(57)【要約】【課題】新規作用機序に基づく抗がん剤の創出ないし開発に有用な手段を提供することを課題とする。【解決手段】以下のステップ、即ち、（１）プロモーターと、該プロモーターの制御下にある再構成Bim遺伝子であって、Bim遺伝子のエクソン２〜４にイントロンを介してBim遺伝子のエクソン５が連結しており、前記エクソン４には終止コドンが導入されている再構成Bim遺伝子と、該再構成Bim遺伝子の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子と、を含む組換えプラスミドを導入した細胞を用意するステップ；（２）前記細胞を被験物質の存在下で培養するステップ：（３）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップ；及び（４）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇を認めることが有効性の指標となるステップを含む、抗がん剤のスクリーニング法が提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（４）を含む、抗がん剤のスクリーニング法：
（１）プロモーターと、該プロモーターの制御下にある再構成Bim遺伝子であって、Bim遺伝子のエクソン２〜４にイントロンを介してBim遺伝子のエクソン５が連結しており、前記エクソン４には終止コドンが導入されている再構成Bim遺伝子と、該再構成Bim遺伝子の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子と、を含む組換えプラスミドを導入した細胞を用意するステップ；
（２）前記細胞を被験物質の存在下で培養するステップ：
（３）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップ；
（４）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇を認めることが有効性の指標となるステップ。
【請求項２】
前記イントロンが、Bim遺伝子のエクソン４とエクソン５の間に存在するネイティブのイントロン又はその一部である、請求項１に記載のスクリーニング法。
【請求項３】
レポーター遺伝子がGFP遺伝子、改変型GFP遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１又は２に記載のスクリーニング法。
【請求項４】
前記イントロンが配列番号２の配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
【請求項５】
終止コドンの導入された前記エクソン４が配列番号１１の配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
【請求項６】
前記再構成Bim遺伝子が配列番号１２の配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
【請求項７】
前記細胞がヒト神経芽細胞腫細胞株、ヒト肝がん細胞株、ヒト乳癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株、ヒトメラノーマ細胞株又はヒト免疫系細胞株である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
【請求項８】
ステップ（３）における検出を、前記レポーター遺伝子の発現産物に特異的な抗体を用いて行う、請求項１〜７のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
【請求項９】
プロモーターと、該プロモーターの制御下にある再構成Bim遺伝子であって、Bim遺伝子のエクソン２〜４にイントロンを介してBim遺伝子のエクソン５が連結しており、前記エクソン４には終止コドンが導入されている再構成Bim遺伝子と、該再構成Bim遺伝子の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子と、を含む組換えプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬剤候補化合物をスクリーニングする方法に関する。詳しくは、アポトーシス促進因子Bimのスプライシングパターン変化を指標にしたスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床の場で使用されている多くの抗がん剤は、DNAの合成や複製を阻害し、細胞増殖を抑制することにより効果を発揮する。近年、mRNAのスプライシングを制御する因子を阻害する化合物が抗がん作用を有していることが報告され（非特許文献１、２）、スプライシング制御は抗がん剤の新たな創薬ターゲットとして期待されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Kotake, Y. et al., Nat. Chem. Biol. 3, 570-575 (2007)
【非特許文献２】Kaida, D. Nat. Chem. Biol. 3, 576-583 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
がんは現在においても死因の第一位の疾患であり、今後もがん患者は増加すると予想されている。それゆえ、より治療効果の高い抗がん剤の開発は急務な課題となっている。新規作用機序に基づく抗がん剤には、従来の抗がん剤に抵抗性を示すがんの治療への利用や、既存の抗がん剤との併用による効果の増強などが期待できる。そこで本発明は、新規作用機序に基づく抗がん剤の創出ないし開発に有用な手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
アポトーシスにより細胞が死に至る過程では、ミトコンドリアに存在し、アポトーシスに対して促進的に働くBH3-onlyタンパク質（Bimなど）が重要な役割を担っている。Bimには複数のバリアント（BimEL, BimL, BimSなど）が存在しており、これらのバリアントはBim mRNA前駆体から選択的スプライシングにより産生される。本発明者らの研究グループは、亜鉛によりBimのスプライシングパターンが変化し、アポトーシス活性が最も強いBimSの産生が亢進することを明らかにしている（第33回日本分子生物学会年会、第83回日本生化学会大会合同学会）。近年、BimSの選択的発現亢進はがん細胞のアポトーシスを促進することが報告されたことから、この分子機構の解明は抗がん剤の開発にもつながると考えられる。
【０００６】
本発明者らは、これまでの研究成果を踏まえ、Bimのスプライシングパターン変化に着目して検討を進めた。その結果、Bimの複雑なスプライシング過程をシンプルに再現することが可能であり、且つBimS選択的な発現を可能にする再構成Bim遺伝子の構築に成功した。当該再構成Bim遺伝子を用いればBimのスプライシングバリアントのうちBimSの産生のみを検出できることから、Bimのスプライシング過程に影響を及ぼす化合物（特に、BimSの優先的な発現を促す化合物）を特異的且つ簡便に同定することが可能になる。
【０００７】
以下に示す本発明は、主として上記成果に基づくものである。
［１］以下のステップ（１）〜（４）を含む、抗がん剤のスクリーニング法：
（１）プロモーターと、該プロモーターの制御下にある再構成Bim遺伝子であって、Bim遺伝子のエクソン２〜４にイントロンを介してBim遺伝子のエクソン５が連結しており、前記エクソン４には終止コドンが導入されている再構成Bim遺伝子と、該再構成Bim遺伝子の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子と、を含む組換えプラスミドを導入した細胞を用意するステップ；
（２）前記細胞を被験物質の存在下で培養するステップ：
（３）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップ；
（４）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇を認めることが有効性の指標となるステップ。
［２］前記イントロンが、Bim遺伝子のエクソン４とエクソン５の間に存在するネイティブのイントロン又はその一部である、［１］に記載のスクリーニング法。
［３］レポーター遺伝子がGFP遺伝子、改変型GFP遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子である、［１］又は［２］に記載のスクリーニング法。
［４］前記イントロンが配列番号２の配列を含む、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
［５］終止コドンの導入された前記エクソン４が配列番号１１の配列を含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
［６］前記再構成Bim遺伝子が配列番号１２の配列を含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
［７］前記細胞がヒト神経芽細胞腫細胞株、ヒト肝がん細胞株、ヒト乳癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株、ヒトメラノーマ細胞株又はヒト免疫系細胞株である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
［８］ステップ（３）における検出を、前記レポーター遺伝子の発現産物に特異的な抗体を用いて行う、［１］〜［７］のいずれか一項に記載のスクリーニング法。
［９］プロモーターと、該プロモーターの制御下にある再構成Bim遺伝子であって、Bim遺伝子のエクソン２〜４にイントロンを介してBim遺伝子のエクソン５が連結しており、前記エクソン４には終止コドンが導入されている再構成Bim遺伝子と、該再構成Bim遺伝子の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子と、を含む組換えプラスミド。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ウエスタンブロットの結果。Bimミニ遺伝子由来のEGFP融合タンパク質の発現が亜鉛の曝露によって変化することを示す。C：コントロール、Zn：亜鉛曝露、BimEL-EGFP：BimELバリアントのEGFP融合タンパク質、BimL-EGFP：BimLバリアントのEGFP融合タンパク質、BimS-EGFP：BimSバリアントのEGFP融合タンパク質。
【図２】BimS選択的ミニ遺伝子の構造と翻訳産物を模式的に示す図。
【図３】ウエスタンブロットの結果。BimS（EGFP融合タンパク質）の産生のみを検出できることがわかる。C：コントロール、Zn：亜鉛曝露、BimS-EGFP：BimSバリアントのEGFP融合タンパク質。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明はBimのスプライシングパターン変化を指標にした、抗がん剤のスクリーニング法を提供する。BimはBH3-onlyタンパク質の一つであり、アポトーシス促進因子として知られている。Bim遺伝子からは、選択的スプライシングの結果、複数のバリアントが発現する。本発明では、レポーター遺伝子を利用してバリアントの一つであるBimSの発現を特異的に検出し、その結果に基づいて被験物質の抗がん剤としての有効性を判定する。
【００１０】
本発明において「がん」は広義に解釈される。従って、様々な「がん」に対する治療薬又は予防薬の開発に本発明を適用可能である。がんはその発生の母体となった臓器の名、もしくは発生母組織の名で呼ばれ、主なものを列記すると、舌癌、歯肉癌、咽頭癌、上顎癌、喉頭癌、唾液腺癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、胆嚢癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、副腎癌、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、子宮癌、卵巣癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、尿道癌、網膜芽細胞腫、結膜癌、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、睾丸腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫などである。
【００１１】
本発明のスクリーニング法では以下のステップ（１）〜（４）を行う。
（１）プロモーターと、該プロモーターの制御下にある再構成Bim遺伝子であって、Bim遺伝子のエクソン２〜４にイントロンを介してBim遺伝子のエクソン５が連結しており、前記エクソン４には終止コドンが導入されている再構成Bim遺伝子と、該再構成Bim遺伝子の下流にインフレームで連結したレポーター遺伝子と、を含む組換えプラスミドを導入した細胞を用意するステップ
（２）前記細胞を被験物質の存在下で培養するステップ
（３）前記レポーター遺伝子の発現を検出するステップ
（４）検出結果に基づき被験物質の有効性を判定するステップであって、前記レポーター遺伝子の発現レベルの上昇を認めることが有効性の指標となるステップ
【００１２】
ステップ（１）では、再構成Bim遺伝子を含む組換えプラスミドを導入した細胞を用意する。再構成Bim遺伝子とは、遺伝子工学的手法を利用して調製される遺伝子であり、Bim遺伝子のエクソン２〜４とエクソン５を含む。詳しくは、Bim遺伝子のエクソン２〜４にイントロンを介してBim遺伝子のエクソン５が連結した構造を再構成Bim遺伝子は備え、エクソン４には終止コドンが導入されている。終止コドンの導入により、BimS以外のスプライシングバリアントについては途中で翻訳が停止し、BimSのみがレポーター遺伝子の発現産物との融合タンパク質として発現することになる（図２を参照）。この特徴に因み、本発明に使用する再構成Bim遺伝子をBimS選択的ミニ遺伝子とも呼称する。エクソン４における終止コドンの導入位置は、スプライシング機構に影響を与えない限りにおいて特に限定されない。好ましくは、スプライシング機構に重要と考えられる、エクソン４の5'末端側１〜３０塩基と3'末端側１〜４０塩基以外の領域に終止コドンを導入する。
【００１３】
エクソン４とエクソン５の間に介在するイントロンとしては、Bim遺伝子のエクソン４とエクソン５の間に存在するネイティブのイントロン（配列番号１）又はその一部を採用することが好ましい。ここでの一部の例は、ネイティブのイントロンの中央領域を欠落させたものである。ここでの中央領域の始点は例えば当該イントロンの100番目の塩基〜7000番目の塩基であり、同終点は例えば18904番目の塩基〜25754番目の塩基である（換言すれば、5'末端側の100塩基〜7000塩基と3'末端側の150塩基〜7000塩基が連結されたものが「イントロンの一部」として採用され得る）。好ましくは、ネイティブのイントロンの5'末端側100塩基〜500塩基と、3'末端側150塩基〜500塩基を連結させたもの（当該構成のイントロンの配列の例を配列番号２に示す。尚、当該配列はEco RI部位を含む。）を採用する。尚、BimS選択的ミニ遺伝子において適切な選択的スプライシングが生ずる限りにおいて、上記以外のイントロン（例えば他の遺伝子由来のイントロン）を用いることもできる。
【００１４】
エクソン２〜４、エクソン５及びイントロン以外の要素（例えばBim遺伝子のエクソン１やエクソン６、Bim遺伝子のエクソン１とエクソン２の間に存在するイントロン、Bim遺伝子のエクソン５とエクソン６の間に存在するイントロン）をBimS選択的ミニ遺伝子が含んでいても良い。
【００１５】
ここで、公共のデータベースに登録されているBim遺伝子（genomic DNA, Chromosome 2-NC_000002.11; mRNA, NM_138621.4）の各エクソンの配列を配列番号３（エクソン１）、配列番号４（エクソン２）、配列番号５（エクソン３）、配列番号６（エクソン４）、配列番号７（エクソン５）、配列番号８（エクソン６）に示す。同様に、Bim遺伝子のエクソン１とエクソン２の間に存在するイントロンの配列を配列番号９に、Bim遺伝子のエクソン５とエクソン６の間に存在するイントロンの配列を配列番号１０にそれぞれ示す。また、終止コドンが導入されたエクソン４の配列の具体例を配列番号１１に、BimS選択的ミニ遺伝子の具体例の配列を配列番号１２にそれぞれ示す。
【００１６】
BimS選択的ミニ遺伝子はプロモーターの制御下にある。ここで「プロモーター」とは、その制御下にある遺伝子の転写の開始を調節する機能領域のことをいう。また、「制御下」とは「支配下」と同義であり、プロモーターと目的遺伝子（本発明ではBimS選択的ミニ遺伝子）が機能的に連結していることを意味する。プロモーターの制御下に目的遺伝子が配置されることによって、当該遺伝子の転写がプロモーターの制御（調節）を受ける。典型的にはプロモーターに目的遺伝子が直接連結されるが、目的遺伝子がプロモーターに転写制御される限りにおいて、プロモーターと目的遺伝子の間に他の配列が介在していてもよい。
【００１７】
プロモーターとして、CMV-IE（サイトメガロウイルス初期遺伝子由来プロモーター）、CAGプロモーター（サイトメガロウイルスのエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターを連結させた構造を有する）、SV40ori、レトロウイルスLTP、SRα、EF1α、βアクチンプロモーター等を例示できる。アセチルコリンレセプタープロモーター、エノラーゼプロモーター、L7プロモーター、ネスチンプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、ケラチンプロモーター、インスリンプロモーター等、組織特異的プロモーターを使用してもよい。
【００１８】
BimS選択的ミニ遺伝子の下流にはインフレームでレポーター遺伝子が連結している。当該構成により、BimSとレポーター遺伝子の発現産物が融合したタンパク質が生ずることになる（図２を参照）。レポーター遺伝子としては、GFP（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、改変型GFP遺伝子（例えばEGFP遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子（ホタルルシフェラーゼ遺伝子、細菌ルシフェラーゼ遺伝子、レニラ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子、フォチヌス（Photinus）ルシフェラーゼ遺伝子等）を用いることができる。
【００１９】
本発明に使用する組換えプラスミドは、例えば、ヒトゲノムDNAから調製したBimS選択的ミニ遺伝子を発現用プラスミドに挿入することによって得ることができる。発現用プラスミドは、使用する細胞との関係を考慮して選択すればよい。現在、各種細胞について種々の発現用プラスミドが入手可能な状態にある。発現用プラスミドの例を挙げれば、pEGFP-N1ベクター（Clontech社）、pDsRed2-N1ベクター（Clontech社）、pGL4.51ベクター（Promega社）である。組換え操作（BimS選択的ミニ遺伝子、プロモーター、レポーター遺伝子等の発現用プラスミドへの挿入等）には、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた方法やPCRを利用した方法等、標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる）を利用することができる。
【００２０】
細胞としては、ヒト神経芽細胞腫細胞株、ヒト肝がん細胞株、ヒト乳癌細胞株、ヒト大腸癌細胞株、ヒトメラノーマ細胞株、ヒト免疫系細胞株等を採用することができる。
【００２１】
細胞への組換えプラスミドの導入、即ちトランスフェクションには、リポフェクション(Felgner, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7413-7417(1987))やエレクトロポレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))等を利用すればよい。トランスフェクション用の各種試薬やキットが市販されており、それらを利用すれば簡便にトランスフェクションを実施することができる。
【００２２】
本発明では、以上のようにして用意した細胞を被験物質の存在下で培養する（ステップ（２））。被験物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被験物質を含まない培養液で培養を開始した後、ある時点で被験物質を添加することにしても、予め被験物質を含む培養液で培養を開始することにしてもよい。培養条件は使用する細胞に標準的なものを採用すればよい。尚、ステップ（２）はin vitroで行われる。
【００２３】
ステップ（２）に続くステップ（３）では、被験物質存在下で培養した後の細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検出する。そして、検出結果に基づき被験物質の有効性を判定する（ステップ（４））。具体的には、被験物質の存在下で培養したことによってレポーター遺伝子の発現レベルが上昇した場合は、被験物質がBimSの発現を促進したと判断し、被験物質が有効であると判定する。複数の被験物質を用いた場合には、発現レベルの上昇の程度を比較し、各被験物質の有効性を評価することができる。有効性が認められた複数の被験物質を用いて再度ステップ（２）及び（３）を行い、有効性の高い物質の絞り込みを行うことにしてもよい。
【００２４】
レポーター遺伝子の発現は常法で検出すればよい。例えば、GFP遺伝子等、その発現産物が蛍光を発する場合には、蛍光の検出によって発現の検出、評価が可能である。ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として採用すれば、より高感度の検出が可能となる。尚、レポーター遺伝子の発現産物に特異的な抗体を用いた免疫学的手法（例えばウエスタンブロット）によってもレポーター遺伝子の発現を検出することが可能である。
【００２５】
被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。また、既存の薬剤を被験物質としてもよい。２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。
【００２６】
基準（対照）との比較によって被験物質の有効性を判定することが好ましい。基準として、典型的には、被験物質の非存在下で細胞を培養した場合のレポーター遺伝子の発現レベル（陰性対照）が用いられる。このような陰性対照との比較に基づき判定すれば、判定結果の客観性、信頼性、正確性等が向上する。陰性対照を用いた場合、典型的には、陰性対照に比較して発現レベルが高いときに、被験物質がBimSの選択的発現を誘導する活性を示すと判定する。一方、有効性が確認された物質を添加した場合のレポーター遺伝子の発現レベルを基準（陽性対照）として採用することもできる。このような陽性対照を用いれば、特定の物質の有効性を基準に被験物質の有効性を判定することが可能となる。このような評価方法は、より有効性の高い物質を選抜するときに特に有効といえる。尚、二つ以上の基準を併用してもよい。
【００２７】
レポーター遺伝子の発現の検出を経時的に行い、培養開始からの経過時間の異なる複数の検出結果を得ることにしてもよい。この場合には、得られた複数の検出結果に基づき被験物質の有効性を判定する。このような経時的な検出及び判定によれば、被験物質の作用に関して有益な多くの情報（例えば持続時間や、作用メカニズムの理解に役立つ情報）を得ることができる。
【００２８】
一方、被験物質の添加濃度が異なる複数の試験群を設定してステップ(２)〜（３）を行うことにしてもよい。この場合、ステップ（４）では各試験群の検出結果を比較して被験物質の有効性を判定する。このようにすれば、例えば濃度依存性など、被験物質の有効性に関してより詳細な情報を得ることができる。
【実施例】
【００２９】
抗がん剤の新規スクリーニング法の開発を目指し、以下の実験を行った。
１．方法
（１）試薬
ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle medium: DMEM)は日水製薬株式会社、ペニシリン、ストレプトマイシンは明治製菓株式会社、ウシ胎児血清(fetal calf serum: FCS)、リポフェクタミン試薬はInvitrogen社、耐熱性DNAポリメラーゼは東洋紡株式会社、抗Bim抗体はCell signaling technology社、硫酸亜鉛、ピリチオンは和光純薬工業株式会社より購入した。その他の試薬は市販の特級品を用いた。
【００３０】
（２）SH-SY5Y細胞の培養と薬剤の添加
ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を使用した。細胞培養には、10% FCS、0.1 mg/mL ストレプトマイシン、100 unit/mL ペニシリンを含むDMEMを使用し、37℃、5% CO2条件下でSH-SY5Y細胞を培養した。細胞への亜鉛曝露は、亜鉛イオノファのピリチオン(1μM)の存在下で行った。
【００３１】
（３）Bimミニ遺伝子の作製
ヒトゲノムDNAを鋳型とし、エクソン2からエクソン4の3'末端側に隣接するイントロンの一部の領域まで（Ex2/4-Int）と、エクソン5の5'末端側に隣接したイントロンの一部からエクソン5の領域まで（Int-Ex5）を、それぞれPCR法により増幅した。Ex2/4-Intの増幅には、Ex2センスプライマー 5'-GGCTCGAGGCCACCATGGCAAAGCAACCTTCTGA-3'（配列番号１３）（Xho I部位およびKozak配列（GCCACC）を含む）およびIntアンチセンスプライマー 5'-GTGAATTCGTTTGATAGTTTGACACATC-3'（配列番号１４）（Eco RI部位を含む）を使用し、Int-Ex5の増幅には、Intセンスプライマー 5’-GTGAATTCTCTTATTCTTTAACCAGAGT-3’（配列番号１５）（Eco RI部位を含む）およびEx5アンチセンスプライマー 5’-ACGGATCCCTCCTTGCATAGTAAGCGT-3’（配列番号１６）（Bam HI部位を含む）を使用した（アンダーラインは制限酵素部位）。Ex2/4-IntおよびInt-Ex5を制限酵素Xho I/Eco RIおよびEco RI/Bam HIでそれぞれ消化し、pBluescript SK(-)（Stratagene社）にそれぞれサブクローニングした（pBluescript Ex2/4-IntおよびpBluescript Int-Ex5）。その後、pBluescript Int-Ex5から切り出したInt-Ex5をpBluescript Ex2/4-Intにサブクローニングし、2つのDNA断片を結合させたBimミニ遺伝子（pBluescript Bim-mini gene）を作製した。次にpBluescript Bim-mini geneから切り出したBimミニ遺伝子をpEGFP-N1 ベクター（Clontech社）のXho I/Bam HI部位にインフレーム（in frame）で挿入し、Bim-EGFPミニ遺伝子を構築した。
【００３２】
（４）BimS選択的ミニ遺伝子の作製
エクソン4への終止コドンの導入は、PCR法を利用して行った。pBluescript Bim-mini geneを鋳型として、Ex2センスプライマーおよびmutアンチセンスプライマー 5’-TGGGGTTTATGTTGATTTGTC-3’（配列番号１７）（アンダーラインは変異部位G>A）を使用しDNAフラグメントmut1を、mutセンスプライマー 5’-GACAAATCAACATAAACCCCA-3’（配列番号１８）（アンダーラインは変異部位C>T）およびEx5アンチセンスプライマーを使用しDNAフラグメントmut2を増幅した。その後、精製したmut1およびmut2の各フラグメントを等量ずつ混ぜ合わせたものを鋳型とし、Ex2センスプライマーおよびEx5アンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、2つのフラグメント結合させたBimS選択的ミニ遺伝子を調製した。その後、BimS選択的ミニ遺伝子をXho I /Bam HIで消化し、pEGFP-N1ベクターのXho I/Bam HI部位にインフレーム（in frame）で挿入し、BimS選択的ミニ遺伝子をEGFPと融合させた発現ベクター（配列番号１２の配列からなるBimS選択的ミニ遺伝子を含む）を構築した。
【００３３】
（５）トランスフェクション
SH-SY5Y細胞(1.5×106/6 cm培養皿)へのプラスミドのトランスフェクションは、リポフェクタミン2000（Invitrogen社）を用いて行った。トランスフェクションから9時間後に培地を交換し、その後、細胞に硫酸亜鉛を曝露（15時間）した。
【００３４】
（６）細胞抽出液の調製
細胞を冷PBSで2回洗浄した後、細胞溶解液(10 mM NaF、1 mM Na3VO4、20 mM β-glycerophosphate、1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride、5μg/mL leupeptin、1 mM DTT、0.1% TritonX-100を含むTris-HCl緩衝液（pH7.8）)を添加（150μL/6 cm培養皿）し回収した。回収した細胞を5〜10分おきに撹拌しながら氷上に30分放置し、細胞を可溶化した。その後、可溶化した細胞を遠心(18,000×g、10分、4℃)し、得られた上清を細胞抽出液とした。
【００３５】
（７）ウエスタンブロット
細胞抽出液(30μg)を12% ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、PVDF膜に転写した。ブロッキング溶液(1% BSAを含むPBS)を用いて、室温で1時間 、PVDF膜をブロッキングした。その後、PVDF膜を抗Bim抗体（1,000倍希釈）と4℃で一晩反応させた。0.1% Tween20を含むPBS(T-PBS)で5分おきに3回洗浄した後、PVDF膜をビオチン標識2次抗体（2,000希釈）と室温で1時間反応させた。T-PBSで5分おきに3回洗浄した後、PVDF膜をアビジン標識ペルオキシダーゼ（5,000倍希釈）と室温で30分間反応させた。T-PBSで5分おきに3回洗浄した後、化学発光法によりBimの検出を行った。
【００３６】
２．結果
本スクリーニング系の開発では、細胞レベルでBimのスプライシング変化をモニターするためにBimミニ遺伝子を利用する。Bimミニ遺伝子はヒトゲノムDNAから単離したBim遺伝子の一部からなる。本検討ではBimミニ遺伝子をEGFPベクターに挿入しており、EGFPとの融合タンパク質が発現する。この遺伝子を利用することで、核内で起きる内因性のBim mRNA前駆体からBimS mRNAへの複雑なスプライシング過程をシンプルに再現することが可能になる。実際、亜鉛によりBimS-EGFPの発現が亢進するという結果を得ている（図１）。しかし、Bimミニ遺伝子を用いたときは、図１に示すように、すべてのBimバリアントがEGFP融合タンパク質として産生される。それゆえ、BimSの発現だけを特異的に検出することはできない。そこで、BimELおよびBimLに含まれ、BimSには含まれないエクソン（エクソン4）に終止コドンを導入し、BimS選択的ミニ遺伝子を構築した（図２）。この操作によりBimEL-およびBimL-EGFPは産生されなくなり、エクソン4を含まないBimS-EGFP mRNAからのみBimS-EGFPが発現する。Bimミニ遺伝子を改変したBimS選択的ミニ遺伝子を用いることで、BimSの産生のみを検出することが可能となる（図３）。本法を利用することで、BimSの優先的な発現という複雑なスプライシング過程に影響を及ぼす化合物を特異的かつ簡便に選択することが可能となる。また、必要に応じてEGFPを検出感度が高いルシフェラーゼに置き換えることで本スクリーニング系は高感度化にも対応可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のスクリーニング法は、アポトーシス促進因子であるBimのスプライシング変化を指標とした方法であり、本法により選択される化合物は、DNA合成・複製を標的とした従来の抗がん剤とは作用機序が全く異なる新規抗がん剤の成分又はその候補になり得る。即ち、本発明によれば、従来の抗がん剤とは異なる作用機序で薬効を示す化合物を見出すことが可能になる。従って、本発明はがん治療の選択肢を広げるものであり、がん治療に多大な貢献をする有用な技術といえる。
【００３８】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【配列表フリーテキスト】
【００３９】
配列番号１３：人工配列の説明：：Ex2センスプライマー
配列番号１４：人工配列の説明：：Intアンチセンスプライマー
配列番号１５：人工配列の説明：：Intセンスプライマー
配列番号１６：人工配列の説明：：Ex5アンチセンスプライマー
配列番号１７：人工配列の説明：：mutアンチセンスプライマー
配列番号１８：人工配列の説明：：mutセンスプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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