(57)【要約】【課題】  Ｄ−乳酸を生産可能な水素酸化細菌および前記細菌を用いた無機炭素源からのＤ−乳酸製造方法を提供すること。【解決手段】  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを水素酸化細菌に導入することで得られるＤ−乳酸を製造可能な細菌、および前記細菌を培養することでＤ−乳酸を製造する方法により前記課題を解決する。【選択図】  図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを水素酸化細菌に導入して得られる、Ｄ−乳酸を製造可能な細菌。
【請求項２】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの水素酸化細菌への導入が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターによる水素酸化細菌の形質転換による導入である、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドを含むベクター、または、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドおよびファジンタンパクをコードするポリヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドを含むベクターである、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
水素酸化細菌がポリヒドロキシ酪酸生産能を欠損させたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａである、請求項１から３のいずれかに記載の細菌。
【請求項５】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼが、大腸菌、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのいずれかに由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項１から４のいずれかに記載の細菌。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の細菌を培養することで、Ｄ−乳酸を製造する方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の細菌を水素、酸素、無機塩および無機炭素源の存在下で培養することで、無機炭素源からＤ−乳酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法を用いた、水素酸化細菌によるＤ−乳酸製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオマス由来の生分解性プラスチックとしてポリ乳酸が注目されている。ポリ乳酸はポリプロピレンやポリスチレンなどの代替としての利用が可能であり、食品包装材、パソコン用記録媒体の包装材、衣料品、食器や洗剤の容器など幅広い応用が期待される。現状、ポリ乳酸はＬ−乳酸のホモポリマーであるポリＬ−乳酸の開発が先行しているものの、ポリＬ−乳酸は従来の石油由来のプラスチックと比較し、耐熱性や耐久性が劣る問題点があった。そこで前記課題を解決すべく、ポリＤ−乳酸とのステレオコンプレックスポリマーを製造する試みがなされており、ポリＤ−乳酸をポリＬ−乳酸と混合させることで、融点を従来のＬ−ポリ乳酸（１７０℃）と比較し５０℃向上（２２０℃）させている。
【０００３】
前記ステレオコンプレックスポリマーの原料である、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸のうち、Ｌ−乳酸の製造についてはこれまでにも発酵生産の研究などが盛んに行なわれている。一方、Ｄ−乳酸の製造については研究例が少なく、光学純度が高く、かつ安価な製造コストでＤ−乳酸を生産する方法の開発が望まれている。
【０００４】
微生物発酵によるＤ−乳酸製造方法としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓなどの乳酸菌を用いた方法、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを導入した酵母を用いた方法、ホスホトランスアセチラーゼなどの遺伝子を破壊した組換え大腸菌による方法などがこれまで報告されている。しかしながら乳酸菌や酵母を用いた製造方法は、発酵培地中での栄養要求性が高く、比較的高価な原料である、酵母エキスやペプトンおよびアミノ酸やビタミンといった添加物を、培地として添加する必要がある。また、発酵段階で窒素源由来の副生成物が生じるため、後続の精製プロセスにおけるコストが上昇する問題点があった。一方、組換え大腸菌による製造方法も生産量が低いという問題点があった。
【０００５】
ところで近年、温室効果ガスの低減化が課題となっている。バイオリファイナリーは化石エネルギー資源からの脱却、循環型社会の構築、地球温暖化に対する解決法として注目されており、特に植物由来のバイオマスを原料とした化学品や燃料の製造に関する研究が盛んに行なわれている。しかし農産物を主原料とする場合、季節や天候など自然現象の影響を受けやすいためプロセスの連続化や無人化がしにくく、かつ森林破壊や食料との競合の問題もあった。そのため、環境中に排出された二酸化炭素そのものを直接有用化学物質に変換する技術の開発が求められている。
【０００６】
自然界では、特定の生物による二酸化炭素の固定化が行なわれており、その際、カルビン・ベンソン経路（Ｃａｌｖｉｎ−Ｂｅｎｓｏｎ−Ｂａｓｓｈａｍ  ｃｙｃｌｅ）、還元的ＴＣＡ（トリカルボン酸）経路、３−ＨＰ（ヒドロキシプロピオン酸）経路、還元的アセチル−ＣｏＡ経路のいずれかによって固定化が行なわれる（非特許文献１）。前記経路のうち、還元的ＴＣＡ経路、３−ＨＰ経路および還元的アセチル−ＣｏＡ経路は１分子の二酸化炭素を固定するのに必要なエネルギー効率がカルビン・ベンソン経路より高い。しかしながら、これら３つの炭素固定化経路を有する微生物は特殊・過酷な条件下で生育するものが多く、微生物自体の増殖速度が極めて遅い。また、当該微生物の遺伝子組換え法についても確立されていないため、研究例は炭素固定に関わる酵素の網羅的解析に留まっているのが実状である。
【０００７】
カルビン・ベンソン経路を炭素固定化経路として利用した、二酸化炭素や炭酸塩からの化学品製造については多く報告されており、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓによるグルコースポリマーの製造（特許文献１）、シアノバクテリアを用いたグルコース／フルクトース／Ｄ−乳酸の製造（非特許文献２）、シアノバクテリアを用いたイソブチルアルデヒドの製造（非特許文献３）、高等植物を用いたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の製造（非特許文献４）があげられる。しかしながら、これらシアノバクテリアや高等植物を用いた例は、光エネルギー（光合成）により炭素固定を行なうためエネルギー効率が悪く、炭素固定効率が低いことが知られている。そのため、工業的に化学品を製造する場合は広大な面積のリアクターが必要となる。一方で化学エネルギー（非光合成）により炭素固定を行なう、鉄酸化細菌、硫黄酸化細菌、水素酸化細菌などの化学合成細菌が知られている。中でも水素酸化細菌は光合成と比べ炭素固定におけるエネルギー効率が格段に高く、リアクターの小型化も可能なため、工業的な化学品製造に利用する微生物として有望視されている。特に水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは、水素を酸化する際に生じる化学エネルギーを用いてカルビン・ベンソン経路で炭素固定を行う独立栄養微生物であり、全ゲノム解析がなされている上、遺伝子組換え方法も確立されている（非特許文献５）ことから、遺伝子工学的手法による有機酸やタンパク質生産の宿主として有望視されている。
【０００８】
水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは二酸化炭素、酸素、水素と無機塩のみの独立栄養条件で増殖することができ、窒素、リン、酸素などが供給制限になるような培養条件下では、菌体重量の９０％に及ぶ大量のポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を蓄積することが知られており、従属栄養条件下での高密度培養においてはＰＨＢを含む菌体収量が２８１ｇ／Ｌにまで達することが報告されている（非特許文献６）。また、現在環境負荷軽減、循環型社会構築の為のバイオベースの生分解性ポリマーに関心が集まる中、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の合成研究も行なわれている。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いたＰＨＡの研究に関しては、培地中の炭素源の種類や組成、培養条件を変動させてＰＨＡの構成成分となるユニット組成をコントロールする研究（非特許文献７）や、遺伝子組換え体を用いて非天然型（３−ヒドロキシプロピオン酸ユニットを取り込んだ）ＰＨＡを生産した研究（非特許文献８）がされている。
【０００９】
また遺伝子工学的手法を用いた、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａによる化学品製造についても報告されている。一例として、２−メチルクエン酸の製造（非特許文献９）、２−ＨＩＢＡ（ヒドロキシイソブチル酸）の製造（非特許文献１０）、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸の製造（非特許文献１１）、シアノフィシンの製造（非特許文献１２）、有機リン加水分解酵素の製造（非特許文献１３）があげられ、特に有機リン加水分解酵素の製造（非特許文献１３）ではタンパク質の高発現を実現している。しかしながら、ここであげた例はいずれもフルクトースやグルコン酸などの有機炭素源を原料にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平０５−１１５２９０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇ，ＩＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，４４７−４６０（２０１０）．
【非特許文献２】Ｎｉｅｄｅｒｈｏｌｔｍｅｙｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７６，３４６２−３４６６（２０１０）．
【非特許文献３】Ａｔｓｕｍｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７，１１７７−１１８０（２００９）．
【非特許文献４】Ｓｎｅｌｌ，ＫＤ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，４，２９−４０（２００２）．
【非特許文献５】Ｃｒａｍｍ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，３８−５２（２００９）．
【非特許文献６】Ｒｙｕ，ＨＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５５，２８−３２（１９９７）．
【非特許文献７】Ｆｏｓｔｅｒ，ＬＪ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７５，１２４１−１２４７（２００７）．
【非特許文献８】Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．，１０，７００−７０６（２００９）．
【非特許文献９】Ｅｗｅｒｉｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，８，５８７−６０２（２００６）．
【非特許文献１０】Ｈｏｅｆｅｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８８，４７７−４８４（２０１０）．
【非特許文献１１】Ｓｈｉｒａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０２，５２９−５３４（２００６）．
【非特許文献１２】Ｄｉｎｉｚ，ＳＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，６９８−７１７（２００６）．
【非特許文献１３】Ｂａｒｎａｒｄ，ＧＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，３８，２６４−２７１（２００４）．
【非特許文献１４】Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７，６−１２（２００１）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述したように、ポリ乳酸の原料であるＤ−乳酸については、光学純度が高く、かつ安価な製造コストで製造する方法の開発が求められている。
【００１３】
また水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは、二酸化炭素、酸素、水素と無機塩のみの独立栄養条件で増殖することができるため、二酸化炭素から有機酸などの化学品を製造させる宿主として有望視されている。しかしながら、これまでの所、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが有する炭素固定経路を利用した、二酸化炭素、炭酸塩、炭酸水素イオンといった無機炭素源からの化学品製造例は、当該細菌が本来生産するポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）の例（非特許文献１４）しかなかった。
【００１４】
そこで本発明の目的は、Ｄ−乳酸を生産可能な水素酸化細菌および前記細菌を用いた無機炭素源からのＤ−乳酸製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、炭素固定能を持つ水素酸化細菌にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入して得られた形質転換体が無機炭素源からＤ−乳酸を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
（１）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを水素酸化細菌に導入して得られる、Ｄ−乳酸を製造可能な細菌。
【００１７】
（２）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの水素酸化細菌への導入が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターによる水素酸化細菌の形質転換による導入である、（１）に記載の細菌。
【００１８】
（３）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドを含むベクター、または、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドおよびファジンタンパクをコードするポリヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドを含むベクターである、（２）に記載の細菌。
【００１９】
（４）水素酸化細菌がポリヒドロキシ酪酸生産能を欠損させたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａである、（１）から（３）のいずれかに記載の細菌。
【００２０】
（５）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼが、大腸菌、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのいずれかに由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼである、（１）から（４）のいずれかに記載の細菌。
【００２１】
（６）（１）から（５）のいずれかに記載の細菌を培養することで、Ｄ−乳酸を製造する方法。
【００２２】
（７）（１）から（５）のいずれかに記載の細菌を水素、酸素、無機塩および無機炭素源の存在下で培養することで、無機炭素源からＤ−乳酸を製造する方法。
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
本発明の細菌は、元来炭素固定能を有している水素酸化細菌にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを付与することで得られ、培養によりＤ−乳酸を製造することができる。特に本発明の細菌は、水素、酸素、無機塩および無機炭素源の存在下（すなわち独立栄養条件下）で培養することで、無機炭素源からＤ−乳酸を製造することができる。本発明において無機炭素源とは、二酸化炭素や炭酸塩、およびそれらが溶液中に溶解した形である炭酸水素イオンや炭酸イオンなどを指す。
【００２５】
本発明の細菌を水素、酸素、無機塩および無機炭素源の存在下（すなわち独立栄養条件下）で培養した場合、まず水素酸化細菌が有するカルボニックアンヒドラーゼの作用により無機炭素源は分子状二酸化炭素に変換され、水素酸化細菌が有するリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の働きにより炭素固定経路に取り込まれる。その後中間代謝物であるピルビン酸を経て、付与したＤ−乳酸デドロゲナーゼの作用によりＤ−乳酸に変換される。一方、本発明の細菌を糖などの有機炭素源存在下で培養した場合は、ペントースリン酸経路、エムデン-マイヤーホフ（Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ）経路またはエントナー・ドウドロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ）経路を経てピルビン酸を生成し、付与したＤ−乳酸デドロゲナーゼの作用によりＤ−乳酸に変換される。
【００２６】
本発明の細菌は、水素酸化細菌に、Ｄ−乳酸を生産するためのＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することで得られる。本発明の細菌を得るのに用いる水素酸化細菌に特に限定はないものの、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが、気体状の二酸化炭素や炭酸塩を単一炭素源とした状態で増殖可能な点、全ゲノム情報が解析されている点、および遺伝子組換え法が確立されている点で好ましい。なお前述したように、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは有機酸を放出せず、菌体内に大量のポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を生産し蓄積することが知られている。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが有するＰＨＢ生産能を欠損させると、中間代謝物であるピルビン酸がアセチルＣｏＡを経てＰＨＢまで誘導し蓄積されるのを抑制できるため、付与したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの作用によるＤ−乳酸製造を促進させることができる。そのため、本発明のＤ−乳酸製造に用いる水素酸化細菌宿主としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＢ生産能を欠損させた変異株が特に好ましい。ＰＨＢ生産能を欠損させたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａの例としては、化学変異株であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ５４１）が例示できる。ただしＰＨＢ＿４株は炭酸固定に関わる遺伝子にも変異があり、炭酸固定能が低いという報告がある。そのため本質的には、遺伝子工学的手法などによりＰｈａＣ（ＰＨＡシンターゼ）のみを欠損させたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ変異株が、本発明におけるＰＨＢ生産能を欠損させたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａとして好ましいといえる。
【００２７】
本発明においてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼは、ピルビン酸よりＤ−乳酸を生成可能なものであれば特に限定はなく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼがあげられる。
【００２８】
本発明の細菌は、水素酸化細菌にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入することで得られる。導入方法としては主に、発現ベクターを用いた方法と、自殺ベクターを用いたゲノム組換え法がある。導入に用いる発現ベクターとしては公知の広域宿主ベクターを用いることができ、一例としてｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２３７５１）、ｐＫＴ２３０、ｐＢＨＲ１があげられる。また導入に用いる自殺ベクターの一例としては、ｐＪＱ２００ｍｐ１８、ｐＮＨＧ１、ｐＬＯ１があげられる。
【００２９】
発現ベクターを用いた方法では、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより水素酸化細菌を形質転換することで本発明の細菌を得ることができる。また、発現ベクターにＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを挿入する際、その５’末端側にファジンプロモーター（ｐｈａｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）配列を有するオリゴヌクレオチドを付加すると好ましい。ファジンプロモーターは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが本来有する、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）顆粒の表面を覆うタンパクであるファジンタンパク（ｐｈａｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産するための強力なプロモーターであり、培地中の窒素源やリン源の枯渇下で活性化することが知られている。そのため、ファジンプロモーターを導入することで、培地中の窒素源やリン源を枯渇させるだけで、高価な誘導剤の添加なしにＤ−乳酸の高生産が可能となる。なお、ファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドを付加する際、ファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドおよびファジンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加させた態様であってもよい。
【００３０】
自殺ベクターを用いたゲノム組換え法によりＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入する場合は、トランスポゾン変異導入によるゲノム中へのランダム変異導入で行なってもよいが、相同組換えにより水素酸化細菌のゲノム中に存在するＤ−乳酸以外の物質生産遺伝子を破壊する形で導入するとさらに効果的である。例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株は酸素欠乏状態でＬ−乳酸を生成することが知られているが、ゲノム中のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを挿入してＬ−乳酸デヒドロゲナーゼを破壊することで、副生成物としてのＬ−乳酸の生成を防ぎ、結果として光学純度の高いＤ−乳酸を得ることができる。
【００３１】
なお、発現ベクターと自殺ベクターとを組み合わせてもよく、例えば、自殺ベクターを用いて水素酸化細菌ゲノム中のＤ−乳酸合成に不要な遺伝子（例えば、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）にＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを挿入して当該遺伝子を破壊後、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより水素酸化細菌を形質転換することで、より効率的にＤ−乳酸を製造可能な細菌が得られることが期待される。なお、発現ベクターと自殺ベクターとを組み合わせた、水素酸化細菌への外来遺伝子導入の一例として、シアノフィシン合成酵素（ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を導入した組換えＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いた、有機炭素源を原料としたシアノフィシン（ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ）生産に関する研究がある。当該研究は、エントナー・ドウドロフ経路の遺伝子であるＫＤＧＰ−アルドラーゼ（２−Ｋｅｔｏ−３−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｌｄｏｌａｓｅ）を破壊したＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａに、ＫＤＧＰ−アルドラーゼとシアノフィシン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することで、プラスミドの脱落を防ぎつつ増殖連動型でシアノフィシンを生産させることができ、その生産性を向上させている。
【００３２】
本発明の細菌は、無機炭素源からＤ−乳酸を製造可能な細菌であるが、有機炭素源からも効率良くＤ−乳酸を製造可能であり、Ｄ−乳酸を製造する際、無機炭素源存在下での培養、有機炭素源存在下での培養、無機炭素源および有機炭素源存在下での培養、いずれの培養でもよく、これらの培養を組み合わせてもよい。例として、
まず栄養源の豊富な培地で菌体を高密度に培養し、窒素源またはリン源枯渇後、有機炭素源を添加してさらに培養を行ないＤ−乳酸を製造する方法や、
まず栄養源の豊富な培地で菌体を高密度に培養し、培養した菌体を水素、酸素、無機塩および二酸化炭素のみを含む栄養源の少ない培地に置換してさらに培養を行ないＤ−乳酸を製造する方法、
が例示できる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の細菌により、以下の効果を奏することができる。
（１）本発明の細菌は、水素酸化細菌の持つ炭素固定能力と遺伝子導入したＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの働きとを組み合わせることで、これまで困難であった無機炭素源からのＤ−乳酸製造を可能とする。本発明の細菌は安価な無機炭素源として工場から排出される二酸化炭素なども利用でき、環境負荷低減にも効果的である。
（２）従来の乳酸発酵法では、原料として、小麦全粒粉加水分解物、酵母エキス、ペプトン、アミノ酸やビタミンなどの高価な原料を用いる必要があった。一方、本発明の細菌を用いたＤ−乳酸の製造方法は、原料として菌の生育に最低限必要な塩を含んだ培地と無機炭素源または有機炭素源しか用いないこと、また無機炭素源として二酸化炭素や炭酸塩、有機炭素源としてグルコン酸やフルクトースと、いずれも安価な原料を使用できること、から安価にＤ−乳酸を製造することができる。
（３）本発明の細菌を用いたＤ−乳酸の製造方法は、Ｄ−乳酸精製のコストを従来の方法より抑えることができる。一般に微生物を用いた乳酸製造においては、精製工程において培地中の窒素源由来の不純物が問題になるが、本発明の細菌は窒素源枯渇後にＤ−乳酸を生成するため、菌体残骸を十分除きさえすれば、その後の精製工程は容易である。また一般に水素酸化細菌は他の微生物と比べ有機酸を蓄積しにくいため、従来の乳酸発酵で問題となっていた酢酸や蟻酸などの副生を最小限に抑えることができ、蓄積した有機酸による増殖阻害も回避可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１（１）から（５）で作製したプラスミドの構造を示した図。
【図２】実施例１（６）から（９）で作製したプラスミドの構造を示した図。
【図３】実施例１で作製したプラスミドによるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａへの形質転換を確認した結果を示す電気泳動写真。
【図４】実施例１（１）から（５）で作製したプラスミドによりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換して得られた形質転換体を用いてＤ−乳酸を製造した結果を示す図。
【図５】実施例１（２）、（６）、（７）、（８）および（９）で作製したプラスミドによりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換して得られた形質転換体を用いてＤ−乳酸を製造した際の菌体量（ＯＤ６００）を示す図。
【図６】実施例１（２）、（６）、（７）、（８）および（９）で作製したプラスミドによりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換して得られた形質転換体を用いてＤ−乳酸を製造した際のＤ−乳酸生成量を示す図。
【図７】本発明の細菌を独立栄養条件下で培養したときの、Ｄ−乳酸生成量を示す図。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明する。なお本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００３６】
実施例１  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ発現ベクターの作製
下記（１）から（９）に示す、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド（発現ベクター）を作製した。
【００３７】
（１）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
（１−１）ＰＣＲ反応により大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より５番目か
ら１０番目までの配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１１番目から３８番
目は配列番号３のうち５’末端側より１０３番目から１３０番目までの領域に相
当）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より４番目か
ら９番目の配列はＥｃｏＲＩサイトの配列であり１０番目から３７番目は配列番
号３のうち５’末端側より１０６５番目から１０９２番目までの領域の相補鎖に
相当）
・鋳型
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｗ３１００株のコロニーを水に懸
濁したもの
・ＰＣＲ反応
９４℃で２分、その後９８℃で１０秒−６３℃で３０秒−６８℃で１分のサイク
ルを４０回、最後に６８℃で７分
（１−２）（１−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号３のうち５’末端側より１０３番目から１０９２番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（１−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションした（反応温度１６℃）。
（１−４）ライゲーション液を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（１−５）形質転換操作後の溶液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））に塗布した。
（１−６）得られたコロニーを培養し、プラスミド抽出後、様々な制限酵素による切断パターンを分析することで、目的とする形質転換体のスクリーニングを行ない、プラスミドｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８は（１−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
（１−７）広域宿主ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２３７５１）で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株の培養液からプラスミド精製キットを用いて調製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
（１−８）（１−７）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約５．１ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
（１−９）（１−６）で得られた形質転換体よりプラスミドｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
（１−１０）（１−９）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（１−１１）（１−８）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（１−１０）で得られたラスミドｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８消化物とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーション反応後（反応温度１６℃）、常法により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（１−１２）形質転換操作後の溶液を、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンと１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ寒天培地に塗布した。
（１−１３）得られたコロニーを培養し、プラスミド抽出後、様々な制限酵素による切断パターンを分析することで、目的とする形質転換体のスクリーニングを行ない、プラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（１））は、大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを含むポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し正方向に挿入されたプラスミドである。
【００３８】
（２）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼおよびＳＤ配列（シャイン・ダルガノ配列）をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
（２−１）ＰＣＲ反応により大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）およびＳＤ配列を含むポリヌクレオチドを増幅した。なおＰＣＲ条件は、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとして配列番号４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より５番目から１０番目までの配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１１番目から４４番目は配列番号３のうち５’末端側より８２番目から１１５番目までの領域に相当）を用いた他は、（１−１）と同様である。
（２−２）（２−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号３のうち５’末端側より８２番目から１０９２番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（２−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、（１−３）と同様にライゲーションを行なった。
（２−４）（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。ｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８は（２−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
（２−５）（２−４）で得られた形質転換体よりプラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
（２−６）（２−５）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（２−７）（１−８）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（２−６）で得られたプラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（２−８）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（２））は、大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードするポリヌクレオチドおよびそのＳＤ配列を含むオリゴヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し、正方向に挿入されたプラスミドである。
【００３９】
（３）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＳＤ配列およびプロモーター領域をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
（３−１）ＰＣＲ反応により大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、ＳＤ配列およびプロモーター領域を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（配列番号３のうち５’末
端側より１番目から２７番目までの領域に相当）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より４番目か
ら９番目の配列はＥｃｏＲＩサイトの配列であり１０番目から３７番目は配列番
号３のうち５’末端側より１０６５番目から１０９２番目までの領域の相補鎖に
相当）
・鋳型
大腸菌Ｗ３１００株のコロニーを水に懸濁したもの
・ＰＣＲ反応
９８℃で２分、その後９８℃で１０秒−５５℃で３０秒−７２℃で１分のサイク
ルを４０回、最後に７２℃で７分
（３−２）（３−１）で得られた約１．１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号３のうち５’末端側より１番目から１０９２番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（３−３）精製したポリヌクレオチド断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてライゲーションした（反応温度４℃）。
（３−４）（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法で、プラスミドＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ形質転換体を得た。ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＧＥＭ−Ｔは（３−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−ＴのＥｃｏＲＶサイトに、ＬａｃＺの向きに対し、逆方向に挿入されたプラスミドである。
（３−５）広域宿主ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２３７５１）で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株の培養液からプラスミド精製キットを用いて調製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｐｅＩで消化した。
（３−６）（３−５）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約５．１ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
（３−７）（３−４）で得られた形質転換体よりプラスミドＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＧＥＭ−Ｔを調製し、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｐｅＩで消化した。
（３−８）（３−７）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１．１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（３−９）（３−６）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（３−８）で得られたプラスミドＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（３−１０）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（３））は、大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードするポリヌクレオチド、そのＳＤ配列からなるオリゴヌクレオチド、およびプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し、正方向に挿入されたプラスミドである。
【００４０】
（４）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ、ＳＤ配列およびプロモーター領域をＬａｃプロモーターに対し逆方向に挿入したプラスミド
（４−１）（３−１）から（３−４）に示す方法と同様な方法で、（３−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＶｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＶサイトに、ＬａｃＺの向きに対し、正方向にｌｄｈＡが挿入されたプラスミドであるｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ形質転換体を得た。
（４−２）（４−１）で得られた形質転換体よりプラスミドｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＧＥＭ−Ｔを調製し、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｐｅＩで消化した。
（４−３）（４−２）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１．１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（４−４）（３−６）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（４−３）で得られたプラスミドｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＧＥＭ−Ｔ消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（４−５）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（４））は、大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードするポリヌクレオチド、そのＳＤ配列からなるオリゴヌクレオチド、およびプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し、逆方向に挿入されたプラスミドである。
【００４１】
（５）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをＬａｃプロモーターに対し逆方向に挿入したプラスミド
（５−１）ＰＣＲ反応により大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を含むポリヌクレオチドを増幅した。なおＰＣＲ条件は、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとして配列番号６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より４番目から９番目までの配列はＥｃｏＲＩサイトの配列であり１０番目から３７番目は配列番号３のうち５’末端側より１０３番目から１３０番目までの領域に相当）を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より５番目から１０番目までの配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１１番目から３８番目は配列番号３のうち５’末端側より１０６５番目から１０９２番目までの領域の相補鎖に相当）を、それぞれ用いた他は、（１−１）と同様である。
（５−２）（５−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号３のうち５’末端側より１０３番目から１０９２番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（５−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、（１−３）と同様にライゲーションを行なった。
（５−４）（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドｒｅｖ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。ｒｅｖ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８は（５−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
（５−５）（５−４）で得られた形質転換体よりプラスミドｒｅｖ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
（５−６）（５−５）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（５−７）（１−８）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（５−６）で得られたプラスミドｒｅｖ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（５−８）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドｒｅｖ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドｒｅｖ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（５））は、大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を含むポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し逆方向に挿入されたプラスミドであり、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼを発現しないように設計したネガコンストラクトである。
【００４２】
（６）Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼおよびＳＤ配列をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
（６−１）ＰＣＲ反応によりＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＩＦＯ３４２６（ＮＢＲＣ３４２６）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．））およびＳＤ配列を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目か
ら６番目の配列はＫｐｎＩサイトの配列、７番目から１３番目の配列は人工ＳＤ
配列（配列番号１８）、１８番目から３１番目は配列番号１０のうち５’末端側
より１番目から１４番目までの領域に相当）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目か
ら６番目の配列はＸｈｏＩサイトの配列であり７番目から３４番目は配列番号
１０のうち５’末端側より９６９番目から９９６番目までの領域に相当）
・鋳型
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＩＦＯ３４２６株のコ
ロニーを水に懸濁したもの
・ＰＣＲ反応
９８℃で２分、その後９８℃で１０秒−６３℃で３０秒−６８℃で１分のサイク
ルを４０回、最後に６８℃で７分
（６−２）（６−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号１０のうち５’末端側より１番目から９９６番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（６−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、（１−３）と同様にライゲーションを行なった。
（６−４）（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ｐＵＣ１１８は（６−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
（６−５）広域宿主ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２３７５１）で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株の培養液からプラスミド精製キットを用いて調製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化した。
（６−６）（６−５）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約５．１ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
（６−７）（６−４）で得られた形質転換体よりプラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化した。
（６−８）（６−７）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（６−９）（６−６）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（６−８）で得られたプラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ｐＵＣ１１８消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（６−１０）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図２（６））は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＩＦＯ３４２６株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、および人工ＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧＡ、配列番号１８）を含むオリゴヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し、正方向に挿入されたプラスミドである。
【００４３】
（７）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼおよびＳＤ配列をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
（７−１）ＰＣＲ反応によりＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＢＲＣ３０７０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｏｘＤ）およびＳＤ配列を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目
から６番目の配列はＫｐｎＩサイトの配列、７番目から１３番目の配列は人工
ＳＤ配列（配列番号１８）、２１番目から４７番目は配列番号１３のうち５’末
端側より２番目から２８番目までの領域に相当）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目
から６番目の配列はＸｈｏＩサイトの配列であり９番目から３３番目は配列番号
１３のうち５’末端側より１３７１番目から１３９５番目までの領域に相当）
・鋳型
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＢＲＣ３０７０株のコロ
ニーを水に懸濁したもの
・ＰＣＲ反応
９４℃で２分、その後９８℃で１０秒−６３℃で３０秒−６８℃で１．４分のサ
イクルを４０回、最後に６８℃で７分
（７−２）（７−１）で得られた約１．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号１３のうち５’末端側より２番目から１３９５番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（７−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、（１−３）と同様にライゲーションを行なった。
（７−４）（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ｐＵＣ１１８は（７−１）で得られた約１．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
（７−５）（７−４）で得られた形質転換体よりプラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化した。
（７−６）（７−５）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１．４ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（７−７）（６−６）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（７−６）で得られたプラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ｐＵＣ１１８消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（７−８）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＤ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図２（７））は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｏｘＤ）をコードするポリヌクレオチドのうち開始コドンをＴＴＧからＡＴＧに変えたもの、および人工ＳＤ配列（ＡＧＧＡＧＧＡ、配列番号１８）を含むオリゴヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し、正方向に挿入されたプラスミドである。
【００４４】
（８）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファジンプロモーター（ｐｈａＰｐ）をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
（８−１）ＰＣＲ反応によりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＡファジンプロモーター（ｐｈａＰｐ、以下Ｐｐと略）を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より７番目
から１２番目の配列はＡｐａＩサイトの配列であり１３番目から３６番目は配列
番号１６のうち５’末端側より１番目から２４番目までの領域に相当）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より７番目
から１２番目の配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１３番目から４０番目
は配列番号１６のうち５’末端側より４１１番目から４３８番目までの領域の相
補鎖に相当）
・鋳型
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９Ｄ−
５）ゲノム
・ＰＣＲ反応
９８℃で２分、その後９８℃で１０秒−５５℃で３０秒−７２℃で１分のサイク
ルを４０回、最後に７２℃で７分
（８−２）（８−１）で得られた約０．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号１６のうち５’末端側より１番目から４３８番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（８−３）精製したポリヌクレオチド断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてライゲーションし、（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドＰｐ／ｐＧＥＭ−Ｔ形質転換体を得た。Ｐｐ／ｐＧＥＭ−Ｔは（８−１）で得られた約０．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−ＴのＥｃｏＲＶサイトに挿入されたプラスミドである。
（８−４）（１）で調製したプラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（１））を制限酵素ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
（８−５）（８−４）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約６．１ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
（８−６）（８−３）で得られた形質転換体よりプラスミドＰｐ／ｐＧＥＭ−Ｔを調製し、制限酵素ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
（８−７）（８−６）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約０．４ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（８−８）（８−５）で得られたプラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（８−７）で得られたプラスミドＰｐ／ｐＧＥＭ−Ｔ消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（８−９）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図２（８））は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来ＰＨＡファジンプロモーター（Ｐｐ）をコードするポリヌクレオチドおよび大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードするポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し、Ｐｐ−ｌｄｈＡの順に正方向に挿入されたプラスミドである。
【００４５】
（９）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＡファジンプロモーター（Ｐｐ）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファジンタンパク（ｐｈａＰ１）と大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）との融合タンパク遺伝子をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
（９−１）ＰＣＲ反応によりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＡファジンプロモーター（Ｐｐ）およびファジンタンパク（ｐｈａＰ１）をコードするポリヌクレオチドのうちｐｈａＰ１の終止コドンを除く全長を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。なおＰＣＲ条件は、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より７番目から１２番目までの配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１３番目から４１番目は配列番号１６のうち５’末端側より９９２番目から１０２０番目までの領域の相補鎖に相当）を用いた他は、（８−１）と同様である。
（９−２）（９−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号１６のうち５’末端側より１番目から１０２０番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
（９−３）精製したポリヌクレオチド断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてライゲーションし、（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドＰｐ−Ｐ１／ｐＧＥＭ−Ｔ形質転換体を得た。Ｐｐ−Ｐ１／ｐＧＥＭ−Ｔは（９−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−ＴのＥｃｏＲＶサイトに挿入されたプラスミドである。
（９−４）（９−３）で得られた形質転換体よりプラスミドＰｐ−Ｐ１／ｐＧＥＭ−Ｔを調製し、制限酵素ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
（９−５）（９−４）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
（９−６）（８−５）で得られたプラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（９−５）で得られたプラスミドＰｐ−Ｐ１／ｐＧＥＭ−Ｔ消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
（９−７）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＰｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＰｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図２（９））は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来ＰＨＡファジンプロモーター（Ｐｐ）をコードするポリヌクレオチドおよび、「ファジンタンパク（ｐｈａＰ１）と大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）との融合タンパク」をコードするポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐｌａｃ）に対し、Ｐｐ−ｐｈａＰ１−ｌｄｈＡの順に正方向に挿入されたプラスミドである。
【００４６】
実施例２  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ形質転換体の作製
実施例１で得られた各プラスミドを用いて接合伝達法により水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換した。
（１）実施例１で得られた各プラスミドにより接合性大腸菌Ｓ１７−１株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換体のスクリーニングを行なった。
（２）得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム）で、３７℃・一晩培養した。
（３）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ  ５４１）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ２５−１株（ＤＳＭ  ４３０；ｃａｎ（炭酸脱水酵素）変異株）をそれぞれ抗生物質を含まないＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトンディッキンソン社製、濃度：８ｇ／Ｌ）培地で、３０℃・一晩培養した。
（４）（２）および（３）の培養液を遠心分離により菌体濃度を濃縮後、ＯＤ６００を用いて菌体濁度を求め、（２）で調製した各大腸菌Ｓ１７−１株形質転換体と（３）で調製した各Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ株とを菌体濁度１：１の比で混合した。
（５）混合後、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ寒天培地（８ｇ／Ｌ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトンディッキンソン社製）、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））により、３７℃で一晩培養した。
（６）プレート表面の菌体をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈを用いて懸濁し、この懸濁液をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈで１０００倍希釈後、６００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ寒天培地により、３０℃で２日から３日培養した。なお、コントロールとして、各大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体のみおよび各Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ株のみについても、同様に培養をした。結果、コントロールの培養液を塗布したプレートではコロニーは０から数個出現するのみであったが、接合を行なった菌体培養液を塗布したプレートからはそれぞれ数十個のコロニーが得られた。なお、得られたクローンは培養後プラスミド抽出し、様々な制限酵素による切断パターンの分析により、目的のプラスミドが伝達されたことを確認した。
（７）得られたクローンがＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであることを確認する為、各接合菌体のクローン培養液からＦａｓｔ  ｐｕｒｅ  ＤＮＡ  ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ製）でゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の増幅を行なった。
【００４７】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果を図３に示す。なお図３の、レーン２、３、８、９、１０の説明において、スラッシュの左側は形質転換に用いたプラスミドを、スラッシュの右側は形質転換に用いた宿主（大腸菌またはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）をそれぞれ示す。大腸菌Ｓ１７−１株（レーン４）およびその形質転換体（レーン８）から抽出したゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた場合ではＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子（ｃｂｂＬ２、ｃｂｂＳ２、ｃｂｂＸ２；約３．１ｋｂｐ）に相当するバンドが確認されなかったのに対し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ親株（レーン５から７）およびその形質転換体（レーン２、３、９、１０）から抽出したゲノムＤＮＡ、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６ゲノムＤＮＡをＰＣＲの鋳型として用いた場合ではＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子（約３．１ｋｂｐ）のバンドが確認できたことから、接合伝達の結果得られた形質転換体が大腸菌ではなく、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであることを確認した。
【００４８】
実施例３  従属栄養培養条件下でのＤ−乳酸生産（その１）
実施例１の（１）から（５）で調製したプラスミドを用いて、それぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）を形質転換して得られた形質転換体（以下、ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、ｓｄ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、ｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、ｒｅｖ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株とそれぞれ表記）、および実施例１の（１）から（５）で調製したプラスミドを用いて、それぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ  ５４１）を形質転換して得られた形質転換体（以下、ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、ｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、ｒｅｖ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株とそれぞれ表記）を用い、従属栄養培養条件下でＤ−乳酸を生成させた。
（１）各形質転換体について、３００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈが入った１４ｍＬラウンドチューブ（ベクトンディッキンソン社製）２本を用意し、当該チューブに各形質転換体のグリセロールストックを植菌した。
（２）３０℃で２日間培養し、７０００Ｇの遠心により菌体を沈降させた後、一方のラウンドチューブの菌体に培地Ａを、他方のラウンドチューブの菌体に培地Ｂを入れ、懸濁させた。
（培地Ａ）
３００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシドを含む３ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ
（培地Ｂ）
３００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ、４％（ｗ／ｖ）のフルクトー
スを含む３ｍＬのＭＳＭ培地（３．６ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｇ／Ｌ  
ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、
１０ｍＬ／Ｌ  Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
※  Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１０ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．３ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、
１．２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
２．０ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、
０．１２ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、０．２ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２、
２０ｍｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、６ｍｇ／Ｌ  ＣｒＣｌ２、
１０ｍＬ／Ｌ  ３５％ＨＣｌ
（３）３０℃で３日間培養後、全てのチューブに４％（ｗ／ｖ）グルコン酸を添加し、引き続き３日間３０℃で培養を行なった。
（４）培養液を１．５ｍＬセーフロックチューブ（エッペンドルフ社製）に１ｍＬずつ採取し、７０００Ｇの遠心により集菌後、培養上清中のＤ−乳酸量を乳酸測定キット（Ｆ−キット  Ｌ−乳酸／Ｄ−乳酸、ジェイ・ケイ・インターナショナル社製）で測定した。
【００４９】
Ｄ−乳酸を定量した結果を図４に示す。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株形質転換体では、ｓｄ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、ｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（培地Ａ）で培養した場合、Ｄ−乳酸の生成が認められた。一方、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株形質転換体では、ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（培地Ａ）およびＭＳＭ培地（培地Ｂ）で培養した場合、ならびにｒｅｖ−ＰＥｃｏｌｉ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株をＭＳＭ培地（培地Ｂ）で培養した場合、Ｄ−乳酸の生成が認められた。
【００５０】
図４より、水素酸化細菌であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａをＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換することで、水素酸化細菌でＤ−乳酸を製造できることがわかる。なお、宿主については、同じＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａであっても、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）生産能を欠損させた株であるＰＨＢ＿４株のほうがＨ１６株よりもＤ−乳酸の生産に好ましいことがわかる。
【００５１】
実施例４  従属栄養培養条件でのＤ−乳酸生産（その２）
実施例３の結果Ｄ−乳酸生産量の高かったｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、実施例１の（６）から（９）で調製したプラスミドを用いて、それぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）を形質転換して得られた形質転換体（以下、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／Ｈ１６株、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／Ｈ１６株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、Ｐｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株とそれぞれ表記）、実施例１の（６）から（９）で調製したプラスミドを用いて、それぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ  ５４１）を形質転換して得られた形質転換体（以下、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ＰＨＢ＿４株、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株とそれぞれ表記）、および実施例１の（６）から（９）で調製したプラスミドを用いて、それぞれＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ２５−１株（ＤＳＭ  ４３０）を形質転換して得られた形質転換体（以下、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／２５−１株、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／２５−１株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ／２５−１株、Ｐｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／２５−１株とそれぞれ表記）を用い、従属栄養培養条件下でＤ−乳酸を生成させた。
（１）各形質転換体について、３００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトンディッキンソン社製）が入った１４ｍＬラウンドチューブ（ベクトンディッキンソン社製）を用意し、当該チューブに各形質転換体のグリセロールストックを植菌した。
（２）３０℃で２日間培養後、培養液４０μＬをそれぞれ培地Ｃ、培地Ｄ、培地Ｅに植菌した。なお、Ｐｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／Ｈ１６株、Ｐｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／２５−１株は増殖が確認できなかったため、以降の操作は行なっていない。
（培地Ｃ）
５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ、４％（ｗ／ｖ）のグルコン酸を
含む３ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ
（培地Ｄ）
５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ、４％（ｗ／ｖ）のフルクトース
を含む３ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ
（培地Ｅ）
５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ、４％（ｗ／ｖ）のグルコン酸、
１％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＭＳＭ培地
（３）３０℃で培養を行ない、培養４日目と７日目の菌体をそれぞれ採取し、ＯＤ６００による菌の濁度と培養上清中のＤ−乳酸量を乳酸測定キット（Ｆ−キット  Ｌ−乳酸／Ｄ−乳酸）で測定した。
【００５２】
ＯＤ６００の結果を図５に、培養上清中のＤ−乳酸量を図６にそれぞれ示す。評価した形質転換体のうち、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）生産能を欠損させた株であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株をＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換して得られた形質転換体（ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−Ｐ１−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／ＰＨＢ＿４株、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／ＰＨＢ＿４株）は菌の増殖が遅く、かつＤ−乳酸を多く生成していることから、Ｄ−乳酸の工業的製造に好ましいといえる。一方、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株と同様にポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）生産能を有する株であるＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ２５−１株をＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターにより形質転換して得られた形質転換体（Ｐｐ−ｌｄｈＡ／２５−１株、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｍｅｓｅｎ．）／２５−１株、Ｄ−ｌｄｈ（Ｌ．ｐｌａｎｔ．）／２５−１株）ではＤ−乳酸の生成がほとんど確認できなかった。
【００５３】
実施例５  独立栄養培養条件でのＤ−乳酸生産
実施例４で評価した形質転換体のうち、ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株およびＰｐ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株を、独立栄養培養条件下でＤ−乳酸を生成させた。
（１）各形質転換体を３００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈで３０℃で一晩培養を行なった。
（２）３００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈに、ＯＤ６００が０．２になるように培養物を植菌し、ＯＤ６００が約１．０になるまで３０℃で培養した。
（３）最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、引き続きＯＤ６００が４から５になるまで３０℃で培養した。
（４）培養後の菌体を７０００Ｇの遠心により集菌後、ＭＳＭ培地に懸濁し、再び７０００Ｇの遠心により菌体を洗浄した。
（５）洗浄後の菌体を、１２０ｍＭのＮａＨＣＯ３、３００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧを含む４ｍＬのＭＳＭ培地に再懸濁し、１００ｍＬ容量の気密性のアルミシールバイアル（ＧＬサイエンス社製）に入れ、開口部をブチルゴムセプタムとアルミシールで封印した。
（６）ガス混合機ＧＢ−３Ｃ（コフロック製）を用いて、体積組成で８０％水素／１０％酸素／１０％二酸化炭素の混合ガスをブチルゴムセプタム部分からシリンジ針により１Ｌ／ｍｉｎ、１分間の流速で流して気相を置換し、３０℃で４日間培養を行なった。
（７）培養液を１．５ｍＬ容のセーフロックチューブ（エッペンドルフ社製）に１ｍＬずつ採取し、７０００Ｇの遠心により集菌後、培養上清中のＤ−乳酸量を乳酸測定キット（Ｆ−キット  Ｌ−乳酸／Ｄ−乳酸）で測定した。
【００５４】
Ｄ−乳酸を定量した結果を図７に示す。ｓｄ−ｌｄｈ／ＰＨＢ＿４株からは約０．７ｇ／ＬのＤ−乳酸が、Ｐｐ−ｌｄｈ／ＰＨＢ＿４株からは０．４ｇ／ＬのＤ−乳酸がそれぞれ生成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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