(57)【要約】【課題】活性化されたＴ細胞に特異的な新規の細胞表面タンパク質を特定し、当該タンパク質を利用した一連の技術を提供する。【解決手段】Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンを指標として、活性化されたＴ細胞を検出する活性化Ｔ細胞の検出方法が提供される。単離された活性化Ｔ細胞に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させることにより、当該Ｔ細胞における活性化を制御するＴ細胞の活性化制御方法も提供される。Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンの、Ｔ細胞活性化のマーカーのための使用も提供される。プロヒビチンへの結合性を有する物質の例として、抗プロヒビチン抗体が挙げられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンを指標として、活性化されたＴ細胞を検出することを特徴とする活性化Ｔ細胞の検出方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞又はその細胞表面タンパク質に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させる工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の活性化Ｔ細胞の検出方法。
【請求項３】
前記プロヒビチンへの結合性を有する物質は、抗プロヒビチン抗体であることを特徴とする請求項２に記載の活性化Ｔ細胞の検出方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞は、癌化したＴ細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の活性化Ｔ細胞の検出方法。
【請求項５】
単離された活性化Ｔ細胞に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させることにより、当該Ｔ細胞における活性化を制御することを特徴とするＴ細胞の活性化制御方法。
【請求項６】
前記活性化Ｔ細胞は癌化したＴ細胞であり、当該Ｔ細胞における活性化を抑制するものであることを特徴とする請求項５に記載のＴ細胞の活性化制御方法。
【請求項７】
前記プロヒビチンへの結合性を有する物質は、抗プロヒビチン抗体であることを特徴とする請求項５又は６に記載のＴ細胞の活性化制御方法。
【請求項８】
Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンの、Ｔ細胞活性化のマーカーのための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化Ｔ細胞の検出方法、Ｔ細胞の活性化制御方法、及びマーカーのための使用に関し、さらに詳細には、活性化Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチン（prohibitin）を指標とする活性化Ｔ細胞の検出方法、当該プロヒビチンを利用したＴ細胞の活性化制御方法、及び当該プロヒビチンのＴ細胞活性化のマーカーのための使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の細胞や分子を標的とした分子標的薬の開発が盛んに行われている。例えば、癌や自己免疫疾患の分子標的薬として、種々の抗体医薬が開発されており、優れた治療成績を収めている。
【０００３】
Ｔ細胞に関連する前記標的分子としては、ＣＴＬＡ−４（Cytotoxic T lymphocyte antigen-4）とＰＤ−１（Programmed death-1）が知られており、近年、特に注目されている（例えば、特許文献１，２、非特許文献１〜４）。ＣＴＬＡ−４とＰＤ−１は、いずれも活性化されたＴ細胞の細胞表面に発現しており、Ｔ細胞の活性化を抑制する負のシグナル伝達分子として機能している。そして、これらの負のシグナル伝達分子からのシグナルと、ＣＤ２８等の正のシグナル伝達分子からのシグナルとのバランスによって、Ｔ細胞の活性化が制御されている。
【０００４】
ＣＴＬＡ−４やＰＤ−１を標的分子とした医薬開発は、すでに行われている。例えば、ヒト化された抗ＣＴＬＡ−４抗体や抗ＰＤ−１抗体が、癌や関節リウマチの治療剤としてすでに上市、または臨床試験段階にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０８−４７３９１号公報
【特許文献２】特開２００６−３４０７１４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】P. Waterhouse, J.M. Penninger, E. Timms, A. Wakeham, A. Shahinian, K.P. Lee, et al., Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4, Science 270 (1995) 985-8.
【非特許文献２】C. Nakaseko, S. Miyatake, T. Iida, S. Hara, R. Abe, H. Ohno, et al., Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA-4) engagement delivers an inhibitory signal through the membrane-proximal region in the absence of the tyrosine motif in the cytoplasmic tail, J. Exp. Med. 190 (1999) 765-74.
【非特許文献３】Y. Agata, A. Kawasaki, H. Nishimura, Y. Ishida, T. Tsubata, H. Yagita, et al., Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes, Int. Immunol. 8 (1996) 765-72.
【非特許文献４】Y. Ishida, Y. Agata, K. Shibahara, T. Honjo, Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death, EMBO J. 11 (1992) 3887-95.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
分子標的薬の開発によって、癌などの疾病の治療可能性が大きく前進した。そして、さらなる分子標的薬の開発のために、新たな標的分子の探索が求められている。
そこで本発明は、活性化されたＴ細胞に特異的な新規の細胞表面タンパク質を特定し、当該タンパク質を利用した一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、分子標的薬の新たな標的となり得るＴ細胞の表面タンパク質を探索した。その結果、ミトコンドリアに存在するタンパク質として知られているプロヒビチン（prohibitin）が、ＣＴＬＡ−４やＰＤ−１と同様に、活性化されていないＴ細胞の細胞表面にはほとんど発現していないが、活性化されたＴ細胞の細胞表面では発現量が顕著に増加していることを見出した。そして、当該Ｔ細胞表面のプロヒビチンを利用した様々な技術を開発し、本発明を完成した。上記した課題を解決するために提供される本発明は、以下のとおりである。
【０００９】
請求項１に記載の発明は、Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンを指標として、活性化されたＴ細胞を検出することを特徴とする活性化Ｔ細胞の検出方法である。
【００１０】
本発明は、活性化Ｔ細胞の検出方法に係るものであり、細胞表面に発現されたプロヒビチンを指標として、活性化Ｔ細胞を検出する。本発明は、活性化されたＴ細胞にのみ特異的に発現している「細胞表面のプロヒビチン」を指標としており、新たな原理に基づくものである。
【００１１】
請求項２に記載の発明は、前記Ｔ細胞又はその細胞表面タンパク質に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させる工程を包含することを特徴とする請求項１に記載の活性化Ｔ細胞の検出方法である。
【００１２】
本発明では、Ｔ細胞自身あるいはＴ細胞の細胞表面タンパク質に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させる。ここで、「プロヒビチンへの結合性を有する物質」には、少なくとも、抗プロヒビチン抗体が含まれる。
【００１３】
請求項１又は２に記載の活性化Ｔ細胞の検出方法において、前記プロヒビチンへの結合性を有する物質は、抗プロヒビチン抗体であることが好ましい（請求項３）。
【００１４】
請求項４に記載の発明は、前記Ｔ細胞は、癌化したＴ細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の活性化Ｔ細胞の検出方法である。
【００１５】
癌化したＴ細胞は活性化Ｔ細胞の代表例であり、細胞表面にプロヒビチンを多く発現している。癌化したＴ細胞の例としては、Ｔ細胞白血病細胞（T-cell leukemia cell）が挙げられる。
【００１６】
請求項５に記載の発明は、単離された活性化Ｔ細胞に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させることにより、当該Ｔ細胞における活性化を制御することを特徴とするＴ細胞の活性化制御方法である。
【００１７】
本発明はＴ細胞の活性化制御方法に係るものであり、単離された活性化Ｔ細胞に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させ、当該Ｔ細胞における活性化を制御する。本発明は、活性化されたＴ細胞にのみ特異的に発現している「細胞表面のプロヒビチン」を標的として、当該Ｔ細胞の活性化を制御するものであり、新たな原理に基づくものである。
ここで、活性化の「制御」には、活性化の「促進」と「抑制」の両方が含まれる。
ここで、「プロヒビチンへの結合性を有する物質」には、少なくとも、抗プロヒビチン抗体が含まれる。
【００１８】
請求項６に記載の発明は、前記活性化Ｔ細胞は癌化したＴ細胞であり、当該Ｔ細胞における活性化を抑制するものであることを特徴とする請求項５に記載のＴ細胞の活性化制御方法である。
【００１９】
前述したとおり、癌化したＴ細胞は活性化Ｔ細胞の代表例である。そして、本発明では、癌化したＴ細胞における細胞表面のプロヒビチンを標的とし、当該プロヒビチンに「プロヒビチンへの結合性を有する物質」を作用させて、当該Ｔ細胞における活性化を抑制する。本発明は、Ｔ細胞白血病細胞などの癌化したＴ細胞を直接の標的とした癌治療について、基礎的知見を得るのに有用である。
【００２０】
請求項５又は６に記載のＴ細胞の活性化制御方法において、前記プロヒビチンへの結合性を有する物質は、抗プロヒビチン抗体であることが好ましい（請求項７）。
【００２１】
請求項８に記載の発明は、Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンの、Ｔ細胞活性化のマーカーのための使用である。
【００２２】
本発明は、Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンの、Ｔ細胞活性化のマーカーのための使用に係るものである。本発明によれば、細胞表面のプロヒビチンをマーカーとして、活性化Ｔ細胞の検出、分離、精製等を容易に行うことができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、癌や自己免疫疾患等の、Ｔ細胞の活性化レベルが関係している疾病の治療法の研究や治療薬開発に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】マウスＴ細胞について行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（ａ）は全細胞タンパク質、（ｂ）は細胞表面タンパク質の場合を示す。
【図２】図１の結果を定量化したグラフであり、（ａ）は全細胞タンパク質、（ｂ）は細胞表面タンパク質の場合を示す。
【図３】マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞について行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（ａ）は全細胞タンパク質、（ｂ）は細胞表面タンパク質の場合を示す。
【図４】抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体で刺激したマウスＴ細胞について行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（ａ）は全細胞タンパク質、（ｂ）は細胞表面タンパク質の場合を示す。
【図５】ヒトＴ細胞について行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（ａ）は全細胞タンパク質、（ｂ）は細胞表面タンパク質の場合を示す。
【図６】図５の結果を定量化したグラフであり、（ａ）は全細胞タンパク質、（ｂ）は細胞表面タンパク質の場合を示す。
【図７】ヒト白血病Ｔ細胞について行ったウエスタンブロッティングの結果を示す写真であり、（ａ）は全細胞タンパク質、（ｂ）は細胞表面タンパク質の場合を示す。
【図８】ヒト白血病Ｔ細胞について行った免疫組織化学染色の結果を表す写真であり、（ａ）はコントロール、（ｂ）は抗プロヒビチン−１抗体と抗ＣＤ３抗体を用いた場合、（ｃ）は抗プロヒビチン−２抗体と抗ＣＤ３抗体を用いた場合を示す。
【図９】抗プロヒビチン抗体のＥＲＫリン酸化に対する影響を調べたウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１０】図９の結果を定量化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の実施形態の説明に先立ち、プロヒビチンに関する一般的な説明をする。
【００２６】
プロヒビチン（prohibitin）は、ミトコンドリア等に存在するタンパク質として知られている。プロヒビチンには、分子量約３０ｋＤａのプロヒビチン−１（ＰＨＢ１）と、分子量約３７ｋＤａのプロヒビチン−２（ＰＨＢ２）の２種があり、ミトコンドリア内においては両者が互いに結合して複合体を形成している。
【００２７】
近年、プロヒビチンがミトコンドリア以外の複数の細胞区画にも存在しており、多様な機能を発揮していることが明らかになりつつある（S. Mishra et al., J. Cell.Mol. Med. 10 (2006) 353-63; S. Mishra et al., FEBS J. 277 (2010) 3938-46; S. Mishra et al.,Trends Mol. Med. 11 (2005) 192-197）。まずミトコンドリアにおいて、プロヒビチンはミトコンドリア内膜に存在している（M.A. Sanz et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 32091; L.G. Nijtmans et al., EMBO J. 19 (2000) 2444-51.）。また、核プロヒビチンは、ｐ５３やＥ２Ｆ１等の転写因子と共同する転写制御因子として機能している（H. Chander et al., EMBO Rep. 11 (2010) 220-5.; B. Joshi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (2003) 459-466.）。乳癌細胞や前立腺癌細胞において、プロヒビチンが核に局在しているとの報告がある（G. Fusaro et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 47853-61.; S.C. Gamble et al., Oncogene 23 (2004) 2996-3004.）。さらに、プロヒビチン−２がエストロゲンレセプターの転写活性を阻害するとの報告がある（J.-W. Kim et al., Cancer Sci. 100 (2009) 1468-78.）。
【００２８】
プロヒビチンは、元々、Ｂ細胞の情報伝達に関係するタンパク質をして同定されたものであり、Ｂ細胞におけるシグナル伝達の調節に関連していることが明らかにされている（M. Terashima et al., EMBO J. 13 (1994) 3782-92.）。またプロヒビチンは、上皮癌細胞のＣ−Ｒａｆの活性化を制御しているとの報告がある（K. Rajalingam et al., Nat. Cell Biol. 7 (2005) 837-43.）。
【００２９】
さらに、プロヒビチンがＴ細胞活性化時に誘導され、ミトコンドリアの膜構造を維持するのに必要であることが報告されている（J.A. Ross et al., J. Biol. Chem. 283 (2008) 4699-713.）。プロヒビチン−１又はプロヒビチン−２を欠損させたマウスが胎生期９日目で死に至り、プロヒビチンが胎生初期に重要な役割を果たしていることが示されている（B. He, Q. Feng et al., Mol. Endocrinol. 22 (2008) 344-60.; S.-Eun Park et al., Mol. Cell. Biol. 25 (2005) 1989-99.）。
【００３０】
そして本発明は、活性化されたＴ細胞において、細胞表面におけるプロヒビチンの発現量が顕著に増加している、という新しい知見に基づいている。以下、本発明の実施形態について順に説明する。
【００３１】
本発明の活性化Ｔ細胞の検出方法は、Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンを指標として、活性化されたＴ細胞を検出することを特徴とするものである。すなわち、本発明は、細胞表面に発現されたプロヒビチンを指標とするものであり、逆に言えば、細胞表面以外に存在しているプロヒビチン、例えば、細胞内（細胞質、核、細胞小器官など）に存在するプロヒビチンを指標とするものではない。
【００３２】
ここで「活性化されたＴ細胞の検出」には、少なくとも、活性化Ｔ細胞の有無の検出が含まれる。例えば、細胞表面のプロヒビチンの発現量と、予め設定した基準値との比較により、Ｔ細胞活性化の有無を判定することができる。
【００３３】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞自身又はＴ細胞の細胞表面タンパク質に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させる工程を包含する。
【００３４】
ここで「プロヒビチンへの結合性を有する物質」としては、プロヒビチンに特異的に結合するものであれば特に限定はなく、タンパク質、低分子化合物等、物質の種類は問わない。プロヒビチンへの結合性を有する物質として、プロヒビチンに対する抗体（抗プロヒビチン抗体）を用いることが、特に好ましい。
【００３５】
前記抗プロヒビチン抗体には、抗プロヒビチン−１抗体と抗プロヒビチン−２抗体の両方が含まれる。プロヒビチン−１とプロヒビチン−２の複合体を特異的に認識する抗体であってもよい。さらに、前記抗プロヒビチン抗体は、ポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。
【００３６】
前記抗プロヒビチン抗体のクラス（アイソタイプ）としては、特に限定はなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ等、いずれのクラスであってもよい。さらに、抗体のサブクラスについても特に限定はなく、例えば、ＩｇＧであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等のいずれのサブクラスであってもよい。
【００３７】
前記抗プロヒビチン抗体には、抗体の機能的断片が含まれる。ここで「抗体の機能的断片」とは、抗体（すなわち免疫グロブリン）の部分断片であって、抗原に対する結合性を保持するものを指す。抗体の部分断片の例としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、ＶＨ−ＶＬ）、ＶＨ、及びこれらの重合体、並びに、これらと重鎖ＣＨ３領域との融合体が挙げられる。
さらに前記抗プロヒビチン抗体は、多重特異性抗体であってもよい。例としては、二重特異性抗体の一種であるダイアボディ（Diabody）（例えば、国際公開第９３／１１１６１号）が挙げられる。
さらに前記抗プロヒビチン抗体は、キメラ型抗体やヒト化抗体であってもよい。
【００３８】
抗プロヒビチン抗体以外の「プロヒビチンへの結合性を有する物質」の例としては、ＣＫＧＧＲＡＫＤＣペプチド（Nature Medicine, vol. 10, 625-632 (2004)）、カプサイシン（Leukemia Research, 27, (2003) 275-283; Biochem. Biophys. Res. Commun., 2009, 379(2), 519-525）、が挙げられる。
【００３９】
本実施形態では、Ｔ細胞自身とＴ細胞の細胞表面タンパク質のいずれもが試料となり得る。Ｔ細胞自身を試料とする場合は、Ｔ細胞に抗プロヒビチン抗体等を直接接触させればよい。一方、細胞表面タンパク質を試料とする場合は、対象となるＴ細胞の細胞表面タンパク質を抽出し、これを試料とすればよい。
【００４０】
プロヒビチンの検出は、公知の方法、例えば標識化合物を用いて行うことができる。抗プロヒビチン抗体を例にとると、標識した抗プロヒビチン抗体を使用するか、抗プロヒビチン抗体に結合する標識物質（標識２次抗体など）を使用すればよい。標識の種類としては、蛍光、酵素、放射性物質、などが挙げられる。
【００４１】
活性化されたＴ細胞の例としては、癌化したＴ細胞が挙げられる。例えば、白血病Ｔ細胞が代表例として挙げられる。
【００４２】
本発明のＴ細胞の活性化制御方法は、単離された活性化Ｔ細胞に、プロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させることにより、当該Ｔ細胞における活性化を制御するものである。
「プロヒビチンへの結合性を有する物質」については、上記した実施形態と同じでありである。特に、キメラ型抗体、ヒト化抗体を用いる実施形態は、抗体医薬の研究に有用である。
【００４３】
活性化Ｔ細胞として癌化したＴ細胞（例えば、白血病Ｔ細胞）を用い、当該Ｔ細胞にプロヒビチンへの結合性を有する物質を接触させて、活性化を抑制することができる。すなわち、細胞表面のプロヒビチンはシグナル伝達物質であることが予想され、細胞表面のプロヒビチンに抗体等を作用させて、Ｔ細胞活性化を抑制することができる。
【００４４】
一方、プロヒビチンへの結合性を有し、かつ細胞表面のプロヒビチンに直接作用してＴ細胞の活性化を促進するような物質があれば、当該物質を「プロヒビチンへの結合性を有する物質」として用いることにより、Ｔ細胞の活性化を促進することも可能である。この実施形態は、正常Ｔ細胞を活性化して癌細胞を殺傷する癌治療について、基礎的知見を得るのに有用である。
【００４５】
本発明は、Ｔ細胞の細胞表面に発現されたプロヒビチンの、Ｔ細胞活性化のマーカーのための使用を包含する。例えば、細胞表面のプロヒビチンをマーカーとして利用した、活性化Ｔ細胞の検出、分離、精製等の各方法は、本発明の一態様である。
【００４６】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
１．実験動物と細胞
清水実験材料社よりＢａｌｂ／ｃマウス（５−７週齢、メス）を入手した。ＡＴＣＣより、ヒト白血病Ｔ細胞株であるＭｏｌｔ−３、Ｍｏｌｔ−４、及びＪｕｒｋａｔ細胞を入手した。本実施例で使用したすべてのＴ細胞は、１０％非働化血清（ＣＣＢ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０ＩＵ ペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
【００４８】
２．活性化Ｔ細胞の調製
（１）Ｔ細胞の単離・調製
Pan T Cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec）を用いて、マウスの脾細胞からマウスＴ細胞を調製した。また、抗ＣＤ４抗体結合マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）と抗ＣＤ８抗体結合マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ調製した。
抗ＣＤ３抗体結合マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて、ヒト末梢血単核球画分よりヒトＴ細胞を調製した。
【００４９】
（２）Ｔ細胞の活性化
マウスＴ細胞（１．５×１０6個）を１００ｎＭ ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（phorbol 12-myristate 13-acetate；ＰＭＡ）と５００ｎｇ／ｍＬ イオノマイシンで刺激した。
マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞についても、同様にして刺激した。
ヒトＴ細胞（１．５×１０6個）についても、同様にして刺激した。
Ｔ細胞への刺激をより生理状態に近い条件で行うために、別途、マウスＴ細胞を５μｇ／ｍＬ 抗マウスＣＤ２８抗体（BioLegend、clone 37.51）と１００ＩＵ マウスＩＬ−２（ＣＳＴ）の存在下、培養プレート（６穴細胞培養プレート、ＢＤ）にコーティングされた抗マウスＣＤ３抗体（BioLegend、clone 145-2C11）で刺激した。
【００５０】
３．プロヒビチン発現誘導の解析
（１）全タンパク質の分離と解析
Ｔ細胞刺激後、０（未刺激）、２４、４８、７２時間経過時に、Ｔ細胞の一部を細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１％プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社））に溶解した。この細胞溶解液にＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティング（下記）に供した。
【００５１】
（２）細胞表面タンパク質の分離と解析
別途、刺激後（０、２４、４８、７２時間）のＴ細胞の一部について、EZ-Link sulfo-NHS-Biotin（サーモサイエンティフィック）を用いて、細胞表面タンパク質をビオチン化した。０．１Ｍグリシン含有ＰＢＳで細胞を洗浄した後、上記（１）と同様にして細胞を溶解した。ストレプトアビジンセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を細胞溶解液に加え、４℃で１時間転倒撹拌した。細胞溶解緩衝液にて洗浄後、担体と共に沈殿させ、細胞表面タンパク質を単離した。沈殿させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティング（下記）に供した。
【００５２】
（３）ウエスタンブロッティング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したタンパク質を、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。このＰＶＤＦ膜を５％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした後、マウス抗プロヒビチン−１抗体（Neo Markers、clone II-14-10）、ウサギ抗プロヒビチン−１抗体（ABGENT）、ウサギ抗プロヒビチン−２抗体（BETHYL）、またはマウス抗βアクチン抗体（シグマ−アルドリッチ）で処理した。続いて、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン）またはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン）と共にインキュベートした。ＥＣＬシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）にてバンドを可視化し、Image J Softwareにて発色強度を測定した。
【００５３】
（４）統計処理
スチューデントのｔ検定にて、平均値間に有意差があるか否かを検討した。
【００５４】
（５）結果
ＰＭＡとイオノマイシンで刺激したマウスＴ細胞について、図１にウエスタンブロッティングの結果を示す。図１（ａ）が全細胞タンパク質の場合、図１（ｂ）が細胞表面タンパク質の場合である。図中、「ＰＢＨ１」、「ＰＢＨ２」、「Actin」は、それぞれ、抗プロヒビチン−１抗体、抗プロヒビチン−２抗体、抗βアクチン抗体で処理した場合を示す（図３，４，５，７においても同じ）。「０、２４、４８、７２」は刺激後の経過時間を示す。
図１（ｂ）に示すように、細胞表面のプロヒビチンは、刺激後（２４、４８、７２時間）において多く検出され、未刺激（０時間）ではごく微量しか検出されなかった。
なお、全細胞タンパク質中には、刺激の有無に関わらず、プロヒビチンが検出された（図１（ａ））。
【００５５】
図２に、刺激後０〜７２時間におけるプロヒビチン−１とプロヒビチン−２のバンドの発色強度を示す。図２（ａ）が全タンパク質、図２（ｂ）が細胞表面タンパク質の場合であり、黒がプロヒビチン−１（ＰＨＢ１）、白がプロヒビチン−２（ＰＨＢ２）を示す。各値は、β−アクチンによりノーマライズし、かつ未刺激（０時間）の発現量を１としたときの相対値で示している。
図２（ｂ）に示すように、細胞表面のプロヒビチン−１（黒）とプロヒビチン−２（白）の発現量は、Ｔ細胞の活性化によって顕著に増大していた。発現量は刺激後４８時間で最大値を示し、プロヒビチン−１（黒）が約６６倍、プロヒビチン−２（白）が約２８倍に増加していた。これは、細胞全体のプロヒビチンの約２０％（プロヒビチン−１）と約２９％（プロヒビチン−２）を占める量であった。
なお、細胞全体におけるプロヒビチン−１とプロヒビチン−２の発現量の増加は、それぞれ最大で約２倍、約２．５倍（いずれも４８時間）であった（図２（ａ））。
【００５６】
ＰＭＡとイオノマイシンで刺激したマウスＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞について、図３にウエスタンブロッティングの結果を示す。図３（ａ）が全細胞タンパク質の場合、図３（ｂ）が細胞表面タンパク質の場合である。「＋」は刺激後４８時間、「−」は未刺激（０時間）を示す。
結果は図１に示したものと同様であり、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれにおいても、細胞表面のプロヒビチンは、活性化されたＴ細胞において顕著に増加していた。これにより、Ｔ細胞のサブクラスに関わらず、細胞表面のプロヒビチンは、活性化されたＴ細胞の細胞表面に多く発現しており、活性化されていないＴ細胞ではごく微量しか発現していないことが示された。
【００５７】
抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体で刺激したマウスＴ細胞（より生理状態に近い条件での刺激）について、図４にウエスタンブロッティングの結果を示す。図４（ａ）が全細胞タンパク質の場合、図４（ｂ）が細胞表面タンパク質の場合である。「＋」は刺激後４８時間、「−」は未刺激（０時間）を示す。
結果は図１、図３に示したものと同様であり、細胞表面のプロヒビチンは、活性化されたＴ細胞において顕著に増加していた。
【００５８】
ＰＭＡとイオノマイシンで刺激したヒトＴ細胞について、図５にウエスタンブロッティングの結果を示す。図５（ａ）が全細胞タンパク質の場合、図５（ｂ）が細胞表面タンパク質の場合である。「＋」は刺激後４８時間、「−」は未刺激（０時間）を示す。
結果は図１，３，４と同様であり、細胞表面のプロヒビチンは、刺激後のみに多く検出され、未刺激ではほとんど検出されなかった。なお全細胞タンパク質中には、未刺激のＴ細胞でもプロヒビチンが検出された。
【００５９】
図６に、図５のプロヒビチン−１とプロヒビチン−２のバンドの発色強度を示す。図６（ａ）が全タンパク質、図６（ｂ）が細胞表面タンパク質の場合であり、黒がプロヒビチン−１（ＰＨＢ１）、白がプロヒビチン−２（ＰＨＢ２）を示す。各値は、β−アクチンによりノーマライズし、かつ未刺激（０時間）の発現量を１としたときの相対値で示している。データは「平均値±標準偏差」で示している（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。
図６（ｂ）に示すように、細胞表面のプロヒビチン−１とプロヒビチン−２の発現量は、Ｔ細胞の活性化に伴って、それぞれ最大で約１６倍、２３倍と顕著に増加していた。
なお細胞全体におけるプロヒビチン−１とプロヒビチン−２の発現量は、Ｔ細胞の活性化に伴って、それぞれ約５．４倍、約２．７倍に増加していた（図６（ａ））。
このように、ヒトＴ細胞においても、細胞表面のプロヒビチンは、活性化されたＴ細胞において顕著に増加していた。
【００６０】
ヒト白血病Ｔ細胞株であるＭｏｌｔ−３、Ｍｏｌｔ−４、及びＪｕｒｋａｔ細胞について、図７にウエスタンブロッティングの結果を示す。図７（ａ）が全細胞タンパク質の場合、図７（ｂ）が細胞表面タンパク質の場合である。図７（ｂ）に示すよう、全ての細胞株において、細胞表面にプロヒビチンが多く発現していた。なお、全細胞タンパク質中にもプロヒビチンは検出された（図７（ａ））。
このように、白血病Ｔ細胞株においても、細胞表面のプロヒビチンが顕著に増加していた。
【００６１】
以上のように、Ｔ細胞から調製した細胞表面タンパク質に抗プロヒビチン抗体を接触させることにより、活性化Ｔ細胞を検出することができた。また、細胞表面のプロヒビチンが、活性化Ｔ細胞のマーカーとなり得ることが示された。
【００６２】
４．Ｊｕｒｋａｔ細胞の免疫組織化学染色
プロヒビチンの脂質ラフトへの局在を示唆する報告がある。またプロヒビチン−１は、ＭＡＰキナーゼ経路の中核を担う分子である。そこで、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｔ細胞受容体を構成するＣＤ３とプロヒビチンの共局在について、下記の免疫組織学的手法で検討した。
【００６３】
Ｊｕｒｋａｔ細胞（５×１０5個）を、５μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＣＤ３抗体（ミリポア社、clone UCHT1）に２．５μｇ／ｍＬウサギ抗プロヒビチン−１抗体（ABGENT）またはウサギ抗プロヒビチン−２抗体（BETHYL）を加えたもので、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、Alexa Fluor 488結合抗マウスＩｇＧ抗体とAlexa Fluor 594結合抗ウサギＩｇＧ抗体（いずれもモレキュラー・プローブ社）で染色した。４％パラホルムアルデヒドで固定化した後、ＤＡＰＩで核染色を行い、Prolong Gold Antifade Reagent（インビトロジェン社）を用いて標本を作製した。
コントロールとして、マウス抗ヒトＣＤ３抗体、ウサギ抗プロヒビチン−１抗体、及びウサギ抗プロヒビチン−２抗体をいずれも使用せずに同様の操作を行った。
【００６４】
結果を図８（ａ）〜（ｃ）に示す。図（写真）中、「ＣＤ３」、「ＰＨＢ１」、「ＰＨＢ２」は、それぞれ、抗ヒトＣＤ３抗体、抗プロヒビチン−１抗体、抗プロヒビチン−２抗体で処理したものを示す。「Ｍｅｒｇｅ」は、抗プロヒビチン−１抗体あるいは抗プロヒビチン−２抗体と抗ＣＤ３抗体の両方の染色像を重ねたものを示す。「ＤＡＰＩ」は、核染色したものを示す。
図８（ｂ），（ｃ）に示すように、いずれの場合もＪｕｒｋａｔ細胞の表面に蛍光が検出され、細胞表面において、ＣＤ３はプロヒビチン−１及びプロヒビチン−２と共局在していた。脂質ラフトは多くの細胞内情報伝達が始まる場所であることから、これにより、プロヒビチンはＴ細胞受容体を介した情報伝達に関与している可能性が示唆された。
【００６５】
また、Ｔ細胞に抗プロヒビチン抗体を直接接触させることにより、活性化Ｔ細胞を検出できることが示された。さらに、細胞表面のプロヒビチンが、活性化Ｔ細胞のマーカーとなり得ることが示された。
【００６６】
５．抗ＣＤ３抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞の刺激とＥＲＫのリン酸化の解析
抗ＣＤ３抗体でＪｕｒｋａｔ細胞を刺激し、抗プロヒビチン抗体のＥＲＫリン酸化に対する影響を調べた。なお、抗ＣＤ３抗体による刺激でＴ細胞が活性化されると、ＥＲＫのリン酸化が促進される。
【００６７】
プロテインＡ磁気ビーズに、「マウス抗ヒトＣＤ３抗体＋ウサギ抗プロヒビチン−１抗体」、「マウス抗ヒトＣＤ３抗体＋ウサギ抗プロヒビチン−２抗体」、又は「マウス抗ヒトＣＤ３抗体＋アイソタイプウサギＩｇＧ」（コントロール）を結合させた。各磁気ビーズ（いずれも９μｇのＩｇＧが結合している）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞の懸濁液（５×１０4個）に加えた。３７℃で１０分間インキュベートした後、細胞を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティング（下記）に供した。
【００６８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したタンパク質を、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。このＰＶＤＦ膜を５％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした後、マウス抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体またはウサギ抗ＥＲＫ１／２抗体で処理した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧまたはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（いずれもインビトロジェン社）で処理した。バンドの可視化と発色強度の測定および統計処理は、上記３−（３）、３−（４）と同様にして行った。
【００６９】
図９に、ウエスタンブロッティングの結果を示す。図中、「Ａｎｔｉ−ＰＢＨ１」は、抗プロヒビチン−１抗体で処理したＪｕｒｋａｔ細胞の場合、「Ａｎｔｉ−ＰＢＨ２」は、抗プロヒビチン−２抗体で処理したＪｕｒｋａｔ細胞の場合を、それぞれ示す（図１０においても同じ）。また「ｐＥＲＫ１／２」は、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体で膜を処理した場合、「ＥＲＫ１／２」は、抗ＥＲＫ１／２抗体で膜を処理した場合を、それぞれ示す。
図９に示すように、抗プロヒビチン−１抗体あるいは抗プロヒビチン−２抗体でＪｕｒｋａｔ細胞を処理した場合、リン酸化ＥＲＫ１／２のバンドが薄くなっており、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＥＲＫ１／２のリン酸化が抑えられていた。
【００７０】
図１０に、発色強度の測定結果を示す。図中、黒はリン酸化ＥＲＫ１（ｐＥＲＫ１）、白はリン酸化ＥＲＫ２（ｐＥＲＫ２）を、それぞれ示す。各値は、ＥＲＫ１／２によりノーマライズし、コントロール実験におけるリン酸化ＥＲＫ１／２の発色強度を１としたときの相対値で示している。データは「平均値±標準偏差」で示している（ｎ＝４、＊ｐ＜０．０５）。
図１０に示すように、抗プロヒビチン−１抗体は、ＥＲＫ１とＥＲＫ２のリン酸化をそれぞれ４０％程度抑制した。また抗プロヒビチン−２抗体は、ＥＲＫ１のリン酸化を２０％程度、ＥＲＫ２のリン酸化を３０％程度、それぞれ抑制した。
以上のように、Ｊｕｒｋａｔ細胞に抗プロヒビチン−１抗体又は抗プロヒビチン−２抗体を接触させることにより、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化を抑制することができた。
また、プロヒビチンはＴ細胞活性化におけるＭＡＰキナーゼ経路に関与していることが示唆された。
【図２】
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【図６】
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【図１０】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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