(57)【要約】【課題】  医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、アフィニティーリガンド（分離剤）などの用途に使用可能なＦｃ結合性タンパク質の、化学修飾による安定化方法を提供すること。【解決手段】  Ｆｃ結合性タンパク質を化学修飾して負電荷を有する解離基を導入することで、アルカリ環境下における安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を提供する。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を化学修飾して負電荷を有する解離基を導入することで、化学修飾前と比較し安定性が向上した、前記タンパク質。
【請求項２】
負電荷を有する解離基がカルボキシル基である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
カルボキシル基の導入が無水コハク酸による処理である、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
Ｆｃ結合性タンパク質に対し１０等量以上の無水コハク酸で処理した、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｆｃ結合性タンパク質が、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
である、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
安定性の向上がアルカリ環境下における安定性の向上である、請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項７】
アルカリ環境下が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の水酸化ナトリウム水溶液環境下である、請求項６に記載のタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に特異的に結合する活性を有し、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、アフィニティーリガンド（分離剤）などの用途に使用可能な、Ｆｃ結合性タンパク質であって、従来のＦｃ結合性タンパク質と比較し、安定性が向上したタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃ結合性タンパク質の一つであるＦｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（Ｋｄ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分されるが、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。
【０００４】
ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１のアミノ酸番号１のメチオニン（Ｍｅｔ）から２９２のヒスチジン（Ｈｉｓ）までがシグナル配列および細胞外領域、配列番号１のアミノ酸番号２９３のバリン（Ｖａｌ）から３７４のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
ＦｃγＲＩは、近年になり見出された予想外の免疫抑制的な生物学的特性により、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域における医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体検出用のバイオセンサーや抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質（リガンド）としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩ生産については、遺伝子組換え技術を用いた、大腸菌（特許文献１）、バチルス属細菌（特許文献２）、酵母（特許文献３）、麹菌（特許文献４）、および動物細胞（非特許文献３）による生産が報告されている。また工業的なＦｃγＲＩ精製に関しては、ＦｃγＲＩを発現する大腸菌の培養液からクロマトグラフィーにより精製する方法（特許文献５）が報告されている。しかしながらＦｃγＲＩを産業利用目的で利用する場合、その物理的安定性が低いことが問題となっていた。特にＦｃγＲＩをバイオセンサーやアフィニティクロマトグラフィー用リガンドとして用いる場合は、長期間の繰り返し使用や、アルカリ性溶液による使用後に付着した不純物の洗浄が必須となるが、前記繰り返し使用や前記洗浄により、抗体結合能が失われることが問題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特開２００９−２０１４０３号公報
【特許文献３】特開２０１１−０７２２４６号公報
【特許文献４】特開２０１１−２００２０３号公報
【特許文献５】特開２０１１−１２６８２７号公報
【特許文献６】特開２０１１−２０６０４６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献４】Ｋ．Ｓｏ−Ｈｅｅ等，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，１６７０，２００７
【非特許文献５】Ｂ．Ｆ．Ｓｈａｗ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，１７，１４４６，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述したＦｃγＲＩが有する問題点を解消するために、ＦｃγＲＩを構成するアミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換することで、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性を向上させる取組みが行なわれている（特許文献６）。しかしながら、構成アミノ酸の置換によるタンパク質の安定性向上に関する、一般的な理論は確立されていない。そのため、アミノ酸置換をランダムに導入した変異体のライブラリーの中から効果的なものをスクリーニングし、効果的な変異を組み合わせて安定性を向上させていく必要があり、多大な労力と研究時間を要する問題があった。
【００１０】
一方、別のタンパク質の安定化法として化学修飾による方法が知られている。例えば、ポリエチレングリコール等の親水性高分子を結合させタンパク質分子の親水性を向上させることによりプロテアーゼ耐性を向上させる方法（非特許文献４）や、無水酢酸によりリジン残基をアセチル化し正電荷を中和することで正味の負電荷を増加させ界面活性剤耐性を向上させる方法（非特許文献５）が知られている。しかしながら、ＦｃγＲＩをはじめとするＦｃ結合性タンパク質については、化学修飾による安定化方法は知られていなかった。
【００１１】
そこで、本発明は、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、アフィニティーリガンド（分離剤）などの用途に使用可能なＦｃ結合性タンパク質の、化学修飾による安定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【００１３】
（１）Ｆｃ結合性タンパク質を化学修飾して負電荷を有する解離基を導入することで、化学修飾前と比較し安定性が向上した、前記タンパク質。
【００１４】
（２）負電荷を有する解離基がカルボキシル基である（１）に記載のタンパク質。
【００１５】
（３）カルボキシル基の導入が無水コハク酸による処理である、（２）に記載のタンパク質。
【００１６】
（４）Ｆｃ結合性タンパク質に対し１０等量以上の無水コハク酸で処理した、（３）に記載のタンパク質。
【００１７】
（５）Ｆｃ結合性タンパク質が、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
である、（１）から（４）のいずれかに記載のタンパク質。
【００１８】
（６）安定性の向上がアルカリ環境下における安定性の向上である、（１）から（５）のいずれかに記載のタンパク質。
【００１９】
（７）アルカリ環境下が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の水酸化ナトリウム水溶液環境下である、（６）に記載のタンパク質。
【００２０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２１】
本発明のタンパク質を得るのに用いるＦｃ結合性タンパク質は、必ずしもＦｃ結合性タンパク質の全領域でなくてもよく、Ｆｃ結合性タンパク質を構成するアミノ酸のうち、少なくとも免疫グロブリン（ＦｃγＲＩの場合はＩｇＧ）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のアミノ酸を含んでいればよい。本発明におけるＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質や、
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。前記（Ｂ）の具体例として、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目から２８９番目までのアミノ酸を含み、かつ以下の（１）から（１６８）のいずれかに記載のアミノ酸置換を１つ以上含むＦｃ結合性タンパク質があげられる（特許文献６）。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（５）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（６）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（７）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（８）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（１０）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（１１）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１２）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１３）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（１４）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１５）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（１７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（１８）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（１９）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（２０）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（２１）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（２２）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（２３）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（２５）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（２６）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２７）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（２８）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（２９）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（３０）配列番号１の１７番目のバリンがグリシンまたはグルタミン酸に置換
（３１）配列番号１の１９番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３２）配列番号１の２０番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（３３）配列番号１の２５番目のスレオニンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（３４）配列番号１の２７番目のグルタミンがプロリンまたはリジンに置換
（３５）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシン、メチオニンまたはアルギニンに置換
（３６）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（３７）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（３８）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（３９）配列番号１の４４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（４０）配列番号１の４５番目のバリンがアラニンに置換
（４１）配列番号１の４６番目のロイシンがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリンまたはトリプトファンに置換
（４２）配列番号１の４７番目のヒスチジンがグルタミン、ロイシンまたはアスパラギンに置換
（４３）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンまたはアラニンに置換
（４４）配列番号１の５０番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（４５）配列番号１の５１番目のセリンがアラニン、スレオニン、ロイシン、プロリンまたはバリンに置換
（４６）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（４７）配列番号１の５３番目のセリンがロイシン、スレオニンまたはプロリンに置換
（４８）配列番号１の５５番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号１の５７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（５０）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（５１）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（５２）配列番号１の６１番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５３）配列番号１の６２番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（５４）配列番号１の６３番目のスレオニンがロイシン、フェニルアラニンに置換
（５５）配列番号１の６４番目のグルタミンがプロリン、ヒスチジン、ロイシン、リジンに置換
（５６）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンまたはバリンに置換
（５７）配列番号１の６６番目のセリンがスレオニンに置換
（５８）配列番号１の６７番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（５９）配列番号１の６９番目のセリンがアラニンに置換
（６０）配列番号１の７０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（６１）配列番号１の７１番目のアルギニンがチロシンに置換
（６２）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（６３）配列番号１の７４番目のセリンがフェニルアラニンに置換
（６４）配列番号１の７６番目のセリンがアスパラギンに置換
（６５）配列番号１の７７番目のバリンがアスパラギン酸またはリジンに置換
（６６）配列番号１の７８番目のアスパラギンがセリンまたはグリシンに置換
（６７）配列番号１の８０番目のセリンがアラニンに置換
（６８）配列番号１の８４番目のアルギニンがセリンに置換
（６９）配列番号１の８８番目のグリシンがセリンに置換
（７０）配列番号１の８９番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７１）配列番号１の９０番目のセリンがグリシンに置換
（７２）配列番号１の９２番目のアルギニンがシステインまたはロイシンに置換
（７３）配列番号１の９６番目のイソロイシンがバリンまたはリジンに置換
（７４）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンまたはリジンに置換
（７５）配列番号１の１０１番目のヒスチジンがロイシンに置換
（７６）配列番号１の１０２番目のアルギニンがセリンまたはロイシンに置換
（７７）配列番号１の１０３番目のグリシンがアスパラギン酸またはセリンに置換
（７８）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（７９）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがアラニン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、スレオニンまたはバリンに置換
（８０）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンまたはフェニルアラニンに置換
（８１）配列番号１の１１８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８２）配列番号１の１２１番目のアラニンがスレオニンまたはバリンに置換
（８３）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンまたはグリシンに置換
（８４）配列番号１の１２９番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（８５）配列番号１の１３１番目のロイシンがグルタミンに置換
（８６）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（８７）配列番号１の１３４番目のアスパラギンがセリンに置換
（８８）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（８９）配列番号１の１３８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（９０）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（９１）配列番号１の１４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（９２）配列番号１の１４１番目のグリシンがアスパラギン酸またはバリンに置換
（９３）配列番号１の１４２番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換
（９４）配列番号１の１４４番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（９５）配列番号１の１４７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（９６）配列番号１の１４８番目のヒスチジンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（９７）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（９８）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（９９）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニン、イソロイシンまたはプロリンに置換
（１００）配列番号１の１５４番目のスレオニンがセリンに置換
（１０１）配列番号１の１５６番目のロイシンがヒスチジンに置換
（１０２）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（１０３）配列番号１の１５９番目のアスパラギンがスレオニンまたはアスパラギン酸に置換
（１０４）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがスレオニン、バリンまたはロイシンに置換
（１０５）配列番号１の１６１番目のセリンがスレオニンに置換
（１０６）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（１０７）配列番号１の１７１番目のメチオニンがスレオニンに置換
（１０８）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（１０９）配列番号１の１７４番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１１０）配列番号１の１７７番目のスレオニンがセリンに置換
（１１１）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（１１２）配列番号１の１８２番目のセリンがスレオニン、ロイシン、バリンまたはグルタミン酸に置換
（１１３）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（１１４）配列番号１の１９０番目のプロリンがセリンに置換
（１１５）配列番号１の１９３番目のバリンがロイシンに置換
（１１６）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがアラニンに置換
（１１７）配列番号１の１９６番目のアラニンがセリンに置換
（１１８）配列番号１の１９８番目のバリンがグリシンまたはメチオニンに置換
（１１９）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２０）配列番号１の２００番目のセリンがグリシンまたはアルギニンに置換
（１２１）配列番号１の２０２番目のロイシンがメチオニンに置換
（１２２）配列番号１の２０３番目のロイシンがヒスチジン、グルタミン、チロシン、アルギニン、プロリンに置換
（１２３）配列番号１の２０４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１２４）配列番号１の２０７番目のロイシンがグルタミン、ヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１２５）配列番号１の２０９番目のスレオニンがアラニンに置換
（１２６）配列番号１の２１１番目のセリンがアルギニンまたはグリシンに置換
（１２７）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンまたはイソロイシンに置換
（１２８）配列番号１の２１５番目のリジンがアルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１２９）配列番号１の２１７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１３０）配列番号１の２１８番目のロイシンがイソロイシン、メチオニンまたはリジンに置換
（１３１）配列番号１の２１９番目のグルタミンがプロリンまたはアルギニンに置換
（１３２）配列番号１の２２３番目のロイシンがアルギニン、グルタミンまたはメチオニンに置換
（１３３）配列番号１の２２４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３４）配列番号１の２２５番目のロイシンがグルタミンに置換
（１３５）配列番号１の２２７番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（１３６）配列番号１の２３０番目のチロシンがヒスチジンまたはフェニルアラニンに置換
（１３７）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンまたはアルギニンに置換
（１３８）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンまたはアスパラギンに置換
（１３９）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１４０）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがグリシンに置換
（１４１）配列番号１の２４４番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１４２）配列番号１の２４５番目のチロシンがヒスチジンまたはグルタミン酸に置換
（１４３）配列番号１の２４６番目のグルタミンがアルギニンまたはリジンに置換
（１４４）配列番号１の２４８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（１４５）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（１４６）配列番号１の２５０番目のアラニンがバリンに置換
（１４７）配列番号１の２５１番目のアルギニンがセリンに置換
（１４８）配列番号１の２５２番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１４９）配列番号１の２５３番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（１５０）配列番号１の２５７番目のロイシンがアルギニンまたはグルタミンに置換
（１５１）配列番号１の２６１番目のグルタミン酸がバリンまたはアラニンに置換
（１５２）配列番号１の２６２番目のアラニンがバリンに置換
（１５３）配列番号１の２６３番目のアラニンがセリンに置換
（１５４）配列番号１の２６４番目のスレオニンがセリンに置換
（１５５）配列番号１の２６５番目のグルタミン酸がアラニンまたはグリシンに置換
（１５６）配列番号１の２６８番目のアスパラギンがセリン、イソロイシンまたはスレオニンに置換
（１５７）配列番号１の２７０番目のロイシンがヒスチジン、アルギニンまたはバリンに置換
（１５８）配列番号１の２７１番目のリジンがアルギニンに置換
（１５９）配列番号１の２７２番目のアルギニンがグルタミンに置換
（１６０）配列番号１の２７７番目のグルタミン酸がバリンに置換
（１６１）配列番号１の２７９番目のグルタミンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６２）配列番号１の２８２番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１６３）配列番号１の２８３番目のロイシンがプロリンに置換
（１６４）配列番号１の２８５番目のロイシンがアルギニンまたはヒスチジンに置換
（１６５）配列番号１の２８６番目のプロリンがグルタミン、アルギニンまたはグルタミン酸に置換
（１６６）配列番号１の２８７番目のスレオニンがイソロイシン、プロリン、アラニンまたはバリンに置換
（１６７）配列番号１の２８８番目のプロリンがアラニン、セリンまたはスレオニンに置換
（１６８）配列番号１の２８９番目のバリンがアラニン、アスパラギン酸、グリシン、ロイシンまたはイソロイシンに置換
本発明のタンパク質は、前述したＦｃ結合性タンパク質を化学修飾して負電荷を有する解離基を導入することで得ることができる。前記化学修飾はＦｃ結合性タンパク質を発現する宿主の培養液の段階で行なってもよいし、Ｆｃ結合性タンパク質を高度に精製した段階で行なってもよいし、その中間段階で行なってもよい。なおＦｃ結合性タンパク質の精製は、遠心分離、限外ろ過、硫酸アンモニウム沈殿分画、カラムクロマトグラフィー等様々な方法を組み合わせることで、目的の純度に達するまで行なえばよい。
【００２２】
本発明における負電荷を有する解離基は、カルボキシル基、硫酸基、または硝酸基等があげられるが、その中でもカルボキシル基が好ましく用いられる。本発明のタンパク質は前記解離基を有する化合物をＦｃ結合性タンパク質に作用させることで得ることができる。前記化合物のうち、カルボキシル基を有する化合物としてはモノヨード酢酸に代表されるハロアルキル酸や無水コハク酸に代表される複数のカルボキシル基を有する酸の無水物が例示される。前記化合物で処理することにより、Ｆｃ結合性タンパク質のうち、リジン残基のアミノ基、ヒスチジン残基のイミダゾール基、システイン残基のチオール基、チロシン残基のフェノール基、セリンまたはスレオニン残基の水酸基等が、各基の反応性に応じてランダムに修飾される。化学修飾を行なうアミノ酸残基の場所については、Ｆｃ結合性タンパク質が有する抗体結合活性を失わず、かつ安定性が向上する範囲であれば、特に限定はない。化学修飾を行なう際の温度、ｐＨ、塩濃度、Ｆｃ結合性タンパク質と前記化合物との比率、反応時間等については、Ｆｃ結合性タンパク質、使用する化合物、必要な安定性等を考慮し適宜設定すればよい。無水コハク酸で処理する方法の一例として、Ｆｃ結合性タンパク質に対し１０等量以上（好ましくは１０から６５等量、さらに好ましくは２０から４０等量）の無水コハク酸で、２３℃で２時間、０．６Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）中で処理する方法があげられ、当該処理によりアルカリ性溶液（例えば、１００ｍＭ以下の水酸化ナトリウム水溶液）に対する耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質を得ることができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のタンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質を化学修飾して負電荷を有する解離基を導入することで得ることができる。本発明のタンパク質は、化学修飾のないＦｃ結合性タンパク質と比較し、特にアルカリ環境下において、高い安定性を示す。また本発明のタンパク質は、その特徴である免疫グロブリンのＦｃ領域への特異的結合活性は保持している。そのため本発明のタンパク質は、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）といった様々な用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒトＦｃγＲＩの構造を示す概略図。
【図２】無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性をＥＬＩＳＡ法で解析した結果。図中、黒丸は無水コハク酸で処理した結果を、白丸は無水酢酸で処理した結果を、それぞれ示す。
【図３】無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真。図中、レーン１は未処理のＦｃ結合性タンパク質の、レーン２は１．３等量の無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の、レーン３は２．５等量の無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の、レーン４は５等量の無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の、レーン５は１０等量の無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の、レーン６は２０等量の無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の、レーン７は４０等量の無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の、レーン８は６２．５等量の無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質の、それぞれ電気泳動写真である。
【図４】無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質のＮａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真。図中のレーン番号は図３と同じである。
【図５】無水コハク酸または無水酢酸で処理したＦｃ結合性タンパク質のアルカリ性溶液（１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液）に対する耐性を評価した結果。図中、白丸は無水コハク酸２０等量で処理したＦｃ結合性タンパク質の、黒丸は無水コハク酸４０等量で処理したＦｃ結合性タンパク質の、白三角は無水酢酸２０等量で処理したＦｃ結合性タンパク質の、黒三角は無水酢酸４０等量で処理したＦｃ結合性タンパク質の、×は未処理のＦｃ結合性タンパク質の、それぞれ結果である。
【実施例】
【００２５】
以下に実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではなく、発明の要旨を逸脱しない範囲で、任意に変更が可能であることはいうまでもない。
【００２６】
実施例１  Ｆｃ結合性タンパク質の調製
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードする、配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを、公知の方法（例えば特許文献１の方法）により、プラスミドｐＴｒｃ９９ａのＮｃｏＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入することで、発現ベクター（ｐＴｒｃｐｅｒＢＦｃＲｍ３２）を作製した。なお、配列番号２のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ３２のアミノ酸配列、３０８番目から３１３番目のヒスチジンがポリヒスチジンタグである。またＦｃＲｍ３２は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒト天然型ＦｃγＲＩのうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、かつ、下記に示すアミノ酸置換を行なったＦｃ結合性タンパク質である。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンをプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンをリジンに置換
（３）配列番号１の３６番目のグルタミン酸をグリシンに置換
（４）配列番号１の３８番目のスレオニンをセリンに置換
（５）配列番号１の４５番目のバリンをアラニンに置換
（６）配列番号１の４６番目のロイシンをプロリンに置換
（７）配列番号１の４９番目のプロリンをセリンに置換
（８）配列番号１の６０番目のグリシンをアスパラギン酸に置換
（９）配列番号１の６３番目のスレオニンをイソロイシンに置換
（１０）配列番号１の６５番目のスレオニンをアラニンに置換
（１１）配列番号１の６９番目のセリンをスレオニンに置換
（１２）配列番号１の７１番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（１３）配列番号１の７７番目のバリンをグルタミン酸に置換
（１４）配列番号１の７８番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（１６）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（１７）配列番号１の１３３番目のチロシンをヒスチジンに置換
（１８）配列番号１の１３９番目のアルギニンをヒスチジンに置換
（１９）配列番号１の１４９番目のトリプトファンをアルギニンに置換
（２０）配列番号１の１５６番目のロイシンをプロリンに置換
（２１）配列番号１の１６０番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（２２）配列番号１の１６３番目のアスパラギンをセリンに置換
（２３）配列番号１の１７３番目のリジンをアルギニンに置換
（２４）配列番号１の１８１番目のイソロイシンをスレオニンに置換
（２５）配列番号１の１９５番目のアスパラギンをスレオニンに置換
（２６）配列番号１の２０３番目のロイシンをヒスチジンに置換
（２７）配列番号１の２０６番目のアスパラギンをスレオニンに置換
（２８）配列番号１の２０７番目のロイシンをグルタミンに置換
（２９）配列番号１の２３１番目のメチオニンをリジンに置換
（３０）配列番号１の２４０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換
（３１）配列番号１の２８３番目のロイシンをヒスチジンに置換
（３２）配列番号１の２８５番目のロイシンをグルタミンに置換
（Ｂ）（Ａ）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｒＢＦｃＲｍ３２を用いて、公知の方法（例えば特許文献１の方法）により、大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（Ｃ）形質転換体を、１００ｍＬの２×ＹＴ培地（バクトトリプトン：１６ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム：５ｇ／Ｌ、アンピシリン：０．１ｍｇ／Ｌ）を入れた、５００ｍＬ容バッフル付三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間、毎分１３０回の回転速度、回転半径１インチで前培養を行なった。
（Ｄ）表１に示す培地組成のうち、酵母エキス、リン酸三ナトリウム十二水和物およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物を投入した培地約１．４Ｌを３Ｌの発酵槽に入れ、１２１℃で２０分間滅菌後、表１に示す残りの培地成分を添加し、さらに（Ａ）の前培養液９０ｍＬを添加して、本培養を行なった。培養装置はエイブル社製ＢＭＳ−０３ＰＩを使用し、通気した空気速度は１．８Ｌ／分に、培養温度は３０℃に、ｐＨは６．９から７．１にそれぞれ設定し、培養中におけるｐＨの変動は、１４％アンモニア水または５０％リン酸の添加により前記範囲に制御した。培養中はグルコース分析計（ＹＳＩ社製２７００）を用いて定期的にグルコース濃度を測定した。炭素源の供給には７００ｇ／Ｌのグルコースを、窒素源の供給には４００ｇ／Ｌの酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）を、それぞれ使用した。供給は、炭素源の溶液と窒素源の溶液を容量比１：１で混合して行なった。エイブル社製ＤＯ（溶存酸素）電極による信号を、エイブル社製培養制御プログラムをインストールしたパーソナルコンピューターにより検出することで、本培養初期に投入したグルコース（２０ｇ／Ｌ）が消費されたことを検知し、溶存酸素濃度が４０％飽和を超えた時点で流加ポンプを起動してグルコース３５０ｇ／Ｌ、酵母エキス２００ｇ／Ｌの混合液を供給した。供給にはワトソン・マーロウ社製定量ポンプ１０１Ｕの高速型を使用した。微生物の増殖は培養液の６００ｎｍの濁度（ＯＤ６００ｎｍ）により測定した。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（Ｅ）ＯＤ６００ｎｍが９０に達したとき、すなわち培養開始１０時間後に培養温度を２５℃に下げ、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるよう培養液に添加することで、Ｆｃ結合性タンパク質の生産誘導をかけた。
【００２９】
４８時間培養を行なったところ、培養液の濁度は１６０に達した。予め求めた濁度と菌体密度の相関式より、乾燥菌体収量は培養液１Ｌあたり４６ｇと求められた。なお、グルコース濃度は、グルコースと酵母エキスの供給を開始した、培養開始８時間後から培養終了（４８時間後）までの期間中、０から０．１ｇ／Ｌに維持された。また、培養終了後の培養液に含まれるＦｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩ）の生産量を特許文献６に記載のＥＬＩＳＡ法により定量した結果、培養液１Ｌあたり１１００ｍｇであった。
【００３０】
実施例２  ＦｃＲの精製
（Ａ）実施例１の培養液１Ｌより、日立冷却遠心機ＣＲ２０ＧＩＩおよびローターＲＰＲ−９−２を使用し、４℃において８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離を行ない、湿菌体２５０ｇを得た。
（Ｂ）得られた湿菌体を１Ｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に懸濁した後、０．３ｇのリゾチーム、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の２０％水溶液１０ｍＬ、デオキシコール酸ナトリウムの１％水溶液１０ｍＬを順次添加し、引き続き０．３Ｍの硫酸マグネシウム水溶液２０ｍＬおよび２５０Ｕ／ｕＬのベンゾナーゼ溶液（メルク社製）１μＬを加え、４℃で一晩放置した。
（Ｃ）放置後、硫酸アンモニウム１４４ｇを加え、日立冷却遠心機ＣＲ２０ＧＩＩおよびローターＲＰＲ−９−２を使用し、４℃において８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離を行ない、上清を回収した。
（Ｄ）回収した上清を、予め緩衝液Ｂ（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−１０ｗ／ｖ％硫酸アンモニウム）で平衡化した容量５０ｍＬのＰｈｅｎｙｌトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）に通過させることで、Ｆｃ結合性タンパク質を吸着させた。引き続きカラムに未吸着の不純物を、カラム通過液のＵＶ吸収が十分に低下するまで緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液Ｃ（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２０ｗ／ｖ％グリセロール）でＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（Ｅ）溶出画分に純水を加えることで電気伝導度１０ｍＳ／ｃｍに調整後、さらに尿素を終濃度１Ｍになるように添加した。この溶液を、予め緩衝液Ｄ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−１Ｍ尿素）で平衡化した容量２０ｍＬのＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）に通過させることで、Ｆｃ結合性タンパク質を吸着させた。引き続きカラムに未吸着の不純物を、カラム通過液のＵＶ吸収が十分に低下するまで緩衝液Ｄで洗浄し、緩衝液Ｅ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−１Ｍ尿素−１Ｍ  ＮａＣｌ）でＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（Ｆ）溶出画分を緩衝液Ｆ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化した容量２０ｍＬのＣＭトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー社製）に通過させることで、Ｆｃ結合性タンパク質を吸着させ、０から１ＭまでのＮａＣｌの濃度勾配溶出により溶出することにより、精製Ｆｃ結合性タンパク質約３００ｍｇ（タンパク質溶液濃度３．５５ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００３１】
実施例３  Ｆｃ結合性タンパク質の無水コハク酸処理
（Ａ）無水コハク酸をＤＭＳＯで希釈し、０から５０ｍＭの溶液を調製した。
（Ｂ）実施例２で調製したＦｃ結合性タンパク質溶液１．０８ｍＬに、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）２．１２ｍＬを加えることで、濃度１．２ｍｇ／ｍＬ（４．０×１０−５Ｍ）のＦｃ結合性タンパク質溶液を調製した。
（Ｃ）調製したＦｃ結合性タンパク質溶液１００μＬに（Ａ）の無水コハク酸溶液５μＬ（Ｆｃ結合性タンパク質に対し無水コハク酸を１．３から６２．５当量）加え、ディープウェルプレートマキシマイザー（タイテック社製）により、２３℃で２時間、５００ｒｐｍで振とうすることで処理を行なった。処理後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬを加えて２３℃で１時間、５００ｒｐｍで振とうすることで処理を停止した。
【００３２】
反応後の残存活性を、特許文献６に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定したところ、約１０当量までは活性への影響は認められなかった。しかしながら、１０当量を超える領域では、無水コハク酸当量（無水コハク酸濃度）依存的に活性が低下した。最も高濃度である無水コハク酸６２．５当量の条件で修飾反応を行なった場合、Ｆｃ結合性タンパク質が有する抗体結合活性は処理前と比較し６０から８０％となった（図２の黒丸）。各濃度の無水コハク酸溶液で処理した後のＦｃ結合性タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析した結果、いずれの溶液で修飾反応を行なっても同一の分子量を示すことを確認した（図３）。すなわち、Ｆｃ結合性タンパク質への無水コハク酸処理による、前記タンパク質の重合や分解は生じていないことが確認された。一方各濃度の無水コハク酸溶液で処理した後のＦｃ結合性タンパク質を、ＳＤＳ無添加のＮａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果では、無水コハク酸１０当量までは大きな変化はないものの、２０から６２．５当量では移動度が大きくなる現象が確認された（図４）。この現象は無水コハク酸処理によりカルボキシル基が付加され、付加されたＦｃ結合性タンパク質の負電荷が増加したため電気泳動における移動度が大きくなったためである。すなわち、無水コハク酸処理によりカルボキシル基が導入されたことが確認された。
【００３３】
比較例１  Ｆｃ結合性タンパク質の無水酢酸処理
無水コハク酸の代わりに無水酢酸を用いた他は、実施例３と同様に実験を行なった。無水酢酸処理した場合も、約１０当量までは活性への影響は認められず、１０当量を超える領域では無水酢酸当量（無水酢酸濃度）依存的に活性が低下した。最も高濃度である無水酢酸６２．５当量の条件で処理を行なった場合、Ｆｃ結合性タンパク質が有する抗体結合活性は処理前と比較し３０から５０％となった（図２の白丸）。各濃度の無水酢酸溶液で処理した後のＦｃ結合性タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析した結果、いずれの溶液で修飾反応を行なっても同一の分子量を示すことを確認した（図３）。一方各濃度の無水酢酸溶液で処理した後のＦｃ結合性タンパク質を、ＳＤＳ無添加のＮａｔｉｖｅポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果では、無水酢酸１０当量までは大きな変化はないものの、２０から６２．５当量では移動度が大きくなる現象が確認された（図４）。しかしながら、その移動度の変化は無水コハク酸処理よりは小さかった。これは無水酢酸処理による正電荷の減少が、カルボキシル基の導入による化学修飾に由来するものではなく、むしろリジン残基のアミノ基等がアセチル化されることに由来するからである。
【００３４】
実施例４  無水コハク酸処理したＦｃ結合性タンパク質の耐アルカリ性評価
（Ａ）実施例３に記載の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質を、タンパク質当たり２０当量または４０当量の無水コハク酸で処理した。処理後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で透析し、さらに０．１５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液で透析することで脱塩した。
（Ｂ）脱塩後の溶液に等量の２００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を加え、２５℃で静置保温した（水酸化ナトリウム水溶液の終濃度１００ｍＭ）。静置保管中は経時的に２０μＬずつ回収を行なった。回収液は１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１８０μＬをそれぞれ加えて中和し、４℃に冷却した。
（Ｃ）中和した回収液を、特許文献６に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて残存活性を測定した。
【００３５】
結果を図５の白丸（２０等量の無水コハク酸で処理）および黒丸（４０等量の無水コハク酸で処理）に示す。無水コハク酸処理したＦｃ結合性タンパク質は１００分処理後も約５０％の活性を保持した。比較のため未処理のＦｃ結合性タンパク質を（Ｂ）と同様の処理を行ない、残存活性を測定した。結果、水酸化ナトリウム水溶液添加後、直ちに失活することが判明した（図５の×）。また比較のため、Ｆｃ結合性タンパク質を実施例３と同様な方法で、タンパク質当たり２０当量または４０当量の無水酢酸にて処理したものを（Ｂ）と同様の処理を行ない、残存活性を測定した。結果、図５の白三角（２０等量の無水酢酸で処理）および黒三角（４０等量の無水酢酸で処理）に示すように、未処理のＦｃ結合性タンパク質と同様、水酸化ナトリウム水溶液添加後、直ちに失活することが判明した。すなわち、Ｆｃ結合性タンパク質をアセチル化する方法では、耐アルカリ性を改善することができないことがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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