(57)【要約】【課題】糖尿病との合併症として危惧される高脂血症を検出することができる、高脂血症の検出方法を提供すること及び創薬スクリーニング方法を提供すること。【解決手段】高脂血症の検出方法は、生体から採取した試料中のAPPL1又はAMPKを高脂血症マーカーとして用いた高脂血症の検出方法であり、APPL1又はAMPKの低値が糖尿病との合併症として危惧される高脂血症である可能性が高いことを示す。疾患の治療剤のスクリーニング方法は、疾患を持つ動物体内の病態細胞から採取した細胞質を封入したリシール細胞においてミトコンドリアの形態異常が観察される前記細胞質に、被検薬剤を添加した細胞質を封入したリシール細胞を作製し、ミトコンドリアの前記形態異常が低減されるか否かを観察することを含む。【選択図】図２
2013213688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取した試料中のAPPL1又はAMPKを高脂血症マーカーとして用いた高脂血症の検出方法であって、APPL1又はAMPKの低値が糖尿病との合併症である高脂血症である可能性が高いことを示す、高脂血症の検出方法。
【請求項２】
疾患を持つ動物体内の病態細胞から採取した細胞質を封入したリシール細胞においてミトコンドリアの形態異常が観察される前記細胞質に、被検薬剤を添加した細胞質を封入したリシール細胞を作製し、ミトコンドリアの前記形態異常が低減されるか否かを観察することを含む、前記疾患の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ミトコンドリアの形態異常が、ミトコンドリアの伸長及び／又は膨潤である請求項２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高脂血症又は糖尿病の検出方法及び疾患の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常及び病態の網羅的マイクロアレイ解析やプロテオーム解析が進み、多数の疾患関連遺伝子やタンパク質が抽出され、その細胞内機能や病態との関連が遺伝子改変マウスなどを用い盛んに研究されようとしている。しかし、その網羅的解析によって抽出される遺伝子・タンパク質の数は膨大であり、創薬・診断研究の現場では、動物個体を使用した前臨床研究におけるコストと時間のパフォーマンスの増大のため、リード化合物のスクリーニングやその副作用・作用機序研究における「細胞アッセイ」の重要性はますます増大してきている。しかし、現行の細胞アッセイの多くは「正常細胞」を使用したものであり、「病態環境」における細胞機能のかく乱の分子解析や、病態状態を示す細胞を利用した創薬スクリーニングを実践することが難しいのが現状である。様々な細胞アッセイに使用できる病態環境を保持した「病態モデル細胞」の汎用性のある作成法が必要となってきている。
【０００３】
現在、患者個人由来のiPS細胞などを基に、個人の遺伝的特性などを保持する「病態細胞」を作成し、それを病態モデル細胞としてテーラーメード医療、再生医療、それを目指した創薬支援システム構築の試みが進められているが、その殆どが遺伝子自身の欠陥に由来する病態モデル細胞作成とその応用を目指しているものが多い。しかし、現在、世界的に問題となっている生活習慣病の多くは、遺伝子欠陥によるものより、正常な細胞が日々の細胞ストレスなどによりその細胞内情報伝達システムを徐々に撹乱させ、ミトコンドリア等のオルガネラ自身の機能攪乱やエピジェネティックス制御の撹乱により核内遺伝子発現が徐々に撹乱されていくことが原因であることが判ってきている。これらの細胞質や核内に時間をかけて蓄積するストレスの総体が、ある閾値を超えた時点で細胞のホメオスタシスが不可逆的に攪乱されてしまうことが病態発現につながっていることを示唆する知見も多く蓄積してきた。逆に、このホメオスタシスが不可逆的に撹乱される前に、様々な方法で細胞に蓄積するストレスを軽減することで病態発現を未然に防ぐことができる。つまり、この様に病態になりつつある細胞内環境を模した様々な「病態モデル細胞」を作成し、創薬スクリーニングや病態発現メカニズムの解明に利用することができれば、今までの細胞アッセイとは全く異なる原理を持った創薬支援ツールを提供することが可能となる。
【０００４】
一方、高脂血症は、動脈硬化やそれに起因する心臓疾患や脳疾患、及び糖尿病の引き金になる病態であり、血液中のコレステロール及び中性脂肪を定量することにより診断が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】F.Kano, K.Takenaka, A.Yamamoto, K.Nagayama, E.Nishida, & M.Murata : J.Cell Biol., 149, 357 (2000).
【非特許文献２】F.Kano, Y.Sako, M.Tagaya, T.Yanagida, & M.Murata : Mol. Biol. Cell, 11, 3073 (2000).
【非特許文献３】F.Kano, A.R.Tanaka, S.Yamauchi, H.Kondo, & M.Murata : Mol. Biol. Cell, 15, 2537 (2004).
【非特許文献４】F. Kano, H.Kondo, A.Yamamoto, A.R.Tanaka, K.Uchiyama, N.Hosokawa, K.Nagata, & M.Murata : Genes Cells, 10, 333 (2005).
【非特許文献５】F.Kano, H.Kondo, A.Yamamoto, Y.Kaneko, K.Uchiyama, N.Hosokawa, K.Nagata, & M.Murata : Genes Cells, 10, 989 (2005).
【非特許文献６】F.Kano, K.Takenaka, & M.Murata : Methods in Molecular Biology (X. Johne Liu ed.) 322, 357 (2006).
【非特許文献７】F.Kano, S.Yamauchi, Y.Yoshida, M.Watanabe-Takahashi, K.Nishikawa, N.Nakamura, & M.Murata : J. Cell Sci., 122, 2218 (2009).
【非特許文献８】F.Kano, T.Arai, M.Matsuto, H.Hayashi, M.Sato, & M.Murata : Biochim. Biophys. Acta. -Mol Cell Res. 31, 6067 (2011).
【非特許文献９】V.Idone, C.Tam, J.W.Goss, D.Toomre, M.Pypaert, & N.W.Andrews : J. Cell Biol., 180, 905 (2008).
【非特許文献１０】P.A.Keyel, L.Loultcheva, R.Roth, R.D.Salter, S.C.Watkins, W.M.Yokoyama, & J.E.Heuser : J. Cell Sci., 124, 2414 (2011).
【非特許文献１１】E.K.Kim, & E.J.Choi : Biochim Biophys Acta., 1802, 396 (2010).
【非特許文献１２】T.F.Franke, C.P.Hornik, L.Segev, G.A.Shostak, & C.Sugimoto : Oncogene, 22, 8983 (2003).
【非特許文献１３】A.Rasola, M.Sciacovelli, B.Pantic, & P.Bernardi : FEBS Lett., 584, 1989 (2010).
【非特許文献１４】S.Ogino, S.Kubo, R.Umemoto, S.Huang, N.Nishida, & I.Shimada : J. Am. Chem. Soc. 131, 10834 (2009).
【非特許文献１５】M.Y.Chang, D.Kim, C.H.Kim, H.C.Kang, E.Yang, J.I.Moon, S.Ko, J.Park, K.S.Park, K.A.Lee, D.Y.Hwang, Y.Chung, R.Lanza, & K.S.Kim : PLoS One., 24, e9838 (2010).
【非特許文献１６】C.K.Taranger, A.Noer, A.L.Sorensen, A.M.Hakelien, A.C.Boquest, & P.Collas : Mol. Biol. Cell, 16, 5719 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、糖尿病との合併症として危惧される高脂血症を検出することができる、高脂血症の検出方法を提供することである。また、本発明のもう１つの目的は、新規な創薬スクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、下記実施例に詳述する方法により、高脂血症の病態モデルとして用いられているApoEノックアウトマウスと正常マウスから肝臓細胞質をそれぞれ調製し、これをそれぞれ封入したリシール細胞を作製し、これらの差異を調べた結果、ApoEノックアウトマウスから調製した細胞質を封入したリシール細胞では、APPL1、及びPI3K-Akt経路のカスケードにおいてAPPL1の上流にあるAMPKが低値となっていることを見出し、APPL1又はAMPKを糖尿病の前段階にある高脂血症のマーカーとして利用できることを見出し、本願第１の発明を完成した。
【０００８】
さらに、上記の研究において、ApoEノックアウトマウスの肝臓細胞質を封入したリシール細胞では、ミトコンドリアの形態異常が認められ、この現象を利用して創薬スクリーニングが可能であることに想到した。
【０００９】
すなわち、本発明は、生体から採取した試料中のAPPL1又はAMPKを高脂血症マーカーとして用いた高脂血症の検出方法であって、APPL1又はAMPKの低値が糖尿病との合併症として危惧される高脂血症である可能性が高いことを示す、高脂血症の検出方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、疾患を持つ動物体内の病態細胞から採取した細胞質を封入したリシール細胞においてミトコンドリアの形態異常が観察される前記細胞質に、被検薬剤を添加した細胞質を封入したリシール細胞を作製し、ミトコンドリアの前記形態異常が低減されるか否かを観察することを含む、前記疾患の治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、糖尿病との合併症として危惧される高脂血症を検出できる新規な方法が提供された。本発明の方法により検出された高脂血症は、そのメカニズムから糖尿病の前段階にあると考えられ、この段階で糖尿病に罹患しないように生活習慣を注意すれば、糖尿病を予防することが可能になる。
【００１２】
また、本発明によれば、動物に代えてリシール細胞を用いて創薬スクリーニングを行うことができる新規な方法が提供された。この創薬スクリーニング方法は、病態モデル動物を用いる従来の方法に比べて簡便、迅速、安価に行うことができ、動物の生命を犠牲にすることも少ない。従って、多種、多様な物質をスクリーニングにかけることができ、スクリーニングの効率が大幅に向上するので、創薬に大きく貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】セミインタクト細胞リシール法を利用した「病態モデル細胞」創成の概念図である。
【図２】病態モデル細胞を用いた細胞機能(可視化)解析と病態改善・進行化合物（因子）のスクリーニングシステムを示す概念図である。
【図３】下記実施例で得られた、正常・病態モデル細胞を用いたEGF受容体下流のシグナル伝達経路の解析結果を示す図である。HeLa細胞を用いて作成した正常モデル細胞(WTリシール細胞)と病態モデル細胞（ApoEリシール細胞）において、EGF刺激後の2種類のシグナル伝達経路（Ras-MAPK経路、PI3K-Akt経路）の活性化状態を調べた。その結果、ApoEリシール細胞ではPI3K-Aktシグナル経路が選択的に阻害されていた。それぞれの経路の活性化状態は、p42/p44MAPKのリン酸化（Ras-MAPK経路）とAktのリン酸化（PI3K-Akt経路）をそれぞれの抗リン酸化抗体による蛍光抗体法により調べた。
【図４】下記実施例で得られた、正常・病態モデル細胞のアポトーシス耐性の解析結果を示す図である。HeLa細胞を用いて作成した正常モデル細胞(WTリシール細胞)と病態モデル細胞（ApoEリシール細胞）に対し、UV照射と飢餓によるアポトーシスを誘導した。誘導直後（０）、誘導後1または２時間後のサンプルに対してTUNEL染色法（左写真で赤色蛍光を発する細胞）によりアポトーシス細胞の割合を計測した（右グラフ）。その結果、アポトーシス誘導後2時間後では、WTリシール細胞に比較して、ApoEリシール細胞のアポトーシスの程度が約2倍となることが判った。このことは、ApoEリシール細胞ではアポトーシス耐性が脆弱化していることが判った。左写真の緑色蛍光はFITCデキストランを細胞質とともに導入されたリシール細胞を示す。
【図５】リシール細胞を用いたミトコンドリア形態と機能アッセイ系の概念図である。
【図６】下記実施例で得られた、CHO-Tom5/GFPを用いたミトコンドリア形態変化を指標にしたキナーゼ阻害剤スクリーニングの結果を示す図である。 キナーゼ阻害剤（80種類）をCHO-Tom5/GFPに37℃、2時間作用させた後、コントロール（DMSO添加）に比べてミトコンドリア形態に変化があるものをスクリーニングした。形態変化としては、コントロールに比べ細かく分裂しているもの（fragmented）、長くなっているもの（elongated）そして長くなりながら形態がドーナツ状になっているもの（elongated/round）の3種類に分類できた。そのうち、Erbstain analog (EGF 受容体キナーゼ阻害剤)、wortmaninne (PI3キナーゼ阻害剤)、Triciribine(Aktキナーゼ阻害剤)はミトコンドリア長を増加させ、かつ、多少膨潤させるフェノタイプを示した。これら3種の阻害剤は、EGF受容体下流のPI3K-Akt経路の阻害剤であり、まさしく、ApoEリシール細胞で見られた伸長したミトコンドリア（elongated）は、PI3K-Akt経路が撹乱された結果であることを強く示唆した。
【図７】下記実施例で得られた、正常・病態モデル細胞のミトコンドリアの形態変化を示す図である。：CHO-Tom5/GFP細胞を用いて作成した正常モデル細胞(WTリシール細胞)と病態モデル細胞（ApoEリシール細胞）において、ミトコンドリアの形態を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。その結果、WTリシール細胞に比較して、ApoEリシール細胞のミトコンドリア長は長く、膨潤していることが観察され（左はGFP蛍光写真、右はその長さのヒストグラム）、膜電位も低下していた。
【図８】下記実施例で得られた、ApoE欠損マウスの肝臓ライセートのAPPL1タンパク質量の減少を示す図である。：WTまたはApoE 欠損マウスの肝臓のライセート中のAPPL1タンパク質量をWestern blotting法により調べた結果、ApoE 欠損マウスでその減少傾向が明白に現れた（A、B）。APPL1は初期エンドソーム膜の細胞質側に局在する外在性膜タンパク質であり、細胞質中にも存在する（C; HeLa細胞におけるAPPL1の局在を蛍光抗体法で観察したもの）。APPL1は初期エンドソーム膜の細胞質側に結合し、EGF受容体キナーゼの活性化に伴うAktの活性化（リン酸化）に関与している（D）。
【図９】下記実施例で得られた、APPL1ノックダウンHeLa細胞におけるEGF受容体下流のシグナル伝達経路の不活化を示す図である。コントロール（scramble siRNA処理）HeLa細胞およびAPPL1ノックダウンHeLa細胞における、EGF刺激による下流シグナル伝達経路活性化をp42/MAPKのリン酸化（Ras-MAPK経路活性化）とAktのリン酸化（PI3K-Akt経路活性化）を指標に、抗p42リン酸化抗体と抗Aktリン酸化抗体を用いた蛍光抗体法によって調べた。その結果、APPL1 ノックダウン細胞では、PI3K-Akt経路だけが選択的に撹乱されていることが判った。
【図１０】ApoEリシール細胞におけるAkt依存的なミトコンドリア媒介のアポトーシスに対する脆弱性のメカニズム仮説を示す概念図である。
【図１１】高脂血症モデルマウス細胞内のAPPL1量を制御すると思われるメカニズムを示す図である。肝臓のAPPL1量は運動によって活性化されるAMPK活性をその阻害剤（Ara-A）及び活性化剤(AICAR)を用いて制御したときのHepG2細胞内のAPPL1のｍRNA量を測定したもの（A,B）。AMPK活性低下によって誘起される肝臓のインスリン抵抗性メカニズムの模式図（C）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上記の通り、下記実施例に詳述する方法により、高脂血症の病態モデルとして用いられているApoEノックアウトマウスと正常マウスから肝臓細胞質をそれぞれ調製し、これをそれぞれ封入したリシール細胞を作製し、これらの差異を調べた結果、ApoEノックアウトマウスから調製した細胞質を封入したリシール細胞では、APPL1、及びPI3K-Akt経路のカスケードにおいてAPPL1の上流にあるAMPKが低値となっていることを見出した。APPL1又はAMPKが低値となっている状態は、糖尿病との合併症として危惧される高脂血症の状態であると考えられる。その理由は次の通りである。過食が原因となる肥満、運動不足、ストレスなど生活習慣が要因となる糖尿病患者の多くは、血中に過剰なグルコースが存在することになりLDLコレステロールが酸化されやすくなったり、血中の中性脂肪の異常増加が起こるため高脂血症が促進されることになる。そのため、糖尿病に高脂血症の合併症があると、動脈硬化をより悪化させることになる。
【００１５】
従って、APPL1及びAMPKは糖尿病の合併症でありその合併症が動脈硬化症などを進行させるとされている高脂血症のマーカーとして利用することができる。APPL1及びAMPK自体は公知であり、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列も公知である。ヒト及びマウスAPPL1のアミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、それぞれGenBank Accession No. NM_012096及びNM_145221に記載されている。また、ヒトAMPKのアミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、サブユニットがあるため、GenBank Accession No. NM_006252., NM_006253., NM_006251., NM_206907., NM_001040633., NM_016203., NM_024429., NM_001206709., NM_001206710., NM_002733., NM_017431., NM_005399に記載されており、マウスのAMPKのアミノ酸配列及びそれをコードするｃＤＮＡの塩基配列は、サブユニットがあるため、NM_001170556., NM_145401., NM_153744., NM_178143., NM_001013367., NM_016781., NM_031869., NM_182997に記載されている。これらの塩基配列（コード領域のみ）をこの順序で配列番号１〜４３の奇数番号で示し、それらがコードするアミノ酸配列を各番号＋１の偶数の配列番号に示す。
【００１６】
APPL1及びAMPKは、そのアミノ酸配列も塩基配列も公知であるから、これらを定量することは常法により容易に行うことができる。例えば、APPL1又は AMPKを抗原とする抗体を作製し、それを用いた免疫測定によりこれらの各タンパク質を定量することができる。この場合、被検試料としては末梢血や、肝臓の生検検体を用いることができる。また、肝臓の生検検体が得られる場合には、これらの各タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列がわかっているので、定量的逆転写ＰＣＲ等の常法により、これらのタンパク質のｍＲＮＡ量を定量して発現量を測定することもできる。
【００１７】
本発明の創薬スクリーニング方法では、疾患を持つ動物体内の病態細胞から採取した細胞質を封入したリシール細胞においてミトコンドリアの形態異常が観察される前記細胞質に、被検薬剤を添加した細胞質を封入したリシール細胞を作製し、ミトコンドリアの前記形態異常が低減されるか否かを観察する。ここで、「リシール細胞」とは、形質膜を透過性にした「セミインタクト細胞」の穴を閉じた（リシールした）細胞である。セミインタクト細胞とは、連鎖球菌の酵素感受性毒素であるストレプトリシンO (Streptolysin O; SLO) などを形質膜に作用させることにより、形質膜を部分的に透過性にした細胞のことである。セミインタクト細胞では、形質膜に孔が開口しているので、病態モデル細胞の細胞質や、それに創薬スクリーニングの試験化合物を添加したもの等を、セミインタクト細胞の細胞質として細胞内に導入することが可能である。その後、形質膜の孔を塞ぐ（リシール）することにより、病態モデル細胞の細胞質と試験化合物が封入された細胞を得ることができる。なお、セミインタクト細胞の作製及びそのリシール方法は、本願発明者らにより確立されており、下記実施例においても詳細に記載されている。
【００１８】
以下、セミインタクト細胞及びリシール細胞並びにそれらの利用方法についてさらに詳細に説明する。
【００１９】
(1)セミインタクト細胞アッセイの発展系としてのリシール法について：
セミインタクト細胞とは、連鎖球菌の酵素感受性毒素ストレプトリシンO（SLO）を形質膜に作用させることにより、形質膜を部分的に透過性にした細胞である(図１)。この細胞系では、オルガネラや細胞骨格の構造や機能及びそれらの相対的空間配置はほぼインタクトに保持したまま、元の細胞質を流出させて他の細胞や臓器から調製した細胞質と「交換」することができるため、細胞を一個の試験管に見立てて、添加した細胞質(＋ATP再生系)に依存的な細胞内のイベントを光学顕微鏡下で分析的に再構成し解析することができる。例えば、セミインタクト正常細胞に病態細胞・組織より調製した「病態細胞質」を導入することにより、セミインタクト細胞内を病態環境にして、その中で生起する「病態環境でのタンパク質・脂質・遺伝子（mRNAも）の動態」を解析できる。我々はこれまでにこのセミインタクト細胞技術とGFP可視化技術をカップルさせた様々な可視化アッセイを構築して、光学顕微鏡下の「単一細胞内」で生起する小胞輸送過程や細胞周期依存的な小胞体、ゴルジ体などのオルガネラ形態変化に関わる制御因子の同定とその機能解析を行ってきた(加納ら、非特許文献１〜８)。
【００２０】
このセミインタクト細胞アッセイには多くの特長がある。例えば、セミインタクト細胞アッセイ法では、特定の時間や状態の細胞から細胞質を調製し、セミインタクト細胞内に導入して生理反応を「同期して」解析できるため、S/N比の高い状態で生理現象の時空間動態解析を達成できる。また、光学顕微鏡下での単一細胞レベルで生命現象の可視化解析が可能となるため、協奏的に起こる生命反応を、形態的に幾つかの素過程に分割しながら、それぞれの素過程に必要な因子を生化学的手法で同定できる。つまり、協奏的に起こる細胞内反応を形態的に、生化学的に素過程に分割して解析し理解できる。また、添加する細胞質とともに膜不透過性の低分子化合物や抗体・恒常的活性化(不活化)機能を持ったリコンビナントタンパク質を導入することによって、導入した化合物・抗体・タンパク質因子の生命反応への効果を解析することはもちろん、反対に、特定のタンパク質に対する抗体を用いて細胞質から特定のタンパク質だけを免疫除去した細胞質を調製し、それを添加することにより免疫除去タンパク質の効果を解析することも可能である。
【００２１】
しかし、このセミインタクト細胞アッセイ系にはその構築原理に基づく大きな弱点があった。それは、形質膜上のSLOが作る孔のため、形質膜上の各種膜受容体を介した細胞外情伝達分子（EGFなど）の細胞質・核内への情報伝達系の解析や、形質膜付近で繰り広げられる膜輸送(エンドサイトーシス、膜のリサイクリングなど)過程の解析に不安が残る点などである。
【００２２】
本明細書に記載するリシール法（再封入法）は、セミインタクト細胞にした際に生じる形質膜上の孔を再封入(閉じる)ことにより上記のセミインタクト細胞アッセイの弱点を補う方法として開発されたものである(図１)。さらに、セミインタクト細胞に、病態モデル個体やヒト患部から採取した病態細胞質を導入した後、リシールすることにより、「病態環境」をミミックした病態モデル細胞を構築できる。そして、今までセミインタクト細胞アッセイ再現が困難であった様々なタンパク質動態やそれを制御するタンパク質ネットワーク解析が可能になると期待できるばかりか、導入した細胞質により核内における遺伝子のエピジェネティクスや転写制御機能の改変を誘起させられれば新規の細胞形質転換法にもなりうる可能性がある。
【００２３】
リシール細胞作成の最適条件について：
先ず、「病態モデル細胞」作成のための、様々な細胞のリシール条件の最適化を行った。最適化の指標の一つは、より高いリシール効率(80〜90％以上)とした。その結果、セミインタクト細胞作成時の形質膜のダメージの大きさ、細胞骨格の正常性がリシール細胞作成効率に大きく影響することが判った。また、リシール時のカルシウムイオンやリシール時に添加する細胞質にも強く依存した。SLOによる穿孔のリシールは、SLOでできた穴のendocytosisよる形質膜からの除去(Idone et al. (9)) 、あるいはectocytosisによるSLOを含むブレブの細胞外への脱落（Keyel et al. (10)）によることが報告されている。これらendocytosisやectocytosisの膜動過程にはアクチンフィラメントや微小管とそれに結合するモータータンパク質の制御が必要不可欠と考えられることから、リシール効率を高めるためには、セミインタクト細胞作成時の微小管やアクチンフィラメントのintegrityの保持方法が重要な決め手であると考えられる。ちなみに、この様な考慮の元に最適化されたリシール条件は、HeLa細胞では、>0.1 mg/ml細胞質と1 mM CaCl2存在下で32℃、5分間インキュベーションすることである。
【００２４】
また、蛍光標識した生体分子やデキストランを用いたセミインタクト細胞への導入分子の大きさ、リシール後の導入物質の保持状態の解析から、カルシウムによるリシールが少なくとも3分以内の非常に短時間で完了すること、推定されているSLOの孔の直径からは推定できない程大きな分子(2000kDaの蛍光標識デキストランなど)が通過でき、かつ、リシール後にそれら分子が不可逆的にリシール細胞に保持されること、なども判った。
【００２５】
(3)リシール細胞の細胞内構造・ストレス負荷状態・機能の検定：
リシール操作は、短時間ではあるが0.5〜1.0ｍMのカルシウムイオンにセミインタクト細胞が晒されることや形質膜の穿孔が伴うため、様々な細胞内情報伝達ネットワーク、オルガネラ形態や細胞のストレス状態に影響を与えると予想される。そこで、リシール細胞のストレス負荷状態を調べた。細胞ストレス負荷により、細胞内ではストレスの種類依存的なキナーゼが活性化され、翻訳制御因子eIF2のリン酸化を介したタンパク質新生の阻害やストレスグラニュールなどを介した翻訳阻害、同時にストレス応答タンパク質群の転写などが誘起される。本研究では、ストレス応答の初期応答キナーゼの活性化を解析することにより、リシール操作自体によるストレス負荷状態を解析した。対象としては、病態細胞で特に注目されている酸化ストレス負荷時に上昇するJNK、p38キナーゼ(Kim et al.非特許文献１１)の活性化状態を検討した。その結果、JNKに対してはその活性上昇は殆ど見られず、p38に関しては一過性の上昇は観察されるが、リシール後30分のインキュベーションにより完全ではないものの沈静化されることが分かった。この残留するp38の活性化は、正常モデル細胞、病態モデル細胞にともに観察される現象であり、このp38の活性化の完全な抑制法を検討するとともに、この微弱なp38活性化が検出する「正常」と「病態」モデル細胞の生命現象の「差異」にどの程度影響するかは留意して実験結果を考察する必要がある。
【００２６】
次にリシール細胞内の構造的・機能的安定性を調べた。先ず、ミトコンドリア（後述）を除く各種オルガネラや細胞骨格の形態はほぼ生細胞のそれ大きく変化がないことを確認できた。次に、（正常）細胞質を導入したリシール細胞において、解析対象となる生命現象が正しく解析できるかどうかを検証することが必要である。今までに、トランスフェリン/トランスフェリン受容体複合体のリサイクリング過程、コレラ毒素のエンドソーム→ゴルジ体間逆行輸送過程、EGF/EGF受容体複合体のEGF依存的なリソソーム分解(受容体のダウンレギュレーション)など、をリシール細胞で再構成することができている。興味深いことに、リシール操作を経ているにもかかわらず、これらの膜輸送過程のキネティクスは生細胞のそれらとほとんど変わらず起こった。これらの初期エンドソームを介した膜動過程は、被覆小胞やラフト構造を介した受容体媒介エンドサイトーシスの基本素過程全て含むため、その正常性を確認できたと言うことは、リシール細胞においてその膜動態関連制御分子群の減少・活性低下や上記で問題にしていたリシール操作に伴う様々な細胞ストレスは、今後のそれら膜動過程解析には大きな影響がないことを示唆している。
【００２７】
本発明の創薬スクリーニング方法では、上記したリシール細胞に疾患を持つ動物体内の病態細胞から採取した細胞質を封入したリシール細胞においてミトコンドリアの形態異常が観察されるかどうかを調べる。なお、ここで、動物としては、特に限定されないが、好ましくは、ヒト及び家畜類、ペット類、家禽類等であり、ヒト用の医薬を創薬する場合にはヒトから採取した細胞質を封入することが好ましい。ミトコンドリアの形態異常としては、下記実施例に具体的に記載されるように、ミトコンドリア長が長くなったり、膨潤したりすることが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。上記リシール細胞において、ミトコンドリアの形態異常が観察される場合、封入する細胞質に創薬スクリーニングの候補物質である被検物質を添加し、リシールして、細胞を培養し、ミトコンドリアの形態異常が低減するか否かを調べる。ミトコンドリアの形態異常が低減すれば、その被検物質は、上記疾患の治療薬として機能する可能性が高いと判定できる。従って、この方法により創薬スクリーニングを行うことができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２９】
本実施例では、病態としては高脂血症病態を標的とした。先ず、高脂血症モデルマウスとそのコントロール（正常）マウスとして、それぞれApoEノックアウトマウス及びwild type マウスを用意し、それらの肝臓細胞質を調製しそれぞれApoE 細胞質とWT細胞質とした。ApoE(-/-) deficient マウスは、アルツハイマー病や高脂血症のモデルマウスとしてその疾患研究に利用されている。それら細胞質を導入したリシールHeLa細胞を、それぞれ「ApoEモデル細胞」（病態モデル細胞）及び「WTモデル細胞」（正常モデル細胞）とした。これらのモデル細胞は、具体的には次のようにして作製した。
【００３０】
HeLa細胞をカバーグラスあるいはグラスボトムディッシュ上に80-90%コンフルエントに培養した。PBSで2回wash後、0.13μg/ml ストレプトリシンO (bioacademia) in DMEMを加え、氷上で5分インキュベーションした。PBSで3回wash後、あらかじめ温めておいたtransport buffer (TB; 25  mM HEPES-KOH, pH 7.4,  115  mM potassium acetate, 2.5 mM MgCl2,)を加え、32℃で5分インキュベーションすることにより、形質膜に穴を開け細胞をセミインタクトにした。TBで2回wash後、3 mg/mlnのWTあるいはApoE細胞質をATP再生系 (1 mM ATP, 8 mM creatine kinase, and 50μg/ml creatine phosphate), 1 mg/ml glucose, 1 mM GTP, 100μg/ml蛍光標識デキストランとともに加え、32℃で45分間インキュベーションし、細胞質の交換を行った。このあと最終濃度1 mMになるように CaCl2を加え、32℃で5分間インキュベーションし、形質膜をリシールした。WT細胞質あるいはApoE細胞質が導入されたリシール細胞をそれぞれ、WTモデル細胞、ApoEモデル細胞とした。
【００３１】
本病態モデル細胞の解析においても重要なことは、「病態モデル細胞」内で検出できる様々な生命反応を、いつも「正常モデル細胞」のそれを対照として、その差異を指標に解析を進める点にある(図２)。この方針で解析を進めることは、上記までの項目で議論してきた「リシール操作」自身によって現れる様々な細胞のストレス応答、細胞内構造や機能の微妙な変化は、「正常モデル細胞」と「病態モデル細胞」にける生命反応の差異に注目する限りは相殺されるべきものであり、逆にこの解析で得られる「差異」は、リシール細胞に導入した正常と病態細胞質のコンポーネントまたはそれらが作る細胞内環境の差異に起因するものである可能性が高いと判断できる。
【００３２】
本研究ではWT細胞質とApoE細胞質の細胞内での振る舞いの違いを検証することで、高脂血症病態細胞質依存的に誘起される様々な細胞内現象の検出を行った。先ず、細胞形質膜上の受容体型チロシンキナーゼであるEGF受容体を介する細胞内シグナル伝達系に注目した。EGF結合によるEGF受容体の活性化により、細胞質内では様々なキナーゼカスケードが活性化されることが知られている。そのうちの一つはRas-MAPK経路、もう一つは、PI3K-Akt経路である（図３）。それぞれの経路の活性化を測定するため、Ras-MAPK経路の活性化においてはp42/p44 MAPKのリン酸化を、PI3K-Akt経路の活性化はAktのリン酸化をそれぞれのリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗体を用いた蛍光抗体法により検出した。この場合、リシール時に用いた細胞質にはTRITC標識デキストランが混入してあるため、リシール細胞のみが赤色に染色され、その染色された細胞における（リシール細胞にのみ） p42/44 MAPKやAktのリン酸化状態およびその時間変化を定量的に計測した。この計測は具体的には次のようにして行った。
【００３３】
リン酸化p42/44 MAPKあるいはリン酸化AktはAlexa488標識二次抗体で染色されているため、各細胞のAlexa488蛍光の平均蛍光量を共焦点レーザー顕微鏡LSM510 (Carl Zeiss)のソフトを用いて計測した。このときTRITC蛍光ポジティブの細胞のシグナルのみを計測に用いることで、インタクト細胞のシグナルを測定から除去することができる。100個以上の細胞のAlexa488蛍光量を測定し、その平均および分散を求め、WTモデル細胞とApoEモデル細胞間で比較した。
【００３４】
その結果、Ras-MAPK経路においては、EGFで刺激したWTリシール細胞とApoEリシール細胞ともに、同じキネティックスを持った一過性のMAPKリン酸化が観察された（図３A）。しかし、PI3K-Akt経路に関しては、WTリシール細胞では、刺激後10分という早い時間に生細胞と同じキネティックスを持ったAktのリン酸化が観察されたが、ApoEリシール細胞ではそれが観察されず、刺激後30分たっても活性化は殆ど見られなかった（図３B, C）。この結果は、ApoE細胞質（高脂血症病態の細胞質環境下）では、PI3K-Akt経路のシグナル伝達系が選択的に撹乱されていることを示唆する。
【００３５】
EGF刺激によるPI3K-Aktシグナル伝達経路の活性化は、細胞増殖、細胞移動、細胞浸潤などの生命現象に深く関わっている。われわれは、特に、Aktの抗アポトーシス作用に注目した（Franke et al. 非特許文献１２）。実際、細胞内のAktのリン酸化（活性化）がアポトーシス誘導に対して阻害的に働くという多くの報告がある。そこで、両リシール細胞を用いて、UV照射と飢餓によるアポトーシス誘導を行い、アポトーシスに対する脆弱性を比較した。図４では、リシール細胞が緑色蛍光（細胞質とともに導入されたFITCデキストランによる）、アポトーシス細胞はTUNEL染色による赤色蛍光が観察されている。その結果、アポトーシス刺激後2時間では、ApoEリシール細胞ではWTリシール細胞に比べ約2倍の確立でアポトーシスが誘導されていることが判った。これは、ApoEリシール細胞のアポトーシスに対する脆弱性を強く示唆している。
【００３６】
実際に、ApoE細胞質が細胞のミトコンドリアを介したアポトーシス誘導に影響を及ぼすと予想される実験結果が、同じく当研究室で構築した「リシール細胞を用いたミトコンドリア形態と機能アッセイ系」（図5概念図参照）を用いて得られている。本アッセイ系は、ミトコンドリアの外膜タンパク質（Tom5）のGFP融合タンパク質を恒常的に発現するCHO細胞株（CHO-Tom5/GFP）を用いて行われた。
【００３７】
ここで用いたCHO-Tom5/GFP細胞株は次のようにして樹立した。Mouse・pEGFP-Tom5プラスミドをCHO（Chinese hamster ovary cell）細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションはLipofectamine Plus (Invitrogen)とLipofectamine reagent (Invitrogen)を用い、メーカーのマニュアルに基づいて行った。トランスフェクションの翌日に細胞をトリプシン溶液により培養皿より剥がし、300 ng/ml Geneticin (Gibco BRL)を含むDMEM-10% 非動化FBS培地中にまきこみ培養した。そのあと３日ごとにGeneticinを含む培地を交換した。７〜１０日後にGeneticin耐性の細胞（つまり当該プラスミドが染色体内に組み込まれた細胞）コロニーが出現するため、これらを24well プレート2枚(1枚はマスタープレート用、もう一枚は以下のグルコース依存的インスリンアッセイに供する)に単離した。アッセイ用24well プレート内の単離した細胞コロニー形成が成熟したところで、蛍光顕微鏡によりGFP-Tom5の蛍光で可視化されたミトコンドリアの形態、細胞全体の扁平さ(光学顕微鏡によるミトコンドリアの形状解析を簡単にするため)を指標にCHO-Tom5細胞株を選択・樹立した。
【００３８】
長さ5〜7μｍという短めの長さが揃ったミトコンドリアを持ち、かつ、細胞質が広く薄く広がり細胞質中のミトコンドリアが形態的に観察しやすいCHO-Tom5/GFPのクローンを選別し株化した。その細胞株をセミインタクト細胞にした後、WT細胞質またはApoE細胞質を導入してリシールした。リシールCHO-Tom5細胞の作成は上記HeLaリシール細胞の作製法に従った。80〜90％コンフルエントに培養したCHO-Tom5 細胞をセミインタクト細胞とし、WT細胞質、ApoE細胞質(ともに細胞質タンパク濃度3.0mg/ml、最終濃度0.1mg/ml  FITC-標識デキストラン(分子量70kDa)を含む)をそれぞれ添加し、32℃で20分間インキュベーションした。その後、最終濃度1.0mMになるようにCaCl2を加えて、更に37℃、5％CO2 インキュベーター内で30分間インキュベーションして「リシールCHO-Tom5細胞」を得た。セミインタクト細胞化またはリシールした直後、ミトコンドリアは丸く膨潤するが30分間37℃のCO2インキュベーターで培養することでもとの形状に復元する。この30分を含め、WT及びApoEリシール細胞を更に90分CO2インキュベーター内で培養して、その後、リン酸緩衝液を用いてミトコンドリア形態が変化しない条件で細胞を固定し、ミトコンドリア画像を多数取得した。なお、ここでの細胞の固定は次の通りに行った。サンプルとなるリシール細胞を、4％パラフォルムアルデヒド(PFA)を含むリン酸緩衝液で、室温、10分間インキュベーションして固定操作を行った。リン酸緩衝液で3回洗浄した後に、1%(v/v)TritonX-100/0.1%(v/v)BSA(ウシ血清アルブミン)を含むリン酸緩衝液で5分間インキュベーションしサンプルの透過性処理（permeabilization）を行った。そのサンプルに対して通常の方法にて間接蛍光抗体法を施したが、全ての操作に使用する緩衝液はリン酸緩衝液とした。
【００３９】
取得した画像よりミトコンドリア長を計測しヒストグラムを作成してWT及びApoEリシール細胞のミトコンドリア形態を比較した。図７に示すように、WTリシール細胞のミトコンドリア長やその細胞内分布状態は生細胞のそれとほとんど変わらなかったが、ApoEリシール細胞では明らかにミトコンドリア長の伸長と膨潤が観察された（細胞内分布も若干核周縁への集積が見られた）。また、TMRMにより、ミトコンドリア膜電位を測定したところ、WTリシール細胞に比べApoEリシール細胞のそれは有意に低下していることが判った。また、興味深いことに、各種EGF受容体キナーゼの阻害剤(Erbstain analog)、PI3Kの阻害剤(wortmaninne)、Aktの阻害剤(Triciribine)を作用させたCHO-Tom5/GFPでは、ApoEリシール細胞のミトコンドリアと酷似した形態的特徴を示すことも判った（図６）。なお、各阻害剤での処理は具体的には次のように行った。すなわち、80〜90％コンフルエントに培養したCHO-Tom5細胞に、各キナーゼ阻害剤(DMSOストック溶液)を最終濃度5μMまたは30μMになるように添加した。コントロールとしては、同容量のDMSOを添加したものを用いた。添加後90分間、37℃の5％CO2インキュベーター内でインキュベーションした後、リン酸緩衝液を用いたミトコンドリア固定法(上述)を用いて細胞を固定し、GFP標識されたミトコンドリア形態を、レーザースキャニング共焦点顕微鏡(LSM510, Zeiss社製)を用いて観察し画像取得した。また多くのコントロール実験より、これらのミトコンドリア形態に関する差は、導入した細胞質の差であることも判った。以上のことより、ApoE細胞質環境では、ミトコンドリアの形態や恐らく機能的にも何らかの撹乱が起こっていること、それにはPI3K-Akt経路の撹乱が起因していることが強く示唆された。
【００４０】
以上の結果より、ApoEリシール細胞におけるアポトーシス耐性の脆弱化は、細胞のアポトーシス活性発現に中心的役割を担うミトコンドリア機能低下が一因となっていることが予想された。最近、ミトコンドリアからのアポトーシス誘導因子・チトクロムCの細胞質への遊離に関与する2種類のチャネル（PTPチャネルとBax/Bak関連チャネル）が報告されており、それらが間接的にではあるがAktのリン酸化によって制御されていること（Rasalo et al. (13)）などから、ApoEリシール細胞では、ミトコンドリア依存的なアポトーシスに対する脆弱性の誘起されており、それがApoE欠損マウスの作る様々な病態に関わっている可能性を示す結果となった。さらに、これらの結果を基に、WTとApoE細胞質を調製したもとの組織（マウス肝臓）のライセートのタンパク質コンポーネントを生化学的比較検討した結果、初期エンドソームに局在する外在性膜タンパク質・APPL1の量がApoE欠損マウスの臓器ではWTマウスのそれに比べて著しく低下しているが判った（図８）。なお、この生化学的比較検討は、具体的に次のようにして行った。
【００４１】
それぞれ5匹のWTまたはApoE(-/-)マウスから調製した肝臓のライセートに対し、10％SDS-PAGEを行った後、セミブロッティング法によりニトロセルロース膜に転写し、５%BSA(ウシ血清アルブミン)溶液でブロッキング後、1次抗体として抗APPL1ウサギ抗体、2次抗体としてHRP標識抗ウサギIgG抗体を用いてウエスタンブロティングを行った。ブロット画像をLAS4000mini（FUJIFILM）により取得後、専用ソフトにより化学発光輝度を定量し比較した。
【００４２】
APPL1は、EGF受容体の活性化にともなうAktの活性化（Aktリン酸化）の制御因子として知られている。実際、siRNA法を用いて、HeLa細胞のAPPL1をノックダウンすると、EGF刺激によるRas-MAPK経路のシグナル伝達はコントロール細胞（scramble siRNA処理）と同様に生起するが、PI3K-Akt経路は、ノックダウン細胞においてだけ選択的に撹乱されることが判った（図９）。これは具体的には次のようにして調べた。HeLa細胞にscramble siRNAあるいはAPPL1 mRNAにターゲットするsiRNA (APPL1 siRNA)を、リポフェクション法（Lipofectamine 2000を使用）によりトランスフェクションした。2日後に血清無しDMEM培地に交換し、16〜20時間後に10%血清を含むDMEM培地で10分間インキュベーションした。そのあとウサギ抗リン酸化p42/44 MAPK (Thr202/Tyr204)抗体（CST）あるいはウサギ抗リン酸化Akt (Ser473)抗体を用いて、間接蛍光抗体法を行った。
【００４３】
PI3K-Akt経路が、ノックダウン細胞においてだけ選択的に撹乱されることは、APPL1の細胞内でのタンパク質量がEGF受容体下流のシグナル伝達、特に、PI3K-Akt経路活性化に密接に関わっていることを強く示唆している。加えて、APPL1タンパク質量が減少しているApoEリシール細胞（または、ApoE欠損マウス個体の（肝臓）細胞）において、EGF依存的なPI3K-Akt経路が攪乱されていることも示唆している。興味深いことに、Aktシグナル活性化（リン酸化）は、その下流因子であるFOXO1の活性化（リン酸化）を通して、アポトーシス誘導に関わる遺伝子発現を負に制御することが知られている（Zhang et al., (15)）。ApoEリシール細胞でPI3K-Akt経路が阻害されているということは、アポトーシス刺激時におけるFOXO1の活性化が不十分になり、その結果、細胞のアポトーシス耐性に対する脆弱性が現れる、というスキームが考えられる。これらのことを総合すると、図１０にApoEリシール細胞におけるアポトーシス耐性に対する脆弱性の予想メカニズムを示した。
【００４４】
また、siRNA法によるAPPL1量を減少させたHepG2細胞（肝臓癌由来細胞）では、インスリン刺激依存的なAktリン酸化が阻害され、インスリンシグナル伝達の最下流と考えられる糖新生に関わるPGC-1α遺伝子やPEPCK遺伝子の転写抑制が減弱する（阻害される）。これは具体的には次のようにして調べた。
【００４５】
APPL1をsiRNA法によりノックダウン(タンパク質量にしてコントロールの約70％に減少)したHepG2細胞を血清飢餓培地で20時間培養した後、インスリン100nMで、0または30分間刺激し、培地を除去した細胞からトータルRNAを調製した。トータルRNAの抽出には、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いた。回収したトータルRNAから、transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche社)を用いて逆転写反応を行ってcDNAを合成し、SYBRGgreen Iを用いてLight Cycler(version3.5)および解析ソフトウエア（Roche Molecular Biochemicals Light Cycler Software version 3.5）により対象遺伝子のmRNAレベルを解析した。なお、ゲノム由来のコンタミネーションを阻止するために、プライマーは、上流。下流ともに、2つのエクソン間をまたぐように設計した(イントロンを間に挟み込む)。解析の結果、インスリン刺激によるPGC-1aおよびPEPCK遺伝子の発現抑制効果が殆ど無くなるまでに減弱した。
【００４６】
PGC-1α遺伝子やPEPCK遺伝子の転写抑制が減弱することは、肝臓細胞のAPPL1量の減少は、肝臓のインスリン抵抗性の原因の一つとなりうることから、APPL1は糖尿病に見られる肝臓のインスリン抵抗性発現メカニズムの鍵タンパク質となり得ることを意味している。
【００４７】
最近、運動によるAPPL1の細胞内発現量が増加するという結果が報告された（Marinho et al., 非特許文献１４）。そこで、運動によって活性化される分子としてセリンースレオニンキナーゼのAMPK(AMP-activated protein kinase)に注目した。AMPK活性の低下は、肝臓におけるインスリン抵抗性を惹起することも報告されており、高脂血症モデルマウス（ApoE欠損マウス）におけるAPPL1量の減少との関連を検討する上での有力候補と考えた。AMPK活性化剤であるAICAR（濃度0.5mM）でHepG2細胞を1時間処理すると、細胞内のAPPL1のｍRNAレベル及びタンパク質量が増加し、逆に、AMPK阻害剤であるAra-A（濃度0.1mM）を1時間処理した細胞では、APPL1のｍRNAレベル及びタンパク質量は減少していることが判った（図１１）。このことは、EGFシグナル伝達（肝臓においてはインスリンシグナル伝達にも関わる）に関わるAPPL1は、AMPKの活性化によって転写レベルでその量を調節しうることを示している。AMPKの活性低下は、肥大した脂肪細胞から分泌されるTNFαや過剰量のグルコース投与によっても惹起されることが知られており、つまり、肥満により運動量も低下している高脂血症モデルマウス（ApoE欠損マウス）の肝臓では、AMPK活性の低下とともにAPPL1量が恒常的に減少するというnegative feedbackがかかっているのではないかと考えられる。一方、AMPKはアディポネクチンシグナルによって活性化されることが判っている。また、APPL1はアディポネクチン受容体に結合することも知られている。これらを考慮すると、アディポネクチンシグナル伝達下では、APPL1はAMPKを活性化させる調節因子であるとともに、活性化されたAMPKによって自らの発現量（転写）を活性化させるというpositive feedback機構を持っている可能性も考えられる。APPL1は、インスリンシグナル伝達を正に制御する分子であるため、インスリンシグナルが活性化される（摂食時）前の細胞においては、AMPKの活性化（つまり、アディポネクチンシグナルONまたは運動による）によるAPPL1量の増加（活性化）は、摂食後に増加するインスリンシグナルを効果的に細胞内で伝達するために重要であると思われる。つまり、摂食前の運動は、AMPKを活性化させて細胞内のAPPL1量を増加させ、インスリンシグナルの効果（肝臓では、主に、糖新生の阻害）を十分発揮させるために重要ということになる。実際、われわれは、AMPKの活性低下が、APPL1量の減少を誘起し、肝臓におけるインスリン抵抗性（インスリン刺激時のリン酸化Akt量の減少、糖新生に関わるPGC-1α遺伝子やPEPCK遺伝子の転写量減少を阻害する）を誘起することを観察している。これは新しいインスリン抵抗性獲得のモデルとなりうる。
【００４８】
この様に、セミインタクト細胞リシール法を用いる利点は、導入した細胞質の差分を解析することで、ターゲットとしている生命現象の制御因子を2次元電気泳動法によるタンパク質発現変動情報、遺伝子発現変動情報、バイオインフォマティックス技術などを駆使して絞り込み、そして同じ実験系で検証することができることである。最終的には、絞り込んだ病態発現に関わる候補「鍵タンパク質」を得て、生細胞レベルでその候補となった「鍵タンパク質」の過剰発現またはノックダウン等を行い、その鍵タンパク質が真に病態発現のフェノタイプを示すかどうかを検証することによって、「鍵タンパク質」を同定するものである。この様な病態発現の鍵タンパク質の同定は、病態改善薬開発のためのリード化合物のよいターゲットとなったり、その鍵タンパク質が関わる病態発現メカニズムを明らかにすることで新規治療法の開発につながる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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