(57)【要約】【課題】  従来の技術では、抗菌剤の実際の病態に対する作用状況を十分に反映しているとは考えにくい抗菌剤と白癬菌を直接作用させる方法、あるいは実験動物を犠牲にした上、免疫学的解析、遺伝学的解析が充分かつ効率的には行われ難い方法が実施されてきた。【解決手段】  動物を用いた白癬菌感染モデルを代替するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして、生きた白癬菌と３次元培養皮膚を共存したことを特徴とする新規な皮膚白癬菌感染モデルを提供する。このモデルに抗真菌製剤等を塗布し、白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価できる【選択図】図１
2013190410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物を用いたｉｎ  ｖｉｖｏの白癬菌感染モデルを代替するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして、生きた白癬菌と３次元培養皮膚を共存させることを特徴とする新規な皮膚白癬菌感染モデル。
【請求項２】
請求項１に記載したモデルに試料を塗布し、白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価することを特徴とする皮膚白癬菌感染に対する抗菌剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は３次元培養皮膚と白癬菌を共培養し、培養皮膚の角層下に白癬菌を生きたまま埋め込んだ感染モデル系およびそれを用いた抗菌剤の効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  白癬はあらゆるヒトの疾患の中でもっとも罹患率が高く、ほぼ世界のすべての地域において人口の１０％以上が常時罹患しているといわれ、日本においても患者数は１千万人を超えるものと推定されている。患者数がもっとも多いのが俗に「水虫」といわれている足白癬で、次いで爪白癬が多い。現在でも患者数が極めて多く、難治性で再発しやすい白癬に対し、新しい治療法および薬剤の開発は重要な社会的課題である。【０００３】  白癬は、トリコフィトン属等の真菌の感染によって引き起こされるが、起因菌としてはトリコフィトン  ルブルム、トリコフィトン  メンタグロフィテス、エピデルモフィトン  フロックスムの順に多い。白癬菌は角化した皮膚の組織、すなわち角質層や毛髪および爪に侵入・発育し、局所の感染（白癬）を引き起こす。【０００４】  白癬に対する抗菌剤の開発において抗菌力の評価が必要不可欠とされている。従来の抗菌力評価は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて直接白癬菌と抗菌剤と作用させる方法がある（特許文献１）。しかし、白癬菌は感染すると角層内に潜り込み、抗菌剤の抗菌力に加え、角層内への浸透力も必要とされているため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価はかならずしも十分とはいえない。これに対し、実状況に近い感染動物モデルの使用は必要不可欠とされ、これまで白癬菌感染のモデル実験は専らモルモットやマウス（特許文献２）を用いて行われてきた。【０００５】  しかしながら、当該動物では感染および病態に関する宿主側の免疫学的解析、遺伝学的解析が充分かつ効率的には行われ難いという問題点があった。また、最近動物愛護の観点より次第に動物試験法の使用が制限されるようになってきている。このため、それらの解析をする必要がない新しい感染モデルの開発が求められていた。【０００６】  一方、３次元培養皮膚は古くから開発され（非特許文献１）、実際の皮膚に近い構造および生理活性を有することからやけどの治癒時の代替皮膚（特許文献３）や、皮膚刺激性試験（特許文献４）や経皮吸収促進試験（特許文献５）などの動物代替試験として用いられているが、白癬菌などの感染モデル系に使用された報告はない。
【先行技術文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２０３８９５
【特許文献２】特開２０１０−１８７６５３
【非特許文献１】Ｅｕｎ  Ｋｙｕｎｇ  Ｙａｎｇ  Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ  ２４、７（２０００）
【特許文献３】特開２００２−２００１６１
【特許文献４】特開２０００−０９３１９３
【特許文献５】特開２０００−２０１６９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  上述したように、従来の技術では、抗菌剤の実際の病態に対する作用状況を十分に反映しているとは考えにくい抗菌剤と白癬菌を直接作用させる方法、あるいは実験動物を犠牲にした上、免疫学的解析、遺伝学的解析が充分かつ効率的には行われ難い方法が実施されてきた。これらが本発明が解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  本発明者らは、動物を用いず、３次元培養皮膚と白癬菌を共培養し、培養皮膚の角層下に白癬菌を生きたまま埋め込んだ感染モデル系を創出し、さらにこのモデルを使えば白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】  すなわち、動物を用いた白癬菌感染モデルを代替するｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして、生きた白癬菌と３次元培養皮膚を共存したことを特徴とする新規な皮膚白癬菌感染モデルを提供するものである。このモデルに抗真菌製剤等を塗布し、白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】  本発明は、抗菌剤と白癬菌を直接作用させる従来の技術に比べ、実際の感染状況に近いｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験条件を提供し、さらに実験動物を用いることなく実際の状況に近い薬剤の抗菌作用を評価する方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  本発明において３次元培養皮膚は、表皮構造又は表皮と真皮構造を有するものである。【００１３】  本発明において白癬菌は皮膚や爪に感染すると認められているものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、トリコフィトン  ルブルム、トリコフィトン  メンタグロフィテス、エピデルモフィトン  フロックスムなどが挙げられる。【００１４】  これらの白癬菌の３次元培養皮膚試料への感染（接種）にあたっては、定量的な評価を可能とするため、白癬菌を予め斜面培地で培養し、回収後、ガーゼなどでろ過して菌糸を除去して平板培地播種する。【００１５】  上記白癬菌を回収し、３次元培養皮膚の表皮側に播く。感染及び角層内の封入は、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、７日間程度培養を行えばよい。感染が十分に行われたことは、組織を切片にし、顕微鏡下で染色した真菌の発育と角層の形成を確認することにより判断することができる。【００１６】  このようにして、白癬菌で感染された３次元培養皮膚に、次いで、抗真菌剤又はこれを含む組成物（以下、「抗真菌製剤」という）を作用させる。この作用させる抗真菌製剤の剤型は、外用剤として通常皮膚に用いられる剤型であれば特に限定されず、例えば、液剤、クリーム剤、軟膏剤として塗布するもの、皮膚を清拭するもの、貼付け剤として貼付けるもの等により作用させることができる。【００１７】  ３次元培養皮膚に抗真菌製剤を作用させるに当たっては、ろ紙や布に事前にしみこませた抗真菌製剤を用いるのが好ましい。一定時間３次元培養皮膚の表皮側に抗真菌製剤を作用させた後、抗真菌製剤を除去する。３次元培養皮膚をホモジナイズし、白癬菌を抽出した後、同様に平板培地にて培養し、菌数を測定する。また、同時に抗真菌製剤の３次元培養皮膚に対する毒性を細胞染色することにより評価することもできる。【００１８】  白癬菌の播種菌数としては１０４ｃｆｕ／ｃｍ２〜１０６ｃｆｕ／ｃｍ２が最も望ましいとされている。【００１９】  以下、実施例に基づいて本発明を詳説する。本発明は特にこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】  １．白癬菌の調製
培地は、ポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）３．９％となるように蒸留水に添加、攪拌後、オートクレーブで滅菌（１２０℃、１５分）し作製した。
トリコフィトン  メンタグロファイテスを斜面培地に播種し、３０℃で１週間培養した。この斜面培地に１０ｍＬの０．０５％ツィーン８０を加えた生理食塩水を添加した。軽くピペッティングして遊離させた後、ガーゼでろ過し菌糸を除去した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心で分生子を集め、０．０５％ツィーン８０−生理食塩水で３回洗浄し、４ｍＬの０．０５％ツィーン８０−生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を血球計算板にて菌量を測定した。【００２１】  上記１．で調製した接種菌液を平板培地に画線し、３０℃で１週間培養した。同様に１０ｍＬの０．０５％ツィーン８０を加えた生理食塩水を添加した。軽くピペッティングして遊離させた後、ガーゼでろ過し菌糸を除去した。３０００ｒｐｍ、５分間遠心で分生子を集め、０．０５％ツィーン８０−生理食塩水で３回洗浄し、４ｍＬの０．０５％ツィーン８０−生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を血球計算板にて菌量を測定した。【００２２】  ２．感染モデルの作製
３次元培養皮膚（クラボウ製）の表皮側にトリコフィトン・メンタグロファイテスを１０５ｃｆｕ／ｃｍ２となるように接種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、７日間程度培養した。感染モデルを切片にし、角層の観察および真菌染色法による白癬菌の観察を行った。【００２３】  白癬菌感染３次元培養皮膚の角層中に白癬菌が観察され（図１）、白癬菌未感染の３次元培養皮膚（図２）と同様に角層が観察された。
【実施例２】
【００２４】  １．抗真菌製剤の評価
直径８ｍｍのろ紙に抗真菌製剤を５０μＬしみ込ませ、３次元培養皮膚の表皮側にのせ、３７℃、５％ＣＯ２の条件で、２４時間培養した。実施例１は塩化ベンザルコニウム含有抗真菌製剤、実施例２はミコナゾール硝酸塩含有抗真菌製剤、実施例３は０．２％ポリヘキサメチレンビグアニド含有抗真菌製剤である。【００２５】  ２．白癬菌の菌数測定と３次元培養皮膚の細胞毒性
抗真菌製剤を塗布２４時間後、ろ紙を除去し、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。３次元培養皮膚をホモジナイズし、白癬菌を抽出した後、平板培地に播き、培養し、３０℃で１週間培養し菌数を測定する。また、別の抗真菌製剤処理後の３次元培養皮膚を１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリンブロマイド］入り培地に浸し、３時間処理し、イソプロパノールで色素であるホルマザンを抽出し５７０ｎｍの吸光度を測定した。細胞賦活率は式１で求めた。
式１
2013190410.tif 000003
【００２６】  抗菌力試験の結果を図３に示す。実施例１〜３のいずれも抗菌力が認められた。さらに時間的に抗菌力が高まることから、角層への浸透に伴い、抗菌力が増加したことがわかった。【００２７】  抗菌力試験の結果を図４に示す。実施例３のみに毒性が低いことがわかり、選択的に白癬菌を死滅させることがわかった。【００２８】  本発明方法によれば、白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価することができ、皮膚に影響がなく、選択的に菌を死滅させる抗菌製剤の評価に応用しうることがわかった。
【図１】
2013190410.tif 000004
【図２】
2013190410.tif 000005
【図３】
2013190410.tif 000006
【図４】
2013190410.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月27日(2012.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は３次元培養皮膚と白癬菌を共培養し、培養皮膚の角層下に白癬菌を生きたまま埋め込んだ感染モデル系およびそれを用いた抗菌剤の効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白癬はあらゆるヒトの疾患の中でもっとも罹患率が高く、ほぼ世界のすべての地域において人口の１０％以上が常時罹患しているといわれ、日本においても患者数は１千万人を超えるものと推定されている。患者数がもっとも多いのが俗に「水虫」といわれている足白癬で、次いで爪白癬が多い。現在でも患者数が極めて多く、難治性で再発しやすい白癬に対し、新しい治療法および薬剤の開発は重要な社会的課題である。
【０００３】
白癬は、トリコフィトン属等の真菌の感染によって引き起こされるが、起因菌としてはトリコフィトン  ルブルム、トリコフィトン  メンタグロフィテス、エピデルモフィトン  フロックスムの順に多い。白癬菌は角化した皮膚の組織、すなわち角質層や毛髪および爪に侵入・発育し、局所の感染（白癬）を引き起こす。
【０００４】
白癬に対する抗菌剤の開発において抗菌力の評価が必要不可欠とされている。従来の抗菌力評価は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて直接白癬菌と抗菌剤と作用させる方法がある（特許文献１）。しかし、白癬菌は感染すると角層内に潜り込み、抗菌剤の抗菌力に加え、角層内への浸透力も必要とされているため、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの評価はかならずしも十分とはいえない。これに対し、実状況に近い感染動物モデルの使用は必要不可欠とされ、これまで白癬菌感染のモデル実験は専らモルモットやマウス（特許文献２）を用いて行われてきた。
【０００５】
しかしながら、当該動物では感染および病態に関する宿主側の免疫学的解析、遺伝学的解析が充分かつ効率的には行われ難いという問題点があった。また、最近動物愛護の観点より次第に動物試験法の使用が制限されるようになってきている。このため、それらの解析をする必要がない新しい感染モデルの開発が求められていた。
【０００６】
一方、３次元培養皮膚は古くから開発され（非特許文献１）、実際の皮膚に近い構造および生理活性を有することからやけどの治癒時の代替皮膚（特許文献３）や、皮膚刺激性試験（特許文献４）や経皮吸収促進試験（特許文献５）などの動物代替試験として用いられているが、白癬菌などの感染モデル系に使用された報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２０３８９５
【特許文献２】特開２０１０−１８７６５３
【特許文献３】特開２００２−２００１６１
【特許文献４】特開２０００−０９３１９３
【特許文献５】特開２０００−２０１６９５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｕｎ Ｋｙｕｎｇ Ｙａｎｇ  Ａｒｔｉｆ Ｏｒｇａｎｓ ２４、７（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来の技術では、抗菌剤の実際の病態に対する作用状況を十分に反映しているとは考えにくい抗菌剤と白癬菌を直接作用させる方法、あるいは実験動物を犠牲にした上、免疫学的解析、遺伝学的解析が充分かつ効率的には行われ難い方法が実施されてきた。これらが本発明が解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、動物を用いず、3次元培養皮膚と白癬菌を共培養し、培養皮膚の角層下に白癬菌を生きたまま埋め込んだ感染モデル系を創出し、さらにこのモデルを使えば白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、動物を用いた白癬菌感染モデルを代替するｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして、生きた白癬菌と3次元培養皮膚を共存したことを特徴とする新規な皮膚白癬菌感染モデルを提供するものである。このモデルに抗真菌製剤等を塗布し、白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、抗菌剤と白癬菌を直接作用させる従来の技術に比べ、実際の感染状況に近いｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験条件を提供し、さらに実験動物を用いることなく実際の状況に近い薬剤の抗菌作用を評価する方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において３次元培養皮膚は、表皮構造又は表皮と真皮構造を有するものである。
【００１４】
本発明において白癬菌は皮膚や爪に感染すると認められているものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、トリコフィトン  ルブルム、トリコフィトン  メンタグロフィテス、エピデルモフィトン  フロックスムなどが挙げられる。
【００１５】
これらの白癬菌の３次元培養皮膚試料への感染（接種） にあたっては、定量的な評価を可能とするため、白癬菌を予め斜面培地で培養し、回収後、ガーゼなどでろ過して菌糸を除去して平板培地播種する。
【００１６】
上記白癬菌を回収し、３次元培養皮膚の表皮側に播く。感染及び角層内の封入は、３７ ℃、５％ＣＯ２の条件で、７ 日間程度培養を行えばよい。感染が十分に行われたことは、組織を切片にし、顕微鏡下で染色した真菌の発育と角層の形成を確認することにより判断することができる。
【００１７】
このようにして、白癬菌で感染された３次元培養皮膚に、次いで、抗真菌剤又はこれを含む組成物（ 以下、「抗真菌製剤」という） を作用させる。この作用させる抗真菌製剤の剤型は、外用剤として通常皮膚に用いられる剤型であれば特に限定されず、例えば、液剤、クリーム剤、軟膏剤として塗布するもの、皮膚を清拭するもの、貼付け剤として貼付けるもの等により作用させることができる。
【００１８】
３次元培養皮膚に抗真菌製剤を作用させるに当たっては、ろ紙や布に事前にしみこませた抗真菌製剤を用いるのが好ましい。一定時間３次元培養皮膚の表皮側に抗真菌製剤を作用させた後、抗真菌製剤を除去する。３次元培養皮膚をホモジナイズし、白癬菌を抽出した後、同様に平板培地にて培養し、菌数を測定する。また、同時に抗真菌製剤の３次元培養皮膚に対する毒性を細胞染色することにより評価することもできる。
【００１９】
白癬菌の播種菌数としては１０４ｃｆｕ／ｃｍ２〜１０６ｃｆｕ／ｃｍ２が最も望ましいとされている。
【００２０】
以下、実施例に基づいて本発明を詳説する。本発明は特にこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
１．白癬菌の調製
培地は、ポテト・デキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）３．９ ％となるように蒸留水に添加、攪拌後、オートクレーブで滅菌（ １ ２ ０ ℃ 、１
５ 分） し作製した。トリコフィトン  メンタグロファイテスを斜面培地に播種し、３０ ℃ で１ 週間培養した。この斜面培地に１ ０ ｍＬの０ ． ０ ５ ％ ツィーン８
０ を加えた生理食塩水を添加した。軽くピペッティングして遊離させた後、ガーゼでろ過し菌糸を除去した。３ ０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ 、５ 分間遠心で分生子を集め、０
． ０ ５ ％ ツィーン８ ０ − 生理食塩水で３ 回洗浄し、４ ｍＬの０ ． ０ ５ ％ ツィーン８ ０ − 生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を血球計算板にて菌量を測定した。
【００２２】
上記１．で調製した接種菌液を平板培地に画線し、３０ ℃ で１ 週間培養した。同様に１ ０ ｍＬの０ ． ０ ５ ％ ツィーン８ ０ を加えた生理食塩水を添加した。軽くピペッティングして遊離させた後、ガーゼでろ過し菌糸を除去した。３
０ ０ ０ ｒ ｐ ｍ 、５ 分間遠心で分生子を集め、０ ． ０ ５ ％ ツィーン８ ０ − 生理食塩水で３ 回洗浄し、４ ｍＬの０ ． ０ ５ ％ ツィーン８
０ − 生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を血球計算板にて菌量を測定した。
【００２３】
２．感染モデルの作製
３次元培養皮膚（クラボウ製）の表皮側にトリコフィトン・メンタグロファイテスを１０５ｃｆｕ／ｃｍ２となるように接種し、３７ ℃、５％ＣＯ２の条件で、７日間程度培養した。感染モデルを切片にし、角層の観察および真菌染色法による白癬菌の観察を行った。
【００２４】
白癬菌感染３次元培養皮膚の角層中に白癬菌が観察され（図１）、白癬菌未感染の３次元培養皮膚（図２）と同様に角層が観察された。
【実施例２】
【００２５】
１．抗真菌製剤の評価
直径８ｍｍのろ紙に抗真菌製剤を５０μＬしみ込ませ、３次元培養皮膚の表皮側にのせ、３７ ℃、５％ＣＯ２の条件で、２４時間培養した。実施例１は塩化ベンザルコニウム含有抗真菌製剤、実施例２はミコナゾール硝酸塩含有抗真菌製剤、実施例３は０．２％ポリヘキサメチレンビグアニド含有抗真菌製剤である。
【００２６】
２．白癬菌の菌数測定と３次元培養皮膚の細胞毒性
抗真菌製剤を塗布２４時間後、ろ紙を除去し、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した。３次元培養皮膚をホモジナイズし、白癬菌を抽出した後、平板培地に播き、培養し、３０
℃ で１ 週間培養し菌数を測定する。また、別の抗真菌製剤処理後の３次元培養皮膚を１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリンブロマイド］入り培地に浸し、３時間処理し、イソプロパノールで色素であるホルマザンを抽出し５７０ｎｍの吸光度を測定した。細胞賦活率は式１で求めた。
【数式１】
【００２７】
細胞賦活率（％）＝（試験物質処理後の吸光度）／（試験物質未処理の吸光度）×１００％
【００２８】
抗菌力試験の結果を図３に示す。実施例１〜３のいずれも抗菌力が認められた。さらに時間的に抗菌力が高まることから、角層への浸透に伴い、抗菌力が増加したことがわかった。
【００２９】
抗菌力試験の結果を図４に示す。実施例３のみに毒性が低いことがわかり、選択的に白癬菌を死滅させることがわかった。
【００３０】
本発明方法によれば、白癬菌に対する抗菌効果と３次元培養皮膚に対する毒性を同時に評価することができ、皮膚に影響がなく、選択的に菌を死滅させる抗菌製剤の評価に応用しうることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】は白癬菌感染の３次元培養皮膚切片の顕微鏡写真である。
【図２】は白癬菌未感染の３次元培養皮膚切片の顕微鏡写真である。
【図３】は白癬菌感染の３次元培養皮膚を用いた抗真菌製剤３種の抗菌力評価結果である。
【図４】は白癬菌未感染の３次元培養皮膚を用いた抗真菌製剤３種の細胞毒性評価結果である。