(57)【要約】【課題】  生薬であるヤバツイの抽出物を含有することを特徴とするヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現・誘導作用に基づくメラニン産生抑制化粧料、すなわち美白用化粧料を提供すること。【解決手段】  サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物を含有することを特徴とするヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導作用に基づくメラニン産生抑制化粧料であり、ヤバツイのアルコール抽出物を各種カラムクロマトグラフィー、更にはＨＰＬＣによる分画操作により分画させたＨＳＰ７０を特異的に発現・誘導する画分を含有するメラニン産生抑制化粧料である。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物を含有することを特徴とするヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導作用に基づくメラニン産生抑制化粧料。
【請求項２】
サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物が、下記の操作により抽出・分画処理して得られた画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のいずれかからなるものである請求項１に記載のメラニン産生抑制化粧料。
（ａ）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）をエタノール抽出して得た抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行った後、９０％メタノール溶液に溶解して得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）；
（ｂ）上記９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ＭＣｌ・ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィーに付し、順次、水溶出−５０％メタノール溶出−メタノール溶出−アセトン溶出を行い得られたメタノール溶出画分（画分Ｂ）；
（ｃ）上記メタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）；及び
（ｄ）上記５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）をＨＰＬＣ（カラム：ＡＲ−ＩＩ  ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出して得た画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）。
【請求項３】
サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物が、上記画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のうち、画分Ｄ３及び／又は画分Ｄ７であることを特徴とする請求項２に記載のメラニン産生抑制化粧料。
【請求項４】
美白用化粧料である請求項１〜３のいずれかに記載のメラニン産生抑制化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シミの原因であるメラニン合成の抑制効果を有する熱ショックタンパク質の発現・誘導による、特異的なメラニン産生抑制化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞、組織あるいは固体においては、一般的な生理的温度より３℃以上高い温度に晒されたときに、生体の防御システムの一つとして、特異的タンパク質の発現（産生）が誘導されることが知られている。
このタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）によって測定した場合、分子量範囲１０〜１１０ＫＤａを有する一群のタンパク質として存在しており、熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン：heat shock proteins、以下、「ＨＳＰ」と称する場合もある）と呼ばれている。
【０００３】
ＨＳＰは、その分子量の相違により幾つかのファミリーが形成されており、例えば、ＨＳＰ９０ファミリー（分子量：９０ｋＤａ以上１１０ｋＤａ以下）、ＨＳＰ７０ファミリー（分子量：７０ｋＤａ以上８０ｋＤａ未満）、ＨＳＰ６０ファミリー（分子量：６０ｋＤａ以上７０ｋＤａ未満）、及び低分子量ＨＳＰファミリー（分子量：６０ｋＤａ未満）のように分類されている。
【０００４】
ＨＳＰの機能は多岐にわたっており、例えば、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ６０ファミリーは、変性タンパク質に結合して、天然のフォールディング（高次構造・折り畳み構造）に巻き戻す作用や、第三のタンパク質や核酸との会合、細胞内での局在化や膜透過への関与など、いわゆる分子シャペロンと呼ばれる機能を担っていることが明らかにされている（非特許文献１及び２）。
なお、分子シャペロンとは、ポリペプチド鎖の合成に引き続くフォールディングや酵素の不可逆的な熱変性の抑制に関与している一連の蛋白質をさす。
【０００５】
このＨＳＰ発現の誘導（産生）を利用した療法の一つとして、癌温熱免疫療法がある。すなわち、全身を加温することによりＨＳＰの生成を誘導し、全身の免疫機能を活発にするのと同時に、がん細胞と正常細胞の識別能力を向上させ、副作用が無く、癌細胞のみを死滅させる治療法である。
【０００６】
ところで、このＨＳＰは、高温ばかりではなく、外的傷害、放射線、紫外線などの外界からのストレスに晒された場合にも、生体防御システムとして、その発現（産生）が誘導される。
すなわち、高温、紫外線などの生体に対するストレスは、細胞のタンパク質を変性させ、不溶性沈殿を形成して細胞にダメージを与える。したがって、かかる細胞へのダメージを防御する目的で、ＨＳＰの生成が誘導されることとなる。
【０００７】
かかる観点から、水生プランクトンであるアルテミアの孵化直前の耐久卵から水抽出した活性エキス（アルテミアエキス）成分が、ヒト皮膚細胞においてＨＳＰ７０の産生を誘発することが見出され、かかる作用を利用した抗皮膚ストレス（ストレス防御）用化粧料が提案されている（特許文献１）。
しかしながら、アルテミアエキスは、化粧料への配合条件として４０℃以下での配合が望ましく、また、タンパク分解酵素との配合禁忌があるなど、その使用に種々の制約を受けている。
【０００８】
人の皮膚は、紫外線を吸収すると、身体を紫外線から守るために、皮膚基底層にあるメラノサイトにおいてチロシナーゼという酵素が紫外線を浴びて活発化され、メラニンが生成される。すなわち、メラニンは、皮膚に日光が当たることで生成される色素であり、紫外線を吸収したり散乱したりするため、強い紫外線から細胞や皮膚を守る働きを有している。
その一方で、皮膚のシミの発生は、このメラニン色素の部分的な異常増加が原因であると考えられている。
【０００９】
したがって、皮膚のシミ等の発生を予防する美白作用を発揮させるためには、紫外線による皮膚ストレスを防御するべく、ＨＳＰの発現を効果的に誘導させてやればよいが、これまでかかる考え方に立脚した美白化粧品は登場してきていない。
本発明者は、ＨＳＰ誘導を発現させる植物成分の検索を検討してきており、これまでに幾つかの生薬成分の抽出物を含有するヒートショックタンパク質誘導剤が提案されているが、美白化粧への応用は一切記載されていない（特許文献２）。
【００１０】
更に最近、本発明者は、ＨＳＰの発現誘導剤によるＨＳＰの一種であるＨＳＰ７０の特異的な発現・誘導により、生成したＨＳＰ７０がチロシナーゼ及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、メラニン産生を抑制すること確認し、かかるＨＳＰの発現誘導剤を含有する皮膚外用剤、及び美白化粧料を提供している（特許文献３）。
【００１１】
したがって、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現・誘導は、メラニン産生を抑制するものであり、効果的なＨＳＰ７０発現誘導作用を有する成分は、極めて強力なメラニン産生抑制化粧料、すなわち、美白化粧料となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−２３８２９７号公報
【特許文献２】特開２００８−１２７２９６号公報
【特許文献３】特開２０１０−０８３８０４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Hendrick, J. P. & Hartl, F. -U., Ann. Rev. Biochem., 62, 349-384 (1993)
【非特許文献２】Georgopoulos, C. & Welch. W. J., Ann. Rev. Cell Biol., 9, 601-634 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者は、更に検討を進め、各種植物成分（生薬）について、ＨＳＰ７０誘導を発現する安全性の高い成分の検索を行ってきていたが、その検討の中で、植物成分としてサワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部の乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物が、ＨＳＰ誘導の発現を強化させることを見出した。
特に、ヤバツイのエタノール抽出エキスを、各種カラムクロマトグラフィー、或いは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等で分画して得た成分（画分）に、極めて強いＨＳＰ７０の発現・誘導が認められることを確認し、その結果、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明は、生薬であるヤバツイの抽出物を含有することを特徴とするヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現・誘導作用に基づくメラニン産生抑制化粧料、すなわち美白用化粧料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的態様は、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物を含有することを特徴とするヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導作用に基づくメラニン産生抑制化粧料である。
【００１６】
より具体的な本発明は、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物が、下記の操作により抽出・分画処理して得られた画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のいずれかからなるものであるメラニン産生抑制化粧料である。
（ａ）サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）をエタノール抽出して得た抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行った後、９０％メタノール溶液に溶解して得た９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）；
（ｂ）上記９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ＭＣｌ・ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィーに付し、順次、水溶出−５０％メタノール溶出−メタノール溶出−アセトン溶出を行い得られたメタノール溶出画分（画分Ｂ）；
（ｃ）上記メタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）；及び
（ｄ）上記５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）をＨＰＬＣ（カラム：ＡＲ−ＩＩ  ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出して得た画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）。
【００１７】
より好ましい本発明は、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物が、上記画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のうち、画分Ｄ３及び／又は画分Ｄ７であることを特徴とするメラニン産生抑制化粧料である。
【００１８】
最も具体的には、本発明は美白用化粧料である上記に記載のメラニン産生抑制化粧料である。
【００１９】
かくして調製されたヤバツイの抽出物は、後記する試験例から明らかなように、ＨＳＰ７０の発現・誘導により、生成したＨＳＰ７０がチロシナーゼ、及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、メラニン産生を抑制することにより、美白効果が発揮されるといった、極めて特異的な化粧料である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物からなる、新規な作用機序に基づく、効果的なメラニン産生抑制作用剤、すなわち、美白化粧料が提供される。
本発明が提供するメラニン産生抑制作用剤並びに美白化粧料は、ＨＳＰ７０の発現を誘導させ、生成されたＨＳＰ７０がメラニン産生に関与するチロシナーゼや小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、その結果、メラニンの産生を抑制するものであり、その結果、シミの予防・改善作用のある有用な美白化粧料を提供することができる。
【００２１】
特に本発明が提供する美白化粧料は、ＨＳＰ７０の発現誘導により、紫外線による直接的な肌への刺激、或いは心身ストレス、ホルモンバランス等の異常に起因するシミなどの発生に対処する、これまで何等検討されていなかった新たな作用機序に基づく美白化粧料を提供する点で、極めて特異的なものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１で行った、ヤバツイの抽出物について、その分画操作の流れを示したフロー図である。
【図２】実施例３における、ヤバツイの抽出画分Ｄ１〜Ｄ１２についての、ＨＳＰ７０の発現誘導の強度を示した図である。
【図３】実施例３における、ヤバツイの抽出画分Ｄ１〜Ｄ１２についての、細胞生存率を示した図である。
【図４】実施例３における、発現誘導強度が強かった画分Ｄ３について、ＨＳＰ７０発現及び細胞生存率と、その濃度との関係に示した図である。
【図５】実施例３における、発現誘導強度が強かった画分Ｄ７について、ＨＳＰ７０発現及び細胞生存率と、その濃度との関係に示した図である。
【００２３】
【図６】実施例４における、本発明の画分Ｄ３及びＤ７によるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果を示す、メラニン含有量を示した図である。
【図７】実施例４における、本発明の画分Ｄ３及びＤ７によるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果を示す、チロシナーゼ活性を示した図である。
【図８】実施例４における、本発明の画分Ｄ３及びＤ７のＩＢＭＸによるメラニン合成酵素の一つであるチロシナーゼのｍＲＮＡ発現誘導に対する効果発現を示した結果である。
【図９】実施例４における、本発明の画分Ｄ３及びＤ７のＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現誘導に対する効果発現を示した図である。
【図１０】実施例５における、本発明の画分Ｄ３及びＤ７によるＵＶ照射による細胞毒性に対する効果である、細胞生存率を示した図である。
【図１１】実施例５における、本発明の画分Ｄ３及びＤ７によるＵＶ照射による細胞毒性に対する効果である、アポトーシスを起こした細胞（sub-G1中の細胞）率を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明で使用されるサワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）は、キク科ヒヨドリバナ属植物に属し、日本全国、東南アジアに生育する多年草である。この地上部乾燥生薬は、ヤバツイ（野馬追）と称され、中国においては解熱・解毒薬として使用されている生薬成分である。
【００２５】
本発明は、上記したように、その基本は、ＨＳＰ７０の発現の誘導によるメラニン産生抑制作用剤であり、具体的には、ヤバツイの抽出物を含有することを特徴とするヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）発現誘導、特にＨＳＰ７０の生成により、チロシナーゼ及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させ、メラニン産生を抑制することを特徴とするメラニン産生抑制化粧料、特に美白化粧料である。
なお、ＨＳＰ７０の発現の誘導によるメラニン産生抑制作用のメカニズムについては、先に本発明者が出願している特許文献３に詳細に検討しており、したがって、その内容は本願明細書の一部として取り込まれるものである。
【００２６】
本願発明における、有効成分となるヤバツイの抽出物は、具体的には以下のようにして調製することができる。
すなわち、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（以下、特に断らない限り、「ヤバツイ」と称する。）の抽出物をエタノール抽出してエタノール抽出物を得る。
なお、ヤバツイは、生薬として市販されており、例えば、丸善製薬（株）から入手することができる。
抽出にあたっては、ヤバツイ１００ｇに対して、エタノールを０．５〜２Ｌ程度加え、加熱還流条件下で抽出を行うのがよい。抽出時間は一概に限定できないが、１〜５時間程度、好ましくは２時間程度でよい。また、抽出温度は、７０℃〜エタノールの沸点付近の温度で行うのがよい。抽出操作を完了した段階で、冷却後綿栓濾過を行い、エタノール抽出液を得る。
この抽出操作を２〜５回、好ましくは３〜４回程度繰り返し、併せたエタノール抽出溶液を減圧下に濃縮し、残渣として、ヤバツイの粗エタノール抽出物を得る。
【００２７】
本発明で使用するヤバツイの抽出物は、上記で得たヤバツイの粗エタノール抽出物を分画操作により分画して得た抽出画分であり、具体的には以下のようにして行うことができる。
最初に、ヤバツイの粗エタノール抽出物を、ヘキサンにより脱脂処理を行う。具体的には、粗エタノール抽出物を９０％メタノール溶液に懸濁させ、分液漏斗に移して少量のヘキサンにより抽出することにより脱脂処理を行う。
脱脂処理した９０％メタノール層を減圧乾固し、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）が得られる。
【００２８】
次いで、上記で得られた９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を、ポリスチレンゲルカラムクロマトグラフィー、具体的には、ＭＣｌ・ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐ（和光純薬工業）カラムクロマトグラフィーに付し、順次、水、５０％メタノール、メタノール溶液の段階的グラジエント法、及びアセトン溶液にて溶出を行い、各溶出画分を得る。
かかる操作において得られたメタノール溶出画分（画分Ｂ）に、ＨＳＰ発現誘導が強く認められた。
【００２９】
ＨＳＰ発現誘導が強く観察されたメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、更にＯＤＳカラムクロマトグラフィーに付し、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液による段階的グラジエント法で溶出を行い、それぞれの溶出画分を得た。
かかる操作において得られた５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）に、ＨＳＰ発現誘導が強く認められた。
【００３０】
次いで、ＨＳＰ発現誘導が強く観察された５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、カラム：ＡＲ−ＩＩ  ＯＤＳ）に付し、４０％メタノールにて溶出して全１２個の溶出画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）を得た。
かくして得られた溶出画分Ｄ１〜Ｄ１２のうち、特に、画分Ｄ３並びに画分Ｄ７に、極めて強いＨＳＰ発現誘導作用があることが判明した。
【００３１】
この画分Ｄ３及びＤ７について、ＨＳＰ発現誘導作用物質の特定を検討したところ、画分Ｄ３には、セスキテルペンラクトンであるユーパリノライドＡ（Eupalinolide A）、画分Ｄ７にはユーパリノライドＢ（Eupalinolide B）が主成分として含有されていることが判明した。
【００３２】
本発明が提供するメラニン産生抑制化粧料は、ヤバツイの抽出物を含有するものであるが、特に、上記の操作により抽出・分画処理して得られた画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のいずれかからなるものを含有するメラニン産生抑制化粧料であり、より好ましくは、上記画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のうち、画分Ｄ３及び／又は画分Ｄ７を含有するメラニン産生抑制化粧料である。
【００３３】
本発明が提供するメラニン産生抑制化粧料は、ヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）のなかでも、特に、ＨＳＰ７０の発現誘導によるメラニン産生抑制作用に基づく化粧料である。
すなわち、ＨＳＰ７０は、メラニン産生に関与するチロシナーゼ及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia転写因子）を制御させるものであり、その結果、メラニンの産生が抑制されるものである。
特に、ＭＩＴＦは、メラニン産生に必須であるチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及び２（チロシナーゼ関連タンパク−１及び２）の発現を制御する転写因子であり、このＭＩＴＦの制御は、メラニン産生をコントロールすることとなり、その結果、美白作用が効果的に発現される。
【００３４】
上記したように、本発明が提供するメラニン産生抑制化粧料は、ヤバツイの抽出物、特に、上記の操作により抽出・分画処理して得られた画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のいずれかからなるものを含有するメラニン産生抑制化粧料であり、より好ましくは、上記画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のうち、画分Ｄ３及び／又は画分Ｄ７を含有するメラニン産生抑制化粧料である。
かかる化粧料としては、具体的には、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック等の皮膚化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム等の下地化粧料、乳液剤、油性、固形状等の各剤型のファンデーション、アイカラー、チークカラー等のメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ネッククリーム、ボディローション等の身体用化粧料等を挙げることができる。
【００３５】
本発明が提供する化粧料においては、ヤバツイの抽出物を含有するものであるが、ヤバツイの抽出物をそのまま、或いは、各種化粧料成分として使用されている他の成分と共に、所望の化粧品の形態で使用することができる。
本発明は、ＨＳＰ発現誘導に基づくメラニン産生抑制化粧料であり、特に美白用化粧料として極めて効果的なものであるが、他の美白成分を併用することにより、相乗的に美白効果が得られることが判明した。
【００３６】
この場合において、ヤバツイの抽出物の含有量は、含有させる抽出・分画処理して得られた画分（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）のＨＳＰ７０発現誘導作用の強さにより一概に限定できず、また、シミの予防・改善の目的、用いる人の性別、体重、年齢、剤型、シミの種類や程度、使用部位、使用回数などの種々の条件により一概に限定できない。
例えば、皮膚に塗布する場合には、０．１μｇ〜１０ｍｇ（活性成分乾燥重量）／ｋｇ／日で、一日１回から数回に分けて適用することができるが、使用量はこの範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
以下に本発明を、ヤバツイの抽出物の調製の実際、その抽出物のＨＳＰ７０の発現の誘導を説明しながら、より詳細に説明していく。
【００３８】
なお、以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１：ヤバツイの溶媒抽出物の調製（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２の調製）
丸善製薬（株）から入手したヤバツイ［サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬］の１０．１ｇを５００ｍＬのナス型フラスコに入れ、１００ｍＬのエタノールを加え、７０℃の水浴上で２時間還流抽出した。冷却後、綿栓濾過してエタノール抽出液を得た。
この還流抽出操作を３回繰り返した後、得られたエタノール抽出液を合わせて減圧濃縮し、エタノール抽出物（４９９ｍｇ）を得た。
このエタノール抽出物を１００ｍＬの９０％メタノールに懸濁させ、分液漏斗に移して３０ｍＬのヘキサンにて３回処理を行い、脱脂した。９０％メタノール溶液層をエバポレーターで減圧乾固し、３１０ｍｇの９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）を得た。
この段階で得られた、ヘキサン溶液溶解画分と、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）について、免疫ブロット法により活性を検討したところ、９０％メタノール溶液画分（画分Ａ）が、活性が強いものであった。
【００４０】
この活性の強かった９０％メタノール溶出画分を、ＭＣｌ・ＧＥＬ  ＣＨＰ−２０Ｐカラムクロマトグラフィー（φ１７ｍｍ×１００ｍｍ：和光純薬工業）の段階的グラジエント法に付し、順次、水（８０ｍＬ）、５０％メタノール（１００ｍＬ）、メタノール（１００ｍＬ）、及びアセトン（１００ｍＬ）溶液にて溶出を行い、各溶出画分を得た。
その結果、水溶出画分（１１９ｍｇ）、５０％メタノール溶出画分（４９ｍｇ）、メタノール溶出画分（画分Ｂ）（１２５ｍｇ）及びアセトン溶出画分（２０ｍｇ）を得た。
得られた四つの画分のうち、メタノール溶出画分（画分Ｂ）（１２５ｍｇ）が最も活性が強いものであった。
【００４１】
次いで、活性の強かったメタノール溶出画分（画分Ｂ）を、Chromatorex ＯＤＳカラムロマトグラフィー（φ１５ｍｍ×１５０ｍｍ）に付し、水−メタノール（１：０→０：１、ｖ／ｖ）の段階的グラジエント法により溶出し、これにより、順次５０％メタノール溶液、７５％メタノール溶液、及びメタノール溶液で溶出を行い得た５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）（４９ｍｇ）を得た。
得られた三つの画分のうち、５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）が最も活性が強いものであった。
【００４２】
最後に、得られた５０％メタノール溶出画分（画分Ｃ）を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Cosmosil ＡＲ−ＩＩ ＯＤＳカラム：φ２０ｍｍ×３５０ｍｍ）に付し、４０％メタノールにて分取し、１２個の溶出画分（画分Ｄ１〜Ｄ１２）を得た。
これらの溶出画分Ｄ１〜Ｄ１２について活性を検討したところ、画分Ｄ３及び画分Ｄ７が最も活性が強いものであった。
【００４３】
以上の分画処理の流れ（フロー）を、図１に示した。
【００４４】
実施例２：細胞培養法におけるＨＳＰ７０の効果の確認
＜細胞培養法及びＨＳＰ過剰発現株の作成＞
マウスメラノーマ由来のＢ１６細胞（理研バイオリソースセンター）を、ＤＭＥＭ培地（１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕ／ｍＬのストレプトマイシン）で、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
ＨＳＰ７０安定発現株は、次の方法で作成した。
リポフェクタミン（ＴＭ２０００：Invitrogen社）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈＨＳＰ７０（山口大学、Ａ．Ｎａｋａｉ博士より供与）、又はｐｃＤＮＡ３．１をＢ１６細胞に導入したのち、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Sigma社）を用いて安定発現株を選択した。
その発現を、イムノブロット法により調べ、ＨＳＰ７０安定発現株を得た。
【００４５】
＜イムノブロット法＞
ヒートショックを１時間行い、更に６時間培養した後、細胞を遠心して回収し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：137mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 4.3mM NaHPO4）で洗った後、ＲＩＰＡ緩衝液［50mM Tris-HCl (pH 7.2), 150mM NaCl, 1% NP-40, 1% Sodium, deoxycolate, 0.05% SDS］に溶解し、遠心した後の上清を全細胞抽出液として実験に用いた。
各サンプルの蛋白質量を、Bio-Rad protein assay kit（Bradford法：Bio Rad社）により求め、同量の蛋白質量に揃えた後、実験に使用した。
サンプルはポリアクリルアミドを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。その後、１次抗体 (against ＨＳＰ７０（R&D system社)、 1:1000 dilution)、及び２次抗体で免疫ブロットし、SuperSignal WestDura（化学発光法：Pierce社）により目的的のバンドをLAS-3000 mini を用いて検出した。
また、ＨＳＰ７０の発現を２倍にする最小有効濃度（ＭＥＣ2.0（μｇ／ｍｌ））として、表示した。
【００４６】
実施例３：ＨＳＰ７０発現の確認
培養液を満たした培養皿に、ヒト線維芽細胞株（NBIRGB：理化学研究所、バイオリソースセンター）を１×１０２個／ｍＬの細胞懸濁となるように播種し、５％炭酸ガス雰囲気下に３７℃にて２４時間培養を行った。
この培養液に、上記実施例１で調製したヤバツイの溶媒抽出物（画分Ａ〜Ｃ、Ｄ１〜Ｄ１２）を上記したイムノブロット法に従ってＨＳＰ７０の発現誘導を検討した。
あわせて、その時の細胞生存率（Safe Induction（SI）Index）（％）も検討した。
その結果を下記表１に示した。
なお、表中には、実施例１で調製したヤバツイのエタノール抽出物、並びにヤバツイの溶媒抽出物として画分Ａ〜Ｃ、及びＤ３、Ｄ７の結果を示した。
【００４７】
【表１】
2013071901.tif 000003
【００４８】
表中の結果より明らかなように、ヤバツイの抽出画分Ａ〜Ｃには、極めて強いＨＳＰ７０の発現誘導作用があることが判明する。
また、図２から判るように、画分Ｄ１〜Ｄ１２の中でも画分Ｄ３並びにＤ７には、更に強いＨＳＰ７０発現誘導作用があることが判明する。
また、ヤバツイ自体はすでに中国において解熱・解毒薬として使用されている生薬であることから、ヤバツイの抽出画分には細胞毒性もなく、安全なものであることが確認された。
【００４９】
既に上記で説明したように、ＨＳＰの発現誘導、特にＨＳＰ７０の発現誘導は、メラニン産生を抑制するものであり、したがって、本発明が提供するヤバツイの抽出物からなるＨＳＰ発現誘導作用を有する成分は、極めて強力なメラニン産生抑制化粧料、すなわち、美白化粧料となる。
【００５０】
なお、上記で得られた画分Ｄ１〜Ｄ１２についての、ＨＳＰ７０の発現誘導の強度、並びに細胞生存率を図２及び図３に示し、さらに、その画分の中で特に発現誘導強度が強かった画分Ｄ３及びＤ７の、ＨＳＰ７０発現、細胞生存率と濃度との関係を図４（画分Ｄ３）及び図５（画分Ｄ７）に示した。
【００５１】
実施例４：画分Ｄ３及び画分Ｄ７によるＩＢＭＸ刺激によるメラニン生成抑制効果
Ｂ１６細胞を、画分Ｄ３又は画分Ｄ７の各濃度（５．０及び１０．０μｇ／ｍＬ）と共に培養した。細胞を、さらに１００μＭのＩＢＭＸ（3-isobutyl-1-methylxanthine：Sigma社）の添加、或いは無添加にて７２時間、或いは４８時間培養した。
各サンプルの蛋白質量を、Bio-Rad protein assay kitにより求め、同量の蛋白質量に揃えた後、４９０ｎｍの吸光度を、プレートリーダー（Fluostar Galaxy社）により測定した。
細胞抽出中のメラニンの量を測定し、コントロールとの比較で表示した。
また、チロシナーゼ活性をコントロールとの比較で表示した。
【００５２】
その結果を、図６及び図７に示した。
図６に、メラニン含有量を示し、図７にチロシナーゼ活性を示した。
いずれの場合において、画分Ｄ３又は画分Ｄ７は、メラニン生成を抑制し、チロシナーゼ活性も低下させていることが理解される。
特に、ＩＢＭＸの添加におけるメラニン生成の抑制、並びにチロシナーゼ活性の低下は強いものであることが判明した。
【００５３】
一方、Ｂ１６細胞を、画分Ｄ３又は画分Ｄ７の各濃度（５．０及び１０．０μｇ／ｍＬ）で、ＩＢＭＸ 100μM存在下並びに非存在下、１２時間［Microphthalmia transcription factor (MITF)］、または４８時間（Tyrosinase）培養した後、RNeasy kitを用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡ 2.5μgを、first-strand cDNA synthesis kitを用いて逆転写し、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡは、iQ SYBR GREEN Supermixを用いてreal-time RT-PCRに利用し、Opticon Monitor Softwareを用いて解析した。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分、９０℃で１０分の後に、９５℃で３０秒、６３℃で６０秒のサイクルを、４５サイクルという条件で行った。
特異性は、反応生成物をテンプレート（−）及び逆転写（−）のコントロールと一緒にアガロースゲル電気泳動を行って確認した。それぞれの反応において、GAPDH遺伝子を内部標準として用いた。
【００５４】
プライマーは、Primer3 Web site（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_  www.cgi）により設計した。プライマーの配列を以下に記載する。
【００５５】
Tyrosinase    5'-ctcctggcagatcatttgt-3'   5'-ggttttggctttgtcatggt-3'
MITF          5'-ctagagcgcatggactttcc-3'  5'-acaagttcctggctgcagtt-3'
GAPDH         5'-aactttggcattgtggaagg-3'  5'-acacattgggggtaggaaca-3'
【００５６】
その結果を、図８及び図９に示した。
図８は、チロシナーゼのｍＲＮＡ発現誘導に対する効果発現を、図９にＭＩＴＦのｍＲＮＡ発現誘導に対する効果発現を示した。
図中に示した結果より、ＩＢＭＸによるメラニン合成酵素の一つであるチロシナーゼやメラニン産生の転写因子であるＭＩＴＦの発現誘導を、画分Ｄ３又は画分Ｄ７は、ＨＳＰ７０を発現誘導し、チロシナーゼやＭＩＴＦの産生を抑制することでメラニンの産生を抑制していることが示された。
【００５７】
実施例５：画分Ｄ３及び画分Ｄ７によるＵＶ照射による細胞毒性に対する効果
ＰＡＭ２１２細胞を、画分Ｄ３又は画分Ｄ７の各濃度と共に６時間培養し、新鮮な培地で洗浄し、さらに１８時間培養した。次いで、細胞を新鮮な培地で洗浄後、各照射量のＵＶで照射し、２４時間培養した。
細胞の生存率は、前記した実施例と同様にＭＴＴ法により行った。アポトーシスを起こした細胞（sub-G1中の細胞）は、fluorescence activated cell sortingによりカウントした、値は、平均値±S.D.で表示した。
【００５８】
その結果を、図１０及び図１１に示した。
図１０に細胞生存率を示し、図１１にアポトーシスを起こした細胞（sub-G1中の細胞）率を示した。
図中に示した結果からも判明するように、画分Ｄ３及び画分Ｄ７によりＨＳＰ７０を誘導発現し、ＵＶ照射による細胞毒性に対する保護効果が確認された。
【００５９】
実施例６：皮膚外用剤
以下の処方により、皮膚外用剤（クリーム剤）を得た。
スクワラン                                              ２０重量％
ミツロウ                                                  ５
精製ホホバ油                                              ５
グリセリンモノステアレート                                ２
ソルビタンモノステアレート                                ２
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート      ２
グリセリン                                                ５
ヤバツイ抽出画分Ｄ３                                      １
ヤバツイ抽出画分Ｄ７                                      １
精製水                                      １００とする残部
【００６０】
実施例７：美白化粧料
（１）ローション
以下の処方により、ローションを得た。
ソルビット                                        ２重量％
１，３−ブチレングリコール                        ２
ポリエチレングリコール１０００                    １
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２５ＥＯ）    ２
エタノール                                      １０
ヤバツイ抽出画分Ｄ３                              １
ヤバツイ抽出画分Ｄ７                              １
防腐剤                                          適量
精製水                              １００とする残部
【００６１】
（２）乳液
以下の処方により、乳液を得た。
スクワラン                                                １重量％
グリセリン                                                １
ステアリルアルコール                                  ０．３
ソルビタンモノステアレート                            １．５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート      ２
１，３−ブチレングリコール                                ５
ヤバツイ抽出画分Ｄ３                                      １
ヤバツイ抽出画分Ｄ７                                      １
精製水                                      １００とする残部
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上記載のように、本発明により、サワヒヨドリ（Eupatorium lindleyanum）の地上部乾燥生薬（ヤバツイ）の抽出物からなる、新規な作用機序に基づく、効果的なメラニン産生抑制作用剤、すなわち、美白化粧料が提供される。
本発明が提供するメラニン産生抑制作用剤並びに美白化粧料は、ＨＳＰ７０の発現を誘導させ、生成されたＨＳＰ７０がメラニン産生を制御させ、その結果、メラニンの産生を抑制するものであり、その結果、シミの予防・改善作用のある有用な美白化粧料を提供することができる。
したがって、本発明が提供する美白化粧料は、ＨＳＰ７０の発現誘導により、紫外線による直接的な肌への刺激、或いは心身ストレス、ホルモンバランス等の異常に起因するシミなどの発生に対処する美白化粧料として、極めて特異的なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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