(57)【要約】【課題】1,4‐ジオキサンやその類縁化合物などの環状エーテル化合物を分解することができる新規の環状エーテル化合物分解微生物、この微生物及び／又は該微生物由来物を使用して環状エーテル化合物を分解する方法を提供する。【解決手段】この発明の環状エーテル化合物分解微生物は、環状エーテル化合物を分解する能力を有し、マイコバクテリウム（Mycobacterium）に属する微生物である。また、この発明の環状エーテル化合物の分解方法は、マイコバクテリウム属に属する微生物及び／又は該微生物由来物を使用する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状エーテル化合物を分解する能力を有し、マイコバクテリウム（Mycobacterium）に属する環状エーテル化合物分解微生物。
【請求項２】
環状エーテル化合物が、少なくとも１つの酸素原子を含む飽和又は不飽和の複素環式化合物である請求項１に記載の環状エーテル化合物分解微生物。
【請求項３】
複素環式化合物が、複素環の炭素原子に少なくとも１つの置換基が結合した構造を有するものである請求項２に記載の環状エーテル化合物分解微生物。
【請求項４】
微生物が、Mycobacterium sp. SK81-1F株（受託番号  NITE P-1199）又はMycobacterium sp. SK87-1F株（受託番号  NITE P-1200）である請求項１〜３の何れかに記載の環状エーテル化合物分解微生物。
【請求項５】
マイコバクテリウムに属する微生物及び／又は該微生物由来物を使用して、環状エーテル化合物を分解する環状エーテル化合物の分解方法。
【請求項６】
環状エーテル化合物が、少なくとも１つの酸素原子を含む飽和又は不飽和の複素環式化合物である請求項５に記載の環状エーテル化合物の分解方法。
【請求項７】
複素環式化合物が、複素環の炭素原子に少なくとも１つの置換基が結合した構造を有するものである請求項６に記載の環状エーテル化合物の分解方法。
【請求項８】
微生物が、Mycobacterium sp. SK81-1F株（受託番号  NITE P-1199）又はMycobacterium sp. SK87-1F株（受託番号  NITE P-1200）である請求項５〜７の何れかに記載の環状エーテル化合物の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、環状エーテル化合物を分解する能力を有する環状エーテル化合物分解微生物、及びこの微生物等を使用して環状エーテル化合物を分解する環状エーテル化合物の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
1,4‐ジオキサンは、塗料やセルロース等の溶剤、有機溶剤の安定剤等の工業用薬剤などとして幅広く使用されており、化学工場排水や廃棄物処分場の埋立地浸出水などからの検出が、多数報告されている。そして、環境中に排出された1,4‐ジオキサンは、環境中においては分解し難く、除去も困難であることが知られている（非特許文献１を参照。）
【０００３】
一方、1,4‐ジオキサンは、動物に対する急性毒性が認められ、ヒトに対しても刺激性や、脳・腎臓・肝臓へ障害が起きる可能性があると考えられており（非特許文献２を参照。）、国際がん研究機関(IARC)によってグループ2B（ヒトに対する発癌性が疑われる）に分類されている物質である。
【０００４】
そして、1,4‐ジオキサンが、環境中で分解され難く、動物やヒトに対して有害であることから、1,4‐ジオキサンやその類縁化合物を環境中から分解除去する方法の開発が既になされている。
【０００５】
具体的には、オゾンと過酸化水素や紫外線を組み合わせて発生する活性酸素の一種で強力な酸化力を持つOHラジカルによって1,4‐ジオキサン等を酸化する促進酸化法、金属触媒下で過酸化水素を添加して発生するOHラジカルによって1,4‐ジオキサン等を酸化するフェントン酸化法などが挙げられる（特許文献１〜３を参照。）
【０００６】
ただ、これらの方法は、電力、薬品などを大量に使用しなければならないため、コストが掛かり、別途、薬品を環境中に放出してしまうという問題点があった。そこで、よりランニングコストがかからず、環境に優しい生物学的処理方法についても研究が進められている（特許文献４〜５及び非特許文献３を参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−０２９９６６号公報
【特許文献２】特開２００１−１２１１６３号公報
【特許文献３】特開２０００−２０２４６６号公報
【特許文献４】特開２００４−２９８１１６号公報
【特許文献５】特開２００８−３０６９３９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「初期リスク評価  1,4-ジオキサン」、日本国独立行政法人  製品評価技術基盤機構、（平成２４年１月２４日検索）、インターネット<http://www.safe.nite.go.jp/risk/files/pdf_hyoukasyo/113riskdoc.pdf>
【非特許文献２】「国際化学物質安全性カード  1,4-ジオキサン」、国立医薬品食品衛生研究所、（平成２４年１月２４日検索）、インターネット<http://www.nihs.go.jp/ICSC/icssj-c/icss0041c.html>
【非特許文献３】「業界初の生物処理による『1,4-ジオキサン処理システム』を製品化」、株式会社日立プラントテクノロジー、（平成２４年１月２４日検索）、インターネット<http://www.hitachi-pt.co.jp/news/2010/20100924.html>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この発明は、1,4‐ジオキサンやその類縁化合物などの環状エーテル化合物を分解することができる新規の環状エーテル化合物分解微生物、この微生物及び／又は該微生物由来物を使用して環状エーテル化合物を分解する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、前記の課題を解決するために、鋭意検討した結果、マイコバクテリウム（Mycobacterium）に属する微生物が環状エーテル化合物を分解することを見出し、この発明を完成した。
【００１１】
すなわち、この発明の環状エーテル化合物分解微生物は、環状エーテル化合物を分解する能力を有し、マイコバクテリウム（Mycobacterium）に属する微生物である。また、この発明の環状エーテル化合物の分解方法は、マイコバクテリウム属に属する微生物及び／又は該微生物由来物を使用する方法である。
【００１２】
なお、環状エーテル化合物としては、少なくとも１つの酸素原子を含む飽和又は不飽和の複素環式化合物が挙げられ、複素環式化合物としては複素環の炭素原子に少なくとも１つの置換基が結合した構造を有するものが挙げられる。また、マイコバクテリウム（Mycobacterium）に属する微生物としては、Mycobacterium sp. SK81-1F株（受託番号  NITE P-1199）又はMycobacterium sp. SK87-1F株（受託番号  NITE P-1200）が挙げられる。
【発明の効果】
【００１３】
この発明の環状エーテル化合物の分解方法は、この発明の環状エーテル化合物分解微生物を利用しているので、1,4‐ジオキサン等の環状エーテル化合物を温和な条件下で分解できる。そのため、この環状エーテル化合物の分解方法を利用することによって、工場排水や水道原水に含まれる環状エーテル化合物をバッチ法等により005効率よく除去できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、汚泥の添加が酸素消費に与える影響を調べた結果を示すグラフである。
【図２】図２は、1,4-ジオキサン分解微生物をPCR-DGGE法によって選別した結果を示す電気泳動写真の一例である。
【図３】図３は、単離した1,4-ジオキサン分解微生物の1,4-ジオキサン分解能力を示すグラフである。なお、図３（ａ）は酸素消費量の変化を示し、図３（ｂ）は酸素消費量から算出した1,4-ジオキサンの分解度の変化を示している。
【図４】図４は、培養温度の違いがSK81-1F株の生育に与える影響を調べた結果を示すグラフである。なお、図４（ａ）はSK81-1F株の培養曲線（吸光度変化）を示し、図４（ｂ）は17日培養後の湿重を温度ごとに示している。
【図５】図５は、培養温度の違いがSK87-1F株の生育に与える影響を調べた結果を示すグラフであり、より具体的には13日培養後の湿重を温度ごとに示すグラフである。
【図６】1,4-ジオキサン培地で培養した休止菌体を使用した場合の分解力を調べた結果を示すグラフである。なお、図６（ａ）は1,4-ジオキサン、図６（ｂ）は1,3-ジオキサン、図６（ｃ）はテトラヒドロフランに対する分解力を調べた結果を示している。
【図７】1,4-ジオキサン培地で培養した休止菌体を使用した場合の分解力を調べた結果を示すグラフである。なお、図６（ａ）は2-メチルテトラヒドロピラン、（ｂ）は2-メチルテトラヒドロフランに対する分解力を調べた結果を示している。また、図７（ｃ）は、1,4-ジオキサンの減少速度に対する他の化合物の減少速度を相対的に示した図である。
【図８】グルコース添加LB培地で培養した休止菌体を使用した場合の分解力を調べた結果を示すグラフである。なお、図８（ａ）は1,4-ジオキサン、図８（ｂ）は1,3-ジオキサン、図８（ｃ）はテトラヒドロフランに対する分解力を調べた結果を示している。
【図９】図９は、pHの違いが、SK81-1F株の休止菌体の1,4-ジオキサン分解力に与える影響を調べた結果を示すグラフである。なお、図９（ａ）SK81-1F株を使用した場合の測定結果を示しており、図９（ｂ）は反応開始5時間までの分解速度をpHごとに算出して、比較した結果を示している。
【図１０】図１０は、pHの違いが、SK87-1F株の休止菌体の1,4-ジオキサン分解に与える影響を調べた結果を示すグラフである。なお、図１０（ａ）はSK87-1F株を使用した場合の測定結果を示しており、図１０（ｂ）は反応開始5時間までの分解速度をpHごとに算出して、比較した結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１.環状エーテル化合物分解微生物
この発明の環状エーテル化合物分解微生物は、マイコバクテリウム（Mycobacterium）に属する微生物であり、1,4-ジオキサンやその類縁化合物などの環状エーテル化合物を分解し得る能力を有する。この発明の微生物による分解メカニズムは現時点では不明であるが、前記化合物を酸化的に開裂するものと推定される。
【００１６】
なお、この発明のマイコバクテリウムに属する微生物として、環状エーテル化合物を分解し得る能力を有する株として単離されたMycobacterium sp. SK81-1F株（受託番号  NITE P-1199）又はMycobacterium sp. SK87-1F株（受託番号  NITE P-1200）が挙げられる。
【００１７】
（１）環状エーテル化合物
この発明の微生物が分解する能力を有する環状エーテル化合物とは、例えば、酸素原子を少なくとも１つ含む飽和又は不飽和の複素環式化合物である。また、複素環式化合物としては、複素環の炭素原子に少なくとも一つの置換基が結合した構造を有してなるものであってもよい。
【００１８】
なお、置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等の直鎖状及び分枝鎖状の脂肪族炭化水素基、水酸基、直鎖状及び分枝鎖状のアルコキシ基、ハロゲン原子、ハロゲン化された直鎖及び分枝鎖状のアルキル基、その他の脂環式化合物が挙げられるが、これに限定されない。
【００１９】
このような環状エーテル化合物としては、より具体的には、1,4-ジオキサンの他、1,3-ジオキサン、2-メチルテトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロピラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、S-トリオキサン、1,3-ジオキソラン、モルホリン、フラン等が挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
（２）単離方法
【００２１】
この発明において新たに単離されたSK81-1F株及びSK87-1F株は、「工場廃液処理用活性汚泥」を分離源として得たものである。すなわち、「工場廃液処理用活性汚泥」に1,4-ジオキサン加えて1,4-ジオキサン分解微生物を集積培養したのち、1,4-ジオキサンを炭素源として含む培地を使用して単離した1,4-ジオキサン分解微生物２株である。なお、単離した菌株は以下ようにして同定した。
【００２２】
（３）菌学的性質
SK81-1F株とSK87-1F株をそれぞれ標準寒天（日水製薬）に植菌して、30℃で48時間培養した。その結果、SK81-1F株はピンク色、レンズ状、円形コロニーを形成した。また、SK87-1F株は黄色、半球状、円形コロニーを形成した。
【００２３】
（４）遺伝学的解析
SK81-1F株とSK87-1F株の微生物学的な帰属分類を、16S rDNA法により調べた。具体的には以下のようにして帰属分類を調べた。
【００２４】
SK81-1F株とSK87-1F株をそれぞれ標準寒天（日水製薬）に植菌して、30℃で48時間培養した。培養後の菌体からInstaGene Matrix(バイオラッド)を使用して、ゲノムDNAを抽出した。抽出したDNAを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって16sリボソームRNA遺伝子（16S rDNA）の一部を増幅して、PCR産物を精製した。なお、PCRプライマーには、9Fと1541Rとを使用した。また、ポリメラーゼはPrimeSTAR HS DNA polymerase（タカラバイオ）を使用し、PCR反応は添付の説明書に従って行った。
【００２５】
PCR産物の塩基配列をサイクルシークンスして、16S rDNA部分塩基配列を決定した。得られたDNA配列の相同性検索した。なお、サイクルシークエンスにおいて、プライマーは9F,785F,802R,1541Rを使用し、サイクルシークエンスにはBigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ）を使用した。また、DNAシーケンサーは、ABI PRISM 3130x1 Genetic Analyzer System（アプライドバイオシステム）を使用し、配列決定はChromasPro 1.4（テクネリシウム）を使用した。さらに、相同性検索は、BLASTを使用して、アポロンDB-BA6.0（テクノスルガ・ラボ）及びGenBank/DDBJ/EMBLに対して行った。
【００２６】
その結果、SK81-1F株の16S rDNAは、Mycobacterium parafortuitum DSM 43528株の16S rDNAに対して98.9%の相同率を示し、Mycobacterium sphagni DSM 44076株及びMycobacterium fortuitum subsp. acetamidolyticum DSM 44220株の16S rDNAに対して98.4%の相同性を示した。なお、SK81-1F株は、Mycobacterium属のクラスターにおいて、何れの既知種とも異なる分子系統学的位置を示した。
【００２７】
また、SK87-1F株の16S rDNAは、Mycobacterium goodii ATCC 700504株の16S rDNAに対して99.1%の相同率を示し、Mycobacterium madagascariense JCM 13574株の16S rDNAに対して98.4%の相同性を示した。なお、SK87-1F株は、Mycobacterium属のクラスターにおいて、何れの既知種とも異なる分子系統学的位置を示した。
【００２８】
以上の結果から、SK81-1F株及びSK87-1F株は何れもMycobacterium属に属すると考えられるが、その種については特定できなかった。そこで、SK81-1F株及びSK87-1F株は何れもMycobacterium sp.に属すると推定した。
【００２９】
（５）菌体の培養
この発明の微生物は、マイコバクテリウム属の微生物を培養する公知の方法に沿って培養できる。具体的には、回分式、半連続式、連続式の何れでもよいが、液体培地を使用する振盪培養又は通気攪拌深部培養等が好ましい。また、培養温度は4〜50℃程度であり、20〜40℃程度が好ましい。さらに、培養液のpHはpH4〜9であり、pH6〜8程度が好ましい。培養時間は、培地の成分の種類、濃度、培養温度、pHなどによって異なるが、回分式における培養時間は、少なくとも3日程度、4〜7日が好ましい。
【００３０】
また、この発明の微生物は、マイコバクテリウムに属する微生物を培養する公知の培地であれば、特に限定することなく使用することができ、培地成分となる炭素源、窒素源、リン源及び無機塩についてもマイコバクテリウムに属する微生物が資化し得る物質であれば特に限定することなく使用できる。
【００３１】
具体的には、炭素源として、グルコース、マルトース、サッカロース、セロビオース、デンプン加水分解液、廃糖蜜等の糖類、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタール酸等の有機酸が挙げられるが、これに限定されない。また、窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩等の無機態窒素、尿素、アミノ酸等の有機態窒素が挙げられるが、これに限定されない。また、リン源として、リン酸カリウム等のリン酸塩が挙げられるが、これに限定されない。また、無機塩としては、カリウム、ナトリウム、カルシウム等の金属の塩が挙げられるが、これに限定されない。また、必要に応じて、鉄、マンガン、マグネシウム、コバルト、銅、ニッケル等の微量成分、ビタミン、ホルモン等を加えてもよい。なお、これら炭素源、窒素源、リン源、無機塩などを含む肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等を使用してもよい。
【００３２】
２．環状エーテル化合物の分解方法
この発明の環状エーテル化合物の分解方法は、この発明の微生物及び／又は該微生物由来物を使用して、環状エーテル化合物を分解する方法である。この方法によれば、穏和な条件で効率的に環状エーテル化合物、特に1,4-ジオキサンを分解除去することができる。
【００３３】
（１）微生物
この発明の微生物は、例えば、この微生物を培養して得られた培養液から濾過、遠心分離等の通常の固液分離手段により回収した微生物である。
【００３４】
（２）微生物由来物
微生物由来物は、前記微生物に由来するものを含むものであれば特に限定されるものではない。具体的には、該微生物を培養して得られた培養液又は固液分離手段により回収した微生物に処理を施した処理物が挙げられる。
【００３５】
ここで、培養液の処理物としては、培養液の濃縮物、乾燥物、界面活性剤及び／又は有機溶剤添加物、溶菌酵素処理物等が挙げられる。また、微生物の処理物としては、微生物の乾燥物、界面活性剤及び／又は有機溶剤添加物、溶菌酵素処理物が挙げられる。
【００３６】
また、微生物由来物として、培養液又は微生物から単離精製した酵素等を使用してもよい。なお、酵素等の精製には、公知の蛋白質の単離精製方法であれば特に限定することなく使用できる。具体的には、遠心分離法、硫安飽和や溶媒沈澱法等の沈殿法、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせて、使用すればよい。
【００３７】
さらに、この発明にかかる微生物及び／又は微生物由来物は、そのままで又は懸濁液や溶解液の状態で環状エーテル化合物の分解に使用してもよいが、多孔性物質や高分子担体を使用して固定化すれば、より高密度で環状エーテル化合物を分解できる。
【００３８】
ここで、多孔性物質や高分子担体としては、微生物や微生物由来物の環状エーテル分解活性を阻害しなければ、特に限定することなく公知の多孔性物質や高分子担体が使用できる。このような多孔性物質として、具体的には、硅藻土、ヒドロキシアパタイト、活性炭、ゼオライト等が挙げられるが、これに限定されない。また、高分子担体として、具体的には、デキストラン、アルギン酸、ポリビニルアルコールなどが挙げられるが、これに限定されない。なお、固定化する際の微生物、微生物由来物の含有量は、微生物等の活性の強さ、多孔性物質や担体の種類、固定化方法、使用方法、使用条件等に応じて任意に変えることができ、特に限定されない。
【００３９】
（３）分解方法
環状エーテル化合物の分解は、この発明の微生物やその微生物由来物と環状エーテル化合物とを、１つの反応系（例えば、１つの培養槽）に共存して接触させることによって行う。具体的には、環状エーテル化合物を含む培地や水溶液中で微生物を培養する方法、環状エーテル化合物を含む培地や水溶液と固体化した微生物等とを接触させる方法、微生物の培養液を、環状エーテル化合物の存在する土壌等に散布する方法等が挙げられるが、これに限定されない。これらの中でも、環状エーテル化合物を含む培地や水溶液中にて、この発明の微生物をその培養に適した条件下で、例えば、１〜7日間程度培養する方法が好ましい。
【００４０】
このようにこの発明の環状エーテル化合物の分解方法によれば、一般に難分解性物質と考えられている1,4-ジオキサンのような環状エーテル化合物を穏和な条件下で効率的に分解除去することができる。そのため、この発明の環状エーテル化合物の分解方法は、例えば、工場廃水の処理や浄水処理に好適に使用できる。
【００４１】
以下、この発明について実施例に基づいてより詳細に説明するが、以下の実施例によって、この発明の特許請求の範囲は如何なる意味においても制限されるものではない。
【実施例１】
【００４２】
1,4-ジオキサン分解微生物の分離
（１）スクリーニング
「工場廃液処理用活性汚泥」と「都市下水活性汚泥」を採取して、各汚泥を1,4-ジオキサンとともに培養し、培養中に好気的生物酸化によって消費された溶存酸素の量、すなわち生物化学的酸素要求量（BOD）を測定した。そして、この測定値から1,4-ジオキサンの分解度を求めた。その詳細を以下に示す。
【００４３】
分解度は、「化学物質の審査及び製造等の規制に関する法律」に従って測定した。具体的には、培養ビンに表１に示す基礎培養基300mLを入れ、「工場廃液処理用活性汚泥」9mg（乾燥重量）又は「都市下水活性汚泥」9mg（乾燥重量）と、1,4-ジオキサン30mgとを添加した。培養ビンを密封して25±1℃で約25日間培養し、培養中の生物化学的酸素要求量（BOD）を、閉鎖系酸素消費量測定装置（クーロメータOM3100A、大倉電気）により測定した（分解区）。なお、比較のために汚泥を添加していない実験対象を調製し、同様にしてBODを測定した（基礎呼吸区）。その結果を図１に示す。
【００４４】
【表１】
2013179897.tif 000002
【００４５】
図１から、「工場廃液処理用活性汚泥」を添加した場合（分解区）と、「工場廃液処理用活性汚泥」を添加しない場合（基礎呼吸区）とでは、酸素消費量に大きな違いがあることが確認できた。これに対して、「都市下水活性汚泥」を添加した場合（分解区）と、「都市下水活性汚泥」を添加しない場合（基礎呼吸区）との間には、酸素消費量に大きな違いは確認できなかった。すなわち、「工場廃液処理用活性汚泥」を添加した場合にのみ、酸素消費量が大きく向上することが分かった。
【００４６】
また、酸素消費量から、培養終了時（培養開始後20.7日）における1,4-ジオキサンの分解度Dを算出した。その結果、「工場廃液処理用活性汚泥」を添加した場合の分解度Dが84.09%であるのに対して、「都市下水活性汚泥」を添加した場合の分解度Dは3.13％であり、添加した汚泥によって分解度Dが大きく異なることが分かった。なお、分解度Dの算出には下記の式を使用した。
【００４７】
すなわち、分解度Dは式「D(%)=100×(BOD-B)/TOD」により算出した。ここで、式中の「BOD」は「分解区の酸素消費濃度（ppm）」を意味し、「B」は「基礎呼吸区の酸素消費濃度（ppm）」を意味し、「TOD」は「分解区の培養びん中の被験物質の理論的酸素消費濃度（ppm）」を意味している。
【００４８】
なお、「TOD」は式「TOD=W×ThOD/L」から算出（181.59ppm）した。ここで、「W」は「分解区の培養びんに添加された被験物質の重量（30mg）」を意味し、「L」は「培養びん内容物の容積（0.300L）」を意味している。また、「ThOD」は「1,4-ジオキサン1mg当たりの酸素消費量(mg)」を意味している。さらに、「分子量Mw、分子式CcHhNnSsPpOoXxで表される化合物」の「ThOD」は、式「ThOD=16.0×(2c+0.5h+2n+2s+2.5p-o)/Mw」であるとして算出（1.82mg）した。
【００４９】
（２）1,4-ジオキサン分解微生物の分離
表１の基礎培養基に寒天(1.5%)、粉末酵母エキスD-3(日本製薬、100mg/L)、1,4-ジオキサン(200mg/L)を加え、1,4-ジオキサン含有平板培地を調製した。（１）で使用した「工場廃液処理用活性汚泥」に由来する培養びんの内容物を、10倍〜10,000倍に希釈した。希釈物を1,4-ジオキサン含有平板培地にそれぞれ100μLずつ塗布し、27℃で1週間から3週間培養した。その結果、約70個のコロニーが得られた。
【００５０】
得られたコロニーを、表１の基礎培養基に粉末酵母エキスD-3(日本製薬、20〜50mg/L)、1,4-ジオキサン(200mg/L〜600mg/L)を加えた1,4-ジオキサン液体培地に接種した。27℃で1週間から3週間振盪培養した。得られた培養液を、再度、10倍〜10,000倍に希釈して、普通寒天平板培地(日水製薬)に100μLを塗布し、27℃で1週間から3週間培養した。その結果、27株が得られた。また、そのうち24株が単一であると判断された。
【実施例２】
【００５１】
２.1,4-ジオキサン分解微生物の単離
実施例１で分離した1,4-ジオキサン分解微生物をPCR-DGGE法によって選別し、1,4-ジオキサン分解微生物を単離した。
【００５２】
（１）鋳型DNAの調製
実施例１で得られた菌株を、表１の基礎培養基に1,4-ジオキサン（200mg/L）を加えた1,4-ジオキサン液体培地に植菌し、25±1℃℃で1週間から3週間培養した。培養した微生物を10,000×G以上で10分問遠心分離して沈殿(菌体)を得た。得られた沈殿をUltra Clean Soil DNA Kit(MO Bio)を使用して処理し、鋳型DNAを抽出した。なお、鋳型DNAの抽出において、ビーズによる菌体破砕過程には、Shake-Master(バイオメディカルサイエンス、1000pm、処理時間4分）を使用した。
【００５３】
（２）PCR法による電気泳動試料の調製、及びPCR産物のDGGE法による電気泳動
（１）で得られた鋳型DNA、DNAポリメラーゼ(Phusion-Hotstart-(Finnzymes))、プライマー（GC-341F、518R(16SrRNA遺伝子V3領域)）を使用して、表２に記載のサイクル条件でPCR反応を行った。得られたPCR産物を電気泳動装置（Dcode微生物群集解析システム(バイオラッド)）により、DGGE法で電気泳動した。その結果の一例を図２に示す。
【００５４】
【表２】
2013179897.tif 000003
【００５５】
図２から、普通寒天培地で単一であると判断された24株は、２つのグループに分けられることが分かった。各グループの菌株からSK81-1F株及びSK87-1F株を選択して、以後の実験に使用した。
【実施例３】
【００５６】
３．単離株の1,4-ジオキサン分解能力の確認
単離した1,4-ジオキサン分解微生物の1,4-ジオキサン分解能力を酸素消費量測定法によって確認した。その詳細を以下に示す。
【００５７】
（１）前培養
単離したSK81-1F株又はSK87-1F株を、表１の基礎培養基に1,4-ジオキサン（200mg/L）を加えた1,4-ジオキサン液体培地に植菌し、27±1℃で7日間前培養した。
【００５８】
（２）分解能力の確認
培養ビンに、表１の基礎培養基300mLと、前培養したSK81-1F株又はSK87-1F株の培養液3mLと、1,4-ジオキサン30mgとを入れた（分解区）。なお、培養液を含まない実験対照（基礎呼吸区）を比較のため調製した。培養ビンを閉鎖系酸素消費量測定装置にセットして、25±1℃で11日間培養しながら生物化学的酸素要求量（BOD）を測定して、1,4-ジオキサンの分解度を算出し、分解度曲線を求めた。なお、使用した閉鎖系酸素消費量測定装置及び分解度Dの算出方法は、実施例１と同じである。酸素消費量の変化を図３（ａ）に示し、酸素消費量から算出した1,4-ジオキサンの分解度の変化を図３（ｂ）に示す。
【００５９】
図３に示すように、実験開始から3〜5日後に分解度はフラットになり、10.8日後の分解度は、SK81-1F株は67.1%、SK87-1F株は67.0%であった。すなわち、SK81-1F株及びSK87-1F株は、高い1,4-ジオキサン分解力を備えていることが分かった。
【実施例４】
【００６０】
４．培養温度が分解微生物の培養に与える影響
培養温度が分解微生物の培養に与える影響を、培地の濁度変化及び菌体の湿重の変化に基づいて調べた。その詳細を以下に示す。
【００６１】
500mL容坂口フラスコに表３に示す組成の培地80mLを入れ、SK81-1F株又はSK87-1F株を植菌した。坂口フラスコを温度傾斜培養機（サンキ精機）にセットし、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃で17日間、105rpmで振盪培養した。
【００６２】
また、振盪培養の開始から、一定期間ごとに分光光度計（U-3310、HITACHI）を使用して、培養液の660nmにおける吸光度の変化を測定した。さらに、培養終了後、培養液を遠心分離して、得られた菌体の湿重を調べた。その結果を図４及び図５に示す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
なお、図４（ａ）はSK81-1F株の培養曲線（吸光度変化）を示し、図４（ｂ）は17日培養後の温度ごとの湿重を示している。また、図５はSK87-1F株の13日培養後の温度ごとの湿重を示している。なお、SK87-1F株の培養曲線（吸光度変化）については、信頼性のある測定値が得られなかったため、記載を省略した。
【００６５】
図４から、SK81-1F株の1,4-ジオキサンを炭素源とする培養には、25℃〜30℃が適していることが分かった。また、図５から、SK87-1F株の1,4-ジオキサンを炭素源とする培養には25℃〜35℃が適していることが分かった。
【実施例５】
【００６６】
５．1,4-ジオキサン濃度が分解微生物の生育に与える影響
培地中の1,4-ジオキサン濃度が分解微生物の培養に与える影響を調べた。以下にその詳細について記載する。
【００６７】
100mL容試験管に表４に示す組成の培地10mLを入れ、SK81-1F株又はSK87-1F株を植菌した。試験管を試験官用振盪培養機にセットし、27℃で49日間、200rpmで振盪培養した。また、振盪培養開始から、菌体の生育を目視によって観察した。SK81-1F株の結果を表５に示し、SK87-1F株の結果を表６に示す。なお、表中の「＋」は「生育」、「±」は「僅かに生育」、「−」は「生育せず」を、それぞれ意味している。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
【表５】
2013179897.tif 000006
【００７０】
【表６】
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【００７１】
表５及び表６から、SK81-1F株は28日間培養すれば最大5,000mg/Lの濃度でも生育できることが確認できた。また、SK87-1F株は28日間培養すれば最大7,000mg/Lの濃度でも生育できることが確認できた。そして、これらの結果から、SK87-1F株はSK81-1F株よりも1,4-ジオキサン濃度が高い環境下でも生育できることが分かった。
【実施例６】
【００７２】
６．数種の環状エーテル化合物に対する分解力
1,4-ジオキサンを含む環状エーテル化合物に対するSK87-1F株とSK81-1F株の分解力を、GC-MSを使用するヘッドスペース法により調べた。なお、環状エーテル化合物として、1,4-ジオキサンの他、1,3-ジオキサン、2-メチルテトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロピラン、テトラヒドロフランを使用した。その詳細を以下に示す。
【００７３】
（１）前培養
単離したSK81-1F株又はSK87-1F株を、表１の基礎培養基に1,4-ジオキサン（200mg/L）を加えた1,4-ジオキサン液体培地に植菌し、27±1℃で7日間前培養した。
【００７４】
（２）数種の環状エーテル化合物に対する分解性
50mL容バイアルに表７に示す組成の培地3mLを入れ、前培養したSK81-1F株又はSK87-1F株の培養液を660nmにおける吸光度が1.0となるように加えて、バイアルに栓をした。バイアルを坂口フラスコ用振盪培養機（いわしや澤田健蔵商店）にセットし、27℃で18〜22時間、110rpmで振盪培養した。
【００７５】
【表７】
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【００７６】
振盪培養中又は完了したバイアルを60℃で30分間保存したのち、バイアルのヘッドスペースに残存する環状エーテル化合物の濃度をGC-MSにより測定した。
【００７７】
なお、GC-MSによる測定は、ガスクロマトグラフ質量分析計（GCMS-QP2010、島津製作所)と、カラム（DB-5ms(30m(長さ),0.25μm(膜厚)×0.25mm(内径)、アジレント・テクノロジー)を使用し、カラム温度40℃で行った。その結果を表８に示す。
【００７８】
【表８】
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【００７９】
表８から、SK81-1F株は1,4-ジオキサンの他、2-メチルテトラヒドロフラン及びテトラヒドロフランに対しても高い分解力を備えていることが分かった。また、SK87-1F株は1,4-ジオキサンの他、1,3-ジオキサン、2-メチルテトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロピラン、テトラヒドロフランに対しても高い分解力を備えていることが分かった。
【実施例７】
【００８０】
７.培地の違いが環状エーテル類に対する分解力に与える影響
SK81-1F株、SK87-1F株を培養する培地の違いが、休止菌体の環状エーテル類の分解力に与える影響をGC-MSを使用するヘッドスペース法により調べた。なお、環状エーテル化合物として、1,4-ジオキサンの他、1,3-ジオキサン、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロピラン、2-メチルテトラヒドロフランを使用した。その詳細を以下に示す。
【００８１】
（１）休止菌体の調製
（ａ）1,4-ジオキサン培地で培養した休止菌体の調製
表９に示す組成の1,4-ジオキサン培地にSK81-1F株又はSK87-1F株を植菌し、28℃で7日間振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌したのち、表１０に示す緩衝液１に懸濁し、休止菌体を調製した。
【００８２】
【表９】
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【００８３】
【表１０】
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【００８４】
（ｂ）グルコース添加LB培地で培養した休止菌体の調製
表１１に示す組成のグルコース添加LB培地にSK81-1F株を植菌し、28℃で40時間振量培養した。また、同じグルコース添加LB培地にSK87-1F株を植菌し、28℃で24時間振盪培養した。これらの培養液を遠心分離して集菌したのち、表１０に示す緩衝液１に懸濁し休止菌体を調製した。
【００８５】
【表１１】
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【００８６】
（２）環状エーテル化合物に対する分解力
70mL容L型試験管に表１２に示す組成の反応液10mLを入れ、660nmにおける吸光度が1.0となるように、各休止菌体を植菌した。栓をして密閉したL型試験管を振盪培養機（パーソナル-11、タイテック）にセットし、28℃で約50時間振盪培養（110rpm）した。また、培養中に各培養液中の環状エーテルの濃度を以下の方法で測定した。
【００８７】
すなわち、振盪培養中又は完了した試験管から、培養液を1mL採取して、10,000rpmで遠心分離して菌体を除去し、上澄を得た。上澄0.8mLを20mL容バイアルに移して、0.8mLのアセトン水溶液（6mg/L）を添加し、バイアルを密封した。密封したバイアルを60℃で30分間保存したのち、バイアルのヘッドスペースに残存する環状エーテル化合物の濃度をGC-MSにより測定した。なお、GC-MSによる測定は実施例６と同様にして行った。
【００８８】
【表１２】
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【００８９】
（ａ）1,4-ジオキサン培地で培養した休止菌体を使用した場合の分解力
1,4-ジオキサン培地で培養した休止菌体を使用した場合の分解力を示す結果を、図６及び図7に示す。なお、図６（ａ）は1,4-ジオキサン、図６（ｂ）は1,3-ジオキサン、図６（ｃ）はテトラヒドロフランに対する分解力を調べた結果を示している。
【００９０】
また、図７（ａ）は2-メチルテトラヒドロピラン、図７（ｂ）は2-メチルテトラヒドロフランに対する分解力を調べた結果を示している。さらに、図７（ｃ）は、1,4-ジオキサンの減少速度に対する他の化合物の減少速度を相対的に示した図である。なお、減少速度の算出には６時間目までの値を使用した。
【００９１】
図６及び図７から、1,4-ジオキサン培地で培養したSK81-1F株及びSK87-1F株の休止菌体は、1,4-ジオキサン等の環状エーテル化合物を分解でき、その分解速度は化合物によって異なることが確認できた。また、SK87-1F株は、SK81-1F株に比べて高い活性を示すことが確認できた。さらに、図７（ｃ）から、SK81-1F株は、1,4-ジオキサンよりもTHFに対する分解能力が高いことが分かった。
【００９２】
（ｂ）グルコース添加LB培地で培養した休止菌体を使用した場合の分解力
グルコース添加LB培地で培養した休止菌体を使用した場合の分解力を示す結果を、図８に示す。なお、図８（ａ）は1,4-ジオキサン、図８（ｂ）は1,3-ジオキサン、図８（ｃ）はテトラヒドロフランに対する分解力を調べた結果を示している。
【００９３】
図８から、グルコース添加LB培地で培養したSK81-1F株の休止菌体は、9時間以上の誘導期ののち、1,4-ジオキサン等の環状エーテル化合物を分解できることが確認できた。一方、グルコース添加LB培地で培養したSK87-1F株の休止菌体には、環状エーテル化合物の分解は確認できなかった。
【実施例８】
【００９４】
８．反応液のpHが分解力に与える影響
反応液のpHの違いが、休止菌体の1,4-ジオキサン分解に与える影響をGC-MSを使用するヘッドスペース法により調べた。その詳細を以下に示す。
【００９５】
まず、実施例７と同様に1,4-ジオキサン培地で培養した休止菌体を調製した。つぎに、表１２に示す反応液に、5mol/L硫酸又は5mol/L水酸化ナトリウムを添加して、pH3.5〜pH8.5の反応液を調製した。調製した休止菌体と反応液を使用して、実施例７と同様に、分解後の1,4-ジオキサンの残存濃度をヘッドスペース法により測定した。その結果を図９及び図１０に示す。
【００９６】
なお、図９（ａ）は、SK81-1F株を使用した場合の測定結果を示しており、図９（ｂ）は反応開始５時間までの分解速度をpHごとに算出して、比較した結果を示している。また、図１０（ａ）は、SK87-1F株を使用した場合の測定結果を示しており、図１０（ｂ）は反応開始５時間までの分解速度をpHごとに算出して、比較した結果を示している。
【００９７】
図９（ａ）及び図１０（ａ）から、SK81-1F株はpH6.1以上、SK87-1F株はpH5.6以上であれば1,4-ジオキサンを50時間後完全に分解できることが確認できた。また、図９（ｂ）及び図１０（ｂ）から、SK81-1F株はpH7.9、SK87-1F株はpH7.2で最大の分解速度を示すことが分かった。
【実施例９】
【００９８】
９．フロックの形成・沈降の確認
SK81-1F株及びSK87-1F株を実施例７と同様にして1,4-ジオキサン培地で培養したのち、培養液を試験管に移し、フロックを形成して沈殿するまでの時間をストップウオッチにより測定した。その結果、S87-1F株は試験管に移してから約2分後に沈殿が確認できた。また、SK81-1F株は、冷蔵庫で一晩程度放置すれば沈殿することが確認できた。そのため、S87-1F株は優れたフロック形成能力を有しており、工場排水等のバッチ処理に適していることが分かった。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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