(57)【要約】【課題】ゼラチナーゼ発現亢進や炎症惹起においても顕著な表現型変化を示すために用いられる動物細胞、トランスジェニック動物、該動物を用いたスクリーニング方法及び該スクリーニング方法により選択される治療及び予防薬並びに治療及び予防方法を提供すること。【解決手段】ＭＭＰ−９遺伝子と、該遺伝子を発現させる任意の発現調節領域とが機能的に結合したＤＮＡが導入された動物細胞において、ＭＭＰ−９遺伝子は開始コドンから１０２位のバリンをグリシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、発現調節領域がＫ１４プロモーター、Ｋ５プロモーター、Ｋ１０プロモーターの何れかである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＭＰ−９遺伝子と、該遺伝子を発現させる任意の発現調節領域とが機能的に結合したＤＮＡが導入されていることを特徴とする動物細胞。
【請求項２】
前記発現調節領域がＫ１４プロモーター、Ｋ５プロモーター、Ｋ１０プロモーターの何れかであることを特徴とする請求項１記載の動物細胞。
【請求項３】
前記ＭＭＰ−９遺伝子は、開始コドンから１０２位のバリンをグリシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードすることを特徴とする請求項１又は２記載の動物細胞。
【請求項４】
前記ＭＭＰ−９遺伝子は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の動物細胞。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位からなる少なくとも１つの改変を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質；
【請求項５】
齧歯類の細胞であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の動物細胞。
【請求項６】
前記齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項５記載の動物細胞。
【請求項７】
細胞が生殖細胞であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載の動物細胞。
【請求項８】
請求項１〜７記載の動物細胞のＤＮＡを導入する工程を含むことを特徴とするトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の作製方法により得られることを特徴とするトランスジェニック動物及びその子孫。
【請求項１０】
請求項９に記載のトランスジェニック動物から単離されたことを特徴とする動物細胞。
【請求項１１】
請求項９に記載のトランスジェニック動物又は請求項１０に記載の動物細胞に被検物質を投与する工程と、
前記被検物質を投与した前記トランスジェニック動物又は前記動物細胞と、無処理の前記トランスジェニック動物又は前記動物細胞とを比較する工程と、
前記ＭＭＰ−９遺伝子が関与する表現型に影響を与える効力を有する前記被検物質や前記トランスジェニック動物又は前記動物細胞の飼育条件を選択する工程と、
を含むこと特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を有効成分として含有し、ヒトを含む哺乳動物に投与可能に製剤化されていることを特徴とするゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の治療薬。
【請求項１３】
請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を投与する工程を含むことを特徴とするゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の治療方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を有効成分として含有し、ヒトを含む哺乳動物に投与可能に製剤化されていることを特徴とするゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の予防薬。
【請求項１５】
請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を投与する工程を含むことを特徴とするゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリクスメタプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）を過剰発現する動物細胞及びその利用に関する。詳しくは、ゼラチナーゼ発現亢進や炎症惹起においても顕著な表現型変化を示すために用いられる動物細胞、該細胞を利用したトランスジェニック動物の作製方法、該動物の作製方法により得られるトランスジェニック動物及びその子孫、ＭＭＰ−９遺伝子が関与する表現型に影響を与える効力を有する被検物質やトランスジェニック動物又は動物細胞の飼育条件を選択するスクリーニング方法、該スクリーニング方法により選択される被検物質又は該物質から誘導される化合物を用いたゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の治療及び予防薬並びに治療及び予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マトリクスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinases ：ＭＭＰｓ）は細胞外マトリクス蛋白を主要な基質とする一群の金属プロテアーゼの総称であり、生体内組織代謝において重要な役割を果たしている。中でもマトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）は、ＭＭＰ−２とともにゼラチナーゼ（gelatinase）として知られ、ゼラチン（gelatin ）成分を分解するのみでなく、別名ＩＶ型コラゲナーゼとも言われるように、各種コラーゲン、エラスチン、ファイブロネクチンなどの細胞外マトリクス成分を分解し、更には主要増殖因子（transforming growth factor−β：ＴＧＦ−β）や腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor −α：ＴＮＦ−α）を活性化する可能性が示されてきた。ＭＭＰ−９とＭＭＰ−２とは別々の異なった遺伝子産物であるが、両者の基質特異性はほぼ同じであることが示されている。
【０００３】
下記非特許文献１、２に示すように、皮膚において、表皮角化細胞はＭＭＰ−９とＭＭＰ−２を、真皮線芽細胞は主にＭＭＰ−２を、また炎症に伴う白血球はＭＭＰ−９を発現することが知られているが、皮膚培養細胞を用いて炎症惹起刺激であるＴＮＦ−αやinterleukin （ＩＬ）−１αのサイトカイン添加、紫外線照射の刺激などにより、どちらの細胞でゼラチナーゼ（特にＭＭＰ−９）が発現誘導されることが本願発明者の研究によって示されている。
【０００４】
また、下記非特許文献２〜４に示すように、ＭＭＰ−９の遺伝子プロモーター領域は、本願発明者が発見したＫＲＥ−Ｍ９領域を含め、発現調節領域が数多く存在し、様々な炎症の場面で種々の炎症性サイトカインによる発現亢進が起こることを報告している。
【０００５】
表皮由来のＭＭＰ−９と表皮の角化との関係については、本願発明者により、好中球由来ＭＭＰ−９の分離、精製を行い、ＭＭＰ−９に対する単クローン抗体を作製し、同抗体により皮膚組織におけるＭＭＰ−９の局在化について検討したところ、表皮角化組織にＭＭＰ−９が局在することを確認した。さらに、培養した表皮角化細胞を用いて、角化細胞への分化刺激を行った際に、ＭＭＰ−２と比較して、ＭＭＰ−９の方がより特異的に発現が亢進されることを確認した。さらに、この発現の亢進に関わる転写因子結合遺伝子領域として、従来から知られるTPA responsive element に加えて角化のマーカーであるinvolucrinと共通な遺伝子プロモーター領域であるＫＲＥ−Ｍ９が、ＭＭＰ−９プロモーター中に存在することを発見したが、該発見は、角化細胞への分化刺激を行った際のＭＭＰ−９の特異的な発現の亢進を支持するものである。
【０００６】
元来、角化は、表皮角化細胞のプログラムされた細胞死であり、アポトーシスの一種として考えられ、かかるアポトーシス、特に表皮細胞のアポトーシスは、炎症の一症状として過角化（すなわち角化異常症）の臨床症状を呈することが多いが、本願発明者の研究により、角化細胞への分化刺激を行った際にＭＭＰ−９が特異的に発現亢進されることが判明したため、かかる表皮の角化におけるアポトーシスに際しての角化異常症についてもＭＭＰ−９が関与している可能性が示唆された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Acta Derm.Venereol.83,105-107(2003)
【非特許文献２】J.Invest.Dermatol.124,331-337(2005)
【非特許文献３】EMBO Rep.2,604-608(2001)
【非特許文献４】Apoptosis 16,1205-1216(2011)
【非特許文献５】Inflammation and Regeneration 28,47-52(2008)
【非特許文献６】Contact Dermatitis 64, 171-172,(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、近年、人為的にＭＭＰ−９を欠如させたマウスの検討、及びＭＭＰ−９の発現をモニターしたトランスジェニックマウスについての検討から、特に周囲の炎症性細胞由来のＭＭＰ−９が、癌の湿潤と転移を引き起こす要因であり、且つ水疱症に際して水疱形成を引き起こす要因であること、また表皮由来のＭＭＰ−９が紫外線照射時のアポトーシスに関わって紫外線皮膚炎となることが明らかになっている。さらに、ＭＭＰ−９が創傷治癒の遅延をもたらすこと、血管新生をもたらすことも明らかになっている。加えて、上記した水疱症、紫外線皮膚炎及び創傷治癒の遅延は、皮膚の炎症性疾患であるため、これらの皮膚の炎症性疾患に関わるＭＭＰ−９は、湿疹皮膚炎に関わっていると推察される。
【０００９】
また、以前から化学兵器として知られるマスタードガス類はびらん剤（vesicant）と呼称され、皮膚への暴露により水疱形成やびらん、潰瘍を来すことが知られているが、これらが発症するときに皮膚由来のＭＭＰ−９が過剰発現し、炎症を来すことが報告されている。なお、非特許文献５、６に示すように、本願発明者は、接触性皮膚炎や難治性潰瘍組織のＭＭＰ−９発現亢進を報告している。
【００１０】
このように、ＭＭＰ−９を含むゼラチナーゼは、皮膚科領域において、癌の浸潤と転移、水疱症における水疱形成、血管新生、創傷治癒の遅延、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、化学兵器暴露後及び角化異常症などの皮膚の炎症性疾患に関わるものである。
【００１１】
また、近年、哺乳類遺伝子の個体レベルでの機能解析方法のひとつとしてトランスジェニック動物を用いた解析が盛んに行われ、皮膚での特異的発現に関与する遺伝子のトランスジェニック動物についても既に幾つかの報告がなされ、表皮や毛嚢上皮に特異的に発現されるＫ１４プロモーターやＫ５プロモーターを用いている。
【００１２】
しかしながら、ＭＭＰ−９を含むゼラチナーゼの発現を亢進させたものは認められず、化学兵器暴露、紫外線照射、接触性皮膚炎を含めた種々の炎症惹起を来しやすい表現型変化を示すトランスジェニック動物の作製が強く望まれている。
【００１３】
そこで、本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、ゼラチナーゼ発現亢進や炎症惹起においても顕著な表現型変化を示すために用いられる動物細胞、該細胞を利用したトランスジェニック動物の作製方法、該動物の作製方法により得られるトランスジェニック動物及びその子孫、ＭＭＰ−９遺伝子が関与する表現型に影響を与える効力を有する被検物質やトランスジェニック動物又は動物細胞の飼育条件を選択するスクリーニング方法、該スクリーニング方法により選択される被検物質又は該物質から誘導される化合物を用いたゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の治療及び予防薬並びに治療及び予防方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記した目的を達成するため、請求項１記載の動物細胞は、ＭＭＰ−９遺伝子と、該遺伝子を発現させる任意の発現調節領域とが機能的に結合したＤＮＡが導入されていることを特徴とする。
【００１５】
請求項２記載の動物細胞は、請求項１記載の動物細胞において、前記発現調節領域がＫ１４プロモーター、Ｋ５プロモーター、Ｋ１０プロモーターの何れかであることを特徴とする。
【００１６】
請求項３記載の動物細胞は、請求項１又は２記載の動物細胞において、前記ＭＭＰ−９遺伝子は、開始コドンから１０２位のバリンをグリシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードすることを特徴とする。
【００１７】
請求項４記載の動物細胞は、請求項１〜３の何れかに記載の動物細胞において、前記ＭＭＰ−９遺伝子は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項３記載の動物細胞。
（Ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位からなる少なくとも１つの改変を含むアミノ酸配列からなるタンパク質であり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質；
【００１８】
請求項５記載の動物細胞は、請求項１〜４の何れかに記載の動物細胞において、齧歯類の細胞であることを特徴とする。
【００１９】
請求項６記載の動物細胞は、請求項５記載の動物細胞において、前記齧歯類がマウスであることを特徴とする。
【００２０】
請求項７記載の動物細胞は、請求項１〜６の何れかに記載の動物細胞において、細胞が生殖細胞であることを特徴とする。
【００２１】
請求項８記載のトランスジェニック動物の作製方法は、請求項１〜７記載の動物細胞のＤＮＡを導入する工程を含むことを特徴とする。
【００２２】
請求項９記載のトランスジェニック動物及びその子孫は、請求項８に記載の作製方法により得られることを特徴とする。
【００２３】
請求項１０記載の動物細胞は、請求項９に記載のトランスジェニック動物から単離されたことを特徴とする。
【００２４】
請求項１１記載のスクリーニング方法は、請求項９に記載のトランスジェニック動物又は請求項１０に記載の動物細胞に被検物質を投与する工程と、
前記被検物質を投与した前記トランスジェニック動物又は前記動物細胞と、無処理の前記トランスジェニック動物又は前記動物細胞とを比較する工程と、
前記ＭＭＰ−９遺伝子が関与する表現型に影響を与える効力を有する前記被検物質や前記トランスジェニック動物又は前記動物細胞の飼育条件を選択する工程と、
を含むこと特徴とする。
【００２５】
請求項１２記載のゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の治療薬は、請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を有効成分として含有し、ヒトを含む哺乳動物に投与可能に製剤化されていることを特徴とする。
【００２６】
請求項１３記載のゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の治療方法は、請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を投与する工程を含むことを特徴とする。
【００２７】
請求項１４記載のゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の予防薬は、請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を有効成分として含有し、ヒトを含む哺乳動物に投与可能に製剤化されていることを特徴とする。
【００２８】
請求項１５記載のゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の予防方法は、請求項１１に記載のスクリーニング方法によって選択される前記被検物質又は該物質から誘導される化合物を投与する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のＭＭＰ−９遺伝子過剰発現によりgelatinase高発現する動物細胞を用いて作製したトランスジェニック動物は表現型変化を示すものであるため、gelatainase 産生細胞のgelatainase 発現亢進に起因する種々の疾患や病態の原因究明や該疾患や病態に対する予防方法、治療方法の検討、さらには該疾患や病態の予防薬、治療薬のスクリーニングを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に係る遺伝子改変ＭＭＰ−９発現ベクターの塩基配列（１〜６６０番）並びにこの塩基配列に対応したＰＣＲプライマーを示す説明図である。
【図２】本発明に係る遺伝子改変ＭＭＰ−９発現ベクターの塩基配列（６６１〜１３８０番）並びにこの塩基配列に対応したＰＣＲプライマーを示す説明図である。
【図３】本発明に係る遺伝子改変ＭＭＰ−９発現ベクターの塩基配列（１３８１〜２１６０番）並びにこの塩基配列に対応したＰＣＲプライマーを示す説明図である。
【図４】遺伝子改変ＭＭＰ−９発現ベクター (pCMV-cDNA(V102G)) の構築を表す図である。
【図５】遺伝子改変MMP-9 発現ベクター (pCMV-cDNA(V102G)) を用いて培養細胞に遺伝子導入した培養液のgelatin-zymograph法の結果を示す図である。
【図６】皮膚ＭＭＰ−９過剰発現トランスジェニックマウス作成用ベクター (phK14-c DNA (V102G))の構築を表す図である。
【図７】（ａ）は受精卵にマイクロインッジェクションを行った後、生まれたマウスについてのトランスジェニック遺伝子発現を解析したＰＣＲ法の結果を示す図であり、（ｂ）は受精卵にマイクロインッジェクションを行った後、生まれたマウスについてのトランスジェニック遺伝子発現を解析したサザンブロット法の結果を示す図である。
【図８】（ａ）は野生型 (上) とF0-006の皮膚MMP-9 過剰発現トランスジェニックマウス (下) との表現型の比較を表す写真であり、（ｂ）は同マウスの耳の拡大写真であり、（ｃ）は同マウスの尻尾の拡大写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための形態について、添付した図面を参照しながら詳細に説明する。また、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではなく、この形態に基づいて当業者などによりなされる実施可能な他の形態、実施例及び運用技術などはすべて本発明の範疇に含まれる。
【００３２】
なお、本明細書において、ＤＮＡの単離・調製、ベクターの調製などの遺伝子操作、及び遺伝子改変動物（以下、「トランスジェニック動物」ともいう）作製の操作などは、特に明記しない限り、Short Protocols in Molecular Biology 3rd edition (K. Struhl et al., John Wiley & Sons (1992)) 、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd edition （T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）、Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual (ColdSpring Harbor Laboratory (1986))などの実験書に記載の周知の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。
【００３３】
［１．ＭＭＰ−９遺伝子を過剰発現する動物細胞について］
本発明に係るＭＭＰ−９遺伝子を過剰発現する動物細胞は、ＭＭＰ−９遺伝子と、該遺伝子を発現させる任意の発現調節領域とが機能的に結合したＤＮＡ（以下、このＤＮＡを「導入ＤＮＡ」と称することがある）が導入されて構成されている。
【００３４】
本発明において、「ＭＭＰ−９遺伝子」とは、ＭＭＰ−９タンパク質をコードする構造遺伝子を意味する。ＭＭＰ−９タンパク質とは、例えば配列表の配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられるが、酵素活性の機能を有する限り、例えば同位のアミノ酸（同番の塩基）が置換されていないＭＭＰ−９遺伝子や、配列番号２のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位からなる少なくとも１つの改変を含むアミノ酸配列が存在するＭＭＰ−９遺伝子でもよい。なお、ここで、配列番号２のアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位からなる少なくとも１つの改変を含むアミノ酸配列からなるＭＭＰ−９遺伝子とは、上記アミノ酸配列の一部が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位されているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持していることを意味する。
【００３５】
また、好ましくは、ＭＭＰ−９が活性化してgelatinase活性を発揮しやすいものがよい。このようなＭＭＰ−９タンパク質をコードする構造遺伝子（ＭＭＰ−９遺伝子）は、導入又は発現の対象とするヒト以外の動物と同種或いは異種由来のものでもよい。
【００３６】
ここで、任意の発現調節領域としては、転写調節領域、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー領域などを適宜選択して用いることができる。転写調節領域としては、転写開始点又はキャップ構造などを含むｍＲＮＡの５’−非翻訳領域や、転写終止点やｐｏｌｙ−Ａシグナルなどを含むｍＲＮＡの３’−非翻訳領域が挙げられる。これらの転写調節領域は、本発明のＭＭＰ−９遺伝子の５’或いは３’−非翻訳領域をそれ自体周知の方法により取得して用いることもできるし、他種遺伝子に適用しても有効であることが解っている転写調節領域を用いることもできる。これらの転写調節領域のうち、本発明のＭＭＰ−９遺伝子の発現に有効であるものの選択は、これを適当な発現ベクターに挿入し、発現効率を解析することにより行うことができる。好ましい転写調節領域としては、例えば、ＭＭＰ−９遺伝子の５’−非翻訳領域と３’−非翻訳領域の一部、ウサギβ-globin polyadenylationsignal、SV40 early gene polyadenylation signal（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527-1531 (1981)）を挙げることができる。
【００３７】
また、本発明において用いられるプロモーターは、ＭＭＰ−９遺伝子とともに導入ＤＮＡを構築され、ヒト以外の動物細胞に導入されて、これを発生させて作製したヒト以外のトランスジェニック動物においてＭＭＰ−９タンパク質を発現し得るものであれば如何なるものでもよいが、皮膚においてより選択的に発現を受けるものが好ましい。それらの中でも元来ＭＭＰ−９を産産生する表皮細胞で選択的に発現するものがより好ましい。具体的には、例えば、Ｋ１４プロモーター（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1563-1567 (1989)）、Ｋ５プロモーター（Mol. Cell Biol, 13, 3176-3190 (1993)）、Ｋ１０プロモーター（Concerted action of TGF-beta 1 and its type II receptor in controlof
epidermal homeostasis in transgenic mice.Cui W, Fowlis DJ, Cousins FM, DuffieE, Bryson S, Balmain A, Akhurst RJ.Genes Dev. 1995 Apr 15;9(8):945-55.）などを挙げることができ、中でもＫ１４プロモーターが好ましい。
【００３８】
また、エンハンサー及びサイレンサーは、遺伝子の転写開始部の５’上流やゲノムのイントロン中に存在するもののうち、本発明のＭＭＰ−９遺伝子の発現に用いるプロモーターの活性制御に有効であるものを選択して用いることができる。それらの中でも、導入ＤＮＡに異種のイントロンを加えることによって発現の組織特異性は変化させずに発現量を増大させる効果を有するものが好ましく、具体的には、例えば、ウサギβ-globin second intron （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527-1531 (1981)）がより好ましい。
【００３９】
これらの適当な発現調節領域とＭＭＰ−９遺伝子をＰＣＲ法などにより連結して構築される導入ＤＮＡの具体例としては、例えばヒトＫ１４プロモーター、ウサギβ-globin second intron 、Kozak 配列、他のＭＭＰ群酵素でも認められているように（Mol. Biol. Cell, 15, 5242-5254 (2004) ）、より活性型の酵素発現を得るため配列番号２に示すアミノ酸配列における開始コドンから１０２位のバリンをグリシンに置換する（すなわち、配列番号１に示す塩基配列における３０５番目の塩基をＴからＧに置換）したＭＭＰ−９遺伝子及びヒトＫ１４polyadenylationsignalを直列に連結したものなどが挙げられる。また、上記構成要素を含むＭＭＰ−９ゲノムを用いることもできる。ＭＭＰ−９ゲノムは、ゲノムライブラリーからそれ自体周知の方法により取得することができる。
【００４０】
本発明で用いるヒト以外の動物細胞は、上述した導入ＤＮＡを導入して発生させることにより、ＭＭＰ−９遺伝子を発現したヒト以外のトランスジェニック動物を作製できるものであれば、如何なるものでもよい。ここで、ヒト以外の動物としては哺乳動物が好ましく、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコなどが挙げられる。これらの中で、マウス、ラット、モルモットなどの齧歯類が好ましく、マウスがより好ましい。
【００４１】
また、動物細胞としては、卵割前の受精卵や精子などの生殖細胞が好ましく用いられる。例えば、受精卵は、ヒト以外の動物の雄と雌を交配させることによって得られる。受精卵は、自然交配によっても得られるが、動物の雌の性周期を人工的に調節した後、雄と交配させる方法が好ましい。動物の雌の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば、初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）を、例えば腹腔注射などにより投与する方法が挙げられる。これらホルモンの投与量、投与間隔などは、該動物の種類により適宜決定すればよい。上記の通り動物の雌にホルモン投与を行って過剰排卵させ、交配後１日目の卵管から摘出することなどによって受精卵を得ることができる。
【００４２】
なお、導入ＤＮＡは、ヒト以外の動物細胞に導入し、これを発生させて作製したヒト以外のトランスジェニック動物において、ＭＭＰ−９タンパク質を発現し得るものであれば特に限定はされない。
【００４３】
［２．トランスジェニック動物及び該動物の作製方法について］
かくして調製される導入ＤＮＡを、ヒト以外の動物生殖細胞に導入してトランスジェニック動物細胞を作製し、さらにこれを発生させることによりヒト以外のトランスジェニック動物を作製することができる。
【００４４】
生殖細胞として受精卵を用いた場合、自然交配又は人工的に得られた受精卵に対し、上述した導入ＤＮＡをマイクロインジェクション法などにより注入して、動物の雌の輸卵管に人工的に移植・着床させて出産させることにより、トランスジェニック動物を得ることができる。また、動物の雌に黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）或いはその類縁体を投与した後に、動物の雄と交配させて、受精能を誘起された偽妊娠雌動物を作製し、得られた偽妊娠雌動物に受精卵を人工的に移植・着床する方法も好ましい。ＬＨＲＨ或いはその類縁体の投与量などは、ヒト以外の動物の種類によりそれぞれ異なる。さらに、上記のヒト以外の動物の雌の性周期を人工的に調節して受精卵を取得する方法と、受精能を誘起された偽妊娠雌動物にこの受精卵を人工的に移植・着床させる方法とを、組み合わせて用いるのが好ましい。
【００４５】
次に、上記したＭＭＰ−９遺伝子と、任意の発現調節領域として皮膚特異的発現プロモーター遺伝子とを含む導入ＤＮＡが導入されたヒト以外の動物生殖細胞を用いて作製されるトランスジェニック動物の作製方法の一例として、マウス受精卵を用いてトランスジェニックマウス（以下、これを「皮膚ＭＭＰ−９過剰発現トランスジェニックマウス」と称することがある）の作製方法について具体的に説明する。
【００４６】
まず、採卵用の雌マウスに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）及び黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）を投与して過剰排卵させ、雄マウスと交配して、膣栓確認後に卵管から受精卵を採取する。得られた受精卵の雄性前核に遺伝子を含む導入ＤＮＡをマイクロインジェクション法などにより導入して、得られる卵細胞をWhitten's の培地などで培養した後、偽妊娠させた雌マウスの輸卵管に移植して被移植動物を飼育し、出産させる。
【００４７】
生まれた仔マウスからＭＭＰ−９遺伝子を発現した仔マウスを選択することにより、皮膚ＭＭＰ−９過剰発現トランスジェニックマウスを得ることができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９／ｓｖ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔなどに由来するマウスの交配により得られるものを用いることができるが、前核段階で細胞質内において雄性前核と雌性前核が独立したときに識別が可能であること、受精卵を多く採取できること、また、マイクロインジェクション操作に好適で産仔の発生率が高いことから、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）系マウス同士の交配によって得られるマウスの受精卵を用いるのが好ましい。また、導入ＤＮＡの量は１００〜３０００コピーが適当であり、導入ＤＮＡの導入方法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法などの通常用いられる方法を挙げることができる。
【００４８】
ここで、導入ＤＮＡが導入された仔マウスの選択は、マウスの尾の先を切り取って、高分子ＤＮＡ抽出法（発生工学実験マニュアル、野村達次監修・勝木元也編、講談社（1987））又はDNAeasy Tissue Kit（QIAGEN社製）などの市販のキットを用いることによりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やpolymerase chain reaction （ＰＣＲ）法などの通常用いられる方法により該ＤＮＡ中のＫ１４プロモーター遺伝子やＭＭＰ−９遺伝子の存在を確認することによって行うことができる。また、実際にその個体内で導入されたＭＭＰ−９遺伝子が発現され、ＭＭＰ−９タンパク質が生成されていることは、ＰＣＲ法やウエスタンブロット法、gelatin-zymograph法 (Methods Mol. Biol. 289, 201-208 (2005)) などの通常用いられる方法により確認することができる。
【００４９】
このように、本発明のトランスジェニック動物は、かくして得られる個体を交配し、導入された導入ＤＮＡが安定に保持されることを確認して通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることもできるし、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。従って、本発明のトランスジェニック動物には、かくして得られる導入ＤＮＡを有する子孫なども含まれる。
【００５０】
また、本発明のトランスジェニック動物にさらに他の遺伝子を導入した動物を得て、複数の遺伝子が関与する疾患のモデル動物として用いることもできる。このような動物は、例えば、本発明のトランスジェニック動物と、他の特定の遺伝子が導入されたトランスジェニック動物とを交配することなどによって得ることができる。特定の遺伝子としては、例えば、もう一種のgelatinaseとして知られるＭＭＰ−２のヒト遺伝子やプロテオグリカンなどを分解するＭＭＰ−３のヒト遺伝子などを挙げることができる。
【００５１】
これらの遺伝子を導入したトランスジェニック動物と本発明のトランスジェニック動物とを交配することにより得られる多重トランスジェニック動物は、例えば皮膚代謝亢進のモデル動物として有用である。例えば、ＭＭＰの生体内阻害因子である、ＴＩＭＰ群（例えばＴＩＭＰ−１やＴＩＭＰ−２）のヒト遺伝子を導入したトランスジェニック動物と交配することにより得られる多重トランスジェニック動物と、本発明のトランスジェニック動物との表現型の解析について比較する際に用いることができる。
【００５２】
また、かかる導入ＤＮＡは、皮膚由来で全身に表現型を来すことが報告されており (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 219-226 (1997)）、かかる動物から得られる皮膚以外の全身、また一部の臓器も本発明の範囲に含まれる。該動物の一部としては、例えば、頭部、指、手、足、腹部、尾などの他、臓器、組織、細胞、細胞内小器官などが挙げられる。中でも、上記のように作製したトランスジェニック動物から得られる動物細胞は特に有用であって、組織培養の細胞源として機能解析やスクリーニングに用いたり、タンパク質や遺伝子を抽出して直接解析するなど、種々の目的に好適に用いることができる。例えば、このような細胞中のＤＮＡ若しくはＲＮＡを直接分析したり、或いは遺伝子により発現されたタンパク質を分析することにより、細胞におけるＭＭＰ−９タンパク質の機能を解析することができる。
【００５３】
また、該細胞をそれ自体周知の組織培養技術により培養して細胞の機能解析などに用いることもできるし、高発現細胞株があれば、そこからＭＭＰ−９タンパク質を大量に単離精製したり、抗体を作製するなどへの利用も可能である。
【００５４】
このような本発明のトランスジェニック動物細胞としては、皮膚の細胞、さらに好ましくは表皮角化細胞や毛嚢上皮細胞、また全身の他臓器の細胞、例えば、該動物の副腎髄質細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、小脳バーグマン細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、ランゲルハンス細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞、間質細胞、メサンギウム細胞、上皮細胞、線維細胞、脂肪細胞、若しくは免疫細胞など、また、これら細胞の前駆細胞、幹細胞、ガン細胞などが挙げられる。
【００５５】
［３．ＭＭＰ−９遺伝子異常発現が関与する表現型に影響を与える効力を有する物質のスクリーニング方法について］
本発明のトランスジェニック動物は、ＭＭＰ−９遺伝子によるgelatinaseの異常発現によって表現型変化を示すため、例えば、ＭＭＰ−９などのgelatinase活性発現亢進に起因する種々の疾患や病態などのモデル動物として有用である。従って、該動物を用いれば、これらの疾患や病態の原因究明及び治療法の検討や、該疾患や病態の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことができる。このような疾患や病態としては、例えば、癌の浸潤と転移、水疱症における水疱形成、血管新生、創傷治癒の遅延、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、化学兵器暴露後、及び角化異常症などの皮膚の炎症性疾患が挙げられる。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法は、本発明のトランスジェニック動物を用いて、該動物を被検物質で処理し、該動物におけるＭＭＰ−９遺伝子が関与する表現型の変化を無処理の対照動物と比較することにより行うことができる。被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規な物質であってもよいし、周知の物質であってもよい。該動物を被検物質で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射、外用などの通常用いられる周知の方法が挙げられ、試験動物の症状、被検物質の性質などに合わせて適宜選択すればよい。また、被検物質の投与量についても、投与方法、被検物質の性質などに合わせて適宜選択することができる。
【００５７】
さらに、本発明のスクリーニング方法は、本発明のトランスジェニック動物から得られる動物細胞を用いて行うこともできる。例えば、該細胞を培養して被検物質で処理し、該細胞や培養液中に含まれるＭＭＰ−９量の変化や、種々のタンパク質或いは遺伝子の変化、形態の変化などを無処理の細胞と比較する方法などにより行うことができる。被検物質としては、上記した物質が挙げられる。該細胞を被検物質で処理する方法としては、該細胞の培養液中に被検物質を添加して培養する方法などが挙げられ、被検物質の添加量は、該細胞の培養状態や被検物質の性質などにより適宜決定すればよい。用いられる細胞としては、皮膚細胞、例えば表皮角化細胞や毛嚢上皮細胞などを挙げることができる。
【００５８】
［４．ＭＭＰ−９異常発現による疾患、病態の予防又は治療薬、並びに予防及び治療方法について］
上記（３）のスクリーニング方法を用いて選択されたＭＭＰ−９遺伝子が関与した表現型に影響を与える効力を有する物質は、前述した被検物質から適宜選ばれた物質であって、また前記のＭＭＰ−９産生細胞に起因する種々の疾患、病態に対して予防及び／又は治療効果を有し、該疾患に対する安全で低毒性な予防又は治療薬として用いることができる。また、上記スクリーニング方法により得られた被検物質から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００５９】
これらの化合物は塩を形成していてもよく、水和物並びに溶媒和物などであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などの薬学的に許容し得る塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、並びにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
【００６０】
上記（３）のスクリーニング方法を用いて選択された物質は、それ自体単独で前記の疾患などの患者に投与することができるが、これらの有効成分の一種又は二種以上を混合して投与することもできる。また、薬理学的に許容される製剤用添加物などを用いて該物質を医薬品組成物として製剤化し、これを投与するのが好ましい。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、マイクロカプセル剤、リポソーム製剤、トローチ、舌下剤、液剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁剤などとして経口的に、或いは無菌の水性液若しくは油性液として製造した注射剤や、座剤、軟膏、貼付剤などとして非経口的に使用できる。これらは、例えば、該物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和し、充填又は打錠などの当業界で周知の方法を用いて製造することができる。これらの医薬品組成物における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６１】
例えば、錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムなどの結合剤、結晶性セルロースなどの賦形剤、セルロース、マンニトール、又はラクトースなどの充填剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの膨化剤、澱粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナトリウム澱粉グリコラートなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの湿潤剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーなどの香味剤などが用いられる。また、錠剤は必要に応じて腸溶性コーティング剤などを用いてコーティングを施すこともできる。カプセルについては、前記の添加剤にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。
【００６２】
また、例えば注射剤として用いる無菌医薬品組成物は、注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などの天然産出植物油などを溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（エタノールなど）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用することができる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用することができる。また、上記の医薬品組成物には、例えば、緩衝剤（リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（ベンジルアルコール、フェノールなど）、及び酸化防止剤などを配合してもよい。かくして調製される注射用の水性液は、通常、該物質を上記のような媒体に溶解させて濾過滅菌してから、適当な滅菌済みバイアル又はアンプルに充填して製造される。安定性を高めるために、該医薬品組成物を凍結させた後にバイアル中の水を真空下で除去してもよい。油性液についても水性液の場合と実質的に同様に製造できるが、該化合物を上記媒体に懸濁させた後にエチレンオキシドなどにより滅菌することによって好適に製造できる。
【００６３】
また、例えば外用に関して通常薬用外用剤又は化粧料に配合される成分、例えば紫外線吸収剤、油性成分、保湿剤、増粘剤、乳化剤、防腐剤、粉体、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、香料、アルコール、水などが配合できる。ここで紫外線吸収剤としては、ジベンゾイルメタン誘導体、ケイ皮酸エステル誘導体、ベンゾフェノン誘導体、ｐ−アミノ安息香酸誘導体などの有機系紫外線吸収剤、及び亜鉛華、雲母、雲母チタン、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウムなどの無機系紫外線吸収剤などが挙げられる。また、油性成分としては、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン、ミツロウ、カルナバロウ、オリーブ油、ラノリン、高級アルコール、脂肪酸、高級アルコールと脂肪酸の合成エステル油、シリコーン油、フッ素系油剤などが挙げられる。このような外用剤は、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤など、皮膚外用剤として用いるものであればいずれでもよく、剤形は特に問わない。
【００６４】
かくして得られる医薬品組成物は安全で低毒性であるので、前記疾患の予防及び／又は治療方法として、例えばヒトやヒト以外の哺乳動物に対して前記の疾患などの予防又は治療薬として投与することもできる。なお、該組成物に含まれる前記化合物の投与量は、対象疾患、症状、対象臓器、投与対象、投与方法などにより適宜決定して用いることができる。また、投与対象に対する一日の投与量を一〜数回に分けて投与するのが望ましい。
【００６５】
また、前記疾患の予防及び／又は治療方法として、ＭＭＰ−９遺伝子が関与した表現型に影響を与える効力を有し、且つ投与対象に対して安全で低毒性が認められた被検物質自体をヒトやヒト以外の哺乳動物に投与することもできる。なお、被検物質の投与量は、対象疾患、症状、対象臓器、投与対象、投与方法などにより適宜決定して用いることができる。また、投与対象に対する一日の投与量を一〜数回に分けて投与するのが望ましい。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明による実施例を示す。なお、本発明はこれらの実施例に記載された態様に限定されるわけではなく、前・後記の趣旨に照らし合わせて設計変更することは何れも本発明の技術的範囲に含まれるものである。
【００６７】
＜Ｋ１４プロモーターを用いた遺伝子改変ＭＭＰ−９発現ベクターの取得＞
まず、図１〜図３に示すように、米国Genecopoeia 社のEX-Mｍ03900-M02 を使用し、また以下の８種のPCR primer、ATG-F: ATGAGTCCCTGGCAGCCCCTGC 、cdna-R1: TGTTCGAATGGCCTTTAGTG 、cdna-F1: GCTGGCAGAGGCATACTTGT 、cdna-F2: CGTCGTGATCCCCACTTACTA、cdna-F3: GTCTTCCTGGGCAAGCAGTA 、 cdna-F4: CTATACCTCCCACGGCCTAT、cdna-F5: TGTGGGTGTACACAGGCAAG 、mu-PF: GGCCCAGACGTGGGTCGATT を用いて、ＰＣＲ法や制限酵素切断、ライゲーションなどの一般的な遺伝子操作法により、図４に示すようなKpnIとNotIでマウスMMP-9cDNA を挿入したベクターに、開始コドンから１０２位のアミノ酸をバリンからグリシンに置換（すなわち、開始コドンから３０５番目の塩基をＴからＧに置換）された遺伝子改変ＭＭＰ−９発現ベクター (pCMV-cDNA(V102G)) を得た。また、得られた遺伝子改変ＭＭＰ−９発現ベクターについて、その塩基配列を確認すると、配列番号１に示す塩基配列であった。なお、図４中において、矢印はサイトメガロウイルスプロモーター配列、cDNAは制限酵素KpnIとNotI切断部に挿入されたマウスＭＭＰ−９の、開始コドンから１０２位のアミノ酸をバリンからグリシンに置換する遺伝子改変のcDNA配列、polyA は、polyA tail配列を示す。
【００６８】
次に、遺伝子改変マウスＭＭＰ−９について、蛋白発現とgelatinase活性を検討するため、図５に示すように、培養２９３Ｔ細胞にRoche 社のFugene６試薬を用いて遺伝子導入を行い、培養上清を回収、gelatin-zymograph法 (Methods Mol. Biol. 289, 201-208 (2005)) を用いて、gelatinase活性を持つ遺伝子改変ＭＭＰ−９のバンドについて潜在型 (矢印) 、活性型 (矢尻) として発現を確認した。
【００６９】
次に、米国ATCC株より分譲して得た、pG3-K14cassette （pG3Z-K14）を用い、ＰＣＲ法や制限酵素切断、ライゲーションなどの一般的な遺伝子操作法により、図６に示すようなウサギβ-globin second intron を挿入、さらにBg／IIで、上述の遺伝子改変ＭＭＰ−９c ＤＮＡ(V102G) を挿入、ヒトＫ１４プロモーター、ウサギβ-globin second intron 、Kozak 配列、遺伝子改変MMP-9cDNA(V102G)、及びヒトＫ１４polyadenylation signalを直列に連結したものを含む皮膚ＭＭＰ−９過剰発現トランスジェニックマウス作成用ベクター (phK14-cDNA(V102G))を得た。図６中の矢印はヒトＫ１４プロモーター、RbG intronはウサギβ-globin second intron 、cDNAは制限酵素Bg／II切断部に挿入されたマウスＭＭＰ−９の、開始コドンから１０２位のアミノ酸をバリンからグリシンに置換する遺伝子改変のcDNA配列、K14 polyA はヒトＫ１４遺伝子のpolyA tail配列を示す。
【００７０】
＜皮膚ＭＭＰ−９過剰発現トランスジェニックマウスの作製と表現型の観察＞
皮膚ＭＭＰ−９過剰発現トランスジェニックマウスの作製採卵用のＣ５７ＢＬ／６系統雌マウスに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン；ＰＭＳＧ）及び黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン；ｈＣＧ）をそれぞれ個体あたり約５単位、４８時間間隔で腹腔内投与して過剰排卵させ、Ｃ５７ＢＬ／６系統雄マウスと交配させた。膣栓確認後、交配後１日目の卵管からマウス受精卵（初期胚）を採取し、上記で得られたphK14-cDNA(V102G))のＤＮＡ溶液を、該受精卵の雄性前核に２ｐｌずつマイクロインジェクションした。これを２細胞期までWhitten's の培地中にて３７℃で培養し、偽妊娠の雌ＩＣＲ系マウスの輸卵管に戻して個体を発生させ、帝王切開により仔マウスを取り出した。得られた仔マウスは、すぐに仮親につけて離乳期まで育てた。
【００７１】
上記で作製したトランスジェニックマウスについて、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行った。作製されたトランスジェニックマウスは、出生後３週経過したところで、９個体の尾の先を切り取って、高分子ＤＮＡ抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出し、各ＤＮＡ６０ｎｇを鋳型として、プライマーは、GT-hk14pro-F3: CAGGTAACTAGGTTTAAGGTGCA  G 、 AGT-hk14pA-R1: TTATGCAACTCAGATAATGAAGCTG 、３５サイクルの条件で３３５３ｂｐの増幅を行った。その後、アガロースゲル電気泳動法を用いて解析し、図７（ａ）に示す陽性の３個体のすべて雄ファウンダーマウス (F0-005, F0-006, F0-007) を得た。図中、Lane１〜９は、各々順にF0-001からF0-009までのマウス由来genome DNAを表し、lane１０〜１２は、各々野生型genome１μｇに加えてトランスジェニック遺伝子を１００ｐｇ、１００ｆｇ、0 g を加えたコントロールを表す。矢印は増幅された陽性バンドを示す。
【００７２】
次に、サザンブロット法を用いて陽性ファウンダーマウスのトランスジェニック遺伝子を定量した。分析用プローブを調製するために、ＰＣＲ法を用いて、プライマーは、GT-hk14pro-F1: GATATACACACCTCCAAAGCAGGAC、AGT-hk14pA-R3: TCTGCACCTTAAACCTAGTTACCTG により９３８ｂｐを増幅し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により分離した。泳動後のゲルから目的のバンドを切り出し、Sephaglas Band Prep Kit （Pharmacia 社製）を用いて精製して、これをランダムプライマー法（Random Primer ＤＮＡLabeling Kit Ver.2; 宝酒造社製）により32Ｐ−標識して分析用プローブとした。調製した分析用プローブを用いて挿入ＤＮＡの内側で一ヶ所のみ切断する制限酵素 (BspHI)によりサザンブロットを行った。その結果、図７（ｂ）に示すように、F0-005、F0-006、F0-007でbandを確認し、特にF0-006で強いトランスジェニック遺伝子の発現を確認した。
【００７３】
得られた３系統の皮膚ＭＭＰ−９過剰発現トランスジェニックマウスのうち、サザンブロット法で高発現のトランスジェニック遺伝子を確認したF0-006マウスで、生後３週頃より、同週令の雄マウスと比較した。その結果、図８（ａ）に示すように、生後１０週間で、野生型（上）と比較してF0-006の皮膚MMP-9 過剰発現トランスジェニックマウス (下) には炎症一般に伴う異常角化を尻尾 (黒矢印) や耳 (白矢尻) に、脱毛を背部 (白矢印) に認めた。また図８（ｂ）では F0-006 の耳の拡大写真、図８（ｃ）では F0-006 の尻尾の拡大写真である。
【００７４】
また、Ｋ１４プロモーターに代えてＫ５プロモーター又はＫ１０プロモーターを用いて上述した手順によりそれぞれ実験を行った場合でも、同様の効果が得られた。さらに、今回使用したＭＭＰ−９遺伝子は配列番号２に示すアミノ酸配列における開始コドンから１０２位のバリンをグリシンに置換（すなわち、配列番号１に示す塩基配列における３０５番目の塩基のＴをＧに置換）した遺伝子に代えて、同位のアミノ酸（同番の塩基）が置換されていないＭＭＰ−９遺伝子でも同様の効果が得られた。これは、置換前のＭＭＰ−９遺伝子と、置換後のＭＭＰ−９遺伝子において、生体内で機能するアミノ酸を持った領域が同様であるためである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年8月21日(2013.8.21)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、マトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）を過剰発現する動物細胞及びその利用に関する。詳しくは、ゼラチナーゼ発現亢進や炎症惹起においても顕著な表現型変化を示すために用いられる動物細胞、該細胞を利用したトランスジェニック動物の作製方法、該動物の作製方法により得られるトランスジェニック動物及びその子孫、ＭＭＰ−９遺伝子が関与する表現型に影響を与える効力を有する被検物質やトランスジェニック動物又は動物細胞の飼育条件を選択するスクリーニング方法、該スクリーニング方法により選択される被検物質又は該物質から誘導される化合物を用いたゼラチナーゼ発現異常を伴う疾患や炎症状態の治療及び予防薬並びに治療及び予防方法に関するものである。