(57)【要約】      （修正有）【課題】複数種類の励起波長を必要とせず簡単な光学構成で、複数種類の蛍光分子から発する複数種類の蛍光を同時観察でき、蛍光分子を蛍光標識として利用する観察対象に与えるダメージが少なく、しかも、蛍光観察に用いる光学部材として一般的なガラスを用いることの可能な蛍光観察方法及び蛍光観察装置を提供する。【解決手段】少なくとも２種類以上の蛍光分子から発せられる複数種類の蛍光を検出する方法であって、７００ｎｍ以下の可視領域の光を用い、夫々の前記蛍光分子の深紫外領域での吸収を利用し、夫々の該蛍光分子を多光子励起して蛍光を発生させ、前記励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時検出する。【選択図】図１
2013200209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種類以上の蛍光分子から発せられる複数種類の蛍光を検出する方法であって、
７００ｎｍ以下の可視領域の光を用い、夫々の前記蛍光分子の深紫外領域での吸収を利用し、夫々の該蛍光分子を多光子励起して蛍光を発生させ、
前記励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時検出することを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項２】
蛍光検出対象に用いる夫々の前記蛍光分子が、深紫外領域と可視領域に吸収波長帯域を持つことを特徴とする請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記励起光が、極短パルスレーザ光であることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
ショートパスフィルタを用いて前記励起光波長の短波長側に発生した蛍光のみを検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記励起光波長の短波長側に発生した４００ｎｍ以上の蛍光を検出することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記多光子励起により発生した複数種類の蛍光を分光選択的に検出することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
前記多光子励起により発生した複数種類の蛍光を共焦点検出することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記多光子励起の際に発生した１光子由来の蛍光と２光子由来の蛍光を同時に検出することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
所定波長の光を高密度で発する光源と、前記光源からの光を用いて７００ｎｍ以下の可視領域の第二高調波を発生させる第二高調波発生素子と、前記第二高調波発生素子から発生した光を用いて複数種類の蛍光分子を多光子励起し、該複数種類の蛍光分子から励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時観察可能に構成された顕微鏡とからなることを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項１０】
所定波長の光を高密度で発する光源と前記光源からの光を用いて７００ｎｍ以下の可視領域の第二高調波を発生させる第二高調波発生素子とを一体的に備える励起光発生部と、前記励起光発生部から発生した光を用いて複数種類の蛍光分子を多光子励起し、該複数種類の蛍光分子から励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時観察可能に構成された顕微鏡とからなることを特徴とする蛍光観察装置。
【請求項１１】
前記第二高調波発生素子が、前記光源の光路から挿脱可能に構成されていることを特徴とする請求項９又は１０に記載の蛍光観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、複数種類の蛍光タンパク等の蛍光分子から発する蛍光を観察する蛍光観察方法及び蛍光観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光分子を利用した生体分子の観察は、医療分野、ライフサイエンス分野においてスタンダードな観察手法である。蛍光波長が異なる様々な蛍光分子が開発されており、それらの蛍光分子を組合せて利用することで、複数種類の生体分子を観察することが可能となる。
【０００３】
従来、蛍光分子から発せられる蛍光の観察方法としては、例えば、可視領域の光を用いて蛍光分子を１光子励起し、励起光波長に対して長波長側に発生する蛍光（ストークスシフト）を検出する方法や、近赤外領域の光を用いて蛍光分子を多光子励起し、励起光波長に対して短波長側に発生する蛍光を検出する方法（例えば、非特許文献１参照）がある。
【０００４】
これらの蛍光観察方法では、複数種類の蛍光分子を観察する場合、蛍光分子の吸収スペクトルに応じて最適な励起光波長を選択する必要があるため、次のような課題があった。
（課題１）複数種類の蛍光分子を同時観察する場合、波長の異なる複数種類の励起光を同時に標本に照射するために、複数種類の励起光を合波するための光学系が必要となり、光学構成が複雑化してしまう。
（課題２）波長の異なる複数種類の励起光を蛍光観察に用いると、励起光の光路上に配置される光学系を通過する際に発生する色収差を原因として、標本面に集光する励起光の焦点位置が、波長毎に異なってしまい空間的な一致が崩れる場合がある。その結果、複数種類の生体分子の重なりや局在を解析する上で、アーチファクトとなるおそれがある。
（課題３）また、波長の異なる複数種類の励起光を逐次切替えて１種類の蛍光分子ごとに蛍光観察することも考えられるが、それでは各蛍光分子から発する蛍光を同時観察することができない。特に、生細胞などの生きた標本の観察において、複数種類の生体分子の動態を同時に観察することが必要な場合に不都合が生じる。
【０００５】
しかるに、上記課題１及び課題２を解決しうる先行技術として、深紫外領域の光を用いて蛍光分子を１光子励起する方法が、次の非特許文献２に開示されている。非特許文献２には、蛍光分子（タンパク）が深紫外領域に吸収波長帯域を持ち、種類の異なる蛍光分子であっても深紫外領域においては共通の吸収波長帯域を持つことが開示されている。
このことから、深紫外領域の光を用いて蛍光分子を１光子励起し、励起光波長に対して長波長側に発生する蛍光（ストークスシフト）を検出すれば、複数種類の蛍光を同時に観察することが可能となる。
【０００６】
しかし、深紫外領域の光を用いて蛍光分子を１光子励起し、励起光波長に対して長波長側に発生する蛍光（ストークスシフト）を検出する場合、次のような問題がある。
（課題４）深紫外領域の光を蛍光分子に集光・導光するために利用できる光学部材が少なく、光学系の構成に制限条件が多く、所望の仕様を満たす光学系の構築が困難である。光学窓やレンズなどの光学部材として一般に用いられるガラスは、紫外線の波長域では吸光係数が著しく増大し、透過率が急激に減少する。このため、例えば、石英ガラスやフッ化カルシウム、フッ化マグネシウムなどの特殊な部材を使用した専用の光学系が必要となってしまう。
（課題５）深紫外領域の光は、可視光や赤外光に比べて光エネルギーが大きく、生体へのフォトダメージが大きい。このため、生細胞など生きた標本が観察対象である場合、深紫外領域の光は、標本に蛍光標識された蛍光分子から発する蛍光を観察するための励起光には適さない。
【０００７】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Science-1990, vol.248, Winfried Denk et al., "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, New Series, Vol. 248, No. 4951(April 6, 1990), pp. 73-76
【非特許文献２】Biochemistry. 2004 Nov 30, 43, 14913-14923, Turoverov et al., "Comparative studies on the structure and stability of fluorescent proteins EGFP, zFP506, mRFP1, "dimer2", and DsRed1"
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、複数種類の励起波長を必要とせず簡単な光学構成で、複数種類の蛍光分子から発する複数種類の蛍光を同時観察でき、蛍光分子を蛍光標識として利用する観察対象に与えるダメージが少なく、しかも、蛍光観察に用いる光学部材として一般的なガラスを用いることの可能な蛍光観察方法及び蛍光観察装置を提供すること目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明による蛍光観察方法は、少なくとも２種類以上の蛍光分子から発せられる複数種類の蛍光を検出する方法であって、７００ｎｍ以下の可視領域の光を用い、夫々の前記蛍光分子の深紫外領域での吸収を利用し、夫々の該蛍光分子を多光子励起して蛍光を発生させ、前記励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時検出することを特徴としている。
【００１１】
また、本発明の蛍光観察方法においては、蛍光検出対象に用いる夫々の前記蛍光分子が、深紫外領域と可視領域に吸収波長帯域を持つのが好ましい。
【００１２】
また、本発明の蛍光観察方法においては、前記励起光が、極短パルスレーザ光であるのが好ましい。
【００１３】
また、本発明の蛍光観察方法においては、ショートパスフィルタを用いて前記励起光波長の短波長側に発生した蛍光のみを検出するのが好ましい。
【００１４】
また、本発明の蛍光観察方法においては、前記励起光波長の短波長側に発生した４００ｎｍ以上の蛍光を検出するのが好ましい。
【００１５】
また、本発明の蛍光観察方法においては、前記多光子励起により発生した複数種類の蛍光を分光選択的に検出するのが好ましい。
【００１６】
また、本発明の蛍光観察方法においては、前記多光子励起により発生した複数種類の蛍光を共焦点検出するのが好ましい。
【００１７】
また、本発明の蛍光観察方法においては、前記多光子励起の際に発生した１光子由来の蛍光と２光子由来の蛍光を同時に検出するのが好ましい。
【００１８】
また、本発明による蛍光観察装置は、所定波長の光を高密度で発する光源と、前記光源からの光を用いて７００ｎｍ以下の可視領域の第二高調波を発生させる第二高調波発生素子と、前記第二高調波発生素子から発生した光を用いて複数種類の蛍光分子を多光子励起し、該複数種類の蛍光分子から励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時観察可能に構成された顕微鏡とからなることを特徴としている。
【００１９】
また、本発明による蛍光観察装置は、所定波長の光を高密度で発する光源と前記光源からの光を用いて７００ｎｍ以下の可視領域の第二高調波を発生させる第二高調波発生素子とを一体的に備える励起光発生部と、前記励起光発生部から発生した光を用いて複数種類の蛍光分子を多光子励起し、該複数種類の蛍光分子から励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時観察可能に構成された顕微鏡とからなることを特徴としている。
【００２０】
また、本発明の蛍光観察装置においては、前記第二高調波発生素子が、前記光原の光路から挿脱可能に構成されているのが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、複数種類の励起波長を必要とせず簡単な光学構成で、複数種類の蛍光分子から発する複数種類の蛍光を同時観察でき、蛍光分子を蛍光標識として利用する観察対象に与えるダメージが少なく、しかも、蛍光観察に用いる光学部材として一般的なガラスを用いることの可能な蛍光観察方法及び蛍光観察装置が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の蛍光観察方法により可視領域の光を用いた多光子励起において、１種類の蛍光分子から発生する蛍光のスペクトルを概念的に示すグラフである。
【図２】従来の可視領域の光を用いた１光子励起、深紫外領域の光を用いた１光子励起、本発明の蛍光観察方法により可視領域の光を用いた多光子励起の夫々におけるエネルギー状態を示す説明図である。
【図３】種類の異なる蛍光分子を夫々別個に用いて２光子励起したときの励起光強度と得られた蛍光強度との関係を示す図で、(a)は蛍光分子として蛍光タンパクSiriusを用いた場合におけるグラフ、(b)は蛍光分子として蛍光タンパクmseCFPを用いた場合におけるグラフ、(c)は蛍光分子として蛍光タンパクmTFP1を用いた場合におけるグラフ、(d)は蛍光分子として蛍光タンパクEGFPを用いた場合におけるグラフである。
【図４】本発明の蛍光観察装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図で、(a)はその一例を示す図、(b)は(a)の一変形例を示す図、(c)は(a)の他の変形例を示す図である。
【図５】本発明の実施例１にかかる蛍光観察方法に用いる蛍光観察装置の全体構成を概略的に示す説明図である。
【図６】実施例１の蛍光観察装置を用いた蛍光観察方法における励起波長、各蛍光タンパクの蛍光波長、各検出器で検出する各蛍光の波長範囲の関係を示すグラフである。
【図７】実施例１の蛍光観察方法を用いて４種類の蛍光タンパクを発現させたHeLa細胞の蛍光像を示す写真で、(a)は蛍光タンパクSiriusからの蛍光画像の写真、(b)は蛍光タンパクmseCFPからの蛍光画像の写真、(c)は蛍光タンパクmTFP1からの蛍光画像の写真、(d)は蛍光タンパクEGFPからの蛍光画像の写真である。
【図８】実施例１の蛍光観察方法を用いて４種類の蛍光タンパクを発現させたHeLa細胞の蛍光画像を、夫々の検出器で検出された蛍光信号を、蛍光波長分離（アンミックス）手法などを用いて処理し、各検出器で主として検出された蛍光以外の蛍光成分のもれ込みを除去し、処理後の各蛍光画像を重ね合わせて示す画像で、(a)はＸＹ面での細胞の蛍光画像、(b)はＸＺ面での細胞の蛍光画像である。
【図９】蛍光色素ATTO488の蛍光強度と励起光強度との関係を示すグラフである。
【図１０】５２０ｎｍのパルス光に励起された、ATTO488で染色されたHeLa細胞中のシトクロムｃ（cytochrome c）の蛍光画像を示す写真である。
【図１１】従来の可視領域の光を用いた１光子励起、近赤外領域の光を用いた２光子励起、深紫外領域の光を用いた１光子励起により、蛍光分子から発生する蛍光のスペクトルを概念的に示すグラフである。
【図１２】複数種類の蛍光タンパクの吸収スペクトルを示すグラフである。
【図１３】図１２に示す蛍光タンパクの励起スペクトルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の実施形態の説明に先立ち、本発明の作用効果について説明する。
本発明の蛍光観察方法は、少なくとも２種類以上の蛍光分子から発せられる複数種類の蛍光を検出する方法であって、７００ｎｍ以下の可視領域の光を用い、夫々の蛍光分子の深紫外領域での吸収を利用し、夫々の該蛍光分子を多光子励起して蛍光を発生させ、励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時検出する。
【００２４】
本発明の蛍光観察方法を導出するに至った経緯を説明する。
図１１は従来の可視領域の光を用いた１光子励起、近赤外領域の光を用いた２光子励起、深紫外領域の光を用いた１光子励起により、蛍光分子から発生する蛍光のスペクトルを概念的に示すグラフである。図１２は複数種類の蛍光タンパクの吸収スペクトルを示すグラフである。図１３は図１２に示す蛍光タンパクの励起スペクトルを示すグラフである。  図１は本発明の蛍光観察方法により可視領域の光を用いた多光子励起において、１種類の蛍光分子から発生する蛍光のスペクトルを概念的に示すグラフである。図２は従来の可視領域の光を用いた１光子励起、深紫外領域の光を用いた１光子励起、本発明の蛍光観察方法により可視領域の光を用いた多光子励起の夫々におけるエネルギー状態を示す説明図である。図３は種類の異なる蛍光分子を夫々別個に用いて２光子励起したときの励起光強度と得られた蛍光強度との関係を示す図で、(a)は蛍光分子として蛍光タンパクSiriusを用いた場合におけるグラフ、(b)は蛍光分子として蛍光タンパクmseCFPを用いた場合におけるグラフ、(c)は蛍光分子として蛍光タンパクmTFP1を用いた場合におけるグラフ、(d)は蛍光分子として蛍光タンパクEGFPを用いた場合におけるグラフである。
【００２５】
図１１に示すように、可視領域の光を用いて蛍光分子を１光子励起すると、励起光波長に対して長波長側に蛍光が発生する。また、近赤外領域の光を用いて蛍光分子を２光子励起すると、励起光波長に対して短波長側に蛍光が発生する。また、深紫外領域の光を用いて蛍光分子を１光子励起すると励起光波長に対して長波長側に蛍光が発生する。
また、図１２に示すように、蛍光タンパクは、可視領域と深紫外領域に吸収波長帯域を持っている。蛍光タンパクの励起に利用される吸収波長帯域は、通常の可視領域の光を用いた１光子励起や近赤外領域の光を用いた２光子励起においては、可視領域が利用される。
また、図１２に示すように、多くの蛍光分子は、深紫外領域に共通の吸収波長帯域を持っている。
図１３に示す励起スペクトルは、各蛍光タンパクから発する蛍光強度を、励起波長を変えながら測定した結果をグラフ化したものである。この励起スペクトルから各励起波長での励起効率を比較することができる。図１３に示すグラフより、深紫外領域でも可視領域と同程度の励起効率が得られることがわかる。
【００２６】
ところで、蛍光は、蛍光分子が所定波長の励起光の光子を吸収することによって、電子が基底準位から励起準位へと遷移し、その後、熱振動緩和を経て、電子が基底準位に遷移する際に発生することが知られている。また、該蛍光の発生方法を、その励起プロセスの違いにより、「１光子吸収蛍光」と「２光子（マルチフォトン）吸収蛍光」に大別することができる。１光子吸収蛍光では、励起光の光子１つが蛍光分子に吸収されることにより、蛍光分子内の電子が励起準位へと遷移するのに対し、２光子吸収蛍光では、励起光の光子２つが同時に蛍光分子に吸収されることにより、蛍光分子内の電子が励起準位へと遷移する。また、１光子吸収蛍光では、蛍光分子の基底準位と励起準位のエネルギー差に略等しいエネルギー（波長）を持つ光を励起光として採用する必要があるのに対し、２光子吸収蛍光では、該エネルギー差以下のエネルギー（波長）を持つ光を励起光として採用できる。一般に、同一の蛍光分子を励起する場合、励起光の波長は、２光子吸収蛍光のほうが、１光子吸収蛍光に比べて長波長となる。また、２光子吸収のプロセスを経て発生した蛍光は、その強度が励起光強度の２乗に比例することが知られている（２乗特性）。
【００２７】
しかるに、本願発明者は、図１に示すように、蛍光分子の深紫外領域での吸収を利用し、多光子吸収プロセスにより蛍光を発生させることと、励起光として可視領域の光を採用することを着想した。蛍光タンパクは、深紫外領域に励起効率の良い吸収特性を有しており、励起光として、吸収波長よりも長い波長を持つ光、例えば、可視領域の５２５ｎｍの波長の光子を用いて２光子励起した場合、該蛍光タンパクの深紫外領域での吸収に基づく２光子吸収蛍光が効率的に発生する（図２）。また、上述したように、２光子吸収を経て発生する蛍光の強度は、励起光強度の２乗に比例する。
このため、２光子吸収蛍光を利用することで、可視領域の光を励起光として採用しつつ、深紫外領域の光で励起した際に発生する蛍光（１光子吸収蛍光）と同等の蛍光を得ることが可能となる。
【００２８】
可視領域の光を用いて蛍光分子を多光子励起することにより蛍光を発生させることができることを実証すべく、本願発明者は、複数種類の蛍光タンパクに対し可視波長の光を用いて２光子励起を試みた。
図３は種類の異なる蛍光分子を夫々別個に用いて２光子励起したときの励起光強度と得られた蛍光強度との関係を示す（各強度を対数プロットした）図で、(a)は蛍光分子として蛍光タンパクSiriusを用いた場合におけるグラフ、(b)は蛍光分子として蛍光タンパクmseCFPを用いた場合におけるグラフ、(c)は蛍光分子として蛍光タンパクmTFP1を用いた場合におけるグラフ、(d)は蛍光分子として蛍光タンパクEGFPを用いた場合におけるグラフである。なお、励起光波長は５２５ｎｍである。
図３の各グラフに示すように、いずれの蛍光タンパクを蛍光分子として用いた場合も、励起光強度の２乗に蛍光強度が比例している（対数プロットの近似直線の傾きがおおよそ２になっている）。このことは、検出された蛍光が２光子励起により生じたものであることを示している。
【００２９】
このような考察及び実証を経て、本願発明者は、少なくとも２種類以上の蛍光分子から発せられる複数種類の蛍光を検出する蛍光観察方法として、７００ｎｍ以下の可視領域の光を用い、夫々の蛍光分子の深紫外領域での吸収を利用し、夫々の該蛍光分子を多光子励起して蛍光を発生させ、励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時検出する方法を想到するに至った。
【００３０】
本発明の蛍光観察方法のように、７００ｎｍ以下の可視領域の光を励起光として用いて蛍光分子を多光子励起すれば、少なくとも２種類以上の蛍光分子からの蛍光を検出する際に、複数種類の励起波長を必要としなくて済む。その結果、波長の異なる複数種類の励起光を用いる場合に必要な励起光を合波するための光学系等が不要となり、光学系の構成を複雑化させずに済む。また、上述したように、波長の異なる複数種類の励起光を蛍光観察に用いた場合に、標本面に集光する励起光の焦点位置が色収差の影響により波長ごとに異なり空間的な一致が崩れる恐れがあるのに対し、本発明の蛍光観察方法では、励起光を複数種類用いないため、標本上での色収差を考慮する必要がない。さらに、波長の異なる複数種類の励起光を１蛍光分子ごとに切り替えて蛍光観察する必要がなく、複数種類の生体分子の動態を同時に観察するのに有利となる。
【００３１】
また、本発明の蛍光観察方法において、励起光として用いる７００ｎｍ以下の可視領域の光は、深紫外光に比べてフォトンエネルギーが小さい。また、多光子励起を利用しているため、焦点面以外では蛍光分子の深紫外領域での吸収が起きない。このため、本発明の蛍光観察方法によれば、蛍光分子が標識される標本へのフォトダメージを小さく抑えることができる。
【００３２】
また、本発明の蛍光観察方法によれば、励起光として可視領域の光を用いるので、光学系に用いる光学部材として一般に用いられているガラス等を利用することができる。
【００３３】
多光子吸収の発生確率は、光子密度の２乗に比例する（２乗特性）。しかるに、本発明の蛍光観察方法によれば、多光子励起を利用しているので、蛍光分子が励起される体積を励起光の焦点位置での体積よりも格段に小さくすることができる。１光子励起における励起光の波長に応じて決まる分解能に比べて、より高分解能に蛍光を検出することができる。その結果、本発明の蛍光観察方法によれば、可視領域の多光子励起により、近赤外の多光子励起において可視領域の１光子励起の分解能が得られるのと同様に、深紫外領域での１光子励起光相当の解像度を得ることができる。
【００３４】
さらに、本発明の蛍光観察方法によれば、可視域の光を励起光として用いるので、可視域の光を透過・反射する部材やコーティングのみを利用し光学系を構成することができる。その結果、光の透過率、反射率を上げることができ、光学系のパフォーマンスを向上させることができる。
【００３５】
なお、本発明の蛍光観察方法において、蛍光検出対象に用いる夫々の蛍光分子は、深紫外領域と可視領域に吸収波長帯域を持つ蛍光分子である。このため、吸収スペクトルが励起光と重なる特性を持つ蛍光分子を多光子励起した際には、多光子励起と１光子励起の夫々の蛍光成分が発生しうる。
【００３６】
また、本発明の蛍光観察方法においては、励起光に極短パルスレーザ光を用いるのが好ましい。このようにすれば、焦点において空間的・時間的にフォトン密度を上げることが可能となり、効率的に２光子励起を行うことができる。
また、極短パルスレーザ光のスペクトル形状を、バンドパスフィルタやエッジフィルタ等の波長選択手段を利用し整形しても良い。こうすることで、蛍光と励起光の分離が容易になり、また、蛍光発光をより効率よく検出することができる。例えば、スペクトル幅の広い極短パルスレーザ光のスペクトルを、エッジフィルタを組み合わせて切り出し、矩形化しても良い。こうすることで、蛍光発光の検出に使える波長帯域を広げることが可能となる。スペクトル形状の切り出しおよび矩形化により、極短パルスレーザの時間形状は広がり、２光子励起の効率が若干落ちるが、蛍光発光をより効率良く検出できるようになる。
【００３７】
また、本発明の蛍光観察方法においては、ショートパスフィルタを用いて励起光波長の短波長側に発生した蛍光のみを検出するのが好ましい。
吸収スペクトルが励起光と重なる特性をもつ蛍光分子を７００ｎｍ以下の可視領域の光を用いて多光子励起する場合、上述したように、２光子励起と１光子励起による蛍光成分が発生する。通常、１光子励起により生じる蛍光は、励起光波長よりも長波長側に発生することが知られている（ストークスシフト）。このため、本発明の蛍光観察方法で蛍光分子を多光子励起した場合、励起光の長波長側には１光子励起により生じる蛍光成分も含まれる。しかるに、ショートパスフィルタ等を用いて励起光よりも長波長側に発生する１光子励起蛍光の成分を除去し、励起光の短波長側のみの蛍光を分光選択的に検出するようにすれば、２光子励起により生じる蛍光を効率的に検出できる。
【００３８】
また、本発明の蛍光観察方法においては、励起光波長の短波長側に発生した４００ｎｍ以上の蛍光を検出するのが好ましい。
このようにすれば、ＤＮＡやタンパクを構成するアミノ酸などの生体自家蛍光物質からの自家蛍光と蛍光分子の蛍光を分離することができ、高コントラストな蛍光イメージングを行うことができる。
【００３９】
また、本発明の蛍光観察方法においては、多光子励起により発生した複数種類の蛍光を分光選択的に検出するのが好ましい。
分光選択的に検出するには、例えば、マルチチャンネルディテクタや、複数組の光電子増倍管とダイクロイックミラーとの組み合わせや、あるいは、マルチフォーカス機構とＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子との組み合わせを用いるとよい。
なお、本発明の蛍光観察方法においては、波長の異なる複数種類の蛍光が同時に発生する。そのため、複数種類の蛍光の波長帯域が互いに重なり合っている場合、検出器において特定の蛍光分子からの蛍光信号のみ検出する際に、該特定の蛍光分子以外の蛍光分子からの蛍光も該検出器で検出されてしまうことがある（蛍光クロストーク）。そうした場合は、該検出器で検出された蛍光信号を、蛍光波長分離（アンミックス）手法などを用いて処理し、該特定の蛍光分子以外の蛍光分子からの蛍光成分を除去することが好ましい。
【００４０】
また、本発明の蛍光観察方法においては、多光子励起により発生した複数種類の蛍光を共焦点検出するのが好ましい。
詳しくは、蛍光を検出するための検出器の前方にピンホールまたはスリット等を配置し、共焦点検出しても良い。
このようにすれば、検出面の外側において発生する１光子励起により生じる蛍光を除去することができる。
また、光学的なセクショニング効果（等高線の部分だけを切り取ったような画像を得る効果）も上がる。
【００４１】
また、本発明の蛍光観察方法においては、多光子励起の際に発生した１光子由来の蛍光と２光子由来の蛍光を同時に検出するようにしてもよい。このようにすれば、励起することによって同時に検出できる蛍光の種類を増やすことができる。
【００４２】
また、本発明による蛍光観察装置は、所定波長の光を高密度で発する光源と、前記光源からの光を用いて７００ｎｍ以下の可視領域の第二高調波を発生させる第二高調波発生素子と、前記第二高調波発生素子から発生した光を用いて複数種類の蛍光分子を励起し、該複数種類の蛍光分子から励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時観察可能に構成された顕微鏡とからなる。
【００４３】
図４は本発明の蛍光観察装置の一実施形態の概略構成を示すブロック図で、(a)はその一例を示す図、(b)は(a)の一変形例を示す図、(c)は(a)の他の変形例を示す図である。
図４(a)の例の蛍光観察装置は、光源部と第二高調波発生部と標本観察部からなる。
光源部は、例えば、モードロックレーザや波長可変レーザ、ＯＰＯ（Optical Parametric Oscillator：光パラメトリック発信器）等、所定波長のレーザパルス光を高密度で発する光源で構成されている。
第二高調波発生部は、ＬＢＯ（LiB3O5：リチウムトリボレート）結晶やＢＢＯ（Barium Borate）結晶などのＳＨＧ（Second harmonic generation）結晶を有し、光源部からの光を用いて７００ｎｍ以下の可視領域の第二高調波を発生させる素子で構成されている。
標本観察部は、例えば、レーザ走査型蛍光顕微鏡、多光子蛍光顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡等、第二高調波発生部から発生した光を用いて複数種類の蛍光分子を励起し、該複数種類の蛍光分子から励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時観察可能な顕微鏡で構成されている。
このように構成すれば、本発明の蛍光観察方法を用いた蛍光観察を行うことができる。
【００４４】
なお、本発明の蛍光観察装置は、図４(b)に示すように、前記光源部と前記第二高調波発生部を一体的に備える励起光発生部と前記励起光発生部から発生した光を用いて複数種類の蛍光分子を多光子励起し、該複数種類の蛍光分子から励起光波長の短波長側又は短波長側及び長波長側に発生した複数種類の蛍光を同時観察可能に構成された顕微鏡とからなる構成としてもよい。このようにすれば、光源部と第二高調波発生部とを外部で接続するための光学系が不要となり、構成を簡便化できる。
【００４５】
あるいは、本発明の蛍光観察装置においては、図４(c)に示すように、第二高調波発生部を光源部の光路から挿脱可能に構成してもよい。
このようにすれば、１台の顕微鏡で複数種類の観察手法を実現できる。例えば、多光子顕微鏡との組み合わせにおいて、高調波発生部を光路から外すことで、近赤外域の２光子励起による蛍光観察を行うことができ、高調波発生部を光路に挿入することで、第二高調波である可視域の２光子励起による蛍光観察を行うことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の実施例について、図面を用いて説明する。
実施例１
図５は本発明の実施例１にかかる蛍光観察方法に用いる蛍光観察装置の全体構成を概略的に示す説明図である。図６は実施例１の蛍光観察装置を用いた蛍光観察方法における励起波長、各蛍光タンパクの蛍光波長、各検出器で検出する各蛍光の波長範囲の関係を示すグラフである。
図５に示すように、本実施例の蛍光観察装置は、光源部１１と、第二高調波発生部１２と、標本観察部１３を備えている。
【００４７】
光源部１１は、モードロックレーザ、波長可変レーザ、ＯＰＯ等の極短パルスレーザで構成されている。
第二高調波発生部１２は、レンズ１２ａと、ＢＢＯ結晶などのＳＨＧ結晶１２ｂと、レンズ１２ｃを有している。ＳＨＧ結晶１２ｂは、光源部１１からのパルスレーザを用いて７００ｎｍ以下の可視領域の波長として５２５ｎｍの第二高調波を発生させる。
なお、本実施例の蛍光観察装置は、第二高調波発生部１２と標本観察部１３との間を接続する光学部材１４として、ミラー１４ａ、レンズ１４ｂ、１４ｃを有している。
標本観察部１３は、ダイクロイックミラー１３ａ１〜１３ａ４と、バンドパスフィルタ１３ｂ１〜１３ｂ５と、検出器１３ｃ１〜１３ｃ４と、２次元走査用ミラー１３ｄとレンズ１３ｅ１〜１３ｅ３と、対物レンズ１３ｆと３次元走査用ステージ１３ｇ等を備えた顕微鏡で構成されている。そして、複数の検出器１３ｃ１〜１３ｃ４とダイクロイックミラー１３ａ１〜１３ａ４を用いて複数種類の蛍光を分光選択的に検出することができるようになっている。なお、図中、１３ｈはピンホール、２０は蛍光分子が標識された生体分子等の標本である。
標本２０には、蛍光分子として４種類の蛍光タンパク（Sirius、mseCFP、mTFP1、EGFP）が標識されている。
【００４８】
ダイクロイックミラー１３ａ１は、第二高調波発生部１２から発生した５２５ｎｍの波長の光を透過させ、それ以外の波長の光を反射させる光学特性を有している。
バンドパスフィルタ１３ｂ１は、標本２０に標識された複数種類の蛍光分子から発生する複数種類の蛍光波長のうち励起光波長５２５ｎｍよりも長波長側の光を遮光し、それ以外の波長帯域の光を透過させる光学特性を有している。
ダイクロイックミラー１３ａ２は、４１０ｎｍ〜４４０ｎｍの波長帯域の光を反射させ、それ以外の波長帯域の光を透過させる光学特性を有している。
バンドパスフィルタ１３ｂ２は、４１０ｎｍ〜４４０ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する光学特性を有している。
ダイクロイックミラー１３ａ３は、４５５ｎｍ〜４７５ｎｍの波長帯域の光を反射し、それ以外の波長帯域の光を透過させる光学特性を有している。
バンドパスフィルタ１３ｂ３は、４５５ｎｍ〜４７５ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する光学特性を有している。
ダイクロイックミラー１３ａ４は、４７５ｎｍ〜４９０ｎｍの波長帯域の光を反射させ、それ以外の波長帯域の光を透過させる光学特性を有している。
バンドパスフィルタ１３ｂ４は、４７５ｎｍ〜４９０ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する光学特性を有している。
バンドパスフィルタ１３ｂ５は、４９０ｎｍ〜５００ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する光学特性を有している。
【００４９】
検出器１３ｃ１〜１３ｃ４は、光電子増倍管（PMT：Photomultiplier Tube）で構成されている。
なお、実施例１では、複数の検出器とダイクロイックミラー（さらには、バンドパスフィルタ）を用いて各蛍光タンパクから発せられる蛍光を分光選択的に検出する構成としたが、これらの構成をマルチチャンネルディテクタに置き換えて、分光スペクトルとして一括的にスペクトルを検出するように構成してもよい。
２次元走査用ミラー１３ｄは、２次元方向を走査するガルバノミラーで構成されている。
３次元走査用ステージ１３ｇは、標本２０を載置した状態で３次元方向に移動可能に構成されている。
【００５０】
このように構成された実施例１の蛍光観察装置を用いて、蛍光分子から発する蛍光を観察する手順について説明する。
光源部１１に備わる極短パルスレーザを介して所定波長のパルスレーザ光を高密度で発振させる。次いで、第二高調波発生部１２に備わるＳＨＧ結晶１２ｂが、光源部１１から発振された光を用いて第二高調波として５２５ｎｍの波長の光を発振する。
光源部１１、第二高調波発生部１２を介して高密度に発せられた５２５ｎｍの波長の光は、光学部材１４を経て標本観察部１３のダイクロイックミラー１３ａ１に入射する。
ダイクロイックミラー１３ａ１は、入射した５２５ｎｍの波長の光を透過させる。ダイクロイックミラー１３ａ１を透過した光は、２次元走査用ミラー１３で反射し、レンズ１３ｅ２、１３ｅ３、対物レンズ１３ｆを経て、標本２０における所定の焦点位置に集光する。標本２０における所定の焦点位置では、５２５ｎｍの波長の光が高密度に照射されることで、標本２０に標識されている夫々の蛍光分子が夫々所定の確率で多光子励起される。多光子吸収蛍光を利用することで、深紫外領域よりも長波長の光を励起光として採用し、夫々の蛍光分子が有する深紫外領域に吸収特性を利用した蛍光を発生させることができる。なお、夫々の蛍光分子は、吸収スペクトルが深紫外領域と可視領域に存在し、可視領域において励起光の波長と重なる特性を有する。このため、夫々の蛍光分子からは１光子励起により励起光波長よりも長波長側の蛍光も発する。従って、蛍光分子から発する蛍光は２光子励起による蛍光のほかに１光子励起による蛍光が混在している。
【００５１】
多光子励起により標本２０に標識されている夫々の蛍光分子から発した蛍光は、対物レンズ１３ｆ、レンズ１３ｅ３、１３ｅ２、２次元走査用ミラー１３ｄを経て、ダイクロイックミラー１３ａ１で反射する。
ダイクロイックミラー１３ａ１で反射した光は、バンドパスフィルタ１３ｂ１に入射する。バンドパスフィルタ１３ｂ１は、励起光波長５２５ｎｍよりも長波長側の光を遮光し、それ以外の波長帯域の光を透過させる。これにより、１光子励起による蛍光が除去される。
バンドパスフィルタ１３ｂ１を透過した光は、レンズ１３ｅ１、ピンホール１３ｈを経て、ダイクロイックミラー１３ａ２に入射する。ダイクロイックミラー１３ａ２は、４１０ｎｍ〜４４０ｎｍの波長帯域の光を反射させ、それ以外の波長帯域の光を透過させる。ダイクロイックミラー１３ａ２で反射した光は、バンドパスフィルタ１３ｂ２に入射する。バンドパスフィルタ１３ｂ２は、入射した光のうち、４１０ｎｍ〜４４０ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する。バンドパスフィルタ１３ｂ２を透過した４１０ｎｍ〜４４０ｎｍの波長帯域の光は、検出器１３ｃ１で検出される。これにより、蛍光タンパクSiriusからの深紫外領域での吸収を利用した多光子励起による蛍光が主として検出される。
【００５２】
ダイクロイックミラー１３ａ２を透過した光は、ダイクロイックミラー１３ａ３に入射する。ダイクロイックミラー１３ａ３は、入射した光のうち、４５５ｎｍ〜４７５ｎｍの波長帯域の光を反射させ、それ以外の波長帯域の光を透過させる。ダイクロイックミラー１３ａ３で反射した光は、バンドパスフィルタ１３ｂ３に入射する。バンドパスフィルタ１３ｂ３は、入射した光のうち、４５５ｎｍ〜４７５ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する。バンドパスフィルタ１３ｂ３を透過した４５５ｎｍ〜４７５ｎｍの波長帯域の光は、検出器１３ｃ２で検出される。これにより、蛍光タンパクCFPからの深紫外領域での吸収を利用した多光子励起による蛍光が主として検出される。
【００５３】
ダイクロイックミラー１３ａ３を透過した光は、ダイクロイックミラー１３ａ４に入射する。ダイクロイックミラー１３ａ４は、入射した光のうち、４７５ｎｍ〜４９０ｎｍの波長帯域の光を反射させ、それ以外の波長帯域の光を透過させる。ダイクロイックミラー１３ａ４で反射した光は、バンドパスフィルタ１３ｂ４に入射する。バンドパスフィルタ１３ｂ４は、入射した光のうち、４７５ｎｍ〜４９０ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する。バンドパスフィルタ１３ｂ４を透過した４７５ｎｍ〜４９０ｎｍの波長帯域の光は、検出器１３ｃ３で検出される。これにより、蛍光タンパクmTFP1からの深紫外領域での吸収を利用した多光子励起による蛍光が主として検出される。
【００５４】
ダイクロイックミラー１３ｂ４を透過した光は、バンドパスフィルタ１３ｂ５に入射する。バンドパスフィルタ１３ｂ５は、入射した光のうち、４９０ｎｍ〜５００ｎｍの波長帯域の光を透過させ、それ以外の波長帯域の光を遮光する。バンドパスフィルタ１３ｂ５を透過した４９０ｎｍ〜５００ｎｍの波長帯域の光は、検出器１３ｃ４で検出される。これにより、蛍光タンパクGFPからの深紫外領域での吸収を利用した多光子励起による蛍光が主として検出される。
なお、夫々の検出器で検出された蛍光は、図示しない公知の信号処理手段や画像化手段を介して、図示しない表示装置に蛍光画像として出力、表示される。
【００５５】
図７は実施例１の蛍光観察方法を用いて４種類の蛍光タンパクを発現させたHeLa細胞の蛍光像を示す写真で、(a)〜(d)の蛍光画像は、検出器１３ｃ１〜１３ｃ４で検出された蛍光信号をそれぞれ画像化したものである。４種の蛍光タンパクは、それぞれ次の細胞小器官に発現させている。イメージングに用いた励起光の波長は５２５ｎｍである。なお、図中、スケールバーは５μｍである。
Sirius：ミトコンドリア（mitochondria）
mseCFP：ヒストンH2B（histoneH2B）
mTFP1：ゴルジ装置（Golgi apparatus）
EGFP：フィブリラリン（fibrillarin）
【００５６】
図８は実施例１の蛍光観察方法を用いて４種類の蛍光タンパクを発現させたHeLa細胞の蛍光画像を、蛍光波長分離（アンミックス）手法を用いて、検出器１３ｃ１〜１３ｃ４で検出された蛍光信号を処理し、重ね合わせて示す写真で、(a)はＸＹ面での細胞の蛍光画像、(b)はＸＺ面での細胞の蛍光画像である。
なお、図中、スケールバーは５μｍである。
【００５７】
なお、実施例１では蛍光分子として蛍光タンパクを用いたが、蛍光タンパク以外の蛍光分子（例えば、化学的な合成物質からなる蛍光色素）も本発明の蛍光観察方法を適用可能である。
【００５８】
図９は蛍光色素ATTO488の蛍光強度と励起光強度との関係を示すグラフである。蛍光は、波長が５６０ｎｍでパルス幅が２００フェムト秒のパルスレーザ光により励起される。図１０は５２０ｎｍのパルス光に励起された、ATTO488で染色されたＨｅＬａ細胞中のシトクロムｃ（cytochrome c）の蛍光画像を示す写真である。図１０中、スケールバーは５μｍである。
図９に示すように、ATTO488に対して波長５６０ｎｍ、パルス幅２００フェムト秒のパルスレーザ光を照射したときに、励起強度の２乗に蛍光強度が比例している。このことから、検出されたATTO488から発する蛍光も２光子励起を経たものであり、本発明の蛍光観察方法による可視波長領域での２光子励起は、蛍光タンパク以外の化学的合成物質にも適用可能であることが明らかである。
その他、蛍光色素Mitotracker Greenについても同様に、本発明が適用可能であることはすでに確認している。
【００５９】
なお、高調波発生部１２には、極短パルス光の群速度に負分散を発生させることにより極短パルス光のパルス幅を調整するプリチャーパを挿入しても良い（図示省略）。そのようにすれば、標本面上でのパルス幅を制御することができ、標本面上で略フーリエ限界パルスにすることができる。これにより、２光子励起効率が上がり、発生する蛍光強度が大きくなる。
また、実施例１では、光路中にピンホール１３ｈを挿入したが、ピンホールを挿入しない構成であっても勿論よい。
【００６０】
また、実施例１では、レンズ１３ｅ１およびピンホール１３ｈをダイクロイックミラー１３ａ２、１３ａ３、１３ａ４およびバンドパスフィルタ１３ｂ５の前方に配置したが、レンズ１３ｅ１およびピンホール１３ｈの組を、それぞれダイクロイックミラー１３ａ２、１３ａ３、１３ａ４およびバンドパスフィルタ１３ｂ５の後方に配置してもよい。そうすることで、各検出器１３ｃ１〜１３ｃ４に入射する蛍光の波長に応じてピンホール１３ｈの位置および径を最適化することができ、蛍光を効率よく検出することができるようになる。
【００６１】
また、１光子励起と２光子励起による蛍光が同時に存在する場合において、励起光の強度を、音響光学素子等（図示略）を用いて単一の周波数で変調しておき、検出器１３ｃ１〜１３ｃ４で検知される蛍光の強度を、ロックインアンプ等（図示略）を用いて該変調周波数の２倍の周波数で復調することで、１光子励起による蛍光成分と２光子励起による蛍光成分とを分離し、２光子励起による蛍光成分のみを抽出しても良い。こうすることで、フィルタによる蛍光の分離が困難な場合の分離能を向上させることが可能となる。
【００６２】
また、例えば、励起光波長の波長幅を７〜１０ｎｍになるように、エッジフィルタ等を利用（図示略）し整形してもよい。そうすることで、蛍光と励起光の分離が容易になり、また、蛍光発光をより効率よく検出することができる。ただし、この波長幅は、この値に制限されるものではなく、使用する蛍光タンパクや励起波長等に応じて最適になるよう変化させてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の蛍光観察方法及び蛍光観察装置は、複数種類の蛍光分子から発する蛍光を同時観察することが求められるあらゆる分野に有用である。
【符号の説明】
【００６４】
１０          蛍光観察装置
１１          光源部
１２          第二高調波発生部
１２ａ、１２ｃ、１３ｅ１、１３ｅ２、１３ｅ３          レンズ
１２ｂ        ＳＨＧ結晶
１３          標本観察部（顕微鏡）
１３ａ１、１３ａ２、１３ａ３、１３ａ４                ダイクロイックミラー
１３ｂ１、１３ｂ２、１３ｂ３、１３ｂ４、１３ｂ５      バンドパスフィルタ
１３ｃ１、１３ｃ２、１３ｃ３、１３ｃ４                検出器（ＰＭＴ）
１３ｄ        ２次元走査用ミラー（ガルバノミラー）
１３ｆ        対物レンズ
１３ｇ        ３次元走査用ステージ
２０          標本
【図１】
2013200209.tif 000003
【図２】
2013200209.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2013200209.tif 000008
【図９】
2013200209.tif 000009
【図１２】
2013200209.tif 000010
【図１３】
2013200209.tif 000011
【図７】
2013200209.tif 000012
【図８】
2013200209.tif 000013
【図１０】
2013200209.tif 000014
【図１１】
2013200209.tif 000015