(57)【要約】【課題】セルロース含有材料から低コストでかつ効率的に有用物質を生産する方法を提供すること。【解決手段】本発明のセルロースを糖化する方法は、（１）セルロース含有材料をイオン液体で処理する工程、および（２）工程（１）で糖化率が１％を超えたときに得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程を含み、該イオン液体のカチオン種は、置換ピリジニウムである。また、本発明のセルロース含有材料からエタノールを生産する方法は、（ａ）セルロース含有材料をイオン液体で処理する工程、（ｂ）工程（ａ）で糖化率が１％を超えたときに得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程、および（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液とエタノール生産微生物とを混合し、該微生物を培養する工程を含み、該イオン液体のカチオン種は、置換ピリジニウムである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースを糖化する方法であって、
（１）セルロース含有材料をイオン液体で処理する工程、および
（２）工程（１）で糖化率が１％を超えたときに得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程
を含み、
該イオン液体のカチオン種が、置換ピリジニウムである、方法。
【請求項２】
前記イオン液体のカチオン種が、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合した置換ピリジニウムであって、該置換基が、置換基が炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオン液体のカチオン種が、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムおよび１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イオン液体のアニオン種が、ハロゲンである、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
セルロース含有材料からエタノールを生産する方法であって、
（ａ）セルロース含有材料をイオン液体で処理する工程、
（ｂ）工程（ａ）で糖化率が１％を超えたときに得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液とエタノール生産微生物とを混合し、該微生物を培養する工程
を含み、
該イオン液体のカチオン種が、置換ピリジニウムである、方法。
【請求項６】
前記イオン液体のカチオン種が、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合した置換ピリジニウムであって、該置換基が、置換基が炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イオン液体のカチオン種が、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムおよび１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記イオン液体のアニオン種が、ハロゲンである、請求項５から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
前記セルラーゼの全部または一部が、前記微生物に由来し、該微生物が、セルラーゼを分泌または表層提示するように形質転換されたセルラーゼ発現微生物である、請求項５から８のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有材料から有用物質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有限である石油資源を代替するものとして、植物に由来するバイオマスに対する期待が高まってきており、バイオマスをエネルギーや各種材料に利用するための各種の試みがなされている。また、バイオマスを化成品やバイオ燃料に利用するバイオリファイナリーの重要性が指摘され、実用化に向けた技術開発が進められている。バイオマスを、エネルギー源やその他の原料として有効利用するためには、バイオマスを動物や微生物が容易に利用可能な炭素源にまで分解・糖化することが必要である。実用化のために解決すべき課題としては、木質系または草本系のバイオマスの主成分であるセルロース、なかでも結晶性セルロースの効率的な分解方法の開発が挙げられる。
【０００３】
現状の糖化プロセスでは、セルロース含有バイオマスを高温・高圧処理や酸処理により前処理してセルロースを分離後、セルロースにセルラーゼを作用させている。これらの前処理には多大なエネルギーや大量のセルラーゼを必要とし、セルロースの前処理に要するコストの低下が課題となっている。
【０００４】
特許文献１は、セルロース含有材料をイオン液体で処理してセルロースを可溶化し、これにセルラーゼを表層提示する酵母を添加して培養することによって、セルロースを糖化しつつエタノール発酵することに成功したことを報告している。発酵開始１２０時間で理論収率の約５６％のエタノールが得られている。しかし、より短時間でより効率よくエタノールを得ることが課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−３６１４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、セルロース含有材料から低コストでかつ効率的に有用物質を生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、セルロース含有材料を特定のイオン液体で処理することによってセルロースが糖化されることを見出し、さらにこの処理液にセルラーゼ発現微生物を添加して培養することによって、効率よくエタノール発酵できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は、セルロースを糖化する方法を提供し、該方法は、（１）セルロース含有材料をイオン液体で処理する工程、および（２）工程（１）で糖化率が１％を超えたときに得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程を含み、該イオン液体のカチオン種は、置換ピリジニウムである。
【０００９】
１つの実施態様では、上記イオン液体のカチオン種が、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合した置換ピリジニウムであって、該置換基が、置換基が炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基である。
【００１０】
１つの実施態様では、上記イオン液体のカチオン種は、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムおよび１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１１】
１つの実施態様では、上記イオン液体のアニオン種は、ハロゲンである。
【００１２】
本発明はまた、セルロース含有材料からエタノールを生産する方法を提供し、該方法は、（ａ）セルロース含有材料をイオン液体で処理する工程、（ｂ）工程（ａ）で糖化率が１％を超えたときに得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程、および（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液とエタノール生産微生物とを混合し、該微生物を培養する工程を含み、該イオン液体のカチオン種は、置換ピリジニウムである。
【００１３】
１つの実施態様では、上記イオン液体のカチオン種が、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合した置換ピリジニウムであって、該置換基が、置換基が炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基である。
【００１４】
１つの実施態様では、上記イオン液体のカチオン種は、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムおよび１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１５】
１つの実施態様では、上記イオン液体のアニオン種は、ハロゲンである。
【００１６】
１つの実施態様では、上記セルラーゼの全部または一部が、前記微生物に由来し、該微生物が、セルラーゼを分泌または表層提示するように形質転換されたセルラーゼ発現微生物である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、セルロース含有材料から低コストでかつ効率的に有用物質を生産する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａｖｉｃｅｌを各種イオン液体で処理した場合の糖化率（％）の経時変化を示すグラフである。
【図２】Ａｖｉｃｅｌを［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］で処理した場合の処理温度が糖化率（％）に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】Ａｖｉｃｅｌを［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］で処理した場合のＡｖｉｃｅｌの量が糖生成量（ｍｇ）および糖化率（％）に及ぼす影響を示すグラフである。
【図４】各種イオン液体で処理したＡｖｉｃｅｌのＦＴ−ＩＲパターンを示すチャートである。
【図５Ａ】各種イオン液体で処理したＡｖｉｃｅｌ（処理温度８０℃）のＳＥＭ観察写真である。
【図５Ｂ】各種イオン液体で処理したＡｖｉｃｅｌ（処理温度１２０℃）のＳＥＭ観察写真である。
【図６】各種イオン液体で処理したＡｖｉｃｅｌの還元末端をＤＮＳ試薬を用いて定量した結果を示すグラフである。
【図７】Ａｖｉｃｅｌを各種イオン液体で１２０℃にて１０分間（Ａ）、３０分間（Ｂ）または１時間（Ｃ）処理した後、さらにセルラーゼで処理した場合の糖化率（％）の経時変化を示すグラフである。
【図８】Ａｖｉｃｅｌを各種イオン液体で８０℃（Ａ）または１２０℃（Ｂ）にて処理した後、さらにセルラーゼで処理した場合の糖化率（％）の経時変化を示すグラフである。
【図９】Ａｖｉｃｅｌをイオン液体［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］で１２０℃にて１０分間、３０分間または１時間処理した後、さらにセルラーゼで処理した場合の糖化率（％）の経時変化を示すグラフである。
【図１０】イオン液体［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］で処理したセルロース含有材料（セルラーゼ添加および無添加）に野生型酵母（Ａ）またはセルラーゼ表層提示酵母（Ｂ）を添加して培養した場合のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示すグラフである。
【図１１】イオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］で処理したＡｖｉｃｅｌ（セルラーゼ添加および無添加）に野生型酵母（Ａ）およびセルラーゼ表層提示酵母（Ｂ）を添加して培養した場合のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示すグラフである。
【図１２】イオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］で処理したバガス（セルラーゼ添加および無添加）に野生型酵母（Ａ）およびセルラーゼ表層提示酵母（Ｂ）を添加して培養した場合のエタノール濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（セルロース）
本明細書において、セルロースとは、グルコースがβ−１，４−グルコシド結合により重合した重合体およびその誘導体をいう。重合体の重合度は、特に限定されないが、好ましくは２００以上である。誘導体としては、例えば、カルボキシメチル化、アルデヒド化、もしくはエステル化などの誘導体が挙げられる。セルロースは、その部分分解物である、セロオリゴ糖、セロビオースを含んでいてもよい。また、配糖体であるβグルコシド、リグニンおよび／またはヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチンなどとの複合体を含んでいてもよい。セルロースは、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよいが、好ましくは結晶性セルロースを含む。また、天然由来のものであってもよいし、人為的に合成したものであってもよい。セルロースの由来は、特に限定されず、植物由来のものでも、真菌由来のものでも、細菌由来のものであってもよい。
【００２０】
本明細書において、糖化とは、セルロースのβ−１，４−グルコシド結合が加水分解を受け、グルコースやセロビオースなどの還元糖が生成することをいい、糖化率とは、加水分解を受けてグルコースおよびセロビオースを生成したセルロースの割合をいう。
【００２１】
セルロース含有材料としては、特に限定されない。例えば、綿や麻などの天然繊維品、レーヨン、キュプラ、アセテート、リヨセルなどの再生繊維品、稲ワラなどの各種ワラ、籾殻、バガス、木材チップなどの農産廃棄物、古紙、建築廃材などの各種廃棄物などを含むバイオマス（木質系および草本系）が挙げられる。
【００２２】
セルロース含有材料は、リグノセルロースを含む実バイオマスの場合には、イオン液体で処理する前に、処理効率を向上するために、適宜粉砕などにより微細化されていることが好ましい。なお、処理工程において微細化されてもよい。
【００２３】
（セルラーゼ）
セルラーゼは、セルロース加水分解酵素とも呼ばれ、セルロースのβ１，４−グルコシド結合を加水分解する。セルラーゼの種類としては、代表的には、エンドβ１，４−グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして通常、１０以下であるが、これに限定されない）を生じる。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性が高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルへの反応性は低い。エンドグルカナーゼは、非晶性セルロースを加水分解する酵素の代表例である。エンドグルカナーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧＩＩ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２５】
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解するが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解する酵素の代表例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅い。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ１およびセロビオヒドロラーゼ２と称される。セロビオヒドロラーゼとしては、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨ２）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
β−グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グルコシド結合を切断し、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成する。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解する酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１と称される。β−グルコシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）挙げられるが、これに限定されない。
【００２７】
セルラーゼとしては、天然由来のものであってもよいし、組換えＤＮＡ技術により製造されたものであってもよいし、市販されているものであってもよい。精製されたものであってもよいし、酵素産生微生物などそのままであってもよい。酵素製剤であってもよいし、セルラーゼ発現微生物などであってもよい。例えば、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）などのClostridium属、Trichoderma reeseiなどのTrichoderma属またはAspergillus oryzaeやAspergillus nigerなどのAspergillus属由来のセルラーゼが挙げられる。Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼであってもよい。
【００２８】
セルラーゼとしては、２種以上を組み合わせて用いてもよい。好ましくは、セルロースをグルコースにまで糖化することが可能な組み合わせである。
【００２９】
（イオン液体）
本発明に用いるイオン液体は、置換ピリジニウム塩である。置換ピリジニウム塩は、以下の式（Ｉ）で表される。
【００３０】
【化１】
2013135641.tif 000002
【００３１】
置換ピリジニウム塩のカチオン種は、ピリジン環上の窒素原子が置換基と結合した置換ピリジニウムである。カチオン種における置換基（式（Ｉ）におけるＲ）は、炭素数１〜８の直鎖状または分岐状のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基であることが好ましい。好ましいアルキル基としては、炭素数１〜６、より好ましくは炭素数３〜６の直鎖状のアルキル基が挙げられる。具体的には、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基が挙げられる。好ましいカチオン種としては、例えば、Ｎ−ｎ−プロピルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ブチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ペンチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウム、１，４−ジメチルピリジニウム、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、１−ｎ−ブチル−４−メチルピリジニウム、１−ｎ−ブチル−２，４−ジメチルピリジニウム、１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムが挙げられる。より好ましくは、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウム、１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムである。カチオン種としては、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
置換ピリジニウム塩のカチオン種は、ピリジン環上の炭素原子も置換基と結合していてもよい。置換基としては、特に限定されないが、好ましくはメチル基、エチル基が挙げられる。置換基が結合する炭素原子の位置も、特に限定されず、複数あってもよい。好ましくは、２位、３位、４位である。
【００３３】
置換ピリジニウム塩のアニオン種としては、特に限定されず、例えば、ハロゲンアニオン、カルボキシレートアニオン、スルホネートアニオン、リン酸アニオンが挙げられる。ハロゲンアニオンとしては塩素アニオン、臭素アニオンおよびヨウ素アニオンなどが挙げられる。カルボキシレートアニオンとしては、炭素数１〜１８のモノカルボキシレートアニオンおよびジカルボキシレートアニオン、例えばホルメートアニオン、アセテートアニオン、フマレートアニオン、オキサレートアニオン、ラクテートアニオンおよびピルベートアニオンが挙げられる。スルホネートアニオンとしては、スルホン酸アニオン、メタンスルホン酸アニオン、オクタンスルホン酸アニオン、ドデカンスルホン酸アニオンおよびエイコサンスルホン酸アニオンなどが挙げられる。リン酸アニオンとしては、リン酸アニオン、メチルリン酸モノエステルアニオン、エチルリン酸モノエステルアニオン、プロピルリン酸モノエステルアニオン、ブチルリン酸モノエステルアニオン、メチルリン酸ジエステルアニオン、エチルリン酸ジエステルアニオン、プロピルリン酸ジエステルアニオン、ブチルリン酸ジエステルアニオンなどが挙げられる。好ましくは、各種リン酸アニオン、カルボキシレートアニオン、ハロゲンアニオンである。より好ましくは、ハロゲンイオンである。アニオン種としては、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
置換ピリジニウム塩としては、上述したカチオン種とアニオン種とを適宜組み合わせたものが挙げられる。例えば、Ｎ−ｎ−プロピルピリジニウムクロリド、Ｎ−ｎ−ブチルピリジニウムクロリド、Ｎ−ｎ−ペンチルピリジニウムクロリド、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムクロリド、１，４−ジメチルピリジニウムクロリド、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウムクロリド、１−ｎ−ブチル−４−メチルピリジニウムクロリド、１−ｎ−ブチル−２，４−ジメチルピリジニウムクロリド、１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムクロリドが挙げられる。好ましくは、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウムクロリド、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムクロリド、１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムクロリドである。カチオン種またはアニオン種としては、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３５】
イオン液体は、商業的に入手できるほか、公知の方法で合成することができる。合成方法としては、特に限定されず、カチオンを塩化物との塩として合成、精製し、次いで所望のアニオンを有するイオン液体の塩と反応させる方法、一旦水酸化物とした上でアニオンを含む酸で中和する方法が挙げられる。イオン液体は高純度であることが好ましい。
【００３６】
（セルロースを糖化する方法）
本発明のセルロースを糖化する方法は、（１）セルロース含有材料を上記イオン液体で処理する工程、および（２）工程（１）で得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程を含む。
【００３７】
（（１）セルロース含有材料を上記イオン液体で処理する工程）
この工程では、セルロース含有材料を上記イオン液体に浸漬する、さらに分散する、さらに懸濁する、あるいはセルロース含有材料に上記イオン液体を噴霧する。この工程では、セルロースが糖化し、グルコースやセロビオースなどの還元糖が生成する。また、イオン液体がセルロース含有材料に浸透し、セルロースの構造が緩和される。
【００３８】
この工程で用いるイオン液体のカチオン種は、好ましくは１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムまたは１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムである。
【００３９】
イオン液体の量は、特に限定されず、例えば、セルロース含有材料１質量部に対して、２〜５０質量部、好ましくは４〜２０質量部である。
【００４０】
この工程では、通常、セルロース含有材料とイオン液体とを加熱する。加熱温度は、特に限定されないが、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは６０℃以上、さらにより好ましくは８０℃以上である。加熱によりセルロースの糖化を促進することができる。また、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１４０℃以下、さらに好ましくは１２０℃以下である。１５０℃を超えるとセルロースの過分解が生じ、４０℃未満ではほとんど糖化しない。
【００４１】
この工程では、ほかにセルロース含有材料をイオン液体中でプレスする処理、粉砕する処理、超音波に曝す処理などを伴ってもよいし、これらの処理を適宜組み合わせてもよい。
【００４２】
この工程の時間は、特に限定されないが、好ましくは１０分間〜３時間、より好ましくは１０分間〜１時間、さらに好ましくは３０分間〜１時間である。
【００４３】
（（２）工程（１）で得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程）
上記工程（１）で得られた処理液には、セルロースが糖化して生成したグルコースやセロビオースなどの還元糖のほかに、未分解のセルロースも含まれている。処理液中に含有されるセルロース残量から算出される糖化率は、好ましくは１％を超えている。上記工程（１）で、セルロース含有材料をイオン液体で処理することによって、セルロースが加水分解を受けるほか、イオン液体がセルロース含有材料に浸透し、セルロースの構造が緩和されているため、セルロースはセルラーゼのアタックを受けやすい状態になっている。
【００４４】
この工程で用いるセルラーゼは、酵素製剤であってもよいし、セルラーゼを分泌または表層提示するように形質転換されたセルラーゼ発現微生物に由来するものであってもよいし、両方を組み合わせたものであってもよい。セルラーゼを分泌または表層提示するように形質転換されたセルラーゼ発現微生物としては、例えば、以下で詳述するセルロース含有材料からエタノールを生産する方法の工程（ｃ）で好ましく用いられる、セルラーゼを分泌または表層提示するように形質転換されたセルラーゼ発現微生物が挙げられる。このようなセルラーゼ発現微生物をそのままあるいは固定化処理して用いてもよいし、セルラーゼ発現微生物から調製したセルラーゼを用いてもよい。
【００４５】
酵素製剤のセルラーゼの量は、特に限定されず、例えば、セルロース１質量部に対して、１〜２０ＦＰＵ、好ましくは５〜１０ＦＰＵである。なお、ＦＰＵ（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐａｐｅｒ  Ｕｎｉｔ）とは、国際純正応用化学連合ＩＵＰＡＣ（International Union of Pure and Applied Chemistry）が定めた方法により測定される濾紙分解活性であり、セルラーゼ活性の効力単位を示す。
【００４６】
反応液の量は、特に限定されないが、好ましくはイオン液体１質量部に対して、２．５〜１００質量部、より好ましくは３〜５０質量部である。反応液の量が、イオン液体１質量部に対して、２．５質量部未満では、セルラーゼの活性がイオン液体により阻害を受けるため、酵素反応が進まない。
【００４７】
セルラーゼを反応させる温度は、特に限定されず、例えば、１０〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃である。
【００４８】
この工程の時間は、特に限定されず、セルロース含有材料の大きさ、形状、由来などに応じて適宜調整すればよい。例えば、１０分間〜１０時間、好ましくは１０分間〜３時間である。
【００４９】
（セルロース含有材料からエタノールを生産する方法）
セルロース含有材料からエタノールを生産する方法は、（ａ）セルロース含有材料を上記イオン液体で処理する工程、（ｂ）工程（ａ）で得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程、および（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液とエタノール生産微生物とを混合し、該微生物を培養する工程を含む。
【００５０】
（（ａ）セルロース含有材料を上記イオン液体で処理する工程）
この工程は、上記のセルロースを糖化する方法における同工程と同様である。すなわち、この工程では、セルロース含有材料を上記イオン液体に浸漬する、さらに分散する、さらに懸濁する、あるいはセルロース含有材料に上記イオン液体を噴霧する。この工程では、セルロースが糖化し、グルコースやセロビオースなどの還元糖が生成する。また、イオン液体がセルロース含有材料に浸透し、セルロースの構造が緩和される。
【００５１】
この工程で用いるイオン液体のカチオン種は、好ましくは１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウム、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムまたは１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムである。
【００５２】
イオン液体の量は、特に限定されず、例えば、セルロース含有材料１質量部に対して、２〜５０質量部、好ましくは４〜２０質量部である。
【００５３】
この工程では、通常、セルロース含有材料とイオン液体とを加熱する。加熱温度は、特に限定されないが、好ましくは４０℃以上、より好ましくは５０℃以上、さらに好ましくは６０℃以上、さらにより好ましくは８０℃以上である。加熱によりセルロースの糖化を促進することができる。また、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１４０℃以下、さらに好ましくは１２０℃以下である。１５０℃を超えるとセルロースの過分解が生じ、４０℃未満ではほとんど糖化しない。
【００５４】
この工程では、ほかにセルロース含有材料をイオン液体中でプレスする処理、粉砕する処理、超音波に曝す処理などを伴ってもよいし、これらの処理を適宜組み合わせてもよい。
【００５５】
この工程の時間は、特に限定されないが、好ましくは１０分間〜３時間、より好ましくは１０分間〜１時間、さらに好ましくは３０分間〜１時間である。
【００５６】
（（ｂ）工程（ａ）で得られた処理液にセルラーゼを反応させる工程）
上記工程（ａ）で得られた処理液には、セルロースが糖化して生成したグルコースやセロビオースなどの還元糖のほかに、未分解のセルロースも含まれている。処理液中に含有されるセルロース残量から算出される糖化率は、好ましくは１％を超えている。上記工程（ａ）で、セルロース含有材料をイオン液体で処理することによって、セルロースが加水分解を受けるほか、イオン液体がセルロース含有材料に浸透し、セルロースの構造が緩和されているため、セルロースはセルラーゼのアタックを受けやすい状態になっている。
【００５７】
この工程で用いるセルラーゼは、酵素製剤であってもよいし、以下の工程（ｃ）で用いる微生物に由来するものであってもよいし、両方を組み合わせたものであってもよい。微生物に由来する場合、該微生物は、セルラーゼを分泌または表層提示するように形質転換されたセルラーゼ発現微生物である。セルラーゼ発現微生物については、以下の工程（ｃ）で詳述する。
【００５８】
酵素製剤のセルラーゼの量は、特に限定されず、例えば、セルロース１質量部に対して、１〜２０ＦＰＵ、好ましくは５〜１０ＦＰＵである。
【００５９】
反応液の量は、特に限定されないが、好ましくはイオン液体１質量部に対して、２．５〜１００質量部、より好ましくは３〜５０質量部である。反応液の量が、イオン液体１質量部に対して、２．５質量部未満では、セルラーゼの活性がイオン液体により阻害を受けるため、酵素反応が進まない。
【００６０】
セルラーゼを反応させる温度は、特に限定されず、例えば、１０〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃である。
【００６１】
この工程の時間は、特に限定されず、セルロース含有材料の大きさ、形状、由来などに応じて適宜調整すればよい。例えば、１０分間〜１０時間、好ましくは１０分間〜３時間である。
【００６２】
（（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液とセルラーゼ発現微生物とを混合し、該微生物を培養する工程）
上記工程（ｂ）で得られた反応液には、イオン液体およびセルラーゼの作用によってセルロースが糖化して生成したグルコースやセロビオースなどの還元糖が高濃度で含まれており、未分解のセルロースもわずかに含まれている。この工程では、糖化により生成したグルコースを炭素源としてエタノール生産微生物を培養することによってエタノール発酵が行われる。また、エタノール生産微生物がセルラーゼ発現微生物の場合、エタノール生産微生物が表層提示するセルラーゼまたは分泌するセルラーゼが、未分解のセルラーゼに作用してさらに糖化を進め、さらにセロビオースをグルコースに分解して、エタノール発酵のための炭素源であるグルコースの濃度を高める。
【００６３】
混合するエタノール生産微生物の量は、特に限定されない。培地の量は、特に限定されないが、好ましくはイオン液体１質量部に対して２０〜１００質量部である。培地の量が、イオン液体１質量部に対して、２０質量部未満では、エタノール生産微生物がイオン液体により阻害を受けるため、発酵が進まない。培地中のイオン液体の濃度は、通常５００ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは２００ｍＭ以下である。５００ｍＭを超えると、エタノール生産微生物がイオン液体により阻害を受けるため、発酵が進まない。
【００６４】
培地の組成は、エタノール生産微生物が十分に増殖し、エタノール発酵できる限り、特に限定されない。培地は、工程（ｂ）で得られた反応液に含まれるグルコースのほかに炭素源を含有していてもよい。
【００６５】
エタノール生産微生物としては、特に限定されず、例えば、酵母、エタノール生産糸状菌、エタノール生産細菌が挙げられる。好ましくは、酵母である。酵母としては、特に限定されず、例えば、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などのシゾサッカロマイセス属の酵母、カンジダ・クルゼイ（Candida krusei）、キャンディダ・シェハーテ（Candidashehatae）などのキャンディダ属の酵母、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、ピヒア・スティピティス（Pichia stipitis）などのピヒア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）などのクルイベロマイセス属の酵母が挙げられる。なかでも、工業的利用性などの観点からサッカロマイセス属酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビジエがより好ましい。エタノール生産糸状菌としては、特に限定されず、例えば、ケカビ（Mucor）属の糸状菌が挙げられる。エタノール生産細菌としては、特に限定されず、例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、エタノールを生産するように形質転換された遺伝子組換え大腸菌が挙げられる。
【００６６】
エタノール生産微生物が発現するセルラーゼは、上記セルラーゼと同様である。例えば、セルラーゼを酵母の細胞外に分泌させるには、公知の分泌シグナルペプチドをセルラーゼに付与したものを酵母で発現するように酵母を形質転換すればよい。また、例えば、セルラーゼを酵母の細胞表面に表層提示するには、表層タンパク質であるα−アグルチニンまたはそのレセプターなどの酵母表層提示システムを利用することができる。例えば、分泌シグナルに加えて凝集性タンパク質であるα−アグルチニンＣ末端側の３２０アミノ酸残基からなるペプチドを利用する。所望のタンパク質を細胞表層に提示するためのポリペプチドや手法は、ＷＯ０１／７９４８３号公報や、特開２００３−２３５５７９号公報、ＷＯ２００２／０４２４８３号パンフレット、ＷＯ２００３／０１６５２５号パンフレット、特開２００６−１３６２２３号公報、藤田らの文献（藤田ら，2004. Appl Environ Microbiol 70:1207-1212および藤田ら, 2002. Appl Environ Microbiol 68:5136-5141.）、村井ら, 1998. Appl Environ Microbiol 64:4857-4861.に開示されている。
【００６７】
エタノール生産微生物の形質転換に用いるセルラーゼ遺伝子はデータベースに登録されている既知のセルラーゼの塩基配列などに基づいて取得できる。すなわち、所定の生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーなどを鋳型としたＰＣＲ増幅やハイブリダイゼーションにより核酸断片として得ることができる。あるいは、化学合成法などにより、核酸断片として合成してもよい。
【００６８】
エタノール生産微生物の形質転換は、各微生物に応じて適宜実施することができる。例えば、酵母の形質転換のための組換えベクターの作製などの一般的な操作は、例えば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)などを参照して適宜実施することができる。酵母に対する組換えベクターの導入などの操作は、例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual second edition（Maniatis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989）など参照して適宜実施することができる。ベクターの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法が挙げられる。ベクターを導入して得られた形質転換酵母は、マーカー遺伝子や活性発現を利用して適宜選抜することができる。
【００６９】
エタノール生産微生物の培養条件は、特に限定されない。培養器を振盪してもしなくてもよい。通気条件としては、嫌気条件、微好気条件、好気条件など適宜選択することができる。培養温度も、特に限定されず、例えば２５℃〜５５℃である。培養時間も必要に応じて適宜設定される。通常、数時間〜１５０時間程度である。培地のｐＨも適宜調整される。培養には、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を添加することができる。
【００７０】
本発明の方法により製造されたエタノールは培地から適宜、回収、精製することができる。本発明の方法は、セルロース含有材料の前処理が簡単であるため、エタノールの製造コストを大幅に低減することができる。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７２】
実施例および参考例で用いたイオン液体は、１−ｎ−ブチル−３−メチルピリジニウムクロリド（以下、［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］：式（ＩＩ））、Ｎ−ｎ−ヘキシルピリジニウムクロリド（以下、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］：式（ＩＩＩ））、１−ｎ−ヘキシル−３−メチルピリジニウムクロリド（以下、［Ｈｍｐｙ］［Ｃｌ］：式（ＩＶ））、１−ｎ−ヘキシル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（以下、［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］：式（Ｖ））、１−ｎ−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロリド（以下、［Ｂｍｉｍ］［Ｃｌ］：式（ＶＩ））、および１−エチル−３−メチルイミダゾリウムジエチルホスフェート（以下、［Ｅｍｉｍ］［ＤＥＰ］：式（ＶＩＩ））である。
【００７３】
【化２】
2013135641.tif 000003
【００７４】
【化３】
2013135641.tif 000004
【００７５】
【化４】
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【００７６】
【化５】
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【００７７】
【化６】
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【００７８】
【化７】
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【００７９】
（参考例１：セルロース含有材料のイオン液体による処理１：イオン種の影響）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｂｍｉｍ］［Ｃｌ］、または［Ｅｍｉｍ］［ＤＥＰ］１ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）５０ｍｇを添加し、それぞれ１２０℃にて１０分間、３０分間または１時間加熱攪拌した。４０℃に冷却したそれぞれのサンプル瓶に４０℃の１００ｍＭクエン酸緩衝液４０００μＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、それぞれのサンプル瓶から分析用試料を採取した。試料中の還元糖の生成を調べるために、試料１０μＬに４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）誘導体化試薬（ＡＢＥＥ１６５ｍｇ、メタノール３５０μＬ、氷酢酸４１μＬ、シアン水素化ホウ素ナトリウム３５ｍｇ）４０μＬを反応させ、生成したＡＢＥＥ誘導体化還元糖をＨＰＬＣにて分析した。結果を図１に示す。ＨＰＬＣ分析条件は次のとおりである。
【００８０】
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｈｏｎｅｎｐａｋ  Ｃ１８（株式会社Ｊ−オイルミルズ）
移動相：０．０２％ＴＦＡ水溶液／アセトニトリル＝８５／１５
検出器：紫外可視吸光光度計（３０５ｎｍ）
【００８１】
図１から明らかなように、結晶性セルロースをピリジニウム系イオン液体で処理すると、セルロースが分解し、グルコースやセロビオースを生成した。特に、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］を用いると顕著に生成した。一方、イミダゾリウム系イオン液体で処理してもセルロースは分解しなかった。すなわち、ピリジニウム系イオン液体は、セルロースを糖化できることがわかった。
【００８２】
（参考例２：セルロース含有材料のイオン液体による処理２：温度の影響）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］１ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）５０ｍｇを添加し、それぞれ８０℃、９０℃、１００℃、１１０℃または１２０℃にて３０分間加熱攪拌した。４０℃に冷却したそれぞれのサンプル瓶に４０℃の１００ｍＭクエン酸緩衝液４０００μＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、それぞれのサンプル瓶から分析用試料を採取した。参考例１と同様にして、試料中の還元糖の生成を調べた。結果を図２に示す。
【００８３】
図２から明らかなように、イオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］で処理する温度を高くすると、セルロースが分解して生成したグルコースやセロビオースの量が増加した。１２０℃にて３０分間処理すると約３０％の糖が生成した。
【００８４】
（参考例３：セルロース含有材料のイオン液体による処理３：量比の影響）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］１ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）５０ｍｇ、２５０ｍｇまたは５００ｍｇを添加し、それぞれ１２０℃にて３０分間加熱攪拌した。４０℃に冷却したそれぞれのサンプル瓶に４０℃の１００ｍＭクエン酸緩衝液４０００μＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、それぞれのサンプル瓶から分析用試料を採取した。参考例１と同様にして、試料中の還元糖の生成を調べた。結果を図３に示す。
【００８５】
図３から明らかなように、イオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］に対し、処理するセルロースの量を多くすると、セルロースが分解して生成したグルコースやセロビオースの量は増加したが、糖化率は３０％程度で一定であった。
【００８６】
（参考例４：イオン液体で処理したセルロース含有材料の構造分析１：ＦＴ−ＩＲ分析）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｂｍｉｍ］［Ｃｌ］、または［Ｅｍｉｍ］［ＤＥＰ］１ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）５０ｍｇを添加し、それぞれ１２０℃にて１時間加熱攪拌した。４０℃に冷却したそれぞれのサンプル瓶にＭｉｌｌｉ−Ｑ水５ｍＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、スパーテルでセルロースを破砕した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５ｍＬで共洗いしながらセルロースを遠心用チューブに移し、遠心分離した（８０００ｒｐｍ、２５℃、２０分間）。上清を捨て、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５ｍＬを加え、ボルテックスにて攪拌して、沈殿物を洗浄した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２５℃、２０分間）を行った。この操作を３回繰り返し、上清を捨て、凍結乾燥させた試料をＦＴ−ＩＲ分析に供した。結果を図４に示す。
【００８７】
図４から明らかなように、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］による処理では、セルロースＩＩ型のピークが観察され、セルロース鎖が部分切断されていることが示唆された。
【００８８】
（参考例５：イオン液体で処理したセルロース含有材料の構造分析２：ＳＥＭ観察）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｍｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］、または［Ｅｍｉｍ］［ＤＥＰ］２ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）１００ｍｇを添加し、それぞれ８０℃または１２０℃にて３０分間加熱攪拌した。８０℃処理では、イオン液体に代えてＭｉｌｌｉ−Ｑ水（日本ミリポア株式会社製）を含むサンプル瓶をコントロールとした。室温に冷却したそれぞれのサンプル瓶にＭｉｌｌｉ−Ｑ水５ｍＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、スパーテルでセルロースを破砕した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５ｍＬで共洗いしながらセルロースを遠心用チューブに移し、遠心分離した（８０００ｒｐｍ、２５℃、２０分間）。上清を捨て、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５ｍＬを加え、ボルテックスにて攪拌して、沈殿物を洗浄した後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２５℃、２０分間）を行った。この操作を３回繰り返し、上清を捨て、凍結乾燥させた試料を、カーボンシールを貼ったサンプル台に少量添加し、その上に白金を蒸着させた。試料中のセルロースの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。結果を図５に示す。
【００８９】
図５（Ａ）から明らかなように、未処理のセルロースは粒径５０μｍほどの粒子を含み、１０００倍の拡大像では、表面が波打っていた。コントロールも未処理のものと同様であった。イミダゾリウム系イオン液体で処理したセルロースでは、凝集した像しか観察できなかった。ピリジニウム系イオン液体で処理したセルロースには、未処理のものと比較して平滑な表面または繊維状の表面を有するものが観察された。これは、ピリジニウム系イオン液体によるセルロースの結晶構造の緩和を示しているものと考えられる。
【００９０】
図５（Ｂ）から明らかなように、１２０℃処理では、ピリジニウム系イオン液体で処理したセルロースでは、明らかに未処理のセルロースと異なる像が得られた。ピリジニウム系イオン液体で処理したセルロースは、細かなセルロース片が集まったような微細構造を形成していた。これは、ピリジニウム系イオン液体により切断され、短くなったセルロース鎖が集まっているものと推察され、直接観察からもピリジニウム系イオン液体によるセルロース鎖の切断が示唆された。一方、イミダゾリウム系イオン液体で処理したセルロースでは、８０℃の場合と同様に、平滑な表面が観察され、細かなセルロース片の集まりは見られなかった。イオン液体のカチオン種の違いにより、セルロース鎖に及ぼす影響が異なることがＳＥＭ観察からも明らかとなった。また、処理温度によっても影響は異なり、ピリジニウム系イオン液体では高温であるほどセルロース鎖の切断が促進されるものと考えられる。
【００９１】
（参考例６：イオン液体で処理したセルロース含有材料の構造分析３：還元末端の定量）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｍｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］、または［Ｅｍｉｍ］［ＤＥＰ］２００ｍｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）１０ｍｇを添加し、それぞれ１２０℃にて３０分間加熱攪拌した。イオン液体を含まないサンプル瓶をコントロールとした。室温に冷却したそれぞれのサンプル瓶にＭｉｌｌｉ−Ｑ水０．８ｍＬを加え、ボルテックスにて撹拌した。ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）試薬（３，５−ジニトロサリチル酸、酒石酸カリウム・ナトリウム塩、フェノール、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム）３ｍＬを添加し、１００℃にて５分間反応させた。これをＭｉｌｌｉ−Ｑ水にて１０倍に希釈後、５４０ｎｍの吸収を測定することにより還元末端を定量した。結果を図６に示す。
【００９２】
図６から明らかなように、ピリジニウム系イオン液体では、未処理の２倍以上の還元末端量であった。これは、ピリジニウム系イオン液体によるセルロース鎖の切断をより定量的に示している。また、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］よりも［Ｈｍｐｙ］［Ｃｌ］の方が還元末端量が多い結果となったが、この温度による処理では［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］による過分解が生じている可能性がある。［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］および［Ｈｍｐｙ］［Ｃｌ］で処理したセルロースは、未処理のセルロースやイミダゾリウム系イオン液体で処理したセルロースと比比較して、還元末端量を増加させる効果が確認され、ある程度の長さにセルロース鎖を切断していることが示唆された。
【００９３】
（実施例１：セルロース含有材料のイオン液体およびセルラーゼによる処理１）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｂｍｉｍ］［Ｃｌ］、または［Ｅｍｉｍ］［ＤＥＰ］１ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）５０ｍｇを添加し、それぞれ１２０℃にて１０分間、３０分間または１時間加熱攪拌した。イオン液体を含まないサンプル瓶をコントロールとした。４０℃に冷却したそれぞれのサンプル瓶に４０℃の１００ｍＭクエン酸緩衝液３５００μＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、混合セルラーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（ＳＩＧＭＡ社）２５μＬおよびＮｏｖｏ  １８８（ＳＩＧＭＡ社）５μＬ）を含有する水溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液）５００μＬを加え、４０℃にて加熱攪拌した。１時間後および２４時間後にそれぞれのサンプル瓶から分析用試料を採取した。参考例１と同様にして、試料中の還元糖の生成を調べた。結果を図７に示す。
【００９４】
図７から明らかなように、イオン液体による処理時間を長くすると、より短時間でセルラーゼによるセルロースの糖化が進んだ。特に、ピリジニウム系イオン液体による処理では、セルラーゼによる処理時間が１時間でも、糖化率が大きく上昇した。
【００９５】
（実施例２：セルロース含有材料のイオン液体およびセルラーゼによる処理２）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］、［Ｈｍｐｙ］［Ｃｌ］、または［Ｈｍｉｍ］［Ｃｌ］１ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）５０ｍｇを添加し、それぞれ８０℃または１２０℃にて３０分間加熱攪拌した。８０℃処理では、イオン液体に代えてＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含むサンプル瓶をコントロールとし、１２０℃処理では、イオン液体を含まないサンプル瓶をコントロールとした。４０℃に冷却したそれぞれのサンプル瓶に４０℃の１００ｍＭクエン酸緩衝液３５００μＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、混合セルラーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（ＳＩＧＭＡ社）２５μＬおよびＮｏｖｏ  １８８（ＳＩＧＭＡ社）５μＬ）を含有する水溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液）５００μＬを加え、４０℃にて加熱攪拌した。０時間後、１時間後、３時間および２４時間後にそれぞれのサンプル瓶から分析用試料を採取した。参考例１と同様にして、試料中の還元糖の生成を調べた。結果を図８に示す。
【００９６】
図８から明らかなように、［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］および［Ｈｍｐｙ］［Ｃｌ］による処理では、処理時間が１時間でも、糖化率が大きく上昇した。これらの結果は、より低温での処理が可能なピリジニウム系イオン液体の有用性を示す。
【００９７】
（実施例３：セルロース含有材料のイオン液体およびセルラーゼによる処理３）
サンプル瓶内のイオン液体［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］１ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）５０ｍｇを添加し、それぞれ１２０℃にて１０分間、３０分間または１時間加熱攪拌した。４０℃に冷却したそれぞれのサンプル瓶に４０℃の１００ｍＭクエン酸緩衝液３５００μＬを加え、ボルテックスにて攪拌後、混合セルラーゼ（Ｎｏｖｏ  Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（ＳＩＧＭＡ社）２５μＬおよびＮｏｖｏ  １８８（ＳＩＧＭＡ社）５μＬ）を含有する水溶液（１００ｍＭクエン酸緩衝液）５００μＬを加え、４０℃にて加熱攪拌した。０時間後、１時間後、３時間後および２４時間後にそれぞれのサンプル瓶から分析用試料を採取した。参考例１と同様にして、試料中の還元糖の生成を調べた。結果を図９に示す。
【００９８】
図９から明らかなように、［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］による処理では、処理時間を長くすると、より短時間でセルラーゼによるセルロースの糖化が進んだ。また、処理時間を長くすると、最終糖化率が低下することから、最適な処理時間が存在することが示された。
【００９９】
（実施例４：イオン液体およびセルラーゼで処理したセルロース含有材料からのエタノール発酵１）
試験管内のイオン液体［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］０．７４ｇに結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）１００ｍｇを添加し、試験管をＣｈｅｍｉ  Ｓｔａｔｉｏｎ（東京理化器械株式会社）にセットした。十字型テフロン（登録商標）攪拌子を用いて１２０℃にて３０分間攪拌した。室温に冷却した試験管に２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５ｍＬを加え、１時間静置した。次いで、試験管に野生型酵母またはセルラーゼ表層提示酵母（δＷ株）の培養液（ＯＤ（６００ｎｍ）＝８０）５ｍＬ、４×ＹＰ培地５ｍＬおよび脱イオン水４．２６ｍＬを添加して、全量を２０ｍＬとした（セルラーゼ無添加）。一部の試験管では、さらに混合セルラーゼ（Ｃｅｌｌｉｃ  ＣＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）２０μＬおよびＣｅｌｌｉｃ  ＨＴｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）５μＬ）を添加して、全量を２０ｍＬとした（セルラーゼ添加）。注射針を通したシリコン栓で試験管に封をし、３０℃にて２００ｒｐｍで攪拌しながら培養を開始した。培養液から２４時間毎に分析用試料を採取し、試料をガスクロマトグラフィーにて分析してエタノール濃度を定量した。結果を図１０に示す。図１０の「Ａｖｉｃｅｌ−あり」などの「あり」は、セルラーゼ添加を示し、「Ａｖｉｃｅｌ−なし」などの「なし」は、セルラーゼ無添加を示す。ガスクロマトグラフィー分析条件は次のとおりである。
【０１００】
＜ガスクロマトグラフィー分析条件＞
システム：ＧＣ２０１０（株式会社島津製作所製）
カラム：ＤＢ−ＦＦＡＰ（Agilent technologies社製；内径０．２５ｍｍ、長さ６０ｍ、膜厚０．５μｍ）
カラム温度：４０→１７０℃（１０℃/分）
キャリアガス：ヘリウム
検出器：ＦＩＤ
【０１０１】
酵母の培養液は、以下のように調製した。最小培地（ＳＤ選択）プレート上のコロニーをＳＤ選択液体培地３０ｍＬへ植菌し、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。この培養液を、ＳＤ培地に終濃度で２０ｇ／Ｌとなるようにカザミノ酸を添加した培地（ＳＤＣ選択培地）４００ｍＬにＯＤ＝０．０５となるように加え、３０℃、１５０ｒｐｍで９６時間培養した。遠心分離により菌体を回収し、脱イオン水で２回洗浄した。
【０１０２】
なお、セルラーゼ表層提示酵母は、セロビオヒドラーゼ、エンドグルカナーゼ、βグルコシダーゼが細胞表層に提示されるように形質転換された遺伝子組換え酵母である（Appl.Environ. Microbiol.(2004)70:1207-1212. Synergistic Saccharification,and Direct Fermentation to Ethanol, ofAmorphous Cellulose by Use of an Engineered Yeast Strain Codisplaying Three Types of Cellulolytic Enzyme Yasuya Fujita, Junji Ito, Mitsuyoshi Ueda, Hideki Fukuda, and Akihiko Kondo.）。
【０１０３】
図１０から明らかなように、イオン液体として［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］を用い、セルロース含有材料としてＡｖｉｃｅｌを用いると、セルラーゼを添加してエタノール発酵した場合、発酵開始６時間以内に理論収率（２．５ｇ／Ｌ）の８０％（２ｇ／Ｌ）を超えるエタノールが得られた。セルラーゼを添加しない場合も、セルラーゼ表層提示酵母を用いると、発酵開始６時間以内に理論収率の６０％（１．５ｇ／Ｌ）を超えるエタノールが得られた。
【０１０４】
（実施例５〜７：イオン液体およびセルラーゼで処理したセルロース含有材料からのエタノール発酵２〜４）
セルロース含有材料として結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）に代えてバガス粉末（粒径４ｍｍ程度に粉砕処理したもの：実施例５）、ユーカリ（実施例６）またはスギ（実施例７）を用いたこと以外は、実施例４と同様に実験を行った。結果を図１０に示す。
【０１０５】
図１０から明らかなように、イオン液体として［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］を用い、セルロース含有材料として実バイオマスのバガス、ユーカリおよびスギを用いると、セルラーゼを添加してエタノール発酵した場合、いずれも発酵開始６時間以内に理論収率（２．５ｇ／Ｌ）の４０％（１ｇ／Ｌ）を超えるエタノールが得られた。
【０１０６】
（実施例８：イオン液体およびセルラーゼで処理したセルロース含有材料からのエタノール発酵５）
イオン液体として［Ｂｍｐｙ］［Ｃｌ］０．７４ｇに代えて［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］０．８０ｇを用いたこと、および１２０℃のほかに８０℃または１００℃にて３０分間攪拌したこと以外は、実施例４と同様に実験を行った。結果を図１１に示す。図１１の、例えば、「８０＋」の「８０」はイオン液体処理を８０℃で行ったことを示し、「＋」はセルラーゼ添加を示す。例えば、「８０−」の「８０」はイオン液体処理を８０℃で行ったことを示し、「−」はセルラーゼ無添加を示す。
【０１０７】
図１１から明らかなように、イオン液体として［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］を用い、セルロース含有材料としてＡｖｉｃｅｌを用いると、セルラーゼを添加してエタノール発酵した場合、発酵開始６時間以内に理論収率（２．５ｇ／Ｌ）の６０％（１．５ｇ／Ｌ）を超えるエタノールが得られた。
【０１０８】
（実施例９：イオン液体およびセルラーゼで処理したセルロース含有材料からのエタノール発酵６）
セルロース含有材料として結晶性セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ−１０１，Ｆｌｕｋａ社）に代えてバガス粉末（粒径４ｍｍ程度に粉砕処理したもの）を用いたこと以外は、実施例８と同様に実験を行った。結果を図１２に示す。
【０１０９】
図１２から明らかなように、イオン液体として［Ｈｐｙ］［Ｃｌ］を用い、セルロース含有材料としてバガスを用いると、セルラーゼを添加してエタノール発酵した場合、発酵開始６時間以内に理論収率（２．５ｇ／Ｌ）の２４％（０．６ｇ／Ｌ）を超えるエタノールが得られた。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明によれば、セルロース含有材料から低コストでかつ効率的に有用物質を生産する方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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