(57)【要約】  【課題】  室温条件下、乾燥状態で保存した後も、核酸増幅を行うことが可能な乾燥試薬、乾燥試薬キット、試薬器および乾燥試薬の製造方法を提供する。  【解決手段】  核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含み、前記核酸モノマーと前記Ｍｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である乾燥試薬を核酸増幅に使用する。これらの乾燥試薬を使用すれば、例えば、室温条件下に保存した場合も、核酸増幅が可能である。また、前記乾燥試薬中は、例えば、さらにＫ＋を含有してもよく、これによって、試薬の安定性を増加できる。また、前記乾燥試薬中は、例えば、Ｔｒｉｓの含有量を一定量以下または未添加とすることで、試薬の安定性を増加できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含み、
下記（Ｘ１）および（Ｘ２）の少なくとも一方の条件を満たす、核酸増幅に使用する乾燥試薬。
（Ｘ１）前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である。
（Ｘ２）含有する全ての核酸モノマーの総モル数とＭｇ２＋のモル数のモル比が、１：０．００７５〜１：２５である。
【請求項２】
前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：５０である、請求項１に記載の乾燥試薬。
【請求項３】
前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：１〜１：３０である、請求項１または２に記載の乾燥試薬。
【請求項４】
さらに、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを含み、前記少なくとも１種類の核酸モノマーと前記トリスヒドロキシメチルアミノメタンのモル比が、１：６０以下である、請求項１から３のいずれか一項に記載の乾燥試薬。
【請求項５】
さらに、トリスヒドロキシメチルアミノメタンを含み、前記少なくとも１種類の核酸モノマーと前記トリスヒドロキシメチルアミノメタンのモル比が、１：３０以下である、請求項１から３のいずれか一項に記載の乾燥試薬。
【請求項６】
前記核酸モノマーとして、アデニンを有する核酸モノマー、グアニンを有する核酸モノマー、シトシンを有する核酸モノマーおよびチミンを有する核酸モノマーを含み、
前記各核酸モノマーは、それぞれ前記モル比を満たす、請求項１から５のいずれか一項に記載の乾燥試薬。
【請求項７】
前記核酸モノマーとして、アデニンを有する核酸モノマー、グアニンを有する核酸モノマー、シトシンを有する核酸モノマーおよびウラシルを有する核酸モノマーを含み、
前記アデニンを有する核酸モノマー、前記グアニンを有する核酸モノマーおよび前記シトシンを有する核酸モノマーは、それぞれ前記モル比を満たし、
前記アデニンを有する核酸モノマーのモル数、前記グアニンを有する核酸モノマーのモル数および前記シトシンを有する核酸モノマーのモル数の平均モル数と、前記ウラシルを有する核酸モノマーのモル数との比が、１：０．５〜１：１０である、請求項１から５のいずれか一項に記載の乾燥試薬。
【請求項８】
前記乾燥試薬に含まれる全核酸モノマーの総モル数とＭｇ２＋のモル数のモル比が、１：０．００７５〜１：２５である、請求項１から７のいずれか一項に記載の乾燥試薬。
【請求項９】
前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．３〜１：１００であり、Ｋ＋を含まない、請求項１から８のいずれか一項に記載の乾燥試薬。
【請求項１０】
さらに、Ｋ＋を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の乾燥試薬。
【請求項１１】
前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＫ＋のモル比が、１：０．０１〜１：１０００である、請求項１０に記載の乾燥試薬。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の乾燥試薬を含む、核酸増幅に使用する乾燥試薬キット。
【請求項１３】
さらに、下記（Ａ）および（Ｂ）の少なくとも一方の乾燥試薬を含む、請求項１２に記載の乾燥試薬キット。
（Ａ）ポリメラーゼを含み、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、トリヒドロキシアミノメタン、核酸モノマーおよびプライマーを含まない乾燥試薬
（Ｂ）プライマーを含み、Ｋ＋を含まない乾燥試薬
【請求項１４】
基材および請求項１から１１のいずれか一項に記載の乾燥試薬を含み、
前記基材に、前記乾燥試薬が配置されている、核酸増幅に使用する試薬器。
【請求項１５】
前記基材が、試験片、チップまたはチューブである、請求項１４に記載の試薬器。
【請求項１６】
少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋とを含む液体試薬を乾燥させる工程を含み、
前記液体試薬が、下記（ｘ１）および（ｘ２）の少なくとも一方の条件を満たす、請求項１から１１のいずれか一項に記載の乾燥試薬を製造する方法。
（ｘ１）前記液体試薬において、前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である。
（ｘ２）前記液体試薬において、含有する全ての核酸モノマーの総モル数とＭｇ２＋のモル数のモル比が、１：０．００７５〜１：２５である。
【請求項１７】
前記液体試薬において、前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．３〜１：１００であり、前記液体試薬がＫ＋を含まない、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記液体試薬において、前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００であり、前記液体試薬がＫ＋を含む、請求項１６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥試薬、乾燥試薬キット、試薬器、乾燥試薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の分野において、目的の核酸配列を増幅する方法として、ＰＣＲ法をはじめとする種々の核酸増幅方法が、広く使用されている。前記核酸増幅は、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等の核酸モノマー、無機塩類、プライマーおよびトリスヒドロキシアミノメタン（正式名称：トリスヒドロキシメチルアミノメタン）等の緩衝剤を必須成分として含む反応液中で行われる。この核酸増幅反応には、一般に、市販の核酸増幅用キットが利用されている。前記キットは、例えば、前記必須成分を適宜組み合せた複数の液体試薬を、別個の容器に収容したキットがあげられる。しかしながら、前記液体試薬は、安定性が悪く、常温での長期保存が困難という問題がある。
【０００３】
そこで、前記安定性の問題を回避すべく、前記必須成分の一部である核酸モノマーおよびプライマーを含む乾燥試薬と、その他の必須成分を含む液体試薬とを組み合せた、核酸増幅用キットが提案されている（特許文献１）。このキットは、例えば、前記乾燥試薬に被検体を添加して、前記乾燥試薬を溶解した後、これに前記液体試薬を混合することによって、核酸増幅を行うことができる。しかしながら、前記液体試薬に含まれるポリメラーゼは、液体条件下での安定性が悪く、常温（室温）で保存することが困難である。このため、前記液体試薬は、例えば、冷蔵保存または凍結保存が必要となる。しかし、例えば、多数の被検体について核酸増幅が必要な場合および流通等を考慮すると、前記核酸増幅用キットは、常温で保存可能であることが望まれる。
【０００４】
他方、各必須成分を乾燥状態とする核酸増幅用キットとして、ポリメラーゼを含む乾燥試薬と、それ以外の必須成分を含む乾燥試薬とを、独立して含むキットが提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−４３９９７号公報
【特許文献２】特表２００８−５０１３３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ポリメラーゼ以外の必須成分を含む乾燥試薬を保存した結果、特に核酸モノマーの保存後の安定性が著しく低下し、十分な核酸増幅が困難であることが、発明者らにより明らかとなった。
【０００７】
そこで、本発明は、例えば、室温条件下、乾燥状態で保存した後も、十分に核酸増幅に使用することが可能な乾燥試薬、乾燥試薬キット、試薬器および乾燥試薬の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の乾燥試薬は、核酸増幅に使用する乾燥試薬であって、少なくとも一種類の核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含み、前記少なくとも一種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である。また、本発明の乾燥試薬キットは、核酸増幅に使用する乾燥試薬キットであって、前記本発明の乾燥試薬を含む。さらに、本発明の試薬器は、核酸増幅に使用する試薬器であって、基材および前記本発明の乾燥試薬を含み、前記基材に、前記乾燥試薬が配置されている。本発明は、後述するように、核酸増幅における、前記乾燥試薬、前記乾燥試薬キットおよび／または試薬器の使用も含む。
【０００９】
本発明の製造方法は、核酸増幅に使用する乾燥試薬の製造方法であって、少なくとも一種類の核酸モノマーとＭｇ２＋とを含む液体試薬を乾燥させる工程を含み、前記液体試薬において、前記少なくとも一種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の乾燥試薬によれば、例えば、室温条件下で保存した後も、核酸増幅を行うことができる。このため、例えば、多数の被検体について核酸増幅を行う場合および流通の際、取扱いが極めて簡便となり、低コスト化が可能となる。また、乾燥状態での保存が可能であることから、例えば、全必須成分を同じチップ上に配置し、チップ化も可能となる。このように、保存後の核酸増幅能を維持し、且つ、取扱い性も向上することから、本発明の乾燥試薬は、核酸増幅を利用する遺伝子解析等において、極めて有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１Ａおよび実施例２Ａにおける、反応液のＴｍ解析の結果を示すグラフであり、単位時間当たりのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの蛍光強度の変化量（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）と温度との関係を示す。縦軸は、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）、横軸は、温度（℃）である。図１において、（Ａ）は、乾燥試薬Ｄ１−１（ｄ２７）の結果、（Ｂ）は、乾燥試薬Ｄ１−３（ｄ２７）の結果、（Ｃ）は、乾燥試薬Ｄ１−４（ｄ２７）の結果、（Ｄ）は、乾燥試薬Ｄ２−１（ｄ１７）の結果、（Ｅ）は、乾燥試薬Ｄ２−１（ｄ２７）の結果、（Ｆ）は、乾燥試薬Ｄ２−５（ｄ２７）の結果、を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜乾燥試薬＞
本発明の乾燥試薬は、前述のように、核酸増幅に使用する乾燥試薬であって、少なくとも1種類の核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含み、前記少なくとも1種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である。本発明において、前記核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比とは、塩基を有する少なくとも１種類の核酸モノマーに対するＭｇ２＋の比である。以下、前記核酸モノマー（ｓ）とＭｇ２＋のモル比を、モル比（ｓ：Ｍｇ２＋）と表わし、前記モル比の範囲に含まれる条件を、条件ｓＭともいう。
【００１３】
本発明の乾燥試薬において、前記モル比（ｓ：Ｍｇ２＋）は、下限が、１：０．０３であり、好ましくは、１：１であり、上限が、１：１００であり、好ましくは、１：５０であり、より好ましくは、１：３０、１：２０、１：１５または１：１０であり、その範囲は、１：０．０３〜１：１００であり、好ましくは、１：０．０３〜１：５０であり、より好ましくは、１：１〜１：３０である。
【００１４】
本発明の乾燥試薬に含まれる前記核酸モノマーの種類は、２種類以上が好ましく、より好ましくは３種類以上、さらに好ましくは４種類以上であり、特に好ましくは４種類または５種類である。前記乾燥試薬に含まれる前記モノマーの種類が２種類以上の場合、前述のように、少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）が、前記条件ｓＭの範囲（１：０．０３〜１：１００）を満たしていればよく、例えば、２種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲を満たしていることが好ましく、３種類、４種類または５種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲を満たしていることがより好ましい。
【００１５】
本発明における核酸モノマーの塩基は、例えば、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を構成する代表的な塩基である、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル）があげられる。以下、アデニンを有する核酸モノマーをアデニン核酸モノマー、グアニンを有する核酸モノマーをグアニン核酸モノマー、シトシンを有する核酸モノマーをシトシン核酸モノマー、チミンを有する核酸モノマーをチミン核酸モノマー、ウラシルを有する核酸モノマーをウラシル核酸モノマーという。前記塩基を有する核酸モノマーは、例えば、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、ウラシルヌクレオチド等のヌクレオチドがあげられ、具体例として、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ等のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）等があげられる。前記塩基は、この他にも、例えば、ポリメラーゼが基質にできる塩基が使用でき、具体例として、イノシン等があげられる。また、前記核酸モノマーは、例えば、天然ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド）でもよいし、人工ヌクレオチドでもよい。前記人工ヌクレオチドは、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ等がある。
【００１６】
以下、前記核酸モノマーとして、アデニン核酸モノマー（例えば、ｄＡＴＰ）、グアニン核酸モノマー（例えば、ｄＧＴＰ）、シトシン核酸モノマー（例えば、ｄＣＴＰ）、および、チミン核酸モノマー（例えば、ｄＴＴＰ）および／またはウラシル核酸モノマー（例えば、ｄＵＴＰ）を含まれる形態を、適宜例示するが、本発明はこれには限定されない。
【００１７】
本発明において、前記核酸モノマーのモル比（比率）は、前記核酸モノマーの種類ごとに求めることができ、例えば、前記各種核酸モノマーのそれぞれの量を基準として、求めることができる。前記量は、例えば、モル数、濃度等があげられる。前記濃度は、例えば、前記乾燥試薬の調製にあたって、乾燥前の試薬における各種核酸モノマーの濃度である。また、前記乾燥試薬においては、乾燥後の試薬における各種核酸モノマーのモル数は、乾燥前の試薬における前記各種核酸モノマーのモル数を反映している。具体例として、本発明の乾燥試薬が、アデニン核酸モノマー（例えば、ｄＡＴＰ）、グアニン核酸モノマー（例えば、ｄＧＴＰ）、シトシン核酸モノマー（例えば、ｄＣＴＰ）、および、チミン核酸モノマー（例えば、ｄＴＴＰ）および／またはウラシル核酸モノマー（例えば、ｄＵＴＰ）を含む場合、それぞれの前記量を基準として、それぞれの前記モル比を求めることができる。
【００１８】
具体例として、本発明の乾燥試薬が、例えば、前記アデニン核酸モノマー、前記グアニン核酸モノマー、前記シトシン核酸モノマーおよび前記チミン核酸モノマーを含む場合、前記４種類のうち少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）が、前記条件ｓＭの範囲（１：０．０３〜１：１００）であればよく、好ましくは、２種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲であり、より好ましくは、３種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲であり、さらに好ましくは、４種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲である。特に好ましくは、前記アデニン核酸モノマー、前記グアニン核酸モノマーおよび前記シトシン核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲であり、最も好ましくは、さらに、前記チミン核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比も、前記範囲である。
【００１９】
また、本発明の乾燥試薬は、例えば、前記チミン核酸モノマーに代えて、前記ウラシル核酸モノマーを含んでもよい。前記ウラシル核酸モノマーを使用する場合、一般的に、他の核酸モノマー、すなわち、前記アデニン核酸モノマー、前記グアニン核酸モノマーおよび／または前記シトシン核酸モノマーよりも、高濃度に設定することが知られている（例えば、PCR  applications  manual  3rd  edition,  Roche  applied  science,  p109参照）。本発明の乾燥試薬が、前記ウラシル核酸モノマーを含む場合、そのモル数は、例えば、以下の条件が例示できる。前記アデニンを有する核酸モノマーのモル数、前記グアニンを有する核酸モノマーのモル数および前記シトシンを有する核酸モノマーのモル数の平均モル数と、前記ウラシルを有する核酸モノマーのモル数との比は、下限が、例えば、１：０．５であり、好ましくは、１：１であり、より好ましくは、１：２であり、上限が、例えば、１：１０であり、好ましくは、１：６であり、より好ましくは、１：４であり、その範囲は、例えば、１：０．５〜１：１０であり、好ましくは、１：１〜１：６であり、より好ましくは、１：２〜１：４である。
【００２０】
本発明の乾燥試薬が、例えば、前記アデニン核酸モノマー、前記グアニン核酸モノマー、前記シトシン核酸モノマーおよび前記ウラシル核酸モノマーを含む場合、前記４種類のうち少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）が、前記条件ｓＭの範囲（１：０．０３〜１：１００）であればよく、好ましくは、２種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲であり、より好ましくは、３種類または４種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲である。特に好ましくは、前記アデニン核酸モノマー、前記グアニン核酸モノマーおよび前記シトシン核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲である。この場合、前記ウラシル核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比は、例えば、前記条件ｓＭの範囲を満たしてもよいし、前記範囲を満たさなくてもよい。後者の場合、例えば、前記ウラシル核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）は、下限が、例えば、１：０．００３であり、好ましくは、１：０．００７５であり、より好ましくは、１：０．０１であり、さらに好ましくは、１：０．０７５であり、特に好ましくは、１：０．２５であり、上限が、例えば、１：２００であり、好ましくは、１：５０であり、より好ましくは、１：２５であり、さらに好ましくは、１：１５であり、その範囲は、例えば、１：０．００３〜１：２００であり、好ましくは、１：０．００７５〜１：５０であり、より好ましくは、１：０．０１〜１：５０または１：０．０７５〜１：５０であり、さらに好ましくは、１：０．０７５〜１：２５または１：０．０１〜１：２５であり、特に好ましくは、１：０．２５〜１：１５である。
【００２１】
本発明において、前記乾燥試薬に含まれる全核酸モノマーの総モル数とＭｇ２＋のモル数のモル比は、例えば、１：０．０３〜１：１００である。以下、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）とＭｇ２＋のモル数との比を、モル比（ｔ：Ｍｇ２＋）と表わし、前記数値範囲に含まれるモル比の条件を、条件ｔＭともいう。
【００２２】
本発明の乾燥試薬において、前記モル比（ｔ：Ｍｇ２＋）は、下限が、例えば、１：０．００７５であり、好ましくは、１：０．０１であり、より好ましくは、１：０．０７５であり、さらに好ましくは、１：０．１であり、特に好ましくは、１：０．２であり、上限が、例えば、１：２５であり、好ましくは１：２０であり、より好ましくは、１：１０であり、さらに好ましくは、１：６であり、その範囲は、例えば、１：０．００７５〜１：２５であり、好ましくは、１：０．００７５〜１：２０であり、より好ましくは、１：０．１〜１：１０であり、さらに好ましくは、１：０．２〜１：６である。
【００２３】
前記モル比（ｔ：Ｍｇ２＋）は、前記乾燥試薬に含まれる各種核酸モノマーの総量のモル数（総モル数）と、Ｍｇ２＋のモル数との比である。前記乾燥試薬における前記核酸モノマーの総量とは、すなわち、前記乾燥試薬に含まれる各種核酸モノマーを全体として一つの核酸モノマーとして捉え、その総量を一つの概念として捉えるものである。この場合、前記乾燥試薬における各種核酸モノマー間の比率は、例えば、均等でもよいし、均等でなくとも良い。
【００２４】
前記ウラシル核酸モノマーを使用する場合、前述のように、他の核酸モノマー、すなわち、前記アデニン核酸モノマー、前記グアニン核酸モノマーおよび／または前記シトシン核酸モノマーよりも、高濃度に設定することが一般的である。本発明の乾燥試薬が前記ウラシル核酸モノマーを含む場合、前記モル比（ｔ：Ｍｇ２＋）は、全核酸モノマーの総モル数に基づいた値が、前記条件ｔＭ（１：０．０３〜１：１００）を満たしてもよいし、以下に示す算出方法により得られる値が、前記条件ｔＭ（１：０．０３〜１：１００）を満たしてもよい。後者の算出方法は、例えば、前記ウラシル核酸モノマーのモル数が、他の核酸モノマーの各モル数よりも大きい場合に採用できる。すなわち、前記ウラシル核酸モノマー以外の各核酸モノマーの平均モル数を、前記ウラシル核酸モノマーのモル数と仮定し、前記ウラシル核酸モノマーの前記仮定モル数と、その他の各核酸モノマーの各モル数とを足し合わせ、これを全核酸モノマーの仮定の総モル数とする。そして、前記仮定の総モル数とＭｇ２＋のモル数から、前記モル比（ｔ：Ｍｇ２＋）を算出する。この値が、前記条件ｔＭを満たすことが好ましい。
【００２５】
本発明において、乾燥試薬は、例えば、「固体試薬」、または「核酸モノマー乾燥試薬」ともいう。前記乾燥試薬の製造時における乾燥方法は、特に制限されないが、例えば、凍結乾燥、スピン乾燥、真空乾燥、熱風乾燥、自然乾燥等が好ましく、自然乾燥がより好ましい。自然乾燥であれば、例えば、設備等を必要とせず、手間やコストを軽減できる。
【００２６】
本発明において、核酸モノマー、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、ポリメラーゼ、トリスヒドロキシアミノメタン（正式名称トリスヒドロキシメチルアミノメタン、以下「Ｔｒｉｓ」ともいう）およびプライマーは、それぞれ、「核酸増幅の必須成分」という。これらの成分が核酸増幅の必須成分であることは、本発明の乾燥試薬が、これらの必須成分を全て含むことを意味するものではない。
【００２７】
本発明の乾燥試薬は、具体例として、以下に示すように、Ｋ＋を含まない第１の核酸モノマー乾燥試薬およびＫ＋を含む第２の核酸モノマー乾燥試薬があげられる。特に示さない限り、モル数およびモル比の説明等は、前述の記載を援用できる。
【００２８】
本発明の第１の核酸モノマー乾燥試薬は、少なくとも１種類の核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含み、前記少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）とＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）は、１：０．３〜１：１００であり、Ｋ＋を含まない。前記第１の核酸モノマー乾燥試薬において、前記核酸モノマー（ｓ）とＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）の条件ｓＭは、下限が、例えば、１：０．０３であり、より好ましくは、１：０．３であり、さらに好ましくは、１：０．５であり、特に好ましくは、１：１であり、上限が、例えば、１：１００であり、好ましくは１：５０であり、特に好ましくは、１：３０、１：２０、１：１５または１：１０であり、その範囲は、前述のように、例えば、１：０．０３〜１：１００好ましくは１：０．３〜１：１００であり、より好ましくは、１：０．５〜１：５０であり、特に好ましくは、１：１〜１：３０である。一般的に、核酸増幅用試薬にＭｇ２＋を過剰量添加すると、反応を阻害することが知られている（http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/pcr_man/chapter_2.pdfのｐ１８参照）。このため、前記核酸モノマー（ｓ）とＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）は、例えば、最大１：１００程度である。
【００２９】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる前記核酸モノマーの種類は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。前記第１の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる前記モノマーの種類が、２種類以上の場合、前述のように、少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）が、前記範囲を満たしていればよく、例えば、２種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲を満たしていることが好ましく、３種類、４種類または５種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋のモル比が、前記範囲を満たしていることがより好ましい。
【００３０】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬において、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）とＭｇ２＋のモル数のモル比（ｔ：Ｍｇ２＋）は、下限が、例えば、１：０．００７５であり、好ましくは、１：０．０７５であり、より好ましくは、１：０．１であり、さらに好ましくは、１：０．２であり、上限が、例えば、１：２５であり、好ましくは１：２０であり、より好ましくは、１：１０であり、さらに好ましくは、１：６であり、その範囲は、例えば、１：０．００７５〜１：２５であり、好ましくは、１：０．０７５〜１：２５であり、より好ましくは、１：０．０７５〜１：２０であり、さらに好ましくは、１：０．１〜１：１０であり、特に好ましくは、１：０．２〜１：６である。
【００３１】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬は、Ｍｇ２＋を、例えば、イオンの状態で含んでもよいし、塩の状態で含んでもよい。Ｍｇ２＋の塩は、例えば、ＭｇＣｌ２、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＭｇＢｒ２、ＭｇＳＯ４、Ｍｇ（ＮＯ３）２等があげられる。
【００３２】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬は、前記核酸モノマーとＭｇ２＋の他に、前記ポリメラーゼ、前記プライマーおよびＫ＋以外であれば、任意で、その他の添加成分を含んでもよい。前記その他の添加成分は、例えば、界面活性剤、糖類、ポリマー等があげられる。
【００３３】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬は、例えば、前記Ｔｒｉｓを含んでもよいが、含まないことが好ましい。前記核酸モノマー乾燥試薬が前記Ｔｒｉｓを含む場合、前記少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）と前記Ｔｒｉｓのモル比（ｓ：Ｔｒｉｓ）の条件ｓＴは、例えば、前記核酸モノマーが１に対して前記Ｔｒｉｓが６０以下（１：６０以下）であり、より好ましくは、１：３０以下、１：２０以下、１：１５以下であり、さらに好ましくは、１：１０以下であり、さらにより好ましくは、１：１以下である。
【００３４】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬において、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）とＴｒｉｓのモル数のモル比（ｔ：Ｔｒｉｓ）の条件ｔＴは、例えば、前記全核酸モノマーが１に対して前記Ｔｒｉｓが１５以下（１：１５以下）であり、好ましくは、１：６以下であり、より好ましくは、１：４以下である。なお、前記全核酸モノマーの総モル数は、前述と同様にして設定できる。
【００３５】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる前記モノマーの種類が、２種類以上の場合、前述のように、少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）と前記Ｔｒｉｓのモル比（ｓ：Ｔｒｉｓ）が、前記条件ｓＴの範囲を満たしていることが好ましく、２種類の核酸モノマーのそれぞれと前記Ｔｒｉｓのモル比が、前記範囲を満たしていることがより好ましく、３種類、４種類または５種類の核酸モノマーのそれぞれと前記Ｔｒｉｓのモル比が、前記範囲を満たしていることがさらに好ましい。
【００３６】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬において、前記各核酸モノマーおよびＭｇ２＋の含有量、ならびに、任意で含まれる前記添加成分の含有量は、それぞれ、特に制限されない。それぞれの前記含有量は、例えば、１回の核酸増幅に必要な量でもよいし、複数回の核酸増幅に必要な量でもよい。前者の場合、例えば、使用時において、適宜、溶媒に前記第１の核酸モノマー乾燥試薬を混合し、その混合液を全て核酸増幅の反応に使用すればよい。また、後者の場合、例えば、使用時において、適宜、溶媒に前記第１の核酸モノマー乾燥試薬を混合し、その混合液から必要量を採取して、核酸増幅の反応に使用すればよい。
【００３７】
核酸増幅を行う場合、前述した「核酸増幅の必須成分」のうち、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる成分以外は、例えば、以下の乾燥試薬（Ａ）および／または乾燥試薬（Ｂ）に含まれていてもよい。
（Ａ）ポリメラーゼを含み、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、前記Ｔｒｉｓ、核酸モノマーおよびプライマーを含まない乾燥試薬
（Ｂ）プライマーを含み、Ｋ＋を含まない乾燥試薬
【００３８】
前記乾燥試薬（Ａ）は、以下、「ポリメラーゼ乾燥試薬」ともいい、前記乾燥試薬（Ｂ）は、以下、「プライマー乾燥試薬」ともいう。前記乾燥試薬（Ａ）および前記乾燥試薬（Ｂ）は、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と別個独立した乾燥試薬である。
【００３９】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬を用いて核酸増幅を行う場合、併用する試薬は特に制限されず、例えば、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および／または前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）を使用することが好ましい。前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）は、例えば、いずれか１種類を前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と併用してもよいし、両方を前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と併用してもよい。前記第１の核酸モノマー乾燥試薬に対して、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）のうち１種類のみを併用する場合、例えば、さらに、液体試薬を併用して、核酸増幅反応を行うことができる。前記液体試薬は、核酸増幅の必須成分のうち、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と前記（Ａ）または前記（Ｂ）の乾燥試薬とに含まれる必須成分以外を含むことが好ましい。この場合、使用時に、例えば、前記各種乾燥試薬を、前記液体試薬または被検体で溶解することによって、増幅反応を行うことができる。他方、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬に対して、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）の両方を併用する場合、例えば、これらの乾燥試薬を、溶媒または被検体で溶解することによって、増幅反応を行うことができる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水および緩衝液等が使用できる。前記被検体は、特に制限されず、核酸増幅の鋳型を含む液体があげられる。
【００４０】
前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）は、前記ポリメラーゼの他に、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、前記Ｔｒｉｓ、前記核酸モノマーおよび前記プライマー以外であれば、任意で、その他の添加成分を含んでもよい。前記その他の添加成分は、例えば、酵素安定化剤、界面活性剤、糖類、ポリマー等があげられる。前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）は、前記プライマーの他に、Ｋ＋以外であれば、任意で、その他の添加成分を含んでもよい。前記その他の添加成分は、例えば、酵素安定化剤、界面活性剤、糖類、ポリマー等があげられる。
【００４１】
前記第１の核酸モノマー乾燥試薬の製造方法は、特に制限されず、例えば、前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋とを含む第１の液体試薬を乾燥させることによって製造できる。
【００４２】
前記第１の液体試薬は、例えば、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる成分の種類および成分比に応じて、調製できる。前記第１の液体試薬において、前記少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）とＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）は、前述の通りである。また、前記全核酸モノマーの総モル数とＭｇ２＋のモル比も、例えば、前述の通りである。
【００４３】
前記第１の液体試薬は、例えば、さらに、前述のような任意の添加成分を適宜含んでもよい。前記第１の液体試薬は、例えば、前記Ｔｒｉｓを含まないことが好ましい。前記第１の液体試薬が前記Ｔｒｉｓを含む場合、前記核酸モノマー（ｓ）と前記Ｔｒｉｓのモル比（ｓ：Ｔｒｉｓ）は、例えば、前述と同様である。また、前記全核酸モノマーの総モル数とＴｒｉｓのモル比も、例えば、前述の通りである。
【００４４】
前記第１の液体試薬は、例えば、前述のような各種成分を、溶媒に溶解または分散することで調製できる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水があげられる。
【００４５】
つぎに、本発明の第２の核酸モノマー乾燥試薬は、少なくとも１種類の核酸モノマーおよびＭｇ２＋と、さらにＫ＋を含む。前記第２の核酸モノマー乾燥試薬において、前記核酸モノマー（ｓ）とＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）の条件ｓＭは、１：０．０３〜１：１００である。前記モル比（ｓ：Ｍｇ２＋）は、下限が、１：０．０３であり、好ましくは、１：０．１であり、好ましくは、１：０．３であり、より好ましくは、１：０．５であり、特に好ましくは、１：１であり、上限が、１：１００であり、好ましくは、１：５０であり、特に好ましくは、１：３０、１：２０、１：１５または１：１０であり、その範囲は、１：０．０３〜１：１００であり、好ましくは、１：０．０３〜１：５０であり、より好ましくは、１：０．３〜１：５０または１：０．３〜１：３０、さらに好ましくは、１：１〜１：５０または１：１〜１：３０であり、特に好ましくは、１：１〜１：３０である。
【００４６】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬において、前記核酸モノマー（ｓ）とＫ＋とのモル比（ｓ：Ｋ＋）の条件ｓＫは、特に制限されない。前記モル比（ｓ：Ｋ＋）は、下限が、例えば、１：０．０１または０．０３であり、好ましくは、１：０．１であり、より好ましくは１：１であり、上限が、例えば、１：１０００であり、好ましくは１：５００であり、より好ましくは１：３００または１：１００であり、その範囲は、例えば、１：０．０１〜１：１０００または１：０．０３〜１：１０００であり、好ましくは、１：０．１〜１：５００であり、特に好ましくは１：１〜1：３００である。
【００４７】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる前記核酸モノマーの種類は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。前記第２の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる前記モノマーの種類が、２種類以上の場合、前述のように、少なくとも１種類の核酸モノマーに対する、Ｍｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）およびＫ＋のモル比（ｓ：Ｋ＋）が、それぞれ前記条件ｓＭおよび条件ｓＫの範囲を満たしていればよく、例えば、２種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋およびＫ＋の各モル比が、前記範囲を満たしていることが好ましく、３種類、４種類または５種類の核酸モノマーのそれぞれとＭｇ２＋およびＫ＋の各モル比が、前記範囲を満たしていることがより好ましい。
【００４８】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬において、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）とＭｇ２＋のモル数のモル比（ｔ：Ｍｇ２＋）の条件ｔＭは、下限が、例えば、１：０．００７５であり、好ましくは、１：０．０１であり、より好ましくは、１：０．０７５であり、さらに好ましくは、１：０．１であり、特に好ましくは、１：０．２であり、上限が、例えば、１：２５であり、好ましくは１：２０であり、より好ましくは、１：１０であり、さらに好ましくは、１：６であり、その範囲は、例えば、１：０．００７５〜１：２５であり、好ましくは、１：０．００７５〜１：２０であり、より好ましくは、１：０．１〜１：１０であり、さらに好ましくは、１：０．２〜１：６である。
【００４９】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬において、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）とＫ＋のモル数のモル比（ｔ：Ｋ＋）の条件ｔＫは、特に制限されない。
【００５０】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬は、Ｋ＋を、例えば、イオンの状態で含んでもよいし、塩の状態で含んでもよい。Ｋ＋の塩は、例えば、ＫＣｌ、ＫＮＯ３、Ｋ２ＳＯ４、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３等があげられる。
【００５１】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬は、前記核酸モノマー、Ｍｇ２＋およびＫ＋の他に、
前記ポリメラーゼおよび前記プライマー以外であれば、任意で、その他の添加成分を含んでもよい。前記その他の添加成分は、例えば、界面活性剤、糖類、ポリマー等があげられる。
【００５２】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬は、例えば、前記Ｔｒｉｓを含んでもよいが、含まないことが好ましい。前記第２の核酸モノマー乾燥試薬が前記Ｔｒｉｓを含む場合、前記少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）と前記Ｔｒｉｓのモル比（ｓ：Ｔｒｉｓ）の条件ｓＴは、例えば、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と同様のモル比があげられる。また、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）と前記Ｔｒｉｓのモル数のモル比（ｔ：Ｔｒｉｓ）の条件ｔＴは、例えば、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と同様のモル比があげられる。
【００５３】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる前記モノマーの種類が、２種類以上の場合、前述のように、少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）に対する、前記Ｔｒｉｓのモル比（ｓ：Ｔｒｉｓ）およびＫ＋のモル比（ｓ：Ｋ＋）が、それぞれ前記条件ｓＴおよび条件ｓＫの範囲を満たしていることが好ましく、２種類の核酸モノマーのそれぞれと前記Ｔｒｉｓのモル比およびＫ＋のモル比が、前記各範囲を満たしていることがより好ましく、３種類、４種類または５種類の核酸モノマーのそれぞれと前記Ｔｒｉｓのモル比およびＫ＋のモル比が、前記各範囲を満たしていることがさらに好ましい。
【００５４】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬において、前記各核酸モノマー、Ｍｇ２＋およびＫ＋含有量、ならびに、任意で含まれる前記添加成分の含有量は、それぞれ、特に制限されず、例えば、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と同様である。
【００５５】
核酸増幅を行う場合、前述した「核酸増幅の必須成分」のうち、前記第２の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる成分以外は、例えば、前述のポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および／またはプライマー乾燥試薬（Ｂ）に含まれていてもよい。
【００５６】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬を用いて核酸増幅を行う場合、併用する試薬は特に制限されず、例えば、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および／または前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）を使用することが好ましい。前記第２の核酸モノマー乾燥試薬は、例えば、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および／または前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）と併用する場合、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬と同様にして使用できる。
【００５７】
前記第２の核酸モノマー乾燥試薬の製造方法は、特に制限されず、例えば、前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋とＫ＋とを含む第２の液体試薬を乾燥させることによって製造できる。
【００５８】
前記第２の液体試薬は、例えば、前記第２の核酸モノマー乾燥試薬に含まれる成分の種類および成分比に応じて、調製できる。前記第２の液体試薬において、前記少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）とＭｇ２＋のモル比（ｓ：Ｍｇ２＋）、前記少なくとも１種類の核酸モノマー（ｓ）とＫ＋とのモル比（ｓ：Ｋ＋）は、例えば、前述の通りである。また、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）とＭｇ２＋のモル比（ｔ：Ｍｇ２＋）、および前記総モル数（ｔ）とＫ＋のモル比（ｔ：Ｋ＋）も、例えば、前述の通りである。
【００５９】
前記第２の液体試薬は、例えば、さらに、前述のような任意の添加成分を適宜含んでもよい。前記第２の液体試薬は、例えば、前記Ｔｒｉｓを含まないことが好ましい。前記第２の液体試薬が前記Ｔｒｉｓを含む場合、前記核酸モノマー（ｓ）と前記Ｔｒｉｓのモル比（ｓ：Ｔｒｉｓ）は、例えば、前述と同様である。また、前記全核酸モノマーの総モル数（ｔ）とＴｒｉｓのモル比（ｔ：Ｔｒｉｓ）も、例えば、前述の通りである。
【００６０】
前記第２の液体試薬は、例えば、前述のような各種成分を、溶媒に溶解または分散することで調製できる。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水があげられる。
【００６１】
本発明の乾燥試薬を使用する核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ法、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられる。
【００６２】
また、本発明の乾燥試薬は、他の形態として、少なくとも１種類の核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含み、含有する全ての核酸モノマーの総モル数とＭｇ２＋のモル数のモル比が、１：０．００７５〜１：２５である、核酸増幅に使用する乾燥試薬があげられる。本発明の乾燥試薬の詳細は、前述の記載を援用できる。
【００６３】
本発明の乾燥試薬キットは、前述のように、核酸増幅に使用する乾燥試薬キットであって、前記本発明の乾燥試薬を含む。本発明の乾燥試薬キットは、本発明の乾燥試薬を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、何ら制限されない。
【００６４】
本発明の乾燥試薬キットは、前記本発明の乾燥試薬として、例えば、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬および前記第２の核酸モノマー乾燥試薬のいずれを使用することもできる。前記第１の核酸モノマー乾燥試薬を用いた前記乾燥試薬キットは、第１の乾燥試薬キット、前記第２の核酸モノマー乾燥試薬を用いた前記乾燥試薬キットは、第２の乾燥試薬キットともいう。
【００６５】
本発明の乾燥試薬キットは、前記本発明の核酸モノマー乾燥試薬の他に、さらに、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および／または前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）を備えてもよい。具体的には、前記核酸モノマー乾燥試薬の他に、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）のうち、いずれか１種類を備えてもよいし、両方を備えてもよいが、前記核酸モノマー乾燥試薬と、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）と前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）の全てを備えることが好ましい。前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）は、それぞれ、例えば、前記本発明の核酸モノマー乾燥試薬と同様にして調製できる。
【００６６】
本発明の乾燥試薬キットは、例えば、前記各乾燥試薬が、別個の基材に配置されてもよいし、同じ基材に配置されてもよい。後者の場合、各乾燥試薬は、例えば、隣接して配置されてもよいし、任意の距離をおいて配置されてもよい。前記基材の種類は、特に制限されず、前記乾燥試薬を配置でき、核酸増幅反応を行えるものであればよい。前記基材は、例えば、ろ紙、多孔質体等の試験片、チップ、チューブ等があげられる。前記乾燥試薬は、例えば、前記基材の表面に配置されてもよく、チューブ等の容器の場合、その内部に配置されてもよい。前者の場合、前記基材は、例えば、前記乾燥試薬を担持するのに適した表面を有することが好ましい。前記乾燥試薬の配置に関しては、例えば、後述する本発明の試薬器を参照できる。本発明の乾燥試薬キットは、例えば、さらに使用説明書を備えることが好ましい。
【００６７】
本発明の試薬器は、前述のように、核酸増幅に使用する試薬器であって、基材および前記本発明の乾燥試薬を含み、前記基材に、前記乾燥試薬が配置されている。本発明の試薬器は、前記基材に、前記本発明の乾燥試薬が配置されていればよく、その他の構成および条件は、何ら制限されない。
【００６８】
本発明の試薬器は、前記本発明の乾燥試薬として、例えば、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬および前記第２の核酸モノマー乾燥試薬のいずれを使用することもできる。前記第１の核酸モノマー乾燥試薬を用いた前記試薬器は、第１の試薬器、前記第２の核酸モノマー乾燥試薬を用いた前記試薬器は、第２の試薬器ともいう。
【００６９】
本発明の試薬器は、例えば、さらに、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および／または前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）を含んでもよい。具体的には、前記核酸モノマー乾燥試薬の他に、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）のうち、いずれか１種類が配置されてもよいし、両方が配置されてもよいが、前記核酸モノマー乾燥試薬と、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）と前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）の全てが配置されていることが好ましい。本発明の試薬器が、前記核酸モノマー乾燥試薬と、前記ポリメラーゼ乾燥試薬（Ａ）および前記プライマー乾燥試薬（Ｂ）のうちいずれか１種類または両方を備える場合、例えば、各乾燥試薬が、それぞれ独立して配置されていることが好ましい。
【００７０】
本発明の試薬器が、前述のように、２種類以上の乾燥試薬を有する場合、各乾燥試薬は、例えば、前記基材における１つの試薬領域内に、独立して配置されてもよいし、２つ以上の試薬領域内に、それぞれ別個に配置されてもよい。前者の場合、例えば、使用時、前記１つの試薬領域に、被検体または溶媒を導入することで、各乾燥試薬を溶解し、混合できる。また、後者の場合、例えば、前記試薬領域間が、流路で連結されていることが好ましい。この場合、例えば、使用時、いずれかの試薬領域に、被検体または溶媒を導入した後、その混合溶液を、さらに、前記流路を介して他の試薬領域に導入することで、各乾燥試薬を溶解し、混合できる。また、本発明の試薬器において、例えば、増幅反応を行うことも可能であることから、本発明の試薬器は、反応器ということもできる。
【００７１】
前記基材の種類は、特に制限されず、前記乾燥試薬を配置でき、核酸増幅反応を行えるものであればよい。前記基材は、例えば、ろ紙、多孔質体等の試験片、チップ、チューブ等があげられる。
【００７２】
本発明の製造方法は、前述のように、核酸増幅に使用する乾燥試薬の製造方法であって、少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋とを含む液体試薬を乾燥させる工程を含み、前記液体試薬において、前記核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である。
【００７３】
本発明の製造方法は、例えば、前記第１の核酸モノマー乾燥試薬を製造する場合、前記液体試薬として、前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．３〜１：１００であり、Ｋ＋を含まない、前記第１の液体試薬を使用することが好ましい。また、本発明の製造方法は、例えば、前記第２の核酸モノマー乾燥試薬を製造する場合、前記液体試薬として、前記少なくとも１種類の核酸モノマー、Ｍｇ２＋およびＫ＋を含み、前記少なくとも１種類の核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比が、１：０．０３〜１：１００である、前記第２の液体試薬を使用することが好ましい。前記液体試薬の調製方法および条件、ならびに、乾燥方法は、前述の通りである。
【００７４】
また、本発明の製造方法は、他の形態として、少なくとも１種類の核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含む液体試薬を乾燥させる工程を含み、前記液体試薬において、含有する全ての核酸モノマーの総モル数とＭｇ２＋のモル数のモル比が、１：０．００７５〜１：２５である方法があげられる。本発明の製造方法の詳細は、前述の記載を援用できる。
【００７５】
このようにして製造した乾燥試薬は、非常に安定性に優れるため、例えば、長期間保存した後でも、保存前と同程度の品質を示すことから、同程度の試薬量で、同様の核酸増幅反応を行うことが可能である。本発明の製造方法により製造した乾燥試薬は、例えば、７０℃以下での保存が可能であり、例えば、約５０℃以下で少なくとも２ヵ月、約３０℃以下で少なくとも１２ヵ月、２０℃以下で少なくとも２４ヵ月程度、保存前の品質を維持して、保存可能である。
【００７６】
本発明の安定化方法は、核酸増幅に使用する乾燥試薬の安定化方法であって、前記本発明の製造方法により、乾燥試薬を製造する工程を含む。本発明の安定化方法は、前記本発明の製造方法により乾燥試薬を製造することが特徴であって、その他の構成および条件は、何ら制限されない。
【実施例】
【００７７】
本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。なお、特に示さない限り、「％」は、ｗ／ｖ％を示す。
【００７８】
実施例１Ａ〜１Ｂでは、核酸モノマーおよびＭｇ２＋を含み、且つＫ＋を含まない第１の核酸モノマー乾燥試薬について、その保存安定性を確認した。
【００７９】
［実施例１Ａ］
本例では、ＰＣＲに使用する必須成分として、核酸モノマーおよびＭｇ２＋を、容器内で乾燥した後、得られた核酸モノマー乾燥試薬を保存し、その保存安定性を確認した。
【００８０】
（１）乾燥試薬の調製
下記表１に示す乾燥用液体試薬Ｄ１−１〜Ｄ１−４を調製した。前記各乾燥用液体試薬２．５μＬを、それぞれ別個の容器の内部に点着し、相対湿度５％未満、２５℃の条件下、一晩乾燥した。このようにして乾燥試薬Ｄ１−１（ｄ０）、Ｄ１−２（ｄ０）、Ｄ１−３（ｄ０）、Ｄ１−４（ｄ０）を得た。「ｄ０」は、後述する保存を行っていない乾燥試薬であることを示す（以下、同様）。
【００８１】
【表１】
2013005796.tif 000003
【００８２】
（２）乾燥試薬の保存
前記各乾燥試薬Ｄ１−１（ｄ０）〜Ｄ１−４（ｄ０）が入った各容器を密閉し、乾燥剤と共にビニール袋に入れ、５０℃で１７日間または２７日間保存した。前記１７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ１−１（ｄ１７）〜Ｄ１−４(ｄ１７）とし、前記２７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ１−１(ｄ２７）〜Ｄ１−４（ｄ２７）とした。
【００８３】
（３）保存後の安定性評価
保存０日、保存１７日および保存２７日の前記各乾燥試薬を使用して、ＰＣＲによる核酸増幅を行い、保存後の安定性を評価した。
【００８４】
まず、前記各乾燥試薬を、用事調製した液体試薬と十分に混合し、液量１０μＬの下記表２の組成のＰＣＲ反応液を調製した。前記液体試薬は、前記乾燥試薬との混合により、各成分の最終濃度（前記ＰＣＲ反応液における各成分の濃度）が、下記表２となるように調製した。
【００８５】
【表２】
2013005796.tif 000004
【００８６】
前記表２におけるプローブおよびプライマーは、以下の通りである。
プローブ（配列番号１）
5’-ggagaaggtcaaGgtatc-(BODIPY FL)-3’
フォワードプライマー（配列番号２）
5’-cggagcccctgcatgcaa-3’
リバースプライマー（配列番号３）
5’-aatgatactatgaatttggggacttcgaa-3’
【００８７】
前記ＰＣＲ反応液について、ＰＣＲマシン(エッペンドルフ社製)でＰＣＲを行った後、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（登録商標）、アークレイ社製）を用いて、Ｔｍ解析を行った。前記ＰＣＲは、前記ＰＣＲ反応液を、９５℃で１分処理後、９５℃で１０秒および６２℃で１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。そして、前記Ｔｍ解析は、前記反応液を９５℃で１秒処理後、温度の上昇速度を１℃／３秒として、４０℃から７５℃に加熱していき、検出波長５２０〜５５５ｎｍにおける、経時的な蛍光強度の変化を測定することにより行った。そして、Ｔｍ解析における試薬反応性から、安定性を評価した。
【００８８】
前記各乾燥試薬の試薬反応性の結果を、表３に示す。表３は、前記乾燥試薬Ｄ１−１〜Ｄ１−４の結果を示す。表３において、「Ｍｇ２＋濃度」は、前記乾燥用液体試薬中のＭｇ２＋濃度を示し、「核酸モノマー」は、含有する核酸モノマーの種類を示し、「モル比」は、各核酸モノマー（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰ）とＭｇ２＋のモル比および全核酸モノマーの合計とＭｇ２＋のモル比であり、前記各核酸モノマーおよび前記合計のモル数をそれぞれ１に換算した場合のＭｇ２＋のモル数を示す。モル比の欄において、上の値は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰに対するＭｇ２＋の各モル比であり、二番目の値は、ｄＵＴＰに対するＭｇ２＋のモル比であり、下の値は、全核酸モノマーの合計に対するＭｇ２＋のモル比である。前記試薬反応性は、Ｔｍ解析時における、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）の最大値を、蛍光値の最大値で割った値を示す。
【００８９】
【表３】
2013005796.tif 000005
【００９０】
さらに、前記Ｔｍ解析の結果を、図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、横軸は、測定時の温度を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。図１において、（Ａ）は、前記乾燥試薬Ｄ１−１（ｄ２７）、（Ｂ）は、前記乾燥試薬Ｄ１−３（ｄ２７）、（Ｃ）は、前記乾燥試薬Ｄ１−４（ｄ２７）を使用した結果を示す。
【００９１】
前述のように、前記試薬反応性は、Ｔｍ解析時における、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）の最大値を、蛍光値の最大値で割った値である。このため、前記試薬反応性と、ＰＣＲによる核酸増幅産物量との間には相関性がある。例えば、前記試薬反応性が０．６である前記Ｄ１−１（ｄ２７）の場合、図１（Ａ）に示すように、ピークが不明瞭で検出不可能であった。一方、前記試薬反応性がそれぞれ、４．１および８．８である、前記Ｄ１−３（ｄ２７）、および前記Ｄ１−４（ｄ２７）の場合、図１（Ｂ）および図１（Ｃ）に示すように、ピークが明瞭で検出可能であった。
【００９２】
また、前記試薬反応性が高くなるに従い、Ｔｍ解析におけるピークが、より明瞭になる傾向が認められた。これらの結果から、例えば、前記試薬反応性が１未満ではＴｍ解析におけるピークを検出不可能であり、ＰＣＲ反応により核酸増幅が検出不可能といえ、２以上ではＴｍ解析におけるピークを検出可能であり、ＰＣＲ反応により核酸増幅可能ということができる。
【００９３】
以上の結果から、表１のＤ１−３およびＤ１−４の組成の乾燥用液体試薬を調製し、これらを乾燥させれば、保存安定性に優れる乾燥試薬を得られることがわかった。
【００９４】
［実施例１Ｂ］
本例では、ＰＣＲに使用する必須成分として、前記核酸モノマーおよびＭｇ２＋に、さらに、Ｔｒｉｓを加え、前記Ｔｒｉｓによる、核酸モノマー乾燥試薬の安定性への影響を確認した。
【００９５】
（１）乾燥試薬の調製
下記表４に示す乾燥用液体試薬Ｄ３−１〜Ｄ３−６を調製した以外は、前記実施例１Ａと同様にして、乾燥試薬Ｄ３−１（ｄ０）〜Ｄ３−６（ｄ０）を調製した。なお、前記各乾燥試薬において、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰとＭｇ２＋のモル比は、それぞれ１：１０であり、ｄＵＴＰとＭｇ２＋のモル比は、１：５であり、全核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比は、１：２である。
【００９６】
【表４】
2013005796.tif 000006
【００９７】
そして、前記各乾燥試薬について、前記実施例１Ａと同様にして、保存および安定性の評価を行った。前記１７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ３−１(ｄ１７）〜Ｄ３−６(ｄ１７）とし、前記２７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ３−１(ｄ２７）〜Ｄ３−６(ｄ２７）とした。
【００９８】
前記実施例１Ｂについて、試薬反応性の結果を、表５に示す。表５は、実施例１Ｂの乾燥試薬Ｄ３−１〜Ｄ３−６の結果を示す。表５において、「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濃度」は、前記各乾燥用液体試薬中のＴｒｉｓ−ＨＣｌ濃度を示し、「核酸モノマー」は、含有する核酸モノマーの種類を示し、「モル比」は、各核酸モノマー（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰ）とＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル比および全核酸モノマーの合計とＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル比であり、前記各核酸モノマーまたは前記合計のモル数をそれぞれ１に換算した場合のＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル数を示す。モル比の欄において、上の値は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰに対するＴｒｉｓ−ＨＣｌの各モル比であり、二番目の値は、ｄＵＴＰに対するＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル比であり、下の値は、全核酸モノマーに対するＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル比である。表５において、試薬反応性は、前記実施例１Ａと同様に算出した。
【００９９】
【表５】
2013005796.tif 000007
【０１００】
表５に示すように、２７日間保存した乾燥試薬（ｄ２７）を使用した場合、試薬反応性は、前記Ｄ３−１（ｄ２７）〜Ｄ３−６（ｄ２７）は、７以上であり、十分な反応性を示した。これらの結果から、表４のＤ３−１〜Ｄ３−６の組成の乾燥用液体試薬を調製し、これらを乾燥させれば、保存安定性に優れる乾燥試薬が得られることがわかった。
【０１０１】
実施例２Ａ〜２Ｃでは、核酸モノマー、Ｍｇ２＋およびＫ＋を含む第２の核酸モノマー乾燥試薬について、その保存安定性を確認した。
【０１０２】
［実施例２Ａ］
本例では、ＰＣＲに使用する必須成分として、前記核酸モノマー、Ｍｇ２＋およびＫ＋を、容器内で乾燥した後、得られた核酸モノマー乾燥試薬を保存し、その保存安定性を確認した。
【０１０３】
下記表６に示す乾燥用液体試薬Ｄ２−１〜Ｄ２−５を調製した以外は、前記実施例１Ａと同様にして、前記乾燥試薬Ｄ２−１（ｄ０）〜Ｄ２−５（ｄ０）を得た。なお、前記各乾燥試薬において、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰとＭｇ２＋のモル比は、それぞれ１：１０であり、ｄＵＴＰとＭｇ２＋のモル比は、１：５であり、全核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比は、１：２である。また、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰとＫ＋のモル比は、それぞれ１：１００であり、ｄＵＴＰとＫ＋のモル比は、１：５０である。
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
そして、前記各乾燥試薬について、前記実施例１Ａと同様にして、保存および安定性の評価を行った。前記１７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ２−１（ｄ１７）〜Ｄ２−５(ｄ１７）とし、前記２７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ２−１(ｄ２７）〜Ｄ２−５（ｄ２７）とした。
【０１０６】
前記各乾燥試薬の試薬反応性の結果を、表７に示す。表７は、前記乾燥試薬Ｄ２−１〜Ｄ２−５の結果を示す。表７において、「Ｍｇ２＋濃度」は、前記乾燥用液体試薬中のＭｇ２＋濃度を示し、「核酸モノマー」は、含有する核酸モノマーの種類を示し、「モル比」は、各核酸モノマー（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰ）とＭｇ２＋のモル比および全核酸モノマーの合計とＭｇ２＋のモル比であり、前記各核酸モノマーのモル数および前記合計のモル数をそれぞれ１に換算した場合のＭｇ２＋のモル数を示す。モル比の欄において、上の値は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰに対するＭｇ２＋の各モル比であり、二番目の値は、ｄＵＴＰに対するＭｇ２＋のモル比であり、下の値は、全核酸モノマーの合計に対するＭｇ２＋のモル比である。表７において、試薬反応性は、前記実施例１Ａと同様に算出した。
【０１０７】
【表７】
2013005796.tif 000009
【０１０８】
表７に示すように、２７日間保存した乾燥試薬（ｄ２７）を使用した場合、前記試薬反応性は、Ｄ２−３（ｄ２７）〜Ｄ２−５（ｄ２７）で４以上であったのに対して、Ｄ２−１（ｄ２７）およびＤ２−２（ｄ２７）では１未満であった。
【０１０９】
さらに、前記Ｔｍ解析の結果を、図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、横軸は、測定時の温度を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。図１において、（Ｄ）は、前記乾燥試薬Ｄ２−１（ｄ１７）、（Ｅ）は、前記乾燥試薬Ｄ２−１（ｄ２７）、（Ｆ）は、前記乾燥試薬Ｄ２−５（ｄ２７）を使用した結果を示す。
【０１１０】
前述のように、前記試薬反応性は、Ｔｍ解析時における、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）の最大値を、蛍光値の最大値で割った値である。このため、前記試薬反応性と、ＰＣＲによる核酸増幅産物量との間には相関性がある。前記Ｄ２−１は、１７日の場合、前記試薬反応性が２．１であり、図１（Ｄ）に示すように、ピークが明瞭で検出可能であったが、２７日の場合、前記試薬反応性が０．５であり、図１（Ｅ）に示すように、ピークが不明瞭で検出不可能であった。一方、前記試薬反応性が６．９である前記Ｄ２−５（ｄ２７）の場合、２７日においても、図１（Ｆ）に示すように、ピークが明瞭で検出可能であった。
【０１１１】
以上の結果から、表６のＤ２−３〜Ｄ２−５の組成の乾燥用液体試薬を調製し、これらを乾燥させれば、保存安定性に優れる乾燥試薬を得られることがわかった。
【０１１２】
［実施例２Ｂ］
本例では、ＰＣＲに使用する成分として、前記核酸モノマー、Ｍｇ２＋およびＫ＋に、さらに、Ｔｒｉｓを加え、前記Ｔｒｉｓによる核酸モノマー乾燥試薬の安定性への影響を確認した。
【０１１３】
（１）乾燥試薬の調製
下記表８に示す乾燥用液体試薬Ｄ４−１〜Ｄ４−６を調製した以外は、前記実施例１Ａと同様にして、乾燥試薬Ｄ４−１（ｄ０）〜Ｄ４−６（ｄ０）を調製した。なお、前記各乾燥試薬において、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰとＭｇ２＋のモル比は、それぞれ１：１０であり、ｄＵＴＰとＭｇ２＋のモル比は、１：５であり、全核酸モノマーとＭｇ２＋のモル比は、１：２である。また、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰとＫ＋のモル比は、それぞれ１：１００であり、ｄＵＴＰとＫ＋のモル比は、１：５０である。
【０１１４】
【表８】
2013005796.tif 000010
【０１１５】
そして、前記各乾燥試薬について、前記実施例１Ａと同様にして、保存および安定性の評価を行った。前記１７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ４−１(ｄ１７）〜Ｄ４−６（ｄ１７）とし、前記２７日間保存した各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ４−１(ｄ２７）〜Ｄ４−６（ｄ２７）とした。
【０１１６】
前記実施例２Ｂについて、試薬反応性の結果を、表９に示す。表９は、実施例２Ｂの乾燥試薬Ｄ４−１〜Ｄ４−６の結果を示す。表９において、「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濃度」は、前記各乾燥用液体試薬中のＴｒｉｓ−ＨＣｌ濃度を示し、「核酸モノマー」は、含有する核酸モノマーの種類を示し、「モル比」は、各核酸モノマー（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰ）とＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル比および全核酸モノマーの合計とＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル比であり、前記各核酸モノマーおよび前記合計のモル数をそれぞれ１に換算した場合のＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル数を示す。モル比の欄において、上の値は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰに対するＴｒｉｓ−ＨＣｌの各モル数であり、二番目の値は、ｄＵＴＰに対するＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル数であり、下の値は、全核酸モノマーの合計に対するＴｒｉｓ−ＨＣｌのモル比である。表９において、試薬反応性は、前記実施例１Ａと同様に算出した。
【０１１７】
【表９】
2013005796.tif 000011
【０１１８】
表９に示すように、２７日間保存した乾燥試薬（ｄ２７）を使用した場合、試薬反応性は、前記Ｄ４−１（ｄ２７）〜Ｄ４−６（ｄ２７）で７以上であり、十分な反応性を示した。これらの結果から、表８のＤ４−１〜Ｄ４−６の組成の乾燥用液体試薬を調製し、これらを乾燥させれば、保存安定性に優れる乾燥試薬が得られることがわかった。
【０１１９】
［実施例２Ｃ］
本例では、ＰＣＲに使用する成分を３つのグループに分け、それぞれを別個の容器内で乾燥した後、得られた３種類の乾燥試薬を保存し、その保存安定性を確認した。
【０１２０】
（１）各乾燥試薬の調製
下記表１０に示す乾燥用液体試薬Ｄ５〜Ｄ７を調製した以外は、前記実施例１Ａと同様にして、乾燥試薬Ｄ５〜Ｄ７を得た。前記Ｄ６におけるポリメラーゼおよび前記Ｄ７におけるプライマーおよびプローブは、それぞれ、前記実施例１Ａと同じものを使用した。
【０１２１】
【表１０】
2013005796.tif 000012
【０１２２】
（２）乾燥試薬の保存
前記各乾燥試薬が入った各容器を密閉し、乾燥剤と共にビニール袋に入れ、３０℃および５０℃で、それぞれ３０日間、６０日間、２４０日間、３７０日間保存した。
【０１２３】
（３）保存後の安定性評価
保存０日、３０日、６０日、２４０日、３７０日の前記各乾燥試薬Ｄ５〜Ｄ７を使用して、ＰＣＲによる核酸増幅を行い、保存後の安定性を評価した。なお、Ｄ５〜７は、それぞれ同じ保存日数のものを組合せて使用した。
【０１２４】
まず、ヒト由来の精製核酸(３０ｐｇ/μＬ)１０μＬを、前記乾燥試薬Ｄ５が入った容器に添加して、前記精製核酸と前記乾燥試薬Ｄ５とを混合した。得られた混合液を、前記乾燥試薬Ｄ６が入った容器に添加して、前記混合液と前記乾燥試薬Ｄ６と混合した。さらに、得られた前記混合液を、前記乾燥試薬Ｄ７が入った容器に添加して、前記混合液と前記乾燥試薬Ｄ７とを混合した。このようにして、鋳型核酸となる前記精製核酸と、前記乾燥試薬Ｄ５、Ｄ６およびＤ７とを混合した。この混合液をＰＣＲ反応液とし、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。ＰＣＲおよびＴｍ解析は、ＰＣＲ条件を、９５℃で１分処理後、９５℃で１秒および６０℃で１５秒を１サイクルとして５０サイクルとした以外は、前記実施例１Ａと同様にして行った。
【０１２５】
本実施例における試薬反応性の結果を、表１１に示す。表１１において、前記試薬反応性は、前記実施例１Ａと同様に算出した。
【０１２６】
【表１１】
2013005796.tif 000013
【０１２７】
表１１に示すように、３０℃で保存した場合、３７０日間でも前記試薬反応性は、７以上を示した。また、５０℃で保存した場合、６０日間でも前記試薬反応性が、検出可能であること裏付ける結果を示した。これらの結果から、表１０の組成の乾燥用液体試薬をそれぞれ調製し、これらを乾燥させれば、３０℃で少なくとも１２ヶ月間、５０℃で少なくとも２ヶ月間安定的に保存可能な乾燥試薬Ｄ５、Ｄ６およびＤ７が得られることが分かった。
【０１２８】
［比較例１］
本例では、ＰＣＲに使用する成分の一部を別個の容器内で乾燥した後、得られた乾燥試薬を保存し、その保存安定性を確認した。
【０１２９】
（１）乾燥試薬の調製
下記表１２に示す乾燥用液体試薬Ｄ８およびＤ９を調製し、相対湿度１０％未満、２５℃の条件下、一晩乾燥させた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、乾燥試薬Ｄ８およびＤ９を得た。なお、Ｄ８は、Ｍｇ２＋が未添加であり、Ｄ９は、前記実施例２ＢにおけるＤ４−８と同組成である。前記Ｄ８におけるプライマーおよびプローブは、それぞれ、前記実施例１Ａと同じものを使用した。
【０１３０】
【表１２】
2013005796.tif 000014
【０１３１】
（２）乾燥試薬の保存
前記各乾燥試薬が入った各容器を密閉し、乾燥剤と共にビニール袋に入れ、５０℃で１４日間保存した。保存０日の各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ８（ｄ０）およびＤ９(ｄ０）とし、保存１４日の各乾燥試薬を、乾燥試薬Ｄ８(ｄ１４）およびＤ９（ｄ１４）とした。
【０１３２】
（３）保存後の安定性評価
保存０日、１４日の前記各乾燥試薬Ｄ８およびＤ９を使用して、ＰＣＲによる核酸増幅を行い、保存後の安定性を評価した。
【０１３３】
前記乾燥試薬Ｄ８が入った容器に、下記表１３に示す組成の乾燥試薬Ｄ８用液体試薬およびヒトゲノム（１００コピー/μＬ）１μＬを添加し、合計１０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、前記実施例１Ａと同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。また、前記乾燥試薬Ｄ９が入った容器に、下記表１３に示す組成の乾燥試薬Ｄ９用液体試薬およびヒトゲノム（１００コピー/μＬ）１μＬを添加し、合計１０μＬのＰＣＲ反応液を調製し、前記実施例１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。下記表１３において、各成分の濃度は、前記ＰＣＲ反応液１０μＬにおける最終濃度を示す。
【０１３４】
【表１３】
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【０１３５】
本比較例における試薬反応性の結果を、表１４に示す。表１４において、前記試薬反応性は、前記実施例１Ａと同様に算出した。
【０１３６】
【表１４】
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表１４に示すように、乾燥試薬Ｄ８およびＤ９は、５０℃で１４日間保存すると、前記試薬反応性が１未満となり、保存安定性が低い乾燥試薬であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明の乾燥試薬によれば、例えば、室温条件下で保存した後も、核酸増幅を行うことができる。このため、例えば、多数の被検体について核酸増幅を行う場合や流通の際、取扱いが極めて簡便となる。また、乾燥状態での保存が可能であることから、例えば、全必須成分を同じチップ上に配置し、チップ化することも可能となる。このように、保存後の核酸増幅能を維持し、且つ、取扱い性も向上することから、本発明は、核酸増幅を利用する遺伝子解析等において、極めて有用なツールといえる。
【０１３８】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【０１３９】
この出願は、平成２３年５月２６日に出願された日本出願特願２０１１−１１８３７８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【図１】
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【配列表】
2013005796000001.app