(57)【要約】【課題】蛍光物質等の標識をすることなく、特定のターゲット物質を迅速、簡便に検出することが可能で、かつ、測定精度が向上されたバイオチップを提供する。【解決手段】基板上に形成した電極配線をＴｉＯ２、ＳｉＯ２などの金属酸化物の絶縁膜で被覆し、この絶縁膜に微細加工技術によって１または複数の微小ウェルを形成し、各ウェルの底部にプローブ物質を固定化したバイオ分子アレイチップを作製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ物質を配列して固定化するための１または複数のウェルが形成されたバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は、金属酸化物の絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成されたバイオチップ。
【請求項２】
該１または複数のウェル底部に露出した電極配線表面上に、核酸、タンパク質、ペプチド、リポソーム、β−アミロイドオリゴマーおよび還元糖よりなる群から選択されるプローブ物質が固定化されている、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項３】
金属酸化物が、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、ＺｎＯよりなる群から選択される、請求項１に記載のバイオチップ。
【請求項４】
少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、ここに、該作用電極は、プローブ物質を配列して固定化するための１または複数のウェルが形成されたバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は、金属酸化物の絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成されたバイオチップであり、
該１または複数のウェル底部に露出した電極配線表面上に、核酸、タンパク質、ペプチド、リポソーム、β−アミロイドオリゴマーおよび還元糖よりなる群から選択されるプローブ物質が固定化され、
処理前に、該バイオチップの第１の電気的信号を測定し；
該バイオチップを試験溶液中で処理した後、該バイオチップの第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する、該１または複数のプローブ物質と特異的結合する非標識ターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンサー。
【請求項５】
該電気的信号が、酸化還元電流値である請求項４記載のバイオセンサー。
【請求項６】
プローブ物質を配列して固定化するための１または複数のウェルが形成されたバイオチップの製造方法であって、
基板上に１または複数の電極配線を形成し、
該１または複数の電極配線を金属酸化物の絶縁膜で被覆し、ついで、
該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルを形成する、バイオチップの製造方法。
【請求項７】
該金属酸化物の絶縁膜にウェルを形成する技術が、ナノインプリンティング技術、ＫｒＦステッパーパターニング、Ｅ−ビーム法、収束イオンビーム法よりなる群から選択される、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属酸化物の絶縁膜を用いたバイオチップに関する。より詳しくは、複数のウェルが形成された金属酸化物の絶縁膜を有し、検出感度が向上したバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新薬開発プロセス、医療診断等などの分野において、バイオチップが注目され、研究開発が盛んに進められている。
バイオチップとは、固体表面上（固相化担体としては、シリコン基板、ガラス基板、高分子、金基板など）にＤＮＡ等の核酸、酵素や抗体のごときタンパク質、ペプチド等のバイオ分子アレイ、あるいは細胞等を固定化し、固定化されたバイオ分子アレイ等のプローブ物質に特定のターゲット物質が結合したときに生じる特異的な反応を検出するものである［特許文献１、２］。
さらに、プローブ物質として、リポソーム、β−アミロイドオリゴマー、還元糖を用いたバイオチップも提案されている［特許文献３、４］。
【０００３】
様々なプローブ物質を用いることが可能になり、バイオチップの有用性は、ますます、増大している。特に、微量のサンプルを用いて大量にハイスループットな検出および解析ができるところから、大量かつ同時並行的な処理を要求されるポストゲノム時代のバイオ分子アレイの機能解析技術にはバイオチップ関連技術が必須となっている。
【０００４】
特許文献１〜４のバイオチップは、基板上に１または複数の電極配線を形成し、該１または複数の電極配線を絶縁膜で被覆し、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルを形成し、次いで、該１または複数のウェルの底部にプローブ物質を固定化することによって作製する。
【０００５】
このようなバイオチップの上面図を図１に示す。ここでは、ガラス基板１０上に８本の電極配線１３を形成し、一度に８点測定が可能なバイオチップ１を形成する。
電極配線１３の一方の端部にはバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部にはバイオ分子アレイ領域で検出した電気的信号を取り出すためのパッド１３２が形成されている。
図２にバイオ分子アレイ領域１３１の拡大上面図を示す。バイオ分子アレイ領域１３１上には絶縁性レジスト膜１４が形成され、この絶縁膜に１または複数の孔を設けることによって、バイオ分子を固定化するための１または複数のウェル１３１ａが形成されている。
バイオ分子アレイ領域１３１には、ウェル１３１ａの直径が５μｍ以上の場合、図２ａに示すように単一のウェルを形成することができ、ウェル１３１ａの直径がサブミクロン以下２０ｎｍ程度までの場合、図２ｂに示すように複数のウェルを配列させることができる。
【０００６】
バイオ分子アレイ領域１３１の断面図を図３ａに示す。ここでは、ガラス基板１０上に、まず、Ｔｉ薄膜１３ａを形成し、その上にＡｕ薄膜１３ｂを形成することによって、Ａｕ／Ｔｉ積層薄膜からなる電極配線１３を形成した。Ａｕ薄膜を直接ガラス基板に形成することもできるが、Ａｕ薄膜の接着強度が弱いので、Ａｕ薄膜の剥離を防止し、バイオチップの信頼性を向上させるためにＴｉ薄膜を用いた。Ｔｉ以外にＣｒを用いることもできる。
【０００７】
この図が示すように、絶縁性レジスト膜に形成された孔は、下部層の電極配線の表面にまで達している。すなわち、バイオ分子アレイ領域に形成されたウェルの側面は絶縁性レジスト膜１４により定められ、ウェルの底部は電極配線１３の表面により定められている。
この構成によって、図３ｂに示すように、ウェル１３１ａの底部の露出した電極表面上にのみプローブとなるバイオ分子を固定化する。この図において、電極表面上に脂質二重層４を固定化し、その上にプローブタンパク質２を固定化している。
【０００８】
このようなバイオチップを作製するために、半導体製造技術の１つであるフォトファブリケーション技術を用いることができる。ここでは、「フォトファブリケーション技術」なる用語は、フォトリソグラフィー技術、蒸着技術、エッチング技術などを組み合わせた技術を意味する。
フォトファブリケーション技術はすでにＩＣやＬＳＩ製造技術の１つとして確立されているため、従来のＤＮＡチップのように小型化や製造工程の自動化が可能で、チップの大量生産や低コスト化につながる。
【０００９】
図４ないし図９は、フォトファブリケーション技術によってバイオチップを作製する工程を示す概略図である
まず、直径５μｍ以上の単一ウェルを作製する工程について説明する。基板１０上にスピンコーターを用いて感光性材料であるフォトレジスト１１を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図４ａ,４ｂ）。この説明ではガラス基板を用いたが、アルミナ基板、シリコン基板、または、シリコーン樹脂のごとき樹脂製基板等のいずれの材質の基板も用いることができる。
次いで、フォトマスクを用いて紫外線１２ａで２０秒間露光し（図４ｃ）、フォトレジスト１１を現像して電極配線１３用の配線パターンを形成する（図４ｄ）。フォトレジストには、露光によって結合が分解して現像液に溶解するもの（ポジ型）と、逆に重合して溶解しないもの（ネガ型）があるが、ここではフォトレジスト１１としてポジ型レジスト（ＡＺ１５００：クラリアントジャパン株式会社）を用いる。
【００１０】
その後、真空蒸着やＲＦスパッタリングなどの蒸着技術によって基板上に電極材料となる金属薄膜を形成する（図４ｅ）。
さらに、これをアセトンのごとき有機溶媒中に浸漬して、レジスト１１を剥離することによって、ガラス基板１０上に電極配線１３を形成する（図４ｆ）。電極配線１３が形成されたチップの概略上面図を図６ａに示す。図６において、一方の端部に円形のバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部には電気的信号を取り出すための角型パッド１３２が形成された電極配線が示されているが、これは電極配線の一例であって、この形状に限定されるものではない。当業者であれば、バイオセンサーに搭載されるバイオチップとして使用できるいずれの形状にも変形することができる。
また、電極配線の本数も、使用の形態に適合させて、適宜増減することができる。
【００１１】
次に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４（ＡＺ１５００）を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図５ａ）。次いで、フォトマスク１２ｂを用いて紫外線１２ａで２０秒間露光し（図５ｂ）、レジスト１４を現像することによって電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域１３１上にウェル１３１ａを形成する（図５ｃ）。これを１５０℃にて５分間ベーキングすることによって、レジスト１４を固着させる（図５ｄ）。ウェルが形成されたチップの概略上面図を図６ｂに示す。
【００１２】
次に、直径がサブミクロン以下のウェルのアレイを作製する工程を説明する。直径５μｍ以上の単一ウェルを作製したときと同様にして電極配線を形成し（図４）、その後、図５ａに示す工程と同様に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４（ＺＥＰ５２０：日本ゼオン株式会社）を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図７ａ）。次いで、７５ｋＶにて電子ビーム１５を照射し（図７ｂ）、レジスト１４を現像することによって電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域１３１上に複数のウェル１３１ａの配列を形成する（図７ｃ）。これを２００℃にて５分間ベーキングすることによって、レジスト１４を固着させる（図７ｄ）。ウェルが形成されたチップの概略上面図を図８に示す。
【００１３】
従来の半導体製造技術を用いれば、基板上にウェルを形成することができるので、上記の条件に限定されることなく、適宜、当業者によく知られた他の条件でウェルを形成することができる。
【００１４】
次に、生物化学の分野でよく知られている方法を用いて、ウェル底部の電極表面上に脂質二重層を形成する。具体的には、まず、チップをピランハ溶液（Ｈ２Ｏ２：Ｈ２ＳＯ４＝１：３［ｖ／ｖ］に１０分間浸漬してウェル底部の電極表面上の有機不純物質を除去し、純粋で十分に洗浄し、エタノールで洗浄した後（図９ａ）、１−オクタデカンチオール（ＯＤＴ）３のエタノール溶液に浸漬してＯＤＴ３をその−ＳＨ基を介して電極表面に結合させる（図９ｂ）。
次いで、リン酸バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）４を溶解して（１０ｍＭ）、ＰＯＰＣ４のリポソーム溶液を調製する。このリポソーム溶液をチップに滴下し、湿度１００％の環境で１時間静置して、電極表面上にＰＯＰＣ４の脂質二重層を形成する（図９ｃ）。
あるいは、９９．９モル％のＰＯＰＣ４および０．１モル％のＯＤＴ３をクロロホルム中でよく混合した後、溶媒をＰＢＳに交換して混合リポソーム溶液を調製し、このリポソーム溶液をチップに滴下して、電極表面上にＰＯＰＣ４の脂質二重層を形成する（図９ｃ）。
いずれの場合も、ウェル底部の電極表面にのみ脂質二重層が固定化されるように、前記のレジスト１４はＯＤＴの−ＳＨ基が結合しない材料であることが必要である。
【００１５】
次に、１ｍＭの（１１−フェロセニル）ウンデシルポリオキシエチレン（Ｆｅ−ＰＥＧ）５および０．１ｍＭのビオチン化した１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｂｉｏ−ＰＥ）２１のリン酸バッファー混合溶液（ｐＨ７．４）を脂質二重層が形成されたチップに滴下し、１時間放置して脂質二重層上にＦｅ−ＰＥＧ５およびＢｉｏ−ＰＥ２１をアンカーする（図９ｄ）。このとき、Ｆｅ−ＰＥＧ５およびＢｉｏ−ＰＥ２１の混合溶液中のモル濃度比を適宜調整することによって、Ｂｉｏ−ＰＥ２１が分散して適度な密度で脂質二重層上にアンカーされるようにする。
脂質二重層は絶縁性であるので、脂質二重層上での現象を電気的信号として検出することが不可能である。そこで、脂質二重層表面を導電性にする目的で、Ｆｅ−ＰＥＧ５を用いる。
【００１６】
さらに、このビオチン修飾脂質二重層が形成されたチップに０．２ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン２２の水溶液を滴下し、湿度１００％の環境で１時間静置して、Ｂｉｏ−ＰＥ２１のビオチンとの特異的結合により、ストレプトアビジン２２を結合させる（図９ｅ）。ＰＢＳで洗浄することによって、脂質二重層に固定化されていない未結合のストレプトアビジンを除去する。
【００１７】
ストレプトアビジンは、ビオチンと生物学的に最も強固で安定に結合（Ｋｄ＝１０−１５Ｍ）するタンパク質であり、４分子のビオチンと結合する。
ストレプトアビジン−ビオチン間の特異的結合を利用して、ストレプトアビジンを修飾した分子と、ビオチンを修飾したもう一つの分子とを結合させる手法が一般的に用いられている。したがって、様々なタンパク質にビオチンを修飾する技術がすでに確立され、そのためのキットも市販されている。また、ビオチン修飾したＤＮＡも商業的に入手可能である。
【００１８】
Ｂｉｏ−ＰＥ２１は脂質二重層上に分散してアンカーされ、１つのストレプトアビジン分子には、１つのビオチンしか結合していないと考えられる。
【００１９】
最後に、予めビオチン化したプローブ抗体２３の溶液にストレプトアビジン固定化チップを浸漬することによって、ストレプトアビジン−ビオチンの特異的結合を介してプローブ抗体２３をウェル底部に固定化する（図９ｆ）。
【００２０】
ストレプトアビジンが基板上に固定化されている場合、ビオチンの有効結合数は１であることがすでに知られている。固定化によりビオチンが接近可能なストレプトアビジンの結合部位が限定されているためと考えられる。特に、本発明の場合、ビオチンにはタンパク質が結合しているので、１つのビオチン化タンパク質がストレプトアビジンに結合した後、立体障害によりさらなるビオチン化タンパク質がストレプトアビジンに接近できないためと考えられる。したがって、１つの固定化ストレプトアビジン２２には１つのビオチン化プローブ抗体２３が結合していると十分に考えられる。
【００２１】
このようなバイオチップを作製するために、ナノインプリンティングリソグラフィー（ＮＩＬ）技術を用いることもできる。
【００２２】
近年、ナノインプリントリソグラフィー（ＮＩＬ）技術は、エレクトロニクス、フォトニクス、磁気デバイス、バイオロジーなど様々な分野において、高解像度でナノスケールのパターンを形成するための最も期待される技術の一つである。
ＮＩＬ技術は、樹脂層にモールド（スタンプまたはテンプレートともいう。）を押しつけることによって樹脂層にパターン形成する技術であり、熱ＮＩＬ技術および光ＮＩＬ技術がある。熱ＮＩＬ技術では、熱可塑性樹脂の層に、そのガラス転移点以上の温度にて、高い圧力で硬質のモールドを押しつけ、その状態で冷却した後、モールドを取り外すことによって、樹脂層にパターニングを行う。また、光ＮＩＬ技術では、光硬化性樹脂の層にモールドを押しつけ、その状態でＵＶ等の光を照射した後、モールドを取り外すことによって、樹脂層にパターニングを行う。
さらに、高スループットかつ低コストで大面積にレリーフパターンを形成するＮＩＬ技術として、ステップ・アンド・フラッシュ・インプリント・リソグラフィー（ＳＦＩＬ）がある。ＳＦＩＬは、低温低圧の条件下で行うＵＶ−ＮＩＬである。ＳＦＩＬでは、低粘度の光硬化性樹脂を基板上に滴下するだけで樹脂層を形成するため、スピンコートを行う必要がない。この技術により、大面積に対して１００ｎｍ以下のサイズの微小パターンを形成することができる［非特許文献１〜５］。
【００２３】
特許文献５は、ＮＩＬ技術を用いて、図１〜４に記載されたものと同様の構成のバイオチップを作製する。
図１０は、ＮＩＬ技術によってバイオチップを作製する工程を示す概略図である
【００２４】
（１）ＵＶ−ＮＩＬ法
ＵＶ硬化性樹脂を用いて、ＳｉＯ２基板上にナノパターンを形成する絶縁性レジスト樹脂層を形成する。
まず、ＳｉＯ２基板１６上に、１重量％のＤＭＰＡを含有するエタノールで希釈した３０重量％のＵＶ硬化性樹脂を３０００ｒｐｍにて２０秒間スピンコートして４５０ｎｍ厚のＵＶ硬化性樹脂の樹脂層１７を形成する。ついで、ホットプレート上で７０℃にて３分間予備加熱処理を行って、溶媒を除去する（図１０ａ）。
モールド１８を減圧下および室温にて、０．２ＭＰａの圧力で１分間樹脂層１７に押しつける（図１０ｂ）。使用するＵＶ硬化性樹脂は低粘度の液体なので、室温に低圧でインプリントを行うことができる。
ＵＶランプを装着したナノインプリント装置（ＮＭ−４０１：明昌機工株式会社製）を用いて、モールド１８に圧力を負荷した状態で、ＵＶ硬化性樹脂の樹脂層１７に３６５ｎｍのＵＶ光１９を１分間照射することによって（紫外線量  ２００ｍＪ／ｃｍ２）、ＵＶ硬化性樹脂の樹脂層１７を硬化して硬化膜１７ａを形成する。
モールド１８を基板から取り外し（図１０ｃ）、ナノパターンが形成されたＵＶ硬化性樹脂の硬化膜１７ａを１２０℃にて１時間加熱処理して、機械強度および溶媒耐性を強化する。
【００２５】
（２）熱−ＮＩＬ法
熱硬化性樹脂を用いて、ＳｉＯ２基板上にナノパターンを形成する絶縁性レジスト樹脂層を形成する。
まず、ＵＶ−オゾンクリーナーを用いて洗浄したＳｉＯ２基板１６上に、熱硬化性樹脂を３０００ｒｐｍにて２０秒間スピンコートして１２０ｎｍ厚の熱硬化性樹脂の樹脂層１７を形成する。ついで、ホットプレート上で８０℃にて１０分間予備加熱処理を行って、溶媒を除去する（図１０ａ）。
その後、ＵＶ光９を照射する代わりに、熱硬化性樹脂の樹脂層１７に比較的高い温度（１５０℃）および圧力（１０ＭＰａ）にて５分間モールド１８を押しつける（図１０ｂ）。
モールド１８に圧力を負荷した状態で、熱硬化性樹脂の樹脂層１７を冷却することによって、熱硬化性樹脂の樹脂層１７を硬化する。その後、モールドを基板から取り外し（図１０ｃ）、熱硬化性樹脂の硬化膜１７ａを形成する。
【００２６】
この図では、ＮＩＬ法を用いてウェルを形成する方法のみを示しているが、基板１６上に電極配線を形成した後、電極配線上にウェルを形成することができる。ＮＩＬ法でウェルを形成すると、厚さが１０〜１５ナノメートル程度の薄い硬化膜が電極配線表面に残存する。このような不要な硬化膜は、Ｏ２プラズマ（１５０Ｗ  ＩＣＰ、ＲＩＥ  ３０Ｗ、２５０ｍＴｏｒｒ，４９ｓｃｃｍ  Ｏ２）およびエッチング誘導結合プラズマ反応性イオン（ＩＣＰ−ＲＩＥ）によるドライエッチングを３０秒間行って除去し、電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域上に複数のウェルの配列を有するバイオチップを形成することができる。
【００２７】
特許文献１〜６に開示または示唆されたバイオチップを作用電極として用い、その他、少なくとも対極および参照電極を含むバイオセンサーを作製すれば、バイオチップ上のプローブ物質にターゲット分子が相互作用したときの電気信号の変化を高感度で検出することができ、試料中のターゲット分子の存在を検知し、さらには、その存在量を測定することができる。通常、電気信号として酸化還元電流を使用する。
ターゲット分子の種類によって、プローブ物質を、ＤＮＡ、抗体などのタンパク質、リポソーム、β−アミロイドオリゴマー、還元糖などを用いて、幅広い分野での測定が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】特許第４３２４７０７号明細書
【特許文献２】特許第４４９７９０３号明細書
【特許文献３】特開２００８−０３２５５４号
【特許文献４】特開２００８−１０５９７８号
【特許文献５】特開２０１０−２３９８２７号
【特許文献６】特開２０１０−１３６１５７号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】S. Y. Chou, P. R. Krauss, J. P. Renstrom, Appl. Phys. Lett. 1995, 67, 3114.
【非特許文献２】S. Y. Chou, P. R. Krauss, J. P. Renstrom, Science 1996, 272, 85.
【非特許文献３】J. Haisma, M. Verheijen, K. Vandenheuvel, J. Vandenberg, J. Vac. Sci. Technol. B 1996, 14, 4124.
【非特許文献４】P. Ruchhoeft, M. Colburn, B. Choi, H. Nounu, S. Johnson, T. Bailey, S. Damle, M. Stewart, J. Ekerdt, S. V. Sreenivasan, J. C. Wolfe, C. G. Willson, J. Vac. Sci. Technol. B 1999, 17, 2965.
【非特許文献５】M. Colburn, S. Johnson, M. Stewart, S. Damle, T. C. Bailey, B. Choi, M. Wedlake, T. Michaelson, S. V. Sreenivasan, J. Ekerdt, C. G. Willson, Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. 1999, 3676, 379.
【非特許文献６】L. J. Guo, P. R. Krauss, S. Y. Chou, Appl. Phys. Lett. 1997, 71, 1881.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
特許文献１〜６に開示されたバイオチップを作用電極として用いたバイオセンサーは、非常に有用であるが、本発明者らは、得られる酸化還元電位が測定毎に大きく変動することに気がついた。本発明者らは、この酸化還元電位の変動は、バイオチップの絶縁性レジスト膜の膨潤に起因することを突き止めた。すなわち、バイオチップの絶縁膜にレジスト組成物を用いているので、バイオチップを測定試料に浸積しているときに樹脂組成物が水により膨潤することによって、絶縁性レジスト膜の膜厚や絶縁性に変化が生じ、得られる酸化還元電位に影響を与えていると考えられる。
【００３１】
したがって、本発明の目的は、絶縁性レジスト膜の膨潤によって、センサーの測定変動を発生させないバイオチップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明は、プローブ物質を固定化するためのウェルのアレイが形成されたバイオチップであり、ウェルの底部には、バイオチップ上の電極配線が露出している。金属酸化物の絶縁膜に形成された複数のウェルの底部に、検出対象によって適切なプローブ物質を固定することができる。
【００３３】
より詳しくは、本発明は、プローブ物質を配列して固定化するための１または複数のウェルが形成されたバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は、金属酸化物の絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成されたバイオチップを提供する。
【００３４】
本発明によるバイオチップにおいて、該１または複数のウェル底部に露出した電極配線表面上に、核酸、タンパク質、ペプチド、リポソーム、β−アミロイドオリゴマーおよび還元糖よりなる群から選択されるプローブ物質を固定化することができる。
【００３５】
本発明のバイオチップにおいて、該金属酸化物が、ＴｉＯ２、ＳｉＯ２、ＺｎＯよりなる群から選択される。
【００３６】
さらに、本発明は、少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、ここに、該作用電極は、本発明のバイオチップ、すなわち、プローブ物質を配列して固定化するための１または複数のウェルが形成されたバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は、金属酸化物の絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成されたバイオチップであり、
該１または複数のウェル底部に露出した電極配線表面上に、核酸、タンパク質、ペプチド、リポソーム、β−アミロイドオリゴマーおよび還元糖よりなる群から選択されるプローブ物質が固定化され、
処理前に、該バイオチップの第１の電気的信号を測定し；
該バイオチップを試験溶液中で処理した後、該バイオチップの第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する、該１または複数のプローブ物質と特異的結合する非標識ターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンサーを提供する。
【００３７】
ここで、「処理」とは、プローブ物質と非標識ターゲット分子とを特異的結合させるために必要なプロセスをいう。したがって、処理前、バイオチップにおいては、該１または複数のプローブ物質には非標識ターゲット分子が結合していない。また、試験溶液中に該非標識ターゲット分子が存在していれば、この処理によって、該１または複数のプローブ物質に非標識ターゲット分子が特異的結合する。本発明のバイオチップに上記の処理を行う前後で、電気的信号を測定し、電気的信号に変化があれば、該試験溶液中に、非標識ターゲット分子が存在していたことを確認することができる。
【００３８】
本発明において、特に、電気的信号として酸化還元電流値を用いる。
すなわち、本発明によれば、非標識ターゲット分子のプローブ物質への特異的結合の有無をバイオチップのバイオ分子アレイ上の酸化還元状態の変化から検出する。したがって、ターゲット分子に蛍光物質等を標識することなく、酸化還元電流値を測定するだけで特異的結合を検出できるので、迅速かつ簡便な測定が可能となる。
すなわち、プローブ物質にターゲット分子が結合していない系で測定した電気的信号とプローブ物質にターゲット分子が結合した系で測定した電気的信号との間に統計学的に有意な変化があった場合、当該有意な変化をターゲット分子とプローブ物質との特異的結合に関連付けることができる。
【００３９】
本発明は、さらに、プローブ物質を配列して固定化するための１または複数のウェルが形成されたバイオチップの製造方法であって、
基板上に１または複数の電極配線を形成し、
該１または複数の電極配線を金属酸化物の絶縁膜で被覆し、ついで、
該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルを形成する、バイオチップの製造方法も提供する。
【００４０】
本発明のバイオチップは、従来のいかなる技術を適用して作製してもよい。
特に、本発明のバイオチップの製造方法において、該金属酸化物の絶縁膜にウェルを形成する技術が、ナノインプリンティング技術、ＫｒＦステッパーパターニング、Ｅ−ビーム法、収束イオンビーム法よりなる群から選択される。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のバイオチップは金属酸化物を絶縁膜として用いるので、試料溶液に浸漬したとき、レジストを絶縁膜として用いる従来のバイオチップと比較して、膨潤による電気的特性への悪影響がないので、安定した測定が可能となる。
また、本発明のバイオチップは金属酸化物を絶縁膜として用いるので、レジストを絶縁膜として用いる従来のバイオチップと比較して、ウェルのサイズを小さく作ることができるので、ウェル内部にタンパク質などのプローブ物質を固定化するとき、ウェル内部に多数のプローブ物質を取り込んでしまうことが減少し、プローブ物質のセンシング能が向上するため、より高い精度の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】従来例のバイオチップの上面図。
【図２】従来例のバイオチップのバイオ分子アレイ領域の上面図。
【図３】従来例のバイオ分子アレイ領域の断面図。
【図４】フォトファブリケーション技術による従来のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図５】フォトファブリケーション技術による従来のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図６】フォトファブリケーション技術による従来のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図７】フォトファブリケーション技術による従来のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図８】フォトファブリケーション技術による従来のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図９】従来のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図１０】ナノインプリントリソグラフィー技術による従来のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図１１】フォトファブリケーション技術による本発明のバイオチップの製造工程を説明する概略図。
【図１２】本発明のバイオチップのバイオ分子アレイ領域の上面の電子顕微鏡写真。
【図１３】本発明の実施例のバイオチップのボルタンメトリー測定結果。
【図１４】比較例のバイオチップのボルタンメトリー測定結果。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
実施例１［金属酸化膜を絶縁膜とするバイオチップ］
（１）バイオチップの製造
一般的な電子ビーム(ｅ−ビーム)リソグラフィー法を利用してナノサイズのウェルを有するバイオチップを製造した。
まず、図４の（ａ）〜（ｆ）のように従来の方法と同様に基板上に電極を形成する。
次に、スピンコーティング法(5000rpm:60秒)を利用して、電極上にｅ−ビーム用レジスト（ポリメチルメタクリレート）の２％クロロベンゼン溶液を150nm厚さでコーティングし、熱処理過程を経て硬化したレジスト膜６１を形成した（図１１ａ）。
硬化したレジスト膜６１に、所定のパターンで電子ビーム６２を照射し（図１１ｂ）、その後、基板を現像溶液（メチルエチルケトン：イソプロピルアルコール＝１：３）に30秒の間浸漬することによってレジスト膜６１を現像した（図１１ｃ）。
【００４４】
以後、一般的な金属酸化蒸着装置を用いる直流マグネトロンスパッタリング法（金属ターゲット、常温蒸着、圧力：５ｍＴｏｒｒ、ＤＣ電力：６０Ｗ）によって、ＳｉＯ２を蒸着して金属酸化物膜６３を形成した（図１１ｄ）。
さらに、基板をアセトンに30分以上浸漬して蒸着後に残ったレジスト膜６１およびレジスト上に蒸着したＳｉＯ２を除去することによって、電極表面を露出させ、複数のウェル６３ａの配列を形成した（図１１ｅ）。得られたバイオチップ概略上面図は示さないが、図８と同様であり、絶縁性レジスト膜１４が金属酸化物（ここでは、ＳｉＯ２）の絶縁膜６３であることが相違する。
【００４５】
上記の方法で、直径６０ｎｍで深さが４０ｎｍでサイズが非常に小さいウェルのアレイが形成された。ウェルのアレイ部分の電子顕微鏡像を図１２に示す。
【００４６】
次に、図９ａから９ｆに図示する従来例のように、露出した電極配線上にストレプトアビジンを固定化したバイオチップＡを作製した。
【００４７】
（２）電気化学的測定
ＢＡＳ１００Ｂ／Ｗポテンシオスタット（Bioanalytical Systems, Inc.)を用いて、室温にてバイオチップの電気化学的測定を行った。測定の際には、バイオチップを作用電極とし、３Ｍ  ＫＣｌ中のＡｇ／ＡｇＣｌを参照電極とし、プラチナ線を対電極とした（１ｍＭ）。
各ＥＣ測定の前には、ナノサイズのウェルのアレイを形成したバイオチップをＨ２ＳＯ４溶液中で＋１．７Ｖにて１分間予備処理を行った。
サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）測定は、１００ｍＭ リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を含有する溶液中で、スキャン速度２００ｍＶ／秒にて行った。ＣＶ測定の設定は以下である。
初期電位：−０．３Ｖ、最終電位：０．６Ｖ、振幅：２５ｍＶ、ステップ電位：４ｍＶ、周期：５０Ｈｚ．
バイオチップＡを溶液に浸漬した直後および、浸漬後３０分から２４０分まで、ＣＶ曲線を得た結果を図１３に示す。
【００４８】
図１３の結果から分かるように、金属酸化膜を絶縁膜として用いたバイオチップは長時間溶液に浸漬してもＣＶ曲線の変動がなく、非常に安定して測定できることが示された。
【００４９】
上の方法で作ったナノ構造のバイオ センサーは既存のポリマーを利用して製作した時より小さい大きさの製作が容易で、ポリマーより耐久性および安定性特にメタル酸化物の絶縁性が非常に良いからバイオセンサーの性能を向上させるのに良いことが分かった。
【００５０】
比較例１［レジスト膜を絶縁膜とするバイオチップ］
（１）バイオチップの製造
直径５μｍ以上の単一ウェルを作製したときと同様にして電極配線を形成し（図４）、その後、図５ａに示す工程と同様に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４（ＺＥＰ５２０：日本ゼオン株式会社）を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図７ａ）。次いで、７５ｋＶにて電子ビーム１５を照射し（図７ｂ）、レジスト１４を現像することによって電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域１３１上に複数のウェル１３１ａの配列を形成した（図７ｃ）。これを２００℃にて５分間ベーキングすることによって、レジスト１４を固着させた（図７ｄ）。ウェルが形成されたチップの概略上面図は図８に示したものと同様である。
【００５１】
次に、実施例１と同様にして、露出した電極配線上にストレプトアビジンが固定化されたバイオチップＢを作製した。
【００５２】
（２）電気化学的測定
実施例１と同じ条件で、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）法によりバイオチップの電気化学的測定を行った。
バイオチップＢを溶液に浸漬した直後および、浸漬後２０分から１２０分まで、ＣＶ曲線を得た結果を図１４に示す。
【００５３】
図１４の結果から分かるように、レジストを絶縁膜として用いたバイオチップは溶液に浸漬すると、ＣＶ曲線が大きく変動した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
従来のレジスト膜を絶縁膜として用いるバイオチップと比較すると、測定安定性が高いため、精度の高い測定を要する分野に応用することができる。
【符号の説明】
【００５５】
１・・・バイオチップ、１０・・・基板、１１・・・フォトレジスト、１２ａ・・・紫外線、１２ｂ・・・フォトマスク、１３・・・電極配線、１３１・・・バイオ分子アレイ領域、１３１ａ,１３１ｂ・・・ウェル、１３２・・・パッド、１４・・・絶縁性レジスト膜、１５・・・電子ビーム、
１６・・・基板、１７・・・樹脂層、１７ａ・・・硬化膜、１８・・・モールド、１９・・・ＵＶ光、
２・・・プローブ、２１・・・ビオチン化１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｂｉｏ−ＰＥ）、２２・・・ストレプトアビジン、２３・・・ビオチン化プローブ抗体、３・・・１−オクタデカンチオール（ＯＤＴ）、４・・・１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、５・・・（１１−フェロセニル）ウンデシルポリオキシエチレン（Ｆｅ−ＰＥＧ）、
６１・・・電子ビームリソグラフィー用レジスト、６２・・・電子ビーム、６３・・・金属酸化膜、６３ａ・・・ウェル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１２】
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