(57)【要約】【課題】静脈出血だけでなく、動脈出血のような圧力を伴う出血に対しても適用可能な止血材を提供する。【解決手段】前記止血材は、繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースと、トロンビンとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースと、トロンビンとを含む、止血材。
【請求項２】
カルボキシメチルセルロースの置換度が０．５〜１．０未満である、請求項１に記載の止血材。
【請求項３】
形状が布帛である、請求項１又は２に記載の止血材。
【請求項４】
目付が１０〜４０ｇ／ｍ２である、請求項３に記載の止血材。
【請求項５】
天然或いは再生セルロース繊維を水酸化ナトリウム水溶液で処理後、モノクロロ酢酸溶液と反応させ、置換度が０．５〜１．０未満になるようにカルボキシメチル化し、続いて強酸でカルボキシメチル基を全て酸型にしたカルボキシメチルセルロース繊維にトロンビンを塗布或いは化学的に結合させ、乾燥させることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の止血材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、止血に促進効果を有する血液凝固酵素トロンビンを含む止血材とその製造方法に係り、詳しくは、体内及び体外の創傷患部に適用することにより血液凝固作用を促し、さらには静脈出血だけでなく動脈出血の止血効果のある体内吸収性の難溶性の体内吸収性止血材料とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の止血材として、酸化セルロース製剤、ゼラチン製剤、微繊維性コラーゲン製剤、血液凝固蛋白質を含む微繊維性コラーゲン製剤の４種が知られ、医薬品或いは医療機器として既に使用されている。
酸化セルロース製剤は、主構造を構成しているポリ無水グルコン酸がヘモグロビンと著しい親和性をもち、これと塩を形成することによって止血作用を示す。この凝血促進作用は血液凝固機序に対する作用ではなく、寧ろ物理的効果と考えられている。即ち、血液の浸潤により酸化セルロース製剤が膨張し褐色若しくは黒色のゼラチン状の塊となって凝血物の形成を促進し、局部の止血補助剤として効果を発揮し、約２週間で患部から消失吸収されるものである。
微繊維性コラーゲン製剤は、牛真皮などから抽出した天然コラーゲンを主な構成物としており、血液との接触により血小板凝集の形成を介して止血を行う。
また、凝固蛋白質を含む微繊維性コラーゲン製剤は、微繊維性コラーゲンの作用の他、内在するトロンビンとフィブリノーゲンの反応により直接フィブリンを形成して止血する。
【０００３】
しかしながら、酸化セルロース製剤は血液凝固機序に直接作用しないため、凝血作用が弱く、更に処置した患部から完全に吸収されるのに約２週間を要するため、その間患部の炎症、癒着を引き起こす原因となる。
ゼラチン製剤は動物由来の材料であるため、狂牛病、ウィルス性肝炎をはじめとする様々な感染症の要因となる可能性が高い。
また、微繊維性コラーゲン製剤は完全に吸収されるのに１ヶ月以上要し、その間患部の炎症、癒着を可能性が高い。更に材料が牛由来のため、狂牛病、未知のウィルスによる感染等の危険性を持っている。
すなわち、上記各止血材を用いた従来の方法による止血は、体内吸収性が悪く、炎症、癒着などを引き起こし易く、さらには未知の感染症に罹患する可能性がある危険性を有するものである。
【０００４】
また、特許文献１には、天然或いは再生セルロース繊維のセルロース分子を構成するグルコース単位中の水酸基を、カルボキシメチル基の置換度（エーテル化度）が０．５〜１．０未満となるように部分的にカルボキシメチル化した可溶性創傷治癒止血セルロース繊維について記載されている。
上記可溶性創傷治癒止血セルロース繊維は、血液と接触することにより迅速に溶解し、著しい止血効果を示すが、血液との接触にてのみ止血効果を示すもの、すなわち、血液中の血小板及びフィブリノーゲンと相互作用して止血効果を示すものであり、大量の出血の創部では血小板やフィブリノーゲンとの接触が不充分となるため、止血効果は低くなる。
【０００５】
更に、特許文献２には、セルロース分子を構成するグルコース単位中の水酸基を置換度（エーテル化度）が０．５〜１．０未満となるように部分的にカルボキシメチル化した天然或いは再生セルロースに、凝固蛋白質を付与してなる可溶性創傷治癒止血セルロース繊維について記載している。
上記凝固蛋白質を含む可溶性創傷治癒止血セルロース繊維は、血液と接触することにより迅速に溶解し、著しい止血効果を示し、更にはセルロース繊維に付与されている凝固蛋白質、すなわち、トロンビン、フィブリノーゲン及び血液凝固第１３因子の作用により更に著しい止血効果を発揮する。しかしながら、凝固蛋白質を含む可溶性創傷治癒止血セルロース繊維は、カルボキシメチル基がＮａ型であり、大量の血液と接触すると迅速に溶解し、物理的に脆弱、すなわち、動脈出血のような圧力を伴う出血を止血するに難点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３０５７４４６号明細書
【特許文献２】特許第３５７６０６３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、静脈出血だけでなく、動脈出血のような圧力を伴う出血に対しても適用可能な止血材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
［１］繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースと、トロンビンとを含む、止血材、
［２］カルボキシメチルセルロースの置換度が０．５〜１．０未満である、［１］の止血材、
［３］形状が布帛である、［１］又は［２］の止血材、
［４］目付が１０〜４０ｇ／ｍ２である、［３］の止血材、
［５］天然或いは再生セルロース繊維を水酸化ナトリウム水溶液で処理後、モノクロロ酢酸溶液と反応させ、置換度が０．５〜１．０未満になるようにカルボキシメチル化し、続いて強酸でカルボキシメチル基を全て酸型にしたカルボキシメチルセルロース繊維にトロンビンを塗布或いは化学的に結合させ、乾燥させることを特徴とする、［１］〜［４］の止血材の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の止血材によれば、静脈出血だけでなく、動脈出血のような圧力を伴う出血に対しても止血することができる。また、体内吸収性があるため、患部の炎症、癒着を引き起こす可能性を低下させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の止血材は、繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースと、血液凝固酵素トロンビンとを少なくとも含み、所望に応じて、それ以外のカルボキシメチルセルロース、例えば、非繊維形状の酸型カルボキシメチルセルロース、任意形状のアルカリ金属型カルボキシメチルセルロース、酸型とアルカリ金属型とが混在したカルボキシメチルセルロースや、その他の血液凝固蛋白質、例えば、フィブリノーゲン、血液凝固第XIII因子、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、α２−プラスミンインヒビター、ヘモコアグラーゼ、イプシロンアミノカプロン酸、トラネキサム酸、アプロチニン、カルシウム、又はリジン等を含むことができるが、カルボキシメチルセルロースとして、その大部分（例えば、６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上）が繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースであることが好ましく、実質的に繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースのみからなることがより好ましい。
【００１１】
本明細書において、「カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）」とは、特に断らない限り、水に難溶な酸型カルボキシメチルセルロース（狭義のカルボキシメチルセルロース）と、水に易溶なアルカリ金属型カルボキシメチルセルロースとを包含する意味で使用する。
酸型カルボキシメチルセルロースは、カルボキシメチル基が実質的に全て酸型であり、水難溶性である。一方、アルカリ金属型カルボキシメチルセルロースは、ｐＨ７．４でカルボキシメチル基が解離しており、陰イオンの状態にあるため、水可溶性である。アルカリ金属型カルボキシメチルセルロースとしては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカリウムなどを挙げることができる。ここで、「実質的に全て」とは、好ましくはカルボキシメチル基の７０％以上が酸型であること、より好ましくはカルボキシメチル基の８０％以上が酸型であること、さらに好ましくは９０％以上が酸型であることを意味する。
【００１２】
酸型カルボキシメチルセルロース又はアルカリ金属型カルボキシメチルセルロースは、カルボキシメチル基が、実質的に酸型又はアルカリ金属型のいずれか一方の状態にある状態をいうが、酸型又はアルカリ金属型のいずれであるかは、例えば、逆滴定法（特開平１１−２４６６０１号公報）により分析することができる。
具体的には、分析対象であるカルボキシメチルセルロース繊維１ｇを細かく切り、すり合わせ三角フラスコ（５０ｍＬ）中に入れ、硝酸メタノール溶液２５ｍＬ（メタノール１００ｍＬと硝酸１０ｍＬの混合液）を加えて１時間振とうし、完全な酸型の試料とする。次いで、ガラスフィルター（Ｇ３）で吸引ろ過することにより試料をトラップし、８００ｇ／Ｌメタノール溶液（無水メタノール１００ｍＬと水２０ｍＬの混合液）１２０ｍＬ（４０ｍＬ×３回）で試料を洗浄し、最後に無水メタノール２５ｍＬで洗浄後、吸引ろ過し、フィルター上の試料を１０５℃で２時間乾燥する。さらに、完全な酸型となった試料０．２ｇを精密に秤量し、すり合わせ三角フラスコ（１００ｍＬ）に入れ、８００ｇ／Ｌメタノール８ｍＬおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム標準液２０ｍＬを加え、２５℃で３０分間振とうし、酸型の試料をナトリウム型にする。そして、余剰の水酸化ナトリウム量を規定度既知の０．０５ｍｏｌ／Ｌの硫酸でフェノールフタレインを指示薬として滴定することにより求め、それより全エーテル化度（すなわち、アルカリ金属型化度）を求める。
【００１３】
一方、これとは別に、カルボキシメチルセルロース繊維１ｇを細かく切り、ガラスフィルター（Ｇ３）に入れる。８００ｇ／Ｌメタノール溶液（無水メタノール１００ｍＬと水２０ｍＬの混合液）１２０ｍＬ（４０ｍＬ×３回）で試料を洗浄し、最後に無水メタノール２５ｍＬで洗浄後、吸引ろ過し、フィルター上の試料を１０５℃で２時間乾燥する。さらに、試料０．２ｇを精密に秤量し、すり合わせ三角フラスコ（１００ｍＬ）に入れ、８００ｇ／Ｌメタノール８ｍＬおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム標準液２０ｍＬを加え、２５℃で３０分間振とうし、試料をナトリウム型にする。そして、余剰の水酸化ナトリウム量を規定度既知の０．０５ｍｏｌ／Ｌの硫酸でフェノールフタレインを指示薬として滴定することにより求め、それより酸型化度を求める。
全エーテル化度に対する酸型化度の割合を求めることで、酸型又はアルカリ金属型のいずれであるか、あるいは、カルボキシメチル基がどの程度、酸型化されているかを求めることができる。
【００１４】
本発明で用いる繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースは、以下の製造方法に限定されるものではないが、例えば、カルボキシメチル基の全てがアルカリ金属型（好ましくはＮａ型）である繊維状のアルカリ金属型カルボキシメチルセルロースを用意し、その構造を維持した状態で充分に酸処理を行うことにより調製することができる。
繊維状のアルカリ金属型カルボキシメチルセルロース、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウムは、天然或いは再生セルロース繊維を水酸化ナトリウム水溶液で処理後、モノクロロ酢酸溶液と反応させ、所望の置換度（エーテル化度）となるようにカルボキシメチル化することにより得ることができる。
酸処理に用いる強酸としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸などを用いることができる。酸濃度としては、例えば、０．０１〜４．８規定、好ましくは０．１〜３．６規定、より好ましくは０．５〜２．４規定であることができる。
アルカリ金属型カルボキシメチルセルロースは、水に易溶であるため、酸処理を行う際の溶媒として、低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）を主体とするアルコール水溶液（アルコール濃度として、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上）を用いることが好ましい。また、水と混ざり合う性質を持つ有機溶媒（例えば、アセトン、アセトニトリル）を用いても良い。
【００１５】
本発明で用いる繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースの置換度（エーテル化度）は、例えば、０．５〜１．５、好ましくは０．５〜１、より好ましくは０．６〜０．９である。その分子量（プルランを指標とした場合）は、例えば、２万〜２００万Ｄａ、好ましくは２万〜１００万Ｄａ、より好ましくは２万〜５０万Ｄａである。
【００１６】
本発明で用いる酸型カルボキシメチルセルロースの形状は、繊維状である限り、特に限定されるものではないが、例えば、繊維形状のまま、あるいは、編物、織布、不織布などの繊維シート（布帛）形状で使用することができる。
酸型カルボキシメチルセルロースの平均繊維径は、止血材として充分な強度を有し、トロンビンを付与する十分な表面積を有し、付与されたトロンビンの血液凝固作用が充分に発揮できる限り、特に限定されるものではないが、下限として、５μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることが好ましい。上限としては、３０μｍ以下であることが好ましく、２５μｍ以下であることがより好ましい。
【００１７】
酸型カルボキシメチルセルロースが繊維シート形状である場合には、その目付は１０〜３００ｇ／ｍ２であることが好ましく、１０〜４０ｇ／ｍ２であることがより好ましい。
特に、酸型カルボキシメチルセルロースが織布である場合には、その目付は、４０〜３００ｇ／ｍ２であることが好ましく、８０〜２５０ｇ／ｍ２であることがより好ましい。酸型カルボキシメチルセルロースが不織布である場合には、その目付は、１０〜１５０ｇ／ｍ２であることが好ましく、１５〜８０ｇ／ｍ２であることがより好ましい。
【００１８】
本発明において、繊維状の酸型カルボキシメチルセルロースにトロンビンを付与する方法は、止血材として使用した際にトロンビンの血液凝固作用が充分に発揮できるように付与されている限り、特に限定されるものではないが、例えば、物理的付与、例えば、塗布、噴霧、浸漬により、あるいは、化学的結合により、付与することができる。
【００１９】
トロンビンの物理的付与は、適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液）に溶解したトロンビン溶液を酸型カルボキシメチルセルロース繊維に対して、例えば、塗布、噴霧、浸漬することにより行うことができる。トロンビン溶液で処理した後の酸型カルボキシメチルセルロースは、凍結乾燥等により乾燥させて用いることもできる。なお、トロンビン溶液には、アルブミン、ポリエチレングリコール、アルギニン、ヒアルロン酸ナトリウム、グリセリン、マンニトール、塩化カルシウムやコラーゲン等を安定化剤や添加剤として加えても良い。
【００２０】
トロンビンの化学的結合としては、例えば、カルボジイミド試薬で処理した酸型カルボキシメチルセルロース繊維に、トロンビンを含む溶液を加えて反応することにより行うことができる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２２】
《実施例１：本発明止血材の調製》
（１）酸型カルボキシメチルセルロース不織布の作製
レーヨン製不織布（サイズ２０ｃｍ×１００ｃｍ、目付１９ｇ／ｍ２、厚さ０．２６ｍｍ、１０枚）３８ｇを反応容器に入れ、水酸化ナトリウム含有エタノール水溶液（２．９ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム、１１ｍｏｌ／Ｌエタノール）２．７６Ｌを添加し、室温で１７時間インキュベートした。更に、モノクロロ酢酸含有エタノール水溶液（３．４ｍｏｌ／Ｌモノクロロ酢酸、１３．４ｍｏｌ／Ｌエタノール）１．６５Ｌを添加し、５０℃で６時間インキュベートした。７０％メタノール水溶液、８０％メタノール水溶液で順次、洗浄後、塩酸含有メタノール水溶液（１．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸、９０％メタノール）でｐＨ６．０〜８．０に中和した。中和後、８０％メタノール水溶液、１００％メタノールで順次、洗浄後、乾燥し、カルボキシルメチル基がＮａ型のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）不織布を得た。
得られたＣＭＣ不織布を硝酸含有メタノール水溶液（１．３ｍｏｌ／Ｌ硝酸、９０％メタノール）４Ｌ中で室温にて２時間振とうすることにより、カルボキシルメチル基が全てＨ型（酸化型）である酸型ＣＭＣ不織布に変換した。８０％メタノール水溶液、１００％メタノールで順次、洗浄後、乾燥した。
【００２３】
（２）酸型カルボキシメチルセルロース不織布への浸漬によるトロンビンの付与
前記（１）で製造した酸型ＣＭＣ不織布１６ｍｇ（約２ｃｍ×４ｃｍ）を直径１０ｃｍのプラスチック製シャーレに入れ、７５０ｕ／ｍＬ トロンビン（日本製薬社製）を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）［トロンビン溶液］３．２ｍＬを加え、ピペッティングによりこのトロンビン溶液をシートに染み込ませた。吸液しなかったトロンビン溶液は回収した。シャーレごと凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥し、トロンビン付与酸型カルボキシメチルセルロース不織布を得た。
【００２４】
（３）酸型カルボキシメチルセルロース不織布への化学的結合によるトロンビンの付与
前記（１）で製造した酸型ＣＭＣ不織布１５６ｍｇ（約５ｃｍ×１５ｃｍ）を折りたたみ、１５ｍＬ容ガラス試験管に入れ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド３８０ｍｇを含む７０％エタノール溶液１０ｍＬを添加した。その後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド３８ｍｇを加え、３０℃で２時間振とう攪拌した後、反応液を除去し、該カルボジイミド試薬で処理した酸型ＣＭＣ不織布を７０％エタノール１０ｍＬで３回洗浄した。次に、トロンビン（日本製薬社製）７５００単位を含む７０％エタノール溶液１０ｍＬを加え、３０℃で２時間反応させた。そして、未反応のカルボキシル基をブロックするために、Ｌ−リジン２９０ｍｇを加え、さらに３０℃で１時間反応させた後、反応液を除去し、反応後の酸型ＣＭＣ不織布を７０％エタノール溶液１０ｍＬで３回、９５％エタノール１０ｍＬで１回洗浄した。これを凍結乾燥することにより、化学的に結合させたトロンビンを含む酸型カルボキシメチルセルロース不織布を得た。
【００２５】
《実施例２：本発明止血材の動脈出血への有効性の評価》
本実施例では、比較用の止血材として、（１）ガーゼ、（２）特許第３５７６０６３号明細書の実施例に記載の手順に従って調製した、凝固蛋白質を含む可溶性創傷治癒止血セルロースを使用し、本発明止血材として、（３）実施例１（２）で調製したトロンビン付与酸型カルボキシメチルセルロース不織布を使用した。
体重約４０ｋｇのブタ（全６頭）を仰向けにし、全身麻酔下で、両側の頚動脈及び両側の大腿動脈（全４箇所）を４ｃｍ露出させた。１８Ｇのショートベベル注射針にて動脈を穿刺し、ただちに、１．５ｃｍ角に切った止血材を貼付し、スポンジで軽く１分間圧迫し、５分間止血状態を観察した。５分間止血されていた状態を「Ａ」、２分間だけ止血できた状態を「Ｂ」、止血できないを「Ｆ」とした。止血実験中の全身血圧も記録した（穿刺の１分前から３０秒毎に穿刺後５分まで）。
止血操作の順序は、止血材は（１）、（２）、（３）の順序で、止血部位は左頚動脈→右頚動脈→右大腿動脈→左大腿動脈の順序で実施した。すなわち、１頭目は、左頚動脈を止血材（１）で、右頚動脈を止血材（２）で、右大腿動脈を止血材（３）で、左大腿動脈を止血材（１）で止血した。
【００２６】
結果を表１に示す。止血率（％）は、次式：
｛（Ａ評価であった穿刺部位数）／（全穿刺部位数）｝×１００
で計算した。
【００２７】
《表１》
止血材                （１）          （２）          （３）  
頚動脈（左）          Ｆ  Ｆ          Ａ  Ｂ          Ａ  Ａ
頚動脈（右）          Ｆ  Ｆ          Ａ  Ａ          Ａ  Ａ
大腿動脈（右）        Ｆ  Ｆ          Ａ  Ｆ          Ｂ  Ａ
大腿動脈（左）        Ｆ  Ｂ          Ｂ  Ａ          Ａ  Ａ  
止血率（％）            ０％          ６３％          ８８％
【００２８】
明らかに、本発明止血材（３）が最も有効であった。この結果は、（３）に塗布してあるトロンビンが直接速やかに血液中のフィブリノーゲンに作用して止血するのに対して、凝固蛋白質を含む可溶性創傷治癒止血セルロース（２）では、塗布しているトロンビンがまず共に塗布してあるフィブリノーゲンに作用して止血するので、（３）に比べて止血が遅延すること、そして、支持体であるセルロース繊維が可溶性であるため、血圧に耐えられないことを反映していると思われる。
なお、血圧はほとんど変化しなかった。
【００２９】
《実施例３：本発明止血材の肝切除部位の止血への有効性の評価》
止血材としては、実施例２と同じ止血材（１）〜（３）を使用した。
体重約４０ｋｇのブタ（全１２頭）を全身麻酔下で、正中切開し、開腹し、肝臓左内側葉の尾側を適当な箇所をＶ字切離し（切離部分の重量は３〜４ｇを目安とした）、出血している血管の止血処理を行うことなく、止血材を貼付し、スポンジで１分間圧迫後、５分後の止血効果を評価した。５分後に止血できた場合を「Ａ」、５分後に止血できなかった場合を「Ｆ」とした。
肝臓左内側葉の切離部位は１頭当たり３箇所とし、止血材（１）〜（３）の貼付部位は１頭毎にローテションして止血効果を評価した。
【００３０】
結果を表２に示す。止血率（％）は、実施例２と同様に、次式：
｛（Ａ評価であった切離部位数）／（全切離部位数）｝×１００
で計算した。
【００３１】
《表２》
止血材          （１）      （２）      （３）  
Ａ評価            ０          ９        １２
Ｆ評価          １２          ３          ０    
止血率（％）      ０％      ７５％    １００％  
【００３２】
明らかに、本発明止血材（３）が最も有効であった。この結果は、（３）に塗布してあるトロンビンが直接速やかに血液中のフィブリノーゲンに作用して止血するのに対して、凝固蛋白質を含む可溶性創傷治癒止血セルロース（２）では、塗布しているトロンビンがまず共に塗布してあるフィブリノーゲンに作用して止血するので、（３）に比べて止血が遅延すること、そして、支持体であるセルロース繊維が可溶性であるため、血圧に耐えられないことを反映していると思われる。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明の止血材は、静脈出血だけでなく、動脈出血のような圧力を伴う出血に対しても適用可能な止血材である。