(57)【要約】【課題】微生物の資化・代謝過程により生じた代謝物質をモニタリングする。【解決手段】代謝物質モニタリング方法は、資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する近赤外光の波長における吸光度の経時変化を測定して代謝物質をモニタリングする。【選択図】図１
2013101111.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物と、前記微生物により資化される資化物質と、前記微生物が生成する代謝物質とを含む試料に近赤外光を照射する照射工程と、
前記試料を透過し、または前記試料により反射された近赤外光の前記試料に対する吸光度を測定する測定工程とを包含し、
前記測定工程は、前記資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する波長における前記吸光度の経時変化を測定して前記代謝物質をモニタリングすることを特徴とする代謝物質モニタリング方法。
【請求項２】
前記代謝物質は、酢酸塩を含み、
前記対応する波長は、２２５５ｎｍを中心とする帯域の波長である請求項１記載の代謝物質モニタリング方法。
【請求項３】
微生物からなる散乱体を含む散乱体液に赤外光を照射する照射工程と、
前記散乱体液に照射された近赤外光に基づいて前記散乱体の濃度を測定する測定工程とを包含し、
前記測定工程は、前記照射された近赤外光に基づいて、前記散乱体の粒子径に対応する前記近赤外光の波長における前記散乱体液の換算散乱係数を算出し、前記換算散乱係数に基づいて前記散乱体の濃度を測定することを特徴とする散乱体濃度測定方法。
【請求項４】
前記微生物は、大腸菌を含み、
前記粒子径に対応する近赤外光の波長は、１２００ｎｍを中心とする帯域の波長である請求項３記載の散乱体濃度測定方法。
【請求項５】
第１微生物からなる第１散乱体と、前記第１微生物の第１粒子径よりも大きい第２粒子径を有する第２微生物からなる第２散乱体とを含む散乱体液に近赤外光を照射する照射工程と、
前記散乱体液に照射された近赤外光に基づいて前記第１及び第２散乱体の濃度を測定する測定工程とを包含し、
前記測定工程は、前記照射された近赤外光に基づいて、前記第１散乱体の第１粒子径に対応する前記近赤外光の第１波長における前記散乱体液の第１換算散乱係数を算出し、前記第１換算散乱係数に基づいて前記第１散乱体の濃度を測定し、前記第２散乱体の第２粒子径に対応する前記近赤外光の第２波長における前記散乱体液の第２換算散乱係数を算出し、前記第２換算散乱係数に基づいて前記第２散乱体の濃度を測定することを特徴とする散乱体濃度測定方法。
【請求項６】
微生物と、前記微生物により資化される資化物質と、前記微生物が生成する代謝物質とを含む試料に近赤外光を照射する照射手段と、
前記試料を透過し、または前記試料により反射された近赤外光の前記試料に対する吸光度を測定する測定手段とを備え、
前記測定手段は、前記資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する波長における前記吸光度の経時変化を測定して前記代謝物質をモニタリングすることを特徴とする代謝物質モニタリング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を含む試料に近赤外光を照射して当該試料の特性を測定する代謝物質モニタリング方法、散乱体濃度測定方法、及び代謝物質モニタリング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
廃水処理に於いて、処理がどの時点でどの程度進んでいるかを知る事は、処理の最適化にとって重要である。廃水処理施設における合理的な運転とは、最小限の運転コストで，要求される処理水質を安定的に維持する運転である。これを実現するためには、処理すべき汚濁負荷を的確に把握し必要となる動力や薬剤を必要最小限に制御する方法や、処理結果である処理水質を監視することにより、要求される水質を維持できなかった場合に動力や薬剤の投入量を増加させる処理制御技術が有効である。しかし、廃水処理施設において処理を強化することは、一般的には運転コストの増大に繋がるために、運転管理の合理化が望まれる。
【０００３】
適切な解析を行い、環境条件の適切な制御を行うことで、ほとんどの有機廃水は生物学的処理により処理することができる。生物学的処理の一般的な方法である活性汚泥法による好気的処理は、有機性の汚水中で微生物を連続的に培養し、汚水中の浮遊物や溶解性物質を吸着・酸化・同化させるものである。活性汚泥の能力は経験的に微生物の代謝過程に基づいて変化することが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
廃水処理の分野では、廃水に含まれる金属や、有機化合物、フロックの濃度を分析することで、処理量の制御が行われおり、これまでに、この分析技術として、近赤外を用いた方法がある。例えば、２００〜２５００ｎｍの波長範囲の可視、紫外光および近赤外を用いて、吸光度スペクトルまたは発光スペクトルの計測値をもとに、ケモメトリックス演算を利用することにより、廃水中の含有成分と濃度を分析する技術（特許文献１）が知られている。この技術は、２００〜２５００ｎｍの波長範囲で連続した波長又は複数の波長で生物処理プラントにおける廃水の吸光度スペクトルまたは発光スペクトルを計測する。そして、このスペクトルデータにケモメトリックス演算を適用することより廃水の含有成分を同定し濃度を演算する。
【０００５】
また、汚泥濃度を正確かつ連続的に測定し、その測定値を指標として、薬品注入や、脱水、焼却など汚泥処理プロセスの効率を高めることが重要である。これまで、可視光を使用した透過光測定法、散乱光測定法などを利用し濁度計を用いて濁度が測定されてきたが、試料の着色により、正確に計測できない場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１３６２０８号公報（２００４年５月１３日公開）
【特許文献２】特開２００４−１７７１２２号公報（２００４年６月２４日公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】社団法人日本下水道協会，エアレーションタンクの微生物−検鏡と培養の手引き−、pp. 1-21
【非特許文献２】J.-N. Phue, S. B. Noronha, R. Hattacharyya, A. J. Wolfe and J. Shiloach: Glucose metabolism at high density growth of E. coli B and E. coli K: differences in metabolic pathways are responsible for efficient glucose utilization in E. coli B as determined by microarrays and Northern blot analysis” Biotechnology and Bioengineering, Vol. 90, pp. 805-820 (2005)
【非特許文献３】J. W. Hall, B. McNeil, M. J. Rollins, I. Draper, B. G. Thompson and G. Macaloney: Near-Infrared spectroscopic determination of acetate, ammonium, biomass, and glycerol in an industrial Eschericha coli fermentation, Applied Spectroscopy, Vol. 50, No. 1, pp. 102-108 (1996)
【非特許文献４】粟津邦男，長塩尚之，石井克典：赤外分光分析による微生物中間生成代謝物の推定に関する基礎的検討，環境システム計測制御学会誌，Vol. 15, No.2, 3, pp. 5-7 (2010)
【非特許文献５】高橋力也，小山幸治，安村和晃，川北省一，鈴木昌治，米山平：バルキング活性汚泥による乳酸，酢酸，プロピオン酸および酪酸の生成，醗酵工学会誌，Vol. 68, No. 1, pp. 17-23 (1990)
【非特許文献６】宗宮功，岸本直之，小野芳郎，西本聡：散乱スペクトル分析による水質の連続分析，水環境学会誌， Vol. 19，No. 1, pp.47-55 (1996)
【非特許文献７】宮田純，中原啓介：廃水処理プラントにおけるオンサイト水質モニタリング技術，JFE技報， No. 13, pp. 59-64 (2006)
【非特許文献８】本多典広，寺田隆哉，南條卓也，石井克典，粟津邦男：Inverse Monte Carlo法による光線力学療法前後の腫瘍組織の光学特性の算出，日本レーザー医学会誌，Vol. 31, No.2, pp. 115-121 (2010)
【非特許文献９】L.-H. Wang, S.L. Jacques and L.-Q. Zheng: Monte Carlo modeling of photon transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine, Vol. 47, pp.131-146 (1995)
【非特許文献１０】V. V. Tuchin: Tissue Optics, SPIE Press, pp. 132-142, (2007)
【非特許文献１１】F. J. Trueba and C. L. Woldringh: Changes in cell diameter during the division cycle of Escherichia coli, Journal of Bacteriology, Vol. 142, No. 3, pp. 869-878 (1980)
【非特許文献１２】B. Alince and P. Lepoutre: Light-scattering of coatings formed from polystyrene pigment particles, Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 76, No. 1, pp. 182-187 (1980)
【非特許文献１３】T. Burger, J. Kuhn, R. Caps and J. Fricke: Quantitative determination of the scattering and absorption coefficients from diffuse reflectance and transmittance measurements: Application to Pharmaceutical Powders, Applied Spectroscopy, Vol. 51, No. 3, pp. 309-317 (1997)
【非特許文献１４】T. Srinorakutara: Determination of yeast cell wall thickness and cell diameter using new methods, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 86, No. 3, 253-260 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記活性汚泥法等の生物学的処理に於いては、これまで主に「処理性能」に着目し、有機物・窒素・リン等の挙動把握・解析が行われている。しかしながら、微生物の代謝過程における資化・代謝により生じた物質にはあまり注目されていない。多段の反応層等の場合、資化・代謝された物質の挙動を知る事は、「処理性能」および「省エネ」の観点から重要であると考えられる。
【０００９】
また、試料の着色や濁度などの光学的特徴は、それぞれ、光の吸収のしやすさを表す吸収係数μａ［ｍｍ−１］、散乱のしやすさを表す換算散乱係数μｓ’［ｍｍ−１］等の光学特性値で記述する事ができる。だが、これまで、光学特性値に着目し、汚泥の吸収係数μａ、換算散乱係数μｓ’を計測し濁度を計測した例はない。
【００１０】
本発明の目的は、微生物の資化・代謝過程により生じた代謝物質をモニタリングすることができる代謝物質モニタリング方法及び代謝物質モニタリング装置を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、微生物からなる散乱体の濃度を近赤外光により測定することができる散乱体濃度測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る代謝物質モニタリング方法は、微生物と、前記微生物により資化される資化物質と、前記微生物が生成する代謝物質とを含む試料に近赤外光を照射する照射工程と、前記試料を透過し、または前記試料により反射された近赤外光の前記試料に対する吸光度を測定する測定工程とを包含し、前記測定工程は、前記資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する波長における前記吸光度の経時変化を測定して前記代謝物質をモニタリングすることを特徴とする。
【００１３】
この特徴により、資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する波長における吸光度の経時変化を測定して代謝物質をモニタリングする。このため、活性汚泥の能力を変化させる微生物の資化・代謝過程により生じた代謝物質をモニタリングすることができる。
【００１４】
本明細書において、「近赤外光」とは、赤外光のうち、７５０ｎｍ以上３０００ｎｍ以下の波長を有する光を意味するものとする。
【００１５】
本発明に係る代謝物質モニタリング方法では、前記代謝物質は、酢酸塩を含み、前記対応する波長は、２２５５ｎｍを中心とする帯域の波長であることが好ましい。
【００１６】
上記構成により、２２５５ｎｍを中心とする帯域の波長における吸光度の経時変化を測定して、グルコースを資化した大腸菌が生成する酢酸塩をモニタリングすることができる。
【００１７】
本発明に係る散乱体濃度測定方法は、微生物からなる散乱体を含む散乱体液に近赤外光を照射する照射工程と、前記散乱体液に照射された近赤外光に基づいて前記散乱体の濃度を測定する測定工程とを包含し、前記測定工程は、前記照射された近赤外光に基づいて、前記散乱体の粒子径に対応する前記近赤外光の波長における前記散乱体液の換算散乱係数を算出し、前記換算散乱係数に基づいて前記散乱体の濃度を測定することを特徴とする。
【００１８】
この特徴により、散乱体の粒子径に対応する前記近赤外光の波長における前記散乱体液の換算散乱係数を算出し、前記換算散乱係数に基づいて前記散乱体の濃度を測定する。このため、微生物からなる散乱体の濃度を近赤外光により測定することができる。
【００１９】
本発明に係る散乱体濃度測定方法では、前記微生物は、大腸菌を含み、前記粒子径に対応する近赤外光の波長は、１２００ｎｍを中心とする帯域の波長であることが好ましい。
【００２０】
上記構成により、大腸菌の粒子径に対応する１２００ｎｍを中心とする帯域の波長に基づいて大腸菌の濃度を測定することができる。
【００２１】
本発明に係る散乱体濃度測定方法は、第１微生物からなる第１散乱体と、前記第１微生物の第１粒子径よりも大きい第２粒子径を有する第２微生物からなる第２散乱体とを含む散乱体液に近赤外光を照射する照射工程と、前記散乱体液に照射された近赤外光に基づいて前記第１及び第２散乱体の濃度を測定する測定工程とを包含し、前記測定工程は、前記照射された近赤外光に基づいて、前記第１散乱体の第１粒子径に対応する前記近赤外光の第１波長における前記散乱体液の第１換算散乱係数を算出し、前記第１換算散乱係数に基づいて前記第１散乱体の濃度を測定し、前記第２散乱体の第２粒子径に対応する前記近赤外光の第２波長における前記散乱体液の第２換算散乱係数を算出し、前記第２換算散乱係数に基づいて前記第２散乱体の濃度を測定することを特徴とする。
【００２２】
この特徴により、前記照射された近赤外光に基づいて、前記第１散乱体の第１粒子径に対応する前記近赤外光の第１波長における前記散乱体液の第１換算散乱係数を算出し、前記第１換算散乱係数に基づいて前記第１散乱体の濃度を測定し、前記第２散乱体の第２粒子径に対応する前記近赤外光の第２波長における前記散乱体液の第２換算散乱係数を算出し、前記第２換算散乱係数に基づいて前記第２散乱体の濃度を測定する。このため、第１散乱体及び第２散乱体の構成比を概算することができる。
【００２３】
本発明に係る代謝物質モニタリング装置は、微生物と、前記微生物により資化される資化物質と、前記微生物が生成する代謝物質とを含む試料に近赤外光を照射する照射手段と、前記試料を透過し、または前記試料により反射された近赤外光の前記試料に対する吸光度を測定する測定手段とを備え、前記測定手段は、前記資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する波長における前記吸光度の経時変化を測定して前記代謝物質をモニタリングすることを特徴とする。
【００２４】
この特徴により、資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する波長における吸光度の経時変化を測定して代謝物質をモニタリングする。このため、活性汚泥の能力を変化させる微生物の資化・代謝過程により生じた代謝物質をモニタリングする代謝物質モニタリング装置を得ることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る代謝物質モニタリング方法は、資化物質を資化した微生物が生成する代謝物質に対応する波長における吸光度の経時変化を測定して代謝物質をモニタリングする。このため、活性汚泥の能力を変化させる微生物の資化・代謝過程により生じた代謝物質をモニタリングすることができる。
【００２６】
本発明に係る散乱体濃度測定方法は、散乱体の粒子径に対応する近赤外光の波長に基づいて散乱体の濃度を測定する。このため、微生物からなる散乱体の濃度を近赤外光により測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施の形態１に係る代謝物質モニタリング装置の構成を示す模式図である。
【図２】実施の形態２に係る散乱体濃度測定装置の構成を示す模式図である。
【図３】実施例１に係るＧＧを添加培養した培養液の近赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図４】実施例１に係るスキムミルクを添加培養した培養液の近赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図５】図３に示すグラフを２次微分したスペクトルを示すグラフである。
【図６】図４に示すグラフを２次微分したスペクトルを示すグラフである。
【図７】実施例１に係るＧＧを添加培養した培養液の近赤外吸収スペクトルの経過時間に伴う増大値のスペクトルを示すグラフである。
【図８】実施例１に係るスキムミルクを添加培養した培養液の近赤外吸収スペクトルの経過時間に伴う増大値のスペクトルを示すグラフである。
【図９】実施例１に係るＧＧを添加培養した培養液における波長２２６０ｎｍ及び波長９７００ｎｍにおける吸光度の経時変化を示すグラフである。
【図１０】実施例１に係るスキムミルクを添加培養した培養液における波長２２６０ｎｍ及び波長９７００ｎｍにおける吸光度の経時変化を示すグラフである。
【図１１】実施例１に係る波長２２６０ｎｍでの吸光度と波長９７００ｎｍでの吸光度の逆数との関係を示すグラフである。
【図１２】実施例２に係る大腸菌濃度毎の吸収係数スペクトルを示すグラフである。
【図１３】実施例２に係る大腸菌濃度毎の換算散乱係数スペクトルを示すグラフである。
【図１４】実施例２に係る大腸菌濃度と換算散乱係数との関係を示すグラフである。
【図１５】実施例３に係る大腸菌濃度と酵母菌濃度との比率毎の換算散乱係数スペクトルを示すグラフである。
【図１６】実施例３に係る大腸菌と酵母との混合溶液における大腸菌濃度の検量線を示すグラフである。
【図１７】実施例３に係る大腸菌と酵母との混合溶液における酵母菌濃度の検量線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本実施の形態では、微生物の資化・代謝により生じる物質と活性汚泥中の微生物との動的把握を簡便に行うことができる分析手法の確立を目的として、近赤外吸収分光分析、および近赤外波長において独自に開発した光学特性算出装置を用いた光学特性値の計測を検討した。本実施の形態では、大腸菌と模擬廃水とを用いた生物処理系を用いて、近赤外吸収分光分析法を活用した反応水中の動的変化の把握、および光学特性値算出法を活用した大腸菌液中の大腸菌濃度の定量的評価を試みたので、以下説明する。
【００２９】
（実施の形態１）
（代謝物質モニタリング装置１の構成）
図１は、実施の形態１に係る代謝物質モニタリング装置１の構成を示す模式図である。代謝物質モニタリング装置１は、代謝物質モニタリング方法を実行する装置であり、近赤外光照射部２を備えている。近赤外光照射部２は、試料４に近赤外光を照射する。
【００３０】
試料４は、微生物と、この微生物により資化される資化物質と、この微生物が生成する代謝物質とを含んでいる。この微生物は、例えば、大腸菌であり、資化物質は、例えば、グルコースである。代謝物質は、例えば、酢酸塩である。
【００３１】
代謝物質モニタリング装置１には、近赤外光測定部３が設けられている。近赤外光測定部３は、試料４により反射された近赤外光の試料４に対する吸光度を測定する。具体的には、近赤外光測定部３は、試料４のグルコースを資化した大腸菌が生成する酢酸塩に対応する２２５５ｎｍを中心とする帯域の波長における吸光度の経時変化を測定して酢酸塩をモニタリングする。
【００３２】
試料４に含まれる微生物は、大腸菌以外のバクテリアであってもよく、また、酵母菌、カビ等の真菌であってもよい。また、資化物質は、グルコースの他、ガラクトースとグルコースとが結合したラクトース（乳糖）、ガラクトース、グルタミン酸、スキムミルク、蛋白質であってもよい。そして、代謝物質は、酢酸塩の他、ピルビン酸でもよい。
【００３３】
実施の形態１では、試料４により反射された近赤外光の試料４に対する吸光度を測定する例を示すが、本発明はこれに限定されない。試料４を透過した近赤外光の吸光度を測定するように構成してもよい。
【００３４】
（実施の形態２）
（散乱体濃度測定装置５の構成）
図２は、実施の形態２に係る散乱体濃度測定装置５の構成を示す模式図である。散乱体濃度測定装置５は、散乱体濃度測定方法を実行する装置であり、近赤外光照射部６を備えている。近赤外光照射部６は、散乱体液８に近赤外光を照射する。
【００３５】
散乱体液８は、微生物からなる散乱体を含む。この微生物は、例えば、大腸菌である。大腸菌の粒子径は、約１０００ｎｍである。
【００３６】
散乱体濃度測定装置５には、近赤外光測定部７が設けられている。近赤外光測定部７は、散乱体液８に照射された近赤外光に基づいて散乱体の濃度を測定する。具体的には、近赤外光測定部７は、散乱体である大腸菌の粒子径に対応する近赤外光の波長に基づいて散乱体の濃度を測定する。例えば、近赤外光測定部７は、大腸菌の粒子径である約１０００ｎｍに対応する１２００ｎｍを中心とする帯域の近赤外光の波長における散乱体液の換算散乱係数μｓ’を算出し、この換算散乱係数μｓ’に基づいて大腸菌の濃度を測定する。
【００３７】
実施の形態２では、散乱体液８により反射された近赤外光の波長に基づいて散乱体液の換算散乱係数μｓ’を算出する例を示すが、本発明はこれに限定されない。散乱体液８を透過した近赤外光により換算散乱係数μｓ’を算出するように構成してもよい。
【００３８】
散乱体液８に含まれる微生物は、大腸菌以外のバクテリアであってもよく、また、酵母菌、カビ等の真菌であってもよい。
【００３９】
散乱体液８は、大腸菌と酵母菌とを含んでいても良い。酵母菌の粒子径は、大腸菌よりも大きい５０００ｎｍ〜１００００ｎｍである。この場合、近赤外光照射部６は、この大腸菌と酵母菌とを含む散乱体液８に近赤外光を照射する。そして、近赤外光測定部７は、照射された近赤外光に基づいて、近赤外光の１２００ｎｍを中心とする帯域の波長における散乱体液の換算散乱係数μｓ’を算出し、換算散乱係数μｓ’に基づいて大腸菌の濃度を測定する。次に、近赤外光測定部７は、近赤外光の２２５５ｎｍを中心とする帯域の波長における散乱体液の換算散乱係数μｓ’を算出し、換算散乱係数μｓ’に基づいて酵母菌の濃度を測定する。
【実施例１】
【００４０】
実施の形態１で前述した代謝物質モニタリング方法の実施例を説明すると以下のとおりである。
【００４１】
（試料の構成）
（前培養・種菌）
普通ブイヨン（ダイゴ製）培地１００ｍＬを５０ｍＬずつ、２つの坂口フラスコに入れ、蒸気滅菌（１２１℃、１５分）し、冷却後、事前に培養しておいた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＮＢＲＣ３３０１）を１白金耳、植菌し、３０℃で３０時間振盪培養を行った。
【００４２】
（集菌・種菌）
遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ．１５分）を２回繰り返し集菌した。菌ペレットを滅菌したリン酸緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．０）で懸濁し、全体で約５０ｍＬに調整した液を大腸菌液とした。大腸菌液の光学特性値を算出する為に、遠心分離（４０００ｒ．ｐ．ｍ．１５分）を行い、上記濃度より１２倍に濃縮し、その後、段階希釈により６．３倍の濃度に調整した。
【００４３】
（植菌）
予め、蒸気滅菌（１２１℃、１５分）を行ったＢＯＤ標準液（グルコース３４１０ｍｇとグルタミン酸３４１０ｍｇとを１Ｌの純水に溶解させたものを５０００ｍｇ／Ｌとした、以下「ＧＧ」と略記）３ｍＬと、１４１００ｍｇ／Ｌのスキムミルク溶液３ｍＬとに種菌液を１ｍＬずつ添加した混合液を遠沈管にいれ、２２℃で振盪培養を行った。
【００４４】
（前培養・種菌）
植菌した培養液を２４時間後までサンプリングし吸光度計測用の試料とした。
【００４５】
（近赤外吸光度計測）
スライドガラス間に厚み１ｍｍのスペーサーを挟み作成したサンプルホルダーに培養液をいれたものを測定試料とした。近赤外波長１０００ｎｍ〜２５００ｎｍにおいて試料の吸光度を計測する為に、光源としてハロゲンランプ（ＨＬ−２００−ＨＰ、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を使用した。光源の光は、コア直径１０００μｍのマルチモードファイバー（ＣＵＳＴＯＭ−ＰＡＴＣＨ−２２４３１４２、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて導光し、ファイバーを通過後、コリメータレンズで擬似平行化した後、試料に照射した。
【００４６】
試料を透過した光はレンズで集光され、マルチモードファイバーを用いて受光器まで導光した。受光器には近赤外分光器（ＮＩＲ２５６−２．５、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いた。測定条件は、透過法、測定面積４．４ｍｍφ、波長分解能約７．５〜２５．０ｎｍ、積算回数１００回にて測定を行った。ここで、ハロゲンランプは、図１で前述した近赤外光照射部２に相当し、受光器（近赤外分光器）は。図１の近赤外光測定部３に相当する。
【００４７】
（近赤外吸分光分析結果）
図３は、実施例１に係るＧＧを添加培養した培養液の近赤外線吸収スペクトルを示すグラフである。図４は、実施例１に係るスキムミルクを添加培養した培養液の近赤外線吸収スペクトルを示すグラフである。
【００４８】
近赤外分光法では、吸光度のピーク位置を検出するための手法として２次微分を取ることが一般的である。２次微分を取る事によりピークが急峻に現れ、尚且つ重なりあったピークの位置の検出も可能になる。そこで、各培養液を測定し得られたスペクトルを２次微分したスペクトルをそれぞれ図５及び図６に示す。
【００４９】
図５は、図３に示すグラフを２次微分したスペクトルを示すグラフである。図６は、図４に示すグラフを２次微分したスペクトルを示すグラフである。
【００５０】
図５における曲線Ａ１は、ＧＧを試料に添加したときの近赤外線吸収スペクトルの２次微分スペクトルを示し、曲線Ａ２は、添加０．５時間後の２次微分スペクトルを示す。曲線Ａ３は添加４時間後の２次微分スペクトルを示し、曲線Ａ４は添加１２時間後の２次微分スペクトルを示し、曲線Ａ５は添加２４時間後の２次微分スペクトルを示す。
【００５１】
同様に、図６における曲線Ｂ１は、スキムミルクを試料に添加したときの近赤外線吸収スペクトルの２次微分スペクトルを示し、曲線Ｂ２は、添加０．５時間後の２次微分スペクトルを示す。曲線Ｂ３は添加４時間後の２次微分スペクトルを示し、曲線Ｂ４は添加１２時間後の２次微分スペクトルを示し、曲線Ｂ５は添加２４時間後の２次微分スペクトルを示す。
【００５２】
図５及び図６に示すように両スペクトルの波長約２２５０ｎｍ付近において２次微分吸光度は大きく異なる。図５に示すＧＧを添加した試料の２次微分吸光度は添加０．５時間後以降，経過時間とともに増加した。また、図６に示すスキムミルクを添加した試料の２次微分吸光度は、添加４時間後以降から１２時間後まで，経過時間とともに増加した。
【００５３】
波長２２５０ｎｍ付近のＧＧおよびスキムミルク添加後の吸光度の増加分を計算する為に、波長２２１８〜２３２１ｎｍにて、ＧＧおよびスキムミルク添加後０．５時間から２４時間の培養液の各吸光度値から，添加０時間後の吸光度値を減算した。得られたＧＧおよびスキムミルク添加後の培養液の吸収スペクトルをそれぞれ図７及び図８に示す。
【００５４】
図７は、実施例１に係るＧＧを添加培養した培養液の近赤外線吸収スペクトルの経過時間に伴う増大値のスペクトルを示すグラフである。図８は、実施例１に係るスキムミルクを添加培養した培養液の近赤外線吸収スペクトルの経過時間に伴う増大値のスペクトルを示すグラフである。
【００５５】
図７における曲線Ｃ１は、ＧＧを試料に添加したときの近赤外線吸収スペクトルを示し、曲線Ｃ２は、添加０．５時間後の減算した吸収スペクトルを示す。曲線Ｃ３は添加５時間後の減算した吸収スペクトルを示し、曲線Ｃ４は添加１２時間後の減算した吸収スペクトルを示し、曲線Ｃ５は添加２４時間後の減算した吸収スペクトルを示す。
【００５６】
同様に、図８における曲線Ｄ１は、スキムミルクを試料に添加したときの近赤外線吸収スペクトルを示し、曲線Ｄ２は、添加０．５時間後の減算した吸収スペクトルを示す。曲線Ｄ３は添加５時間後の減算した吸収スペクトルを示し、曲線Ｄ４は添加１２時間後の減算した吸収スペクトルを示し、曲線Ｄ５は添加２４時間後の減算した吸収スペクトルを示す。
【００５７】
図７及び図８に示すように、ＧＧおよびスキムミルクを添加した場合ともに経過時間とともに波長２２５５ｎｍを中心とする吸収帯の値が増加した。
【００５８】
（波長２２５５ｎｍ付近における近赤外吸収分光分析）
波長２２５５ｎｍ付近にて、ＧＧおよびスキムミルクを混合後、時間経過に伴う吸収帯の増加が認められた。嫌気状態において、大腸菌がグルコースを資化することで、酢酸塩が生じることが報告されている（非特許文献２）。Ｈａｌｌらは，大腸菌を用いた実験にて、波長２２６０ｎｍの吸収帯が酢酸塩由来であることを報告している（非特許文献３）。今回の実験では、植菌後、振盪培養を行っていた際、遠沈管の蓋を閉めていたために、遠沈管内が嫌気状態になった可能性がある。
【００５９】
以上より、本研究で観測された反応時間に伴う波長２２５５ｎｍの吸収帯の増加は、大腸菌がグルコース等を資化することにより生じる酢酸塩由来であると考えられた。
【００６０】
本発明者らは、全有機炭素（ＴＯＣ）の経時的減少に伴う、糖類等の赤外吸収が消長することを報告している（非特許文献４）。そこで、実施例１で得られた波長２２５５ｎｍの吸光度と、過去にＴＯＣ濃度と相関が得られた赤外波長９７００ｎｍ（９．７μｍ）の吸光度との関連性を検討した。
【００６１】
赤外波長９７００ｎｍ（９．７μｍ）のデータは過去に報告した値を参考にした（非特許文献４）。ただし、参考にした実験データは実施例１と試料濃度の条件が異なることを特記する。試料濃度は本実施例と異なるものの、大腸菌が資化・代謝することによるＴＯＣ濃度の変化は同様の傾向があるため、実験データを参考資料として用いた。
【００６２】
ＧＧおよびスキムミルクを添加した後の波長２２５５ｎｍと波長９７００ｎｍ（９．７μｍ）における吸光度の経時変化をそれぞれ図９及び図１０に示す。
【００６３】
図９は、実施例１に係るＧＧを添加培養した培養液における波長２２６０ｎｍ及び波長９７００ｎｍにおける吸光度の経時変化を示すグラフである。図１０は、実施例１に係るスキムミルクを添加培養した培養液における波長２２００ｎｍ及び波長９７００ｎｍにおける吸光度の経時変化を示すグラフである。
【００６４】
図９に示すように，ＧＧを添加後、時間経過とともにＴＯＣと相関のある波長９７００ｎｍ（９．７μｍ）の吸光度（吸収）は指数関数的に減少し（非特許文献４）、一方、酢酸塩由来と考えられる波長２２５５ｎｍの吸光度（吸収）は増加する傾向が得られた。また、図１０に示すようにスキムミルクを添加後、時間経化とともに、波長９７００ｎｍ（９．７μｍ）の吸光度（吸収）は指数関数的に減少し、波長２２５５ｎｍの吸光度（吸収）は増加する傾向が得られ、この変化はＧＧを添加した際と同様の傾向であった。
【００６５】
ここで，波長９７００ｎｍ（９．７μｍ）の吸光度の変化と波長２２５５ｎｍの吸光度の変化とに相関があるかどうか検討した。図１１は、実施例１に係る波長２２６０ｎｍでの吸光度と波長９７００ｎｍでの吸光度の逆数との関係を示すグラフであり、波長９７００ｎｍ（９．７μｍ）の吸光度の逆数を縦軸にとり，波長２２５５ｎｍの吸光度を横軸にとり作成した。
【００６６】
図１１に示すように、ＴＯＣ濃度の減少に相関のある波長９７００ｎｍの吸光度と、微生物が資化し生じた酢酸塩由来と考えられる波長２２５５ｎｍの吸光度の増加には相関が得られた。高橋らは、活性汚泥のバルキングが酢酸塩などの有機塩と関係していると報告しており（非特許文献５）、本手法で計測可能であった酢酸塩由来の吸収をモニタリングすることで、活性汚泥のバルキングを防ぐためのツールになる可能性が得られた。今後は、好機状態の場合に、活性汚泥より資化・代謝され生じる物質が近赤外波長域で検出可能かどうかを検討する必要がある。
【００６７】
これまで、廃水中の浮遊性固形汚濁物質を、レイリー散乱光を測定することによりモニタリングすることができることは、宗宮らにより報告されている（非特許文献６）。また、宮田らは蛍光分析法が廃水処理プラント運用のためのモニタリング技術として活用できることを報告している（非特許文献７）。
【００６８】
本発明者らは、赤外分光分析が生物過程処理によるモニタリングにおいて有効であると報告した（非特許文献４）。赤外分光分析法を用いる場合、測定前に前処理として、試料を乾燥させる必要がある。しかし、今回用いた近赤外波長は、赤外波長に比して、水の吸収が弱い波長域であり、試料への光の侵達度が数ｍｍオーダーである。そのため、近赤外分光分析法は、前処理を必要とせずに測定対象を迅速に計測できる簡便な方法である。また、本実験結果より、近赤外分光分析法は，資化・代謝された物質の同定が可能であることが示唆された。
【００６９】
今後、活性汚泥などから廃水処理過程で生じた物質を測定し、近赤外波長域がモニタリング技術として有力な手法であるか検討する。本手法で用いられている近赤外波長は、紫外・可視光よりも光の散乱による検出光へのノイズの影響が小さく、シグナルの検出が妨害されにくいと考えられる。活性汚泥を測定する際に、濁度の増加に伴うシグナルの鈍化がどの程度計測結果に影響するかを検討する必要があると考えられる。
【００７０】
（まとめ）
実施例１では、廃水処理に於いて処理がどの時点でどの程度進んでいるか知る為に、近赤外分光分析法により、微生物が資化・代謝し生じた物質のモニタリングに着目し本発明を実施した。波長２２６０ｎｍ付近の長波長側の分光分析を行うことにより、ＧＧおよびスキムミルク添加後の培養時間の増加に伴い、資化・代謝された酢酸塩の増加を観測することができた。以上より、本発明は、近赤外分光分析を活用し、廃水処理中の資化・代謝により生じた物質を観測することで廃水処理の過程をモニタリングするための技術となることができる。
【実施例２】
【００７１】
実施の形態２で前述した散乱体濃度測定方法の実施例を説明すると以下のとおりである。
【００７２】
（試料の構成）
実施例２の培養液は、実施例１で使用した培養液と同じ培養液を使用した。
【００７３】
（光学特性値の算出）
スライドガラス（Ｓ１１１２、松浪硝子工業株式会社）間に厚み０．２ｍｍのスペーサーを挟み、作成したサンプルホルダーに培養液を入れたものを測定試料とした。大腸菌液の光学特性値は双積分球光学系とｉｎｖｅｒｓｅ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ法とを組み合わせた光学特性算出装置を用いて算出した（非特許文献８）。
【００７４】
光源にはハロゲンランプ（ＬＳ−Ｈ１５０ＩＲ−ＦＢＣ、株式会社住田光学ガラス）を用いた。光源からの光を、レンズを用いて集光し、二つの積分球（ＣＳＴＭ−３Ｐ−ＧＰＳ−０３３−ＳＬ、Ｌａｂｓｐｈｅｒｅ）の間に設置した試料に照射し拡散反射率Ｒｄと透過率Ｔｔを計測した。拡散反射率Ｒｄおよび透過率Ｔｔは、コア直径１０００μｍのマルチモードファイバー（ＣＵＳＴＯＭ−ＰＡＴＣＨ−２２４３１４２、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて導光され、ファイバーを通過後、受光器まで導光した。受光器には近赤外分光器（ＮＩＲ２５６−２．５、Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）を用いた。測定条件は、波長８４０〜２６３２ｎｍ、波長分解能約７．５〜２５．０ｎｍ、積算回数２００回にて測定を行った。測定した拡散反射率Ｒｄおよび透過率Ｔｔから、Ｗａｎｇらにより作成されたＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏシミュレーション（非特許文献９）を用いて独自に開発したｉｎｖｅｒｓｅ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ法により、光学特性値である吸収係数μａおよび換算散乱係数μｓ’を算出した。
【００７５】
（光学特性値算出結果）
図１２は、実施例２に係る大腸菌濃度毎の吸収係数μａスペクトルを示すグラフである。図１３は、実施例２に係る大腸菌濃度毎の換算散乱係数μｓ’スペクトルを示すグラフである。
【００７６】
図１２に大腸菌濃度毎の吸収係数μａスペクトルを示す。波長１０００ｎｍ〜１３００ｎｍにおいて吸収係数μａは、大腸菌の濃度の増加とともに増加した。また、図１３に大腸菌濃度毎の換算散乱係数μｓ’スペクトルを示す。波長１０００ｎｍ〜１４００ｎｍにおいて、換算散乱係数μｓ’は大腸菌の濃度の増加とともに増加した。そこで、波長１２００ｎｍにおける大腸菌液の換算散乱係数μｓ’と大腸菌液の濃度との相関を検討した。
【００７７】
図１４は、実施例２に係る大腸菌濃度と波長１２００ｎｍにおける大腸菌液の換算散乱係数μｓ’との関係を示すグラフである。大腸菌液の換算散乱係数μｓ’と大腸菌の濃度とは、線形近似で良い相関が得られた（相関係数Ｒ＝０．９以上）。
【００７８】
（大腸菌液の換算散乱係数μＳ’）
波長１２００ｎｍ付近にて、大腸菌液内の大腸菌の濃度と大腸菌液の換算散乱係数μｓ’には高い相関（Ｒ≧０．９）が得られた。一般的に光は、光の波長と散乱体の大きさとが一致する際、よく散乱される（非特許文献１０）。また、大腸菌の大きさは、およそ１０００ｎｍ程度である（非特許文献１１）。
【００７９】
以上より、大腸菌液の換算散乱係数μＳ’が大腸菌液の大腸菌の濃度と相関が得られた理由として、測定に用いた波長１２００ｎｍが大腸菌の大きさとほぼ等しかった為に、波長１２００ｎｍの光が大腸菌に散乱された結果、大腸菌液内の大腸菌の濃度と大腸菌液の換算散乱係数μＳ’に相関が得られたと考えられた。この結果は、計測対象とする物質の粒子径が近赤外域における波長と近い場合、近赤外波長を用いることで、物質の濁度を定量的に計測できる可能性を示唆している。
【００８０】
一方、散乱体を含む測定対象の換算散乱係数μＳ’の大きさは散乱体の大きさやその濃度に依存することが知られている（非特許文献１０）。Ａｌｉｎｃｅら（非特許文献１２）やＢｕｒｇｅｒら（非特許文献１３）により、粒子径の異なる散乱媒体の換算散乱係数μＳ’を算出した結果、換算散乱係数μＳ’スペクトルの値やスペクトルパターンは粒子径により異なるということが報告されている。活性汚泥中には、大腸菌等の浮遊細菌、酵母等の浮遊真菌や、菌類の集合体であるフロックなどが存在する。酵母等の大きさはおよそ５０００〜１００００ｎｍである（非特許文献１４）。また、フロックは、菌類の集合体であることから大腸菌や酵母よりもさらに大きな粒子径の散乱体となる。その為、活性汚泥の換算散乱係数μＳ’スペクトルを算出することにより、活性汚泥中の菌の構成比などを概算できる可能性がある。
【００８１】
実施例２の散乱体濃度測定方法によれば、可視光よりも波長の長い近赤外光を散乱体液に深さ数ｍｍオーダーまで打ち込み、一旦、散乱体液の中を通って返ってきた近赤外光に基づいて、散乱体の濃度を測定することができる。このため、可視光を散乱体液に透過させて濁度を測定する従来の濁度計のように、可視光を透過させるためにガラス窓で挟んだ測定用サンプルを作成する必要がなく、測定対象を迅速且つ簡便に測定することができる。
【００８２】
（まとめ）
実施例２では、廃水処理に於いて処理がどの時点でどの程度進んでいるか知る為に，光学特性値算出装置（図２に示す近赤外光測定部７に相当する）により、大腸菌の濃度の定量に着目し本発明を実施した。波長１２００ｎｍの短波長側の分光分析を行うことにより、大腸菌液の換算散乱係数μＳ’を用いて大腸菌液内の大腸菌の濃度を測定可能であることが実証された。以上より、本発明は、近赤外分光分析を活用し、大腸菌の濃度を測定することで廃水処理の過程をモニタリングするための技術となることができる。
【実施例３】
【００８３】
前述した実施例２では、大腸菌溶液を測定対象とし、換算散乱係数μＳ’を用いて大腸菌液内の大腸菌の濃度を測定したが、実施例３では、大腸菌と酵母菌との混合液を測定対象とし、換算散乱係数μＳ’を用いて混合液内の大腸菌の濃度及び酵母菌の濃度を測定する。
【００８４】
（大腸菌濃度と酵母菌濃度との比率毎の換算散乱係数スペクトル）
図１５は、実施例３に係る大腸菌濃度と酵母菌濃度との体積分率毎の換算散乱係数μＳ’のスペクトルを示すグラフである。横軸は、大腸菌と酵母菌との混合液に照射した近赤外光の波長を示しており、縦軸は、換算散乱係数μＳ’を示している。
【００８５】
図１５に示すグラフは、大腸菌と酵母菌との体積分率が、０：１０、１：９、２：８、…、９：１、１０：０の１１種類の混合溶液の測定結果を示している。
【００８６】
このグラフ中の線Ｌ１は、大腸菌と酵母菌との体積分率が、０：１０である混合溶液の測定結果を示している。線Ｌ２は体積分率が１：９である混合溶液の測定結果を示しており、線Ｌ３は体積分率が２：８である混合溶液の測定結果を示している。線Ｌ４は体積分率が３：７の混合溶液の測定結果であり、線Ｌ５は体積分率が４：６の混合溶液の測定結果である。線Ｌ６は体積分率が５：５の混合溶液の測定結果であり、線Ｌ７は体積分率が６：４の混合溶液の測定結果であり、線Ｌ８は体積分率が７：３の混合溶液の測定結果である。線Ｌ９は体積分率が８：２の混合溶液の測定結果であり、線Ｌ１０は体積分率が９：１の混合溶液の測定結果であり、線Ｌ１１は体積分率が１０：０の混合溶液の測定結果である。
【００８７】
図１５に示すこれら線Ｌ１〜線Ｌ１１の測定結果は、近赤外光の波長１１００〜１３００ｎｍにおいて、大腸菌の体積分率の増加とともに換算散乱係数μｓ´も増加したことを示している。
【００８８】
（大腸菌濃度の検量線）
図１６は、実施例３に係る大腸菌と酵母との混合溶液における大腸菌濃度の検量線を示すグラフである。横軸は、調整した大腸菌濃度の体積分率を示しており、縦軸は、大腸菌の体積分率の予測値を示している。
【００８９】
図１６の横軸の調整した大腸菌濃度の体積分率の０〜１０の値は、図１５の大腸菌と酵母菌との体積分率を示す０：１０、１：９、２：８、…、９：１、１０：０の１１種類の溶液に対応する実測値を表している。即ち、これらの値は、０．００００、１．００００、２．００００、…、９．００００、１０．００００である。
【００９０】
縦軸の大腸菌の体積分率の予測値は、図１５に示す大腸菌と酵母との混合液における換算散乱係数スペクトルμＳ’の測定結果から、部分的最小２乗回帰分析に基づいて算出した大腸菌の体積分率の予測値である。
【００９１】
換算散乱係数スペクトルμＳ’の測定結果から大腸菌の体積分率の予測値を算出する具体的方法は、以下のとおりである。まず、予測変数Ｘと応答変数Ｙとのデータセットを作成する。そして、予測変数Ｘと応答変数Ｙとを用いたデータセット（Ｘ、Ｙ）により直交化信号補正（Orthogonal signal correction：ＯＳＣ）を実行し、補正後のデータセット（Ｘ´、Ｙ）を生成する。次に、部分的最小２乗回帰分析により主成分数を求める。そして、最適な検量線を得るための主成分数（因子数）を決定する。その後、最適な主成分数を選択した時の大腸菌の体積分率の予測値を得る。
【００９２】
そして、調整した大腸菌濃度の体積分率と大腸菌の体積分率の予測値とをグラフにプロットすると、図１６に示す検量線が得られる。この検量線によって、大腸菌と酵母との混合溶液における換算散乱係数スペクトルμＳ’の測定結果から、混合溶液における大腸菌の体積分率を求めることが可能となる。
【００９３】
（酵母菌濃度の検量線）
図１７は、実施例３に係る大腸菌と酵母との混合溶液における酵母菌濃度の検量線を示すグラフである。横軸は、調整した酵母菌濃度の体積分率を示しており、縦軸は、酵母菌の体積分率の予測値を示している。
【００９４】
図１７の横軸の調整した酵母菌濃度の体積分率の０〜１０の値は、図１５の大腸菌と酵母菌との体積分率を示す１０：０、９：１、…、２：８、１：９、０：１０の溶液に対応する実測値を表している。
【００９５】
縦軸の酵母菌の体積分率の予測値は、図１５に示す大腸菌と酵母との混合液における波長１１００ｎｍ〜１３００ｎｍでの換算散乱係数スペクトルμＳ’の測定結果から、部分的最小２乗回帰分析に基づいて算出した酵母菌の体積分率の予測値である。
【００９６】
具体的には、大腸菌の体積分率を求める場合と同様に、予測変数Ｘと応答変数Ｙとのデータセットを作成する。そして、予測変数Ｘと応答変数Ｙとを用いたデータセット（Ｘ、Ｙ）により直交化信号補正（Orthogonal signal correction：ＯＳＣ）を実行し、補正後のデータセット（Ｘ´、Ｙ）を生成する。次に、部分的最小２乗回帰分析により主成分を求める。そして、最適な検量線を得るための主成分数（因子数）を決定する。その後、最適な主成分数を選択した時の酵母菌の体積分率の予測値を得る。
【００９７】
調整した酵母菌濃度の体積分率と酵母菌の体積分率の予測値とをグラフにプロットすると、図１７に示す検量線が得られる。この検量線によって、大腸菌と酵母との混合溶液における換算散乱係数スペクトルμＳ’の測定結果から、混合溶液における酵母菌の体積分率を求めることが可能となる。
【００９８】
（付記事項）
本発明は上述した各実施形態及び各実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、微生物を含む試料に近赤外光を照射して当該試料の特性を測定する代謝物質モニタリング方法、散乱体濃度測定方法、及び代謝物質モニタリング装置に利用することができる。
【０１００】
また、本発明は、廃水処理過程のモニタリングの他、広く、近赤外光を用いた生物代謝系のモニタリングに適用することができる。例えば、海水の汚濁状況の測定、土石流が流れた川の水質測定、湖の濁度、透明度の測定にも利用することができる。
【符号の説明】
【０１０１】
１  代謝物質モニタリング装置
２  近赤外光照射部（照射手段）
３  近赤外光測定部（測定手段）
４  試料
５  散乱体濃度測定装置
６  近赤外光照射部（照射手段）
７  近赤外光測定部（測定手段）
８  散乱体液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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