(57)【要約】      （修正有）【課題】P-gpによって細胞外に排泄される薬物の効果を判定する方法を提供する。【解決手段】被験者から採取された生物学的サンプルについて、ヒトmiR-145量を測定する工程を含むことを特徴とするP-gpによって細胞外に排泄される薬物の効果を判定する方法によって達成される。このとき、当該薬物が、抗がん薬、免疫抑制薬、抗HIV薬、コルヒチン、ジゴキシン、キニジン、ベラパミル、ステロイドからなる群から選択される一つのものであることが好ましい。また、生物学的サンプルが、血液であることが好ましい。【選択図】図４
2013224860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被験者から採取した生物学的サンプルを固定する工程と、
（Ｂ）ヒトmiR-145量を測定する工程と、
（Ｃ）該工程（Ｂ）に基づき、P-gpによって細胞外に排泄される薬物を検出・測定・判定する工程と、
を備えることを特徴とする薬物効果診断用キット。
【請求項２】
P-gpによって細胞外に排出される薬物が、抗がん薬、免疫抑制薬、抗HIV薬、コルヒチン、ジゴキシン、キニジン、ベラパミル、ステロイドからなる群から選択される一つのものであることを特徴とする薬物効果診断用キット。
【請求項３】
生物学的サンプルが、血液又は尿であることを特徴とする請求項１または２に記載の薬物効果診断用キット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の薬物効果診断用キットを用いて測定する方法であって、被験者から採取された生物学的サンプルについて、ヒトmiR-145量を測定する工程を含むことを特徴とするP-gpによって細胞外に排泄される薬物の効果を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、miR-145がMDR1／P-gpの転写後調節に係る機構に関し、P-gpによって細胞外に排泄される薬物の効果を判定するキットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
Multidrug resistance protein 1 (MDR1)遺伝子にコードされたP-糖タンパクは、細胞外へ薬物を輸送するATP結合カセットトランスポータであり（Schwab et al., 2003：非特許文献は、全て末尾に著書名をアルファベット順にして記載した。）、様々な正常組織（肝臓，小腸，腎臓、脳、胎盤など）に加えがん細胞に発現し、薬物の体内動態制御や抗がん薬耐性に重要な役割を果たしているがん（Cordon-Cardo et al., 1990; Gottesman et al., 2002）。P-gpの発現量及び機能には、大きな個人差が存在することが知られている（Masuda and Inui, 2006）。我々は既報において、肝虚血再灌流後に、小腸におけるP-gpの発現量が上昇することを報告した（Ikemura et al., 2009）。しかしながら、肝虚血再灌流後に小腸のP-gp発現量が増加するメカニズムについては、依然として不明であった。近年、P-gpの発現量及び機能の個人差には、MDR1 mRNA の安定性あるいはmRNA からの翻訳調節が影響している可能性が示され（Kimchi-Sarfaty et al., 2007; Wang and Sadee, 2006）、P-gpの転写後調節機構の解明が重要視されている。
機能性小分子RNAであるマイクロRNA（miRNA）は、新たな転写後調節因子として注目されている（E Eulalio et al., 2008）。miRNAは、標的とするmRNAの3'-非翻訳領域（3'-UTR）に結合することによって、mRNAの分解や翻訳を抑制する（Filipowicz et al., 2008; Kim, 2005）。近年、miRNAの役割は、がん研究領域のみならず、薬物動態領域においても注目を集めており、薬物トランスポータ、薬物代謝酵素、及び核内受容体の転写後調節に関与することが報告されている（Dalmasso et al., 2011; Pan et al., 2009; Takagi et al., 2010; Takagi et al., 2008）。また、miR-27a及びmiR-451が、何らかの転写因子に作用し、間接的にP-gpの発現を調節することが報告されている（Li et al., 2010; Zhu et al., 2008）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、miRNAがMDR1の3'-UTRへの直接的な作用により、P-gpの発現量及び機能を制御するというデータは得られていない。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、P-gpによって細胞外に排泄される薬物の効果を判定するキットなどを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、肝虚血再灌流後の小腸におけるmiRNAの発現変動と、小腸上皮細胞におけるP-gpの転写後調節におけるmiRNAの役割を調べた結果、miR-145がMDR1の3'-UTRへの直接的な作用によって、mRNAからの翻訳抑制を介してP-gpの発現量及び機能を制御することを見出し、本発明を完成するに至った。
こうして、本願発明に係る薬物効果診断用キットは、（Ａ）被験者から採取した生物学的サンプルを固定する工程と、（Ｂ）ヒトmiR-145量を測定する工程と、（Ｃ）該工程（Ｂ）に基づき、P-gpによって細胞外に排泄される薬物を検出・測定・判定する工程と、を備えることを特徴とする。
上記発明において、P-gpによって細胞外に排出される薬物が、抗がん薬、免疫抑制薬、抗HIV薬、コルヒチン、ジゴキシン、キニジン、ベラパミル、ステロイドからなる群から選択される一つのものであることが好ましい。
また、生物学的サンプルが、血液及び尿であることが好ましい。
また、上記課題を解決するための発明に係るP-gpによって細胞外に排泄される薬物の効果を判定する方法は、被験者から採取された生物学的サンプルについて、ヒトmiR-145量を測定する工程を含むことを特徴とする。
P-gpとは、MDR1遺伝子によってコードされた分子量約18万の膜タンパク質である。P-gpは、細胞膜上に存在して細胞毒性を有する化合物などの細胞外排出を行うトランスポータであり、各種の正常組織（例えば、小腸、肺、腎臓の近位尿細管、血液脳関門の毛細血管内皮細胞等）に発現している。P-gpは、ATP-binding Cassette Subfamily B 1(ABCB1)、又はMultidrug resistance protein 1(MDR1)とも呼ばれる。P-gpは1280個のアミノ酸から構成されており、12回膜貫通型の糖タンパク質である。アミノ基側末端及びカルボキシル基側末端は、共に細胞内に存在しており、12個の膜貫通ドメインのうち6個目と7個目の間、及びカルボキシル基末端には、ATP結合ドメインが存在している。
【０００５】
P-gpによって細胞外に排泄される薬物としては、例えば、抗がん薬（イリノテカン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセルなど）、免疫抑制薬（タクロリムス、シクロスポリンAなど）、抗HIV薬、コルヒチン、フェキソフェナジン、ジゴキシン、キニジン、ベラパミル、オセルタミビル、ロペラミド、ステロイドなどが例示される。これらのうち、抗がん薬、免疫抑制薬、またはジゴキシンであることが好ましい。
マイクロRNA(miRNA)とは、細胞内に存在する20〜25塩基程度の1本鎖RNAで、タンパク質には翻訳されないノンコーディングRNA(ncRNA)であり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられている。mature miRNAの元となるDNA配列は、miRNAよりも長く、かつmiRNA配列と、ほぼ相補的な逆向きの配列とを含んでいる。このDNA配列が1本鎖RNAに転写されると、miRNA配列と逆相補配列は結合して2本鎖となり、全体としてヘアピンループ構造をとって、primary miRNA（pri-miRNA）となる。pri-miRNA分子の一部が核内のDroshaによって切断されると、miRNA前駆体（pre-miRNA）となり、次いでpre-miRNA分子はキャリアタンパク質（Exportin-5）によって核外に輸送された後、Dicerによって20-25塩基のmiRNA配列となる。miRNAの一部には、mRNAに相補的な配列（多くは、3'-UTR領域に対する配列）が含まれており、そのmRNAとmiRNAとの結合により、mRNAの翻訳抑制や、mRNAの分解を引き起こすと考えられている。このように、miRNAはタンパク質の翻訳を制御する機能があると考えられている。
【０００６】
miR-145は、miRNAの一種である。miR-145は、5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3'（配列番号１）の配列を有している。miR-145は、様々な組織において、豊富に発現しており、がんの進行に伴いその発現が減少し、腫瘍細胞の発達及び転移の抑制に関連することが見出されつつある。今回の本発明者の知見によって、miR-145がMDR1の3'-UTRへの直接的な作用によって、mRNAからの翻訳抑制を介してP-gpの発現及び機能を制御することが明らかとされた。
生物学的サンプルとは、対象者から体外に採取されたものを意味しており、各組織からの採取片や、血液（血清、血漿、血球（赤血球、白血球を含む））が含まれる。miRNAは、組織中、唾液中、尿中、及びヒト血漿中でも安定に存在することが知られている。このため、本発明においては、簡易かつ繰り返しの採取が行える血液（血漿）又は尿を生物学的サンプルとして利用できる可能性がある。
miR-145の発現量を測定する工程（方法）としては、一般にmiRNAの測定に採用されている方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、RNaseプロテクションアッセイ、TaqManR MicroRNA アッセイを用いることができる。これらのうち、感度等の観点から、TaqMan MicroRNA アッセイを用いることが好ましい。
本発明によれば、被験者から採取された生物学的サンプルについて、ヒトmiR-145量を測定する。miR-145は、MDR1の3'-UTRへの直接的な作用によって、mRNAからの翻訳抑制を介してP-gpの発現及び機能を制御する。このため、miR-145量が低い場合には、P-gpの発現が抑制されず、P-gpによる細胞外への薬物の排泄活性が高いので、薬物の効果が低くなり、薬物投与量を増加させる等の対応を取れる。一方、miR-145量が高い場合には、P-gpの発現が抑制されるため、P-gpによる細胞外への薬物の排泄活性が低いので薬物の効果が高くなり、薬物投与量を減少させる等の対応を取れる。
【発明の効果】
【０００７】
このように、本発明によれば、P-gpによって細胞外に排泄される薬物の効果を判定するキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒト（A）、ラット（B）及びマウス（C）のMDR1 及びMdr1a mRNA の3'-UTRにおいて、miR-145の標的結合部位をmiRandaプログラムによって予測したときの結果を示す図である。
【図２】miR-145, Mdr1a 及び Mdr1b の発現量を小腸上部（A, D, G）、小腸中部（B, E, H）、及び小腸下部（C, F, I）で確認した結果を示すグラフである。miR-145発現量（A, B, C）はRT-PCR法で測定し、U6 snRNA 発現量に基づき補正した。Mdr1a（D, E, F）及びMdr1b（G, H, I）のmRNA量はRT-PCR法で測定し、GAPDHの発現量に基づき補正した。各データは、平均値±S.E.（n=5）にて示した。グラフ中、「*」は、偽処置ラットに比較して5％の危険率で有意であったことを示す（P＜0.05）。
【図３】HEK293細胞において、miR-145がMDR1 mRNAの3'-UTRへの作用を示すグラフである。MDR1 mRNAの3'-UTR配列を導入したレポータープラスミド（50 ng）と、miR-145前駆体（10, 30, 50 nM）またはmiR-コントロール前駆体（50 nM）またはVehicle（Control）をHEK293細胞にコトランスフェクションし、24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。各データは、3回の独立した試験結果の平均値±S.E.にて示した。グラフ中、「**」はコントロールに比較して1％の危険率（P＜0.01）で有意であったことを、「***」はコントロールに比較して0.1％の危険率（P＜0.001）で有意であったことを示す。
【図４】Caco-2細胞において、miR-145阻害物質がmiR-145, MDR1 mRNA 及びP-gpの発現量に対して与える影響を確認した試験結果を示すグラフである。Caco-2細胞に50nM miR-145阻害物質または50nM miR-コントロール阻害物質またはVehicle（Control）をトランスフェクションした後、48時間経過後のデータを示した。（A）miR-145量はRT-PCT法によって測定し、U6 snRNA 発現量に基づき補正した。（B）MDR1 mRNA量はRT-PCR法によって測定し、GAPDH 発現量に基づき補正した。（C）Caco-2細胞におけるP-gp及びVillinの発現量は、ウエスタンブロット分析によって求めた。（D）P-gp発現量は、Villinのデータに基づき補正した。各データは、3回の独立した試験結果の平均値±S.E.にて示した。グラフ中、「*」は、コントロールに比較して5％の危険率で有意であったことを示す（P＜0.05）。
【図５】Caco-2細胞において、P-gpを介したRho123輸送活性を示す結果である。Caco-2細胞に50nM miR-145阻害物質または50nM miR-コントロール阻害物質またはVehicle（Control）をトランスフェクションした。48時間後にシクロスポリンＡ（CsA; 10μM）の存在下または非存在下において、1μM ローダミン123（Rho123）と共に37℃、1時間インキュベーションした。（A）CsAの存在下または非存在下におけるCaco-2細胞中のRho123蓄積量を示すデータである。（B）CsAの存在下におけるRho123の細胞内蓄積量からCsAの非存在下におけるRho123の細胞内蓄積量を減算することによって算出した、P-gpを介したRho123の輸送活性を示すデータである。各データは、3回の独立した試験結果の平均値±S.E.にて示した。グラフ中、「*」は、コントロールに比較して5％の危険率で有意（P＜0.05）であったこと示す。「††」は、CsA非存在下のCaco-2細胞中のRho123の蓄積量に比較して1％の危険率で有意（P＜0.01）に相違したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶ。
材料と方法
＜試験材料＞
miR-145前駆体（Pre-miRTM miRNA precursor, AM17100, プロダクトID PM11480）、miR-145阻害物質（Anti-miRTM inhibitor, AM17000, プロダクトID AM11480）、miR-145前駆体に対するコントロールオリゴ（Pre-miRTM Negative control, AM17110）、及びmiR-145阻害物質に対するコントロールオリゴ（Anti-miRTM  Negative control、AM17010）は、Ambion社（Austin, TX, USA）から入手した。Rho123は、和光純薬から入手した。その他の試薬は、全て利用可能な最高純度のものを用いた。
【００１０】
＜動物＞
9週齢のWistar系雄性ラットを実験に使用した（SLCジャパン株式会社より入手）。ラットは、実験前12時間絶食させ、水は自由摂取させた。本実験は、動物実験のための三重大学審査委員会によって承認され、アメリカ国立衛生研究所（NIH）のガイドライン（Institute of Laboratory Animal Resources, 1996）に従って実施した。
肝虚血再灌流モデルラットの詳細は、我々の既報に報告の通りである（Ikemura et al., 2009）。簡単に説明すると、ラットに50 mg/kgのペントバルビタールを腹腔内投与した後、血管クリップを使用して肝臓の左葉及び中葉への血流を60分間遮断することにより、70%肝部分虚血を起こさせた。模擬処置ラットは、肝臓の左葉及び中葉への血流遮断を行うことなく、それ以外は同じ処置を行った。再灌流から12時間後、小腸（上部、中部、および下部）の組織を採取した。
【００１１】
＜Total RAN抽出とRT-PCR＞
Total RNAは、mirVanaTM miRNA分離キット（Ambion、Austin, TX,）を用いて単離した。miRNAはTaqManR MicroRNA 逆転写キットおよびmiR-145とU6に対するTaqManR MicroRNAアッセイ（いずれもApplied Biosystems, Foster, CA, USA）を使用し、ステムループ・ハイブリダイゼーションによりTotal RNAから目的のmature miRNAのみを逆転写した。 MDR1 mRNA発現量に対しては、PrimeScriptTM RT試薬キット（タカラバイオ株式会社）を用い、添付のマニュアルに従って、Total RNA（100 ng）からcDNAを合成した。その後、cDNAは、SYBRR Premix Ex TaqTM（タカラバイオ株式会社）を用いてRT-PCRを行った。PCRに用いたプライマーは、次の通りであった。ヒトMDR1センス5'-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3'（配列番号２）、ヒトMDR1アンチセンス5'-TGTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3'（配列番号３）、ラットMdr1aセンス5'-GACGGAATTGATAATGTGGACA-3'（配列番号４）、ラットMdr1aアンチセンス5'-GTACGTCGTCATCCAGAGC-3'（配列番号５）、ラットMdr1bセンス5'-GAAATAATGCTTATGAATCCCAAAG-3'（配列番号６）、ラットMdr1bアンチセンス5'-GGTTTCATGGTCGTCGTCTCTTGA-3'（配列番号７）、ヒトおよびラットGAPDHセンス5'-CCTTCATTGACCTCAACTA-3'（配列番号８）、ヒトおよびラットのGAPDHのアンチセンス5'-GGAAGGCCATGCCAGTGAG-3'（配列番号９）。特定のDNA産物の増幅と検出は、ABI7300 Sequence Detection System（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて行った。miR-145発現量は、U6 sn RNA発現量に基づき補正した。MDR1 mRNA発現量は、GAPDH発現量に基づき補正した。
【００１２】
＜RNAラベリングとmiRXploreTM マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション＞
単離したRNAサンプルの品質と安定性は、Agilent2100バイオアナライザープラットフォーム（Agilent Technologies, Boeblingen, Germany）を用いて評価した。RNAサンプルは、miRXploreTM社（Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany）のプロトコールに従い、模擬処置ラットと肝虚血再灌流後のラットから得られた小腸上部サンプルを、それぞれHy3とHy5で標識した。その後、標識したサンプルは、HybTMハイブリダイゼーション・ステーション（Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany）を使用して、miRXploreTMマイクロアレイによって、一晩ハイブリダイズさせた。
【００１３】
＜miRXploreTMマイクロアレイによる解析＞
ハイブリダイズしたmiRXploreTMマイクロアレイの蛍光シグナルは、レーザスキャナシステム（Agilent Technologies, Boeblingen, Germany）を用いて検出した。miRXploreTMマイクロアレイイメージにおける各スポットの平均シグナルと平均バックグラウンド強度を測定するために、 ImaGeneRソフトウェア（Biodiscovery, El Segundo）を使用した。PIQORTMアナライザ・ソフトウェア（Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany）を用い、バックグラウンドを減算処理した後、正味のシグナル強度のデータの正規化を行い、miRNAのHy5／Hy3比率を計算した。カットオフ値を1.5倍と設定した。
【００１４】
＜細胞培養＞
培養ヒト腸上皮細胞がんCaco-2と、ヒト胎児腎由来の細胞株HEK293は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Rockville, MD,USA）から入手した。Caco-2細胞は、10％ウシ胎児血清および1％非必須アミノ酸を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で、抗生物質を添加しないで培養し、継代数40〜60の間で使用した。 HEK293細胞は、10％ウシ胎児血清を含むDMEMで、抗生物質を添加しないで培養し、継代数60〜70の間で使用した。これらの細胞は、加湿大気中5％二酸化炭素下で37℃で培養した。
【００１５】
＜Caco 2細胞へのmiR-145阻害物質のトランスフェクション＞
SiPORTTM NeoFXTMトランスフェクション試薬（Ambion, Austin, TX, USA）とOpti-MEMI培地（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用し、操作手順に従って、プラスチックプレート上で培養したCaco-2細胞に対し、50 nM miR-145阻害物質、50 nM miRコントロール阻害物質、またはVehicleをトランスフェクションした。48時間後、Rho123輸送活性の測定、または、細胞からTotal RNAおよびタンパク質を抽出した。
【００１６】
＜ルシフェラーゼ・アッセイ＞
MDR13'-UTRの683 塩基対の断片をpLightSwitchレポーターベクター（Swithgear Genomics, Menlo Park, CA, USA）のルシフェラーゼ遺伝子の下流に挿入した。96ウェルプレート上で培養したHEK293細胞に対し、リポフェクタミン2000（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて、50ng のMDR1 3'-UTRレポータープラスミドと50nMのmiR-145前駆体またはコントロール前駆体とをコトランスフェクションした。24時間後、細胞のルシフェラーゼ活性をLightSwtchルシフェラーゼアッセイsystemTM（Swithgear Genomics, Heidelberg, Germany）とAppliskanTMルミノメーター（Thermo scientific, USA）を用いて測定した。
【００１７】
＜P-gpに対するウエスタンブロッティング＞
Caco-2細胞から単離したタンパク質（12.5μg）を7.5％SDS-PAGEにより分離した。C219モノクローナル抗体（Calbiochem, San Diego, CA, USA）を用いてP-gpに対するウエスタンブロット法を既報に従って（Shimomura et al., 2002）実施した。Villinに対するポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA）を添付のマニュアルに従って使用した。各レーンのバンドの相対強度は、画像処理ソフトウエア：Image J 1.38（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）を用いて測定し、P-gpとVillinの強度比を求めた（Omae et al., 2005）。
【００１８】
＜Caco 2細胞によるRho123輸送試験＞
Caco-2細胞を用いてRho123の細胞内蓄積量を調べた。使用したインキュベーション溶液の組成は、145 mM NaCl、3mM KCl、1mM CaCl2、0.5mM MgCl2、5mM D-glucose、5mM HEPES（pH7.4）であった。培養用培地を除去した後、上記インキュベーション溶液にて細胞を1回洗浄した後、P-gp阻害薬であるシクロスポリンA（10μM）の存在下または非存在下で、37℃にて30分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、細胞を10μM シクロスポリンAの存在下または非存在下で、1μM Rho123と共に、37℃にて1時間インキュベーションした。その後、薬液を除去し、氷冷した3％牛血清アルブミンを含むインキュベーション培地にて1回、氷冷したインキュベーション培地にて2回洗浄した。細胞を1N NaOHで可溶化し、細胞のタンパク量をクマシー・ブリリアント・ブルー・タンパク質アッセイキット（ナカライテスク）を使用して、Bradford法（Bradford, 1976）により測定した。このとき、ウシγグロブリンを標準品として用いた。Rho123の細胞内蓄積量を確認するために、抽出溶液1mL（インキュベーション溶液：メタノール=50：50）で溶出し、HPLCによりRho123の測定を行った。 HPLC分析には、HPLCシステム（LC-20AB、島津製作所）を使用し、逆相Chemcobond 5-ODS-Hカラム（4.0×150ミリメートル、株式会社ケムコ）と蛍光検出器（RF-10AXL、島津製作所）を用いた。カラム温度は40℃に設定した。Rho123の溶出には、20mM 酢酸ナトリウム（pH4.0）：メタノール=20：80を使用し、1 ml/minの流速で行った。蛍光検出器の波長は、励起波長488 nm、測定波長535 nmとした。
【００１９】
＜統計解析＞
すべてのデータは、平均値±S.E.として表した。統計解析は、GraphPad Prism5.02（GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA）を用い、ダネット検定に続けて、一元配置分散分析を行った。2群間の差は、対応のないt-検定によって行った。有意水準はp＜0.05とした。
【００２０】
試験結果
＜肝虚血再灌流後の小腸におけるmiRNA発現変動とMdr1aおよびMdr1b mRNA発現量＞
偽処置ラット及び肝虚血再灌流処置ラットの小腸上部から単離したRNAサンプルをmiRbase version 16.0に準じたmiRExploreTM マイクロアレイを用いて475個種類のラットmature miRNAに対してスクリーニングしたところ、模擬処置ラットに比較し、1.5倍以上に上昇または1.5分の1以下に減少したmiRNAのリストを表１に示した。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
肝虚血再灌流後の小腸上部において、10種類のmiRNAが減少し、4種類のmiRNAが増加していた。これらのmiRNAのうち、miRandaプログラムを用いた標的予測検索により、ヒト、ラット、及びマウスにおいて、減少が認められたmiR-145のみが、MDR1及びMdr1aの3’-UTRに相補的配列を有し、MDR1及びMdr1a遺伝子の発現を調節する因子である可能性が示された（図1）。一方、マイクロアレイ解析から検出された他のmiRNAは、MDR1及びMdr1aの3'-UTRに相補的配列は存在しなかった。更に、模擬処置ラット及び肝虚血再灌流後ラットから抽出したTotal RNAを用いたRT-PCR解析によって、小腸におけるmiR-145発現量を測定した。図2A, 2B及び2Cには、各ラット群の小腸におけるU6 snRNA発現量に基づき補正したmiR-145発現量を示した。肝虚血再灌流後の小腸上部（2A）、小腸中部（2B）、及び小腸下部（2C）のmiR-145量は、模擬処置ラットのmiR-145発現量に比べると、それぞれ約33%、47, 48%に減少していた。このデータは、マイクロアレイ解析の結果とほぼ同様の結果であった（表1）。模擬処置ラット及び肝虚血再灌流後ラットの小腸上部、小腸中部、及び小腸下部の Mdr1a mRNA 発現量及び Mdr1b mRNA 発現量をRT-PCR解析によって評価した（図2D-2I）。模擬処置ラット及び肝虚血再灌流後ラットの両群において、小腸の Mdr1a 及びMdr1b mRNA 発現量には有意な差違が認められなかった。
【００２３】
＜HEK293細胞におけるMDR1の3'-UTRに対するmiR-145の抑制効果＞
miR-145がMDR1 mRNAの3'-UTRに対して直接作用する否かを確認するために、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の下流に miR-145予想標的結合部位を含むMDR1 の3'-UTR配列を導入し、このレポータプラスミドとmiR-145前駆体またはmiR-コントロール前駆体をHEK293細胞にコトランスフェクションした。MDR1 の3'-UTRに対するmiR-145の抑制効果をHEK293細胞のルシフェラーゼ活性を測定することにより評価した。図3に示すように、ルシフェラーゼ活性は、miR-145の過剰発現により、用量依存的に有意に減少した。一方、miR-コントロール前駆体では、ルシフェラーゼ活性への有意な影響は認められなかった。
【００２４】
＜Caco-2細胞におけるMDR1 mRNA及びP-gp発現量に対するmiR-145の役割＞
miR-145を介したP-gpの発現調節を確認するために、Caco-2細胞にmiR-145阻害物質、miR-コントロール阻害物質、またはVehicle（コントロール）をトランスフェクションした。miR-コントロール阻害物質をトランスフェクションした場合には、miR-145発現量に対しては何の影響も及ぼさなかった。miR-145阻害物質をトランスフェクションすると、48時間後にはCaco-2細胞中のmiR-145量は、コントロールに比較し、16％程度に減少を示した（図4）。このことから、miR-145阻害物質のトランスフェクションにより、miR-145発現量がノックダウンされていることが確認された。
Caco-2細胞へのトランスフェクションから48時間後に、Total RNAを使用して、MDR1のmRNA濃度をRT-PCR法によって測定した。図4Bには、GAPDH発現量に基づき補正したMDR1のmRNA発現量を示した。MDR1 mRNA発現量は、miR-145阻害物質またはmiR-145コントロール阻害物質のトランスフェクションによっては、変化はみられなかった（図4B）。トランスフェクションから48時間後のCaco-2細胞から得られたサンプルについて、P-gp及びVillinの発現量をウエスタンブロット法で比較した（図4C）。図4Dには、Villinのシグナルに基づき補正したP-gp発現量の結果を示した。P-gp発現量は、コントロールに比べると、miR-145阻害物質のトランスフェクションによって、約160％程度まで上昇した。一方、miR-145コントロール阻害物質のトランスフェクションによっては、P-gp発現量は変化しなかった。
【００２５】
＜Caco-2細胞におけるP-gpの機能に及ぼすmiR-145の影響＞
P-gpの排泄輸送活性に対するmiR-145の役割を調べるために、Caco-2細胞にmiR-145阻害物質、miR-コントロール阻害物質、またはVehicle（コントロール）をトランスフェクションしたときのP-gpを介したRho123輸送機能をシクロスポリンA（CsA, P-gp阻害物質）を用いて調べた。図5Aに示すように、miR-145阻害物質をトランスフェクションしたCaco-2細胞では、CsA非存在下のRho123細胞内蓄積量は、Vehicle（コントロール）に比較すると有意ではないものの、減少する傾向にあった。miR-145阻害物質またはmiR-コントロール阻害物質をトランスフェクションしたCaco-2細胞では、CsA存在下のRho123細胞内蓄積量は、CsA非存在下の細胞内蓄積量に比較すると有意に増大した。図5Bには、CsAの存在下におけるRho123の細胞内蓄積量からCsAの非存在下でのRho123の細胞内蓄積量を減算することによって算出したP-gpを介したRho123の輸送活性を示した。miR-145阻害物質をトランスフェクションしたCaco-2細胞では、P-gpを介したRho123の輸送活性は、コントロールの約280％まで増加した。一方、miR-145コントロール阻害物質をトランスフェクションしたCaco-2細胞では、P-gpの機能に対しては、影響が認められなかった。
【００２６】
＜考察＞
P-gp（MDR1）は、薬物体内動態やがん細胞の薬剤耐性を規定する排泄トランスポータである。肝虚血再灌流後に小腸におけるP-gp発現量が上昇することは解明してきたが、この現象に関する詳細なメカニズムは、依然として不明のままである。miRNAは、薬物トランスポータや薬物代謝酵素の転写後調節を通じて、薬物体内動態変動や薬剤耐性獲得に重要な役割を果たしている。本研究の目的は、肝虚血再灌流後における小腸でのmiRNAの発現変動と、小腸上皮細胞におけるP-gpの転写後調節に及ぼすmiRNAの役割を調べることである。
まず、肝虚血再灌流後における小腸のP-gp発現量上昇の調節機構を探る為、小腸各部位におけるMdr1a及びMdr1b mRNA発現量について検討した（図2）。しかしながら、すべての部位においてMdr1a及びMdr1b mRNA発現量に、2群間で有意な差はみられなかったことから、肝虚血再灌流後におけるP-gp発現量上昇には転写調節ではなく、転写後調節の関与の可能性が示された。次に、miRNAを介したP-gpの転写後調節機構を探るために、模擬処置ラットと肝虚血再灌流後ラットを用いて、小腸上部におけるmiRNAの発現変動を比較した。表１に示すように、肝虚血再灌流後ラットでは、小腸上部において様々なmiRNAの発現量の変動が示された。これらのうち、miRandaプログラムを用いた解析によって、減少がみられたmiR-145は、MDR1 及びMdr1a mRNAの3'-UTRに相補的配列を持つことから、miR-145の発現減少に着目した（図1）。RT-PCRによって小腸上部、中部、下部のmiR-145発現量を測定したところ、それぞれ約33％、47%、48%まで減少が認められた(図２)。
【００２７】
この結果は、表1に示すようにマイクロアレイ解析の結果とほぼ同様であった。以上より、P-gp発現量とmiR-145発現量は、負の相関を示した。一方で、マイクロアレイ解析により検出された他のmiRNAには、MDR1及びMdr1aの3'-UTRに対する相補的配列は認められなかったものの、他のmiRNAが、何らかのP-gpの転写因子に作用し、間接的にP-gpの翻訳を調節する可能性は否定できない。さらに、miR-21は、肺がん細胞において、腫瘍抑制タンパク質であるprogrammed cell death 4(PDCD4）の発現制御を介して、P-gpの発現を増加させることが報告されている（Bourguignon et al., 2009）。本研究では、表1のマイクロアレイ解析の結果に示すように、肝虚血再灌流後にmiR-21の発現量は増加していた。データには示さないが、RT-PCR解析の結果では、模擬処置ラットと肝虚血再灌流後ラットとにおいてmiR-21の発現には有意差が認められなかったことから、肝虚血再灌流後における小腸のP-gp発現量の増加は、miR-21を介した発現調節の関与は少ないものと考えられた。
【００２８】
MDR1がmiR-145によって直接的に制御されているか否かを確認するために、HEK293細胞を使用して、MDR1の3'-UTRを含むプラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイを行った（図3）。その結果、MDR1はmiR-145によって制御されていることが示された。次いで、Caco-2細胞を用いて、miR-145がP-gpに関して、タンパク質レベル、mRNAレベル、及び機能に如何なる影響を及ぼしているかをノックダウン・アプローチによって調べた。miR-145阻害物質をトランスフェクションしたところ、MDR1 mRNA発現量は変化させずに、P-gp発現量を増加させると共に、Rho123輸送活性を増加させることが分かった。（図4B,4C,4D,5B）。これらの結果より、P-gpはmiR-145によって調節を受けており、その制御機構は、MDR1の3'-UTRへの直接的な作用によってmRNAからの翻訳を抑制することであると分かった。これらの知見は、miRNAが、MDR1の3'-UTRへの直接的な作用によって、P-gpの発現を制御することを示す初めてのものである。
【００２９】
miR-145は、小腸（細胞当たり7942コピー）、腎臓（細胞当たり2130コピー）、脳（細胞当たり991コピー）、及び肝臓（細胞当たり606コピー）を含め、正常のヒト組織においても偏在的かつ豊富に発現している（Lee et al., 2008）。多くの研究報告によれば、miR-145の発現量は、結腸がん（Michael et al., 2003）、乳がん（(Iorio et al., 2005; Kim et al., 2011）、及び肺がん（Yanaihara et al., 2006）を含む種々のがん細胞においてその発現量が減少していることが知られ、腫瘍細胞の発達及び転移の抑制に関わるがん抑制miRNAとしての役割について幅広い研究がなされている。また、がんShiらによれば、miR-145を過剰発現させると、グルココルチコイドによって引き起こされる抗がん薬耐性が減弱し、P-gpの基質であるマイトマイシンへの感受性が増大すると報告している（Shi et al., 2012）。このように、miR-145は、がんの発生機構やがん細胞の薬剤耐性についても重要な役割を果たしている。
【００３０】
本研究の結果、miR-145が、MDR1の3'-UTRへの直接的な作用によって、mRNAからの翻訳抑制を介してP-gpの発現及び機能を制御することが明らかとなった。また、肝虚血再灌流後の小腸上皮細胞に発現するP-gpの発現・機能上昇にも深く関与するものと考えられた。更に、本研究は、P-gp発現量及び機能の個体差に関する新規メカニズム及びがん細胞の薬剤耐性に関する理解を深めるデータを提供するものであると考えられた。
このように、本実施形態によれば、MDR1によって細胞外に排泄される薬物の効果を判定するキット及び方法を提供できた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００３１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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