(57)【要約】【課題】プラバスタチン類縁体、並びに、プラバスタチン類縁体のエステル部分に存在するメチル基が[11C]で標識化されたプラバスタチン類縁体及びプラバスタチン類縁体の前駆体を提供し、ＰＥＴ用分子プローブやトランスポーター機能評価用プローブに適用可能とすることを解決すべき課題とする。【解決手段】本発明は、下記化学構造式（ただし、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して炭素数６以下のアルキル基）又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなるプラバスタチン類縁体である。８位の炭素に結合したエステル部分の末端メチル基が[11C]で標識されているものは、ＰＥＴ用分子プローブやトランスポーター機能評価用プローブ。2013231008.tif 000014【選択図】図１
2013231008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（ただし、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素又は炭素数６以下のアルキル基を示す）又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなるプラバスタチン類縁体。
【化１】
2013231008.tif 000012
【請求項２】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１つはメチル基であることを特徴とする請求項１記載のプラバスタチン類縁体。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１つは [11C]で標識されたメチル基であることを特徴とする請求項２記載のプラバスタチン類縁体。
【請求項４】
請求項３に記載のプラバスタチン類縁体を含有することを特徴とするＰＥＴ用分子プローブ。
【請求項５】
請求項３に記載のプラバスタチン類縁体を含有することを特徴とするトランスポーター機能評価用プローブ。
【請求項６】
下記一般式（Ａ）示されるプラバスタチン類縁体の前駆体（ただし、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素又は炭素数６以下のアルキル基を示し、Ｘはトリアルキルスズ、有機基置換ホウ素化合物基、ボロン酸基及びボロン酸エステル基のいずれかを示し、Ｙは下記置換基（a）、（b）及び（c）のいずれかを示し、Ｐｒは水酸基の保護基を示し、Ｚはアルキル基又は芳香族置換基を示す）。
【化２】
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプラバスタチン類縁体、並びに、プラバスタチン類縁体のエステル部分に存在するメチル基が[11C]で標識化されたプラバスタチン類縁体及びプラバスタチン類縁体、その前駆体及びそれらを用いたＰＥＴ用分子プローブ及びトランスポーター機能評価用プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品のプラバスタチン(下記化学式(1)参照)はHMG-CoAの阻害剤であり、血中コレステロール低下剤として臨床的に使用されている。プラバスタチンの体内動態には、薬物トランスポーターOATP1B1、MRP2の関与が大きいことがわかっている。このプラバスタチンの体内動態特性を把握することにより、これらの薬物トランスポーターのヒトin vivoにおける機能が解明でき、薬物トランスポーターを介した薬物間相互作用や遺伝子多型の解析など、新たな医薬品の開発に応用可能と考えられるため有益である。
【０００３】
【化１】
2013231008.tif 000003
【０００４】
しかしながら、プラバスタチンの体内動態についての研究手法としては、血中濃度の時間的な変化をHPLC等で調べる以外に、効果的な研究ツールがなかった。
【０００５】
一方、薬物の膜輸送に関する最近の研究によると、薬物の細胞内への取り込みは従来考えられていた受動拡散とよばれる単純な浸透による経路だけではなく、トランスポーターと呼ばれる特別なタンパク質を介した輸送が行われているということが分かっている。上記プラバスタチンについても、肝臓内にある特定のトランスポーター(OATP1B1,MRP2)によって輸送されることが知られており、トランスポーターが薬物の吸収と体内動態に関してどのような役割を果たしているかを知ることは、新規の医薬品の開発にとって重要なこととなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO/2007/046258
【特許文献２】WO/2010/074272
【特許文献３】WO2008/023780
【特許文献４】特開昭57-156463号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Suzuki, M., et al., Chem. Eur. J., 3, 2039-2042 (1997).
【非特許文献２】Hosoya, T., et al., Org. Biomol. Chem., 4, 410-415 (2006).
【非特許文献３】Hosoya, T., et al., Org. Biomol. Chem., 2, 24-27 (2004).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、プラバスタチンをＰＥＴプローブ化できれば、新規の医薬品開発の際に、トランスポーターを介したプラバスタチンの体内での動きをＰＥＴというツールで可視化することができ、この結果をもとに薬物動態の予測研究に役立てられるのではないかと考えた。ＰＥＴとは、11Cや18Fなどのポジトロンを放出する短寿命放射性核種で標識されたトレーサーを生体内に投与し、トレーサーにより発生するγ線をＰＥＴカメラ（ガンマ線シンチレーターと光電子増倍管からなる検出器）によって計測して、その体内分布をコンピューターにより画像化する方法であり、小動物からヒトまで含めた生体での薬剤の薬物挙動や標的部位への到達度を、非侵襲的かつ定量的に追跡することができる。
【０００９】
しかし、技術活用の鍵となるＰＥＴプローブの合成は、分子に組み込む放射性核種の寿命が短いために困難を伴う。すなわち、ＰＥＴ法で使用される短寿命放射核種としては11Cや18Fなどが用いられ、これらの放射性核種で標識された化合物がトレーサーとして用いられる。これらの中でも11Cは有機化合物中に存在している炭素原子を利用しているため適用範囲が極めて広く、理想的な放射性核種といえる。しかしながら、11Cは半減期が２０分と短く、合成からＰＥＴ法での測定までを極めて短時間で行なわなければならないため、合成に与えられる時間はごくわずかとなってしまう。
【００１０】
さらには、サイクロトロンで製造できる11C核種は超微量（数十から数百ｎｍｏｌレベル；12Cの混入を考慮した値）であり、超希薄な11C核種の化合物と化学反応させるために、大過剰の被標識基質の存在下という特殊な条件下で行われる。このため、いかに短時間で効率良く生物活性有機化合物や創薬候補化合物をＰＥＴ分子プローブ化できるかということが最重要課題となっている。
【００１１】
こうした状況下、本発明者の鈴木らは、[11C]ヨウ化メチルを用いた炭素母核上への[11C]メチル化について開発を行ってきた。すなわち、有機スズ化合物を中間原料として、これにStille型カップリング反応を適用することにより、芳香環上への高速C-[11C]メチル化のみならず、オレフィンやアルキンやヘテロ芳香環上への高速C-[11C]メチル化も可能としてきた（特許文献１、２及び非特許文献１〜３）。そしてさらには、従来の有機スズ化合物への高速C-[11C]メチル化と相補的に、新たに有機ホウ素化合物を用いSuzuki-Miyaura型カップリング反応を適応した高速C-[11C]メチル化反応も開発している（特許文献３、非特許文献４）。
【００１２】
こうした炭素母核上への[11C]メチル化の新規合成法の開発にもかかわらず、プラバスタチンやその誘導体についての[11C]標識化されたＰＥＴプローブは従来合成されていなかった。
【００１３】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、プラバスタチン類縁体、並びに、プラバスタチン類縁体のエステル部分に存在するメチル基が[11C]で標識化されたプラバスタチン類縁体及びプラバスタチン類縁体の前駆体を提供し、ＰＥＴ用分子プローブやトランスポーター機能評価用プローブに適用可能とすることを解決すべき課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
高速メチル化法（特許文献１、２及び非特許文献１〜３）は、これらの課題を解決するための強力なツールとなる方法ではあるが、完全なる汎用方法ではない。なぜならば、メチル化される基質に存在する官能基が反応を阻害したりする場合があるからである。
【００１５】
このことは、プラバスタチンに存在するメチル基が11Cで標識化された化合物を合成する場合にもいえる。すなわち、これらの化合物の合成のためには、プラバスタチンに存在する水酸基やカルボキシ基の保護をどうするかという問題がある。また、プラバスタチンは、塩の形態で水溶性の化合物として得られるため、分離精製に困難を伴う。さらには、最終段階で脱保護反応や加水分解反応を迅速に行う必要がある。
【００１６】
本発明者らは、これらの困難を克服すべく鋭意研究を行った結果、プラバスタチンのエステル部分に二重結合が導入され、末端のメチル基が11Cで標識化されたデヒドロプラバスタチン及びそのコールド体（11Cで標識化されていない化合物）の合成に成功し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明の第1の局面は、下記化学構造式（ただし、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素又は炭素数６以下のアルキル基を示す）又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなるプラバスタチン類縁体である。
【００１８】
【化２】
2013231008.tif 000004
【００１９】
「薬学上許容される塩」について特に限定はないが、酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、グリコール酸塩、フタル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等の有機酸塩）等が挙げられる。
【００２０】
また、「プロドラッグ」とは、生体内で加水分解されて本発明のプラバスタチン類縁体を再生する化合物のことをいう。本発明のプロドラッグには、当業者に知られたプロドラッグ化のすべての手法で製造される化合物が含まれる。例えば、本発明のプラバスタチン類縁体のカルボキシ基を生体内で容易に加水分解されうるエステル基またはアミド基等に誘導した化合物が、プロドラッグに相当する。例えば、そのカルボキシ基を、メチル、エチル等のアルキル、メチルオキシメチル、エチルオキシメチル、２−メチルオキシエチル、２−メチルオキシエチルオキシメチル等のアルキルオキシアルキル、ピバロイルオキシメチル、アセチルオキシメチル、シクロヘキシルアセチルオキシメチル、1-メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチル等のアシルオキシメチル、エチルオキシカルボニルオキシ-1-エチル等のアルコキシカルボニルアルキル、シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ-1-エチル等のシクロアルキルオキシカルボニルアルキル等に誘導した化合物が挙げられる。
【００２１】
本発明の第２の局面は、上記のプラバスタチン類縁体におけるＲ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１つはメチル基であることを特徴とする。
第２の局面のプラバスタチン類縁体は、以下の第1工程〜第3工程を行うことによって製造することができる。
・第1工程
プラバスタチンナトリウム塩のエステル部分をナトリウムメチラート等の塩基でエステル交換することによって除去した後、カルボン酸基を保護基で保護し、さらに８位以外のヒドロキシ基を保護基で保護する。
・第２工程
下記一般式（ここでＲ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素又は炭素数６以下のアルキル基を示し、Ｒ４はアルキル基又は芳香族置換基を示す）で示された化合物の炭素−炭素二重結合を臭素でジブロム化した後、ＤＢＵ等の塩基で脱臭化水素化して再び炭素−炭素二重結合を形成させた後、β炭素にトリアルキルスズ、有機基置換ホウ素化合物基、ボロン酸基及びボロン酸エステル基のいずれかを結合させる。
【００２２】
【化３】
2013231008.tif 000005
・第３工程
第1工程で製造した化合物と第2工程で製造した化合物とをエステル化させた後、高速メチル化を行い、第２の局面のプラバスタチン類縁体を得る。
【００２３】
本発明の第３の局面は、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のいずれか１つは [11C]で標識されたメチル基であることを特徴とする。
第３の局面のプラバスタチン類縁体は、上記第3工程における高速メチル化の際、[11C]で標識化された高速メチル化を行うことによって得ることができる。
【００２４】
本発明の第３の局面の[11C]で標識されたプラバスタチン類縁体は、プラバスタチン類縁体の部分構造を有する下記有機スズ化合物あるいは有機ホウ素化合物（ただし、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素又は炭素数６以下のアルキル基を示し、Ｘはトリアルキルスズ、有機基置換ホウ素化合物基、ボロン酸基及びボロン酸エステル基のいずれかを示す。また、Ｙは下記置換基（a）、（b）及び（c）のいずれかを示し、Ｐｒは水酸基の保護基を示し、Ｚはアルキル基又は芳香族置換基を示す。）からなる前駆体の高速[11C]メチル化を経由して合成することができる。
【化４】
2013231008.tif 000006
【００２５】
Ｘがトリアルキルスズである場合のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、オクチル基等が挙げられる。
なお、本明細書において有機基置換ホウ素化合物基とは、9-ボラビシクロ[3.3.1]ノナン基等のようにホウ素に直接カーボンが結合した官能基を示す概念であり、ボロン酸エステル基はボロン酸のピナコールエステル基も含む概念である。
また、水酸基の保護基としては、tert-ブチルジメチルシリル基、トリメチルシリル基、アセチル基、ＭＯＭ，ＭＥＭ，ＢＯＭ，ＴＨＰ，ＰＭＢ，ＴＢＤＰＳ等が挙げられる。
【００２６】
本発明の11C標識プラバスタチンは、ＰＥＴ用分子プローブとして好適に用いることができる。本発明者らは、これらのＰＥＴ用分子プローブを用いてＰＥＴ法によるイメージングに成功している。
また、プラバスタチンは前述したようにHMG-CoAの阻害剤であり、肝臓内にある特定のトランスポーター(OATP1B1, MRP2)によって輸送されることが知られている。このため、11Cで標識されたプラバスタチンを用い、ＰＥＴ法を適用することによって、OATP1B1やMRP2というトランスポーターを介したプラバスタチンの体内動態を知ることができる。すなわち、11Cで標識されたプラバスタチンをトランスポーター機能評価用のプローブとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ラットへ[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を投与した後の、時間ごとの腹部の放射能のPETイメージである。
【図２】ラットへ[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を投与した後の、時間ごとの血中放射能の経時変化を示すグラフである。
【図３】ラットへ[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を投与した後の、時間ごとの胆汁中の放射能の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
実施例では、血中コレステロール低下剤として知られるプラバスタチン（pravastatin）(1)の８位のエステル部分がαβ不飽和エステルに変換された2´,3´-デヒドロプラバスタチン(
(2´,3´-dehydropravastatin)(4)を合成した。実施例として2´,3´-デヒドロプラバスタチン(4)をターゲットにした理由は以下のとおりである。
すなわち、プラバスタチン(1)とよく似た構造を有する医薬品のシンバスタチン(simvastatin)(2)及びロバスタチン(lovastatin)(3)は、プラバスタチン(1)におけるエステル部分の構造を比較するとメチル基の数が異なり、シンバスタチン(2)ではエステル部分の不斉炭素が無くなっているにもかかわらず、生理活性としてはプラバスタチン(1)と大きな差はない。このことから、エステル部分の構造変換は化合物の生理活性に変化を与えないと思われ、2´,3´-デヒドロプラバスタチン(4)も同様の生理活性を有するものと推定されたからである。
【００２９】
【化５】
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【００３０】
2´,3´-デヒドロプラバスタチン(4)の合成は、下記スキーム１〜３に示すように、エステル部分の脱離と再構築による方法で合成した。すなわち、スキーム１に示すように、プラバスタチンナトリウム塩のエステル部分をナトリウムメチラートでエステル交換することによって除き、トリエチルアミンの存在下でシアノホスホン酸ジエチルで処置してラクトンとした後、tert-butyldimethylsilylchloride（TBSCl）によって８位以外のヒドロキシ基を保護した。
【００３１】
【化６】
2013231008.tif 000008
【００３２】
カルボン酸ユニットは、以下に示すスキーム２に従って合成した。
市販のtert-ブチルメタクリレート(8)を四塩化炭素中において、０℃〜室温にて臭素を添加してジブロム化を行い、定量的に化合物(9)を得た。その後ＤＢＵを用い、０℃ＴＨＦ溶媒中で脱臭化水素化し、ビニルブロミド(10)を９９％収率で得た。続いて、ビニルブロミド(10)を3-pinacol boronated methacrylate (11)に変換し（収率６９％）、さらにトリフルオロ酢酸を用いて脱エステル化し、boronated acid (12)を収率６０％で得た。
【００３３】
【化７】
2013231008.tif 000009
【００３４】
デヒドロプラバスタチン(4)の合成は、スキーム３に従って合成した。すなわち、アルコール（7）を市販のチグリン酸を用い、ジエチルクロロホスフェート及びトリエチルアミンを用いてエステル化を行い、70%収率でエステル(13）を得た。(E)異性体：(Z)異性体の比率は7:3のであった。さらに順相HPLCによって純粋な(E)異性体(13）を分取した。こうして得られたエステル(13）をテトラブチルアンモニウムイオンの塩基性を大過剰の酢酸で中和した状態でフッ素イオンにより脱保護して化合物(14）を得た（収率90％）。なお、酢酸無しの条件では、化合物(14）は得られず、その代わりに、脱水を経て芳香族化した化合物(15）が生成した。化合物(13）が脱保護されたラクトン(14)は、水酸化ナトリウムによって加水分解され定量的にデヒドロプラバスタチン(4）を与えた。予想されたように、デヒドロプラバスタチン・ナトリウム(4)は、天然プラバスタチン・ナトリウムと同様、OATP1B1トランスポーターの良い基質となることが証明された。こうした肯定的な生物学的情報に基づき、11C放射性核種でデヒドロプラバスタチン(4)を標識化する研究を行った。
【００３５】
【化８】
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【００３６】
[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の合成は以下に示すスキーム４に従って合成した。
すなわち、まずアルコール中間体(7)を、化合物(13)を合成した場合と同様の条件下、アクリル酸ボロンエステル(12)と反応させて、11C標識化の前駆体となるボロン酸エステル(16)を得た。この物質はTBAFの存在下で非常に不安定であったので、ＴＢＳを脱保護させることなくボロン酸エステル(16)を11C標識化の基質とした。ボロン酸エステル16は、ＴＨＦ中、Pd2(dba)3 、P(o-toly)3及びK2CO3 (モル比で1:3:4)存在下、 65 °C で5 分間反応させることにより、11Cで標識化された化合物(13)を得た。このとき、副生成物として、脱水素化された化合物(15)も得られた。ＴＨＦ中での脱保護では、目的化合物である[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の他に放射性の副生成物が得られた。この物質はLC-MSによって [11C](17)であると同定された。
通常の高速メチル化反応ではその[11C]ヨウ化メチルの捕獲効率からDMFが多く用いられるが、本法では標識反応に続く脱保護反応、加水分解反応により適応するためにTHFを用いている。
【００３７】
【化９】
2013231008.tif 000011
【００３８】
以下、デヒドロプラバスタチン(4)及び[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の合成に関する詳細な説明を述べる。
＜操作方法、装置及び試薬＞
すべての操作は、特に明記しない限りアルゴン空気の下で行った。アルゴン・ガスは、P2O5（メルク、SICAPENT）へ通風することによって乾燥した。 NMRスペクトルは、JEOL AL-400分光計（1Hでは400MHz、13Cでは100MHz）で測定した。化学シフトはテトラメチルシランを内部標準とするδppmで示されている。13C-NMRのための内部標準はクロロホルム-d1（13Cではδ77.0）を用いた。1H及び13C-NMRスペクトルは、CDCl3又は、CD3OD溶液中で測定した。質量スペクトルはThermofisher Scientific LCQ Fleet質量分析計で測定した。高分解能質量スペクトルは、JEOL JMS-T100LC質量分析計で測定した。旋光度はJASCO P-2100旋光度計を用いた。融点測定はAS-ONE ATM-01融点測定器を用いて測定した。
［11C］メチル化は、すべて遠隔操作で、鉛遮蔽されたホットセル内で行った。［11C］二酸化炭素はCYPRIS HM-12Sのサイクロトロン（住友重機械工業）を使い、14N（p、α）11C反応によって合成し、分子イメージング科学研究センターに設置された11C-標識自動合成装置を用い、水素化リチウムアルミニウムでの処理及びそれに続くヨウ水素酸での処理によって、［11C］ヨウ化メチルを合成した。こうして得られた［11C］ヨウ化メチルは、直ちにパラジウム（0）によって行われる高速メチル化反応に供した。
［11C］メチル化された化合物のための分析HPLCシステムは、アロカ・ラジオアナライザー（RLC-700）と、システム・コントローラ（CBM-20A）、オンライン デガッサー（DGU-20A3）、溶媒供給ユニット（LC-20AB）、カラム・オーブン（CTO-20AC）、フォトダイオードアレイ検出器（SPD-M20A）及びソフトウェア（LC-ソリューション）を備えた島津HPLCシステムから構成されている。分析及び分取HPLCのためのカラムは、COSMOSIL C18 MS-II 4.6×100mm及び10×250mm（ナカライテスク）を用いた。放射能は、ATOMLAB（登録商標）300投与量較正器（アロカ）で定量した。
【００３９】
tert-butyl 2,3-dibromo-2-methylpropanoate (9)の合成
tert-butyl methacrylate (8.15 mL, 50 mmol)をCCl4に溶解して０℃下で2.65mlの臭素(51 mmol)を加えた後、室温で16時間撹拌した。反応混合液を飽和硫酸水素ナトリウムでクエンチした後、エーテルで希釈した。有機層をエーテルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を減圧濃縮し目的の化合物(9)を得た。
1H NMR (CDCl3) δ4.18(dd, J=0.49, 9.75 Hz, 1H), 3.70(d, J=9.75 Hz, 1H), 1.98(d, J=0.49 Hz, 3H), 1.51(s, 9H) 
13C NMR (CDCl3) δ167.0, 82.8, 56.6, 38.2, 27.2, 25.9  
Mass spectra (EI) 289 (M+4-CH3), 287 (M+2-CH3), 285 (M-CH3), 231 (M+4-OtBu), 229 (M+2-OtBu), 227 (M-OtBu), 203 (M+4-OtBu-CO), 201 (M+2-OtBu-CO), 119 (M-OtBu-CO)
HRMS (EI) m/z calcd for C7H11O281Br2: 288.9085; found 288.9088 [M-CH3], m/z calcd for C7H11O279Br81Br: 286.9105; found 286.9102 [M-CH3], m/z calcd for C7H11O279Br2: 284.9125; found 284.9135 [M-CH3]
【００４０】
(E)-tert-butyl 3-bromo-2-methylacrylate (10)の合成
tert-butyl 2,3-dibromo-2-methylpropanoate (3.03 g, 10 mmol)をTHFに溶解させ、０℃に冷却し、DBU (1.65 mL, 11 mmol)を添加し１６時間室温下で撹拌した。反応混合液をエーテルで希釈し、水洗した。有機層をクエン酸で３回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で２回洗浄した後、塩化ナトリウム溶液を加えた。有機層を無水Na2SO4 によって脱水し、減圧濃縮し、化合物10を1.86 g (8.46 mmol, 収率85 %)で得た。
1H NMR (CDCl3) δ7.41(q, J=1.6 Hz, 1H), 1.96(d, J=1.6 Hz, 3H), 1.49(s, 9H) 
13C NMR (CDCl3) δ164.0, 135.4, 121.6, 81.4, 27.9, 15.5  
Mass spectra (EI) 222 (M+2), 220 (M) 149, (M+2-OtBu), 147 (M-OtBu), 121 (M+2-OtBu-CO), 119 (M-OtBu) 
HRMS (EI) m/z calcd for C4H4O181Br: 148.9425; found 148.9423 [M-OtBu], m/z calcd for C4H4O179Br: 146.9445; found 148.9444 [M-OtBu]
【００４１】
(E)-tert-butyl 2-methyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)acrylate(11)の合成
(E)-tert-butyl 3-bromo-2-methylacrylate (221 mg, 1 mmol) と、酢酸カリウム (196 mg, 2 mmol)と、bis (pinacolato) diboron (508 mg, 2 mmol)とを3.5 mL の 1,4-dioxaneに溶かし、10 mgのPdCl2(dppf)CH2Cl2を添加し、80 °C で16 時間加熱する。反応混合液を水で希釈し、エーテルで４回抽出する。有機層をまとめ、食塩水で洗い、無水Na2SO4で脱水後、濃縮した。粗生成物をSiO2 カラムクロマトグラフィーで精製し、184 mg (収率68.6%)の化合物11を得た。
1H NMR (CDCl3) δ6.43(q, J=1.2 Hz, 1H), 2.11(d, J=1.2 Hz, 3H), 1.48(s, 9H), 1.29(s, 12H) 
13C NMR (CDCl3) δ149.21, 83.5, 80.5, 28.0, 24.8, 7.0  
MS (ESI) 291 (M+Na) 
HRMS (TOF) m/z calcd for C14H25B1O4Na1: 291.1746; found 291.1743 [M+Na]
Melting point 62 °C
【００４２】
(E)-2-methyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)acrylic acid (12)の合成
(E)-tert-butyl 2-methyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)acrylate (268 mg, 1 mmol)を5 mL の CH2Cl2 に溶かし、0 °C下で 0.5 mL のトリフルオロ酢酸を加え、室温にて２時間撹拌した。反応混合液をPLC (hexane/EtOAc 1/1)で精製し、化合物12を126 mg (収率59.3%)、原料のボロン化合物を37 mg (13.8%)回収した。
1H NMR (CD3OD) δ11.1(br, 1H), 6.40(q, J=1.2 Hz, 1H), 2.09(d, J=1.2 Hz, 3H), 1.29(s, 12H) 
13C NMR (CD3OD) δ171.8, 145.6, 83.3, 24.4, 16.3  
MS (ESI) 213 (M+H) [positive mode], 211(M-1) [negative mode] 
HRMS (TOF) m/z calcd for C10H16B1O4: 211.1143; found 211.1150 [M-H]
Melting point 152 °C
【００４３】
(E)-(1S,3S,7S,8S)-3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-8-(2-((2R,4R)-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methylbut-2-enoate (13)の合成
4-pyrrolidinopyridine 89 mg (0.6 mmol)を0.6mlのベンゼンに溶解し、112 μL(0.8 mmol)の トリメチルアミン及び40 mg (0.4 mmol) のチグリン酸を0 °C下で加えた後、2.5時間還流を行った。反応終了後、反応混合液を室温まで冷却した後、酢酸エチルで希釈した。希釈溶液を5％クエン酸で３回洗浄し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で２回洗浄し、塩化ナトリウム溶液を加えた。有機層を無水Na2SO4で脱水し、減圧下で濃縮し、得られたオイルをシリカゲルカラムで精製して化合物13を108 mg (172μmol,収率 86%) 得た。
1H NMR (CDCl3) δ6.77(m, 1H), 5.99(d, 1H, J=9.77 Hz), 5.85(dd, 1H, J=5.85, 9.77 Hz), 5.49(br-s, 1H), 5.41(br-s, 1H), 4.57(m, 1H), 4.42(m, 1H), 4.26(m, 1H), 2.34-2.40(m, 5H), 1.26-1.85(m, 15H), 0.88(s, 18H), 0.88(s, 3H), 0.07(s, 12H) 
13C NMR (CDCl3) δ170.7, 167.9, 137.6, 135.6, 135.0, 129.1, 128.1, 127.6, 76.5, 70.1, 66.1, 64.0, 39.7, 38.0, 37.5, 37.2, 33.3, 31.5, 18.7, 18.4, 14.9, 14.2, 12.5, -4.47 
[a]25d +69.6 (c = 18.9, CHCl3)
MS (ESI) 655 (M+Na), 633(M+Na) 
HRMS (TOF) m/z calcd for C35H60O6Si2Na1: 655.3826; found 655.3826 [M+Na]
【００４４】
(E)-(1S,3S,7S,8S)-3-hydroxy-8-(2-((2R,4R)-4-hydroxy-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methylbut-2-enoate (14)の合成
40 mg (63μmol)の
(E)-(1S,3S,7S,8S)-3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-8-(2-((2R,4R)-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methylbut-2-enoateを0.5 mL の THF 溶液を、86 μL (1.5 mmol) の酢酸と1 mL (1 mmol) の1.0 M tetrabuthylammonium fluorideの THF 溶液を 0 °C下において加えた。混合物を 14時間室温で撹拌した。撹拌終了後、混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて2回洗浄し、塩化ナトリウム溶液を加えた。有機層を無水Na2SO4で脱水し、減圧下で濃縮し、得られたオイルをシリカゲルカラムで精製して化合物14を23 mg (56.9 μmol, 90%)得た。
1H NMR (CDCl3)δ 6.78(m, 1H), 6.01(d, 1H, J=9.51 Hz), 5.89(dd, 1H, J=5.83, 9.51 Hz), 5.59(br-s, 1H), 5.44(br-s, 1H), 4.60(m, 1H), 4.42(m, 1H), 4.35(m, 1H), 2.57-2.75(m, 3H), 2.34-2.42(m, 2H), 1.90(m, 1H), 1.29-1.79(m, 15H), 0.91(d, 3H, J=7.07 Hz) 
13C NMR (CDCl3) δ 170.2, 167.5, 137.7, 135.6, 135.2, 128.4, 127.3, 126.0, 75.8, 69.3, 64.9, 62.5, 30.2, 38.4, 37.6, 36.7, 36.5, 35.8, 32.5, 30.9, 23.4, 14.3, 13.5, 11.9  
[a]25d +266.4 (c = 0.50, CHCl3)
MS (ESI) 427 (M+Na), 831(2M+Na)
HRMS (TOF) m/z calcd for C23H32O6Na1: 427.2097; found 427.2105 [M+Na]
Melting point 156 °C
【００４５】
sodium (3R,5R)-3,5-dihydroxy-7-((1S,2S,6S,8S)-6-hydroxy-2-methyl-8-(((E)-2-methylbut-2-enoyl)oxy)-1,2,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl)heptanoate (4)の合成
1,4-dioxane（1 mL） と水（480 μL）の混合溶媒中に、(E)-(1S,3S,7S,8S)-3-hydroxy-8-(2-((2R,4R)-4-hydroxy-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methylbut-2-enoateを23 mg (56.9 μmol)溶解させ、水酸化ナトリウム水溶液（0.1 M）を569μＬ(56.9 μmol)を加えて室温で30分撹拌した。反応終了間際に凍結乾燥させ、白色粉末27 ｍｇを得た。ＨＰＬＣを用いて精製し、純粋な化合物（４）を23mg得た。
1H NMR (CD3OD) δ 6.77(m, 1H), 5.99(d, 1H, J=9.51 Hz), 5.88(m, 1H), 5.51(br-s, 1H), 5.38(br-s, 1H), 4.26(m, 1H), 4.05(m, 1H), 3.65(br-s, 1H), 2.20-2.53(m, 6H), 1.78(s, 3H), 1.77(s, 3H), 1.22-1.70(m, 7H), 0.91(d, 3H, J=7.1 Hz) 
13C NMR (CD3OD) δ180.4, 169.1, 138.7, 136.8, 136.7, 130.0, 128.6, 72.3, 71.3, 69.4, 68.1, 65.5, 45.5, 44.9, 39.0, 38.5, 37.1, 35.4, 32.4, 25.0, 14.4, 14.0, 12.1  
[a]25d +131.3 (c = 0.44, EtOH)
MS (ESI) 421 (M-Na) [negative mode] 
HRMS (TOF) m/z calcd for C23H33O7: 421.2226; found 421.2221 [M-Na] 
Melting point 134 °C
【００４６】
(E)-(1S,3S,7S,8S)-3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-8-(2-((2R,4R)-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)acrylate (16)の合成
(E)-2-methyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)acrylic acid (121 mg; 0.57 mmol) と 4-pyrrolidinopyridine (134 mg; 0.9 mmol) と0.8ｍＬのベンゼンに溶解した Et3N (168 μL; 1.2 mmol)の混合溶液に、 diethyl chlorophosphate (130 μL; 0.75 mmol)を0℃で30分かけて滴下した。反応混合物に(4R, 6R)-6-{2-[(1S, 2S, 6S, 8S, 8aR)-1,2,6,7,8,8a-hexahydro-6-tert-butyldimethylsilyloxy-8-hydroxy-2-methyl-1-naphthyl]ethyl}tetrahydro-4-t-butyldimethylsilyloxy-2H-pyran-2-one (165 mg; 0.3 mmol)を加え室温にし、ethyl acetateで希釈した。希釈された混合物は5% citric acidで3回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、エバボレータで溶媒を留去した。得られた油状化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成し、目的化合物（１６）を収率86.0％で192mg 得た。
1H NMR (CDCl3) δ 6.41(s, 1H), 5.97(d, 1H, J=9.76 Hz), 5.84(dd, 1H, J=5.85, 9.76 Hz), 5.47(br-s, 1H), 5.41(br-s, 1H), 4.56(m, 1H), 4.41(m, 1H), 4.26(m, 1H), 2.35-2.57(m, 5H), 2.17(s, 2H), 2.12(s, 3H), 1.85-1.64(m, 4H), 1.30-1.26(m, 15H), 0.88(s, 18H), 0.88(s, 3H), 0.06(s, 12H) 
13C NMR (CDCl3) δ170.3, 167.2, 147.3, 135.1, 134.4, 127.7, 127.2, 83.7, 76.3, 70.5, 65.5, 63.5, 39.3, 37.6, 36.9, 36.7, 36.6, 32.9, 31.0, 25.9, 25.7, 24.8, 23.6, 18.2, 18.0, 17.1, 13.7, -4.57, -4.66, -4.87, -4.91 
MS (ESI) 744(M+H), 767 (M+Na) 
[a]25d +93.0 (c = 0.60, CHCl3)
HRMS (TOF) m/z calcd for C40H69BO8Si2Na: 767.4529; found 767.4526 [M+Na] 
Melting point 63 °C
【００４７】
(3R,5R)-3,5-dihydroxy-7-((1S,2S,6S,8S)-6-hydroxy-2-methyl-8-((1-[11C]-(E)-2-methylbut-2-enoyl)oxy)-1,2,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl)heptanoate [11C]-4の合成
従来の方法に従って[11C]CO2から合成した[11C]methyl iodideを、300μＬのＴＨＦに溶解した(E)-(1S,3S,7S,8S)-3-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-8-(2-((2R,4R)-4-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl)ethyl)-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl 2-methyl-3-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)acrylate (2.0mg;2.7μmol)、Pd2(dba)3 (2.0mg;2.2μmol)、P(o-toly)3(2.0mg;6.6μmol),及びK2CO3(1.2mg;8.7 μmol)中でトラップした。反応混合物を5分間65℃で加熱した。反応混合物を0℃にした。その後、反応混合物に200μLのTBAF溶液（1 M）加え、60℃で2分間加熱した。その後反応容器を室温に戻し、0.1Mの水酸化ナトリウム水溶液400μＬを加え、1分間静置した。その後、10mM酢酸アンモニウム水溶液400 μLで希釈し、混合物を分取ＨＰＬＣカラムに注入した。移動相は10ｍＭ酢酸アンモニウム及びアセトニトリル（70:30）、流量は5mL/minで、UV検出波長230nmを使用した。[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の保持時間は12.5分であった。目的のフラクションをフラスコに集め、エバポレータで溶媒を留去した。
PET測定に用いられる[11C]デヒドロプラバスタチン(4)は生理食塩水4mLに溶解して調製した。合成時間の合計は34分であった。放射化学収率は（HPLC分析収率）は64％、崩壊補正収率は19.7%（n=3）、比放射能（SA）は79GBq/μmol（n=3）であった。
【００４８】
＜[11C]デヒドロプラバスタチン(4)のＰＥＴへの適用＞
（ＰＥＴ画像）
ラットへ[11C]デヒドロプラバスタチン(4)（22±1MBq/body）を投与した後の、各時間における腹部のPET画像(maximum intensity projection画像)を図1に示す。
【００４９】
・正常ラット（図１Ａ参照）
[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を正常ラット静脈内に投与後、投与後初期においては、放射能の大半は肝臓及び腎臓に集積した。その後、投与後60分では、殆どの放射能が腸管に、次いで膀胱に集積がみられ、肝臓を経由し胆汁排泄、また腎臓を経由し尿排泄される過程が経時的な画像より確認された。PET画像の定量解析により、投与後60分では、投与量の約67.9±8.9%が腸管に、約1.51±0.33%が膀胱に集積していることが明らかになった。以上から、正常ラットにおける[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の放射能の主な消失経路は、胆汁排泄であることがPETを用いた解析で明らかになった。
【００５０】
・リファンピシン併用ラット（図１Ｂ参照）
トランスポーターの一種であるOatp（Organic anion transporting polypeptide）の典型的な阻害剤であるリファンビシンを併用した場合、正常ラット場合と比較して、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を投与後、初期における肝臓に分布した放射能の減少、加えて腸管に胆汁として排出される放射能の著しい減少が経時的な画像より確認された。
【００５１】
・Mrp2遺伝子変異欠損ラット（図１Ｃ参照）
Mrp2遺伝子変異欠損ラットにおける、胆汁排泄された放射能は、正常ラットと比較して著しく減少した。
【００５２】
上記のラットにおける[11C]デヒドロプラバスタチン(4)投与後の組織中の放射性代謝物-親化合物の分離定量を行なったところ、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)投与後2分においては、血中の放射能の殆どが投与した未変化体の[11C]デヒドロプラバスタチン(4)であったが、投与後20分以内においては血液、肝臓及び胆汁で[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の放射性代謝物が検出され、投与後一定時間経過後の、特に血中、肝臓中においては放射性代謝物の存在は無視できない量であることが示された。一方、懸濁肝細胞を用いたin vitro代謝実験においては、ラット肝細胞を用いた場合に比べ、ヒト肝細胞においては、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の代謝安定性が非常に高いことが示されている。従って、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を用いたPET評価により、肝胆系輸送に関わる薬物トランスポーターのうち、OATPとMRP2の機能評価が少なくとも可能であることを、ラットを用いた基礎検討により明らかにすることができた。
【００５３】
以下、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)のPET撮像法に関する詳細な説明を述べる。
PET撮像に用いた[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の物理化学的な特性は、(1)合計放射能 1.2GBq; (2) 放射化学的純度 99%、化学純度、98%; (3) 放射化学収率、64%; 崩壊補正収率 19.7%; 比放射能 79GBq/μmolを示すものを用いた。
PET撮像に用いた動物は、体重180〜242gの雄性のSpragie-Dawlay(SD)ラットと、体重287gの雄性Mrp2遺伝子変異欠損ラット（Eisai hyperbilirubinemicラット, EHBRs）は、日本SLC社から購入した。
1.5%イソフルラン吸収麻酔下において、PET装置内（MicroPET Focus 220、シーメンス社）にうつ伏せに固定した。その後、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)をラット尾静脈から単回bolus投与（約22±1 MBq/body）すると同時に、PET撮像を開始した。PETスキャンは60分間行い、収集後にヒストグラミングを行い，ダイナミックデータを得た。PET画像データはfiltered back projection (FBP)法にて画像再構成を行った。
更に、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の肝取り込み輸送におけるOatp類が関与を明らかにするための試験では、Oatpの典型的な阻害剤であるリファンピシンを併用薬として用い、同様のPET評価を行なった。リファンピシンの併用投与法は、尾静脈よりrifampicin を0.5~1.5 μmol/min/kgの速度にて、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)投与の90分前からPET撮像終了後までおこなった。
加えて、ラットのアセトニトリルで除タンパク処理をしたラット組織試料（血、肝臓ホモジェネート及び胆汁）について、血、肝臓及び胆汁の放射性代謝物分析を、放射性検出器を備えたHPLC解析により行なった。溶出液を254nmのUV吸光度及びNaIポジトロン検出器（UG-SCA30, ユニバーサル技研）によってモニタリングし、未変化体、代謝物に由来する放射能の量は、総量放射能の割合として算出した。
【００５４】
（[11C]デヒドロプラバスタチン(4)投与後の血中放射能の経時変化） 
上記ＰＥＴ画像撮影と並行して、[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を投与したラットから一定時間毎に血液を採取し、血中放射能を測定した。その結果、図２に示すように、正常なラットでは、投与された[11C]デヒドロプラバスタチン(4)は時間経過とともに速やかに減少するのに対して、排泄トランスポーターであるMrp2が欠損したラットでは血液から肝臓へは輸送されるが、胆汁へ排泄が著しく低下した。そのために、結果として血中の[11C]デヒドロプラバスタチン(4)の放射能が有意に上昇した。また、肝取込みに関わるトランスポーターであるOatpsをリファンピシン併用により阻害した場合、血中から肝臓への取込が阻害されるために、血中の[11C]デヒドロプラバスタチン放射能が有意に上昇した。以上の結果は、上記ＰＥＴ画像から得られた知見と整合するものである。
【００５５】
（[11C]デヒドロプラバスタチン(4)投与後の胆汁放射能の経時変化） 
[11C]デヒドロプラバスタチン(4)を投与したラットからPET画像で腸管に胆汁排泄された放射能分布の画像データをもとに、各時間における放射能を測定した。投与された[11C]デヒドロプラバスタチン(4)は血中から肝臓、次いで胆汁排泄を経て腸管内へ排泄されるが、図３に示すように、正常なラットでは速やかに胆汁に排泄が起こっている。しかしながら、Mrp2の欠損したラットでは胆汁への排泄が大きく低下している。また、リファンピシンを併用した条件においては、肝取込トランスポータ―であるOatpの阻害に加え、胆汁排泄過程の阻害も見られているため、排泄量も大きく低下した。
【００５６】
この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、ＰＥＴ用分子プローブとして、医薬産業などにおいて利用することができる。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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