(57)【要約】【課題】汚泥等の凝集に用いる凝集剤について、酵母の細胞壁を化学修飾することにより、安価な生分解性凝集剤を得ることを特徴とする凝集剤生産システムを提供すること。【解決手段】汚泥等の凝集に用いる凝集剤について、酵母の細胞壁に含まれるキチンを脱アセチル化することにより、安価な生分解性凝集剤キトサンを得ることを特徴とするキトサン生産システムである。さらに、正電荷を有するキトサンとは別に、細胞壁成分を化学的に硫酸化あるいはリン酸化することにより負電荷を帯びた酵母凝集剤を生産し、正電荷および負電荷を帯びた酵母由来の凝集剤を得ることが出来る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
汚泥等の凝集に用いる凝集剤について、酵母の細胞壁を化学修飾することにより、安価な生分解性凝集剤を得ることを特徴とする凝集剤生産システム。
【請求項２】
酵母の細胞壁に含まれるキチンを脱アセチル化することにより、キトサンを得ることを特徴とするキトサン生産システム。
【請求項３】
酵母の細胞壁成分を化学的に硫酸化あるいはリン酸化することにより負電荷を帯びた酵母凝集剤を得ることを特徴とする凝集剤生産システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、汚泥等の凝集に用いる凝集剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  汚泥処理の効率化と汚泥の資源化は、循環型社会の構築に欠くことが出来ない重要なテーマである。汚泥の緑農地利用は、有機資源の物質循環にも繋がる利用法である。特に、農業集落排水処理施設から生じる余剰汚泥は、工場排水などからの有害物質が含まれる可能性が低く、積極的な緑農地への活用が期待される。【０００３】  現状での処理法は、排水処理施設にて活性汚泥法により水処理が行われ、そこで生じた有機性汚泥（余剰汚泥）は、そのまま引抜き、最終処分場へ持ち込まれるか、脱水機による減量、またはさらに乾燥、発酵処理を行い減量した後、搬出される。濃縮・脱水工程では効率を上げるため、凝集剤が使用される。凝集剤とは余剰汚泥に投入することで、分散した汚泥成分を凝集、フロック化させ、沈降、脱水効率を高める作用を持つ。例えば一般的には硫酸アルミニウム等の無機系凝集剤やポリアクリルアミドといった有機系合成高分子凝集剤が用いられる。生分解性凝集剤としてはカニ殻由来のキトサンやカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が知られている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  硫酸アルミニウムなどの無機系凝集剤は、緑農地へのアルミニウムの蓄積を考えると、好ましくない。また、一般的に凝集力が弱いものが多く、汚泥に対する注入率も高くなり、脱水後の汚泥量の増加にもつながる。有機系合成高分子凝集剤はモノマーが発がん性物質であるといった健康への影響が心配される。安全かつ効果的な凝集剤が必要とされている。カニ殻由来のキトサンといった天然高分子由来の生分解性の凝集剤も存在するが、単価が高く、脱水工程におけるランニングコストが格段に高くなってしまい、その普及を妨げている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明は上述のような課題を解決しようとするものである。即ち汚泥等の凝集に用いる凝集剤について、酵母の細胞壁に含まれるキチンを脱アセチル化することにより、安価な生分解性凝集剤キトサンを得ることを特徴とするキトサン生産システムである。さらに、正電荷を有するキトサンとは別に、細胞壁成分を化学的に硫酸化あるいはリン酸化することにより負電荷を帯びた酵母凝集剤を生産し、正電荷および負電荷を帯びた酵母由来の凝集剤を提供する。
【発明の効果】
【０００６】  上述のように本発明のキトサン生産システムは酵母の細胞壁に含まれるキチンを脱アセチル化することにより、安価な生分解性凝集剤キトサンを得ることが出来る。また、細胞壁成分を硫酸化、リン酸化することにより負電荷を帯びた安価な生分解性凝集剤を得ることも出来る。
【発明を実施するための形態】
【０００７】  以下、本発明の実施例について、説明する。
【０００８】  酵母にも様々な種類があるが、ごく一般的で、食品でも使用されるパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いた。パン酵母の細胞壁にはキチンが含まれる。キトサン生産に使用する酵母には、高いキチン生産能が必要となる。そのため、細胞壁に多量のキチンを含むパン酵母の変異株を材料に用いる必要がある。
【０００９】  以前の研究で取得した細胞壁変異株のなかから、細胞壁中のβ−１，６−グルカン含量が極端に低くなったｂｉｇ１遺伝子欠損株を選抜し、その株では細胞壁中のキチン含量が高いことを、キチンに特異的に染色する蛍光試薬（カルコフルオロホワイト）を用いて確認した。具体的には、カルコフルオロホワイトで染色した後に、蛍光顕微鏡で各細胞を観察し、ｂｉｇ１遺伝子欠損株では、野生株よりかなり強い蛍光が観察された。この結果からｂｉｇ１遺伝子欠損株を材料に用いた。しかし、浸透圧に対して感受性で、培養に浸透圧保護材を添加する必要があり、しかも増殖が遅かった。そのため、引き続いてキチン含量が高い変異株を探索した。結果として、細胞壁の形成に関与するａｎｐ１遺伝子とｐｅｒ１遺伝子の各欠損株から、両者を掛け合わせて出来た二重欠損株を候補として得た。この変異株では、培養に浸透圧保護材が必要ではなく、増殖にも大きな問題はなかった。また、上記の染色実験により、ｂｉｇ１遺伝子欠損株と同様に細胞壁中のキチン含量が高かった。
このようなキチン含量の高い株は、上述のような遺伝子破壊株を用いなくとも変異処理した酵母の中から、浸透圧感受性が高くなった株を選抜し、その中から上記染色法を用いスクリーニングすることによっても得ることができる。
キトサン酵母に関する実施例では、ｂｉｇ１遺伝子欠損株とこの二重欠損株を使
2013188731.tif 000002
【００１０】  酵母細胞壁のキチンを、水酸化ナトリウムを用いた濃アルカリで処理し、脱アセチル化し、キトサン酵母を得た。将来は、組換え操作により酵母に脱アセチル化酵素遺伝子を導入し、それを酵母自身に発現させ、その酵素が自身の細胞壁中のキチンに作用することにより、細胞壁のキチンを細胞自身でキトサン化する酵母の構築が可能と考えられる。ここでは、その前段階として、濃アルカリ処理により化学的に細胞表面のキチンを脱アセチル化し、キトサン含有酵母を作製し、その汚泥に対する凝集効果を検討している。
また、負電荷を帯びた酵母凝集剤については、酵母そのものを化学修飾により改変し、その汚泥に対する凝集効果を検討している。
【００１１】
2013188731.tif 000003
分離により回収した後に、細胞をエタノール固定し、洗浄し、その後に４０％水酸化ナトリウム溶液に懸濁した。さらにオートクレープを用い１気圧、１２１℃で３時間処理を行い、処理後に蒸留水で細胞を洗浄した。
【００１２】  細胞が脱アセチル化されていることを確認するために、常法に従い、ＫＢｒ法によるＩＲスペクトルから脱アセチル化度を測定した。その結果、高温アルカリ処理する前の細胞のアセチル基含有率は約８０％で、処理後は２５％と計算された。カニ殻由来の市販キトサンのアセチル基含有率は１０％以下であることから、まだ脱アセチル化は十分とは言えないが、今回の処理により反応は進んでいることを確認出来た。処理温度や処理時間を最適化することで、アセチル基含有率をさらに下げることが可能と考えられる。
【００１３】  次に得られた脱アセチル化細胞を用いて、凝集効果を調べた。某農業集落排水処理施設より汚泥を提供いただき、それを試験に供した。５００μｌの汚泥に対し、０．２５％（ｗ／ｖ）のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）２０μｌと０．５％の市販キトサン（３０μｌ）を添加するコントロール実験では、汚泥の凝集が観察された。ＣＭＣは凝集助剤として用いており、それ単品では凝集しないが、初めに注入することで、凝集フロックを強固にする作用を持っている。脱アセチル化細胞は、細胞自体が凝集する傾向が見られたため、酸を加えるなどの方法で細胞を分散させ、汚泥凝集活性を測定した。
コントロールと同様の凝集操作を行い、結果として、キトサンの代わりに脱アセチル化酵母を添加した場合も汚泥の凝集が観察された。添加量は市販キトサンより高いがアセチル基含有率を下げることによりその量は削減できると考えられる。今回の脱アセチル化酵母はアルカリ処理により細胞表層のグルカンやマンナンが除去され、キトサンが露出した状態になったと考えられる。いずれにせよ、本実験により、酵母自身に初めて汚泥に対する凝集効果を見いだすことが出来た。
【００１４】
2013188731.tif 000004
出来た。また、細胞壁に変異を持たない野生株を用い、脱アセチル化処理し同様の操作をした場合は、活性を見いだせなかったことから、実験材料として上述のようなキチン含量が高い酵母を用いることが重要であることが示された。ｂｉｇ１
2013188731.tif 000005
検出された。今回はキチンを脱アセチル化することにより酵母に正電荷を付与できたが、その他にも、例えば、酵母を化学的にアミノ化することによっても同様の効果の酵母を得ることが可能と考えられる。
【００１５】  また、細胞壁成分をリン酸化や硫酸化することにより負電荷を帯びた安価な生分解性凝集剤を得ることも出来る。例えば、市販パン酵母を用い、蒸留水に懸濁したのち、ｐＨを１２に調整し、リン酸化反応を行う為に２０％Ｎａ３Ｐ３Ｏ９を添加する。数日間反応を行いその後、蒸留水で洗い酵母を回収する。リン酸化反応の進行は元素分析により確認できる。また、硫酸化については、例えば、硫酸化剤としてＤＭＦ−ＳＯ３錯体を用いることが可能であり、元素分析によりその反応を確認できる。得られた酵母を用い、凝集剤としての活性を確認した。某農業集落排水処理施設より汚泥を提供いただき、それを試験に供した。キトサン酵母の時とは逆で、ＣＭＣは凝集助剤として用いており、それ単品では凝集しない。ＣＭＣのかわりにリン酸化酵母や硫酸化酵母を用い、キトサンと併用することにより、凝集が観察された。さらに、キトサンのかわりに前述のようにして得られたキトサン酵母、ＣＭＣのかわりにリン酸化酵母を用いても凝集が観察された。
【００１６】  今回の結果から、遺伝的な組換えにより、化学修飾酵母と同様の特徴を有する酵母を構築できれば、培養で得られる酵母細胞自身が有効な凝集剤になることが示された。将来はさらなる微生物凝集剤のコストダウンに貢献出来ることが期待される。