(57)【要約】【課題】新規なＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化、正常化または安定化剤、リンパ管安定化剤、ならびにこれらの剤を含むしわ防止または改善剤およびむくみ改善または予防剤を提供すること。【解決手段】本発明は、チリロサイドを有効成分とするＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化、正常化または安定化剤、およびリンパ管安定化剤、ならびにこれらの剤を含むしわ防止または改善剤およびむくみ改善または予防剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チリロサイドを有効成分とするＴｉｅ２活性化剤。
【請求項２】
チリロサイドを有効成分とする血管の成熟化、正常化または安定化剤。
【請求項３】
チリロサイドを有効成分とするリンパ管安定化剤。
【請求項４】
請求項１に記載のＴｉｅ２活性化剤、請求項２に記載の血管の成熟化、正常化または安定化剤、あるいは請求項３に記載のリンパ管安定化剤のいずれかを含む、しわ防止または改善剤。
【請求項５】
請求項１に記載のＴｉｅ２活性化剤、請求項２に記載の血管の成熟化、正常化または安定化剤、あるいは請求項３に記載のリンパ管安定化剤のいずれかを含む、むくみ改善または予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｉｅ２活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、脈管形成および血管新生とよばれる二つのプロセスにより構築される。まず、血管内皮細胞に壁細胞が裏打ちすることにより、血管が安定化される（脈管形成）。しかし、局所的に酸素が不足している部分が生じると、壁細胞がはがれて、血管は枝分かれして酸素が不足している箇所へ伸びていく（血管新生）。血管新生によって栄養や酸素が行き届くようになると、壁細胞が再び内皮細胞に集積し、新生血管は安定化される。
【０００３】
血管の裏打ちとは、血管内皮細胞に対して、該内皮細胞の外腔面から、壁細胞が、細胞外マトリックスを介してあるいは直接的に接着していることをいう。血管径の大きさによって内皮細胞と壁細胞との接着する比率が異なり、大血管系では、１層の内皮細胞に複数層の壁細胞が裏打ちしており、中、小血管では、内皮細胞１細胞に壁細胞が１細胞裏打ちするものが多く、より径の細い血管では、１個の壁細胞が複数の内皮細胞に接着している。このように、壁細胞が血管内皮細胞に対し裏打ちすることは、血管の構造的な「成熟化」過程にとって重要である。また、血管内皮細胞同士の接着により、血管内環境因子（細胞および液性因子）が容易に血管外に漏出しないような内皮細胞間の接着斑を形成することが、機能的な血管の「成熟化」過程にとって重要である。さらに、組織の酸素や栄養分の需要に応じて、特にそれらが不足する際には、血管は、管腔を拡大化させることで血流を増加させ、酸素、養分を組織に十分に行き渡らせるように調節する。血管内皮細胞同士が接着斑を形成することで透過性を制御し、血管内皮細胞が壁細胞の裏打ちを伴うことにより構造的に安定化され、血管腔を大中小に制御していく過程を、本明細書中で「血管の成熟化」という。
【０００４】
種々の病態において、構造の乱れた血管が構築され、内皮細胞同士の接着が抑制された、または壁細胞の内皮細胞への接着が欠損した未熟な血管が形成される。これらが無秩序な血管透過性の亢進を招くことにより、組織内と血管内との間の液性因子および細胞の交通が異常となる。透過性が亢進すれば組織浮腫が生じ、組織の機能不全の原因となり、炎症細胞の浸潤が無秩序に生じることで炎症を招く。壁細胞は既存の血管からの血管の発芽を抑制していることから、壁細胞の伴わない血管からは血管の発芽が過剰となり、無秩序な血管の発芽が誘導され、病態の悪化をもたらす。このような現象は、糖尿病性網膜症、腫瘍、炎症などの病態で観察される。血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生をまねくような異常な血管を、内皮細胞同士の接着を高め、壁細胞の内皮細胞への裏打ちを促進することにより、正常な状態にすることを、本明細書中で「血管の正常化」という。
【０００５】
また、上記のような異常な血管は、糖尿病、高脂血症、高血圧などにより、血流内外環境因子の変化が内皮細胞や壁細胞に障害（細胞死など）を与えたり、癌や炎症により血管新生促進因子の過度の産生上昇が引き金になって生じる。このような病態が発生した際に、既存の血管に対する障害を抑制し、内皮細胞同士の解離および／または内皮細胞と壁細胞との解離を抑制することを、本明細書中で「血管の安定化」という。また、この安定化には内皮細胞の細胞死を抑制する機構も含まれる。
【０００６】
血管系とは別個に、組織液の排水路として形成されているリンパ管は、末梢組織で血管から漏出した間質液、タンパク質、脂肪、細胞などを血管系へと環流することにより血液量を一定に保ち、閉鎖循環系を維持する。皮膚に存在する毛細血管では、内皮細胞の外側を基底膜が取り囲み、さらに周皮細胞が付着しているのに対し、毛細リンパ管では、内皮細胞の外には基底膜がほとんどなく、周皮細胞の付着もない。この構造が、効率よく間質から体液や細胞を取り込む（回収機能）ために役立っている。リンパ管の機能にはリンパ管内皮細胞が適切に配置して裏打ちされていることが必要であり、これを本明細書中では「リンパ管の安定化」という。
【０００７】
Ｔｉｅ２（tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain 2）は、血管内皮細胞に発現する受容体型チロシンキナーゼ（タンパク質のチロシン残基をリン酸化する酵素）である。
【０００８】
特許文献１は、紫外線Ｂ（ＵＶＢ）の照射を受けた皮膚組織中の内皮細胞と壁細胞との接着が抑制され、Ｔｉｅ２のリン酸化（活性化）が抑制された状態に誘導されること；Ｔｉｅ２を強制発現させた細胞を用いて調べた結果、ニッケイ（Cinnamomum）属植物由来のケイシ抽出物にＴｉｅ２を活性化する作用があること；ＵＶＢの照射により光老化を惹起させたマウス皮膚にケイシ抽出物を塗布すると、皮膚の改善作用が見られることを記載している。特許文献１では、ケイシ抽出物が、Ｔｉｅ２リン酸化により内皮細胞−壁細胞間の接着を改善、促進し、安定な血管構造を形成し、ひいてはＵＶＢ誘導性の皮膚損傷およびしわ形成を回復することが確認されている。
【０００９】
Ｔｉｅ２とリンパ管との関係について、アンジオポエチンのAng-1とリンパ管内皮細胞で発現しているＴｉｅ２との関係に着目してAng-1の機能についてリンパドレナージュアッセイにより調べた結果、Ang-1は、Ｔｉｅ２の活性化を介してリンパ管の回収機能を促進することが明らかにされた（特許文献２）。
【００１０】
このように、Ｔｉｅ２活性化は、血管の成熟化、正常化または安定化、ならびにリンパ管の安定化に寄与することが明らかにされている。Ｔｉｅ２を活性化する種々の物質および植物抽出物がさらに報告されている（特許文献３〜９および非特許文献１）。
【００１１】
ところで、チリロサイド（tiliroside）は、ポリフェノールの１種であり、いくつかの薬効が知られている。そのような薬効として、脂肪代謝促進剤および抗糖尿病剤（特許文献１０）、骨格筋における脂肪代謝促進剤（特許文献１１）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００９−２６３３５８号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／１５４２３７号
【特許文献３】特開２００９−２６３３５９号公報
【特許文献４】特開２０１０−２４１７１２号公報
【特許文献５】特開２０１１−１０２２７２号公報
【特許文献６】特開２０１１−１０２２７３号公報
【特許文献７】特開２０１１−１０２２７４号公報
【特許文献８】特開２０１１−１０２２７５号公報
【特許文献９】特開２０１１−２０１８１１号公報
【特許文献１０】特開２００７−１７６８５８号公報
【特許文献１１】特開２０１０−２０２５９４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】「Tie2」（タイツー）の活性化する植物エキス（ヒハツ）の存在  バイオサイエンス最前線  File-2［健康美容EXPO］（http://www.e-expo.net/contents/c/tie2/page02.html）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、新規なＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化、正常化または安定化剤、リンパ管安定化剤、ならびにこれらの剤を含むしわ防止または改善剤およびむくみ改善または予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、チリロサイドを有効成分とするＴｉｅ２活性化剤を提供する。
【００１６】
本発明はまた、チリロサイドを有効成分とする血管の成熟化、正常化または安定化剤を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、チリロサイドを有効成分とするリンパ管安定化剤を提供する。
【００１８】
本発明はよりさらに、上記Ｔｉｅ２活性化剤、上記血管の成熟化、正常化または安定化剤、あるいは上記リンパ管安定化剤のいずれかを含む、しわ防止または改善剤を提供する。
【００１９】
本発明はなおさらに、上記Ｔｉｅ２活性化剤、上記血管の成熟化、正常化または安定化剤、あるいは上記リンパ管安定化剤のいずれかを含む、むくみ改善または予防剤を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、チリロサイドはＴｉｅ２を活性化し、それにより血管を成熟化、正常化または安定化および／またはリンパ管を安定化し、その結果のしわの防止または改善、およびむくみの改善または防止が期待される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のＴｉｅ２活性化剤は、チリロサイドを有効成分とする。Ｔｉｅ２の活性化とは、Ｔｉｅ２をリン酸化することでその活性体（リン酸化Ｔｉｅ２）に変換することをいう。本発明のＴｉｅ２活性化剤は、飲食品（例えばサプリメント、飲料）、医薬品（例えば皮膚外用剤、内服薬）、医薬部外品、または化粧品の材料として好適である。
【００２２】
チリロサイドは、ポリフェノールの１種であり、以下の式（Ｉ）で表される。
【００２３】
【化１】
2013213015.tif 000002
【００２４】
チリロサイドは、主に植物の各部位（例えば、植物全体、花、茎、鱗茎、根、種子（偽果）、種皮など）に含有される。具体的には、ローズヒップ（特にRosa caninaの偽果（果実および種子を含む））、ナニワイバラ（R. laviegata）の偽果（金櫻子）、ハマナス（R. rugosa）の偽果および花、リンデン（Tilia cordata、T. platyphyllos、またはT. argentea）の花および葉、ウスベニアオイ（Malva silvestris）の全草、ウスベニタチアオイ（Althaea officinalis）の葉および花、ツリーラヴァテラ（Lavatera thuringiaca）の葉、エゾツルキンバイ（Potentilla anserina）の葉および果実、ヒメオドリコソウ（Lamium purpureum, L. album）の全草、タチアオイ（Althaea rosea）の葉および根、ラズベリー（Rubus idaeus）の葉および果実、いちご（Fragaria ananassa）の果実および種子などが挙げられる。好ましくはローズヒップである。
【００２５】
本発明においては、チリロサイドを含有する上記植物、その加工物（乾燥物、破断物、細断物、またはこれらを粉末化した乾燥粉末、乾燥物を粉砕後成形したものなど）、またはこれらの抽出物を「チリロサイド」として用いてもよい。本明細書において、抽出物とは、上記植物またはその加工物を溶媒で抽出して得られる抽出液、その希釈液または濃縮液、あるいはそれらの乾燥物を意味する。チリロサイドの精製度が高い点、あるいは飲食品、医薬品、化粧品などとして使用する点などを考慮すると、抽出物が好ましい。
【００２６】
抽出に用いる溶媒は、極性溶媒であっても、非極性溶媒であってもよく、特に制限されない。このような溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノール等のアルコール類；エーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類；ヘプタン、ヘキサンなどの炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；および、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化脂肪族炭化水素類が挙げられる。これらの溶媒は、単独で、または組合せて用いることができる。
【００２７】
上記溶媒の中でも、アルコール、酢酸エチル、水、およびこれらの２またはそれ以上の混合溶媒が好ましく用いられる。アルコールとしては、エタノール、１-プロパノール、２-プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノール等の低級アルコールが好ましく用いられる。アルコールと水との混合溶媒がより好ましい。例えば、エタノールと水とを容積比で９９：１〜１：９９、好ましくは９５：５〜５：９５、さらに好ましくは７０：３０〜３０：７０で用いてもよい。エタノールが多い方が好ましく、例えば、７０ｖ／ｖ（容量／容量）％エタノール（エタノール：水＝７０：３０）も用いられる。
【００２８】
抽出方法に特に制限はないが、使用における安全性および利便性の観点から、できるだけ緩やかな条件で行うことが好ましい。例えば、原料植物部位またはその乾燥物を粉砕、破砕または細断し、これに５〜２０倍量の極性または非極性溶媒を加え、０℃〜溶媒の還流温度の範囲で３０分〜４８時間、振盪、撹拌あるいは還流などの条件下、抽出を行う。抽出後、濾過、遠心分離などの分離操作を行い、不溶物を除去して、必要に応じて希釈、濃縮操作を行うことにより、抽出液を得ることができる。さらに必要に応じて、上記不溶物について同じ操作を繰り返してさらに抽出し、その抽出液を併せて用いてもよい。
【００２９】
この抽出液は、そのままあるいは濃縮して、液状物、濃縮物、ペースト状で、あるいは、さらにこれらを乾燥した乾燥物の形状で用いられる。乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、減圧乾燥、流動乾燥等の当業者が通常用いる方法により行われる。抽出物は、当業者が通常用いる精製方法によりさらに精製してもよい。
【００３０】
このようにして得られる抽出物は、チリロサイドを乾燥質量換算で好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０２質量％以上、さらに好ましくは０．０４質量％以上含有する。抽出物中のチリロサイドは、例えば、高速液体クロマトグラフィーなどにより確認される。
【００３１】
本発明はまた、チリロサイドを有効成分とする血管の成熟化、正常化または安定化剤を提供する。本発明は、チリロサイドを有効成分とするリンパ管安定化剤もまた提供する。本明細書中では、本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化、正常化または安定化剤、ならびにリンパ管安定化剤をまとめて、本発明の剤ともいう。
【００３２】
本発明の剤は、血管の構造変化を原因とする、種々の疾患および老化の予防または改善に有効な医薬品または化粧品として利用できる。
【００３３】
本発明の剤は、血管の正常化および安定化を誘導することにより、種々の炎症性疾患、免疫疾患、成人病など、例えば、種々の感染症、癌、関節リウマチ、痛風、高血圧、糖尿病、動脈硬化症、アトピー性皮膚炎などにおいて、血管新生および／または血管透過性の破綻を伴う全身の病変部位の改善を図る医薬品として利用できる。また、血管透過性の抑制により、皮膚を含む臓器、器官、各種組織内の浮腫（例えば炎症性疾患、免疫疾患、成人病による血管浮腫；紫外線曝露、虫さされ、アレルギーなどによる血管透過性亢進による浮腫やかゆみなどの症状）を改善する医薬品または化粧品として利用できる。
【００３４】
さらに、本発明の剤は、種々の要因によって誘導される内皮細胞の細胞死、たとえば炎症性疾患や免疫疾患、成人病など、例えば、種々の感染症、癌、関節リウマチ、痛風、高血圧、糖尿病、動脈硬化症、または放射線障害、種々の薬剤や紫外線による内皮細胞の細胞死を抑制して、血管の不安定化を抑制できる医薬品または化粧品として利用できる。
【００３５】
本発明の剤は、血管の成熟化および血管腔の拡大化により、外傷、縟そうなどの創傷治癒の促進、血管再生医療における血管の成熟化、虚血性疾患（例えば脳梗塞、心筋梗塞）の改善剤として、医薬品に利用できる。また、血流改善効果を期待して、腰痛症、凍傷、脱毛症などに対する内服および外用医薬品として利用できる。脳血流の増大においては、痴呆症への応用も可能である。脱毛症に対しては、化粧品としての利用も可能である。
【００３６】
本発明の剤は、癌において癌細胞の休眠を誘導する治療薬として、幹細胞においてその生体内外での維持薬として利用が可能である。
【００３７】
光老化とは、一般に日光に対する被曝が繰り返された結果として認められる、皮膚の外見および機能の変化を意味する。日光の構成要素である紫外線（ＵＶ）、特に中間ＵＶ（ＵＶＢと呼ばれる、波長２９０〜３２０nm）が主として、光老化を引き起こす。光老化を引き起こすのに必要なＵＶＢの被曝量は、現在のところ知られていない。しかしながら、紅斑または日焼けを引き起こすレベルでのＵＶＢに対する繰り返しの被曝が、通常、光老化に結びつく。臨床的には、光老化は、肌荒れ、しわの形成、斑の着色、土色化、たるみの形成、毛細管拡張症の発症、ほくろの発生、紫斑病の発症、傷つき易くなる、萎縮、繊維症的色素除去領域の発生、前悪性腫瘍、悪性腫瘍の発症などとして特定され得る。光老化は普通、顔、耳、頭、首、と手のような、日光に習慣的に曝される皮膚に起こり、皮膚の老化においては、皮膚障害および紫外線に対する曝露による光老化が主因となるが、本発明の剤は、光老化の原因となる血管障害を抑制することにより、光老化の改善に利用できる。
【００３８】
本発明の剤は、リンパ管の構造の不安定化を原因とする、リンパ液の漏出による種々の皮膚疾患、例えば浮腫（むくみ）の改善および予防に有効な医薬品または化粧品として利用できる。浮腫には、例えば紫外線照射、フィラリア、手術、悪性腫瘍、炎症にともなう二次性のリンパ浮腫や、先天性リンパ浮腫、例えばMilroy病、Meige病、lymphedema-distichiasis症候群がある。
【００３９】
本発明の剤は、しわ防止または改善剤、あるいはむくみ改善または予防剤としても用いられ得る。
【００４０】
本発明の剤は、上述したようにチリロサイドを有効成分として含むが、本発明の効果を損なわない範囲において、他の種々の成分を含有することができる。
【００４１】
本発明の剤は、食品、医薬品および化粧品の用途に使用することができる。本発明の剤は、ヒトおよび動物に用いることができる。
【００４２】
本発明の剤は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の剤の投与形態は、特に制限されるものではなく、経口、非経口、外用などである。剤型としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤などの外用剤；注射剤、点滴剤、坐剤などの非経口投与剤；または錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤などの経口投与剤が挙げられる。好ましくは経口投与剤または外用剤である。
【００４３】
経口用としては、経口投与用の医薬品、流動食、病者用食品、乳幼児食品、栄養機能食品、特定保健用食品などが挙げられる。本発明の剤は、通常の飲食品もしくは飼料に配合することもでき、例えば、牛乳、清涼飲料水、ゼリー飲料などの各種飲料、ヨーグルト、発酵乳などの乳製品、キャンディー、グミ、チョコレート、ビスケット、クラッカーなどの各種菓子類、ごはん、パン、うどん、ドレッシングなどの各種食品などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
外用剤としては、例えば、皮膚への塗布もしくは投与が可能な化粧品または医薬品が挙げられる。化粧品としては、例えば、洗顔料、化粧水、美容液、乳液、スプレー剤、パックシート、クリーム、軟膏剤、入浴剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。化粧品は、医薬部外品として製造販売されるものも含み得る。その剤型は、皮膚に適用できるものであればいずれでもよく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾールなどの任意の剤型が適用される。外用剤の医薬品としては、皮膚への投与用の組成物（例えば、皮膚外用剤）が挙げられる。
【００４５】
本発明の剤は、例えば、通常の飲食品や医薬品に使用される賦形剤、防湿剤、防腐剤、強化剤、増粘剤、乳化剤、酸化防止剤、甘味料、酸味料、調味料、着色料、香料など；化粧品などに通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤などを必要に応じて適宜配合することができる。
【００４６】
本発明のＴｉｅ２活性化剤、血管の成熟化、正常化または安定化剤、リンパ管安定化剤、しわ防止または改善剤、およびむくみ改善または予防剤は、チリロサイドを、以下に説明する投与量などを満たすような量で配合し得る。経口摂取または投与の場合、チリロサイドの経口の摂取または投与量は、ヒトでは、１日あたり、0.01〜100ｍｇが好ましく、0.1〜0.3ｍｇがより好ましい。外用の場合、チリロサイドの外用量は、ヒトでは、１日あたり、0.01〜100ｍｇが好ましく、0.1〜0.3ｍｇがより好ましい。チリロサイドとしてチリロサイドを含有する上記植物、その加工物、またはこれらの抽出物を用いる場合は、チリロサイドの含有量に応じて適宜設定すればよい。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、試験群とコントロール群との有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。この検定結果は、危険率（ｐ）が０．０５以下である場合を有意とした。各表において、危険率（ｐ）が０．０５以下の場合、末尾に＊：ｐ＜０．０５を付して表記する。
【００４８】
（実施例１：ローズヒップ抽出液の調製）
チリ産のローズヒップ（Rosa caninaの果実（種子を含む））の乾燥粉砕物に、５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を加えて、９０℃付近で還流抽出した。この混合物を濾過して不溶物を除去した後、減圧下、エタノールを留去して抽出液を得た。
【００４９】
（実施例２：チリロサイドの調製）
実施例１で得られた抽出液を乾燥して粉末を得た。この粉末を５０（ｖ／ｖ）％メタノール水溶液に溶解し、これを、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（オープンカラム）により以下の条件１で分画した。得られた画分について、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりチリロサイドを検出した。なお、指標として市販標品tiliroside（フナコシ）を用いた。
【００５０】
（条件１）
カラム：シリカゲル（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ（登録商標）ＯＤＳ：Fuji silysia Chemical LTD.社製）を充填（１５ｃｍΦ×６０ｃｍ）
移動層：メタノール／水（容積比が５０／５０、７０／３０、および１００／０の順で溶出を行う）
【００５１】
ＴＬＣによりチリロサイドが検出された画分を合わせた（画分１とする）。この画分１を、さらに順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（オープンカラム）により以下の条件２で分画した。上記と同様にして、チリロサイドが検出された画分を合わせた（画分２とする）。
【００５２】
（条件２）
カラム：シリカゲル６０Ｎ（球状、中性）（関東化学株式会社）を充填（５ｃｍΦ×４０ｃｍ）
移動層：トリクロロメタン／メタノール／水（容積比が１５／３／１、１０／３／１、および７／３／１の順で溶出を行い、最後にメタノールのみで溶出する）
【００５３】
画分２を、さらにプレパラティブ用カラムおよび示唆屈折率検出器（ＲＩ）を備えた高速液体クロマトグラフィー装置を用いて以下の条件３で分画した。得られた画分を乾燥してチリロサイド６７．１ｍｇを得た。
【００５４】
（条件３）
カラム：      ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ（株式会社ワイエムシィ）
カラム温度：  室温
移動層：      アセトニトリル／水（容積比：３０／７０）
流速：        １０ｍＬ／ｍｉｎ
【００５５】
（実施例３：Ｔｉｅ２活性化の評価）
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、９６ウェルプレートに2.0×104細胞／0.1mL／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EG2）を用いて一晩培養した。次いで、一晩培養後のＨＵＶＥＣを、細胞刺激（チリロサイド添加）の３時間前に0.1mLの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EB2）に置換し、再度培養を行った。その後ウェル内に、以下の表１に示す濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したチリロサイドを0.1mL添加し、２０分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（R&D Systems社製、Human Phospho-Tie2（Y992）Immunoassay）を用いてプロトコールに従って細胞内のリン酸化型Ｔｉｅ２量および総Ｔｉｅ２量を測定し、総Ｔｉｅ２に対するリン酸化型Ｔｉｅ２の比率を計算した。
【００５６】
また、陰性コントロールとしてＤＭＳＯ単独についても、同様に総Ｔｉｅ２に対するリン酸化型Ｔｉｅ２の比率を計算した。
【００５７】
下記式に従いＴｉｅ２活性化率を計算し、リン酸化作用を評価した：
Ｔｉｅ２活性化率（％）＝
［｛（被験試料添加時のリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（被験試料添加時の総Ｔｉｅ２の測定値）｝／｛（陰性コントロールでのリン酸化型Ｔｉｅ２の測定値）／（陰性コントロールでの総Ｔｉｅ２の測定値）｝］×１００
陰性コントロール（ＤＭＳＯ単独）処理の場合のＴｉｅ２活性化率を１００％とする。
【００５８】
【表１】
2013213015.tif 000003
【００５９】
本結果より、チリロサイドは、Ｔｉｅ２活性化促進作用を有することが分かった。特に200μg/mLの濃度において、有意なＴｉｅ２活性化促進作用が確認された。チリロサイドには、Ｔｉｅ２活性化作用を介した血管、リンパ管構造の安定化が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、チリロサイドはＴｉｅ２を活性化し、それにより血管を成熟化、正常化または安定化および／またはリンパ管を安定化し得る。本発明によれば、しわの防止または改善およびむくみの改善または予防に加え、血管およびリンパ管の構造の不安定化を原因とする種々の疾患または状態を予防または改善するのに役立つ食品、化粧品、医薬品などが提供され得る。