(57)【要約】【課題】少量の生体試料を用いるだけで測定が可能である方法の提供を課題とする。【解決手段】  以下の工程を含む、生体の抗酸化能の測定方法：  （ａ）被験物質を投与した被験生体から採取した試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液と、  （ｂ）被験物質を投与しない、もしくは対照物質を投与した対照生体から採取した対照試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物を含む対照溶液との間において、吸光度の経時的変化の差異を測定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、生体の抗酸化能の測定方法：
（ａ）被験物質を投与した被験生体から採取した試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液と、
（ｂ）被験物質を投与しない、もしくは対照物質を投与した対照生体から採取した対照試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物を含む対照溶液
との間において、吸光度の経時的変化の差異を測定する工程。
【請求項２】
上記ラジカル開始剤が2,2'-アゾビス(2-アミジノプロパン)・二塩酸塩（AAPH）、および上記化合物がピラニンであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、生体の抗酸化能を亢進できる被験物質の評価方法：
（１）（ａ）被験物質を投与した被験生体から採取した試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液と、
（ｂ）被験物質を投与しない、もしくは対照物質を投与した対照生体から採取した対照試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物を含む対照溶液
との間において、吸光度の経時的変化を比較する工程、ならびに
（２）上記工程（１）において、上記試験溶液の吸光度の経時的変化が、上記対照溶液の吸光度の経時的変化と比べて遅延する場合は、上記被験物質が生体内の抗酸化能を亢進する活性を有すると判定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に生体の抗酸化能測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内において生じる活性酸素は、血管拡張や免疫系による非自己因子に対する防御手段として必須である一方で、過剰な活性酸素は体に種々の悪影響を及ぼすことが知られている。例えば、ヒトにおいて過剰な活性酸素は血管内皮細胞を攻撃し、動脈硬化性疾患（虚血性心疾患、脳血管障害など）の原因となる。また、過剰な活性酸素は細胞内のDNAを損傷させ、癌などの疾患の原因となるとも考えられている。過剰な活性酸素による生体への障害は、総称して酸化ストレスと呼ばれている。酸化ストレスはQOLの低下の原因となり、酸化ストレスを緩和すること、すなわち生体の抗酸化能を向上させる方法が広く求められている。
【０００３】
試験管内で活性酸素を消去する活性（抗酸化能）を有する化合物が、抗酸化物質として多数知られている。例えば、アスコルビン酸（ビタミンC）やビタミンE類は、代表的な抗酸化物質である。試験管内において、個々の物質の抗酸化能を測定する方法は公知であり、抗酸化能を有する多くの生体物質が見出されている。
【０００４】
しかしながら、試験管内で抗酸化能を有する化合物が多数知られている一方で、それらの化合物が生体に投与または摂取などされた場合に、生体内の抗酸化能がどのように変化するかについてはほとんど知られていないのが現状である。このような現状の原因として、従来は生体の抗酸化能を簡便に測定する方法が知られていないことが挙げられる。従来技術は、生体内の酸化生成物の測定や抗酸化物質の存在量の定量を行なうという方法であり、生体の酸化の結果もしくは抗酸化能のごく一端を測定するにとどまる方法であった。また、生体の抗酸化能を向上させるために上記のような抗酸化物質を摂取することが広く提唱されているが、このような摂取が実際に生体の抗酸化能の向上にどの程度寄与するかを測定できないという現状もある。
【０００５】
さらに、上記のような方法は、大量の生体試料、例えばヒトであれば数ミリリットルの血液を必要とする方法であったり、中小の診療所、医院には導入が困難である分析機器を必要とする方法であったりするのが現状である。すなわち、被験者の負担が少ない方法で、かつ、幅広い場所において簡便に生体の抗酸化能を測定する方法はないというのが、現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Roberts, L. J.; Morrow, J. D. Measurement of F(2)-isoprostanes as an index of oxidative stress in vivo. Free Radic Biol Med 28:505-513; 2000.
【非特許文献２】Roberts, L. J., 2nd; Oates, J. A.; Linton, M. F.; Fazio, S.; Meador, B. P.; Gross, M. D.; Shyr, Y.; Morrow, J. D. The relationship between dose of vitamin E and suppression of oxidative stress in humans. Free Radic Biol Med 43:1388-1393; 2007.
【非特許文献３】Yoshida, Y.; Itoh, N.; Hayakawa, M.; Habuchi, Y.; Saito, Y.; Tsukamoto, Y.; Cynshi, O.; Jishage, K.; Arai, H.; Niki, E. The role of alpha-tocopherol in motor hypofunction with aging in alpha-tocopherol transfer protein knockout mice as assessed by oxidative stress biomarkers. The Journal of nutritional biochemistry 21:66-76; 2010.
【非特許文献４】Kasai, H. Analysis of a form of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, as a marker of cellular oxidative stress during carcinogenesis. Mutat Res 387:147-163; 1997.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、従来技術では、生体の抗酸化能を評価する手法がないのが現状である。また、従来技術における個々の酸化生成物の測定や抗酸化物質の定量には、数ミリリットルの血液など、多量の生体試料が必要であった。そこで、本発明は、上記従来技術の課題を解決することを目的とする。具体的には、生体の抗酸化能の測定方法を、特に少量（例えば、数マイクロリットル）の生体試料を用いるだけで測定が可能である方法の提供を主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、生体から採取した試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液を用いることで、生体の抗酸化能を測定できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてさらに改良を重ねることによって完成したものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記態様の発明を包含する。
【００１０】
項１、以下の工程を含む、生体の抗酸化能の測定方法：
（ａ）被験物質を投与した被験生体から採取した試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液と、
（ｂ）被験物質を投与しない、もしくは対照物質を投与した対照生体から採取した対照試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物を含む対照溶液
との間において、吸光度の経時的変化の差異を測定する工程。
【００１１】
項２、上記ラジカル開始剤が2,2'-アゾビス(2-アミジノプロパン)・二塩酸塩（AAPH）、および上記化合物がピラニンであることを特徴とする、項1に記載の方法。
【００１２】
項３、以下の工程を含む、生体の抗酸化能を亢進できる被験物質の評価方法：
（１）（ａ）被験物質を投与した被験生体から採取した試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液と、
（ｂ）被験物質を投与しない、もしくは対照物質を投与した対照生体から採取した対照試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物を含む対照溶液
との間において、吸光度の経時的変化を比較する工程、ならびに
（２）上記工程（１）において、上記試験溶液の吸光度の経時的変化が、上記対照溶液の吸光度の経時的変化と比べて遅延する場合は、上記被験物質が生体内の抗酸化能を亢進する活性を有すると判定する工程。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の測定方法により、検査時点における生体の抗酸化能を測定することができる。本発明の測定方法を使用することによって、医薬、機能性食品、およびサプリメントなどの投与による、生体の抗酸化能の変化をモニターできる。また、抗酸化に根ざした薬物のスクリーニングや、酸化ストレスが関与する疾患の病状進行評価にも応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本願発明の一例の概略図を示す。
【図２】抗酸化能評価の測定結果を示す。上図はsh01投与マウスの血漿試料を用いた結果、下図はsh02投与マウスの血漿試料を用いた結果をそれぞれ示す。横軸は、反応開始時（t=0）からの経過時間（秒、Time, s）を示す。縦軸は、反応開始からt秒経過時における吸光度の、反応開始時の吸光度に対する相対値（(ABS)t/(ABS)0%）を示す。
【図３】LC-MSによるショウガオール誘導体の検出結果を示す。上図はsh01およびその加水分解物（脱エチル体、sh01 deethylate）の検出結果、下図はsh02およびその加水分解物（脱エチル体、sh02 deethylate）の検出をそれぞれ示す。横軸は、投与時（t=0）からの経過時間（時間、Time, h）を示す。縦軸は、検出濃度（Conc., ng/ml）を示す。
【図４】試料中のショウガオール誘導体濃度（Conc. of Shogaol derivative deethylate (ng/ml)、横軸）と、ピラニンの吸光度が減少し始めるまでの時間（Lag time、縦軸）との相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（１）生体の抗酸化能の測定方法
本発明は、生体の抗酸化能を測定するための方法を提供するものである。
【００１６】
本発明の測定方法において対象とする上記生体は、活性酸素が生じる生体である限り、特に限定されるものではない。酸化ストレスは動物および植物のいずれにも生じるため、上記生体は動物または植物のいずれでもありうる。QOLを低下させる酸化ストレスを防ぐための、生体の抗酸化能を向上できる有用な被験物質を探索するとの観点などからは、生体は好ましくは鳥類および哺乳類（例えば、ヒト、サルなどの類人猿、マウス、ラットおよびウサギなどの実験モデル哺乳類、イヌおよびネコなどの愛玩哺乳類動物、ブタ、ウシおよびヒツジなどの家畜哺乳類動物など）、特に好ましくはヒトである。
【００１７】
本発明の測定方法が対象とする上記生体の抗酸化能とは、酸素分子（O2）と比べて強い酸化反応性をもつ活性酸素を、消去、除去、または緩和できる、生体が有する活性を指す。
【００１８】
活性酸素は幅広い分子種を含み、酸素原子を含む分子種において、酸素分子（O2）と比べて強い酸化反応性を有する分子種である限度において、特に制限されない。
【００１９】
上記活性酸素の具体的な分子種の例として、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシラジカル、ヒドロキシオキシラジカル、アルキルヒドロペルオキシラジカル、アルコキシラジカル、次亜塩素酸ラジカルなどの酸素フリーラジカル（不対電子を有する酸素原子または不対電子を有する酸素原子を含む分子）が上記活性酸素の具体例として例示される。
【００２０】
なお、上記活性酸素は生体内で自然に発生するもの、または生体内で人為的に発生させたもののいずれであってもよい。活性酸素は、生体内で自然に発生することが公知である。活性酸素は、例えば、真核生物の細胞内における呼吸反応で、ミトコンドリアの電子伝達系の中間産物として生じる。細胞内にはNADPHオキシダーゼやキサンチンオキダーゼなど活性酸素を生成する酵素が存在する。また、紫外線または放射線などを、細胞に照射することでも活性酸素は発生しうる。
【００２１】
上記生体の抗酸化能が発揮される機序としては、上記活性酸素が有する強い酸化反応性を消去、除去または緩和できる限り、特に限定されるものではない。抗酸化能が発揮される機序の具体例として、アスコルビン酸（ビタミンC）、ビタミンE類（α−およびγ−トコフェロール、ならびにα−およびγ−トコトリエノール、カロテノイド、フラボノイド、およびグルタチオンなどの分子による非特異的な還元作用に基づく抗酸化作用、ならびに、スーパーオキシドアニオンラジカルに対するスーパーオキシドジムスターゼなど特定の活性酸素の分子種に対する特異的な抗酸化作用を有する分子によるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の測定方法は、下記の工程を含むことを特徴とする：
（ａ）被験物質を投与した被験生体から採取した試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液と、
（ｂ）被験物質を投与しないもしくは対照物質を投与した対照生体から採取した対照試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物を含む対照溶液
との間において、吸光度の経時的変化の差異を測定する工程。
【００２３】
上記試験試料は、被験物質を投与した被験生体から採取して得る。上記試験試料は、本発明の測定方法を実施できることを限度として、被験生体から採取できるあらゆる生体試料（例えば、体液、細胞、組織など）を用いることができ、特に制限されるものではない。上記試験試料として、生体から採取できる固体または液体の試料を用いることができる。試料の採取をすることおよび試験溶液の調製の簡便さの観点からは、上記試料は液体試料であることが好ましい。液体試料の具体例として、血液、血漿、血清、尿、汗、涙、消化液、リンパ液、脳脊髄液、羊水などが挙げられるが、これらに限定されない。上記液体試料は、好ましくは血液、血漿、血清、および尿、特に好ましくは血漿または血清である。
【００２４】
上記試験試料を被験生体から採取する方法は、上記試験試料に応じて適した採取方法を、公知の採取方法より、当業者が適宜選択できる。
【００２５】
上記被験生体は、本発明の測定対象となりうるあらゆる生体から選択されるものに、被験物質を投与した生体である。
【００２６】
上記被験物質は、生体に許容されるあらゆる物質を用いることができる。好ましくは、上記被験物質は、生体の抗酸化能を変化（好ましくは亢進）させることが期待される化合物、または当該化合物を含む組成物である。上記化合物は、試験管内で抗酸化活性を有する化合物、またはそれ自身は抗酸化活性を有しないが生体の遺伝子活性もしくは酵素活性の調節によって生体の抗酸化能を変化（好ましくは亢進）させることが期待される化合物などから選択することができる。上記被験物質が組成物である場合は、上記化合物（有効成分（の候補））、および生体に許容される担体からなる組成物とすることができる。上記担体は、水、生理食塩水、生体に許容される緩衝液もしくは生体に許容される有機溶媒などの溶媒、生体に許容される賦形剤などの固体から、当業者が投与方法および測定目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
上記被験生体における被験物質の投与方法は、特に制限されるものではなく、投与される被験物質および投与対象の被験生体に応じて、当業者が適宜設定し得る。投与方法の具体例として、経口投与、摂食、注射（循環器系（好ましくは静脈）への注射、皮下への注射、筋肉への注射など）、塗布などによる表皮もしくは粘膜からの吸収、吸引などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
上記工程において、上記試験試料、ラジカル開始剤、および活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物を含む試験溶液を作製する。
【００２９】
上記ラジカル開始剤は、上記試験溶液中で活性酸素の発生を開始するために試験溶液に含める。上記ラジカル開始剤は、ラジカル開始剤として公知のあらゆる化合物および組成物を用いることができる。なお、ラジカル開始剤とは、緩和な条件で反応性の高いフリーラジカル（不対電子を有する酸素原子または不対電子を有する原子を含む分子）を発生させる活性を有する化合物もしくは組成物を指す。上記ラジカル開始剤は、生理的条件でラジカル開始剤として機能することが好ましい。ここで、生理的条件とは、生理的温度（３０〜４５℃、好ましくは３５〜４０℃、より好ましくは３７℃程度）、生理的ｐＨ（７．３〜７．５程度、好ましくは７．３５〜７．４５程度、より好ましくは約７．４程度）、および生理的塩濃度（０．８〜１．０％程度、好ましくは０．８５〜０．９５％程度、より好ましくは約０．９％程度）からなる群から選択される少なくとも１つ以上を指す。また、試験溶液と対照溶液との間において、吸光度の経時的差異を正確に測定するとの観点から、上記ラジカル開始剤は、活性酸素の発生が開始する時点を制御できるものであることが好ましい。例えば、上記活性酸素の発生が開始する時点を制御できるラジカル開始剤として、特定の温度域において活性酸素を一定速度で発生させるものを用いることができる。
【００３０】
上記ラジカル開始剤として、例えば2,2'-アゾビス(2-アミジノプロパン)・二塩酸塩（2,2'-Azobis(2-amidinopropane)・2hydrochloride、AAPH）、2,2’-azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)-propane] (AIPH)、2,2’-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) (AMVN)、2,2’-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile (Meo-AMVN)などの一定速度でラジカルを生成できるラジカル開始剤を用いることができるが、これらに限定されない。また、ラジカル発生剤は水溶性であることが好ましい。特に好ましいラジカル開始剤として、AAPHが挙げられる。AAPHは、３０〜４５℃程度に加温することで、生理的ｐＨの水溶液中で、一定速度で酸素ラジカルを発生する水溶性のラジカル開始剤である。
【００３１】
上記活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物は、活性酸素との反応により活性酸素を消去し、同時に上記試験溶液の吸光度を変化させる特性を有する化合物であれば、特に限定されない。上記吸光度の変化は、好ましくは吸光度の減少であるが、これに限定されない。上記化合物は、生理的条件において活性酸素との接触により吸光度が変化するものであることが好ましい。また、上記化合物は、好ましくは、水溶性の化合物である。上記化合物は、例えば、活性酸素との接触により活性酸素の消去と同時に化学的構造変化（好ましくは、不可逆的な構造変化）により、活性酸素との接触前後において、特定波長の吸光度が変化する化合物であってもよい。測定の容易性および簡便性の観点からは、吸光度の変化は、好ましくは可視光域における吸光度の変化である。上記化合物の具体例として、ピラニン（8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸三ナトリウム）、クロシン（8,8'-ジアポ-ψ,ψ-カロテン-8,8'-二酸ビス(6-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)）、N,N’-Diphenyl-p-phenylenediamine (DPPD)、4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-undecanoic acid (BODIPY)、β-カロテン、Pyrogallol red、などを例示することができるが、これに限定されない。好ましくは、上記化合物はピラニンである。
【００３２】
上記試験溶液は、上記被験試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物を含む。必要に応じて、試験溶液の反応を阻害しないことを条件として、追加の成分を含めることができる。上記成分は、試験溶液のｐＨおよび塩濃度を生理的条件に合わせる成分であってもよいが、これに限定されない。上記成分の具体例として、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline、PBS）およびトリス緩衝生理食塩水（Tris Buffered Saline、TBS）などの等張液でありかつ緩衝液である溶液、リン酸含有緩衝液、クエン酸含有緩衝液、ホウ酸含有緩衝液、酒石酸含有緩衝液、炭酸含有緩衝液、トリス含有緩衝液、および酢酸含有緩衝液などの緩衝液、生理食塩水などの等張液を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３３】
上記試験溶液における含有成分の配合量は、本発明の測定が行えることを限度として、特に制限されない。好ましくは、上記試験溶液における吸光度の経時変化が容易に観察できるように上記試験試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物の配合量を適宜調整することが好ましい。より好ましくは、上記化合物の吸光度の変化の開始から完了まで要する時間が、３０秒〜３時間程度、好ましくは５分〜２時間程度、より好ましくは１０分〜１時間程度となるように、上記試験試料、上記ラジカル開始剤、および上記化合物の配合量調整することが好ましい。
【００３４】
上記試料は、ラジカル開始剤による活性酸素の発生が反応開始する時点（反応開始時点）において、試験溶液中、１〜３０重量％程度、好ましくは５〜１５重量％程度、より好ましくは約１０重量％程度とすることができる。
【００３５】
上記ラジカル開始剤および上記化合物の反応開始時点での試験溶液中の含有量は、用いるラジカル開始剤および化合物の組み合わせに応じて適宜設定することができる。例えば、上記ラジカル開始剤がばAAPHであり上記化合物が例えばピラニンである場合、AAPHの配合量を、反応開始時点において、試験溶液１リットルあたり２５〜７５ミリモル程度、好ましくは４５〜５５ミリモル程度、より好ましくは約５０ミリモル程度、ならびに、ピラニンの配合量を、反応開始時点において、試験溶液１リットルあたり２５〜７５マイクロモル程度、好ましくは４５〜５５マイクロモル程度、より好ましくは約５０マイクロモル程度とすることができる。
【００３６】
上記工程において、対照試料を得る。上記対照試料は、本発明の試験試料に対する対照となりうる限り、あらゆる生体試料を用いることができる。上記対照試料は、上記試験試料と同種の試料を、上記試験試料と同様の方法で採取したものであることが好ましい。
【００３７】
上記対照試料を得るための、対照生体、対照物質、および対照生体への対照物質の投与方法は、上記試験試料の場合と同様の条件から、測定目的に応じて当業者が適宜設定しうる。好ましくは、対照生体、対照物質、および対照生体への対照物質の投与方法は、いずれか一つを上記試験試料の場合と異なるものとする。例えば、対照生体、対照物資、および対照生体への対照物質の投与方法の３点のうち、対照生体のみを試験試料の場合と条件が異なるものとすることで、生体の差異による、被験物質の投与（ここでは、対照物質および投与方法は同一）による生体の抗酸化能の変化の差異を測定することができる。あるいは、上記対照物質のみを試験試料の場合と異なるものとすることで、被験物質の投与による生体の抗酸化能の変化を測定することができる。この場合、対照生体は、被験生体と条件が同様であるが異なる生体、または被験生体と同一の生体のいずれとすることもできる。対照生体への対照物質の投与方法のみを試験試料の場合と異なるものとすることによって、投与方法の差異による、被験物質の投与（ここでは、対照物質および投与方法は同一）による生体の抗酸化能の変化の差異を測定することができる。この場合、対照生体は、被験生体と条件が同様であるが異なる生体、または被験生体と同一の生体のいずれとすることもできる。
【００３８】
上記対照生体は、本発明の測定方法に適した対照試料の由来となりうる生体である限り、特に制限されるものではない。上記対照生体は、測定目的に応じて、上記被験生体と条件が異なる生体、または条件が同様である生体であってもよい。ここで条件が異なるとは、生物種が異なる、性別が異なる、誕生後経過時間（年齢など）が異なる、遺伝子型が異なる、生体がヒトである場合は人種が異なるなどを含むが、これらに限定されない。上記対照生体が、上記被験生体と条件が同様である生体である場合、上記対照生体は上記被験生体と同一の生体または異なる生体のいずれであってもよい。
【００３９】
上記対照物質は、被験物質に対する対照となりうることを限度として、特に制限されるものではなく、当業者が測定目的に応じて適宜設定しうる。上記対照物質は、測定目的に応じて、上記被験物質と異なっても、同じであってもよい。上記対照物質が被験物質と異なる場合は、上記被験物質が組成物である場合において、上記対照物質を、被験物質である組成物の有効成分（の候補）を除いた、担体からなる組成物とすることができる。または、上記被験物質が組成物である場合において、上記対照物質を、被験物質と同じ有効成分を含む担体が異なる組成物とすることもできる。無論、上記対照生体は、被験物質を投与しない生体とすることもできる。
【００４０】
上記対照物質の投与方法は、対照生体が得られることを限度として、特に制限されるものではなく、投与される対照生体および対照物質、ならびに測定目的に応じて、当業者が適宜設定し得る。具体的には、上記被験物質の投与方法の具体例などから、当業者が適宜選択することができる。上記対照物質の投与方法は、測定目的に応じて、上記被験物質の投与方法と同一または異なるもののいずれとすることもできる。
【００４１】
上記対照溶液は、試験試料の代わりに上記対照試料を含むこと以外は、上記試験溶液と同様に作製する。
【００４２】
上記工程において、作製した上記試験溶液および上記対照溶液において、上記ラジカル開始剤による活性酸素の発生を反応開始させる。上記反応開始の方法は、上記ラジカル開始剤に応じて、当業者が適宜設定することができる。上記試験溶液および上記対照溶液において、上記ラジカル開始剤がAAPHである場合は、３０〜４５℃程度、好ましくは３５〜４０℃程度、より好ましくは約３７℃程度で反応させることができる。
【００４３】
上記工程において、上記試験溶液と上記対照溶液との間において、吸光度の経時的差異を測定する。
【００４４】
上記吸光度の経時的差異を測定するための方法は、上記試験溶液の吸光度の経時的変化、および上記対照溶液の吸光度の経時的変化をそれぞれ測定し、測定結果を比較することで求めることができる。上記吸光度の経時的変化を測定するための方法は、当業者が公知の手法より適宜選択することができ、特に限定されるものではない。例えば、公知の分光光度計を用いた手法を、用いることができる。公知のマイクローリーダープレートなどを用いる場合、少量（数マイクロリットル）の試料を用いて作製した溶液で測定を行なうことができる。吸光度の変化が可視光域における吸光度の変化である場合は、目視による測定を行なうことができる。上記化合物がピラニンである場合は、吸光度の変化は、ピラニンの特異的な吸光が測定される波長領域、好ましくは４３０〜４８０ｎｍ、より好ましくは４５０〜４６０ｎｍ程度、特に好ましくは約４５４ｎｍ程度の波長領域における吸光度の変化である。
【００４５】
上記吸光度の経時的差異は、上記試験溶液の吸光度の経時的変化、および上記対照溶液の吸光度の経時的変化の測定結果から、当業者が適宜求めることができる。上記吸光度の経時的差異として、例えば、上記試験溶液と上記対照溶液との間における、
（イ）吸光度の変化が開始するまでに要する時間の差異、
（ロ）吸光度が反応開始時点と比べて一定割合変化する（例えば、完全に消失する、１/2消失するなど）までに要する時間の差異、
（ハ）一定時間後の吸光度の差異
などを挙げることができるが、これらに限定されない。上記吸光度の経時的差異は、上記の具体例を含めて、上記試験溶液および上記対照溶液の吸光度の経時的変化をグラフにプロットすることで、容易に測定することができる。
【００４６】
かくして、生体の抗酸化能が測定される。
【００４７】
なお、上記試験溶液および上記対照溶液において、以下のような反応が進行すると考えられる。
（i）上記ラジカル開始剤により、溶液中にフリーラジカルが供給される、
（ii）溶液中に発生したフリーラジカルが、溶液中の酸素原子含有化合物（生体試料由来の脂質化合物、溶液中の酸素分子など）と反応し、活性酸素分子種を発生させる、
（iii）生体試料（被験試料または対照試料）の抗酸化能、すなわち生体試料に含まれる抗酸化物質が、活性酸素を消去または除去する、
（iv）生体試料中の抗酸化物質が消費され低減すると、上記ラジカル開始剤により供給される活性酸素は上記活性酸素との反応により吸光度が変化する化合物と反応し、溶液の吸光度の変化が開始する、および
（v）活性酸素と上記化合物との反応終了、または上記ラジカル開始剤による活性酸素の供給終了のいずれかにより、上記試験溶液および上記対照溶液の反応が終了する。
【００４８】
すなわち、本発明の測定方法は、生体試料の抗酸化能（生体試料に含まれる抗酸化物質）が、活性酸素と上記化合物との反応を抑制することに基づき、上記被験試料と上記対照試料との抗酸化能の差を、活性酸素と上記化合物との反応を抑制する効果の差を検出することにより測定する方法である。
（２）生体の抗酸化能を亢進できる被験物質の評価方法
本発明は、生体の抗酸化能を亢進できる被験物質の評価方法を提供する。本発明の評価方法は、上記（１）の測定方法を用いて行なうことができる。
【００４９】
本発明の評価方法において、上記「（１）生体の抗酸化能の測定方法」と同様に、（ａ）試験溶液と（ｂ）対照溶液との間で、吸光度の経時的変化を測定する。
【００５０】
上記試験溶液および上記対照溶液は、上記「（１）生体の抗酸化能の測定方法」と同様の手段で作製することができる。ただし、上記対照溶液において、対照生体、対照物資、および対照生体への対照物質の投与方法の３点のうち、上記対照物質のみを試験試料の場合と異なるものとすることが好ましい。
【００５１】
上記吸光度の経時的変化の測定は、上記「（１）生体の抗酸化能の測定方法」と同様の手段で行なうことができる。
【００５２】
次いで、本発明の評価方法において、上記試験溶液の吸光度の経時的変化が、上記対照溶液の吸光度の経時的変化と比べて遅延する場合は、上記被験物質が生体内の抗酸化能を亢進する活性を有すると判定する。上記試験溶液の吸光度の経時的変化が、上記対照溶液の吸光度の経時的変化と比べて遅延する場合として、例えば、
（イ）上記試験溶液において吸光度の変化が開始するまでに要する時間が上記対照溶液と比べて長い場合、
（ロ）上記試験溶液において吸光度が反応開始時点と比べて一定割合変化する（例えば、完全に消失する、１/2消失するなど）までに要する時間が上記対照溶液と比べて長い場合、
（ハ）上記試験溶液における一定時間後の吸光度と反応開始時点の吸光度との差が、上記対照溶液における一定時間後の吸光度と反応開始時点の吸光度との差と比べて小さい場合、などを挙げることができるが、これらに限定されない。上記遅延は、上記の具体例を含めて、上記試験溶液および上記対照溶液の吸光度の経時的変化をグラフにプロットすることで、容易に判定することができる。
【００５３】
かくして、生体の抗酸化能を亢進できる被験物質が評価される。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例をもって、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
実施例１  ショウガオール誘導体投与マウスにおける抗酸化能評価
＜材料と方法＞
（１）ショウガオール誘導体
下記式（１）および式（２）で示す、ショウガオール誘導体sh01（ethyl 12-(3-methoxy-4-(methoxymethoxy)phenyl)-10-oxododec-8-enoate）およびsh02（ethyl 12-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-10-oxododec-8-enoate）を用いた。
【００５６】
【化１】
2013044613.tif 000002
【００５７】
なお、ショウガオール（1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-decen-3-one）は、下記式（３）で示す化合物であり、フェノール基（フェノール性水酸基）において活性酸素を補足する抗酸化物質であると考えられている。従って、上記ショウガオール誘導体sh01はフェノール基がエーテル化されているため、抗酸化作用を有さない。一方、上記ショウガオール誘導体sh02は抗酸化作用を有する。
【００５８】
【化２】
2013044613.tif 000003
【００５９】
また、上記sh01およびsh02は、カルボン酸がエチルエステル化された構造を有している。エチルエステル構造は、実験動物やヒトの消化管・血漿中に存在するエステラーゼ活性により速やかに加水分解され、カルボン酸体となる。従って、sh01またはsh02を投与した被検体からは、エチルエステル体および加水分解産物であるカルボン酸体の両方が検出される。
【００６０】
（２）マウス処理
被験マウスとして、雄性C57BL/6マウスを用いた。ショウガオール誘導体sh01またはsh02を20mg/mL含む、0.5重量%（w/v）メチルセルロース懸濁液（投与媒体）を投与液とし、各々の投与液について被験マウスの体重1kg当たり5mLの投与液を、マウスに経口投与した（各n=2）。投与後30分、1時間、2時間、4時間、6時間および8時間に、ヘパリン採血管で採血し、マウス血漿試料を得た。
【００６１】
対照群として、同マウスにショーガオール誘導体を含まない0.5w/v%メチルセルロース懸濁液を投与したマウスを用いで、同様に血漿を採取した（n=2）。
【００６２】
（３）抗酸化能評価
本発明の方法に従って、マウス血漿試料の抗酸化能を評価した。評価方法の概略を図１に示す。
【００６３】
具体的には、96wellプレートにPBS緩衝液を70μL、（２）で得られたマウス血漿試料10μLおよび50μMのピラニン溶液（溶媒はPBS緩衝液）10μLを添加し、混和を行い、37℃で10分静置した。次いで、500mMのAAPH溶液（溶媒はPBS緩衝液）10μLを添加して、反応を開始した。
【００６４】
各試験溶液において、ピラニンに由来する454 nmの吸光度（ABS）の変化を分光光度計（Viento XS、DSファーマバイオメディカル)で3時間測定した。
【００６５】
（４）ショウガオール誘導体検出
（２）で得られた各マウス血漿試料25μL、メタノール50μLおよび内標準物質としてケトコナゾール(Sigma-Aldrich)を50ナノグラム含むメタノール溶液50μLを混合した。次いで、混合した試料を、温度20℃にて19,200×gで遠心分離した。遠心分離した試料の上清を分取し、上清中に含まれるショウガオール誘導体sh01およびsh02、ならびにそれらの加水分解物（脱エチル体）を、液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS、LC: Accela 1000 （ThermoFisher Scientific）およびMS: TSQ Quantum Discovery MAX （ThermoFisher Scientific））で検出し、その濃度を測定した。
【００６６】
＜実験結果および考察＞
（１）抗酸化能評価
吸光度の抗酸化能評価の測定結果を図２に示す。各マウス血漿試料について、反応開始時（t=0）からの経過時間（秒）を横軸にプロットした。反応開始からt秒経過時における吸光度の、反応開始時の吸光度に対する相対値（(ABS)t/(ABS)0%）を縦軸にプロットした。
【００６７】
各マウス血漿試料の測定結果と投与媒体である0.5w/v%メチルセルロース懸濁液のみを投与したマウス由来の血漿の測定結果（図中、「投与媒体のみ」）との間で、ピラニンの吸光度が減少し始めるまでの時間（Lag time）を、比較した。具体的には、t=0付近の値の接線(横軸に対してほぼ水平の直線となる)と、測定曲線の接線の交点となる時間をLag timeとした。
【００６８】
sh01を投与した場合は、投与後早い時点ではLag time の大きな変動は、見られなかった。sh02を投与した場合は、投与後早い時点ではLag timeが大きく、遅い時点では徐々にLag timeが小さくなった。
【００６９】
（２）ショウガオール誘導体検出
LC-MSによる試料中のショウガオール誘導体の検出結果を図３に示す。
【００７０】
sh01は経口投与後に速やかに分解され、投与後１時間で加水分解物は高濃度に達した。sh02は経口投与後に速やかに加水分解され、加水分解物も速やかに消失した。
【００７１】
（３）抗酸化能評価とショウガオール誘導体検出との対比
試料中のショウガオール誘導体濃度を横軸に、ピラニンの吸光度が減少し始めるまでの時間（Lag time）を縦軸に、それぞれプロットしたグラフを図４に示す。被験マウスにおいて、抗酸化作用を示すフェノール基を有するsh02は、血漿中濃度とLag timeの間に直線性が認められた。一方、抗酸化作用を持たないsh01では、血漿中濃度が増加しても、抗酸化作用に変化は認められなかった。なお、図中の横線は、対照試料である0.5w/v%メチルセルロース懸濁液（投与媒体のみ）を投与したマウスの抗酸化能（平均値）を示している。
【図１】
2013044613.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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