(57)【要約】      （修正有）【課題】液体洗剤に対する溶解性の向上したアルカリプロテアーゼの提供。【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、前記の特定な配列からなるアミノ酸配列の所定の位置又はそれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されている変異アルカリプロテアーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表１−１〜１−２の（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、当該表１−１〜１−２の（ｉｉ）記載のアミノ酸残基に置換することを含む、液体洗剤に対するアルカリプロテアーゼの溶解性の向上方法。
【表１−１】
2013233141.tif 000032
【表１−２】
2013233141.tif 000033
【請求項２】
前記同一性が９０％以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位、６８位及び２５５位、又はそれらに相当する位置におけるアミノ酸残基が、下記に示すアミノ酸残基である、請求項１又は２記載の方法。
３０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
６８位又はこれに相当する位置：ヒスチジン
２５５位又はこれに相当する位置：セリン
【請求項４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の表２（ｉ）記載の位置又はそれらに相当する位置におけるアミノ酸残基が、当該表２（ｉｉ）記載のアミノ酸残基である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【表２】
2013233141.tif 000034
【請求項５】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、（Ａ）４０５位、（Ｂ）８１位、（Ｃ）４０位、（Ｄ）１９１位及び（Ｅ）５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、（Ａ）４０５位、（Ｂ）８１位、（Ｃ）４０位、（Ｄ）１９１位及び（Ｅ）５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記（Ａ）４０５位、（Ｂ）８１位、（Ｃ）４０位、（Ｄ）１９１位及び（Ｅ）５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を下記アミノ酸残基に置換する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）４０５位又はこれに相当する位置：ロイシン又はトリプトファン
（Ｂ）８１位又はこれに相当する位置：ロイシン、プロリン、チロシン又はトリプトファン
（Ｃ）４０位又はこれに相当する位置：イソロイシン、フェニルアラニン又はロイシン
（Ｄ）１９１位又はこれに相当する位置：ロイシン又はバリン
（Ｅ）５９位又はこれに相当する位置：バリン、イソロイシン又はロイシン
【請求項８】
前記液体洗剤が界面活性剤４０〜９０質量％を含有する濃縮液体洗剤である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表３−１〜３−２の（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、該表３−１〜３−２の（ｉｉ）記載のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなる、変異アルカリプロテアーゼ。
【表３−１】
2013233141.tif 000035
【表３−２】
2013233141.tif 000036
【請求項１０】
前記同一性が９０％以上である請求項９記載の変異アルカリプロテアーゼ。
【請求項１１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位、６８位及び２５５位、又はそれらに相当する位置におけるアミノ酸残基が、下記に示すアミノ酸残基である、請求項９又は１０記載の変異アルカリプロテアーゼ。
３０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
６８位又はこれに相当する位置：ヒスチジン
２５５位又はこれに相当する位置：セリン
【請求項１２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の表４（ｉ）記載の位置又はそれらに相当する位置におけるアミノ酸残基が、当該表４（ｉｉ）記載のアミノ酸残基である、請求項９〜１１のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼ。
【表４】
2013233141.tif 000037
【請求項１３】
前記１以上のアミノ酸残基が、（Ａ'）４０５位、（Ｂ'）８１位、（Ｃ'）４０位、（Ｄ'）１９１位及び（Ｅ'）５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、請求項９〜１２のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼ。
【請求項１４】
前記１以上のアミノ酸残基が、（Ａ'）４０５位、（Ｂ'）８１位、（Ｃ'）４０位、（Ｄ'）１９１位及び（Ｅ'）５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、請求項９〜１３のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼ。
【請求項１５】
前記（Ａ'）４０５位、（Ｂ'）８１位、（Ｃ'）４０位、（Ｄ'）１９１位及び（Ｅ'）５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を下記アミノ酸残基に置換する、請求項９〜１４のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼ。
（Ａ'）４０５位又はこれに相当する位置：ロイシン又はトリプトファン
（Ｂ'）８１位又はこれに相当する位置：ロイシン、プロリン、チロシン又はトリプトファン
（Ｃ'）４０位又はこれに相当する位置：イソロイシン、フェニルアラニン又はロイシン
（Ｄ'）１９１位又はこれに相当する位置：ロイシン又はバリン
（Ｅ'）５９位又はこれに相当する位置：バリン、イソロイシン又はロイシン
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【請求項１７】
請求項１６記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１９】
請求項１８記載の形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法。
【請求項２０】
請求項９〜１５のいずれか１項記載の変異アルカリプロテアーゼを含有する液体洗剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体洗剤に対するアルカリプロテアーゼの溶解性を向上させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業分野でのプロテアーゼ利用の歴史は古く、衣料用洗剤をはじめとする洗浄剤から繊維の改質剤、皮革処理剤、化粧料、浴剤、食品改質剤或いは医薬品としての利用まで非常に多岐にわたっている。これらの用途の中で最も工業的に大量に生産されているものが洗剤用プロテアーゼであり、例えば、アルカラーゼ、サビナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マクサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）、及びＫＡＰ（花王）等が知られている。
【０００３】
洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣料に付着したタンパク質を主成分とする汚れを分解して低分子化し、界面活性剤による可溶化を促進することである。しかし、実際の汚れはタンパク質だけでなく皮脂由来の脂質や固体粒子等、有機物と無機物が入り混じった複数の成分を内包する複合汚れである。そこで、タンパク質だけでなく皮脂等も混在する複合汚れに対しても優れた洗浄性を有する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼ群が開発され、特許出願されている（特許文献１参照）。当該アルカリプロテアーゼ群は、その分子量、一次構造、酵素学的性質、特に非常に強い酸化剤耐性を有する点で、従来から知られているバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼであるズブチリシンとは異なる。よって、当該アルカリプロテアーゼ群は、新しいズブチリシンサブファミリーに分類することが提唱されている（非特許文献１）。
【０００４】
洗浄剤はその形態により、粉末洗剤と液体洗剤に分類することが出来る。液体洗剤は、粉末洗剤に比べて溶解性に優れ、また、汚れ部分に原液を直接塗布出来るメリットがある。さらに最近では、使用量が従来の液体洗剤の半分程度でよい液体洗剤（いわゆる、濃縮液体洗剤）も市販されている。濃縮液体洗剤は、容器が小さく収納に場所をとらないことや、輸送時に係る燃料の削減のみならず、製品によっては、洗浄メカニズムを基礎から見直すことで、濯ぎ性を改善して洗濯時間を短縮し、水の使用量を節約できるという利点を有している。
【０００５】
酵素配合液体洗剤が常に一定の酵素活性を発揮するためには、洗剤に配合されたプロテアーゼ等の酵素を、液体洗剤に溶解した状態で安定に存在させなければならない。さらに、洗剤の洗浄力を高めるためには、洗剤に酵素をできるだけ多く配合することが望ましい。しかし、液体洗剤への酵素の安定的な配合に関しては、技術的な困難さがあることが広く知られている。元来、酵素を液体中で常温保存すること自体が、タンパク質の変性を招きやすい上に、液体洗剤には界面活性剤、脂肪酸、溶剤等が含有され、ｐＨも弱アルカリ性である。よって液体洗剤は、酵素にとって極めて厳しい環境条件になっている。また、プロテアーゼはタンパク質分解酵素であるが故に自己消化の問題も有しており、液体洗剤中での安定保存をさらに困難なものにしている。さらに、濃縮液体洗剤の場合、従来の液体洗剤と比べて濃縮されていて水分含有量が少ないため、多量の酵素を溶解させることは難しいという問題がある。
【０００６】
液体洗剤中での酵素活性の安定保存のための技術として、カルシウムイオン、ホウ砂、ホウ酸、ホウ素化合物、ギ酸などのカルボン酸、ポリオール等の酵素安定化剤を加えることは公知である。また、プロテアーゼの活性を阻害することにより、自己消化の問題を解決すべく検討もなされており、４−置換フェニルボロン酸（特許文献２）や、ある種のペプチドアルデヒド及びホウ素組成物（特許文献３）によるプロテアーゼの可逆的阻害による安定化法が報告されている。また、デキストランで化学修飾したプロテアーゼが、界面活性剤を含む水溶液中での安定性を向上させ得ることが報告されている（非特許文献２）。さらに、界面活性剤に対する安定性が向上したプロテアーゼ変異体も知られている（特許文献４〜６）。
【０００７】
他方、液体洗剤に対する酵素の溶解性を向上させるための技術は、これまで開発されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【特許文献２】特表平１１−５０７６８０号公報
【特許文献３】特表２０００−５０６９３３号公報
【特許文献４】特開２００９−０３４０６２号公報
【特許文献５】特開２００９−０３４０６３号公報
【特許文献６】国際公開第２０１０／１２６１５６号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Saekiら, Biochem.Biophys.Res.Commun., 279, 313-319, 2000
【非特許文献２】Cosmetics & Toiletries magazine, 111, p79-88, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、液体洗剤に対するアルカリプロテアーゼの溶解性を向上させる方法、及び液体洗剤に対する溶解性が向上した変異アルカリプロテアーゼを提供することに関する。本発明はまた、当該変異アルカリプロテアーゼを含有する液体洗剤組成物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼＫＰ４３が、ある特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することによって、液体洗剤に対する溶解性が向上することを見出した。
【００１２】
すなわち、一態様において、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表１−１〜１−２の（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、当該表１−１〜１−２の（ｉｉ）記載のアミノ酸残基に置換することを含む、液体洗剤に対するアルカリプロテアーゼの溶解性の向上方法を提供する。
【００１３】
【表１−１】
2013233141.tif 000002
【表１−２】
2013233141.tif 000003
【００１４】
別の一態様において、本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の表２−１〜２−２の（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、該表２−１〜２−２の（ｉｉ）記載のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなる、変異アルカリプロテアーゼを提供する。
【００１５】
【表２−１】
2013233141.tif 000004
【表２−２】
2013233141.tif 000005
【００１６】
さらなる一態様において、本発明は、上記変異アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を提供する。
【００１７】
さらなる一態様において、本発明は、上記遺伝子を含有する組換えベクターを提供する。
【００１８】
さらなる一態様において、本発明は、上記組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
【００１９】
さらなる一態様において、本発明は、上記形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。
【００２０】
さらなる一態様において、本発明は、上記変異アルカリプロテアーゼを含有する液体洗剤組成物を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、液体洗剤に溶解しやすいアルカリプロテアーゼを提供することができる。本発明の変異アルカリプロテアーゼは、液体洗剤、とりわけ濃縮液体洗剤に対する溶解性が向上しており、これらの洗剤により多くの量を配合することが可能となる。よって、本発明のアルカリプロテアーゼを配合した液体洗剤は、従来と比べてより高い酵素活性を有し、高い洗浄力を発揮することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【００２３】
本明細書において、「（アミノ酸配列間の）同一性」とは、２つのアミノ酸配列を同一性が最大となるように整列（アラインメント）したときに、両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００２４】
本発明は、アルカリプロテアーゼの溶解性を向上させる方法を提供する。本発明の方法の対象となるアルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼである。本明細書においては、これらを親アルカリプロテアーゼということがある。言い換えると、本明細書における「親アルカリプロテアーゼ」とは、アミノ酸残基に所定の変異がなされて溶解性が向上した変異アルカリプロテアーゼとなされるアルカリプロテアーゼである。
【００２５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる親アルカリプロテアーゼとしては、例えば、ＫＰ４３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）〕由来のアルカリプロテアーゼが挙げられる（ＷＯ９９／１８２１８号パンフレット）。
【００２６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリプロテアーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは異なるが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９７．５％以上、なおより好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアルカリプロテアーゼ、ならびに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアルカリプロテアーゼが挙げられる。なお、本明細書において、１個〜数個とは、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個を意味する。
【００２７】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリプロテアーゼの例としては、プロテアーゼＫＰ９８６０[バチルス エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０３]；プロテアーゼＥ−１[バチルス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、特開昭４９−７１１９１号公報、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０２]；プロテアーゼＹａ[バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２９）由来、特開昭６１−２８０２６８号公報、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０４]；プロテアーゼＳＤ５２１[バチルス ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１６２）由来、特開平３−１９１７８１号公報、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０５]；プロテアーゼＡ−１[ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８／０１２９３、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０６]；プロテアーゼＡ−２[ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ９８／５６９２７]；プロテアーゼ９８６５〔バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）由来、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕が挙げられる。
【００２８】
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリプロテアーゼの例としては、上記ＫＰ−４３株由来のアルカリプロテアーゼにおいて、特開２００２−２１８９８９号公報、特開２００２−３０６１７６号公報、特開２００３−１２５７８３号公報、特開２００４−０００１２２号公報、特開２００４−０５７１９５号公報、特開２００４−０３０５１７５号公報、特開２００４−３０５１７６号公報、特開２００６−１２９８６５号公報、特開２００８−２１２０８４号公報、特開２００９−０３４０６３号公報、特開２００９−０３４０６２号公報、特開２０１０−２７３６７２号公報又は特開２０１０-２７３６７３号公報に記載の変異のうちの１以上を施した変異体アルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００２９】
好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリプロテアーゼにおいて、少なくとも、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位に相当するアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、６８位又に相当するアミノ酸残基はヒスチジンであり、且つ２５５位に相当するアミノ酸残基はセリンである。これらのアミノ酸残基はアルカリプロテアーゼにおいて必須なアミノ酸であることが推定されている（Saekiら, Journal of bioscience and Bioengineering, 103, 501-508, 2007）。
【００３０】
より好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる親アルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列における下記表３（ｉ）に記載の各位置に相当する位置のアミノ酸残基が、当該表（ｉｉ）に記載のアミノ酸残基である。下記表３（ｉ）に示す位置は、上記に例示した親アルカリプロテアーゼ間で高度に保存されているアミノ酸残基（Saekiら, Journal of bioscience and Bioengineering, 103, 501-508, 2007）の位置のなかから、上記に挙げた特開公報に記載の変異体アルカリプロテアーゼで変異されているアミノ酸残基、及び本発明の方法において置換され得るアミノ酸残基の位置を除外したものである。
【００３１】
【表３】
2013233141.tif 000006
【００３２】
あるいは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが有する次の何れかの酵素学的性質を有するものが、本発明の親アルカリプロテアーゼとしてより好ましい。１）酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定である。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素（５ｍＭ塩化カルシウムを含有）溶液中（２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃２０分間放置した後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上であることをいう。２）５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す。３）ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で阻害される。４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。
【００３３】
本発明の方法においては、上記親アルカリプロテアーゼの目的位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することより、その溶解性を向上させる。すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、下記表４−１〜４−３に示される位置のアミノ酸残基のいずれか１以上を、当該表に示される変異後のアミノ酸残基と置換する。あるいは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のアルカリプロテアーゼにおいて、下記表４−１〜４−３に示される位置に相当する位置のアミノ酸残基のいずれか１以上を、当該表に示される変異後のアミノ酸残基と置換する。本発明の方法により上記アミノ酸が置換された変異アルカリプロテアーゼが得られる。当該変異アルカリプロテアーゼは、アルカリプロテアーゼ活性を有し、且つ親アルカリプロテアーゼと比べて、液体洗剤、好ましくは濃縮液体洗剤に対する溶解性が向上している。
【００３４】
【表４−１】
2013233141.tif 000007
【表４−２】
2013233141.tif 000008
【表４−３】
2013233141.tif 000009
【００３５】
本発明の方法において、置換されるべき親アルカリプロテアーゼのアミノ酸残基の位置は、配列番号２で示されるアミノ酸配列においては、好ましくは、４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位から選ばれる位置の少なくとも１つを含む。より好ましくは、置換される位置は、上記に挙げた位置の少なくとも２つを含む。さらに好ましくは、置換される位置は、上記に挙げた位置の少なくとも３つを含む。
また好ましくは、置換される位置は、少なくとも、４０５位と、８１位、４０位又は１９１位との組み合わせを含む。より好ましくは、置換される位置は、４０５位及び８１位と、４０位、１９１位又は５９位との組み合わせを含む。さらになお好ましくは、４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位の全てが置換される。
【００３６】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列においては、置換されるべき位置は、好ましくは、配列番号２の４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位のそれぞれに相当する位置から選ばれる位置の少なくとも１つを含む。より好ましくは、置換されるべき位置は、上記に挙げた位置の少なくとも２つを含む。さらに好ましくは、置換される位置は、上記に挙げた位置の少なくとも３つを含む。
また好ましくは、置換される位置は、少なくとも、４０５位に相当する位置と、８１位、１９１位及び４０位のいずれかに相当する位置との組み合わせを含む。より好ましくは、置換される位置は、４０５位に相当する位置及び８１位に相当する位置と、４０位、１９１位及び５９位のいずれかに相当する位置との組み合わせを含む。さらになお好ましくは、４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位それぞれに相当する位置の全てが置換される。
【００３７】
上記４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位若しくはそれらに相当する位置の単置換、二重又は多重置換に加えて、さらに表４−１〜４−３に示した他の位置若しくはそれらに相当する位置のアミノ酸残基が置換されていてもよい。
【００３８】
置換後のアミノ酸残基は、４０５位又はこれに相当する位置についてはロイシン又はトリプトファンが好ましく、８１位又はこれに相当する位置についてはロイシン、プロリン、チロシン又はトリプトファンが好ましく、４０位又はこれに相当する位置についてはイソロイシン、フェニルアラニン又はロイシンが好ましく、１９１位又はこれに相当する位置についてはロイシン又はバリンが好ましく、５９位又はこれに相当する位置についてはバリン、イソロイシン又はロイシンが好ましい。
【００３９】
本明細書において、「相当する位置のアミノ酸残基」の特定は、公知のアルゴリズムを用いて、目的アミノ酸配列を参照配列（配列番号２で示されるアミノ酸配列）と比較し、各アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより行なうことができる。アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アルカリプロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。アラインメントは、例えば、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイトから利用することができる。
【００４０】
当業者であれば、上記で得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリジン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置のアミノ酸残基」と称される。
【００４２】
すなわち、上記方法を用いることにより、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列の（ａ）４０５位のアミノ酸残基（アスパラギン残基）、（ｂ）８１位のアミノ酸残基（セリン残基）、（ｃ）４０位のアミノ酸残基（セリン残基）、（ｄ）１９１位のアミノ酸残基（セリン残基）、及び（ｅ）５９位のアミノ酸残基（トレオニン残基）に相当する位置のアミノ酸残基は、プロテアーゼＫＰ９８６０においては、それぞれ、（ａ）４０５位のアスパラギン残基、（ｂ）８１位のアラニン残基、（ｃ）４０位のセリン残基、（ｄ）１９１位のセリン残基、及び（ｅ）５９位のトレオニン残基、というように特定することができる。
【００４３】
プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号２）の（ａ）４０５位、（ｂ）８１位、（ｃ）４０位、（ｄ）１９１位、（ｅ）５９位に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記で例示したプロテアーゼＫＰ９８６０、プロテアーゼ９８６５、プロテアーゼＥ−１、プロテアーゼＹａ、プロテアーゼＳＤ５２１、プロテアーゼＡ−１、プロテアーゼＡ−２について示す（表５）。これらの位置のアミノ酸残基は、高度に保存されているか、又は類似のアミノ酸残基として保存されている。
【００４４】
【表５】
2013233141.tif 000010
【００４５】
また例えば、前述の特開２００６−１２９８６５号公報に記載されるような、配列番号２のアルカリプロテアーゼの１３３位と１３４位の間に１アミノ酸残基を挿入した変異アルカリプロテアーゼにおいては、配列番号２の１３４位以降の位置に相当する位置は、配列番号２と比べて１残基下流に位置する。
【００４６】
斯くして特定される「相当する位置」は、アミノ酸配列において高い同一性を有し且つアルカリプロテアーゼであるタンパク質同士の間では、その三次元構造中で同等の位置に存在すると考えられる。したがって、相当する位置に存在するアミノ酸残基の変異は、プロテアーゼの特異的機能に対して互いに類似した効果を及ぼすと推定される。
【００４７】
本発明の方法により得られた変異アルカリプロテアーゼは、表４−１〜４−３に記載された位置若しくはそれらに相当する位置のアミノ酸残基の置換に加えて、その液体洗剤に対する溶解性向上効果を妨げない限り、他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）をさらに伴うものであってもよい。当該変異は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
【００４８】
本発明の方法において、アルカリプロテアーゼのアミノ酸残基を置換する手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列をコードするアルカリプロテアーゼ遺伝子（以下、親アルカリプロテアーゼ遺伝子）内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異遺伝子から変異アルカリプロテアーゼを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基が所望のアミノ酸残基に置換された変異アルカリプロテアーゼを得ることができる。
【００４９】
親アルカリプロテアーゼ遺伝子への目的の変異の導入は、例えば基本的には、親アルカリプロテアーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００５０】
親アルカリプロテアーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親アルカリプロテアーゼ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。
本発明ではまた、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つの変異プライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）７７（１），ｐ．６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。このＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた変異導入手順については、後述の実施例にも詳述している。
【００５１】
親アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したバチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）、バチルス エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、バチルス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）、バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２９）、バチルス ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１６２）、バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）等の菌、又はそれらの変異株から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。
【００５２】
上記バチルス属菌株からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，８：ｐ．１５１−１５６に記載の方法などを用いて行うことができる。親アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから切り出した親アルカリプロテアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。
【００５３】
プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７０５９−７０７１，１９８９）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。変異プライマーを含むプライマーセットを使用し、親アルカリプロテアーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された変異アルカリプロテアーゼ遺伝子を得ることができる。本発明はこのようにして得られる変異アルカリプロテアーゼ遺伝子にも関する。なお本発明において「変異アルカリプロテアーゼ遺伝子」とは、変異アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び人工核酸等を含む）を意味する。本発明に係る「遺伝子」は、オープンリーディングフレームに加えて非翻訳領域（ＵＴＲ）などの他のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００５４】
得られた変異アルカリプロテアーゼ遺伝子を常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより、組換えベクターを作製することができる。本発明で用いるベクターは特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターがより好ましく、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターであることがさらに好ましい。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、変異アルカリプロテアーゼを組換え生産する上で特に好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、後述のｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、プラスミドｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ，（１９８５）６０，ｐ．２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６，ｐ．８７３２）等のシャトルベクター、ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７８）１３４，ｐ．３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１８（１９８７）ｐ．８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），ｐ．１６３−１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【００５５】
変異アルカリプロテアーゼを組換え生産する目的では、ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須な各種エレメントの他、選択マーカー遺伝子やポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等の有用な配列を必要に応じて含み得る。
【００５６】
変異アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えベクターを用いて、形質転換体を作製することができる。本発明では、本発明に係る変異アルカリプロテアーゼ遺伝子を含む組換えベクター（具体的には組換え発現ベクター）を宿主細胞に導入することにより形質転換体（形質転換細胞）を作製し、それを組換えタンパク質の発現が誘導される条件下で培養することにより、変異アルカリプロテアーゼを産生させることができる。
【００５７】
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞を使用することができる。本発明においては、特に、枯草菌等のバチルス属細菌を使用することが好ましい。
【００５８】
形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｂｏｔｔ．Ｋ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９６７）９３，１９２５）、エレクトロポレーション法（Ｂｒｉｇｉｄｉ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）５５，１３５）、プロトプラスト形質転換法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９７９）１６８，ｐ．１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５６，ｐ．１１３０−１１３４）などが挙げられる。
【００５９】
組換えタンパク質生産のための上記形質転換体の培養は、当業者には一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、薬剤選択マーカーの種類に対応してアンピシリンやテトラサイクリン等を添加してもよい。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した細菌等を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ−マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。
【００６０】
本発明の方法において、変異アルカリプロテアーゼは、無細胞翻訳系を使用して変異アルカリプロテアーゼ遺伝子又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。発現された変異アルカリプロテアーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、又は無細胞翻訳系から取得することができる。しかし遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮したその培養上清や溶菌液上清等の溶液は、粗酵素液としてそのまま使用することもできる。発現された変異アルカリプロテアーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。
【００６１】
なお本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，（２００１）３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。特に、枯草菌の遺伝子組換え実験については例えば、吉川博文著"７．２  枯草菌系"「続生化学実験講座１．遺伝子研究法ＩＩ」，（１９８６）東京化学同人社（東京），ｐ．１５０−１６９等の枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。
【００６２】
斯くして本発明の方法により得られた変異アルカリプロテアーゼは、親アルカリプロテアーゼと比べて、液体洗剤、好ましくは濃縮液体洗剤に対する溶解性が向上している。従って、本発明はまた、本発明の液体洗剤に対するアルカリプロテアーゼの溶解性の向上方法に従って作製された変異アルカリプロテアーゼ、それをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）、当該遺伝子を含むベクター、及び当該ベクターを含む形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法を提供する。
【００６３】
また本発明の変異アルカリプロテアーゼは、親アルカリプロテアーゼと比べて、液体洗剤に対する溶解性が向上している。よって本発明の変異アルカリプロテアーゼは、各種粉末洗剤配合用酵素としても有用であるが、好ましくは各種液体洗剤配合用酵素として有用であり、より好ましくは濃縮液体洗剤配合用酵素として有用である。本発明の変異アルカリプロテアーゼを含有する液体洗剤は、従来と比べてより多くのアルカリプロテアーゼを含有することが可能になるので、従来と比べてより高いプロテアーゼ活性を有することができ、結果としてより強力な酵素洗浄力を発揮することができる。従って、本願発明はまた、本発明の変異アルカリプロテアーゼを含有する液体洗剤組成物を提供する。
【００６４】
本発明の液体洗剤組成物における本発明の変異アルカリプロテアーゼの含有量は、アルカリプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗剤組成物１ｋｇ当たり０．１〜２５０００Ｕが好ましく、０．１〜５０００Ｕがより好ましく、０．１〜２５００Ｕがさらに好ましい。
なお、アルカリプロテアーゼ活性とは以下の方法により測定される：１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．９ｍｌ、４０ｍＭＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍｌを試験管に採り、３０℃で５分間保温する。これに酵素液０．０５ｍｌを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍｌを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定する。ここで酵素１単位（Ｕ）は上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する量とする。
【００６５】
本発明の液体洗剤組成物は、本発明の変異アルカリプロテアーゼに加えて、界面活性剤及び水を含有する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６６】
非イオン性界面活性剤としては、一般的に液体洗剤に配合されているＣ８〜Ｃ２２の炭化水素基を有し、Ｃ２オキシアルキレン基が数モル以上付加された非イオン性界面活性剤であればよいが、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６〜３５）〔特開２０１０−２７５４６８号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１〜５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１０−２６５４４５号公報、特開２０１１−６３７８４号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０〜３０、ｎ＝０〜５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−１８９５５１号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）ｌＯ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０〜１、ｍ＝１４〜５０、ｎ＝１〜５、Ｒ2＝水素（ｌ＝０）又はＣ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２２９３８５号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５〜３０、ｎ＝１〜５）〔特開２０１０−２２９３８７号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ−Ｈ及び／又はＲ2−ＣＯＯ−（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素基、Ｒ2＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０〜５、ｎ＝２〜１０、ｐ＝０〜５、ｑ＝２〜１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２５４８８１号公報〕；
Ｒ1−ＣＯＯ−（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３〜５、ｎ＝８〜２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２６５３３３号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＰＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＰＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ１０−Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５〜１５、ｎ＝１〜３）〔特開平８−１５７８６７号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＥＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ１１−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０〜２０）〔特開２００８−７７０６号公報、特開２００９−７４５１号公報、特開２００９−１５５５９４号公報、特開２００９−１５５６０６号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＡＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ９−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ｍ＝５〜３０）〔特開２００９−１４４００２号公報、特開２００９−１７３８５８号公報、特開２０１０−１８９６１２号公報〕；
ならびに、脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等が挙げられる。
【００６７】
陰イオン界面活性剤としては、カルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。
【００６８】
陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。両性イオン活性剤としては、アルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。
【００６９】
本発明の液体洗剤組成物は、好ましくは濃縮液体洗剤組成物である。本明細書において、「濃縮液体洗剤」とは、界面活性剤を４０質量％以上、水を６０質量％未満含有する液体洗剤を意味し得る。好ましくは、界面活性剤を４０〜９０質量％、水を５質量％以上６０質量％未満含有する液体洗剤であり得、より好ましくは、界面活性剤を４５〜９０質量％、水を５質量％以上５５質量％未満含有する液体洗剤であり得、さらに好ましくは、界面活性剤を５０〜７５質量％、水を５質量％以上５０質量％未満含有する液体洗剤、さらにより好ましくは界面活性剤濃度を５０〜７５質量％、水を５質量％以上３０質量％未満含有する液体洗剤であり得る。
【００７０】
本発明の液体洗剤組成物は、さらに、液体洗剤に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、キレート剤、有機酸又はその塩、本発明の変異アルカリプロテアーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類等を含み得る。
【００７１】
水溶性ポリマーとしては、例えば、（ｉ）炭素数２〜５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（ｉ）又は（ii）はいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０−２７５４６８号公報、特開平１０−０６０４９６号公報）、ならびにアルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９−１５５６０６号公報）等が挙げられる。
【００７２】
水混和性有機溶剤としては、例えば、アルカノール類のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、１〜４０質量％、好ましくは１〜３５質量％である。
【００７３】
アルカリ剤としては、例えば、Ｃ２−Ｃ４のアルカノールを１〜３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、０〜２０質量％、好ましくは０〜１０質量％である。
【００７４】
キレート剤としては、例えばニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、これらのアルカリ金属または低級アミン塩等が挙げられる。本発明の液体洗剤組成物における当該キレート剤の含有量は、０．１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．１〜４質量％である。
【００７５】
有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、またはそれらの塩などの多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類が挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が特に好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、０〜５質量％、好ましくは０〜３質量％である。
【００７６】
再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸−酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができるが、配合に適さない場合は除外してもよい。
【００７７】
色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１〜１０質量％が好ましい。
【００７８】
漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００７９】
蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００８０】
本発明の変異アルカリプロテアーゼ以外の他の酵素としては、例えば、他のプロテアーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等を始めとする加水分解酵素、並びにそれらのうち２種以上の混合物が挙げられる。
【００８１】
その他成分として、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ビヒドロキシ化合物、蟻酸等の酵素安定化剤、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などの可溶化剤、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ−リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤等を配合してもよい。
【００８２】
本発明の液体洗剤組成物の好ましい組成として、特開２０１０−１８９５５１、特開２０１０−２６５３３３、特開２０１０−２７５４６８、ＷＯ２０１０／０５８８３２，ＷＯ２０１０／１１９９３５又はＷＯ２０１０／１３７６３５の実施例に記載の組成が挙げられる。例えば、特開２０１０−２７５４６８号公報の実施例に記載の液体洗浄剤組成物であればいずれでもよいが、具体的に例を挙げると、実施例３に記載の液体洗剤組成物は、界面活性剤を６６％（非イオン界面活性剤４６％、陰イオン界面活性剤を２０％）、水溶性ポリマー（ポリエチレングリコール（エチレンオキシド平均付加モル数２５）アリルエーテル／アクリル酸＝７５／２５（質量比）共重合体）を３％、水混和性有機溶剤（ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコール）を１４％、アルカリ剤（モノエタノールアミン）を５％、イオン交換水１１％及び色素、香料等を配合した組成物に酵素を配合することにより、調製することができる（組成物Ｃ）。
例えば下記市販液体洗剤組成物は、界面活性剤を４０％以上含有する濃縮液体洗剤であるが、製品表示ラベルに記載の成分を以下に示す。
組成物Ａ（アタックＮｅｏ；花王株式会社製）：界面活性剤（非イオン系界面活性剤、陰イオン活性剤：直鎖アルキルベンゼン系、脂肪酸系）７４％、安定化剤（ブチルカルビトール）、アルカリ剤、分散剤、酵素。
組成物Ｂ（ＮＡＮＯＸ；ライオン株式会社製）：界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩）５５％、安定化剤、酵素。
【００８３】
本発明の液体洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましくは衣料用、又は布製品（シーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）用のものである。本発明に係る洗浄剤組成物は、本発明の変異アルカリプロテアーゼを従来品と比べて多量に含有することができることから、高い酵素洗浄力を発揮することができる。
【００８４】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の組成物、製造方法、用途又は方法を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００８５】
＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表１−１〜１−２の（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、当該表１−１〜１−２の（ｉｉ）記載のアミノ酸残基に置換する工程を含む、液体洗剤に対するアルカリプロテアーゼの溶解性の向上方法。
【００８６】
＜２＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表２−１〜２−２の（ｉ）記載の位置又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、該表２−１〜２−２の（ｉｉ）記載のアミノ酸残基であるアミノ酸配列からなる、変異アルカリプロテアーゼ。
【００８７】
＜３＞上記＜１＞〜＜２＞において、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９７．５％以上、なおより好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼである。
【００８８】
＜４＞上記＜１＞〜＜２＞において、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼは、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアルカリプロテアーゼである。
【００８９】
＜５＞上記＜１＞〜＜２＞において、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼは、好ましくは、以下からなる群より選択されるプロテアーゼである：
プロテアーゼＫＰ９８６０［バチルス  エスピーＫＳＭ―ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０３]；
プロテアーゼＥ−１[バチルス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、特開昭４９−７１１９１号公報、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０２]；
プロテアーゼＹａ[バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２９）由来、特開昭６１−２８０２６８号公報、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０４]；
プロテアーゼＳＤ５２１[バチルス ＳＤ５２１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１６２）由来、特開平３−１９１７８１号公報、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０５]；
プロテアーゼＡ−１[ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８／０１２９３、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４６４０６]；
プロテアーゼＡ−２[ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ９８／５６９２７]；又は
プロテアーゼ９８６５〔バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）由来、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０８４１５５〕。
【００９０】
＜６＞上記＜１＞〜＜２＞において、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼは、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１９５位のチロシンをグルタミンに、３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに、６５位のトレオニンをプロリンに、２７３位のバリンをイソロイシンに、３５９位のトレオニンをセリンに、３８７位のセリンをアラニンに、１６６位のアスパラギンをグリシンに、１６７位のグリシンをバリンに、１３３位のアラニンをセリンに、及び１３４位のバリンをトレオニンに置換し、且つ１３３位と１３４位の間にセリンを挿入して得られたアルカリプロテアーゼであり、より好ましくは、配列番号２５０で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼである。
【００９１】
＜７＞上記＜１＞〜＜６＞において、好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３０位、６８位及び２５５位に相当する位置に、下記に示すアミノ酸残基を有する。
３０位に相当する位置：アスパラギン酸
６８位に相当する位置：ヒスチジン
２５５位に相当する位置：セリン
【００９２】
＜８＞上記＜７＞において、好ましくは、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の上記表３（ｉ）記載の位置に相当する位置に、当該表３（ｉｉ）記載のアミノ酸残基を有する。
【００９３】
＜９＞上記＜１＞〜＜８＞において、好ましくは、上記少なくとも１つのアミノ酸残基は、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。
【００９４】
＜１０＞上記＜１＞〜＜９＞において、好ましくは、上記少なくとも１つのアミノ酸残基は、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも２つを含む。
【００９５】
＜１１＞上記＜１＞、＜３＞〜＜１０＞記載のアルカリプロテアーゼの溶解性の向上方法において、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基は、下記アミノ酸残基に置換される。
４０５位又はこれに相当する位置：ロイシン又はトリプトファン
８１位又はこれに相当する位置：ロイシン、プロリン、チロシン又はトリプトファン
４０位又はこれに相当する位置：イソロイシン、フェニルアラニン又はロイシン
１９１位又はこれに相当する位置：ロイシン又はバリン
５９位又はこれに相当する位置：バリン、イソロイシン又はロイシン
【００９６】
＜１２＞上記＜２＞〜＜１０＞記載の変異アルカリプロテアーゼにおいて、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の４０５位、８１位、４０位、１９１位及び５９位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、下記アミノ酸残基である。
４０５位又はこれに相当する位置：ロイシン又はトリプトファン
８１位又はこれに相当する位置：ロイシン、プロリン、チロシン又はトリプトファン
４０位又はこれに相当する位置：イソロイシン、フェニルアラニン又はロイシン
１９１位又はこれに相当する位置：ロイシン又はバリン
５９位又はこれに相当する位置：バリン、イソロイシン又はロイシン
【００９７】
＜１３＞上記＜１＞、＜３＞〜＜１１＞において、上記液体洗剤は、好ましくは界面活性剤を４０質量％以上、水を６０質量％未満含有し、より好ましくは界面活性剤を４０〜９０質量％、水を５質量％以上６０質量％未満含有し、さらに好ましくは界面活性剤を４５〜９０質量％、水を５質量％以上５５質量％未満含有し、さらにより好ましくは界面活性剤を５０〜７５質量％、水を５質量％以上５０質量％未満含有し、なお好ましくは界面活性剤濃度を５０〜７５質量％、水を５質量％以上３０質量％未満含有する。
【００９８】
＜１４＞上記＜２＞〜＜１０＞及び＜１２＞のいずれか１に記載の変異アルカリプロテアーゼ、または上記＜１＞〜＜１１＞及び＜１３＞のいずれか１に記載の溶解性の向上したアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
【００９９】
＜１５＞上記＜１４＞記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【０１００】
＜１６＞上記＜１７＞記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【０１０１】
＜１７＞上記＜１６＞記載の形質転換体を用いる変異アルカリプロテアーゼの製造方法。
【０１０２】
＜１８＞上記＜２＞〜＜１０＞及び＜１２＞のいずれか１に記載の変異アルカリプロテアーゼ、または上記＜１＞〜＜１１＞及び＜１３＞のいずれか１に記載の溶解性の向上したアルカリプロテアーゼを含有する液体洗剤組成物。
【０１０３】
＜１９＞上記＜１８＞において、上記液体洗剤組成物は、好ましくは界面活性剤を４０質量％以上、水を６０質量％未満含有し、より好ましくは界面活性剤を４０〜９０質量％、水を５質量％以上６０質量％未満含有し、さらに好ましくは界面活性剤を４５〜９０質量％、水を５質量％以上５５質量％未満含有し、さらにより好ましくは界面活性剤を５０〜７５質量％、水を５質量％以上５０質量％未満含有し、なお好ましくは界面活性剤濃度を５０〜７５質量％、水を５質量％以上３０質量％未満含有する。
【実施例】
【０１０４】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１０５】
実施例１  アルカリプロテアーゼ変異体の作製
本発明のアルカリプロテアーゼ変異体の作製方法を、野生型ＫＰ４３プロテアーゼ成熟酵素領域のアミノ酸配列（配列番号２）における１１位のアスパラギン酸残基（Ｄ１１）をグリシンに変異させた変異体「Ｄ１１Ｇ」の作製を例として以下に示す。
【０１０６】
後述の参考例１（２）に示されたプラスミドｐＨＡ６４ＴＳＢを充分に希釈して鋳型とし、開始コドンの上流部分に相補するプライマーＫＧ２４Ｓ２（配列番号３：ATAAGGATCCGTGAGGAGGGAACCGA、ＢａｍＨＩサイトを有する）と、Ｄ１１のコドンと隣接する上流領域に相補するプライマーＤ１１＿Ｒ（配列番号４：CGCTTTGACAATTCCACGCGCAAC）を用いてＰＣＲを行い、ＫＰ４３プロテアーゼＮ末端側部分をコードするＤＮＡ配列を増幅した。ついでプラスミドｐＨＡ６４ＴＳＢを鋳型とし、Ｄ１１のコドンをグリシンのコドンに置換するためのプライマーＤ１１Ｇ＿Ｆ（配列番号５：GGAATTGTCAAAGCGGGAGTGGCTCAGAGCAGCTAC、５'側の一部がプライマーＤ１１＿Ｒと相補する）と、終止コドン下流のプライマーＫＧ１１Ｓ（配列番号６：CCCCTCTAGACGATTACCATATTAATTCCTCTACCC、ＸｂａＩサイトを有する）を用いてＰＣＲを行い、ＫＰ４３プロテアーゼＣ末端側部分をコードするＤＮＡ配列を増幅した。得られたＮ末端側部分をコードするＰＣＲ産物とＣ末端側部分をコードするＰＣＲ産物を混合して鋳型とし、先のプライマーＫＧ２４Ｓ２とプライマーＫＧ１１Ｓを用いてＰＣＲをおこなうことで、Ｄ１１のコドンがグリシンのコドンに変換された変異ＫＰ４３プロテアーゼ遺伝子の全長を含むＰＣＲ産物を得た。ついでこのＰＣＲ産物をエタノール沈殿にて精製したのち制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで同時消化し、後述の参考例１（１）に示された遺伝子挿入・発現用ベクターと混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてライゲーション反応を行った。このライゲーション産物をエタノール沈殿にて精製したのち、これをもって宿主菌であるバチルス エスピー  ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）をエレクトロポレーション法にて形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地に塗沫した。数日後に寒天培地に発生したコロニーについて、スキムミルク溶解斑を有する形質転換体を分離することで、Ｄ１１がグリシンに変異したＫＰ４３プロテアーゼ変異体「Ｄ１１Ｇ」を生産する形質転換体を得た。
【０１０７】
同様に、プライマーＤ１１＿Ｒ及びプライマーＤ１１Ｇ＿Ｆに代えて、下記表６−１〜６−１３の「変異プライマーＲ」欄及び「変異プライマーＦ」欄に記載のプライマーをそれぞれ用いて同様の操作をおこなうことで、下記表６−１〜６−１３の「ＫＰ４３プロテアーゼ変異」欄記載の変異を有するＫＰ４３プロテアーゼ変異体を生産する形質転換体を得た。  得られた形質転換体のそれぞれを後述の参考例１（２）と同様の方法で培養し、変異プロテアーゼを含む培養上清を得た。
【０１０８】
【表６−１】
2013233141.tif 000011
【表６−２】
2013233141.tif 000012
【表６−３】
2013233141.tif 000013
【表６−４】
2013233141.tif 000014
【表６−５】
2013233141.tif 000015
【表６−６】
2013233141.tif 000016
【表６−７】
2013233141.tif 000017
【表６−８】
2013233141.tif 000018
【表６−９】
2013233141.tif 000019
【表６−１０】
2013233141.tif 000020
【表６−１１】
2013233141.tif 000021
【表６−１２】
2013233141.tif 000022
【表６−１３】
2013233141.tif 000023
【０１０９】
実施例２  アルカリプロテアーゼ変異体の溶解性評価
実施例１で得た変異アルカリプロテアーゼの培養上清中のタンパク濃度を後述の参考例２（１）の方法にて求め、さらに後述の参考例２（２）の方法にて、同培養上清を一定量加えた組成物Ｃにおける濁度から相対濁度（％）を求めた。各変異アルカリプロテアーゼについてＮ＝３以上の相対濁度を平均し、各変異アルカリプロテアーゼの相対濁度とした。
結果を表７に示す。いずれの変異アルカリプロテアーゼも、親アルカリプロテアーゼ（ＷＴ）に対する相対濁度が９５％以下であり、溶解性が向上していることが示された。
【０１１０】
【表７】
2013233141.tif 000024
【０１１１】
実施例３  多重変異体の溶解性評価
実施例２で見出された溶解性向上変異を多重化し、その効果を評価した。すなわち、実施例２で得られた溶解性が向上した変異プロテアーゼを産生する宿主菌からプラスミドを抽出し、このプラスミドを鋳型として実施例１と同様の方法を用いて、実施例２で見出された別の溶解性向上変異を導入し、二重変異体とした。さらに、当該二重変異体を産生する宿主菌から抽出したプラスミドを鋳型として同様の手順を繰り返し、三重変異体を作製した。実施例２と同様の手順で、二重変異体及び三重変異体について、親アルカリプロテアーゼ（ＷＴ）に対する相対濁度（％）（Ｎ＝３以上の平均値）を求めた。結果を表８に示す。
【０１１２】
【表８】
2013233141.tif 000025
【０１１３】
実施例４  市販濃縮液体洗剤での多重変異体の溶解性評価
実施例３で構築した多重変異体の溶解性について、市販の濃縮液体洗剤〔組成物Ａ；アタックＮｅｏ（花王）、及び組成物Ｂ；ＮＡＮＯＸ（ライオン）、各組成を表９に示す〕を用いて、親アルカリプロテアーゼ（ＷＴ）に対する相対濁度（％）（Ｎ＝３以上の平均値）を実施例２と同様の手順で求めた。市販洗剤は、７０℃で８時間恒温とした後に、評価に用いた。結果を表１０に示す。
【０１１４】
【表９】
2013233141.tif 000026
【０１１５】
【表１０】
2013233141.tif 000027
【０１１６】
実施例５  ＫＰ４３プロテアーゼ変異体を親プロテアーゼとするアルカリプロテアーゼ変異体の溶解性評価
特開２００２-２１８９８９号公報、特開２００２-３０３１７６号公報、特開２００４-０００１２２号公報、特開２００４-３-５１７６号公報、及び特開２００６-１２９８６５号公報の記載を参考に、ＫＰ４３プロテアーゼ（配列番号２）に以下の変異を逐次重ねて導入し、ＫＰ４３プロテアーゼ変異体（配列番号２５０）を作製した：
１９５位のチロシンをグルタミンに置換（特開２００２-２１８９８９号公報）；
３６９位のアスパラギン酸をアスパラギンに置換（特開２００２-３０３１７６号公報）；
６５位のトレオニンをプロリンに置換、２７３位のバリンをイソロイシンに置換、３５９位のトレオニンをセリンに置換、及び３８７位のセリンをアラニンに置換（特開２００４-０００１２２号公報）；
１６６位のアスパラギンをグリシンに置換、及び１６７位のグリシンをバリンに置換（特開２００４-３-５１７６号公報）；
１３３位のアラニンをセリンに置換、１３４位のバリンをトレオニンに置換、及び１３３位と１３４位の間にセリンを挿入（特開２００６-１２９８６５号公報）。
これらの変異を導入したＫＰ４３プロテアーゼ変異体（配列番号２５０）は野生型ＫＰ４３；ＷＴに対してアミノ酸配列において９７．５％の同一性を有する。
当該ＫＰ４３プロテアーゼ変異体を親アルカリプロテアーゼとして、実施例１と同様の手順で変異アルカリプロテアーゼを作製した。より具体的には当該親プロテアーゼのための変異プライマーを設計・調製し、これらのプライマーを用いて、実施例１と同様に変異を導入することによって変異アルカリプロテアーゼを作製した。得られた変異アルカリプロテアーゼについて、実施例２と同様の手順で、親アルカリプロテアーゼ（ＫＰ４３プロテアーゼ変異体）に対する相対濁度（％）（Ｎ＝３以上の平均値）を求め、液体洗剤への溶解性を評価した。
結果を表１１に示す。ＫＰ４３プロテアーゼ変異体を親プロテアーゼとした場合においても、野生型ＫＰ４３プロテアーゼを親プロテアーゼとした場合と同様に、変異アルカリプロテアーゼに液体洗剤への溶解性向上効果が確認された。
【０１１７】
【表１１】
2013233141.tif 000028
【０１１８】
実施例６  ＫＰ４３プロテアーゼ変異体を親プロテアーゼとするアルカリプロテアーゼ多重変異体の溶解性評価
実施例２及び実施例５で見出された溶解性向上変異を多重化し、その溶解性向上効果を評価した。すなわち、実施例５で作製したＫＰ４３プロテアーゼ変異体（配列番号２５０）を親アルカリプロテアーゼとして、実施例３と同様の手順で、表１２に示すとおりの単変異体、二重変異体、三重変異体、四重変異体、五重変異体を作製した。実施例２と同様の手順で、各変異体について親アルカリプロテアーゼに対する相対濁度（％）（Ｎ＝２以上の平均値）を求めた。結果を表１２に示す。
【０１１９】
【表１２】
2013233141.tif 000029
【０１２０】
実施例７  ＫＰ４３プロテアーゼ変異体を親プロテアーゼとするアルカリプロテアーゼ多重変異体の加速試験による溶解性評価
実施例６で作製された、ＫＰ４３プロテアーゼ変異体（配列番号２５０）を親アルカリプロテアーゼとする多重変異体について、より実使用条件に近い容量の液体洗剤で沈殿形成の加速試験を実施した。すなわち、液体洗剤（例えば上述の組成物Ｃ；特開２０１０−２７５４６８の実施例３に記載のもの）９ｍＬをガラス瓶（マルエム  スクリュー管Ｎｏ．５）に加え、さらに適宜希釈したアルカリプロテアーゼ多重変異体を最終濃度が０．２〜０．４ｇ／Ｌとなるように加えてよく撹拌し、密栓のうえ４０℃または５０℃にて保存した。１週間ごとに瓶の底に沈殿が生じていないか確認した。結果を表１３に示す。
【０１２１】
【表１３】
2013233141.tif 000030
【０１２２】
実施例８  ＫＰ４３プロテアーゼ変異体を親プロテアーゼとするアルカリプロテアーゼ多重変異体の洗浄力評価
実施例６で作製された、ＫＰ４３プロテアーゼ変異体（配列番号２５０）を親アルカリプロテアーゼとする多重変異体について、洗浄力を評価した。洗浄力評価は、ターゴトメーター（上島製作所製）を用いて行った。液体洗剤（例えば上述の組成物Ｃ；特開２０１０−２７５４６８の実施例３に記載のもの）３５０μＬを１Ｌの水道水に溶解した洗浄液に、酵素を最終濃度で０．０７１６ｍｇ／Ｌになるように添加した。次いで、汚染布ＥＭＰＡ１１７（ＥＭＰＡ社製、血液／ミルク／カーボン）を６×６ｃｍ角に裁断したものを添加し、２０℃で洗浄（８０ｒｐｍ）を行った。水道水によるすすぎを行った後、色彩色差計（ＭＩＮＯＬＴＡ、ＣＭ３５００ｄ）を用いて明度を測定し、洗浄前後における明度の変化から洗浄率を算出した（下式）。
洗浄率（％）＝（Ｌ２−Ｌ１）／（Ｌ０−Ｌ１）×１００
Ｌ０： 汚染布の原布の明度
Ｌ１： 洗浄前の汚染布の明度
Ｌ２： 洗浄後の汚染布の明度
相対洗浄率は親アルカリプロテアーゼの洗浄率を１００とした場合の変異体の洗浄率とした。結果を表１４に示す。実施例６で作製された各変異体は、親アルカリプロテアーゼと同等の洗浄率を示した。
【０１２３】
【表１４】
2013233141.tif 000031
【０１２４】
参考例１  酵素調製法
液体洗剤に対する酵素の溶解性評価に供する酵素の調製法について、野生型ＫＰ４３プロテアーゼを例として以下に示す。
（１）遺伝子挿入・発現用ベクターの調製
市販のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社製）を鋳型とし、プライマーｐＨＹ＋１（ＨｉｎｄＩＩＩ）Ｆ（ggggAAGCTTCTAGAGATCTGCAGGTCGACGG：配列番号２５１）及びプライマーｐＨＹ＋３０４０（ＨｉｎｄＩＩＩ）Ｒ（ggggaagcttAAGGTAAAGGATAAAACAGCACAATTCCAAG：配列番号２５２）を用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂａｓａｌ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅産物を制限酵素  ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社）で消化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）をもちいて分子内環化を行い、エタノール沈殿にて精製した。これをもって宿主菌となるバチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）をエレクトロポレーション法にて形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１％スキムミルク、１．５％寒天、０．０５％炭酸ナトリウム、１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫した。数日後に寒天培地に発生したコロニーを形質転換体として分離し、プラスミドを抽出した。ＤＮＡシーケンサーＰｒｉｓｍ３１００（ＡＢＩ社製）を用いてプラスミド全長の配列解析を行い、ＰＣＲのエラーによる意図しない変異が導入されていないことを確認し、ｐＨＡ３０４０とした。
ついでＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０４８２）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマーＳＰ６４−Ｆ（ＥｃｏＲＩ）（gggggaattcGAACAAGTACTTACCATTTTAGAGTC：配列番号２５３）及びプライマーＳＰ６４−Ｒ（ＢａｍＨＩ）（ggggggatccTTATTAAAGTAATTGAATCAAATAGC：配列番号２５４）を用いてＰＣＲ増幅し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−６４由来のＥｎｄｏ−１，４−ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．Ｍ８４９６３）上流のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を得た。この増幅産物と先に構築したｐＨＡ３０４０を適量混合し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｒｏｃｈｅ社）とＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ社）で二重消化したのちLigation Highをもちいて連結反応を行い、エタノール沈殿にて精製した。これをもって宿主菌となるバチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）をエレクトロポレーション法にて形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地に塗沫した。数日後に寒天培地に発生したコロニーを形質転換体として分離し、プラスミドを抽出した。マルチクローニングサイト内に挿入されたプロモーター配列の解析を行い、ＰＣＲのエラーによる意図しない変異が導入されていないことを確認し、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４（配列番号２５５）とした。これを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ（Ｒｏｃｈｅ社）にて同時消化し、遺伝子挿入・発現用ベクターとした。
（２）ＫＰ４３プロテアーゼの調製
野生型ＫＰ４３プロテアーゼ遺伝子配列（配列番号１）を含むＤＮＡ（遺伝子上流の５'−末端にＢａｍＨＩサイト、遺伝子下流の３'−末端にＸｂａＩサイトを有する）をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩにて同時消化し、先の遺伝子挿入・発現用ベクターと混合して、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてライゲーション反応を行った。ライゲーション産物をエタノール沈殿にて精製したのち、これをもって宿主菌であるバチルス エスピー  ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）をエレクトロポレーション法にて形質転換し、スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地に塗沫した。数日後に寒天培地に出現したコロニーについて、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。この形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出し、先の配列番号１に示されるプロテアーゼ遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、結果得られたプラスミドをｐＨＡ６４ＴＳＢとした。
ｐＨＡ６４ＴＳＢを保持するＫＳＭ−９８６５株の形質転換体を５ｍＬの種母培地［６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．１％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム・７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．３％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン］に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。次いで３０ｍＬの主培地［８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム・７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン］に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。培養によって得られたＫＰ４３プロテアーゼを含む培養液を遠心分離し、培養上清を得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、培養上清に含まれる蛋白質がＫＰ４３プロテアーゼのみであることを確認した。必要に応じてゲル濾過カラムＥｃｏｎｏｐａｃｋ  １０−ＤＧ（バイオラッド）にて脱塩精製を行なった。
【０１２５】
参考例２  酵素溶解性評価法
（１）プロテアーゼ蛋白量測定方法
培養上清中または脱塩精製サンプル中のプロテアーゼ蛋白量の測定は、プロテインアッセイラピッドキット（和光純薬工業）を用いて以下のとおり行なった。すなわち、９６穴プレートの各ウェルに、同キットの発色液２５０μＬを加え、さらに適宜希釈した酵素サンプル１０μＬを混和し、室温で３０分間撹拌したのち、マイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。同キット付属の牛胸腺アルブミン（ＢＳＡ）標準液を用いて同時に作製した検量線から、プロテアーゼ蛋白濃度（ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ相当）を算出した。
【０１２６】
（２）プロテアーゼの液体洗剤への溶解性評価
親アルカリプロテアーゼ（野生型ＫＰ４３；ＷＴ）、又は変異アルカリプロテアーゼを含む培養上清を用いて、液体洗剤への溶解性を評価した。すなわち、９６穴プレートの各ウェルに１５０μＬの液体洗剤（例えば上述の組成物Ｃ；特開２０１０−２７５４６８の実施例３に記載）を添加し、そこに各種タンパク濃度のアルカリプロテアーゼを含む培養上清、またはその脱塩精製サンプル６．５μＬを加え、十分に攪拌した。室温で２時間放置の後、マイクロプレートリーダーＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）にて、６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクとして、培養上清の代わりにイオン交換水を加えた際の吸光度を差引いた値を算出し、これを濁度（ΔＯＤ６５０ｎｍ）としてプロテアーゼ溶解性の指標とした。得られたΔＯＤ６５０ｎｍ値に基づき、次式によって各変異体における親アルカリプロテアーゼ（ＷＴ）に対する相対濁度を算出した。
相対濁度（％）＝（各変異体の濁度／各変異体の濃度）／（親アルカリプロテアーゼの濁度／親アルカリプロテアーゼの濃度）×１００
組成物Ｃにプロテアーゼを添加した際の濁度（ΔＯＤ６５０ｎｍ）は、組成物中のプロテアーゼ濃度と良好な比例関係にあった。またプロテアーゼとして培養上清を用いた場合でも、ゲル濾過精製サンプルを用いた場合でも、同様の比例関係が得られた。
【０１２７】
参考例３
プロテアーゼ活性測定法
実施例において得られたアルカリプロテアーゼの活性測定は次の手順で行った。すなわち、１／１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．９ｍｌ、４０ｍＭＧｌｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐ−ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍｌを試験管に採り、３０℃で５分間保温した。これに酵素液０．０５ｍｌを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍｌを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、酵素１単位（Ｕ）は上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを生成する量とした。
【０１２８】
以上、本発明の実施形態を説明したが、これが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。
【配列表】
2013233141000001.app