(57)【要約】      （修正有）【課題】白金系抗腫瘍剤の水溶性を改善し、腫瘍部に選択的に集積・滞留させて抗腫瘍効果を増大させ、正常器官組織への副作用を軽減した抗腫瘍剤の提供。【解決手段】式［Ｉ］で表されるイオン結合体を有効成分として含む高分子型抗腫瘍剤。2013155159.tif 000017式中、ｍは高分子型抗腫瘍剤の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍとなる整数であり、Ｒ１とＲ２は、ＮＨ３、アミン等であり、ｎは０〜５の整数であり、Ｒ３はアルキル、アルコキシ、カルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種、若しくは隣り合った二つの炭素に結合するＲ３が構成する置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体を有効成分として含むことを特徴とする高分子型抗腫瘍剤。
【請求項２】
イオン結合体が、以下の式［Ｉ］で表される化合物であることを特徴とする請求項１記載の高分子型抗腫瘍剤。
【化１】
2013155159.tif 000010
（ただし、ｍは高分子型抗腫瘍剤の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍとなる整数であり、
Ｒ１とＲ２がそれぞれ異なって若しくは同じである、ＮＨ３、直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜１０であるアルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が６〜１２である芳香族アミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が４〜１２である含窒素芳香族化合物からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは、Ｒ１及びＲ２が一緒になって構成する、置換若しくは非置換の直鎖状若しくは分岐した炭素数が２〜８であるアルキルジアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルジアミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が６〜１０であるオルト二置換芳香族ジアミンからなる群から選ばれる一種であり、
ｎは０〜５の整数であり
ｎが１のとき、
Ｒ３が直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
ｎが２〜５のとき、
Ｒ３が同時に又は異なる直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは隣り合った二つの炭素に結合するＲ３が構成する置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基、
である。）
【請求項３】
白金系抗腫瘍剤が、シスプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、ロバプラチンからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項４】
スチレン・マレイン酸系共重合体が、スチレン・マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）であることを特徴とする請求項１記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項５】
イオン結合体が、シスプラチンとスチレン・マレイン酸共重合体とのイオン結合体であることを特徴とする請求項１記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項６】
イオン結合体が、白金系抗腫瘍剤を１８％以上含量することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項７】
ＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果により、正常組織への蓄積率よりも腫瘍組織への蓄積率のほうが高いことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項８】
ＥＰＲ効果により、腫瘍組織へ選択的に蓄積することを特徴とする請求項７記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項９】
白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体からの白金系抗腫瘍剤の放出率が、中性条件での放出率よりも酸性条件での放出率の方が高いことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項１０】
白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体からの白金系抗腫瘍剤の放出率が、正常細胞での放出率よりも腫瘍細胞での放出率のほうが高いことを特徴とする請求項９に記載の高分子型抗腫瘍剤。
【請求項１１】
以下の式［II］で表されるスチレン・無水マレイン酸系共重合体と以下の式［III］で表される含白金化合物とを、ｐＨ９以上の水溶液中で反応させることにより得られる以下の式［Ｉ］で表されるイオン結合体が有効成分となるように配合することを特徴とする高分子型抗腫瘍剤の製造方法。
【化２】
2013155159.tif 000011
【化３】
2013155159.tif 000012
【化４】
2013155159.tif 000013
（ただし、ｍは高分子型抗腫瘍剤の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍとなる整数であり、
Ｒ１とＲ２がそれぞれ異なって若しくは同じである、ＮＨ３、直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜１０であるアルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が６〜１２である芳香族アミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が４〜１２である含窒素芳香族化合物からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは、Ｒ１及びＲ２が一緒になって構成する、置換若しくは非置換の直鎖状若しくは分岐した炭素数が２〜８であるアルキルジアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルジアミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が６〜１０であるオルト二置換芳香族ジアミンからなる群から選ばれる一種であり、
ｎは０〜５の整数であり
ｎが１のとき、
Ｒ３が直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
ｎが２〜５のとき、
Ｒ３が同時に又は異なる直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは隣り合った二つの炭素に結合するＲ３が構成する置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基であり、
Ｘはそれぞれ同時に又は異なるＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、及びハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシからなる群から選ばれる一種
である。）
【請求項１２】
以下の式［II］で表されるスチレン・無水マレイン酸系共重合体と以下の式［IV］で表される含白金化合物とを、ｐＨ９以上の水溶液中で反応させることを特徴とする以下の式［Ｉ］で表されるイオン結合体が有効成分となるように配合することを特徴とする高分子型抗腫瘍剤の製造方法。
【化５】
2013155159.tif 000014
【化６】
2013155159.tif 000015
【化７】
2013155159.tif 000016
（ただし、ｍは高分子型抗腫瘍剤の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍとなる整数であり、
Ｒ１とＲ２がそれぞれ異なって若しくは同じである、ＮＨ３、直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜１０であるアルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が６〜１２である芳香族アミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が４〜１２である含窒素芳香族化合物からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは、Ｒ１及びＲ２が一緒になって構成する、置換若しくは非置換の直鎖状若しくは分岐した炭素数が２〜８であるアルキルジアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルジアミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が６〜１０であるオルト二置換芳香族ジアミンからなる群から選ばれる一種であり、
ｎは０〜５の整数であり
ｎが１のとき、
Ｒ３が直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
ｎが２〜５のとき、
Ｒ３が同時に又は異なる直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは隣り合った二つの炭素に結合するＲ３が構成する置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基であり、
Ｘはそれぞれ同時に又は異なるＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、及びハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシからなる群から選ばれる一種であり、
Ｙはそれぞれ同時に又は異なるＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、ＯＨ、ハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシ、及び直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜３のアルコキシからなる群から選ばれる一種
である。）
【請求項１３】
ｐＨ９以上の水溶液中で反応させた反応水溶液を凍結乾燥することで含白金化合物を微粉末化し、その後に再びｐＨ９以上の水溶液として反応を続けることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の高分子型抗腫瘍剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とを、イオン結合により結合させ、高分子複合体とした高分子型抗腫瘍剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シスプラチン（ＣＤＤＰ、ｃｉｓ−ジアミンジクロロプラチナ（ＩＩ））は、１９６５年に米国の細菌学者B.Rosenbergらによって発見され、その後の研究で抗腫瘍効果が確認された初めての白金系抗腫瘍剤であり（B. Rosenberg, L. Vancamp, J. E. Trosko, V. H. Mansour, “Platinum Compounds: a New Class of Potent Antitumour Agents” Nature, 5191, 385-386 (1969)．）、胃・食道・肺・卵巣など様々な癌種を治療する上でのキードラッグ（Key Drug）となっている。ＣＤＤＰの抗腫瘍メカニズムは、水和の過程を経てＤＮＡ鎖におけるグアニン塩基と結合することにより、ＤＮＡ合成及びそれに続く腫瘍細胞の分裂を濃度依存的に阻害するものと考えられている。
【０００３】
しかし、シスプラチンは正常組織へも容易に移行するため、正常器官・組織に対しても作用し、腎毒性・骨髄毒性・聴毒性などの重篤な副作用を引き起こすことにより、治療の断念を余儀なくされるケースがしばしば問題となっている。
【０００４】
さらに、シスプラチンは水に対して極めて難溶性であり、それらの投与の際には多くの水分負荷が必要になるため、投与時間が長時間に及ぶことや高濃度の薬液を直接腫瘍部位へ送達させる動注療法には不向きであることなど製剤学的な欠点がある。
【０００５】
これらの欠点を克服するために、ネダプラチン、カルボプラチン、ＣＩ−９７３、オキサリプラチン、ピコプラチン（ＡＭＤ４７３）、オルマプラチン、サトラプラチン（ＪＭ−２１６）、イプロプラチン、アロプラチン、ロバプラチン及びＪＭ−３３５といった様々な白金系抗腫瘍剤が発明され、臨床で用いられている。しかし、これらの白金系抗腫瘍剤もシスプラチンと比較すると毒性は低減化されているものの、腎毒性・骨髄毒性・聴毒性などの重篤な副作用を引き起こし、治療の断念を余儀なくされる問題が依然と存在する。
【０００６】
このような理由から、近年、腫瘍細胞又は組織にのみ選択的に細胞毒性を示すＤＤＳ（Drug Delivery System）を利用することで、毒性による副作用を画期的に低下させ、薬剤耐性をも克服可能な標的志向性抗腫瘍剤の開発に全力が尽くされている。すなわち、現在臨床において使用されているほとんどの低分子量の単量体形態の抗腫瘍剤は腫瘍細胞や腫瘍組織に選択性がないため、現在、腫瘍細胞や腫瘍組織に選択性を有する抗腫瘍剤を開発するための高分子薬物伝達システムの応用研究が全世界的に盛んになされている。その代表例として、抗体や、腫瘍細胞若しくは組織に高発現する受容体に親和力の強い標的化グループを既存の抗腫瘍剤に直接的に結合させる、または、抗腫瘍剤と標的化グループを水溶性高分子に一緒に結合させることにより抗腫瘍剤に標的志向性を与える方法（能動的標的化）と、標的化グループなしに腫瘍組織に対する透過保有特性を有する高分子粒子に抗腫瘍剤を結合させることにより抗腫瘍剤に腫瘍組織選択性を与える方法（受動的標的化）などを挙げることができる。
【０００７】
特に、腫瘍組織に対する受動的標的化ＤＤＳとして、本発明者らによって、高分子粒子が固形癌組織に対して高い透過性及び保有性効果、すなわちＥＰＲ（enhanced permeabyity and retention）効果を示すという事実が発見されて以来（H. Maeda, and Y. Matsumura, “Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs.” CRC Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Sys 6, 193-210 (1989).）、腫瘍組織選択性の高い高分子物質に関する研究が全世界的に盛んになされている。
【０００８】
ＥＰＲ効果とは、
１．腫瘍組織は、急激に増殖するために血管新生が速く、血管壁には正常組織の血管よりも１桁以上広い数百ナノメートルの隙間が開いているため、高分子粒子は正常組織の血管壁からは漏れず、腫瘍組織だけに入り、病変部位の濃度だけが上昇する；
２．腫瘍組織はリンパ管が未発達であるために、腫瘍組織に流入した高分子粒子およびその高分子粒子から放出された低分子化合物を流し出すメカニズムが発達しておらず、結果的に抗腫瘍剤が腫瘍組織に長時間残存する；
という、２つの特徴を併せ持つ効果である。
【０００９】
つまり、低分子抗腫瘍剤を高分子複合体化し、高分子型抗腫瘍剤とすることで、ＥＰＲ効果を利用する抗腫瘍剤の腫瘍組織への集積性を高めることを目的としたＤＤＳが達成できる。
【００１０】
腫瘍集積性を高めることを目的としたＤＤＳ製剤開発を考慮する上で重要な点は、両親媒性ブロックコポリマーに抗腫瘍活性本体を一時的に不活化した状態で保持させ、これをターゲティングに適した粒子径に仕上げると同時に、腫瘍組織に到達した際には活性体を速やかに放出させ、抗腫瘍剤を活性化することである。
【００１１】
このような技術背景を元に、本発明者は低分子抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸共重合体が非共有結合により結合し、かつ、低分子抗腫瘍剤がミセルに取り込まれた高分子ミセル複合体構造を形成してなる高分子型抗腫瘍剤を発明した（特許第４６６９３９３号）。この発明において、高分子型抗腫瘍剤は血中滞留性が増し、腫瘍選択的な集積性が確認され、その結果副作用の低減が確認された。しかし、低分子抗腫瘍剤としてシスプラチンを用いた際には、その一部がスチレン・マレイン酸共重合体とイオン結合しているものがあるものの、その大部分はミセル中に包合されている形態で存在するために、血中に滞留する高分子ミセル複合体からシスプラチンが放出され、その一部分が正常組織へと移行し副作用を生じる恐れがある。また、高分子ミセル複合体の一部が正常組織へと集積し、そこでシスプラチンが放出されることで副作用を生じる恐れもある。
【００１２】
白金系抗腫瘍剤を高分子型抗腫瘍剤としたものには、腫瘍組織選択性及び生分解性のポリホスファゼン・白金（ＩＩ）抱合錯体抗腫瘍剤（特表２００６−５２５２２４）、腫瘍組織選択性及び生分解性を有する環状ポリホスファゼン三量体−白金（ＩＩ）錯体コンジュゲート抗癌剤（特表２０１０−５２４９２２）という同一発明者による二つの発明がある。これらの高分子型抗腫瘍剤は、ポリホスファゼンや環状ポリホスファゼン三量体に白金系抗腫瘍剤を担持したペプチドをスペーサーとして有し、このペプチドが細胞内でペプチダーゼにより加水分解を受けることで白金系抗腫瘍剤を活性化する。これらにおいても、正常組織へと集積した高分子型抗腫瘍剤からペプチダーゼにより白金系抗腫瘍剤が活性化され、副作用を生じる恐れが依然として存在する。
【００１３】
この他にも、白金系抗腫瘍剤を高分子型抗腫瘍剤とした発明には、ポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントからなる共重合体、またはポリエチレングリコールセグメントとポリグルタミン酸セグメントからなる共重合体にジアミノシクロヘキサン白金（ＩＩ）が固定化されている配位錯体（特許第３９５９９２号）がある。この錯体を高分子型抗腫瘍剤として用いると、血液中での滞留性及び腫瘍への集積性が高まることが記載されているが、同時に、動物実験において、腎臓及び肝臓への集積性がシスプラチンと同程度であることが記載されていることから、シスプラチンと同程度の副作用が生じることが懸念される。
【００１４】
上記発明のように、高分子型抗腫瘍剤の作用機序としては、選択的に腫瘍細胞に取り込まれ、細胞内で白金系抗腫瘍剤が活性化されることが理想的ではあるが、現実の技術的限界として、高分子型抗腫瘍剤のＥＰＲ効果を持ってしても一部の高分子型抗腫瘍剤は正常組織へも蓄積し、副作用を生じてしまうことを避けることは出来ない。このため、正常組織へ移行した高分子型抗腫瘍剤からの白金系抗腫瘍剤の活性化を抑制できる高分子型抗腫瘍剤の開発が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第４６６９３９３号
【特許文献２】特表２００６−５２５２２４
【特許文献３】特表２０１０−５２４９２２
【特許文献４】特許第３９５９９２号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】B. Rosenberg, L. Vancamp, J. E. Trosko, V. H. Mansour, “Platinum Compounds: a New Class of Potent Antitumour Agents” Nature, 5191, 385-386 (1969)．
【非特許文献２】H. Maeda, and Y. Matsumura, “Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs.” CRC Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Sys 6, 193-210 (1989).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、ＥＰＲ効果により腫瘍部位へ集積すること、及び腫瘍部位で特異的に白金系抗腫瘍剤が放出されることを特徴とする白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体を有効成分として含む高分子型抗腫瘍剤を提供すること、及びこの高分子型抗腫瘍剤の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、白金系抗腫瘍剤をスチレン・マレイン酸系共重合体のカルボキシル基と二座で直接イオン結合させ、白金系抗腫瘍剤をスチレン・マレイン酸系共重合体に安定化したイオン結合体を開発した。このイオン結合体は、腫瘍組織に特徴的なｐＨ５．５〜６．０の酸性環境において白金系抗腫瘍剤を放出し、活性化することで抗腫瘍活性を示した。これに対して、正常組織におけるｐＨ７．４程度の中性環境ではこのイオン結合体からの白金系抗腫瘍剤の放出は非常に微量であった。このため、この白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体が、既知の抗腫瘍剤と比べ副作用が非常に小さい高分子型抗腫瘍剤となることを見い出した。
【００１９】
すなわち、本発明は（１）白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体を有効成分として含むことを特徴とする高分子型抗腫瘍剤に関する。
【００２０】
また、本発明は（２）イオン結合体が、以下の式［Ｉ］で表される化合物であることを特徴とする上記（１）記載の高分子型抗腫瘍剤に関する。
【００２１】
【化１】
2013155159.tif 000002
【００２２】
（ただし、ｍは高分子型抗腫瘍剤の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍとなる整数であり、
Ｒ１とＲ２がそれぞれ異なって若しくは同じである、ＮＨ３、直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜１０であるアルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が６〜１２である芳香族アミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が４〜１２である含窒素芳香族化合物からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは、Ｒ１及びＲ２が一緒になって構成する、置換若しくは非置換の直鎖状若しくは分岐した炭素数が２〜８であるアルキルジアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルジアミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が６〜１０であるオルト二置換芳香族ジアミンからなる群から選ばれる一種であり、
ｎは０〜５の整数であり
ｎが１のとき、
Ｒ３が直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
ｎが２〜５のとき、
Ｒ３が同時に又は異なる直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは隣り合った二つの炭素に結合するＲ３が構成する置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基、
である。）
【００２３】
さらに本発明は、（３）白金系抗腫瘍剤が、シスプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、ロバプラチンからなる群から選ばれることを特徴とする前記（１）に記載の高分子型抗腫瘍剤、（４）スチレン・マレイン酸系共重合体が、スチレン・マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）であることを特徴とする前記（１）に記載の高分子型抗腫瘍剤、（５）イオン結合体が、シスプラチンとスチレン・マレイン酸共重合体とのイオン結合体であることを特徴とする前記（１）に記載の高分子型抗腫瘍剤、（６）イオン結合体が、白金系抗腫瘍剤を１８％以上含量することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の高分子型抗腫瘍剤に関する。
【００２４】
本発明はまた、（７）ＥＰＲ効果により、正常組織への蓄積率よりも腫瘍組織への蓄積率のほうが高いことを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載の高分子型抗腫瘍剤、（８）ＥＰＲ効果により、腫瘍組織へ選択的に蓄積することを特徴とする前記（７）に記載の高分子型抗腫瘍剤、（９）白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体からの白金系抗腫瘍剤の放出率が、中性条件での放出率よりも酸性条件での放出率の方が高いことを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれかに記載の高分子型抗腫瘍剤、（１０）白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体からの白金系抗腫瘍剤の放出率が、正常細胞での放出率よりも腫瘍細胞での放出率のほうが高いことを特徴とする前記（９）に記載の高分子型抗腫瘍剤に関する。
【００２５】
本発明はさらに、（１１）以下の式［II］で表されるスチレン・無水マレイン酸系共重合体と以下の式［III］で表される含白金化合物とを、ｐＨ９以上の水溶液中で反応させることにより得られる以下の式［Ｉ］で表されるイオン結合体が有効成分となるように配合することを特徴とする高分子型抗腫瘍剤の製造方法に関する。
【００２６】
【化２】
2013155159.tif 000003
【００２７】
【化３】
2013155159.tif 000004
【００２８】
【化４】
2013155159.tif 000005
【００２９】
（ただし、ｍは高分子型抗腫瘍剤の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍとなる整数であり、
Ｒ１とＲ２がそれぞれ異なって若しくは同じである、ＮＨ３、直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜１０であるアルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が６〜１２である芳香族アミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が４〜１２である含窒素芳香族化合物からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは、Ｒ１及びＲ２が一緒になって構成する、置換若しくは非置換の直鎖状若しくは分岐した炭素数が２〜８であるアルキルジアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルジアミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が６〜１０であるオルト二置換芳香族ジアミンからなる群から選ばれる一種であり、
ｎは０〜５の整数であり
ｎが１のとき、
Ｒ３が直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
ｎが２〜５のとき、
Ｒ３が同時に又は異なる直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは隣り合った二つの炭素に結合するＲ３が構成する置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基であり、
Ｘはそれぞれ同時に又は異なるＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、及びハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシからなる群から選ばれる一種
である。）
【００３０】
本発明はさらに、（１２）以下の式［II］で表されるスチレン・無水マレイン酸系共重合体と以下の式［IV］で表される含白金化合物とを、ｐＨ９以上の水溶液中で反応させることを特徴とする以下の式［Ｉ］で表されるイオン結合体が有効成分となるように配合することを特徴とする高分子型抗腫瘍剤の製造方法に関する。
【００３１】
【化５】
2013155159.tif 000006
【００３２】
【化６】
2013155159.tif 000007
【００３３】
【化７】
2013155159.tif 000008
【００３４】
（ただし、ｍは高分子型抗腫瘍剤の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍとなる整数であり、
Ｒ１とＲ２がそれぞれ異なって若しくは同じである、ＮＨ３、直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜１０であるアルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルアミン、置換若しくは非置換の炭素数が６〜１２である芳香族アミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が４〜１２である含窒素芳香族化合物からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは、Ｒ１及びＲ２が一緒になって構成する、置換若しくは非置換の直鎖状若しくは分岐した炭素数が２〜８であるアルキルジアミン、置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルジアミン、及び置換若しくは非置換の炭素数が６〜１０であるオルト二置換芳香族ジアミンからなる群から選ばれる一種であり、
ｎは０〜５の整数であり
ｎが１のとき、
Ｒ３が直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
ｎが２〜５のとき、
Ｒ３が同時に又は異なる直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル、メトキシ、メトキシメトキシ、メトキシエトキシ、エトキシメトキシ、エトキシエトキシ、１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル、メタンスルホニルオキシ、トリフルオロメタンスルホニルオキシ、ニトロ、ニトリル、及び水酸基がそれぞれ異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護された糖若しくはオリゴ糖からなる群から選ばれる一種であり、
若しくは隣り合った二つの炭素に結合するＲ３が構成する置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基であり、
Ｘはそれぞれ同時に又は異なるＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、及びハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシからなる群から選ばれる一種であり、
Ｙはそれぞれ同時に又は異なるＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、ＯＨ、ハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシ、及び直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜３のアルコキシからなる群から選ばれる一種
である。）
【００３５】
本発明はさらに、（１３）ｐＨ９以上の水溶液中で反応させた反応水溶液を凍結乾燥することで含白金化合物を微粉末化し、その後に再びｐＨ９以上の水溶液として反応を続けることを特徴とする前記（１１）又は（１２）に記載の高分子型抗腫瘍剤の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によると、白金系抗腫瘍剤を高分子複合体とし、分子の存在状態を改変することにより、水溶性を改善し、腫瘍部に選択的に集積させ、腫瘍部での滞留時間を長くし、更に腫瘍部で選択的に抗腫瘍剤を高分子複合体から放出させ、それにより抗腫瘍効果を増大させるとともに、正常器官組織への副作用を軽減した高分子型抗腫瘍剤を提供することができる。
【００３７】
本発明の高分子型抗腫瘍剤は、白金系抗腫瘍剤部位のプラチナ原子とスチレン・マレイン酸系共重合体のカルボキシル基とが二座でイオン結合することで、腫瘍組織に特徴的なｐＨ５．５〜６．０の酸性環境において白金系抗腫瘍剤を放出し活性化することにより、抗腫瘍活性を示す。一方、この高分子型抗腫瘍剤は、中性条件では白金系抗腫瘍剤が放出されないため、公知の白金系抗腫瘍剤と比較して、副作用の発生が極めて低くなることが期待できる。
【００３８】
また、本発明でスチレン・マレイン酸系共重合体を用いるのは、スチレン・マレイン酸系共重合体が
１．両親媒性であるため難水溶性である白金系抗腫瘍剤の可溶化能が優れている；
２．エンドサイトーシス経路によって速やかに細胞内へ取り込まれることが示唆されている（T. Oda, H. Maeda, “Binding to and Internalization by Cultured Cells of Neocarzinostatin and Enhancement of Its Actions by Conjugation with Lipophilic Styrene-Maleic Acid Copolymer” Cancer Research 47 (1987) 3206-3211.）；
３．マクロファージ、Ｔ−細胞、ＮＫ−細胞活性化による免疫能の賦活作用を介した抗腫瘍効果が期待できる（T. Oda, T. Morinaga, H. Maeda, “Stimulation of macrophage by polyanions and its conjugated proteins and effect on cell membrane” Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 181 (1986) 9-17.）；
という３点で優れているためであり、このことから、スチレン・マレイン酸系共重合体以外の高分子担体を用いた高分子型抗腫瘍剤と比較して、より強い抗腫瘍活性を示すことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ＳＭＡ−ＣＤＤＰ（実線）、ＳＭＡ（破線）、シスプラチン（点線）の紫外可視吸収スペクトルを示す図である。
【図２】ＳＭＡ−ＣＤＤＰ及びシスプラチンのゲルクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図３】ＳＭＡ−ＣＤＤＰの粒子径分布を示す図である。
【図４】ＳＭＡ−ＣＤＤＰからのシスプラチンの放出率を示す図である。
【図５】ＳＭＡ−ＣＤＤＰとシスプラチンのヒト子宮頸がん細胞に対する細胞毒性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明の高分子型抗腫瘍剤としては、白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体を有効成分として含む限り特に制限はされず、ここで、「イオン結合体を有効成分として含む」とは、イオン結合体を腫瘍細胞の分裂阻害因子の主成分として含むことを意味し、「腫瘍細胞の分裂阻害因子の主成分として含む」とは、腫瘍細胞の分裂を阻害する総因子の少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、中でも９９％以上含むことを意味する。本発明の高分子型抗腫瘍剤の使用法としては特に制限されないが、具体的には点滴による投与が挙げられる。
【００４１】
上記イオン結合体は、水溶性の低い低分子白金系抗腫瘍剤と両親媒性のスチレン・マレイン酸系共重合体とがイオン結合したものであり、このイオン結合体の水溶性は対応する低分子白金系抗腫瘍剤と比較して、遥かに高い水溶性を獲得した。高い水溶性の獲得により、投与の際には水分負荷を減らすことができ、投与時間を短縮し、高濃度の薬液を直接腫瘍部位へ送達させる動注療法をも可能にするという効果を奏する。
【００４２】
また、上記イオン結合体の流体力学直径は６０ｎｍ〜１６０ｎｍであるため、ＥＰＲ効果により、腫瘍組織に選択的に取り込まれ、正常組織にはほとんど取り込まれない。これは、腫瘍組織が急激に増殖するために、腫瘍組織周辺の血管新生が速く、その血管壁には正常組織の血管よりも１桁以上広い数百ナノメートルの隙間が開いているために、高分子化した抗腫瘍剤は正常組織の血管壁からはほとんど漏れず腫瘍組織だけに入り、病変部位の抗腫瘍剤濃度が上昇する。このために、本発明の高分子型抗腫瘍剤は、正常組織への蓄積率よりも腫瘍組織への蓄積率のほうが高くなる。そして、腫瘍組織ではリンパ管が未発達であるために、腫瘍組織に流入した抗腫瘍剤を流しだすメカニズムが発達しておらず、結果的に抗腫瘍剤は腫瘍組織に長時間残存する。一方、正常組織ではリンパ管が発達しているために、わずかに取り込まれた高分子型抗腫瘍剤は、リンパ管によって組織外に排出される。このため、本発明の高分子型抗腫瘍剤は、腫瘍組織へ選択的に蓄積する。
【００４３】
さらに、上記イオン結合体、中性条件では白金系抗腫瘍剤がスチレン・マレイン酸系共重合体から放出されないが、酸性条件下では、水素イオン（Ｈ+）とマレイン酸部分のカルボキシル基にイオン結合したプラチナ原子とがイオン交換することで、白金系抗腫瘍剤がスチレン・マレイン酸系共重合体から放出され、活性化される。
【００４４】
生体内において正常組織はｐＨ７．４程度の中性環境にあるが、腫瘍組織は一般的に低酸素状態となっており、嫌気的解糖によって乳酸が産生され蓄積しているために、ｐＨ５．５〜６．０の酸性環境となっている。このため、上記イオン結合体は正常組織では白金系抗腫瘍剤が活性化されることはないが、腫瘍組織に蓄積したイオン結合体からは、腫瘍組織の酸性環境のために白金系抗腫瘍剤がスチレン・マレイン酸系共重合体から放出される。
【００４５】
以上の腫瘍組織へ選択的に蓄積し、腫瘍組織で特異的に白金系抗腫瘍剤を放出するという、イオン結合体の二つの特徴から、本発明のイオン結合体を有効成分として含む高分子型抗腫瘍剤は正常組織にほとんど影響を与えることなく、腫瘍組織のみで活性化され、選択的な抗腫瘍活性を示すことで、極めて副作用の発生が少ない抗腫瘍剤となる。
【００４６】
本発明の、白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合体が腫瘍細胞の分裂を阻害する作用機序としては、
ｉ）難水溶性白金系抗腫瘍剤が両親媒性であるスチレン・マレイン酸系共重合体にイオン結合することで、イオン結合体を可溶化し；
ii）イオン結合体の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍであるためにＥＰＲ効果により、また、腫瘍組織へ選択的に取り込まれ、蓄積し；
iii）スチレン・マレイン酸系共重合体がエンドサイトーシス経路によって速やかに細胞内へ取り込まれる特徴を利用することで、腫瘍細胞へイオン結合体を選択的に取り込み；
iv）腫瘍組織の酸性環境により、白金系抗腫瘍剤がイオン結合体から放出されることにより活性化され；
ｖ）活性化された白金系抗腫瘍剤がＤＮＡ鎖におけるグアニン塩基と結合することにより、ＤＮＡ合成及びそれに続く腫瘍細胞の分裂を濃度依存的に阻害する；
というものである。
vi）また、白金系抗腫瘍剤を放出した後のスチレン・マレイン酸系共重合体に関しても、マクロファージ、Ｔ−細胞、ＮＫ−細胞活性化による免疫能の賦活作用を介した抗腫瘍効果が期待できる。
【００４７】
上記イオン結合体として、より具体的には上記式［Ｉ］で表される化合物を挙げることができ、Ｒ１とＲ２に含まれる窒素原子の不対電子対とプラチナ原子の空の軌道とが、配位結合により安定な錯体をつくり、白金系抗腫瘍剤のプラチナ原子とスチレン・マレイン酸系共重合体のマレイン酸単位中の二つのカルボキシル基とが、二座でイオン結合し安定な７員環を形成する。
【００４８】
式［Ｉ］における「直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜１０であるアルキルアミン」として、具体的には、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、イソブチルアミン、ジエチルアミン、シクロプロピルメチルアミン、ペンチルアミン、２−ペンチルアミン、３−ペンチルアミン、ネオペンチルアミン、ｔｅｒｔ−アミルアミン、３，３−ジメチル−２−ブチルアミン、ジプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、２，２−ジメチルシクロプロピルメチルアミン、ヘプチルアミン、アミノメチルシクロヘキサン、オクチルアミン、１−シクロヘキシルエチルアミン、１−フェネチルアミン、２−フェネチルアミン、１−（ｐ−トリル）エチルアミン、ノニルアミン、クミルアミン、１−メチル−３−フェニルプロピルアミン、２−フェニル−１−プロピルアミン、デシルアミン、４−フェニルブチルアミン、２−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、及びこれらのハロゲン置換体等を挙げることができる。
【００４９】
式［Ｉ］における「置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルアミン」として、具体的には、シクロプロピルアミン、シクロブチルアミン、シクロペンチルアミン、シクロヘキシルアミン、シクロヘプチルアミン、１−アミノ−２−メチルシクロヘキサン、１−アミノ−３−メチルシクロヘキサン、１−アミノ−４−メチルシクロヘキサン、シクロオクチルアミン、シクロノニルアミン、２，２，５，５−テトラメチルシクロペンチルアミン、３，３，５−トリメチルシクロヘキシルアミン、１−アミノインダン、２−アミノインダン、シクロデシルアミン、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシルアミン、３−ノルアダマンチルアミン、２，２，６，６−テトラメチルシクロシクロヘキシルアミン、１−アダマンタンアミン、２−アミノアダマンタン、１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフチルアミン、及びこれらのハロゲン置換体等を挙げることができる。
【００５０】
式［Ｉ］における「置換若しくは非置換の炭素数が６〜１２である芳香族アミン」として、具体的には、アニリン、メチルアニリン、２−エチニルアニリン、３−エチニルアニリン、４−エチニルアニリン、３，５−ジニトロアニリン、３，４−メチレンジオキシアニリン、ジメチルアニリン、ジメトキシアニリン、エチルアニリン、３−エチニルアニリン、３−メトキシ−２−メチルアニリン、トリメチルアニリン、プロピルアニリン、イソプロピルアニリン、イソプロポキシアニリン、５−アミノインダン、２−メチル−６−エチルアニリン、ジエチルアニリン、ブチルアニリン、ｓｅｃ−ブチルアニリン、ｔｅｒｔ−ブチルアニリン、２−メチル−５−イソプロピルアニリン、ナフチルアミン、ニトロナフチルアミン、メチルナフチルアミン、５−アミノテトラリン、４−アミルアニリン、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−メチルアニリン、エチルナフチルアミン、ジメチルナフチルアミン、２−アミノビフェニル、３-アミノビフェニル、及びこれらのハロゲン置換体等を挙げることができる。
【００５１】
式［Ｉ］における「置換若しくは非置換の炭素数が４〜１２である含窒素芳香族化合物」として、具体的には、ピロール、３−メチルピロール、２，５−ジメチルピロール、２，４−ジメチルピロール、２−エチルピロール、３−エチル−２，４−ジメチルピロール、３−ヘプチルピロール、ピリジン、２−ニトロピリジン、３−ニトロピリジン、４−ニトロピリジン、２−メチルピリジン、３−メチルピリジン、４−メチルピリジン、２−エチニルピリジン、３−エチニルピリジン、４−エチニルピリジン、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、２−エチルピリジン、３−エチルピリジン、４−エチルピリジン、２−プロピルピリジン、３−プロピルピリジン、４−プロピルピリジン、２−（３−ペンチル）ピリジン、２−フェニルピリジン、３−フェニルピリジン、４−フェニルピリジン、２，３−ジメチルピリジン、２，４−ジメチルピリジン、２，５−ジメチルピリジン、２，６−ジメチルピリジン、３，４−ジメチルピリジン、３，５−ジメチルピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピリジン、４−イソプロピルピリジン、２，３−シクロペンテノピリジン、３−ブチルピリジン、４−アミルピリジン、４−シアノピリジン、２，５−ジメチルピリジン、２−シアノピリジン、３−シアノピリジン、２−シアノ−３−メチルピリジン、４−メチル−３−シアノピリジン、２−メチル−５−ニトロピリジン、４−メチル−３−ニトロピリジン、５−メチル−３−ニトロピリジン、２−メトキシ−３−ニトロピリジン、２−メトキシ−５−ニトロピリジン、３−メトキシ−２−ニトロピリジン、３−エトキシ−２−ニトロピリジン、２−エトキシ−５−ニトロピリジン、２−メトキシ−６−メチルピリジン、２，３，５−トリメチル−４−メトキシピリジン、２−メチル−３，４−ジメトキシピリジン、２，３−ジメチル−４−エトキシピリジン、インドール、２−メチルインドール、３−メチルインドール、４−メチルインドール、５−メチルインドール、６−メチルインドール、７−メチルインドール、４−メトキシインドール、５−メトキシインドール、６−メトキシインドール、７−メトキシインドール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、７−ニトロインドール、３−インドールアセトニトリル、２，３−ジメチルインドール、３−メトキシメチルインドール、キノリン、２−メチルキノリン、３−メチルキノリン、４−メチルキノリン、５−メチルキノリン、６−メチルキノリン、７−メチルキノリン、８−メチルキノリン、２−ニトロキノリン、３−ニトロキノリン、４−ニトロキノリン、５−ニトロキノリン、６−ニトロキノリン、７−ニトロキノリン、８−ニトロキノリン、２，６−ジメチルキノリン、２，４−ジメチルキノリン、２−メチル−６−メトキシキノリン、２−メチル−６−エトキシキノリン、２−メチル−８−エトキシキノリン、４−メチル−６−エトキシキノリン、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン、２−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロキノリン、２−メチル−６−ニトロキノリン、２−メチル−８−ニトロキノリン、７−メチル−８−ニトロキノリン、６−メトキシ−８−ニトロキノリン、イソキノリン、１−メチルイソキノリン、６，７−ジメトキシイソキノリン、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン、カルバゾール、１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾールカルバゾール、１，２，３，４−テトラヒドロカルバゾール、及びこれらのハロゲン置換体等を挙げることができる。
【００５２】
式［Ｉ］における「置換若しくは非置換の直鎖状若しくは分岐した炭素数が２〜８であるアルキルジアミン」として、具体的には、エチレンジアミン、１，２−プロパンジアミン、１，３−プロパンジアミン、１，２−ブタンジアミン、１，３−ブタンジアミン、１，４−ブタンジアミン、２，３−ブタンジアミン、２，４−ブチルジアミン、１，２−ジアミノ−２−メチルプロパン、２−メチル−１，３−プロパンジアミン、２−メチル−１，４−ブタンジアミン、１，２−ペンタンジアミン、１，３−ペンタンジアミン、１，４−ペンタンジアミン、１，５−ペンタンジアミン、２，３−ペンタンジアミン、２，４−ペンタンジアミン、１，２−ヘキサンジアミン、１，３−ヘキサンジアミン、１，４−ヘキサンジアミン、１，５−ヘキサンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、２，３−ヘキサンジアミン、２，４−ヘキサンジアミン、２，５−ヘキサンジアミン、３，４−ヘキサンジアミン、１，５−ジアミノ−２−メチルペンタン、１，２−ヘプタンジアミン、１，３−ヘプタンジアミン、１，４−ヘプタンジアミン、１，５−ヘプタンジアミン、１，６−ヘプタンジアミン、１，７−ヘプタンジアミン、２，３−ヘプタンジアミン、２，４−ヘプタンジアミン、２，５−ヘプタンジアミン、２，６−ヘプタンジアミン、３，４−ヘプタンジアミン、３，５−ヘプタンジアミン、１，２−オクタンジアミン、１，３−オクタンジアミン、１，４−オクタンジアミン、１，５−オクタンジアミン、１，６−オクタンジアミン、１，７−オクタンジアミン、１，８−オクタンジアミン、２，３−オクタンジアミン、２，４−オクタンジアミン、２，５−オクタンジアミン、２，６−オクタンジアミン、２，７−オクタンジアミン、３，４−オクタンジアミン、３，５−オクタンジアミン、３，６−オクタンジアミン、及びこれらのハロゲン置換体等を挙げることができる。
【００５３】
式［Ｉ］における「置換若しくは非置換の炭素数が３〜１０である環状アルキルジアミン」として、具体的には、シクロプロパンジアミン、１，２−シクロブタンジアミン、１，２−シクロペンタンジアミン、１，２−シクロヘキサンジアミン、１，２−シクロヘプタンジアミン、１，２−シクロオクタンジアミン、１，２−シクロノナンジアミン、１，２−アミノインダン、１，２−シクロデカンジアミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−１，２−ナフチルアミン、及び１，２，３，４−テトラヒドロ−２，３−ナフチルアミン等を挙げることができる。
【００５４】
式［Ｉ］における「置換若しくは非置換の炭素数が６〜１０であるオルト二置換芳香族ジアミン」として、具体的には、１，２−フェニレンジアミン、２,３−ジアミノトルエン、３，４−ジアミノトルエン、４，５−ジメチル−１，２−フェニレンジアミン、２，３−ジアミノナフタレン、及びこれらのハロゲン置換体等を挙げることができる。
【００５５】
式［Ｉ］における「直鎖状若しくは分岐した炭素数１〜４であるアルキル」として、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ-ブチル、及びこれらのハロゲン置換体等を挙げることができる。
【００５６】
式［Ｉ］における「１〜３個のフッ素原子または塩素原子または臭素原子で置換された若しくは非置換の炭素数１〜４であるカルボキシル」として、具体的には、ホルミルオキシ、フルオロアセトキシ、ジフルオロアセトキシ、トリフルオロアセトキシ、クロロアセトキシ、ジクロロアセトキシ、トリクロロアセトキシ、クロロジフルオロアセトキシ、ブロモアセトキシ、ジブロモアセトキシ、トリブロモアセトキシ、ヨードアセトキシ、プロピオキシ、２−クロロプロピオキシ、２，３−ジクロロプロピオキシ、２−ブロモプロピオキシ、２，３−ジブロモプロピオキシ、アクリロキシ、ブチロキシ、２−クロロブチロキシ、２，３−ジクロロブチロキシ、２，３−ジクロロイソブチロキシ、２−ブロモブチロキシ、２，３−ジブロモブチロキシ、イソブチロキシ、メタクリロキシ、２−(クロロメチル)アクリロキシ、２−(ブロモメチル)アクリロキシ、２−（トリフルオロメチル)アクリロキシ、クロトキシ、４，４，４−トリフルオロクロトキシ、４−ブロモクロトキシ等を挙げることができる。
【００５７】
式［Ｉ］における「糖」として、具体的には、リブロース、キシルロース、リボース、アラビノース、キシロース、マンノース、イドース、ガラクトース、フコース、及びラムノース等を挙げることができ、「オリゴ糖」としては前記の糖が２〜１０個からなって構成するものである。これら糖及びオリゴ糖の水酸基は異なって若しくは同時にメチル若しくはアセチル若しくは分子内アセタールで保護されることが好ましく、分子内アセタールとは具体的には、１つのＲ３を構成する糖又はオリゴ糖の二つの水酸基を含むメチレンアセタール、エチリデンアセタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、及びアセトニド等を挙げることができる。
【００５８】
式［Ｉ］における「置換若しくは非置換のメチレンジオキシ基」として、具体的には、メチレンジオキシ、メチルメチレンジオキシ、フェニルメチレンジオキシ、ｐ−メトキシフェニルメチレンジオキシ、及びジメチルメチレンジオキシ等を挙げることができる。
【００５９】
式［Ｉ］における「ハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシ」として、具体的には、フルオロアセトキシ、ジフルオロアセトキシ、トリフルオロアセトキシ、クロロアセトキシ、ジクロロアセトキシ、トリクロロアセトキシ、クロロジフルオロアセトキシ、ブロモアセトキシ、ジブロモアセトキシ、トリブロモアセトキシ、及びヨードアセトキシ等を挙げることができる。
【００６０】
本発明のイオン結合体の最も好適な態様としては、式［Ｉ］で表されるイオン結合体が、シスプラチンとスチレン・マレイン酸共重合体とのイオン結合体である。
【００６１】
本発明の高分子型抗腫瘍剤における白金系抗腫瘍剤としては、上記式［III］に示される含白金化合物を挙げることができ、特にシスプラチン、オキサリプラチン、オルマプラチン、ロバプラチンを好適に例示することができる。
【００６２】
上記式［Ｉ］で表されるイオン結合体における白金系抗腫瘍剤では、Ｒ１及びＲ２に含まれる窒素原子が配位結合したプラチナ原子とスチレン・マレイン酸系共重合体のマレイン酸単位中の二つのカルボキシル基とが形成する７員環のイオン結合が、ｐＨ５．５〜６．０の酸性環境において切断され、イオン結合体から該白金系抗腫瘍剤が放出、活性化される。このとき、ｐＨ５．５〜６．０の酸性環境にある腫瘍細胞では、イオン結合体と比較して圧倒的に多量の水素イオンが存在するために、Ｒ１及びＲ２がプラチナ原子と二つのカルボキシル基とのイオン結合切断に与える影響が小さくなるためである。
【００６３】
腫瘍細胞においてイオン結合体から放出されることにより活性化された白金系抗腫瘍剤中のプラチナ原子は、正に荷電しているため二本のＤＮＡ鎖のグアニン塩基を架橋し、ＤＮＡ鎖の複製を阻害することで、腫瘍細胞の分裂を阻害する。この際に、上記に示したＲ１及びＲ２は、正電荷を持つプラチナ原子を安定化するために働き、プラチナ原子とＤＮＡ鎖のグアニン塩基との反応を妨げないため、様々なＲ１及びＲ２を選択することができる。
【００６４】
本発明におけるスチレン・マレイン酸系共重合体としては、上記式［II］に示される化合物、すなわち、スチレン・マレイン酸共重合体のスチレン単位中のフェニル基に上記のＲ３で示される置換基が結合した化合物を挙げることができる。
【００６５】
上記式［Ｉ］で表されるイオン結合体におけるスチレン・マレイン酸系共重合体としては、ＥＰＲ効果発現のため、白金系抗腫瘍剤と形成するイオン結合体の流体力学直径が６０ｎｍ〜１６０ｎｍ、好ましくは８０ｎｍ〜１３０ｎｍ、より好ましくは９０ｎｍ〜１２０ｎｍであることが好ましい。ここで、共重合体のスチレン単位中のフェニル基に結合するＲ３は、該イオン結合体が両親媒性とするものであり、一つは、難水溶性である白金系抗腫瘍剤を可溶化するために、イオン結合体を水溶性とする必要があり、二つは、該イオン結合体がエンドサイトーシス経路によって速やかに細胞内へ取り込まれるために、イオン結合体を脂溶性とする必要があるためである。一方、Ｒ３はマレイン酸単位の二つのカルボキシル基のｐＫａにほとんど影響を与えないため、白金系抗腫瘍剤とスチレン・マレイン酸系共重合体とのイオン結合切断及びイオン結合形成反応に与える影響がほとんどない。このため、Ｒ３としては、上記の様々な置換基を選択することができる。
【００６６】
本発明の高分子型抗腫瘍剤の製造方法としては、上記式［II］で表されるスチレン・無水マレイン酸系共重合体と、上記式［III］又は式［IV］で表される含白金化合物とを、ｐＨ９以上、好ましくはｐＨ９〜１１、より好ましくはｐＨ９．５〜１０．５の水溶液中で反応させることにより得られる上記式［Ｉ］で表されるイオン結合体が有効成分となるように配合する製造方法であれば特に制限されない。
【００６７】
上記式［III］又は式［IV］における「ハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシ」としては、フルオロアセトキシ、ジフルオロアセトキシ、トリフルオロアセトキシ、クロロアセトキシ、ジクロロアセトキシ、トリクロロアセトキシ、クロロジフルオロアセトキシ、ブロモアセトキシ、ジブロモアセトキシ、トリブロモアセトキシ、及びヨードアセトキシ等を挙げることができる。
【００６８】
上記式［IV］における「直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜３のアルコキシ」としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、メトキシエトキシ、及びエトキシメトキシ等を挙げることができる。
【００６９】
本件発明の特徴である、白金系抗腫瘍剤のプラチナ原子とスチレン・マレイン酸系共重合体のマレイン酸単位中の二つのカルボキシル基との二座でイオン結合は、その詳細は不明であるが、式［III］又は式［IV］で表される含白金化合物の存在下、式［II］で表されるスチレン・無水マレイン酸系共重合体をｐＨ９以上、好ましくはｐＨ９〜１１、より好ましくはｐＨ９．５〜１０．５の水溶液中で加水分解することで達成される。
【００７０】
水溶液のｐＨ調整剤としては、水溶液のｐＨが９以上、好ましくはｐＨ９〜１１、より好ましくはｐＨ９．５〜１０．５となるものであれば特に制限されないが、具体的には炭酸リチウム、炭酸水素リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び水酸化バリウム等を挙げることができる。
【００７１】
先行技術文献として示した特許第４６６９３９３号には白金系抗腫瘍剤としてシスプラチンを用い、スチレン・マレイン酸系共重合体としてスチレン・マレイン酸共重合体を用いた、高分子型抗腫瘍剤が記載されている。これに示された方法では、あらかじめスチレン・無水マレイン酸共重合体を加水分解し、その後シスプラチンを加えることで高分子型抗腫瘍剤を製造しているが、この高分子型抗腫瘍剤ではシスプラチンの大部分がスチレン・マレイン酸共重合体のミセル中に抱合されおり、ほとんどのシスプラチンとスチレン・マレイン酸共重合体とがイオン結合してはいない。
【００７２】
このことから、含白金化合物の存在下でスチレン・無水マレイン酸系共重合体をｐＨ９以上、好ましくはｐＨ９〜１１、より好ましくはｐＨ９．５〜１０．５の水溶液中で加水分解することで、白金系抗腫瘍剤のプラチナ原子とスチレン・マレイン酸系共重合体のマレイン酸単位中の二つのカルボキシル基との二座でイオン結合を生じるという予期せぬ効果を奏することを見いだした。
【００７３】
ここで、式［III］または式［IV］で表される含白金化合物上のＲ１及びＲ２は、プラチナ原子とスチレン・マレイン酸系共重合体のマレイン酸単位中の二つのカルボキシル基とが、二座でイオン結合し安定な７員環を形成することができ、正電荷を持つプラチナ原子を安定化するため、ＮＨ３に限らず上記に示した様々なＲ１及びＲ２を選択することができる。
【００７４】
また、式［III］または式［IV］で表される含白金化合物上のＸが、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、及びハロゲンで置換されたアセトキシであるとき、ＸのｐＫａは、マレイン酸単位中の二つのカルボキシル基のｐＫａより小さく、スチレン・無水マレイン酸系共重合体の無水マレイン酸部位が加水分解され生じたカルボン酸アニオンが、含白金化合物上のＸと交換し、二つのイオン結合を含む安定な７員環構造を形成することができる。なお、非置換のアセトキシは、マレイン酸単位中の二つのカルボキシル基のｐＫａと同等のｐＫａをもつが、元のアセトキシが結合した含白金化合物よりも、プラチナ原子とスチレン・マレイン酸系共重合体のマレイン酸単位中の二つのカルボキシル基とが７員環を形成した化合物が熱力学的に安定であるために、交換反応が進行する。
【００７５】
さらに、式［IV］で表される含白金化合物上のＹは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ３、ＯＨ、ハロゲンで置換された若しくは非置換のアセトキシ、及び直鎖状若しくは分岐した炭素数が１〜３のアルコキシからなる群から選ばれる一種であることから、上記イオン結合形成反応において、ほとんど影響を及ぼさない。
【００７６】
また、本発明では、反応中に一度凍結乾燥を行うことで、式［III］または式［IV］で表される含白金化合物の微粉末化を行い、再度、水溶液中で反応を行うことによりスチレン・マレイン酸系共重合体への白金系抗腫瘍剤の取り込みを大幅に改善できるという効果を見い出した。
【００７７】
このように、式［III］または式［IV］で表される含白金化合物の存在下、式［II］で表されるスチレン・マレイン酸系共重合体をｐＨ９以上、好ましくはｐＨ９〜１１、より好ましくはｐＨ９．５〜１０．５の水溶液中で加水分解し、一度凍結乾燥を行い、再度、水溶液中で反応を行うことにより、式［Ｉ］で表される白金系抗腫瘍剤の含量が１８％以上となるイオン結合体の製造方法を見い出した。
【実施例１】
【００７８】
シスプラチン−スチレン・マレイン酸共重合体高分子型抗腫瘍剤（ＳＭＡ−ＣＤＤＰ）の製造方法
スチレン・無水マレイン酸共重合体（０．５ｇ／０．２６ｍｍｏｌ）とシスプラチン（０．２ｇ／０．６７ｍｍｏｌ）を０．１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、５分間超音波処理した。その後、この溶液を遮光下４５℃、ｐＨ１０に保ち、３日間程度攪拌した。次に反応溶液を一度凍結乾燥させた。これによりシスプラチンが微粉末化しスチレン・マレイン酸共重合体とシスプラチンの結合効率が上昇する。凍結乾燥品を蒸留水で溶解し、遮光下室温、ｐＨ１０に保ち、１日間程度攪拌し、ＳＭＡ−ＣＤＤＰを調製した。この溶液をミリポア社製Millipore lab scale TFF system により５ｋＤａろ過膜を用いて限外ろ過を行い、ＳＭＡ−ＣＤＤＰを濃縮・精製した。最後に、得られた濃縮液を凍結乾燥し安定的粉末製剤に変換したＳＭＡ−ＣＤＤＰを得た。この反応を３回行ったところ、ＳＭＡ−ＣＤＤＰの平均収量、平均収率はそれぞれ０．５３±０．０３ｇ、７５．２±５．８％、シスプラチンの含有率は２０．１±０．８％、および、シスプラチンの回収率は５２．８±５．４％であった。以下の実施例には、ここで得られたＳＭＡ−ＣＤＤＰを用いた。
【００７９】
［比較例１］
スチレン・無水マレイン酸共重合体（１．０ｇ／０．２６ｍｍｏｌ）とシスプラチン（０．２ｇ／０．６７ｍｍｏｌ）を０．１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、５分間超音波処理した。その後、この溶液を遮光下４５℃、ｐＨ１０に保ち、３日間程度攪拌し、ＳＭＡ−ＣＤＤＰを調製した。この溶液をMillipore lab scale TFF system により５ｋＤａろ過膜を用いて限外ろ過を行い、ＳＭＡ−ＣＤＤＰを濃縮・精製した。最後に、得られた濃縮液を凍結乾燥し安定的粉末製剤に変換したＳＭＡ−ＣＤＤＰを得た。（収量０．６５ｇ、収率５４．２％、シスプラチンの含有率１２．０％）
【実施例２】
【００８０】
紫外可視吸収スペクトル
図１にＳＭＡ−ＣＤＤＰ（実線）、スチレン・マレイン酸共重合体（ＳＭＡ：破線）、シスプラチン（ＣＤＤＰ：点線）の水溶液中での紫外可視吸収スペクトルを示す。ＳＭＡ−ＣＤＤＰのスペクトルは２５８ｎｍの極大吸収（スチレン・マレイン酸共重合体の極大吸収）と３００ｎｍの吸収（シスプラチンの極大吸収）を併せ持つものであった。この結果から実施例１で製造したＳＭＡ−ＣＤＤＰはシスプラチン含有することが分かる。
【実施例３】
【００８１】
ゲルクロマトグラフィー
ゲルクロマトグラフィーの結果を図２に示す。ゲルクロマトグラムにはファルマシアＬＫＢ社製のセファデックスＧ−２５ファインカラムを用い、溶出液としてｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを用いた。検出は、スチレン・マレイン酸共重合体の極大吸収波長である２５８ｎｍ、及びシスプラチンの極大吸収波長である３００ｎｍを用いて行った。ここでは、２５８ｎｍにおけるＳＭＡ−ＣＤＤＰの吸光度を実線、３００ｎｍにおけるＳＭＡ−ＣＤＤＰの吸光度を点線、３００ｎｍにおけるシスプラチンの吸光度を破線で示した。ＳＭＡ−ＣＤＤＰのゲルクロマトグラフィーを行うと、２５８ｎｍ及び３００ｎｍの検出波長において流出開始から２４ｍＬでＳＭＡ−ＣＤＤＰのピークが検出されたが、その他の流出範囲では何も検出されなかった。この結果から、実施例１において均一な分子量分布を持つＳＭＡ−ＣＤＤＰの合成に至ったことと、ＳＭＡ−ＣＤＤＰ中にシスプラチの残存が認められないことが確認された。また、ＳＭＡ−ＣＤＤＰは流出開始から２４ｍＬで検出されたのに対し、シスプラチンは６６ｍＬで検出されたことから、ＳＭＡ−ＣＤＤＰはシスプラチンと比較して分子量が明らかに増大しており、ＳＭＡへの結合によってシスプラチンの高分子化が達成できたことが証明された。
【００８２】
粒子径分布
ＳＭＡ−ＣＤＤＰの粒子径分布を図３に示す。図に示すように、水溶液中において非常に狭い粒子径分布を持つナノ粒子であることが明らかとなった。この結果から、ＳＭＡ−ＣＤＤＰは、ＥＰＲ効果による腫瘍組織への選択的送達が可能となり、シスプラチンに比べ高い腫瘍組織集積性とそれに伴う正常組織への有害反応低下によって効率的な抗腫瘍効果を得るものと考えられる。
【００８３】
ＳＭＡ−ＣＤＤＰの物理化学的性質
実施例１で製造したＳＭＡ−ＣＤＤＰは表１に示すような物理学的性質を持つ。特に、ＳＭＡ−ＣＤＤＰの高い水溶性（５．２ｍｇ／ｍＬ）はシスプラチンの水溶性（１ｍｇ／ｍＬ）と比較して５倍以上の値を示した。このことから、シスプラチンはＳＭＡとイオン結合させることにより、点滴投与時の水分負荷の軽減や高濃度の薬液調整が可能となり動注療法施行時の治療効果増強や利便性の向上をもたらすことが明らかとなった。
【００８４】
【表１】
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【実施例４】
【００８５】
ＳＭＡ−ＣＤＤＰからのシスプラチンの活性化
ｐＨ５．５（実線）及びｐＨ７．４（点線）の水溶液中におけるＳＭＡ−ＣＤＤＰからの経時的なシスプラチンの活性化率を図４に示す。ｐＨ７．４の水溶液中では、測定から９６時間で３．０±０．４％のシスプラチンが加水分解によって極めて緩やかにＳＭＡから放出されるのに対し、ｐＨ５．５の水溶液中では開始から２４時間でＳＭＡから放出されたシスプラチンの量が４．４±０．５％となりｐＨ７．４の水溶液中における９６時間でのシスプラチンの活性化率を上回った。さらにｐＨ５．５の水溶液中での９６時間経過後のシスプラチンの活性化率は、１７．４±０．２％とｐＨ７．４におけるシスプラチンの活性化率と比較して５倍以上の高い値を示した。これより、ＳＭＡ−ＣＤＤＰは体内循環中の血液状態を想定した中性条件下においてシスプラチンの活性化は最小限に抑制されるが、腫瘍細胞内に取り込まれた後、細胞内の低ｐＨ状態に反応して速やかにシスプラチンを活性化し、選択的に標的細胞に作用する特徴を持つ高分子であることが明らかとなった。
【実施例５】
【００８６】
細胞毒性の検定
図５は、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）を用いてＳＭＡ−ＣＤＤＰ（実線）とシスプラチン（点線）の細胞毒性をＭＴＴ法により評価したものである。図に示すように、ＳＭＡ−ＣＤＤＰとシスプラチンのＩＣ５０値はそれぞれ約１０４．１μＭと４．４μＭであった。この結果は、ＳＭＡ−ＣＤＤＰからのシスプラチンの活性化が非常に緩やかであることと関係していると考えられる。実施例４における７２時間でのＳＭＡ−ＣＤＤＰからのシスプラチンの放出率はｐＨ７．４で僅か２．２％であるため、細胞内に取り込まれた後、その低ｐＨ状態に応答してシスプラチンの放出率が上昇したと予想されるが、細胞内取り込み速度が律速段階となり、培養が７２時間ではＳＭＡ−ＣＤＤＰの細胞毒性はシスプラチンのおよそ５％程度に留まったものと思われる。これは、多くの高分子医薬にも同様にみられる現象で、ＳＭＡ−ＣＤＤＰ内のＳＭＡとシスプラチンとのイオン結合が比較的安定であること、ＳＭＡ−ＣＤＤＰから活性化されたシスプラチンによって細胞毒性がもたらされたことが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明は、「医薬品分野」において、副作用の発生率を極めて低くする高分子型抗腫瘍剤を提供するものであり、癌による死亡率が増加の一途をたどっている今日において、本発明の提供する高分子型抗腫瘍剤は医薬品として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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