(57)【要約】【課題】本発明は、劣化耐性を有する表面親水性基材を提供することを目的とする。【解決手段】基材と、前記基材の表面に配置されるポリアルキレングリコールを含む親水性層とを備える表面親水性基材にγ線を照射する照射工程；及び照射工程においてγ線が照射された表面親水性基材を冷蔵する冷蔵工程；を行うことにより、劣化耐性を有する表面親水性基材を製造することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、前記基材の表面に配置されるポリアルキレングリコールを含む親水性層とを備える表面親水性基材にγ線を照射する照射工程；及び
照射工程においてγ線が照射された表面親水性基材を冷蔵する冷蔵工程；
を含む、劣化耐性を有する表面親水性基材の製造方法。
【請求項２】
照射工程において照射されるγ線の累積強度が１０ｋＧｙ以下である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、劣化耐性を有する表面親水性基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養を目的としたプラスチック製基材は滅菌を施して無菌状態にする必要がある。その方法としては、プラスチックが変形又は変性しない温度で処理が可能なγ線やエチレンオキサイドによる滅菌等が挙げられる。
【０００３】
しかし、エチレンオキサイドは細胞に毒性を与えることが知られているため、例えば医療機器に関しては残存濃度が非特許文献１で定められる基準値以下であることが要求される。そのため、製品出荷の際にはエチレンオキサイドの残存濃度を確認する必要がある。
【０００４】
一方、γ線は細胞へのダメージが少ないため、ポリスチレン製の細胞培養基材の滅菌に多く使用されている（例えば、特許文献１及び特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−６１６０９号公報
【特許文献２】特開２００７−１２４９８５号公報
【特許文献３】特願２０１１−１４３２５９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】医薬監第６９号  別添３
【非特許文献２】Ｒｅｖｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９号  ９８５５〜９８６２頁
【非特許文献３】Ｏｋｏｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２５号  ６９４７〜６９５３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞やタンパク質等の接着を抑制するための親水性高分子を基材表面に配置した製品にγ線を照射すると、基材表面近傍に存在する空気と反応して活性酸素が発生する。そして、活性酸素は親水性高分子を酸化させ、製品の品質を劣化させる。これを防止するために真空包装してγ線滅菌時の酸化反応を抑制するという方法が考えられるが、専用の機械が必要となるうえにコストや手間がかかる。更に、輸送の際に振動により基材が傷つきやすいという問題も生じる。
【０００８】
そこで、本発明は、親水性層が表面に配置された表面親水性基材の劣化を防止する簡便な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、少なくとも表面親水性基材にγ線を照射して滅菌した後、低温環境下に置いて冷蔵保存することにより、表面親水性基材の劣化を防止できることを見出した。更に、このようにして処理した表面親水性基材はその後室温においても劣化が防止され安定に保存できることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）基材と、前記基材の表面に配置されるポリアルキレングリコールを含む親水性層とを備える表面親水性基材にγ線を照射する照射工程；及び
照射工程においてγ線が照射された表面親水性基材を冷蔵する冷蔵工程；
を含む、劣化耐性を有する表面親水性基材の製造方法。
（２）照射工程において照射されるγ線の累積強度が１０ｋＧｙ以下である、（１）に記載の製造方法。
（３）ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、（１）又は（２）に記載の製造方法。
本発明は更に以下の発明も包含する。
（４）基材と、前記基材の表面に配置されるポリアルキレングリコールを含む親水性層とを備える表面親水性基材にγ線を照射する照射工程；及び
照射工程においてγ線が照射された表面親水性基材を冷蔵する冷蔵工程；
を含む、表面親水性基材の劣化防止方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、劣化しにくい安定な表面親水性基材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１及び比較例１における抗体吸着試験の結果を示す。
【図２】実施例２における抗体吸着試験の結果を示す。
【図３】実施例３における細胞培養試験の結果を示す。
【図４】比較例２における細胞培養試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜表面親水性基材＞
表面親水性基材は、ポリアルキレングリコールを含む親水性層が表面に配置された基材である。
基材の種類及び形状は特に限定されない。基材の種類として、例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等を挙げることができる。特に、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、又はポリプロピレン樹脂が好ましい。基材の表面には本発明の目的を妨げない限り任意の層を設けてもよいし、任意の処理を施してもよい。例えば、基材表面にオゾン処理、プラズマ処理、スパッタリング処理等の処理技術を用いて親水化を施すことができる。
【００１４】
基材の形状は、最終的な表面親水性基材の用途に応じた任意の形状とすることができる。例えば、管状、フィルム状、板状、筐体状とすることができる。具体的にはチューブ、カテーテル、スライド、プレート、マルチウェルプレート、シャーレ、フラスコ、ボトル、セルスタック等を挙げることができる。また、非多孔質、多孔質、織物、編物等いずれの形態であってもよい。
【００１５】
親水性層を配置する基材表面の部位は、基材表面の全体である必要はなく、基材表面の一部であってもよい。
【００１６】
親水性層は、アルキレングリコール単位：
−[Ｒ−Ｏ]−（Ｒはアルキレンを指す）
からなるポリアルキレングリコールを含む。
【００１７】
アルキレングリコール単位中のＲは、例えばエチレン又はプロピレンであることができ、好ましくはエチレンである。ポリアルキレングリコールは、繰り返し単位数（重合度＝ｍ）が好ましくは４以上、特に好ましくは９以上である。ポリアルキレングリコールの重合度ｍの上限は特に限定されないが、典型的には２３以下である。
【００１８】
ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである場合、ポリエチレングリコールの数平均分子量は３００以上であることが好ましい。ポリエチレングリコールの数平均分子量の上限は特に限定されないが、数平均分子量が大きくなるほど粘度が増して取扱いが難しいこと、及びポリエチレングリコールの高密度での配置が難しいことから、ポリエチレングリコールの数平均分子量は２５０００以下であることが好ましく、１００００以下であることがより好ましい。
【００１９】
基材表面に親水性層を配置する方法は特に限定されない。例えば、ポリアルキレングリコールを、シラノール等を含むプライマー層を介して、基材表面に間接的に結合させてもよいし、基材表面に結合可能な基をポリアルキレングリコールに導入して基材表面に直接結合させてもよい。また、特許文献３に記載の方法を使用してもよい。
親水性層はポリアルキレングリコール以外の親水性化合物を更に含んでいてもよい。
【００２０】
＜照射工程＞
照射工程ではγ線を照射することにより表面親水性基材を滅菌する。γ線は滅菌を達成することができる強度で照射すればよい。γ線の累積強度に特に限定はないが、親水性層へのダメージを抑えるためには１０ｋＧｙ以下であることが好ましい。一方、十分な滅菌を達成するためには１ｋＧｙ以上であることが好ましい。具体的には、１〜１０ｋＧｙであることが好ましく、３〜９ｋＧｙであることがより好ましく、５〜８ｋＧｙであることが特に好ましい。これらの累積強度に至るまでγ線を連続的に照射してもよいし、断続的に照射してもよい。
【００２１】
γ線は透過性が高いため、複数の表面親水性基材を積み重ねて一度に滅菌することができる。そのため、本発明の方法は、劣化耐性を有する表面親水性基材を大規模に製造することができる。
【００２２】
特に限定するものではないが、１〜２時間かけて上記の累積強度となるようにγ線を照射することが好ましい。このような時間をかけてγ線を照射することにより、複数の表面親水性基材を均一に処理することができ、一定の品質を保つことができる。
【００２３】
照射工程に先立って、表面親水性基材を包装材で包装してもよい。包装材の種類は特に限定されないが、微生物の透過を防止し、ガスを透過させるナイロンを使用することが好ましい。表面親水性基材を包装してからγ線滅菌することにより、滅菌後に包装して微生物が混入することを防止することができる。また、包装後に滅菌するため、無菌状態で包装を行う必要がなく、作業効率が向上する。
【００２４】
＜冷蔵工程＞
γ線を照射した表面親水性基材を室温で放置しておくと親水性層が劣化していくため、速やかに冷蔵保存することが好ましい。特に限定するものではないが、γ線照射後、１０分以内に冷蔵することが好ましい。
【００２５】
冷蔵保存する温度は、室温より低い温度であればよい。室温よりも低い温度で保存することにより、室温で保存した場合と比較して劣化が生じにくくなる。冷蔵保存する温度の下限は、親水性層に悪影響が生じない温度であればよい。親水性層に悪影響が生じる温度としては、例えば、親水性層が凍結する温度等を挙げることができる。このような温度は使用するポリアルキレングリコールの種類や分子量等によって変化する。
冷蔵保存する好ましい温度は１０℃以下、より好ましくは０〜８℃、特に好ましくは２〜６℃である。
【００２６】
冷蔵保存をわずかに行うだけでも、冷蔵保存をしない表面親水性基材と比較して、劣化が生じにくくなる。十分に劣化を防止するためには、好ましくは３〜１４日、より好ましくは４〜１０日、特に好ましくは５〜７日冷蔵保存する。
なお、上記冷蔵保存に適した低温環境下でγ線を照射し、そのまま所定時間保存してもよい。
【００２７】
γ線を照射した表面親水性基材を一度冷蔵保存すると、その後は常温で保存しても劣化を防止することができる。つまり、本発明は、冷蔵保存中においてのみ劣化が防止される表面親水性基材を提供するのではなく、常温でも劣化が防止される表面親水性基材を提供することができる。劣化耐性を有する本発明の表面親水性基材は、劣化することなく常温（２０℃±１５℃）で少なくとも１ヶ月間保存することができる。従って、本発明の表面親水性基材は一定の品質を長期間保つことができ、更に保管及び流通を容易にすることができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【００２９】
＜実施例１＞
基材としての９６穴丸底ポリスチレン製プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に親水性ポリマーとしてのポリエチレングリコール（関東化学社）をコーティングした製品を用いた。
【００３０】
上記コーティングは特許文献３に記載された方法に従った。以下その概略を記載する。１．８ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ社）に３５０μｌの希塩酸（ｐＨ２．４）を添加してシラノールを調製した。これを１００ｍｌの２−プロパノール（純正化学社）に入れた上で５００μｌのトリエチルアミン（和光純薬工業社）を添加した。このシラノール溶液を９６穴丸底プレートに１ウェル当たり１００μｌずつ分注した。コーティングを施す面を下にして室温で１３５分間放置した。その後、ウェル内を純水で洗浄した後に８０℃で１０分間乾燥させた。次に触媒量の濃硫酸を含んだポリエチレングリコール４００（数平均分子量３８０−４２０、関東化学社）を１ウェル当たり１００μｌずつ分注した後に８０℃で４５分間インキュベートした。純水で洗浄した後に８０℃で１０分間、乾燥させた。この操作によってポリシロキサンからなるプライマー層上にポリエチレングリコールを含む親水性ポリマー層が形成された。
【００３１】
ポリエチレングリコールをコーティングした基材をナイロン製の袋に包装したうえでγ線を５ｋＧｙ又は８ｋＧｙの強度で照射した。その後、４℃の冷蔵環境下で１週間保存し、サンプルを作成した。
【００３２】
＜比較例１＞
実施例１と同様にγ線滅菌した後、２０〜２３℃に保たれた室温環境下で１週間保存してサンプルを作成した。実施例１及び比較例１のサンプルについて以下の品質チェックを行った。
【００３３】
ポリエチレングリコール表面の品質をチェックする簡便な方法として抗体を用いたタンパク質吸着を測る方法が挙げられる。これはポリエチレングリコールが、非特許文献２及び３に記載されているとおり、タンパク質吸着を抑制する性質を保有しているためである。
【００３４】
以下その品質チェック法の概略を説明する。
リン酸緩衝液に溶解した１μｇ/ｍｌの西洋ワサビ由来ペルオキシターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ザイムド社）を５０μｌずつウェルに入れ、１晩、室温中でインキュベートした。翌日、体積比０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業社）を含むリン酸緩衝液で３回洗浄した後に、残存したペルオキシターゼをＳＡＴ−３（同仁化学社）により１０分間発色させた。反応は等量の０．５規定希硫酸により停止させた。その後、プレートリーダーにより４９４ｎｍ及び６２０ｎｍでの吸光度をそれぞれ測定し、前者から後者を引いた値をデータ値として取得した。
【００３５】
＜結果１＞
タンパク質の吸着が大きいほど上記データ値は大きくなり、表面コーティングが劣化していると考えられる。測定結果を図１に示す。この結果から、γ線滅菌後、１週間冷蔵保存したサンプルは品質がγ線滅菌を施していないコントロール品と同等の品質を保つことが判明した。一方、室温保存したサンプルは大きく劣化していることが判明した。
【００３６】
＜実施例２＞
実施例１と同様にγ線滅菌し、冷蔵環境下で３週間保存したサンプルを作成した。このサンプルを４０℃湿度９０％の環境下で１ヶ月間保存した後、実施例１及び比較例１と同様に抗体を用いた品質チェックを行った。
【００３７】
＜結果２＞
結果を図２に示す。保存により品質が劣化していないことが判明した。この結果は、作成したγ線滅菌サンプルが冷蔵処理後に常温で保存可能であることを示している。
【００３８】
＜実施例３＞
実施例１と同様に作製したポリエチレングリコールコーティングプレートをナイロン製の袋に大気中で梱包した物、及び真空中で梱包した物をそれぞれ作製した。その後、５ｋＧｙの強度でγ線を照射した後、実施例１と同様に１週間冷蔵環境下で保存し、サンプルを作成した。
【００３９】
＜比較例２＞
実施例１と同様に作製したポリエチレングリコールコーティングプレートを、実施例３と同様の方法でナイロン製の袋に入れ真空包装を行った。その後、５ｋＧｙの強度でγ線を照射した後、比較例１と同様に１週間室温で保存し、サンプルを作成した。
【００４０】
実施例３及び比較例２のサンプルを用い、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中に１ウェル当たり1×１０４個のＣＣＬ１６３細胞を播種した。３日間培養した後、細胞の様子を光学顕微鏡（オリンパス社）によって観察した。
【００４１】
ポリエチレングリコールコーティングの品質が正常に保たれていれば、細胞は接着せず、スフェロイド状に細胞が浮遊塊を形成する。
【００４２】
＜結果３＞
結果を図３及び図４に示す。真空梱包と大気梱包との間に明確な差は見られなかった。一方、比較例２のサンプルでは細胞接着が見られた。これは真空状態においても室温で保存するとポリエチレングリコールコーティングが劣化したことを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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