(57)【要約】【課題】所望の吸収波長及び蛍光波長が得られ、簡単な構成の顕微鏡システムで効率的に励起できて、蛍光を効率的に検出できる蛍光顕微鏡用発光ラベラを提供する。【解決手段】蛍光顕微鏡により観察する試料を染色する蛍光顕微鏡用発光ラベラ１であって、両極性化合物２と、両極性化合物２の疎水環境に内包された極性応答性色素分子３と、を有し、疎水環境は、極性応答性色素分子３の所定の吸収波長帯域及び蛍光波長帯域に対応する電場からなる。【選択図】図３
2013190318.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光顕微鏡により観察する試料を染色する蛍光顕微鏡用発光ラベラであって、
両極性化合物と、
前記両極性化合物の疎水環境に内包された極性応答性色素分子と、を有し、
前記疎水環境は、前記極性応答性色素分子の所定の吸収波長帯域及び蛍光波長帯域に対応する電場からなる、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記電場は、前記両極性化合物の疎水部を構成する分子鎖の長さ及び／又は親水部の電場強度よって調整されている、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記両極性化合物は、スフィンゴリン脂質又はグリセロリン脂質からなり、親水性の溶媒中で脂質２重膜を形成し、
前記極性応答性色素分子は、前記脂質２重膜の内部の疎水環境に内包されている、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項４】
請求項３に記載の蛍光顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記分子鎖はアルキル基であり、
前記極性応答性色素分子は、６‐（p‐トルイジニル）ナフタレン‐２‐スルホン酸、８‐アニリノナフタレン‐１‐スルホン酸、アラダン、エチジウムブロミド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ‐１、ヘキスト３３２５８、ＤＡＰＩ（４',６-diamidino-２-phenylindole）、ナイルレッド、ナイルブルー、３‐ＡＢＮ、３‐ＤＭＡＢＮ、Ｂｏｃ‐ＤＬ‐ＣＤＡＰＡ‐ＯＨ、のいずれかを含む、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡用発光ラベラ。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の蛍光顕微鏡用発光ラベラにおいて、
前記脂質２重膜はリポソーム構造を成し、
前記リポソーム構造の中空構造内に水溶性の化合物を封入してなる、
ことを特徴とする蛍光顕微鏡用発光ラベラ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡により観察する試料を染色するのに使用される蛍光顕微鏡用発光ラベラに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術及び電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
特に、最近では、生物用の蛍光顕微鏡のニーズが急速に高まっている。その理由は、生物試料内の生命現象を、１分子観察により高感度でその場で観察できることにある。特に、ライフサイエンスの研究開発の現場では、次々と発現する新たな生命現象の解明に迫られていることから、蛍光顕微鏡の高機能化の要求が高い。
【０００４】
蛍光顕微鏡用発光ラベラとしては、例えば特許文献１に記載のものが知られている。蛍光顕微鏡法においては、発光効率（蛍光収率）の高い色素分子により生物試料を染色し、その蛍光信号を画像化する。より具体的には、励起光（ポンプ光）により、基底状態（Ｓ０状態）の色素分子を第１電子励起状態（Ｓ１状態）に遷移させる。この分子は、ナノ秒オーダで蛍光緩和する。この時、Ｓ０状態からＳ１状態へ遷移させるポンプ光の波長帯域を、所謂、吸収波長にマッチさせると、微弱な強度で試料に光損傷を与えることなく、蛍光画像を顕微鏡観察することができる。
【０００５】
蛍光顕微鏡の形態としては、通常の蛍光画像を目視するタイプの他に、レーザ光を空間走査しながら試料に集光し、集光ポイント毎に試料からの蛍光信号を検出する。この蛍光信号は、数値データとして、一旦、時系列にメモリに格納されてから、制御コンピュータにより再配列されて、モニタ上に蛍光画像として表示される。
【０００６】
上記の蛍光顕微鏡の形態は、レーザ走査型顕微鏡と呼ばれている。レーザ走査型顕微鏡では、蛍光信号用の検出器の手前にピンホール、すなわち共焦点ピンホールを設置することで、試料内の限定した深さにおける蛍光信号のみを切り出して検出できる。すなわち、レーザ光の集光位置と共役な焦点位置にピンホール設置するものであり、これにより試料の３次元像を画像化することができる（例えば、特許文献２参照）。
【０００７】
また、超解像顕微鏡と称される回折限界を超える高い空間分解をもつレーザ走査型顕微鏡も開発されている（例えば、特許文献３参照）。図１０は、蛍光分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１励起状態Ｓ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２励起状態Ｓ２に励起されている様子を示している。なお、図１０は、Ｓ２状態からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【０００８】
図１０に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１１は、図１０と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【０００９】
図１１において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光が照射されたため、第１励起状態Ｓ１の分子のほとんどが即座に高位の第２励起状態Ｓ２に励起されて、第１励起状態Ｓ１の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなる。しかも、第２励起状態Ｓ２からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１０】
このような現象は、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１１】
ところが、図１１の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を、空間的に一部重ね合わせて蛍光領域を抑制するので、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を利用した超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１２】
特許文献３に開示の顕微鏡においては、中空状に整形されたイレース光をポンプ光と同軸に合成して観察試料に集光している。ここで、イレース光を中空状に整形する方法としては、例えば図１２や図１３に示すような、イレース光の位相差が光軸周りに２πで周回するような位相板を用いる位相空間変調が知られている。
【００１３】
図１２に示す位相板は、位相が連続的に変化するようにガラス基板を切削又はエッチングして形成される。図１３に示す位相板は、イレース光波長に対してλ／８ずつ位相を異ならせて光学多層膜を形成したり、あるいはガラス基板をエッチングしたりして形成される。このような位相板を通過したイレース光を集光すると、光軸上で電場が相殺された中空状のイレース光が生成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２００３−５３３４４６号公報
【特許文献２】特開２００５−２４６４２号公報
【特許文献３】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ところで、蛍光顕微鏡においては、色素分子の吸収及び発光特性が顕微鏡機能やシステムに大きな影響を与える。試料によっては、自家蛍光と分離するために、自家蛍光と波長領域で重ならない蛍光波長帯域を有する色素分子を選定する必要がある。また、更なる高度な要求として、特定の生体分子のみ選択的に吸着するような色素分子を選定する必要がある。
【００１６】
色素分子は、分子構造特有の吸収及び蛍光の波長帯域を有しており、一般に、それらを人為的には調整することができない。したがって、色素分子に応じて、ポンプ光波長や検出系の分光フィルタの特性を合わせる必要があった。しかも、量子化学によれば吸収及び蛍光の波長帯域は不連続である。そのため、特に、レーザ走査型顕微鏡においては、好ましくない状況を作り出すことになる。つまり、レーザ光源は、近年、メンテナンスフリーの様々なタイプにものが市販されているが、発振波長はそれぞれにおいて原理的に単色で、調整できない。そのため、色素分子を効率的に励起できない。
【００１７】
なお、Ｔｉ：サファイアレーザ等の波長可変のレーザ光源も存在するが、波長可変のレーザ光源は、極めて高価で、かつ操作及び保守管理が非常に難しい。また、波長可変のレーザ光源を使用したとしても、その発振波長及び色素分子の蛍光波長に応じて、検出系の分光フィルタ等を選択しなければならないため、顕微鏡システムの構成が複雑になる。
【００１８】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、所望の吸収波長及び蛍光波長が得られ、簡単な構成の顕微鏡システムで効率的に励起できて、蛍光を効率的に検出できる蛍光顕微鏡用発光ラベラを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的を達成する本発明に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラは、
両極性化合物と、
前記両極性化合物の疎水環境に内包された極性応答性色素分子と、を有し、
前記疎水環境は、前記極性応答性色素分子の所定の吸収波長帯域及び蛍光波長帯域に対応する電場からなる、
ことを特徴とするものである。
【００２０】
前記電場は、前記両極性化合物の疎水部を構成する分子鎖の長さ及び／又は親水部の電場強度よって調整されている、
ことを特徴とする。
【００２１】
前記両極性化合物は、スフィンゴリン脂質又はグリセロリン脂質からなり、親水性の溶媒中で脂質２重膜を形成し、
前記極性応答性色素分子は、前記脂質２重膜の内部の疎水環境に内包されている、
ことを特徴とする。
【００２２】
前記分子鎖はアルキル基であり、
前記極性応答性色素分子は、６‐（p‐トルイジニル）ナフタレン‐２‐スルホン酸、８‐アニリノナフタレン‐１‐スルホン酸、アラダン、エチジウムブロミド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ‐１、ヘキスト３３２５８、ＤＡＰＩ（４',６-diamidino-２-phenylindole）、ナイルレッド、ナイルブルー、３‐ＡＢＮ、３‐ＤＭＡＢＮ、Ｂｏｃ‐ＤＬ‐ＣＤＡＰＡ‐ＯＨ、のいずれかを含む、
ことを特徴とする。
【００２３】
前記脂質２重膜はリポソーム構造を成し、
前記リポソーム構造の中空構造内に水溶性の化合物を封入してなる、
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、所望の蛍光及び吸収波長が得られ、簡単な構成の顕微鏡システムで効率的に励起できて、蛍光を効率的に検出できる蛍光顕微鏡用発光ラベラが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】環境応答性分子の励起構造変化の過程を示す図である。
【図２】図１の環境応答性分子の蛍光発光を説明するためのエネルギーダイヤグラムである。
【図３】第１実施の形態に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラの構成を模式的に示す断面図である。
【図４】図３のリン脂質２重膜を構成するリン脂質分子を示す模式図である。
【図５】溶媒の極性の強さ応じたナイルレッドの吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの変化を示す図である。
【図６】図３の蛍光顕微鏡用発光ラベラの製造方法の一例を示す順次の工程図である。
【図７】第２実施の形態に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラの構成を模式的に示す断面図である。
【図８】蛍光顕微鏡の一例の構成を示す模式図である。
【図９】ミセルの脂質膜を模式的に示す図である。
【図１０】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１１】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１２】超解像顕微鏡に使用される位相板の一例を示す拡大平面図である。
【図１３】超解像顕微鏡に使用される位相板の他の例を示す拡大平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
先ず、本発明の実施の形態の説明に先立って、本発明に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラの原理について説明する。
【００２７】
蛍光色素分子には、溶媒との相互作用により、全く別の分子構造を持つものに変化するものが存在する。その中で、代表的なものが環境応答性分子である。図１は、環境応答性分子の励起構造変化の過程を示す図であり、図２は、環境応答性分子の蛍光発光を説明するためのエネルギーダイヤグラムである。環境応答性分子は、ポンプ光によりＳ０状態からＳ１状態に励起されると、外界に存在する溶媒中の分子と衝突を繰り返す。その際、水分子のように極性をもつ分子が衝突すると、クーロン相互作用により色素分子の電子が更に励起されて、すなわち溶媒緩和されて、別の分子構造もつように分子軌道が再編成される。
【００２８】
その結果、分子の構成元素は同じであっても、価電子軌道が変化して、光学特性が変化する。すなわち、Ｓ１状態の分子よりもエネルギー準位の低い別の電子構造をもつ分子のＳ’1状態に変化する。そして、Ｓ’1状態から、同じく別の電子構造をもつ分子の基底状態Ｓ’０状態に緩和する。その際、蛍光を出すが、この場合の蛍光は、元の分子構造を持つ分子が出すＳ１状態からＳ０状態へ緩和する場合の蛍光よりも波長が長くなる。この現象は、溶媒分子の極性が強いほど、長波長側にシフトする性質がある。
【００２９】
このような分子は、極性応答性色素分子と呼ばれる。この分子は、トルエンなど非極性中分子の溶媒中ではクーロン相互作用が働かないため、Ｓ１状態より別の電子構造をもつ分子のＳ’1状態に変化せず、Ｓ１状態からＳ０状態への緩和に伴う短波長の蛍光を出す。極性応答性色素分子は、生物用蛍光顕微鏡における試料染色材料として用いられる。
【００３０】
一般に、極性応答性色素分子は、電子供与部位と電子吸引部位をもつ。すなわち、単一の分子内において、電子密度がリッチな化学基（電子供与部位）と電子密度が疎の化学基（電子吸引部位）をもっている。このような分子は、外的な電場の摂動により分子内の電子構造を変える。すなわち、電子供与部位に存在する電子が電子吸引部位に移行する。同時に、分子構造を変化させ、光学的特性も変化する。一般に、電子供与部位に存在する電子が電子吸引部位に移行する場合、各分子軌道のエネルギー準位が低くなるため、蛍光波長が長くなる。極性応答性色素分子は、多くの場合、極性溶媒中に置かれると、その電場により構造変化を起こす。
【００３１】
このように、極性応答性色素分子は、存在する周辺環境の電場の影響を敏感に受けるため、生物試料内おける環境センサとしても機能する。例えば、脂肪細胞のように極性の弱い試料を染色した場合は、短波長で強度の強い蛍光が出る。しかし、極性分子が近くに存在すると、Ｓ１状態からＳ’1状態への分子構造の変性が起こり、蛍光波長が赤色方向に変位する。したがって、この性質を利用すれば、生物試料内の部位の特定や化学状態の分析に利用できる。また、逆に、この性質を利用すれば、人為的に吸収及び蛍光の波長帯域を調整できる蛍光顕微鏡用ラベラを提案できる。
【００３２】
そこで、本発明の一実施の形態においては、極性応答性色素分子を脂質２重膜の内部に内抱させ、かつ、内抱空間の電場を人為的に調整することで、極性応答性色素分子の吸収及び蛍光の波長帯域を微調整して、所望の吸収及び蛍光の波長帯域を有する蛍光顕微鏡用ラベラを得る。
【００３３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００３４】
（第１実施の形態）
図３は、第１実施の形態に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラの構成を模式的に示す断面図である。この蛍光顕微鏡用発光ラベラ１は、両極性化合物であるリポソーム構造のリン脂質２重膜２と、リン脂質２重膜２の疎水基側の疎水環境に内包された極性応答性色素分子３とを備える。つまり、蛍光顕微鏡用発光ラベラ１は、リン脂質２重膜２内の疎水環境に、極性応答性色素分子３を閉じ込めたリポソーム構造からなる。リン脂質２重膜２は、例えばスフィンゴリン脂質又はグリセロリン脂質からなる。
【００３５】
図３の蛍光顕微鏡用発光ラベラ１は、最小で直径２０ｎｍと、顕微鏡対物レンズの回折限界よりも十分小さくできるので、高空間分解能に対応できる。しかも、多量の極性応答性色素分子３を膜内に抱合できるので、極めて明るいラベラとして機能させることが可能となる。
【００３６】
図４は、図３の脂質２重膜２を構成するリン脂質分子を示す模式図である。リン脂質分子１１は、親水部であるリン酸部１１ａと、リン酸部１１ａから伸びる疎水部であるアルキル基部１１ｂとからなる。リン酸部１１ａは、強い極性を有し、水等の極性分子をひきつける。アルキル基部１１ｂは、長鎖分子であり、様々な長さのアルキル基（アルキル鎖）を有するように分子設計することが可能である。アルキル基部１１ｂは、無極性であるため、極性分子である溶媒とは親和しない。
【００３７】
リン脂質分子１１は、親水性の溶媒中で拡散されると、２重膜を形成しつつ、リポソーム構造を自己形成する（図３）。リポソーム構造では、２重膜のアルキル鎖が対向した閉鎖空間が疎水ポケットとなる。しかし、完全な疎水性では、リン酸部１１ａや外界の極性溶媒の電場の影響を受ける。その程度は、アルキル基部１１ｂのアルキル鎖の長さに強く依存する。
【００３８】
アルキル鎖は、一般に偶数倍で側鎖を伸ばしていくに従って、疎水部と外界及び親水部との距離が離れて電場の影響が弱まり、疎水性が高まる。しかし、アルキル鎖の数が２程度の場合は、外界及び親水部と接近して電界の影響を強く受け、実質上、疎水性が失われる。
【００３９】
本実施の形態に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラ１は、リン脂質分子１１の上記の特性に着目して、極性応答性色素分子３の分光特性を制御する。つまり、極性応答性色素分子３を上記の疎水ポケットに入り込ませる。極性応答性色素分子３は、基本的に疎水性の分子であるので、上記の疎水ポケットに容易に入り込ませることができる。また、リン脂質分子１１は、極性応答性色素分子３が所望の吸収波長及び蛍光波長となる電界強度を受けるように、アルキル鎖の長さを決定しておく。これにより、極性応答性色素分子３の分光特性を決定することができる。
【００４０】
例えば、極性応答性色素分子３がナイルレッドの場合は、溶媒の極性の強さ応じて、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを、図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、著しく変化させることができる。なお、図５（ａ）の吸収スペクトル及び図５（ｂ）の蛍光スペクトルの強度は、それぞれ正規化して示している。また、図５（ａ）及び（ｂ）において、特性Ｉは溶媒がジエチルエーテルの場合、特性IIは溶媒がエチルエーテルの場合、特性IIIは溶媒がアセトニトリルの場合、特性IVは溶媒がホルムアミドの場合をそれぞれ示し、特性Iから特性IVに向けて溶媒の極性が強くなっている。
【００４１】
図５（ａ）及び（ｂ）から明らかなように、溶媒が無極性のジエチルエーテル媒質中では、最大吸収波長が５０６ｎｍ、最大蛍光波長が５６１ｎｍとなる。これに対し、極性が強いホルムアミド溶媒中では、最大吸収波長が５７３ｎｍ、最大蛍光波長が６３７ｎｍと大きく長波長側にシフトする。
【００４２】
このことは、リン脂質分子１１のアルキル鎖の長さを調整して、ナイルレッドを疎水領域に封入すれば、ナイルレッドからの蛍光を、少なくとも、５６１ｎｍ〜６３７ｎｍの波長範囲で制御できることになる。すなわち、色素が存在する電場環境を制御することで、黄色から赤い蛍光色を選択することをできる。それに応じて、吸収スペクトルを５０６ｎｍ〜５７３ｎｍまで調整することができる。より具体的には、例えば、極性の強い水溶液中で、アルキル鎖の長さが調整されたリン脂質２重層の疎水環境にナイルレッドを内包させる。
【００４３】
例えば、アルキル鎖を最短の２とすれば、ナイルレッドは、ほぼ極性溶媒中と同じ分光特性を示し、６３０ｎｍ前後の赤い蛍光を発する。また、アルキル鎖を２０程度にすれば、殆ど疎水環境となるため、５６０ｎｍ前後の黄色い蛍光を発する。また、最大吸収波長も、５０６ｎｍと短波長になる。
【００４４】
このように、吸収波長がシフトすると、励起光源として、安価で簡便に入手し易いＮｄ:ＹＡＧレーザ（発振波長１０６４ｎｍ）、Ａｒレーザ（発振波長４８８ｎｍ）、Ｈｅ−Ｎｅレーザ（発振波長５４３ｎｍ）を用いて、ナイルレッドを高い吸収効率で励起することができる。なお、Ｎｄ:ＹＡＧレーザを用いる場合は、その２倍波（波長５３２ｎｍ）を励起光として用いる。つまり、レーザ光源の波長に色素分子の分光特性を合わせ込むことができる。
【００４５】
図６（ａ）〜（ｈ）は、図３に示した蛍光顕微鏡用発光ラベラ１の製造方法の一例を示す順次の工程図である。この製造方法は、逆相蒸発法と呼ばれるものである。先ず、図６（ａ）に示すように、所望の吸収及び蛍光の波長帯域が得られるように、アルキル鎖の長さが調整されたリン脂質分子１１を、ジエチルエーテル１２（重量０．５％）に溶解させる。次に、図６（ｂ）に示すように、無極性溶媒として、例えば、トルエン１３を混入する。すると、極性溶媒のジエチルエーテル１２の層と無極性溶媒のトルエン１３の層とに分離する。その結果、溶解したリン脂質分子１１は、リン酸部１１ａをジエチルエーテル１２側に、アルキル基部１１ｂをトルエン１３側に向けて平面展開する。
【００４６】
その後、図６（ｃ）に示すように、界面層１４が形成されたのち、極性応答性色素分子３として、例えばナイルレッドをトルエン１３側に溶解させる。この際、例えば、１ｍｇ/ｍｌの濃度で、極性応答性色素分子３を溶解させる。更に、ＨＥＰＥＳ緩衝液(ｐＨ７．２)を加える。これにより、極性応答性色素分子３は、図６（ｄ）に示すように、リン脂質分子１１のアルキル基部１１ｂに吸着して、安定に固着される。次に、約１時間の超音波により界面層１４を切断して、図６（ｅ）に示すように、エマルジョン１５を形成する。その後、ジエチルエーテル１２を留除して、図６（ｆ）に示すように、エマルジョン１５を集合させる。次に、渦を与えて拡散する。これにより、図６（ｇ）に示すように、一部のエマルジョンのリン脂質分子１１の相が逆転して、リン脂質２重膜が形成され始め、極性応答性色素分子３が無極性の脂質２重膜２の内側に封入される。
【００４７】
その後、最後工程として、減圧下でジエチルエーテル１２を完全に留除して、図６（ｈ）に示すように、極性応答性色素分子３が脂質２重膜２の内側の閉じ込められたリポソーム構造の蛍光顕微鏡用発光ラベラ１を形成する。これにより、直径２０ｎｍ〜２００ｎｍの粒径分布をもつリポソームが得られる。これらを、遠心分離機やろ過膜を通すことで、求めるサイズのリポソームが分別でき、回折限界サイズ以下の所望の径を有し、かつ所望の吸収波長及び蛍光波長を有する蛍光顕微鏡用発光ラベラ１が得られる。
【００４８】
（第２実施の形態）
図７は、第２実施の形態に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラの構成を模式的に示す断面図である。この蛍光顕微鏡用発光ラベラ２１は、図３に示した蛍光顕微鏡用発光ラベラ１において、リポソーム構造の中空部に水溶性の化合物である所定の薬剤２２を封入してなるものである。したがって、図３に示した構成要素と同一構成要素には、同一参照符号を付して説明を省略する。
【００４９】
図７の蛍光顕微鏡用発光ラベラ２１は、近年注目されているドラッグデリバリー技術により、所定の部位に薬剤２２を輸送し、蛍光顕微鏡により薬剤２２の代謝移動を観察して薬剤反応を解析するのに使用可能である。薬剤２２としては、神経伝達物質であるアセチルコリン、局所麻酔薬であるプロカイン等が封入される。
【００５０】
ここで、デリバリー媒体であるリポソームに、極性応答性色素分子３としてナイルレッドを内包させる場合は、リポソームを構成するリン脂質分子のアルキル鎖を長くして、脂質２重膜２の内部を強い疎水性とすれば、蛍光波長及び吸収波長を短波長側にシフトさせることができる。すなわち、吸収波長帯域を５５０ｎｍより短波長側にでき、蛍光波長帯域を６００ｎｍより短波長側にできる。これにより、血液中のリポソームの輸送を蛍光顕微鏡で確実に追跡することが可能となる。
【００５１】
すなわち、一般に、ドラッグデリバリー技術においては、血流により薬剤を伝達する。しかし、血液中には、ヘモグロビンが存在する。ヘモグロビンは、吸収波長帯域が６００ｎｍより長波長側であり、自蛍光波長帯域は７００ｎｍより長波長側である。したがって、蛍光顕微鏡用発光ラベラ２１を上記のように構成すれば、ヘモグロビンの自家蛍光とは干渉せず、血液中のリポソームの輸送を蛍光顕微鏡で正確に追跡することが可能となる。
【００５２】
また、薬剤２２に関しては、照明光の波長を吸収して化学組成が変化し、薬剤機能が失われる場合が懸念される。しかし、アルキル鎖の長さを調整することで、薬剤２２に対して光損傷を与えない吸収波長帯域に、ナイルレッドの分光学的特性を調整することが可能となる。
【００５３】
次に、上述した本発明に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラによって染色された試料を観察する蛍光顕微鏡について説明する。
【００５４】
図８は、蛍光顕微鏡の一例の構成を示す模式図である。この蛍光顕微鏡は、レーザ走査型顕微鏡からなるもので、第１のレーザ光源１０１及び第２のレーザ光源１０２を備える。第１のレーザ光源１０１は、例えばＡｒレーザ（発振波長４８８ｎｍ）からなり、第２のレーザ光源１０２は、例えば半導体レーザ（発振波長５６８ｎｍ）からなる。第１のレーザ光源１０１及び第２のレーザ光源１０２は、必要に応じていずれか一方が切り換えて使用される。これら第１のレーザ光源１０１及び第２のレーザ光源１０２の光軸は、ダイクロイックプリズム１０３により同軸に結合される。
【００５５】
そして、第１のレーザ光源１０１又は第２のレーザ光源１０２から射出されたレーザ光（励起光）は、ダイクロイックプリズム１０３、ダイクロイックフィルタ１０４、二次元走査用のガルバノミラー１０５，１０６及び瞳投影レンズ１０７を経て、対物レンズ１０８により試料ステージ１０９上の試料１１０に集光される。試料１１０は、例えば図３又は図７に示したようなナイルレッドを内包した蛍光顕微鏡用発光ラベラによって染色されている。蛍光顕微鏡用発光ラベラは、励起光の照射によりナイルレッドが励起されて蛍光を発生する。
【００５６】
試料１１０から発生した蛍光は、入射レーザ光と逆の光路を辿り、ダイクロイックフィルタ１０４により励起光と分離されて、集光レンズ１１１、共焦点ピンホール１１２及び分光フィルタ１１３を経て光電子増倍管１１４で検出される。
【００５７】
ここで、第１のレーザ光源１０１及び第２のレーザ光源１０２は、試料１１０に導入された蛍光顕微鏡用発光ラベラに応じて、いずれか一方が選択される。すなわち、蛍光顕微鏡用発光ラベラは、上述したように、リン脂質分子のアルキル鎖が２の場合、極性環境に近くなって、ナイルレッドの吸収波長帯域が長波長側にシフトする。したがって、この場合は、発振波長５６８ｎｍの半導体レーザからなる第２のレーザ光源１０２が使用される。これにより、試料１１０内の蛍光顕微鏡用発光ラベラを効率的に励起できる。
【００５８】
また、リン脂質分子のアルキル鎖が２０程度の場合、ナイルレッドは疎水環境におかれることになって、吸収波長帯域が短波長側にシフトする。したがって、この場合は、発振波長４８８ｎｍのＡｒレーザからなる第１のレーザ光源１０１が使用される。これにより、試料１１０内の蛍光顕微鏡用発光ラベラを効率的に励起できる。なお、ダイクロイックフィルタ１０４や分光フィルタ１１３は、検出する蛍光波長等に応じて所要の分光特性を有するものに交換するようにしてもよい。
【００５９】
このように、本発明に係る蛍光顕微鏡用発光ラベラによって染色された試料１１０を蛍光観察する場合は、光源の波長と蛍光顕微鏡用発光ラベラの色素分子の波長とを最適化することができる。したがって、試料１１０を、光損傷することなく効率的に励起して、その蛍光像を観察することができる。特に、試料１１０が図７に示した構成の蛍光顕微鏡用発光ラベラによって染色された場合は、ドラックデリバリー及び代謝経路の追及に効果を発揮することができる。
【００６０】
なお、試料１１０は、特許文献３に開示されているような超解像蛍光顕微鏡により観察することも可能である。この場合は、ポンプ光及びイレース光の波長と蛍光顕微鏡用発光ラベラの色素分子の波長とを最適化することにより、蛍光顕微鏡用発光ラベラを回折限界よりも十分小さくできることと相俟って、超解像機能を最大限効果的に誘導することが可能となる。
【００６１】
本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、極性応答性色素分子を内包する両極性化合物の電場は、溶媒や親水部に結合する極性分子により親水部の電場強度を調整したり、あるいは、親水部の電場強度及び疎水部の分子鎖の長さの双方を調整したりして、所定の吸収波長帯域及び蛍光波長帯域が得られるように構成してもよい。
【００６２】
また、両極性化合物は、リポソーム構造に限らず、ミセル構造とすることもできる。ミセル構造の場合、例えば図９に模式図を示すように、リン脂質分子１１は、水溶液中で親水部１１ａが外側を向き、疎水部（無極性部）１１ｂが内側に向く１重の粒径構造をとる。この場合、内側に無極性領域が形成されるので、この領域に極性応答性色素分子を封入する。ミセルの場合、リポソームのようにドラックデリバリー手段として用いることはできないが、リポソームよりも小さい粒径にできるので、高解像度用の発光ラベラとしてより効果的である。また、この場合は、例えば、親水基側にタンパクやリンカー分子を修飾することにより、生体内の特定の部位に展開される蛍光ラベラ分子を得ることが可能となる。
【００６３】
また、ミセルは、人工のものを含め界面活性剤を利用することもできる。界面活性剤は、親水性部分がイオン性（カチオン性・アニオン性・双性）のものと、非イオン性（ノニオン性）のものとに大別される。また、低分子系と高分子系とに分類されることもある。
【００６４】
さらに、極性応答性色素分子は、ナイルレッドの他に、蛍光収率の高いものを用いることができる。例えば、６‐（p‐トルイジニル）ナフタレン‐２‐スルホン酸、８‐アニリノナフタレン‐１‐スルホン酸、アラダン、エチジウムブロミド、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ‐１、ヘキスト３３２５８、ＤＡＰＩ（４',６-diamidino-２-phenylindole）、ナイルブルー、３‐ＡＢＮ、３‐ＤＭＡＢＮ、Ｂｏｃ‐ＤＬ‐ＣＤＡＰＡ‐ＯＨ、なども利用できる。
【符号の説明】
【００６５】
１，２１  蛍光顕微鏡用発光ラベラ
２  リン脂質２重膜
３  極性応答性色素分子
１１  リン脂質分子（両極性化合物）
１１ａ  リン酸部（親水部）
１１ｂ  アルキル基部（疎水部）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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