(57)【要約】【課題】  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子を含むベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、ＡＭＶ逆転写酵素を製造するにあたり、当該形質転換体によりＡＭＶ逆転写酵素を大量に発現させることが可能な宿主を提供すること。【解決手段】  宿主として、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌Ｗ３１１０株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株のいずれかを用いることで、ＡＭＶ逆転写酵素の大量発現を実現する。【選択図】  図８
2013146235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する方法であって、
前記宿主が、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌Ｗ３１１０株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株のいずれかである、前記方法。
【請求項２】
トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子が、配列番号１または２に記載のヌクレオチド配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子を、大腸菌コドンを用いて変換した遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子が、配列番号３または４に記載のヌクレオチド配列、当該ヌクレオチド配列と実質的に相同な配列、または当該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な配列を含むポリヌクレオチドからなる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子を用いた、前記逆転写酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスの増殖に必須の因子として発見された逆転写酵素は、一本鎖ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成（逆転写）する、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有しており、ｃＤＮＡ合成等に必須な遺伝子工学試薬あるいは遺伝子診断用酵素として利用されている。
【０００３】
逆転写酵素の一つである、トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、分子量約６３ｋＤａのα鎖および分子量約９５ｋＤａのβ鎖からなるヘテロダイマーであり、ＡＳＬＶファミリーとして知られている。このうちα鎖は、タンパク質分解性プロセシングによりβ鎖から形成される（非特許文献１）。
【０００４】
ＡＭＶ逆転写酵素は、所定のバリアントが大腸菌または真核生物昆虫細胞において発現されるとの報告がある（特許文献１）。またシャペロンと共発現することで大腸菌において発現されるとの報告がある（特許文献２）。しかしながら、工業的にＡＭＶ逆転写酵素を大量に製造するには、特許文献１および２に記載の方法よりも大量に発現させる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５３４１２５号公報
【特許文献２】特開２００２−３１５５８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｅ  Ｇｒｉｃｅ  Ｓ．Ｆ．Ｊ．，Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１６３（１９９３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードする遺伝子を含むベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体を用いて、ＡＭＶ逆転写酵素を製造するにあたり、当該形質転換体によりＡＭＶ逆転写酵素を大量に発現させることが可能な宿主を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素をコードする遺伝子を含むベクターを用いて形質転換する宿主として、形質転換体を用いた物質製造の適用例が多い大腸菌に着目し、ＡＭＶ逆転写酵素を大量に発現可能な大腸菌について鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体を培養することで、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素を製造する方法であって、
前記宿主が、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌Ｗ３１１０株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株のいずれかである、前記方法である。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子が、配列番号１または２に記載のヌクレオチド配列を含むトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子を、大腸菌コドンを用いて変換した遺伝子である、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素をコードする遺伝子が、配列番号３または４に記載のヌクレオチド配列、当該ヌクレオチド配列と実質的に相同な配列、または当該ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な配列を含むポリヌクレオチドからなる、前記第一の態様に記載の方法である。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明においてＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子（以下、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子とも表記する）とは、ｍＲＮＡへの転写と転写されたｍＲＮＡの翻訳によってＡＭＶ逆転写酵素を製造し得る遺伝子のことをいう。ＡＭＶが本来有する、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の全長は２５７４塩基であり、そのヌクレオチド配列を配列番号１に示す。なお配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子は、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖をコードする遺伝子であるが、ＡＭＶ逆転写酵素にはβ鎖よりも低分子のα鎖も存在し、そのヌクレオチド配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列のうち５’末端側１７１６塩基からなる（配列番号２）。これら遺伝子により翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列は、公的のデータベース（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に収録されており、一例として配列番号１３５（ＡＭＶ逆転写酵素β鎖）および１３６（ＡＭＶ逆転写酵素α鎖）がある。
【００１４】
本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の一例として、配列番号１または２に記載のヌクレオチド配列を含むＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を、大腸菌コドンを用いて変換した遺伝子がある。ここで「大腸菌コドンを用いて変換した」とは、配列番号１または２に記載のヌクレオチド配列を含むＡＭＶ逆転写酵素遺伝子から転写されるｍＲＮＡ中に存在する大腸菌レアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）、すなわち大腸菌での使用頻度が低いコドンを、当該コドンがコードするアミノ酸を変更することなく、大腸菌における使用頻度が高いコドンに変換することをいう。大腸菌におけるコドン使用頻度の高低は、公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を参考にゲノム遺伝子の解析を行なうことで推測できる。具体的には、大腸菌における使用頻度の高いコドンとして、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＵＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＵＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ例示できる。このように大腸菌における使用頻度の高いコドンに変換されたｍＲＮＡが転写されるよう、コドンを変換したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子は、大腸菌を用いた工業的規模でのＡＭＶ逆転写酵素発現が可能となるため好ましい。大腸菌コドンを用いた変換は、当該コドンに対応する（当該コドンに転写される）ヌクレオチド配列の領域（コドン）を変換することにより可能である。ヌクレオチド配列の変換は、例えばＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法等の従来公知の変異導入法を利用して行なうことができる。特に、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組み合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，３０，４３，２００２）が、好ましい大腸菌コドンを用いた変換方法の一例としてあげられる。当該方法は、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲにより合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を合成する方法である。
【００１５】
配列番号１または２に記載の配列を含むＡＭＶ逆転写酵素遺伝子から、大腸菌コドンを用いて変換したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を得る際、配列番号１または２に記載のヌクレオチド配列に存在する大腸菌レアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）の全てを大腸菌における使用頻度が高いコドンに変換してもよいし、その一部（好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％以上）を変換してもよい。本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の好ましい例として、
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子を、大腸菌コドンを用いて変換した、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子や、
配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むＡＭＶ逆転写酵素α鎖遺伝子を、大腸菌コドンを用いて変換した、配列番号４に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子、
があげられる。なお本発明におけるＡＭＶ逆転写酵素遺伝子では、その５’末端側または３’末端側に、分析・精製を容易にするためのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドや、大腸菌での分泌発現を促すためのシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。具体例としては、
配列番号３に記載のヌクレオチド配列の５’末端側にメチオニンをコードするオリゴヌクレオチド（ａｔｇ）を付加した配列からなる遺伝子（配列番号５）や、
配列番号４に記載のヌクレオチド配列の５’末端側にメチオニンをコードするオリゴヌクレオチド（ａｔｇ）を付加した配列からなる遺伝子（配列番号６）、
があげられる。
【００１６】
本発明においてＡＭＶ逆転写酵素遺伝子は、ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質が発現可能な範囲で、当該遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に相同的な配列を含む遺伝子であってもよいし、当該遺伝子のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む遺伝子であってもよい。ここで「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一なタンパク質」とは、具体的には、ＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの酵素活性（逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）活性）のうち１つ以上が、ＡＭＶが本来有するＡＭＶ逆転写酵素と同等以上の活性を有するタンパク質のことをいう。具体的には、ＡＭＶが本来有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のヌクレオチド配列と、少なくとも７５％以上（好ましくは８５％、より好ましくは９５％以上）の相同性を有したヌクレオチド配列を含む遺伝子から翻訳されたタンパク質であればよい。またここで「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、具体的には、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、または７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件が例示できる。
【００１７】
本発明の製造方法では、前述したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を適切なプラスミドベクターに挿入し、それを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体を培養することで製造する。ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のプラスミドベクターへの挿入は、挿入するプラスミドベクターの適切な位置に遺伝子工学的に挿入すればよい。ここでいう適切な位置とは、プラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で自由に決定してよい。またプラスミドベクターに挿入する場合、例えばプロモータ機能を有するオリゴヌクレオチドを付加してもよい。大腸菌で機能するプロモータとして、例えばｌａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータまたはＴ７プロモータが例示できる。その中でもｔｒｃプロモータは、転写活性の調節が容易なため好ましい。挿入するプラスミドベクターは、形質転換する大腸菌内で安定に存在し、複製することができるものであれば特に制限はない。プラスミドベクターの具体例として、大腸菌内で安定に存在し複製できるプラスミドベクターとして知られている、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＥＴ系、広宿主域（Ｂｒｏａｄ−Ｈｏｓｔ−Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクターがあげられる。その中でもｐＴｒｃ９９Ａベクターが好ましいプラスミドベクターとして例示できる。
【００１８】
本発明において宿主は、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌Ｗ３１１０株のいずれかであり、中でも大腸菌Ｗ３１１０株が好ましい。なお前述した大腸菌に対し、ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチル等の化学物質、紫外線、放射線等の従来公知の手段により変異処理した、大腸菌変異株を使用してもよい。
【００１９】
プラスミドベクターを用いて大腸菌を形質転換する方法については、例えば、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，ｐ．４６９−６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰｒｅｓｓやＭｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，ｐ．３０５−６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載の方法により行なえばよい。
【００２０】
前述した方法で得られた形質転換体は、例えば必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地により培養すればよい。なおプラスミドベクターを含有した形質転換体を選択して培養することを目的に、プラスミドベクターの構成を基にした選抜剤を培地に添加するとよい。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターを使用する場合には、培地にアンピシリンやカルベニシリンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素、無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよい。さらにグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を添加しても良い。培養温度は、例えば約２０℃から４０℃までの範囲であればよく、好ましくは３５℃から３８℃までの範囲、より好ましくは３７℃付近である。ｐＨは６．８から７．４までの範囲であればよく、好ましくは７．０付近である。
【００２１】
前述した方法で得られた形質転換体を培養してＡＭＶ逆転写酵素を製造する際、当該形質転換体に含まれるプラスミドベクターにｔｒｃプロモータといった誘導性のプロモータが含まれている場合は、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度まで培養を行なった後、誘導操作を行なうことで、ＡＭＶ逆転写酵素を発現させるとよい。具体的には、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０を示す増殖期間に、誘導剤を添加する誘導操作を行ない、引き続き培養すればよい。添加する誘導剤は、使用するプロモータに応じて適宜選択して使用すればよい。例えば、誘導性のプロモーターがｔｒｃプロモータの場合、添加する誘導剤としてＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）が例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は終濃度で約０．１から１０．０ｍＭまでの範囲の中から適宜選択すればよいが、好ましくは１．０ｍＭから１０．０ｍＭまでの範囲、より好ましくは５．０ｍＭ付近である。なお誘導操作後に培養温度を下げてもよく、具体的には、１０℃から３０℃までの範囲、好ましくは１５℃から２５℃までの範囲、より好ましくは２５℃付近である。
【００２２】
前述した方法で得られた形質転換体の培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出する際には、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すればよい。例えば、発現したＡＭＶ逆転写酵素が大腸菌内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出すればよい。なお前記抽出段階では種々の蛋白質が混在しているが、ストレプトマイシン塩酸塩やポリミンＰを添加することで核酸と共沈させることにより効率的にＡＭＶ逆転写酵素を沈澱回収することができる。さらに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーを単独または組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素を高純度に精製することができる。クロマトグラフィーを用いたＡＭＶ逆転写酵素精製の一例として、ポリプロピレングリコール基を導入した疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いてＡＭＶ逆転写酵素を精製後、ホスホセルロース担体を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製することで、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖、およびＡＭＶ逆転写酵素α鎖β鎖ヘテロ複合体を、分離精製することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の製造方法は、ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを用いて形質転換する宿主として、大腸菌ＭＶ１１８４株、大腸菌ＧＭ３１株、大腸菌ＨＢ１０１株、大腸菌ＪＭ１０１株、大腸菌Ｗ３１１０株のいずれかを用いることを特徴としており、ＡＭＶ逆転写酵素を工業的に製造するのに有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】トリ骨髄芽細胞腫ウイルスが本来有する、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１、下段）と、実施例１で設計したＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３、上段）とを比較した結果である。
【図２】トリ骨髄芽細胞腫ウイルスが本来有する、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１、下段）と、実施例１で設計したＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３、上段）とを比較した結果である。
【図３】プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢの構造を示す図である。
【図４】プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡの構造を示す図である。
【図５】プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄの構造を示す図である。
【図６】プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄの構造を示す図である。
【図７】プラスミドベクターの違いによる大腸菌での発現量の差を示す電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）写真である。
【図８】宿主である大腸菌菌株の違いによる発現量の差を示した図である。
【図９】培養中の濁度の変化と逆転写活性の変化を示す図である。図中黒丸は培養中の濁度変化を、白丸は逆転写活性の変化を、それぞれ示している。
【図１０】ホスホセルロースカラムからの溶出画分の逆転写酵素活性、ＴＲＣ法での検出時間、および電気泳動写真を示す図である。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００２６】
実施例１  トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子の配列設計
配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子（ＡＭＶコドン）から、大腸菌コドンを用いて変換した、配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子を、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法により設計した。ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子（ＡＭＶコドン）のヌクレオチド配列（配列番号１）と、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子（大腸菌コドン）のヌクレオチド配列（配列番号３）とを比較した結果を図１および２に示す。配列番号１および３に記載の配列からなる遺伝子により翻訳されるＡＭＶ逆転写酵素β鎖のアミノ酸配列は同一（配列番号１３５）であるが、ヌクレオチド配列の相同性は７４％であった。
【００２７】
実施例２  ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の作製
（１）実施例１で設計した、配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子を作製するため、配列番号７から１２６に記載のヌクレオチド配列からなる１２０種類のオリゴヌクレオチドを合成した。
（２）（１）で合成したオリゴヌクレオチドから配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子を作製するため、以下に示す二段階のＰＣＲ反応を行なった。
（２−１）表１に示す反応液を作製し、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第一ステップ、６２℃で３０秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間反応させることで一段階目のＰＣＲを行なった。なお、表１中のＤＮＡミックスとは、配列番号７から１２６に記載の配列からなる１２０種類のオリゴヌクレオチド溶液（濃度：５０ｐｍｏｌ／μＬ）をそれぞれ等量ずつ採取し、混合した溶液である。
【００２８】
【表１】
2013146235.tif 000003
（２−２）表２に示す反応液を作製し、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第一ステップ、６５℃で３０秒間の第二ステップ、７２℃で１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応させることで二段階目のＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲプライマーとして配列番号７（５’―ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＧ―３’）および配列番号１２６（５’―ＴＴＡＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣＴ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００２９】
【表２】
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（３）ＰＣＲ反応終了後、０．９％アガロース電気泳動により設計通りのサイズに相当するＤＮＡバンドを確認し、当該ＤＮＡバンドから市販の試薬（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出した。
（４）抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入後、当該ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。調製したプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ（図３）は制限酵素解析およびヌクレオチド配列決定（実施例３）を行なった。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢのヌクレオチド配列を配列番号１３１に示した。
（５）配列番号４に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ逆転写酵素α鎖遺伝子をＰＣＲ反応により作製した。ＰＣＲ反応は、鋳型としてｐＴｒｃＡＭＶＢを、ＰＣＲプライマーとして配列番号７および配列番号１２７（５’―ＴＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＣＣ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は、（２−２）に記載の方法と同様な方法で実施した。
（６）ＰＣＲ反応終了後、（３）から（４）に記載の方法と同様な方法で、形質転換体を取得し、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡを調製した。調製したプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡ（図４）は制限酵素解析およびヌクレオチド配列決定（実施例３）を行なった。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡのヌクレオチド配列を配列番号１３２に示した。
（７）ＡＭＶ逆転写酵素β鎖遺伝子（ＡＭＶコドン）を含むプラスミドを保持した大腸菌クローン（ＡＴＣＣ  ３１９９０）からＰＣＲ反応によりＡＭＶ逆転写酵素β鎖をコードする遺伝子を作製した。ＰＣＲ反応は、鋳型としてＡＴＣＣ  ３１９９０の培養抽出物を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２８（５’― ＡＴＧＡＣＴＧＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＣＧＣＴＣ―３’）および配列番号１２９（５’―ＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＴＣＡＴＣ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、（２−２）に記載の方法と同様な方法で実施した。
（８）ＰＣＲ反応終了後、（３）から（４）に記載の方法と同様な方法で、形質転換体を取得し、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ（図５）を調製した。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄのヌクレオチド配列を配列番号１３３に示した。
（９）ＡＴＣＣ  ３１９９０からＰＣＲ反応によりＡＭＶ逆転写酵素α鎖をコードする遺伝子を作製した。ＰＣＲ反応は、鋳型としてＡＴＣＣ  ３１９９０の培養抽出物を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２８および配列番号１３０（５’―ＴＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＣＴＧＣＣ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、（２−２）に記載の方法と同様な方法で実施した。
（１０）ＰＣＲ反応終了後、（３）から（４）に記載の方法と同様な方法で、形質転換体を取得し、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄを調製（図６）した。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄのヌクレオチド配列を配列番号１３４に示した。
【００３０】
実施例３  配列の確認
実施例２で作製したプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ（図３）およびｐＴｒｃＡＭＶＡ（図４）に挿入したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のヌクレオチド配列を、チェーンターミネータ法に基づく市販の試薬キット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーには合成した１２０種類のオリゴヌクレオチドを適宜使用した。その結果、ｐＴｒｃＡＭＶＢおよびｐＴｒｃＡＭＶＡに挿入したＤＮＡのヌクレオチド配列は設計通りであることを確認した。
【００３１】
実施例４  ＡＭＶ逆転写酵素の発現（その１）
（１）プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ（図３）を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬの抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地を用いて３７℃で１８時間培養した。
（２）培養後、出現した任意のコロニーをピックアップすることで形質転換体を得た。ここで得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢと命名した。なお、ｐＴｒｃＡＭＶＡ（図４）、ｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ（図５）、ｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄ（図６）についても同様に実施し、形質転換体（ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡ、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄ）をそれぞれ得た。
（３）得られた形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍＬの抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種し、３７℃で培養した。ＯＤ６６０ｎｍの値が約０．５になったところで０．１５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）（タカラバイオ社）を添加した。
（４）ＩＰＴＧ添加から適当な間隔で各形質転換体培養液を採取し、市販のキット（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ノバジェン社）を用いてタンパク質溶液を調製した。調製したタンパク質溶液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（実施例１０）に供した。
【００３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図７に示す。ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を含むプラスミドベクターを用いて大腸菌を形質転換して得られる形質転換体により、ＡＭＶ逆転写酵素を発現させる際、ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子として、ＡＭＶコドンを利用したもの（ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄ）よりも、宿主と同一である大腸菌コドンを利用したもの（ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢ、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡ）のほうが発現量が多いことが分かる。
【００３３】
実施例５  宿主大腸菌の検討
（１）プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ（図３）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１１０株（タカラバイオ社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１株（アジレント・テクノロジー社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＫ３８３株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＹ１４３６株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１株（アジレント・テクノロジー社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株（タカラバイオ社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＢ７９１株（ＡＴＣＣ  ５３６２２）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４株（タカラバイオ社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ６００（アジレント・テクノロジー社）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ４１１０株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＧＭ３１株（ＮＢＲＰ  ＭＥ７７４１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＣ１１８株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５株（東洋紡績社）、またはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（東洋紡績社）をそれぞれ形質転換後、５０μｇ／ｍＬの抗生物質（アンピシリン）を添加したＬＢ寒天培地を用いて３７℃で１８時間培養した。
（２）培養後、出現した任意のコロニーをピックアップし５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベニシリンを添加した２×ＹＴ液体培地に接種した。
（３）３７℃・１６０ｒｐｍで振盪培養し、ＯＤ６６０ｎｍの値が約０．５になったところで、培養温度を１５℃または２５℃に下げ、５ｍＭのＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を添加しさらに４５時間振盪培養を行なった。
（４）培養菌体を４℃・５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで回収し、−３０℃で凍結保存した。
（５）凍結菌体を５ｍＬ／湿菌体質量のバッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（商品名））に懸濁し、超音波破砕後、４℃・５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで未破砕の菌体を取り除き抽出液を得た。
（６）抽出液の活性をＴＲＣ法（実施例８）により測定した。
【００３４】
結果を図８に示す。今回検討した大腸菌菌株のうち、ＤＨ５α株、Ｃ６００株、ＪＭ１１０株、ＭＣ４１１０株、ＴＧ１株、ＭＶ１１８４株、Ｗ３１１０株、ＧＭ３１株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０１株を形質転換して得られた形質転換体を用いた場合、ＪＭ１０９株を形質転換して得られた形質転換体と比較して検出時間が短縮しており、前記形質転換体ではＡＭＶ逆転写酵素発現量が増大していることがわかる。その中でも特に、ＭＶ１１８４株、Ｗ３１１０株、ＧＭ３１株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０１株を形質転換して得られた形質転換体が、ＡＭＶ逆転写酵素を高く発現していることがわかる。
【００３５】
実施例６  ＡＭＶ逆転写酵素の発現（その２）
実施例５で得た形質転換体のうち、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ（図３）を用いて、大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換して得られた形質転換体（Ｗ３１１０／ｐＴｒｃＡＭＶＢ）を用いてＡＭＶ逆転写酵素を発現させた。
（１）２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１ｍｇ／ｍＬカルベニシリンナトリウム）１００ｍＬに、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃＡＭＶＢを植菌し、５００ｍＬバッフル付三角フラスコ中、３０℃・１３０ｒｐｍで一晩振とう培養を行なうことで前培養を行なった。
（２）表３に示す培地２．１Ｌを全容３．０Ｌ発酵槽（サクラ精機社、ＴＦＬＣ−３）に入れ、１２１℃で２０分間の滅菌後、（１）で得られた前培養液を２１ｍＬ植菌し、本培養を開始した。発酵槽の培養温度は３７℃に、撹拌速度は５００ｒｐｍに、ｐＨは６．９から７．１に、それぞれ設定し、５０％のリン酸水溶液を用いてｐＨの調整を行なった。
【００３６】
【表３】
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（３）培養開始から３時間後に発酵槽の培養温度を２５℃に下げ、０．５ＭのＩＰＴＧ水溶液を２１ｍＬ添加した。
（４）約１４０時間培養後、培養液を４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで、菌体を回収した。
（５）培養菌体から実施例５に記載の方法でタンパク質を抽出後、抽出液の活性を逆転写活性（実施例９）により測定した。
【００３７】
培養中の濁度変化および逆転写活性の変化を図９に示す。
【００３８】
実施例７  ＡＭＶ逆転写酵素の精製
（１）形質転換体Ｗ３１１０／ｐＴｒｃＡＭＶＢ培養液を４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで、培養菌体を回収し、−３０℃で凍結保存した。
（２）凍結菌体を５ｍＬ／湿菌体質量のバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し、超音波破砕後、４℃・８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで未破砕菌体を除き抽出液を得た。
（３）抽出液に０．８３％のストレプトマイシン（和光純薬社）を添加し、４℃で３０分間撹拌後、４℃・１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離することで沈澱を回収した。
（４）等量のバッファーＢに沈殿を再溶解し、粗精製溶液とした。
（５）粗精製溶液２００ｍＬに硫酸アンモニウム（和光純薬社）を１５％飽和になるになるまで少量ずつ添加した。さらに当該粗精製溶液を、あらかじめバッファーＣ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５％飽和硫酸アンモニウム）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＰＰＧ−６００Ｍ（東ソー社）ゲルを充填したカラム（１０ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｃｍ）に添加した。
（６）十分量のバッファーＣをカラムに通液することで、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、１０カラムボリューム（ＣＶ）でバッファーＢが１００％となるようなリニアグラジエント溶出法により、ＡＭＶ逆転写酵素を溶出させた（流速５ｍＬ／分）。
（７）カラムからの溶出液を、１０ｍＬ毎に試験管に分注し、ＴＲＣ法（実施例８）によりＡＭＶ逆転写酵素の活性画分を決定した。
（８）（７）で決定したＡＭＶ逆転写酵素の活性フラクションをバッファーＡで透析後、あらかじめバッファーＡで平衡化したホスホセルロース（Ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｐ１１、Ｗｈａｔｍａｎ社製）ゲルを充填したカラム（１０ｍｍＩ．Ｄ．×５ｃｍ）に添加した。
（９）十分量のバッファーＡをカラムに通液することで、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、１０ＣＶでバッファーＤ（１Ｍ  ＫＣｌを含むバッファーＡ）が１００％となるようなリニアグラジエント溶出法により、ＡＭＶ逆転写酵素を溶出させた（流速０．５ｍＬ／分）。
（１０）カラムからの溶出液を、１ｍＬ毎に試験管に分注し、ＴＲＣ法（実施例８）、逆転写活性（実施例９）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例１０）により、ＡＭＶ逆転写酵素のうちα鎖とβ鎖とのヘテロ複合体を含む画分を決定した。
【００３９】
ホスホセルロースカラムからの溶出画分を測定した結果を図１０に示す。ホスホセルロースカラムからの溶出画分において、ＡＭＶ逆転写酵素β鎖（分子量９５ｋＤａ）に相当するバンドのみが検出される画分、ＡＭＶ逆転写酵素α鎖（分子量６３ｋＤａ）に相当するバンドのみが検出される画分、α鎖に相当するバンドとβ鎖に相当するバンドがともに検出される画分をそれぞれ確認することができた。図１０の結果から本精製方法により、ＡＭＶ逆転写酵素、特にα鎖とβ鎖とのヘテロ複合体を精製できることがわかった。
【００４０】
実施例８  ＴＲＣ法を利用した活性測定
ＡＭＶ逆転写酵素が有する酵素活性を、下記に示すＴＲＣ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用した方法（特開２００３−３３４０９５号公報）により評価した。
（１）ＴＲＣＲｔｅｓｔ  ＮｏｒｏＷ（東ソー社）に添付の陽性標準液を、ＴＲＣＲｔｅｓｔ  ＮｏｒｏＷ（東ソー社）に添付の陰性標準液で５倍希釈することにより、ＲＮＡ試料を調製した。
（２）ＴＲＣＲｔｅｓｔ  ＮｏｒｏＷ（東ソー社）に添付の基質試薬１０μＬおよびＴＲＣＲｔｅｓｔ  ＮｏｒｏＷ（東ソー社）に添付のプライマー試薬１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社）に分注し、これに（１）で調製したＲＮＡ試料５μＬを添加した。
（３）（２）の混合液を４２℃で５分間保温後、あらかじめ４２℃で２分間保温した、以下の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
【００４１】
酵素液の組成：
０．１２ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン
２．０％（ｗ／ｖ）  ソルビトール
２８．４Ｕ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
１μＬ  溶出画分または６．４Ｕ  ＡＭＶ−ＲＴ対照品（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ社）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４２℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に２０分間測定した。蛍光測定値が初期蛍光値の１．２倍になった時間を検出時間とした。
【００４２】
実施例９  逆転写活性測定
菌体抽出液または溶出画分の逆転写活性を、市販の試薬（リバーストランスクリプターゼアッセイ，発色（ロシュ社））を用いて以下に示す方法で測定した。
（１）Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで適宜希釈した菌体抽出液または溶出画分４０μＬに、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ２０μＬを添加し、４２℃で３０分間インキュベートした。
（２）インキュベート後のサンプル６０μＬをＭＰ  ｍｏｄｕｌｅに移し、３７℃で１時間インキュベート後、ＭＰ  ｍｏｄｕｌｅを２５０μＬのＷａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで５回洗浄した。
（３）ＭＰ  ｍｏｄｕｌｅに２００μＬのＡｎｔｉ―ＤＩＧ−ＰＯＤ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎを加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＭＰ  ｍｏｄｕｌｅを２５０μＬのＷａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで５回洗浄した。
（４）ＭＰ  ｍｏｄｕｌｅに２００μＬのＡＢＴＳ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、２５℃で１０分間インキュベート後、４９０ｎｍの吸光度を参照に４０５ｎｍの吸光度を測定した。なお、ＡＭＶ逆転写酵素の標準品としてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＡＭＶ逆転写酵素を使用した。
【００４３】
実施例１０  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
溶出画分および精製ＡＭＶ逆転写酵素の純度検定をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて以下に示す方法で行なった。
（１）メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液を調製溶液に添加後、９８℃で５分間熱処理し、５％から２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。なお、ＡＭＶ逆転写酵素の標準品としてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＡＭＶ逆転写酵素を使用した。
（２）電気泳動後、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）  Ｇ−２５０による染色を行ない、常用される脱色法によりゲルを脱色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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