(57)【要約】【課題】低温において会合し、高温において解離し、この会合、解離が可逆反応である、できるだけ分子量の小さい二種類の分子材料を提供する。【解決手段】水溶液中で、低温において会合してロイシンジッパー構造を形成し、高温において熱変性して解離する二種類のペプチドであって、図１Ａに示すように、ペプチド配列中にアラニン残基を増やすことで状態遷移中央温度が４５℃以上である分子量の小さい二種類のペプチドの組み合わせを開発した。【選択図】図１Ａ
2013155147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む２４残基長以下の第１のペプチドと、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む第２のペプチドとからなる２４残基長以下の第２の二種類のペプチドの組み合わせであって、両ペプチドの合計濃度が125mg/lの以下の水溶液中で、２０℃以下の低温において第１、第２のペプチドが会合してロイシンジッパー構造を形成し、７０℃以上の高温においてロイシンジッパー構造から変性して第１、第２のペプチドが解離し、この会合から解離への状態遷移中央温度が４５℃以上であることを特徴とし、さらに会合、解離の状態遷移が温度変化に対して可逆的であることを特徴とする第１および第２の二種類のペプチドの組み合わせ。
【請求項２】
第１および第２のペプチドのＮ末端及びＣ末端が電荷を持たないように修飾された請求項１に記載の二種類のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は温度変化に応じて会合、解離する二種類のペプチドのアミノ酸配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
二種類の分子が水溶液中において、溶液の条件（温度、pH、イオン強度、他の溶質の濃度）の変化に対応して可逆的に会合、解離をする現象は、さまざまな分野に応用されてきた。たとえば、その二種類の一方が、検出対象である化学物質であれば、もう一方の分子を基板やビーズに固定することで、検出対象の化学物質を吸着し、検出する方法として利用できる。また、その二種類の分子の一方を溶液に接する、あるいは溶液内に置かれた基板やビーズに固定し、水溶液中に遊離しないようにしておき、もう一方の分子を、別の機能分子に結合させ、特定の溶液条件のもとでは、基板に固定された側の分子と、機能分子に固定された分子の二つが会合することにより、機能分子が基板あるいはビーズ上に固定され、その溶液条件を変化させることによって、二つの分子が解離し、結果として機能分子が基板あるいはビーズから解離し、溶液中に遊離するようにできる。このような機能分子の着脱機構は、多段階の化学反応を利用する化学分析装置や、医療の分野における条件に応じて薬剤を投与する場合に利用でき、多くの応用分野が期待できる。
【０００３】
以上のような目的で溶液条件の変化に対して会合、解離する二種類の分子として研究されてきたものは、自然界、とくに生物が合成、利用してきた分子、およびそれを改変したものが多い。第１に考えられるものは、抗原抗体反応にかかわる抗原と抗体の二種類の分子である。抗原となる分子と、それに結合するように生物が対応して合成する抗体分子は、抗体の合成条件を設定することによって、特定の溶液条件の変化に対応して会合、解離する。第２に考えられるものは、生体内で通常２量体として存在する二種類のタンパク質である。たとえば、ヒトのヘモグロビンは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの四つのペプチド鎖が会合した４量体であり、そのうち、ＡとＣは同じ配列からなり、またＢとＤも同じ配列からなるペプチド鎖である。よって、ヘモグロビンのＡ鎖とＢ鎖は、溶液条件によって会合、解離を行う二種類の分子として利用可能である。しかしながら一般的に抗体も含めてタンパク質はアミノ酸が１００以上結合した高分子であり、溶液条件によって会合、解離する二種類の分子の一方あるいは両方がタンパク質である場合、会合、解離が可逆的でないことが多い。また、可逆的であっても、会合、解離が起こる溶液条件を目的にかなうようにするための改変は難しい。このような状況において、会合・解離の溶液条件をさまざまな設定できる二種類の分子としてDNAをはじめとする核酸を利用することも検討されてきた。DNAの二重鎖は、低温において安定であるが、高温においては、変性して二重鎖を構成する二本のDNA鎖が解離する。これは可逆反応であり、かつ、DNAの塩基配列や長さによって、会合・解離の温度設計が自由にできる。また、設計された配列のDNAを作る技術は確立されている。しかしながら、DNAはタンパク質やペプチド鎖に比べて、分子量が大きく、また設計されたDNAを大量に製造するのが難しい。
【０００４】
こうした状況において、溶液条件によって会合、解離を可逆的に行う分子であって、設計自由度が高く、大量に製造可能で、かつ通常のDNAやタンパク質に比べて小さな分子量をもつものとして、低温でロイシンジッパー構造を形成して会合し、高温においてはこの構造の変性によって解離する二種類のペプチドを考えることができる。
【０００５】
二種類のペプチドが、低温においてロイシンジッパー構造を形成して会合し、高温で熱変性して、解離し、かつまた低温に戻したときに、可逆的にロイシンジッパー構造を形成して会合する現象は、非常に古くから知られている。そもそも生体内において、このロイシンジッパー構造を形成して会合するペプチドは塩基性ロイシンジッパー転写因子（以下英語名である basic leucine zipper transcription factor にちなんで、bZIPと略記する）と呼ばれるタンパク質発現の転写制御機構にかかわるタンパク質の一部である。同種、あるいは二種のbZIPが、ロイシンジッパー構造を形成して会合すると、その両者の結合した２量体は、生体細胞核内DNAの特定の領域に結合し、そのDNA領域近傍の遺伝子が、転写されるのを抑制または促進し制御する。ヒトについては、現在までに百種類以上のbZIP転写因子タンパク質、またはそれをコードしている遺伝子が知られている。中でも、JUNファミリーと呼ばれる３種類(JUN, JUNB, JUND)のbZIP転写因子は、細胞のがん化にかかわる転写因子として知られている。これらがbZIPがロイシンジッパー構造を形成して会合する組み合わせはそれほど特異的ではなく、たとえば、JUNは、JUN同士で会合する場合もあれば、FOSと呼ばれる別系統のbZIP転写因子とも会合する。この会合の組み合わせは、それぞれの転写因子の発現の濃度や温度そのほかの細胞内条件に依存し、この組み合わせごとに転写因子としての機能が異なっていて、会合の組み合わせに応じて異なるタンパク質の発現が抑制あるいは促進され制御される。これが細胞内の条件の変化に即応した制御機構として働くとされている。
【０００６】
bZIP転写因子のほとんどは、そのロイシンジッパー構造の形成にかかわるbZIP領域のアミノ酸配列において、７残基ごとにロイシン残基が現れることを特徴としている。二つのbZIP領域がロイシンジッパー構造を形成するときには、その両者がαヘリックス構造を形成し、かつ双方のロイシン残基の側鎖が疎水結合することにより、αヘリックス二つがたがいに高次の二重らせん構造を構成して会合する。この会合しロイシンジッパー構造を形成しているとき、これを構成する二つのペプチドのＮ末端側からＣ末端側への向きは、同じ向きである。すなわち、Ｃ末端側同士、Ｎ末端側同士が結合する並行な会合である。ただし、反並行な会合もあり得る。また、７残基ごとに現れるとされるロイシン残基がつねにロイシンであるわけではなく、稀にイソロイシンやアラニンなど他の疎水性側鎖を有するアミノ酸である場合や、さらに、大変稀には、親水的な側鎖をもつアミノ酸である場合もあり得る。
【０００７】
bZIP転写因子の温度変化に対する会合、解離の仕組み、およびその熱力学特性については、さまざまな研究がなされてきたが、その中でも、酵母由来のGCN4と呼ばれる二種類のペプチドに関する研究が多数存在する。〈非特許先行文献１〉では、GCN4を改変した３０残基長の二種類のペプチドが提示された。二種類のペプチド双方が２８残基長か、それより長いものについては、想定される濃度条件（10〜1000μM）のもとで会合、解離しはじめる状態遷移中央温度は0℃以下の低温から80℃まで幅広く設定可能である。しかしながら、２４残基長以下の短いペプチドの場合、想定される濃度条件のもとで、会合、解離の状態遷移中央温度を３０℃以上にすることは難しい。すなわち短いペプチドでは会合時の結合力が弱いため、高温において会合している状態を保つことが難しく、ほとんどの場合３０以下の低温でも容易に解離し、会合、解離の状態遷移中央温度が40℃を超えるものは知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Marti D.N., Jelesarov I., Bosshard H.R.,(2000) Interhelical Ion Pairing in Coiled Coils: Solution Structure of a Heterodimeric Leucine Zipper and Determination of pKa Values of Glu Side Chains. Biochemistry 39,pp12804-12818
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、低温で、ロイシンジッパー構造を形成して会合し、高温で熱変性して解離し、かつこの会合、解離が可逆的である二種類のペプチドであって、全体濃度が125mg/lであるときに会合状態と解離状態が拮抗する状態遷移中央温度が、50℃前後に達するものの中で、できるだけ短いものとして、２４残基長以下の長さのもので、かつペプチドの配列の一部改変により、状態遷移中央温度を下げることが容易である二種類のペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者が、この〈非特許先行文献１〉で提示されたGCN4を改変した３０残基長の二種類のペプチドについて再実験を行ったところ、濃度125mg/l、pH 7.4（7.5mM リン酸バッファーによる）, イオン強度100mM（NaClによる）,の条件で、会合、解離の遷移中央温度は、65℃であった。これらGCN4を改変した３０残基長のペプチドは、双方ともに、７残基ごとに現れるロイシン残基を４残基持っている。よってロイシンジッパー構造を形成する正味の領域は、（７×４＝）２８残基である。さらに配列を詳しくみると、比較的類似した７残基長の部分配列が４回繰り返す構造になっている。二種類のペプチドＡ，Ｂのうち、全体で負電荷をもペプチドＡは、７残基長の-EVAQLEQ-  をもとに、これに１ヶ所ないし２ヶ所改変した配列が４回繰り返す28残基長の配列を有している。また、全体で正電荷をもつペプチドＢは、７残基長の-KVAQLKQ-をもとに、これに１ヶ所ないし３ヶ所改変した配列が４回繰り返す28残基長の配列を有している。とくに、リジン残基(K)は、同様に側鎖が正電荷をもつアルギニン残基(R)に置換されているところが多い。そこで、ロイシンジッパーのロイシンを５番目の残基とするこの７残基長の部分配列を、ひとつのユニットとして考えることができることが判明した。すなわち、GCN4を改変した３０残基長のペプチドＡ、Ｂは、それぞれ４ユニットからなる、（７×４＝）２８残基長の配列を基本としている。この二種類のペプチドＡ，Ｂについては、〈非特許先行文献１〉が開示するように、核磁気共鳴法によって、水溶液中でロイシンジッパー構造を形成して会合していることが判明している。これによれば、ペプチドＡの第１のユニットと、ペプチドＢの第１のユニットがそれぞれ会合し、以下、第２のユニット同士、第３のユニット同士、第４のユニット同士が会合して、ロイシンジッパー構造を形成していることが判明した。それぞれのユニットの会合においては、まずもっとも主要な結合は、双方のユニット５番目のロイシンの側鎖間の疎水結合である。続いて、Ａの各ユニットの１番目のグルタミン酸残基(E)の負の電荷をもつ側鎖がＢの各ユニットの６番目のリジン、あるいはアルギニン残基の正の電荷をもつ側鎖と静電的な相互作用により結合し、同じく、Ａの各ユニットの６番目のグルタミン酸の側鎖と、Ｂの各ユニットの１番目のリジンあるいはアルギニン残基の側鎖と静電的な相互作用により結合している。また、各ユニットの会合において、２番目の残基であるバリン(V)の側鎖が他方のバリンの側鎖と、疎水的な相互作用により結合し、また双方のＮ末端側から３番目のユニットの２番目のアスパラギンの側鎖は、他方のユニットのアスパラギン(N)と水素結合をしている。
【００１１】
本発明者は、前記  GCN4の改変型の調査で明らかになったロイシンジッパー構造の詳細に基づき、GCN4の改変型ペプチドＡ，Ｂが４ユニット長（７×４＝２８残基長）の配列を基本とするのに対して、３ユニット長で十分に高い状態遷移中央温度である４７．８℃を実現する配列をもつ二種類のペプチドが存在することを実証した。また、配列の一部改変によって、容易に状態遷移中央温度を下げることができることを示した。
【００１２】
すなわち第１の発明は、GCN4の改変型で得られたペプチドＡの基本となるユニットの７残基の配列とペプチドＢの７残基の配列を参考にし、通常αヘリックスをもっとも構成しやすいアミノ酸がアラニンであることに着目し、GCN4の改変型よりも二つのユニットの結合に直接かかわらない部分で二つのアラニン残基が連続する配列をもたせ、第１のペプチドのユニットの配列として、-EVAALEQ-を提供し、第２のペプチドのユニットの基本配列として、-KVAALKQ- を提供し、それぞれの基本の７残基長のユニットが３回繰り返される（７×３＝）２１残基長の配列を含む第１、第２のペプチドのそれぞれの配列を提供したことである（請求項１）。これにより従来の生物由来のbZIP領域の配列やそれらを一部改変して得られる３ユニット長の二種類のペプチドに比べて大幅に高い状態遷移中央温度を実現する二種類のペプチドを提供することができた。また、第１のペプチド、第２のペプチド双方の配列を一カ所改変することによって、請求項１に記載の二種類のペプチドに比べて会合、解離の状態遷移中央温度が低い二種類のペプチドが得られ、さらに、請求項１に記載の二種類のペプチド双方の配列を４カ所改変することにより、会合、解離の状態遷移中央温度がさらに低い二種類のペプチドが得られた。
【００１３】
ついで第１、第２のペプチドの双方のＮ末端側をアセチル化、Ｃ末端側をアミド化し、Ｎ末端の正電荷、およびＣ末端の負電荷を取り除き、これら第１、第２のペプチドが並行に会合するのを阻害しないようにした（請求項２）。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、前記（背景技術）において述べたように、機能分子の温度変化に対して可逆的な着脱機構を担う二種類の分子として有効に利用できる。このような用途において従来利用可能であった抗原抗体やＤＮＡにくらべて分子量が小さいため、機能分子の機能への影響が小さい。さらに従来の生物由来のbZIP配列やそれを改変したものに比べても分子量が小さいため、製造効率が高く、応用展開を容易にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】第１のペプチドのアミノ酸配列（配列番号１、３、５）、第２のペプチドのアミノ酸配列（配列番号２、４、６）を示す図
【図１Ｂ】ロイシンジッパー構造形成時のアミノ酸残基配置の推定図
【図２】第１のペプチドを、配列番号１を含むようにし、第２のペプチドを配列番号２を含むようにした場合の、円二色性（ＣＤ）分光測定結果で、ＣＤスペクトルの温度変化の実験結果を示すグラフ
【図３】請求項１記載のペプチドの組み合わせについて円二色性（ＣＤ）分光測定の波長222nmの値の温度変化の実験結果のグラフ
【図４】第１のペプチドが配列番号１を含み、第２のペプチドが配列番号２を含む場合の円二色性（ＣＤ）分光測定の波長222nmの値の温度変化の実験結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の高分子材料について、実施の形態及び実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の二種類のペプチドのうちの第１のペプチドは、図１Ａの配列番号１に記載の２１残基長の配列を含み、溶解度を増す目的でＮ末端側にEQ- を付加し、Ｃ末端側に-Kを付加した２４残基長のペプチドで、さらにＮ末端の正電荷を除去するために、アセチル化修飾を行い、Ｃ末端の負電荷を除去するためにアミド化修飾を行ったものであり、また第２のペプチドは、図１Ａの配列番号２、配列番号４、あるいは配列番号６に記載の２１残基長の配列を含み、第１のペプチド同様、Ｎ末端側にEQ-を付加し、Ｃ末端側に-Kを付加した２４残基長のペプチドで、同じく第１のペプチド同様Ｎ末端をアセチル化修飾し、Ｃ末端をアミド化修飾したものである。
【００１８】
図１Ｂは、第１のペプチドと第２のペプチドがロイシンジッパー構造を形成して会合している際に想定されるアミノ酸残基の配置の概略である。これはＮ末端側から見た図になっており、第１のペプチドと第２のペプチドの会合しているユニット内でのアミノ酸残基配置を示している。ロイシン（L）と、ロイシンが疏水結合し、また、バリン(V)とバリンが疎水結合し、配列上中央のユニット間の会合では、アスパラギン（N）とアスパラギンが水素結合をしていることを示す。また、第１のペプチド側のユニットにあるグルタミン酸（E）が、第２のペプチド側のユニットにあるリジン(K)と静電相互作用により結合していることを表わしている。以上のロイシンとロイシンの（L-L）の結合、バリンとバリン（V-V）の結合、アスパラギンとアスパラギン（N-N）の結合、およびグルタミン酸とリジン（E-K）の結合は、どれもユニット間の結合として重要なものであり、これを大きく変更することは会合の相互作用を弱める結果となる。本発明では、直接会合にかかわらないユニット内の３番目と４番目の残基をアラニンとしたことに特徴がある。アラニンはαヘリックスを安定させるものと考えられているため、これを配列上連続して二つ置くことにより、ヘリックスの安定性が高まり、したがって会合力が相対的に高まることにつながり、これが、状態遷移中央温度を押し上げる結果となる。
【００１９】
本発明の二種類のペプチドが、会合、解離を可逆的に行うことは、水溶液が、7.5mMのリン酸バッファによりpHが7.4に調整され、NaClによりイオン強度が100mMに調整されたものである場合に実験により実証された。この溶液条件はヒトの生理的な条件に近いものを選んだ。溶液条件を変えることで、会合、解離の状態遷移中央温度を下げることは容易であるが、イオン強度を10mM以下まで弱くする以外の方法で、解離の状態遷移中央温度をより高いものに上げることは、難しい。
【００２０】
第１のペプチドが配列番号１に記載の２１残基長配列を含み、第２のペプチドが配列番号２に記載の２１残基長配列を含む場合、二種類のペプチドの溶液での濃度合計が125mg/l以下でなければならない。これを超える濃度の場合、高温で二つのペプチドが解離した状況においてアミロイド形成が発生し、低温に下げたのちもロイシンジッパー構造を形成する会合が起こりにくくなり、会合、解離が可逆的ではなくなる。これは、第１のペプチドが配列番号１の配列を含み、第２のペプチドが配列番号２の配列を含む組み合わせの場合、両ペプチドともに疏水性が高く、不溶性のアミロイド形成を促進するためである。このことから、状態遷移中央温度をさらに高める目的で、配列番号１、配列番号２に記載の配列のグルタミンを一ヶ所ないし三ヶ所すべてについてアラニン(A)に変更した場合、あるいは、同様の目的で、配列番号１、配列番号２に記載のバリンをイソロイシン(I)に変更した場合、ペプチドの疎水性度が高まるため、同一の溶液条件で会合、解離の状態遷移中央温度を高めることができも、アミロイド形成がさらに促進され、十分な低濃度においても、もはや可逆的な会合、解離を起こさない。
【００２１】
（実施例）
１．実験法
１−１．ペプチド合成および溶液の調整
各種ペプチドの合成およびＮ末端、Ｃ末端の修飾は、シグマアルドリッチジャパン株式会社ライフサイエンス事業部に依頼し、凍結乾燥された純度95%以上のものを得た。
各種ペプチドは、まず純水中に溶解させて4g/lの濃度（純度による調整を行う）の溶液を調整し、これをリン酸バッファー、NaCl溶液と混合し、最終的にペプチドの濃度が1g/lで、pHが7.4、リン酸バッファーの濃度が7.5mM、NaClによるイオン強度が100mMになるように調整した。
【００２２】
１−２．円二色性（CD）分光測定
測定対象のペプチドの組み合わせにそって、二種のペプチドの1g/lの溶液それぞれから500μlずつ取り出したものを混合し、これを、7.5mMリン酸バッファー、NaCl 100mMの溶液で８倍に希釈し、二種のペプチドの濃度合計が125mg/lで7.5mMリン酸バッファー、pH 7.4, イオン強度 100mM (NaCl)の溶液を得た。これから400μlをＣＤ分光器用角型石英セルに入れ、円二色性（ＣＤ）分光測定を行った。なお、第１と第２のペプチドの配列の組み合わせによっては、二種類のペプチドの合計濃度が500mg/l（２倍希釈）および250mg/l（４倍希釈）で同一の実験を行った場合もある。これらは、125mg/lの濃度（８倍希釈）に希釈する過程で得られた溶液である。
【００２３】
１−３．円二色性（CD）分光測定結果からの各種熱力学特性の計算法
円二色性（CD）分光測定で、波長222nm の値であるθ(222)を、溶液中のペプチドやタンパク質のαヘリックスの含有度を測定するために用いる。ロイシンジッパー構造を形成しているときには、二種類のペプチドは会合していると同時に両者がαヘリックス構造を形成している。解離している状態では、ロイシンジッパー構造が変性していることにより、二種類のペプチドの双方はαヘリックス構造をほとんど形成せず、他のランダムコイル構造や、部分的にβストランド構造に変性する。円二色性（ＣＤ）測定で波長222nm  におけるCD値である θ(222)の値は、αヘリックス構造である場合は、大きな負値になり、ランダムコイル構造では、ほぼ０であり、また、βストランド構造では、αヘリックス構造に比べて半分程度の絶対値をもつ負値になる。よって、低温において二種のペプチドが会合してロイシンジッパー構造を形成しているときのθ(222)は絶対値の大きな負値であり、解離すると、αヘリックス構造の他の構造への変性により絶対値の小さな負値に変化する。よって、温度依存性のあるθ(222)の値を会合してロイシンジッパー構造を形成している状態と解離している状態の二状態のみからなる変性を仮定して解析することにより、二種類のペプチドの会合、解離にかかわる各種熱力学特性、すなわち状態遷移中央温度（Tm）、変性エンタルピー変化（ΔHD(T)）、変性ギブス自由エネルギー変化（ΔGD(T)）、およびここから変性エントロピー変化（ΔSD(T)）を求めることができる。ここで述べる方法は〈非特許先行文献１〉にある方法をそのまま踏襲している。
【００２４】
第１のペプチドをAとし、第２のペプチドをBとし、温度T KにおけるペプチドA,Bが会合している率を、fN(T)とし、変性して解離している率をfD(T)とする。この二つは、fD(T)=1-fN(T)の関係がある。この系における変性の平衡定数をKD,AB(T)とすると、これは以下の〈数１〉によってあらわすことができる。
【００２５】
【数１】
2013155147.tif 000003
【００２６】
ここで、[A]は、ペプチドAの溶液中での濃度、[B]は、ペプチドＢの溶液中での濃度であり、[AB]は、AとBが会合してロイシンジッパー構造を形成している複合体ABの濃度である。また、Ctotは、A,Bの会合が全く起こっていない完全解離した状態を想定したときの、Aの濃度[A]totと、Bの濃度[B]totの和、すなわち[A]tot + [B]tot である。絶対温度TKにおけるθ(222)の測定値を、θobs(T)とすると、〈数２〉で表せる。
【００２７】
【数２】
2013155147.tif 000004
【００２８】
この式で、θN(0)と、θD(0)は、絶対温度0Kにおいて想定されるθ(222)のそれぞれ会合状態、解離（変性）状態の値である。fN(T)は、変性のギブス自由エネルギーΔGD(T)に依存し、これは、〈数３〉で表わされる。
【００２９】
【数３】
2013155147.tif 000005
【００３０】
ギブス・ヘルムホルツの式を用いて会合、解離の変性による熱容量変化ΔCpが一定と仮定すると、ΔGD(T)と、ΔHD(T)、ΔCp、KD(T)との関係は〈数４〉で与えられる。
【００３１】
【数４】
2013155147.tif 000006
【００３２】
会合状態と解離した変性状態が拮抗するとき、fN(T)と、f  D(T)はともに１／２であるから、このときの温度が、状態遷移中央温度 Tmであり、このときの平衡定数は〈数式１〉からKD(Tm)はCtot/4 である。これらの〈数式１〉、〈数式２〉、〈数式３〉、〈数式４〉を用いて、実験で得られる温度依存のθ(222)の値に、各数式から計算されるθobs(T)が最適に適合するようなTm, mN, mD, θN(0), θD(0), ΔCp, ΔHD(Tm)の組み合わせを探索する。本発明での解析では、mDを０とし、ΔCpをあらかじめ2.0kJ/mol/K前後であると仮定し、また、θN(0)は、GCN4の改変型の低温での観測値からあらかじめ推定した値近傍であるように設定した。
【００３３】
２．実験結果
図２(a)に、第１のペプチドと、第２のペプチドを含む溶液でこの二種類のペプチドが会合・解離する状況を円二色性（ＣＤ）分光測定を行って得られたＣＤスペクトルの温度変化の実測値を示す。次に、図３は各ペプチドの組み合わせにおいて円二色性（ＣＤ）分光測定での波長222nmにおける値θ(222)の温度変化を表す。図３(a)は第１のペプチドを配列番号１の配列を含むものとし、第２のペプチドを配列番号２の配列を含むものとした場合、図３(b)は、第１のペプチドを配列番号３の配列を含むものとし、第２のペプチドを配列番号４の配列を含むものとした場合、および、図３(c)は、第１のペプチドを配列番号５の配列を含むものとし、第２のペプチドを配列番号６のペプチドを含むものにした場合をそれぞれ示す。
【００３４】
図２に示されるように、本発明の二種類のペプチド、すなわち第１のペプチドと第２のペプチドを125mg/lの濃度になるように調整した水溶液中において、図２(a)にしめされるように、低温においてαヘリックスを形成していることが確認され、図２(b)、(c)、(d)、(e)に示すように、高温になるにつれて、αヘリックスが崩壊し、ランダムコイル及びβストランド構造の混合したランダムな構造に変性することが確認された。図３(a)及び図３(d)に示されるように、第１のペプチドが配列番号１の配列を含み、第２のペプチドが配列番号２の配列を含む場合は、会合、解離の状態遷移中央温度が47.8℃であることが実証された。この二種類のペプチドにそれぞれ改変を加えた場合、図３(b)、(c)、及び(d)に示すように、どれも状態遷移中央温度は、47.8℃を超えることはないことも示された。また、図３に示される各ペプチドの組み合わせにおいては、どれも、温度上昇、下降時の結果が重なっており、会合、解離が可逆的であることが示された。また、図４に示されるように、第１のペプチドが配列番号１の配列を含み、第２のペプチドが配列番号２の配列を含む組み合わせにおいては、250mg/lの濃度にした場合、高温での解離後、低温に戻したときに、ロイシンジッパー構造の形成が完全ではなく、解離から会合への可逆性が示されなかった。よって、状態遷移中央温度を125mg/lの濃度において、47.8℃以上の温度にするために、二種類のペプチドの配列をよりアラニン(A)を増やしたり、またバリン(V)をイソロイシン(I)に変更したりするなど改変を行った場合、ペプチドの疎水性が高まり、結果として、125mg/lの濃度においても可逆性が得られず、本発明の第１のペプチドが配列番号１の配列を含み、第２のペプチドが配列番号２の配列を含む組み合わせが３ユニット長で２４残基以下のペプチドとしては、おそらく考えられる範囲で、もっとも状態遷移中央温度が高いペプチドの組み合わせであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の二種類のペプチドは、機能分子の基板、あるいはビーズからの着脱を温度変化によって行うための会合分子として利用されることを想定している。すなわち、本発明の二種類のペプチドの一方を、水溶液中の基板、あるいはビーズに容易には解離しない強い結合によって固定し、もう一方のペプチドを機能分子に容易には解離しない強い結合によって結合した状況で、0℃に近い低温で、本発明の二種類のペプチドを会合させることによって、機能分子は基板上に弱い結合力（あるいは会合力）で固定される。そののち、利用している溶液条件での二種類のペプチドの会合、解離の状態遷移中央温度より高い温度に上昇させることによって、二種類のペプチドは解離し、機能分子を基板上から溶液中に遊離させることができる。このような機構は、μTAS等の名称で呼ばれる、多段階の化学反応を微細な装置で実現する化学分析装置において、極めて利用価値が高い。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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