(57)【要約】【課題】  淋菌検査において、従来の検査キットと比較し、高感度、高特異性、かつ迅速に結果が得られる方法を提供すること。【解決手段】  淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する、特定の塩基配列からなる第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する、特定の塩基配列からなる第二のプライマーとを用いて、前記特定塩基配列を含むポリヌクレオチドを増幅し検出することにより、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いて、前記特定塩基配列を含むポリヌクレオチドを増幅することで、試料中の淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを検出する方法であって、
前記第一のプライマーが、配列番号１４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが、配列番号２４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記検出方法。
【請求項２】
前記第一のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列の相補配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが、配列番号２３に記載の塩基配列の相補配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記第一または第二のプライマーのいずれか一方は、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を少なくとも付加している、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列を含むポリヌクレオチドの増幅を、
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により行なう、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
生成したＲＮＡ転写産物を、当該転写産物の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブを用いて検出し、かつ前記プローブの塩基配列が配列番号３０または３１に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの塩基配列である、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程の前に、
前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１５塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、請求項４または５に記載の検出方法。
【請求項７】
配列番号１４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、
配列番号２４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、
を少なくとも含む、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速かつ高感度に淋菌を検出する方法、および当該方法を用いた検出試薬に関する。本発明は、臨床検査、公衆衛生の分野に有用である。
【背景技術】
【０００２】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）はナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属に属するグラム陰性の双球菌であり、淋菌感染症の原因微生物である。
【０００３】
淋菌感染症は、性感染症の中では性器クラミジア感染症と並び、頻度の高い感染症である。主に性行為で感染し、男性では尿道炎を、女性では子宮頚管炎や尿道炎を、それぞれ引き起こす。また重症になると、男性では精巣上体炎が、女性では骨盤内炎症性疾患が、それぞれ生じる。
【０００４】
近年、性行動の多様化を反映して、咽頭や直腸感染など、性器外の感染例が増加している。このような場合、症状に乏しい場合が多く、無自覚のうちに他者への感染源となる場合がある（非特許文献１）。
【０００５】
日本において淋菌感染症は、定点把握疾患の一つとして、発生動向調査が行なわれている。それによると、男性では、淋菌感染症の発生件数は性器クラミジア感染症の発生件数とほぼ等しく、それぞれ性感染症全体の約４０％を占めている。一方、女性では、淋菌感染症は性感染症全体の約１０％程度である（非特許文献２）。
【０００６】
淋菌感染症は、一般的に女性の場合、感染しても無症状の例（無症候性感染）が多い。そのため治療をせず、男性における淋菌感染症の主たる感染源となることが多い。特に淋菌が咽頭に感染した場合の多くは炎症症状が乏しく、検査が実施されない場合が多い。
【０００７】
前述したように、女性の淋菌感染や咽頭への淋菌感染は、比較的症状が軽微であることが多いため、医療機関を受診しない患者が多数存在する。しかしながら、無症候性感染者でも他者への淋菌感染源となり得る。また女性の場合、感染を放置すると子宮外妊娠、不妊症、分娩時の産道感染による新生児結膜炎等、重篤な合併症が生じる可能性もある。そのため、淋菌への感染が判明した時点で、確実に治療することが必要であり、感染が疑われる患者や妊婦に対し、淋菌検査を実施することは大変重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許３２４１７１７号公報
【特許文献２】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献３】特開２００１−０３７５００号公報
【特許文献４】特許２６５０１５９号公報
【特許文献５】特許３１５２９２７号公報
【特許文献６】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献７】特開２００１−０１３１４７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】性感染症  診断・治療  ガイドライン、４９−５６（２００８）
【非特許文献２】古屋隆三郎、日本臨牀、６７（１）、１２９−１３５（２００９）
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来より臨床現場で用いられている淋菌感染症の検査法としては、尿道分泌物のグラム染色標本の検鏡検査、分離培養法による検査、核酸増幅検査等があげられる。グラム染色による検鏡検査は、迅速な検査法であるものの、他の雑菌が存在すると淋菌の確認が困難となる問題があった。培養法による検査は、他の雑菌が混入すると淋菌の確認が困難となること、淋菌が熱、乾燥、温度変化に弱く検体輸送中に菌が死滅しやすいこと、操作が繁雑であること、結果に数日間を要するため迅速検査には向かないこと、などの問題があった。一方、核酸増幅検査は、淋菌に特異的な遺伝子（ＤＮＡやＲＮＡ）を増幅し検出する方法であり、ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ法やＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等が、ＲＮＡを増幅する方法としてＴＭＡ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（特許文献１）等が、それぞれ用いられている。核酸増幅検査は、感度、特異性ともに従来の検査と比較して極めて高く、また非侵襲検体である尿検体が使用できる点で、現在は本検査が主流となりつつある。
【００１１】
核酸増幅を利用した淋菌検査に関しては検査キットが市販されており、一例として、コバスアンプリコアＳＴＤ−１（ロシュ社、ＰＣＲ法を利用）、ＢＤプローブテックＥＴ（ベクトン・ディッキンソン社、ＳＤＡ法を利用）、アプティマコンボ２（ジェン・プローブ社、ＴＭＡ法を利用）があげられる。しかしながら前記キットによる淋菌検査は、淋菌以外のナイセリア属菌に対する交差反応性の問題や、検査終了まで要する時間が長い（４時間から５時間程度）という問題があった。医師が、医療機関を訪れた患者に対し、淋菌に感染しているか否かを当日中に診断するには、検査結果を少なくとも２時間以内に提示できるシステムが好ましい。そのため、より迅速な淋菌検査法が求められている。
【００１２】
また淋菌が属するナイセリア属菌には、ヒトに細菌性髄膜炎を引き起こす髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等、ヒトに対して病原性を有する菌の他に、多くの非病原性の菌が存在する。非病原性のナイセリア属菌のいくつかは、常在菌としてヒトの口腔内に普通に見られる。そのため、淋菌の検査において、特に咽頭を検査する際は、淋菌に対する高い感度とともに、高い特異性を有することが必要である。
【００１３】
そこで本発明の目的は、核酸増幅を利用した淋菌検査において、従来のキットと比較し、高感度、高特異性、かつ迅速に結果が得られる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち本発明の第一の態様は、
淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いて、前記特定塩基配列を含むポリヌクレオチドを増幅することで、試料中の淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを検出する方法であって、
前記第一のプライマーが、配列番号１４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが、配列番号２４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記検出方法である。
【００１６】
また本発明の第二の態様は、
前記第一のプライマーが、配列番号１１に記載の塩基配列の相補配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
前記第二のプライマーが、配列番号２３に記載の塩基配列の相補配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記第一の態様に記載の検出方法である。
【００１７】
また本発明の第三の態様は、前記第一または第二のプライマーのいずれか一方は、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を少なくとも付加している、前記第一または第二の態様に記載の検出方法である。
【００１８】
また本発明の第四の態様は、
淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列を含むポリヌクレオチドの増幅を、
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により行なう、前記第三の態様に記載の検出方法である。
【００１９】
また本発明の第五の態様は、生成したＲＮＡ転写産物を、当該転写産物の一部の塩基配列と相補的２本鎖を形成すると、形成前と比較し蛍光特性が変化するプローブを用いて検出し、かつ前記プローブの塩基配列が配列番号３０または３１に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの塩基配列である、前記第四の態様に記載の検出方法である。
【００２０】
また本発明の第六の態様は、
第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程の前に、
前記特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素により、前記特定塩基配列の５’末端側を切断する工程を行ない、
かつ前記切断用オリゴヌクレオチドが、配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１５塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記第四または第五の態様に記載の検出方法である。
【００２１】
さらに本発明の第七の態様は、
配列番号１４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、
配列番号２４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドと、
を少なくとも含む、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの検出試薬である。
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明の検出方法では、淋菌を高感度に検出するため、細胞当たりの含有量（ＲＮＡコピー数）が多い、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を標的に選択した。また淋菌に対する特異性を高めるため、淋菌ｒＲＮＡ配列のうち、淋菌に特異的な配列を探索することで、本発明の検出方法および検出試薬で使用するオリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ）を設計した。
【００２４】
本発明における試料の例として、食品、飲料水、環境水、糞便、嘔吐物、鼻腔・咽頭・尿道・子宮頚管等のぬぐい液、うがい液、血液、尿、その他分泌液、体液、組織洗浄液があげられる。
【００２５】
本発明において特定塩基配列とは、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡのうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同的なＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列のことをいう。すなわち本発明では、前記特定塩基配列またはその相補配列を含むポリヌクレオチドが増幅されることになる。
【００２６】
本発明におけるストリンジェントな条件の例として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載のＲＮＡ増幅条件があげられる。
【００２７】
本発明の検出方法で使用するプライマーのうち、第一のプライマーは配列番号１４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の５５番目から２０１番目までの塩基配列の相補配列）中の少なくとも連続した１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであればよく、第二のプライマーは配列番号２４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３８７番目から４４８番目までの塩基配列）中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであればよい。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。プライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から５０塩基までの範囲である。
【００２８】
本発明の検出方法では、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅して検出を行なう。前記ポリヌクレオチドを増幅する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ法（特許文献１）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許文献４および５）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法（特許文献２および３、非特許文献３）があげられ、適宜選択可能である。その中でも、混入するＤＮＡの影響を受けず、かつ一定温度でＲＮＡ増幅が可能な、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法またはＴＲＣ法が好ましい。
【００２９】
ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法またはＴＲＣ法による、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列からなるＲＮＡの増幅は、
（１）第二のプライマーおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを鋳型とした特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素による、ＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）第一のプライマーおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型とした特定塩基配列または特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、および
（５）前記ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の工程におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
により行なう。
【００３０】
前記（１）の工程で使用するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（２）の工程で使用するＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素、および前記（３）で使用するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、それぞれ別個の酵素を用いてもよいし、複数の活性を有する酵素を組み合わせて用いてもよいが、前記３つの活性全てを有する酵素を用いると好ましい。当該好ましい酵素の一例として、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素といった、分子生物学の分野で通常使用されるレトロウイルス由来の逆転写酵素があげられる。
【００３１】
前記（４）の工程で使用するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素は、分子生物学の分野で汎用されるバクテリアファージ由来の、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなどを使用することができる。第一または第二のプライマーの５’末端側に、前記（４）の工程で使用するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した、プロモーター配列を付加することで、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列を含むＲＮＡが転写される。なお、前記プロモーター配列に、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。
【００３２】
前記（１）から（５）の工程による淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列からなるＲＮＡ増幅反応は一定温度で行なうことができる。また反応温度は、前記（１）から（４）で使用する酵素が活性を示す範囲であれば、任意の温度で設定することが可能である。一例として、前記（１）から（３）で使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素であり、前記（４）で使用する酵素がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの場合、３５℃から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０℃から５０℃の範囲で設定すると好ましい。
【００３３】
前記（４）の工程で生成したＲＮＡ転写産物の検出は、従来より知られた核酸検出方法を利用することができ、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）当該転写配列の一部の塩基配列とハイブリダイズ（相補結合）することで蛍光特性が変化するように設計された蛍光物質標識プローブを用いた方法、
等があげられる。しかし、前記（Ａ）および（Ｂ）の方法は、操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。一方、前記（Ｃ）の方法は前記課題を解決可能な方法であるため、ＲＮＡ転写産物の検出法として好ましい。前記蛍光物質標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター標識プローブがあげられる。
【００３４】
インターカレーター標識プローブは、ＲＮＡ転写産物の一部の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ（相補結合）可能なオリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル部または塩基部分に、適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素を結合（標識）させたプローブであり、ＲＮＡ転写産物と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることで蛍光特性が変化するプローブである。本発明の測定方法で用いる試薬にインターカレーター標識プローブをさらに含むことで、前記（１）から（５）に示すＲＮＡ増幅反応を行ないつつ、蛍光特性の変化から、増幅したＲＮＡ転写産物を検出することができる（特許文献２および非特許文献３）。インターカレーター性蛍光色素としては、従来より知られた色素を用いることができ、一例として、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、ヘミシアニンおよびこれらの誘導体があげられる。インターカレーター性蛍光色素は相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって特定波長における蛍光強度が変化する。例えば、オキサゾールイエローは、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加する。なお本発明の検出方法でインターカレーター標識プローブを用いる場合、当該プローブの３’末端側の水酸基は適当な基で修飾し、３’末端側からの核酸伸長を防止するとよい（特許文献６および非特許文献４）。オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、従来より知られた方法で行なうことができ（特許文献６および非特許文献４）、市販のキット（例えばＬａｂｅｌ−ＯＮ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製））を利用してもよい。本発明の検出方法で使用するインターカレーター標識プローブの塩基配列は、具体的には、配列番号３０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１４６番目から１８８番目までの領域）または配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３８１番目から４１２番目までの領域）に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの塩基配列であればよい。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。プローブの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基から３０塩基までの範囲である。
【００３５】
第一のプライマーの５’末端側に、前記（４）の工程で使用するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素に対応した、プロモーター配列を付加した場合、前記（１）の工程の前に、
（０）淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’末端側に隣接した領域に相補的な切断用オリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素により、前記特定核酸配列の５’末端側を切断する工程、
を行なうと好ましい。特定塩基配列の５’末端部位で切断されることで、前記（１）の工程により合成したｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーの、プロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記（３）の工程で前記ｃＤＮＡの３’末端側を伸長することにより、効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。前記（０）の工程で使用するＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素は、前述したレトロウイルス由来の逆転写酵素（例えばＡＭＶ逆転写酵素）が有するＲＮａｓｅ  Ｈ活性を利用してもよいし、別途ＲＮａｓｅ  Ｈを添加してもよい。なお切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は、伸長反応を防止するために適当な修飾（例えばアミノ化）を施すと好ましい。本発明の検出方法で使用する切断用オリゴヌクレオチドは、具体的には、配列番号７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４１番目から１８９番目までの塩基配列）中の少なくとも連続する１５塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであればよい。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、前記塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。オリゴヌクレオチドの長さは任意に設定できるが、好ましくは１５塩基から５０塩基までの範囲である。
【００３６】
本発明の検出試薬は、少なくとも
配列番号１４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な第一のプライマーと、
配列番号２４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な第二のプライマーと、
を含んでいればよい。前記第一のプライマーの好ましい例として、配列番号８、９、１０、１１、１３のいずれかに記載の塩基配列の相補配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。また前記第二のプライマーの好ましい例として、配列番号１５から２３のいずれかに記載の塩基配列の相補配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。また、前記第一または第二のプライマーのいずれか一方は、その５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（例えば、配列番号３２に記載の配列からなるＴ７プロモーター配列）を少なくとも付加していると好ましい。
【００３７】
さらに本発明の検出試薬に、
配列番号３０または３１に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を結合（標識）させたインターカレーター標識プローブ、および／または
配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１５塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な切断用オリゴヌクレオチド、
を含んでいると好ましい。また前記切断用ヌクレオチドのさらに好ましい例として、配列番号１、２、３、４、６のいずれかに記載の塩基配列の相補配列中の少なくとも連続する１５塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。なお、前記切断用ヌクレオチドは、前記第一のプライマーの５’末端側と重複し、かつ当該重複部位から５’側に隣接した領域に相補的な配列である必要である。例えば、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の６７番目から８６番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドである場合、切断用ヌクレオチドの一例として配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の５６番目から７５番目までの塩基配列の相補配列）からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の５５番目から７４番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドである場合、切断用ヌクレオチドの一例として配列番号２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４１番目から６３番目までの塩基配列の相補配列）からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、
（ｉｉｉ）第一のプライマーが配列番号１０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の９４番目から１１７番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドである場合、切断用ヌクレオチドの一例として配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の７８番目から１０３番目までの塩基配列の相補配列）からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、
（ｉｖ）第一のプライマーが配列番号１１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１０７番目から１２６番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドである場合、切断用ヌクレオチドの一例として配列番号４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の９３番目から１１５番目までの塩基配列の相補配列）からなるオリゴヌクレオチドがあげられ、
（ｖ）第一のプライマーが配列番号１３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１８２番目から２０１番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドである場合、切断用ヌクレオチドの一例として配列番号６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１７０番目から１８９番目までの塩基配列の相補配列）からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
【００３８】
淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む試料に、本発明の検出試薬に含まれるオリゴヌクレオチド（プライマー・プローブ・切断用オリゴヌクレオチド）、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度３５から６５℃（好ましくは４０から５０℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定することにより、試料中の淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡの増幅および測定を、３０分以内に実施することが可能である。
【発明の効果】
【００３９】
本発明は、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーとを用いて、前記特定塩基配列を含むポリヌクレオチドを増幅することで、試料中の淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを検出する方法であって、前記第一のプライマーが、配列番号１４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが、配列番号２４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、ことを特徴としている。前記第一および第二のプライマーを用いることで、迅速かつ特異性高く、試料中に微量に含まれる淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅させることができる。よって遺伝子群や遺伝子型を問わず、淋菌を迅速かつ特異性高く検出することができる。
【００４０】
なお本発明では、配列番号３０または３１に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドにインターカレーター性蛍光色素を結合（標識）させたインターカレーター標識プローブを含んでいると好ましい。前記プローブをあらかじめ増幅系に添加することで、前記第一および第二のプライマーにより淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ中の特定塩基配列を増幅させつつ、前記プローブの蛍光特性の変化により、増幅した前記特定塩基配列を経時的に検出することができる。前記増幅反応および前記検出は、試料および必要成分を添加した後は、途中蓋を開けることなく密閉容器中で実施できるため、コンタミネーション防止という点でも好ましい。
【００４１】
本発明により試料中に含まれる淋菌を高感度に検出することができ、検出時間も従来技術と比較し迅速である。そのため、検査結果を従来よりも迅速に医師に提示することが可能となり、感染拡大防止、および、適切な薬剤の投与による耐性菌の発生の防止に寄与するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。なお、３’末端の水酸基からの伸長反応を防止するために３’末端の水酸基はグリコール酸修飾がなされている。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００４４】
実施例１  標準ＲＮＡの調製
以降の実施例で使用する淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は下記（１）から（４）に示す方法で調製した。
（１）淋菌（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９４２４）のＲＮＡ抽出物を用い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列領域の２本鎖ＤＮＡを調製した（なお、当該ＤＮＡの５’末端側にはＳＰ６プロモーターを付加している）。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを、定法に従い、ｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（３）（２）の形質転換大腸菌の培養物からプラスミドを抽出し、挿入ＤＮＡの３’末端側を制限酵素で消化し、直鎖状のＤＮＡを調製した。
（４）（３）で調製したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写を実施し、引き続きＤＮａｓｅ  Ｉ処理により前記２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製し、標準ＲＮＡを調製した。当該ＲＮＡは２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
【００４５】
調製した標準ＲＮＡは、淋菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列を含み、全長は約１５００塩基（当該ＲＮＡの５’末端にはＳＰ６プロモーターに由来する８塩基が付加されている）である。
【００４６】
実施例２  インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（ＩＮＡＦプローブ）の調製
インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を非特許文献４に記載の方法で調製した。具体的には、
配列番号２５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１７０番目から１８８番目までの塩基配列の相補配列）のうち５’末端から８番目のシトシンと９番目のアデニンの間、
配列番号２６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１７６番目から１９５番目までの塩基配列の相補配列）のうち５’末端から１０番目のシトシンと１１番目のシトシンの間、
配列番号２７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３８１番目から４０２番目までの塩基配列（ただし３８９番目はシトシンではなくチミン）の相補配列）のうち５’末端から７番目のチミンと８番目のグアニンの間、
配列番号２８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３９６番目から４１２番目までの塩基配列の相補配列）のうち５’末端から４番目のシトシンと５番目のグアニンの間、
配列番号２９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１４６番目から１６２番目までの塩基配列の相補配列）のうち５’末端から７番目のグアニンと８番目のアデニンの間、
のそれぞれリン酸ジエステル部分に、それぞれリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させたオキサゾールイエロー標識核酸プローブを調製した（図１）。
【００４７】
実施例３  淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットの検討（その１）
表１および２に示す、第一のプライマー、第二のプライマー、ＩＮＡＦプローブ、切断用オリゴヌクレオチドの組み合わせ（プライマーセット）を用いて、下記（１）から（４）に示す方法で標準ＲＮＡの測定を行ない、検出性能、特異性等について評価した。
（１）実施例１で調製した標準ＲＮＡを、ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｕ／μＬ  リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて、１０３コピー／５μＬになるように希釈し、ＲＮＡ試料として用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
【００４８】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
１．０μＭ  第一のプライマー（当該プライマーは、各配列番号に記載の塩基配列
の５’末端側にＴ７プロモータ配列（配列番号３２）を付加している）
１．０μＭ  第二のプライマー
２５ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例２で調製）
各０．１６μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（当該オリゴヌクレオチドの３’末端
側水酸基はアミノ基で修飾されている）
６Ｕ  リボヌクレアーゼインヒビター（タカラバイオ社）
１３．０％  ＤＭＳＯ
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５μＬを添加した。
【００４９】
酵素液の組成：反応時（３０μＬ中）の最終濃度
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素  （ライフサイエンス社）
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ  （インビトロジェン社）
３．６μｇ  牛血清アルブミン
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
【００５０】
酵素添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表１および２に示す。表中のＮｅｇａとは、標的核酸の代わりに注射用蒸留水を加えて反応させたものである。表中のＮ．Ｄ．とは、酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。表中の「判定」とは、標準ＲＮＡの検出時間、Ｎｅｇａの測定結果、蛍光強度比などから総合的に判断したものであり、良好な組み合わせから順番に「○」「△」「×」と記載している。
【００５１】
【表１】
2013188181.tif 000002
【００５２】
【表２】
2013188181.tif 000003
表１および２の結果より、
切断用オリゴヌクレオチドとして、配列番号７に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１５塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例である、
配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の５６番目から７５番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４１番目から６３番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の７８番目から１０３番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号４に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の９３番目から１１５番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１７０番目から１８９番目までの塩基配列の相補配列）、のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが、
第一のプライマーとして、配列番号１４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例である、配列番号８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の６７番目から８６番目までの塩基配列）、
配列番号９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の５５番目から７４番目までの塩基配列）、
配列番号１０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の９４番目から１１７番目までの塩基配列）、
配列番号１１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１０７番目から１２６番目までの塩基配列）、
配列番号１３に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１８２番目から２０１番目までの塩基配列）、のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが、
第二のプライマーとして、配列番号２４に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例である、
配列番号１５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３８７番目から４０４番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１６に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４０２番目から４１８番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４０３番目から４１９番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４０６番目から４２５番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１９に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４１２番目から４３５番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２０に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４２６番目から４４８番目までの塩基配列の相補配列）、のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが、
ＩＮＡＦプローブを構成するオリゴヌクレオチドとして、
配列番号３０または３１に記載の塩基配列中の少なくとも連続する１０塩基とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例である、
配列番号２５に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１７０番目から１８８番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２７に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３８１番目から４０２番目までの塩基配列（ただし３８９番目はシトシンではなくチミン）の相補配列）、
配列番号２８に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３９６番目から４１２番目までの塩基配列の相補配列）、のいずれかからなるオリゴヌクレオチドが、
それぞれ使用できることが分かった。
【００５３】
実施例４  淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットの検討（その２）
実施例３の結果、「○」と判定したオリゴヌクレオチドの組み合わせのうち、特に良好な性能であると判断した、以下の組み合わせについて、低濃度領域における標準ＲＮＡの測定を行なった。なお実験方法は、ＲＮＡ試料として１０２コピー／５μＬ、３００コピー／５μＬ、１０３コピー／５μＬを用いた他は、実施例３と同じである。
（組み合わせＡ）
切断用オリゴヌクレオチド：配列番号１、第一のプライマー：配列番号８
第二のプライマー：配列番号１５、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２５
（組み合わせＭ）
切断用オリゴヌクレオチド：配列番号２、第一のプライマー：配列番号９
第二のプライマー：配列番号１５、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２５
（組み合わせＡＫ）
切断用オリゴヌクレオチド：配列番号４、第一のプライマー：配列番号１１
第二のプライマー：配列番号１５、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２５
（組み合わせＡＭ）
切断用オリゴヌクレオチド：配列番号４、第一のプライマー：配列番号１１
第二のプライマー：配列番号１７、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２５
（組み合わせＢＫ）
切断用オリゴヌクレオチド：配列番号６、第一のプライマー：配列番号１３
第二のプライマー：配列番号１７、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２７
（組み合わせＢＳ）
切断用オリゴヌクレオチド：配列番号６、第一のプライマー：配列番号１３
第二のプライマー：配列番号１９、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２８
結果を表３に示す。本実施例で検討した６つの組み合わせのうち、組み合わせＡ／ＡＫ／ＡＭ／ＢＫ／ＢＳは、低濃度の淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出に特に好ましいことが判明した。
【００５４】
【表３】
2013188181.tif 000004
実施例５  淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットの検討（その３）
実施例４の結果、低濃度の淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出に好ましいとされた５つの組み合わせ（組み合わせＡ／ＡＫ／ＡＭ／ＢＫ／ＢＳ）について、反応特異性（交差反応性）を検討した。なお実験方法は、ＲＮＡ試料として下記に示す淋菌以外のナイセリア属菌培養物のＲＮＡ抽出物を用いた他は、実施例３と同様である。また培養物からのＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）を使用した。
【００５５】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｅｌｏｎｇａｔａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２５２９５）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｉｃｃａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２９２５６）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４６８５）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２３９７０）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｕｂｆｌａｖａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４９２７５）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４２２１）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｕｃｏｓａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２５９９９）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３１２０）
結果を表４に示す。本実施例で検討した５つの組み合わせのうち、組み合わせＡＫ／ＡＭ／ＢＳは、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡに対する反応特異性が特に高い（交差反応性が特に低い）ことが判明した。
【００５６】
【表４】
2013188181.tif 000005
また、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡに対する反応特異性が特に高かった３つの組み合わせ（組み合わせＡＫ／ＡＭ／ＢＳ）について、各反応液中のＲＮＡ増幅産物の有無をアガロース電気泳動にて確認した。結果を表５に示す。表５において、電気泳動における＋の数は、増幅産物に由来するバンドの濃さの程度を示したものであり、＋の数が多いほど増幅産物量が多いことを表している。−は増幅産物が生成しなかったことを表している。前記３つの組み合わせのうち、組み合わせＡＭがＲＮＡ増幅段階での特異性が最も高いことが判明した。
【００５７】
【表５】
2013188181.tif 000006
実施例６  淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットの検討（その４）
実施例５で選定したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（組み合わせＡＭ）のうち、第二のプライマーを、配列番号２１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の４０３番目から４１８番目までの塩基配列の相補配列）、配列番号２２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３９５番目から４１４番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３９５番目から４０９番目までの塩基配列の相補配列）からなるオリゴヌクレオチドに変更して、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４６８５）存在下での淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出を検討した。なお実験方法は、ＲＮＡ試料として、５０ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／ｔｅｓｔの淋菌ＲＮＡ抽出物と１０２ｃｆｕ／ｔｅｓｔから１０７ｃｆｕ／ｔｅｓｔのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４６８５）ＲＮＡ抽出物との混合物を用いた他は、実施例３と同様である。また菌からのＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）を使用した。
【００５８】
結果を表６に示す。第二のプライマーを配列番号１７（組み合わせＡＭ）から配列番号２３に変更することで、高濃度のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４６８５）が存在しても淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを検出できることが判明した。
【００５９】
【表６】
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実施例７  淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出用プライマーセットの検討（その５）
実施例６で選定したオリゴヌクレオチドの組み合わせ（切断用オリゴヌクレオチド：配列番号４、第一のプライマー：配列番号１１、第二のプライマー：配列番号２３、ＩＮＡＦプローブ：配列番号２５）のうち、ＩＮＡＦプローブを配列番号２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の３９６番目から４１２番目までの塩基配列の相補配列）または配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＪ２３９３０４の１４６番目から１６２番目までの塩基配列の相補配列）からなるプローブに変更して、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する交差反応性を検討した。なお実験方法は、ＲＮＡ試料として下記に示す髄膜炎菌培養物のＲＮＡ抽出物を用いた他は、実施例３と同様である。また培養物からのＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）を使用した。
【００６０】
髄膜炎菌（血清型Ａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３０７７）
髄膜炎菌（血清型Ｂ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＢＡＡ−３３５）
髄膜炎菌（血清型Ｃ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３１０２）
髄膜炎菌（血清型Ｄ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３１１３）
髄膜炎菌（血清型Ｙ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３５５６１）
髄膜炎菌（血清型Ｗ１３５）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３５５５９）
結果を表７に示す。配列番号２９に記載の塩基配列からなるＩＮＡＦプローブを用いたときは髄膜炎菌に対する交差反応性がないことが判明した。
【００６１】
【表７】
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実施例３から７までの検討で得られた、淋菌１６Ｓ  ｒＲＮＡを増幅検出するのに最適なオリゴヌクレオチドの組み合わせを表８に示す。
【００６２】
【表８】
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実施例８  選定したプライマーセットを用いた淋菌の検出
表８に記載のオリゴヌクレオチドの組み合わせ（プライマーセット）を用い、下記（１）から（３）に示す方法で淋菌の検出を行なった。
（１）トリプチケースソイ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ）培地（ベクトンディッキンソン社）を用い、５％ＣＯ２環境下で液体培養した淋菌（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９４２４）をＰＢＳで段階希釈し、希釈系列を調製した。淋菌の段階希釈液は、チョコレートＩＩ寒天培地（ベクトンディッキンソン社）に接種し、コロニー数をカウントすることで濃度を決定した。
（２）（１）で調製した淋菌希釈系列を、ＥＸＴＲＡＧＥＮ  ＩＩ（東ソー社）で抽出し、ＲＮＡ抽出物を調製した。
（３）オリゴヌクレオチドの組み合わせとして表８の組み合わせを、ＲＮＡ試料として（２）で調製したＲＮＡ抽出物を用いた他は、実施例３に記載と同様な方法で測定を行なった。
【００６３】
結果を表９に示す。淋菌０．０３ｃｆｕ／ｔｅｓｔまで検出可能であり、検出時間も２０分以内と、極めて迅速、かつ高感度に測定可能であることが判明した。
【００６４】
【表９】
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【図１】
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【配列表】
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