(57)【要約】【課題】  タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた、前記タンパク質を発現可能な大腸菌を培養することで組換えタンパク質を製造する方法において、前記タンパク質を効率的に製造するのに最適な溶存酸素濃度および酸素の供給方法を提供すること。【解決手段】  タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、溶存酸素濃度１０％から６０％の条件で培養することで、前記課題を解決する。具体的には、酸素移動速度２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上、ゲージ圧０．０５ＭＰａ以上、または通気する気体の酸素分圧を３０％以上とすることで、前記課題を解決する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、溶存酸素濃度１０％から６０％の条件で培養することで前記タンパク質を製造する方法。
【請求項２】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、酸素移動速度２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上で培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、ゲージ圧０．０５ＭＰａ以上かつ／または酸素分圧３０％以上の気体を通気する条件で培養する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記大腸菌が、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｆｃ結合性タンパク質が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法により得られた、遺伝子組換えタンパク質を発現可能な大腸菌を用いて、組換えタンパク質を効率的に製造する方法に関する。特に本発明は、前記大腸菌を一定の範囲の溶存酸素濃度で培養することで、組換えタンパク質の製造量を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌を利用した組換えタンパク質の生産は、特許文献１をはじめとし、これまでにも多くの例が報告されている。組換えタンパク質を効率的に製造するには、大腸菌細胞を高密度に培養することが必要である。大腸菌は酸素要求性が高いことから、大腸菌細胞を高密度に培養するにはより多くの酸素が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０００−５０１９３６号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５５８０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質のうちＦｃ受容体は、Ｆｃ結合性タンパク質の一つであり、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃ受容体はその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγ受容体、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃε受容体、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃα受容体などがある（非特許文献１）。また、各受容体は、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγ受容体の場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。Ｆｃ受容体は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある。またＦｃ受容体の機能である抗体（免疫グロブリン）の吸着能は、各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
Ｆｃ受容体を安価に製造することを目的に、Ｆｃ受容体を発現可能な遺伝子組換え体を利用した製造方法についてこれまで検討されており、例えば、組換え大腸菌を用いたＦｃγＲＩの製造方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、大腸菌を用いた発現系では、ＦｃγＲＩの発現量が極めて低いという問題点があった。
【０００７】
そこで本発明の目的は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた、前記タンパク質を発現可能な大腸菌を培養することで組換えタンパク質を製造する方法において、タンパク質、特にＦｃ結合性タンパク質を効率的に製造するのに最適な溶存酸素濃度および酸素の供給方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題に対し、組換え大腸菌培養における最適な溶存酸素濃度について鋭意検討した結果、本発明の完成に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
（ｉ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、溶存酸素濃度１０％から６０％の条件で培養することで前記タンパク質を製造する方法。
【００１０】
（ｉｉ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、酸素移動速度２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上で培養する、（ｉ）に記載の方法。
【００１１】
（ｉｉｉ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、ゲージ圧０．０５ＭＰａ以上かつ／または酸素分圧３０％以上の気体を通気する条件で培養する、（ｉ）または（ｉｉ）に記載の方法。
【００１２】
（ｉｖ）前記大腸菌が、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）である、（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載の方法。
【００１３】
（ｖ）  タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、（ｉ）から（ｉｖ）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（ｖｉ）Ｆｃ結合性タンパク質が、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質である、（ｖ）に記載の方法。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
大腸菌は増殖に大量の酸素を必要とするため、酸素の供給量を制御することが特に重要となる。本発明の製造方法では、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を、溶存酸素濃度１０％から６０％、好ましくは２０％から５０％の条件で培養することを特徴としている。前記溶存酸素濃度条件を満たすには、例えば酸素移動速度（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｔｅ、以下ＯＴＲと略する）を２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上、好ましくは２３０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上の条件で培養すればよい。ＯＴＲは、例えば、排気ガス中に含まれる酸素を分析計を用いて測定後、下記に示すＷａｎｇらの計算式（Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９７９）に各値を代入することで算出することができる。
【００１７】
ＯＴＲ＝７．３２×１０５（ＱｉＰｉｙｉ／Ｔｉ−Ｑ０Ｐ０ｙ０／Ｔ０）／ＶＬ
Ｑｉ：培養槽入口での通気量、Ｑ０：培養槽出口での通気量
Ｐｉ：培養槽入口での圧力、Ｐ０：培養槽出口での圧力
ｙｉ：培養槽入口での気体中の酸素のモル分率
ｙ０：培養槽入口での気体中の酸素のモル分率
Ｔｉ：培養槽出口での気体温度、Ｔ０：培養槽出口での気体温度
ＶＬ：培養液量
すなわち、ＯＴＲを２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上にするには、培養槽における撹拌回転数を増加させる、培養槽を加圧することで培養液中への酸素溶解度を増加させる、培養槽に導入する気体中の酸素分圧を上昇させる、等行なえばよい。具体的には、培養槽を加圧する方法を採用する場合は、ゲージ圧０．０５ＭＰａ以上、好ましくはゲージ圧０．１ＭＰａ以上の条件で培養すればよく、培養槽に導入する気体中の酸素分圧を上昇させる方法を採用する場合は、酸素分圧が３０％以上、好ましくは４０％以上の条件で培養すればよい。なお組換え大腸菌を培養する際、菌体増殖が活発な対数増殖期および遺伝子組換えタンパク質の発現誘導時に特に大量の酸素を必要とし、それ以降はさほど酸素を必要としない。したがって本発明の製造方法では、少なくとも対数増殖期および発現誘導時においてＯＴＲを前記値以上とすればよい。具体的には、培養槽を加圧する方法を採用する場合、少なくとも対数増殖期および発現誘導時においてゲージ圧を０．０５ＭＰａ以上とすればよく、それ以降は常圧に落としてよい。また培養槽に導入する気体中の酸素分圧を上昇させる方法を採用する場合、少なくとも対数増殖期および発現誘導時において酸素分圧を３０％以上とすればよく、それ以降は通常の空気を導入してもよい。
【００１８】
本発明の製造方法のうち、組換え大腸菌を培養するのに用いる培地成分については、前記組換え大腸菌を増殖可能であり、かつ発現ベクターに挿入したポリヌクレオチドから翻訳されるタンパク質を発現可能なものであれば特に限定はない。培地に含まれる炭素源の一例として、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、粗糖、糖蜜があげられる。培地に含まれる窒素源の一例として、酵母エキス、ポリペプトン、カゼインおよびその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキスがあげられるが、中でも酵母エキスが窒素源として好ましい。なお、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩やマンガン塩などの金属塩をさらに培地に添加してもよい。金属塩の具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅（ＩＩ）、塩化銅（ＩＩ）、硫酸マンガン、塩化マンガン（ＩＩ）があげられる。さらに必要に応じ、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンといったビタミン類を培地に添加してもよい。
【００１９】
なお本発明の製造方法において、組換え大腸菌を培養する際、培養開始時に炭素源や窒素源といった栄養源を一度に培地に投入すると、組換え大腸菌の増殖およびタンパク質製造が阻害されたり、酢酸などの副生成物が生産されたりするため、タンパク質の発現効率および得られたタンパク質の品質に悪影響を与える可能性がある。そのため、培養開始時に投入する栄養源は最小限とし、培養中に栄養源を追加供給（流加）しながら培養を行なう流加培養により、タンパク質を製造すると好ましい。
【００２０】
本発明の好ましい製造方法である、流加培養によるタンパク質製造の一例を以下に述べる。必要最小限の炭素源および窒素源を投入した培地に、必要に応じて金属塩やビタミン類等を添加した後、組換え大腸菌の培養を開始する。組換え大腸菌の増殖により炭素源が消費され所定の濃度まで低下した時点で、培養液中の炭素源を所定の濃度に維持しつつ、炭素源と窒素源を供給（流加）して培養することで、組換え大腸菌からタンパク質を発現させ、製造する。培養開始時に投入する炭素源の濃度は、炭素源がグルコースの場合、０から２０ｇ／Ｌとすると好ましい。また供給（流加）する炭素源と窒素源は、高濃度の溶液とすると培養液の液量増加を抑えられるため好ましく、炭素源をグルコース、窒素源を酵母エキスとした場合、供給（流加）するグルコース溶液の濃度は３００から９００ｇ／Ｌに、酵母エキス溶液の濃度は１５０から５００ｇ／Ｌに、それぞれすると好ましい。炭素源と窒素源を供給（流加）する際維持する、所定の濃度とは、炭素源が枯渇せず有機酸などの副生成物が生産しない濃度をいう。炭素源をグルコースとした場合、炭素源濃度が５ｇ／Ｌを超えた状態で培養を行なうと副生成物として有機酸が生産され、それが多量に蓄積することにより組換え大腸菌の増殖や組換えタンパク質の生産を抑制する可能性があるため、好ましくない。よって、炭素源をグルコースとした場合の所定の濃度とは、少なくとも５ｇ／Ｌ以下、好ましくは１ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは０．１ｇ／Ｌ以下である。炭素源供給量の制御は、例えば、炭素源を供給するポンプの稼働時間より行なうことができる。炭素源の枯渇をモニターする方法は特に限定はなく、一例として呼吸活性の低下によりモニターすることができる。呼吸活性の低下は、例えば培養液の溶存酸素濃度（ＤＯ）の上昇、排ガス中の酸素濃度の上昇、炭酸ガス濃度の低下、ｐＨの上昇として現れる。特に、ＤＯは応答が速いことから、炭素源の枯渇をモニターするのに好ましい指標である。その理由として、炭素源の濃度が十分に維持されている場合には、微生物の呼吸により酸素が消費されるためＤＯは酸素飽和濃度より低い値に維持されるが、炭素源が枯渇すると微生物の呼吸活性が低下しＤＯが急激に上昇するためである。なお、ＤＯの急激な上昇に連動させて炭素源を追加する方法をＤＯスタット法という。ＤＯ以外の指標（排ガス組成、炭酸ガス濃度、ｐＨ上昇）でモニターしてもよいが、その場合ＤＯを指標とした場合と比較し応答が遅いという欠点がある。窒素源の供給（流加）量は、炭素源供給（流加）量に比例した量を供給（流加）すればよい。窒素源の供給（流加）方法は特に限定はなく、例えば、炭素源水溶液と窒素源水溶液を任意の濃度で混合し、当該混合液を培地に供給（流加）する方法が例示できる。
【００２１】
本発明の製造方法における組換え大腸菌の培養条件は、製造に用いる組換え大腸菌が増殖しタンパク質を発現し得る条件であれば特に限定はないが、培養温度は１５から５０℃が好ましく、特に好ましい温度は２０から３３℃である。ｐＨは６から８が好ましい。培養時間は任意に設定できるが、通常は数時間から１００時間の間に設定される。
【００２２】
本発明の好ましい製造方法では、組換え大腸菌からのタンパク質発現を誘導するために、培養開始から一定時間経過後、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に添加して、さらに培養する。ＩＰＴＧの濃度は最終濃度として０．０１から２．０ｍＭが好ましく、特に好ましい濃度は最終濃度０．１から２．０ｍＭである。
【００２３】
本発明の製造方法で製造可能なタンパク質の一例として、インシュリン、インターフェロン、インターロイキン、抗体、エリスロポエチン、成長ホルモン、およびそれらの受容体のタンパク質等があげられる。以降、本発明の製造方法で製造するタンパク質の好ましい例である、Ｆｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。
【００２４】
本発明の製造方法で製造する、Ｆｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域と結合する細胞表面に存在する受容体タンパク質である。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体の場合、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩなどがあげられる。本発明の製造方法で製造するＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（Ｂ）の具体例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ以下の（１）から（１４６）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含むＦｃ結合性タンパク質があげられる（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（１）配列番号１の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（２）配列番号１の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３）配列番号１の２０番目のスレオニンがイソロイシンまたはプロリンに置換
（４）配列番号１の２５番目のスレオニンがメチオニン、アルギニンまたはリジンに置換
（５）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（６）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（７）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（８）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（９）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（１０）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（１１）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１２）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（１３）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、トリプトファン、アルギニンまたはプロリンに置換
（１４）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（１５）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（１６）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１７）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（１８）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（１９）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（２０）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２１）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２２）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（２３）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（２４）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の６２番目のアラニンがグルタミン酸またはバリンに置換
（２６）配列番号１の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンまたはイソロイシンに置換
（２７）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（２８）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（２９）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（３０）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（３１）配列番号１の６９番目のセリンがアラニン、フェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（３２）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（３３）配列番号１の７１番目のアルギニンがチロシンまたはヒスチジンに置換
（３４）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（３５）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（３６）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（３７）配列番号１の７７番目のバリンがアスパラギン酸、リジン、アラニンまたはグルタミン酸に置換
（３８）配列番号１の７８番目のアスパラギンがセリン、グリシンまたはアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（４０）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（４１）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（４２）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（４３）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（４４）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（４５）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４６）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（４７）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（４８）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（４９）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（５０）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（５１）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（５２）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（５３）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（５４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（５５）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（５６）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（５７）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（５８）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（５９）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（６０）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（６１）配列番号１の１３１番目のロイシンがグルタミン、アルギニンまたはプロリンに置換
（６２）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（６３）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（６４）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（６５）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（６６）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（６７）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（６８）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（６９）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（７０）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（７１）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（７２）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（７３）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがアルギニンまたはロイシンに置換
（７４）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（７５）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（７６）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（７７）配列番号１の１５６番目のロイシンがヒスチジンまたはプロリンに置換
（７８）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（７９）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（８０）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリン、ロイシンまたはメチオニンに置換
（８１）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（８２）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（８３）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（８４）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（８５）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（８６）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（８７）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（８８）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（８９）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（９０）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（９１）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（９２）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（９３）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがアラニンまたはスレオニンに置換
（９４）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（９５）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（９６）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（９７）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（９８）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（９９）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１００）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１０１）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（１０２）配列番号１の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジン、アルギニンまたはプロリンに置換
（１０３）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０４）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１０５）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１０６）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１０７）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１０８）配列番号１の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニン、リジンまたはバリンに置換
（１０９）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１１０）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１１１）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１１２）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１１３）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１１４）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１１５）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１１６）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１１７）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１１８）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがグリシンまたはアスパラギン酸に置換
（１１９）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２０）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１２１）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１２２）配列番号１の２４８番目のロイシンがイソロイシンまたはセリンに置換
（１２３）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１２４）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１２５）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１２６）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１２７）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１２８）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１２９）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１３０）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１３１）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１３２）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１３３）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１３４）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１３５）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１３６）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１３７）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１３８）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１３９）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１４０）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１４１）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンまたはヒスチジンに置換
（１４２）配列番号１の２８５番目のロイシンがアルギニン、ヒスチジンまたはグルタミンに置換
（１４３）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１４４）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１４５）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１４６）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
なお、本発明の製造方法で製造するＦｃ結合性タンパク質では、分析・精製の迅速化やタンパク質の安定化等の目的でＮ末端側、Ｃ末端側またはＦｃ結合性タンパク質内部に、ポリヒスチジンタグやＣ−ｍｙｃタグといった任意のペプチドを付加してもよく、不溶性担体への固定化目的でシステイン残基を一つ以上含むシステインタグ（例えば、配列番号２の３０８番目のグリシンから３１８番目のグリシンまでのアミノ酸からなるオリゴペプチド）をＮ末端側またはＣ末端側に付加してもよい。
【００２５】
本発明の製造方法で製造する、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製するには、Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する必要があるが、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおけるコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）は必ずしもヒトに合わせる必要はなく、例えば、大腸菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ、当該宿主におけるコドンの使用頻度が少ないもの）の全部または一部を、コードするアミノ酸を同一のまま、大腸菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドであってもよい。なお、コドンの使用頻度の情報は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）から得ることができる。
【００２６】
本発明の製造方法で用いる、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するベクターに特に限定はなく、大腸菌で異種タンパク質を発現可能なベクターの中から、適宜選択し使用すればよい。具体例としては、ｐＴｒｃ９９ａ（ライフテクノロジーズ社製）があげられる。
【００２７】
本発明の製造方法で組換え大腸菌より発現したＦｃ結合性タンパク質を定量する方法としては、一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した後に色素や免疫学的方法で染色して比色定量する方法やＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法などの方法を用いることができるが、ＥＬＩＳＡ法による活性定量が簡便で好ましい。ＥＬＩＳＡ法におけるＦｃ結合性タンパク質の組み合わせは前記タンパク質が定量できる方法であれば特に限定されないが、
（ａ）Ｆｃ結合性タンパク質に対する抗体
（ｂ）Ｆｃ結合性タンパク質
（ｃ）酵素標識抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体
の順番で重ねたサンドイッチ法による方法を好ましく用いることができる。
ここで酵素標識抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体として、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で標識された抗Ｆｃ結合性タンパク質抗体が好ましく使用することができる。また、ＥＬＩＳＡによる検出法についても特に限定されないが、標識に用いた酵素の特異的発色試薬、蛍光試薬または化学発光試薬が市販されており、それらを標識に用いた酵素に応じて任意に使用することができる。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた場合は発色基質をペルオキシダーゼと過酸化水素で酸化反応させて比色定量する方法があり、例えばＴＭＢ  ２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（フナコシ社製）などの市販の試薬で発色させた後、市販の測定装置（例えばマイクロタイタープレートリーダＭＰＲＡ４ｉ、東ソー社製）で比色定量することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換して得られた組換え大腸菌を培養してタンパク質を製造する方法において、溶存酸素濃度１０％から６０％の条件で培養することを特徴としており、前記製造方法により組換え大腸菌の効率的な培養および組換え大腸菌からの効率的なタンパク質の発現を実現することができる。具体的には、酸素移動速度２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上、ゲージ圧０．０５ＭＰａ以上、または通気する気体の酸素分圧を３０％以上とすることで、前記溶存酸素濃度条件の範囲となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１の製造方法における、溶存酸素濃度の推移を示した図。図中、横軸は時間（単位は時間）を示し、縦軸は溶存酸素濃度（単位は％）を示す。
【図２】実施例１の製造方法における、形質転換体（組換え大腸菌）の増殖およびヒトＦｃγＲＩ生産量を示した図。図中、横軸は時間（単位は時間）を示し、縦軸のうち、白丸は微生物の増殖量を示す６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００、単位は任意単位）を、黒三角はＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ）生産量（単位はｍｇ／Ｌ）をそれぞれ示す。
【図３】比較例１の製造方法における、溶存酸素濃度の推移を示した図。図中、横軸は時間（単位は時間）を示し、縦軸は溶存酸素濃度（単位は％）を示す。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明の製造方法によるＦｃ結合性タンパク質の製造を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な組換え大腸菌を、ゲージ圧０．１２ＭＰａに加圧して培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産を行なった。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードする、配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを、公知の方法（例えば特許文献２の方法）により、プラスミドｐＴｒｃ９９ａのＮｃｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入することで、発現ベクター（ｐＴｒｃｐｅｒＢＦｃＲｍ３６ｂＤ４Ｃ）を作製した。なお、配列番号２のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までの領域）、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３６ｂのアミノ酸配列、３０８番目のグリシンから３１８番目のグリシンまでが不溶性担体に固定化させるためのシステインタグである。なおＦｃＲｍ３６ｂは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒト天然型ＦｃγＲＩのうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつ、下記に示すアミノ酸置換を行なったＦｃ結合性タンパク質である。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンをプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンをリジンに置換
（３）配列番号１の３５番目のグルタミンをロイシンに置換
（４）配列番号１の３６番目のグルタミン酸をグリシンに置換
（５）配列番号１の３８番目のスレオニンをセリンに置換
（６）配列番号１の４１番目のロイシンをメチオニンに置換
（７）配列番号１の４５番目のバリンをアラニンに置換
（８）配列番号１の４６番目のロイシンをプロリンに置換
（９）配列番号１の４９番目のプロリンをセリンに置換
（１０）配列番号１の５２番目のセリンをグリシンに置換
（１１）配列番号１の６０番目のグリシンをアスパラギン酸に置換
（１２）配列番号１の６３番目のスレオニンをイソロイシンに置換
（１３）配列番号１の６５番目のスレオニンをアラニンに置換
（１４）配列番号１の６９番目のセリンをスレオニンに置換
（１５）配列番号１の７１番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（１６）配列番号１の７７番目のバリンをグルタミン酸に置換
（１７）配列番号１の７８番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（１８）配列番号１の１００番目のイソロイシンをバリンに置換
（１９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンをロイシンに置換
（２０）配列番号１の１３３番目のチロシンをヒスチジンに置換
（２１）配列番号１の１３９番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（２２）配列番号１の１４９番目のトリプトファンをアルギニンに置換
（２３）配列番号１の１５２番目のアスパラギンをスレオニンに置換
（２４）配列番号１の１５６番目のロイシンをプロリンに置換
（２５）配列番号１の１６０番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（２６）配列番号１の１６３番目のアスパラギンをセリンに置換
（２７）配列番号１の１７３番目のリジンをアルギニンに置換
（２８）配列番号１の１８１番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（２９）配列番号１の１９５番目のアスパラギンをスレオニンに置換
（３０）配列番号１の２０３番目のロイシンをヒスチジンに置換
（３１）配列番号１の２０６番目のアスパラギンをスレオニンに置換
（３２）配列番号１の２０７番目のロイシンをグルタミンに置換
（３３）配列番号１の２３１番目のメチオニンをリジンに置換
（３４）配列番号１の２４０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（３５）配列番号１の２８３番目のロイシンをヒスチジンに置換
（３６）配列番号１の２８５番目のロイシンをグルタミンに置換
（Ｂ）（Ａ）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｒＢＦｃＲｍ３６ｂＤ４Ｃを用いて、公知の方法（例えば特許文献２の方法）により、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を形質転換した。
（Ｃ）形質転換体（組換え大腸菌）を、１００ｍＬの２×ＹＴ培地（バクトトリプトン（ベクトンディッキントン社製）：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製）：１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ、アンピシリン：０．１ｍｇ／Ｌ）を入れた、５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間、毎分１３０回の回転速度、回転半径１インチで前培養を行なった。
（Ｄ）表１に示す培地組成のうち、酵母エキス、リン酸三ナトリウム・十二水和物およびリン酸水素二ナトリウム・十二水和物を投入した培地約３．０Ｌを１０Ｌの培養槽に入れ、１２１℃で２０分間滅菌後、グルコース、硫酸マグネシウム・七水和物、硫酸鉄（ＩＩ）・七水和物および塩化マンガン（ＩＩ）・四水和物を、表１に示す濃度にそれぞれなるよう添加し、さらに（Ａ）の前培養液１５０ｍＬを添加することで、本培養を行なった。
【００３２】
【表１】
2013188141.tif 000003
培養装置はエイブル社製ＢＭＳ−１０を使用し、培養槽に導入した空気の速度は５．０Ｌ／分に、培養温度は３０℃に、ｐＨは６．９から７．１にそれぞれ設定し、培養中におけるｐＨの変動は、１４％アンモニア水または５０％リン酸の添加により前記範囲に制御した。培養開始８時間後からゲージ圧０．１２ＭＰａに加圧した。この場合のＯＴＲ（酸素移動速度）最大値は２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）であった。培養８時間以降、培養終了まで溶存酸素濃度は２０％から５０％の範囲に維持された（図１）。培養中はグルコース分析計（ＹＳＩ社製２７００）を用いて定期的にグルコース濃度を測定した。炭素源の供給には７００ｇ／Ｌのグルコースを、窒素源の供給には４００ｇ／Ｌの酵母エキス（オリエンタル酵母工業社製）を、それぞれ使用した。供給は、炭素源の溶液と窒素源の溶液を容量比１：１で混合して行なった。培養開始８時間後から供給を開始した。培養１０時間から３１時間までは、菌体の増殖に合わせて段階的にポンプの回転速度を上昇し、供給を行なった。供給にはワトソン・マーロウ社製定量ポンプ１０１Ｕの高速型を使用した。微生物の増殖は培養液の６００ｎｍの濁度（ＯＤ６００）により測定した。
（Ｅ）ＯＤ６００が２００に達したとき、すなわち培養開始３１時間後に、培養温度を２５℃に下げ、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるよう培養液に添加することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産誘導をかけた。なお培養開始３１時間以降は、圧力を大気圧に下げて培養を行なった。またエイブル社製ＤＯ（溶存酸素）電極による信号を、エイブル社製培養制御プログラムをインストールしたパーソナルコンピューターにより検出することで、培養液中のグルコース（２０ｇ／Ｌ）が消費されたことを検知し、溶存酸素濃度が４０％飽和を超えた時点で流加ポンプを起動して、３５０ｇ／Ｌのグルコースと２００ｇ／Ｌの酵母エキスとの混合液を供給した。
【００３３】
７２時間培養を行なったところ、培養液の濁度（ＯＤ６００）は２３０に達した。あらかじめ求めた濁度と菌体密度の相関式より、乾燥菌体収量は培養液１Ｌあたり６５ｇと求められた。なお、グルコース濃度は、グルコースと酵母エキスの供給を開始した、培養開始８時間後から培養終了（７２時間後）までの期間中、０から０．１ｇ／Ｌに維持された。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり５００ｍｇであった（図２）。
【００３４】
実施例２
培養槽に導入する気体の酸素分圧を５０％とし（混合比：空気／純酸素＝０．６３／０．３７）、培養槽のゲージ圧を０ＭＰａとした他は、実施例１と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。培養８時間以降、培養終了まで溶存酸素濃度は２０％から５０％の範囲に維持された。この際のＯＴＲ最大値は２３０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）であった。７２時間培養を行なったところ、培養液の濁度は２３０に達した（乾燥菌体収量６５ｇ／Ｌ）。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり５９０ｍｇであった。
【００３５】
比較例１
培養時の圧力を大気圧（ゲージ圧０ＭＰａ）、培養槽に導入する気体を空気とした他は、実施例１と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を培養した。培養８時間以降、発現誘導までの間、溶存酸素濃度は０％となった（図３）。この際のＯＴＲ最大値は１５０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）であった。７２時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１７０に達した（乾燥菌体収量４９ｇ／Ｌ（培養液））。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質の生産量をＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり３００ｍｇであった。
【００３６】
実施例および比較例の結果を表２にまとめる。ＯＴＲ最大値が２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上（すなわち溶存酸素濃度１０％から６０％）の条件（実施例）で培養を行なうと、ＯＴＲ最大値が２００ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）未満（すなわち溶存酸素濃度１０％未満）の条件（比較例）で培養を行なったときと比較し、Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ）の生産量が向上することがわかる。また実施例１と実施例２を比較すると、ＯＴＲ最大値が２３０ｍｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）以上の条件で培養を行なうと、Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ）の生産量がさらに向上することがわかる。
【００３７】
【表２】
2013188141.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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