(57)【要約】【課題】  植物に含まれるリグニン量を効果的に低減する方法を提供すること。【解決手段】  本発明の植物に含まれるリグニン量を低減する方法は、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させることによるものである。【選択図】  図３
2013179877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させることによる植物に含まれるリグニン量を低減する方法。
【請求項２】
リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの間にＨｉｎｇｅ領域を有する融合タンパク質を植物体内で発現させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させるための遺伝子構築物を含むベクター。
【請求項４】
請求項３記載のベクターを使用してリグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させるための遺伝子構築物を体内に導入した形質転換植物。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換植物のバイオマスとしての利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物に含まれるリグニン量を低減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化石燃料の減少や地球環境の悪化が進む今日、地球上で最も多量に存在する有機物であるリグノセルロースをバイオマスとして利用することに注目が集まっている。リグノセルロースは、構造性多糖であるセルロースと芳香族化合物の重合体であるリグニンから構成されており、植物の茎葉の主成分であって、個体・組織・細胞を堅固にすることで、植物に外界の物理的ストレスに対する抵抗性を付与したり病原菌の侵入を阻止したりして、その正常な生育に欠かせない役割を担っている。バイオマスとしてリグノセルロースを利用する場合、その糖化効率を向上させることが重要であるが、これは必ずしも容易なことではない。その理由の一つとして糖化効率の向上を妨げるリグニンの存在がある。リグニンは、リグノセルロースの物理的強度を高めてセルロースの単離を困難にするだけでなく、セルロース分解酵素を非特異的に吸着することでその不活性化を引き起こすことが知られている。
【０００３】
上記の点に鑑み、植物に含まれるリグニン量を低減する方法についての研究が行われている。例えば非特許文献１や非特許文献２では、植物体内におけるリグニン生合成酵素の発現を抑制することで植物に含まれるリグニン量を低減する方法が提案されている。しかしながら、その効果は必ずしも十分なものではなく、より優れた方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，ｖｏｌ．２５，ｐｐ．７５９−７６１
【非特許文献２】Ｂｅｒｔｈｅｔ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２０１１，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１１２４−１１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、植物に含まれるリグニン量を効果的に低減する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、リグニン分解酵素とセルロース分解酵素が有するセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させることで、植物に含まれるリグニン量を効果的に低減することができることを見出した。
【０００７】
上記の点に鑑みてなされた本発明の植物に含まれるリグニン量を低減する方法は、請求項１記載の通り、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させることによるものである。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの間にＨｉｎｇｅ領域を有する融合タンパク質を植物体内で発現させるものである。
また、本発明のベクターは、請求項３記載の通り、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させるための遺伝子構築物を含むものである。
また、本発明の形質転換植物は、請求項４記載の通り、請求項３記載のベクターを使用してリグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させるための遺伝子構築物を体内に導入したものである。
また、本発明は、請求項５記載の通り、請求項４記載の形質転換植物のバイオマスとしての利用である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させることで、植物に含まれるリグニン量を効果的に低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例におけるＬａｃ−ＣＢＤを発現するｐＣＳ００５の構築図である。
【図２】同、形質転換イネの稈のラッカーゼ活性の測定結果である。
【図３】同、形質転換イネの稈のリグニン含量の測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の植物に含まれるリグニン量を低減する方法は、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させることによるものである。
【００１１】
本発明において、植物体内で発現させる融合タンパク質を構成するリグニン分解酵素は、リグニンを分解する作用を有するものであればその由来や種類などは限定されるものではない。具体的には、糸状菌や担子菌などに由来する、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどの一電子酸化酵素の他、細菌に由来し、可溶化したリグニン化合物に対して特異的に作用する、β−エーテラーゼ、デメチラーゼ、デカルボキシラーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼなどが挙げられる。
【００１２】
本発明において、植物体内で発現させる融合タンパク質を構成するセルロース結合ドメインは、セルロース分解酵素がセルロースに結合するために有するドメインであればその由来や種類などは限定されるものではない。具体的には、セルロソーム、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼなどが有するセルロース結合ドメインが挙げられる。こうしたセルロース分解酵素は、各種の微生物が生産する。セルロース分解酵素を生産する微生物としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｃｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｕｍｏｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｕｄａ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｔｒｈｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅ  ｓｏｒｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓなどが挙げられる。
【００１３】
リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの間にはＨｉｎｇｅ領域を存在させることが望ましい。Ｈｉｎｇｅ領域はリグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの間のリンカーとしてリグニン分解酵素の活性発現に寄与する。Ｈｉｎｇｅ領域の具体例としては、セルロース分解菌であるＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉが産生するエンドグルカナーゼがドメイン間リンカーとして有するＰＴ配列（必要であれば例えばＱｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００８，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．２８−３６やＹｅｈ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．１１６，ｐｐ．２３３−２４４やＧｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８９，ｖｏｌ．２４４，ｐｐ．１２７−１３１やＧｒｅｅｎｗｏｏｄ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９２，ｖｏｌ．５，ｐｐ．３６１−３６５やＸｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，ｖｏｌ．１３５，ｐｐ．３１９−３２５などを参照のこと）が挙げられる。Ｈｉｎｇｅ領域は、セロビオヒドロラーゼが有するドメイン間リンカー（必要であれば例えばＴａｋｋｉｎｅｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９１，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７−８４１を参照のこと）やＭ１３ｐｈａｇｅ由来のＬＨＳリンカー（必要であれば例えばＬｅｖｙ  Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｐ．Ｓｃｉ．，２００１，ｖｏｌ．７，ｐｐ．５０−５７を参照のこと）などであってもよい。
【００１４】
リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質の植物体内での発現は、例えばリグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させるための遺伝子構築物を含むベクターを使用して遺伝子構築物を植物体内に導入することで行うことができる。リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を植物体内で発現させるための遺伝子構築物を含むベクターは、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を体内で発現させたい植物の種類や遺伝子構築物の植物体内への導入方法などに応じて、自体公知の遺伝子工学的手法によって作製することができる。遺伝子構築物の植物体内への導入は、例えばベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ  ＥＨＡ１０１株などのアグロバクテリウムに導入した後、ベクターを保持したアグロバクテリウムを植物に感染させることで行うことができる（必要であれば例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）やＨｉｅｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．２０１−２１８などを参照のこと）。
【００１５】
本発明によれば、リグニン分解酵素とセルロース結合ドメインの融合タンパク質を体内で発現させることによって植物に含まれるリグニンを分解することで、その含量を効果的に低減することができる。よって、リグノセルロースの糖化効率を向上させることできるので、バイオマスとしてリグノセルロースを効率的に利用することができる。なお、リグノセルロースはあらゆる高等植物に含まれているので、本発明はあらゆる高等植物に適用することができるが、中でも、バイオマスとしての有効利用が期待されている、イネ、ススキ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、ポプラ、ユーカリなどに適用することが望ましい。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１７】
（１）ラッカーゼ−セルロース結合ドメイン融合タンパク質（Ｌａｃ−ＣＢＤ）発現ベクターの作製
ラッカーゼ（Ｌａｃ）はＴｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ由来のＬａｃＩＩＩをコードする遺伝子ｃｖＬ３を使用した。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ由来のＣＢＤをコードする遺伝子領域（ｃｂｄ）を使用した。ｃｖＬ３とｃｂｄの連結はオーバーラップＰＣＲにより行った。まず、Ｌａｃについて、ｐＴ７ＧＰＴＬａｃ（Ｋａｊｉｔａ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００４，ｖｏｌ．６６，ｐｐ．１９４−１９９）を鋳型として、配列番号１で表される５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣ−３’と配列番号２で表される５’−ＴＴＧＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＣＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＣＧＣＴＣＧＧＧＴＣＧＡＧＣＧＣＡＴＣＧＴＡＧ−３’からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。また、ＣＢＤについて、ｐＥＴ３５ｂ（＋）（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を鋳型として、配列番号３で表される５’−ＡＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＴＡＡＣ−３’と配列番号４で表される５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴ−３’からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。次に、これらの２種類のＤＮＡ断片に、配列番号１で表される５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣ−３’と配列番号４で表される５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＴ−３’からなるプライマーセットを用いてオーバーラップＰＣＲを行い、２つのＤＮＡ断片が連結された約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。こうして得られた約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化し、ｐＵＣ１１８（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ．Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）にクローニングすることでｐＣＳ００３を構築した。続いて、ｃｖＬ３とｃｂｄの間のＨｉｎｇｅ領域として、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ  Ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ  Ａ由来のＰＴ配列（Ｑｉ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２００８，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．２８−３６）を選択し、配列番号５で表される５’−ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣ−３’と配列番号６で表される５’−ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＧＧＴ−３’からなるオリゴヌクレオチドを混合して互いにアニールさせた後ポリメラーゼ反応を行い、約０．１ｋｂｐのＤＮＡ断片（５’−ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴ−３’：配列番号７）を調製した。得られたＤＮＡ断片をＮｏｔＩで消化し、同様にＮｏｔＩで消化したｐＣＳ００３と連結し、ｐＣＳ００４を構築した��ｐＣＳ００４をＢａｍＨＩで消化して得られる約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、イネにおける高発現プロモーターとして知られているトウモロコシ由来のユビキチンプロモーターを遺伝子発現プロモーターとして使用した、バイナリーベクターｐＢＵＨ４（Ｎｉｇｏｒｉｋａｗａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｉｃｅ，Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ，２０１２）に連結し、Ｌａｃ−ＣＢＤを発現するｐＣＳ００５を構築した（図１）。
【００１８】
（２）イネの形質転換
ｐＣＳ００５とｐＢＵＨ４をそれぞれ使用してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０１株を形質転換した。形質転換は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）に記載のエレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換方法に準じて行った。得られたアグロバクテリウム形質転換体を介してイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）台中６５号を形質転換した（Ｈｉｅｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．２０１−２１８）。形質転換イネは隔離温室（自然光、２７℃）で栽培した。その結果、Ｌａｃ−ＣＢＤをコードする遺伝子がゲノムに挿入された形質転換イネを７系統獲得した。
【００１９】
（３）形質転換イネの稈のラッカーゼ活性の測定
乳鉢を用いて十分にすりつぶした形質転換イネ（ｐＣＳ００５使用個体７系統、コントロール（ｐＢＵＨ４）使用個体１系統）の稈を、６０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、氷中で１０分間静置した。遠心分離により上清を回収し、回収した上清をＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３０Ｋ（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いて濃縮した溶液を粗酵素液とした。この粗酵素液から調製した１０μｇのタンパク質を含む６０ｍＭ酢酸緩衝液４５０μＬにカタラーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）５μＬを加え、２５℃で３時間静置した。続いて、１０ｍＭの２，２−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）溶液を５０μＬ添加して混合した後、さらに２５℃で２４時間静置してから、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ｐＣＳ００５を使用した３つの系統（ＣＳ００５−２，ＣＳ００５−３，ＣＳ００５−４）のそれぞれから調製した粗酵素液を用いた実験結果を図２に示す。図２から明らかなように、いずれの系統においてもコントロールよりも高いラッカーゼ活性が検出された。中でもＣＳ００５−４は高いラッカーゼ活性を示した。
【００２０】
（４）形質転換イネの稈のリグニン含量の測定
形質転換イネの稈の細胞壁を、石井らにより報告された方法（２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２６，１６９８−１７０５）を改良して調製した。稈を粉砕し８０％エタノールに懸濁して５分間静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を再度８０％エタノールに懸濁して５分間静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を９５％エタノールに懸濁して５分間静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を１００％エタノールに懸濁して５分間静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物をクロロホルム−メタノール（１：１、ｖ／ｖ）溶液に懸濁して５分間静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を脱水アセトンに懸濁して５分間静置した後、遠心分離により沈殿物を回収した。得られた沈殿物を十分に乾燥し、細胞壁画分とした。この細胞壁画分を２Ｍ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＦＡ）に懸濁した後１２１℃で１時間処理し、ヘミセルロースなどの非結晶性多糖を加水分解して可溶化した。ＴＦＡに不溶性の残渣を濃度が７２％（ｗｔ／ｗｔ）の硫酸に懸濁して室温で２時間静置した後、純水を用いて硫酸濃度を３％（ｗｔ／ｗｔ）に希釈した。３％硫酸懸濁液を１００℃で３時間処理し、結晶性セルロースを加水分解して可溶化した。３％硫酸に不溶性の残渣を１０５℃で１２時間以上処理してから乾燥させ、乾燥重量を測定した。乾燥した残渣を７５０℃で６時間処理し、得られた残渣量（灰分量）を測定し、揮発して減少した重量分をリグニン量（Ｋｌａｓｏｎリグニン量）とした。ｐＣＳ００５を使用した３つの系統（ＣＳ００５−２，ＣＳ００５−３，ＣＳ００５−４）のそれぞれについてのリグニン含量の測定結果を図３に示す。図３から明らかなように、いずれの系統においてもリグニン含量はコントロールよりも少なかったが、ラッカーゼ活性が高い系統ほど、リグニン含量は少なかった。
【００２１】
（５）まとめ
以上の結果から、本発明によれば、セルロース結合ドメインと融合させたリグニン分解酵素を植物体内で発現させることで、植物に含まれるリグニン量を効果的に低減することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、植物に含まれるリグニン量を効果的に低減する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2013179877.tif 000003
【図２】
2013179877.tif 000004
【図３】
2013179877.tif 000005
【配列表】
2013179877000001.app