(57)【要約】【課題】本発明は、味ニューロンにヒト味物質受容体等の外来化学受容体を有する形質転換ショウジョウバエの提供、及び該形質転換ショウジョウバエを用いて受容体特性や受容体のリガンドを解析する方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は外来の化学受容体を味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエを作製する方法、該作製方法により作製した形質転換ショウジョウバエ作製方法、及び、該形質転換ショウジョウバエを用いた化学受容体のリガンドのスクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来の化学受容体を味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエ。
【請求項２】
味ニューロンが糖受容体であるGr5a受容体を発現する味ニューロンである、請求項１記載の形質転換ショウジョウバエ。
【請求項３】
外来の化学受容体がヒト味覚受容体である、請求項１又は２に記載の形質転換ショウジョウバエ。
【請求項４】
外来の化学受容体が、T2R4、T2R38、及びPKD2L1からなる群より選択される受容体である、請求項３記載の形質転換ショウジョウバエ。
【請求項５】
外来の化学受容体を味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエを作製する方法であって、
(i)  UAS配列と、その下流に味ニューロン特異的に発現させようとする化学受容体をコードするDNAとを含む構築物をショウジョウバエに導入し、
(ii)  ショウジョウバエの味ニューロンに特異的なプロモーターと、その下流にGal4遺伝子を含む構築物をショウジョウバエに導入し、
(iii)  (i)で得られたショウジョウバエと、(ii)で得られたショウジョウバエを交配し子孫を得ることを含む方法。
【請求項６】
味ニューロンが糖受容体であるGr5a受容体を発現する味ニューロンである、請求項５記載の形質転換ショウジョウバエを作製する方法。
【請求項７】
外来の化学受容体がヒト味覚受容体である、請求項５又は６に記載の形質転換ショウジョウバエを作製する方法。
【請求項８】
外来の化学受容体が、T2R4、T2R38、及びPKD2L1からなる群より選択される受容体である、請求項７記載の形質転換ショウジョウバエを作製する方法。
【請求項９】
化学受容体を味ニューロンにおいて発現する形質転換ショウジョウバエを用いて該受容体のリガンドを試験する方法であって、以下のステップ
(1)  該化学受容体を味ニューロンにおいて発現する形質転換ショウジョウバエを用意するステップ、
(2)  該形質転換ショウジョウバエを、試験化合物を含む溶液と、該試験化合物を自由摂食できる状態で接触させるステップ、
(3)  該形質転換ショウジョウバエが前記試験化合物を含む溶液を摂食したか否かをモニタリングするステップ、
を含む方法。
【請求項１０】
リガンドの試験がリガンドのスクリーニングである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
リガンドの試験がリガンドの味覚の判定である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
形質転換ショウジョウバエが試験化合物を含む溶液を摂食した場合に該試験化合物が味ニューロンにおいて発現させた受容体のリガンドであることを示す、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
試験化合物溶液に色素を含ませておき、色素がショウジョウバエ消化器に含まれている場合に摂食したことを示す、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
味ニューロンが糖受容体であるGr5a受容体を発現する味ニューロンである、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
外来の化学受容体がヒト味覚受容体である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
外来の化学受容体が、T2R4、T2R38、及びPKD2L1からなる群より選択される受容体である、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換体昆虫味ニューロン発現系に関する。より詳細には、本発明は化学受容体、特にヒトの味覚受容体遺伝子をショウジョウバエの味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエ及び該形質転換ショウジョウバエを用いた味覚物質試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物である高等動物には外界にある多様な化学物質をはじめ、細胞間においても情報伝達を担う化学物質が多種類存在する。これらの化学物質を受容するために多種類の膜タンパク質受容体とその遺伝子が進化しているが、受容体の種類が膨大なために今日でもその多くがまだ解析されていない。組換え技術によりこれらの受容体遺伝子を培養細胞に発現させて機能を解析する技術が開発されているが、安定性、発現レベル、コストなどの面で応用性が限られる。例えば受容体遺伝子を発見しても、従来の技術では、培養細胞レベルでの解析結果しか得ることができず、高等動物等のレベルでの当該受容体の機能解析はできなかった。個体レベルでの機能解析には、ノックアウトマウス等特殊な遺伝子改変動物が使用されている。しかしながらトランスジェニックマウス等の作製は大変な困難を伴い、発生当初より遺伝子発現が改変されるため、応用できる範囲が狭い。またモデル哺乳動物を用いて味物質受容体の機能的変異体を作製し、それらの受容体の役割を体系的に分析するのは多大な労力を要する。
【０００３】
呈味物質は、甘味・苦味・酸味・塩味・旨味の5つの基本味から構成されることが知られている。これまでの生化学的・電気生理学的解析から、酸味と塩味は味細胞で発現するチャネル型受容体で認識され、甘味・苦味・旨味はG蛋白質共役型受容体で認識されていると考えられている。近年、味細胞で発現するG蛋白質共役型受容体が幾つか同定され、T1RファミリーやT2Rファミリー等がある。
【０００４】
従来の呈味性の評価は主として被験者による官能検査により行われている。近年味覚分子機構の研究が哺乳類や昆虫で進展し、ヒト基本味の受容タンパク質とその遺伝子が多く発見されている。しかしながらヒトの味覚特性に基づく科学的な測定法は開発されていない。
【０００５】
苦味は動植物、医薬品などに含まれる様々な有機、無機化合物の味で、微量で顕著な摂食の抑制や嘔吐反応を引き起こす。そこで安全で有用な苦味減弱機能をもつ調味物質は食品や医薬品の開発と改良において大きな需要が期待できるが、従来の方法では試作段階から評価段階までの開発に時間がかかる。
【０００６】
Chandrashekarら(2000)は、ヒト味覚受容体のファミリー（T2R）を報告しており、T2Rが苦味物質の受容体として機能することを実証した（非特許文献１）。同文献の著者らは異種発現系としてHEK細胞などの培養細胞にヒト味覚受容体を発現させた。しかしそのままでは培養細胞に味応答を引き起こす細胞内情報伝達系が欠如しているため、味覚物質による細胞応答は見られない。そこでChandrashekarらは共役Gタンパク質と活性化をモニターするレポーター等を導入した人工的な系を構築した（非特許文献１）。
【０００７】
またAlderは苦味に関連するT2R遺伝子を記載している（特許文献１）。特許文献１には、T2Rポリペプチドを発現する非ヒト動物をアッセイに使用しうることが記載されているが、非ヒト動物の種類に関するさらなる記載はなく、また該動物のどの器官でどのようにT2R遺伝子を発現させるかに関する記載はない。
【０００８】
未分化の培養細胞とウイルスベクターを用いる発現系では導入すべき化学受容体遺伝子をはじめ細胞内の共役因子などの発現レベルや発現時期の制御が困難であり、十分な感度や定量性を確保するのは困難である。
【０００９】
近年、培養細胞発現系に代えて、高等動物の組換え技術を使う第２世代の発現系が発展しており、例えばGal4/UASバイナリー系が挙げられる。これを用いた例として、ショウジョウバエ（Drosophila）の光受容細胞を用いた異所受容体及び膜タンパク質発現が報告された。Erogluら（2002）は異所GPCRがGal4/UASバイナリー系を用いてトランスジェニックハエ光受容細胞において豊富に発現可能であることを示した（非特許文献２）。Panneelsら（2011）は種々の真核動物由来の受容体、トランスポーター、及びチャネルを含む膜タンパク質が光受容細胞において高発現レベルにて産生されうることを示した（非特許文献３）。Ahmadら（2006）はさらに、異所性発現ウシロドプシンが正しく標的化され、成熟過程においてグリコシル化され、クロモホアと会合し、天然の光色素と同様に光り変換を示すことを報告した（非特許文献４）。同文献の著者らはまた、トランスジェニックウシロドプシンが哺乳動物光受容体Gタンパク質であるトランスデューシンを活性化するが、内在性シグナル伝達機構とカップリングして光受容体応答を惹起することはできなかったことを報告した。
【００１０】
ショウジョウバエ（Drosophila）における味覚受容体ニューロンに関する分子研究からは、ニューロンが、昆虫嗅覚受容体（OR）と遠い関係にある巨大なGPCR（Ｇタンパク質共役型受容体）ファミリーに属する種々の味覚受容体（GR）を発現することが示された（Clyneら, 2000・非特許文献５）。
【００１１】
Talluriら(1995)はショウジョウバエの化学感覚細胞で発現されるdGqα-3を報告した（非特許文献８）。Usui-Aokiら(2005)はショウジョウバエのGr5aニューロンでのGqαの機能的な関連を報告している（非特許文献９）。他の種類のGqαサブユニットもGr5aニューロンの正常な糖応答に必要であることが示されており（uenoら、非特許文献１０。Kainら、非特許文献１１）、ショウジョウバエの味受容体ニューロンは、複数の受容体とシグナル伝達機構を備えたユニークな細胞であることが示唆されている。Gr5aは糖受容体をコードするショウジョウバエの遺伝子である（Chybら、非特許文献１２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第7105650号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Chandrashekarら, Cell, Vol. 100, pp. 703-711, (2000)
【非特許文献２】Erogluら, EMBO reports, 3, pp. 491-496, （2002）
【非特許文献３】Panneelsら, PLoS ONE, 6(4), e18478, （2011）
【非特許文献４】Ahmadら, Invest Ophthalmol Vis Sci, 47, pp. 3722-3728 （2006）
【非特許文献５】Clyneら, Science, 287, pp. 1830-1834, (2000)
【非特許文献６】Dethier, V. G. "The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding" Cambridge, MA: Harvard University Press (1976)
【非特許文献７】Fujishiro et al., J Insect Physiol, 30, 317-325, (1984)
【非特許文献８】Talluriら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. 92(25): pp. 11475-11479 (1995)
【非特許文献９】Usui-Aokiら, J. Neurogenet. vol. 19(3-4): pp. 123-141 (2005)
【非特許文献１０】Ueno et al., J Neurosci, vol. 26, pp. 6143-6152 (2006)
【非特許文献１１】Kain et al., Chem Senses, vol. 35, pp. 663-673 (2010)
【非特許文献１２】Chybら、PNAS vol. 100 no. Suppl 2 pp. 14526-14530 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、味ニューロン（味覚ニューロン）にヒト味物質受容体等の外来化学受容体を有する形質転換ショウジョウバエの提供を目的とする。本発明はさらに該形質転換ショウジョウバエを用いて受容体特性や受容体のリガンドを解析する方法の提供を目的とする。より具体的には、例えば、食品の呈味成分を前記形質転換ショウジョウバエを用いたバイオアッセイ法により分析的、客観的に評価する新しいシステムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、培養細胞を対象とする従来の発現系を用いるのではなく、高等動物の組換え技術を使う第２世代の発現系を導入し、ヒト苦味受容体T2R4及びT2R38又は酸味受容体PKD2L1を味覚ニューロンで発現するショウジョウバエ形質転換体を構築した。形質転換体がヒト苦味受容体T2R4若しくはT2R38、又は酸味受容体PKD2L1遺伝子を保有しこれを発現することをRT-PCRにより確認した。驚くべきことに、異所的に導入した化学受容体分子は、ハエ味覚ニューロンにおいて機能的に発現した。
【００１６】
すなわち、ヒトT2R4及びT2R38苦味受容体、又はPKD2L1酸味受容体をハエ味覚ニューロン及び他の組織上に発現するトランスジェニックショウジョウバエを、慣用のGal4/UASバイナリーシステムを用いて構築し、分子解析によりT2R mRNAはGal4ドライバーの組織特異性にしたがって発現されていることを確認した。次いで、ハエ味覚ニューロン上に該受容体を発現する組換えショウジョウバエを行動アッセイにより解析し、異所性に発現する化学受容体が細胞応答とカップリングしているかを調べた。野生型のハエは、哺乳動物と同様に、T2R4及びT2R38リガンド等のT2Rリガンドに対して強い忌避行動を示す。そこで本発明者らはショウジョウバエの糖受容体ニューロン上に該異所受容体を発現している該組換えショウジョウバエを解析し、該異所受容体が機能性であり該ニューロンを活性化するならば、リガンド依存的に、摂取行動を促進するか否かを確認した。その結果、T2R4を発現する形質転換体では、対照のショウジョウバエと比較して、T2R4のリガンドであるデナトニウム及びキニンに対する摂食嗜好性に有意な増大が見られ、T2R38を発現する形質転換体は、前記２つのリガンドに対する嗜好性の増大を示さなかった。また、T2R38又はPKD2L1を発現する形質転換体は、それぞれT2R38リガンドであるフェニルチオカルバミド（PTC）又はクエン酸に対する摂食嗜好性の増大を示した。これらの結果より、ヒトの味物質受容体を発現する形質転換体は、味物質受容体依存的かつリガンド依存的な摂食嗜好性の増大を示すことがわかった。このようにして、ショウジョウバエの味ニューロンは、化学受容体機能を分析するためのin vivo異種発現系となり得ることが見出された。
【００１７】
すなわち本発明は以下のとおりである。
[１]  外来の化学受容体を味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエ。
[２]  味ニューロンが糖受容体であるGr5a受容体を発現する味ニューロンである、[１]の形質転換ショウジョウバエ。
[３]  外来の化学受容体がヒト味覚受容体である、[１]又は[２]の形質転換ショウジョウバエ。
[４]  外来の化学受容体が、T2R4、T2R38、及びPKD2L1からなる群より選択される受容体である、[３]の形質転換ショウジョウバエ。
[５]  外来の化学受容体を味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエを作製する方法であって、
(i)  UAS配列と、その下流に味ニューロン特異的に発現させようとする化学受容体をコードするDNAとを含む構築物をショウジョウバエに導入し、
(ii)  ショウジョウバエの味ニューロンに特異的なプロモーターと、その下流にGal4遺伝子を含む構築物をショウジョウバエに導入し、
(iii)  (i)で得られたショウジョウバエと、(ii)で得られたショウジョウバエを交配し子孫を得ることを含む方法。
[６]  味ニューロンが糖受容体であるGr5a受容体を発現する味ニューロンである、[５]の形質転換ショウジョウバエを作製する方法。
[７]  外来の化学受容体がヒト味覚受容体である、[５]又は[６]の形質転換ショウジョウバエを作製する方法。
[８]  外来の化学受容体が、T2R4、T2R38、及びPKD2L1からなる群より選択される受容体である、[７]の形質転換ショウジョウバエを作製する方法。
[９]  化学受容体を味ニューロンにおいて発現する形質転換ショウジョウバエを用いて該受容体のリガンドを試験する方法であって、以下のステップ
(1)  該化学受容体を味ニューロンにおいて発現する形質転換ショウジョウバエを用意するステップ、
(2)  該形質転換ショウジョウバエを、試験化合物を含む溶液と、該試験化合物を自由摂食できる状態で接触させるステップ、
(3)  該形質転換ショウジョウバエが前記試験化合物を含む溶液を摂食したか否かをモニタリングするステップ、
を含む方法。
[１０]  リガンドの試験がリガンドのスクリーニングである、[９]の方法。
[１１]  リガンドの試験がリガンドの味覚の判定である、[９]の方法。
[１２]  形質転換ショウジョウバエが試験化合物を含む溶液を摂食した場合に該試験化合物が味ニューロンにおいて発現させた受容体のリガンドであることを示す、[９]〜[１１]のいずれかの方法。
[１３]  試験化合物溶液に色素を含ませておき、色素がショウジョウバエ消化器に含まれている場合に摂食したことを示す、[９]〜[１２]のいずれかの方法。
[１４]  味ニューロンが糖受容体であるGr5a受容体を発現する味ニューロンである、[９]〜[１３]のいずれかの方法。
[１５]  外来の化学受容体がヒト味覚受容体である、[９]〜[１４]のいずれかの方法。
[１６]  外来の化学受容体が、T2R4、T2R38、及びPKD2L1からなる群より選択される受容体である、[１５]の方法。
【発明の効果】
【００１８】
化学受容体の機能はこれまで試験管内や培養細胞を使う実験によりリガンドとの結合や受容体の活性化で引き起こされる生化学的な変化、細胞の活性化などを解析することにより調べられてきた。しかしこのような従来の方法では化学受容体の応答性は本来の生体内における変化と比較すると感度や安定性に劣る。本発明の形質転換ショウジョウバエは、種々のヒトの味物質受容体遺伝子をショウジョウバエの味ニューロン上で発現し、外来の化学受容体がin vivoの条件下で活性化し、化学受容体の活性化と味ニューロンの活動とが共役する。その結果、形質転換ショウジョウバエの摂食行動等の生理的現象により、受容体のリガンドとの結合や受容体の活性化を測定することができる。本発明の形質転換ショウジョウバエの作製法を用いて、様々な化学受容体を発現する形質転換ショウジョウバエを作製することにより、本来の細胞環境に近い条件で化学受容体を解析することができる。
【００１９】
例えば本発明を用いることにより、ヒトの味物質受容体のそれぞれをショウジョウバエに組み込んだ系統を作製し、食品成分に含まれる呈味成分を評価できる総合的なシステムを構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Gal4ドライバーの制御下で種々のヒト味物質受容体を発現させたトランスジェニックショウジョウバエのRT-PCR分析結果を示す図である。図１Ａ第２行に見られるように、各組織から単離された全RNAから逆転写されたcDNAの量を調整するためにRp49の量を揃えてある。図１Ａ第１列の対の左側（＋）がUAS-T2R38構築物及びGal4ドライバー構築物の両方を保有するハエであり、対の右側（−）がUAS-T2R38構築物のみを保有するハエである。図１Ａ第１行はT2R38発現量である。図１Ａ第１列の対はGr5a-Gal4による、吻でのT2R38転写産物量を示す。図１Ａ第２列の対は、elav-Gal4による、成体頭部でのT2R38転写産物量を示す。図１Ａ第３列の対は、Act79B-Gal4による、腹部でのT2R38転写産物量を示す。図１Ａの第３行はGr5a-Gal4/UAS-T2R38ハエ（＋）及び対照（−）の吻における内因性Gr5a転写産物の量を示す。図１ＢはGr5a-Gal4/UAS-T2R4及びGr5a-Gal4/UAS-PKD2L1形質転換体のRT-PCR分析結果を示す図である。第１列の対がT2R4であり、第２列の対がPKD2L1である。対の左側がGr5a-Gal4ドライバー有り（＋）、右側が対照（−）である。
【図２−１】トランスジェニックショウジョウバエの摂食試験の結果を示す図であり、0.1 mMキニーネに対する嗜好性を示す図である。垂直の棒は嗜好性指数(PI)を示し、水平の棒は生データの％比を示す。水平の棒において、白抜きの部分は試験溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、斜線部は試験溶液及び対照溶液の両方を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、黒塗りの部分は対照溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示す。ホモ接合体又はヘテロ接合体としてGr5a-Gal4及びUAS-T2Rの両方を保有するすべてのF2ハエを（＋）で、該２つの構築物のいずれも保有しない又はそのうちの一つしか保有しない残りのF2ハエを（−）で示す。（＋）及び（−）F2ハエの合計数を垂直の棒の中に記載した。水平の棒の横の＊印は統計的に有意な差異を示す。
【図２−２】トランスジェニックショウジョウバエの摂食試験の結果を示す図であり、0.03 mMデナトニウムに対する嗜好性を示す図である。垂直の棒は嗜好性指数(PI)を示し、水平の棒は生データの％比を示す。水平の棒において、白抜きの部分は試験溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、斜線部は試験溶液及び対照溶液の両方を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、黒塗りの部分は対照溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示す。ホモ−又はヘテロ接合体としてGr5a-Gal4及びUAS-T2Rの両方を保有するすべてのF2ハエを（＋）で、該２つの構築物のいずれも保有しない又はそのうちの一つしか保有しない残りのF2ハエを（−）で示す。（＋）及び（−）F2ハエの合計数を垂直の棒の中に記載した。水平の棒の横の＊印は統計的に有意な差異を示す。
【図２−３】トランスジェニックショウジョウバエの摂食試験の結果を示す図であり、10 mM PTCに対する嗜好性を示す図である。垂直の棒は嗜好性指数(PI)を示し、水平の棒は生データの％比を示す。水平の棒において、白抜きの部分は試験溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、斜線部は試験溶液及び対照溶液の両方を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、黒塗りの部分は対照溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示す。ホモ−又はヘテロ接合体としてGr5a-Gal4及びUAS-T2Rの両方を保有するすべてのF2ハエを（＋）で、該２つの構築物のいずれも保有しない又はそのうちの一つしか保有しない残りのF2ハエを（−）で示す。（＋）及び（−）F2ハエの合計数を垂直の棒の中に記載した。水平の棒の横の＊印は統計的に有意な差異を示す。
【図３】10 mMクエン酸を用いたトランスジェニックショウジョウバエの摂食試験の結果を示す図である。垂直の棒は嗜好性指数(PI)を示し、水平の棒は生データの％比を示す。水平の棒において、白抜きの部分は試験溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、斜線部は試験溶液及び対照溶液の両方を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示しており、黒塗りの部分は対照溶液を選択したF2ショウジョウバエの個体数のパーセンテージを示している。ホモ−又はヘテロ接合体としてGr5a-Gal4及びUAS-PKD2L1構築物の両方を保有するすべてのF2ハエを（＋）で、該２つの構築物のいずれも保有しない又はそのうちの一つしか保有しない残りのF2ハエを（−）で示す。（＋）及び（−）F2ハエの合計数を垂直の棒の中に記載した。水平の棒の横の＊印は統計的に有意な差異を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の形質転換ショウジョウバエ(Drosophila)は、ヒト味覚受容体遺伝子等の外来化学受容体遺伝子がショウジョウバエの味ニューロンで発現されるように導入されている。該化学受容体遺伝子はショウジョウバエの味ニューロンで発現し、該化学受容体のリガンドがショウジョウバエの味ニューロンで発現している化学受容体に結合すると、化学受容体がin vivoで活性化し、味ニューロンからショウジョウバエの中枢神経系へと情報が伝達され、リガンドと化学受容体の種類により、摂食行動又は忌避行動という生理現象が起こり、該生理現象を確認することにより、化学受容体がその受容体のリガンドを受容したかどうかを測定することができる。また、化学受容体が活性化し、味ニューロンが活動し情報伝達が起こることを化学受容体の活性化と味ニューロンの活動がカップリング（共役）するということもできる。ここで、外来化学受容体とは、ショウジョウバエ以外の動物の有する化学受容体をいう。
【００２２】
ショウジョウバエを用いる利点として、１）受容体のリガンド決定に有用であること、２）受容体が活性化されたときの機能を、よりin vivoでの細胞環境に近い条件下で分析できること、３）ヒト遺伝子をモデルマウスよりもヒト機能を反映すること、４）遺伝子導入による発現が味ニューロンのみに現れるため、ノックアウトマウスのように発生時死亡による実験系の崩壊が避けられること等が挙げられる。さらにショウジョウバエは遺伝的交配が可能であり、それにより各導入遺伝子群、あるいはすでに遺伝的変異が明らかである個体群との交配により、導入遺伝子と関わる遺伝子群を個体変異、すなわち生理学的状況で特定できる。また、複数の味覚受容体遺伝子を導入したショウジョウバエ系統を作製することも可能である。
【００２３】
（Ａ）本発明の形質転換ショウジョウバエの作製方法
本発明の形質転換ショウジョウバエは、外来の化学受容体遺伝子をショウジョウバエの味ニューロンで異所性発現する。ここで、異所性発現とは、本来発現する場所以外の場所で遺伝子が発現することを言う。例えば、化学受容体遺伝子としてヒトの味覚受容体遺伝子を用いる場合、本来ならば、ヒトの味細胞で発現する該味覚受容体遺伝子がショウジョウバエの味ニューロンにおいて異所性発現することになる。本発明の形質転換ショウジョウバエは、外来の化学受容体遺伝子をショウジョウバエの味ニューロンで特異的に発現するように導入すればよい。この際、好ましくはGal4/UASバイナリー発現系を用いる。Gal4/UASバイナリー発現系は、酵母の転写因子であるGAL4タンパク質とその標的配列であるUAS(upstream activator sequence)を利用した転写機構を用いた発現系である（Brandら, 1993, Development, vol. 118, pp. 401-415)。GAL4タンパク質は転写調節因子であり、GAL4転写調節因子の認識配列であるUAS（上流活性化配列）に結合し、UASに連結された目的遺伝子の転写が活性化され、該目的遺伝子の発現を誘導する。特定の組織又は器官で特異的に作用する組織特異的なプロモーターとGal4遺伝子を連結した構築物であるGal4ドライバーとUASの下流に目的遺伝子を連結した構築物をショウジョウバエに導入することにより、特定の組織又は器官でGAL4タンパク質が発現し、発現したGAL4タンパク質がUASに結合し、UAS下流の目的遺伝子を発現させることができる。上記のGal4/UASバイナリー発現系をショウジョウバエに構築するためには、例えば、Gal4ドライバーを形質転換により導入したショウジョウバエとUASと目的遺伝子を連結した構築物を形質転換により導入したショウジョウバエを交配し、Gal4ドライバー及びUASと目的遺伝子を連結した構築物の両方を有するショウジョウバエを得ればよい。本発明においては、ショウジョウバエの味ニューロンで目的の遺伝子を発現させるため味ニューロンに特異的なプロモーターとGal4遺伝子を連結すればよい。このようにショウジョウバエの味ニューロンで特異的に機能するプロモーターとして、ショウジョウバエの糖受容体遺伝子であるGr5aのプロモーターを用いればよい。該プロモーターの下流にGal4のDNAを連結したGr5a-Gal4ドライバーを含むベクターを用いて形質転換したGal4ドライバーを有するショウジョウバエとUASと目的遺伝子を連結した構築物を含むベクターを用いて形質転換したショウジョウバエを交配すればよい。
【００２４】
一例として、Gr5a-Gal4構築物を有するショウジョウバエはUeno et al., 2006, J Neurosci, vol. 26, pp. 6143-6152に記載されている方法で作製することができる。すなわちまずショウジョウバエゲノムから、Gr5aの第１コドンATGの直ちに上流から、隣接する遺伝子CG3171の転写開始部位までに対応する配列である853bpのPCR産物を生成する。このGr5a上流断片とGal4配列とを例えばpP{CaSpeR-4}ベクターにサブクローニングする。該Gr5a-Gal4構築物を注入することによりw Gr5a+; Gr5a-Gal4ショウジョウバエを作製することができる（同文献第6144頁左欄Material and Methods）。また、ショウジョウバエの形質転換に用いることのできるUASを含むベクターとしては、例えばpUASTベクターが挙げられる（Brand, A. H. and Perrimon, N., (1993). Development, vol. 118, pp. 401-415）。まず目的の遺伝子をPCR等で増幅して例えばプラスミドベクターにクローニングし次いでpUASTベクターにサブクローニングする。次いで目的遺伝子を含有するpUASTベクターをショウジョウバエに導入ずればよい。形質転換方法としては慣用のどのような方法を用いてもよく、例えば該pUASTベクターをショウジョウバエの胚、特に野性型ショウジョウバエであるw1118の胚にマイクロ注入することにより行うことができる。このようにして得られたショウジョウバエ系統のその他の生物学的性質は正常ショウジョウバエと変わらない。糖受容体であるGr5aはショウジョウバエの味ニューロンで特異的に発現するので、上記のように作製したGr5a-Gal4ドライバーとUAS-目的遺伝子構築物を有するショウジョウバエにおいて、味ニューロンにおいて特異的に目的遺伝子が発現する。
【００２５】
本発明においては、目的遺伝子として以下に説明する化学受容体をコードする遺伝子を用いればよい。
【００２６】
化学受容体は、生体において、リガンドである化学物質を受容して情報伝達をし得るタンパク質であり、本発明において用いる化学受容体は限定されない。また、本発明の化学受容体は、任意の生物に由来するものでありうるが、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト由来である。化学受容体の例として、味覚受容体、好ましくはヒトの味覚受容体が挙げられる。ヒトには、甘味・苦味・酸味・塩味・旨味の5つの味覚があり、それぞれの味覚について味覚受容体が存在する。例えば、酸味と塩味は味細胞で発現するチャネル型受容体で認識され、甘味・苦味・旨味はG蛋白質共役型受容体で認識される。これらのいずれの味覚受容体を用いることができる。具体的には、甘味受容体及び旨み受容体としてT1R2、T1R3等のT1ファミリーの受容体が挙げられ、苦味受容体としてT2R4、T2R38等のT2ファミリーの受容体が挙げられ、酸味受容体としてPKD2L1、LKD1L3等のPKDファミリーの受容体が挙げられる。T2Rファミリー等のGタンパク質共役受容体（GPCR）のファミリーの受容体は細胞外刺激に応答してGタンパク質に結合し、二次的なメッセンジャー物質の産生を促進しうる。例えば、T2R4はクロロフェニラミン、コルヒチン、安息香酸デナトニウム、キニーネ及び他の苦味物質により活性化される苦味受容体であり、T2R38はフェニルチオカルバミド（PTC）及びプロピルチオウラシル（PROP）に対するリガンド特異性を有する苦味受容体である（Meyerhof et al., (2010), Chem Senses, 35, 157-170）。また、PKDファミリーの受容体であるPKD2L1は多発性嚢胞腎様イオンチャネルである、酸味受容体である。本発明において、苦味受容体、酸味受容体等の受容体を総称して味覚受容体あるいは味物質受容体等と呼ぶ。本発明において「味覚受容体活性」とは、タンパク質受容体が味物質を受容してシグナルを伝達する活性であり、特に苦味受容体であればリガンド苦味物質、酸味受容体であればリガンド酸味物質を受容したときの活性をいう。味覚受容体活性は、例えば本発明の受容体タンパク質を発現する形質転換細胞に味物質刺激を加えた場合に、カルシウム放出、膜電位変化等の細胞内変化が生じるアッセイ系を用いて測定することもできるが、好ましくは本発明の受容体タンパク質を味ニューロンで発現させ味物質刺激を加えた場合に形質転換ショウジョウバエの摂食嗜好性の変化により測定することもできる。本明細書において味覚受容体活性は味物質受容体活性と同義に用いる。
【００２７】
本発明で用いるT2R4、T2R38、PKD2L1の塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９、１０、１１、１２、１３、１４に例示する。該アミノ酸配列を含むタンパク質が味覚受容体活性を有する限り、当該アミノ酸配列は複数個、好ましくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加等の変異を有してよい。また、配列番号９、１０及び１１とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸も本発明で用いることができる。ストリンジェントな条件とは、対象塩基配列と90%以上の相同性、好ましくは95％以上の相同性、より好ましくは９７％以上の相同性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることをいう。通常、完全ハイブリッドの融解温度より約5℃〜約30℃、好ましくは約10℃〜約25℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件は、例えばJ. Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載されている。
【００２８】
本発明の味物質受容体は、ショウジョウバエのどの部位で発現させてもよいが、感覚細胞、特に食道、唇弁、ふ節、産卵器官、羽等に存在する味ニューロン（味受容体ニューロン(GRN)）において発現させることが好ましい。味ニューロンは、天然においてショウジョウハエの味物質受容体が発現しており、味覚受容器官として機能する神経細胞をいう。味ニューロンとしては、糖を受容するGr5aや苦味物質を受容するGr66a等のGR（Gustatory Receptor)を発現している神経細胞が挙げられる。
【００２９】
得られた形質転換ショウジョウバエは、さらに他の系統と交配することも可能であり、交配を重ねることで、複数の味覚物質受容体遺伝子を発現するショウジョウバエを作製することもできる。上記のようにして得られた形質転換ショウジョウバエは、卵の状態で保存・輸送可能である。
【００３０】
形質転換及び導入遺伝子の発現は、慣用の方法により、例えばRT-PCR法により確認することができる。具体的にはGal4ドライバーの効力は、GAl4及びUAS構築物の両方を保有する形質転換体のRT-PCR産物の量を、UAS構築物のみを保有する対照形質転換体のそれと比較することにより推定することができる。当業者であれば通常の知識に基づいてPCRのためのプライマー設計や条件選択を行うことができる。
【００３１】
（Ｂ）  外来化学受容体遺伝子を味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエを用いた味覚物質の試験方法
上記の方法で作製したヒト味物質受容体遺伝子等の外来化学受容体遺伝子をショウジョウバエの味ニューロンで発現する形質転換ショウジョウバエを用いて味覚物質の試験を行うことができる。ここで、味覚物質の試験とは、特定の味覚物質を評価し、スクリーニングする方法、試験化合物の味覚を判定する方法を含む。
【００３２】
該方法は、例えば以下の(1)〜(3)のステップを含む。
(1)  ヒト味物質受容体遺伝子等の外来化学受容体遺伝子を味ニューロンで発現する組換えショウジョウバエを用意するステップ、
(2)  該形質転換ショウジョウバエを、試験化合物を含む溶液と、該試験化合物を自由摂食できる状態で接触させるステップ、
(3)  該形質転換ショウジョウバエが前記試験化合物を含む溶液を摂食したか否かをモニタリングするステップ。
【００３３】
(1)の「ヒト味物質受容体遺伝子等の外来化学受容体遺伝子を味ニューロンで発現する」とは、ヒト味物質受容体遺伝子等の外来化学受容体遺伝子が元々発現する場所で発現した場合に、該受容体の機能を発揮するように発現することをいう。すなわち、前記化学受容体のリガンドがショウジョウバエの味ニューロンで発現している化学受容体に結合すると、化学受容体がin vivoで活性化し、味ニューロンからショウジョウバエの中枢神経系へと情報が伝達され、リガンドと化学受容体の種類により、摂食行動又は忌避行動という生理現象が起こる。例えば、ヒトの味物質受容体遺伝子をショウジョウバエの味ニューロンで発現させた場合、ショウジョウバエが該味物質と摂食した場合、ショウジョウバエは該味物質に対して嗜好性を示し摂食行動が起こることにより、ショウジョウバエの味ニューロンで発現したヒトの味物質受容体はヒトの味覚系をショウジョウバエにおいて再現させることができる。
【００３４】
(2)の「試験化合物を含む溶液と、該試験化合物を自由摂食できる状態で接触させる」とはショウジョウバエが嗜好により摂食可能な状態で接触させることをいう。摂食とはショウジョウバエの味ニューロンを有する吻やふ節と試験化合物を含む溶液を接触させることをいう。該接触により吻やふ節の味ニューロンに発現したヒト味物質受容体等の外来化学受容体にリガンドである試験化合物が結合し、上記（１）のように摂食行動等が起こり得る。例えば、容器に試験化合物を含む溶液を入れ、該容器にショウジョウバエを嗜好に応じて自由に摂食できるような状態で放すことをいう。
【００３５】
(3)の形質転換ショウジョウバエが前記試験化合物を含む溶液を摂食したか否かをモニタリングするとは、ショウジョウバエが試験化合物を含む溶液を吻を用いて摂食したかを調べることをいう。摂食行動を観察してもよいし、試験化合物に色素を含ませておいて、摂食により色素がショウジョウバエ消化器に取り込まれたか否かを観察してもよい。ショウジョウバエが消化器に色素を取り込んだ場合、ショウジョウバエの腹部の色が前記色素の色になるので、体外から目視により観察することができる。このモニタリングは、味覚に関連した感覚神経の神経応答性を測定することでもある。
【００３６】
ヒト味物質受容体遺伝子等の外来化学受容体遺伝子をショウジョウバエの糖を受容する受容体であるGr5aを発現する味ニューロンで発現させた場合、該外来化学受容体にリガンドが結合するとショウジョウバエは該外来化学受容体に嗜好性を示し、摂食行動が起こる。一方、外来化学受容体遺伝子をショウジョウバエの苦味物質を受容する受容体であるGr66aを発現する味ニューロンで発現させた場合、該外来化学受容体にリガンドが結合するとショウジョウバエは該外来化学受容体に嗜好性を示さず、忌避行動を起こし、結局摂食行動が起こらない。
【００３７】
特定の味物質を評価し、スクリーニングするためには、例えば、ヒトが甘味と知覚し得る味物質をスクリーニングする場合、ショウジョウバエのGr5aを発現する味ニューロンにヒトにとっての甘味物質をリガンドとして結合する甘味物質受容体を発現させ、該ショウジョウバエを用いて試験化合物を上記方法により、試験すればよい。試験化合物が甘味物質の場合、ショウジョウバエは該化合物と接触することにより摂食行動を起こす。同様に、ヒトが苦味と知覚し得る味物質をスクリーニングする場合、ショウジョウバエのGr5aを発現する味ニューロンにヒトにとっての苦味物質をリガンドとして結合する苦味物質受容体を発現させ、該ショウジョウバエを用いて試験化合物を上記方法により、試験すればよい。試験化合物が苦味物質の場合、ショウジョウバエは該化合物と接触することにより摂食行動を起こす。この際、ショウジョウバエのGr66aを発現する味ニューロンを利用した場合、摂食行動ではなく、忌避行動が起こる。
【００３８】
また、試験化合物の味覚を判定するには、ヒトの種々の味覚、すなわち、５種類の味覚の受容体を味ニューロンで発現する、複数のショウジョウバエをそれぞれ作製し、前記試験化合物とショウジョウバエとを摂食させ、どの味覚受容体を有するショウジョウバエが該試験化合物との接触により摂食行動を起こすかを調べればよい。例えば、試験化合物が苦味物質の場合、ヒトの苦味物質受容体をGr5aを発現する味ニューロン上で発現するショウジョウバエが摂食行動を起こすので、該試験化合物が苦味物質であることがわかる。
【００３９】
この際、ヒトの甘味・苦味・酸味・塩味・旨味の5つの呈味物質の受容体を有する５種類の形質転換ショウジョウバエを作製しておき、該５種類のショウジョウバエの１種、２種、３種、４種又は５種を用いればよい。
【００４０】
上記の試験は、例えば、ショウジョウバエが摂食した試験化合物を含む溶液の量により定量的に解析することができ、このようにして得られた定量値は神経応答性を示す値でもある。該定量値により、ある食品中の呈味成分を分析することができる。例えば、ヒトのそれぞれの呈身物質の受容体を有する複数のショウジョウバエを用いてある食品を試験した場合、該食品中に含まれる呈味成分に比率により、各呈味成分に対する神経応答性が異なり、それぞれの呈味成分に対する神経応答性により、前記食品の味質を総合的に評価することができる。
【００４１】
なお、摂食行動の観察とは、摂食嗜好性の変化も含み、摂食嗜好性の変化とは、ある呈味物質が含有される食糧又は溶液をより摂食するようになり、すなわち当該呈味物質に対する嗜好性が強化される（高まる）又はある呈味物質が含有される食糧又は溶液をさほど摂食しなくなり、すなわち当該呈味物質に対する嗜好性が減弱される（低下する）ことを包含するものとする。
【００４２】
摂食行動の観察において、以下の摂食嗜好性試験を行ってもよい。
【００４３】
昆虫の味覚化学感覚子は、接触化学検出のための単純な毛様器官であり、２〜４個の双極性受容体ニューロンを有する。各ニューロンは異なる味物質受容体及び／又は他の種類の化学受容体のサブセットを発現し、糖、塩、苦味物質又は食物若しくは環境にある水分のような化合物を検出する。ハエのニューロンの機能を分析する生理学的又は行動的方法が確立されている。そのような方法の一例として、Uenoらが記載した摂食嗜好性試験が挙げられる(2001, Curr, Biol, vol. 11, pp. 1451-1455)。さらに、Uenoらの方法を改変して用いてもよい。例えば、食物を枯渇させた状態のショウジョウバエをマイクロテストプレートに入れ、試験物質を含有する試験溶液及び試験物質を含有しない対照溶液の２種類の溶液を二者択一的に選択できるようにする。この際、各溶液は、ハエの摂食選択の目視検査のために、着色することが好ましい。ショウジョウバエの摂食試験の後に、実体顕微鏡でハエの腹部の着色を検査することによりショウジョウバエがどちらを嗜好し二者択一的に選択したかを知ることができる。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例は、例示のみを意図し、何ら本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。特に断らない限り、試薬は、市販されているか、又は当技術分野で慣用の手法、公知文献の手順に従って入手又は調製する。本発明の精神から逸脱することなく、記載する手順を改変することが可能である。
【００４５】
実施例１  ショウジョウバエ形質転換体の構築
ヒトT2R遺伝子はイントロン配列を含まないことから、ヒト苦味受容体T2R4及びT2R38遺伝子をコードする配列はヒトゲノムDNAサンプルから取得した。ヒト酸味受容体PKD2L1 cDNAクローンはかずさDNA研究所から取得した（製品ID：OR909159、千葉、日本）。コード配列は、Hisタグ配列と共に開始コドンを有する遺伝子特異的フォワードプライマー及び終止コドン配列を有するリバースプライマーを用いて増幅した。T2R4遺伝子をクローニングするために、フォワード及びリバースプライマーに、それぞれBglII及びNotI制限配列を追加した。用いた配列は、以下のとおりである：
agatctatgcatcaccatcaccatcaccttcggttattctatttctctgctatt （配列番号１）及び
gcggccgcctattttttgaaacaaagaatcttctttgctgttgttttc（配列番号２）
【００４６】
T2R38遺伝子をクローニングするために、フォワード及びリバースプライマーに、それぞれNotI及びKpnI制限配列を追加した。用いた配列は、以下のとおりである：
ggtaccatgcatcaccatcaccatcacttgactctaactcgcatccgcact（配列番号３）
ggtacctcagcacagtgtccgggaatctgccttgtggtcggc（配列番号４）
【００４７】
PKD2L1遺伝子のコード配列は、開始コドン及びHisタグを含有するフォワードプライマー及び終止コドンを有するリバースプライマーを用いて増幅した。用いた配列は、以下のとおりである：
atgcatcaccatcaccatcacaatgctgtgggaagtcctga（配列番号５）
ttaactcctctgcaacgttggaatctc（配列番号６）
【００４８】
PCR産物はプラスミドベクターにクローニングし、Gal4ドライバーにより標的配列を増幅するためのハエベクターであるpUASTにサブクローニングした。
【００４９】
各pUAST構築物をw1118胚にマイクロ注入して、形質転換体を取得した。次に、第３染色体に該インサートを有する形質転換体を選択し、これをAct79B-Gal4、elav-Gal4 (Bloomington Stock Center)又はGr5a-Gal4 (Ueno et al., (2006), J Neurosci, 26, 6143-6152)系統に交配した。次に、Gal4及びUAS構築物の両方をホモ接合体として保有する形質転換株を確立し、本発明に使用した。
【００５０】
実施例２  形質転換ショウジョウバエ組織における哺乳動物味覚受容体の発現の確認
方法
RT-PCRにより形質転換ショウジョウバエ組織における哺乳動物味覚受容体の発現を確認した。Gal4ドライバー（Gr5a-Gal4, elav-Gal4又はAct79B-Gal4）に対応して、種々の組織から総RNAを単離し精製した(RNeasy Micro, Qiagen社)。Gr5a-Gal4, elav-Gal4又はAct79B-Gal4が成体における糖受容体ニューロンである味ニューロン、中枢神経系及び死体における発現を駆動することから、50個体の吻、37個体の頭部及び5個体の腹部をそれぞれmRNA単離のために切除した。逆転写は、逆転写酵素(Omniscript RT又はSensiscript RT, Qiagen社)及びオリゴdTプライマーを用いて行った。次いで上記の遺伝子特異的プライマーを用いてT2R及びPKD2L1 cDNAを増幅した。Gr5aプロモーター領域のcDNAはUeno et al., (2006), J Neurosci, 26, 6143-6152に記載の方法で増幅した。各Gal4ドライバーの効力は、GAl4及びUAS構築物の両方を保有する形質転換体におけるRT-PCR産物の量を、UAS構築物のみを保有する対照形質転換体のそれと比較することにより推定した。
【００５１】
異なる調製物からのcDNAの量は、リボソームタンパク質L32遺伝子であるRp49の平行分析により正規化し、これによりテンプレートcDNAはRp49に対する遺伝子特異的プライマーの対であるcaccatccgcccagcatacag（配列番号７）及びaatctccttgcgcttcttggaggag（配列番号８）を用いたRT-PCR産物の量とほぼ同一の量を生じた。
【００５２】
結果
哺乳動物味覚受容体の発現が、Gal4ドライバーの制御下で誘導されるかを確認するために、RT-PCR分析により、転写産物を分析し、これを一部の内因性転写産物と比較した。結果を図１に示す。
【００５３】
Gal4ドライバーを有しないUAS構築物のみを保有する形質転換体も、比較のための対照として用いた。分析の前に、組織から単離された全RNAから逆転写されたcDNAの量は、内因性リボソームタンパク質遺伝子Rp49により調整した（図１Ａの第２行）。最初の分析では、T2R38発現組織からの転写産物をUAS-T2R38構築物及びGal4ドライバー構築物の両方を保有するハエと、UAS-T2R38構築物のみを保有するハエとを比較した。Gr5aを発現するニューロンにおける発現を制御するGr5aプロモーター-Gal4(本明細書において、Gr5a-Gal4という。)は、吻でT2R38転写産物を有意に増大させた（図１Ａ）。同様に、成体中枢神経系において発現を駆動するelav-Gal4は、成体頭部において転写産物を増強し（図１Ａの第２列の対）、また、成体の死体において発現を駆動するAct79B-Gal4は、腹部において転写産物を増強させた（図１Ａの第３列の対）。
【００５４】
一方で、Gr5a-Gal4/UAS-T2R38ハエの吻における内因性Gr5a転写産物の量は、対照とさほど相違せず（図１Ａの第３行）、これはRp49転写産物について観察されたのと同様であった。
【００５５】
苦味受容体T2R4及び酸味受容体PKD2L1の異所性発現のために、類似のRT-PCR分析をGr5a-Gal4/UAS-T2R4及びGr5a-Gal4/UAS-PKD2L1形質転換体についても行った（図１Ｂ）。T2R4転写産物の量は、Gr5a-Gal4/UAS-T2R4の吻においても増大していた。この結果は、哺乳動物苦味受容体T2R4及びT2R38がGr5a-Gal4ドライバーの制御下で糖受容体ニューロンにおいて発現可能であることを示している。しかしながら、Gr5a-Gal4/UAS-PKD2L1形質転換体の吻ではPKD2L1転写産物の量に有意な増大は得られなかった。このことは、Gr5a-Gal4ドライバーはGr5aニューロンにおいてPKD2L1の転写を効果的に増強しないか、又はPKD2L1転写産物は他の種類の細胞で非特異的に発現されることを示唆する。
【００５６】
実施例３  摂食嗜好性試験
方法
哺乳動物の味物質受容体が宿主Gr5aニューロンにおいて機能的に作用し、内因性シグナル伝達機構にカップリングすることを確認するために、Gr5a-Gal4形質転換体を用いて摂食嗜好性試験を実施し、味覚応答における変化がトランス遺伝子の異所性発現と関連しているか分析した。Gr5a-Gal4/UAS-T2R又はUAS-PKD2L1形質転換体株における遺伝的バックグラウンドは可変性であることから、本発明者らは、各ホモ接合性トランスジェニック系統を常染色体バランサー系統と交配させた。第２及び第３染色体で種々の組合せを保有する全てのF2組換えハエを、摂食嗜好性試験に供した。
【００５７】
行動嗜好性アッセイはUenoら, (2001), Curr Biol, 11, 1451-1455に記載の方法で、一部改変を加えて実施した。食物を枯渇させた状態のハエをマイクロテストプレートに入れ、暗所で25℃にて１時間にわたり、試験リガンドを含有する溶液及びリガンドを含有しない対照溶液の２種類の溶液を選択できるようにした。各溶液は、ハエがどちらの摂食を選択したかを目視検査するために、それぞれ青色(0.125 mMブリリアントブルーFCF)又は赤色の食物着色料(0.5 mM アシッドレッド27)を含有させた。0.1 mM塩酸キニーネ、0.03 mM安息香酸デナトニウム及び10 mMフェニルチオカルバミド(PTC)(和光、大阪、日本)をT2R4及びT2R38形質転換ハエ用の試験溶液として用いた。苦味物質である塩酸キニーネ及び安息香酸デナトニウムはT2R4の特異的リガンドであり、フェニルチオカルバミド(PTC)はT2R38の特異的リガンドである(Meyerhof et al., (2010), Chem Senses, 35, 157-170)。T2R4及びT2R38形質転換ハエ用の試験溶液及び対照溶液のいずれも、1mMスクロース溶液に混合した。
【００５８】
PKD2L1形質転換体ハエ用に、蒸留水に溶解させた上記の色素を混合した10 mMクエン酸(和光、大阪、日本)及び蒸留水を、それぞれ試験溶液及び対照溶液として用いた。野生型のハエは1 mMスクロースを含まないクエン酸に対してかなりの嗜好性を示したことから、試験溶液は10 mMクエン酸及び青色色素のみを含み、対照溶液は赤色色素のみを含有した。摂食試験の後に、ハエを冷蔵庫に移し、実体顕微鏡の下で腹部の着色を検査した。腹部の着色により、ハエを青色（グループ１）、赤色（グループ２）、紫色（グループ３、混合）又は着色無し（グループ４）に分類した。なお、図２−１、図２−２、図２−３及び図３中の水平の棒における白抜きの部分はグループ１に対応し、黒塗りの部分はグループ２に対応し、斜線部分はグループ３に対応する。
【００５９】
受容体に対するリガンドを含む試験溶液は青色色素を含有することから、嗜好性指数(Preference Index, PI)は
PI  ＝  (NBlue＋NPurple／２)／NColored × 100
[式中、NBlue及びNPurpleは、それぞれ、グループ１及びグループ３に分類されたハエの個体数である]
として定義される。また、NColoredは、
NColored  ＝  NBlue ＋ NPurple ＋ NRed 
[式中、NBlue、NPurple及びNRedは、それぞれ、グループ１、グループ３及びグループ２に分類されたハエの個体数である]
すなわち、有色の腹部を有するハエを合計した数として定義される。ショウジョウバエ系統の間の遺伝的バックグラウンドによる偏りの可能性を最小化するために、ホモ接合体トランスジェニック系統であるGr5a-Gal4; UAS-T2R4、Gr5a-Gal4; UAS-T2R38又はGr5a-Gal4; UAS-PKD2L1（Gr5a-Gal4; UAS-T2R4は、Gr5a-Gal4構築物とUAS-T2R4構築物を含む遺伝子の型を示す）を、常染色体バランサー系統CyO/Sp; Sb/TM3,Serと交配させ、第２及び第３染色体構築物及び優性マーカーの種々の組合せを保有するF2組換体を得て、以降の実験に用いた。
【００６０】
統計分析は以下のようにして行った。上記の摂食嗜好性アッセイの後に、全てのF2組換体ハエを、第２及び第３染色体上の優性マーカーに基づく遺伝子型について、及び腹部の色により判定した摂食嗜好性について、個体ごとに分類した。Gal4及びUAS構築物の両方をホモ接合体又はヘテロ接合体として保有しているF2ハエの摂食嗜好性を、該２つの構築物の一方又は双方を保有しない残りのF2ハエ全てにおける嗜好性と比較した。嗜好性指数(PI)は比率であることから、嗜好性アッセイにおけるグループ１、２又は３として分類されたF2ハエの数を合計し、各グループの合計数を、カイ二乗検定により統計的に比較した。
【００６１】
結果
方法において記載したように、摂食試験の後に、個々のハエを腹部色素の色に従い４つのグループに分類し、次いで実体顕微鏡の元で各グループのハエの数をカウントした。結果を図２−１、図２−２及び図２−３並びに図３に示す。試験溶液に対する嗜好性は上記のとおり定義した嗜好性指数(PI)として示し（図２−１、図２−２及び図２−３並びに図３の垂直の棒）、さらに％比での生データとして（図２−１、図２−２及び図２−３並びに図３の水平の棒）示した。図２−１、図２−２及び図２−３並びに図３は、ホモ接合体又はヘテロ接合体としてGr5a-Gal4構築物とUAS-T2R又はUAS-PKD2L1構築物を保有するすべてのF2ハエは、該２つの構築物のいずれも保有しないか、又はそのうちの一つしか保有しない残りのF2ハエと比較した結果を示す（図２−１、図２−２及び図２−３並びに図３においてそれぞれ、＋及び−として示す）。該結果は、約200〜950のF2ハエに基づく摂食嗜好性を各形質転換体型及び各試験リガンドについて分析して得た結果である。
【００６２】
0.1 mMキニーネ(図２−１)及び0.03 mMデナトニウム(図２−２)又は10 mM PTC(図２−３)に対する嗜好性を、T2R4又はT2R38受容体を有するF2ハエについて、上記の苦味物質を含む試験溶液を用いて調べた。野生型ハエが試験溶液を穏やかに拒絶するように、試験溶液の濃度を予め決定しておいた。特異的にT2Rファミリー受容体を活性化するための３種の苦味物質の最少濃度は、T2R4についてはキニーネが0.01 mM、デナトニウムが0.3 mMであり、そしてT2R38についてはPTCが0.02 μMであった。本実施例で用いた濃度は、Meyerhof et al., (2010), Chem Senses, 35, 157-170で報告されている、HEK-293細胞発現研究で用いられた濃度よりも、キニーネ、エナトニウム及びPTCについて、それぞれ10、0.1及び5×105倍高かった。
【００６３】
苦味溶液と対照溶液の二者択一試験において、試験溶液及び対照溶液の両方を選択したグループ３のハエ（紫の腹部）は、グループ１（青色腹部）又はグループ２（赤色腹部）よりも多かった。
【００６４】
Gr5a糖ニューロン上でT2R4を発現する形質転換体F2ハエ及び他の非発現F2ハエでグループ１、２及び３として分類されたハエの数についてカイ二乗検定を行ったところ、T2R4を発現する形質転換体の0.1 mMキニーネ(P<0.001)及び0.03 mMデナトニウム(P<0.05)への嗜好性が非発現F2ハエと比較して小さいながらも有意に増大することが示された。
【００６５】
興味深いことに、Gr5a糖ニューロン上でT2R38を発現する形質転換体F2ハエは、反対に、非発現F2ハエと比較して、２種類のT2R4リガンドに対する嗜好性に関し有意の減少を示した(0.1 mMキニーネについてはp<0.05; 0.03 mMデナトニウムについてはp<0.05)。同様に、Gr5a糖ニューロン上でT2R38を発現するF2ハエは、非発現F2ハエと比較して、10 mM PTCに対する嗜好性の増大を示した(p<0.01) (図２−３)。
【００６６】
T2R4発現形質転換体は非発現対照と比較して統計的に有意な差異を示さなかった(P>0.5)ことから、T2R4又はT2R38をGr5aニューロン上で発現させたときに、10 mM PTCは特異的にT2R38を活性化するが、T2R4は活性化しないことが示唆される。
【００６７】
Gr5aニューロン上で酸味受容体PKD2L1を発現する形質転換体ハエをクエン酸溶液を用いて分析した結果を図３に示す。野生型(w1118)ハエは1 mMスクロースを含まないクエン酸溶液に対して強固な嗜好性を示した。例えば、蒸留水に対する10 mMクエン酸溶液の平均的な嗜好性は、PIにして約75〜80％であった（データは示されていない）。最大に近い嗜好性値を比較するため、この実験ではF2組換体ハエの合計数を増やした（図３）。
【００６８】
Gr5a糖ニューロンでPKD2L1を発現するF2ハエと非発現対照ハエとの、10 mMクエン酸に対する嗜好性についてカイ二乗検定を行ったところ、PKD2L1を発現するF2ハエと非発現対照ハエとの間で小さいながらも有意の差異が示され(P<0.05)、このことはクエン酸がGr5aニューロンで発現されたときのPKD2L1を活性化することを示唆する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【配列表】
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