(57)【要約】      （修正有）【課題】二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールの製造の効率性を増大させる方法を提供する。【解決手段】キャンディダパラプシロシス由来の二級アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列において、例えば、４１位、４９位、７７位、９０位、９７位および／または１１３位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、二級アルコール脱水素酵素を保持し、且つ有機溶媒耐性を具備する二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）を得る。本酵素はケトンを原料とする光学活性アルコールの製造などに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）二級アルコール脱水素酵素活性、および（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比した改善された有機溶媒耐性、を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項６】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における５３位のグルタミン酸が置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における５３位のグルタミン酸が置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項７】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における７７位のアスパラギン酸が置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における７７位のアスパラギン酸が置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項８】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９０位のバリンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９０位のバリンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項９】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９７位のグリシンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９７位のグリシンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における１１３位のフェニルアラニンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における１１３位のフェニルアラニンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項１１】
（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における３０６位のプロリンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における３０６位のプロリンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、および１１３位のフェニルアラニンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項１２】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンおよび９０位のバリンが置換されたアミノ酸配列からなる、請求項５または８に記載のタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号４）からなる、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項１４】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンが、チロシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号６）またはアルギニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号８）からなる、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項１５】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における５３位のグルタミン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列からなる、請求項６に記載のタンパク質。
【請求項１６】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における７７位のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１０）からなる、請求項７に記載のタンパク質。
【請求項１７】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９０位のバリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１２）からなる、請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１８】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９７位のグリシンが、トリプトファンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１４）、またはグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列（配列番号１６）からなる、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１９】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における１１３位のフェニルアラニンがロイシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１８）からなる、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項２０】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における３０６位のプロリンがロイシンに置換されたアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項２１】
配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンがアルギニンに置換され、且つ９０位のバリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号２０）からなる、請求項１４または１７に記載のタンパク質。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のいずれかに記載される塩基配列を含む、請求項２２に記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組換えベクターが導入された細胞またはその処理物。
【請求項２６】
該細胞が、原核細胞である、請求項２５に記載の細胞またはその処理物。
【請求項２７】
該細胞が、大腸菌である、請求項２６に記載の細胞またはその処理物。
【請求項２８】
請求項２５乃至２７に記載の細胞を培養する工程を含む、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項２９】
ケトン化合物に、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項２１乃至２３に記載の細胞もしくはその処理物を作用させる工程を含む、二級アルコールの製造方法。
【請求項３０】
二級アルコールに、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項２５乃至２７に記載の細胞もしくはその処理物を作用させる工程を含む、ケトン化合物の製造方法。
【請求項３１】
ラセミの二級アルコールに、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項２５乃至２７に記載の細胞もしくはその処理物を作用させる工程を含む、光学活性二級アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機溶媒耐性を具備するキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組み換えベクター、該組み換えベクターが導入された細胞若しくはその処理物、及びこれらを利用した二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品や農薬の有効成分となる化合物の製造において有用な多くの酵素は、有機溶媒によって失活を受けやすく、反応効率の低下を招き、反応時間の短縮、生成物の高濃度蓄積など反応効率の向上を図る上で有機溶媒耐性に優れた酵素が切望され、研究開発が行われている（特許文献１〜４）。
【０００３】
そのような酵素の中で、キャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素（配列番号２）を含む二級アルコール脱水素酵素は、基質となる二級アルコールの脱水素化によるケトン化合物の生成及びケトン化合物の水素化による二級アルコール生成を触媒する活性を有し、他の多くの酵素と同様に、医薬品や農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性化合物の製造に利用されている（特許文献５）。
しかし、他の酵素と同様に、これら二級アルコール脱水素酵素も、温度、pH、溶媒の種類、圧力に対する感受性が高く、至適条件と異なる場合には、容易に変性または失活する。特に、疎水性の高い反応基質、生成物あるいはその他添加される有機溶媒によって失活が起こり、反応効率の低下を招くという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２２３７７６号公報
【特許文献２】特開２００６−２２３２４６号公報
【特許文献３】特開２００８−  ２２７０６号公報
【特許文献４】特開２０１０−１６１９４６号公報
【特許文献５】特開平７−２３１７８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みて、有機溶媒に耐性の高い二級アルコール脱水素酵素を提供するとともに、これを利用することにより基質の負荷量や生成物の蓄積量の増大、添加剤としての有機溶媒量の増大を可能とし、反応効率の向上をもたらし、二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールの製造の効率性を増大させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
キャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素は、配列番号２に記載されるとおりの３３６アミノ酸からなる長大な分子であり、それ故、それをコードするＤＮＡは、例えば配列番号１に記載されるとおりの1,011塩基という長大なものである。また、同酵素において酵素活性に寄与する領域やアミノ酸部位はおろか、有機溶媒に対する感受性に関与する領域やアミノ酸部位は何ら明らかにされていない。
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく、キャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素について、無数に考えられる変異体のそれぞれについて精力的に研究を行い、そのような無数の変異体の中から二級アルコール脱水素酵素活性を保持しながら、有機溶媒耐性を具備する複数の変異型タンパク質（変異型酵素）を見出し、本願発明を完成した。
即ち本発明は、具体的には、以下に記載される有機溶媒耐性を具備するキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組み換えベクター、該組み換えベクターが導入された細胞若しくはその処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）、及びこれらを利用した二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールを製造する方法に関する。
【０００８】
[1]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）二級アルコール脱水素酵素活性、および（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比した改善された有機溶媒耐性、を有するタンパク質。
[2]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する、前記[1]に記載のタンパク質。
[3]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる、前記[1]または[2]に記載のタンパク質。
[4]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[3]に記載のタンパク質。
[5]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[3]に記載のタンパク質。
[6]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における５３位のグルタミン酸が置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における５３位のグルタミン酸が置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[3]に記載のタンパク質。
[7]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における７７位のアスパラギン酸が置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における７７位のアスパラギン酸が置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[3]に記載のタンパク質。
[8]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９０位のバリンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９０位のバリンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[3]に記載のタンパク質。
[9]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９７位のグリシンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９７位のグリシンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[3]に記載のタンパク質。
[10]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における１１３位のフェニルアラニンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における１１３位のフェニルアラニンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[9]に記載のタンパク質。
[11]  （ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における３０６位のプロリンが置換されたアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列における３０６位のプロリンが置換され、且つ配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、および１１３位のフェニルアラニンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、
からなる、前記[3]に記載のタンパク質。
[12]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンおよび９０位のバリンが置換されたアミノ酸配列からなる、前記[5]または[8]に記載のタンパク質。
[13]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号４）からなる、前記[4]に記載のタンパク質。
[14]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンが、チロシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号６）またはアルギニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号８）からなる、前記[5]に記載のタンパク質。
[15]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における５３位のグルタミン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列からなる、前記[6]に記載のタンパク質。
[16]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における７７位のアスパラギン酸がグリシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１０）からなる、前記[7]に記載のタンパク質。
[17]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９０位のバリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１２）からなる、前記[8]に記載のタンパク質。
[18]   配列番号２に記載されるアミノ酸配列における９７位のグリシンが、トリプトファンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１４）、またはグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列（配列番号１６）からなる、前記[9]に記載のタンパク質。
[19]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における１１３位のフェニルアラニンがロイシンに置換されたアミノ酸配列（配列番号１８）からなる、前記[10]に記載のタンパク質。
[20]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における３０６位のプロリンがロイシンに置換されたアミノ酸配列からなる、前記[11]に記載のタンパク質。
[21]  配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４９位のヒスチジンがアルギニンに置換され、且つ９０位のバリンがアラニンに置換されたアミノ酸配列（配列番号２０）からなる、前記[14]または[17]に記載のタンパク質。
[22]  前記[1]乃至[21]のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
[23]  配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９のいずれかに記載される塩基配列を含む、請求項２２に記載のＤＮＡ。
[24]  前記[22]または[23]に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
[25]  前記[24]に記載の組換えベクターが導入された細胞またはその処理物。
[26]  該細胞が、原核細胞である、前記[25]に記載の細胞またはその処理物。
[27]  該細胞が、大腸菌である、前記[26]に記載の細胞またはその処理物。
[28]  前記[25]乃至[27]に記載の細胞を培養する工程を含む、前記[1]乃至[21]のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
[29]  ケトン化合物に、請求項１乃至２１のいずれかに記載のタンパク質または前記[21]乃至[23]に記載の細胞もしくはその処理物を作用させる工程を含む、二級アルコールの製造方法。
[30]  二級アルコールに、前記[1]乃至[21]のいずれかに記載のタンパク質または前記[25]乃至[27]に記載の細胞もしくはその処理物を作用させる工程を含む、ケトン化合物の製造方法。
[31]  ラセミの二級アルコールに、前記[1]乃至[21]のいずれかに記載のタンパク質または前記[25]乃至[27]に記載の細胞もしくはその処理物を作用させる工程を含む、光学活性二級アルコールの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
二級アルコール脱水素酵素を用いた二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールの製造において、本発明の二級アルコール脱水素酵素の各種変異型タンパク質（変異型酵素）は、二級アルコール脱水素酵素を保持する一方で、高い有機溶媒耐性を有することから、これを利用することにより酵素反応における基質の負荷量や生成物の蓄積量の増大を許容し、また添加剤としての有機溶媒量の増大をも可能となることから、反応効率の向上をもたらされ、二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールの効率良い製造が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、有機溶媒耐性を有するキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組み換えベクター、該組み換えベクターが導入された細胞若しくはその処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）、及びこれらを利用した二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールを製造する方法を提供する。
本発明におけるキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、例えば、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされる。
【００１１】
本発明におけるキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ（ａ）二級アルコール脱水素酵素活性、および（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比した改善された有機溶媒耐性、を有するタンパク質である。
本願発明において「配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸」とは、配列番号２に記載されるアミノ酸配列における１乃至６個の任意のアミノ酸であり、好ましくは１乃至５個のアミノ酸であり、より好ましくは１乃至４個のアミノ酸であり、さらに好ましくは１乃至３個のアミノ酸であり、特に好ましくは１または２個のアミノ酸である。
【００１２】
本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）はまた、配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有し、かつ（ａ）二級アルコール脱水素酵素活性、および（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比した改善された有機溶媒耐性、を有するタンパク質である。
【００１３】
本発明において「配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性」とは、好ましくは「配列番号２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性」を意味する。
本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）は、より具体的には、配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンからなる群から選ばれる１または複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１４】
ここで、アミノ酸の「置換」とは、天然アミノ酸、即ち、アラニン（Ala; A）、アルギニン（Arg; R）、アスパラギン（Asn; N）、アスパラギン酸（Asp; D）、システイン（Cys; C）、グルタミン（Gln; Q）、グルタミン酸（Glu; E）、グリシン（Gly; G）、ヒスチジン（His; H）、イソロイシン（Ile; I）、ロイシン（Leu; L）、リジン（Lys; K）、メチオニン（Met; M）、フェニルアラニン（Phe; F）、プロリン（Pro; P）、セリン（Ser; S）、トレオニン（Thr; T）、トリプトファン（Trp; W）、チロシン（Tyr; Y）、またはバリン（Val; V）の任意のアミノ酸への置換であってもよく、さらには、非天然アミノ酸、または各種の修飾されたアミノ酸であってもよい。
【００１５】
また、当該変異型タンパク質（変異型酵素）が、１または複数のアミノ酸の置換に加え、他の位置にアミノ酸の欠失、付加および／または挿入の変異を伴う場合には、当該置換されるアミノ酸の位置は、それらアミノ酸の欠失、付加および／または挿入の後のアミノ酸配列における、配列番号２に記載されるアミノ酸配列における４１位のバリン、４９位のヒスチジン、５３位のグルタミン酸、７７位のアスパラギン酸、９０位のバリン、９７位のグリシン、１１３位のフェニルアラニン、および３０６位のプロリンにそれぞれ対応するアミノ酸の位置である。
【００１６】
本発明において「二級アルコール脱水素酵素活性」とは、（１）二級アルコール化合物を酸化してケトン化合物を生成させる活性、（２）ケトン化合物を還元して二級アルコール化合物を生成させる活性、または（３）ラセミの二級アルコールのうちの一方のエナンチオマーを酸化することにより光学活性な二級アルコールを生成させる活性、を意味する。また、本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）が有する「二級アルコール脱水素酵素活性」は、これら（１）乃至（３）のいずれか１つの活性を有していればよく、また野生型タンパク質の当該活性との比較において同等以上（即ち、野生型タンパク質の活性との相対において、比活性が1.0以上）である必要はなく、1.0未満であってもよい。
本発明においては、この活性は、タンパク質（酵素）を発現する細胞、その処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）または該タンパク質の粗精製物若しくは精製物のいずれかの形態において発揮、検出され得る活性を意味する。
【００１７】
本発明において「配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比した改善された有機溶媒耐性」とは、任意の有機溶媒存在下において、酵素活性（前記の二級アルコール脱水素酵素活性）の半減期が、野生型酵素と比較して、少なくとも５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上の延長されていることを意味する。
本発明においては、この活性は、タンパク質（酵素）を発現する細胞、その処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）または該タンパク質の粗精製物若しくは精製物のいずれかの形態において発揮、検出され得る活性を意味する。
【００１８】
またここで「有機溶媒存在下」とは、水性溶媒に対して、１種または複数種の有機溶媒が１０％ V/V以上、たとえば２０〜９０％V/V、具体的には３０〜７０％V/V、より具体的には４０〜６０％V/Vの有機溶媒が存在することを言う。
本発明における「有機溶媒」としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール（イソプロピルアルコール）等のアルコール類、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸プロピル等の酢酸エステル類、アセト酢酸エチル、アセト酢酸メチル等のアセト酢酸エステル類、４−クロロアセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢酸メチル等の４−ハロ−３−オキソ酪酸エステル類等を挙げることができるが、これらの有機溶媒に限定されない。
【００１９】
本発明における「二級アルコール脱水素酵素活性」は、当業者によって一般的に行われる方法によって測定することができる。例えば、以下の方法を例示することができる。
Tris-HCl緩衝液（pH 9.0、100mM）、NAD+ （0.5〜5mM）、イソプロパノール（IPA；2.5〜3％、100〜650mM）および酵素（酵素を発現する大腸菌の菌体、菌体処理物、粗精製酵素または精製酵素）を含む反応液中で、室温（例えば25℃）で約6〜8時間反応させ、NADHの増加にともなう340nmの吸光度の増加を測定する。１Ｕは、1分間に１molのNADHの増加を触媒する酵素量とする。
また、タンパク質の定量は、例えばバイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行うことができる。
【００２０】
本発明における変異型タンパク質（変異型酵素）の「有機溶媒耐性活性」は、それぞれの変異型酵素についての有機溶媒存在下における一定時間の酵素反応後の酵素活性（残存活性）を、野生型酵素についての残存活性との対比において測定できる。例えば以下の方法が挙げられる。
各変異型酵素（酵素を発現する大腸菌の菌体、菌体処理物、粗精製酵素または精製酵素）を含む培養液に100μlのイソプロパノール（IPA）を添加し、室温（例えば25℃）で24時間振盪し反応させる。反応液（5μl）を、200μlの反応用緩衝液（Tris-HCl緩衝液（pH 9.0、100mM）、NAD+ （0.5〜5mM）、イソプロパノール（IPA；2.5〜3％、100〜650mM））に添加し、室温（例えば25℃）で約6〜8時間反応させ、NADHの増加にともなう340nmの吸光度の増加を測定する。
【００２１】
また、本発明における変異型タンパク質（変異型酵素）の有機溶媒中での活性半減期は、上記の酵素の有機溶媒耐性活性の測定方法において、酵素を含む培養液と当量のイソプロパノール（IPA）を添加し、振盪処理開始後、経時的（例えば、２、３、４、７および２４時間後）にサンプリングを行い、上記の方法で酵素活性（残存活性）を測定し、有機溶媒存在下での反応時間および得られた残存活性についての値に基づき、以下の関係式を用いて算出することができる。
【００２２】
各パラメータを次のように定義する。但し、野生型酵素と変異型酵素で有機溶媒未処理の活性は同等と仮定する。
Ａ０：  有機溶媒未処理の野生型酵素及び変異型酵素の活性
ｔ：  任意の有機溶媒での処理時間
Ａ１：  任意の有機溶媒でtだけ処理した際の野生型酵素の活性
Ａ２：  任意の有機溶媒でtだけ処理した際の変異型酵素の活性
Ｔ１：  任意の有機溶媒存在下での野生型酵素の半減期
Ｔ２：  任意の有機溶媒存在下での変異型酵素の半減期
上記の定義より、以下の関係式が導出される。
Ａ１＝２（−ｔ／Ｔ１）  ×  Ａ０        （式１）
Ａ２＝２（−ｔ／Ｔ２）  ×  Ａ０        （式２）
上記の式１および式２より、以下の関係式が導出される。
Ｔ２＝（ｔ×Ｔ１）／（ｔ−Ｔ１×ｌｏｇ２（Ａ２／Ａ１））
【００２３】
本発明は、上記のキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）をコードするＤＮＡに関する。
本発明のＤＮＡは、当該変異型タンパク質（変異型酵素）をコードする限り、どのような宿重関係にある塩基配列からなるＤＮＡをも包含する。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡであり、さらに具体的には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に記載される塩基配列を含むＤＮＡ、またはそれと宿重関係にある任意の塩基配列を含むＤＮＡである。
【００２４】
本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）をコードするDNAは、例えば配列番号：１に記載されたキャンディダ  パラプシロシス由来二級アルコール脱水素酵素をコードするDNAの塩基配列中の１または複数の塩基を、ランダムまたは部位特異的に他の塩基に置換することにより変異を導入することによって得ることができる。
具体的な手法としては、例えば、配列番号：１に記載されたキャンディダ  パラプシロシス由来二級アルコール脱水素酵素をコードするDNAを含むプラスミド（例えば、pSF-CPA4；国際出願公開WO2007/142210号公報）を鋳型として、エラープローンＰＣＲ（Journal of Theoretical Biology, Vol.234 (2005) p.497-509；  Methods Mol Biol., Vol.634, 2010, p.103-109;など）を行うことにより、変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。得られた個々の変異ＤＮＡを適切なプラスミドに挿入し、次いで、変異ＤＮＡが挿入されたプラスミドを適切な宿主細胞（好ましくは、大腸菌）にエレクトロポレーション等により導入することにより、変異型タンパク質（変異型酵素）をコードするＤＮＡを有し、該変異型酵素を産生する組み換え細胞（例えば、組み換え大腸菌）を得、様々な変異型タンパク質（変異型酵素）を産生する組み換え細胞のライブラリーを得ることができる。
また、このエラープローンＰＣＲにおいては、添加する硫酸マンガンの量を調節することにより変異導入率を制御することが可能である。
【００２５】
本発明はまた、上記の本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）をコードするDNAを含む組換えベクターを提供し、本発明の組換えベクターは、上記に例示したような方法で作製した変異型タンパク質をコードするＤＮＡを所望のベクターに挿入することにより作製することができる。
上記のとおり、これら本発明の組換えベクターを適切な宿主細胞（好ましくは、微生物や大腸菌等の細菌）にエレクトロポレーション等により導入することにより、変異型タンパク質（変異型酵素）をコードするＤＮＡを有し、該変異型酵素を産生する本発明の組換え細胞（例えば、組み換え大腸菌）を得ることができる。
そして、これら本発明の組換え細胞を適切な条件下で培養することにより、本発明の二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）を得ることができる。
また、これら本発明の組換え細胞を適切な条件下で処理することにより、本発明の細胞の処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）を得ることができる。
【００２６】
上記の本発明における組換え細胞の作製に利用可能な宿主細胞は、特に限定されないが、微生物や細菌を好適な例として挙げることができる。もちろん植物細胞および動物細胞であっても好適に利用することができる。
微生物や細菌としては、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属等の細菌；  また、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属等の放線菌；  サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属等の酵母；  ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属の等のカビを挙げることができる。本願発明の宿主には、キャンディダ  パラプシロシス、その突然変異株または変種が包含される。
好ましくは、エシェリヒア(Escherichia)属の細菌、即ち大腸菌を挙げることができる。大腸菌としては、特に限定されないが、例えば、JM109、HB101等を挙げることができる。
【００２７】
上述した本発明における組換えベクターに利用できるベクターとしては、上記の様々の宿主細胞において本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）をコードするDNAの発現を可能とする任意のベクターが包含される。好適な一例としては、上記の各種の細菌または微生物を宿主における組換えDNAの発現に適した各種のプラスミドベクターを挙げることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、pBR、pUC系プラスミドが挙げられる。また、該ベクターには、lac(β-ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、PR等に由来するプロモーターが利用可能である。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターを挙げることができる。
さらに具体的な一例としては、市販のpSE420（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したpSE420D（特開2000-189170）やpSE420U（国際出願公開WO2006/132145）を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明には、キャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素（配列番号２）の種々の変異体を産生する自然発生的なキャンディダ  パラプシロシスの突然変異株、変種も包含される。
【００２９】
また本発明は、有機溶媒耐性を具備するキャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素の変異型タンパク質（変異型酵素）、該変異型タンパク質（変異酵素）を産生する細胞またはその処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）を用いた、二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールを製造する方法を提供する。
本発明によるケトンの製造の原料となる二級アルコール（基質化合物）としては、キャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素（配列番号２）が作用し得るものであれば特に制限はないが、例えば、以下のような一般式で示される化合物を意味する。
Ｒ１−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ２
Ｒ１：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−Ｃ６の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
Ｒ２：Ｈもしくは、ハロゲンによる置換を含むＣ１−Ｃ２のアルキル基。
または、例えば以下のような一般式で示される化合物を意味する。
Ｒ３−ＣＨ（ＯＨ）（Ｒ４）−ＣＯＯＲ５。
Ｒ３：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−Ｃ５の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
Ｒ４：Ｈ、ハロゲンもしくはハロゲン置換を含むＣ１−Ｃ２のアルキル基。
Ｒ５：Ｃ１−Ｃ４の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
【００３０】
本発明による脱水素酵素反応においては、酸化的条件下で本発明による二級アルコール脱水素酵素（タンパク質（酵素）を発現する細胞、その処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）または該タンパク質の粗精製物若しくは精製物）を、NAD+またはNADP+、好ましくはNAD+存在下で基質と接触させる。酸化的脱水素反応の場合、例えば、基質である二級アルコールを濃度1〜1,000mM、NAD+を0.001mM〜100mM、好ましくは0.01〜10mMで使用することができる。反応温度は反応が進行する温度であれば特に限定されないが、例えば、4〜60℃、好ましくは25〜55℃（例えば25℃）を挙げることができる。反応pHは5〜10、好ましくは6〜9、より好ましくは約8.5であり得る。酸化的な条件とは、上記pH範囲を与えることによって達成することができる。
【００３１】
また、本発明にかかる二級アルコール脱水素酵素は、ケトンに対する還元活性も有することから、還元的条件下においては酸化反応の逆反応を触媒することができる。従って、ケトンを基質として本発明の変異型酵素（タンパク質（酵素）を発現する細胞、その処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）または該タンパク質の粗精製物若しくは精製物）に作用させ、反応産物である二級アルコールを製造することができる。
本発明による二級アルコールの製造の原料となるケトン（基質化合物）としては、キャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素（配列番号２）が作用し得るものであれば特に制限はないが、例えば、以下のような一般式で示される化合物を意味する。
Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２
Ｒ１：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−Ｃ６の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
Ｒ２：Ｈもしくは、ハロゲンによる置換を含むＣ１−Ｃ２のアルキル基。
または、例えば以下のような一般式で示される化合物を意味する。
Ｒ３−ＣＯ−ＣＨＲ４−ＣＯＯＲ５
Ｒ３：ハロゲンまたは芳香族による置換を含む、Ｃ１−Ｃ５の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
Ｒ４：Ｈ、ハロゲンもしくはハロゲン置換を含むＣ１−Ｃ２のアルキル基。
Ｒ５：Ｃ１−Ｃ４の直鎖、あるいは分岐鎖アルキル基。
【００３２】
二級アルコールの製造においては、基質であるケトンを濃度1〜1,000mM、NADHまたはNADPH、好ましくはNADHを0.001mM〜100mM、好ましくは、0.01〜10mMで使用することができる。これらの基質や補酵素は、反応媒体中で必ずしも完全に溶解しなくてもよい。反応温度は反応が進行する温度であれば限定されないが、例えば、4〜60℃、好ましくは25〜55℃（例えば25℃）を挙げることができる。反応pHは5〜10、好ましくは6〜9である。還元的な条件とは、上記pH範囲を与えることによって達成することができる。
【００３３】
また、本発明にかかる二級アルコール脱水素酵素は高い立体選択性をし、この選択性を利用して、ラセミ（S体とR体の混合物）の二級アルコールの一方のエナンチオマーのみを酸化させることにより、光学活性な二級アルコールを製造することが可能である。
具体的には、S体とR体とが混在する二級アルコールにラセミ体に、本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）（タンパク質（酵素）を発現する細胞、その処理物（細胞が細菌にあっては菌体破砕物を含む）または該タンパク質の粗精製物若しくは精製物）をNAD+またはNADP+、好ましくはNAD+共存下で作用させることにより、R体に対してのみ特異的に作用し、酸化することにより、光学活性であるS体を蓄積させ、S体を分離することにより、高純度の光学活性な二級アルコールを得ることができる。
【００３４】
上記の酵素反応においては、基質や出発材料は、様々な形態で接触させることができ、例えば、酵素、基質、ならびに補酵素との接触は、それら全ての混合液中で行ってもよく、あるいは上述した有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ヘキサンなどの有機溶媒中、若しくは、水性媒体との二相系において行うこともできる。緩衝液等の水系にメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性溶媒を加えた混合溶媒系においても行うことが可能である。
また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなり過ぎないように連続的、もしくは間欠的に添加することが望ましい。
また、本発明においては酵素反応は、逆ミセル系での反応も行うことができ、界面活性剤としては、例えばエーロゾルOT（Aerosol OT）を用いたイソオクタン／水逆ミセル系等を挙げることができる。
更に本発明の二級アルコール、ケトン、光学活性二級アルコールの製造方法においては、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明の変異型酵素、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体を固定化する場合には、含硫多糖、例えばκ-カラギーナンやアルギン酸カルシウム、寒天ゲル法、ポリアクリルアミドゲル法等の公知の方法により固定化することができる。
【００３５】
上記の本発明の二級アルコールの製造における酵素反応では、補酵素NADHまたはNADPHの消費に伴って反応環境が次第に酸化的となる。還元的な状態を維持するために、上記反応系にNADHまたはNADPHの再生系を組み合わせることができる。
還元反応に伴って生ずるNAD+またはNADP+の、NADHまたはNADPHへの再生は、微生物の持つNAD+またはNADP+還元能（解糖系など）を用いて行うことができる。即ち、これらNAD+またはNADP+還元能は、反応系にグルコースやエタノール、イソプロパノールを添加することにより増強することが可能である。
また、本発明の変異型二級アルコール脱水素酵素のイソプロパノール（IPA）やエタノールの脱水素活性を利用し、反応系にイソプロパノール（IPA）やエタノールを添加することにより酵素単独でNADHまたはNADPHの再生を行うことも可能である。
さらに、NAD+またはNADP+からNADHまたはNADPHを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。例えば、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素を含む微生物、その処理物、ならびに精製酵素を反応系に共存させることによりNADHまたはNADPHの再生を行うことができる。
【００３６】
上記のNADHまたはNADPH再生のために反応系に添加される化合物、例えば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のイソプロパノール（IPA）やエタノールなどは、基質であるケトンに対してモル比で1〜20、好ましくは1〜5倍過剰に添加することができる。
NADHまたはNADPH再生用の酵素であるグルコース脱水素酵素やギ酸脱水素酵素などは、本発明の変異型タンパク質（変異型酵素）に比較して酵素活性で0.1〜100倍、好ましくは0.5〜20倍程度添加することができる。
【００３７】
逆に、ケトン化合物に対する酸化反応に伴って生じるNADHまたはNADPHのNAD+またはNADP+への再生は、微生物の有するNADHまたはNADPH酸化活性（NADHまたはNADPH脱水素酵素、NADHまたはNADPHオキシダーゼなどの電子伝達系)を利用して行うことができる。
また、本発明の変異型二級アルコール脱水素酵素の持つ還元活性を利用し、反応系にアセトンなどのケトンを添加することにより本酵素単独でNAD+またはNADP+の再生を行うことも可能である。更に、NADHまたはNADPHのNAD+またはNADP+への酸化活性を有する微生物菌体、その破砕物、酵素（ジアホラーゼなど）を反応系に添加することによっても行うことができる。
【００３８】
上記のようにして製造されるケトン、二級アルコールまたは光学活性二級アルコールは、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留、晶析等を適当に組み合わせることにより行うことができる。
例えば、ケトンの精製に際しては、本願発明の変異型タンパク質（変異型酵素）を産生する菌体（大腸菌など）を含む反応液を遠心分離し、菌体を除いた後、限外ろ過によりタンパク質を除去し、得られたろ液に酢酸エチル、トルエン等の溶媒を添加してケトンを溶媒層に抽出する。これを相分離後、減圧濃縮することにより純度の高いケトンを精製することができる。
【００３９】
以下、本発明の具体的な態様を、実施例を以って例示的に記載するがこれらに限定されるものではないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００４０】
キャンディダ  パラプシロシス由来の二級アルコール脱水素酵素の各種の変異型酵素のライブラリーの作製
キャンディダ  パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来の二級アルコール脱水素酵素をコードするDNA（配列番号１）を含むプラスミドpSF-CPA4（国際出願公開WO2007/142210号公報）を鋳型として、フォーワードプライマーpSF-CPA4-1523F（5’-CGAATACCTCATCGTGCAGG-3’／配列番号２１）およびリバースプライマーpSF-CPA4-2782R（5’-TACGGCGTTTCACTTCTGAG-3’／配列番号２２）を用いてエラープローンPCRを行った。
PCRは、以下の反応条件で、94℃ 5分での反応を1サイクル、次いで、変性94℃ 30秒、アニーリング60℃ 30秒、及び伸長72℃ 80秒の１セットの反応を30サイクル、次いで、72℃2分の反応を１サイクル行い、反応終了後4℃で保持し、多数の特異的な増幅DNAを得た。
＜PCR条件＞
プラスミド（pSF-CPA4）                    0.5ng
10×PC緩衝液                                5μl
dNTP 混合物                                 5nmol
フォーワードプライマー（pSF-CPA4-1523F）    15pmol
リバースプライマー（pSF-CPA4-2782R）        15pmol
TaKaRa Ex Taqポリメラーゼ（商標）         0.5U
---------------------------------------------------
合計                                        50μl
得られたそれぞれの増幅DNA断片を、HindIII及びXbaIで二重消化した。一方、プラスミドベクターpSE420U（国際出願公開WO2006/132145）を、HindIII及びXbaIで二重消化して線状化し、DNA Ligation Kit（Mighty Mix（商標）；タカラバイオ社製）を用いて、この線状化プラスミドに、前記で得た二重消化したDNA断片のそれぞれを挿入、連結した。
各PCR増幅DNA断片が挿入されたプラスミドのそれぞれにより、大腸菌JM109株を形質転換し、様々な変異型酵素をコードするDNAを保持する組換え大腸菌クローンを得た。これを変異型酵素のライブラリーとして得た。
【実施例２】
【００４１】
有機溶媒耐性変異型酵素のスクリーニングおよび同定
実施例１で作製した多数の変異型酵素をコードするDNAを保持する組換え大腸菌クローンを含むライブラリー中の各クローンを、0.01 mMのIPTG、50μg/mlのアンピシリン、10.0g/LのBacto Tryptone、5.0g/LのBact Yeast Extract、および5.0g/LのNaClを含有し、NaOHでpH7.2に調整した滅菌培地（100μl）に播種し、33℃で24時間振とう培養した。
得られた培養液に100μLのイソプロパノール（IPA）を添加し、25℃で24時間振とう処理した。
得られた処理液5μLを200μLの反応用緩衝液（100mM Tris-HCl(pH9.0)、5mM NAD+、3% IPA）に添加し、室温で6時間程度（対照とする野生型酵素サンプルの吸光度が約0.1になるまで）反応させ、340nmの吸光度を測定し、各変異酵素の残存活性を求め、野生型酵素サンプルの吸光度との対比により各変異型酵素の残存活性を比活性として算出した。
また、各変異型酵素の半減期を算出するため、各変異型酵素発現菌体の培養液と等量のイソプロパノールを添加し、振とう処理開始後2、3、4、7、及び24時間目にサンプリングを行い、上記と同様の方法で残存活性を測定した。
同様にして求めた野生型酵素の半減期と、変異型酵素／野生型酵素の吸光度比から変異型酵素の半減期を算出し、有機溶媒耐性を評価した（表１）。
【実施例３】
【００４２】
有機溶媒耐性変異型酵素の塩基配列解析
実施例２で得られた有機溶媒耐性変異型酵素を産生する大腸菌クローンを、50μg/mLのアンピシリン、10.0g/LのBacto Tryptone、5.0g/LのBact Yeast Extract、および5.0g/LのNaClを含有し、NaOHでpH7.2に調整した滅菌培地に播種し、33℃で16時間振とう培養した後、QIAprep Spin Miniprep Kit（商標；Qiagen社製）を用いて、各クローンからプラスミドDNAを抽出した。
得られたそれぞれのプラスミドの塩基配列の決定し、有機溶媒耐性変異型酵素の変異アミノ酸部位を明らかにした（表１）。
表1に示されるとおり、各変異型酵素は、野生型酵素のアミノ酸配列（配列番号２）において以下のアミノ酸の変異を有していた。
・変異体V41A：  41位のバリンのアラニンに置換
・変異体H49R：  49位のヒスチジンのアルギニンへの置換
・変異体H49Y：  49位のヒスチジンのチロシンへの置換
・変異体D77G：  77位のアスパラギン酸のグリシンへの置換
・変異体V90A：  90位のバリンのアラニンへの置換
・変異体G97E：  97位のグリシンのグルタミン酸への置換
・変異体G97W：  97位のグリシンのトリプトファンへの置換
・変異体F113L：  113位のフェニルアラニンのロイシンへの置換
・変異体H49R/V90A：  49位のヒスチジンのアルギニンへの置換、および90位のバリンのアラニンへの置換
【００４３】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の二級アルコール脱水素酵素の各種変異型タンパク質（変異型酵素）は、二級アルコール脱水素酵素を保持する一方で、高い有機溶媒耐性を有することから、二級アルコール脱水素酵素を用いた二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールの製造において、本発明の変異型酵素を利用することにより酵素反応における基質の負荷量や生成物の蓄積量の増大を許容し、また添加剤としての有機溶媒量の増大をも可能となることから、反応効率の向上をもたらされ、二級アルコール、ケトン若しくは光学活性二級アルコールの効率良い製造が可能となる。
【配列表】
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