(57)【要約】【課題】細菌感染誘発卵巣機能障害及びその改善作用を有する物質の評価系の提供。【解決手段】動物に過排卵処置を行う手順と、前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、前記動物に被検物質を投与する手順と、これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含む、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法では、過排卵処置とリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸の投与により作出される細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルを用いて、被検物質投与の有無による排卵数の変化を調べることにより、被検物質の細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用を簡便に評価することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物に過排卵処置を行う手順と、
前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、
前記動物に被検物質を投与する手順と、
これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含む、
細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
動物に過排卵処置を行う手順と、
前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、を含む、
細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルの作出方法。
【請求項３】
過排卵処置とリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸の投与により作出される、細菌感染誘発卵巣機能障害のモデル動物。
【請求項４】
動物に過排卵処置を行う手順と、前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、
前記動物に被検物質を投与する手順と、
これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含む、
細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法によって得られる細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤。
【請求項５】
ヒドロキシチロソールを含有する、請求項４記載の細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤。
【請求項６】
アントシアニンを含有する、請求項４記載の細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤。
【請求項７】
ハスカップ抽出物を含有する、請求項４記載の細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤。
【請求項８】
請求項４から７の何れか一項に記載の細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤を有効成分として含有する医薬品組成物。
【請求項９】
請求項４から７の何れか一項に記載の細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤を含有する飼料。
【請求項１０】
動物に過排卵処置を行う手順と、
前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、
前記動物に被検物質を投与する手順と、
これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含む、
細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法によって得られる細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤を投与する手順を含む、
細菌感染に起因する家畜又は家禽の卵巣機能障害の改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染に起因する卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌感染に起因した家畜及び家禽の繁殖障害は、ブタ及びウシなどでは産仔数の低下による食肉生産量の減少及び搾乳不能による牛乳生産量の減少を引き起こし、ニワトリなどでは産卵数の低下を引き起こすため、生産効率上大きな問題となっている。繁殖障害を引き起こす細菌感染には、子宮内膜炎及び乳房炎などがある。これらの細菌感染による卵巣機能障害が繁殖障害の原因と推察されている。
【０００３】
細菌感染による卵巣機能障害を防止するため、家畜に抗生物質を投与することが行われている。しかし、抗生物質投与期間中あるいは投与後一定期間の間は食肉や生乳の出荷が制限される。このため、抗生物質によらず、天然物由来成分を用いて卵巣機能障害を改善する方法が求められている。
【０００４】
また、ヒトにおいても、分娩又は性行為の際に膣から移入する細菌によって引き起こされる骨盤内炎症疾患が、卵巣機能障害に伴う不妊症の原因として知られている。骨盤内炎症疾患の再発を繰り返すことにより、不妊症のリスクが高まるとされている。
【０００５】
細菌感染による卵巣機能障害を改善し、正常な排卵を促すことは、産業動物における生産効率向上、並びに動物及びヒトの不妊治療のために極めて重要である。
【０００６】
本発明に関連して、特許文献１には、ラクトフェリンを有効成分として含有する卵巣機能改善剤が開示されている。また、特許文献２には、オレウロペイン、オレウロペイン誘導体又はヒドロキシチロソールから選択される一以上を有効成分として含有する不妊治療剤が開示されている。なお、特許文献１に開示される卵巣機能改善剤は抗癌化学療法による卵巣機能障害のためのものであり、特許文献２に開示される不妊治療剤は暑熱ストレスあるいは酸化ストレスによる卵巣機能障害に適用されるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／１０１７８９号
【特許文献２】特開２００９−１９１０１２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細菌感染による卵巣機能障害の改善のため、その病態を適切に再現でき、改善作用を有する物質のスクリーニングに利用可能な評価系の開発が求められる。
【０００９】
そこで、本発明は、細菌感染誘発卵巣機能障害及びその改善作用を有する物質の評価系を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本発明は、動物に過排卵処置を行う手順と、前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、前記動物に被検物質を投与する手順と、これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含む、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
このスクリーニング方法では、過排卵処置とリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸の投与により作出される細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルを用いて、被検物質投与の有無による排卵数の変化を調べることにより、被検物質の細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用を簡便に評価することができる。
【００１１】
また、本発明は、動物に過排卵処置を行う手順と、前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、を含む、細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルの作出方法を提供する。
さらに本発明は、過排卵処置とリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸の投与により作出される、細菌感染誘発卵巣機能障害のモデル動物を提供する。
【００１２】
本発明は、動物に過排卵処置を行う手順と、前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、前記動物に被検物質を投与する手順と、これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含む、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法によって得られる細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤をも提供する。前記細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤は、ヒドロキシチロソールを含有してもよく、アントシアニンを含有してもよく、ハスカップ抽出物を含有してもよい。
【００１３】
さらに、本発明は、動物に過排卵処置を行う手順と、前記動物にリポポリサッカライド及び／又はリポタイコ酸を投与する手順と、前記動物に被検物質を投与する手順と、これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含む、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング方法によって得られる細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤を投与する手順を含む、細菌感染に起因する家畜又は家禽の卵巣機能障害の改善方法をも提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、細菌感染誘発卵巣機能障害及びその改善作用を有する物質の評価系が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルを作出するための実験スケジュールを説明する図である（実験例１）。
【図２】リポポリサッカライド又はペプチドグリカンの投与と過排卵処置を行ったマウスの排卵数を計測した結果を示す図面代用グラフである（実験例１）。
【図３】リポポリサッカライドの投与と過排卵処置のスケジュールを説明する図である（実験例１）。
【図４】リポポリサッカライドの投与と過排卵処置を行ったマウスの排卵数を計測した結果を示す図面代用グラフである（実験例１）。
【図５】２１〜２５日齢の各日齢のマウスの卵巣中のＬＰＳ受容体の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した結果を示す図面代用写真である（実験例１）。
【図６】リポタイコ酸の投与と過排卵処置を行ったマウスの排卵数を計測した結果を示す図面代用グラフである（実験例２）。
【図７】リポポリサッカライドの投与と過排卵処置のスケジュールを説明する図である（実験例３）。
【図８】リポポリサッカライドの投与と過排卵処置を行ったマウスの排卵数を計測した結果を示す図面代用グラフである（実験例３）。
【図９】細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニングの実験スケジュールを説明する図である（実験例４）。
【図１０】ヒドロキシチロソール、オレウロペイン及びグリチルリチンの細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を評価した結果を示す図面代用グラフである（実験例４）。
【図１１】細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニングの実験スケジュールを説明する図である（実験例５）。
【図１２】アントシアニンの細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を評価した結果を示す図面代用グラフである（実験例５）。
【図１３】細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニングの実験スケジュールを説明する図である（実験例６）。
【図１４】ハスカップ抽出液の細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を評価した結果を示す図面代用グラフである（実験例６）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．スクリーニング方法
（１）細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルの作出
本発明者は、過排卵処置に細菌の構成成分投与を組み合わせた「過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデル」が、細菌感染誘発卵巣機能障害の適切な病態モデルとなり得ることを初めて見出した（実験例１及び実験例２参照）。過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルでは、過排卵処置によって刺激された卵巣から排卵される卵子数が、細菌の構成成分投与によって減少する。この排卵数の減少は、細菌の構成成分による卵巣機能障害のために引き起こされていると考えられるため、同動物モデルは、細菌感染による卵巣の機能障害の病態を反映したものとなり得る。
【００１７】
細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルは、定法に従った過排卵処置と細菌の構成成分投与とを組み合わせることによって作出できる。過排卵処置は、通常、ＰＭＳＧ（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）とｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）とを動物に投与することによって行われている。細菌の構成成分としては、例えば、グラム陰性菌の構成成分であり、内毒素と呼ばれるＬＰＳ（リポポリサッカライド）や、グラム陽性菌の構成成分であるＬＴＡ（リポタイコ酸）等が挙げられる。これらの細菌の構成成分を腹腔内に投与する。
【００１８】
モデル動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ及びサルなどであってよく、卵巣機能を備える動物であれば特に限定されない（ただし、ヒトは除く）。例えばマウスをモデル動物に用いる場合、ＰＭＳＧを腹腔投与し、４８時間後にｈＣＧを腹腔投与することで、さらに２４時間後に過排卵を誘起できる。マウスにおけるＰＭＳＧ及びｈＣＧの投与量は、０．１〜１００ＩＵ（インターナショナルユニット）、好ましくは１〜１０ＩＵとされる。また、ＬＰＳやＬＴＡは、ＰＭＳＧ及び／又はｈＣＧの投与の前後あるいは同時に腹腔内投与する。マウスにおけるＬＰＳの投与量は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０４〜４ｍｇ／ｋｇ体重程度とされる。マウスにおけるＬＴＡの投与量は、０．４ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは４．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、より好ましくは２０ｍｇ／ｋｇ体重以上とされる。ただし、ＰＭＳＧ、ｈＣＧ、ＬＰＳ及びＬＴＡの投与タイミング及び投与量は、使用するモデル動物に応じて適宜調整され得るものとする。
【００１９】
卵巣機能障害を確実に誘発するため、ＬＰＳ及び／又はＬＴＡは、後述する実験例３に示すように、２回以上投与することが望ましい。モデル動物において卵巣機能障害が確実に誘発されることによって、後述する細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニングをモデル動物で行う場合に、スクリーニング結果の評価の精度が増す。
【００２０】
例えばマウスをモデル動物に用いる場合、ＰＭＳＧ投与と同時にＬＰＳ及び／又はＬＴＡの１回目の投与を、ＰＭＳＧ投与２４時間後にＬＰＳ及び／又はＬＴＡの２回目の投与を行う。ただし、ＰＭＳＧ、ｈＣＧ、ＬＰＳ及びＬＴＡの投与回数は、投与タイミング及び投与量に応じて適宜設定され得るものとする。例えばマウスでは、ＰＭＳＧ投与２４時間後にＬＰＳを単回投与することで、卵巣機能障害を誘発することも可能である。
【００２１】
モデル動物には、未性成熟動物を用いることが好ましい。性成熟後の動物では、内因性の排卵周期が存在し、過排卵処置に影響を与えるためである。マウスをモデル動物とする場合には、２７〜２８日齢の個体を用いることが適当である。また、後述する細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニングにおいては、被検物質のマウスへの投与期間に応じて、さらに日齢の少ない個体を用いてもよい。
【００２２】
細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルは、排卵数を指標として細菌の構成成分による卵巣機能障害の程度を簡便に評価することができるため、細菌感染誘発卵巣機能障害の病態メカニズムの解明、予防又は治療方法の開発などのために有用である。
【００２３】
さらに、細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルに被検物質を投与し、排卵数の減少を抑制し得る物質を探索することで、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質をスクリーニングすることが可能である。次に、このスクリーニング方法について説明する。
【００２４】
（２）細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用を有する物質のスクリーニング方法
本発明に係るスクリーニング方法は、細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルに被検物質を投与し、被検物質を投与しない場合に比しての排卵数の変化を調べることにより、被検物質の細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用の有無を判定するものである。
【００２５】
このスクリーニング方法は、具体的には、動物に過排卵処置を行う手順と、前記動物にＬＰＳ及び／又はＬＴＡを投与する手順と、前記動物に被検物質を投与する手順と、これらの手順の後に、前記動物の排卵数を計測する手順と、を含んでいる。このうち、過排卵処置及びＬＰＳ及び／又はＬＴＡの投与の両手順は、上述の細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルの作出と同様にして行うことができる。
【００２６】
被検物質投与の手順は、過排卵処置及びＬＰＳ及び／又はＬＴＡの投与の前後あるいは同時に被検物質を動物に投与することによって行われる。被検物質の投与は、腹腔投与、経口投与及び皮下投与などのいずれの投与方法によって行ってもよい。
【００２７】
排卵数の計測手順では、動物を開腹し、排卵卵子数を数える。本発明に係るスクリーニング方法では、被検物質を投与した場合にこの手順で計測される排卵数が、投与していない場合に計測される排卵数に比べて多いときに、被検物質が細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用を有していると判定できる。一方、被検物質を投与した場合にこの手順で計測される排卵数が、投与していない場合に計測される排卵数に比べて同等又は少ないとき、被検物質は細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用を有さないと判定される。
【００２８】
本発明に係るスクリーニング方法における被検物質は、天然化合物であっても合成化合物であってもよいが、特に天然物由来成分とすることが好適である。細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用を有する天然物由来成分が見出されれば、抗生物質によらずに細菌感染誘発卵巣機能障害を治療又は予防することが可能となる。
【００２９】
２．細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤
（１）細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤
本発明者は、本発明に係るスクリーニング方法を用いて、暑熱ストレスあるいは酸化ストレスによる卵巣機能障害に改善効果を示すことが知られているオレウロペインとヒドロキシチロソールについて細菌感染誘発卵巣機能障害の改善効果を検討した。なお、ヒドロキシチロソール（3,4-dihydroxyphenylethanol）は、オリーブに含まれる成分であり、ポリフェノールの一種である。ヒドロキシチロソールは、同じくオリーブに含まれるオレウロペインの分解物である。
【００３０】
その結果、本発明者は、ヒドロキシチロソールのみで改善効果を確認した。実験例４に示すように、ヒドロキシチロソールは、細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルにおいて、ＬＰＳ投与による排卵数の減少を顕著に抑制した。従って、ヒドロキシチロソールは、細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤となり得る。即ち、ヒドロキシチロソールを含有する細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤の有効性が示された。
【００３１】
また、本発明者は、本発明に係るスクリーニング方法を用いて、アントシアニン及びハスカップ（スイカズラ科スイカズラ属クロミノウグイスカグラ、Lonicera caerulea L.）抽出物について細菌感染誘発卵巣機能障害の改善効果を検討した。アントシアニン（anthocyanin）とは、アントシアニジンがアグリコンとして糖と結合した配糖体であり、果実類等の植物に含まれる水溶性色素である。アントシアニンとしては、例えば、デルフィニジン、シアニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペチュニジンなどが挙げられる。
【００３２】
その結果、本発明者は、アントシアニン及びハスカップ抽出物についても改善効果を確認した。実験例５及び実験例６に示すように、アントシアニン及びハスカップ抽出物は、細菌感染誘発卵巣機能障害動物モデルにおいて、ＬＰＳ投与による排卵数の減少を顕著に抑制した。従って、アントシアニン及びハスカップ抽出物は、細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤となり得る。即ち、アントシアニンを含有する細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤、及びハスカップ抽出物を含有する細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤、の有効性が示された。
【００３３】
細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤としてヒドロキシチロソール、アントシアニン又はハスカップ抽出物を家畜又は家禽に投与すれば、子宮内膜炎及び乳房炎などの細菌感染に起因した卵巣機能障害を治療又は予防することができ、産仔数及び産卵数の低下を防止して生産効率を向上させることが可能である。また、細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤をヒトに適用すれば、骨盤内炎症疾患を原因とする卵巣機能障害及び不妊症を治療又は予防することも可能と考えられる。
【００３４】
（２）医薬品組成物
上記細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤は、これを有効成分として含有する医薬品組成物として適用できる。
【００３５】
この医薬品組成物は、天然物由来成分であるヒドロキシチロソール、アントシアニン、又は、果実類であるハスカップ由来の抽出物を有効成分とするため、長期にわたって連続的に適用できる可能性が高く、副作用も少ない可能性が高い。
【００３６】
本発明に係る医薬品組成物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液又は懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。医薬品組成物は、本発明に係る細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤を、生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造される。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。
【００３７】
医薬品組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、投与対象（動物を含む）の年齢や体重、症状等を考慮して決定されるものである。
【００３８】
（３）飼料等
また、上記細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤は、これを有効成分として含有する飼料又は食品組成物としても適用できる。
【００３９】
この飼料又は食品組成物を産業動物に給餌すれば、細菌感染誘発卵巣機能障害を予防できる可能性がある。なお、食品組成物は、健康補助食品（機能性食品）としてヒトへの適用も考えられる。
【００４０】
本発明に係る飼料は、上記細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤と、生草や乾草、青刈飼料作物（青刈トウモロコシ等）、わら類、生草や乾草、青刈飼料作物（青刈トウモロコシ等）、わら類等と混合することにより得ることができる。
【００４１】
一般に、家畜の飼料は、粗飼料、濃厚飼料、及び特殊飼料の３種類に大別される。このうち、粗飼料は相対的に粗繊維含量が多く、容積が多い割には可消化栄養分が少ない飼料を指す。粗飼料には、生草や乾草、青刈飼料作物（青刈トウモロコシ等）、根菜類、わら類などが用いられている。また、濃厚飼料は比較的養分含量が高く、水分や粗繊維含量の低い飼料を指す。濃厚飼料には、トウモロコシ、マイロ、大麦、エンバク、米、アワ、ヒエ、キビ、コーリャンなどの穀類や、米糠、ふすま類などの穀物副産物（糠類）、落花生粕、綿実粕、ヒマワリ粕、菜種粕、胡麻粕、亜麻仁粕などの油粕類などが用いられている。
【００４２】
本発明に係る飼料は、これらの飼料に、オリーブの実や花、茎、根、好ましくは葉を、生の状態であるいは乾燥物として添加することにより製造することもできる。オリーブ葉等は、そのままあるいは粉砕して粉状としたものを添加し得る。また、オリーブオイルの搾油の際に発生した絞りかすを添加することもできる。
【００４３】
また、アントシアニンを含む果実類等やハスカップの実についても、上記の飼料に、生の状態であるいは乾燥物として、添加することにより製造することもできる。アントシアニンを含む果実類等やハスカップの実などは、そのままあるいは粉砕して粉状としたものを添加し得る。
【００４４】
また、食品組成物は、上記細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤に、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等の通常食品原料として使用されているものを適宜配合することにより製造することができる。また、一般に食品材料として使用される米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどと混合してもよい。
【００４５】
食品組成物としては、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、経腸栄養食品等を挙げることができる。これらの食品組成物は、動物に給餌することも可能である。
【００４６】
上記の細菌感染誘発卵巣機能障害改善剤及びこれを有効成分とする医薬品組成物等において、ヒドロキシチロソール及びアントシアニンは、天然物抽出成分及び該抽出物の精製成分に由来するものとできる。また、化学合成されたヒドロキシチロソール及びアントシアニンを使用することも当然に可能である。
【００４７】
ヒドロキシチロソールを天然物抽出成分として得る場合、特にオリーブ(Olea europaea)からの抽出が好適である。オリーブは、地中海原産の常緑樹であり、その実から得られるオリーブオイルは古くから食用されている。
【００４８】
ヒドロキシチロソールは、オリーブに多く含まれることが既に知られており、水、アルコール等の有機溶剤や油等によりオリーブから抽出できる。抽出のための有機溶剤には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、エーテル類、クロロホルム、及びジクロロメタン等を用いることができる。さらに、得られた抽出物を公知の方法で濃縮すれば、ヒドロキシチロソールを精製成分として得ることができる。
【００４９】
オリーブには、その実、葉、花、茎、根のいずれの部分も用いることができ、これらは生の状態で用いてもよく、あるいは乾燥物を用いてもよい。このうち、オレウロペイン等は、特にオリーブ葉に多いため、剪定や伐採されたオリーブの葉を有効に利用してヒドロキシチロソールを抽出することができる。
【００５０】
また、アントシアニンは、ブルーベリーやブドウなどの果実類や、サツマイモなどの野菜類など、多くの植物に含まれていることが知られている。アントシアニンを天然物抽出成分として得る場合、これらの植物の実や花などからの抽出が好適である。アントシアニンの抽出方法については、公知の抽出方法から適宜選択することができる。
【００５１】
本発明にかかる飼料及び食品組成物には、必要に応じて、細菌感染による卵巣機能障害の改善に用いられるものである旨が表示される。
【実施例】
【００５２】
＜実験例１＞
１．細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルの作出１
本実験例では、マウスを用い、定法に従った過排卵処置に、細菌の構成成分投与を組み合わせることにより、細菌感染誘発卵巣機能障害の病態作出を試みた。
【００５３】
実験スケジュールを図１に示す。
本実験例では、細菌の構成成分として、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）とペプチドグリカン（ＰＧＮ）を用いた。
実験１日目に、２７〜２８日齢の未性成熟マウスの腹腔に、ＬＰＳ又はＰＧＮと、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）、５ＩＵを投与した。
実験２日目に、再度、ＬＰＳ又はＰＧＮを腹腔投与した。
実験３日目に、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、５ＩＵを腹腔投与した。
実験４日目に開腹し、排卵数を計測した。
【００５４】
結果を図２に示す。図２Ａは異なる濃度のＬＰＳを投与したマウスの排卵数、図２Ｂは異なる濃度のＰＧＮを投与したマウスの排卵数を示す。ＬＰＳを投与したマウスでは、コントロール群（０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ））に比して濃度依存的に排卵数の減少が認められ、最大濃度（４．０ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）投与群では排卵数が半減した。一方、ＰＧＮを投与したマウスでは、コントロール群に比して排卵数の有意な変化は認められなかった。
【００５５】
また、ＬＰＳの投与スケジュールと排卵数との関係についても検討した。投与スケジュールを図３に示す。図３において黒い矢印は、ＬＰＳ投与（２．０ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）を表わしている。結果を図４に示す。実験１日目のみに単回投与し、実験２日目に２度目のＬＰＳ投与を行わない場合（図３及び図４、投与回数１回（前半）参照）では、ＬＰＳを投与していない場合に比べ、排卵数が数個程度減少した。一方、実験１日目のＬＰＳ投与を行わず、実験２日目のみに単回投与した場合（図３及び図４、投与回数１回（後半）参照）では、ＬＰＳを投与していない場合に比べ、排卵数が半分程度まで減少した。
【００５６】
これらの結果は、過排卵処置により刺激された卵巣の機能が、細菌の構成成分の一つである、内毒素と呼ばれるＬＰＳ投与によって障害され、排卵数の低下が生じていることを示している。従って、過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルは、細菌感染誘発卵巣機能障害の病態を反映し得るものであることが分かった。細菌の構成成分の一つであるＬＰＳ（内毒素）投与による卵巣機能障害は、非絶食マウス及び絶食マウスの両方で同様に確認できた。
【００５７】
なお、本実験例に先立って、２１〜２５日齢の各日齢のマウスの卵巣中のＬＰＳ受容体の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した結果を図５に示す。ＬＰＳ受容体として機能するＴＬＲ４（Toll-like receptor 4）は２４日齢以降のマウスの卵巣中で発現していることが確認された。また、２４日齢以降では、ＴＬＲ４と複合体を形成し共同して機能するＭＤ−２及びＣＤ１４の発現も確認された。なお、実験に供した２７〜２８日齢のマウスの卵巣中では、ＰＧＮの受容体であるＴＬＲ２、ＮＯＤ−１、ＮＯＤ−２も発現が確認された。
【００５８】
＜実験例２＞
２．細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルの作出２
本実験例では、マウスを用い、定法に従った過排卵処置に、リポタイコ酸（ＬＴＡ）の投与を組み合わせることにより、細菌感染誘発卵巣機能障害の病態作出を試みた。
【００５９】
実験スケジュールは、実験例１（図１参照）と同様に行った。
実験１日目に、２７〜２８日齢の未性成熟マウスの腹腔にＰＭＳＧ、５ＩＵと、リポタイコ酸（ＬＴＡ）を、０．４、２．０、４．０、２０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）の何れかの濃度で投与した。また、２７〜２８日齢の未性成熟マウスに、ＬＴＡを投与せず、ＰＭＳＧ、５ＩＵのみを投与し、コントロール群とした。
実験２日目に、再度、実験１日目と等量のＬＴＡを上記のマウスに腹腔投与した。
実験３日目に、上記のマウスに、ｈＣＧ、５ＩＵを腹腔投与した。
実験４日目に、上記のマウスについて開腹し、排卵数を計測した。
【００６０】
結果を図６に示す。図６は、異なる濃度のＬＴＡが投与されたマウスの排卵数を示す。ＬＴＡが、０．４〜４．０ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗの範囲で投与されたマウスにおいては、コントロール群（０ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）に比べ、排卵数が減少していた。さらに、ＬＴＡを最大濃度（２０ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）で投与されたマウスでは、排卵数がコントロール群に比べ、半分程度にまで減少していた。
【００６１】
これらの結果は、過排卵処置により刺激された卵巣の機能がＬＴＡの投与によって障害され、排卵数の低下が生じていることを示している。従って、過排卵処置とＬＴＡ投与を組み合わせた動物モデルは、細菌感染誘発卵巣機能障害の病態を反映し得るものであることが分かった。なお、マウスにおいて、ＬＴＡ投与による採食量の減少は見られなかった。
【００６２】
＜実験例３＞
３．細菌の構成成分の投与回数の検討
本実験例では、マウスにおいて細菌感染誘発卵巣機能障害の病態を作り出すために必要な細菌の構成成分の投与回数を検討した。
【００６３】
実験スケジュールを図７に示す。
本実験例では、２７〜２８日齢の未性成熟マウスに対して、過排卵処置として、実験例１及び実験例２と同様にＰＭＳＧ（５ＩＵ）及びｈＣＧ（５ＩＵ）を投与した。ＰＭＳＧは実験１日目に、ｈＣＧは実験３日目に、各々マウスに対して投与した。
また、本実験例では、実験例１と同様に、マウスにおいて細菌感染誘発卵巣機能障害の病態を作り出すために、過排卵処置と併せてＬＰＳ（２．０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）））を投与した。
【００６４】
図７に示すように、ＬＰＳの投与回数１回のマウスについては、実験１日目のみＬＰＳを上記濃度で投与した（図７、矢印（黒）参照））。投与回数２回のマウスについては、実験１日目と２日目に、各々上記の濃度のＬＰＳを投与した。投与回数３回のマウスについては、実験１日目、２日目、３日目の計３回、毎回上記の濃度のＬＰＳを投与した。
これらのマウスについては、実験４日目に開腹し、排卵数を計測した。また、過排卵処置のみを行い、ＬＰＳ投与を行っていないコントロール群（ＬＰＳ投与回数０回）も用意した。
【００６５】
結果を図８に示す。ＬＰＳを１回投与したマウスにおいては、コントロール群（ＬＰＳ投与回数０回）に比べ、排卵数が減少していた。また、ＬＰＳを２回投与したマウスにおいては、コントロール群に比べ排卵数が半分程度にまで減少していた。さらに、ＬＰＳを３回投与したマウスにおいては、コントロール群に比べ排卵数が４割程度までに減少していた。
【００６６】
本実験例の結果から、細菌の構成成分の単回投与であっても過排卵処置されたマウスにおいて排卵数の減少が見られるが、マウスにおいて細菌感染誘発卵巣機能障害の病態を作り出すためには、細菌の構成成分の投与回数は、２回以上が好ましいことが示された。また、本実験例及び上述した実験例１に示すように、ＬＰＳの投与回数が１回であっても排卵数を減少させることはできるが、少なくとも１回のＬＰＳ投与は、ＰＭＳＧ投与２４時間後に行われることが好ましいことが示された。
【００６７】
＜実験例４＞
４．過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルを用いた細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング１
本実験例では、実験例１で確立した細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルを用いて、同障害の改善作用を有する天然物由来成分のスクリーニングを行った。
【００６８】
実験スケジュールを図９に示す。
実験１日目に、２７〜２８日齢の未性成熟マウスにＬＰＳ（４．０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ））とＰＭＳＧ（５ＩＵ）を腹腔投与し、同時に被検物質を経口投与した。被検物質には、オリーブの葉の成分であるヒドロキシチロソール及びオレウロペイン、並びに甘草の根の成分であるグリチルリチンを用いた。
実験２日目に、再度、ＬＰＳの腹腔投与と被検物質の経口投与を行った。
実験３日目にｈＣＧ（５ＩＵ）を腹腔投与した。
実験４日目に開腹し、排卵数を計測した。
【００６９】
結果を図１０に示す。図１０Ａは、ヒドロキシチロソールについての結果を示し、図１０Ｂは、オレウロペインについての結果を示し、図１０Ｃは、グリチルリチンについての結果を示す。ＬＰＳにヒドロキシチロソールを５．０μｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗで同時投与したマウスでは、ヒドロキシチロソールを投与していないコントロール群（０μｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）に比して排卵数の減少が抑止され、排卵数がＬＰＳ非投与群と同程度（実験例１参照）にまで回復した。一方、ＬＰＳにオレウロペインを同時投与したマウスでは、０．５，２．５，５．０μｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗのいずれの投与量においても排卵数の減少抑止効果は認められなかった。また、グリチルリチンも、投与量０．０５ｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗでは、排卵数の減少抑止効果はみられなかった。
【００７０】
これらの結果は、ヒドロキシチロソールが内毒素などの細菌の構成成分投与による排卵数低下を抑止し、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有していること、及び過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルが同改善作用を有する物質をスクリーニングするための有効な評価系となり得ることを示している。
【００７１】
＜実験例５＞
５．過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルを用いた細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング２
本実験例では、実験例４と同様に、実験例１で確立した細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルを用いて、同障害の改善作用を有する天然物由来成分のスクリーニングを行った。
【００７２】
実験スケジュールを図１１に示す。
実験１日目から４日目まで、２３〜２４日齢の未性成熟マウスに被検物質であるアントシアニン（常盤植物化学研究所、ビルベロン−２５）を経口投与し、試験群１及び試験群２とした。１回に投与するアントシアニンの量は、４０００ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）とした。
実験５日目に、試験群２のマウスにＬＰＳ（２．０ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ）とＰＭＳＧ（５ＩＵ）を腹腔投与し、同時に被検物質を上記濃度で経口投与した。試験群１のマウスについては、上記濃度でＰＭＳＧのみを腹腔投与し、同時に被検物質を上記濃度で経口投与した。また、被検物質を投与していない２７〜２８日齢の未性成熟マウスに上記濃度でＰＭＳＧのみを腹腔投与し、コントロール群１とした。さらに、被検物質を投与していない２７〜２８日齢の未性成熟マウスに上記濃度でＬＰＳとＰＭＳＧを腹腔投与し、コントロール群２とした。
実験６日目に、試験群２及びコントロール群２のマウスに、再度、上記濃度でＬＰＳの腹腔投与を行った。また、試験群１及び試験群２のマウスに、再度、上記濃度で被検物質の経口投与を行った。
実験７日目に、試験群１、２及びコントロール群１、２の各々のマウスに、ｈＣＧ（５ＩＵ）を腹腔投与した。
実験８日目に、試験群１、２及びコントロール群１、２の各々のマウスについて、開腹し、排卵数を計測した。
【００７３】
結果を図１２に示す。図１２は、コントロール群１の排卵数を１００とした時の、コントロール群２、試験群１及び試験群２の排卵数の割合（％）を示す。
【００７４】
ＬＰＳ及びアントシアニンを投与した試験群２では、アントシアニンを投与していないコントロール群２に比して排卵数の減少が抑止され、ＬＰＳが投与されていないコントロール群１と同程度にまで回復した。一方、ＬＰＳが投与されず、アントシアニンのみが投与された試験群１においても、排卵数は、コントロール群１と同程度であった。これは、細菌に感染していない状態で上記濃度のアントシアニンを投与しても排卵に影響を与えないことを示している。
【００７５】
本実験例の結果は、アントシアニンが内毒素などの細菌の構成成分投与による排卵数低下を抑止し、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有していること、及び過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルが同改善作用を有する物質をスクリーニングするための有効な評価系となり得ることを示している。
【００７６】
＜実験例６＞
６．過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルを用いた細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有する物質のスクリーニング３
本実験例では、実験例４及び５と同様に、実験例１で確立した細菌感染誘発卵巣機能障害の動物モデルを用いて、同障害の改善作用を有する天然物由来成分のスクリーニングを行った。
【００７７】
実験スケジュールを図１３に示す。
本実験例では、被検物質としてハスカップ抽出物を選び、ハスカップ抽出物を含む液体（ハスカップ抽出液）として、果皮を除いた生のハスカップを絞って得たハスカップ果汁を用いた。
実験１日目から４日目まで、２３〜２４日齢の未性成熟マウスにハスカップ果汁を経口投与し、試験群３及び試験群４とした。１回に投与するハスカップ果汁の量は、１００μｌとした。
実験５日目に、試験群４のマウスにＬＰＳ（２．０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（ｍｇ／ｋｇ  Ｂ．Ｗ））とＰＭＳＧ（５ＩＵ）を腹腔投与し、同時に上記と同量のハスカップ果汁を経口投与した。試験群３のマウスについては、上記濃度でＰＭＳＧのみを腹腔投与し、同時に上記と同量のハスカップ果汁を経口投与した。また、上記のハスカップ果汁を投与していない２７〜２８日齢の未性成熟マウスに上記濃度でＰＭＳＧのみを腹腔投与し、コントロール群３とした。さらに、上記のハスカップ果汁を投与していない２７〜２８日齢の未性成熟マウスに上記濃度でＬＰＳとＰＭＳＧを腹腔投与し、コントロール群４とした。
実験６日目に、試験群４及びコントロール群４のマウスに、再度、上記濃度でＬＰＳの腹腔投与を行った。また、試験群３及び試験群４のマウスに、再度、上記と同量のハスカップ果汁を経口投与した。
実験７日目に、試験群３、４及びコントロール群３、４の各々のマウスに、ｈＣＧ（５ＩＵ）を腹腔投与した。
実験８日目に、試験群３、４及びコントロール群３、４の各々のマウスについて、開腹し、排卵数を計測した。
【００７８】
結果を図１４に示す。図１４は、コントロール群３の排卵数を１００とした時の、コントロール群４、試験群３及び試験群４の排卵数の割合（％）を示す。
【００７９】
ＬＰＳ及びハスカップ果汁を投与した試験群４では、ハスカップ果汁を投与していないコントロール群４に比して排卵数の減少が抑止され、ＬＰＳが投与されていないコントロール群３に対して９０％程度まで回復した。一方、ＬＰＳを投与せず、ハスカップ果汁のみを投与した試験群３においても、排卵数は、コントロール群３と同程度であった。これは、細菌に感染していない状態で上記の容量のハスカップ果汁を投与しても排卵に影響を与えないことを示している。
【００８０】
これらの結果は、ハスカップ果汁に含まれる成分、即ちハスカップ抽出物が内毒素などの細菌の構成成分投与による排卵数低下を抑止し、細菌感染誘発卵巣機能障害の改善作用を有していること、及び過排卵処置・細菌の構成成分投与動物モデルが同改善作用を有する物質をスクリーニングするための有効な評価系となり得ることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明に係る細菌感染誘発卵巣機能障害改善作用を有する物質のスクリーニング方法等は、産業動物における生産効率向上、並びに動物及びヒトの不妊治療を目的として、細菌感染による卵巣機能障害を改善し、正常な排卵を促す作用を有する物質を見出すために用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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