(57)【要約】【課題】  粒子に内包された色素の漏出を抑制することのできる粒子を提供することを目的とする。【解決手段】  乳酸とグリコール酸の共重合体と、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体から選ばれる少なくとも１つの化合物とを有する粒子であって、粒径が１０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とする粒子。【選択図】  図１
2013199476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸とグリコール酸の共重合体と、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体から選ばれる少なくとも１つの化合物とを有する粒子であって、粒径が１０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とする粒子。
【請求項２】
前記化合物が、下記化学式３で表されることを特徴とする請求項１に記載の粒子。
【化１】
2013199476.tif 000015
（化学式３）
（化学式３において、Ｒ２０１乃至Ｒ２２４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数１乃至１８のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基のいずれかである。
また、Ｒ１０１、Ｒ１０２はそれぞれ独立に、−ＯＨ、−ＯＲ１１、−ＯＣＯＲ１２、−ＯＳｉ（−Ｒ１３）（−Ｒ１４）（−Ｒ１５）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数１乃至１８のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基のいずれかである。
また、Ｒ１１乃至Ｒ１５はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数１乃至１８のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基のいずれかである。）
【請求項３】
前記化合物が化学式１で示される化合物、化学式２で示される化合物、Ｓｉｌｉｃｏｎ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｏｃｔｙｌｏｘｉｄｅ、Ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｂｉｓ（ｄｉ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ  ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｏｘｙ）ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ（ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）のいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載の粒子。
【化２】
2013199476.tif 000016
【化３】
2013199476.tif 000017
【請求項４】
前記共重合体における乳酸とグリコール酸との共重合比が２５：７５から７５：２５の範囲内であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項５】
前記粒子の表面に１種類または２種類以上の界面活性剤を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項６】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルとリン脂質のうち少なくともいずれか一方から選択された界面活性剤であることを特徴とする請求項５に記載の粒子。
【請求項７】
前記ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルが下記化学式４で表されることを特徴とする請求項６に記載の粒子。
【化４】
2013199476.tif 000018
（化学式４）
化学式４において、Ｒ２１乃至Ｒ２４はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＣＲ’から選択される。前記Ｒ’は炭素数１乃至１８の、飽和または不飽和アルキル基である。ｗとｘとｙとｚの総和が１０乃至３０の整数である。
【請求項８】
前記粒子は、標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項９】
前記捕捉分子が一本鎖抗体であることを特徴とする請求項８に記載の粒子。
【請求項１０】
前記一本鎖抗体が配列番号２で表される配列を有することを特徴とする請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
請求項１に記載の粒子と、前記粒子が分散された分散媒とを有することを特徴とする光イメージング用造影剤。
【請求項１２】
請求項１に記載の粒子と、前記粒子が分散された分散媒とを有することを特徴とする光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は粒子、及び、それを有する光イメージング用造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算して層画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものを好適に用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、近赤外波長領域の光を吸収する色素などを体内に投与し、造影剤として利用することもできる。近赤外波長領域の光は、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高いため、この光を吸収する色素はＰＡＴ装置における造影剤や、蛍光装置における造影剤として好適に用いることができる。
【０００４】
これら近赤外波長領域の光を吸収する色素は、測定部位に集積させることを目的として、しばしば粒子中に内包されて造影剤として使用される。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４（２００４）２９−３８（以下、非特許文献１と略す）には、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を界面活性剤にしてエマルジョン溶媒拡散法によって得たインドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）を含有する、乳酸とグリコール酸の共重合体（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ、以下ＰＬＧＡと略すことがある）粒子が開示されている。
【０００５】
色素を粒子中に内包した造影剤の場合、ＰＡＴ装置での測定では、前記造影剤内の色素は高密度に内包されていることが望ましい。これは粒子中に内包されている色素が多いほど、単位粒子あたりのモル吸光係数が大きく、光音響信号が大きいからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，７４（２００４）２９−３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に開示されたＩＣＧを含有する粒子は、血清中において、色素が粒子内から漏出すると考えられる。これは、ＩＣＧが親水性の構造と疎水性の構造との両方を有するため、界面活性機能を持つことが原因であると考えられる。つまり、非特許文献１のＩＣＧを含有する粒子のＩＣＧは、疎水性である粒子のコア部分よりも粒子表面に多く存在しており、血清と混合させることで粒子表面に存在していたＩＣＧが血清中のタンパク質と相互作用し、粒子外へ漏出してしまうと考えられる。
【０００８】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、粒子に内包された色素の漏出を抑制することのできる粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る粒子は、乳酸とグリコール酸の共重合体と、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体から選ばれる少なくとも１つの化合物とを有する粒子であって、粒径が１０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る粒子によれば、疎水性の色素であるシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体を用いるため、該色素の粒子外への漏出が少ない。また、粒子の構成成分としてＰＬＧＡを用いるため、腫瘍への集積性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態に係る粒子の構造の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態に係る粒子の構造の他の例を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係る粒子を製造する工程の一例を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る粒子を製造する工程の他の例を示す図である。
【図５】本発明の実施例に係る粒子の色素残存率を示したグラフである。
【図６】本発明の実施例に係る粒子の投与量あたりの血液中の存在量の割合および腫瘍への集積量の割合を示したグラフである。
【図７】本発明の実施例に係る粒子をマウスに投与して光音響イメージング及び蛍光イメージングを行った結果を示す。
【図８】本発明の実施例に係る粒子において、平均粒子径の違いによる腫瘍集積量を比較したグラフである。
【図９】本発明の実施例に係る粒子（ＰＮＰ１０）をマウスに投与して光音響イメージングを行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明するが本発明はこれらに限られない。
【００１３】
本実施形態に係る粒子は、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）と、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体から選ばれる少なくとも１つの化合物とを有する粒子であって、粒径が１０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることを特徴とする。
【００１４】
本発明に係る粒子は、疎水性であるＰＬＧＡと、疎水性のナフタロシアニン骨格を有するシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体とを有するため、親水性の構造を有するＩＣＧを用いる場合に比べて、粒子外への漏出が少ない。したがって、本実施形態に係る粒子は、粒子あたりのモル吸光係数が大きいため、大きな光音響信号を与える造影剤として好適である。また、後述するように、粒子の構成成分としてＰＬＧＡを用いることで、腫瘍への集積性を上げることができる。
【００１５】
なお、本実施形態に係る粒子は、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体を１種類有していてもよいし、複数種類有していてもよい。
【００１６】
また、本実施形態おける粒子は標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。
【００１７】
（粒子の一例）
本実施形態に係る粒子の一例について、図１を用いて説明する。本実施形態に係る粒子１０１は、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体１０２と、ＰＬＧＡ１０３とを有する。また、粒子表面に界面活性剤１０４を有する。界面活性剤１０４を用いることで、粒子１０１が水中で凝集しにくくなる。
【００１８】
（粒子の他の例）
本実施形態に係る粒子の他の例は図２のように、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体２０２と、ＰＬＧＡ２０３とを有する粒子２０１である。また、粒子２０１の表面に第一の界面活性剤２０４及び第二の界面活性剤２０５を有する。第一の界面活性剤２０４を用いることで、粒子２０１が水中で凝集しにくくなる。また、第二の界面活性剤２０５として末端にアミノ基やマレイミド基などの官能基を有する化合物を用いることで、粒子２０１の表面にアミド結合やマレイミド基とチオール基のカップリング反応による結合を介して抗体などのタンパク質を結合させることができる。
【００１９】
（粒径）
本実施形態に係る粒子の粒径は、１０ｎｍ以上１０００ｎｍ未満である。本実施形態に係る粒子の粒径が１０００ｎｍ未満の場合、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くの粒子を集積させることができる。集積した粒子を、蛍光や光音響といった各種画像形成モダリティを用いて検出することによって、腫瘍部位を特異的にイメージングすることができる。また、粒子の粒径は５００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることが好ましい。本実施形態に係る粒子の粒径が２００ｎｍ以下であると、粒子が血中のマクロファージに取り込まれにくく、血中滞留性が高くなると考えられるからである。
【００２０】
本実施形態において粒子の粒径は例えば、動的光散乱解析装置（ＤＬＳ−８０００、大塚電子社製）を用いて、動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）法によって流体力学的直径を測定することで求めることができる。
【００２１】
（シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体）
本実施形態にシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体とは、例えば化学式３で示される化合物である。
【００２２】
例えば、下記の化学式１で示されるＳｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｂｉｓ（ｔｒｉｈｅｘｙｌｓｉｌｙｌｏｘｉｄｅ）（以下、化合物１と略すことがある）、または下記の化学式２で示されるＳｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、またはＳｉｌｉｃｏｎ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｄｉｏｃｔｙｌｏｘｉｄｅ、またはＳｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ、またはＢｉｓ（ｄｉ−ｉｓｏｂｕｔｙｌ  ｏｃｔａｄｅｃｙｌｓｉｌｏｘｙ）  ｓｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ（ｉｓｏＢＯＳＩＮＣ）等を使用することができる。特に化学式１で示されるＳｉｌｉｃｏｎ  ２，３−ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ｂｉｓ（ｔｒｉｈｅｘｙｌｓｉｌｙｌｏｘｉｄｅ）が好ましい。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
【化２】
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【００２５】
【化３】
2013199476.tif 000005
（化学式３）
【００２６】
（化学式３において、Ｒ２０１乃至Ｒ２２４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数１乃至１８のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基のいずれかである。
また、Ｒ１０１、Ｒ１０２はそれぞれ独立に、−ＯＨ、−ＯＲ１１、−ＯＣＯＲ１２、−ＯＳｉ（−Ｒ１３）（−Ｒ１４）（−Ｒ１５）、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数１乃至１８のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基のいずれかである。
また、Ｒ１１乃至Ｒ１５はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換の炭素数１乃至１８のアルキル基、置換または無置換の芳香族基から選択される。前記炭化水素基、及び前記芳香族基の置換基はハロゲン原子、アセトキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、炭素数１〜１８のアルキル基のいずれかである。）
【００２７】
本実施形態におけるシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体は、生体透過性の優れた６００ｎｍから９００ｎｍの近赤外波長領域の光に対して吸収を持つことが好ましい。これは、生体に投与された本実施形態に係る粒子の位置を、蛍光イメージングや光音響イメージング装置で検出するときに、これらの装置で用いる光の波長として、生体に照射したときに安全で、かつ、生体に対して比較的高い透過性をもつ近赤外波長領域の波長を選択できるからである。
【００２８】
（乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ））
本実施形態に係る粒子で用いる乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）は、粒子形状を形成するコアとなる高分子材料である。ＰＬＧＡは加水分解を受けやすい性質から、不要となった際に生体内に蓄積しにくく、対外へ排出される効果が期待される。また、本実施形態におけるＰＬＧＡの平均分子量は２０００以上１００００００以下であることが好ましく、１００００以上６０００００以下であることがさらに好ましく、１５０００以上２５０００以下であること特に好ましい。最も好ましくは、平均分子量２００００のＰＬＧＡである。更に、ＰＬＧＡの乳酸とグリコール酸との共重合比は、２５：７５から７５：２５の範囲内であることが好ましい。例えば、乳酸：グリコール酸の共重合比が２５：７５、５０：５０、または７５：２５のＰＬＧＡを挙げることができる。最も好ましくは、乳酸：グリコール酸の共重合比が５０：５０のＰＬＧＡである。本実施形態におけるＰＬＧＡを構成する乳酸は、Ｄ−体、Ｌ−体、ラセミ体のいずれのものも使用することができる。
【００２９】
（界面活性剤）
本実施形態における界面活性剤（図１の界面活性剤１０４、図２の第一の界面活性剤２０４、第二の界面活性剤２０５）としては、特に限定されず、後述するように粒子を調製する過程で、エマルジョンを形成することができればいかなるものでもよい。例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、高分子界面活性剤又はリン脂質等を使用することができる。これらの界面活性剤は、１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
上記の非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル（例、化学式４で示される化合物）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｎ−１０１、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）  ＣＯ５３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）  ＣＯ６３０、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）  ＣＯ７２０並びにＩＧＥＰＡＬ（登録商標）  ＣＯ７３０等を挙げることができる。
【００３１】
【化４】
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（化学式４）
【００３２】
化学式４において、Ｒ２１乃至Ｒ２４はそれぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＣＲ’から選択される。前記Ｒ’は炭素数１乃至１８の、飽和または不飽和アルキル基である。また、化学式４において、ｗ、ｘ、ｙ、ｚは、ｗとｘとｙとｚの総和が１０乃至３０の整数となる範囲で任意の値をとりうる。化学式４の一例として、ｗとｘとｙとｚの総和が１０乃至３０の整数となる範囲において、ｗ、ｘ、ｙ、ｚがそれぞれ独立に１乃至１０の整数である場合が挙げられる。
【００３３】
化学式４で示されるポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステルとしては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０及びＴｗｅｅｎ（登録商標）８５等を挙げることができる。
【００３４】
また、上記のアニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホネート、デシルベンゼンスルホネート、ウンデシルベンゼンスルホネート、トリデシルベンゼンスルホネート、ノニルベンゼンスルホネート並びにこれらのナトリウム、カリウム及びアンモニウム塩等を挙げることができる。
【００３５】
また、上記のカチオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化ヘキサデシルピリジニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム及び塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム等を挙げることができる。
【００３６】
また、上記の高分子界面活性剤としては、ポリビニルアルコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール及びゼラチン等を挙げることができる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールの市販品としては、プルロニックＦ６８（ＢＡＳＦ社製）、プルロニックＦ１２７（ＢＡＳＦ社製）などが挙げられる。
【００３７】
また、上記のリン脂質としては、水酸基、メトキシ基、アミノ基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基又はマレイミド基のいずれかの官能基を有するホスファチジル系リン脂質であることが好ましい。また、界面活性剤に使用するリン脂質はＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）鎖を含むものであってもよい。
【００３８】
官能基が水酸基、メトキシ基、アミノ基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、マレイミド基でありＰＥＧ鎖を含むような界面活性剤に使用するリン脂質としては、例えば、化学式５で示される１，２−Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨ）、化学式６で示されるＰｏｌｙ（ｏｘｙ−１，２−ｅｔｈａｎｅｄｉｙｌ），α−［７−ｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｏｘｉｄｏ−１３−ｏｘｏ−１０−［（１−ｏｘｏｏｃｔａｄｅｃｙｌ）ｏｘｙ］−６，８，１２−ｔｒｉｏｘａ−３−ａｚａ−７−ｐｈｏｓｐｈａｔｒｉａｃｏｎｔ−１−ｙｌ］−ω−ｍｅｔｈｏｘｙ−（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＭｅ）、化学式７で示されるＮ−（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２）、化学式８で示される３−（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｇｌｕｔａｒｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）、化学式９で示されるＮ−（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｃａｒｂａｍｙｌ  ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）等のリン脂質を挙げることができる。なお、化学式５乃至９で示される化合物において、ｎは５以上５００以下の整数である。
【００３９】
【化５】
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【００４０】
【化６】
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【００４１】
【化７】
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【００４２】
【化８】
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【００４３】
【化９】
2013199476.tif 000011
【００４４】
（捕捉分子）
本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。抗体は一本鎖抗体であることが好ましい。一本鎖抗体の具体例として、下記配列番号２で表わされる配列を有するものが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る粒子を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
【００４５】
（光イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、本実施形態に係る粒子と、この粒子が分散された分散媒とを有する。また、本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、必要に応じて本実施形態に係る粒子の他に薬理上許容できる添加物を有していても良い。
【００４６】
ここで分散媒は、本実施形態に係る粒子を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水などが挙げられる。本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る粒子をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る粒子と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に粒子を分散媒に分散させて使用してもよい。
【００４７】
本実施形態において光イメージングとは、光を照射することで、イメージング（画像化）することを意味する。すなわち、本実施形態に係る光イメージング用造影剤のシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体に光が照射されることで、音響波や蛍光などを発する。発せられた音響波を検出することで光音響イメージングをすることができ、発せられた蛍光を検出することで蛍光イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本実施形態に係る粒子は光音響イメージング用造影剤として用いることが好ましい。
【００４８】
本実施形態に係る光イメージング用造影剤は、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、粒子を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波や蛍光を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波や蛍光を正常部位から発せられる音響波や蛍光よりも大きくすることができる。従って、本実施形態に係る粒子は腫瘍部位を特異的に検出する光イメージング用造影剤として用いることができる。
【００４９】
（粒子の製造方法）
本実施形態における粒子を得る方法としては、限定されるものではないが、例えばナノエマルジョン法を挙げることができる。ナノエマルション法による粒子の製造方法について、図３を用いて説明する。図３は図１で示す粒子１０１をナノエマルジョン法により製造する工程の一例示したものである。具体的には、以下の（Ａ）から（Ｃ）の工程により粒子１０１の水分散液を得ることができる。
（Ａ）シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体１０２、及びＰＬＧＡ１０３を有機溶媒に溶解させて得られる第一液体１０５を、界面活性剤１０４を溶解させた水溶液である第二液体１０６に加えて混合液を得る工程。
（Ｂ）（Ａ）で得た混合液を乳化することにより水中油（以下、Ｏ／Ｗと略すことがある）型のエマルジョン１０７を得る工程。
（Ｃ）（Ｂ）で得たエマルジョン１０７の分散質から第一液体１０５に含まれる有機溶媒を留去する工程。
【００５０】
なお、（Ａ）から（Ｃ）以外の工程を有していてもよい。
【００５１】
次に、図２で示すように、二種類の界面活性剤を用いた粒子２０１を製造する工程の一例を図４に示す。具体的には、以下の（Ｄ）から（Ｆ）の工程により粒子２０１の水分散液を得ることができる。なお、三種類以上の界面活性剤を用いた粒子も、同様の工程によって製造することができる。
（Ｄ）シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体２０２、及びＰＬＧＡ２０３を有機溶媒に溶解させて得られる第一液体２０６を、第一の界面活性剤２０４と第二の界面活性剤２０５とを溶解させた水溶液である第二液体２０７に加えて混合液を得る工程。
（Ｅ）（Ｄ）で得た混合液を乳化することによりＯ／Ｗ型のエマルジョン２０８を得る工程。
（Ｆ）（Ｅ）で得たエマルジョン２０８の分散質から第一液体２０６に含まれる有機溶媒を留去する工程。
【００５２】
（第一液体）
上記ナノエマルジョン法で用いる第一液体の溶媒として使用する有機溶媒としては、水への溶解性がないか又は溶解性が小さく、且つ、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体及びＰＬＧＡを溶解することができるものであればいかなる有機溶媒をも使用することが可能である。ただし、揮発性の有機溶媒であることが好ましい。
【００５３】
このような有機溶媒としては、限定されるものではないが、ハロゲン化炭化水素（ジクロロメタン、クロロホルム、クロロエタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、四塩化炭素等）、エーテル類（エチルエーテル、イソブチルエーテル等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、及び芳香族炭化水素（ベンゼン、トルエン、キシレン等）等を用いることができる。これらの有機溶媒は単独で用いても良いし、あるいは２種類以上を適宜の割合で混合して用いることもできる。
【００５４】
また、第一液体におけるシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体の濃度は、０．０００５〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。
【００５５】
また、第一液体におけるＰＬＧＡの濃度は、０．０５以上１００ｍｇ／ｍｌ以下とすることが好ましい。
【００５６】
また、第一液体におけるシリコンナフタロシアニンまたはその誘導体とＰＬＧＡとの重量比は、１：１以上１：１００以下の範囲であることが好ましい。
【００５７】
（第二液体）
上記ナノエマルジョン法に用いる第二液体は、界面活性剤１０４または、第一の界面活性剤２０４及び第二の界面活性剤２０５を溶解した水溶液である。第二液体に界面活性剤１０４または、第一の界面活性剤２０４及び第二の界面活性剤２０５をあらかじめ含ませておくと、第一液体と混合した際にエマルジョンを安定化させることができる。但し、本実施形態においては第一液体と第二液体とを混合した分散液に界面活性剤１０４または、第一の界面活性剤２０４及び第二の界面活性剤２０５を含ませることができればよく、界面活性剤１０４または、第一の界面活性剤２０４及び第二の界面活性剤２０５は必ずしも第二液体に予め溶解されている必要はない。
【００５８】
また、第二液体に含まれる界面活性剤１０４または、第一の界面活性剤２０４及び第二の界面活性剤２０５）の好ましい濃度は、用いる界面活性剤の種類及び第一液体との混合比にもよる。例えば、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を用いたときは、第二液体中の濃度を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。また、例えば、ＰＥＧ鎖を含むリン脂質を界面活性剤として用いたときは、第二液体中の濃度を０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌとすることが好ましい。
【００５９】
また、第一の界面活性剤２０４として非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は高分子界面活性剤を、第二の界面活性剤２０５としてＰＥＧ鎖を含むリン脂質を用いた場合の第一の界面活性剤２０４と第二の界面活性剤２０５との構成比は、モル比で１００：１以上１：１以下の範囲が好ましい。第二の界面活性剤２０５の構成比が１：１以下である場合、粒子を形成しやすいため好ましい。一方、界面活性剤２０５の構成比が１００：１以上である場合、捕捉分子を固定化する場合、固定化できる捕捉分子の個数が多いため好ましい。
【００６０】
（エマルジョン）
上記ナノエマルジョン法におけるエマルジョンは、本発明の目的を達成可能であればいかなる物性のエマルジョンでもよいが、１ピークの粒径分布を有し、且つ、平均粒径が１０００ｎｍ以下のエマルジョンであることが好ましい。
【００６１】
このようなエマルジョンは、例えば、断続振とう法、プロペラ型攪拌機及びタービン型攪拌機等のミキサーを利用する攪拌法、並びにコロイドミル法、ホモジナイザー法及び超音波照射法等の従来公知の乳化手法によって調製することが可能である。これらの方法は単独で用いてもよいし、あるいは２種以上の方法を組み合わせて用いることも可能である。また、エマルジョンは１段階の乳化によって調製しても良いし、多段階の乳化によって調製しても良い。但し、乳化手法は、本発明の目的を達成できる範囲においてこれらの手法に限定されるものではない。
【００６２】
エマルジョンは、第二液体に第一液体を加えて得られる混合液から調製されるＯ／Ｗ型のエマルジョンである。ここで、第一液体と第二液体の混合とは、第一液体と第二液体とを空間的に隔離せずに互いに接触して存在させることを意味し、必ずしも互いに混和することを要さない。
【００６３】
混合液における第一液体と第二液体との割合は、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを形成することができれば特に限定されることはないが、好ましくは、第一液体と第二液体との重量比が、１：２以上１：１０００以下となる範囲で混合することが好ましい。
【００６４】
（留去）
上記ナノエマルジョン法における留去とは、エマルジョンの分散質から第一液体に含まれる有機溶媒を除去する操作である。即ち、シリコンナフタロシアニンまたはその誘導体、ＰＬＧＡ、有機溶媒から構成された分散質から有機溶媒を除去することである。
【００６５】
留去は、従来知られる何れの方法でも実施可能であるが、加熱によって除去する方法、あるいはエバポレーター等の減圧装置を利用した方法を挙げることができる。加熱による除去の場合の加熱温度は、Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを維持できれば特に限定されないが、好ましい温度は０℃以上８０℃以下の範囲である。但し、留去は、本発明の目的を達成できる範囲において上記手法に限定されない。
【００６６】
（捕捉分子の固定化）
本実施形態における粒子に捕捉分子を固定化する方法としては、用いる捕捉分子の種類にもよるが、いかなる公知の方法をも使用することができる。例えば、第一の界面活性剤２０４又は第二の界面活性剤２０５が有する官能基と捕捉分子の官能基とを反応させて化学結合する方法等を使用することができる。
【００６７】
例えば、第一の界面活性剤２０４又は第二の界面活性剤２０５がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、アミノ基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基は、グリシン、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
【００６８】
また、第一の界面活性剤２０４又は第二の界面活性剤２０５がマレイミド基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、チオール基を有する捕捉分子と反応させて、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、界面活性剤の未反応のマレイミド基は、Ｌ−システイン、メルカプトエタノール、又は末端にチオール基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等と反応させて失活させることが好ましい。
【００６９】
また、第一の界面活性剤２０４又は第二の界面活性剤２０５がアミノ基を有するホスファチジル系リン脂質である場合、グルタルアルデヒドを用いて捕捉分子のアミノ基と反応させ、粒子に捕捉分子を固定化することができる。捕捉分子の固定化後、エタノールアミン、又は末端にアミノ基を有するオリゴエチレングリコール若しくはポリエチレングリコール等を反応させて未反応のアミノ基の活性をブロックすることが好ましい。あるいは、界面活性剤のアミノ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド基やマレイミド基に置換して、捕捉分子を固定化しても良い。
【００７０】
（造影方法）
生体内に投与された本実施形態に係る粒子を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る粒子を検出する方法は以下の工程を有する。但し、本実施形態に係る造影方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係る粒子を生体内に投与する工程。
（ｂ）生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る粒子から発せられる音響波を検出する工程。
【００７１】
上記（ａ）の工程において本実施形態に係る粒子を生体内に投与する方法は特に限定されず、経口投与や注射等の方法によることができる。
【００７２】
また、上記（ｂ）の工程において、生体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る粒子から発せられる音響波を検出する装置は特に限定されない。光を発生される装置としては例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）など用いることができる。また、音響波を検出する装置としては特に限定されないが、超音波探触子などを用いることができる。上記（ｂ）の工程において生体に照射する光としては、生体に照射したときに安全で、かつ高い生体透過性を示す６００ｎｍから９００ｎｍの近赤外波長であることが好ましい。また、光を発生させる装置、音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。
【００７３】
本実施形態に係る粒子を用いた造影方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍などの部位を造影することができる。
【００７４】
次に、生体内に投与された本実施形態に係る粒子を、蛍光イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る粒子を検出する方法は以下の工程を有する。
（ｃ）本実施形態に係る粒子を生体内に投与する工程。
（ｄ）生体に光を照射し、生体内に存在する本実施形態に係る粒子から発せられる蛍光を検出する工程。
【００７５】
上記（ｃ）の工程において、本実施形態に係る粒子を生体内に投与する方法は特に限定されず、経口投与や注射等の方法によることができる。
【００７６】
また、上記（ｄ）の工程において、生体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る粒子から発せられる蛍光を検出する装置は特に限定されない。
【００７７】
更に、捕捉分子を有する粒子を生体中で用いた場合、捕捉分子を適宜選択することによって、種々の標的部位を特異的に検出することができる。例えば、捕捉分子として腫瘍に特異的に結合する物質を採用すれば、腫瘍の特異的検出が可能となる。また捕捉分子として、特定の疾病部位の周辺に多く存在するタンパク質や酵素などの生体物質に特異的に結合する物質を用いれば、その疾病を特異的に検出することが可能である。また、本実施形態に係る粒子は、捕捉分子を持たない場合でも、ＥＰＲ効果によって腫瘍を検出することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例で本発明の粒子を作製する際に用いる具体的な試薬や反応条件等を挙げているが、これらの試薬や反応条件等は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【００７９】
（粒子のモル吸光係数の測定方法）
以下の実施例において、粒子のモル吸光係数は以下のように測定する。まず、粒子の濃度ｃを求める。粒子の濃度は、ある体積の粒子溶液を凍結乾燥させることにより、粒子の重量を求め、これと粒子の平均分子量と乾燥前の溶液体積とから算出できる。続いて既知濃度の粒子溶液を幅ｌの吸光セルに添加する。このセルに６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長の光を照射して、該波長における吸光度Ａを求める。以下の実施例において、吸光度を測定する装置としては、ＵＶ／ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ  ４０（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いたが、一般的な紫外可視分光光度計であればいずれのものでも用いることができる。例えば、Ｇｅｎｅ  Ｑｕａｎｔ  １３００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）、ＲＡＭＢＤＡ  ２５（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いることができる。
【００８０】
吸光度Ａが１より大きい場合は、粒子溶液を適宜希釈する。最後に、ランバート・ベールの式に上記のＡ、ｃ、ｌを代入することで、モル吸光係数εを求めることができる。ｌを一定とした場合、好ましくは、数種類の濃度の粒子溶液を用いて、ｃに対するＡの直線性を確認する。
【００８１】
（色素漏出率評価方法）
本実施形態に係る色素漏出率評価方法は、以下の各実施例で得た粒子と血清とを混合し加温し、粒子と血清の混合物を遠心分離し、遠心分離前後の混合物の上清を回収し吸光度を測定する方法である。
【００８２】
色素漏出率評価方法は具体的には以下の通りである。すなわち、初めに以下の各実施例で得られた粒子と血清を体積比１：９となるように混合し、３７℃で２４時間静置する。前記血清としてウシ胎児由来血清を用いたが、マウス由来血清などを用いることができる。
【００８３】
次に、前記の２４時間静置後の粒子と血清の混合物を８００００ｒｐｍ（２８８０００×ｇ）で、２５℃で１７分間遠心分離する。遠心分離装置として、ｈｉｍａｃ  ＣＳ１５０ＧＸＬ（日立工機社製）を用いた。
【００８４】
次に回収作業を行った。具体的には、遠心分離後の前記混合物から、沈殿を分散させないようにゆっくりと２００μｌ分の上清を回収し、９６ウェルプレートへ移した。更に遠心分離前の前記混合物からも２００μｌ分の溶液を回収し、９６ウェルプレートの前記上清とは別のウェルへ移した。前記回収作業を終えた９６ウェルプレート中の試料の吸光度を測定し、遠心分離前の溶液の吸光度に対する遠心分離後の上清の吸光度として粒子からの色素漏出率を算出した。更に、１００％から前記色素漏出率を差し引くことによって粒子中の色素残存率を算出することができる。吸光度測定装置としては、ＶＡＲＩＯ  ＳＫＡＮ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＥＬＥＣＴＲＯＮ社製）を用いた。なお、９６ウェルプレートではなくキュベットを用いて吸光度を測定することもできる。キュベット式の吸光度測定装置としては、Ｇｅｎｅ  Ｑｕａｎｔ  １３００（ＧＥヘルスケア社製）を用いたが、ＵＶ／ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ  ４０（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いることもできる。
【００８５】
（光音響信号強度の測定方法）
音響波の測定、具体的には光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光をＰＢＳ中に分散したサンプルに照射し、サンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７００〜１０００ｎｍで可変であり、測定時はサンプルの吸収極大値付近の波長を選択した。エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μＬであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ  ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。前記ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号強度の測定を行った。小動物へ投与したサンプルの生体内からの光音響信号の測定においても基本的に上記システムを用いた。小動物の測定の場合には、上記システムに加えて小動物の位置を保持するための加温式稼働ステージと、撮像位置を撮影するためのＣＣＤカメラを設置した。
【００８６】
（実施例１、化合物１を有する粒子（粒子１））
（粒子１（ＰＮＰ１）の調製）
上記の化合物１（０．８８ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）およびＰＬＧＡ（５ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液１を調製した。
【００８７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液１を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【００８８】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＰＬＧＡ中に化合物１を含む粒子１の水分散液を得た。以後、この粒子１をＰＮＰ１と呼ぶ。
【００８９】
（ＰＮＰ１の物性評価）
動的光散乱解析装置（大塚電子社製、ＤＬＳ−８０００）で分析したところ、ＰＮＰ１の平均粒径は１２５．８ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１のモル吸光係数は８．１×１０９  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は２．３×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。
ＰＮＰ１について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９６％であった。
【００９０】
（実施例２、化合物１を含有する粒子（粒子２））
（粒子２（ＰＮＰ２）の調製）
Ｔｗｅｅｎ２０の量を１８０ｍｇから９０ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子２（以下、ＰＮＰ２と呼ぶ）を作製した。
【００９１】
（ＰＮＰ２の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ２の平均粒径は１７３．７ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ２のモル吸光係数は５．６×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は１．７×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ２について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９８％であった。
【００９２】
（実施例３、化合物１を含有する粒子（粒子３））
（粒子３（ＰＮＰ３）の調製）
Ｔｗｅｅｎ２０の量を１８０ｍｇから３６０ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子３（以下、ＰＮＰ３と略す）を作製した。
【００９３】
（ＰＮＰ３の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ３の平均粒径は１４３．４ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ３のモル吸光係数は２．８×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は８．８×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ３について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％以上であった。
【００９４】
（実施例４、化合物１を含有する粒子（粒子４））
（粒子４（ＰＮＰ４）の調製）
化合物１の量を０．８８ｍｇから４．４ｍｇへ変更し、且つＴｗｅｅｎ２０の量を１８０ｍｇから９０ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子４（以下、ＰＮＰ４と略す）を作製した。
【００９５】
（ＰＮＰ４の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ４の平均粒径は１８０．４ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ４のモル吸光係数は７．７×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は２．４×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ４について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％であった。
【００９６】
（実施例５、化合物１を含有する粒子（粒子５））
（粒子５（ＰＮＰ５）の合成）
化合物１の量を０．８８ｍｇから４．４ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子５（以下、ＰＮＰ５と略す）を調製した。
【００９７】
（ＰＮＰ５の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ５の平均粒径は１６２．１ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ５のモル吸光係数は９．９×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は３．０×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ５について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％以上であった。
【００９８】
（実施例６、化合物１を含有する粒子（粒子６））
（粒子６（ＰＮＰ６）の合成）
化合物１の量を０．８８ｍｇから４．４ｍｇへ変更し、且つＴｗｅｅｎ２０の量を１８０ｍｇから３６０ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子６（以下、ＰＮＰ６と略す）を調製した。
【００９９】
（ＰＮＰ６の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ６の平均粒径は１２７．５ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ６のモル吸光係数は５．２×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は１．６×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ６について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％以上であった。
【０１００】
（実施例７、化合物１を含有する粒子（粒子７））
（粒子７（ＰＮＰ７）の合成）
化合物１の量を０．８８ｍｇから１７．６ｍｇへ変更し、且つＴｗｅｅｎ２０の量を１８０ｍｇから９０ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子７（以下、ＰＮＰ７と略す）を作製した。
【０１０１】
（ＰＮＰ７の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ７の平均粒径は１３７．６ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ７のモル吸光係数は３．４×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は１．２×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ７について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％以上であった。
【０１０２】
（実施例８、化合物１を含有する粒子（粒子８））
（色素含有ポリマーナノ粒子８（ＰＮＰ８）の合成）
化合物１の量を０．８８ｍｇから１７．６ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子８（以下、ＰＮＰ８と略す）を作製した。
【０１０３】
（ＰＮＰ８の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ８の平均粒径は１１６．７ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ８のモル吸光係数は１．０×１０１１  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は３．１×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ８について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％以上であった。
【０１０４】
（実施例９、化合物１を含有する粒子（粒子９））
（粒子９（ＰＮＰ９）の合成）
化合物１の量を０．８８ｍｇから１７．６ｍｇへ変更し、且つＴｗｅｅｎ２０の量を１８０ｍｇから３６０ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１を調製した方法と同様の方法で粒子９（以下、ＰＮＰ９と略す）を調製した。
【０１０５】
（ＰＮＰ９の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ９の平均粒径は１１４．４ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ９のモル吸光係数は６．０×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は１．５×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ９について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％以上であった。
【０１０６】
（実施例１０、化合物１を含有する粒子（粒子１０））
（粒子１０（ＰＮＰ１０）の合成）
上記の化合物１（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）およびＰＬＧＡ（５ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液２を調製した。
【０１０７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）および化学式７で示されるリン脂質であるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０ＰＡ（２２ｍｇ、日油社製、以下ＤＡと略すことがある）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液２を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１０８】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０およびリン脂質で保護され、且つＰＬＧＡ中に前記化合物１を含む粒子１０の水分散液を得た。以後、この粒子１０をＰＮＰ１０と略す。
【０１０９】
（ＰＮＰ１０の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１０の平均粒径は１６８．５ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１０のモル吸光係数は５．７×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は２．０×１０１２  Ｖ  Ｊ−−１Ｍ−１だった。ＰＮＰ１０について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％であった。
【０１１０】
（実施例１１、化合物１を含有する粒子（粒子１１））
（粒子１１（ＰＮＰ１１）の合成）
ＤＡの量を２２ｍｇから１１ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１０と同様の方法で粒子１１（以下、ＰＮＰ１１と略す）を調製した。
【０１１１】
（ＰＮＰ１１の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１１の平均粒径は１６９．１ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１１のモル吸光係数は７．８×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は２．５×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ１１について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９９％以上であった。
【０１１２】
（実施例１２、化合物１を含有する粒子（粒子１２））
（粒子１２（ＰＮＰ１２）の合成）
上記の化合物１（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）および、ＰＬＧＡ（５ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液２を調製した。
【０１１３】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）、および化学式６で示されるリン脂質であるＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＤＳＰＥ−０２０−ＣＮ（２０ｍｇ、日油社製、以下ＤＯと略すことがある）、およびＤＡ（２ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液２を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１１４】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０およびリン脂質で保護され、且つＰＬＧＡ中に前記化合物１を含む粒子１２の水分散液を得た。以後、この粒子１２をＰＮＰ１２と略す。
【０１１５】
（ＰＮＰ１２の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１２の平均粒径は９７．８ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１２のモル吸光係数は２．０×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は６．１×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ１２について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は８０％であった。
【０１１６】
（実施例１３、化合物１を含有する粒子（粒子１３））
（粒子１３（ＰＮＰ１３）の合成）
化合物１の量を４．４ｍｇから８．８ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１２と同様の方法で粒子１３（以下、ＰＮＰ１３と略す）を調製した。
【０１１７】
（ＰＮＰ１３の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１３の平均粒径は７４．２ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１３のモル吸光係数は１．２×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は８．０×１０１１  Ｖ  Ｊ−−１Ｍ−１だった。ＰＮＰ１３について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は８５％であった。
【０１１８】
（実施例１４、化合物１を含有する粒子（粒子１４））
（粒子１４（ＰＮＰ１４）の合成）
化合物１の量を４．４ｍｇから１７．６ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１２と同様の方法で粒子１４（以下、ＰＮＰ１４と略す）を作製した。
【０１１９】
（ＰＮＰ１４の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１４の平均粒径は８７．８ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１４のモル吸光係数は２．７×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は１．１×１０１２  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ１４について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９１％であった。
【０１２０】
（実施例１５、化合物１を含有する粒子（粒子１５））
（色素含有ポリマーナノ粒子１５（ＰＮＰ１５）の合成）
上記の化合物１（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）および、ＰＬＧＡ（５ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液２を調製した。
【０１２１】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）、およびＤＯ（１８ｍｇ、日油社製）、およびＤＡ（４ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液２を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１２２】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０およびリン脂質で保護され、且つＰＬＧＡ中に前記化合物１を含む粒子１５の水分散液を得た。以後、この粒子１５をＰＮＰ１５と略す。
【０１２３】
（ＰＮＰ１５の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１５の平均粒径は８０．３ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１５のモル吸光係数は１．０×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は５．８×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ１５について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は７４％であった。
【０１２４】
（実施例１６、化合物１を含有する粒子（粒子１６））
（粒子１６（ＰＮＰ１６）の合成）
化合物１の量を４．４ｍｇから８．８ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１５と同様の方法で粒子１６（以下、ＰＮＰ１６と略す）を調製した。
【０１２５】
（ＰＮＰ１６の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１６の平均粒径は９４．６ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１６のモル吸光係数は２．１×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は７．５×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ１６について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は８９％であった。
【０１２６】
（実施例１７、化合物１を含有する粒子（粒子１７））
（粒子１７（ＰＮＰ１７）の合成）
化合物１の量を４．４ｍｇから１７．６ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１５と同様の方法で粒子１７（以下、ＰＮＰ１７と略す）を作製した。
【０１２７】
（ＰＮＰ１７の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１７の平均粒径は９２．９ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１７のモル吸光係数は２．７×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は９．７×１０１１  Ｖ  Ｊ−−１Ｍ−１だった。ＰＮＰ１７について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９３％であった。
【０１２８】
（実施例１８、化合物１を含有する粒子（粒子１８））
（色素含有ポリマーナノ粒子１８（ＰＮＰ１８）の合成）
上記の化合物１（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）および、ＰＬＧＡ（５ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液２を調製した。
【０１２９】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）、およびＤＯ（１１ｍｇ、日油社製）、およびＤＡ（１１ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液２を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１３０】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０およびリン脂質で保護され、且つＰＬＧＡ中に前記化合物１を含む粒子１８の水分散液を得た。以後、この粒子１８をＰＮＰ１８と略す。
【０１３１】
（ＰＮＰ１８の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１８の平均粒径は９７．１ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１８のモル吸光係数は１．５×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は５．１×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ１８について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は８６％であった。
【０１３２】
（実施例１９、化合物１を含有する粒子（粒子１９））
（粒子１９（ＰＮＰ１９）の合成）
化合物１の量を４．４ｍｇから８．８ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１８と同様の方法で粒子１９（以下、ＰＮＰ１９と略す）を作製した。
【０１３３】
（ＰＮＰ１９の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ１９の平均粒径は９８．３ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ１９のモル吸光係数は２．２×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は９．６×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ１９について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は８９％であった。
【０１３４】
（実施例２０、化合物１を含有する粒子（粒子２０））
（粒子２０（ＰＮＰ２０）の合成）
化合物１の量を４．４ｍｇから１７．６ｍｇへ変更した他は、前述したＰＮＰ１８と同様の方法で粒子２０（以下、ＰＮＰ２０と略す）を作製した。
【０１３５】
（ＰＮＰ２０の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ２０の平均粒径は１０５ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ２０のモル吸光係数は３．８×１０１０  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は１．１×１０１１  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ２０について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９３％であった。
【０１３６】
（実施例２１、化合物２を有する粒子（粒子２１））
（粒子２１（ＰＮＰ２１）の調製）
化合物２（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）および、ＰＬＧＡ（２０ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液３を調製した。
【０１３７】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ、東京化成社製）、およびＤＯ（７．３ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液３を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１３８】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０およびリン脂質で保護され、且つＰＬＧＡ中に化合物２を含む粒子２１の水分散液を得た。以後、この粒子２１をＰＮＰ２１と呼ぶ。
【０１３９】
（ＰＮＰ２１の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ２１の平均粒径は１６１．４ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ２１のモル吸光係数は６．７×１０８  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は２．２×１０１０  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＰＮＰ２１について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９７％であった。
【０１４０】
（実施例２２）（組成の異なるＰＬＧＡ、またはポリ乳酸、またはポリスチレンを使用したＰＮＰの比較）
（粒子２２（ＰＮＰ２２）の調製）
前述の化合物１（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）および、ＰＬＧＡ（５ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液２を調製した。
【０１４１】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液２を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１４２】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルターユニットを用いた限外ろ過操作した。ろ液中の化合物１に由来する７７０ｎｍ付近の吸光度が０．１以下になるまで遠心操作することにより過剰の界面活性剤を取り除いた。以上の操作を経て粒子表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＰＬＧＡ中に前記化合物１を含む粒子２２の水分散液を得た。以後、この粒子２２をＰＮＰ２２と略す。
【０１４３】
（ＰＮＰ２２の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ２２の平均粒径は１０６．９ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ２２のモル吸光係数は１．９８×１０９  Ｍ−１ｃｍ−１であった。ＰＮＰ２２について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は６９％であった。実施例５にて記載のＰＮＰ５と仕込み条件は同じだが、平均粒径や粒子中の色素残存率が異なる結果となった。これは、ＰＮＰ５は遠心精製（２００００×ｇ）であるのに対してＰＮＰ２２は限外ろ過精製であり、過剰の界面活性剤の除去が不十分であったためであると考えられる。
【０１４４】
（組成の異なるＰＬＧＡ、またはポリ乳酸、またはポリスチレンを使用したＰＮＰの調製）
ＰＮＰ２２のＰＬＧＡのかわりに、以下の表１に示すポリマーを用いてＰＮＰを調製した。ここで、ＰＬＡは、ポリ乳酸を、ＰＳは、ポリスチレンをそれぞれ表す。ポリマーを変更した他は、前述したＰＮＰ２２を調製した方法と同様の方法でおこなった。それぞれ粒子２３〜２９あるいはＰＮＰ２３〜２９と示す。
【０１４５】
【表１】
2013199476.tif 000012
【０１４６】
（ＰＮＰ２３〜２９の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ２３〜２９の平均粒径は１００ｎｍ程度（キュムラント解析値）であった。また、ＰＮＰ２３〜２９のモル吸光係数は８×１０８〜２×１０９  Ｍ−１ｃｍ−１程度であった。ＰＮＰ２３〜２９について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は４０〜６０％程度であった。
【０１４７】
次に、ＰＮＰ２２とＰＮＰ２３〜２９の色素漏出性について比較した。ＰＮＰ２２の色素残存率を１として、ＰＮＰ２３〜２９の色素残存率を相対値で表し、グラフにした（図５）。その結果、ＰＮＰ２２が最も色素残存率が高いことが確認された。図５より、粒子に内包された色素の漏出を抑制するためには、ポリマーの平均分子量は２００００程度が好ましく、同程度の分子量であれば、乳酸：グリコール酸の組成比が５０：５０であるＰＬＧＡが最も好ましいことが示唆された。
【０１４８】
（比較例１、色素としてＩＣＧを使用したＰＮＰとの比較）
（粒子（ＩＣＧ−ＰＮＰ）の調製）
インドシアニングリーン（以下、ＩＣＧと略す。４．４ｍｇ、（財）日本公定書協会製）をメタノール１ｍＬに溶解し、ＰＬＧＡ（２０ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）を溶解したクロロホルム１ｍＬと混和し、ＩＣＧメタノールクロロホルム溶液を調製した。
【０１４９】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ、東京化成社製）およびＤＯ（７．３ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記ＩＣＧメタノールクロロホルム溶液を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１５０】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０およびＤＯで保護され、且つＰＭＭＡ１中にＩＣＧを含む粒子の水分散液を得た。以後、この粒子をＩＣＧ−ＰＮＰと略す。
【０１５１】
（ＩＣＧ−ＰＮＰの物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＩＣＧ−ＰＮＰの平均粒径は８３．４ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、ＩＣＧ−ＰＮＰのモル吸光係数は２．８×１０９  Ｍ−１ｃｍ−１であり、光音響信号強度は６．８×１０１０  Ｖ  Ｊ−１  Ｍ−１だった。ＩＣＧ−ＰＮＰについて前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は１２％であった。
【０１５２】
（比較例２、ＰＭＭＡを使用したＰＮＰとの比較）
（粒子（ＰＮＰ−ＰＭＭＡ１）の調製）
前述の化合物１（０．８８ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）および、Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ−ｃｏ−ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）（以下、ＰＭＭＡ１と略す。５ｍｇ、ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ：ｍｅｔｈａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ＝１：０．０１６、平均分子量１５０００、シグマアルドリッチ社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、色素クロロホルム溶液４を調製した。
【０１５３】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（１８０ｍｇ、東京化成社製）水溶液を室温で２０分以上撹拌した後、前記色素クロロホルム溶液４を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１５４】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０で保護され、且つＰＭＭＡ１中に前記化合物１を含む粒子の水分散液を得た。以後、この粒子をＰＮＰ−ＰＭＭＡ１と略す。
【０１５５】
（粒子（ＰＮＰ−ＰＭＭＡ２および３）の調製）
ＰＮＰ−ＰＭＭＡ１と同じ方法で、以下の表２に示すポリマーを使用してＰＮＰを作製した。ここで、表２中ではＰｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ−ｃｏ−ｂｕｔｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ：ｂｕｔｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ＝８５：１５、平均分子量７５０００、シグマアルドリッチ社製）をＰＭＭＡ２、Ｐｏｌｙ（ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ），  ｉｓｏｔａｃｔｉｃ（＞８０％ｉｓｏｔａｃｔｉｃ、シグマアルドリッチ社製）を、ＰＭＭＡ３と略して表記した。ＰＭＭＡ２を使用したＰＮＰをＰＮＰ−ＰＭＭＡ２、ＰＭＭＡ３を使用したＰＮＰをＰＮＰ−ＰＭＭＡ３とそれぞれ呼ぶ。
【０１５６】
（粒子（ＰＮＰ−ＰＭＭＡ４、５、６）の調製）
ＰＮＰ−ＰＭＭＡ１から３と同様の方法で、Ｔｗｅｅｎ２０水溶液にＤＡ（１１ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を用いてＰＮＰ−ＰＭＭＡ４から６を作製した。
【０１５７】
【表２】
2013199476.tif 000013
【０１５８】
（粒子（ＰＮＰ−ＰＭＭＡ１〜６）の物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ−ＰＭＭＡ１〜６の平均粒径は１２０〜１３０ｎｍ（キュムラント解析値）であった。前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率はＰＮＰ−ＰＭＭＡ１が最も高く９６％であったが、ポリマーとしてＰＬＧＡを使用して作製したＰＮＰ１よりも４％程度低い値となった。更に、リン脂質としてＤＡを添加したＰＮＰ−ＰＭＭＡ４〜６では、ポリマーとしてＰＬＧＡを使用して作製したＰＮＰよりも５０％程度色素残存率が低いことがわかった。以上より、ＰＬＧＡをポリマーとして使用することで色素残存率がもっとも高いＰＮＰを作製できることがわかった。
【０１５９】
（比較例３、Ｎｃ−ＰＮＰとの比較）
２，３−Ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ（４．４ｍｇ、シグマアルドリッチジャパン社製）および、ＰＬＧＡ（２０ｍｇ、乳酸：グリコール酸の組成比５０：５０、平均分子量２００００、和光純薬工業社製）をクロロホルム１．６ｍＬに溶解し、２，３−Ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅクロロホルム溶液を調製した。
【０１６０】
次に、Ｔｗｅｅｎ２０（６０ｍｇ、東京化成社製）、およびＤＯ（７．３ｍｇ、日油社製）を溶解した水溶液（２０ｍＬ）を室温で２０分以上撹拌した後、前記２，３−Ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅクロロホルム溶液を滴下混合し、この混合溶液を３０分間撹拌した。その後、超音波分散機で９０秒間処理することによってＯ／Ｗ型のエマルジョンを調製した。
【０１６１】
次に前記エマルジョンを加温状態（４０℃）で撹拌し、分散質からクロロホルムを除去した後、限外ろ過または遠心分離操作することにより過剰の界面活性剤を取り除くことによって、粒子表面がＴｗｅｅｎ２０およびリン脂質で保護され、且つＰＬＧＡ中に２，３−Ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅを含む粒子の水分散液を得た。以後、この粒子をＮｃ−ＰＮＰと呼ぶ。
【０１６２】
（Ｎｃ−ＰＮＰの物性評価）
動的光散乱解析装置で分析したところ、ＰＮＰ２１の平均粒径は１６２．６ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、Ｎｃ−ＰＮＰのモル吸光係数は６．７×１０８  Ｍ−１ｃｍ−１であった。Ｎｃ−ＰＮＰについて前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は９３％であった。一方で、２，３−Ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅの代わりに化合物１を用いて、Ｎｃ−ＰＮＰと同じ方法で作製した粒子では、平均粒径が１６６．３ｎｍ（キュムラント解析値）、モル吸光係数は１．６×１０１１  Ｍ−１ｃｍ−１であり、粒子中の色素残存率は９２％であった。両粒子間において、色素残存率に大きな差はないものの、モル吸光係数には１５０倍の差があった。これは粒子中に内包された色素量の差であり、実際に化合物１を用いた粒子では系に投入したうち８４％が粒子に存在するのに対し、
Ｎｃ−ＰＮＰでは、１１％存在するのみであった。このことから、粒子中の色素残存率を高め、且つ高いモル吸光係数を持つ粒子を作製するためには、中心金属としてＳｉを有し、好ましくは中心金属のＳｉにアルキル鎖のような嵩高い分子が結合しているナフタロシアニン色素を使用することが有効であると考えられる。
【０１６３】
（実施例２３）（粒子１０（ＰＮＰ１０）を使用した腫瘍イメージング）
腫瘍イメージングにおいては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約２週間前に２×１０６個のＮ８７ヒト胃癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−５８２２）を、マウスの左肩に皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は１７〜２２ｇであった。担癌させたマウスにＰＮＰ１０のＰＢＳ溶液を、２００μＬ（粒子として１３ｎｍｏｌ）を静脈注射した。
【０１６４】
比較例の一つ目として実施例１０において、ＰＬＧＡ（５ｍｇ）をポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ、以下、ＰＳと略すことがある）（５ｍｇ、平均分子量２００００、東京化成社製）へ変更した他は同様の方法で、粒子の水分散液を得た。以後、この粒子をＰＮＰ−ＰＳと略す。次に比較例の二つ目として、化合物１をＦＢＳへ分散させた水溶液を作製した。以後、この水溶液をＤｙｅと略す。前述の通り作製した担癌マウスの尾部にＰＮＰ−ＰＳのＰＢＳ溶液または、Ｄｙｅを、２００μＬ（粒子として１３ｎｍｏｌ、Ｄｙｅは色素量として１３ｎｍｏｌ）を静脈注射した。
【０１６５】
上記のＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅを投与した担癌マウスは、投与後いかなる視覚的問題も無いことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。ＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅを投与したマウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（ＸＥＮＯＧＥＮ社  登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社）を用いて、投与２４時間後に測定した。更に、同時撮影したＣＣＤカメラの画像より腫瘍部位の範囲を選択し、該範囲における蛍光強度を算出した。
【０１６６】
続いて、上記全身蛍光像を測定したそれぞれのマウスから２４時間後に血液を採取した。血液採取方法は以下の通りである。ＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅを投与した尾静脈とは異なるもう一方の尾静脈をナイフで傷付けて、出てきた血液をヘマトクリット管で回収した。採血したヘマトクリット管をＩＶＩＳ（ＸＥＮＯＧＥＮ社  登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ  （ＸＥＮＯＧＥＮ社）装置内に置き、蛍光像を測定した。ＩＶＩＳ（ＸＥＮＯＧＥＮ社  登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ  （ＸＥＮＯＧＥＮ社）に搭載されているＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  （ＸＥＮＯＧＥＮ社登録商標）  ２．３  ソフトウェアを使用して、均等な面積の観測範囲（ＲＯＩ；Ｒｅｇｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を設定し、それぞれのヘマトクリット管の蛍光値を算出した。一方で、既知濃度のＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅをマウス血液で種々の濃度に希釈してヘマトクリット管で採取し、このヘマトクリット管をＩＶＩＳ（ＸＥＮＯＧＥＮ社  登録商標）  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００Ｓｅｒｉｅｓ  （ＸＥＮＯＧＥＮ社）装置内に置き、蛍光像を測定した。前述の方法と同じようにＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  （ＸＥＮＯＧＥＮ社登録商標）  ２．３  ソフトウェアを使用して、均等な面積の観測範囲（ＲＯＩ；Ｒｅｇｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を設定し、それぞれのヘマトクリット管の蛍光値を算出した。算出した蛍光値とＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅの濃度から関係式を導出した。この関係式と、マウス尾静脈から採血したヘマトクリット管の蛍光値から、マウス血液中に存在するＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅの量を算出した。算出されたそれぞれの血液中の存在量を全投与量で除することで、投与量あたりの血液中の存在量の割合（％ＩＤ）を算出した。
【０１６７】
算出された結果を図６（ａ）に示した。Ｄｙｅは、０．５％ＩＤ、ＰＮＰ−ＰＳは、７．９％ＩＤ、ＰＮＰ１０は１２．６％ＩＤであり、ＤｙｅおよびＰＮＰ−ＰＳに比較して、ＰＮＰ１０は２４時間後の血液中の存在割合が高い値となった。
【０１６８】
続いて、腫瘍組織の重さで規格化した場合の全投与量に対する腫瘍への集積量の割合（％ＩＤ／ｇ）を算出した。初めに、既知濃度のＰＮＰ１０またはＰＮＰ−ＰＳをＦＢＳで種々の濃度に希釈して５０μｌをマウス皮下へ投与し、該投与部位の蛍光強度を前記ＩＶＩＳ（ＸＥＮＯＧＥＮ社  登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社）にて測定した。ここで、前述の５０μｌという投与量は、Ｎ８７腫瘍の平均サイズ（５０ｍｇ）と同体積であることから決定した。次に前述の測定から得られるマウス皮下からの蛍光強度と、マウス皮下へ投与したＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅの濃度から関係式を導出した。この関係式と、腫瘍部位の範囲の蛍光強度から腫瘍へ集積したＰＮＰ１０、ＰＮＰ−ＰＳ、またはＤｙｅの集積量の割合を算出した。ここで、蛍光強度の測定には、皮下投与も腫瘍部位も同一の大きさのＲＯＩを使用した。
【０１６９】
算出された結果を図６（ｂ）に示す。Ｄｙｅは、４．８％ＩＤ／ｇ、ＰＮＰ−ＰＳは、１７．７％ＩＤ／ｇ、ＰＮＰ１０は４１．６％ＩＤ／ｇであり、ＤｙｅおよびＰＮＰ−ＰＳに比較して、ＰＮＰ１０は２４時間後の腫瘍への集積量の割合が高い値となった。
【０１７０】
ＰＮＰ１０を投与した別の担癌マウスについて、光音響イメージングをおこなった。結果を図７に示す。ＣＣＤカメラにて確認された癌腫瘍の位置（ｂ）から高い光音響信号が得られた（ａ）。同一の担癌マウスを蛍光イメージング（ｃ）を観察したところ、高シグナル位置が一致しており、投与したＰＮＰ１０が腫瘍へ集積し蛍光と光音響信号を発生せしめていることが確認された。
【０１７１】
（実施例２４）（粒径の異なるＰＮＰの物性評価）
実施例５にて記載の方法にてＰＮＰ５を調製した。精製方法は、遠心精製（２００００×ｇ、４５分間）で実施した。遠心精製の上清を回収し、７２１００×ｇ、１５分間の条件でさらに遠心し、沈殿した画分を回収し、ＰＢＳへ再分散させた。以降、この再分散溶液中に含まれる粒子をＰＮＰ５’と略す。
【０１７２】
ＰＮＰ５’について動的光散乱解析装置で分析したところ、平均粒径は４９．３ｎｍ（キュムラント解析値）であった。また、モル吸光係数は３．１×１０９  Ｍ−１ｃｍ−１であった。ＰＮＰ５’について前述の色素漏出試験を実施したところ、粒子中の色素残存率は５５％であった。ここで、ＰＮＰ５’の色素残存率が低いのは、粒径が小さいため遠心分離時の遠心力（２８８００×ｇ）では十分に沈殿せずに上清に残存してしまうためである。
【０１７３】
（粒径の異なるＰＮＰの腫瘍集積性評価）
実施例２３と同じ方法で担癌マウスを作製し、ＰＮＰ５、またはＰＮＰ５’のＰＢＳ溶液を、２００μｌ（粒子として１３ｎｍｏｌ）を静脈注射した。上記のＰＮＰ５、ＰＮＰ５’を投与した担癌マウスは、投与後いかなる視覚的問題も無いことから、全注射が良好に耐容されたと判断した。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織を摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加し、ホモジネートした。次いで、癌組織重量の２０．２５倍量のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社）を用いて、プラスチックチューブの状態で、ホモジネート溶液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量を定量した。その結果を図８にまとめた。ＰＮＰ５および、ＰＮＰ５’の投与量に対する癌組織への移行率は、それぞれ０．１１％（癌組織１ｇあたり）、０．２９％であった。したがって、平均粒径４９．３ｎｍ（キュムラント解析値）のＰＮＰ５’は、平均粒径１６２．１ｎｍ（キュムラント解析値）のＰＮＰ５に比べて腫瘍集積量が多いことがわかった。
【０１７４】
（実施例２５、リンパ節集積率の評価）
実施例１０で作製したＰＮＰ１０をマウスの足底皮下に投与し、投与後２４時間後に摘出し、ホモジネート後有機溶媒で抽出して膝下リンパ節への集積率を測定した。投与量は色素量で１３ｎｍｏｌとした。比較例としてＩＣＧ水溶液も同様に投与測定した。表３に結果を示した。ＩＣＧに比較してＰＮＰ１０ではリンパ節への集積率が約８０倍増加した。この結果より、本発明の粒子はリンパ節の造影用として機能できることが分かった。
【０１７５】
【表３】
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【０１７６】
（リンパ節の光音響イメージング）
ＰＮＰ１０をマウスの足底皮下に投与し、投与後２４時間後に膝下リンパ節の光音響イメージングを行った。その結果を図９に示す。図９の（ｂ）で確認されるリンパ節付近から強い光音響信号がかんさつされた（図９（ａ））。比較例として未投与のリンパ節からは、蛍光信号は確認されなかった。この結果より、本発明の粒子はリンパ節造影用の光音響用造影剤として機能できることが分かった。
【０１７７】
（実施例２６、捕捉分子を有するＰＮＰ）
（一本鎖抗体ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖの調製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列（ｈｕ４Ｄ５−８）を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードする遺伝子ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖを作製した。まずｈｕ４Ｄ５−８のＶＬ、ＶＨ遺伝子をペプチド（ＧＧＧＧＳ）３をコードするｃＤＮＡで連結したｃＤＮＡを作製した。５’末端には制限酵素ＮｃｏＩ  を、３’末端には制限酵素ＮｏｔＩの認識サイトを導入した。以下に塩基配列を示す。
配列番号１：
5’-CCATGGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGTGGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCGGCCGC-3’
（制限酵素の認識サイトを下線で示す。）
【０１７８】
上記遺伝子断片ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＴ７／ｌａｃプロモーターの下流に挿入した。具体的には、制限酵素ＮｃｏＩとＮｏｔＩで消化処理したｐＥＴ−２２ｂ（＋）に、上記のｃＤＮＡをライゲーションする。
【０１７９】
この発現プラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に転嫁し、２８℃、１２０ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１ｍＭでＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０分、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／５００ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１Ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充てんしたカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８ｋＤａであることを確認した。以下に調製された抗体のアミノ酸配列を示す。以後、ｈｕ４Ｄ５−８ｓｃＦｖをｓｃＦｖと略す。
配列番号２：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAALEHHHHHHGGC
【０１８０】
（ＰＮＰ１０へのｓｃＦｖの修飾）
前述の通り調製したｓｃＦｖを５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８ｍＭ  ＫＣｌ／１３７ｍＭ  ＮａＣｌ／１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）にバッファー置換後、１０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で約２時間、還元処理した。
【０１８１】
実施例１０で作製したＰＮＰ１０の表面に存在する１級アミノ基を介して、ｓｃＦｖの修飾を行った。まず、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］  ｅｓｔｅｒ  （ＳＭ（ＰＥＧ）２、サーモサイエンティフィック社）  ０．１ｍｇ（２３３ｎｍｏｌ）を、ＰＮＰ１０の水分散液（ＰＮＰ濃度：４．８×１０１２個／ｍｌ）の２．９ｍｌに溶解した。次に、０．３３ｍｌのほう酸バッファー（ｐＨ８．５）を加えた。この粒子懸濁液を室温で２時間撹拌した後、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、マレイミド基を導入したＰＮＰ１０（以下、マレイミド化ＰＮＰ１０と略す）と未反応のＳＭ（ＰＥＧ）２を、水を展開溶媒として分離し、マレイミド化ＰＮＰ１０の水溶液およそ６ｍｌを得た。この水溶液に１Ｍの２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）溶液を１２０μｌ加えることで、マレイミド化ＰＮＰ１０のＨＥＰＥＳ溶液を得た。
【０１８２】
前記還元処理したｓｃＦｖを、前記マレイミド化ＰＮＰ１０のＨＥＰＥＳ溶液に添加し、４℃で１５時間以上反応させた。仕込みの反応モル比（ｓｃＦｖ／マレイミド化ＰＮＰ１０）は、７２０で行った。ここで「仕込み」とは反応系に加えられた、という意味であり、「仕込みの反応モル比」とは、反応系に加えられたｓｃＦｖとマレイミド化ＰＮＰ１０のモル濃度比のことをいう。反応後、この溶液に、末端チオール基を有するポリエチレングリコール（分子量１０００、ＰＬＳ−６０６、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ社製）１６．８ｎｍｏｌを加え、室温で３０分撹拌した。次いで、この溶液をフィルターろ過（ポアサイズ１．２μｍ）した後、１００ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりマレイミド化ＰＮＰ１０へ結合しなかったｓｃＦｖを除去して、ｓｃＦｖが修飾されたＰＮＰ１０を得た。以後、得られたこの粒子をｓｃＦｖ−  ＰＮＰ１０と略す。
【０１８３】
（ｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０の物性評価）
ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ、ビシンコニン酸）法を用いて、ＰＮＰ１０へのｓｃＦｖの修飾量を算出した結果、粒子あたりに２８０個のｓｃＦｖが修飾されていることがわかった。動的光散乱解析装置で分析したところ、ｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０の平均粒径は約４００ｎｍ（キュムラント解析値）であった。
【０１８４】
（ｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０の細胞結合能評価）
培養細胞に対するｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０の結合能評価を行った。前日にＨＥＲ２陽性細胞（Ｎ８７細胞）またはＨＥＲ２陰性細胞（ＳＵＩＴ２細胞）を４８ウェルプレートに播種した（４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。翌日、培地を除去し、増殖培地２００μｌを入れた後、ｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０を種々の濃度で１００μｌ添加した（ＰＮＰ濃度として、０．５７、１．１、２．３、４．６、９．１ｐＭ）。４℃で３時間、静置した。その後、ｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０を含む培地を除去し、ＰＢＳ  １ｍｌで２回、洗浄した。ＰＢＳを除去した後、細胞を溶解させるため、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｐ−ｉｓｏｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ）の１％水溶液を１ウェルにつき３００μｌ加えた。３７℃で１時間以上インキュベートした。このＴｒｉｔｏｎ溶液をマイクロチューブに移したのち、これにＴＨＦ  ２００ｕｌを添加して溶液中の色素量を蛍光測定により求めた。蛍光測定は、励起波長は７３０ｎｍ、蛍光波長は８２０ｎｍとした。蛍光強度値とインキュベートしたｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０濃度より、スキャッチャードプロットを作成し、Ｎ８７細胞に対するｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０の見かけの平衡解離定数（ＫＤ）を求めた結果、０．３５ｎＭであった。一方、ＳＵＩＴ−２細胞への結合は弱く、その結果、蛍光強度値が小さかったため、スキャッチャードプロットからＫＤは求められなかった。以上の結果より、ｓｃＦｖ−ＰＮＰ１０は、ＨＥＲ２を認識してＨＥＲ２陽性細胞に対して選択的に結合することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図７】
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【図９】
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