(57)【要約】【課題】部材に保持された微量の核酸−タンパク質複合体を、簡便かつ高精度に単離できる、核酸−タンパク質複合体の単離装置の提供。【解決手段】核酸−タンパク質複合体９１を保持可能な第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２が積層された保持構造体１０、並びに保持構造体１０に電圧を印加するための陰極１３、陽極１４及び直流電源装置１５を備え、電圧印加時に、核酸−タンパク質複合体９１と、核酸９３及び／又はタンパク質９２と、が保持された第一の保持部材１１から、核酸−タンパク質複合体９１を第二の保持部材１２に転写して保持することにより、核酸−タンパク質複合体９１が単離可能とされたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置１。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸−タンパク質複合体を保持可能な第一の保持部材及び第二の保持部材が積層された保持構造体、並びに前記保持構造体に電圧を印加するための電極及び電源を備え、電圧印加時に、核酸−タンパク質複合体と、核酸及び／又はタンパク質と、が保持された第一の保持部材から、前記核酸−タンパク質複合体を第二の保持部材に転写して保持することにより、前記核酸−タンパク質複合体が単離可能とされたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置。
【請求項２】
前記第一の保持部材及び第二の保持部材がシート状であることを特徴とする請求項１に記載の核酸−タンパク質複合体の単離装置。
【請求項３】
前記第一の保持部材と前記第二の保持部材との間に、さらに、前記核酸−タンパク質複合体が透過可能なゲル状媒体が積層されたことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸−タンパク質複合体の単離装置。
【請求項４】
前記ゲル状媒体が、アクリルアミドゲル又はアガロースゲルであることを特徴とする請求項３に記載の核酸−タンパク質複合体の単離装置。
【請求項５】
二次元電気泳動により分離したタンパク質を転写して、さらに前記タンパク質から形成させた核酸−タンパク質複合体を保持する転写部材を、前記第一の保持部材としたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸−タンパク質複合体の単離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の核酸−タンパク質複合体の単離に好適な、核酸−タンパク質複合体の単離装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医学、工学、薬学、理学、農学等の生命科学分野において、核酸とタンパク質との相互作用を、迅速、定量的及び網羅的に再現性良く分析するための新たな技術が求められている。
核酸とタンパク質との相互作用は、主として二つの機構から説明することができる。一つは、タンパク質を主体、核酸を客体として位置付け、転写因子と呼ばれるタンパク質が特定の塩基配列のプロモーターやエンハンサーを認識し、ここへ結合する転写制御と呼ばれる機構である。ヒトの場合、約１８００の転写因子が知られており、これらは、代謝、免疫、知覚、運動等の様々な生命活動をコントロールする役割を担っている。
【０００３】
もう一つは、核酸を主体、タンパク質を客体として位置付け、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、核酸医薬と呼ばれる特定の塩基配列とコンフォメーションを有する核酸が、タンパク質の特定部位を認識し、ここへ結合する機構である。このような機構は、例えば、抗体に代わる分子認識素子であるバイオセンサーや、医薬材料として、各種産業での利用が期待されている。
【０００４】
例えば、ＤＮＡとタンパク質との相互作用、又は結合を定量的に分析する手段としては、目的とするＤＮＡ結合タンパク質（ＤＮＡ−タンパク質複合体）と、その他の夾雑物とを含有する生体試料等の試料から、ＤＮＡ結合タンパク質等の分離精製操作を行なわずに、短時間でＤＮＡ結合タンパク質の含有量を定量する方法と、定量用キットが開示されている（特許文献１参照）。ＤＮＡの塩基配列及びタンパク質の種類が共に既知であれば、上記のような手段で、目的とするＤＮＡ結合タンパク質のみを光学的に補足でき、定量分析を行うことが可能となる。しかし、ＤＮＡの塩基配列及びタンパク質の種類の少なくとも一方が未知の場合には、上記のような手段で、ＤＮＡ結合タンパク質の定量分析を行うことは困難である。
【０００５】
これに対して、核酸の塩基配列及びタンパク質の種類が共に未知の場合に、核酸とタンパク質との多様な相互作用を分析できる手段として、ＳＤＳ電気泳動又は二次元電気泳動でタンパク質を他の成分から分離し、転写膜へ転写した後、転写膜上で核酸と複合体（核酸−タンパク質複合体）を形成させる方法が開示されており、例えば、転写因子分析のためのサウスウェスタンブロッティング（非特許文献１及び参照）、ＤＮＡアプタマーのスクリーニングのためのアプタマーブロッティング（非特許文献３参照）が知られている。
【０００６】
ここで、「二次元電気泳動」とは、生体組織や細胞から回収した多様なタンパク質を含む試料に対して、一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にＳＤＳ電気泳動を行い、シート状のゲルに数百以上のタンパク質を展開する方法である。また、「転写」とは、タンパク質を不安定なゲル中から多孔質膜（転写膜）に電気的作用により移動させる方法である。そして、「核酸−タンパク質複合体」とは、鍵と鍵穴の関係と表現される特異的相互作用によって、タンパク質と核酸とから形成されたものである。通常は、前記複合体形成後に、特定のタンパク質又は核酸に蛍光体等の標識物質を結合させて前記複合体を標識し、これを光学的に検出する。さらに、特異的に相互作用する核酸及びタンパク質のみを転写膜から回収し、シーケンサー分析による核酸の塩基配列の決定、又は質量分析によるタンパク質の構成アミノ酸の解析が行われる。
【０００７】
上記の方法では、核酸−タンパク質複合体形成後の転写膜上には、通常、核酸−タンパク質複合体、核酸及びタンパク質が混在している。そして、この後、目的とする核酸−タンパク質複合体に対して、正確なシーケンサー分析及び質量分析を行うためには、不要な核酸及びタンパク質を除去して、核酸−タンパク質複合体のみを単離することが必要不可欠となる。ここで従来は、目的とする核酸−タンパク質複合体を、これが保持されている膜ごとカッターで切り取る方法や、ピッカーと呼ばれる円形中空の刃物によって、膜ごとくり抜く（ピッキング）方法が適用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−００８６０８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J.chromatogr.,2009,9,1221(41),p6881,Methods for proteomics analysis of transcription factors
【非特許文献２】J.proteome Res.,2009,8(7),p3693,Two-dimensional southwestern blotting and characterization of transcription factors On-blot
【非特許文献３】Biotechnol.Lett.,(2006)28：1377-1381,A screening method for DNA aptamers that bind to a specific,unidentified protein in tissue samples
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年は、分析時間の短縮、試料の少量化、分析の自動化等が求められ、上記の方法でも、二次元電気泳動用ゲルの小型化が進められており、例えば、縦横５ｃｍの小型規格等もあり、このような小型規格で二次元電気泳動を行った場合には、核酸−タンパク質複合体が、ゲルにおいて直径１mm以下の微小なスポットとして分離されることがある。このとき、従来の単離方法では、カッターの細かくて正確な操作が困難であり、ピッカーの中空部の直径が最小で２ｍｍ程度であるため、目的とする核酸−タンパク質複合体だけでなく、その周辺に存在する不要成分も誤って取り出してしまう危険性が高く、目的とする核酸−タンパク質複合体のみを単離することが困難であるという問題点があった。また、目的とする核酸−タンパク質複合体が多数存在する場合には、これらを個別に切り取り又はくり抜きにより単離する必要があり、作業時間、労力及び再現性が実用的ではなく、簡便かつ高精度に単離できないという問題点があった。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、部材に保持された微量の核酸−タンパク質複合体を、簡便かつ高精度に単離できる、核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するため、
本発明は、核酸−タンパク質複合体を保持可能な第一の保持部材及び第二の保持部材が積層された保持構造体、並びに前記保持構造体に電圧を印加するための電極及び電源を備え、電圧印加時に、核酸−タンパク質複合体と、核酸及び／又はタンパク質と、が保持された第一の保持部材から、前記核酸−タンパク質複合体を第二の保持部材に転写して保持することにより、前記核酸−タンパク質複合体が単離可能とされたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
【００１３】
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、前記第一の保持部材及び第二の保持部材がシート状であることを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、前記第一の保持部材と前記第二の保持部材との間に、さらに、前記核酸−タンパク質複合体が透過可能なゲル状媒体が積層されたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、前記ゲル状媒体が、アクリルアミドゲル又はアガロースゲルであることを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
また、本発明は、かかる核酸−タンパク質複合体の単離装置において、二次元電気泳動により分離したタンパク質を転写して、さらに前記タンパク質から形成させた核酸−タンパク質複合体を保持する転写部材を、前記第一の保持部材としたことを特徴とする核酸−タンパク質複合体の単離装置を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、部材に保持された微量の核酸−タンパク質複合体を、簡便かつ高精度に単離できる、核酸−タンパク質複合体の単離装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第一の実施形態に係る単離装置を模式的に例示する概略図である。
【図２】本発明の第一の実施形態に係る単離装置を使用した場合の、核酸−タンパク質複合体の単離方法を例示するフロー図である。
【図３】本発明の第二の実施形態に係る単離装置を模式的に例示する概略図である。
【図４】実施例１における、核酸−タンパク質複合体及びタンパク質を保持した第一の保持部材を模式的に示す平面図である。
【図５】実施例１で取得した、電圧印加後の第二の保持部材の撮像データである。
【図６】図５の撮像データにおける、３個のスポットの蛍光量の平均値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る核酸−タンパク質複合体の単離装置（以下、「単離装置」と略記することがある）は、核酸−タンパク質複合体を保持可能な第一の保持部材及び第二の保持部材が積層された保持構造体、並びに前記保持構造体に電圧を印加するための電極及び電源を備え、電圧印加時に、核酸−タンパク質複合体と、核酸及び／又はタンパク質と、が保持された第一の保持部材から、前記核酸−タンパク質複合体を第二の保持部材に転写して保持することにより、前記核酸−タンパク質複合体が単離可能とされたことを特徴とする。
本発明においては、特に断りの無い限り、「転写」とは、前記核酸−タンパク質複合体の第一の保持部材から第二の保持部材への移動を指すものとする。
また、本明細書において、濃度の単位「Ｍ」は、モル／Ｌを意味する。
【００１７】
本発明において、第一の保持部材に保持された核酸−タンパク質複合体を構成するタンパク質は、分析対象の試料から得られたものである。また、核酸−タンパク質複合体とは異なる、上記の単独のタンパク質（以下、「単独のタンパク質」と略記することがある）には、分析対象の試料から得られたものが少なくとも含まれる。一方、核酸−タンパク質複合体とは異なる上記の単独の核酸（以下、「単独の核酸」と略記することがある）は、必ずしも、分析対象の試料から得られたものではない。
【００１８】
分析対象の前記試料は、生体から採取した生体由来試料、該生体由来試料を処理して得られた処理試料、人工的に作製した人工試料、これら試料の二種以上を混合して得られた混合試料等が例示できる。
【００１９】
前記複合体中の核酸及びタンパク質は、いずれも、前記単独の核酸及び単独のタンパク質と同じ種類であってもよいし、異なる種類であってもよい。
【００２０】
第一の保持部材に保持された、前記複合体中の核酸及びタンパク質、並びに前記単独の核酸及び単独のタンパク質は、いずれも、一種のみでもよいし、二種以上でもよい。
【００２１】
前記複合体中の核酸、及び単独の核酸は、いずれも、天然由来の核酸及び人工合成核酸のいずれでもよく、具体的には、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）及びＲＮＡ（リボ核酸）だけでなく、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）等の核酸アナログも例示できる。
そして、前記ＤＮＡ及びＲＮＡとして、具体的には、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、mＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ＭｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ＰｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＳｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＳｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等が例示できる。
【００２２】
前記複合体中のタンパク質、及び単独のタンパク質は、動物由来タンパク質、植物由来タンパク質、微生物由来タンパク質、人工合成タンパク質、これらの二種以上が混成された混成タンパク質、及びこれらタンパク質が糖鎖修飾等の翻訳後修飾を受けた修飾タンパク質のいずれでもよい。
【００２３】
前記動物由来タンパク質としては、ヒト、実験動物、家畜もしくは培養細胞から得られた組織を構成するタンパク質、又は上記のヒト等から抽出されたタンパク質が例示できる。ここで、前記実験動物としては、キイロショウジョウバエ、線虫、マウス、モルモット、アフリカツメカエル、メダカ、カニクイザル、ニホンザル等が例示できる。
前記植物由来タンパク質としては、農業用植物；トウモロコシ、サトウキビ等のバイオエタノール製造用の植物；薬理効果を有する植物；漢方薬剤の原料植物等が例示できる。
前記微生物由来タンパク質としては、ウイルス、細菌、真菌又は原虫に由来するタンパク質が例示でき、病原性微生物に由来するタンパク質が好ましい。
【００２４】
（第一の実施形態）
図１は、本発明の第一の実施形態に係る単離装置を模式的に例示する概略図である。ただし、ここでは、単離装置の構成をより判り易く説明するために、一部の構造を分解して示している。
【００２５】
ここに示す単離装置１は、陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４がこの順に積層され、陰極１３及び陽極１４が、それぞれ電線１８により直流電源装置１５に電気的に接続されて、概略構成されている。第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２が積層されて構成された保持構造体１０をはじめ、陰極１３及び陽極１４の一対の電極間に配置されたものは、直流電源装置１５作動時に、これら電極（陰極１３及び陽極１４）から電圧が印加可能となっている。
【００２６】
陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４は、互いの接触面同士が密着して積層されていればよい。
【００２７】
陰極１３及び陽極１４の材質は公知のものでよく、金、白金、銀、銅等の単体金属；ステンレス等の合金；グラッシーカーボン、グラファイトカーボン等のカーボン（非金属）が例示できる。
【００２８】
陰極１３及び陽極１４は、ここに示すようにプレート状であることが好ましく、その厚さは、それぞれ独立して０．１〜１ｍｍであることが好ましい。
【００２９】
陰極１３及び陽極１４は、互いに同一でもよいし、互いに異なっていてもよい。ここで、「陰極及び陽極が互いに異なる」とは、これら電極の構造、材質、厚さ、大きさ及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。
【００３０】
第一の保持部材１１は、核酸−タンパク質複合体、核酸及びタンパク質を保持可能なものであれば、その材質は特に限定されない。ここで、「第一の保持部材１１が、核酸−タンパク質複合体、核酸及びタンパク質を保持可能」とは、陰極１３及び陽極１４へ電圧を印加していない状態で、第一の保持部材１１がこれら分子を有した状態を維持できればよいことを意味し、必ずしもこれら分子が第一の保持部材１１と共有結合を形成している必要はなく、例えば、吸着等の作用により前記分子が維持できることを含む。
【００３１】
第一の保持部材１１の材質は、電気泳動で使用されるゲル等の分離媒体から前記分子を転写する転写部材（転写膜）と同様の材質であることが好ましく、疎水性であることがより好ましく、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、ナイロン等の合成樹脂が例示できる。また、通電性のプレート素材でもよい。
【００３２】
第一の保持部材１１の構造としては、繊維状の原材料を用いた織布もしくは不織布、又はマイクロポア構造を有するものが好ましい。
【００３３】
第一の保持部材１１は、ここに示すようにシート状であることが好ましく、その厚さは、０．０５〜２ｍｍであることが好ましい。
【００３４】
第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２の積層方向（図中のＺ方向）に対して直交する二方向（図中のＸ方向及びＹ方向）における第一の保持部材１１の大きさは、目的に応じて任意に設定できるが、前記二方向における辺の長さが、それぞれ独立に１０〜３００ｍｍであることが好ましく、５０〜１００ｍｍであることがより好ましい。
【００３５】
第一の保持部材１１は、単層からなるもの及び複数層からなるもの（図中のＺ方向に複数の層が積層されてなるもの）のいずれでもよく、複数層からなる場合、これら層は、すべて同じでもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみが同じであってもよい。ここで、「層が異なる」とは、層の構造、材質、厚さ、大きさ（積層面の面積）及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。
【００３６】
第一の保持部材１１は、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を転写（以下、「前転写」と略記することがある）した後の転写膜が好適である。すなわち、二次元電気泳動により分離したタンパク質を前転写し、このタンパク質から形成させた核酸−タンパク質複合体を保持した転写部材（転写膜）を、第一の保持部材１１として使用することが好ましい。
【００３７】
第二の保持部材１２は、核酸−タンパク質複合体を保持可能なものであれば、特に限定されず、例えば、材質、構造及び厚さを、第一の保持部材１１と同様とすることができる。ここで、「第二の保持部材１２が、核酸−タンパク質複合体を保持可能」とは、第二の保持部材１２が核酸−タンパク質複合体を有した状態を維持できればよいことを意味し、必ずしも核酸−タンパク質複合体が第二の保持部材１２と共有結合を形成している必要はなく、例えば、吸着等の作用により前記分子が維持できることを含む。
【００３８】
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、それぞれ公知のものでよい。
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、いずれも、緩衝液又は純水が含浸された状態で使用される。
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、それぞれ、厚さが０．２〜２ｍｍであることが好ましい。
【００３９】
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、いずれも、単層からなるもの及び複数層からなるもの（図中のＺ方向に複数の層が積層されてなるもの）のいずれでもよいが、複数層からなるものが好ましい。第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７が複数層からなる場合、これら層は、すべて同じでもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみが同じであってもよい。ここで、「層が異なる」とは、第一の保持部材１１の場合と同じである。
第一のろ紙１６及び／又は第二のろ紙１７として、複数層からなるものを使用することで、緩衝液又は純水の含浸量が向上し、核酸−タンパク質複合体の第二の保持部材１２への転写を、より安定して行うことができる。
【００４０】
第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７は、互いに同一でもよいし、互いに異なっていてもよい。ここで、「第一のろ紙１６及び第二のろ紙１７が互いに異なる」とは、これらろ紙の構造、材質、厚さ、大きさ及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。
【００４１】
電線１８及び直流電源装置１５は、通常の直流電源回路で使用されるものでよい。
【００４２】
陰極１３の積層面（陰極１３の、第一の保持部材１１と対向する面）の大きさと、陽極１４の積層面（陽極１４の、第二の保持部材１２と対向する面）の大きさは、いずれも、第一の保持部材１１の積層面（第一の保持部材１１の、陰極１３と対向する面及び第二の保持部材１２との接触面）、及び第二の保持部材１２の積層面（第二の保持部材１２の、陽極１４と対向する面及び第一の保持部材１１との接触面）に対して、それぞれ同等以上の大きさであることが好ましく、第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２のそれぞれの積層面に対して、１〜１．５倍の大きさであることがより好ましい。下限値以上であることで、保持構造体１０に対して電圧をより均一に印加でき、より高精度に核酸−タンパク質複合体を単離できると共に、第二の保持部材１２において、目的物である核酸−タンパク質複合体同士をより高精度に分離できる。また、上限値以下であることで、陰極１３及び第二の保持部材１２の接触、並びに陽極１４及び第一の保持部材１１の接触を抑制する高い効果が得られる。
【００４３】
陰極１３、第一のろ紙１６及び第一の保持部材１１の積層構造において、陰極１３の積層面は、第一のろ紙１６を介して、第一の保持部材１１の積層面（第一の保持部材１１の、陰極１３と対向する面）の全面を被覆していることが好ましい。
また、陽極１４、第二のろ紙１７及び第二の保持部材１２の積層構造において、陽極１４の積層面は、第二のろ紙１７を介して、第二の保持部材１２の積層面（第二の保持部材１２の、陽極１４と対向する面）の全面を被覆していることが好ましい。
【００４４】
第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２の積層構造（保持構造体１０）において、第二の保持部材１２の積層面（第二の保持部材１２の、第一の保持部材１１との接触面）の大きさは、第一の保持部材１１の積層面（第一の保持部材１１の、第二の保持部材１２との接触面）の大きさに対して同等以上であることが好ましく、第一の保持部材１１の積層面に対して、１〜１．５倍の大きさであることがより好ましい。下限値以上であることで、第二の保持部材１２において、目的物である核酸−タンパク質複合体同士をより高精度に分離できる。また、上限値以下であることで、陰極１３及び第二の保持部材１２の接触を抑制する高い効果が得られる。
また、前記積層構造において、第二の保持部材１２の積層面は、第一の保持部材１１の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
【００４５】
第一のろ紙１６及び第一の保持部材１１の積層構造において、第一のろ紙１６の積層面の大きさは、第一の保持部材１１の積層面の大きさに対して同等以上であることが好ましい。そして、第一のろ紙１６の積層面は、第一の保持部材１１の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
同様に、第二のろ紙１７及び第二の保持部材１２の積層構造において、第二のろ紙１７の積層面の大きさは、第二の保持部材１２の積層面の大きさに対して同等以上であることが好ましい。そして、第二のろ紙１７の積層面は、第二の保持部材１２の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
【００４６】
ここでは、陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４として、それぞれ、積層面の形状が四角形状であるものを示しているが、目的に応じてその他の形状としてもよい。
【００４７】
単離装置１は、陰極１３、第一のろ紙１６、第一の保持部材１１、第二の保持部材１２、第二のろ紙１７及び陽極１４をこの順に、互いの接触面同士を密着させて積層し、陰極１３及び陽極１４を、それぞれ電線１８により直流電源装置１５に電気的に接続することで、製造できる。陰極１３から陽極１４までの積層構造は、例えば、ひも状又はクリップ状等の結束具等、二層以上の積層体を固定する公知の固定手段を使用して、固定してもよい。
【００４８】
単離装置１においては、第一の保持部材１１として、核酸−タンパク質複合体と、核酸及び／又はタンパク質と、が保持されたものを使用し、これと第二の保持部材１２が積層されてなる保持構造体１０に、直流電源装置１５によって陰極１３及び陽極１４間に電圧を印加することにより、陰極１３から陽極１４へ電流を流す。すると、核酸−タンパク質複合体が第一の保持部材１１から第二の保持部材１２に移動して転写され、保持される。図１では、核酸−タンパク質複合体９１が、矢印Ａで示すように、第一の保持部材１１から第二の保持部材１２に移動し、保持される様子を例示している。
【００４９】
このように、核酸−タンパク質複合体が転写されるのは、核酸−タンパク質複合体が、これを構成する核酸に由来するマイナス電荷（−電荷）を帯びているからであり、通常の電気泳動と同様の作用により電極間を移動する。ここで、「核酸に由来するマイナス電荷」としては、ヌクレオシド同士を連結しているリン酸エステル結合中のマイナス電荷が例示できる。
【００５０】
これに対して、第一の保持部材１１に保持されているタンパク質は、通常、電荷を帯びていないか、又はマイナス電荷を帯びていたとしても、その量は極めて微量であるので、電圧を印加しても移動し難く、第二の保持部材１２に転写されずに第一の保持部材１１に保持されたままとなる。また、タンパク質は、分子量が大きいほど、さらに転写され難い。図１では、タンパク質９２が、電圧印加時にもすべて第一の保持部材１１から移動せず、第一の保持部材１１に保持されている様子を例示している。
【００５１】
一方、第一の保持部材１１に保持されている核酸は、核酸−タンパク質複合体中の核酸と同様にマイナス電荷を帯びており、さらに核酸−タンパク質複合体よりも分子量が小さいため、核酸−タンパク質複合体よりも電圧を印加したときに移動し易く、したがって、第二の保持部材１２に保持及び固定されること無く、第二のろ紙１７に到達し、ここで保持される。図１では、核酸９３が、すべて第二のろ紙１７に移動して、保持されている様子を例示している。
【００５２】
電圧印加時の電圧は、適宜調節すればよく、特に限定されないが、例えば、１０〜６０Ｖとすることが好ましい。
また、電圧印加の時間は、電圧に応じて適宜調節すればよく、特に限定されないが、５〜３０分間であることが好ましい。
電圧印加時の電圧及び時間等の各条件は、途中で変更することなく一定のままとしてもよいし、途中で変更して適宜調節してもよい。
電圧の印加は、核酸−タンパク質複合体の第二の保持部材１２での保持量が最大となるように、適宜調節することが好ましい。
【００５３】
第二の保持部材１２に転写及び保持された核酸−タンパク質複合体は、例えば、これを構成するタンパク質又は核酸を、蛍光標識法、化学発光法又は染色法等の公知の方法で、これらの方法に特有のシグナルを検出することで、検出できる。検出されたシグナルの強度は、タンパク質又は核酸の量に比例するので、検量線を作成してこれを利用することで、第二の保持部材１２に保持された核酸−タンパク質複合体を定量できる。さらに、保持された核酸−タンパク質複合体は、適宜公知の方法で取り出すことができ、シーケンサー分析による核酸の塩基配列の決定、及び質量分析によるタンパク質の構成アミノ酸の解析を行うことができる。このとき、核酸−タンパク質複合体は、不要成分が混入することなく、簡便な方法で取り出せるので、塩基配列の決定や構成アミノ酸の解析を、簡便かつ高精度に行うことができる。
【００５４】
第一の保持部材１１として、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を前転写した後の転写膜を使用する場合、このような第一の保持部材１１は、適宜公知の方法で得られる。以下、その方法の例について説明する。
【００５５】
まず、二次元電気泳動に供する試料（上記の分析対象の試料）について、二次元電気泳動をより確実に行うために、タンパク質以外の高分子の除去、一次元目の等電点電気泳動におけるタンパク質の分離を阻害する塩類の除去、二次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）におけるタンパク質の分離を阻害するタンパク質の３次構造及び４次構造等の高次構造を解除するための生化学的処理、をそれぞれ行うことで、前処理を行う。この前処理は、通常は、試料に対して、超音波破砕処理、フィルター処理、透析処理、熱処理、脱塩処理等の処理を行うことで達成される。
【００５６】
次いで、得られた試料を二次元電気泳動に供する。具体的には、溶液状とした試料を等電点電気泳動用ゲルへ浸透させ、等電点電気泳動を行い、平衡化させた後、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行えばよい。二次元電気泳動により、タンパク質等の分子がゲル中で分離される。
例えば、全自動二次元電気泳動システム「Ａｕｔｏ２Ｄ」（販売元：シャープ株式会社）を使用すれば、1〜１０μｇの試料に対して、ｐＨ４〜８の範囲での等電点電気泳動、及び分子量１０〜１５０ｋＤａの範囲でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを順次行い、等電点電気泳動の方向（横方向）が５０mm、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの方向（縦方向）が５０mmという微小のゲルにおいても、簡便にかつ短時間で精度よく試料を展開できる。
【００５７】
次いで、二次元電気泳動後のゲルから、タンパク質を転写膜へ移動させることで、前転写する。例えば、マイナス電荷を帯びているタンパク質は、セミドライ方式の電気泳動の手法により、前転写することが可能である。転写膜は、後の工程で第一の保持部材として機能するものであり、タンパク質を吸着等により保持できるものが例示でき、上記の第一の保持部材１１と同様の材質、構造及び厚さのものが使用できる。
【００５８】
前転写後の転写膜は、メタノール、エタノール等のアルコールで洗浄処理することが好ましい。このようにすることで、タンパク質以外の、ＳＤＳ等のマイナス電荷を帯びた成分を、転写膜から除去でき、このような成分の第二の保持部材１２への転写が抑制されると共に、タンパク質を本来の高次構造に戻してから複合体を形成させることができるので、より高精度に核酸−タンパク質複合体を単離できる。
【００５９】
次いで、前転写後の転写膜上のタンパク質に、これと特異的に相互作用する塩基配列を有する核酸を作用させ、単離対象の核酸−タンパク質複合体を転写膜上で形成させる。ここで、「特異的に相互作用する」とは、水素結合、疎水結合等により、免疫反応のような選択性の高い結合を分子間で形成することを意味する。
複合体形成を行う前には、通常、転写膜のブロッキング処理及び第一の洗浄処理を行う。
【００６０】
転写膜のブロッキング処理は、目的とするもの以外の核酸が転写膜に固定（吸着）されるのを防ぐ処理であり、例えば、ブロッキング剤としてスキムミルク、ウシ血清アルブミン、ブロッキング用ポリマー等を用いて行うことができる。
【００６１】
転写膜の第一の洗浄処理は、ブロッキング処理後の転写膜から、過剰のブロッキング剤を除去する処理であり、例えば、界面活性剤ｔｗｅｅｎを含むトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液等の、界面活性剤を含む緩衝液を用いて行うことができる。
【００６２】
複合体形成は、転写膜に対して核酸の添加処理、及び第二の洗浄処理を行うことで達成される。
【００６３】
転写膜に対する核酸の添加処理は、転写膜のタンパク質保持部に核酸を万遍なく接触させることができれば、いかなる方法で行ってもよいが、好ましい方法として、核酸を含有する溶液中に転写膜を浸漬する方法が例示できる。この場合、転写膜は、前記溶液を振とうさせながら浸漬することが好ましく、転写膜浸漬時の前記溶液の温度は２５〜３５℃であることが好ましい。このようにすることで、核酸−タンパク質複合体をより効率的に形成できる。
【００６４】
添加する核酸が、本来の高次構造を解除されたものである場合には、加熱処理等により、本来の高次構造に戻したものを使用することが好ましい。
【００６５】
添加する核酸で好ましいものとしては、２０〜１００量体（塩基）の、ランダム塩基配列の１本鎖又は２本鎖ＤＮＡが例示できる。
【００６６】
転写膜に対する第二の洗浄処理は、核酸の添加処理後の転写膜（前記溶液を使用した場合には、浸漬している前記溶液から引き上げられた後の転写膜）に付着している不要成分（例えば、過剰の核酸）を除去するものであり、例えば、界面活性剤を含む緩衝液での洗浄で行うことができる。ここで、界面活性剤を含む緩衝液としては、ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）を緩衝液で濃度が０．０５体積％となるように希釈した溶液が例示できる。第二の洗浄処理は、形成させた核酸−タンパク質複合体を損なわないよう、洗浄時間、洗浄回数、界面活性剤の濃度等の処理条件を適宜調節しておこなうことが好ましい。
【００６７】
図２は、単離装置１を使用した場合の核酸−タンパク質複合体の単離方法のうち、第一の保持部材１１として、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を前転写した後の転写膜を使用した場合の、単離方法を例示するフロー図である。
【００６８】
本実施形態（単離装置１）によれば、上記のように、目的とする核酸−タンパク質複合体が第二の保持部材１２に転写及び保持されるのに対し、タンパク質は第一の保持部材１１に保持されたままとなり、核酸は第二の保持部材１２を通過して第二のろ紙１７にまで移動して、ここで保持される。したがって、核酸−タンパク質複合体が選択的に、第一の保持部材１１から第二の保持部材１２に転写されて、保持される。
そして、カッターやピッカーを使用する従来法とは異なり、上記のような転写を行うことで、第一の保持部材１１に保持された核酸−タンパク質複合体が微量であっても、使用する器具や装置の制約を受けることがなく、不要成分を誤って共に取り出すことがなく、目的とする核酸−タンパク質複合体のみを簡便かつ高精度に単離できる。さらに、目的とする核酸−タンパク質複合体が多数存在する場合でも、作業時間及び労力を大幅に低減でき、極めて高い再現性が得られるので、すべての核酸−タンパク質複合体を簡便かつ高精度に単離できる。
【００６９】
（第二の実施形態）
図３は、本発明の第二の実施形態に係る単離装置を模式的に例示する概略図である。ここでも、図１の場合と同様に、単離装置の構成をより判り易く説明するために、一部の構造を分解して示している。なお、図３において、図１に示すものと同じ構成要素には、図１の場合と同じ符号を付し、その詳細な説明は省略する。
【００７０】
図３に示す単離装置２は、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間に、さらに、核酸−タンパク質複合体が透過可能な中間部材１９が積層されたものである。第一の保持部材１１、中間部材１９及び第二の保持部材１２は、互いの接触面同士が密着して積層されていればよい。単離装置２においては、これら三種の部材が積層され、保持構造体２０が構成されている。単離装置２は、この点以外は単離装置１と同じである。
中間部材１９は、第一の保持部材１１から第二の保持部材１２への核酸−タンパク質複合体の転写を、より高精度に行うためのものである。
【００７１】
例えば、図１に示す単離装置１において、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間の密着度が低く、これらの接触面同士の間に気泡等の空隙部が存在する場合には、これら保持部材間の導電性が低下することがあり、その場合、核酸−タンパク質複合体の転写を正常に行えない可能性がある。これに対して、空隙部が生じ難くなるように中間部材１９を設けることで、上記のような保持部材間の導電性の低下が抑制される。
【００７２】
また、例えば、第一の保持部材１１にマイナス電荷を帯びた不要成分が保持されていたとしても、中間部材１９を設けることで、この不要成分の第二の保持部材１２への転写が抑制される。その理由は、以下の通りである。
前記不要成分としては、単離装置１のところで説明したように、タンパク質が例示できる。また、第一の保持部材１１として、二次元電気泳動後の分離媒体（ゲル）から分子を前転写した後の転写膜を使用した場合には、ＳＤＳ等のマイナス電荷を帯びた成分をこの転写膜から除去する操作を行ったとしても、この成分が完全には除去されず、この成分や、この成分と相互作用して形成された複合体が、転写膜に残存することがあるので、これらも前記不要成分となる。以上のような不要成分は、いずれも、マイナス電荷を帯びていたとしても、その量が微量であれば、たとえ電圧印加時に第一の保持部材１１から第二の保持部材１２へ向けて移動したとしても、目的物である核酸−タンパク質複合体よりもはるかに移動し難い。したがって、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間に中間部材１９が積層され、これら保持部材間の移動距離が長くなっていることにより、前記不要成分と核酸−タンパク質複合体とでは、これらの移動のし易さの相違に基づいて、電圧印加時における移動距離の差がより大きくなる。したがって、核酸−タンパク質複合体のみをより選択的に転写することが可能となる。
【００７３】
中間部材１９は、核酸−タンパク質複合体が透過可能であれば、その材質等は特に限定されない。好ましい中間部材１９としては、ゲル状媒体が例示でき、通常の電気泳動で使用されるものが例示できるが、なかでもアクリルアミドゲル又はアガロースゲルが好ましい。
【００７４】
中間部材１９は、シート状又はプレート状であることが好ましく、その厚さは、目的に応じて任意に調節できるが、０．５〜３ｍｍであることが好ましい。
【００７５】
中間部材１９は、単層からなるもの及び複数層からなるもの（図中のＺ方向に複数の層が積層されてなるもの）のいずれでもよく、複数層からなる場合、これら層は、すべて同じでもよいし、すべて異なっていてもよく、一部のみが同じであってもよい。ここで、「層が異なる」とは、層の構造、材質、厚さ、大きさ（積層面の面積）及び外形の少なくとも一つが互いに異なることを意味する。
ただし、本実施形態においては、単層からなる中間部材１９でも、十分な効果を有する。
【００７６】
第一の保持部材１１及び中間部材１９の積層構造において、中間部材１９の積層面の大きさは、第一の保持部材１１の積層面の大きさに対して同等以下であることが好ましい。そして、第一の保持部材１１の積層面上にある核酸−タンパク質複合体が、中間部材１９の積層面と接触できる限り、中間部材１９の積層面の大きさは特に限定されないが、第一の保持部材１１の積層面に対して、３０〜１００％の大きさであることがより好ましい。下限値以上とすることで、第一の保持部材１１、中間部材１９及び第二の保持部材１２の積層構造がより安定して維持され、例えば、第一の保持部材１１及び第二の保持部材１２の接触を抑制する高い効果が得られる。また、上限値以下とすることで、中間部材１９の陰極１３又は陽極１４との接触を抑制する高い効果が得られる。
また、前記積層構造において、第一の保持部材１１の積層面は、中間部材１９の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
【００７７】
同様に、第二の保持部材１２及び中間部材１９の積層構造において、第二の保持部材１２の積層面は、中間部材１９の積層面の全面を被覆していることが好ましい。
【００７８】
単離装置２は、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間に、さらに中間部材１９を密着させて積層する点以外は、単離装置１と同様の方法で製造できる。
【００７９】
単離装置２を使用した場合には、単離装置１を使用した場合と同様の方法で、核酸−タンパク質複合体を単離できる。
【００８０】
本実施形態（単離装置２）によれば、第一の保持部材１１と第二の保持部材１２との間で導電性の低下が抑制され、さらに、マイナス電荷を帯びた不要成分の転写が抑制されるので、核酸−タンパク質複合体をより高精度に単離できる。
【実施例】
【００８１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
【００８２】
［実施例１］
図３に示す単離装置を使用して、核酸−タンパク質複合体を単離した。具体的には、以下の通りである。
（核酸−タンパク質複合体を保持した第一の保持部材の作製）
配列番号１で表される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、このＤＮＡと特定的に結合することが知られているＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社製）とを、表１に示す組成の緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）に添加し、室温で１時間混和して、目的とするＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体（核酸−タンパク質複合体）を含む溶液（１）を得た。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、光学的に検出可能とするために、「ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ６４７  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（同仁化学社製）を使用して、波長６４７ｎｍの光の照射によって蛍光を発する蛍光物質で標識した。
また、前記ＤＮＡを添加しなかったこと以外は、前記溶液（１）の場合と同様の方法で、標識したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む溶液（２）を得た。
【００８３】
【表１】
2013178140.tif 000003
【００８４】
なお、表１中、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を、「ＤＴＴ」はジチオトレイトールを、「ＮＰ−４０」はポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテルを、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを、それぞれ示す。また、「最終濃度」は、ＤＮＡ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの添加前の緩衝液における各成分の濃度を意味する。なお、ＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８．０）は、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製）と水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨ調整して作製したものである。
【００８５】
次いで、第一の保持部材として縦７０ｍｍ、横８０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍのＰＶＤＦ膜（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜）を使用し、これに、得られた溶液（１）を直径６ｍｍとなるように３箇所滴下して３個のスポットを形成させた。また、このＰＶＤＦの前記スポットと重ならない位置に、得られた溶液（２）を直径６ｍｍとなるように３箇所滴下して、同様に３個のスポットを形成させた。
これにより、ＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを保持したＰＶＤＦ膜（第一の保持部材）を作製した。得られたＰＶＤＦ膜の平面図を図４に模式的に示す。図４中、符号１１０はＰＶＤＦ膜（第一の保持部材）を、符号８１は溶液（１）のスポットを、符号８２は溶液（２）のスポットを、それぞれ示す。
【００８６】
（単離装置の作製）
上記のＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを保持したＰＶＤＦ膜（第一の保持部材）に加え、第二の保持部材として縦７０ｍｍ、横８０ｍｍ、厚さ０．２ｍｍのニトロセルロース膜（ライフテクノロジー社製）を、中間部材であるゲル状媒体として縦４０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ１ｍｍの１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを、第一のろ紙及び第二のろ紙として縦７０ｍｍ、横８０ｍｍ、厚さ１ｍｍのろ紙（ライフテクノロジー社製）にＴｒｉｓ−酢酸緩衝液を含浸させたものを、陰極及び陽極として縦１００ｍｍ、横１００ｍｍの白金メッキ電極を、直流電源装置としてバイオクラフト社製のものを、それぞれ使用し、図３に示す単離装置を作製した。
【００８７】
（核酸−タンパク質複合体の単離）
作製した単離装置において、１０分間、３０Ｖの電圧を印加した。
次いで、蛍光検出装置（ＧＥヘルスケア社製「タイフーン」）を使用して、ニトロセルロース膜（第二の保持部材）上の蛍光シグナルを検出し、その蛍光量を測定した。このとき、同じ蛍光検出装置により、ニトロセルロース膜の撮像データを取得した。撮像データ取得の条件は、蛍光検出モードで、励起波長６３３ｎｍ、蛍光波長６７０ｎｍ、ＰＭＴ５００Ｖとした。取得したニトロセルロース膜の撮像データを図５に示す。図５中、（ａ）はニトロセルロース膜のうち、溶液（１）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域の撮像データであり、（ｂ）はニトロセルロース膜のうち、溶液（２）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域の撮像データである。
【００８８】
図５（ａ）から明らかなように、ニトロセルロース膜のうち、溶液（１）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域には、３個の明確な蛍光スポット（Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．３）が観測された。一方、図５（ｂ）から明らかなように、ニトロセルロース膜のうち、溶液（２）の３個のスポットを形成させたＰＶＤＦ膜の直下の領域には、蛍光スポットがごく僅か観測されたのみであった。
図５（ａ）及び（ｂ）におけるそれぞれの３個のスポットの蛍光量の平均値を図６に示す。図６中、（Ａ）は図５（ａ）の３個のスポットの蛍光量の平均値を示し、（Ｂ）は図５（ｂ）の３個のスポットの蛍光量の平均値を示す。
図６中の（Ａ）に対応する、図５（ａ）の蛍光量の平均値は２０．０であり、標準偏差は４．４であった。一方、図６中の（Ｂ）に対応する、図５（ｂ）の蛍光量の平均値は８．７であり、標準偏差は１．５であった。これら２群のｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った結果、０．０１＜Ｐ＜０．０５となり、有意水準５％で平均値に差があることが示された。
【００８９】
図５（ａ）で、電圧印加前のＰＶＤＦ膜における溶液（１）のスポットと同数（３個）の蛍光スポットが明確に観測され、図５（ｂ）で蛍光スポットがほとんど観測されなかったことから、図５（ａ）で検出された蛍光シグナルは、ＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体に由来するものであり、電圧の印加により、ＰＶＤＦ膜からニトロセルロース膜に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは転写されず、ＤＮＡ−Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体が選択的に転写されたことを確認できた。ＤＮＡは、ニトロセルロース膜を通過して、第二のろ紙に移動したと推測された。なお、図５（ｂ）で蛍光スポットがごく僅か観測されたのは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの蛍光物質による標識時に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに結合しなかった蛍光物質が僅かに存在し、この遊離した状態の蛍光物質が溶液（２）中に存在して、電圧印加時にＰＶＤＦ膜からニトロセルロース膜に転写されたことが原因であると推測された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、医学、工学、薬学、理学、農学等の生命科学分野において、核酸とタンパク質との相互作用の分析に利用可能である。
【符号の説明】
【００９１】
１，２・・・単離装置、１０，２０・・・保持構造体、１１，１１０・・・第一の保持部材、１２・・・第二の保持部材、１３・・・陰極、１４・・・陽極、１５・・・直流電源装置、１９・・・中間部材（ゲル状媒体）、９１・・・核酸−タンパク質複合体、９２・・・タンパク質、９３・・・核酸
【図１】
2013178140.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【配列表】
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