(57)【要約】      （修正有）【課題】播種前の種子や苗からのイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌を、多数の検体であっても高感度・高特異的に高精度で検出でき、検出標的ＤＮＡ部位に応じて確実に検知し同時に検出して判別できるイネの細菌病菌由来ＤＮＡ配列検出用のプローブによる検出チップの提供。【解決手段】イネの細菌病菌の検出チップは、特定な配列からなる塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有してイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌とを検出するプローブが、基材上に固定されている検出チップ。【選択図】図１
2013153706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記［塩基配列１〜９］
ctcctttctcgagcttattccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列１］
cggaacacctgggtagtctctgtagggaagggggcat             ・・・［塩基配列２］
tgacaaacgttcagggatgctgagcagttgtcat                ・・・［塩基配列３］
taacaatctggaagaagtagtaaagtggatagcg                ・・・［塩基配列４］
ctcctttctcgagctaataccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列５］
cggaaacctgagacgtctctgtacatgggggcat                ・・・［塩基配列６］
taaagaaggcttggaccaaggttgcttggtgccgaggtttccttat    ・・・［塩基配列７］
tcagaggataagtcagaagtagcacttatcggct                ・・・［塩基配列８］
taacaatctagaagaagtagtaatttggatagcg                ・・・［塩基配列９］
の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出するプローブが、基材上に固定されていることを特徴とするイネの細菌病菌の検出チップ。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列が、前記［塩基配列１、４、５、８及び９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基配列を有するものであって前記イネもみ枯細菌病菌と前記イネ苗立枯細菌病菌との両方を検出するものであり、又は
前記ＤＮＡ配列が、前記［塩基配列２及び３］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基配列を有するものであって前記イネもみ枯細菌病菌を検出するものであり、又は
前記ＤＮＡ配列が、前記［塩基配列６及び７］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基配列を有するものであって前記イネ苗立枯細菌病菌を検出するものであることを特徴とする請求項１に記載のイネの細菌病菌の検出チップ。
【請求項３】
前記ＤＮＡ配列が、５’末端にアミノ標識されたオリゴＤＮＡ配列であることを特徴する請求項１〜２の何れかに記載のイネの細菌病菌の検出チップ。
【請求項４】
イネの検体の検出標的ＤＮＡ配列が、蛍光標識及び／又はビオチン標識されていることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のイネの細菌病菌の検出チップ。
【請求項５】
前記プローブが、前記基材にスポットされて前記固定がされていることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のイネの細菌病菌の検出チップ。
【請求項６】
前記基材が、ガラスチップ、プラスチックチップ、又はナイロンメンブレンチップであることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のイネの細菌病菌の検出チップ。
【請求項７】
前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなる前記ＤＮＡ配列を含有する前記プローブの異なる複数が、基材上に固定されていることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のイネの細菌病菌の検出チップ。
【請求項８】
下記［塩基配列１〜９］
ctcctttctcgagcttattccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列１］
cggaacacctgggtagtctctgtagggaagggggcat             ・・・［塩基配列２］
tgacaaacgttcagggatgctgagcagttgtcat                ・・・［塩基配列３］
taacaatctggaagaagtagtaaagtggatagcg                ・・・［塩基配列４］
ctcctttctcgagctaataccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列５］
cggaaacctgagacgtctctgtacatgggggcat                ・・・［塩基配列６］
taaagaaggcttggaccaaggttgcttggtgccgaggtttccttat    ・・・［塩基配列７］
tcagaggataagtcagaagtagcacttatcggct                ・・・［塩基配列８］
taacaatctagaagaagtagtaatttggatagcg                ・・・［塩基配列９］
の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出するプローブが、基材上に固定されているこれらイネの細菌病菌の検出チップに、イネの検体を載せ、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、検出することにより、前記イネの細菌病菌を同定することを特徴とするイネの細菌病菌の検出方法。
【請求項９】
イネの検体の検出標的ＤＮＡ配列が蛍光標識されており、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、その蛍光標識による蛍光部位の視認及び／又は蛍光波長の相違の検知により、検出することを特徴とする請求項８に記載のイネの細菌病菌の検出方法。
【請求項１０】
イネの検体の検出標的ＤＮＡ配列がビオチン標識されており、イネの検体の検出標的ＤＮＡ配列がビオチン標識されており、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、そのビオチン標識に反応する酵素反応に応じた発色により、検出することを特徴とする請求項８に記載のイネの細菌病菌の検出方法。
【請求項１１】
前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなる前記ＤＮＡ配列を含有する前記プローブの異なる複数が、基材上に固定されていることによって、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、検出することを特徴とする請求項８〜１０の何れかに記載のイネの細菌病菌の検出方法。
【請求項１２】
下記［塩基配列１〜９］
ctcctttctcgagcttattccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列１］
cggaacacctgggtagtctctgtagggaagggggcat             ・・・［塩基配列２］
tgacaaacgttcagggatgctgagcagttgtcat                ・・・［塩基配列３］
taacaatctggaagaagtagtaaagtggatagcg                ・・・［塩基配列４］
ctcctttctcgagctaataccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列５］
cggaaacctgagacgtctctgtacatgggggcat                ・・・［塩基配列６］
taaagaaggcttggaccaaggttgcttggtgccgaggtttccttat    ・・・［塩基配列７］
tcagaggataagtcagaagtagcacttatcggct                ・・・［塩基配列８］
taacaatctagaagaagtagtaatttggatagcg                ・・・［塩基配列９］
の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出することを特徴とするイネの細菌病菌の検出プローブ。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ配列が、５’末端にアミノ標識されたオリゴＤＮＡ配列であることを特徴する請求項１２に記載のイネの細菌病菌の検出プローブ。
【請求項１４】
下記［塩基配列１〜９］
ctcctttctcgagcttattccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列１］
cggaacacctgggtagtctctgtagggaagggggcat             ・・・［塩基配列２］
tgacaaacgttcagggatgctgagcagttgtcat                ・・・［塩基配列３］
taacaatctggaagaagtagtaaagtggatagcg                ・・・［塩基配列４］
ctcctttctcgagctaataccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列５］
cggaaacctgagacgtctctgtacatgggggcat                ・・・［塩基配列６］
taaagaaggcttggaccaaggttgcttggtgccgaggtttccttat    ・・・［塩基配列７］
tcagaggataagtcagaagtagcacttatcggct                ・・・［塩基配列８］
taacaatctagaagaagtagtaatttggatagcg                ・・・［塩基配列９］
の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるもので、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかに結合することを特徴とするＤＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イネもみ枯細菌病菌（Burkholderia glumae）とイネ苗立枯細菌病菌（Burkholderia plantarii）とを検出するためのもので、それらイネの細菌病菌由来ＤＮＡ配列検出用のプローブを利用した検出チップ、及びそれを用いた検出方法である。
【背景技術】
【０００２】
イネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌は何れも、イネの育苗期に全国的に発生する種子伝染性の細菌病菌であり、好気性の桿菌である。イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との両細菌病菌は、特に育苗時に発生し、苗の褐編や腐敗や枯死の症状を引き起こし、苗供給の重大な障害を生じさせている。これら両方のイネの細菌病菌は、１９７０年代に普及した機械移植栽培及びそれに伴う箱育苗が流行の原因と言われており、現在でも日本における水稲の主要な伝染病として挙げられている。
【０００３】
これら両方のイネの細菌病菌を始めとする様々な細菌病菌の同定法や検出法が、これまでに研究、開発されてきた。その検出法として、選択培地や識別培地を用いた培養による方法、血清学的性質を利用した方法、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：Polymerase chain amplification reaction）法などがある。比較的新しい方法としてはマルチプレックスＰＣＲ法や、ＬＡＭＰ（ループ形成等温増幅：Loop-Mediated Isothermal Amplification）法がある。
【０００４】
このような検出法のうち、これら両方のイネの細菌病菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の配列における配列一部を利用する方法としては、例えば非特許文献１に、ＰＣＲ法が開示され、特許文献１にＬＡＭＰ法が開示されている。
【０００５】
従来のＰＣＲ法やＬＡＭＰ法は、同一チップ上でプローブスポット箇所の仕方や使用するプローブ種を選択することで複数サンプルを同時に検出するような大量処理不能なものであり、選択的培地培養による方法は、判定まで数日を要するものであり、血清学的性質を用いた方法は、哺乳動物にこれらイネの細菌病菌の抗血清を産生させ抗原抗体反応を観察する面倒なものである。何れの方法も、迅速性・大量処理能力性・簡便性・経済性等の観点から、生産ラインでのこれら両方のイネの細菌病菌の検出に不向きである。
【０００６】
食の安全・採算性の観点から、日本人の主食となるコメを減農薬・無農薬で生育することが望まれる。しかし現状ではこれら両方のイネの細菌病菌を生産現場で検知して取り除くことが事実上出来ないことから、これら両方のイネの細菌病菌の防除対策として、已むを得ず全育苗箱に農薬による種子消毒が行われている。
【０００７】
種子消毒を行わずとも、これらイネの細菌病菌を、同時に直接、検出したり判別したりして細菌病菌感染の種子や苗を迅速に選別するのに適している簡易で大量処理可能なＤＮＡチップを使用したイネの細菌病菌の検出法は、未だに無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本植物病理学会報、第６３巻、ｐ.４５５−４６２、１９９７年
【０００９】
【特許文献１】特開２００８−２２０２２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、播種前の種子や苗からのイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌を、多数の検体であっても高感度・高特異的に高精度で検出でき、さらにこれら両方のイネの細菌病菌を、それらの検出標的ＤＮＡ部位に応じて確実に検知し同時に検出して判別できるイネの細菌病菌由来ＤＮＡ配列検出用のプローブによる検出チップ、及びそれを用いた検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載のイネの細菌病菌の検出チップは、下記［塩基配列１〜９］
ctcctttctcgagcttattccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列１］
cggaacacctgggtagtctctgtagggaagggggcat             ・・・［塩基配列２］
tgacaaacgttcagggatgctgagcagttgtcat                ・・・［塩基配列３］
taacaatctggaagaagtagtaaagtggatagcg                ・・・［塩基配列４］
ctcctttctcgagctaataccgcatacattgagc                ・・・［塩基配列５］
cggaaacctgagacgtctctgtacatgggggcat                ・・・［塩基配列６］
taaagaaggcttggaccaaggttgcttggtgccgaggtttccttat    ・・・［塩基配列７］
tcagaggataagtcagaagtagcacttatcggct                ・・・［塩基配列８］
taacaatctagaagaagtagtaatttggatagcg                ・・・［塩基配列９］
の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出するプローブが、基材上に固定されていることを特徴とする。
【００１２】
請求項２に記載のイネの細菌病菌の検出チップは、請求項１に記載されたもので、前記ＤＮＡ配列が、前記［塩基配列１、４、５、８及び９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基配列を有するものであって前記イネもみ枯細菌病菌と前記イネ苗立枯細菌病菌との両方を検出するものであり、又は
前記ＤＮＡ配列が、前記［塩基配列２及び３］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基配列を有するものであって前記イネもみ枯細菌病菌を検出するものであり、又は
前記ＤＮＡ配列が、前記［塩基配列６及び７］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基配列を有するものであって前記イネ苗立枯細菌病菌を検出するものであることを特徴とする。
【００１３】
請求項３に記載のイネの細菌病菌の検出チップは、請求項１〜２の何れかに記載されたもので、前記ＤＮＡ配列が、５’末端にアミノ標識されたオリゴＤＮＡ配列であることを特徴する。
【００１４】
請求項４に記載のイネの細菌病菌の検出チップは、請求項１〜３の何れかに記載されたもので、イネの検体の検出標的ＤＮＡ配列が、蛍光標識及び／又はビオチン標識されていることを特徴とする。
【００１５】
請求項５に記載のイネの細菌病菌の検出チップは、請求項１〜４の何れかに記載されたもので、前記プローブが、前記基材にスポットされて前記固定がされていることを特徴とする。
【００１６】
請求項６に記載のイネの細菌病菌の検出チップは、請求項１〜５の何れかに記載されたもので、前記基材が、ガラスチップ、プラスチックチップ、又はナイロンメンブレンチップであることを特徴とする。
【００１７】
請求項７に記載のイネの細菌病菌の検出チップは、請求項１〜６の何れかに記載されたもので、前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなる前記ＤＮＡ配列を含有する前記プローブの異なる複数が、基材上に固定されていることを特徴とする。
【００１８】
請求項８に記載のイネの細菌病菌の検出方法は、前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出するプローブが、基材上に固定されているこれらイネの細菌病菌の検出チップに、イネの検体を載せ、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、検出することにより、前記イネの細菌病菌を同定することを特徴とする。
【００１９】
請求項９に記載のイネの細菌病菌の検出方法は、請求項８に記載されたもので、イネの検体の検出標的ＤＮＡ配列が蛍光標識されており、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、その蛍光標識による蛍光部位の視認及び／又は蛍光波長の相違の検知により、検出することを特徴とする。
【００２０】
請求項１０に記載のイネの細菌病菌の検出方法は、請求項８に記載されたもので、イネの検体の検出標的ＤＮＡ配列がビオチン標識されており、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、そのビオチン標識に反応する酵素反応に応じた発色により、検出することを特徴とする。
【００２１】
請求項１１に記載のイネの細菌病菌の検出方法は、請求項８〜１０の何れかに記載されたもので、前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなる前記ＤＮＡ配列を含有する前記プローブの異なる複数が、基材上に固定されていることによって、前記プローブと前記イネの細菌病菌との結合の有無を、検出することを特徴とする。
【００２２】
請求項１２に記載のイネの細菌病菌の検出プローブは、前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出することを特徴とする。
【００２３】
請求項１３に記載のイネの細菌病菌の検出プローブは、請求項１２に記載されたもので、前記ＤＮＡ配列が、５’末端にアミノ標識されたオリゴＤＮＡ配列であることを特徴する。
【００２４】
請求項１４に記載のＤＮＡ配列は、前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるもので、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかに結合することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のイネの細菌病菌の検出チップは、播種前の種子中や苗中のイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌とを、高感度・高特異的に高精度で簡易に、目視又は光学的検出機器で検出できるものである。この検出チップは、これら両方のイネの細菌病菌の検出標的ＤＮＡ部位へ、検出チップに付されたイネの細菌病菌由来ＤＮＡ配列検出用のプローブが相補的に結合して、複合体を形成することに応じて、生化学的な手法による蛍光発色や着色のような色調などの変化で、確実に検知して同時に検出して判別できるものである。
【００２６】
この検出チップは、とりわけイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との両細菌病菌中の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子−２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の配列に由来する細菌特異的ＤＮＡ配列をプローブとして有することによって、これらイネの細菌病菌を検出することができるものである。この検出チップは、同一チップ上でプローブスポット箇所の仕方や使用するプローブ種を選択することで複数サンプルを同時に検出して、イネの種や苗がこれらイネの細菌病菌に感染しているかを解析できるものである。このような検出チップは、従来のイネの細菌病菌の検出法にないタイプのものであり、迅速に大量処理が可能なものである。
【００２７】
この検出チップを用いたイネの細菌病菌の検出方法によれば、イネの種子や苗などの多数の検体であっても、簡易かつ迅速に、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌とを検出することができる。しかも、この検出チップのプローブを単数又は適宜複数用いることにより、これら両方のイネの細菌病菌を同時に検出でき、また何れのイネの細菌病菌であるかの種判別をすることが、できる。
【００２８】
この検出チップに付されるプローブは、イネもみ枯細菌病菌基準株とイネ苗立枯細菌病菌基準株とを基にして、確実にこれらイネの細菌病菌を検出できる前記［塩基配列１〜９］の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなる前記ＤＮＡ配列を含有し、検体となるこれらイネの細菌病菌中の検出標的ＤＮＡ部位との相同性が高いものであるから、検出に誤差や誤認を生じない。
【００２９】
また、この検出チップに付されるプローブを構成するＤＮＡ配列は、最少で１７塩基〜最大でも４６塩基というものであり、ＤＮＡ自動合成装置で簡易・簡便にかつ迅速・正確に、高純度で得られるから、この検出チップによるイネの細菌病菌の検出方法の際に、誤差や誤認や検出ミスを生じない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明を適用するイネの細菌病菌の検出チップに付されるプローブを構成するＤＮＡ配列となり得る塩基配列と、イネもみ枯細菌病菌基準株及びイネ苗立枯細菌病菌基準株のそれぞれの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の全塩基配列との関係を示した図である。
【図２】発明を適用するイネの細菌病菌の検出チップを用いたイネの細菌病菌の検出方法で、検出するのに供したイネもみ枯細菌病菌の登録株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の全塩基配列を示した図である。
【図３】発明を適用するイネの細菌病菌の検出チップを用いたイネの細菌病菌の検出方法で、検出するのに供したイネ苗立枯細菌病菌の登録株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の全塩基配列を示した図である。
【図４】発明を適用するイネの細菌病菌の検出チップを用いたイネの細菌病菌の検出方法で、検出するのに供した別なイネ苗立枯細菌病菌の登録株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の全塩基配列を示した図である。
【図５】本発明を適用するイネの細菌病菌の検出チップを用いた検出方法に用いられるイネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌の夫々の検出標的ＤＮＡ含有フラグメントの電気流動の結果を示す図である。
【図６】本発明を適用するイネの細菌病菌の検出チップを用いた検出方法により、イネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌を検出した結果を示す図である。
【図７】本発明を適用する別なイネの細菌病菌の検出チップを用いた検出方法により、イネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌を検出した結果を示す図である。
【図８】本発明を適用する別なイネの細菌病菌の検出チップを用いた検出方法により、イネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌を検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００３２】
本発明のイネの細菌病菌の検出チップは、下記［塩基配列１〜９］（配列表の配列番号１〜９）
ctcctttctcgagcttattccgcatacattgagc            ・・・［塩基配列１；配列番号１］、
cggaacacctgggtagtctctgtagggaagggggcat         ・・・［塩基配列２；配列番号２］、
tgacaaacgttcagggatgctgagcagttgtcat            ・・・［塩基配列３；配列番号３］、
taacaatctggaagaagtagtaaagtggatagcg            ・・・［塩基配列４；配列番号４］、
ctcctttctcgagctaataccgcatacattgagc            ・・・［塩基配列５；配列番号５］、
cggaaacctgagacgtctctgtacatgggggcat            ・・・［塩基配列６；配列番号６］、
taaagaaggcttggaccaaggttgcttggtgccgaggtttccttat・・・［塩基配列７；配列番号７］、
tcagaggataagtcagaagtagcacttatcggct            ・・・［塩基配列８；配列番号８］、
taacaatctagaagaagtagtaatttggatagcg            ・・・［塩基配列９；配列番号９］  
の何れかの塩基配列の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出するプローブが、ガラスチップ、プラスチックチップ、又はナイロンメンブレンチップ製の基材上に固定されたものである。
【００３３】
検出チップは、それの基材として例えばＤＮＡチップ用の基板が用いられたものである。プローブは、前記ＤＮＡ配列を含有しており、イネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌の基準株の１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間に存在する［塩基配列１〜９］の連続する少なくとも１７塩基、好ましくは２０塩基以上、一層好ましくは２５塩基以上、より一層好ましくは３０塩基以上を使ったこれらイネの細菌病菌の特異的検出用プローブＤＮＡを、含有するものである。
【００３４】
検出チップは、これら［塩基配列１〜９］の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによって、これらイネの細菌病菌を特異的に検出することができるようになっている。イネの細菌病菌に感染しているか否か検知すべきイネの種子や苗の検出標的ＤＮＡとして、イネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌の１６ＳｒＲＮＡと２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間に存在する塩基配列を増幅し、検出標的ＤＮＡ含有フラグメントである検体とする。
【００３５】
この検出チップは、その検体と、プローブとを、ハイブリダイゼーション反応させ、必要に応じ検出標的ＤＮＡへ蛍光物質を予め標識しておくことで、何れかのイネの細菌病菌に感染しているかを判別できるようになっている。必要に応じ２種の検出標的ＤＮＡへ種類ごとに異なる蛍光物質を標識することでこれらイネの細菌病菌の何れに感染しているかの精度を上げて判別できるようになっている。
【００３６】
検出チップは、単一のプローブを有するものであってもよいが、これらイネの細菌病菌の両方を同時に検出できるように、またこれらイネの細菌病菌の種判別ができるように、複数のプロープを有していてもよい。
【００３７】
図１に、イネもみ枯細菌病菌検出用及びイネ苗立枯細菌病菌検出用のプローブに用いられるもので連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を成すための［塩基配列１〜９］と、それらイネの細菌病菌の基準株の１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間に存在する全塩基配列との関係を、示す。
【００３８】
図１の通り、独立行政法人農業生物資源研究所(NIAS)の農業生物資源ジーンバンクで公表されたデータベースによるイネもみ枯細菌病菌基準株(MAFF301169）とイネ苗立枯細菌病菌基準株(MAFF301723)とにおけるこれら２細菌の１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間に存在する塩基配列を並べると、かなりの相同性が認められる。なお、図１中、配列の相同性の比較のために塩基配列の数を１２０塩基ずつ便宜的に示してある。
【００３９】
ところで、イネもみ枯細菌病菌には、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間に存在する塩基配列に多型が無く、一方、イネ苗立枯細菌病菌には、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間に存在する塩基配列に多型が存在することが、非特許文献１に記載の通り、公知である。
【００４０】
本発明者らは、図１に示すように、これらのイネの細菌病菌基準株の１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間に存在する塩基配列中で、ハイブリダイゼーションすることができそれを検出できるプローブとなり得る部位を、種々検討したところ、［塩基配列１〜９］が、見出された。
【００４１】
このようなプローブとなり得る部位は、前記データベースで公表されたこれらイネもみ枯細菌病菌基準株とイネ苗立枯細菌病菌基準株の２細菌を並べて記載した図１を参照して説明すると、イネもみ枯細菌病菌検出用プローブとなり得る配列として２箇所あり夫々［塩基配列２及び３］として見出された部位であり、イネ苗立枯細菌病菌検出プローブとなるＤＮＡ配列は２箇所あり夫々［塩基配列６及び７］として見出された部位である。このように、試行錯誤の末に漸く見出されたこれらの部位のうち連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れかを検出することが、できる。
【００４２】
これらに含まれる各塩基配列［塩基配列２又は３］若しくは［塩基配列６又は７］の少なくとも１７塩基配列を含有するプローブを作製する場合、スポットされたプローブ［塩基配列２又は３、塩基配列６又は７］に対してハイブリダイゼーションさせる細菌種が、約８０％以下の相同性を持つ相対する他方の細菌病菌の場合にはクロスハイブリダイゼーションが起こらず、スポットされたプローブに対する種特異的なイネの細菌病菌を検出できるプローブ用ＤＮＡ配列として、イネの細菌病菌の検出チップに使用できる（図１参照）。従って、その相同性は、基材や測定条件によって多少の変動はあるものの、約８０％を越えることが好ましく、１００％であれば一層好ましい。なお、このような率の相同性を表す比率は、ハイブリダイゼーションの際の実験系での条件、例えば温度やＤＮＡ濃度や塩濃度やｐＨなどに影響を受け易いが、後述する実施例の条件において、求められた値である。
【００４３】
また、このようなプローブとなり得る別な部位は、前記のようにこれらイネもみ枯細菌病菌基準株とイネ苗立枯細菌病菌基準株の２細菌を並べて記載した図１を参照して説明すると、イネもみ枯細菌病菌検出用とイネ苗立枯細菌病菌検出用とを兼ねるプローブとなり得るＤＮＡ配列として５箇所あり夫々、［塩基配列１、４、５、８及び９］として見出された部位である。このように、試行錯誤の末に漸く見出されたこれらの部位のうち連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有することによってイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との両方を検出することが、できる。
【００４４】
これらに含まれる各塩基配列［塩基配列１、４、５、８及び９］の少なくとも１７塩基配列を含有するプローブを作製する場合、プローブ配列に対して約８６％以上の相同性を持つ細菌病菌の場合にはこれらの種間及び／又は株間に関わらずイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌の両方を検出チップに使用できる。なお、このような率の相同性を表す比率も前記同様に、後述する実施例の条件において、求められた値である。
【００４５】
このような相同性は、例えば３０塩基のＤＮＡ配列を含有するプローブの場合、４塩基程度の違いでも、これら２細菌とも検出できる。
【００４６】
一方、多型が存在するイネ苗立菌枯細菌病菌であっても、［塩基配列７］のみ又は［塩基配列８］のみ、若しくは［塩基配列7及び８］の配列の少なくとも１７塩基配列からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを作製すれば、イネ苗立菌枯細菌病菌を検出できるプローブ用ＤＮＡ配列として、イネの細菌病菌の検出チップに使用できる。現在知られているイネ苗立菌枯細菌病菌は、如何なる多型であっても、［塩基配列７］と［塩基配列８］との両配列の少なくとも１７塩基配列からなるＤＮＡ配列を有する二つのプローブを付したイネの細菌病菌の検出チップにすれば、何れかのプローブで検出できるので、イネ苗立菌枯細菌病菌の検出漏れが生じない。
【００４７】
なお、［塩基配列８］に対応するイネもみ枯細菌病菌のＤＮＡ配列［塩基配列Ａ］は、イネもみ枯細菌病菌基準株とイネ苗立枯細菌病菌基準株とであれば２細菌病菌の相同性が８６．６％以上となるが、イネ苗立枯細菌病菌の多型である別な個体次第では相同性が８６．６％未満（例えば、３０塩基のＤＮＡ配列を含有するプローブの場合、５塩基の違い程度）となり誤検出の恐れがあるので、イネの細菌病菌の検出チップのプローブとして用いるのは、好ましくない。（図１参照）
【００４８】
イネの細菌病菌の検出チップは、ＤＮＡ配列が、５’末端にアミノ標識されたオリゴＤＮＡ配列をプローブとして用いるものであってもよい。アミノ標識する基としてＨ2Ｎ(ＣＨ2)6−のようなアミノアルキレン基が挙げられる。
【００４９】
イネの細菌病菌の検出チップは、プローブを、ガラスチップ、プラスチックチップ、又はナイロンメンブレンチップ製の基材上に固定することによって、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との判別の際に、これら細菌の増幅した検出標的ＤＮＡ部位を、種別に異なった蛍光波長の蛍光標識物質で直接標識し、又は蛍光標識化合物と化学的及び／又は生物学的に反応して発色し得る標識性官能基などで適宜標識することで、検出結果の精度を、格段に向上させることができる。
【００５０】
このような標識物質として、一般的にＤＮＡチップに汎用されている蛍光色素、例えばｃｙ３やｃｙ５(何れもＧＥヘルスケア社の商品名)、フルオレセイン(ＦＩＴＣ)、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８やＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６（何れもモレキュラー プローブズ社の商品名)が挙げられる。
【００５１】
また、イネの細菌病菌の検出チップは、プローブを、ナイロンメンブレンチップ製の基材上に固定することによって、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との判別の際に、これら細菌の増幅した検出標的ＤＮＡ部位を、ビオチン標識することで、酵素反応に基づく発色を利用して検出結果の精度を、格段に向上させることができる。このような発色には、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンの発色性基質であるブロモクロロインドリルリン酸(ＢＣＩＰ)と発色剤であるニトロブルーテトラゾリウム(ＮＢＴ)を用いた方法や、ペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンとペルオキシターゼと反応すると酸化し発色するテトラメチルベンシジン(ＴＭＢ)を用いた方法などが挙げられる。
【００５２】
イネの細菌病菌の検出チップは、例えばプローブを、基材に付すことにより作製される。具体的には、スポット方法を利用するものでピン先端の固相への機械的な接触によるピン方式（より具体的には後述の実施例参照）、インクジェットプリンタの原理を利用するものでインクジェット方式、スポッター内に加熱によって泡を生じさせ、その圧力を利用してサンプルを噴出させるバブルジェット方式(バブルジェットは登録商標)、毛細管によるキャピラリー方式などの方式を使用して、プローブを基板にスポットし、固定させることにより、作製される。
【００５３】
このようなイネの細菌病菌の検出チップを用いたイネの細菌病菌の検出方法は、この検出チップのプローブ側に、イネに由来する検体、例えばＰＣＲ増幅し標識した部分ＤＮＡのような検体を載せ、プローブとイネの細菌病菌に由来する検出標的ＤＮＡ部位との結合の有無を、目視又は光学的検出機器で検出することにより、イネの細菌病菌を同定するというものである。
【００５４】
その検出方法の一例は、以下の通りである。イネもみ枯細菌病菌及びイネ苗立枯細菌病菌を検出する場合を例に説明する。
【００５５】
イネもみ枯細菌病菌の検出標的ＤＮＡ部位は、１６ＳｒＲＮＡ及び２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の塩基配列に含まれており（図１参照）、その全塩基配列は、配列表の配列番号１０に記載されている。
【００５６】
例えば、［塩基配列２］の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを用いて、イネもみ枯細菌病菌のみの感染を検出する場合、検出標的ＤＮＡ部位は、配列番号１０の５’末端側から１〜２８０塩基(以下、この検出標的ＤＮＡ含有フラグメントやその部位をＧＬ−Ｆ１と略記する)に含まれており、［塩基配列３］の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを用いて、イネもみ枯細菌病菌を検出する場合、検出標的ＤＮＡ部位は、配列番号１０の５’末端側から２８３〜４４８塩基(以下、この検出標的ＤＮＡ含有フラグメントやその部位をＧＬ−Ｆ２と略記する)に含まれているので、それを利用する（図１参照）。
【００５７】
また、［塩基配列６］の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを用いて、イネ苗立枯細菌病菌のみの感染を検出する場合、検出標的ＤＮＡ部位は、配列番号１１の５’末端側から１〜２８０塩基(以下、この検出標的ＤＮＡ含有フラグメントやその部位をＢＰ−Ｆ１と略記する)に含まれており、［塩基配列７］の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを用いて、イネ苗立枯細菌病菌のみの感染を検出する場合、検出標的ＤＮＡ部位は、配列番号１０の５’末端側から２８３〜４４８塩基(以下、この検出標的ＤＮＡ含有フラグメントやその部位をＢＰ−Ｆ２と略記する)に含まれている。イネ苗立枯細菌病菌を検出するには、ＢＰ−Ｆ１とＢＰ−Ｆ２との何れか一方又は両方を利用する（図１参照）。
【００５８】
また、［塩基配列１］又は［塩基配列５］の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを用いて、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れか一方の感染を検出する場合、検出標的ＤＮＡ部位は、前記のＧＬ−Ｆ１・ＢＰ−Ｆ１に含まれており、これを利用して、これらイネの細菌病菌の何れか一方に感染していることを、検出することができる。［塩基配列４］、［塩基配列８］、［塩基配列９］の内の連続する少なくとも１７塩基からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを用いて、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との少なくとも何れか一方の感染を検出する場合、検出標的ＤＮＡ部位は、前記のＧＬ−Ｆ２・ＢＰ−Ｆ２に含まれおり、これを利用して、これらイネの細菌病菌の何れか一方に感染していることを、検出することができる。（図１参照）。
【００５９】
検出標的ＤＮＡ含有部位ＧＬ−Ｆ１とＢＰ−Ｆ１とであるＦ１（図１参照）は、表１の配列番号１２及び１３に記載のプライマーを、夫々フォワードプライマー（Ｆプライマー）及びリバースプライマー（Ｒプライマー）として用いて、ＰＣＲ法により増幅して用いる。検出標的ＤＮＡ含有部位ＧＬ−Ｆ２とＧＬ−Ｆ２とであるＦ２（図１参照）は、表１の配列番号１４及び１５に記載のプライマーを夫々フォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いて、ＰＣＲ法により増幅して用いる。
【００６０】
【表１】
2013153706.tif 000003
【００６１】
ＰＣＲ法により増幅した検体である検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＧＬ−Ｆ１、ＧＬ−Ｆ２、ＢＰ−Ｆ１及び／又はＢＰ−Ｆ２）を、イネの細菌病菌の検出チップに付し、チップ上のプローブとイネの細菌病菌に由来する検出標的ＤＮＡ含有部位との結合の有無を、蛍光標識の目視又は光学的蛍光検出などによって検出することにより、イネの細菌病菌が同定される。
【実施例】
【００６２】
以下、本発明のイネの細菌病菌の検出チップを用いたイネの細菌病菌の検出方法の具体的な実施例を、実施例１〜３に示す。
【００６３】
（実施例１）
本発明のイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との種判別用プローブを用いたイネの細菌病菌の検出チップを、使用して両細菌病菌を、同時に検出した例を示す。
【００６４】
(1)ＤＮＡチップ基板として、スライド基板と、ハイブリダイゼーションカバーと、スポッティング液やブロッキング液やハイブリダイゼーションバッファー液、その他各種試薬とからなるオリゴ固定化基板Ｉキット（住友ベークライト株式会社製；製品番号BS-11607）を使用した。
【００６５】
(2)イネの細菌病菌の検出チップを作製するに当たり、先ず、塩基配列２、３、６、７の各塩基配列の内の連続する３０塩基からなるＤＮＡ配列を含有するプローブを調製した。
調製したＤＮＡ配列を表２に示す。
【００６６】
【表２】
2013153706.tif 000004
【００６７】
調製すべき所望のＤＮＡ配列は、塩基配列２の内の連続する３０塩基（３０ｍｅｒ）からなるＤＮＡ配列である塩基配列１６及び１７、塩基配列３の内の連続する３０塩基からなるＤＮＡ配列である塩基配列１８及び１９、塩基配列６の内の連続する３０塩基からなるＤＮＡ配列である塩基配列２０及び２１、塩基配列７の内の連続する３０塩基からなるＤＮＡ配列である塩基配列２２及び２３である。これら所望のＤＮＡ配列は、各配列番号２，３，６，７における塩基配列に由来する３０塩基の５’末端アミノ修飾オリゴＤＮＡとして合成して、調製されたものである。それらは、市販のＤＮＡ自動合成装置を用いてその取扱説明書の手順に従って合成され、次いで、通常用いられる方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、より具体的にはカラムは逆相ＨＰＬＣ用カラムを用いて溶出）によって精製して、得たものである。
【００６８】
(3)オリゴ固定化基板Ｉキットの仕様に従って、スライド基板（住友ベークライト株式会社製）上に、調製ＤＮＡ配列（塩基配列１６〜２３：配列番号１６〜２３）を、スポットして付した。具体的には、先ず、各調製ＤＮＡ配列をプローブ用ＤＮＡ配列となるように、オリゴ固定化基板Ｉキットに添付のスポット液によって、夫々１０μＭに調整した。その後、下記表３の通り縦４段×横６列の２４スポットとなるように、レイアウトし、ピン型スポッター（高電工業株式会社製；商品名MARKS-I）を使ってスライド基板に、スポットサイズを直径０．２ｍｍとしスポット間隔を０．３ｍｍにして、スポットした。
【００６９】
【表３】
2013153706.tif 000005
【００７０】
(4)スポット後、得られたスライド基板を、８０℃で１時間加熱することにより、プローブをスライド基板表面に固定化した。その後、０．１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液に浸漬してから、沸騰水に２分浸水後、風乾し、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との検出チップを得た。
【００７１】
(5)検出の対象となる供試験株として、イネもみ枯細菌病菌は独立行政法人農業生物資源研究所(NIAS)の農業生物資源ジーンバンクの登録株であり水稲由来のMAFF106713株、イネ苗立枯細菌病菌は同登録株であり水稲由来のMAFF106672株とMAFF106721株とを使用した。
【００７２】
(6)イネもみ枯細菌病菌の１株とイネ苗立枯細菌病菌の２株との夫々における検出標的ＤＮＡ含有部位を、表１に記載のフォワードプライマー及びリバースプライマーによるＰＣＲ法により、以下のようにして、増幅した。
ＧＬ−Ｆ１及びＢＰ−Ｆ１を増幅する場合は、表１で示した１７Ｆプライマーと２７７Ｒプライマーを使用し、ＧＬ−Ｆ２およびＢＰ−Ｆ２を増幅する場合は２８０Ｆプライマーと４５７Ｒプライマーを使用して、夫々次の組成の反応液を、最終的な全量を５０μｌとし、以下の反応プログラムを行なった。
〔反応液組成〕全量５０μｌ
・１０×ＥＸｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）                        ５μｌ
・デオキシリボヌクレオシド三リン酸類：ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）（タカラバイオ株式会社製）                                ４μｌ
・ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）        ０．２５μｌ
・１０μＭファワードプライマー（１７Ｆ又は２８０Ｆ）                      １μｌ
・１０μＭリバースプライマー  （１９Ｆ又は４５６Ｒ）                      １μｌ
・菌液もしくは菌由来ＤＮＡ（菌由来ＤＮＡはコロニーＰＣＲ産物およびＤＮＡ抽出キット等を使用して得たＤＮＡ）                                                １μｌ
・滅菌蒸留水                                                      ３７．７５μｌ
〔反応プログラム〕
最初に９４℃で２分間変性した後、熱変性：９４℃で３０秒間と、アニーリング：４５℃で３０秒間と、ポリメラーゼ伸長反応：７２℃で１分間とからなる１サイクルとして、計３０サイクル行なった後、７２℃で５分間伸長反応を行った。その反応装置はTaKaRa PCR Thermal Cycker Dise Standard（タカラバイオ株式会社製；商品名）を使用した。
【００７３】
なお、イネもみ枯細菌病菌（MAFF106713株）、及びイネ苗立枯細菌病菌（MAFF106672株とMAFF106721株）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間の全塩基配列を、夫々図２〜４に示す（配列番号２４〜２６）。
【００７４】
(7)図２〜４に示すように、前記ＰＣＲ法によって増幅した３株毎の検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（図１のＦ１及びＦ２に対応）を、以下のようにして精製して調製した。
先ず、ＰＣＲ産物をＰＣＲ産物精製キットであるQIA quick PCR Purification Kit（ＱＩＡＧＥＮ社製；商品名）を使用し、キット付属のカラムへのＤＮＡ吸着と洗浄を行い、滅菌蒸留水によって精製された検出標的ＤＮＡの溶出を行なって、精製した各標的検出ＤＮＡを、２μｇずつ調製した。
【００７５】
(8)図２〜４に示すように、イネもみ枯細菌病菌（MAFF106713株）から得た検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（図１のＦ１及びＦ２に対応：夫々ＧＬ−Ｆ１、ＧＬ−Ｆ２）と、イネ苗立枯細菌病菌（MAFF106672株、MAFF106721株）から得た検出標的ＤＮＡ含有部位（図１のＦ１及びＦ２に対応：夫々ＢＰ−Ｆ１、ＢＰ−Ｆ２）を、２％アガロースゲルで電気泳動を行い、SYBER Gold S11494（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製；商品名）で染色後紫外線を照射することによって、検出標的ＤＮＡのバンドを確認した。その結果を図５に示す。図５から明らかな通り、検出標的ＤＮＡ含有フラグメントが得られていることを、確認できた。
【００７６】
(9)前記(7)で得た各検出標的ＤＮＡ含有フラグメントに対して、ＵＬＹＳＩＳ核酸標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製；商品名ULYSIS Nucleic Acid Labeling Kits；商品番号U21650及びU21652）を用いて、そのプロトコールに従い、以下のように蛍光標識した。ＵＬＹＳＩＳ核酸標識キットに付属のLabeling bufferの２０μlに、前記(7)で得た各検出標的ＤＮＡ含有フラグメント２μｇを置換し、９５℃で５分間変性した後、イネもみ枯細菌病菌の検出標的ＤＮＡ含有フラグメントの２μｇに対して、緑色に蛍光発色するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ex492,Em520）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製；商品名ULYSIS Nucleic Acid Labeling Kits U21650）また、イネ苗立枯細菌病菌の検出標的ＤＮＡ含有フラグメントの２μｇに対して、赤色に蛍光発色するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６（Ex555,Em570）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製；商品名ULYSIS Nucleic Acid Labeling Kits U21652）を用い、夫々を加え、８０℃で１５分間インキュベートさせることによって、各検出標的ＤＮＡ含有フラグメントを、直接蛍光標識した。標識後余分な標識物質を取り除くために、それを精製用スピンカラム（ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ社製；商品名CENTRE-SEP（PRINCETON SEPARATION CS901））に通し、蛍光標識検出標的ＤＮＡ含有フラグメントの約２μｇ相当を含む溶液１０μｌを、得た。
【００７７】
(10)イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との夫々の蛍光標識された検出標的ＤＮＡ含有フラグメントを５μｌずつ混合し、２細菌病菌由来のＦ１フラグメント同士又はＦ２フラグメント同士が混在したＤＮＡサンプルを作製し、２×ハイブリダイゼーションバッファー（オリゴ固定化基板Iキット添付）の１２．５μｌに加え、ハイブリダイゼーション液を調製した。
【００７８】
(11)ハイブリダイゼーション液を、９５℃で５分間加熱し、変性させた。
【００７９】
(12)前記(4)で作製したイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との検出チップに、ハイブリダイゼーションカバーをかけ、そのカバーの隙間からハイブリダイゼーション液を加え、５５℃で４８時間インキュベートした。
【００８０】
(13)２×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の緩衝液を１×ＳＣＣとし、その２倍の濃度である２×ＳＳＣ即ち３００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム）＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣ、イオン交換水の順に検出チップを浸盪することによって洗浄し、その後、風乾した。
【００８１】
(14)落射型蛍光顕微鏡（株式会社ニコン製；商品名Nicon ECLIPSE 80i）を使用し検出チップ上のプローブスポットを観察し、併せて固体撮影素子(ＣＣＤ)カメラ（浜松ホトニクス株式会社製）を使用して検出チップ表面の画像を全プローブスポットごと取得した。
【００８２】
(15)取得した画像は、画像解析ソフト（浜松ホトニクス株式会社製；商品名AQUA Cosmos Version2.63）を用い、同一箇所について異なった波長(緑色の蛍光用に５２７ｎｍ、赤色の蛍光用に５８６ｎｍ)で観測された画像を、重ね合わせた。その画像を図６に示し、併せてその結果を表４に示す。
【００８３】
【表４】
2013153706.tif 000006
【００８４】
図６写真（左）及び表４から明らかな通り、イネもみ枯細菌病菌由来で緑色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＧＬ−Ｆ１）及びイネ苗立枯細菌病菌由来で赤色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＢＰ−Ｆ１）とを混合した場合、この検出チップで、ＧＬ−Ｆ１検出用のプローブのみでＧＬ−Ｆ１を検出し、ＢＰ−Ｆ１検出用のプローブのみでＢＰ−Ｆ１を検出した。
【００８５】
図６写真（中）及び表４から明らかな通り、イネもみ枯細菌病菌由来で緑色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＧＬ−Ｆ２）及びイネ苗立枯細菌病菌由来で赤色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＢＰ−Ｆ２）とを混合した場合、この検出チップで、ＧＬ−Ｆ２検出用のプローブのみでＧＬ−Ｆ２を検出し、ＢＰ−Ｆ２検出用のプローブのみでＢＰ−Ｆ２を検出した。
【００８６】
図６写真（右）及び表４から明らかな通り、イネもみ枯細菌病菌由来で緑色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＧＬ−Ｆ１）及び別な個体であって変異型であるイネ苗立枯細菌病菌由来で赤色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＢＰ−Ｆ１）とを混合した場合、この検出チップで、ＧＬ−Ｆ１検出用のプローブのみでＧＬ−Ｆ１を検出し、ＢＰ−Ｆ１検出用のプローブのみでＢＰ−Ｆ１を検出した。
【００８７】
これらの結果から、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌とに由来する２種の検出標的ＤＮＡ含有フラグメントが混在していても、確実にハイブリダイゼーションを起こすので蛍光観察により夫々検出できること、及び２種の標的ＤＮＡ含有フラグメントが、ＧＬ検出用プローブとＢＰ検出用プローブとに競合せず誤ったクロスハイブリダイゼーション（ミスハイブリダイゼーション）を引き起こすことなく、２細菌の何れであるかを正確に検出して種判別できることが、確かめられた。従って、この検出チップを用いたイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との検出方法によれば、これら２細菌の同時検出画像が目視で高感度・高精度で確認できた。なお、これら以外の変異型であるイネ苗立枯細菌病菌由来で赤色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメントであっても、検出可能である。
【００８８】
（実施例２）
本発明のイネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との種判別用プローブを用いたイネの細菌病菌の検出チップを、使用して両細菌病菌の少なくとも何れかに感染したことを、検出した例を示す。
【００８９】
(1)下記表５に示す塩基配列を調製ＤＮＡ配列として用いたことと、４スポット並べた検出チップにしたこと以外は、前記実施例１の(01)〜(06)までの工程を、同様に行った。
【００９０】
【表５】
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【００９１】
(2)実施例１の(7)〜(8)と同様にして、イネもみ枯細菌病菌（MAFF106713株）由来の検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＧＬ−Ｆ１、ＧＬ−Ｆ２）と、イネ苗立枯細菌病菌（MAFF106672株、MAFF106721株）由来の夫々検出標的ＤＮＡ含有フラグメント（ＢＰ−Ｆ１、ＢＰ−Ｆ２）を得た。
【００９２】
(3)前記(2)で得た各検出標的ＤＮＡ含有フラグメントに対して、ＵＬＹＳＩＳ核酸標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製；商品名ULYSIS Nucleic Acid Labeling Kits U21652）を用いて、そのプロトコールに従い、赤色に蛍光発色するAlexa Fluor546（Ex555,Em570）を各検出標的ＤＮＡ含有フラグメントに加え８０℃で１５分間インキュベートすることにより、蛍光標識し、それを精製用スピンカラム（CENTRE-SEP（PRINCETON SEPARATION CS901））を通し、およそ２μgを含む１０μｌ溶液の蛍光標識された検出標的ＤＮＡ含有フラグメントを得た。
【００９３】
(4)イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌との蛍光標識された検出標的ＤＮＡ含有フラグメントを、夫々別々に、１０μl、２×ハイブリダイゼーションバッファー（オリゴ固定化基板Iキット添付）２５μｌと、ミリポア社製超純水製造装置ＭｉｌｌｉＱで精製した滅菌水１０μｌとを加え、イネもみ枯細菌病菌（MAFF106713株）のみに由来の検出標的ＤＮＡ含有フラグメントのハイブリダイゼーション液と、イネ苗立枯細菌病菌（MAFF106672株、MAFF106721株）のみに由来の検出標的ＤＮＡ含有フラグメントのハイブリダイゼーション液とを、調製した。
【００９４】
(5)次いで、ハイブリダイゼーション液に対し、実施例１の(11)〜(14)と同様な工程を行った。
【００９５】
(6)取得した画像は、その画像をパーソナルコンピュータのディスプレイに映し出すための画像解析ソフト（AQUA Cosmos  Version2.63）を用い、画像処理した。その観測された画像を、図７に示し、併せてその結果を表６に示す。
【００９６】
【表６】
2013153706.tif 000008
【００９７】
図７及び表６から明らかな通り、イネもみ枯細菌病菌由来又はイネ苗立枯細菌病菌由来で赤色の蛍光標識した検出標的ＤＮＡ含有フラグメントは、この検出チップで、何れも検出することができた。この場合、図１の塩基配列６において、別なＢＰ株での供試を行い続けているが、現在変異に関係なく検出されることから、イネ苗立枯細菌病菌が変異していても、変異に関係なく検出できることが分かった。
【００９８】
（実施例３）
イネもみ枯細菌病菌やイネ苗立枯細菌病菌を検出するプローブが、ナイロンメンブレン製の基材上に固定されている、別なイネの細菌病菌の検出チップの実施例を、示す。このイネの細菌病菌の検出チップを、使用して、イネの細菌病菌を、検出した例を以下に示す。
【００９９】
(1)イネの細菌病菌の検出チップの基材に使用したナイロンメンブレンは、バイオダインＣ（ＰＡＬＬ社製）である。プローブをスポットする前に、１６％ＥＤＣ溶液（東京化成工業株式会社製；商品名EDC D1601）に１５分間浸し、蒸留水で３０秒間洗浄してから使用した。
【０１００】
(2)使用プローブは、塩基配列６（配列番号６）又は塩基配列２（配列番号２）に含まれるアミノ修飾プローブ３０ｍｅｒの何れかである。具体的には、塩基配列６（配列番号６）の一部を有する塩基配列２１（配列番号２１）と、塩基配列２（配列番号２）の一部を有する塩基配列１７（配列番号１７）とを、夫々を、０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．４）で１０μＭに希釈して、スポット作製用の液を、調製した。
【０１０１】
(3)そのスポットには、バキュームトランスファー装置（株式会社バイオクラフト社製；商品名BS-31）を用いた。その上に、前記(1)で調製した前処理済みのナイロンメンブレンチップを置き、各プローブ（５μΜ）５μｌを、直接スポットした。
【０１０２】
(4)スポットし、ナイロンメンブレンチップを乾燥させた後、０．１ＭのＮａＯＨ水溶液で１０分間洗浄後、蒸留水で洗浄し、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳに５０℃で１０分間浸し、２０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に１５分浸し、プローブを固定した。その後、ハイブリダイゼーション直前に、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１０分間浸盪し、さらにブッロッキング液（２×ＳＳＣ＋３％ＢＳＡ(ウシ血清)）中、５０℃で１５分間浸とうしてブロッキングを行なって、イネの細菌病菌の検出チップを作製し、使用した。
【０１０３】
(5)イネもみ枯細菌病菌（MAFF301169）とイネ苗立枯細菌病菌(MAFF301723)との夫々における検出標的ＤＮＡ含有部位Ｆ１の増幅と標識は、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社製；商品名）と、Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社製；商品名Biotin-16-dUTP）とを使用することによって、同時に行なうＰＣＲラベリング法により、行った。このような標識及び増幅反応液の組成は以下の通りとし、ＰＣＲを以下の反応プログラムに従って行なうことによって、ビオチン標識された検出標的ＤＮＡを得た。
〔反応組成〕全量５０μｌ
・１０×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ  （タカラバイオ株式会社製）                      ５μｌ
・１ｍＭのＢｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ（Ｒｏｓｈｅ社製）              ２．５μｌ
・１０ｍＭ  ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ（ＧＥヘルスケア社製）            １μｌ
・１０ｍＭ  ｄＴＴＰ（ＧＥヘルスケア社製）                            ０．６μｌ
・ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）        ０．２５μｌ
・１０μＭファワードプライマー（１７Ｆ）                                  １μｌ
・１０μＭリバースプライマー  （２７７Ｒ）                                １μｌ
・菌液もしくは菌由来ＤＮＡ                                                １μｌ
・滅菌蒸留水                                                      ３７．７５μｌ
〔反応プログラム〕
最初に９４℃で２分間変性した後、熱変性：９４℃で３０秒間と、アニーリング：４５℃で３０秒間と、ポリメラーゼ伸長反応：７２℃で１分間とからなる１サイクルとして、計３０サイクル行なった後、７２℃で５分間伸長反応を行った。反応装置はTaKaRa PCR Thermal Cycker Dise Standard（タカラバイオ株式会社製；商品名）を使用した。
【０１０４】
(6)前記(5)で得たＰＣＲラベリングした検出標的ＤＮＡフラグメントを、精製用スピンカラム（ＰＲＩＮＣＥＴＯＮ社製；商品名CENTRE-SEP（PRINCETON SEPARATION CS901））に通し、余分なビオチンを除去し、精製した検出標的ＤＮＡフラグメントを、２μｇ相当量を、得た。
【０１０５】
(7)ハイブリダイゼーション直前に、ビオチン標識した検出標的ＤＮＡフラグメント２μｇを２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳの１５０μｌに加えたハイブリダイゼーション液を、調製し、そのハイブリダイゼーション液を１００℃で１０分間加熱することで検出標的ＤＮＡフラグメントを変性させた。
【０１０６】
(8)変性した検出標的ＤＮＡフラグメントを含有するハイブリダイゼーション液に２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳを１ｍｌ追加し、メンブレン基材を有したイネの細菌病菌の検出チップとを、ビニール袋にパッキングし、ハイブリダイゼーションさせた。５５℃のインキュベータ内で、左右に振盪又はローテーターで反転させながら、５５℃で２時間、ハイブリダイゼーション反応を行った。
【０１０７】
(9)ハイブリダイゼーション後、イネの細菌病菌の検出チップのナイロンメンブレンチップの洗浄は、ＴＢＳ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭのＮａＣｌ）＋６％ＢＳＡ中、５０℃で３０分間振盪後、さらにＴＢＳに５分間振盪することにより、行った。
【０１０８】
(10)スポットの発色の基質となるアルカリフォスファターゼを、各プローブに結合したビオチン標識検出標的ＤＮＡに結合させるために、ＴＢＳにＡＰ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ社製；商品名Alkaline Phosphatase Labeled Streptavidin 475−3000）を５００分の１から１０００分の１希釈した溶液と、ナイロンメンブレンインチップとを、ビニール袋にパッキングし、２０分間左右に振盪又はローテーターで反転させた。
【０１０９】
(11)余分なＡＰ標識ストレプトアビジンを洗い落とすために、ナイロンメンブレンチップをＴＢＳに１０分間浸して洗浄し、発色の前処理としてＡＰ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ９．５）中、１０分間振盪した。
【０１１０】
(12)乾いたバットにナイロンメンブレンチップを置き、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ社製；BCIP/NBT Phospatase Substrate 1-Component）をナイロンメンブレンチップの表面を覆うように、掛けた。３０秒間程度で発色が始まり、３分間後に、蒸留水を流水することによって反応停止させた。
【０１１１】
(13)イネの細菌病菌の検出チップのナイロンメンブレンチップ上に、約直径３ｍｍの茶色のスポットが目視で観察できた。その結果を、図８に示す。図８から明らかな通り、塩基配列２（配列番号２）又は塩基配列６（配列番号６）に含まれるアミノ修飾プローブである塩基配列３０ｍｅｒの何れかである塩基配列１７（配列番号１７）と塩基配列２１（配列番号２１）からなるプローブを使用して、イネもみ枯れ細菌病菌特異的検出とイネ苗立枯細菌病菌特異的検出とを、行うことができた。なお、この場合、プローブ配列に対して１００％の相同性を持つ細菌病菌を検出したこととなる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明のイネの細菌病菌の検出チップ及びそれを用いた検出方法によれば、特定のＤＮＡ配列を含有するプローブを用いることによって、イネもみ枯細菌病菌とイネ苗立枯細菌病菌とを、同時検出、種判別が可能となる。またこれら２細菌に共通の検出プローブ配置と、これら２種の何れかに特異的な検出プローブ配置とを、適宜使い分けることにより、これら２細菌の種判別を必要としないが何れかへの感染を検出する場合と、これら２細菌病菌の種別を特定したい場合との目的別の二タイプの検査チップを、作製できる。
【０１１３】
本発明のイネの細菌病菌の検出チップ及びそれを用いた検出方法を用いれば、イネ苗生産の安定供給や農薬の軽減に、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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