(57)【要約】【課題】酵素センサを用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する検出方法であって、迅速で高感度かつ高精度な検出を再現性よく行うことが可能な検出方法を提供する。【解決手段】酵素センサ１０の電極１２及び酵素層１３が収納され、第１開閉バルブ５１を介して真空ポンプ３０と連通するとともに第２開閉バルブ５２を介して溶液タンク４０と連通する密閉空間を形成する形成ステップと、次いで、第２開閉バルブ５１を閉めた状態で第１開閉バルブ５１を開き、真空ポンプ３０によって密閉空間（液溜形成部１４内）を減圧する減圧ステップと、次いで、密閉空間が所定の減圧状態になると、第１開閉バルブ５１を閉める第１バルブ閉鎖ステップと、次いで、第２開閉バルブ５２を開き、溶液タンク４０内の溶液を密閉空間に注入する注入ステップと、を有し、注入ステップの後に試料溶液中の検出対象物質を検出する。【選択図】図６
2013238400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極と、当該電極上に設けられた酵素層と、を備える酵素センサを用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する検出方法において、
前記酵素層は、多孔質体と、当該多孔質体の細孔の内部に固定された酵素と、からなる層であり、
前記電極及び前記酵素層が収納され、第１開閉バルブを介して真空ポンプと連通するとともに第２開閉バルブを介して溶液タンクと連通する密閉空間を形成する形成ステップと、
次いで、前記第２開閉バルブを閉めた状態で前記第１開閉バルブを開き、前記真空ポンプによって前記密閉空間を減圧する減圧ステップと、
次いで、前記密閉空間が所定の減圧状態になると、前記第１開閉バルブを閉める第１バルブ閉鎖ステップと、
次いで、前記第２開閉バルブを開き、前記溶液タンク内の溶液を前記密閉空間に注入する注入ステップと、を有し、
前記注入ステップの後に、試料溶液中の検出対象物質を検出することを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記多孔質体は、シート状の多孔質体であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素センサを用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、電極と、当該電極上に設けられた多孔質体（具体的には、シリカ系メソ多孔体）と、当該多孔質体の細孔の内部に固定された酵素と、を備え、細孔のサイズが酵素のサイズの０．５〜２．０倍である酵素センサが知られている（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１記載の酵素センサによれば、多孔質体の細孔のサイズが酵素のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているため、多孔質体の細孔の内部に酵素をしっかりと固定できる。そのため、優れた安定性を有し、かつ、長寿命化が可能となる。
さらに、特許文献１記載の酵素センサが備える多孔質体は比表面積が非常に大きく、また、当該多孔質体の細孔のサイズが酵素のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているため、より高密度に酵素を固定できるとともに、酵素が凝集を起こして失活してしまうこと等を抑制できる。そのため、優れた感度を有している。
【０００３】
このような酵素センサを用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する場合、例えば、分析領域（電極と、酵素が固定化された多孔質体と、を含む領域）を試料溶液に接触させるようになっている。その際、多孔質体と電極との間、多孔質体や電極の表面、多孔質体の細孔の内部等に気泡が付着してしまって、試料溶液等の必要な溶液が多孔質体全体や電極全体に行き渡らないことがある。ここで、酵素が固定化されたシート状の多孔質体（具体的には、メソポーラスアルミナのシート（厚さ５０μｍ））と電極とを備える酵素センサの分析領域を溶液に接触させた状態で撮影した写真を図９に示す。図９において、白色粒状のものが気泡である。図９から、多孔質体と電極との間や、多孔質体の表面等に、複数の気泡が付着していることが分かる。
試料溶液等の必要な溶液が多孔質体全体や電極全体に行き渡らないと、酵素センサからの応答が小さくなったり、酵素センサからの応答がばらついて測定誤差が生じたりするので、迅速で高感度かつ高精度な検出を再現性よく行うことができない。
【０００４】
ところで、１６の異なるオリゴヌクレオチドをアレイ方眼上の異なる位置に同時に結合させることができるアプリケーション装置において、真空ラインのバルブを開け、一方で、溶液投入窓のバルブを閉める。こうして、反応チャンバーから空気を除去し、チャンバー内を陰圧状態にする。その後、真空ラインのバルブを閉め、溶液投入窓のバルブを開ける。陰圧のため、溶液は反応チャンバー内へ流れる。このようにすれば、反応チャンバー内に気泡が形成する可能性を排除できることが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２００８７号公報
【特許文献２】特許第４２９４７３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献２は、オリゴヌクレオチドを活性化アレイ表面に結合させる際における微小孔内の液体の充填、排出については記載されているものの、酵素センサを用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する際における気泡の発生を抑制することについては記載されていない。
【０００７】
本発明の課題は、酵素センサを用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する検出方法であって、迅速で高感度かつ高精度な検出を再現性よく行うことが可能な検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、
電極と、当該電極上に設けられた酵素層と、を備える酵素センサを用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する検出方法において、
前記酵素層は、多孔質体と、当該多孔質体の細孔の内部に固定された酵素と、からなる層であり、
前記電極及び前記酵素層が収納され、第１開閉バルブを介して真空ポンプと連通するとともに第２開閉バルブを介して溶液タンクと連通する密閉空間を形成する形成ステップと、
次いで、前記第２開閉バルブを閉めた状態で前記第１開閉バルブを開き、前記真空ポンプによって前記密閉空間を減圧する減圧ステップと、
次いで、前記密閉空間が所定の減圧状態になると、前記第１開閉バルブを閉める第１バルブ閉鎖ステップと、
次いで、前記第２開閉バルブを開き、前記溶液タンク内の溶液を前記密閉空間に注入する注入ステップと、を有し、
前記注入ステップの後に、試料溶液中の検出対象物質を検出することを特徴とする。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の検出方法において、
前記多孔質体は、シート状の多孔質体であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、減圧状態にすることによって気泡の原因となる空気を非常に少なくすることができるので、気泡が発生して、酵素層と電極との間、酵素層や電極の表面、酵素層の細孔の内部等に気泡が付着することを防止できる。
また、減圧状態にすることによって、酵素層と電極との間、酵素層の細孔の内部等に、必要な溶液を速やかに供給することができる。
すなわち、気泡が発生して酵素センサからの応答が小さくなったり酵素センサからの応答がばらついて測定誤差が生じたりすることを防止できるので、結果として酵素センサを用いて迅速で高感度かつ高精度な検出を再現性よく行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施形態の酵素センサを備える検出装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図２】実施形態の酵素センサの構成の一例を示す斜視図である。
【図３】（ａ）実施形態の酵素センサの構成の一例を示す模式図、（ｂ）実施形態の酵素センサの要部の構成の一例を示す模式図である。
【図４】本実施形態の酵素センサが備える多孔質体の構成の一例を示す模式図である。
【図５】本実施形態の検出方法の一例を示す図である。
【図６】本実施形態の検出方法の一例を示す図である。
【図７】本実施形態の検出方法の一例を示す図である。
【図８】本実施形態の検出方法の一例を示す図である。
【図９】従来の問題点である気泡を説明するための写真であって、酵素が固定化されたシート状の多孔質体と電極とを備える酵素センサの分析領域を溶液に接触させた状態で撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図を参照して、本発明の実施形態を説明する。ただし、発明の範囲は、図示例に限定されない。
【００１３】
［検出装置の構成］
まず、本実施形態の酵素センサ１０を備える検出装置１の構成について説明する。
検出装置１は、酵素センサ１０を使用して、試料に含まれる検出対象物質を検出又は定量する装置である。
【００１４】
図１は、検出装置１の構成の一例を示すブロック図である。
検出装置１は、図１に示すように、主に、酵素センサ１０と、接続手段４を介して酵素センサ１０と接続する電圧印加手段２及び電流測定手段３と、を備えて構成される。
電圧印加手段２は、酵素センサ１０の電極１２に所定の電圧値の電圧を印加する。具体的には、電圧印加手段２は、作用電極１２１と参照電極１２３との間に電圧を印加する。
また、電流測定手段３は、電圧印加手段２による電圧印加時に酵素センサ１０の電極１２に流れる電流値を応答電流値（後述）として測定する。
【００１５】
なお、図１では、接続手段４から延びる１本のリード線に電圧印加手段２及び電流測定手段３が接続されているが、接続手段４と電圧印加手段２及び電流測定手段３との接続の仕方はこれに限定されるものではない。具体的には、例えば、接続手段４から延びる複数本のリード線のうち一部のリード線に電圧印加手段２が接続されるとともに、他の一部のリード線に電流測定手段３が接続されるよう構成することも可能である。
【００１６】
［酵素センサの構成］
本実施形態の酵素センサ１０は、酵素１３ａを用い、試料に含まれる検出対象物質を検出又は定量するために酵素反応に伴う所定の変化を電気化学的に検出するセンサである。
具体的には、酵素センサ１０は、例えば、酵素１３ａとして基質と反応して所定の物質を生成する酵素を用い、試料に含まれる基質（検出対象物質）を検出又は定量するために当該所定の物質を電気化学的に検出したり、酵素１３ａとして酵素阻害物質によって活性が阻害される酵素を用い、試料に含まれる酵素阻害物質（検出対象物質）を検出又は定量するために酵素１３ａの活性を電気化学的に検出したりする。
図２は、酵素センサ１０の構成の一例を示す斜視図である。図３（ａ）は、酵素センサ１０の構成の一例を示す模式図であり、図３（ｂ）は、酵素センサ１０の要部（具体的には、液溜形成部１４及び絶縁膜１５を除いた部分）の構成の一例を示す模式図である。
【００１７】
酵素センサ１０は、図２、図３（ａ），（ｂ）に示すように、主に、基板１１と、基板１１上に形成された電極１２（作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３）と、作用電極１２１上に形成された酵素層１３と、酵素層１３の周囲に液溜を形成するための液溜形成部１４と、電極１２からの配線を保護するための絶縁膜１５と、を備えて構成される。
【００１８】
基板１１は、例えば、シリコン、セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）等からなる絶縁性基板である。
【００１９】
電極１２は、例えば、スクリーン印刷法によって基板１１上に形成された導電層である。
作用電極１２１としては、例えば、金、白金、銅、アルミニウム等の貴金属や、ＳｎＯ２、Ｉｎ２Ｏ３、ＷＯ３、ＴｉＯ２、グラファイト、グラフェン、グラッシカーボンなどを用いることができる。
対電極１２２としては、例えば、二極方式の場合は銀、三極方式の場合は銀やその他の金属を用いることができる。
参照電極１２３としては、例えば、カロメル電極、銀/塩化銀等を用いることができる。
【００２０】
なお、酵素センサ１０の電極方式は、作用電極と対電極と参照電極との三極方式に限定されるものではなく、作用電極と対電極との二極方式であっても良い。
また、電極１２は、スクリーン印刷法によって形成されたものに限定されるものではなく、電極１２の形成方法は適宜任意に変更可能である。具体的には、電極１２は、例えば、蒸着法、スパッタリング法等によって形成することも可能である。
【００２１】
また、作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３の大きさ、形状、構成には、特に制限はない。
具体的には、例えば、これらの電極は、市販の電解セル、測定セル等で使用する大きな電極であっても良いし、ディスク電極、回転リングディスク電極、ファイバー電極等であっても良いし、例えば、フォトリソグラフィー等の公知の微細加工技術により作製した微小電極（円盤電極、円筒電極、帯状電極、配列帯状電極、配列円盤電極、リング電極、球状電極、櫛型電極、ペア電極等）であっても良い。また、作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３はそれぞれ同じ大きさ、形状、構成であっても良いし、異なる大きさ、形状、構成であっても良い。
【００２２】
酵素層１３は、基質と反応して所定の物質を生成する酵素や、酵素阻害物質によって活性が阻害される酵素などを、酵素１３ａとして含む層である。
ここで、基質と反応して所定の物質を生成する酵素としては、例えば、基質と反応して過酸化水素を生成する各種の酸化酵素（アルコールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ等）、基質と反応してＮＡＤＨ（還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤ＋（酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）等を生成する各種の脱水素酵素（アセトアルデヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、乳酸脱水素酵素等）などを用いることができる。
また、酵素阻害物質によって活性が阻害される酵素としては、例えば、有機リン系農薬やカーバメート系農薬などの酵素阻害物質によって活性が阻害される各種の酵素（アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）やブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）などのコリンエステラーゼ等）などを用いることができる。
なお、酵素層１３には、一種類の酵素１３ａのみが含まれていても良いし、複数種類の酵素１３ａが含まれていても良い。
また、酵素層１３には、酵素１３ａ等と電極１２（具体的には、作用電極１２１）との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体や、酵素１３ａの活性の発現を触媒するための補酵素などが含まれていても良い。
【００２３】
ここで、本実施形態において、酵素１３ａは、多孔質体の細孔の内部に固定された状態で酵素層１３に含まれていることとする。
すなわち、本実施形態の酵素層１３は、多孔質体と、当該多孔質体の細孔の内部に固定された酵素１３ａと、からなる層である。
なお、本実施形態では、多孔質体として、厚さ５０μｍのシート状の多孔質体、具体的にはアルミナ細孔内にメソ多孔性シリカ１３ｂが充填されたメソポーラスアルミナのシート（図４参照）を用い、メソ多孔性シリカ１３ｂの細孔の内部に酵素１３ａを固定するよう構成したが、これに限定されるものではなく、多孔質体の形状や構成などは適宜任意に変更可能である。具体的には、多孔質体の厚さは、５０μｍに限定されるものではなく、適宜任意に変更可能である。また、多孔質体の形状は、シート状以外に、例えば、粉末状であっても、顆粒状であっても、バルク状であっても良い。また、多孔質体は、酵素１３ａを固定化するためのメソ多孔性シリカ１３ｂと当該メソ多孔性シリカ１３ｂを支持するための陽極酸化アルミナＡとにより構成されるメソポーラスアルミナのシート（図４参照）以外に、例えば、酵素１３ａを固定化するためのメソ多孔性カーボンと当該メソ多孔性カーボンを支持するための陽極酸化アルミナＡとにより構成されるものであっても、メソ多孔性シリカ１３ｂのみにより構成されるものであっても、メソ多孔性カーボンのみにより構成されるものであっても良い。
【００２４】
ここで、メソ多孔性シリカ１３ｂは、例えば、ケイ酸やアルミナなどの各種金属酸化物、ケイ酸と他種の金属との複合酸化物等によって構成することができる。
例えば、ケイ酸により構成されるメソ多孔性シリカ１３ｂの作製においては、例えば、カネマイトのような層状シリケート、アルコキシシラン、シリカゲル、水ガラス、ケイ酸ソーダ等を好ましく用いることができる。
具体的には、メソ多孔性シリカ１３ｂは、例えば、無機材料を界面活性剤と混合反応させて、界面活性剤のミセルの周りに無機の骨格が形成された界面活性剤／無機複合体を形成させた後、例えば、４００℃〜６００℃で焼成したり有機溶剤で抽出したりする等して界面活性剤を除去することにより作製される。これにより、メソ多孔性シリカ１３ｂは、無機骨格中に、界面活性剤のミセルと同じ形状のメソポア細孔を有するものとなる。
【００２５】
メソ多孔性シリカ１３ｂの作製において、ケイ酸等のケイ素含有化合物を出発材料とする場合には、例えば、カネマイトのような層状シリケートを形成して、この層間にミセルを挿入し、そして、ミセルが存在しない層間をシリケート分子でつなぎ、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。
また、メソ多孔性シリカ１３ｂの作製において、水ガラス等のケイ素含有物質を出発材料とする場合には、例えば、ミセルの周囲にシリケート分子を集合させて重合させることによりシリカを形成し、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。この場合、通常、ミセルの形状は柱状となり、その結果、メソ多孔性シリカ１３ｂに、柱状の細孔が形成されることになる。
メソ多孔性シリカ１３ｂは、作製段階で、界面活性剤のアルキル鎖の長さを変えてミセルの径を変化させることによって、細孔の内径を制御することができる。また、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼン、トリプロピルベンゼン等の比較的疎水性の分子を添加することによって、ミセルを膨潤させ、さらに大きな内径の細孔を形成することもできる。
【００２６】
メソ多孔性シリカ１３ｂの形状としては、例えば、粉末状、顆粒状、シート状、バルク状等がある。
また、メソ多孔性シリカ１３ｂにおける細孔の配向は、ランダムであっても、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたものであっても良い。
メソ多孔性シリカ１３ｂの種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、大きな空隙率を持つという特徴を有する、例えば、ＫＳＷ、ＦＳＭ、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＨＯＭ等の公知の種類を採用することができる。
さらに、メソ多孔性シリカ１３ｂの種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、細孔（チャンネル）の方向が一方向に向いているという特徴を有する、例えば、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等の公知の種類を採用することができる。具体的には、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等は、例えば、図４（ａ）に示すように、陽極酸化アルミナＡが有する円筒形のアルミナ細孔内に界面活性剤を鋳型として作製される、アルミナ細孔の方向と同一のチャンネル方向を有するメソ多孔性シリカ１３ｂのナノチャンネル集合体（一次元シリカナノチャンネルの集合体）が充填されたメソポーラスアルミナのシートである。
また、アルミナ細孔内にメソ多孔性シリカ１３ｂが充填されたメソポーラスアルミナのシートは、例えば、図４（ｂ）に示すようなシート、具体的には、陽極酸化アルミナＡが有する円筒形のアルミナ細孔内に当該アルミナ細孔の内壁に沿って形成されたメソ多孔性シリカ１３ｂ（中空糸状のシリカ構造体）と、アルミナ細孔内に導入されてメソ多孔性シリカ１３ｂ（中空糸状のシリカ構造体）に固定された酵素１３ａと、を備えて構成されるシートであっても良い。図４（ｂ）に示すメソポーラスアルミナのシートにおいて、酵素１３ａは、メソ多孔性シリカ１３ｂ（中空糸状のシリカ構造体）の壁面部分に固定されており、メソ多孔性シリカ１３ｂ（中空糸状のシリカ構造体）の中空部分は、何も充填されていない空洞となっている。
【００２７】
メソ多孔性シリカ１３ｂの細孔のサイズは、当該メソ多孔性シリカ１３ｂに固定する酵素１３ａの立体構造の変化を防止可能な程度に設定されていることが好ましい。これにより、酵素１３ａの立体構造を維持することができ、メソ多孔性シリカ１３ｂの細孔の内部に固定された酵素１３ａ（すなわち、酵素層１３に含まれる酵素１３ａ）を安定化することができる。
具体的には、メソ多孔性シリカ１３ｂの細孔のサイズは、酵素１３ａ（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素１３ａのサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素１３ａのサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。すなわち、メソ多孔性シリカ１３ｂの細孔の直径（中心細孔直径）は、酵素１３ａの直径の０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素１３ａの直径の０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素１３ａの直径とほぼ同等であることが最も好ましい。なお、具体的な中心細孔直径の値は、酵素１３ａの直径との関係で決定されるので一律には規定できないが、例えば、１〜５０ｎｍ程度とすることができる。
【００２８】
ここで、酵素１３ａが多量体を形成する場合には、酵素１３ａのサイズ（径）は、多量体のサイズ（径）とすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
【００２９】
メソ多孔性シリカ１３ｂの比表面積は、例えば、２００〜１５００ｍ２程度である。
メソ多孔性シリカ１３ｂの細孔の深さは、２ｎｍ以上である。具体的には、好ましい深さの範囲は２０〜１０００ｎｍであり、より好ましい深さの範囲は５０〜５００ｎｍであり、最も好ましい深さの範囲は５０〜１５０ｎｍである。
メソ多孔性シリカ１３ｂの細孔のピッチは、細孔のピッチを細孔の中心間の距離と定義すると、好ましいピッチは２〜５００ｎｍであり、より好ましいピッチは２〜１００ｎｍであり、最も好ましいピッチは２〜５０ｎｍである。
【００３０】
液溜形成部１４は、分析領域（作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３が配置された平面視略円形状の領域）を取り囲む円筒状の部材である。基板１１の電極１２が形成された側の面上に液溜形成部１４を配置すると、液溜形成部１４の一方の開口端（下端）側が閉塞されるため、液溜形成部１４内に液体（検出対象物質を含む試料溶液等）を溜めることができる。
【００３１】
ここで、酵素１３ａとして基質と反応して所定の物質を生成する酵素を用いた場合に、本実施形態の酵素センサ１０によって、基質と酵素１３ａの反応により生成する所定の物質を電気化学的に検出する原理の一例について説明する。
基質を乳酸、酵素層１３に含まれる酵素１３ａを乳酸オキシダーゼとし、酵素層１３に電子伝達体としてコバルトフタロシアニンが含まれている場合、液溜形成部１４内に基質（乳酸）を含む試料溶液を注入すると、酵素層１３に含まれる酵素１３ａ（乳酸オキシダーゼ）は、当該基質（乳酸）と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びピルビン酸（Pyruvate）を生成する。生成した過酸化水素は、酵素層１３に含まれる電子伝達体（コバルトフタロシアニン）を介して効率的に電子（ｅ−）を電極１２（作用電極１２１）に渡し、酸素（Ｏ２）になる。この際、作用電極１２１と対電極１２２との間には、還元型のコバルトフタロシアニン（Ｃｏ＋ＰＣ）を酸化型のコバルトフタロシアニン（Ｃｏ２＋ＰＣ）に戻すために電流が流れる。当該電流の値（以下「応答電流値」と称する。）は、試料中の基質の量に比例するため、応答電流値を測定することにより、その測定された応答電流値から試料中の基質（検出対象物質）を検出又は定量することができる。
【００３２】
また、酵素１３ａとして酵素阻害物質によって活性が阻害される酵素を用いた場合に、本実施形態の酵素センサ１０によって、酵素阻害物質によって阻害される酵素１３ａの活性を電気化学的に検出する原理の一例について説明する。
基質をアセチルチオコリン（或いは、ブチリルチオコリン等であっても良い。）、酵素層１３に含まれる酵素１３ａをコリンエステラーゼとし、酵素層１３に電子伝達体としてＴＣＮＱ（テトラシアノキノジメタン）が含まれている場合、液溜形成部１４内に基質（アセチルチオコリン）を含む基質溶液を注入すると、酵素層１３に含まれる酵素１３ａ（コリンエステラーゼ）は、当該基質（アセチルチオコリン）と反応して、チオコリンを生成する。生成したチオコリンは、酵素層１３に含まれる電子伝達体（ＴＣＮＱ）を介して効率的に電子（ｅ−）を電極１２（作用電極１２１）に渡し、ジチオビスコリンになる。この際、作用電極１２１と対電極１２２との間には、還元型の電子伝達体を再酸化する電流が流れる。当該電流の値（応答電流値）は、酵素の活性に比例するため、応答電流値を測定することにより、その測定された応答電流値から酵素１３ａの活性を求めることができる。
【００３３】
酵素阻害物質である有機リン系農薬は、コリンエステラーゼ等の酵素に不可逆的に、また、酵素阻害物質であるカーバメート系農薬は、コリンエステラーゼ等の酵素に可逆的に結合して、触媒作用（活性）を阻害する。
そのため、酵素阻害物質に接触させる前の酵素センサ１０における酵素１３ａの活性と、酵素阻害物質に接触させた後の酵素センサ１０における酵素１３ａの活性と、を比較して、酵素阻害物質によって酵素の活性が阻害されることに伴い生じる酵素の活性の低下度合いから、試料中の酵素阻害物質（検出対象物質）を検出又は定量することができる。
【００３４】
このように、酵素層１３に含まれる酵素１３ａが、基質と反応して所定の物質を生成する酵素である場合には、液溜形成部１４内に基質（検出対象物質）を含む試料溶液を注入して、酵素層１３及び電極１２を試料溶液に接触させるようになっている。
また、酵素層１３に含まれる酵素１３ａが、酵素阻害物質によって活性が阻害される酵素である場合には、液溜形成部１４内に酵素阻害物質（検出対象物質）を含む試料溶液を注入して、酵素層１３及び電極１２を試料溶液に接触させた後、液溜形成部１４内に基質を含む基質溶液を注入して、酵素層１３及び電極１２を基質溶液に接触させるようになっている。
液溜形成部１４内に試料溶液等の溶液を注入すると、気泡が発生して、酵素層１３と作用電極１２１との間、酵素層１３や電極１２の表面、酵素層１３の細孔の内部等に気泡が付着してしまうことがある。本実施形態の場合、酵素層１３を構成する多孔質体や作用電極１２１に親水化処理を施しているが、それでも、気泡が付着してしまう（図９参照）。特に、酵素層１３を構成する多孔質体が、シート状の多孔質体（例えば、アルミナ細孔内にメソ多孔性シリカ１３ｂが充填されたメソポーラスアルミナのシート（図４参照））である場合には、目視で確認できるほど気泡が付着する。
【００３５】
気泡が発生して酵素層１３と作用電極１２１との間や作用電極１２１の表面に気泡が付着すると、作用電極１２１の実効面積が小さくなってしまう。また、気泡が発生して酵素層１３と作用電極１２１との間や酵素層１３の表面や酵素層１３の細孔の内部に気泡が付着すると、当該気泡が大きなものである場合には特に、酵素層１３の気泡に接している部分における酵素反応が妨げられてしまう。このように、気泡が発生すると酵素反応が抑制されるので、酵素センサ１０の応答電流が小さくなり、迅速で高感度な検出を行うことができないという不具合が生じてしまう。また、発生する気泡の大きさや量は制御できないため、同じ手順で測定を行っても発生する気泡の大きさや量がばらつき、その結果、酵素センサ１０の応答電流がばらついて、迅速で高精度な検出を再現性よく行うことができないという不具合も生じてしまう。
【００３６】
そこで、本実施形態では、溶液注入時における気泡の発生を抑制するために、図５に示すような減圧機能付溶液注入装置１００を用いて、酵素センサ１０の液溜形成部１４内に試料溶液等の溶液を注入することとする。なお、図５から図８においては、絶縁膜１５の図示を省略している。
減圧機能付溶液注入装置１００は、液溜形成部１４の他方の開口端（上端）側を閉塞するための上蓋２０と、第１開閉バルブ５１を介して上蓋２０と接続する真空ポンプ３０と、第２開閉バルブ５２を介して上蓋２０と接続する溶液タンク４０と、を備えて構成される。
【００３７】
液溜形成部１４は、液溜形成部１４内を減圧状態にしようとした時に、外気がもれ入ってこないよう、基板１１（或いは絶縁膜１５）との接合部に隙間やピンホールがないことと、液溜形成部１４内を減圧状態にした時に、外気からの圧力に耐えるような強度を持つことと、が重要である。具体的には、例えば、基板１１（或いは絶縁膜１５）と液溜形成部１４とをエポキシ樹脂製接着剤で接着することで、外気がもれ入ってこないよう構成することが可能である。また、液溜形成部１４の材質や厚さなどは、その大きさに依存して決める必要があるが、液溜形成部１４をアクリル樹脂やアルミニウムなどで作製することで、外気からの圧力に耐えるような強度を持たせることが可能である。
【００３８】
上蓋２０は、液溜形成部１４の上端と接する部分に、ゴム製等のパッキン２０ａを備えており、パッキン２０ａが液溜形成部１４と上蓋２０との間に挟み込まれることによって、液溜形成部１４内の密閉性を確保できるよう構成されている。
また、上蓋２０には二つの配管が付けられており、一方の配管には、第１開閉バルブ５１を介して真空ポンプ３０が取り付けられているとともに、もう一方の配管には、第２開閉バルブ５２を介して溶液タンク４０が取り付けられている。
【００３９】
なお、本実施形態では、上蓋２０を、液溜形成部１４とは別体として構成し、液溜形成部１４に着脱自在に装着できるよう構成したが、上蓋２０は液溜形成部１４と一体的に構成されていても良い。
また、真空ポンプ３０は、大気圧から動作するものであれば、油回転式ロータリーポンプであっても、ダイヤフラム式ポンプであっても、或いはその他のポンプであっても良い。
【００４０】
［酵素センサを用いた検出方法］
次に、本実施形態の酵素センサ１０を用いた検出方法の一例について説明する。
なお、図５から図８において、ハッチングしている開閉バルブ（第１開閉バルブ５１、第２開閉バルブ５２）は、閉状態の開閉バルブを示し、ハッチングしていない開閉バルブは、開状態の開閉バルブを示す。また、便宜上、図５から図８において、酵素層１３と作用電極１２１とは離間しているが、実際には、酵素層１３は、作用電極１２１上に載置されて作用電極１２１と接している。
まず、電極１２及び酵素層１３が収納され、第１開閉バルブ５１を介して真空ポンプ３０と連通するとともに第２開閉バルブ５１を介して溶液タンク４０と連通する密閉空間を形成する（形成ステップ）。
具体的には、例えば、図５に示すように、酵素センサ１０に減圧機能付溶液注入装置１００を上方から装着して、図６に示すように、上蓋２０を液溜形成部１４に押し付ける。押し付ける力は、パッキン２０ａが変形して液溜形成部１４内の気密性を保持できる程度で良い。
【００４１】
次いで、第２開閉バルブ５２を閉めた状態で第１開閉バルブ５１を開き、真空ポンプ３０によって密閉空間（液溜形成部１４内）を減圧する（減圧ステップ）。
具体的には、例えば、真空ポンプ３０を動作させた状態で、図７に示すように、第１開閉バルブ５１を開け、液溜形成部１４内の空気を排出することで、液溜形成部１４内を減圧状態にする。減圧状態は１００Ｐａ以下が望ましい。なお、図示した減圧機能付溶液注入装置１００には、圧力を測定する圧力計を設けていないが、圧力計を配管の途中等に設けることで、所望の減圧状態となったか否かを確認することができる。また、一度、排気時間と圧力との関係を測定して、所望の減圧状態となる排気時間を取得しておけば、圧力計を配管の途中等に設けなくても、減圧ステップ中に排気時間を計測するだけで、所望の減圧状態を得ることができる。
【００４２】
次いで、密閉空間（液溜形成部１４内）が所定の減圧状態になると、第１開閉バルブ５１を閉める（第１バルブ閉鎖ステップ）。
具体的には、液溜形成部１４内が所定の減圧状態（所望の減圧状態）になったら、第１開閉バルブ５１を閉め、真空ポンプ３０を停止させる。
【００４３】
次いで、第１開閉バルブ５１を閉めた状態で第２開閉バルブ５２を開き、溶液タンク４０内の溶液を密閉空間（液溜形成部１４内）に注入する（注入ステップ）。
具体的には、例えば、図８に示すように、第２開閉バルブ５２を静かに開け、溶液タンク４０内の溶液を液溜形成部１４内に注入する。なお、図示では、酵素センサ１０に減圧機能付溶液注入装置１００を装着する前の時点から、溶液タンク４０内に溶液が入っているが、これに限定されるものではなく、注入ステップの実行直前までに溶液タンク４０内に溶液が入っていれば、溶液タンク４０内に溶液を入れるタイミングは適宜任意に変更可能である。
【００４４】
その後、酵素センサ１０からの応答に基づいて、試料溶液中の検出対象物質を検出又は定量する（検出ステップ）。
ここで、酵素センサ１０が備える酵素１３ａが、基質と反応して所定の物質を生成する酵素である場合には、注入ステップで減圧状態の液溜形成部１４内に試料溶液を注入した直後に検出ステップを行うことが可能である。一方、酵素センサ１０が備える酵素１３ａが、酵素阻害物質によって活性が阻害される酵素である場合には、注入ステップで減圧状態の液溜形成部１４内に試料溶液を注入した後、液溜形成部１４内に基質溶液を注入してから、検出ステップを行うこととなる。基質溶液を注入する場合、試料溶液を注入する場合と同様、液溜形成部１４内を減圧してから基質溶液を注入しても良いが、その前の試料溶液の注入によって酵素層１３と作用電極１２１との間、酵素層１３や電極１２の表面、酵素層１３の細孔の内部等が濡れているので、液溜形成部１４内を減圧することなく基質溶液を注入しても、酵素層１３と作用電極１２１との間、酵素層１３や電極１２の表面、酵素層１３の細孔の内部等に気泡が付着することはない。すなわち、試料溶液中の検出対象物質を検出するための一連の工程において、液溜形成部１４内に溶液を注入する注入工程が２回以上ある場合には、最初の注入工程のみ減圧状態の液溜形成部１４内に溶液を注入すれば良い。なお、当該最初の注入工程で注入する溶液は、試料溶液以外の溶液であっても良い。すなわち、注入ステップで減圧状態の液溜形成部１４内に注入する溶液は試料溶液であっても、試料溶液以外の溶液であっても良い。
【００４５】
そして、最後に、酵素センサ１０から減圧機能付溶液注入装置１００を取り外す（取り外しステップ）。
なお、減圧機能付溶液注入装置１００を取り外すタイミングは、検出ステップの後に限定されるものではなく、例えば、注入ステップで減圧状態の液溜形成部１４内に溶液を注入した後、検出ステップの前に、減圧機能付溶液注入装置１００を取り外しても良い。
【００４６】
以上説明した本実施形態の検出方法によれば、電極１２と、当該電極１２（具体的には、作用電極１２１）上に設けられた酵素層１３と、を備える酵素センサ１０を用いて試料溶液中の検出対象物質を検出する検出方法であって、酵素層１３は、多孔質体と、当該多孔質体の細孔の内部に固定された酵素１３ａと、からなる層であり、電極１２及び酵素層１３が収納され、第１開閉バルブ５１を介して真空ポンプ３０と連通するとともに第２開閉バルブ５２を介して溶液タンク４０と連通する密閉空間を形成する形成ステップと、次いで、第２開閉バルブ５２を閉めた状態で第１開閉バルブ５１を開き、真空ポンプ３０によって密閉空間（液溜形成部１４内）を減圧する減圧ステップと、次いで、密閉空間（液溜形成部１４内）が所定の減圧状態になると、第１開閉バルブ５１を閉める第１バルブ閉鎖ステップと、次いで、第２開閉バルブ５２を開き、溶液タンク４０内の溶液（試料溶液であっても、試料溶液以外の溶液であっても良い。）を密閉空間（液溜形成部１４内）に注入する注入ステップと、を有し、注入ステップの後に、試料溶液中の検出対象物質を検出するよう構成されている。
【００４７】
したがって、減圧状態にすることによって気泡の原因となる空気を非常に少なくすることができるので、気泡が発生して、酵素層１３と作用電極１２１との間、酵素層１３や電極１２の表面、酵素層１３の細孔の内部等に気泡が付着することを防止できる。
また、減圧状態にすることによって、酵素層１３と作用電極１２１との間や、酵素層１３の細孔の内部等に、必要な溶液を速やかに供給することができる。特に、本実施形態の酵素センサ１０のように、酵素層１３を構成する多孔質体と作用電極１２１とに親水化処理が施してある場合には、溶液のぬれ性が良いため、必要な溶液をより速やかに供給することが可能となる。
すなわち、気泡が発生して酵素センサ１０からの応答が小さくなったり酵素センサ１０からの応答がばらついて測定誤差が生じたりすることを防止できるので、結果として酵素センサ１０を用いて迅速で高感度かつ高精度な検出を再現性よく行うことが可能となる。
【００４８】
なお、本実施形態では、上蓋２０で液溜形成部１４に蓋をして、電極１２及び酵素層１３を密閉空間（液溜形成部１４内）に収納するよう構成したが、これに限定されるものではなく、少なくとも電極１２及び酵素層１３が密閉空間に収納されるのであれば、基板１１等も密閉空間に収納しても良い。具体的には、例えば、酵素センサ１０全体を収納可能で密閉可能な収納容器を減圧機能付溶液注入装置１００に備えて、酵素センサ１０を当該収納容器に収納した状態で、各ステップを行うように構成することも可能である。
【００４９】
以上説明した本実施形態の検出方法によれば、酵素層１３を構成する多孔質体は、シート状の多孔質体である。
したがって、多孔質体（酵素１３ａが固定された多孔質体、或いは、酵素１３ａを固定する前の多孔質体）を作用電極１２１上に取り付ける作業を簡易に行うことができる。また、前述したように、シート状の多孔質体を用いると、気泡の付着を目視で確認できるほど気泡が発生するが、そのような場合でも、本実施形態の検出方法によれば、気泡の発生を抑制することができる。
なお、多孔質体の形状は、シート状に限定されるものではなく、粉末状、顆粒状、バルク状等であっても良い。
【００５０】
なお、今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
また、本発明は、非常に細かいところ（例えば、１μｍ以下の径の孔や隙間）に空気が残留することを防止できるので、酵素センサだけでなく、酵素バイオ電池や酵素リアクターにも応用することができる。
【符号の説明】
【００５１】
１０  酵素センサ
１２  電極
１３  酵素層
１３ａ  酵素
３０  真空ポンプ
４０  溶液タンク
５１  第１開閉バルブ
５２  第２開閉バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図４】
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【図９】
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