(57)【要約】【課題】AAPPを特異的に認識する抗体、特にAAPPの強力なコラーゲン結合作用を阻害する抗体を提供すること。【解決手段】AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用及びコラーゲン結合作用に重要なアミノ配列（活性部位）を抗原として抗体を作製し、該抗体がAAPPのコラーゲン結合作用に対する阻害作用を有することを確認して、本発明を完成するに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選択されるポリペプチドを重鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、Anopheline Anti-Platelet Protein（AAPP）を認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
【請求項２】
下記の群より選択されるポリペプチドを軽鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、AAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
【請求項３】
下記の（１）〜（７）より選択されるポリペプチドを重鎖可変領域配列として並びに下記の（８）〜（１４）より選択されるポリペプチドを軽鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、AAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（８）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（９）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１０）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１２）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１３）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１４）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
【請求項４】
分子量が約１５０万ダルトン及び／又はサブクラスがIgG1である請求項１〜３に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項５】
AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することを特徴とする請求項１〜４に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項６】
ヒト化抗体若しくはヒト化抗体断片、一本鎖抗体若しくは一本鎖抗体断片、又はFab抗体若しくはFab抗体断片である請求項１〜５に記載の抗体又は抗体断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１に記載の抗体又は抗体断片を含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用の阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜６に記載の抗体又は抗体断片を産出する細胞。
【請求項９】
下記の（１）〜（１５）より選択される、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することが可能なポリペプチド。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（８）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（９）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１０）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１２）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１３）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１４）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（１５）上記（１）〜（１４）に記載のポリペプチドを２個以上含むポリペプチド
【請求項１０】
請求項９に記載のポリペプチドを含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤。
【請求項１１】
以下の工程を含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤のスクリーニング方法：
（１）AAPP、請求項１〜６のいずれか１に記載の抗体若しくは抗体の断片又は／並びに請求項９に記載のポリペプチド、並びに候補阻害物質の存在下において、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を測定する工程；及び
（２）候補阻害物質の存在下における測定値を候補阻害物質の非存在下における測定値と対比して、該作用を減退又は喪失させる候補阻害物質をAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤として選択する工程。
【請求項１２】
以下の工程を含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤のスクリーニング方法：
（１）AAPP、請求項１〜６のいずれか１に記載の抗体若しくは抗体の断片又は／並びに請求項９に記載のポリペプチド、並びに候補増強物質の存在下において、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を測定する工程；及び
（２）候補増強物質の存在下における測定値を候補増強物質の非存在下における測定値と対比して、該作用を増強させる候補増強物質をAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤として選択する工程。
【請求項１３】
以下のポリペプチドを抗原とするAAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Anopheline Anti-Platelet Protein（AAPP）を認識する抗体又は抗体断片、並びに、該抗体又は抗体断片を含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤に関する。
さらに、本発明は、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤又は増強剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（血小板）
血小板は、血管内皮細胞の傷害の際や、その他の様々な因子によって凝集を引き起こす。この血小板血栓によって、冠血管が閉塞されれば心筋梗塞が、脳血管が閉塞されれば脳梗塞が、末梢血管が閉塞されれば慢性動脈閉塞症などが、それぞれ惹起される。このような血小板の活性化(凝集能の賦活)に伴われる血栓性疾患としては、動脈硬化症、虚血性脳梗塞、心筋梗塞・狭心症を始めとする虚血性心疾患、慢性動脈閉塞症、静脈血栓症などが例示される。
【０００３】
（血小板凝集抑制剤）
血小板凝集を抑制する作用を有する薬剤は、合併症として上記のような各種の疾患を伴う虚血性疾患の予防薬として、また、高血圧症、肺高血圧症、脳梗塞、肺梗塞、クモ膜下出血後の病態の予防薬などとして使用されている。
更に、上記薬剤は、冠動脈形成術(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty: PTCA)や、ステント留置の際の血栓形成予防にも用いられており、ステント自体にそのような血小板の凝集を抑制する作用を有する薬剤を包接、塗布または埋め込みなどにより施工して、ステント後の再狭窄の予防剤としても使用されている。
【０００４】
（SY-001）
本発明者は、ハマダラ蚊唾液腺から新規なタンパク質（SY-001）を見出し、これをコードするDNAを単離同定するに成功すると共に、当該タンパク質が血小板凝集阻害作用及び／又は血小板接着阻害作用を有することを新たに見出した（参照：特許文献１）。
【０００５】
（Anopheline Anti-Platelet Protein）
本発明者は、ハマダラ蚊の唾液腺からクローニングされたGE(Gly Glu)リッチな配列を有するタンパク質（AAPP：Anopheline Anti-Platelet Protein)を報告した(参照：非特許文献１)。該タンパク質は、810塩基のオープンリーディングフレーム(ORF)を有しており、269のアミノ酸残基よりなる推定28.5kDaのタンパク質であり、血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、及びコラーゲン結合作用を有することを確認している。
【０００６】
しかしながら、AAPPに対する抗体、特に、AAPPのコラーゲン結合作用を阻害する抗体は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００９−５１４７８５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】渡辺裕之ら、衛生動物、55 Suppl., pp41,19(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、AAPPを特異的に認識する抗体、特にAAPPの強力な血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用及びコラーゲン結合作用を阻害する抗体を提供することを解決すべき課題とした。
さらに、本発明は、該抗体を用いて、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤又は増強剤のスクリーニング方法を提供することも解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用及びコラーゲン結合作用に重要なアミノ配列（活性部位）を抗原として抗体を作製し、該抗体がAAPPのコラーゲン結合作用に対する阻害作用を有することを確認して、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．下記の群より選択されるポリペプチドを重鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、Anopheline Anti-Platelet Protein（AAPP）を認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
２．下記の群より選択されるポリペプチドを軽鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、AAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
３．下記の（１）〜（７）より選択されるポリペプチドを重鎖可変領域配列として並びに下記の（８）〜（１４）より選択されるポリペプチドを軽鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、AAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（８）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（９）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１０）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１２）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１３）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１４）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
４．分子量が約１５０万ダルトン及び／又はサブクラスがIgG1である前項１〜３に記載の抗体又は抗体断片。
５．AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することを特徴とする前項１〜４に記載の抗体又は抗体断片。
６．ヒト化抗体若しくはヒト化抗体断片、一本鎖抗体若しくは一本鎖抗体断片、又はFab抗体若しくはFab抗体断片である前項１〜５に記載の抗体又は抗体断片。
７．前項１〜６のいずれか１に記載の抗体又は抗体断片を含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用の阻害剤。
８．前項１〜６に記載の抗体又は抗体断片を産出する細胞。
９．下記の（１）〜（１５）より選択される、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することが可能なポリペプチド。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（８）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（９）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１０）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１２）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１３）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１４）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（１５）上記（１）〜（１４）に記載のポリペプチドを２個以上含むポリペプチド
１０．前項９に記載のポリペプチドを含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤。
１１．以下の工程を含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤のスクリーニング方法：
（１）AAPP、前項１〜６のいずれか１に記載の抗体若しくは抗体の断片又は／並びに前項９に記載のポリペプチド、並びに候補阻害物質の存在下において、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を測定する工程；及び
（２）候補阻害物質の存在下における測定値を候補阻害物質の非存在下における測定値と対比して、該作用を減退又は喪失させる候補阻害物質をAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤として選択する工程。
１２．以下の工程を含むAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤のスクリーニング方法：
（１）AAPP、前項１〜６のいずれか１に記載の抗体若しくは抗体の断片又は／並びに前項９に記載のポリペプチド、並びに候補増強物質の存在下において、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を測定する工程；及び
（２）候補増強物質の存在下における測定値を候補増強物質の非存在下における測定値と対比して、該作用を増強させる候補増強物質をAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤として選択する工程。
１３．以下のポリペプチドを抗原とするAAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
【発明の効果】
【００１２】
本発明では、AAPPを特異的に認識する抗体、特にAAPPの強力なコラーゲン結合作用を阻害する抗体を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】AAPPのアミノ酸配列を示す模式図。
【図２】（１）AAPPの部分配列を示す模式図（図中の"r"は、"recombinant"を意味する）、（２）AAPP全長配列及びAAPP各部分配列の合成確認結果（図中の"Trx"は、"thioredoxin"を意味する）。
【図３】AAPP全長配列、AAPP各部分配列及びAAPPex3-4部分変異配列のコラーゲン結合能の測定結果。
【図４】各抗体によるAAPPのコラーゲン結合能に対する阻害効果の測定結果。
【図５】各抗体によるAAPPのコラーゲン結合能に対する阻害効果割合。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（本明細書の用語）
本明細書におけるポリヌクレオチド(DNA分子)とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の1本鎖DNAを包含し、その長さに制限されるものではない。
また、本明細書におけるポリヌクレオチド(DNA分子)は、機能領域の別を問うものではなく、発現抑制領域、コード領域、リーダー配列、エキソンおよびイントロンのいずれか少なくともひとつを含むことができる。また、ポリヌクレオチドには、RNA及びDNAが含まれる。
また、ポリヌクレオチドの変異体(変異体DNA)には、天然に存在するアレル変異体；天然に存在しない変異体；欠失、置換、付加および挿入がなされた変異体などが含まれる。ただし、これらの変異体は、変異前のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能と実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードするものとする。
【００１５】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの相同性は、FASTAプログラムを使用した測定｛Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318(1994)｝によって解析することができる。
相同性解析の最も好ましく且つ簡便な方法としては、下記の既知の配列データベースを利用することができる。
・DNA Database of Japan(DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)
・Genebank(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/web/Genebank/Index.htlm)
・the European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html)
相同性解析には多数の検索アルゴリズムが利用可能である。その一例としては、BLASTプログラムと称されるプログラムが挙げられる。
【００１６】
（AAPP：Anopheline Anti-Platelet Protein）
AAPPは、810塩基のオープンリーディングフレーム(ORF)を有しており、269のアミノ酸残基よりなる推定28.5kDaのタンパク質であり、血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用及びコラーゲン結合作用を有する（参照：非特許文献１）。
本発明では、下記実施例１により、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用及びコラーゲン結合作用に重要な活性部位が、AAPPexon3-4（参照：図１及び配列番号１）であることを特定している。
【００１７】
（本発明のAAPPを認識する抗体）
本発明のAAPPを認識する抗体は、以下の通りである。
１．以下のポリペプチドを抗原とするAAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
２．下記の群より選択されるポリペプチドを重鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、AAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
３．下記の群より選択されるポリペプチドを軽鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、AAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
４．下記の（１）〜（７）より選択されるポリペプチドを重鎖可変領域配列として並びに下記の（８）〜（１４）より選択されるポリペプチドを軽鎖可変領域配列として抗原認識部位に含む、AAPPを認識する抗体又は抗体断片。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（８）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（９）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１０）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１２）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１３）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１４）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
【００１８】
（本発明のAAPPを認識する抗体の特性）
本発明の抗体は、分子量約150万であり、サブクラスはIgG1である。
また、下記実施例３により、前記抗体は、AAPPのコラーゲン結合能を阻害することを確認している（参照：図３、４）。さらに、前記抗体がAAPPのコラーゲン結合能を阻害することにより、AAPPがコラーゲンと結合できず血小板凝集が起こる。
すなわち、前記抗体が、AAPPのコラーゲン結合能を阻害することにより、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、及び／又は、血小板活性化抑制作用を阻害することができると考えられる。
よって、好ましくは、本発明の抗体は、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害作用を有する。
なお、本発明の抗体のAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する「阻害」とは、AAPP本来の血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を低減させる又は喪失させることを意味する。
加えて、前記抗体は、ヒト化抗体若しくはヒト化抗体断片、一本鎖抗体若しくは一本鎖抗体断片、又はFab抗体若しくはFab抗体断片を含むものである。さらに、前記抗体は、自体公知の方法により、ヒト化抗体にすることができる。
【００１９】
｛本発明の抗体作製に使用する免疫原（抗原）｝
本発明の抗体を産出させるための免疫原として、AAPPのアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチドを用いることができる。
下記実施例１から明らかなように、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用及びコラーゲン結合作用に重要な活性部位が、下記のアミノ酸配列で構成されるAAPPexon3-4（参照：図１）であることを特定している。
GEESPVNTYHQVHNLLKNIMNVGTKNNYLKSFILARLQERLMNPTIDLVGSISKYSKIKECFDSLADDVKSLVEKSETSYEECSKDKNNPHCGSEGTRELDEGLIEREQKLSDCIVEKRDSE（配列番号１）
よって、好ましくは、以下のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として使用することができる。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
なお、免疫原となるペプチドの作製は、遺伝子工学的手法、化学合成、および無細胞タンパク質合成により実施できる。ペプチドは、作製された後に、さらに精製して用いることができる。
また、ペプチドの精製および／または分離は、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により実施できる。分離操作方法として、硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよび透析法等の公知の方法を例示できる。これら方法は単独でまたは適宜組合せて使用できる。
【００２０】
（免疫方法）
上記記載の免疫原となる精製したペプチド又は部分ペプチドを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解又は懸濁したものを抗原液として使用する。抗原液は通常抗原物質を50〜500μg/mL程度含む濃度に調製すればよい。また、ペプチド単独だけでは抗原性が低い場合には、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に架橋して用いることができる。
当該抗原で免疫感作する動物（被免疫動物）は、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウスである。
【００２１】
上記被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、前記抗原溶液をアジュバントと混合して投与することができる。ここで使用可能なアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ribi（ＭＰＬ）、Ribi（ＴＤＭ）、Ribi（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）。百日咳ワクチン（Boredetella pertussis vaccine）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバントを使用する組合せが特に好ましい。
【００２２】
免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無などにより、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原液0.05〜1ml（抗原物質10〜200μg）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔内注射することで、当該抗原溶液を、アジュバントを使用せずに投与することもできる。抗体価は追加免疫の約５〜１０日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
【００２３】
（モノクローナル抗体の作製）
モノクローナル抗体（以下、「ＭｏＡｂ」と略する場合がある）は、自体公知の方法、例えばケーラーとミルシュタインの方法（Kohler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495−497.）にしたがって作製することができる。
例えば、免疫動物から抗体産出細胞を含む組織（例えば、脾臓又はリンパ節）を回収し、該抗体産出細胞と自体公知の腫瘍細胞（例えば、骨腫瘍細胞）とを融合させることによってハイブリドーマを作製し、次いでハイブリドーマをクローン化した後、所望の抗体を産出しているハイブリドーマを選別し、このハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。
骨髄腫細胞として、マウス、ラット、ヒトなど由来のものが使用され、例えばマウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が例示される。骨髄腫細胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているものがあり、これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生する免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合することがあるので、特に免疫グロブリン軽鎖を産生しない骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653やSP2/o-Ag14などを用いることが好ましい。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞の保存方法は自体公知の手法に従って行えばよく、例えばウマ、ウサギもしくはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代培養したものについて凍結により保存される。また細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。
【００２４】
（ハイブリドーマの作製）
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。例えばＰＥＧ法の場合、約30〜60％のＰＥＧ（平均分子量1,000〜6,000）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を1〜10：1、好ましくは5〜10：1の混合比で懸濁し、温度約25〜37℃、pH6〜8の条件下で、約30秒〜3分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞を洗浄しＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロタイタープレート中に播種して培養を続ける。
融合操作後の細胞は選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株を死滅させ、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換し、さらに２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウェルを確認する。
【００２５】
生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取して抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。
さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離する。
【００２６】
ハイブリドーマが産生する抗体の免疫グロブリンサブクラスは、該ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより知ることができる。
【００２７】
（モノクローナル抗体の取得方法）
ハイブリドーマからのＭｏＡｂの取得方法は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選択することができる。例えば、該ハイブリドーマを移植したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により培養上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数mg/mLの高濃度のＭｏＡｂを得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。
細胞培養によるＭｏＡｂの取得は、抗体産生量はインビボより低いが、マウス腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。
抗体を、ハイブリドーマを移植したマウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（2, 6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制作用を有する物質を投与したBALB/cマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約106個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。
細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、高密度培養方法又はスピンナーフラスコ培養方法などの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。
腹水や培養上清からのＭｏＡｂの精製は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などを応用することで、容易に達成される。
さらに、ＭｏＡｂが、マウスＩｇＧである場合には、プロテインＡ結合単体又は抗マウスイムノグロブリン結合単体を用いたアフィニティークロマトグラフィー法により精製することが可能であり、簡便である。
【００２８】
（本発明のAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害するポリペプチド）
下記実施例４により、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することができる抗体の重鎖配列及び軽鎖配列を特定している。
よって、該重鎖配列、該軽鎖配列、又は該配列の一部を改変したポリペプチドは、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することができる。
より詳しくは、本発明のAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することが可能なポリペプチド（以後、「本発明のペプチド」と略する場合がある）は、以下の通りである。
（１）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（２）配列番号２に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（３）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（４）配列番号２に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（５）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（６）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（７）配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（８）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（９）配列番号４に記載の塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加された塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１０）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと95％以上の相同性を有する塩基配列で表されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１１）配列番号４に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相補鎖とストリジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードするポリペプチド
（１２）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１３）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列で表されるポリペプチド
（１４）配列番号５に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドと95％以上の相同性を有ポリペプチド
（１５）上記（１）〜（１４）に記載のポリペプチドを２個以上含むポリペプチド
なお、上記（１５）の上記（１）〜（１４）に記載のポリペプチドを２個以上含むポリペプチドとは、自体公知のリンカー等を介して各ペプチドを連結することにより作製することができる。
【００２９】
本発明において、「複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加された」とは、2個以上から20個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたことをいう。この複数個のアミノ酸は、好ましくは2個以上から10個以下、より好ましくは2個以上から7個以下、更により好ましくは2個以上から5個以下である。また、この改変されたアミノ酸配列は、配列番号に記載のアミノ酸配列との相同性が、例えば約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、更により好ましくは約98％以上であるのがよい。
欠失、置換、付加又は挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ulmer）の技術（K. M. Ulmer,「Science」1983年, 第219巻,p.666-671）を利用できる。このような変異の導入において、該改変されたアミノ酸を含むポリペプチドの基本的な性質（物性、機能又は免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基又はカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
加えて、該改変されたアミノ酸を含むポリペプチドは、好ましくは、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用の阻害作用を有する。
【００３０】
本発明において、「複数個の塩基が欠失、挿入、置換または付加された」とは、2個以上から20個以下の塩基が欠失、挿入、置換または付加されたことをいう。この複数個の塩基は、好ましくは2個以上から20個以下、より好ましくは2個以上から10個以下、更により好ましくは2個以上から5個以下である。また、この改変された塩基配列は、配列番号に記載の塩基配列との相同性が、例えば約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、更により好ましくは約98％以上であるのがよい。
加えて、該改変された塩基配列を含むポリヌクレオチドをコードするポリペプチドは、好ましくは、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用の阻害作用を有する。
なお、本発明のペプチドのAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する「阻害」とは、AAPP本来の血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を低減させる又は喪失させることを意味する。
ここで「ストリンジェントな条件」としては、0.1％SDSを含む2×SSC中、50℃でハイブリダイズし、0.1%SDSを含む1×SSC中、60℃での洗浄によっても脱離しない条件を挙げることができる。
【００３１】
（AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、及び／又はコラーゲン結合作用の阻害剤）
本発明のAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤は、本発明の抗体若しくは抗体断片、並びに／又は本発明のペプチドを有効成分として含む。
さらに、治療等（予防も含む）の目的に応じて、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、液剤、注射剤（液剤、懸濁剤）または遺伝子療法に用いる形態などの各種の形態に、常法にしたがって調製することができる。
加えて、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤も含むことができる。その他、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびpH調整剤等を適宜使用することもできる。
前記阻害剤の投与量または摂取量については、本発明の効果が得られるものであれば特に限定されるものではなく、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。前記阻害剤は、１日１〜数回に分けて投与または摂取することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与または摂取してもよい。
【００３２】
（本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板凝集阻害に対する阻害作用測定方法）
本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板凝集阻害に対する阻害効果は、以下の方法に従って測定することができる。
ヒトの全血から遠心分離操作によりPRPを調製した後、この調製されたPRPを、AAPP及び本発明の抗体又はペプチドを含む溶液、例えばPBS溶液とプレインキュベーションし、更にこの溶液に血小板凝集惹起剤を添加して血小板を凝集させる。血小板凝集惹起剤には、例えばADP(アデノシン2リン酸)、コラーゲン、CRP(collagen related peptide：コラーゲン関連ペプチド)、convulxin(コンバルキシン)、TRAP(thrombin receptor activator peptide：トロンビン・レセプター・アゴニスト・ペプチド)、エピネフリン、アラキドン酸、U-46619(トロンボキサンA2アナログ：TXA2 analog)、A23187(カルシウムイオノフォア)などが包含される。
得られる溶液の血小板凝集率を比濁透過光法血小板凝集計(MCM HEMA TRACER 313M:エム・シー・メディカル社製)を利用して測定し、得られる測定値から、本発明の抗体又はペプチドを含まないコントロールにおける同値を基準として、AAPPの血小板凝集阻害率を算出する。
これにより、本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板凝集阻害に対する阻害効果を検出することができる。
【００３３】
（本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板接着阻害に対する阻害作用測定方法）
本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板接着阻害に対する阻害効果は、以下の方法に従って測定することができる。
所定濃度でAAPP及び本発明の抗体又はペプチドを含むPBS溶液をコラーゲン溶液でコーティングされた９６ウェルプレートに添加し、室温で1時間インキュベートする。インキュベーション後、血小板懸濁液をウェルに添加し、室温で45分間インキュベートする。インキュベーション後、インキュベーション溶液をウェルからピペットで除去し、ウェルをPBSで洗浄する。
各ウェルのタンパク質の量をDcプロテインアッセイキット(BIO-RAD Laboratories)を用いて測定する。AAPPの血小板接着阻害作用率を、本発明の抗体又はペプチドを含まないコントロール値に基づき得られた測定値から計算し、血小板接着曲線からAAPPの血小板接着阻害作用を計算する。このようにして、本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板接着阻害に対する阻害効果を検出することができる。
【００３４】
（本発明の抗体又はペプチドのAAPPのコラーゲン結合能に対する阻害作用測定方法）
本発明の抗体又はペプチドのAAPPのコラーゲン結合能に対する阻害効果は、以下の方法に従って測定することができる。
300μlのブロッキング溶液を、コラーゲンコーティングを有する又は有しない各96ウェルプレートに添加し、1時間インキュベートする。各ウェルからインキュベーション溶液を除去後、AAPP及び本発明の抗体又はペプチドを含む所定濃度の溶液100μlを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートする。各ウェルからインキュベーション溶液を除去後、TBS洗浄バッファーで洗浄し、100μlの抗His-tagHRP抗体（キアゲン社製品）を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートする。TBS洗浄バッファーで洗浄後、ABTSペルオキシダーゼ基質(KPL Ltd.)100μlを各ウェルに加え、該96ウェルプレートを穏やかに振盪する。
反応の完結後、該ウェルを次いでマイクロプレートリーダーを用い、405-410nmでの吸光度変化により測定する。
所定濃度のAAPPのコラーゲン結合能は、本発明の抗体又はペプチドを含まないコントロールにおける値に基づき得られたOD値から計算され、そのコラーゲン結合曲線からAAPPのコラーゲン結合能を計算する。このようにして、本発明の抗体又はペプチドのAAPPのコラーゲン結合能に対する阻害効果を検出することができる。
【００３５】
（本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板活性化抑制作用に対する抑制作用測定方法）
本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板活性化抑制作用に対する阻害作用は、下記方法によって測定することができる。
健常者から抗凝固剤入りシリンジで採血して得られる全血から遠心分離操作によりPRPを調製する。次いで、調製したPRPを適当なバッファー、例えばTyrode-Hepes (134 mM NaCl, 0.34 mM Na2HPO4 , 2.9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM Hepes, 5 mM グルコース, 1 mM MgCl2, pH 7.3))で希釈し、この希釈系列にAAPPを所定濃度で添加してプレインキュベートする。この液に、蛍光標識した抗P-セレクチン抗体、PAC-1（GPIIb/GPIIIa複合体を認識する抗体(Becton Dickinson社製)）、フィブリノーゲン、アネキシンV等を添加した後、血小板凝集惹起剤、例えばADP、コラーゲン、TRAP等を添加して血小板を活性化させる。かくして活性化させた血小板の蛍光強度をフローサイトメトリー等で測定して、血小板活性化に対するAAPPの作用(活性化抑制作用)を計算する。このようにして、本発明の抗体又はペプチドのAAPPの血小板活性化抑制作用に対する阻害効果を検出することができる。
【００３６】
比濁透過光法血小板凝集計を利用するAAPPの有する血小板凝集阻害作用の測定法の詳細については、本発明では、例えば、Born, G.V.R., "Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal", Nature, 1962, 194, 927-9およびSudo, T., et al., "Potent effects of novel anti-platelet aggregatory cilostamide analogues on recombinant cyclic nucleotide phosphodiesterase isozyme activity", Biochem. Pharmacol., 2000, 59, 347-56が参照される。また、血小板の活性化測定については、例えば、Ito, H., et al., "Cilostazol inhibits platelet-leukocyte interaction by suppression of platelet activation", Platelets, 2004, 15, 293-301が参照される。
【００３７】
（AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤のスクリーニング方法）
本発明のAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤のスクリーニング方法（以後、「本発明の阻害剤のスクリーニング方法」と称する場合がある）では、本発明の抗体又はペプチド並びにAAPPの存在下において、候補阻害物質を添加することにより、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を減退又は喪失させる効果を有する物質をスクリーニングする。これにより、該物質は、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤になる。
加えて、本発明の阻害剤のスクリーニング方法の工程は、少なくとも以下を含む：
（１）AAPP、本発明の抗体若しくは抗体の断片又は／並びにポリペプチド、並びに候補阻害物質の存在下において、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を測定する工程；及び
（２）候補阻害物質の存在下における測定値を候補阻害物質の非存在下における測定値と対比して、該作用を減退又は喪失させる候補阻害物質をAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する阻害剤として選択する工程。
血小板凝集阻害作用の程度は、比濁透過光法血小板凝集計を利用して得られる測定値から算出される血小板凝集阻害率によって求めることができる。より詳しくは、ヒトから抗凝固剤入りシリンジで採血し、採血した全血から遠心分離操作によりヒト多血小板血漿(PRP) を調製し、該液に予めPBSに溶解したAAPP及び本発明の抗体又はペプチド溶液を加えて37℃でプレインキュベーションした後、凝集惹起剤としてコラーゲン溶液(NYCOMED社製)を添加して血小板を凝集させ、さらに所定時間インキュベート後、溶液の透光度を比濁透過光法血小板凝集計(例えばMCM HEMA TRACER 313M：エム・シー・メディカル株式会社製など)を用いて測定して、血小板凝集曲線を作成し、この曲線からAAPP及び本発明の抗体又はペプチド溶液、又は、AAPP及び本発明の抗体又はペプチド溶液+候補阻害物質の各場合の血小板凝集阻害率を算出することができる。上記凝集惹起剤としては、コラーゲンの他に、ADP、CRP、コンバルキシン、TRAP、エピネフリン、アラキドン酸、U-46619、A23187などを用いることもできる。
【００３８】
（AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤のスクリーニング方法）
本発明のAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤のスクリーニング方法（以後、「本発明の増強剤のスクリーニング方法」と称する場合がある）では、本発明の抗体又はペプチド並びにAAPPの存在下において、候補阻害物質を添加することにより、血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を増強させる効果を有する物質をスクリーニングする。これにより、該物質は、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤になる。
加えて、本発明の阻害剤のスクリーニング方法の工程は、少なくとも以下を含む：
（１）AAPP、本発明の抗体若しくは抗体の断片又は／並びにポリペプチド、並びに候補増強物質の存在下において、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を測定する工程；及び
（２）候補増強物質の存在下における測定値を候補増強物質の非存在下における測定値と対比して、該作用を増強させる候補増強物質をAAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に対する増強剤として選択する工程。
【００３９】
（候補阻害物質又は候補増強物質）
上記スクリーニングで使用する候補阻害物質又は候補増強物質としては任意の物質を使用することができる。候補阻害物質又は候補増強物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物特にsiRNAでもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。
候補阻害物質又は候補増強物質はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。候補阻害物質又は候補増強物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
（抗原の選択）
AAPPを特異的に認識するだけでなく、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害することができる抗体を作製するために、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に関与する重要な部位（活性部位）を特定した。詳細は、以下の通りである。
【００４２】
（AAPP全長配列、AAPP各部分配列及びAAPP部分変異配列の作製及び該作製確認）
AAPPの全長配列｛AAPPex1-4：図１及び図２（１）｝、各部分配列｛AAPPex1-2、AAPPex2、AAPPex2-3、AAPPex3-4、AAPPex4：参照：図１及び図２（１）｝、又はAAPPex3-4の部分変異配列｛AAPPex3-4C4：配列番号6（GEESPVNTYHQVHNLLKNIMNVGTKNNYLKSFILARLQERLMNPTIDLVGSISKYSKIKECFDSLADDVKSLVEKSETSYEECSKDKNNPHCGSEGTRELDEGLIEREQKLSDCIVEKRDSE、exon4に含まれる4つのCのうち、4番目のCをAに変異させたもの）｝、thioredoxin及びHisTag（His×5）をコードするcDNAをpET32ベクターに導入して、プラスミドpET32-AAPPex1-4（又は、AAPPex1-2、AAPPex2、AAPPex2-3、AAPPex3-4、AAPPex3-4C4、AAPPex4）を構築した。
【００４３】
上記で得られた各プラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3) (ノバジェン社)を形質転換し、得られた形質転換体をアンピシリン50μg/mLを含むLB培地(LBA) 6mL中で、37℃、15時間振盪培養した。次いで、培養液をLBA600mL中に加えて、37℃、4時間振盪培養後、培養液中に100 mM IPTGを6mL加え、更に37℃、4時間振盪培養した。培養液を6,000×gで15分間遠心して上清を除き、得られるペレットに6M塩酸グアニジン溶液40mLを加えて溶菌した。得られた菌液を30,000×gで25分間遠心して上清を回収し、これにNi-NTA(Qiagen)1.8mLを加えて、4℃で15時間撹拌した。混合物を、3,000×gで3分間遠心して上清を捨て、Ni-NTAを回収し、このものに10 mMイミダゾールを含む6M尿素-TBS溶液(6M尿素、150mM NaCl、50mM TrisHCl [pH7.5])を加え、得られる混合物を更に3,000×gで3分間遠心して上清を捨て、得られるNi-NTAをカラムに詰めた。
【００４４】
該カラムからのAAPP全長配列、AAPP各部分配列及びAAPPex3-4部分変異配列の溶出は、次の通り行った。
Ni-NTAカラム内でAAPPのリフォールディングを行うために、グランジエントミキサー器を用いて6M尿素-TBS溶液から0M尿素-TBS溶液に置換した。20mM、50mM、100mMおよび200mMイミダゾールをそれぞれ含むTBS溶液を2mLずつ順次カラムに流して各フラクションを回収した。
さらに、各フラクションの一部を12% SDS-PAGEにて電気泳動し、クマジー染色によりAAPP全長配列、AAPP各部分配列及びAAPPex3-4部分変異配列に一致する分子量であることを確認した｛参照：図２（２）｝。
加えて、インサートを含まないpET32をトランスフォーメーションした大腸菌からthioredoxinを上記と同様な方法で精製し、コントロールとして使用した。
【００４５】
（AAPP全長配列、AAPP各部分配列及びAAPPex3-4部分変異配列のコラーゲン結合能の測定及び該測定結果）
ブロッキング溶液(300μL)を、コラーゲンでコーティングされた96ウェルプレート(NUNC, 152038) 又はコーティングされていない96ウェルプレート(NUNC, 260895)の各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。各ウェルの溶液を除去し、0.3-300 nMのAAPPex1-4、AAPPex1-2、AAPPex2、AAPPex2-3、AAPPex3-4、AAPPex3-4C4、AAPPex4又はthioredoxinを含む溶液100μLを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。各ウェルの溶液を除去し、TBS洗浄バッファーで洗浄し、100μlの抗His-tagHRP抗体（キアゲン社製品）を各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートする。TBS洗浄バッファーで洗浄後、ABTSペルオキシダーゼ基質(KPL Ltd.)100μlを各ウェルに加え、該96ウェルプレートを穏やかに振盪する。
反応の完結後、該ウェルを次いでマイクロプレートリーダーを用い、405-410nmでの吸光度変化により測定した。
該測定結果を図３に示す。図３の結果から明らかなように、AAPPex1-4（全長配列）及びAAPPex3-4のみがコラーゲンに結合した。一方、AAPPex3-4の部分変異配列であるAAPPex3-4C4はコラーゲンに結合することができなかった。
【００４６】
（抗原の選択結果）
図３の結果から明らかなように、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用に関与する重要な部位（活性部位）は、AAPPex3-4であることを特定した。
これにより、AAPPex3-4を抗原とした選択した。
【実施例２】
【００４７】
（AAPPを認識する抗体の作製）
実施例１で抗原として選択したAAPPex3-4をBALB/cマウスに3回免疫後、従来の方法でミエローマ細胞と融合し、融合した細胞をHAT培地で選択し、64個の独立したハイブリドーマを得た。
ハイブリドーマを単クローン化するための限界稀釈法を行なった。培養したハイブリドーマを培養液で希釈し、次に、各々の懸濁液を96穴組織培養用プレートに0.1 mlずつ分注し培養した。細胞増殖の認められた穴の培養液中の抗体産生の有無を調べた。この操作を２度繰り返して、単一クローン細胞を得た。
【００４８】
前処理したマウスに前記単一クローン化ハイブリドーマをマウス腹腔内に接種した。約1〜3週間後より目的とする複数のモノクローナル抗体（1E5、28B8、8H7）を含む腹水が得られた。
【００４９】
前記抗体を含有する腹水に、当量のPBS緩衝液を加え、次いで、当量の飽和硫安溶液を加え、最終的に50% 硫安溶液とした。腹水の硫安溶液は10,000 rpmで15分間遠心分離した後、上清を除去し、抗体タンパク質の沈澱を得た。この沈殿物をPBSで溶解し、HiTrap Protein G (GE Healthcare)でIgGタンパクとして精製した。
【実施例３】
【００５０】
（各抗体によるAAPPのコラーゲン結合能に対する阻害効果の確認）
実施例２で得られたモノクローナル抗体（1E5、28B8、8H7）を0.2mgから0.001mgまで段階希釈した溶液を準備した。さらに、該溶液に、実施例１で作製した20nM AAPPex1-4を加え、室温で30分間インキュベーションした後に、コラーゲンtype１をコートした96well plateに添加した。
該添加１時間後に、PBS-Tｗ20で3回洗浄し、抗His-tagHRP抗体（キアゲン社製品）を加え、１時間後にPBS-Tw20で３回洗浄した。
さらに、発色液（ABS+過酸化水素水）を加えて、発色をマルチプレートリーダーで検出した。なお、AAPPex1-4は５個のHis残基が付加されており、AAPPがコラーゲンに結合すると抗His-tag HRP抗体で検出できる。
【００５１】
前記検出結果を図４に示す。図４の結果から明らかなように、モノクローナル抗体である8H7抗体のみが濃度依存的にAAPPのコラーゲン結合能を阻害した。
加えて、各モノクローナル (0.001-0.2mg/ml)におけるAAPPのコラーゲン結合能の阻害効率を図５に示した。
図５の結果から明らかなように、8H7抗体は、他の２つのモノクローナル抗体とは異なり、AAPPのコラーゲン結合能を強く阻害したことを確認した。
【実施例４】
【００５２】
（8H7抗体の構造解析）
上記実施例３で得られた8H7抗体の重鎖配列及び軽鎖配列を特定した。詳細は、以下の通りである。
【００５３】
8H7産生ハイブリドーマから、全RNAを抽出した。その後、全RNAから、5'RACE法により8H7抗体の軽鎖及び重鎖の目的領域のDNA配列を得た。さらに、該軽鎖DNA配列及び重鎖ＤＮＡ配列を増幅した。
次に、増幅した軽鎖及び重鎖の可変領域DNA断片は1% アガロースゲルで電気泳動し、さらに精製した。その後、精製した各断片を公知のオートシークエンサーで解析を行なった。
【００５４】
前記解析結果から得られた配列は、以下の通りである。
（１）8H7抗体の重鎖可変領域塩基配列（8H7 VH-B5 DNA配列）
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAATGGATTGGTTTGATTGATCCTTCAGACAGTGAAACTCACTACAATCAAATGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGGGGGACCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCG（配列番号２）
（２）なお、上記塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、以下の通りである。
8H7抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列（8H7 VH-B5 アミノ酸配列）
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGLIDPSDSETHYNQMFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGTYWGQGTTLTVSS（配列番号３）
（３）8H7抗体の軽鎖可変領域塩基配列（8H7 VL-G44 DNA配列）
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATTCCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG（配列番号４）
（４）上記塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、以下の通りである。
8H7抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列（8H7 VL-G44 アミノ酸配列）
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASIPCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIKR（配列番号５）
加えて、8H7抗体は分子量約150万であり、サブクラスはIgG1であることを確認した。
【００５５】
（総論）
本発明では、AAPPの血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用、及び／又はコラーゲン結合作用を阻害する効果を持つ抗体を作製でき、さらに該抗体の構造解析を行うことができた。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
AAPPを特異的に認識する抗体、特にAAPPの強力な血小板凝集阻害作用、血小板接着阻害作用、血小板活性化抑制作用及びコラーゲン結合阻害作用を阻害する抗体を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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