(57)【要約】      （修正有）【課題】抗老化剤並びにそれを配合した皮膚化粧料及び美容飲食品の提供。【解決手段】蜂の子を配合した抗老化剤及びその製法。さらに、ミツバチの採取する花粉を配合した抗老化剤及びその製法。蜂の子は、１０ｎｍから５０μｍの粒子径からなる粉末が好ましい。蜂の子粉末と虫媒花粉との粒度をあわせて混合することが好ましい。コラーゲン産生促進作用、エラスターゼ阻害作用及び紫外線ＵＶ−Ｂダメージからの回復作用を有し、皮膚の構成を正常化させ、抗老化作用をもたらすことができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蜂の子を配合することを特長とする抗老化剤及びその製法
【請求項２】
請求項１からなる粉末にミツバチの採取する花粉を配合することを特長とする抗老化剤及びその製法
【請求項３】
蜂の子粉末１０ｎｍから５０μｍの粒子径からなることを特長とする抗老化剤及びその製法
【請求項４】
皮膚線維芽細胞増殖促進作用、エラスターゼ活性阻害作用、ヒアルロン酸産生促進作用、Ｉ型コラーゲン産生促進作用、及びＵＶ−Ｂダメージからの回復作用の少なくともいずれかを有することを特長とする請求項１、２、３に記載の抗老化剤及びその製法
【請求項５】
めまい、耳鳴り、難聴に対する回復作用の少なくてもいずれかを有することを特長とする請求項１、２、３、に記載の抗老化剤及びその製法
【請求項６】
自律神経失調、認知症、更年障害からの回復作用の少なくともいずれかを有することを特長とする請求項１、２、３に記載の抗老化剤及びその製法
【請求項７】
育毛効果、養毛効果の少なくともいずれかを有することを特長とする請求項１、２、３に記載の抗老化剤及びその製法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、蜂の子を含有する抗老化作用並びに抗老化を利用した美容食品に関する。
【背景技術】
【０００２】  「蜂の子」は蜂のサナギのことで、中国では漢方の生薬として用いられ、中国最古の薬学「神農本草経」では上薬と呼ばれる副作用のない不老長寿の最高の薬に分類されている。【０００３】  また明の時代の薬学書「本草網目」には、「頭痛蟲毒を除き、虚るい・傷中を補す。人体を光沢にし、顔色を好くして老衰せず」と記され広範に使用されてきた。本邦では滋養強壮目的で習慣的に食される地域もある一方、耳鳴り、メニエール病などに特効薬が見当たらないことから、蜂の子由来の微小循環改善作用に基づく耳鳴り、メニエール病改善に繁用されている。【０００４】  蜂の子の栄養価は高く、ローヤルゼリーをも凌ぐと言われている。それ故に中国では、３千年以上もの古来から珍重されてきた。最も栄養価が高いと言われる生後２１目の雄蜂の子を使用し必須アミノ酸は全種類含まれ、５７．７％ものアミノ酸が含まれている。【０００５】  しかしながら、昆虫なので、新鮮さを保持し、外観から、そのまま摂取することは困難を伴った。そのため、乾燥粉砕した粉末、タンパク分解酵素、糖分解酵素などを用い、液化し、その後、乾燥粉末にして食品にする方法が一般的であった。【０００６】  耳鳴り、難聴、めまい、肩こりなどに脳循環・代謝改善薬として血管を拡張することで、血流量を増やし、内耳の働き（代謝）を活性化させるもの、末梢神経に栄養を与えるビタミン、血流促進や循環改善目的に使われるビタミンなどがあるが、著効を期待できるものはほとんどないのが現状であった。【０００７】  また、蜂の子関連で疲労回復、脂質代謝、生活習慣病予防に関するもので、臨床効果を検討したものはない（特許文献１〜４）。▲辻▼（非特許文献１）は蜂の子に、免疫を上げる作用があるとし、また、鶴崎ら（非特許文献２）は蜂の子に抗酸化作用があり、それが、耳鳴り、めまい、難聴、メニエール病などに対して民間伝承薬として汎用されている根拠としている。【０００８】  しかしながら美肌関連で作用メカニズム、臨床報告まで論じたものはなく、また美肌メカニズムと育毛関連と考えられている。（非特許文献３，４）毛包の成長を促進し、毛周期における休止期から成長期への移行と成長期の延長に関して重要な働きをしていることについて類推できる（特許文献５，６）（非特許文献５，６）が、本特許のように臨床効果までは報告されていない。
【発明の概要】
【０００９】  蜂の子使用者の皮膚症状にしわ、しみなど老化症状が出にくい人が多いことから、蜂の子並びに蜂の子抽出物について、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロンサン産生促進作用、エラスターゼ阻害作用及び紫外線ＵＶ−Ｂダメージを培養細胞で検討した結果、蜂の子が皮膚に対し優れた抗老化作用を有し、美肌メカニズムに深く関与していることが実施例２〜５の結果から明らかになった。
【０００１０】  本発明者らは、前記課題を検討したところ、蜂の子はそのままでも効果は得られるものの、あまり強くない、本発明で考察した方法、即ち微粉末にして吸収性をよくしたり、蜂の子抽出物を作成したり、または蜂の子粉末などに虫媒花粉を配合してやることによって、今までに報告のない実施例、臨床例に記載のような美肌効果、育毛効果が発現したので本特許を完成するに至った。
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  以上に述べた従来の天然物の蜂の子から皮膚の構成を正常化させ、抗老化作用をもたらすことがコラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロンサン産生促進作用、エラスターゼ阻害作用及び紫外線ＵＶ−Ｂダメージからの回復作用を有する抗老化剤並びにそれを配合した皮膚化粧料及び美容食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  そして、本発明は上記目的を達成する手段は、蜂の子使用者の皮膚症状にしわ、しみなどの老化症状が出にくい人が多いことから、蜂の子並びに蜂の子抽出物について、コラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロンサン産生促進作用、エラスターゼ阻害作用及び紫外線ＵＶ−Ｂダメージを培養細胞で検討した結果、蜂の子が皮膚に対し優れた抗老化作用を有し、美肌メカニズムに深く関与していることが実施例２〜５の結果から明らかになった。【００１３】  本発明者らは、前記課題を検討したところ、蜂の子はそのままでも効果は得られるものの、あまり強くない、本発明で考察した方法、即ち微粉末にして吸収性をよくしたり、蜂の子抽出物を作成したり、または蜂の子粉末などに虫媒花粉を配合してやることによって、今までに報告のない実施例、臨床例に記載のような美肌効果、育毛効果が発現したので本特許を完成するに至った。【００１４】  さらに本発明は前記した目的課題を達成する手段として、人間の皮膚の真皮及び表皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあってはエラチン、コラーゲン、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックスによって皮膚構造は構成されている【００１５】  若い皮膚は、これらの皮膚組織のホメオタシス（恒常性）を保つことにより、バリヤ性が十分なために水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張り、きめや艶があってみずみずしい状態に維持される。【００１６】  ところが、紫外線、乾燥、過剰の皮膚洗浄など、外的因子によりエイジングが進行すると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンは生産量が減少すると共に架橋による弾性低下もコラーゲンのエスラスチンも分解・変質を起こす。【００１７】  外的因子の影響や加齢に伴う線維芽細胞の増殖率低下もコラーゲンの産生量の減少、天然保湿因子であるヒアルロン酸の産生量の低下を引き起こす。【００１８】  その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めることから、肌は張りや艶を失い、肌荒れ、シワ、くすみ等の老化症状を呈する。皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等の真皮マトリックス成分の減少・変性と、線維芽細胞の増殖率の低下とが関与している。【００１９】  近年、上記変化を誘導する因子として、特にマトリックス系プロテアーゼの関与が指摘されている。マトリックス系プロテアーゼの中でも、コラゲナーゼ、即ちＭＭＰ−１（マトリックスメタロプロテアーゼ）は、皮膚の真皮マトリックスの主な構成成分であるタイプＩ，ＩＩＩコラーゲンを分解する酵素として知られているが、その発現は紫外線の照射により大きく増加し、紫外線によるコラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワ形成等の大きな要因となることが考えられている。【００２０】  そこで、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進作用、エラステーゼ阻害作用、線維芽細胞増殖作用、ＭＭＰ−１、ＵＶＢに対する効果などについて、培養細胞での評価ならびに臨床効果と蜂の子超微細粉末化したものと虫媒花粉を配合してなることを特長とする天然物の蜂の子が皮膚の構成を正常化される。【００２１】  いわゆる、抗老化���用をもたらすことが臨床効果及び培養細胞での結果、即ち、コラーゲン産生促進、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用を明らかに認めたことから、それを有効成分として含有する抗老化剤並びにそれを配合した皮膚化粧料及び美容用飲食品を提供することにある。【００２２】  蜂の子の超微粉末、抽出物を含むことを特長とする摂食組成物を提供すること及び、交感神経、副交感神経線維を修復させることによって神経伝達機能を正常化させ、自律神経失調症、認知症、更年期障害などにも効果が期待でき、気になる耳なり、メニエール病、肩こりを改善させ、さらに、二次効果として、美肌をもたらす。【００２３】  しかも美肌効果から、毛髪の地肌環境が整えられ育毛効果が発揮される臨床効果が得られた蜂の子飲食品を提供することができる。【００２４】  通常、天然物を粉末する場合、粒度分布は１００ミクロンを中心にする物がほとんどで、生産性の問題から、さらに微粉砕することは付加価値が上昇しない限り行わない。【００２５】  今回、蜂の子はそのままででも効果を得られていたが、即効的ではなかった。そこで、生産性の問題で、コストが通常の１０倍以上必要な、ナノサイズまでの粉砕、及び、有効成分を抽出し、粉末にしたものを用いて、実施例、臨床例のように評価したところ、明らかに有効性が上昇し、実感できるものとなったため本発明を成立させることができた。【００２６】  臨床用に蜂の子超微粉末２００ｍｇ花粉８０ｍｇシュガーエステル１０ｍｇをゼラチン製１号ハードカプセルに充填し、臨床試験に使用した。ここでいう蜂の子は超微粉砕機１ｎｍ〜５０μｍの粒度分布を有する。【００２７】  望ましくは１０ｎｍ〜１μｍの粒度分布のものに一番臨床効果が高いことが確認され、有効性を確実にするため、民間伝承薬としても使用され続けている漢方薬。ビタミン、ミネラルなどを配合しても差し支えない。【００２８】  蜂の子から有効成分を抽出するには溶媒として、水を用い、蜂の子の重量の３〜２０倍量（望ましくは５〜１０倍量）を加え、３０〜９０℃で数時間撹拌抽出することにより得られる。【００２９】  抽出液は、成長ろ過し、凍結乾燥、もしくはスプレードライヤーで粉末にすることが望ましい。溶媒として、エタノールを使用することはなんら制限されるものではない。エタノール以外の有機溶媒を使用することは何ら差し支えないが残留した場合、摂食組成物としては食品衛生上使用不可能であるため、注意が必要である。【００３０】  また、［臨床試験３］は、薄毛、抜け毛といった毛髪の退化症状を呈する３０才代〜５０才の男性からなる被験者３０名を用い、１日２回朝と就寝前に、３ヶ月間使用させた。試験の開始前と使用から３ヶ月後にビデオマイクロスコープを用いて頭髪量と太さを観察し、「有効」、「やや有効」、「無効」の３段階にて評価し、その効果を「表７」に示した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】  以下、本発明の実施形態を
【実施例１】細胞調整、
【実施例２】細胞増殖試験、
【実施例３】Ｉ型コラーゲン産生促進作用試験、
【実施例４】ヒアルロン酸産生促進作用試験、
【実施例５】エラスターゼ活性阻害作用試験、
臨床例に基づいて説明する。【００３２】  本発明の蜂の子は、そのまま摂食しても効果は得られるものの、即効的なものではない。大きな問題は蜂の子自体昆虫であり、そのまま摂食することは一般的には困難が伴う。【００３３】  本発明で考案した方法は、微粉末にして吸収性をよくしたり、水、または有機溶媒で抽出して抽出物を粉末化した顆粒、カプセル、錠剤、アメなどに虫媒花粉を配合してやることができる。【００３４】  蜂の子抽出物は、一般的な方法で調整することができる。例えば抽出溶媒としては特に限定されないが、例えば、水：メチルアルコール、エチルアルコール等の低級一価アルコール；グルセリン、プロビレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン等のケトン類；エチルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；等の一種又は二種以上を用いることができる。水と低級一価アルコールとの混合液を用いるのが好ましい。また、抽出前に、乾燥、細切、圧搾又は発酵等の前処理を行う事もできる。【００３５】  蜂の子は、乾燥、細切したのち、通常の機械粉砕機、ビンミルなどを使用しても良いが、ナノサイズまでにするには、通常の粉砕機では長時間必要になり、粉砕中に物が過熱で渇変化し、味、匂いまでも劣化してしまうのが通例であった。【００３６】  そこで、過熱劣化しないように超微粉化させるには通常、石臼、ジェットミルを用いるが、動態摩擦の粉砕機を用いるのが費用対効果の点でも最適である。【００３７】  このようにして得られた粉末と虫媒花粉を粒度をあわせて混合することが重要である。粒度を併せることは均一性を保障するのみなく、害虫の異物除去にも有意義である。花粉も栄養ゆたかな食品であるため、微粒子化することが特に花粉の品質を保証してくれることになる。【００３８】  即ち、超微粒子にしてやると言うことは、消化酵素による消化をうけなくても消化管で速やかに吸収され、有効活用させることを意味しているため、有意性が高い。【００３９】  このようにして得られた花粉微粒子、蜂の子微粒子を適宜混合し顆粒、錠剤、カプセル剤に加工することができる。もちろん、両者のみを押し出し均一混合し顆粒製造にして顆粒、錠剤、カプセル剤に加工することができる。【００４０】  顆粒、錠剤、カプセル剤の中に入れるものは前記、微粒子でなくても、前術、水、または各種有機溶媒抽出物であってもよく、特に、ハードカプセルの形態の場合は服用しやすく、添加物を極力少なく製品化でき、１カプセル中に必要量を凝集できることからメリットがあるため、有用である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】  安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、皮膚外用剤及び飲食品に広く使用可能な抗老化剤は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。【００４２】  しかるに、生活習慣病の前段階とでもいうべき、耳鳴り、難聴、めまい、肩こりなどの自覚症状の緩解に蜂の子もしくは蜂の子抽出物が関与し、しかも、他覚症状の皮膚の諸問題をも正常化させ、抗老化作用をもたらすことがコラーゲン産生促進作用、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用及び紫外線ＵＶ−Ｂダメージからの回復作用をメカニズムに考えられ、臨床効果も確認されたため、ストレス社会を生き抜く上でも現代社会人に最も要望される抗老化剤並びにそれを配合したいわゆる不定愁訴改善効果を有する美容飲食品を提供できる可能性がある。
【発明の効果】
【００４３】  本発明の抗老化用食品補助剤は、細胞増殖能に優れ、細胞を賦活化させることにより肌の衰えによる老化を有効に抑えることが出来る。
【００４４】  本発明の抗老化剤は、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用に優れており、老化を防ぐ抗老化剤として、また細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤として用いることが出来る。また、豊富に含まれるアミノ酸及び、何らかの循環促進剤の効果と類推される、育毛効果も期待できる。
【実施例】
【実施例１】  細胞の調整
正常ヒト線維芽細胞ＨＨＤＦ（ＡＤ）：ＫＵＲＡＢＯのＮＨＤＦ（ＡＤ）細胞は培養液を使用してインキュベーター（３７℃´５％ＣＯ２）で培養。ＦＣＳは５６℃´３０分にて不活性化したものを使用した。付着細胞をはがす際、培養液を除いた後０．２５％トリプシンＥＤＴＡを２ｍｌ加え、洗浄後、インキュベーダー（３７℃´５％ＣＯ２）で４分処理。トリプシン処理後０．２５％ＦＣＳ培養液を８ｍｌ加え撹拌し、１０００ｒ．Ｐ．Ｍ．／分４℃遠心分離を行い細胞を検出した。ＮＨＤＦ（ＡＤ）細胞の保存はセルバンカーを用い約５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、冷凍保存し、随時、以下の試験に用いた。
【実施例２】  細胞増殖試験
Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を用い、細胞数を吸光度（４０５ｎｍ）を用いて測定した。好感度水溶性彫る間算を生成する新規テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８を発色基質として採用する。
ヒト正常皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（ＡＤ）を５％ＦＣＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を４．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度に上記培地で希釈した後、９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌ当たり２００μＬずつ播種し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％ＦＣＳ含有ダルベッコＭＥＭにて細胞をリンスし、その後、５％ＦＣＳ培養液で蜂の子各濃度に調整した培地に交換した。蜂の子検体の調整は必要濃度になるように５％ＦＣＳ培養液（水性媒体）で調整した。培地交換後、インキュベーター（８７℃５％ＣＯ２）内で７２時間培養した。培養後、細胞数をカウントした。Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液を各ｗｅｌｌに１０μｌずつ添加して、インキュベーター（３７℃５％ＣＯ２）内で３時間呈色反応後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。結果は表１に示した。
【表１】
2013249300.tif 000002
【実施例３】  Ｉ型コラーゲン産生促進作用試験
蜂の子を被験試料とし、下記の試験方法によりＩ型コラーゲン生促進作用を試験した。ヒト正常線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）を１０％ＦＣＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に上記培養で希釈した後、２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌに１ｍｌずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被試験料（蜂の子水溶液）を各ｗｅｌｌに１５０μＬ添加し、３日間培養した。培養後、各ｗｅｌｌの培地中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
Ｉ型コラーゲン生成促進作用の計算方法は以下のとおりである。結果を表２に示した。
Ｉ型コラーゲン生成促進作用
促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時のＩ型コラーゲン量  Ｂ：被験試料無添加時のＩ型コラーゲン量
各ｗｅｌｌの培地中のＩ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
Ｉ型コラーゲン産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
Ｉ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時のＩ型コラーゲン量  Ｂ：被験試料無添加時のＩ型コラーゲン量
【表２】
2013249300.tif 000003
【実験例４】
ヒアルロン酸産生促進作用試験
ヒト真皮線維芽細胞を２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅを用い、コンフルエントまで培養し、培養液を各濃度の蜂の子抽出物を被験試料として交換し、７２時間処理後、培養液を回収した。回収した培養液はＨｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（生化学工業）を用いて培養液中のヒアルロン酸量を測定し産生促進効果を比較評価し、結果を表３に示した。
【表３】
2013249300.tif 000004
【実施例５】  エラスターゼ活性阻害作用試験
前記各濃度蜂の子抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりエラスターゼ活性阻害作用を試験した。９６ｗｅｌｌプレートにて、０．２ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８．０）で調整した被験試験資料５０μＬ及び２０μｇ／ｍＬエラスターゼ・タイプＩＩＩ溶液５０μＬを混合した。その後、上記緩衝液にて調整した０．４５１４ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−ＳＵＣＣＩＮＹＬ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ｐ−ＮＩＴＲＯＡＮＩＬＩＤＥ  １００μＬを添加して２５−ＳＵＣＣＩＮＹＬ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ｐ−ＮＩＴＲＯＡＮＩＬＩＤＥ  １００μＬを添加して、２５℃にて１５分反応させた。反応終了後、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の方法で空試験を行い補正した。表４に示した。
エラスターゼ活性阻害作用の計算方法は以下のとおりである。
エラスターゼ活性阻害率（％）＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
Ａ：被験者試料無添加、酵素添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験者試料無添加、酵素無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｃ：被験者試料添加、酵素添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｄ：被験者試料添加、酵素無添加での波長４１５ｎｍにおける吸光度
【表４】
2013249300.tif 000005
【実施例６】  ＵＶ−Ｂダメージからの回復作用試験
蜂の子微粉末、抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりＵＶ−Ｂダメージからの回復作用を試験した。ヒト正常皮膚線維芽細胞（ＮＢＩＲＧＢ）を１０％ＦＳＢ含有α−ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。
回収した細胞をα−ＭＥＭを用いて２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈し後、４８ｗｅｌｌブレードに１ｗｅｌｌあたり２００μＬずつ播種した。２４時間培養後、培地１００μＬのＰＢＳ（−）へ交換し、１．０Ｊ／ｃｍ２のＵＶ−Ｂを照射した。
照射後、直ちに、ＰＢＳ（−）を抜き、１０％ＦＳＢ有含Ｄ−ＭＥＭに溶解した披験試料を各ｗｅｌｌに４００μＬ添加し、２４時間培養した。
紫外線ＵＶ−Ｂダメージから回復効果は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで溶解したＭＴＴを各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノ−ル２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｍｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。また、同様に細胞播種した後、ＵＶ−Ｂを照射しない細胞、及び細胞播種後ＵＶ−Ｂを照射し被験試料を添加しない細胞についても同様に測定し、それぞれの非照射群と照射群とした。
ＵＶ−Ｂダメージ回復作用の計算方法は以下の通りである。結果を表５に示した。
ＵＶ−Ｂダメージ回復率（％）＝｛（Ｎｔ−Ｃ）−（Ｎｔ−Ｓａ｝／（Ｎｔ−Ｃ）×１００
Ｎｔ：ＵＶ−Ｂを照射しないで細胞での吸光度
Ｃ：ＵＶ−Ｂを照射し被験試料を添加しない細胞での吸光度
Ｓａ：ＵＶ−Ｂを照射し被験試料を添加した細胞での吸光度
【表５】
2013249300.tif 000006
【臨床試験１：自覚症状】
蜂の子含有カプセルを以下のように調整した。
蜂の子７０％花粉２５％シュガーエステル５％を１号ゼラチン製のハードカプセルに充填したものを臨床試験用とし、毎食前１粒／回／日を６ヵ月間水で服用し、服用前、服用後１ヵ月後、３ヵ月後について以下の臨床評価項目を統計処理した。被験者は３２歳から６５歳の６カ月以上の耳鳴り自覚症状を主訴とする者３０名及び４１歳から６９歳の６ヵ月以上の難聴を主訴とする者１５名及び２８歳から５９歳のめまいを主訴とする者３０名にインフォームドコンセントを実施し、被験者に本臨床試験の目的、方法など周知させた。
評価項目と判定基準
自覚症状（耳鳴り、難聴、めまい、その他の項目）の改善について、
有効（かなりよくなったと感じた者）、
やや有効（やや良くなったと感じた者）、
無効（不変もしくは悪くなったと感じた者）、
の３段階で投与１ヵ月後、３ヵ月後の自覚症状の変化を評価した。
表６に結果を示した。
【表６】
2013249300.tif 000007
【臨床試験２】
他覚症状の皮膚症状については臨床試験１で用いた蜂の子配合美容食品１ヵ月後、３ヵ月後及び６ヵ月後の他覚症状の変化を評価した。即ち、目じりのしわ、肌のはり、たるみの状態を統計的画像処理し、弾性力についてはキュートメーターＭＰＡ５８０を用い分析データーを統計評価した。表７に結果を示した。
他覚症状の評価項目と判定基準
目じりのところのしわについて、以下の判定基準で判定した
有    効：  かなり目立たなくなった。
やや有効：  以前より目立たなくなった。
不    変：  変化無し。
悪    化：  目立つようになった。
頬の弾性力については以下の判定基準で評価した。
有    効：  ５％以上の弾力性上昇。
やや有効：  ０〜５％弾性力が上昇。
不    変：  変化無し、または弾性力減少
【表７】
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【臨床試験３】
育毛剤として使用試験
薄毛、抜け毛といった毛髪の退化症状を呈する３０才代〜５０才代の男性からなる被験者３０名を用い、臨床１で用いた蜂の子含有食品を毎食後１粒／回／日、３ヵ月間使用させた。使用試験の開始前と使用から３ヵ月後にビデオマイクロスコープを用いて頭髪の毛髪量と太さを観察し、「有効」、「やや有効」、「不変」、の３段階にて評価し、その効果を表８に示した。
判定基準      有    効：  かなり目立たなくなった。
やや有効：  以前より目立たなくなった。
無    効：  なんら、変わらなかった。
【表８】
2013249300.tif 000009