(57)【要約】【課題】Nrf2活性化剤及びその利用を提供する。【解決手段】インドール吸着剤を有効成分とする、Nrf2活性化剤を提供する。本吸着剤は、腸管等におけるインドールの吸着を介して抗酸化遺伝子であるNrf2遺伝子の発現を増大させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドール吸着剤を有効成分とする、Nrf2活性化剤。
【請求項２】
前記インドール吸着剤は、活性炭である、請求項１に記載のNrf2活性化剤。
【請求項３】
前記インドール吸着剤は、球状活性炭である、請求項１又は２に記載のNrf2活性化剤。
【請求項４】
インドール吸着剤を有効成分として含有する、Nrf2の活性化が有効な障害又は疾患の予防又は改善剤。
【請求項５】
前記疾患は、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）、腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患から選択される、請求項４に記載の予防又は改善剤。
【請求項６】
消化管経由で投与する、請求項４又は５に記載の予防又は改善剤。
【請求項７】
インドール吸着剤と、
以下の式で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物と、
【化１０】
2013231013.tif 000011
(式中、Yは、-H、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、またはC1-C14-アルコキシ、C2-C14-アルケニルオキシ、C2-C14-アルキニルオキシ、C1-C14-アリールオキシ、C2-C14-アラルコキシ、C1-C14-アルキルアミノ、C2-C14-アルケニルアミノ、C2-C14-アルキニルアミノ、C1-C14-アリールアミノ、C3-C10-アリール、もしくはC2-C14-アラルキルアミノであって、これらの基のいずれも、ヘテロ原子置換されているか、またはヘテロ原子置換されていない。)
を有効成分として含有する、Nrf2の活性化が有効な障害又は疾患の予防又は改善剤。
【請求項８】
前記疾患は、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）、腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患から選択される、請求項７に記載の予防又は改善剤。
【請求項９】
消化管経由で投与する、請求項７又は８に記載の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、Nrf2活性化剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Nrf2（nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2）タンパク質は、酸化ストレス応答の遺伝子発現を制御する転写因子であって、ストレス発生時において抗酸化ストレス応答系酵素群の遺伝子発現を活性化する転写因子として知られている。
【０００３】
非酸化ストレス時にあっては、Nrf2タンパク質は、酸化ストレスを感知するKeap1タンパク質と結合し、プロテアソームにより恒常的に分解され、抗酸化ストレスタンパク質の発現が抑制されている。相互作用して、その活性が通常は抑制されている。一方、酸化ストレス時にあっては、Keap1タンパク質とNrf2タンパク質との相互作用が抑制され、その結果、Nrf2は蓄積して細胞核に移行し、抗酸化ストレスタンパク質の遺伝子発現を誘導することが知られている。
【０００４】
したがって、Nrf2タンパク質を活性化する物質は、酸化ストレスによる細胞等への各種の障害を回避又は抑制できると考えられる。
【０００５】
一方、クレメジン（AST-120）は、所定の炭素源を処理して得られる球状活性炭であることが知られている（特許文献１、２）。消化管において、インドールなどの尿毒症毒素を腸管内で吸着し、便ととともに排出し、この結果、インドールが肝臓で酸化され硫酸抱合されてできるインドキシル硫酸の産生が抑制されることがわかっている。
【０００６】
また、腎臓病により腎機能が低下する機序は必ずしも明らかではないが、腎臓での酸化ストレスが亢進し腎組織障害が起きていると考えられている。また、Nrf2タンパク質の発現が低下しているために抗酸化ストレスタンパク質の発現が低下していることが推測されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭６２−１１６１１号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０３９３８１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書は、Nrf2活性化剤及びその利用を提供する。
【０００９】
本発明者は、経口吸着剤であるクレメジンを投与することで、腎臓でのNrf2タンパク質が増加しているという知見を得た。本明細書の開示は、この知見に基づき以下の手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（１）インドール吸着剤を有効成分とする、Nrf2活性化剤。
（２）前記インドール吸着剤は、活性炭である、（１）に記載のNrf2活性化剤。
（３）前記インドール吸着剤は、球状活性炭である、（１）又は（２）に記載のNrf2活性化剤。
（４）インドール吸着剤を有効成分として含有する、Nrf2の活性化が有効な障害又は疾患の予防又は改善剤。
（５）前記疾患は、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）、腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患から選択される、（４）に記載の予防又は改善剤。
（６）消化管経由で投与する、（４）又は（５）に記載の予防又は改善剤。
（７）インドール吸着剤と、
以下の式で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物と、
【化１】
2013231013.tif 000002
(式中、Yは、-H、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、またはC1-C14-アルコキシ、C2-C14-アルケニルオキシ、C2-C14-アルキニルオキシ、C1-C14-アリールオキシ、C2-C14-アラルコキシ、C1-C14-アルキルアミノ、C2-C14-アルケニルアミノ、C2-C14-アルキニルアミノ、C1-C14-アリールアミノ、C3-C10-アリール、もしくはC2-C14-アラルキルアミノであって、これらの基のいずれも、ヘテロ原子置換されているか、またはヘテロ原子置換されていない。)
を有効成分として含有する、Nrf2の活性化が有効な障害又は疾患の予防又は改善剤。
（８）前記疾患は、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）、腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患から選択される、（７）に記載の予防又は改善剤。
（９）消化管経由で投与する、（７）又は（８）に記載の予防又は改善剤。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】AST-120は、尿毒症ラットと比較して、腎臓におけるNrf2とそのターゲットの抗酸化酵素であるHO-1（ヘムオキシゲナーゼ-1）の発現を増大させ、腎尿細管における酸化ストレスマーカーである8-OHdG（8-ヒドロキシデオキシグアノシン）の染色を減少させることを示す図である。正常、尿毒症、およびAST-120投与尿毒症ラットの腎臓から得られた切片は、抗Nrf2、抗HO-1及び抗8-OHdGの各抗体で免疫染色した。
【図２】図２に示す各免疫染色結果において、Nrf2、HO-1及び8-OHdGの免疫染色の陽性領域を定量した結果を示す図である。AはNrf2、BはHO-1及びCは8-OHdGの各陽性領域を示す。
【図３】インドキシル硫酸の投与により、腎臓におけるNrf2とHO-1の発現が減少し、8-OHdGの染色が増加することを示す図である。ダール食塩抵抗性正常血圧ラット（DN）、ダール食塩抵抗性正常血圧のインドキシル硫酸投与ラット（DN+IS）、ダール食塩感受性高血圧ラット（DH）、およびダール食塩感受性高血圧のインドキシル硫酸投与ラット（DH+IS）の腎臓から得られた切片を、抗Nrf2、抗HO-1及び抗8-OHdGの各抗体で免疫染色した。
【図４】図３に示す各免疫染色結果において、Nrf2、HO-1、及び8-OHdGの免疫染色の陽性領域を定量した結果を示す図である。AはNrf2、BはHO-1及びCは8-OHdGの各陽性領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書は、インドール吸着剤が、Nrf2遺伝子の発現を増大させることができるNrf2活性化剤として機能しうることを初めて見出したことに基づいている。典型的なインドール吸着剤である球状活性炭であるクレメジンは、腸管内において、インドキシル硫酸の前駆体であるインドールを吸着し、尿毒症毒素であるインドキシル硫酸の生成を抑制することができることは知られている。しかしながら、インドールの吸着が、抗酸化遺伝子であるNrf2遺伝子の発現を増大させることに寄与していることは知られていなかった。
【００１３】
球状活性炭などのインドール吸着剤は、顕著な副作用は知られていない。このため、本明細書に開示されるNrf2活性化剤は、Nrf2活性化が有効なヒト及び非ヒトの障害又は疾患の予防又は改善剤として有用である。同時に、こうした疾患の予防又は改善方法としても有用である。
【００１４】
本明細書に開示されるNrf2活性化剤は、インドールの吸着に基づくものであるため、他のNrf2活性化剤との併用が有用である。例えば、特開２０１１-５０９４１号公報に開示されるトリテルペノイド（典型的には、バルドキソロンメチル（一般名）が挙げられる。）との併用が有用である。Nrf2活性化剤は、このほか、各種知られており、特開２０１２−８２１７３号公報、特開２０１１−２５６１２６号公報、特開２０１１−２０７８１５号公報に開示される化合物等が挙げられる。
【００１５】
以下、本明細書の開示の各種の形態について詳細に説明する。
【００１６】
（Nrf2活性化剤）
本明細書に開示されるNrf2活性化剤は、インドール吸着剤を有効成分として含むことができる。インドール吸着剤は、当該作用を有していれば特に限定されないが、ヒトや非ヒト哺乳動物等の動物の消化管、特に腸管内におけるインドールを吸着可能であれば、特に限定されない。こうしたインドール吸着剤としては、クレメジン（販売名）として販売されているものを入手できるほか、一般的に入手できる活性炭（不定形のほか、球状活性炭を含む）のほか、公知の方法で製造できる活性炭を取得してもよい。インドール吸着剤としては、球状であることが好ましい。球状であると表面積が大きいため、より大きなインドール吸着能を発揮できるほか、製造工程等における取り扱いにおいて好適である他、経口投与剤として好適であるからである。
【００１７】
活性炭は、材料、製造方法等のほか、その表面積（比表面積）、細孔容量及び表面官能基等の種類により、インドールの吸着能が異なることがありうるが、インドールの吸着能を公知の方法で評価して適宜選択して用いることができる。こうしたインドール吸着剤としては、例えば、特許文献１及び２に記載したもののほか、特開２０１２−５１８７０号公報に開示された吸着剤が挙げられる。なお、インドールの吸着能の評価方法としては、例えば、特開２０１２−５１８７０号に記載の方法を挙げることができる。
【００１８】
（Nrf2の活性化が有効な障害又は疾患の予防又は改善剤）
本明細書に開示されるNrf2の活性化が有効な障害又は疾患の予防又は改善剤は、インドール吸着剤を有効成分として含有することができる。本剤は、上述のようにインドールの吸着によりNrf2の発現を活性化するものであるから、重篤な副作用がない。したがって、予防又は改善剤として有用である。
【００１９】
Nrf2の活性低下は、活性酸素などの酸化ストレスの増大を意味するため、ヒト及び非ヒト動物の各種疾患や障害の発生や憎悪に関連していることが知られている。活性酸素や関連する生体異物により障害を受ける組織は、生体内の任意の組織でありえ、例えば、眼、神経、筋、上皮、血液、リンパ、消化管、血管、脳、骨、関節、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、甲状腺等が挙げられる。組織障害及び疾患の例としては、慢性炎症、癌、動脈硬化、高血圧症、脳神経変性疾患、皮膚疾患、喘息、肝機能障害、角結膜障害、緑内障性網膜症、視神経障害、糖尿病性網膜症、黄斑変性、白内障、光網膜症、糖尿病、紫外線応答性皮膚損傷、好中球減少症、細胞性免疫不全、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症、肺気管支炎、リウマチ性関節炎、肝炎、膵炎、血管炎、食道炎、潰瘍性大腸炎等が挙げられる。なかでも、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）、腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患は、酸化ストレスと関連が大きくかつ病態もＱＯＬに大きく影響するため、本剤が有用である。特に、腎臓疾患（急性腎障害、慢性腎臓病）、腎臓疾患を伴う糖尿病、腎臓疾患を伴う心臓血管疾患が挙げられる。
【００２０】
本剤は、任意の投与形態で投与され得るが、投与形態としては、インドールの吸着剤であるという性質上、投与量にもよるが、消化管経由で投与することが好ましい。好ましくは経口投与である。経口投与のための剤型としては、錠剤、丸剤、カプセル剤（硬カプセル剤及び軟カプセル剤を含む）、散剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ、エリキシル、チュアブル剤、液剤（例えば、ドリンク剤）等が挙げられる。直接、腸管経由で投与してもよい。また、あるいは、体内の血流を体外にある本剤を含むフィルターやカラムを通過ないし循環させて血流内のインドールを吸着除去することも可能である。
【００２１】
本剤にあっては、インドール吸着剤を一種又は二種以上組み合わせて配合してもよい。また、インドール吸着剤のほか、以下の式で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、を有効成分とする合剤あるいは用時に組み合わせて投与する薬剤の組み合わせとしてもよい。
【００２２】
【化２】
2013231013.tif 000003
(式中、Yは、-H、ヒドロキシ、アミノ、ハロ、またはC1-C14-アルコキシ、C2-C14-アルケニルオキシ、C2-C14-アルキニルオキシ、C1-C14-アリールオキシ、C2-C14-アラルコキシ、C1-C14-アルキルアミノ、C2-C14-アルケニルアミノ、C2-C14-アルキニルアミノ、C1-C14-アリールアミノ、C3-C10-アリール、もしくはC2-C14-アラルキルアミノであって、これらの基のいずれも、ヘテロ原子置換されているか、またはヘテロ原子置換されていない。)
【００２３】
当該化合物は、インドール吸着作用によらないでNrf2活性化作用を有するため、両者の作用により、当該化合物の副作用を低減しつつ、Nrf2活性化作用を発揮できる。こうした化合物としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。なかでも、バルドキソロンメチルが好ましい
【００２４】
【化３】
2013231013.tif 000004
【００２５】
【化４】
2013231013.tif 000005
【００２６】
【化５】
2013231013.tif 000006
【００２７】
（バルドキソロンメチル）
【化６】
2013231013.tif 000007
【００２８】
【化７】
2013231013.tif 000008
【００２９】
【化８】
2013231013.tif 000009
【００３０】
さらに、以下の式で表される化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、を有効成分とする合剤あるいは用時に組み合わせて投与する薬剤の組み合わせとしてもよい。
【００３１】
【化９】
2013231013.tif 000010
【００３２】
また、組み合わせて用いる場合において、当該化合物の投与形態は、経口及び非経口のいずれであってもよい。経口の場合には、上記した投与形態が採用できるほか、非経口の場合には、注射、輸液、経皮、経鼻、吸入、坐剤、ボーラス等が挙げられる。
【００３３】
本剤にあっては、有効成分ほか薬学的に許容される担体と組み合わせて配合してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。
【００３４】
本剤の投与量は、投与される個体の状態、体重、性別、年齢、又はその他の要因に従って変動し得る。成人（体重６０ｋｇ）の１日当りのインドール吸着剤の投与量は、０．０１〜１００ｇが好ましく、３〜９ｇがさらに好ましい。本剤は、１日に３回、１日に２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、又は任意の期間及び間隔で投与され得る。
【実施例】
【００３５】
以下、本明細書の開示を具現化した具体例を示す。なお、本明細書の開示は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３６】
以下に、実施例で用いた試薬や実験方法について記載する。
【００３７】
（１）試薬
抗体は、以下のサプライヤーから得た。免疫組織化学法のための抗Nrf2（SC-722）：サンタクルスバイオテクノロジー（サンタクルーズ、カリフォルニア州）、抗HO-1（ab13243）：アブカム（ケンブリッジ、英国）、抗8ヒドロキシデオキシグアノシン（8-OHdG）（MOG-020P）：ジャパン インスティテュート フォ ザ コントール オブ エイジング、NIKKEN SEIL（静岡、日本）、抗ウサギIgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合抗体、抗マウスIgG、HRP-結合型抗体；Cell Signaling Technology（ビバリー、MA、米国）、インドキシル硫酸：アルファAesar社（ランカシャー、英国）
【００３８】
（２）動物実験１
【００３９】
以前に報告された方法（Bolati D, Shimizu H, Niwa T. AST-120 Ameliorates Epithelial-to-Mesenchymal Transition and Interstitial Fibrosis in the Kidneys of Chronic Kidney Disease Rats. J Ren Nutr 22: 176-180, 2012.）に従い、実験ラットを作製した。 7週齢の雄Sprague-Dawleyラット（クレア、東京、日本）を、4/5腎亜全摘により尿毒症ラットを作製した。最初、左腎の腎動脈と静脈を結紮しておき、さらに左腎の5分の3を、カミソリで除去し、トロンビンは止血のために切断面に塗布した。その後、左の腎臓の動脈と静脈の結紮を解除した。最初の手術から１週間後、右腎は、腎動脈と静脈の結紮後に除去した。これらの操作は、ペントバルビタールナトリウム（シェリング・プラウ社、（株）、米国ニュージャージー州）の麻酔下で行った。
【００４０】
腎亜全摘1週間後、ラットを2つのグループに無作為に割り付けて、コントロールの尿毒症ラット（n= 9）及びAST-120投与尿毒症ラット（n= 9）とした。コントロール尿毒症ラットには、粉餌（CE-2、クレア）のみを投与したのに対し、AST-120を10週間、粉餌とともに、４g/ kg /日の用量でラットに経口投与した。なお、正常ラット（n =9）を尿毒症ラットのデータと比較するために使用した。インドキシル硫酸の血清レベルは、高速液体クロマトグラフィーで測定した。
【００４１】
（３）動物実験２
実験ラットは、既報告（Adijiang A, Shimizu H, Higuchi Y, Nishijima F, Niwa T.   Indoxyl sulfate reduces klotho expression and promotes senescence in the kidneys of hypertensive rats. J Ren Nutr 21: 105-109, 2011.）に従い作製した。5週齢のダール食塩抵抗性ラット（ダール・イワイ、n= 16）とダール食塩感受性ラット（ダール・イワイ、n =16）は、日本SLC株式会社（浜松市、静岡県、日本）から購入し、飼料粉ラット餌（CE-2、クレア、東京、日本）で水とで2週間飼育した。その後、餌（CE-2）と水に溶解した塩（1.5％NaCl）とで飼育した。
【００４２】
ダール食塩抵抗性正常血圧ラット（DN、N = 16 ）とダール食塩感受性高血圧ラット（DH、n = 16）との2グループに分け、さらに無作為にコントロールラットとインドキシル硫酸投与ラット（インドキシル硫酸200 mg/kg）とに割り付けた。16週齢で、ダール食塩感受性ラットは>140ミリメートルHgの収縮期血圧（BP）の高血圧となった。
【００４３】
上のことから、4つのグループは以下の通りとなった。
ダール食塩抵抗性正常血圧ラット（DN、n= 8）
ダール食塩抵抗性正常血圧のインドキシル硫酸投与したラット（DN+IS、n =8）
ダール食塩感受性高血圧ラット（DH、n= 8）
ダール食塩感受性高血圧インドキシル硫酸投与したラット（DH+ IS、n =8）
【００４４】
48週齢（試験の32週）目に、ラットを麻酔し、24時間の尿サンプルを代謝ケージで収集した後に、大動脈から血液サンプルを採取した。BPを、空気カフと小動物用の血圧計（UR-5000、上田Avancer（株）、東京、日本）でラットの尾を用いて測定した。腎臓組織を免疫組織化学的分析のために摘出した。
【００４５】
（４）免疫組織化学
ストレプトアビジン−ビオチン複合体（SABC）法を、Nrf2、HO-1及び8-OHdGの免疫組織化学に使用し、4μｍの切片をパラフィン包埋組織から切り出した。その後、切片を、キシレンで脱パラフィンし、エタノールで再水和した。抗原の表出には10 mMクエン酸緩衝液（pH6.0）を用いて５分間のマイクロ波処理を２回行なった。
【００４６】
切片を、内因性ペルオキシダーゼ活性を消去するために3％過酸化水素メタノールで10分間インキュベートし、次いで室温で30分間、10％血清（ニチレイ社、東京、日本）とともにインキュベートした。 4℃で一晩、それぞれの切片を、一次抗体（Nrf2, 1:100; HO-1, 1:50; 8-OHdG 1:20）とインキュベートした。切片を、二次抗体とともに室温で３０分間インキュベートし、その後、３７℃で３０分間ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ、東京、日本）とインキュベートした。
【００４７】
Nrf-2、HO-1および8-OHdGの局在を、0.03％過酸化水素を含む30 mg/mlの濃度の３，３− ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DABタブレット、メルク、ダルムシュタット、ドイツ）を使用して可視化した。切片は、（DN100、E600、ニコン、東京、日本）を用いて撮影した。その後、免疫染色陽性領域はNIHイメージ1.62を使用して腎皮質における10個のランダムな区画で定量した。
【００４８】
（５）統計解析
データは平均値±SEとして表した。免疫組織化学的値の違いは、フィッシャーの最小有意差（LSD）ANOVAのテストによって分析した。P値が0.05未満だったときの結果は統計的に有意であると考えられた。
【実施例１】
【００４９】
（AST-120によるNrf2機能の活性化の評価）
本実施例では、インドキシル硫酸の血清レベルを減少させることによって、尿毒症ラットの腎臓でNrf2の機能を活性化するかどうかを確認した。これらのラットの実験パラメータは、既に報告されている（Bolati D, Shimizu H, Niwa T. AST-120 Ameliorates Epithelial-to-Mesenchymal Transition and Interstitial Fibrosis in the Kidneys of Chronic Kidney Disease Rats. J Ren Nutr 22: 176-180, 2012.）。
【００５０】
実験の10週時点でのインドキシル硫酸の血清レベルは、正常ラットで0.08±0.007 mg / dl、尿毒症ラットで0.52±0.16 mg / dl（P <0.05対正常）であり、AST-120投与尿毒症ラットで0.12±0.02 mg / dl（P<0.05対尿毒症）であった（Bolati D, Shimizu H, Niwa T. AST-120 Ameliorates Epithelial-to-Mesenchymal Transition and Interstitial Fibrosis in the Kidneys of Chronic Kidney Disease Rats. J Ren Nutr 22: 176-180, 2012.）。図１に、各ラットの腎臓から得られた切片の免疫組織化学による染色写真を示し、図２には、Nrf2、HO-1及び8-OHdGの陽性領域の割合（％）を示す。
【００５１】
図１に示すように、Nrf2とHO-1の両方が近位および遠位尿細管を含む尿細管上皮細胞で発現していた。さらに、ROS（reactive oxygen species、活性酸素種）マーカーである8-OHdGの陽性領域が尿細管上皮細胞の核に局在していることがわかった。さらに、図１及び図２から、AST-120は、コントロール尿毒症ラットと比較して、顕著にNrf2発現を腎臓で増加させることがわかった。
【００５２】
また、図１及び図２から、AST-120はコントロール尿毒症ラットと比較して顕著にNrf2の下流の分子であるHO-1の腎臓での発現を増加させていることがわかった。これらの結果から、HO-1は抗酸化遺伝子であるため、AST-120は、尿毒症ラットの腎臓におけるROSを抑制すると推測できた。さらに、図１及び図２に示すように、AST-120投与尿毒症ラットの腎臓における8-OHdGの染色レベルは、尿毒症ラットと比較して大幅に抑制された。以上の結果から、AST-120は、それによって尿毒症ラットの腎臓におけるROSのレベルを下げる、Nrf2の機能を活性化することが推測された。
【実施例２】
【００５３】
（インドキシル硫酸塩のラットの腎臓におけるNrf2の機能の抑制の評価）
本実施例では，インドキシル硫酸塩が腎臓でNrf 2の機能を抑制するかどうかを確認するために、正常血圧と高血圧ラットの腎臓におけるNrf2の発現に対するインドキシル硫酸の影響を評価した。これらのラットの実験パラメータは、既に報告されている（Adijiang A, Shimizu H, Higuchi Y, Nishijima F, Niwa T. Indoxyl sulfate reduces klotho expression and promotes senescence in the kidneys of hypertensive rats. J Ren Nutr 21: 105-109, 2011）。
【００５４】
実験から第32週の時点でインドキシル硫酸の血清レベルは以下のとおりであった。
DNラット：0.10±0.01 mg / dl
DN+ISラット：0.94±0.13 mg / dl（P <0.001対DN）
DHラット：0.06±0.01 mg / dl
DH +ISラット：1.89±0.26 mg / dl（P <0.001対DH）
【００５５】
また、実験から第32週の時点で収縮期血圧は、以下のとおりであった。
DNラット：143±3 mmHg
DN+ISラット：141±３3 mmHg
DHラット：158±5 mmHg
DH +ISラット：158±9 mmHg
【００５６】
図３に、各ラットの腎臓から得られた切片の免疫組織化学による染色写真を示し、図４には、Nrf2、HO-1及び8-OHdGの陽性領域の割合（％）を示す。
【００５７】
図３及び図４に示すように、Nrf2とHO-1の発現レベルは、DNに比較して、DN+IS、DH及びDH＋ISにおいて減少した。一方、8-OHdGの発現レベルは、DNに比較して、DN+IS、DH及びDH＋ISにおいて増大した。さらに、DH+ISの腎臓における8-OHdGの染色レベルは、DHラットに比較して有意に高かった。これらの結果から、インドキシル硫酸は、腎臓におけるNrf2機能を抑制していることがわかった。
【００５８】
以上の結果から、以下のことがわかる。
インドキシル硫酸は、腎障害を促進するが、AST-120は、腸においてインドキシル硫酸の前駆体であるインドールを吸着することによりインドキシル硫酸の血清レベルを低下させ腎臓の機能不全の進行を抑制する。
また、AST-120は、Nrf2の発現を増加させ、尿毒症ラットの腎臓における抗酸化作用を誘導することを明らかにした。すなわち、AST-120は、HO-1の発現を増加させ、腎臓におけるROSを抑制する。
増加したROSは、腎臓近位尿細管細胞の機能不全につながる、壊死、アポトーシス、炎症、線維化を促進することがわかっている。インターロイキン6、腫瘍壊死因子、アンジオテンシンIIなどの増加した液性因子は、尿毒症ラットにおけるROSを誘導するということがわかってきている。したがって、AST-120は、腎臓におけるNrf2の発現増加により、ROSを抑制し、腎機能不全を抑制することができると考えられる。
【００５９】
結論として、AST-120によるインドキシル硫酸の除去は、尿毒症患者の腎臓でNrf2の発現を増加させる、すなわち、AST-120は、Nrf2の活性化剤として作用する。
【００６０】
近年、Nrf2の活性化剤であるバルドキソロンメチルが、腎不全や糖尿病性腎症の進行を弱めることが報告されている。しかし、バルドキソロンメチルは用量依存的に筋肉のけいれんなどの副作用を増加させることがわかっている。AST-120のNrf2活性化剤の作用をバルドキソロンメチルと組み合わせることにより、バルドキソロンメチルの使用量を低減してNrf2活性化と副作用の低減との双方を実現できると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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