(57)【要約】      （修正有）【課題】現在行われている血清学的なO抗原分類に代わる，迅速で精度の高い腸管出血性大腸菌O抗原型の検査方法の開発。【解決手段】特定の配列のプライマーセット，およびこれらプライマーセットを用いた大腸菌検査方法，検査キット。現在行われている血清学的なO抗原分類に代わる，迅速で正確なO抗原型分類手法の提供が可能となった。すなわち，本プライマーセットを用いて大腸菌O抗原の特異的な核酸配列を増幅することにより，大腸菌分離株の検出および判別が可能となった。【選択図】図４
2013220032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記プライマーセットのいずれか又は複数を含む大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって，各プライマーセットはそれぞれ，
プライマーセット１が配列番号１〜４，
プライマーセット２が配列番号５〜８，
プライマーセット３が配列番号９〜１２，
プライマーセット４が配列番号１３〜１６，
プライマーセット５が配列番号１７〜２０，
プライマーセット６が配列番号２１〜２４，
プライマーセット７が配列番号２５〜２８，
プライマーセット８が配列番号２９〜３２，
プライマーセット９が配列番号３３〜３６，
プライマーセット１０が配列番号３７〜４０，
プライマーセット１１が配列番号４１〜４４，
プライマーセット１２が配列番号４５〜４８，
プライマーセット１３が配列番号４９〜５２，
プライマーセット１４が配列番号５３〜５６，
に示すプライマーからなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記プライマーセット１がO41抗原，
前記プライマーセット２がO48抗原，
前記プライマーセット３がO69抗原，
前記プライマーセット４がO74抗原，
前記プライマーセット５がO76抗原，
前記プライマーセット６がO88抗原，
前記プライマーセット７がO113抗原，
前記プライマーセット８がO156抗原，
前記プライマーセット９がO170抗原，
前記プライマーセット１０がO174抗原，
前記プライマーセット１１がO175抗原，
前記プライマーセット１２がO179抗原，
前記プライマーセット１３がO180抗原，
前記プライマーセット１４がO181抗原，
の特異的な塩基配列を増幅することを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
請求項１ないし２に記載のプライマーセットを用いて，大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅し，大腸菌分離株の検出，同定を行うことを特徴とする大腸菌O抗原の検査方法
【請求項４】
大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅する方法がLAMP法であることを特徴とする請求項３に記載の大腸菌O抗原の検査方法
【請求項５】
請求項１ないし２に記載のプライマーセットと，核酸増幅用試薬を少なくとも含むことを特徴とする検査キット
【請求項６】
さらに蛍光試薬を含むことを特徴とする請求項５に記載の検査キット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，LAMP法を用いた大腸菌O抗原型の検査方法および検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管出血性大腸菌による感染症は，日本において，年間約４０００件発生している。感染症患者の一部は溶血性尿毒症症候群や脳症などを併発して死亡することもあり，腸管出血性大腸菌は，時に，重大な結果をもたらす。そのため，腸管出血性大腸菌は，最も注意が必要な食中毒細菌の一つである。
【０００３】
腸管出血性大腸菌について，集団感染であるか否かの判断，汚染範囲の把握，汚染源・汚染経路の追跡と特定，さらに疫学研究を行うためには，腸管出血性大腸菌分離株の詳細な分類と比較が必要となる。その一つの方法として，菌体抗原を標的とした血清学的な分類方法（O抗原型分類）が，ほぼすべての腸管出血性大腸菌分離株で行われている。
【０００４】
O抗原とは，真正細菌における細胞壁の抗原である。O抗原は糖鎖構造を有しており，真正細菌によって，O抗原を構成する糖の種類や結合順などが異なるという特徴を有する。このO抗原が真正細菌ごとに異なる糖鎖構造を有する特徴を利用して，O抗原は，真正細菌の検出や同定，分類に利用される。腸管出血性大腸菌を含めた大腸菌についても同様であり，O抗原は，大腸菌分離株の検出や同定，分類に利用されている。
【０００５】
大腸菌について現在のところ，大腸菌のリファレンスと研究に関する世界保健機関協力センターでもあるデンマーク国立血清学研究所（SSI：Statens Serum Institut）により，184種類のO抗原型が定められている（非特許文献１）。日本においては，2007年から2011年の間に，地方衛生研究所や保健所などから国立感染症研究所に送付された約13,000株の腸管出血性大腸菌のO抗原型を詳しく調べた結果，O157やO26，O111，O103といった，これまで主要とされてきたO抗原型株が大半を占めていた。その一方，分離数は少ないものの，これまでに国内外において報告例の少ない（または無い）O抗原型株も見つかった。これらの確認されたO抗原型株を合わせると，腸管出血性大腸菌として，86種類ものO抗原型が確認された。血便などの重症患者から希少O抗原型株が分離されたケースもあり，今後は，これら希少O抗原型株についても十分な注意が必要となってくる。
【０００６】
一旦，腸管出血性大腸菌の感染などが起こった場合，医療機関の検査室や細菌の検査を行う機関では，感染拡大を防ぐために，迅速で正確な腸管出血性大腸菌の細分類を必要とする。しかしながら，現在確認されているだけでも86種類もの多種多様なO抗原型の腸管出血性大腸菌が存在する中で，現在行われている血清学的なO抗原型分類では，全ての腸管出血性大腸菌分離株を迅速に分類決定することは困難である。すなわち，国内メーカーからは50種類のO抗原免疫血清しか販売されておらず，国内メーカー販売品では上述した86種類のうち，わずか33種類しかカバーできていない。また，SSIが販売するO抗原免疫血清は高価（１種類約５万円）で，各検査室（機関）が全種類を揃えるのは実質的に不可能である。
これらの事情から，現在行われている血清学的なO抗原分類に代わる，迅速で精度の高い腸管出血性大腸菌O抗原型の検査方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】STATENS SERUM INSTUT, E.coli strains, インターネット＜URL：http://www.ssi.dk/English/SSI%20Diagnostica/Products%20from%20SSI%20Diagnostica/Bacterial%20strains/E%20coli.aspx＞
【非特許文献２】DedRoy et al.Animal Health Research Reviews 12(2); 169-185
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記事情を背景として，本発明では，現在行われている血清学的なO抗原分類に代わる，迅速で精度の高い腸管出血性大腸菌O抗原型の検査方法の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者は，大腸菌のO抗原合成に関わる２つの遺伝子に着目した。すなわち，大腸菌染色体上の，O抗原の合成を司る遺伝子領域に存在する，O抗原糖鎖合成酵素遺伝子（wzy）とO抗原糖鎖輸送タンパク遺伝子（wzx）である。これらwzyとwzxは，大腸菌のO抗原型の間で，高い塩基配列的特異性を保持していることが知られている。
【００１１】
発明者は，O抗原コード領域の塩基配列情報が知られていない複数種の大腸菌株について，wzyないしwzxの塩基配列を明らかにした。この明らかにした12種のwzyないしwzxの塩基配列情報，ならびに既知の塩基配列情報を用いて，wzyないしwzxを増幅するためのプライマーセットに関する発明を完成させた。さらには，それらプライマーセットを用いて，大腸菌のO抗原型を特異的に検出，判別する大腸菌O抗原型の検査方法および検査キットにかかる発明を完成させた。
【００１２】
本発明は以下の構成からなる。
【００１３】
本発明の第一の構成は，後述するプライマーセットのいずれか又は複数を含む大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅するためのプライマーセットであって，各プライマーセットはそれぞれ，プライマーセット１が配列番号１〜４，プライマーセット２が配列番号５〜８，プライマーセット３が配列番号９〜１２，プライマーセット４が配列番号１３〜１６，プライマーセット５が配列番号１７〜２０，プライマーセット６が配列番号２１〜２４，プライマーセット７が配列番号２５〜２８，プライマーセット８が配列番号２９〜３２，プライマーセット９が配列番号３３〜３６，プライマーセット１０が配列番号３７〜４０，プライマーセット１１が配列番号４１〜４４，プライマーセット１２が配列番号４５〜４８，プライマーセット１３が配列番号４９〜５２，プライマーセット１４が配列番号５３〜５６に示すプライマーからなることを特徴とするプライマーセットである。
【００１４】
本発明の第二の構成は，前記プライマーセット１がO41抗原，前記プライマーセット２がO48抗原，前記プライマーセット３がO69抗原，前記プライマーセット４がO74抗原，前記プライマーセット５がO76抗原，前記プライマーセット６がO88抗原，前記プライマーセット７がO113抗原，前記プライマーセット８がO156抗原，前記プライマーセット９がO170抗原，前記プライマーセット１０がO174抗原，前記プライマーセット１１がO175抗原，前記プライマーセット１２がO179抗原，前記プライマーセット１３がO180抗原，前記プライマーセット１４がO181抗原の特異的な塩基配列を増幅することを特徴とする第一の構成に記載のプライマーセットである。
【００１５】
本発明の第三の構成は，第一ないし第二の構成に記載のプライマーセットを用いて，大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅し，大腸菌分離株の検出，同定を行うことを特徴とする大腸菌O抗原の検査方法である。
【００１６】
本発明の第四の構成は，大腸菌O抗原に特異的な塩基配列を増幅する方法がLAMP法であることを特徴とする第三の構成に記載の大腸菌O抗原の検査方法である。
【００１７】
本発明の第五の構成は，第一ないし第二の構成に記載のプライマーセットと，核酸増幅用試薬を少なくとも含むことを特徴とする検査キットである。
【００１８】
本発明の第六の構成は，さらに蛍光試薬を含むことを特徴とする第五の構成に記載の検査キットである。
【００１９】
本発明において，プライマーセットを構成する各プライマーの配列は下記のとおりである。
【００２０】
プライマーセット１
F3（配列番号１）：ACTTGTTTGATGGTTTTAGCT
B3（配列番号２）：ATCCCTTTTCTTGATATTTCCAT
FIP（配列番号３）：CCATGCCTGCCTAAATAAATGAAAGTGCAATGATTATTCTATGCATAGG
BIP（配列番号４）：TTGTGCAATTGGGATAAGCCGACATCAAATGACTCAATCCGG
【００２１】
プライマーセット２
F3（配列番号５）：ATATTGCTGGGGGTTGGT
B3（配列番号６）：ATTGCAGTTGTTCCGAGT
FIP（配列番号７）：CCAATCATGCCAGTTTCAATTAAGAAATGCAGTCGATGTTATTGGT
BIP（配列番号８）：TGTGCATTTACCTCAAAGAGGATGGACATTGATGCTATCAAAAATGGA
【００２２】
プライマーセット３
F3（配列番号９）：AATGATTGTCTTGATGGCTG
B3（配列番号１０）：CCTGAACTGTAAAAAGTAGGC
FIP（配列番号１１）：AGGGAAAAATGGTAGAACCCAATAATATTGTCTAGTGTTTATGGAGATG
BIP（配列番号１２）：ATTACGCAGAATCTAATCAAGCGATCAAGATATGAAGAGCAGCAA
【００２３】
プライマーセット４
F3（配列番号１３）：GATTATAGAGTATATGCATCAGGTA
B3（配列番号１４）：CCGATTATATATGCAACCAACAA
FIP（配列番号１５）：CCAGACCATACCCAAATGGATTGAGATGAGCTATATGGTGCG
BIP（配列番号１６）：ATTCGATAACAGGCATTGACTTTCCGGCCAAGTTCAATCCCTAT
【００２４】
プライマーセット５
F3（配列番号１７）：CTTTTGTGGGTAGAATGAAGTT
B3（配列番号１８）：GCTGACTAATGCAAAACCA
FIP（配列番号１９）：CGAACCCATCAATATCAGTTTCAGACATTCCTTATCTATTATTGCAGCAC
BIP（配列番号２０）：TGTCCGTTGGGGGGCTTATAATTATACCAAACTGATCCCAGTA
【００２５】
プライマーセット６
F3（配列番号２１）：GAGCCAAGTTTAAATGGCTAT
B3（配列番号２２）：ACGGAATGAGCTGGTATG
FIP（配列番号２３）：CAAACGCCAAAATTAGTCTGTACTTTTATGGTTTAATGTTCTTGATGGTC
BIP（配列番号２４）：ATTTCAGGTGCGAAATTTTCATTCCAAAAGCCTTTCACCTTGAAG
【００２６】
プライマーセット７
F3（配列番号２５）：GCTGGGATTCTGGCATAT
B3（配列番号２６）：GGAATATTATTCCTTAGAGCATTCA
FIP（配列番号２７）：ACTCCATATGTCAGAAACGCTCATATTCCATATGATACAATGGATTTAGC
BIP（配列番号２８）：TGCATGAAATGTTTAAATGCAGCGTAAACGTTGCTATAAATGGAAGC
【００２７】
プライマーセット８
F3（配列番号２９）：GGGGGACTATAAGTGTCATG
B3（配列番号３０）：AGGGTCTTTGAAGCAGTAG
FIP（配列番号３１）：CCGCCTTTGTATATTGGAGTTACTAAACATAAATCAGAGATGTGAAAGTC
BIP（配列番号３２）：TGCAATAATATTTTGGTTGGCACTCTTGTTAATACTAAGGCTGGGAAT
【００２８】
プライマーセット９
F3（配列番号３３）：TGTTATAGTATTCGCTTTGTGTT
B3（配列番号３４）：TTCACGAAGCATCACTACA
FIP（配列番号３５）：ACGTCCATTGGGATTTGTTATTGTAATTGGATTTATATATGCAGCAATCG
BIP（配列番号３６）：TTCTGGATTCATTAGACCGTCAGCAGCATATATAGAATGATAAGGCC
【００２９】
プライマーセット１０
F3（配列番号３７）：ATTTGGATTACTATTAGGCTGG
B3（配列番号３８）：CCTATCAGTATCTTTCATAAATGCT
FIP（配列番号３９）：ACCGCAGATATTAGCAATAGAAAGTGTTTTAAAAGGGAGTCAATTGAGA
BIP（配列番号４０）：ATTCTGATGGGGTGGAATTTAATCAAAATTAACCATGTAACAACAGTC
【００３０】
プライマーセット１１
F3（配列番号４１）：CTTGTTGCATATTATTATTCTAGCG
B3（配列番号４２）：TATAATAAGAAGCAGGCCAATT
FIP（配列番号４３）：TCGATAATTTGACAGAACTGCTTCCTCTTCTGTTTAGACTTGATAAGGT
BIP（配列番号４４）：ACTTAGGAAAAGTGACTTCAACGGCAGACTAGTATAAACTGTTGTATCC
【００３１】
プライマーセット１２
F3（配列番号４５）：AAATACTGCAGCGCTTTC
B3（配列番号４６）：ACACTCAACAGTGATGTGAT
FIP（配列番号４７）：ATGCGATAATGCCAATAACCCAAGTAGCATTATTGTGTATGCTACTTTC
BIP（配列番号４８）：GTCTCAAACTGCAAGTGCTTTTATGTCTTTTTATGATGTCTTCGAATG
【００３２】
プライマーセット１３
F3（配列番号４９）：GCTGAATATAGAATTATGGGACTT
B3（配列番号５０）：GTGACATATAATAATGATAAGGCAC
FIP（配列番号５１）：GGTTAAGAAGCCAATATCACCAACTGTATATGATGATAGCATTCCCCTT
BIP（配列番号５２）：ATCAGAATAAACCACTTGTCGGACTAATGTTAACATAACTCGTGCA
【００３３】
プライマーセット１４
F3（配列番号５３）：CCTATTGTTATCATTTTATTGCGGT
B3（配列番号５４）：TGTAATGTTACTCGATCTGCC
FIP（配列番号５５）：GTTCGACGAAATATAAACCAGCAATGTTATACAAATTGTTTAACTCTCGG
BIP（配列番号５６）：GCATTCGCTGTTATAGGTGTGGCCATAATCCACTCGTATAGGTC
【００３４】
なお，本発明のプライマーセットは，F3，B3，FIP，BIPのプライマーから構成されている。それぞれの表記については，下記のとおり設計されたプライマーであることを示す。
［F3］
F3c領域と相補的な配列であるF3領域を持つように設計されたアウタープライマー。
［B3］
B3c領域と相補的な配列であるB3領域を持つように設計されたアウタープライマー。
［FIP］
F2c領域と相補的な配列であるF2領域を3’末端側に持ち，5’末端側にF1c領域と同じ配列を持つように設計されたインナープライマー。
［BIP］
B2c領域と相補的な配列であるB2領域を3’末端側に持ち，5’末端側にB1c領域と同じ配列を持つように設計されたインナープライマー。
【発明の効果】
【００３５】
本発明により，現在行われている血清学的なO抗原分類に代わる，迅速で精度の高いO抗原型分類手法の提供が可能となった。すなわち，本発明におけるプライマーセットを用いて大腸菌O抗原の特異的な核酸配列を増幅することにより，大腸菌分離株の検出および判別を，迅速かつ高い精度で行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】大腸菌O41抗原および048抗原のwzy遺伝子配列を示した図
【図２】大腸菌O69抗原および074抗原のwzy遺伝子配列を示した図
【図３】大腸菌O76抗原および088抗原のwzy遺伝子配列を示した図
【図４】大腸菌O156抗原および0170抗原のwzy遺伝子配列を示した図
【図５】大腸菌O175抗原および0179抗原のwzy遺伝子配列を示した図
【図６】大腸菌O180抗原および0181抗原のwzy遺伝子配列を示した図
【図７】大腸菌O113抗原および0174抗原のwzy遺伝子配列を示した図
【図８】反応溶液組成を示した図
【図９】Pool templateの説明図
【図１０】Pool templateの各poolに含まれている大腸菌分離株種を示した図
【図１１】実施例１から４のLAMP法による判別結果を示した図
【図１２】実施例５から８のLAMP法による判別結果を示した図
【図１３】実施例９から１２のLAMP法による判別結果を示した図
【図１４】実施例１３から１４のLAMP法による判別結果を示した図
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下，本発明のプライマーセット，ならびにこれを用いた大腸菌検査方法，検査キットについて，LAMP法を例にとり，説明を行う。
【００３８】
まず，LAMP法について簡単に説明を行う。
LAMP法（Loop-Mediated Isothermal Amplification）とは，鋳型となる塩基配列に自身の３’末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに，このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより，等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法として定義される（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）。LAMP法の核酸増幅で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは，鋳型核酸の塩基配列の計６領域，すなわち３’末端側からF3c，F2c，F1cという領域と，５’末端側からB3，B2，B1という領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のプライマーであって，各々インナープライマーF及びB，アウタープライマーF及びBと呼ばれる。また，F1c，F2c，F3cの相補的な塩基配列はF1，F2，F3と，B1，B2，B3の相補的な塩基配列はB1c，B2c，B3cとそれぞれ呼ばれる。
【００３９】
続いてLAMP法による検査方法の一連の流れについて説明を行う。
LAMP法による大腸菌検査のためには，検体試料が必要である。この検体試料としては，通常用いられるあらゆる検体試料を用いることが可能であり，例えば，大腸菌感染が疑われる食品，ヒトや動物由来の生体試料などが挙げられる。
大腸菌検査のための検体試料については，通常用いられる前処理を行い，LAMP法に用いる際の試料とすればよい。例えば，タンパク質分解酵素等による組織細胞由来タンパク質を分解後，フェノール及びクロロホルムを用いて核酸抽出や精製を行ったり，市販されている抽出キットを用いて得られた核酸を抽出したりするなどである。
【００４０】
検体試料の準備ができたら，本発明のプライマーセットを用いて，核酸増幅のための操作を行う。この核酸増幅の際の操作として，例えば，反応溶液中，少なくとも１セットのプライマーセット，鋳型依存性核酸合成酵素，デオキシヌクレオチド3リン酸などの基質を，60から65℃で15分から1時間程度インキュベートすればよい。
【００４１】
本発明のプライマーセットは，プライマーセット１（配列番号１から４）が主としてO41抗原，プライマーセット２（配列番号５から８）が主としてO48抗原，プライマーセット３（配列番号９から１２）が主としてO69抗原，プライマーセット４（配列番号１３から１６）が主としてO74抗原，プライマーセット５（配列番号１７から２０）が主としてO76抗原，プライマーセット６（配列番号２１から２４）が主としてO88抗原，プライマーセット７（配列番号２５から２８）が主としてO113抗原，プライマーセット８（配列番号２９から３２）が主としてO156抗原，プライマーセット９（配列番号３３から３６）が主としてO170抗原，プライマーセット１０（配列番号３７から４０）が主としてO174抗原，プライマーセット１１（配列番号４１から４４）が主としてO175抗原，プライマーセット１２（配列番号４５から４８）が主としてO179抗原，前記プライマーセット１３（配列番号４９から５２）が主としてO180抗原，前記プライマーセット１４（配列番号５３から５６）が主としてO181抗原の特異的な塩基配列を増幅することを目的とするプライマーセットである。
【００４２】
本発明のプライマーセットは，検出対象となる大腸菌分離株の核酸領域を効率よく増幅することが可能である。これにより，検出対象である大腸菌分離株を高率かつ迅速に検出することができる。加えて，プライマーセットを組み合わせて用いることにより，大腸菌分離株の判別が可能となる。
本発明において，これらプライマーセットは，主な検出対象の型の大腸菌分離株のみの検出に限定する意図ではなく，その他の型の大腸菌分離株の検出に用いてもかまわない。例えば，プライマーセット１を用いて，O41抗原以外の大腸菌分離株を検出するなどである。大腸菌分離株の検出・判別を行う場合，対象となる大腸菌O抗原型が分からないことが通常である。その場合などには種々のプライマーセットを複合的に用いることにより，より正確な大腸菌分離株の検出や判別が可能となる。
【００４３】
鋳型依存性核酸合成酵素は，通常用いられるあらゆる鋳型依存性核酸合成酵素を用いることができる。このような酵素として，例えば，Bst DNAポリメラーゼ，Bca(exo-)DNAポリメラーゼ，大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ，好ましくはBst DNAポリメラーゼが挙げられる。
【００４４】
核酸増幅反応操作が終了したら，核酸増幅産物の検出を行う。核酸増幅産物の検出には，通常用いられるあらゆる検出方法を用いることができる。例えば，増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドを用いた検出や蛍光性インターカレーター法，アガロースゲル電気泳動法による検出などである。アガロースゲル電気泳動法においてLAMP増幅産物は，塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
加えて，LAMP法では目視による検出ができる場合があり，迅速な大腸菌分離株の検出が必要な場合に好ましい。すなわち，LAMP法では，核酸の合成により基質が大量に消費され，副産物であるピロリン酸が，共存するマグネシウムと反応してピロリン酸マグネシウムとなり，反応液が肉眼で確認できる程度に白濁することから大腸菌分離株の検出が可能である。この場合，反応中の濁度上昇経過や反応終了後の濁度を光学的に観察できる分光光度計等の測定機器を用いて，大腸菌分離株の検出を確認することも可能である。
【００４５】
本発明のプライマーセットを用いて核酸増幅の検出を行う際に必要な各種の試薬類は，あらかじめパッケージングしてキット化することにより，検査キットとすることができる。この場合，検査キットは，少なくとも１セットの本発明のプライマーセットと，核酸増幅用試薬を含む。核酸増幅用試薬として，例えば，核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ，鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素，逆転写活性を持つ酵素，酵素反応に好適な条件を与える緩衝液や塩類，酵素や鋳型を安定化する保護剤などが挙げられる。
本発明における検査キットは，さらに蛍光検出用試薬を含むことができる。これにより，UV照射等で目視により核酸増幅の有無を確認することができるため，簡便性を向上させることができるという効果を有する。この蛍光検出用試薬として，例えば，カルセインが挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下，本発明について，実施例をもとに詳細に説明を行うが，当然のことながら，本発明は，下記の内容に限定されるものではない。
【００４７】
＜実験方法＞
１．標的とした大腸菌O抗原型
実施例では，14種類の大腸菌O抗原型（O41，O48，O69，O74，O76，O88，O113，O156，O170，O174，O175，O179，O180，O181）を対象とした。
【００４８】
２．塩基配列情報の取得
(1)  12種類の大腸菌O抗原型（O41，O48，O69，O74，O76，O88，O156，O170，O175，O179，O180，O181）については，これまでにO抗原コード領域の塩基配列情報が知られていないことから，大腸菌O抗原型標準株を用いて塩基配列を決定した。各大腸菌O抗原型標準株よりDNAを精製し，それらを鋳型DNAとしてO抗原コード領域の両外側に設計したプライマーを用いてPCRにて増幅後（増幅産物は15〜25kb），増幅産物をショットガンシークエンス法により決定した。得られた配列情報からNCBIの統合データベースを元にアノテーションし，wzyまたはwzxと予想される遺伝子を特定した（図１から図６，配列番号５７〜６８）。
(2)  2種類の大腸菌O抗原型（O113，O174）については，既に明らかとなっている塩基配列（Paton and Paton. Infec and Immun 67(11); 5930-5937，Beutin et al. J Clin Microbiol43(10); 169-185）をGenBankより取得した（図７，配列番号６９，７０）。
【００４９】
３．プライマーの設計
得られたwzyまたはwzxの塩基配列を基に，それぞれ４本（FIP, BIP, F3,B3）のプライマーを設計した。
【００５０】
４．LAMP法による核酸増幅操作および検出操作
(1)  反応には96穴PCR反応用プレートを用いた。
(2)  図８に示す組成で反応液を混和し，サーマルサイクラー（ABI3100）にて，63℃で59分，80℃で2分反応させた。
(3)  PCR反応用のフタを開いて上下を反転させ，UVトランスイルミネーター上に設置し，312nmのUVを照射して発色の有無をゲル撮影装置で確認した。
(4)  なお，反応液中には，DNA増幅により蛍光発色する試薬（Calcein）が含まれているため，増幅反応後は，UV照射により大腸菌O抗原型の検出のみを行うことができる。このとき，泳動確認行程を省略することができることにより，より迅速かつ簡便な検出が可能となる。
【００５１】
５．Pool
templateおよびSingle templateによる大腸菌O抗原型の検出および判別
(1)  全ての大腸菌O抗原型をカバーする標準株184株を用い，各プライマーセットによるLAMP法を実施した。
(2)  第一段階としてPool templateにより網羅的な検出操作を行い，第二段階としてSingle templateによりO抗原を確定させる検出操作を行った。
(3)  Pool templateには任意の数（本実施例では１番から３７番までの３７個）のプールを用い，それぞれ１つのプールには任意の数の種類（本実施例では５種類）の，大腸菌O抗原型の標準株DNAが含まれている（図９，１０。図１０中Pool Template No.は，当該大腸菌O抗原型が，その番号のプールに含まれていることを示す。）。これにより，Pool templateにて蛍光が確認された場合，蛍光があったプールの５種類の大腸菌O抗原標準株のうち，いずれか又は複数に対して，核酸増幅が行われたことを意味する。
(4)  Single templateには，それぞれ１つの穴の中に１つの大腸菌O抗原型の標準株DNAが含まれている。これにより，Single templateにて蛍光が確認された場合，蛍光があった穴の大腸菌O抗原標準株の核酸増幅が行われたことを意味する。
【００５２】
＜実験結果＞
結果を図１１から図１４に示す。
【００５３】
１．実施例１では，プライマーセット１（配列番号１〜４）を用いた。Pool templateの９番にて蛍光が確認され，大腸菌O抗原標準株O41，O42，O43，O44，O45のいずれか又は複数に対して核酸増幅が行われたことが確認された。次に，Single templateにて確認を行ったところ，O41での蛍光が確認された（図１１）。よって，実施例１のプライマーセット１で，O41に特異的に検出することが確認できた。
２．実施例２では，プライマーセット２（配列番号５〜８）を用いた。Pool templateの１０番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O48での蛍光が確認された（図１１）。よって，実施例２のプライマーセット２で，O48に特異的に検出することが確認できた。
３．実施例３では，プライマーセット３（配列番号９〜１２）を用いた。Pool templateの１４番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O69での蛍光が確認された（図１１）。よって，実施例３のプライマーセット３で，O69に特異的に検出することが確認できた。
４．実施例４では，プライマーセット４（配列番号１３〜１６）を用いた。Pool templateの１５番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O74での蛍光が確認された（図１１）。よって，実施例４のプライマーセット４で，O74に特異的に検出することが確認できた。
【００５４】
５．実施例５では，プライマーセット５（配列番号１７〜２０）を用いた。Pool templateの１５番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O76での蛍光が確認された（図１２）。よって，実施例５のプライマーセット５で，O76に特異的に検出することが確認できた。
６．実施例６では，プライマーセット６（配列番号２１〜２４）を用いた。Pool templateの１８番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O88での蛍光が確認された（図１２）。よって，実施例６のプライマーセット６で，O88に特異的に検出することが確認できた。
７．実施例７では，プライマーセット７（配列番号２５〜２８）を用いた。Pool templateの２２番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O113での蛍光が確認された（図１２）。よって，実施例７のプライマーセット７で，O113に特異的に検出することが確認できた。
８．実施例８では，プライマーセット８（配列番号２９〜３２）を用いた。Pool templateの３１番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O156での蛍光が確認された（図１２）。よって，実施例８のプライマーセット８で，O156に特異的に検出することが確認できた。
【００５５】
９．実施例９では，プライマーセット９（配列番号３３〜３６）を用いた。Pool templateの３４番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O170での蛍光が確認された（図１３）。よって，実施例９のプライマーセット９で，O170に特異的に検出することが確認できた。
１０．実施例１０では，プライマーセット１０（配列番号３７〜４０）を用いた。Pool templateの３５番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O174での蛍光が確認された（図１３）。よって，実施例１０のプライマーセット１０で，O174に特異的に検出することが確認できた。
１１．実施例１１では，プライマーセット１１（配列番号４１〜４４）を用いた。Pool templateの３５番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O175での蛍光が確認された（図１３）。よって，実施例１１のプライマーセット１１で，O175に特異的に検出することが確認できた。
１２．実施例１２では，プライマーセット１２（配列番号４５〜４８）を用いた。Pool templateの３６番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O179での蛍光が確認された（図１３）。よって，実施例１２のプライマーセット１２で，O179に特異的に検出することが確認できた。
【００５６】
１３．実施例１３では，プライマーセット１３（配列番号４９〜５２）を用いた。Pool templateの３６番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O181での蛍光が確認された（図１４）。よって，実施例１３のプライマーセット１３で，O181に特異的に検出することが確認できた。
１４．実施例１４では，プライマーセット１４（配列番号５３〜５６）を用いた。Pool templateの３６番にて蛍光が確認され，Single templateにて確認を行ったところ，O180での蛍光が確認された（図１４）。よって，実施例１４のプライマーセット１４で，O180に特異的に検出することが確認できた。
【００５７】
本実施例の各プライマーセットにより，大腸菌のO抗原型を，遺伝学的に迅速かつ正確に判別できることが確認できた。特にO170とO175を除く12種類のO抗原型についてはこれまでに腸管出血性大腸菌のO抗原型としても確認されている。よって，本発明の成果は，今後，医療や公衆衛生・食品衛生の場において，腸管出血性大腸菌を含む病原大腸菌感染症の予防や感染拡大を防ぐ為に有効なことが期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は，医療分野，公衆衛生分野および食品衛生分野での感染症原因大腸菌の分類・同定技術おいて利用することが出来る。
【図１】
2013220032.tif 000003
【図２】
2013220032.tif 000004
【図３】
2013220032.tif 000005
【図４】
2013220032.tif 000006
【図５】
2013220032.tif 000007
【図６】
2013220032.tif 000008
【図７】
2013220032.tif 000009
【図８】
2013220032.tif 000010
【図９】
2013220032.tif 000011
【図１０】
2013220032.tif 000012
【図１１】
2013220032.tif 000013
【図１２】
2013220032.tif 000014
【図１３】
2013220032.tif 000015
【図１４】
2013220032.tif 000016
【配列表】
2013220032000001.app