(57)【要約】【課題】血液寒天培地で溶血を起こす溶血素産生細菌を検索する場合において、培地性能を保持したまま、従来の血液寒天平板培地に比べて細菌の培養時間を短縮することが可能である検出用培地を提供する。【解決手段】シャーレ１４内に、赤血球を含む血液寒天培地からなる下層１６と赤血球を含まない寒天培地からなる上層１８とを重層し平板培地に形成して、溶血素産生細菌の検出用培地１０を構成した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌を培養しその細菌が産生する溶血素によって血液寒天培地で発現する溶血の状態を観察して細菌を検出するための溶血素産生細菌の検出用培地において、
赤血球が添加された寒天培地と赤血球が添加されていない寒天培地とを重層したことを特徴とする溶血素産生細菌の検出用培地。
【請求項２】
赤血球が添加された寒天培地により下層が形成され、赤血球が添加されていない寒天培地により上層が形成された請求項１に記載の溶血素産生細菌の検出用培地。
【請求項３】
赤血球が添加されていない寒天培地により下層が形成され、赤血球が添加された寒天培地により上層が形成された請求項１に記載の溶血素産生細菌の検出用培地。
【請求項４】
検出対象細菌は腸管出血性大腸菌である請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の溶血素産生細菌の検出用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、腸管出血性大腸菌等の細菌を検出するために用いられる培地であり、より詳しくは、細菌を血液寒天培地上で培養したときに細菌が産生する溶血素により、コロニーの周辺の培地に含まれる赤血球を溶解（溶血）する現象を起こす場合において、その溶血の状態を観察して細菌を検索するために用いられる溶血素産生細菌の検出用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の中には、血液寒天培地上で培養したときに、その細菌コロニーの周辺の培地に含まれる赤血球の細胞膜を破壊してヘモグロビンを溶出させるものが存在することが知られている。このような現象は、微生物学や細菌学の分野で溶血と呼ばれているが、この溶血は、コロニーの周囲の一定領域内で起き、溶血帯（溶血環）として肉眼観察することができる。この溶血は、細菌を培養したときに細菌が溶血素を産生して、その溶血素がコロニーから血液寒天培地中に拡散することによって起こる。溶血性は、細菌の種類によって相違し、通常、α型（不完全溶血）、β型（完全溶血）およびγ型（非溶血）の３つに分類される。α型は、コロニーの周辺に狭い緑色の溶血帯が形成される場合であり、その狭い溶血帯の外側は溶血しているが、内側には赤血球のオキシヘモグロビンがメトヘモグロビンに変化した緑色の部分が見られる。β型は、コロニーの周辺に無色透明に抜けた広い溶血帯が形成される場合であり、その部分の培地中からほとんどの赤血球が消失している。γ型は、溶血が全く認められない場合である。細菌の溶血性は、同一の培養条件下においては細菌の種類によってほぼ一定であるので、この溶血性を利用して細菌の鑑別・同定が行われている。
【０００３】
例えば、ベロ毒素を産生するＯ１５７等の腸管出血性大腸菌は、ベロ毒素のほかに、エンテロヘモリシンと称される特殊な溶血素を産生し、ベロ毒素産生性とエンテロヘモリシン産生性との間に高い相関性があること、したがってベロ毒素産生性と溶血性との間に高い相関性があることが報告されており、その報告を受けて、腸管出血性大腸菌のスクリーニング（探索）に溶血（エンテロヘモリシン産生）を指標とすることが検討され試みられている。これに関連した技術として、志賀毒素（ベロ毒素の一種）を産生する大腸菌の検出を容易にするために、血液寒天培地にエンテロヘモリシン産生誘導剤、細胞膜および細胞壁合成阻害剤といった薬剤を添加して、エンテロヘモリシンの産生を促進し、その溶血性を明瞭にする、といった技術が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
ところで、溶血性の検査に使用される血液寒天培地は、滅菌した寒天培地を加温して溶解した後、５０℃ぐらいの温度に冷まし、寒天が固まる前に羊、馬、兎等の新鮮な赤血球液を寒天培地に対して５％〜１０％の割合で加え、泡立てないように培地成分と赤血球液とを良く混合してから、平板あるいは斜面に固めて製造される。この場合において、平板の血液寒天培地を製造するときは、例えば直径９ｃｍのシャーレを用いるとすると、そのシャーレ内に１８ｍｌ〜２０ｍｌの血液寒天を分注して３ｍｍ程度の厚みの平板培地とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４３９４７７１号公報（第２頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血液寒天平板培地を用いて細菌の溶血性を検査する場合には、白金耳により細菌を平板培地上に画線塗沫し、あるいは、釣菌した白金耳を平板培地にシャーレの底に当たるまで穿刺して植菌し、細菌の培養を行う。溶血性をもつ細菌が培養されて溶血素が産生されると、その溶血素が平板培地の平面方向および厚み方向に拡散して溶血が起こる。このとき、溶血が平板培地の厚み方向の全体に達しない段階では、平板培地を上方から観察しても、またシャーレの底面側から平板培地を観察しても、溶血帯の形成を正しく確認することができないので、或る程度の時間、例えば２４時間培養した後に判定を行う必要がある。そして、例えばβ型溶血が起こっているときは、シャーレの底面側から平板培地を見ると、細菌コロニーの周辺に無色透明に抜けた広い溶血帯を観察することができることになる。
【０００７】
上記したように、細菌の溶血性の検査においては、溶血が平板培地の厚み方向の全体にわたって起こる程度の時間、細菌の培養を行う必要がある。なお、シャーレ内への血液寒天の分注量を少なくして平板培地の厚みを薄くすれば、例えば直径９ｃｍのシャーレ内に９ｍｌ〜１０ｍｌの血液寒天を分注して平板培地の厚みを１．５ｍｍ程度とすれば、溶血が平板培地の厚み方向の全体に達する時間を短縮して培養時間を短くすることができると考えられる。しかしながら、血液寒天平板培地の厚みを薄くすると、培地からの水分蒸発により培地の性能を一定以上に保持することができなくなる。
【０００８】
この発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、血液寒天培地で溶血を起こす溶血素産生細菌を検索するために用いられる培地であって、培地性能を保持したまま、従来の血液寒天平板培地に比べて細菌の培養時間を短縮することが可能である溶血素産生細菌の検出用培地を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
請求項１に係る発明は、細菌を培養しその細菌が産生する溶血素によって血液寒天培地で発現する溶血の状態を観察して細菌を検出するための溶血素産生細菌の検出用培地において、赤血球が添加された寒天培地と赤血球が添加されていない寒天培地とを重層したことを特徴とする。
【００１０】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の検出用培地において、下層が、赤血球が添加された寒天培地により形成され、上層が、赤血球が添加されていない寒天培地により形成されたことを特徴とする。
【００１１】
請求項３に係る発明は、請求項１に記載の検出用培地において、下層が、赤血球が添加されていない寒天培地により形成され、上層が、赤血球が添加された寒天培地により形成されたことを特徴とする。
【００１２】
請求項４に係る発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の検出用培地において、検出対象細菌が腸管出血性大腸菌であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
請求項１に係る発明の溶血素産生細菌の検出用培地においては、赤血球が添加された寒天培地と赤血球が添加されていない寒天培地とで、平板培地の一定の厚みを確保することができる。一方、赤血球を含有することにより赤色を呈する寒天培地の厚みが薄くなるので、細菌の溶血性の検査において、赤血球が添加された寒天培地部分の厚み方向の全体にわたり溶血する時間を短縮することができる。
したがって、この検出用培地を用いて溶血素産生細菌の検索を行うときは、培地性能を保持したまま、従来の血液寒天平板培地に比べて細菌の培養時間を短縮することが可能となる。
【００１４】
請求項２に係る発明の検出用培地では、赤血球が添加された寒天培地に細菌を接種し、例えば、釣菌した白金耳を、赤血球が添加されていない寒天培地からなる上層側から、赤血球が添加された寒天培地からなる下層の底面まで穿刺して植菌し、細菌の培養を行ったとき、溶血性をもつ細菌が培養されて溶血素が産生されると、その溶血素が下層の寒天培地部分の平面方向および厚み方向に拡散して溶血が起こる。そして、溶血が下層の寒天培地部分の厚み方向の全体に及べば、培地をその底面側（あるいは上面側）から見たときに細菌コロニー周辺の溶血帯の形成を正しく確認することができる。
【００１５】
請求項３に係る発明の検出用培地では、赤血球が添加された寒天培地に細菌を接種し、例えば、白金耳により細菌を、赤血球が添加された寒天培地からなる上層面上に画線塗沫し、細菌の培養を行ったとき、溶血性をもつ細菌が培養されて溶血素が産生されると、その溶血素が上層の寒天培地部分の平面方向および厚み方向に拡散して溶血が起こる。そして、溶血が上層の寒天培地部分の厚み方向の全体に及べば、培地をその底面側（あるいは上面側）から見たときに細菌コロニー周辺の溶血帯の形成を正しく確認することができる。
【００１６】
請求項４に係る発明の検出用培地では、腸管出血性大腸菌を検索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】この発明の実施形態の１例を示し、シャーレ内に作成された溶血素産生細菌の検出用培地の縦断面図である。
【図２】図１に示した溶血素産生細菌の検出用培地に植菌している様子を示す縦断面図である。
【図３】図１に示した検出用培地を用いて溶血素産生細菌を培養し溶血が起こっている状態を示す縦断面図である。
【図４】図１に示した検出用培地を用いて溶血素産生細菌を培養し溶血が起こっている状態を示す、シャーレの底面側から見た図である。
【図５】この発明の別の実施形態を示し、シャーレ内に作成された溶血素産生細菌の検出用培地の縦断面図である。
【図６】図５に示した溶血素産生細菌の検出用培地に植菌している様子を示す縦断面図である。
【図７】図５に示した検出用培地を用いて溶血素産生細菌を培養し溶血が起こっている状態を示す縦断面図である。
【図８】図５に示した検出用培地を用いて溶血素産生細菌を培養し溶血が起こっている状態を示す、シャーレの底面側から見た図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、この発明の最良の実施形態について説明する。
図１は、この発明の実施形態の１例を示し、溶血素産生細菌の検出用培地をシャーレ内に作成した平板培地の縦断面図である。
【００１９】
この検出用培地１０は、蓋１２を有するシャーレ１４内に、赤血球が添加された寒天培地と赤血球が添加されていない寒天培地とを順番に分注し冷却固化して形成されている。すなわち、この検出用培地１０は、血液寒天培地からなる下層１６と赤血球を含まない寒天培地からなる上層１８とを重層し平板培地にして形成されている。
【００２０】
上層１８をなす寒天培地としては、細菌の培養に一般的に使用されている組成の寒天培地を使用すればよく、対象となる菌の特性や検査目的等により適当な組成の寒天培地を使用すればよい。例えば、ペプトン、塩化ナトリウムおよび寒天を組成成分とする寒天培地、肉エキス、ペプトン、塩化ナトリウムおよび寒天を組成成分とする寒天培地（普通寒天培地）などが使用される。また、それらの基礎寒天培地に、必要により溶性デンプン、酵母エキス、トリプトース、ビタミン類等の公知の添加成分を含有させることができる。
【００２１】
下層１６をなす血液寒天培地は、上記したような組成の寒天培地に新鮮な赤血球液を加えて調製される。赤血球としては羊赤血球、馬赤血球、兎赤血球などが使用される。赤血球液は、無菌の保存血液または脱繊維素血液（採血直後に繊維素を除いたもの）を遠心分離処理し、その赤血球層を緩衝液で洗浄した後、緩衝液を加えてｐＨ７．２に調整して作製される。血液寒天培地における赤血球の配合割合は、培地に対して例えば１％〜１０％とされる。
【００２２】
次に、図１に示した検出用培地１０を製造する方法について説明する。
所定組成の寒天培地（組成の１例として、ペプトン１２．５ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、塩化カルシウム１．４５ｇ、寒天１５ｇ、水１，０００ｍｌ）を作成しオートクレーブで滅菌した後、５０℃ぐらいの温度に冷まし、寒天が固まる前に新鮮な赤血球液、例えば羊洗浄血球液を５０ｍｌ加え、泡立てないように培地成分と羊洗浄血球液とを良く混合してから、血液寒天培地をシャーレ内に分注して冷却し平板に固める。このとき、例えば直径９ｃｍのシャーレを用いるとすると、そのシャーレ内に９ｍｌ〜１０ｍｌの血液寒天を分注して１．５ｍｍ程度の厚みの平板培地とする。続いて、上記組成の寒天培地（羊洗浄血球液を含まない）を作成しオートクレーブで滅菌した後、適当な温度に冷ましてから、液状の寒天培地をシャーレ内に分注して、固化した血液寒天平板培地上に注ぎ入れ、冷却し平板に固める。このときの分注量は、例えば９ｍｌ〜１０ｍｌとし、これにより、１．５ｍｍ程度の厚みの寒天平板培地が形成され、図１に示したように、血液寒天培地からなる赤色の下層１６と赤血球を含まない寒天培地からなる無色透明の上層１８とが重層された検出用培地１０が得られる。
【００２３】
図１に示した検出用培地１０を用いて溶血素産生細菌、例えば腸管出血性大腸菌の検索を行うときは、図２に示すように、患者や環境などから採取した試料から釣菌した白金耳２０を、上層１８をなす寒天培地に垂直に突き入れ、下層１６をなす血液寒天培地の底面まで穿刺して細菌を接種する。そして、常法により、例えば３７℃の温度で１８時間〜２４時間培養する。図３に縦断面図を、図４にシャーレの底面側から見た図を示すように、細菌が増殖してコロニー２２を形成し、細菌が溶血素を産生すると、その溶血素が下層１６をなす血液寒天培地の平面方向および厚み方向に拡散して溶血が起こる。溶血が下層１６の血液寒天培地の厚み方向の全体に及ぶと、例えばエンテロヘモリジン溶血が起こった場合には血液寒天培地の赤色が部分的に抜けてコロニー２２の周辺に無色透明の溶血帯２４が形成される。この溶血帯２４の形成は、シャーレ１４の底面側から見ることにより正しく確認することができる。
【００２４】
図５は、この発明の別の実施形態を示し、溶血素産生細菌の検出用培地をシャーレ内に作成した平板培地の縦断面図である。
【００２５】
この検出用培地２６は、蓋２８を有するシャーレ３０内に、赤血球を含まない寒天培地からなる下層３２と血液寒天培地からなる上層３４とを重層し平板培地にして形成されている。寒天培地および血液寒天培地の各組成、血液寒天培地の調製方法、使用される赤血球液やその配合割合等は、図１に示した検出用培地１０と同様である。
【００２６】
図５に示した検出用培地２６を製造する方法について説明すると、まず、所定組成の寒天培地（組成の１例として、ペプトン１２．５ｇ、塩化ナトリウム５．０ｇ、塩化カルシウム１．４５ｇ、寒天１５ｇ、水１，０００ｍｌ）を作成しオートクレーブで滅菌した後、適当な温度に冷ましてから、液状の寒天培地をシャーレ内に分注して冷却し平板に固める。このとき、例えば直径９ｃｍのシャーレを用いるとすると、そのシャーレ内に９ｍｌ〜１０ｍｌの血液寒天を分注して１．５ｍｍ程度の厚みの平板培地とする。続いて、上記組成の寒天培地を作成しオートクレーブで滅菌した後、５０℃ぐらいの温度に冷まし、寒天が固まる前に新鮮な赤血球液、例えば羊洗浄血球液を５０ｍｌ加え、泡立てないように培地成分と羊洗浄血球液とを良く混合してから、血液寒天培地をシャーレ内に分注して、固化した寒天平板培地上に注ぎ入れ、冷却し平板に固める。このときの分注量は、例えば９ｍｌ〜１０ｍｌとし、これにより、１．５ｍｍ程度の厚みの血液寒天平板培地が形成され、図５に示したように、赤血球を含まない寒天培地からなる無色透明の下層３２と血液寒天培地からなる赤色の上層３４とが重層された検出用培地２６が得られる。
【００２７】
図５に示した検出用培地２６を用いて腸管出血性大腸菌等の溶血素産生細菌の検索を行うときは、図６に示すように、白金耳２０により細菌を、上層３４をなす血液寒天培地上に画線塗沫して接種する。そして、常法により、例えば３７℃の温度で１８時間〜２４時間培養する。図７に縦断面図を、図８にシャーレの底面側から見た図を示すように、細菌が増殖してコロニー３６を形成し、細菌が溶血素を産生すると、その溶血素が上層３４をなす血液寒天培地の平面方向および厚み方向に拡散して溶血が起こる。溶血が上層３４の血液寒天培地の厚み方向の全体に及ぶと、例えばエンテロヘモリジン溶血が起こった場合には血液寒天培地の赤色が部分的に抜けてコロニー３６の周辺に無色透明の溶血帯３８が形成される。この溶血帯３８の形成は、シャーレ３０の底面側（あるいは上面側）から見ることにより正しく確認することができる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
この発明は、溶血を起こす腸管出血性大腸菌等の細菌の検査を行う医療機関、臨床検査機関などの事業所に提供される溶血素産生細菌の検出用培地を製造する場合に利用される。
【符号の説明】
【００２９】
１０、２６  溶血素産生細菌の検出用培地
１２、２８  シャーレの蓋
１４、３０  シャーレ
１６  血液寒天培地からなる下層
１８  赤血球を含まない寒天培地からなる上層
２０  白金耳
２２、３６  細菌のコロニー
２４、３８  溶血帯
３２  赤血球を含まない寒天培地からなる下層
３４  血液寒天培地からなる上層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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