(57)【要約】【課題】ユーグレナを原料として簡便な操作により脂肪酸エステルを高い歩留で製造する方法を提供すること。【解決手段】次の工程（ａ）及び（ｂ）；（ａ）ユーグレナに対して、１種類以上のタンパク質分解酵素を０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］添加し、水相で反応させる工程、及び（ｂ）前記工程（ａ）の反応液から、脂肪酸エステルを分相させて採取する工程を含む、脂肪酸エステルの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）ユーグレナに対して、１種類以上のタンパク質分解酵素を０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］添加し、水相で反応させる工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）の反応液から、脂肪酸エステルを分相させて採取する工程
を含む、脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項２】
タンパク質分解酵素がアルカリプロテアーゼである、請求項１記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）において、溶媒抽出により脂肪酸エステルを採取する、請求項１又は２記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において、遠心分離により脂肪酸エステルを採取する、請求項１又は２記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項５】
ユーグレナがＥｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ａｓｔａｓｉａ  ｌｏｎｇａ又はその変種若しくは変異株である、請求項１〜４の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項６】
ユーグレナの体内に脂肪酸エステルを蓄積させる工程により培養したユーグレナを使用する、請求項１〜５の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項７】
ユーグレナの乾燥藻体に対するタンパク質分解酵素の添加量が、０．０００１〜４．８［ｇ-酵素製剤／ｇ-乾燥藻体］である、請求項１〜６の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、２５℃における反応液の初発ｐＨが２〜１２である、請求項１〜７の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項９】
工程（ａ）において、反応温度が２０〜８０℃である、請求項１〜８の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１０】
工程（ａ）において、反応時間が０．１〜１６時間である、請求項１〜９の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１１】
工程（ａ）で使用するユーグレナが、ユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量が、ユーグレナの乾燥藻体を基準として、２０〜９０質量％である、請求項１〜１０の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１２】
工程（ａ）の前に、培養によりユーグレナの体内に脂肪酸エステルを蓄積させる工程を有する、請求項１〜１１の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１３】
培地に接種するユーグレナの量が、培地の体積に対して０．０１〜１０［ｇ-乾燥藻体／Ｌ］である、請求項１２に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１４】
培養温度が２０〜３３℃である、請求項１２又は１３に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１５】
好気的条件下で培養した後、嫌気的条件下で培養する、請求項１２〜１４の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１６】
好気的条件における培地の初発ｐＨ（２５℃）が２〜７である、請求項１５に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１７】
好気的条件における通気条件が、培養液１Ｌあたり０．０１〜２Ｌ／ｍｉｎである、請求項１５又は１６に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１８】
好気的条件における培養期間は、好ましくは４８〜７２０時間である、請求項１５〜１７の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項１９】
嫌気的条件における培地の初発ｐＨ（２５℃）が２〜１１である、請求項１５〜１８の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項２０】
脂肪酸エステルが炭素数１０〜３０の脂肪酸と炭素数１０〜２０の高級アルコールとのエステルである、請求項１〜１９の何れか１項に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０の何れか１項に記載の方法で得られた脂肪族エステルを水素化触媒の存在下水素化する、脂肪族アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸エステルの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化を始めとする環境問題に対する意識や関心が高まり、二酸化炭素の排出量を低減することや、二酸化炭素の固定化により大気中の二酸化炭素濃度を低減することが大きな課題となっている。そのため、化石燃料への依存から脱却し、カーボンニュートラルな資源であるバイオマスをエネルギー源として積極的に活用しようとする試みが活発になされている。
【０００３】
例えば、ユーグレナは、藻体内で脂質等を産生する藻類として知られており、その脂質生産性に着目して、ユーグレナを好気的に培養した後、嫌気条件下に置くことで藻体内の貯蔵多糖パラミロンをロウ・エステルに転換させ、次いで物理的に破壊した後、遠心分離や溶媒抽出等によりロウ・エステルを単離する方法が提案されている（特許文献１）。また、ユーグレナをオートクレーブで加熱加圧した後、高濃度のタンパク質分解酵素を作用させ、次いでろ過して水溶性成分を分取する方法も知られているが、水不溶成分の分取については一切検討されていない（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭５９−１１８０９０号公報
【特許文献２】特開２０１０−９００６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、ユーグレナを物理的破砕又は高濃度のタンパク質分解酵素により処理し、藻体外に取り出された水不溶の脂肪酸エステルの分取を試みたところ、脂肪酸エステルの歩留の向上が困難であり、とりわけ高濃度のタンパク質分解酵素を作用させた場合には脂肪酸エステルの歩留が著しく低下することが判明した。
したがって、本発明の課題は、ユーグレナを原料として簡便な操作により脂肪酸エステルを高い歩留で製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に鑑み検討した結果、ユーグレナに対して従来に比して極めて少ない量のタンパク質分解酵素を作用させると、意外なことに、ユーグレナから脂肪酸エステルを高い歩留で採取できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の工程（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）ユーグレナに対して、１種類以上のタンパク質分解酵素を０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］添加し、水相で反応させる工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）の反応液から、脂肪酸エステルを分相させて採取する工程
を含む、脂肪酸エステルの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ユーグレナを原料として簡便な操作により高い歩留で脂肪酸エステルを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の脂肪酸エステルの製造方法は、工程（ａ）及び（ｂ）を含むものである。以下、各工程について詳細に説明する。
【００１０】
工程（ａ）
工程（ａ）は、ユーグレナに対して、１種類以上のタンパク質分解酵素を０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］添加し、水相で反応させる工程である。これにより、藻体中の脂肪酸エステルを藻体外に取り出すことができる。
【００１１】
＜ユーグレナ＞
本発明でいうユーグレナとは、ユーグレナ属に属する微細藻類であり、動物と植物の双方に分類されている。動物学上では鞭毛虫綱（ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）に、また植物学上ではユーグレナ藻綱（ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）に、それぞれ属する微生物である。具体的には、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ａｓｔａｓｉａ  ｌｏｎｇａ等が挙げられ、これらの変種や上記株と実質的に同一の藻類学的性質を有する株の変異株も包含される。中でも、取扱の容易性の点から、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ａｓｔａｓｉａ  ｌｏｎｇａ又はその変種若しくは変異株が好ましい。
【００１２】
本発明で使用するユーグレナは、沼や池等の天然系に生息するものを採取したものでも、従来公知の培地を用いて培養したものでもよく、更には商業的に入手したものでもよいが、本発明においては、体内に脂肪酸エステルを豊富に蓄積したユーグレナが好適に使用される。
本発明で使用するユーグレナとしては、ユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量が、藻体当たりの脂肪酸エステルの生産量の観点から、ユーグレナの乾燥藻体を基準として、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは５０質量％以上のものである。一方、本発明で使用するユーグレナとしては、ユーグレナの培養にかかる時間の短縮、又はユーグレナの入手容易性の観点から、ユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量が、ユーグレナの乾燥藻体を基準として、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８５質量％以下、更に好ましくは８０質量％以下のものである。
ユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量の範囲としては、藻体当たりの脂肪酸エステルの生産量、及びユーグレナの培養にかかる時間の短縮若しくはユーグレナの入手容易性の観点から、ユーグレナの乾燥藻体を基準として、好ましくは２０〜９０質量％、より好ましくは４０〜８５質量％、更に好ましくは５０〜８０質量％である。
【００１３】
ユーグレナの体内に蓄積される脂肪酸エステルは、例えば、炭素数１０〜３０の脂肪酸と炭素数１０〜２０の高級アルコールとのエステルである。ここで、本明細書において「脂肪酸エステル」とは、脂肪酸と１価から３価のアルコールとのエステルの総称であり、高級脂肪酸とグリセリンとのエステルであるグリセリドや、脂肪酸と高級アルコールとのエステルであるワックスも包含する概念である。なお、脂肪酸は、飽和脂肪酸でも不飽和脂肪酸でもよいが、飽和の直鎖脂肪酸であることが好ましい。中でも、脂肪酸エステルとしては、炭素数１０〜２０の脂肪酸と炭素数１０〜１６の高級アルコールとの脂肪酸エステルが好ましい。脂肪酸の具体例としては、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、エルカ酸、トリアコンタン酸等が挙げられる。また、高級アルコールの具体例としては、デカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、セチルアルコール、イコサノール等が挙げられる。また、脂肪酸エステルの具体例としては、例えば、デカン酸ドデシル、ドデカン酸ドデシル、ドデカン酸テトラデシル、テトラデカン酸ドデシル、テトラデカン酸テトラデシル、テトラデカン酸ヘキサデシル、テトラデカン酸オクタデシル、ヘキサデカン酸ドデシル、ヘキサデカン酸テトラデシル、ヘキサデカン酸ヘキサデシル、ヘキサデカン酸オクタデシル等を挙げることができる。
【００１４】
好ましい量の脂肪酸エステルを体内に含有したユーグレナは、入手したユーグレナを培養によりユーグレナの体内に脂肪酸エステルを蓄積させる工程に供することによっても得ることができる。具体的には以下の方法が挙げられる。
培地としては、例えば、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地、Ｈｕｔｎｅｒ培地、及びＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地（「ユーグレナ  生理と生化学」、北岡正三朗    編、株式会社学会出版センター、ｐ２４２〜２４３）等を挙げることができる。
また、グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシット、グリセリン、可溶性澱粉、廃糖蜜、転化糖、酢酸等の資化しうる有機酸、エタノール等の炭素源；アンモニア、アンモニウム塩等の無機・有機アンモニウム塩、コーングルテンミール、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、魚肉エキス、ポリペプトン、各種アミノ酸、ソイビーンミール等の窒素源；更に必要に応じてリン酸、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｎａ+、Ｋ+等の無機塩；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等のビタミン類を添加した固体培地、液体培地等も用いることができる。
【００１５】
培地に接種するユーグレナの量は特に制限されないが、培地の体積に対して０．０１〜１０［ｇ−乾燥藻体／Ｌ］が好ましく、０．１〜５［ｇ−乾燥藻体／Ｌ］がより好ましい。
【００１６】
培養方法は特に限定されず、通気培養、嫌気培養、攪拌培養、振盪培養、静置培養等を採用することができる。中でも、脂肪酸エステルの生産性向上の点から、好気的条件下で培養した後、嫌気的条件下で培養することが好ましい。
【００１７】
好気的条件下で培養する場合、培養温度は２０〜３３℃が好ましく、２８〜３０℃がより好ましい。培地の初発ｐＨ（２５℃）は、２〜７が好ましく、３〜５がより好ましい。
また、通気条件は、培養液１Ｌあたり０．０１〜２Ｌ／ｍｉｎが好ましく、０．１〜０．５Ｌ／ｍｉｎがより好ましい。
好気的条件下での培養期間は、４８〜７２０時間が好ましく、７２〜３６０時間がより好ましい。
【００１８】
一方、嫌気的条件下で培養する場合、培養温度は２０〜３３℃が好ましく、２８〜３０℃がより好ましい。培地の初発ｐＨ（２５℃）は、２〜１１が好ましく、３〜８がより好ましい。
本発明においては、嫌気的条件とするために、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、水素ガス、その他不活性ガスを１種又は２種以上組み合わせて通気することができる。中でも、窒素ガス又は炭酸ガス雰囲気下の条件が好ましい。通気量は不活性ガスの種類に応じて適宜設定可能であるが、例えば、窒素ガスの場合、通気量は培養液１Ｌあたり０．０１〜２Ｌ／ｍｉｎが好ましい。
嫌気的条件下での培養期間は、６〜３６０時間が好ましく、８〜３００時間がより好ましい。
【００１９】
培地のｐＨ調整には、例えば、緩衝剤を使用することが可能である。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、乳酸、グルコン酸、酒石酸等の有機酸、炭酸、リン酸、塩酸、硫酸等の無機酸、水酸化ナトリウム等のアルカリ水酸化物、アンモニア又はアンモニア水等が挙げられる。緩衝剤は、１種又は２種以上組み合わせて使用することが可能であり、その使用量は、所望のｐＨとなるように適宜選択することができる。
【００２０】
ユーグレナの培養は、暗所下に行っても、光照射下に行ってもよい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光又は太陽光のいずれでもよい。照度は１０００〜２００００Ｌｕｘが好ましく、２０００〜８０００Ｌｕｘがより好ましい。
また、攪拌、振盪速度は細胞への損傷を考慮して適宜設定することが可能であり、通常１０〜３００ｒ／ｍｉｎである。
【００２１】
＜酵素反応＞
ユーグレナに対するタンパク質分解酵素の酵素反応は水相で行われる。例えば、ユーグレナとタンパク質分解酵素と水を混合し、反応させることができる。また、タンパク質分解酵素を、ユーグレナを含む培養液に添加し反応させることができる。
【００２２】
本発明で使用するタンパク質分解酵素としてはプロテアーゼ活性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ペプシン、パンクレアチン、パパイン、ズブチリシン、キモトリプシン等を挙げることができる。また、タンパク質分解酵素として市販品を使用することが可能であり、例えば、パンチダーゼＭＰ、アロアーゼＡＰ−１０（以上、ヤクルト薬品工業社製）、プロテアーゼＡアマノＳＤ、プロテアーゼＭアマノＳＤ（以上、アマノエンザイム製）、サビナーゼ１６．０  ＥＸ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ  １６Ｌ  ＥＸ（以上、ノボザイムズ社製）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ４０００Ｌ（ジェネンコア社製）等を挙げることができる。なお、タンパク質分解酵素は、１種又は２種以上を組み合わせて使用することが可能であり、また同種又は異種の酵素を用いて複数回作用させることもできる。
【００２３】
タンパク質分解酵素には、アルカリ性領域に至適ｐＨを有するアルカリプロテアーゼと、酸性領域に至適ｐＨを有する酸性プロテアーゼが存在するが、より少ない添加量で脂肪酸エステルの歩留を向上させることが可能であることから、アルカリプロテアーゼが好ましい。
アルカリプロテアーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えばバチルス属細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｍａｐａｌｕｓなど）が産生するアルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００２４】
タンパク質分解酵素の添加量は、酵素活性が０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］の範囲内となる量である。本発明においては、脂肪酸エステルの藻体外への抽出の観点から、タンパク質分解酵素の添加量を０．００１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以上となる量とするが、０．０１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以上となる量が好ましい。また、脂肪酸エステルの歩留向上の観点から、タンパク質分解酵素の添加量を９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下となる量とするが、９［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下となる量が好ましく、５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下となる量がより好ましく、２［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下となる量が更に好ましく、１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下となる量が更に好ましい。
タンパク質分解酵素の添加量の範囲としては、脂肪酸エステルの藻体外への抽出、及び脂肪酸エステルの歩留向上の観点から、０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］の範囲内となる量であり、０．００１〜９［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］の範囲内となる量が好ましく、０．０１〜５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］の範囲内となる量がより好ましく、０．０１〜２［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］の範囲内となる量が更に好ましく、０．０１〜１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］の範囲内となる量が更に好ましい。ここで、本明細書において「酵素活性１ＰＵ」とは、カゼインを基質として酵素を作用させたときに、１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離する酵素量をいう。「酵素活性１ＰＵ」は実施例に記載したように市販のキットを用いることで測定することができる。
【００２５】
また、ユーグレナの乾燥藻体に対するタンパク質分解酵素の添加量は、脂肪酸エステルの歩留向上の観点から、０．０００１〜４．８［ｇ−酵素製剤／ｇ−乾燥藻体］が好ましく、０．０００５〜３［ｇ−酵素製剤／ｇ−乾燥藻体］がより好ましく、０．００１〜１［ｇ−酵素製剤／ｇ−乾燥藻体］が更に好ましい。
【００２６】
酵素反応の条件は、使用するタンパク質分解酵素の至適条件等を考慮して適宜設定することが可能であるが、例えば、反応液の初発ｐＨ（２５℃）は、通常２〜１２、好ましくは４〜１１、より好ましくは６．５〜１０．５である。また、反応温度は、通常２０〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、より好ましくは４０〜６０℃であり、反応時間は、通常０．１〜１６時間、好ましくは０．２５〜８時間、より好ましくは０．５〜４時間である。
【００２７】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、工程（ａ）後の反応液から、脂肪酸エステルを分相させて採取する工程である。
脂肪酸エステルの採取方法としては反応液から脂肪酸エステルを分取することができれば特に限定されないが、例えば、溶媒抽出、遠心分離、静置処理、カラムクロマトグラフィー等が挙げられ、これらは１種又は２種以上を組み合わせて適用することができる。中でも、脂肪酸エステルの歩留の向上の観点から、溶媒抽出、遠心分離及び静置処理から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせ、更に溶媒抽出と遠心分離の組み合わせ、溶媒抽出と静置処理の組み合わせ、又は遠心分離が好ましい。
【００２８】
溶媒抽出は、反応液に有機溶媒を添加し、有機相と水相を相分離させ有機相を取得することで、反応液から脂肪酸エステルを採取することができる。
溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール等のアルコール類；ブチレングリコール等の多価アルコール類；メチルエチルケトン等のケトン類等が挙げられる。溶媒は、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することが可能であり、また同種又は異種の溶媒を用いて複数回行うこともできる。
中でも、脂肪酸エステルの溶解性及び歩留の向上の観点から、非極性溶媒が好ましい。具体的には、ハロゲン化炭化水素類、炭化水素類、芳香族炭化水素類が挙げられ、中でも、炭化水素類が好ましく、ヘキサンがより好ましい。
また、メタノール、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、アセトン等の水と相溶性のある有機溶媒を補助的に用いることもできる。
【００２９】
有機溶媒の使用量は、少なすぎると有機相と水相とが相分離し難くなるため、一般に、溶媒抽出においては通常大量の有機溶媒が使用される。これに対し、本発明においては、タンパク質分解酵素の使用量を低減することにより、有機相と水相との相分離を促進することができる。そのため、例えば、有機溶媒の使用量として、脂肪酸エステルを含む有機相と培養液を含む水相との容量比（有機相／水相）を１以下にまで低減することが可能である。有機溶媒の使用量は、有機相／水相の容量比として、好ましくは０．６５〜１、より好ましくは０．７５〜１、更に好ましくは０．８５〜１となる量である。
【００３０】
抽出方法は、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出等のいずれでもよい。例えば、「生物化学実験法２４  植物脂質代謝実験法」（山田晃弘  編著、株式会社学会出版センター、ｐ３−４）に記載の方法を参考にすることができる。
抽出温度は特に限定されないが、脂肪酸エステルの抽出効率の観点から、１０〜５０℃がより好ましく、２０〜４０℃が更に好ましい。
【００３１】
遠心分離は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な機器を使用することができる。この場合の遠心力は５００〜２００００Ｇが好ましく、１０００〜１００００Ｇがより好ましい。遠心分離の温度条件としては、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。また、回転数と時間は適宜設定可能であるが、例えば、分離板型の場合、回転数は、好ましくは５０００〜２００００ｒ／ｍｉｎ、より好ましくは８０００〜１８０００ｒ／ｍｉｎであり、処理時間は、好ましくは１〜３０分、より好ましくは１〜１５分である。
【００３２】
静置処理は、脂肪酸エステルと水相とが相分離するまで反応液を静止状態に置けばよい。本発明においては、溶媒抽出と静置処理を組み合わせることで、より一層効率的に脂肪酸エステルを分取することが可能になる。静置温度は特に限定されないが、１０〜５０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。静置時間は適宜設定可能であるが、好ましくは３０〜３００分、より好ましくは６０〜１５０分である。
【００３３】
本発明は、このような簡便な操作により、体内に脂肪酸エステルを蓄積したユーグレナから７５％以上、好ましくは８０％以上の高い歩留で脂肪酸エステルを採取することができる。
詳細なメカニズムは不明であるが、適当な量のタンパク質分解酵素を、脂肪酸エステルを蓄積したユーグレナに作用させることによって、油水分離がし易くなっていることがこのような効果の原因の一つと考えられる。
【００３４】
また、本発明では、工程（ｂ）で採取された脂肪酸エステルを、水素化触媒の存在下、水素化することによって脂肪族アルコールを製造することができる。
本発明において用いられる水素化触媒としては、公知の水素化触媒のいずれも使用することができる。例えば、銅、コバルト、クロム、白金、ロジウム、パラジウム、イリジウム等から選ばれる少なくとも１種の金属を含有する触媒が挙げられる。なかでも銅系触媒が好ましく、銅−クロム系触媒、銅−亜鉛系触媒、銅−鉄−アルミニウム系触媒、銅−シリカ系触媒等を好適に用いることができる。
【００３５】
水素化触媒は、触媒金属を、例えば、炭素（活性炭）、アルミナ、シリカ−アルミナ、シリカ、炭酸バリウム、硫酸バリウム、炭酸カルシウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ゼオライト等の担体に担持させた固体触媒の形態で用いることもできる。
水素化触媒は、市販のものを用いてもよく、従来公知の方法にて調製してもよい。例えば、沈殿法、イオン交換法、蒸発乾固法、噴霧乾燥法、混練法等により担持固体触媒を調製することができる。
【００３６】
水素圧力は、常圧でもよいが、加圧下で行うことが好ましく、ゲージ圧で０．１〜３５ＭＰａが好ましく、３〜３０ＭＰａがより好ましい。
【００３７】
反応温度は、３０〜３００℃が好ましく、１３０〜２７０℃がより好ましく、１５０〜２５０℃が更に好ましい。また、反応時間は、０．５〜７時間が好ましく、１〜６時間がより好ましく、３〜５時間が更に好ましい。
【００３８】
水素化触媒の使用量は、反応温度あるいは反応圧力に応じて、実用的な反応収率が得られる範囲内において任意に選択できるが、脂肪酸エステル１００質量部に対して、０．１〜３０質量部が好ましく、０．５〜２０質量部がより好ましい。
【００３９】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の製造方法を開示する。
【００４０】
＜１＞
次の工程（ａ）及び（ｂ）；
（ａ）ユーグレナに対して、１種類以上のタンパク質分解酵素を０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］添加し、水相で反応させる工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）の反応液から、脂肪酸エステルを分相させて採取する工程
を含む、脂肪酸エステルの製造方法。
【００４１】
＜２＞
タンパク質分解酵素が好ましくはアルカリプロテアーゼである、前記＜１＞記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜３＞
工程（ｂ）において、好ましくは溶媒抽出、遠心分離及び静置処理から選ばれる１種又は２種以上の組み合わせ、より好ましくは溶媒抽出と遠心分離、溶媒抽出と静置処理、又は遠心分離により脂肪酸エステルを採取する、前記＜１＞又は＜２＞記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜４＞
ユーグレナが好ましくはＥｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ａｓｔａｓｉａ  ｌｏｎｇａ又はその変種若しくは変異株である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【００４２】
＜５＞
工程（ａ）において、タンパク質分解酵素の添加量が、好ましくは酵素活性が０．００１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以上、より好ましくは０．０１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以上となる量であって、好ましくは９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下、より好ましくは９［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下、更に好ましくは５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下、更に好ましくは２［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下、更に好ましくは１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］以下となる量である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜６＞
工程（ａ）において、タンパク質分解酵素の添加量が、好ましくは０．００１〜９．５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］、より好ましくは０．００１〜９［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］、更に好ましくは０．００１〜５［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］、更に好ましくは０．０１〜２［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］、更に好ましくは０．０１〜１［ＰＵ／ｇ−乾燥藻体］の範囲内となる量である前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜７＞
工程（ａ）において、ユーグレナの乾燥藻体に対するタンパク質分解酵素の添加量が、好ましくは０．０００１〜４．８［ｇ−酵素製剤／ｇ−乾燥藻体］、より好ましくは０．０００５〜３［ｇ−酵素製剤／ｇ−乾燥藻体］、更に好ましくは０．００１〜１［ｇ−酵素製剤／ｇ−乾燥藻体］である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜８＞
工程（ａ）において、２５℃における反応液の初発ｐＨが、好ましくは２〜１２、より好ましくは４〜１１、更に好ましくは６．５〜１０．５である、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜９＞
工程（ａ）において、反応温度が、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは３０〜７０℃、更に好ましくは４０〜６０℃である、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１０＞
工程（ａ）において、反応時間が、好ましくは０．１〜１６時間、より好ましくは０．２５〜８時間、更に好ましくは０．５〜４時間である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【００４３】
＜１１＞
工程（ｂ）において、溶媒抽出に用いる有機溶媒が、好ましくは非極性溶媒、より好ましくはハロゲン化炭化水素類、炭化水素類、又は芳香族炭化水素類、更に好ましくは炭化水素類、更に好ましくはヘキサンである、前記＜３＞〜＜１０＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１２＞
工程（ｂ）において、溶媒抽出に用いる有機溶媒の使用量が、有機相／水相の容量比として、好ましくは０．６５〜１、より好ましくは０．７５〜１、更に好ましくは０．８５〜１となる量である、前記＜３＞〜＜１１＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【００４４】
＜１３＞
工程（ａ）で使用するユーグレナは、ユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量が、ユーグレナの乾燥藻体を基準として、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは５０質量％以上のものである、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１４＞
工程（ａ）で使用するユーグレナは、ユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量が、ユーグレナの乾燥藻体を基準として、好ましくは９０質量％以下、より好ましくは８５質量％以下、更に好ましくは８０質量％以下のものである、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１５＞
工程（ａ）で使用するユーグレナは、ユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量が、ユーグレナの乾燥藻体を基準として、好ましくは２０〜９０質量％、より好ましくは４０〜８５質量％、更に好ましくは５０〜８０質量％のものである、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１６＞
工程（ａ）の前に、培養によりユーグレナの体内に脂肪酸エステルを蓄積させる工程を有する、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１７＞
培地に接種するユーグレナの量が、培地の体積に対して、好ましくは０．０１〜１０［ｇ−乾燥藻体／Ｌ］、より好ましくは０．１〜５［ｇ−乾燥藻体／Ｌ］である、前記＜１６＞に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１８＞
好気的条件下で培養した後、嫌気的条件下で培養する、前記＜１６＞又は＜１７＞に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜１９＞
培養温度が好ましくは２０〜３３℃、より好ましくは２８〜３０℃である、前記＜１６＞〜＜１８＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２０＞
好気的条件における培地の初発ｐＨ（２５℃）は、好ましくは２〜７、より好ましくは３〜５である、前記＜１８＞又は＜１９＞に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２１＞
好気的条件における通気条件は、培養液１Ｌあたり、好ましくは０．０１〜２Ｌ／ｍｉｎ、より好ましくは０．１〜０．５Ｌ／ｍｉｎである、前記＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２２＞
好気的条件における培養期間は、好ましくは４８〜７２０時間、より好ましくは７２〜３６０時間である、前記＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２３＞
嫌気的条件における培地の初発ｐＨ（２５℃）は、好ましくは２〜１１、より好ましくは３〜８である、前記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２４＞
嫌気的条件における窒素ガスの通気量は、培養液１Ｌあたり、好ましくは０．０１〜２Ｌ／ｍｉｎである、前記＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２５＞
嫌気的条件における培養期間は、好ましくは６〜３６０時間、より好ましくは８〜３００時間である、前記＜１８＞〜＜２４＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
【００４５】
＜２６＞
脂肪酸エステルが好ましくは炭素数１０〜３０の脂肪酸と炭素数１０〜２０の高級アルコールとのエステルである、前記＜１＞〜＜２５＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２７＞
脂肪酸エステルが好ましくは炭素数１０〜２０の脂肪酸と炭素数１０〜１６の高級アルコールとのエステルである、前記＜１＞〜＜２５＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２８＞
脂肪酸エステルが好ましくはデカン酸ドデシル、ドデカン酸ドデシル、ドデカン酸テトラデシル、テトラデカン酸ドデシル、テトラデカン酸テトラデシル、テトラデカン酸ヘキサデシル、テトラデカン酸オクタデシル、ヘキサデカン酸ドデシル、ヘキサデカン酸テトラデシル、ヘキサデカン酸ヘキサデシル及びヘキサデカン酸オクタデシルから選ばれる少なくとも１種である、前記＜１＞〜＜２５＞のいずれか１に記載の脂肪酸エステルの製造方法。
＜２９＞
前記＜１＞〜＜２８＞のいずれか１に記載の方法で得られた脂肪酸エステルを水素化触媒の存在下水素化する脂肪族アルコールの製造方法。
【実施例】
【００４６】
＜分析方法＞
１．プロテアーゼ活性（カゼイン法）の測定
基質としてカゼイン１％（ｗ／ｖ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製Ｃａｓｅｉｎ，  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｍｉｌｋ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｆｒｅｅ）使用し、これを含む至適ｐＨの５０ｍＭ緩衝液を至適温度で５分間保温した後、０．１ｍＬの酵素溶液を加え、そのままの温度で１５分間反応を行った。このとき、酵素は上記緩衝液を用いて適当濃度に希釈したものを用いた。反応液に反応停止液２．０ｍＬを加え、至適温度で３０分間静置した後、濾過を行った。濾液０．１ｍＬに、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ社製、Ｌｏｗｒｙ法）のＡ’試薬０．５ｍＬ及びＢ試薬４ｍＬ
を添加して２５℃で１５分間静置後、７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
ここで、「至適ｐＨ」とは酵素活性が最も高くなるｐＨのことであり、「至適温度」とは酵素活性が最も高くなる温度のことである。なお、酸性プロテアーゼの場合、至適ｐＨ、至適温度は通常ｐＨ２〜７．３、２０〜８０℃であり、アルカリプロテアーゼの場合、至適ｐＨ、至適温度は通常ｐＨ８〜１２、２０〜８０℃である。
【００４７】
＜アルカリプロテアーゼのプロテアーゼ活性の測定＞
カゼイン１％（ｗ／ｖ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製Ｃａｓｅｉｎ，  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｍｉｌｋ，  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｄ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｆｒｅｅ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）１．０ｍＬを３０℃で５分間保持した後、０．１ｍＬの酵素溶液を加え、そのままの温度で１５分間反応を行った。このとき、酵素は５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて適当濃度に希釈したものを用いた。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０ｍＬ加え、３０℃で３０分間静置したのち、Ｎｏ．２ろ紙（アドバンテック社製）にて濾過を行い、濾液中の酸可溶蛋白質分解物をＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ社製、Ｌｏｗｒｙ法）によって定量した。すなわち、濾液に、ＤＣプロテインアッセイのＡ’試薬を０
．５ｍＬ及びＢ試薬４ｍＬを添加して２５℃で１５分間静置後、７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４８】
＜パンチダーゼ  ＭＰのプロテアーゼ活性の測定＞
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）の代わりに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いた以外は、前述のアルカリプロテアーゼ等の場合と同様の操作により分析を行った。
【００４９】
＜検量線の作成＞
緩衝液にＬ−チロシンを０〜０．３ｍＭになるように溶解してＬ−チロシン溶液を作製した。各濃度のＬ−チロシン溶液０．１ｍＬに、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ社製、Ｌｏｗｒｙ法）のＡ’試薬０．５ｍＬ及びＢ試薬４ｍＬを添加して２５℃で１５分
間静置後、７５０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。
【００５０】
２．脂肪酸エステルの分析
試料をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）にて分析した。条件は下記のとおりである。
・装置  ：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６８９０Ｎ
・カラム：Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＡＢ製Ｕｌｔｒａ−Ａｌｌｏｙ−１、ＭＳ／ＨＴ  １５ｍ×０．２５ｍｍ×０．１５μｍ
・オーブン温度：６０℃（２分間保持）−［１０℃／ｍｉｎで昇温］−３５０℃（１５分間保持）
・キャリアガス：Ｈｅ（５．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・注入量：１μＬ
・スプリット比：１４：１
・注入口温度：３００℃
・圧力  ：１８５ｋＰａ
【００５１】
そして、ドデカン酸ドデシル（和光純薬工業社製）、ヘキサデカン酸ドデシル（シグマアルドリッチ社製）、ヘキサデカン酸ヘキサデシル（シグマアルドリッチ社製）、及びテトラデカン酸ヘキサデシル（和光純薬工業社製）の試薬を標準物質とし、面積比からこれら脂肪酸エステルの総量を求めた。
【００５２】
３．脂肪酸エステル抽出率（ＥF）の分析
反応液８００μＬにクロロホルム８００μＬを添加し、室温で３０分間激しく撹拌後、クロロホルム相と水相が分相するまで静置、又は遠心分離（回転数１５，０００ｒ／ｍｉｎ、温度２５℃で３分間）を行った。次いで、クロロホルム相を分取し、クロロホルム相中の脂肪酸エステルの質量（ＣF）を分析し、その質量を脂肪酸エステル抽出率１００％とした。次に、反応液８００μＬにヘキサン８００μＬを添加し、上記クロロホルム抽出と同様の操作によりヘキサン抽出を行い、ヘキサン相中の脂肪酸エステルの質量（ＨF）を分析した。そして、次式により脂肪酸エステル抽出率を算出した。
脂肪酸エステル抽出率（％）＝ＨF／ＣF×１００
（式中、ＨFはヘキサン相中の脂肪酸エステル質量を示し、ＣFはクロロホルム相中の脂肪酸エステル質量を示す。）
【００５３】
４．溶媒回収率（ＲF）の算出
次式により、溶媒回収率を算出した。
溶媒回収率（％）＝ＲH／ＡH×１００
（式中、ＲHは回収したヘキサン相の質量を示し、ＡHは添加したヘキサンの質量を示す。）
【００５４】
５．脂肪酸エステル歩留の算出
次式により、脂肪酸エステルの歩留を算出した。
脂肪酸エステル歩留（％）＝（ＥF／１００）×（ＲF／１００）×１００
（式中、ＥFは脂肪酸エステル抽出率（％）を示し、ＲFは溶媒回収率（％）を示す。）
【００５５】
６．脂肪酸エステル回収率（ＳF）の算出
反応液１５００μＬを使用し、遠心分離（回転数１５０００ｒ／ｍ、温度２５℃で３分間）を行い、上の相を分取した。これに、クロロホルム８００μＬを添加して、室温で３０分間激しく撹拌後、遠心分離（回転数１５，０００ｒ／ｍｉｎ、温度２５℃で３分間）を行った。次いで、クロロホルム相を分取し、クロロホルム相中の脂肪酸エステルの質量（ＢF）を分析した。そして、次式により脂肪酸エステル回収率を算出した。
脂肪酸エステル回収率（％）＝ＢF／ＣF×１００
（式中、ＢFは反応液から分取した上の相を抽出したクロロホルム相中の脂肪酸エステル質量を示し、ＣFは反応液を抽出したクロロホルム相中の脂肪酸エステル質量を示す。）
【００５６】
７．脂肪酸エステル歩留の算出
次式により、脂肪酸エステルの歩留を算出した。
脂肪酸エステル歩留（％）＝（ＥF／１００）×（ＳF／１００）×１００
（式中、ＥFは脂肪酸エステル抽出率（％）を示し、ＳFは脂肪酸エステル回収率（％）を示す。）
【００５７】
ユーグレナの培養
製造例１
グルコース１００ｇ、ポリペプトン２５．０ｇ、硫酸アンモニウム１．２５ｇ、リン酸二水素一カリウム１．２５ｇ、硫酸マグネシウム・七水和物２．５０ｇ、炭酸カルシウム０．６００ｇ、エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）０．２５０ｇ、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）・六水和物０．２５０ｇ、硫酸亜鉛０．１２５ｇ、硫酸マンガン・五水和物０．０９０ｇ、チアミン塩酸塩１２．５ｍｇ、シアノコバラミン５μｇを含む液体培地５Ｌを調製した。次いで、調製した液体培地を１．５Ｌ採取し、これを２Ｌ容ジャーファーメンターに仕込み、１規定の塩酸によりｐＨ（２５℃）を４．５に調整した。その後、１２１℃で３０分間加熱することにより滅菌した。これに同組成の培地で培養したユーグレナ・グラシリスの培養液を４０ｍＬ接種し（ユーグレナの量０．１５ｇ−乾燥藻体／Ｌ）、２８℃で暗所にて４日間通気撹拌培養した。このときの空気の通気量は５００ｍＬ／ｍｉｎとし、撹拌回転数は１５０ｒ／ｍｉｎとした。
その後、通気を窒素に切り替えて通気量を５００ｍＬ／ｍｉｎとした以外は、上記と同じ条件で培養を更に１１日間継続した。得られた培養液中のユーグレナの含有量は５．４［ｇ−乾燥藻体／Ｌ］であり、またユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量は乾燥藻体を基準として７４質量％であった。通気を窒素に切り替えた際の培養液の初発ｐＨ（２５℃）は３．４であった。なお、ユーグレナ・グラシリスは、国立環境研究所微生物系統保存施設より入手したＮＩＥＳ‐４８を使用した。
得られた培養液は実施例並びに比較例１、３及び４に用いた。
【００５８】
製造例２
製造例１と同様の操作を行ったところ、得られた培養液中のユーグレナの含有量は５．１［ｇ−乾燥藻体／Ｌ］であり、またユーグレナの体内に蓄積された脂肪酸エステルの含有量は乾燥藻体を基準として７６質量％であった。
得られた培養液は比較例２に用いた。
【００５９】
実施例１
培養液５．００ｇに酵素（ヤクルト薬品社製：パンチダーゼ  ＭＰ）を１．００ｍｇ（培養液中での酵素の濃度として０．０２０質量％）添加して、よく撹拌した。溶液の初発ｐＨ（２５℃）は７．３であった。
次に、酵素を添加した培養液８００μＬをエッペンチューブに分注して、４０℃で１２０分静置し、酵素反応を行った。
反応液を２５℃になるまで冷却した後、ヘキサンで抽出してヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。
前述の３．脂肪酸エステル抽出率、４．溶媒回収率及び５．脂肪酸エステル歩留を分析した。なお、回収したヘキサン相の質量、及びヘキサン相中の脂肪酸エステル質量の測定には、エッペンチューブ４本分のヘキサン相を用い、エッペンチューブ１本当たりの平均値を求めた。また、３．脂肪酸エステル抽出率の分析において分相操作は静置にて行った。分析結果を表１に示す。
【００６０】
実施例２
酵素（パンチダーゼ  ＭＰ）の添加量を５．００ｍｇ（培養液中での酵素の濃度として０．１０質量％）とした以外は実施例１と同様の操作によりヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。分析を行った結果を表１に示す。
【００６１】
実施例３
酵素（パンチダーゼ  ＭＰ）の添加量を０．１２５ｇ（培養液中での酵素の濃度として２．５質量％）とした以外は実施例１と同様の操作によりヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。分析を行った結果を表１に示す。
【００６２】
実施例４
水酸化ナトリウムを用いて液温２５℃での初発ｐＨを１０に調整した培養液５．００ｇに、パンチダーゼの代わりに０．１００質量％の酵素（花王社製：アルカリプロテアーゼ）水溶液を１５０μＬ（培養液中での酵素の濃度として０．００３０質量％）添加して、よく撹拌し、酵素反応温度を５０℃とした以外は、実施例１と同様の操作によりヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。分析を行った結果を表１に示す。
【００６３】
実施例５
水酸化ナトリウムを用いて液温２５℃での初発ｐＨを１０に調整した培養液５．００ｇに、パンチダーゼの代わりに０．１８９質量％の酵素（ノボザイムズ社製：Ｅｖｅｒｌａｓｅ  １６Ｌ  ＥＸ）水溶液を２５０μＬ（培養液中での酵素の濃度として０．００９５質量％）添加して、よく撹拌し、酵素反応温度を５０℃としたこと、及び３．脂肪酸エステル抽出率の分析において分相操作を遠心分離にて行ったこと以外は、実施例１と同様の操作によりヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。分析を行った結果を表１に示す。
【００６４】
実施例６
水酸化ナトリウムを用いて液温２５℃での初発ｐＨを１０に調整した培養液５．００ｇに、パンチダーゼの代わりに０．０９６０質量％の酵素（ジェネンコア社製：Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ４０００Ｌ）水溶液を２５０μＬ（培養液中での酵素の濃度として０．００４８質量％）添加して、よく撹拌し、酵素反応温度を５０℃としたこと、及び３．脂肪酸エステル抽出率の分析において分相操作を遠心分離にて行ったこと以外は、実施例１と同様の操作によりヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。分析を行った結果を表１に示す。
【００６５】
比較例１
酵素処理を行わずに培養液を２５℃になるまで冷却した後、ヘキサンで抽出してヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。
前述の３．脂肪酸エステル抽出率の分析を行った。回収したヘキサン相の質量、及びヘキサン相中の脂肪酸エステル質量の測定には、エッペンチューブ４本分のヘキサン相を用い、エッペンチューブ１本当たりの平均値を求めた。また、３．脂肪酸エステル抽出率の分析において分相操作は遠心分離にて行った。分析結果を表１に示す。
【００６６】
比較例２
培養液１００ｇを湿式微粒化装置（スギノマシン製スターバースト、型式ＨＪＰ−２５００１、ボール衝突チャンバー）にて機械的破砕を行った。このときの処理条件は、噴射圧力５０ＭＰａ、チャンバーノズル径０．２５ｍｍ、パス回数を２回とした。得られた処理液に対して比較例１と同様の操作によりヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。分析を行った結果を表１に示す。
【００６７】
比較例３
酵素（パンチダーゼ  ＭＰ）の添加量を０．２５０ｇ（培養液中での酵素の濃度として５質量％）とした以外は実施例１と同様の操作によりヘキサン相として脂肪酸エステルを得た。分析を行った結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
2013233142.tif 000002
【００６９】
実施例７
水酸化ナトリウムを用いて液温２５℃での初発ｐＨを１０に調整した培養液１２．５ｇに、０．１００質量％の酵素（花王社製：アルカリプロテアーゼ）水溶液を６２５μＬ（添加した酵素の培養液中での濃度として０．００５０質量％）添加して、よく撹拌した。酵素反応温度を６０℃として６０分静置し、酵素反応を行った。反応液を２５℃になるまで冷却した後、遠心分離により、上相液として脂肪酸エステルを得た。
前述の３．脂肪酸エステル抽出率を分析した。ここでの分相操作は遠心分離にて行った。また、冷却した反応液に対して６．脂肪酸エステル回収率及び７．脂肪酸エステル歩留を分析した。分析結果を表２に示す。
【００７０】
比較例４
酵素処理を行わずに、培養液の温度を６０℃として６０分静置した。次いで、培養液を２５℃になるまで冷却した後、遠心分離により、上相液として脂肪酸エステルを得た。
得られた培養液に対して実施例７と同様の操作により分析を行った。分析結果を表２に示す。
【００７１】
【表２】
2013233142.tif 000003
【００７２】
表１及び表２から明らかなように、本発明の方法によれば、ユーグレナから高い歩留で脂肪酸エステルを採取することができた。他方、ユーグレナに対して機械的破砕、酵素的破砕のいずれも行わなかった比較例１と比較例４は、藻体外へ脂肪酸エステルが取り出されず、歩留は低かった。また、ユーグレナに対して機械的破砕のみ行った比較例２と、高濃度のタンパク質分解酵素を作用させた比較例３は、藻体外に取り出された脂肪酸エステルの分取が困難で、歩留が低くなった。