(57)【要約】【課題】  健康維持に役立つ免疫抑制乳酸菌組成物や免疫抑制乳酸発酵食品を提供する。【解決手段】  あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）や、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillusparabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）のうちの少なくとも１種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有する。これら乳酸菌は、免疫抑制作用を有する。【選択図】  図１
2013188198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）から選択される少なくとも１種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有し、免疫抑制作用を有することを特徴とする免疫抑制乳酸菌組成物。
【請求項２】
前記ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus parabuchneri）が、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２５７で寄託されたラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus parabuchneri）ＡＮＰ２−１であることを特徴とする請求項１記載の免疫抑制乳酸菌組成物。
【請求項３】
あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）から選択される少なくとも１種を含有し免疫抑制作用を有する乳酸菌組成物を用い、食品原料を乳酸発酵させたことを特徴とする免疫抑制乳酸発酵食品。
【請求項４】
前記ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus parabuchneri）が、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター  受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−１２５７で寄託されたラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus parabuchneri）ＡＮＰ２−１であることを特徴とする請求項３記載の免疫抑制乳酸発酵食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫抑制作用を有する新規な免疫抑制乳酸菌組成物及び免疫抑制乳酸発酵食品に関し、特に、あじなれずし食品から単離される特定の乳酸菌の菌体等を含有する免疫抑制乳酸菌組成物及び免疫抑制乳酸発酵食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管や呼吸器粘膜に分布する免疫システムは、免疫系全体の６０％以上を占め、その特徴的な免疫活動により、外来異物の認識・排除を行い、生命活動を維持するのに極めて重要な役割を担っている。
【０００３】
粘膜免疫システムの中でも消化管免疫は，食物からの栄養源の取り込みを監視する他、微生物や食物由来の成分、薬物などの影響を受け、腸内環境の保全や食物アレルギー応答の制御、免疫寛容、造血などの生体応答と密接に関連している。この特徴的な消化管免疫反応は、パイエル板という腸の特殊なリンパ組織によって担われ、このリンパの機能を制御するアジュバント活性様のメカニズムが経口可能なワクチンや抗アレルギー薬開発のための新規な薬理学的作用機序として注目されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００４】
一方で、石川県下で造られる発酵食品には、あじなれずし、かぶらずし、だいこんずし、いかこうじ漬け等、独自性のある発酵食品が多く、この発酵プロセスには、多くの乳酸菌が関与している。
【０００５】
前記なれずしの遊離アミノ酸には、γ−アミノ酪酸を多く含むものがあり、このγ−アミノ酪酸の人等の哺乳動物に対する代表的な生理作用として、脳機能改善、精神安定化、血圧上昇抑制等が知られている。また、なれずしの有機酸量の主成分である乳酸は、乳酸菌によって生成されるが、乳酸菌は、生菌、死菌であっても、その菌体成分が生体に吸収されるか、あるいは腸内細菌を介して、免疫機能の増強や肝機能の促進等に有利に働くとされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mowat et al. Nature Rev.Immunol., Vol.3, 332
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のなれずし等の乳酸発酵食品は、腸内環境を改善し、生体の健康維持や増進に役立つものと考えられるが、免疫に対する機能性等については、未だ十分に解明されていない。
【０００８】
本発明は、このような実情に鑑みて提案されたものであり、石川県下で造られる発酵食品の粘膜応答に及ぼす影響や作用機序を遺伝子レベルで解明し、腸管機能に優れた乳酸菌を見出すことにより、健康維持に役立つ乳酸菌組成物や乳酸発酵食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、石川県の特産の発酵食品について、発酵菌の菌叢解析を行うとともに、ＤＮＡマイクロアレイ法によって腸管の機能に及ぼす影響をサイトカイン産生レベルで評価することで、免疫抑制作用に優れた菌を見出すに至った。本発明は、見出された乳酸菌を用いて、免疫抑制作用に優れた乳酸菌組成物及び乳酸発酵食品を提供するものである。
【００１０】
すなわち、本発明の免疫抑制乳酸菌組成物は、あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）から選択される少なくとも１種の菌体、菌体成分、菌体由来成分、菌体処理物のうちの少なくとも１種を含有し、免疫抑制作用を有することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の免疫抑制乳酸発酵食品は、あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）から選択される少なくとも１種を含有し免疫抑制作用を有する乳酸菌組成物を用い、食品原料を乳酸発酵させたことを特徴とする。
【００１２】
あじなれずし食品由来のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）は、消化管免疫関連サイトカインのうち、ＩＬ−２産生には影響せず、ＩＦＮ−γの産生を選択的に抑制する。すなわち、これら乳酸菌は、消化管の過剰な単球系炎症応答を選択的に抑制する。したがって、これらを含む乳酸菌組成物や、これら乳酸菌を用いて乳酸発酵された乳酸発酵食品は、免疫抑制作用に優れ、例えば大腸炎を緩和する機能食品として、身体の健康維持に役立つ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、免疫抑制作用に優れ、健康維持に有用な乳酸菌組成物を提供することができ、また、これを用いて乳酸発酵させることで、同じく免疫抑制作用に優れ、健康維持に有用な乳酸発酵食品を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】あじなれずしから単離された乳酸菌のＩＦＮ−γ産生を示す図である。
【図２】あじなれずしから単離された乳酸菌のＩＬ−２産生を示す図である。
【発明の実施の形態】
【００１５】
以下、本発明を適用した乳酸菌組成物及び乳酸発酵食品の実施形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明の免疫抑制乳酸菌組成物は、「あじなれずし食品」由来のラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus
brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus
alimentarius）から選択される少なくとも１種を含むことを特徴とするものであり、これにより免疫活性を抑制するという機能を有する。
【００１７】
「なれずし」は、塩蔵した魚を米飯と共に漬け込み熟成させた発酵食品であり、いわゆる「ほんなれ」と「なまなれ」とがある。「ほんなれ」は、熟成期間が長く、米飯が粥状になるまでじっくりと熟成させているため、魚だけが食される。「なまなれ」は、熟成期間が短く、発酵の初期段階を利用するため、米飯は食用可能な形状となっており、魚とともに食する。
【００１８】
能登地方の「なれずし」は、市販品や一般家庭で作られたもの等があるが、原魚に各種魚が利用されており、熟成期間は約２ヶ月間で、「なまなれ」に類する。この能登地方のアジ（鯵）を用いた「なれずし」が、本発明で言うところの「あじなれずし食品」である。
【００１９】
前述の「なれずし」の発酵プロセスには、多くの乳酸菌が関与しているが、本発明者らは、乳酸菌の菌叢解析を行うとともに、ＤＮＡマイクロアレイ法によりその機能を評価した。その結果、「あじなれずし食品」の乳酸発酵に関与するラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）が、消化管免疫関連サイトカインのうち特定のサイトカインの産生を抑制し、消化管の過剰な単球系炎症応答を選択的に抑制することを見出した。
【００２０】
本発明の乳酸菌組成物において使用する前記ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）や、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）は、菌体そのものであってもよいし、菌体成分や菌体由来成分、菌体処理物等であってもよい。例えば、前記菌体成分は、水やアルコールで抽出することにより得ることができる。
【００２１】
また、前記ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus
plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）は、それぞれ単独で用いてもよいし、これらのうちの２種以上を混合して用いることも可能であり、他の乳酸菌等を添加することも可能である。
【００２２】
さらに、本発明の乳酸菌組成物を薬剤等の形態で供する場合には、薬理上許容し得る担体、賦活剤、各種添加物等を加えることも可能である。
【００２３】
一方、本発明の免疫抑制乳酸発酵食品は、前記免疫抑制機能を有するラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）や、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus
parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）を用い、各種食品原料を発酵させたものである。これら免疫抑制機能を有する乳酸菌を予め仕込んでおくことで、特定の乳酸菌（前記ラクトバチルス・ブレビスやラクトバチルス・パラブチネリ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アリメンタリウス）が増殖し、免疫抑制機能に優れた乳酸発酵食品を提供することが可能となる。
【００２４】
乳酸発酵させる食品原料は任意であり、あらゆる種類の発酵食品に適用することが可能である。例えば、あじなれずしにも適用することができるし、かぶらずし、だいこんずし、いかこうじ漬け等にも適用することができる。勿論、これらに限らず、世の中に知られている乳酸発酵食品の全てに適用することが可能である。発酵に際しては、例えば前記ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・パラブチネリ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アリメンタリウスを豊富に含む菌叢を利用して発酵食品を造り、製品とすればよい。
【００２５】
以上のように、本発明の免疫抑制乳酸菌組成物や免疫抑制乳酸発酵食品は、免疫抑制機能を有する「あじなれずし食品」由来のラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・パラブチネリ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・アリメンタリウスを含有しているので、大腸炎を緩和する等、健康を維持する上で極めて有用なものである。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果を基に説明する。
【００２７】
実験方法
数種の「なれずし」から発酵に関係する菌を採取して菌叢解析を実施し、単離された菌をマウスに経口投与し、小腸のリンパ節（パイエル板）細胞が産生するサイトカインのＩＬ−２とＩＦＮ−γの産生を指標に免疫応答に及ぼす影響を調べると共に，小腸のリンパ節を含む組織を採取してｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、これを２万個の発現遺伝子が解析可能なＤＮＡマイクロアレイに付し、有益な遺伝子群の変動を指標に健康に有用な菌を探索した。
【００２８】
（１）サンプルの作製
菌体を濾過後に凍結乾燥に付し、乾燥粉末体を得た。これをサンプルとして以下の実験に用いた。
（２）実験動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（雄，５ｗ，日本チャールズリバー）を実験時に適宜購入し、金沢大学自然研動物飼育施設で１週間以上飼育、馴化させてから実験に使用した。
【００２９】
（３）サンプルの調製と投与
（１）の方法で得られたサンプルについて、最終投与量が３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙになるよう、用時、精製水に懸濁して投与サンプルを調製した。この投与サンプルを（２）の条件で飼育したマウスに０．１ｍＬ／１０ｇで１日１回（午前１０時）、連続的に５日間、経口投与した。
【００３０】
（４）パイエル板構成細胞の採取
初回のサンプル投与開始から７日後に、マウスを過剰のエーテルにより致死せしめ、無菌条件下に小腸を摘出して、散布するパイエル板を実体顕微鏡下に摘出した。得られたパイエル板を冷えたリン酸緩衝液に入れて洗浄後、７５０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（ｔｙｐｅＩ：シグマ・アルドリッチ社製）完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０）に投入し、１時間インキュベートした。インキュベート終了後、分離したパイエル板構成リンパ球を２００μｍのナイロンメッシュを通してシングルセル懸濁液として細胞数を計測した。
【００３１】
パイエル板構成細胞を３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度となるように５％ＦＣＳ化ＲＰＭＩ−１６４０培地に再浮遊して調製し、２４ウエル培養プレートに１ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２気流下、３７℃で１時間の安定培養を行った後に、最終濃度が５μｇ／ｍＬのConcanavalin
A（ＣｏｎＡ），あるいは１μｇ／ｍＬのlipopolysaccharide（ＬＰＳ）を各ウエルに添加し、４８〜１４４時間、静置培養した。
【００３２】
（５）培養液上清中のＴｈ１およびＴｈ２関連サイトカインの測定
ＣｏｎＡによる刺激培養終了後に、培養液上清を回収し、ここに含まれるＴヘルパー細胞による免疫調節因子であるＩＬ−２とＩＦＮ−γ（Ｔｈ１）、ＩＬ−４とＩＬ−５（Ｔｈ２）を市販のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて測定した。測定方法は、ｋｉｔの添付文書に従い、形成する発色色素の吸光度を測定し、標準物質による検量線からそれぞれのサイトカイン産生量を算定した。
【００３３】
発酵食品から単離できた乳酸菌
（数種のあじなれずし食品由来）
AN1-1: Lactobacillus buchneri
AN1-3: L. alimentarius
AN1-5: L. brevis
AN1-7: L. casei
AN2-2: L. brevis = AN1-5
AN2-3: L. plantarum
AN2-5: L. alimentarius = AN1-3
AN3-2: L. plantarum = AN2-3
AN3-5: L. brevis = AN1-5, AN2-2
AN4-1: L. plantarum = AN2-3, AN3-2
AN5-1: L. paraplantarum
AN5-3: L. plantarum = AN2-3, AN3-2,
AN4-1
ANP1-4: L. brevis
ANP2-1: L. parabuchneri
【００３４】
上記に示される乳酸菌のうち、ラクトバチラス・ブチネリ（Lactobacillus
buchneri） AN1-1、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis） AN1-5およびAN3-5、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum) AN3-2、ラクトバチルス・パラブチネリ（Lactobacillus parabuchneri）ANP2-1は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託申請し、以下の受託番号で受託された。
【００３５】
Lactobacillus buchneri AN1-1（受託番号：NITE P-1123）
Lactobacillus brevis AN1-5（受託番号：NITE P-1124）
Lactobacillus plantarum AN3-2（受託番号：NITE P-1255）
Lactobacillus brevis AN3-5（受託番号：NITE P-1256）
Lactobacillus parabuchneri ANP2-1（受託番号：NITE P-1257）
【００３６】
単離乳酸菌の生物活性の要約
あじなれずし由来の乳酸菌のうち、ＡＮＰ１−４（Lactobacillus brevis）、ＡＮＰ２−１（L.parabuchneri）、ＡＮ２−５(L. alimentarius)、 ＡＮ５−３（L.platarum）の４種は、消化管免疫関連サイトカインのうち、ＩＬ−２産生には影響せず、ＩＦＮ−γの産生を選択的に抑制した。このことから、これらの乳酸菌は、消化管の過剰な単球系炎症応答を選択的に抑制するので、これらの菌および菌叢を豊富に含む食品やこれらの菌を用いて発酵させた食材は、大腸炎を緩和する機能性食品となるものと考えられる。
【００３７】
小腸におけるサイトカイン産生の結果
「あじなれずし製品」から単離された乳酸菌でＡＮおよびＡＮＰシリーズの１４種について、培養菌体をマウスに経口投与してパイエル板構成細胞によるＴｈサイトカイン産生に及ぼす影響を調べた。その結果、Ｔｈ１サイトカイン産生のうちＩＦＮ−γ産生を抑制させたのは、ＡＮＰ１−４、ＡＮＰ２−１、ＡＮ２−５、ＡＮ５−３の４種の菌であった。これら４種の菌のＩＦＮ−γ産生を図１、ＩＬ−２産生を図２に示す。
【００３８】
先ず、ＡＮＰ１−４（L. brevis）であるが、図１に示す通り、３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量のＡＮＰ１−４をマウスに経口投与することにより、ＩＦＮ−γの産生は４０％以上有意に抑制された。一方、ＩＬ−２は抑制しなかった。なお、データには示していないが、ＡＮＰ１−４はＴｈ２のサイトカインのＩＬ−４とＩＬ−５産生には影響しない。
【００３９】
次に、ＡＮＰ２−１（L.parabuchneri）であるが、ＡＮＰ２−１を経口投与することによりＡＮＰ１−４よりも強いＩＦＮ−γ産生の抑制活性が認められ、その活性は７０％以上の抑制活性であった。なお、ＡＮＰ２−１もＩＬ−２産生には影響しなかった。
【００４０】
ＡＮ２−５（ L. alimentarius）は、ＡＮＰ２−１よりも弱いが、ＩＦＮ−γ産生を７０％以上有意に抑制した。なお、ＡＮ２−５もＩＬ−２産生には影響しなかった。ＡＮ５−３ （L. plantarum ）は、ＩＦＮ−γ産生において抑制活性を示すが、活性はＡＮＰ２−１ほど強くはなかった。
【図１】
2013188198.tif 000003
【図２】
2013188198.tif 000004