(57)【要約】      （修正有）【課題】エンドセリン作用抑制剤の有効成分を高濃度で含有し、エンドセリン作用抑制効果に優れる、エンドセリン作用抑制剤の製造方法、及びエンドセリン作用抑制剤の有効成分を高濃度で含有する、ナガサルオガセ抽出物の製造方法の提供。【解決手段】ナガサルオガセ（Usnea  longissima）を０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出する工程を含む、エベルン酸高含有ナガサルオガセ抽出物の製造方法、及びナガサルオガセを０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出する工程を含む、エンドセリン作用抑制剤の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナガサルオガセ（Usnea longissima）を０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出する工程を含む、エベルン酸高含有ナガサルオガセ抽出物の製造方法。
【請求項２】
前記アルコール又はアルコール溶液が１００体積％メタノールである、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記アルコール又はアルコール溶液が、含水率が１０体積％以下のエタノール溶液である、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
ナガサルオガセ（Usnea longissima）を０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出する工程を含む、エンドセリン作用抑制剤の製造方法。
【請求項５】
前記アルコール又はアルコール溶液が１００体積％メタノールである、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記アルコール又はアルコール溶液が、含水率が１０体積％以下のエタノール溶液である、請求項４記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の製造方法により得られるナガサルオガセ抽出物又はエンドセリン作用抑制剤を有効成分とする、美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドセリン作用抑制剤の製造方法及びナガサルオガセ抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリンは、内皮細胞由来のペプチドホルモンで、受容体を通して種々の細胞や組織に作用する。例えば、血管平滑筋細胞等において細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。
近年、エンドセリンが表皮メラノサイト（メラニン細胞）に対し細胞内カルシウム濃度上昇を促し、細胞内のシグナル伝達系を介して細胞増殖を促進するとともに、メラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼの活性を増強することが報告されている（非特許文献２参照）。また、エンドセリンは表皮角化細胞（ケラチノサイト）が産生するメラノサイト活性化因子の１つであること（非特許文献３）、紫外線誘導性色素沈着や老人性色素斑形成の重要な要因であることが報告されている（非特許文献４、５）。
このようなエンドセリンの生体作用から、エンドセリンの作用を抑制しうる物質は、メラニン生成や色素沈着等を抑制し、美白剤として有用である。
【０００３】
一方、ウメノキゴケ（Parmeliaceae）科サルオガセ（Usnea）属の地衣類の１種であるナガサルオガセ（Usnea longissima）の抽出物がメラニン生成阻害作用を有することが知られている（特許文献１及び２、並びに非特許文献６参照）。これに対し、ナガサルオガセ抽出物に含まれるエベルン酸が、抗発ガンプロモーション作用を有することが知られている（非特許文献７参照）。しかし、エベルン酸にメラニン生成阻害作用があることはこれまで知られておらず、神経変性疾患の治療方法、エプスタイン−バーウイルスの活性化抑制剤、脱臭剤組成物等に用いられているだけである（例えば、特許文献３〜５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平４−２８２３１９号公報
【特許文献２】特開平４−２８２３２１号公報
【特許文献３】国際公開第２００８／１０９５２１号
【特許文献４】特開平７−６９８８２号公報
【特許文献５】独国特許出願公開第２３５１８６４号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hirata  Y．et  al.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，1988，vol．154，p．868-875
【非特許文献２】Yada  Y．et  al.，J．Biol．Chem.，1991，vol．266，p．18352-18357
【非特許文献３】Imokawa  G．et  al.，J．Biol．Chem.，1992，vol．267，p．24675-24680
【非特許文献４】Imokawa  G．et  al.，J．Invest．Dermatol.，1995，vol．105，p．32-37
【非特許文献５】Kadono  S．et  al.，J．Invest．Dermatol.，2001，vol．116，p．571-577
【非特許文献６】Moo-Sung  Kim   et  al.，J．Microbiology，2007，vol．45，p．578-582
【非特許文献７】木下靖浩、「地衣類の薬理作用」、日本ペイント定期技術情報誌、1997年、第11巻、p．25-29
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エンドセリン作用抑制剤の有効成分を高濃度で含有し、エンドセリン作用抑制効果に優れる、エンドセリン作用抑制剤の製造方法の提供を課題とする。また、本発明は、エンドセリン作用抑制剤の有効成分を高濃度で含有する、ナガサルオガセ抽出物の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題に鑑み、エンドセリンの作用を抑制する新規物質を探求すべく鋭意検討を行った。その結果、下記式で表されるエベルン酸が、エンドセリンの作用によって引き起こされるメラノサイト内のカルシウム（イオン）濃度上昇の抑制効果を有することを見出した。
【０００８】
【化１】
2013166732.tif 000002
【０００９】
さらに、本発明者らは、高含有のエベルン酸を含む抽出物が効率的に得られる、ナガサルオガセの抽出条件について検討を行った。非特許文献６では、抽出溶媒としてメタノールを用いてナガサルオガセを７０〜８０℃という高温で抽出し、ろ過後の濃縮を５０℃で行っている。しかし、このような高温条件下でナガサルオガセを処理すると、エベルン酸のアルコール分解が起こり、エベルン酸の収量が大きく低下することを見出した。さらに、特許文献１及び特許文献２には、抽出溶媒としてメタノール等のアルコールを用いて、ナガサルオガセを低温で抽出することが記載されている。しかし、含水率の高いアルコール溶液を抽出溶媒として用いた場合、エベルン酸の加水分解により、エベルン酸の収量が大きく低下することを見出した。このような結果から、含水率の低いアルコール又はアルコール溶液を抽出溶媒として用いて、ナガサルオガセを低温で抽出することにより、エンドセリンの作用によって引き起こされるメラノサイト内のカルシウム（イオン）濃度上昇を効果的に抑制するエベルン酸を高濃度で含有するナガサルオガセ抽出物が得られるとの知見を得た。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、ナガサルオガセを０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出する工程を含む、エベルン酸高含有ナガサルオガセ抽出物の製造方法に関する。
また、本発明は、ナガサルオガセを０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出する工程を含む、エンドセリン作用抑制剤の製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記製造方法により得られるナガサルオガセ抽出物又はエンドセリン作用抑制剤を有効成分とする、美白剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のエンドセリン作用抑制剤の製造方法は、エンドセリン作用抑制剤の有効成分であるエベルン酸を高濃度で含有し、エンドセリン作用抑制効果に優れる、エンドセリン作用抑制剤を製造することができる。また、本発明のナガサルオガセ抽出物の製造方法は、エンドセリン作用抑制剤の有効成分であるエベルン酸を高濃度で含有するナガサルオガセ抽出物を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の製造方法において、抽出溶媒として含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて、０℃以上２０℃未満の温度でナガサルオガセの抽出を行う。当該方法により、含水率の高いアルコール溶液を用いた場合や、２０℃以上の温度で抽出する場合と比べ、エンドセリン作用抑制効果を有するエベルン酸を高濃度で含有するナガサルオガセ抽出物及びエンドセリン作用抑制剤が得られる。
【００１３】
本明細書において、「エベルン酸高含有ナガサルオガセ抽出物」とは、本発明で規定する抽出条件下で抽出して得られるナガサルオガセ抽出物中のエベルン酸含有量が、本発明で規定する抽出条件以外の条件下で抽出して得られる抽出物中のエベルン酸含有量よりも多いことを意味する。例えば、後述の実施例で示すように、本発明における抽出温度条件下（０℃以上２０℃未満の温度）で抽出を行う場合、抽出溶媒として含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて得られるナガサルオガセ抽出物は、含水率が１０体積％よりも高いアルコール溶液を用いて得られるナガサルオガセ抽出物と比べて、エベルン酸の含有量が上昇する。同様に、本発明で用いる抽出溶媒（含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液）を用いて抽出を行う場合、抽出温度を０℃以上２０℃未満としたときに得られるナガサルオガセ抽出物は、抽出温度を２０℃以上としたときに得られるナガサルオガセ抽出物と比べて、エベルン酸の含有量が上昇する。
このように、抽出温度及び抽出溶媒のいずれか一方の条件を本発明で規定する条件とし、他方の条件も本発明で規定する条件としたときに得られるナガサルオガセ抽出物中のエベルン酸の含有量が、他方の条件は本発明で規定する条件以外の条件としたときと比較して高いものであれば、本発明で規定する抽出条件下で得られるナガサルオガセ抽出物は本明細書における「エベルン酸高含有ナガサルオガセ抽出物」に含むものとする。
【００１４】
前記ナガサルオガセ抽出物において、エベルン酸は塩の形態で存在してもよい。エベルン酸の塩としては特に限定されないが、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン等のアルキルアミン塩及び４級アンモニウム塩、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン等のアルカノールアミン塩、又はリジン、ヒスチジン、アルギニン等のアミノ酸塩などが挙げられ、好ましくは、アルカリ金属塩、アルカノールアミン塩、アミノ酸塩である。
【００１５】
本発明で用いるナガサルオガセは、ウメノキゴケ（Parmeliaceae）科サルオガセ（Usnea）属の地衣類の１種である。本発明では、天然に存在するナガサルオガセを採取して用いてもよいし、市販品を入手して用いてもよい。
本発明において、ナガサルオガセの全ての任意の部位（全体、全草、地衣体、枝状体、葉状体、子実体等）を用いることができ、各部位を複数組み合わせて用いてもよい。
本発明に用いるナガサルオガセは、天然に存在するそのままの状態でもよいが、本発明における抽出温度が比較的低温であるため、抽出効率を高めるために、乾燥、凍結乾燥、細断、粉砕などの処理を施したものを用いるのが好ましい。
【００１６】
後述の実施例でも示すように、ナガサルオガセを２０℃以上の温度で抽出するとエベルン酸のアルコール分解が起こり、エベルン酸の収量が大きく低下する。したがって、本発明では、ナガサルオガセを０℃以上２０℃未満の温度で抽出を行う。抽出温度は、０〜１５℃が好ましい。抽出時間に特に制限はないが、３時間〜３０日間が好ましく、８時間〜１０日間がより好ましい。抽出効率を上げるため、抽出の際に攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。なお、抽出溶媒の使用量に特に制限はないが、抽出原料のナガサルオガセに対し質量比で１〜５０倍量であることが好ましく、５〜３０倍量であることがより好ましい。
【００１７】
本発明において抽出溶媒として用いるアルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール等の低級アルコール類（好ましくは、炭素数１〜４の低級アルコール類）、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール等の多価アルコール類が挙げられる。本発明では、これらの溶媒を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明においては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等の低級アルコール類を用いるのが好ましく、メタノール、エタノールを用いるのがより好ましい。
【００１８】
本発明において、抽出溶媒として用いるアルコール又はアルコール溶液の含水率を１０体積％以下とする。後述の実施例でも示すように、含水率の高いアルコール溶液を抽出溶媒として用いると、エベルン酸の加水分解により、エベルン酸の収量が大きく低下する。抽出溶媒の含水率は、５体積％以下が好ましい。
【００１９】
前記抽出工程の後、必要に応じて更に適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留等により活性の高い画分を分画してもよい。本発明の製造方法により得られる抽出物には、このようにして得られた各種抽出物、その希釈液、その濃縮液、その精製物又はそれらの乾燥末等が包含される。
【００２０】
後述の実施例で示すように、前記抽出工程により、エベルン酸高含有ナガサルオガセ抽出物を得ることができる。したがって、エベルン酸はメラノサイトに対するエンドセリンの作用を抑制することでメラニン生成を抑制しうるため、本発明の製造方法で得られるナガサルオガセ抽出物は、優れたエンドセリン作用抑制効果及び美白効果を奏する。なお、本明細書において「美白（作用）」とは、メラニン色素生成や色素沈着を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
【００２１】
本発明により得られるナガサルオガセ抽出物は、そのままエンドセリン作用抑制剤又は美白剤として用いてもよい。また、本発明により得られるナガサルオガセ抽出物と、例えば酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤とを混合して用いてもよい。さらには、その他のエンドセリン作用抑制剤、その他の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、色材種、油性物質、高分子化合物、防腐剤、粉体、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等、通常の美白剤に用いられる成分と混合して用いてもよい。
【００２２】
本発明の方法により得られるエンドセリン作用抑制剤及び美白剤は、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚等に適用することができ、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ローション、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
【００２３】
本発明の方法により得られるエンドセリン作用抑制剤及び美白剤におけるナガサルオガセ抽出物の含有量に特に制限はなく、ナガサルオガセ抽出物中のエベルン酸濃度に依存して適宜設定することができる。
また、本発明の方法により得られるエンドセリン作用抑制剤及び美白剤の使用量に特に制限はなく、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ2当たり０．１〜５μｇが好ましく、液状製剤の場合、皮膚面１ｃｍ2当たり０．１〜１０μｇが好ましい。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
試験例１  エベルン酸のエンドセリン作用抑制作用の検証
（エベルン酸の製造）
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール水溶液１Ｌとを混合して、２０℃で１４日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物９４０ｍＬ（固形分１．７６ｇ）を得た。この抽出物中の固形分５５．３ｍｇをＨＰＬＣで分画し、エベルン酸４．４ｍｇ（収率７．９６％）を得た。
単離成分の構造解析は、ＮＭＲにより行った。単離成分のＮＭＲスペクトルデータが文献で報告されているエベルン酸（Phytochemistry，Vol．48，No．5，pp．815-822，1998参照）のスペクトルデータとほぼ一致したことから、単離された成分はエベルン酸であると同定した。なお、ＮＭＲによる構造解析の結果を表１に示す。下記表１において、Ｍｅはメチル基を表す。
【００２６】
【表１】
2013166732.tif 000003
【００２７】
（ジャーマンカミツレ抽出物の調製）
ジャーマンカミツレ（和名：カミツレ、新和物産社より入手）の花部４０ｇと、５０体積％エタノール含有水溶液４００ｍＬとを混合して、室温で１４日間抽出後ろ過し、ジャーマンカミツレ抽出物（２２１ｍＬ）を得た（蒸発残分２．６３％）。
【００２８】
エベルン酸及びジャーマンカミツレ抽出物について、下記の評価系を用いてエンドセリン作用抑制効果を検証した。なお、エンドセリンはメラノサイトに作用してカルシウム濃度を上昇させ、メラニン産生を増加させることが知られており（Yada  Y．et  al.，J．Biol．Chem.，1991，vol．266，p．18352-18357；Imokawa  G．et  al.，J．Biol．Chem.，1992，vol．267，p．24675-24680など参照）、エンドセリンの当該作用を抑制する物質は美白成分として有用である。
【００２９】
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社製）を、蛍光検出用の９６穴プレートに３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で播種し、５％ＣＯ2下にて３７℃で培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ  ２５４を用いた。
３日間培養後、培養プレートからデカントで培地を除去し、細胞内Ｃａ2++測定試薬Fluo4-AMを含むアッセイバッファーに置換し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＦＤＳＳ（Functional  Drug  Screening  System）機器において測定開始２０秒後に所定濃度のエベルン酸又はジャーマンカミツレ抽出物で１分間前処理した後、リガンドであるエンドセリン（ＥＴ−１、終濃度１００ｎＭ）を添加し、Fluo4-AMの蛍光をＥｘ．４８０ｎｍ／Ｅｍ．５４０ｎｍの測定波長で測定開始から５分後まで経時的に検出した。
コントロールにおけるFluo4-AMの蛍光増加比（Max．ratio-Min．ratio）を１００とした場合の相対値（％）で、各化合物又は抽出物における、エンドセリン刺激による細胞内カルシウム（カルシウムイオン）濃度上昇率（％）を算出し、エンドセリン作用抑制効果を評価した。なお、コントロールとして、エタノールを添加したものを用いた。
その結果を表２に示す。
【００３０】
【表２】
2013166732.tif 000004
【００３１】
ジャーマンカミツレ抽出物は、エンドセリンの作用によるメラノサイトのＣａ濃度上昇を抑制し、メラニン産生を抑制することが知られている（例えば、文献Pigment  Cell  Res.，1997，vol．10，p．218-228参照）。表２から明らかなように、ジャーマンカミツレ抽出物を添加した系では、濃度依存的なカルシウム濃度上昇抑制作用が確認された。特に濃度が１ｖ／ｖ％の系では、２０％以上もカルシウム濃度上昇が抑制され、優れたエンドセリン抑制作用が確認された。
これに対して、表２から明らかなように、エベルン酸を添加した系では、エンドセリン刺激によるメラノサイト内のカルシウム濃度上昇が、濃度依存的に抑制された。すなわち、エベルン酸は、公知の美白成分であるジャーマンカミツレ抽出物と同等またはそれ以上の、優れたエンドセリン抑制作用を有し、美白成分として有用であることがわかる。
【００３２】
比較例１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１０体積％エタノール溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１７３.０ｇ（蒸発残分０．３４２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００３３】
比較例２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１０体積％エタノール溶液２００ｍＬとを混合して３０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１６９．６ｇ（蒸発残分０．３７２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００３４】
比較例３
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１０体積％エタノール溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１６８．６ｇ（蒸発残分０．４２２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００３５】
比較例４
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール溶液１Ｌとを混合して１５℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物８６３．０ｇ（蒸発残分０．３３４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００３６】
比較例５
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール溶液ｍＬとを混合して２０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物８５８．５ｇ（蒸発残分０．３７４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００３７】
比較例６
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）５０ｇと５０体積％エタノール溶液１Ｌとを混合して３０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物８５３．５ｇ（蒸発残分０．４２０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００３８】
実施例１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール溶液２００ｍＬとを混合して１５℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４９．０ｇ（蒸発残分０．２７６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００３９】
比較例７
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール溶液２００ｍＬとを混合して２０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４８．５ｇ（蒸発残分０．２６０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４０】
比較例８
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール溶液２００ｍＬとを混合して３０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４７．３ｇ（蒸発残分０．３４４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４１】
比較例９
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと９５体積％エタノール溶液２００ｍＬとを混合して４０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４５．５ｇ（蒸発残分０．４１４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４２】
試験例２  エベルン酸濃度の測定
上記実施例１及び比較例１〜１０で得られた各ナガサルオガセ抽出物中のエベルン酸濃度を、ＨＰＬＣを用いて下記の条件で分析した。測定に用いた装置及び測定条件は下記のとおりである。
測定機器(HPLC)：Agilent  Technologies  Open  LAB  CDS  LC02-1260、オートサンプラーG1329B  1260  ALS、カラムオーブンG1316A  1260  TCC、検出器G1315D  1260  DAD  VL、ポンプG1312B  1260  Bin  pump、G1379B  1260  μ-Degasser
＜HPLC分析条件＞
流速：０．７５ｍＬ/ｍｉｎ
使用したカラム：Inertsil  ODS-3  ５μｍ(GL  Science)、3.0I.D.×１５０ｍｍ
検出波長：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃
移動相：（0.1%トリフルオロ酢酸含有水溶液）：（0.1%トリフルオロ酢酸含有メタノール）＝３０：７０（エベルン酸のリテンションタイム：8.900分）
結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
2013166732.tif 000005
【００４４】
表３の結果から明らかなように、本発明の方法によれば、エベルン酸高含有のナガサルオガセ抽出物を得ることができる。
これに対して、抽出溶媒として用いるアルコール溶液中の含水率が高いと、ナガサルオガセ抽出物中のエベルン酸濃度が大きく低下した（比較例１〜６）。また、抽出温度が２０℃以上の場合、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いたとしても、低温で抽出した場合と比べてエベルン酸濃度が大きく低下した（比較例７〜９）。
【００４５】
実施例２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）３．６５ｇと１００体積％メタノール７３ｍＬとを混合して５℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物４８．７ｇ（蒸発残分０．３３０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４６】
実施例３
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して１５℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４４．２ｇ（蒸発残分０．３８６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４７】
比較例１０
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して２０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４３．４ｇ（蒸発残分０．３６０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４８】
比較例１１
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して３０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４３．７ｇ（蒸発残分０．４５２（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００４９】
比較例１２
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して４０℃で８日間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４３．７２ｇ（蒸発残分０．５４０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５０】
実施例４
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して５℃で３時間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４４．２ｇ（蒸発残分０．１８０（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５１】
実施例５
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して５℃で８時間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４４．０ｇ（蒸発残分０．１８４（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５２】
実施例６
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して５℃で２４時間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４４．６ｇ（蒸発残分０．１９８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５３】
実施例７
ナガサルオガセ（新和物産社より入手）１０ｇと１００体積％メタノール２００ｍＬとを混合して５℃で４８時間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４４．４ｇ（蒸発残分０．２０８（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５４】
実施例８
ナガサルオガセ（新和物産社より入手、中国産）１０ｇと１００体積％メタノール２００  ｍＬとを混合して５℃で７２時間抽出後ろ過し、ナガサルオガセ抽出物１４５．０    ｇ（蒸発残分０．２１６（ｗ／ｖ）％）を得た。
【００５５】
試験例３  エベルン酸濃度の測定
上記実施例２〜８及び比較例１１〜１３で得られた各ナガサルオガセ抽出物中のエベルン酸濃度を、試験例２と同様の方法により測定した。その結果を表４に示す。
【００５６】
【表４】
2013166732.tif 000006
【００５７】
表４の結果から明らかなように、本発明の方法によれば、抽出温度を２０℃未満としているので、エベルン酸高含有のナガサルオガセ抽出物を得ることができる。
これに対して、抽出温度が２０℃以上の場合、低温で抽出した場合と比べてエベルン酸濃度が大きく低下した（比較例１０〜１２）。
【００５８】
以上のように、ナガサルオガセを０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出することで、エベルン酸高含有のナガサルオガセ抽出物を製造することができる。エベルン酸は優れたエンドセリン抑制作用を有するので、ナガサルオガセを０℃以上２０℃未満の温度で、含水率が１０体積％以下のアルコール又はアルコール又はアルコール溶液を用いて抽出することで、エンドセリン作用抑制効果に優れたエンドセリン作用抑制剤を製造することができる。
【００５９】
（処方例）
前記実施例で得られた抽出物を有効成分とする、下記に示す組成のローション、乳液、美容液及びクリームの形態のエンドセリン作用抑制剤又は美白剤を常法により各々調製した。
【００６０】
１．ローションの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
1,3-ブチレングリコール                                              ８．０
グリセリン                                                          ５．０
エタノール                                                          ３．０
実施例１で得られたナガサルオガセ抽出物                              ３．０
カミツレエキス                                                      ３．０
キキョウエキス                                                      １．０
チョウジエキス                                                      １．０
キサンタンガム                                                      ０．１
ヒアルロン酸                                                        ０．１
リン酸二ナトリウム                                                  ０．１
リン酸二水素ナトリウム                                              ０．１
アスコルビン酸２−グルコシド                                        ２．０
精製水                                                              残部
香料                                                                適量
防腐剤                                                              適量
【００６１】
２．乳液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例１で得られたナガサルオガセ抽出物                              １．０
カミツレエキス                                                      １．０
キキョウエキス                                                      １．０
アルテアエキス                                                      ２．０
スクワラン                                                          ３．０
オリブ油                                                            ３．０
グリセリン                                                          ５．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：40）１．０
カルボキシビニルポリマー                                            ０．２
水酸化カリウム                                                      ０．１
キサンタンガム                                                      ０．２
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０２
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
【００６２】
３．美容液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例１で得られたナガサルオガセ抽出物                              １．０
カミツレエキス                                                      １．０
キキョウエキス                                                      １．０
チョウジエキス                                                      １．０
カルボキシビニルポリマー                                            ０．２
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                            ０．２
水酸化カリウム                                                      ０．２
キサンタンガム                                                      ０．１
ヒアルロン酸                                                        ０．２
クエン酸ナトリウム                                                  ０．１５
クエン酸                                                            ０．０３
グリセリン                                                          １０．０
1,3-ブチレングリコール                                              ５．０
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
香料                                                                適量
【００６３】
４．美容液の調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例３で得られたナガサルオガセ抽出物                              ３．０
カミツレエキス                                                      １．０
チョウジエキス                                                      １．０
キキョウエキス                                                      １．０
キサンタンガム                                                      ０．２
カルボキシメチルセルロース                                          ０．２
カルボキシビニルポリマー                                            ０．２
水酸化カリウム                                                      ０．１
クエン酸                                                            ０．０３
クエン酸ナトリウム                                                  ０．１５
グリセリン                                                          ５．０
プロピレングリコール                                                ３．０
ポリエチレングリコール（分子量１５００）                            １．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール                              ０．５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
【００６４】
５．クリームの調製
（組成）                                                        （配合：質量％）
実施例３で得られたナガサルオガセ抽出物                              ３．０
カミツレエキス                                                      ２．０
キキョウエキス                                                      ２．０
チョウジエキス                                                      ２．０
メチルポリシロキサン                                                ３．０
スクワラン                                                          ２．０
ジカプリン酸ネオペンチルグリコール                                  ３．０
ステアリルアルコール                                                １．５
セタノール                                                          １．０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（エチレンオキサイドの付加モル数：60）０．５
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体                            ０．３
水酸化カリウム                                                      ０．１５
キサンタンガム                                                      ０．１
エデト酸二ナトリウム                                                ０．０５
精製水                                                              残部
防腐剤                                                              適量
香料                                                                適量