(57)【要約】【課題】濃縮プロセスのモニタリングに用いることができる方法を提供すること。【解決手段】陰性対照配列および陽性対照配列をＤＮＡライブラリーに加える、または陰性対照配列および／もしくは陽性対照配列をライブラリーから選ぶステップ（９０１）と、陰性対照配列の捕捉前の量および陽性対照配列の捕捉前の量を決定するステップ（９０２）と、捕捉後ライブラリーを作製するためにベイト配列を用いてＤＮＡライブラリーからの標的配列の濃縮を行うステップ（９０３）と、捕捉後ライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉後の量および陽性対照配列の捕捉後の量を決定するステップ（９０４）と、陽性対照配列の捕捉後の量、陰性対照配列の捕捉後の量、陽性対照配列の捕捉前の量、および陰性対照配列の捕捉前の量に基づいて、標的濃縮の効率を決定するステップ（９０５）とを含む、ＤＮＡライブラリーからの標的濃縮の効率を決定するための方法（９００）。【選択図】図９
2013111081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡライブラリーからの標的濃縮の効率を決定するための方法（９００）であって、
陰性対照配列および／もしくは陽性対照配列をＤＮＡライブラリーに加える、または陰性対照配列および／もしくは陽性対照配列をＤＮＡライブラリーから選択するステップ（９０１）と、
ＤＮＡライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉前の量および陽性対照配列の捕捉前の量を決定するステップ（９０２）と、
捕捉後ライブラリーを作製するために、少なくとも１つのベイト配列を用いてＤＮＡライブラリーからの標的配列の濃縮を行うステップ（９０３）と、
捕捉後ライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉後の量および陽性対照配列の捕捉後の量を決定するステップ（９０４）と、
陰性対照配列の捕捉後の量に対する陽性対照配列の捕捉後の量の比率に基づいて、または
（ｉ）陽性対照配列の捕捉前の量および陰性対照配列の捕捉前の量の第１の比率と（ｉｉ）陽性対照配列の捕捉後の量および陰性対照配列の捕捉後の量の第２の比率との比較に基づいて、
標的濃縮の効率を決定するステップ（９０５）と
を含む方法。
【請求項２】
前記陰性対照配列が、長鎖散在エレメント（ＬＩＮＥ）または短鎖散在エレメント（ＳＩＮＥ）から選択される反復エレメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反復エレメントがＡｌｕエレメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反復エレメントが、配列番号１の配列を有するＡｌｕＪｏである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記反復エレメントが、配列番号５の配列を有するＬ１ＭＥｅである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ベイト配列が、リボ核酸（ＲＮＡ）のオリゴマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ベイト配列が、親和性リガンドまたは固体担体に付着している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記親和性リガンドがビオチンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡライブラリーからの標的濃縮の効率を決定するための方法（８００）であって、
陰性対照配列をＤＮＡライブラリーに加える、または陰性対照配列をＤＮＡライブラリーから選択するステップ（８０１）と、
ＤＮＡライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉前の量を決定するステップ（８０２）と、
捕捉後ライブラリーを作製するために、少なくとも１つのベイト配列を用いてＤＮＡライブラリーからの標的配列の濃縮を行うステップ（８０３）と、
捕捉後ライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉後の量を決定するステップ（８０４）と、
陰性対照配列の捕捉前の量と陰性対照配列の捕捉後の量とを比較することによって、標的濃縮の効率を決定するステップ（８０５）と
を含む方法。
【請求項１０】
前記陰性対照配列が、長鎖散在エレメント（ＬＩＮＥ）または短鎖散在エレメント（ＳＩＮＥ）から選択される反復エレメントである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反復エレメントがＡｌｕエレメントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記反復エレメントが、配列番号１の配列を有するＡｌｕＪｏである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記反復エレメントが、配列番号５の配列を有するＬ１ＭＥｅである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベイト配列が、リボ核酸（ＲＮＡ）のオリゴマーを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベイト配列が、親和性リガンドまたは固体担体に付着している、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記親和性リガンドがビオチンである、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡライブラリー組成物の分析の分野に、特に、ＤＮＡライブラリーにおける配列の相対的存在量の変化を分析するための方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムをシークエンシングするためのさらに効率的な技術の必要性によって、次世代ゲノムシークエンシング技術が開発されてきた。これらの次世代シークエンシング技術によって、ゲノムをシークエンシングする方法は激変したが、これらの技術には弱点がある。例えば、これらの技術は、ゲノムの特定の領域を容易に標的にすることができない。
【０００３】
ゲノムの特定の領域をシークエンシングできることには、多くの用途に適用できる。例えば、一部の疾患は、わずか数個のヌクレオチドの突然変異から生じる。これらのわずかな突然変異を同定するためにヒトゲノム全体をシークエンシングすることは非効率的であろう。同様に、多くの複雑な疾患は、疾患のリスクに関連する１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）またはＳＮＰの組み合わせを伴う。ゲノムにおけるこのようなＳＮＰの同定は、一塩基の変化を発見したり、全ての配列変異体を同定したりするために、罹患した個体のゲノムＤＮＡの広範な領域（典型的には、１００キロベース超）をシークエンシングすることを伴うため、困難な課題である。
【０００４】
このような課題を容易にするために、分析またはシークエンシングの前に目的の配列についてライブラリーを濃縮することを伴う、さらに新たなアプローチが開発されている。濃縮の後、目的の配列のサブセットは、さらに効率的にシークエンシングされ得る。濃縮システムは、典型的には、目的の領域を囲む配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡ断片を捕獲するためのベイトとして用いる。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイズした配列をライブラリーから単離することを容易にし得る修飾を含むことが多い。
【０００５】
このような濃縮システムの例は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から入手可能なＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システムである。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システムは、目的の配列を濃縮するために、ビオチン−アビジンに基づく選択技術を用いる。このシステムは、シークエンシングの作業フローの費用およびプロセスの効率を大幅に向上させ得る。
【０００６】
図１は、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）を用いる、ライブラリーから目的のＤＮＡ配列を濃縮するプロセスを説明する略図を示す。図１において示されるように、ゲノムライブラリー試料は、配列断片をアダプター内にクローニングすることによって調製される。このライブラリーは、次に、ビオチン化されたＲＮＡベイト（すなわち、ビオチンタグを有するＲＮＡオリゴヌクレオチド）でプローブされる。ハイブリダイゼーションの後、ビオチン化されたベイトに結合した配列は、ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズを用いて、混合物から分離される。ビーズは（結合した配列とともに）洗浄され、次に、濃縮された標的配列が一本鎖ＤＮＡ配列として放出されるように、ＲＮＡ配列は消化される。目的のＤＮＡ配列は、次いで、ＰＣＲを用いて増幅されて、さらなる分析またはシークエンシングのための、濃縮された配列を生産することができる。この濃縮方法によって、比較的容易に目的の配列に焦点を当てることが可能になる。
【０００７】
類似のアプローチが、米国特許出願公開第２０１１０１８４１６１号において最近開示されている。この出願において開示される方法によると、断片化され変性したゲノム核酸分子を含有する試料が、ハイブリダイズ条件下で、基質上に固定されたオリゴヌクレオチドプローブに曝露される。固定されたプローブにハイブリダイズする目的の核酸分子は、次に、他の配列から分離され、結合したＤＮＡ断片は基質から溶出されて、濃縮されたライブラリーが作製できる。
【０００８】
このような濃縮アプローチでは、濃縮されたライブラリーをシークエンシングする努力を費やす前に、標的配列が実際に濃縮されているか（およびどの程度濃縮されているか）を確認できることが望ましい。したがって、濃縮のモニタリングを可能にするために、陽性対照配列およびベイトが濃縮プロセスに含まれることが多い。濃縮の量的推計が望ましい場合、内部標準配列もまた含まれ得る。濃縮サイクルの後、または濃縮の推計が望ましい場合、濃縮されたライブラリーのアリコートを取り出し、典型的には定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの増幅技術を用いて分析することができる。
【０００９】
標的にされたＤＮＡ分子を増幅し、同時に定量するために、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（またはリアルタイムＰＣＲ）を用いることができる。このプロセスは、ＤＮＡ試料における１つまたは複数の特定の配列を増幅するためのＰＣＲを伴う。同時に、リアルタイムでの定量をもたらすように、プローブ（典型的には、蛍光プローブ）が反応混合物内に含まれる。リアルタイムＰＣＲ産物を定量するための、２つの一般的に用いられる蛍光プローブは、（１）配列非特異的な様式で二本鎖ＤＮＡ分子内にインターカレートする非配列特異的蛍光染料（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）、および（２）ＤＮＡ標的とのハイブリダイゼーションの後になって初めて、またはＰＣＲ産物内への組み込みの後に検出を可能にする配列特異的なＤＮＡプローブ（例えば、蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチド）である。
【００１０】
蛍光レポーターの例には、別の基によって消光される１つのフルオロフォアを有するプローブが含まれ得る。プローブが増幅配列内に組み込まれると、フルオロフォア分子または蛍光クエンチャー分子は切断され、それによって、フルオロフォアが発光することが可能になる。このアプローチの例は、米国特許第５，７２３，５９１号において記載されているようなＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイである。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、中央のプローブオリゴヌクレオチドに隣接する２つのＰＣＲプライマーを用いる。プローブオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含有する。ＰＣＲプロセスにおける重合ステップの間、ポリメラーゼはプローブオリゴヌクレオチドを切断する。この切断によって、フルオロフォアおよびクエンチャーは物理的に分離され、これによって、蛍光の発光が変化する。生産されるＰＣＲ産物が多いほど、蛍光シグナルの強度は増大する。
【発明の概要】
【００１１】
これらの先行技術では、さらに高い信頼性でＤＮＡライブラリーの濃縮をモニタリングすることができる。しかし、濃縮プロセスのモニタリングに用いることができる方法の必要性は依然として存在する。
【００１２】
本発明の１つの態様は、ＤＮＡライブラリーからの標的濃縮の効率を決定するための方法に関する。本発明の１つの実施形態に従った方法は、陰性対照配列および／もしくは陽性対照配列をＤＮＡライブラリーに加える、または、陰性対照配列および／もしくは陽性対照配列をＤＮＡライブラリーから選ぶステップと、ＤＮＡライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉前の量および陽性対照配列の捕捉前の量を決定するステップと、捕捉後ライブラリーを作製するために少なくとも１つのベイト配列を用いてＤＮＡライブラリーからの標的配列の濃縮を行うステップと、捕捉後ライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉後の量および陽性対照配列の捕捉後の量を決定するステップと、陰性対照配列の捕捉後の量に対する陽性対照配列の捕捉後の量の比率に基づいて、または（ｉ）陽性対照配列の捕捉前の量および陰性対照配列の捕捉前の量の第１の比率と（ｉｉ）陽性対照配列の捕捉後の量および陰性対照配列の捕捉後の量の第２の比率との比較に基づいて、標的濃縮の効率を決定するステップとを含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、ＤＮＡライブラリーからの標的濃縮の効率を決定するための方法に関する。本発明の１つの実施形態に従った方法は、陰性対照配列をＤＮＡライブラリーに加える、または陰性対照配列をＤＮＡライブラリーから選ぶステップと、ＤＮＡライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉前の量を決定するステップと、捕捉後ライブラリーを作製するために少なくとも１つのベイト配列を用いてＤＮＡライブラリーからの標的配列の濃縮を行うステップと、捕捉後ライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉後の量を決定するステップと、陰性対照配列の捕捉前の量と陰性対照配列の捕捉後の量とを比較することによって標的濃縮の効率を決定するステップとを含む。
【００１４】
本発明の他の態様および利点は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システムを用いる標的濃縮のプロセスを説明する略図を示す図である。
【図２】本発明の１つの実施形態に従ったＡｌｕＪｏ配列の増幅および定量のための、ＡｌｕＪｏの配列ならびにプライマーおよびプローブを示す図である。
【図３】本発明の１つの実施形態に従ったＬ１ＭＥｅ配列の増幅および定量のための、Ｌ１ＭＥｅの配列ならびにプライマーおよびプローブを示す図である。
【図４】本発明の１つの実施形態に従ったｑＰＣＲアッセイのための標準曲線のグラフを示す図である。
【図５】本発明の１つの実施形態に従った捕捉実験前後の様々な陽性対照配列およびＳＩＮＥ陰性対照配列の量を示す図である。
【図６Ａ】様々なライブラリーを用いる捕捉実験前の５つの陽性対照配列および１つの陰性対照配列（ＡｌｕＪｏ）の量を示す図である。
【図６Ｂ】本発明の１つの実施形態に従った捕捉実験後のこれらの配列の量を示す図である。
【図７Ａ】様々な条件下での捕捉実験前の５つの陽性対照配列および１つの陰性対照配列（ＡｌｕＪｏ）の量を示す図である。
【図７Ｂ】本発明の１つの実施形態に従った捕捉実験後のこれらの配列の量を示す図である。
【図８】本発明の１つの実施形態に従った方法を説明するフローチャートを示す図である。
【図９】本発明の１つの実施形態に従った方法を説明するフローチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態は、ＤＮＡライブラリーからの目的の配列の濃縮をモニタリングするための方法に関する。上記のように、ＤＮＡライブラリーから目的の配列を濃縮するプロセスにおいて、陽性対照を含めることによって、濃縮の進行をモニタリングすることが可能になることが示されている。本発明の方法は、陰性対照配列を用いることによって、濃縮のモニタリングにおけるさらなる向上を提供する。本発明の方法は、陰性対照配列を単独で、または陽性対照配列と組み合わせて用い得る。本発明の実施形態は、特に陽性対照配列と共に用いると、予想外の利点をもたらす。さらに、本発明の方法は、特定のライブラリーのために設計されたものではなく、したがって、標的ライブラリーに関わらず一般的な適用性を有する。
【００１７】
本明細書において用いられる場合、「陰性対照配列」は、ＤＮＡライブラリーからの標的配列の濃縮において陰性対照として用いるための、選択された配列を有するオリゴヌクレオチドを言う。以下に記載されるように、陰性対照配列は、好ましくは、ＳＩＮＥファミリーまたはＬＩＮＥファミリーに属する反復エレメントである。
【００１８】
「陽性対照配列」は、ＤＮＡライブラリーからの標的配列の濃縮において陽性対照として用いるための選択された配列を有するオリゴヌクレオチドを言う。陽性対照配列は、ＤＮＡライブラリーにおいて見られる配列、またはＤＮＡライブラリー内に添加された外因性の配列であり得る。
【００１９】
本明細書において用いられる場合、「ベイト配列」は、ライブラリーから目的の配列（標的配列）を濃縮する（捕捉する）ために選択された配列を有するオリゴヌクレオチドである。ベイト配列は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システムのためのベイト）、またはＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの組み合わせであり得る。ベイト配列と結合した配列の単離を容易にするために、ベイト配列は、親和性リガンド（例えば、ビオチン）と連結していてもよい。あるいは、ベイト配列は、固体担体に付着していてもよい。典型的には、濃縮実験において、目的の配列（標的配列）の周囲に１つまたは複数のベイト配列が設計される。ベイト配列は、標的配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、ベイト配列は、結合した標的配列と共に、混合物から単離される。
【００２０】
ＤＮＡライブラリーは、典型的には、多くのゲノムＤＮＡ断片を含む。本明細書において用いられる場合、「ＤＮＡライブラリー」は、増幅およびシークエンシングを容易にするためにＤＮＡ断片が特異的アダプターによって隣接されている、第二世代ゲノムライブラリーを言う場合がある。
【００２１】
「濃縮」または「捕捉」は、１つまたは複数のベイト配列を用いてＤＮＡライブラリーから標的配列を濃縮するプロセスを言う。１つまたは複数のベイト配列を用いることによる標的配列の濃縮後のＤＮＡライブラリーは、「捕捉後ライブラリー」と呼ばれる。捕捉実験前のＤＮＡライブラリーは、「捕捉前ライブラリー」と呼ばれ得る。したがって、配列（例えば、陽性対照配列または陰性対照配列）の量（数量）は、それが捕捉実験の前であるか後であるかに応じて、「捕捉前の量」または「捕捉後の量」と呼ばれ得る。
【００２２】
本明細書において用いられる場合、「（１つまたは複数の）ＬＩＮＥ」は、真核生物のゲノムにおいて多数見られる遺伝子エレメントの群である「（１つまたは複数の）長鎖散在エレメント」を言う。ＬＩＮＥの５’ＵＴＲは、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーター配列を含有するが、ＬＩＮＥの３’ＵＴＲは、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）およびポリＡ尾部を含有する。したがって、ＬＩＮＥは、５’ＵＴＲにあるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを用いてＲＮＡに転写され得る。ＬＩＮＥは逆転写酵素をコードし、多くのＬＩＮＥはまたエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ｈなど）をコードする。逆転写酵素は、他のＲＮＡよりもＬＩＮＥのＲＮＡに対して高い特異性を有し、そして、新たな部位でゲノム内に組み込まれ得るＲＮＡのＤＮＡコピーを作製し得る。ＬＩＮＥは自律的にコピーし得るため、ＬＩＮＥは、ゲノムを増大し得る。ヒトゲノムは、例えば、約５０万個のＬＩＮＥを含有し、これはゲノムのおよそ１７％である。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、「（１つまたは複数の）ＳＩＮＥ」は、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、および他の低分子核内ＲＮＡなどのＲＮＡ分子から逆転写された短いＤＮＡ配列（５００ベース未満）である「（１つまたは複数の）短鎖散在エレメント」を言う。霊長類における最も一般的なＳＩＮＥは、Ａｌｕ配列である。約１５０万個のコピーで、ＳＩＮＥは、ヒトゲノムの約１１％を構成する。これらのうち、１００万を超えるコピーが「Ａｌｕ」エレメントであり、これは、ヒトゲノムの約１０．７％を占める。
【００２４】
ＳＩＮＥまたはＬＩＮＥにおける反復配列は、「反復エレメント」と呼ばれ得る。「Ａｌｕ配列」または「Ａｌｕエレメント」は、Ａｌｕ制限エンドヌクレアーゼの作用によって最初に特徴付けされた短い一続きのＤＮＡを言う。Ａｌｕ配列は、通常、約３００ｂｐ長である。Ａｌｕ配列は、ヒトゲノムにおいて最も豊富な可動性エレメントであり、短鎖散在エレメント（ＳＩＮＥ）として分類される。Ａｌｕエレメントの典型的な構造は、５’−部分Ａ−Ａ５ＴＡＣＡ６−部分Ｂ−ポリＡ尾部−３’であり、式中、「部分Ａ」および「部分Ｂ」は、類似の配列であるが、逆方向に配置されている。ポリＡ尾部の長さは、Ａｌｕファミリー間で異なる。Ａｌｕ配列は、ＡｌｕＪおよびＡｌｕＳとして知られている２つの主要なサブファミリーならびに多くのサブサブファミリーに分けられた。Ａｌｕ配列（またはＡｌｕエレメント）の具体的な例は、ＡｌｕＪｏである。
【００２５】
本発明の実施形態に従うと、濃縮プロセスのモニタリングに用いるための「陰性対照配列」は、好ましくは、以下の特性の１つまたは複数を有する。まず、陰性対照配列は、濃縮の標的であってはならない。したがって、陰性対照配列は、濃縮実験において減少する。さらに、これらの陰性対照配列は、好ましくは、ほとんどのライブラリーにおいて見られる。陰性対照がほとんどのライブラリーにおいて見られるならば、このような陰性対照配列を用いる実験設計は、様々な濃縮目的で多くのライブラリーに適用可能となる。したがって、新たなライブラリーを用いる場合に陰性対照を再設計する必要はない。最後に、陰性対照配列は、好ましくは、モニタリングが容易である。
【００２６】
これらの基準に基づいて、本発明の発明者らは、ゲノムにおいてしばしば見られる反復配列が、本発明の実施形態と共に用いるための良好な陰性対照配列であることを見出した。このような反復配列の例には、ＬＩＮＥ（長鎖散在核内エレメント）、ＳＩＮＥ（低分子散在反復エレメント）、および他の類似の配列が含まれ得る。これらの反復配列は、直接反復（例えば、全体的な直接反復、局所的な直接単純反復、局所的な直接反復、スペーサーを伴う局所的な直接反復など）または逆反復（例えば、全体的な逆反復、局所的な逆反復、スペーサーを伴う逆反復、パリンドローム反復など）であり得る。例えば、Ｕｓｓｅｒｙら、「Ｗｏｒｄ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ，Ｒｅｐｅａｔｓ，ａｎｄ  Ｒｅｐｅａｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ」、Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ：Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．８（第１版）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１３３〜１４４頁（２００８）を参照されたい。これらの反復配列は、それらが生物学的機能を有していようがいまいが、本発明の実施形態に従った陰性対照配列として用いられ得る。
【００２７】
これらの反復配列は濃縮実験における目的ではないため、これらは、通常、標的ライブラリーの設計の間に意図的に「マスキング」される。したがって、各標的濃縮実験のために陰性対照を具体的に設計する必要はない。したがって、このような反復配列を陰性対照のモニタリングに用いることは一般的に有用であり得、すなわち、様々なＤＮＡライブラリーに適用可能である。
【００２８】
上記のように、Ａｌｕ反復は、ゲノムにおいて極めて豊富である。例えば、Ａｌｕ反復についてのＢＬＡＳＴサーチでは、９１，０００超のヒットがヒト参照ゲノムにおいて得られた。Ａｌｕ反復の実際の存在量は、約１Ｍコピー／細胞であると推定される。コピー／ゲノムが多数であることに起因して、このような反復は、ゲノムをシークエンシングする必要なくオンターゲット％と相関し得る、濃縮の敏感な尺度として作用し得る。
【００２９】
ＳＩＮＥは、ｅＡｒｒａｙ（商標）による（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒアルゴリズムを用いる）ＥＬＩＤ設計から自動的に排除されるため、捕捉の陰性対照として用いることができる。ｅＡｒｒａｙ（商標）は、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）捕捉のためのベイトを設計するためのオンラインツールであり、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．のウェブサイトから入手可能である。ＳＩＮＥは濃縮の標的ではないため、これらは残される（捕捉されない）はずで、濃縮されたライブラリーは、ＳＩＮＥ配列の有意な低減を示すはずである。１つの実験において、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅと共同で、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）濃縮の後に、ＳＩＮＥの含有量が１２．６％から４．１％に低下することが見出された。このことは、ベイトの設計を通じてマスキングされた反復配列が濃縮（捕捉）実験において減少し得ることを裏付けるものである。さらに重要なことに、この結果は、濃縮効率を推定するために陰性対照配列のみを用い得る（すなわち、いかなる陽性対照も用いない）ことを示す。すなわち、陰性対照配列の減少の程度は、標的配列の濃縮の倍率を推定するために用いることができる。
【００３０】
さらに、本発明の実施形態に従うと、陰性対照配列として用いられる反復配列（例えば、ＳＩＮＥ配列またはＬＩＮＥ配列）は、非特異的な捕捉によって、最終的には、捕捉されたライブラリーとなるため、非特異的なＤＮＡの捕捉の量（すなわち、オフターゲット％）を評価するためにも用いることができる。
【００３１】
図２は、ＳＩＮＥでありヒトゲノムにおいて非常に豊富な、陰性対照配列ＡｌｕＪｏの例を示す。図２において示されるように、ＡｌｕＪｏ配列は、３１１ヌクレオチド長（配列番号１）である。プライマー対（左プライマーおよび右プライマー）およびプローブオリゴヌクレオチド（それぞれ２０ｎｔ）が、この陰性対照配列のｑＰＣＲ分析（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ）のために設計される。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイのためのプライマーおよびプローブの設計は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）またはＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）のＷｈｉｔｅｈｅａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｒｉｍｅｒ３などの市販されているプログラムを用いて行うことができる。
【００３２】
ＡｌｕＪｏ配列内の２つのプライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドの位置を図２に示す。これらのオリゴヌクレオチドの配列は以下に示す通りである。
ＡｌｕＪｏ：配列番号１
1 AGCTGGGCGTGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGAACTTTGGGAGGCTGAGACTGGCTGA
61 TTTCTTGAGCCCAGGAGTTTGAGACTAGCCTGGACAACATAGTGAGACCCCATCTTTACA
121 AAAAAATTAAAAAAAATTAGTGGACATGGTGGCATGCACCTCTAGTCCCAGTTACTCAGG
181 AGGCTGAGGTGGGAGGATCACCTGTGCCCAGGCTGAGGCTGCAGTGAGCCATGATCACGC
241 CACTGCACTCCAGCCTGCGTGACAGAGCAAGACCCTGTCTCAAAAGAAAAGAAAAAAAAA
301 GAAGAAAGAAA
左プライマー：GTGGCATGCACCTCTAGTCC  配列番号２
右プライマー：TGAGACAGGGTCTTGCTCTG  配列番号３
プローブ：TACTCAGGAGGCTGAGGTGG  配列番号４
【００３３】
図２は、本発明の方法と共に用いるためのＳＩＮＥ陰性対照配列の設計の１つの例を示す。図３は、ＬＩＮＥ配列である別の例（すなわち、Ｌ１ＭＥｅ反復）を示す。このＬ１ＭＥｅ反復（配列番号５）は、ヒトゲノムにおいて、ＡｌｕＪｏほど豊富ではない。それでも、Ｌ１ＭＥｅ反復は、良好な陰性対照配列でもある。Ｌ１ＭＥｅ反復を陰性対照配列として用いるための、左プライマー（配列番号６）、右プライマー（配列番号７）、およびプローブ（配列番号８）の設計が、図３において説明される。これらのオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
Ｌ１ＭＥｅ：配列番号５
1 ATGCTATTTACGAGAGAAGCATTTGCAACAAAATGCCAAAGAGAAGGTGAAAATAGCTGG
61 AAAAAAAATGCGCAAAGCAAATAACCAATAGAAAGAAAGCCAAGTTGGGCTAGCAAAATC
121 AGACAAAATAACCTTCGAGGTGCAAACAACTTT
左プライマー：GCGCAAAGCAAATAACCAAT  配列番号６
右プライマー：TGTTTGCACCTCGAAGGTTA  配列番号７
プローブ：TGGGCTAGCAAAATCAGACA  配列番号８
【００３４】
図２および図３は、それぞれ、陰性対照配列として用いるためのＳＩＮＥ配列およびＬＩＮＥ配列の例、ならびにそれらのプライマーおよびプローブの設計を示す。当業者には、他の反復配列（ＬＩＮＥまたはＳＩＮＥ）が、本発明の実施形態に従った陰性対照配列として用いるために同様に設計され得ることが理解されよう。以下は、本発明の実施形態に従った陰性対照配列として用いられ得るいくつかのさらなる反復配列の例である。
【００３５】
ＡｌｕＳｘ（Ａｌｕファミリー、ＳＩＮＥ反復）：配列番号９。
GGCTGGATGCAGTGGCTCGTGCCTGTAATCCCAACACTTTGGGAGGCTGA
GGCGGGTGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGGCTGGCCAACAT
GGCAAAACCCCGCCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGCATAGTGG
TGCACGCCTGTAATCACAGCTACTCAAGAGGCTGAAGCAGGAGAATTGCT
TGAACTCAGGAGGTGGAGGTGGCAGTGAGCCAAGATCGTGCCACTGCACT
CCAGCCTCAGTGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAAATAAATAAATAAA
A
【００３６】
ＡｌｕＹ（Ａｌｕファミリー、ＳＩＮＥ反復）：配列番号１０。
GGCCGGGCGCGGGGGCTCGCGCCTGTCATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGA
GGCGGGCGGATCACGAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACACGG
GGAAACCCCGTCTCCACTAAAAATACAAAAAGTTAGCCGGGCGCGGTGGC
GGGCGCCTGCGGTCCCAGCTGCTGGGGAGGCCGAGGCGGGAGCATGGCGG
GAACCGGGAGGCGGAGCCTGCAGTGAGCCGAGATGGCGCCACCGCACTCC
AGCCTGGGCGACCCAGCGAGACTCCGCCTCAAAAAAAAAAAAAGAA
【００３７】
Ｌ５（ＬＴＥファミリー、ＬＩＮＥ反復）：配列番号１１。
TCTCTTTATTTGCTTCTGCTAATTAAAAAATCAGAGCTAAAGATACTTAA
ACACTACAGTTAAAATGCCATGGTTGTCTATTGGCTTAACGAATTCTCTT
ATGAAATCAACTCTAAAATGCTATCCATCATAAATCATGAAACGCAATTT
TTCTTATTCTCTTTAGAGCTTTACAATTCATCTTAAAGACCAGTGTTTAC
ACTCTCTTCTGTAGGTTGTACAATAACTTTTGGCGAGAAAAAATAAAAGT
CTGGCTTTCTGAC
【００３８】
ＭＥＲ５８Ａ（ｈＡＴ−Ｃｈａｒｌｉｅファミリー、ＤＮＡ反復）：配列番号１２。
GGAGGTGGTAAATTTGACTCATGGGACAAATCTTTTGTAAATAAAGTTTC
ACTGGAACCCAGTCACACTCATTTGTTTCTGTATTGTCTGTTGACAGTTT
TTATGCTACAATAAGAGTTGAGTAGTTATGACAGACACTCTAGGGCCTGT
AGAGCCTATAATATTTACTTTTGGCCTTTTACGGAAGAAGTTTACTGACC
【００３９】
ＭＬＴ１Ａ（ＥＲＶＬ−ＭａＬＲファミリー、ＬＴＲ反復）：配列番号１３。
CTCCTCTGTCTTTTCCCACCAAGTGAGGATGCGAAGAGAAGGTGGCTGTC
TGCAAACCAGGAAGAGAGCCCTCACCGGGAACCCGTCCAGCTGCCACCTT
GAACTTGGACTTCCAAGCCTCCAGAACTGTGAGGGATAAATGTATGATTT
TAAAGTCGCCCAGTGTGTGGTATTTTGTT
【００４０】
本発明の実施形態に従うと、濃縮（捕捉）実験後の陰性対照配列の減少は、標的配列が濃縮されることの指標となる。濃縮実験における陰性対照配列の減少をモニタリングするための技術は、標的配列または陽性対照配列の濃縮をモニタリングするために用いられる技術と同様であり得る。典型的には、モニタリング技術は、試料の増幅と、その後の増幅された試料の定量を伴う。あるいは、増幅および定量は、同時に行うことができる。同時の増幅および定量のための１つのこのような技術は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であり、これはリアルタイムＰＣＲとしても知られている。
【００４１】
ｑＰＣＲプロセスは、通常のＰＣＲ技術を用いる、ＤＮＡ試料における１つまたは複数の特定の配列の増幅を伴う。ＰＣＲ産物は、反応混合物内に含まれるプローブ（典型的には、蛍光プローブ）を用いて、リアルタイムで定量される。蛍光プローブは、二本鎖ＤＮＡ生成物の量に基づいてシグナルを発して、リアルタイムな定量をもたらす。
【００４２】
上記のように、２つのタイプの蛍光プローブが、ｑＰＣＲ産物の定量において一般的に用いられる。第１のタイプは、配列非特異的な様式で二本鎖ＤＮＡ分子内にインターカレートする非特異的な蛍光染料である。このような蛍光染料の例には、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、エチジウムブロマイド、ＤＡＰＩ（４９，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＳＹＴＯ（登録商標）−１３（ビス−ベンズイミド蛍光染料）、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、およびＴＯＴＯ（登録商標）−１（チアゾールオレンジの二量体）が含まれる。ＳＹＴＯ（登録商標）−１３、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、およびＴＯＴＯ（登録商標）−１は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｄｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能である。これらの蛍光プローブは、典型的には、それ自体で蛍光シグナルをほとんど発しないか全く発しない。しかし、それらが二本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子内にインターカレートすると、塩基の積み重ねによって疎水性の環境がもたらされ、これによって、これらのプローブが増強した蛍光を有することが可能になる。これらの染料は配列非特異的な様式で二本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子内にインターカレートするため、蛍光シグナルの強度は、二本鎖分子内にインターカレートするこれらの染料の量のみを反映する。したがって、このような蛍光染料の存在においてリアルタイムＰＣＲにおいて検出される蛍光シグナルの強度は、二本鎖生成物の量を反映する。
【００４３】
ＤＮＡ生成物の量を推定するためのｑＰＣＲにおいて用いられる第２のタイプの蛍光プローブは、配列特異的なＤＮＡプローブである。これらの配列特異的なＤＮＡプローブは、典型的には、蛍光レポーター（フルオロフォア）で標識されたオリゴヌクレオチドである。さらに、これらの配列特異的なＤＮＡプローブはそれぞれ、蛍光レポーターからの蛍光シグナルを抑制する蛍光クエンチャーを含む。クエンチャー分子が蛍光レポーターから切り離されて初めて、蛍光レポーターからのシグナルは実質的に増大する。これらの配列特異的なプローブは、混合物内の標的配列の量の定量に用いることができるため、混合物内に同様に存在する他の配列からの干渉を伴わずに特定の配列の量を推定するために特に有用である。このアプローチは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能なＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいて用いられる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、米国特許第５，７２３，５９１号において記載されている。
【００４４】
ＤＮＡライブラリーの迅速な定量のためのｑＰＣＲの使用が、最近実証されている（Ｂｕｅｈｌｅｒら、「Ｒａｐｉｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、５０（２０１０）、Ｓ１５〜Ｓ１８）。この刊行物において示されているように、ｑＰＣＲによって、ＤＮＡライブラリーの正確な定量測定値を得ることができる。さらに、次世代ライブラリーアダプターを含有する断片のみが増幅されるため、ｑＰＣＲは、このようなライブラリーにおけるＤＮＡ濃度の過大評価を最小にし得、すなわち、アダプターを有さないかまたは１つのアダプターを有する断片は増幅されない。
【００４５】
ＤＮＡライブラリーにおける配列組成のモニタリングにおけるｑＰＣＲの有用性は、Ｄａｎｉｅｌ  Ａｉｒｄら、「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１、１２−Ｒ１８によって最近実証された。この出版物において、著者は、ＤＮＡライブラリーの増幅において生じるバイアスを調査するためにｑＰＣＲを用いた。様々な要因（ＧＣ含有量を含む）は、ＰＣＲ反応の効率に影響し得、異なるＰＣＲ機およびＰＣＲプロトコルもまた、増幅されたライブラリーにおける配列のバイアスを生じさせ得る。バイアスを評価するために、著者は、増幅前後の様々な配列を定量するためにｑＰＣＲを用いて、配列が異なると濃縮される程度が異なるかどうかを観察した。このモニタリング技術を用いて、著者は、ＰＣＲ増幅におけるバイアスを最小にするＰＣＲプロトコルを設計することができた。この研究は、ＤＮＡライブラリーの配列組成分析におけるｑＰＣＲの有用性を立証するものである。
【００４６】
本発明の実施形態に従うと、ｑＰＣＲは、市販されている機器および販売者によって提供される標準的なプロトコルを用いて行うことができる。市販されているｑＰＣＲ機器の例は、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）Ｍｘ３００５Ｐ  ＱＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍである。このシステムは、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘまたはＢｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩＩ  Ｕｌｔｒａ−Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用い得る。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩを用いるためのサイクル条件は、例えば、以下の通りであり得る。９５℃で１０分間の活性化、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒を４０サイクル、および７０から９５℃への融解曲線。Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩＩ  Ｕｌｔｒａ−Ｆａｓｔのためのサイクル条件は、例えば、以下の通りであり得る。９５／９８℃で３分間の活性化、９５／９８℃で１０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２０秒を４０サイクル、および７２から９８℃への融解曲線。
【００４７】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎに基づくアッセイは、非特異的であり、全ての二本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ分子を定量するために用いることができる。特異的配列の定量が必要である場合、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用いることができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、配列を増幅するために２つのプライマーを用い、蛍光シグナルを生じさせるために標的配列に特異的なプローブを用いる。各プローブは、フルオロフォアおよび蛍光クエンチャーを含む。蛍光クエンチャーは、フルオロフォアがシグナルを発することを妨げる。プローブが標的配列鋳型に結合すると、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、一部をプローブから切断し、フルオロフォアを蛍光クエンチャーから分離させる。その結果、フルオロフォアからの蛍光シグナルは検出可能となる。当業者には、目的に応じて、非特異的なｑＰＣＲアッセイ（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎに基づく方法）または配列特異的なｑＰＣＲアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ）のいずれかが本発明の実施形態と共に用いられ得ることが理解されよう。さらに、他の類似のｑＰＣＲ定量方法もまた、本発明の範囲から逸脱することなく用いることができる。
【００４８】
例えば、メカニズムに基づくｑＰＣＲ定量方法もまた、用いることができる。メカニズムに基づくｑＰＣＲ方法は、定量のために標準曲線を必要としない。メカニズムに基づくｑＰＣＲ方法、例えばＰＣＲの二パラメータ質量作用動力学モデル（ＭＡＫ２）は、標準曲線方法に等しい、またはさらに良い定量性能を有することが示されている。これらのメカニズムに基づく方法は、元の試料濃度を推定するために、ポリメラーゼ増幅プロセスについての知識を用いる。Ｂｏｇｇｙ  Ｇ．Ｊ．、Ｗｏｏｌｆ  Ｐ．Ｊ．（２０１０）、「Ａ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｄａｔａ」、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（８）：ｅ１２３５５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１２３５５を参照されたい。
【００４９】
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の定量は、本明細書において記載される実施例においてｑＰＣＲと共に示されているが、当業者には、これらの分子を定量するための他の技術もまた、本発明の範囲から逸脱することなく用いることができることが理解されよう。例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）は、有用な代用品である。
【００５０】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）でＨｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡキットを用いる、濃縮されたライブラリーの定量を、製造者の指示に従って行うことができる（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡのウェブサイトから入手可能な「Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡ  ｋｉｔ  Ｇｕｉｄｅ」）。例えば、試験試料は、１：５０および１：１００に希釈され得、１μｌを、サイズ決定および定量のためのＤＮＡマーカーとともに、プライムされたチップ上でランされた。濃度は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）ソフトウェアを用いて、１６０から４００ｂｐの断片サイズで決定することができる。データは、希釈について補正され、平均され得る。
【００５１】
ＤＮＡ濃度を定量するためにｑＰＣＲ技術を用いる場合、標準曲線が必要である。標準曲線を作成するために、典型的には、一連の増幅は、既知の濃度の配列を用いて行われる。増幅産物が検出可能となる（例えば、閾値レベルを超える）ために必要なＰＣＲサイクルの数は、閾値サイクル（Ｃｔ）と呼ばれ、これは、配列の最初の濃度に対して反比例する。したがって、最初の濃度の対数に対する閾値サイクル（Ｃｔ）のプロットは、線形関係を示す。
【００５２】
図４は、３つの試験配列、６４４、１２１９、およびＡｌｕＪｏについての標準曲線の例を示す。図４に示される例において、３つの配列全ては、最初のコピー数（１０２から１０５のコピー）と閾値サイクル（Ｃｔ）との間の良好な線形の相関を示す。このような標準曲線があれば、閾値サイクル数（Ｃｔ）が分かっていれば、特定の配列についての最初のコピー数を推定することができる。
【００５３】
図４はまた、ＡｌｕＪｏ配列がｑＰＣＲ定量に対してさらに敏感であり、他の２つの試験配列（６４４および１２１９）よりも約５サイクル早く検出され得ることを示し、このことは、ＡｌｕＪｏの検出感度が他の２つの配列よりも約３２倍優れていることを示唆する。ＡｌｕＪｏ配列のより優れた感度は、反復配列の固有の配列含有量および／またはさらに良好なプライマー／プローブ設計の結果生じ得る。陰性対照配列のより優れた検出感度は、本発明の実施形態と共に用いるために望ましい。
【００５４】
本発明の実施形態の有用性を説明するために、ＳＩＮＥ配列を一連の濃縮実験における陰性対照配列として用いている。図５は、このような実験の結果である。濃縮（捕捉）プロセスの前に、ＳＩＮＥおよび５つの陽性対照配列（７７、２９６、６２、６４４、および１２１９）のコピー数は、標準曲線に基づいてほぼ同じに、すなわち、それぞれ１×１０３から１×１０４コピーの間に調節される。
【００５５】
図５において示されるように、捕捉の後、陽性対照配列のコピー数は全て、それぞれ約１×１０６および１×１０７コピーに増大するが、陰性対照配列（ＳＩＮＥ）は、約１×１０１および１×１０２コピーに低減する。すなわち、全ての陽性対照配列は、約１０３倍濃縮されるが、陰性対照配列は、約１０２倍低減する。したがって、捕捉の後に、ＳＩＮＥ陰性対照配列と比較して約１０４〜１０５倍多い陽性対照配列が存在する。これらの結果は、陽性対照配列の濃縮が良好に機能すること、および陰性対照配列が実際に減少することを明らかに示す。配列分析はまた、オンターゲットのパーセンテージ（すなわち、捕捉後のライブラリーにおける標的配列のパーセンテージ）が約５５％〜６０％の範囲であることを明らかにする。
【００５６】
上記のように、ｑＰＣＲはまた、目的の配列を定量するために用いることができる。定量が望ましい場合、ならびに異なるライブラリーおよび／または機械の間の差異が関心事である場合には、アッセイに内部標準を含めることができる。例えば、図６Ａおよび図６Ｂは、ＡｌｕＪｏ配列を陰性対照配列として用いて様々なライブラリーからの５つの陽性対照配列（すなわち、７７、６４４、６２、２９６、および１２１９）の濃縮をモニタリングする実験の結果を示す。図６Ａは、濃縮前のライブラリーにおける様々な配列の相対量を示す。捕捉前のライブラリーにおいて、陽性対照配列および陰性対照配列は、ほぼ同じ量（約１×１０２〜１×１０３）で存在する。
【００５７】
図６Ｂは、濃縮後の、ライブラリーにおける相対量の結果を示す。捕捉後のライブラリーにおいて、陽性対照配列の含有量は約１×１０３まで増大するが、陰性対照配列の含有量は、約１×１０１〜１×１０２まで低減する。捕捉前および捕捉後の存在量の間の比較は、陽性対照配列が有意に濃縮されることを明らかに示す。陰性対照配列に対する陽性対照配列の比率を基準として用いれば、濃縮は特に明らかである。
【００５８】
図６Ａおよび図６Ｂにおいて示される実験はまた、単一のＡｌｕＪｏ陰性対照配列が様々なライブラリーと共に用いられ得ることを示し、このことは、本方法の広範な適用性を説明する。言い換えると、新たなライブラリーを用いる場合に、陰性対照配列を再設計する必要がない。
【００５９】
本発明の実施形態に従った捕捉プロセスをモニタリングするための様々な条件を調べるために、５つのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ベイト（６２、７７、２９６、６４４、および１２１９）を陽性対照配列として用いＡｌｕＪｏ配列を陰性対照配列として用いる一連の実験を、異なる条件下で、例えば、異なるハイブリダイゼーション条件、洗浄条件、および／または溶出条件の下で行う。これらの条件を、以下の表に示す。
【００６０】
【表１】
2013111081.tif 000003
【００６１】
図７Ａは、様々な捕捉実験についての濃縮の倍率のデータを示す。示されるデータは、５つの陽性対照標的全ての平均値である。様々な配列のオンターゲットのパーセンテージもまた示されている。捕捉されたプールにおける標的配列の量（％表示）であるオンターゲット％は、特定のベイト設計、用いられるベイトの量、捕捉条件（例えば、ハイブリダイゼーションの温度および時間）、洗浄条件（例えば、洗浄緩衝液、温度、および回数）、および溶出条件（例えば、溶出緩衝液および温度）で変化する。
【００６２】
Ｃａｐ＃１３（５０×ベイト）とＣａｐ＃１７（２００×ベイト）との間の比較によって、ベイトが増えても濃縮の倍率が増大しないことが明らかになる。しかし、ベイトが増えると、オンターゲット％が有意に向上する。Ｃａｐ＃４１（４８時間）とＣａｐ＃４５（４時間）とＣａｐ＃４９（２時間）との間の比較によって、ハイブリダイゼーション時間が長くなると濃縮の倍率およびオンターゲット％の両方が向上することが明らかになり、このことは、アニーリングが緩やかなプロセスであることを示唆する。
【００６３】
図７Ｂは、陰性対照（ＡｌｕＪｏ）配列に対する５つの対照標的の平均値の比率に基づく濃縮の倍率のデータを示す。陽性／陰性の比率を見ると、濃縮の倍率がさらに大きいことは明らかである。例えば、図７Ａにおいて、陽性配列での濃縮の倍率は約１０２から約１０３の範囲であるが、図７Ｂにおける濃縮の倍率は約１０３から約１０５である。したがって、比率は、濃縮のさらに敏感な測定をもたらす。
【００６４】
図８は、本発明の１つの実施形態に従った方法８００を説明するフローチャートを示す。この方法に従うと、そのうちの１つまたは複数の標的配列が濃縮されるライブラリーに、陰性対照配列を場合によって加えることができる（ステップ８０１）。しかし、ほとんどのケースにおいて、ライブラリー内に既に存在する１つまたは複数の反復配列（すなわち、内在性配列）を陰性対照配列として用いることができる。したがって、ステップ８０１は、ほとんどのケースでは不必要である。しかし、既に陰性対照配列ならびにそのプライマーおよびプローブが手の内にある場合には、このような外因性の陰性対照配列を用いることがさらに都合が良いか、または有利であり得る（例えば、濃度を制御することができる）。上記のように、本発明の実施形態と共に用いるための陰性配列は、好ましくは、ＳＩＮＥファミリーまたはＬＩＮＥファミリーにおける反復エレメントから選択される。内在性であっても添加されたものであっても、ＤＮＡライブラリー内の陰性対照配列の量が不明の場合には、捕捉前ライブラリーにおける陰性対照配列の捕捉前の量を決定する（ステップ８０２）。この量の決定は、上記のｑＰＣＲで、またはあらゆる他の適切な方法で行うことができる。捕捉前ライブラリーに加えられた陰性対照配列の量が分かっている場合には、ステップ８０２を飛ばすことができる。このケースでは、陰性対照配列の量を「決定すること」は、このような情報を「得ること」を意味することが意図される。
【００６５】
次に、（１つまたは複数の）標的配列の捕捉または濃縮を行う（ステップ８０３）。捕捉または濃縮は、市販されているシステムのいずれかを用いて、かつ製造者の手順に従って行うことができる。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．のＩｌｌｕｍｉｎａ機器と組み合わせた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システム。
【００６６】
捕捉の後、捕捉後ライブラリーにおける陰性対照配列の量が決定される（ステップ８０４）。ここでも、この量の決定は、ｑＰＣＲまたはあらゆる他の適切な方法を用いることができる。
【００６７】
最後に、捕捉（濃縮）効率が、陰性対照配列の捕捉前の量および捕捉後の量から決定され得る（ステップ８０５）。効率は、陰性対照配列の減少の程度に基づいて推定または決定され得る。
【００６８】
例えば、上記のＳｃｒｉｐｐｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅとの共同実験では、ＳＩＮＥの含有量が１２．６％から４．１％に低下することが見出された。これらの数は、この特定の実験についての濃縮の効率のおおまかな指標を提供するために用いることができる。陰性対照配列のみの捕捉前の量および捕捉後の量（すなわち、約３倍（１２．６／４．１≒３．１））から推定される数は、濃縮の実際の効率の推計未満である可能性が最も高い。例えば、図６Ａおよび図６Ｂにおける陰性対照配列の比較に基づいて、陰性対照配列の１×１０１〜１×１０２倍の低減の指標が得られる。しかし、陽性対照配列は、１×１０２〜１×１０３倍の濃縮を示す。この方法が濃縮の倍率の正確な量的推計をもたらさない場合があっても、この推計は少なくとも、濃縮が成功したかどうかの指標を提供する。
【００６９】
濃縮の効率のさらに正確な推計を得るために、図９において示される方法９００において説明されるように、１つまたは複数の陽性対照配列を含めるべきである。図９において示されるように、場合によって、１つもしくは複数の陰性対照配列および／または１つもしくは複数の陽性対照配列をＤＮＡライブラリーに加えることができる（ステップ９０１）。ここでも、場合によって、１つもしくは複数の陰性対照配列を加えることができるか、または内在性反復配列を陰性対照として用いることができる。同様に、陽性対照配列は内在性であり得、すなわち、配列は、標的ライブラリー内に元々存在する。いくつかのケースにおいて、外因性の陽性対照配列を加えることが有利であり得る（例えば、既知の濃度）。陰性対照配列および陽性対照配列の量が不明の場合には、濃縮の前にこれらの捕捉前の量を決定する（ステップ９０２）。陰性対照配列および陽性対照配列の量が分かっているか、または両配列が同じ（またはほぼ同じ）量で加えられる場合には、ステップ９０２を飛ばすことができる。このケースでは、陰性対照配列および陽性対照配列の量を「決定すること」は、このような情報を「得ること」を意味することが意図される。決定は、ｑＰＣＲまたはあらゆる他の適切な方法で行うことができる。
【００７０】
次に、所望の標的配列の濃縮は、１つまたは複数のベイト配列を用いて行われる（ステップ９０３）。ここでも、濃縮は、あらゆる市販されているシステムおよび機器を用いて行うことができる。
【００７１】
濃縮の後、陰性対照配列および陽性対照配列の量が決定される（ステップ９０４）。最後に、濃縮の効率が、陰性対照配列および陽性対照配列の捕捉前の量および捕捉後の量に基づいて決定される（ステップ９０５）。
【００７２】
捕捉前の量および捕捉後の量に基づいて濃縮効率を決定するために、いくつかのアプローチが存在する。まず、陰性対照および陽性対照の量がほぼ同じ量でステップ９０１において加えられる場合、陰性配列および陽性配列の捕捉後の量のみを用いて効率を推定することができる。具体的には、陰性対照配列の捕捉後の量に対する陽性対照配列の捕捉後の量の比率が、濃縮効率の良好な指標を提供する。このアプローチの１つの例を図７Ｂに示す。
【００７３】
別のアプローチ（陰性対照配列および陽性対照配列の捕捉前の量が（ほぼ）同じでない場合に有用な）において、陰性対照配列の捕捉前の量に対する陽性対照配列の捕捉前の量の第１の比率および陰性対照配列の捕捉後の量に対する陽性対照配列の捕捉後の量の第２の比率を導き出すことができる。次に、第１の比率および第２の比率の比較によって、濃縮の効率の推計が得られる。
【００７４】
＜ライブラリーの調製＞
本発明の実施形態と共に用いられるライブラリーは、市販されているライブラリーであり得るか、または実験室において調製され得る。ＤＮＡライブラリーの調製は、ペアエンドシークエンシングのための標準的なプロトコルに従って、様々な販売者（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）から入手可能な市販のキットを用いることができる（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．から入手可能な「Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ」）。例えば、ゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ、３μｇ）を適切なサイズ（例えば、２００〜５００ｂｐ）に断片化することができる（例えば、せん断、噴霧化、または超音波処理によって）。例えば、せん断は、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｅ２１０機器を用いて中央断片サイズ（例えば、２００〜２５０ｂｐ）まで実施することができる。これらの断片の末端は、フィルイン反応およびエキソヌクレアーゼ活性の組み合わせで修復されて、平滑末端となる。次に、３’非鋳型Ａ’を平滑末端に付加する。その後、ペアエンドアダプターをＤＮＡ断片にライゲーションする。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）システムのための５’末端アダプターおよび３’末端アダプターを以下に示す。このように調製されたライブラリーに、アガロースゲル（例えば、４％Ｎｕｓｉｅｖｅ（登録商標）３：１アガロースゲル）上でサイズ選択を施し、ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出を用いて精製することができる。次に、ライブラリーを数サイクル（例えば、６〜８サイクル）のＰＣＲによって増幅することができる。
【００７５】
Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター：
Ｐ５：AATGATACGGCGACCACCGA  配列番号１４
Ｐ７：CAAGCAGAAGACGGCATACGA  配列番号１５
【００７６】
＜標的配列の濃縮＞
本発明の実施形態に従うと、当技術分野において知られているあらゆる濃縮システムを用いることができる。標的配列の濃縮のために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．のＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）システムおよびＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システムなどの、いくつかの機器が販売者から入手可能である。本発明の実施形態は、いかなる特定の手順または機器によっても限定されない。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍは、ユーザー定義のゲノムサブセットの特異的な濃縮を提供する（Ｇｎｉｒｋｅら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７、（２００９）、１８２〜１８９頁を参照されたい）。この方法は、図１において説明されるように、ゲノムＤＮＡライブラリーの、特別注文のビオチン化されたＲＮＡプローブ（典型的には、１２０ｍｅｒのＲＮＡプローブ）に対するハイブリダイゼーション、およびその後の磁気ビーズへの固定に基づくものであり、その後、洗浄ステップおよび溶出ステップがある。このプロセスは、ヒトＸ染色体、全てのヒトエキソン、または４番染色体上の領域に特異的な異なるＲＮＡ捕捉プローブセットを用いる、いくつかのライブラリーの濃縮において検証されている。捕捉されたＤＮＡ断片の溶出の後、ライブラリーは、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）特異的なプライマー（配列番号１４および配列番号１５）を用いて、数サイクル（例えば、１２〜１４サイクル）のＰＣＲ分、再増幅され得る。増幅によって、シークエンシングの前に、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｈｉｇｈ  ＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップまたはｑＰＣＲを用いる正確な定量が可能になる。
【００７７】
本発明の実施形態の利点には、以下の１つまたは複数が含まれ得る。陰性対照を用いる本発明の実施形態は、全体的に適用可能である。特異的な陰性対照は不必要である。その代わりに、ほとんどのゲノムにおいて通常見られる反復配列を、陰性対照として用いることができる。逆に、１つのライブラリーのために特異的に設計される陰性対照は、異なるプローブライブラリーに用いることができない。このような特異的な「陰性対照」エレメントはプローブライブラリーから除去されるため、陰性対照が新たなライブラリー内に存在する可能性は低い。したがって、そのたびに、新たな陰性対照を設計する必要がある。
【００７８】
本発明の実施形態はまた、陰性対照に対する陽性対照の比率を提供するために用いることができる。上記に示されるように、このような比率は、濃縮後の試料のみを用いて濃縮を推定するために用いることができる。濃縮前の試料は必要ではないため、このような濃縮実験における時間およびコストを節約することができる。
【００７９】
本発明は限られた数の実施形態に関して記載されてきたが、本開示の利益を享受する当業者には、本明細書において開示される本発明の範囲から逸脱しない他の実施形態が考え出され得ることが理解されよう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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