(57)【要約】【課題】特に食品原材料として優れた特性を有する小麦粉及びデンプンを提供すること。【解決手段】GBSSI-A1、GBSSI-B1及びGBSSI-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損し、かつ、SSIIa-A1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損したコムギ（ただし、GBSSI-A1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギ、並びにGBSSI-A1、GBSSI-B1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギを除く）の収穫物を製粉して得られた小麦粉を提供した。本発明の小麦粉は、一般的な湯種法よりも低温で生地中マルトース含量を高めることができる、凍結融解後のデンプンの物性が良好である、などの利点を有する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
GBSSI-A1、GBSSI-B1及びGBSSI-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損し、かつ、SSIIa-A1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損したコムギ（ただし、GBSSI-A1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギ、並びにGBSSI-A1、GBSSI-B1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギを除く）の収穫物を製粉して得られた小麦粉。
【請求項２】
前記収穫物が、GBSSI-B1及びGBSSI-D1の酵素活性を欠損したコムギの収穫物である請求項１記載の小麦粉。
【請求項３】
前記収穫物が、GBSSI-A1及びGBSSI-B1の酵素活性を欠損したコムギの収穫物である請求項１記載の小麦粉。
【請求項４】
前記収穫物が、GBSSI-B1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギの収穫物である請求項２記載の小麦粉。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の小麦粉を含む穀粉組成物。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の小麦粉又は請求項５記載の穀粉組成物を使用して製造された食品。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の小麦粉又は請求項５記載の穀粉組成物を使用して製造された製品。
【請求項８】
GBSSI-A1、GBSSI-B1及びGBSSI-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損し、かつ、SSIIa-A1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損したコムギ（ただし、GBSSI-A1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギ、並びにGBSSI-A1、GBSSI-B1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギを除く）の収穫物、又は該収穫物を製粉して得られた小麦粉から分離されたデンプン。
【請求項９】
前記収穫物が、GBSSI-B1及びGBSSI-D1の酵素活性を欠損したコムギの収穫物である請求項８記載のデンプン。
【請求項１０】
前記収穫物が、GBSSI-A1及びGBSSI-B1の酵素活性を欠損したコムギの収穫物である請求項８記載のデンプン。
【請求項１１】
前記収穫物が、GBSSI-B1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギの収穫物である請求項９記載のデンプン。
【請求項１２】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のデンプンを使用して製造された食品。
【請求項１３】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のデンプンを使用して製造された製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２つの顆粒結合性澱粉合成酵素I（GBSSI）と２つの澱粉合成酵素IIa型（SSIIa）の酵素活性を欠損したコムギから調製された小麦粉に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは、グルコースがα-1,4結合で連なった直鎖状のアミロースとα-1,6結合を介して枝分かれ構造をもったアミロペクチンという２つの成分の混合物である。これら成分は種々の酵素の働きによって合成され、穀物においては種子の胚乳部分に蓄積される。
【０００３】
アミロースは、主に顆粒結合性澱粉合成酵素遺伝子にコードされる顆粒結合性澱粉合成酵素（Granule-Bound Starch Synthase; GBSS）によって合成され、コムギにおいては顆粒結合性澱粉合成酵素I（GBSSI）によって合成されている。異質6倍体である主要な普通系コムギの染色体には、同祖染色体であるA、B、Dの３つのゲノムが存在する。普通系コムギであれば、GBSSI遺伝子は３種類存在し（Wx-A1遺伝子、Wx-B1遺伝子、Wx-D1遺伝子; それぞれGBSSI-A1遺伝子、GBSSI-B1遺伝子、GBSSI-D1遺伝子といわれることもある）、それぞれ7A、4A、7D染色体上に存在する。これらの遺伝子から顆粒結合性澱粉合成酵素（GBSSI-A1、GBSSI-B1、GBSSI-D1）が発現している。ゲノムDNA上に生じた変異によりGBSSIの酵素活性が欠損した系統も存在する。例えば、公知のコムギ品種では、「ホクシン」がGBSSI-B1欠損型（アミロース含量がやや低い）、「チクゴイズミ」がGBSSI-A1、B1欠損型（アミロース含量が低い）、「はつもち」及び「もち乙女」がGBSSI全欠損型（モチ性、アミロース含量が極端に低い）である。GBSSIの欠損パターンを簡便に識別する方法としては、胚乳の各GBSSIタンパク質の有無を直接解析する方法や、ゲノムDNA配列を元にして調べる方法などが確立されている（例えば、特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。
【０００４】
一方、アミロペクチンは、複数の酵素の働きによって合成されている。この複数の酵素とは、（可溶性）澱粉合成酵素I型（Starch Synthase I; SSI）、（可溶性）澱粉合成酵素II型（Starch Synthase II; SSII）、（可溶性）澱粉合成酵素III型（Starch Synthase III; SSIII）、枝作り酵素（Branching enzyme; BE）、枝切り酵素（Debranching enzyme; DBE）などである。
【０００５】
コムギにおいて、アミロペクチンの分岐鎖合成に関わる酵素の1つとして知られる澱粉合成酵素IIa型（SSIIa）（SSIIa-A1、SSIIa-B1、SSIIa-D1）は、7A、7B、7D染色体上に存在する３種類のSSIIa遺伝子（SSIIa-A1遺伝子、SSIIa-B1遺伝子、SSIIa-D1遺伝子）によりコードされている。これらSSIIaに関しても、ゲノムDNA上に生じた変異により酵素活性が欠損した系統が存在し、公知のコムギ品種で例示すると、「Chosen57」がSSIIa-A1欠損型、「関東79号」がSSIIa-B1欠損型、「Turkey116」がSSIIa-D1欠損型である。SSIIaに関しても、欠損パターンを識別する方法が公知である（特許文献２、非特許文献４）。
【０００６】
デンプンは高度に結晶化した顆粒の形で植物に貯蔵されている。これに水分を加えて加熱することでデンプン粒は次第に膨潤し、ある一定の温度で結晶構造が崩れ糊状になる（糊化）。その後、冷却することで糊化デンプンは次第に粘性が増大しゲル化する。このようなデンプンの特性や、アミロースとアミロペクチンの含量比は、由来する植物種によって大きく異なる場合があることが知られている。
【０００７】
デンプンは植物における貯蔵物質で重要なエネルギー源であるとともに、ヒトにとっても重要なエネルギー源である。デンプンを摂取する際には、これを含む穀粒を加工し食品に利用するだけでなく、上記の膨潤や糊化の特性を利用し、増粘剤、保水剤、ゲル形成剤などの食品添加剤として使用される。一方、食品関連分野以外でも、糊やフィルムの原料として古くから利用されている。また、化学的、あるいは物理的に修飾を施した加工デンプンなどにも多くの需要がある。デンプンは貯蔵される器官（種子や塊茎）の重量の大部分を占めており、デンプン特性が変化すれば、これら器官を原料とした上記食品の食感、あるいはそのようなデンプンを使用した食品添加剤を加えた食品の加工性などに与える影響は大きいことから、多様な特性を持ったデンプンの開発に対する需要は高い。
【０００８】
前述したようにデンプンの特性は植物種によって大きく異なる場合がある。しかしながら、同一植物種内でのデンプンの多様性については、アミロース含量の違いによる物性の変化に負うところが大きい。例えば、GBSSIが全て野生型であるコムギのアミロース含量に比べて、ホクシン、チクゴイズミのアミロース含量は有意に低下し、うどん等麺用粉としての利用に優れているとされ、商業的にも広く栽培されている。また、イネやトウモロコシではアミロース含量が極端に低いモチ性デンプンを蓄積する系統が知られていたが、コムギでは中村ら（特許文献１）によって初めてモチコムギが育種され、通常のコムギを用いた食品に比べて独特の加工性や食感を有していることが知られている。
【０００９】
小麦デンプンにおいて、アミロース含量はデンプンの特性を現す指標の一つとしてよく議論されるが、アミロペクチンの構造については議論されることが比較的少ない。したがって、一般的に食品に使用されるコムギのデンプン特性の違いは主にアミロース含量の違いに起因するものに限られ、コムギデンプン特性における多様性は非常に限られたものとなっている。このため新たな特性をもったデンプンを蓄積するコムギを開発することができれば、従来とは異なった特徴を具える改良製品、あるいは新たな用途の開発が可能となることから、このようなコムギの開発は切に望まれている。
【００１０】
新規なデンプン特性を有するコムギの作出例として、山守らは、３つのSSIIaを全欠損したコムギ系統を開発したことを報告している（非特許文献１参照）。このコムギではアミロースが高含量で蓄積されている（以下ハイアミロースコムギと呼ぶ）ことも報告されているが、種子重量当たりのデンプンの割合が少なく、そのため得られる小麦粉の収量が低く、製粉における生産性の点で課題が残る。また、ハイアミロースコムギ由来の小麦粉は、食パンなどの加工食品の製造に使用すると、極端に製品ボリュームが小さくなるなどの課題があり、まだ実用化には至っていない。
【００１１】
一方、３つのGBSSIを全欠損したモチコムギ由来の小麦粉を食パンなどの加工食品の製造に用いた場合には、焼成後に形を保持できずにしぼむ、口溶けが悪い、歯切れが悪い食感になるなどの点で課題が残る。そのため広く普及するまでには至っていない。
【００１２】
以上のような新規なデンプン特性を有するコムギが作出されてはいるものの、GBSSIやSSIIaを全欠損させたコムギではいずれも、食品加工に用いるためには未だ多くの課題が残っているため、より実用性があり、かつ新規なデンプン特性を持つコムギの作出が望まれている。
【００１３】
本願発明者らは、GBSSIとSSIIaの酵素活性制御により新たな特性のデンプンを蓄積するコムギを提供することを目的として、GBSSI-A1、GBSSI-B1、GBSSI-D1及びSSIIa-A1、SSIIa-B1、SSIIa-D1の６種の酵素の欠損の組み合わせ６３通り（野生型を除く）のうちの特定の組み合わせで酵素活性を欠損したコムギ系統を作出し、デンプンの特性を解析した（特許文献３）。特許文献３には、GBSSI-A(-)B(+)D(-)/SSIIa-A(+)B(-)D(-)及びGBSSI-A(-)B(-)D(+)/SSIIa-A(+)B(-)D(-)という、２つのGBSSIと２つのSSIIaを欠損した２種類のコムギ系統を作出したことも記載されている。しかしながら、これら系統のデンプンの特性については、十分には検討されていない。また、３つのGBSSIのうちの２つを欠損し、かつ、３つのSSIIaのうちの２つを欠損した、特許文献３に記載された系統以外のコムギ系統については、その作出さえ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平６−１２５６６９号公報
【特許文献２】特開２００５−３３３８３２号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００６／１１８３００号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Yamamori et. al., Theor. Appl. Genet (2000)101:21-29
【非特許文献２】Nakamura et. al., Genome (2002)45:1150-1156
【非特許文献３】Saito et. al., Mol. Breed. (2009)23:209-217
【非特許文献４】Shimbata et. al., Theor. Appl. Genet (2005)111:1072-1079
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、特に食品原材料として優れた特性を有する小麦粉及びデンプンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本願発明者らは、３つのGBSSIのうちの２つを欠損し、かつ、３つのSSIIaのうちの２つを欠損したコムギ７系統を新たに作出し、小麦粉及びデンプンを調製してその特性を鋭意検討したところ、他の系統と比較して当該系統は食品原材料として非常に優れた各種特性を有することを見出し、本願発明を完成した。
【００１８】
すなわち、本発明は、GBSSI-A1、GBSSI-B1及びGBSSI-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損し、かつ、SSIIa-A1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損したコムギ（ただし、GBSSI-A1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギ、並びにGBSSI-A1、GBSSI-B1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギを除く）の収穫物を製粉して得られた小麦粉を提供する。また、本発明は、上記本発明の小麦粉を含む穀粉組成物を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の小麦粉又は本発明の穀粉組成物を使用して製造された食品及び製品を提供する。さらに、本発明は、GBSSI-A1、GBSSI-B1及びGBSSI-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損し、かつ、SSIIa-A1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損したコムギ（ただし、GBSSI-A1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギ、並びにGBSSI-A1、GBSSI-B1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギを除く）の収穫物、又は該収穫物を製粉して得られた小麦粉から分離されたデンプンを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のデンプンを使用して製造された食品及び製品を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、特に食品の製造に優れた効果を発揮する小麦粉、穀粉組成物及びデンプンが提供された。前述したように、GBSSIを全欠損したモチコムギ由来の小麦粉や、SSIIaを全欠損したハイアミロースコムギ由来の小麦粉では、コムギ加工食品に使用した際の、製品体積の小ささ、食感の悪さ、また、小麦粉生産における収量の低さなどの欠点がある。本発明の小麦粉は、そのような欠点はなく、かつ下記に挙げる利点を有している。
【００２０】
本発明の小麦粉は、他の系統由来の小麦粉に比べ、６０℃程度の条件下で捏ねあげた時の生地中マルトース含量が非常に多い。生地中にマルトースが多く生成すると、パン等のベーカリー食品のようなイースト菌などを利用する食品においては、菌の醗酵活動を高め、生地性の改良や焼成後により風味や食感に優れた食品を製造することができる。湯種法のような生地中のマルトース含量を高める手法は知られているが、一般的な湯種法に採用される熱湯を使用する、もしくは高温で処理する方法では、タンパク質やその他の小麦粉由来の成分が熱で変性する恐れがあり、加工食品の品質や食感に悪影響を及ぼす要因ともなりえるが、本発明の小麦粉を使用すれば、より低い温度でマルトース含量を高めることができ、熱によるタンパク質の変性等を低減できる。さらには６０℃程度の湯ならば熱湯を使用するよりも作業現場での安全性が高く、燃料費などの点からも大規模生産において非常に有利である。また、本発明のデンプンは凍結融解後も良好な物性を有し、食感に優れた冷凍食品などを提供することが可能になる。さらには、通常、小麦粉を用いた冷凍食品には食感改良や品質劣化の防止のため加工デンプンを添加することが多いが、本発明の小麦粉を使用すれば加工デンプンの使用は必要なくなる、もしくは使用を大幅に削減できる、という利点もあり、この点においてもコムギ加工食品の大規模生産において非常に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（かたさ）を評価した結果である。
【図２】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（粘り）を評価した結果である。
【図３】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（スポンジ感）を評価した結果である。
【図４】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（口溶け）を評価した結果である。
【図５】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（滑らかさ）を評価した結果である。
【図６】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（ざらつき）を評価した結果である。
【図７】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（ぼそぼそ感）を評価した結果である。
【図８】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（みずみずしさ）を評価した結果である。
【図９】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（しっとり感）を評価した結果である。
【図１０】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの食感（飲み込みやすさ）を評価した結果である。
【図１１】実施例で用いたコムギ系統由来のデンプンについて、凍結融解後のデンプンゲルの離水率を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】各系統由来の小麦粉サンプルを６０℃に加温して混捏し作製した生地中のマルトース含量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明で用いるコムギ系統は、アミロースを合成する酵素GBSSI-A1, B1, D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損し、かつ、アミロペクチンの枝鎖を伸長させる酵素SSIIa-A1, B1, D1のうちのいずれか２つの酵素活性を欠損した系統（ただし、GBSSI-A1、GBSSI-D1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギ系統、並びにGBSSI-A1、GBSSI-B1、SSIIa-B1及びSSIIa-D1の酵素活性を欠損したコムギ系統を除く）である。本明細書において、この系統を便宜的に「コムギ酵素2/2欠損体」と呼ぶことがある。
【００２３】
下記実施例では、コムギ酵素2/2欠損体を用いて各種の試験を行ない、コムギ酵素2/2欠損体由来の小麦粉にはモチコムギ由来の小麦粉やハイアミロースコムギ由来の小麦粉のような欠点がなく、かつ、上述した各種の利点を有することが具体的に示されている。コムギ酵素2/2欠損体由来の小麦粉が有するこうした有利な特徴は、３つのGBSSIのうちのいずれか２つの酵素活性と、３つのSSIIaのうちのいずれか２つの酵素活性とを欠損していることによりもたらされる特徴である。
【００２４】
GBSSIについては、３つのGBSSIの欠損パターンに応じてアミロース含量に有意な差が見られることが知られている。３つのGBSSIのうちの１つの酵素活性を欠損したコムギ系統は、３つ全てを発現しているコムギに比べてアミロース含量がやや低下し（やや低アミロースコムギと呼ばれる）、２つの酵素活性を欠損した場合にはさらに低下し（低アミロースコムギと呼ばれる）、３つ全てを欠損した場合にはアミロースを含まないモチコムギとなる。SSIIaについては、発現している酵素の活性によりアミロペクチンの鎖長構造が異なることが知られており、野生型、３つのSSIIaのうち１つを欠損している系統、３つのSSIIaのうち２つを欠損している系統、３つのSSIIaすべてを欠損している系統の間で差異が見られる。つまり、GBSSIもSSIIaも、２つの酵素活性を欠損した系統とそれ以外の系統との間で特徴に差異があり、コムギ酵素2/2欠損体は共通する有利な特徴を有している。
【００２５】
コムギ酵素2/2欠損体の中でも、GBSSI-B1及びGBSSI-D1の酵素活性を欠損したコムギ並びにGBSSI-A1及びGBSSI-B1の酵素活性を欠損したコムギにおいて、コムギ酵素2/2欠損体が持つ有利な特徴が特に強く認められる傾向がある。また、デンプンゲルの官能評価では、GBSSI-B1及びGBSSI-D1の酵素活性を欠損したコムギ由来のデンプンゲルの評価が特に優れる傾向があった。本発明では、これらのコムギ系統を特に好ましく用いることができるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
コムギのGBSSI-A1, B1, D1及びSSIIa-A1, B1, D1の配列（ゲノムDNA、タンパク質）は公知であり、それぞれGenBankに下記のaccession番号で登録されている。これらの各配列を下記表１の通りに配列表に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
もっとも、配列表に示した配列は野生型配列の一例であり、天然に存在するコムギ（一般に流通しているコムギ品種も含む）には、各酵素タンパク質の活性は正常であるが塩基配列ないしはアミノ酸配列が一部相違するものも存在し得る。本発明において「GBSSI-A1遺伝子」「GBSSI-A1タンパク質」といった場合には、配列表に示した塩基配列又はアミノ酸配列と完全に同一の配列を有するものだけではなく、酵素活性を損なわない天然の変異を含む配列を有するものも包含される。他の酵素についても同様である。そのような天然の変異配列は、通常、配列表に示した各塩基配列又はアミノ酸配列と９０％以上、例えば９５％以上、あるいは９８％以上の同一性を有する。
【００２９】
「酵素活性を欠損した」とは、植物体内で正常な酵素活性を有する当該タンパク質が機能していないこと、例えば、正常な酵素活性を有するタンパク質を発現していないことをいう。より具体的には、遺伝子配列の変異（一つ又は複数の塩基の置換、欠失、挿入、逆位、転座などの変異をいい、遺伝子領域全体の欠失も含む）、mRNA転写の欠損、タンパク質翻訳の欠損、コムギ植物体内での酵素活性の阻害などの態様が挙げられる。本発明においては、野生型の各酵素の活性の１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満にまで酵素活性が低下ないしは欠失していれば、いずれの態様であってもよい。最も好ましくは、コムギ酵素2/2欠損体は、３種のGBSSIのうちのいずれか２つ、及び３種のSSIIaのうちのいずれか２つの酵素タンパク質を細胞内に蓄積せず、各酵素の活性が完全に失われたコムギであり、より具体的には、２つのGBSSI及び２つのSSIIaを発現しないコムギである。
【００３０】
SSIIaは、一般的にはアミロペクチン分岐鎖（α-1,6結合により枝分かれしたグルコース重合体）の合成、特に重合度が中程度の鎖（11から25程度の重合度をもつ鎖）の合成に関与していると考えられている。ゆえに、SSIIaの酵素活性は、基質となるADP-グルコースとアミロペクチンを認識し、ADP-グルコースからグルコースをアミロペクチン分岐鎖の末端に結合させる活性と考えることができる。一方、GBSSIは、基本的にはアミロース合成に関与していると考えられている。よってGBSSIの酵素活性は、基質となるADP-グルコースとアミロースを認識し、ADP-グルコースからグルコースを伸長途中のアミロースの末端に付加する働きであると考えることができる。
【００３１】
従って、GBSSI-A1, B1, D1及びSSIIa-A1, B1, D1の酵素活性については、常法により上記の活性を調べることでその強弱を確認することができる。一例を挙げると、当該酵素を種子から精製し、基質となるADP-[U-14C]グルコースやアミロースあるいはアミロペクチン、さらには反応条件を整えるための成分を加えることで反応を行う。一定時間の反応を終えたところで100℃に加熱することにより酵素を失活させ、陰イオン交換カラムを用いて未反応のADP-[U-14C]グルコースを除いた後、アミロースあるいはアミロペクチンに取り込まれた[U-14C]グルコースの量を、液体シンチレーションカウンターを用いて計測する。別の方法としては、種子より粗精製したタンパク質画分、あるいはデンプン画分（タンパク質含量にして5-10μg）について、未変成{通常のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）からSDSとβ-mercaptoethanolを除いた条件}でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。分離の終わったゲルを50 mM グリシン、100 mM 硫酸アンモニウム、5nM β-mercaptoethanol、5 mM MgCl2、0.5mg/ml 牛血清アルブミン、0.01 mg/ml アミロースあるいはアミロペクチン、4mM ADP-グルコースからなる溶液に浸し、4時間から12時間放置する。その後、0.2% ヨウ素、0.02% ヨウ化カリウムからなる溶液を加えることで染色を行い、酵素活性を判定する方法を用いても良い。
【００３２】
酵素活性が欠損しているか否かの確認は、例えば、酵素活性の測定、酵素タンパク質の蓄積量の測定、mRNA発現量の測定、ゲノムDNAの塩基配列の確認等により実施できる。
【００３３】
酵素活性の強弱の確認方法は上述の、基質となるADP-[U-14C]グルコースやアミロースあるいはアミロペクチン、さらには反応条件を整えるための成分を加えることで反応を行う方法の通りである。
【００３４】
酵素タンパク質がコムギ植物体細胞内で蓄積していないこと（より具体的には、酵素タンパク質が発現していないこと）の確認は、コムギ種子又は精製デンプンのSDS-PAGEや二次元電気泳動により行なうことができる。SDS-PAGEで確認されるバンドのサイズは、SSIIa-A1が115 kDa、SSIIa-B1が100 kDa、SSIIa-D1が108 kDaであり、非特許文献１に発現の有無を確認する方法が記載されている。また、GBSSIについては、GBSSI-A1、B1、D1ともにSDS-PAGEで確認されるバンドのサイズはおよそ61kDaであり、とりわけGBSSI-B1 とGBSSI-D1のバンドの識別が困難な場合があるため、SDS-PAGEで発現の有無を判定するよりも、特許文献１に記載されているデンプン結合タンパク質の二次元電気泳動により確認する方法が適している。詳細な方法は特許文献１に記載される通りであり、野生型で現れる領域にスポットがあるか否かを確認すればよい。
【００３５】
また、酵素活性の欠損は、酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異があるかどうかを調べることによっても確認し得る。特に、酵素の欠損変異が放射線照射や変異原性化学物質への曝露等の変異誘発処理により生じたものである場合、１残基のみのアミノ酸置換を伴う変異が生じる可能性がある。こういった場合には、酵素タンパクの有無を調べるSDS-PAGEのような方法では識別することが困難な場合が多いため、DNA上の変異を確認する手法が適する。SSIIaの場合、酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異とは、酵素の基質となるADP-グルコースやアミロペクチンの認識・結合部位における変異、あるいはグルコースをアミロペクチンの非還元末端へ転移する活性中心部位における変異、あるいはN末端に存在するシグナル配列部位における変異等が挙げられる。GBSSIの場合、酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異とは、酵素の基質となるADP-グルコースやアミロースの認識・結合部位における変異、あるいはグルコースをアミロースの非還元末端へ転移する活性中心部位における変異等が挙げられる。
【００３６】
GBSSI酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異があるかどうかを調べるためのプライマーとしては、例えば、下記実施例で使用しているプライマー（配列番号１３〜１９）を挙げることができる。このことは非特許文献２および非特許文献３にも記載されている。酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異があるか否かの判定基準は下記実施例中の表２に記載される通りである。これらのプライマーを用いてPCR等の核酸増幅法を行なえば、公知のコムギ品種「もち乙女」（３つのGBSSIを欠損）が有する酵素欠損変異を検出することができる。従って、本発明の実施において使用するコムギ酵素2/2欠損体のGBSSI欠損変異が「もち乙女」に由来する場合、ないしは「もち乙女」と同じGBSSI欠損を有するその他の品種に由来する場合には、配列番号１３〜１９のプライマーを用いて欠損を確認することができる。
【００３７】
また、SSIIa酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上の変異があるかどうかを調べるためのプライマーとしては、例えば、下記実施例で使用しているプライマー（配列番号２０〜２５）を挙げることができる。このことは非特許文献４にも記載されている。酵素活性を失わせるようなゲノムDNA上に変異があるか否かの判定基準は下記実施例中の表２に記載される通りである。これらのプライマーを用いてPCR等の核酸増幅法を行なえば、公知のコムギ品種「Chosen57」（SSIIa-A1欠損型）、「関東79号」（SSIIa-B1欠損型）及び「Turkey116」（SSIIa-D1欠損型）が有する酵素欠損変異を検出することができる。従って、本発明の実施において使用するコムギ酵素2/2欠損体のSSIIa欠損変異が上記品種に由来する場合、ないしは上記品種と同じSSIIa欠損を有するその他の品種に由来する場合には、配列番号２０〜２５のプライマーを用いて欠損を確認することができる。
【００３８】
本発明で用いられるコムギ酵素2/2欠損体は、下記実施例に記載されるように、６つの酵素を任意の組み合わせで欠損している公知のコムギ品種の交配により作出することができる。放射線処理（γ線、β線、X線、中性子線等）、化学物質処理（エチルメタンスルホン酸等）その他の変異誘発処理を行ない、所望の酵素欠損体を選抜して交配に用いてもよい。また、単子葉植物の形質転換体の作出方法が各種公知であり、目的遺伝子の機能を欠損させる遺伝子工学的手法も公知である。例えば、RNAiやアンチセンス法により目的遺伝子の発現を阻害する方法があり、また、植物において目的の遺伝子のみを破壊する遺伝子破壊法も公知となっている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2010) June 29, 107(26): 12034-12039）。従って、本発明で用いるコムギ系統は、遺伝子工学的手法により作出することもできる。
【００３９】
本発明で用いるコムギ酵素2/2欠損体では、GBSSIとSSIIaの酵素活性の欠損以外の遺伝的形質は特に限定されず、他の形質を導入したものも包含される。例えば、耐病性、グルテン適性、耐倒伏性、秋撒き性、春撒き性、多収性、低温耐性、穂発芽耐性、製粉適性などの有用形質と、２つのGBSSI及び２つのSSIIaの酵素活性の欠損とを組み合わせて有するコムギであってよい。
【００４０】
本発明の小麦粉は、コムギ酵素2/2欠損体の収穫物（穎果、ないしは種子）を製粉して得ることができる。製粉方法は特に限定されず、従来のコムギ品種の収穫物から小麦粉を製造するときに用いられる一般的な製粉方法を用いることができる。小麦粉の形態は特に限定されず、例えば、通常の製粉工程を経て「ふすま」などの成分を除いた小麦粉でもよいし、分別しない全粒粉であってもよい。
【００４１】
本発明の小麦粉は、他の小麦粉又は小麦粉以外の穀粉と混合した穀粉組成物として提供することもできる。他の小麦粉としては、例えば強力粉、中力粉、薄力粉等の小麦粉、あるいはこれらには分類されていないコムギ由来の小麦粉を挙げることができ、小麦粉以外の穀粉としては、ライ麦粉、米粉等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明のデンプンは、コムギ酵素2/2欠損体の収穫物又は本発明の小麦粉から常法により抽出分離して得ることができる。コムギ酵素2/2欠損体由来のデンプンは、GBSSI及びSSIIaの欠損の組合せパターンが異なる他の系統由来のものと比較して、凍結融解後の物性が非常に良好であり、食感も非常に優れている。
【００４３】
本発明の小麦粉、穀粉組成物及びデンプンは、上記した特徴（凍結融解後の物性が非常に良好で、食感も非常に優れる）を有するため、特に食品に好ましく用いることができる。前記食品としては、通常小麦粉（全粒粉を含む）あるいはデンプンを利用する食品等が挙げられる。例えば、ベーカリー食品、麺類、菓子類、揚げ物、焼き物、練り物、及びこれらの冷凍食品の他、ハンバーグなどの「つなぎ」としての利用が挙げられる。本発明の小麦粉又はデンプンをそのまま利用しても良いし、GBSSI及びSSIIaの欠損パターンが異なる他のコムギ由来の小麦粉又はデンプンと混合して使用しても良い。また、アルコール飲料などの発酵原料、アミノ酸や多糖などの醗酵生産のための原料としても用いることができる。
【００４４】
小麦粉又はデンプンを利用した冷凍食品は種々のものが公知であり、加熱調理済みの食品を冷凍した冷凍食品や、加熱調理前の状態で冷凍される冷凍食品（主として料理の材料として用いられる）が挙げられるが、本発明ではいずれであってもよい。例えば、特に限定されないが、うどんや焼きそば等の麺類（生麺又は調理済み麺類）、パン類・ケーキ類・ピザ類を含むベーカリー食品、天ぷら・フライ等の揚げ物類（衣に小麦粉又はデンプンを含む）、餃子・春巻き・焼売等の中華総菜類（皮に小麦粉又はデンプンを含む）、饅頭類（皮に小麦粉又はデンプンを含む）、パイ生地、パン生地、クッキー生地等の冷凍食品を挙げることができる。
【００４５】
ベーカリー食品としては、例えば、食パン、フランスパン、ロールパン、菓子パンなどのパン類；イーストドーナツなどの揚げパン類；蒸パン類；ピザパイ等のピザ類；スポンジケーキなどのケーキ類；クッキー、ビスケットなどの焼き菓子類などが挙げられる。本発明のベーカリー食品は、本発明の小麦粉又は穀粉組成物に、重曹などの化学膨張剤、イースト、イーストフード、食塩、糖類、油脂類、卵、乳製品、水などの一般にベーカリー食品の製造に使用される各種副原料を配合したものを混練して生地を作り、これを醗酵等により膨化させ、あるいはそのまま焼成または油揚げすることにより製造される。必要に応じて、ビタミン、ミネラルなどの添加剤を加えることができる。本発明のベーカリー食品の製造に際しては、通常採用されている製造方法、製造装置、凍結方法、凍結装置などのいずれを使用しても良い。特に、本発明の小麦粉は、６０℃程度（５５℃〜６０℃）に加温して捏ね上げたときのマルトース含量が他系統由来の小麦粉と比較して非常に多く、この性質を利用して食味に優れたベーカリー食品を提供することができる。
【００４６】
また、本発明の小麦粉、穀粉組成物及びデンプンは、食品以外の製品、例えば工業製品に用いることができる。工業製品としては、粘度安定剤、保水剤、コロイド安定剤、糊、接着剤などが挙げられる。本発明の小麦粉、穀粉組成物及びデンプンを、酸やアルカリ、酵素等で処理してデキストリンを生成し、これを利用して接着剤、繊維、フィルムなどへ利用することも可能である。また、このデキストリンのうち水溶性画分は、難消化性デキストリンとして整腸作用などに優れた機能性食品として利用できる。あるいは種々の無機、有機酸と反応させてデンプンエステルを形成させて利用しても良い。特にリン酸と反応させたリン酸デンプンは増粘剤として有用である。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４８】
[コムギ系統の作出]
２つのGBSSIを欠損し、かつ、２つのSSIIaを欠損したコムギ系統は、下記の２系統を親系統として作出された。
親系統１：
「関東79号」（SSIIa-B1欠損型）と外国産品種である「Turkey116」（SSIIa-D1欠損型）、「Chosen57」（SSIIa-A1欠損型）の３品種を順次交配して選抜された、SSIIaを完全に欠損した系統。
親系統２：
もち乙女（GBSSI全欠損型、SSIIaタンパク質は野生型）と「Kestrel」を交配し、そのF5世代の種子から選抜された、GBSSIを完全に欠損した系統。
【００４９】
コムギの栽培、交配は定法に従った。上記の親系統１と親系統２を交配し、F1世代を得た。これを自家受精させてF2、あるいはそれ以降の世代を得た。これら後代の中から、PCRによりGBSSIおよびSSIIa遺伝子の遺伝子型の判別を行ない、所望のコムギ系統を選抜した。PCRによる遺伝子型の確認の具体的な方法は以下の通りである。
【００５０】
コムギの種子を発芽させ、幼葉からのゲノムDNAの精製をキアゲン社製DNeasy plant miniキットを用いて行った。発芽した種子の幼葉を100 mgとり、液体窒素中でパウダー状になるまですりつぶした。すりつぶしたサンプルを1.5 ml容チューブに移し、その後キットに添付のバッファーAP1とRNase solutionを加えて65度で10分間加熱した。次にバッファーAP2を加えて氷上で5分間放置した後、析出した沈殿物を遠心操作により取り除いた。上澄み液にバッファーAP3を加えて混合した後、全量をmini spin columnに供し、遠心操作を行いDNAをメンブランに吸着させた。バッファーAWによる洗浄を2回行った後、バッファーAEを加えて5分間放置し、遠心によりDNA溶液を回収した。
【００５１】
PCRには下記のプライマーを用いた。
GBSSI-A1遺伝子確認用プライマー：
AFC：TCGTGTTCGTCGGCGCCGAGATGG（配列番号１３）
AR2：CCGCGCTTGTAGCAGTGGAAGTACC（配列番号１４）
GBSSI-B1遺伝子確認用プライマー：
BDFL：CTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACT（配列番号１５）
BRC1：GGTTGCGGTTGGGGTCGATGAC（配列番号１６）
BFC：CGTAGTAAGGTGCAAAAAAGTGCCACG（配列番号１７）
BRC2：ACAGCCTTATTGTACCAAGACCCATGTGTG（配列番号１８）
GBSSI-D1遺伝子確認用プライマー：
BDFL：CTGGCCTGCTACCTCAAGAGCAACT（配列番号１５）
DRSL：CTGTTTCACCATGATCGCTCCCCTT（配列番号１９）
SSIIa-A1遺伝子確認用プライマー：
SSIIAF1：GCGTTTACCCCACAGAGC（配列番号２０）
SSIIAR1：ACGCGCCATACAGCAAGTCATA（配列番号２１）
SSIIa-B1遺伝子確認用プライマー：
SSIIBF1：ATTTCTTCGGTACACCATTGGCTA（配列番号２２）
SSIIBR1：TGCCGCAGCATGCC（配列番号２３）
SSIIa-D1遺伝子確認用プライマー：
SSIIDF1：GGGAGCTGAAATTTTATTGCTTATTG（配列番号２４）
SSIIDR1：TCGCGGTGAAGAGAACATGG（配列番号２５）
【００５２】
GBSSI遺伝子確認用のPCR反応は、10×Taq bufferを5μL, dNTPを終濃度0.2mM, Mg(Cl)2を終濃度1.5mM, プライマー各終濃度0.2μM, ゲノムDNAを終濃度2ng/μL、Taq polymerase（タカラバイオ社）を終濃度0.05 U/μLの組成で全量50μLで行なった。GeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、95℃ 5分−[95℃ 30秒−65℃ 30秒−72℃ 2分]×32サイクル−72℃ 7分の反応条件とした。
【００５３】
SSIIa遺伝子確認用のPCR反応は、10×LA Taq bufferを2μL, dNTPを終濃度0.2mM, Mg(Cl)2を終濃度2.25mM, プライマー各終濃度0.25μM, ゲノムDNAを終濃度1ng/μL、LA Taq（タカラバイオ社）を終濃度0.025 U/μLの組成で全量20μLで行なった。GeneAmp PCR System 9700（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、98℃ 5分−[98℃ 30秒−65℃ 30秒−74℃ 1分]×40サイクル−74℃ 5分の反応条件とした。
【００５４】
ＰＣＲ増幅反応液は３％アガロースゲルによる電気泳動に供した後、エチジウムブロマイド染色を行い、増幅バンドのサイズに基づいて下記の通り遺伝子型を判定した。
【００５５】
【表２】
2013188206.tif 000004
【００５６】
以上の確認を行ない、２つのGBSSIの酵素活性を欠損し、かつ、２つのSSIIaの酵素活性を欠損する遺伝子型を有するコムギ7系統を選抜した。
GBSSI遺伝子A(+)B(-)D(-)／SSIIa遺伝子A(+)B(-)D(-)
GBSSI遺伝子A(+)B(-)D(-)／SSIIa遺伝子A(-)B(+)D(-)
GBSSI遺伝子A(+)B(-)D(-)／SSIIa遺伝子A(-)B(-)D(+)
GBSSI遺伝子A(-)B(+)D(-)／SSIIa遺伝子A(-)B(+)D(-)
GBSSI遺伝子A(-)B(+)D(-)／SSIIa遺伝子A(-)B(-)D(+)
GBSSI遺伝子A(-)B(-)D(+)／SSIIa遺伝子A(-)B(+)D(-)
GBSSI遺伝子A(-)B(-)D(+)／SSIIa遺伝子A(-)B(-)D(+)
それぞれ、（+）:酵素活性を有する遺伝子、（-）:酵素活性を欠損する遺伝子、であることを示す
【００５７】
また、下記表３に示す(i)、(ii)、(vi)〜(xii)の遺伝子型を有するコムギ系統も選抜した。これらの系統及び上記した７種のコムギ酵素2/2欠損体系統に加えて国内で流通しているコムギ品種２種（(iii)及び(iv)）を用いて、後述する通り小麦粉及び全粒粉を調製し、各種の実験を行なった。
【００５８】
[試料（小麦）]
下記表３に示す遺伝子型を有する１８種のコムギ系統を用いた。
(i)：上記で作出されたコムギ系統（野生型のコムギ系統と同じ遺伝子型）
(ii)：上記で作出されたコムギ系統（上記親系統１と同じ遺伝子型）
(iii)：ホクシン（国内で流通している小麦品種、やや低アミロース）
(iv)：チクゴイズミ（国内で流通している小麦品種、低アミロース）
(v), (xiii)〜(xviii)：上記で作出されたコムギ系統（コムギ酵素2/2欠損体系統）
(vi)〜(ix), (xi), (xii)：上記で作出されたコムギ系統
(x)：上記で作出されたコムギ系統（上記親系統２と同じ遺伝子型）
【００５９】
【表３】
2013188206.tif 000005
【００６０】
[小麦粉および全粒粉の調製]
収穫したコムギは水分が14%になるように加水し一晩放置した後、ビューラー社製またはブラベンダー社製のテストミルにて挽砕した。ビューラー社製テストミルで挽砕した場合には、1B、2B、3B、1M、2M、3Mの取り口から得られた粉を混合して小麦粉とした。ブラベンダー社製テストミルで挽砕した場合には、1等粉、2等粉を合わせて小麦粉を得た。また、収穫したコムギは超遠心粉砕機 ZM 200 (Retsch社) を用いて全粒粉に調製した。ロータ回転数は14,000 rpmとし、スクリーンは梯形孔の0.75 mmとした。
【００６１】
[小麦粉からのデンプン精製]
上記小麦粉よりデンプンを次のようにして精製した。小麦粉重量に対し、0.5倍の重量の水を加え、よく捏ねて生地を作成し、冷水中で1時間浸漬した。その後、水中で生地を捏ねてデンプンをもみだした。このデンプン懸濁液を2,070×gで10分間遠心分離し、上清を除去した。デンプンの上層に沈澱したペントザン等の夾雑物を除去した。この操作を繰り返してデンプンを洗浄した。このデンプンを凍結乾燥して精製デンプンを得た。また、精製したデンプンは水分含量を測定し、乾物重量を求めた。
【００６２】
[アミロース含量の測定]
精製したデンプンを用いてアミロース含量を測定した。AMYLOSE / AMYLOPECTIN ASSAY KIT (Megazyme社) を使用し、キットの手順書に従って測定を行った。結果を下記表４に示す。
【００６３】
[RVA測定]
調製した全粒粉を用いてラピッドビスコアナライザー (RVA) を用いた粘度特性の測定を行った。装置にはNEWPORT SCIENTIFIC 社製 model RVA-4を用い、測定法はアメリカ穀物学会の定める公定法 (AACC法76-21) の小麦粉用の方法に従い、STD3のプログラムで測定した。ただし、水の代わりに1 mM 硝酸銀水溶液を使用した。結果を下記表４に示す。
【００６４】
【表４】
2013188206.tif 000006
【００６５】
[凍結融解後のデンプンゲルの物性評価]
精製したデンプンを用いてデンプンゲルを調製し、凍結融解後の物性評価を行った。乾燥重量ベースで10％(w/w)となるように水を加えてデンプン懸濁液を調製し、ナイロンパックに密封した。ナイロンパックを65℃のウォーターバス中で15分間置いた後、沸騰水中で20分間加熱することで糊化させた。糊化後、25℃で1時間デンプンゲルを冷まし、さらに4℃で十分冷却した後に、−30℃に5時間置くことで凍結させた。その後4℃で3時間、25℃で1時間放置して完全に解凍させた。これを再び−30℃で12時間凍結し、4℃で3時間、25℃で1時間放置することで解凍させた。
【００６６】
上記条件により凍結融解を行なったデンプンゲルの食感を、6名のパネラーにより以下に挙げた項目と評価基準に従って5段階評価し、各項目における平均値を算出した。
【００６７】
【表５】
2013188206.tif 000007
【００６８】
官能評価の結果を図１〜図１０に示す。本願発明の系統のデンプンゲルは他の系統に比べ、口溶けよく滑らかで適度な粘りがあり、かつデンプンが極端に劣化した、スポンジのような悪い食感がほとんど感じられず、ぼそぼそした感じもほとんど感じられなかった。GBSSI遺伝子 A(+)B(-)D(-)の遺伝子型を有する(v)、(xiii)及び(xiv)の系統のデンプンゲルで特に官能評価の結果が優れている傾向があった。このように、本願発明のデンプンゲルは他の系統に比べ、総合的に著しく良好な物性を有していた。
【００６９】
よって、このような凍結融解後の食感における特徴より、本願発明のデンプンまたは小麦粉を、製造、流通、販売、購入後の保存などにおいて冷凍する必要がある冷凍食品などの材料の一部に用いれば、融解後の食感に優れた製品が開発できると期待される。
【００７０】
さらに、本願発明のデンプンまたは小麦粉を、製造、流通、販売などにおいて冷凍する必要がない食品の材料の一部に用いても、食品の購入後の保存において冷凍した場合に、また特に長期間に亘り冷凍保存した場合に、融解後の食感に優れた製品が開発できると期待される。
【００７１】
[凍結融解後のデンプンゲルの離水率測定]
精製したデンプンを用いて凍結融解後のデンプンゲルの離水率を測定した。乾物重量ベースで8％(w/w)となるように水を加えてデンプン懸濁液を調製し、ナイロンパックに密閉した。ナイロンパックを65℃のウォーターバス中で15分間置いた後、沸騰水中で20分間加熱することでデンプンを糊化させた。糊化後、25℃で1時間デンプンゲルを冷まし、−30℃に5時間置くことで凍結させた。その後、25℃に1時間30分置くことで解凍させ、再び−30℃に14時間置くことで冷凍させた後、25℃で1時間30分置くことで解凍させた。
【００７２】
以上の工程を経たデンプンゲルを、ナイロンメッシュに包んだ。このナイロンメッシュを50 ml容プラスチックチューブの上端に固定することで、遠心分離によりゲルと離水した水分が確実に分離するようにセットした。この状態で100×gで5分間遠心分離を行なった。分離した水分重量を測定し、遠心分離に用いたデンプンゲルとの重量比から離水率を算出した。離水率(%)の算出には下記の式を用いた。
離水率(%) = 分離した水分重量(g) ÷ 遠心分離に用いたデンプンゲル重量(g) ×100
【００７３】
結果を図１１に示す。一般的に凍結融解により劣化しやすいデンプンは、より多くの水分が分離してくることから、離水率の測定は劣化程度の指標となる。本願発明の系統のデンプンゲルはその他の系統のデンプンに比べ離水率が極端に低く、凍結融解後のデンプンゲルの状態が極めて良好であるといえる。
【００７４】
よって、このような凍結融解後のデンプンゲルの離水率の特徴からも、本願発明のデンプンまたは小麦粉を、製造、流通、販売、購入後の保存などにおいて冷凍する必要がある冷凍食品などの材料の一部に用いれば、融解後の食感に優れた製品が開発できると期待される。
【００７５】
さらに、本願発明のデンプンまたは小麦粉を、製造、流通、販売などにおいて冷凍する必要がない食品の材料の一部に用いても、食品の購入後の保存において冷凍した場合に、また特に長期間に亘り冷凍保存した場合に、融解後の食感に優れた製品が開発できると期待される。
【００７６】
[加熱処理した生地中のマルトース含量の測定]
前述の小麦粉を用いて、加熱条件下で調製した生地中のマルトース含量の測定を行った。小麦粉１ｇを遠心チューブに測りとり、60℃の温水2mlと混合し60℃で保温しながら5分間薬さじで混捏し、小麦粉生地を作製した。作製した小麦粉生地を氷上で十分に冷却した後に80%エタノールを10ml加えよく撹拌し、密栓して沸騰水中で20分間加熱して酵素を失活させるとともに糖分を抽出した。これを氷上で十分冷却してから40%エタノールを30ml加えよく混合し、4℃で20分間振とうした。その後、容器内の溶液1.5mlを採取し遠心チューブに移し、4℃、17,800×gで5分間遠心分離し、上清200μlを新たな1.5ml遠心チューブに移し、濃縮遠心乾燥機で乾燥した。乾燥後に75μlの超純水を加えよく混合し、続いて75μlのアセトニトリルを加えよく混合した。これを4℃(17,800×g)で5分間遠心分離し、上清をPTFEフィルター（ADVANTEC DISMIC-3 0.5μm）に通し、その溶液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC, Waters社製 alliance e2695 separation module)を用いて測定した。検出には示差屈折率検出器（Waters社製 2414 Refractive Index Detector）を用い、75%(v/v)アセトニトリルを分離溶媒として、ASAHIPAK NH2P-50 3Eカラムを用いて分離した。あらかじめ標準物質を用いて作成しておいた検量線をもとに、マルトースのピーク面積から濃度を算出し、生地を構成する小麦粉乾燥重量あたりのマルトース含量を算出し、サンプル間の比較を行なった。
【００７７】
結果を図１２に示す。本願発明の小麦粉は野生型の遺伝子型系統の小麦粉に比べ、およそ2.7〜4.3倍という非常に多くのマルトースを生地中に生成していた。
【００７８】
よって、本願発明の小麦粉を使用すれば、熱湯より低い温度で生地中のマルトース含量を高めることができ、熱によるタンパク質の変性等を低減した状態で、より風味や食感に優れた食品を製造することができる。特に、パン等のベーカリー食品のようなイースト菌などを利用する食品においては、菌の醗酵活動を高めたり、生地性の改良やより風味や食感に優れた製品を製造することができる。
【００７９】
[β-アミラーゼ活性測定]
生地中にマルトースが生成するのは小麦粉内在のβ-アミラーゼの働きによる。β-アミラーゼは、デンプンの非還元末端からマルトースを切り出していく酵素であり、糊化したデンプンによく働く。特定温度条件で生地中にマルトースを多く生成する本願発明の系統に関して、その特徴が小麦粉内在β-アミラーゼの活性の違いに起因しているのかどうかを確認するため、各系統の小麦粉中のβ-アミラーゼ活性を測定した。測定には市販のβ-アミラーゼ活性測定キット(Megazyme社)を使用し、キットの手順書に従って測定を行った。
【００８０】
結果を下記表６に示す。図１２の結果との対比から、β-アミラーゼ活性はマルトース生成量と相関する結果ではないことが判明した。この結果は、マルトース生成量が高くなる原因が、小麦粉に内在するβ-アミラーゼ活性が元々高かったためではなく、デンプンの性質の違いに起因していることを示唆している。
【００８１】
【表６】
2013188206.tif 000008
【００８２】
[食パンの製造]
ビューラー社製テストミルで調製した本願発明の(v)の小麦粉を使用し、自動ホームベーカリー（エムケー精工株式会社）を用いて「食パンコース」プログラムで食パンを作製した。以下に示す配合で作製した。
水              190 ml
小麦粉          280ｇ
砂糖            20 g
塩              4 g
ショートニング  20 g
脱脂粉乳        6 g
ドライイースト  2.4 g
【００８３】
本願発明の(v)の小麦粉で作製した食パンには、モチコムギやハイアミロースコムギ由来の小麦粉を使用した食パンのような欠点、例えば極端な低ボリュームなどの製品外観の悪さや食感の悪さなどは無かった。
【００８４】
よって、本願発明の小麦粉を原料に用いると、従来のモチコムギおよびハイアミロースコムギ由来の小麦粉とは異なり、通常の製パン方法で良好なボリュームと食感を有する食パンが製造できると期待される。
【図１】
2013188206.tif 000009
【図２】
2013188206.tif 000010
【図３】
2013188206.tif 000011
【図４】
2013188206.tif 000012
【図５】
2013188206.tif 000013
【図６】
2013188206.tif 000014
【図７】
2013188206.tif 000015
【図８】
2013188206.tif 000016
【図９】
2013188206.tif 000017
【図１０】
2013188206.tif 000018
【図１１】
2013188206.tif 000019
【図１２】
2013188206.tif 000020
【配列表】
2013188206000001.app