(57)【要約】【課題】カルシニューリン活性を抑制する物質をより簡便に且つより特異的にスクリーニングできるようにする。【解決手段】まず、酵母の増殖においてカルシニューリンと拮抗的に作用する非必須遺伝子の発現が抑制されたことによって制限温度における増殖が抑制される酵母変異体を、被検物質で処理して且つ制限温度で培養する。その後、酵母変異体の増殖の有無を測定する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の増殖においてカルシニューリンと拮抗的に作用する非必須遺伝子の発現が抑制されたことによって制限温度における増殖が抑制される酵母変異体を、被検物質で処理して且つ前記制限温度で培養した後に、前記酵母変異体の増殖の有無を測定することを特徴とするカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記非必須遺伝子は、破壊されたことにより遺伝子発現が抑制されていることを特徴とする請求項１に記載のカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記非必須遺伝子は、ｖｒｐ１遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載のカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ｖｒｐ１遺伝子は、配列番号１に記載の配列を有することを特徴とする請求項３に記載のカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記制限温度は、３５℃以上且つ３６℃以下であることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１項に記載のカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記酵母変異体は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）であることを特徴とする請求項１〜５のうちいずれか１項に記載のカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母を用いた特定の物質のスクリーニング方法に関し、特に、カルシニューリン活性を抑制する物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾患の病態に関わる特定のタンパク質の活性を抑制又は促進する分子標的治療薬は、メカニズムが明らかなため、強い薬効が期待でき、副作用も予見可能な軽微なものになると考えられ、数多くの機関において研究が行われている。
【０００３】
上記のようなタンパク質のうち、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性脱リン酸化酵素として発見されたカルシニューリン（ＣＮ）は、免疫応答、細胞増殖、細胞のがん化及びアポトーシス等の制御に関わるタンパク質として知られている。これらの制御に関連するＣＮは、自己免疫疾患及び癌等の疾病に関与することも明らかとなっている。
【０００４】
例えば、細胞増殖において、Ｃａ２＋の存在下では、ＣＮが活性化され、これと共にＭＡＰ（mitogen activated protein）キナーゼが活性化されて、これらが協調的にその下流のシグナル伝達経路を活性化することにより、細胞周期がＧ２期で停止して、細胞増殖が抑制されることが知られている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【０００５】
また、免疫応答において、ＣＮは、ヘルパーＴ細胞の活性化に関与し、サイトカインの産生等を促進するが、免疫抑制剤であるタクロリムス（ＦＫ５０６）により、ＣＮの活性化が抑制されて、免疫応答が抑制されることが知られている。
【０００６】
そこで、免疫抑制剤となる新規物質を探索する目的で、ＣＮの活性を抑制する物質のスクリーニング方法を開発することが試みられている（例えば、特許文献１を参照。）。ＣＮは酵母からヒト等の哺乳動物にまで広く存在するため、ヒトを含む哺乳動物等の高等真核生物におけるＣＮの機能を解析する上で、まず、生命の仕組みが最も詳しく理解されている生物の一つである酵母を用いてＣＮの作用機構について解析されている。このため、ＣＮ活性を抑制する物質のスクリーニングには、酵母が主に用いられ、例えば特定の遺伝子が破壊された酵母が用いられる。
【０００７】
非特許文献２には、ＣＮ活性が上記の通り細胞周期を停止して細胞増殖を抑制する作用に着目して、細胞増殖を指標として、ＣＮの活性が関与するシグナル経路を抑制する物質を探索するためのスクリーニング方法が記載されている。具体的には、野生株と比較してＣａ２＋の感受性が大きいｚｄｓ１遺伝子が破壊された出芽酵母の変異体を用いて、種々の被検物質に対してスクリーニングを行っている。ｚｄｓ１破壊株は、上記の通りＣａ２＋の感受性が大きいため、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含む培地で培養した場合、その増殖はＣＮ活性により強く抑制される。そのため、このスクリーニング方法は、ＣＮ活性を抑制する物質を高い特異性でスクリーニングすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−３２２８９１号公報
【特許文献２】特開２００２−２０９５７４号公報
【特許文献３】特開２００５−３２８７６９号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ０１／０１４５２２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nature, 392, 303-306 (1998)
【非特許文献２】Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(9),1942-1946 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、非特許文献２に示されたスクリーニング方法では、培地にＣａＣｌ２を加える必要があり、これにより、ＣＮに関わるシグナル経路のみならず、種々のシグナル経路が活性化してしまうこととなる。このため、スクリーニングされた物質がＣＮに選択的に働く物質であるか否かの判断が困難となるおそれがある。また、このスクリーニング方法では、上記の通り培地にＣａＣｌ２を加える工程が必要であるため、例えばスクリーニングを行うための酵母株ごとに最適なＣａ２＋の処理濃度を探索し、その濃度の溶液を調整する必要があり、工程が煩雑となる。
【００１１】
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＮ活性を抑制する物質をより簡便に且つより特異的にスクリーニングできるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究した結果、酵母の増殖においてカルシニューリンと拮抗的に作用する非必須遺伝子の発現が抑制された酵母変異体は、制限温度では、増殖できず、カルシニューリン活性を抑制することによりその増殖が回復することを見出して本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、酵母の増殖においてカルシニューリンと拮抗的に作用する非必須遺伝子の発現が抑制されたことによって制限温度における増殖が抑制された酵母変異体を、被検物質で処理して且つ制限温度で培養した後に、酵母変異体の増殖の有無を測定することを特徴とする。
【００１４】
本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法によると、通常、制限温度では、増殖が抑制され、一方、カルシニューリン活性を抑制すると増殖が回復する酵母変異体を用いる。このため、培養温度により酵母の生育を制御できて且つ増殖の制御のためにＣａ２＋の処理を必要としないので、極めて簡便に且つ高い特異性でカルシニューリン活性を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００１５】
また、本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法において、非必須遺伝子は、破壊されたことにより遺伝子発現が抑制されていることが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法において、酵母の増殖においてカルシニューリンと拮抗的に作用する非必須遺伝子は、ｖｒｐ１遺伝子であることが好ましい。
【００１７】
また、このとき、ｖｒｐ１遺伝子は、例えば後に記載する配列番号１に示す配列を有する。
【００１８】
本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法では、制限温度として、３５℃以上且つ３６℃以下を採用することができる。
【００１９】
本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法では、酵母変異体として出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用いることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法によると、制限温度において増殖が抑制され、カルシニューリン活性を抑制すると増殖が回復する酵母変異体を用いるため、温度により酵母の増殖を制御でき、Ｃａ２＋の処理を必要としない。その結果、極めて簡便に且つ高い特異性でカルシニューリン活性を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】（ａ）〜（ｄ）は酵母を制限温度で培養した際のＣＮとｖｒｐ１遺伝子により発現するＶｒｐ１タンパク質との作用を模式的に示し、（ａ）は正常の酵母の場合を示す図であり、（ｂ）はｖｒｐ１が破壊された酵母変異体の場合を示す図であり、（ｃ）は酵母変異体にＦＫ５０６を処理した場合を示す図であり、（ｄ）はｖｒｐ１及びｆｋｂ１が破壊された酵母変異体にＦＫ５０６を処理した場合を示す図である。
【図２】実施例２における野生株及び酵母変異体の温度依存的な増殖、及びＦＫ５０６処理による増殖の回復について試験した結果を示す図である。
【図３】実施例３における野生株、ｃｎｂ１破壊株、ｖｒｐ１破壊株及びｃｎｂ１とｖｒｐ１との二重破壊株の温度依存的な増殖、並びにＦＫ５０６処理による増殖の回復について試験した結果を示す図である。
【図４】実施例４におけるｖｒｐ１破壊株、並びにｖｒｐ１及びｆｋｂ１の二重破壊株の温度依存的な増殖について試験した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されない。また、本発明の効果を奏する範囲を逸脱しない範囲で、適宜変更は可能である。
【００２３】
本発明に係るカルシニューリン（ＣＮ）活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、酵母の増殖においてＣＮと拮抗的に作用する非必須遺伝子の発現が抑制された酵母が、制限温度では増殖が抑制されることを利用したスクリーニング方法である。すなわち、本発明に係るＣＮ活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、酵母の増殖においてＣＮと拮抗的に作用する非必須遺伝子の発現が抑制されたことによって制限温度における増殖が抑制された酵母変異体を、被検物質で処理して且つ制限温度で培養した後に、酵母変異体の増殖の有無を測定することを特徴とする。
【００２４】
ここで、「ＣＮと拮抗的に作用する非必須遺伝子」とは、酵母の生存及び生育に必須でない遺伝子であり、細胞増殖の抑制に関わるＣＮの活性と拮抗して細胞増殖を促進する作用を示す遺伝子をいう。そのような非必須遺伝子としては、例えばｖｒｐ１遺伝子等が挙げられる。
【００２５】
また、本明細書でいう「遺伝子の発現が抑制された」とは、当該遺伝子の破壊、欠損及び変異の導入等によって、結果として、当該遺伝子による機能性タンパク質の産生が減少する、又は機能が低下した変異タンパク質が産生することを意味している。なお、「破壊」するための方法としては、相同組換えにより目的遺伝子を他の遺伝子に置換する方法（例えば、特許文献２等を参照。）、トランスポゾンを用いて目的の遺伝子を破壊する方法（例えば、特許文献３等を参照。）、又は栄養要求性を解除する選択マーカーを用いた目的遺伝子を破壊する方法（例えば、特許文献４等を参照。）等を用いることができる。また、「欠損」は、当該遺伝子のコード領域及び調節領域における少なくとも一部の欠損を意味する。また、「変異」とは、当該遺伝子のコード領域及び調節領域における１又は２以上の塩基の挿入、置換及び付加を含む。
【００２６】
また、「制限温度」とは、野生株では増殖が可能であるが、上記の非必須遺伝子に変異を有する酵母変異体では増殖が抑制される温度のことをいう。制限温度は、酵母の種及び発現が抑制された非必須遺伝子等により異なり、さらに培養条件及び培養機器等により多少の差違は生じるが、最も増殖が抑制される温度を選択すればよい。例えば、ｖｒｐ１遺伝子が破壊等により発現抑制された出芽酵母では、３５℃以上且つ３６℃以下の範囲で選択することが好ましい。
【００２７】
また、本発明に係るスクリーニング方法において、「被検物質を処理する」とは、被検物質を酵母変異体に影響を与えることが可能な状態にすればよく、例えば被検物質を、酵母変異体を培養する培地に加えてもよく、ペーパーディスク等の吸水性を有する材料に含ませて、それを培地に載置してもよい。
【００２８】
本発明に係るスクリーニング方法において、酵母は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又は分裂酵母（Schizosaccharomyces ponbe）等から選択でき、選択された酵母の株と制限温度とを組み合わせて、良好な増殖抑制が見られる条件をそれぞれ選択することができる。非必須遺伝子が破壊等により発現抑制された酵母は、種々の微生物寄託機関に保管されている株の分譲を受けてもよく、商業的に入手が可能な株を購入してもよい。さらに、これらの他に、相同組変え等を利用して野生株に含まれる所望の非必須遺伝子を破壊してもよく、適当な非必須遺伝子破壊株ライブラリから、ＣＮと拮抗的に作用する非必須遺伝子が破壊された酵母変異体を選択してもよい。酵母の非必須遺伝子破壊株ライブラリとしては、例えばOpen Biosystems社製のYeast Knock Out Strain Collection等を用いることができる。
【００２９】
ここで、ｖｒｐ１遺伝子を有する酵母の野生株及びｖｒｐ１遺伝子が破壊された酵母変異体を制限温度で培養した際の増殖の有無及びその機構について、図１を参照しながら説明する。図１（ａ）〜（ｄ）は野生株又は酵母変異体を制限温度で培養した際のＣＮとｖｒｐ１遺伝子により発現するＶｒｐ１タンパク質との作用を模式的に示しており、（ａ）は野生株の場合を示し、（ｂ）は酵母変異体の場合を示し、（ｃ）は酵母変異体にＣＮ活性阻害剤であるＦＫ５０６を処理した場合を示し、（ｄ）はｖｒｐ１遺伝子及び、後述するｆｋｂ１遺伝子が破壊された酵母変異体にＦＫ５０６を処理した場合を示している。
【００３０】
図１（ａ）に示すように、野生株では、酵母の増殖を促進するＶｒｐ１と増殖を抑制するＣＮとが拮抗的に作用するため、結果として酵母は増殖することとなる。一方、ｖｒｐ１遺伝子が破壊された酵母変異体では、図１（ｂ）に示すように、制限温度ではＣＮがＶｒｐ１と拮抗することなく作用するため、酵母の増殖は抑制される。このとき、ＣＮ活性阻害剤であるＦＫ５０６を酵母に処理すると、図１（ｃ）に示すように、ＦＫ５０６はＦＫＢＰ（FK506 binding protein）と結合し、この複合体によりＣＮ活性が抑制されるため、結果として酵母は増殖することとなる。また、ｖｒｐ１と共に、ＦＫＢＰの発現に関わるｆｋｂ１遺伝子が破壊された二重破壊株にＦＫ５０６を処理すると、図１（ｄ）に示すように、ＦＫＢＰが発現しない。このため、ＦＫ５０６はＦＫＢＰと結合できず、ＣＮ活性が抑制されないので、ＣＮの作用により酵母の増殖は抑制される。
【００３１】
すなわち、ｖｒｐ１遺伝子が破壊された酵母変異体は、制限温度において、ＣＮ活性が抑制されなければ細胞増殖することができない。この特性を利用して、被検物質を酵母変異体に処理して制限温度で培養することにより、酵母変異体が増殖するかどうかを測定することにより、ＣＮ活性を抑制する物質のスクリーニングを行うことができる。さらに、言い換えると、被検物質を酵母変異体に処理して制限温度で培養することにより、酵母変異体が増殖すれば、その被検物質は、ＣＮ活性を抑制する物質であるといえる。
【００３２】
このように、本発明に係るスクリーニング方法は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）等のカルシウム塩を酵母に処理することなく、単に培養温度を制限温度に調節することのみによって、ＣＮによる細胞増殖抑制を起こすことができるため、より簡便で且つより特異性が高いスクリーニングを可能とする。
【実施例】
【００３３】
以下に、本発明に係るＣＮ活性を抑制する物質のスクリーニング方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【００３４】
（実施例１）
本実施例では、本発明に係るスクリーニング方法に用いられる酵母変異体の取得について説明する。本発明に係る酵母変異体の取得のために、まず、親株がＢＹ４７４１株である出芽酵母非必須遺伝子破壊ライブラリ（Yeast Knock Out Strain Collection, Yeast Mat a Collection,YSC1053：Open Biosystems社製、フナコシ株式会社より購入）を用いて、この中から３５．５℃において増殖が抑制される株を選択した。さらに、選択された株に対して、ＣＮ活性阻害剤であるタクロリムス（ＦＫ５０６）により、３５．５℃における増殖が回復した株を選択した。選択された酵母変異体は、配列番号１に示す遺伝子配列を有するｖｒｐ１（ＹＬＲ３３７Ｃ）遺伝子が破壊されていることが確認されたため、ｖｒｐ１破壊株と結論付けた。
【００３５】
上記のように選択されたｖｒｐ１破壊株が、ＣＮ活性を抑制する物質のスクリーニング方法に用いることが可能かどうか確認するために、以下の試験を行った。
【００３６】
（実施例２）
本実施例では、野生株及びｖｒｐ１遺伝子が破壊された酵母変異体に対して、制限温度におけるＦＫ５０６の感受性について評価し、それぞれの結果を比較した。
【００３７】
まず、菌体２ｍｌをＹＰＤ培地に植菌し、２５℃で一晩培養した。培養後、菌体濃度を血球計算板（血球計数装置）を用いて測定し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように滅菌水で希釈した。これを原液として、５倍希釈の系列を作製し、それらをＹＰＤ寒天培地、又は２．０μｇ／ｍｌのＦＫ５０６を含むＹＰＤ寒天培地にそれぞれ植菌した。その後、それらを２８℃又は３５．５℃で培養した。その後、各株の増殖を観察した結果を図２に示す。なお、図２において、２８℃培養を行った株についてはＦＫ５０６を処理しておらず、各結果は左から原液、５倍希釈及び２５倍希釈の菌体を培地に植菌した結果である。
【００３８】
図２に示すように、２８℃培養では、野生株（ＷＴ）及び酵母変異体（Δｖｒｐ１）は、共に増殖していることがわかる。一方、３５．５℃培養では、野生株の増殖は見られるが、Δｖｒｐ１の増殖が抑制されている。３５．５℃培養において、ＦＫ５０６を処理すると、Δｖｒｐ１の増殖が２８℃培養程ではないが、回復していることがわかる。この結果から、制限温度（３５．５℃）において、ｖｒｐ１が破壊された酵母変異体は、ＣＮ活性が抑制されることにより増殖が回復する可能性が示唆された。
【００３９】
（実施例３）
本実施例では、上記の増殖の回復が、ＣＮ活性の抑制に関連していることを確認するために、ＣＮの調節サブユニットであるｃｎｂ１が破壊された変異体（Δｃｎｂ１）を用いて、上記と同様の試験を行った。その結果を図３に示す。なお、Δｃｎｂ１は、配列番号２に示す遺伝子配列を有するｃｎｂ１（ＹＫＬ１９０Ｗ）遺伝子を破壊することにより作製した。具体的には、常法に従って、カナマイシン耐性遺伝子を含むｃｎｂ１遺伝子の相同組変え部位を有するベクターを構築し、それを野生株に導入した。これにより、相同組換えが起こったカナマイシン耐性を有する株を選択することによって、Δｃｎｂ１を取得した。また、同様の遺伝子破壊をΔｖｒｐ１に対して行うことにより、ｖｒｐ１とｃｎｂ１との両方が破壊された二重変異体（Δｃｎｂ１Δｖｒｐ１）を作製し、この試験に用いた。
【００４０】
図３に示すように、野生株（ＷＴ）及び各変異体は、２８℃培養では、それぞれ増殖が見られた。一方、３５．５℃培養において、野生株及びΔｃｎｂ１は、２８℃培養と同等の増殖が見られたが、Δｖｒｐ１の増殖は顕著に抑制された。また、Δｃｎｂ１Δｖｒｐ１は、Δｖｒｐ１と比較すると、増殖が回復していることがわかる。この結果から、制限温度におけるΔｖｒｐ１の増殖抑制は、ＣＮ活性が関わっていることが示唆された。すなわち、ｃｎｂ１が破壊されていると、ＣＮが作用しないため、ｖｒｐ１が破壊されていても細胞増殖が起こる。
【００４１】
（実施例４）
本実施例では、ｖｒｐ１破壊株が、本発明に係るスクリーニング方法に用いることが可能であることを、さらに確認した。すなわち、ｖｒｐ１遺伝子と、ＣＮ活性阻害剤であるＦＫ５０６と結合することによってＣＮ活性を抑制するＦＫＢＰ（FK506 binding protein）の発現に関与するｆｋｂ１遺伝子とが破壊された酵母変異体（Δｖｒｐ１Δｆｋｂ１）を用いて以下の試験を行った。なお、Δｖｒｐ１Δｆｋｂ１は、Δｖｒｐ１に対して、さらに配列番号３に示す遺伝子配列を有するｆｋｂ１（ＹＮＬ１３５Ｃ）遺伝子を破壊することにより作製した。具体的に、上記と同様に、常法に従って、薬剤耐性遺伝子を含むｆｋｂ１遺伝子の相同組変え部位を有するベクターを構築し、Δｖｒｐ１に導入して、Δｖｒｐ１Δｆｋｂ１を作製した。
【００４２】
まず、Δｖｒｐ１及びΔｖｒｐ１Δｆｋｂ１のそれぞれをＹＰＤ培地で培養し、０．７％ａｇａｒを含むＹＰＤ培地１０ｍｌに、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度となるように調製した。次に、培養プレートに２％ａｇａｒを含むＹＰＤ培地２０ｍｌを入れ、予め、固めておき、その上に上記の調製した培養液を加えた。次に、その培養液の上に直径が８ｍｍのペーパーディスクを３枚載置した。３枚のペーパーディスクのうち、１枚は２００ｎｇのＦＫ５０６を添加し、他の１枚には４００ｎｇのＦＫ５０６を添加し、残りの１枚にはＦＫ５０６の溶媒として用いたエタノールを添加した。その後、培養プレートを３５．５℃のインキュベータに入れ、各株を２日間培養した。その結果を図４に示す。
【００４３】
図４に示すように、Δｖｒｐ１において、ＦＫ５０６を処理されなかった菌体は、増殖が見られなかったが、ＦＫ５０６を処理した菌体は、ＦＫ５０６の濃度依存的に増殖が見られた。一方、Δｖｒｐ１Δｆｋｐ１では、ＦＫ５０６を処理しても増殖は見られなかった。すなわち、ＦＫ５０６がＣＮ活性を抑制するために必要なタンパク質であるＦＫＢＰが存在しない場合、ＦＫ５０６を処理しても酵母の増殖は回復しない。この結果から、ｖｒｐ１欠損株は、制限温度において、ＣＮ活性を抑制することで増殖を回復できる。これにより、ｖｒｐ１欠損株は、本発明のスクリーニング方法に用いることができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明に係るカルシニューリン活性を抑制する物質のスクリーニング方法は、極めて簡便に且つ高い特異性で当該物質をスクリーニングできるため、カルシニューリン活性が関わる疾病に対する薬剤となる可能性がある物質をスクリーニングする方法として有用であり、製薬産業等において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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