(57)【要約】【課題】  核酸を固定化した金属探針を用いて、トンネル電流を測定することに基づく、簡便かつ迅速な遺伝子解析方法を提供する。【解決課題】  （ｉ）標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との間のトンネル電流を測定する工程；および（ｉｉ）測定されたトンネル電流に基づいてサンプル核酸を分析する工程を含む、核酸の分析方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との間のトンネル電流を測定する工程；および
（ｉｉ）測定されたトンネル電流に基づいてサンプル核酸を分析する工程を含む、核酸の分析方法。
【請求項２】
工程（ｉ）において、前記金属探針と前記固体基板との距離を変化させながらトンネル電流を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ）において、前記金属探針と前記固体基板との距離が予め定めた距離である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）を繰り返す、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉ）において、配列既知の対照核酸に対するトンネル電流と、工程（ｉ）で測定したサンプル核酸に対するトンネル電流とを比較することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）において、プローブ核酸とサンプル核酸との特異的なトンネル電流値を得ることを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉ）において、標的核酸に相補的なプローブ核酸とサンプル核酸との特異的なトンネル電流値と、前記プローブ核酸と配列既知の対照核酸との特異的なトンネル電流値とを比較することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）における対照核酸に対するトンネル電流が予め測定されている、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＳＮＰ解析のための、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対照核酸が、標的核酸におけるＳＮＰの遺伝子型のいずれかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
プローブ核酸が、標的核酸と実質的に同じヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サンプル核酸が、標的核酸と実質的に同じヌクレオチド長である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
プローブ核酸およびサンプル核酸が、標的核酸と同じヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸が、４〜１５ヌクレオチド長である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の方法に用いられる、プローブ核酸を固定化した金属探針。
【請求項１６】
請求項１５に記載の金属探針を備えた、トンネル電流測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子を解析するための方法に関する。より詳細には、本発明は、トンネル電流の測定に基づく、遺伝子の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学における技術的発展により様々な生物のゲノム構造が明らかになり、多くの遺伝的疾患やウイルス性疾患において遺伝子の変異が関与することが明らかになってきた。そのため、医学、分子生物学などの様々な分野において、特定の遺伝子配列における変異を検出し、解析する方法の確立が重要な課題となっている。
【０００３】
一塩基多型（ＳＮＰ）に関する研究は、疾病関連遺伝子の探索、疾病に対するリスク診断、薬剤応答性や副作用の解明などに重要と考えられている。ＳＮＰを検出する方法としては、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をゲルにより分離した後に、色素でＤＮＡ断片を染色し検出する電気泳動法、または蛍光検出とＤＮＡチップとを組合せたキャピラリー電気泳動法がよく知られる。しかし、これらの方法は解析に長時間を要する等の問題がある。
【０００４】
走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）では、金属探針を用いたトンネル電流測定に基づき、実空間における原子レベルの表面の原子構造または分子構造の分析が可能である。ＳＴＭに用いられる金属探針を有機分子で化学修飾した分子探針が開発された。分子探針を備えたＳＴＭでは、様々な官能基または化学種を同定することが可能になる（非特許文献１、特許文献１）。アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルなどのチオール誘導体を有する核酸塩基探針を用いたＳＴＭでは、核酸塩基の識別および核酸配列の配列決定が可能となる（特許文献２）。核酸塩基探針を備えたＳＴＭによる核酸配列の配列決定には、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルの４種類の核酸塩基探針がそれぞれ必要である。また、前記配列決定では走査する必要もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２９４０８２号公報
【特許文献２】特開２００８−５２５７９２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】西野 智昭ら、表面化学、２００６年、Ｖｏｌ．２７、Ｎｏ．１、２７〜３３頁「分子探針による化学選択性ＳＴＭ」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便かつ迅速に遺伝子解析を行うことができる核酸の分析方法を提供することを目的とする。本発明はまた、前記方法に用い得る金属探針、および前記金属探針を備えた装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、金属探針に固定化された標的核酸に相補的なプローブ核酸が、標的核酸を固定化した固体基板上で、該標的核酸とハイブリッド形成した場合に大きなトンネル電流が流れることを見出した。さらに、本発明者らは、前記金属探針と前記固体基板との距離を変化させたところ、ハイブリッド形成した二本鎖核酸に特異的なトンネル電流が得られること、および、前記の特異的なトンネル電流がハイブリダイズの程度によって異なることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の遺伝子の分析方法、前記方法に用いられるプローブ核酸が固定化された金属探針、および前記金属探針を備えたトンネル電流測定装置に関する。
【００１０】
［１］（ｉ）標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との間のトンネル電流を測定する工程；および（ｉｉ）測定されたトンネル電流に基づいてサンプル核酸を分析する工程を含む、核酸の分析方法。
［２］工程（ｉ）において、前記金属探針と前記固体基板との距離を変化させながらトンネル電流を測定する、［１］に記載の方法。
［３］工程（ｉ）において、前記金属探針と前記固体基板との距離が予め定めた距離である、［１］に記載の方法。
［４］工程（ｉ）を繰り返す、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］工程（ｉｉ）において、配列既知の対照核酸に対するトンネル電流と、工程（ｉ）で測定したサンプル核酸に対するトンネル電流とを比較することを含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］工程（ｉｉ）において、プローブ核酸とサンプル核酸との特異的なトンネル電流値を得ることを含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］工程（ｉｉ）において、標的核酸に相補的なプローブ核酸とサンプル核酸との特異的なトンネル電流値と、前記プローブ核酸と配列既知の対照核酸との特異的なトンネル電流値とを比較することを含む、［６］に記載の方法。
［８］工程（ｉｉ）における対照核酸に対するトンネル電流が予め測定されている、［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ＳＮＰ解析のための、［８］に記載の方法。
［１０］対照核酸が、標的核酸におけるＳＮＰの遺伝子型のいずれかである、［９］に記載の方法。
［１１］プローブ核酸が、標的核酸と実質的に同じヌクレオチド長である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］サンプル核酸が、標的核酸と実質的に同じヌクレオチド長である、［１１］に記載の方法。
［１３］プローブ核酸およびサンプル核酸が、標的配列と同じヌクレオチド長である、［１２］に記載の方法。
［１４］標的核酸が、４〜１５ヌクレオチド長である、［１］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法に用いられる、プローブ核酸を固定化した金属探針。
［１６］［１５］に記載の金属探針を備えた、トンネル電流測定装置。
【００１１】
本発明において、工程（ｉ）は、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との間のトンネル電流を測定する工程である。
【００１２】
本発明方法の第１の態様において、工程（ｉ）は、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との距離を変化させながら、前記金属探針と前記固体基板との間のトンネル電流を測定する。この態様の１つの実施形態において、前記金属探針と前記固体基板との距離は、前記金属探針と前記固体基板とを近接させた後に、前記金属探針と前記固体基板とを離すことによって、変化させる。
標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板とを近接させると、プローブ核酸は、サンプル核酸中の標的核酸とハイブリッドを形成し得る。
【００１３】
次いで該金属探針と該固体基板とを離す。該金属探針と該固体基板との距離が大きくなるにつれて、該金属探針と該固体基板との間のトンネル電流は減衰する傾向がある。プローブ核酸と標的核酸がハイブリッド形成している場合、該金属探針と該固体基板とがある距離になった時点で、該金属探針と該固体基板との間のトンネル電流が、上記のトンネル電流の減衰傾向から予想されるトンネル電流よりも大きくなる。この第１の態様において、本発明の方法は、金属探針と固体基板との距離を変化させながらトンネル電流を測定することによって得られる、該金属探針と該固体基板との間のトンネル電流の特異的な変化に基づいて、サンプル核酸を解析するものである。
【００１４】
本発明方法の第２の態様において、工程（ｉ）は、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との距離を予め定めた距離として、前記金属探針と前記固体基板との間のトンネル電流を測定する。
標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との距離が予め定めた距離である場合に、プローブ核酸は、サンプル核酸中の標的核酸とハイブリッドを形成し得る。
【００１５】
１つの実施形態において、予め定めた距離は、該プローブ核酸と該標的核酸がハイブリッド形成している場合、該金属探針と該固体基板とを離した際に観察されるトンネル電流の減衰傾向から予測されるトンネル電流よりも大きな特異的なトンネル電流が得られる距離である。この第２の態様において、本発明の方法は、金属探針と固体基板とを予め定めた距離でトンネル電流を測定することによって、該金属探針と該固体基板との間の特異的なトンネル電流に基づいて、サンプル核酸を解析するものである。
【００１６】
本発明において、工程（ｉｉ）は、測定されたトンネル電流に基づいてサンプル核酸を分析する工程である。１つの実施形態において、工程（ｉｉ）は、配列既知の対照核酸に対するトンネル電流と、工程（ｉ）で測定したサンプル核酸に対するトンネル電流とを比較することを含む。例えば工程（ｉｉ）は、標的核酸に相補的なプローブ核酸と、配列既知の対照核酸およびサンプル核酸それぞれに認められる特異的なトンネル電流を数値化して、特異的トンネル電流値を得、これを比較することによってサンプル核酸の配列を解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】核酸金探針１および核酸固定基板１を用いたトンネル電流測定で得られた電流−移動距離のデータに基づく、電流値のヒストグラム。横軸は、トンネル電流測定で得られた電流値を示す。縦軸は、電流値のカウントを示す。
【図２】水溶液中測定用金探針および核酸固定基板２を用いたトンネル電流測定で得られた電流−移動距離のデータに基づく、電流値のヒストグラム。横軸は、トンネル電流測定で得られた電流値を示す。縦軸は、電流値のカウントを示す。
【図３】核酸金探針２および核酸固定基板１を用いたトンネル電流測定で得られた電流−移動距離のデータに基づく、電流値のヒストグラム。横軸は、トンネル電流測定で得られた電流値を示す。縦軸は、電流値のカウントを示す。
【図４】核酸金探針１〜４のいずれかの核酸金探針および核酸固定基板１を用いて得られた、プローブ核酸と標的核酸との特異的なトンネル電流値を示す棒グラフ。横軸は、核酸金探針１〜４に固定化された各プローブ核酸の４番目のヌクレオチドを示す。縦軸は、得られたプローブ核酸と標的核酸との特異的なトンネル電流値を示す。
【図５】核酸金探針５および核酸固定基板３を用いたトンネル電流測定で得られた電流−移動距離のデータに基づく、電流値のヒストグラム。横軸は、トンネル電流測定で得られた電流値を示す。縦軸は、電流値のカウントを示す。
【図６】核酸金探針１および核酸固定基板１を用いたトンネル電流測定で得られた電流−時間のデータに基づく、電流値のヒストグラム。横軸は、トンネル電流測定で得られた電流値を示す。縦軸は、電流値のカウントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、「核酸」は、２以上のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを意味する。核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡを含むすべてのＤＮＡおよびＲＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってよい。
【００１９】
本発明において、「サンプル核酸」は、標的とする配列（以下、標的配列ともいう）を有することが期待される核酸を意味する。本発明において、サンプル核酸は、その供給源、例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ等または試料調製に起因する夾雑物を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明において、サンプル核酸は、好ましくは一本鎖の核酸である。例えば核酸の分析がサンプル核酸中のＳＮＰを分析することを目的とする場合、該サンプル核酸は、ＳＮＰの遺伝子型のいずれかであることが期待される核酸である。
【００２１】
本発明において、固体基板に固定化されるサンプル核酸は、１種類であっても複数種類であってもよい。
【００２２】
本発明において、「標的核酸」は、標的配列を有する核酸を意味する。限定するものではないが、本発明において、核酸の分析が、サンプル核酸中のＳＮＰを分析することを目的とする場合、標的配列は、ＳＮＰの各遺伝子型を含む配列である。
【００２３】
本発明において、「標的核酸に相補的なプローブ核酸」は、標的配列を有する核酸（すなわち、標的核酸）と塩基対を形成し得る核酸を意味する。本発明において、「標的核酸に相補的なプローブ核酸」は、標的配列に対して１００％相補的（フルマッチ）な配列を有する核酸、または標的配列に対して一部ミスマッチを含有する相補配列であるが、標的核酸にハイブリダイズし得る核酸を意味する。ミスマッチは１塩基〜２塩基であることが好ましい。
【００２４】
本発明の１つの実施形態において、「標的核酸に相補的な」核酸は、好ましくは、標的配列に対して１００％相補的な配列を有する核酸である。核酸の分析が、サンプル核酸中のＳＮＰを分析することを目的とする場合、「標的核酸に相補的なプローブ核酸」は、好ましくはＳＮＰの遺伝子型のいずれかを含む配列に１００％相補的な配列を有する核酸である。本発明において、標的核酸に相補的なプローブ核酸は、好ましくは一本鎖の核酸である。
【００２５】
本発明において、「対照核酸」は、既知配列を有する核酸を意味する。核酸の分析がサンプル核酸中の標的配列を検出する場合は、対照核酸は標的核酸と同一の配列とすればよい。
核酸の分析が、ＳＮＰ検出を目的とする場合、対照核酸として、ＳＮＰのいずれかの遺伝子型を含む配列を用いてもよいし、ＳＮＰ遺伝子型それぞれの核酸を用いてもよい。
【００２６】
本発明において、標的核酸は、限定するものではないが、４〜１５ヌクレオチド長である。標的核酸は、６〜１２ヌクレオチド長、８〜１２ヌクレオチド長、または８ヌクレオチド長であってよい。
【００２７】
本発明において、「標的核酸と相補的なプローブ核酸」は、限定するものではないが、標的核酸と実質的に同じヌクレオチド長である。本発明において「実質的に同じヌクレオチド長」は、標的核酸のヌクレオチド長と、プローブ核酸のヌクレオチド長との差が、０〜３ヌクレオチド長、好ましくは０〜２ヌクレオチド長、より好ましくは０〜１ヌクレオチド長である。最も好ましくは、本発明において、標的核酸と相補的なプローブ核は、標的核酸と同じヌクレオチド長である。
【００２８】
本発明において、サンプル核酸または対照核酸のヌクレオチド長もまた、標的核酸と実質的に同じヌクレオチド長であることが好ましい。
【００２９】
本発明において、「金属探針」は、限定するものではないが、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）用の金線、白金線、白金イリジウム線、タングステン線などであってよい。金属探針は、ＮａＣｌ、ＮａＯＨ、ＫＣＮなどの水溶液中で電気化学エッチングおよび超音波浴中またはピラニア溶液中で洗浄してもよい。本発明に用いられる金属探針の直径は、例えば、０．２〜０．５ｍｍであってよい。
【００３０】
本発明において、金属探針は、その先端以外の部分を非導電性材料で被覆して、絶縁してもよい。絶縁処理に用い得る非導電性材料としては、ポリジメチルシロキサンなどの合成樹脂、商用の真空グリースおよびマニキュアなどが挙げられる。当該絶縁処理を施した金属探針を用いることで、水溶液中でのトンネル電流の測定が容易になる。本明細書において、前記のような絶縁処理を施した金属探針を「水中測定用金属探針」ともいう。
【００３１】
標的核酸に相補的なプローブ核酸の金属探針への固定化は、各種の化学反応を介して実施することができる。例えば、チオール基（−ＳＨ基）を末端に導入した核酸（以下、チオール末端核酸ともいう）と、金線から調製した金属探針（以下、金探針ともいう）とを用いて調製することができる。この場合、限定するものではないが、チオール末端核酸は、金−硫黄結合を介して金探針に直接固定化され得る。チオール基を導入する核酸の末端は、５’端であっても３’端であってもよい。チオール末端核酸の金探針への固定化は、チオール末端核酸を含有する溶液に金探針を浸漬することによって実施し得る。前記溶液の核酸濃度は、例えば、０．０５〜１０ｍＭであってよい。プローブ核酸を溶解する溶媒は、水系溶媒または有機溶媒であってよい。前記溶媒は、好ましくは水系溶媒である。
【００３２】
標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針は、適当な溶媒で洗浄して、固定化されていない余分な核酸分子を除去することが好ましい。洗浄後の前記金属探針は、不活性ガス中で乾燥させ、乾燥状態で保存することができる。
【００３３】
本発明において、サンプル核酸を固定化する固体基板は、限定するものではないが、従来の走査型トンネル顕微鏡に用いられる固体基板であってよい。そのような固体基板としては、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、グラファイトなどの金属基板および半金属基板；ならびに非導電性基板の表面を導電性材料で被覆した固体基板、例えば、金被覆マイカ、金被覆ガラスなどの金属被覆基板が挙げられる。
【００３４】
サンプル核酸を固定化した固体基板は、限定するものではないが、チオール基（−ＳＨ基）を末端に導入したサンプル核酸と金被覆した固体基板とを用いて調製することができる。この場合、チオール末端核酸は、金−硫黄結合を介して、金被覆固体基板に直接固定化され得る。チオール基を導入する末端は、５’端であっても３’端であってもよい。チオール末端核酸の金被覆固体基板への固定化は、限定するものではないが、チオール末端核酸を含有する溶液に金被覆固体基板を浸漬させることによって実施し得る。金被覆固体基板への核酸の固定化は、０．０５〜１０ｍＭの核酸濃度で実施し得る。サンプル核酸を溶解する溶媒は、水系溶媒または有機溶媒であってよい。前記溶媒は、好ましくは水系溶媒である。
【００３５】
サンプル核酸を固定化した金被覆固体基板は、適当な溶媒で洗浄して、固定化されていない余分な核酸分子を除去することが好ましい。洗浄後の前記金被覆固体基板は、不活性ガス中で乾燥させ、乾燥状態で保存することができる。
【００３６】
トンネル電流の測定手段としては、走査型トンネル顕微鏡に用いられる測定手段が挙げられる。トンネル電流は、サンプル核酸を固定化した固体基板および標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針を、トンネル電流測定手段、例えば走査型トンネル顕微鏡にそれぞれ装着し、装着した前記固体基板と前記金属探針との間にバイアス電圧を印加することで測定される。
【００３７】
本発明において、「トンネル電流」は、金属探針と固体基板との間に一本鎖核酸または二本鎖核酸が存在していている又は存在していないに関わらず、金属探針と固体基板との間に流れる電流を意味する。本発明において、「トンネル電流の測定」には、測定したトンネル電流を記録することを含み得る。
【００３８】
本発明において、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板は、好適にはリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＳＳＣ（塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを混合した緩衝液）などの緩衝液中に存在させて、トンネル電流の測定を行う。
【００３９】
本発明において、固体基板と金属探針との間に印加するバイアス電圧は、限定するものではないが、金属探針とプローブ核酸との間の結合、例えば金−硫黄結合が開裂しない大きさである。前記のバイアス電圧は、例えば、-１５００ｍＶ〜１５００ｍＶであってよい。印加するバイアス電圧は、金属探針側を陰極にし、固体基板側を陽極にしてもよいし、または金属探針側を陽極にし、固体基板側を陰極にしてもよい。
【００４０】
本発明において、工程（ｉ）では、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との間のトンネル電流を測定する。
【００４１】
本発明方法の第１の態様において、工程（ｉ）は、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向した、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との距離を変化させながら、前記金属探針と前記固体基板との間のトンネル電流を測定する。１つの実施形態において、工程（ｉ）は、トンネル電流を測定しながら、前記金属探針と前記固体基板との距離は、前記金属探針と前記固体基板とを近接させること、および／または前記金属探針と前記固体基板とを離すことによって、変化させる。
【００４２】
他の実施形態では、工程（ｉ）は、トンネル電流を測定しながら、前記金属探針と前記固体基板との距離を、前記金属探針と前記固体基板とを近接させた後に、前記金属探針と前記固体基板とを離すことによって、変化させる。この実施形態において、金属探針と固体基板との近接は限定するものではないが、予め定めたトンネル電流が得られる距離まで、固体基板の表面に対してＺ軸もしくは垂直方向に、前記金属探針と前記固体基板とを近接させることである。あるいは、金属探針と固体基板との近接は限定するものではないが、予め定めたトンネル電流が得られる距離まで、核酸が固定された固体基板上の領域に対して、Ｚ軸もしくは垂直方向、Ｘ−Ｙ平面もしくは水平方向、または斜め方向に、前記探針と前記固定基板上の領域とを近接させることである。前記の予め定めたトンネル電流は、トンネル電流の測定に用いる装置の性能または設定により定め得る。例えば、予め定めたトンネル電流が得られる距離は、トンネル電流測定装置で測定できる電流の上限よりも低いトンネル電流が得られる距離までである。
【００４３】
金属探針と固体基板とを離す際、両者の最大距離は、限定するものではないが、プローブ核酸または標的核酸の鎖長より長いことが好ましい。好適には、前記の最大距離は、プローブ核酸と標的核酸がハイブリッド形成した場合の鎖長よりも長い。核酸の鎖長は核酸配列から概算することができる。ヌクレオチドの鎖長は、塩基対間の距離にヌクレオチドの数を掛け合わせて概算することができる。塩基対間の距離は、例えば、２．２Å〜３．８Åとして概算することができる。限定するものではないが、塩基対間の距離は、例えば、Ｂ型の二重らせん構造に鑑みて、３．３Åであることが知られている。金属探針と固体基板とを離す距離は、このように計算されるヌクレオチドの鎖長よりも、１〜１００ｎｍ長いことが好ましいが、これらに限定されない。
【００４４】
第１の態様の工程（ｉ）において、金属探針と固体基板との距離を変化させる際の速度は特に限定されず、一定速度あってもよいし、可変速度であってもよい。金属探針と固体基板とを離す速度は、一定速度であることが好ましい。例えば、前記一定速度は、１ｎｍ／ｓ〜５００ｎｍ／ｓの速度、好ましくは５ｎｍ／ｓ〜５０ｎｍ／ｓの速度であってよい。
【００４５】
第１の態様において、金属探針と固体基板との距離を変化させる方向は、該金属探針に対向した、該固体基板の表面に対し、Ｚ軸方向もしくは垂直方向、または斜め方向であってもよい。あるいは、前記方向は、金属探針に対向した、固体基板の表面上の核酸が固定化された領域に対して、Ｚ軸方向もしくは垂直方向、Ｘ−Ｙ平面もしくは水平方向、または斜め方向であってよい。金属探針と固体基板との距離を変化させる場合、金属探針を移動させても、固体基板を移動させても、または金属探針と固体基板の両方を互いに移動させてもよい。
【００４６】
第１の態様の特定の実施形態において、工程（ｉ）を繰り返す。この場合、金属探針に対向した、固体基板のＸＹ−表面におけるＸＹ座標は、前回のＸＹ座標と同じであってもよいし、あるいはＸ座標もしくはＹ座標またはその両方が異なっていてもよい。
【００４７】
第１の態様の１つの実施形態において、工程（ｉｉ）における測定されたトンネル電流は、工程（ｉ）において測定されたトンネル電流のうち、金属探針と固体基板との距離が大きくなる過程で測定されたトンネル電流であることが好ましい。
【００４８】
本発明において、工程（ｉｉ）では、測定されたトンネル電流に基づいてサンプル核酸を分析する。１つの実施形態において、予め測定しておいた配列既知の対照核酸により得られたトンネル電流と、サンプル核酸により得られたトンネル電流を比較して、サンプル核酸を分析する。
トンネル電流の比較は例えば、下記のようにして行うことができる。該金属探針と該固体基板との間のトンネル電流を測定し、「電流−移動距離のデータ」または「電流−時間のデータ」を得る。「電流−移動距離のデータ」において、金属探針と固体基板との間のトンネル電流は、金属探針と固体基板の距離が大きくなるにつれ、概して減衰傾向を示す。前記の「電流−移動距離のデータ」または「電流−時間のデータ」に基づいて、例えば、配列既知の対照核酸に対するトンネル電流およびサンプル核酸に対するトンネル電流それぞれに関する「電流値のヒストグラム」を作成する。作成した電流値のヒストグラムにおいて、電流値に対する電流値のカウントは、電流値が大きくなるにつれ概して減衰傾向を示すが、特定の電流値で、電流値カウントの増大がピークとして観察される。例えば、図１で示される電流値のヒストグラムにおいては、約１０ｎＡ付近に電流値のカウントのピークが観察される。本発明において、工程（ｉｉ）では、例えば、サンプル核酸に対するトンネル電流に基づいて作成された電流値のヒストグラムで観察される電流値カウントのピークと、対照核酸に対するトンネル電流に基づいて作成された電流値のヒストグラムで観察される電流値カウントのピークとを比較して、サンプル核酸の配列を解析することができる。
【００４９】
電流値カウントのピークは、例えば電流値のヒストグラムをオーバーレイするなどして比較してもよいし、電流値カウントのピーク位置から特異的なトンネル電流値を数値化してこれを比較してもよい。特異的なトンネル電流値は限定するものではないが、上記のように作成した電流値のヒストグラムにおいて観察される電流値カウントのピークの頂点位置を特定して該電流値としてもよいし、または上記の電流値のヒストグラムにおいて、例えばガウス関数をモデル式として用いたフィッティングにより得てもよい。
【００５０】
本発明方法の第２の態様において、工程（ｉ）では、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面にサンプル核酸を固定化した固体基板との距離は、予め定めた距離である。この態様において、「予め定めた距離」は、金属探針に固定化された標的核酸に相補的なプローブ核酸と、固体基板に固定化された核酸中の標的核酸とがハイブリッド形成することができ、かつ、ハイブリッド形成した二本鎖核酸に特異的なトンネル電流が得られることが期待される距離である。
【００５１】
第２の態様の１つの実施形態において、「予め定めた距離」は限定するものではないが、トンネル電流を測定しながら、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、表面に標的核酸を固定化した固体基板とを近接させ、本発明の第１の態様の方法等を用いて得られる特異的なトンネル電流値の１倍〜１０倍、好ましくは１倍〜５倍、より好ましくは１．５倍〜３倍のトンネル電流値が得られる距離である。
【００５２】
第２の態様の他の実施形態において、「予め定めた距離」は限定するものではないが、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面に標的核酸を固定化した固体基板との距離が、該プローブ核酸と該標的核酸とでハイブリッド形成した二本鎖核酸が解離する距離よりも僅かに短い距離である。この実施形態において、前記の二本鎖核酸が解離する距離は、限定するものではないが、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面に標的核酸を固定化した固体基板とを、該プローブ核酸と該標的核酸とがハイブリッド形成し得るまで十分に近接させた後に、該金属探針と該固体基板とを離しながらトンネル電流を測定し、測定されるトンネル電流が、該金属探針と該固体基板との距離に依存したトンネル電流の減衰傾向よりも、大きな減衰を示す距離であってもよいし、または、塩基対間の距離にヌクレオチドの数を掛け合わせて得られる核酸の鎖長に基づいて概算される距離であってもよい。この実施形態において、「予め定めた距離」は、前記の二本鎖核酸が解離する距離よりも、０．０１ｎｍ〜1ｎｍ、好ましくは０．１ｎｍ〜０．３ｎｍ短い距離であってよいが、これに限定されない。
【００５３】
第２の態様の特定の実施形態において、工程（ｉ）を繰り返す。この場合、金属探針に対向した固体基板のＸＹ−表面におけるＸＹ座標は、前回のＸＹ座標と同じであってもよいし、あるいはＸ座標もしくはＹ座標またはその両方が前回の座標と異なっていてもよい。さらに、予め定めた距離は、前回の金属探針と固体基板との距離と同じであってもよいし、または異なっていてもよい。
【００５４】
本発明の１つの態様において、本発明の方法を用いてＳＮＰの分析を行う。「ＳＮＰ」は、個体のゲノム塩基配列中に一塩基が変異した多様性が存在し、その変異が集団内で１％以上の頻度で見られる、一塩基多型を意味する。本発明において、「ＳＮＰ」は、３種類または４種類の対立遺伝子が存在する場合に特に「ＳＮＰｓ」と称される一塩基多型も包含する。ＳＮＰの遺伝子型のいずれかを含む配列は、例えば、公知のＳＮＰデータベース（例えば、http://SNP.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html）を利用することで得ることができる。
【００５５】
ＳＮＰの解析を行う場合、サンプル核酸はＳＮＰの遺伝子型のいずれかであることが期待される核酸である。かかるサンプル核酸は、例えば、被験体からのゲノムＤＮＡまたは全ＲＮＡ等と公知のＳＮＰデータベースから利用可能なプライマーセットとを使用するＰＣＲ法により調製することができる。
【００５６】
本発明において、サンプル核酸中の「ＳＮＰの分析」は、該サンプル核酸中のＳＮＰを検出することを含み、さらに、ＳＮＰの遺伝子型を決定することを含み得る。本発明において、「ＳＮＰの遺伝子型を特定する」とは、標的核酸に少なくとも２種類の対立遺伝子が存在する場合に、サンプル核酸中の１つの対立遺伝子を他の対立遺伝子から識別し、かつ前記１つの対立遺伝子の遺伝子型を特定することを意味する。
【００５７】
本態様において、プローブ核酸を前記の特定される１つの対立遺伝子と１００％相補的な配列としてよい。あるいは、プローブ核酸を前記の特定される１つの対立遺伝子とは別の対立遺伝子と１００％相補的な配列としてもよい。この場合、前記の特定される１つの対立遺伝子は、プローブ核酸に対してミスマッチを有する遺伝子型である。本発明の１つの実施形態において、ＳＮＰについての核酸の分析は、標的核酸に相補的なプローブ核酸とサンプル核酸との特異的なトンネル電流値と、予め測定された前記プローブ核酸と対照核酸との特異的な対照トンネル電流値との比較に基づいて行われ得る。
【００５８】
対照核酸としては、ＳＮＰのいずれかの遺伝子型を含む配列を用い、サンプル核酸の配列が当該遺伝子型と同一か否かをそれぞれの特異的なトンネル電流を比較して決定すればよい。または、対照核酸としてＳＮＰ遺伝子型それぞれの核酸を用い、それぞれに特異的なトンネル電流を予め測定しておき、サンプル核酸により得られる特異的トンネル電流を各ＳＮＰの遺伝子型の対照核酸にて得られたものと比較することによってサンプル核酸のＳＮＰの遺伝子型を同定することができる。
【００５９】
本発明の別の態様において、表面上の複数の不連続なサブアレイ領域に複数種類のサンプル核酸をそれぞれ固定化した固体基板を用いて、各サブアレイ毎にサンプル核酸を分析する。かかる態様において（ｉ）標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針と、前記金属探針に対向させた、表面上の複数の不連続なサブアレイ領域に複数種類のサンプル核酸をそれぞれ固定化した固体基板との間のトンネル電流を各サブアレイ領域について測定する工程；および（ｉｉ）測定された各サブアレイ領域についてのトンネル電流に基づいて、各サンプル核酸を分析する工程を含む、核酸の分析方法が提供される。
【００６０】
本発明はまた、上記の核酸の分析方法に用いられる、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針を提供する。この態様の１つの実施形態において、金属探針に固定化されたプローブ核酸は、４〜１５ヌクレオチド長、６〜１２ヌクレオチド長、８〜１２ヌクレオチド長、または８ヌクレオチド長であってもよい。
【００６１】
本発明はさらに、上記の核酸の分析方法に用いられる、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針を備えたトンネル電流測定装置を提供する。
【００６２】
以下、実施例および比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、以下の実施例および比較例は単に例示を目的として提供され、本発明は以下の実施例および比較例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
＜金探針の製造＞
金線（（株）田中貴金属製、直径０．２５ｍｍ）に、１％  ＨＣｌＯ４を含む３ＭのＮａＣｌ水溶液中、１０Ｖ交流条件で電気化学エッチングを施し、次いで超音波浴中およびピラニア溶液中で洗浄処理を施すことにより、金探針を得た。
【００６４】
＜水溶液中測定用探針の製造＞
金探針を、その先端部分を除き、ポリジメチルシロキサンを用いて絶縁した。この絶縁処理により、水溶液中でのトンネル電流の測定が可能となる。このように絶縁処理を施した金探針を以下、水溶液中測定用金探針ともいう。
【００６５】
＜プローブ核酸を固定化した金探針の調製＞
水溶液中測定用金探針を、チオール基（−ＳＨ基）を３’末端に導入した一本鎖のプローブ核酸を含むリン酸緩衝生理食塩水（一本鎖核酸濃度１．０μＭ）に１２時間浸漬した後に、水溶液で洗浄することによって、前記の一本鎖核酸を固定化した金探針（以下、「核酸金探針」ともいう）を調製した。
【００６６】
＜固体基板の製造＞
マイカを８３０Ｋで加熱し、約２．０×１０−４Ｐａの条件で金原子をマイカ表面に真空蒸着させ、エピタキシャル成長により金（111）薄膜をマイカ表面に形成した。得られた金薄膜を８３０Ｋで１０時間アニーリングし、金薄膜表面上に巨大テラスを形成した。前記マイカ上の金薄膜にエポキシ樹脂Ｅｐｏｔｅｋ３７７（エポキシテクノロジー社製）によって１０×１０ｍｍ２のガラス板を接着した。このガラス板をマイカから剥離することによって、Ａｕ（111）表面を備えたガラス板の固体基板を得た。
【００６７】
＜核酸固定基板の調製＞
前記のＡｕ（111）表面を備えたガラス板の固体基板を、チオール基（−ＳＨ基）を３’末端に導入した一本鎖核酸またはチオール基（−ＳＨ基）を３’末端に導入した二本鎖核酸を含むリン酸緩衝生理食塩水緩衝溶液（核酸濃度  １．０μＭ）に１時間浸漬した後に、０．１Ｍ  ＮａＣｌＯ４水溶液で洗浄することによって、前記の一本鎖または二本鎖の核酸を該Ａｕ（111）表面に固定化した固体基板（以下、「核酸固定基板」ともいう）を調製した。
【００６８】
＜トンネル電流測定＞
上記の核酸金探針を、走査型トンネル顕微鏡（アジレントテクノロジー社製「５１００ＡＦＭ／ＳＰＭ」）に装着した。上記の核酸固定基板を、５１００ＡＦＭ／ＳＰＭのトンネル電流測定用容器に装着し、前記容器を０．１Ｍ  ＮａＣｌＯ４水溶液の電解質水溶液で満たした。装着した核酸金探針および核酸固定基板の間にバイアス電圧−２００ｍＶ（試料側陰極）を印加した。次いで、前記核酸金探針を、トンネル電流９５ｎＡが得られる距離まで、前記核酸固定基板に近接させた。その後、前記核酸金探針を、前記核酸固定基板に対して５ｎｍ上方まで、２０ｎｍ／ｓの速度で移動させながら、電流値を高速データ取得装置（横河メータ＆インスツルメンツ社製「ＳＬ−１０００」）にて記録した。
【００６９】
実施例で用いた核酸金探針のプローブ核酸の配列は、以下のとおりである：
【表１】
2013160722.tif 000002
【００７０】
実施例で用いた核酸固定基板、核酸鎖の種類（一本鎖または二本鎖）および固定した核酸の配列は、以下のとおりである：
【表２】
2013160722.tif 000003
【００７１】
実施例１
核酸金探針１および核酸固定基板１を用いて、上記トンネル電流測定で記載したように、トンネル電流を測定した。測定したトンネル電流は、得られた電流−移動距離データに基づいて作成した、電流値のヒストグラムとして示す（図１）。核酸金探針１のプローブ核酸配列（５’−ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣ−３’）は、核酸固定基板１の固定化した核酸の配列（５’−ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＧ−３’）と１００％相補的であった。図１で示されるように、電流値のカウントは、電流値が大きくなるに従って、指数関数的に減衰した。電流値が１０ｎＡ付近において、増大した電流値のカウントがピークとして観察された。図１で観察された増大した電流値カウントを示すピークを、ガウス関数を用いてフィッティングし、平均電流値±標準偏差９．７±１．８ｎＡを得た。
【００７２】
比較例１
水溶液中測定用金探針、すなわち一本鎖核酸（プローブ核酸）を固定化していない金探針および核酸固定基板２を用いて、上記トンネル電流測定で記載したように、トンネル電流を測定した。測定したトンネル電流は、得られた電流−移動距離データに基づいて作成した、電流値のヒストグラムとして示す（図２）。核酸固定基板２で用いた二本鎖核酸は、１００％相補的であった（５’−ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＧＣ−３’および５’−ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＧ−３’）。核酸固定基板２の二本鎖核酸は、それぞれの一本鎖核酸を含むリン酸緩衝液（各一本鎖核酸濃度：１．０μＭ）を混合し、前記混合液を７０℃に熱した後に徐冷することで調製した。図２で示されるように、電流値が１０ｎＡ付近において、増大した電流値カウントがピークとして観察された。図２で観察された増大した電流値カウントを示すピークを、ガウス関数を用いてフィッティングし、平均電流値±標準偏差９．６±１．５ｎＡを得た。
【００７３】
実施例１で用いた核酸金探針１のプローブ核酸と核酸固定基板１の固定化した核酸とで形成され得る二本鎖核酸と、比較例１で用いた核酸固定基板２の固定化した二本鎖核酸とは、同じ配列であり、かつ同じ鎖長であって、互いに１００％相補的であるため、同一である。比較例１では、固体基板上にあらかじめ調製された二本鎖核酸に特異的なトンネル電流値が得られたと考えられる。一方、実施例１では、固体基板上に固定化された核酸と核酸金探針１に固定化されたプローブ核酸とがハイブリッド形成した二本鎖核酸に特異的なトンネル電流値が得られたと考えられる。あらかじめ調製された二本鎖核酸に基づいて得られた比較例１の二本鎖核酸に特異的なトンネル電流値（９．６±１．５ｎＡ）と、金属探針に固定化されたプローブ核酸を用いてハイブリッド形成した二本鎖核酸に基づいて得られた実施例１の二本鎖核酸に特異的な電流値（９．７±１．８ｎＡ）とは、良く一致した。これは、プローブ核酸を固定化した金属探針を用いて、固体基板上に固定化された核酸の検出が可能であり、さらに、プローブ核酸の金属探針への固定化は、前記の固体基板上に固定化された核酸の検出に影響を及ぼさないことを示している。
【００７４】
実施例２
核酸金探針２および核酸固定基板１を用いて、上記トンネル電流測定で記載したように、トンネル電流を測定した。測定したトンネル電流は、得られた電流−移動距離データに基づいて作成した、電流値のヒストグラムとして示す（図３）。核酸金探針２のプローブ核酸配列（５’−ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＧＣ−３’）には、核酸固定基板１の固定化した核酸の配列（５’−ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＧ−３’）に対してミスマッチが存在した。前記のミスマッチは、上記配列において下線で示す。図３で示されるように、電流値が２ｎＡ付近において、増大した電流値カウントがピークとして観察された。図３で観察された増大した電流値カウントを示すピークを、ガウス関数を用いてフィッティングし、平均電流値±標準偏差１．８±０．３ｎＡを得た。
【００７５】
実施例３
核酸金探針３および核酸金探針４と核酸固定基板１とを用いて、上記トンネル電流測定で記載したように、トンネル電流をそれぞれ測定した。核酸金探針３と核酸固定基板１とを用いた場合のプローブ核酸と固体基板に固定した核酸に特異的なトンネル電流値は、０．６３ｎＡであった。核酸金探針４と核酸固定基板１とを用いた場合のプローブ核酸と固定基板に固定化した核酸に特異的なトンネル電流値は、０．５１ｎＡであった。核酸金探針３（５’−ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣ−３’）および核酸金探針４（５’−ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣ−３’）のプローブ核酸配列には、核酸固定基板１の固定化した核酸の配列（５’−ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＧ−３’）に対してミスマッチがそれぞれ存在した。前記のミスマッチは、上記配列においてそれぞれ下線で示す。
【００７６】
実施例１〜３で得られたプローブ核酸と固体基板に固定化した核酸に特異的なトンネル電流値を、図４に示す。図４から明らかなように、ハイブリッド形成され得る二本鎖核酸にミスマッチが存在する場合（図４、横軸 Ｔ、ＡまたはＧ）の核酸固定基板１の固定化した核酸と核酸金探針２〜４のプローブ核酸との特異的なトンネル電流値は、ハイブリッド形成され得る二本鎖核酸が１００％相補的（フルマッチ）である場合（図４、横軸 Ｃ）の核酸固定基板１の固定化した核酸と核酸金探針１のプローブ核酸との特異的なトンネル電流値と比較して、異なった。さらに、プローブ核酸と固体基板に固定化した核酸とで形成され得る二本鎖核酸に存在するミスマッチの種類が異なる場合（例えば、図４、横軸 ＴおよびＡ）であっても、該プローブ核酸と固体基板に固定化した該核酸との特異的なトンネル電流値は異なった。
【００７７】
かくして、本発明の特定の実施形態によれば、標的核酸に少なくとも２種類の対立遺伝子が存在する場合に、１つの対立遺伝子を他の対立遺伝子から識別し、かつ前記１つの対立遺伝子の遺伝子型を特定し得る。例えば、この実施形態において、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針を用いて、標的核酸に存在し得る少なくとも２種類の対立遺伝子のいずれかの遺伝子型である対照核酸に対するトンネル電流をそれぞれ測定し、各対照核酸に特異的なトンネル電流値を得る。前記プローブ核酸を固定化した金属探針を用いて、固体基板に固定化したサンプル核酸に対するトンネル電流を測定し、該サンプル核酸に特異的なトンネル電流値を得る。得られたサンプル核酸に特異的なトンネル電流値を、各対立遺伝子に特異的なトンネル電流値と比較し、サンプル核酸に特異的なトンネル電流値と、同一または近似する特異的なトンネル電流値を示す対照核酸を特定する。この場合、当該サンプル核酸は、特定された対照核酸の遺伝子型であることが示唆される。この実施形態によれば、本発明の方法が、標的核酸に少なくとも２種類の対立遺伝子が存在する場合に、１種類のプローブ核酸を用いて、サンプル核酸に存在し得る各ＳＮＰの遺伝子型を特定し得ることが理解される。
【００７８】
本発明によれば、標的核酸に相補的なプローブ核酸を固定化した金属探針は、核酸が固定化された固体基板上を、または固体基板に固定化された核酸上を走査する必要がないため、標的核酸の分析を迅速に行い得る。
【００７９】
実施例４
核酸金探針５および核酸固定基板３を用いて、上記トンネル電流測定で記載したように、トンネル電流を測定した（図５）。核酸金探針５のプローブ核酸配列（５’−ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＡＧＣ−３’）は、核酸固定基板３の標的核酸配列（５’−ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＴＣＡ−３’）と１００％相補的であった。図５で示されるように、電流値が５０ｐＡ付近において、増大した電流値カウントがピークとして観察された。図５で観察された増大した電流値カウントを示すピークを、ガウス関数を用いてフィッティングし、平均電流値±標準偏差５１±８ｐＡを得た。
【００８０】
図１および図５で示されるように、実施例１で得られた特異的なトンネル電流値は、実施例４で得られた特異的なトンネル電流値と異なった。実施例１で用いた核酸金探針１のプローブ核酸の配列と核酸固定基板１の標的核酸の配列とは１００％相補的であり、また、実施例４で用いた核酸金探針５の配列と核酸固定基板３の標的核酸の配列とは１００％相補的であった。実施例１で形成され得る二本鎖核酸の鎖長は８ヌクレオチド長であるのに対し、実施例４で形成され得る二本鎖核酸の鎖長は１２ヌクレオチド長である。かくして、本発明による核酸の分析方法は、二本鎖核酸のヌクレオチド長に特に限定されないことが理解される。
【００８１】
実施例５
核酸金探針１および核酸固定基板１を用いて、トンネル電流を測定した。トンネル電流は、２０ｎＡのトンネル電流が得られた距離に前記核酸金探針と前記核酸固体基板とを保ってトンネル電流を測定したことを除いて、上記のトンネル電流測定に記載した方法で測定した。測定したトンネル電流は、得られた電流−時間のデータに基づいて作成した、電流値のヒストグラムとして示す（図６）。図６で示されるように、電流値カウントのピークが電流値約８．７ｎＡで観察された。
【００８２】
実施例１および実施例５では共に、核酸金探針１および核酸固定基板１を用いた。実施例１で得られた電流カウントのピークの電流値（９．７±１．８ｎＡ）は、実施例５で得られた電流カウントのピークの電流値（８．７ｎＡ）と非常によく一致した。かくして、本発明による核酸の分析方法は、金属探針と固体基板との距離を変化させながらトンネル電流を測定する態様に、特に限定されないことが理解される。
【図１】
2013160722.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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