(57)【要約】【課題】標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行う。【解決手段】光源２からの励起光の波面を変調する空間光変調素子１３と、標本Ａ上において励起光を２次元的に走査するスキャナ１０と、該スキャナ１０による励起光の標本Ａ上の走査位置から発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する撮像部２０と、スキャナ１０によって標本Ａ上の少なくとも１箇所の位置に対するスポット状の励起光を照射させ、標本Ａにおいて発生した蛍光を撮像部２０により撮影させ、取得された蛍光スポット像に基づいて標本Ａの位置における収差をソフトウェアにより決定し、決定された収差に基づいて空間光変調素子１３を制御する制御部５とを備える顕微鏡１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの励起光の波面を変調する空間光変調素子と、
標本上において励起光を２次元的に走査するスキャナと、
該スキャナによる励起光の標本上の走査位置から発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する撮像部と、
前記スキャナによって前記標本上の少なくとも１箇所の位置に対するスポット状の前記励起光を照射させ、励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を前記撮像部により撮影させ、取得された蛍光スポット像に基づいて前記標本の位置における収差をソフトウェア的に決定し、決定された収差に基づいて前記空間光変調素子を制御する制御部とを備える顕微鏡。
【請求項２】
前記制御部が、前記標本の位置における種々の収差を含むスポット像をソフトウェア的に生成した複数の参照スポット像と前記撮像部において取得された蛍光スポット像とを比較して、類似性の高い参照スポット像に含まれる収差を、前記標本の位置における収差として決定する請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記参照スポット像が、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数を用いてソフトウェア的に生成されている請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記制御部が、前記参照スポット像と前記蛍光スポット像との類似性を相互相関によって判定する請求項２または請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記撮像部が、前記標本上の２以上の位置に対するスポット状の励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を撮影して複数の蛍光スポット像を取得する請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記標本上の２以上の位置に対するスポット状の励起光の照射パターンが、前記空間光変調素子により生成される請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
光源からの励起光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する顕微鏡の収差補正方法であって、
前記標本に対してスポット状の励起光を照射して取得した蛍光スポット像に基づいて、前記標本の位置における収差をソフトウェア的に決定するステップと、
決定された収差を低下させるように前記励起光の波面を変調するステップとを含む顕微鏡の収差補正方法。
【請求項８】
収差を決定するステップが、前記標本の位置における種々の収差を含むスポット像からなる複数の参照スポット像をソフトウェア的に生成するステップと、生成された参照スポット像と前記蛍光スポット像とを比較するステップとを含み、類似性の高い参照スポット像に含まれる収差を、前記標本の位置における収差として決定する請求項７に記載の顕微鏡の収差補正方法。
【請求項９】
前記参照スポット像が、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数を用いてソフトウェア的に生成される請求項８に記載の顕微鏡の収差補正方法。
【請求項１０】
収差を決定するステップが、前記参照スポット像と前記蛍光スポット像との類似性を相互相関によって判定する請求項８または請求項９に記載の顕微鏡の収差補正方法。
【請求項１１】
収差を決定するステップが、前記標本上の２以上の位置に対するスポット状の励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を撮影して取得した複数の蛍光スポット像に基づいて決定する請求項７から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡の収差補正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡とその収差補正方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、波面補正装置による補正量を変化させながら複数枚の画像を取得し、取得された画像を比較して最も良好に収差を補正できる補正量を決定する技術が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】“Adaptive harmonicgeneration microscopy of mammalian embryos”，OPTICS LETTERS，Vol.34，No.20，October 15，2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、この非特許文献１の技術では、波面補正装置による補正量が決定されるまでの間に、標本を何度も撮影する必要があり、照射する光が励起光である場合には、標本にフォトブリーチングのようなダメージが与えられてしまうという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができる顕微鏡とその収差補正方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源からの励起光の波面を変調する空間光変調素子と、標本上において励起光を２次元的に走査するスキャナと、該スキャナによる励起光の標本上の走査位置から発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する撮像部と、前記スキャナによって前記標本上の少なくとも１箇所の位置に対するスポット状の前記励起光を照射させ、励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を前記撮像部により撮影させ、取得された蛍光スポット像に基づいて前記標本の位置における収差をソフトウェアにより決定し、決定された収差に基づいて前記空間光変調素子を制御する制御部とを備える顕微鏡を提供する。
【０００６】
本態様によれば、光源から発せられた励起光がスキャナによって標本上で走査されると、標本内に含まれる蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。そして、発生した蛍光は撮像部により撮影されることにより、蛍光画像が取得される。
【０００７】
制御部が、スキャナを制御して標本上の少なくとも１箇所にスポット状の励起光を照射させ、そのときに発生した蛍光を撮像部により撮影させることで、蛍光スポット像が取得される。この蛍光スポット像は、標本までの光路に存在する光学部材の屈折率不均一性に基づく収差が含まれている場合には変形するので、制御部はその光学スポット像の形状に基づいて収差をソフトウェア的に決定することができる。
【０００８】
制御部は、決定された収差に基づいて空間光変調素子を制御することにより、収差をなくすように、励起光の波面を変調することができる。すなわち、上記により変調された波面を有する励起光をスキャナによって標本上で走査することにより、精密な蛍光画像を取得して、精度よく観察することができる。この場合において、収差を取り除くために空間光変調素子により発生する位相パターンを、蛍光スポット像を１回撮影するだけで決定することができ、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができる。
【０００９】
上記態様においては、前記制御部が、前記標本の位置における種々の収差を含むスポット像をソフトウェア的に生成した複数の参照スポット像と前記撮像部において取得された蛍光スポット像とを比較して、類似性の高い参照スポット像に含まれる収差を、前記標本の位置における収差として決定してもよい。
このようにすることで、種々の収差を含む複数の参照スポット像は、ソフトウェア的に簡易に生成することができ、各参照スポット像の形状と、撮影した蛍光スポット像の形状とを比較して、最も類似する参照スポット像に含まれる収差を、標本の位置における収差として決定することができる。
【００１０】
また、上記態様においては、前記参照スポット像が、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数を用いてソフトウェア的に生成されていてもよい。
このようにすることで、種々の収差を含む参照スポット像を、ソフトウェア的に簡易に生成することができる。
【００１１】
また、上記態様においては、前記制御部が、前記参照スポット像と前記蛍光スポット像との類似性を相互相関によって判定してもよい。
このようにすることで、２つのスポット像の類似性を簡易に判定し、取得された蛍光スポット像に最も類似している参照スポット像を簡易に決定することができる。
【００１２】
また、上記態様においては、前記撮像部が、前記標本上の２以上の位置に対するスポット状の励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を撮影して複数の蛍光スポット像を取得してもよい。
このようにすることで、複数の蛍光スポット像の各々について参照スポット像との類似性を判定することができ、決定される収差の精度を向上することができる。
【００１３】
また、上記態様においては、前記標本上の２以上の位置に対するスポット状の励起光の照射パターンが、前記空間光変調素子により生成されてもよい。
このようにすることで、空間光変調素子の制御により励起光の波面を変調して、複数の位置にスポット状の励起光を同時に照射することができる。
【００１４】
また、本発明の他の態様は、光源からの励起光を標本に照射し、標本において発生した蛍光を撮影して蛍光画像を取得する顕微鏡の収差補正方法であって、前記標本に対してスポット状の励起光を照射して取得した蛍光スポット像に基づいて、前記標本の位置における収差をソフトウェア的に決定するステップと、決定された収差を低下させるように前記励起光の波面を変調するステップとを含む顕微鏡の収差補正方法を提供する。
【００１５】
本態様によれば、収差を取り除くために励起光の波面に与える変調を、蛍光スポット像を１回撮影するだけで決定することができ、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができる。
【００１６】
上記態様においては、収差を決定するステップが、前記標本の位置における種々の収差を含むスポット像からなる複数の参照スポット像をソフトウェア的に生成するステップと、生成された参照スポット像と前記蛍光スポット像とを比較するステップとを含み、類似性の高い参照スポット像に含まれる収差を、前記標本の位置における収差として決定してもよい。
【００１７】
また、上記態様においては、前記参照スポット像が、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数を用いてソフトウェア的に生成されてもよい。
また、上記態様においては、収差を決定するステップが、前記参照スポット像と前記蛍光スポット像との類似性を相互相関によって判定してもよい。
また、上記態様においては、収差を決定するステップが、前記標本上の２以上の位置に対するスポット状の励起光の照射により前記標本において発生した蛍光を撮影して取得した複数の蛍光スポット像に基づいて決定してもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、標本に与えるダメージを抑えつつ、標本の位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。
【図２】図１の顕微鏡による本実施形態に係る位相補正方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図１の顕微鏡により取得される（ａ）蛍光画像、（ｂ）選択されたスポット位置、（ｃ）蛍光スポット像の一例をそれぞれ示す図である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、顕微鏡の記憶部に、異なる収差ベクトルとともに記憶された参照スポット像の３つの例を示す図である。
【図５】図１の顕微鏡の変形例を示す全体構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一実施形態に係る顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、光源２からの励起光を標本Ａに照射する照明光学系３と、標本Ａにおいて発生した蛍光を撮影する撮影光学系４と、これらを制御する制御部５とを備えている。
【００２１】
照明光学系３は、光源２からの励起光をコリメートするコリメートレンズ６と、励起光の波面を変調する波面変調部７と、波面変調部７において変調された波面をリレーするリレー光学系８，９と、励起光を２次元的に走査する第１スキャナ１０と、励起光を反射し蛍光を透過するダイクロイックミラー１１と、励起光を標本Ａに照射する対物レンズ１２とを備えている。
【００２２】
波面変調部７は、反射型の波面変調素子（空間光変調素子）１３と、該波面変調素子１３への励起光の入射角度を波面変調素子１３の法線方向に近づけるための折り返しミラー１４とを備えている。波面変調素子１３は、制御部５からの指令に従う照射パターンを達成可能なホログラムの位相パターンを反射面に発生し、反射面において反射される励起光の波面を位相パターンに従う形態に変調するようになっている。また、波面変調素子１３は、その反射面を鏡面状にすることで、入射された励起光を変調することなく反射することができるようになっている。
第１スキャナ１０は、非平行な軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー１０ａ，１０ｂを近接して配置した、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。
【００２３】
撮影光学系４は、対物レンズ１２によって集光され、ダイクロイックミラー１１を透過した標本Ａからの蛍光をリレーするリレー光学系１５と、標本Ａ上における蛍光の検出位置を２次元的に走査させる第２スキャナ１６と、集光レンズ１７，１８と、共焦点ピンホール１９と、光電子増倍管２０とを備えている。
第２スキャナ１６も、非平行な軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー１６ａ，１６ｂを近接して配置した、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。
【００２４】
制御部５は、光電子増倍管２０により取得された蛍光の強度情報と第１スキャナ１０および第２スキャナ１６の走査位置情報とに基づいて蛍光画像を生成するようになっている。
また、制御部５は、第２スキャナ１６を停止して、第１スキャナ１０を作動させることにより、取得された蛍光画像に基づいて、スポット状の励起光を照射する位置を設定するとともに、設定された位置にスポット状の励起光が照射されるように第１スキャナ１０を停止した状態で、第２スキャナ１６を作動させて蛍光スポット像を取得させるようになっている。
【００２５】
また、制御部５は、種々の収差を含むスポット像をソフトウェア的に生成した複数の参照スポット像を収差と対応づけて記憶する記憶部５ａを備えている。
参照スポット像は、例えば、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数を用いて生成する。
【００２６】
すなわち、収差は、対物レンズ１２の瞳位置かつＺｅｒｎｉｋｅＺ（ρ，θ）ベースで与えることとし、収差ベクトルをΔＷ＝（Ｚ１，Ｚ２，…，Ｚｎ）とする。無収差の場合にはΔＷ＝（０，０，…，０）である。
【００２７】
例えば、Ｚ５に０．１λの収差を含む場合には、図４（ａ）に示されるように、収差ベクトルΔＷ＝（０，０，０，０，０．１，０，…，０）の参照スポット像を生成する。
次に、図４（ｂ）に示されるように、Ｚ８に０．１λの収差を含む収差ベクトルΔＷ＝（０，０，０，０，０，０，０，０．１，０，…，０）の参照スポット像を生成する。
次に、図４（ｃ）に示されるように、Ｚ５に０．１λ、Ｚ８に０．１λの収差を含む収差ベクトルΔＷ＝（０，０，０，０，０．１，０，０，０．１，０，…，０）の参照スポット像を生成する。
【００２８】
このようにして、この工程を所定数のＺｅｒｎｉｋｅ係数について、所定の収差範囲にわたって、所定の収差間隔で、（収差範囲／収差間隔）＾（Ｚｅｒｎｉｋｅ係数の数）回繰り返す。
例えば、５個のＺｅｒｎｉｋｅ係数Ｚ５，Ｚ６，Ｚ７，Ｚ８，Ｚ９に対して、±５λの収差範囲を０．１λ間隔で行う場合、１００５回繰り返すことになる。
【００２９】
そして、制御部５は、このようにして生成された複数の参照スポット像と、撮影により取得した蛍光スポット像との相互相関をとり、その評価関数値が最も大きくなった場合の収差ベクトルΔＷ＝（０，０，０，０，Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，Ｘ４，Ｘ５，…，Ｘｎ）を標本Ａの位置における収差として決定する。
さらに、制御部５は、得られた収差ベクトルΔＷを補正し得る位相パターンを波面変調素子１３の反射面に発生させるように、波面変調素子１３に指令するようになっている。これにより、標本Ａに無収差のスポットを形成することができ、強度の高い蛍光像を得ることができることになる。
【００３０】
このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１の収差補正方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１の収差補正方法は、図２に示されるように、まず、波面変調素子１３による波面の補正を行わない状態、すなわち、波面変調素子１３の反射面を鏡面に設定する（ステップＳ１）。
【００３１】
次いで、第２スキャナ１６を停止して（ステップＳ２）、第１スキャナ１０を作動させる（ステップＳ３）。これにより、光源２からの励起光を波面変調素子１３において無変調のまま反射させ、リレー光学系８によってリレーし、第１スキャナ１０によって２次元的に走査する。第１スキャナ１０によって２次元的に走査された励起光は、リレー光学系９によってリレーされ、ダイクロイックミラー１１によって反射され、対物レンズ１２によって標本Ａ上に集光され、標本Ａ内に存在している蛍光物質を励起する。
【００３２】
標本Ａ内で蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光は、対物レンズ１２によって集光され、ダイクロイックミラー１１を透過し、リレー光学系１５によってリレーされた後、停止している第２スキャナ１６を通過して、集光レンズ１７により集光され、対物レンズ１２の焦点面において発生した蛍光のみが、共焦点ピンホール１９を通過し、集光レンズ１８によって集光されて、光電子増倍管２０により検出される。光電子増倍管２０により検出された蛍光強度と、各蛍光強度を検出した時点での第１スキャナ１０の走査位置とを対応づけて記憶することにより、図３（ａ）に示される蛍光画像が取得される（ステップＳ４）。
【００３３】
次に、制御部５は、取得された蛍光画像内において、所定の面積で蛍光強度の高い領域を検出し、図３（ｂ）に示されるように、その位置をスポット位置として設定し（ステップＳ５）、第１スキャナ１０に送る。図３（ｂ）は、図３（ａ）の枠で囲んだ領域の拡大図であり、破線は、図３（ａ）の蛍光画像において蛍光を発生する蛍光物質の存在する部分の境界を示しており、スポット像がある領域の方が蛍光物質が存在する領域である。
そして、設定されたスポット位置に励起光が照射されるように第１スキャナ１０を停止させ（ステップＳ６）、第２スキャナ１６を作動させる（ステップＳ７）。
【００３４】
これにより、設定された標本Ａ上のスポット位置に、スポット状の励起光が照射されるので、第２スキャナ１６の作動によって、図３（ｃ）に示されるように、スポット位置周辺の蛍光画像である蛍光スポット像を取得する（ステップＳ８）。
【００３５】
次に、制御部５は、記憶部５ａに記憶されている参照スポット像を読み出し（ステップＳ９）、取得された蛍光スポット像と読み出された参照スポット像との類似性を読み出した全ての参照スポット像に対して算出する（ステップＳ１０）。類似性の算出は、上述したように、異なる収差ベクトルΔＷを有するように生成された各参照スポット像と、撮影により取得された蛍光スポット像との相互相関の評価関数値を算出することにより行われる。
【００３６】
そして、評価関数値の最も大きくなる参照スポット像を決定することにより、蛍光スポット像に最も類似する参照スポット像の収差ベクトルΔＷを決定する（ステップＳ１１）。
制御部５は、上述のようにして決定された収差ベクトルΔＷを補正し得る位相パターンを波面変調素子１３の反射面に発生させるように、波面変調素子１３に指令する（ステップＳ１２）。
【００３７】
このようにして波面変調素子が設定された状態で、第２スキャナ１６を停止し（ステップＳ１３）、第１スキャナ１０を作動させることにより（ステップＳ１４）、標本Ａに無収差のスポットを形成し、該スポットを第１スキャナ１０によって２次元的に走査させる。これにより、各走査位置において強度の高い蛍光を発生させることができる。
そして、各走査位置において発生した強度の高い蛍光を光電子増倍管２０において検出することにより、標本の鮮明な蛍光画像を取得することができる（ステップＳ１５）。
【００３８】
すなわち、本実施形態に係る顕微鏡１およびその位相補正方法によれば、波面変調素子１３において発生する位相パターンを決定するための情報の取得を、標本Ａに励起光を複数回照射することにより試行錯誤的に行うのではなく、１回の撮影により取得した蛍光スポット像と、ソフトウェア的に発生させた複数の参照スポット像との比較により行う。このため、標本Ａに過度の励起光を照射せずに済み、標本Ａに与えるダメージを抑えつつ、標本Ａの位置における収差を補正して精度よく観察を行うことができるという利点がある。
【００３９】
なお、本実施形態においては、参照スポット像の生成を全ての組み合わせについて計算することとしたが、全ての組み合わせについて計算すると計算量が多いので、これに代えて、以下の通りに計算してもよい。
すなわち、まず、Ｚ５に０．１λの収差を含む収差ベクトルΔＷ＝（０，０，０，０，０．１，０，…，０）の場合の参照スポット像を生成する。
そして、撮影した蛍光スポット像と生成された参照スポット像の相互相関をとり、その値をＭ１とする。
【００４０】
次に、Ｚｅｒｎｉｋｅ係数Ｚ５に０．２λの収差を含む収差ベクトルΔＷ＝（０，０，０，０，０．２，０，…，０）の場合の参照スポット像を生成し、蛍光スポット像との相互相関をとり、その値をＭ２とする。この工程を所定の収差範囲にわたって、所定の収差間隔で繰り返し、相互相関が最も大きな値となった収差ベクトルΔＷ＝（０，０，０，０，Ｘ１，０，…，０）をＺｅｒｎｉｋｅ係数Ｚ５の値として決定する。この工程をＺ６，Ｚ７，…と繰り返し、順次Ｚｅｒｎｉｋｅ係数の値を決定していく。
【００４１】
この方法によれば、繰り返し回数は１００×５回となり、大幅に計算量を減らすことができる。
あるいは、相互相関の値が所定の値を超えた時点で計算を終了することにしてもよい。これによっても、大幅に計算量を減らすことができる。
【００４２】
また、本実施形態においては、蛍光を検出する撮影光学系４に、光電子増倍管２０を用いたため、蛍光スポット像を取得するために、第２スキャナ１６を作動させることとしたが、これに代えて、図５に示されるように、ＣＣＤあるいはＣＭＯＳイメージセンサのような撮像素子を採用し、第２スキャナ１６をなくしてもよい。
【００４３】
また、本実施形態においては、標本Ａにおける１つの蛍光スポット像を取得して、参照スポット像との類似性を判定することとしたが、これに代えて、複数の蛍光スポット像を取得して、参照スポット像との類似性を計算し、それらの平均によって、類似性を判定することにしてもよい。このようにすることで、精度よく収差ベクトルΔＷを決定することができる。
【００４４】
また、この場合に、標本Ａ上に形成する複数のスポットは、第１スキャナ１０の動作により、その位置を逐次変化させることにしてもよいし、波面変調素子１３によって、複数のスポットを同時に標本Ａに生成するような位相パターンを励起光に与えてもよい。位相パターンを励起光に与えることにより複数のスポットを同時に標本Ａに生成する場合、撮影光学系４にＣＣＤやＣＭＯＳイメージセンサのような撮像素子を配置することにより、同時に複数地点の蛍光スポット像を取得することができる。
【００４５】
また、本実施形態においては、反射型の波面変調素子を例示したが、これに代えて、透過型の波面変調素子を採用することにしてもよい。
また、本実施形態においては、図１において共焦点ピンホール１９を用いた顕微鏡を例示したが、これに代えて、光源２に超短パルスレーザを用いて多光子励起による蛍光観察を行うこととして、共焦点ピンホールを省略してもよい。
【符号の説明】
【００４６】
１  顕微鏡
２  光源
５  制御部
１０  第１スキャナ（スキャナ）
１３  波面変調素子（空間光変調素子）
２０  光電子増倍管（撮像部）
【図１】
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【図２】
2013160893.tif 000004
【図３】
2013160893.tif 000005
【図４】
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【図５】
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