(57)【要約】【課題】骨や歯の充填材として用いた場合にバイオフィルムの形成を阻害することができる抗菌性材料を提供すること。【解決手段】抗菌性材料は、表面上に、プロタミン等の水中でプラスに帯電する物質が吸着され、かつ、この物質が徐放されないリン酸カルシウム微小球を含み、バイオフィルム形成阻害活性を有する。骨又は歯のインプラント材はこの抗菌性材料から成る。【効果】この抗菌性材料では、プロタミン等の水中でプラスに帯電する物質がリン酸カルシウム微小球の表面上に徐放されないように吸着されているので、時間が経過してもこの物質が枯渇することはなく、継続的に抗菌効果を発揮するので、遅発性感染によるバイオフィルムの形成を防止することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面上に、水中でプラスに帯電する物質が吸着され、かつ、該物質が徐放されないリン酸カルシウム微小球を含み、バイオフィルム形成阻害活性を有する抗菌性材料。
【請求項２】
水中でプラスに帯電する物質が、遊離のアミノ基を持つ塩基性アミノ酸若しくはアミノ糖又はそれらから主として成るポリペプチド若しくは多糖類である請求項１記載の抗菌性材料。
【請求項３】
水中でプラスに帯電する物質が、塩基性アミノ酸から主として成るポリペプチドである請求項２記載の抗菌性材料。
【請求項４】
前記ポリペプチドがプロタミンである請求項３記載の抗菌性材料。
【請求項５】
周囲に細菌生育の阻止円が形成されない請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗菌性材料。
【請求項６】
前記リン酸カルシウム微小球が、水溶性カルシウム塩と、水溶性リン酸塩とを含む水溶液を超音波噴霧熱分解して得られたものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗菌性材料。
【請求項７】
β−リン酸三カルシウムをさらに含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗菌性材料。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗菌性材料から成る骨又は歯のインプラント材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性材料及びそれから成る骨又は歯のインプラント材に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨や関節疾患における手術的治療法はさまざまな種類の生体材料の開発、応用により、近年目覚ましい進歩を遂げている。しかし、術後感染症、特に人工関節および骨接合材料といったインプラントを使用する手術に合併する感染症は、抗菌薬の発達した現在でも重大な問題である。骨・関節感染症の多くは治療に抵抗して遷延化するが、その原因のひとつとして細菌の形成するバイオフィルムが注目されている。一度、バイオフィルムがインプラント表面に形成されると抗菌薬の全身投与などの治療に抵抗し、インプラントの抜去を余儀なくされる場合や多数回の手術を含めた長期間の加療が必要となる場合もある。
【０００３】
近年、骨髄炎の治療方法として、抗生物質を含有させたリン酸カルシウムセメントが報告されている（非特許文献１及び２）。しかしながら、抗生物質を含有させたリン酸カルシウムセメントを骨インプラント材として用いた場合、術後、時間が経過するとバイオフィルムが形成されることがあり、また、耐性菌の出現により抗生物質が効かなくなる恐れもある。
【０００４】
一方、塩基性アミノ酸であるアルギニンを主成分として含むポリペプチドであるプロタミンが抗菌性を発揮することはよく知られており、食品の保存料等として用いられている。また、多孔質リン酸カルシウム硬化体にプロタミンを含有させた、プロタミンを徐放する抗菌性材料を人工骨やプロタミン徐放体として用いることも知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2005-46530号公報
【０００６】
【非特許文献１】Daniel P Lew et al., Lancet,364,369-379(2004)
【非特許文献２】Uwe Joosten et al., Biomaterials, 26, 5251-5258(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、骨や歯の充填材として用いた場合にバイオフィルムの形成を阻害することができる抗菌性材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、リン酸カルシウム微小球の表面上に、プロタミン等の水中でプラスに帯電する物質が徐放されないように吸着させることが可能であり、該物質が吸着されたリン酸カルシウム微小球がバイオフィルム形成阻害活性を有することを見出し本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、表面上に、水中でプラスに帯電する物質が吸着され、かつ、該物質が徐放されないリン酸カルシウム微小球を含み、バイオフィルム形成阻害活性を有する抗菌性材料を提供する。また、本発明は、上記本発明の抗菌性材料から成る骨又は歯のインプラント材を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、骨や歯の充填材として用いた場合にバイオフィルムの形成を阻害することができる抗菌性材料が初めて提供された。上記の通り、プロタミンを徐放する多孔性リン酸カルシウム硬化体は特許文献１に記載されているように公知であるが、このような公知の徐放性材料では、プロタミンが徐放されている間は抗菌効果が発揮されると考えられるものの、プロタミンが枯渇した後は、手術時に感染していた化膿菌等の病原菌による遅発性感染(late infection)によりバイオフィルムが形成される恐れがある。本発明の抗菌性材料では、プロタミン等の水中でプラスに帯電する物質がリン酸カルシウム微小球の表面上に徐放されないように吸着されているので、時間が経過しても該物質が枯渇することはなく、継続的に抗菌効果を発揮するので、遅発性感染によるバイオフィルムの形成を防止することができる。従って、本発明は、骨や歯のインプラントを用いる医療分野に大いに貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例で作製したリン酸カルシウム微小球のＸ線回折分析の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例で作製したリン酸カルシウム微小球のフーリエ変換赤外分光分析の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例で作製したリン酸カルシウム微小球の洗浄前（左）及び洗浄後(右）の走査電子顕微鏡(SEM)写真である。
【図４】本発明の実施例で作製したリン酸カルシウム微小球の洗浄前及び洗浄後の比表面積の測定結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例で作製したリン酸カルシウム微小球をプロタミン水溶液に振とう下で浸漬した時間とプロタミン吸着量との関係を示す図である。
【図６】本発明の実施例で作製したプロタミン吸着微小球を、リン酸緩衝液(PBS)中に振とう下、浸漬した際の浸漬時間とプロタミン放出量との関係を示す図である。
【図７】本発明の実施例で作製したプロタミン担持微小球粉体の結晶相をXRDにより分析した結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例で作製したプロタミン吸着微小球粉体のSEM写真（右）をプロタミン吸着前のSEM写真（左）と共に示す図である。
【図９】本発明の実施例で作製したプロタミン吸着微小球粉体のζ電位をプロタミン吸着前の微小球粉体のζ電位と比較して示す図である。
【図１０】本発明の実施例で作製したプロタミン吸着微小球をＸ線光電子分光分析で分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記の通り、本発明の抗菌性材料は、リン酸カルシウム微小球の表面上に、水中でプラスに帯電する物質が吸着されたものを含む。ここで、「水中でプラスに帯電する物質」（以下、便宜的に「陽性物質」と呼ぶことがある）は、遊離のアミノ基等の水中でプラス（正）に帯電する官能基を持つものが好ましく、アミノ基としては１級アミノ基〜４級アミノ基のいずれでもよく、これらを複数種類持つものであってもよい。陽性帯電する物質としては、遊離のアミノ基を持つ塩基性アミノ酸若しくはアミノ糖又はそれらから主として成るポリペプチド若しくは多糖類が好ましい。ここで、「主として成る」とは、該ポリペプチド又は多糖類の構成単位の半数以上が遊離のアミノ基を持つ単位であることを意味する。また、塩基性アミノ酸としては、アルギニン、リシン、ヒスチジン、トリプトファン等が好まく、アミノ糖としては、グルコサミン、ガラクトサミン等が挙げられる。陽性物質としては、塩基性アミノ酸から主として成るポリペプチドが特に好ましく、とりわけ、プロタミンが好ましい。プロタミンは、構成アミノ酸の約６０％がアルギニンである塩基性のポリペプチドであり、天然のものは魚類の精巣に含まれており、食品添加物としても用いられていることからも明らかなように、その安全性が確認されているものである。
【００１３】
本発明で用いられるリン酸カルシウム微小球（粉体）を構成する「リン酸カルシウム」は、リン酸三カルシウム(Ca3(PO4)2)やヒドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)等から成るものであり、リン酸三カルシウムとヒドロキシアパタイトの両者を含むものであってもよい。下記実施例で製造したリン酸カルシウム微小球は、これらの両者を含むものである。微小球の直径としては、0.5μm〜3μm程度のものが好ましい。下記実施例において具体的に製造されたリン酸カルシウム微小球は、そのSEM写真から明らかなように、ほとんど全ての微小球がこの範囲の直径を有している。リン酸カルシウム微小球としては、微小球の内部に陽性物質が含有されにくい非多孔性のものが好ましい。
【００１４】
リン酸カルシウム微小球自体は、公知のものを用いることができるが、水溶性カルシウム塩と、水溶性リン酸塩とを含む水溶液を超音波噴霧熱分解して得られたものを好ましく用いることができる。超音波噴霧熱分解は、水溶液を超音波処理しながら噴霧し、噴霧された液体を加熱し、生成した粉体を回収する操作である。水溶性カルシウム塩としては、硝酸カルシウム（水和塩であってもよい）が好ましく、水溶性リン酸塩としてはリン酸水素二アンモニウム((NH4)2HPO4)が好ましい。水溶性カルシウム塩と水溶性リン酸塩との混合比率は、Ca/P比として1.2〜1.8程度が好ましく、1.4〜1.6程度がさらに好ましい。水溶液中のカルシウム塩の濃度は、0.4M(mol・dm-3)〜0.8M程度、さらには0.5M〜0.7M程度が好ましく、リン酸塩の濃度は0.2M〜0.6M程度、さらには0.3M〜0.5M程度が好ましい。また、水溶液中には、難溶性リン酸カルシウムの生成を避けるために、硝酸を含ませることが好ましく、この場合の硝酸の濃度は、0.2M〜0.6M程度、さらには0.3M〜0.5M程度が好ましい。超音波処理に用いる超音波の振動数は、特に限定されないが、1.8MHz〜3MHz程度が好ましく、また、噴霧に用いる空気の流量は、1〜2L/分(dm3・min-1)程度が好ましい。加熱温度は、250℃〜900℃が好ましく、特に、250℃〜350℃程度の第１段階と、800℃〜900℃程度の第２段階に分けて連続的に行うことが好ましく、これは、上記した各温度範囲に設定した２個の電気炉内を連続的に通過させることにより達成することができる。
【００１５】
リン酸カルシウム微小球の表面上への陽性物質の吸着は、単に、リン酸カルシウム微小球を陽性物質の水溶液中に浸漬することにより行うことができる。この際の陽性物質の濃度は特に限定されないが、通常、0.5〜2mg/mL程度でよい。また、浸漬時間は、陽性物質の吸着量がほとんど飽和する時間が好ましく、陽性物質がプロタミンの場合、３日〜４日程度が好ましい。なお、プロタミンの場合、浸漬時間が４日で吸着量がほぼ完全に飽和するので、それ以上浸漬しても意味はない。浸漬は室温下で行うことができ、振とう又は撹拌下に行うことが好ましい。
【００１６】
浸漬処理後、未吸着の陽性物質を洗浄除去することにより、本発明の抗菌性材料が得られる。この際の洗浄除去は、例えば緩衝液中で撹拌下に微小球を浸漬することにより行うことができ、室温下、２４時間の浸漬処理で未吸着の陽性物質をほぼ完全に除去することができる。
【００１７】
このようにして得られた陽性物質被覆リン酸カルシウム微小球では、陽性物質のプラス荷電と、リン酸カルシウムのリン酸部分のマイナス荷電とが電気的に結合していると考えられる。これはイオン性物質である塩化ナトリウムの存在下で上記吸着工程を行うと、吸着量が顕著に低下することからそのように考えられる。陽性物質は、電気的にリン酸カルシウム微小球表面上に吸着されているので、未吸着の陽性物質を洗浄除去した後は、陽性物質は徐放されない。また、陽性物質は、吸着された状態で抗菌作用を発揮するので、得られた抗菌性材料はバイオフィルム形成阻害活性を有する。ここで、バイオフィルム形成阻害活性を有するか否かは、下記実施例において具体的に記載するバイオフィルム形成アッセイにより調べることができ、対照（陽性物質を被覆していないもの）と比較して明らかにバイオフィルム形成が阻害されているものはバイオフィルム形成阻害活性を有する。
【００１８】
上記した陽性物質被覆リン酸カルシウム微小球は、そのままでも抗菌性材料として骨や歯の充填材等として利用可能であるが、β−リン酸三カルシウム（陽性物質で被覆されていない）と混合することにより、水中での崩壊を防止することができ、インプラント材としてより好ましいものとすることができる。この場合、陽性物質被覆リン酸カルシウム微小球とβ−リン酸三カルシウムとの混合比率は、重量比で1:0.25〜1:4程度が好ましく、さらに好ましくは1:0.5〜1:2程度であり、最も好ましくは1:0.8〜1:1.2程度である。
【００１９】
このようにして得られた粉体は、常法に従い、水、好ましくはリン酸水素二ナトリウム水溶液と混練し、成形することにより任意の形状のセメントとすることができる。この際、リン酸水素二ナトリウム水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常、1〜5質量％程度である。
【００２０】
本発明の抗菌性材料やその成形物は、骨や歯の充填材や、人工骨、人工関節等のインプラント材として使用することができる。なお、ここで、「インプラント材」は、骨又は歯の中に埋め込まれ、又は、骨や歯の代替品若しくはその一部として体内に埋め込まれて用いられるものを意味する。
【００２１】
本発明の抗菌性材料をインプラント材として用いた場合、陽性物質はリン酸カルシウム微小球の表面上に、徐放されることなく吸着されており、吸着された状態でバイオフィルム形成を阻害するので、術後、時間が経過しても長期間に亘り継続的にバイオフィルム形成が防止され、遅発性感染を包含する術後感染を効果的に防止することができる。
【００２２】
なお、本発明の抗菌性材料では、吸着された陽性物質が徐放されないので、下記実施例に具体的に記載するとおり抗菌性材料の周囲に細菌生育の阻止円が形成されない。阻止円の形成は、抗菌活性を調べる手法として広く用いられているものであり、この方法により阻止円が形成されない場合には、抗菌活性はないと判断されるのが通常である。本願発明者らは、本発明の材料が、阻止円を形成せず、従って、抗菌活性を有さないと考えられたにも拘わらず、驚くべきことに、バイオフィルムの形成を阻害する活性を有することを見出し、この材料を抗菌性のインプラント材として利用可能なことを初めて見出したものである。
【００２３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
1) リン酸カルシウム微小球の合成
試料溶液はCa/P 比が1.50となるように、0.60 mol・dm-3 Ca(NO3)2・4H2O, 0.40 mol・dm-3(NH4)2HPO4, 0.40 mol・dm-3 HNO3を混合して調製した。それを熱分解条件を上部電気炉温度850℃、下部電気炉温度300℃とし、超音波振動数は2.4 MHzに設定して超音波噴霧熱分解を行い、リン酸カルシウム微小球を得た。得られた粉体を純水で洗浄し、硝酸イオンを除去したものを洗浄粉体として、以降の実験に用いた。得られた合成粉体および洗浄粉体の粉体性状を粉末X 線回折法(XRD)、赤外分光光度法(IR)、および走査型電子顕微鏡（SEM）などを用いて調査した。
【００２５】
2) プロタミン担持微小球の作製
1)で合成した微小球粉体をプロタミン溶液(1.0 mg/mL)に加えた後、室温にて一定時間振とうした(150 rpm)。これを9000 rpm で遠心分離し、上清と沈澱に区別した。上清のプロタミン濃度を測定することにより、担持前後の溶液の濃度差を求めることで微小球へのプロタミンの吸着量を算出した。一方、沈殿は24 時間凍結乾燥し、これをプロタミン担持微小球とした。得られたプロタミン担持微小球をPBS に懸濁し、室温にて任意の時間振とうし、放出されたプロタミン濃度を測定し、徐放量を算出した。サンプリング時間毎に懸濁液を遠心分離し、上清のみを回収した後、再びPBS を加え懸濁、振とうを繰り返し、経時的な徐放量を調べた。上清中のプロタミン量はBradford 法により測定した。得られた粉体性状についてはXRD, SEM, 表面電位計などを用いて調べた。
【００２６】
3) プロタミン担持微小球セメントの作製
a) プロタミン担持微小球からなるセメントの作製
微小球またはプロタミン担持微小球を固液比1/0.3 (w/w)となるよう純水と混練し、100 MPa で一軸加圧成形し、セメントを作製した。これらをX-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS)およびin vitro 抗菌性試験(阻止円法)に用いた。
【００２７】
b) プロタミン担持微小球及びβ-リン酸三カルシウム (β-TCP)粉体からなるセメントの作製
調製したプロタミン担持微小球とβ-TCP 粉体を重量比1:1 となるよう混合した粉体をセメントの原料粉体とした。この粉体を固液比1/0.3 (w/w)となるよう2.5 mass% Na2HPO4 と混練し、100 MPa で一軸加圧成形し、直径15mm のセメントを作製した。作製したセメントを用いてin vitro抗菌性試験(biofilm 形成試験)に用いた。
【００２８】
4) プロタミン担持微小球セメントの抗菌性評価
a) 阻止円法による抗菌性評価
3-a)で作製したセメントを寒天培地上に静置した後、黄色ブドウ球菌(1x105 cfu)を加えたtop agar を流し込み、37℃インキュベータ中で48 時間静置培養した。培養後、形成された阻止円の面積から抗菌性を評価した。
【００２９】
b) Biofilm 形成法による抗菌性評価
黄色ブドウ球菌を LB 培地中で18 時間前培養し、これをOD600=0.05となるよう希釈した。希釈した菌液1.2 mL を24穴プレートへ設置したセメント上へ播種し、25℃インキュベータ中で24時間静置培養した。培養後、バイオフィルムの形成を評価するためにLIVE/DEAD BacLight dye（商品名）で黄色ブドウ球菌を染色し、蛍光顕微鏡により菌の生死の状態を観察した。
【００３０】
結果
1) リン酸カルシウム微小球の特性評価
はじめに、合成粉体の結晶相を Ｘ線回折(XRD)により同定した(図１)。その結果、洗浄粉体ではヒドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2; HAp)およびリン酸三カルシウム(β-Ca3(PO4)2;β-TCP)に帰属される回折ピークが認められた。また、FT-IRスペクトルより、合成粉体に残存している硝酸イオン(NO3-)は洗浄処理することで除去されることが確認された(図２)。次に、合成粉体および洗浄粉体の SEM による形態観察結果を図３に示す。粉体はいずれも球状粒子で構成されており、洗浄処理による微小球の形態への影響は観察されなかった。さらに、合成粉体および洗浄粉体の比表面積をBET法により測定した。合成粉体の場合、その比表面積(Specific surface area; SSA)は10.6 m2・g-1であったのに対し、粉体を洗浄することによりSSA は14.4 m2・g-1に増大した (図４)。
【００３１】
2) プロタミン担持微小球の作製とその特性評価
リン酸カルシウム微小球粉体とプロタミン溶液を共にチューブに入れ、振とうさせるバッチ法を利用して、微小球へのプロタミン担持を試みた結果、微小球へのプロタミンの吸着量は振とう時間に依存して増加し、反応24時間程度でほぼ一定となることが分かった(図５)。以降、24時間振とう、吸着させた微小球粉体を「プロタミン担持微小球」とした。次に、調製したプロタミン担持微小球粉体をPSB に浸漬、振とうすることで粉体からのプロタミンの放出挙動を調べた(図６)。その結果、浸漬直後にプロタミンは急激に放出されたが、その後は緩やかな放出挙動を示した。初期バーストはプロタミン担持後の粉体を洗浄していなかったことによる未吸着のプロタミンが放出したによるものと考えられる。一方、得られたプロタミン担持微小球粉体の結晶相はXRDにより同定した(図７)。担持前の微小球と同様に、HApおよびβ-TCPに帰属される回折ピークが認められた。しかし、プロタミン溶液と微小球粉体とを24 時間反応させたため、β-TCPは水和反応により一部がHApへ相転移した。また、プロタミン担持後の粉体は担持前に比べ、結晶性が低下することが分かった。続いて、粉体形態をSMEにより観察した(図８)。粉体はプロタミンの有無に関わらず、球状粒子であった。しかし、プロタミン担持微小球は微小球表面にプロタミンのコーティング膜状の層が形成された上に、β-TCPがHApへ転移したことにより、針状の析出物が観察された。さらに、この粉体の表面電位(ζ電位)を測定した結果、プロタミンを担持させたことにより、ζ電位は吸着したプロタミンに相応して、正電荷側へシフトした(図９)。吸着 (図５)および表面電位(図９)の結果から、プロタミンは微小球粉体に吸着していると考えられる。
【００３２】
そこで、プロタミンと微小球との関係を詳細に調べるためにＸ線光電子分光(X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS))によりプロタミン担持微小球の表面状態を解析した(図１０)。その結果、N 1s スペクトルにおいてプロタミン担持微小球は、微小球に比べ強いピークが認められた。さらに、このN 1sスペクトルを詳細に解析した結果、プロタミンに由来するアミド態窒素、アミノ態窒素、アンモニア態窒素のピークが確認され、プロタミンと微小球との吸着が裏付けられる結果となった。この吸着は微小球のHApもしくはβ-TCPのリン酸基(PO43-)とプロタミンのアミノ基(NH2+)がイオン結合したものと推測される。
【００３３】
3) プロタミン担持微小球セメントの抗菌性評価
プロタミンは微生物に対する抗菌性を保持していることから、リン酸カルシウム微小球へ担持させた場合にも同様に抗菌性を示すことが期待できる。そこで、プロタミン担持微小球粉体からセメントを作製し、その抗菌性を阻止円法を用いて評価した。その結果、予想に反して阻止円の形成は認められず、抗菌活性を示さなかった。これは、プロタミンが微小球へ吸着しているため、寒天培地中へ放出されるプロタミン量が僅かとなり、阻止円を形成することができなかったと考えられる。
【００３４】
そこで、抗菌性の評価方法を変更し、バイオフィルム形成能の有無でプロタミン担持微小球の抗菌性評価を行った。その際、セメントを培地中へ浸漬させ、バイオフィルム形成の可否を調べるため、水中において崩れない「非崩壊性のセメント」の作製が必要となる。しかし、微小球粉体のみで作製したセメントは水中では崩壊してしまった。そこで、我々が既に開発済みであるβ-TCP粉体と各微小球とを混合することで、非崩壊性のセメントを作製した。その結果、コントロールのβ-TCP セメント上では、菌が大量に付着しバイオフィルムが形成されたのに対し、微小球との混合セメントではいずれも菌が僅かにしか存在せず、バイオフィルムの形成を阻害できた。これはセメントからの僅かな未洗浄プロタミンの放出と微小球に吸着したプロタミンと菌とが接触することで細胞内の電子分布の不均衡が起こることにより細胞壁が破壊され、バイオフィルムが形成されなかったものと考えられる。
【００３５】
以上の結果から、プロタミン担持リン酸カルシウム微小球は、菌と接触することによりその抗菌性を発現することが可能な上に、微小球からのプロタミンの放出は僅かであることから、安全性も非常に高いと考えられる。したがって、本発明の抗菌性材料はバイオフィルム形成を阻害可能な優れた生体材料として活用されることが期待できる。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図１０】
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