(57)【要約】【課題】  哺乳類動物の腫瘍細胞増殖を抑制する化合物を提供する。【解決手段】  哺乳類動物の腫瘍細胞増殖を抑制する化合物は、下記構造を有する化合物（Ｉ）であって、ｎは０〜９の整数である。2013170168.tif 000006  化合物（Ｉ）は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞又は肝癌細胞を抑制する。【選択図】図１Ａ
2013170168.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で示す構造を有し、哺乳類動物の腫瘍細胞増殖を抑制する化合物（Ｉ）であって、
【化１】
2013170168.tif 000005
ｎは、０〜９の整数である化合物。
【請求項２】
前記腫瘍細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞又は肝癌細胞である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記乳癌細胞は、エストロゲン受容体陽性の乳癌細胞株、又はエストロゲン受容体陰性の乳癌細胞株である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物（Ｉ）は、ｎ＝０である請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の前記化合物（Ｉ）、前記化合物（Ｉ）を有効成分とする加工物、又は天然物からの抽出物、前記化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩類、前記化合物（Ｉ）の薬学的に許容される溶媒和物、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物。
【請求項６】
前記化合物（Ｉ）を有効成分とする加工物は、樟芝の発酵液である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
乳癌細胞増殖抑制（ヒトの治療を除く）に応用される請求項１に記載の化合物（Ｉ）の使用方法。
【請求項８】
前記乳癌細胞増殖抑制は、乳癌上皮−間葉細胞転換抑制、乳癌細胞転移抑制、血管新生抑制、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現抑制又は乳癌細胞のオートファジー調節を含む請求項７に記載の化合物（Ｉ）の使用方法。
【請求項９】
乳癌細胞増殖抑制薬物の調製に応用される請求項１に記載の化合物（Ｉ）の使用方法。
【請求項１０】
前記乳癌細胞増殖抑制薬物は、乳癌上皮−間葉細胞転換抑制薬物、乳癌細胞転移抑制薬物、血管新生抑制薬物、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現抑制薬物又は乳癌細胞のオートファジー調節薬物を含む請求項９に記載の化合物（Ｉ）の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物に関し、特に、哺乳動物の腫瘍細胞増殖を抑制する化合物及びその医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
統計によれば、乳癌で死ぬ人は、毎年、全世界で２５万もおり、台湾では、乳癌の発生率が女性癌の第２位を占めている。１９９０年から１９９１年まで、台湾地域における癌の死亡者数が、一年間で３．８３％増え、３２９９３人になり、死亡率の２６．０５％を占めていた。乳癌は、台湾女性の１０大致死癌の１つで、次第に増える傾向にあり、多発年齢も欧米より若い。毎年、１２００人近い女性が乳癌で死亡し、それは女性の健康を著しく脅かしている。癌の発生は、遺伝子及び後天的な環境と強く関わっており、特に飲食と緊密な関係にある。
【０００３】
乳癌の治療方法は、手術、放射線治療、化学療法、内分泌療法、免疫療法及び漢方治療を含む。乳癌の治療は、疾病の段階、患者の年齢、患者が更年期かどうか、腫瘍の大きさ、及び腫瘍の表面に特定のホルモンの受容体があるか否かに基づいて決めなければならない。
乳癌の初期においては、癌細胞を確実に破壊するために、外科手術による治療に合わせて、放射線治療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）を行う。少量の癌細胞が残る、或いは他に転移すると、危険性があるため、ホルモン療法、化学療法及びモノクロナール抗体療法を含む薬物療法（補助療法ともいう）と合わせなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１９１４８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在の乳癌治療薬には、それぞれ副作用があるが、好適な治療効果を達成するために、使用においては、患者自身の状況及び病歴を考慮する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そのため、本発明の一態様は、下記化学式１で示す構造を有し、哺乳類動物の腫瘍細胞増殖を抑制する化合物（Ｉ）であって、
【化１】
2013170168.tif 000003
ｎは０〜９の整数である化合物を提供する。ここで、化合物（Ｉ）で増殖が抑制可能な腫瘍細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞又は肝癌細胞である。
【０００７】
本発明の一実施例によると、化合物（Ｉ）で増殖が抑制される乳癌細胞は、エストロゲン受容体陽性の乳癌細胞株、又はエストロゲン受容体陰性の乳癌細胞株である。
【０００８】
本発明の別の態様は、前記化合物（Ｉ）、化合物（Ｉ）を有効成分とする加工物、又は天然物からの抽出物、化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩類、化合物（Ｉ）の薬学的に許容される溶媒和物（ｓｏｌｖａｔｅ）又はそれらの組み合わせを含む哺乳類動物の腫瘍細胞増殖を抑制するための医薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明の一実施例によると、哺乳類動物の腫瘍細胞増殖を抑制するための医薬組成物において、化合物（Ｉ）を有効成分とする加工物は、樟芝（ベニクスノキタケ）の発酵液である。
【００１０】
本発明の一実施例によると、乳癌の癌細胞増殖を抑制する医薬組成物は、内服剤、注射剤又は外用塗布剤である。
【００１１】
本発明の別の態様は、乳癌上皮−間葉細胞転換抑制、又は乳癌上皮−間葉細胞転換抑制薬物の調製に応用される化合物（Ｉ）の使用方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様は、乳癌細胞転移抑制、又は乳癌細胞転移抑制薬物の調製に応用される化合物（Ｉ）の使用方法を提供する。
【００１３】
本発明のさらに他の態様は、血管新生抑制、又は血管新生抑制薬物の調製に応用される化合物（Ｉ）の使用方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらに１つの態様は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現抑制、又はＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現抑制薬物の調製に応用される化合物（Ｉ）の使用方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらに１つの態様は、乳癌細胞のアポトーシス／オートファジー調節、又は乳癌細胞のアポトーシス／オートファジー調節薬物の調製に応用される化合物（Ｉ）の使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
上記によると、本発明の実施例による化合物（Ｉ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ+）、或いは非エストロゲン受容体（ＥＲ−）薬物に好適に用いられ、化合物（Ｉ）の乳癌を予防する作用メカニズムは、乳癌上皮−間葉細胞転換、癌細胞転移、血管新生、癌細胞のオートファジー／アポトーシスの進行に対する抑制を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
下記図面の説明は、本発明の前記または他の目的、特徴、メリット、実施例をより分かりやすくするためのものである。
【００１８】
【図１Ａ】異なる投与量の化合物（Ｉ）を与えた場合の、ヒトの正常な乳腺細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）、非侵入性乳癌細胞（ＭＣＦ−７）及び侵入性乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の生存率への抑制に対する影響を定量化した図である。
【図１Ｂ】細胞コロニー形成アッセイによって、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のコロニー形成に対する化合物（Ｉ）の影響を解析した結果である。
【図２Ａ】濃度０、０．５、１、２ｍＭの化合物（Ｉ）により２４時間培養された乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＥＭＴ関連タンパク質のウエスタンブロット解析結果である。
【図２Ｂ】濃度０、１０、１５、２０μＭの化合物（Ｉ）により２４時間培養された乳癌細胞ＭＣＦ−７におけるＥＭＴ関連タンパク質のウエスタンブロット解析結果である。
【図３】Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの一次抗体を用いて、免疫細胞化学的解析によって得られたＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎルシフェラーゼ活性を定量化した解析図である。
【図４】細胞免疫蛍光染色法によって、ＮＦ−κＢの一次抗体を用いて、蛍光顕微鏡で２００倍視野において観察した写真である。
【図５Ａ】異なる投与量の化合物（Ｉ）を与えた場合の、ウエスタンブロット解析法によって、乳癌細胞における特定のタンパク質の含有量への影響を検出する結果である。
【図５Ｂ】異なる投与量の化合物（Ｉ）を与えた場合の、Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ酵素活性解析法によって、乳癌細胞におけるＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２及びｕＰＡの酵素活性への影響を検出する結果である。
【図６】ウエスタンブロット解析法によって、化合物（Ｉ）処理時間の増加の、乳癌細胞におけるＥＲＫ１／２、ｐ３８及びＪＮＫ１／２のタンパク質含有量及びそのリン酸化反応への影響を検出した結果である。
【図７】ウエスタンブロット解析法によって、化合物（Ｉ）処理時間の増加の、乳癌細胞におけるＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのタンパク質含有量及びそのリン酸化反応への影響を検出した結果である。
【図８】活性酸素種産生量測定法によって、化合物（Ｉ）処理投与量の増加の、乳癌細胞におけるＲＯＳ含有量への影響を検出した結果である。
【図９】乳癌細胞を化合物（Ｉ）によって処理して培養した後の細胞の生存率を解析して定量化した図である。
【図１０】スクラッチアッセイによって、異なる投与量の化合物（Ｉ）による癌細胞遊走を解析して定量化した図である。
【図１１】トランスウェル移動アッセイによって、化合物（Ｉ）による乳癌細胞移行への影響を観察した結果を示す図である。
【図１２】異なる投与量の化合物（Ｉ）による、ヒト臍帯静脈内皮細胞の細胞生存率についての解析である。
【図１３】スクラッチアッセイによって、顕微鏡下で、異なる投与量の化合物（Ｉ）による、ＴＮＦ−αに刺激された細胞遊走の状況の解析である。
【図１４】Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ酵素活性解析法によって、化合物（Ｉ）に対する、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αに刺激された細胞が誘導されて発生したＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２の酵素活性を検出した解析結果である。
【図１５】異なる投与量の化合物（Ｉ）による、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３の細胞生存率についての解析である。
【図１６】異なる濃度の化合物（Ｉ）が存在する場合の、ウエスタンブロット解析による、腫瘍細胞の生存を促進するＨｅｒ−２／ｎｅｕ関連タンパク質の発現状況である。
【図１７】活性酸素種産生量測定法によって、化合物（Ｉ）で処理した乳癌細胞におけるＲＯＳ含有量を検出して定量化した図である。
【図１８】２．５ｍＭの酸化防止剤ＮＡＣが存在する場合の、４０μＭの化合物（Ｉ）で処理した乳癌細胞の細胞生存率解析である。
【図１９】異なる濃度の化合物（Ｉ）が存在する場合の、乳癌細胞ＭＣＦ−７を７２時間培養した後、細胞オートファジー関連のＬＣ３Ｂタンパク質の発現状況である。
【図２０】異なる濃度の化合物（Ｉ）が存在する場合の、乳癌細胞ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１を２４、４８又は７２時間培養した後、細胞オートファジー関連のＬＣ３−ＩＩタンパク質の発現状況である。
【図２１】対照群及び化合物（Ｉ）注射群のＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１移植ヌードマウスの成長週数と腫瘍体積を比較した結果である。
【図２２】組織病理学検査の顕微鏡写真である。
【図２３】腫瘍移植ヌードマウスの細胞内のシグナル伝達関連タンパク質の発現量の、免疫組織化学染色による顕微鏡写真である
【図２４】図２３に示したＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの一次抗体反応を定量化した結果である。
【図２５】図２３に示したＶｉｍｅｎｔｉｎの一次抗体反応を定量化した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施形態によると、癌細胞増殖を抑制できる化合物（Ｉ）としては、化学合成によるもの、又は天然物、加工物若しくはその抽出物に由来するものであってよく、本発明の実施例によると、合成された化合物（Ｉ）、又は樟芝の発酵液から得られた化合物（Ｉ）含有の天然物又は加工物の抽出物に関わらず、乳癌細胞成長に対して、何れも抑制効果が一致していることを表している。そのため、下記試験例では、ｎ＝０の場合の化合物（Ｉ）の構造を、試験の対象とする。理解すべきことは、純粋な化合物（Ｉ）による効果は、化合物（Ｉ）を主な有効成分とする混合物に同様に現れることである。
【００２０】
下記実施例は、本発明の特定事項を明らかにし、当業者による本発明の内容に対する理解及び実施に寄与するためのものである。ただし、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００２１】
[一、化合物（Ｉ）による多種類の腫瘍細胞の生存率への抑制]
＜試験例１：化合物（Ｉ）は異なる組織の癌細胞の生存率に影響を与えることができる＞
本発明の実施例の化合物（Ｉ）は、多種類の腫瘍細胞を死滅させる能力を有する。異なる細胞に対する化合物（Ｉ）の半数致死量（ＩＣ50）について、下記表１を参照する。
【００２２】
【表１】
2013170168.tif 000004
【００２３】
表１の結果から、化合物（Ｉ）は、乳癌細胞の成長に対する抑制作用が最も著しく、そのＩＣ50は７．５１μＭであることが判明した。そのため、下記で、乳癌細胞を例として、乳癌細胞の成長に対する化合物（Ｉ）の影響を解析する。
【００２４】
＜試験例１‐１：化合物（Ｉ）による乳癌細胞の生存率への抑制＞
試験用の細胞は、ヒト乳腺細胞ＭＣＦ−１０Ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１であった。ＭＣＦ−７は、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ；ＥＲα）陽性（ＥＲα（+））の乳腺癌細胞株であり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、エストロゲン受容体陰性（ＥＲα（‐））の乳腺癌細胞株である。
【００２５】
乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７）を、食品工業発展研究所の生物資源保存及び研究センター（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ；ＢＣＲＣ）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ‐ＤＭＥＭ）培養液で培養した。ヒト乳腺細胞ＭＣＦ−１０Ａを、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培養液（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ‐ＤＭＥＭ  Ｆ１２／ｉｎｓｕｌｉｎ／ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｌ／  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）で培養した。インキュベーターを、５％ＣＯ２、３７℃恒温に維持した。細胞を一定数まで培養した場合、回転数９００ｒｐｍで１０分間遠心して、培養液を除去し、実験の２４時間前に、培養液を交換し、細胞の数を細胞計数器（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）によって算出した。
【００２６】
細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の測定は、細胞賦活評価試験（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｓｓａｙ；ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）によって行った。細胞生存率検出の試験方法については、Ｐａｒａｄａ‐Ｔｕｒｓｋａ等により提案されたステップを参照する。
【００２７】
乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、２４穴プレートに植え、翌日、細胞が壁に付着した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培養液を加え、細胞を同期化させた後、翌日、異なる濃度の化合物（Ｉ）を加え、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養し、ＰＢＳで１回洗浄し、また、それぞれ４００μｌのＭＴＴ試薬を加え、４時間反応させた後、４００μｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を更に加え、１２時間反応させ、２００μｌの上澄みを抽出して９６穴マイクロプレートに入れ、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【００２８】
図１Ａは、異なる投与量の化合物（Ｉ）を与える場合の、ヒトの正常な乳腺細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）、非侵入性乳癌細胞（ＭＣＦ−７）及び侵入性乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の生存率への抑制に対する影響を定量化した図である。データ結果を、平均値±標準偏差（ＳＤ値）で表し、ｎ＝３、ｐ＜０．０５である。
【００２９】
図１Ａの結果から、試験濃度０〜４０μＭの化合物（Ｉ）がＭＣＦ−１０Ａ、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に２４時間作用した後、正常な乳腺細胞ＭＣＦ−１０Ａに対するＩＣ５０濃度は、約２５μＭであり、ＭＣＦ−７に対するＩＣ50濃度は、約３０μＭであり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する毒性は最も強く、そのＩＣ50濃度は、約６．５μＭであることが明らかになった。
【００３０】
前記結果から、化合物（Ｉ）は、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株活性に対して、強い抑制効果を有することが判明できる。
＜試験例１‐２：化合物（Ｉ）による腫瘍細胞の細胞コロニーの形成への抑制＞
【００３１】
乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のコロニー形成に対する化合物（Ｉ）の影響を理解するために、細胞コロニー形成アッセイ（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって観察した。
【００３２】
図１Ｂの（ａ）部分は、細胞を細胞マトリックスに付着させた後、異なる濃度の化合物（Ｉ）で２４時間反応させてから、１０％ＦＢＳを含む新鮮な細胞培養液に交換した後、５日間培養した細胞コロニーの成長状況であり、図１Ｂの（ｂ）部分は、（ａ）部分に示した細胞コロニーをコンピュータに走査して、７０％アルコールでコロニーを溶解し、吸光度５４０ｎｍで測定して得られた数値である。
【００３３】
図１Ｂの（ａ）部分の結果は、化合物（Ｉ）が、乳癌細胞のコロニー形成に対して著しい抑制作用を有することを示し、（ｂ）部分の結果から、試験の形成した乳癌細胞コロニーの数は、化合物（Ｉ）の投与量との依存性を示すことが判明できる。
【００３４】
[二、化合物（Ｉ）による乳癌上皮−間葉細胞転換（ＥＭＴ）への抑制]
＜試験例２−１：化合物（Ｉ）による乳癌細胞上皮−間葉細胞転換への抑制＞
腫瘍転移とは、腫瘍細胞が原発巣から、一連のステップを介して、遠位部の器官組織へ拡散し、別の新しい腫瘍塊を形成する過程である。癌細胞が侵入移行能力を得るのは、まず、上皮細胞形態と間葉細胞形態との間の相互転換、それと同時に、互いの元の細胞特性も変えることにあり、したがって、上皮−間葉細胞転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥＭＴ）とは、上皮細胞形態が間葉細胞形態に変わる過程である。
【００３５】
癌転移は、侵入能力（ｉｎｖａｓｉｏｎ）の起動、遊出（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）及び転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）の過程を含む。侵入の過程において、腫瘍細胞は、細胞同士の間の接着性を失い、移動性を得る。そして、遊出した細胞は、血液及びリンパ系に入り、最後、癌細胞は、目標位置に転移して、新しい腫瘍細胞になる。
【００３６】
癌細胞にＥＭＴを起動させるには、数多くのシグナル伝達経路があり、トランスフォーミング成長因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β：ＴＧＦ−β）、Ｗｎｔ／β−ｃａｔｅｎｉｎ(カテニン)、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅｓ（ＰＩ３Ｋ）及び核内因子（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ）−κＢ（ＮＦ−κＢ）等を含む、数多くのタンパク質の活性化に関わっている。細胞がＴＧＦ−βにより活性化されると、例えば、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、ｓｌｕｇ、ＳＩＰ１のような転写因子は、上皮細胞形態の代表的な分子であるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ(カドヘリン)の発現を更に低下させ、間葉形態の代表的な分子であるＮ‐ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ（インテグリン）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ビメンチン）及び細胞外マトリックス金属プロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＭＭＰｓ）の発現を増加させ、細胞の移動及び侵襲性を促進する。
【００３７】
また、上皮内癌が転移するかどうかは、腫瘍細胞の周囲の環境の変化が重要な要素である。肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）及びトランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ‐β：ＴＧＦ−β）を含む数多くの成長因子及びシトシンも、癌転移を促進する可能性が高い。おおよそで言えば、これらの成長因子は、ＰＫＣ、ＰＩ３／ＡＫＴ及びＨＧＦＲ‐ｃＭｅｔのようなシグナル伝導経路を介して、Ｎ‐ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（フィブロネクチン）、ｓｎａｉｌ、ｓｌｕｇ、ｔｗｉｓｔ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３又はＭＭＰ−９等の関連タンパク質の発現を活性化させて、腫瘍転移を促進する一方、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ；ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎ（デスモプラキン）、ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）及び細胞接着分子（Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＣＡＭ）等の関連タンパク質の発現を減少させることがある。
【００３８】
よって、以下、化合物（Ｉ）による腫瘍細胞への抑制作用のメカニズムを観察するために、前記指標的な細胞タンパク質について、ウエスタンブロット解析を行った。
【００３９】
図２Ａ及び図２Ｂは、ウエスタンブロット解析法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって、異なる投与量の化合物（Ｉ）を与えた場合の、乳癌細胞における特定のタンパク質の含有量への影響を検出する図である。
【００４０】
その内、図２Ａは、２４時間培養された乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＥＭＴ関連タンパク質の発現に対する、濃度０、０．５、１、２ｍＭの化合物（Ｉ）の影響状況であり、図２Ｂは、２４時間培養された乳癌細胞ＭＣＦ−７におけるＥＭＴ関連タンパク質の発現に対する、濃度０、１０、１５、２０μＭの化合物（Ｉ）の影響状況である。
【００４１】
ウエスタンブロット解析のステップは、下記の通りである。
細胞を４℃のＰＢＳで２回洗浄し、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を加え、ラバーポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ  ｐｏｌｉｃｅｍａｎ）で細胞をすり潰して溶解させ、この細胞溶解液を１．５ｍｌの微量遠心管に入れ、１分間振動し、また、回転数１２０００ｒｐｍで１０分間遠心して上澄みを取って、タンパク質の濃度をバイオラッドプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）で測定し、残りのタンパク質抽出液を−７０℃で保存する。１００μｇのタンパク質溶液を取って、等体積で約２倍濃度のＳＤＳ／プロテインローディングバッファ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を加え、１００℃で１０分間煮沸し、冷却した後、タンパク質サンプルをそれぞれ入れて、電圧を１００ボルトに調整し、タンパク質サンプルの泳動が終わってから、タンパク質電気泳動の転写を行う。
１枚のニトロセルロース紙を取り、メタノールで濡らした後、４℃のアイスボックスにおける転写タンクにいれて、６００μＡの電流でタンパク質の転移を行い、４時間後、ＰＶＤＦを取り出して、１％ＢＳＡのＰＢＳブロッキング溶液に置いて、２時間揺動させた後、一次抗体のブロッキング溶液に置いて、室温で１時間ゆっくり揺動させ、ＰＢＳＴで、毎回３−５分間、回転数１００ｒｐｍでＰＶＤＦを３回洗浄する。
その後、ＰＶＤＦ膜を、異なる一次抗体、希釈倍数によって、水平型回転装置において、室温で２時間揺動させ、ＰＢＳＴで３回洗浄し、そして、冷光画像機器を用いて、ＰＶＤＦ膜を、タンパク質の側を上向きにするように、プラスチックグリップで黒色金属プレートに置いて、１：１で混合された化学発光基体（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を膜に加え、異なる抗体の蛍光の強弱によって露光時間を決める。
【００４２】
図２Ａに示した（ａ）部分は、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｏｃｃｌｕｄｉｎ及びＩＣＡＭを含む、腫瘍の進行に対する抑制に寄与するタンパク質の発現状況である。（ｂ）部分は、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、β−ｃａｔｅｎｉｎ及びＶＥＧＦを含む、腫瘍の進行を促進するタンパク質の発現状況である。β−ａｃｔｉｎ（アクチン）は、内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）である。
【００４３】
図２Ａ（ａ）部分の結果が示すように、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、腫瘍の進行に対する抑制に寄与するタンパク質であるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｏｃｃｌｕｄｉｎ及びＩＣＡＭの発現量は何れも増え、投与量の依存性を示す。それに対して、図２Ａ（ｂ）部分の結果は、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における腫瘍の進行を促進するタンパク質の発現量は何れも減少することを示す。
【００４４】
また、図２Ｂの中で、（ａ）部分は、乳癌細胞ＭＣＦ−７における、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ−β−ｃａｔｅｎｉｎ及びｏｃｃｌｕｄｉｎを含む、腫瘍の進行に対する抑制に寄与するタンパク質の発現状況である。（ｂ）部分は、乳癌細胞ＭＣＦ−７における、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ及びβ−ｃａｔｅｎｉｎを含む、腫瘍の進行を促進するタンパク質の発現状況である。β−ａｃｔｉｎは、内部標準である。
【００４５】
図２Ｂは、図２Ａと類似する結果を示す。図２Ｂ（ａ）部分の結果が示すように、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＭＣＦ−７細胞において、腫瘍の進行に対する抑制に寄与するタンパク質であるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ−β−ｃａｔｅｎｉｎ及びｏｃｃｌｕｄｉｎの発現量は何れも増え、投与量の依存性を示す。それに対して、（ｂ）部分の結果は、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＭＣＦ−７細胞における、腫瘍の進行を促進するタンパク質の発現量は何れも減少することが明らかになった。
【００４６】
よって、化合物（Ｉ）は、上皮−間葉細胞転換に対して、著しい抑制効果を有する。また、現在、侵入性癌細胞が改めてＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを過剰に発現する場合、その侵入性が比較的低くなり、腫瘍の進行抑制に寄与する、と開示する文献がある。
【００４７】
＜試験例２−２：化合物（Ｉ）による乳癌細胞の細胞質におけるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現の向上＞
ウエスタンブロット解析の結果によると、化合物（Ｉ）は、乳癌細胞のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ発現に対する向上効果、及び乳癌細胞のＶｉｍｅｎｔｉｎ発現に対する抑制効果を有するため、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を例として、細胞におけるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＶｉｍｅｎｔｉｎの発現状況を実際的に観察する。
【００４８】
図３は、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの一次抗体を用いて免疫細胞化学的解析（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ；ＩＣＣ）によって得られたＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎルシフェラーゼ活性（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を定量化した解析図である。その内、空ベクトル（ｐＣ３．１）のみ含有する形質転換体を陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）とし、化合物（Ｉ）を添加しなかったものを背景値対照群とし、その翻訳活性を１００％とする。
【００４９】
免疫細胞化学的解析は、腫瘍組織をパラフィンで埋め込み、ミクロトームで厚さ５ｍｍのスライドを切り出し、また、脱ろう、再水和、回復等を経て、スライドを挟み出して、一次抗体Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎに入れて、１．５時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体で更に３０分間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄し、３,３'-ジアミノベンジジン（３',３'‐ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｅｎｄｉｎｅ；ＤＡＢ）によって１：３０の割合で染色し、更に、Ｅｎｔｅｌｌａｎで封入する。
【００５０】
図３の結果は、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞質におけるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量も連れて増えることを示す。なお、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるｖｉｍｅｎｔｉｎの発現も、化合物（Ｉ）に抑制される。
【００５１】
＜試験例２−３：化合物（Ｉ）による乳癌細胞におけるＮＦκＢの発現の向上＞
前記によると、化合物（Ｉ）は、乳癌細胞における上皮細胞形態の代表的な分子であるＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現を著しく向上させ、間葉形態の代表的な分子であるＶｉｍｅｎｔｉｎの発現を低下させることができることが既に分かったため、そのシグナル伝達経路における上下流の活性化因子の発現を検討することによって、腫瘍の進行を抑制する関連メカニズムを更に明確にすることができる。
【００５２】
癌細胞の転移中において、核内因子（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ）−κＢ（ＮＦ−κＢ）の転写活性は、かなり重要な要因であり、ＮＦ−κＢは、数多くの転移関連タンパク質の発現を調整・制御するため、細胞におけるＮＦ−κＢの発現状況によって、化合物（Ｉ）によるＥＭＴシグナル伝達への影響を更に理解する。
【００５３】
図４は、細胞免疫蛍光染色（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｅｎｒｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）法によって、ＮＦ−κＢの一次抗体を用いて、蛍光顕微鏡で２００倍視野において観察した写真である。
【００５４】
細胞免疫蛍光染色解析とは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、異なる濃度の化合物（Ｉ）で刺激した後、ＮＦ−κＢの一次抗体（１：２５０希釈）を加え、３７℃、５％ＣＯ２において２時間培養した。更に、蛍光二次抗体（１：２００希釈）を加え、最後、ＤＡＰＩ（１：１０００希釈）を加え、光線を避けるように室温で５分間放置し、蛍光顕微鏡で観察して写真を撮り（２００ｘ）、また、マウンティングジェルで封入する。
【００５５】
図４の結果が示すように、化合物（Ｉ）は、ＮＦ−κＢの発現を低下させることができ、それは、転移関連タンパク質の発現を低下させることに関わる可能性がある。
【００５６】
[三、化合物（Ｉ）による乳癌細胞転移（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）抑制]
＜試験例３−１：化合物（Ｉ）による乳癌細胞におけるＭＭＰｓの発現の低下＞
癌細胞転移の過程において、細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）の分解が伴っていることが一般的であるが、ＥＣＭ分解の役割をするのは、主にマトリックス金属プロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ；ＭＭＰｓ）、及びＭＭＰｓの活性化を促進するウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕｒｏｋｉｎａｓＥ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ｕＰＡ）である。乳癌腫瘍細胞は、ＭＭＰｓを大量に分泌するが、数多くの研究によると、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は、血管新生作用及び腫瘍転移過程において、非常に重要な役割を演じていると考えられる。また、マトリックス金属プロテアーゼ抑制剤ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２の発現は、ＭＭＰｓの活性を抑制でき、血漿プラスミノーゲン活性化因子阻害因子（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｔｉｏｎ；ＰＡＩ）ＰＡＩ−１は、ｕＰＡの活性を抑制でき、腫瘍細胞の侵入及び転移に対する抑制作用を達成できる。
【００５７】
そのため、以下、化合物（Ｉ）による腫瘍細胞転移に対する抑制作用のメカニズムを説明するために、血管新生及び上皮内癌転移に関連する前記細胞タンパク質について、ウエスタンブロット解析を行う。
【００５８】
図５Ａは、異なる投与量の化合物（Ｉ）を与える場合の、ウエスタンブロット解析法によって、乳癌細胞における特定のタンパク質の含有量への影響を検出する結果である。それぞれ濃度０、０．５、１、２μＭの化合物（Ｉ）によって２４時間培養された乳癌細胞における、細胞転移関連タンパク質の発現状況について、ウエスタンブロット解析のステップは、試験例２−２に示したものと同じであるので、ここで繰り返して説明しない。
【００５９】
図５Ａに示した（ａ）部分は、乳癌細胞におけるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ及びｕＰＡＲの発現状況である。（ｂ）部分は、乳癌細胞におけるＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＰＡＩ−１の発現状況である。β−ａｃｔｉｎは、内部標準である。
【００６０】
図５Ａ（ａ）部分の結果が示すように、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、乳癌細胞におけるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ及びｕＰＡＲの発現が抑制され、投与量の依存性を示す。それに対して、図４Ａ（ｂ）部分の結果は、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、乳癌細胞におけるＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＰＡＩ−１の発現量が何れも増えることが明らかになった。
【００６１】
前記結果から、化合物（Ｉ）は、ＭＭＰ抑制剤の発現を促進し、且つＭＭＰの活性化物ｕＰＡを抑制する効能によって、マトリックス金属プロテアーゼを不活性化させ、ＭＭＰｓの活性、又は腫瘍細胞の侵入及び転移に対する抑制作用を達成できることが判明した。
【００６２】
図５Ｂは、異なる投与量の化合物（Ｉ）を与える場合の、Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ酵素活性解析法によって、乳癌細胞におけるＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２及びｕＰＡの酵素活性への影響を検出する結果である。
【００６３】
Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ酵素活性解析方法は、細胞（１×１０６）を６穴プレートに植え、翌日、細胞が壁に付着した後、血清なしのＤＭＥＭ培養液によって、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間放置する。異なる濃度投与量の化合物（Ｉ）が加えられたＤＭＥＭ培養液を加え、２時間培養した後、ＰＢＳで洗浄し、細胞培養液を抽出して微量遠心管に入れ、回転数１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを取ってタンパク質ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分離を行う。その後、それぞれゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）、又はカゼイン（Ｃａｓｅｉｎ）を基質とし、その酵素活性を解析する。
【００６４】
図５Ｂの結果は、化合物（Ｉ）の投与量の増加に伴い、乳癌細胞において、血管新生作用及び腫瘍転移を促進するＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ｕＰＡ酵素の活性が低下することを示す。
＜試験例３−２：化合物（Ｉ）による、腫瘍シグナル伝導タンパク質のリン酸化反応への抑制＞
【００６５】
癌細胞において、ＭＭＰｓ及びｕＰＡ活性化のシグナル伝導経路、及び細胞アポトーシスのシグナル伝導過程には、ｓｅｒｉｎｅ（セリン）／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ（スレオニン）  ｋｉｎａｓｅｓのキナーゼファミリー−マイトジェン活性化プロテインキナーゼファミリー（ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ；ＭＡＰＫｓ）が参加している。ＭＡＰＫｓは、ＥＲＫ１／２（ｅｘｔｒａｃｅｌｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｌｕａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ2−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ）及びｐ３８を含む。ＭＡＰＫファミリーには、複数のメンバー及び複数の反応経路があり、一連のタンパク質リン酸化反応により、シグナルの伝導を行う。
【００６６】
細胞において、リン酸化されたＭＡＰＫ関連タンパク質は、数多くのシグナルを伝達でき、細胞の生理的機能に対するＭＡＰＫｓの影響は、炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍｉｎａｔｉｏｎ）、細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、発癌遺伝子形質転換、腫瘍細胞転移を含み、更に核内の転写因子を下方制御し、転移関連タンパク質を含む各種のタンパク質の発現に影響する。従来、異なる細胞における研究は、ＥＲＫ１／２、Ｐ３８及びＪＮＫ経路を介して、ＭＭＰｓ及びｕＰＡの発現を調整・制御できることを示し、例えば、ｐ３８のリン酸化を抑制すると、ＴＩＭＰ−２の発現量を増加させ、癌細胞の転移能力を低下させることができ、また、癌細胞転移の抑制において、ＪＮＫもかなり重要な役割を演じている。そのため、ＭＡＰＫｓ経路の抑制は、血管新生、細胞増殖及び癌細胞転移の抑制に関わっている。
【００６７】
よって、以下、化合物（Ｉ）による腫瘍細胞転移に対する抑制作用のメカニズムを説明するために、前記血管新生、細胞増殖及び癌細胞転移に関連する細胞タンパク質について、ウエスタンブロット解析を行う。
【００６８】
図６は、ウエスタンブロット解析法によって、化合物（Ｉ）処理時間の増加の、乳癌細胞におけるＥＲＫ１／２、ｐ３８及びＪＮＫ１／２のタンパク質含有量及びそのリン酸化反応への影響を検出する結果である。乳癌細胞を、２μＭの化合物（Ｉ）によって０〜１２０分間処理した後、ウエスタンブロット解析を行い、解析ステップは、試験例２−２に示したものと同じであるので、ここで繰り返して説明しない。
【００６９】
図６の結果は、化合物（Ｉ）処理時間の増加に伴い、ＥＲＫ１／２、ｐ３８、ＪＮＫ１／２のタンパク質発現は、影響されないが、そのリン酸化が抑制されるような状況があるので、シグナルが核内に伝達されて転写因子を調整・制御することが妨げられ、血管新生作用及び腫瘍転移を促進することができる酵素の発現に影響することを示す。
【００７０】
＜試験例３−３：化合物（Ｉ）による腫瘍細胞のシグナル伝達への影響＞
リン酸化により活性化された腫瘍関連タンパク質ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔは、成長、生存、炎症及び移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）のような、細胞の数多くの反応を調節できる。成長因子受容体（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が活性化されると、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化により、下流タンパク質の活性化を起動し、腫瘍細胞の生存を促進する。
【００７１】
よって、以下、化合物（Ｉ）による腫瘍細胞転移に対する抑制作用のメカニズムを説明するために、細胞におけるＰＩ３Ｋ及びＡｋｔについて、ウエスタンブロット解析を行う。
【００７２】
図７は、ウエスタンブロット解析法によって、化合物（Ｉ）処理時間の増加の、乳癌細胞におけるＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのタンパク質の含有量及びそのリン酸化反応への影響を検出する結果を示す。乳癌細胞を、２μＭの化合物（Ｉ）によって０〜１２０分間処理した後、ウエスタンブロット解析を行い、解析ステップは、試験例２−２に示したものと同じであるので、ここで繰り返して説明しない。
【００７３】
図７の結果は、化合物（Ｉ）処理時間の増加に伴い、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのタンパク質発現は、影響されないが、そのリン酸化、特にＰＩ３Ｋのリン酸化が抑制されるような状況があるので、シグナルが核内に伝達されて転写因子を調整・制御することが妨げられ、腫瘍細胞の成長、生存、炎症及び移動に影響することを示す。
【００７４】
＜試験例３−４：化合物（Ｉ）は活性酸素を発生することで、腫瘍細胞の成長に影響する＞
活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）は、Ｏ-2、・ＯＨ及びＨ2Ｏ2のような、生物体が、細胞内の代謝及び環境の刺激で発生した分子である。細胞内のラジカルによる細胞アポトーシスの可能なメカニズムとして、ラジカルがＤＮＡを変えて細胞アポトーシスを誘発すること、タンパク質−ラジカルの作用によりタンパク質を変性することがある。近年、ＲＯＳは、正常な細胞において、重要なシグナル伝導役割をしていると開示する研究も多い。
【００７５】
図８は、活性酸素種産生量測定法によって、化合物（Ｉ）処理投与量の増加の、乳癌細胞におけるＲＯＳ含有量への影響を検出する結果であり、図９は、乳癌細胞を同一方法で培養した後、細胞賦活評価試験（ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）を行って得られた結果である。
【００７６】
図８は、活性酸素種産生量測定法によって、化合物（Ｉ）処理投与量の増加の、乳癌細胞におけるＲＯＳ含有量への影響を検出し、蛍光顕微鏡による２００Ｘ視野における写真である。細胞内活性酸素種産生量測定法としては、細胞（５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、２４穴プレートに植え、翌日、細胞が壁に付着した後、血清を含まないＤＭＥＭ培養液で、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに１２時間放置する。化合物（Ｉ）を、１％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培養液に加え、２時間培養した後、ＰＢＳで洗浄する。１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを加えて作用させ、ＰＢＳで洗浄した後、１０μＭ蛍光プローブ（ＤＣＦＨ２−ＤＡ）含有の培養液を更に加え、３７℃で３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄して余分な染剤を除去した後、最後、０．２５％のＴｒｉｔｏｘ‐１００で細胞を打ち破る。蛍光スペクトラムアナライザによって吸光度を測定し、励起波長を４８５±２０ｎｍに設定し、散乱波長を５３０±２５ｎｍに設定する。
【００７７】
図８の（ａ）部分の結果は、化合物（Ｉ）処理投与量の増加に伴い、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における活性酸素の含有量も増え、それにより腫瘍細胞アポトーシスとなる可能性があることを示し、（ｂ）部分の結果は、化合物（Ｉ）及び酸化防止剤ＮＡＣを同時に加えた場合、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における活性酸素の含有量の増加の情況が不明確となる傾向があることを示す。
【００７８】
図９は、単に異なる投与量の化合物（Ｉ）で処理した後の細胞の生存率、及び化合物（Ｉ）に酸化防止剤ＮＡＣを加えて処理する場合、細胞の生存率を正常に回復させることができるかをそれぞれ比較し、それによって、化合物（Ｉ）による、腫瘍細胞成長に対する活性酸素の増加の効果を明確する。細胞生存検出の試験方法については、試験例２−１のステップを参照し、ＭＤＡ‐ＭＤ‐２３１乳癌細胞を、０、２、５、７．５、１０及び１５ｍＭの化合物（Ｉ）によって２４時間処理した後、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１乳癌細胞の生存率に対する影響を観察する。図９は、定量化された図であり、データ結果を、平均値±標準偏差（ＳＤ値）で表し、ｎ＝３である。
【００７９】
図９は、図８と類似する結果を示す。濃度２〜１５μＭの化合物（Ｉ）がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に作用した後、細胞の生存率は、化合物（Ｉ）処理濃度の増加に伴って明確に低下するが、それに対して、化合物（Ｉ）及び酸化防止剤ＮＡＣを添加した試験群において、細胞の生存率は、影響されない。
【００８０】
前記結果から、化合物（Ｉ）は、活性酸素を発生することにより、腫瘍細胞の死亡を促進することが判明した。
【００８１】
＜試験例３−５：化合物（Ｉ）による腫瘍細胞の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）への抑制＞
癌細胞が転移する際に、高転移性細胞株である場合、細胞の間が破壊され、更に、細胞自身は、大量のタンパク質分解酵素を放出して、細胞外マトリックス分解を促進すると、癌細胞の遊走状況を増え、癌細胞の転移となる。
【００８２】
図１０は、スクラッチアッセイ（Ｗｏｕｎｄ  ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  ａｓｓａｙ）によって、癌細胞遊走に対する異なる投与量の化合物（Ｉ）の影響効果を解析する図である。
【００８３】
細胞遊走（Ｗｏｕｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の観察方法としては、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｃｅｌｌ（３×１０5）を１２穴プレートに植え、翌日、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ＦＢＳ含有の細胞培養液に交換し、翌日、一定のスペースがあるように穴の底部をこすった後、細胞培養液を除去して、ＰＢＳで２回洗浄し、１％ＦＢＳ含有の細胞培養液及び異なる濃度の化合物（Ｉ）を加え、０、１２、２４、３６時間でそれぞれ写真を撮って細胞遊走の状況を観察し、反応が終わった後、７５％の冷えたアルコールで３０分間固定し、アルコールが完全に揮発した後、Ｇｉｅｍｓａ  Ｓｔａｉｎで染色し、顕微鏡（２００Ｘ）において、３つの視野を任意に選択し、遊走した細胞量をカウントする（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａ１., ２００８）。スクラッチアッセイは、化合物（Ｉ）を添加しなかったものを対照群とし、０．５、１、２μＭの化合物（Ｉ）を添加したものを試験群として、乳癌細胞を０、１２、２４、３６時間処理した後、ＭＤＡ‐ＭＤ‐２３１乳癌細胞の遊走に対する化合物（Ｉ）の定量化した結果を観察し、データ結果を、平均値±標準偏差（ＳＤ値）で表し、ｎ＝３である。
【００８４】
図１０に示すように、遊走する細胞量をカウントする場合、低い濃度（０．５μＭ）の化合物（Ｉ）が存在すると、１２〜２４時間で、約６０‐７０％の乳癌細胞が遊走し、化合物（Ｉ）の濃度が１μＭ以上になると、乳癌細胞の遊走能力を著しく抑制できるようになる。
【００８５】
＜試験例３−６：化合物（Ｉ）による腫瘍細胞侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）への抑制＞
悪性腫瘍が転移しようとする場合、腫瘍細胞は、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）を破壊することによって、組織の基底膜（ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に更に侵入するのは、侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）と呼ばれ、それは、金属タンパク質酵素群ＭＭＰｓの参加によって、癌細胞の侵襲能力を促進することである。
【００８６】
図１１において、（ａ）部分は、トランスウェル侵入アッセイ（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）で染色された顕微鏡写真によって、化合物（Ｉ）による乳癌細胞移行への影響を観察した結果である。（ｂ）部分は、（ａ）部分の結果を定量化した図である。データ結果を、平均値±標準偏差（ＳＤ値）で表し、ｎ＝３である。
【００８７】
トランスウェル移動アッセイは、細胞外マトリックスの成分としてマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を用い、細胞間環境を模擬することができ、ＢＤ  マトリゲル（登録商標）  侵入チャンバー（Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ）における細胞がマトリゲルマトリックスにおける成長因子に刺激されると、細胞は、若干のマトリックス分解酵素を分泌し、マトリゲルを分解し、細胞の移行を吸引することができ、細胞の移能が強い場合、染色した後、濾過膜上に細胞を観察することができる。
【００８８】
トランスウェル移動アッセイ方法は、化学誘引物質として、トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）に１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭを８００μｌ加え、５００μｌの細胞（１×１０5）をトランスウェルに植え、ＦＢＳ無しのＤＭＥＭ培養液及び０．５、１、２μＭの化合物（Ｉ）をそれぞれ加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーターに移して２０時間培養し、Ｇｉｅｍｓａで１５分間染色した後、光学顕微鏡によって２００倍視野で観察して写真を撮る。毎回の実験において、各群は、三重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）のトランスウェルの平均値を代表とする。
【００８９】
トランスウェル移動アッセイの定量化方法は、トランスウェル膜の下表面における９つの視野を任意に選び取り、各視野における細胞総数を算出する。９つの視野における細胞数の平均値は、各トランスウェルの乳癌細胞の走化性移動の指標であり、毎回の実験中の各群は、三重のトランスウェルの平均値を代表とする（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａ１., ２００５）。
【００９０】
図１１（ａ）部分の顕微鏡写真によって細胞の移行状況を観察した結果、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、癌細胞の移行が著しく低下することが明確に見られた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、高転移性のヒト乳癌細胞株であるため、図１１（ａ）部分の写真において、対照群には、数多くの細胞が化学誘引物質（１０％ＦＢＳ細胞培養液）に誘引され、細胞外マトリックスを模擬するＭａｔｒｉｇｅｌを通過して、濾過膜まで移行することが観察でき、０．５、１、２μＭの化合物（Ｉ）が加えられた試験群において、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、乳癌細胞の移行が著しく低下した。
【００９１】
なお、図１１（ｂ）部分が示すように、カウントされた移行の細胞量は、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、移行能力が減少する。
【００９２】
[四、化合物（Ｉ）による血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）への抑制]
前記試験例から、化合物（Ｉ）はＭＡＰＫｓ経路におけるＥＲＫ１／２、ｐ３８、ＪＮＫ１／２のリン酸化反応に影響することが判明でき、現在、ＭＡＰＫｓ経路は、血管新生、細胞増殖及び癌細胞転移の抑制に関わっている可能性があり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞は、ＴＮＦ−αによりＭＭＰ−９及びＡＰ−１の発現を誘導することができ、また、ＥＲＫ抑制剤又はＰ３８抑制剤を加えた後、ＴＮＦ−αに誘導されたＭＭＰ−９の発現を低下させることができることが既に知られている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａ１., ２００８）。
【００９３】
よって、以下、化合物（Ｉ）がＴＮＦ−αに影響して、誘導したＭＭＰ−９活性の発現を低下させるかどうかについて更に解析する。
【００９４】
＜試験例４‐１：化合物（Ｉ）によるＴＮＦ−αに誘導されたＭＭＰ発現への抑制＞
図１２は、異なる投与量の化合物（Ｉ）を使用して、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣｓ）の細胞の生存率についての解析である。
【００９５】
細胞の生存率の測定としては、内皮細胞（ＥＡｈｙ９２６細胞株）を、約８割満たすように植え、１５％ＦＢＳ‐ＤＭＥＭ含有の１ＸＨＡＴ（融合特性を有する細胞を選別）、１％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１％ＰＳＮの培養基で培養する。細胞を一定数まで培養した場合、９００ｒｐｍ、１０分間遠心して、培養液を除去し、実験の２４時間前に、培養液を交換し、血球計算器によって細胞の数を算出する。細胞（５×１０4）を２４穴プレートに更に植え、翌日、細胞が壁に付着した後、濃度５、１０、２０μＭの化合物（Ｉ）をそれぞれ加えて１時間処理し、化合物（Ｉ）を添加しなかったものを対照群とし、ＰＢＳで２回洗浄した後、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α／ＴＧＦ−で刺激し、ＰＢＳで洗浄する。各穴に４００μＬのＭＴＴ試薬を加え、２時間反応させ、上澄みを９６穴マイクロプレートに入れて、５７０ｎｍの波長で吸光度を測定する。
【００９６】
図１２の結果は、添加された化合物（Ｉ）の濃度が１０μＭ以上となる場合、細胞の生存率が明確に低下することを示す。
【００９７】
また、図１３は、スクラッチアッセイによって、顕微鏡下で、異なる投与量の化合物（Ｉ）による、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αに刺激された細胞遊走の状況（引き伸ばし倍率２００Ｘ）の解析である。
【００９８】
細胞遊走の観察方法については、試験例３−５に述べた内容を参照する。スクラッチアッセイは、化合物（Ｉ）も添加せず、ＴＮＦ−αにも刺激されなかった細胞を、対照群とし、対照群の細胞は、遊走の能力を有さない。他の試験群は、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αに刺激された細胞であり、化合物（Ｉ）の無添加、或いは１０μＭ又は２０μＭの化合物（Ｉ）の添加で、２４時間処理した後、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１乳癌細胞遊走に対する化合物（Ｉ）の影響を観察する。
【００９９】
図１３の顕微鏡写真によって細胞の遊走状況を観察した結果、化合物（Ｉ）を添加しなかった試験群において、ＴＮＦ−αに刺激されるため、表皮細胞の遊走能力が強く、こすられた細胞間のスペースは、次第に近づいて狭くなるが、１０μＭ又は２０μＭの化合物（Ｉ）で処理した試験群において、化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、細胞遊走の現象が益々不明確になることが明らかである。
【０１００】
図１３の結果から、化合物（Ｉ）は、細胞に対するＴＮＦ−αの刺激作用を回復する効果を有することが判明した。そのため、化合物（Ｉ）が、ＭＭＰｓに対するＴＮＦ−αの誘導効果に影響するかどうかについて、更に検出する。
【０１０１】
図１４は、ザイモグラフィ（Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）酵素活性解析法によって、化合物（Ｉ）に対する、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αに刺激された細胞が誘導されて発生したＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２の酵素活性を検出する解析結果である。Ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ酵素活性解析方法は、試験例４‐１の述べた通りである。
【０１０２】
化合物（Ｉ）も添加せず、ＴＮＦ−αにも刺激されなかった細胞を、対照群とし、対照群の細胞は、酵素活性を有さない。他の試験群は、化合物（Ｉ）を添加せず、或いは５μＭ、１０μＭ、又は２０μＭの化合物（Ｉ）によって処理するものであり、化合物（Ｉ）が、ＭＭＰｓに対するＴＮＦ−αの誘導効果に影響するかどうかを観察した。
【０１０３】
図１４の酵素活性解析結果から、化合物（Ｉ）を添加しなかった試験群において、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−２の酵素活性が発現できる一方、２０μＭの化合物（Ｉ）によって処理された試験群において、ＭＭＰ−２の酵素活性を全く発現できないことが明らかである。そのため、化合物（Ｉ）は、ＭＭＰｓに対するＴＮＦ−αの誘導への抑制効果を有する。
【０１０４】
図１２、図１３及び図１４の結果から、化合物（Ｉ）は、ＴＮＦ−αに誘導されたＭＭＰｓタンパク質の活性、特に、血管新生作用及び腫瘍転移を促進できるＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９酵素の活性を抑制できることが分かった。
【０１０５】
[五、化合物（Ｉ）によるＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現への抑制]
癌原遺伝子Ｈｅｒ−２は、染色体１７ｑ２１に位置し、抗アポトーシス、Ａｋｔ経路、ＭＡＰＫに関わり、内因性チロシンキナーゼ活性を有し、細胞の成長、増殖及び分化の調整・制御に関与するものであり、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｍＲＮＡが大量に発現すると、癌細胞の繁殖力を増強させ、細胞周期制御異常を引き起こし、損傷したＤＮＡを遅延無しに回復させることができず、不正常な細胞の増殖を引き起こす。
【０１０６】
以下、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３を対象として、化合物（Ｉ）によるＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現への影響を説明する。
【０１０７】
＜試験例５‐１：化合物（Ｉ）によるＨｅｒ−２／ｎｅｕ及びその下流遺伝子発現への抑制＞
図１５は、異なる投与量の化合物（Ｉ）による、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４５３の細胞の生存率についての解析である。
【０１０８】
細胞の生存率の測定は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を５％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）−ＤＭＥＭ  Ｆ１２／ｉｎｓｕｌｉｎ（インシュリン）／ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｌ（ヒドロコルチゾール）／上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の培養液に培養する。インキュベーターを５％ＣＯ２、３７℃恒温に維持する。細胞を一定数まで培養した場合、９００ｒｐｍで１０分間遠心して、培養液を除去し、実験の２４時間前に、培養液を交換し、血球計算器によって細胞の数を算出した。
【０１０９】
図１５の結果は、添加された化合物（Ｉ）の濃度の増加に伴い、乳癌細胞の生存率は著しく低下することを示す。
【０１１０】
図１６は、異なる濃度の化合物（Ｉ）が存在する場合の、ウエスタンブロット解析による、腫瘍細胞の生存を促進するＨｅｒ−２／ｎｅｕ関連タンパク質の発現状況である。乳癌細胞を、それぞれ１０〜６０μＭの化合物（Ｉ）によって処理した後、ウエスタンブロット解析を行い、解析ステップは、試験例２−２に示したものと同じであるので、ここで繰り返して説明しない。
【０１１１】
図１６の結果は、化合物（Ｉ）処理濃度の向上に伴い、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕにより活性化されたＰ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅの発現量は、著しく低下してＨｅｒ−２／ｎｅｕの発現量と一致する傾向を表すことを示す。また、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのタンパク質発現も、高濃度の化合物（Ｉ）に抑制され、それに従って、下流のシグナル伝達を抑制し、乳癌細胞の成長、生存、炎症及び移動に影響した。
【０１１２】
図１６の結果から、乳癌細胞を４０μＭの化合物（Ｉ）で処理した後、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びＰ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅの発現を完全に抑制することができることが判明したので、以下、４０μＭの化合物（Ｉ）によって細胞を処理し、細胞におけるＲＯＳの含有量を観察する。細胞内活性酸素種産生量測定法は、試験例３−４に示した通りである。
【０１１３】
図１７は、活性酸素種産生量測定法によって、４０μＭの化合物（Ｉ）で処理した乳癌細胞を検出し、処理時間の増加の、乳癌細胞におけるＲＯＳ含有量への影響を定量化した図であり、実験結果データを、平均値±標準偏差（ＳＤ値）で表す（ｎ＝３）。ＳＰＳＳシステムで分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い、ダンカンの多重範囲検定によって群間差を比較する。Ｐ＜０．０５は、著しい差異を持つことを表す。
【０１１４】
活性酸素種産生量測定の結果は、化合物（Ｉ）で処理した試験群において、乳癌細胞における活性酸素の含有量は、対照群より高く、それにより腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があることを示す。
【０１１５】
図１７の定量化結果は、化合物（Ｉ）を添加しなかった対照群に比べて、化合物（Ｉ）で処理した試験群の細胞において、活性酸素の増加量は何れも著しい差異を持っていることを示す。
【０１１６】
図１８は、２．５ｍＭの酸化防止剤ＮＡＣが存在する場合の、４０μＭの化合物（Ｉ）で処理した乳癌細胞の細胞生存率解析である。結果は、単に化合物（Ｉ）で細胞を処理する場合、細胞の生存率は、対照群に比べて、半分減少したが、酸化防止剤ＮＡＣが化合物（Ｉ）と同時に存在する場合、細胞の生存率を回復することができ、細胞を死滅させる化合物（Ｉ）の効果を大幅に弱めることを示し、化合物（Ｉ）は、ＲＯＳを発生することにより、乳癌細胞の死亡を促すことが分かる。
【０１１７】
[六、化合物（Ｉ）による乳癌細胞のオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｅ）への誘導]
細胞のオートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）とは、自己消化で提供したものをリサイクルし、臨時的な代替エネルギーとする生理メカニズムであり、細胞がオートファジーを持続的に、又は過剰に誘導する場合、細胞アポトーシスとなることがある。細胞のオートファジーと細胞アポトーシスは、互いに調節し、細胞が誘導アポトーシス等の療法を抵抗する場合、オートファジー性細胞死亡は、代わりに細胞アポトーシスのメカニズムとすることができると開示する研究がある。よって、オートファジー性細胞死亡を誘導することを、癌を治療するための治療対策とするのは、合理的である。
【０１１８】
以下、ウエスタンブロット解析によって、乳癌細胞のオートファジーメカニズムに対する化合物（Ｉ）の効果を検証する。その結果を、図１９及び図２０に示す。
【０１１９】
＜試験例６‐１：化合物（Ｉ）による乳癌細胞のオートファジー関連のタンパク質の発現への誘導＞
図１９は、異なる濃度の化合物（Ｉ）が存在する場合の、乳癌細胞ＭＣＦ−７を７２時間培養した後、細胞オートファジー関連のＬＣ３Ｂタンパク質の発現状況である。結果は、化合物（Ｉ）の濃度が１０μＭ以上である場合、ＬＣ３Ｂタンパク質の発現量は、対照群との間に著しい差異を有し、化合物（Ｉ）は、乳癌細胞ＭＣＦ−７の細胞オートファジーに関わる可能性があることを示す。
【０１２０】
図２０は、異なる濃度の化合物（Ｉ）が存在する場合の、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を２４、４８又は７２時間培養した後、細胞オートファジー関連のＬＣ３−ＩＩタンパク質の発現状況である。結果は、化合物（Ｉ）の濃度が７．５μＭである場合、ＬＣ３−ＩＩタンパク質の発現量は、対照群との間に著しい差異を有し、化合物（Ｉ）は、乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞オートファジーに関わる可能性があることを示す。
【０１２１】
[七、化合物（Ｉ）による動物実験におけるヌードマウス乳癌腫瘍への抑制]
前記細胞実験により、化合物（Ｉ）は、乳癌細胞成長に対する抑制効果を有することが判明したが、以下、生体内試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の方式によって、その効能を更に検証する。
【０１２２】
＜試験例７‐１：生体内試験における、化合物（Ｉ）によるヌードマウス乳癌腫瘍の成長への抑制＞
生体内試験を、ヌードマウス異種移植腫瘍モデル（ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）によって行った。実験動物は、中華民国国家動物センターから購入したＢＡＬＢ／ｃ‐ｎｕ系ヌードマウスであった。無菌箱で飼育し、光照射期間は、７：００〜１９：００であり、濾過された空気、滅菌された水及び飼料を提供し、自由摂食させた。８〜１０週齢の成熟した雌のヌードマウスを用いて、実験を行った。
【０１２３】
乳癌細胞（２×１０6／１００μｌ）を、皮下注射の方式によって、６０匹のヌードマウスの背部の一側に埋め込み、約１０日間、ヌードマウスの背部に１〜３ｍｍの腫瘍ができた後、任意に４つの群に分けて、更に、異なる投与量の樟芝活性成分を３つの群に投与し、その腫瘍の生成の状況を毎日観察して、撮影して保存し、３日ごとに腫瘍の体積を測定し、体積の算出方式は、１９８７年Ｏｓｂｏｒｎｅ氏らにより提案された公式に準拠する。
【０１２４】
試験動物を、対照群（全く無処理）、溶剤群（生理食塩水のみ注射）及び化合物（Ｉ）注射群（投与量０．７５ｍｇ／Ｋｇ）に分けて、毎日注射し、動物を正常な状況で飼育し、各群の実験動物の腫瘍の成長状況を比較するように、撮影して記録する。
【０１２５】
図２１において、（ａ）部分は、対照群及び化合物（Ｉ）注射群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１移植ヌードマウスの腫瘍の写真である。（ｂ）部分は、対照群及び化合物（Ｉ）注射群のＭＤＡ−ＭＢ−２３１移植ヌードマウスの成長週数と腫瘍体積とを比較する図である。
【０１２６】
図２１の（ａ）部分において、化合物（Ｉ）を注射した移植ヌードマウスは、腫瘍の体積が対照群に比べて明らかに小さく、化合物（Ｉ）を一定の期間にわたって注射した後、腫瘍は完全に消失したことが分かる。
【０１２７】
図２１の（ｂ）部分の比較図においても、化合物（Ｉ）を注射した移植ヌードマウスは、腫瘍の体積が対照群に比べて小さいことが分かり、また、その腫瘍重量は、対照群が０．４５５±０．３２８であり、注射群が０．０３９±０．０２８であり、注射群と対照群との間には、著しい差異がある。
【０１２８】
＜試験例７‐２：腫瘍移植ヌードマウスの組織病理学による検査比較＞
腫瘍移植ヌードマウスの組織病理検査を、組織病理学的なＨ＆Ｅ染色法によって行った。腫瘍及び内臓の組織を、パラフィンで埋め込み、ミクロトームで厚さ５ｍｍのスライドを切り出し、また、脱ろう、再水和、回復等を経て、ＲＯ水で洗浄し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎによって３０〜５０秒染色し、０．１％酢酸水で更に２０秒反応させ、ＲＯ水で洗浄し、最後、Ｅｏｓｉｎによって１００秒染色して、Ｈｉｓｔｏｃｌａｄで封入する。
【０１２９】
図２２は、組織病理学検査の顕微鏡写真である。図から、化合物（Ｉ）を注射しなかった対照群の移植ヌードマウスは、腫瘍の体積が大きく（拡大倍率２０Ｘ）、その腫瘍細胞が、高度な有糸分裂状態（拡大倍率４００Ｘ）を示したことに対し、化合物（Ｉ）を０．７５ｍｇ／Ｋｇ／日で注射した注射群の移植ヌードマウスは、腫瘍の体積が小さく（拡大倍率２０Ｘ）、腫瘍細胞が低度な有糸分裂状態（拡大倍率４００Ｘ）を示したことが明らかである。前記結果は、適当な投与量の化合物（Ｉ）を直接に注射すれば、腫瘍細胞の分裂を効果的に抑制できることを示す。
【０１３０】
＜試験例７‐３：腫瘍移植ヌードマウスの細胞内のＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＶｉｍｅｎｔｉｎの発現＞
腫瘍移植ヌードマウスの細胞内のシグナル伝達関連のタンパク質の発現量を、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）法によって行った。本実験は、特に、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＶｉｍｅｎｔｉｎの発現について検出した。免疫組織化学染色法及びその定量化方法は、試験例２−２の通りであるが、ここで繰り返して説明しない。
【０１３１】
図２３は、腫瘍移植ヌードマウスの細胞内のシグナル伝達関連タンパク質の発現量の、免疫組織化学染色による顕微鏡写真である。図２４及び図２５はそれぞれ、図２３の一次抗体の反応物を定量化した結果である。
【０１３２】
図２１、図２２及び図２３の結果は、化合物（Ｉ）を０．７５ｍｇ／Ｋｇ／日で注射した注射群の移植ヌードマウスは、腫瘍の進行に対する抑制に寄与する腫瘍組織内のタンパク質Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの量が高く、また、腫瘍の進行を促進するタンパク質Ｖｉｍｅｎｔｉｎの量が低いことを示す。よって、化合物（Ｉ）は、腫瘍組織成長を直接的に抑制する効果を有する。
【０１３３】
上記によると、化合物（Ｉ）又は化合物（Ｉ）を有効成分とする混合物は、腫瘍細胞増殖を抑制できるので、化合物（Ｉ）又は化合物（Ｉ）を有効成分とする混合物は、医薬組成物の形式で治療用の薬物として提供されることができる。
【０１３４】
化合物（Ｉ）含有の医薬組成物において、化合物（Ｉ）は、遊離状態の形式又は薬学的に許容される塩の形式で存在している。また、化合物（Ｉ）含有の医薬組成物は、例えば、賦形剤、溶剤、乳化剤、懸濁化剤、分解剤、結合剤、安定化剤、防腐剤、潤滑剤、吸収遅延剤及びリポソームのような、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を更に備えてよい。化合物（Ｉ）含有の医薬組成物は、腫瘍細胞増殖を抑制するように、実際の要求によって、経口投与の形式又は外用塗布剤の形式のような、好適に応用できる投薬形式に製造されてよい。
【０１３５】
上記により、本発明の実施例による化合物（Ｉ）及びその医薬組成物は、乳癌上皮−間葉細胞転換抑制、乳癌細胞転移抑制、血管新生抑制、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ発現抑制、乳癌細胞のアポトーシス／オートファジー調節、又は前記機能に関連する薬物の調製に応用できる。
【０１３６】
本発明では実施形態を前述の通りに開示したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神と領域から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができる。従って本発明の保護範囲は、特許請求の範囲の記載を基準とする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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