(57)【要約】【課題】物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法の提供。【解決手段】物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法であって、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように３ステップ又はそれ以上行うことを含み、前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法であって、
浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように４ステップ又はそれ以上行うことを含み、
前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、
物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法。
【請求項２】
トータルのコーティング層の厚みが４ｎｍを超えるように前記ステップを繰り返す、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記物理的負荷への耐性が向上した細胞が、三次元組織の製造ではない用途に用いるための細胞である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
物理的負荷への耐性が向上した細胞が、物理的負荷による生存率低下が抑制される細胞又は物理的負荷による細胞内容物の漏出が抑制される細胞である、請求項１から３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の製造方法により製造される物理的負荷への耐性が向上した細胞。
【請求項６】
浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように４ステップ又はそれ以上行うことを含み、
前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、
細胞の物理的負荷への耐性を向上する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法、及びそれにより製造される物理的負荷への耐性が向上した細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新たな医療として再生医療が注目され、細胞を三次元組織化するための様々な方法が提案されている（例えば、特許文献１）。一方、組織工学や再生医療の分野では、組織レベルの操作に加えて細胞レベルでの操作が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−２２８９２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞の種類や操作によっては、遠心分離などの物理的負荷により細胞膜が脆弱化して破壊され、細胞の内容物が漏出するダメージをうけたり、細胞が死滅したりするという問題があった。このため、物理的負荷への耐性が向上した細胞が求められている。そこで、本発明は、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一又は複数の実施形態において、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法であって、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように４ステップ又はそれ以上行うことを含み、前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）に関する。
【０００６】
本発明は、一又は複数の実施形態において、本発明の製造方法により製造される物理的負荷への耐性が向上した細胞に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、物理的負荷への耐性が向上した細胞を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、細胞の物理的負荷への耐性が向上するメカニズムの一例を説明するためのスキームである。
【図２】図２は、FN-Gコート細胞及び非コート細胞についての遠心分離処理回数と生存率との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、コーティング層の厚みと生存率との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、FN-Gコート細胞、Col IV-LNコート細胞及び非コート細胞についてのステップ回数と細胞から放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）との関係を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、種々の非コート細胞について遠心分離処理回数と生存率との関係を示すグラフであり、図５Ｂは、FN-Gコート細胞及び非コート細胞についての生存率及び収率を示すグラフである。
【図６】図６Ａは、FN-Gコート細胞、Col IV-LNコート細胞、PDDA-PSSコート細胞及び非コート細胞についての生存率を示すグラフであり、図６Ｂはこれらの細胞の収率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて細胞表面にコーティング層Ａ及びコーティング層Ｂを交互に形成するステップを少なくとも４ステップ行うことにより、細胞の物理的負荷への耐性が向上するとの知見に基く。
【００１０】
本発明により、物理的負荷への耐性が向上された細胞が得られるというメカニズムの詳細については不明であるが以下のように推定される。図１に示すように、表面がコーティングされていない細胞は、遠心分離等の物理的負荷が付与されると、細胞膜が脆弱化して破壊され、例えば、細胞内容物（例えば、乳酸脱水素酵素等）が細胞外に放出（漏出）されたり、細胞が死滅したりする。これに対し、溶液Ａ又は溶液Ｂを交互に接触させるステップを少なくとも４ステップ行って細胞表面にコーティング層Ａ及びコーティング層Ｂを交互に形成することにより、細胞膜の脆弱化が防がれ、細胞の物理的負荷への耐性が向上すると推定される。ただし、これらの推測は本発明を限定するものではない。なお、以下、コーティング層Ａとコーティング層Ｂとを含めて単に「コーティング層」という場合もある。
【００１１】
本明細書において「物理的負荷」とは、機械的ストレス及び/又は力学的刺激であって、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞の成育環境では通常与えられない機械的ストレス及び/又は力学的刺激が挙げられる。物理的負荷としては、限定されない一又は複数の実施形態において、振動、衝撃、応力、及び遠心力等が挙げられる。また、本明細書において「物理的負荷への耐性が向上した細胞」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、本発明の製造方法により形成されるコーティング層を有さない細胞と比較して、同様の物理的負荷を与えた後の細胞の生存率が高い細胞、又は、細胞内容物の漏出が少ない細胞をいう。
【００１２】
本明細書において「浮遊している細胞」とは、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞が基材等やその他の細胞と接着せず、１個１個の細胞が独立して存在していることをいう。本明細書において「浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触」とは、浮遊した状態の細胞を溶液Ａ又は溶液Ｂと接触させることのみならず、溶液Ａ又は溶液Ｂと接触させることにより細胞が浮遊した状態になることを含む。本明細書において「細胞をコーティングするコーティング層Ａ（又はＢ）を形成する」とは、細胞表面に溶液Ａ（又は溶液Ｂ）の含有物が吸着し、被膜状の構造を形成することを含む。
【００１３】
［物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法］
本発明は、一又は複数の実施形態において、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法であって、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように４ステップ又はそれ以上行うことを含む、物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法に関する。
【００１４】
本発明の製造方法は、コーティング層Ａを形成するステップとコーティング層Ｂを形成するステップとを交互に行い、それらのステップの合計（「コーティング層Ａを形成するステップの回数」と「コーティング層Ｂを形成するステップの回数」との合計）が４ステップ以上となるように細胞を溶液Ａ又は溶液Ｂに交互に接触させる。
【００１５】
本発明の製造方法において、溶液Ａの含有物と溶液Ｂの含有物との組み合わせは、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「ＲＧＤ配列を有する物質」ともいう）と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子（以下、「相互作用を有する物質」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「正の電荷を有する物質」ともいう）と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「負の電荷を有する物質」ともいう）との組み合わせである。
【００１６】
（ＲＧＤ配列を有する物質）
ＲＧＤ配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００１７】
ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、例えば、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。
【００１８】
ＲＧＤ配列を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
【００１９】
ＲＧＤ配列を有する物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。
【００２０】
（相互作用する物質）
相互作用する物質とは、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等により、化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
【００２１】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、例えば、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール−グラフト−ポリアクリル酸、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
【００２２】
相互作用する物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。
【００２３】
ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子またはタンパク質であればよい。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせとしては、例えば、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、ＲＧＤ配列を有する物質及び相互作用を有する物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００２４】
（正の電荷を有する物質）
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００２５】
（負の電荷を有する物質）
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
【００２６】
正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせとしては、例えば、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。ポリスルホン酸塩としては、例えば、ポリスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する物質及び負の電荷を有する物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
【００２７】
以下に、細胞を、ＲＧＤ配列を有する物質を含有する溶液Ａと接触させた後、ＲＧＤ配列を有する物質に相互作用を有する物質を含有する溶液Ｂと接触させ、この順序でこれらを交互に接触させ、最後に溶液Ａと接触させる方法を例にとり、本発明の製造方法の一例を説明する。
【００２８】
細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、例えば、培養細胞が挙げられる。培養細胞は、ヒト細胞又はヒト以外の細胞であって、例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、例えば、物理的耐性の低い細胞であり、肝ガン細胞が挙げられる。肝ガン細胞としては、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、及びＨｕｈ−７細胞等が挙げられ、中でも、物理的耐性が低く、本発明による効果が得られやすい点から、ＨｅｐＧ２細胞が好ましい。細胞はヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の由来の細胞であってもよい。
【００２９】
まず、細胞を溶液Ａと接触させる。これにより細胞表面に細胞をコーティングするコーティング層Ａが形成される。細胞と溶液Ａとの接触は、例えば、細胞を溶液Ａに浸漬すること、細胞に溶液Ａを塗布、滴下又は噴霧すること等により行うことができる。中でも、操作が容易であるという理由から溶液Ａに細胞を浸漬させることにより、細胞と溶液Ａとの接触を行うことが好ましい。
【００３０】
接触条件は、例えば、接触方法、溶液Ａに含まれる含有物及び又は細胞の種類、及び含有液の濃度等に応じて適宜決定できる。接触時間は、例えば、３０秒〜２４時間であり、好ましくは１分〜６０分、より好ましくは１分〜１５分、さらに好ましくは１分〜１０分、さらにより好ましくは１分〜５分である。接触時の雰囲気温度及び又は含有液の温度は、例えば、４〜６０℃であり、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。
【００３１】
溶液Ａは、ＲＧＤ配列を有する物質と、溶媒又は分散媒体（以下、「溶媒等」ともいう）とを含む。溶液ＡにおけるＲＧＤ配列を有する物質の含有量は、例えば、０．０００１〜１質量％が好ましく、より好ましくは０．０１〜０．５質量％、さらに好ましくは０．０２〜０．１質量％である。溶媒としては、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Tris-HCl緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Britton-Robinson緩衝液、又はGTA緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、例えば、３〜１１であり、好ましくは６〜８、より好ましくは７．２〜７．４である。
【００３２】
溶液Ａは、さらに、必要に応じて、例えば、塩、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド、又は医薬組成物等を含有してもよい。医薬組成物としては、例えば、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、又は抗炎症剤等が挙げられる。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等が挙げられる。塩は、一種類でもよいし二種類以上含有していてもよい。溶液Ａの含有液中の塩濃度は、特に制限されないが、例えば、１×１０-6Ｍ〜２Ｍであり、好ましくは１×１０-4Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは１×１０-4Ｍ〜０．０５Ｍである。
【００３３】
ついで、コーティング層Ａの形成に使用されなかった物質を除去する。除去は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による除去は、例えば、溶液Ａに細胞を分散させた状態で遠心分離し、ついで上澄みを除去することにより行うことができる。遠心分離条件は、細胞の種類、細胞の濃度、及び溶液Ａに含まれる含有物の組成によって適宜決定できる。
【００３４】
上記物質の除去に加えて、洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による洗浄は、例えば、上澄みを除去された細胞に溶媒を添加し、遠心分離及び上澄みの除去をすることにより行うことができる。洗浄に用いる溶媒は、溶液Ａの溶媒と同じであることが好ましい。
【００３５】
ついで、コーティング層Ａが形成された細胞を溶液Ｂに接触させる。接触後、好ましくは、コーティング層Ｂの形成に用いられなかった物質の除去操作、及び洗浄操作を行う。これにより、コーティング層Ａの表面にコーティング層Ｂが形成される。細胞と溶液Ｂとの接触は、ＲＧＤ配列を有する物質に代えて相互作用する物質を使用する以外は、溶液Ａとの接触と同様に行うことができる。
【００３６】
そして、上記と同様にして、コーティング層Ａ及びＢがそれぞれ形成された細胞と、溶液Ａとの接触、その後のコーティング層Ａの形成に用いられなかった物質の除去、及び洗浄操作、並びに溶液Ｂとの接触、その後の除去操作及び洗浄操作を順次行う。これにより、コーティング層Ａとコーティング層Ｂとが交互に形成された細胞が得られる。
【００３７】
コーティング層Ａ及びＢの形成は、トータルのステップ回数が４ステップ以上行えばよく、好ましくはトータルのコーティング層の厚みが４ｎｍを超えるように前記ステップを繰り返すことであり、より好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは６ｎｍ以上、さらに好ましくは８ｎｍ以上である。上限は特に制限されないが、例えば、１０００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下、より好ましくは３０ｎｍ以下である。コーティング層Ａ及びＢのトータルの層数は、例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層であってもよい。なお、コーティング層の厚みは、実施例に基きQCM測定法により求めることができる。
【００３８】
このようにして得られた細胞は、優れた物理的耐性を示す。よって、本発明の製造方法により得られた細胞は、例えば、組織工学や再生医療の分野のみならず、細胞の保存及び又は輸送等においても有用である。物理的負荷への耐性が向上した細胞は、三次元組織の製造ではない用途に用いるための細胞であってもよい。また、物理的負荷への耐性が向上した細胞は、物理的負荷による生存率低下が抑制される細胞又は物理的負荷による細胞内容物の漏出が抑制される細胞であってもよい。
【００３９】
本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞は、上記の通り、優れた物理的耐性を示す。このため、本発明は、一又は複数の実施形態において、細胞の輸送及び/又は保存のために、本発明の製造方法により物理的負荷への耐性が向上した細胞を製造する方法に関する。
【００４０】
［物理的負荷への耐性が向上した細胞］
本発明は、一又は複数の実施形態において、本発明の製造方法により製造される物理的負荷への耐性が向上した細胞（以下、「本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞」ともいう）に関する。本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞は、細胞表面にコーティング層が形成されていることから、例えば、細胞膜の脆弱化が抑制され、遠心分離等の細胞の物理的負荷に対して優れた耐性を示すという効果を好ましくは奏する。
【００４１】
本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞は、細胞と、細胞表面に形成されたコーティング層Ａとコーティング層Ｂとを含む。コーティング層Ａとコーティング層Ｂとは交互に形成されており、コーティング層のトータルの厚みは、４ｎｍを超えることが好ましい。隣接するコーティング層Ａとコーティング層Ｂとは互いに接するように形成されていることが好ましい。
【００４２】
本発明は、一又は複数の実施形態において、細胞と、前記細胞表面に形成されたコーティング層とを含み、コーティング層の厚みが４ｎｍを超える、物理的負荷への耐性が向上した細胞に関する。コーティング層は、コーティング層Ａとコーティング層Ｂとを含み、前記コーティング層Ａとコーティング層Ｂとは交互に形成されており、コーティング層Ａの成分とコーティング層Ｂとの組み合わせは、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである。本実施形態における細胞は、本発明の製造方法により製造することができる。
【００４３】
［細胞の物理的負荷の耐性を向上させる方法］
本発明は、一又は複数の実施形態において、浮遊している細胞に溶液Ａ又は溶液Ｂを接触させて前記細胞をコーティングするコーティング層Ａ又はコーティング層Ｂを形成するステップを、コーティング層ＡとＢとが交互に形成されるように３ステップ又はそれ以上行うことを含み、前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせである、細胞の物理的負荷への耐性を向上させる方法（以下、「本発明の耐性向上方法」ともいう。）に関する。本発明の耐性向上方法は、本発明の製造方法と同様に行うことができる。
【００４４】
［キット］
本発明は、一又は複数の実施形態において、本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法に使用するキットであって、コーティング層Ａを形成するための溶液Ａと、コーティング層Ｂを形成するための溶液Ｂとを含み、前記溶液Ａの含有物と前記溶液Ｂの含有物との組み合わせが、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子との組み合わせであるキットに関する。本発明のキットによれば、本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造を行うことができ、また、本発明の物理的負荷への耐性が向上した細胞を容易に得ることができる。
【００４５】
本発明のキットは、一又は複数の実施形態において、さらに、本発明の製造方法が記載された説明書を含むキットに関する。なお、本発明のキットは、説明書が本発明のキットの同梱されることなくウェブ上で提供される場合も含みうる。
【００４６】
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。
【実施例】
【００４７】
［コーティング層の厚み］
細胞表面に形成されたコーティング層の厚みは、別途、基材上にコーティング層の形成を行い、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定法を用い、行った処理（ステップ）数と形成される厚みとを測定し、その結果から細胞表面へのコーティング層形成時に行ったステップの回数に応じて算出した。QCM測定法を用いた測定は以下のように行った。QCM水晶センサをピランハ溶液で１分間洗浄してから、0.2 mg/mlフィブロネクチン（以下、「FN」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ１）。ついで0.2 mg/mlゼラチン（以下、「Ｇ」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ２）。このステップ１及び２を交互に繰り返すことによりQCM水晶センサにコーティング層を形成すると共に、振動数シフトの測定を行った。得られた振動数シフトに基づき、ステップの回数とそれにより形成されるコーティング層の厚みとを得た。
【００４８】
（実施例１）
［細胞へのコーティング層の形成］
HepG2細胞をプラスチックシャーレ上からトリプシン処理によって回収した。回収した細胞を1×107cell/mlの濃度で0.2mg/mlのフィブロネクチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（FN浸漬操作）。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（洗浄操作）。上澄みを除き、0.2mg/mlのゼラチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い（G浸漬操作）、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、Ｇ浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びＧ浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで１ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによってFN-Gコート細胞を準備した（コーティング層の厚み：8nm）。
【００４９】
［ストレス耐性試験］
FN-Gコート細胞を1×107cell/mlの濃度で50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500 rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った。上澄みを除き、新しい50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させた。この遠心分離を１、２、３、４、６、８又は１０回行い、細胞の生存率を測定することによって、細胞のストレス耐性を評価した。生存率は、遠心分離処理後の細胞をトリパンブルー染色し、血球計算盤を用いた目視計測またはセルカウンターを用いて測定し、測定された全細胞数に占める生細胞の数によって算出した。その結果を図２に示す。
【００５０】
（比較例１）
コーティング層を形成していないHepG2細胞（以下、「非コート細胞」という）を用いた以外は、実施例１と同様にストレス耐性試験を行った。その結果を図２に示す。
【００５１】
図２は、遠心分離処理の回数と細胞の生存率との関係を示すグラフであって、図２においてマーカーが丸であるグラフが実施例１の結果を示し、三角であるグラフが比較例１の結果を示す。図２に示すように、FN-Gコート細胞は、遠心分離処理を２回以上行った場合、非コート細胞と比較して生存率が高かった。よって、実施例１のFN-Gコート細胞は、物理的負荷への耐性が向上したことが確認できた。
【００５２】
（実施例２）
実施例１と同様の手順で、FN浸漬操作及びＧ浸漬操作をそれぞれ１、２又は４回行った後、FN浸漬操作を１回行うことにより、３種類のFN-Gコート細胞を製造した。得られたFN-Gコート細胞のコーティング層の厚みは、トータル３ステップであるFN-Gコート細胞は4nm、トータル５ステップであるFN-Gコート細胞は5nm、トータル９ステップであるFN-Gコート細胞は7nmであった。これらのFN-Gコート細胞と、比較例１と同様の非コート細胞とを用いて、実施例１と同様の条件で遠心分離処理を数回行い、生存率を測定した。その結果を図３に示す。図３に示すように、コーティング層の厚みが４ｎｍを越えると生存率が向上し、５ｎｍ以上になるとほぼ100%の生存率を示した。よって、コーティング層の厚みが４ｎｍを超えると、細胞のストレス耐性が大幅に向上することが確認できた。
【００５３】
（実施例３）
HepG2細胞にFN-Gコート又はCol IV-LNコートを行った場合、あるいは細胞にコートをしない場合について、細胞から放出される乳酸脱水素酵素（LDH）の量をLDH活性により求めた。その結果を図４に示す。なお、FN-Gコート細胞（HepG2細胞にFN-Gコートした細胞）は、実施例１と同様の手順で、FN浸漬操作を１回行うことにより製造したもの（FNコート細胞）、あるいはFN浸漬操作とG浸漬操作をそれぞれ１又は２回行った後、FN浸漬操作を１回行うことにより製造したものの合計３種類のFN-Gコート細胞（又はFNコート細胞）を用いた。Col IV-LNコート細胞は、フィブロネクチンに代えてコラーゲン、ゼラチンに代えてラミニンを使用した以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した。非コート細胞は、FNを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液及びGを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に代えて50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を用いた以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性は、LDH Cytotoxicity Assay kit（Cayman chemical社）により求めた。
【００５４】
図４に示すように、コート細胞は、非コート細胞と比較して細胞外に放出されるLDHの量が少なかった。よって、細胞表面にコーティング層を形成することによって、細胞膜の緩みを抑制できることが確認できた。
【００５５】
（実施例４）
まず、コーティング層が形成されていない細胞を用いて、実施例１と同様にして遠心分離処理を１、２、４、６、１０、又は１８回行い、生存率を測定した。細胞は、HepG2、Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MIA PaCa-2、BxPC-3及びHT-29を用いた。その結果を図５Ａに示す。図５Ａは、遠心分離処理の回数と細胞の生存率との関係を示すグラフである。図５Ａに示すように、遠心分離処理を２回以上行った場合、HepG2細胞の生存率が下がり、遠心分離処理の回数が増えるとともに生存率は減少した。また、遠心分離処理を１０回以上行った場合、Huh-7細胞の生存率が下がった。
【００５６】
つぎに、Huh-7細胞を用いた以外は、実施例１と同様にFN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことにより、FN-Gコート細胞を製造し、その生存率及び収率を測定した。また、比較例として、FNを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液及びGを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に代えて50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を用いた以外は、実施例１と同様の浸漬操作・遠心分離処理を行うことにより、非コート細胞を準備し、その生存率及び収率を測定した。なお、生存率は、測定された全細胞数に占める生細胞数の割合により求めた。収率は、スタート時の細胞数に対する浸漬・遠心分離処理後の全細胞数の割合により求めた。
【００５７】
その結果を図５Ｂに示す。図５ＢはFN-GコートしたHuh-7細胞及び非コートのHuh-7細胞の生存率と細胞収率とを示すグラフである。図５Ｂに示すように、FN-GコートしたHuh-7細胞は、非コート細胞と比較して生存率及び収率が向上した。よって、Huh-7細胞でも細胞のストレス耐性が向上することが確認できた。
【００５８】
（実施例５）
FN-Gコート細胞、Col IV-LNコート細胞、PDDA−PSSコート細胞、及び非コート細胞を用いて細胞の生存率及び収率を測定した。生存率及び収率は、実施例４と同様の方法により求めた。なお、Col IV-LNコート細胞は、FNに代えてコラーゲン、Gに代えてラミニンを使用した以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した（コーティング層の厚み：９ｎｍ）。PDDA−PSSコート細胞は、FNに代えてPDDA、Gに代えてPSSを使用した以外は、FN-Gコート細胞と同様にして製造した（コーティング層の厚み：１４ｎｍ）。非コート細胞は、HepG2細胞を用いた以外は、実施例４と同様にした。その結果を図６に示す。図６Ａは各細胞の生存率を示すグラフであって、図６Ｂはトータルの細胞収率を示すグラフであり、図６Bにおいて白い部分が生存する細胞、黒い部分が死滅した細胞を示す。図６Ａ及びＢに示すように、コート細胞は、コーティング層の組成にかかわらず、いずれも非コート細胞よりも生存率及び収率が高かった。よって、コーティング層の組成にかかわらず細胞の物理的負荷耐性が向上することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
このため、本発明は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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