(57)【要約】【課題】経口用光老化抑制剤を提供する。【解決手段】ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する経口用光老化抑制剤。【選択図】図１
2013180988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする経口用光老化抑制剤。
【請求項２】
紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤として使用されることを特徴とする請求項１に記載の経口用光老化抑制剤。
【請求項３】
皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤として使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の経口用光老化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口用光老化抑制剤に関し、より詳細には、紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤として有効な経口用光老化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は常に紫外線に曝露されており、長年かつ繰り返しの紫外線曝露によって皮膚の光老化が促進される。紫外線暴露により、皮膚真皮の細胞外マトリックスの大半を占めるコラーゲンが切断されて顕著に減少するとともにコラーゲン繊維束の乱れが生じ、皮膚の弾力性が失われ、シワが形成される。
【０００３】
ヒアルロン酸は、生体、特に皮下組織に存在するムコ多糖類であり、その高い保湿機能により、化粧料の成分として広く利用されている。ヒアルロン酸は、光老化や紫外線により誘発されるシワ形成を抑制するための化粧料にも利用されており、例えば、ヒアルロン酸、紫外線吸収剤および抗酸化剤を配合した化粧料を皮膚に塗布することにより、日焼け現象等の紫外線障害を抑制することが知られている（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、従来の化粧料において、ヒアルロン酸は皮膚に潤いを与えるための保湿成分として使用されており、特許文献１の化粧料による紫外線障害の抑制効果も紫外線吸収剤および抗酸化剤により得られるものであるため、ヒアルロン酸のみを皮膚に塗布した場合、光老化や紫外線により誘発されるシワ形成を十分に抑制できない。
【０００５】
また、紫外線吸収剤や酸化防止剤を含有する化粧料の効果が期待できるのは、塗布を行った皮膚の局所的な部分のみであり、広範囲の皮膚で光老化を抑制するには不向きである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１７６４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、光老化、特に紫外線により誘発されるシワの形成の抑制に有効な経口用光老化抑制剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩が、経口摂取により光老化を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする経口用光老化抑制剤、
（２）紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤として使用されることを特徴とする（１）に記載の経口用光老化抑制剤、
（３）皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤として使用されることを特徴とする（１）または（２）に記載の経口用光老化抑制剤、
である。
【発明の効果】
【００１０】
上記経口用光老化抑制剤によれば、光老化、特に紫外線により誘発されるシワの形成を抑制することができる。また、上記経口用光老化抑制剤によれば、皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生を促進するため、光老化の抑制に有効な新規製剤が提供される。
【００１１】
また、上記経口用光老化抑制剤は経口摂取するものであることから、生体内で作用することができるため、広範囲の皮膚で光老化を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施例１〜３のヒアルロン酸の紫外線により誘発されるシワ形成抑制作用の確認試験において、紫外線照射開始６週間後の背部皮膚の状態を示す写真である。
【図２】図２は、本発明の実施例１〜３のヒアルロン酸の紫外線により誘発されるシワ形成抑制作用の確認試験において、紫外線照射開始６週間後の背部皮膚組織標本の断面を示す写真である。
【図３】図３は、本発明の実施例１〜３のヒアルロン酸の紫外線により誘発されるシワ形成抑制作用の確認試験において、紫外線照射開始６週間後の背部皮膚組織標本から測定した表皮厚を表すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例１〜３のヒアルロン酸の紫外線により誘発されるシワ形成抑制作用の確認試験において、紫外線照射開始６週間後の皮膚中のI型コラーゲンを検出したウエスタンブロットのバンド、およびそのバンド強度を表すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例１〜３のヒアルロン酸の紫外線により誘発されるシワ形成抑制作用の確認試験において、紫外線照射開始６週間後の皮膚中のデコリンを検出したウエスタンブロットのバンド、およびそのバンド強度を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照しつつ、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。
【００１４】
１．経口用光老化抑制剤
本発明の経口用光老化抑制剤は、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１５】
１．１．ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩
本発明において、「ヒアルロン酸」とは、β−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類である。すなわち、ヒアルロン酸は、β−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものである。また、「ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩」としては、特に限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１６】
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、動物等の生体組織（例えば鶏冠、さい帯、皮膚、関節液等）から抽出されたものでもよく、あるいは、微生物、動物細胞または植物細胞を培養して得られたもの（例えばストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）、化学的または酵素的に合成されたもの等を使用することができる。
【００１７】
なお、本発明において使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の純度は、医薬品で使用できるレベルであればよく、好ましくは９０％以上であればよく、より好ましくは９５％以上であればよい。この純度は、カルバゾール硫酸法（例えば日本薬局方）にて測定されたグルクロン酸定量値から算出された値である。
【００１８】
カルバゾール硫酸法は、ホウ酸ナトリウム・硫酸溶液中にヒアルロン酸水溶液を加えて混和し、ヒアルロン酸を加熱分解した後冷却し、カルバゾール・エタノール溶液を加えて混和し、加熱後放冷した試料液の吸光度（５３０ｎｍ）を測定する方法である。同様に処理したＤ−グルクロノラクトンを用いて検量線を作成し、Ｄ−グルクロノラクトン換算値を算出した後、１．１０２を乗じてグルクロン酸定量値を求める。得られたグルクロン酸定量値に（ヒアルロン酸類の分子量／グルクロン酸の分子量）を乗じてヒアルロン酸類の含有量を算出する。
【００１９】
また、本発明の経口用光老化抑制剤で使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、光老化抑制効果を十分に得られる点から、好ましくは１００万以下であり、より好ましくは４００〜１０万以下、さらに好ましくは２，０００〜２万である。
【００２０】
なお、本発明で規定されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の平均分子量は、以下の方法により測定される。
【００２１】
即ち、約０．０５ｇの精製ヒアルロン酸を精密に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液に溶かし、正確に１００ｍＬとした溶液及びこの溶液８ｍＬ、１２ｍＬ並びに１６ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液を加えて正確に２０ｍＬとした溶液を試料溶液とする。この試料溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液につき、日本薬局方（第十四改正）一般試験法の粘度測定法（第１法  毛細管粘度測定法）により３０．０±０．１℃で比粘度を測定し（式（１））、各濃度における還元粘度を算出する（式（２））。還元粘度を縦軸に、本品の換算した乾燥物に対する濃度（ｇ／１００ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線と縦軸との交点から極限粘度を求める。ここで求められた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（式（３））に代入し、平均分子量を算出する（T.C. Laurent, M. Ryan, A. Pietruszkiewicz,:B.B.A., 42, 476-485(1960)）。
（式１）
比粘度 ＝ {(試料溶液の所要流下秒数)/(0.2moｌ/L塩化ナトリウム溶液の所要流下秒数)}−1
（式２）
還元粘度 = 比粘度/(本品の換算した乾燥物に対する濃度（g/100mL）)
（式３）
極限粘度 ＝ ３．６×１０−４Ｍ０．７８
Ｍ：平均分子量
【００２２】
本発明の経口用光老化抑制剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量は、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩が有効成分として機能しうる量であればよく、通常１質量％以上であり、好ましくは５〜９５質量％である。
【００２３】
１．２．光老化の抑制
本発明の経口用光老化抑制剤は、経口投与により、紫外線暴露による皮膚の光老化を抑制する。
皮膚は常に紫外線に曝露されており、長年かつ繰り返しの紫外線曝露によって皮膚の光老化が促進される。特に、顔や手のような直接紫外線を浴びるケースが多い露出部の肌の老化原因はほとんどが光老化であると考えられている。したがって、顔や手においては、加齢によって起こる自然老化よりも光老化を抑制することが重要である。
【００２４】
光老化の主な症状としては、深いシワの形成や、しみの発生であるが、本発明の経口用光老化抑制剤は、特に紫外線により誘発されるシワの形成を抑制することができる。紫外線により誘発されるシワは、紫外線により皮膚真皮のコラーゲンが切断されて減少するとともにコラーゲン繊維束の乱れが生じ、皮膚の弾力性が失われることによって形成される。
【００２５】
本発明の経口用光老化抑制剤は、経口投与により、紫外線暴露による皮膚中のコラーゲンの産生を促進することができる。また、本発明の光老化抑制剤は、コラーゲンの形成に関与する遺伝子の発現を促進する作用を有する。
さらに、本発明の経口用光老化抑制剤は、経口投与により、紫外線暴露による皮膚中のデコリンの産生を促進することができる。
皮膚中のコラーゲンは、例えば血管壁や皮膚を構成しており、これらの器官に弾力性を与えるのに重要な役割を担っており、皮膚においては弾力やハリを保つのに大きな役割を果たしている。また、デコリンは、皮膚真皮のコラーゲン繊維を束ね、コラーゲン繊維形成を正常にし、皮膚の保水力やハリに影響を与える。
【００２６】
したがって、本発明の経口用光老化抑制剤は、皮膚中のコラーゲンおよびデコリンの産生を促進することができるため、皮膚の弾力やハリを保持し、シワ形成を効果的に抑制することができる。また、本発明の経口用光老化抑制剤は、経口投与により、紫外線暴露による皮膚中のコラーゲンおよびデコリンの減少を抑制することができる。
【００２７】
皮膚中のコラーゲン量およびデコリン量の産生促進作用は、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、アフィニティクロマトグラフィー等によるコラーゲンおよびデコリン蛋白質の検出によって、コラーゲン遺伝子の発現促進は、例えば、ノーザンブロッティング、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡチップ等によるコラーゲンｍＲＮＡの検出または定量等の公知の生化学的分析方法により確認することができる。
【００２８】
また、本発明の経口用光老化抑制剤に使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、前記のようなコラーゲン遺伝子の発現促進作用を有することから、コラーゲン遺伝子発現促進剤として使用することができる。
前記コラーゲン遺伝子としては、Col4a1（その配列は「Assay ID : Mm00802372_m1, Accession
number : Bru, Col4a-1, Del(8)44H, Raw, Svc」にて閲覧可能である）、Col1a1（その配列は「Assay ID:
Mm00801666_g1 Accession number : Mov13, RP23-112C19.9, Col1a-1, Cola-1, Cola1,
Mov-13」にて閲覧可能である）、Col3a1（その配列は「Assay ID: Mm01254476_m1 Accession
number : AW550625, Col3a-1, KIAA4231, MMS10-W, Ms10w, mKIAA4231」にて閲覧可能である）およびCol7a1（その配列は「Assay ID: Mm00483818_m1 Accession
number : AW209154」にて閲覧可能である）が挙げられる。
【００２９】
本発明の経口用光老化抑制剤によれば、皮膚中のコラーゲンおよびデコリンの産生を促進し、紫外線暴露による皮膚中のコラーゲンおよびデコリン量の減少を抑制する結果、光老化、特に紫外線により誘発されるシワの形成を抑制することができる。
【００３０】
本発明の経口用光老化抑制剤を経口摂取することによって皮膚中のコラーゲンおよびデコリンの産生が促進される作用機序については必ずしも明らかではないが、ヒアルロン酸を経口摂取したマウスの腸管上皮表面の受容体にヒアルロン酸が結合することが報告されている（Akira Asari, Tomoyuki Kanemitsu, Hithoshi Kurihara, Oral
Administration of High Molecular Weight Hyaluronan (900 KDa) Controls Immune
System via Toll-like Receptor 4 in the Intestinal Epithelium）。したがって、本発明の有効成分であるヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩を経口摂取すると、該ヒアルロン酸またはその薬学的に許容できる塩が腸管上皮表面の受容体に結合し、情報伝達された結果、皮膚の真皮繊維芽細胞等でコラーゲンやデコリンの産生が促進されたと推察される。
なお、ヒアルロン酸も皮膚真皮に含まれ、皮膚の水分を保持し保湿に寄与しているが、皮膚を保湿するだけでは、光老化で形成される深いシワの形成を十分に抑制することができない。
【００３１】
本発明の経口用光老化抑制剤に使用するヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、上記のような作用機序により生体内で作用するため、本発明の経口用光老化抑制剤は、広範囲の皮膚で光老化を抑制することができる。
【００３２】
本発明の経口用光老化抑制剤は、有効成分であるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の原料を含むことができる。そのような原料の例としては水、賦形剤、抗酸化剤、防腐剤、湿潤剤、粘稠剤、緩衝剤、吸着剤、溶剤、乳化剤、安定化剤、界面活性剤、滑沢剤、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、アルコール類等が挙げられる。
【００３３】
本発明の経口用光老化抑制剤の剤形は特に限定されないが、本発明の経口用光老化抑制剤を経口摂取する場合、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の液剤等の経口投与剤が挙げられる。
【００３４】
ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は生体物質であるため、多量に摂取しても副作用がない、またはきわめて低いと考えられるが、本発明の経口用光老化抑制剤として摂取するヒアルロン酸及び／またはその塩の量は、一日当たり１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは１００〜５００ｍｇを目安とすることができる。投与回数は、紫外線照射量や季節に応じて一日当たり一回もしくは複数回を選択できる。
【００３５】
２．紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤
皮膚は紫外線暴露により、皮膚真皮の細胞外マトリックスの大半を占めるコラーゲンが破壊され顕著に減少するとともに、コラーゲン繊維束の乱れが生じるため、皮膚の弾力性が失われ、シワが形成される。
【００３６】
本発明の経口用光老化抑制剤は、紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤用途に好適に用いることができる。本発明の一実施形態に係る紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤は、経口投与により、紫外線暴露による皮膚中のコラーゲンの減少を抑制することができるため、紫外線により誘発されるシワ形成を効果的に抑制することができる。
【００３７】
本実施形態に係る紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤において、有効成分として含まれるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩としては、上記本発明に係る経口用光老化抑制剤において有効成分として使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を使用することができる。また、本実施形態に係る紫外線により誘発されるシワ形成の抑制剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量及び投与量ならびに他の成分もまた、上記本発明に係る経口用光老化抑制剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量及び投与量と同様である。
【００３８】
３．皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤
皮膚中のコラーゲンは、例えば血管壁や皮膚を構成しており、これらの器官に弾力性を与えるのに重要な役割を担っており、皮膚においては弾力やハリを保つのに大きな役割を果たしている。皮膚は紫外線暴露により、皮膚真皮の細胞外マトリックスの大半を占めるコラーゲンが顕著に減少するとともにコラーゲン繊維束の乱れが生じ、皮膚の弾力性が失われ、シワが形成される。また、デコリンは、皮膚真皮のコラーゲン繊維を束ね、コラーゲン繊維形成を正常にし、皮膚の保水力やハリに影響を与える。
【００３９】
本発明の経口用光老化抑制剤は、皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤用途に好適に用いることができる。本発明の一実施形態に係る皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤は、経口投与により、皮膚中のコラーゲンおよびデコリンの産生を促進することができるため、皮膚の弾力やハリを保持し、シワ形成を効果的に抑制することができる。
【００４０】
本実施形態に係る皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤において、有効成分として含まれるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩としては、上記本発明に係る経口用光老化抑制剤において有効成分として使用されるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩を使用することができる。また、本実施形態に係る皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量及び投与量ならびに他の成分もまた、上記本発明に係る経口用光老化抑制剤におけるヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩の含有量及び投与量と同様である。
【００４１】
本実施形態に係る皮膚中のコラーゲンおよび／またはデコリンの産生促進剤によれば、皮膚中のコラーゲンおよびデコリンの産生を促進し、紫外線暴露による皮膚中のコラーゲンおよびデコリン量の減少を抑制する結果、光老化、特に紫外線により誘発されるシワの形成を抑制することができる。また、上記経口用光老化抑制剤は経口摂取するものであることから、生体内で作用することができるため、広範囲の皮膚で光老化を抑制することができる。
【００４２】
４．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００４３】
４．１．実施例１〜３および比較例１
下記の各ヒアルロン酸をそれぞれ精製水に溶解させ、各経口用光老化抑制剤を得た。
なお、後述する試験例１において、各ヒアルロン酸の投与量が２００ｍｇ／Ｋｇ／日となるように、ラットの平均体重及び平均飲水量から濃度を算出して、試験液を調製した。
実施例１：ヒアルロン酸（平均分子量３０万、白色粉末、キユーピー株式会社製）
実施例２：ヒアルロン酸（平均分子量５万、白色粉末、キユーピー株式会社製）
実施例３：ヒアルロン酸（平均分子量８,０００、白色粉末、キユーピー株式会社製）
また、滅菌精製水を比較例１とした。
【００４４】
４．２．試験例１
試験例１では、ヒアルロン酸の光老化抑制作用を確認し、該作用機序を解明するために、へアレスマウスにヒアルロン酸を蒸留水に溶解させた水溶液を経口投与した。
【００４５】
Ｈｏｓ：ＨＲ−１系雄ヘアレスマウス（６週齢）を皮膚水分量、皮膚粘弾性、体重により有意差のないよう群分けを行い、実施例１〜３および比較例１の経口用光老化抑制剤の評価を、各群ｎ＝６で行った（表１参照）。
【００４６】
マウスの背部に３回／週の頻度で、６週間ＵＶＢを照射した。総照射量は１回当たり２．８Ｊとした。
試験期間中、１回／日の頻度で、実施例１〜３の経口用光老化抑制剤を体重１ｋｇあたり２００ｍｇ経口投与した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
［背部皮膚の状態観察］
試験期間終了後、背部皮膚の状態を観察した。背部皮膚の写真を図１に示す。
図１より、ＵＶ（＋）コントロール群では、ＵＶ（−）コントロール群と比較して、ＵＶＢ照射によって背部の正中線に対して垂直方向に深いシワが形成されており、ＵＶＢ照射による顕著なシワ形成の誘発が確認された。
一方、本発明の経口用光老化抑制剤を投与した群（実施例１〜３投与群）では、ＵＶ（−）コントロール群と比較するとシワが形成されているが、ＵＶ（＋）コントロール群と比較してシワの深さは浅く、ＵＶＢ照射により誘発されるシワ形成の抑制効果が認められた。
【００４９】
［表皮厚の測定］
試験期間終了後、マウスを解剖し、背部皮膚組織標本から表皮厚を測定した。背部皮膚組織標本をヘマトクリット染色したものの写真を図２に、表皮厚の測定結果を図３に示す。
図２より、ＵＶ（＋）コントロール群では、ＵＶ（−）コントロール群と比較して表皮の肥厚化が認められた。一方、実施例１〜３の経口用光老化抑制剤を投与した群では、いずれもＵＶ（＋）コントロール群と比較して表皮の肥厚化が抑制された。
図３より、ＵＶ（−）コントロール群に対し、ＵＶ（＋）コントロール群は１％、実施例１投与群および実施例２投与群では５％の危険率で有意に表皮厚が増加し、実施例３投与群では有意な増加は見られなかった。しかし、実施例１〜３の経口用光老化抑制剤を投与した群では、ＵＶ（＋）コントロール群と比較して、いずれも表皮厚が低値であった。また、ＵＶ（＋）コントロール群とのＤｕｎｎｅｔの検定において、実施例２投与群ではｐ＝０．０６５、実施例３投与群ではｐ＝０．０５４となり、両群ともに表皮の肥厚化を抑制する傾向があることが確認できた。
【００５０】
［皮膚中のI型コラーゲン量およびデコリン量］
試験期間終了後、マウスの背部から皮膚を切除して取り出し、凍結粉砕後、ラウリル硫酸ナトリウムを含む緩衝液に溶解することで試料を調製し、ウエスタンブロット法により、I型コラーゲン量およびデコリン量を測定した。
ここで、ウエスタンブロット法とは、ゲル電気泳動によって分子量にしたがい分離したタンパク質を転写膜に写し取り、さらに特定のタンパク質に対する抗体を用いて転写膜上で抗原抗体反応によって特定のタンパク質を発色させてその存在を肉眼観察する方法をいい、蛍光試薬で発色させる方法や、酵素反応を利用して発色させる方法など、多くの周知の手法が適用可能である。今回、I型コラーゲンを識別するために抗ブタ真皮由来I型コラーゲンウサギ抗血清を作製して一次抗体として使用し、デコリンに対しては抗ウシ胎盤由来デコリンウサギ抗血清を作製して使用した。それぞれ、二次抗体としてＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ
ＩｇＧ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて発色反応を行った。結果をそれぞれ図４、図５に示す。
【００５１】
図４に示すように、ウエスタンブロット法によりI型コラーゲンα１鎖のバンドが認められ、このバンド強度をＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ））を使用して測定し、コラーゲン量を定量した。
ＵＶ（＋）コントロール群では、ＵＶ（−）コントロール群と比較してI型コラーゲンα１鎖の量が減少しており、ＵＶＢ照射による皮膚中のI型コラーゲン量の減少が認められた。一方、実施例１投与群では、I型コラーゲンα１鎖の量はＵＶ（＋）コントロール群と比較してわずかに増加し、実施例２投与群および実施例３投与群では、I型コラーゲンα１鎖の量がＵＶ（＋）コントロール群と比較して顕著に増加した。
このように、本発明の経口用光老化抑制剤の経口投与により、皮膚中のI型コラーゲン量が増加することが確認された。
【００５２】
図５に示すように、ウエスタンブロット法によりデコリンのバンドが認められ、このバンド強度をＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ））を使用して測定し、デコリン量を定量した。
ＵＶ（＋）コントロール群では、ＵＶ（−）コントロール群と比較してデコリンの量が著しく低下しており、ＵＶＢ照射による皮膚中のデコリン量の低下が認められた。一方、本発明の経口用光老化抑制剤を投与した群では、いずれの群においてもデコリンの量がＵＶ（＋）コントロール群と比較して増加し、特に実施例２投与群および実施例３投与群では、ＵＶ（−）コントロール群と同等以上のデコリンの量であった。
また、ウエスタンブロット法により検出されるデコリンのバンドの位置で、デコリンの分子量を推定できるが、実施例２投与群および実施例３投与群は、ＵＶ（−）コントロール群と比較して高分子の位置にバンドが検出された。
このように、本発明の経口用光老化抑制剤の経口投与により、皮膚中のデコリン量が増加することが確認された。
【００５３】
［I型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量］
本発明の経口用光老化抑制剤がI型コラーゲンの遺伝子発現に与える影響を確認するために、ｍＲＮＡ発現量の測定を以下の方法にて行った。
【００５４】
試験期間終了後、マウスの背部から切除した皮膚組織からＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン株式会社）を用いｍＲＮＡを回収して、リアルタイムＰＣＲ機器（Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００、タカラバイオ株式会社）を用いたI型コラーゲンおよびデコリンのｍＲＮＡの定量を行った。まず、逆転写によってｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。すなわち、熱変性（９５℃、５秒）およびアニーリング（６０℃、３０秒）を４０回繰り返す増幅反応を行い、同時にＤＮＡに結合するＣｙｂｒＧｒｅｅｎの蛍光をモニタリングすることによってＤＮＡの増幅を測定し、対照のｍＲＮＡ量を１とした場合の定量を行った。用いたマウスI型コラーゲン、デコリン、ＧＡＰＤＨのプライマーはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＤｉｃｅＴＭ Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ８００
Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ.１．０２Ａで設計した。I型コラーゲンの配列は５’−ＡＴＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＴＧ−３’（Ｆｏｒｗａｒｄ）、５’−ＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＴＡ−３’（Ｒｅｖｅｒｓｅ）、ＧＡＰＤＨの配列は５’−ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ−３’（Ｆｏｒｗａｒｄ）、５’−ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧ−３’（Ｒｅｖｅｒｓｅ）である。
結果をそれぞれ表２に示す。結果は、ＵＶ（−）コントロール群のｍＲＮＡ発現量を１とした場合の相対値で示す。
【００５５】
【表２】
2013180988.tif 000004
【００５６】
表２より、ＵＶ（＋）コントロール群では、ＵＶ（−）コントロール群と比較してI型コラーゲンのｍＲＮＡ量が減少しており、ＵＶＢ照射によるI型コラーゲンのｍＲＮＡの減少が認められた。一方、本発明の実施例３投与群では、ＵＶ（−）コントロール群と比較してI型コラーゲンのｍＲＮＡ量が増加した。
このように、ヒアルロン酸の経口投与により、I型コラーゲンのｍＲＮＡ量が増加することが確認された。
【００５７】
４．３．実施例４
実施例１で使用したヒアルロン酸（平均分子量３０万のヒアルロン酸）を経口用光老化抑制剤として使用して、内容物が下記の配合であるソフトカプセルを製した。
【００５８】
［配合割合］
経口用光老化抑制剤（平均分子量３０万のヒアルロン酸）    ２０％
オリーブ油                                              ５０％
ミツロウ                                                １０％
中鎖脂肪酸トリグリセリド                                １０％
乳化剤                                                  １０％
――――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【００５９】
４．４．実施例５
実施例２で使用したヒアルロン酸（平均分子量５万のヒアルロン酸）を経口用光老化抑制剤として使用して、下記の配合の散剤（顆粒剤）を製した。
【００６０】
［配合割合］
経口用光老化抑制剤（平均分子量５万のヒアルロン酸）      １０％
乳糖                                                    ６０％
トウモロコシデンプン                                    ２５％
ヒプロメロース                                            ５％
――――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【００６１】
４．５．実施例６
実施例３で使用したヒアルロン酸（平均分子量８，０００のヒアルロン酸）を光老化抑制剤として使用して、下記の配合の錠剤を製した。
【００６２】
［配合割合］
経口用光老化抑制剤（平均分子量８，０００のヒアルロン酸）  ２５％
乳糖                                                      ２４％
結晶セルロース                                            ２０％
トウモロコシデンプン                                      １５％
デキストリン                                              １０％
乳化剤                                                      ５％
二酸化ケイ素                                                １％
――――――――――――――――――――――――――――――――
１００％
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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