(57)【要約】      （修正有）【課題】外来性遺伝子からのタンパク質発現効率を向上させることができる、新規化合物を提供。【解決手段】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるＳＡＨＡ（suberoylanilide hydroxamic acid）を修飾したＳＡＨＡ誘導体。遺伝子発現効率向上効果を有するため、遺伝子発現増強剤として有用である。また、該化合物は、外来性遺伝子の発現を効果的に向上させることができるため、外来性遺伝子導入剤と共に使用される遺伝子導入剤補助剤としても有用である。2013184940.tif 000032【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2013184940.tif 000024
［式中；
Ｘは一般式（２）：
【化２】
2013184940.tif 000025
（式中；Ｒ１は、各出現において独立して、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基を示し、ｍは、０〜３の整数を示す。）
で表される一価の基、
式（３）：
【化３】
2013184940.tif 000026
で表される一価の基、
一般式（４）：
【化４】
2013184940.tif 000027
（式中；Ｒ２は各出現において独立して、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基を示し、ｎは０〜３の整数を示す。）
で表される一価の基、又は
式（５）：
【化５】
2013184940.tif 000028
で表される一価の基を示す。
Ｙは、二価の炭化水素基を示す。
Ｚは、式（６）：
【化６】
2013184940.tif 000029
で表される二価の基、
式（７）：
【化７】
2013184940.tif 000030
で表される二価の基、又は
一般式（８）：
【化８】
2013184940.tif 000031
（式中；ｐは０〜１０の整数を示す。）
で表される二価の基を示す。
Ｒ３は、一価の炭化水素基を示す。
Ｒ４は、一価の炭化水素基を示す。］
で表される化合物及び／又はその塩。
【請求項２】
Ｚが式（６）で表される二価の基である、請求項１に記載の化合物及び／又はその塩。
【請求項３】
Ｘが一般式（２）で表される一価の基である、請求項１又は２に記載の化合物及び／又はその塩。
【請求項４】
Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して炭素数９〜２５のアルケニル基である請求項１〜３のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩。
【請求項５】
Ｙが炭素数２〜１０のアルキレン基である請求項１〜４のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩を含有する、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩を含有する、遺伝子発現増強剤。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩を含有する、遺伝子導入剤補助剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、並びに該化合物を含有するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、遺伝子発現増強剤、及び遺伝子導入剤補助剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、種々の分野において、外来性遺伝子を細胞内に導入して発現させる技術が用いられている。例えば、遺伝子治療の分野においては、内在性の異常遺伝子による機能不全を補償する目的で、外来性の正常遺伝子を細胞内に導入し、該正常遺伝子から正常タンパク質を発現させることにより治療することが試みられている。別の例として、ＲＮＡ干渉の分野においては、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を発現させることができるプラスミドＤＮＡを細胞内に導入し、該ＤＮＡから発現させたｓｉＲＮＡにより、目的遺伝子発現の抑制を行うことが行われている。
【０００３】
これらの分野においては、外来性遺伝子からの遺伝子発現効率の低さが問題になることが多い。上記遺伝子治療の分野でいえば、外来性の正常遺伝子からの正常タンパク質の発現効率が十分でないため、異常遺伝子による細胞の機能不全を十分に補償できないことが問題となる。そこで、外来性遺伝子からの遺伝子発現効率を向上させる化合物の開発が求められている。
【０００４】
このような化合物として、非特許文献１には、公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が記載されている。非特許文献１においては、これらの公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、外来性遺伝子からの遺伝子発現効率を向上させたことが記載されている。しかしながら、これらの化合物の遺伝子発現効率向上効果は依然として不十分であるため、より優れた遺伝子発現効率向上効果を有する新規化合物の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】日本薬学会  第１３１年会  要旨集  ポスター発表２９Ｐ−０４５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、外来性遺伝子からの遺伝子発現効率を向上させることができる新規化合物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、鋭意研究の結果、公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるＳＡＨＡ（suberoylanilide hydroxamic acid）を修飾したＳＡＨＡ誘導体が、外来性遺伝子からの遺伝子発現効率を顕著に向上させることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は、下記の構成を有するものを包含する。
【０００９】
項１．
一般式（１）：
【００１０】
【化１】
2013184940.tif 000002
【００１１】
［式中；
Ｘは一般式（２）：
【００１２】
【化２】
2013184940.tif 000003
【００１３】
（式中；Ｒ１は、各出現において独立して、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基を示し、ｍは、０〜３の整数を示す。）
で表される一価の基、
式（３）：
【００１４】
【化３】
2013184940.tif 000004
【００１５】
で表される一価の基、
一般式（４）：
【００１６】
【化４】
2013184940.tif 000005
【００１７】
（式中；Ｒ２は各出現において独立して、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基を示し、ｎは０〜３の整数を示す。）
で表される一価の基、又は
式（５）：
【００１８】
【化５】
2013184940.tif 000006
【００１９】
で表される一価の基を示す。
Ｙは、二価の炭化水素基を示す。
Ｚは、式（６）：
【００２０】
【化６】
2013184940.tif 000007
【００２１】
で表される二価の基、
式（７）：
【００２２】
【化７】
2013184940.tif 000008
【００２３】
で表される二価の基、又は
一般式（８）：
【００２４】
【化８】
2013184940.tif 000009
【００２５】
（式中；ｐは０〜１０の整数を示す。）
で表される二価の基を示す。
Ｒ３は、一価の炭化水素基を示す。
Ｒ４は、一価の炭化水素基を示す。］
で表される化合物及び／又はその塩。
【００２６】
項２.
Ｚが式（６）で表される二価の基である、項１に記載の化合物及び／又はその塩。
【００２７】
項３.
Ｘが一般式（２）で表される一価の基である、項１又は２に記載の化合物及び／又はその塩。
【００２８】
項４.
Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立して炭素数９〜２５のアルケニル基である項１〜３のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩。
【００２９】
項５.
Ｙが炭素数２〜１０のアルキレン基である項１〜４のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩。
【００３０】
項６.
項１〜５のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩を含有する、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤。
【００３１】
項７.
項１〜５のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩を含有する、遺伝子発現増強剤。
【００３２】
項８.
項１〜５のいずれかに記載の化合物及び／又はその塩を含有する、遺伝子導入剤補助剤。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、外来性遺伝子からの遺伝子発現効率を向上させることができる、新規化合物を提供することができる。該化合物は、遺伝子発現効率向上効果を有するため、遺伝子発現増強剤として有用である。また、該化合物は、細胞内に導入された外来性遺伝子の発現を効果的に向上させることができるため、遺伝子導入剤と共に使用される遺伝子導入剤補助剤としても有用である。さらに、該化合物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害作用、特に細胞内におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害作用に優れているため、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】SAHA誘導体（K005）の遺伝子発現効率に対する効果を示す。
【図２】SAHA誘導体（K006）の遺伝子発現効率に対する効果を示す。
【図３】SAHA誘導体の細胞内アセチル化に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
１．化合物
本発明の化合物は、一般式（１）：
【００３６】
【化９】
2013184940.tif 000010
【００３７】
［式中；
Ｘは一般式（２）：
【００３８】
【化１０】
2013184940.tif 000011
【００３９】
（式中；Ｒ１は、各出現において独立して、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基を示し、ｍは、０〜３の整数を示す。）
で表される一価の基、
式（３）：
【００４０】
【化１１】
2013184940.tif 000012
【００４１】
で表される一価の基、
一般式（４）：
【００４２】
【化１２】
2013184940.tif 000013
【００４３】
（式中；Ｒ２は各出現において独立して、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基を示し、ｎは０〜３の整数を示す。）
で表される一価の基、又は
式（５）：
【００４４】
【化１３】
2013184940.tif 000014
【００４５】
で表される一価の基を示す。
Ｙは、二価の炭化水素基を示す。
Ｚは、式（６）：
【００４６】
【化１４】
2013184940.tif 000015
【００４７】
で表される二価の基、
式（７）：
【００４８】
【化１５】
2013184940.tif 000016
【００４９】
で表される二価の基、又は
一般式（８）：
【００５０】
【化１６】
2013184940.tif 000017
【００５１】
（式中；ｐは０〜１０の整数を示す。）
で表される二価の基を示す。
Ｒ３は、一価の炭化水素基を示す。
Ｒ４は、一価の炭化水素基を示す。］
で表される化合物及び／又はその塩である。
【００５２】
一般式（１）中、Ｘは、一般式（２）で表される一価の基、式（３）で表される一価の基、一般式（４）で表される一価の基、又は式（５）で表される一価の基である。Ｘとしては、好ましくは一般式（２）で表される一価の基が挙げられる。
【００５３】
一般式（２）中、Ｒ１は、各出現において独立して（下記ｍが２以上の場合）、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基である。Ｒ１としては、好ましくは置換されていてもよいアミノ基が例示される。
【００５４】
Ｒ１で示されるアルコキシ基としては、例えば炭素数１〜４、好ましくは炭素数１〜３、より好ましくは炭素数１又は２の、直鎖又は分枝状のアルコキシ基が例示される。このアルコキシ基の具体例としては、特に限定されないが、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、又はｔｅｒｔ−ブトキシ基等が挙げられる。
【００５５】
Ｒ１で示される置換されていてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基、及び１又は２個の低級アルキル基で置換された基が例示される。この低級アルキル基としては、特に限定されないが、例えば炭素数１〜４、好ましくは炭素数１〜３、より好ましくは炭素数１又は２の、直鎖又は分枝状のアルキル基が例示される。このアルキル基の具体例としては、特に限定されないが、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００５６】
Ｒ１で示されるチエニル基としては、特に限定されないが、２−チエニル基、又は３−チエニル基が例示される。
【００５７】
一般式（２）中、ｍは、０〜３の整数である。ｍとしては、好ましくは０又は１が例示され、より好ましくは０が例示される。
【００５８】
一般式（４）中、Ｒ２は、各出現において独立して（下記ｎが２以上の場合）、水酸基、アルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、ニトロ基、又はチエニル基である。Ｒ１としては、好ましくは置換されていてもよいアミノ基が例示される。
【００５９】
Ｒ２で示されるアルコキシ基としては、特に限定されないが、例えば炭素数１〜４、好ましくは炭素数１〜３、より好ましくは炭素数１又は２の、直鎖又は分枝状のアルコキシ基が例示される。このアルコキシ基の具体例としては、特に限定されないが、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、又はｔｅｒｔ−ブトキシ基等が挙げられる。
【００６０】
Ｒ２で示される置換されていてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基、又は１又は２個の低級アルキル基で置換された基が例示される。この低級アルキル基としては、特に限定されないが、例えば炭素数１〜４、好ましくは炭素数１〜３、より好ましくは炭素数１又は２の、直鎖又は分枝状のアルキル基が例示される。このアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、又はｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００６１】
Ｒ２で示されるチエニル基としては、２−チエニル基、又は３−チエニル基が例示される。
【００６２】
一般式（４）中、ｎは、０〜３の整数である。ｎとしては、好ましくは０又は１が例示され、より好ましくは０が例示される。
【００６３】
一般式（１）中、Ｙは、二価の炭化水素基である。
【００６４】
Ｙで示される二価の炭化水素基としては、特に限定されないが、例えば炭素数２〜１０の直鎖若しくは分枝状の二価の鎖式炭化水素基、炭素数２〜１０の直鎖若しくは分枝状の二価の環式炭化水素基、又は炭素数６〜１０の二価の芳香族炭化水素基が例示される。この中でも、好ましくは炭素数２〜１０の直鎖若しくは分枝状のアルキレン基が挙げられ、より好ましくは炭素数２〜１０の直鎖のアルキレン基が挙げられ、さらに好ましくは炭素数４〜８の直鎖のアルキレン基が挙げられる。
【００６５】
一般式（１）中、Ｚは、式（６）で表される二価の基、式（７）で表される二価の基、又は一般式（８）で表される二価の基である。Ｚとしては、遺伝子発現増強作用の観点から、好ましくは式（６）で表される二価の基又は式（７）で表される二価の基が挙げられ、より好ましくは式（６）で表される二価の基が挙げられる。
【００６６】
一般式（８）中、ｐは０〜１０の整数である。ｐとしては、好ましくは０〜６の整数が例示され、より好ましくは０〜４の整数が例示され、さらに好ましくは１〜３の整数が例示される。
【００６７】
一般式（１）中、Ｒ３は、一価の炭化水素基を示す。
【００６８】
Ｒ３で示される一価の炭化水素基としては、特に限定されないが、例えば直鎖若しくは分枝状の一価の鎖式飽和炭化水素基、又は直鎖若しくは分枝状の一価の鎖式不飽和炭化水素基が例示される。この中でも、好ましくは炭素数２〜３０のアルキル基、又は炭素数２〜３０のアルケニル基が挙げられ、より好ましくは炭素数９〜２５のアルキル基、又は炭素数９〜２５のアルケニル基が挙げられ、さらに好ましくは炭素数９〜２５のアルケニル基が挙げられ、よりさらに好ましくは炭素数１２〜２２のアルケニル基が挙げられ、特に好ましくは炭素数１５〜１９のアルケニル基が挙げられる。
【００６９】
一般式（１）中、Ｒ４は、一価の炭化水素基を示す。
【００７０】
Ｒ４で示される一価の炭化水素基としては、特に限定されないが、例えば直鎖若しくは分枝状の一価の鎖式飽和炭化水素基、又は直鎖若しくは分枝状の一価の鎖式不飽和炭化水素基が例示される。この中でも、好ましくは炭素数２〜３０のアルキル基、又は炭素数２〜３０のアルケニル基が挙げられ、より好ましくは炭素数９〜２５のアルキル基、又は炭素数９〜２５のアルケニル基が挙げられ、さらに好ましくは炭素数９〜２５のアルケニル基が挙げられ、よりさらに好ましくは炭素数１２〜２２のアルケニル基が挙げられ、特に好ましくは炭素数１５〜１９のアルケニル基が挙げられる。
【００７１】
一般式（１）で表される化合物は、遺伝子発現効率向上効果を有するため、遺伝子発現増強剤として有用である。また、該化合物は、外来性遺伝子の発現を効果的に向上させることができるため、遺伝子導入剤と共に使用される遺伝子導入剤補助剤としても有用である。さらに、該化合物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害作用、特に細胞内におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害作用に優れているため、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としても有用である。
【００７２】
塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に限定されるものではないが、例えば付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等が例示される。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、コハク酸塩等の有機酸塩等が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。
【００７３】
２．化合物の製造
本発明の一般式（１）で表される化合物は、公知の方法又はこれに準じる方法によって合成することができる。例えば一般式（１）においてＺが式（６）で表される二価の基である場合の化合物（一般式（１２）で表される化合物）は、下記反応式によって合成することができる。
【００７４】
【化１７】
2013184940.tif 000018
【００７５】
［式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ３、及びＲ４は、前記に同じである。］
反応（１）は、一般式（９）で表される化合物中の水酸基とリン酸とを脱水縮合させる反応、又は一般式（９）で表される化合物中の水酸基とリン酸塩化物とを縮合させる反応である。
【００７６】
一般式（９）で表される化合物は、いわゆるジグリセリドであり、種々市販されているものを用いてもよいし、グリセリンと脂肪酸から公知の方法によって合成したものを用いてもよい。
【００７７】
リン酸との脱水縮合反応は、公知の方法、例えば適当な溶媒（例えばアセトニトリル）中、好ましくは脱水剤（例えばトリクロロアセトニトリル）の存在下で行えばよい。また、リン酸塩化物との縮合反応は、公知の方法、例えば適当な塩基性溶媒中（例えばピリジン）の存在下で行えばよい。これらの反応における反応温度及び反応時間の条件についても公知の方法に従って適宜設定すればよく、例えば室温で２時間という条件が挙げられる。
【００７８】
このようにして得られた一般式（１０）で表される化合物は、そのまま下記反応（２）に用いてもよいし、公知の精製方法（例えば薄層クロマトグラフィー）で精製したものを下記反応（２）に用いてもよい。
【００７９】
反応（２）は、一般式（１０）で表される化合物中のリン原子に置換している水酸基と、一般式（１１）で表される化合物中の水酸基とを脱水縮合させる反応、又は一般式（１０）で表される化合物中のリン原子に置換している塩素原子と、一般式（１１）で表される化合物中の水酸基とを縮合させる反応である。
【００８０】
一般式（１１）で表される化合物としては、例えば、公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である、下記式：
【００８１】
【化１８】
2013184940.tif 000019
【００８２】
で表される化合物（ＳＡＨＡ）、又はＳＡＨＡを公知の方法によって修飾した化合物を用いることができる。また、ＳＡＨＡの上記構造式中、点線で囲まれた部分（ｎ−へキシレン基）はＳＡＨＡが本来有するヒストン脱アセチル化酵素阻害活性に影響がないと考えられているため、この部分が他の二価の炭化水素基である化合物も、一般式（１１）で表される化合物として用いることができる。一般式（１１）で表される化合物は、ＳＡＨＡの公知の製造方法、又はこれに準じる方法に従って製造することができる。
【００８３】
反応（２）におけるリン酸との脱水縮合反応は、公知の方法、例えば適当な溶媒（例えばピリジン）中、好ましくは脱水剤（例えば塩化2,4,6-トリイソプロピルベンゼンスルホニル(TPS-Cl)）の存在下で行えばよい。一方、反応（２）におけるリン酸塩化物との縮合反応は、公知の方法、例えば適当な塩基性溶媒中（例えばピリジン）の存在下で行えばよい。これらの反応における反応温度及び反応時間の条件についても公知の方法に従って適宜設定すればよく、例えば室温で２時間という条件が挙げられる。
【００８４】
上記方法によって一般式（１２）で表される化合物が得られる。上記反応（１）において、リン酸塩化物を用いた場合は、反応（２）終了後、例えば水を加えるなどして、塩素原子を水酸基に置換することにより、一般式（１２）で表される化合物が得られる。
【００８５】
また、例えば一般式（１）において、Ｚが一般式（８）で表される二価の基である場合の化合物（一般式（１５）で表される化合物）は、下記反応式によって合成することができる。
【００８６】
【化１９】
2013184940.tif 000020
【００８７】
［式中、Ｘ、Ｙ、ｐ、Ｒ３、及びＲ４は、前記に同じである。］
反応（３）は、一般式（９）で表される化合物中の水酸基と、一般式（１３）で表される化合物中の水酸基とを脱水縮合させる反応である。
【００８８】
脱水縮合反応は、公知の方法、例えば適当な溶媒（ジクロロエチレン等）中、好ましくは脱水縮合剤又は脱水剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)又はジメチルアミノピリジン(DMAP)等）の存在下で行えばよい。また、一般式（１３）で表される化合物に代えて、ジカルボン酸無水物、例えば無水コハク酸を用いても脱水縮合反応を良好に行うことができる。これらの反応における反応温度及び反応時間の条件についても公知の方法に従って適宜設定すればよく、例えば室温で２０時間という条件が挙げられる。
【００８９】
このようにして得られた一般式（１４）で表される化合物は、そのまま下記反応（４）に用いてもよいし、公知の精製方法（例えば薄層クロマトグラフィー）で精製したものを下記反応（４）に用いてもよい。
【００９０】
反応（４）は、一般式（１４）で表される化合物中の水酸基と、一般式（１１）で表される化合物中の水酸基とを脱水縮合させる反応である。
【００９１】
反応（４）における脱水縮合反応は、公知の方法、例えば適当な溶媒中、好ましくは脱水縮合剤や脱水剤（例えばジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、又はDCCと添加剤であるN-ヒドロキシスクシンイミド(HOSu)との合剤など）の存在下で行えばよい。この反応における反応温度及び反応時間の条件についても公知の方法に従って適宜設定すればよく、例えば室温で３時間という条件が挙げられる。
【００９２】
上記方法によって一般式（１５）で表される化合物が得られる。
【００９３】
さらに、一般式（１）において、Ｚが式（７）で表される二価の基である場合の化合物も、上記一般式（１２）で表される化合物や、上記一般式（１５）で表される化合物の製造方法に準じて、主に脱水縮合反応により製造することができる。
【００９４】
３．化合物の用途 
一般式（１）で表される化合物は、遺伝子発現効率向上効果を有するため、遺伝子発現増強剤として有用である。また、該化合物は、外来性遺伝子の発現を効果的に向上させることができるため、外来性遺伝子導入剤と共に使用される遺伝子導入剤補助剤としても有用である。さらに、該化合物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害作用、特に細胞内におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害作用に優れているため、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としても有用である。
【００９５】
従って、本発明によれば、一般式（１）で表される化合物及び／若しくはその塩を有効成分として含有する、遺伝子発現増強剤、遺伝子導入剤補助剤、又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が提供される。
【００９６】
本発明の遺伝子発現増強剤、遺伝子導入剤補助剤、又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤には、その活性を損なわない限りにおいて、他の成分を含有させることができる。他の成分としては、緩衝剤、塩類、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等が挙げられる。これらは、所望の剤の種類（遺伝子発現増強剤、遺伝子導入剤補助剤、又はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤等）及び所望の剤形（液剤、又は固形剤（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等、若しくは坐剤等））に従って適宜組み合わせて、公知の方法により含有させることができる。
【００９７】
本発明の遺伝子発現増強剤によれば、例えば、遺伝子発現効率、特に外来性遺伝子発現効率を顕著に向上させることができる。本発明の遺伝子発現増強剤の使用態様としては、例えば、公知の細胞内導入方法（エレクトロポレーション法、リポフェクション法）によって細胞内に導入するという態様が挙げられる。このようにして細胞内に導入された本発明の遺伝子発現増強剤は、細胞内の遺伝子発現を増強し得る。
【００９８】
また、好ましい使用態様としては、本発明の遺伝子増強剤は、外来性遺伝子と共に細胞内に導入される。導入の方法としては、公知の細胞内導入方法であれば特に限定されないが、好ましくは公知の遺伝子導入剤を利用した細胞内導入方法が挙げられる。公知の遺伝子導入剤としては、例えばカチオン性脂質が挙げられる。
【００９９】
本発明の遺伝子導入剤補助剤によれば、遺伝子導入剤により導入された遺伝子からの遺伝子発現効率を顕著に向上させることができる。本発明の遺伝子導入剤補助剤の使用態様としては、例えば、上記した本発明の遺伝子発現増強剤の好ましい使用態様と同様の使用態様が挙げられる。
【０１００】
本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によれば、例えば細胞内に導入することにより細胞内のヒストン、さらにはチューブリンの脱アセチル化を阻害することにより、これらのアセチル化量を増加させることができる。本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の使用態様としては、例えば、公知の細胞内導入方法（エレクトロポレーション法、リポフェクション法）によって細胞内に導入するという態様が挙げられる。このようにして細胞内に導入された本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、細胞内のヒストン脱アセチル化酵素の活性を阻害し、所望の効果を発揮し得る。
【実施例】
【０１０１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１０２】
実施例１：SAHA誘導体（K005）の製造
下記反応式に従って、SAHA誘導体（K005: 1,4-anilino-4-hydroxy-1-{[(9Z)-9-octadecenoyloxy]methyl}-4-oxido-7,14-dioxo-3,5-dioxa-6-aza-4-phosphatetradec-1-yl (9Z)-9-octadecenoate）を製造した。詳細を以下に説明する。
【０１０３】
【化２０】
2013184940.tif 000021
【０１０４】
化合物１（1,2-ジオレイルグリセリド）は、公知の文献（Carla A. H. Prata, Xiao-Xiang Zhang, Dan Luo, Thomas J. McIntosh, Philippe Barthelemy, Mark W. Grinstaff, “Lipophilic Peptides for Gene Delivery” Bioconjugate Chem., 19, 418-420 (2008)）に記載の方法に従って合成した。
【０１０５】
SAHA（Suberoylanilide hydroxamic acid）は、公知の文献（John C. Stowell, Rachel I. Huot, Lainie Van Voast, “The Synthesis of N-Hydroxy-N'-phenyloctanediamide and Its Inhibitory Effect on Proliferation of AXC Rat Prostate Cancer Cells” J. Med. Chem., 38 (8), 1411-13 (1995)）に記載の方法に従って合成した。
【０１０６】
化合物１ (68.0 mg, 0.110 mmol）を脱水Pyridine 2 ml に溶解させ、氷冷下POCl3  (10.2 μL, 0.110 mmol) を滴下した。この溶液を室温で2時間撹拌した後、SAHA 28.9 mg （0.110 mmol）を加え、室温で2時間撹拌した。反応液に H2O (20 μL)を加え、室温で0.5時間撹拌した。エバポレーターで反応液を減圧濃縮し、オイル状の混合物を得た。これを分取SiO2薄層クロマトグラフィー（クロロホルム ： メタノール = 7 ： 1）で精製し、SAHA誘導体（K005） (11.2 mg ,収率10.7 %） を得た。得られたSAHA誘導体（K005）をNMRで測定したデータを以下に示す。
【０１０７】
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.877 (t, 6H, J=6.4 Hz, CH3CH2), 1.253-1.679 (m, 52H), 1.992-2.292 (m, 16H), 4.178-4.661 (m, 5H) 5.284-5.374 (m, 4H), 7.079-7.589 (m, 5H, Ar-H), ESI-MS m/z 946 ([M-H]-) (calcd for C53H91N2O10P: 946.6)。
【０１０８】
実施例２：SAHA誘導体（K006）の製造
下記反応式に従ってSAHA誘導体（K006：2-[(4-{[(8-anilino-8-oxooctanoyl)amino]oxy}-4-oxobutanoyl)oxy]-1-{[(9Z)-9-octadecenoyloxy]methyl}ethyl (9Z)-9-octadecenoate）を製造した。詳細を以下に説明する。
【０１０９】
【化２１】
2013184940.tif 000022
【０１１０】
化合物１（1,2-ジオレイルグリセリド）は、上記「実施例１:SAHA誘導体（K005）の製造」において製造したものを使用した。
【０１１１】
化合物２（1,2-dioleoyl-3-succinyl-glycerol）は次のようにして製造した。化合物１(372 mg, 0.599 mmol)、無水コハク酸 (120 mg, 1.20 mmol)、トリエチルアミン(0.2 ml)をCH2Cl2 (10 ml) に溶かし、アルゴン雰囲気下、室温で20時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え、水と飽和食塩水で有機層を洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥後、減圧濃縮した。得られたオイル状物質にヘキサンを加え沈殿を取り除いた後、ヘキサン溶液を減圧濃縮しオイル状の化合物２(422 mg, 0.586 mmol, 収率97.8%) を得た。
【０１１２】
化合物２(255 mg, 0.354 mmol)をCH2Cl2(8 ml) に溶解し、この溶液にDCC (73.0 mg, 0.354 mmol)、HOSu (40.7 mg, 0.354 mmol) を加え、室温で1時間撹拌した。反応液中の不溶物を濾過して除き、ろ液を減圧濃縮した。これにより得られた化合物３(328.1mg)は精製せず次の反応に用いた。
【０１１３】
化合物３(0.177 mmol) をDMF (3 ml) に溶かし、SAHA (46.8 mg, 0.177 mmol) を加え、室温で3時間撹拌した。反応液を濾過し、不溶物を除いた後、ろ液を減圧濃縮した。濃縮物を酢酸エチルに溶解し、この溶液を水と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥後、減圧濃縮した。残渣はSiO2分取薄層クロマトグラフィー (展開溶媒:酢酸エチル/ヘキサン = 1/1)で精製し、SAHA誘導体（K006） (97.8 mg, 0.101 mmol, 収率 57.1 %)を得た。得られたSAHA誘導体（K006）をNMRで測定したデータを以下に示す。
【０１１４】
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ 0.88, (t, 6H, J=7.0 Hz, 2xCH3), 1.27-1.42 (m, 44H), 1.59-1.76 (m, 8H), 1.98-2.01 (m, 8H), 2.24-2.38 (m, 8H), 2.70-2.80 (m, 4H), 4.182 (dd, 2H, J=6.0, 12.0 Hz, CH2), 4.296 (dd, 2H, J=4.4, 12.0 Hz, CH2), 5.24-5.39 (m, 5H), 7.07-7.53 (m, 5H, Ar-H), 13C-NMR (CDCl3, 100.40 MHz) 14.094, 22.656, 24.624, 24.788, 25.076, 26.756, 27.151, 27.200, 27.983, 28.131, 28.814, 29.061, 29.094, 29.152, 29.300, 29.497, 29.678, 29.744, 31.877, 32.461, 33.852, 33.992, 37.154, 61.786, 69.895, 119.769, 124.149, 128.940, 129.689, 130.010, 137.988, 170.548, 170.630, 171.561, 173.487, HR-FAB-MS m/z: 967.6984 (calcd for C57H95N2O10, 967.6987)。
【０１１５】
実施例３：SAHA誘導体（K007）の製造
下記反応式に従ってSAHA誘導体（K007：2-({4-[({8-[4-(dimethylamino)anilino]-8-oxooctanoyl}amino)oxy]-4-oxobutanoyl}oxy)-1-{[(9Z)-9-octadecenoyloxy]methyl}ethyl (9Z)-9-octadecenoateを製造した。詳細を以下に説明する。
【０１１６】
【化２２】
2013184940.tif 000023
【０１１７】
化合物３(0.177 mmol) をDMF (3 ml) に溶かし、DMA-SAHA (54.4 mg, 0.177 mmol) を加え、室温で2時間撹拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、水と飽和炭酸水素水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥後、減圧濃縮した。残渣はSiO2分取薄層クロマトグラフィー(展開溶媒:酢酸エチル/ヘキサン= 3/2)で精製し、目的のK007 (60.3 mg, 収率 33.7 %)を得た。得られたSAHA誘導体（K007）をNMRで測定したデータを以下に示す。
【０１１８】
1H-NMR (CDCl3, 400MHz) δ0.879, (t, 6H, J=7.2 Hz, 2(CH3CH2)), 1.265-1.421 (m, 44H) 1.586-1.748 (m, 8H) 1.909-2.014 (m, 8H), 2.235-2.346 (m, 8H), 2.704-2.801 (m, 4H), 2.910 (s, 6H), 4.165 (dd, 2H, J=6.0, 12.0 Hz, CH2), 4.293 (dd, 2H, J=4.0, 12.0 Hz, CH2), 5.226-5.411 (m, 5H), 6.684-7.351 (m, 4H, Ar-H). 13C-NMR (100.40 MHz CDCl3) 14.06, 22.62, 24.62, 24.75, 24.87, 25.30, 25.53, 26.68, 27.12, 27.16, 28.07, 28.20, 28.77, 28.93, 29.03, 29.06, 29.12, 29.26, 29.46, 29.65, 29.70, 31.59, 31.84, 32.41, 33.81, 33.94, 36.91, 40.91, 49.05, 61.75, 69.77, 113.06, 121.79, 127.90, 129.66, 129.95, 147.90, 157.12, 170.42, 170.69, 171.48, 173.41. IR (CHCl3) cm-1: 3030.0, 3006.8, 2927.7, 2854.5, 1739.7, 1670.2, 1519.8, 1456.2, 1419.5, 1236.3, 1213.1, 1164.9, 1114.8, 819.7, 785.0, 771.5, 758.0, 669.3. HR-FAB-MS m/z: 1009.7288 (calcd for C59H100N3O10, [M+H+] 1009.7330)。
【０１１９】
試験例１：SAHA誘導体（K005）の遺伝子発現効率に対する効果
ヒト結腸がん細胞HCT116またはマウス卵巣細胞CHO−K1に、レポータープラスミドDNA（pCMV-lu：サイトメガロウイルスプロモーターの3’側にルシフェラーゼタンパク質をコードする配列を有するプラスミドDNA）と共にSAHA誘導体（K005）をトランスフェクションし、トランスフェクション後のレポータータンパク質の発現量を測定することにより、SAHA誘導体（K005）の遺伝子発現効率に対する効果を測定した。実験の詳細を以下に示す。
【０１２０】
＜材料＞
培地として、HCT116の培養にはMcCOY's 5A (with or without 10% FBS)を用い、CHO-K1の培養にはF12 (with or without 10% FBS)を用いた。SAHA誘導体（K005）をDMSOに溶解し、該溶液をストック溶液（SAHA誘導体（K005）ストック溶液）として用いた。レポータープラスミドDNAは、該DNA濃度が0.2 μg/50 μlになるように無血清培地で希釈し、該希釈液をレポータープラスミドDNA溶液として、トランスフェクションに使用した。
【０１２１】
＜前培養＞
トランスフェクションの前日に細胞をトリプシン処理して計数した。計測数に基づき、血清(10%FBS)入り培地で細胞懸濁液（HCT116の場合は2.5×105 cells/ml、CHO-K1の場合は1×105cells/ ml）を調製した。この細胞懸濁液を、24 well 細胞培養プレートの各wellに0.5 mlずつ播種し、CO2インキュベーター(37℃、5％CO2)中で24時間培養した。
【０１２２】
＜トランスフェクション＞
カチオン性脂質としてLipofectamineTM 2000を、濃度0.5μl/50μlになるように、無血清培地で希釈した。希釈は両液をピペッティングにより緩やかに混合して行った。この希釈液をカチオン性脂質溶液として使用した。
【０１２３】
一方、SAHA誘導体（K005）ストック溶液を、1ウェル（600μl）当り0.5μl添加した場合のSAHA誘導体（K005）の濃度が0.5、1、2、又は4μM になるように適宜DMSOで希釈した。この溶液0.5μlを、直接カチオン性脂質溶液に加えた。混合液はピペッティングにより緩やかに混合した後、室温で10分間インキュベートした。
【０１２４】
SAHA誘導体（K005）が加えられたカチオン性脂質溶液50μlに対してレポータープラスミドDNA溶液50μlを添加し、ピペッティングにより緩やかに混合した後、室温で20分間インキュベートした。
【０１２５】
該混合液を各ウェルに100 μlずつ添加し、プレートをゆすって軽く混合した。
【０１２６】
CO2インキュベーター(37℃、5％CO2)で24時間培養したのち、細胞内のタンパク質を定法により抽出し、該抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１２７】
結果を図１に示す。図１中、横軸の数値は、ウェル（600μl）中のSAHA誘導体（K005）の濃度を示し、縦軸の数値はルシフェラーゼ活性を示す。HCT116とCHO-K1の両細胞株において、SAHA誘導体（K005）を加えることにより、SAHA誘導体（K005）の濃度0μMの場合（コントロール）に比べて、レポーター活性の上昇、すなわちレポーター遺伝子発現効率の向上が見られた。特に、SAHA誘導体（K005）の濃度4μMの場合は、レポーター遺伝子発現効率をコントロールに比べて20倍以上（HCT116の場合は23倍、CHOの場合は28倍）も向上させた。
【０１２８】
試験例２：SAHA誘導体（K006）の遺伝子発現効率に対する効果
SAHA誘導体（K005）ストック溶液に代えて、SAHA誘導体（K006）をDMSOに溶解したSAHA誘導体（K006）ストック溶液を用い、カチオン性脂質としてLipofectamineTM 2000に代えてLipofectamineLTXを用い、細胞株としてHCT116のみを用いた以外は、上記試験例３と同様に行った。
【０１２９】
結果を図２に示す。SAHA誘導体（K006）を加えることにより、SAHA誘導体（K006）の濃度0μMの場合（コントロール）に比べて、レポーター活性の上昇、すなわちレポーター遺伝子発現効率の向上が見られた。
【０１３０】
試験例３：SAHA誘導体の細胞内アセチル化に対する影響
HCT116にSAHA誘導体（K005）をトランスフェクションし、トランスフェクション後の、アセチル化チューブリン及びアセチル化ヒストンH3の量を測定することにより、SAHA誘導体（K005）の細胞内アセチル化に対する影響を評価した。実験の詳細を以下に示す。
【０１３１】
＜前培養＞
10cm シャーレに培養したHCT116細胞をPBS 2 mlで2回洗浄し、これにトリプシン1 mlを加え37 ℃で5min 処理した。10％FBSを含むMcCoy’s 5A培地10 ml に細胞を懸濁し、この液を10000 rpm、5分 遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを同一の培地に懸濁した。この 細胞懸濁液を60 mm Dishに5 mlずつ 2.0×105cells/mlになるように播種し、これをCO2インキュベーター(37℃、5％CO2)中で24時間培養した。その後、培地を無血清のMcCoy’s 5A培地に交換し、さらに24時間培養した。トランスフェクション前に同培地で2回洗浄した。
【０１３２】
＜トランスフェクションおよび細胞溶解液の調整＞
Lipofectamine2000を濃度5 μl / 500 μlになるように無血清培地に希釈した。SAHA及びK005のストック溶液を、培養培地中の終濃度が1 μMになるようにDMSOで希釈した溶液を調製した。この溶液をLipofectamine2000溶液に加えた後、室温で10分間インキュベートした。SAHA及びK005が加えられたLipofectamine2000溶液500 μlに対し、レポータープラスミドDNA溶液500 μlを添加し混合した後、室温で10分間インキュベートした。混合液を前培養後の60 mm Dishに1000 μl添加し6または24時間インキュベートした。トランスフェクション後の60 mm dish をPBS 1 mlで2回洗浄し、CR (Convance Reserch) Lysis buffer 150 μlを加え細胞を溶解した。細胞溶解液を15000 rpmで10分間遠心分離した。得られた上清を細胞溶解液とした。
【０１３３】
＜アセチル化ヒストンH3とアセチル化チューブリンの検出＞
定法により細胞溶解液を電気泳動（SDS-PAGE）に付し、分離したタンパク質をメンブランに転写した。アセチル化ヒストンH3の分析には一次抗体としてanti acetyl Histone H3 (ミリポア)、アセチル化チューブリンの分析には、一次抗体としてMonoclonal Anti-Tublin, Acetylated antibody produced in mose, clone 6-11B-1, ascites fluid (Sigma-Aldrich)、Actinの分析には、一次抗体としてRabbit Anti-Actin, affinity isolated antibody (Sigma-Aldrich)を用いて免疫染色した。いずれも二次抗としてAnti-rabbit IgG Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) (GEヘルスケア)を用いて一次抗体を標識した後、Lumigen PS-3 (Lumigen) により検出定量した。
【０１３４】
結果を図３に示す。この結果より、SAHA誘導体（K005）は、公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるSAHAと同程度に或いはSAHAよりも顕著に、細胞内のチューブリンやヒストンH3のアセチル化を向上させることが示された。このことから、試験例１に示されたSAHA誘導体（K005）の遺伝子発現増強作用は、Tubulinのアセチル化による導入遺伝子の核への輸送の促進、及び核内でのヒストンH3アセチル化による転写活性化に起因すると予測された。
【図１】
2013184940.tif 000033
【図２】
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【図３】
2013184940.tif 000035