(57)【要約】【課題】グルコース以外の炭素源を利用する場合であっても優れたプロモーター活性を示す。【解決手段】サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のYGR086C遺伝子の上流に位置し、当該YGR086C遺伝子の発現を制御している領域からなるプロモーター。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のYGR086C遺伝子の上流に位置し、当該YGR086C遺伝子の発現を制御している領域からなるプロモーター。
【請求項２】
上記領域は配列番号１に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
上記領域は配列番号１に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列からなることを特徴とする請求項１記載のプロモーター。
【請求項４】
上記領域は配列番号１に示す塩基配列からなるDNAの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなることを特徴とする請求項１記載のプロモーター。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれか一項記載のプロモーターを含む核酸構築物。
【請求項６】
請求項１乃至４いずれか一項記載のプロモーターを含む発現ベクター。
【請求項７】
上記プロモーターの下流に位置する遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項１乃至４いずれか一項記載のプロモーターを所望の遺伝子の上流に組み入れた形質転換体。
【請求項９】
上記所望の遺伝子が外来性の遺伝子であることを特徴とする請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
セルロース系バイオマスを糖化し、且つエタノール発酵能を有することを特徴とする請求項８記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項８乃至１０いずれか一項記載の形質転換体を培養し、培養後の培地及び/又は形質転換体内より目的物質を回収する、物質の製造方法。
【請求項１２】
上記形質転換体をセルロース含有培地にて培養することを特徴とする請求項１１記載の物質の製造方法。
【請求項１３】
上記セルロース含有培地は、セルロース系バイオマスの前処理物を含むことを特徴とする請求項１２記載の物質の製造方法。
【請求項１４】
上記目的物質は、セルロース系バイオマスを糖化してなる糖類からエタノール発酵により合成されたエタノールであることを特徴とする請求項１１記載の物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母において機能する新規プロモーター及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に代表される酵母は、その発酵能を利用した食品工業に使用され、また各種物質生産の宿主として広く利用されている。さらに、酵母は、遺伝子工学における主要な研究対象となっている。ところで、一般的に酵母において、所定の遺伝子を発現させる場合、恒常的に高発現を可能とするようなプロモーターを使用する。酵母において使用可能なプロモーターとしては、例えば、TDH3プロモーター、ADH1プロモーター及びTEF1プロモーター等が知られている。これら公知のプロモーターは、通常の培地、すなわち炭素源としてグルコースを使用した培地において使用される。
【０００３】
しかしながら、上述した各種プロモーターは、炭素源としてグルコースを使用した培地で培養する酵母において下流の遺伝子を恒常的に高発現させることができるが、他の炭素源を利用した場合に発現量が十分ではなかった。すなわち、従来、グルコース以外の炭素源を利用する場合に所望の遺伝子を高発現できるプロモーターは知られていなかった。
【０００４】
例えば、酵母において、各種ストレス環境においても安定して機能するプロモーターとして特許文献１に開示されるように、細胞壁タンパク質をコードするSED1遺伝子のプロモーターを同定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2003-265177号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に開示されたプロモーターや上述した公知のプロモーターは、例えばセルロース、前処理後のセルロース及びセルロースとともにセルラーゼを含む培地において、プロモーター活性が低下してしまうといった問題があった。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、グルコース以外の炭素源を利用する場合であっても優れたプロモーター活性を示す新規プロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、グルコース以外の炭素源を利用する場合であっても優れたプロモーター活性を示す新規なプロモーターを同定することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は以下を包含する。
【０００８】
（１）サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のYGR086C遺伝子の上流に位置し、当該YGR086C遺伝子の発現を制御している領域からなるプロモーター。
（２）上記領域は配列番号１に示す塩基配列からなることを特徴とする（１）記載のプロモーター。
（３）上記領域は配列番号１に示す塩基配列に対して８０％以上の同一性を有する塩基配列からなることを特徴とする（１）記載のプロモーター。
（４）上記領域は配列番号１に示す塩基配列からなるDNAの相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAからなることを特徴とする（１）記載のプロモーター。
（５）（１）乃至（４）いずれか一記載のプロモーターを含む核酸構築物。
（６）（１）乃至（４）いずれか一記載のプロモーターを含む発現ベクター。
（７）上記プロモーターの下流に位置する遺伝子を更に含むことを特徴とする（６）記載の発現ベクター。
（８）（１）乃至（４）いずれか一記載のプロモーターを所望の遺伝子の上流に組み入れた形質転換体。
（９）上記所望の遺伝子が外来性の遺伝子であることを特徴とする（８）記載の形質転換体。
（１０）セルロース系バイオマスを糖化し、且つエタノール発酵能を有することを特徴とする（８）記載の形質転換体。
（１１）（８）乃至（１０）いずれか一記載の形質転換体を培養し、培養後の培地及び/又は形質転換体内より目的物質を回収する、物質の製造方法。
（１２）上記形質転換体をセルロース含有培地にて培養することを特徴とする（１１）記載の物質の製造方法。
（１３）上記セルロース含有培地は、セルロース系バイオマスの前処理物を含むことを特徴とする（１２）記載の物質の製造方法。
（１４）上記目的物質は、セルロース系バイオマスを糖化してなる糖類からエタノール発酵により合成されたエタノールであることを特徴とする（１１）記載の物質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るプロモーターによれば、グルコース以外の炭素源を利用する場合であっても優れたプロモーター活性を示すことができる。特に、本発明に係るプロモーターを利用することによって、例えばセルロース及びセルラーゼを含有する培地において所望の遺伝子の発現量を増大させることができる。
【００１０】
また、本発明に係る物質の製造方法によれば、上記プロモーターを利用することで、グルコース以外の炭素源を利用する場合であっても所定の遺伝子の発現量が向上することにより、目的物質について優れた生産性を達成することができる。すなわち、本発明に係る物質の製造方法は、上記プロモーターにより発現が促進される遺伝子によりコードされるタンパク質及び/又は当該タンパク質が関与する各種物質の生産性を大幅に向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】TDH3遺伝子、PDC1遺伝子、YGR086C遺伝子、YIL057C遺伝子、FBP1遺伝子及びENA2遺伝子の各プロモーターのプロモーター活性をグルコース培地で評価した結果を示す特性図である。
【図２】TDH3プロモーター、PDC1プロモーター及びYGR086Cプロモーターに関して種々の炭素源を使用したときのプロモーター活性を評価した結果を示す特性図である。
【図３】図２に示したプロモーター活性を、グルコースを炭素源とした場合の各々のプロモーター強度を1としたときの相対値とした結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係るプロモーターは、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のYGR086C遺伝子のプロモーターである。サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のYGR086C遺伝子のプロモーターとは、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の染色体上における、YGR086C遺伝子の発現を制御している領域を意味する。YGR086C遺伝子は、PIL1遺伝子とも呼称され、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞膜に固定された、アイソソーム（eisosome）の主成分となるタンパク質をコードすることが知られている（Nature 439, 998-1003 (23 February 2006)）。
【００１３】
本発明に係るプロモーターは、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるYGR086C遺伝子の上流に存在する如何なる領域でもよい。一例として、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるYGR086C遺伝子の上流800塩基からなる領域の塩基配列を配列番号１に示す。なお、配列番号１の塩基配列は、５’末端から３’末端に向かって記載されている。よって、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるYGR086C遺伝子は、配列番号１の塩基配列の下流側、すなわち３’末端側に位置することとなる。
【００１４】
すなわち、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるYGR086C遺伝子のプロモーターとしては、配列番号１に示した800塩基を含む領域とすることができる。ただし、本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示した800塩基を含む領域に限定されず、配列番号１に示した800塩基のうち３’末端側の連続する領域であって、プロモーター活性を有する領域としてもよい。配列番号１に示した800塩基のうち３’末端側の連続する領域とは、例えば、配列番号１に示した800塩基のうち３’末端から連続する400塩基、500塩基、600塩基、700塩基或いは750塩基からなる領域を挙げることができる。
【００１５】
また、本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示した800塩基を含む領域とする場合、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）染色体において配列番号１に示す塩基配列の５’末端に続く更に上流の領域を含んでいても良い。すなわち、本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示した塩基配列の更に上流を含む領域としてもよい。配列番号１に示した塩基配列の更に上流を含む領域とは、例えば、配列番号１に示した塩基配列の５’末端から更に100塩基上流を含む900塩基の領域、５’末端から更に200塩基上流を含む1000塩基の領域、５’末端から更に300塩基上流を含む1100塩基の領域、５’末端から更に400塩基上流を含む1200塩基の領域、５’末端から更に500〜1000塩基上流を含む1300〜1800塩基の領域とすることができる。
【００１６】
なお、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、染色体の全塩基配列が既に決定されており、公知の情報として入手可能である。よって、上述したように、配列番号１に示す塩基配列の５’末端に続く更に上流の領域は、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の染色体の全塩基配列情報を格納したデータベースから容易に入手することができる。若しくは、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から抽出した染色体を用いたインバースPCRといった手法により、配列番号１に示す塩基配列の５’末端に続く更に上流領域を増幅し、得られた上流領域の塩基配列を公知の手法によって決定することもできる。
【００１７】
また、本発明に係るプロモーターは、上述のように配列番号１に示した塩基配列を基準として規定できるが、基準となる塩基配列は配列番号１に限定されるものではない。例えば、配列番号１に示した塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の一致度を有するポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を基準としても良い。すなわち、本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示した塩基配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の一致度を有する塩基配列とすることができる。
【００１８】
なお、一致度の値は、配列類似性を検索するプログラム（相同性検索プログラムと称される場合もある）を用いて、配列番号１の塩基配列と他の塩基配列とをアライメントした際に、当該他の塩基配列における、配列番号１の塩基配列に対して一致した塩基の割合として算出される値である。
【００１９】
さらに、本発明に係るプロモーターは、上述のように配列番号１に示した塩基配列を基準として規定できるが、基準となる塩基配列は配列番号１に限定されるものではない。例えば、配列番号１に示した塩基配列における１又は複数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を基準としても良い。ここで、複数個の塩基とは、例えば２〜２００個の塩基を意味し、好ましくは２〜１００個、より好ましくは２〜５０個、最も好ましくは２〜２５個のアミノ酸を意味する。
【００２０】
さらにまた、本発明に係るプロモーターは、例えば、配列番号１に示した塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドの一部又は全部に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドの塩基配列を基準としても良い。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合を維持することを意味する。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００２１】
なお、所定の塩基配列を有するポリヌクレオチドがプロモーター活性を有するか否かは、適当な宿主を用いたレポーターアッセイにより検証することができる。ここで、適当な宿主としては、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等の酵母を使用することもできる。レポーターアッセイに使用するレポーター遺伝子としては、何ら限定されず、例えば、ルシフェラーゼ（LUC)遺伝子やβ-グルクロニダーゼ（GUS)遺伝子を使用することができる。これらレポーター遺伝子を用いたアッセイも、従来公知のプロトコルを適宜改変して使用することができる。
【００２２】
以上に説明した、本発明に係るプロモーターは、下流に配置された遺伝子の発現を制御する機能を有する。なお、下流とは、転写方向、すなわちセンス鎖における5'側から3'側に向かう方向を意味する。特に、本発明に係るプロモーターは、グルコース以外の炭素源を利用する場合であっても優れたプロモーター活性を示すことができる。よって、本発明に係るプロモーターを利用することによって、グルコース以外の炭素源を利用する場合であっても、転写活性に優れた発現制御領域を有する核酸構築物を提供することができる。なお、核酸構築物には、上述したプロモーターの他に、当該プロモーターの転写活性を向上させるようなシス作用エレメントが含まれていても良い。この核酸構築物は、例えば、両末端に制限酵素認識配列を有するように構築することもできる。また、この核酸構築物は、例えば、従来公知の発現ベクターに組み込むこともできる。すなわち、上述した本発明に係るプロモーターを、所望の遺伝子の発現を可能とする発現ベクターに組み込むことで、グルコース以外の炭素源を利用した場合でも当該遺伝子を高発現できる発現ベクターを提供できる。
【００２３】
この発現ベクターは、主として宿主細胞の形質転換に使用する従来公知のあらゆる発現ベクターに対して、上述したプロモーターを組み込むことで作製することができる。また、上述したプロモーターを有する発現ベクターは、宿主細胞の染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態のいずれであっても良い。また、発現ベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター等のいずれであっても良い。なお、発現ベクターには、上述したプロモーターの他に、エンハンサー、選択マーカー、複製開始点、マルチプルクローニングサイト等を備えることができる。
【００２４】
ここで、選択マーカーとは、発現ベクターの導入の目印として導入する遺伝子であり、通常、蛍光タンパク質や呈色反応を示す酵素をコードする遺伝子、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子及び薬剤耐性遺伝子が使用されている。本発明においても、これら通常の選択マーカー遺伝子を使用して発現ベクターを構築することができる。
【００２５】
また、この発現ベクターを、酵母に対する形質転換に使用する場合、当該発現ベクターに所望の遺伝子を組み込むことで、組換えベクターを作製することができる。この組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することで、宿主細胞内において当該遺伝子が高レベルで転写されることとなる。ここで宿主細胞としては、酵母を使用することができる。酵母としては、特に限定するものではないがキャンディダ シェハーテ（Candida shehatae）、ピキア スティピティス（Pichia stipitis）、パチソレン タノフィルス（Pachysolen tannophilus）、サッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びシゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccaromyces pombe）などの酵母が挙げられ、特にサッカロマイセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。また、宿主となる酵母としては、野生株に限定されず、野生株に対して変異原処理を施して得られる変異株や、所定の遺伝子が導入された組換え酵母のいずれであっても良い。
【００２６】
本発明に係るプロモーターを含む発現ベクターを酵母に導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００２７】
ところで、上述した本発明に係るプロモーターの下流に配置する遺伝子は、宿主酵母において発現させることを企図する遺伝子であり、特に限定されず、如何なるタンパク質をコードする遺伝子を対象とすることができる。例えば、遺伝子としては、セルロース系バイオマスに由来する糖からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。より具体的に遺伝子としては、アルカリプロテアーゼ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、アスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子、アスパルチックプロテアーゼ遺伝子、セロビオヒドロラーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼ遺伝子、グリオキサールオキシダーゼ遺伝子、ラッカーゼ遺伝子、リグニンオキシダーゼ遺伝子、リグニンペルオキシダーゼ遺伝子、リパーゼ遺伝子、マンガンペルオキシダーゼ遺伝子、1,2-α-マンノシダーゼ遺伝子、ヌクレアーゼ遺伝子、ペクチンリアーゼ遺伝子、ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子、酸性ホスファターゼ遺伝子、ポリガラクチュロナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子、β-キシロシダーゼ遺伝子等を挙げることができる。
【００２８】
さらに詳細に、バイオマスに由来する糖からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子としては、例えばキシロースの代謝に関与する酵素をコードする遺伝子（キシロース代謝関連遺伝子）を挙げることができる。キシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子、あるいはキシロースをキシルロースに変換するキシロースイソメラーゼをコードするキシロースイソメラーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００２９】
酵母ゲノムに導入されるキシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。なお、ストレプトマイセスムリナスクラスター由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子等を利用することもできる。
【００３０】
バイオマスに由来する糖からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子としては、上述したキシロース代謝関連遺伝子以外にも、セロビオース、ガラクトース、ラクトース、マンノース及びスクロースといった糖分からのエタノール発酵に関与する各種酵素をコードする遺伝子でもよい。
【００３１】
一方、本発明に係るプロモーター及び当該プロモーターを利用した形質転換酵母を利用することで、各種目的の物質を製造することができる。ここで、製造目的の物質とは、上記プロモーターにより高レベルに転写される遺伝子がコードするタンパク質、当該タンパク質が関与する物質のいずれも意味する。タンパク質が関与する物質とは、例えば、当該タンパク質が酵素として代謝経路に関与している場合の代謝産物を意味する。
【００３２】
ここで、生産対象のタンパク質としては、何ら限定されず、如何なる分子量、如何なる生物種由来、如何なる等電点、如何なるアミノ酸配列のタンパク質であっても良い。特に、生産対象のタンパク質としては、リゾチーム、キモシン、レクチン、インターロイキン、ラクトフェリン、抗Ｆａｓ抗体などの抗体医薬、ダニアレルゲン、花粉アレルゲン、木質バイオマス分解のためのセルロース分解酵素、サイトカイン等が高等生物由来の遺伝子によりコードされるタンパク質として例示できる。
【００３３】
なお、製造目的の物質が菌体外に分泌生産される場合には、菌体の破壊処理を行わず、定法に従って当該物質を回収できる。また、製造目的の物質が菌体内に生産される場合には、菌体を破壊処理した後、定法に従って当該物質を回収できる。なお、製造目的の物質がタンパク質である場合、培地の上清サンプルや菌体破壊処理後の上清サンプルを直接、当該技術分野で知られているドデシルナトリウム硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で解析することにより測定できる。細胞培養中に生産された目的タンパク質は培地の中に分泌され、そして、例えば細胞培地から不要な成分を取り除くことにより、精製、又は、単離される。目的タンパク質の精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上またはDEAEなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGE、硫酸アンモニュウム沈殿法、ゲルろ過等の手法を単独で又は組み合わせて使用できる。
【００３４】
また、製造目的の物質がエタノールである場合、酵母を培養した培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【００３５】
特に、本発明に係るプロモーターは、グルコース以外の炭素源を含む培地においてより優れたプロモーター活性を示すといった特徴を有している。特に、本発明に係るプロモーターは、セルロース系バイオマス及びセルラーゼを含む培地において優れたプロモーター活性を示す。言い換えると、本発明に係るプロモーターは、セルロースの存在下、又はセルロースとセルラーゼの存在下において優れたプロモーター活性を示す。セルロースとセルラーゼの存在下とは、セルロースのセルラーゼ分解物の存在下という意味を含む。セルラーゼ分解物としては、単糖であるβ-グルコース、β-グルコースを構成糖とするオリゴ糖（セロビオース等）を挙げることができる。
【００３６】
したがって、本発明に係るプロモーター及び当該プロモーターを利用した形質転換体は、は、セルロース系バイオマスを用いた、いわゆる同時糖化発酵によるエタノール製造に利用されることが好ましい。このとき、本発明に係るプロモーターは、セルロース系バイオマスに含まれるキシロース等のグルコース以外の糖成分をエタノール発酵に利用する反応に関与する酵素をコードする遺伝子と連結され、当該遺伝子とともに酵母に導入される（組換え酵母）。なお、グルコース以外の糖成分としては、例えば、キシロース、セロビオース、ガラクトース、ラクトース、マンノース及びスクロースを挙げることができる。
【００３７】
なお、この同時糖化発酵とは、培地中に含まれるセルロースやヘミセルロース等の高分子多糖を低分子化する糖化反応と、糖化反応により生成した糖分（主として単糖）からエタノールを合成するエタノール発酵とが同時に進行する反応系を意味する。糖化反応とは、例えば、セルロース鎖に対してランダムに作用してセロオリゴ糖を生産するエンドグルカナーゼ、セルロース鎖の末端から作用してセロビオースを生産するセロビオヒドロラーゼI及びII、並びに生産されたオリゴ糖に対して作用して単糖であるグルコースを生産するβ-グルコシダーゼが関与する反応を意味する。なお、これらの酵素をまとめてセルラーゼと称する場合がある。同時糖化発酵における糖化反応には、市販されているセルラーゼ製剤を使用することができる。また、同時糖化発酵における糖化反応には、ヘミセルラーゼを加水分解して低分子化するヘミセルラーゼを使用することもできる。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
〔実施例１〕
本実施例では、セルロースを含有する培地において優れたプロモーター活性を示す新規なプロモーターを同定した。
【００４０】
実験手法
＜同時糖化発酵で高発現を行う遺伝子の選定＞
表１に示す反応液にて30℃、200rpm振とうし、同時糖化発酵を実施した。
【００４１】
【表１】
2013192522.tif 000003
【００４２】
本実施例では、表１における炭素源をグルコース又はセルロースとした。なお表１中、NS50013及びNS50010はノボザイム社製のセルラーゼである。同時糖化発酵開始から24時間後、回収した酵母菌体内の全RNA量をマイクロアレイで解析した。なお、マイクロアレイ解析において、遺伝子の標識は、Quick Amp Labeling Kit（アジレスト社製）を使用した。標識された遺伝子は、YeastオリゴDNAマイクロアレイ（アジレスト社製）にスポットした後、スキャナ（アジレスト社製）を用いてスキャニングを実施した。スキャンした画像は、Feature extractionソフトウェア（アジレスト社製）を用いて数値化し、解析した。その結果、炭素源をグルコースとした場合に発現し、かつセルロース/セルラーゼ混合培地中で特に高発現している遺伝子として、YGR086C、FBP1、YIL057C及びENA2を選定した。
【００４３】
＜プロモーター評価用酵母の作製＞
Saccharomyces cerevisiae OC-2株のゲノムを鋳型にYGR086C、FBP1、YIL057C、ENA2及びTHD3遺伝子の上流800 bp領域をPCRで増幅した。PCRに使用したプライマーを表２にまとめた。
【００４４】
【表２】
2013192522.tif 000004
【００４５】
得られた上流800 bp領域の下流にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を融合させた、レポーターアッセイ用遺伝子を構築した。具体的には、pAUR-LacZ（特開2003-164295号公報参照）をSalIで線状化した後、各PCR増幅断片をIn-Fusionクローニング（In-Fusion HD Cloning kit（タカラバイオ社製））で融合することで、レポーターアッセイ用遺伝子を構築した。なお、一般的な酵母のプロモーターであるPDC1プロモーターの制御下でβ-ガラクトシダーゼを生産させるレポーターアッセイ用遺伝子としては、具体的に、pAUR-LacZ-OC2PDC1（特開2003-164295号公報参照）を使用した。
【００４６】
次に、上述のように作製したレポーターアッセイ用遺伝子を用いてSaccharomyces cerevisiae OC-2株を形質転換した。すなわち、上述のように構築したレポーターアッセイ用遺伝子のAur1領域を線状化し、酢酸リチウム法でSaccharomyces cerevisiae OC-2株を形質転換した。得られた形質転換酵母は、オーレオバシジンを添加したYPD寒天培地を用いて薬剤耐性を指標として選抜した。
【００４７】
以上のようにして、各種のプロモーターの制御下にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する発現カセットが染色体に組み込まれた形質転換酵母(プロモーター評価用酵母)を作製した。
【００４８】
＜プロモーターの評価＞
プロモーター評価用酵母を寒天培地より白金耳で1ループ取り、試験管にて2mlのYPD(1%乾燥酵母エキス、2%バクトペプトン、2%グルコース)培地で30℃、160rpmで24時間振とう培養した。その後、それら酵母を初期OD=0.1にそろえて10mlのYPD培地で30℃、160rpmで24時間振とう培養した。培養した酵母を3000rpm、5分間遠心し、回収した。その後、D.W.で2回洗浄した。表１の組成となるように培地(炭素源はグルコース、セロビオース、前処理バイオマス、もしくはアビセル(セルロース)を使用)を作製し、30℃、200rpmで24時間振とうすることで発酵(同時糖化発酵)した。なお、本実施例で、前処理バイオマスとは、希酸処理したネピアグラスのことである。
【００４９】
次に、培養後の酵母を遠心分離し、スパチュラを使用して回収した。その後、残存しているセルラーゼを除去する目的で、酵母をD.W.で3回洗浄した後、50mMのTris-HCl(pH8.0)で2回洗浄した。ガラスビーズとボルテックスを使用して酵母を破砕し、その後、遠心分離することで酵母抽出液を得た。得られた酵母抽出液はブラッドフォード法によるタンパク質濃度測定、β-Galactosidase Enzyme Assay System (プロメガ社製)を用いたβ-ガラクトシダーゼ活性測定を行った。プロモーターの強度は破砕溶液の全タンパク質濃度に占めるβ-ガラクトシダーゼ活性値(A420)を指標に評価した。
【００５０】
＜形質転換酵母のβ-ガラクトシダーゼ生産有無の確認結果＞
マイクロアレイの解析データより、YGR086C遺伝子、FBP1遺伝子、YIL057C遺伝子及びENA2遺伝子のプロモーターは、グルコース培地でプロモーター活性を示すことが見込まれる。そこで、表１の培地(炭素源としてグルコースを使用)で24時間発酵し、形質転換酵母がYGR086C、FBP1、YIL057C、ENA2、PDC1もしくはTDH3プロモーターでβ-ガラクトシダーゼを生産する事を確認した。その結果を図１に示した。図１から判るように、TDH3プロモーター、PDC1プロモーター及びYGR086Cプロモーターは、炭素源としてグルコースを使用した場合にプロモーター活性を示すことが確認できた。しかし、FBP1プロモーター、YIL057Cプロモーター及びENA2プロモーターについては、グルコースを炭素源としたときプロモーター活性が著しく低いことが確認できた。
【００５１】
＜TDH3、PDC1、YGR086Cプロモーターの詳細評価＞
上述のように、グルコースを炭素源とするときにプロモーター活性を示すことが確認できたプロモーター、すなわちTDH3プロモーター、PDC1プロモーター及びYGR086Cプロモーターに関して、更に詳細を解析した。なお、TDH3プロモーター及びPDC1プロモーターは、グルコースを炭素源とする場合にプロモーター活性を示すことが公知であり、コントロートとして評価した。
【００５２】
本実施例では、種々の炭素源を使用したときのプロモーター活性を評価した。すなわち、炭素源として、セルロースを含まない基質：グルコース及びセロビオースを使用したとき、並びにセルロースを含む基質：前処理バイオマス及びアビセルを使用したときのプロモーター活性を評価した。プロモーター活性の評価結果を図２に示した。また、グルコースを炭素源とした場合の各々のプロモーター強度を1としたときの、他の炭素源を用いた場合のプロモーター強度の相対比を図３に示した。なお、図２及び３における横軸の数字は表３に示す炭素源の種類を意味している。
【００５３】
【表３】
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【００５４】
図２及び３より、新規なプロモーターであるYGR086Cプロモーターは、グルコースを炭素源とする場合にもプロモーター活性を示したが、特に、セルロースを含有する培地において優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。詳細には、YGR086Cプロモーターは、培地にセルロースを含み、当該セルロースを糖化する酵素が存在するときに優れたプロモーター活性を示すことが明らかとなった。このYGR086Cプロモーターにおけるプロモーター活性は、従来公知の高発現プロモーターであるTDH3プロモーター及びPDC1プロモーターと比較して極めて優れたプロモーター活性と評価することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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