(57)【要約】【課題】視神経細胞を保護することで緑内障等の眼疾患の進行を遅らせることを可能ならしめる、神経細胞保護作用を有する薬剤のスクリーニング方法、スクリーニング方法で選択された物質を病態モデル動物に投与し、インビボで該物質の薬効を判定する方法等を提供すること。【解決手段】眼疾患の治療に使用する薬剤のスクリーング方法であって、培養細胞に被験物質を接触させる工程、被験物質の存在下で培養細胞を高ストレス条件下で培養する工程、及び、該培養細胞に対する保護作用を有する被験物質を選択する工程を含む、前記スクリーニング方法、該スクリーニング方法で選択された物質を病態モデル動物に投与し、インビボで該物質の薬効を判定する方法、及び、該スクリーニング方法を実施するために使用するキット又は装置。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼疾患の治療に使用する薬剤のスクリーング方法であって、培養細胞に被験物質を接触させる工程、被験物質の存在下で培養細胞を高ストレス条件下で培養する工程、及び、該培養細胞に対する保護作用を有する被験物質を選択する工程を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２】
加圧条件及び／又は低酸素濃度条件下で培養する工程を含む、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
加圧は50〜70mmHgの範囲で行なわれ、酸素濃度は0.5〜2％の範囲である、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
培養細胞が、眼の上皮組織である網膜の構造に関与する細胞である、上記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
培養細胞が、哺乳動物のアストロサイト、線維芽細胞、視細胞、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、マクロファージ、ミクログリア、網膜色素上皮細胞、及び網膜血管内皮細胞から成る群から選択される１種又は２種以上である、上記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
培養細胞に対する保護作用を一定時間培養後の細胞の生死によって判定する、上記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
眼疾患が緑内障、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、及び、高度近視から成る群から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法で選択された物質を病態モデル動物に投与し、インビボで該物質の薬効を判定する方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法を実施するために使用するキット又は装置であって、培養装置、加圧・低酸素チャンバー、圧力調整装置（水カラム）、ヒーター、酸素濃度測定器、及び圧力測定器（マノメーター）を含む該キット又は装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑内障等の眼疾患の治療に使用する薬剤スクリーニング方法等にに関する。
【背景技術】
【０００２】
失明原因疾患の第一位は緑内障であり、高齢化社会に伴い年々増加している。緑内障とは、視神経細胞が障害されて萎縮し、視野が損われ、視力も低下していく眼疾患である。従来、緑内障は眼圧が高くなることで、視神経細胞が障害され発症すると考えられ、現在、緑内障では降眼圧剤の使用が主な治療方針となっている。
【０００３】
しかしながら、日本人では緑内障患者の70％は正常眼圧緑内障であり、治療により眼圧が下降しない症例や、眼圧が正常範囲内でも緑内障が進行する症例が多く認められ、このような症例では現状の治療に限界がある。正常眼圧で進行する緑内障患者では乳頭陥凹と視神経乳頭の血管退縮による循環不全が認められる。
【０００４】
特許文献１には、神経損傷を抑制するための化合物及びその特定方法に関する発明が記載されている。当該文献に記載の発明は、緑内障で眼圧が上昇すること、高圧力で神経細胞が障害を受ける旨が開示されている。そして、眼圧の増加が眼の流体中へのアデノシン5’-三リン酸（ATP）の放出を引き起こす可能性があり、単離した網膜に細胞外ATPを適用すると圧力誘発による網膜神経節細胞損傷に似た病状を起こし得るという発見に基づくものである。当該文献には、特定の化合物の神経保護効果を調べるために、該化合物存在下、静水圧条件（10-90mmHg）下で細胞を培養したことが開示されている。しかし、当該文献には、細胞を低酸素状態で培養することについては記載されていない。
【０００５】
又、特許文献２は緑内障の治療法に関する発明が記載されている。当該文献に記載の発明は、緑内障に見られる神経損傷に随伴して大グリア細胞の活性化と組織再構築が起こることに基づき、緑内障性神経障害の治療用薬剤として、グリア細胞からのＴＮＦ-αの放出、合成、または産生を拮抗、阻害等する化合物が記載されている。そして、実施例には、培養細胞を用いた検討を行うにあたって、網膜神経節細胞の細胞死の分子メカニズムを試験する際の疑似緑内障環境を作るために、擬似虚血（グルコースを欠如させた培地で低酸素状態（９５％Ｎ２/５％ＣＯ２）又は流体静力学的高圧（50ｍｍHg）下で、網膜神経節細胞と網膜グリア細胞を共培養したことが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００８−５４２３８５
【特許文献２】特表２００３−５２９５６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、視神経細胞を保護することで緑内障等の眼疾患の進行を遅らせることを可能ならしめる、神経細胞保護作用を有する薬剤のスクリーニング方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、網膜細胞の培養細胞とマウス病態モデルを用いた薬剤スクリーニング方法において、該細胞の培養を特定の低栄養且つ高ストレス条件（例えば、高圧及び／又は低酸素濃度）下で実施することによって、眼疾患の治療に有効な神経細胞を保護する薬剤をスクリーニングすることが可能であることを見出し、本発明に至った。
【０００９】
即ち、本発明は、第一の態様として、眼疾患の治療に使用する薬剤のスクリーング方法であって、培養細胞に被験物質を接触させる工程、被験物質の存在下で培養細胞を高ストレス条件下、例えば、加圧条件及び／又は低酸素濃度条件下で培養する工程、及び、該培養細胞に対する保護作用を有する被験物質を選択する工程を含む、前記スクリーニング方法に係る。
【００１０】
第二の態様として、本発明のスクリーニング方法で選択された物質を病態モデル動物に投与し、インビボで該物質の薬効を判定する方法に係る。
【００１１】
更に、第三の態様として、このようなスクリーニング方法を実施するために使用する各種キットに係る。尚、以下、本発明のスクリーニング方法及びスクリーニングキットを含めて、「スクリーニング系」と称することがある。
【発明の効果】
【００１２】
本発明方法を用いることによって、in vitroにおける特殊な環境下で、緑内障等の眼疾患の治療に有効な神経細胞を保護する薬剤を大規模な薬剤ライブラリーから効率的、且つ、迅速にスクリーニングすることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】アストロサイト（星状膠細胞）を用いた薬剤スクリーニングの結果を示す。
【図２】初代培養線維芽細胞を用いた薬剤スクリーニングの結果を示す。
【図３】網膜神経節細胞の混合培養細胞を用いた薬剤スクリーニングの結果を示す。
【図４】網膜神経節細胞の混合培養細胞を用いた加圧又は低酸素条件下における薬剤スクリーニングの結果を示す。
【図５】網膜神経節細胞の混合培養細胞を用いた加圧及び低酸素条件下における薬剤スクリーニングの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、「眼疾患」とは、視神経細胞が関与する、例えば、緑内障、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、及び、高度近視等の疾患を意味する。
【００１５】
既に記載したように、緑内障とは、視神経細胞が障害されて萎縮し、視野が損われ、視力も低下していく眼疾患である。一般的に、緑内障には、正常眼圧緑内障、色素緑内障、偽離脱性緑内障、急性隅角閉塞緑内障、絶対緑内障、単性緑内障、慢性緑内障、先天性緑内障、若年性緑内障、原発性開放隅角緑内障、狭隅角緑内障、及び、慢性開放隅角緑内障といった各疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法で使用する培養細胞としては、動物、特に、ヒト、マーモセット、ラット、ブタ及びマウス等の哺乳動物の、例えば、アストロサイト（星状膠細胞）、線維芽細胞、視細胞（光受容細胞）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、アマクリン細胞、マクロファージ、ミクログリア、網膜色素上皮細胞、及び網膜血管内皮細胞等の眼の上皮組織である網膜の構造に関与する各種の細胞から成る群から選択される１種又は２種以上（共培養系）を用いる。
【００１７】
このような培養細胞は、実験動物又はヒト患者から摘出された器官・組織から分離して調製された初代培養細胞、又は、市販の細胞株も含めて、当業者に公知の各種の継代培養されている樹立培養細胞株を使用してもよい。従って、培養細胞が器官・組織から分離調製されたものである場合には、培養細胞は必ずしも一種類の細胞にまで単離されている必要はない。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法においては、培養細胞と被験物質を接触させた後に、被験物質の存在下で該培養細胞を高ストレス条件下、例えば、加圧条件及び／又は低酸素濃度条件下で培養することを特徴とする。ここで、「加圧」とは、好ましくは、40〜100mmHg、好ましくは、50〜70mmHgの範囲を意味し、「低酸素濃度」とは、酸素濃度が  0.2〜5％、好ましくは、0.5〜2％の範囲を意味する。尚、このような加圧及び低酸素濃度の培養条件は、以下に示すようなキット又は装置を使用することによって適宜設定することが出来る
【００１９】
本発明のスクリーニング方法においては、一般に、培養細胞に対する「保護作用」とは、外部からの様々な要因・因子の影響に対して、該培養細胞が有する正常な増殖能、機能及び／又は特性等を保護・維持・発揮させる作用を意味する。従って、被験物質が該培養細胞に対する保護作用を有するか否かの判定（測定）は、培養細胞に種類等に応じて当業者に公知の各種の検査及び測定手段によって実施することが出来る。例えば、被験物質を選択する培養細胞に対する保護作用は、一定時間培養後の細胞の生死（即ち、細胞増殖能）によって判定することが出来る。
【００２０】
又、本発明のスクリーニング方法において、培養細胞に被験物質を接触させる方法・手段に特に制限はなく、当業者に公知の任意の方法・手段で実施することが出来る。例えば、培養の培養培地に適当量の被験物質を添加した後、被験物質の存在下で培養細胞を適当な時間（例えば、数時間〜数日）培養することによって、被験物質が該培養細胞に対する保護作用を有するか否かの判定を行うことが出来る。培地の種類、培養温度・湿度、培養細胞の培地への播種細胞数（細胞密度）、被験物質の培地への添加量及び添加後の培養時間・条件等の本発明のスクリーニングにおけるその他の各種条件は、被験物質及び培養、並びに、スクリーニング方法に使用するキットの種類等に応じて当業者が適宜設定することができる。
【００２１】
更に、このようなスクリーニング方法で選択された物質を当業者に公知のマウス等の適当な病態モデル動物（高眼圧障害、軸索障害、炎症障害、酸化ストレス障害、高血糖障害）に投与し、当業者に公知の任意の手段によってインビボで該物質の薬効を判定することが出来る。
【００２２】
スクリーニング方法を実施するために使用するキット又は装置は、該方法に含まれる各工程を実施するに必要な要素を含む。例えば、培養装置、加圧・低酸素チャンバー、圧力調整装置（水カラム）、ヒーター、酸素濃度測定器、及び圧力測定器（マノメーター）等の各パーツを含む。更に、被験物質が該培養細胞に対する保護作用を有するか否かを判定（測定）するための検査及び測定手段に使用するの測定用試薬・器具・試薬等を服務ことが出来る。
【００２３】
以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
アストロサイト（星状膠細胞）を用いた薬剤スクリーニング
ラットのアストロサイト（星状膠細胞）を以下の手順で調製した。
9-11週齢のSDラットから摘出した眼球から網膜を単離し、 パパイン溶液中で酵素処理をした。37℃で15分インキュベーション後、 wash bufferで網膜を2回洗浄し、 細胞分離した。細胞懸濁液を70 μmセルストレイナーで細胞塊を除去し、 PLLコーティングフラスコへ2,000 cells / mm2の密度で播種した。37℃で1ヶ月間培養したのちに、 アストロサイトマーカー（Glial fibrillary acidic protein（GFAP））で免疫染色を行い、 培養した細胞がアストロサイトであることを確認した。この免疫染色は以下の方法で行った。
播種した細胞をPBSで3回洗浄し、4% PFAで室温、10分インキュベーションした。0.1% TritonX / PBSで室温、5分インキュベーションし、膜透過処理を行った。PBSで洗浄後、ブロッキング液（10% goat serum、 0.5% fish gelatin、 3% BSA、 0.2% Tween20）で室温、30分ブロッキングした。GFAP抗体（DAKO）を4℃で一晩反応させ、PBST（0.22% Tween20 / PBS）洗浄を1回、PBS洗浄を2回行った。二次抗体を室温、1時間反応させ、PBST洗浄を1回、PBS洗浄を2回行った。ヘキストで核染色し、PBS洗浄を2回行った細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。
【００２５】
こうして調製された高純度のアストロサイトを96 wellに2,000cell/mm2の密度で播種し、培地；10% FBS、 1% PenStrep、 DMEM/F12 (5 ng/ml bFGF、 0.5 ng/ml PDGF)中で24時間、37 ℃で培養し、次いで、被検物質の代わりに、細胞保護作用があることが明らかであるY-27632（神経保護剤： ROCK inhibitor：Calbiochem）を最終濃度5 μMとなるように100 μl添加して所定の加圧条件（60 mmHg）下で培養を継続し、24時間後にAlmar blue 試薬（invitrogen）を各ウェルに100 μl添加し、蛍光強度（Ex.544nm; Em.590nm）を測定し、増殖能を定量的に評価した。その結果、図１に示されるように、圧力により細胞傷害が誘導されており、その傷害はY-27632の添加によって抑制されることが本発明のスクリーニング方法で測定されることが確認された。なお、図中、ＮＰは非加圧下、Ｐは加圧下の条件で培養したことを示す。
【実施例２】
【００２６】
初代培養線維芽細胞を用いた薬剤スクリーニング
コモンマーモセット（メス、 3歳）の眼球からテノン嚢を摘出し、 DMEM（10% FBS、 1% Antibiotic-Antimycotic）中で組織片培養した。37℃で1ヶ月間培養したのちに、 線維芽細胞特異的マーカー（fibroblast-specific protein-1（FSP-1））で免疫染色を行い、 培養した細胞が線維芽細胞であることを確認した。この免疫染色は以下の方法で行った。
播種した細胞をPBSで3回洗浄し、4% PFAで室温、10分インキュベーションした。0.1% TritonX / PBSで室温、5分インキュベーションし、膜透過処理を行った。PBSで洗浄後、ブロッキング液（10% goat serum、 0.5% fish gelatin、 3% BSA、 0.2% Tween20）で室温、30分ブロッキングした。FSP-1抗体（Chemicon）を4℃で一晩反応させ、PBST（0.22% Tween20 / PBS）洗浄を1回、PBS洗浄を2回行った。二次抗体を室温、1時間反応させ、PBST洗浄を1回、PBS洗浄を2回行った。ヘキストで核染色し、PBS洗浄を2回行った細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。
【００２７】
こうして調製されたコモンマーモセット線維芽細胞を96 well plateへ3,000 cells / mm2の密度で播種し、 DMEM（1% Antibiotic-Antimycotic）で希釈した薬剤を投与した。薬剤には一般的に緑内障手術で使用されているトラニラスト（和光純薬工業）、 マイトマイシンC（協和発酵キリン）を選択し、 それぞれ300 μM、 10 μMとなるように投与した。37℃で24時間インキュベーション後、 Almar blue試薬（invitrogen）を添加したのちに37℃で2時間インキュベーションし、 蛍光強度（Ex.544 nm、 Em. 590 nm）を測定することで増殖能を定量的に評価した。その結果、 図２に示されるように、トラニラスト、 マイトマイシンCともに線維芽細胞増殖抑制活性を示すことが本発明のスクリーニング方法により確認された。
【実施例３】
【００２８】
網膜神経節細胞の混合培養細胞を用いた薬剤スクリーニング
9-11週齢のC57 / BL6マウスから摘出した眼球から網膜を単離し、 パパイン溶液中で酵素処理をした。37℃で15分インキュベーション後、 wash bufferで網膜を2回洗浄し、 細胞分離した。細胞懸濁液を70 μmセルストレイナーで細胞塊を除去し、 CC2コーティング96 well plateへ6,500 cells / mm2の密度で播種した。本発明において、 5種類の抗酸化酵素を含むB-27サプリメント（invitrogen）を添加したNeurobasal A培地（invitrogen）で懸濁した細胞懸濁液（以下、 AO+）と抗酸化酵素を除いた細胞懸濁液（以下、 AO-）をそれぞれポジティブコントロール、 ネガティブコントロールとした。このときAO-では細胞分離によるグルタミン酸障害および、それに伴う酸化ストレスが生じていると考えられ、AO+では抗酸化酵素により細胞内の酸化ストレスが軽減されていると考えられる。細胞懸濁液を37℃で15分インキュベーション後、 AO-へ既知のNMDA受容体アンタゴニストであるMK801（Sigma-Aldrich）を10 μMとなるように投与した。37℃で2時間インキュベーション後、 Almar blue試薬（invitrogen）を添加したのちに37℃で24時間インキュベーションし、 蛍光強度（Ex.544 nm、 Em.590 nm）を測定することで増殖能を定量的に評価した。
【００２９】
その結果、 図３に示されるように、MK801はAO+と同等の神経保護活性を示すことが本発明のスクリーニング方法により確認された。このMK801による保護効果はグルタミン酸受容体の一種であるNMDA受容体を阻害したことによるグルタミン酸障害と酸化ストレスの軽減が寄与しているものと考えられる。
【実施例４】
【００３０】
加圧、低酸素条件下における薬剤スクリーニング
実施例３の方法に従って細胞懸濁液を調製し、AO-へタンニン酸（MicroSource Discovery System社）を10 μMとなるように投与した。37℃で2時間インキュベーション後、 Almar blue試薬（invitrogen）を添加したのちに37℃、加圧（60 mmHg）下（Ａ）または低酸素（1% O2）下（Ｂ）またはその両条件下（Ｃ）で24時間インキュベーションし、 蛍光強度（Ex. 544 nm、 Em. 590 nm）を測定することで増殖能を定量的に評価した。低酸素条件下でスクリーニングを行う際は、使用する培地をすべて1% O2で15分以上バブリングし、培地中の酸素濃度を1%に置換した。
【００３１】
その結果、 図４及び図５に示されるように、タンニン酸はすべてのストレス条件下においてAO+と同等以上の神経保護活性を示すことが本発明のスクリーニング方法により確認された。このタンニン酸の保護効果は細胞外カルシウムのキレートやprotein kinase C（PKC）の阻害による細胞内へのカルシウム流入の阻害が寄与しているものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明を用いて薬剤ライブラリーの中から特殊な環境（高ストレス下）において培養細胞の増殖能を評価し、得られたデータに基づき神経保護効果の強い化合物を選択し、動物モデルに投与また最終的には緑内障等の眼疾患患者へ投与することが出来る。本邦だけでも４０歳以上の約３０人に１人は眼圧が正常である正常眼圧緑内障を有すると言われているが、現在、緑内障治療薬の薬理作用はほとんど降圧作用のみである。従って、本発明方法を使用することに選択される神経保護効果の強い化合物からなる治療薬を併用することにより、多くの緑内障患者の症状の進行を遅らせることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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