(57)【要約】【課題】薬品的な異風味がなく食品利用に適した天然物由来のイソ吉草酸を効率良く製造する方法の提供。【解決手段】ピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母を、２０〜５０ｍＭのロイシンを含有する培地中に培養する工程を含む、イソ吉草酸を含む培養物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母を、２０〜５０ｍＭのロイシンを含有する培地中に培養する工程を含む、イソ吉草酸を含む培養物の製造方法。
【請求項２】
酵母が、ピキア・アノマラ、ピキア・ロベルツィ及びピキア・パストリスからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培地が１〜５ｗ／ｖ％の糖を更に含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵母を好気的条件下で培養する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により得られる培養物を飲食品に添加する工程を含む飲食品の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により製造される飲食品。
【請求項７】
調味料、発酵食品、スープ及び畜肉加工品からなる群より選択される１種である、請求項６に記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母を利用したイソ吉草酸を含む培養物の製造方法およびイソ吉草酸を含有する飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、イソ吉草酸は畜肉風味のフレーバー等として食品の風味付けに広く用いられている。イソ吉草酸は種々の方法により製造可能であるが、化学合成品は薬品的な異風味を有するため、食品に利用するには適していない。そのため、食品に利用するイソ吉草酸としては、天然物由来のものに関心が高まっている。
【０００３】
天然物由来のイソ吉草酸の製造方法としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を培養する方法等が報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１及び２等）。しかし、その生成量は４〜数十ｐｐｍ程度にとどまっており未だ不十分であることから、効率のよい製造方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，５９９，７００号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】FEMS yeast Research，6，726-743，2006
【非特許文献２】FOOD Microbiology，24，139-148，2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、薬品的な異風味がなく食品利用に適した天然物由来のイソ吉草酸を効率良く製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定濃度のロイシンを含有する培地を用いて、ピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母を培養することにより、効率よくイソ吉草酸を含む培養物を製造し得ることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００８】
［１］  ピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母を、２０〜５０ｍＭのロイシンを含有する培地中に培養する工程を含む、イソ吉草酸を含む培養物の製造方法。
［２］  酵母が、ピキア・アノマラ、ピキア・ロベルツィ及びピキア・パストリスからなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］に記載の方法。
［３］  培地が１〜５ｗ／ｖ％の糖を更に含有する、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  酵母を好気的条件下で培養する、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］  上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法により得られる培養物を飲食品に添加する工程を含む飲食品の製造方法。
［６］  上記［５］に記載の方法により製造される飲食品。
［７］  調味料、発酵食品、スープ及び畜肉加工品からなる群より選択される１種である、上記［６］に記載の飲食品。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、薬品的な異風味がなく食品利用に適した天然物由来のイソ吉草酸を効率良く製造する方法を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において培地のグルコース濃度を０〜６ｗ／ｖ％に調整したときのイソ吉草酸生産量を表したグラフである。
【図２】実施例3-1〜3-7のイソ吉草酸生産量を表したグラフである。
【図３】実施例4-1、4-2及び比較例4-1のイソ吉草酸生産量を表したグラフである。
【図４】実施例5-1〜5-3のイソ吉草酸生産量を表したグラフである。
【図５】ピキア・ロベルツィ及びピキア・パストリスのイソ吉草酸生産量を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において使用する酵母は、ピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母である。当該酵母は、ピキア属に属し、且つ、イソ吉草酸を生産する能力を有すれば特に限定されず、例えば、ピキア・アノマラ（Pichia anomala）、ピキア・ロベルツィ（Pichia robertsii）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等が挙げられ、イソ吉草酸の生産性や食経験の観点から、特に好ましくはピキア・アノマラである。これらの酵母は、単独で使用しても２種以上を併用してもよいが、単独で使用することが好ましい。
ここで「イソ吉草酸を生産する能力を有する」酵母とは、それを培地に培養したときに、培地中に有意な量のイソ吉草酸を蓄積する酵母をいう。
尚、上記のピキア・ロベルツィ及びピキア・パストリスは、本願の基礎出願の出願後に、それぞれ属種名が変更され、現在はデバリオマイセス・ロベルトシエ（Debaryomyces robertsiae）及びコマガテラ・パストリス（Komagataella pastoris）となっているが、本明細書ではピキア・ロベルツィ及びピキア・パストリスと称する。本発明においては、これらのように、ピキア属から分類学上の属種名が変更になった酵母であっても、ピキア属に包含されるものとする。
【００１２】
ピキア・アノマラの具体例としては、NBRC 10213株、NBRC 00130株、IFO 0963株、ATCC 20144株、IFO 0120株、IFO 0146株、IFO 0145株、IFO 0118株、IFO 0149株、IFO 0569株、NRRL Y-366株等が挙げられ、好ましくはNBRC 10213株、NBRC 00130株、NRRL Y-366株である。また、ピキア・ロベルツィの具体例としては、ATCC 22312株、AJ5548株（NITE P-1313株）等が挙げられ、ピキア・パストリスの具体例としては、ATCC 28485株、AJ14468株（NITE P-1314株）等が挙げられる。
上記の菌株は公益財団法人発酵研究所(IFO)、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NBRC）、アグリカルチュラルリサーチサービスカルチャーコレクション（NRRL）等から容易に入手することができる。また、AJ5548株、AJ14468株は、2012年4月6日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD：NITE Patent Microorganisms Depositary。〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、各々NITE P-1313、NITE P-1314の受託番号で寄託されており、分譲を受けることができる
また、上記菌株以外にも、これらの菌株から誘導されたイソ吉草酸生産能を有する変異株等も使用できる。
以下、本発明において使用する酵母を、「イソ吉草酸生産酵母」とも称する。
【００１３】
本発明において使用する培地は、特定濃度のロイシンを含有する。培地のロイシン濃度は、２０〜５０ｍＭが好ましく、３０〜５０ｍＭがより好ましい。
【００１４】
培地に含有されるロイシンは、Ｌ−体、Ｄ−体、及びこれらの混合物（例えば、ラセミ体）の何れでもよいが、好ましくはＬ−体、Ｄ−体であり、特に好ましくはＬ−体である。
【００１５】
ロイシンは、遊離体のみならず塩の形態であってもよい。塩の形態としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム等無機塩基との塩（金属塩等）や、アンモニアや各種アミン等有機塩基との塩（アンモニウム塩等）、更に塩酸、硫酸等無機酸との塩や、酢酸等有機酸との塩を挙げることができる。
【００１６】
本発明において使用する培地は、特定濃度のロイシンを含有すれば合成培地、半合成培地、天然培地の何れでもよく、本発明のイソ吉草酸生産酵母が資化し得る炭素源、窒素源、その他の栄養素等を適宜含有する。
【００１７】
炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、デキストラン、澱粉糖化液、糖蜜等が挙げられる。
【００１８】
窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸等の天然窒素源；蛋白加水分解物、蛋白酵素分解物、醤油等の有機窒素源；硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源等が挙げられる。
【００１９】
その他の栄養素としては、例えば、ビタミン類、銅などの微量金属類等が挙げられる。抗生物質等を含有してもよい。
【００２０】
本発明において使用する培地は、簡便には市販の培地に特定濃度のロイシンを添加したものである。市販の培地としては、ピキア属に属する酵母の培養に適したものであれば特に限定されず、例えば、ＹＮＢ（Yeast Nitrogen Base）培地、ＹＰＤ培地等が挙げられる。
【００２１】
本発明において使用する培地は、更に糖を含有することが好ましい。培地中に含まれる糖としては、例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース等が挙げられる。本発明において使用する培地は、これらの糖のうち、１種のみを含有してもよいし、２種以上を含有してもよい。培地の糖濃度は、５ｗ／ｖ％以下が好ましく、より好ましくは３ｗ／ｖ％以下である。当該糖濃度が５ｗ／ｖ％以下であると、副生成物であるイソアミルアルコールの生成が抑制され、イソ吉草酸の生成量が多くなる。ここで「糖濃度」とは、培地中に含まれる１種又は２種以上の糖の濃度（ｗ／ｖ％）の合計をいう。
培地の糖濃度の下限値は特に限定されないが、培地の糖濃度は１ｗ／ｖ％以上が好ましい。
【００２２】
本発明において使用する培地は、糖に代えて、または糖と組み合わせてエタノール又はイソアミルアルコールを含有していてもよく、エタノールを含有することが特に好ましい。培地がエタノール又はイソアミルアルコールを含有することにより、イソ吉草酸の生成量がより多くなる。
【００２３】
本発明においては培地中に塩化ナトリウムが含まれる場合があるが、培地の塩化ナトリウム濃度は、５ｗ／ｖ％以下が好ましく、３ｗ／ｖ％以下がより好ましい。当該塩化ナトリウム濃度が５ｗ／ｖ％以下であると、イソ吉草酸生産酵母の生育が阻害されにくくなり、イソ吉草酸の生成量が多くなる。また、このことは塩化ナトリウムに限られず、塩化カリウム等の浸透圧を高める物質が培地中に含まれる場合も、その物質の濃度は、上記塩化ナトリウム濃度と同様に設定されることが好ましい。
【００２４】
培地のｐＨは３〜８であることが好ましく、特に好ましくは４〜７である。培養中にイソ吉草酸の生成に伴い、培地のｐＨが低下しすぎる場合には、必要に応じて培地のｐＨをこれらの範囲内に調整してもよい。
【００２５】
イソ吉草酸生産酵母の培養は、嫌気的条件下で行ってもよいが、好気的条件下で行われることが好ましい。ここで「好気的条件下」とは、培地の一部乃至全部が酸素供給下にあることをいう。培地に酸素を供給する方法は特に制限されないが、例えば、静置、通気、攪拌、振盪等が挙げられ、中でも通気、攪拌、または振盪して培養することが好ましい。
【００２６】
培地の静置、通気、攪拌、振盪等は公知の方法で行うことができる。攪拌は、例えば、プロペラ又はこれに類似する機械的攪拌装置を使用すること等により行うことができる。通気は、例えば、培地中に滅菌エアーを通過させること等により行うことができる。振盪は、往復振盪や回転振盪等の何れであってもよく、例えば、市販の振盪培養器を使用すること等により行うことができる。
【００２７】
培養温度は、通常１５〜３５℃であり、好ましくは１８〜３２℃である。
【００２８】
培養期間は、通常１〜１０日間であり、好ましくは１〜５日間である。
【００２９】
上述の培養条件を適宜組み合わせ得ることは言うまでもなく、例えば、２０〜５０ｍＭ（より好ましくは３０〜５０ｍＭ）のロイシンを含有し、塩化ナトリウム濃度が５ｗ／ｖ％以下（より好ましくは３ｗ／ｖ％以下）である培地を用いてピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母を好気的条件下にて（より好ましくは、振盪して）培養する方法、及び、２０〜５０ｍＭ（より好ましくは３０〜５０ｍＭ）のロイシンを含有し、ｐＨが３〜８（より好ましくは４〜７）である培地を用いてピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母を培養する方法等により、ピキア属に属し、且つイソ吉草酸を生産する能力を有する酵母のイソ吉草酸生産能をより増強することができる。
【００３０】
上述の方法により得られる培養物（以下、単に「本発明の培養物」とも称する）中のイソ吉草酸の含有量は、通常５０ｐｐｍ以上であり、好ましくは１００ｐｐｍ以上である。上限値は特に制限されないが、当該含有量は通常１００００ｐｐｍ以下である。尚、本発明の培養物中のイソ吉草酸の含有量は、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィ／質量分析）により測定される。
【００３１】
本発明の培養物からイソ吉草酸を採取する場合、その採取方法は特に限定されず、公知の単離精製方法を１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。例えば、イオン交換樹脂法、晶析法等の手段を、単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００３２】
本発明は、本発明の培養物を飲食品に添加する工程を含む飲食品の製造方法も提供する。
本発明の飲食品の製造方法は、本発明の培養物を飲食品に添加する工程を含む以外は、公知の飲食品と同様の原料を用い、同様の製造方法によって行うことができる。本発明の培養物が添加される飲食品としては、例えば、調味料（風味調味料、辛味調味料、めんつゆ、ケチャップ、オイスターソース、ソース、ドレッシング等）、発酵食品（乳発酵食品、大豆発酵食品、醤油等）飲料、カレー、ハヤシライス、シチュー、スープ、畜肉加工品（ハム、ソーセージ等）、菓子等が挙げられ、好ましくは調味料（風味調味料、辛味調味料、めんつゆ、オイスターソース、ソース、ドレッシング等）、発酵食品（大豆発酵食品、醤油等）スープ、畜肉加工品（ハム、ソーセージ等）である。
【００３３】
本発明の培養物は、上述の方法により得られる培養物をそのまま使用してもよく、又は本発明のイソ吉草酸生産酵母を分離した培養液を使用してもよい。あるいは、これらの濃縮物を使用することもできる。
【００３４】
本発明の培養物を飲食品に添加する量は、飲食品の種類等に応じて適宜調整すればよいが、飲食品の全重量に対して、通常０．０１〜１５重量％であり、好ましくは０．１〜１０重量％である。
【００３５】
本発明の培養物を飲食品に添加する時期は特に制限されず、例えば、飲食品を製造、調理等する際に他の原料と併せて添加してもよいし、飲食品の完成後に添加してもよいし、飲食品の喫食直前及び／又は喫食中に添加してもよい。
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００３７】
（イソ吉草酸生成量の測定方法）
下記の実施例１〜６におけるイソ吉草酸生成量の測定はＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィ／質量分析）により行った。測定条件は以下の通りである。
【００３８】
［ＧＣ／ＭＳ測定条件］
使用機器：GC-MATE（ＪＥＯＬ社製）
抽出方法：固層マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）法
ＳＰＭＥファイバー：DVB/CAR/PDMS（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）
カラム：Inert Cap WAX（０．２５ｍｍ×３０ｍ×０．２５ｕｍ）
吸着条件：４０℃、３０分
脱着条件：２５０℃、３分（スプリットレス）
オーブン条件：４０℃で５分間保持〜５℃／分の昇温速度で２００℃まで加熱し、１５分間保持〜２３０℃で５分間保持
【００３９】
（実施例１  培地の糖濃度の検討）
Pichia anomala NRRL Y-366株を下記表１に示す組成の合成培地にてシード培養した後、２ｖ／ｖ％ずつ下記表２に示す組成の合成培地に植菌し、本培養を行った。７２時間培養後及び９６時間培養後に、各々のイソ吉草酸生成量を測定した。培養条件は下記の通りである。窒素源には酵母エキス及びタンパク加水分解物（塩化ナトリウム１．２ｗ／ｖ％含有）を用いた。結果を図１に示す。
【００４０】
【表１】
2013223485.tif 000002
【００４１】
【表２】
2013223485.tif 000003
【００４２】
［培養条件］
ｐＨ：６．０
培養温度：３０℃
培養手段：振盪（１２０ｒｐｍ）
培養液量：１００ｍｌ
【００４３】
図１に示す通り、培地の糖濃度が１〜５ｗ／ｖ％であるとき、イソ吉草酸生産量が多かった。
【００４４】
（実施例２  培地の培養手段の検討）
実施例2-1及び2-2として、Pichia anomala NBRC 10213株を下記表３、４に示す合成培地、培養手段にてそれぞれ培養し、３６時間培養後及び７２時間培養後に、各々のイソ吉草酸生成量を測定した。窒素源には酵母エキス及びタンパク加水分解物（塩化ナトリウム２ｗ／ｖ％含有）を用いた。また、培地の振盪は振盪培養機を用いることにより行った。結果を表５に示す。
【００４５】
【表３】
2013223485.tif 000004
【００４６】
【表４】
2013223485.tif 000005
【００４７】
［培養条件］
ロイシン濃度：５０ｍＭ
糖濃度：１ｗ／ｖ％
ｐＨ：６．０
培養温度：３０℃
【００４８】
【表５】
2013223485.tif 000006
【００４９】
表５に示す通り、振盪して培養した実施例2-2は、静置して培養した実施例2-1に比べ、イソ吉草酸生産量が著しく増大した。
【００５０】
（実施例３  培地のｐＨの検討）
Pichia anomala NBRC 10213株を上記表１に示す組成の合成培地にてシード培養した後、２ｖ／ｖ％ずつ下記表６に示す組成の実施例3-1〜3-7の合成培地に植菌し、本培養を行った。６４時間培養後及び８８時間培養後に、各々のイソ吉草酸生成量を測定した。培養条件は下記の通りである。窒素源には酵母エキス及びタンパク加水分解物（塩化ナトリウム１．２ｗ／ｖ％含有）を用いた。結果を図２に示す。
【００５１】
【表６】
2013223485.tif 000007
【００５２】
［培養条件］
シード培養用培地のｐＨ：無調整
培養温度：３０℃
培養手段：振盪（１２０ｒｐｍ）
培養液量：１００ｍｌ
本培養用培地のロイシン濃度：５０ｍＭ
本培養用培地のバッファー濃度：５０ｍＭ
【００５３】
図２に示す結果より、培地のｐＨは３．０〜８．０に設定することが好ましいと推定される。
【００５４】
（実施例４  培地のロイシン濃度の検討）
実施例4-1、4-2及び比較例4-1として、Pichia anomala NBRC 10213株を、下記表７に示す合成培地にてそれぞれ培養し、４８時間培養後及び７２時間培養後に、各々のイソ吉草酸生成量を測定した。各々の培養条件は下記の通りである。なお、培養開始から４８時間後におけるｐＨ低下が著しかったため、水酸化ナトリウムにてｐＨの調製を適宜行った。結果を図３に示す。
【００５５】
【表７】
2013223485.tif 000008
【００５６】
［培養条件］
ｐＨ：５．０
糖濃度：６ｗ／ｖ％
塩化ナトリウム濃度：０ｗ／ｖ％
培養温度：３０℃
培養手段：振盪（１２０ｒｐｍ）
初発菌数：１×１０５個／ｍｌ
【００５７】
図３に示す通り、２０〜５０ｍＭのロイシンを含有する培地にて培養を行った実施例4-1及び4-2は、イソ吉草酸生産量が多かった。
【００５８】
（実施例５  イソ吉草酸高生産株の検討）
下記表８示す３種のPichia anomala 株を下記表９に示す培地にてそれぞれシード培養した後、同菌数になるよう下記表１０に示す培地に植菌し、本培養を行った。窒素源には酵母エキス及びタンパク加水分解物を用いた。９６時間培養後、各々のイソ吉草酸生成量を測定した。結果を図４に示す。
【００５９】
【表８】
2013223485.tif 000009
【００６０】
【表９】
2013223485.tif 000010
【００６１】
【表１０】
2013223485.tif 000011
【００６２】
［培養条件］
ｐＨ：６．０
ロイシン濃度：５０ｍＭ
糖濃度：２ｗ／ｖ％
塩化ナトリウム濃度：０ｗ／ｖ％
培養温度：３０℃
培養手段：振盪（１２０ｒｐｍ）
初発菌数：１×１０５個／ｍｌ
【００６３】
図４に示す通り、表８に示す３種のPichia anomala株は、いずれも十分な量である１００ｐｐｍ以上のイソ吉草酸を生産した。
【００６４】
（実施例６  Pichia属でのイソ吉草酸生成可否の検討）
ピキア・ロベルツィ（Pichia robertsii、受託番号：NITE P-1313）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris、受託番号：NITE P-1314）を、ＹＰＤ培地にてシード培養した後、２ｍｌずつ下記表１１に示す組成の本培養用培地に添加し、本培養を行った。３日間培養後に、各々のイソ吉草酸生成量を測定した。培養条件は下記の通りである。結果を図５に示す。
【００６５】
【表１１】
2013223485.tif 000012
【００６６】
［培養条件］
シード培養用培地：ＹＰＤ培地
本培養用培地のロイシン濃度：５０ｍＭ
ｐＨ：６．０
塩化ナトリウム：無添加
培養手段：振盪（１２０ｒｐｍ）
培養温度：３０℃
培養液量：１００ｍｌ
【００６７】
図５に示す結果より、ピキア・ロベルツィ（生成量：１６０ｐｐｍ）及びピキア・パストリス（生成量：５２０ｐｐｍ）のいずれにおいても、イソ吉草酸の生成が確認された。
【００６８】
（実施例７  めんつゆの製造）
めんつゆ（ヤマキ（株）製、商品名：めんつゆ）に実施例５で調整したPichia anomala培養物を０．２重量％添加し、よく混合した。
得られためんつゆについて、４名の専門パネルにより、官能評価を行った。対照には、Pichia anomala培養物を添加していないめんつゆを用いた。
Pichia anomala培養物を添加しためんつゆは、対照よりも醤油の香りやうま味が増強されていた。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、薬品的な異風味がなく食品利用に適した天然物由来のイソ吉草酸を効率良く製造する方法を提供できる。
【図１】
2013223485.tif 000013
【図２】
2013223485.tif 000014
【図３】
2013223485.tif 000015
【図４】
2013223485.tif 000016
【図５】
2013223485.tif 000017