(57)【要約】      （修正有）【課題】生体試料中の多数の蛋白質の検出および分析に用いられるバイオチップにおいて、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持することにより高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供する。【解決手段】基体表面に蛋白質を固定化してなるバイオチップの製造方法であって、（１）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、（２）基体表面に蛋白質を溶媒に溶解又は分散した液体を点着または塗布する工程、（３）蛋白質を固定化する工程、を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法、および前記製造方法で製造されるバイオチップ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体表面に蛋白質を固定化してなるバイオチップの製造方法であって、
（１）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、
（２）基体表面に蛋白質を溶媒に溶解又は分散した液体を点着または塗布する工程、
（３）蛋白質を固定化する工程、
を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
【請求項２】
前記（３）工程において、湿度５０％以下の乾燥状態におく請求項１記載のバイオチップの製造方法。
【請求項３】
ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１または２記載のバイオチップの製造方法。
【請求項４】
前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体と蛋白質を固定化する官能基を有する単量体との共重合体である請求項１乃至３いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項５】
前記（３）工程の固定化が化学結合により蛋白質が固定化されている請求項１乃至４いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項６】
前記の蛋白質を固定化する官能基が活性エステル基である請求項５記載のバイオチップの製造方法。
【請求項７】
前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求項５または６記載のバイオチップの製造方法。
【請求項８】
蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている請求項１乃至７いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項９】
複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している請求項８記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１０】
基体の形状がスライドガラス状である請求項１乃至９いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１１】
基体の材質がプラスチックである請求項１乃至１０いずれか1項に記載のバイオチップの
製造方法。
【請求項１２】
前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド及びそれらの共重合体よりなる群より少なくとも1種である請求項１１記載のバイオチップの製造方法。
【請求項１３】
前記蛋白質が、抗体である請求項１乃至１２いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法
【請求項１４】
請求項１乃至１３いずれか１項に記載の製造方法で作製したことを特徴とするバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の多数の蛋白質の検出および分析に用いられるバイオチップの製造方法に関する技術であり、さらに詳しくは、抗原抗体反応を用いた免疫分析、プロテオミクス、ならびに遺伝子活性の細胞内蛋白質レベルでの測定に用いられるバイオチップの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。
蛋白質、またはそれを捕捉する分子を基板上に固定化した後、該表面上で他の蛋白質（例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはその抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質） と反応させて検出機等で検出する場合、蛋白質、またはそれを捕捉する
【０００３】
分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ 比） を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（ 例え
ば非特許文献１参照） 。
【０００４】
このため通常は、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に、これらの分子が固定されていない部分で他の蛋白質が非特異的に吸着するのを防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異吸着防止能は十分でない。また、蛋白質、またはそれを捕捉する分子を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質、またはそれを捕捉する分子の上に吸着防止剤がコーティングされてしまう場合があり、続く反応、即ち他の蛋白質（ 例えば抗原抗体反応では、蛋白質に対してはそ
の抗体、また蛋白質を捕捉する分子に対してはその蛋白質）との反応において、反応性が低下するという問題があった。このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ蛋白質、またはそれを捕捉する分子が固定されていない部分での非特異吸着量の少ないバイオチップが求められている。
【０００５】
また、すべての蛋白質（プロテオーム）の変動をプロファイリングする技術面では、超微量の蛋白質や数ナノリットルというような超微量の溶液の操作を可能とするマイクロフルイディクスの技術や、チップ上での前処理、分離、検出を目標とする「ラボ・オン・チップ」の概念が重要となってくる。この技術においては、サンプルである蛋白質などの生理活性物質が、流路内に固定化されたキャプチャーと特異的に反応し、かつキャプチャー部以外の流路の内壁への非特異吸着を抑制することが必要となる。
【０００６】
例えば、特許文献２や３の発明においては、生理活性物質固定のためのアミノ基含有ポリマーと親水性ポリマーを組み合わせることで、この目的を達成しようとした。基体の親水性を高めることで非特異吸着を抑制することが可能になった。
【０００７】
しかしながら、親水性を高めることは、基体表面に水を落とした時の前進接触角を低くすることでもあり、その結果、生理活性物質を含む水溶液を基体表面にスポットした場合に、スポット面積が広がり、さらにスポット外周部がにじんで真円のスポットにならないなどの問題が生じた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特開２００５−０９１２４５号公報
【特許文献３】特表２０１０−００８３７８号広報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、２０００年、ｐ．５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持することにより高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、（１）〜（１４）に示す以下の通りである。
（１）基体表面に蛋白質を固定化してなるバイオチップの製造方法であって、（１）基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布する工程、（２）基体表面に蛋白質を溶媒に溶解又は分散した液体を点着または塗布する工程、（３）蛋白質を固定化する工程、を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
（２）前記（３）工程において、湿度５０％以下の乾燥状態におく（１）記載のバイオチップの製造方法。
（３）ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（１）または（２）記載のバイオチップの製造方法。
（４）前記ポリマーがホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を有する単量体と蛋白質を固定化する官能基を有する単量体との共重合体である（１）乃至（３）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（５）前記（３）工程の固定化が化学結合により蛋白質が固定化されている（１）乃至（４）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（６）前記の蛋白質を固定化する官能基が活性エステル基である（５）記載のバイオチップの製造方法。
（７）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（５）または（６）記載のバイオチップの製造方法。
（８）蛋白質が基体表面にスポット状に固定化されている（１）乃至（７）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（９）複数種の蛋白質のスポットが基体表面の同一区画中に存在している（８）記載のバイオチップの製造方法。
（１０）基体の形状がスライドガラス状である（１）乃至（９）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
（１１）基体の材質がプラスチックである（１）乃至（１０）いずれか1項に記載のバイ
オチップの製造方法。
（１２）前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド及びそれらの共重合体よりなる群より少なくとも1種である（１１）記載のバイオチップの製造方法。
（１３）前記蛋白質が、抗体である（１）乃至（１２）いずれか１項に記載のバイオチップの製造方法
（１４）（１）乃至（１３）いずれか１項に記載の製造方法で作製したことを特徴とするバイオチップ。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、吸着防止剤をコーティングすることなしに、蛋白質を基体表面の任意の位置に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、かつ良好なスポット形状を維持した高感度でハイスループットな生理活性物質の検出ができるバイオチップの製造方法を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１の抗原存在下での測定結果を示す図。
【図２】実施例１の抗原無しでの測定結果を示す図。
【図３】比較例１の抗原存在下での測定結果を示す図。
【図４】比較例１の抗原無しでの測定結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のバイオチップの製造方法は、基体表面にホスホリルコリン基を有するポリマーをコートする工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
（ポリマーの構成）
ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（ 例えばI s h i
h a r a K , T s u j i T , K u r o s a k i T , N a k a b a y a s h i N ,J o u r n a l o f B i o m e d i c a l M a t e r i a l s R e s e a r c h , 2 8 ( 2 ) , p p . 2 2 5 - 2 3 2 , ( 1 9 9 4 )４ など） 。
【００１６】
本発明で用いるホスホリルコリン基は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を挙げられることができるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明に使用するポリマーは生理活性物質を固定化するための官能基を有することが好ましい。本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基をとしては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基などがあるがこれらに限定されない。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましい。特に、活性エステル基が生理活性物質との結合において広く用いられ、実績もあることから最も好ましい。
【００１８】
基体表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性等の観点から、基体表面とポリマーとの疎水効果によって結合していることが好ましい。
また、本発明に使用するポリマーは、ホスホリルコリン基以外に他の基を含んでもよく、ホスホリルコリン基を有する単量体、活性エステル基を有する単量体と疎水性基であるブチルメタクリレート基を有する単量体との三元共重合体が好ましい。
【００１９】
（ポリマーのコーティング）
本発明のバイオチップは、基体表面を該ポリマーでコーティングすることにより、生理活
性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。
基体へのポリマーのコーティングは、例えば有機溶剤にポリマーを０．０５〜１０重量％濃度になるように溶解したポリマー溶液を調製し、浸漬、吹きつけなどの公知の方法で基体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００２０】
用いる有機溶剤としては、２−ブタノン、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトンなどの単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基体を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。また、溶液中でポリマーを加水分解させる場合にも、水と任意の割合で混ざるので好ましい。
【００２１】
本発明のポリマーを溶解した溶液を基体表面に塗布した後、溶液を除去し、有機溶媒で洗浄したのち、遠心乾燥するのが好ましい。
【００２２】
（基体の素材）
基体の素材は、通常ガラス、金属その他を用いることができるが、本発明に使用する基体の素材としては、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックを使用し、特に熱可塑性樹脂であることが好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましい。例えばポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド及びそれらの共重合体よりなる群より少なくとも1種等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優
れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα − オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体等を指す。
【００２３】
（基体の形状）
本発明に使用する基体の形状は、特に限定しないが、スライドガラス状の基板、マルチウェルプレート、ビーズ状の球体等が挙げられる。これらの基体表面に微細な流路を有していてもよく、流路内に抗体を固定化させることも可能である。
【００２４】
（蛋白質の固定化）
本発明において蛋白質を基体上に固定化する際には、蛋白質を溶媒で溶解又は分散した液体を点着する方法が好ましい。
蛋白質を溶解または分散する溶媒のｐＨは８〜１０であることが好ましく、ｐＨ９．０〜９．９がより好ましい。蛋白質固定化の工程における環境については、温度は２０℃ 以
上が必要であり、好ましくは２５〜７０℃ である。
【００２５】
この際に重要なことは、固定化の工程において湿度を０〜５０％に保つことである。特に湿度３５〜４５％の条件下ではスポットの滲みやかすれによるスポット形状の異常が見られず、シグナル強度が安定し、より好適である。固定化後は、固定化されなかった蛋白質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することが好ましい。
【００２６】
蛋白質が基体表面にスポット状に固定化される場合、本発明の条件下では、スポットの滲みやかすれによるスポット形状の異常の発生が抑制され得ることにより、複数種の蛋白質のスポットを基体表面の同一区画中に存在させることが可能である。これにより、同一の検体中の複数種の蛋白質を同時に測定することが可能となる。
【実施例】
【００２７】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
【００２８】
１．ポリマーの調製
（１）ポリマーの合成
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と記載）、n−ブ
チルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」と記載）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載。）を脱水エタノールに溶解させた。
そこに、さらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載、和光純薬工業社製）を添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。
なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に７０：２７：３である。
その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集することにより第１のポリマーを得た。
なお、上述したＭＥＯＮＰについては、以下の（２）に示すようにして合成した。
【００２９】
（２）ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂製、「Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００」）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。
−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業社製）およびクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。
−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してＭＥＯＮＰを得た。
【００３０】
２．抗原の検出
［実施例１］（ＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮ抗体を湿度５０％以下の乾燥状態で固定化した場合）
【００３１】
（１）まず、ＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮの検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
基体として直径７ｍｍ、深さ１ｍｍのウェルを備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。該基体にポリマーの０．５ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを成型品のウェルに点着したのち乾燥、次に、エタノールを用いて洗浄し、ウェル底面に、ポリマーを導入した。
【００３２】
（２）次に、一次抗体（RABBIT IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN（Cappel社製））の５μｇ／ｍＬリン酸バッファー溶液を調製し、これを穴部に点着したのち、４５％以下の乾燥状態、室温下で一晩静置した。洗浄液（0.05% triton X100 /PBS）を用いて３回洗浄を行った。
【００３３】
（３）次に、Ａｌｂｕｍｉｎ抗原（Albumin 、Rat (-)（Cappel社製））の７０μｇ／ｍ
ＬＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００３４】
（４）次に、標識化二次抗体（オチン標識 SHEEP IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN（Cappel社製））の１ｕｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（0.05% triton X100）を調製し、これを穴部に点
着したのち、３７℃の環境下に１時間静置して、抗原抗体反応を実施した。洗浄液を用い
て３回洗浄を行った。
【００３５】
（５）次に、Cy3標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（0.05% triton X100）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に０．５時間静置した。洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【００３６】
（６）測定は、ウェルについて、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０nm蛍光波長：５７０nm）を行った。
結果を図1に示す。図１によると抗原依存的に蛍光シグナルが得られた。また、各スポ
ットの形も形状のよい円をしめしていた。
【００３７】
［比較例］（ＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮ抗体を湿度５０％以上の多湿下で固定化した場合）実施例１と同様の操作で、（２）の一次抗体の固定化において、湿度６０％の条件下で実施した。
その結果、抗原依存的な蛍光シグナルが得られなかった。
【００３８】
実施例１、と比較例１とでは、明らかに得られた蛍光シグナルの強度、形状が著しく異なり、実施例１において良好な結果が得られたことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、不要な生理活性物質の吸着および結合を抑制し、高感度でハイスループットな生理活性物質の検出および分析用のバイオチップに使用することができる。
【図１】
2013148483.tif 000003
【図２】
2013148483.tif 000004
【図３】
2013148483.tif 000005
【図４】
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