(57)【要約】      （修正有）【課題】白血病細胞増殖抑制組成物の提供。【解決手段】アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）又はセネシオグラベオレンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）からの式（１）含有抽出組成物。2013180993.tif 000013（Ｒ１、Ｒ２は、水酸基、アシロキシ基、アセトキシ基、プロピオノキシ基、及び芳香族基など）【選択図】図４Ａ
2013180993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）又はセネシオ  グラベオレンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）から抽出された組成物
を含む白血病細胞増殖抑制組成物。
【請求項２】
有効成分として、下記式（１）
【化１】
2013180993.tif 000011
で表されるシナロピクリン類の化合物（ただし、Ｒ１、Ｒ２は、水酸基、アシロキシ基、アセトキシ基、プロピオノキシ基、又は芳香族基を示す。Ｒ１、Ｒ２の芳香族基は、フェニル基又はベンジル基で、それらが更に置換されていてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２はエステル、エーテル、エポキシ、又はジオールの酸化された外部オレフィンを示してもよい）
を含むことを特徴とする白血病細胞増殖抑制組成物。
【請求項３】
有効成分として、下記式（２）
【化２】
2013180993.tif 000012
で表されるアセトフェノン類の化合物（ただし、Ｒは、メチル基、アリル基、プレニル基、ゲラニル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、又は炭素数５までのアルキル基で、それらが更に置換されていてもよい。）
を含むことを特徴とする白血病細胞増殖抑制組成物。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする医薬。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする抗癌剤。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする食品。
【請求項７】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする非ヒト動物の治療方法。
【請求項８】
アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）又はセネシオ  グラベオレンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）の抽出物を、白血病細胞増殖抑制組成物として用いる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病細胞増殖抑制組成物、医薬、抗癌剤、食品、治療方法、白血病細胞増殖抑制化合物として用いる方法に係り、特に生薬由来成分から抽出されたヒト白血病細胞増殖抑制組成物、医薬、抗癌剤、食品、治療方法、白血病細胞増殖抑制組成物として用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、古来より使用されている生薬の有効成分の抽出及び活性の探索が積極的に行われている。
このように生薬の一種である民間伝承薬（健康茶）として利用されている植物として、アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ、キク科チョウセンアザミ）が知られている。
アーティチョークは、地中海地方が原産の多年草で、暖かい温帯気候で肥沃なローム層に繁茂し、高さは１．５ｍに達する。アーティチョークの葉は、アザミの葉のように大きくその上部は灰緑色で基部の方は白く、頭状花は非常に大きく紫緑色である。今日では、アーティチョークは、ヨーロッパやアメリカで広く栽培されている。アーティチョークの芽やがくは野菜として食用に供され、葉は肝炎や脂質異常症の治療に用いられている。アーティチョークの全草には、セスキテルペンラクトンで強い苦みを持つシナロピクリンと多量のイヌリンが含まれており、葉はさらに肝臓保護作用をもつシナリンを含む。
【０００３】
また、アーティチョークは、地中海地方の民間療法では、生の葉の汁をワインまたは水に混ぜて肝臓の薬とされている。糖尿病の後期にも用いられ、血糖値を有意に下げることから糖尿病患者にはよい食物とされる。利尿薬としても利用される他、フランスでは、リウマチにも効果があるとされる。
ここで、特許文献１を参照すると、シナロピクリン及び／又はその誘導体を有効成分とすることを特徴とするＮＦ−κＢ活性化抑制剤が記載されている（以下、従来技術１という。）。
ＮＦ−κＢは、免疫グロブリンκ鎖遺伝子のエンハンサーに結合する転写因子であり、炎症、自己免疫疾患等に関連している。
【０００４】
また、セネシオ  グラベオレンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）は、ペルー共和国で民間伝承薬（健康茶）として利用されているキオン属植物である。
キオン属植物は世界中で約１３００種が知られており、日本では１１種が確認されているが、セネシオ  グラベオレンスは確認されておらず、和名も付けられていない。ペルーでは「ｃｈａｃｈａｃｏｍａ」と呼ばれ、健康茶として利用されている。この健康茶は、高山病に効果があると言われている。また、セネシオ  グラベオレンスは、抗菌活性が知られている。
ここで、非特許文献１を参照すると、セネシオ  グラベオレンスの精油成分の分析結果と抗菌試験の結果が報告されている（以下、従来技術２という。）。
【０００５】
一方、ヒト白血病に対する新規治療化合物を、各種の生薬から抽出する研究も行われている。
特許文献２を参照すると、牛乳等に含まれる多機能性鉄結合糖蛋白質であるラクトフェリンから、ヒト白血病（ＨＬ−６０）細胞に対し毒作用を有する抗腫瘍性ポリペプチドを抽出した例が記載されている（以下、従来技術３という。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２０６５３２号公報
【特許文献２】特開２００３−１７１３９９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｅｒｅｚ  Ｃ，  Ａｇｎｅｓｅ  ＡＭ，  Ｃａｂｒｅｒａ  ＪＬ．，「Ｔｈｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｏｉｌ  ｏｆ  Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ  （Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）：  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ．」，Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９９，６６（１），ｐ．９１〜９６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来技術１、従来技術２とも、化合物のヒト白血病に対する具体的な作用効果を示すものではなかった。
また、従来技術３は、白血病細胞ＨＬ−６０の増殖抑制効果があまり強くなかった。
このため、生薬由来で効果の大きい、新規の白血病細胞増殖抑制組成物が求められていた。
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の白血病細胞増殖抑制組成物は、アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）又はセネシオ  グラベオレンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）から抽出された組成物を含むことを特徴とする。
本発明の白血病細胞増殖抑制組成物は、前記アーティチョークから抽出された組成物は、有効成分として下記式（１）
【化１】
2013180993.tif 000003
で表されるシナロピクリン類の化合物（ただし、Ｒ１、Ｒ２は、水酸基、アシロキシ基、アセトキシ基、プロピオノキシ基、及び芳香族基を示す。Ｒ１、Ｒ２の芳香族基は、フェニル基又はベンジル基で、それらが更に置換されていてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２はエステル、エーテル、エポキシ、又はジオールの酸化された外部オレフィンを示してもよい）を含むことを特徴とする。
本発明の白血病細胞増殖抑制組成物は、前記セネシオ  グラベオレンスから抽出された組成物は、有効成分として下記式（２）
【化２】
2013180993.tif 000004
で表されるアセトフェノン類の化合物（ただし、Ｒは、メチル基、アリル基、プレニル基、ゲラニル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基、又は炭素数５までのアルキル基で、それらが更に置換されていてもよい。）を含むことを特徴とする。
本発明の医薬は、前記白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする。
本発明の抗癌剤は、前記白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする。
本発明の食品は、前記白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする。
本発明の非ヒト動物の治療方法は、前記白血病細胞増殖抑制組成物を用いたことを特徴とする。
本発明の白血病細胞増殖抑制組成物として用いる方法は、アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ  ｓｃｏｌｙｍｕｓ）又はセネシオ  グラベオレンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）の抽出物をもちいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、アーティチョーク又はセネシオ  グラベオレンスの植物体から、白血病細胞ＨＬ−６０を顕著に増殖抑制するヒト白血病細胞増殖抑制組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施の形態の実施例１に係るＨＬ−６０増殖抑制試験における試料の濃度調整の概念図である。
【図２】本発明の実施の形態の実施例１に係るアーティチョーク抽出物のカラムクロマトグラフィーの概念図である。
【図３Ａ】本発明の実施の形態の実施例１に係る機器分析による化合物の構造解析の結果を示す概念図である。
【図３Ｂ】本発明の実施の形態の実施例１に係る機器分析による化合物の構造解析の結果を示す概念図である。
【図４Ａ】本発明の実施の形態の実施例１に係るシナロピクリンのＨＬ−６０に対する増殖抑制試験の結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】本発明の実施の形態の実施例１に係るシナロピクリンのＨＵＶＥＣに対する細胞毒性試験の結果を示すグラフである。
【図５】本発明の実施の形態の実施例２に係るセネシオ  グラベオレンス抽出物のカラムクロマトグラフィーの概念図である。
【図６】本発明の実施の形態の実施例２に係る機器分析による化合物の構造解析の結果を示す概念図である。
【図７】本発明の実施の形態の実施例２に係るアセトフェノン類の構造類縁体のＨＬ−６０に対する増殖抑制試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜実施の形態＞
本発明の発明者らは、ヒト白血病に対する新規治療用の化合物を、各種の生薬から抽出するため、鋭意実験・研究を行って、アーティチョーク及びセネシオ  グラベオレンスの抽出物に、ヒト白血病細胞ＨＬ−６０（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ）に対する、増殖抑制効果があることを見いだした。
ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０は、急性骨髄性白血病患者より分離された白血病細胞で、顆粒球、単球、マクロファージの３通りの分化方向性があることから重用されている。ＨＬ−６０は、成熟した血液細胞に分化する過程でその分化を停止し、体内でも試験管内でも「見かけ上」無限に増殖する性質を持っている。
【００１４】
更に研究を進め、本発明の発明者らは、アーティチョーク乾燥葉のメタノール抽出物から、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性化合物１種を単離した。ＮＭＲとＭＳスペクトルにより、シナロピクリン類（Ｃｙｎａｒｏｐｉｃｒｉｎ類似化合物）と同定して、本発明を完成させた。
本発明のアーティチョーク由来のヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、シナロピクリン類として下記式（１）で表される化合物を用いることができる。
【００１５】
【化３】
2013180993.tif 000005
【００１６】
ここで、式（１）の、Ｒ１、Ｒ２は、例えば、水酸基、アシロキシ基、アセトキシ基、プロピオノキシ基、及び芳香族基を用いてもよい。
また、Ｒ１、Ｒ２の芳香族基は、フェニル基又はベンジル基で、それらが更に置換されていてもよい。
また、Ｒ１、Ｒ２は各種エステル、エーテル、エポキシ、又はジオール等の酸化された外部オレフィンを用いてもよい。
【００１７】
また、本発明者らは、シナロピクリン類のＨＬ−６０／健常細胞との増殖抑制／細胞毒性を比較した。
具体的には、本発明の実施の形態に係るシナロピクリン類について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける５０％阻害のために必要な薬物の濃度を表すＩＣ50値（半数阻害濃度）を測定した。
結果として、本実施形態のシナロピクリン類のＨＬ−６０細胞に対するＩＣ50値は、１．１６μＭであった。これに対して、シナロピクリン類の、健常細胞である正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ、ＨＵＶＥＣ）に対するＩＣ50値は、１２．４μＭであった。ＨＵＶＥＣはヒトの臍帯静脈由来の正常細胞由来細胞株であり、細胞毒性試験や血管新生阻害剤の検定に、しばしば用いられている。
すなわち、本発明者らは、シナロピクリン類が、ＨＬ−６０に対して健常細胞の１０倍程度の高い選択性を示すことを見いだした。
【００１８】
また、本発明の発明者らは、セネシオ  グラベオレンス葉の乾燥品のメタノール抽出物から、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性化合物としてアセトフェノン類（Ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ類似化合物）の１種を単離した。
ＮＭＲとＭＳスペクトルにより同定したところ、当該化合物の化学構造は、下記の式（２）のような、アセトフェノン類であった。
【００１９】
【化４】
2013180993.tif 000006
【００２０】
ここで、式（２）の、Ｒは、例えば、メチル基、アリル基であってもよい。
また、Ｒは、プレニル基、ゲラニル基、ファルネシル基、ゲラニルゲラニル基であってもよい。
また、Ｒは、炭素数５程度のアルキル基で、それらが更に置換されていてもよい。その他にも、各種の修飾が可能である。
特に、このアセトフェノン類としては、後述する実施例２の式（４）に示す、４'−ｈｙｄｒｏｘｙ−３'−（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅを用いることが好ましい。
【００２１】
このセネシオ  グラベオレンス由来のアセトフェノン類のＩＣ50値は、０．１１ｍＭ（１１０μＭ）であった。
【００２２】
このように、本発明の実施の形態に係るアーティチョーク又はセネシオ  グラベオレンス由来のヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、ＨＬ−６０細胞に対して高い増殖抑制効果がある。このため、ヒト白血病用の新規の治療薬（医薬）やサプリメント等に利用することができる。この医薬やサプリメント等には、アーティチョーク又はセネシオ  グラベオレンスの抽出液そのものを用いても、同定された上述のシナロピクリン類又はアセトフェノン類を化学合成して用いてもよい。この化学合成の際には、適宜、効果が高いアナログ等を合成して用いることができる。
本実施形態のアーティチョーク又はセネシオ  グラベオレンス由来のヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、ＨＬ−６０の増殖を停止させ、顕微鏡観察によると、正常な血液細胞に分化誘導させる活性を有する。このため、臨床的にも有望な白血病細胞の治療薬となることが期待される。また、本実施形態のヒト白血病細胞増殖抑制組成物を用いて、ＨＬ−６０の分化誘導の過程を、生化学的、組織化学的手法により詳細に調査することが可能であり、がん抑制効果を調べるために用いることができる。
また、上述したように、本実施形態のアーティチョーク由来のヒト白血病細胞増殖抑制組成物については、がん細胞と正常細胞に対する増殖抑制に選択性がある。このため、人体にとって副作用の少ないがん抑制活性物質として使用できる。
【００２３】
ここで、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、任意の製剤上許容しうる担体（例えば、生理食塩水、補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０等を挙げることができるが、それらに限定されない）と共に投与することができる。また、適切な賦形剤等を含んでもよい。
【００２４】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、製剤上許容しうる担体を調製するために、適切な薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。
このキャリアとしては、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン等の生体親和性材料を含んでもよい。あるいはまた、種々の乳濁液であってもよい。
さらに、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、乳化剤、可塑剤などから選択される１または２種以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
【００２５】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、経口投与のための投与に適した投与形態において、当該分野で周知の製剤上許容しうる担体を用いて処方され得る。
本発明の実施の形態に係る医薬組成物の投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することもできる。
非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。
【００２６】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、抗癌剤として、白血病だけではなく、各種のガンや腫瘍等を含む各種症例の治療に用いることができる。
【００２７】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物を上述の治療に用いるために、投与間隔および投与量は、疾患の状況、さらに対象の状態などの種々の条件に応じて適宜選択および変更することが可能である。
【００２８】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物の１回の投与量および投与回数は、投与の目的により、更に患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて、上述のＩＣ50値を基に、適宜選択および変更することが可能である。
投与回数および期間は、投与状態をモニターし、その状態により再度あるいは繰り返し投与を行う。
【００２９】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【００３０】
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されない。しかしながら、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【００３１】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、ヒト用に特に限定されるものではなく、例えば、家畜動物種、野生動物の白血病の抑制と治療を含む。
このため、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、広く動物の治療、家畜の発育増進等の対象とすることができる。
また、疾病の予防や健康増進のため、健康食品のような食物、動物用の飼料、又は食餌に含ませることもできる。
【００３２】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、食品、飼料、及び各種製品へ常法に従って添加することができる。この際の添加量は製品の種類に応じて適宜選択することができるが、製品の質量％当たりの濃度として、上述のＩＣ50値に対応した量を用いることができる。特に、健康食品としては、低容量で抗ガン作用、ガンの予防作用の効果が得られる。
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、様々な形態で利用することができる。たとえば、各種の健康食品、化粧品、清涼飲料、和菓子、洋菓子等に配合することができる。
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物は、適用製品として、具体的には、漬物類、畜肉製品、魚肉製品等の食品、家畜用の飼料、ペットフード等に用いることができる。
【００３３】
また、本発明の実施の形態に係るヒト白血病細胞増殖抑制組成物には、不適当でない限り、適宜添加剤を常法に従って配合することが可能である。
当該添加剤は、必ずしも一つだけではなく、幾つかのものを組み合わせて使用してもよく、製品の種類、組成、予想される汚染乃至腐敗原因微生物、ｐＨ、水分活性、要求される保存温度、保存期間等に応じて組み合わせて使用することができる。
また、アーティチョークから抽出した組成物と、セネシオ  グラベオレンスから抽出した組成物とを両方含むヒト白血病細胞増殖抑制組成物を提供することもできる。
【００３４】
次に本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３５】
〔アーティチョークからのヒト白血病細胞増殖抑制組成物の分離〕
ペルー産のアーティチョークの茎と葉から得られた乾燥試料をメタノールに浸漬し、不溶物をろ過した後、メタノールを減圧留去して粗抽出物を得た。
この粗抽出物について、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を試験したところ、強い活性を示した。このため、この粗抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画・精製を行って、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を指標に、活性物質の単離を行った。
【００３６】
ＨＬ−６０細胞に対する活性試験は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養維持したＨＬ−６０細胞に、最終濃度が５０．０ｐｐｍ、１２．５ｐｐｍ、３．１３ｐｐｍ、０．７８１ｐｐｍの４つの濃度になるように抽出物試料を添加した。
７２時間培養した後、ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ色素を添加し、さらに２４時間培養後に吸光度を測定し、増殖抑制活性のＩＣ50値を算出した。単離した化合物については、ＮＭＲ等の機器分析で構造解析を行った。
また、単離した化合物の構造類縁体のいくつかについても、同様に活性試験を行い、ＩＣ50値を算出した。
【００３７】
結果として、アーティチョーク葉の乾燥品のメタノール抽出物から、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性化合物１種を単離した。ＮＭＲとＭＳスペクトルにより、その化学構造をシナロピクリンと同定した。葉と茎の乾燥品からの単離収率は１．２４ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔであった。
この組成物のＩＣ50値は、ＨＬ−６０に対しては１．１６μＭであり、ＨＵＶＥＣに対しては１２．４μＭであった。つまり、がん細胞に対して約１０倍の選択性を示した。
このように、本実施例の組成物は、ＨＬ−６０に対する増殖抑制、特に健常細胞との間で選択性があるため、医薬品やサプリメントへの応用が考えられる。
以下で、実施例１の各実験方法の詳細と結果について説明する。
【００３８】
（細胞）
本実施例では、ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ製）に対する増殖抑制試験を行った。
また、ＨＵＶＥＣ（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ製）に対する増殖抑制試験も行い、白血病細胞への選択性についても調べた。
【００３９】
（ＨＬ−６０増殖抑制試験）
ＨＬ−６０細胞は、１０％  ＦＢＳを含む  ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．製）、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養して維持した。
図１を参照すると、まず、濃縮乾固した各試料を、ＤＭＳＯ（和光純薬工業株式会社製）で１２．５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。これを４８ｗｅｌｌプレート（Ｍｕｌｔｉ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  Ｃｏ．  ＬＴＤ製）で公比４倍の希釈系列で４段階の濃度（１００ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、６．２５ｐｐｍ、１．５６ｐｐｍ）になるよう、細胞培養用の培地で希釈した。
【００４０】
分注後の９６ｗｅｌｌプレートを、３７℃、５％ＣＯ2条件下で７２時間培養し、ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．製）を２０μｌずつ添加し、さらに２４時間培養した。
培養後、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｍｏｄｅｌ  ６８０，日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ）を用いて、５７０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度を測定し、以下の数式を用いて、増殖率を求めた。
【００４１】
【数１】
2013180993.tif 000007
【００４２】
（ＨＵＶＥＣに対する細胞毒性試験試験）  
ＨＵＶＥＣはＥＧＭ−２培地（タカラバイオ社製）で、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養して維持した。
１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１ｗｅｌｌ当り１００μｌ分注し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。濃縮乾固した各試料をＤＭＳＯで１２．５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。これを４８ｗｅｌｌプレート（Ｍｕｌｔｉ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  Ｃｏ．  ＬＴＤ製）で公比４倍の希釈系列で４段階の濃度（１００ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、６．２５ｐｐｍ、１．５６ｐｐｍ）にＥＧＭ−２培地で希釈した。
細胞懸濁液の入った９６ｗｅｌｌマイクロプレート（Ｍｕｌｔｉ  Ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ、Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ  Ｃｏ．  ＬＴＤ製）にサンプルを１ｗｅｌｌ当り１００μｌずつ添加し、最終濃度を公比４倍の希釈系列で４段階の濃度（５０．０ｐｐｍ、１２．５ｐｐｍ、３．３１ｐｐｍ、０．７８１ｐｐｍ）とした。
試験は、上述のＨＬ−６０増殖抑制試験と同様に、各試料の濃度について、３反復の試験区を設定した。また、コントロールとして細胞液１００μｌ＋培地１００μｌ、ブランクとして各濃度の試料１００μｌ＋培地１００μｌ、培地２００μｌを、それぞれ分注した。
【００４３】
これらの分注後の９６ｗｅｌｌプレートを、上述のＨＬ−６０増殖抑制試験と同様に、３７℃、５％ＣＯ2条件下で７２時間後、ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅの２０μｌを添加し、さらに２４時間培養した。
培養後、上清２００μｌを新しい９６ｗｅｌｌマイクロプレートに移し、５７０ｎｍと５９５ｎｍの吸光度を測定し、ＨＬ−６０増殖抑制試験と同様の数式を用いて、増殖率を求めた。
【００４４】
（アーティチョークのメタノール抽出物の調製）
ペルー産の植物アーティチョーク（Ｃ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ）３．８８ｇを、メタノール（ＭｅＯＨ、関東化学株式会社製）１００ｍｌに一晩浸漬した。不溶物をろ過後、再度新たにＭｅＯＨ２００ｍｌに一晩浸漬した。不溶物をろ過し、再度新たにＭｅＯＨ２００ｍｌに二晩浸漬した。不溶物をろ過し、ろ液を合わせて減圧濃縮した。
デシケーターで乾燥して、１．６７ｇの粗抽出物を得た。粗抽出物は、使用時まで冷蔵庫で保存した。
【００４５】
（アーティチョーク抽出物のカラムクロマトグラフィー）
図２を参照して、本実施例のアーティチョーク抽出物のカラムクロマトグラフィーの実験の流れについて説明する。
まず、抽出したアーティチョークの粗抽出物１．６７ｇをＭｅＯＨに溶解し、約５ｇのセルロースパウダーを加えて減圧濃縮した。その後、デシケーターで乾燥させた。
これをＤｉａｉｏｎ  ＨＰ２０（三菱化学製）を充填剤として、調製したカラムクロマトグラフィーの上部に添加し、分画を行った。溶離液は、Ｈ2Ｏ：ＭｅＯＨ＝１０：０、８：２、６：４、５：５、４：６、２：８、０：１０の順で用い、その後、ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ3＝５：５とした。溶媒を減圧留去し、それぞれＦｒ．１（１．２９ｇ）、Ｆｒ．２（３２．３ｍｇ）、Ｆｒ．３（２０．０ｍｇ）、Ｆｒ．４（１６．７ｍｇ）、Ｆｒ．５（１５．０ｍｇ）、Ｆｒ．６（２０．２ｍｇ）、Ｆｒ．７（２３．８ｍｇ）、Ｆｒ．８（４７．９ｍｇ）を得た。
次に、Ｆｒ．６を充填剤として調製したカラムクロマトグラフィーの上部に添加し、分画を行った。溶離液は、それぞれ、ヘキサン：酢酸エチル＝８：２、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、０：１０、ＭｅＯＨの順で用いた。溶媒を減圧留去し、それぞれＦｒ．６−１（０．７ｍｇ）、Ｆｒ．６−２（０．３ｍｇ）、Ｆｒ．６−３（０．１ｍｇ）、Ｆｒ．６−４（０．９ｍｇ）、Ｆｒ．６−５（４．８ｍｇ）、Ｆｒ．６−６（０．１ｍｇ）、Ｆｒ．６−７（９．６ｍｇ）を得た。このとき、Ｆｒ．６−５は、ＴＬＣ上、単一のスポットであり、化合物１種を単離した。
単離したこの化合物を、ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、ＭＳ（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による機器分析に用いた。
【００４６】
（機器分析による構造解析の結果）
ＥＳＩ−ＨＲ−ＭＳ（Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：
ｍ／ｚ＝３６９．１３００［Ｍ＋Ｎａ］+    Ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ19Ｈ22Ｏ6Ｎａ，３６９．１３０９
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ）：
δ２．９８（Ｈ−１，ｄｄｄ），２．２４（Ｈ−２，ｄｔ），１．７３（Ｈ−２'，ｄｄｄ），４．５６（Ｈ−３，ｔ），２．８５（Ｈ−５，ｔ），４．２５（Ｈ−６，ｄｄ），３．１９（Ｈ−７，ｔｔ），５．１４（Ｈ−８，ｄｄｄ），２．７０（Ｈ−９，ｄｄ），２．４０（Ｈ−９'，ｄｄ），６．２２（Ｈ−１３，ｄ），５．６１（Ｈ−１３'，ｄ），５．１５（Ｈ−１４，ｓ），４．９４（Ｈ−１４'，ｓ），５．５０（Ｈ−１５，ｓ），５．３６（Ｈ−１５'，ｓ），４．３８，５．９６，６．３３（ＯＣＯＲ2，ｓ）
13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ，１００ＭＨｚ）：
δ４５．４（Ｃ−１），３９．２（Ｃ−２），７３．９（Ｃ−３），１５２．３（Ｃ−４），５１．５（Ｃ−５），７８．５（Ｃ−６），４７．７（Ｃ−７），７４．４（Ｃ−８），３７．２（Ｃ−９），１４１．８（Ｃ−１０），１３７．４（Ｃ−１１），１６９．１（Ｃ−１２），１２２．８（Ｃ−１３），１１８．３（Ｃ−１４），１１３．７（Ｃ−１５），６２．４，１２６．９，１３９．３，１６５．４
【００４７】
図３Ａを参照すると、1Ｈ，13Ｃ−ＮＭＲ，ＨＭＢＣ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ）測定により、セスキテルペン骨格と側鎖の平面構造を推定した。
また、図３Ｂを参照すると、ＮＯＥＳＹ，カップリング定数より水素の相対立体配置を推定した。
これらの機器分析の結果、抽出された化合物を、シナロピクリンと同定した。葉と茎の乾燥品からの単離収率は、１．２４ｍｇ／ｍｌであった。
旋光度は、［α］25D＝＋１０７．３°（ｃ０．２４５、ＥｔＯＨ）であり、シナロピクリンの文献値とおおむね一致したため、文献に基づき、絶対配置は下記の式（３）の通りと推定される。
【００４８】
【化５】
2013180993.tif 000008
【００４９】
（細胞に対する試験結果）
図４Ａを参照すると、アーティチョークから単離したシナロピクリンにおける増殖抑制試験において、ＨＬ−６０に対するＩＣ50値は１．１６μＭであった。図４Ａでは、縦軸が増殖率（％）を示し、横軸が濃度（ｐｐｍ）を示す。また、図４Ａの菱形及び四角の点は、ＩＣ50値を求めるための、それぞれの濃度での増殖率を示す。この菱形及び四角の点は、シグモイド関数に回帰する。
また、図４Ｂを参照すると、アーティチョークから単離したシナロピクリンの細胞毒性試験において、ＨＵＶＥＣに対するＩＣ50値は、１２．４μＭであった。図４Ｂにおいても、縦軸が増殖率（％）、横軸が濃度（ｐｐｍ）を示す。また、菱形及び四角の点はＩＣ50値を求めるための、それぞれの濃度での増殖率を示す。この菱形及び四角の点も、シグモイド関数に回帰する。
すなわち、シナロピクリンは、がん細胞に対して約１０倍の選択性を示した。
なお、実験したシナロピクリンの構造類縁体と比較すると、シナロピクリンのＨＬ−６０に対するＩＣ50値及びがん細胞に対する選択性が一番高かった。
【実施例２】
【００５０】
〔セネシオ  グラベオレンスからのヒト白血病細胞増殖抑制組成物の分離〕
ペルー産のセネシオ  グラベオレンスの葉から得られた乾燥試料を、メタノールに浸漬し、不溶物をろ過した後、メタノールを減圧留去して粗抽出物を得た。
この粗抽出物について、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を試験したところ、強い活性を示したので、カラムクロマトグラフィーにて分画・精製を行い、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性を指標に、活性物質の単離を行った。
【００５１】
ＨＬ−６０細胞に対する活性試験は、上述の実施例１と同様に、増殖抑制活性のＩＣ50値を算出した。単離した化合物については、ＮＭＲ等の機器分析で構造解析を行った。また、単離した化合物の構造類縁体のいくつかについても、同様に活性試験を行い、ＩＣ50値を算出した。
【００５２】
結果として、セネシオ  グラベオレンス葉の乾燥品のメタノール抽出物から、ＨＬ−６０細胞に対する増殖抑制活性化合物１種を単離した。ＮＭＲとＭＳスペクトルにより、その化学構造はアセトフェノン類であり、４'−ｈｙｄｒｏｘｙ−３'−（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅと同定した。単離収率は６．７７ｍｇ／ｇｄｒｙｗｅｉｇｈｔで、ＩＣ５０値は、０．１１ｍＭ（１１０μＭ）であった。
このように、本実施例の組成物もＨＬ−６０に対する増殖抑制効果があるため、医薬品やサプリメントへの応用が考えられる。
【００５３】
（ＨＬ−６０増殖抑制試験）
実施例１と同様に、ＨＬ−６０細胞を用いた増殖抑制試験を行った。
【００５４】
（セネシオ  グラベオレンスのメタノール抽出物の調製）
ペルー産の植物セネシオ  グラベオレンス（Ｓｅｎｅｃｉｏ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）葉の乾燥品の５．７５ｇをＭｅＯＨ（関東化学株式会社製）８０ｍｌに一晩浸漬した。不溶物をろ過後、再度新たにＭｅＯＨ  ８０ｍｌに二晩浸漬した。不溶物をろ過し、ろ液を合わせて減圧濃縮した。減圧にて乾燥し、粗抽出物１．７８ｇを得た。粗抽出物は、使用時まで冷蔵庫で保存した。
【００５５】
（セネシオ  グラベオレンスの抽出物のカラムクロマトグラフィー）
図５を参照して、本実施例のセネシオ  グラベオレンス抽出物のカラムクロマトグラフィーの流れについて説明する。
まず、上述のように抽出したセネシオ  グラベオレンスの粗抽出物１．７８ｇを、ＭｅＯＨに溶解して、約５ｇのセルロースパウダーを加えて減圧濃縮した。その後、減圧下で乾燥させた。
これを、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ２０（三菱化学製）を充填剤として調製したカラムクロマトグラフィーの上部に添加し、分画を行った。溶離液は、Ｈ2Ｏ：ＭｅＯＨ＝１０：０、８：２、６：４、５：５、４：６、２：８、０：１０の順で用いた。
溶媒を減圧留去し、ＴＬＣ上で類似のスポットを示す分画をまとめて５分画とし、それぞれＦｒ．１（２５０ｍｇ）、Ｆｒ．２（１６０ｍｇ）、Ｆｒ．３（９６ｍｇ）、Ｆｒ．４（８１ｍｇ）、Ｆｒ．５（１０５ｍｇ）を得た。
活性試験により活性のあったＦｒ．５を、ＯＤＳを充填剤として調製したカラムクロマトグラフィーの上部に添加し、分画を行った。溶離液は、Ｈ2Ｏ：ＭｅＯＨ＝８：２、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、０：１０、ＭｅＯＨの順で用いた。溶媒を減圧留去し、それぞれＦｒ．５−１（４．０ｍｇ）、Ｆｒ．５−２（４．３ｍｇ）、Ｆｒ．５−３（３．２ｍｇ）、Ｆｒ．５−４（２．９ｍｇ）、Ｆｒ．５−５（１２．５ｍｇ）、Ｆｒ．５−６（３８．９ｍｇ）、Ｆｒ．５−７（２１．４ｍｇ）を得た。このとき、Ｆｒ．５−６は、ＴＬＣ上、単一のスポットであり、ここから化合物１種を単離した。単離収率は、６．７７ｍｇ／ｇ  ｄｒｙ  ｗｅｉｇｈｔであった。
【００５６】
（機器分析による構造解析の結果）
単離した化合物のＮＭＲ、ＭＳの結果を以下の表に示す：
【００５７】
【表１】
2013180993.tif 000009
【００５８】
ＥＳＩ−ＨＲ−ＭＳの結果より、分子量＝２０４と決定した。
図６を参照すると、1Ｈ，13Ｃ−ＮＭＲ，ＨＭＱＣ（ＣＤ3ＯＤ，４００ＭＨｚ）測定により、部分構造を推定した。具体的には、図６の各部位のように、ＨＭＢＣ，ＮＯＥ測定により、各部分構造の結合を推定した。図６内の数値は、水素におけるδ値（水素数、カップリングパターン、結合定数。４級炭素では省略）、炭素におけるδ値である。
この結果として、単離した化合物を以下の式（４）の４'−ｈｙｄｒｏｘｙ−３'−（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅと同定した。
【００５９】
【化６】
2013180993.tif 000010
【００６０】
（細胞に対する活性試験結果）
ＨＬ−６０増殖抑制試験によると、単離したアセトフェノン類である４'−ｈｙｄｒｏｘｙ−３'−（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅのＩＣ50値は、２３．３ｐｐｍであり、分子量に換算すると０．１１ｍＭ（１１０μＭ）であった。
クロマトグラフィーでの他の分画には顕著な活性は見られないことから、本化合物がＨＬ−６０に対する主たる活性化合物であると考えられる。
【００６１】
（構造類縁体についての活性試験結果）
図７を参照すると、セネシオ  グラベオレンスから単離した４'−ｈｙｄｒｏｘｙ−３'−（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅの構造類縁体化合物（アナログ）に対して、上述のＨＬ−６０増殖抑制試験を行った。
図７（ａ）〜（ｉ）の各化合物のうち、４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅのＩＣ50値は０．４６ｍＭであった。また、２，３，４−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅのＩＣ50値は、０．４６ｍＭであった。また、２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅのＩＣ50値は、０．４４ｍＭであった。また、３−ａｌｌｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅのＩＣ50値は、０．４４ｍＭであった。それ以外の化合物においては、ＩＣ50値は１ｍＭ以上であった。
すなわち、これらの構造類縁体化合物に比べて、セネシオ  グラベオレンスから単離した４'−ｈｙｄｒｏｘｙ−３'−（３−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅのＨＬ−６０増殖抑制効果が高いことが分かる。
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のアーティチョーク又はセネシオ  グラベオレンスから抽出した組成物は、ヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対する増殖抑制に用いることができ、産業上に利用することができる。
【図１】
2013180993.tif 000014
【図２】
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【図３Ａ】
2013180993.tif 000016
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2013180993.tif 000020
【図６】
2013180993.tif 000021
【図７】
2013180993.tif 000022