(57)【要約】【課題】心臓特異的アセチルコリン（ＡＣｈ）産生系が亢進した非ヒト動物を提供することにある。特に成獣において、心筋細胞に特異的にＡＣｈを産生する心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物を提供することにある。  また、このモデル動物を用いた慢性心不全の薬剤のスクリーニング方法を提供することにある。【解決手段】心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現する非ヒト動物を作製し、成獣におけるする心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進の生理的意義を評価する。また、本発明は、心臓特異的ＡＣｈ産生系が亢進した非ヒト動物、当該非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織を用いたストレススクリーニング方法に関する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物。
【請求項２】
心筋細胞において、出生後に心筋細胞に発現し、成獣において発現が最大となる遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物。
【請求項３】
プロモーターがα−ミオシン重鎖遺伝子の転写調節領域である、請求項１又は２に記載の心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の心臓特異的コリンアセチルトランスフェラーゼ産生系亢進非ヒト動物由来の、心筋細胞若しくは心臓組織。
【請求項５】
心筋細胞において、出生後に心筋細胞に発現し、成獣において発現が最大となる遺伝子のプロモーターの制御下に、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ鎖を連結したポリヌクレオチドを含む導入遺伝子構築物。
【請求項６】
プロモーターがα−ミオシン重鎖遺伝子の転写調節領域である、請求項５に記載の導入遺伝子構築物。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の導入遺伝子構築物が宿主細胞に組み込まれた形質転換体。
【請求項８】
宿主細胞が受精卵である請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
以下の工程を含む、心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物を製造する方法：
請求項８記載の形質転換体を、宿主細胞と同じ生物種の偽妊雌娠非ヒト動物の卵管膨大部、若しくは卵管に注入するか、
上記形質転換体を培養後、宿主細胞と同じ生物種の偽妊雌娠非ヒト動物の子宮内に注入する工程。
【請求項１０】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含む、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織を用いた、心臓におけるアセチルコリン産生系亢進により、耐性となるストレスの決定方法：
（ｉ）心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物又は当該非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織、及び、対照非ヒト動物又は対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織に、被験ストレスを単独で、又は組み合わせて、負荷する工程、
（ｉｉ）ストレス負荷後の、心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物又は当該非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度と、
対照非ヒト動物又は対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度を比較する工程、及び
（ｉｉｉ）心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物又は当該非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度が、
対照非ヒト動物又は対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度よりも低い場合に、
当該ストレスを、心臓におけるアセチルコリン産生系亢進により耐性となるストレスであると、決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓特異的アセチルコリン（ＡＣｈ）産生系が亢進した非ヒト動物、当該非ヒト動物由来の心筋細胞及び心臓組織の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリン（ＡＣｈともいう。）は、脳全体に分布する神経伝達物質として、初めて見いだされた物質である。ＡＣｈは、副交感神経系(迷走神経系)や運動神経系の神経細胞の軸索終末部のシナプス小胞に存在し、神経の興奮に伴って、小胞から放出され、軸索終末部と結合した筋組織に作用する。分泌されたＡＣｈは、筋組織内に存在するアセチルコリンエステラーゼの働きにより、速やかに分解される。
【０００３】
心臓において、交感神経系は、心機能を亢進させる作用を有するが、交感神経系の長期的な興奮は、より早く心臓を疲弊させる。既にヒトにおいては、交感神経系の作用が亢進している者、すなわち心拍数が正常よりも多い者は、心拍数が正常な患者と比較して、生命予後が悪いことが報告されている。また、慢性心不全患者に、交感神経系軸索終末部由来の神経伝達物質に対する遮断薬を心機能が著しく低下しない程度に投与すると、患者の生命予後が改善されることも報告されている。
【０００４】
副交感神経は、生体内で唯一交感神経の作用に対して拮抗作用を有する組織であり、その作用は、迷走神経系の軸索終末部から分泌されるＡＣｈの作用によるものであると考えられていた。
【０００５】
しかしながら、本発明者らが研究を重ねたところ、心臓は自らＡＣｈを産生するシステムを有しており、心臓に存在するＡＣｈは、迷走神経系に由来するものと、心臓が自ら産生するものが存在することが明らかとなった（非特許文献１）。
【０００６】
一方で、アルツハイマー病の進行抑制薬であるドネペジル等のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の投与により、脳内ＡＣｈの濃度が高まる一方で、徐脈や心不全が引き起こされることも報告されている。
【０００７】
このことから、心臓においてＡＣｈの長期的な作用を観察することは、自律神経系による心臓のホメオスタシスを維持するための薬剤又は心筋梗塞や慢性心不全の治療薬の開発において重要であるといえる。
【０００８】
しかしながら、正常状態では、迷走神経細胞軸索終末部から分泌されたＡＣｈは、心臓組織内に存在するアセチルコリンエステラーゼにより、速やかに分解されるため、個体レベルでの心臓におけるＡＣｈの長期的な作用、自律神経系による心機能の維持機構の解析は困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７６：５１１１−５１２５，  ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、心臓特異的ＡＣｈ産生系が亢進した非ヒト動物を提供することにある。特に成獣において、心筋細胞に特異的にＡＣｈを産生する心臓特異的ＡＣｈ産生系が亢進した非ヒト動物を提供することにある。
【００１１】
また、本発明の目的は、当該動物を用いて、心臓のＡＣｈ産生量を高めることにより耐性になるストレスをスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
亢進した交感神経系の作用から、心臓の早期疲弊を防止するためには、交感神経の作用に拮抗するＡＣｈの産生を、心臓において誘導する必要がある。本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、出生後から心筋細胞に徐々に発現されるα−ミオシン重鎖（以下、αＭＨＣともいう）遺伝子のプロモーター領域を単離し、その下流に、ＡＣｈ合成酵素であるマウスのコリンアセチルトランスフェラーゼ（以下、ＣｈＡＴともいう）ｃＤＮＡを結合することにより構築された遺伝子構築物すなわちトランスジーンを用いて、心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物を作製することに成功した。
【００１３】
すなわち、本発明は、産業上及び医療・医学研究上有用な発明として、以下の非ヒト動物、導入遺伝子構築物、非ヒト動物より採取された細胞及び組織を含む。
項１．心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物。
項２．心筋細胞において、出生後に心筋細胞に発現し、成獣において発現が最大となる遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物。
項３．プロモーターがα−ミオシン重鎖遺伝子の転写調節領域である、項１又は２に記載の心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物。
項４．項１〜３のいずれか一つに記載の心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物由来の、心筋細胞若しくは心臓組織。
項５．心筋細胞において、出生後に心筋細胞に発現し、成獣において発現が最大となる遺伝子のプロモーターの制御下に、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ鎖を連結したポリヌクレオチドを含む導入遺伝子構築物。
項６．プロモーターがα−ミオシン重鎖遺伝子の転写調節領域である、請求項５に記載の導入遺伝子構築物。
項７．項５又は６に記載の導入遺伝子構築物が宿主細胞に組み込まれた形質転換体。
項８．宿主細胞が受精卵である項７に記載の形質転換体。
項９．以下の工程を含む、心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のコリンアセチルトランスフェラーゼを発現する心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物を製造する方法：
項８記載の形質転換体を、宿主細胞と同じ生物種の偽妊雌娠非ヒト動物の卵管膨大部、若しくは卵管に注入するか、
上記形質転換体を培養後、宿主細胞と同じ生物種の偽妊雌娠非ヒト動物の子宮内に注入する工程。
項１０．以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の工程を含む、トランスジェニック非ヒト動物又はトランスジェニック非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織を用いた、心臓におけるアセチルコリン産生系亢進により、耐性となるストレスの決定方法：
（ｉ）心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物又は当該非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織、及び、対照非ヒト動物又は対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織に、被験ストレスを単独で、又は組み合わせて、負荷する工程、
（ｉｉ）ストレス負荷後の、心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物又は当該非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度と、
対照非ヒト動物又は対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度を比較する工程、及び
（ｉｉｉ）心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物又は当該非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度が、
対照非ヒト動物又は対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度よりも低い場合に、
当該ストレスを、心臓におけるアセチルコリン産生系亢進により耐性となるストレスであると、決定する工程。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーターの制御下において、外来性のＣｈＡＴを発現するトランスジェニック非ヒト動物、及びその製造方法が提供できる。係る方法により得られたトランスジェニック非ヒト動物を用いることにより、心臓特異的なＡＣｈ産生系亢進が心臓に対してもたらす効果を評価できる。また、当該非ヒト動物を用いることにより、交感神経系との相互作用も含めて、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進の効果を、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。さらに、胎児期には発現されず、出生後から心筋細胞内でＡＣｈの産生を増加させることにより、胎児期の発生に影響を与えることなく、成獣において、ＡＣｈの産生の増加の効果を評価することができる。
【００１５】
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物は、正常状態では、心拍数及び血圧を見る限り、野生型の非ヒト動物と差は認められないか、認められてもわずかである。
【００１６】
しかしながら、実験的に心筋梗塞を誘発した場合、野生型の非ヒト動物では、心臓組織の壊死などが広範囲にわたって壊死するなど心筋梗塞時の典型的な症状が現れるのに対して、トランスジェニック非ヒト動物では、心臓組織の壊死が軽減され、生存率も、野生型非ヒト動物よりも高い値を示す。
【００１７】
すなわち、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物は、虚血ストレスに対して、野生型マウスよりも高い抵抗性を示す。このことは、虚血疾患から心臓組織を保護するために、心筋細胞内のＡＣｈ濃度を上げる手段(物理的、化学的手法を含む)を施すとが有効であることを示している。
【００１８】
また、トランスジェニック非ヒト動物から採取した、心筋細胞若しくは心臓組織に対して、様々なストレスを負荷することにより、心筋細胞内のＡＣｈが、どのようなストレスから心臓組織を保護することができるのか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで簡便に評価することができる。
【００１９】
従って、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物又は、その心筋細胞若しくは心臓組織の耐ストレス性を評価することにより、当該非ヒト動物等おいて耐性となるストレスを見いだすことができる。また、その結果、当該ストレスに起因して発症又は悪化する疾患や病態の予防又は治療に対して、治療の指針として、心筋細胞内のＡＣｈ濃度を上げる手段（物理的、化学的手段を含む）を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１には、導入遺伝子構築物（トランスジーン）のマップを示す。導入遺伝子構築物は、ＢｇｌＩ／ＳａｌＩ消化したｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターに、導入遺伝子構築物が有するＢａｍＨＩ及びＳａｌＩサイトを使って挿入した。導入遺伝子構築物には、‘ｐｒｏｍｏｔｅｒ’で表される約５．４ｋｂのαＭＨＣプロモーター塩基配列、及び‘ｍＣｈＡＴ’で表される約２．０ｋｂのｍＣｈＡＴのｃＤＮＡ配列が存在する。
【図２】図２は、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターに導入遺伝子構築物が組み込まれたことを制限酵素消化及び電気泳動により確認したものである。上の矢頭（約９．０ｋｂ）は、導入遺伝子構築物由来の断片を、下の矢頭（５．０ｋｂよりやや大きい）は、ベクター由来の断片を示す。
【図３】図３は、導入遺伝子構築物の外来性のＣｈＡＴの発現に伴って発現される、ＥＧＦＰのタンパク質の発現を、ウエスタンブロッティングで検出した像である。ＷＴは野生型マウスを、ｍＣｈＡＴ  Ｔｇｍは、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスを示す。また、Ｂｒは脳、Ｈは心臓、Ｋｉｄは腎臓、Ｌｉｖは肝臓、Ｓｋは、骨格筋を表す。
【図４】図４は、導入遺伝子構築物由来の外来性のＣｈＡＴのタンパク質の発現を、ウエスタンブロッティングで検出した像である。ＷＴは野生型マウスを、ｍＣｈＡＴ  Ｔｇｍは、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスを示す。また、Ｂｒは脳、Ｈは心臓、Ｋｉｄは腎臓、Ｌｉｖは肝臓、Ｓｋは、骨格筋を表す。
【図５】図５は、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織におけるＥＧＦＰのタンパク質の免疫染色像である。
【図６】図６は、野生型マウス及び、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心室筋組織内のＡＣｈの含有量を測定したものである。検体属性のＷＴは野生型マウスを示し、Ｎｏ．２１７、Ｎｏ．２４８、Ｎｏ．２５７はｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの個体番号を示す。Ｗｅｉｇｈｔは、１０００μｌのＰＣＡ（過塩素酸）に溶解した心筋組織の量を示す。クロマトグラム面積は、電気化学法により検出され描かれたスペクトルのＡＣｈ又は内部標準（ＩＰＨＣ）の面積（ｍＶ・ｓ）を表す。ｒａｔｉｏはＡＣｈのクロマトグラム面積を内部標準のクロマトグラム面積で除した値を示す。検体濃度）は、内部標準のクロマトグラム面積及び濃度から換算したＡＣｈの濃度を示す。組織含有量は、組織１ｇに換算した場合のＡＣｈの含有量（ｎｍｏｌ）を示す。
【図７】図７は、野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織におけるＨＩＦ−１αの発現をウエスタンブロッティングで観察した図である。ＷＴは野生型マウスを、ｍＣｈＡＴ  Ｔｇｍは、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスを示す。１及び２は、異なる個体であることを示す。
【図８】図８は、野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心拍数及び血圧を比較した図である。
【図９】図９には、野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織におけるｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の免疫染色像を示す。
【図１０】図１０左には、野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織におけるＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ４のタンパク発現量をウエスタンブロッティングで比較した図を示す。図１０右のグラフは、野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織におけるグルコースの含有量を示す。
【図１１】図１１には、心筋梗塞誘導前の野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓重量と、心筋梗塞誘導後の野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓重量を示す。Ｐｒｅ−ＭＩは心筋梗塞惹起前、Ｐｏｓｔ−ＭＩは心筋梗塞惹起後を示す。
【図１２】図１２には、心筋梗塞誘導後の野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスのマッソントリクローム染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、副交感神経に代表される神経細胞にのみ存在されると考えられていたＡＣｈ産生系が、心臓にも存在することに着目し、心筋細胞に特異的にＣｈＡＴを発現させ、心筋細胞でのＡＣｈ産生が亢進した非ヒト動物を提供する。当該非ヒト動物によれば、心筋細胞でのＡＣｈ産生が亢進した際の心臓の機能を、評価することができる。特に、出生後から成獣に至るまでの非ヒト動物の心筋細胞に、特異的にＣｈＡＴを発現させることにより、成獣におけるＡＣｈ産生亢進時の、心臓の機能、虚血状態での心筋細胞におけるＡＣｈの作用について評価することができる。
【００２２】
１．心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物の作製
以下に、心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物の作製方法について示す。
なお、遺伝子組換え技術及び方法について、「常法」と表した場合には、「新遺伝子工学ハンドブック  改訂第５版  羊土社  ２０１０年１１月１５日発行」に掲載されているか、本書に掲載されている技術と同等視できる技術及び方法をいう。
【００２３】
また、遺伝子組換え動物及び形質転換体の取り扱いについては、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（平成十五年六月十八日法律第九十七号、最終改正：平成一九年三月三〇日法律第八号）」を遵守するものとする。
【００２４】
本発明において、非ヒト動物として利用できる動物には、ヒトを除く霊長目、齧歯目、ウサギ目、ネコ目、偶蹄目、奇蹄目等の哺乳動物の他、キジ目、カモ目に属する鳥類も含まれる。
【００２５】
非ヒト動物として用いられる哺乳動物として、好ましくは、霊長類としてはサル、ネコ目としてはイヌ等、偶蹄目としてはウシ、ヒツジ、ブタ等、奇蹄目としてはウマ、ウサギ目としては日本白色家兎又はニュージーランドホワイトラビット等、齧歯目としてはマウス、ラット、モルモット又はハムスター等が挙げられ、より好ましくはマウス、ラット、ブタ、ヒツジであり、最も好ましくはマウスである。鳥類としては、好ましくは、ニワトリである。
【００２６】
本発明における、「心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーター」とは、特に制限されないが、心筋細胞において、特異的に発現するｍＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡ等の機能性ＲＮＡをコードする遺伝子等の転写調節領域を意味する。
【００２７】
プロモーターとして好ましいのは、心筋線維を形成するアクチンまたはミオシン遺伝子等の転写調節領域である。より好ましくは、α−ミオシン重鎖遺伝子又はβミオシン重鎖遺伝子の転写調節領域であり、さらに好ましくは、α−ミオシン重鎖遺伝子の転写調節領域である。
【００２８】
また、成人の心臓におけるＡＣｈ産生亢進の作用を評価するためには、胎生期や出生直後にはＡＣｈの産生が亢進せず、成獣でＡＣｈの産生が亢進する非ヒト動物であることが望ましい。
【００２９】
ここで、「心筋細胞において、出生後に心筋細胞に発現し、成獣において発現が最大となる遺伝子」とは、胎生期には発現せず、出生後、成長に伴って発現が上昇する遺伝子を意味する。
【００３０】
発現が上昇するとは、その遺伝子の心臓における発現をｍＲＮＡ又はタンパク質レベルで解析した際に、出生前の動物の心臓での当該遺伝子の発現と、成獣の心臓での当該遺伝子の発現を比較したときに、２倍以上、好ましくは５倍以上、成獣の心臓の方が高い発現を示すことをいう。
【００３１】
成獣とは、第二次性徴期以降の生物をいう。例えば、マウスであれば生後８週目以降、ラットであれば生後１２週目以降が目安となる。
【００３２】
このような性質を持つ遺伝子としては、α−ミオシン重鎖遺伝子又はβミオシン重鎖遺伝子等が挙げられる。より好ましくは、α−ミオシン重鎖遺伝子である。
【００３３】
本発明明細書等において、心筋細胞において特異的に発現する遺伝子のプロモーター、及び、心筋細胞において、出生後に心筋細胞に発現し、成獣において発現が最大となる遺伝子のプロモーターを含めて、心筋細胞特異的発現プロモーターと表現することがある。
【００３４】
心臓特異的発現プロモーターとして好ましくは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の塩基配列を有するＤＮＡである：
（ａ）マウスα−ミオシン重鎖遺伝子由来であって、配列表の配列番号１に示す配列を含む塩基配列、
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ心臓特異的発現プロモーターとして機能しうる塩基配列、又は
（ｃ）上記（ａ）の塩基配列において、少なくとも１塩基以上の塩基が置換、欠失、若しくは付加された塩基配列を有し、かつ心臓特異的発現プロモーターとして機能しうる塩基配列。
【００３５】
ここで、上記（ｂ）の塩基配列において、ストリンジェントな条件とは、例えば、６５℃で５×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中でハイブリダイズさせ、更に０．１％のＳＤＳを含有する０．５×ＳＳＣ溶液を用いて６５℃で洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」  （Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｄ．  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００３６】
上記ストリンジェントな条件では、（ａ）の塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を示す塩基配列を有するＤＮＡが、（ａ）の塩基配列で示されるＤＮＡとハイブリダイズすることができる。
【００３７】
また、（ｃ）の態様において、少なくとも１塩基以上の塩基が置換、欠失、若しくは付加された塩基配列とは、好ましくは１〜２０００塩基、より好ましくは１〜５００塩基、さらに好ましくは１〜１００塩基の置換、欠失、若しくは付加された塩基配列をいう。これらの塩基配列の置換、欠失、若しくは付加は、（ａ）の塩基配列中に連続して起こっていてもよいし、不連続に起こっていてもよい。
【００３８】
プロモーターの長さについては、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の塩基配列を有するＤＮＡであればよく、そのプロモーターが心臓特異的発現プロモーターとして機能し、遺伝子組換え可能な長さであれば、特に制限はない。
【００３９】
またプロモーターは、自然界に存在する塩基配列を有するであっても良いが、自然界に存在する塩基配列に変異を入れたものや、また、同じプロモーターをタンデムに繰り返したもの、他の遺伝子の転写調節領域と組み合わせたもの、人工的に合成したもの等、心筋細胞内での転写活性を上げる方向に機能するものであれば、特に制限はない。
【００４０】
さらに、プロモーターのクローニング方法は、常法に従って行えばよく、特に制限されない。
【００４１】
「外来性のＣｈＡＴ」は、細胞外から受精卵や宿主細胞に遺伝子導入され、導入後発現されたタンパク質がＣｈＡＴとしての機能を発揮するタンパク質であること意味する。
【００４２】
ＣｈＡＴとして機能を発揮するタンパク質をコードする核酸配列の由来は、遺伝子導入される受精卵や宿主細胞の生物種と同種であっても異種であってもよく、生物から抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応及びＤＮＡ合成反応を含む工程を経て得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、遺伝子組換えによって得られたもの、塩基置換により変異導入されたもの又は人工合成遺伝子等であってもよい。
【００４３】
ＣｈＡＴとして機能を発揮するタンパク質をコードする核酸配列として好ましくは、ＣｈＡＴ−ｃＤＮＡであるが、遺伝子導入後、転写の過程で、一部スプライシングを受けるものであってもよい。
【００４４】
ＣｈＡＴ−ｃＤＮＡを提供する生物種としては、霊長目、齧歯目、ウサギ目、ネコ目、偶蹄目、奇蹄目等の哺乳動物の他、キジ目に属する鳥類等が挙げられる。好ましくは、霊長目としてはヒト又はサル、ネコ目としてはイヌ、奇蹄目としてはウマ、偶蹄目としてはウシ、ヒツジ又はブタ、ウサギ目としては日本白色家兎又はニュージーランドホワイトラビット、齧歯目としては、マウス、ラット又はモルモット、キジ目としてはニワトリ等が挙げられ、好ましくは、ヒト、ラット、マウス又はニワトリであり、より好ましくは、ヒト、ラット又はマウス、さらに好ましくは、ラット又はマウスである。
【００４５】
本発明明細書等において外来性のＣｈＡＴ機能を発揮するタンパク質をコードする塩基配列は、外来性ＣｈＡＴ遺伝子と表現することがある。
【００４６】
外来性ＣｈＡＴ遺伝子として好ましくは、以下の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）の塩基配列を有するＤＮＡである：
（ｄ）マウスＣｈＡＴ−ｃＤＮＡ由来であって、配列表の配列番号２に示す配列を含む塩基配列、
（ｅ）上記（ｄ）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＣｈＡＴ機能を発揮するタンパク質をコードする塩基配列、又は、
（ｆ）上記（ｄ）の塩基配列において、少なくとも１塩基以上の塩基が置換、欠失、若しくは付加された塩基配列を有し、かつＣｈＡＴ機能を発揮するタンパク質をコードする塩基配列。
【００４７】
ここで、上記（ｅ）の塩基配列において、ストリンジェントな条件とは、例えば、６５℃で５×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中でハイブリダイズさせ、更に０．１％のＳＤＳを含有する０．５×ＳＳＣ溶液を用いて６５℃で洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）」  （Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｄ．  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００４８】
上記ストリンジェントな条件では、（ｄ）の塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を示す塩基配列を有するＤＮＡが、（ｄ）の塩基配列で示されるＤＮＡとハイブリダイズすることができる。
【００４９】
また、（ｆ）の態様において、少なくとも１塩基以上の塩基が置換、欠失、若しくは付加された塩基配列とは、好ましくは１〜２００塩基、より好ましくは１〜１００塩基、さらに好ましくは１〜５０塩基の置換、欠失、若しくは付加された塩基配列をいう。これらの塩基配列の置換、欠失、若しくは付加は、（ｄ）の塩基配列中に連続して起こっていてもよいし、不連続に起こっていてもよい。
【００５０】
心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物は、受精卵又は宿主細胞に導入遺伝子構築物を遺伝子導入する工程を経て、又は、導入遺伝子構築物を遺伝子導入した細胞より作製される。
【００５１】
ここで導入遺伝子構築物とは、心筋細胞特異的発現プロモーターで制御可能となるように、心筋細胞特異的発現プロモーター塩基配列を含むＤＮＡ鎖と外来性ＣｈＡＴ遺伝子を含むＤＮＡ鎖を連結したポリヌクレオチドを、ベクター等に組み込んだＤＮＡの構築物をいう。
【００５２】
ベクターには、プロモーターや外来性ＣｈＡＴ遺伝子をコードする塩基配列の他、外来性ＣｈＡＴ遺伝子の塩基配列の下流にポリＡシグナルをコードする塩基配列を含む。また、これら塩基配列の他にも、ベクターには、エンハンサー、薬剤耐性遺伝子、複製起点、心筋細胞発現プロモーター以外のプロモーターとして機能する塩基配列が含まれていてもよい。また、ＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子の塩基配列やｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）のような翻訳調節のための塩基配列が含まれていても良い。
【００５３】
ベクターは、プラスミド由来であってもよいし、ウイルス、トランスポゾン等由来でもよく、その由来は特に制限されない。
【００５４】
心筋細胞発現プロモーター及び外来性ＣｈＡＴ遺伝子のベクターへの挿入方法は、当該プロモーターの制御下で、外来性ｍＣｈＡＴ遺伝子が発現、機能できるものであればよく、常法によって行うことができ、特に制限されない。
【００５５】
心筋細胞発現プロモーター及び外来性ＣｈＡＴ遺伝子を、ライゲーション又はＰＣＲ等で結合した後、ベクターに組み込んでもよいし、心筋細胞発現プロモーター又は外来性ＣｈＡＴ遺伝子のどちらか一方を先にベクターに挿入した後、もう一方を後から前記で構築したベクターに組み込んでもよい。心筋細胞発現プロモーター及び外来性ＣｈＡＴ遺伝子のベクターへの挿入の順番は、特に制限されない。
【００５６】
心臓特異的アセチルコリン産生系亢進非ヒト動物の製造方法は、例えば以下の工程を含む：
（１−ｉ）上記導入遺伝子構築物を受精卵にマイクロインジェクション又は遺伝子導入する工程、
（１−ｉｉ）（１−ｉ）の導入遺伝子構築物を導入した受精卵を、導入直後に受精卵と同じ生物種の偽妊娠メスの卵管膨大部若しくは卵管内等に注入する工程、又は、前記導入遺伝子構築物を導入した受精卵を、数日間培養した後に受精卵と同じ生物種の偽妊娠メスの子宮内に注入する工程。
【００５７】
非ヒト動物の作製は、トランスジェニック動物を作製できる方法であればよく、常法によるトランスジェニック動物の作製方法によって行うことができる。
【００５８】
上記方法によって得られた導入遺伝子構築物を、制限酵素消化によって直鎖化し、マイクロインジェクションによって、例えば、交配０．５日程度の受精卵の雄性前核にインジェクションする。また、マイクロインジェクションの他、リポフェクション等を用いて行うこともできる。
【００５９】
遺伝子を導入された受精卵は、導入遺伝子構築物を導入直後に受精卵と同じ生物種の偽妊娠メスの卵管膨大部、若しくは卵管内等に注入される。受精卵と偽妊娠メスの系統は、同じであっても異なっていてもよい。
【００６０】
また、受精卵は、導入遺伝子構築物を導入直後に卵管等へ注入されるほか、導入遺伝子構築物を導入後、数日間の培養を経て、子宮内に戻されてもよい。
【００６１】
ただし、トランスジェニック動物の作製方法は、この方法に制限されない。
【００６２】
また、本発明の「非ヒト動物」には、上記の導入遺伝子構築物を用いて作出されたトランスジェニック動物の他、当該トランスジェニック動物同士の自然交配により繁殖させたトランスジェニック動物、当該トランスジェニック動物から得られる体細胞(出生前又は出生後)から細胞核を取り出し、脱核させた受精卵又は脱核させた卵細胞に注入する方法、いわゆるクローン動物の製造方法によって得られた動物も含むものとする。
【００６３】
この他、本発明の「非ヒト動物」には、上記のトランスジェニック動物の作製方法によって、導入遺伝子構築物をマイクロインジェクションした受精卵から発生した個体の他、出生したトランスジェニック動物同士を交配させ形成された胚由来のＥＳ細胞を用いて作出された動物も含むものとする。また当該トランスジェニック動物等由来の体細胞等に、ｉＰＳ細胞の作製方法又はこれと同等の方法を適用し、多能性分化能を獲得したＥＳ細胞様細胞を経て、作出された動物が含まれる。
【００６４】
２．心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物の由来の心筋細胞及び心臓組織
心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞には、当該非ヒト動物の成獣の心臓組織由来の心筋細胞の他、ＡＣｈの産生が低いものの、培養によって発現がより強く誘導されうる出生後直後から成獣に至るまでの心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞が含まれる。
【００６５】
出生後直後から成獣に至るまでの当該非ヒト動物由来の心筋細胞としては、出生後約２〜３日目の哺乳動物又は孵化後約２〜３日目の鳥類の雛から心臓組織を採取し、コラゲナーゼタイプＩＩ及びタイプＩＶ等のタンパク分解酵素の存在下で、膠原繊維等を消化して得られる細胞を、ゼラチン及びフィブロネクチン等をあらかじめコーティングしたディッシュ等で、適切な条件下で培養した初代心筋培養細胞が好ましい。
【００６６】
また、当該非ヒト動物由来の成獣の心筋細胞としては、第二次性徴期以降の非ヒト動物から心臓組織を採取し、コラゲナーゼタイプＩＩ並びにタイプＩＶ、及びプロテアーゼタイプＸＩＶ等で心臓組織を処理し、得られた細胞をゼラチン、フィブロネクチン及びラミニンなどをコーティングしたディッシュで培養したものを適切な条件下で培養した初代心筋培養細胞が好ましい。
【００６７】
さらに、上記初代心筋培養細胞には、これらの細胞に他の遺伝子を形質導入して、長期培養可能にした細胞、又は不死化した細胞も含まれる。また、これらの細胞を凍結保存した細胞も含まれる。
【００６８】
心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心臓組織には、当該非ヒト動物の成獣の心臓組織の他、ＡＣｈの産生が低いものの、培養によって発現がより強く誘導されうる出生後直後から成獣に至るまでの心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心臓組織が含まれる。
【００６９】
上記心臓組織には、心室又は心房の心筋組織を採取し、スライスした組織；摘出した心臓全体；上記の心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞から再構築された心臓組織等も含まれる。心筋組織は、一層の心筋細胞層からなっていてもよいし、数層の心筋細胞層が重層していてもよい。好ましくは、一層の心筋細胞層からなる心臓組織である。
【００７０】
スライスした心筋組織は、例えば、Ｗａｌｔｅｒ  Ｈａｂｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ；Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００９，５（２）：  ６２−６６．に記載された方法等に従って、培養することができる。
【００７１】
また摘出した心臓は、ランゲンドルフ法等で、灌流することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拍動を維持することができる。
【００７２】
心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞から再構築した心臓組織は、バイオテクノロジーシリーズ  再生医療技術の最前線（岡野光夫ら監修  シーエムシー出版  ２００７年６月発行）等、公知の方法によって得ることできる。
【００７３】
３．導入遺伝子構築物を導入した形質転換体
前記導入遺伝子構築物は、トランスジェニック動物の作製に用いられる他、宿主細胞に遺伝子導入して、形質転換体を得ることができる。
【００７４】
宿主細胞としては、受精卵；ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞；ラットＨ９ｃ２細胞、マウスＨＬ−１細胞、ヒトＡＣ細胞等の培養心筋細胞、初代培養心筋細胞、幹細胞由来心筋細胞等の心筋細胞；ＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞由来細胞等の心筋細胞以外の培養細胞等が含まれる。
【００７５】
受精卵は、自然交配によって得られたものでもよく、人工授精により得られたものでよい。受精卵を用いた形質転換体は、トランスジェニック動物の作製に用いることができる。
【００７６】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞は、公知の方法で作製することができるが、理研細胞バンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｌａｂ／ｃｅｌｌ／）等から入手することもできる。多能性幹細胞を宿主とした形質転換体は、ブラストシストにマイクロインジェクションし、個体として出生させてもよく、さらに出生した個体同士を交配させて、次世代以降の個体を、使用することができる。また、個体発生を介さずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接、心筋細胞に分化させて、用いることもできる。
【００７７】
初代培養心筋細胞とは、前記導入遺伝子構築物を導入していない、出生後間もない動物由来の心筋細胞及び成獣の心筋細胞の両方が含まれる。初代心筋培養細胞は、例えば、２．で述べた方法と同様にして得ることができる。また、市販されたものを用いてもよい。
【００７８】
上記幹細胞由来心筋細胞等とは、組織幹細胞、胎性幹細胞、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等から心筋細胞へ分化させた細胞をいう（Ｙｕａｓａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：６０７−６１１，２００５、ＲｅｐｒｏＣａｒｄｉｏ  ２（リプロセル株式会社）参照）。
【００７９】
培養心筋細胞、初代培養心筋細胞、幹細胞由来心筋細胞等の心筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により、耐性となるストレスの決定方法等のスクリーニング方法に用いることができる。またこれらの細胞は、２．で述べた心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞から心臓組織を再構築する方法に準じて、心臓組織に構築して用いることもできる。
【００８０】
心筋細胞以外の培養細胞等を宿主細胞として用いた形質転換体は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける心臓特異的ＡＣｈ産生系の亢進の生理機能解析実験、病態解析実験の際の対照実験等の目的に用いることができる。
【００８１】
４．心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により、耐性となるストレスを検索する方法
本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物又は、その心筋細胞若しくは心臓組織では、心筋細胞内のＡＣｈ濃度が上昇している。従って、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物又は、その心筋細胞若しくは心臓組織にストレスを負荷した際、対照非ヒト動物又は、その心筋細胞若しくは心臓組織に同じストレスを付加した場合と比較して、ストレス負荷による障害が低い場合に、当該トランスジェニック非ヒト動物等は、当該ストレスに対して、耐性であると評価することができる。つまり本発明のトランスジェニック非ヒト動物又は、その心筋細胞若しくは心臓組織を用いることにより、心筋細胞内のＡＣｈ濃度を上げることにより耐性となるストレスを選別し、決定することができる。その結果、心臓内のＡＣｈ濃度を上昇させる処置（物理的、化学的処置を含む）は、心臓を保護する方法として、有効であると評価することができる。
【００８２】
ここでいうストレスとは、実験環境下で被験動物又は細胞若しくは組織に対して負荷を与えうる、物理的、電気的、化学的、生理学的、精神的なストレスをいう。具体的には心臓の虚血、運動負荷、心房ペーシング負荷、心拍数を上昇させる薬剤の投与、高血糖又は低血糖を惹起する薬剤の投与、低酸素等のストレスである。
【００８３】
また上記ストレス負荷による障害とは、生存率；心臓重量；心拍数；血圧；血中ガス分圧；クレアチンキナーゼ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ型、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、γ−ＧＴＰ（γグルタミルトランスペプチダーゼ）、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、コリンエステラーゼ、グルコース、ミオグロビン、Ｈ−ＦＡＢＰ（心臓型脂肪酸結合タンパク）、心筋トポロニンＴ、心筋トロポニンＩ、ミオシン軽鎖、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＡＣｈ、グルコース等の生化学的検査、心電図等の心機能検査；超音波検査；ＭＲＩ検査；Ｘ線ＣＴ検査；ＲＩ検査；電気生理的検査；ヘマトキシリン−エオジン染色、組織化学染色、免疫染色、核酸検出法等の組織学的検査；細胞若しくは組織中のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量等の少なくとも1つの方法を用いて評価することができる、心臓又は、心筋細胞若しくは心臓組織における組織学的又は機能的障害をいう。
【００８４】
負荷するストレスは、動物個体を用いるか、心筋細胞若しくは心臓組織を用いるかに応じて、例えば、以下の挙げるものから選択されるが、以下は例示であり、限定されるものではない。
【００８５】
心臓の虚血ストレスは、公知の方法により行うことができる。例えば、被験動物を麻酔下で開胸し、心臓の動脈、好ましくは、冠動脈、より好ましくは冠動脈左前下行枝を縫合糸などで、結紮し、その後開胸部分を縫合し、通常飼育条件で飼育される。
【００８６】
運動負荷ストレスは、公知の方法により行うことができる。例えばトレッドミル走負荷が挙げられる。
【００８７】
心房ペーシング負荷ストレスは、公知の方法により行うことができる。
【００８８】
ストレス負荷のために投与される心拍数を上昇させる薬剤としては、例えば、α1受容体作動薬、β1受容体作動薬等の交感神経動作薬；乾燥甲状腺、レボチロキシンナトリウム（Ｔ４）水和物、リオチロニン（Ｔ３）等の甲状腺ホルモン剤等が挙げられる。
【００８９】
ストレス負荷のために投与される高血糖を惹起する薬剤としては、高カロリー輸液；コルチゾン醋酸エステル、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン等の副腎皮質ステロイド剤；インターフェロン−α、インターフェロン−β等のインターフェロン剤等が挙げられる。
【００９０】
ストレス負荷のために投与される低血糖を惹起する薬剤としては、動物インスリン製剤、インスリンアナログ製剤等のインスリン製剤；グリクラジド、グリメピリド、グリベンクラミド等のスルホニル尿素類；アカルボース、ボグリボース、ミグリトール等のαグルコシダーゼ阻害剤等が挙げられる。
【００９１】
低酸素ストレスは、動物であれば、例えば酸素濃度１５．３％〜１６．４％程度の低酸素室内等で飼育することにより行うことができる。また心筋細胞若しくは心臓組織であれば、例えば酸素濃度１〜５％程度の低酸素インキュベーター内で培養することにより行うことができる。
【００９２】
心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により、耐性となるストレスの種類は、具体的には、以下の方法により決定することができる。
【００９３】
＜トランスジェニック非ヒト動物を用いた、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により、耐性となるストレスの決定方法＞
以下に記載する動物実験は、「研究機関等における動物実験等の実施に関する基本指針（文部科学省告示第七十一号）」、「動物の愛護及び管理に関する法律（昭和四十八年十月一日法律第百五号  最終改正：平成二三年八月三〇日法律第一〇五号）」を遵守して行われるものとする。
【００９４】
対照非ヒト動物とは、トランスジェニック非ヒト動物と同種系の、遺伝子改変を伴わない野生型の動物、又は遺伝子改変を伴うトランスジェニック非ヒト動物と同種系の動物をいう。
【００９５】
トランスジェニック非ヒト動物を用いた、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により、耐性となるストレスの決定方法は、以下の（４−ｉ）、（４−ｉｉ）及び（４−ｉｉｉ）を含む：
（４−ｉ）被験ストレスを単独で、又は組み合わせて、心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物及び、対照非ヒト動物に負荷する工程、
（４−ｉｉ）ストレス負荷後の、心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物の障害の程度と対照非ヒト動物の障害の程度を比較する工程、及び
（４−ｉｉｉ）心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物の障害の程度が、対照非ヒト動物の障害の程度よりも低い場合に、当該ストレスを、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により耐性となるストレスであると、決定する工程。
【００９６】
つまり、この方法により決定されたストレスに対して、ＡＣｈの産生が亢進された心臓は、耐性を有すると判断することができる。このため、心臓におけるＡＣｈの産生の亢進は、ヒトにおいても、心筋細胞内又は心臓組織内のＡＣｈ濃度を上昇させる処置（物理的、化学的処置を含む）が、当該ストレスから、心臓を保護するように作用すると判断することができる。
【００９７】
従って、本発明の方法で得られた知見に基づいて、心臓を各種ストレスから保護するための処置方法を検討し、開発することが可能となる。
【００９８】
ストレスの負荷条件は、動物種や動物の週齢、体重、健康状態等に応じて適宜設定できる。
【００９９】
＜トランスジェニック非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織由来の心筋細胞若しくは心臓組織を用いた、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により、心筋細胞若しくは心臓組織の障害を軽減することができるストレスの種類の決定方法＞
トランスジェニック非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織を用いた、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により、耐性となるストレスの決定方法は、以下の（４−ｉｖ）、（４−ｖ）及び（４−ｖｉ）を含む：
（４−ｉｖ）被験ストレスを単独で、又は組み合わせて、心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織、及び、対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織に負荷する工程、
（４−ｖ）ストレス負荷後の、心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度と、対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度を比較する工程、及び
（４−ｖｉ）心臓特異的ＡＣｈ産生系亢進非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度が、対照非ヒト動物由来の心筋細胞若しくは心臓組織の障害の程度よりも低い場合に、当該ストレスを、心臓におけるＡＣｈ産生系亢進により耐性となるストレスであると、決定する工程。
【０１００】
つまり、この方法により決定されたストレスに対して、ＡＣｈの産生が亢進された心臓は、耐性を有すると判断することができる。このため、心臓におけるＡＣｈの産生の亢進は、ヒトにおいても、心筋細胞内又は心臓組織内のＡＣｈ濃度を上昇させる処置（物理的、化学的処置を含む）が、当該ストレスから、心臓を保護するように作用すると判断することができる。
【０１０１】
従って、本発明の方法で得られた知見に基づいて、心臓を各種ストレスから保護するための処置方法を検討し、開発することが可能となる。
【０１０２】
ストレスの負荷条件は、細胞種に応じて適宜設定できる。
【０１０３】
当該決定方法に用いられる、上記非ヒト動物由来心筋細胞若しくは心臓組織としては、先述したトランスジェニック動物由来のものが好ましいが、前記導入遺伝子構築物を導入した初代心筋培養細胞又はその細胞から派生した細胞及び再構築された心臓組織、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等から分化させる前又は分化させた後の心筋細胞に前記導入遺伝子構築物を導入したもの、それら心筋細胞から再構築された心臓組織を用いることができる。
【０１０４】
心臓内又は、心筋細胞内若しくは心臓組織内のＡＣｈ濃度を上昇させる機能を持つ薬剤には、ドネペジル塩酸塩などのＡＣｈエステラーゼ阻害薬等のアセチルコリン動作薬が挙げられる。
【実施例】
【０１０５】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
また、実施例で使用される略語は、以下の用語を示す。
【０１０６】
αＭＨＣ：α−ミオシン重鎖
ＥＧＦＰ：Ｅｎｈｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｍＣｈＡＴ：マウスコリンアセチルトランスフェラーゼ
ＤＡＢ：ジアミノベンジジン
ＰＣＡ：（過塩素酸）
【０１０７】
＜実施例１：トランスジェニックマウスの作製方法＞
１．αＭＨＣプロモーターのクローニング
αＭＨＣ遺伝子をコードするＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｎｏ．Ｕ７１４４１．１の塩基番号１番から５４３０番までの領域の約５．４ｋｂをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲは、３つのプライマーセットを用いて、三カ所に分けて増幅を行った。ＰＣＲに用いた最も５’上流側の領域の増幅に用いたプライマーセットの塩基配列は、フォワードプライマーが、５’−ａｔａｇｇａｔｃｃｔｇｃａａｇｇｔｃａｃａｃａａｇ−３’（配列番号３）、リバースプライマーが５’−ｇｇｃｔｔｇｔｃｃｔｔｇｃｔｔｃｃａｔｇｔｃｔｔ−３’（配列番号４）である。中間領域の増幅に用いたプライマーセットの塩基配列は、フォワードプライマーが、５’−ｔｇａｇａａｇｇａｇｃｃｔｇｇａａｃａｇａｇａａｔ−３’（配列番号５）、リバースプライマーが５’−ａａｇａｇａａｔｔｃｔａｃａｃｃｃｃｃｔｃｃｔｃｔ−３’（配列番号６）である。最も３’側の領域増幅に用いたプライマーセットの塩基配列は、フォワードプライマーが、５’−ｇｃｇａａｔｔｃｔｃｔｔａｃｔａｔｃａａａｇｇｇａａａｃｔｇａｇ−３’（配列番号７）、リバースプライマーが５’−ａｔｇａａｔｔｃｃｔｔａｔｇｇｇｇｇａｇａｔａｇｇａｇｇｇａｔ−３’（配列番号８）である。鋳型として、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）から常法にしたがって抽出したＤＮＡを用いた。ＰＣＲには、耐熱性ポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ株式会社、日本）を用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃３分間熱変性を行った後、９４℃３０秒、６４℃１分、７２℃２分の増幅反応を４３サイクル行った。
【０１０８】
増幅された３種の産物を、プロモーター領域に内在するＳｍａＩ及びＥｃｏＲＩサイトによって、連結した。制限酵素マップは、図１Ａに示す。
【０１０９】
２．ｍＣｈＡＴ  ｃＤＮＡのクローニング
マウスの脳から総ＲＮＡを抽出し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡）を用いて、逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行い、二本鎖のｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００９８９１塩基配列番号３３１〜２２６８までを、増幅できるように設定した。ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列は、フォワードプライマーが、５’−ｃａａａｔｃｇａｔａｔｇｃｃｔａｔｃｃｔｇｇａａａａｇｇｔｃ−３’（配列番号８）、リバースプライマーが５’−ａｔｔｇｔｃｇａｃｃｔａｇｔｇｇｇａｇｔａｇｔｃａａｇａｔｔ−３’（配列番号１０)である。ＰＣＲには、耐熱性ポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ株式会社、日本）を用いた。ＰＣＲ反応は、９４℃３分間熱変性を行った後、９４℃３０秒、６４℃１分、７２℃２分の増幅反応を４３サイクル行った。この反応により約２．０ｋｂの増幅産物が得られた。
【０１１０】
３．αＭＨＣプロモーター及び、ｍＣｈＡＴ  ｃＤＮＡを挿入したベクターの構築
１．で作製したプロモーターと、２．で作製したｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩサイトで連結し遺伝子構築物を作製した後、当該遺伝子構築物をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによって消化した。この消化後の遺伝子構築物を、ＢｇｌＩ及びＳａｌＩで消化したｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（ＢＤバイオサイエンス  クロンテック）に挿入した。マップは、図１に示す。ライゲーション及び導入遺伝子構築物のサブクローニングは、常法に従って行った。
【０１１１】
作製した導入遺伝子構築物の確認は、ＮｈｅＩ及びＳｓｐＩで単独消化又は、二重消化した後、アガロースゲル電気泳動及びエチジムブロマイド染色により行った。
【０１１２】
その結果を、図２に示す。ＮｈｅＩ及びＳｓｐＩの二重消化により、αＭＨＣプロモーターとｍＣｈＡＴ  ｃＤＮＡが連結した、遺伝子構築物に由来するバンドが検出された。
【０１１３】
４．トランスジェニックマウスの作製
３．作製した導入遺伝子構築物をＮｈｅＩ及びＳｓｐＩを用いた制限酵素処理によって切り出し、直鎖状のまま精製した。
【０１１４】
採卵用メスマウスに性腺刺激ホルモンを腹腔内に投与し、オスと交配させた。交尾確認後この採卵用メスマウスの卵管膨大部を切開し、受精卵を採取し培養した。インジェクションピペットに直鎖化し精製した導入遺伝子構築物を吸引して、オス前核へ遺伝子構築物を注入した。
【０１１５】
精管結紮オスマウスと交配させた偽妊娠メスマウスの輸卵管開口部に、インジェクションピペットを挿入し受精卵を注入した。
【０１１６】
遺伝子導入した受精卵を注入されたマウスは、通常飼育下で飼育され、自然出産させた。生後３から４週の仔マウスの尾を切断し、導入遺伝子構築物のスクリーニングに用いた。
【０１１７】
＜実施例２：作製したトランスジェニックマウスの各組織における外来性ＣｈＡＴの発現解析＞
ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスにおけるＣｈＡＴ及び、ＥＧＦＰのタンパク質レベルでの発現を、ウエスタンブロッティングによって確認した。
【０１１８】
ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの各組織から、常法に従って、タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜にタンパク質をトランスファーした。
【０１１９】
ＥＧＦＰを検出するために、一次抗体として、ウサギ抗Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ抗体ポリクローナル（ＭＢＬ株式会社、日本）を用いた。二次抗体には、ペルオキシダ−ゼ標識のヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いた。ペルオキシダーゼの検出は、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を用いて、化学発光を行い、Ｘ線フィルムに感光させた。
【０１２０】
ＣｈＡＴ蛋白発現を検出するために、一次抗体として、ヤギ抗ｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅポリクローナル抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）を用いた。二次抗体には、ペルオキシダ−ゼ標識のウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。検出は、上記と同様に行った。
【０１２１】
その結果、ＥＧＦＰ（図３）、ｍＣｈＡＴ（図４）とも、心臓に特異的に発現していることが証明された。
【０１２２】
＜実施例３：ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織におけるＥＧＦＰタンパク質の発現＞
ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓を採取し、４％パラフォルムアルデヒドで固定後、常法によりパラフィン包埋切片を作成した。
【０１２３】
常法により、切片の脱パラフィン、親水処理を行った後、内因性のペルオキシダーゼの不活化処理を行った。その後、１％ウシ血清アルブミンでブロッキングを行い、一次抗体を反応させた。一次抗体は、ウエスタンブロッティングと同じ抗体を１００倍希釈して用いた。洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて一次抗体を検出した。発色基質には、ＤＡＢを用いた。核染には、ヘマトキシリンを用いた。
【０１２４】
図５に示すように、ＤＡＢのシグナルは、心筋細胞内に検出され、ＥＧＦＰタンパク質の発現が確認された。このことから、マウス受精卵に導入した、導入遺伝子構築物由来のｍＣｈＡＴ遺伝子が、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓に発現していることが示された。
【０１２５】
＜実施例４：ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織ＡＣｈ産生量の測定＞
１．組織からのＡＣｈの抽出
野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスを深麻酔によって屠殺後、心臓を取り出した。１００ｍｇの心臓組織を０．１Ｍ  ＰＣＡ溶液中でホモジェナイズし、内部標準物質イソプロピルホモコリン塩酸塩（ＩＰＨＣ）５ｘ１０−７Ｍを添加して、その後遠心したものを、１Ｍ重炭酸カリウムでｐＨ５〜６に滴定後、ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ＭＣ  （１０，０００ＭＷ  ｃｕｔ  ｏｆｆ  ＵＦＣ３ＬＧＣ００）フィルター（ミリポア）を通して精製したのち−８０℃で保存した。
【０１２６】
２．ＡＣｈ量の測定
アセチルコリンＡＣｈの定量は、ＨＰＬＣにより行った。上記で抽出した組織抽出物を解凍し、測定に供した。
【０１２７】
ＨＰＬＣ解析システムは、ＨＴＥＣ−５００（Ｅｉｃｏｍ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）用いた。このＨＰＬＣ解析システムは、ポンプ（ＥＰ−３００）、オートインジェクター（ＣＭＡ−２００／２４０  ２０μｌインジェクション、６０分間隔）
、分離カラム（ＡＣ−Ｇｅｌ  ２．０φ×１５０ｍｍ）、固定化酵素カラム（ＡＣ−Ｅｍｚｙｍｅｐａｃｋ  １．０φ×４．０ｍｍ）、電気化学検出器（ＥＣＤ−３００  ３００ｍＶ）、脱気装置（ＤＧ−３００）を備えている。
【０１２８】
ＡＣｈの検出は、２０μｌのサンプルを注入し、移動相に５０ｍＭ重炭酸カリウムバッファーｐＨ８．５０（ＳＤＳ  ３００ｍｇ／ｌ、ＥＤＴＡ  ５０ｍｇ／ｌ含有）を用い、分析温度３３℃、移動相流速０．１５ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【０１２９】
３．測定結果
測定結果を図６に示す。この結果、野生型マウスと比較して、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスでは、組織１ｇ当たりに含まれるＡＣｈ量が、約５０倍以上上昇していることが示された。
【０１３０】
＜実施例５：野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織におけるＨＩＦ−１αの発現＞
野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織における低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒ−１α：ＨＩＦ−１α）の発現をウエスタンブロッティングで観察した。
【０１３１】
ＨＩＦ−１αを検出するための一次抗体は、抗ＨＩＦ−１モノクローナル抗体（Ｎｏｖｏｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用した。また、インターナルスタンダードとして、αチューブリンを用いた。αチューブリンを検出するための抗体は、抗チューブリン抗体（Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ  ｃｏｒｐ）を使用した。ウエスタンブロッティングは、先述した方法で行った。
【０１３２】
その結果、野生型マウスと比較して、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスでは、ＣｈＡＴの発現が上昇しているとともに、ＨＩＦ−１αの発現も上昇していることが確認された（図７）。
【０１３３】
＜実施例６：野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスにおける生理学的活性値の比較＞
１．野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの循環機能の比較
テールカフ法によりソフトロン社ＢＰ−９８−Ｌを用いて心拍数及び血圧を測定した。
【０１３４】
野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心拍数、及び血圧を比較した。野生型マウスの心拍数は、１分間あたり平均５９３．９±７４．７回であるのに対して、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの平均心拍数は、１分間あたり平均６５９．６±４９．２回であり、有意差は認められなかった（図８左）。
【０１３５】
最高血圧は、野生型マウスは、平均９２．１±７．７ｍｍＨｇであるのに対して、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスは、平均９９．０±９．９ｍｍＨｇであり、有意差は認められなかった。最低血圧も同様に、野生型マウスは、平均６９．０±７．９ｍｍＨｇであるのに対して、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスは、平均６９．２±７．５ｍｍＨｇであり、有意差は認められなかった（図８右）。
【０１３６】
次に、野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織における血管増生を観察するため、血管マーカーであるｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の免疫染色を行った。
【０１３７】
一次抗体には、抗ｖＷＦ抗体（ＤＡＫＯ社）を用い、先述した方法で免疫染色を行った。
【０１３８】
その結果、野生型マウスに比べて、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスでは、抗ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体の陽性となる細胞が多く検出された。従って、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織では、野生型マウスに比べて、血管が増生していることが示された（図９）。
２．野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの代謝活性の比較
野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの代謝活性を比較するため、心筋細胞内へのグルコース取り込み能を評価した。
【０１３９】
細胞内へのグルコースの輸送は、細胞膜に存在するグルコース輸送体を介して行われるため、グルコース輸送体クラスＩに分類されるＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ４のタンパク質レベルでの発現をウエスタンブロッティングで観察した。
【０１４０】
ＧＬＵＴ１の検出には、一次抗体として、抗Ｇｌｕｔ１抗体（ミリポア）を用い、ＧＬＵＴ４の検出には、一次抗体として、抗Ｇｌｕｔ４抗体（ミリポア）を用いて、上記の方法に従って、ウエスタンブロッティングを行った。その結果、野生型マウスに比べて、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスでは、ＧＬＵＴ1及びＧＬＵＴ４ともに発現が上昇していた（図１０左）。
【０１４１】
次に、組織内のグルコース量を測定した。
【０１４２】
ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウス及び野生型マウスを深麻酔により屠殺後、心臓を採取し、ＰＢＳ内でホモジナイズした。遠心分離により残渣を除去し、上清中のグルコース濃度をＧｌｕｃｏｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて測定した。測定方法は、添付のプロトコールに従った。
【０１４３】
野生型マウスの心臓組織１ｇあたりのグルコース含有量を１００％として、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓組織１ｇあたりのグルコース量を相対比で表した。ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心臓におけるグルコース含有量は、野生型マウスと比べて有意に上昇していた（図１０右）。
【０１４４】
これらのことから、ｍＣｈＡＴトランスへニックマウスにおいては、心筋細胞内へのグルコースの取り込みが上昇していることが示された。
【０１４５】
＜実施例７：野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスを用いた心筋梗塞モデルでの生理活性値の比較＞
野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスを、麻酔下で開胸し、冠動脈左前下行枝を８−０ナイロン糸で結紮した。
【０１４６】
結紮から１３日後の、野生型マウス及びｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの生存率、心臓重量、組織像を比較した。
【０１４７】
心筋梗塞誘発後の生存率は、野生型マウスでは、４１．７％（ｎ＝１２）であったのに対し、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスでは、９２．３％（ｎ＝１３）であり、生存率がｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスでは有意に上昇していた。
【０１４８】
また、心筋梗塞誘発後の心臓重量を比較すると図１１に示したように、野生型マウスでは、２倍程度心臓の重量が上昇したのに対して、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスででは、野生型マウスほどの上昇は認められなかった。
【０１４９】
さらに、マッソントリクローム染色を行い、心筋梗塞誘発後の心臓組織の線維化の進行を観察した(図１２)。
【０１５０】
マッソントリクローム染色は、「染色法のすべて、１９９０年２月発行、医師薬出版株式会社」の手順に従って行った。
【０１５１】
その結果、野生型マウス(図１２左)では、心筋梗塞誘発後１３日目に、線維化した部分を示す好塩基性（青）の染色像が広範囲に認められ、心筋細胞を示す好酸性（赤）の染色像は、ほとんど認められなくなっていた。これは、虚血によって心筋細胞が壊死し、その部分が結合組織で置き換えられたことを示ししていた。これに対し、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの心筋梗塞誘発後の心臓組織(図１２右)では、心筋を示す赤い染色像が保たれており、野生型マウスよりも、ｍＣｈＡＴトランスジェニックマウスの方が心筋梗塞、すなわち虚血に対して抵抗性を有していることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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