(57)【要約】【課題】  医療の進歩や環境計測への社会的ニーズにより、稀釈を必要としないより広い検出範囲や、高い検出感度、オンサイトでの迅速分析などの特性が必要とされる被検物質の測定が要求されてきている。【解決手段】  前述の目的を達成するために、本発明者らが検討を重ねた結果、金属微粒子を標識物質として用いた免疫測定法等において、被検物質の量に対応した金属微粒子の量を、従来試料溶液中の金属元素の測定のみを行っていた液体電極プラズマ発光分析法を用いて測定することによって、被検物質の高感度で広い検出範囲を有するオンサイトでの測定が実現されるとの知見を得、本発明を完成させるに至った。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属微粒子を標識物質として用いる被検物質の測定法であって、試料溶液中の被検物質の濃度に対応した金属微粒子の量を、液体電極プラズマ発光分析法により測定し、前記金属元素の発光強度に基づいて被検物質の濃度をしらべることを特徴とする被検物質の測定方法。
【請求項２】
金属微粒子の量を測定する際に、あらかじめ金属微粒子をイオン化することを特徴とする請求項１に記載の被検物質の測定方法。
【請求項３】
前記金属微粒子のイオン化を、硝酸で行うことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の被検物質の測定方法。
【請求項４】
標識物質である金属微粒子が銀微粒子であることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の被検物質の測定方法。
【請求項５】
銀微粒子の直径が２０から６０ｎｍであることを特徴とする請求項４に記載の被検物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、液体電極プラズマによる、金属微粒子を標識物質として用いた被検物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  タンパク質、核酸などの生物化学的物質を簡便かつ高感度に測定する方法として、抗体や相補的な核酸など被検物質に特異的に結合する物質に酵素や金属ナノ粒子などを標識し、その標識体を測定する方法が知られている。そのひとつは抗原抗体反応を利用する免疫測定法で、免疫学、臨床、組織学、生化学等の分野で多用されている。用いられているのは主に酵素を標識物質とするＥＬＩＳＡ法で、酵素反応に由来する発色は発光などの信号を得ることにより被検物質の検知や濃度測定を行うものである。しかしながらＥＬＩＳＡ法では、検出の濃度範囲が一桁から二桁で、測定の際に試料の希釈を繰り返す必要があるものがあった。また、発色や発光の信号検出時に光学系の装置を必要とするため、大型の装置が必要であった。【０００３】  また、免疫測定法のひとつとして、イムノクロマト片を用いたイムノクロマト法がある。イムノクロマト法は、操作の簡便さや検出時間の短さから、特にオンサイトでの検出が望まれる病院での検査などに広く利用されるようになってきた。しかしながら、検出ラインの目視判定が主に行われていて、定量的な測定は不十分であった。【０００４】  これに対し、下記非特許文献１のように、金属ナノ粒子で標識した抗体を用いた電気化学的検出が検出装置の小型化や操作の簡便化などの観点から注目されている。【０００５】  また、下記非特許文献２のように、金ナノ粒子やランタノイド系元素をラベル物質に用いた、誘導結合プラズマ質量分析装置による検出が試みられている。しかしながら、プラズマ発生のためにアルゴンガスや大容量の電源が必要で、小型化が困難であった。そのため、オンサイトでの免疫測定には不向きである。【０００６】  一方、液体電極プラズマと名付けたプラズマ発生手法を利用して、液体試料中の金属元素を分析する小型の元素分析装置が下記特許文献１のように提案され、実用化されている。
【先行技術文献】
【０００７】
【特許文献】
【特許文献】  １）特許  第３９３２３６８号
【０００８】
【非特許文献】
【非特許文献】  １）Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  ２０，（２００８）１４−２１．  ２）Ｔｒａｎｄ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９，（２０１０）３９９−４０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  医療の進歩や環境計測への社会的ニーズにより、稀釈操作を必要としないより広い検出範囲や、高い検出感度、オンサイトでの迅速分析などの特性が必要とされる被検物質の測定が要求されてきている。
本発明は上記事情を鑑みて提案されたものであり、被検物質の定量的分析を行ううえで、より広い検出範囲、より高い検出感度を有する、移動や携帯が可能な測定方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  前述の目的を達成するために、本発明者らが検討を重ねた結果、金属微粒子を標識物質として用いた免疫測定法等において、被検物質の量に対応した金属微粒子の量を、従来試料溶液中の金属元素の測定のみを行っていた液体電極プラズマ発光分析法を用いて測定することによって、被検物質の高感度で広い検出範囲を有するオンサイトでの測定が実現されるとの知見を得、本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【００１１】  液体電極プラズマ（ＬＥＰ）と名付けたプラズマ発生手法を利用して、イムノアッセイを行った。本法は、試料溶液に電圧をかけてプラズマを発生させるため、アルゴンガスや大容量の電源が不要で、小型化が可能である。しかし、通常用いられる抗体へのラベル分子である金ナノ粒子では、高い感度を得るのに十分なスペクトル強度が得られず、ランタノイド系元素は高価なため、実用的ではない。高いスペクトル強度が得られ、免疫反応に安定的に利用できる新たな金属標識物質をスクリーニングした結果、銀ナノ粒子をラベル物質とし、硝酸で酸化した銀イオンを測定することで、広い検出範囲を有する高感度な検出が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を適用して銀微粒子を標識物質として被検物質の濃度を測定する場合の、サンドイッチ型免疫反応をモデルとした概略図
【図２】本発明に利用する、カラムチップの構造図
【図３】銀微粒子を直接測定した場合とイオン化してから測定した場合のスペクトルのシグナル強度比較図
【図４】本発明を適用した場合の、銀微粒子の直径とシグナル強度との関係図
【図５】本発明を適用した測定方法による、マイクロウエルを使用した場合の被検物質濃度とシグナル強度との相関図
【図６】本発明を適用した測定方法による、イムノクロマトストリップを使用した場合の被検物質濃度とシグナル強度との相関図
【図７】本発明を適用した測定方法による、カラムチップを使用した場合の被検物質濃度とシグナル強度との相関図
【発明を実施するための形態】
【００１２】  本発明の液体電極プラズマによる金属微粒子を標識物質として用いた被検物質の測定法において、被検物質とは、生体物質、合成物質などのあらゆる物質であり、金属微粒子を標識するために用いるものは、被検物質と特異的に結合する物質で、特に抗体、抗原、ホルモン、受容体、レクチン、糖、たんぱく質、核酸などである。
【００１３】  本発明の液体電極プラズマによる金属微粒子を標識物質として用いた被検物質の測定法においては、被検物質を含む試料を特異的結合反応用デバイスに添加する試料添加工程と、被検物質が特異的に結合する第１の物質が固定された担体に被検物質が捕捉される工程と、担体に捕捉された被検査物質に第２の特異的結合反応により金属微粒子が標識される金属微粒子標識工程と、被検物質に標識された金属微粒子をイオン化し液体電極プラズマ元素分析用チップに導入する行程と、液体電極プラズマによりスペクトルを発生させそのシグナル強度を読み取る行程と、読み取られたシグナル強度から被検物質の濃度を換算する濃度換算工程とを有している。
【００１４】  前記の被検物質が特異的に結合する第１の物質を固定する担体は、マイクロウエルのように試料を添加する際の容器であってもよいし、磁気微粒子、メンブレン、カラムへの充填用材であってもよい。
【００１５】  標識物質である金属微粒子としては、銀コロイド粒子のほか、標識物質として利用される金属微粒子を任意に用いることができる。たとえば金、白金、銅などの微粒子やそれらのコロイド粒子などである。なかでも粒径２０ｎｍ〜６０ｎｍの銀コロイド粒子、特に粒径４０ｎｍ程度の銀コロイド粒子を用いることが好ましい。
【００１６】  ＜第１の実施形態＞
第１の実施形態では、特異的結合反応デバイスがマイクロウエルであり、特異的結合反応がサンドイッチ型免疫反応である場合の濃度測定法について、図１を参照しながら解説する。
【００１７】  先ず、担体であるマイクロウエルデバイス１内に１次抗体２を固定する。マイクロウエル内部は非特異吸着を防ぐためにブロッキングをする。また、被検物質３の異なる部位を認識する２次抗体４を用意し、これに金属微粒子５として例えば銀ナノ粒子を標識することにより標識抗体を用意しておく。
【００１８】  次に、未知量の被検物質３を含む溶液をマイクロウエルに供給し、１次抗体２と接触させて免疫反応により被検物質を捕捉する。さらに、金属微粒子の標識２次抗体を含む溶液を供給し被検物質を介して結合することにより、被検物質の濃度に応じた量の金属微粒子がマイクロウエル内に捕捉される。次に、マイクロウエル内に酸化性の溶液を供給して金属微粒子をイオン化し、その金属イオンを含む溶液６を液体電極プラズマ元素分析用のチップ７に導入し、金属イオン濃度を液体電極プラズマ元素分析にて測定する。既知濃度の被検物質の濃度と金属イオン濃度の関係をあらかじめ求めておき、測定された金属イオン濃度の値と比較することにより被検物質の濃度を求めることができる。
【００１９】  前記酸化性の溶液としては、金属をイオン化できるものであれば何でもよいが、例えば硝酸溶液を用いることができる。金属微粒子の酸化のしやすさを考慮すれば、０．１Ｍ〜２Ｍの硝酸水溶液を用いることが好ましい。
【００２０】  ＜第２の実施形態＞
第２の実施形態では、特異的反応デバイスがイムノストリップであり、特異的結合反応がサンドイッチ型免疫反応である場合の濃度測定法を解説する。
【００２１】  先ず、前記１次抗体を固定したイムノストリップを用意する。イムノストリップは非特異吸着を防ぐためにブロッキングをする。また、被検物質の異なる部位を認識する前記２次抗体を用意し、これに金属微粒子として例えば銀ナノ粒子を標識することにより標識抗体を用意しておく。
【００２２】  次に、未知量の被検物質を含む溶液と前記金属微粒子の標識２次抗体を含む溶液の混合液をイムノストリップに展開し、免疫反応により金属微粒子の標識２次抗体と特異的に結合した被検物質を捕捉する。その結果、被検物質の濃度に応じた量の金属微粒子がイムノストリップ上に捕捉される。補足部位の金属微粒子を前記第２の実施形態で用いたと同様の酸化性の溶液でイオン化し、その金属イオンを含む溶液の金属濃度を液体電極プラズマ元素分析にて測定する。既知濃度の被検物質の濃度と金属イオン濃度の関係をあらかじめ求めておき、測定された金属イオン濃度の値と比較することにより被検物質の濃度を求めろことができる。
【００２３】  ＜第３の実施形態＞
第３の実施形態では、特異的反応デバイスがカラムチップであり、特異的結合反応がサンドイッチ型免疫反応である場合の濃度測定法について図２をもとに解説する。使用するカラムチップは、試料溶液の移動ができるものであればどのようなものでも良いが、特にマイクロピペットなどに装填して簡便に液の吸い上げや吐き出しのできるものが好ましい。
【００２４】  先ず、先端部８にあらかじめ前記金属微粒子の標識２次抗体を滴下・乾燥などにより配置しておく。被検物質の１次抗体を固定した担体９をチップ内に充填し、その前後はグラスウール１０などを用いて液の流れを妨げず充填担体の核酸を防ぐための栓をする。担体は非特異吸着を防ぐためにブロッキングをする。
【００２５】  次に、未知量の被検物質を含む溶液をカラムチップ先端Ａから吸い上げ、免疫反応により金属微粒子の標識２次抗体と特異的に結合した被検物質をカラムチップ内の担体に捕捉する。その結果、被検物質の濃度に応じた量の金属微粒子がカラムチップ内に捕捉される。次いで、前記第２の実施形態と同様の酸化性の溶液を吸い上げ、補足部位の金属微粒子をイオン化し、その金属イオンを含む溶液の金属濃度を液体電極プラズマ元素分析にて測定する。既知濃度の被検物質の濃度と金属イオン濃度の関係をあらかじめ求めておき、測定された金属イオン濃度の値と比較することにより被検物質の濃度を求めることができる。
【００２６】  本カラムチップにおいては、前記００１３で述べた行程のうち、被検物質を含む試料を特異的結合反応用デバイスに添加する試料添加工程と、被検物質が特異的に結合する第１の物質が固定された担体に被検物質が捕捉される工程と、担体に捕捉された被検査物質に第２の特異的結合反応により金属微粒子が標識される金属微粒子標識工程と、被検物質に標識された金属微粒子をイオン化し液体電極プラズマ元素分析用チップに導入する行程までを、カラムチップからの溶液の吸い上げと吐き出しの一連の操作のみで行うことができる。
【実施例】
【００２７】  以下に、本発明を実施例に基づいて解説する。【００２８】  実施例１
図３には、銀コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）をそのまま液体電極プラズマ発光分析法にて測定したスペクトルを図３に示す。Ａは銀微粒子をイオン化してから測定したもの、Ｂは銀微粒子をイオンにすることなくそのまま測定したものである。このように、銀微粒子はそのまま測定することが可能であったが、そのシグナル強度は銀イオン溶液に比べて小さかった。【００２９】  実施例２
標識物質を使った被検物質の検出法の例として、マイクロウエルを使ったサンドイッチ型免疫反応を選び、被検物質の例として、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）をあげ、解説する。【００３０】  一次抗体の固定
マイクロウエルへｈＣＧの一次抗体（抗αーサブユニット抗体）を固定する。５０ｍＭのリン酸バッファー＋生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した１００μｇ／ｍＬの一次抗体５０μＬをマイクロウエルに入れ、４℃で１２時間静置する。その後、ウエルを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、非特異吸着を防ぐために１％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）Ｌ２００μＬをウエルに入れ、４℃で１２時間以上静置する。【００３１】  二次抗体への銀微粒子の標識
ｈＣＧの二次抗体の５ｍＭリン酸バッファー溶液（５０μｇ／ｍＬ）１００μＬを９００μＬの銀コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）に添加し、室温で１０分間静置する。その後、非特異吸着を防ぐために、１％のポリエチレングリコールの５０ｍＭリン酸バッファー溶液を１００μＬ、さらに１０％のＢＳＡを１００μＬ添加する。生成した銀微粒子標識二次抗体は、遠心分離（８０００ｇ、１５分、４℃）により集める。３００μＬの保存溶液（１％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ３、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸バッファー）中に懸濁して、４℃で保存する。【００３２】  サンドイッチ型免疫反応
一次抗体を固定したマイクロウエル内をＰＢＳＴで３回洗浄し、５０μＬの試料を供給し室温でゆっくりと震盪した。３０分後、ウエル内をＰＢＳＴで３回洗浄し、５倍に稀釈した銀微粒子保存液を５０μＬ添加し、室温でゆっくりと震盪した。３０分後、ウエルをＰＢＳＴで３回洗浄し、ウエル内に一次抗体−被検物質−二次抗体−銀微粒子の複合体を得た。【００３３】  銀微粒子量の測定
６０μＬの０．１Ｍ硝酸をマイクロウエル内に供給し、銀微粒子を溶解した後、測定用の石英チップ（ＬｅｐｉＣｕｖｅ−Ｃ  ｃｕｖｅｔｔｅ）内に導入した。銀イオン量の測定は、ＭＨ−５０００の超小型元素分析装置で行った。測定条件は、印加電圧が８５０Ｖ、パルス時間が３０ｍｓ、パルス間隔が２７０ｍｓ、パルス２０回で１クール、５クールの累積強度を１測定の強度とした。【００３４】  まず、銀微粒子の粒子径が及ぼす影響について検討した。直径が２０ｎｍ、４０ｎｍ、６０ｎｍの銀微粒子を標識した抗体を用いて、サンドイッチ型免疫反応を実施した。ｈＣＧの濃度が１ｎｇ／ｍＬの場合で比較した結果、図４に示すように、直径４０ｎｍの銀微粒子を標識物質として用いた場合に最も高い強度がえられた。【００３５】  直径４０ｎｍの銀微粒子を標識物質に用いて、各種濃度のｈＣＧ溶液を試料に免疫反応を実施し、得られたシグナル強度と濃度との相関を示したのが図５である。被検物質の濃度１ｐｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬにかけての対数と、シグナル強度の対数との間に良好な直線性がえられた。また、被検物質の検出限界は１．３ｐｇ／ｍＬと算出された。これより、本発明を適用した測定法により、３桁にわたる広い濃度範囲で測定ができ、かつ高感度の測定ができることが示された。【００３６】  実施例３
標識物質を用いた被検物質の測定法の例としてイムノストリップを用いたサンドイッチ型免疫反応を選び、被検物質の例として、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）をあげ、解説する。【００３７】  一次抗体の固定
イムノストリップへｈＣＧの一次抗体（抗αーサブユニット抗体）を固定する。１ｍｇ／ｍＬの一次抗体溶液６５０μＬに、２０％のスクロース液（５０ｍＭのリン酸バッファー）３００μＬと１００μＬの２ープロパノールを加えて混合する。この混合液をディスペンサー（ＸＹＺ  ３２００，ＢｉｏＤｏｔ  Ｉｎｃ．）に充填し、ニトロセルロースメンブレン上に、ライン状になるように噴霧する。室温で１時間静置して乾燥させた後、非特異吸着を防ぐために０．５％のカゼインを含む５０ｍＭのホウ酸溶液にメンブレンを浸し、室温で３０分間静置する。その後、０．０５％のドデシル硫酸ナトリウムを含むＰＢＳにメンブレンを室温で浸し、洗浄する。３０分後メンブレンを引き上げて乾燥させ、メンブレンの片側に吸収パッドを貼付けて、５ｍｍ幅の短冊状にカットする。【００３８】  サンドイッチ型免疫反応
３０μＬの試料を容器にとり、実施例２と同様に作成した銀微粒子標識抗体保存液６μＬを添加し、良く混合した。混合液にメンブレンの吸収パッドと反対側を浸すと、毛細管現象により混合液がメンブレン上を移動し、吸収パッドに到達した。これに伴って、試料中の被検物質と銀微粒子標識抗体との複合体は、メンブレン上にライン状に固定された一次抗体に補足される。【００３９】  銀微粒子量の測定
メンブレンの一次抗体が固定されたライン部分を切り出し、当該部分の銀微粒子を６０μＬの０．１Ｍ硝酸で溶解した。溶解後の溶液は実施例２と同様に測定した。【００４０】  直径４０ｎｍの銀微粒子を標識物質に用いて、各種濃度のｈＣＧ溶液を試料に免疫反応を実施し、得られたシグナル強度と濃度との相関を示したのが図６である。被検物質の濃度の対数と、シグナル強度の対数との間に良好な直線性がえられた。【００４１】  実施例４
標識物質を用いた被検物質の測定法の例としてカラムチップを用いたサンドイッチ型免疫反応を選び、被検物質の例として、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）をあげ、解説する。【００４２】  カラムチップの作成
マイクロピペットの管状チップを利用して、図２の構造を有するチップを作成した。先端部分には実施例２と同様に作成した銀微粒子標識抗体溶液を、６μＬ吸収後乾燥させて固定した。その後グラスウールではさむように実施例３と同様に作成した一次抗体が固定されたニトロセルロースメンブレンを粉砕し充填した。【００４３】  サンプル中ｈＣＧの測定
前記チップをマイクロピペットに装填し、容器にとった３０μＬの試料をゆっくり吸い上げた後押し出す。これを２回繰り返した。次いでリン酸バッファー１０μＬを吸い上げて押し出した。最後に、１０μＬの１Ｍ硝酸で吸い上げ、押し出しを２回繰り返し、さらに最終濃度が０．１Ｍ硝酸となるように蒸留水９０μＬを吸い上げてから、その溶液をそのまま測定用の石英チップへ導入し、実施例２と同様に測定した。【００４４】  直径４０ｎｍの銀微粒子を標識物質に用いて、各種濃度のｈＣＧ溶液を試料に免疫反応を実施し、得られたシグナル強度と濃度との相関を示したのが図７である。被検物質の濃度の対数と、シグナル強度との間に良好な直線性がえられた。
【産業上の利用の可能性】
【００４５】  本発明によれば、試料中に含まれている未知量の被検物質濃度を、被検物質と特異的に結合する物質の金属微粒子による標識体を用いて、液体電極プラズマ元素分析法により測定することができる。本法によれば、広い検出範囲を有するため試料の稀釈操作を減らすことができ、高い検出感度を有し、オンサイトでの迅速分析が可能である。従って今後、診断や環境計測、食品産業など幅広い分野での各種計測に使用することができる。
【符号の説明】１  マイクロウエル、  ２  １次抗体、  ３  被検物質、  ４  ２次抗体、５  金属微粒子、  ６  被検物質の濃度に応じた金属イオンを含む溶液、  ７  液体電極プラズマ元素分析用チップ、  ８  標識２次抗体を配置する部位、  １０  １次抗体固定担体、  １１  栓
【図１】
2013101092.tif 000002
【図２】
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【図３】
2013101092.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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