から選択され、
R3はH、OCH3、及びOCH(CH3)2からなる群から選択され、
R4はH及びCH3からなる群から選択され、かつ、
R5はH及びClからなる群から選択される。
[実施態様17]
前記ミトコンドリア分裂阻害剤がmdivi-1である、実施態様15に記載の方法。
[実施態様18]
前記癌細胞が、非肺小細胞癌、グリオブラストーマ、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、又は神経芽細胞腫由来の癌細胞である、実施態様15から17のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様19]
前記接触させる工程が、塗布、静注、筋注、又は経口による投与である、実施態様15から18のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様20]
前記TRAILポリペプチドのアミノ酸配列が、ヒト由来のTRAILポリペプチドと同一である、実施態様15から19のいずれか1項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
ミトコンドリア分裂阻害剤を用いる、癌細胞のTRAIL誘導性アポトーシスを増強するための薬剤及び方法は、TRAIL抵抗性の癌細胞を効果的に殺すのに対し、正常細胞に対する細胞傷害性を全く示さないか又は僅かしか示さない。従って、当該薬剤又は方法を用いることにより、癌患者の予後を改善し、また、TRAIL療法被験者のQOLを向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトメラノーマ細胞A375に対する、TRAIL、mdivi-1、及びこれらの組み合わせのアポトーシス誘導効果を蛍光顕微鏡で観察した図である。Live: カルセイン染色。Dead: エチジウムブロマイド・ホモダイマー染色。左パネルは明視野像である。
【図２】正常メラノサイトに対する、TRAIL、mdivi-1、及びこれらの組み合わせのアポトーシス誘導効果を蛍光顕微鏡で観察した図である。Live: カルセイン染色。Dead: エチジウムブロマイド・ホモダイマー染色。左パネルは明視野像である。
【図３】ヒトメラノーマ細胞A375をTRAIL、mdivi-1、及びこれらの組み合わせで処理した場合の、アポトーシス細胞の割合(%)を示す棒グラフである。A: 最終濃度25ng/mLのTRAILタンパク質で処理した場合。B: 最終濃度100ng/mLのTRAILタンパク質で処理した場合。vehicle: mdivi-1なし。25μM Mdivi-1: 25μMのmdivi-1で処理した場合。50μM Mdivi-1: 50μMのmdivi-1で処理した場合。**はp<0.01、***はp<0.001を表す(AnovaおよびTukey post hoc test)。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[定義]
【００１８】
有効量:ミトコンドリア分裂阻害剤の有効量(最終濃度)は、例えば、1〜999μM、1〜607μM、1〜368μM、1〜223μM、1〜135μM、1〜82μM、1〜50μM、2〜999μM、2〜607μM、2〜368μM、2〜223μM、2〜135μM、2〜82μM、2〜50μM、3〜999μM、3〜607μM、3〜368μM、3〜223μM、3〜135μM、3〜82μM、3〜50μM、5〜999μM、5〜607μM、5〜368μM、5〜223μM、5〜135μM、5〜82μM、5〜50μM、9〜999μM、9〜607μM、9〜368μM、9〜223μM、9〜135μM、9〜82μM、9〜50μM、15〜999μM、15〜607μM、15〜368μM、15〜223μM、15〜135μM、15〜82μM、15〜50μM、25〜999μM、25〜607μM、25〜368μM、25〜223μM、25〜135μM、25〜82μM、25〜50μMであり、好ましくは25〜50μM (mdivi-1の場合は、8.8〜17.6μg/ml)である。
【００１９】
ミトコンドリア分裂阻害剤: 一実施形態においては、ミトコンドリア分裂阻害剤は下記一般式で表される化合物を意味する。
【化４】
2013142070.tif 000006
ここで、R1はCl及びCF3からなる群から選択され、
R2はH及びClからなる群から選択され、
R3はH、OCH3、及びOCH(CH3)2からなる群から選択され、
R4はH及びCH3からなる群から選択され、かつ、
R5はH及びClからなる群から選択される。
【００２０】
本発明に特に適したミトコンドリア分裂阻害剤の例としては、以下の化学式であらわされる化合物が挙げられる(非特許文献25)。
【化５】
2013142070.tif 000007
【化６】
2013142070.tif 000008
【化７】
2013142070.tif 000009
【化８】
2013142070.tif 000010
【化９】
2013142070.tif 000011
【００２１】
mdivi-1:以下の化学式で示される、IUPAC名: 3-(2,4-dichloro-5-methoxyphenyl)-2-sulfanylidene-1H-quinazolin-4-one の化合物を意味する。
【化１０】
2013142070.tif 000012
【００２２】
癌細胞:本願明細書において癌細胞と言うときは、任意の癌細胞を意味する。本件発明の一実施形態において、癌細胞という用語はTRAIL抵抗性を示す任意の癌細胞を意味する。本件発明の他の実施形態においては、癌細胞という用語は非肺小細胞癌、グリオブラストーマ、慢性リンパ性白血病、星状細胞腫、髄膜腫、膵臓癌、メラノーマ、又は神経芽細胞腫由来の癌細胞を意味する。
【００２３】
選択的:本願明細書において、癌細胞の「選択的」なTRAIL誘導性アポトーシスと言うときは、正常細胞と比較して、癌細胞において高頻度でTRAIL誘導性アポトーシスが生ずることを意味する。
【００２４】
TRAIL誘導性アポトーシス:本願明細書において「TRAIL誘導性アポトーシス」とは、TRAILタンパク質が癌細胞に対して誘導するアポトーシスを意味する。
【００２５】
増加させる:本願明細書において、TRAIL誘導性アポトーシスを「増加させる」と言うときは、ミトコンドリア分裂阻害剤をTRAILと併用した場合に、TRAILのみの場合と比較して、癌細胞において高頻度でTRAIL誘導性アポトーシスが生ずることを意味する。
【００２６】
TRAILポリペプチド:本願明細書において「TRAILポリペプチド」と言うときは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL))を意味する。本件発明に使用されるTRAILポリペプチドは、効果の観点から、被験者と同一の種由来のアミノ酸配列を有することが好ましい。また、安全性及び経済性の観点から、TRAILポリペプチドは組換え型であることが好ましい。
【００２７】
同時:本願明細書において「同時」投与と言うときは、単にミトコンドリア分裂阻害剤とTRAILポリペプチドを併用することを意味し、正確に同時である必要はない。
【００２８】
逐次的:本願明細書において「逐次的」投与と言うときは、ミトコンドリア分裂阻害剤とTRAILポリペプチドを意図的に一定の時間差を持って投与することを意味する。
【００２９】
投与:ミトコンドリア分裂阻害剤又はTRAILポリペプチドの投与は、メラノーマ等の皮膚癌では塗布、静注、筋注、又は経口による投与が好ましく、その他の癌では静注、筋注、又は経口による投与が好ましい。
【００３０】
[実験材料及び実験方法]
【００３１】
<ミトコンドリア分裂阻害剤>
Mdivi-1はEnzo Life Sciences, Inc.,から購入した(Cat. No. BML-CM127-0050)。
【００３２】
<株化細胞及び培養条件>
ヒトメラノーマ細胞(A375細胞)は、10%FBS/DMEM (High glucose)を用いて、5%CO2/95%大気中37℃で培養した。ヒト白血病細胞(Jurkat細胞)は、10%FBS/DRPMI1640を用いて、5%CO2/95%大気中37℃で培養した。
【００３３】
<TRAILタンパク質>
可溶性ヒトリコンビナントTRAIL (500μg/ml) (Killer TRAILTM, Cat. No. ALX-201-073-3020, Enzo Life Sciences, Inc.)を-80℃で保存した。これを使用時に最終濃度が6.3〜100 ng/mlになるように希釈して使用した。
【００３４】
<アポトーシスアッセイ>
24ウェルプレートに接着させたA375細胞又は浮遊させたJurkat細胞 (2×105 cells/ウェル)に、Mdivi-1(最終濃度:8.8〜17.6μg/ml)とTRAIL(最終濃度:25〜100 ng/ml)を単独またはコンビネーションで添加し、37℃で24時間培養した。細胞を洗浄後、FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Pharmingen社)を用いて染色したアポトーシス (Annexin V+)細胞の割合を、フローサイトメーターFACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA) で測定し、データをCellQuest software (BD Bioscience)で解析した。
【００３５】
<蛍光顕微鏡観察>
8チャンバーカバーガラス(Asahi Glass Co., Tokyo, Japan)に接着させたA375細胞(1×104 cells)にMdivi-1(最終濃度:8.8〜17.6μg/ml)とTRAIL(最終濃度:25〜100 ng/ml)を単独又はコンビネーションで添加した。細胞を洗浄後LIVE/DEAD(登録商標)Viability/Cytotoxicity Kit(Invitrogen)を用いて細胞死を調べた。即ち、4μMカルセイン-AMエチヂウムブロマイドホモダイマー(ethidium bromide homodimer)を用いて細胞を37℃で30分染色した後、蛍光顕微鏡(Olympus IX71 inverted microscope, Olympus, Tokyo, Japan)で観察し、データをLuminaVision software (Mitani Corporation, Fukui, Japan)を用いて解析した。
【実施例】
【００３６】
[実施例1]
ヒトメラノーマ細胞A375及び正常メラノサイトに対するヒトリコンビナントTRAILの効果を、それぞれ図1及び図2に示した。生細胞はカルセイン(calcein)で緑色に、死細胞はエチヂウムブロマイドホモダイマーで赤色に、それぞれ染色される。TRAIL(100 ng/ml)単独、20時間処理では殆ど細胞死が見られず、ヒトメラノーマ細胞A375はTRAIL抵抗性であることが確認された(図1、TRAIL)。
【００３７】
ミトコンドリア分裂阻害剤mdivi-1(最終濃度17.6μg/ml (50μM))は、単独では細胞死を起こさないが(図1、Mdivi)、TRAILのアポトーシス誘導効果を著しく増強した(図1、TRAIL+Mdivi)。
【００３８】
一方で、TRAIL単独、mdivi-1単独、又は両者の組み合わせのいずれも、正常メラノサイトに対して殆ど細胞傷害性を示さなかった(図2)。
【００３９】
[実施例2]
実施例1と同様の実験において、アネキシンV-FITC及びヨウ化プロピジウム(PI)で染色した細胞をフローサイトメーターで解析し、全体の細胞数に対する百分率として図3に示した。ヒトメラノーマ細胞A375は25ng/mL又は100ng/mLのTRAILに対して抵抗性を示したが(vehicle)、25μM又は50μMのmdivi-1の同時投与により、濃度依存的にアポトーシスが誘導された(25μM Mdivi-1、50μM Mdivi-1)。25から100ng/mLの間で、TRAILはある程度の濃度依存性を示し、100ng/mLの方がより多くの細胞にアポトーシスを誘導した。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
ミトコンドリア分裂阻害剤を含む医薬は、製薬産業、医療産業、及び研究試薬製造業界などにおいて利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４１】
【特許文献１】WO/2004/072641
【非特許文献】
【００４２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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