(57)【要約】      （修正有）【課題】大豆おからから分離させた主に低分子ペプチドを含む抽出物を含有する化粧料組成物と、低分子ペプチド抽出物製造方法の提供。【解決手段】大豆おからを抽出するステップと、濾過後に熱処理するステップ、さらに遠心分離するステップからなる低分子ペプチド抽出物の製造方法。【効果】大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物は、ＤＰＰＨ酸化抑制能があり、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼ発現抑制効果を示し、これらの複合相乗作用によって優れた皮膚シワ改善効果及び抗老化効果を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物を有効成分として含有する化粧料組成物。
【請求項２】
前記低分子ペプチドは、分子量が５００〜３０００Ｄａであることを特徴とする請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項３】
前記大豆おからは、白大豆、黒大豆（Glycine max (L.) Merr.）、タンキリマメ（痰切豆；Rhynchosia Nulubilis Loureiro）、アズキ（小豆；Phaseolus angularis (Willd.) W. Wight）、緑豆（Vigna radiata (L.) Wilczek）、ササゲ（Vigna sinensis King）、エンドウ（Pisum sativum L.）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris var. humilis）、ソラマメ（Vicia faba L.）及びナタマメ（Canavalia gladiata DC.）からなる群から選択された１種以上により製造されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の化粧料組成物。
【請求項４】
前記大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物を、組成物の総質量に対して０．０００１〜３０質量％で含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
前記大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物は、抽出物の総質量に対して前記低分子ペプチドを１０〜３０質量％の量で含有することを特徴とする請求項１又は２に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
前記組成物は、抗酸化用であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化粧料組成物。
【請求項７】
前記組成物は、抗老化用であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化粧料組成物
【請求項８】
（１）大豆おからに抽出溶媒を添加して攪拌抽出するステップと、
（２）前記（１）ステップの大豆おから抽出物を濾過し、熱処理するステップと、
（３）前記（２）ステップの抽出物を遠心分離するステップと、
を含む大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の製造方法。
【請求項９】
前記低分子ペプチドは、分子量が１００〜３０００Ｄａであることを特徴とする請求項８に記載の大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の製造方法。
【請求項１０】
前記大豆おからは、白大豆、黒大豆（Glycine max (L.) Merr.）、タンキリマメ（痰切豆；Rhynchosia Nulubilis Loureiro）、アズキ（小豆；Phaseolus angularis (Willd.) W. Wight）、緑豆（Vigna radiata (L.) Wilczek）、ササゲ（Vigna sinensis King）、エンドウ（Pisum sativum L.）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris var. humilis）、ソラマメ（Vicia faba L.）及びナタマメ（Canavalia gladiata DC.）からなる群から選択された１種以上により製造されたものであることを特徴とする請求項８又は９に記載の大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の製造方法。
【請求項１１】
前記（１）ステップの抽出溶媒は、精製水、メタノール、エタノール、グリセリン、エチルアセテート、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジクロロメタン、及びヘキサンからなる群から選択された１種以上を使用することを特徴とする請求項８又は９に記載の大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の製造方法。
【請求項１２】
前記（１）ステップの抽出は、１０〜８０℃の温度で行われることを特徴とする請求項８又は９に記載の大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の製造方法。
【請求項１３】
前記（２）ステップの熱処理は、８０〜１２０℃の温度で行われることを特徴とする請求項８又は９に記載の大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆から低分子ペプチド抽出物を分離する方法及び得られた抽出物を含有する化粧料組成物に関し、より詳しくは、大豆おからから分離させた主に低分子ペプチドを含む抽出物を含有することにより、抗酸化及び抗老化に効能を有する化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素は、体内酵素系、還元代謝、化学薬品、公害物質及び光化学反応などの各種物理的、化学的及び環境的な要因などによって生成され、細胞構成成分の脂質、タンパク質、糖及びＤＮＡなどに対して非選択的、非可逆的な破壊作用をすることにより、細胞老化または癌をはじめとする各種疾病を起こすものと知られている。また、これらの活性酸素による脂質過酸化の結果で生成される脂質と酸化物をはじめとする様々な体内過酸化物も、細胞に対する酸化的破壊を起こして各種機能障害を引き起こすことにより、様々な疾病の原因になる。したがって、このようなフリーラジカルを消去することができる化合物（ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒｓ）または過酸化物の生成抑制物質のような抗酸化剤が、これらの酸化物に起因する老化及び各種疾患の抑制または治療薬として期待される実情である。
【０００３】
人間の皮膚は、歳を取るにつれて、様々な内的および外的な要因によって変化を経る。すなわち、内的には、新陳代謝を調節する各種ホルモンの分泌が減少し、免疫細胞の機能と細胞の活性が低下し、生体に必要な免疫タンパク質及び生体構成タンパク質の生合成が減るようになる。また、外的には、オゾン層の破壊によって太陽光線のうち地表に到達する紫外線の含量が増加し、環境汚染がさらに深刻化することでフリーラジカル及び活性有害酸素などが増加することにより、皮膚の厚さが減少し、シワが増加し、弾力が減少するだけでなく、皮膚血色もくすんでいて、皮膚トラブルがしばしば発生し、シミ、ソバカス及び肝斑が増加するなど、様々な変化を起こすようになる。
【０００４】
老化が進むほど皮膚を構成する物質であるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸及び糖タンパク質の含有量並びに配列が変わるか又は減少する症状が現れるようになり、フリーラジカル及び活性有害酸素による酸化的ストレスを受けるようになる。また、老化が進むか紫外線により、皮膚を構成する大部分の細胞では、炎症を起こすと知られている炎症性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）を生成する酵素のシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２、ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の生合成が増加し、これらの炎症性因子によって皮膚組織を分解する酵素のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の生合成が増加し、ｉＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）によるＮＯ（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ）の生成が増加すると知られている。すなわち、自然的に進められる内因性老化による細胞活性の減少及び微細炎症によって基質物質の生合成が減少し、様々な有害環境によるストレスの増加及び太陽光線による活性酸素種の増加のような外的要因により、分解及び変性が加速化されて皮膚基質が破壊され薄くなりながら、皮膚老化の諸般症状が現れるようになる。したがって、このような老化の現象を防止し、改善させることができる活性成分に対して多くの研究が行われていることが現実である。
【０００５】
ペプチドは、様々な種類のアミノ酸がペプチド結合によって重合物を形成しているもので、一般的に２〜５０個のアミノ酸が結合されており、分子量が１０，０００Ｄａ（ｄａｌｔｏｎ）以下のものをいう。オリゴペプチド（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ）は、アミノ酸の数が１０個以下のペプチドをいい、このうち低分子大豆ペプチドは、溶解度が高くて、酸アルカリによる沈殿物がほとんどなく、水溶液での低い粘度により、健康食品の素材として応用が多様である。特に、分子量１，０００Ｄａ以上のオリゴペプチドは、小腸内の胆汁酸及びコレステロールと結合して排出され、血清コレステロールの濃度を低くする効果と、抗腫瘍、抗高血圧、免疫増強などの生理活性機能とが報告されているが、皮膚における抗酸化及び抗老化の効果に対しては未だ報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これにより、本発明者は、大豆由来抽出物のうち、皮膚に安全ながらも抗酸化、抗老化の効果が優秀であり、製品としての安定性も優秀な低分子ペプチドを含有する抗酸化及び抗老化の化粧料を製造するために研究している間、大豆のおからを抽出した後、濾過及び熱処理の後に、遠心分離方法によって製造された抽出物が低分子ペプチドの含有が高くて、抗酸化効果及び抗老化効果が非常に優秀であることを発見して本発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、大豆おからを抽出するステップと、前記ステップの抽出物に対して濾過後に熱処理をするステップと、前記ステップで熱処理された抽出物に対して遠心分離をするステップと、を含む低分子ペプチドの含量が増加した低分子大豆ペプチド抽出物の製造方法を提供することにある。
【０００８】
また、本発明の他の目的は、前記製造方法によって抽出した大豆おから低分子ペプチド抽出物を含有する皮膚抗酸化及び抗老化の効能が優秀である化粧料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、大豆おからを抽出するステップと、前記ステップの抽出物に対して濾過後に熱処理をするステップと、前記ステップで熱処理された抽出物に対して遠心分離をするステップと、を含む低分子ペプチドの含量が増加した低分子大豆ペプチド抽出物の製造方法を提供する。また、本発明は、前記抽出物を有効成分として含有する化粧料組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明による大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物は、ＤＰＰＨ酸化抑制能に優れて抗酸化効能があり、プロコラーゲン生成促進とコラゲナーゼ発現抑制効果を示しており、この二種類の活性の複合相乗作用によって優れた皮膚シワ改善効果及び抗老化効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】大豆抽出物に含有されたタンパク質の大きさを示したグラフである。
【図２】大豆おから抽出物に含有されたタンパク質の大きさを示したグラフである。
【図３】大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物に含有されたタンパク質の大きさを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明が提供する化粧料組成物は、大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物を有効成分として含有する。
【００１３】
本発明の前記大豆おからは、白大豆、黒大豆（Glycine max (L.) Merr.）、タンキリマメ（痰切豆；Rhynchosia Nulubilis Loureiro）、アズキ（小豆；Phaseolus angularis (Willd.) W. Wight）、緑豆（Vigna radiata (L.) Wilczek）、ササゲ（Vigna sinensis King）、エンドウ（Pisum sativum L.）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris var. humilis）、ソラマメ（Vicia faba L.）及びナタマメ（Canavalia gladiata DC.）からなる群から選択された１種以上の大豆により製造されたものを使用することができる。
【００１４】
本発明の前記低分子ペプチドは、分子量１００Ｄａ以上３０００Ｄａ以下の低分子ペプチドを使用することができ、好ましくは、１００Ｄａ以上１０００Ｄａ以下の低分子ペプチドを使用することができる。
【００１５】
本発明の化粧料組成物は、前記大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物を組成物の総質量に対して０．０００１〜３０質量％の量で含有する。含量が０．０００１質量％未満であれば、前記抽出物による抗酸化及び抗老化の効果などを得ることができず、含量が３０質量％を超過すれば、含量増加に比べて効果の増加が大きくないためである。
【００１６】
本発明の前記大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物は、抽出物の総質量に対して前記低分子ペプチドを１０〜３０質量％の量で含有する。
【００１７】
本発明の前記大豆おからは、当業界で用いられる通常的な方法によって製造され、具体的な例を挙げれば、大豆を水で洗った後、水に浸けて一晩の間にのばした後、水を適量ずつ添加しながら石臼または粉砕機で粉砕する。粉砕された大豆に大豆体積の３〜４倍の水を加えて１００〜１０５℃で１５分間加熱した後、濾過して豆乳を除去し、おからを得る。
【００１８】
本発明で用いられる大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物は、下記の方法により製造される。
（１）大豆おからに抽出溶媒を添加して攪拌抽出するステップと、
（２）前記（１）ステップの大豆おから抽出物を濾過し、熱処理するステップと、
（３）前記（２）ステップの抽出物を遠心分離するステップと、を含んで、大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物を製造する方法。
【００１９】
本発明において、前記（１）ステップの抽出溶媒は、水または有機溶媒を使用することができ、より具体的には、精製水、メタノール、エタノール、グリセリン、エチルアセテート、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジクロロメタン、及びヘキサンからなる群から選択された１種を単独でまたは２種以上混合して使用することができる。
【００２０】
前記（１）ステップの抽出温度は、１０〜８０℃が好ましく、６〜２４時間の間抽出することができる。前記抽出温度及び抽出時間を外れれば、抽出効率が劣るか又は成分の変化が起こる可能性がある。
【００２１】
前記（２）ステップにおける濾過は、当業界に知られた通常的な方法により、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透膜などを利用することができ、好ましくは、微細濾過をする。
【００２２】
前記（２）ステップにおける熱処理は、８０〜１２０℃で行うことが好ましい。８０℃未満では抽出効率が劣る可能性があり、１２０℃を超過すれば、成分の変化が起こったり有効成分が破壊されたりするためである。
【００２３】
前記のような方法で製造した大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物を含有した化粧料組成物は、ＤＰＰＨ酸化抑制実験を通じて抗酸化効能があることを確認することができ、プロコラーゲンの生成促進とコラゲナーゼの発現抑制効果があり、この二種類の活性の複合相乗作用により、優れた皮膚シワ改善効果を提供することができる。
以下、実施例及び試験例を通じて本発明をより詳細に説明するが、本発明がこれらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
［実施例１］大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の製造
白大豆で製造した大豆おから１ｋｇと精製水３Ｌとを容器に入れて混合した後、攪拌を行った。その後、これを濾布濾過により残渣と濾液に分離し、分離された濾液を減圧濃縮させた。濃縮された抽出物を１００℃で２０分間熱処理を加えて、これを遠心分離により残渣と濾液に分離した。生成された濾液を乾燥することにより、大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物１２ｇを製造し、収得した。
【００２５】
［比較例１］大豆抽出物の製造
白大豆１ｋｇと精製水３Ｌとを容器に入れて混合した後、攪拌した。その後、これを濾布濾過により残渣と濾液に分離し、分離された濾液を乾燥することにより、大豆抽出物１１２ｇを収得した。
【００２６】
［比較例２］大豆おから抽出物の製造
白大豆で製造した大豆おから１ｋｇと精製水３Ｌとを容器に入れて混合した後、攪拌を行った。その後、これを濾布濾過により残渣と濾液に分離し、分離された濾液を乾燥することにより、大豆おから抽出物６０ｇを収得した。
【００２７】
［試験例１］実施例１、比較例１〜２の抽出物のタンパク質の大きさの差異
前記実施例１及び比較例１〜２で製造した抽出物のタンパク質の大きさの差異を、Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆを用いて分析し、その結果を下記の図１〜３に示した。
図１〜３の結果から分かるように、比較例１の大豆抽出物の場合、抽出されたタンパク質の質量が６９００〜８３８０ｍ／ｚに集中し、大豆おから抽出物は約１４５９、５１００及び７８００ｍ／ｚに集中することに比べて、大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の場合には、５００〜１００ｍ／ｚにタンパク質の質量が小さな低分子ペプチドが１０〜３０％の含量で抽出されることを確認することができる。これにより、本発明の製造方法によって低分子ペプチドの含量が高い抽出物を得ることができることが分かる。
【００２８】
［試験例２］抗酸化効果試験（ＤＰＰＨテスト）
前記実施例１の大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物及び比較例１〜２の天然物抽出物のＤＰＰＨ酸化抑制効能を、トロロックスと比較して測定した。有機ラジカルのＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル、１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌ  ｈｙｄｒａｚｙｌ）の還元によって（抗酸化剤は酸化される）発生する吸光度の変化を通じて、抗酸化能を評価する方法を使用した。上記で収得した抽出物である実施例１及び比較例１〜２に対するＤＰＰＨの酸化が抑制され、吸光度が対照群に比べて減少する程度を測定することで、対照群の吸光度に比べて５０％以下の吸光度を示す濃度を有効抗酸化濃度として評価した。
１００μＭ（ｉｎ エタノール）ＤＰＰＨ溶液１９０ｕｌと、上記で収得した実施例及び比較例と、対照試料とをそれぞれ１０ｕｌずつ入れて反応液を作製し、３７℃で３０分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。対照試料としては広く使用されている合成抗酸化剤のトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）を使用した。各物質のＤＰＰＨ分析結果は、下記の表１に示し、ＩＣ50は添加した試料によって吸光度が５０％減少した時の試料濃度を意味する。
【００２９】
【表１】
2013112683.tif 000002
前記表１から確認できるように、本発明による大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の実施例１は、大豆抽出物の比較例１及び大豆おから抽出物の比較例２よりも、抗酸化能が非常に優秀であることが分かる。
【００３０】
［試験例３］コラゲナーゼ発現抑制効能の測定
前記実施例１の大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物及び比較例１〜２の天然物抽出物のコラゲナーゼ発現抑制能を、トコフェロール及びＥＧＣＧと比較して測定した。コラゲナーゼの発現程度が低いほどコラゲナーゼの発現抑制能が高く、皮膚内のコラーゲンの分解が少なくなり、したがって、生成されるシワの量が少なくなる。また、トコフェロール及びＥＧＣＧは、抗酸化物質であって、皮膚の表皮細胞を再生させ、皮膚の老化を防止する機能があるものと知られた物質である。
【００３１】
試験は２．５％のウシ胎仔血清が含有されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉａ）培地が入っている９６穴マイクロタイタープレート（９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ）に人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／穴（ｗｅｌｌ）になるように入れて、９０％程度育つ時まで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶かした前記比較例１〜２及び実施例１、トコフェロール及びＥＧＣＧを、１０-4モル濃度で２４時間の間に処理した後、細胞培養液を採取した。採取した細胞培養液を商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定器具（米国のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｓｉａ社）を利用してコラゲナーゼの生成程度を測定した。まず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された９６−穴プレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に採取された細胞培養液を入れて、３時間の間に抗原−抗体反応を恒温槽で実施した。３時間後に発色団が結合された２次コラーゲン抗体を９６−穴プレートに入れて、再び１５分間反応させた。１５分後に発色誘発物質を入れて室温で１５分間発色を誘発させ、再び１Ｍ硫酸を入れて反応（発色）を中止させれば、反応液の色は黄色を帯びて、反応進行の程度により黄色の程度が異なるように現れた。黄色を帯びる９６−穴プレートの吸光度を吸光計を利用して４０５ｎｍで測定し、下記の数式１によってコラゲナーゼの合成程度を計算した。このとき、組成物を処理しなかった群から採取された細胞培養液の反応吸光度を対照群にした。すなわち、非処理群でのコラゲナーゼの発現程度を１００にし、これと対比して組成物を処理した群でのコラゲナーゼの発現程度を求めた。結果は表２に示した。
【００３２】
【数１】
2013112683.tif 000003
【００３３】
【表２】
2013112683.tif 000004
前記表２の結果において、本発明による大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の実施例１は、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でコラゲナーゼの発現を抑制することを確認することができる。また、コラゲナーゼの発現抑制能が抗酸化物質として知られているトコフェロールよりも優秀であることを確認することができる。
【００３４】
［試験例４］プロコラーゲンの生成促進効能実験
前記比較例１の大豆抽出物、比較例２の大豆おから抽出物、及び実施例１から得た大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物のプロコラーゲンの生成能をビタミンＣと比較して測定した。プロコラーゲンは、コラーゲン生成誘導物質であって、コラーゲンの生成と老化防止に必要な物質であり、プロコラーゲンの生成程度が高いほどコラーゲンの生成程度が高くなり、したがって、皮膚シワの生成を防止することができる。また、ビタミンＣは、コラーゲンの合成に必須成分として知られている。
試験は、２．５％のウシ胎仔血清が含有されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉａ）培地が入っている９６穴マイクロタイタープレートに人間の繊維芽細胞を５，０００細胞／穴（ｗｅｌｌ）になるように入れて、９０％程度育つ時まで培養した。その後、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した後、無血清ＤＭＥＭ培地に溶かした前記比較例１〜２及び実施例１、ビタミンＣを１０-4モル濃度で２４時間の間に処理した後、細胞培養液を採取した。２４時間後に培地中に遊離したプロコラーゲンの量をプロコラーゲンタイプ−１  Ｃ−ペプチドＥＩＡキット（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ−１  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＩＡ  ｋｉｔ）（ＭＫ１０１、Ｔａｋａｒａ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。測定した結果は、下記の数式２によってプロコラーゲンの生成程度を計算し、このとき、組成物を処理しなかった群から採取されたプロコラーゲンの生成程度を対照群にした。すなわち、非処理群でのプロコラーゲンの生成程度を１００にし、これと対比して組成物を処理した群でのプロコラーゲンの生成程度を求めた。結果は表３に示した。
【００３５】
【数２】
2013112683.tif 000005
【００３６】
【表３】
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【００３７】
表３の結果において、大豆おから由来の低分子ペプチド抽出物の実施例１は、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でプロコラーゲンの生成を促進することを確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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