(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ末端アミノ酸残基がリジン残基であるか否かに関わらず、Ｃ末端ペプチド断片を回収する方法を提供する。【解決手段】タンパク質を、Ｃ末端カルボキシル基の選択的修飾に供し、修飾タンパク質を得る工程と、前記修飾タンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、前記消化物を、酸性条件下、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、タンパク質のＣ末端ペプチドを回収する方法。【選択図】図２
2013124242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を、Ｃ末端カルボキシル基の選択的修飾に供し、修飾タンパク質を得る工程と、
前記修飾タンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、
前記消化物を、酸性条件下、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、
タンパク質のＣ末端ペプチドを回収する方法。
【請求項２】
前記Ｃ末端カルボキシル基の選択的修飾が、酸無水物、活性エステル化剤存在下における酸無水物とカルボン酸との混合物、若しくは、塩基触媒、酸触媒及び／又はフェノール触媒存在下における、蟻酸と酸無水物との混合物、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物、及び／又はホルミル基を有する酸無水物を用いた前記Ｃ末端カルボキシル基の選択的活性化を行い、求核試薬を反応させることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記求核試薬が、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム基を有する化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記固相担体が、ヒドラジノ基、ヒドロキシアミノ基、アミノ基からなる群から選ばれる基によって官能基化された担体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
Ｃ末端がブロックされているタンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、
前記消化物を、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、
タンパク質のＣ末端ペプチドを回収する方法。
【請求項６】
分離された前記Ｃ末端ペプチド断片のＮ末端アミノ基を修飾する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾試薬が、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム基を有する化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって前記タンパク質から前記Ｃ末端ペプチド断片を回収する工程と、
回収された前記Ｃ末端ペプチド断片を、質量分析測定に供し、アミノ酸配列を決定する工程とを含む、タンパク質のＣ末端アミノ酸配列決定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のアミノ酸配列決定分野に関する。より具体的には、タンパク質切断処理物からＣ末端ペプチド断片を選択的に回収する方法及びそれを用いたタンパク質のＣ末端配列決定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
de novo配列解析法のためのタンパク質Ｃ末端ペプチド断片の回収法の例として、以下の方法が知られている。タンパク質をリジルエンドペプチダーゼ消化に供してペプチド断片混合物を得て、ペプチド断片混合物をスクシンイミジルオキシカルボニルメチルトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミドを用いた修飾に供してＮ末端アミノ基が修飾されたペプチド断片混合物を得て、さらに、修飾ペプチド断片混合物をアミノ基に反応する固相担体に供して、Ｃ末端ペプチド断片以外のペプチド断片を側鎖アミノ基を介して捕捉することにより、Ｃ末端ペプチド断片を選択的に回収する。（例えば非特許文献１（Proteomics 8, 1539-1550 (2008)参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】プロテオミクス、第８巻、２００８年、ｐ．１５３９−１５５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の方法は、リジン残基の側鎖アミノ基を介した捕捉によってペプチド断片の分離を行うため、Ｃ末端アミノ酸残基がリジン残基であるタンパク質には原理的に適用することができない。
そこで本発明の目的は、Ｃ末端アミノ酸残基がリジン残基であるか否かに関わらず、Ｃ末端ペプチド断片を回収する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討の結果、Ｃ末端修飾タンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化（シングルダイジェスチョン）、又は、グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化（ダブルダイジェスチョン）に供して生じる、Ｃ末端ペプチド断片及びその他のペプチド断片が、カルボキシル基を結合する官能基を有する固相担体への結合能において有効な差を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
タンパク質を、Ｃ末端カルボキシル基の選択的修飾に供し、修飾タンパク質を得る工程と、
前記修飾タンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、
前記消化物を、酸性条件下、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、
タンパク質のＣ末端ペプチドを回収する方法。
【０００７】
消化工程において「グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化」（以下、シングルダイジェスチョンと記載する場合がある）を行う場合の本発明の一例の概要を、図１に示す。
消化工程において「グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化」（以下、ダブルダイジェスチョンと記載する場合がある）を行う場合の本発明の一例の概要を、図２に示す。
Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とは、分離工程において、カルボキシル基を介して捕捉可能な固相担体（カルボキシル基をスカベンジングする固相担体）への結合能が異なり、この結合能の差によって互いに分離が可能となる。
【０００８】
（２）
前記Ｃ末端カルボキシル基の選択的修飾が、
酸無水物、
活性エステル化剤存在下における酸無水物とカルボン酸との混合物、若しくは、
塩基触媒、酸触媒及び／又はフェノール触媒存在下における、蟻酸と酸無水物との混合物、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物、及び／又はホルミル基を有する酸無水物
を用いた前記Ｃ末端カルボキシル基の選択的活性化を行い、求核試薬を反応させることによって行われる、（１）に記載の方法。
【０００９】
タンパク質Ｃ末端カルボキシル基の選択的活性化においては、より具体的には、タンパク質Ｃ末端におけるオキサゾロン環形成を含む反応が行われる。
【００１０】
（３）
前記求核修飾試薬が、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム基を有する化合物である、（２）に記載の方法。
【００１１】
（４）
前記固相担体が、トシルヒドラジノ基によって官能基化された担体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１２】
（５）
Ｃ末端がブロックされているタンパク質を、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化、又は、グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下における消化に供し、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る工程と、
前記消化物を、固相担体への接触に供し、前記その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、前記Ｃ末端ペプチド断片を分離する工程とを含む、
タンパク質のＣ末端ペプチドを回収する方法。
上記（５）の本発明の一例の概要を、図３に示す。
【００１３】
（６）
分離された前記Ｃ末端ペプチド断片のＮ末端アミノ基を修飾する工程をさらに含む、（５）に記載の方法。
（７）
前記修飾試薬が、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム基を有する化合物である、（６）に記載の方法。
【００１４】
（８）
（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって前記タンパク質から前記Ｃ末端ペプチド断片を回収する工程と、
回収された前記Ｃ末端ペプチド断片を、質量分析測定に供し、アミノ酸配列を決定する工程とを含む、タンパク質のＣ末端アミノ酸配列決定法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、Ｃ末端アミノ酸残基がリジン残基であるか否かに関わらず、Ｃ末端ペプチド断片を回収する方法が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】シングルダイジェスチョンを行う本発明の一例の概略を示したものである。タンパク質及びペプチド断片中、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基が存在する位置をそれぞれＥ及びＤで文字表記し、且つカルボキシル基及びその誘導体化された基を文字表記した。TMPPは、tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumpropyl基を表す。
【図２】ダブルダイジェスチョンを行う本発明の一例の概略を示したものである。タンパク質及びペプチド断片中、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基が存在する位置をそれぞれＥ及びＤで文字表記し、且つカルボキシル基及びその誘導体化された基を文字表記した。TMPPは、tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumpropyl基を表す。
【図３】Ｃ末端がブロックされたタンパク質が供される本発明の一例の概略を示したものである。タンパク質及びペプチド断片中、グルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基が存在する位置をそれぞれＥ及びＤで文字表記し、且つカルボキシル基、カルバモイル基及びアミノ基の誘導体化された基を文字表記した。TMPPは、tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumacetyl基を表す。
【図４】CALM_BOVINから単離されたＣ末端ペプチド断片を検出した質量分析結果である。
【図５】CALM_BOVINのＣ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果である。
【図６】CYC_COLLIから単離されたＣ末端ペプチド断片を検出した質量分析結果である。
【図７】CYC_COLLIのＣ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果である。
【図８】TPIS_RABITから単離されたＣ末端ペプチド断片を検出した質量分析結果である。
【図９】TPIS_RABITのＣ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果である。
【図１０】Galanin(rat)から単離されたＣ末端ペプチド断片を検出した質量分析結果である。
【図１１】Galanin(rat)のＣ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［１．タンパク質］
本明細書において、タンパク質とは、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いる。
本発明の方法に供されるタンパク質は、Ｃ末端カルボキシル基がフリーであるか否かを問わない。Ｃ末端カルボキシル基がフリーでないタンパク質は、すなわち、Ｃ末端カルボキシル基において誘導体化されているタンパク質であり、本明細書においては、Ｃ末端がブロックされたタンパク質と記載する場合がある。Ｃ末端がブロックされているタンパク質の代表的な例としては、Ｃ末端がアミド化されたものが挙げられるが、その他の例として、置換されたアミン化合物によるアルキルアミド化、エステル化なども挙げられる。
【００１８】
本発明の方法に供されるタンパク質は、Ｃ末端残基が側鎖アミノ基を有するリジンであるか否かを問わない。消化後のＣ末端ペプチド断片の分離において用いられる固相担体が、カルボキシル基を介して捕捉することができるものであるためである。
本発明の方法に供されるタンパク質は、通常の前処理として還元アルキル化等の処理を経たものであってよい。
【００１９】
［２．Ｃ末端カルボキシル基の選択的修飾］
タンパク質のＣ末端カルボキシル基は、選択的に修飾される。すなわち、選択的修飾においては、グルタミン酸残基やアスパラギン酸残基の側鎖に存在するカルボキシル基は修飾されない。なお、Ｃ末端カルボキシル基の選択的修飾は、原理的には、本発明に供されるタンパク質のＣ末端がフリーのカルボキシル基である場合に行われる。しかしながら、本発明に供されるタンパク質のＣ末端の態様（すなわちブロックされているか否か）が不明である場合も、この工程を行うことができる。
【００２０】
選択的修飾の具体的手法としては、タンパク質のＣ末端において、分子内でオキサゾロン環を形成し、オキサゾロン環を開環することによって、Ｃ末端が修飾されたタンパク質を得ることができる。以下項目２−１〜２−３に、選択的修飾法について３態様を挙げるが、これらの態様に限らず、当業者が適宜その方法を選択することができる。
【００２１】
［２−１．Ｃ末端選択的修飾法１］
オキサゾロン環形成後、求核試薬を作用させることによって、オキサゾロン環の開環と同時にＣ末端が修飾されたタンパク質を得る。
【００２２】
オキサゾロン環形成のための試薬としては、酸無水物を用いることが好ましい。酸無水物としては、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、オルトスルホ安息香酸無水物、無水プロピオン酸等を用いることができる。
【００２３】
次に、求核基を有する化合物（求核試薬）を反応させる。求核基としては、アミノ基（−ＮＨ２）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、チオール基（−ＳＨ）、ヒドラジノ基（−ＮＨＮＨ２）、ヒドロキシアミノ基（−ＮＨＯＨ）、セミカルバジド基（−ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）、アミノ基及びチオール基で置換されたエチレン基（−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ（ＳＨ）−）、アミノ基及びチオール基で置換されたエテン基（−Ｃ（ＮＨ２）＝Ｃ（ＳＨ）−）、システイニル基（−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨ）、活性メチレン基などの求核基から選ぶことができる。ここで、活性メチレン基は、カルボニル基に隣接したメチレン基、カルボニル基にはさまれたメチレン基、及び不飽和結合にはさまれたメチレン基をいう。
【００２４】
求核基を有する化合物としては、上記求核基が適当な構造に結合したものを用いることができる。例えば、上記求核基は、芳香族環やイミダゾリン環などに結合していてよい。芳香族環としては、ベンゼン環の他、ピリミジン環などの複素環が挙げられる。また、上記求核基は、電荷を有する基に結合していることが好ましい。正電荷を有する基の例として、ホスホニウム基、グアニジノ基などが挙げられ、負電荷を有する基の例として、スルホニル基などが挙げられる。求核基を有する化合物が電荷を有する態様は、質量分析を用いたアミノ酸配列解析法において有効である点で好ましい。  
本発明においては、求核基を有する化合物がトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム基含有化合物であることが好ましい。より具体的には、求核基を有する化合物がトリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムアルキルアミン（アルキル鎖長は例えば炭素数１〜１０であることが好ましい。図１及び２においては、この求核試薬を用いてＣ末端修飾が行われた態様を例示している。
【００２５】
［２−２．Ｃ末端選択的修飾法２］
オキサゾロン環形成後、オキサゾロンを開環して活性エステルに一旦変換し、その後、求核試薬を作用させることによってＣ末端が修飾されたタンパク質を得る。
【００２６】
オキサゾロン環形成のための試薬として、酸無水物とカルボン酸との混合物（酸−酸無水物混合物）を用いることができる。カルボン酸としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸などを用いることができる。酸無水物としては、上述項目２−１のＣ末端選択的修飾法１におけるものと同様のものを用いることができる。特に好ましい酸−酸無水物混合物の一例としては、ギ酸と酸無水物とからなる混合物が挙げられる。
【００２７】
カルボン酸と酸無水物との混合物を用いるオキサゾロン環形成は、活性エステル化剤の存在下で行うと、生成したオキサゾロン環を速やかに活性エステルに変換することができるため好ましい。活性エステル化反応は、上述のオキサゾロン環形成反応のための条件と同様の条件の下で行うことができる。
活性エステル化剤としては、一般にペプチド合成に用いられる比較的酸性度の高い水酸基を有する化合物を用いることができる。例えば、ペンタフルオロフェノール、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェノール、p-ニトロフェノール、N-ヒドロキシコハク酸イミド（HNOSu）、N-ヒドロキシベンズトリアゾール（HOBt）などが挙げられる。
この態様は、オキサゾロン環形成と同時にタンパク質の側鎖アミノ基や側鎖水酸基もカルボン酸によってアシル化されうることにより不活性化する点で好ましい。カルボン酸にギ酸を用いた場合は、これら側鎖官能基はホルミル化される。
【００２８】
上述のように活性エステル化されたタンパク質のＣ末端は、求核基を有する化合物をカップリングさせることによって修飾することができる。求核基を有する化合物としては、上述項目２−１のＣ末端選択的修飾法１で述べたものと同様のものを用いることができる。
【００２９】
［２−３．Ｃ末端選択的修飾法３］
オキサゾロン環の形成と同時にオキサゾロン環をホルミル化し、脱炭酸によって開環してアルデヒド基へ変換し、その後、求核試薬を作用させることによってＣ末端が修飾されたタンパク質を得る。
【００３０】
オキサゾロン環の形成及びホルミル化のための試薬としては、オキサゾロン環形成及びオキサゾロン環へのホルミル基の導入を実現し、且つオキサゾロン環におけるホルミル化で導入されるホルミル基の供給源を含む試薬が用いられる。具体的には、蟻酸と酸無水物との混合物（蟻酸−酸無水物混合物）、蟻酸と酸ハロゲン化物との混合物（蟻酸−酸ハロゲン化物混合物）、及びホルミル基を有する酸無水物から少なくとも１種が選ばれる。
蟻酸−酸無水物混合物における酸無水物としては、例えば、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸、無水安息香酸、オルトスルホ安息香酸無水物、無水プロピオン酸、無水ペンタフルオロプロピオン酸などを挙げることができる。
蟻酸−酸ハロゲン化物混合物における酸ハロゲン化物としては、例えば、蟻酸塩基物、塩化アセチル、臭化アセチル、塩化ベンゾイルなど挙げることができる。
ホルミル基を有する酸無水物は、少なくとも蟻酸から誘導される酸無水物であり、蟻酸と蟻酸以外の酸との混合酸無水物及び無水蟻酸が挙げられる。蟻酸と蟻酸以外の酸との混合酸無水物としては、例えば、蟻酸と酢酸との混合酸無水物などが挙げられる。
この態様は、オキサゾロン環形成及びホルミル化と同時にタンパク質の側鎖アミノ基や側鎖水酸基もホルミル化され、不活性化される点で好ましい。
【００３１】
一方、オキサゾロン環形成後のＣ末端アミノ酸残基のＣα−水素の引き抜き、及び引き続くホルミル化と脱炭酸反応とにおいては、触媒が必要である。触媒は、塩基触媒、酸触媒及びフェノール触媒から１種又は複数種が選ばれる。塩基触媒としては、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの典型的な塩基が挙げられる。また、フェノール触媒は、蟻酸或いはその他のホルミル基含有物質中で塩基触媒として作用すると考えられるが、場合により酸触媒として作用する可能性も考えられる。フェノール触媒の例としては、ペンタフルオロフェノール、ｐ−ニトロフェノールなどが挙げられる。
【００３２】
次に、求核基を有する化合物を反応させる。求核基を有する化合物としては、上述項目２−１のＣ末端選択的修飾法１で述べたものと同様のものを用いることができる。
【００３３】
［３．消化］
Ｃ末端修飾工程に供されて得られたタンパク質は、特定のアミノ酸残基での切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下に供され、Ｃ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とを含む消化物を得る。
本発明では、下記のシングルダイジェスチョン及びダブルダイジェスチョンのいずれかによって、所望の消化が行われる。
【００３４】
［３−１．シングルダイジェスチョン］
シングルダイジェスチョンでは、グルタミン酸及びアスパラギン酸両方のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境を構築する。
グルタミン酸及びアスパラギン酸両方のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境としては、リン酸バッファー中にＧｌｕＣを含む環境が挙げられる。ＧｌｕＣは、より具体的にはStaphylococcus aureus V8由来のものが知られている。この環境において、ｐＨは４〜９、好ましくは８〜８．５である。
シングルダイジェスチョンによって得られる消化物においては、図１に示すように、Ｃ末端ペプチド断片がカルボキシル基を有さない点で特徴的であり、その他のペプチド断片がカルボキシル基を有する点と異なる。
【００３５】
［３−２．ダブルダイジェスチョン］
シングルダイジェスチョンにおけるリン酸バッファー中で作用させるＧｌｕＣは、基質によっては、アスパラギン酸のＣ末端における切断がされにくい場合がある。このような場合、ダブルダイジェスチョンを行うことが好ましい。
ダブルダイジェスチョンでは、グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境及びアスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境をそれぞれ構築する。なお、ダブルダイジェスチョンにおいては、それぞれの消化の順番は問わない。
【００３６】
グルタミン酸のＣ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境としては、重炭酸アンモニウム及び／又は酢酸アンモニウム中にＧｌｕＣを含む環境が挙げられる。また、シングルダイジェスチョンと同じ環境であることも許容する。
アスパラギン酸のＮ末端切断能を有するエンドプロテイナーゼ条件下の環境としては、ＡｓｐＮを使用する環境が挙げられる。この環境においては、リン酸バッファーを用いることができ、ｐＨは７．０〜８．０である。
ダブルダイジェスチョンによって得られる消化物においては、図２に示すように、Ｃ末端ペプチド断片がカルボキシル基を有する場合があるが、この場合、Ｃ末端ペプチド断片のカルボキシル基がＮ末端アミノ酸残基の側鎖に存在する点で特徴的であり、他のペプチド断片におけるカルボキシル基がＣ末端アミノ酸残基に存在する点と異なる。
【００３７】
［４．分離］
分離工程においては、酸性条件下で、消化物を固相担体に接触させ、その他のペプチド断片を前記固相担体で捕捉することによって、Ｃ末端ペプチド断片を分離する。
【００３８】
固相担体は、酸性条件下でカルボキシル基と共有結合可能な官能基と担体部とを有するものであればよい。酸性条件下でカルボキシル基と共有結合可能な官能基は、より具体的には、酸性条件下において、Ｃ末端残基に存在するカルボキシル基と共有結合可能であって、Ｎ末端残基に存在するカルボキシル基とは共有結合しない官能基である。例えば、ヒドラジノ基、ヒドロキシアミノ基、アミノ基等によって官能基化された担体を用いることができる。
担体部としては特に限定されないが、例えば、ガラスやレジンを用いることができる。より具体的には、シリカゲル、ガラス（多孔質ガラス）、ポリスチレン、などが挙げられる。
【００３９】
分離工程における条件としては、固相担体における官能基とカルボキシル基とが反応可能な酸性条件であればよく、官能基の種類に応じて当業者が適宜決定することができる。例えば、反応系のｐＨを１〜５、好ましくは２〜３とすることができる。反応温度は２４〜８０℃、好ましくは４０〜５０℃であり、反応時間は０．５〜５時間、好ましくは０．５〜２時間でありうる。
【００４０】
消化工程で得られたＣ末端ペプチド断片とその他のペプチド断片とは、固相担体への結合能において有効な差を有する。
例えば、消化工程におけるシングルダイジェスチョンによって得られた消化物においては、Ｃ末端ペプチド断片はカルボキシル基を有さず、その他のペプチド断片はカルボキシル基を有する。固相担体へは、カルボキシル基を有するその他のペプチド断片がカルボキシル基を介して結合し、カルボキシル基を有さないＣ末端ペプチド断片は結合することなく溶出する。
【００４１】
また、消化工程におけるダブルダイジェスチョンによって得られた消化物が、Ｎ末端アミノ酸残基の側鎖にカルボキシル基を有するＣ末端ペプチド断片を含む場合、その他のペプチド断片のみがＣ末端カルボキシル基を介して結合し、Ｃ末端ペプチド断片は、カルボキシル基を有していても結合することなく溶出する。
Ｃ末端ペプチド断片がカルボキシル基を有しているにも関わらず固相担体に結合しないのは、Ｃ末端ペプチド断片が有するカルボキシル基がＮ末端アミノ酸残基の側鎖に存在しており、この位置におけるカルボキシル基が、その他のペプチド断片がそのＣ末端に有するカルボキシル基よりも酸性度が高いことに起因する。この高い酸性度のため、固相担体の官能基と反応せず、Ｃ末端ペプチド断片は固相担体に結合することなく溶出する。
【００４２】
［５．Ｎ末端修飾］
分離されたＣ末端ペプチド断片は、そのＮ末端が修飾されることができる。このＮ末端修飾が行われる場合を挙げると、本発明に供されるタンパク質のＣ末端がブロックされていた場合（図３）や、Ｃ末端選択的修飾工程において電荷を有しない基で修飾した場合が挙げられる。
Ｎ末端修飾法としては、アミノ基を修飾可能な方法を特に限定されることなく、当業者が適宜選択することができるものである。好ましくは、Ｎ末端のαアミノ基が選択的に修飾される一方で、側鎖に存在しうるεアミノ基は修飾を受けない方法が用いられる。
Ｎ末端修飾工程において用いられる修飾試薬は、前述の選択的Ｃ末端修飾工程で用いられる修飾試薬における求核基と同様、電荷を有する求核基を有する化合物であることが好ましい。
【００４３】
例えば、修飾試薬の例としては、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸、及びその誘導体が挙げられる。トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸の誘導体としては、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸のエステル、活性エステル、酸ハロゲン化物、酸無水物、及び酸アジドなどが挙げられる。トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸の活性エステルとしては、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル（TMPP-Ac-OSu）、トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウム酢酸のスルホスクシンイミジルエステルなどが挙げられる。さらに具体的な修飾試薬の例としては、（スクシンイミジルオキシカルボニルメチル）トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミドが挙げられる。図３においては、この求核試薬を用いてＮ末端修飾が行われた態様を例示している。
上記以外にも、修飾試薬として、以下のものを使用してもよい。例えば、５−ブロモニコチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（BrNANHS）、４−スルホフェニルイソチオシアネート（SPITC)を用いることができる。
【００４４】
［６．質量分析］
Ｃ末端ペプチド断片は、好ましくはその末端に電荷を有する基で修飾を受けた態様で、質量分析に供される。
末端に電荷を有する基で修飾されているＣ末端ペプチド断片は、末端に付与された電荷によって、質量分析に供された場合に好ましい効果を生じさせる。具体的には、質量分析におけるフラグメンテーションで生じるフラグメントイオンの中で、電荷を有する基を持つイオン種の感度を上げる（正電荷を有する場合）、或いは下げる（負電荷を有する場合）ことができる。その結果、観測されるフラグメントイオンの複雑さが減少しアミノ酸配列解析が容易となる。すなわち、Ｃ末端ペプチド断片を電荷を有する基で修飾しておくことは、質量分析におけるアミノ酸配列解析を容易にさせる点で好ましい。
【００４５】
アミノ酸配列の同定は、ESI（Electrospray Ionization）法を利用した質量分析装置によるMS/MS解析、MALDI（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization）−TOF（Time-Of-Flight）型質量分析装置によるPSD（Post-Source Decay）解析やCID（Collision-Induced Dissociation）解析、及びMALDI法を利用した質量分析装置によるMS/MS解析などによって行うことができる。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【００４７】
本実施例では、CALM_BOVIN、CYC_COLLI、TPIS_RABIT及びGalanin(rat)（いずれもSigma社製）をそれぞれ解析すべきタンパク質として、以下の操作に供した。
解析すべきタンパク質（０．５ナノモル）を定法によりＳＳ結合還元を行い、ヨードアセトアミドでアルキル化した。
還元−アルキル化されたタンパク質溶液をアセトン中に加え、タンパク質を沈殿させることによって不要な試薬等を除去した。得られたタンパク質を減圧下乾燥させ、HCOOH-AcOH-pentafluorophenolを加えてＣ末端ＣＯＯＨ基のみを活性化した。ここにTMPP-propylamineの溶液を加え、活性化されたＣＯＯＨ基をアミド化した。このようにしてＣ末端が選択的に修飾されたタンパク質を、アセトン沈殿により精製し、乾燥させた。乾燥させた修飾タンパク質をリン酸バッファー（pH8）に溶解し、GluCを加えて３７℃で３時間消化を行った。消化物液に１０ｍｍｏｌのＨＣｌを加えてｐＨ２程度に調整し、予め１ｍｍｏｌのＨＣｌで洗浄したSiliaBond(R) Tosyl Hydrazine（シリサイクル社製）（トシルヒドラジノ基で官能基化されたガラスビーズ）に加えて５０℃で３０分反応させた。反応後、上澄みを回収し、さらにＨＣＯＯＨでガラスビーズを洗浄し、洗浄後の上澄みも回収した。
回収した上澄みを併せたものを、質量分析測定によるＣ末端ペプチド断片の回収の確認、及びＭＳ／ＭＳ（ＰＳＤ）測定によるde novo配列解析に供した。
【００４８】
なお、CYC_COLLI及びTPIS_RABITの場合においては、以下のダブルダイジェスチョンをさらに行った。この場合は、GluCでの消化後、AspNを加えて３７℃で３時間消化した。その後の工程は、上記と同様に行った。
【００４９】
CALM_BOVINから単離されたＣ末端ペプチド断片（C-term peptide）を検出した質量分析結果を図４に、当該Ｃ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果を図５に示す。解析された配列は、FVQMMTAK（配列番号１）である。配列番号１のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化（formylation）されており、且つカルボキシル基がTMPP（tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumpropylamido）化されている。
【００５０】
CYC_COLLIから単離されたＣ末端ペプチド断片（C-term peptide）を検出した質量分析結果を図６に、当該Ｃ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果を図７に示す。解析された配列は、DLIAYLKQATAK（配列番号２）である。配列番号２のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化（formylation）されており、且つカルボキシル基がTMPP（tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumpropylamido）化されている。
【００５１】
TPIS_RABITから単離されたＣ末端ペプチド断片（C-term peptide）を検出した質量分析結果を図８に、当該Ｃ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果を図９に示す。Ｃ末端ペプチド断片は、内部アミノ酸残基Kのεアミノ基がホルミル化（formylation）されているものと、アセチル化されているものとの両方が検出された。配列解析には、ホルミル化されているものを用いた。解析された配列は、DIINAKQ（配列番号３）である。配列番号３のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化（formylation）されており、Ｃ末端アミノ酸残基Qのα-カルボキシル基がTMPP（tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumpropylamido）化されている。
【００５２】
Galanin(rat)から単離されたＣ末端ペプチド断片（C-term peptide）を検出した質量分析結果を図１０に、当該Ｃ末端ペプチド断片のPSDによるde novo配列解析結果を図１１に示す。解析された配列は、KHGLT（配列番号４）である。配列番号４のペプチドはKのεアミノ基がホルミル化（formylation）されており、且つαアミノ基がTMPP-Ac（tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphoniumacetyl）化されており、Ｃ末端アミノ酸残基Tのカルボキシル基がアミド化されている。この例はC末端がアミド化されたタンパク質のC末端解析例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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