(57)【要約】【課題】致死でないＨｍｇｂ１遺伝子欠損非ヒト動物の作製を可能とする非ヒト動物、及び、致死でないＨｍｇｂ１遺伝子欠損非ヒト動物を提供する。【解決手段】ゲノム上のＨｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １（Ｈｍｇｂ１）遺伝子の一部又は全部をはさむ位置に、２つのリコンビナーゼ標的配列を有する、コンディショナルノックアウト非ヒト動物、及び、上記のコンディショナルノックアウト非ヒト動物から誘導され、体の一部又は全部のＨｍｇｂ１遺伝子の一部又は全部が欠損した、非ヒト動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム上のＨｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １（Ｈｍｇｂ１）遺伝子の一部又は全部をはさむ位置に、２つのリコンビナーゼ標的配列を有する、コンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項２】
ゲノム上のＨｍｇｂ１遺伝子の一部をはさむ位置に、２つのリコンビナーゼ標的配列を有しており、前記位置は、Ｈｍｇｂ１遺伝子の第２エキソンの５’側及び第４エキソンの３’側である、請求項１に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項３】
前記リコンビナーゼ標的配列は、ｌｏｘＰ配列である、請求項１又は２に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項４】
前記非ヒト動物は、マウスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項５】
Ｔ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合のＴ細胞集団の存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物と同等である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項６】
Ｂ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合のＢ細胞集団の存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物と比較して減少する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項７】
骨髄系細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合に、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物と比較して、ＬＰＳ投与に対する抵抗性が低下する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項８】
骨髄系細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合に、ＬＰＳ投与後の血中ＩＬ−６の存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物のＬＰＳ投与後の血中ＩＬ−６の存在量と同等である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項９】
骨髄系細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合に、ＬＰＳ投与後の血中ＴＮＦ−αの存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物のＬＰＳ投与後の血中ＴＮＦ−αの存在量と比較して増加する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のコンディショナルノックアウト非ヒト動物から誘導され、体の一部又は全部のＨｍｇｂ１遺伝子の一部又は全部が欠損した、非ヒト動物。
【請求項１１】
前記コンディショナルノックアウト非ヒト動物の体の一部又は全部でリコンビナーゼを反応させて誘導される、請求項１０に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼである、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者らは、これまでの研究において、ＤＮＡ、ＲＮＡを問わず、核酸を認識し、免疫系の活性化に関与する分子として、ＨＭＧＢ（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ）タンパク質を同定した（非特許文献１を参照）。ＨＭＧＢタンパク質はファミリーを形成しており（ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＨＭＧＢ３）、互いにアミノ酸配列において高い相同性を示す分子である。その分子構造は高等真核生物において保存されており、Ｎ末端側に２つのＤＮＡ結合ドメイン（ＨＭＧ  ｂｏｘ  Ａ、Ｂ）とＣ末端側に酸性アミノ酸に富む領域を有している。ＨＭＧＢタンパク質は、核タンパク質として機能する一方、一部は細胞質に存在し、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ  ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）９シグナル伝達経路に関与することが報告されている。ＨＭＧＢタンパク質を欠損した細胞では、核酸刺激による転写因子の活性化やＩ型ＩＦＮ（インターフェロン）や炎症性サイトカインの誘導が起こらない。このことから、核酸と結合するＨＭＧＢタンパク質は細胞質内核酸認識受容体によるリガンド認識に不可欠な分子であると考えられている（非特許文献１を参照）。
【０００３】
上述のように、ＨＭＧＢタンパク質が、ＤＮＡ、ＲＮＡを問わず核酸と結合し、免疫応答の活性化に関与することが明らかとなった。一方、ＨＭＧＢタンパク質が、核酸認識機構における役割のみならず、様々な免疫応答に関与することが多数報告されている。中でも、ＨＭＧＢ１（ＨＭＧＢ１タンパク質）は、その多彩な機能から近年注目を浴びている。
【０００４】
ＨＭＧＢ１は核内で恒常的に発現しており、ＨＭＧ  ｂｏｘを介して塩基配列非依存的にＤＮＡに結合し、ＤＮＡ及びクロマチン構造の変化に関与することで、遺伝子の転写制御を調節していることが報告されている。さらに、Ｔ細胞受容体や抗体の遺伝子組換えに必須の役割を果たすことが知られている、ＲＡＧ１（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  １）及びＲＡＧ２とも相互作用することが報告されており、Ｔ細胞受容体、抗体遺伝子の組換えを促進すると考えられている。
【０００５】
ＨＭＧＢ１は、上述のような核内における機能に加え、細胞外に放出されることにより炎症性サイトカイン様の活性を示すことが報告されている。細胞外へのＨＭＧＢ１の放出には、受動的放出と能動的放出の２つの様式があることが知られている。細胞傷害やネクローシスによって細胞内容物が流出する際、核内に存在するＨＭＧＢ１が細胞外へ受動的に拡散し、炎症性サイトカインとしての活性を示す。一方、マクロファージ、単核球、樹状細胞では、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）、ＩＬ（インターロイキン）−１、ＩＦＮ−γや、ＰＡＭＰｓ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）の一種であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）刺激により、ＨＭＧＢ１を細胞外へ積極的に分泌することが報告されている。このように放出されたＨＭＧＢ１はさまざまな受容体に結合する。
【０００６】
ＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、ＨＭＧＢ１の受容体として最初に同定された分子であり、ＨＭＧＢ１がＲＡＧＥに結合することで、炎症性サイトカインが誘導されるだけでなく、樹状細胞の成熟が促進されることが知られている。また、ＨＭＧＢ１はＴＬＲ４にも結合し、ＩＬ−６やＴＮＦ−α等、炎症性サイトカイン産生を誘導することも報告されている。そして、ＬＰＳ誘導性ショック死モデルにおいて、ＨＭＧＢ１はサイトカインストーム等のその病態の増悪に関与していると考えられている。
【０００７】
これらの受容体によるＨＭＧＢ１の認識に加え、ＨＭＧＢ１は種々のリガンドとも結合することが知られている。ＨＭＧＢ１はＬＰＳと結合することでＬＰＳの凝集を阻害してＣＤ１４との会合を促進し、ＴＬＲ４を介した免疫応答を増強すると考えられている。また、ＩＬ１−βとも結合し、ＨＭＧＢ１−ＩＬ−１β複合体による刺激はＩＬ−１βのみの刺激に比べて炎症性サイトカインの産生を増強することが知られている。
【０００８】
上記のように、ＨＭＧＢ１は細胞質内における機能、核内における役割に加え、死細胞や免疫担当細胞から分泌され、受容体による認識を介し、サイトカイン産生の誘導に関与するなど、様々な免疫応答の活性化に関与していると考えられる。ＨＭＧＢ１は、このような多彩な機能を有しており、敗血症や自己免疫疾患等の病態の増悪に関与することが多数報告されている。
【０００９】
例えば、１９９９年にＷａｎｇらにより、ＴＬＲ４のリガンドであるＬＰＳ刺激に応じ、細胞外にＨＭＧＢ１が放出され、ＨＭＧＢ１の中和抗体を投与することで、ＬＰＳ誘導性ショック死が減弱することから、ＨＭＧＢ１はエンドトキシンショックにおける致死性を決める重要な分子であると報告されている（非特許文献２を参照）。実際、敗血症の患者では血中のＨＭＧＢ１の量が多く、さらに重篤な患者ではそれが顕著であることも知られている。
【００１０】
病態の増悪におけるＨＭＧＢ１の増加は、肝臓移植、心筋梗塞の患者においても報告されている。肝臓虚血再還流のモデル実験では、再還流後１時間で血中に放出されるＨＭＧＢ１の量が増加し、そのＨＭＧＢ１は高濃度の状態で２４時間維持され、その際にＨＭＧＢ１中和抗体を投与することで肝傷害が軽減することが報告されている。
【００１１】
また、ＨＭＧＢ１は自己免疫疾患への関与も示唆されている。関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；  ＲＡ）では滑膜炎を起こしている部位においてＨＭＧＢ１の増加が見られることが報告されている。また、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ；  ＳＬＥ）において、ヌクレオソームと結合したＨＭＧＢ１が患者の血漿中で増加していることも報告されている。ＳＬＥでは、核酸を含む自己抗原に対する抗体により免疫複合体が構成され、それを樹状細胞、マクロファージ等が認識し、免疫応答を活性化して過度な免疫応答を誘導することが、病態の増悪に関与していると考えられている。実際、ＨＭＧＢ１−ＤＮＡ複合体によりｐＤＣ（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ＤＣ；  形質細胞様樹状細胞）においてＩＦＮ−α（インターフェロンα）が大量に産生され、自己応答性のＢ細胞の増殖が促進されることが知られている。また、ＳＬＥやＲＡ患者ではＨＭＧＢ１抗体の産生が健常者に比べて高くなっていることから、ＨＭＧＢ１が、自己免疫疾患の増悪や炎症反応の増幅に関与していると考えられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｙａｎａｉ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４６２，９９−１０３，（２００９）．
【非特許文献２】Ｗａｎｇ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，２４８−２５１，（１９９９）．
【非特許文献３】Ｃａｌｏｇｅｒｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２，２７６−２８０，（１９９９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このように、ＨＭＧＢ１は免疫応答に様々に関与し、ＳＬＥ等の病態の増悪にも寄与することが報告されている。したがって、核酸による免疫応答の活性化におけるＨＭＧＢ１の役割に加え、自己免疫疾患や炎症に関与するＨＭＧＢ１の役割を明らかにすることは重要であると考えられる。しかしながら、Ｈｍｇｂ１遺伝子欠損マウスは致死であることが報告されており、Ｈｍｇｂ１を欠損したマウスは生まれてくるものの、低血糖症状を示し生後１日以内に死に至ってしまう（非特許文献３を参照）。そのため、Ｈｍｇｂ１遺伝子欠損マウス用いたｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸認識機構の解析、及び病態における役割の解析はなされていない。
【００１４】
そこで本発明は、致死でないＨｍｇｂ１遺伝子欠損非ヒト動物の作製を可能とする非ヒト動物を提供することを目的とする。本発明はまた、致死でないＨｍｇｂ１遺伝子欠損非ヒト動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ゲノム上のＨｍｇｂ１遺伝子の一部又は全部をはさむ位置に、２つのリコンビナーゼ標的配列を有する、コンディショナルノックアウト非ヒト動物を提供する。このコンディショナルノックアウト非ヒト動物において、上記のリコンビナーゼ標的配列に、これを標的とするリコンビナーゼを時期・組織特異的に反応させることにより、Ｈｍｇｂ１遺伝子の一部又は全部を欠損させ、致死でないＨｍｇｂ１遺伝子欠損非ヒト動物を作製することができる。このＨｍｇｂ１遺伝子欠損非ヒト動物により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＨＭＧＢ１の核酸認識機構、及び、免疫応答、免疫疾患、癌等の病態におけるＨＭＧＢ１の役割を解析することが可能となる。
【００１６】
上記のコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、ゲノム上のＨｍｇｂ１遺伝子の一部をはさむ位置に、２つのリコンビナーゼ標的配列を有しているものであってもよく、ゲノム上のＨｍｇｂ１遺伝子の第２エキソンの５’側及び第４エキソンの３’側にリコンビナーゼ標的配列を有しているものであってもよい。また、リコンビナーゼ標的配列は、ｌｏｘＰ配列であってもよい。後述するように、発明者らは、このような遺伝子構造を有するコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、時期・組織特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させることができることを証明した。
【００１７】
上記の非ヒト動物は、マウスであってもよい。マウスは、取り扱いが容易で、様々な実験系が確立されている点で好ましい。
【００１８】
上記のコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、Ｔ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合のＴ細胞集団の存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物と同等であることが好ましい。また、上記のコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、Ｂ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合のＢ細胞集団の存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物と比較して減少することが好ましい。
【００１９】
また、上記のコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、骨髄系細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させた場合に、次のような性質を示すことが好ましい。
（１）Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物と比較して、ＬＰＳ投与に対する抵抗性が低下する。
（２）ＬＰＳ投与後の血中ＩＬ−６の存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物のＬＰＳ投与後の血中ＩＬ−６の存在量と同等である。
（３）ＬＰＳ投与後の血中ＴＮＦ−αの存在量が、Ｈｍｇｂ１遺伝子を欠損させていない対照動物のＬＰＳ投与後の血中ＴＮＦ−αの存在量と比較して増加する。
このようなコンディショナルノックアウト非ヒト動物は、時期・組織特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損した非ヒト動物を作製し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨＭＧＢ１の免疫応答、免疫疾患、癌等における役割について解析する実験系として適している。
【００２０】
本発明はまた、上記のコンディショナルノックアウト非ヒト動物から誘導され、体の一部又は全部のＨｍｇｂ１遺伝子の一部又は全部が欠損した、非ヒト動物を提供する。このような非ヒト動物は、致死でないため、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸認識機構、及び、免疫応答、免疫疾患、癌等の病態におけるＨＭＧＢ１の役割を解析する実験系として適している。
【００２１】
上記の誘導は、上記のコンディショナルノックアウト非ヒト動物の体の一部又は全部でリコンビナーゼを反応させることにより行われるものであってもよい。また、上記のリコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼであってもよい。後述するように、このような方法で体の一部又は全部のＨｍｇｂ１遺伝子が欠損した非ヒト動物を用いて、ＨＭＧＢ１の免疫応答、免疫疾患、癌等における役割について解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１（Ａ）〜（Ｄ）は、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの作製について説明する図である。
【図２】図２（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスを用いたＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの作製について説明する図である。
【図３】図３（Ａ）及び（Ｂ）は、ＨＭＧＢ１の免疫細胞群への影響を検討した結果を示すグラフである。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｅ）は、Ｔ細胞及びＢ細胞分化におけるＨＭＧＢ１の関与を検討した結果を示す図である。
【図５】図５（Ａ）〜（Ｇ）は、Ｌｙｓ−ＣｒｅマウスのＬＰＳによる免疫応答を検討した結果を示す図である。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｄ）は、ＨＭＧＢ１欠損マクロファージにおけるＴＬＲｓを介したサイトカイン誘導を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
コンディショナルノックアウト非ヒト動物とは、標的遺伝子の一部又は全部を、時期・組織特異的に（コンディショナルに）欠損させることが可能なように遺伝子操作した非ヒト動物をいう。コンディショナルノックアウト非ヒト動物の作製に利用し得るシステムとしては、例えば、リコンビナーゼ／リコンビナーゼ標的配列システムが挙げられる。リコンビナーゼ標的配列とは、リコンビナーゼが認識し、相同組換えを起こす配列である。リコンビナーゼ／リコンビナーゼ標的配列システムとしては、例えば、Ｐ１バクテリオファージに由来するＣｒｅリコンビナーゼ及び３４ｂｐからなるｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムが挙げられる。リコンビナーゼ／リコンビナーゼ標的配列システムを用いる場合、ゲノム上の標的遺伝子の一部又は全部をはさむ位置に、２つのリコンビナーゼ標的配列を導入することにより、コンディショナルノックアウト非ヒト動物を得ることができる。
【００２４】
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムにおいては、Ｃｒｅリコンビナーゼが、同じ方向の２つのｌｏｘＰ配列を認識し、それらのｌｏｘＰ配列間で相同組換えを起こすことにより、その間に存在していたＤＮＡ配列が切り出されて欠損する。したがって、標的遺伝子を２つのｌｏｘＰ配列ではさむように遺伝子操作することにより、コンディショナルノックアウト非ヒト動物を作製することができる。そして、そのようなコンディショナルノックアウト非ヒト動物において、Ｃｒｅリコンビナーゼを時期・組織特異的に発現させることにより、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現した細胞内で標的遺伝子を欠損させることができる。
【００２５】
標的遺伝子を２つのｌｏｘＰ配列ではさむとは、ゲノム上の欠損させる対象のＤＮＡ配列の５’側及び３’側に同じ方向の２つのｌｏｘＰ配列を導入することをいう。
【００２６】
Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物とは、標的遺伝子がＨｍｇｂ１である上記の非ヒト動物を意味する。非ヒト動物は、ヒト以外の哺乳動物であることが好ましく、マウス、ラット、ヤギ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ等が例示できる。このなかでも、取り扱いが容易で、実験系が確立されていることから、マウスであることが好ましい。
【００２７】
本明細書において、致死とは、生後数日以内に死亡することをいう。Ｈｍｇｂ１遺伝子欠損マウスは致死であるが、Ｈｍｇｂ１遺伝子を時期・組織特異的に欠損させた非ヒト動物は致死ではないため、この非ヒト動物を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ＨＭＧＢ１タンパクによる核酸認識機構、及び、免疫応答、免疫疾患、癌等の病態におけるＨＭＧＢ１の役割を解析することができる。
【００２８】
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ標的配列システムを利用してＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物を作製する方法としては、特に限定されないが、Ｈｍｇｂ１遺伝子座において、Ｈｍｇｂ１遺伝子の第２エキソンの５’側及び第４エキソンの３’側にリコンビナーゼ標的配列を有するように遺伝子操作することが好ましい。より具体的には、リコンビナーゼ／リコンビナーゼ標的配列システムは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムであってよく、Ｈｍｇｂ１遺伝子の第２エキソンの５’側第５６〜８９塩基、及び、第４エキソンの３’側第５７〜９０塩基の位置にｌｏｘＰ配列を有するように遺伝子操作することが好ましい。実施例において後述するように、発明者らは、この方法により得られたコンディショナルノックアウト非ヒト動物が、時期・組織特異的にＨｍＧｂ１遺伝子を欠損させることができることを証明した。ｌｏｘＰの塩基配列は、５’−ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ−３’（配列番号１）である。
【００２９】
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ標的配列システムを利用して作製したＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物において、時期・組織特異的にＨｍＧｂ１遺伝子の欠損を誘導するためには、ＨｍＧｂ１遺伝子を欠損させたい時期・組織において、リコンビナーゼを発現させるとよい。より詳細には、リコンビナーゼをリコンビナーゼ標的配列に反応させて相同組換えを起こさせるとよい。
【００３０】
リコンビナーゼ／リコンビナーゼ標的配列システムがＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムである場合には、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。より具体的には、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物を、時期・組織特異的プロモータの下流に連結したＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を導入した、トランスジェニック非ヒト動物と交配させることにより、その子孫動物において、時期・組織特異的にＨｍＧｂ１遺伝子の欠損を誘導する方法が挙げられる。その他の方法としては、例えば、アデノウイルスベクター等を用いて、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子をＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物に導入することにより、Ｃｒｅリコンビナーゼが発現した部位においてＨｍＧｂ１遺伝子の欠損を誘導することができる。時期・組織特異的にＨｍＧｂ１遺伝子が欠損することにより、時期・組織特異的にＨＭＧＢ１タンパクが欠損する。
【００３１】
Ｔ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させる方法としては、例えば、Ｔ細胞特異的にＣｒｅを発現する非ヒト動物とＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物とを交配させることが挙げられる。この方法により得られた子孫動物は、Ｔ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損する。より具体的には、例えば、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスと、Ｔ細胞特異的にＣｒｅを発現するＬｃｋ−Ｃｒｅマウスとを交配することにより、子孫マウスにおいてＴ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させることができる。
【００３２】
Ｂ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させる方法としては、例えば、Ｂ細胞特異的にＣｒｅを発現する非ヒト動物とＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物とを交配させることが挙げられる。この方法により得られた子孫動物は、Ｂ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損する。より具体的には、例えば、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスと、Ｂ細胞特異的にＣｒｅを発現するｍｂ．１−Ｃｒｅマウスとを交配することにより、子孫マウスにおいてＢ細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させることができる。
【００３３】
骨髄系細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させる方法としては、例えば、骨髄系細胞特異的にＣｒｅを発現する非ヒト動物とＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物とを交配させることが挙げられる。この方法により得られた子孫動物は、骨髄系細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損する。より具体的には、例えば、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスと、骨髄系細胞特異的にＣｒｅを発現するＬｙｓ−Ｃｒｅマウスとを交配することにより、子孫マウスにおいて骨髄系細胞特異的にＨｍｇｂ１遺伝子を欠損させることができる。Ｌｙｓ−Ｃｒｅマウスとは、Ｌｙｓｏｚｙｍｅプロモータ制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現する遺伝子（Ｌｙｓ−Ｃｒｅ）を有するマウスである。Ｌｙｓ−Ｃｒｅマウスは、骨髄系の細胞、特にマクロファージや好中球でＣｒｅリコンビナーゼを発現し、それらの細胞群において高頻度でｌｏｘＰに挟まれた遺伝子を欠損させることが知られている。
【００３４】
Ｔ細胞集団の存在量が同等であるとは、試験動物の胸腺、脾臓、血液等に含まれるＴ細胞集団の存在量（存在割合）を、対照動物のそれと比較した場合に、差が認められないことを意味する。より詳細には、Ｔ細胞集団の存在量に統計学的に有意な差が存在しないことを意味する。Ｔ細胞集団としては、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋細胞、ＴＣＲαβ＋ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３ε＋ＮＫ１．１＋細胞等が挙げられる。細胞のＴ細胞関連抗原の発現パターンを解析する方法としては、細胞をＴ細胞関連抗原に対する蛍光色素結合抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析する方法等が挙げられる。
【００３５】
Ｂ細胞集団の存在量が減少するとは、試験動物の脾臓、血液等に含まれるＢ細胞集団の存在量（存在割合）を、対照動物のそれと比較した場合に、Ｂ細胞集団の存在量が減少することを意味する。より詳細には、試験動物のＢ細胞集団の存在量が統計学的に有意な差を伴って減少することを意味する。Ｂ細胞集団としては、Ｂ２２０＋ＣＤ３ε−細胞、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ３ε−細胞等が挙げられる。細胞集団のＢ細胞関連抗原の発現パターンを解析する方法としては、細胞集団を、Ｂ細胞関連抗原に対する蛍光色素結合抗体で染色し、フローサイトメトリーによって解析する方法が挙げられる。
【００３６】
ＬＰＳ投与に対する抵抗性が低下するとは、試験動物及び対照動物に同量のＬＰＳを投与した場合に、対照動物の生存率と比較して、試験動物の生存率が低下することを意味する。ＬＰＳは腹腔内投与されることが好ましい。
【００３７】
試験動物及び対照動物の血中ＩＬ−６及び血中ＴＮＦ−αの存在量は、例えばＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法によって測定することができる。血中ＩＬ−６の存在量が同等であるとは、試験動物及び対照動物の血中ＩＬ−６の存在量に差が認められないことを意味する。より詳細には、血中ＩＬ−６の存在量に統計学的に有意な差が存在しないことを意味する。また、血中ＴＮＦ−αの存在量が増加するとは、対照動物の血中ＴＮＦ−αの存在量と比較して、試験動物の血中ＴＮＦ−αの存在量が増加することを意味する。より詳細には、試験動物の血中ＴＮＦ−αの存在量が、統計学的に有意な差を伴って増加することを意味する。
【実施例】
【００３８】
Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの作製
（Ｈｍｇｂ１ターゲッティングベクターの作製）
Ｈｍｇｂ１遺伝子座のゲノム断片は１２９／Ｏｌａ系マウス由来ＥＳ細胞（Ｅ１４．１）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、Ａ  ｓｅｎｓｅプライマー：５’−ＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡ−３’（配列番号２）、Ａ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＡＡＴＣＧＡＴＴＣＡＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号３）、Ｂ  ｓｅｎｓｅプライマー：５’−ＡＣＴＡＧＴＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＡＣ−３’（配列番号４）、Ｂ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＧＴＣＧＡＣＡＧＴＴＡＴＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号５）、Ｃ  ｓｅｎｓｅプライマー：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧ−３’（配列番号６）、Ｃ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＧＣＡＣ−３’（配列番号７）、を用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって得た。
【００３９】
この遺伝子断片を、それぞれ、コンディショナルノックアウト用のベクターである、ｐＫＳＴＫＮＥＯｌｏｘＰベクターのＫｐｎＩ−ＣｌａＩ、ＸｂａＩ−ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ−ＳａｃＩＩサイト間に挿入した。そのベクターに、更にｐＭｃ１ＤＴｐＡプラスミドより切り出したジフテリアトキシンＡサブユニットｃＤＮＡをＸｈｏＩサイト間に挿入し、Ｈｍｇｂ１ターゲッティングベクターとした。Ｈｍｇｂ１ターゲッティングベクターの一部の塩基配列を配列番号８に示す。配列番号８において、第５７５５〜５８９２塩基がＨｍｇｂ１遺伝子の第１エキソンであり、第５８９３〜７９９０塩基が第１イントロンの途中までであり、第８０３３〜８０６６塩基が１つ目のＬｏｘＰ配列であり、第８５８１〜９３８４塩基がネオマイシン耐性遺伝子であり、第１００１１〜１００４４塩基が２つ目のＬｏｘＰ配列であり、第１００５０〜１００９９塩基が第１イントロンの途中からであり、第１０１００〜１０２６３塩基が第２エキソンであり、第１０２６４〜１０４１０塩基が第２イントロンであり、第１０４１１〜１０５５６塩基が第３エキソンであり、第１０５５７〜１０９４９塩基が第３イントロンであり、第１０９５０〜１１１２４塩基が第４エキソンであり、第１１１２５〜１１１７４塩基が第４イントロンの途中までであり、第１１１８１〜１１２１４塩基が３つ目のＬｏｘＰ配列であり、第１１２２８〜１１９９０塩基が第４イントロンの途中からであり、第１１９９１〜１３６７７塩基が第５エキソンである。なお、Ｈｍｇｂ１遺伝子の開始コドンの位置は配列番号８の第１０１１４−１０１１６塩基のＡＴＧであり、これは第２エキソンの途中に位置する。また、１つ目のＬｏｘＰ配列は第１エキソンの３’側第２１４１〜２１７４塩基に位置する。
【００４０】
Ｈｍｇｂ１ターゲッティングベクターをＫｐｎＩで制限酵素処理を行い直鎖状にし、２０μｇのベクターを用いてエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に導入し、あらかじめマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ社製）で処理したマウス繊維芽細胞上に播種した。エレクトロポレーションから２４時間後、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含む培地に変え、８日間セレクションを行った。Ｇ４１８耐性を示したコロニーの一部からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法、サザンブロット解析により、目的のクローン（以下、「ＨＲクローン」という。）を選抜した。
【００４１】
ＰＣＲ法によるＨＲクローンのスクリーニングには、ｓｅｎｓｅプライマー：５’−ＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧ−３’（配列番号９）、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＴＡＣＡＧＧ−３’（配列番号１０）を用いた。また、サザンブロット解析では、プローブＡ  ｓｅｎｓｅプライマー：５’−ＣＧＴＡＡＴＧＡＡＡＣＧＣＣＣＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号１１）、プローブＡ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１２）、プローブＢ  ｓｅｎｓｅプライマー：５’−ＧＡＡＴＧＧＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１３）、プローブＢ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＴＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＴＧＧ−３’（配列番号１４）を用いてＰＣＲ法により得たＤＮＡ断片をプローブの作製に使用した。
【００４２】
ＨＲクローンに、更にＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクター（ｐＩＣ−Ｃｒｅベクター）１０μｇをエレクトロポレーション法で導入して、あらかじめマイトマイシンＣで処理したマウス線維芽細胞上に播種し、１週間の培養によりコロニーを形成させた。そのコロニーを、Ｇ４１８を含む培地と含まない培地中に分けて培養を行い、Ｇ４１８に感受性を示したコロニーに対してＰＣＲ法及びサザンブロット解析により目的のクローンを選抜した。ＰＣＲ法によるスクリーニングでは、ｓｅｎｓｅプライマー：５’−ＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号１５）、ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：５’−ＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＧＧＣＡＡＧＴＴ−３’（配列番号１６）を用いた。これによって得られたクローンを胚盤胞期の卵内に挿入し、その卵を仮親のマウスに移植した後、生まれてきたキメラマウスを掛け合わせてＦ１マウスを得た。
【００４３】
（サザンブロット解析）
Ｆ１マウスのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＶ又はＨｉｎｄＩＩＩで一晩制限酵素処理した後、フェノール抽出、エタノール沈殿、洗浄、乾燥し、適量の滅菌水に溶解した。各サンプルを１レーン当たり２μｇになるように調製し、１．０％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルを０．２５Ｍ  ＨＣｌ溶液中で２０分間振とうした後、蒸留水でゲルをすすぎ、さらに０．４Ｍ  ＮａＯＨ溶液中で更に３０分間振とうした。その後、ナイロン・メンブレン（ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）をのせて１６時間放置し、ゲノムＤＮＡをメンブレンにトランスファーした。
【００４４】
メンブレンを２ｘＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）中で１５分間振とうして中和、風乾し、ＵＶクロスリンカーを用いて１２０，０００μＪのＵＶを照射した。ＵＶによってＤＮＡを固定したメンブレンを、５〜１０ｍＬのハイブリダイゼーションバッファー（ＵＬＴＲＡｈｙｂ、ＡＢＩ社製）中でプレハイブリダイゼーション（４２℃、１時間）し、ＤＮＡプローブを加えて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【００４５】
ＤＮＡプローブの作製にはＢｃａＢＥＳＴ  ラベリングキット（ＴａＫａＲａ社製）を用いた。２０ｎｇのＤＮＡをテンプレートにしてキットに添付のランダムプライマー２μＬを加え９５℃で３分間加熱した後、氷上で急冷した。そこに１０ｘバッファー、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅを各２．５μＬ、標識ｄＣＴＰ［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ＮＥＧ−５１３Ｚ）（１．８５Ｂｑ、５０μＣｉ）を５μＬ加えた。さらに、ＢｃａＢＥＳＴ  ＤＮＡポリメラーゼ１μＬを加え、５０℃で１０分間インキュベートした。ラベルしたＤＮＡをＰｒｏｂｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて精製した。ハイブリダイゼーション後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて４２℃、１５分間の振とう洗浄をそれぞれ２回ずつ行った。洗浄後、メンブレンの水分を拭き取って、ハイブリバックに包み、これを−８０℃でＸ線フィルムに露光し現像した。
【００４６】
（タモキシフェン投与）
マウスに、１個体あたり９．０ｍｇ／４０ｇ（マウス）となるように、コーンオイル（ｓｉｇｍａ社製）に懸濁したタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ社製）を、腹腔内注射により３日ごとに２週間投与した。
【００４７】
（ＬＰＳ誘導性ショック）
マウスに、１個体あたり１．０ｍｇ／２０ｇ（マウス）又は１．２５ｍｇ／２０ｇ（マウス）となるように、ＰＢＳに懸濁したＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ社製）を、腹腔内注射により投与した。ＬＰＳ投与後２時間、６時間、１２時間後にマウスの尾静脈より血清を回収した。また、マウスの生存について経過観察を行った。
【００４８】
（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを利用できる変異マウスの作製）
まず、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いて特定の条件でＨＭＧＢ１を欠損させるための変異マウスの作製を行った。ＣｒｅリコンビナーゼはＩ型トポイソメラーゼ、ｌｏｘＰは３４ｂｐからなる特定のＤＮＡ配列であり、両方ともＰ１バクテリオファージに由来する。Ｃｒｅリコンビナーゼが同じ方向の２つのｌｏｘＰ配列を認識することで、ｌｏｘＰ同士で相同組換えが起こり認識配列間に位置していたＤＮＡ配列が切り出される。
【００４９】
このシステムを適用するために、まず、図１（Ａ）に示すように、Ｈｍｇｂ１遺伝子の開始コドンを含んでいる第２エキソンの上流と第４エキソンの下流のそれぞれ直近にｌｏｘＰ配列を持つＨｍｇｂ１遺伝子座のターゲッティングベクターを構築した。このターゲッティングベクターは、ポジィティブ選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（アミノグリコシドリン酸転移酵素をコードする；ｎｅｏ）を、また相同でない部位での遺伝子挿入や組換えを起こした細胞を死滅させるために、毒素であるジフテリアトキシンＡサブユニットの遺伝子（ＤＴＡ）を有している。
【００５０】
エレクトロポレーション法を用いて胚性幹細胞にターゲッティングベクターを導入した後、Ｇ４１８を含む培地で培養し、Ｇ４１８耐性クローンを選抜した。Ｇ４１８はアミノグリコシド系抗生物質であり、真核生物の８０Ｓリボソームによるタンパク質合成を阻害する。その結果得られたＧ４１８耐性クローンから、２８８個のコロニーを選択して、ＰＣＲ及びサザンブロット法によりＨｍｇｂ１遺伝子座で相同組換えを起こしたクローン（ＨＲクローン）を探索した。その結果、ＰＣＲ法によりＧ４１８耐性であったクローンから８クローンが選抜された。続いて、その８クローンに対するサザンブロット解析によって、７クローンはＨｍｇｂ１遺伝子の近傍に設計したプローブ（プローブＡ、Ｂ）及びｎｅｏプローブに対して、期待される長さで遺伝子断片が検出されたため、目的のＨＲクローンであることが判明した。なお、図１（Ｂ）に示すように、他の１クローン（ｃｌｏｎｅ  ６５）では予想される遺伝子断片の長さではなかったことから非特異な挿入が起こったと考えられた。
【００５１】
ＨＲクローンは、Ｈｍｇｂ１遺伝子座にｌｏｘＰ配列を持つクローンであるが、相同組換えの過程で同遺伝子座内にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されている。コンディショナル欠損では特定の組織や細胞での遺伝子欠損を目的としているため、意図しない組織や細胞では遺伝子発現が正常でなければならない。しかしながら、遺伝子座にプロモータを有する他の遺伝子が挿入されると、元の遺伝子のプロモータへ干渉が起こり、遺伝子発現パターンが変動する危険性がある。そこで、可能な限り野生型の遺伝子配列と一致させるために、ネオマイシン耐性遺伝子の除去を行った。
【００５２】
ネオマイシン耐性遺伝子はｌｏｘＰに挟まれているため、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いることで切り出すことができる。そこで、エレクトロポレーションによりＨＲクローンにＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクター（ｐＩＣ−Ｃｒｅベクター）を導入し一過的にＣｒｅリコンビナーゼを発現させたのち、コロニーを拾い、それらに対してＧ４１８への感受性を試験して選抜を行い、サザンブロット法により確認した。図１（Ｃ）に示すように、３つのＨＲクローン（ｃｌｏｎｅ１３３、１９２、２１７）に対して全部で約２，０００クローンを試験した結果、ＨＲクローン由来であり、かつネオマイシン耐性遺伝子を持たずにＨｍｇｂ１遺伝子座に２つのｌｏｘＰが挿入されているクローン（以下「ｆｌｏｘクローン」という。）をそれぞれ３種類単離することに成功した。さらに、このようにして選抜したｆｌｏｘクローンを胚盤胞期の卵内に挿入し、その卵を仮親のマウスに移植した後に生まれてきたキメラマウスを掛け合わせてＦ１マウスを得た。図１（Ｄ）に示すように、これらのマウスの遺伝子型を解析したところ、ｃｌｏｎｅ１３３と１９２由来のキメラマウスにおいて、それぞれ生殖系列移行（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が起きていることを確認した。なお、以下の解析はｃｌｏｎｅ１３３由来マウスを用いて行った。
【００５３】
図１は、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウス（Ｈｍｇｂ１ｆｌｏｘマウス）の作製について説明する図である。図１（Ａ）にＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウス作製の概略図を示す。開始コドンを含む第２エキソンの直前と第４エキソンの直後にｌｏｘＰを挿入したＨｍｇｂ１遺伝子ターゲッティングベクターを構築した。ターゲッティングベクターはネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）とジフテリアトキシンＡサブユニット遺伝子（ＤＴＡ）を持つ。プローブＡ、ＢによってＥｃｏＲＶで制限酵素処理されたゲノムＤＮＡに対するサザンブロット解析により、野生型のＨｍｇｂ１遺伝子座（ＷＴ）は１６．５ｋｂ、ターゲッティングベクターと相同組換えをしたＨｍｇｂ１遺伝子座（ＨＲ）は、それぞれ１０．７ｋｂ及び６．２ｋｂのバンドとして検出される。さらに、ＢａｍＨＩで制限酵素処理されたゲノムＤＮＡに対するサザンブロット解析では、ＨＲ、ＨＲからｎｅｏを取り除いたＨｍｇｂ１遺伝子座（ｆｌｏｘ）及び第２エキソンから第４エキソンを除いたＨｍｇｂ１遺伝子座（ｎｕｌｌ）は、プローブＢを用いて、それぞれ８．０、６．０、５．０ｋｂのバンドとして検出される。
【００５４】
図１（Ｂ）に、エレクトロポレーション法を用いて胚性幹細胞にターゲッティングベクターを導入後、Ｇ４１８耐性かつＨＲに特異的なプライマーを用いたＰＣＲ解析で陽性を示した８クローンに対するサザンプロット解析を行った結果を示す。ゲノムＤＮＡはＥｃｏＲＶ又はＢａｍＨＩで制限酵素処理を行い、図に示したプローブを用いてＤＮＡ断片を検出した。
【００５５】
図１（Ｃ）は、図１（Ｂ）で単離したクローンのうち３クローンに対して、ＣｒｅリコンビナーゼｃＤＮＡを組込んだベクター（１０μｇ）をエレクトロポレーション法によって一過的に導入し、Ｇ４１８感受性を示した細胞に対して、図１（Ｂ）と同様の条件でサザンプロット解析を行った結果を示す。
【００５６】
図１（Ｄ）は、図１（Ｃ）で得たｆｌｏｘクローン由来のキメラマウスとそのＦ１マウスにおける生殖系列移行の有無を示す。
【００５７】
Ｃｒｅ−エストロゲン受容体遺伝子を導入したＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの作製と解析
上記の方法により作製されたマウスを用いて、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを作製した。まず、様々な臓器においてＨＭＧＢ１を欠損させた際にマウス個体、又は細胞集団に異常がみられるかどうか検討した。
【００５８】
Ｃｒｅ−エストロゲン受容体（Ｃｒｅ−ＥＲＴ２）マウスにはエストロゲン受容体の変異体であるＥＲＴ２がＣｒｅとの融合タンパク質として発現しており、エストロゲン投与には反応しないが、エストロゲンの類似体であるタモキシフェンと強く結合し、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２融合タンパク質が核内移行し、核内においてＣｒｅリコンビナーゼが機能することで組換えが全身の細胞で起きるシステムである。
【００５９】
このＣｒｅ−エストロゲン受容体マウスとＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを交配し、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋及び、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋マウスを得た。ここで、「ｆｌ」は、上記のｆｌｏｘクローンが有する、Ｈｍｇｂ１遺伝子座に２つのｌｏｘＰが挿入された遺伝子座を表す。
【００６０】
生後５週齢及び１４週齢のこれらのマウスにタモキシフェンを３日おきに２週間投与し続けた。興味深いことに、図２（Ａ）に示すように、非特許文献３に記載されたＨｍｇｂ１−／−マウスと異なり、タモキシフェン投与後のマウスは致死性を示さず、対照のＨｍｇｂ１＋／＋／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋マウスと比較し、外見では何らの異常を示さず、体重等にも変化は確認されなかった。
【００６１】
図２（Ｂ）に示すように、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋マウスにタモキシフェン投与後、骨髄細胞由来のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロッティング法により解析したところ、Ｈｍｇｂ１遺伝子のターゲットされた領域において、効率よく遺伝子の組換えが起き、遺伝子の欠失が起きていることが確認された。また、図２（Ｃ）に示すように、ＨＭＧＢ１タンパク質の発現について、抗ＨＭＧＢ１抗体を用いて確認したところ、様々な臓器及び細胞群においてＨＭＧＢ１の発現が顕著に減弱していることが示された。
【００６２】
さらに、図３（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、胸腺及び脾臓において、免疫担当細胞の細胞集団についてフローサイトメトリーを用いて解析したところ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ等、様々な細胞集団においてそれらの数に大きな異常は見られなかった。これらのことから、今回作製したＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを用いることで、ＨＭＧＢ１の発現を欠失させることができることが判明した。このマウスでは特段の異常は現在のところ見いだされていないが、今回の実験ではＨＭＧＢ１の発現が残存していることから、今後は更なる工夫や詳細な解析を行うことが必要と考えている。
【００６３】
図２は、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスを用いたＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスの作製について説明する図である。図２（Ａ）に、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋マウスにタモキシフェン（９ｍｇ／２０ｇ体重）を２週間投与した後、マウスの体重変化を検討した結果を示す。
【００６４】
図２（Ｂ）及び（Ｃ）に、図２（Ａ）のマウスを用いて、骨髄細胞におけるＨｍｇｂ１遺伝子の組換え及び各臓器におけるＨＭＧＢ１の発現量をそれぞれサザンブロット、ウェスタンブロットにより解析した結果を示す。図２（Ａ）では生後５週齢及び１４週齢のマウスを、図２（Ｂ）及び（Ｃ）では、１４週齢のマウスを用いた。
【００６５】
図３は、ＨＭＧＢ１の免疫細胞群への影響を検討した結果を示すグラフである。生後１４週齢（Ａ）及び５週齢（Ｂ）のＨｍｇｂ１＋／＋／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋マウス及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｃｒｅ−ＥＲＴ２＋マウスに、タモキシフェン（９ｍｇ／２０ｇ体重）を２週間投与した後、胸腺細胞又は脾臓細胞群の割合を図に示した蛍光色素結合抗体により染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
【００６６】
（３）変異マウスを用いたＴ細胞、Ｂ細胞におけるＨＭＧＢ１の役割
上記のように、発明者らが作製したＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを用いることで、ＨＭＧＢ１の発現を欠失させることができることが明らかとなった。そこで、これまで報告されているＨＭＧＢ１の機能について検討した。
【００６７】
ＨＭＧＢ１はＲＡＧ１及びＲＡＧ２と結合し、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体の遺伝子組換えを促進することが報告されていた。そこで、Ｔ細胞特異的、又はＢ細胞特異的にＨＭＧＢ１の発現を欠失できるよう、Ｔ細胞特異的にＣｒｅを発現するＬｃｋ−Ｃｒｅマウス、又はＢ細胞特異的にＣｒｅを発現するｍｂ．１−ＣｒｅマウスとＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスとの交配を行った。得られたＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋マウス及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウスについて、脾臓又は胸腺を用いて細胞集団の解析を行った。
【００６８】
まず、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋マウス及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋マウスについて、胸腺細胞及び脾細胞をフローサイトメトリーにて解析した。その結果、図４（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、胸腺におけるＴ細胞群には両者において差異は認められなかった。また、図４（Ｃ）に示すように、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋マウスの脾臓において、ＴＣＲ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞に若干の減弱を認めたものの、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は変化せず、大きな差異は見られなかった。
【００６９】
次に、Ｈｍｇｂ１＋／＋／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウス及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウスについて解析を行った。興味深いことに、図４（Ｄ）に示すように、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウス由来の脾臓はＨｍｇｂ１＋／＋／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウス由来、又はＨｍｇｂ１＋／ｆ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウス由来の脾臓と比較し、明らかに大きさが異なり、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウス由来の脾臓は小さくなっていた。これらのマウス由来の脾細胞を用いてＢ細胞マーカーであるＢ２２０とＴ細胞マーカーであるＣＤ３ε及びＩｇＭに対して染色を行い、フローサイトメトリーにて細胞集団の解析を行った。その結果、図４（Ｅ）に示すように、Ｂ２２０＋ＣＤ３ε−細胞数についてＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウス由来脾細胞に著明な減弱を認めた。同時に、Ｂ２２０＋ＩｇＭ＋ＣＤ３ε−についても染色を行ったが、同様に細胞集団に顕著な差異が認められ、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウスではＢ細胞集団に異常を来すことが明らかとなった。ＲＡＧ欠損マウスにおいては、Ｔ細胞、Ｂ細胞ともに異常が認められることが報告されている。ＨＭＧＢ１がどのように、特にＢ細胞の分化過程に寄与しているのか、今後明らかにしていきたい課題であると考えている。
【００７０】
図４は、Ｔ細胞及びＢ細胞分化におけるＨＭＧＢ１の関与を検討した結果を示す図である。図４（Ａ）は、脾臓細胞におけるＨＭＧＢ１の発現量をウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。図４（Ｂ）は、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋マウスについて、胸腺細胞群の割合を、ＣＤ４及びＣＤ８に対する蛍光色素結合抗体により染色し、フローサイトメトリーによって解析した結果を示すグラフである。
【００７１】
図４（Ｃ）は、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｃｋ−Ｃｒｅ＋マウスについて、脾臓細胞群の割合を、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ３ε又はＮＫ１．１に対する蛍光色素結合抗体により染色し、フローサイトメトリーによって解析した結果を示すグラフである。図４（Ｄ）は、Ｈｍｇｂ１＋／＋／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋、Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウスの脾臓の写真を示す。
【００７２】
図４（Ｅ）は、Ｈｍｇｂ１＋／＋／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／ｍｂ．１−Ｃｒｅ＋マウスにおける脾臓細胞群の割合を、ＣＤ３ε、Ｂ２２０又はＩｇＭに対する蛍光色素結合抗体により染色し、フローサイトメトリーによって解析した結果を示すグラフである。
【００７３】
（４）ＬＰＳ誘導性敗血症モデルにおけるＨＭＧＢ１の役割
上述のように、ＨＭＧＢ１はさまざまな病態の増悪に働く、炎症性サイトカインとして機能することも示唆されている。実際に敗血症、ＲＡ、ＳＬＥの患者において、分泌されたＨＭＧＢ１量が増加していることが報告されている。敗血症のモデルとして用いられるマウスへのＬＰＳ投与では、血中における炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６の濃度が投与後間もなく上昇し、これら炎症性サイトカインの過剰生産により、過度の炎症反応が惹起され致死性になると考えられている。この際、これらサイトカインの持続的産生に関与する因子としてＨＭＧＢ１の作用が示唆されている。血中でのＨＭＧＢ１濃度は投与後８時間後から上昇し始めて、１６〜３６時間後まで高濃度で維持されるが、この際にＨＭＧＢ１中和抗体を投与することでマウスの生存率が改善する。またｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬＰＳ刺激によりマクロファージ等の細胞において、ＨＭＧＢ１が能動的に分泌されることが知られており、ＬＰＳ投与によりこれらの細胞から分泌されたＨＭＧＢ１が敗血症の致死性に作用していると考えられている。
【００７４】
そこで、マクロファージ等によって産生されるＨＭＧＢ１の、敗血症モデルとして知られるＬＰＳ誘導性ショックにおける役割について検討するため、ＨＭＧＢ１を能動的に放出するマクロファージや単球等の細胞でＨｍｇｂ１遺伝子を欠損したマウスを作製し、敗血症モデルにおいてＬＰＳに対する感受性について検討を行った。
【００７５】
マクロファージや単球を含む細胞群でＨｍｇｂ１遺伝子を欠損したマウス作製するために、Ｌｙｓｏｚｙｍｅプロモータ制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現する遺伝子（Ｌｙｓ−Ｃｒｅ）を有するマウスとＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスとの交配を行った。Ｌｙｓ−Ｃｒｅマウスは骨髄系の細胞、特にマクロファージや好中球でＣｒｅリコンビナーゼを発現し、それらの細胞群において高頻度でｌｏｘＰに挟まれた遺伝子を切り出すことが知られている。この交配によって得られたマウスでのＨＭＧＢ１の欠損について検討するため、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋、Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスにおけるチオグリコレート誘導性マクロファージを単離し、サザンブロット法及び抗ＨＭＧＢ１抗体を用いて解析を行った。図５（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、サザンブロットによる解析では、Ｈｍｇｂ１遺伝子の欠失が確認され、また、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋細胞ではＨＭＧＢ１タンパク質はほとんどその発現が認められなかった。
【００７６】
Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスにおいても、マクロファージ等の細胞群においてＨｍｇｂ１遺伝子が欠失することが確認されたので、このマウスにＬＰＳ投与し、その生存率について検討を行った。Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスに致死量のＬＰＳを腹腔内投与した。その結果、図５（Ｃ）に示すように、予想に反し、興味深いことに、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスの全ての個体がＬＰＳ投与により死亡した一方、Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスでは７個体中２個体が生き残った。このことから、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスでは、ＨＭＧＢ１がＬＰＳ誘導性致死に対して増悪にはたらくのではなく、逆に耐性を付与しているのではないかと考えられた。
【００７７】
このことをさらに検討するため、致死量以下の濃度のＬＰＳをマウスの腹腔に投与し、ＬＰＳ投与による致死性について検討を行った。その結果、図５（Ｄ）に示すように、ＨＭＧＢ１を正常に発現しているＨｍｇｂ１＋／＋／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスは、全ての個体がＬＰＳ投与に対して抵抗性を示したのに対し、Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスの８０％、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスの全ての個体が死に至ることが明らかとなった。また、図５（Ｅ）に示すように、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスにおいては、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスと比較し、ＬＰＳ投与後の血中におけるＩＬ−６の産生にはほとんど差異が認められないものの、ＴＮＦ−αの誘導が顕著に増加していることが判明した。
【００７８】
図５（Ｇ）に示すように、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−マウス由来の常在性腹腔マクロファージにＬＰＳ刺激を行うと、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来のマクロファージでは、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−由来のマクロファージと比較し、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの誘導が有意に増加していた。一つの可能性として、ＬＰＳ誘導性ショックにおけるＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスの脆弱性は、ＨＭＧＢ１を欠損したマクロファージからの多量のＴＮＦ−α産生が関与している可能性が考えられた。
【００７９】
上記の解析から、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスはＬＰＳ誘導性ショックに対し、脆弱性を示すことが明らかとなった。また、その際、血中のＴＮＦ−αの産生が増強していることが判明した。何故、ＨＭＧＢ１欠損マクロファージにおいて、ＬＰＳ刺激時のＴＮＦ−αの産生が亢進するのか、このＴＮＦ−αの増加のみが致死性の理由なのかどうか、更に、ＬＰＳ投与により放出されるＨＭＧＢ１と脆弱性との関連等については不明であり、今後明らかにすべき課題であると考えている。
【００８０】
図５は、Ｌｙｓ−ＣｒｅマウスのＬＰＳによる免疫応答を検討した結果を示す図である。図５（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋、Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来のチオグリコレート誘導マクロファージにおけるＨｍｇｂ１遺伝子の組換え及びＨＭＧＢ１の発現量をそれぞれサザンブロット及びウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
【００８１】
図５（Ｃ）は、Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋（ｎ＝７）、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋（ｎ＝８）マウスのＬＰＳ（１．２５ｍｇ／２０ｇ体重）の腹腔内投与後の生存曲線を示すグラフである。生後１２〜１４週齢のマウスを用いた。図５（Ｄ）は、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋（ｎ＝４）、Ｈｍｇｂ１＋／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋（ｎ＝５）、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋（ｎ＝５）マウスのＬＰＳ（１．０ｍｇ／２０ｇ体重）の腹腔内投与後の生存曲線を示すグラフである。生後８〜１０週齢のマウスを用いた。
【００８２】
図５（Ｅ）は、図５（Ｄ）のマウスの血中におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて計測した結果を示すグラフである。値は平均値±標準誤差であり、ＮＤは検出不可であったことを示す。アステリスク（＊）は、Ｈｍｇｂ１＋／＋／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスと比較して、値がＰ＜０．０１で有意差があることを示す。図５（Ｆ）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来の常在性マクロファージにおけるＨＭＧＢ１の発現量をウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
【００８３】
図５（Ｇ）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来の常在性マクロファージを、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６遺伝子についてｍＲＮＡの相対発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をｑＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。値は平均値±標準誤差であり（ｎ＝３）、アステリスク（＊）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−マウスと比較して、値がＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【００８４】
（５）ＨＭＧＢ１欠損マクロファージにおける核酸刺激に対する応答
上述のように、発明者らの先行研究から、ＨＭＧＢタンパク質は核酸による免疫応答に必須であることが明らかとなった（非特許文献１を参照）。ＨＭＧＢ１、３はＤＮＡ及びＲＮＡに、ＨＭＧＢ２はＤＮＡに結合する分子であるが、ＨＭＧＢタンパク質がどのように核酸を認識しているか、またその下流のシグナル伝達の活性化における役割の詳細については不明である。さらに、Ｈｍｇｂ１遺伝子欠損マウスが生後早期に致死を示すため、生体での免疫担当細胞におけるＨＭＧＢ１の核酸刺激による免疫応答への関与や、核酸認識受容体としてのＨＭＧＢ１の生体内における役割については検討がなされてこなかった。そこで、上記において作製したＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスを用いて、核酸による免疫応答機構の解析を行った。
【００８５】
Ｈｍｇｂ１−／−ＭＥＦｓ（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、マウス胎児繊維芽細胞）では、ＤＮＡやＲＮＡ刺激によるサイトカインの誘導が野生型に比べて減弱する一方で、ＬＰＳ等の非核酸による刺激では核酸刺激時のような減弱は見られない。また同様の結果が、分化誘導した樹状細胞においても確認されている（非特許文献１を参照）。そこで、他の免疫担当細胞であるマクロファージにおけるＤＮＡ刺激によるサイトカイン遺伝子誘導に対するＨＭＧＢ１の関与を検討した。
【００８６】
Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウスから常在性マクロファージを単離し、それぞれＣｐＧ−Β  ＤＮＡ（以下「ＣｐＧ−Ｂ」という。）５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１７）やＬＰＳを用いて刺激を行い、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６のｍＲＮＡの誘導についてｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。その結果、図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ＨＭＧＢ１を欠損することでＣｐＧ−Ｂ刺激によるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの誘導は減弱されず、むしろ増強し、ＬＰＳ刺激においても同様の傾向を示した。一方、図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ＣｐＧ−Ｂ刺激によるＩＬ−６  ｍＲＮＡの誘導は、対照細胞と比較し、ＨＭＧＢ１を欠失したマクロファージにおいて増強が認められたものの、ＬＰＳ刺激によるＨＭＧＢ１を欠失したマクロファージにおけるＩＬ−６  ｍＲＮＡの誘導は、対照細胞と比較し差異は認められなかった。また、図６（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来の骨髄細胞からＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、マクロファージコロニー刺激因子）により分化誘導したマクロファージ（Ｍ−ＣＳＦマクロファージ）を用いて同様の検討を行ったところ、対照細胞と比較し、ＨＭＧＢ１を欠損した細胞では、ＣｐＧ−Ｂ刺激によるＴＮＦ−α及びＩＬ−６のｍＲＮＡの誘導が増強される結果が得られた。さらに興味深いことに、図６（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、Ｍ−ＣＳＦマクロファージでは、常在性マクロファージとは異なり、ＨＭＧＢ１欠損細胞におけるＬＰＳ刺激により、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡと同様にＩＬ−６  ｍＲＮＡも増強されていた。
【００８７】
図６は、ＨＭＧＢ１欠損マクロファージにおけるＴＬＲｓを介したサイトカイン誘導を検討した結果を示す図である。図６（Ａ）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来の常在性マクロファージにおけるＨＭＧＢ１の発現量をウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
【００８８】
図６（Ｂ）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来の常在性マクロファージを、ＣｐＧ−Ｂ（１μＭ）又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を、ｑＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。
【００８９】
図６（Ｃ）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来の骨髄細胞よりＭ−ＣＳＦを用いて分化誘導したマクロファージにおけるＨＭＧＢ１の発現量をウェスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
【００９０】
図６（Ｄ）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−及びＨｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ＋マウス由来の骨髄細胞よりＭ−ＣＳＦを用いて分化誘導したマクロファージを、ＣｐＧ−Ｂ（１μＭ）又はＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激しＴＮＦ−α及びＩＬ−６遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をｑＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示すグラフである。
【００９１】
図６（Ｂ）及び（Ｄ）において、値は平均値±標準誤差であり（ｎ＝３）、アステリスク（＊）は、Ｈｍｇｂ１ｆｌ／ｆｌ／Ｌｙｓ−Ｃｒｅ−マウスと比較して、値がＰ＜０．０５で有意差があることを示す。また、図６のデータは１度の試験結果である。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明において作製したＨｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物により、様々な病態発症における役割をより詳細に理解でき、それらの克服に新しい戦略を提供できることが期待される。実際、ＨＭＧＢ１は、核酸認識受容体としての機能に加え、ＳＬＥ等の自己免疫疾患や虚血・再還流等の炎症の病態、更には癌細胞の増殖等にも密接な関連があることが示唆されている多彩な機能を有する分子である。本発明により、Ｈｍｇｂ１遺伝子のコンディショナルノックアウト非ヒト動物が提供されたことから、今後、これらの機能・病態について検討を行い、ＨＭＧＢ１の免疫応答における役割について、その詳細を明らかにできる。また、ＨＭＧＢ１の作用を明らかにしていくことは、阻害剤や治療法の開発に道を拓くことに繋がることから、本発明は極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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