(57)【要約】【課題】本発明は、膜タンパク質を大量に得ることができる生産方法を提供することを目的とする。【解決手段】細菌及び界面活性剤（Ａ）を含有する培養液を用いて膜タンパク質を分泌生産する膜タンパク質の生産方法であり、好ましくは界面活性剤（Ａ）として、ＨＬＢが０〜８のノニオン性界面活性剤（Ａ１）を含む界面活性剤を使用する生産方法であり、さらに好ましくは界面活性剤（Ａ）としてＨＬＢが０〜８のノニオン性界面活性剤（Ａ１）及び下記界面活性剤（Ａ２）を含む界面活性剤を使用する生産方法。界面活性剤（Ａ２）：両性界面活性剤（Ａ２−１）、アニオン性界面活性剤（Ａ２−２）、カチオン性界面活性剤（Ａ２−３）及びＨＬＢが８を超え１３以下であるノニオン性界面活性剤（Ａ２−４）からなる群より選ばれる少なくとも１種。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌及び界面活性剤（Ａ）を含有する培養液を用いて膜タンパク質を分泌生産する膜タンパク質の生産方法。
【請求項２】
界面活性剤（Ａ）が、ＨＬＢが０〜８のノニオン性界面活性剤（Ａ１）を含む請求項１に記載の膜タンパク質の生産方法。
【請求項３】
界面活性剤（Ａ）が、ＨＬＢが０〜８のノニオン性界面活性剤（Ａ１）及び下記界面活性剤（Ａ２）を含む請求項１又は２に記載の膜タンパク質の生産方法。
界面活性剤（Ａ２）：両性界面活性剤（Ａ２−１）、アニオン性界面活性剤（Ａ２−２）、カチオン性界面活性剤（Ａ２−３）及びＨＬＢが８を超え１３以下であるノニオン性界面活性剤（Ａ２−４）からなる群より選ばれる少なくとも１種。
【請求項４】
培養液中の界面活性剤（Ａ）の含有量が培養液の重量を基準として０．１〜１０重量％である請求項１〜３のいずれかに記載の膜タンパク質の生産方法。
【請求項５】
培養液中のノニオン性界面活性剤（Ａ１）の含有量が、培養液の重量を基準として０．１〜１０重量％である請求項２〜４のいずれかに記載の膜タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、アミノ酸やタンパク質等を生産するために広く利用されている。特に近年は、医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を、遺伝子工学技術を活用して細菌に導入して形質転換し、この細菌を培養してタンパク質を発現させ、目的のタンパク質を効率的に生産する技術が知られている。生産したタンパク質は、工業用、食品加工用及び医薬品用等のタンパク質として幅広く用いられている。
【０００３】
膜タンパク質は、細胞膜上に存在するタンパク質であり、細菌で生産しようとすると不活性の封入体となりやすく、また生産量が少量（培養液の体積を基準として５０ｍｇ／Ｌ以下）である問題がある。
【０００４】
膜タンパク質を細菌から活性がある状態で取り出すには、細菌の膜成分ごと取り出す必要があり、工程が複雑となる問題もある。これらの理由から、現在まで膜タンパク質は商業生産されておらず、商業利用されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】生物工学会誌、香山憲夫  他、２０００年、第７８巻、第３号、ｐ８２−９３
【非特許文献２】Ｖａｌａｒｉｅ  Ｌ  ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、１９９９年、Ｖｏｌ．２７４、Ｎｏ．７、ｐ４２４６−４２５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、膜タンパク質を大量に得ることができる生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明に至った。
すなわち、本発明の膜タンパク質の生産方法は、細菌及び界面活性剤（Ａ）を含有する培養液を用いて膜タンパク質を分泌生産する膜タンパク質の生産方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の膜タンパク質の生産方法は、膜タンパク質を大量に得ることが可能である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
膜タンパク質とは、細胞の脂質膜に存在するタンパク質でり、細菌内では細胞の脂質膜に結合しているタンパク質である。
膜タンパク質は、大量に生産することが難しいが、本発明の生産方法によれば、大量に得ることができる。さらに、膜タンパク質は、膜タンパク質以外のタンパク質と比較して不活性となりやすく、活性がある状態のものを得ることが難しいが、本発明の生産方法によれば、活性のある状態で得ることが可能である。
膜タンパク質としては、従来知られている膜タンパク質が含まれ、特に限定されないが、具体的には、酵素｛ヒアルロン酸シンターゼ（ストレプトコッカスピオゲネスや藻類ウイルス由来のヒアルロン酸合成酵素等）及び還元酵素（Ｐ４５０等）等｝及び抗体（ＩｇＤ等）等が挙げられる。
【００１０】
本発明における細菌として、以下に例を挙げるがこれに限定するものではない。細菌は、真正細菌及び古細菌が含まれる。真正細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陰性細菌としては、エシェリチア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サーマス属菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、リゾビウム属菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、シュワネラ属菌（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属）等が挙げられる。グラム陽性菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属  （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等に含まれる細菌が挙げられる。
【００１１】
これらのうち、膜タンパク質を大量に生産する観点から、グラム陰性菌が好ましく、さらに好ましくはエシェリチア属であり、より好ましくは大腸菌である。
【００１２】
本発明の生産方法で使用される界面活性剤（Ａ）には、ＨＬＢが０〜８のノニオン性界面活性剤（Ａ１）及び下記界面活性剤（Ａ２）が含まれる。
界面活性剤（Ａ２）：両性界面活性剤（Ａ２−１）、アニオン性界面活性剤（Ａ２−２）、カチオン性界面活性剤（Ａ２−３）及びＨＬＢが８を超え１３以下であるノニオン性界面活性剤（Ａ２−４）からなる群より選ばれる少なくとも１種。
【００１３】
（Ａ１）としては、ＨＬＢが０〜８の界面活性剤である、脂肪族モノアルコールアルキレンオキサイド（以下、アルキレンオキサイドはＡＯと略記）付加物（Ａ１−１）、アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ１−２）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ１−３）及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ１−４）が含まれる。
なお、ＨＬＢは、ノニオン性界面活性剤の親水性及び疎水性を示す尺度として知られており、ＨＬＢの値が高いほど親水性が高いことを意味する。本発明におけるＨＬＢとは下記式（１）で計算される数値である（藤本武彦著、界面活性剤入門、１４２頁、三洋化成工業株式会社発行）。
【００１４】
ＨＬＢ＝２０×｛親水基の分子量／界面活性剤の分子量｝      （１）
【００１５】
（Ａ１）のＨＬＢは、膜タンパク質の安定化の観点から、０を超え８以下のものが好ましく、さらに好ましくは０を超え７以下であり、次にさらに好ましくは０．５〜６であり、特に好ましくは１〜５である。
【００１６】
脂肪族モノアルコールＡＯ付加物（Ａ１−１）において、脂肪族モノアルコールとしては、炭素数８〜２４の脂肪族モノアルコールが含まれる。脂肪族モノアルコールとして、具体的には、カプリルアルコール、デシルアルコール、ドデシルアルコール、オクタデシルアルコール、オレイルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール等が挙げられる。ＡＯとしては、炭素数２〜４のＡＯが含まれる。ＡＯとして、具体的には、エチレンオキサイド（以下、ＥＯと記載する）及びプロピレンオキサイド（以下、ＰＯと記載する）等が挙げられる。ＡＯは２種以上を併用してもいい。ＡＯの付加モル数は、ＡＯを１種使用する場合は、付加モル数１〜２０、ＡＯを２種以上併用する場合は、合計付加モル数２〜４０のものが含まれる。ＡＯがＥＯである場合は、ＥＯ付加モル数を少なくし、脂肪族アルコールの炭素数が長くなるとＨＬＢが低くなる。（Ａ１−１）として、具体的には、オレイルアルコールＥＯ付加物及びデシルアルコールＥＯＰＯ付加物等が挙げられ、オレイルアルコールＥＯ２モル付加物（ＨＬＢ＝６．０）及びデシルアルコールのＥＯ８モルＰＯ７モルブロック付加物（ＨＬＢ８．０）等が挙げられる。
【００１７】
アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ１−２）において、アルキルフェノールとしては、炭素数７〜３０のアルキルフェノールが含まれ、例えば、ブチルフェノール、ペンチルフェノール、ヘキシルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、デシルフェノール及びドデシルフェノール等が挙げられる。ＡＯとしては、炭素数２〜４のＡＯが含まれる。ＡＯとして、具体的には、ＥＯ及びＰＯ等が挙げられる。ＡＯは２種以上を併用してもいい。ＡＯの付加モル数は、ＡＯを１種使用する場合は、付加モル数１〜２０、ＡＯを２種以上併用する場合は、合計付加モル数２〜４０のものが含まれる。ＡＯがＥＯである場合は、ＥＯ付加モル数を少なくするとＨＬＢが小さくなる。（Ａ１−２）として、具体的には、ノニルフェノールＥＯ付加物等が挙げられ、ノニルフェノールＥＯ２モル付加物（ＨＬＢ＝５．７）等が挙げられる。
【００１８】
脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ１−３）は、脂肪酸とＡＯの共重合体とのエステル化物であり、脂肪酸としては、炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）が含まれる。ＡＯは、炭素数２〜４のＡＯであり、例えばＥＯ及びＰＯが挙げられる。ＡＯは２種以上を併用してもいい。ＡＯの付加モル数は、ＡＯを１種使用する場合は、付加モル数１〜２０、ＡＯを２種以上併用する場合は、合計付加モル数２〜４０のものが含まれる。ＡＯがＥＯである場合は、ＥＯ付加モル数を少なくするとＨＬＢが小さくなる。（Ａ１−３）として具体的には、ポリオキシエチレングリコールジラウリン酸エステル（オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝６．６）、ポリオキシエチレングリコールジオレイン酸エステル（オキシエチレンの重合度＝５、ＨＬＢ＝５．６）等が挙げられる。
【００１９】
多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ１−４）としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物；糖（炭素数３〜７の単糖、二糖、三糖、オリゴ糖及び多糖等）の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド（ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等）及びこれらのＡＯ付加物等が含まれる。（Ａ１−４）として具体的にはトリオレイン酸ソルビタン（ＨＬＢ＝１．８）、モノオレイン酸ソルビタン（ＨＬＢ＝４．３）及びモノステアリン酸ソルビタン（ＨＬＢ＝４．７）等が挙げられる。
【００２０】
本発明の生産方法においては、培養液中に（Ａ１）を含有することにより、膜タンパク質が安定化された状態で培養液中に分泌されるので、活性のある膜タンパク質として取り出すことができ、細菌を破砕して取り出した膜タンパク質と比較して活性の高い膜タンパクを得ることができる。
【００２１】
（Ａ１）のうち、膜タンパク質の安定化の観点から、ＨＬＢが０〜８のアルコールＡＯ付加物（Ａ１−１）、アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ１−２）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ１−３）及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ１−４）が好ましく、さらに好ましくは多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ１−４）であり、特に好ましくはトリオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン及びモノステアリン酸ソルビタンである。
【００２２】
両性界面活性剤（Ａ２−１）としては、カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ２−１−１）、硫酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ２−１−２）、スルホン酸塩型両性界面活性剤（Ａ２−１−３）及びリン酸エステル塩型両性界面活性剤（Ａ２−１−４）等が含まれる。
【００２３】
カルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ２−１−１）としては、アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ２−１−１−１）、ベタイン型両性界面活性剤（Ａ２−１−１−２）及びイミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ２−１−１−３）等が挙げられる。
【００２４】
アミノ酸型両性界面活性剤（Ａ２−１−１−１）としては、分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する両性界面活性剤であり、下記一般式（１）で示される化合物等が挙げられる。
［Ｒ−ＮＨ−（ＣＨ2）n−ＣＯＯ-］mＭ  （１）
一般式（１）中、Ｒは炭素数１〜２０の１価の炭化水素基である。ｎは１以上の整数である。ｍは１以上の整数である。Ｍはプロトン；又はアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（アミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む）及び第４級アンモニウム等の１価又は２価のカチオンである。
また、（Ａ２−１−１−１）として具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤（コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等）；アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤（ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等）及びＮ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
【００２５】
ベタイン型両性界面活性剤（Ａ２−１−１−２）は、分子内に第４級アンモニウム塩型のカチオン部分とカルボン酸型のアニオン部分を持っている両性界面活性剤である。（Ａ２−１−１−２）は下記一般式（２）で示される化合物が挙げられる。（Ａ１−１−２）として具体的には、アルキルジメチルベタイン（ステアリルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）、アミドベタイン（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン等（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタインや硬化ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン等）及びラウリン酸アミドプロピルベタイン等）並びにアルキルジヒドロキシアルキルベタイン（ラウリルジヒドロキシエチルベタイン等）等が挙げられる。
Ｒ−Ｎ+（ＣＨ3）2−ＣＨ2ＣＯＯ-          （２）
一般式（２）中、Ｒは炭素数１〜２０の１価の炭化水素基である。
【００２６】
イミダゾリン型両性界面活性剤（Ａ２−１−１−３）としては、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。
【００２７】
その他の両性界面活性剤としては、ナトリウムラウロイルグリシン、ナトリウムラウリルジアミノエチルグリシン、ラウリルジアミノエチルグリシン塩酸塩及びジオクチルジアミノエチルグリシン塩酸塩等のグリシン型両性界面活性剤；ペンタデシルスルホタウリン等のスルホベタイン型両性界面活性剤；コールアミドプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、コールアミドプロピルジメチルアンモニオ２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）；ラウリルジメチルアミンオキサイド等のアルキルアミンオキサイド型両性界面活性剤等が含まれる。
【００２８】
アニオン性界面活性剤（Ａ２−２）としては、エーテルカルボン酸（Ａ２−２−１）及びその塩、硫酸エステル（Ａ２−２−２）又はその塩、エーテル硫酸エステル（Ａ２−２−３）及びその塩、スルホン酸塩（Ａ２−２−４）、スルホコハク酸塩（Ａ２−２−５）、リン酸エステル（Ａ２−２−６）及びその塩、エーテルリン酸エステル（Ａ２−２−７）及びその塩、脂肪酸塩（Ａ２−２−８）、アシル化アミノ酸塩並びに天然由来のカルボン酸及びその塩（ケノデオキシコール酸、コール酸及びデオキシコール酸等）等が挙げられる。
【００２９】
エーテルカルボン酸（Ａ２−２−１）又はその塩としては炭化水素基（炭素数８〜２４）を有するエーテルカルボン酸及びその塩が含まれる。（Ａ２−２−１）又はその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンオクチルエーテル酢酸ナトリウム塩及びラウリルグリコール酢酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３０】
硫酸エステル（Ａ２−２−２）及びその塩としては、炭化水素基（炭素数８〜２４）を有する硫酸エステル及びその塩が含まれる。（Ａ２−２−２）及びその塩として具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム塩及びラウリル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３１】
エーテル硫酸エステル（Ａ２−２−３）及びその塩としては、炭化水素基（炭素数８〜２４）を有するエーテル硫酸エステル及びその塩が含まれる。（Ａ２−２−３）及びその塩として具体的には、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等が挙げられる。
【００３２】
スルホン酸塩（Ａ２−２−４）としては、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩及びナフタレンスルホン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３３】
スルホコハク酸塩（Ａ２−２−５）としては、ポリオキシエチレンラウリルスルホコハク酸二ナトリウム塩、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム塩及びスルホコハク酸ポリオキシエチレンラウロイルエタノールアミド二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３４】
リン酸エステル（Ａ２−２−６）としては、オクチルリン酸二ナトリウム塩及びラウリルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３５】
エーテルリン酸エステル（Ａ２−２−７）としては、ポリオキシエチレンオクチルエーテルリン酸二ナトリウム塩及びポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸二ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３６】
脂肪酸塩（Ａ２−２−８）としては、オクチル酸ナトリウム塩、ラウリル酸ナトリウム塩及びステアリン酸ナトリウム塩等が挙げられる。
【００３７】
カチオン性界面活性剤（Ａ２−３）としては、アミン塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２−３−１）及び第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２−３−２）等が含まれる。
【００３８】
アミン塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２−３−１）としては、１〜３級アミンを無機酸（塩酸、硝酸、硫酸、ヨウ化水素酸など）または有機酸（酢酸、ギ酸、蓚酸、乳酸、グルコン酸、アジピン酸、アルキル燐酸など）で中和したものが含まれる。例えば、第１級アミン塩型のものとしては、脂肪族高級アミン（ラウリルアミン、ステアリルアミン、セチルアミン、硬化牛脂アミン、ロジンアミンなどの高級アミン）の無機酸塩または有機酸塩；低級アミン類の高級脂肪酸（ステアリン酸、オレイン酸など）塩などが挙げられる。第２級アミン塩型のものとしては、例えば脂肪族アミンのエチレンオキサイド付加物などの無機酸塩または有機酸塩が挙げられる。また、第３級アミン塩型のものとしては、例えば、脂肪族アミン（トリエチルアミン、エチルジメチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなど）、脂肪族アミンのエチレンオキサイド（２モル以上）付加物、脂環式アミン（Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルヘキサメチレンイミン、Ｎ−メチルモルホリン、１，８−ジアザビシクロ（５，４，０）−７−ウンデセンなど）、含窒素ヘテロ環芳香族アミン（４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、４，４’−ジピリジルなど）の無機酸塩または有機酸塩；トリエタノールアミンモノステアレート、ステアラミドエチルジエチルメチルエタノールアミンなどの３級アミン類の無機酸塩または有機酸塩などが挙げられる。
【００３９】
第４級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤（Ａ２−３−２）としては、３級アミン類と４級化剤（メチルクロライド、メチルブロマイド、エチルクロライド、ベンジルクロライド、ジメチル硫酸などのアルキル化剤；エチレンオキサイドなど）との反応で得られるものが含まれる。例えば、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ジオクチルジメチルアンモニウムブロマイド、ステアリルトリメチルアンモニウムブロマイド、ラウリルジメチルベンジルアンモニウムクロライド（塩化ベンザルコニウム）、セチルピリジニウムクロライド、ポリオキシエチレントリメチルアンモニウムクロライド、ステアラミドエチルジエチルメチルアンモニウムメトサルフェートなどが挙げられる。
【００４０】
ＨＬＢが８を超え１３以下であるノニオン性界面活性剤（Ａ２−４）としては、ＨＬＢが８を超え１３以下である、脂肪族モノアルコールＡＯ付加物（Ａ２−４−１）、アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ２−４−２）、脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ２−４−３）及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ２−４−４）等が含まれる。
【００４１】
脂肪族モノアルコールＡＯ付加物（Ａ２−４−１）において、脂肪族モノアルコールとしては、炭素数８〜２４の脂肪族モノアルコールが含まれる。脂肪族モノアルコールとして、具体的には、カプリルアルコール、デシルアルコール、ドデシルアルコール、オクタデシルアルコール、オレイルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ヤシ油アルキルアルコール等が挙げられる。ＡＯとしては、炭素数２〜４のＡＯが含まれる。ＡＯとして、具体的には、ＥＯ及びＰＯ等が挙げられる。ＡＯは２種以上を併用してもいい。ＡＯの付加モル数は、ＡＯを１種使用する場合は、付加モル数１〜２０、ＡＯを２種以上併用する場合は、合計付加モル数２〜４０のものが含まれる。ＡＯがＥＯである場合は、ＥＯ付加モル数多くし、脂肪族アルコールの炭素数が短くなるとＨＬＢが高くなる。（Ａ２−４−１）として具体的には、ラウリルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、オレイルアルコールＥＯ５モル付加物（ＨＬＢ＝９．０）、オレイルアルコールＥＯ６モル付加物（ＨＬＢ＝１０．２）、オレイルアルコールＥＯ７モル付加物（ＨＬＢ＝１１．０）、オレイルアルコールＥＯ１０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．４）、１，２−ドデカンジオールモノオキシエチレン付加物（ＨＬＢ＝１０．４）及びデシルアルコールＥＯ５モル付加物（ＨＬＢ＝１０．３）等が挙げられる。
【００４２】
アルキルフェノールＡＯ付加物（Ａ２−４−２）において、アルキルフェノールとしては、炭素数７〜３０のアルキルフェノールが含まれ、例えば、ブチルフェノール、ペンチルフェノール、ヘキシルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、デシルフェノール及びドデシルフェノール等が挙げられる。ＡＯとしては、炭素数２〜４のＡＯが含まれる。ＡＯとして、具体的には、ＥＯ及びＰＯ等が挙げられる。ＡＯは２種以上を併用してもいい。ＡＯの付加モル数は、ＡＯを１種使用する場合は、付加モル数１〜２０、ＡＯを２種以上併用する場合は、合計付加モル数２〜４０のものが含まれる。ＡＯがＥＯである場合は、ＥＯ付加モル数多くするとＨＬＢが大きくなる。（Ａ２−４−２）として具体的には、オクチルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物並びにノニルフェノールのＥＯ１〜２０モル及び／又はＰＯ１〜２０モル付加物等が挙げられる。また、ＴＲＩＴＯＮTMＸ−１１４（ＨＬＢ＝１２．４）、ｉｇｅｐａｌTMＣＡ−５２０（ＨＬＢ＝１０．０）及びｉｇｅｐａｌTMＣＡ−６３０（ＨＬＢ＝１３．０）等が市場から容易に入手できる。
【００４３】
脂肪酸ＡＯ付加物（Ａ２−４−３）は、脂肪酸とＡＯの共重合体とのエステル化物であり、脂肪酸としては、炭素数８〜２４の脂肪酸（デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びヤシ油脂肪酸等）が含まれる。ＡＯは、炭素数２〜４のＡＯであり、例えばＥＯ及びＰＯが挙げられる。ＡＯは２種以上を併用してもいい。ＡＯの付加モル数は、ＡＯを１種使用する場合は、付加モル数１〜２０、ＡＯを２種以上併用する場合は、合計付加モル数２〜４０のものが含まれる。ＡＯがＥＯである場合は、ＥＯ付加モル数多くするとＨＬＢが大きくなる。（Ａ２−４−３）として具体的には、オレイン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．８）、ジオレイン酸ＥＯ１２モル付加物（ＨＬＢ＝１０．４）、ジオレイン酸ＥＯ２０モル付加物（ＨＬＢ＝１２．９）及びステアリン酸ＥＯ９モル付加物（ＨＬＢ＝１１．９）等が挙げられる。
【００４４】
多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ２−４−４）としては、炭素数３〜３６の２〜８価の多価アルコール（グリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、ソルビット及びソルビタン等）のＥＯ及び／又はＰＯ付加物；前記多価アルコールの脂肪酸エステル及びそのＥＯ付加物、並びに、砂糖の脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド（ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド等）及びこれらのＡＯ付加物が含まれる。（Ａ２−４−４）として具体的には、ソルビタンテトラオレイン酸エステルＥＯ３２モル付加物（ＨＬＢ＝１１．４）及びソルビタンヘキサオレイン酸エステルＥＯ４６モル付加物（ＨＬＢ＝１０．２）等が挙げられる。
【００４５】
本発明の生産方法において、培養液中に（Ａ２）を含有することにより、膜タンパク質が培養液中に分泌されやすくなり、膜タンパク質を大量に得ることができる。
【００４６】
（Ａ２）のうち、分泌効率の観点から、両性界面活性剤、アニオン性界面活性剤及びＨＬＢが８を超え１３以下のノニオン性界面活性剤が好ましく、さらに好ましくはカルボン酸塩型両性界面活性剤（Ａ２−１−１）、エーテルカルボン酸（Ａ２−２−１）、スルホン酸塩（Ａ２−２−４）、脂肪族モノアルコールＡＯ付加物（Ａ２−４−１）及び多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ２−４−４）であり、特に好ましくはポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸ナトリウム塩（ポリオキシエチレントリデシルエーテル酢酸のナトリウム塩）、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、１，２−ドデカンジオールモノオキシエチレン付加物、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、硬化ヤシ油脂肪酸アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン、コカミノプロピオン酸ナトリウム、ドデシルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸のナトリウム塩）、脂肪族モノアルコールＥＯ付加物、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩（ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸のナトリウム塩）及びデシルアルコールＥＯ付加物である。
【００４７】
本発明の生産方法においては、上記界面活性剤（Ａ）は１種用いてもよく、２種以上用いてもいい。
また、２種以上用いる場合は、分泌効率と膜タンパク質安定化の観点から、（Ａ１）と（Ａ２）とを併用することが好ましく、さらに好ましくはＨＬＢが０〜８の多価アルコール型ノニオン性界面活性剤（Ａ１−４）とベタイン型両性界面活性剤（Ａ２−１−１−２）との併用、特に好ましくはモノオレイン酸ソルビタンとヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインとの併用である。
（Ａ１）と（Ａ２）とを併用することで、さらに活性の高い膜タンパク質をより大量に生産することができる。
【００４８】
本発明において界面活性剤（Ａ）は、界面活性剤（Ａ）をそのまま使用してもよいし、必要により水と混合して、水性希釈液（水溶液状又は水分散液状）として用いてもよい。
水性希釈液における、界面活性剤（Ａ）の合計濃度は、対象となる細菌、膜タンパク質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、膜タンパク質の生産量及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、０．１〜９９重量％が好ましく、好ましくは１〜５０重量％である。
【００４９】
界面活性剤を用いて膜タンパク質の生産を行った場合の分泌効率（％）は、生産性の観点から、１〜１００が好ましく、さらに好ましくは５〜１００、次にさらに好ましくは１０〜１００、特に好ましくは５０〜１００である。
【００５０】
界面活性剤の分泌効率とは、界面活性剤により細菌内の膜タンパク質が細菌外（培養液中）へ分泌されること示している。
なお、本発明においては、下記式によって定義される。
分泌効率（％）＝１００×｛（Ｘ／Ｙ）−Ｚ｝
Ｘ：遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の膜タンパク質
Ｙ：培養液中の全膜タンパク質
Ｚ：溶菌した細菌の割合を示し、下記の式によって定義される。
Ｚ＝Ｚ１／Ｚ２
Ｚ１：遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の細胞質内局在物質
Ｚ２：培養液中の全細胞質内局在物質
なお細胞質内局在物質とは、細胞質内に存在している物質であり、溶菌によって培養液中に溶出される物質をさす。
【００５１】
分泌効率は、例えば細菌内で生産された膜タンパク質がより外膜移行するようにすれば分泌効率は上がり、より外膜移行しないようにすれば分泌効率は下がる。また、スクリーニングによって分泌効率の高い界面活性剤を選定することにより分泌効率を上げることができる。
【００５２】
本発明の生産方法において、界面活性剤（Ａ１）のみ含有する場合、培養液中の（Ａ１）の含有量（重量％）は、対象となる細菌、生産される膜タンパク質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、膜タンパク質の生産性及び高活性の膜タンパク質を得る観点から、０．０１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０、特に好ましくは０．１〜５である。
また、本発明の生産方法において、界面活性剤（Ａ２）のみを含有する場合、培養液中の（Ａ２）の含有量（重量％）は、対象となる細菌、生産される膜タンパク質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、膜タンパク質の生産性及び高活性の膜タンパク質を得る観点から、０．０１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０、特に好ましくは０．１〜５である。
【００５３】
本発明の生産方法において、界面活性剤（Ａ１）及び界面活性剤（Ａ２）を使用する場合、培養液中の界面活性剤（Ａ）の含有量（重量％、界面活性剤（Ａ１）及び界面活性剤（Ａ２）の合計量）は、対象となる細菌、生産される膜タンパク質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、膜タンパク質の生産性及び高活性の膜タンパク質を得る観点から、０．０１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０、次にさらに好ましくは０．１〜５である。
また、本発明の生産方法において、界面活性剤（Ａ１）及び界面活性剤（Ａ２）を使用する場合、培養液中の（Ａ１）の含有量（重量％）は、対象となる細菌、生産される膜タンパク質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、膜タンパク質の生産性及び高活性の膜タンパク質を得る観点から、０．０１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０、特に好ましくは０．１〜５である。
また、本発明の生産方法において、界面活性剤（Ａ１）及び界面活性剤（Ａ２）を使用する場合、培養液中の（Ａ２）の含有量（重量％）は、対象となる細菌、生産される膜タンパク質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、培養液の重量を基準として、膜タンパク質の生産性及び高活性の膜タンパク質を得る観点から、０．０１〜１５が好ましく、さらに好ましくは０．１〜１０、特に好ましくは０．１〜５である。
本発明の生産方法において、界面活性剤（Ａ１）及び界面活性剤（Ａ２）を使用する場合、培養液中の（Ａ１）と（Ａ２）との重量比（（Ａ１）／（Ａ２））は、分泌効率と膜タンパク質安定化の観点から、０．１〜１０が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５であり、特に好ましくは１〜２である。
【００５４】
界面活性剤（Ａ）はあらかじめ培地と混合して使用する以外に、培地に細菌を懸濁させた培養液に後から添加しても良い。後から添加する場合、膜タンパク質を大量に得る観点から、培養後３〜７２時間後に界面活性剤（Ａ）を加えることが好ましい。
培地との混合は、４℃〜９９℃で培養液に界面活性剤（Ａ）を添加し、撹拌羽根又はスターラー等で撹拌することで行うことができる。後から混合する際は、撹拌羽根等で撹拌しながら添加することで行うことができる。
【００５５】
培養液は、一般的には、細菌及び培地を含有し、細菌を培養するための液体であるが、本発明においては、さらに、界面活性剤（Ａ）を含むものである。
培地とは、微生物の培養において生育環境を提供するものをいい、具体的には、水等の水性媒体中に炭素源、窒素源及び無機塩類等を溶解したものをいう。培地は、当該微生物が資化しうる炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有していればよい。各成分の量も限定されず、当業者が適宜選択することができる。培地として、具体的には、肉汁培地、肉汁ゼラチン培地、硝酸塩培地、牛乳培地、コーンミール培地、ＭＲ−ＶＰ培地、トマトジュース培地、ＴＳＩ培地、ＳＩＭ培地、グルコース−ブイヨン培地、ＹＭ培地、細菌用完全培地、Ｌｅｎｎｏｘ培地（Ｌ培地）、ＬＢ培地、大腸菌用最少培地（Ｄａｖｉｓ培地）、大腸菌用最少塩培地（ＭＳ）、トリス−グルコース培地（ＴＧ培地）、ＥＭＢ糖指示培地、枯草菌用最少培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ  最少培地）、無機塩類液、枯草菌用最少塩培地、枯草菌形質転換用培地Ｉ、枯草菌形質転換用培地ＩＩ、酵母用完全培地（ＹＰＡＤ）、酵母用最少培地、アカパンカビ用完全培地、アカパンカビ用最少培地（Ｖｏｇｅｌ  培地  Ｎ）、アカパンカビ交雑用最少培地、アスペルギルス用完全培地（ＡＮＡ培地）及びツァペック−ドッグス培地等が挙げられる。
また、培養液には、必要によりさらに、炭素源、窒素源及び無機塩類等を溶解してもいい。炭素源としては、細菌がＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を合成でき、なおかつ代謝により同化できる物であり、グルコース等の糖、脂質及びタンパク質等が挙げられる。窒素源としては、細菌がタンパク質や核酸の生合成に用いることができる物であり、タンパク質、アミノ酸、アンモニア及び尿素等が挙げられる。無機塩類としては、硫酸アンモニウム等が挙げられる。
培養液に溶解する炭素源、窒素源及び無機塩類等の量は特に限定されない。
【００５６】
本発明において乾燥菌体密度とは、膜タンパク質の分泌生産において、培養開始時から培養終了時までのいずれかの時点における培養液１Ｌ中に含まれる細菌の重量を表す。なお、この細菌の重量は、乾燥させた状態の細菌の重量である。
乾燥菌体密度は、次の手順（１）〜（５）により求める。
手順（１）：あらかじめ容器（遠心チューブ）の重量を測定しておく。
手順（２）：培養液１００ｍｌを手順（１）で重量を測定した容器に入れ、遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌する。
手順（３）：容器中の集菌した細菌を、０．９重量％ＮａＣｌ水溶液［手順（２）で使用した培養液と同じ体積］で洗い、再度遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌する。
手順（４）：手順（３）で得られた細菌を容器にいれたままの状態で、１０５℃で１０時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定する。
手順（５）：手順（４）の後さらに１０５℃で２時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定して重量変化が無いことを確認する。さらに重量が減少するなら重量変化が無くなるまで１０５℃で乾燥を持続する。
手順（５）と手順（１）の測定値と手順（２）で使用した培養液の体積（Ｌ）を下記式に当てはめることにより、乾燥菌体密度を求める。
乾燥菌体密度（ｇ／Ｌ）＝（［手順（５）の測定値］−［手順（１）の測定値］）／０．１
【００５７】
本発明の生産方法における乾燥菌体密度は、培養液の体積を基準として１．５〜５００ｇ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは３〜２００ｇ／Ｌであり、特に好ましくは４〜１００ｇ／Ｌである。乾燥菌体密度が１．５ｇ／Ｌ以上であることで、膜タンパク質の生産量が高くなり、５００ｇ／Ｌ以下であることで、細菌が死ぬことなく、膜タンパク質を効率よく分泌生産することができる。
細菌が大腸菌である場合の乾燥菌体密度は、培養液の体積を基準として、膜タンパク質の生産が実施可能な観点から、１．５〜５００ｇ／Ｌが好ましく、さらに好ましくは３〜１００ｇ／Ｌであり、次にさらに好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌであり、最も好ましくは１２〜２７ｇ／Ｌである。
本発明の膜タンパク質の生産方法において、上記範囲内であれば、乾燥菌体密度が大きければ大きいほど膜タンパク質の生産量は増加する。
【００５８】
本発明の膜タンパク質の生産方法において、膜タンパク質の生産量の観点から、乾燥菌体密度が上記範囲内である時間が、膜タンパク質を分泌させる工程に要する時間の１０％以上であることが好ましく、さらに好ましくは５０％以上である。
【００５９】
乾燥菌体密度は、例えば十分な通気条件下で半回分培養法を用いて適切な速度で流加を行うことによって増加させることができ、制限した通気条件下で回分培養を行うことによって減らすことができる。また、培養開始から界面活性剤を入れるまでの時間を長くすることによって増加し、培養開始から界面活性剤を入れるまでの時間を短くすることによって減らすことができる。
【００６０】
本発明の膜タンパク質の生産方法において、膜タンパク質の分泌生産をする生産方法には、下記工程（ａ）及び（ｂ）を含む細胞外分泌生産方法が含まれる。下記工程において、膜タンパク質を分泌生産する工程は工程（ａ）である。
工程（ａ）：膜タンパク質を生産する細菌（グラム陰性細菌等）と界面活性剤を同時に存在させて膜タンパク質を細胞外（培養液中）に分泌させる工程。
工程（ｂ）：工程（ａ）の後、培養液から膜タンパク質を分離する工程。
【００６１】
以下に本発明の界面活性剤を使用する膜タンパク質の生産方法の一例を示す。
（ｉ）遺伝子組み換え
（ｉ−１）目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、該ｍＲＮＡから単鎖のｃＤＮＡを、次に二重鎖ＤＮＡを合成し、該二本鎖ＤＮＡをファージＤＮＡ又はプラスミドに組み込む。得られた組み換えファージ又はプラスミドを宿主大腸菌に形質転換しｃＤＮＡライブラリーを作成する。
（ｉ−２）目的とするＤＮＡを含有するファージＤＮＡ又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージＤＮＡ又はプラスミドと目的とする膜タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
（ｉ−３）スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ又はその一部を切りだし、該クローン化ＤＮＡ又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。外膜に移行させるシグナル配列をコードするＤＮＡを同時に連結することもできる。
（ｉｉ）培養
（ｉｉ−１）宿主細菌を発現ベクターで形質転換して組み換え細菌を作成し、組み換え細菌を前培養する。前培養は寒天培地上で通常１５〜４３℃で３〜７２時間行う。
（ｉｉ−２）膜タンパク質の生産に用いる培養液を１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で前培養した組み換え細菌を培養する。培養は、通常１５〜４３℃で１２〜７２時間行う。なお、培養開始と同時に界面活性剤（Ａ）を使用する場合は、界面活性剤（Ａ）と培地を混合し均一化したものを用いて、前培養した組み換え細菌を同様に培養する。また、培養後６時間から７２時間後に界面活性剤（Ａ）を加える場合は、界面活性剤を加えてから１〜１０００時間培養を継続する。
（ｉｉｉ）精製
（ｉｉｉ−１）培養液中に分泌されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
（ｉｉｉ−２）膜タンパク質を含む培養液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜行うことによって分離精製される。
【００６２】
（ｉｉｉ−１）で分離された宿主細胞は、その後、新たに培養液を供給することにより、さらに培養することができる。その培養液等をさらに（ｉｉｉ）の工程に供し精製、培養を繰り返すことにより、膜タンパク質の連続生産を行うことができる。
【００６３】
上記の（ｉｉｉ）のタンパク質の分離・取り出し工程におけるカラムクロマトグラフィーに使用される充填剤としては、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、アクリルアミド及びビニルポリマー等が挙げられ、市販品ではＳｅｐｈａｄｅｘシリーズ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌシリーズ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅシリーズ（以上、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌシリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等がある。
【００６４】
本発明の膜タンパク質の生産方法を使用することにより、短時間で高い収量を得ることができるため、高生産量を達成することができる。また、本発明の膜タンパク質の生産方法は、膜タンパク質が培養液中に分泌されるため、膜タンパク質の精製が容易である。
【００６５】
本発明の膜タンパク質の生産方法は、界面活性剤と細菌とを同時に存在させて、膜タンパク質を培養液中に分泌させる工程を含む。この工程において、細菌が生存している限り、細菌が膜タンパク質を作成し培養液中に分泌することができると推察される。さらに、細菌が膜タンパク質を作成する能力を有していれば、作成する膜タンパク質の種類は問わず本発明の生産方法が使用できると推察される。
本発明の膜タンパク質の生産方法は、細菌内で作成した膜タンパク質が細菌の外膜に移行している場合に特に有効である。膜タンパク質が外膜に移行していることによって、膜タンパク質が培養液中に分泌されやすくなる。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例、比較例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６７】
株の作成、菌体重量の測定は当業者が行う標準的な方法に基づいて行った。
【００６８】
＜製造例１＞
ｐＭＸベクターに組み込まれた大腸菌由来ＡＤＥＡ外膜移行シグナルとストレプトコッカスピオゲネス由来ヒアルロン酸合成酵素を結合させた核酸配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をｐＥＴ−２２ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ制限酵素サイトとＸｈｏＩ制限酵素サイトに結合した。その後λＤＥ３  Ｌｙｓｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、大腸菌株ＡＧ１（ＴＯＹＯＢＯ社）を改変して作成したＡＧ１（ＤＥ３）大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してヒアルロン酸合成酵素発現株（α）を作成した。
【００６９】
＜ヒアルロン酸合成酵素量の測定＞
実施例１及び比較例１で得られた培養上清を用いて、培養上清中に含まれるヒアルロン酸合成酵素量を測定した。タンパク質量の検量線として１μｇ、２．５μｇ、５μｇの牛血清アルブミンをＳＤＳ−ＰＡＧＥした。クーマシーブリリアントブルー染色液によってタンパク質を染色した。牛血清アルブミンのバンドから検量線を作成した。検量線を用いて、培養上清中に含まれるヒアルロン酸合成酵素量を算出した。
【００７０】
＜ヒアルロン酸合成量の測定＞
実施例１〜４及び比較例１で得られたヒアルロン酸合成酵素を含む培養上清１０μＬに、それぞれ０．１重量％になるようにＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンとＵＤＰ−グルクロン酸とを添加し、緩衝液中で混合し、３０℃で２時間反応させた。
反応後、反応液をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。電気泳動したゲルをアルシアンブルー染色液によって染色した。同時に精製ヒアルロン酸を１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇを電気泳動し、染色した。電気泳動した際に見られるヒアルロン酸のバンドからヒアルロン酸検量線を作成した。検量線を用いて、電気泳動した際に見られるヒアルロン酸のバンドからヒアルロン酸合成量を算出した。
【００７１】
＜ヒアルロン酸合成酵素の比活性＞
得られたヒアルロン酸合成酵素量及びヒアルロン酸合成量の値を用いて、下記数式により、ヒアルロン酸合成酵素の比活性を算出した。
比活性＝（ヒアルロン酸合成量）／（ヒアルロン酸合成酵素量）
【００７２】
＜比較例１＞
製造例１で得た大腸菌（α）の終夜培養液１ｍｌをそれぞれ作成し、０．５ｍｌをＬＢ培地（アンピシリン  １００ｍｇ／Ｌ含有）５ｍｌに植菌して３０℃３時間振とう培養を行い前培養液を作成した。前培養液を５０ｍＬの培地（酵母エキス（日本製薬社製）１．２ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）０．６ｇ、リン酸２カリウム０．４７ｇ、リン酸１カリウム０．１１ｇ、硫酸アンモニウム０．３５ｇ、リン酸２ナトリウム１２水和物０．６６ｇ、クエン酸ナトリウム２水和物０．０２ｇ、グリセロール０．２ｇ、ラクトアルブミン水解物１．５ｇ、消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）０．３ｇ、１ｍＭ硫酸マグネシウム、微量金属溶液（塩化カルシウム１８．９μｇ、塩化鉄（III）５００μｇ、硫酸亜鉛７水和物９．０μｇ、硫酸銅５．１μｇ、塩化マンガン４水和物６．７μｇ、塩化コバルト４．９μｇ、エチレンジアミン４酢酸４ナトリウム２００μｇ）、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）に植菌し微生物培養装置（エイブル社製、製品名「ＢｉｏＪｒ．８」）を用いてｐＨ６．８、３０℃を維持したまま培養を開始した。培養開始３時間後１Ｍ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を０．１５ｍＬ加えた。培養開始１４時間後から、グリセリン／タンパク質溶液（５０重量％  グリセリン、５０ｇ／Ｌ  ラクトアルブミン水解物、３３ｇ／Ｌ  消泡剤（信越シリコーン製、「ＫＭ−７０」）、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリン）の滴下を開始し、培養を開始した。
培養開始から３６時間後に培養液を回収し、遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、菌体を除去し培養上清を得た。
得られた培養上清を用いて、ヒアルロン酸合成酵素量、ヒアルロン酸合成量、ヒアルロン酸合成酵素の比活性を測定した。結果を表１に示す。
【００７３】
＜実施例１＞
培養を開始するまでは比較例１と同様に実施した。
培養開始１４時間後、培養液の重量を基準としてそれぞれ１重量％になるように界面活性剤（Ａ１）としてモノオレイン酸ソルビタン（ＨＬＢ＝４．３）、界面活性剤（Ａ２）としてヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインを加えた。培養開始から３６時間後に培養液を回収し、遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、菌体を除去し培養上清を得た。
得られた培養上清を用いて、ヒアルロン酸合成酵素量、ヒアルロン酸合成量、ヒアルロン酸合成酵素の比活性を測定した。結果を表１に示す。
【００７４】
＜実施例２＞
培養を開始するまでは比較例１と同様に実施した。
培養開始１４時間後、培養液の重量を基準としてそれぞれ１重量％になるように界面活性剤（Ａ１）としてトリオレイン酸ソルビタン（ＨＬＢ＝１．８）、界面活性剤（Ａ２）としてヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインを加えた。培養開始から３６時間後に培養液を回収し、遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、菌体を除去し培養上清を得た。
得られた培養上清を用いて、ヒアルロン酸合成酵素量、ヒアルロン酸合成量、ヒアルロン酸合成酵素の比活性を測定した。結果を表１に示す。
【００７５】
＜実施例３＞
培養を開始するまでは比較例１と同様に実施した。
培養開始１４時間後、培養液の重量を基準としてそれぞれ１重量％になるように界面活性剤（Ａ１）としてモノステアリン酸ソルビタン（ＨＬＢ＝４．７）、界面活性剤（Ａ２）としてヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインを加えた。培養開始から３６時間後に培養液を回収し、遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、菌体を除去し培養上清を得た。
得られた培養上清を用いて、ヒアルロン酸合成酵素量、ヒアルロン酸合成量、ヒアルロン酸合成酵素の比活性を測定した。結果を表１に示す。
【００７６】
＜実施例４＞
培養を開始するまでは比較例１と同様に実施した。
培養開始１４時間後、培養液の重量を基準としてそれぞれ１重量％になるように界面活性剤（Ａ１）としてデシルアルコールのＥＯ８モルＰＯ７モルブロック付加物（ＨＬＢ８．０）、界面活性剤（Ａ２）としてヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインを加えた。培養開始から３６時間後に培養液を回収し、遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、菌体を除去し培養上清を得た。
得られた培養上清を用いて、ヒアルロン酸合成酵素量、ヒアルロン酸合成量、ヒアルロン酸合成酵素の比活性を測定した。結果を表１に示す。
【００７７】
＜実施例５＞
培養を開始するまでは比較例１と同様に実施した。
培養開始１４時間後、培養液の重量を基準として１重量％になるように界面活性剤（Ａ２）としてヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタインを加えた。培養開始から３６時間後に培養液を回収し、遠心分離（４，０００Ｇ、１５分、４℃）して、菌体を除去し培養上清を得た。
得られた培養上清を用いて、ヒアルロン酸合成酵素量、ヒアルロン酸合成量、ヒアルロン酸合成酵素の比活性を測定した。結果を表１に示す。
【００７８】
【表１】
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【００７９】
表１の結果から、界面活性剤（Ａ）を使用していない比較例１では、培養上清中に含まれる膜タンパク質であるヒアルロン酸合成酵素の量が１０ｍｇ／Ｌと少ないことが分かる。一方、界面活性剤（Ａ）を使用して培養した実施例１〜５では、培養上清中のヒアルロン酸合成酵素量が１６５ｍｇ／Ｌ以上と極めて多く、本発明の生産方法を用いることで、膜タンパク質を大量に得ることができることが分かる。
また、実施例１〜５で得たヒアルロン酸合成酵素は、比活性０．１８ｍｇ／ｍｇ／ｈ以上と比較例１で得たヒアルロン酸合成酵素よりも非常に高かった。特に、界面活性剤（Ａ１）及び（Ａ２）を併用した実施例１〜４は、（Ａ２）のみを用いた実施例５よりもさらに比活性が高く、（Ａ１）と（Ａ２）を併用することで、さらに比活性の高い膜タンパク質を得ることができることが分かる。
以上のことから、本発明の生産方法を用いれば、膜タンパク質を大量に得ることができ、さらに、得られた膜タンパク質の活性が高いことが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の膜タンパク質の生産方法は、膜タンパク質を大量に得ることが可能である。また、得られた膜タンパク質は、酵素反応用、食品加工用、洗浄剤用、繊維処理用、製紙用途、酵素変換用途などとして好適に使用できる。