(57)【要約】【課題】細胞接着性に優れ、かつシグナル伝達系を活性化できる医療用材料を提供することである。【解決手段】基材の表面に皮膜が形成されてなり、前記皮膜が、細胞接着性配列領域および絹由来配列領域を含むペプチドまたはタンパク質からなり、前記絹由来配列領域が、固体状態において逆平行βシート構造をなす医療用材料である。前記ペプチドまたはタンパク質が、一般配列（ａ）：[Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)n Ala Ser]m（配列中、ｎは１以上の整数を示す。ｍは１〜３０の整数を示す。）で表される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材の表面に皮膜が形成されてなり、
前記皮膜が、細胞接着性配列領域および絹由来配列領域を含むペプチドまたはタンパク質からなり、
前記絹由来配列領域が、固体状態において逆平行βシート構造であることを特徴とする医療用材料。
【請求項２】
前記基材の構成材料が、チタン合金またはコバルト−クロム−モリブデン合金である請求項１に記載の医療用材料。
【請求項３】
前記皮膜が、アルコール処理されている請求項１または２に記載の医療用材料。
【請求項４】
前記アルコール処理におけるアルコールが、炭素数１〜４の低級アルコールである請求項３に記載の医療用材料。
【請求項５】
前記アルコール処理が、アルコール濃度５０ｖ／ｖ％以上のアルコール水溶液中か、またはアルコール中に前記皮膜を浸漬することによって行われている請求項３または４に記載の医療用材料。
【請求項６】
前記細胞接着性配列領域が、固体状態においてランダムコイルである請求項１〜５のいずれかに記載の医療用材料。
【請求項７】
前記細胞接着性配列領域が、Gly Arg Gly Asp Ser配列を含む請求項１〜６のいずれかに記載の医療用材料。
【請求項８】
前記Gly Arg Gly Asp Ser配列の個数が、１〜３０個である請求項７に記載の医療用材料。
【請求項９】
前記ペプチドまたはタンパク質が、一般配列（ａ）：
[Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)n Ala Ser]m
（配列中、ｎは１以上の整数を示す。ｍは１〜３０の整数を示す。）
で表される請求項１〜８のいずれかに記載の医療用材料。
【請求項１０】
インプラント、人工膝関節または人工股関節である請求項１〜９のいずれかに記載の医療用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内に埋植して使用する医療用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に埋植して使用する医療用材料として、基材の表面に細胞接着性配列領域を含むペプチドやタンパク質からなる皮膜を形成してなるものが知られている（例えば、特許文献１参照）。このような医療用材料は、例えばインプラント等に使用されるとともに、インプラント周囲における早期の組織形成を目的として、細胞接着性配列領域を含むペプチドやタンパク質を、ディップコーティングやシランカップリング剤等によって基材へ固定化することが検討されている。
【０００３】
生体内に埋植して使用する医療用材料の皮膜には、埋植後組織が形成されるまで安定して存在することが求められる。
しかし、特許文献１に記載されているような従来の細胞接着性配列領域を含むペプチドやタンパク質には水溶性のものが多く、それゆえ単なるディップコーティングでは、皮膜が安定して存在し難いという問題があった。
【０００４】
一方、シランカップリング剤による固定化では、工程が煩雑になるという問題がある。また、シランカップリング剤による固定化方法に用いられている従来の細胞接着性配列領域を含むペプチドやタンパク質は、１分子中の細胞接着シグナルを表す最少アミノ酸配列の数が少なく、細胞接着性、シグナル伝達系の活性化が不十分であった。さらに、ディップコーティングやシランカップリング剤等による固定化では、細胞接着性配列領域の運動性が損なわれ易く、細胞接着性、シグナル伝達系の活性化が不十分になるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４５１０５１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、細胞接着性に優れ、かつシグナル伝達系を活性化できる医療用材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、以下の構成からなる解決手段を見出し、本発明を完成するに至った。
（１）基材の表面に皮膜が形成されてなり、前記皮膜が、細胞接着性配列領域および絹由来配列領域を含むペプチドまたはタンパク質からなり、前記絹由来配列領域が、固体状態において逆平行βシート構造であることを特徴とする医療用材料。
（２）前記基材の構成材料が、チタン合金またはコバルト−クロム−モリブデン合金である前記（１）に記載の医療用材料。
（３）前記皮膜が、アルコール処理されている前記（１）または（２）に記載の医療用材料。
（４）前記アルコール処理におけるアルコールが、炭素数１〜４の低級アルコールである前記（３）に記載の医療用材料。
（５）前記アルコール処理が、アルコール濃度５０ｖ／ｖ％以上のアルコール水溶液中か、またはアルコール中に前記皮膜を浸漬することによって行われている前記（３）または（４）に記載の医療用材料。
（６）前記細胞接着性配列領域が、固体状態においてランダムコイルである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の医療用材料。
（７）前記細胞接着性配列領域が、Gly Arg Gly Asp Ser配列を含む前記（１）〜（６）のいずれかに記載の医療用材料。
（８）前記Gly Arg Gly Asp Ser配列の個数が、１〜３０個である前記（７）に記載の医療用材料。
（９）前記ペプチドまたはタンパク質が、一般配列（ａ）：[Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)n Ala Ser]m（配列中、ｎは１以上の整数を示す。ｍは１〜３０の整数を示す。）で表される前記（１）〜（８）のいずれかに記載の医療用材料。
（１０）インプラント、人工膝関節または人工股関節である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の医療用材料。
【０００８】
なお、本発明における「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着し易くなる性質を意味するものとする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞接着性を向上させ、かつシグナル伝達系を活性化させて、早期の組織形成を達成できるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１の初期細胞接着性および増殖性の評価結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、実施例１のシグナル伝達系の活性化の評価結果を示す図である。
【図３】（ａ）〜（ｅ）は、実施例２の構造評価における１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定結果を示す図である。
【図４】実施例３の含水状態の運動性における１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の医療用材料は、生体内に埋植して使用するものであり、基材の表面に皮膜が形成されてなる。基材の構成材料としては、例えば整形外科分野や循環器分野等で使用される金属または非金属医療用材料等が挙げられ、具体例としては、チタン、チタン合金、コバルト−クロム−モリブデン合金、ステンレス鋼、ポリエチレン等の合成樹脂等が挙げられ、特にチタン合金またはコバルト−クロム−モリブデン合金であるのが好ましい。
【００１２】
皮膜は、細胞接着性配列領域および絹由来配列領域を含むペプチドまたはタンパク質からなるとともに、絹由来配列領域が固体状態において逆平行βシート構造である。これにより、皮膜全体が水、緩衝溶液、体液、細胞培養用の培地等に対して不溶化され、埋植後組織が形成されるまで安定して存在するようになる。また、細胞接着性配列領域が、固体状態および含水状態のいずれにおいても高い運動性を示すようになり、その結果、細胞接着性が向上し、かつシグナル伝達系を活性化できる。これらの理由としては、以下の理由が推察される。
【００１３】
すなわち、皮膜を構成している上述したペプチドまたはタンパク質は、細胞接着性配列領域および絹由来配列領域のそれぞれを、複数含んでいる。絹由来配列領域は疎水性であり、この絹由来配列領域が固体状態において逆平行βシート構造であると、隣接している絹由来配列領域同士が互いに架橋して水素結合を形成する。この水素結合が皮膜中に複数形成されていることによって、皮膜全体が水、緩衝溶液、体液、細胞培養用の培地等に対して不溶化されるものと推察される。また、細胞接着性配列領域は、隣接している水素結合の間に位置するようになり、これに起因して細胞接着性配列領域が固体状態および含水状態のいずれにおいても高い運動性を示すようになると推察される。なお、絹由来配列領域が固体状態において逆平行βシート構造であることの確認は、例えば１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定等によって行うことができる。
【００１４】
絹由来配列領域を固体状態において逆平行βシート構造とするには、例えば皮膜に対してアルコール処理や加湿処理等を施せばよい。特にアルコール処理を採用すると、簡単に効率よく絹由来配列領域を固体状態において逆平行βシート構造にできる。
【００１５】
アルコール処理は、アルコールを水で希釈したアルコール水溶液中か、アルコール中に皮膜を浸漬することによって行うのが好ましい。アルコールとしては、例えば炭素数１〜４の低級アルコール等が挙げられ、炭素数１〜４の低級アルコールとしては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられ、これらは１種または２種以上を混合して用いてもよく、特にメタノールおよびエタノールから選ばれる少なくとも１種であるのが好ましい。また、水としては、純水や超純水等の純度の高いものが好ましい。
【００１６】
アルコール水溶液のアルコール濃度としては、５０ｖ／ｖ％以上であるのが好ましく、７０ｖ／ｖ％以上であるのがより好ましく、９０ｖ／ｖ％以上であるのがさらに好ましい。アルコール濃度があまり低いと、アルコール処理による効果が得られ難くなるので好ましくない。皮膜を浸漬する際のアルコール水溶液およびアルコールの温度としては、４〜２５℃程度が適当であり、皮膜の浸漬時間としては、１５〜６０分程度が適当である。
【００１７】
皮膜を構成している細胞接着性配列領域および絹由来配列領域のうち細胞接着性配列領域は、固体状態において絹由来配列領域から独立してランダムコイルであるのが好ましい。これにより、細胞接着性配列領域の運動性を向上させることが可能となる。この理由としては、細胞接着性配列領域が固体状態においてランダムコイルであると、細胞接着性配列領域が皮膜の表面に露出し易く、これに起因して運動性が向上するものと推察される。細胞接着性配列領域が固体状態においてランダムコイルであることの確認は、例えば１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定等によって行うことができる。
【００１８】
細胞接着性配列領域は、Gly Arg Gly Asp Ser配列を含むのが好ましい。Gly Arg Gly Asp Ser配列は、高い運動性を示す。Gly Arg Gly Asp Ser配列の個数としては、１〜３０個であるのが好ましく、１〜２０個であるのがより好ましく、１〜１０個であるのがさらに好ましい。
【００１９】
一方、絹由来配列領域は、絹由来の配列を含むものであり、具体例としては、Ala Gly Ser Gly Ala Gly連鎖領域、Gly Ala Gly Ala Gly Tyr連鎖領域、Gly Ala連鎖領域を含む家蚕絹由来結晶部領域の配列；Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly配列、Ala連鎖領域とGlyリッチ領域とを含むクモ由来絹；Ala Ala Gly連鎖領域、Ala Gly連鎖領域、Ala連鎖領域とGlyリッチ領域とを含む野蚕絹由来結晶部領域；等が挙げられる。連鎖領域は、３回以上繰り返されているのが好ましい。
【００２０】
上述した細胞接着性配列領域および絹由来配列領域を含むペプチドまたはタンパク質としては、上述した一般配列（ａ）で表されるものが好ましい。一般配列（ａ）中、ｎは１以上、好ましくは３〜１０、より好ましくは３〜５の整数を示す。また、ｍは１〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０の整数を示す。
【００２１】
上述したペプチドまたはタンパク質は、例えば遺伝子工学的手法；酵素法、固相合成法、液相合成法等の有機合成法；等によって作製することができる。得られたペプチドまたはタンパク質を、例えば緩衝溶液等に加えて溶解させ、基材の表面に塗布して乾燥させることによって、基材の表面に皮膜を形成することができる。緩衝溶液としては、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）等が挙げられる。乾燥する際の雰囲気温度としては、２０〜２５℃程度が適当である。形成される皮膜の厚さとしては、５〜１０μｍ程度が適当である。
【００２２】
そして、形成された皮膜に対して上述したアルコール処理や加湿処理等を施し、絹由来配列領域を固体状態において逆平行βシート構造にし、本発明の医療用材料を得る。本発明の医療用材料上において、例えば歯髄細胞、骨芽細胞様細胞、血管内皮細胞等の種々の細胞は、有意に高い接着性および増殖性を示すとともに、シグナル伝達系の活性化を示すようになる。それゆえ、本発明の医療用材料は、例えばインプラント、人工膝関節、人工股関節等に好適に用いることができる。
【００２３】
以下、作製例および実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の作製例および実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】
＜作製例１＞
上述した一般配列（ａ）中、ｎが３であり、ｍが１０である配列：[Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3Ala Ser]10で表されるタンパク質（ａ１）を含むタンパク質として、Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile Gly Ser Ser Arg Thr Ser [Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3 Ala Ser]10 Met Ser Arg Val Asp Leu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His配列（配列番号１）で表されるタンパク質（Ａ）を、遺伝子工学的手法によって作製した。
【００２５】
具体的には、まず、絹フィブロインの各配列および細胞接着性配列をコードする遺伝子にタンデム重合のための制限酵素認識配列を付与したオリゴヌクレオチドをそれぞれ設計し、それらを重合して目的配列が１０回繰り返されている遺伝子を構築した。
【００２６】
次に、各遺伝子を発現ベクターｐＥＴ３０ａに導入後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを宿主としてタンパク質を発現させ、アフィニティ精製後に濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製してタンパク質（Ａ）を得た。そして、得られたタンパク質（Ａ）中に目的のバンド、すなわちタンパク質（ａ１）が含まれていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって確認した。
【００２７】
＜作製例２＞
Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Gly Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly配列（配列番号２）で表されるペプチド（Ｂ）を、有機合成法によって作製した。
【００２８】
具体的には、まず、Ｆｍｏｃ固相合成法によって合成スケール０．２ミリモルで目的配列を有する粗ペプチドを合成した。次に、得られた粗ペプチドを水に溶解させ、逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、ペプチド（Ｂ）を得た。
【実施例１】
【００２９】
＜医療用材料の作製＞
まず、作製例１で得られたタンパク質（Ａ）を緩衝溶液に加えて溶解させ、基材の表面に塗布して雰囲気温度２３℃で乾燥させ、基材の表面に厚さ５μｍの皮膜が形成されてなる医療用材料（Ａ）を得た。使用した緩衝溶液および基材は、以下の通りである。
緩衝溶液：ＧＩＢＣＯ社製のリン酸緩衝生理食塩水「ＰＢＳ  １００１０−０２３」
基材：チタン合金（Ｔｉ−６Ａｌ−４Ｖ）
【００３０】
次に、得られた医療用材料（Ａ）の皮膜をアルコール処理し、医療用材料（Ｂ）を得た。アルコール処理は、アルコール水溶液中に医療用材料（Ａ）を浸漬することによって行った。用いたアルコール水溶液の組成および温度、並びに浸漬時間は、以下の通りである。
アルコール水溶液の組成：メタノールを純水で希釈したメタノール濃度９０ｖ／ｖ％のメタノール水溶液
アルコール水溶液の温度：２５℃
浸漬時間：３０分
【００３１】
＜評価＞
得られた医療用材料（Ｂ）について、細胞接着性およびシグナル伝達系の活性化を評価した。各評価方法を以下に示すとともに、その結果を図１および図２に示す。
【００３２】
（細胞接着性）
医療用材料（Ｂ）の皮膜の表面に、マウス骨芽細胞様細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２で播種し、cell viabililty assayによって１日、３日、７日毎に生細胞数をそれぞれ定量した。その結果を、試料Ｎｏ．１として図１に示す。
【００３３】
また、試料Ｎｏ．１とは別に、上述したチタン合金からなる基材の表面に直接マウス骨芽細胞様細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２で播種し、cell viabililty assayによって１日、３日、７日毎に生細胞数をそれぞれ定量した。その結果を、試料Ｎｏ．２として図１に示す。
【００３４】
図１から明らかなように、細胞播種後１日において、試料Ｎｏ．１は試料Ｎｏ．２よりも生細胞数が多いことから、試料Ｎｏ．１は試料Ｎｏ．２よりも細胞接着性に優れているのがわかる。また、試料Ｎｏ．１は細胞播種後３日でコンフルエントに達しているのに対し、試料Ｎｏ．２は細胞播種後７日でコンフルエントに達する結果を示した。これらの結果から、試料Ｎｏ．１は試料Ｎｏ．２よりも細胞接着性に優れ、かつ高い細胞増殖性を示すことがわかる。
【００３５】
（シグナル伝達系の活性化）
医療用材料（Ｂ）の皮膜の表面に、マウス骨芽細胞様細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２で播種し、細胞播種後２時間において、ＤＡＰＩ、抗ビンキュリン抗体、抗ｐＦＡＫ抗体によって染色をした。その結果を、図２（ａ）〜（ｃ）に示す。なお、図２（ａ）〜（ｃ）の詳細は、以下の通りである。
図２（ａ）：接着斑ビンキュリンの蛍光染色結果を示す図である。
図２（ｂ）：活性化ドメインｐＦＡＫの蛍光染色結果を示す図である。
図２（ｃ）：図２（ａ），（ｂ）を重ね合わせた状態を示す図である。
【００３６】
図２（ａ）〜（ｃ）から明らかなように、ビンキュリンとｐＦＡＫ、すなわち活性化ドメインの分布とに重なりが得られていることから、シグナル伝達系が活性化されているのがわかる。
【実施例２】
【００３７】
作製例１，２で得られたタンパク質（Ａ），ペプチド（Ｂ）について、構造を評価した。具体的には、タンパク質（Ａ），ペプチド（Ｂ）の固体状態における１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定を行った。測定装置および測定条件は、以下の通りである。
測定装置：Ｂｒｕｃｋｅｒ社製の「ＡＶＡＮＣＥ−４００」
測定条件：Spect Freq obs. 100.6MHz, spect freq irr. 400 MHz, H90 pulse 6msec, contact time 2 ms, pulse delay 3 sec, RG 2048, acq time 7.5 msec, spin rate 8kHz
【００３８】
また、(Ala Gly)15配列（配列番号３）、(Ala Gly Ser Gly Ala Gly)5配列（配列番号４）、ペプチド（Ｂ）をAla Gly Ser Gly Ala Gly [3-13C] Ala7Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Gly Thr [2-13C] Gly19Arg [1-13C] Gly Asp Ser Pro Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glyで表されるように同位体ラベル化したものについても、タンパク質（Ａ），ペプチド（Ｂ）と同様にして固体状態における１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定を行った。これらの測定結果を、図３（ａ）〜（ｅ）に示す。
【００３９】
なお、(Ala Gly)15配列（配列番号３）、(Ala Gly Ser Gly Ala Gly)5配列（配列番号４）はいずれも、コントロールであり、ペプチド（Ｂ）と同様にＦｍｏｃ固相合成法によって作製したものである。また、図３（ａ）〜（ｅ）の詳細は、以下の通りである。
図３（ａ）：(Ala Gly)15配列
図３（ｂ）：(Ala Gly Ser Gly Ala Gly)5配列
図３（ｃ）：タンパク質（Ａ）
図３（ｄ）：実線が同位体ラベル化したペプチド（Ｂ）、破線が同位体ラベル化していないペプチド（Ｂ）
図３（ｅ）：図３（ｄ）における実線と破線との差を示すスペクトル
【００４０】
図３（ａ）〜（ｃ）におけるAla Cβの化学シフトと波形から明らかなように、絹由来配列領域（Ala Gly Ser Gly Ala Gly）が、図３（ａ）ではtype-IIβ-turn構造（Silk I）であり、図３（ｂ），（ｃ）では主に逆平行βシート構造（Silk II）であるのがわかる。
【００４１】
また、図３（ｄ），（ｅ）から明らかなように、絹由来配列領域（Ala Gly Ser Gly Ala Gly）が逆平行βシート構造であり、細胞接着性配列領域（Gly Arg Gly Asp Ser）がランダムコイルであるのがわかる。
【実施例３】
【００４２】
作製例２で得られたペプチド（Ｂ）について、乾燥状態と含水状態の運動性を評価した。同位体ラベル化したペプチド（Ｂ）について２５℃の雰囲気温度中で、１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定を行った。測定装置および測定条件は、以下の通りである。
測定装置：Ｂｒｕｃｋｅｒ社製の「ＡＶＡＮＣＥ−４００」
測定条件：Spect Freq obs. 100Hz, spect freq irr. 400 MHz, H90 pulse 4.5sec, contact time 2 ms, pulse delay 3 sec, RG 2048, acq time 29msec, spin rate 8kHz
【００４３】
次に、乾燥状態にある同位体ラベル化したペプチド（Ｂ）を、水温２５℃の水中に３０分間浸漬し含水状態にした後、乾燥状態の場合と同様にして１３Ｃ  ＣＰ／ＭＡＳ測定を行った。乾燥状態および含水状態の各々の測定結果を、図４に示す。
【００４４】
図４から明らかなように、乾燥状態における複数のピークのうちGly Asp部位のピークのみが、含水状態において減少しているのがわかる。この結果より、細胞接着性配列領域のGly Arg Gly Asp Ser配列は、含水状態において高い運動性を示すのがわかる。
【図１】
2013135740.tif 000002
【図２】
2013135740.tif 000003
【図３】
2013135740.tif 000004
【図４】
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【配列表】
2013135740000001.xml