(57)【要約】【課題】  二酸化炭素を唯一の炭素源としてＤ−乳酸を製造可能な細菌および当該細菌を用いた二酸化炭素からのＤ−乳酸製法を提供すること。【解決手段】  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを水素酸化細菌において導入または発現増強して得られるＤ−乳酸を製造可能な細菌、および前記細菌を二酸化炭素を唯一の炭素源として培養することでＤ−乳酸を製造する方法により前記課題を解決する。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、水素酸化細菌において導入または発現増強して得られる、Ｄ−乳酸を製造可能な細菌。
【請求項２】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの水素酸化細菌への導入が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによる水素酸化細菌の形質転換による導入である、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドをさらに付加したベクターである、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
無機炭素固定に関わるタンパク質がリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）である、請求項１から３のいずれかに記載の細菌。
【請求項５】
無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質が、ｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターである、請求項１から４のいずれかに記載の細菌。
【請求項６】
水素酸化細菌がＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａである、請求項１から５のいずれかに記載の細菌。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の細菌を培地中で培養してＤ−乳酸を生成させ、培地からＤ−乳酸を回収することを含む、Ｄ−乳酸の製造方法。
【請求項８】
前記培地は二酸化炭素を炭素源として含む、請求項７に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項９】
前記培地は二酸化炭素を唯一の炭素源として含む、請求項７に記載のＤ−乳酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれか一項に記載の方法によりＤ−乳酸を製造し、得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行なうことを特徴とする、Ｄ−乳酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法を用いた、水素酸化細菌によるＤ−乳酸製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオマス由来の生分解性プラスチックとしてポリ乳酸が注目されている。ポリ乳酸はポリプロピレンやポリスチレンなどの代替としての利用が可能であり、食品包装材、パソコン用記録媒体の包装材、衣料品、食器や洗剤の容器など幅広い応用が期待される。現状、ポリ乳酸はＬ−乳酸のホモポリマーである、ポリＬ−乳酸の開発が先行しているものの、ポリＬ−乳酸は従来の石油由来のプラスチックと比較し、耐熱性や耐久性が劣る問題点があった。そこで前記課題を解決すべく、ポリＤ−乳酸とのステレオコンプレックスポリマーを製造する試みがなされており、ポリＤ−乳酸をポリＬ−乳酸と混合させることで、融点を従来のＬ−ポリ乳酸（１７０℃）と比較し５０℃向上（２２０℃）させている。
【０００３】
前記ステレオコンプレックスポリマーの原料である、Ｌ−乳酸およびＤ−乳酸のうち、Ｌ−乳酸の製造についてはこれまでにも発酵生産の研究などが盛んに行なわれている。一方、Ｄ−乳酸の製造については研究例が少なく、光学純度が高く、かつ安価な製造コストでＤ−乳酸を生産する方法の開発が望まれている。
【０００４】
微生物発酵によるＤ−乳酸製造方法としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓなどの乳酸菌を用いた方法、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを導入した酵母を用いた方法、ホスホトランスアセチラーゼなどの遺伝子を破壊した組換え大腸菌による方法などがこれまで報告されている。しかしながら乳酸菌や酵母を用いた製造方法は、発酵培地中での栄養要求性が高く、比較的高価な原料である、酵母エキスやペプトンおよびアミノ酸やビタミンといった栄養源を培地へ添加する必要がある。また、発酵段階で窒素源由来の副生成物が生じるため、後続の精製プロセスにおけるコストが上昇する問題点があった。一方、組換え大腸菌による製造方法も生産量が低いという問題点があった。
【０００５】
ところで近年、温室効果ガスの低減化が課題となっている。バイオリファイナリーは化石エネルギー資源からの脱却、循環型社会の構築、地球温暖化に対する解決法として注目されており、特に植物由来のバイオマスを原料とした化学品や燃料の製造に関する研究が盛んに行なわれている。しかし農産物を主原料とする場合、季節や天候など自然現象の影響を受けやすいためプロセスの連続化や無人化がしにくく、かつ森林破壊や食料との競合の問題もあった。そのため、環境中に排出された二酸化炭素そのものを直接有用化学物質に変換する技術の開発が求められている。
【０００６】
自然界では、特定の生物による無機炭素の固定化が行なわれており、その際、カルビン・ベンソン経路（Ｃａｌｖｉｎ−Ｂｅｎｓｏｎ−Ｂａｓｓｈａｍ  ｃｙｃｌｅ）、還元的ＴＣＡ（トリカルボン酸）経路、３−ＨＰ（ヒドロキシプロピオン酸）経路、還元的アセチル−ＣｏＡ経路のいずれかによって固定化が行なわれる（非特許文献１）。前記経路のうち、還元的ＴＣＡ経路、３−ＨＰ経路および還元的アセチル−ＣｏＡ経路は１分子の二酸化炭素を固定するのに必要なエネルギー効率がカルビン・ベンソン経路より高い。しかしながら、これら３つの無機炭素固定化経路を有する微生物は特殊・過酷な条件下で生育するものが多く、微生物自体の増殖速度が極めて遅い。また、当該微生物の遺伝子組換え法についても確立されていない場合が多いため、研究例は無機炭素固定に関わる酵素の網
羅的解析に留まっているのが実状である。
【０００７】
カルビン・ベンソン経路を無機炭素固定化経路として利用した、二酸化炭素や炭酸塩からの化学品製造については多く報告されており、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓによるグルコースポリマーの製造（特許文献１）、シアノバクテリアを用いたグルコース／フルクトース／Ｄ−乳酸の製造（非特許文献２）、シアノバクテリアを用いたイソブチルアルデヒドの製造（非特許文献３）、高等植物を用いたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の製造（非特許文献４）があげられる。しかしながら、これらシアノバクテリアや高等植物を用いた例は、光エネルギー（光合成）により無機炭素固定を行なうためエネルギー効率が悪く、無機炭素固定効率が低いことが知られている。そのため、工業的に化学品を製造する場合は広大な面積のリアクターが必要となる。一方で化学エネルギー（非光合成）により無機炭素固定を行なう、鉄酸化細菌、硫黄酸化細菌、水素酸化細菌などの化学合成細菌が知られている。中でも水素酸化細菌は光合成と比べ無機炭素固定におけるエネルギー効率が格段に高く、リアクターの小型化も可能なため、工業的な化学品製造に利用する微生物として有望視されている。特に水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ
ｅｕｔｒｏｐｈａは、水素を酸化する際に生じる化学エネルギーを用いてカルビン・ベンソン経路で無機炭素固定を行う独立栄養微生物であり、全ゲノム解析がなされている上、遺伝子組換え方法も確立されている（非特許文献５）ことから、遺伝子工学的手法による有機酸やタンパク質生産の宿主として有望視されている。
【０００８】
水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは二酸化炭素、酸素、水素と無機塩のみの独立栄養条件で増殖することができ、窒素、リン、酸素などが供給制限になるような培養条件下では、菌体重量の９０％に及ぶ大量のポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を蓄積することが知られており、従属栄養条件下での高密度培養においてはＰＨＢを含む菌体収量が２８１ｇ／Ｌにまで達することが報告されている（非特許文献６）。また、現在環境負荷軽減、循環型社会構築の為のバイオベースの生分解性ポリマーに関心が集まる中、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の合成研究も行なわれている。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いたＰＨＡの研究に関しては、培地中の炭素原料の種類や組成、培養条件を変動させてＰＨＡの構成成分となるユニット組成をコントロールする研究（非特許文献７）や、遺伝子組換え体を用いて非天然型（３−ヒドロキシプロピオン酸ユニットを取り込んだ）ＰＨＡを生産した研究（非特許文献８）がされている。
【０００９】
また遺伝子工学的手法を用いた、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａによるＰＨＡ以外の化学品生産についても報告されている。一例として、２−メチルクエン酸の生産（非特許文献９）、２−ＨＩＢＡ（ヒドロキシイソブチル酸）の生産（非特許文献１０）、Ｒ−３−ヒドロキシ酪酸の生産（非特許文献１１）、シアノフィシンの生産（非特許文献１２）、有機リン加水分解酵素の生産（非特許文献１３）があげられ、特に有機リン加水分解酵素の生産（非特許文献１３）ではタンパク質の高発現を実現している。しかしながら、ここであげた例はいずれもフルクトースやグルコン酸などの有機炭素原料を原料にしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平０５−１１５２９０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｅｒｇ，ＩＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８，４４７−４６０（２０１０）．
【非特許文献２】Ｎｉｅｄｅｒｈｏｌｔｍｅｙｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７６，３４６２−３４６６（２０１０）．
【非特許文献３】Ａｔｓｕｍｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７，１１７７−１１８０（２００９）．
【非特許文献４】Ｓｎｅｌｌ，ＫＤ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，４，２９−４０（２００２）．
【非特許文献５】Ｃｒａｍｍ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，３８−５２（２００９）．
【非特許文献６】Ｒｙｕ，ＨＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５５，２８−３２（１９９７）．
【非特許文献７】Ｆｏｓｔｅｒ，ＬＪ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７５，１２４１−１２４７（２００７）．
【非特許文献８】Ｆｕｋｕｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．，１０，７００−７０６（２００９）．
【非特許文献９】Ｅｗｅｒｉｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，８，５８７−６０２（２００６）．
【非特許文献１０】Ｈｏｅｆｅｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８８，４７７−４８４（２０１０）．
【非特許文献１１】Ｓｈｉｒａｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０２，５２９−５３４（２００６）．
【非特許文献１２】Ｄｉｎｉｚ，ＳＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９３，  ６９８−７１７（２００６）．
【非特許文献１３】Ｂａｒｎａｒｄ，ＧＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，３８，２６４−２７１（２００４）．
【非特許文献１４】Ｉｓｈｉｚａｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７，６−１２（２００１）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述したように、ポリ乳酸の原料であるＤ−乳酸については、光学純度が高く、かつ安価な製造コストで製造する方法の開発が求められている。
【００１３】
また水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａは、二酸化炭素、酸素、水素と無機塩のみの独立栄養条件で増殖することができるため、二酸化炭素原料から有機酸などの化学品を製造させる宿主として有望視されている。しかしながら、従来は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが有する無機炭素固定経路を利用した、二酸化炭素、酸素、水素と無機塩のみからの化学品製造例は、当該細菌が本来生産するポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）の例（非特許文献１４）に限られていた。
【００１４】
以前の検討で、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入したＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを培養することで、無機炭素源からのＤ−乳酸製造を実現している。しかしながら二酸化炭素を唯一の無機炭素源として培養した場合、Ｄ−乳酸の生産性は低かった。すなわち本方法で使用した細菌を用いてＤ−乳酸を製造するには、あらかじめ培地に炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を添加して培地中の溶存無機炭素源濃度を高めることで、菌体の無機炭素同化効率を高める必要があった。二酸化炭素を唯一の炭素源としてＤ−乳酸を製造しようとする場合、二酸化炭素の培地中への溶解度が低いため、本方法で使用した細菌よりも無機炭素同化効率が高い細菌を取得する必要がある。
【００１５】
そこで本発明の目的は、二酸化炭素を唯一の炭素源としてＤ−乳酸を製造可能な細菌および当該細菌を用いた二酸化炭素からのＤ−乳酸製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを水素酸化細菌に導入することで得られた、無機炭素同化効率を高めた水素酸化細菌により、二酸化炭素を唯一の炭素源としたＤ−乳酸の製造が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
（１）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、水素酸化細菌において導入または発現増強して得られる、Ｄ−乳酸を製造可能な細菌。
（２）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの水素酸化細菌への導入が、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによる水素酸化細菌の形質転換による導入である、（１）に記載の細菌。
（３）Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの５’末端側にファジンプロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドをさらに付加したベクターである、（２）に記載の細菌。
（４）無機炭素固定に関わるタンパク質がリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）である、（１）から（３）のいずれかに記載の細菌。
（５）無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質が、ｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターである、（１）から（４）のいずれかに記載の細菌。
（６）水素酸化細菌がＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａである、（１）から（５）のいずれかに記載の細菌。
（７）（１）から（６）のいずれかに記載の細菌を培地中で培養してＤ−乳酸を生成させ、培地からＤ−乳酸を回収することを含む、Ｄ−乳酸の製造方法。
（８）前記培地は二酸化炭素を炭素源として含む、（７）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（９）前記培地は二酸化炭素を唯一の炭素源として含む、（７）に記載のＤ−乳酸の製造方法。
（１０）（７）から（９）のいずれかの方法によりＤ−乳酸を製造し、得られたＤ−乳酸を用いて重合反応を行うことを特徴とする、Ｄ−乳酸含有ポリマーの製造方法。
。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細菌により、以下の効果を奏することができる。
（１）本発明の細菌は、水素酸化細菌に、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入または発現増強することで、無機炭素同化効率を向上した細菌であり、二酸化炭素を直接無機炭素原料としたＤ−乳酸生産が可能である。
（２）従来の乳酸発酵法では、原料として、小麦全粒粉加水分解物、酵母エキス、ペプトン、アミノ酸やビタミンなどの高価な原料を用いる必要があった。一方、本発明の細菌を用いたＤ−乳酸の製造方法は、原料として菌の生育に最低限必要な塩を含んだ培地と無機
炭素源しか用いる必要がないため、安価な原料からＤ−乳酸を製造することができる。本発明の細菌は特に工場から排出される二酸化炭素を唯一の炭素源として利用できるため、環境負荷低減にも効果的である。また光合成細菌の生産系と異なり、リアクターを小型化することができるため、安価で高効率なプロセスでＤ−乳酸を製造することができる。
（３）本発明の細菌を用いたＤ−乳酸の製造方法は、Ｄ−乳酸を精製する際のコストを従来の方法より抑えることができる。一般に微生物を用いた乳酸製造においては、培地成分由来の不純物が問題になるが、本発明の細菌は原料として菌の生育に最低限必要な塩を含んだ培地と無機炭素源しか用いないため、菌体残渣を十分除去さえすれば、その後の精製工程は容易である。また一般に水素酸化細菌は他の微生物と比べ有機酸を蓄積しにくいため、従来の乳酸発酵で問題となっていた酢酸や蟻酸などの副生を最小限に抑えることができ、蓄積した有機酸による増殖阻害も回避可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１（１）から（５）で作製したプラスミドの構造を示した図。
【図２】実施例１（２）から（５）で作製したプラスミドによりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換して得られた形質転換体を用いて、グルコン酸を炭素源としてＤ−乳酸を製造した結果を示す図。
【図３】実施例１（２）から（５）で作製したプラスミドによりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換して得られた形質転換体を用いて、グルコン酸を炭素源としてＤ−乳酸を製造した際の菌体量（ＯＤ600）を示す図。
【図４】実施例１（２）から（５）で作製したプラスミドによりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換して得られた形質転換体を用いて、二酸化炭素を炭素源としてＤ−乳酸を製造した結果を示す図。
【図５】実施例１（２）から（５）で作製したプラスミドによりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換して得られた形質転換体を用いて、二酸化炭素を炭素源としてＤ−乳酸を製造した際の菌体量（ＯＤ600）を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の細菌は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、水素酸化細菌において導入または発現増強することで無機炭素同化効率が向上した細菌であり、培養の際、二酸化炭素を唯一の炭素源として培養しても、Ｄ−乳酸の製造が可能な細菌である。
なお、「Ｄ−乳酸を製造可能な細菌」とは、培地中で培養したときに、Ｄ−乳酸を培地に分泌し、培地から回収可能な程度にＤ−乳酸を製造できる能力を有する細菌を意味する。
【００２１】
無機炭素固定に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては無機炭素固定に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されず、例えば、リブロース１，５−ビスリン酸に二酸化炭素を固定する効果を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの中から適宜選択可能であるが、好ましい一例としてリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）をコードするポリヌクレオチドがあげられ、その具体例としてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）由来のＲｕｂｉｓｃｏをコードするポリヌクレオチドがあげられる。Ｒｕｂｉｓｃｏは大サブユニットと小サブユニットによって構成されるので、大サブユニットと小サブユニットそれぞれをコードするポリヌクレオチドを導入する。これらは同時に導入してもよいし、別々に導入してもよい。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）由来のＲｕｂｉｓｃｏの大サブユニットをコードするポリヌクレオチドとしては配列番号１１の塩基番号８８から１５４５の塩基配列を有する遺
伝子が挙げられ、小サブユニットをコードするポリヌクレオチドとしては配列番号１１の塩基番号１６０６から２０２２の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。
Ｒｕｂｉｓｃｏの大サブユニットをコードするポリヌクレオチドは、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットとともにリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性を発揮できるタンパク質をコードするものである限り、配列番号１１の塩基番号８８から１５４５の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。Ｒｕｂｉｓｃｏの小サブユニットをコードするポリヌクレオチドは、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットとともにリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性を発揮できるタンパク質をコードするものである限り、配列番号１１の塩基番号１６０６〜２０２２の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる（以下、同じ）。
また、Ｒｕｂｉｓｃｏの大サブユニットをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットとともにリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性を発揮できるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。Ｒｕｂｉｓｃｏの小サブユニットをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットとともにリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性を発揮できるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
さらに、Ｒｕｂｉｓｃｏの大サブユニットをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットとともにリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性を発揮できるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。Ｒｕｂｉｓｃｏの小サブユニットをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニットとともにリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性を発揮できるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「１または数個」とは、好ましくは、１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個を意味する（以下、同じ）。
【００２２】
なお、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子を導入する場合、大サブユニットと小サブユニットの会合を促進するために、シャペロンをコードするポリヌクレオチドをさらに導入してもよい。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）由来のシャペロンをコードするポリヌクレオチドとしては配列番号１１の塩基番号２１８８から３１３８の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。シャペロンをコードするポリヌクレオチドは、Ｒｕｂｉｓｃｏの大小サブユニットの会合を促進できるタンパク質をコードするものである限り、配列番号１１の塩基番号２１８８から３１３８の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、配列番号１４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、または、配列番号１４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２３】
無機炭素の輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、炭酸イオンや炭酸水素イオンの輸送能や濃縮能を向上させることが可能な炭酸イオントランスポーターをコードするポリヌクレオチドの中から適宜選択可能であるが、好ましい一例
としてｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターをコードするポリヌクレオチドがあげられ、その具体例としてＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属ＰＣＣ７９４２株（ＡＴＣＣ  ３３９１２）由来のｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターをコードするポリヌクレオチドがあげられる。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属ＰＣＣ７９４２株（ＡＴＣＣ  ３３９１２）由来のｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１７の塩基番号７から１４０７の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。また、ｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターをコードするポリヌクレオチドは、炭酸イオントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号１７の塩基番号７から１４０７の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
また、ｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号１８のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、炭酸イオントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
さらに、ｉｃｔＢファミリーに属する炭酸イオントランスポーターをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、炭酸イオントランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２４】
一方Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、ピルビン酸よりＤ−乳酸を生成する働きを持つタンパク質をコードするものであれば特に限定はなく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いることができる。大腸菌由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子としては、配列番号３の塩基番号１０３から１０８９の塩基配列を有する大腸菌Ｗ３１１０株由来の遺伝子を挙げることができる。また、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものである限り、配列番号３の塩基番号１０３から１０８９の塩基配列の相補配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。
また、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
さらに、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２５】
本発明の細菌を得るのに用いる水素酸化細菌は、水素を酸化できるものである限り特に限定はないものの、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａなどのＲａｌｓｔｏｎｉａ属細菌やＨｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓなどのＨｙｄｒｏｇｅｎｏｖｉｂｒｉｏ属細菌が挙げられる。この中で、気体状の二酸化炭素や炭酸塩を唯一の炭素源とした条件で増殖可能な点、全ゲノム情報が解析されている点、および遺伝子組換え法が確立されている点で、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが好ましく、その一例としてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）やＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ  ５４１）があげられる。
【００２６】
本発明の細菌は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに
無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを遺伝子組み換え技術により水素酸化細菌へ導入することで得ることができる。導入方法としては主に、発現ベクターを用いた方法と、自殺ベクターを用いたゲノム組換え法がある。導入に用いる発現ベクターとしては公知の広域宿主ベクターを用いることができ、一例としてｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２３７５１）、ｐＫＴ２３０、ｐＢＨＲ１があげられる。また導入に用いる自殺ベクターの一例としては、ｐＪＱ２００ｍｐ１８、ｐＮＨＧ１、ｐＬＯ１があげられる。
なお、水素酸化細菌としてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いる場合は、無機炭素固定に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしてのＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子については、宿主のＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ自身が有する内因性のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の発現を増強してもよい。例えば、染色体上でＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子のプロモーターを下記のような強力なプロモーターに置換することで内因性のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の発現を増強させることができる。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａのＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子は配列番号１１に示すように、大サブユニットコード領域、小サブユニットコード領域、シャペロンコード領域の順でオペロンを形成しているので、大サブユニットコード領域の５’側に強力なプロモーターを配置させればこれらをまとめて発現増強できる。
【００２７】
発現ベクターを用いた方法では、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、接合性大腸菌を用いた接合法などにより水素酸化細菌を形質転換することで本発明の細菌を得ることができる。また発現ベクターにこれらのポリヌクレオチドを導入する際、その順番は特に限定されない。
【００２８】
それぞれの遺伝子は５’末端にプロモーター配列を付加して遺伝子発現を制御することも可能であるし、単一のプロモーターの下流に各遺伝子を連結し、導入した各遺伝子の発現すべてを単一のプロモーターで制御することも可能である。この際、プロモーターは、水素酸化細菌で機能するものであれば特に限定はなく、その一例として、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ファジンプロモーター（ｐｈａｓｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）などがあげられる。この中では、ファジンプロモーターがより好ましい。ファジンプロモーターはＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａが本来有する、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）顆粒を覆うタンパク質であるファジンタンパク質（ｐｈａｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を生産するための強力なプロモーターであり、培地中の窒素源やリン源の枯渇下で活性化することが知られている。そのため、ファジンプロモーターを導入することで、培地中の窒素源やリン源を枯渇させるだけで、高価な誘導剤の添加なしにＤ−乳酸の生産が可能となる。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファジンプロモーターとしては、配列番号８の塩基番号１から４３８の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、水素酸化細菌においてプロモーター活性を有する限り、配列番号８の塩基番号１から４３８の塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００２９】
また、自殺ベクターを用いたゲノム組換え法により、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素の輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、水素酸化細菌のゲノムへ導入することでも本発明の細菌が作製可能である。この場合はトランスポゾン変異導入によるゲノム中へのランダム変異導入で行なってもよいが、相同組換えにより水素酸化細菌のゲノム中に存在するＤ−乳酸以外の物質生産遺伝子を破壊する形で導入するとさらに効果的である。例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（Ｄ
ＳＭ  ５４１）は酸素欠乏状態でＬ−乳酸を生成することが知られているが、ゲノム中のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼを破壊することで、副生成物としてのＬ−乳酸の生成を防ぎ、結果として光学純度の高いＤ−乳酸を得ることができる。
【００３０】
なお、発現ベクターと自殺ベクターとを組み合わせてもよく、水素酸化細菌への外来遺伝子導入の一例として、シアノフィシン合成酵素（ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）を導入した組換えＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを用いた、有機炭素原料を原料としたシアノフィシン（ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ）生産に関する研究例が知られている。当該研究は、エントナー・ドウドロフ経路の遺伝子であるＫＤＧＰ−アルドラーゼ（２−Ｋｅｔｏ−３−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ６−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ａｌｄｏｌａｓｅ）を破壊したＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａに、ＫＤＧＰ−アルドラーゼとシアノフィシン合成酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することで、プラスミドの脱落を防ぎつつ増殖連動型でシアノフィシンを生産させることができ、その生産性を向上させている（Ｖｏｓｓ， I．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，８，  ６６−７８（２００６））。
【００３１】
同様に本発明では、例えば、自殺ベクターを用いて水素酸化細菌ゲノム中の無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードする遺伝子（例えば、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子）を破壊した宿主を作製後、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより水素酸化細菌を形質転換することで、二酸化炭素を唯一の炭素源とした培養により増殖連動型でＤ−乳酸の生産をより効率的に行なえる細菌を取得することができる。また、自殺ベクターを用いて水素酸化細菌ゲノム中のＤ−乳酸合成に不要な遺伝子（例えば、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）に、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入して当該遺伝子を破壊した宿主を作製後、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに無機炭素固定に関わるタンパク質および／または無機炭素輸送や濃縮に関わるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより水素酸化細菌を形質転換することで、二酸化炭素を唯一の炭素源とした培養による光学純度の高いＤ−乳酸の生産をより効率的に行なえる細菌を取得することができる。
【００３２】
なお本発明の細菌は、無機炭素同化効率を向上させた細菌であり、二酸化炭素を唯一の炭素源として培養することでＤ−乳酸を製造可能な細菌であるが、炭酸塩などの無機炭素原料またはグルコン酸やフルクトースなどの有機炭素原料を炭素源として細菌を培養し、Ｄ−乳酸を製造することも可能である。従って、本発明の細菌を用いてＤ−乳酸の製造を行なう場合は、二酸化炭素を唯一の炭素源として培養してもよいし、二酸化炭素と他の炭素源を用いて培養してもよいし、二酸化炭素以外の炭素源を用いて培養してもよい。
また、例えば、まず栄養源の豊富な培地で本発明の細菌を高密度に培養後、培養菌体を二酸化炭素を唯一の炭素源とした独立栄養条件下で培養を行なうことで、Ｄ−乳酸を製造してもよい。
二酸化炭素を唯一の炭素源とした独立栄養条件下で培養を行なう場合は、例えば、８０％水素／１０％酸素／１０％二酸化炭素の組成の気相条件下で、１０から４０℃で、３時間〜１０日間水素酸化細菌の培養を行なうことで、Ｄ−乳酸が培地中に蓄積される。また、この場合、気相中の各気体の組成はＤ−乳酸の生成を阻害しない範囲で、例えば３０％以内の組成範囲内で増減が可能であり、密閉した培養器にて混合気体を常圧（１０１．３
ｋＰａ）以上の加圧条件で導入する方法や、開放系の培養器にて当該組成の混合気体を連続通気する方法でＤ−乳酸を製造することも可能である。Ｄ−乳酸は常法にしたがって培地から回収できる。Ｄ−乳酸は必要に応じて菌体からも回収してよい。
【００３３】
本発明の方法によって製造されたＤ−乳酸を用いて重合反応を行なうことにより、ポリＤ−乳酸などのＤ−乳酸含有ポリマーを得ることができる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明する。なお本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００３５】
実施例１  発現ベクターの作製
下記（１）から（５）に示す、プラスミド（発現ベクター）を作製した。
【００３６】
（１）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼをＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
【００３７】
（１−１）ＰＣＲ反応により大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より５番目か
ら１０番目までの配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１１番目から３８番
目は配列番号３のうち５’末端側より１０３番目から１３０番目までの領域に相
当）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より４番目か
ら９番目の配列はＥｃｏＲＩサイトの配列であり１０番目から３７番目は配列番
号３のうち５’末端側より１０６５番目から１０９２番目までの領域の相補鎖に
相当）
・鋳型
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｗ３１００株のコロニーを水に懸
濁したもの
・ＰＣＲ反応
９４℃で２分、その後９８℃で１０秒−６３℃で３０秒−６８℃で１分のサイク
ルを４０回、最後に６８℃で７分
【００３８】
（１−２）（１−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号３のうち５’末端側より１０３番目から１０９２番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
【００３９】
（１−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにライゲーションした（反応温度１６℃）。
【００４０】
（１−４）ライゲーション液を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
【００４１】
（１−５）形質転換操作後の溶液を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトンディッキンソン社製））に塗布した。
【００４２】
（１−６）得られたコロニーを培養し、プラスミド抽出後、様々な制限酵素による切断パターンを分析することで、目的とする形質転換体のスクリーニングを行ない、プラスミドｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８は（１−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
【００４３】
（１−７）広域宿主ベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．Ｕ２３７５１）で形質転換した大腸菌ＪＭ１０９株の培養液からプラスミド精製キットを用いて調製したｐＢＢＲ１ＭＣＳ２を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
【００４４】
（１−８）（１−７）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約５．１ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
【００４５】
（１−９）（１−６）で得られた形質転換体よりプラスミドｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
【００４６】
（１−１０）（１−９）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
【００４７】
（１−１１）（１−８）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（１−１０）で得られたラスミドｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８消化物とをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてライゲーション反応後（反応温度１６℃）、常法により大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００４８】
（１−１２）形質転換操作後の溶液を、２０μｇ／ｍＬのカナマイシンと１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ寒天培地に塗布した。
【００４９】
（１−１３）得られたコロニーを培養し、プラスミド抽出後、様々な制限酵素による切断パターンを分析することで、目的とする形質転換体のスクリーニングを行ない、プラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（１））は、大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼを含むポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐlac）に対し正方向に挿入された
プラスミドである。
【００５０】
（２）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼおよびＳＤ配列（シャイン・ダルガノ配列）をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
【００５１】
（２−１）ＰＣＲ反応により大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）およびＳＤ配列を含むポリヌクレオチドを増幅した。なおＰＣＲ条件は、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとして配列番号５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より５番目から１０番目までの配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１１番目から４４番目は配列番号３のうち５’末端側より８２番目から１１５番目までの領域に相
当）を用いた他は、（１−１）と同様である。
【００５２】
（２−２）（２−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号３のうち５’末端側より８２番目から１０９２番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
【００５３】
（２−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、（１−３）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。ｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８は（２−１）で得られた約１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
【００５４】
（２−４）（２−３）で得られた形質転換体よりプラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
【００５５】
（２−５）（２−４）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
【００５６】
（２−６）（１−８）で得られたｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（２−５）で得られたプラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＵＣ１１８消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
【００５７】
（２−７）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（２））は、大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードするポリヌクレオチドおよびそのＳＤ配列を含むオリゴヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐlac）に対し正方向に挿入されたプラスミドで
ある。
【００５８】
（３）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファジンプロモーター（ｐｈａＰｐ）をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
【００５９】
（３−１）ＰＣＲ反応によりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＰＨＡファジンプロモーター（ｐｈａＰｐ、以下Ｐｐと略）を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より７番目
から１２番目の配列はＡｐａＩサイトの配列であり１３番目から３６番目は配列
番号８のうち５’末端側より１番目から２４番目までの領域に相当）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より７番目
から１２番目の配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり１３番目から４０番目
は配列番号８のうち５’末端側より４１１番目から４３８番目までの領域の相
補鎖に相当）
・鋳型
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株ゲノム（ＡＴＣＣ
１７６９９Ｄ−５）
・ＰＣＲ反応
９８℃で２分、その後９８℃で１０秒−５５℃で３０秒−７２℃で１分のサイク
ルを４０回、最後に７２℃で７分
【００６０】
（３−２）（３−１）で得られた約０．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号８のうち５’末端側より１番目から４３８番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
【００６１】
（３−３）精製したポリヌクレオチド断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）を用いてライゲーションし、（１−４）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドＰｐ／ｐＧＥＭ−Ｔ形質転換体を得た。Ｐｐ／ｐＧＥＭ−Ｔは（３−１）で得られた約０．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＧＥＭ−ＴのＥｃｏＲＶサイトに挿入されたプラスミドである。
【００６２】
（３−４）（１）で調製したプラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（１））を制限酵素ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
【００６３】
（３−５）（３−４）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約６．１ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
【００６４】
（３−６）（３−３）で得られた形質転換体よりプラスミドＰｐ／ｐＧＥＭ−Ｔを調製し、制限酵素ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
【００６５】
（３−７）（３−６）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約０．４ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
【００６６】
（３−８）（３−５）で得られたプラスミドｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（３−７）で得られたプラスミドＰｐ／ｐＧＥＭ−Ｔ消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
【００６７】
（３−９）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（３））は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来ＰＨＡファジンプロモーター（Ｐｐ）をコードするポリヌクレオチドおよび大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードするポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐlac）に対し、Ｐｐ−ｌｄｈＡの順に正方向に挿入されたプラ
スミドである。
【００６８】
（４）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ；ｃｂｂＬ２、ｃｂｂＳ２、ｃｂｂＸ２）およびＳＤ配列をＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
【００６９】
（４−１）ＰＣＲ反応によりＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の大サブユニット（ｃｂｂＬ２）、小サブユニット（ｃｂｂＳ２）、シャペロン（ｃｂｂＸ２）を含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。なお、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号９）は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子のプロモータ
ー領域の−３５領域（配列番号１１のうち５’末端側から１２番目から１７番目の領域であり配列番号９のうち５’末端側から１８番目から２３番目の領域）をｔｔｔａｃｃからｔｔｇａｃａに、−１０領域（配列番号１１のうち５’末端側から３５番目から４０番目の領域であり配列番号９のうち５’末端側から４１番目から４６番目の領域）をｔａｔｃｔｔからｔａｔａａｔに、それぞれ変えたポリヌクレオチドを増幅するよう設計したものである。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目
から６番目の配列はＡｐａＩサイトの配列）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目
から６番目の配列はＨｉｎｄＩＩＩサイトの配列であり７番目から４３番目は
配列番号１１のうち５’末端側より３１０５番目から３１４１番目までの領域の
相補鎖に相当）
・鋳型
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株ゲノム（ＡＴＣＣ
１７６９９Ｄ−５）
・ＰＣＲ反応
９４℃で２分、その後９８℃で１０秒−６３℃で３０秒−６８℃で４分のサイク
ルを４０回、最後に６８℃で７分
【００７０】
（４−２）（４−１）で得られた約３．１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号１１のうち５’末端側より１番目から３１４１番目までのポリヌクレオチド領域中、５’末端側から１２番目から１７番目までと３５番目から４０番目までの領域に、前記の配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドによる変異を導入したもの）をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
【００７１】
（４−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、（１−３）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドＲｕｂｉｓｃｏ／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。Ｒｕｂｉｓｃｏ／ｐＵＣ１１８は（４−１）で得られた約３．１ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入されたプラスミドである。
【００７２】
（４−４）（２）で調製したプラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（２））を制限酵素ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
【００７３】
（４−５）（４−４）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約６．１ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
【００７４】
（４−６）（４−３）で得られた形質転換体よりプラスミドＲｕｂｉｓｃｏ／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、ＳｃａＩで消化した。
【００７５】
（４−７）（４−６）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約３．１ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
【００７６】
（４−８）（４−５）で得られたプラスミドｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物
と、（４−７）で得られたプラスミドＲｕｂｉｓｃｏ／ｐＵＣ１１８消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
【００７７】
（４−９）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＲｕｂｉｓｃｏ−ｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＲｕｂｉｓｃｏ−ｓｄ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（４））は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の大サブユニット（ｃｂｂＬ２）、小サブユニット（ｃｂｂＳ２）、シャペロン（ｃｂｂＸ２）および大腸菌Ｗ３１００株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）とＳＤ配列をコードするポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐlac）
に対し、Ｒｕｂｉｓｃｏ−ＳＤ配列−ｌｄｈＡの順に正方向に挿入されたプラスミドである。
【００７８】
（５）大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファジンプロモーター（ｐｈａＰｐ）およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属ＰＣＣ７９４２株由来のｉｃｔＢ炭酸イオントランスポーターをＬａｃプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミド
【００７９】
（５−１）ＰＣＲ反応によりＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属ＰＣＣ７９４２株由来のｉｃｔＢ（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）炭酸イオントランスポーターを含むポリヌクレオチドを増幅した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
（ＰＣＲ条件）
・ＤＮＡポリメラーゼ
ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡績社製）
・Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目
から６番目の配列はＳｐｅＩサイトの配列であり、１４番目から４０番目は配列
番号１７のうち５’末端側より１番目から２７番目までの領域）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ
配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端側より１番目
から６番目の配列はＳａｃＩサイトの配列であり７番目から３３番目は
配列番号１７のうち５’末端側より１３８４番目から１４１０番目までの領域の
相補鎖に相当）
・鋳型
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属ＰＣＣ７９４２株ゲノム（ＡＴＣＣ  ３３９１２
Ｄ−５）
・ＰＣＲ反応
９４℃で２分、その後９８℃で１０秒−６３℃で３０秒−６８℃で１．５分のサ
イクルを４０回、最後に６８℃で７分
【００８０】
（５−２）（５−１）で得られた約１．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物（配列番号１７のうち５’末端側より1番目から１４１０番目までのポリヌクレオチドを含む）をアガロー
スゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キット（キアゲン社製）を用いてゲルから抽出することでポリヌクレオチド断片を精製した。
【００８１】
（５−３）精製したポリヌクレオチド断片をリン酸化後、（１−３）から（１−６）に示す方法と同様な方法を用いて、プラスミドｉｃｔＢ／ｐＵＣ１１８形質転換体を得た。ｉｃｔＢ／ｐＵＣ１１８は（５−１）で得られた約１．４ｋｂｐ断片のＰＣＲ増幅産物がｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトに、ｉｃｔＢ遺伝子をｐＵＣ１１８のＬａｃＺプロモーターに対し正方向に挿入したプラスミドである。
【００８２】
（５−４）（３）で調製したプラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（３））を制限酵素ＳａｃＩで消化し、ＢＡＰアルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）によって脱リン酸化を行なった。
【００８３】
（５−５）（５−４）のＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いてゲルから抽出することで精製し、約６．５ｋｂｐのＤＮＡ産物を得た。
【００８４】
（５−６）（５−３）で得られた形質転換体よりプラスミドｉｃｔＢ／ｐＵＣ１１８を調製し、制限酵素ＳａｃＩで消化した。
【００８５】
（５−７）（５−６）の消化物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル抽出キットを用いて約１．４ｋｂｐのＤＮＡ産物をゲルから抽出することで精製した。
【００８６】
（５−８）（５−５）で得られたプラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２消化物と、（５−７）で得られたプラスミドｉｃｔＢ／ｐＵＣ１１８消化物とを（１−１１）と同様な方法でライゲーションおよび形質転換を行なった。
【００８７】
（５−９）（１−１２）から（１−１３）に示す方法と同様な方法により、プラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２形質転換体を得た。プラスミドＰｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図１（５））は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属ＰＣＣ７９４２株由来のｉｃｔＢ炭酸イオントランスポーターおよび大腸菌Ｗ３１１０株由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ由来のファジンプロモーター（Ｐｐ）をコードするポリヌクレオチドが、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２のＬａｃＺ（Ｐlac）に対し、Ｐｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢの順に正方向に挿入さ
れたプラスミドである。
【００８８】
実施例２  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ形質転換体の作製
実施例１で得られた各プラスミドを用いて接合伝達法により水素酸化細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａを形質転換した。
【００８９】
（１）実施例１で得られた各プラスミドにより接合性大腸菌Ｓ１７−１株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて形質転換体のスクリーニングを行なった。
【００９０】
（２）得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ（１０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン（ベクトンディッキンソン社製）、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム）で、３７℃・一晩培養した。
【００９１】
（３）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ  ５４１）をそれぞれ抗生物質を含まないＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトンディッキンソン社製、濃度：８ｇ／Ｌ）培地で、３０℃・一晩培養した。
【００９２】
（４）（２）および（３）の培養液を遠心分離により菌体を濃縮後、ＯＤ600を用いて菌
体濁度を求め、（２）で調製した各大腸菌Ｓ１７−１株形質転換体と（３）で調製した各Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ株とを菌体濁度１：１の比で混合した。
【００９３】
（５）混合後、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ寒天培地（８ｇ／Ｌ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトンディッキンソン社製）、１５ｇ／Ｌ  バクトアガロース（ベクトン
ディッキンソン社製））により、３７℃で一晩培養した。
【００９４】
（６）プレート表面の菌体をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈを用いて懸濁し、この懸濁液をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈで１０００倍希釈後、６００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ寒天培地により、３０℃で２日から３日培養した。なお、コントロールとして、各大腸菌Ｓ１７−１株の形質転換体のみおよび各Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ株のみについても、同様に培養をした。
【００９５】
結果、コントロールの培養液を塗布したプレートではコロニーは数個出現するのみであったが、接合を行なった菌体培養液を塗布したプレートからはそれぞれ数十個のコロニーが得られた。得られたそれぞれのクローンは５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ（ベクトンディッキンソン社製、濃度：８ｇ／Ｌ）培地で、３０℃・一晩培養後プラスミド抽出し、様々な制限酵素による切断パターンの分析により、目的のプラスミドが伝達されたことを確認した。
【００９６】
実施例３  従属栄養培養条件でのＤ−乳酸生産
実施例１の（２）から（５）で調製したプラスミドを用いて、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＢ＿４株（ＤＳＭ  ５４１）を形質転換して得られた形質転換体（以下、ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｒｕｂｉｓｃｏ−ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／ＰＨＢ＿４株とそれぞれ表記）、および実施例１の（５）で調製したプラスミドを用いて、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６株（ＡＴＣＣ  １７６９９）を形質転換して得られた形質転換体（以下、Ｐｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／Ｈ１６株と表記）を用いて、それぞれ従属栄養条件下で培養することで、Ｄ−乳酸を生成させた。
【００９７】
（１）各形質転換体について、１４ｍＬラウンドチューブ（ベクトンディッキンソン社製）中に５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈを分注し、当該チューブに各形質転換体のグリセロールストックを植菌した。
【００９８】
（２）３０℃で２日間培養し、７０００Ｇの遠心により菌体を沈降させた後上清を廃棄し、炭素原料を含まない無機塩培地（培地Ａ）を５ｍＬ加えて菌体を再懸濁した。
（培地Ａ）
ＭＳＭ培地（３．６ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．５ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、
０．５ｇ／Ｌ  ＮＨ4Ｃｌ、０．２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、
１０ｍＬ／Ｌ  Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
※  Ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
１０ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．３ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、
１．２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、
２．０ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ／Ｌ  Ｈ3ＢＯ3、
０．１２ｇ／Ｌ  （ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24、０．２ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ2、
２０ｍｇ／Ｌ  ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、６ｍｇ／Ｌ  ＣｒＣｌ2、
１０ｍＬ／Ｌ  ３５％ＨＣｌ
【００９９】
（３）再び、７０００Ｇの遠心により菌体を沈降させた後上清を廃棄し、培地Ａを１ｍＬ加えて菌体を再懸濁した。
【０１００】
（４）１４ｍＬラウンドチューブ中に、以下の組成からなる、培地Ｂおよび培地Ｃをそれぞれ３ｍＬずつ分注したものを用意し、（３）の懸濁液をそれぞれ５０μＬずつ植菌した。植菌直後の菌体濁度ＯＤ600は概ね０．１から０．２であった。
（培地Ｂ）
３００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシド）、４％（ｗ／ｖ）のグルコン酸を含むＮｕｔｒｉｅｎｔ
Ｂｒｏｔｈ
（培地Ｃ）
３００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシド）、４％（ｗ／ｖ）のグルコン酸を含む培地Ａ
【０１０１】
（５）３０℃で培養を行ない、１日目、２日目、５日目の培養液を１．５ｍＬセーフロックチューブ（エッペンドルフ社製）に１ｍＬずつ採取した。
【０１０２】
（６）菌体濁度（ＯＤ600）を分光光度計により測定した後、７０００Ｇの遠心により菌
体を沈降させ、培養上清中のＤ−乳酸量を乳酸測定キット（Ｆ−キット  Ｌ−乳酸／Ｄ−乳酸、ジェイ・ケイ・インターナショナル社製）で測定した。
培地Ｂおよび培地Ｃでの培養物についてＤ−乳酸を定量した結果を、図２（１）および図２（２）にそれぞれ示す。また、培地Ｂおよび培地Ｃで培養したときの培養液の菌体濁度を、図３（１）および図３（２）にそれぞれ示す。ＰＨＢ＿４株の形質転換体である、ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｒｕｂｉｓｃｏ−ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／ＰＨＢ＿４株についてＤ−乳酸の生成が確認された。
【０１０３】
実施例４  独立栄養培養条件でのＤ−乳酸生産
実施例３で評価した形質転換体である、ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｒｕｂｉｓｃｏ−ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／ＰＨＢ＿４株、Ｐｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／Ｈ１６株を用いて、それぞれ独立栄養培養条件下で培養することで、Ｄ−乳酸を生成させた。
【０１０４】
（１）各形質転換体について、１４ｍＬラウンドチューブ（ベクトンディッキンソン社製）中に５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３ｍＬのＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈを分注し、当該チューブに各形質転換体のグリセロールストックを植菌した。
【０１０５】
（２）３０℃で２日間培養し、７０００Ｇの遠心により菌体を沈降させた後、上清を廃棄し、実施例３に記載の炭素原料を含まない無機塩培地（培地Ａ）を５ｍＬ加えて菌体を再懸濁した。
【０１０６】
（３）再び７０００Ｇの遠心により菌体を沈降させた後、上清を廃棄し、培地Ａを１ｍＬ加えて菌体を再懸濁した。
【０１０７】
（４）１００ｍＬ容量の気密性のアルミシールバイアル（ＧＬサイエンス社製）に培地Ｄを５ｍＬ入れ、開口部をブチルゴムセプタムとアルミシールで封印した。
（培地Ｄ）
３００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシド）を含む培地Ａ
【０１０８】
（５）ガス混合機ＧＢ−３Ｃ（コフロック製）を用いて、体積組成で８０％水素／１０％酸素／１０％二酸化炭素の混合ガスをブチルゴムセプタム部分からシリンジ針により１Ｌ／ｍｉｎ、１分間の流速で流して気相を置換した。
【０１０９】
（６）ブチルゴムセプタム部分からシリンジ針により（３）の懸濁液をそれぞれ１００μＬずつ植菌した。植菌直後の菌体濁度ＯＤ600は概ね０．１から０．２であった。
【０１１０】
（７）３０℃で培養を行ない、３．７日目、６．５日目の培養液をブチルゴムセプタム部分からシリンジ針により１．５ｍＬセーフロックチューブ（エッペンドルフ社製）に１ｍＬずつ採取した。
【０１１１】
（８）菌体濁度（ＯＤ600）を分光光度計により測定した後、７０００Ｇの遠心により菌
体を沈降させ、培養上清中のＤ−乳酸量を乳酸測定キット（Ｆ−キット  Ｌ−乳酸／Ｄ−乳酸、ジェイ・ケイ・インターナショナル社製）で測定した。
Ｄ−乳酸を定量した結果を図４、培養液中の菌体濁度を図５に示す。検討した形質転換体のうち、Ｒｕｂｉｓｃｏ−ｓｄ−ｌｄｈＡ／ＰＨＢ＿４株およびＰｐ−ｌｄｈＡ−ｉｃｔＢ／Ｈ１６株について、二酸化炭素を唯一の炭素源としたＤ−乳酸の生成が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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