(57)【要約】【課題】植物病原糸状菌による病害を防除する生体材料由来の化合物または組成物を提供する。【解決手段】（Ａ）ミミズ糞土を水抽出工程に供して、第一水相を得る工程、  （Ｂ）前記第一水相を、一般式（Ｉ）で表されるカルボン酸エステル以外の有機溶媒抽出工程に供して、有機相と第二水相とを得る工程、（Ｃ）前記第二水相を一般式（Ｉ）：Ｒ−ＣＯＯＲ’（Ｒは炭素数１〜８のアルキル基、Ｒ’は炭素数１〜４のアルキル基である）で表されるカルボン酸エステル抽出工程に供してカルボン酸エステル相と第三水相とを得る工程、および（Ｄ）前記カルボン酸エステル相からカルボン酸エステルを除去してカルボン酸エステル抽出物を得る工程、を含む、ミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）ミミズ糞土を水抽出工程に供して、第一水相を得る工程、
（Ｂ）前記第一水相を、一般式（Ｉ）で表されるカルボン酸エステル以外の有機溶媒抽出工程に供して、有機相と第二水相とを得る工程、
（Ｃ）前記第二水相を一般式（Ｉ）： 
【化１】
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で表されるカルボン酸エステル抽出工程に供してカルボン酸エステル相と第三水相とを得る工程、および
（Ｄ）前記カルボン酸エステル相からカルボン酸エステルを除去してカルボン酸エステル抽出物を得る工程、
を含む、ミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記式（Ｉ）におけるＲは炭素数１〜３のアルキル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有機溶媒は塩素含有炭化水素である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記（Ａ）の水抽出工程を７０〜１００℃で実施する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法で得たミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法で得たミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物を含む、植物病原糸状菌による植物病害を防除するための組成物。
【請求項７】
一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される化合物：
【化２】
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【化３】
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を含む、植物病原糸状菌による植物病害を防除するための組成物。
【請求項８】
前記植物病原糸状菌は、イネいもち病菌、ウリ炭そ病菌、またはイチゴ炭そ病菌である、請求項６または７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病原糸状菌は植物に深刻な病気を引き起こすため、農業生産の安定の観点から当該菌による病害を防除することが重要な課題となっている。このため植物病原糸状菌による病害を防除する種々の化合物が提案されている。例えば特許文献１には、工業的に合成された複素環を有する化合物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１０６０１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
消費者は工業的に合成された農薬を用いない安全かつ安心な食物を求めている。従って、植物病原糸状菌による病害を防除する化合物または組成物においても、工業的に合成されたものではなく、生体材料由来のものへのニーズが高まりつつある。しかしながら、生体材料由来でありながら植物病原糸状菌によってもたらされる病害に対して優れた防除活性を有する化合物または組成物は未だ得られていない。
【０００５】
かかる事情を鑑み、本発明は、植物病原糸状菌による病害を防除する生体材料由来の化合物または組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、ミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物およびその中に含まれる特定の化合物が、植物病原糸状菌による病害を防除する活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、前記課題は以下の本発明により解決される。
［１］（Ａ）ミミズ糞土を水抽出工程に供して、第一水相を得る工程、
（Ｂ）前記第一水相を、一般式（Ｉ）で表されるカルボン酸エステル以外の有機溶媒抽出工程に供して、有機相と第二水相とを得る工程、
（Ｃ）前記第二水相を一般式（Ｉ）：Ｒ−ＣＯＯＲ’（Ｒは炭素数１〜８のアルキル基、Ｒ’は炭素数１〜４のアルキル基である）
で表されるカルボン酸エステル抽出工程に供してカルボン酸エステル相と第三水相とを得る工程、および
（Ｄ）前記カルボン酸エステル相からカルボン酸エステルを除去してカルボン酸エステル抽出物を得る工程、
を含む、ミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物の製造方法。
［２］前記［１］に記載の方法で得たミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物。
［３］前記［１］または［２］に記載の方法で得たミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物を含む、植物病原糸状菌による植物病害を防除するための組成物。
［４］後述の一般式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される化合物を含む、植物病原糸状菌による植物病害を防除するための組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、植物病原糸状菌による病害を防除する生体材料由来の化合物または組成物が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の概要を示す工程図である。
【図２】ミミズ糞土の団粒構造の概要を示す図である。
【図３】カルボン酸エステル抽出物の活性を示す図である。
【図４】カルボン酸エステル抽出物の画分のイネいもち病原菌への活性を示す図である。
【図５】カルボン酸エステル抽出物の画分のイネいもち病原菌への活性を示す図である。
【図６】カルボン酸エステル抽出物の画分のイネいもち病原菌への活性を示す図である。
【図７】カルボン酸エステル抽出物の画分のウリ炭そ病原菌への活性を示す図である。
【図８】カルボン酸エステル抽出物の画分のイチゴ炭そ病原菌への活性を示す図である。
【図９】ＨＤＤＡがイネいもち病原菌の呼吸阻害へ与える影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．ミミズ糞土のカルボン酸エステル抽出物の製造方法
本発明の製造方法は、（Ａ）ミミズ糞土を水抽出工程に供して、第一水相を得る工程、（Ｂ）前記第一水相を、後述する一般式（Ｉ）で表されるカルボン酸エステル以外の有機溶媒抽出工程に供して、有機相と第二水相とを得る工程、（Ｃ）前記第二水相を一般式（Ｉ）で表されるカルボン酸エステル抽出工程に供してカルボン酸エステル相と第三水相とを得る工程、および（Ｄ）前記カルボン酸エステル相からカルボン酸エステルを除去してカルボン酸エステル抽出物を得る工程、を含む。図１に本発明の製造方法の概要を示す。以下、必要に応じて符号を参照し本発明を説明する。本発明において「〜」はその両端の値を含む。
【００１１】
１−１．Ａ工程
本工程では、ミミズ糞土１を水抽出工程に供して第一水相Ａ１および固相Ａ２を得る。ミミズ糞土とは、ミミズの排泄物を含む土である。ミミズ糞土については後で詳しく説明する。
【００１２】
（１）抽出操作および条件等
抽出は、ビーカー等の容器にミミズ糞土と水を装入して撹拌することで行なえる。抽出時の水の温度は室温〜１００℃としてよいが、抽出を効率よく行なう観点から、７０℃以上が好ましく、８０℃以上がより好ましい。同様に、水の温度の上限に関しては、１００℃以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。抽出時間は適宜調整してよいが、７０〜１００℃で抽出を行なう場合、０．５〜５時間が好ましく、１〜３時間がより好ましい。
【００１３】
抽出を効率よく行なう観点から、ミミズ糞土１００質量部に対して、水の量は２００〜１０００質量部が好ましく、３００〜５００質量部がより好ましい。
抽出が完了した後の容器内容物は、ろ過等により、ミミズ糞土の残渣である固相Ａ２と第一水相Ａ１とに分離される。第一水相Ａ１から水を除去すると第一水抽出物を単離できる。この場合、水を蒸発させて除去することが好ましい。第一水抽出物は、通常、固体または液体である。
【００１４】
第一水相Ａ１またはこれから単離された第一水抽出物を保存する場合は、成分の劣化等を防ぐために、−２０℃以下程度の低温にて保存することが好ましい。
（２）ミミズ糞土
ミミズ糞土とはミミズの排泄物を含む土である。ミミズとは環形動物門貧毛綱に属する動物である。本発明においては、入手容易性等の観点から、フトミミズ科、ツリミミズ科に分類されるミミズ由来のミミズ糞土が好ましく、中でもシマミミズ由来のミミズ糞土が好ましい。
【００１５】
ｉ）ミミズ糞土の構造
本発明で用いるミミズ糞土は、団粒構造を有することが好ましい。図２はミミズ糞土の団粒構造を模式的に示す。図２中、１２は団粒であり団粒１２が複数個凝集することにより凝集体１０および団粒間隙間１６が形成される。団粒１２とは、糞土の微粒子が糊状の有機物を介して結合されてできた微小な団粒内隙間１４を有する粒である。糊状の有機物とは、有機物が微生物等により分解されて生成された粘着性の物質である。
【００１６】
凝集体１０は、団粒内隙間１４および団粒間隙間１６に水を保持できる。また、団粒１２は水には溶解しないので、この保持された水は効率よく排水される。従って、このような団粒構造を有するミミズ糞土を用いると、本工程において効率よく第一水抽出物を得ることができる。この凝集体の直径は約０．１〜０．２ｍｍが好ましい。本発明で用いるミミズ糞土は前記凝集体がさらに凝集して構成された粒子であってもよい。本発明で用いるミミズ糞土粒子の平均粒子径は０．１〜０．６ｍｍが好ましい。このような平均粒子径を有するミミズ糞土粒子は飛散しにくいので取り扱い性に優れる。
【００１７】
ｉｉ）ミミズ糞土の産生方法
ミミズ糞土は、餌をミミズに摂食させて産生することが好ましい。餌としては特に限定されないが、例えば、木材のチップ、食物の残渣、キノコ類の菌床粕等が挙げられる。中でも、キノコ類の菌床粕を含む餌が好ましく、シイタケの菌床粕を含む餌がより好ましい。菌床粕とは、キノコ類の栽培に用いた菌床の廃棄物である。菌床とは、キノコ栽培における培地であって、オガクズ等の木質基材に栄養源を混ぜた培地である。シイタケの菌床粕を含む餌を摂食したミミズにより産生されたミミズ糞土を用いると、植物病原糸状菌による病害を防除する活性がより向上する。
【００１８】
ミミズへの給餌量は、ミミズ１００質量部あたり５０〜１００質量部とすることが好ましい。給餌量が５０質量部未満であると、ミミズ糞土の生産性が十分でないことがある。給餌量が１００質量部を超えると、コストが増加することがある。この餌を与え、土壌でミミズを飼育することにより、ミミズが食餌、排泄して、ミミズ糞土が産生される。
【００１９】
ｉｉｉ）ミミズ糞土の成分
本発明で用いるミミズ糞土は、炭素、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびナトリウムを含むことが好ましい。各成分の濃度は以下のとおりであることが好ましい。これらの濃度は独立行政法人農業環境技術研究所が定める肥料分析法に基づいて求められるが、以下にその測定方法の概要も合わせて示す。
【００２０】
全炭素濃度：２５０〜４００ｍｇ／ｇ。全炭素濃度は、ミミズ糞土に含まれる炭素の総量であり、ミミズ糞土を燃焼させて発生する二酸化炭素を定量して求められる。
全窒素濃度：１５〜３０ｍｇ／ｇ。全窒素濃度は、ミミズ糞土に含まれる窒素の総量であり、ミミズ糞土を燃焼させて発生する酸化窒素を定量することにより求められる。
【００２１】
アンモニア態窒素濃度：１５〜３０ｍｇ／ｋｇ。アンモニア態窒素は、アンモニウム塩の形態で存在する窒素である。この濃度は、ミミズ糞土を２Ｍの塩化カリウム水溶液で抽出し、抽出物をアルカリ性にしてアンモニウム塩をアンモニアにし、水蒸気蒸留してアンモニアを分留して定量して求められる。
【００２２】
硝酸態窒素濃度：７００〜１０００ｍｇ／ｋｇ。硝酸態窒素は、硝酸イオンのように酸化窒素の形で存在する窒素である。この濃度は、１）ミミズ糞土を２Ｍの塩化カリウム水溶液で抽出し、抽出液にデバルタ合金等の還元性の金属を装入して、亜硝酸イオン、硝酸イオンをアンモニウムイオンに還元し、２）この液をさらにアルカリ性にして、アンモニウムイオンをアンモニアにし、アンモニアを水蒸気蒸留して定量し、３）この値から、別に求めたアンモニア態窒素濃度を差し引くことで求められる。
【００２３】
全リン濃度：５〜２０ｍｇ／ｇ。全リン濃度は、ミミズ糞土に含まれるリンの総量であり、ミミズ糞土を乾式で灰化した後、バナドモリブデンイエロー溶液を添加して吸光光度分析して求められる。
【００２４】
全カリウム濃度：５〜２０ｍｇ／ｇ
全カルシウム濃度：３０〜６０ｍｇ／ｇ
全マグネシウム濃度：５〜２０ｍｇ／ｇ
全ナトリウム濃度：０．５〜２ｍｇ／ｇ
全カリウム濃度等は、ミミズ糞土に含まれるカリウム等の総量であり、ミミズ糞土を乾式で灰化した後、フレーム原子吸光分析して求められる。
【００２５】
本発明で用いるミミズ糞土は、上記成分の他にミミズの消化器官に由来する酵素等の生態由来物質を含むことが好ましい。
また、本発明で用いるミミズ糞土の抽出水は中性〜弱アルカリ性であることが好ましく、ｐＨが７〜８であることがより好ましい。ミミズ糞土の前記抽出水の電気伝導度は、０．５〜２ｄＳ／ｍが好ましい。前記ｐＨと電気伝導度が上記範囲にあるミミズ糞土からは、栄養素が抽出されやすい。ｐＨと電気伝導度は、独立行政法人農業環境技術研究所が定める肥料分析法に準じて、１質量部のミミズ糞土を１０質量部の水で抽出して得た抽出水から求められる。
【００２６】
１−２．Ｂ工程
本工程では、前記第一水相Ａ１を、一般式（Ｉ）で表されるカルボン酸エステル以外の有機溶媒抽出工程に供して第二水相Ｂ１と有機相Ｂ２とを得る。
【００２７】
ここで用いる有機溶媒は、一般式（Ｉ）で表されるカルボン酸エステル以外の、水と分離可能な有機溶媒であれば特に限定されない。しかしながら沸点が高いと溶媒を除去することが困難になる場合があるので、沸点が１００℃以下の有機溶媒が好ましく、沸点が５０℃以下の有機溶媒がより好ましい。このような有機溶媒としては、ハロゲン含有炭化水素が挙げられ、中でも入手容易であることから炭素数が２〜５のハロゲン含有炭化水素が好ましく、炭素数が２〜３のハロゲン含有炭化水素がより好ましく、炭素数が２のハロゲン含有炭化水素がさらに好ましい。入手が容易であることから、塩化メチレンまたはクロロホルム等の塩素含有炭化水素が特に好ましい。
【００２８】
抽出操作には、分液漏斗等、公知の手段を用いることができる。使用する前記有機溶媒の量は、１００質量部の第一水相Ａ１に対して、５０〜２００質量部が好ましい。抽出操作は複数回（例えば２〜５回）実施してもよい。抽出における温度は、使用する有機溶媒により適宜選択してよいが、作業性を考慮すると２０〜３０℃程度が好ましい。
【００２９】
第二水相Ｂ１および有機相Ｂ２から、それぞれ水および有機溶媒を除去すると、第二水抽出物および有機溶媒抽出物を単離できる。この場合、水および有機溶媒を蒸発させて除去することが好ましい。第二水抽出物および有機溶媒抽出物は、通常、液体か固体である。これらの相および抽出物を保存する場合は、成分の劣化を防ぐため、−２０℃以下程度の低温にて保存することが好ましい。
【００３０】
１−３．Ｃ工程
本工程では、第二水相Ｂ１を特定のカルボン酸エステル抽出工程に供して、カルボン酸エステル相Ｃ１および第三水相Ｃ２を得る。本工程で用いるカルボン酸エステルは室温で液体であり、その構造は一般式（Ｉ）で表される。
【００３１】
Ｒ−ＣＯＯＲ’      （Ｉ）
Ｒは炭素数１〜８のアルキル基であり、Ｒ’は炭素数１〜４のアルキル基である。本発明においてアルキル基は、１級アルキル基、２級アルキル基、および３級アルキル基を含む。
【００３２】
次工程において、カルボン酸エステル相Ｃ１からカルボン酸エステルを除去することにより、カルボン酸エステル抽出物Ｄ１が単離できる。この際、カルボン酸エステルは公知の方法で除去できるが、蒸発させて除去することが好ましい。従って、Ｃ工程で用いるカルボン酸の沸点はあまり高くないことが好ましい。よって式（Ｉ）におけるＲのアルキル基の炭素数は１〜６が好ましく、１〜４がより好ましく、１〜３がさらに好ましく、２〜３が特に好ましい。同様にＲ’のアルキル基の炭素数は１〜３が好ましく、２〜３がより好ましい。好ましいカルボン酸エステルの具体例としては、酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸プロピルなどの酢酸のエステルや、酪酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられる。
【００３３】
抽出操作は、分液漏斗等、公知の手段を用いて行なうことが好ましい。使用するカルボン酸エステルの量は、１００質量部の第二水相Ｂ１に対して、５０〜２００質量部が好ましい。抽出操作は複数回（例えば２〜５回）実施してもよい。抽出における温度は、使用する有機溶媒により適宜選択してよいが、作業性を考慮すると２０〜３０℃程度が好ましい。
【００３４】
１−４．Ｄ工程
本工程ではカルボン酸エステル相Ｃ１からカルボン酸エステルを除去して、カルボン酸エステル抽出物Ｄ１を得る。前述のとおり、カルボン酸エステルを蒸発させて除去することが好ましい。具体的には、風乾、減圧乾燥、蒸留、エバポレーターを用いる乾燥等によりカルボン酸エステルをカルボン酸エステル相Ｃ１から除去できる。カルボン酸エステル相Ｃ１を加熱する場合は、温度が高すぎると成分が劣化する恐れがあるので、３０〜７０℃に加熱することが好ましい。本工程で得られるカルボン酸エステル抽出物Ｄ１は、通常、固体または液体である。
【００３５】
２．カルボン酸エステル抽出物
（１）特性
カルボン酸エステル抽出物Ｄ１は、植物病原糸状菌による病害を防除する活性を有する。糸状菌とは糸状の菌糸で生活する真菌や細菌であり、植物病原糸状菌とは、植物に寄生して生育し、感染して発病させる糸状菌である。植物病原糸状菌の胞子は、宿主（イネ等）に接着すると発芽管を伸ばし、その先端に形成される付着器と呼ばれる器官を経由して宿主に侵入することが知られている。従って、植物病原糸状菌による病害を防除する活性は、付着器形成および発芽の状態を観察することで評価できる。
【００３６】
カルボン酸エステル抽出物Ｄ１が前記活性を有する機構は、限定されないが次のように考えられる。カルボン酸エステル抽出物Ｄ１を、さらにクロロホルムとメタノールを溶媒とするクロマトグラフィーで分画すると、特定の画分において顕著な活性が見られる。当該画分の解析から、前記活性を有する化合物は式（ＩＩ）で表されるアルキルジ脂肪酸、または式（ＩＩＩ）で表されるジフタル酸のエステルであると考えられる。
ＨＯＯＣ−Ｒ２−ＣＯＯＨ      （ＩＩ）
Ｒ２は炭素数１０〜２０のアルキル基であり、好ましくは炭素数１１〜１３のアルキル基である。
【００３７】
【化１】
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【００３８】
Ｒ３は独立に炭素数３〜１０のアルキル基であり、好ましくは炭素数４〜７のアルキル基である。「独立に」とは、２つのＲ３が同一または異なってよいことを意味するが、２つのＲ３は同一であることが好ましい。
【００３９】
Ｒ４は独立に炭素数１〜４のアルキル基であり、好ましくは炭素数１〜２のアルキル基である。ｎは独立に０〜４の整数である。２つのＲ４およびｎは同一または異なってよいが、同一であることが好ましい。
これらの化合物は、植物病原糸状菌の呼吸を阻害する作用を有すると考えられる。
【００４０】
（２）用途
カルボン酸エステル抽出物Ｄ１、および前記式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される化合物は前記の活性を有するので、植物病原糸状菌による植物病害を防除する用途に好適である。例えば、カルボン酸エステル抽出物Ｄ１または前記化合物を水または有機溶剤に溶解して薬剤組成物として使用できる。
【００４１】
あるいは、カルボン酸エステル抽出物Ｄ１または前記化合物を、公知の方法で製剤化して農園芸用組成物として使用できる。製剤の形態としては、粒剤、乳剤、水性液剤、油剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。
【実施例】
【００４２】
［実施例１］酢酸エチル抽出物の調製
以下、図１を参照しながら実施例１を説明する。
Ａ工程
ミミズ糞土（商品名：みみず太郎１００、株式会社豊徳製）１５０ｇおよび蒸留水６００ｍＬをビーカーに装入した。ビーカーを外部から加熱して内容物の温度を９０℃とした。この温度を保ちながら、２時間、内部を撹拌して水抽出を行なった。次いで、内容物の温度を４０℃に冷却し、遠心分離機（株式会社日立製作所製）を用いて、ビーカー内容物を分離しミミズ糞土を沈殿させた。回転速度は３０００ｒｐｍとし１５分間分離を行なった。この時のビーカー内の水の温度は４℃であった。セライト（関東化学株式会社製）を用いて上清液を濾過し、第一水相Ａ１と、固相Ａ２を得た。
【００４３】
Ｂ工程
前記水相Ａ１約６００ｍＬに塩化メチレン（関東化学株式会社製）３００ｍＬを加え、分液漏斗を用いて水相と有機相とに分液した。得られた水相に、再度塩化メチレン３００ｍＬを加えて抽出を行なった。さらに同様の操作を繰り返し、塩化メチレンによる抽出を合計で３回行った。このようにして第二水相Ｂ１を得た。さらに３回の抽出で得た塩化メチレン相を合わせて有機相Ｂ２を得た。
【００４４】
Ｃ工程
６００ｍＬの第二水相Ｂ１に酢酸エチル（関東化学株式会社製）３００ｍＬを加え、分液漏斗を用いてカルボン酸エステル相Ｃ１と第三水相Ｃ２とに分液した。
【００４５】
Ｄ工程
カルボン酸エステル相Ｃ１をシャーレに流し込み、室温（２０℃）にて酢酸エチルを蒸発させて除去し、カルボン酸エステル抽出物（酢酸エチル抽出物）Ｄ１を単離した。当該酢酸エチル抽出物Ｄ１をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度の酢酸エチル抽出物溶液を得た。
【００４６】
［実施例２］酢酸エチル抽出物の活性
（１）オートミール寒天培地（５％［ｗ／ｖ］粉末オートミール（オートミール（The Quaker Oats Company社製）をコーヒーミル（ＭＫ−６１Ｍ−Ｇ、パナソニック株式会社製）で粉末にしたもの）、０．５％［ｗ／ｖ］のスクロース（ナカライテスク株式会社製）、１．５％［ｗ／ｖ］寒天（和光純薬工業株式会社製）、およびＹＧ（０．５％Yeast Extract、２．０％glucose（関東化学株式会社製））寒天培地を、滅菌済みプラスチック培養シャーレ（滅菌シャーレ（深型）ＣＳＰＤ９０−２０、関東化学株式会社製）に流し込み平板培地を準備した。
【００４７】
（２）イネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）菌株として、東京理科大学理工学部鎌倉研究室で維持している日本産イネ病原菌株であるＰ２株を準備した。前記平板培地を用い、２８℃にて当該菌株を７日間静置培養した。
【００４８】
これにより得た菌叢から、滅菌筆および滅菌水で気中菌糸を除去した後、ＢＬＢランプ（ＦＬ２０Ｓ・ＢＬＢ、株式会社東芝製）照射下でさらに３日間培養することにより胞子形成を誘導した。この際、培養用シャーレにパラフィルム（PECHINEY PASTIC PACKAGING社製）を巻いた後、ハサミにより通気口を作成したシャーレを用いた。
【００４９】
形成された胞子を滅菌筆で滅菌蒸留水中に懸濁した。その濃度を、血球計算盤（THOMA、HIRSCHMANN（登録商標）Laborgerate製）を用いて胞子数が、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した。次に当該胞子懸濁液に、実施例１で調製した１０ｍｇ／ｍＬの濃度の酢酸エチル抽出物溶液を添加し、胞子懸濁液中の酢酸エチル抽出物濃度を１００μｇ／ｍＬとした。
【００５０】
（３）２５×７５ｍｍのポリカーボネート板を準備し、滅菌水中で振盪して洗浄した後乾燥した。当該ポリカーボネート板上に、（２）で得た胞子懸濁液を２０μｌずつ３ヶ所に滴下した。次いで水で湿らせた紙ウエス（キムタオル、日本製紙クレシア株式会社製）を敷いたプラスチックケースを準備し、その中にポリカーボネート板を装入して蓋をした。胞子懸濁液滴下後、６時間、１２時間、２４時間、３６時間後に顕微鏡観察を行ない、付着器形成率を調査した。付着器形成率は以下のようにして算出した。
発芽率＝発芽している胞子数／全胞子数
付着器形成率＝発芽管の先端に付着器を形成している胞子数／発芽している胞子数
この実験を、独立して３回行い、これらの結果を平均した。
【００５１】
［比較例１］
実施例２の（２）において、胞子懸濁液に酢酸エチル抽出物溶液を添加しなかった以外は、実施例２と同様に発芽率および付着器形成率を評価した。
【００５２】
［比較例２］
実施例２の（２）において、酢酸エチル抽出物溶液の代わりにＤＭＳＯを胞子懸濁液に添加した以外は、実施例２と同様に発芽率および付着器形成率を評価した。この際、胞子懸濁液中、ＤＭＳＯの濃度が１質量％となるようにした。
【００５３】
［比較例３］塩化メチレン抽出物の活性
実施例１の工程Ｂで得た有機相Ｂ２（塩化メチレン相）を風乾して塩化メチレンを除去し、有機溶媒抽出物（塩化メチレン抽出物）を得た。次に当該抽出物をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度の塩化メチレン抽出物溶液を得た。
【００５４】
実施例２の（２）において、酢酸エチル抽出物溶液の代わりに塩化メチレン抽出物溶液を胞子懸濁液に添加した以外は、実施例２と同様に発芽率および付着器形成率を評価した。
【００５５】
［比較例４］水抽出物の活性
実施例１の工程Ｃで得た第三水相Ｃ３を減圧下（１０ｍｍＨｇ）５０℃で乾燥して水を除去し第三水抽出物を単離した。当該抽出物を、ＤＭＳＯに溶解した。不溶の固形分をろ過して除去し、第三水抽出物のＤＭＳＯ溶液を得た。このとき、ＤＭＳＯに溶解している第三水抽出物の成分（以下「ＤＭＳＯ可溶成分」という）の濃度が、溶液中１０ｍｇ／ｍＬとなるようにした。
【００５６】
実施例２の（２）において、このように調製した第三水抽出物のＤＭＳＯ溶液を、酢酸エチル抽出物溶液の代わりに胞子懸濁液に添加した以外は、実施例２と同様に発芽率および付着器形成率を評価した。この際、胞子懸濁液中の前記ＤＭＳＯ可溶成分の濃度を１００μｇ／ｍＬとした。
【００５７】
［比較例５］水抽出物の活性
比較例４においてろ過により除去した固形分を水に溶解して、固形分濃度が１０ｍｇ／ｍＬの水溶液を得た。
【００５８】
実施例２の（２）において、酢酸エチル抽出物溶液の代わりに当該水溶液を胞子懸濁液に添加した以外は、実施例２と同様に発芽率および付着器形成率を評価した。この際、胞子懸濁液中の固形分濃度を１００μｇ／ｍＬとした。
【００５９】
実施例２および比較例１〜５の結果を図３に示す。図３の縦軸は、比較例２における発芽率および付着器形成率を１とした相対値である。図３から、実施例１の酢酸エチル抽出物が発芽率および付着器形成率を著しく低減させることが分かる。
【００６０】
［実施例３］酢酸エチル抽出物の分画
実施例１で得た酢酸エチル抽出物を、下記の溶媒を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー（Silica Gel 60N、関東化学株式会社製）により分画した。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
各画分について実施例２と同様にして発芽率および付着器形成率を評価した。結果を図４に示す。図４から、画分３および４に極めて優れた活性が確認された。
【００６３】
［実施例４］酢酸エチル抽出物の分画
実施例３で得た画分３について、下記の溶媒を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより分画した。
【００６４】
【表２】
2013180995.tif 000005
【００６５】
各画分を２０℃で乾燥して溶媒を除去し、固体または液体の成分を得た後、当該成分をＤＭＳＯに溶解し溶液とした。当該溶液を胞子懸濁液に添加し、実施例２と同様にして発芽率および付着器形成率を評価した。ただし、胞子懸濁液における固体または液体の成分濃度を１０μｇ／ｍＬとした。結果を図５に示す。図５から、画分３−２に極めて優れた活性が確認された。
【００６６】
［実施例５］酢酸エチル抽出物の分画
実施例３で得た画分４について、実施例４と同じ溶媒を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより分画し、画分４−１、画分４−２、および画分４−３を得た。
【００６７】
各画分について実施例４と同様にして発芽率および付着器形成率を評価した。結果を図６に示す。図６から、画分４−２に極めて優れた活性が確認された。
実施例４および５で得た画分３−２および４−２を混合し、ＬＣ／ＭＳ（Bruker Daltonics社製）およびＮＭＲ（Bruker Biospin社製）を用いて、活性物質の同定を行なった。その結果、以下の化合物を同定した。
【００６８】
【化４】
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【００６９】
［実施例６］ウリ炭そ病菌（Colletotricum orbiculare）に対する活性
実施例４および５で得た画分３−２および４−２を混合し、以下の溶媒を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより分画した。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
ウリ炭そ病菌として東京理科大学理工学部鎌倉研究室で維持している野生株を準備した。イネいもち病菌の代わりにウリ炭そ病菌を用い、かつ酢酸エチル抽出物の代わりに画分ａ〜ｅを用いて、実施例２と同様にして発芽率および付着器形成率を評価した。ただし、胞子懸濁液における固体または油状成分濃度は１０μｇ／ｍＬとした。結果を図７に示す。この結果から、酢酸エチル抽出物は、ウリ炭そ病菌による病害を防除する活性が高いことが明らかである。
【００７２】
［実施例７］イチゴ炭そ病菌（Glomerella cingulata）に対する活性
イチゴ炭そ病菌として東京理科大学理工学部鎌倉研究室で維持している野生株を準備した。ウリ炭そ病菌の代わりにイチゴ炭そ病菌を用いた以外は、実施例６と同様にして付着器形成率を評価した。結果を図８に示す。この結果から、酢酸エチル抽出物は、イチゴ炭そ病菌による病害を防除する活性が高いことが明らかである。
【００７３】
［参考例１］
実施例５で単離したＨＤＤＡがイネいもち病菌の呼吸に与える影響を検討した。具体的には、実施例１の（２）において、酢酸エチル抽出物溶液の代わりにＨＤＤＡを胞子懸濁液に添加し、溶存酸素計（Model SWC-301DO、株式会社三商製）の酸素電極を挿入した密閉容器内で撹拌培養することによって、イネいもち病菌の酸素消費量を測定した。この際、胞子懸濁液中のＨＤＤＡの濃度を５００μｇ／ｍＬとした。
【００７４】
比較のため、実施例１の（２）において、酢酸エチル抽出物溶液の代わりにＤＭＳＯを胞子懸濁液に添加した場合においての酸素消費量を測定した。胞子懸濁液中のＤＭＳＯの濃度は１質量％とした。結果を図９に示す。この結果から、ＨＤＤＡはイネいもち病菌の呼吸を阻害することが示唆された。
【符号の説明】
【００７５】
１  ミミズ糞土
１０  団粒の凝集体
１２  団粒
１４  団粒内隙間
１６  団粒間隙間
Ａ１  第一水相
Ａ２  固相
Ｂ１  第二水相
Ｂ２  有機相
Ｃ１  カルボン酸エステル相
Ｃ２  第三水相
Ｄ１  カルボン酸エステル抽出物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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