(57)【要約】      （修正有）【課題】肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターすることが可能なトランスジェニック非ヒト動物およびそれを用いた肝糖産生をモニターする方法を提供する。【解決手段】肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されている、肝糖産生をモニターするためのトランスジェニック非ヒト動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に、2つの部位特異的組換え酵素の認識部位に挟まれたスタッファー配列、および分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が5’側よりこの順に含まれるDNAが導入されている第一の遺伝子組換え非ヒト動物またはその子孫と、肝臓特異的プロモーターの制御下に部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含むDNAが導入された、該第一の遺伝子組換え非ヒト動物と同種の第二の遺伝子組換え非ヒト動物またはその子孫を交配する工程を含む、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物の作出方法。
【請求項２】
分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子および部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子をホモまたはヘテロに有する動物をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
肝臓において、スタッファー配列が除去されている動物をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
得られたトランスジェニック非ヒト動物が、肝糖産生をモニターするために利用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
レポータータンパク質がルシフェラーゼである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により作出された、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されている、肝糖産生をモニターするためのトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１０】
肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現する、請求項９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプル中のレポータータンパク質の量を測定することを含む、該トランスジェニック非ヒト動物の肝糖産生をモニターする方法。
【請求項１２】
トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプルが血液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与する工程、該トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプル中のレポータータンパク質の量を測定する工程、該トランスジェニック非ヒト動物の肝糖産生をモニターして、該被験物質が肝糖産生に与える影響を評価する工程を含む、肝糖産生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプルが血液である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターすることが可能なトランスジェニック非ヒト動物およびそれを用いた肝糖産生をモニターする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、糖尿病患者の世界的増加を背景として、肝臓における糖産生（以下、「肝糖産生」と記載）を制御するのに有効な薬剤の探索・開発が求められている。
【０００３】
通常、このような薬剤の探索・開発においては、実験動物が用いられており、被験物質を投与された動物の肝糖産生の変化を指標にして、当該被験物質の効果が評価される。
【０００４】
従来的に、肝糖産生の評価に際しては、高インスリン正常血糖クランプ法、ピルビン酸負荷法、肝糖産生酵素量測定法が用いられている。
【０００５】
しかしながら、高インスリン正常血糖クランプ法は、実験動物への静脈内カニューレの留置といった特殊技術を要すること、検査中血糖値を一定に保つために5〜10分ごとに採血を行わなければならず操作が煩雑であること、これらの操作により実験動物に多大なストレスを与えること、といった問題を有する。また、ピルビン酸負荷法は、精度が低くデータのばらつきが大きいこと、そのため正確な測定値を得るためには大量の実験動物を必要とすること、また、得られる結果が肝糖産生のみを反映するものではない、といった問題を有する。そして、肝糖産生酵素量測定法においては、被験物質の評価に際して実験動物の長期飼育が必要であること、肝糖産生に関与する酵素量を測定するに際して、肝臓の摘出が必要であり、同一個体で経時的に評価・検討することができないこと、またデータのばらつきが大きい、といった問題を有する。
したがって、当該分野においては、簡便かつ効率的な肝糖産生のモニター方法が求められていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、実験動物における肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されているトランスジェニック非ヒト動物を作製し、当該トランスジェニック非ヒト動物を用いることによって、簡便かつ効率的に肝糖産生をモニターできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は以下を包含する。
［１］  グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に、2つの部位特異的組換え酵素の認識部位に挟まれたスタッファー配列、および分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が5’側よりこの順に含まれるDNAが導入されている第一の遺伝子組換え非ヒト動物またはその子孫と、肝臓特異的プロモーターの制御下に部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含むDNAが導入された、該第一の遺伝子組換え非ヒト動物と同種の第二の遺伝子組換え非ヒト動物またはその子孫を交配する工程を含む、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト動物の作出方法。
［２］  分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子および部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子をホモまたはヘテロに有する動物をスクリーニングする工程をさらに含む、［１］の方法。
［３］  肝臓において、スタッファー配列が除去されている動物をスクリーニングする工程をさらに含む、［１］または［２］の方法。
［４］  得られたトランスジェニック非ヒト動物が、肝糖産生をモニターするために利用される、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］  レポータータンパク質がルシフェラーゼである、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］  非ヒト動物がげっ歯類である、［１］〜［６］のいずれかの方法。
［８］  ［１］〜［７］のいずれかの方法により作出された、トランスジェニック非ヒト動物。
［９］  肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されている、肝糖産生をモニターするためのトランスジェニック非ヒト動物。
［１０］  肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現する、［９］のトランスジェニック非ヒト動物。
［１１］  ［８］〜［１０］のいずれかのトランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプル中のレポータータンパク質の量を測定することを含む、該トランスジェニック非ヒト動物の肝糖産生をモニターする方法。
［１２］  トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプルが血液である、［１１］の方法。
［１３］  ［８］〜［１０］のいずれかのトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与する工程、該トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプル中のレポータータンパク質の量を測定する工程、該トランスジェニック非ヒト動物の肝糖産生をモニターして、該被験物質が肝糖産生に与える影響を評価する工程を含む、肝糖産生に影響を与える物質のスクリーニング方法。
［１４］  トランスジェニック非ヒト動物に由来するサンプルが血液である、［１３］の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、実験動物における肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターする方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は肝臓における糖産生を示す模式図である。
【図２】図２は正常マウスおよび糖尿病モデルマウスにおけるG6Pアーゼの発現量の解析結果（Ａ）ならびに、糖尿病モデルマウスに対するインスリン投与によるG6Pアーゼの発現量の解析結果（Ｂ）を示す。
【図３】図３は、マウスG6Pアーゼ遺伝子座の開始コドンをつぶすかたちで、loxP-YFP-loxP-GLuc配列を含むDNA断片を挿入して作製したターゲッティングベクターの模式図を示す。（Ａ）：ベクターの全体図。（Ｂ）：loxP-YFP-loxP-GLuc配列を含むDNA断片挿入部の詳細図。
【図４】図４は、絶食時および再食時のトランスジェニックマウスより得られた血液サンプルを用いて測定されたGLuc活性の解析結果（Ａ）ならびに絶食時および再食時の野生型マウスに由来するG6PアーゼをコードするmRNA量の解析結果（Ｂ）を示す。グラフＡの縦軸は、絶食開始時（摂食直後）のGLuc活性を１とする相対値によって示す。グラフＢの縦軸は、G6PアーゼをコードするmRNA量を、サンプルごとの内部標準蛋白であるRps18遺伝子をコードするmRNA量で除した値を示す。ＡＬ：随時摂食状態（朝10時）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明における肝糖産生をモニターするためのトランスジェニック非ヒト動物は、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼ（以下、「G6Pアーゼ」と記載）プロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されており、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現する。
【００１２】
本発明において「肝糖産生をモニターする」とは、肝糖産生量を測定および評価することを意味し、より詳細には、肝臓におけるG6Pアーゼプロモーターの活性を測定および評価することを意味する。肝糖産生は、肝臓におけるグリコーゲン分解と糖新生の主に二つの代謝経路からなり、最終的に両経路にて産生されたグルコース−6−リン酸がG6Pアーゼの働きにより脱リン酸化されてグルコースを生じ、血中へと分泌される（図１）。すなわち、グルコースの産生量（肝糖産生量）は、G6Pアーゼの活性および発現量によって制御されている。したがって、G6Pアーゼの発現を制御するG6Pアーゼプロモーターの活性を測定および評価することによって、肝糖産生量を間接的に測定および評価することができる。また、本発明においては、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されており、これにより肝糖産生に関与するG6Pアーゼプロモーターの活性のみを特異的に測定および評価することができる。
【００１３】
本発明において「G6Pアーゼプロモーターの制御下」とは、G6Pアーゼプロモーターの3’側に連結された遺伝子が、当該プロモーターの活性に応じて、転写が駆動されることを意味する。前記トランスジェニック非ヒト動物においては、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの3’側に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が連結されており、当該プロモーター活性に応じて、当該遺伝子の転写が駆動される。
【００１４】
「分泌型のレポータータンパク質」とは、細胞内で発現された後、トランスジェニック非ヒト動物の体液中に分泌または排泄されるレポータータンパク質を意味する。「体液」としては、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、汗、尿、唾液など（これらに限定はされない）が挙げられ、好ましくは血液であり、さらに好ましくは血清である。「レポータータンパク質」は、免疫学的手法、比色反応、蛍光発光、化学発光などにより容易に検出できるものであれば良く、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられるがこれらに限定はされない。レポータータンパク質には必要に応じて、体液中に分泌または排泄されるために必要なシグナルペプチドを付加しても良い。また、分泌型のレポータータンパク質は市販のものを利用することができ、例えば、Cypridinaルシフェラーゼ、Gaussiaルシフェラーゼ、Metridiaルシフェラーゼ、Vargulaルシフェラーゼ、Oplophorusルシフェラーゼ、Pleuromammaルシフェラーゼなど（これらに限定はされない）を好適に利用することができる。
【００１５】
「非ヒト動物」としては、ヒトを除く哺乳動物（ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなど）が挙げられ、好ましくはげっ歯類に属する哺乳動物である。げっ歯類に属する哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギなどが挙げられるがこれらに限定はされない。好ましくは、本発明において「非ヒト動物」はマウスである。
【００１６】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、公知のトランスジェニック非ヒト動物作製方法に基づいて作出することができる。以下、トランスジェニックマウスの作出方法について詳述するが、他の非ヒト動物についても同様の手法を用いて作出できることは当業者にとって明らかである。
【００１７】
本発明のトランスジェニックマウスは、以下の第一のトランスジェニックマウスまたはその子孫と第二のトランスジェニックマウスまたはその子孫とを交配することによって作出することができる。
【００１８】
第一のトランスジェニックマウスは、G6Pアーゼプロモーターの制御下に、2つの部位特異的組換え酵素の認識部位に挟まれたスタッファー配列、および分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が5’側よりこの順に含まれるDNA断片が導入されている。第一のトランスジェニックマウスにおいては、スタッファー配列の存在により、G6Pアーゼプロモーターの制御下において、分泌型のレポータータンパク質の発現が阻害されている。
【００１９】
第二のトランスジェニックマウスは、肝臓特異的プロモーターの制御下に部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片が導入されており、当該トランスジェニックマウスの肝臓において特異的に部位特異的組換え酵素が発現されている。
【００２０】
これらのトランスジェニックマウスを交配させることによって、肝臓特異的プロモーターの制御下に発現される部位特異的組換え酵素の働きにより、スタッファー配列が切り出され、肝臓特異的に、G6Pアーゼプロモーターの制御下において分泌型のレポータータンパク質を発現する仔を得ることができる。
【００２１】
用いるマウスは、限定されないが、例えば、C57Bl/6Nマウス、C57Bl/6Jマウス（B6マウス）、BALB/cマウス等が用いられる。
【００２２】
各トランスジェニックマウスは、公知の手法、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7380-7384(1980)に記載の方法により作出することができる。
【００２３】
すなわち、標的とする遺伝子導入部位周辺のゲノムDNA配列と相同な配列（相同組換え部位）中に、目的のDNA断片を含む、遺伝子組換えDNA構築物を作製する。
【００２４】
第一のトランスジェニックマウス作製においては、標的とするG6Pアーゼプロモーターより3’下流領域の塩基配列中に、2つの部位特異的組換え酵素の認識部位に挟まれたスタッファー配列、および分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子を5’側よりこの順に含んでなる、遺伝子組換えDNA構築物を作製する。
【００２５】
少なくともG6Pアーゼプロモーターの3’下流領域を含む、マウス11番染色体のゲノムDNA配列は公知であり、公開されたデータベース（例えば、GenBank等）にNC_000077として登録されており、当該DNA構築物の作製においてはこれらの遺伝子情報を利用することができる。また、下記実施例にて詳述するとおり、当該DNA構築物の作製に際しては、少なくとも標的とするG6Pアーゼプロモーターの3’下流領域の塩基配列を含むBACクローンを利用することができる。このようなBACクローンは、当業者であれば上記公開されたデータベースに登録された遺伝子情報を利用して、ゲノムライブラリーより容易にクローニング・作製することが可能であるし、また、市販のものを利用しても良い。すなわち、BACクローン上のG6Pアーゼプロモーターの3’下流領域に、上記DNA断片を相同組換えにより導入し、得られた組換えBACクローンを含むBACベクターを、遺伝子組換えDNA構築物として利用することができる。
【００２６】
「2つの部位特異的組換え酵素の認識部位」とは、部位特異的組換え酵素によって認識され、その間に挟まれたスタッファー配列の切り出しを生じる機能を有する。このような部位特異的組換え酵素の認識部位としてはloxP配列が挙げられる。
【００２７】
「スタッファー配列」は、その3’側に連結されたレポータータンパク質をコードする遺伝子の転写を阻止するために設けられた配列であり、当該スタッファー配列が部位特異的組換え酵素によって切り出されることによって、G6Pアーゼプロモーターの制御下に、分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が配置され、G6Pアーゼプロモーターの制御下に、分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子の転写が可能となる。スタッファー配列は特に限定されず、例えば、分泌型のレポータータンパク質とは異なるレポータータンパク質をコードする遺伝子や薬剤耐性遺伝子など（例えば、LacZ、GFP、CFP、YFP、Ｎeoなど）が挙げられる。スタッファー配列は必要に応じて、その3’末端にポリＡ配列を含んでも良い。
【００２８】
「レポータータンパク質をコードする遺伝子」は、その3’末端が、G6Pアーゼをコードする遺伝子の5’上流領域にあっても良いし、G6Pアーゼをコードする遺伝子に接していても良く、あるいは、レポータータンパク質をコードする遺伝子の導入により、G6Pアーゼをコードする遺伝子の一部または全部が欠失されても良い。
【００２９】
第二のトランスジェニックマウス作製においては、標的とする遺伝子導入部位周辺のゲノムDNA配列中に、肝臓特異的プロモーターおよびその制御下に部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子を含んでなる、遺伝子組換えDNA構築物を作製する。
【００３０】
「部位特異的組換え酵素」としては、上記部位特異的組換え酵素によって認識される配列にて、その間に挟まれたスタッファー配列を切り出すことが可能なものであれば特に限定されず、例えばGre酵素が挙げられる。
【００３１】
「肝臓特異的プロモーター」としては、肝臓アルブミンプロモーター、α−フェトプロテインプロモーター、α１−抗トリプシンプロモーター、トランスフェリントランスサイレチンプロモーター、血清アミロイドＡプロモーター、トランスチレチンプロモーター、肝細胞核因子６（ＨＮＦ−６）プロモーターなどが挙げられる。例えば、肝臓アルブミンプロモーターを好適に利用することができる。
【００３２】
次いで、得られた各DNA構築物を、マウスの全能性細胞にそれぞれ導入する。
「全能性細胞」としては、受精卵、初期胚のほか、ES細胞（胚性幹細胞）などの多能性細胞が挙げられる。初期胚を用いる場合、８細胞期以前の胚が好ましい。
【００３３】
DNA構築物の細胞への導入方法は、限定されないが、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法等により行うことができる。この中でもマウス受精卵の雄性前核へのマイクロインジェクションが好ましい。
【００３４】
続いて、DNA構築物を導入した細胞を、レシピエントマウスの卵管に移植する。レシピエントマウスとしては、好ましくは精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
そして、この細胞を個体へと発生させる。
【００３５】
次いで、発生した個体から、体細胞及び生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。得られたマウスを野生型マウスと交配し、F1マウスを得る。ヘテロ接合体の選択は、例えば、F1動物の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定できる。
【００３６】
得られた第一および第二のトランスジェニックマウスのヘテロ接合体同士を交配させ、分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子および部位特異的組換え酵素をコードする遺伝子をホモまたはヘテロに有する動物ならびに／あるいは肝臓において、スタッファー配列が除去されている動物を、上記手法によりスクリーニングする。
【００３７】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、当該非ヒト動物における肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターすることができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物においては、G6Pアーゼプロモーターの活性に応じて、分泌型のレポータータンパク質が体液中に分泌または排泄される。したがって、体液中に含まれるレポータータンパク質量を測定・評価することによって、G6Pアーゼプロモーターの活性を測定・評価することができ、すなわち、肝糖産生量を間接的に測定・評価することができる。
【００３８】
「体液」としては、上記定義のものが挙げられ、好ましくは血液（全血、血漿、血清）、より好ましくは血清である。測定・評価に付される血液量は少なくとも1〜15μＬ、好ましくは5〜10μＬの量で十分であり、当該非ヒト動物に与えるストレスを最小限に留めることができる。また、血液は、尾静脈または眼窩静脈叢から容易に採取することができる。
【００３９】
レポータータンパク質量の測定・評価方法は、用いたレポータータンパク質に応じて適宜選択することができ、その量または活性を定量的に測定・評価することができる。用いたレポータータンパク質がルシフェラーゼであれば、採取した体液にルシフェラーゼの基質を添加して、生じた発光をルミノメーターで測定すればよく、煩雑な操作を必要としない。
【００４０】
上記のとおり本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、肝糖産生を簡便かつ効率的にモニターすることができることから、被験物質が肝糖産生に与える影響を評価するための実験動物として利用することができる。
【００４１】
すなわち、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に被験物質を投与し、被験物質が肝糖産生に与える影響を評価することができる。被験物質は、トランスジェニック非ヒト動物に対して経口投与または非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与など）することができる。被験物質投与前後のトランスジェニック非ヒト動物より体液（例えば、血液）サンプルを採取して、体液中に含まれるレポータータンパク質の増減を指標として、当該被験物質の効果を評価することができる。例えば、被験物質の投与により、体液中に含まれるレポータータンパク質の量が低減した場合には、当該被験物質は肝糖産生を抑制する効果を有すると判断することができ、逆に、体液中に含まれるレポータータンパク質の量が増大した場合には、当該被験物質は肝糖産生を促進する効果を有すると判断することができる。
【実施例】
【００４２】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、これらの実施例によって制限されるものではない。
【００４３】
実施例１：肝臓におけるG6Pアーゼの発現量
正常マウスおよび2型糖尿病モデルマウス（C57BLKSJ db/dbマウス）を随時摂食下で肝臓40ｍｇを採取し、当該組織に含まれるG6PアーゼmRNA量を、G6PアーゼのＰ32で放射線ラベルしたcDNAプローブを用いて、ノーザンブロット法により検出した。
【００４４】
結果を図２（Ａ）に示す。
図２（Ａ）より明らかな通り、肝糖産生量が過剰な2型糖尿病状態においてはG6Pアーゼの発現量が正常状態に比べて顕著に高いことが明らかとなった。
【００４５】
次に、16時間絶食させた2型糖尿病モデルマウス（C57BLKSJ db/dbマウス）における、インスリン投与の有無におけるG6Pアーゼの発現量の変化を調べた。インスリン投与群には、インスリン（10 mU/kg体重/分）を投与し、対象には生理食塩水を同様に投与した。上記同様に、肝組織をそれぞれ採取した後、当該組織に含まれるG6PアーゼmRNA量を上記ノーザンブロット法により検出した。
【００４６】
結果を図２（Ｂ）に示す。
図２（Ｂ）より明らかな通り、肝糖産生を抑制するインスリン投与により、G6Pアーゼの発現量が顕著に減少することが明らかとなった。
これらの結果は、肝糖産生量とG6Pアーゼの発現量との間には相関関係があることを示す。
【００４７】
実施例２：肝糖産生モニターマウスの作製
BACクローン（RP24-183A19）(BACPAC Resources Center, Children's Hospital Oakland Research Institute)は、マウスG6PC遺伝子座とともに、5’上流の89.4 kbのゲノム配列、および3’下流の75.3 kbのゲノム配列を含む、11番染色体の174.8 kbをカバーしている。
【００４８】
Red/ET組み換え法により、RP24-183A19上にloxP-YFP-loxP-GLuc配列を含むDNA断片を挿入し、ターゲッティングベクターを構築した(図３)。
【００４９】
図３に示す通り、ターゲッティングベクターには、マウスG6PC遺伝子のエキソン１に存在する翻訳開始コドンの直前に翻訳開始コドンをつぶす形でGaussia ルシフェラーゼ(GLuc)遺伝子を挿入した。
【００５０】
当該ターゲッティングベクターを用いて、G6Pアーゼの内因性プロモーターの下流に、LoxP配列で挟まれたYFPと、さらにその下流に分泌型ルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase）を有したトランスジェニックマウスを作製した（フェニックスバイオ社に委託）。
【００５１】
次いで、得られたトランスジェニックマウスと、肝臓アルブミンプロモーターの制御下においてCre組み換え酵素を発現するトランスジェニックマウス(Division of Endocrinology, Diabetes and Bone Diseases, Department of Medicine, Mt.Sinai School of Medicine, Dr. Derek LeRoithよりご分与いただいたもの）を交配させ、分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子およびCre組み換え酵素をコードする遺伝子を指標にして、これら遺伝子をヘテロに有するマウスを選択した。遺伝子型の識別は、従来公知の手法に従って行い、子マウスの尾よりゲノムDNAを抽出し、各遺伝子に特異的な配列を含むプライマーを用いたゲノムPCR法により行った。
【００５２】
実施例３：GLuc活性の測定
実施例２で得られたトランスジェニックマウスを24時間絶食させ、8時間〜24時間の各時点で、血液サンプルを尾静脈より採取した。また、実施例２で得られたトランスジェニックマウスを24時間絶食させ、再食させた後、6時間〜24時間の各時点で、血液サンプルを尾静脈より採取した。
【００５３】
一方、野生型マウスを同様に、24時間絶食させ、8時間〜24時間の各時点で、屠殺して肝臓を採取し、各サンプルより従来公知の手法に従って行いmRNAを抽出してcDNAを合成した。また、野生型マウスを上記同様に、24時間絶食させ、再食させた後、6時間〜24時間の各時点で、屠殺して肝臓を採取し、各サンプルより従来公知の手法に従って行いmRNAを抽出してcDNAを合成した。
【００５４】
上記トランスジェニックマウスより得られた血液サンプルを用いて、各サンプル中のGLuc活性を測定した。GLuc活性の測定は、製造元のプロトコルに従って、Gaussia Luciferase Assay Kit(New England BioLabs社製)を使用し、ルミノメーター（Berthold社製TristarLB941）を用いて測定した。
結果、絶食時間の経過に伴い、GLuc活性の増大が観察された（図４（Ａ））。
【００５５】
一方、上記野生型マウスより得られた各cDNAを鋳型として、G6Pアーゼをコードする遺伝子に特異的な配列を含むプライマーを用いたPCR法を行い、各サンプルにおけるG6Pアーゼの発現量を定量した。
結果、絶食時間の経過に伴い、G6PアーゼをコードするmRNA量の増大が観察された（図４（Ｂ））。
【００５６】
これらの結果は、肝糖産生の制御に関与するG6Pアーゼの発現量と、トランスジェニックマウスより得られた血液サンプルを用いて測定されたGLuc活性との間の相関関係を示す。一般的に、絶食時においては肝糖産生量が増大することが知られている。トランスジェニックマウスにおいて測定されたGLuc活性の増大は、絶食時における肝糖産生量の増大を反映するものである。
【００５７】
再食時の結果についても、野生型マウスに由来するG6PアーゼをコードするmRNA量と、トランスジェニックマウスに由来するGLuc活性との間に相関関係が見られ、再食により、両者の値は共に低下した（図４）。一般的に、摂食時においては肝糖産生量が低下することが知られている。トランスジェニックマウスにおいて測定されたGLuc活性の低下は、摂食時における肝糖産生量の低下を反映するものである。
【００５８】
上記実施例の結果は、トランスジェニックマウスより得られた血液サンプル中のGLuc活性を用いて、当該マウスの肝糖産生の挙動を評価できることを示す。
【００５９】
実施例４：肝糖産生に影響を与える物質の評価
フォルスコリンは、アデニル酸サイクラーゼを活性化する作用をもち、cAMP産生を増大させ、肝臓におけるグルコース産生を促進することが知られている（Nature 437(7062):1109-1111(2005)）。
【００６０】
実施例２で得られたトランスジェニックマウスに、フォルスコリンを10mg/kg体重にて腹腔内に投与した。
【００６１】
３時間後、当該トランスジェニックマウスより血液サンプルを採取して、サンプル中のGLuc活性を実施例３と同様に測定した。
結果、フォルスコリンを投与したトランスジェニックマウスにおいては、GLuc活性が増大した（最大10.4倍に増加した）。
【００６２】
上記実施例の結果は、トランスジェニックマウスより得られた血液サンプル中のGLuc活性が、肝糖産生に対する投与物質の効果を反映することを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明によれば、肝臓特異的に、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの制御下に分泌型のレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入されているトランスジェニック非ヒト動物を提供することができる。当該トランスジェニック非ヒト動物においては、グルコース−6−ホスファターゼプロモーターの活性に応じて、レポータータンパク質が体液中へと分泌されるために、体液中のレポータータンパク質量を測定することによって簡便かつ効率的に肝糖産生をモニターできる。また、本発明によれば、肝糖産生を一匹から経時的にモニターすることができ、個体差を考慮せずにより正確な評価を得ることができる。したがって、本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物は、肝糖産生に対する被験物質の評価系として利用することができ、薬剤開発等の分野において貢献することが期待される。
【図１】
2013220083.tif 000002
【図２】
2013220083.tif 000003
【図３】
2013220083.tif 000004
【図４】
2013220083.tif 000005