(57)【要約】【課題】等温核酸増幅反応、特に低温で行う等温核酸増幅反応において、検出シグナルを安定的に補正すること。【解決手段】以下（１）および（２）を含む、等温核酸増幅反応における標的核酸の検出方法：（１）補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブの存在下において、核酸試料を、等温条件下で標的核酸の増幅反応に供すること；ならびに（２）該増幅反応において、検出用核酸プローブに起因する検出シグナルを、補正用核酸プローブに起因する検出シグナルで補正すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（１）および（２）を含む、等温核酸増幅反応における標的核酸の検出方法：
（１）補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブの存在下において、核酸試料を、等温条件下で標的核酸の増幅反応に供すること；ならびに
（２）該増幅反応において、検出用核酸プローブに起因する検出シグナルを、補正用核酸プローブに起因する検出シグナルで補正すること。
【請求項２】
補正用核酸プローブが、標的核酸のヌクレオチド配列に相補的でないヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド部分、および検出シグナル発生部分を含み、
検出用核酸プローブが、標的核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド部分、および検出シグナル発生部分を含み、
補正用核酸プローブの検出シグナル発生部分および検出用核酸プローブの検出シグナル発生部分が互いに異なる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
補正用核酸プローブが、８〜５０個のヌクレオチド残基からなる一本鎖ポリヌクレオチド部分を含み、かつ
検出用核酸プローブが、８〜５０個のヌクレオチド残基からなる一本鎖ポリヌクレオチド部分を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
補正核酸プローブと検出用核酸プローブとの長さの差が、９ヌクレオチド残基の範囲内にある、請求項３記載の方法。
【請求項５】
補正核酸プローブと検出用核酸プローブとの長さの差が、３ヌクレオチド残基の範囲内にある、請求項４記載の方法。
【請求項６】
補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列が、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列に対して、５０％以下の同一性％を示す、請求項２〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
補正用核酸プローブの検出シグナル発生部分および検出用核酸プローブの検出シグナル発生部分が異なる蛍光物質である、請求項２記載の方法。
【請求項８】
蛍光物質が二本鎖核酸構造の形成により消光する性質を有する蛍光物質である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
以下（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれかである、請求項８記載の方法：
（Ｉ）補正用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第１の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端に有し、かつ、検出用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第２の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端に有する；あるいは
（ＩＩ）補正用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第１の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の５’末端に有し、かつ、検出用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第２の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の５’末端に有する。
【請求項１０】
５０℃未満の等温条件下で標的核酸の増幅反応が行われる、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
等温核酸増幅反応がリコンビナーゼを用いる方法である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブを含む、キット。
【請求項１３】
ポリメラーゼをさらに含む、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
リコンビナーゼをさらに含む、請求項１２または１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等温核酸増幅反応における検出シグナルの補正方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
リアルタイムＰＣＲ等のリアルタイム核酸増幅アッセイでは、検出される蛍光シグナルのベースラインを安定化させるためにＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）等の内部参照蛍光物質を使用するのが一般的である。また、内部参照蛍光物質としては、特許文献１に開示されるものも知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ９７／０４６７０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、等温核酸増幅反応、特に低温で行う等温核酸増幅反応では、蛍光シグナルのベースラインが安定化しない。したがって、測定対象の検出シグナルを安定的に補正することは難しい。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、等温核酸増幅反応、特に低温で行う等温核酸増幅反応では、蛍光シグナルのベースラインが安定化しない原因が、検出用核酸プローブと内部参照蛍光物質が異なる挙動を示す場合が多いことにあると考えた。本発明者らは、このような仮説の下で鋭意検討した結果、検出用核酸プローブの挙動を模倣し得る補正用核酸プローブの使用により、等温核酸増幅反応における蛍光シグナルのベースラインを安定化できること、したがって、測定対象の検出シグナルを安定的に補正できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（１）および（２）を含む、等温核酸増幅反応における標的核酸の検出方法：
（１）補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブの存在下において、核酸試料を、等温条件下で標的核酸の増幅反応に供すること；ならびに
（２）該増幅反応において、検出用核酸プローブに起因する検出シグナルを、補正用核酸プローブに起因する検出シグナルで補正すること。
〔２〕補正用核酸プローブが、標的核酸のヌクレオチド配列に相補的でないヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド部分、および検出シグナル発生部分を含み、
検出用核酸プローブが、標的核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド部分、および検出シグナル発生部分を含み、
補正用核酸プローブの検出シグナル発生部分および検出用核酸プローブの検出シグナル発生部分が互いに異なる、〔１〕の方法。
〔３〕補正用核酸プローブが、８〜５０個のヌクレオチド残基からなる一本鎖ポリヌクレオチド部分を含み、かつ
検出用核酸プローブが、８〜５０個のヌクレオチド残基からなる一本鎖ポリヌクレオチド部分を含む、〔２〕の方法。
〔４〕補正核酸プローブと検出用核酸プローブとの長さの差が、９ヌクレオチド残基の範囲内にある、〔３〕の方法。
〔５〕補正核酸プローブと検出用核酸プローブとの長さの差が、３ヌクレオチド残基の範囲内にある、〔４〕の方法。
〔６〕補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列が、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列に対して、５０％以下の同一性％を示す、〔２〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕補正用核酸プローブの検出シグナル発生部分および検出用核酸プローブの検出シグナル発生部分が異なる蛍光物質である、〔２〕の方法。
〔８〕蛍光物質が二本鎖核酸構造の形成により消光する性質を有する蛍光物質である、〔７〕の方法。
〔９〕以下（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれかである、〔８〕の方法：
（Ｉ）補正用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第１の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端に有し、かつ、検出用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第２の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端に有する；あるいは
（ＩＩ）補正用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第１の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の５’末端に有し、かつ、検出用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第２の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の５’末端に有する。
〔１０〕５０℃未満の等温条件下で標的核酸の増幅反応が行われる、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕等温核酸増幅反応がリコンビナーゼを用いる方法である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブを含む、キット。
〔１３〕ポリメラーゼをさらに含む、〔１２〕のキット。
〔１４〕リコンビナーゼをさらに含む、〔１２〕または〔１３〕のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、補正用核酸プローブを用いることにより、等温核酸増幅反応、特に低温で行う等温核酸増幅反応における測定対象の検出シグナルを安定的に補正することができる。したがって、本発明は、等温核酸増幅反応による測定対象の定性的および定量的測定に有用である。具体的には、本発明の方法は、等温核酸増幅反応における標的核酸の検出における精度に優れる。また、本発明のキットによれば、例えば、等温核酸増幅反応における標的核酸の検出を簡便に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  １）による蛍光強度変化率の補正を示す図である。ボックスで囲まれた数値（％）は、反応１分後の蛍光強度変化率を示し、ボックスで囲まれた時間（ｍｉｎ．）は、蛍光強度変化率の安定化に要した時間（ベースラインに至るまでの時間）を示す。ＤＷ：Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ。以下同様である。
【図２】図２は、ＲＯＸリファレンスダイによる蛍光強度変化率の補正を示す図である。
【図３】図３は、補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２）による蛍光強度変化率の補正を示す図である。
【図４】図４は、補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ３）による蛍光強度変化率の補正を示す図である。
【図５】図５は、補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ４）による蛍光強度変化率の補正を示す図である。
【図６】図６は、補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ５）による蛍光強度変化率の補正を示す図である。
【図７】図７は、補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ６）による蛍光強度変化率の補正を示す図である。
【図８】図８は、補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ７）による蛍光強度変化率の補正を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、等温核酸増幅反応における検出シグナルの補正方法を提供する。
【００１０】
等温核酸増幅反応としては、等温条件下で標的核酸を増幅できる任意の方法が用いられる。このような方法としては、例えば、転写を媒介させる方法、ニッキング酵素（例、制限酵素、リボヌクレアーゼＨ）を用いる方法、ループ構造を介した連鎖的なＤＮＡ合成を利用する方法、ローリングサークル型のＤＮＡ複製反応を利用する方法、ヘリカーゼを用いる方法、リコンビナーゼを用いる方法が挙げられる。転写を媒介させる方法としては、例えば、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。制限酵素やリボヌクレアーゼＨなどのニッキング酵素を用いる方法としては、例えば、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）法が挙げられる。ループ構造を介した連鎖的なＤＮＡ合成を利用する方法としては、例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＭＡＰ（Ｓｍａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）法が挙げられる。ローリングサークル型のＤＮＡ複製反応を利用する方法としては、例えば、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。ヘリカーゼを用いる方法としては、例えば、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。リコンビナーゼを用いる方法としては、例えば、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＩＢＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法が挙げられる。
【００１１】
等温核酸増幅反応は、主に、５０℃以上（例、５０℃以上７０℃未満）の中高温条件下で行われる等温核酸増幅反応、および５０℃未満（例、２５℃以上５０℃未満）の低温条件下で行なわれる等温核酸増幅反応に分類することができる。従来、等温核酸増幅反応、特に低温で行う等温核酸増幅反応では、検出用核酸プローブと内部参照蛍光物質が異なる挙動を示す場合が多く、検出シグナルのベースラインを安定化させるのが難しかった（参考例１、および図２中のＤＷを参照）。一方、本発明の方法では、補正用核酸プローブが低温条件下でも検出用核酸プローブと類似した挙動を示し得るので、検出シグナルのベースラインの安定化および測定対象の検出シグナルの安定的な補正を達成することができる（例、実施例１、および図１を参照）。具体的には、本発明の方法は、５０℃未満、好ましくは４５℃未満、より好ましくは４２℃未満の低温条件下で行われた場合であっても、検出シグナルのベースラインの安定化および測定対象の検出シグナルの安定的な補正を達成することができる。上述した等温核酸増幅反応のうち、転写を媒介させる方法、制限酵素やリボヌクレアーゼＨなどのニッキング酵素を用いる方法、ローリングサークル型のＤＮＡ複製反応を利用する方法、ヘリカーゼを用いる方法、およびリコンビナーゼを用いる方法は、このような低温条件下で行うことができる。したがって、本発明の方法は、このような低温条件下であっても好適に行うことができる。
【００１２】
本発明の方法は、以下（１）および（２）を含む：
（１）補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブの存在下において、核酸試料を、等温条件下で標的核酸の増幅反応に供すること；ならびに
（２）該増幅反応において、検出用核酸プローブに起因する検出シグナルを、補正用核酸プローブに起因する検出シグナルで補正すること。
【００１３】
標的核酸の検出用核酸プローブは、標的核酸に特異的に結合することにより、検出可能なシグナルを発生する核酸プローブである。標的核酸の検出用核酸プローブは、標的核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド部分、および検出シグナル発生部分を含む。
【００１４】
検出用核酸プローブは、その一本鎖ポリヌクレオチド部分が標的核酸に対して相補的に結合するように設計される。検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ）ならびにそれらの修飾核酸塩基（例、イノシン、ウリジン、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ピリミジン誘導体）からなる群より選ばれる核酸塩基を有するヌクレオチドから構成される。当業者は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分を構成し得る、修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを適宜選択することができる。検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、核酸プローブの構成ヌクレオチドとして汎用されている、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）からなる群より選ばれる核酸塩基を有するヌクレオチドのみから構成されてもよい。一本鎖ポリヌクレオチド部分は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッド分子であってもよい。
【００１５】
検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、ヌクレオチド配列同一性％の観点から、規定されてもよい。具体的には、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列は、標的核酸に対して相補的に結合できる程度に、標的核酸の相補鎖中の特定領域のヌクレオチド配列に対して有意なヌクレオチド配列同一性％を示す。検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列および上記特定領域のヌクレオチド配列の間で算出される、このような有意なヌクレオチド配列同一性％は、例えば９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらにより好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、特に好ましくは１００％である。この場合、ヌクレオチド配列同一性％は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列の長さを基準にして算出される。ヌクレオチド配列同一性％は、当該分野で周知の方法により決定することができ、例えば、２つのヌクレオチド配列の比較を行うことができるインターネット上で利用可能なプログラムをデフォルト設定で利用してもよい。例えば、ヌクレオチド配列同一性％は、ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９９１）１２：３３７−３５７）により算定してもよい。ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムによる算定は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌで公開されているＷｉｌｌｉａｍ  Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｌａｌｉｇｎプログラムをデフォルト設定（ただし、ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄをｇｌｏｂａｌとする）で利用することにより簡便に行うことができる。
【００１６】
検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の長さは、本発明の方法で採用される条件（例、温度条件）下において標的核酸との相補的な結合が可能である長さである限り特に限定されず、本発明の方法で採用される等温核酸増幅反応の種類に応じて適宜決定することができる。一般的には、一本鎖ポリヌクレオチド部分の長さは、８〜５０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは１２〜４０ヌクレオチド長である。一本鎖ポリヌクレオチド部分の長さはまた、他の観点から決定されてもよい。例えば、本発明の方法がリコンビナーゼを用いる方法（例、ＲＰＡ法）により行なわれる場合、リコンビナーゼによる一本鎖ポリヌクレオチド部分の認識性の観点から、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の長さは、例えば２０〜５０ヌクレオチド長、好ましくは２０〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは３０〜４０ヌクレオチド長である。本発明の方法がリコンビナーゼを用いる方法（例、ＲＰＡ法）により行われる場合、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分がリコンビナーゼにより認識され標的核酸と相補的に結合するので、標的核酸を特異的に検出することができる。
【００１７】
検出用核酸プローブの検出シグナル発生部分は、検出可能なシグナルを発生し得る物質から構成され、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分と相補的に結合した標的核酸の検出を可能にする。検出シグナル発生部分としては、例えば、蛍光物質が挙げられる。
【００１８】
検出シグナル発生部分が蛍光物質である場合、検出用核酸プローブは、核酸塩基による蛍光消光現象を利用したプローブであってもよい。このような検出用核酸プローブは、上記一本鎖ポリヌクレオチド部分、および二本鎖核酸構造の形成により消光する性質を有する蛍光物質を含む。二本鎖核酸構造の形成により消光する性質を有する蛍光物質としては、例えば、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質が挙げられる。グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（２−オキソ−６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（Ｎ−［２−（ヨードアセチルアミノ）エチル］−５，７−ジメチル−４，４−ジフルオロ−３ａ−アゾニア−４−ボラ（ＩＶ）−４Ｈ−４ａ−アザ−ｓ−インダセン−３−プロパンアミド）、５−ＣＲ６Ｇ（５−カルボキシローダミン）、ＴＡＭＲＡ（（６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサノエート）、６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、Ａｌｅｘａ  ４８８（商標）、Ａｌｅｘａ  ５３２（商標）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／Ｃ３が挙げられる。
【００１９】
検出シグナル発生部分が蛍光物質である場合、検出用核酸プローブはまた、常態では蛍光を発しないプローブであってもよい。このような検出用核酸プローブは、上記一本鎖ポリヌクレオチド部分、および蛍光物質に加えて、消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）をさらに含み、蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合に蛍光を発する。このようなプローブとしては、例えば、加水分解プローブおよびステム・ループ構造プローブが挙げられる。加水分解プローブは、標的核酸に相補的に結合して二本鎖構造を形成している間、蛍光物質はクエンチングされているものの、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によってプローブが分解されると消光効果が解消し、蛍光を発するプローブである。ステム・ループ構造プローブは、自己ヘアピン構造を有し、標的核酸に相補的に結合する際にヘアピン構造から引き伸ばされると消光効果が解消し、蛍光を発するプローブである。このような検出用核酸プローブに用いられる蛍光物質としては、例えば、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＲＯＸ（カルボキシ−６−ローダミン）、およびＴＡＭＲＡ（（６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサノエート）が挙げられる。このような検出用核酸プローブに用いられる消光物質としては、例えば、ＢＨＱ−１（［（４−（２−ニトロ−４−メチル−フェニル）−アゾ）−イル−（（２−メトキシ−５−メチル−フェニル）−アゾ）］−アニリン）、ＢＨＱ−２（（［（４−（１−ニトロ−フェニル）−アゾ）−イル−（（２，５−ジメトキシ−フェニル）−アゾ）］−アニリン）、Ｄａｂｃｙｌ（４−［［４−（ジメチルアミノ）−フェニル］−アゾ］−安息香酸）、Ｅｃｌｉｐｓｅ（４−［［２−クロロ−４−ニトロ−フェニル］−アゾ］−アニリン）、ＴＡＭＲＡ（（６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサノエート）が挙げられる。
【００２０】
本発明の方法において、標的核酸の数は、１つであってもよいが、複数（例、２つ、３つ、４つ）であってもよい。標的核酸の数が複数である場合には、同数の検出用核酸プローブを用いることができる。この場合、複数の検出用核酸プローブは、それぞれ、異なる種類のシグナル発生部分を含む。複数の検出用核酸プローブを用いることにより、複数の標的核酸の多重的な解析が可能である。
【００２１】
補正用核酸プローブは、標的核酸に結合する能力を有さず、かつ、検出可能なシグナルを発生する核酸である。補正用核酸プローブは、標的核酸のヌクレオチド配列に相補的でないヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド部分、および検出シグナル発生部分を含む。補正用核酸プローブは、検出用核酸プローブとは、異なる検出シグナル発生部分を含むように設計され、それにより、補正用核酸プローブから発生する検出シグナルおよび検出用核酸プローブから発生する検出シグナルが識別される。
【００２２】
補正用核酸プローブは、その一本鎖ポリヌクレオチド部分が標的核酸に対して相補的に結合しないように設計される。補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ）ならびにそれらの修飾核酸塩基（例、イノシン、ウリジン、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ピリミジン誘導体）からなる群より選ばれる核酸塩基を有するヌクレオチドから構成される。当業者は、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分を構成し得る、修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを適宜選択することができる。検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の構造特性を極力模倣するという観点から、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の構成ヌクレオチドと同種のヌクレオチドから構成されることが好ましい。したがって、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、核酸プローブの構成ヌクレオチドとして汎用されている、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）からなる群より選ばれる核酸塩基を有するヌクレオチドのみから構成されてもよい。一本鎖ポリヌクレオチド部分は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッド分子であってもよい。検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の構造特性を極力模倣するという観点から、好ましくは、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分がＤＮＡである場合、ＤＮＡであり、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分がＲＮＡである場合、ＲＮＡであり、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分がＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッド分子である場合、ハイブリッド分子である。
【００２３】
補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、同一のヌクレオチドから構成されるホモマー、または複数のヌクレオチドから構成されるヘテロマーであってもよいが、検出用核酸プローブが通常、複数のヌクレオチドから構成されるという観点、および複数のヌクレオチドから通常構成される検出用核酸プローブの挙動を補正用核酸プローブが模倣するべきであるという観点からは、ヘテロマーであることが好ましい。一本鎖ポリヌクレオチド部分がヘテロマーである場合、一本鎖ポリヌクレオチド部分は、上述したヌクレオチドのうち、少なくとも２種のヌクレオチド、好ましくは３種または４種のヌクレオチドを有する。
【００２４】
補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の長さは、８〜５０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド長、より好ましくは１２〜４０ヌクレオチド長である。補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の長さはまた、特に限定されるものではないが、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の長さとの関係で、規定してもよい。補正核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分と検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分との長さの差は、例えば９ヌクレオチド残基の範囲内、より好ましくは６ヌクレオチド残基の範囲内、さらにより好ましくは３ヌクレオチド残基の範囲内であってもよい。
【００２５】
補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分と、類似したＧＣ含量を有していてもよい。例えば、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のＧＣ含量（％）は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のＧＣ含量（％）に対して、±１０％、±７％、±５％または±３％の範囲内であってもよい。
【００２６】
補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分と、類似した融点（Ｔｍ値）を有していてもよい。例えば、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の融点（℃）は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の融点（℃）に対して、±１０℃、±７℃、±５℃または±３℃の範囲内であってもよい。融点は、当該分野で周知の方法により適宜決定することができ、例えば、市販のソフトウェアにより決定してもよい。
【００２７】
補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、標的核酸の相補鎖中の任意領域のヌクレオチド配列に対する同一性％の観点から、規定されてもよい。具体的には、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列は、標的核酸に対して相補的に結合できない程度に、標的核酸の相補鎖中の任意領域のヌクレオチド配列に対して有意でないヌクレオチド配列同一性％を示す。補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列および上記任意領域のヌクレオチド配列の間で算出される、このような有意でないヌクレオチド配列同一性％は、例えば６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下または３０％以下の配列同一性％に対応する。この場合、ヌクレオチド配列同一性％は、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列の長さを基準にして算出される。ヌクレオチド配列同一性％は、当該分野で周知の方法により決定することができ、例えば、上述したとおり決定してもよい。
【００２８】
補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分はまた、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列に対する同一性％の観点から、規定されてもよい。具体的には、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列に対して、例えば６０％以下の配列同一性％を示し、好ましくは５５％以下の配列同一性％を示し、より好ましくは５０％以下の配列同一性％を示し、さらにより好ましくは４５％以下の配列同一性％を示し、特に好ましくは４０％以下、３５％以下または３０％以下の配列同一性％を示す。特に好ましい実施形態では、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列は、標的核酸の相補鎖中の特定領域のヌクレオチド配列に対して１００％のヌクレオチド配列同一性％を示し、かつ、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列は、検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列に対して、上述したヌクレオチド配列同一性％を示す。補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列および検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分のヌクレオチド配列の長さが互いに異なる場合には、ヌクレオチド配列同一性％は、より長いヌクレオチド配列の長さを基準にして算出される。ヌクレオチド配列同一性％は、当該分野で周知の方法により決定することができ、例えば、上述したとおり決定してもよい。
【００２９】
補正用核酸プローブはまた、ヒト等の任意の動物などに由来する試料に対する汎用性プローブとして用いることができる。例えば、ヒトゲノムは、約３，０００，０００，０００個のヌクレオチドから構成されることが知られている。理論上、ポリヌクレオチドの長さが１６ヌクレオチド残基長であればヒトゲノムに対して特異的な一つの座標を規定し得る（４１６＝約４，３００，０００，０００）。換言すれば、ポリヌクレオチドの長さが１７以上のヌクレオチド残基長であれば、ヒトゲノム上の任意の領域に対して完全に相補的でない一本鎖ポリヌクレオチドを設計し得る。したがって、補正用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分は、前段落で述べたようなヌクレオチド長を有する場合、ヒトゲノム上の任意の領域に対して非相補的であり得る。また、ヒトゲノム上の任意の領域、および任意のヒトＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）上の任意の領域に対して非相補的である汎用性の補正用核酸プローブの設計は、候補ヌクレオチド配列をヒトの遺伝子情報（例、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）データベースに照合することにより、候補ヌクレオチド配列と高い同一性を示したヌクレオチド配列をデータベースからピックアップし、次いで、当該ヌクレオチド配列に対してより低い同一性を示すように改変した候補ヌクレオチド配列を再度データベースに照合するといった操作を繰り返すことにより、行うことができる。データの照合はまた、感染症の原因となるウイルスおよび微生物等の遺伝子情報データベースに対しても行うことができる。このような手法により設計された一本鎖ポリヌクレオチド部分を有する補正用核酸プローブは、ヒト由来試料に対する汎用性プローブとして有用であり、ヒトの診断、治療モニタリングなどに好適に使用される。
【００３０】
補正用核酸プローブの検出シグナル発生部分は、検出可能なシグナルを発生し得る物質から構成され、等温核酸増幅反応における測定対象の検出シグナルの補正を可能にする。検出シグナル発生部分としては、例えば、蛍光物質が挙げられる。
【００３１】
検出シグナル発生部分が蛍光物質である場合、補正用核酸プローブは、核酸塩基による蛍光消光現象を利用したプローブであってもよい。このような補正用核酸プローブは、上記一本鎖ポリヌクレオチド部分、および二本鎖核酸構造の形成により消光する性質を有する蛍光物質を含む。二本鎖核酸構造の形成により消光する性質を有する蛍光物質としては、例えば、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質が挙げられる。グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質としては、例えば、上述したものが挙げられる。検出用核酸プローブが、核酸塩基による蛍光消光現象を利用したプローブである場合、等温核酸増幅反応において補正用核酸プローブが検出用核酸プローブの挙動を模倣するという観点からは、補正用核酸プローブもまた、核酸塩基による蛍光消光現象を利用したプローブであることが好ましい。
【００３２】
検出シグナル発生部分が蛍光物質である場合、補正用核酸プローブはまた、常態では蛍光を発しないプローブであってもよい。このような補正用核酸プローブは、上記一本鎖ポリヌクレオチド部分、および蛍光物質に加えて、消光物質（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）をさらに含み、蛍光物質と消光物質との距離が離れた場合に蛍光を発する。このようなプローブとしては、例えば、上述したような加水分解プローブおよびステム・ループ構造プローブが挙げられる。このような補正用核酸プローブに用いられる蛍光物質および消光物質としては、例えば、検出用核酸プローブについて上述したものが挙げられる。検出用核酸プローブが、常態では蛍光を発しないプローブである場合、等温核酸増幅反応において補正用核酸プローブが検出用核酸プローブの挙動を模倣するという観点からは、補正用核酸プローブもまた、常態では蛍光を発しないプローブであることが好ましい。特に、検出用核酸プローブが加水分解プローブである場合、補正用核酸プローブもまた加水分解プローブであることが好ましく、検出用核酸プローブがステム・ループ構造プローブである場合、補正用核酸プローブもまたステム・ループ構造プローブであることが好ましい。
【００３３】
本発明の方法において用いられる補正用核酸プローブの数は、１つであってもよいが、複数（例、２つ、３つ、４つ）であってもよい。補正用核酸プローブの数が複数である場合には、複数の補正用核酸プローブは、異なる検出シグナル発生部分を含んでいてもよいが、同じ検出シグナル発生部分を含むこともまた好ましい。複数の補正用核酸プローブが同じ検出シグナル発生部分を含む場合、補正用核酸プローブの検出シグナルを平均化することにより、測定対照の検出シグナルの補正に利用することができる。
【００３４】
好ましい実施形態では、補正用核酸プローブの検出シグナル発生部分および検出用核酸プローブの検出シグナル発生部分の双方が、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質である。この場合、補正用核酸プローブおよび検出用核酸プローブの一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端または５’末端のヌクレオチド残基がシトシン含有ヌクレオチドであり、かつ、当該シトシン含有ヌクレオチドがグアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質に結合している。検出用核酸プローブが、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端または５’末端に、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを有する場合、検出用核酸プローブが標的核酸と相補的に結合することにより、蛍光物質とグアニン塩基が近接し、グアニン塩基の影響を受けて蛍光物質からの蛍光シグナルが消光する。等温核酸増幅反応において補正用核酸プローブが検出用核酸プローブの挙動を模倣するという観点からは、補正用核酸プローブの構成（グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する蛍光物質による補正用核酸プローブの末端標識様式）は、検出用核酸プローブのものと同様であることが好ましい。具体的には、以下（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれかである構成を有することが好ましい：
（Ｉ）補正用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第１の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端に有し、かつ、検出用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第２の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端に有する；あるいは
（ＩＩ）補正用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第１の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の５’末端に有し、かつ、検出用核酸プローブが、グアニン塩基に近接した場合に蛍光シグナルが減少する第２の蛍光物質に結合しているシトシン含有ヌクレオチドを、その一本鎖ポリヌクレオチド部分の５’末端に有する。
なお、（ＩＩ）の場合、一本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端は、ポリメラーゼによる伸長反応を回避するため、脱リン酸化処理されていることが好ましい。
【００３５】
【化１】
2013153709.tif 000002
【００３６】
核酸試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸試料自体、またはそれを含有する任意の試料が用いられる。核酸試料は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物等の動物、植物、昆虫、微生物（例、細菌、酵母）、ウイルス（例、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の肝炎ウイルス、ＨＩＶ等のレトロウイルス）に由来する核酸成分を含有する、または含有すると疑われる試料であってもよい。哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物または家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられる。核酸試料は、疾患に罹患している、または疾患に罹患していると疑われる哺乳動物に由来する生体試料（例、血液、唾液、毛髪、粘膜、組織サンプル）であってもよい。核酸試料は、必要に応じて、核酸の抽出後に、本発明の方法に用いられる。測定対象がＲＮＡである場合、逆転写反応後に本発明の方法に用いられ得る。
【００３７】
本発明では、上述したような補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブの存在下において、核酸試料が、等温条件下で標的核酸の増幅反応に供される。等温条件下での標的核酸の増幅反応は、採用される等温核酸増幅反応の反応条件に沿うように適宜行われる。
【００３８】
例えば、反応温度は、等温核酸増幅反応において上述した温度と同様である。具体的には、等温核酸増幅反応は、５０℃以上（例、５０℃以上７０℃未満）の高温条件下、または５０℃未満（例、２５℃以上５０℃未満）の低温条件下で行なわれてもよい。等温核酸増幅反応が低温条件下で行なわれる場合、温度は、５０℃未満、好ましくは４５℃未満、より好ましくは４２℃未満であってもよい。
【００３９】
等温核酸増幅反応に用いられる反応液中の検出用核酸プローブの濃度は、例えば０．０１〜２μＭ、好ましくは０．０２〜１μＭ、より好ましくは０．０４〜０．５μＭである。
反応液中の補正用核酸プローブの濃度は、例えば０．０１〜２μＭ、好ましくは０．０２〜１μＭ、より好ましくは０．０４〜０．５μＭである。
等温核酸増幅反応において補正用核酸プローブが検出用核酸プローブの挙動を模倣するという観点からは、それらの濃度も近いことが好ましい。したがって、検出用核酸プローブに対する補正用核酸プローブの濃度の割合（検出用核酸プローブ／補正用核酸プローブ）は、例えば１／１００〜１００の範囲内であり、好ましくは１／１０〜１０の範囲内であり、より好ましくは１／５〜５の範囲内であり、さらにより好ましくは１／２〜２の範囲内であり、特に好ましくは１（即ち、等濃度）である。
等温核酸増幅反応の他の条件（例、プライマー濃度、反応液に添加される核酸試料の量、反応時間）は、適宜設定することができる。
【００４０】
補正用核酸プローブに起因する検出シグナルによる、検出用核酸プローブに起因する検出シグナルの補正は、検出シグナルの補正に関する自体公知の方法により行うことができる。例えば、検出用核酸プローブに起因する検出シグナルの値を、補正用核酸プローブに起因する検出シグナルの値で除算することによって、検出用核酸プローブに起因する検出シグナルを補正することができる。
【００４１】
本発明はまた、キットを提供する。
【００４２】
本発明のキットは、補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブを含む。補正用核酸プローブおよび標的核酸の検出用核酸プローブの詳細は、上述したとおりである。本発明のキットは、例えば、上述した核酸増幅反応に用いられる。
【００４３】
本発明のキットは、ポリメラーゼを含んでいてもよい。ポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００４４】
ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである場合、本発明のキットは、制限酵素、リボヌクレアーゼＨ、ライゲース、ヘリカーゼおよびリコンビナーゼからなる群より選ばれる１種以上の酵素をさらに含んでいてもよい。この場合、本発明のキットは、上記酵素に加えて、融解温度調整剤（例、ベタイン）または一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を含んでいてもよい。この場合、本発明のキットは、ｄＮＴＰｓをさらに含んでいてもよい。本発明のキットは、リコンビナーゼを含む場合、ＡＴＰをさらに含んでいてもよい。
【００４５】
ポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼである場合、本発明のキットは、逆転写酵素（例、ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素、またはＲＮａｓｅＨ活性を有しない酵素）をさらに含んでいてもよい。この場合、本発明のキットは、ｄＮＴＰｓまたはＮＴＰｓの一方、好ましくはｄＮＴＰｓおよびＮＴＰｓの双方を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明のキットはまた、標的核酸に対するプライマーを含んでいてもよい。本発明のキットに含まれるプライマーの数は、１以上であり、採用されるべき核酸増幅反応に応じて変化し得る（例、１、２、３または６個）。プライマーとしては、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッド分子が挙げられる。
【００４７】
具体的には、本発明のキットは、採用されるべき核酸増幅反応に応じて、表１に示されるような成分を含んでいてもよい。本発明のキットはまた、ポジティブコントロール〔例、正常または異常な標的核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）〕および／またはネガティブコントロール〔例、異常または正常な標的核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）〕を含んでいてもよい。本発明のキットはさらに、定性的および／または定量的アッセイにおける比較用コントロールとして用いることができるハウスキーピング遺伝子（例、ＧＡＰＤＨ、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１）に対する核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のような他のコントロールを含んでいてもよい。本発明のキットはまた、これらのコントロールに対するプライマーを含んでいてもよい。本発明のキットは、個々の容器（例、チューブ）に隔離された形態で各成分を含んでいてもよいが、２種以上の成分が同一容器中で予め混合されていてもよい。
【００４８】
【表１】
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【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
【００５０】
（材料）
表２に示されるヌクレオチド配列からなる検出用核酸プローブ、および表３に示されるヌクレオチド配列からなる補正用核酸プローブを、以降の実験で用いた。
【００５１】
【表２】
2013153709.tif 000004
【００５２】
【表３】
2013153709.tif 000005
【００５３】
検出用核酸プローブおよび補正用核酸プローブの詳細は、それぞれ、表４、５に示すとおりである。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
（実施例１）
核酸増幅アッセイには、ＴｗｉｓｔＤｘ社製のＲＰＡ法を原理とするＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃキットを使用した。このキットは、核酸増幅反応に必要な成分として、ＤＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼ、ｄＮＴＰｓ、ＡＴＰおよび一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）を含む。したがって、以下に示すアッセイでは、これらの成分を利用した。核酸増幅用の２種類のプライマーはＳＩＧＭＡ社、標的核酸はインビトロジェン社、検出用核酸プローブ（ＨＢ＿ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ）および補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−１）は日鉄環境エンジニアリング社が人工合成したものをそれぞれ使用した。
２種類のプライマー配列は、フォワードプライマー：５’−ｇｃｔａｔｃｇｃｔｇｇａｔｇｔｇｔｃｔｇｃｇｇｃｇｔｔｔｔａｔｃａ−３’（配列番号９）、リバースプライマー：５’−ｔｔｇｃｇａａａｇｃｃｃａｇｇａｔｇａｔｇｇｇａｔｇｇｇａａｔａｃ−３’（配列番号１０）を使用した。標的核酸はＨＢＶのＳ抗原部位に相当する遺伝子配列を使用した。検出用核酸プローブは３’末端にＢＯＤＩＰＹ、補正用核酸プローブは３’末端にＴＡＭＲＡを標識したものをそれぞれ使用した。
Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに、０．２μＭフォワードプライマー、０．４μＭリバースプライマー、０．０５μＭ検出用核酸プローブ、０．０５μＭ補正用核酸プローブとなるように添加した。次に、標的核酸を１０００コピー／５０μＬとなるように加えた後、調製した溶液をＲＰＡ  Ｐｅｌｌｅｔに４７．５μＬ加え、溶解した。同様に標的核酸の代わりにＤｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（ＤＷ）を使用した溶液も調製した。
上記で調製した溶液に、２８０ｍＭ酢酸マグネシウム溶液を２．５μＬ添加し、良く撹拌した後、３７℃で３０分インキュベーションした。インキュベーション時には３０秒毎に蛍光シグナルを測定した。
得られたデータは次のように処理した。各測定時間での蛍光強度比＝（検出用核酸プローブの蛍光強度シグナル／補正用核酸プローブの蛍光強度シグナル）を求めた後、反応開始５分後の蛍光強度比を基準としたときの各測定時間での蛍光強度比の変化率（蛍光強度変化率）を求めた（図１）。また、補正用核酸プローブの非存在下（未補正）で同様の実験を行い、未補正の場合に得られた実験結果を、補正用核酸プローブにより補正した場合に得られた実験結果と比較した（図１）。
その結果、補正用核酸プローブ（核酸プローブであるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ−１）の存在下では、検出シグナルのベースライン蛍光強度変化率（図１の「ＤＷ」）が安定化された。具体的には、反応過程初期において、ベースライン蛍光強度変化率（１ｍｉｎ．）は、補正用核酸プローブにより補正した場合、低い値（１．１５％）を示した（図１）。反応過程初期において、ベースライン蛍光強度変化率は、未補正の場合、安定化しなかったのに対し、補正用核酸プローブにより補正した場合、短時間（２ｍｉｎ．）で安定化した（図１）。反応過程後期において、補正用核酸プローブにより補正した場合、ベースライン蛍光強度変化率の安定化が確認された（図１）。検出シグナルのベースライン蛍光強度変化率の安定化は、等温核酸増幅反応における測定対象の検出シグナルの安定的な補正に資する（図１の「１０３ｃｏｐｉｅｓ／ａｓｓａｙ」）。したがって、補正用核酸プローブは、等温核酸増幅反応における測定対象の検出シグナルの補正に有益であることが示された。
【００５７】
（参考例１）
補正用核酸プローブの代わりに、インビトロジェン社製ＲＯＸリファレンスダイを用いた以外は、実施例１と同様の方法で試験して、蛍光強度変化率を求めた（図２）。また、ＲＯＸの非存在下（未補正）で同様の実験を行い、未補正の場合に得られた実験結果を、ＲＯＸにより補正した場合に得られた実験結果と比較した（図２）。
その結果、ＲＯＸ（非核酸分子）では、等温核酸増幅反応においてベースライン蛍光強度変化率を安定化できなかった（図２）。すなわち、ＲＯＸは、実験操作（例、反応液の調製のための試薬の分注操作）の精度管理におけるコントロールとしては有用であると考えられるが、等温核酸増幅反応における測定対象の検出シグナルの補正には必ずしも有用でないことが示された。
【００５８】
実施例２：補正用核酸プローブの長さについての検討
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−１（２４塩基）の代わりに、長さの異なる補正用核酸プローブ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−２：２７塩基、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−３：３０塩基、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−４：３３塩基、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−５：３６塩基、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−６：３９塩基、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ−７：４２塩基）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で試験して、蛍光強度変化率を求めた（図３〜８）。また、実施例１および参考例１の実験結果と併せて、本実施例の実験結果をまとめると、以下の表６、７のとおりであった。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
【表７】
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【００６１】
表６、７より、補正用核酸プローブ（核酸プローブであるＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓ−１〜８）は、ＲＯＸ（非核酸プローブ）に比し、ベースライン蛍光強度変化率の安定化（すなわち、等温核酸増幅反応における検出シグナルの補正）に優れることが確認された。また、補正用核酸プローブと検出用核酸プローブとの長さの差が３ヌクレオチド残基の範囲内である場合、補正用核酸プローブの効果が特に優れることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、等温核酸増幅反応による標的核酸の測定に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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