(57)【要約】【解決課題】本発明は，ヒアルロン酸オリゴ糖の，細胞外基質形成促進に対する効果を明らかにし，ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分とする細胞外基質形成促進剤を提供することを課題とする。【解決手段】ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を有効成分として含有する細胞外基質形成促進剤は，細胞が細胞外基質を形成することを促進する。さらに，ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分として含有する細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質を成長させケーブル状細胞外基質の形成を促進することができる。【選択図】図３
2013170149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を有効成分として，有効量含有し，
前記ヒアルロン酸オリゴ糖は２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖である，細胞外基質形成促進剤。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸オリゴ糖は４糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖である，請求項１に記載の細胞外基質形成促進剤。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸オリゴ糖が４糖のヒアルロン酸オリゴ糖である，請求項１に記載の細胞外基質形成促進剤。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞外基質形成促進剤を含む，医薬品。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞外基質形成促進剤を含む，食品。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞外基質形成促進剤を含む，化粧料。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞外基質形成促進剤を含む，医薬部外品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分とする細胞外基質形成促進剤に関する。具体的に説明すると，本発明は，細胞が細胞外基質を形成することを促進する細胞外基質形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から，ヒアルロン酸は，医薬品や化粧料に保湿成分として用いられている。また，ヒアルロン酸は，関節，皮膚，脳などの細胞外マトリックスを構成する天然高分子としても知られている。
【０００３】
ヒアルロン酸は，Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖単位が連結した多糖類である。ヒアルロン酸は，その分子量によって，高分子量ヒアルロン酸，低分子量ヒアルロン酸又は超低分子量ヒアルロン酸であるヒアルロン酸オリゴ糖に分類される。高分子量ヒアルロン酸の分子量は一般的に１０万から１００万程度である。低分子量ヒアルロン酸の分子量は１万から１０万程度である。超低分子量ヒアルロン酸であるヒアルロン酸オリゴ糖の分子量は，４００から１万程度である（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２２８巻第１３２４〜１３２６頁（１９８５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒアルロン酸は，様々な生理活性を持っており，その生理活性は分子量によって大きく異なる。特に，ヒアルロン酸オリゴ糖は，低分子量のヒアルロン酸や高分子量のヒアルロン酸と非常に異なる生理活性を持つことが知られているが，その機能や効用は未だ明らかではなかった。また，ヒアルロン酸オリゴ糖が，細胞外基質を形成することを促進することについては知られていなかった。
そこで，本発明は，ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分として含有し，細胞外基質又はケーブル状細胞外基質を形成することを促進する細胞外基質形成促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は，ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分として含有する細胞外基質形成促進剤が，細胞外基質の形成を促進するという知見を得た。さらに，本発明者は，ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分として含有する細胞外基質形成促進剤が，細胞外基質を成長させるという知見を得た。
【０００７】
本発明は，ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を有効成分として，有効量含有する細胞外基質形成促進剤に関する。ヒアルロン酸オリゴ糖は，２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖である。ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を含有する細胞外基質形成促進剤は，２糖以上２０糖以下のサイズから選択されたヒアルロン酸オリゴ糖を含有することにより，細胞外基質の形成を促進する。
【０００８】
本発明の好ましい態様は，ヒアルロン酸オリゴ糖が，４糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸オリゴ糖である。ヒアルロン酸オリゴ糖が４糖以上１０糖以下のサイズから選択されることにより，より効果的に，細胞外基質の形成を促進する。
【０００９】
本発明の好ましい態様は，ヒアルロン酸オリゴ糖が４糖のヒアルロン酸オリゴ糖である。４糖のヒアルロン酸オリゴ糖は，分子量が小さく，細胞内への浸透性に優れているため，より効果的に，細胞外基質の形成を促進することができる。
【００１０】
本発明の他の側面は，細胞外基質形成促進剤を含む医薬品に関する。本発明の医薬品は，生体表面に塗布されても良いし，経口投与又は非経口投与によって生体内の組織に吸収されるように投与されても良い。
【００１１】
本発明の他の側面は，細胞外基質形成促進剤を含む食品に関する。本発明の食品は，生体内の組織に吸収されるようにヒアルロン酸オリゴ糖を含有する。
【００１２】
本発明の他の側面は，細胞外基質形成促進剤を含む化粧料に関する。本発明の化粧料は，生体表面に塗布されることで，皮膚細胞に浸透し，効力を発揮することができる。
【００１３】
本発明の他の側面は，細胞外基質形成促進剤を含む医薬部外品に関する。本発明の化医薬部外品は，生体表面に塗布されても良いし，経口投与又は非経口投与によって生体内の組織に吸収されるように投与されても良い。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば，ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を有効成分として含有する細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質形成を促進することができる。
また，２糖以上２０糖以下のヒアルロン酸オリゴ糖は，合成や分解によって容易に生成されるため，製造コストを抑えることができる。このため，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，安価なコストで得ることができる。
【００１５】
また，従来の高分子量のヒアルロン酸は，粘性が高いため，細胞内に浸透しにくいという問題があった。しかし，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は低粘度であり，分子量の小さいヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分として含有しているため，細胞内に浸透しやすく，効果的に細胞外基質形成を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は，ヒト表皮角化細胞の様子を撮影したものである。図１（ａ）は，ヒアルロン酸オリゴ糖を加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｂ）は，０．０１μｇ／ｍｌのヒアルロン酸オリゴ糖を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｃ）は，細胞外基質を形成したヒト表皮角化細胞の様子を拡大して示したものである。
【図２】図２は，細胞外基質を持った細胞の出現率をグラフで示したものである。
【図３】図３は，ケーブル状細胞外基質を持ったヒト表皮角化細胞の様子を撮影したものである。
【図４】図４は，ケーブル状細胞外基質を持った細胞の出現率をグラフで示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の細胞外基質形成促進剤には，ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体が有効成分として含まれる。本発明の細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質の形成を促進するものである。さらに，本発明の細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質を成長させケーブル状細胞外基質の形成を促進することができる。
【００１８】
（ヒアルロン酸オリゴ糖）
ヒアルロン酸は，Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖単位が連結した多糖類であり，哺乳類の生体内で，関節，硝子体，皮膚，脳などの細胞外マトリックスを構成する天然高分子として知られている。ヒアルロン酸は，その分子量によって，高分子量ヒアルロン酸，低分子量ヒアルロン酸又は超低分子量ヒアルロン酸であるヒアルロン酸オリゴ糖に分類される。高分子量ヒアルロン酸の分子量は一般的に１０万から１００万程度である。低分子量ヒアルロン酸の分子量は１万から１０万程度である。超低分子量ヒアルロン酸であるヒアルロン酸オリゴ糖の分子量は，約２００から１万程度である。本明細書において，超低分子量のヒアルロン酸をヒアルロン酸オリゴ糖という。
【００１９】
ヒアルロン酸オリゴ糖は，Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二糖単位が連結した２糖を基本単位として構成される。本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は，基本的にはＤ−グルクロン酸の１位とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの３位が結合した２糖の基本単位を少なくとも１単位含む２糖以上のものであればよい。本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は，２糖単位が１単位以上１０単位以下結合したものであることが好ましく，これらの塩又は誘導体であってもよい。２糖のヒアルロン酸オリゴ糖とは，基本単位を１単位含むもので，４糖のヒアルロン酸オリゴ糖とは，基本単位を２単位含むものである。
【００２０】
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は，基本単位が１単位以上１０単位以下，すなわち２糖以上２０糖以下のサイズであること好ましい。さらに，本発明に用いるヒアルロン酸オリゴ糖は，基本単位が４糖以上１６糖以下のサイズであることがより好ましく，４糖以上１０糖以下のサイズであることがさらに好ましく，４糖で構成されることが特に好ましい。本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は，２糖以上２０糖以下のサイズであれば，複数種のサイズが混合したものでも良く，単一のサイズのものから構成されても良い。本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖に単一のサイズのものを用いる場合は，４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を用いることが好ましい。４糖のヒアルロン酸オリゴ糖は，特に，効果的に細胞外基質の形成を促進する。
【００２１】
ヒアルロン酸オリゴ糖の塩とは，薬学的に許容されるヒアルロン酸オリゴ糖の塩を意味する。ヒアルロン酸オリゴ糖の塩として，アルカリ金属塩が好ましく，ナトリウム塩がより好ましい。本明細書において，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩には，無水塩のみならず含水塩が含まれても良い。これらの塩は，例えば，溶液内で電離してヒアルロン酸オリゴ糖と同様に機能する。
【００２２】
ヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体とは，薬学的に許容されるヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を意味する。ヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体として，アシル基などの加水分解性保護基を有したもの，あるいはレシチンなどを結合させたものを使用することができる。
【００２３】
本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体のうち１種類のみを含むものであってもよく，複数種の混合物を含むものであってもよい。複数種のアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体には，サイズや分子構造の異なるアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を含んでもよい。
【００２４】
本発明は，２糖以上２０糖以下のヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分とするものであるため，細胞外基質形成促進剤の粘性を低く抑えることができる。従来の高分子量のヒアルロン酸は，粘性が高いため，細胞内に浸透しにくいという問題があった。また，従来の高分子量のヒアルロン酸は，高粘度のため，効率よく広範囲に塗布することが不可能であった。
しかし，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，２糖以上２０糖以下の低分子量のヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分とするものであるため，細胞内に浸透しやすい。また，低粘度であるため，効率よく広範囲に細胞外基質形成促進剤を塗布することができる。このため，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，より効果的に，細胞外基質の形成を促進することができる。
また，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，必要に応じて，増粘剤を添加して，粘性を高めて使用してもよい。このため，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，適用領域が広い。
【００２５】
（細胞外基質）
細胞外基質は，細胞の外に存在し，タンパク質，脂質およびグリコサミノグリカンなどの糖質などから構成される分子構造体である。細胞外基質は，皮膚などの体表面だけでなく，生体内の組織や，軟骨といった組織にも存在する構造体である。
細胞外基質は，細胞間の骨格的役割を果たし，細胞増殖や細胞運動時の足場として機能する。また，細胞外基質は，細胞間の接着に関与し，細胞増殖因子や，細胞成長因子といった分泌物を保持する機能も有する。細胞外基質は，皮膚などの体表面においては，皮膚に弾力を与え，外部からの異物の侵入を防ぐ機能を有する。さらに，細胞外基質は，生体内においては，臓器を支持し，組織の境界線を形成する働きを担う。
このように，細胞外基質は，組織や細胞の成長段階に合わせて様々な形態をとることで，様々な生命活動に寄与している。
【００２６】
上述したように，細胞外基質は，細胞増殖や，細胞運動にも寄与している。このため，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質の形成を促進することで，細胞外基質が関与する疾患の治療を行うことができる。
また，細胞外基質は，細胞増殖時に増殖細胞の足場として重要な働きをする。また，細胞外基質は細胞周囲の環境として細胞を良好な状態に保つ作用がある。
【００２７】
細胞外基質は，皮膚の表面にも存在し，皮膚に弾力を与える働きをすることから，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，皮膚に弾力を与えるための化粧料としても効果を発揮する。
また，細胞外基質は，外部からの異物の侵入を防ぐ働きをするため，細胞外基質形成促進剤は，生体防御の機能を促進することができる。
このように，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質の形成を促進することで，生体組織の様々な場所において，効力を発揮する。
【００２８】
（ケーブル状細胞外基質）
本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質を成長させケーブル状細胞外基質の形成を促進する剤としても用いることができる。ケーブル状細胞外基質とは，複数の細胞に股がって伸びた一連の細胞外基質のことをいう。本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，細胞外基質の形成を促進する過程で，細胞外基質の成長を促進する。
本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，ケーブル状細胞外基質を形成することで，広範囲に渡って，一連の細胞外基質を形成することができる。ケーブル状細胞外基質は，個々の細胞外基質よりも広範囲に渡って伸長するため，細胞増殖や細胞運動を，広範囲に渡って制御することができる。
【００２９】
（ヒアルロン酸オリゴ糖の製造方法）
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は，動物等の天然物から抽出されたもの，微生物を培養して得られたもの，化学的もしくは酵素的に合成されたものを使用することができる。例えば鶏冠，臍体，皮膚，関節液などの生体組織から公知の抽出法と精製法によって得ることができる。また乳酸菌やストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によっても製造できる。
また本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は，市販の高分子量のヒアルロン酸を酵素分解，酸分解，塩基分解，加熱処理，超音波処理などの分解処理により製造することができる。
【００３０】
酵素分解の方法によりヒアルロン酸オリゴ糖を製造する場合，国際公開第２００２／４４７１号パンフレットや，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２年，第１２巻，第７号，第４２１−４２６頁に開示される方法に準じて製造することができる。高分子量ヒアルロン酸塩を，溶液のｐＨが５付近になるように緩衝液（例えば，０．１Ｍリン酸緩衝液）に溶解し，ヒアルロニダーゼを添加して加水分解を行う。加水分解の温度は，３７℃付近が好ましく，１〜２４時間程度反応させる。反応後，１０，０００ｒｐｍ程度で遠心分離して上清を回収し，この上清をイオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸オリゴ糖を得ることができる。
【００３１】
酸加水分解によりヒアルロン酸オリゴ糖を製造する場合，高分子量ヒアルロン酸塩を，濃塩酸の５０％水溶液中において，４０℃〜還流温度で１〜５時間程度反応させる。反応後，イオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸オリゴ糖を得ることができる。
また，ＤＭＳＯの溶媒中に０．０５〜１Ｍ程度の塩酸を用いて加熱することにより，より緩和な条件下で加水分解を行うこともできる。
【００３２】
本発明で使用するヒアルロン酸オリゴ糖は，合成や分解によって容易に生成されるため，製造コストを抑えることができる。このため，本発明に係る細胞外基質形成促進剤は，安価なコストで得ることができる。
【００３３】
また，ヒアルロン酸オリゴ糖は毒性や抗原性がほとんどないことや，生体が元来有している治療作用や疾患の防止作用を増強することから，副作用の極めて少ない細胞外基質形成促進剤として有効に作用する。
【００３４】
（有効量）
ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体の含有量は，本発明の効果を発揮するものであれば特に限定されるものではないが，ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体は，細胞外基質形成促進剤の総重量に対して，０．０１重量％以上１０重量％以下，好ましくは０．１重量％以上５重量％以下，さらに好ましくは，０．５重量％以上２重量％以下含まれることが好ましい。ヒアルロン酸オリゴ糖に対するヒアルロン酸オリゴ糖の含有率は，ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体の合計重量の含有率である。
【００３５】
本発明の他の側面は，ヒアルロン酸オリゴ糖，ヒアルロン酸オリゴ糖の塩又はヒアルロン酸オリゴ糖の誘導体を含有する細胞外基質形成促進剤を含む医薬品，食品，化粧料，又は医薬部外品に関する。細胞外基質形成促進剤を含む医薬品は，例えば，錠剤，液剤，乾燥粉末剤，注射剤，点滴剤，外用剤，貼付剤，気化投与用の液剤又は挿入剤とすることができる。
細胞外基質形成促進剤を含む食品は，例えば，液状食品，錠剤食品，粉末状食品，及び顆粒状食品とすることができる。
細胞外基質形成促進剤を含む化粧料は，例えば，点眼剤，ゲル，クリーム，スプレー液剤，噴霧液剤，又は泡状エアゾール製剤とすることができる。化粧料には，ゲル状やシート状のフェイスマスクも含まれる。
細胞外基質形成促進剤を含む医薬部外品は，例えば，錠剤，液剤，乾燥粉末剤，外用剤，貼付剤，液剤，ゲル，クリーム，スプレー液剤，噴霧液剤，又は泡状エアゾール製剤とすることができる。
【００３６】
本発明に係る細胞外基質形成促進剤を含む医薬品，食品，化粧料，又は医薬部外品は，１種又は２種以上の薬学的に許容される担体又は成分と組み合わせて調製しても良い。本発明に係る医薬品，化粧料又は医薬部外品には，例えば，ステアリン酸カルシウムや乳化剤といった滑沢剤，イオン交換水などの角質層へ水分を供給するための精製水，グリセリン，ＰＥＧといった角質層の保湿のための保湿剤，エステル油，植物油といった保湿性や使用感の向上のためのエモリエント剤（水分が蒸発することを防ぐ油成分），原料成分を可溶化するための可溶化剤，ｐＨを調整するための緩衝剤，微生物を抑制し，腐敗を防止するための防腐剤，着色するための着色剤，紫外線吸収剤といった退色や変色を防止するための退色防止剤，収れん剤，殺菌剤，賦活剤，及び消炎剤といった薬剤を加えることができる。
本発明に係る食品には，例えば，ビタミンＢ１，ビタミンＢ２，ビタミンＢ６，ビタミンＢ１２，葉酸，ナイアシン，及びビタミンＥといったビタミン類，油脂類，増粘剤，防腐剤，着色料，並びに酸化防止剤，調味料，酸味料，甘味料を加えることができる。
【００３７】
細胞外基質形成促進剤を含む医薬品を投与する方法としては，経口又は非経口投与する方法があげられる。経口投与の場合は，１日１回又は数回に分けて錠剤や，顆粒剤又は液剤を経口投与することが好ましい。非経口投与の場合は，治療薬を含む液剤を生体内に灌流または静脈注射により投与することが好ましい。
【実施例１】
【００３８】
細胞外基質形成促進剤の調製
ヒアルロン酸オリゴ糖は，Ｈｙａｌｏｓｅ社製のＨＹＡ−ＯＬＩＧＯ４ＥＦ５を用いて，細胞外基質形成促進剤を調製した。
ヒアルロン酸オリゴ糖の最終濃度が０．０１μｇ／ｍｌ，０．１μｇ／ｍｌ，１．０μｇ／ｍｌ，１０μｇ／ｍｌとなるように，ヒアルロン酸オリゴ糖を細胞培養液に加えて，攪拌し，溶解した。コントロール用組成物として，ヒアルロン酸オリゴ糖を添加していない細胞培養液を用意した。細胞培養液には，Ｇｉｂｃｏ社のｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ＳＦＭを用いた。
【００３９】
アジア人女性由来のヒト表皮角化細胞を培養し，準備した。ヒト表皮角化細胞は，長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて３７℃，５％ＣＯ２下で培養した後，トリプシン処理により細胞を回収した。その後，細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し，一晩培養した。培養終了後，各ｗｅｌｌの培養液を，ヒアルロン酸オリゴ糖を添加していない細胞培養液，ヒアルロン酸オリゴ糖を添加した各濃度の細胞培養液に替え，２４時間培養した。
【００４０】
２４時間経過後に，各ｗｅｌｌの細胞をアルシアンブルーで染色した。アルシアンブルーは，細胞外基質成分であるグリコサミノグリカンを染色する成分である。
染色した細胞を，ニコン社製の顕微鏡を用いて観察し，細胞の形状及び細胞の染色像を撮影した。
【００４１】
図１は，ヒアルロン酸オリゴ糖を添加した細胞培養液又はヒアルロン酸オリゴ糖を添加していない細胞培養液でヒト表皮角化細胞を２４時間培養し，アルシアンブルーで染色した各細胞群を撮影したものである。図中の矢印は，細胞外基質も持った細胞を示している。
図１（ａ）は，ヒアルロン酸オリゴ糖を加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ａ）に示されているように，細胞外基質を形成した細胞の数は少ないことがわかる。また，細胞外基質を形成した場合においても，その細胞外基質が広がる範囲は狭く，細胞外基質が発達していないことがわかる。
図１（ｂ）は，０．０１μｇ／ｍｌのヒアルロン酸オリゴ糖を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｂ）に示されているように，細胞外基質を形成した細胞の数は，ヒアルロン酸オリゴ糖を加えていない培養液で培養した細胞群に比べて多いことがわかる。また，細胞外基質を形成した場合，その細胞外基質が広がる範囲は図１（ａ）と比較して広く，細胞外基質が発達していることがわかる。
図１（ｃ）は，図１（ｂ）で細胞外基質を形成したヒト表皮角化細胞を拡大して示したものである。細胞外基質は，細胞の周囲に円形状や，線状に形成されていることがわかる。
【００４２】
図２は，４糖又は６糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した細胞培養液，又はヒアルロン酸オリゴ糖を添加していない細胞培養液でヒト表皮角化細胞を２４時間培養した後に，細胞外基質を形成した細胞の出現率をグラフで示したものである。グラフの縦軸は，単位面積あたりの細胞外基質を形成した細胞の個数を示している。
ヒアルロン酸オリゴ糖を添加していない細胞培養液で培養した細胞群では，数個の細胞が細胞外基質を形成したのみであった。一方，４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合は，０．０１μｇ／ｍｌの濃度において，細胞外基質を持った細胞が，３５個以上観察された。４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合は，添加量が低濃度であっても細胞外基質を持った細胞の出現率が増加していることがわかる。４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合における細胞外基質を持った細胞の出現率は，０．１μｇ／ｍｌまでは濃度依存的に増加することがわかる。出現率は，１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの高濃度においては，減少傾向となるが，細胞外基質を形成した細胞の出現率と比較すると有意に高いことがわかる。
６糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合は，１０μｇ／ｍｌの高濃度において，細胞外基質を持った細胞の出現率が増加することがわかる。
【００４３】
図３は，ヒアルロン酸オリゴ糖を添加した細胞培養液でヒト表皮角化細胞を２４時間培養し，アルシアンブルーで染色した細胞群を撮影したものである。図中の矢印は，ケーブル状の細胞外基質を示している。図３では，６〜８個の細胞が一連のケーブル状細胞外基質を形成していることがわかる。
【００４４】
図４は，４糖又は６糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した細胞培養液又はヒアルロン酸オリゴ糖を添加していない細胞培養液でヒト表皮角化細胞を２４時間培養した後に，ケーブル状細胞外基質を形成した細胞の出現率をグラフで示したものである。
ヒアルロン酸オリゴ糖を添加していない細胞培養液で培養した細胞群では，ケーブル状の細胞外基質を形成した細胞はなかった。一方，４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合は，０．０１μｇ／ｍｌの濃度においてケーブル状の細胞外基質を持った細胞が，８個以上観察された。４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合は，添加量が低濃度であってもケーブル状の細胞外基質を持った細胞の出現率が増加していることがわかる。４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合におけるケーブル状の細胞外基質を持った細胞の出現率は，０．１μｇ／ｍｌの濃度において，最も高いことがわかる。出現率は，１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌの高濃度においては，減少傾向となるが，細胞外基質を形成した細胞の出現率と比較すると有意に高いことがわかる。
６糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合は，０．０１μｇ／ｍｌの濃度においてケーブル状の細胞外基質を持った細胞が，７個以上観察された。６糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合は，濃度依存的な出現率の変化は見られなかった。
【００４５】
以上の結果より，ヒアルロン酸オリゴ糖を添加した細胞培養液で細胞を培養した場合，細胞外基質の形成を促進することがわかった。細胞外基質及びケーブル状細胞外基質の形成は，４糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合に最も促進されることがわかった。６糖のヒアルロン酸オリゴ糖を添加した場合も細胞外基質の形成は促進されるが，ケーブル状細胞外基質の形成の方が促進される傾向があることがわかった。
【図１】
2013170149.tif 000003
【図２】
2013170149.tif 000004
【図３】
2013170149.tif 000005
【図４】
2013170149.tif 000006