(57)【要約】【課題】本発明は、より簡便で感度及び特異度の高い膵臓癌の検査方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、被検者の血清中のトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ）レベルを測定する工程を含む、膵臓癌の検査方法を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の血清中のトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ）レベルを測定する工程を含む、膵臓癌の検査方法。
【請求項２】
前記ＴＦＦが、ＴＦＦ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血清ＴＦＦレベルを測定する工程は、抗ＴＦＦタンパク質抗体を用いたイムノアッセイによって行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗ＴＦＦ抗体を含む、膵臓癌の検査用キット。
【請求項５】
前記抗ＴＦＦ抗体が、抗ＴＦＦ３抗体である、請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者の血清中のトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ）タンパク質量を測定する工程を含む膵臓癌の検査方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、膵臓癌の検査としては、超音波検査、ＣＴ検査、磁気共鳴胆管膵管撮影法（MRCP法）、内視鏡的逆行性胆管膵管撮影法（ERCP法）、超音波内視鏡検査（EUS）、PET検査等の画像によるものや、CA19-9、CEA、Dupan-2、CA50など腫瘍マーカーを検出する血液検査などが用いられている。
【０００３】
しかしながら画像診断は、大規模な設備と高額な装置が必要であり、広く普及しているとはいえない。また、これまでに用いられている腫瘍マーカーは、感度及び特異度が十分とはいえず、いずれもある程度癌が進行しないと増加しないものが多いので早期発見には適していない。
【０００４】
膵臓癌は、初期症状がほとんどないため早期発見が困難であり、進行が早く予後も悪い難治性癌である。治癒の可能性は、膵臓癌のステージにより、早期発見やその趨勢の見極めは、膵臓癌による死亡率を低下させるために非常に重要である。したがって、早期癌の発見や進行度等の判断に有用な、より簡便で感度及び特異度の高い膵臓癌の検査方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、より簡便で感度及び特異度の高い膵臓癌の検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、血清中のトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ）の濃度は膵臓癌患者と非膵臓癌患者で有意に異なり、ＴＦＦをマーカーとすることによって感度及び特異度が高い検査ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
〔１〕被検者の血清中のトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ）レベルを測定する工程を含む、膵臓癌の検査方法；
〔２〕前記ＴＦＦが、ＴＦＦ３である、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記血清ＴＦＦレベルを測定する工程は、抗ＴＦＦタンパク質抗体を用いたイムノアッセイによって行う、上記〔１〕または〔２〕に記載の方法；
〔４〕抗ＴＦＦ抗体を含む、膵臓癌の検査用キット；及び
〔５〕前記抗ＴＦＦ抗体が、抗ＴＦＦ３抗体である、上記〔４〕に記載のキット、に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の検査方法によれば、被検者の血液から調製した血清中のTFF濃度を測定するという簡便かつ苦痛を伴わない方法により、感度及び特異度の高い膵臓癌の検査を行うことができる。特に、TFF3は、現行の膵臓癌マーカーであるCEAまたはCA19−9が正常値である患者においても増加しており、TFF3をマーカーとすれば、簡便な方法でより早期に膵臓癌を発見できる可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（膵臓癌の検査方法）
本発明に係る膵臓癌の検査方法の一態様は、被検者の血清中のTFFタンパク質量を測定する工程を含む。
【００１０】
TFFは、いずれも12-22kDaのTFF1、TFF2、TFF3の3つの安定なタンパク質からなるファミリーであり、哺乳動物の消化管から分泌されることが知られている（非特許文献１〜４）。
【００１１】
TFFはTFF1〜3が共通に有する3つのループ構造にちなんで名づけられた。TFFはこのループ構造によりタンパク質分解に対して極めて安定となり、耐酸性や耐熱性にも優れている。TFF1〜3は、消化管においてそれぞれ組織特異的に広く発現している。TFF1は、胃粘膜の表層粘液細胞で発現し、TFF2は胃底部のmucus neck cells、deep antral gland cells、及び十二指腸のブルンナー腺で発現し、TFF3は小腸及び大腸の杯細胞で発現している。
【００１２】
また、慢性的なヘリコバクターピロリ菌の感染によって生じる慢性萎縮性胃炎における粘膜の組織学的な変化には、foveolar hyperplasia、Spasmolytic polypeptide (TFF2)-expressing metaplasia（SPEM）及び腸上皮化生を伴う分泌性の萎縮があるが、これらの組織においてもTFFが発現することが知られている。
【００１３】
foveolar hyperplasiaは、もともとTFF1を発現する小窩表層粘液細胞からなる胃小窩の伸長である。SPEMは胃底部のTFF2陽性細胞を特徴とするantral phenotype lineageである。SPEMは胃癌を取り囲む胃粘膜によく見られ、初期の胃癌の58%においてTFF2は陽性である。腸上皮化生は胃粘膜に生じる腸型細胞（intestinal phenotype cells）を特徴とし、腸型胃癌の前癌病変であると考えられている。TFF3は、前述の小腸及び大腸の杯細胞に加え、胃の腸上皮化生でも発現する。
【００１４】
後述する実施例に示されるとおり、血清TFF3レベルは、健常者と比較して膵臓癌患者において有意に高く、従来用いられている腫瘍マーカーCEAまたはCA19−9が正常値である場合にも上昇が見られた。
【００１５】
本発明に係る検査に用いられる血清は、被検者から採取した血液から常法にしたがって調製したものを用いることができる。
【００１６】
血清中のTFFを測定する工程は、液体中の特定のタンパク質を検出、測定するためのあらゆる方法を用いて行うことができ、例えば、例えば、イムノアッセイ（凝集法、比濁法を含む）、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴（SPR）法等が挙げられるが、これらに限定されない。抗TFF抗体とTFFとの抗原抗体反応を利用してTFF量を測定するイムノアッセイは、特に簡便で好ましい。
【００１７】
イムノアッセイは、検出可能に標識した抗TFF抗体、及び／又は検出可能に標識した抗TFF抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（EIA又はELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA）、蛍光偏光イムノアッセイ（FPIA）、化学発光イムノアッセイ（CLIA）、蛍光酵素イムノアッセイ（FLEIA）、化学発光酵素イムノアッセイ（CLEIA）、電気化学発光イムノアッセイ（ECLIA）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。
【００１８】
ELISA法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、RIA法では、125I、131I、35S、3H等の放射性物質、FPIA法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、CLIA法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
【００１９】
また、イムノアッセイでは、抗TFF抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。
【００２０】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるELISA法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができて好ましい。
【００２１】
ELISA法には競合法とサンドイッチ法がある。競合法では、マイクロプレート等の固相担体に抗TFF抗体を固定し、血清サンプルと酵素標識したTFFを添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。血清サンプル中のTFFが多ければ発色は弱くなり、血清サンプル中のTFFが少なければ発色が強くなるので、検量線を用いてTFFレベルを求めることができる。
【００２２】
サンドイッチ法では、固相担体に抗TFF抗体を固定し、血清サンプルを添加し、反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する抗TFF抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、TFF量を求めることができる。サンドイッチ法では、固相担体に固定した抗体と血清サンプル中のTFFを反応させた後、非標識抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。
【００２３】
酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、3,3’−diaminobenzidine（DAB）、
3,3’5,5’−tetramethylbenzidine（TMB）、o−phenylenediamine（OPD）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、p−nitropheny phosphate（NPP）等を用いることができる。
【００２４】
本明細書において「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的物質は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
【００２５】
また、上記イムノアッセイの中で、微量のタンパク質を簡便に検出できる方法として凝集法も好ましい。凝集法としては、例えば、抗体にラテックス粒子を結合させたラテックス凝集法が挙げられる。
【００２６】
ラテックス粒子に抗TFF抗体を結合させて適宜処理した血清サンプルに混合すると、TFFが存在すれば、抗体結合ラテックス粒子が凝集する。そこで、サンプルに近赤外光を照射して、吸光度の測定（比濁法）又は散乱光の測定（比朧法）により凝集塊を定量し、抗原の濃度を求めることができる。
【００２７】
抗TFF抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、TFF1〜3のそれぞれ又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、TFF1〜3のそれぞれ又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。抗TFF抗体は、既存の抗体を用いてもよい。
【００２８】
本明細書において「膵臓癌」は通常の意味で用いられ、病理学的な分類、形態、深達度、進行で示される病期等によらず、あらゆる状態の膵臓癌を含む。
【００２９】
本明細書において「検査」は、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べることを意味し、本発明の検査方法は、例えば検査会社等で実施され得る。
【００３０】
また、本発明において、「検査」は、症状が現れない段階で膵臓癌の可能性を調べるスクリーニング検査と、膵臓癌に罹患していることが明らかになった後で、その進行度、予後、治療効果、再発の可能性などの癌の趨勢を調べる検査とのいずれも含み、本発明の検査方法は、いずれの検査にも有用である。
【００３１】
本発明の検査方法の一態様は、血清TFF3レベルを測定する工程を含む膵臓癌の検査方法であって、血清TFF3レベルのカットオフ値は、測定値から適宜決定することができる。
【００３２】
また、本発明に係る検査方法は、従来用いられている腫瘍マーカーによる検査方法と組み合わせてもよい。
（膵臓癌の診断方法）
なお、本発明は、被検者の血清中のトレフォイルファクターファミリー（ＴＦＦ）レベルを測定する工程を含む、膵臓癌の診断方法も包含する。
【００３３】
ここで「診断」は、医療行為者が、検査結果等に基づいて、被検者が特定の疾患に罹患しているかどうか判断することを意味する。
【００３４】
本発明に係る膵臓癌の診断方法について用いられる用語のうち、前述の本発明に係る検査方法で用いられた用語はそれと同義であり、ここでは説明を省略する。
（膵臓癌の検査用キット）
本発明に係る膵臓癌の検査用キットは、上述した検査方法を使用して膵臓癌の検査を行うためのキットであり、抗TFF1抗体、抗TFF2抗体、及び抗TFF3抗体の少なくとも1つを含む。
【００３５】
本発明の検査用キットは、抗TFF抗体とTFFとの抗原抗体反応を利用するイムノアッセイによって、血清TFFレベルを測定するために必要な試薬及び装置を含む。
【００３６】
検査用キットの一態様は、サンドイッチ法によってTFFを測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗TFF抗体；アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗TFF抗体；及び、アルカリホスファターゼ基質（NPP等）又はペルオキシダーゼの基質（DAB、TMB、OPD等）、を含む。
【００３７】
捕獲抗体と標識抗体は、異なるエピトープを認識する。
【００３８】
このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに血清サンプルを適宜希釈して添加した後インキュベートし、サンプルを除去して洗浄する。次に、標識した抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、TFFレベルを求めることができる。
【００３９】
検査用キットの別の態様は、二次抗体を使用してサンドイッチ法によりTFFを測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗TFF抗体；一次抗体として、抗TFF抗体；二次抗体として、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗TFF抗体；及び、アルカリホスファターゼ（NPP等）又はペルオキシダーゼの基質（DAB、TMB、OPD等）、を含む。
【００４０】
捕獲抗体と一次抗体は、異なるエピトープを認識する。
【００４１】
このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに血清サンプルを適宜希釈して添加した後インキュベートし、サンプルを除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、TFFレベルを求めることができる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。
【００４２】
また、検査用キットの別の態様は、マイクロタイタープレート；一次抗体としての抗TFF抗体；アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗TFF抗体；及び、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼの基質、を含む。
【００４３】
かかるキットによれば、まず、適当な濃度に希釈したサンプルでマイクロタイタープレートをコーティングし、一次抗体を添加する。インキュベート及び洗浄を行った後、酵素標識した二次抗体を添加し、インキュベート及び洗浄を行い、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、TFFレベルを求めることができる。
【００４４】
各検査用キットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことも好ましい。
【００４５】
標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（25I、131I、35S、3H等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また標識抗体としてビオチン化抗体を用い、キットに標識したアビジン又はストレプトアビジンを加えることもできる。
【００４６】
本発明の検査用キットのさらに別の態様として、ラテックス凝集法によってTFFレベルを測定するためのものも挙げられる。このキットは、抗TFF抗体感作ラテックスを含み、血清サンプルと抗TFF抗体とを混合し、光学的方法で集塊を定量する。キットに凝集反応を可視化する凝集反応板が含まれていることも好ましい。
【００４７】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
＜被検者＞
横浜市立大学附属病院に2011年1月から2011年4月に入院した膵臓癌患者18名を対象とした。
＜血清TFFレベルの測定＞
常法に従ってヒトTFF3発現プラスミドを構築し、発現させ、組換えヒトTFF3を精製した。これを用いてウサギを免疫し、ヒトTFF3に対する抗血清を得た。
【００４９】
血清TFF3レベルは、この抗血清を用いたELISA法により測定した。感度は30pg/mLであった。抗血清はTFF3に特異的に反応し、他のTFFに対する交差反応は示さなかった。
＜結果＞
測定結果を下表に示す。コントロール群として2006年9月から11月にNTT関東中央病院で健康診断を受けた健康な男女269名について測定した血清TFF3レベルは、2.84±0.84（レンジ1.22−6.25）ng/mLであり、すべての膵臓癌患者において血清TFF3レベルは、コントロール群に比較して有意に高かった。
【００５０】
表中、太字で示した症例（No.4、6、12、17−19）は、現在使用されているマーカーCEA及びCA19−9はともに正常値であった。また、CEA及びCA19−9のいずれか一方が正常値である症例は12例であり、血清TFF3レベルがこれまでのマーカー以上に有用である可能性が示唆された。
【００５１】
【表１】
2013083556.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５２】
【非特許文献１】Plaut AG. N Engl J Med 1997;336:506-507
【非特許文献２】Ribieras S. et al. Biochim Biophys Acta 1998;1378:F61-F77
【非特許文献３】Kjellev S. Cell Mol Life Sci 2009;66:1350-1369
【非特許文献４】Wong WM. et al. Gut 1999;44:890-895