(57)【要約】【課題】タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能に関連する成分が、傷害されたタイトジャンクションにおいてどの様に皮膚中に分布あるいは輸送されるかを視覚的に鑑別できる鑑別法を提供する。【解決手段】皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルと、蛍光標識してなる皮膚生理関連成分とを用い、皮膚生理関連成分の分布の変化より、タイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作製し、
標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養した場合に、
皮膚関連成分を角層方向に分泌する表皮細胞の働きを早める効果を有する、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、傷害タイトジャンクションの回復促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料などの皮膚外用剤の生理学的作用の探求に有用な、皮膚内における物質輸送、物質分布の鑑別法に関し、更に詳細には、タイトジャンクションがどの程度に特定の物質の皮膚内における物質輸送、物質分布に関与するかを鑑別する技術に関する。また、当該鑑別法により見出した傷害タイトジャンクションの回復促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚におけるバリア機能は、生体にとっての異物の生体内への侵入を防ぐ意味で重要な機能の一つとなっている。かかるバリア機能の不全は肌荒れ、炎症などの原因ともなり、その保全策は化粧料分野においては一大課題となっている。この様な皮膚バリア機能の因子としては、角層細胞の形状や接合状態に起因する角層のバリア機能、表皮・真皮の含水量などの皮膚保湿性などが挙げられ、単純なものではなく、多くの因子が絡み合っていることが既に知られている。これらの因子で近年特に注目されているのは、表皮顆粒層に存在するタイトジャンクション蛋白であり、かかるタイトジャンクション蛋白を介した細胞接合の不全に皮膚バリア機能の低下が起因すると言う説である。（例えば、特許文献１、特許文献２を参照）このタイトジャンクションの機能に注目した化粧料素材のスクリーニング法も前記の特許文献に開示されている。この方法では、タイトジャンクション機能の不全による皮膚バリア機能の低下を改善する成分を、数値として評価でき、タイトジャンクションが皮膚内の物質の移動に対して、何らかの機能を担っていることは推定させているが、皮膚機能としての物質の輸送、分布に対しての働きは明らかにしていない。この様なタイトジャンクションの物質の輸送、分布に対して担っている働きを明らかにすることは、皮膚生理において、タイトジャンクションの果たすべき役割を明確にすることにつながり、非常に有益なことと言える。
【０００３】
タイトジャンクションの障害因子として、紫外線（例えば、特許文献３を参照）、カプリン酸などが存することは既に知られている（例えば、非特許文献１を参照）が、これらを用いて、培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害し、それが皮膚内の物質の輸送、分布にどの様な影響を与えるかについては何らの検討も存しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２６０９２号公報
【特許文献２】特開２００６−２５０７８６号公報
【特許文献３】特開２００７−２１０９４８ 号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kondoh M. et. al., Mol Pharmacol. 2005 Mar;67(3):749-56
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、皮膚生理学的に有用な、皮膚内の物質の輸送と分布に対してのタイトジャンクションの関与の程度を明らかにせしめる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、皮膚生理学的に有用な、皮膚内の物質の輸送と分布に対してのタイトジャンクションの関与の程度を明らかにせしめる技術を求めて、鋭
意研究努力を重ねた結果、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作製し、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、前記標識の分布状況を指標とすることにより、この様な課題が解決できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下に示す通りである。
（１）皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作製し、
標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養した場合に、
皮膚関連成分を角層方向に分泌する表皮細胞の働きを早める効果を有する、ε，γ−グルタミルリジン及び／又はパルマリア抽出物を含む、傷害タイトジャンクションの回復促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、皮膚生理学的に有用な、皮膚内の物質の輸送と分布に対してのタイトジャンクションの関与の程度を明らかにせしめる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】培養上清に放出された蛍光標識セラミドに対するカプリン酸ナトリウムの影響を示す図である。（図面代用写真）
【図２】カプリン酸ナトリウム未処理の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像を示す図である。図中点線で囲まれた部分が角層で、それよりも下の部分が表皮層である。以下同様。（図面代用写真）
【図３】１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像を示す図である。（図面代用写真）
【図４】１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、カプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に置換して１８時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像を示す図である。（図面代用写真）
【図５】蛍光標識セラミドの細胞外への分泌量に対するε，γ−グルタミルリジン、パルマリア抽出物の影響を示す図である。（図面代用写真）
【図６】１ｍＭカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、維持培地に置換して１２時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像を示す図である。（図面代用写真）
【図７】１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンを含有する維持培地に置換して１２時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像を示す図である。（図面代用写真）
【図８】１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、０．１％パルマリア抽出物を含有する維持培地に置換して１２時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像を示す図である。（図面代用写真）
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の皮膚関連成分の分布又は輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の鑑別法は、皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理して、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作成し、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、前記標識の分布状況を指標とすることを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト又はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な（癌化していない）ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することも出来る。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」（正常培養ヒト三次元皮膚モデ
ル）などが好適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚又は培養皮膚三次元モデルは、顆粒層側から傷害手段を講じてタイトジャンクション部分を傷害する。傷害手段としては、例えば、紫外線や化学物質などが好ましく例示でき、紫外線であれば、波長２８０〜３２０ｎｍの紫外線を７．５〜２００ｍJ／ｃｍ2、さらに好ましくは５０〜１６０ｍJ／ｃｍ2の単位あたりのエネルギー量で照射すればよく、化学的な処置であれば、カプリン酸、カプリル酸などの中鎖長（炭素数８〜１２）の脂肪族飽和直鎖脂肪酸またはその一価金属塩の０．１〜１０ｍM、さらに好ましくは０．５〜２ｍMの溶液を真皮側又は表皮基底層側から、５〜２４時間、さらに好ましくは１０〜１５時間作用させればよい。また、オクルディンやクローディンの細胞外ドメインを認識する中和抗体を使用することもできる。これらの傷害処置の内、特に好ましいものは化学的傷害処置であり、なかでもカプリン酸ナトリウムによる処理が特に好ましい。これはタイトジャンクションに対して均質な損傷がなしうるからである。この様な均質な傷害は、後記の傷害タイトジャンクションの回復促進剤のスクリーニングにおいては、そのメカニズムを的確に鑑別する上で非常に重要な因子となる。処置後傷害手段は直ちに皮膚又は培養皮膚三次元モデルより離脱させる。離脱は、紫外線照射であれば照射を終了することによりできるし、化学的傷害手段であれば、培地又はPBS（リン酸緩衝生理食塩水）などで洗浄することによりなしうる。斯くして得られたタイトジャンクション傷害皮膚モデルを、標識してなる皮膚関連成分を含む培地中で培養し、しかる後に、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに取り込まれなかった標識された皮膚関連成分を洗浄などによって除去した後に、暫く培養を続け、培養上清中に放出される、標識してなる皮膚関連成分を測定したり、組織片を切り出し、標本に加工し、標識を認識しうる観察手段によって標識の分布状況を観察する。
【００１１】
ここで、前記標識してなる皮膚関連成分を構成する皮膚関連成分としては、皮膚生理学上、皮膚の生理に関与する蓋然性の高い成分であり、例えば、タイプ１〜７のセラミド、スフィンゴシン、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴ燐脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミンなどの燐脂質類、コラーゲン、エラスチンなどの繊維素、αーＭＳＨ、コラゲナーゼ、エラスターゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、グルタチオンレダクターゼ、プロテアーゼなどの酵素類が好適に例示できる。標識としては、例えば、フルオレセイン等の蛍光発色基をエステル結合やアミド結合で導入したり、アミノ基にヨウ素、テクネチウムなどの放射性同位体を導入したり、水酸基を放射性のフッ素で置換したりした放射性同位体に誘導する方法、ルシェフェラーゼやペルオキシダーゼなどの酵素とコンジュゲートを形成せしめ、基質を反応させて発色や発光をさせる方法などが好ましく例示できる。これらの標識の内、好ましいものは、検知感度及び安全性がともに高い蛍光標識である。この様な蛍光標識は、例えば、対象となる成分と蛍光標識基を有するカルボン酸とをＤＣＣ等のペプチド合成試薬の存在下反応させることにより得ることができる。又、この様な標識皮膚関連成分には市販されているものも存し、この様な市販品を購入し利用することもできる。この様な市販品としては例えば、セラミドの蛍光標識体である「BODIPY（登録商標）FL-C5-Ceramide-BSA」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）が特に好ましく例示できる。
【００１２】
この様な標識された皮膚生理関連成分は、例えば市販の培地、「EPI-100」（倉敷紡績株式会社）などの液体培地中に１〜１０μM、好ましくは２．５〜７．５μM溶解させ、かかる培地で前記タイトジャンクション傷害皮膚モデルを０．５〜１０時間、好ましくは１〜５時間培養し、皮膚モデル中に取り込ませる。この時、培養時間のドーズを振り、輸送・分布速度の指標としても良い。斯くして、標識してなる皮膚生理関連成分をチャージしたタイトジャンクション傷害皮膚モデルは、そのまま培養を継続して培養上清中に放出される標識してなる皮膚生理関連成分を測定することができるし、所望により組織固定をして、切片などの観察標本に切り出す。観察標本は、標識検知に適した観察手段で観察され
る。蛍光標識であれば、顕微鏡標本に切り出し、蛍光顕微鏡下観察される。
【００１３】
観察に際しては、タイトジャンクションを傷害せずに、同様の処理で作成した、タイトジャンクション非傷害皮膚モデルを対照において観察することにより、タイトジャンクションの皮膚生理関連成分の輸送と分布に対する寄与が明確になり好ましい。
【００１４】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加える。
【実施例】
【００１５】
実施例１
＜工程１＞「EPI-200」を培養プレートに移し、表皮基底層側に２００μｌの5μM 「BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA」を含む維持培地(EPI-100 クラボウ製)を加え、３７℃、５%二酸化炭素で４時間培養した後、4℃冷蔵庫で１時間静置した。
＜工程２＞５００μｌの新鮮な維持培地に置換し、３７℃、５% CO2で２０時間培養した。＜工程３＞３００μｌの５%脱脂牛血清アルブミンを含む維持培地に置換し、４℃で３０分間静置した。
＜工程４＞工程３を２回繰り返した。
＜工程５＞新鮮な維持培地及び1mMカプリン酸ナトリウムを含む維持培地にそれぞれ置換し、３７℃、５%二酸化炭素で培養した。
＜工程６＞培養１２時間後、1mM C10を含まない新鮮な維持培地に置換した(C10R)。経時的に培養上清の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍ）を測定した。
【００１６】
図１は培養上清の蛍光強度を測定することにより放出されたセラミドの相対量を示したグラフである。カプリン酸ナトリウムで処理していない場合（図１中Control）は時間経過とともに培養上清中に放出されるセラミドが増加していくが、１ｍMカプリン酸ナトリウム処理により（図１中C10）、セラミドの増加が妨げられた。培養５時間後にカプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に交換することにより（図１中C10R）、セラミドの放出量が再び増加した。
【００１７】
実施例２
＜工程１＞「EPI-200」を培養プレートに移し、表皮基底層側に２００μｌの5μM 「BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA」を含む維持培地（EPI-100、クラボウ製）を加え、３７℃、５%二酸化炭素で４時間培養した後、４℃冷蔵庫で１時間静置した。
＜工程２＞５００μｌの新鮮な維持培地に置換し、３７℃、５% CO2で２０時間培養した。
＜工程３＞３００μｌの５%脱脂牛血清アルブミンを含む維持培地に置換し、４℃で３０分間静置した。
＜工程４＞工程３を２回繰り返した。
＜工程５＞新鮮な維持培地及び１mMカプリン酸ナトリウムを含む維持培地にそれぞれ置換し、３７℃、５%二酸化炭素で培養した。
＜工程６＞培養１２時間後、１mMカプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に置換した。
＜工程７＞一定時間培養後「EPI-200」を支持体から切り離し、「OCTコンパウンド」（サクラファインテック社製）に包埋して液体窒素で凍結した。
＜工程８＞凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡下、励起波長４７０ｎｍ/蛍光波長５２５ｎｍで観察した。
【００１８】
図２はカプリン酸ナトリウム未処理、図３は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、図４は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、カプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に置換したときの「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像である。角層（図
中点線で囲まれた部分）直下の表皮顆粒層（矢印）の蛍光（セラミド）がカプリン酸ナトリウム未処理では細胞間の上部分に多く認められるのに対して（図２）、カプリン酸ナトリウム処理により消失していることが判る（図３）。この後カプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に置換することにより、再び表皮基底層の細胞間の上部分（矢印）に蛍光（セラミド）が認められる（図４）。
【００１９】
実施例３
実施例２と同様に＜工程６＞まで行うが、＜工程６＞の後、別個の「EPI-200」を、５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジン、０．１％パルマリア抽出物それぞれ単独で含有する維持培地に置換し６時間培養を続けた。その後培地を回収し、細胞外に分泌された「BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA」の蛍光強度（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍ）を、ARVO SX Multilabel Counter（PerkinElmer社製）を用いて測定した。さらに、その後＜工程８＞まで進めた。
【００２０】
結果を図５に示すが、ε，γ−グルタミルリジン、パルマリア抽出物は、いずれも無添加コントロールよりも有意に蛍光標識セラミド「BODIPY FL-C5-Ceramide-BSA」の細胞外への分泌量を促進する。また図６は１ｍＭカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、維持培地に置換して１２時間後、図７は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、５００μｇ／ｍｌε，γ−グルタミルリジンを含有する維持培地に置換して１２時間後、図８は１ｍMカプリン酸ナトリウム処理１２時間後、０．１％パルマリア抽出物を含有する維持培地に置換して１２時間後の「EPI-200」の凍結切片の蛍光画像である。角層直下の表皮顆粒層の蛍光（セラミド）が図６では細胞間の上部分には多く認められないのに対して、図７、８ではそれぞれ表皮顆粒層の細胞間の上部分（矢印）に多く認められる。つまり、ε，γ−グルタミルリジン及びパルマリア抽出物はそれぞれ単独で、セラミドを角層方向に分泌する表皮細胞の働きを早める効果を有することが判る。即ち本鑑別法は、セラミドの組織内輸送へのタイトジャンクションの関与の程度の評価に適していることが判る。
【産業上の利用可能性】
【００２１】
本発明は、化粧料などの皮膚外用剤の有効成分の評価に応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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