(57)【要約】【課題】新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤を提供する。【解決手段】リポポリサッカライドと、下記一般式（１）で表されるピロリドン誘導体とを組み合わせてなる免疫賦活剤。2013170155.tif 000004（式中、Ｒは水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポポリサッカライドと、下記一般式（１）で表されるピロリドン誘導体とを組み合わせてなる免疫賦活剤。
【化１】
2013170155.tif 000003
（式中、Ｒは水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す）
【請求項２】
リポポリサッカライドと前記ピロリドン誘導体とが一の製剤中に含まれるものである請求項１記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
前記ピロリドン誘導体が、Ｎ−メチルピロリドン又はＮ−エチルピロリドンである請求項１又は２記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
剤形が、経皮投与製剤である請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の免疫賦活剤を含む免疫療法剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活剤及び免疫療法剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、元来生体が有している外来抗原排除という免疫応答を利用することによる療法であり、免疫系を賦活させることで種々の疾患を治療するものである。免疫療法には、皮下、皮内、経皮投与法などがあり、抗原と免疫賦活剤を順次に或いは同時に投与することで、投与抗原に対する高い免疫応答を期待することができる。
【０００３】
免疫賦活剤には、自然免疫系に関連する細胞表面に発現するトールライクレセプター（ＴＬＲｓ）に結合するものと、結合せずに威力を発揮するものとに大別される。ＴＬＲｓは１９９７年にＭｅｄｚｈｉｔｏｖらによって発見された分子群であり（非特許文献１）、現在までにヒトで１０種類、マウスで１２種類が確認されている。ＴＬＲｓにリガンドが結合することで自然免疫系は活性化され、抗原特異的免疫応答である、獲得免疫系への橋渡しをしている。これまでに各ＴＬＲｓに結合するリガンドの同定が行われており、バクテリアリポペプチド（ＴＬＲ１，２）、マイコプラズマリポペプチド（ＴＬＲ２，６）、ＲＮＡ（ＴＬＲ３，７）、リポポリサッカロイド（ＴＬＲ４）、フラジェリン（ＴＬＲ５）、バクテリアＤＮＡ（ＴＬＲ９）などが同定されている（特許文献１）。ＴＬＲ４に結合するリポポリサッカロイド（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌細胞壁成分であるリポ多糖類である。このＬＰＳは、ＴＬＲｓリガンドの中でも最も研究が進められているリガンドの１つであり、抗原特異的免疫応答を増強する免疫賦活剤として利用されている（特許文献２）。しかし、ＬＰＳはエンドトキシンとしても知られ、生体に敗血症を齎すケースがある。そこで、ＬＰＳ活性中心であるリピドＡの誘導体を利用した免疫賦活剤が開発され、各種ワクチンに利用されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−０２４６１９号公報
【特許文献２】特開２０１１−１０５７４９号公報
【特許文献３】特開２０１１−０５１９９７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ．１９９７；３８８：３９４−３９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これら従来の免疫賦活剤の効果は十分ではなく、さらに優れた免疫賦活剤及びそれを用いた免疫療法剤が望まれていた。
従って、本発明の課題は、新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、種々の成分を用いて脾臓細胞から産生される液性因子の産生誘導能を指標として免疫賦活作用を検討してきたところ、グラム陰性細菌由来ＬＰＳとピロリドン類の組み合わせが強い免疫賦活能を有し、免疫療法剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、リポポリサッカライドと、下記一般式（１）で表されるピロリドン誘導体とを組み合わせてなる免疫賦活剤を提供するものである。また、本発明は、上記の免疫賦活剤を含む免疫療法剤を提供するものである。
【０００９】
【化１】
2013170155.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｒは水素原子または炭素数１〜１２のアルキル基を示す）
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、脾臓細胞から放出される液性因子の割合が顕著に増大されるので、優れた免疫賦活剤が提供できるとともに、その免疫賦活剤を含む免疫療法剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＬＰＳ及びピロリドン誘導体のＩＬ−１α及びＩＦＮ−γ産生に及ぼす作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の免疫賦活剤は、リポポリサッカロイド（以下ＬＰＳという）と、上記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなるものである。
かい
【００１４】
ＬＰＳは、グラム陰性細菌由来のリポ多糖で、自然免疫に携わる細胞群に発現するＴＬＲ４に結合することで、炎症性サイトカインの産生を誘導する。ＬＰＳは、グラム陰性菌の細胞壁外胞の構成成分であるから、各種のグラム陰性菌から採取することができる。ＬＰＳを採取することができるグラム陰性菌としては、大腸菌（E.coli）、クレブシエラ・ニューモニエ、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・アエルギノーサ、ビブリオ・コレラ、サルモネラ・ミネソタ等を用いることができるが、大腸菌がより好ましい。これらの菌体からＬＰＳの採取方法は、例えば菌体を高圧蒸気滅菌や乾熱滅菌により死菌とした後、イソプロピルアルコール、ヘキサン、水などの溶媒に懸濁し、固液分離して液層を採取することにより行うことができる。液層は、さらに、温フェノール水抽出法、フェノール−クロロホルム−石油エーテル法等により精製して用いられる。
【００１５】
ピロリドン類を示す一般式（１）中、Ｒとしては炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましい。Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられるが、メチル基が特に好ましい。すなわち、ピロリドン類（１）としては、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドンが特に好ましい。
【００１６】
ＬＰＳとピロリドン類（１）とを組み合わせて用いれば、後記実施例に示すように、脾臓細胞から産生される液性因子であるＩＬ−１α及びＩＦＮ−γの産生量を増大させる作用、特にＩＦＮ−γの産生量を増大させる作用を有することから、これらの組み合わせは、ヒトを含む哺乳動物の免疫賦活剤として有用であり、免疫療法剤として有用である。また、ピロリドン類（１）は単独で免疫賦活作用を有するので、ＬＰＳの投与量を少なく抑制することができるため、安全性上特に好ましい。
【００１７】
本発明の免疫賦活剤は、ＬＰＳとピロリドン類（１）とを組み合わせて投与できればよく、同時投与であっても、互いに逐次投与であってもよい。また、ＬＰＳとピロリドン類（１）とは、投与経路が同一でも、互いに異なっていてもよい。
【００１８】
本発明の免疫療法剤は、上記の免疫賦活剤を含むものであり、好ましくはさらに抗原を含むものである。本発明の免疫療法剤は、免疫賦活剤および抗原を含む１つの製剤としてもよいし、免疫賦活剤および抗原を別体の製剤として含むキットであってもよい。また、他の免疫賦活剤、免疫調節剤、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＴＬＲ賦活剤（イミキモド、ＣｐＧヌクレオチド）等と併用してもよい。
【００１９】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤の投与方法としては、経皮投与、経粘膜投与、経口投与、皮下注射、皮内注射等が挙げられるが、経皮投与がより好ましい。本発明の免疫賦活剤と抗原を併用して投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。抗原の投与は、本発明の免疫賦活剤と抗原とを同時に投与してもよく、また本発明の免疫賦活剤を投与した後に抗原を投与してもよい。
上記抗原としては、免疫応答を引き起こすことができる分子であれば、特に制限はないが、例えばペプチドまたはタンパク質が挙げられる。ペプチドとしては、天然由来のペプチドまたは合成ペプチドのいずれでもよく、３〜２５のアミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。タンパク質としては、天然由来のタンパク質または合成タンパク質のいずれでもよい。具体的には、癌抗原（腫瘍抗原）、種々のウイルス由来抗原、感染原因菌由来抗原、種々のアレルギー原因抗原等が挙げられる。
【００２０】
本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤は、前記のように経皮投与製剤とするのが好ましい。経皮投与製剤の剤形としては、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤等の他、パップ剤、テープ剤等の貼付剤が挙げられる。これらの経皮投与製剤中のピロリドン類（１）の含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。また、これらの経皮投与製剤中のＬＰＳの含有量は、０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。さらに、ピロリドン類（１）とＬＰＳとの含有質量比（ピロリドン類：ＬＰＳ）は、１００：１〜１：１０が好ましく、１００：１〜１：１がより好ましい。
【００２１】
また、本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤には、希釈剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤；水等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤の剤形としては、ピロリドン類（１）を粘着層に含有する貼付剤がより好ましい。当該粘着層中のピロリドン類（１）の含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。また当該粘着層中のＬＰＳの含有量は０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％がさらに好ましい。
【００２３】
粘着層は水系でも非水系でもよい。水系の粘着層を形成するための水系粘着剤としては、従来公知の水性ジェルを用いることができる。また、非水系の粘着層を形成するための非水系粘着剤としては、例えば、ゴム系粘着剤、アクリル系粘着剤、シリコーン系粘着剤、ウレタン系粘着剤等が挙げられる。これらの中でも、粘着力の制御が容易である点で、ゴム系粘着剤およびアクリル系粘着剤が好ましい。
【００２４】
また、本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）の粘着層には、可塑剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
常温で液状又はペースト状の成分は、粘着層全体の質量に基づいて合計で、好ましくは１〜４０質量％、さらに好ましくは５〜３５質量％の範囲内で適宜配合される。
【００２５】
粘着層の坪量は、粘着層が水系粘着剤で形成されている場合には、１００〜３０００ｇ／ｍ2であることが好ましく、２００〜２０００ｇ／ｍ2であることがより好ましい。また、粘着層が非水系粘着剤で形成されている場合には、１０〜５００ｇ／ｍ2であることが好ましく、２０〜１００ｇ／ｍ2であることがより好ましい。
【００２６】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）は、支持基材を有していることが好ましい。
支持基材は、粘着層を支持する機能を有する。かかる支持基材は、可撓性（柔軟性）を有し、貼付時における曲面追従性をもち、加工時における裁断または打ち抜き等に適したものが好ましい。
このような支持基材としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）等のポリオレフィン、ポリアリレート、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、エチレン酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリスルホン、ナイロン、ポリ乳酸、レーヨン、アクリル等の樹脂からなるプラスチックフィルム、織物、編物および不織布を用いることが可能である。さらに、プラスチックフィルムと、プラスチックフィルム、織物、編物、不織布および紙等とのラミネートシートや金属蒸着を施したプラスチックフィルムを用いることが可能である。
支持基材の平均厚さは、２〜４０００μｍであるのが好ましく、１０〜３００μｍであるのがより好ましい。
【００２７】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）は、剥離シートを有していることが好ましい。
剥離シートは、貼付剤の保管時（未使用時）において、粘着層の貼付面を保護する機能を有するとともに、有効成分の拡散を防止する機能を有している。
【００２８】
このような剥離シートとしては、例えば、ポリエチレンラミネート紙、ポリプロピレンラミネート紙等のラミネート紙類；ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系フィルム、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン系フィルム等の合成樹脂フィルム等が使用できる。また、剥離シートは、必要に応じてこれらの材料の片面または両面にシリコーン樹脂等により剥離処理が施されたものを使用してもよい。
また、剥離シートの平均厚さは、１０〜２００μｍであることが好ましく、１５〜１００μｍであることがより好ましい。
【００２９】
本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤（剤形が貼付剤の場合）は、生体の皮膚表面に貼付することにより、経皮で免疫賦活剤であるＬＰＳ及びピロリドン類（１）を生体に投与することができる。
免疫療法剤として、免疫賦活剤と併用して抗原を投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。
抗原を経皮で投与する場合には、上記貼付剤の剥離直後または剥離後約９６時間以内に、好ましくは剥離後約７２時間以内に、特に好ましくは剥離後約４８時間以内に、上記貼付剤を貼付したところと同じ表皮表面に、抗原を塗布するか、抗原を含む別の貼付剤を貼付することにより行うことができる。
また、粘着層の粘着力をＪＩＳ  Ｚ０２３７に準拠した測定方法（対ベークライト板）で、３〜２０Ｎ／２５ｍｍ程度に調整すると、上記貼付剤の剥離により皮膚表皮角質層を物理的に破壊させることができ、皮膚表皮角質層の破壊により抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化が引き起こされる。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００３１】
実施例１
精製水に対して、ＬＰＳとＮＭＰとを、濃度がＬＰＳ：１μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤１を調製した。
実施例２
精製水に対して、ＬＰＳとＮＭＰとを、濃度がＬＰＳ：１μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１０μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤２を調製した。
実施例３
精製水に対して、ＬＰＳとＮＭＰとを、濃度がＬＰＳ：１μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ：１００μｇ/ｍｌとなるように溶解して、免疫賦活剤３を調製した。
【００３２】
比較例１
精製水に対して、ＬＰＳを、濃度が１μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤１を調製した。
比較例２
精製水をそのまま比較用製剤２とした。
比較例３
精製水に対して、ＮＭＰを、濃度が１μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤３を調製した。
比較例４
精製水に対して、ＮＭＰを、濃度が１０μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤４を調製した。
比較例５
精製水に対して、ＮＭＰを、濃度が１００μｇ/ｍｌとなるように溶解して、比較用製剤５を調製した。
【００３３】
（試験方法）
８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を取り出し、ピンセットで単一細胞化した。これらの細胞を１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２４ウェルプレートに１×１０6／ｍｌで播種した。播種した細胞に対して、免疫賦活剤１〜３または比較用製剤１〜５をそれぞれ添加し７２時間培養後に細胞上清を回収した。
回収した細胞上清中に含まれる液性因子（ＩＬ−１ａ、ＩＦＮ−γ）の含有量を、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。結果を図１に示す。
【００３４】
（試験結果）
図１の結果から、ＬＰＳのみの場合（比較例１）、精製水のみの場合（比較例２）およびＮＭＰのみの場合（比較例３〜５）と比較して、ＬＰＳとＮＭＰとを併用した場合（実施例１〜３）では、産生される液性因子の増大が観察された。ＬＰＳとＮＭＰとの併用効果は、ＩＦＮ−γで特に顕著であった。
【図１】
2013170155.tif 000005