(57)【要約】      （修正有）【課題】既存の医薬とは異なる分子を標的とする新規な作用機序を持った、インフルエンザの予防又は治療薬を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む、１２アミノ酸程度のペプチドであって、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンと結合可能なペプチド。また、候補ペプチドから、抗インフルエンザ薬を選択するスクリーニング方法であって、特定の塩基配列を含む核酸を鋳型として、無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる工程と、該ライブラリーとヘマグルチニンを接触させてインキュベートし、ヘマグルチニン結合ペプチドを選択する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのペプチド：
（ｉ）配列番号：１−２４で表されるアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のペプチドの部分配列を含むペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能なペプチド；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能なペプチド。
【請求項２】
環状化している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
クロロアセチルアミノ酸と、システインを含み、クロロアセチルアミノ酸とシステインとのチオエーテル結合により環状化している、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｎ末端から３アミノ酸以内にクロロアセチルアミノ酸を有し、Ｃ末端から３アミノ酸以内にシステインを有する、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号：２５−４８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、Ｎ末端のクロロアセチル−トリプトファンと、Ｃ末端から２番目のシステインとのチオエーテル結合により環状化している、ペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドを含むインフルエンザの予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項７】
インフルエンザの予防又は治療薬を製造するための、請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドの誘導体の使用。
【請求項８】
候補ペプチドから、インフルエンザの予防又は治療薬を選択するスクリーニング方法であって、
以下の配列を含む核酸を鋳型として無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる工程と、
ＡＴＧ（ＮＮＫ）ｎ（配列番号：４９）
〔式中、ｎは４〜１２の整数を示し、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣに相当し、Ｋは、Ｔ又はＧに相当する。〕；
前記ペプチドライブラリーとヘマグルチニンを接触させてインキュベートし、ヘマグルチニンと結合するペプチドを選択する工程と、
を含む方法。
【請求項９】
前記鋳型として、（ＮＮＫ）ｎの３’末端にＴＧＣを含むものを用い、
前記無細胞翻訳系において、コドンＡＴＧに対応するアミノアシルｔＲＮＡとして、クロロアセチル化アミノ酸を用い、
前記ペプチドライブラリーとヘマグルチニンを接触させてインキュベートする工程に先立って、ペプチドを環状化させる工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか１項に記載のペプチドを含む、インフルエンザウイルス検出薬。
【請求項１１】
請求項１０に記載のインフルエンザ検出薬を含む、インフルエンザウイルス検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗インフルエンザウイルス活性を有するペプチド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
新型インフルエンザウイルスの発生と拡大は歴史的に人類に大きな被害をもたらしており、現在においても高病原性鳥インフルエンザなどはヒトからヒトに感染するウイルスに変異した場合に大きな脅威となることが予想されている。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、エンベロープをもつＲＮＡウイルスであり、核タンパク質（ＮＰ）及びマトリックスタンパク質（Ｍ）の抗原性により、Ａ、Ｂ、Ｃ型に分類される。ヒトでの流行は主にＡ型及びＢ型である。
Ａ、Ｂ、Ｃといった型が同じであっても、エンベロープ表面上の分子であるヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原性の違いから、さらに複数の亜型に分類され、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１等と表される。
【０００４】
既存の抗インフルエンザ薬として、ザナミビル（リレンザ（登録商標））（例えば特許文献１）やオセルタミビル（タミフル（登録商標））（例えば、特許文献２）が広く用いられている。
ザナミビルやオセルタミビルは、インフルエンザウイルスが感染細胞から他の細胞に感染する際に必要となるノイラミニダーゼの活性を抑えることで作用する。さらに他の作用機序を持つ抗インフルエンザ薬としてＭ２蛋白を標的とするアマンタジン、リマンタジンがあり、細胞感染後のウイルスの脱殻を阻害する。
ノイラミニダーゼあるいはＭ２蛋白の機能を阻害するこれらの薬剤は、酵素やイオンチャネルを標的とする他の薬剤と同様に、基質からの誘導体化や立体構造に基づく分子設計、あるいは既存化合物からの機能の発見などの過程を経て開発されている。すなわち生体に存在する分子の類縁体あるいは化学的に調製された低分子に属する。
【０００５】
しかしながら、Ｍ２蛋白阻害薬は、Ａ型インフルエンザにしか有効でなく、ノイラミニダーゼ阻害剤は、ノイラミニダーゼを有しないＣ型インフルエンザには奏功しない。
また、抗ウイルス薬は変異によるウイルスの薬剤耐性の獲得により効力に限界が生じるのが一般的であり、ザナミビル、オセルタミビル、アマンタジンなど投与実績の多い抗インフルエンザウイルス薬においても耐性ウイルスの出現が認められている。ウイルスの薬剤耐性の獲得は標的分子の変異による薬剤の親和性の低下によるものの他に、異なる分子の変異による増殖力の回復という間接的な機構によるものもあり、長期にわたって耐性の獲得を完全に回避できる薬剤を創製することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５３６０８１７号
【特許文献２】米国特許第５７６３４８３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、既存の医薬とは異なる分子を標的とする新規な作用機序を持った抗インフルエンザ薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、インフルエンザウイルスの表面に多数存在し細胞感染に重要な役割を果たしているヘマグルチニンに結合する化合物を多種類選択することが、インフルエンザウイルスに対する阻害作用を示す新規な薬剤の開発に結び付くと考えた。
ヘマグルチニンに結合する化合物を効率的に多種類得るための手段として、無細胞翻訳系で調製したペプチドのライブラリーを母集団とするスクリーニングを実施した。このスクリーニングによりヘマグルチニンに高い親和性を有するペプチドを数十種類得ることに成功した。
得られたペプチドを合成し、インフルエンザウイルス阻害試験により、阻害活性を確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕以下のいずれかのペプチド：
（ｉ）配列番号：１−２４で表されるアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のペプチドの部分配列を含むペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能なペプチド；及び
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能なペプチド；
〔２〕環状化している、上記〔１〕に記載のペプチド；
〔３〕クロロアセチルアミノ酸と、システインを含み、クロロアセチルアミノ酸とシステインとのチオエーテル結合により環状化している、上記〔２〕に記載のペプチド；
〔４〕Ｎ末端から３アミノ酸以内にクロロアセチルアミノ酸を有し、Ｃ末端から３アミノ酸以内にシステインを有する、上記〔３〕に記載のペプチド；
〔５〕配列番号：２５−４８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであって、Ｎ末端のクロロアセチル−トリプトファンと、Ｃ末端から２番目のシステインとのチオエーテル結合により環状化している、ペプチド；
〔６〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドを含むインフルエンザの予防又は治療のための医薬組成物；
〔７〕インフルエンザの予防又は治療薬を製造するための、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドの誘導体の使用；
〔８〕候補ペプチドから、インフルエンザの予防又は治療薬を選択するスクリーニング方法であって、
以下の配列を含む核酸を鋳型として無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる工程と、
ＡＴＧ（ＮＮＫ）ｎ（配列番号：４９）
〔式中、ｎは４〜１２の整数を示し、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣに相当し、Ｋは、Ｔ又はＧに相当する。〕；
前記ペプチドライブラリーとヘマグルチニンを接触させてインキュベートし、ヘマグルチニンと結合するペプチドを選択する工程と、
を含む方法；
〔９〕前記鋳型として、（ＮＮＫ）ｎの３’末端にＴＧＣを含むものを用い、
前記無細胞翻訳系において、コドンＡＴＧに対応するアミノアシルｔＲＮＡとして、クロロアセチル化アミノ酸を用い、
前記ペプチドライブラリーとヘマグルチニンを接触させてインキュベートする工程に先立って、ペプチドを環状化させる工程を含む、上記〔８〕に記載の方法；
〔１０〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載のペプチドを含む、インフルエンザウイルス検出薬；及び
〔１１〕上記〔１０〕に記載のインフルエンザ検出薬を含む、インフルエンザウイルス検出用キット、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のペプチドは、ヘマグルチニンに結合することによりインフルエンザウイルスに対する阻害活性を示すので、ノイラミニダーゼ阻害剤やＭ２蛋白阻害剤に耐性を有するインフルエンザウイルスに対しても抗ウイルス効果を有する。
また、本発明のペプチドを、ノイラミニダーゼやＭ２蛋白等を標的とする薬剤と組み合わせることにより、薬剤耐性変異体が出現する確率をより低くすることができるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、特殊環状ペプチドの選択実験における回収率の変化を示したグラフである。
【図２】図２は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３に対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である。
【図３】図３は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３に対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である。
【図４】図４は、図２及び図３の結果をもとに作成した各ウェルのプラーク数を示すグラフである。
【図５】図５は、図２及び図３の結果をもとに作成した各ウェルのプラーク数を示すグラフである。
【図６】図６は、図２及び図３の結果をもとに作成した各ウェルのプラークの直径を示すグラフである縦軸はｍｍを示す。
【図７】図７は、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１に対する、本発明のペプチドによる増殖阻害試験の結果を示すプレートの写真である。
【図８】図８は、インフルエンザウイルスに対するペプチドの中和活性を確認するため、ペプチドとインフルエンザウイルスを予め混合し、この混合液と細胞を接触させて増殖阻害試験を行った結果を示すプレートの写真である。
【図９】図９は、ペプチドとウイルス液の処理条件を示す。
【図１０】図１０は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３に対する、本発明のペプチドの中和活性を調べた結果を示すプレートの写真である。
【図１１】図１１は、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３に対する、タミフル及びリレンザの中和活性を調べた結果を示すプレートの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（ペプチド）
本発明に係るペプチドの一態様は、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかである。
（ｉ）配列番号：１−２４で表されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｉｉ）前記（ｉ）に記載のペプチドの部分配列を含むペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能なペプチド。
（ｉｉｉ）前記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能。
【００１２】
本明細書においてペプチドは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で結合しているものをいい、例えば、８−２０アミノ酸がペプチド結合したものとすることができる。
本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体、誘導体、アナログを含む。本明細書においてアミノ酸は、天然タンパク性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
【００１３】
本明細書においては、生細胞におけるリボソーム上で翻訳合成に用いられる２０種類の天然型アミノ酸以外のアミノ酸、即ち、以下の（１）〜（３）に該当するアミノ酸を「特殊アミノ酸」と呼ぶ場合がある。
（１）翻訳合成された後に修飾を受けたポリペプチド上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸（例えば、リン酸化チロシン、アセチル化リジン、ファルネシル化システイン）
（２）リボソーム上での翻訳合成には用いられないが天然に存在するアミノ酸
（３）天然に存在しない人工アミノ酸（非天然型アミノ酸）
【００１４】
配列番号：１−２４で表されるアミノ酸を下表に示す。
【表１】
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【００１５】
（ｉ）のペプチドは、配列番号：１−２４で表されるアミノ酸配列のみからなるポリペプチドであってもよく、その少なくとも一端に１以上のアミノ酸が結合しているものであってもよい。（ｉ）のペプチドの全長は、例えば１５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、又は３０アミノ酸以下とすることができる。
【００１６】
（ｉｉ）のペプチドは、（ｉ）に記載のペプチドの部分配列を含むペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能なペプチドである限りどのようなペプチドであってもよく、例えば、（ｉ）のペプチドの連続した６アミノ酸を含み、その少なくとも一端に１以上のアミノ酸が結合したもの；（ｉ）のペプチドの連続した８アミノ酸を含み、その少なくとも一端に１以上のアミノ酸が結合したもの；（ｉ）のペプチドの連続した１０アミノ酸を含み、その少なくとも一端に１以上のアミノ酸が結合したもの等とすることができる。（ｉｉ）のペプチドの全長は、例えば１５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、又は３０アミノ酸以下とすることができる。
【００１７】
（ｉｉｉ）のペプチドは、（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されているペプチドであって、ヘマグルチニンと結合可能である限り、どのようなペプチドであってもよい。ヘマグルチニンと結合可能であるか否かは、当業者が公知の方法に従って確認することができる。
【００１８】
本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、付加、若しくは置換されているペプチド」という場合、欠失等されるアミノ酸の個数は、そのペプチドが、ヘマグルチニンに対する結合能を維持する限り特に限定されないが、例えば、１〜５個、１〜３個、又は１〜２個とすることができる。あるいは全体の長さの１０％以内、又は５％以内としてもよい。欠失、付加、置換される場所は、ペプチドの末端であっても、中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
【００１９】
本発明のペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、その種々の誘導体も包含する。かかる誘導体としては、例えば、そのＣ末端がアミドやエステルになっているもの、投与したときに細胞内に導入されるよう、膜透過性ペプチド（cell-penetrating peptide, ＣＰＰ）と融合させたものが挙げられる。ＣＰＰは、細胞膜への親和性、細胞内への移行性を有するペプチドの総称であり、ＨＩＶ−１ウイルスが発現するTrans-activator of transcription protein（ＴＡＴタンパク質）の１１個のアミノ酸からなるドメインであるprotein-transduction domain（ＰＴＤ）や、ショウジョウバエのAntennapedia、ヘルペスウイルス由来のVP22、オリゴアルギニンなどが知られている。一般に、ＣＰＰはアルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸の含有率が高いものが多い。
また、本発明のペプチドの誘導体としては、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、糖鎖付加などの修飾が加えられたもの、他のペプチドやタンパク質との融合ペプチドも挙げられる。これらの誘導体は、公知の方法又はそれに準ずる方法で当業者が調製することができる。
【００２０】
また、本発明のペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、その塩も包含する。ペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
【００２１】
本明細書において、ヘマグルチニンとは、インフルエンザウイルスをはじめとする多くの細菌やウイルスの表面に存在する抗原性糖タンパク質をいい、「ＨＡ」と表される。ヘマグルチニンは、ウイルスによる宿主細胞への接着過程に関与する。具体的には、ウイルス表面のヘマグルチニンが標的とする宿主細胞表面にあるシアル酸と結合すると、ウイルスは細胞膜に包みこまれ、ウイルスを含むエンドソームの形で細胞内に取り込まれる。続いて、エンドソーム膜とウイルス膜が融合し、ウイルスゲノムが細胞内に挿入され、増殖が開始される。
ヘマグルチニンには、サブタイプが少なくとも１６種類存在し、Ｈ１〜Ｈ１６と呼ばれる。インフルエンザの亜型名のＨはヘマグルチニンを示す。
【００２２】
本発明のペプチドは、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法；遺伝子組み換え法等、公知のペプチドの製造方法によって製造することができる。
【００２３】
固相法は、例えば、水酸基を有するレジンの水酸基と、α−アミノ基が保護基で保護された第一のアミノ酸（通常、目的とするペプチドのＣ末端アミノ酸）のカルボキシ基をエステル化反応させる。エステル化触媒としては、１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。
次に、第一アミノ酸のα−アミノ基の保護基を脱離させるとともに、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第二のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第一及び第二のアミノ酸を結合させる。さらに、第二のアミノ酸のα−アミノ基を脱保護し、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第三のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第二及び第三のアミノ酸を結合させる。これを繰り返して、目的とする長さのペプチドが合成されたら、すべての官能基を脱保護する。
【００２４】
固相合成のレジンとしては、Merrifield resin、MBHA resin、Cl-Trt resin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino-PEGA resin（メルク社）、HMPA-PEGA resin（メルク社）等が挙げられる。これらのレジンは、溶剤（ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等）で洗浄してから用いることができる。
α−アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ又はＺ）基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等が挙げられる。Ｃｂｚ基はフッ化水素酸、水素化等によって脱保護でき、Ｂｏｃ基はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により脱保護でき、Ｆｍｏｃ基はピペリジンによる処理で脱保護できる。
α−カルボキシ基の保護は、メチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等を用いることができる。
アミノ酸のその他の官能基として、セリンやトレオニンのヒドロキシ基はベンジル基やｔｅｒｔ−ブチル基で保護することができ、チロシンのヒドロキシ基は２−ブロモベンジルオキシカルボニル希やｔｅｒｔ−ブチル基で保護する。リジン側鎖のアミノ基、グルタミン酸やアスパラギン酸のカルボキシ基は、α−アミノ基、α−カルボキシ基と同様に保護することができる。
【００２５】
カルボキシ基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣあるいはＷＳＣ）、（１Ｈ−ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチル］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
【００２６】
レジンからのペプチド鎖の切断は、ＴＦＡ、フッ化水素（ＨＦ）等の酸で処理することによって行うことができる。
【００２７】
遺伝子組み換え法（翻訳合成系）によるペプチドの製造は、本発明のペプチドをコードする核酸を用いて行うことができる。本発明のペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明のペプチドをコードする核酸は、公知の方法又はそれに準ずる方法で調製することができる。例えば、自動合成装置によって合成することができる。得られたＤＮＡをベクターに挿入するために制限酵素認識部位を加えたり、できたペプチド鎖を酵素などで切り出すためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んでもよい。
上述のとおり、本発明のペプチドを膜透過性ペプチド等と融合させる場合、上記核酸は、膜透過性ペプチドをコードする核酸も含む。
宿主由来のプロテアーゼによる分解を抑制するため、目的のペプチドを他のペプチドとのキメラペプチドとして発現させるキメラタンパク質発現法を用いることもできる。この場合、上記核酸としては、目的とするペプチドと、これに結合するペプチドとをコードする核酸が用いられる。
【００２８】
続いて、本発明のペプチドをコードする核酸を用いて発現ベクターを調製する。核酸はそのまま、又は制限酵素で消化し、又はリンカーを付加する等して、発現ベクターのプロモータの下流に挿入することができる。ベクターとしては、大腸菌由来プラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、バクテリオファージ（eファージ、M13ファージ等）、ウイルス（レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、バキュロウイルス等）、コスミド等が挙げられる。
【００２９】
プロモータは、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。宿主が動物細胞である場合は、例えば、SV40（simian virus 40）由来プロモータ、CMV（cytomegalovirus）由来プロモータを用いることができる。宿主が大腸菌である場合は、trpプロモータ、T7プロモータ、lacプロモータ等を用いることができる。
発現ベクターには、DNA複製開始点（ori）、選択マーカー（抗生物質抵抗性、栄養要求性等）、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、タグ（FLAG、HA、GST、GFPなど）をコードする核酸等を組み込むこともできる。
【００３０】
次に、上記発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する。宿主は、ベクターとの関係で適宜選択することができ、例えば、大腸菌、枯草菌、バチルス属菌）、酵母、昆虫又は昆虫細胞、動物細胞等が用いられる。動物細胞として、例えば、HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、ミエローマ細胞、HeLa細胞、Vero細胞を用いることができる。形質転換は、宿主の種類に応じ、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等、公知の方法に従って行うことができる。形質転換体を常法に従って培養することにより、目的とするペプチドが発現する。
【００３１】
形質転換体の培養物からのペプチドの精製は、培養細胞を回収し、適当な緩衝液に懸濁してから超音波処理、凍結融解などの方法により細胞を破壊し、遠心分離やろ過によって粗抽出液を得る。培養液中にペプチドが分泌される場合には、上清を回収する。
粗抽出液又は培養上清からの精製も公知の方法又はそれに準ずる方法（例えば、塩析、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS−PAGE法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等）で行うことができる。
得られたペプチドは、公知の方法又はそれに準ずる方法で遊離体から塩に、又は塩
から遊離体に変換してもよい。
【００３２】
翻訳合成系は、無細胞翻訳系としてもよい。無細胞翻訳系は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、リボソームＲＮＡ、アミノ酸、ｒＲＮＡ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子（ＩＦ）伸長因子（ＥＦ）、終結因子（ＲＦ）、およびリボソーム再生因子（ＲＲＦ）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液加えてもよい。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を加えてもよい。
これらを含む系に、透析を用いて連続的にエネルギーを供給することで、数１００μｇから数ｍｇ／ｍＬのタンパク質を生産することができる。遺伝子ＤＮＡからの転写を併せて行うためにＲＮＡポリメラーゼを含む系としてもよい。市販されている無細胞翻訳系として、大腸菌由来の系としてはロシュ・ダイアグノスティックス社のＲＴＳ−１００（登録商標）、ＰＧＩ社のＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）等、小麦胚芽抽出液を用いた系としてはゾイジーン社やセルフリーサイエンス社のもの等を使用できる。
無細胞翻訳系によれば、発現産物を精製することなく純度の高い形で得ることができる。
【００３３】
無細胞翻訳系においては、天然のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に合成されるアミノアシルｔＲＮＡに代えて、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸をｔＲＮＡに連結（アシル化）した人工のアミノアシルｔＲＮＡを用いてもよい。かかるアミノアシルｔＲＮＡは、人工のリボザイムを用いて合成することができる。
かかるリボザイムとしては、フレキシザイム（flexizyme）（H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga (2006) Nature Methods 3, 357-359 "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides"；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894 "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group"；及びWO2007/066627等）が挙げられる。フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等の呼称でも知られる。
【００３４】
フレキシザイムによって生成された、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸が連結されたｔＲＮＡを用いることにより、所望のコドンを、所望のアミノ酸又はヒドロキシ酸と関連付けて翻訳することができる。所望のアミノ酸としては、特殊アミノ酸を用いてもよい。
特殊アミノ酸の例を下表に示すが、これらに限定されない。なお、表中ＤＢＥとＣＭＥは、特殊アミノ酸をフレキシザイムでｔＲＮＡに結合させるときのエステルの種類であり、ＤＢＥは、3,5-dinitrobenzyl esterを意味し、ＣＭＥは、cyanomethyl esterを意味する。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００３５】
本発明のペプチドは、一態様として環状化されていてもよく、環状化されたペプチドも本発明のペプチドに包含される。本明細書において環状化とは、１つのペプチド内において、１アミノ酸以上離れた２つのアミノ酸が直接に、又はリンカー等を介して間接的に結合し、分子内に環状の構造を作ることを意味する。
環状化は、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ−Ｓ−Ｃ結合、Ｃ−Ｎ−Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ−Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、チオアミド結合などによることができるが、これらに限定されない。
ペプチドを環状化することにより、ペプチドの構造を安定化させ、標的への親和性を高めることができる場合がある。
【００３６】
例えば、環状化のために、特殊アミノ酸としてクロロアセチル化したアミノ酸を用い、特殊アミノ酸とｔＲＮＡとの複合体をフレキシザイムによって生成して翻訳合成系に用いてもよい。かかる複合体は、クロロアセチル化したアミノ酸とｔＲＮＡをフレキシザイムの存在下で反応させることにより調製することができる。
クロロアセチル化アミノ酸としては、例えば、上表に示した特殊アミノ酸のうち、N-Chloroacetyl-L-alanine、N-Chloroacetyl-L-phenylalanine、N-Chloroacetyl-L-tyrosine、N-Chloroacetyl-L-tryptophan、N-Chloroacetyl-D-alanine、N-Chloroacetyl-D-phenylalanine、N-Chloroacetyl-D-tyrosine、N-Chloroacetyl-D-tryptophan、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophaneを用いることができる。
これらは開始アミノ酸として用いられるので、ペプチドのＮ末端アミノ酸となる。したがって、これらの特殊アミノ酸を用いれば、Ｎ末端アミノ酸と、同じペプチド内のシステインとの間にチオエーテル結合が生成され、環状構造が形成される。
また、クロロアセチル化アミノ酸として、Nγ-(2-chloroacetyl)-α,γ-diaminobutylic acid、又はNγ-(2-chloroacetyl)-α,γ-diaminopropanoic acidを用いれば、ペプチド鎖のどの部位にも導入できるので、任意の箇所のアミノ酸と、同じペプチド内のシステインとの間にチオエーテル結合が生成され、環状構造が形成される。
特殊アミノ酸を用いた環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)に記載された方法に従って行うことができ、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【００３７】
具体的には、例えば、クロロアセチル−Ｌ／Ｄ−トリプトファンを、配列番号１−２４で表されるアミノ酸配列のＮ末端に配置し、同アミノ酸配列のＣ末端側にシステインを配置することができる。
クロロアセチル化アミノ酸とシステインの位置は、環状化によってヘマグルチニンへの親和性が低下しない限り、ペプチド内のどこであってもよい。例えば、クロロアセチル化アミノ酸を、Ｎ末端から３アミノ酸以内に配置し、システインをＣ末端から３アミノ酸以内に配置してもよい。
【００３８】
クロロアセチル化アミノ酸とシステインとの間に形成されるチオエーテル結合は生体内の還元条件下でも分解を受けにくいので、ペプチドの血中半減期を長くして生理活性効果を持続させることが可能である。
なお、クロロアセチル化アミノ酸をペプチドに導入する方法として、特殊アミノ酸を用いないで任意の方法でペプチドを合成し、当該ペプチドのいずれかのアミノ酸残基をクロロアセチル化して、ペプチド内のシステインとの間にチオエーテル結合を生成させて環状化することもできる。
【００３９】
（医薬組成物）
後述する実施例に示されるとおり、本発明のペプチドは、インフルエンザウイルス表面のヘマグルチニンに結合することにより、抗インフルエンザウイルス効果を示す。従って、本発明のペプチドを含む組成物は、インフルエンザの予防又は治療剤として有用である。
本明細書において、インフルエンザとは、インフルエンザウイルスによる急性感染症をいう。感染すると、ヒトにおいては高熱、筋肉痛などを伴う風邪様の症状があらわれる。腹痛、嘔吐、下痢などの胃腸症状を伴う場合もあり、合併症として肺炎とインフルエンザ脳症がある。
本明細書において感染とは、ウイルスが皮膚や粘膜を介して生体に侵入する過程、又は、ウイルスが膜融合により細胞内に侵入する過程のいずれかを指す用語として用いられる。また、本明細書においてウイルス感染とは、症状の有無にかかわらずウイルスが生体内に侵入している状態をいう。
【００４０】
本明細書においてインフルエンザの治療または予防とは、その最も広い意味で用いられ、例えば、インフルエンザウイルスの感染と関連する一つ又は複数の症状の緩和若しくは悪化の阻止、感染後の症状の発生の抑制、生体内におけるウイルスの細胞への感染の阻止（遅延又は停止）、生体内におけるウイルスの増殖の阻止（遅延又は停止）、生体内におけるウイルス数の減少等を生じさせることをいう。これらのうち少なくとも一つの効果を示すとき、インフルエンザの治療または予防に有用であると判断される。
また、後述する実施例に示されるとおり、本発明のペプチドは、ヘマグルチニンに対する中和活性を有するので、インフルエンザワクチンと同様の効果を得られうるものと理解される。
【００４１】
本明細書において、医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射投与、経皮投与、経粘膜投与（経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、経直腸）投与等が上げられる。
上記医薬組成物は、ポリペプチドが代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて、各種の修飾を行うことができる。例えば、ポリペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし、抗原性を低下させることができる。また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これにポリペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
【００４２】
上記医薬組成物は、有効成分をそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる担体、賦形剤、添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、等が挙げられるがこれらに限定されない。
上記医薬組成物は、ペプチドが経粘膜吸収されにくいことに鑑みて、難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤を含むことができる。かかる吸収促進剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、サポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸等の胆汁酸塩；EDTA、サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、N-アシルコラーゲンペプチド、N-アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、一酸化窒素供与体等を用いることができる。
【００４３】
丸剤又は錠剤は、糖衣、胃溶性、腸溶性物質で被覆することもできる。
注射剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、アルコール類等を含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、防腐剤等を加えることができる。
【００４４】
本発明の医薬組成物を哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、30μg〜100g、100μg〜500mg、100μg〜100mgを1回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、1μg/kg〜3000μg/kg、3μg/kg〜1000μg/kgを1回又は数回に分けて投与してもよい。
【００４５】
（スクリーニング方法）
本発明は、候補ペプチドから、インフルエンザの予防又は治療薬を選択するスクリーニング方法も包含する。
本発明のスクリーニング方法は、その一態様において、
以下の配列を含む核酸を鋳型として無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる工程と
ＡＴＧ（ＮＮＫ）ｎ（配列番号：４９）
〔式中、ｎは４〜１２の整数を示し、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣに相当し、Ｋは、Ｔ又はＧに相当する。〕；
前記ペプチドライブラリーとヘマグルチニンを接触させてインキュベートし、ヘマグルチニンと結合するペプチドを選択する工程と、を含む。
ＡＴＧ（ＮＮＫ）ｎを含む核酸は、例えば、この３’末端にシステインをコードするＴＧＣや、グリシンセリンリンカーをコードする塩基配列（例えば、ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣ；配列番号：５０）を付加したものとしてもよい。
無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる工程は、上述したペプチドの製造方法に従って行うことができる。
【００４６】
また、本発明のスクリーニング方法は、その一態様において、無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる際、ＡＴＧに対応するアミノアシルｔＲＮＡとして、特殊アミノ酸の開始アミノ酸を用いてもよい。
開始アミノ酸の中でもクロロアセチル化アミノ酸を用いれば、システインとの間にチオエーテル結合が生成され、環状ペプチドライブラリーとすることができる。
【００４７】
（インフルエンザウイルス検出薬及び検出用キット）
本発明は、本発明のペプチドを含むインフルエンザウイルス検出薬も包含する。本発明のペプチドは、インフルエンザウイルス表面のヘマグルチニンに特異的に結合する。従って、例えば、ＥＬＩＳＡ法等のイムノアッセイにおける抗インフルエンザ抗体に代えて、本発明のペプチドを用いて試料中のインフルエンザウイルスを検出することができる。
検出薬として用いる場合、本発明のペプチドは、検出可能に標識してもよい。ペプチドの標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
また、イムノアッセイでは、本発明のペプチドをビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができて好ましい。例えば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン以外の部分を特異的に認識する抗体を固相担体に固定し、サンプルを添加して反応させた後、標識した本発明のペプチドを添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、インフルエンザウイルスを検出することができる。固相担体に固定した抗体と試料を反応させた後、標識していない本発明のペプチドを添加し、本発明のペプチドに対する抗体を酵素標識してさらに添加してもよい。
酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３'−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３'５，５'−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。
【００４８】
本明細書において「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
【００４９】
本発明に係る検査用キットは、上記検出に必要な試薬及び器具（本発明のペプチド、抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むが、これらに限定されない）を含む。
【実施例】
【００５０】
以下に示す実施例は、単なる例示であって、上述した実施形態と共に本発明を詳細に説明することのみを意図しており、本発明を限定するものではない。
【００５１】
［ヘマグルチニンに結合する特殊環状ペプチドの選択］
＜スクリーニング１＞
Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルス（１２０３／０４）（PROSPEC社）のヘマグルチニンをバキュロ系で組換え発現したタンパク質を、ＤＭＳＯに溶解し、リン酸ナトリウム水溶液でpH8.0-8.2に調整した約３当量のビオチン活性エステル体（Sulfo-NHS-LC-Biotin（PIERCE社））と反応させた。この反応溶液を精製せずにストレプトアビジン固定磁気ビーズ（Dynabeads M-280 Streptavidin（Invitrogen社））の懸濁液と混合し、ビオチン化されていないヘマグルチニンを除いて選択実験に用いる標的ビーズとした。
特殊環状ペプチドライブラリーの鋳型分子として、ＡＴＧ（ＮＮＫ）ｎＴＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣ（配列番号：５１）を用いた。式中、ｎは４〜１２の整数を示し、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣに相当し、Ｋは、Ｔ又はＧに相当する。
このＤＮＡ分子は転写開始配列と翻訳促進配列（GGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT：配列番号：５３）を５’側に、グリシンセリンリンカー配列と対応付けのためのタグ配列（ＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣ；配列番号：５０）を３’側にそれぞれ有する。これを転写してｍＲＮＡとし、対応付けに用いる核酸誘導体を共有結合させた（国際公開第２０１１／０４９１５７号パンフレット参照）。この複合体２４０ｐｍｏｌを最初の翻訳に用いた。
翻訳系にはメチオニンを除く１９種類の天然型アミノ酸の他に、開始コドンに対応するｔＲＮＡにクロロアセチル−Ｄ／Ｌ−トリプトファンを結合させた複合体を約５０μＭ相当の濃度で加えた。この複合体はクロロアセチル−Ｄ／Ｌ−トリプトファンシアノメチルエステルとｔＲＮＡをフレキシザイムの存在下で反応させることで調製した（H. Murakami et al., Nat. Methods (2006)3:357-359; Y. Goto et al., ACS Chem. Biol. (2008)3:120-129; Y. Goto et al., RNA (2008)14:1390-1398）。
翻訳溶液約２４０μＬに１００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）水溶液を４８μｌ加えて３０分静置したのち、ストレプトアビジン固定磁気ビーズと混合して４℃で１時間混合した。上清をとりビオチン化ヘマグルチニンを結合した標的ビーズと合わせ、１時間４℃で混合したのちＴＢＳＴ（５０ｍＭ  トリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液、１２０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。このビーズに逆転写反応混合液を加え、４２℃で１時間反応させた。上清をＰＣＲ反応液で希釈し、その一部をリアルタイムＰＣＲで定量した。この定量結果に従いサイクル数を決めて残りの溶液のＰＣＲ反応を行った。
得られたＰＣＲ反応物を鋳型に転写し、１回目の１２分の１のスケールで２回目の選択実験を実施した。２回目以降の逆転写反応は翻訳の後に行ない、２本鎖の形で標的ビーズと反応させた。標的ビーズにＰＣＲ反応液を加えて９５℃で加熱し、鋳型の核酸を回収した。この選択実験を核酸の回収量がヘマグルチニンを固定した場合に固定しない場合よりも１０倍以上多く得られた５回目まで繰り返した。各選択実験後の回収率の変化を図１に示した。
最終的に回収されたＤＮＡをプラスミド（pGEM-T Easy（Promega社））にライゲーションし、クローニングして６４個の配列を解析したところ、２個から５個の重複を含む５２種類の核酸に対応していた。
【００５２】
＜スクリーニング２＞
次に、この５２種類の核酸から３種類を選択し、この３種類の核酸配列に基づいて、経験則により、以下のコード領域を含む鋳型分子を設計した。
ＡＴＧＶＶＫＮＮＫＨＷＴＶＶＫＮＮＫＶＤＡＶＤＡＴＷＴＮＮＫＨＷＴＶＶＫＴＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＧＧＧＴＴＣＧ（配列番号：５２）
この配列においてＶはＣ、Ａ又はＧを、ＨはＴ、Ｃ又はＡを、ＷはＴ又はＡを、ＤはＴ、Ａ又はＧをそれぞれ示す。
クロロアセチル−Ｄ−トリプトファンが３’位にエステル結合したｔＲＮＡの存在下で核酸ライブラリーを転写して、核酸誘導体と結合させたライブラリー約５０ｐｍｏｌを５０μｌの無細胞翻訳系で翻訳した。ＥＤＴＡ（１００ｍＭ）水溶液を１０μｌ加えて３７℃で３０分静置したのち、逆転写反応によりｃＤＮＡを形成させた。
この複合体を初期翻訳物ライブラリーとして、スクリーニング１と同様の操作でヘマグルチニンに対する親和性選択を繰り返した。ただしヘマグルチニンとの相互作用は４℃ではなく室温で実施した。選択実験を６回まで繰り返して最終的に回収されたＤＮＡをＰＣＲで増幅してクローニングした。解析した１７配列はすべて異なっていたが、全体に収束しており相同性の高さが認められた。
【００５３】
［ヘマグルチニンに結合する特殊環状ペプチドの化学合成］
選択の結果得られた核酸に対応すると考えられるペプチドが実際にヘマグルチニンに対する結合活性を持つかどうか、インフルエンザウイルスの増殖に対する阻害活性を持つかどうかを確認する目的で、上記スクリーニング１及び２で得られた６９種類のペプチドから選択した下表の２４種類のペプチドを化学合成した。
ペプチド合成は、自動合成機ＳｙｒｏＩ（Biotage Japan社）を用い、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）をαアミノ基の保護基として用いる一般的な固相合成法に従って行った。
Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭ  ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）の３μｍｏｌ相当を合成用チップに加え、2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate（ＨＢＴＵ）、及びＦｍｏｃ基で保護したアミノ酸（いずれもＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）を順次反応させた。
Ｎ末端のトリプトファンを連結してＦｍｏｃを外したのち、1-methyl-2-pyrrolidinone（ＮＭＰ；Nacalai Tesuque社）に溶解したＮ−ヒドロキシコハク酸クロロアセチルを６当量加えて１時間静置した。
得られたペプチドレジンを、N,N-dimethylformamide（ＤＭＦ；Nacalai Tesuque社）と塩化メチレンで３回洗浄して乾燥し、トリフルオロ酢酸−水−トリイソプロピルシランの混合物（体積比で９０：５：５）を加えて室温で２時間攪拌した。
エーテル沈殿により切断された粗ペプチドを回収し、ジエチルエーテルで２回洗浄して乾燥したのち、終濃度が１０ｍＭとなるように１２５ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む８０％ＤＭＳＯ水溶液を加えて、室温で１時間攪拌した。
環状ペプチド溶液を酸性にして濾過し、Ｃ４カラム（Cosmosil AR300 5C4（10×250mm、Nacalai Tesuque社）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで目的物を精製した。移動相として０．１％トリフルオロ酢酸を含む水−アセトニトリルを用いた。生成したペプチドは、Autoflex II（Bruker Daltonics社）を用いてMALDI-TOF-MSにより同定した。
以下の２４種類のペプチドをインフルエンザウイルスの増殖阻害試験に用いた。
【表８】
2013071904.tif 000009
【００５４】
［インフルエンザウイルスの増殖に対するペプチドの阻害活性の評価］
１．インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３株に対する阻害
インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３に対する阻害試験を以下の手順で行った。
1) アッセイ3日前にMDCK細胞を6wellプレートへ2×105cells/wellで播いた。
2) インフルエンザウイルス感染前日に各ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭを含有する細胞培養培地に交換して細胞を前処理した。
3) 1%BSAを含有するMEM培地で希釈したインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１(1×103PFU/ml)ウイルス液0.1mlを各wellに加え、全体に行き渡らせた。
4) 37 or 34℃，1時間吸着した。15分おきにプレートを揺らした。
5) ウイルス液を取り除き、BSA(-)/MEMで1回洗浄した。
6) ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭ，10μg/mlアセチルトリプシン，0.8%アガロース加1%BSA/MEM 2mlを各wellに加えた。
7) アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、CO2インキュベーターへ入れた。
8) 37 or 34℃，2〜3日培養した。
9) 10%ホルマリンを加えた。室温，1時間固定した。
10) ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
11) 1%クリスタルバイオレットで1時間染色した。
12) 水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。
【００５５】
図２及び３に培養後のプレートの写真を示す。ネガティブコントロール（ＮＣ）と比較して、Ｎｏ．１１、１２、１８及び２４（図２）、並びにＮｏ．１９及びＮｏ．２３（図３）では、プラークの大きさ及び数に明らかに差が見られた。使用したウイルスの量をBack-titrationを行って確認したが所定のウイルス量であった。
図４〜６に、プラーク数とプラークの直径の比較を示す。図４及び５に示されるとおり、全体としてネガティブコントロールに比較してプラークの数が減少する傾向にあり、Ｎｏ．１１及び１２では半数以下に減少した（図４）。また、Ｎｏ．１４もプラーク数は半数以下、Ｎｏ．１９は０．１μＭ以上においてプラーク数がゼロ、Ｎｏ．２３は１μＭにおいてプラーク数が１／１０であった。
また、図６に示されるとおり、いずれのペプチドについても、用量依存的にプラークの直径が減少する傾向が見られた。
Ｎｏ．１８の１μＭでは、プラークの数及び直径ともに、ザナミビル（商品名リレンザ）と同等な減少が見られ、Ｎｏ．２４の１μＭでは、プラークの直径が約半分に縮小された。Ｎｏ．１４、１９及び２３でも、ネガティブコントロールに比較して、プラーク直径も半分以下であった（データ図示せず）。
【００５６】
２．インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株に対する阻害
同様に、インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１に対するペプチドによる阻害試験を行った。
インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株A/Tokyo/2619/2009に対する阻害試験を以下の手順で行った。
1) アッセイ3日前にMDCK細胞を6wellプレートへ2×105cells/wellで播いた。
2) インフルエンザウイルス感染前日に各ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭを含有する細胞培養培地に交換して細胞を前処理した。
3) 1%BSAを含有するMEM培地で希釈したインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１(1×103PFU/ml)ウイルス液0.1mlを各wellに加え、全体に行き渡らせた。
4) 37 or 34℃，1時間吸着。15分おきにプレートを揺らした。
5) ウイルス液を取り除き、BSA(-)/MEMで1回洗浄した。
6) ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭ，10μg/mlアセチルトリプシン，0.8%アガロース加1%BSA/MEM 2mlを各wellに加えた。
7) アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、CO2インキュベーターへ入れる。
8) 37 or 34℃，2〜3日培養した。
9) 10%ホルマリンを加えた。室温，1時間固定した。
10) ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
11) 1%クリスタルバイオレットで1時間染色した。
12) 水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。
結果を図７に示す。リレンザが効果を示さないＨ１Ｎ１に対しても増殖阻害効果を有するペプチドが見られた。特にＮｏ．２３及び２４は高い増殖阻害効果を示した。
【００５７】
３．インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１−Ｖａｃ３株に対する中和活性
また、インフルエンザウイルスに対するペプチドの中和活性を確認するため、ペプチドとインフルエンザウイルスをまず混合し、その後、この混合液と細胞を接触させる試験を行った。具体的な試験方法を以下に示す。
1) アッセイ3日前にMDCK細胞を6wellプレートへ2×105cells/wellで播いた。
2) インフルエンザウイルス感染前日に各ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭを含有する細胞培養培地に交換して細胞を前処理した。
3) 各ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭを含有する細胞培養培地110μlに５５ＰＦＵのウイルス溶液（Ｈ５Ｎ１  Ｖａｃ−３）110μlを混合し、ＣＯ2インキュベータにおいて３７℃で１時間インキュベートした。
4) ペプチドとインキュベートしたウイルス液0.2mlを各wellに加え、全体に行き渡らせた。
5) 37 or 34℃，1時間吸着。15分おきにプレートを揺らした。
6) ウイルス液を取り除き、BSA(-)/MEMで1回洗浄した。
7) ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭ，10μg/mlアセチルトリプシン，0.8%アガロース加1%BSA/MEM 2mlを各wellに加えた。又は、オセルタミビル（商品名タミフル）若しくはザナミビル（商品名リレンザ）を0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭ含むアガロース培地を重層した。
8) アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、CO2インキュベーターへ入れた。
9) 37 or 34℃，2〜3日培養した。
10) 10%ホルマリンを加えた。室温，1時間固定した。
11) ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
12) 1%クリスタルバイオレットで1時間染色した。
13) 水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。
結果を図８に示す。図９に被験ペプチドとウイルス液の処理条件を示す。各ウェルの右上の数字がプラーク数を表す。ペプチドＮｏ．１１，１４，１８は図９の２条件すなわち中和反応のみで、無効条件と比較してプラーク数が半数以下に減少した。この結果は、ペプチドＮｏ．１１，１４，１８ペプチドが、インフルエンザウイルスに対する中和活性を有する可能性を示唆するものである
【００５８】
さらに、インフルエンザウイルスに対するＮｏ．２３，２４ペプチドの中和活性を確認するため、ペプチドとインフルエンザウイルスをまず混合し、その後、この混合液と細胞を接触させる試験を行った。具体的な試験方法を以下に示す。
1) アッセイ3日前にMDCK細胞を6wellプレートへ2×105cells/wellで播いた。
2) 各ペプチド0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭを含有する細胞培養培地110μlに５５ＰＦＵのウイルス溶液（Ｈ５Ｎ１  Ｖａｃ−３）110μlを混合し、ＣＯ2インキュベータにおいて３７℃で１時間インキュベートした。
3) ペプチドとインキュベートしたウイルス液0.2mlを各wellに加え、全体に行き渡らせた。
4) 37 or 34℃，1時間吸着。15分おきにプレートを揺らした。
5) ウイルス液を取り除き、BSA(-)/MEMで1回洗浄した。
6) 10μg/mlアセチルトリプシン，0.8%アガロース加1%BSA/MEM 2mlを各wellに加えた。試験の陽性コントロールとして、オセルタミビル（商品名タミフル）若しくはザナミビル（商品名リレンザ）を0.01μＭ、0.1μＭ、1μＭ含むアガロース培地を重層した。
7) アガロース凝固後、プレートの上下を反転させ、CO2インキュベーターへ入れた。
8) 37 or 34℃，2〜3日培養した。
9) 10%ホルマリンを加えた。室温，1時間固定した。
10) ホルマリンとアガロース培地を取り除き、水洗した。
11) 1%クリスタルバイオレットで1時間染色した。
12) 水洗、乾燥後にプラーク数を判定した。
中和試験結果を図１０及び陽性コントロールの結果を図１１に示す。使用したウイルスの量をBack-titrationを行って確認したが所定のウイルス量であった。各ウェルの右上の数字がプラーク数を表す。いずれのペプチドも、無効条件と比較してプラーク数が半数以下に減少した。この結果は、本発明のペプチドが、インフルエンザウイルスに対する中和活性を有する可能性を示唆するものである。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
配列番号：１〜２４は、抗インフルエンザウイルス活性を有するペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２５〜４８は、抗インフルエンザウイルス活性を有する環状ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：４９は、無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる際に用いられる鋳型核酸配列の一例である。
配列番号：５０は、グリシン−セリンリンカーをコードする核酸の塩基配列である。
配列番号：５１は、無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる際に用いられる鋳型核酸配列の一例である。
配列番号：５２は、無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる際に用いられる鋳型核酸配列の一例である。
配列番号：５３は、無細胞翻訳系でペプチドライブラリーを発現させる際に用いられる鋳型核酸配列の５’側に付加される翻訳促進配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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