(57)【要約】【課題】低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓを効果的に分解するバイオレメディエーション技術を提供すること。【解決手段】低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓ分解能を有する新規なスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌、またはこの分解菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含んでなる有機塩素化合物分解剤である。またこの分解菌とともに分解菌ＰＤ６５３を含む有機塩素化合物分解剤である。これらの分解菌または分解剤によれば低塩素化ＰＣＢｓや４種ＨＣＨｓを分解可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２２２として寄託された低塩素化ＰＣＢｓ分解能を有するスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する新規な有機塩素系化合物分解菌。
【請求項２】
受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２２２として寄託されたα−ＨＣＨ、β−ＨＣＨ、γ−ＨＣＨおよびδ−ＨＣＨ分解能を有するスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する新規な有機塩素系化合物分解菌。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載の分解菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含んでなる有機塩素系化合物分解資材。
【請求項４】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４０５として国際寄託されているβ−ＨＣＨ分解能を有するノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌をさらに含んでなる請求項３記載の有機塩素系化合物分解資材。
【請求項５】
請求項４記載のノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌に対して、請求項１または請求項２記載の分解菌を２倍〜６倍の割合で有している請求項４記載の有機塩素系化合物分解資材。
【請求項６】
請求項１または請求項２記載の分解菌の炭素源または窒素源となる基質として、ピルビン酸またはその塩の少なくとも何れか一方とメチオニンとを含む請求項３〜請求項５何れか１項記載の有機塩素系化合物分解資材。
【請求項７】
請求項１または請求項２記載の分解菌または請求項３〜請求項６何れか１項記載の有機塩素系化合物分解資材を含有してなる汚染環境の浄化装置。
【請求項８】
有機塩素系化合物を分解可能な分解菌が多孔質材中に集積した有機塩素系化合物分解資材の製造方法において、
前記分解菌の炭素源または窒素源となる基質と、前記分解菌とを含む培養液を前記多孔質材中に浸漬させて、分解菌と基質とを多孔質材中に担持させることを特徴とする有機塩素系化合物分解資材の製造方法。
【請求項９】
所定有機化合物が低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓであり、分解菌がスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌、またはノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌である請求項８記載の有機塩素系化合物分解資材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低塩素化ＰＣＢまたはＨＣＨｓを分解する能力を有するスフィンゴモナス属に属する分解菌を含む新規な有機塩素系化合物分解菌に関し、この分解菌を用いた有機塩素系化合物分解資材やその製造方法、汚染環境の浄化装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
カネクロール等の商品名で販売されたＰＣＢｓ、例えばカネクロールＫＣ−３００（商品名）に代表される低塩素化ＰＣＢｓ（Ｃｌ数２〜４）は廃コンデンサーやトランス内の絶縁油中に高濃度で含まれており、化学的処理法（脱塩素化分解方式等）を用いた処理が行われている。しかし、この処理法はコストが高く、その処理も殆ど進んでいない。また、この残留性有機汚染物質は、土壌などの環境中に放出されると分解されにくく、食物連鎖などを通じて生物の体内に蓄積しやすい。そのため、人の健康や生態系に対し有害であるにもかかわらず、微量ながらも土壌中に混入すれば有効な分解手段は無い。
【０００３】
一方、有機塩素系殺虫剤ヘキサクロロシクロヘキサン（ＨＣＨｓ）は、主に４つの異性体（α体、β体、γ体、δ体）が８：１：２：１の割合で含まれている残留性有機汚染物質である。毒性・生物濃縮性が強く難分解性であるため、我が国では１９７０年に使用が禁止された。現在、ＨＣＨｓは埋設農薬処理事業の対象農薬であり、２００９年にδ体を除く３種異性体が残留性有機汚染物質（ＰＯＰｓ）に指定された。異性体の中でα体、γ体に関しては好気的に分解・無機化する細菌が単離され、代謝経路や分解酵素遺伝子も明らかになっている。しかし、化学的に最も安定なβ体や次に安定なδ体を完全脱塩素分解（無機化）する資化性菌は発見されていない。
【０００４】
こうした汚染物質により汚染された土壌や地下水に対する浄化法に関しては、栄養素や酸素等を汚染現場に供給し土着の分解菌を増殖・活性化させて浄化を行うバイオスティミュレーション法や、外来から特定の機能を有する微生物を導入するバイオオーギュメンテーション法など、微生物等の生物機能（特に分解能）を利用する原位置バイオレメディエーションに期待が寄せられており、シマジンの分解に関するバイオレメディエーション技術が特開２００５−２７５３６号公報（特許文献１）に、ＰＣＮＢ分解に関するバイオレメディエーション技術が特開平１１−３１８４３５号公報（特許文献２）等に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２７５３６号公報
【特許文献２】特開平１１−３１８４３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓは残留性有機汚染物質に指定されていながら、効果的な分解技術は確立されていない。
そこで本発明は、ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓを効果的に分解するバイオレメディエーション技術を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２２２（受託番号未定）として寄託された低塩素化ＰＣＢｓ分解能を有するスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する有機塩素系化合物分解菌を提供する。
【０００８】
受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２２２として寄託された低塩素化ＰＣＢｓ分解能を有するスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する有機塩素系化合物分解菌は、低塩素化ＰＣＢｓを分解する新規に発見された菌株であるため、難分解性の低塩素化ＰＣＢｓを含む汚染土壌に代表される汚染環境を効果的に浄化することが期待できる。ここで低塩素化ＰＣＢｓとは、保有する塩素数が１〜１０にあるＰＣＢｓ異性体のうちその塩素数が４以下、好ましくは２〜４であるＰＣＢｓをいうものである。
【０００９】
そしてまた、受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２２２（受託番号未定）として寄託されたα−ＨＣＨ、β−ＨＣＨ、γ−ＨＣＨおよびδ−ＨＣＨ分解能を有するスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する有機塩素系化合物分解菌を提供する。
受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２２２として寄託されたα−ＨＣＨ、β−ＨＣＨ、γ−ＨＣＨおよびδ−ＨＣＨ分解能を有するスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する有機塩素系化合物分解菌は、α−ＨＣＨやγ−ＨＣＨのみならず、β−ＨＣＨやδ−ＨＣＨをも分解する新規に発見された菌株であるため、難分解性のβ−ＨＣＨやδ−ＨＣＨを含む汚染土壌に代表される汚染環境を効果的に浄化することが期待できる。
【００１０】
また、スフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する有機塩素系化合物分解菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含んでなる有機塩素系化合物分解資材を提供する。
スフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する有機塩素系化合物分解菌を木質炭化素材等の多孔質材中に含むため、この分解菌を安定的に保持し、生育させることができる。また、多孔質材を有機塩素系化合物分解菌を含む担体として取り扱えるため、有機塩素系化合物分解菌の取扱いが容易である。
【００１１】
有機塩素系化合物分解資材は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４０５として国際寄託されているβ−ＨＣＨ分解能を有するノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌をさらに含む有機塩素系化合物分解資材とすることができる。
ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌を、スフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌に加えてさらに含むため、ＨＣＨｓのうち分解しにくいβ体を効果的に分解できる。そのため、ＨＣＨｓの分解能に非常に優れた有機塩素系化合物分解資材である。
【００１２】
ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌に対して、スフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌を２倍〜６倍の割合で有している有機塩素系化合物分解資材とすることができる。
ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌に対してスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌を２倍〜６倍の割合で有している有機塩素系化合物分解資材としたため、前記ＰＤ６５３株の性質を有する分解菌と前記ＴＳＫ−１株の性質を有する分解菌とを多孔質材中に共存させることができ、それぞれの分解菌によるＨＣＨｓの分解を効果的に行うことができる。ＴＳＫ−１株の割合が２倍より少ないとＴＳＫ−１株の生育が劣りδ−ＨＣＨの分解が不十分になるおそれがある。また、ＴＳＫ−１株の割合が５倍より多いとＰＤ６５３株の生育が劣りβ−ＨＣＨの分解が不十分になるおそれがある。こうした割合は、３倍を超えて６倍以下とすることがさらに好ましい。
【００１３】
この分解資材は、分解菌とともにその分解菌の炭素源または窒素源となる基質として、ピルビン酸またはその塩の少なくとも何れか一方とメチオニンとを含むものとすることができる。炭素源または窒素源となる基質として、ピルビン酸またはその塩の少なくとも何れか一方とメチオニンとを含むため、多孔質材中の分解菌の生育を良くすることができる。そのため、低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓの分解能を高めることができる。
【００１４】
さらに、こうした分解菌や分解資材を含有した汚染環境の浄化装置を提供する。低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓを分解する能力のある分解菌や分解資材を含むため、汚染土壌や汚染水の浄化を行うことができる。
【００１５】
さらにまた、所定有機塩素系化合物を分解可能な分解菌が多孔質材中に集積した有機塩素系化合物分解資材の製造方法について、前記分解菌の窒素源または炭素源となる基質と、前記分解菌とを含む培養液を前記多孔質材中に浸漬させて、分解菌と基質とを多孔質材中に担持させることを特徴とする有機塩素系化合物分解資材の製造方法を提供する。
所定有機塩素系化合物を分解可能な分解菌の窒素源または炭素源となる基質と、前記分解菌とを含む培養液を多孔質材中に浸漬させて、分解菌と基質とを多孔質材中に担持させたため、分解菌と基質とを効率的に多孔質材中に含ませることができる。そのため、分解菌と基質とを含む分解資材を簡単に製造することができる。
【００１６】
所定有機化合物が低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓであり、分解菌がスフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌やノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３株の有する菌学的性質の一部または全部の性質を有する分解菌とすれば、低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨを効果的に分解できる有機塩素系化合物分解資材を得ることができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の有機塩素系化合物分解菌、有機塩素系化合物分解資材、汚染環境の浄化装置によれば低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓに汚染された土壌等の汚染環境を簡易に浄化することができる。
また、本発明の所定有機塩素系化合物を分解可能な分解菌が多孔質材中に集積した有機塩素系化合物分解資材の製造方法によれば、有機塩素系化合物分解資材や汚染環境の浄化装置を簡単に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】塩基配列をもとにしたＴＳＫ−１株の分子系統樹を示す説明図である。
【図２】ＴＳＫ培地とＲ２Ａ培地でのＴＳＫ−１株の増殖程度を比較するグラフ図である。
【図３】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株による各種低塩素化ＰＣＢｓの分解を示すグラフ図である。
【図４】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株による各種低塩素化ＰＣＢｓ分解後のＣｌ−濃度を示すグラフ図である。
【図５】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株によるＫＣ−３００の脱塩素分解後のＫＣ−３００濃度を示すグラフ図である。
【図６】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株によるＫＣ−３００の脱塩素分解後の塩素イオン濃度を示すグラフ図である。
【図７】無機塩培地でのＴＳＫ−１株によるα−ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図８】無機塩培地でのＴＳＫ−１株によるγ−ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図９】無機塩培地でのＴＳＫ−１株によるβ−ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図１０】無機塩培地でのＴＳＫ−１株によるδ−ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図１１】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株によるα−ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図１２】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株によるβ−ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図１３】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株によるδ−ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図１４】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株による４種ＨＣＨの同時分解を示すグラフ図である。
【図１５】ＴＳＫ培地でのＴＳＫ−１株による４種ＨＣＨの同時分解時におけるＴＳＫ−１株の増殖を示すグラフ図である。
【図１６】ＴＳＫ培地での２種複合系による４種ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【図１７】ＴＳＫ培地での２種複合系による４種ＨＣＨの分解における濁度の変化を示すグラフ図である。
【図１８】汚染土壌での２種複合系による４種ＨＣＨの分解を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓを分解するための技術について以下に詳細に説明する。
【００２０】
低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓを分解するＴＳＫ−１株：
バイオレメディエーションを行うためには低塩素化ＰＣＢｓまたはＨＣＨｓに対する分解菌（以下「分解菌」という）の存在が不可欠である。この分解菌の取得については土壌木炭還流法を応用した手段を用い、この分解菌を含む分解資材を得た。
【００２１】
γ−ヘキサクロロシクロヘキサン（γ−ＨＣＨ）とクロロタロニル（ＴＰＮ）の連用土壌を２ｍｍ以下に篩分した２０ｇと、粉砕して４〜６ｍｍに篩分けした木質炭化素材Ａ１００（広葉樹を４００℃〜６００℃で焼成、比表面積９５〜１２０ｍ２／ｇ、ｐＨ７．８）１ｇとを混和して還流装置であるパーコレータ（「分解菌迅速集積装置」藤原製作所社製）に充填し、炭素源がγ−ＨＣＨ（５ｍｇ／Ｌ）のみである無機塩培地（５Ｈ）２５０ｍＬを還流させ、２５℃、暗所で３週間培養した。そして、経時的に還流液中のγ−ＨＣＨおよびＣｌ−（γ−ＨＣＨの代謝物）濃度をＧＣ−ＥＣＤ、ＩＣで調べ、分解菌の集積状況を確認した。
【００２２】
なお、無機塩培地の組成は以下のとおりである。
培地１Ｌあたり、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを１．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．５ｇ、ＮＨ４ＮＯ３を１００ｍｇ、Trace element を１０ｍＬ、そしてここでは前記γ−ＨＣＨを５ｍｇ含み、ｐＨは６．８である。
【００２３】
洗浄後オ−トクレーブ滅菌したＡ１００を上述のパーコレータと同種で別のパーコレータに７．５ｇ充填した。これに上記培養で分解菌の集積が進んだＡ１００を０．２５ｇ接種し、前記と同様に、炭素源がγ−ＨＣＨ（５ｍｇ／Ｌ）のみである無機塩培地（５Ｈ）２５０ｍＬを還流させ、２５℃、暗所で３週間培養した。
そして、分解菌が集積したＡ１００をパーコレータから取り出し粉砕して、リン酸バッファーで１０−４に希釈したものを無機塩培地（５Ｈ）に接種し、培養して、分解活性を確認した。
【００２４】
さらに、この培養液を限界希釈法により１０−７倍まで段階希釈して分解菌の集積密度を高め、分解活性のある１０−７希釈液での培養液を得た。この培養液をＲ２Ａ寒天培地に平板塗抹後、５％γ−ＨＣＨ含有エーテルを噴霧、培養し、形成されたクリアゾーンから分解菌を単離・同定した。ここで無機塩培地に代えてＲ２Ａ寒天培地を用いたのは分解菌の生育を高めるためである。
【００２５】
この分解菌の形態的特徴は、桿菌（０．７〜０．８×１．５〜５．０μｍ）であり、培養的性質はＲ２Ａ寒天培地で３０℃で可能であり、黄色で光沢“＋”、色素産生“＋”であり、Ｒ２Ａ液体培地３０℃で表面発育の有無“−”、培地の混濁の有無“＋”であり、ゼラチン穿刺培地３０℃で生育状態“−”、ゼラチン液化“−”、リトマス・ミルク３０℃で凝固“−”、液化“−”である。
生理的性質は、グラム染色性“−”、硝酸塩の還元“−”、脱窒反応“−”、ＭＲテスト“−”、ＶＰテスト“−”、インドール産生“−”、硫化水素の生成“−”、デンプンの加水分解“−”、クエン酸の利用(Koser)“−”、クエン酸の利用(Christensen)“−”、無機窒素源の利用(硝酸塩)“−”、無機窒素源の利用(アンモニウム塩)“−”、ウレアーゼ活性“−”、カタラーゼ“−”、オキシダーゼ“＋”、生育の範囲はｐＨについてｐH５“−”、ｐH６“＋ｗ”、ｐH７〜９．５“＋”、生育の範囲は温度について１５℃“＋ｗ”、２０℃“＋”、２５℃“＋”、３７℃“−”、嫌気的生育性“−”、Ｏ−Ｆテスト(酸化／発酵)“−／−”である。
【００２６】
また、以下に示す酸産生試験培地組成において、糖類からの酸産生／ガス産生については、Ｌ−アラビノース“−／−”、Ｄ−グルコース“−／−”、Ｄ−フラノース“−／−”、マルトース“−／−”、ラクトース“−／−”、Ｄ−ソルビトール“−／−”、イノシトール“−／−”、Ｄ−キシロース“−／−”、Ｄ−マンノース“−／−”、Ｄ−ガラクトース“−／−”、サッカロース“−／−”、トレハロース“−／−”、Ｄ−マンニトール“−／−”、グリセリン“−／−”である。
【００２７】
酸産生試験培地組成は、Yeast Extract ０．５ｇ、Bacto Proteose Peptone No. 3 ０．５ｇ、Bacto Casamino Acid ０．５ｇ、Soluble Starch ０．５ｇ、Sodium Pyruvate ０．３ｇ、K2HPO4 ０．３ｇ、MgSO4・7H2O ０．０５ｇ、寒天０．０２ｇ、超純水１０００ｍＬ、0.2％ Phenol Red ０．０５ｍＬ、各糖１０ｇでｐＨは８．０である。
その他の生理学的性質は、β−ガラクトシダーゼ活性“−”、アルギニンジヒドロラーゼ“−”、リジンデカルボキシラーゼ活性“−”、トリプトファンデアミナーゼ活性“−”、ゼラチナーゼ活性“−”である。
【００２８】
なお“＋”は「陽性」、“−”は「陰性」、“ｗ”は「反応弱い」をそれぞれ表す。また、各試験の実施方法は、英国NCIMB研究所の試験方法および１）BARROW,(G.I.) and FELTHAM, (R.K.A): Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. 1993, Cambridge University Press. ２）坂崎利一・吉崎悦郎・三木寛二：新細菌培地学講座・下(第二版). 1988, 近大出版  ３）長谷川武治編著、微生物の分類と同定(下). 学会出版センター 1995. に基づき、また細菌同定キットAP120E,(bioMerieux, France)を用いている。
【００２９】
得られた分解菌は、スフィンゴモナスエスピーＴＳＫ−１（Sphingomonas sp. TSK-1）（「ＴＳＫ−１株」ともいう）と帰属した。その１６Ｓ  ｒＲＮＡ塩基配列（１４８２塩基）の塩基配列を配列番号１とした配列表に示す。ＴＳＫ−１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  〒305-8566 茨城県つくば市東１−１−１に受領番号：ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２２２２、受託日：２０１２年３月１日（受託番号未定）として寄託されている。この塩基配列に基づくこの菌株の分子系統樹を図１に示す。この系統樹からわかるように、既存の分解菌とは系統的に大きく異なっている。
【００３０】
β−ＨＣＨを分解するＰＤ６５３株：
ＰＤ６５３株は、ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３（Nocardioides sp. PD653）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４０５として国際寄託されている分解菌であり、特開２００７−１４２０２号公報にも記載がある。
【００３１】
ＰＤ６５３株の菌学的性質は次のとおりである。形態的特徴は、桿菌（０．７〜０．８×１．０〜１．２μｍ）であり、胞子形成は無く、淡黄色、円形、半レンズ状隆起状態、全縁スムーズで不透明、バター様の粘稠度を有するコロニーを形成する。培養的性質はＲ２Ａ寒天培地３０℃にて３〜７日、好気培養を行う。変異や培養条件、生理的状態によるコロニー形態の変化は認められない。運動性“−”、グラム染色“−”である。生理的性質は、カタラーゼ“＋”、オキシダーゼ“−”、酸／ガス産生（グルコース）：“−／−”、Ｏ／Ｆテスト（グルコース）“−／−”、ＧＣ含量：７０．８％である。“＋”、“−”の表記は上記と同様である。
ＰＤ６５３株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分塩基配列に基づく分子系統解析を行い、ＰＤ６５３株の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列のうち連続した１４８７塩基を決定しているので、この１４８７塩基を配列番号２とした配列表に示す。
【００３２】
なお、ＰＤ６５３株は、単独でＰＣＮＢに対する分解能を有していることがわかっており、また、単独でＨＣＢに対する分解能を有していることもわかっているが、各ＨＣＨに対する分解能を有することは知られていなかった。しかしながら、ＨＣＢとβ−ＨＣＨはともにＣｌ基がすべてエクアトリアル位にある点で立体構造が似ていることに鑑み、ＰＤ６５３株によるβ−ＨＣＨの分解性能について検討したのである。
【００３３】
有機塩素系化合物分解資材：
有機汚染物質である低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓを土壌中や水中などの汚染環境中で効果的に分解するためには、有機塩素系化合物分解菌を土壌中や水中に高密度で長期間存在させる必要がある。そのため、有機塩素系化合物分解菌の餌となる基質とともに有機塩素系化合物分解菌の住みかとなる木質炭化素材のような多孔質材に担持させることが好ましい。基質のうち炭素源としては、ピルビン酸やピルビン酸ナトリウムなどのその塩が好ましい。窒素源としてはメチオニンやチロシン等が好ましいが、メチオニンがより好ましい。
分解菌の住みかとなる担体としては木質炭化素材等に見られるような比表面積が５０ｍ２／ｇ〜６００ｍ２ ／ｇである多孔質材が好ましい。分解菌が利用しやすい形態に資化材が吸着されやすく、また、担体への分解菌の安定的な集積が可能となるからである。
また、多孔質材は分解菌の含有率を高めるため、２μｍ〜５０μｍ、より好ましくは５μｍ〜２０μｍの大きさの細孔が容積比率で１０％以上あることが好ましい。
【００３４】
有機塩素系化合物分解資材を用いた汚染物質の浄化方法：
有機塩素系化合物分解資材を用いて、低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓによって汚染された物質を浄化するには次のような方法がある。
汚染土壌における低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓの除去に関しては、有機塩素系化合物分解資材を汚染土壌中に埋設して混和する。土壌中に埋設しておくことで、土壌中に含まれている低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓは分解菌によって分解される。この方法によれば、土壌中の低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓが地下水に混入することを避けることができ、地下水汚染の防止を図ることが可能となる。
この技術の応用として、低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓの存在する表層及び下層土壌への混入、ゴルフ場のグリーン面の下層土壌への混入、産業破棄物処理場の下層土壌への混入、工場等における有機廃液置き場の下層土壌への混入などが挙げられ、こうした応用により低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓを処理することができる。
【００３５】
汚染環境の浄化装置：
有機塩素系化合物分解資材を通気性のある筐体内に詰め込むなどして有機塩素系化合物分解資材を土壌に含めた集積層を筐体内に保有すれば簡単にバイオリアクターとして、低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓを分解除去する汚染環境の浄化装置（有機塩素系化合物分解除去装置）とすることができる。
該装置にＨＣＨｓで汚染された土壌を混入し水を還流させることでその土壌を浄化することもできる。また、該装置にＨＣＨｓで汚染された水を還流させることで、この汚染水を浄化することができる。なお、ＨＣＨｓに代えて低塩素化ＰＣＢｓについても同様に取り扱うことができる。
あるいはまた、この装置を、生活排水路、水田地帯の農業排水路、ゴルフ場の排水路などの水路の一部に設けることにより、水中に溶解、分散した低塩素化ＰＣＢｓやＨＣＨｓを分解除去し、汚染環境を浄化する汚染環境の浄化装置として利用することができる。
【実施例】
【００３６】
＜実験例１＞
[ＴＳＫ培地の作製：図２]
ＴＳＫ−１株が生育し、Ｃｌ−濃度が低くＴＳＫ−１株による脱塩素分解が判別可能な半合成培地であるＴＳＫ培地を開発した。
ＴＳＫ培地の組成は、その１Ｌにおいて、ペプトンＣＥ９０Ｍを１．０ｇ、酵母エキスＢＳＰ−Ｂを０．２５ｇ、メチオニンを０．５ｇ、ピルビン酸ナトリウムを０．６ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４を０．０８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．０５ｇ含みｐＨは７．２〜７．４である。
【００３７】
ＴＳＫ培地は、ＴＳＫ−１株の培養に適するＲ２Ａ（Ｄｉｆｃｏ）液体培地の Proteose Peptone No.3 と Bacto Yeast Extract とカザミノ酸を、ペプトンＣＥ９０Ｍと酵母エキスＢＳＰ−Ｂとメチオニンに変えることで、培地中のＣｌ−濃度を約６８．１ｍｇ／Ｌから約０．６９ｍｇ／Ｌとして１／１００に減少させ、可溶性デンプンとグルコースを除外してメチオニンを加え、さらにピルビン酸ナトリウムを２倍量にすることで、炭素源を変更しＲ２Ａ液体培地よりも増殖を速めることに成功した（図２）。
【００３８】
このように栄養源を変更したのは、ＴＳＫ−１株は、可溶性デンプンとグルコースを炭素源として利用する能力がなく、他の栄養源としてはピルビン酸を利用できることができ、また、ピルビン酸量を増やすことで生育を向上させることがわかったからである。メチオニンについては、窒素源を２０種類のアミノ酸の中から検討したところ、メチオニンが最も窒素源として優れており、またピルビン酸とメチオニンを組合せても生育に良い影響を与えることが判明したからである。
【００３９】
＜実験例２＞
[ＴＳＫ−１株による低塩素化ＰＣＢｓ分解試験：図３〜図４]
ＴＳＫ培地を用いて低塩素化ＰＣＢｓ分解試験を行った。
まず、低塩素化ＰＣＢｓとして、２，４’−ジクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃８）、２，２’，５−トリクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃１８）、２，４’，５−トリクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃３１）、２’，３，４−トリクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃３３）、２，２’，３，５’−テトラクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃４４）、２，２’，５，５’−テトラクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃５２）、２，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃６６）を混合した７種の低塩素化ＰＣＢｓを各１０００ｐｐｍ含むアセトン溶液Ａと、低塩素化ＰＣＢｓとして２，４，４’−トリクロロビフェニル（ＩＵＰＡＣ＃＝＃２８）を１０００ｐｐｍ含むアセトン溶液Ｂとを準備した。
【００４０】
そして、ＴＳＫ培地に上記アセトン溶液Ａを各ＰＣＢｓの終濃度が５ｐｐｍになるように添加した。同様に別のＴＳＫ培地にアセトン溶液ＢをＰＣＢｓの終濃度が５ｐｐｍになるように添加した。そして、アセトン溶液Ａを加えたＴＳＫ培地とアセトン溶液Ｂを加えたＴＳＫ培地をそれぞれ同様に以下の手順で実験した。
こうしたＰＣＢｓを含むＴＳＫ培地には、ＴＳＫ−１株培養液（組成は、培養液１Ｌあたり、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを１．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．５ｇ含むリン酸バッファーにＴＳＫ−１株を含みＯＤ６００＝１．０である）を、前記培地１０ｍＬに対し１ｍＬ添加した。対照としては１ｍＬリン酸バッファーを添加したものを用いた。
【００４１】
それから、５０ｍＬの共栓つき三角フラスコで１８０ｒｐｍ、３０℃で１０日間振とう培養した。１週間後に２２ｍＬのヘキサンを加え、１０分間振とう後、ヘキサン層を１０倍希釈してＧＣ−ＥＣＤで各ＰＣＢｓ濃度を分析した。その結果を図３に示す。また、Ｃｌ−濃度をイオンクロマトグラフィーで測定し、その結果を図４に示す。
【００４２】
アセトン溶液Ｂでの＃２８のＰＣＢ（２，４，４’−トリクロロビフェニル）分解試験からは、図３より、培養１０日間で＃２８が１７％（０．９５ｍｇ／Ｌ）分解し、図４より、塩素イオンが０．３９ｍｇ／Ｌ生成したことがわかった。＃２８のＰＣＢの分子量が２５７であり、塩素の占める割合が４１．４％であるので、３塩素が脱離した。よって、＃２８は完全脱塩素分解したことがわかった。
また、アセトン溶液Ａでの７種ＰＣＢｓ分解試験からは、４塩素を有するＰＣＢｓでは約２５％〜３０％、３塩素を有するＰＣＢｓでは約１５％〜２０％、２塩素を有するＰＣＢｓでは約１０％分解していることがわかった。これにより、塩素数が多いＰＣＢｓの方をより分解し易いことがわかった。
【００４３】
＜実験例３＞
[ＴＳＫ−１株によるＫＣ−３００（商品名）の分解試験：図５〜図６]
ＴＳＫ培地を用いてＫＣ−３００（商品名）の分解試験を行った。ＫＣ−３００はカネクロールＫＣ−３００（商品名）として販売された各種ＰＣＢｓの混合物であり、分子中に塩素を２塩素から４塩素含む低塩素化ＰＣＢｓが約９６％を占めた物質である。
このＫＣ−３００を１０００ｐｐｍ含むアセトン溶液を準備し、先の実施例１２で用いたアセトン溶液Ａに代えてこのアセトン溶液を用いた以外は実施例１２と同様の実験を行った。その結果を図５、図６に示す。
図５、図６より、塩素イオンが０．６４ｍｇ／Ｌ生成し、ＫＣ−３００が２６％分解したことがわかった。
【００４４】
＜実験例４＞
[無機塩培地を用いたＴＳＫ−１株によるα−ＨＣＨ分解試験：図７]
α−ＨＣＨ、１７．２μＭ（５ｍｇ／Ｌ）を唯一の炭素源とする無機塩培地２０ｍＬ（組成は、培地１Ｌあたり、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを１．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．５ｇ、ＮＨ４ＮＯ３を１００ｍｇ、Trace element を１０ｍＬ、そしてここではα−ＨＣＨを５ｍｇ含み、ｐＨは６．８である）にＴＳＫ−１株培養液（組成は、培養液１Ｌあたり、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを１．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．５ｇ含むリン酸バッファーにＴＳＫ−１株を含みＯＤ６００＝２．０４である）１ｍＬを接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで１０日間培養した。４、７、１０日目にそれぞれヘキサンを２０ｍＬ加えて全抽出し、ヘキサン層のα−ＨＣＨ濃度をＧＣ−ＥＣＤで、水層のＣｌ−濃度をイオンクロマトグラフィーで測定した。同時に培地の濁度（ＯＤ６００）も測定した。
【００４５】
上記無機塩培地を用いたα−ＨＣＨの分解試験の結果、図７で示すように、１０日間の培養でα−ＨＣＨは消失し１００％分解していることがわかった。また、４当量のＣｌ−を検出したことから、ＴＳＫ−１株はα−ＨＣＨの４塩素を脱離させることがわかった。
【００４６】
＜実験例５＞
[無機塩培地を用いたＴＳＫ−１株によるγ−ＨＣＨ分解試験：図８]
実験例４の無機塩培地において、α−ＨＣＨに代えてγ−ＨＣＨを用いた以外は実験例４と同様にしてγ−ＨＣＨの分解試験を行った。結果を図８に示す。
無機塩培地を用いたγ−ＨＣＨの分解試験の結果、１０日間の培養で６当量のＣｌ−を検出したことから、ＴＳＫ−１株はγ−ＨＣＨを完全脱塩素して１００％分解することがわかった。
【００４７】
＜実験例６＞
[無機塩培地を用いたＴＳＫ−１株によるβ−ＨＣＨ分解試験：図９]
実験例４の無機塩培地において、α−ＨＣＨに代えてβ−ＨＣＨを用いた以外は実験例４と同様にしてβ−ＨＣＨの分解試験を行った。結果を図９に示す。
無機塩培地を用いたβ−ＨＣＨの分解試験の結果、１０日間の培養でβ−ＨＣＨを分解し１当量のＣｌ−を検出した。また、β−ＨＣＨは消失した。この結果、β−ＨＣＨを唯一の炭素源とする無機塩培地に接種したＴＳＫ−１株からは、β−ＨＣＨの脱塩素が生じβ−ＨＣＨを１００％分解するものの、完全脱塩素を起こすまでには至らないことがわかった。
【００４８】
＜実験例７＞
[無機塩培地を用いたＴＳＫ−１株によるδ−ＨＣＨ分解試験：図１０]
実験例４の無機塩培地において、α−ＨＣＨに代えてδ−ＨＣＨを用いた以外は実験例４と同様にしてδ−ＨＣＨの分解試験を行った。また、残ったヘキサン層を１００倍濃縮後、ＧＣ−ＭＳで測定し、δ−ＨＣＨの代謝物を解析した。結果を図１０に示す。
無機塩培地を用いたδ−ＨＣＨの分解試験の結果、１０日間の培養でδ−ＨＣＨは８０％分解し２当量のＣｌ−を検出した。また、代謝物を解析したところ、ペンタクロロシクロヘキサノールとテトラクロロシクロヘキセノールと判明した。
この結果、δ−ＨＣＨを唯一の炭素源とする無機塩培地に接種したＴＳＫ−１株からは、δ−ＨＣＨの脱塩素は起きるものの、完全脱塩素を起こすまでには至らないことがわかった。
【００４９】
＜実験例８＞
[ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株によるα−ＨＣＨ分解試験：図１１]
上記ＴＳＫ培地を用い、α−ＨＣＨ分解試験を行った。ＴＳＫ培地３０ｍＬにα−ＨＣＨ、１３．８μＭ（４ｍｇ／Ｌ）含ませ、実験例４と同じＴＳＫ−１培養液（ＯＤ６００＝１．００）１．５ｍＬを接種し、３０℃、暗所、１８０ｒｐｍで１０日間振とう培養した。４、７、１０日目にサンプリング（破壊分析）し、培地中のα−ＨＣＨ濃度と、Ｃｌ−濃度、培地の濁度（ＯＤ６００）を測定した。より具体的には、培地にヘキサンを３０ｍＬ加えて全抽出し、ヘキサン層からＧＣ−ＥＣＤでα−ＨＣＨ濃度を測定し、水層からイオンクロマトグラフィーでＣｌ−濃度を測定した。その結果を図１１で示す。
ＴＳＫ培地を用いたα−ＨＣＨの分解試験の結果、１０日間の培養で６当量のＣｌ−を検出し、α−ＨＣＨを完全脱塩素して１００％分解することがわかった。
【００５０】
＜実験例９＞
[ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株によるβ−ＨＣＨ分解試験：図１２]
実験例８のＴＳＫ培地におけるα−ＨＣＨに代えてβ−ＨＣＨを用いた以外は実験例８と同様にしてβ−ＨＣＨの分解試験を行った。結果を図１２に示す。
ＴＳＫ培地を用いたβ−ＨＣＨの分解試験の結果、１２日間の培養で分解菌の増殖を伴ってβ−ＨＣＨは９０％分解し、２塩素脱離を起こしていることがわかった。
【００５１】
＜実験例１０＞
[ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株によるδ−ＨＣＨ分解試験：図１３]
実験例８のＴＳＫ培地におけるα−ＨＣＨに代えてδ−ＨＣＨを用い、実験例８のＴＳＫ−１株培養液と同様の培養液で濁度を変えたもの（ＯＤ６００＝０．０５）を接種した以外は実験例８と同様にしてδ−ＨＣＨの分解試験を行った。結果を図１３に示す。
上記ＴＳＫ培地を用いたδ−ＨＣＨの分解試験の結果、１０日間の培養で６当量のＣｌ−を検出し、ＴＳＫ−１株はδ−ＨＣＨを完全脱塩素して１００％分解できることがわかった。
また、δ−ＨＣＨ分解試験の結果との比較から、分解速度はδ−ＨＣＨよりもα−ＨＣＨの方が速いことがわかった。
【００５２】
＜実験例１１＞
[ＴＳＫ培地を用いたＴＳＫ−１株による４種ＨＣＨ分解試験：図１４、図１５]
実験例８のＴＳＫ培地におけるα−ＨＣＨの４ｍｇ／Ｌに加えて、β−ＨＣＨを２ｍｇ／Ｌ、γ−ＨＣＨを４ｍｇ／Ｌ、δ−ＨＣＨを４ｍｇ／Ｌにｍｇ加えた以外は実験例８と同様にしてα体，β体，γ体，δ体の４種ＨＣＨの分解試験を行った。結果を図１４および図１５に示す。
１０日間の培養でα体，γ体，δ体は１００％分解し、β体は９１％分解し、脱塩素化率は５３．０％であった。また、ＴＳＫ−１株は増殖を伴って４種ＨＣＨを分解することがわかった。
【００５３】
＜実験例１２＞
[２種（ＴＳＫ−１株＋ＰＤ６５３株）複合系による４種ＨＣＨ分解試験：図１６、図１７]
上記ＴＳＫ培地を用い、α−、β−、γ−、δ−ＨＣＨ分解試験を行った。ＴＳＫ培地２０ｍＬにα−ＨＣＨを５ｍｇ／Ｌ、β−ＨＣＨを２ｍｇ／Ｌ、γ−ＨＣＨを５ｍｇ／Ｌ、δ−ＨＣＨを５ｍｇ／Ｌ含ませ、ＴＳＫ−１分解菌とＰＤ６５３分解菌の割合が３：１になるように、実験例８と同じ培養液の濁度を変えたもの（組成は、Ｒ２Ａ培地にＰＤ６５３株を含みＯＤ６００＝０．５２である）１．０ｍＬとを接種し、３０℃、暗所、１８０ｒｐｍで１４日間振とう培養した。４、７、１４日目にサンプリング（破壊分析）し、培地中の各ＨＣＨ濃度と、Ｃｌ−濃度、培地の濁度（ＯＤ６００）を測定した。より具体的には、培地にヘキサンを３０ｍＬ加えて全抽出し、ヘキサン層からＧＣ−ＥＣＤでδ−ＨＣＨ濃度を測定し、水層からイオンクロマトグラフィーでＣｌ−濃度を測定した。各ＨＣＨ濃度とＣｌ−濃度を図１６に、濁度を図１７に示す。
【００５４】
２種複合系による４種ＨＣＨの分解試験の結果、α−ＨＣＨは１００％、β−ＨＣＨも１００％、γ−ＨＣＨも１００％分解することがわかった。δ−ＨＣＨは９０％分解し、脱塩化率は６５％であった。この結果は、ＴＳＫ−１株よりもＰＤ６５３株の方が増殖速度が速いため、ＴＳＫ−１株の増殖がやや阻害されたためと考えられる。
【００５５】
＜実験例１３＞
[２種（ＴＳＫ−１株＋ＰＤ６５３株）複合系によるＨＣＨｓ実汚染土壌の分解除去試験：図１８]
ＴＳＫ−１分解菌を含む上記培養液（ＯＤ６００＝０．６）とＰＤ６５３分解菌を含む上記培養液（ＯＤ６００＝１．０）とを６：１の割合で混合した分解菌含有培養液３０ｍＬを、洗浄、滅菌した木質炭化素材（ヤシ殻炭ＣＣ１５０；比表面積１５０ｍ２／ｇ、ｐＨ７．８、粒径０．５ｍｍ〜４．０ｍｍ）２０ｇに一晩浸漬した。そして、ＨＣＨｓ汚染土壌３０ｇ（乾土相当）に対し、分解菌が集積したこの木質炭化素材１．５ｇ（乾物相当前記汚染土壌に対して５％相当）を混和し、土壌水分を３０％に調整した後、２５℃、暗所で４週間、静置培養した。この間、毎週攪拌と水分調整を行った。そして培養２週目に木質炭化素材が混じった汚染土壌１０ｇをＡＳＥ（商標）で抽出し、精製後、ＧＣ−ＥＣＤで各ＨＣＨを分析した。その結果を図１８に示す。
【００５６】
図１８より、４種ＨＣＨはその全てが１５％以上（β−ＨＣＨで１８．５％、δ−ＨＣＨで３４．６％）減少していることがわかった。特にγ−ＨＣＨは７６．１％、α−ＨＣＨは６７．１％と５０％を超えていることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2013220044.tif 000019
【図１８】
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【配列表】
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