(57)【要約】      （修正有）【課題】血栓形成抑制効果と血管内皮細胞接着性を有する生体吸収性薬物徐放担体とそれを用いた医療機器の提供。【解決手段】細胞接着性ペプチド含有高分子がクエン酸活性エステル体により架橋された生体吸収性高分子、および脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子を含有する生体吸収性薬物徐放担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性ペプチド含有高分子がクエン酸活性エステル体により架橋された生体吸収性高分子、および脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子を含有することを特徴とする生体吸収性薬物徐放担体。
【請求項２】
細胞接着性ペプチド含有高分子と脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子との割合が質量比で90/10〜10/90の範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の生体吸収性薬物徐放担体。
【請求項３】
細胞接着性ペプチド含有高分子は、ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、コラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、酸処理コラーゲン、およびこれらの誘導体から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の生体吸収性薬物徐放担体。
【請求項４】
細胞接着性ペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン（YIGSR）、およびイソロイシン−リシン−バリン−アラニン−バリン（IKVAV）のペプチド配列から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の生体吸収性薬物徐放担体。
【請求項５】
クエン酸活性エステル体は、クエン酸のカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、またはこれらの誘導体によって少なくとも２つ以上修飾した生体低分子誘導体であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の生体吸収性薬物徐放担体。
【請求項６】
脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリεカプロラクトンおよびこれらの共重合体の1種または2種以上の組み合わせであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の生体吸収性薬物徐放担体。
【請求項７】
生体に埋め込みまたは接合して使用されることで医療上の処置を行うことができる医療機器であって、少なくともその生体に埋め込みまたは接合される部分の表面が、請求項１から６のいずれかに記載の生体吸収性薬物徐放担体により構成されていることを特徴とする医療機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体に接触または埋め込まれて使用され、その状態が長期に続くと、時間の経過とともに、生体内に吸収されてゆく生体吸収性薬物徐放担体とそれを用いた医療機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤溶出性ステント（特許文献１〜３参照）は、狭窄した血管を拡張し、血管平滑筋の過増殖により引き起こされる再狭窄を抑制するための薬物を持続的に溶出する医療機器として、これまで、金網状金属材料表面に薬剤を含有した高分子層がコーティングされ実用化されている。
【０００３】
これらは、血栓形成抑制効果を示すとともに、薬物を徐放するが、コーティングが合成高分子であるため内皮組織が形成されにくい、溶出した薬物は内皮細胞の増殖も抑制してしまうといった問題がある。
【０００４】
したがって、ステントを血管内に留置後、元の組織に戻るのに多大な時間を要する。
【０００５】
このように、血液と長期間接触して使用される医療機器の表面改質には限界があり、血管内皮細胞の抗血栓性を利用しようとする試みが行われている。
【０００６】
また、生体内の血管において、血管内皮細胞がプロスタグランジンI2を産生して血小板凝集を抑制し、血液凝固反応を抑制するため血栓は形成されないが、血管内皮細胞が剥離した部分には血栓が形成されてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２６４２５３号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５６９９号公報
【特許文献３】特開２００４−０２４８８９号公報
【特許文献４】特開２０１１−１６０８５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した問題点の解決には、炎症反応や血栓形成を起こさないことに加え、血管内皮細胞の接着性も併せ持ったマトリックスの創製が不可欠である。さらに、生体内で長期にわたり薬物を徐放することも必要である。本発明者らは、これまでの生体吸収性担体に関する研究成果（特許文献４）等も考慮し、新規な生体吸収性薬物徐放担体の検討を試みた。
【０００９】
本発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、血栓形成抑制効果血栓形成抑制効果と血管内皮細胞接着性を有する生体吸収性薬物徐放担体とそれを用いた医療機器を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明の生体吸収性薬物徐放担体は、細胞接着性ペプチド含有高分子がクエン酸活性エステル体により架橋された生体吸収性高分子、および脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子を含有することを特徴としている。
【００１１】
この生体吸収性薬物徐放担体において、細胞接着性ペプチド含有高分子と脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子との割合が質量比で90/10〜10/90の範囲内であることが好ましい。
【００１２】
この生体吸収性薬物徐放担体において、細胞接着性ペプチド含有高分子は、ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、コラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、酸処理コラーゲン、およびこれらの誘導体から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１３】
この生体吸収性薬物徐放担体において、細胞接着性ペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン（YIGSR）、およびイソロイシン−リシン−バリン−アラニン−バリン（IKVAV）のペプチド配列から選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１４】
この生体吸収性薬物徐放担体において、クエン酸活性エステル体は、クエン酸のカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、またはこれらの誘導体によって少なくとも2つ以上修飾した生体低分子誘導体であることが好ましい。
【００１５】
この生体吸収性薬物徐放担体において、脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリε-カプロラクトンの1種または2種以上の共重合体であることが好ましい。
【００１６】
本発明の医療機器は、生体に埋め込みまたは接合して使用されることで医療上の処置を行うことができる医療機器であって、少なくともその生体に埋め込みまたは接合される部分の表面が、上記の生体吸収性薬物徐放担体により構成されていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、血栓形成抑制効果と血管内皮細胞接着性を有する生体吸収性薬物徐放担体とそれを用いた医療機器が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝100/0）を示す実体顕微鏡像である。
【図２】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝100/0）を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図３】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝80/20）を示す実体顕微鏡像である。
【図４】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝80/20）を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図５】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝60/40）を示す実体顕微鏡像である。
【図６】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝60/40）を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図７】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝40/60）を示す実体顕微鏡像である。
【図８】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝40/60）を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図９】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝20/80）を示す実体顕微鏡像である。
【図１０】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝20/80）を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図１１】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝0/100）を示す実体顕微鏡像である。
【図１２】生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果（PLLA/AlGelatin-TSC＝0/100）を示す走査型電子顕微鏡写真である。
【図１３】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝100/0）上でHUVECを1日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１４】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝80/20）上でHUVECを1日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝60/40）上でHUVECを1日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝40/60）上でHUVECを1日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１７】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝20/80）上でHUVECを1日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝0/100）上でHUVECを1日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１９】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝100/0）上でHUVECを7日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２０】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝80/20）上でHUVECを7日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２１】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝60/40）上でHUVECを7日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２２】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝40/60）上でHUVECを7日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２３】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝20/80）上でHUVECを7日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２４】生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC＝0/100）上でHUVECを7日間培養した後の細胞の形態を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２５】調製したステントの断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【図２６】調製したステントの断面の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明の生体吸収性薬物徐放担体は、細胞接着性ペプチド含有高分子がクエン酸活性エステル体により架橋された生体吸収性高分子、および脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子を含有している。
【００２１】
細胞接着ペプチド含有高分子は、クエン酸活性エステル体との架橋反応が可能で、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン（YIGSR）、イソロイシン−リシン−バリン−アラニン−バリン（IKVAV）等のペプチド配列から選ばれる少なくとも1種の細胞接着ペプチドを有している高分子であることが必要である。
【００２２】
このようなものとしては、コラーゲン、アテロコラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、ゼラチン（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（RGD）含有）、酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、ケラチン、血清アルブミン、卵白アルブミン、遺伝子組み換えアルブミン、ヘモグロビン、カゼインおよびグロブリン、フィブリノーゲンおよびこれらの誘導体等が挙げられる。
【００２３】
さらに、アルカリ処理により分子内にカルボキシル基が存在し、かつクエン酸活性エステル体と反応するアミノ基を有している点で、アルカリ処理ゼラチン、アルカリ処理コラーゲン、およびその誘導体が好ましい。
【００２４】
ゼラチンは一般に、骨、皮を、酸またはアルカリで前処理した後、原料中のコラーゲンを温水によって加熱変性し、抽出したものであり、さらに、例えば、ろ過、イオン交換を施し、高温殺菌して製品化される。アルカリ処理ゼラチンにおけるアルカリの前処理は、石灰処理など、当業者に良く認識された工程である。
【００２５】
本発明では、新田ゼラチン株式会社製「ゼラチンLS-H、Lot.101109」などが使用できる。
【００２６】
生体吸収性高分子を構成する架橋剤としては、クエン酸活性エステル体が用いられる。クエン酸活性エステル体を用いることで、優れた血栓形成抑制効果と血管内皮細胞接着性を発現することができる。また、クエン酸活性エステル体を用いることにより分解性を制御可能である。
【００２７】
クエン酸活性エステル体としては、クエン酸のカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド、またはこれらの誘導体によって少なくとも2つ以上修飾した生体低分子誘導体が好ましい。
【００２８】
脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子としては、生分解性高分子自体の生体適合性、分解産物の安全性を考慮すると、乳酸、グリコール酸、γ−ブチロラクトン、δ−バレロラクトン、ε−カプロラクトン、テトラメチレンカーボネート、ジオキサノンの少なくとも１種類以上からなる重合体であることが好ましい。
【００２９】
より具体的には、例えば、ポリ（乳酸−グリコール酸）、ポリグリコール酸、ポリ(乳酸−ε−カプロラクトン)、ポリ(グリコール酸−ε−カプロラクトン)、ポリ−ｐ−ジオキサノン、ポリ（グリコール酸−トリメチレンカーボネート）、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸等が挙げられる。
【００３０】
なかでも、ガラス転移温度が例えば30〜80℃の範囲にあり、かつ、生分解速度が半年以内に生体内で分解消失する速度であるものが本発明において好ましく用いられる。これらのポリマーの分子量は、コーティング層の強度確保、コーティング作業効率等の観点から、10,000〜500,000が適当であり、好ましくは50,000〜200,000である。ここで分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した重量平均分子量（標準ポリスチレン換算値）である。
【００３１】
ポリ乳酸は、通常は、Ｌ乳酸単位から構成されるポリ-L-乳酸が好ましい。また、ポリ乳酸は、ホモポリマーのみならず、乳酸モノマーまたはラクチドと共重合可能な他の成分が共重合された乳酸系コポリマーであってもよい。このような他の成分としては、2個以上のエステル結合形成性の官能基を持つジカルボン酸、多価アルコール、ヒドロキシカルボン酸、ラクトン等が挙げられる。
【００３２】
ポリ乳酸は従来公知の方法で合成することができる。すなわち、特開平７−３３８６１号公報、特開昭５９−９６１２３号公報、高分子討論会予稿集４４巻、３１９８−３１９９頁に記載のような乳酸からの直接脱水縮合、または乳酸環状二量体ラクチドの開環重合によって合成することができる。
【００３３】
これらの原料から本発明の生体吸収性薬物徐放担体を調製する際には、細胞接着性ペプチド含有高分子、クエン酸活性エステル体、および脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子を含有する反応溶液を調製する。
【００３４】
この反応溶液において、細胞接着性ペプチド含有高分子と脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子との比率は、血栓形成抑制効果、血管内皮細胞接着性、薬物徐放性等を考慮すると、合成される生体吸収性薬物徐放担体における細胞接着性ペプチド含有高分子と脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子との割合が質量比で好ましくは90/10〜10/90、より好ましくは90/10〜20/80、さらに好ましくは85/15〜40/60となる範囲内である。
【００３５】
生体吸収性高分子を生成する時に、架橋密度を調整する場合は、細胞接着ペプチド含有高分子の反応溶液中濃度を調整することで行うことができる。
【００３６】
この濃度が低いと架橋密度が低く脆弱な生体吸収性高分子となり、生体への吸収が早期になされる。また、高濃度になると架橋密度が高くなり、強靭な生体吸収性高分子が得られ、生体内での吸収速度を緩やかにすることができる。
【００３７】
この生体内での適正な吸収速度は、その使用目的や使用規模により異なるので、それに合わせた強度を持たせるように、生体吸収性高分子の生成時の反応溶液濃度を調整することができる。例えば、溶液中における細胞接着性ペプチド含有高分子の濃度は、コーティング液の場合は5〜90質量％の範囲内にすることができる。なお、この高分子の濃度が過少であると、架橋密度が高い架橋構造が維持され難く、生体吸収性高分子が得られ難い。
【００３８】
細胞接着ペプチド含有高分子とその架橋剤であるクエン酸活性エステル体との混合割合は、良好な架橋反応を生じさせることや血栓形成抑制効果等を考慮すると、反応溶液中での細胞接着ペプチド含有高分子の濃度が10質量％であるとき、クエン酸活性エステル体を5〜40mMとするのが好ましい。
【００３９】
なお、クエン酸活性エステル体が過少であると、血栓形成抑制効果効果が得られにくくなる。これは、このクエン酸活性エステル体が不足する場合には架橋点が少なく、残存アミノ基量が多くなるため得られる生体吸収性高分子がプラスに電荷を帯びているためであると考えられる。
【００４０】
逆に、クエン酸活性エステル体が過剰であると、架橋密度が高い架橋構造が維持され難く、生体吸収性高分子が得られ難い。過剰であると個々の細胞接着ペプチド含有高分子とクエン酸のカルボキシル基の1つあるいは2つが結合して、架橋に使用されなくなり、その結果、架橋点が減少し、構造が維持されないためであると考えられる。
【００４１】
この反応溶液には、細胞接着性ペプチド含有高分子、脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子、およびクエン酸活性エステル体と共に、徐放のための薬剤を添加する。
【００４２】
薬剤としては、例えば、抗血栓剤、抗がん剤、免疫抑制剤、抗生物質、抗炎症剤、細胞分化誘導剤等が挙げられる。また、この薬剤は、低分子量の化合物であってもよいし、生物活性を有する高分子量の化合物（生物活性高分子量体）であってもよい。
【００４３】
免疫抑制剤に関して例を挙げると、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、マイコフェノレートモフェチル、およびそれらのアナログ（エバロリムス、ＡＢＴ−５７８（ゾタロリムス）、ＣＣＩ−７７９、ＡＰ２３５７３等が挙げられる。これらの薬剤をコーティングしたステントを冠状動脈の狭窄部分に留置することで、ステントが隣接する冠状動脈組織中の薬剤量が高まり、結果として再狭窄が抑制される。
【００４４】
抗がん剤に関して例を挙げると、タキソール（パクリタキセル）等が挙げられる。
細胞分化誘導剤に関して例を挙げると、タミバロテン等が挙げられる。
【００４５】
薬剤の添加量は、反応溶液中の濃度として、例えば、0.1〜100mMとなるように調製することができる。
【００４６】
反応溶液に用いることができる溶媒としては、細胞接着ペプチド含有高分子、クエン酸活性エステル体、脂肪族ポリエステル系生体内分解性高分子、および薬剤を溶解する溶媒であり、非プロトン性極性溶媒が好ましい。非プロトン性極性溶媒として、具体的には、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N,N-ジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドン、1,1,1,3,3,3‐ヘキサフルオロイソプロパノール等が挙げられる。
【００４７】
生体吸収性薬物徐放担体を合成するための反応溶液の調製において、混合のための具体的手段は特に限定されないが、例えば、小型のミキサーのような攪拌装置などを用いて十分均一に混合することが好ましい。
【００４８】
例えば、金属材料や樹脂材料の芯材の表面にコーティングして人工血管を構成する場合は、反応溶液をコーティングした後、適切な温度条件にて架橋反応を進行させて芯材の表面に生体吸収性薬物徐放担体を形成する。
【００４９】
例えば、ステントの場合には、ステント本体の円筒状表面の少なくとも外表面、好ましくは、外表面と内表面の両面に、ポリマー被覆層を形成し、このポリマー被覆層に薬剤を担持させる。その方法としては、薬剤とポリマーとを溶解した溶液を霧状化してステントに吹き付けるスプレー法、薬剤とポリマーとを適当な溶剤に溶かして調製したコーティング液中にステントを浸漬し、引き上げて溶剤を乾燥させるディッピング法、薬剤とポリマーを別々な溶剤に溶解し２本のノズルから同時にステントに吹き付ける２重同時スプレー法等が挙げられる。塗布後の溶媒除去は、減圧、送風、加熱等の方法によって適宜行われる。
【００５０】
架橋反応の温度は、好ましくは0〜100℃、より好ましくは20〜35℃である。過剰な高温で反応させると反応速度が速くなるため、均一なコーティングが難しい。また、過小な低温で反応させた場合、溶媒が凍ってしまい反応を進めることが難しい。
【００５１】
細胞接着ペプチド含有高分子とクエン酸活性エステル体とからなる生体吸収性高分子の形成時に生成する反応副生成物（N-ヒドロキシスクシンイミド、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド等）や未反応物は、得られた生体吸収性薬物徐放担体を純水に浸漬することによって除去が可能である。これにより、不純物のない生体吸収性薬物徐放担体を生体適用器具に適用できるようになり、不純物による不測の事態を招く可能性をなくすことができる。
【００５２】
本発明の生体吸収性薬物徐放担体は、生体に埋め込みまたは接合して使用されることで医療上の処置を行うことができる医療機器に好適に用いることができる。このような医療機器は、少なくともその生体に埋め込みまたは接合される部分の表面が、本発明の生体吸収性薬物徐放担体により構成される。
【００５３】
このような医療機器としては、例えば、ステント、ステント用移植片、手術用器具、吻合機器、人工血管、血管用移植片、心臓人工弁、血管用パッチ、房室用シャント、カテーテル、ガイドワイヤ、拡張用バルーンカテーテル、フィルタ、点滴用チューブ等が挙げられる。
【００５４】
ステント本体を構成する素材については、特に制限はなく、従来から知られている金属材料、セラミックや高分子材料が用いられるが、なかでも高剛性かつ耐腐食性の金属であることが好ましい。具体例としてステンレス鋼、タンタル、ニッケル−チタン合金（ニチノールを含む）、マグネシウム合金およびコバルト合金（コバルト−クロム−ニッケル合金を含む）などが挙げられる。
【００５５】
ステント本体の構造としては、外表面と内表面とを有する円筒形状を有しており、バルーン拡張型、自己拡張型、およびそれらの組合せであってよい。
【００５６】
実施形態のコーティング層に含まれる生分解性高分子の特性やコーティング層中の生分解性高分子重量と薬剤重量の比率を変化させることで、コーティング層からの薬剤の放出挙動を当該ステントが目的とする治療部位の性状に合わせて容易に調整できる。ステント留置後の慢性期には前記生分解性高分子はすべて生分解により消失し、ステント基材のみが体内に残留することになる。
【００５７】
特に、本発明の生体吸収性薬物徐放担体は、機能不全に陥った血管を代替する人工血管に好適に用いることができる。このような人工血管は、その全体または表面が、上記の生体吸収性薬物徐放担体により構成される。例えば、上記のように金属材料や樹脂材料の芯材の表面全体を生体吸収性薬物徐放担体にて覆った形態、人工血管の全体を生体吸収性薬物徐放担体により構成した形態等が挙げられる。
【００５８】
その他、生体内で分解し、血管内皮細胞接着性と血栓形成抑制効果の機能を有する本発明の生体吸収性薬物徐放担体は、縫合糸や中空糸等の医療分野に適用可能である。
【実施例】
【００５９】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
１．生体吸収性薬物徐放担体の調製
生体吸収性薬物徐放担体は、生分解性ポリエステルとしてポリ-L-乳酸（PLLA）、細胞接着ペプチド含有高分子としてアルカリ処理ゼラチン（AlGelatin）、クエン酸活性エステル体としてN-ヒドロキシスクシンイミドにより3つのカルボキシル基が修飾されたトリスクシンイミジルシトレート(TSC)を用いて調製した。
【００６０】
ポリ-L-乳酸はPolyScience社製、Lot.18402-10（標準ポリスチレン換算重量平均分子量80,000-100,000）を使用し、アルカリ処理ゼラチンは新田ゼラチン株式会社製、ゼラチンLS-H、Lot.101109を使用した。
【００６１】
AlGelatin溶液およびPLLA溶液は、AlGelatinおよびPLLAをそれぞれHFIP溶液に溶解することにより調製し、終濃度が１% (w/v)となるように調製した。
【００６２】
TSCはAlGelatin溶液に溶解することにより終濃度が2mMとなるよう調製した。
【００６３】
得られた1%AlGelatin溶液および1%PLLA溶液を所定比（AlGelatin溶液/PLLA溶液=100/0, 80/20, 60/40, 40/60, 20/80, 0/100）混合し、薬物としてタミバロテン（Am80）を溶解させることにより終濃度1 mMとなるように調製した（膨潤度測定ならびに細胞培養実験用サンプルを除く）。
【００６４】
ペンシルスターラーを用いて溶液全体が均一になるように撹拌後、正方形（5×5cm）に切り抜いたシリコーンゴム内に流し込み、30℃で12時間静置した。
【００６５】
引き続き、50℃で12時間減圧乾燥を行い、得られた板状の生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC）を1時間水中（4℃）に浸漬し、TSCの活性エステルとゼラチンのアミノ基を反応させることにより架橋を形成させるとともに、溶媒、未反応のTSCおよび副生成物であるN-ヒドロキシスクシンイミドを除去した。
【００６６】
再び、30℃で12時間静置後、50℃で12時間減圧乾燥を行うことで生体吸収性薬物徐放担体を得た。
２．生体吸収性薬物徐放担体のステントへのコーティング
1%PLLA溶液/1％AlGelatin-TSC溶液＝80/20で混合し、Am80を所定量溶解させることにより終濃度0, 0.3, 1, 2 mMとなるようなコーティング液を得た。
【００６７】
あらかじめ60分間UV照射を行ったコバルト-クロム合金(Co-Cr)製ステントにコーティング液をスプレーコーティングし30℃で12時間静置した。
【００６８】
引き続き、50℃で12時間減圧乾燥を行い、得られた板状の生体吸収性薬物徐放担体（PLLA/AlGelatin-TSC）を1時間水中（4℃）に浸漬し、TSCの活性エステルとゼラチンのアミノ基を反応させることにより架橋を形成させるとともに、溶媒および副生成物であるN-ヒドロキシスクシンイミドを除去した。
【００６９】
その後、30℃で12時間静置後、50℃で12時間減圧乾燥を行うことで生体吸収性薬物徐放担体をステントへコーティングした。
【００７０】
Am80含有量の異なる4種類のステントは、それぞれMatrix (Am80濃度0 mM), low dose (Am80濃度0.3 mM), medium dose (Am80濃度1 mM), high dose (Am80濃度2 mM)とした。
３．生体吸収性薬物徐放担体の膨潤度測定
生体吸収性薬物徐放担体（円形、直径6 mm）は、乾燥重量（Wd）を測定後、リン酸緩衝液（0.1MPBS）中に平衡膨潤に達するまで浸漬後、再び重量(Ww)を測定した。
【００７１】
なお、生体吸収性薬物徐放担体の膨潤度は以下の式より算出した。
膨潤度= (Ww-Wd)/Wd
４．生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価
生体吸収性薬物徐放担体（円形、直径6 mm）と血液との相互作用の評価は、ラットより採取した血液約1 mL中に生体吸収性薬物徐放担体を浸漬し、30分間インキュベート（37°C）した後、0.1 M PBSで3回洗浄し、実体顕微鏡および走査型電子顕微鏡にて観察した。
５．生体吸収性薬物徐放担体の血管内皮細胞接着性評価
生体吸収性薬物徐放担体（円形、直径6 mm）上にヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）を播種し、5％CO2存在下37℃で1日および7日間培養後、その数をWST-1（同仁化学）により計数した。
【００７２】
各条件における細胞の形態は核をDapi、アクチンをAlexa Fluor 488により染色し、蛍光顕微鏡(IX-71, Olympus社製)により観察した。
６．試験管内における生体吸収性薬物徐放担体からの薬物の徐放特性
PLLAとAlGelatin-TSCの混合比の異なるAm80濃度1 mMを含有した生体吸収性薬物徐放担体からの試験管内での徐放特性は、生体吸収性薬物徐放担体（円形、直径6 mm）を0.1 M PBS 10 mL中に浸漬後、経時的に2mLを採取し、HPLCによりAm80溶出量を定量した。
【００７３】
なお、HPLC用サンプル採取後は、新しい0.1 M PBS 2mLを添加した。
【００７４】
採取した溶液は40度に加温したODSカラム（4.6ID×150mm, 4.4μm, コスモシル5C18Ar-II, ナカライテスク製）を装着したHPLCを用いて定量した。
【００７５】
なお、移動相にはアセトニトリル：酢酸：水＝0.65：0.0175：0.3225（v/v/v）を用い、ポンプ(PU-2080, Jasco製)により毎分1mLで送液し、UV検出器(UV-2070, Jasco製)を用いて286nmの吸光度を測定した。
７．試験管内におけるステントからの薬物の徐放特性
ステントからの試験管内での徐放特性は、ステントを0.1 M PBS 1mL中に浸漬後、一定時間後に0.2 mLを採取し、HPLCによりAm80含有量を定量した。
【００７６】
なお、HPLC用サンプル採取後は、0.1 M PBS 0.2 mLを添加した。
【００７７】
Am80溶出の定量は前項と同様の用法により定量した。
８．ステントのブタへの埋入実験
吸入麻酔下のブタ（3か月、メス）冠動脈に埋入した各種ステント（コバルトクロム合金製ベアメタルステント（BMS）、コバルトクロム合金製生体吸収性薬物徐放担体コーティングステント（Matrix）、コバルトクロム合金製Am80低溶出量（low dose）、コバルトクロム合金製Am80中溶出量（medium dose）、コバルトクロム合金製Am80高溶出量（high dose）、Xience V）をそれぞれ1.2倍に拡張した後、IVUS（血管内超音波法）を入れてステント埋入部の血管平均内径を測定した。
【００７８】
28日後、再びブタを吸入麻酔し、IVUSによりステント埋入部の血管の平均内径（MLD）を測定し、Late lumen lossは血管への埋入直後の平均内径とMLDとの差とした。
９．走査型電子顕微鏡(SEM)観察
t-ブタノールを用いて臨界点乾燥させたサンプルは白金蒸着後、SEM(JSM-5600, JEOL製)を用いて観察した。
[結果]
（Ａ）生体吸収性薬物徐放担体の膨潤度
表1に示すように得られた生体吸収性薬物徐放担体の膨潤度は、AlGelatin-TSC割合の増加に伴い増加した。
【００７９】
これは、AlGelatin-TSCの親水性に由来した膨潤と考えられる。
【００８０】
逆にPLLAは疎水性であるため、PLLA含有割合が高いPLLA/AlGelatin-TSC＝100/0または80/20ではほとんど膨潤は起こらなかった。
【００８１】
【表１】
2013180118.tif 000002
【００８２】
（Ｂ）生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果
表2および図1〜12には、PLLA/AlGelatin-TSC比を変化させたときの生体吸収性薬物徐放担体の血栓形成抑制効果評価を行った結果を示す。
【００８３】
【表２】
2013180118.tif 000003
【００８４】
図1〜12に示すように、PLLA/AlGelatin-TSC＝100/0の時には、明らかな血栓形成が認められた。
【００８５】
一方、AlGelatin-TSCを含むものでは血栓形成が起こりにくい傾向がみられた。したがって、AlGelatin-TSCの混合により、カルボキシル基に起因したマイナスチャージを導入できるため血小板の吸着が抑制されたものと考えられる。
（Ｃ）生体吸収性薬物徐放担体の血管内皮細胞接着性
表3および図13〜18には、生体吸収性薬物徐放担体上でHUVECを1日間培養した後の細胞数を示す。
【００８６】
【表３】
2013180118.tif 000004
【００８７】
PLLA/AlGelatin-TSC=100/0, 40/60, 20/80, 0/100の場合には、細胞数はあまり認められなかったが、PLLA/AlGelatin-TSC=80/20, 60/40の場合には、多くの細胞数が認められた。
【００８８】
また、表4および図19〜24には、生体吸収性薬物徐放担体上でHUVECを7日間培養した後の細胞数を示す。
【００８９】
【表４】
2013180118.tif 000005
【００９０】
生体吸収性薬物徐放担体の種類による細胞数の差は、1日培養後よりも顕著になり、PLLA/AlGelatin-TSC=100/0の時に細胞数が低下したものの、PLLA/AlGelatin-TSC=80/20の時に最も高い細胞数が認められた。
【００９１】
この傾向は、得られた生体吸収性薬物徐放担体の膨潤度とゼラチンの含有割合に起因すると考えられる。
【００９２】
すなわち、PLLA/AlGelatin-TSC=80/20の場合、膨潤度が低く、ゼラチン中に含まれるアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)配列などの細胞接着ペプチドの濃縮が起こっているため細胞接着が起こりやすくなったものと考えられる。
【００９３】
一方、PLLA/AlGelatin-TSC=40/60, 20/80, 0/100の生体吸収性薬物徐放担体の場合、含水率が高いために細胞が接着する足場である細胞接着ペプチドの密度が低くなり、結果として細胞数が少なくなったのではないかと考えられる。
【００９４】
また、PLLA/AlGelatin-TSC＝100/0の場合、ゼラチン由来の細胞接着ペプチドを含有しないために細胞数が少なくなったのでないかと考えられる。
（Ｄ）試験管内での生体吸収性薬物徐放担体からのAm80徐放特性
表5には生体吸収性薬物徐放担体からの28日後のAm80の溶出率を示す。
【００９５】
【表５】
2013180118.tif 000006
【００９６】
PLLA/AlGelatin-TSC=100/0の場合、徐々にAm80を溶出し、28日後までにステント中のAm80のうち約14％が溶出されることが確認された。
【００９７】
同様にAlGelatin-TSCが含まれるものも同様の傾向を示し、PLLA/AlGelatin-TSC=80/20の場合、28日後までに約88%が溶出されることが確認された。
【００９８】
一方、PLLA含有割合の低いPLLA/AlGelatin-TSC=60/40, 40/60, 20/80, 0/100では実験開始後4日程度でほぼすべてのAm80を溶出しており、持続的にAm80を放出させることは困難であった。
（Ｅ）試験管内での生体吸収性薬物徐放担体からのAm80徐放特性
これまでに述べた血栓形成抑制効果、細胞接着性、Am80の徐放特性試験の結果よりPLLA/AlGelatin-TSCの混合比は80/20が最適であることが明らかとなった。
【００９９】
したがって、ステントへのコーティングはPLLA/AlGelatin-TSC＝80/20とした。図25、26には調製したステントの断面、表6に平均のコーティング厚さ、表7に1ステントあたりのAm80の含有量を示す。
【０１００】
【表６】
2013180118.tif 000007
【０１０１】
【表７】
2013180118.tif 000008
【０１０２】
この結果、ステントのコーティングの厚さは、ステントの種類にかかわらず、15mm程度であった。
【０１０３】
一方、Am80含有量はステントの種類によって異なり3.2〜54.9mgに変化させることに成功した。
【０１０４】
表8にはAm80の仕込み濃度を変化させた3種類のステントからの28日後のAm80の溶出率を示す。
【０１０５】
【表８】
2013180118.tif 000009
【０１０６】
Am80仕込み濃度を変化させることで、Am80の溶出量を変化させることができ、Am80の溶出量はhigh dose＞middle dose>low doseの順であることがわかった。
【０１０７】
一方、ステントに含まれるAm80の総量に占める累計溶出量の割合を溶出率とし、28日後の溶出率を表9に記す。
【０１０８】
【表９】
2013180118.tif 000010
【０１０９】
この結果、ステントの種類にかかわらず、Am80の溶出率は41〜44％であることが明らかとなった。
（Ｆ）ステントのブタへの埋入実験
得られたステントの生体内での効能を評価するためにブタの冠動脈に埋入した。
【０１１０】
なお、コントロールには、コーティングをしていないBMS、Am80を含有しないMatrix、既存のDESであるXienceVを用いた。
【０１１１】
表10には、各種ステントの28日後の血管径であるMLDを示す。なお、S. No. 10-01はBMS、S. No. 10-02はMatrix、S. No. 10-06はXience Vである。
【０１１２】
【表１０】
2013180118.tif 000011
【０１１３】
MLDはXience Vが最も高く、血管径が最も大きく保たれている傾向がみられたものの、他のサンプルと比較して有意差はみられなかった。
【０１１４】
表11には、各種ステントのLate lumen lossを示す。
【０１１５】
【表１１】
2013180118.tif 000012
【０１１６】
Late lumen lossはXience Vが最も小さく、内膜形成が抑制できる傾向がみられた。しかしながら、いずれのサンプル間にも有意な差はみられず、Xience Vと同等であることが明らかとなった。
【図１】
2013180118.tif 000013
【図２】
2013180118.tif 000014
【図３】
2013180118.tif 000015
【図４】
2013180118.tif 000016
【図５】
2013180118.tif 000017
【図６】
2013180118.tif 000018
【図７】
2013180118.tif 000019
【図８】
2013180118.tif 000020
【図９】
2013180118.tif 000021
【図１０】
2013180118.tif 000022
【図１１】
2013180118.tif 000023
【図１２】
2013180118.tif 000024
【図１３】
2013180118.tif 000025
【図１４】
2013180118.tif 000026
【図１５】
2013180118.tif 000027
【図１６】
2013180118.tif 000028
【図１７】
2013180118.tif 000029
【図１８】
2013180118.tif 000030
【図１９】
2013180118.tif 000031
【図２０】
2013180118.tif 000032
【図２１】
2013180118.tif 000033
【図２２】
2013180118.tif 000034
【図２３】
2013180118.tif 000035
【図２４】
2013180118.tif 000036
【図２５】
2013180118.tif 000037
【図２６】
2013180118.tif 000038