(57)【要約】【課題】微生物を正確、迅速かつ簡便に検出するための方法を提供する。【解決手段】微生物または微生物由来の核酸を検出する方法であって、血液培養ボトルの液層を試料として採取し、採取した試料を検出時の終濃度が血液培養液に対して希釈倍率２倍を越え１００倍以下となるように溶液で希釈して得られた試料を遺伝子検査に供して、試料に含まれる微生物由来の核酸を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液培養ボトル中の微生物または微生物由来の核酸を検出する方法であって以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）血液培養ボトルの液層の一部または全部を試料として採取する工程
（２）（１）で採取した試料を、続く（３）の工程での終濃度が、血液培養液に対して希釈倍率２倍を越え１００倍以下となるように水またはトリス緩衝液で希釈する工程
（３）（２）の試料を遺伝子検査に供して、試料に含まれる微生物由来の核酸を検出する工程
【請求項２】
血液培養ボトル中の微生物または微生物由来の核酸を検出する方法であって以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）血液培養ボトルの液層の一部または全部を試料として採取する工程
（２）（１）で採取した試料を水またはトリス緩衝液で希釈し、次いで、得られた希釈試料にカオトロピック塩を含む溶液を添加し、カオトロピック塩を含む溶液を添加した試料からシリカを含むカラムによって核酸を精製する工程であって、続く（３）の工程での終濃度が、血液培養液に対して希釈倍率２倍を越え１００倍以下となるようにする工程
（３）（２）の試料を遺伝子検査に供して、試料に含まれる微生物由来の核酸を検出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液培養サンプルからの迅速な微生物検出、同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は重篤な全身感染症で、確定診断には血液中の起因微生物の検出・同定が必須である。 
近年、癌治療や臓器移植など医療の高度化に伴い、敗血症発症のリスクの高い重症患者が増えている。 
また、院内感染の観点からメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をはじめとする多剤耐性菌が敗血症の起因菌となることも多く、適切な抗菌薬を選択し患者を救命するためには、血液中の起因菌を可能な限り迅速に検出・同定することが臨床上重要である。 
【０００３】
これらの検出を行うに際して、遺伝子検査は非常に迅速に検出、同定が行われるメリットがある。一方、遺伝子検査では、検査に投入できる血液量が少ないことから、一般に、感度を上げる等の目的で測定前に血液培養が行われている。
血液培養液を試料とした従来の遺伝子検査では、血液培養液中の微生物菌体から核酸を抽出し遺伝子検査に供する方法、あるいは血液培養液中の微生物菌体を回収して溶菌させてから遺伝子検査に供する方法が主に用いられてきた。（非特許文献１、非特許文献２）
これらの方法には、核酸抽出工程あるいは溶菌工程に要する手間と時間により検査の迅速性が失われるという欠点がある。さらに核酸抽出工程あるいは溶菌工程を失敗すれば続く遺伝子検査を適切に行えないという問題点も指摘されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０００，  ｐ．３４０７−３４１２
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ａｕｇｕｓｔ  ２００２，  ｐ．２７８６−２７９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の遺伝子検査に関する問題点を解決しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、血液培養液の濃度をある一定の範囲にすることにより、従来技術よりも迅速かつ正確にＭＲＳＡを検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［項１］
血液培養ボトル中の微生物または微生物由来の核酸を検出する方法であって以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）血液培養ボトルの液層の一部または全部を試料として採取する工程
（２）（１）で採取した試料を、続く（３）の工程での終濃度が、血液培養液に対して希釈倍率２倍を越え１００倍以下となるように水またはトリス緩衝液で希釈する工程
（３）（２）の試料を遺伝子検査に供して、試料に含まれる微生物由来の核酸を検出する工程
［項２］
血液培養ボトル中の微生物または微生物由来の核酸を検出する方法であって以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）血液培養ボトルの液層の一部または全部を試料として採取する工程
（２）（１）で採取した試料を水またはトリス緩衝液で希釈し、次いで、得られた希釈試料にカオトロピック塩を含む溶液を添加し、カオトロピック塩を含む溶液を添加した試料からシリカを含むカラムによって核酸を精製する工程であって、続く（３）の工程での終濃度が、血液培養液に対して希釈倍率２倍を越え１００倍以下となるようにする工程
（３）（２）の試料を遺伝子検査に供して、試料に含まれる微生物由来の核酸を検出する工程
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、血液培養によって増殖させた微生物の検出を迅速かつ簡便に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】比較例１の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施形態の一局面は、血液培養ボトル中の微生物または微生物由来の核酸を検出する方法であって、以下の（１）〜（３）の工程を含む方法である。
（１）血液培養ボトルの液層の一部または全部を試料として採取する工程
（２）（１）で採取した試料を、続く（３）の工程での終濃度が、血液培養液に対して希釈倍率２倍を越え１００倍以下となるように水またはトリス緩衝液で希釈する工程
（３）（２）の試料を遺伝子検査に供して、試料に含まれる微生物由来の核酸を検出する工程
【００１０】
通常、試料の希釈は、検出対象である微生物菌体の濃度を低下させるため、検査にはふさわしくないと考えられてきた。
しかし意外なことに、発明者らの検討によれば、血液培養液をそのまま核酸増幅に供しても遺伝子が検出できないのに対し、核酸増幅系における血液培養液の終濃度が５％未満になるよう希釈を行えば、微生物の溶菌操作等を行うことなく簡易な操作で核酸増幅および検出が可能であることが明らかになった。
【００１１】
本発明における遺伝子検査とは、核酸を検出する方法および／または核酸から微生物を同定する方法である。検査法としては従来公知の各方法を用いることができ特に限定されないが、好ましくは（１）核酸増幅反応により核酸を増幅する工程（２）該増幅産物を検出する工程、の二つの工程を含む方法である。
【００１２】
核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法は特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００１３】
核酸増幅産物の検出工程に用いられる具体的な核酸検出方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法、シークエンス法、ＤＮＡプローブ法、リアルタイムＰＣＲ法等があげられるが、ＤＮＡプローブ法を用いることが好ましい。
【００１４】
上記検出工程の前に、希釈して得られた試料にカオトロピック塩を含む溶液を添加し、カオトロピック塩を含む溶液を添加した試料からシリカを含むカラムによって核酸を精製する工程を含んでも良い。
この工程に用いる溶液やカラムは特に限定されない。カオトロピック塩としてはグアニジンイソチオシアネート、グアニジン塩酸塩等が例示され、好ましくは２〜４ｍｏｌ／Ｌのグアニジン塩酸塩である。また、カラムとしては、シリカモノリスが例示され、市販のものを用いることができる。
【００１５】
本発明の方法の検出対象となる微生物、または、本発明の方法の検出対象である核酸の由来となる微生物は、血液培養ボトルによって培養可能な微生物であれば特に限定されない。
【００１６】
本発明の方法において、血液培養方法は特に限定されない。例えば市販の血液培養ボトルを用いて定法により培養すればよい。
血液培養に用いる培地も特に限定されず、市販の血液培養ボトルを用いることができる。
【００１７】
本発明において、血液培養液の希釈に用いる溶液は、遺伝子検査を著しく阻害するものでなければ特に限定されない。希釈に用いる溶液としては、水、トリス緩衝液が挙げられる。
【００１８】
本発明において、遺伝子検査を行うために適切な血液培養液の希釈倍率は、血液培養液に対して２倍を越え１００倍以下である。これは、検出液中の終濃度で０．１％以上５％未満に相当する。検出系中の血液培養液の終濃度が４％以下である（希釈倍率２５倍を超える）ことがより好ましく、３．４％以下である（希釈倍率３０倍を超える）ことがより好ましく、３％以下である（希釈倍率３３．３倍を超える）ことがより好ましい。終濃度の下限については特に限定されないが、一般的に検出系中の試料濃度が小さくなるほど検出されなくなる可能性が高まる（測定系の検出限界にもよるが）ため、十分な検出能を確保するという観点から０．１％以上であることが好ましい。
【００１９】
試料を希釈する工程には、得られた希釈試料にカオトロピック塩を含む溶液を添加し、カオトロピック塩を含む溶液を添加した試料からシリカを含むカラムによって核酸を精製する工程を含んでも良い。この場合、希釈倍率は、全体の工程を通して、続く核酸検出工程での終濃度が、血液培養液に対して希釈倍率２倍を越え１００倍以下となるようにすればよい。
なお、シリカを含むカラムによって核酸を精製する工程における希釈倍率は、カラムに供した血液培養液の液量と、カラムから溶出させた溶出液の液量との比率で決定する。
【実施例】
【００２０】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２１】
〔実施例１：血液培養ボトルで培養したコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の直接検出〕
（１）試料の調製
メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む血液培養液を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で検出系１０μＬでの終濃度が１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／２００、１／３００、１／４００、１／５００、１／１０００の濃度になるようそれぞれ希釈し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
以下に血液培養液の検出系中の試料終濃度と試料希釈倍率との関係を表１に示す。
【００２２】
【表１】
2013055888.tif 000002
【００２３】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、ＰＣＲ法および蛍光プローブ法を利用してメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線は下記条件で実施した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００２４】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号１）  ３００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号２）  １５００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ３００ｎＭ
×１０緩衝液  １μＬ
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ
ＢＳＡ  １μｇ
ＤＭＳＯ  ０．７５μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製）  ０．３Ｕ
試料  １μＬ
【００２５】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００２６】
結果
図１は、温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。血液培養液を終濃度１／１０または１／２０となるように希釈した試料からはメチシリン耐性遺伝子を検出することができなかった。これに対して、終濃度を１／５０以下となるように希釈した試料からはメチシリン耐性遺伝子が検出された。
以上の結果から、検出系に血液培養液成分が少なくとも５％以上含まれる場合は、血液培養液中の菌に対する遺伝子検査が阻害されることが示された。さらに、本実施例により検出系に含まれる血液培養液成分が２％以下であれば遺伝子検査が実施可能であることが明らかになった。
【００２７】
〔実施例２：血液培養ボトルで培養したコアグラーゼ陰性ブドウ球菌のシリカモノリスによる核酸精製からの検出〕
（１）試料の調製
メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む血液培養液を溶液量３００μＬ中の終濃度が１、１／１０、１／４０となるように精製水で希釈した。これをモノリス構造のシリカ固層カラムを含むチップ（以下モノリスチップ、ＧＬサイエンス製）を用いて核酸精製を行い、精製した核酸を含む溶液を試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
以下に血液培養液から精製した核酸を含む溶液試料の検出系中の試料終濃度と試料希釈倍率との関係を表２に示す。なお、検出系での終濃度とは血液培養液からの精製物が核酸増幅系に占める割合によって示される。
【００２８】
【表２】
2013055888.tif 000003
【００２９】
（２）核酸精製
核酸精製は以下の手順で行った。血液培養液を精製水で希釈した以降の工程は全てＧＥＮＥＣＵＢＥ（東洋紡）を使用して行った。
メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む血液培養液を（１）に記載の終濃度となるように精製水で希釈した。各希釈液量は３００μＬとなるように調製した。この希釈液３００μＬにＧＥＮＥＣＵＢＥ用溶解吸着液（東洋紡）５５０μＬを添加し、６５℃で５分間加熱した。加熱後の溶液をモノリスチップに通した。次に、ＧＥＮＥＣＵＢＥ用洗浄液（東洋紡）３５０μＬをモノリスチップに通し、モノリスチップを洗浄した。この洗浄工程は２回行った。洗浄後、１０ｍＭ水酸化カリウム２０μＬでモノリスチップに吸着していた核酸を溶出し回収した。この回収した溶液を遺伝子検査試料とした。
（３）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、ＰＣＲ法および蛍光プローブ法を利用してメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線は下記条件で実施した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００３０】
核酸増幅および融解曲線解析試薬
以下の試薬を含む１３．２μＬ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号１）  ３００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号２）  １５００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ３００ｎＭ
×１０緩衝液  １．３μＬ
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ
ＢＳＡ  １．３μｇ
ＤＭＳＯ  ０．９８μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製）  ０．４Ｕ
試料  ４μＬ
【００３１】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００３２】
結果
本実施例の結果を表３に示す。血液培養液を希釈せずに核酸精製を行った後、精製された核酸を含む溶液を試料として遺伝子検査を行ったところ、該試料からメチシリン耐性遺伝子は検出されなかった（表では結果を「×」で表示、「ＮＣ」はネガティブコントロール）。これに対して、血液培養液の割合が１／１０または１／４０となるように精製水で希釈し、該希釈液から核酸を精製し、精製された核酸を含む溶液を試料として遺伝子検査を行うと、該試料からメチシリン耐性遺伝子が検出された（表では結果を「○」で表示）。
この結果は二つのことを示唆している。すなわち、第一にはシリカ固層カラムによる核酸精製では、血液培養液に含まれる遺伝子検査の阻害要因を完全には除去できないことである。第二には、シリカ固層カラムで血液培養液からの核酸精製を行う場合でも、血液培養液を予め希釈することが遺伝子検査を正確に実施する上で非常に有効な手段となることである。
【００３３】
【表３】
2013055888.tif 000004
【００３４】
〔比較例１：リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈した血液培養液からのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の直接検出〕
（１）試料の調製
メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む血液培養液を１０ｍＭのリン酸カリウム‐ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で検出系１０μＬでの終濃度が１／１０、１／５０、１／１００、１／２００、１／５００、１／１０００の濃度になるようそれぞれ希釈し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として水を使用した。
【００３５】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、ＰＣＲ法および蛍光プローブ法を利用してメチシリン耐性遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線は下記条件で実施した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００３６】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号１）  ３００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号２）  １５００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）  ３００ｎＭ
×１０緩衝液  １μＬ
ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４  ４ｍＭ
ＢＳＡ  １μｇ
ＤＭＳＯ  ０．７５μＬ
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製）  ０．３Ｕ
試料  １μＬ
【００３７】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００３８】
結果
図２は、温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。本比較例では終濃度を１／２００となるように希釈した試料のみメチシリン耐性遺伝子が検出された。
実施例１の結果と比較すると、血液培養液中のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌由来メチシリン耐性遺伝子を検出することができる血液培養液終濃度の範囲が著しく狭まっていることが明らかである。これはリン酸緩衝液によって核酸増幅が阻害されていることを示唆している。
本比較例の結果は、血液培養液の希釈に使用する溶液としては、リン酸緩衝液は不適当であり、トリス緩衝液の方がより好ましいことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明により、従来技術よりも迅速かつ正確に血液培養ボトルで生育させた微生物を検出することができ、診断や医療の分野に貢献する。
【図１】
2013055888.tif 000005
【図２】
2013055888.tif 000006
【配列表】
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