(57)【要約】【課題】化学物質の発生毒性をより正確に判定する方法等を提供すること。【解決手段】化学物質が有する発生毒性の予測方法であり、化学物質が有する細胞毒性に基づく変数と、化学物質が有する分化抑制に基づく変数と、化学物質が有する物性値に基づく変数とを組み合わせて得られる関数式に対して、被験物質が有する細胞毒性に係る評価スコアと、前記被験物質が有する分化抑制に係る評価スコアと、前記被験物質が有する物性値に係るスコアとを、各々対応する変数に代入し、算出される判定値を対照値と比較して、その差異に基づいて前記被験物質が有する発生毒性の有無若しくはその程度を評価する工程を含むことを特徴とする予測方法等【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質が有する発生毒性の予測方法であり、
化学物質が有する細胞毒性に基づく変数と、化学物質が有する分化抑制に基づく変数と、化学物質が有する物性値に基づく変数とを組み合わせて得られる関数式に対して、被験物質が有する細胞毒性に係る評価スコアと、前記被験物質が有する分化抑制に係る評価スコアと、前記被験物質が有する物性値に係るスコアとを、各々対応する変数に代入し、算出される判定値を対照値と比較して、その差異に基づいて前記被験物質が有する発生毒性の有無若しくはその程度を評価する工程を含むことを特徴とする予測方法。
【請求項２】
前記関数式が、３元１次関数式であることを特徴とする請求項１記載の予測方法。
【請求項３】
前記３元１次関数式が、ｙ= ａ * ｘ１ + ｂ * ｘ２＋ｃ * ｘ３ ＋ ｄ
（式中、ｙは判定値を表わす。ｘ１は化学物質が有する細胞毒性に基づく変数を表わし、ｘ２は化学物質が有する分化抑制に基づく変数を表わし、ｘ３は化学物質が有する物性値に基づく変数を表わす。ａ、b、ｃ及びｄは定数を表わす。＊は乗算を表わす。）
であることを特徴とする請求項２記載の予測方法。
【請求項４】
前記の化学物質が有する細胞毒性に基づく変数が、ＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における50％細胞増殖抑制濃度（ＩＣ５０）の常用対数であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか記載の予測方法。
【請求項５】
前記の化学物質が有する分化抑制に基づく変数が、ＩＣ５０とＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における50％分化抑制濃度（ＩＤ５０）との比の常用対数であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか記載の予測方法。
【請求項６】
前記の化学物質が有する物性値に基づく変数が、オクタノール/水分配係数（LogＰ）であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか記載の予測方法。
【請求項７】
前記被験物質が、Ｓ９代謝安定性試験において代謝安定性を有すると判定された化学物質であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか記載の予測方法。
【請求項８】
前記３元１次関数式における定数が、ａが-0.80〜-0.38の範囲であり、ｂが0.64〜1.60の範囲であり、ｃが-0.37〜0.26の範囲であり、ｄが0.41〜0.90の範囲であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか記載の予測方法。
【請求項９】
被験物質について、（１）請求項１〜８のいずれかに記載される予測方法に用いられる、前記被験物質が有する細胞毒性に係る評価スコアと、前記被験物質が有する分化抑制に係る評価スコアと、前記被験物質が有する物性値に係るスコアとを入力・蓄積・管理する手段、（２）前記スコアを、化学物質が有する細胞毒性に基づく変数と、化学物質が有する分化抑制に基づく変数と、化学物質が有する物性値に基づく変数とを組み合わせて得られる関数式の各々対応する変数に代入して、判定値を算出・蓄積・管理する手段、（３）前記判定値と対照値とを比較してその差異データを算出・蓄積・管理する手段、（４）前記差異データを前記被験物質が有する発生毒性の有無若しくはその程度を評価するための条件に基づき照会・検索する手段、及び、（５）照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内動態を考慮した化学物質の発生毒性の予測方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の開発においては、作用が強い化学物質の選抜が重要であるが、同時に、高い安全性を有する化学物質の選択も重要である。医薬、農薬、化粧品、工業製品等の化学物質のヒトに対する安全性を評価するためには、通常、非ヒト動物個体を用いた多くの毒性試験が行われる。これらの毒性試験のうち、生殖性や胎児・新生児の発生等に対する毒性は、総じて生殖・発生毒性と称され、医薬、農薬及び他の化学物質においては、その製造・販売に際し、これらの生殖毒性や発生毒性に関する試験を実施することが求められている。発生毒性試験の一例として、化学物質を妊娠期の非ヒト哺乳動物に投与し、当該哺乳動物の胎児に及ぼす形態的な変化の有無及びその程度等を調べる試験を催奇形性試験といい、一般的には、化学物質をラット、マウス、ウサギ、サル等の非ヒト動物個体の妊娠雌動物に一定期間投与し、当該動物個体の胎児の外形、内臓及び骨格等を詳細に観察することにより、当該化学物質が有する発生毒性の評価が行われている。高い安全性を有する化学物質の選択においては、非ヒト哺乳動物を用いた安全性試験が行われることが多いが、費用および時間の面で、非ヒト哺乳動物を用いずに実施できるより簡便な試験が望まれている。
従来、より簡便な発生毒性試験法としてマウス胚性幹細胞（以下、ES細胞と記すこともある。）を用いた試験法（EST : Embryonic Stem cell Test）（非特許文献１および２参照、）が検討されてきたものの実用化には至っていない。実用化に至っていない原因としては、実験精度と予測精度とが不十分であることが考えられる。実験精度を高める検討の結果、特定の遺伝子発現レベルを測定する方法（特許文献１参照）が開発されており、簡便で汎用性の高い試験が可能となった。一方、予測精度を高め、実験結果からヒトにおける発生毒性を正確に予測するためには、精度の高い予測方法の開発が重要と考えられている。従来の予測方法においては、被験化学物質による、balb/c 3T3のような分化した細胞を用いた50％細胞増殖抑制濃度（IC50）、ES細胞由来の心筋分化細胞における50％細胞増殖抑制濃度（ES-IC50）、ES細胞の心筋分化過程における50％分化抑制濃度（ES-ID50）を用いて判定していたが、判定式の構築に用いた化学物質においては比較的高い予測性を示すものの、それ以外の化学物質においては、予測性は低いものであった（非特許文献３参照）。予測精度が低い一因としては、前記予測方法では、3T3細胞およびES細胞における細胞毒性に基づく変数および分化抑制に基づく変数のみを用いて発生毒性を判定していたことにあり、実際のヒトを含めた哺乳動物における発生毒性の発現のためには、化学物質が体内に取り込まれた後、吸収・分布・代謝・排泄が関与するため、投与した化学物質が胎児へ到達する程度を示す変数をも考慮した予測方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2010-11843
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献２】H. Spielmann, I. Pohl, B. Doring, M. Liebsch, F. Moldenhauer, In vitro toxicology, 10(1), p119-127,1997
【非特許文献３】E. Genschow, H. Spielmann, G. Scholz, I. Pohl, A. Seiler, N. Clemann, S. Bremer, K. Becker, ATLA 32, p209-244, 2004
【非特許文献３】Marx-Stoelting P. et al., ATLA 37, p313-328, 2009
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、吸収・分布・代謝・排泄に関しては、吸収速度定数、分配係数、代謝速度、排泄速度定数等、多数の変数が存在するため、発生毒性を正しく判定するための変数を特定し、簡便な予測方法を開発するのは困難であった。近年、吸収・分布・代謝・排泄をコンピューターモデリングによって再現する手法として、生理学的薬物動態（ＰＢＰＫ）モデルの研究が進んでおり、ESTで算出した発生毒性試験結果から、組織分布や代謝速度等に基づく変数から構築したPBPKモデルを用いて換算することにより、体内で発生毒性を引き起こす投与量を予測することが可能になった（Verwei M. et al., Toxicology Letters 165, p79-87, 2006）。前記の研究では、血漿蛋白との結合や、脂質への取り込みに影響する物性値であるオクタノール/水分配係数（LogP）や、吸収に基づく変数として吸収速度定数、代謝分解に基づく変数として肝クリアランス等を用いて体内で発生毒性を引き起こす投与量を予測しているが、発生毒性の有無を予測・判定する方法ではなく、また、投与量の予測のためには、吸収・分布・代謝・排泄に関する多数の変数を算出する必要があり、簡便さに乏しいものであった。また、容易に代謝分解される化学物質は、胎児に到達できず、EST試験では、発生毒性を正しく判定できないため、EST試験を適用可能な化学物質の範囲についても明らかにする必要があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、かかる状況下において鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．化学物質が有する発生毒性の予測方法であり、
化学物質が有する細胞毒性に基づく変数と、化学物質が有する分化抑制に基づく変数と、化学物質が有する物性値に基づく変数とを組み合わせて得られる関数式に対して、被験物質が有する細胞毒性に係る評価スコアと、前記被験物質が有する分化抑制に係る評価スコアと、前記被験物質が有する物性値に係るスコアとを、各々対応する変数に代入し、算出される判定値を対照値と比較して、その差異に基づいて前記被験物質が有する発生毒性の有無若しくはその程度を評価する工程を含むことを特徴とする予測方法（以下、本発明予測方法と記すこともある。）；
２．前記関数式が、３元１次関数式であることを特徴とする前項１記載の予測方法；
３．前記３元１次関数式が、ｙ= ａ * ｘ１ + ｂ * ｘ２＋ｃ * ｘ３ ＋ ｄ
（式中、ｙは判定値を表わす。ｘ１は化学物質が有する細胞毒性に基づく変数を表わし、ｘ２は化学物質が有する分化抑制に基づく変数を表わし、ｘ３は化学物質が有する物性値に基づく変数を表わす。ａ、b、ｃ及びｄは定数を表わす。＊は乗算を表わす。）
であることを特徴とする前項２記載の予測方法；
４．前記の化学物質が有する細胞毒性に基づく変数が、ＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における50％細胞増殖抑制濃度（ＩＣ５０）の常用対数であることを特徴とする前項１乃至３のいずれか記載の予測方法；
５．前記の化学物質が有する分化抑制に基づく変数が、ＩＣ５０とＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における50％分化抑制濃度（ＩＤ５０）との比の常用対数であることを特徴とする前項１乃至４のいずれか記載の予測方法；
６．前記の化学物質が有する物性値に基づく変数が、オクタノール/水分配係数（LogＰ）であることを特徴とする前項１乃至５のいずれか記載の予測方法；
７．前記被験物質が、Ｓ９代謝安定性試験において代謝安定性を有すると判定された化学物質であることを特徴とする前項１乃至６のいずれか記載の予測方法；
８．前記３元１次関数式における定数が、ａが-0.80〜-0.38の範囲であり、ｂが0.64〜1.60の範囲であり、ｃが-0.37〜0.26の範囲であり、ｄが0.41〜0.90の範囲であることを特徴とする前項１乃至７のいずれか記載の予測方法；
９．被験物質について、（１）前項１〜８のいずれかに記載される予測方法に用いられる、前記被験物質が有する細胞毒性に係る評価スコアと、前記被験物質が有する分化抑制に係る評価スコアと、前記被験物質が有する物性値に係るスコアとを入力・蓄積・管理する手段、（２）前記スコアを、化学物質が有する細胞毒性に基づく変数と、化学物質が有する分化抑制に基づく変数と、化学物質が有する物性値に基づく変数とを組み合わせて得られる関数式の各々対応する変数に代入して、判定値を算出・蓄積・管理する手段、（３）前記判定値と対照値とを比較してその差異データを算出・蓄積・管理する手段、（４）前記差異データを前記被験物質が有する発生毒性の有無若しくはその程度を評価するための条件に基づき照会・検索する手段、及び、（５）照会・検索された結果を表示・出力する手段を具備することを特徴とするシステム；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、化学物質の発生毒性をより正確に判定する方法等を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明において「（化学物質の）発生毒性」とは、受精、受胎に係る胎児の発達(発生)に対する悪影響及び異常を引き起こす有害作用の総称であり、胎児に奇形を引き起こす催奇形性又は催奇性も含む。発生毒性により引き起こされる悪影響や異常としては、具体的には例えば、発育遅滞や機能・知能の障害等の肉眼形態的又は機能的な異常を示す先天異常、胎生期の胎児の死亡等を挙げることができる。
【００１０】
本発明において「細胞毒性に基づく変数」としては、例えば、化学物質の暴露による細胞死、機能障害、増殖阻害等を定量的に示す変数であり、形態の変動割合、または、細胞中の因子の濃度、活性もしくは量、または、50％細胞増殖抑制濃度（IC50）等を挙げることができる。このような形態や因子としては、例えば、細胞膜、細胞内代謝物、mRNA、蛋白等を好ましく挙げることができる。より具体的には例えば、色素染色、LDH活性、ATP濃度等を挙げることができる。前記変数は、生物学実験によって算出することが可能であり、例えば、細胞数測定、放射性チミジンの精細胞への取り込み、ATP量等の測定結果から算出することができる。また、構造活性相関（QSAR）等による計算機科学を用いて算出することも可能である。
【００１１】
本発明において「分化抑制に基づく変数」としては、例えば、細胞を分化誘導する際に化学物質の暴露により、通常に分化誘導された細胞と比較した細胞の状態や機能の欠損を定量的に示す変数であり、形態の変動割合、または、細胞中の因子の濃度、活性もしくは量、または、50％分化抑制濃度（ID50）等を挙げることができる。このような形態や因子としては、細胞の形状、細胞内代謝物、mRNA、蛋白等を好ましく挙げることができる。このような因子としては、具体的には例えば、心臓の拍動、mRNA、蛋白等を好ましく挙げることができる。より具体的には例えば、Hand1 mRNA、Cmya1 mRNA等を挙げることができる。前記変数は、生物学実験によって算出することが可能であり、例えば、心臓の拍動回数測定、mRNA量等の測定結果から算出することができる。また、構造活性相関（QSAR）等による計算機科学を用いて算出することも可能である。
【００１２】
本発明における「物性値に基づく変数」は、化学物質の体内における吸収・分布・排泄を定量的に記述するための変数である。このような変数としては、例えば、脂溶性、水溶解度、膜透過性、トランスポーターの阻害度等を好ましく挙げることができる。具体的には例えば、LogP等を挙げることができる。前記変数は、生化学的実験によって算出することが可能であり、具体的には例えば、生体試料で反応させた後の化学物質量のLC-MSによる測定等の測定結果から算出することができる。また、構造活性相関（QSAR）等による計算機科学を用いて算出することも可能である。
【００１３】
本発明におけおける「LogP」とは化学物質の脂溶性を意味する数値であり、具体的には例えば、フラスコ振盪法、HPLC法等の物理化学実験、フラグメント法等の計算機科学により算出される。
【００１４】
本発明における「代謝分解に基づく変数」は、体内における代謝分解を定量的に記述するための変数である。このような変数としては、例えば、代謝速度定数、ミカエリスメンテン定数、代謝半減期等を好ましく挙げることができる。具体的には例えば、ラットにおけるS９代謝安定性等を挙げることができる。
【００１５】
本発明における「代謝安定性を有する」とは、体内において、容易に代謝分解されないことを意味し、代謝分解に基づく変数から判断することが可能である。
本発明においては、例えば、ラット肝臓S9による代謝安定性等を挙げることができる。具体的には例えば、ラット肝臓S9で代謝させた反応液中の代謝物量をLC-MS/MSを用いて測定する方法等を挙げることができる。
【００１６】
本発明において、「分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的及び／又は機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生等はっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を、ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内若しくは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【００１７】
本発明における「50%分化抑制濃度」とは、化学物質が分化に与える影響の変数であり、当該化学物質に接触した細胞の分化過程において発現が抑えられる遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から算出された、遺伝子発現レベルが50%阻害された濃度である。
【００１８】
本発明において「ES細胞由来の心筋分化細胞」とは、初期胚に由来する多能性幹細胞（ES細胞）から心筋細胞へ分化させた細胞のことをいう。心筋は、不随意に律動的な収縮を行う心筋細胞から構成され、幹細胞から分化誘導することも可能である。分化心筋を特定する方法としては、例えば、心筋ミオシン軽鎖Myh6遺伝子、心房性ナトリウム利尿ペプチドANP遺伝子等の発現を確認する方法等を挙げることができる。
【００１９】
本発明における「ＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における50％分化抑制濃度」とは、化学物質が胎児に与える影響の変数であり、当該化学物質に接触したES細胞および接触していないES細胞の心筋分化過程において発現が抑えられる遺伝子又はそのオ−ソログな遺伝子の発現レベルの測定値から算出された、遺伝子発現レベルが50%阻害された濃度である。例えば、「ＩＤ５０」で示される数値等を挙げることができる。本発明における分化抑制に基づく変数としては、具体的には例えば、ＩＤ５０／ＩＣ５０の比の常用対数で示される数値を挙げることができる。
【００２０】
本発明における「ＥＳ細胞の心筋分化過程において発現が抑えられる遺伝子」とは、化学物質が発生毒性を有する場合において、当該化学物質に接触したＥＳ細胞由来の心筋分化細胞において発現が抑えられる遺伝子である。例えば、「Hand1」のような遺伝子を挙げることができる。より具体的には例えば、Hand1遺伝子のＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における発現量は、発生毒性を有する化学物質に接触した場合、発現量が低下することが知られている（特開2010-11843）。即ち、Hand1遺伝子の発現量は、ES細胞から心筋細胞へ分化する際の変数として考えることができる。
【００２１】
「Hand1」遺伝子とは「heart and neural crest derivatives expressed transcript 1」遺伝子であり、Hand1以外にもHxt、Th1、eHAND、Ehand1、Thing1として記載される場合もある。National center for Biotechnology Information (NCBI)のデータベースにおいて、例えば、マウスHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列が登録番号NM_008213.2として、また当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列が登録番号NP_032239.1として掲載されている。ヒトHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号NM_004821.1として、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号NP_004812.1として掲載されている。チンパンジーHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_518050.2として、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_518050.2として掲載されている。イヌHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号XM_546282.2として、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_546282.2として掲載されている。ラットHand1遺伝子のmRNAをコードする塩基配列は登録番号 NM_021592.2として、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列は登録番号XP_067603.1として掲載されている。
例えば、「Hand1」遺伝子の発現量を測定する方法としては、例えば、目的の細胞等において、遺伝子の転写産物量や翻訳産物量を測定する方法等を挙げることができる。遺伝子の転写産物量を測定する方法としては、例えば、ｍＲＮＡの発現量を測定する方法をあげることができる。具体的には例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法、PCR法、リアルタイムPCR法等の分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法を挙げることができる。遺伝子の翻訳産物量を測定する方法としては、当該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現量を測定する方法等を挙げることができる。具体的には例えば、ELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等の免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法を挙げることができる。また、遺伝子の発現変動とは、通常の分子生物学的測定方法又は免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価されるｍＲＮＡレベル又はポリペプチドレベルでの発現量が増加或いは減少することを意味する。
遺伝子の発現レベルは、遺伝子のプロモーター配列と当該プロモーター配列に作動可能に接続されたレポータータンパク質コード配列とを含むレポーター遺伝子の発現レベルを変数として測定することもできる。
分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法又はＰＣＲ法等を挙げることができる。免疫学的測定方法としては、例えば、ELISA法、RIA法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫染色法等を挙げることができる。また免疫染色の検出法としては、例えば、文献(A. Seiler, A. Visan, R. Buesen, E. Genschow, H. Spielmann, Reproductive Toxicology 18, p231-240 (2004)) に例示されるフトーサイトメトリーまたはFACS（fluorescence activated cell sorting）を用いた解析方法等を挙げることができる。また、アレイ（例えば、DNAアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法等を挙げることができる。DNAアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新PCR法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、NatGenet. ２００２ Dec；３２ Suppl：５２６−３２に詳述されている。上述に加えて、RT−PCR、RACE法、SSCP法、免疫沈降法、two-hybridシステム、インビトロ翻訳等も挙げることができる。そのような分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法 ・ 中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）等に記載されており、本発明においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本発明においては、化学物質に接触した細胞の分化過程においてHand1の発現レベルが50%阻害された濃度を前記ID50として考えてもよい。
尚、「ＥＳ細胞の心筋分化過程において発現が抑えられる遺伝子」としては、Hand1に限られるものではなく、ＥＳ細胞の心筋分化過程において発現が抑えられる遺伝子であればよく、具体的には例えば、ADAM19遺伝子、Cmya1遺伝子、Pitx2遺伝子、Smyd1遺伝子、Pim2遺伝子、Tbx20遺伝子、Myl4遺伝子、Myl7遺伝子、Hbb-bh1遺伝子、Hba-a1遺伝子、Col1a2遺伝子、Hba-x遺伝子、Basp1遺伝子、Cpe遺伝子、DDR1遺伝子、Marcks遺伝子、NDN遺伝子、Nnat遺伝子、Ptbp2遺伝子、Sfrp遺伝子、Sox11遺伝子、Ttc3遺伝子、Tubb2b遺伝子、Ubqln2遺伝子、Vim遺伝子、Six3遺伝子、Arx遺伝子、Dcx遺伝子、L1cam遺伝子、Emx2遺伝子、Wnt1遺伝子、Reln遺伝子、Pax6遺伝子等も挙げることができる。
【００２２】
本発明において、式１中のａ、ｂ、ｃおよびｄを算出するためには、発生毒性が既知であり、代謝分解に係る評価スコアから判断された代謝安定性を有する化学物質の細胞毒性に係る評価スコア、分化抑制に係る評価スコアおよび物性値に係る評価スコアから、統計解析を行うことにより、算出することができる。
本発明方法における「統計解析」とは、複数のデータを数値解析して、事象の大小、分散、確率、相関または因果関係等を推定することを意味する。例えば、検定・推定、分散分析、多変量解析等の解析法を用いて推定すればよい。尚、多変量解析には、例えば、回帰分析、重回帰分析、ロジスティック回帰分析、判別分析、又は主成分分析等を挙げることができる。
【００２３】
本発明方法における「判別分析」とは、複数のデータを複数のカテゴリーに分類するための判別式を用いた統計解析手法である。例えば、カテゴリーごとの平方和および積和から線形判別関数（判別式）を算出することができる。
【００２４】
このようにして算出した式１に、発生毒性を判定したい化学物質の細胞毒性に係る評価スコア、分化抑制に係る評価スコア、物性値に係る評価スコアを代入することにより、当該化学物質の発生毒性を判定することができる。判別式の判定スコア（ｙ）が正の場合には、前記化学物質の発生毒性が陽性であると評価し、一方、前記判別得点(ｙ)が負の場合には、前記化学物質の発生毒性が陰性であると評価すればよい。
このような判断結果により、本発明方法では、発生毒性を判定することが可能となる。
【００２５】
具体的な例としては、物性値に基づく変数がLogPであり、代謝分解に基づく変数がＳ９代謝安定性であり、細胞毒性に基づく変数が、生物学実験によって算出されたＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における50％細胞増殖抑制濃度（ＩＣ５０）の常用対数であり、かつ、前記分化抑制に基づく変数がＩＣ５０と生物学実験によって算出されたＥＳ細胞由来の心筋分化細胞における50％分化抑制濃度（ＩＤ５０）との比の常用対数であるである場合には、本発明予測方法を好ましくは適用することができる。
【００２６】
そして、S9代謝安定性の結果から、代謝安定性を有する化学物質を選抜し、次いで、本発明予測方法における式１の係数ａ、ｂ、ｃおよびｄのそれぞれが-0.80〜-0.38、0.64〜1.60、-0.37〜0.26および0.41〜0.90である判定式を作成して、発生毒性を判定する化学物質の発生毒性を判定すればよい。
【００２７】
本発明は、被験物質について、（１）本発明予測方法に用いられる、前記被験物質が有する細胞毒性に係る評価スコアと、前記被験物質が有する分化抑制に係る評価スコアと、前記被験物質が有する物性値に係るスコアとを入力・蓄積・管理する手段（以下、手段ａと記すこともある。）、（２）前記スコアを、化学物質が有する細胞毒性に基づく変数と、化学物質が有する分化抑制に基づく変数と、化学物質が有する物性値に基づく変数とを組み合わせて得られる関数式の各々対応する変数に代入して、判定値を算出・蓄積・管理する手段（以下、手段ｂと記すこともある。）、（３）前記判定値と対照値とを比較してその差異データを算出・蓄積・管理する手段（以下、手段ｃと記すこともある。）、（４）前記差異データを前記被験物質が有する発生毒性の有無若しくはその程度を評価するための条件に基づき照会・検索する手段（以下、手段ｄと記すこともある。）、及び、（５）照会・検索された結果を表示・出力する手段（以下、手段ｅと記すこともある。）、を具備することを特徴とするシステムをも含むものである。
【００２８】
まず、手段ａについて説明する。手段ａは、前記のとおり、本発明予測方法に用いられる、前記被験物質が有する細胞毒性に係る評価スコアと、前記被験物質が有する分化抑制に係る評価スコアと、前記被験物質が有する物性値に係るスコアとを入力・蓄積・管理する手段である。かかる情報は、入力手段１により入力され、通常記憶手段２に記憶される。入力手段としては、例えば、キーボード、マウス等の当該情報の入力可能なものを挙げることができる。当該情報の入力及び蓄積・管理が完了すれば、次の手段ｂに進む。尚、当該情報の蓄積・管理には、コンピュータ等のハードウェアとＯＳ及びデータベース管理等のソフトウエアとを用いて、データ構造を有する情報を入力し、適当な記憶装置、例えば、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスク等のコンピュータ読取可能な記録媒体に蓄積することにより、大量のデータを効率良く蓄積し管理すればよい。
【００２９】
手段ｂについて説明する。手段ｂは、前記のとおり、手段ａにより蓄積・管理された前記スコアの各々を、化学物質が有する細胞毒性に基づく変数と、化学物質が有する分化抑制に基づく変数と、化学物質が有する物性値に基づく変数とを組み合わせて得られる関数式の各々対応する変数に代入して、判定値を算出・蓄積・管理する手段である。かかる情報は、手段ａにより蓄積・管理されたスコアを、予め登録された関数式の各々対応する変数に代入して、判定値を算出し、通常記憶手段２に記憶される。当該判定値の算出及び蓄積・管理が完了すれば、次の手段ｃに進む。
【００３０】
手段ｃについて説明する。手段ｃは、前記のとおり、前記判定値と対照値とを比較してその差異データを算出・蓄積・管理する手段である。かかる情報は、手段ｂにより蓄積・管理された判定値を、予め登録された対照値と比較してその差異データを算出し、通常記憶手段２に記憶される。当該差異データの算出及び蓄積・管理が完了すれば、次の手段ｄに進む。
【００３１】
手段ｄについて説明する。手段ｄは、前記のとおり、前記差異データを前記被験物質が有する発生毒性の有無若しくはその程度を評価するための条件に基づき照会・検索する手段である。かかる情報は、手段ｃにより蓄積・管理された差異データを、入力手段２により照会・検索のための条件が入力され、通常記憶手段２に記憶された上記情報の中で当該条件に合致したものを選択すれば、次の手段ｅに進む。
【００３２】
手段ｅについて説明する。手段ｅは、前記のとおり、照会・検索された結果を表示・出力する手段である。表示・出力手段３としては、例えば、ディスプレイ、プリンタ等が挙げられ、当該結果をコンピュータのディスプレイ装置に表示するか、印刷等により紙上に出力するか等すればよい。
【００３３】
本発明の具体的な適用・応用例としては、下記のような本発明の実施態様を挙げることができる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例によって、更に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１  （生物学実験により細胞毒性に係る評価スコアを算出する工程）
１．ES細胞由来の心筋分化細胞における50％細胞増殖抑制濃度（IC50）の算出
Hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたHand1-ES細胞株（特開2010-11843）は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。未分化なHand1-ES細胞は、0.25%トリプシン／1mMEDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地（以下、心筋分化培地）に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、5,000個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液（心筋分化培地）を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加して、または、溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を10000μLの容量で細胞培養用96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2条件下にて培養を行った。
用いた３５種類の被験物質は以下の表１にその発生毒性の結果とともに示す（Paquette J. et al., Birth Defects Research (Part B) 83, p104-111, 2008)。
【００３６】
【表１】
2013231609.tif 000002
【００３７】
培養6日目に各ウェルの上清を吸引除去した後、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayキット（プロメガ社）中の溶液を各ウェルに添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンター（パッカードジャパン社）にて活性を測定した。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、当該被験物質の濃度毎に集計し、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出した。化学物質が母動物に与える影響はHand1-ES細胞のルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50％細胞増殖抑制濃度（IC50）を測定した。
【００３８】
２．細胞毒性に係る評価スコアの算出
測定して得られたIC50を単位ng/mLで表し、マイクロソフト社Excel（登録商標）に入力した。前記Excelの関数計算機能を用いてその常用対数を算出し、細胞毒性に係る評価スコアとした。算出された細胞毒性に係る評価スコアは、以下で示す分化抑制に係る評価スコア、物性値に係る評価スコア、代謝分解に係る評価スコアとともに表２に示す。
【００３９】
実施例２  （生物学実験により分化毒性に係る評価スコアを算出する工程）
１．ES細胞由来の心筋分化細胞における50％分化抑制濃度（ID50）の算出
Hand1遺伝子のプロモーター発現制御下にレポーター遺伝子を含むベクターで形質転換されたHand1-ES細胞株（特開2010-11843）は、100μg/mLのG418を含むLIF添加15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地で未分化維持培養を行った。未分化なHand1-ES細胞は、0.25%トリプシン／1mMEDTAを用いて分散させた後、15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地にて細胞を懸濁した。遠心操作及び上清の吸引操作により、残余トリプシンを除去して、LIFを含まない15%非働化処理済み牛胎児血清を含むDMEM培地（以下、心筋分化培地）に細胞を懸濁した。その後、少量の細胞溶液を用いて、細胞数をカウントし、7,500個/mLの細胞数になるように細胞懸濁液（心筋分化培地）を調製した。調製した細胞懸濁液に溶媒対照群としてPBS(-)またはDMSO等の溶媒のみを添加して、または、溶媒で数段階に希釈して調製した被験物質を添加した後、それぞれの細胞懸濁液を100μLの容量で非接着性白色U底の96ウェルプレートに播種し、37℃、5%CO2条件下にて培養を行った。
被験物質としては、実施例１と同じ化学物質を用いた。
培養６日目に各ウェルに、ルシフェラーゼ発光試薬Steady-Glo（プロメガ社）を100μL添加し30分間振盪した後、TopCount NXTルミネッセンス検出カウンターにてルシフェラーゼ活性を測定した。得られた活性値は平均化し、溶媒対照群、当該被験物質の濃度毎に集計し、溶媒対照群の平均値を100%として各濃度の相対値を算出した。前記被験物質が胎児に与える影響はHand1-ES細胞のルシフェラーゼ活性の測定値から、50%ルシフェラーゼ活性が阻害される濃度として50％分化抑制濃度（ID50）を求めた。
【００４０】
２．分化抑制に係る評価スコアの算出
実施例１で測定して得られたIC50を本実施例で測定して得られたID50で除し、マイクロソフト社Excel（登録商標）に入力した。前記Excelの関数計算機能を用いてその常用対数を算出し、分化抑制に係る評価スコアとした。算出された分化抑制に係る評価スコアは、細胞毒性に係る評価スコア、物性値に係る評価スコア、代謝分解に係る評価スコアとともに表２に示す。
【００４１】
実施例３  （計算機科学により、物性値に係る評価スコアを算出する工程）
１．LogPの算出
実施例１で用いた被験物質について、化学構造式をKowWin (v1.67、EPIsuite, US EPA）に入力して、計算された値を物性値に係る評価スコアとして用いた。算出された物性値に係る評価スコアは、細胞毒性に係る評価スコア、分化抑制に係る評価スコア、代謝分解に係る評価スコアとともに表２に示す。
【００４２】
実施例４  （生物学実験により、代謝分解に係る評価スコアを算出する工程）
１．S9代謝安定性の算出
S9代謝安定性については、以下のように算出した。実施例１で用いた被験物質について、それぞれ、100 μＬの反応液（0.25 mg protein/mLラット肝臓S9、3mM β−NADPH、1 μＬ被験物質）を４連で調製した。２連については、37℃で35分間振とうしながらインキュベーションし、２連については、インキュベーションをしなかった。これらに４倍量のメタノールを加えて反応を停止させ、よく混合した。−20℃の冷凍庫で約30分間冷却後、3,000rpmで約10分間遠心分離し、上清をLC-MS／MSにて測定した。化学物質由来のイオンピーク面積の比率を、インキュベーションを実施したサンプルをしないサンプルで除して算出し、代謝分解に係る評価スコアとした。尚、無機イオンであるLithium ChlorideおよびBoric acidに関しては、上記S9代謝安定性試験は実施せず、100%とした。算出された代謝分解に係る評価スコアは、細胞毒性に係る評価スコア、分化毒性に係る評価スコア、物性値に係る評価スコアとともに以下の表２に示す。
【００４３】
【表２】
2013231609.tif 000003
【００４４】
実施例５  （統計解析により発生毒性の判定式を算出する工程）
１．判定式の算出
実施例４において算出したＳ９代謝安定性が１００％以上の化学物質１１種類、９５％以上の化学物質１６種類、９０％以上の化学物質２０種類、８０％以上の化学物質２２種類、７０％以上の化学物質２６種類、５０％以上の化学物質２９種類、２０％以上の化学物質３２種類および全ての化学物質３５種類について、実施例１において算出した細胞毒性に係る評価スコア（ｘ１）、実施例２において算出した分化抑制に係る評価スコア（ｘ２）および実施例３において算出した物性値に係る評価スコア（ｘ３）を記述子とした判別分析にかけ、文献に記載された発生毒性の有無を判別する式を算出した。尚、判別分析に用いた統計解析ソフトウェアとしては、PASW Statics（Ver18、SPSS）を用いた。その結果、それぞれの場合について、以下の表３に示す、判別式に各評価スコアを代入した際に、正になる場合を陽性と判定し、負になる場合を陰性と判定する判別式を算出した。更に、前記判別式を用いて、判別式算出に用いた代謝安定性を有する化学物質（難代謝化学物質）および判別式算出に用いなかったその他の化学物質（易代謝化学物質）を判別し、その判別における正確度を表３に示す。
【００４５】
【表３】
2013231609.tif 000004
【００４６】
表３から明らかなように、いずれの判別式においても、判別式の算出に用いた難代謝化学物質については、正確度が0.6以上であったが、判別式の算出に用いなかった易代謝化学物質については、0.6以上の正確度を有する判別式はS9代謝安定性が70%以上のものを用いて判別式を構築した場合のみであった。即ち、難代謝化学物質および易代謝化学物質のいずれも0.6以上の正確度で判定可能な判別式を構築するためには、S9代謝安定性が70%以上〜100％以上の難代謝化学物質を用いて判別式を算出することが好ましいことが明らかになった。そのための判別式の係数としては、70%以上〜100%以上の５種類の判別式の係数の平均値±2SD（標準偏差）の信頼限界値を考慮すると、判別式の係数ａ、ｂ、ｃ、ｄのそれぞれが、-0.80〜-0.38、0.64〜1.60、-0.37〜0.26および0.41〜0.90であればよいことが確認された。これらの５種類の判別式の中では、Ｓ９代謝安定性が90%以上の化学物質を用いて判別式を構築した場合が最も正確度が高かったため、以降では、この判別式を発生毒性の判定式とした。
【００４７】
実施例６  （発生毒性を判定する工程）
１．発生毒性の判定
発生毒性を判定する化学物質38種類のそれぞれについて、実施例１、２および３に記載した方法で、細胞毒性に係る評価スコア、分化抑制に係る評価スコアおよび物性値に係る評価スコアを算出した。算出した評価スコアを実施例５に記載した判定式に代入することにより、判別得点（ｙ）を算出した。(1)正の場合には、発生毒性を陽性として評価し、(2)負の場合には、発生毒性を陰性として判定した。
結果を表４及び表５に（判別得点（ｙ）、発生毒性評価及び発生毒性（参考文献記載に基づくもの）を前記化学物質毎に列挙したもの）に示す。
【００４８】
【表４】
2013231609.tif 000005
【００４９】
【表５】
2013231609.tif 000006
【００５０】
表４に示すとおり、予測性は82％（=31/38）であり、良好な予測性を示した。また、代謝分解に係る評価スコアが30以上の化学物質32種類に限ると、予測性は88%（＝28/32）であり、更に予測性が高かった。
【００５１】
比較例１  （代謝分解に基づく変数および物性値に基づく変数を用いない場合の発生毒性の判定）
１．判定式の算出
実施例１において使用した化学物質全てについて、実施例１において算出した細胞毒性に係る評価スコアおよび実施例２において算出した分化抑制に係る評価スコアのみを用いて、実施例５と同様の方法で、判別分析を行った結果、判別式ｙ＝-0.61＊ｘ１ ＋ 0.50 ＊ｘ２ ＋ 0.52となり、当該式を比較例における判定式とした。
【００５２】
２．発生毒性の判定
実施例６で示した化学物質３８種類の細胞毒性に係る評価スコアおよび分化抑制に係る評価スコアを前記判定式に代入することにより、判別得点（ｙ）を算出した。(1)正の場合には、発生毒性を陽性として評価し、(2)負の場合には、発生毒性を陰性として判定した。判定結果から算出した予測性は55％であり、実施例６と比較して低いものであった。その要因としては、代謝分解に基づく変数および物性値に基づく変数を用いていないために、易代謝安定性の化学物質や、胎児へ移行しにくい化学物質等について、正確な判定ができなかったためと考えられた。
【００５３】
以上の工程により従来のESTにおける判定法よりも正確に被験物質の発生毒性を予測することが可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、化学物質の開発においては、発生毒性を有する可能性のある分子を早期に選別して、更に詳細に評価する目的や、発生毒性を有する可能性の低い分子を選抜する際等に利用される。