(57)【要約】【課題】ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を迅速かつ簡便に検出する方法の提供。【解決手段】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いたピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて試料中のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を検出する方法。
【請求項２】
表面上に抗ＰＱＱ抗体を固定化したＳＰＲセンサーチップを備えたＳＰＲ装置を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料が血清を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料中のＰＱＱ含量を定量する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
抗ＰＱＱ抗体がポリクローナル抗体である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
表面上に抗ＰＱＱ抗体を固定化してなる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴（以下、単に「ＳＰＲ」ということがある）法を用いてピロロキノリンキノンを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノン（以下、単に「ＰＱＱ」ということがある）は、ビタミンの可能性を有する物質として発見され、注目を集める物質である。ＰＱＱは、特に、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防・治療作用、創傷治癒促進作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用、グリオキシラーゼＩ阻害作用および制癌作用などの多くの重要な生理活性を有することが知られ、ＰＱＱ利用の産業上の重要性が高まっている。ＰＱＱは、細菌並びにカビおよび酵母など真菌に広く存在し、これらから精製することで調製することができるが、有機化学的合成法や発酵法などによって調製することもできる。
【０００３】
ＰＱＱの測定法としては、酵素活性を用いた方法（酵素法）、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）を用いた方法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた方法が知られている。酵素法によるＰＱＱの測定法は、大腸菌またはアシネトバクター・カルコアセチカス由来のキノプロテインであるグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）のアポタンパク質（補酵素であるＰＱＱを欠いたタンパク質）のＰＱＱ依存性酵素活性を指標とした測定法であり、ｎＭオーダーの濃度でのＰＱＱの定量性が報告されている（非特許文献１）。一方、ＧＣ／ＭＳ法では、１３Ｃを導入したＰＱＱを内部標準として用いることで定量精度を高めることができ、数十ｐｇレベルでのＰＱＱの定量性が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、ＧＣ／ＭＳ法は前処理が複雑かつ煩雑であり、迅速性や簡便性の点で不利である。また、ＨＰＬＣを用いた方法は比較的簡便であるが、アミノ酸やタンパク質が存在する溶液の場合、検出が困難となる可能性がある。特に、血清などを含む溶液の分析には適さないと考えられる。
【０００４】
また、これらとは別の方法で、ＰＱＱを３−［１−メチル−３，５−ジ（メトキシカルボニル）ピロール−２−イル］−２，４，６−トリ（メトキシカルボニル）ピリジンに変換した後に、変換後の化合物量を測定する方法なども知られている（特許文献１および２）が、変換処理や測定の際に特殊な内部標準を必要とする点で、簡便な方法とは言えない。
【０００５】
これらに対して、抗体を用いる測定方法が広く知られているが、ＰＱＱのような低分子の抗体を作製することは困難であると考えられ、また、仮に抗ＰＱＱ抗体を得られたとしても、従来の免疫沈降法やＥＬＩＳＡ法は手順が煩雑であり、簡便な方法とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１−３１２４６１号公報
【特許文献２】特開平４−１４５３６０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ameyama M. et. al., Analytical Biochemistry, 1985, Vol. 151, p263-267
【非特許文献２】Kumazawa T. et. al., Bichem. Biophys. Acta, 1992, Vol. 1156, p62-66
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を迅速かつ簡便に検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＰＱＱとタンパク質とのコンジュゲートを免疫に使用することにより、良好な抗ＰＱＱ抗体を得られること、および得られた抗ＰＱＱ抗体がＳＰＲによるＰＱＱの定量に良好に用いることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１０】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて試料中のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を検出する方法。
（２）表面上に抗ＰＱＱ抗体を固定化したＳＰＲセンサーチップを備えたＳＰＲ装置を用いる、上記（１）に記載の方法。
（３）試料が血清を含有する、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）試料中のＰＱＱ含量を定量する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）抗ＰＱＱ抗体がポリクローナル抗体である、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）表面上に抗ＰＱＱ抗体を固定化してなる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップ。
【００１１】
本発明では、ＳＰＲを利用して迅速かつ簡便に試料中のＰＱＱを検出することができる。本発明の方法は特に、飲食品や血液、血清、細胞培養用培地などの不純物を含む試料中のＰＱＱを簡便かつ迅速に検出できる点で極めて有利である。
【発明の具体的な説明】
【００１２】
本発明の方法による検出対象のＰＱＱは、下記式（１）で示される化学構造を有する。
【化１】
2013160712.tif 000002
【００１３】
ＰＱＱは溶液中では還元され、下記式（２）で示される化学構造を有する場合があるが、本発明の方法では式（２）で示される化学構造を有するＰＱＱ（還元型ＰＱＱ）も検出することができる。すなわち、本発明のＰＱＱを検出する方法は式（２）で示される化学構造を有する還元型ＰＱＱを検出する態様も含むものとする。
【化２】
2013160712.tif 000003
【００１４】
ＰＱＱはまた、血清や培地などの試料中において、タンパク質などの他の成分と反応してＰＱＱ類縁体を形成していることがあるが、本発明の方法ではこのようなＰＱＱ類縁体も検出することができる。すなわち、本発明のＰＱＱを検出する方法はこのようなＰＱＱ類縁体を検出する態様も含むものとする。
【００１５】
上記のＰＱＱ類縁体は、式（１）で示される化学構造を有するＰＱＱと他の成分とから構成される複合体であれば特に限定されないが、例えば、下記式（３）で示される化学構造を有する複合体、下記式（４）で示される化学構造を有する金属錯体および下記式（５）で示される化学構造を有する複合体が挙げられる。
【化３】
2013160712.tif 000004
（上記式中、Ｒはアミノ酸残基を表す。）
【化４】
2013160712.tif 000005
（上記式中、Ｍは金属イオンを表し、Ｍを介してタンパク質やペプチドと結合していてもよい。）
【化５】
2013160712.tif 000006
（上記式中、Ｐはタンパク質残基またはペプチド残基を表す。）
【００１６】
表面プラズモン共鳴では、一般的に、ＳＰＲセンサーチップ上に固定化された物質と試料中の測定対象の物質とが結合すると、光を照射した際に生じる共鳴角に変化がもたらされ、共鳴角の変化を測定することにより測定対象の物質を検出することが可能である。ＳＰＲは、検出感度に優れ、また測定が１検体あたり１５分程度であることから、迅速かつ簡便な測定が可能である点で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や競合ＥＬＩＳＡなどのＥＬＩＳＡ法、酵素法などの方法と比べて有利である。
【００１７】
表面プラズモン共鳴装置（ＳＰＲ装置）としては、ＳＰＲ原理を用いた測定が可能な装置であればいずれの装置であってもよく、市販の装置を用いてもよい。一般的なＳＰＲ装置では、偏光をプリズムで全反射させて、ＳＰＲセンサーチップの基板に照射し、表面プラズモン共鳴を引き起こし、その後、試料溶液とＳＰＲセンサーチップとを接触させて生じる共鳴角の変化を測定することにより、試料中の物質の検出を行うことができる。
【００１８】
本発明のＳＰＲセンサーチップは、例えば、透明基板とその表面上の金属膜から形成され、ＰＱＱを検出するためにその表面上にさらに、抗ＰＱＱ抗体や上記のＰＱＱ依存性脱水素酵素などのＰＱＱ結合物質が固定化され得る。金属膜は、透明基板に直接的に接していることもあれば、クロム等からなる他の層（介在層）を介して間接的に接していても良い。
【００１９】
本発明のＳＰＲセンサーチップの透明基板としては、ＳＰＲに用いられるものであればいずれのものであっても良いが、例えば、ガラス製、ポリエチレンテレフタラート製、ポリカーボネート製などの照射レーザー波長に対して光学的に透明な材料からなるものを好適に用いることができる。透明基板は、偏光性を示さず、加工性に優れた材料からなることが好ましく、０．１〜２０ｍｍ厚であることが好ましい。
【００２０】
本発明のＳＰＲセンサーチップの金属膜としては、表面プラズモン共鳴が生じうるものであれば特に限定されないが、例えば、金、銀、銅、アルミニウム若しくは白金、またはこれらの混合物から形成される金属膜が挙げられる。金属膜の膜厚は、好ましくは１００〜２０００Åであり、より好ましくは２００〜６００Åである。金属膜の形成は常法により行うことができ、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気メッキ法、無電解メッキ法等の当業者に周知の方法によって行うことができ、好ましくは、スパッタ法を用いることができる。
【００２１】
ＳＰＲセンサーチップへの抗ＰＱＱ抗体の固定化は、製造者による取扱説明書などに記載の方法により行うことができる。
【００２２】
本発明の方法によるＰＱＱの検出は、抗ＰＱＱ抗体を通常の方法でＳＰＲのセンサーチップ上に固定化し、洗浄した後に、試料と接触させ、光を照射した際に生じる共鳴角の変化を検出することにより行うことができる。より具体的には、共鳴角の０．１°の変化を１，０００共鳴単位（ＲＵ）とした場合、１共鳴単位はＰＱＱの５０μＭの濃度変化に相当することが確認されており、共鳴角の変化から結合したタンパク質量を見積もることができる。このように本発明の方法ではＰＱＱを定量することができることから、本発明の方法はＰＱＱの定量方法として実施することができる。
【００２３】
ＰＱＱは分子量３３０程度の小分子であることから、ＰＱＱに対する良好な抗体は一般的な方法では得ることが困難である。しかし、本発明によれば、ＰＱＱの高分子量化が良好な抗ＰＱＱ抗体の作製に有効であった。具体的には、ＰＱＱと巨大生体分子とのコンジュゲートを免疫に使用する方法を用いることでＰＱＱに対する良好な抗体が得られ、得られた抗ＰＱＱ抗体はＳＰＲによるＰＱＱの検出に良好に用いることができた。
【００２４】
ＰＱＱの高分子量化に用いることができる生体分子としては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）若しくはＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）などのタンパク質またはこれらタンパク質の混合物などが挙げられる。作製する抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であっても良いが、感度および取得容易性の観点からは、ポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００２５】
上記のようにして得られた抗ＰＱＱ抗体は式（１）の酸化型ＰＱＱのみならず、式（２）の還元型ＰＱＱや、試料中（特に血清や培地中）の成分と複合体を形成したＰＱＱ類縁体も検出することができ、ＰＱＱを網羅的に検出できる点で有利である。
【００２６】
本発明による測定試料は、不純物を多種多様に含む試料であってもよく、特に限定されないが、例えば、食品、アルコール飲料や清涼飲料水などの飲食品とすることができる。すなわち、本発明によれば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて飲食品中のＰＱＱを検出する方法が提供される。
【００２７】
また、本発明によれば、通常の方法では測定困難な、血清やタンパク質を多量に含む試料であっても、極めて迅速かつ簡便な手順によって、感度良く測定が可能である。すなわち、本発明によれば、血清を含む試料中のＰＱＱを検出する方法が提供される。血清を含む試料としては、例えば、ヒト、マウス、ウシ若しくはブタ等の哺乳動物から採取した血液、または細胞培養用の培地などを挙げることができる。
【実施例】
【００２８】
実施例１：抗ＰＱＱ抗体の作製
（１）ＰＱＱをコンジュゲートした抗原タンパク質の作製
１５ｍｇのＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）およびＢＳＡ（ウシ血清アルブミン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を３ｍＬのＰＢＳに溶解させ、１ｍｇのＰＱＱジナトリウム塩、６０ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、３０ｍｇのＥＤＣ（１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル（カルボジイミド））；サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を添加し混合した後に、室温で５時間静置し、次いで３ＬのＰＢＳ（４℃）で２４時間透析した。透析の際には、ＰＢＳを３回交換した。
【００２９】
得られた抗原タンパク質の定量はＢＣＡ法により実施した。具体的には、ＢＣＡプロテインアッセイリエージェントキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、１０μＬの超純水、１０μＬのＢＣＡスタンダード（ＢＳＡ濃度：２００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬまたは２０００μｇ／ｍＬの６通りの希釈系列）、および１０μＬの抗原タンパク質をそれぞれ９６穴プレートに２ウェルずつアプライした。各ウェルに、キットの試薬Ａと試薬Ｂとを５０：１の容積比で混合した溶液を２００μＬずつさらに添加し、攪拌後、３７℃で３０分間加熱した。その後、室温で５分以上静置した後に、マイクロプレートリーダを用いて吸光度（５６２ｎｍ）を測定し、抗原タンパク質量を算出した。
【００３０】
（２）抗原タンパク質によるマウスの免疫
免疫には、６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用いた。３００μＬのＰＢＳに溶解させた抗原タンパク質（０．６ｍｇ／ｍＬ）と３００μＬのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ‘ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｂａｎｔ；和光純薬社製）とを混合し、エマルジョン化してから、そのうちの１００μＬをマウスの腹腔内に投与した（初回免疫）。初回免疫の１０日後、３００μＬのＰＢＳに溶解させた抗原タンパク質（０．２ｍｇ／ｍＬ）とアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｂａｎｔ；和光純薬社製）とを混合し、エマルジョン化してから、そのうちの１００μＬをマウスの腹腔内に投与した（追加免疫）。追加免疫のさらに１週間後、マウスの尾静脈から採血し、血液を凝固させた後に、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、２μＬの血清（抗ＰＱＱ抗体を含む）を回収した。
【００３１】
実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いたＰＱＱの定量
（１）リン酸緩衝液中のＰＱＱの定量
ＳＰＲチップとしては金チップ（ＮＴＴ−ＡＴ製）を用い、実施例１で作製した抗体を通常の方法でチップ表面に固定した。チップ表面をブロッキングした後に、ＳＰＲ装置（製品名：ＰＳ−０１１１、ＮＴＴ−ＡＴ社製）に取り付け、ＰＱＱジナトリウム塩を溶解したリン酸緩衝液を５μＬ／分で流して、チップ表面に固定化された抗体と溶液中のＰＱＱジナトリウム塩との結合を、共鳴角を６７．６９０°から６７．６９７°へと増加させるＳＰＲシグナルとして検出した。この共鳴角度の変化はＰＱＱジナトリウム塩濃度に依存する。リン酸緩衝液に溶解したＰＱＱジナトリウム塩は、１０ｍＭ以上の濃度で検出が可能であった。
【００３２】
（２）血清を含む培地中のＰＱＱの定量
次に、リン酸緩衝液を用いる代わりに、血清を含む培地を用いる以外は、上記（１）と同様の方法により、ＰＱＱジナトリウム塩の定量を試みた。培地としては、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するα−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）を用いた。血清を含有する培地中では、チップ表面に固定化された抗体と溶液中のＰＱＱジナトリウム塩との結合を、共鳴角を６７．９０°から６７．９２°へと増加させるＳＰＲシグナルとして検出した。この共鳴角度の変化はＰＱＱジナトリウム塩濃度に依存する。血清を含む環境下のＳＰＲシグナルは、（１）でのバッファー環境（リン酸緩衝液）下のＳＰＲシグナルよりも大きく、検出により適していることが分かった。血清を含む培地中のＰＱＱジナトリウム塩も、１０ｍＭ以上の濃度で検出が可能であった。
【００３３】
このように実施例１で作製した抗体を用いたＳＰＲでは、リン酸緩衝液中のＰＱＱジナトリウム塩および血清を含む培地中のＰＱＱジナトリウム塩のいずれでも、ＰＱＱジナトリウム塩の定量を極めて迅速かつ簡便な手順で行うことができた。ＰＱＱは分子量３３０程度の低分子であり、抗体作製やＳＰＲによる検出が困難であることを考慮すれば、ＳＰＲにより１０ｍＭ程度の感度でＰＱＱを検出できたことは驚くべき結果であると考えられる。
【００３４】
比較例１：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＰＱＱの定量
（１）リン酸緩衝液中のＰＱＱの定量
実施例２では、実施例１で作製した抗体を用いたＳＰＲにより溶液中のＰＱＱ濃度の定量を行ったが、本比較例では、従来技術であるＨＰＬＣを用いたＰＱＱの定量を行った。
【００３５】
ＨＰＬＣは、ＬＣ−２０Ａ（島津製作所製）および粒径５μｍのＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＴＭＳカラム（１５０×４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．）を用い、測定温度を４０℃とした。カラムに、実施例２で調製したリン酸緩衝液中のＰＱＱジナトリウム塩を流し込んだ後に、ＰＱＱジナトリウム塩の溶出液として１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａを用い、溶出速度は１．５ｍＬ／分として、ＰＱＱジナトリウム塩を溶出させて定量を試みた。
【００３６】
その結果、リン酸緩衝液中のＰＱＱジナトリウム塩は、１０ｍＭ以上の濃度で検出が可能であった。
【００３７】
（２）血清を含む培地中のＰＱＱの定量
リン酸緩衝液中のＰＱＱジナトリウム塩の代わりに、血清を含む培地中のＰＱＱジナトリウム塩をカラムに流し込む以外は、上記（１）と同様の方法により、ＰＱＱジナトリウム塩の定量を試みた。リン酸緩衝液中のＰＱＱジナトリウム塩は１０ｍＭ以上の濃度で検出が可能であったのに対して、血清を含む培地中のＰＱＱジナトリウム塩は、１０ｍＭの濃度では検出不能であった。このように、ＨＰＬＣによる測定では、操作が煩雑で時間がかかる上に、測定が血清等の培地成分により困難となることが分かった。
【００３８】
比較例２：競合ＥＬＩＳＡ法によるＰＱＱの定量
本比較例では、実施例１で作製した抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡ法によりＰＱＱの定量を行った。
【００３９】
９６穴プレートに１ウェル当り１００μＬの５０μＬ／ｍＬのＰＱＱ−ＢＳＡをアプライし、一晩静置した。２００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄し、２００μＬのスキムミルクを用いて３７℃、４００ｒｐｍの条件で１時間ブロッキングした。ウェルをさらに２００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、血清と５０μＬ／ｍＬのＰＱＱ−ＢＳＡとを１：１の容積比で混合した混合溶液をウェルに１００μＬずつアプライし、３７℃、４００ｒｐｍの条件で１時間反応させた。その後、２００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した。プレートに固定されたＰＱＱ−ＢＳＡと結合した抗体を検出するため、５０００分の１に希釈した抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）をウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃、４００ｒｐｍの条件で１時間反応させた。２００μＬのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄し、各ウェルに１００μＬの発色液（６ｍｇ  ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）および３０％  Ｈ２Ｏ２を含有する０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム）を添加して、発色させ、５０μＬの２Ｎ硫酸で反応を停止させて、４９２ｎｍの吸光度を測定することにより、ＰＱＱの定量を行った。
【００４０】
ＰＱＱは、１０ｍＭの濃度で検出することが可能であったが、競合ＥＬＩＳＡ法による測定には多大な時間を要し、手順も煩雑であった。
【００４１】
比較例３：酵素法によるＰＱＱの定量
ＰＱＱはグルコース脱水素酵素の補酵素として機能することが知られている。そこで、本比較例では、ＰＱＱを補酵素としてグルコース脱水素酵素に取り込ませ、得られたグルコース脱水素酵素の酵素活性からＰＱＱを定量することを試みた。
【００４２】
まず、ホロ型のグルコース脱水素酵素であるＡｍａｎｏ５（ＧＤＨ；天野エンザイム社製）からＰＱＱを除去するために、透析を行った。具体的には、Ａｍａｎｏ５を透析バッファー１（０．１Ｍ酢酸ナトリウム（和光純薬社製）、３Ｍ臭化カリウム（和光純薬社製）、ｐＨ７．０）に０．４ｍｇ／ｍＬで溶解させ、透析チューブに入れて両端をタコ糸で縛った。透析外液としても５００ｍＬの透析バッファー１を用いて、４日間にわたり透析を行った。透析の際、透析外液は１日１回の頻度で交換した。４日目に透析外液を透析バッファー２（０．０２Ｍリン酸水素カリウム、ｐＨ７．０）に交換し、その後、１時間おきに透析外液を透析バッファー２で３回交換した。針付きシリンジを用いて透析チューブ内の酵素溶液を吸い出し、等量の１００％グリセロール（和光純薬社製）を加えて、グルコース脱水素酵素のアポ酵素（補酵素であるＰＱＱを欠如した酵素）溶液を得た。
【００４３】
次に、得られたアポ酵素を用いてＰＱＱの定量を行った。表１の組成で溶液Ａ〜Ｆを調製し、溶液Ａ、Ｂ、ＣおよびＤをそれぞれ２．５ｍＬ、５０μＬ、５０μＬおよび３００μＬの容積で混合し、反応溶液を作製した。
【表１】
2013160712.tif 000007
【００４４】
反応溶液を２５℃で５分間インキュベートした後に、溶液Ｆを１００μＬ添加して即座に混和し、酵素反応を開始させた。１分後および３分後に吸光度（ＯＤ＝６００）を測定し、以下の式から酵素活性を求めた。コントロールは、溶液Ｆの代わりに溶液Ｅを用いた。
【数１】
2013160712.tif 000008
Ａ１：１分後の吸光度
Ａ３：３分後の吸光度
Ａｂ１：コントロールにおける１分後の吸光度
Ａｂ３：コントロールにおける３分後の吸光度
Ｄｍ：溶液ＦにおけるＰＱＱの希釈倍率
【００４５】
この方法を用いて、１０ｍＭＰＱＱを含有するリン酸緩衝液の測定を行ったが、吸光度の変化が早すぎたため、Ａ１とＡ３の吸光度に差は認められず、精確な測定を行うことができなかった。このように、酵素法を用いたＰＱＱの測定では、膨大な時間と手間がかかる上に、測定が困難であった。