(57)【要約】      （修正有）【課題】植物体中におけるリグニン含有量をあまり低減させずに植物の収量を十分に確保することができ、しかも効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができるトランスジェニック植物、および効率よく糖類を製造することができる糖類の製造方法を提供すること。【解決手段】草本性単子葉植物中のリグノセルロースの非結晶領域および／または結晶領域の表層領域の生合成を行なう酵素の遺伝子発現と、前記結晶領域の内側層領域の生合成を行なう酵素の遺伝子発現とが抑制されたトランスジェニック植物、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドまたはそのバリアントをコードする遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック植物、および前記トランスジェニック植物を用いる糖類の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
草本性単子葉植物中のリグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成を行なう酵素をコードする遺伝子の発現と、前記リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成を行なう酵素をコードする遺伝子の発現とが抑制されてなるトランスジェニック植物。
【請求項２】
前記リグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成を行なう酵素が、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素である請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
前記シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも４０％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、および
（ｄ）配列番号：１に示される塩基配列または配列番号：１と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドである請求項２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成を行なう酵素が、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素である請求項１〜３のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
前記カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼが、（Ａ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも３５％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、および
（Ｄ）配列番号：３に示される塩基配列または配列番号：３と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドである請求項４に記載のトランスジェニック植物。
【請求項６】
前記草本性単子葉植物が、イネ科植物である請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
草本性単子葉植物において、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも４０％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、および
（ｄ）配列番号：１に示される塩基配列または配列番号：１と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されてなるトランスジェニック植物。
【請求項８】
草本性単子葉植物において、（Ａ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも３５％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、および
（Ｄ）配列番号：３に示される塩基配列または配列番号：３と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されてなるトランスジェニック植物。
【請求項９】
植物中のセルロースを糖化して糖類を得る糖類の製造方法であって、前記植物として、請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェニック植物を用いることを特徴とする糖類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類の製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、燃料、化合物などの原料を製造するのに有用なトランスジェニック植物および糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、細胞壁等に炭水化物を多く含んでいるため、燃料、化合物などの原料としての利用が期待されている。例えば、トウモロコシ、サトウキビなどの可食植物の可食部に含まれるデンプンおよびスクロースは、ガソリンなどに混合することによって燃料として用いられるバイオエタノールなどの原料として用いられている。しかし、可食植物は、食糧または家畜飼料としても用いられていることから、当該可食植物の需要の増加は、価格の高騰や食糧難を招くおそれがある。
【０００３】
これに対して、植物の細胞壁を構成するセルロースは、地球上において最も多く存在するバイオマスとして知られている。セルロースは、デンプンと同様にグルコースを構成単位とする重合体であるが、セルロースにおけるグルコースの結合様式は、デンプンにおけるグルコースの結合様式と異なる。そのため、ヒトは、セルロースを消化することができないことから、かかるセルロースを燃料、化合物などの原料として利用する場合には、可食植物のような問題を生じるおそれが小さいと考えられている。しかし、植物体に含まれているセルロースは、酵素などによって分解しがたいリグニンと結合した状態で存在しているため、そのままの状態で燃料などの原料として使用することが困難である。
【０００４】
近年、遺伝子工学的手法を用い、リグニン生合成系に関わる特定の遺伝子の発現を抑制することにより、植物の細胞壁中におけるリグニン含有量を低減させる方法が報告されている（例えば、特許文献１および２など参照）。しかし、リグニンは、植物にとって植物体の支持、水の輸送、病傷害耐性などを担う重要な成分であるため、特に草本性単子葉植物は、植物体中におけるリグニン含有量が大きく低減した場合、生育が悪くなるおそれがある。
【０００５】
したがって、原料となる植物の植物体中におけるリグニン含有量をあまり低減させずに植物の収量を十分に確保することができるとともに、効率よく糖化を行なうことができる植物体を利用した糖類の製造方法の開発が待ち望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５１４２２７号公報
【特許文献２】特表２００８−５１３０３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、植物体中におけるリグニン含有量をあまり低減させずに植物の収量を十分に確保することができ、しかも効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができるトランスジェニック植物を提供することを課題とする。また、本発明は、効率よく糖類を製造することができる糖類の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、
〔１〕  草本性単子葉植物中のリグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成を行なう酵素をコードする遺伝子の発現と、前記リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成を行なう酵素をコードする遺伝子の発現とが抑制されてなるトランスジェニック植物、
〔２〕  前記リグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成を行なう酵素が、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素である前記〔１〕に記載のトランスジェニック植物、
〔３〕  前記シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼが、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも４０％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、および
（ｄ）配列番号：１に示される塩基配列または配列番号：１と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドである前記〔２〕に記載のトランスジェニック植物、
〔４〕  リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成を行なう酵素が、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のトランスジェニック植物、
〔５〕  前記カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼが、（Ａ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、および
（Ｃ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも３５％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、および
（Ｄ）配列番号：３に示される塩基配列または配列番号：３と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドである前記〔４〕に記載のトランスジェニック植物、
〔６〕  前記草本性単子葉植物が、イネ科植物である、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のトランスジェニック植物、
〔７〕  草本性単子葉植物において、（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも４０％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、および
（ｄ）配列番号：１に示される塩基配列または配列番号：１と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されてなるトランスジェニック植物、
〔８〕  草本性単子葉植物において、（Ａ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも３５％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、および
（Ｄ）配列番号：３に示される塩基配列または配列番号：３と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されてなるトランスジェニック植物、ならびに
〔９〕  植物中のセルロースを糖化して糖類を得る糖類の製造方法であって、前記植物として、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のトランスジェニック植物を用いることを特徴とする糖類の製造方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のトランスジェニック植物によれば、植物体中におけるリグニン含有量をあまり低減させずに植物の収量を十分に確保することができ、しかも効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができるという優れた効果が奏される。また、本発明の糖類の製造方法によれば、効率よく糖類を製造することができるという優れた効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試験例１において、反応時間と糖化率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２】試験例２において、反応時間と糖化率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．トランスジェニック植物
本発明のトランスジェニック植物は、草本性単子葉植物中のリグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成を行なう酵素（以下、「酵素Ｉ」という）をコードする遺伝子の発現と、前記リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成を行なう酵素（以下、「酵素ＩＩ」という）をコードする遺伝子の発現とが抑制されたトランスジェニック植物である（以下、「トランスジェニック植物１」という）。
【００１２】
草本性単子葉植物では、リグニン生合成系に関わる遺伝子の発現が抑制された場合、植物体中におけるリグニン含有量が低減するにしたがって植物体の強度が低下し、生育に悪影響を及ぼす。
【００１３】
しかしながら、本発明のトランスジェニック植物１は、前記酵素Ｉをコードする遺伝子および酵素ＩＩをコードする遺伝子の両方の発現が抑制されているため、野生型の草本性単子葉植物と比べて、生育に影響を与えない程度に植物体中におけるリグニン含有量を低減させることができる。さらに、本発明のトランスジェニック植物１は、前記酵素Ｉをコードする遺伝子および酵素ＩＩをコードする遺伝子のいずれか一方の発現を抑制した場合よりも、当該植物体に含まれるセルロースを糖化する際の反応時間を短くすることができる。
【００１４】
したがって、本発明のトランスジェニック植物１によれば、リグニン含有量をあまり低減させずに原料となる植物の収量を十分に確保することができ、しかも野生型の草本性単子葉植物の植物体に含まれるセルロースを糖化する場合と比べて、極めて効率よく糖化を行なうことが可能となる。
【００１５】
草本性単子葉植物としては、例えば、イネ科植物、イグサ科植物、カヤツリグサ科植物、ガマ科植物、ホシクサ科植物、ヤシ科植物、ツユクサ科植物、ミズアオイ科植物、バショウ科植物、ショウガ科植物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのなかでは、栽培が容易であり、遺伝子導入による形質転換体の作製が容易である観点から、イネ科植物が好ましい。
【００１６】
前記イネ科植物としては、例えば、イネ属植物、コムギ属植物、オオムギ属植物、カラスムギ属植物、ライムギ属植物、キビ属植物、アワ属植物、エノコログサ属植物、トウモロコシ属植物、オヒシバ属植物、モロコシ属植物、タケ連植物、コマモ属植物、サトウキビ属植物、ジュダマ属植物、ヨシ属植物、ススキ属植物、ササ属植物、シバ属植物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記イネ科植物のなかでは、栽培が容易であり、遺伝子導入による形質転換体の作製が容易である観点から、イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、マコモ、サトウキビ、ハトムギ、ヨシ、ススキ、ササ、ダンチク、シロガネヨシおよびシバが好ましく、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、キビ、アワおよびヒエがより好ましく、イネがさらに好ましい。
【００１７】
本明細書において、「リグノセルロースの非結晶領域」とは、Ｘ線回折法によってリグノセルロースを解析したときに、その結晶化度が１５％未満である領域であり、酸による加水分解で容易に分解される領域をいう。また、「リグノセルロースの結晶領域の表層領域」とは、Ｘ線回折法によってリグノセルロースを解析したときに、その結晶化度が１５％以上である領域であり、酸によって容易に分解されない領域であり、表面特性として少なくともカチオンを吸着する性質のある領域をいう。また、「リグノセルロースの結晶領域の内側層領域」とは、Ｘ線回折法によってリグノセルロースを解析したときに、その結晶化度が１５％以上である領域であり、表面特性として少なくともカチオンを吸着しない領域をいう。
【００１８】
前記酵素Ｉとしては、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、その類縁酵素などが挙げられる。なお、本明細書において、「シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼの類縁酵素」とは、アミノ酸配列上の共通点および作用機序の共通点がなくても、リグノセルロースの非結晶領域および／またはリグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成に関与する点で、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼと同じである酵素をいう。
【００１９】
前記シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼとしては、例えば、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ８ｃ（ＣＡＤ８ｃ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０６７０８５）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ７（ＣＡＤ７）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ１０２４５２）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ様（ＣＡＤＬ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０６８８２４）などのシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属する酵素が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼのなかでは、効率よく糖化を行なう観点から、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２が好ましい。
【００２０】
前記シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼの類縁酵素としては、例えば、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ２（４ＣＬ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０７００８３）、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ３（４ＣＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ１２０９６４）、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ４（４ＣＬ４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０８００８３Ｈ２４）、ヒドロキシシンナモイルＣｏＡシキミ酸／キナ酸ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ１（ＨＣＴ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０７２５２８）、ヒドロキシシンナモイルＣｏＡシキミ酸／キナ酸ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ２（ＨＣＴ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０６０７０５）、ヒドロキシシンナモイルＣｏＡシキミ酸／キナ酸ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ３（ＨＣＴ３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ１０１９００）、ｐ−クマロイルシキミ酸／キナ酸  ３−ヒドロキシラーゼ１（Ｃ３Ｈ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０９９６９５）、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ１（ＣＯＡ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０６５７４４）、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ２０（ＣＯＡ２０）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０７１４８２）、カフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ１（ＣｏＡＯＭＴ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０６１７５７）、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ１９（ＣＣＲ１９）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０６７９４９）、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ２０（ＣＣＲ２０）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０７２８７２）、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ２１（ＣＣＲ２１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０７０７４６）、フェルラ酸−５−ヒドロキシラーゼ様２（Ｆ５ＨＬ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ２０７２５３）、フェルラ酸−５−ヒドロキシラーゼ１（Ｆ５Ｈ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０６７８４７）、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ２（ＰＡＬ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０５４０９５）、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ１（ＰＡＬ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ１０２８１７）、ケイ皮酸  ４−ヒドロキシラーゼ１（Ｃ４Ｈ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０７２５８８）、ケイ皮酸  ４−ヒドロキシラーゼ２（Ｃ４Ｈ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ１００５９８）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２１】
前記酵素ＩＩとしては、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、その類縁酵素などが挙げられる。なお、本明細書において、「カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの類縁酵素」とは、アミノ酸配列上の共通点および作用機序の共通点がなくても、リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成に関与する点で、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼと同じである酵素をいう。
【００２２】
前記カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼとしては、例えば、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ３、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ２などのカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼファミリーに属する酵素が挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼのなかでは、効率よく糖化を行なう観点から、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ３が好ましい。
【００２３】
前記カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの類縁酵素は、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼと同様に、リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成に関与する酵素であればよく、特に限定されるものではない。
【００２４】
本発明のトランスジェニック植物１のなかでは、生育に影響を与えない程度に植物体中におけるリグニン含有量を低減させ、植物体に含まれるセルロースの糖化率を著しく向上させる観点から、草本性単子葉植物中のシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２遺伝子の発現と、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子、特にカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ３遺伝子の発現とが抑制されたトランスジェニック植物が好ましい。
【００２５】
前記シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼは、
（ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも４０％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド、および
（ｄ）配列番号：１に示される塩基配列または配列番号：１と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドである。
【００２６】
また、前記カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼは、
（Ａ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４において、１個もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対する配列同一性が少なくとも３５％であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド、および
（Ｄ）配列番号：３に示される塩基配列または配列番号：３と縮重を介して異なる塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドであって、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチド
からなる群より選ばれたポリペプチドである。
【００２７】
前記（ａ）において、配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ｐ−クマル酸を経て生成されるシンナムアルデヒドをシンナミルアルコールに変換する活性を有する。また、前記（Ａ）において、配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、カフェー酸および５−ヒドロキシフェルラ酸をメチル化して、それぞれフェルラ酸およびシナップ酸を生成する活性を有する。
【００２８】
前記（ｂ）および（Ｂ）において、前記「１個もしくは数個」とは、１〜３０個をいう。前記「１個もしくは数個」は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個または２個をいう。
【００２９】
前記（ｂ）および（Ｂ）において、前記置換は、特定のアミノ酸残基と、当該特定のアミノ酸残基と親水性、疎水性、極性、非極性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴などの物理化学的性質が類似したアミノ酸残基（以下、本明細書においては、「類似アミノ酸残基」ともいう）との間の保存的置換であってもよい。前記保存的置換としては、例えば、グリシン残基およびアラニン残基の相互間での置換、バリン残基、イソロイシン残基およびロイシン残基の相互間での置換、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基およびグルタミン残基の相互間での置換、セリン残基およびスレオニン残基の相互間での置換、リジン残基およびアルギニン残基の相互間での置換、フェニルアラニン残基およびチロシン残基の相互間での置換などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３０】
前記（ｃ）において、配列同一性は、ポリペプチドが、草本性単子葉植物において、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示す範囲であればよく、４０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。また、前記（Ｃ）において、配列同一性は、ポリペプチドが、草本性単子葉植物において、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示す範囲であればよく、３５％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。本明細書において、「配列同一性」は、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列（参照配列）に対して、評価対象のアミノ酸配列（クエリー配列）を、Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：１０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：３、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）およびＭａｔｒｉｘ：ＢＬＳＵＭ６２の条件でＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくＰＲＯＴＥＩＮ  ＢＬＡＳＴを用いてアライメントして算出された値をいう。
【００３１】
前記（ｄ）および（Ｄ）において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、前記相補鎖と、前記相補鎖に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温、よりストリンジェントな条件として４２℃以上、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件が挙げられる。
【００３２】
前記（ｄ）および（Ｄ）において、「相補鎖」とは、対となる塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸をいう。
【００３３】
ポリペプチドがシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すことは、例えば、前記ポリペプチドによってコニフェリルアルコールが酸化されることを確認することによって評価することができる。また、ポリペプチドがカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ活性を示すことは、前記ポリペプチドによってカフェー酸または５−ヒドロキシフェルラ酸にメチル基が導入されることを確認することによって評価することができる。
【００３４】
遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えば、ＲＮＡｉによって遺伝子の発現を抑制する方法（ＲＮＡｉ法）；アンチセンス核酸によって転写の阻害または遺伝子を含む核酸の分解を行なって遺伝子の発現を抑制する方法（アンチセンス法）；遺伝子へのフレームシフト変異、ナンセンス変異などの導入によって遺伝子の発現を抑制する方法；遺伝子が座上するゲノム領域の欠失によって遺伝子の発現を抑制する方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのなかでは、簡便な操作で、効率よく遺伝子の発現を抑制することができることから、ＲＮＡｉによって遺伝子の発現を抑制することが好ましい。
【００３５】
前記ＲＮＡｉ法においては、ベクターにＲＮＡｉトリガーの配列を組み込んだＲＮＡｉトリガーベクター、発現抑制対象の遺伝子に応じたｓｉＲＮＡなどを用いることができる。
【００３６】
前記ＲＮＡｉトリガーの配列は、発現抑制対象の遺伝子に特異的な部分の塩基配列などに基づいて設計することができる。例えば、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーの配列としては、例えば、配列番号：１１に示される塩基配列、配列番号：１２に示される塩基配列などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーの配列としては、例えば、配列番号：１３に示される塩基配列などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３７】
ｓｉＲＮＡは、例えば、下記１）〜５）などの条件に基づいて設計することができる。
１）  発現抑制対象の遺伝子の塩基配列に特異的であること
２）  ガイド鎖の５’末端がアデニン残基またはウラシル残基であること、
３）  パッセンジャー鎖の５’末端がグアニン残基またはシトシン残基であること、
４）  アンチセンス鎖の５’末端領域にアデニン残基またはウラシル残基の存在量が多くなっていること、
５）  長いＧＣの連続配列がないこと。
【００３８】
前記アンチセンス法においては、アンチセンス核酸として、発現抑制対象の遺伝子の塩基配列に対応する標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ、ｍＲＮＡなど）の配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部からなり、前記標的核酸とのハイブリッドを形成することにより、前記標的核酸にコードされる遺伝子の発現を抑制する核酸が用いられる。標的核酸中におけるアンチセンス核酸による標的領域としては、特に限定されるものではなく、５’末端非翻訳領域、翻訳開始コドン、コード領域、翻訳終止コドン、３’末端非翻訳領域などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３９】
前記アンチセンス核酸は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子およびＤＮＡとＲＮＡとのキメラ分子のいずれであってもよい。また、前記アンチセンス核酸は、本発明の目的を妨げないものであれば、非ヌクレオチド骨格を有するポリマー（例えば、ペプチド核酸など）、ＲＮＡやＤＮＡと構成糖が異なるポリマー、修飾基（例えば、アンチセンス核酸の導入を容易にする官能基、アンチセンス核酸の安定性を向上させる官能基、標的となるｍＲＮＡとの結合安定性を向上させる官能基など）を有する核酸などや、これらの組み合わせの化合物などの核酸誘導体であってもよい。
【００４０】
なお、これらのＲＮＡｉトリガーベクター、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸は、収量を十分に確保することができ、かつ効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができる糖化向上剤として用いることもできる。
【００４１】
遺伝子の発現の抑制は、植物における前記遺伝子に対応するｍＲＮＡ量、前記ｍＲＮＡの有無を調べ、野生型植物における前記遺伝子に対応するｍＲＮＡ量と比べて、ｍＲＮＡ量が低減していること、植物における前記遺伝子に対応するｍＲＮＡが検出されないことなどを遺伝子の発現が抑制されたことの指標として用いて確認することができる。
【００４２】
本発明のトランスジェニック植物は、他の側面では、草本性単子葉植物において、前記（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドからなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック植物である（以下、「トランスジェニック植物２」という）。
【００４３】
本発明のトランスジェニック植物２は、前記（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドからなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されているため、草本性単子葉植物中のリグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成が抑制される。したがって、本発明のトランスジェニック植物２によれば、糖化の前期段階に糖化酵素が作用しやすくなっており、反応が速やかに行なわれるため、糖化に要する反応時間を低減させることが可能な状態の植物体を得ることができる。
【００４４】
本発明のトランスジェニック植物は、さらに他の側面では、草本性単子葉植物において、前記（Ａ）〜（Ｄ）のポリペプチドからなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック植物である（以下、「トランスジェニック植物３」という）。
【００４５】
本発明のトランスジェニック植物３は、前記（Ａ）〜（Ｄ）のポリペプチドからなる群より選ばれたポリペプチドをコードする遺伝子の発現が抑制されているため、草本性単子葉植物中のリグノセルロースの結晶領域において、糖化酵素が作用しにくい内側層領域の生合成が抑制される。したがって、本発明のトランスジェニック植物３によれば、糖化反応が開始されてから非結晶領域および表層領域が糖化された後において糖化酵素が内側層領域に作用しやすくなっており、内側層領域の糖化が速やかに行なわれるため、糖類の収率をさらに向上させることが可能な植物体を得ることができる。
【００４６】
２．糖類の製造方法
本発明の糖類の製造方法は、植物中のセルロースを糖化して糖類を得る糖類の製造方法であって、前記植物として、前記トランスジェニック植物を用いることを特徴とする。本発明の糖類の製造方法は、前記トランスジェニック植物を用いるため、効率よく糖化を行なって糖類を製造することができる。
【００４７】
前記トランスジェニック植物のなかでは、植物の収量を十分に確保し、かつ植物体に含まれるセルロースの糖化率を向上させる観点から、好ましくはトランスジェニック植物１である。
【００４８】
植物中のセルロースの糖化に先立ち、まず、トランスジェニック植物の植物体の全部またはその一部を収穫する。トランスジェニック植物の植物体の一部を用いる場合、糖化に用いる部位としては、根、茎、葉、実（果実）、花などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。例えば、トランスジェニック植物がイネ科植物、具体的にはイネ、トウモロコシ、コムギなどに由来する場合、糖化に用いる部位は、好ましくは葉および茎、より好ましくは茎である。また、トランスジェニック植物が可食植物に由来する場合、糖化に用いる部位は、食糧および飼料との競合を防ぐ観点から、好ましくは非可食部位である。
【００４９】
収穫された植物体は、糖化をより効率よく行なう観点から、粉砕することが望ましい。また、収穫された植物体は、必要に応じて、デンプンが除去されていてもよい。
【００５０】
さらに、糖化をより効率よく行なう観点から、収穫された植物体を乾燥させてもよい。植物体の乾燥は、自然乾燥であってもよく、乾燥器などを用いた強制的な乾燥であってもよい。
【００５１】
植物中のセルロースの糖化は、例えば、糖化酵素を用いる酵素糖化法、硫酸を用いる硫酸糖化法等により行なうことができる。これらのなかでは、外部環境に対する負荷を低減し、かつ糖化を適切に制御する観点から、好ましくは酵素糖化法である。
【００５２】
前記酵素糖化法においては、糖化は、植物体と糖化酵素とを当該糖化酵素に応じた反応条件下に接触させることによって行なわれる。植物体に接触させる糖化酵素の量、反応条件（例えば、反応時間、反応温度など）は、用いられる植物体の種類および量、糖化酵素の種類などによって異なることから、当該植物体の種類および量、糖化酵素の種類に応じて適宜決定することが望ましい。
【００５３】
前記糖化酵素としては、例えば、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、エンドグルカナーゼなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００５４】
また、前記硫酸糖化法においては、糖化は、植物体と硫酸とを加熱条件下に接触させることによって行なわれる。植物体に接触させる硫酸の量、反応条件（例えば、反応時間、反応温度など）は、用いられる植物体の種類および量などによって異なることから、当該植物体の種類および量などに応じて適宜決定することが望ましい。
【００５５】
本発明の糖類の製造方法によって得られた糖類には、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖などが含まれる。したがって、本発明の糖類の製造方法によって得られた糖類は、用途に応じて、そのまま用いてもよく、精製して用いてもよい。
【００５６】
本発明の糖類の製造方法によって得られた糖類は、例えば、食品、医薬品、家畜用飼料、養殖用飼料、これらの添加物などに用いることができる。また、本発明の糖類の製造方法によって得られた糖類は、微生物による利用が容易な単糖、二糖、オリゴ糖、多糖などが含まれることから、微生物による有用物質の生産（例えば、アルコール発酵、乳酸発酵、メタン発酵、酪酸発酵など）のための原料などに用いることができる。
【００５７】
３．糖化促進剤のスクリーニング方法
前述したように、草本性単子葉植物におけるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現またはカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することにより、植物体中におけるリグニン含有量をあまり低減させずに植物の収量を十分に確保することができ、かつ効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができる。したがって、被検物質の有無によるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子またはカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量の変化を調べることにより、被検物質のなかから収量を十分に確保することができ、かつ効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができる糖化向上剤を選抜することができる。
【００５８】
糖化促進剤のスクリーニング方法では、被験物質存在下および非存在下それぞれでの草本性単子葉植物におけるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子またはカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子の挙動を調べる。例えば、被験物質存在下での草本性単子葉植物における前記遺伝子の発現量が、被験物質非存在下での草本性単子葉植物における前記遺伝子の発現量よりも低減している場合、この被験物質は、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子またはカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現を抑制しているため、収量を十分に確保することができ、かつ効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができる糖化向上剤であると評価することができる。
【００５９】
前記遺伝子の発現量は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析などにより測定することができる。
【００６０】
本発明の糖化促進剤のスクリーニング方法により選抜することができる糖化促進剤の存在下に草本性単子葉植物を育成した場合、収量を十分に確保することができ、かつ効率よく糖化を行なうのに適した植物体が得られることが期待できることから、かかる糖化促進剤のスクリーニング方法は、糖類の製造に適した植物の育成に有用である。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例に基づいて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００６２】
（実施例１）
（１）ＲＮＡｉトリガーベクターの作製
配列番号：１に示されるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（以下、「ＣＡＤ２」と表記する）遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマー対〔フォワードプライマー（配列番号：５、５’−ＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡ−３’）およびリバースプライマー（配列番号：６、５’−ｃａｃｃＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＧＣＡ−３’（小文字部分の配列はエントリーベクターにクローニングするための付加配列である））〕と、鋳型としてのＣＡＤ２遺伝子のｃＤＮＡ（アクセッション番号：ＡＫ１０５０１１）を用いてＰＣＲを行ない、ＰＣＲ産物（ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉトリガー（配列番号：１１））を得た。得られたＰＣＲ産物をエントリーベクター〔ライフテクノロジーズ  コーポレーション製、商品名：ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ〕に導入し、組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミドと、組換え酵素〔ライフテクノロジーズ  コーポレーション製、商品名：ＬＲクロナーゼとを用い、ｐＡＮＤＡベクター〔三木大介ら、プラント・アンド・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、第４５巻、２００４年発行、ｐｐ．４９０−４９５）〕に導入し、ＲＮＡｉトリガーベクターｐＡＮＤＡ−ＣＡＤを得た。
【００６３】
（２）ＣＡＤ２抑制イネの作製
実施例１（１）で得られたｐＡＮＤＡ−ＣＡＤを、エレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム・ツメファシエンスＨＢ１０１株に導入し、形質転換アグロバクテリウムを得た。得られた形質転換アグロバクテリウムを、単子葉植物であるイネ〔日本晴（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ．  Ｎｉｐｐｏｎｎｂａｒｅ）〕の種子から誘導したカルスに感染させた。感染後のカルスのなかから、ハイグロマイシンを含む寒天培地で培養したときに生存しているカルスを選択し、さらに再分化培地へ移植することよって形質転換個体を得た。得られた形質転換個体を、組換え植物用の閉鎖系温室中で育成させ、ＣＡＤ２遺伝子の発現が抑制されたＣＡＤ２抑制イネを得た。
【００６４】
（３）デンプン除去試料の調製
実施例１（２）で得られたＣＡＤ２抑制イネを登熟させた。登熟したＣＡＤ２抑制イネを刈り取り、稲わらを得た。得られた稲わらを１ヶ月間室内にて乾燥させた後、粉砕して粉末試料２０ｍｇを得た。つぎに、α−アミラーゼおよびアミログルコシダーゼによるデンプン分解反応を行なうことによって粉末試料中のデンプンを糖化させてデンプンを除去し、デンプン除去試料を得た。
【００６５】
（実施例２）
（１）ＲＮＡｉトリガーベクターの作製
実施例１（１）において、配列番号：１に示されるＣＡＤ２遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマー対の代わりに、配列番号：３で示されるカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ３（以下、「ＣＯＭＴ３」と表記する）遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマー対〔フォワードプライマー（配列番号：７、５’−ｃａｃｃＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＡＣＴ−３’（小文字部分の配列はエントリーベクターにクローニングするための付加配列である））およびリバースプライマー（配列番号：８、５’−ＴＡＣＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣ−３’）〕を用いたことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、ＲＮＡｉトリガーベクターｐＡＮＤＡ−ＣＯＭＴを得た。なお、ＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉトリガーの塩基配列は、配列番号：１３に示される配列である。
【００６６】
（２）ＣＯＭＴ３抑制イネの作製
実施例１（２）において、実施例１（１）で得られたｐＡＮＤＡ−ＣＡＤの代わりに、実施例２（１）で得られたｐＡＮＤＡ−ＣＯＭＴを用いたことを除き、実施例１（２）と同様の操作を行ない、ＣＯＭＴ３遺伝子の発現が抑制されたＣＯＭＴ３抑制イネを得た。
【００６７】
（３）デンプン除去試料の調製
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られたＣＡＤ２抑制イネの代わりに、実施例２（２）で得られたＣＯＭＴ３抑制イネを用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、デンプン除去試料を得た。
【００６８】
（比較例１）
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた組換えイネの代わりに、野生型イネ〔日本晴（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ．  Ｎｉｐｐｏｎｎｂａｒｅ）〕を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、デンプン除去試料を得た。
【００６９】
（試験例１）
（１）リグニン含有量の測定
鈴木史朗ら〔プラント・バイオテクノロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２６巻、２００９年発行、ｐｐ．３３７−３４０〕に記載の定量法に従って、実施例１（２）で得られたＣＡＤ２抑制イネ、実施例２（２）で得られたＣＯＭＴ３抑制イネおよび野生型イネ（比較例１）〔日本晴（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｃｖ．  Ｎｉｐｐｏｎｎｂａｒｅ）〕それぞれの稲わら中のリグニンを定量した。ＣＡＤ２抑制イネ（実施例１）、ＣＯＭＴ３抑制イネ（実施例２）および野生型イネ（比較例１）それぞれの稲わら中におけるリグニン含有量を調べた結果を表１に示す。
【００７０】
【表１】
2013153731.tif 000002
【００７１】
表１に示された結果から、野生型イネ（比較例１）の稲わら中におけるリグニン含有量が１７．５質量％であるのに対して、ＣＡＤ２抑制イネ（実施例１）の稲わら中におけるリグニン含有量は１５．２質量％であり、野生型イネ（比較例１）の稲わら中におけるリグニン含有量と比べて低減していることがわかる。また、表１に示された結果から、ＣＯＭＴ３抑制イネ（実施例２）の稲わら中におけるリグニン含有量は１１．０質量％であり、野生型イネ（比較例１）の稲わら中におけるリグニン含有量と比べて低減していることがわかる。
【００７２】
なお、ＣＡＤ２抑制イネ（実施例１）およびＣＯＭＴ３抑制イネ（実施例２）それぞれの収量（植物体の乾燥重量）は、野生型イネ（比較例１）の収量（植物体の乾燥重量）と同程度であった。したがって、これらの結果から、ＣＡＤ２遺伝子またはＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制することにより、生育に影響を与えない程度に植物体中におけるリグニン含有量を低減させることができることがわかる。
【００７３】
（２）硫酸糖化によって得られた糖化試料のグルコース濃度の測定
実施例１、２および比較例１それぞれで得られたデンプン除去試料２０ｍｇに７２質量％硫酸水溶液１ｍＬを添加した。つぎに、得られた各混合物を、３０℃で穏やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした後、硫酸濃度が９％となるように蒸留水で希釈した。得られた各希釈物を、１００℃で２時間インキュベーションした後、炭酸カルシウムで中和し、糖化試料を得た。得られた各糖化試料を、遠心分離（１００００×ｇ）に供して、それぞれ、上澄み液を回収した。得られた各上澄み液の糖含有量を、グルコース定量試薬〔和光純薬（株）製、商品名：グルコースＣＩＩ−テストワコー〕を用いて測定し、各糖化試料のグルコース濃度を算出した。得られたグルコース濃度をＣｓ（ｍｇ／ｍＬ）とした。
【００７４】
（３）酵素糖化によって得られた糖化試料のグルコース濃度の測定
実施例１、２および比較例１それぞれで得られたデンプン除去試料を、ポリプロピレン製チューブに入れた。各デンプン除去試料に、セルラーゼ、β−グルコシダーゼおよびヘミセルラーゼを含む酵素液１ｍＬを添加し、反応溶液を得た。前記酵素液１ｍＬの組成は、セルラーゼ１.１ＦＰＵ、β−グルコシダーゼ２.５ＣｂＵ、ヘミセルラーゼ０.０６５ｍｇおよび５０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４.８）である。反応溶液が入ったポリプロピレンチューブをサーモブロック回転器（日伸理科ＳＮ−４８ＢＮ）にセットし、回転させながら５０℃で糖化反応を行なった。糖化反応開始時から１時間、２時間、６時間、１０時間、１４時間、２４時間および４８時間経過時それぞれに、反応溶液を１００℃で１０分間加熱して各酵素を失活させることによって糖化反応を終了させた。得られた産物を、氷上にて冷却させ、糖化試料を得た。得られた各糖化試料を、遠心分離（１０，０００×ｇ）に供して、上澄み液を回収した。得られた各上澄み液の糖含有量を、グルコース定量試薬〔和光純薬（株）製、商品名：グルコースＣＩＩ−テストワコー〕を用いて測定し、各糖化試料のグルコース濃度を算出した。得られたグルコース濃度をＣｅ（ｍｇ／ｍＬ）とした。
【００７５】
（４）糖化率の算出
前記（２）で得られた糖含有量Ｃｓと、前記（３）で得られた糖含有量Ｃｅとを用い、式（Ｉ）：
【００７６】
【数１】
2013153731.tif 000003
【００７７】
（式中、Ｃｅは酵素糖化によって得られた糖化試料のグルコース濃度、Ｃｓは硫酸糖化によって得られた糖化試料のグルコース濃度の測定を示す）
に基づき、各反応時間における糖化率を算出した。試験例１において、反応時間と糖化率との関係を調べた結果を図１に示す。図１中、白三角は実施例１で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、白丸は実施例２で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、黒四角は比較例１で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率を示す。
【００７８】
図１に示された結果から、ＣＡＤ２抑制イネおよびＣＯＭＴ３抑制イネから得られたデンプン除去試料（実施例１および２）それぞれを用いたときの糖化率は、野生型イネから得られたデンプン除去試料（比較例１）を用いたときの糖化率と比べて、著しく高くなっていることがわかる。したがって、これらの結果から、ＣＡＤ２遺伝子またはＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制することにより、野生型イネと比べて、セルロースの糖化率が著しく向上することがわかる。
【００７９】
また、図１に示された結果から、イネにおいて、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制した場合（実施例１）、野生型イネの場合と比べて、糖化反応の前期段階に糖化率が急激に上昇することから、草本性単子葉植物中のリグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域におけるリグニンの生合成が抑制されていることが示唆される。したがって、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制することにより、糖化の前期段階に糖化酵素が作用しやすく、糖化に要する反応時間を低減させることが可能な状態の植物体が得られることが期待できる。
【００８０】
さらに、図１に示された結果から、イネにおいて、ＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制した場合（実施例２）、野生型イネの場合と比べて、糖化反応の後期段階の糖化率の上昇度合いが大きくなっていることから、草本性単子葉植物中のリグノセルロースの結晶領域の内側層領域におけるリグニンの生合成が抑制されていることが示唆される。したがって、ＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制することにより、糖化の後期段階において内層側領域への酵素のアクセシビリティが向上し、その結果、糖類の収率を向上させることが可能な植物体を得ることができる。
【００８１】
なお、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉトリガー（配列番号：１１）の代わりに、ＣＡＤ２遺伝子の塩基配列に基づいて作製された別のＲＮＡｉトリガー（配列番号：１２）が組み込まれたＲＮＡｉトリガーベクターを用いた場合にも、実施例１で得られたＣＡＤ２抑制イネと同様の結果が得られた。
【００８２】
（実験例１〜５）
実施例１（１）において、配列番号：１に示されるＣＡＤ２遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマー対の代わりに、モノリグノール生合成系遺伝子の１つであるカフェオイル−ＣｏＡ  Ｏ−メチルトランスフェラーゼ２０（以下、「ＣＯＡ２０」と表記する）遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＫ０７１４８２）に基づいて作製されたプライマー対〔フォワードプライマー（配列番号：９、５’−ＡＡＧＡＧＧＡＣＡＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＴＣＴＴ−３’）およびリバースプライマー（配列番号：１０、５’−ｃａｃｃＴＴＡＡＴＣＡＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＡＴＧ−３’（小文字部分の配列はエントリーベクターにクローニングするための付加配列である））〕を用いたことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、ＲＮＡｉトリガーベクターを得た。
【００８３】
つぎに、実施例１（２）において、実施例１（１）で得られたｐＡＮＤＡ−ＣＡＤの代わりに、比較例２（１）で得られたＲＮＡｉトリガーベクターを用いたことを除き、実施例１（２）と同様の操作を行ない、ＣＯＡ２０遺伝子の発現が抑制された５個体のＣＯＡ２０抑制イネ（実験例１〜５）を得た。
【００８４】
その後、実施例１（３）において、実施例１（２）で得られたＣＡＤ２抑制イネの代わりに、比較例２（２）で得られた５個体のＣＯＡ２０抑制イネを用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、デンプン除去試料を得た。
【００８５】
（比較例２〜５）
比較例１において、比較例１で用いられた野生型イネとは別の４個体（比較例２〜５）それぞれを用いたことを除き、比較例１と同様に操作を行ない、デンプン除去試料を得た。
【００８６】
（試験例２）
試験例１（１）において、実施例１（２）で得られたＣＡＤ２抑制イネ、実施例２（２）で得られたＣＯＭＴ３抑制イネおよび野生型イネ（比較例１）の代わりに、ＣＯＡ２０抑制イネ（実験例１〜５）および野生型イネ（比較例２〜５）を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、ＣＯＡ２０抑制イネ（実験例１〜５）および野生型イネ（比較例２〜５）それぞれの稲わら中におけるリグニン含有量を測定した。ＣＯＡ２０抑制イネ（実験例１〜５）および野生型イネ（比較例２〜５）それぞれの稲わら中におけるリグニン含有量を調べた結果を表２に示す。
【００８７】
また、実施例１、実施例２および比較例１で得られたデンプン除去試料の代わりに、実験例１〜５および比較例２〜５で得られたデンプン除去試料を用いたことを除き、試験例１（２）〜（４）と同様の操作を行ない、各反応時間における糖化率を算出した。試験例２において、反応時間と糖化率との関係を調べた結果を図２に示す。図２中、白四角は実験例１で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、白矩形は実験例２で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、白三角は実験例３で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、白丸は実験例４で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、クロスは実験例５で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、黒四角は比較例２で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、黒矩形は比較例３で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、黒三角は比較例４で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率、黒丸は比較例５で得られたデンプン除去試料を用いたときの糖化率を示す。
【００８８】
【表２】
2013153731.tif 000004
【００８９】
表２に示された結果から、ＣＡＤ２遺伝子およびＣＯＭＴ３遺伝子と同様にモノリグノール生合成系遺伝子に分類されるＣＯＡ２０遺伝子の発現が抑制されたＣＯＡ２０抑制イネ（実験例１〜５）中におけるリグニン含有量は平均１６．３質量％であり、野生型イネ（比較例２〜５）の稲わら中におけるリグニン含有量と比べて低減していることがわかる。
【００９０】
しかしながら、図２に示された結果から、ＣＡＤ２遺伝子およびＣＯＭＴ３遺伝子と同様にモノリグノール生合成系遺伝子に分類されるＣＯＡ２０遺伝子の発現が抑制されたＣＯＡ２０抑制イネから得られたデンプン除去試料（実験例１〜５）を用いたときの糖化率は、野生型イネから得られたデンプン除去試料（比較例２〜５）を用いたときの糖化率と同程度であることがわかる。したがって、これらの結果から、ＣＯＡ２０遺伝子の発現を抑制した場合、野生型イネ中におけるリグニン含有量よりもリグニン含有量が低減するにもかかわらず、糖化率は向上しないことがわかる。
【００９１】
以上の結果から、ＣＡＤ２遺伝子またはＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制することにより、生育に影響を与えない程度に植物体中におけるリグニン含有量を低減させて植物の収量を十分に確保することができるとともに、植物体に含まれるセルロースの糖化率を著しく向上させることができることがわかる。
【００９２】
（実施例３）
実施例１（２）において、実施例１（１）で得られたｐＡＮＤＡ−ＣＡＤの代わりに、実施例１（１）で得られたｐＡＮＤＡ−ＣＡＤおよび実施例２（１）で得られたｐＡＮＤＡ−ＣＯＭＴの両方を併用することを除き、実施例１（２）と同様の操作を行ない、ＣＡＤ２遺伝子の発現およびＣＯＭＴ３遺伝子の発現の両方が抑制されたＣＡＤ２−ＣＯＭＴ３抑制イネを得る。このとき、ＣＡＤ２−ＣＯＭＴ３抑制イネの収量（植物体の乾燥重量）は、野生型イネの収量（植物体の乾燥重量）と同程度となる。
【００９３】
つぎに、実施例１（３）において、実施例１（２）で得られたＣＡＤ２抑制イネの代わりに、前記ＣＡＤ２−ＣＯＭＴ３抑制イネを用いることを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、デンプン除去試料を得る。
【００９４】
その後、試験例１と同様の操作を行ない、ＣＡＤ２−ＣＯＭＴ３抑制イネの稲わら中におけるリグニン含有量および前記デンプン除去試料を用いたときの糖化率を調べる。
【００９５】
また、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉトリガーベクターであるｐＡＮＤＡ−ＣＡＤおよびＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉトリガーベクターであるｐＡＮＤＡ−ＣＯＭＴの両方を用いる代わりに、図１に示されるＣＡＤ２を用いたときの反応時間と糖化率との関係と同様の傾向が見られるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼファミリーに属する酵素（ＣＡＤＬ、ＣＡＤ８ｃ、ＣＡＤ７）や類縁酵素（４ＣＬ２、４ＣＬ３、４ＣＬ４、ＨＣＴ１、ＨＣＴ２、ＨＣＴ３、Ｃ３Ｈ１、ＣＯＡ１、ＣＯＡ２０、ＣｏＡＯＭＴ１、ＣＣＲ１９、ＣＣＲ２０、ＣＣＲ２１、Ｆ５ＨＬ２、Ｆ５Ｈ１、ＰＡＬ２、ＰＡＬ１、Ｃ４Ｈ１、Ｃ４Ｈ２）をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉトリガーベクターおよび図１に示されるＣＯＭＴ３を用いたときの反応時間と糖化率との関係と同様の傾向が見られるカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼファミリーに属する酵素（ＣＯＭＴ２）や類縁酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するＲＮＡｉトリガーベクターの両方を用いることを除き、前記と同様に、糖化率を調べる。
【００９６】
その結果、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現およびカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現の両方が抑制されたイネの稲わら中におけるリグニン含有量は、ＣＡＤ２遺伝子の発現およびＣＯＭＴ３遺伝子の発現のいずれか一方が抑制されたイネの稲わら中におけるリグニン含有量とほぼ同じであり、生育状態も同様であるが、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現およびカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現の両方が抑制されたイネから得られたデンプン除去試料の糖化率は、ＣＡＤ２遺伝子の発現およびＣＯＭＴ３遺伝子の発現のいずれか一方が抑制されたイネから得られたデンプン除去試料の糖化率よりも著しく高くなることが示される。
【００９７】
以上の結果から、草本性単子葉植物中のリグノセルロースの非結晶領域および／または該リグノセルロースの結晶領域の表層領域の生合成を行なう酵素をコードする遺伝子の発現と、前記リグノセルロースの結晶領域の内側層領域の生合成を行なう酵素をコードする遺伝子の発現とを抑制することにより、植物体中におけるリグニン含有量をあまり低減させずに植物の収量を十分に確保することができ、しかも効率よく糖化を行なうのに適した植物体を得ることができることが期待される。また、かかる植物体中のセルロースを糖化することにより、効率よく糖類を製造することができることが期待される。
【００９８】
（実施例４）
被験物質を含む培地中で野生型イネのカルスを育成する。得られたイネにおけるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量および／またはカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量を調べる。また、被験物質を含まない培地中で野生型イネのカルスを育成し、前記と同様に、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量および／またはカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼもしくはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量を調べる。
【００９９】
その結果、被験物質を含まない培地中で育成したイネにおけるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量と比べて、被験物質を含む培地中で育成したイネにおけるシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量が低減している場合、この被験物質は、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現を抑制しているため、単子葉植物に含まれるセルロースの糖化効率を向上させる糖化向上剤であると評価することができる。また、被験物質を含まない培地中で育成したイネにおけるカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量と比べて、被験物質を含む培地中で育成したイネにおけるカフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現量が低減している場合、この被験物質は、カフェー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼまたはその類縁酵素をコードする遺伝子の発現を抑制しているため、単子葉植物に含まれるセルロースの糖化効率を向上させる糖化向上剤であると評価することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号：５は、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーをコードするＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：６は、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーをコードするＤＮＡを増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：７は、ＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーをコードするＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：８は、ＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーをコードするＤＮＡを増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：９は、ＣＯＡ２０遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーをコードするＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーの配列である。
配列番号：１０は、ＣＯＡ２０遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーをコードするＤＮＡを増幅するためのリバースプライマーの配列である。
配列番号：１１は、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーの配列である。
配列番号：１２は、ＣＡＤ２遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーの配列である。
配列番号：１３は、ＣＯＭＴ３遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガーの配列である。
【図１】
2013153731.tif 000005
【図２】
2013153731.tif 000006
【配列表】
2013153731000001.app