(57)【要約】【課題】新たなＡＬＳ予防治療剤の提供。【解決手段】クロセチン又はその糖エステルを有効成分とする筋萎縮性側索硬化症予防治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロセチン又はその糖エステルを有効成分とする筋萎縮性側索硬化症予防治療剤。
【請求項２】
クロセチン又はその糖エステルが、クロセチン−β−Ｄ−ゲンチオビオシル−β−Ｄ−グルコシルエステルである請求項１記載の筋萎縮性側索硬化症予防治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の予防治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（以下、ＡＬＳ）は、重篤な筋内の萎縮と筋力低下をきたす神経変性疾患で、運動ニューロン病の一種である。極めて進行が速く、半数ほどが発症３年から５年で呼吸筋麻痺により死亡する。ＡＬＳの有病率は、人口１０万人当たり約３人から５人とされ、日本では約４０００〜５０００人の患者がいると考えられている。４０代から５０代に発症する例が多い。
【０００３】
ＡＬＳの原因は、未だ不明であるが、ＡＬＳの治療薬としては、神経栄養因子、神経保護作用、カスパーゼ抑制、銅キレート作用、グルタミン酸抑制作用、抗酸化剤等に基づいた薬剤についての検討がなされている。しかし、現在、ＡＬＳ治療薬として販売されているのは、グルタミン酸受容体のアンタゴニストおよびグルタミン酸遊離阻害剤としてグルタミン酸抑制作用のあるリルゾールのみである（特許文献１）。
【０００４】
ＡＬＳのうち約５から１０％は家族性筋萎縮性側索硬化症（以下、ＦＡＬＳ）である（非特許文献１、２）。ＡＬＳの病因解明の一つの糸口として、１９９３年にＦＡＬＳのうち約２０％に、銅・亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ｃｏｐｐｅｒ／ｚｉｎｃ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ１）遺伝子に異常を持つ家系が存在することが報告された（非特許文献３、４、５）。この発見に基づいて、ヒト変異ＳＯＤ１遺伝子を高発現するトランスジェニックマウスが遺伝子工学的に開発されている（非特許文献６）。このトランスジェニックマウスは、ヒトＡＬＳと同様に運動ニューロン障害による運動麻痺症状を呈し、やがて四肢麻痺、最終的には呼吸筋麻痺を惹起させ瀕死状態に陥り死亡する。尚かつ病理学的にもヒトと同様の運動ニューロン障害の病理組織像を示す。従って、このトランスジェニックマウスはヒトＡＬＳ動物モデルとして有用である。最近、ＨＳＰ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）誘導作用を有するヒドロキシルアミン誘導体である、アリモクロモル（ａｒｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）が、このＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）Ｔｇマウスにおいて運動ニューロンの細胞死抑制と延命作用を有し、ＡＬＳに有効であることが報告された（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２７１３３８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｄｓｏｎ  ＡＪ．Ｂｒａｉｎ  １９８１；１０４：２１７−２４７
【非特許文献２】Ｊｕｎｅｊａ  Ｔら．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７；４８：５５−５７
【非特許文献３】Ｋａｔｏら．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ａｎｄ  Ｍｏｖｅｍｅｎｔ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＩＳＮ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ  Ｐｒｅｓｓ，２００３：ｐｐ３５０−３６８
【非特許文献４】Ｄｅｎｇ  ＨＸら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；２６１：１０４７−１０５１
【非特許文献５】Ｒｏｓｅｎ  ＤＲら．Ｎａｔｕｒｅ  １９９３；３６２：５９−６２
【非特許文献６】Ｇｕｒｎｅｙ  ＭＥら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６４：１７７２−１７７５
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０：４０２−４０５，２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、リルゾールのＡＬＳに対する効果は十分とは言えず、新たなＡＬＳ予防治療剤の開発が望まれている。
従って、本発明の課題は、新たなＡＬＳ予防治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、ＦＡＬＳトランスジェニックマウス細胞及びニューロラチリズムモデルラット細胞を用いて、植物中の成分の薬理作用を検討してきたところ、サフラン中のクロセチン又はその糖エステルが、抗酸化剤として知られているレスベラトロールに比べて強力なＡＬＳ治療効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、クロセチン又はその糖エステルを有効成分とするＡＬＳ予防治療剤を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、サフラン中の成分として知られているクロセチン又はその糖エステルの投与によりＡＬＳが予防治療できる。クロセチン又はその糖エステルは、安全性も高く、長期間投与可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明ＡＬＳ予防治療剤の有効成分は、クロセチン又はその糖エステルである。クロセチンは、下記式（１）を有する化合物であり、クロッカス、サフラン、クチナシ等に含まれているカロテノイドカルボン酸である。
【００１２】
【化１】
2013170165.tif 000002
【００１３】
また、クロセチンの糖エステルとしては、下記式（２）で示されるように、クロセチンのカルボキシル基に単糖又は二糖がエステル結合した化合物が挙げられる。
【００１４】
【化２】
2013170165.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ1及びＲ2は、一方は両方が同一又は異なって、単糖残基又は二糖残基であり、残余は水素原子である）
【００１６】
Ｒ1及びＲ2の単糖残基又は二糖残基としては、グルコシル基、フルクトシル基、グルコシル−グルコシル基（ゲンチオビオース残基）、グルコシル−フルクトシル基、フルクトシル−フルクトシル基等が挙げられる。Ｒ1及びＲ2の両方が単糖残基又は二糖残基であるのがより好ましい。このうち、Ｒ1がβ−Ｄ−ゲンチオビオシル基で、Ｒ2がβ−Ｄ−グルコシル基である、クロセチン−β−Ｄ−ゲンチオビオシル−β−Ｄ−グルコシルエステルが特に好ましい。
【００１７】
クロセチン又はその糖エステルは、アヤメ科クロッカス属やアカネ科クチナシ属等の植物から抽出することもできるが、公知の手法により化学的に合成してもよい。植物からの抽出方法としては、アヤメ科クロッカス属のクロッカス、サフランやアカネ科クチナシ属のクチナシ等の粗アルコールエキスからブタノール画分を採取し、さらに逆相クロマトグラフィーにより分画してもよい。なお、クロセチン又はその糖エステルを含有する植物からの抽出物をそのまま使用してもよい。
【００１８】
クロセチン又はその糖エステルは、異性体を使用してもよいし、その塩、水和物等を使用してもよい。
【００１９】
クロセチン又はその糖エステルは、後記の実施例に示すように、ＡＬＳモデルにおいて明らかな運動能力低下の遅延、及び生存日数の延長が認められ、ＡＬＳ予防治療剤として有用である。
【００２０】
本発明のＡＬＳ予防治療剤の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口投与としては髄腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、吸入、直腸内、鼻腔内投与及び点鼻、点耳、点眼、外用投与等が挙げられる。
【００２１】
本発明のＡＬＳ予防治療剤としては、有効成分であるクロセチン若しくはその糖エステル又はこれを含む植物抽出物をそのまま患者に投与してもよいが、好ましくは、有効成分と薬学的に許容し得る添加物とを含む医薬組成物の形態の製剤として投与すべきである。薬学的に許容し得る添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。
【００２２】
経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、又は外用剤（貼付、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、スプレーなどを含む）などを挙げることができる。
【００２３】
経口投与に適する製剤には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。注射、点滴用、点鼻剤、点耳剤又は点眼剤に適する製剤には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成し得る溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。坐剤に適する製剤には、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等の基剤、及び必要に応じて非イオン界面活性剤のような界面活性剤等の添加物を用いることができる。
軟膏剤に適する製剤には、通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて用いられる。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００２４】
貼付剤に適する製剤としては、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布したものが挙げられる。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００２５】
本発明のＡＬＳ予防治療剤の投与量は、疾患の進行状況又は症状の程度、患者の年齢や体重などの諸条件に応じて適宜選択可能であるが、クロセチン又はその糖エステルとして１日１０〜１０００mg程度であるのが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２７】
製造例１
乾燥サフラン（群馬県沼田産）５０ｇに７５％エタノール（ＥｔＯＨ）（または７５％メタノール（ＭｅＯＨ））１〜２Ｌを加え、振とう抽出を行う。濾液を得、エバポレーターを用いて濃縮乾固を行う。ここまでを２〜３回繰り返す。濃縮乾固物の重量を量り（３１ｇ）、その３０ｇを液々分配に付す。その３０ｇを最小限の水に懸濁溶解し、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）１Ｌを加え、分液ロートで分画を行う。２回繰り返し、得られた酢酸エチル画分に無水硫酸ナトリウムを加える。１昼夜静置後、濾液を得、エバポレーターを用いて濃縮乾固を行い、酢酸エチル画分４．１ｇを得る。残りの水画分にブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）１Ｌを加え、分液ロートで分画を行う。２回繰り返し、エバポレーターを用いて得られたブタノール画分の濃縮乾固を行い、ブタノール画分１２．３ｇを得る。ブタノール画分１０ｇを最小限の水または水／メタノールに溶解し、水／メタノール系のＯＤＳ−カラムクロマトグラフ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ７５Ｃ１８−ＯＰＮ，１０ｇ；カラムサイズ：３．８×２２cm）に付す。水／メタノール系で溶出を行い（２０％〜８０％ＭｅＯＨ、各６００mL）、１００mLずつに分画し、画分１〜３７を得る。各画分を適量に濃縮し、少量をＴＬＣ（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ254，Ｓｏｌｖ．：ｎ−ＢｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ2Ｏ＝７：１：２，ｖ／ｖ）に付し、ＵＶ254および硫酸（５０％）焼きでスポットを確認し、それぞれのスポットの集約した画分をまとめる（主要画分：５−８画分１．０ｇ、２１−２３画分２．０ｇ、２４−２８画分１．０ｇ、２９−３５画分１．７ｇ）。
活性主画分と思われる２４−２８画分１．０ｇに対してメタノールによる結晶化を行い、結晶１６０ｍｇを得る。同上ＴＬＣで単離を確認した。得られた結晶をＮＭＲ、ＩＲ、ＭＳ等により分析した結果、オールトランス−クロセチン−β−Ｄ−ゲンチオビオシル−β−Ｄ−グルコシルエステル（化合物１）であることを確認した。
【００２８】
試験例
（１）動物の管理および遺伝子保持動物の作製：
動物は日本大学薬学部実験動物センターにおいて室温２３℃±１℃、湿度５０±１０℃、清浄度ＳＰＦ（バリヤ）区域マウス飼育室で飼育した。ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡトランスジェニックマウスはＪａｃｋｓｏｎラボラトリー（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂより購入し遺伝子保持雄とワイルドタイプ雌との交配により自家繁殖して作製した。Ｆ１についてＧｕｒｎｅｙらの方法に従ってＰＣＲ法により本遺伝子を保持している個体を選別した。（Ｇｕｒｎｅｙ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４，１７７２−１７７５（１９９４））。１か月後に離乳させ、薬物投与開始１週間前より単独でポリカーボネートケージで飼育した。同時期からロータロッド法の訓練を３日ごとに行った。
【００２９】
（２）被検化合物（化合物１）溶液の調製と保管：
化合物１は十分に乾燥された粉末として遮光下低温保存された。微細とした粉末の表面を最終体積の２％容積の９９．５％エタノール（試薬特級、和光純薬製）にて潤したのち、滅菌精製水を加え、懸濁液とした。対照用としては、同エタノール２％溶液を調製した。これらの液は４℃前後の低温に保管し、投与直前に十分に懸濁させた後ただちにツベルクリンシリンジにとり、投与に供した。本懸濁液は同保存条件下、７日以内に使用した。
【００３０】
（３）被検化合物（化合物１）溶液、対照溶液の動物への投与方法：
同上センター内実験室において、生後９週の雌雄の遺伝子保持マウスについて、ステンレス製経口ゾンデ（マウス用）を用いて毎朝９時±１時間に被検物質を７５mg／kg体重、５０μL／１０ｇ体重で経口投与した。投与終了後は通常の環境（マウス飼育室）に戻し飼育した。
【００３１】
（４）体重測定：体重を毎朝９時±１時間の時間帯に測定した。
【００３２】
（５）運動能力測定：
週１回同じ曜日の午前中に同上センター内、特殊実験室内でロータロッド（Ｒｏｔａ−Ｒｏｄ  Ｔｒｅａｄｍｉｌｌ  ｆｏｒ  ｍｉｃｅ室町器械製ＭＫ−６００、毎分１５回転）法で落下せずに歩行する能力を検定した。３００秒まで落下せずに歩行できたものはカットオフとして終了し、それ以前に落下したものについては落下するまでの時間を測定した。間に１５−２０分の休憩時間を置き、３回測定した測定値の平均値を求めた。
【００３３】
（６）生存日数の測定：
投与群について、動物が正向反射を３０秒以上行えなくなった時点を死亡として判定した。
【００３４】
（７）実験結果
化合物１を投与した動物群（６匹、構成は雄3匹、♀3匹）および２％エタノール溶液を投与された群（６匹、構成は雄3匹、♀3匹）を比較した結果、運動能力の低下が約１４日延長された。
生存日数ではそれぞれの群の平均死亡日数の比較により１６．５日延長された。
また、化合物１の効果は、抗酸化剤であるレスベラトロールよりも明らかに優れていることを確認した。