(57)【要約】      （修正有）【課題】植物ホルモンであるオーキシンの新規合成阻害剤を提供する。【解決手段】植物のオーキシン生合成経路におけるフラビンモノオキシゲナーゼであるＹＵＣＣＡの活性を阻害する、下式Ｉで示されるメチマゾール様の５員環構造を有するＹＵＣＣＡ特異的なＩＡＡ合成阻害剤。2013184930.tif 000017［式中、Ｘは炭素原子又は窒素原子を表し、Ｙは炭素原子を表し、ＸとＹの間の結合は単結合又は二重結合であり、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が単結合の場合はＲ１は水素原子を表し、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在しない。］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物成長制御剤であって、植物のオーキシン合成経路におけるフラビンモノオキシゲナーゼであるＹＵＣＣＡの活性を阻害することによりオーキシンの合成を調節する、前記植物成長制御剤。
【請求項２】
ＹＵＣＣＡの活性を阻害するための阻害剤であって、当該阻害剤は式Ｉ：
【化１】
2013184930.tif 000013
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在しない］
の構造部分を有する化合物を含む、前記阻害剤。
【請求項３】
化合物が、式ＩＩ：
【化２】
2013184930.tif 000014
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在せず；
Ｒ２は、置換されているもしくは置換されていない３〜８員シクロアルキル、置換されているもしくは置換されていない３〜８員ヘテロシクロアルキル、置換されているもしくは置換されていないアリール、又は、置換されているもしくは置換されていないヘテロアリールであり；そして
Ｒ３は、水素であるか、又は、Ｘが窒素でありそしてＸとＹの間の結合が二重結合である場合はＲ３は存在せず；
あるいは、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合するＸ及びＹと一緒になって、式ＩＩに示される５員環と共に、置換されている又は置換されていない縮合環を形成する、ここでＲ２、Ｒ３、Ｘ及びＹが形成する環構造は３〜８員シクロアルキル、３〜８員ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリールからなる群より選択される］
で表される、請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
化合物が、式ＩＩＩ：
【化３】
2013184930.tif 000015
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在せず；
Ｒ３は、水素であるか、又は、Ｘが窒素でありそしてＸとＹの間の結合が二重結合である場合はＲ３は存在せず；そして
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される］
で表される、請求項３に記載の阻害剤。
【請求項５】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、及びＲ８は水素であり、かつＲ６は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；又は
Ｒ４、Ｒ６、及びＲ８は水素であり、かつＲ５及びＲ７はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される、請求項４に記載の阻害剤。
【請求項６】
化合物が、式ＩＶ：
【化４】
2013184930.tif 000016
［式中、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される］
で表される、請求項３に記載の阻害剤。
【請求項７】
Ｒ９、Ｒ１１、及びＲ１２が水素であり、かつＲ１０が水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；又は
Ｒ９、及びＲ１１が水素であり、かつＲ１０及びＲ１２がそれぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここでＲａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される、請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
請求項２ないし７のいずれか１項に記載の阻害剤を含む、請求項１に記載の植物成長制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ホルモン・オーキシンの新規合成阻害剤とその利用に関する。具体的には、植物のオーキシン合成経路におけるフラビンモノオキシゲナーゼであるＹＵＣＣＡの活性を阻害するための、新規合成阻害剤とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物ホルモンに関連する農薬類は、数多く、歴史的にも古くから農業、園芸など様々な分野で用いられてきている。例えば、ジベレリンは種なしブドウ、エチレンは果物の成熟、オーキシンは除草剤や発根剤が、よく知られている。一方、それらのホルモンの植物体内での合成を阻害する合成阻害剤も、ジベレリンではウニコナゾール、エチレンではアミノオキシ酢酸などが、商品として世界的に使われている。
【０００３】
植物ホルモンであるオーキシンは、植物ホルモンの中で最も早く見つけられたもので、植物の発生から生育、花芽・種子形成にいたる、植物の生活環すべてにおいて重要な働きをするホルモンである。インド−ル−３−酢酸（ＩＡＡ）は主要な天然オーキシンである。合成オーキシンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）などが知られている。オーキシンの作用阻害剤としては、２，３，５−トリヨード安息香酸（ＴＩＢＡ）などが知られている。これらの合成オーキシンやオーキシンの作用阻害剤は、除草剤、発根剤、枯れ葉剤、果実落下促進剤など、広く農業・園芸分野で使用されている。しかしながら、上述のようなオーキシン関連の農薬、生理活性剤として用いられているのは、オーキシンの類似化合物及び輸送阻害物質がほとんどである。
【０００４】
一方、オーキシンそのものの合成を阻害する物質・化合物の厳密な特定に特定に成功した例はごくわずかである。これまでに特定されたオーキシン（インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）等）の生合成阻害剤としては、国際公開第ＷＯ２００８／１５００３１号パンフレットに記載の化合物が挙げられる。しかし、現在までに特定されたオーキシン生合成阻害剤は、必ずしもオーキシン生合成の鍵反応を阻害するものではない。また、オーキシン生合成の鍵反応を触媒する酵素に対する特異性も論じられていないか低いものである。このため、これらの公知の阻害剤のオーキシン合成阻害効果は比較的低い。
【０００５】
最近、理化学研究所の研究グループが、シロイヌナズナにおける主要なオーキシン生合成経路を解明した（Mashiguchi, K., et al., PNAS, Vol.108, No.45, p.18512-18517, 2011）。
彼らは、シロイヌナズナのトリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ、シロイヌナズナのＴＡＴを特にＴＡＡと称する）がトリプトファンをインドール−３−ピルビン酸（ＩＰｙＡ）に変換する反応を触媒し、その後ＹＵＣＣＡ（フラビンモノオキシゲナーゼ様タンパク質）がＩＰｙＡをＩＡＡに変換する反応を触媒する経路を解明した（図１）。彼らはまた、ＩＰｙＡを反応中間体としてトリプトファンからＩＡＡを生合成する経路がシロイヌナズナにおけるＩＡＡ生合成の主要経路であること、またＹＵＣＣＡが関与する反応はこの経路における律速段階であることを示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００８／１５００３１号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mashiguchi, K., et al., PNAS, Vol.108, No.45, p.18512-18517, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、植物ホルモン・オーキシンの新規合成阻害剤とその利用を提供することにある。具体的には、植物のオーキシン生合成経路における律速段階の反応に関与するＹＵＣＣＡの活性を阻害するための、新規合成阻害剤とその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。具体的には、本発明者らはトウモロコシ幼葉鞘のインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）合成に着目し、幼葉鞘先端のＩＡＡ生産量の抑制効果及び幼葉鞘の重力屈曲の抑制効果の両方を測定することで、約１００００種の化合物で構成されるケミカルライブラリーから、ＩＡＡ合成阻害剤を特定するスクリーニングを行った。本発明者らはさらに、スクリーニングで得られた化合物について、シロイヌナズナのＹＵＣＣＡ過剰発現株の表現型を、野生型の表現型に回復させる効果を検討し、ＩＡＡ合成阻害剤であってＹＵＣＣＡ特異的に作用するものを同定することに成功した。また、このようにして同定されたＹＵＣＣＡ特異的なＩＡＡ合成阻害剤が、メチマゾール様の５員環構造（−Ｎ−Ｃ（ＳＨ）＝Ｎ−を含む５員環構造）という共通する化学構造を有することを見いだし、本発明を完成させた。
【００１０】
以上、本発明の理解のために本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。
本発明は以下を提供する。
【００１１】
（１）  植物成長制御剤であって、植物のオーキシン合成経路におけるフラビンモノオキシゲナーゼであるＹＵＣＣＡの活性を阻害することによりオーキシンの合成を調節する、前記植物成長制御剤。
【００１２】
（２）  ＹＵＣＣＡの活性を阻害するための阻害剤であって、当該阻害剤は式Ｉ：
【００１３】
【化１】
2013184930.tif 000002
【００１４】
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在しない］
の構造部分を有する化合物を含む、前記阻害剤。
【００１５】
（３）  化合物が、式ＩＩ：
【００１６】
【化２】
2013184930.tif 000003
【００１７】
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在せず；
Ｒ２は、置換されているもしくは置換されていない３〜８員シクロアルキル、置換されているもしくは置換されていない３〜８員ヘテロシクロアルキル、置換されているもしくは置換されていないアリール、又は、置換されているもしくは置換されていないヘテロアリールであり；そして
Ｒ３は、水素であるか、又は、Ｘが窒素でありそしてＸとＹの間の結合が二重結合である場合はＲ３は存在せず；
あるいは、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合するＸ及びＹと一緒になって、式ＩＩに示される５員環と共に、置換されている又は置換されていない縮合環を形成する、ここでＲ２、Ｒ３、Ｘ及びＹが形成する環構造は３〜８員シクロアルキル、３〜８員ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリールからなる群より選択される］
で表される、（２）に記載の阻害剤。
（４）  化合物が、式ＩＩＩ：
【００１８】
【化３】
2013184930.tif 000004
【００１９】
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在せず；
Ｒ３は、水素であるか、又は、Ｘが窒素でありそしてＸとＹの間の結合が二重結合である場合はＲ３は存在せず；そして
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される］
で表される、（３）に記載の阻害剤。
【００２０】
（５）  化合物が、式ＩＶ：
【００２１】
【化４】
2013184930.tif 000005
【００２２】
［式中、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される］
で表される、（３）に記載の阻害剤。
【００２３】
（６）上記式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの化合物を含む、（１）に記載の植物成長制御剤。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、植物ホルモン・オーキシンの新規合成阻害剤とその利用を提供する。具体的には、植物のオーキシン生合成経路における律速段階の反応に関与するＹＵＣＣＡの活性を阻害するための、新規合成阻害剤とその利用を提供する。本発明のオーキシン生合成阻害剤は、オーキシン生合成の鍵反応を触媒する酵素の阻害剤であり、低濃度で強い阻害効果を示すとともに、植物への毒性も低いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、天然オーキシンであるインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）について推定されている生合成経路を示す図である。“ＴＡＴ”はトリプトファンアミノトランスフェラーゼを、“ＹＵＣＣＡ”はフラビンモノオキシゲナーゼ様タンパク質であるＹＵＣＣＡを意味する。
【図２】図２は、トウモロコシ幼葉鞘の重力屈曲の評価を利用した、オーキシン合成阻害剤スクリーニング方法（方法１）の模式図である。
【図３】図３は、トウモロコシ幼葉鞘先端部分のＩＡＡ量を測定することによる、オーキシン合成阻害剤のスクリーニング方法（方法２）の模式図である。
【図４】図４は、スクリーニング方法１及び２で同定されたオーキシン合成阻害剤の候補化合物及び公知の阻害剤の構造式を示す図である。（Ａ）スクリーニング方法１及び２で得られたＩＡＡ生合成阻害剤の候補化合物の構造式；（Ｂ）公知の阻害剤の構造式；（Ｃ）メチマゾールの構造式。
【図５】図５は、メチマゾール又はＭＢＩ様の５員環構造を有する候補化合物の、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−１株）及びＹＵＣＣＡを過剰発現するシロイヌナズナ（３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株）の表現型に対して及ぼす影響を検討した結果を示す写真である。
【図６】図６は、メチマゾール又はＭＢＩ様の５員環構造を有しない候補化合物の、野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−１株）及びＹＵＣＣＡを過剰発現するシロイヌナズナ（３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株）の表現型に対して及ぼす影響を検討した結果を示す写真である。
【図７】図７は、化合物１１０−Ｃ６（５−（４−クロロフェニル）−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール）の、シロイヌナズナ野生型株（Ｃｏｌ−１株）及びＹＵＣＣＡ過剰発現株（３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株）の根の長さに対して及ぼす影響を検討した結果を示す写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【図８】図８は、化合物１１０−Ｃ６（５−（４−クロロフェニル）−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール）の、シロイヌナズナ野生型株（Ｃｏｌ−１株）及びオーキシン生合成欠損変異体（ｓａｖ３−２変異体）の根の長さに対して及ぼす影響を検討した結果を示す写真（Ａ）及びグラフ（Ｂ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
定義
本明細書において「ＹＵＣＣＡ」とは、フラビンモノオキシゲナーゼ様のタンパク質である。ＹＵＣＣＡは、植物のオーキシン合成経路において、インドール−３−ピルビン酸（ＩＰｙＡ）をインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）に変換する反応を触媒する酵素として作用する。
【００２７】
本明細書において、「ＹＵＣＣＡの活性の阻害剤」、「ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤」、「ＹＵＣＣＡの活性を阻害するための阻害剤」の用語は互換的に使用される。これらの用語は、オーキシンの生合成に関わる酵素が触媒する反応の中でも、ＹＵＣＣＡが触媒する反応をより強力に阻害する阻害剤を意味する。すなわち、これらの用語が意図する阻害剤は、ＹＵＣＣＡが触媒する反応を特異的に阻害するものである。
【００２８】
本明細書において「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群より選択される原子またはそのラジカルを意味する。
本明細書において「アルキル」とは、一般式−ＣｎＨ２ｎ＋１（ｎは整数）で示される、直鎖状または分岐状の飽和炭化水素鎖を意味する。Ｃ１〜Ｃ８アルキルは、炭素数が１〜８のアルキルを意味する。例えば、直鎖状Ｃ１〜Ｃ８アルキルには、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルまたはオクチルが含まれ、分岐状Ｃ１〜Ｃ８アルキルには、イソプロピル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００２９】
本明細書において「アルケニル」とは、一般式−ＣｎＨ２ｎ−１（ｎは整数）で示される、直鎖状または分岐状の炭化水素鎖であって炭素−炭素二重結合を１つ有する官能基を意味する。Ｃ２〜Ｃ８アルケニルは、炭素数が２〜８のアルケニルを意味する。Ｃ２〜Ｃ８アルケニルの例には、エテニル、プロペニル、ブテニル、２−メチルプロペニルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
本明細書において「アルキニル」とは、一般式−ＣｎＨ２ｎ−３（ｎは整数）で示される、直鎖状または分岐状の炭化水素鎖であって炭素−炭素三重結合を１つ有する官能基を意味する。Ｃ２〜Ｃ８アルキニルは、炭素数が２〜８のアルキニルを意味する。Ｃ２〜Ｃ８アルキニルの例には、エチニル、プロピニル、プロピルギル（プロパ−２−イン−１−イル）、ブチニル、などが含まれるがこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書において「ハロアルキル」とは、少なくとも１つのハロゲンで水素原子が置換されたアルキルを意味する。好ましいハロアルキルの例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、「ハロアルケニル」とは少なくとも１つのハロゲンで水素原子が置換されたアルケニルを意味し、「ハロアルキニル」とは少なくとも１つのハロゲンで水素原子が置換されたアルキニル意味する。
【００３２】
本明細書において「シクロアルキル」とは、一般式−ＣｎＨ２ｎ−１（ｎは整数）で示される、飽和炭化水素環を意味する。３〜８員シクロアルキルは、３〜８個の炭素で構成される環状の炭化水素を意味する。３〜８員シクロアルキルの例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書において「ヘテロシクロアルキル」とは、シクロアルキルの環を構成する炭素原子の少なくとも１つが、他の元素に置換されている構造を有する官能基を意味する。すなわち、ヘテロシクロアルキルは環を構成する元素として、少なくとも１つの炭素以外の元素、例えば、非限定的に酸素、硫黄、および／または窒素、を含む。３〜８員ヘテロシクロアルキルにおいて、環を構成する元素は３〜８個である。
【００３４】
本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の芳香環から水素原子１個を除いた残りの原子団で構成される官能基を意味する。アリールの例には、フェニル、ナフチルアントリル、フェナントリルが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書において「ヘテロアリール」とは、複素環式基であって芳香族性を有する官能記を意味する。すなわち、ヘテロアリールは環を構成する元素として、少なくとも１つの炭素以外の元素、例えば、非限定的に酸素、硫黄、および／または窒素、を含み、かつ芳香族性を有する官能基である。ヘテロアリールの例には、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラニル、チオピラニル、ピリジニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、トリアジニル、インドリニル、キノリニルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書において「縮合環」とは、２個またはそれ以上の環が２個またはそれ以上の原子を共有して結合している環式構造を意味する。
本明細書において、「置換されている」とは、置換される対象となる官能基の水素原子が、任意の置換基で置換されることを意味する。好ましい置換基の例には、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、および−ＮＨ−Ｒａ、（ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される）からなる群より選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書において、「メチマゾール様の５員環構造」又は「ＭＢＩ（２−メルカプトベンゾイミダゾール）様の５員環構造」とは、メチマゾール又はＭＢＩ（構造式は図４（Ｂ）及び（Ｃ）を参照）に含まれる、−Ｎ−Ｃ（ＳＨ）＝Ｎ−を含む５員環構造を意味する。すなわち、「メチマゾール様の５員環構造」又は「ＭＢＩ（２−メルカプトベンゾイミダゾール）様の５員環構造」は、式Ｉ：
【００３８】
【化５】
2013184930.tif 000006
【００３９】
［式中の各原子及び置換基は、以下に定義されるとおりである］の構造である。ここで、当該５員環構造には互変異性体が存在する。よっては、「メチマゾール様の５員環構造」又は「ＭＢＩ（２−メルカプトベンゾイミダゾール）様の５員環構造」は、互変異性体の構造である、−Ｎ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−を含む５員環構造として、あるいは以下の式Ｉ’：
【００４０】
【化６】
2013184930.tif 000007
【００４１】
［式中の各原子及び置換基の定義は、式Ｉにおける対応する各原子及び置換基の定義と同様である］
の構造としても標記できる。式Ｉの５員環構造に対応する式ＩＩ、式ＩＩＩ及び式ＩＶ中の５員環構造についても同様に、式Ｉ’のように互変異性体の形式で記載することができる。
【００４２】
その他の用語については、当業者が通常理解する意味において用いられる。
ＹＵＣＣＡの活性の阻害剤
ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤は、メチマゾール様の５員環構造（−Ｎ−Ｃ（ＳＨ）＝Ｎ−を含む５員環構造）を有する化合物を含む。
【００４３】
一態様において、ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤は、式Ｉ：
【００４４】
【化７】
2013184930.tif 000008
【００４５】
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在しない］
の構造部分を有する化合物を含む。
【００４６】
別の態様において、ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤は、式ＩＩ：
【００４７】
【化８】
2013184930.tif 000009
【００４８】
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在せず；
Ｒ２は、置換されているもしくは置換されていない３〜８員シクロアルキル、置換されているもしくは置換されていない３〜８員ヘテロシクロアルキル、置換されているもしくは置換されていないアリール、又は、置換されているもしくは置換されていないヘテロアリールであり；そして
Ｒ３は、水素であるか、又は、Ｘが窒素でありそしてＸとＹの間の結合が二重結合である場合はＲ３は存在せず；
あるいは、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合するＸ及びＹと一緒になって、式ＩＩに示される５員環と共に、置換されている又は置換されていない縮合環を形成する、ここでＲ２、Ｒ３、Ｘ及びＹが形成する環構造は３〜８員シクロアルキル、３〜８員ヘテロシクロアルキル、アリール、及びヘテロアリールからなる群より選択される］
で表される化合物を含む。
【００４９】
さらに別の態様において、ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤は、式ＩＩＩ：
【００５０】
【化９】
2013184930.tif 000010
【００５１】
［式中、
Ｘは、炭素又は窒素であり；
Ｙは、炭素であり；
ＸとＹの間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は、単結合又は二重結合であり；
ただし、ＸとＹの間の結合、及び、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合の双方が同時に二重結合であることはなく；
Ｒ１は、水素であるか、又は、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合が二重結合である場合はＲ１は存在せず；
Ｒ３は、水素であるか、又は、Ｘが窒素でありそしてＸとＹの間の結合が二重結合である場合はＲ３は存在せず；そして
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される］
で表される化合物を含む。
【００５２】
好ましい態様において、上記式ＩＩＩの化合物におけるＲ４、Ｒ５、Ｒ７、及びＲ８は水素であり、かつＲ６は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択され；好ましくはＲ６は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、及び−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、からなる群より選択され；さらに好ましくはＲ６は水素、ハロゲン、及びハロゲン化メチルからなる群より選択される。この態様において好ましくは、Ｘ、Ｙ、Ｒ１及びＲ３は以下の様式であってもよい：Ｘは窒素であり、ＸとＹの間の結合は二重結合であり、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は単結合であり、Ｒ１は水素であり、Ｒ３は存在しない。
【００５３】
別の好ましい態様において、上記式ＩＩＩの化合物におけるＲ４、Ｒ６、及びＲ８は水素であり、かつＲ５及びＲ７はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択され；好ましくはＲ５及びＲ７はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、及び−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、からなる群より選択され；さらに好ましくはＲ５及びＲ７はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、及びハロゲン化メチルからなる群より選択される。この態様において、好ましくはＸ、Ｙ、Ｒ１及びＲ３は以下の様式であってもよい：Ｘは窒素であり、ＸとＹの間の結合は単結合であり、ＹとＲ１が結合する窒素原子の間の結合は二重結合であり、Ｒ１は存在せず、Ｒ３は水素である。
【００５４】
さらに好ましい態様において、上記式ＩＩＩの化合物は、
化合物１１０−Ｃ６（５−（４−クロロフェニル）−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール）
化合物６３−Ｂ５（５−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール）
であってよい。
【００５５】
別の態様において、ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤は、式ＩＶ：
【００５６】
【化１０】
2013184930.tif 000011
【００５７】
［式中、
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；
ここで、Ｒａは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、及びＣ２〜Ｃ８ハロアルキニル、からなる群より選択される］
で表される化合物を含む。
【００５８】
好ましい態様において、上記式ＩＶの化合物におけるＲ９、Ｒ１１、及びＲ１２は水素であり、そしてＲ１０は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択され；好ましくはＲ１０は水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、及び−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、からなる群より選択され；さらに好ましくはＲ１０は水素、ハロゲン、及びハロゲン化メチルからなる群より選択される。
【００５９】
別の好ましい態様において、上記式ＩＶの化合物におけるＲ９及びＲ１１は水素であり、そしてＲ１０及びＲ１２はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８ハロアルキニル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ、及びＮＨ−Ｒａ、からなる群より選択される；好ましくはＲ１０及びＲ１２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、及び−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、からなる群より選択され；さらに好ましくはＲ１０及びＲ１２はそれぞれ独立して水素、ハロゲン、及びハロゲン化メチルからなる群より選択される。
【００６０】
さらに好ましい態様において、上記式ＩＶの化合物は、
化合物７９−Ｈ８（５−（トリフルオロメチル）ベンゾイミダゾール−２−チオール）
であってよい。
【００６１】
ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤化合物の合成方法
上記式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶで表される化合物は、当業者に公知の合成方法を用いて製造することができる。当該化合物の一部は市販品より入手することも可能である。
【００６２】
上記の化合物は、例えば、１，２，４−トリアゾール−３−チオール、５−フェニル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール、５−フェニル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール、２−メルカプトベンゾイミダゾール、などを出発原料として用い、公知の合成方法により各種の官能基を導入することにより調製してもよい。
【００６３】
なお、化合物１１０Ｃ−６、６３−Ｂ５、７９−Ｈ８（図４を参照）は、Maybridge社化合物コレクションであるHitFinder10000と称する製品中に含まれる化合物であり、市販品より入手することもできる。
【００６４】
植物成長制御剤
本発明のＹＵＣＣＡの活性の阻害剤は、適切な担体とともに製剤化して植物成長制御剤とすることができる。本発明の植物成長制御剤は、生合成されるオーキシンの量の調節に用いることができるため、植物の成長を制御するために用いることができる。例えば、根の伸長の阻害、芽生えの成長抑制などの作用を通して、植物成長抑制剤や除草剤として使用することができる。一方、オーキシンを過剰に生産する植物株に対しては、そのオーキシン量を減少させることにより、成長を促すこともできる。
【００６５】
本発明の植物成長制御剤に含まれる担体には、クレー、タルク、珪藻土、ゼオライト、ベントナイトなどの固体担体；エタノールなどのアルコール類、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール類、及びパラフィン系炭化水素などの炭化水素溶剤、などの液体製剤；が含まれてよい。
【００６６】
本発明の植物成長制御剤には、農薬等の製剤上使用される補助剤、例えば点着剤、乳化剤、着色剤等を含めてもよい。
本発明の植物成長制御剤は、固体製剤、液体製剤、乳懸濁製剤、噴霧・蒸散用製剤、マイクロカプセル、として製剤化することができる。固体製剤としては、粉末剤、粒剤、顆粒剤、錠剤、水和剤、顆粒水和剤が含まれるがこれらに限定されない。液体製剤としては、液剤、油剤などが含まれる。乳懸濁製剤には、乳剤、マイクロエマルション、サスポエマルション、フロアブル製剤、ゾル剤、などが含まれるがこれらに限定されない。噴霧・蒸散用製剤には、エアロゾル剤、くん蒸剤などが含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
ＩＡＡ生合成阻害剤のスクリーニング方法
スクリーニング方法１
トウモロコシ幼葉鞘先端部位は高いＩＡＡ合成活性を有しており、また、幼葉鞘先端で合成されたＩＡＡは幼葉鞘先端が重力に逆らう方向に屈曲して生長する屈曲反応を引き起こすために必要である。この現象を利用し、トウモロコシ幼葉鞘先端に試験化合物を処理して、重力屈曲を観察することにより、試験化合物のＩＡＡ生合成阻害活性を評価することができる。
【００６８】
スクリーニング方法１は、以下：
（１）植物の幼葉鞘セグメントの先端約２ｍｍの部分に試験化合物を注入し；
（２）試験化合物を注入した幼葉鞘セグメントを水平に傾け、暗室中で静置し；
（３）所定の時間（例えば、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間）後に、重力屈曲の度合いを観察し；そして
（４）屈曲反応を阻害した試験化合物をＩＡＡ合成阻害剤として同定する；
工程を含む。
【００６９】
植物は単子葉植物、好ましくはトウモロコシである。
スクリーニング方法１の概略は図２に示す。
スクリーニング方法２
ＩＡＡ合成阻害剤は、幼葉鞘におけるＩＡＡ合成量を直接測定することによってもスクリーニングすることができる。
【００７０】
スクリーニング方法２は、以下：
（１）植物の幼葉鞘先端の切片を、試験化合物を含むまたは含まない緩衝液とともに所定の時間（例えば、４５分間、６０分間、７５分間、９０分間、１２０分間、１５０分間、１８０分間、２１０分間）インキュベートし；
（２）緩衝液中へ溶出されたＩＡＡをＨＰＬＣで分析し；
（３）幼葉鞘先端に残されたＩＡＡを抽出して、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析計）で分析し；
（４）試験化合物を含む緩衝液とともにインキュベートされた幼葉鞘について工程（２）及び（３）の両方で測定されたＩＡＡ量が、試験化合物を含まない緩衝液とともにインキュベートされた幼葉鞘について測定された量よりも減少していた場合、当該試験化合物をＩＡＡ合成阻害剤として同定する；
工程を含む。
【００７１】
植物は単子葉植物、好ましくはトウモロコシである。
スクリーニング方法２の概略は図３に示す。
ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤化合物の同定方法
ＹＵＣＣＡ過剰発現株の表現型と、野生型の植物の表現型を比較することにより、ＩＡＡ生合成阻害剤が、ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤であるか否かを同定することができる。シロイヌナズナにおいてＹＵＣＣＡを過剰発現する株は、野生型と比較してその芽生えにおいて（ｉ）胚軸が長い、（ｉｉ）根が短い、（ｉｉｉ）葉がカールする、というＩＡＡ過剰生産株に特徴的な表現型を示す。よって、試験化合物をＹＵＣＣＡ過剰発現株に作用させたときに、上記（ｉ）ないし（ｉｉｉ）の少なくとも１つの表現型を野生型のものに回復させた場合には、当該試験化合物はＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤として同定される。
【００７２】
すなわち、ＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤化合物の同定方法は、以下：
（１）試験化合物を含む培地中で、ＹＵＣＣＡ過剰発現株のシロイヌナズナ種子を発芽させ；
（２）所定の期間（例えば３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間）培養した後、芽生えの表現型を観察し；
（３）（ｉ）胚軸が長い、（ｉｉ）根が短い、（ｉｉｉ）葉がカールする、のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは３つ、の表現型が野生型の表現型に回復した場合、当該試験化合物をＹＵＣＣＡ特異的な阻害剤として同定する；
工程を含む。
【００７３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００７４】
実施例１：ＩＡＡ合成阻害剤のスクリーニング
トウモロコシ幼葉鞘は、古くから天然のオーキシンであるインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）の合成や輸送の研究に用いられている。本発明者らはこれまでに、トウモロコシ幼葉鞘先端部位が高いＩＡＡ合成活性を有することを示してきた。また、近年の本発明者らの研究により、幼葉鞘先端に１−ナフチルフタラミン酸（ＮＰＡ）などのＩＡＡ輸送阻害剤を処理すると、幼葉鞘先端が重力に逆らう方向に屈曲して生長する屈曲反応を完全に阻害することから、幼葉鞘先端で合成されたＩＡＡは幼葉鞘の屈曲反応を引き起こすために必要であることがわかっている（Nishimura, T., et al., Plant Cell Physiol. Vol.50, No.11, p.l1874-1885, 2009（参照により本明細書にその全体を援用する））。さらに、幼葉鞘先端に特異的に発現している遺伝子をマイクロアレイ法により解析したところＡｔＹＵＣＣＡ−ｌｉｋｅ遺伝子が３種、幼葉鞘先端特異的に発現していることを見いだした。また、理化学研究所の研究グループにより、ＹＵＣＣＡは、インドール−３−ピルビン酸（ＩＰｙＡ）からＩＡＡを生成する反応を触媒することにより、オーキシン合成経路に関わっていることが見いだされた（Mashiguchi, K., et al., PNAS, Vol.108, No.45, p.18512-18517, 2011（参照により本明細書にその全体を援用する））。
【００７５】
そこで、ＹＵＣＣＡの阻害剤を同定するために、トウモロコシ幼葉鞘先端に試験化合物を処理し、重力屈曲及び合成量を観察することで、ＩＡＡ合成阻害剤のスクリーニングを行った。試験化合物としては、Maybridge社のHitFinder 10000として市販されている化合物コレクションを用いた。
【００７６】
方法１：重力屈曲によるスクリーニング
２ｃｍのトウモロコシ幼葉鞘セグメントの先端約２ｍｍの部分をHitFinder 10000の各試験化合物で処理した。幼葉鞘先端の処理は、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）、ｐＨ６．７）中、２００μＭの試験化合物を、幼葉鞘先端に注入することにより行った。試験化合物溶液を注入した後、幼葉鞘セグメントを水平に傾けて暗室中で３時間静置した後、重力屈曲を観察した（図２）。屈曲反応を阻害した化合物を候補化合物として選択した。それぞれの試験化合物について、２つの幼葉鞘セグメントを用いることで、２つ組で試験を行った。
【００７７】
同じスクリーニングを行うことにより、屈曲反応の阻害について再現性を確認した。さらに、試験化合物の濃度を０μＭ、１００μＭ、及び５００μＭで試験するスクリーニングを行うことで化合物の用量依存性を確認した。
【００７８】
方法２：ＩＡＡ合成量によるスクリーニング
９６ウェル・マイクロプレートの各ウェルに、HitFinder 10000の各試験化合物を１００μＭの濃度で含む緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）１００μｌ及びトウモロコシ幼葉鞘の先端２ｍｍ切片を入れた。暗所、２５℃で１２０分間インキュベートした後、緩衝液中へ溶出されたＩＡＡをＨＰＬＣ−蛍光検出器で測定した。ＩＡＡ量を減少させた試験化合物を候補化合物として選択した（図３）。
【００７９】
さらに、ＮＰＡのようなＩＡＡ輸送阻害剤は、幼葉鞘先端からのＩＡＡ輸送を阻害すると共に、先端にＩＡＡを蓄積させる。よって、緩衝液中に溶出されるＩＡＡ量が減少している場合、ＩＡＡ合成阻害によって減少しているのか、ＩＡＡ輸送阻害によって減少しているのか、区別ができない。ＩＡＡ合成阻害剤をＩＡＡ輸送阻害剤と区別するために、緩衝液中へのＩＡＡ溶出の減少を生じた候補化合物について、幼葉鞘先端のＩＡＡ量についても測定を行った。具体的には、インキュベート後の幼葉鞘先端をプレートから取り出し、液体窒素で凍結させた。液体窒素で凍結させたサンプルをエッペンドルフチューブにとり、ガラスビーズ(φ１．０ｍｍを７〜１０ｍｇ、φ０．５ｍｍを１５〜２０ｍｇ) 、ブチルヒドロシキトルエン（ＢＨＴ、０．１％（ｗ／ｖ））入りの８０％（ｖ／ｖ）  メタノールを１２０μｌ加え、同時に内部標準として１３Ｃ６−ＩＡＡを一定量加えた。これを２〜３℃に冷却させたマイクロスマッシュ（ＭＳ−１００Ｒ（ＴＯＭＹ））で破砕（６０秒間、４０００ｒｐｍ）した。この粗抽出液を遠心（４℃、１５分間、１５０００ｒｐｍ）した後、上清をシリンジにとり、フィルター（MILLIPORE ; Non-Sterile 4 mm Millex-HV）ろ過してＨＰＬＣ用サンプルとした。蛍光検出器を接続したＨＰＬＣ装置で、上記サンプルを分析した。蛍光検出器による励起光２８０ｎｍ、検出３５５ｎｍの吸収を示す、標準ＩＡＡと同じリテンションタイム（Ｒ．Ｔ．）のピークに相当する分画をバイアルに集め、窒素ガスを吹き付けて濃縮、乾燥させた。ここに３〜５ｍｌのＮ−メチル−Ｎ−トリメチルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を加え十分に撹拌し、６０℃、１５分間の熱処理でＩＡＡをトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）しＧＣ−ＭＳ用のサンプルとした（Mori, Y., Nishimura, T. and Koshiba, T. (2005) Vigorous synthesis of indole-3-acetic acid in the apical very tip leads to a constant basipetal flow of the hormone in maize coleoptiles. Plant Sci. 168: 467-473.（参照により本明細書にその全体を援用する）。ＧＣ−ＭＳでサンプル中に含まれるＩＡＡを定量した。
【００８０】
上記の２種類の測定により、緩衝液中へ溶出されたＩＡＡ量を減少させた候補化合物であって幼葉鞘先端にＩＡＡを蓄積させた化合物を輸送阻害剤、緩衝液中へ溶出されたＩＡＡ量を減少させた候補化合物であって幼葉鞘先端におけるＩＡＡを減少させた化合物を合成阻害剤とした。
【００８１】
評価
上記の方法１及び方法２のスクリーニングにより選択した候補化合物について、以下の３つの評価系によりＩＡＡ合成阻害活性を評価した。すべての評価系において、候補化合物を含まないリン酸カリウム緩衝液を対照として用いた。
【００８２】
評価系（ａ）：候補化合物（３００μＭ）を、幼葉鞘先端３ｍｍ切片の先端部２ｍｍの部分に注入し、寒天ブロック上に１．５時間静置した。その後、幼葉鞘先端の切片及び寒天ブロックを液体窒素で凍結させた。凍結させたサンプルから、上記方法２で記載したのと同様の手順により、ＧＣ−ＭＳ用のサンプルを調製した。先端部に含まれるＩＡＡの量及び寒天ブロック中に拡散したＩＡＡの量を、ＧＣ−ＭＳで測定した。ＧＣ−ＭＳに供する試料の調製方法及び測定条件は、スクリーニング方法２において記載した方法及び条件と同様である。測定結果は、２つの独立した試験結果の平均として算出した。
【００８３】
評価系（ｂ）：候補化合物（５００μＭ）及び安定同位体で標識したトリプトファン（１ｍＭ）を、幼葉鞘先端２ｃｍ切片の先端部２ｍｍの部分に注入した。１時間静置した後、幼葉鞘先端の切片を液体窒素で凍結させた。凍結させたサンプルから、上記方法２で記載したのと同様の手順により、ＧＣ−ＭＳ用のサンプルを調製した。幼葉鞘先端部における、標識されていないおよび標識されたＩＡＡの量をＧＣ−ＭＳにより測定した。トリプトファンは、ＩＡＡ合成経路における出発物質であるので、安定同位体標識を含むＩＡＡの比率が対照と比較して少ない場合は、候補化合物がＩＡＡ合成阻害剤として作用したことを示す指標となる。
【００８４】
評価系（ｃ）：スクリーニング方法１と同様の実験を行い、候補化合物を作用させた場合の重力屈曲の度合いを評価した。リン酸カリウム緩衝液を用いた対照を“−”（重力屈曲あり）とし、重力屈曲が阻害される程度ごとに、“＋”（弱い阻害）＜“＋＋”（中程度の阻害）＜“＋＋＋”（高度の阻害）として段階的に評価した。
【００８５】
結果
結果を表１（Ａ）ないし（Ｃ）に示す。表１（Ａ）はスクリーニング方法１により最終的に選択された５つの化合物（１１０−Ｃ６、７９−Ｈ８、６３−Ｂ５、７−Ｆ３、及び８７−Ａ３）についての結果を示す。表１（Ｂ）は、スクリーニング方法２により最終的に選択された３つの化合物（７−Ｆ３、６２−Ｈ１０及び４０−Ｅ８）についての結果を示す。表１（Ｃ）は、公知のＩＡＡ合成阻害剤（Ｌ−ＡＯＰＰ（Ｌ−アミノオキシフェニルプロピオン酸）、ＭＢＩ（２−メルカプトベンゾイミダゾール）、及び５−ｍＴ（５−メチルトリプトファン））について、評価した結果を示す。評価に用いた化合物の構造式を、図４に示す。
【００８６】
【表１】
2013184930.tif 000012
【００８７】
以上の結果より、スクリーニング方法１及び２によって、１００００の化合物のコレクションから、公知のＩＡＡ合成阻害剤と同等あるいはそれよりも強力なＩＡＡ合成阻害剤を同定することができた。
【００８８】
実施例２：ＹＵＣＣＡを標的とするＩＡＡ合成阻害剤のスクリーニング
シロイヌナズナ３５：：ＹＵＣＣＡ１株は、ＹＵＣＣＡ１を過剰発現する株である。３５：：ＹＵＣＣＡ１株は、シロイヌナズナ野生型Ｃｏｌ−０株と比較して、その芽生えにおいて（ｉ）胚軸が長い、（ｉｉ）根が短い、（ｉｉｉ）葉がカールする、というＩＡＡ過剰生産株に特徴的な表現型を示す。各阻害候補剤を、シロイヌナズナ３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の芽生えに処理し、３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型を野生型レベルに回復させる能力について評価することにより、ＹＵＣＣＡを標的とするＩＡＡ合成阻害剤のスクリーニングを行った。
【００８９】
実験方法
シロイヌナズナ３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の種子は、Ｚｈａｏ，Ｙ．博士より提供を受けた。３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株は、以下の論文：Zhao, Y., et al., Science, Vol.291, p.306-309, 2001（参照により本明細書にその全体を援用する）に報告されている。
【００９０】
５μＭ、２０μＭ、５０μＭｍ又は１００μＭの候補化合物を補った×０．５  ＭＳ液体培地中で、シロイヌナズナ野生型Ｃｏｌ−０株及び３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の種子を発芽させ、５日目の芽生えの表現型を観察した。
【００９１】
結果
結果を図５及び図６に示す。
１１０−Ｃ６、７９−Ｈ８及び６３−Ｂ５は、その構造式中に−Ｎ−Ｃ（ＳＨ）＝Ｎ−を含む５員の複素環を含む点で類似する構造を有している。これらの化合物は、メチマゾール（１−メチル−２−メルカプト−１Ｈ−イミダゾール）の類縁体である。図５に示される結果から、これらの化合物３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株にを作用させた場合、（ｉ）胚軸が長い、（ｉｉ）根が短い、（ｉｉｉ）葉がカールする、というＩＡＡ過剰発現の表現型を、野生型の表現型に回復させる作用が確認された。
【００９２】
具体的には、１１０−Ｃ６では、濃度が高くなると生育阻害がみられるものの、５μＭや２０μＭで作用させた場合には３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型を、ほぼ野生型の表現型に回復される現象が観察された。７９−Ｈ８を３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株に作用させた場合は、胚軸の長さは若干長いままであったが、根が伸長している、葉の丸まり（カール）が解消されているなど、野生型の表現型に回復される現象が観察された。そして、６３−Ｂ５を作用させた場合は、、濃度が高くなると生育阻害がみられるものの、低濃度では、３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型を、ほぼ野生型の表現型に回復される現象が観察された。
【００９３】
一方、メチマゾール様の構造を有しない３５−Ｈ５、７−Ｆ３、６２−Ｈ１０及び８７−Ａ３は、３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型を、野生型の表現型に回復させる作用が弱いか、ほとんど作用せず、あるいは非常に強い生育阻害／生育毒性が観察された（図６）。具体的には、３５−Ｈ５を作用させても３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型である胚軸の長さや葉の丸まりが維持されたままであった。７−Ｆ３を作用させた場合は、３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型である胚軸の長さや根の短さが維持されたままであった。６２−Ｈ１０を作用させた場合は、３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型である胚軸の長さや葉の丸まりが維持されたままであるとともに、強い生育阻害が観察された、８７−Ａ３については、強い生育毒性が観察された。
【００９４】
これらの結果から、メチマゾール様の５員環構造（−Ｎ−Ｃ（ＳＨ）＝Ｎ−を含む５員環構造）を有する化合物は、ＹＵＣＣＡの作用を特異的に阻害する活性を有することが明らかとなった。
【００９５】
さらに、ＩＡＡ過剰生産様の表現型を示す、ｓｕｒ２過剰発現株について、メチマゾール様の構造を有する１１０−Ｃ６、７９−Ｈ８及び６３−Ｂ５を用いて同様の実験を行ったところ、野生型の表現型への回復効果は観察されなかった（データは示さない）。この結果もまた、これらの化合物がＹＵＣＣＡの作用を特異的に阻害していることを裏付けるものである。
【００９６】
実施例３：化合物１１０−Ｃ６の効果
実施例２において、シロイヌナズナ３５：：ＹＵＣＣＡ１株の表現型を顕著に野生型に回復させた化合物１１０−Ｃ６（５−（４−クロロフェニル）−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−チオール）について、植物に及ぼす種々の影響について検討した。
（３−１）根の伸長に対する影響
シロイヌナズナ野生株Ｃｏｌ−０、オーキシン過剰発現株である３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株、及び、オーキシン生合成欠損変異体であってＹＵＣＣＡ経路のＴＡＡ１を発現しないｓａｖ３−２変異体（Tao, Y., et al., Cell, Vol.133, p.164-176, 2008（参照により本明細書にその全体を援用する））を垂直寒天プレート上で栽培し、それらの植物の根の伸長における化合物１１０−Ｃ６の効果を観察した。
【００９７】
シロイヌナズナ野生株Ｃｏｌ−０、３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株、及びｓａｖ３−２変異体の芽生えを、５μＭ、２０μＭ、もしくは１００μＭの１１０−Ｃ６を含む、又は１１０−Ｃ６を含まない、垂直寒天プレート（０．５×ＭＳ培地、１％ Bacto agar）上で、５日間栽培した。栽培５日後の根の伸長を測定した。
【００９８】
結果
結果を図７及び８に示す。結果を野生株Ｃｏｌ−０では、低濃度（５μＭ）の１１０−Ｃ６で処理した場合に根の伸長が見られ、高濃度（１００μＭ）では抑制が見られた。一方、３５Ｓ：：ＹＵＣＣＡ１株では、高濃度（１００μＭ）でも根の伸長が観察され、高濃度での伸長抑制に対して耐性を示した。また、オーキシン生合成欠損変異体であるｓａｖ３−２変異体では、より低濃度で根の伸長が抑制された。
【００９９】
これらの結果から、１１０−Ｃ６はＹＵＣＣＡ依存的なＩＡＡ合成経路に対して特異的に働くＩＡＡ合成阻害剤であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明のオーキシン生合成阻害剤は、オーキシン生合成の鍵反応を触媒する酵素の阻害剤であり、低濃度で強い阻害効果を示すとともに、植物への毒性も低いものである。本発明のオーキシン生合成阻害剤は、農薬として農業及び園芸の分野での利用が期待できる。また、新たな農薬を設計する上での指標として利用することもできる。さらには、植物ホルモンの作用機構を解明するための試薬として、植物学研究の方面での利用も期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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