(57)【要約】【課題】ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症を効果的に予防することができる安全性の高い薬理組成物及び該薬理組成物を含有する魚類用ワクチン、並びに、前記薬理組成物の安価で簡便な製造方法の提供。【解決手段】２価カチオンキレート剤を含む培地でノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）を培養する培養工程を含む薬理組成物の製造方法、並びに、前記薬理組成物の製造方法により得られる薬理組成物、及び前記薬理組成物を含有する魚類用ワクチンである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２価カチオンキレート剤を含む培地でノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）を培養する培養工程を含むことを特徴とする薬理組成物の製造方法。
【請求項２】
２価カチオンキレート剤がグリコールエーテルジアミン四酢酸である請求項１に記載の薬理組成物の製造方法。
【請求項３】
培地におけるグリコールエーテルジアミン四酢酸の濃度が１０ｍＭ以下である請求項２に記載の薬理組成物の製造方法。
【請求項４】
培養工程の後、ノカルジア・セリオレを不活化乃至弱毒化する不活化乃至弱毒化工程を更に含む請求項１から３のいずれかに記載の薬理組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の薬理組成物の製造方法により得られることを特徴とする薬理組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の薬理組成物を含有することを特徴とする魚類用ワクチン。
【請求項７】
不活化乃至弱毒化ワクチンである請求項６に記載の魚類用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノカルジア症に対して好適に用いられる薬理組成物及びその製造方法、並びに、前記薬理組成物を含有する魚類用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、水産資源保護などの観点から魚類の養殖の必要性がますます高くなっている。そのため魚類は、高密度で養殖されることが多く、飼育される環境の悪化が進み細菌感染症が多発する傾向がある。これらの中でも、養殖のハマチ、ブリ、カンパチなどにおいてはノカルジア症の被害が問題となっている。
【０００３】
ノカルジア症は、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ Ｓｅｒｉｏｌａｅ）を原因菌とする感染症であり、ノカルジア症に感染した魚体は、外観上、体外上部に小隆起が生じ、魚体を開くと内臓各部に白色の粟粒結節が認められる。症状の進行に伴い腫瘍内部の膿が増大し、潰瘍となり、死に至ることがある感染症である（例えば、非特許文献１参照）。またその感染速度も非常に速いものであり重大な問題となっている。
【０００４】
魚類の細菌感染症への対応策として抗生物質や合成抗菌剤が使用されているが、これらの薬剤は、耐性菌の出願や細菌の多剤耐性菌化によって効力を失うことがあり、また養殖魚肉中に抗菌剤が残存するため安全性の面で問題である。
【０００５】
この問題に対し、広範囲にわたる魚病原因菌への抗菌作用を有し、魚類に適用して魚病の予防及び治療をすることができる甘草抽出物由来の魚病原因菌に対する抗菌剤（特許文献１参照）や、魚類表面又は内部に付着乃至繁殖する細菌類の駆除を目的とした有機酸を主成分とする魚類の病原性細菌類の駆除剤（特許文献２参照）などが提案されている。
しかし、これらの抗菌剤や駆除剤は、相当長期間の連続投薬を行わなければ効果が期待できず、経済的理由などから使用されておらず、養殖現場においては、病死魚の除去処分、収容尾数の分散、栄養の改善などの消極的処置しかとられていないのが現状である。
【０００６】
したがって、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症に対して優れた予防作用を有する安全性の高い薬理組成物及び該薬理組成物を含有する魚類用ワクチン、並びに、前記薬理組成物の安価で簡便な製造方法の提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２９２３８５号公報
【特許文献２】特開２００７−２５４４６３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】狩谷  貞治ら，  魚病研究，  １９６８．７，  ３（１），  ｐ．１６〜２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症を効果的に予防することができる安全性の高い薬理組成物及び該薬理組成物を含有する魚類用ワクチン、並びに、前記薬理組成物の安価で簡便な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、２価カチオンキレート剤を含む培地でノカルジア・セリオレを培養することにより、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有し、安全性の高い薬理組成物を製造できることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ２価カチオンキレート剤を含む培地でノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）を培養する培養工程を含むことを特徴とする薬理組成物の製造方法である。
＜２＞  ２価カチオンキレート剤がグリコールエーテルジアミン四酢酸である前記＜１＞に記載の薬理組成物の製造方法である。
＜３＞  培地におけるグリコールエーテルジアミン四酢酸の濃度が１０ｍＭ以下である前記＜２＞に記載の薬理組成物の製造方法である。
＜４＞  培地の種類が、ハートインフュージョン培地、ＴＳＢ培地、及びＬＢ培地のいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の薬理組成物の製造方法である。
＜５＞  培地が、更に血清を含む前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の薬理組成物の製造方法である。
＜６＞  培養工程の後、ノカルジア・セリオレを不活化乃至弱毒化する不活化乃至弱毒化工程を更に含む前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の薬理組成物の製造方法である。
＜７＞  前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の薬理組成物の製造方法により得られることを特徴とする薬理組成物である。
＜８＞  免疫原性組成物である前記＜７＞に記載の薬理組成物である。
＜９＞  免疫賦活化組成物である前記＜７＞に記載の薬理組成物である。
＜１０＞  ワクチン組成物である前記＜７＞に記載の薬理組成物である。
＜１１＞  ノカルジア症に対する予防組成物である前記＜７＞に記載の薬理組成物である。
＜１２＞  前記＜７＞から＜１１＞のいずれかに記載の薬理組成物を含有することを特徴とする魚類用ワクチンである。
＜１３＞  不活化乃至弱毒化ワクチンである前記＜１２＞に記載の魚類用ワクチンである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症を効果的に予防することができる安全性の高い薬理組成物及び該薬理組成物を含有する魚類用ワクチン、並びに、前記薬理組成物の安価で簡便な製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、試験例１においてノカルジア・セリオレ攻撃後の各日数における生存率の結果を示す図である。縦軸：生存率（％）、横軸：攻撃後の日数（日）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（薬理組成物及びその製造方法）
本発明の薬理組成物の製造方法は、２価カチオンキレート剤を含む培地でノカルジア・セリオレを培養する培養工程を少なくとも含み、不活化乃至弱毒化工程を含むことが好ましく、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
本発明の薬理組成物は、本発明の前記薬理組成物の製造方法による得ることができ、２価カチオンキレート剤を含む培地で培養したノカルジア・セリオレを少なくとも含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
以下に、本発明の薬理組成物の説明と併せて、本発明の薬理組成物の製造方法について説明する。
【００１５】
＜薬理組成物の製造方法＞
前記薬理組成物の製造方法は、２価カチオンキレート剤を含む培地でノカルジア・セリオレを培養する培養工程を少なくとも含む。
【００１６】
＜＜培養工程＞＞
−培地−
前記ノカルジア・セリオレの培養に用いる培地としては、２価カチオンキレート剤を含む培地であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の栄養培地に２価カチオンキレート剤を添加した培地などが挙げられる。前記栄養培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノカルジア属の培養に利用されている公知のものなどが挙げられる。前記栄養培地は、液体培地であってもよく、寒天培地であってもよい。
【００１７】
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源、炭素源、血清などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記窒素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
前記炭素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン等の炭水化物や脂肪などが挙げられる。
前記血清としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウシ胎児血清（ＢＳＡ）、ブタ血清などが挙げられる。
更に、前記窒素源、前記炭素源、前記血清以外にも、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加することもでき、その他必要に応じて微量の金属塩を培地に添加することもできる。
これらの材料は、前記ノカルジア・セリオレが利用し得るものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
【００１８】
前記培地が無機塩を含有する場合、その塩濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０質量％〜４．５質量％が好ましく、０質量％〜０．５質量％がより好ましい。前記塩濃度が４．５質量％を超えると、ノカルジア・セリオレが増殖しないことがある。
【００１９】
前記公知の栄養培地の具体的な例としては、小川培地、サブロー（ＳＡＢＯＵＲＡＵＤ）培地、ベネット（ＢＥＮＮＥＴＴ’Ｓ）培地、サウトン（ＳＡＵＴＯＮ）培地、デュボス（ＤＵＢＯＳ）培地、キルヒナー（ＫＩＲＣＨＩＮＥＲ）培地、ハートインフュージョン（Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地、ＴＳＢ（トリプケースソイブロス）培地、ＰＰＬＯ（マイコプラズマ寒天基礎）培地、ＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地などが挙げられる。
これらの中でも、ハートインフュージョン培地、ＴＳＢ培地、ＬＢ培地が好ましく、ＴＳＢ培地、ＬＢ培地が、ノカルジア症に対して優れた予防作用を奏し、魚類の生存率を高めることができる点で特に好ましい。
【００２０】
前記培地のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５．０〜８．５が好ましく、６．５〜７．０がより好ましい。前記ｐＨが、５．０未満又は８．５を超えると、ノカルジア・セリオレが増殖しないことがある。一方、前記ｐＨが前記より好ましい範囲であると、ノカルジア・セリオレが好適に増殖することができる。
【００２１】
−２価カチオンキレート剤−
前記２価カチオンキレート剤の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡ−２ナトリウム、ＥＤＴＡ−２カリウム、ＥＤＴＡ−３カリウム、シュウ酸アンモニウム、シュウ酸カリウム、クエン酸、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、ビス２アミノフェニルエチレングリコール四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記２価カチオンキレート剤は、ＥＧＴＡが、ノカルジア症に対して優れた予防作用を奏し、魚類の生存率を高めることができる点で好ましい。
【００２２】
前記培地中の２価カチオンキレート剤の濃度としては、特に制限はなく、ノカルジア・セリオレが好適に増殖することができる範囲内で適宜選択することができるが、１０ｍＭ以下が好ましい。
【００２３】
−培養方法−
前記培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、振盪培養、静置培養などが挙げられる。これらの中でも、前記ノカルジア・セリオレが好気性菌である観点から振盪培養が好ましい。
【００２４】
前記培養の際の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養の際の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜３７℃が好ましく、３０℃〜２０℃がより好ましい。前記温度が、１０℃未満又は３７℃を超えると、ノカルジア・セリオレが増殖しないことがある。一方、前記温度が前記より好ましい範囲であると、ノカルジア・セリオレが好適に増殖することができる。
【００２５】
前記ノカルジア・セリオレは、入手後、２価カチオンキレート剤を含む培地で培養する前に、２価カチオンキレート剤を含まない前記栄養培地で予め培養してもよく、更にこれを数回継代培養したものを用いてもよい。
【００２６】
−ノカルジア・セリオレ−
前記ノカルジア・セリオレを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、野外から採取した魚類の皮下組織、筋肉、鰓、鰓蓋、内蔵器官等の魚体内外から分離する方法などが挙げられる。また、前記ノカルジア・セリオレは、市販品を用いてもよく、各種微生物の保存機関などから入手したものを用いてもよい。
前記市販品の具体的な例としては、ＡＴＣＣ、各県の水産試験場などが挙げられる。
前記保存機関から入手可能なノカルジア・セリオレとしては、例えば、ＡＴＣＣ４３９９３などが挙げられる。
前記ノカルジア・セリオレの一般的な菌体的性状は、以下のとおりである。
【００２７】
−−形態的、生化学的特徴−−
前記ノカルジア・セリオレは、魚類の患部から常法により採取し３質量％小川培地に接種し２５℃で培養すると、４日間〜５日間後にコロニーが出現し、約２週間培養後では、淡黄色〜橙黄色に変化をする、いぼ状に隆起した緻密な固いコロニーを形成する。コロニー出現初期は表面平滑で、周辺は円形を画くが、成長するにつれて表面にはしわが生じ、周辺は鋸歯状となる。このコロニーを小川培地を用いて再分離培養し純粋培養すると、分枝した糸状となる。気中菌糸を有し非運動性である。長期培養した菌体においては、長桿状、短桿状、球状などの形態が認められる多形態である。液体培地で培養すると、液面上層によく成育する好気性菌である。ＺＩＥＨＬ−ＮＥＥＬＳＥＮ染色で弱抗酸性を示し、グラム陽性である。その他の菌体学的特徴は、狩谷  貞治ら，  魚病研究，  １９６８．７，  ３（１），  ｐ．１６〜２３に詳しく説明されている。
【００２８】
また、ノカルジア・セリオレは、ＰＣＲ法などにより遺伝学的特徴を調べることで同定することができる。前記遺伝学的特徴としては、例えば、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）に登録されているノカルジア・セリオレの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子であるＪＦ８３４０６６、ＪＦ８３４０６７、ＪＦ８３４０６８、ＪＦ８３４０６９との相同性が９５％以上のものなどが挙げられる。
【００２９】
＜＜不活化乃至弱毒化工程＞＞
前記不活化乃至弱毒化工程は、前記ノカルジア・セリオレを不活化乃至弱毒化する工程である。前記不活化乃至弱毒化工程は、前記培養工程の後に行われる。
本発明において「不活化」とは、ノカルジア・セリオレを、感染能及び定着能の少なくともいずれかを有さない状態にすることを意味し、例えば、死滅したノカルジア・セリオレなどが挙げられる。また、本発明において「弱毒化」とは、ノカルジア・セリオレを、複製はし得るものの、感染や疾病を引き起こすことはない状態にすることを意味する。
【００３０】
前記培養工程後のノカルジア・セリオレを不活化乃至弱毒化する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノカルジア・セリオレを不活化剤に浸漬する方法、低ｐＨ液状インキュベーション処理する方法等の化学的処理法や、加温処理する方法、紫外線照射する方法、音波処理する方法等の物理的処理法などが挙げられる。これらの処理は、１種単独で行ってもよく、２種以上を組み合わせて行ってもよい。これらの中でも、不活化剤に浸漬する方法が、簡便に不活化することができ、更にノカルジア症に対する予防効果が高い点で好ましい。
【００３１】
−不活化剤による処理−
前記不活化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ホルムアルデヒド、フェノール等の有機溶剤、イオン系又は非イオン系の界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３２】
前記不活化剤の濃度としては、特に制限はなく、不活化剤の種類などに応じて適宜選択することができるが、０．１質量％〜０．５質量％が好ましく、０．２質量％〜０．４質量％がより好ましい。前記濃度が、０．１質量％未満であると、前記ノカルジア・セリオレの不活化が不十分となり安全性が低下することがあり、０．５質量％を超えると、予防作用が低下することがある。一方、前記不活化剤の濃度が前記好ましい範囲内であると、効率よく不活化することができ、安全性が高まる点で好ましい。
【００３３】
前記培養工程後のノカルジア・セリオレを前記不活化剤に浸漬する時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４時間〜２４時間が好ましい。前記浸漬時間が、４時間未満であると、前記ノカルジア・セリオレの不活化が不十分となり安全性が低下することがあり、２４時間を超えると、それ以上は不活化反応が飽和し、製造効率が悪くなることがある。一方、前記不活化剤に浸漬する時間が前記好ましい範囲内であると、効率よく不活化することができ、安全性が高まる点で好ましい。
【００３４】
前記培養工程後のノカルジア・セリオレを前記不活化剤に浸漬する温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、２５℃〜３７℃が好ましい。前記温度が、２５℃未満であると、不活化が不十分となり安全性が低下することがあり、３７℃を超えると、予防作用が低下することがある。一方、前記不活化剤に浸漬する温度が前記好ましい範囲内であると、効率よく不活化することができ、安全性が高まる点で好ましい。
【００３５】
前記不活化乃至弱毒化工程により、前記ノカルジア・セリオレが不活化乃至弱毒化したか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培地に接種し培養することにより確認する方法などが挙げられる。
【００３６】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、洗浄工程などが挙げられる。
【００３７】
前記洗浄工程は、前記培養後のノカルジア・セリオレの菌体を洗浄する工程である。前記洗浄工程は、前記培養工程後及び前記不活化乃至弱毒化工程後の少なくともいずれかで行われることが好ましい。これにより、菌体に付着した２価カチオンキレート剤及び／又は不活化剤や不純物等を洗浄することができる。２価カチオンキレート剤が高濃度に菌体に残存していると、対象魚類が死亡することがあるため、特に、高濃度の２価カチオンキレート剤を用いて前記ノカルジア・セリオレを培養した場合、前記洗浄工程が有効である。
【００３８】
洗浄に用いる洗浄液としては、前記２価カチオンキレート剤を含まないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記２価カチオンキレート剤を含まない基礎培地、ＰＢＳ、水などが挙げられる。
【００３９】
洗浄を行う方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養工程で得られた菌体を遠心分離等の公知の手法で分離した後、培養上清を除去し、前記菌体を前記洗浄液に再浮遊させる方法などが挙げられる。前記洗浄回数としては、特に制限はない。
【００４０】
＜薬理組成物＞
前記薬理組成物は、前記薬理組成物の製造方法により得ることができるノカルジア・セリオレを少なくとも含有する。
【００４１】
前記薬理組成物は、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有する組成物であり、投与対象の免疫を賦活化することができ、投与対象に投与後、該投与対象の体内で抗体産生を誘導することができる。したがって、前記薬理組成物は、予防組成物、免疫原性組成物、免疫賦活化組成物、ワクチン組成物などとしても好適に用いられる。
【００４２】
前記薬理組成物が、ノカルジア症に対して予防作用を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、魚類を用いた攻撃試験、投与対象個体の血中抗体量を測定する方法などが挙げられる。
前記魚類を用いた攻撃試験について、ノカルジア症を具体例として説明する。通常、魚類をノカルジア・セリオレで攻撃するとノカルジア症に感染し、これにより攻撃後の魚類の生存率が低下する。一方、前記薬理組成物を魚類に投与すると、免疫力が高まり、ノカルジア・セリオレの攻撃に耐え、生存率は低下しない。したがって、この生存率により予防作用を確認することができる。
【００４３】
＜＜用途＞＞
前記薬理組成物は、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有するため、予防組成物、免疫原性組成物、免疫賦活化組成物、ワクチン組成物として好適に利用可能であり、後述する本発明の魚類用ワクチンに特に好適に利用可能である。
【００４４】
（魚類用ワクチン）
本発明の魚類用ワクチンは、前記ノカルジア・セリオレによる魚類の感染症を予防するためのワクチンであり、本発明の前記薬理組成物を少なくとも含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
前記ノカルジア・セリオレによる感染症としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノカルジア症などが挙げられる。
【００４５】
＜＜薬理組成物＞＞
前記薬理組成物としては、本発明の前記薬理組成物の項目に記載したとおりである。前記薬理組成物は、２価カチオンキレート剤を含む培地で培養したノカルジア・セリオレを含有するため、前記薬理組成物を含むワクチンを魚類に予防的に投与することにより、魚類体内にノカルジア・セリオレに対する免疫を付与することができ、ノカルジア・セリオレによる感染症を予防することができる。即ち、前記薬理組成物は、前記魚類用ワクチンの有効成分となり得る。
【００４６】
前記魚類用ワクチンは、生ワクチンであってもよく、不活化乃至弱毒化ワクチンであってもよいが、副反応が少なく、安全性が高い観点から、不活化乃至弱毒化ワクチンであることが好ましい。
また、前記魚類用ワクチンは、２価カチオンキレート剤を含む培地で培養したノカルジア・セリオレの菌体そのものを含む菌体ワクチンであってもよく、前記菌体の一部を含有する成分ワクチンであってもよい。
【００４７】
前記魚類用ワクチンにおける、前記薬理組成物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記魚類用ワクチンは、前記薬理組成物そのものであってもよい。
【００４８】
＜＜その他の成分＞＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記医薬的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する本発明の医薬の項目に記載されるような各種担体などが挙げられる。また、ビタミンＥアセテート可溶化液、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、（鉱物）油エマルジョン、非イオン性界面活性剤、スクワレン、サポニン等のアジュバントを含んでいてもよい。
前記魚類用ワクチン中の、前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
＜＜製造＞＞
前記魚類用ワクチンの製造方法としては、特に制限はなく、所望の剤型等に応じて、適宜選択することができる。
前記魚類用ワクチンが生ワクチンである場合は、前記不活化乃至弱毒化工程を経ていない薬理組成物を用いることが好ましく、不活化乃至弱毒化ワクチンである場合は、前記不活化乃至弱毒化工程を経た薬理組成物を用いることが好ましい。
【００５０】
＜＜剤型＞＞
前魚類用ワクチンの剤型としては、特に制限はなく、後述する所望の投与方法等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤などが挙げられる。
【００５１】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記有効成分としての薬理組成物に、賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造する方法などが挙げられる。
前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。
【００５２】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００５３】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、混餌剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記有効成分としての薬理組成物に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造する方法などが挙げられる。
【００５４】
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００５５】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記有効成分としての薬理組成物に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造する方法などが挙げられる。
【００５６】
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
前記局所麻酔剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５７】
＜＜投与＞＞
前記魚類用ワクチンの投与対象としては、魚類であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ブリ、ハマチ、カンパチ、ヒラマサ等のブリ属に属する魚類、ヒラメ、マダイ、カワハギ、金魚、鯉などが挙げられる。
前記魚類用ワクチンの投与方法としては、特に制限はなく、前記魚類用ワクチンの剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、腹腔内投与法、鰓に投与する方法などが挙げられる。前記投与方法が経口投与法である場合、前記魚類用ワクチンを、魚類を飼育する水槽等に溶かし、魚類を該水槽に浸漬して投与してもよく、餌に混合して投与してもよい。
前記魚類用ワクチンの投与量、投与回数、投与時期としては、特に制限はなく、投与対象である魚類の年齢、体重、症状、投与方法、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００５８】
＜＜使用＞＞
前記魚類用ワクチンは、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記魚類用ワクチンは、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００５９】
＜＜用途＞＞
前記魚類用ワクチンは、本発明の前記薬理組成物を含有するため、前記ワクチンを魚類に投与することにより、前記魚類の体内にノカルジア・セリオレに対する抗体を産生させることができ、その後のノカルジア・セリオレによる感染症の発症を防ぐことができる。即ち、前記魚類用ワクチンは、ノカルジア・セリオレによる魚類の感染症を予防するための魚類への投与（予防接種）に好適に利用可能である。
なお、前記魚類用ワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ノカルジア・セリオレによる魚類の感染症を予防するための予防接種方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００６０】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００６１】
＜ノカルジア・セリオレの分離＞
大分県産の約３ｋｇのブリの鰓の結節を１質量％小川寒天培地（組成：リン酸２水素カリウム３．２ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム３．２ｇ／Ｌ、蒸留水３２０ｍＬ／Ｌ、全卵液６４１ｍＬ／Ｌ、グリセリン１９ｍＬ／Ｌ、２％マラカイトグリーン１９ｍＬ／Ｌ）に接種し、２５℃で４日間〜５日間培養することにより、ノカルジア・セリオレを分離した。以下、この分離株を「分離株１」と称することがある。
分離株１を１質量％小川培地で２５℃にて５日間培養し、単一のコロニーから同様の方法で６回の継代培養を繰り返し、７代目のコロニーを得た。以下、前記７代目のクローンを「ＮＳ００１株」と称することがある。
【００６２】
−染色試験−
ＮＳ００１株を用いて塗抹標本を作製した。この、塗抹標本をグラム染色した。その結果、グラム陽性の糸状菌が観察された。
【００６３】
−性状試験−
ＮＳ００１株を１質量％小川培地で２５℃にて培養した。培養開始から４日間後にコロニーが出現し、２週間後に淡黄色〜橙黄色のいぼ状の緻密な固いコロニーが形成された。
【００６４】
−ＰＣＲ分析−
Ｍｉｙｏｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２００３，  Ｖｏｌ．３８，  ｐｐ．９３−９７に従い、ＮＳ−１プライマー及びＮＧ−１プライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドを用いて可視化した。その結果、目的の大きさに単一のバンドが認められた。
【００６５】
これらの菌体学的特徴より、ＮＳ００１株は、ノカルジア・セリオレであることが同定された。
【００６６】
（製造例１）
＜ワクチン１の製造＞
ＮＳ００１株をＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて２５℃にて約９６時間培養した（前培養）。前培養したＮＳ００１株を、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地に接種し、２５℃で７２時間振盪培養した（本培養）。本培養終了後、終濃度が０．３質量％となるようにホルマリン（３０％ホルムアルデヒド水溶液）を添加し、３７℃で一晩置くことにより、ＮＳ００１株を不活化した。不活化したＮＳ００１株の菌体を、８，０００ｒｐｍにて３０分間遠心することにより回収し、０．３質量％ホルマリンを含むＰＢＳ（組成：塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．２ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．２４ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０））に再浮遊させた（洗浄）。次いで、０．３質量％ホルマリンを含むＰＢＳでＯＤ６３０における濁度が約１．５となるよう調製し、ワクチン１を製造した。
【００６７】
（製造例２）
＜ワクチン２の製造＞
製造例１のワクチン１の製造において、本培養に用いた０．１ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地に代えて、１ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、ワクチン２を製造した。
【００６８】
（製造例３）
＜ワクチン３の製造＞
ＮＳ００１株をＬＢ寒天培地（組成：イーストエクストラクト５ｍｇ／ｍＬ、トリプトン１０ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム１０、ｇ／ｍＬ、寒天２ｇ／ｍＬ）を用いて、２５℃にて約９６時間培養した（前培養）。前培養したＮＳ００１株を、１０ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＴＳＢ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、２５℃で約７２時間振盪培養した（本培養）。本培養終了後、終濃度が０．３質量％となるようにホルマリンを添加し、３７℃で一晩置くことにより、ＮＳ００１株を不活化した。不活化したＮＳ００１株の菌体を、８，０００ｒｐｍにて３０分間遠心することにより回収した。次いで、０．３質量％ホルマリンを含むＰＢＳに再浮遊させた（洗浄）。次いで、０．３質量％ホルマリンを含むＰＢＳでＯＤ６３０における濁度が約１．５となるよう調製し、ワクチン３を製造した。
【００６９】
（製造例４：ワクチン４の製造）
製造例３のワクチン３の製造において、本培養に用いた１０ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＴＳＢ液体培地に代えて、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ及び１質量％ブタ血清を含むＬＢ液体培地を用いたこと以外は、製造例３と同様の方法で、ワクチン４を製造した。
【００７０】
（比較製造例１）
＜不活化ＮＳ００１株の作製＞
製造例１のワクチン１の製造において、本培養に用いた０．１ｍＭ  ＥＧＴＡを含むＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地に代えて、ＥＧＴＡを含まないＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、不活化ＮＳ００１株を製造した。
【００７１】
（試験例１：ノカルジア症に対するワクチン効果の検討）
＜安全性試験＞
製造例１〜４で製造したワクチン１〜４、及び比較製造例１で製造した不活化ＮＳ００１株をブリ（ニッスイ人工種苗、体重約７５ｇ）の腹腔内にそれぞれ０．１ｍＬ投与し、エアレーションをした循環式水槽（２００Ｌ容、水温度２５℃±１℃）に入れ１４日間飼育した。
ワクチン１を投与した群を「ワクチン１投与群」（ｎ＝１０）、ワクチン２を投与した群を「ワクチン２投与群」（ｎ＝１０）、ワクチン３を投与した群を「ワクチン３投与群」（ｎ＝２０）、ワクチン４を投与した群を「ワクチン４投与群」（ｎ＝２０）、不活化ＮＳ００１株を投与した群を「不活化ＮＳ００１株投与群」（ｎ＝１０）とそれぞれ称する。
また、対照として、ブリ（ニッスイ人工種苗、体重約７５ｇ、ｎ＝５０）にワクチンを投与することなく、ワクチン１投与群などと同様の条件で飼育したものを「対照群」とした。
なお、各群は、循環式水槽に（２００Ｌ容）に対して１０匹ずつ入れて試験を実施した。
【００７２】
対照群及び各投与群について、飼育期間中、投与部位、体色、摂餌、及び遊泳を観察したところ、ワクチン１投与群、ワクチン２投与群、ワクチン３投与群、及びワクチン４投与群は、対照群と同様の状態であり、異常を示した個体は認められなかった。また、不活化ＮＳ００１株投与群も、異常を示した個体は認められなかった。これより、ワクチン１〜４は、安全性が高いことが確認された。
【００７３】
＜攻撃試験＞
攻撃用菌体としては、ＮＳ００１株を、ＬＢ培地（組成：イーストエクストラクト５ｍｇ／ｍＬ、トリプトン１０ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｍＬ）を用いて２５℃にて７２時間培養した菌体を用いた。
前記安全性試験終了後（ワクチン投与から１４日目）に、対照群及び各投与群に前記攻撃用菌体を１尾当たり０．１ｍｇ投与することにより攻撃した。攻撃後、更に１４日間前記安全性試験と同様の条件で飼育し、観察した。
攻撃０日目〜１４日目の各日数における生存率（％）を次式により算出した結果を表１及び図１に示す。
生存率（％）＝（各日数における各群の生存尾数／試験に用いた各群の尾数）×１００
【００７４】
【表１】
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【００７５】
表１及び図１の結果より、ＥＧＴＡを添加した培地で培養したノカルジア・セリオレは、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有し、ワクチンとして好適に使用できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の薬理組成物及び魚類用ワクチンは、安全性が高く、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症を効果的に予防することができる。また、本発明の前記薬理組成物の製造方法は、該薬理組成物を安価で簡便に製造することができる。
【図１】
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