(57)【要約】【課題】ポテックスウイルスに対して高度抵抗性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供すること。【解決手段】ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをウイルス抵抗性付与剤とし、ウイルス抵抗性を付与したい植物細胞または植物体に、当該ポリペプチドを導入する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
ＪＡＸ１ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリペプチド、または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含有するポテックスウイルスに対するウイルス抵抗性付与剤。
【請求項５】
請求項１または２のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項３のポリヌクレオチドを外来的に有する植物細胞、植物体またはその後代。
【請求項７】
植物細胞に、ポテックスウイルスに対するウイルス抵抗性を付与する方法であって、
前記植物細胞で、請求項１または２に記載のポリペプチドを発現させる工程を含む、方法。
【請求項８】
ウイルス抵抗性ペプチドを得る方法であって、
変異ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを導入された植物細胞または植物体が、ポテックスウイルスに対する抵抗性を獲得するかどうか調べる工程と、
前記抵抗性を獲得した前記ポリペプチドをウイルス抵抗性ペプチドと認定する工程を含む方法。
【請求項９】
植物ウイルス複製阻害レクチンを得る方法であって、
レクチンを導入された植物細胞または植物体が、植物ウイルスに対する複製阻害活性を獲得するかどうかを調べる工程と、
前記複製阻害活性を獲得した前記レクチンを植物ウイルス複製阻害レクチンと認定する工程を含む方法。
【請求項１０】
植物細胞または植物体におけるポテックスウイルス抵抗性のマーカーであって、
ＪＡＸ１ペプチドまたはＪＡＸ１遺伝子のｍＲＮＡであることを特徴とするマーカー。
【請求項１１】
植物細胞または植物体におけるポテックスウイルス抵抗性の検定方法であって、
前記植物細胞または植物体において、ＪＡＸ１ペプチドまたはＪＡＸ１遺伝子のｍＲＮＡが発現しているかどうか調べる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ウイルス抵抗性遺伝子ＪＡＸ１、該遺伝子がコードするタンパク質とこれらの利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物ウイルスは傷や媒介生物により感染植物から健全植物へと伝染し、農作物の収量及び品質の低下を引き起こす。しかしながら植物ウイルスは、その増殖過程を宿主植物の代謝系に依存しているために、有効な化学農薬の開発が困難で実用化されていない。そのため、近縁の品種や野生種との交配による抵抗性育種が主要な防除手段である。種々の作物種についてウイルス抵抗性品種の育種が長年に亘って行われてきた結果、植物ウイルス抵抗性品種の総数は膨大な数に上ると考えられ、遺伝学的解析による抵抗性遺伝子座が判明している抵抗性品種だけでも２８１種を数える（非特許文献１参照）。しかし、これらのうち抵抗性遺伝子配列の単離・同定に至っている優性遺伝子は１５遺伝子のみである（非特許文献１参照）。
【０００３】
ウイルス、菌類、細菌を含む植物病原微生物に対する抵抗性を司る抵抗性遺伝子の多くは類似した構造をとり、nucleotide binding site（NB）やleucine-rich repeat（LRR）をもつＮＢ-ＬＲＲ遺伝子である。ＮＢ-ＬＲＲ遺伝子産物は病原微生物のもつ非病原性遺伝子産物を直接もしくは間接に認識する受容体であると考えられている（非特許文献２参照）。ＮＢ-ＬＲＲ遺伝子産物を介した病害抵抗性は真性抵抗性と呼ばれ、ＮＢ-ＬＲＲ遺伝子産物による病原微生物の認識を起点として様々な防御反応が誘導され、最終的には植物の細胞死を伴う過敏感反応が誘導される。一方で、近年非ＮＢ-ＬＲＲタイプの抵抗性遺伝子が相次いで単離・同定されており、これらの遺伝子産物により誘導される抵抗性は真性抵抗性において見られる種々の防御応答や過敏感反応を伴わない事が明らかにされている（非特許文献３参照）。植物ウイルスに対する抵抗性遺伝子の中では１３遺伝子がＮＢ-ＬＲＲ遺伝子であり、２遺伝子が非ＮＢ-ＬＲＲ遺伝子である（非特許文献１参照）。
【０００４】
ポテックスウイルスはプラス一本鎖ＲＮＡをゲノムに持つ、アルファフレキシウイルス科ポテックスウイルス属に分類される植物ＲＮＡウイルスの総称である。ポテックスウイルスの粒子は、４７０〜５８０ｘ１３ｎｍのひも状粒子で、これまで３５種および７暫定種が知られている（非特許文献４参照）。ポテックスウイルスのゲノムＲＮＡには５つのＯＲＦが存在し、５’末端から、ゲノム複製に関わる複製酵素、細胞間移行に関わる移行タンパク質、ウイルス粒子を構成する外被タンパク質がコードされている。またゲノムＲＮＡの５’末端にはキャップ構造、３’末端にはポリＡ配列を持つ。ポテックスウイルス属に属するそれぞれのウイルスの宿主範囲は限られているが、様々な宿主範囲を有するウイルス種が存在するため、ポテックスウイルス全体では極めて幅広い植物種に感染する（非特許文献５参照）。また、ポテックスウイルスには世界中で発生しジャガイモ生産に大きな被害を与えるジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）や日本では発生が確認されていないもののヨーロッパでトマト生産に甚大な被害を与えるペピーノモザイクウイルス（pepino mosaic virus；ＰｅｐＭＶ）など作物生産上重要なウイルスが含まれる。
【０００５】
ポテックスウイルスに対する抵抗性遺伝子としてはジャガイモの野生種であるSolanum demissumよりＲｘ遺伝子が単離されている（非特許文献６参照）。Ｒｘ遺伝子はＮＢ-ＬＲＲ遺伝子であり、ＰＶＸの外被タンパク質を認識して真性抵抗性を誘導し、細胞レベルでウイルス増殖を強く抑制する。しかし、真性抵抗性は打破されやすい抵抗性であるとされており、ＮＢ-ＬＲＲ遺伝子を１つしか持たない抵抗性品種は病原体の非病原性遺伝子の変異等により比較的容易に打破されることが知られている。実際にＲｘ遺伝子による抵抗性を打破するＰＶＸ系統が多数発生している（非特許文献７参照）。また、Ｒｘ遺伝子はＰｅｐＭＶにも抵抗性を示すことが最近明らかにされたが、すでに抵抗性打破株が報告されている（非特許文献８参照）。このようにポテックスウイルスに対する抵抗性遺伝子は１遺伝子しか単離されておらず、容易に打破される状況にあるため、新たな抵抗性遺伝子の単離が待ち望まれていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kang, B.C., Yeam, I., and Jahn, M.M. (2005). Genetics of plant virus resistance. Ann. Rev. Phytopathol. 43: 581-621.
【非特許文献２】Eitas, T.K., and Dangl, J.L. (2010). NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13: 472-477.
【非特許文献２】Nicaise, V., Roux, M., and Zipfel, C. (2009). Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physiol. 150: 1638-1647.
【非特許文献４】King, A. M. Q., Adams, M. J., Carstens, E. B., Lefkowitz, E. J. Virus Taxonomy. Ninth report of the international committee on taxonomy of viruses. Academic Press. 2012
【非特許文献５】Brunt, A. A., Crabtree, K., Dallwitz, M. J., Gibbs, A. J. and Watson, L. (1995) Viruses of plants: Description and lists from the VIDE database. CAB International, Wallingford
【非特許文献６】Bendahmane, A., Kanyuka, K., and Baulcombe, D.C. (1999). The Rx gene from potato controls separate virus resistance and cell death responses. Plant Cell 11: 781-791.
【非特許文献７】Baulcombe D, Gilbert J, Goulden M, Kohm B, Cruz SS.(1994) Molecular biology of resistance to potato virus X in potato. Biochem Soc Symp. 60:207-218.
【非特許文献８】Candresse T, Marais A, Faure C, Dubrana MP, Gombert J, Bendahmane A. (2010) Multiple coat protein mutations abolish recognition of Pepino mosaic potexvirus (PepMV) by the potato rx resistance gene in transgenic tomatoes. Mol Plant Microbe Interact. 23:376-383.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明はポテックスウイルスに対して高度抵抗性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ポテックスウイルス属に属するplantago asiatica mosaic virus （ＰｌＡＭＶ）をシロイヌナズナの様々なエコタイプに接種し、その罹病性を解析することで、ＰｌＡＭＶ抵抗性のシロイヌナズナエコタイプを発見し、原因遺伝子を同定することによりウイルス抵抗性遺伝子ＪＡＸ１を見出した。そして、異なる科に属する系統学的に離れた植物種においてもＪＡＸ１ポリペプチドによるウイルス抵抗性が発揮されること確認すると共に、ＪＡＸ１ポリペプチドはＰｌＡＭＶのみならず、ＰＶＸやＷＣｌＭＶを含む調べた限り全てのポテックスウイルスの感染を阻害できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の一実施態様は、ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ＪＡＸ１ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を有してもよい。本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのポリペプチド、または上記ポリヌクレオチドを含有するポテックスウイルスに対するウイルス抵抗性付与剤である。また、本発明の一実施態様は、上記いずれかのポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物である。
【００１０】
また、本発明の他の一実施態様は、上記いずれかのポリヌクレオチドを外来的に有する植物細胞、植物体またはその後代である。
【００１１】
また、本発明のさらなる一実施態様は、植物細胞に、ポテックスウイルスに対する抵抗性を付与する方法であって、前記植物細胞で、上記いずれかのポリペプチドを発現させる工程を含む、方法である。
【００１２】
また、本発明のさらなる一実施態様は、ウイルス抵抗性ペプチドを得る方法であって、変異ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを導入された植物細胞または植物体が、ポテックスウイルスに対する抵抗性を獲得するかどうか調べる工程と、前記抵抗性を獲得した変異ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをウイルス抵抗性ペプチドと認定する工程を含む方法である。
【００１３】
また、本発明のさらなる一実施態様は、植物ウイルス複製阻害レクチンを得る方法であって、レクチンを導入された植物細胞または植物体が、植物ウイルスに対する複製阻害活性を獲得するかどうかを調べる工程と、前記複製阻害活性を獲得した前記レクチンを植物ウイルス複製阻害レクチンと認定する工程を含む方法である。
【００１４】
さらに、本発明の一実施態様は、植物細胞または植物体におけるウイルス抵抗性のマーカーであって、ＪＡＸ１ペプチドまたはＪＡＸ１遺伝子のｍＲＮＡであることを特徴とする。他の実施態様として、植物細胞または植物体におけるポテックスウイルス抵抗性の検定方法は、前記植物細胞または植物体において、ＪＡＸ１ペプチドまたはＪＡＸ１遺伝子のｍＲＮＡが発現しているかどうか調べる工程を含む。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によって、ポテックスウイルスに対して高度抵抗性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施例において、タバコ(N. benthamiana)にＧＦＰ発現ウイルスを接種し、紫外線照射下でウイルス蓄積を観察した写真である。ＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）を接種すると同時にコントロール遺伝子（ｐＣＡＭＢＩＡ−１３０１）（左側）またはＪＡＸ１ポリペプチド（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１）（右側）を発現させた。接種４日後に接種葉を紫外線照射下でウイルス感染に伴うＧＦＰ蛍光を観察した。
【図２】本発明の一実施例において、ノーザンブロット解析によりウイルスＲＮＡを検出した写真である。ＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）を接種すると同時にＪＡＸ１ポリペプチド（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１）またはコントロール遺伝子（ｐＣＡＭＢＩＡ−１３０１）を発現させた。接種４日後に接種葉より全ＲＮＡを抽出し、ウイルス特異的プローブを用いてノーザンブロット解析した。
【図３】本発明の一実施例において、シロイヌナズナ（A. thaliana Ｃｏｌ−０）プロトプラストに、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１）またはコントロール遺伝子（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１）及びＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）を接種し、紫外線照射下でウイルス感染をＧＦＰ蛍光として観察した写真である。
【図４】本発明の一実施例において、シロイヌナズナプロトプラストに、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１）またはコントロール遺伝子（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１）及びＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）を接種し、ウイルス特異的プライマーを用いた逆転写リアルタイムＰＣＲ解析によって、ウイルスＲＮＡの蓄積を定量化したグラフである。
【図５】本発明の一実施例において、シロイヌナズナを、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１）で形質転換し、ＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）を接種し、紫外線照射下でウイルス感染をＧＦＰ蛍光として観察した写真である。なお、コントロールとして、非形質転換シロイヌナズナを用いた。
【図６】本発明の一実施例において、タバコを、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１）で形質転換し、ＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）を接種し、紫外線照射下でウイルス感染をＧＦＰ蛍光として観察した写真である。なお、コントロールとして、非形質転換タバコを用いた。
【図７】本発明の一実施例において、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１）により形質転換したタバコに、（Ａ）ＰＶＸのＧＦＰ発現ウイルスベクター（ＣＸＩ）、（Ｂ）ＷＣｌＭＶ、または（Ｃ）ＡＶ３を接種した。ＣＸＩ接種株は紫外線照射下でウイルス感染をＧＦＰ蛍光として観察し、ＷＣｌＭＶ接種株とＡＶ３接種株は上位葉より全ＲＮＡを抽出しウイルス特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。なお、コントロールとして、非形質転換タバコを用いた。
【図８】実施例で用いたポテックスウイルスの複製酵素のアミノ酸配列の相同性を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されない。
【００１８】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを改変した方法を用いた。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合、特に説明が無い場合にはそれらに添付のプロトコールを用いた。
【００１９】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾できることは、当業者にとって明らかである。
【００２０】
＜ＪＡＸ１ポリペプチド及びその使用方法＞
本発明の一実施態様は、ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド（ＪＡＸ１ポリペプチドとも称する）を植物細胞または植物体で発現させることで植物細胞または植物体にウイルス抵抗性を付与することを特徴とする。より詳細には、ＪＡＸ１ポリペプチドはポテックスウイルスのゲノム複製過程を阻害することで、ウイルス増殖を極めて効果的に阻害する。これにより植物は植物ウイルスに対する抵抗性を獲得する。ＪＡＸ１ポリペプチドは、植物由来のタンパク質であり、別途に資材、薬剤および施設を用いることなく植物ウイルス病を効果的に防除できるという特徴がある。
【００２１】
ここで、ＪＡＸ１ペプチドとは、
（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド、 
（２）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子のホモログやオーソログがコードするペプチド、
（３）配列番号１の一部のアミノ酸配列からなり、植物細胞又は植物体にウイルス抵抗性を付与できるポリペプチド、
（４）（１）から（３）に記載のいずれかのポリペプチド配列において、数アミノ酸残基が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有し、植物細胞又は植物体にウイルス抵抗性を付与できる変異ポリペプチド、を意味する。
【００２２】
なお、（４）の変異ポリペプチドは、（１）〜（３）のポリペプチドにおいて、ウイルス抵抗性に必要なアミノ酸に変異が生じていないか、変異が生じていてもウイルス抵抗性活性を失わせないような変異を有する変異ポリペプチドであり、当業者にとって（１）〜（３）のポリペプチドと均等物であることが明らかなポリペプチドのことを意味する。なお、これらのポリペプチドは、糖鎖などの修飾がなされていてもよい。
【００２３】
また、ＪＡＸ１ポリペプチドは、ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含んでいれば良く、ＪＡＸ１ペプチドそのものでも良いが、ＪＡＸ１ペプチド以外にタグペプチドやマーカーペプチドなどが付加されていてもよい。
【００２４】
ＪＡＸ１ポリペプチドが植物に抵抗性を与える標的ウイルスは特に限定されないが、ポテックスウイルス（Potexvirus）属に属するウイルスであることが好ましく、オオバコモザイクウイルス（plantago asiatica mosaic virus; ＰｌＡＭＶ）、ジャガイモＸウイルス（potato virus X; PVX）、シロクローバーモザイクウイルス（white clover mosaic virus; WClMV) 、アスパラガスウイルス３（asparagus virus 3; AV3)、イチゴマイルドイエローエッジウイルス（strawberry mild yellow edge virus; SMYEV）、pepino mosaic virus (PepMV)などを例示できる。
【００２５】
ＪＡＸ１ポリペプチドの植物細胞または植物体への導入方法は、特に限定されず、ＪＡＸ１ポリペプチド自体の導入、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを植物細胞または植物体で発現させることによる導入、またはＪＡＸ１ポリペプチドを発現する細胞を植物体に移植することによる導入など、いずれの方法によって行ってもよい。
【００２６】
植物細胞または植物体に導入するためのＪＡＸ１ポリペプチドは、その取得・調製法によって特に限定されず、天然由来のポリペプチドであっても、遺伝子組換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、または周知の方法で化学合成したポリペプチドであってもよい。天然由来のポリペプチドは、タンパク質の単離・精製法を適宜組み合わせることにより、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現している生体植物から取得することができる。化学合成により本発明に係るポリペプチドを調製する場合には、例えばFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）やtBoc法（ｔ-ブチルオキシカルボニル法）等の当業者に周知の化学合成法に従って製造することができる。また、各種市販のペプチド合成機を利用してＪＡＸ１ポリペプチドを製造することもできる。遺伝子組換え技術によりポリペプチドを調製する場合には、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、たとえば、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現する発現ベクターによって、培養細胞等の宿主細胞を形質転換し、ポリペプチドを発現させればよい。
【００２７】
このようにして得られるＪＡＸ１ポリペプチドを植物細胞または植物体に導入する方法は特に限定されず、例えば、注射器等で、葉等の植物個体の一部に注入してもよい。
【００２８】
また、ＪＡＸ１ポリペプチドを植物細胞または植物体に導入するには、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物、たとえば、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現する発現ベクターによって、ＪＡＸ１ポリペプチドを植物細胞または植物体で発現させてもよい。ＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを植物細胞または植物体で発現させるため、まず、ＪＡＸ１をコードするＤＮＡを発現させる上で適切なプロモーターの下流に挿入した発現ベクターを作製する。この発現ベクターを植物細胞または植物体に直接導入するか、あるいは、植物から単離した組織、器官、または、植物由来の細胞、カルスなどに導入した後、植物個体に移植または植物個体を再生することによって、植物細胞または植物体へＪＡＸ１ポリペプチドを導入することができる。
【００２９】
ＤＮＡを植物細胞または植物体で発現させる具体的な方法においては、まず、当業者に周知の方法を用い、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに組込む。ここで使用するベクターは例えばｐＣＡＭＢＩＡ１３０１等を用いることができるが、特に制限されない。
【００３０】
このようにして作製した発現ベクターを植物細胞または植物体に導入する。この工程は、植物細胞または植物体に直接導入する方法、あるいは、植物から単離した組織、器官、もしくは、植物由来細胞、カルスを用いる方法、から選択できる。以下、各々について、その例を詳細に説明する。
【００３１】
発現ベクターを植物体に直接導入する方法としては、例えば、アグロバクテリウムを介したアグロバクテリウム法が挙げられる。アグロバクテリウム法では、例えばエレクトロポレーション法（Nagel et al., Microbiology Letters, 1990, 67, 325）等の当業者に周知の方法を用いて、発現ベクターをアグロバクテリウムに導入する。
【００３２】
次いで、発現ベクター導入アグロバクテリウムを浸漬バッファーに懸濁したアグロバクテリウム菌液を作製し、植物の一部または全体を浸漬する（Gelvin et al., Molecular Biology Manual, Academic Press Publishers; Cough & Bent, Plant J. 1996, 16, 735-743）。これによって、生体植物の浸漬した部分の細胞にＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入することができ、その場所で、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現、蓄積させることができる。あるいは、前記発現ベクターを、エレクトロポーテーション法やパーティクルガン法等の当業者に周知の方法を用いて生体植物個体の細胞に直接導入することができる。これによって、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを導入されたこの細胞においてＪＡＸ１ポリペプチドを発現させることができる。
【００３３】
一方、植物由来の組織、器官、株化細胞、カルスなどの培養下にある細胞を用いて、発現ベクターを植物個体に導入する場合、アグロバクテリウムを介して、あるいは、直接、植物由来細胞に発現ベクターを導入することにより、まず、ＪＡＸ１ポリペプチド発現する形質転換細胞を作製する。
【００３４】
アグロバクテリウムを介する場合、上記のような培養下にある細胞を発現ベクター導入アグロバクテリウムと共培養し、アグロバクテリウムをそれらの細胞に感染させることにより、形質転換細胞を作製する。一方、発現ベクターを直接細胞に導入する場合、培養下にある細胞に対し、エレクトロポーテーション法、パーティクルガン法等の当業者に周知の方法を用いればよい。得られた形質転換細胞はＪＡＸ１ポリペプチドを発現する。この形質転換細胞を、常法に従って植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン等）を添加した培地で培養することによって植物体に再生することができる。このようにして、個体全体の細胞が、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを有する形質転換植物を得ることができる。このＤＮＡは、ＪＡＸ１ポリペプチドの上流に付加されているプロモーターの制御下で、このポリペプチドを発現する。あるいはＪＡＸ１ポリペプチドをコードするＤＮＡを有する組換えウイルスを植物体の一部に導入すると、組換えウイルスが植物体全体に移行し、全身でこのペプチドを発現するようになる。
【００３５】
＜変異ＪＡＸ１ポリペプチドの検定方法＞
本発明者らは、ＪＡＸ１ポリペプチドが、植物細胞および植物体に、ポテックスウイルスに対する抵抗性を付与することを発見した。従って、新規ウイルス抵抗性ペプチドを見つけるためには、ＪＡＸ１と無関係のペプチドをランダムに試すより、ＪＡＸ１ポリペプチドに変異を導入した変異ＪＡＸ１ポリペプチドについて、ウイルス抵抗性があるかどうか調べる方が、同定できる効率が良いと考えられる。
【００３６】
そこで、本発明の一実施態様は、ウイルス抵抗性ペプチドを得る方法であって、変異ＪＡＸ１ペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチド（変異ＪＡＸ１ポリペプチドとも称する）を導入された植物細胞または植物体が、ポテックスウイルスに対する抵抗性を獲得するかどうか調べる工程と、抵抗性を獲得したポリペプチドをウイルス抵抗性ペプチドと認定する工程を含む。
【００３７】
ここで、変異ＪＡＸ１ペプチドは特に限定されないが、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドに対し、一定量のアミノ酸が欠失、挿入、または置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであればよく、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドとの相同性が、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９８％以上であることがさらに好ましい。
【００３８】
変異ＪＡＸ１ポリペプチドが植物ウイルス抵抗性を付与できるかどうか、すなわち、変異ＪＡＸ１ポリペプチドを導入された植物細胞または植物体が、ポテックスウイルスに対する抵抗性を獲得するかどうかを調べる方法は特に限定されず、例えば、実施例に示すのと同様に、タバコやシロイヌナズナなどの植物体やプロトプラストにおいて、一過的にあるいは形質転換によって変異ＪＡＸ１ポリペプチドを発現させ、ポテックスウイルスを感染させて、ポテックスウイルスが増殖するかどうかや感染が成立するかどうかについて、マーカー分子やウイルス転写物を検出することによって、ウイルスやウイルスＤＮＡを調べればよい。
【００３９】
この検定方法を用いて、変異ＪＡＸ１ペプチドの中から、ウイルス抵抗性ペプチドをスクリーニングすることができる。例えば、ウイルス抵抗性ペプチドの候補である複数の変異ＪＡＸ１ペプチドに対し、この検定方法を用いて、ウイルス抵抗性ペプチドかどうか検定し、ウイルス抵抗性を有する変異ＪＡＸ１ペプチドを選択すれば良い。
【００４０】
＜植物ウイルス複製阻害レクチンの検定方法＞
本発明者らは、ある種のレクチンが、植物ウイルス複製阻害効果を有することを発見した。これまでに、RTM1が植物にウイルス抵抗性をもたらすレクチンであることが知られていたが、その抵抗性は植物体内におけるウイルスの移動を阻害することによるものであって、ウイルス複製を阻害することによって直接的にウイルス抵抗性を与えるもののほうが、ウイルス抵抗性を付加する効果が高いと考えられる。
【００４１】
そこで、本発明の一実施態様は、植物ウイルス複製阻害レクチンを得る方法であって、レクチンを導入された植物細胞または植物体が、植物ウイルスに対する複製阻害活性を獲得するかどうか調べる工程と、複製阻害活性を有する前記レクチンを植物ウイルス複製阻害レクチンと認定する工程を含む。
【００４２】
ここで、レクチンを導入された植物細胞または植物体が、植物ウイルスに対する複製阻害活性を獲得するかどうか調べる方法は、特に限定されず、例えば、実施例に示すのと同様に、タバコやシロイヌナズナなどの植物体やプロトプラストにおいて、一過的にあるいは形質転換によってレクチンを発現させた後、ポテックスウイルスを感染させて、ポテックスウイルスが増殖するかどうかについて、マーカー分子やウイルス転写物を検出することによって、ウイルスやウイルスＤＮＡを調べればよい。そして、ウイルス複製阻害活性を有しているレクチンを植物ウイルス複製阻害レクチンと認定する。ここで用いるレクチンは特に限定されないが、ＩｇＡ１ヒンジ部のＯ結合型糖鎖を特異的に認識するジャカリンと相同性を有するジャカリン様レクチンであることが好ましい。
【００４３】
この検定方法を用いて、レクチンの中から、植物ウイルス複製阻害レクチンをスクリーニングすることができる。例えば、植物ウイルス複製阻害レクチンの候補である複数のレクチンに対し、この検定方法を用いて、植物ウイルス複製阻害レクチンかどうか検定し、活性を有するレクチンを選択すれば良い。
【００４４】
<ウイルス抵抗性のマーカー>
本発明の一実施形態において、ＪＡＸ１ペプチドまたはＪＡＸ１遺伝子のｍＲＮＡは、植物細胞または植物体におけるウイルス抵抗性のマーカーとして利用できる。ここで、植物細胞または植物体は、機能的なＪＡＸ１遺伝子を有しているものであれば特に限定されないが、シロイヌナズナであることが好ましい。
【００４５】
このマーカーの使用例として、植物細胞または植物体において、ＪＡＸ１ペプチドまたはＪＡＸ１遺伝子のｍＲＮＡが発現しているかどうか、例えば、植物細胞または植物体またはそれらの抽出物中に、そのマーカーが存在するかどうかを調べ、発現している場合、その植物細胞または植物体が、ポテックスウイルスに対する抵抗性を有していると判断することができる。発現を調べる方法は特に限定されず、ＥＬＩＳＡやＰＣＲなど、当業者には技術常識である様々な方法がある。
【００４６】
また、このマーカーは、ポテックスウイルスに対する抵抗性の無い植物に抵抗性を付与する際にも利用できる。例えば、ＪＡＸ１遺伝子を有しポテックスウイルスに対する抵抗性のある植物と、内在的にＪＡＸ１遺伝子を有さずポテックスウイルスに対する抵抗性のない植物を交配したり、ポテックスウイルスに対する抵抗性のない植物に外来性ＪＡＸ１遺伝子を導入したりして、抵抗性のない植物に抵抗性を付与する際、その抵抗性のマーカーとして用い、抵抗性を獲得した植物を選択することもできる。
【実施例】
【００４７】
〈実施例１〉
本実施例では、ナス科植物であるタバコ植物体でＪＡＸ１ポリペプチドを一過的に発現させることにより、ポテックスウイルスに対する抵抗性を付与できることを示す。
【００４８】
Ｐ１ＡＭＶに対して抵抗性を示すシロイヌナズナエコタイプＢａｙ−０由来のＪＡＸ１ポリペプチド(配列番号１)をコードするＤＮＡ配列（配列番号２）をＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ここでは、鋳型ＤＮＡとしてＢａｙ−０エコタイプよりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社)により全ＲＮＡを抽出し、ＡＭＶ逆転写酵素（インビトロジェン社）により合成したｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
【００４９】
プライマーＳ1：tttccATGGCTACACCATCAGGTTC（配列番号３）
プライマーＡＳ１：tttcccgggTTACTTAGCAGGAGAAAGCG（配列番号４）
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＮｃｏＩ、ＳｍａＩ）で切断し、植物発現ベクター（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１）のマルチクローニングサイトに挿入することにより、ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１ベクターを作製した。
【００５０】
ｐＰｌＡＭＶ−ＧＦＰΔＣＰ（ＰｌＡＭＶ由来のＣＰ欠損ＧＦＰ発現ベクター(Ozeki, J., Hashimoto, M., Komatsu, K., Maejima, K., Himeno, M., Senshu, H., Kawanishi, T., Kagiwada, S., Yamaji, Y., and Namba, S. (2009) Mol. Plant-Microbe Interact. 22: 677-685.)に、ＰＣＲで増幅したＣＰのＤＮＡ配列を挿入することによりＰ１ＡＭＶのＧＦＰ発現ウイルスベクターを構築した。ＰＣＲの鋳型ＤＮＡには、Ｐ１ＡＭＶの感染性ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ；Ozeki, J., Takahashi, S., Komatsu, K., Kagiwada, S., Yamashita, K., Mori, T., Hirata, H., Yamaji, Y., Ugaki, M., and Namba, S. (2006) Arch Virol. 151:2067-2075.
）を用い、ＰＣＲプライマーは、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。
【００５１】
プライマー  ＣＰＦ：
tttactagtAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGATGGCACTCAACCAAGCTCC
（配列番号５）
プライマー  ＣＰＲ：tttactagtCTAGTCGGAGGGGGAGGG（配列番号６）
得られたＰＣＲ産物を制限酵素（ＳｐｅＩ）で切断し、ｐＰｌＡＭＶ−ＧＦＰΔＣＰのＳｐｅＩ部位に挿入することにより、ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰを作成した。
【００５２】
ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１、ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）ＥＨＡ１０５系統にエレクトロポレーション法によって導入した。対照群として、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ベクターを上記と同様にアグロバクテリウムに導入した。
【００５３】
アグロバクテリウムは、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した選択培地を用いて選択し、その後、液体培地で、菌濃度が０．８（ＯＤ６００）になるまで２８℃で培養した。このアグロバクテリウムを、浸漬バッファー（１０ｍＭ morpholineprapanesulfonic acid、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０μＭ acetosyrigone、 ｐＨ５．６）に菌濃度０．８（ＯＤ６００）となるよう懸濁し、ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰと、ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１またはｐＣＡＭＢＩＡ１３０１の組み合わせで混合し、アグロバクテリウム懸濁液をタバコ（N. benthamiana）の展開葉にシリンジを用いて注入、アグロバクテリウムを感染させた。こうして得られたタバコ個体を２５℃に保たれたチャンバーで生育させ、４日後にウイルス感染の有無について、注入部位を紫外光照射下で観察するほか（図１）、ウイルス配列特異的なプローブを用いてノーザンブロット解析によりウイルスＲＮＡの蓄積を解析した（図２）。なお、注入部位で、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子が実際に発現していることは、ＪＡＸ１抗体を用いたウェスタンブロット解析で確認した。
【００５４】
図1に示すように、注入部位を紫外線照射下で観察したところ、対象区（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１とｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）では、ウイルス感染を示すＧＦＰ蛍光が観察されたのに対して、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現させた部位（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１とｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）ではＧＦＰ蛍光が観察されなかった。
【００５５】
また、図２に示すように、ウイルス特異的プローブを用いたノーザンブロット解析でも、対象区ではウイルスＲＮＡの蓄積が認められたのに対して、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現させた部位ではウイルスＲＮＡの蓄積が認められなかった。
【００５６】
このように、タバコ植物体にＪＡＸ１ポリペプチドを一過的に発現させることで、タバコに対して、ＰｌＡＭＶのウイルスの増殖を抑制し、ウイルス抵抗性を付与することができた。
【００５７】
〈実施例２〉
本実施例では、植物プロトプラストでＪＡＸ１ポリペプチドを一過的に発現させることにより、プロトプラストに、ポテックスウイルスに対する抵抗性を付与できることを示す。
【００５８】
シロイヌナズナ培養細胞（Mathur et al., 1998, Methods Mol. Biol., 82:27-30）よりAbel and （Theologis, 1994, Plant J. 5;421-427）の手法によりプロトプラストを精製し、プロトプラストへの遺伝子導入を行った。精製済みのシロイヌナズナプロトプラスト溶液にサケ精子ＤＮＡ、ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰとｐＣＡＭ−ＪＡＸ１またはｐＣＡＭＢＩＡ１３０１の組み合わせで混合し、さらにＰＥＧ-ＣＨＳ溶液（０．４  Ｍマンニトール、０．１  Ｍ硝酸カルシウム、４０％ポリエチレングリコール）を混合し、室温で３０分静置した。バッファーで洗浄した後に２３℃で培養した。
【００５９】
図３に示すように、遺伝子導入３日後に紫外線照射下でプロトプラストを観察したところ、対象区（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１とｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）では、ウイルス感染を示す強いＧＦＰ蛍光が観察されたのに対して、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現させたプロトプルト（ｐＣＡＭ−ＪＡＸ１とｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）ではＧＦＰ蛍光が弱かった。
【００６０】
また、図４に示すように、ウイルス特異的プライマーを用いた逆転写リアルタイムＰＣＲ解析でも、対象区におけるウイルスＲＮＡの蓄積に対して、ＪＡＸ１ポリペプチドを発現させたプロトプラストではウイルスＲＮＡの蓄積は１０％程度であった。
【００６１】
このことからＪＡＸ１ポリペプチドは、単細胞におけるＰｌＡＭＶのウイルス複製過程を阻害していることが示された。
【００６２】
〈実施例３〉
本実施例では、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子でアブラナ科植物であるシロイヌナズナを形質転換することにより、シロイヌナズナ植物体に対して、ＰｌＡＭＶに対する抵抗性を付与できることを示す。
【００６３】
ＪＡＸ１ポリプチドを発現するＪＡＸ１形質転換シロイヌナズナの作成方法を以下に述べる。実施例１で用いたｐＣＡＭ−ＪＡＸ１にて形質転換したアグロバクテリウムを用い、floral dip法（cough & Bent, Plant J. 1996、16、735-743）によりシロイヌナズナ(A. thaliana、Col-0エコタイプ)を形質転換した。形質転換体は、Ｔ１植物の種子をカナマイシン選択培地（ムラシゲ・スクーグ培地用塩類（和光社）、ＭＳビタミン(Ｓｉｇｍａ社）、１％スクロース、０．７％寒天、５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に播種することにより選択した。なお、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した。
【００６４】
ウイルス接種試験の方法ならびに結果を以下に述べる。ＪＡＸ１形質転換シロイヌナズナと非形質転換シロイヌナズナにＰｌＡＭＶを接種し、ウイルス感染するかどうかを調べた。なお、ＰｌＡＭＶは、ウイルス感染を蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蓄積として検出できる、ＧＦＰ発現ウイルスベクター（ｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ）をアグロインフィルトレーション法にて接種した。
【００６５】
図５には、ＪＡＸ１形質転換シロイヌナズナと非形質転換シロイヌナズナにＧＦＰ発現ウイルスベクターを接種した場合の接種試験の結果を示した。ウイルス接種したシロイヌナズナ個体を、ウイルスベクターを接種した２０日後に紫外線照射下で観察したところ、非形質転換シロイヌナズナではウイルス感染を示すＧＦＰ蛍光が認められたのに対して、ＪＡＸ１形質転換シロイヌナズナではＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【００６６】
このことから、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子でシロイヌナズナに形質転換することにより、シロイヌナズナ植物体にＰｌＡＭＶ抵抗性を付与できた。
【００６７】
〈実施例４〉
本実施例では、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子で、タバコを形質転換することにより、タバコ植物体に対しても、ＰｌＡＭＶおよび複数のポテックスウイルスに対する抵抗性を付与できることを示す。
【００６８】
ＪＡＸ１ポリペプチドを発現する形質転換タバコの作製方法を以下に述べる。  
実施例１で用いたｐＣＡＭ−ＪＡＸ１にて形質転換したアグロバクテリウムを用い、リーフディスク法（Science. 1985, 8, 1229-1231）によりタバコを形質転換した。形質転換体は、常法に従い、植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン）および抗生物質（ハイグロマイシン、クラフォラン）等を含むムラシゲ・スクーグ選択培地（ムラシゲ・スクーグ培地用塩類(和光社)、ＭＳビタミン（Ｓｉｇｍａ社）、３％ショ糖、０．８％ 寒天）に順次移植することにより選択した。ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子がタバコで発現していることはＲＴ−ＰＣＲ法により確認した。
【００６９】
ウイルス接種試験の方法ならびに結果を以下に述べる。ＪＡＸ１形質転換タバコと非形質転換タバコに複数のポテックスウイルスをそれぞれ接種し、ウイルス感染しているかどうかを調べた。接種したポテックスウイルスは、ＰｌＡＭＶ、ＰＶＸ、シロクローバーモザイクウイルス（white clover mosaic virus; WClMV）、アスパラガスウイルス３（asparagus virus 3; AV3）である。なお、ＰｌＡＭＶとＰＶＸは、ウイルス感染を蛍光タンパク質の蓄積として検出できる、ＧＦＰ発現ウイルスベクター（それぞれｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰ、及びＣＸＩ）をアグロインフィルトレーション法にて接種した。ＷＣｌＭＶとＡＶ３は、感染植物葉をリン酸バッファー（０．１Ｍ  リン酸水素二ナトリウム、０．１Ｍ リン酸二水素ナトリウム）にて摩砕したウイルス溶液を機械接種法にて接種した。
【００７０】
図６には、ＪＡＸ１形質転換タバコと非形質転換タバコにＰｌＡＭＶを接種した場合の接種試験の結果を示した。ＪＡＸ１形質転換タバコと非形質転換タバコにｐＣＡＭ−ＰｌＡＭＶ−ＧＦＰを接種し、紫外線照射下で観察したところ、非形質転換タバコではウイルス感染を示すＧＦＰ蛍光が認められたのに対して、ＪＡＸ１形質転換タバコではＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【００７１】
図７には、ＪＡＸ１形質転換タバコと非形質転換タバコにＰＶＸ、ＷＣｌＭＶ、またはＡＶ３を接種した場合の接種試験の結果を示した。図７（Ａ）ではＣＸＩを接種し、紫外線照射下で観察した。非形質転換タバコではＧＦＰ蛍光が観察されＰＶＸの全身感染が確認されるのに対して、ＪＡＸ１形質転換タバコではＧＦＰ蛍光が認められなかった。図７（Ｂ）では、ＪＡＸ１形質転換タバコと非形質転換タバコにＷＣｌＭＶを接種し、上位葉より全ＲＮＡを抽出しウイルス特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、１％寒天にて泳動した。非形質転換タバコより抽出した全ＲＮＡを用いた場合に限り、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅が観察されたことから、ＷＣｌＭＶの全身感染が確認されたのに対して、ＪＡＸ１形質転換タバコより抽出した全ＲＮＡを用いた場合ではＲＴ−ＰＣＲによる増幅は観察されず、ウイルス感染していなかった。図７（Ｃ）では、ＪＡＸ１形質転換タバコと非形質転換タバコにＡＶ３を接種し、上位葉より全ＲＮＡを抽出しウイルス特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い１％寒天に泳動した。この場合も非形質転換タバコの全ＲＮＡを用いた場合に限りＰＣＲの増幅が認められたことから、ＪＡＸ１形質転換タバコではＡＶ３が感染しなかった。
【００７２】
このように、ＪＡＸ１ポリペプチドをコードする遺伝子を形質転換することによりタバコが、ＰｌＡＭＶをはじめとする複数のポテックスウイルスに対して抵抗性を獲得した。
【００７３】
図８には、４種のポテックスウイルスの複製酵素のアミノ酸配列を相互比較した結果を示している。本実施例で用いたポテックスウイルスの複製酵素のアミノ酸配列は３７．８〜４５．４％の相同性を持っていた。ポテックスウイルスの複製酵素のアミノ酸配列は４０．４−７３．３％の相同性をもつとされている(Adams, M. J. et al., Arch Virol. 2004. 149, 1045-1060)。実施例１で示したようにＪＡＸ１ポリペプチドはウイルス複製過程を阻害することで植物にウイルス抵抗性を付与し、さらに実施例２および３で示したようにアミノ酸配列の異なる複数のポテックスウイルスに対しても抵抗性を付与できた。
【００７４】
このように、ＪＡＸ１ポリペプチドは、普遍的にポテックスウイルスの複製を阻害することができる。
【図４】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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