(57)【要約】【課題】褐藻類からフコキサンチンを効率良く低コストで、高収率に製造する。【解決手段】  褐藻類から取得したフコキサンチン含有抽出物を出発材料とし、中性シリカゲルを固定相にかつアセトン・ヘキサン混合剤を移動相に用いた第１段階の液体クロマトグラフィーにより、フコキサンチン含有抽出物からフコキサンチン粗画分を分離する。得られたフコキサンチン粗画分を濃縮した後、この濃縮物から、同じく中性シリカゲルを固定相にかつアセトン・ヘキサン混合剤を移動相に用いた第２段階の液体クロマトグラフィーにより、フコキサンチン画分を分離精製する。【選択図】図１（Ａ）
2013166790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
褐藻類からのフコキサンチン含有抽出物から第１段階の液体クロマトグラフィーによりフコキサンチン粗画分を分離する過程と、
前記フコキサンチン粗画分から第２段階の液体クロマトグラフィーによりフコキサンチン画分を分離する過程とを含み、
中性シリカゲルを固定相としかつアセトン・ヘキサン混合剤を移動相として、前記第１及び第２段階の前記液体クロマトグラフィーを行うことを特徴とするフコキサンチンの製造方法。
【請求項２】
前記フコキサンチン粗画分を濃縮し、得られた濃縮物から前記第２段階の液体クロマトグラフィーによりフコキサンチンを分離することを特徴とする請求項１に記載のフコキサンチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、褐藻類、その他の不等毛藻類に存在するカロテノイドと呼ばれる色素の一種であるフコキサンチンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、コンブやワカメなどの褐藻には、黄色の葉緑体に光合成色素としてクロロフィルａ及びｃ、光合成の補助色素としてフコキサンチンが存在することが知られている。とりわけ、フコキサンチンは、抗酸化活性で抗腫瘍効果があること、脂肪組織における脂肪の燃焼を助ける痩身効果があることが指摘されている。褐藻中のフコキサンチン含量は非常に少なく、生の褐藻１００ｇ当たりで昆布が約１９mg、ワカメが１１mg程度との報告がある。そこで、医薬品や食品分野での実用化を図るために、フコキサンチンを褐藻類から高収率で製造する方法が様々に研究、開発されている。
【０００３】
例えば、加熱処理した褐藻から有機溶媒でフコキサンチンを含む脂溶性油を抽出し、これをアセトン・ヘキサン混合溶液などの溶媒に溶解した後、カラムクロマトグラフィーに展開させることによって、高純度のフコキサンチンを精製する方法が提案されている（例えば、特許文献１、２を参照）。前記カラムクロマトグラフィーには、シリカゲルが充填剤（固定相）に、脂溶性油の溶解に使用したのと同じアセトン・ヘキサン混合溶液が展開溶媒に使用されている。
【０００４】
また、乾燥粉砕した褐藻類に有機溶媒を加えて褐藻類エキスを抽出し、これを合成吸着樹脂に接触させ、この樹脂に吸着したフコキサンチンを溶離させることによって、フコキサンチン高含有の褐藻類エキスを製造する方法が知られている（例えば、特許文献３を参照）。フコキサンチンの合成吸着樹脂からの溶離は、例えば前記樹脂と溶離液とを混合したり、前記樹脂を充填したカラムに溶離液を通液することによって行われる。得られた褐藻類エキスは、水を混合した後静置することによって、フコキサンチンが沈殿、粗精製され、更に、液−液分配、再結晶、高速液体クロマトグラフィーを行うことによって、高純度のフコキサンチンが精製される。
【０００５】
更に、オキナワモズクの盤状体または糸状体などの褐藻類を細胞破砕処理し、得られたた破砕物を遠心分離などにより固液分離し、分離したチコライド膜を界面活性剤含有緩衝液で可溶化した後、イオン交換クロマトグラフィーと、更にゲルろ過クロマトグラフィー（または限外ろ過）に供して、高純度のフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質を精製する方法が知られている（例えば、特許文献４を参照）。このフコキサンチン−クロロフィルａ／ｃタンパク質は、例えばフコキサンチン製造の原料に用いられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】再表２００７／０４９７８６号公報
【特許文献２】特開２００８−２３１１９８号公報
【特許文献３】特開２００９−１２０４９４号公報
【特許文献４】特開２０１１−０５７６４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、少なくとも本願発明者が知る限り、褐藻類から抽出したフコキサンチンは医薬品又は食品の分野で実用化されるに至っていない。その理由は、従来の製造方法では、フコキサンチンを実用化に十分な高い収率でかつ低コストで製造することが困難だからと考えられる。
【０００８】
本願発明者は、褐藻類に含まれるフコキサンチンと他の色素、特にクロロフィルａ及びｃが、互いに少しずつ異なる極性を有することに注目した。具体的には、フコキサンチンとクロロフィルａの分子が極性、無極性両方の性質を有するのに対し、クロロフィルｃ、クロロフィルａ分解物は極性のみを有する。これらを極性順に大きい方から表すと、クロロフィルａ分解物（淡緑色）＞クロロフィルｃ（褐色）＞フコキサンチン（赤〜橙色）＞フコキサンチン分解物（黄色）＞クロロフィルａ（深緑色）になることを見出した。
【０００９】
このように互いに極性が異なる物質を分離するために、例えばシリカゲルをカラムの充填剤（固定相）に用いた液体クロマトグラフィーが広く採用されている。上述した従来技術のように、褐藻類からの抽出物を出発材料として、液体クロマトグラフィーでフコキサンチンを精製、製造する場合、褐藻類からの抽出に使用する抽出溶媒と、クロマトグラフィーの展開溶剤、即ち移動相とは、一般的に異なるものを使用する。多くの場合使用されるシリカゲルは酸性シリカゲルであるが、これは極性物質との強い吸着性を示すので、展開溶剤（移動相）には、水分と無極性溶剤との混合溶剤が適していると考えられる。
【００１０】
酸性シリカゲルの表面には多くの水酸基（−ＯＨ基）があるので、水酸基を有する分子構造のフコキサンチンは、水素結合によって酸性シリカゲルに吸着され易い。そのため、移動相に無極性溶媒を使用した場合、クロロフィルａが脂溶性なので、多く溶出するのに対し、フコキサンチンはシリカゲルに吸着されたまま、溶出し難い。この後、極性溶媒であるメタノールを用いて展開すると、残っていたフコキサンチン、クロロフィルｃ、クロロフィルａ分解物が吸着サイトから一斉に脱離して溶出してくるが、これらを分離、分画するためには、長いカラムと長時間の分離操作、使用する移動相の種類を多くするなどの高度な分画技術が必要である。そのため、クロマトグラフィー装置が大型化し、更に複雑化、高度化する虞がある。
【００１１】
他方、中性シリカゲルは、酸性シリカゲルよりも水酸基が少ない。しかも、クロロフィルｃとクロロフィルａ分解物は、フコキサンチンよりも極性が大きく、吸着性が強い。そのため、中性シリカゲルを固定相に用いると、フコキサンチンは吸着できずに、多くが溶出する。ところが、極性溶媒のメタノールを移動相に使用した場合、フコキサンチンと集合体の形態をなしているであろう無極性である集合体のクロロフィルａとを分離、分画することはできなかった。
【００１２】
そこで、本発明の目的は、褐藻類、その他の不等毛藻類からフコキサンチンを効率良く低コストで、高収率に製造する方法を提供することにある。
更に本発明の目的は、比較的簡単かつ小型で安価な設備・装置を用いてフコキサンチンを製造し得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者は、フコキサンチン、その他の色素の極性等について更に検討、研究した結果、極性の弱いアセトンと無極性のヘキサンとの混合溶剤が、中性シリカゲルカラムにおいて、フコキサンチンと無極性のクロロフィルａとを分画可能であることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。
【００１４】
本発明によれば、褐藻類からのフコキサンチン含有抽出物から第１段階の液体クロマトグラフィーによりフコキサンチン粗画分を分離する過程と、
前記フコキサンチン粗画分から第２段階の液体クロマトグラフィーによりフコキサンチン画分を分離する過程とを含み、
【００１５】
中性シリカゲルを固定相としかつアセトン・ヘキサン混合剤を移動相として、前記第１及び第２段階の前記液体クロマトグラフィーを行うフコキサンチンの製造方法が提供される。
【００１６】
フコキサンチンは、上述したように中程度の無極性と解され、酸性シリカゲルに比して中性シリカゲルへの吸着性が低いので、第１及び第２段階の液体クロマトグラフィーにおいて、中性シリカゲルカラムと組み合わせて、移動相溶媒にアセトン・ヘキサン混合剤を選択することによって、フコキサンチンよりも無極性の性質とそれよりも高い極性とを示すクロロフィルａから容易に分離することができる。その結果、褐藻類に含まれるフコキサンチンを効率良く低コストで、高収率に分離精製することができる。
【００１７】
しかも、第１及び第２段階の液体クロマトグラフィーにおいて、酸性シリカゲルカラムの場合に要求されるであろう長いカラムや長時間の分離操作を必要とせず、１種類の移動相で済むので、必要以上に高度な分画技術が要求されることもない。従って、カラム長を短くしてクロマトグラフィー装置を小型化し、装置全体を簡単かつ安価に構成するとともに、液体クロマトグラフィーによる分離が２段階で行われるにも拘わらず、全体として分離操作を簡単にかつ迅速に行うことができる。
【００１８】
また、カラム長が短い小型のクロマトグラフィー装置を用いることができ、かつ移動相が１種類であることによって、使用後のシリカゲルをカラムから取り出して回収し、残存する移動相溶媒を簡単に脱離させて、再使用に供することができる。更に、第１及び第２過程の液体クロマトグラフィーにおいて、フコキサンチン含有抽出物及びフコキサンチン粗画分を注入する前にカラムに注入した移動相溶媒の相当部分が、そのまま速やかにカラムから流出するので、これを適当な容器に回収して再使用することができる。
【００１９】
或る実施例では、前記フコキサンチン粗画分を濃縮し、得られた濃縮物から前記第２段階の液体クロマトグラフィーによりフコキサンチンを分離することによって、より高純度のフコキサンチンをより効率良く、より短時間で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１（Ａ）】本発明による方法の好適実施例における第１段階の分離分画過程を示す模式図。
【図１（Ｂ）】本発明による方法の好適実施例における第１段階の分離分画過程を示す模式図。
【図２（Ａ）】本発明による方法の好適実施例における第２段階の分離精製過程を示す模式図。
【図２（Ｂ）】本発明による方法の好適実施例における第２段階の分離精製過程を示す模式図。
【図２（Ｃ）】本発明による方法の好適実施例における第２段階の分離精製過程を示す模式図。
【図３】図３は、本発明の実施例の方法により得た各試料について各細胞株の生存率を示すグラフ。
【図４】図４は、本発明の実施例の方法により得たフコキサンチンについて各細胞株の増殖阻害率を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下に、添付図面を参照しつつ、本発明の方法をその好適な実施態様に基づいて詳細に説明する。
【００２２】
先ず、褐藻体からフコキサンチンを含むフコキサンチン含有抽出物を取得し、これを出発材料として使用する。フコキサンチン含有抽出物は、例えば松田太一外の論文「アカモク（Sargassumhorneri）抽出物の抗腫蕩性」（北大水産彙報、５６（３）、ｐ．７５−８６、２００５年発行）に記載される方法によって取得することができる。この方法によれば、目的とする生の又は凍結保存した褐藻体を凍結乾燥又は天日乾燥させ、例えば回転数２５，０００／分の粉砕器で粉砕する。この粉砕物に、抽出溶剤として重量比４倍量のアセトンを加え、４℃、４日間遮光下で、時々撹拌しながら抽出を行い、その遠心上清をろ紙で濾過することにより、本実施態様の出発材料としてのフコキサンチン含有抽出物が得られる。このようにして得られた抽出物には、フコキサンチン以外の色素として、クロロフィルａ及びｃが含まれている。
【００２３】
本発明において、前記褐藻体には、コンブ、ワカメ、ヨレモク、アカモク、ヒジキ、その他褐藻類一般を使用できる。特に、含まれる色素の数が少ないヨレモク、アカモクは、色素純度の高いフコキサンチン含有抽出物が得られるので、好ましい。また、フコキサンチン含有抽出物の取得は、上記方法に限定されるものでなく、上記各特許文献に記載されている方法、その他従来から公知の様々な方法を用いることができる。
【００２４】
本発明の方法によれば、前記フコキサンチン含有抽出物からのフコキサンチンの分離精製は、液体クロマトグラフィーにより、大きく２段階の過程に分けて行われる。第１段階では、前記フコキサンチン含有抽出物からフコキサンチンの粗画分を分離し、併せてクロロフィルａ及びｃの各粗画分を分取する。第２段階では、前記フコキサンチン粗画分からフコキサンチンを単離精製し、更にクロロフィルａ及びｃの前記各粗画分からクロロフィルａ及びｃをそれぞれ単離精製する。
【００２５】
図１（Ａ）及び（Ｂ）は、第１段階の液体クロマトグラフィーによる分離過程を模式的に示している。これら各図に示すように、本実施態様に使用する液体クロマトグラフィー装置１は、カラム２と、前記カラムからの溶出物を収容するための４つの回収容器３〜６とから構成される。カラム２は、小規模生産の場合、例えば比較的長さの短いデスポーザブル注射器の注射筒を用いることができる。回収容器３〜６は、例えば三角フラスコ、ビーカーなどを用いることができ、前記注射筒の筒先部分７の開口直下に配置する。
【００２６】
カラム２には、固定相充填剤として中性シリカゲル８を使用する。中性シリカゲル８には、従来のクロマトグラフィーと同様に、予め移動相溶媒に浸漬しておいたものを使用するのが好ましい。カラム２内には、予め前記移動相溶媒に浸漬した脱脂綿９が、前記注射筒の底部に圧縮して一定の厚さで平らに充填され、かつ海砂１０（２０〜３５メッシュ）が一定の厚さで重層されている。中性シリカゲル８は、海砂１０の上に例えばピペットを用いて充填する。充填した中性シリカゲル８の平らな上面には、前記シリカゲルから前記移動相溶媒が完全に流下した後、シリカゲル界面の乱れを防止するために、円形の濾紙１１を重ねることが好ましい。
【００２７】
更にカラム２には、筒先部分７に所定径の注射針１２が装着されている。カラム２から流出する移動相溶媒の速度は、注射針１２の内径によって調整される。要求される移動相溶媒の流速によって、適当な内径の注射針１２を選択することができ、それによって要求される一定の流速を常に確保することができる。別の実施例において、カラム２に注射筒ではなく、クロマトグラフィー専用のカラムを用いた場合には、周知のように、付属のコックやペリスタポンプを用いて移動相溶媒の流速を調節することができる。
【００２８】
第１過程では、最初の第１分離操作によって、前記フコキサンチン含有抽出物からクロロフィルａとフコキサンチンとを分離する。第１分離操作では、第１移動相溶媒として、アセトンとヘキサンとの混合剤を、例えば体積比４：６（ｖ／ｖ）で使用する。尚、本実施態様において、中性シリカゲル８及び脱脂綿９を予め浸漬するのに使用する前記移動相溶媒は、第１移動相溶媒である。
【００２９】
図１（Ａ）に示すように、カラム２の下に回収容器３を配置して、カラム２の上端開口から所定量の前記フコキサンチン含有抽出物を、カラム全体に亘って均一になるように添加する。この添加量は、固定相充填剤に対して概ね体積比２０：１に設定することが好ましい。添加した前記フコキサンチン含有抽出物の全量が中性シリカゲル８側に移動した後、所定量の第１移動相溶媒を速やかに添加し、分離を開始する。
【００３０】
前記第１移動相溶媒の添加後、或る程度の時間が経過すると、カラム２の内部には、下側に緑色物質と上側にオレンジ色物質とが観察される。カラム２から最初に流出してくる前記緑色物質を回収容器３に回収する。次に、回収容器４を回収容器３と交換して、カラム２の下に配置する。前記緑色物質よりも遅れて時間をかけて流出してくる前記オレンジ色物質は、回収容器４に回収する。カラム２から流出してくる前記物質が、糸状ではなく滴状に落下するように、注射針１２の内径を選択することが好ましい。
【００３１】
第１過程の第１分離操作によって、前記フコキサンチン含有抽出物は、大まかに３つの物質に分離される。即ち、カラム２から最初に流出した回収容器３の濃緑色の分画１３と、遅れて流出した回収容器４の淡黄色の分画１４と、中性シリカゲル８に吸着した半透明淡緑色の物質である。濃緑色の分画１３は、無極性に近い性質を有する集合体のクロロフィルａの粗画分である。淡黄色の分画１４は、中程度の無極性物質と考えられ、フコキサンチン及びその分解物、即ちフコキサンチンの粗画分である。この分画１４には、クロロフィルａも少なからず存在すると考えられる。中性シリカゲル８への吸着物質は、強い極性を有するクロロフィルｃとクロロフィルａの分解物質（単分子又はそれに近い状態）である。
【００３２】
更に第１過程では、第２分離操作によって、中性シリカゲル８から前記吸着物質を溶出させて、クロロフィルｃとクロロフィルａ分解物とを分取する。先ず、図１（Ｂ）に示すように、カラム２の下に回収容器５を配置して、カラム２の上端開口から所定量の第２移動相溶媒を添加する。第２移動相溶媒としては、例えば、中性シリカゲル８より強い極性を有するメタノールを使用する。これによって、クロロフィルｃとクロロフィルａ分解物とが、中性シリカゲル８の吸着サイトから脱離して溶出する。
【００３３】
前記第２移動相溶媒の添加後、或る程度の時間が経過すると、カラム２の内部には、下側に褐色物質と上側に緑色物質とが観察される。カラム２から最初に流出してくる前記褐色物質を回収容器５に回収する。次に、回収容器６を回収容器５と交換して、カラム２の下に配置する。前記緑色物質は、前記褐色物質よりも遅れて時間をかけて流出してくるので、これを回収容器６に回収する。先に回収容器５に回収した褐色の分画１５は、比較的強い極性のクロロフィルｃの粗画分である。遅れて回収容器６に回収した緑色の分画１６は、それより強い極性のクロロフィルａ分解物の粗画分である。
【００３４】
このように、本発明によれば、第１段階の液体クロマトグラフィーにおいて、固定相の中性シリカゲルに無極性の（又は極性の弱い）移動相を用いることによって、クロロフィルａとフコキサンチンとを異なる保持時間で分取することができる。更に、極性溶剤を移動相に用いることによって、クロロフィルｃとクロロフィルａ分解物とを異なる保持時間で分取することができる。
【００３５】
本実施態様によれば、回収容器４に収容する分画１４即ちフコキサンチン粗画分は、その中に含まれる前記第１移動相溶媒を、例えばロータリーエバポレーターによって留去した後、所定量の第１移動相溶媒に溶解させることにより、例えば１／１００程度に濃縮する。この濃縮物のフコキサンチン粗画分を、次の第２段階の液体クロマトグラフィーにかける。同様に、前記集合体クロロフィルａ粗画分及びクロロフィルｃ粗画分もそれぞれ濃縮し、得られた濃縮物を第２段階の液体クロマトグラフィーにかけることができる。
【００３６】
図２（Ａ）〜（Ｃ）は、第２段階の液体クロマトグラフィーによる分離精製過程を模式的に示している。これら各図に示すように、第２段階で使用する液体クロマトグラフィー装置２１は、カラム２２と、前記カラムからの溶出物を収容するために全部で７つの回収容器２３〜２９とから構成される。カラム２２は、第１段階と同様に、例えば比較的長さの短いデスポーザブル注射器の注射筒を使用できるが、第２段階での前記各粗画分の添加量は、第１段階のフコキサンチン含有抽出物の添加量よりも、前記濃縮によって大幅に減少しているので、より小型のもので十分である。回収容器２３〜２９も、同様に三角フラスコを使用できるが、第１段階より小型にすることができる。
【００３７】
カラム２２の固定相充填剤も、同様に中性シリカゲル３０を使用するが、分離精度を高めるために、シリカゲル粒子が均一のものを使用することが好ましい。同様に、カラム２２内には、予め移動相溶媒に浸漬した脱脂綿３１が、前記注射筒の底部に圧縮して一定の厚さで平らに充填され、海砂３２が一定の厚さで重層され、その上に中性シリカゲル３０が充填され、かつその平らな上面に円形の濾紙３３が重ねられている。尚、中性シリカゲル３０は、予め移動相溶媒に浸漬しておいたものを充填する。また、カラム２２には、前記注射筒の筒先部分３４に、移動相溶媒の流速を調節する所定径の注射針３５が装着されている。
【００３８】
第２段階では、その第１分離操作によって、前記フコキサンチン粗画分からフコキサンチンとフコキサンチン分解物とを分離する。第１分離操作では、移動相溶媒として第１段階と同じアセトン・ヘキサン混合剤の第１移動相溶媒を使用する。尚、中性シリカゲル０及び脱脂綿３１を予め浸漬するのに使用する前記移動相溶媒が、第１移動相溶媒であることは言うまでもない。
【００３９】
図２（Ａ）に示すように、カラム２２の下に回収容器２３を配置し、カラム２２の上端開口から所定量の前記フコキサンチン粗画分濃縮物を添加する。この添加量は、第１段階と同様に、固定相充填剤に対して概ね体積比２０：１に設定することが好ましい。添加した全量が濾紙３２から中性シリカゲル３０側に移動した後、所定量の第１移動相溶媒を速やかに添加し、分離を開始する。
【００４０】
前記第１移動相溶媒の添加後、或る程度の時間が経過すると、カラム２２の内部には、下側に緑色物質と、上側に帯状にオレンジ色〜黄色の物質とが観察される。カラム２２から最初に流出してくる前記緑色物質を回収容器２３に回収する。次に、回収容器２４を回収容器２３と交換してカラム２２の下に配置し、先に流出してくる上側の黄色物質を回収する。更に、回収容器２５を回収容器２４と交換してカラム２２の下に配置し、最後に遅れて流出してくるオレンジ色物質を回収する。
【００４１】
最初に回収される回収容器２３の前記緑色物質は、第１段階で前記フコキサンチン粗画分に混在していた集合体クロロフィルａの画分３６である。次に回収される回収容器２４の前記黄色物質は、フコキサンチンよりも極性の弱いフコキサンチン代謝物の画分３７である。最後に回収される前記オレンジ色物質が、目的とするフコキサンチンの画分３８である。また、クロロフィルｃが前記フコキサンチン粗画分に混在していたとしても、第１段階と同様に中性シリカゲル３０に吸着され、溶出しないので、取得したフコキサンチンに混在する虞はない。このようにして、前記フコキサンチン粗画分からフコキサンチン画分を高精度に単離することができる。
【００４２】
得られたフコキサンチン画分３８から前記第１移動相溶媒を留去して、目的のフコキサンチンを精製する。フコキサンチンは比較的酸化し易いので、固形で保存する場合には、保存容器に窒素ガスを封入したり真空保存することが好ましい。また、溶液保存の場合は、揮発性の少ないジメチルサルホオキシド等の有機溶媒に溶解して保存することが好ましい。
【００４３】
また、第２段階では、第２分離操作によって、前記集合体クロロフィルａ粗画分からクロロフィルａとフコキサンチン分解物とを分離する。図２（Ｂ）に示すように、固定相として中性シリカゲル３０を充填したカラム２２の下に回収容器２６を配置し、カラム２２の上端開口から所定量の前記集合体クロロフィルａ粗画分濃縮物を添加する。添加した全量が濾紙３２から中性シリカゲル３０側に移動した後、第１分離操作と同じくアセトン・ヘキサン混合剤である前記第１移動相溶媒を所定量添加し、分離を開始する。
【００４４】
この場合、カラム２２から最初に緑色の集合体クロロフィルａ画分３９が流出して、回収容器２６に回収される。次に、カラム２２の下に回収容器２７を回収容器２６と交換して配置し、カラム２２から遅れて流出してくる黄色のフコキサンチン分解物画分４０を回収する。得られた集合体クロロフィルａ画分３９から前記第１移動相溶媒を留去することによって、クロロフィルａを分離精製することができる。
【００４５】
更に、第２段階では、第３分離操作によって、前記クロロフィルｃ粗画分からクロロフィルｃとクロロフィルａ分解物とを分離する。図２（Ｃ）に示すように、固定相として中性シリカゲル３０を充填したカラム２２の下に回収容器２８を配置し、カラム２２の上端開口から所定量の前記クロロフィルｃ粗画分濃縮物を添加する。添加した全量が濾紙３２から中性シリカゲル３０側に移動した後、第１段階の第２分離操作と同じくメタノールである前記第２移動相溶媒を所定量添加し、分離を開始する。
【００４６】
この場合、カラム２２から最初に褐色のクロロフィルｃ画分４１が流出して、回収容器２８に回収される。次に、カラム２２の下に回収容器２９を回収容器２８と交換して配置し、カラム２２から遅れて流出してくる緑色のクロロフィルａ分解物画分４２を回収する。得られたクロロフィルｃ画分４１から前記第２移動相溶媒を留去することによって、クロロフィルｃを分離精製することができる。
【００４７】
本発明によれば、中性シリカゲル８、３０を充填したときにカラム２、２２から流出してくる前記移動相溶媒、及び第１，第２段階で分離開始直後に前記カラムから目的物質よりも先に流出してくる前記移動相溶媒は、例えば前記中性シリカゲルを事前に浸漬処理するために再使用することができる。また、中性シリカゲル８、３０及び海砂１０、３２は、比較的短いカラム２，２２からの回収が容易にできるので、使用した溶剤を完全に除去することによって、再使用することができる。
【００４８】
また、上述した実施態様では、比較的小規模でのフコキサンチン製造に適した構成を説明している。しかし、これを工場規模の大量生産に適したものに拡大可能なことは、当業者であれば容易に理解することができる。
【実施例１】
【００４９】
褐藻類の１種であるヨレモクを、アセトンを抽出溶剤とする上記実施態様の方法により抽出処理してフコキサンチン含有抽出物を得た。これを出発材料として、本実施態様の第１段階を次のクロマトグラフィー条件で行った。
カラム：カテーテル用シリンジ（注射筒ＪＭＳシリンジカテーテルフィット１００ml、内径３．５cm、長さ１３．５cm）
固定相：シリカゲル６０Ｎ（球状・中性、６３−２１０μm）
移動相：アセトン・n-ヘキサン混合液（４：６）
注射針：規格２３Ｇ×１・１／４”（内径０．６×長さ３２mm）（但し、針基を生ゴム管でシリンジ筒先と接続）
海砂：２０〜３５メッシュ
【００５０】
フコキサンチン含有抽出物を５ml添加した後、移動相溶媒を２ml添加し、フコキサンチン粗画分約１００mlを得た。これから移動相溶媒をロータリーエバポレーターで留去し、移動相溶媒１mlに溶解した。得られたフコキサンチン粗画分濃縮物を用いて、本実施態様の第２段階を次のクロマトグラフィー条件で行い、フコキサンチンを単離精製した。
カラム：汎用プラスチック製注射筒２０ml（ＳＳ−２０ＥＳＺ）
固定相：シリカゲル６０Ｎ（球状・中性、４０−５０μm）
移動相：アセトン・n-ヘキサン混合液（４：６）
注射針：規格２６Ｇ×１／２”（内径０．４５×長さ１３mm）
【実施例２】
【００５１】
（収穫した物質の評価）
本実施態様の製造方法により得られたフコキサンチンの活性、機能を、以下のとおり生物試験に供して評価した。具体的には、各試料について細胞増殖生存率又は阻害度をＭＴＴアッセイ法により測定し、比較した。ここで、ＭＴＴアッセイ法とは、薬物作用によるアポトーシス又はネクローシスの誘導では死滅しない細胞の生存率や増殖率を測定する方法をいう。
先ず、各試料について測定結果の比較を正確に行うために、以下のようにして各試料の濃度を一定にした。
【００５２】
（試料の乾燥）
フコキサンチンが酸化され易い物質であることを考慮して、以下のように試料の乾燥を行った。先ず、上記実施例１で得られた出発材料のフコキサンチン含有抽出物５mlをロータリー・エバポレイターでウォータバス温度をアセトン・ヘキサン溶剤４０℃、メタノール溶剤６０℃に設定して真空乾燥させ、その重量を測定して２例の平均値から１７mgの収穫量を得、これを試料全量とした。
【００５３】
本実施態様の第１段階でフコキサンチン含有抽出物５mlから得られた前記各粗画分を含む移動相溶媒５０〜２００mlを、それぞれ分画終了後直ちに真空凍結乾燥（２０分以内）させ、前記エバポレーター用のナスフラスコに移動相溶媒１mlを添加して溶解させた。これらを本実施態様の第２段階の試料に用い、得られた各画分の移動相溶媒約２０mlを同様に真空乾燥させ、その後直ちに移動相溶媒１mlを添加して前記ナスフラスコから回収し、６ml容量のスクリュー管瓶に入れた。これらを、管底を６０℃に温めた条件下で、強制的に風乾させて１５分以内で乾燥させた。得られた試料の収穫重量を測定した。いずれの分画にもカラム充填剤の微細なシリカゲルの混入が避けられないので、各分画の重量比を算出し、全重量１７mgからそれぞれの分画量を算出した。得られた各試料１mg／mlをそれぞれ溶媒ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）で溶解調整し、以下の生物試験の出発材料とした。
【００５４】
（細胞増殖阻害実験）
前記各試料の細胞増殖阻害実験を以下の要領で行った。使用した細胞株、その由来及び培地は次のとおりである。
・正常線維芽細胞株NIH/3T3（市販品）；培地：Minimum Essential Medium Eagle
・ヒト乳がん細胞株ZA-H4（新札幌恵愛会病院福井里佳博士提供）；培地：RPMI-1640 Medium
・ヒト膵臓がん細胞株HPC-4（新札幌恵愛会病院八十島孝博博士提供）；培地：RPMI-1640 Medium
・ヒト結腸がん細胞株HT-29（市販品）；培地：McCOY’S 5A Medium Modified
【００５５】
先ず、通常通りの細胞培養操作を行なった。即ち、培養器庫内を３７℃、５％ＣＯ2に設定し、各細胞株の培地に、１０％血清と抗生物質ペニシリン（１００units／ml）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ml）とを添加した。９６穴マイクロプレートに１穴当り４，０００個の細胞を蒔き、１日培養した後、前記各試料を添加した。前記試料添加後２日目に、ＭＴＴ法により各細胞株の生存率を求めた。添加する前記各試料は、予めそれぞれ１０μg／mlをＤＭＳＯで溶解調整した。
【００５６】
（試験結果）
前記各試料についてＭＴＴ法により求められた各細胞株の生存率の比較結果を図３に示す。更に、フコキサンチンについて各細胞株の増殖阻害率の比較結果を図４に示す。図３に示すように、フコキサンチン及びフコキサンチン分解物（フコキサンチン代謝物も含むと思われる）は、マウス正常細胞NIH/3T3に対するよりも、ヒトがん細胞ZA-H4、HPC-4、HT-29への増殖阻害効果が高かった。また、図３及び図４から、正常細胞NIH-3T3、乳がん細胞ZA-H4、結腸がん細胞HT-29のフコキサンチン及びクロロフィルａ，ｃへの応答が、膵臓がん細胞HPC-4とは異なることが分かった。これら生物試験の結果から、本発明の方法により製造されたフコキサンチンは、人体に対しても十分な抗腫瘍効果を発揮し得る高純度、高品質のものであることが確認された。
【符号の説明】
【００５７】
１，２１  クロマトグラフィー装置
２，２２  カラム
３〜６，２３〜２９  回収容器
８，３０  中性シリカゲル
【図１（Ａ）】
2013166790.tif 000003
【図１（Ｂ）】
2013166790.tif 000004
【図２（Ａ）】
2013166790.tif 000005
【図２（Ｂ）】
2013166790.tif 000006
【図２（Ｃ）】
2013166790.tif 000007
【図３】
2013166790.tif 000008
【図４】
2013166790.tif 000009