(57)【要約】【課題】少数の磁性粒子を用いて、感度及び再現性の高い分析を行うことができる試料分析装置及び試料分析方法を提供する。【解決手段】検出部として平坦な基板を使用し、分析の１サイクルごとに、検出部に吸着した少数の磁性粒子の画像を撮像するとともに、当該少数の磁性粒子の発光量を取得し、磁性粒子１個当たりの平均発光量に基づいて、分析対象物質の定量分析を行う。【選択図】図１
2013238420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象の粒子を捕捉する捕捉部と、
前記捕捉部に照明光を照射する照明部と、
前記捕捉部に捕捉され、前記照明光によって照射された粒子を撮像する撮像部と、
前記捕捉部に捕捉された粒子を発光させる発光手段と、
前記撮像部の視野と同じ視野内で、前記発光手段により発光させられた粒子の発光量を検出する光検出部と、
前記撮像部によって撮像された画像中の粒子の個数、面積又は密度を算出し、当該算出した粒子の個数、面積又は密度と、前記光検出手段によって検出された発光量とに基づいて分析を行う演算処理部と、
を備えることを特徴とする試料分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の試料分析装置において、
前記撮像部は、前記光検出部を兼ねていることを特徴とする試料分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の試料分析装置において、
前記捕捉部と前記撮像部を結ぶ光路中、あるいは前記捕捉部と前記光検出部を結ぶ光路中に移動可能あるいは角度調整可能に配置された光路切り換え用のミラーを備えることを特徴とする試料分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の試料分析装置おいて、
前記捕捉部に捕捉された粒子の画像と発光を前記撮像部と前記光検出部に分割して導くためのハーフミラーを備えたことを特徴とする試料分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の試料分析装置において、
前記発光手段は、前記粒子に励起光を照射する励起光光源であり、
前記粒子は前記励起光の照射により蛍光を発光することを特徴とする試料分析装置。
【請求項６】
請求項１に記載の試料分析装置において、
前記発光手段は、前記粒子へ添加する化学発光基質であり、
前記粒子は前記化学発光基質により化学発光することを特徴とする試料分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の試料分析装置において、
前記撮像部は、前記粒子の明視野画像を撮像することを特徴とする試料分析装置。
【請求項８】
請求項１に記載の試料分析装置において、
前記粒子は磁性粒子であり、
磁石と、前記磁石を前記捕捉部に近い位置と遠い位置の間に駆動する駆動部を有することを特徴とする試料分析装置。
【請求項９】
測定対象の粒子を捕捉部に捕捉する工程と、
前記捕捉部に捕捉された粒子に照明光を照射する工程と、
前記照明光を照射された粒子の画像を撮像する工程と、
前記捕捉部に捕捉された前記粒子を発光させる工程と、
前記捕捉部に捕捉された、前記画像と同じ視野内に存在する粒子による発光量を検出する工程と、
前記画像中の粒子の個数を算出する工程と、
前記算出された粒子の個数と前記検出された発光量から、粒子１個当たりの平均発光量を算出する工程と、
を有することを特徴とする試料分析方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の試料分析方法において、
前記粒子を発光させる工程では、前記粒子に励起光を照射して蛍光を発光させることを特徴とする試料分析方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の試料分析方法において、
前記粒子を発光させる工程では、化学発光基質を添加して前記粒子を化学発光させることを特徴とする試料分析方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の試料分析方法において、
前記粒子は磁性粒子であり、磁力により前記粒子を前記捕捉部に捕捉することを特徴とする試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は試料分析装置及び試料分析方法に係り、特に血清、尿などの生体液由来の分析試料を分析するための試料分析装置及び試料分析方法に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
初めに、試料分析の例として、免疫分析について説明する。免疫分析とは、抗原と抗体の特異的な結合を利用して、血清や尿などの生体液由来の分析試料に含まれる抗体や抗原を定量分析することを意味し、免疫分析の結果に基づいて、疾病の診断を行う。
【０００３】
代表的な免疫分析法として、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay：酵素免疫分析法）がある。ＥＬＩＳＡでは、分析対象物質である抗原に対する抗体（第一抗体）をプラスチック製容器の底などに固定化し、この容器に血清などの分析試料を入れ、分析試料に含まれる抗原を第一抗体に結合させる。さらに、標識物質を結合した抗体（第二抗体）を、第一抗体に結合した抗原にさらに結合させ、標識物質が発する信号を検出することにより、抗原を定量分析する。標識物質として、例えば蛍光物質を用いる。この場合、標識物質を結合した第二抗体のうち、抗原に結合したものの濃度に依存して蛍光が増減し、この蛍光を光検出器で検出することにより、分析試料中の抗原を定量することができる。
【０００４】
免疫分析装置の具体的な一例を挙げると、固相として磁性粒子を用い、第一抗体を磁性粒子の表面に固定化する。第二抗体には、標識物質として発光標識物質を結合する。分析試料に含まれる分析対象物質（抗原）と、第一抗体が固定化された磁性粒子とを混合すると、抗原が第一抗体を介して磁性粒子に結合する。さらに、第二抗体を反応させると、発光標識物質が第二抗体、抗原、第一抗体を介して磁性粒子に結合する。磁性粒子に結合する発光標識物質の濃度は、分析試料に含まれる抗原の濃度に依存して増減する。
【０００５】
抗原が結合した磁性粒子を、試料分析装置の所定の位置に磁気吸着したのち、レーザー光等を作用させることにより、磁性粒子に結合した発光標識物質を発光させる。この発光を検出し発光量を測定することにより、分析試料に含まれる抗原を定量分析することができる。
【０００６】
感度及び再現性の高い免疫分析を行うためには、分析対象物質である抗原を結合した磁性粒子を、磁石等を用いて所定の位置に磁気吸着して捕捉するとともに、その間に抗原と結合していない第二抗体を含む溶液を交換する。この操作をＢ／Ｆ分離（Bound/Free分離）とよぶ。
【０００７】
上記の方法において、１回の分析に用いる磁性粒子の個数についての制約はないが、一般的には分析１回あたり１０5〜１０6個の粒子を使用する。しかし、分析コストを低減するためには、より少数の磁性粒子を用いて、より低濃度の分析対象物質を定量分析するための技術が必要である。少数の磁性粒子を用いる試料分析方法として、特許文献１がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４７９００２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１で開示されている試料分析方法では、検出部として、多数の微小な開口部を有する基板を使用する。分析対象物質を結合した微粒子を、基板上の微小な開口部に充填する。そして、基板上の開口部に１個ずつ充填された微粒子の発光画像を取得する。ここで、特許文献１に開示された検出部を用いて、磁性粒子を検出部の微小な開口部に吸着させる場合、Ｂ／Ｆ分離時に溶液を交換するときに、開口部内に溶液が残存してしまい、十分なＢ／Ｆ分離が達成できなかった。また、１回の分析サイクルが終了した後、検出部から分析済みのサンプルを排出し、検出部を洗浄するときに、開口部内に磁性粒子及び溶液が残存してしまい、検出部の十分な洗浄が達成できなかった。
【００１０】
本発明は、感度及び再現性の高い分析を行うことができる試料分析装置及び試料分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明では、粒子捕捉部として平坦な基板を使用し、粒子捕捉部に分析試料を連続的に流すことで、異なる試料に対し同一の粒子捕捉部を繰り返し使用する。より具体的には、磁性粒子を含む試料液を流路中に流し、流路内に設定した粒子捕捉部に近づけた磁石により磁性粒子を捕捉する。従って、微細な開口部を有する基板と比較して、分析サイクル中に十分なＢ／Ｆ分離を行うことができる。また、分析サイクル終了後に、粒子捕捉部を十分に洗浄することができる。
【００１２】
一方、粒子捕捉部が平坦な基板であることから、基板上の各磁性粒子の磁気吸着位置はランダムになる。そこで、粒子捕捉部に磁気吸着した少数の磁性粒子の明視野画像を撮像する撮像部、及び当該少量の磁性粒子の発光を検出する光検出部を設置する。少数の磁性粒子の明視野画像から、検出部に磁気吸着した磁性粒子の個数を算出し、この値と、当該少数粒子の発光量を用いて、磁性粒子１個当たりの平均発光量を算出することで定量分析を行う。発光には、蛍光や化学発光を利用することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、Ｂ／Ｆ分離効率の向上、洗浄効率の向上、測定精度の向上、測定結果の再現性の向上、分析感度の向上等を見込むことができる。
【００１４】
上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明による試料分析装置の一例を示す概略図。
【図２】流路内の粒子吸着位置とミラーの位置関係を示す図。
【図３】流路内の粒子吸着位置とミラーの位置関係を示す図。
【図４】流路内の粒子吸着位置とミラーの位置関係を示す図。
【図５】流路内の粒子吸着位置とミラーの位置関係を示す図。
【図６】本発明による試料分析装置の他の例を示す概略図。
【図７】本発明による試料分析装置の他の例を示す概略図。
【図８】粒子吸着位置における、吸着粒子密度と発光量の関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施例を、図面を用いて説明する。
試料分析装置の一例として、磁性粒子を用いる免疫分析装置について説明する。なお、本発明は、免疫分析装置に限らず、磁性粒子を用いて、磁場強度の切り替えにより磁性粒子を捕捉する原理に基づく試料分析装置であれば適用可能であり、例えばＤＮＡシーケンシング装置、生化学分析装置などに対しても適用可能である。
【００１７】
図１は、本発明による試料分析装置の一例を示す概略図である。図１において、流路１５は、チューブ２１及びチューブ２２を通して、シッパーノズル２４及びポンプ２５と接続される。シッパーノズル２４はアーム２６により移動可能であり、その移動範囲内に、試料液容器３２、洗浄液容器３３、緩衝液容器４０を設置する。
【００１８】
バルブ３０を流路１５とポンプ２５との間のチューブ２２に設ける。ポンプ２５はコントローラ３７で制御し、所定量の溶液の吸引及び吐出が可能である。チューブ２２は、さらにチューブ２３を介して廃液容器３４へと続く。
【００１９】
検出部となるフローセルの流路壁１４は可視光領域で透明な材料で製作し、その内部には溶液が流通する流路１５を形成する。流路壁は可視光を透過するため、流路内の溶液の流動状態を外部から観察することができる。流路壁１４の全体を透明な材料で製作する代わりに、光を透過させる部分にのみ、透明な材料を使用してもよい。
【００２０】
フローセルの流路壁は、フローセル内の粒子吸着位置に吸着した磁性粒子の表面に結合した発光標識物質が発する光の波長に対して、実質的に透明である材料で製作されるのが好ましく、例えばガラス、石英、プラスチックなどで製作されるのが好ましい。
【００２１】
流路１５は、深さ（すなわち厚さ）に対し幅が２〜２０倍になるように製作されていることが望ましい。これにより、フローセル内に導入された試料液に含まれる磁性粒子が流路の幅方向に拡がりやすくし、磁性粒子が粒子吸着位置１３の面内に均一に吸着しやすくする。
【００２２】
流路１５の下部周辺には、レーザー光源１８、集光レンズ１７を設置する。レーザー光源１８から照射されたレーザー光は集光レンズ１７で集光され、流路１５内の粒子吸着位置１３に照射される。
【００２３】
磁性粒子の磁気吸着のための磁場印加手段として、磁石１１を用いる。磁性粒子を粒子吸着位置１３に磁気吸着する際には、磁石１１を流路１５の直下に移動する。例えば、磁石１１を、水平方向に自由に移動することが可能なスライド機構１６に設置し、磁性粒子を磁気吸着する際には、磁石１１を流路１５の直下に移動する。流路１５内を洗浄する際には、磁性粒子に対する磁場の影響を十分に低減できる位置まで磁石１１を移動する。なお、スライド機構１６を用いて磁石１１を、流路に対して水平方向に移動させる代わりに、流路に対して上下方向に移動させてもよい。
【００２４】
フローセルの流路内に設置する粒子吸着位置１３は、下側に磁石１１を接近し、上側に磁性粒子を磁気吸着することを考慮し、金、白金、炭素など、汚れの付きにくい平坦な表面を形成可能な非磁性材料で製作することが好ましい。
【００２５】
コントローラ３７は、アーム２６、光検出器３９、撮像装置４１、ミラー駆動機構４２、スライド機構１６、レーザー光源１８、照明４５、ポンプ２５、バルブ３０，３１、データ格納部４８と信号線３８ａ〜３８ｅによって接続されており、それぞれを制御することができる。
【００２６】
磁性粒子１０は、磁石１１による磁気力によって、流路１５内の粒子吸着位置１３の表面に磁気吸着される。磁性粒子表面に結合した発光標識物質の発光を測定するときには、スライド機構１６により磁石１１を流路１５から遠ざけ、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０に磁気力が働かないようにする。この際、流路１５内の液体の流れを停止し、磁性粒子１０を粒子吸着位置１３に吸着したまま、流路１５内に留める。ここで、流路１５の下部に設置されたレーザー光源１８からレーザー光を磁性粒子１０に照射することにより、磁性粒子表面の発光標識物質を発光させる。この発光標識物質からの発光量を、光検出器３９で検出する。
【００２７】
磁石１１の形状は直方体を基本とするが、円柱、角柱など他の形状でもよい。磁石の配置方法は、Ｎ極及びＳ極を横方向にしてフローセルと略平行に配置する方法、又はＮ極及びＳ極を縦方向にしてフローセルと略垂直に配置する方法のいずれかが望ましい。また、磁石は、永久磁石も、電磁石も用いることができる。
【００２８】
流路１５内における磁性粒子１０の吸着分布は、磁性粒子に働く２種類の力、すなわち、流路１５の下側に配置された磁石１１の磁場から受ける磁気力、及び、磁性粒子を含む試料液をフローセル内に導入する際の流れ場から受ける抗力により決まる。磁性粒子が流れ場から受ける抗力が、磁場から受ける磁気力よりも大きい場合、磁性粒子は粒子吸着位置１３に磁気吸着せずに、試料液と共に流路外に排出されてしまうため、磁場の大きさに応じて、溶液の流速を適正化する必要がある。例えば、流路１５内の磁場の大きさは、０．１〜０．５Ｔが好ましい。また、その際の液体の流速は、０．０５〜０．１０ｍ／ｓが好ましい。
【００２９】
光検出器３９は、磁性粒子表面の発光標識物質が発する光を検出できる装置であればよく、例えば、ＣＣＤカメラ、光電子増倍管、フォトマルチプレクサなどを使用することが好ましい。撮像装置４１は、対物レンズ４４を介して磁性粒子１０の明視野画像を取得できる装置であればよく、例えばＣＣＤカメラなどを使用することが好ましい。
【００３０】
流路１５の上側周辺には、対物レンズ４４、ミラー４３、及びミラー駆動機構４２を設置する。ミラー駆動機構４２は、ミラー４３の保持角度を調整する機能を有する。ミラー駆動機構４２によりミラー４３の保持角度を、流路１５に対して４５度に保持した場合、フローセル内の粒子吸着位置１３の磁性粒子１０から発した光が対物レンズ４４、ミラー４３を介して光検出器３９に至る光路が設定される。一方、ミラー駆動機構４２により、ミラー４３の角度を、流路１５に対して９０度に保持した場合、粒子吸着位置１３の磁性粒子１０から発した光が対物レンズ４４を介して撮像装置４１に至る光路が設定される。
【００３１】
ミラー駆動機構４２は、以上のようにミラー４３の保持角度を調整する機能を有するものの他、流路１５に対してミラー４３を平行移動する機能を有するものでもよい。ミラー４３の角度を流路１５に対して４５度に保持したまま、ミラー駆動機構４２によりミラー４３を流路１５に対して平行移動し、ミラー４３を対物レンズ４４の上方位置に設置した場合、粒子吸着位置１３の磁性粒子１０から発した光が対物レンズ４４、ミラー４３を介して光検出器３９に至る光路が設定される。また、ミラー４３の角度を流路１５に対して４５度に保持したまま、ミラー駆動機構４２によりミラー４３を流路１５に対して平行移動し、ミラー４３を対物レンズ４４から離れた位置に設置した場合、粒子吸着位置１３の磁性粒子１０からの光が対物レンズ４４を介して撮像装置４１に至る光路が設定される。
【００３２】
なお、光検出器３９の設置位置と撮像装置４１の設置位置は、交換してもよい。すなわち、図１に示した撮像装置４１の位置に光検出器３９を配置し、光検出器３９の位置に撮像装置４１を配置してもよい。
【００３３】
洗浄液容器３３にはチューブ２１、流路１５、及びチューブ２２の内部を洗浄するための洗浄液が収容されている。試料液容器３２には、分析試料を磁性粒子溶液及び所定の試薬と混合して、一定温度（例えば３７℃）で一定時間反応させた試料液が収容されている。緩衝液容器４０には、チューブ２１、流路１５、及びチューブ２２の内部を満たすための緩衝液が収容されている。
【００３４】
次に、分析試料、磁性粒子、磁性粒子溶液、発光標識物質、及び試料液について説明する。
【００３５】
分析試料とは、血清、尿などの生体液由来試料である。分析試料が血清の場合、分析対象物質は、腫瘍マーカー、甲状腺関連物質、ホルモン、心筋マーカー、感染症関連物質などである。
【００３６】
磁性粒子は、例えば、強磁性を示す酸化鉄粒子をポリマーで被覆した粒子である。磁性粒子の粒径は０．０１μｍ（マイクロメートル）〜２００μｍ（マイクロメートル）の範囲が好ましく、１μｍ〜１０μｍの範囲がより好ましい。比重は、１．３〜１．５の範囲が好ましい。磁性粒子の表面には、分析対象物質を特異的に結合する性質を持つ物質、例えば抗原に特異的に結合する性質を持つ抗体を結合する。
【００３７】
磁性粒子溶液とは、緩衝液中に上記の磁性粒子を均一に分散した溶液である。緩衝液としては、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液などを使用することができる。
【００３８】
発光標識物質は、以下のような物質であることが好ましい。
（１）蛍光免疫分析法で使用される標識物質。例えば、フルオレセインイソチオシアネートで標識した抗体など。
（２）化学発光免疫分析法で使用される標識物質。例えば、アクリジニウムエステルで標識した抗体など。
（３）化学発光酵素免疫分析法で使用される標識物質。例えば、ルミノールやアダマンチル誘導体を発光基質とする化学発光酵素で標識した抗体など。
【００３９】
発光標識物質を、適切な手段により分析対象物質と特異的に結合させ、適切な手段により発光させる。
【００４０】
試料液とは、分析対象物質を含む分析試料を、磁性粒子溶液、及び発光標識物質と混合して、一定温度で一定時間反応させたものである。
【００４１】
次に、本発明で開示する試料分析装置の分析サイクルについて説明する。
分析サイクルの開始前に、予め反応ユニット３６内で、分析対象物質を含む分析試料、磁性粒子溶液、及び発光標識物質を混合して、一定温度で一定時間反応させ、試料液を調製しておく。反応ユニット３６内で反応させた試料液を収容した試料液容器３２を、所定の位置にセットした時点から、分析の１サイクルが開始する。分析の１サイクルは、試料液吸引期間、磁性粒子吸着期間、画像撮像期間、発光検出期間、洗浄期間、リセット期間、及び予備吸引期間から成る。
【００４２】
試料液吸引期間では、コントローラ３７の信号によりスライド機構１６を稼働させ、磁石１１を流路１５内の粒子吸着位置１３の下部に移動させる。バルブ３０は開いた状態、バルブ３１は閉じた状態に設定する。アーム２６がコントローラ３７の信号により動作し、シッパーノズル２４を試料液容器３２内に挿入する。コントローラ３７の信号により、ポンプ２５が一定量の吸引動作をする。試料液容器３２内の試料液が、チューブ２１内にある緩衝液に続いて吸引され、チューブ２１内に流入する。この状態でポンプ２５を停止し、アーム２６を動作してシッパーノズル２４を駆動し、洗浄機構３５内を通過させる。このとき、シッパーノズル２４の先端が洗浄される。
【００４３】
磁性粒子吸着期間では、コントローラ３７からの信号により、ポンプ２５を一定速度で吸引する。その間に、チューブ２１内にあった試料液は、流路１５内を通過する。流路１５内の粒子吸着位置１３の下部には磁石１１が設置されているため、試料液に含まれる磁性粒子１０は磁石１１の方向に吸引され、流路１５内の粒子吸着位置１３の表面に磁気吸着される。
【００４４】
画像撮像期間では、コントローラ３７からの信号によりミラー駆動機構４２を駆動してミラー４３の位置が調整され、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４を介して撮像装置４１に至る光路が選択される。照明４５を点灯し、照明光を流路１５中の粒子吸着位置１３に照射する。この状態で、粒子吸着位置１３に磁気吸着されている磁性粒子１０の画像が、対物レンズを介して、撮像装置４１により撮像される。このとき、対物レンズ４４の倍率を選択することにより、１枚の画像で撮像される粒子吸着位置１３の面積、及び磁性粒子１０の個数を調整する。また、対物レンズ４４の空間分解能を調整することにより、撮像する画像の空間分解能を調整する。ここで、対物レンズ４４の空間分解能を示す値が、磁性粒子の粒径よりも小さい場合、撮像した画像中で、磁性粒子を１個ずつ識別することができる。
【００４５】
発光検出期間では、スライド機構１６を駆動し、磁石１１を流路１５から遠ざける。ミラー駆動機構４２を駆動してミラー４３の位置が調整され、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４を介して光検出器３９に至る光路が選択される。続いて、コントローラ３７からの信号でレーザー光源１８からレーザー光を照射し、集光レンズ１７を通して、レーザー光を粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０に照射する。このとき、粒子吸着位置１３の磁性粒子１０の表面に結合した発光標識物質が発光する。この発光を、光学フィルタにより波長選択し、光検出器３９により検出する。このとき、光検出器３９の受光視野は撮像装置４１による撮像視野と同じである。従って、光検出器３９は、先の画像撮像期間に撮像装置４１によって撮像された磁性粒子群と同じ磁性粒子群から発生された発光強度を一度に検出することになる。所定時間経過後、レーザー光の照射を停止する。発光検出期間中に、アーム２６によりシッパーノズル２４を移動させ、洗浄機構３５内を通過させる。
【００４６】
なお、画像撮像期間と発光検出期間の順序を入れ替えて、発光検出期間の後に画像撮像期間がくるように設定してもよい。
【００４７】
洗浄期間では、ポンプ２５によって洗浄液容器３３から洗浄液を吸引し、チューブ２１を介して流路１５内に洗浄液を通過させる。この際、流路から磁石１１を遠ざけているために、磁性粒子１０は粒子吸着位置１３上に保持されず、洗浄液とともに流路外に排出される。
【００４８】
リセット期間では、バルブ３０を閉じ、バルブ３１を開いてポンプ２５を吐出動作する。ポンプ２５内の液は、廃液容器３４に排出される。
【００４９】
予備吸引期間では、アーム２６を駆動して、シッパーノズル２４を緩衝液容器４０に挿入する。次に、バルブ３１を閉じ、バルブ３０を開いたのち、ポンプ２５を駆動して緩衝液容器４０内の緩衝液を吸引し、シッパーノズル２４を介して、チューブ２１及び流路１５内に緩衝液を満たす。予備吸引期間後、次の分析サイクルが実行可能になる。
【００５０】
図２及び図３は、流路内の粒子吸着位置とミラーの位置関係を示す図であり、ミラーの移動による光路切換えの例を説明する図である。
【００５１】
図２の配置の場合、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４を介して撮像装置４１への光路が設定される。ミラー駆動機構４２を駆動し、ミラー４３を流路１５に対して平行に移動し、光路上から外れた位置に設置する。照明４５を点灯し、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０に照明光を照射する。この状態で、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０の明視野画像を撮像装置４１により撮像することができる。
【００５２】
図３の配置の場合、ミラー駆動機構４２を駆動し、ミラー４３を粒子吸着位置１３及び対物レンズ４４の上方に設置する。ミラー４３の設置角度は、粒子吸着位置１３の面に対して４５度が好ましい。このとき、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４及びミラー４３を介して光検出器３９に至る光路が設定される。照明４５を消灯し、所定の方法により、磁性粒子１０の表面の発光標識物質を発光させる。この状態で、磁性粒子表面の発光標識物質の発光が、対物レンズ４４及びミラー４３を介して光検出器３９へと導入され、撮像装置４１で撮像された明視野画像内の磁性粒子に結合した発光標識物質の発光量の総量を取得することができる。
【００５３】
図４及び図５は、流路内の粒子吸着位置とミラーの位置関係を示す図であり、ミラーの角度変更による光路切換えの例を説明する図である。
【００５４】
図４の配置の場合、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４を介して撮像装置４１に至るの光路が設定される。ミラー駆動機構４２を駆動し、ミラー４３の設置角度を、流路１５に対して９０度に設定し、ミラー４３をこの光路上から外れた位置に設置する。そして、照明４５を点灯し、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０に照明光を照射する。この状態で、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０の明視野画像を撮像装置４１により撮像することができる。
【００５５】
図５の配置の場合、ミラー駆動機構４２を駆動し、ミラー４３の設置角度を、粒子吸着位置１３の面に対して４５度に設定する。このとき、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４及びミラー４３を介して光検出器３９に至る光路が設定される。照明４５を消灯し、所定の方法により、磁性粒子表面の発光標識物質を発光させる。この状態で、磁性粒子表面の発光標識物質の発光が、対物レンズ４４及びミラー４３を介して光検出器３９へと導入され、撮像装置４１で撮像された明視野画像内に存在する磁性粒子に結合した発光標識物質の発光量の総量を取得することができる。
【００５６】
図６は、本発明による試料分析装置の他の実施例を示す概略図である。本実施例の試料分析装置では、レーザー光源を流路に対して光検出器側に配置した。
【００５７】
レーザー光源１８からのレーザー光は固定ミラー５０で反射され、対物レンズ４４によってフローセルの粒子吸着位置１３に吸着された磁性粒子１０に照射される。磁性粒子１０から発生された発光は、対物レンズ４４、ミラー４３を介して光検出器３９で検出される。この配置の場合、照明ユニット４７に配置する固定ミラー４６，５０はいずれもハーフミラーとする必要がある。また、ミラー駆動機構４２によって駆動されるミラー４３は、例えば、励起光としてのレーザー光を透過し、磁性粒子１０から発生される蛍光等の発光を反射するダイクロイックミラーとする。
【００５８】
図１に示した試料分析装置の場合には、レーザー光源１８とフローセルの間に磁石１１が介在していた。従って、レーザー光源１８からの励起レーザー光で粒子吸着位置１３の磁性粒子１０を照射する際には、磁石１１をレーザー光の光路外に移動する必要があった。図６のようにレーザー光源１８からのレーザー光を照明ユニット４７からフローセルに照射する構造とすることで、発光量測定時にも磁性粒子１０を磁石１１によって粒子吸着位置１３に固定することができるため、測定の安定度を増すことができる。また、粒子吸着位置１３を透明材料で構成する必要もなくなる。
【００５９】
なお、図１あるいは図６に示した装置構成において、ミラー４３を固定のハーフミラーとし、ミラー駆動機構４２を省略することも可能である。
【００６０】
以上の実施例では、２つの検出部、すなわち光検出器と撮像装置を用いたが、発光量を取得する機能を有する撮像装置を用いることにより、１つの検出部で光検出器と撮像装置を兼用することも可能である。その場合、ミラー駆動機構を用いて光路の切り替えを行うことなく、磁性粒子の明視野画像及び発光量を取得することができる。ここで、発光量を取得する機能を有する撮像装置とは、例えば、撮像した画像内の全画素（ピクセル）の輝度値を算出し、それらの輝度値の総和を算出する機能を有する撮像装置を指す。
【００６１】
図７は、本発明による試料分析装置の他の実施例を示す概略図である。本実施例の試料分析装置は、一台の撮像装置で明視野画像の撮像と発光量の取得を行う。
【００６２】
図７に示した装置構成は、図１に示した試料分析装置から光検出器３９、ミラー４３及びミラー駆動機構４２を除去したものに相当する。まず、照明４５を点灯し、固定ミラー（ハーフミラー）４６及び対物レンズ４４を介して、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０に照明光を照射する。この状態で、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０の明視野画像を撮像装置４１により撮像する。このとき、粒子には十分な光量の照明光を照射するので、撮像装置４１の受光感度は低く設定しておくことが好ましい。次に、照明４５を消灯し、所定の方法により、磁性粒子１０の表面に結合した発光標識物質を発光させる。この発光が、対物レンズ４４を介して撮像装置４１へと導入され、発光標識物質の発光量を取得する。このとき、粒子の表面に結合した発光標識物質からの発光は極めて微弱であるから、撮像装置４１の受光感度は高く設定しておくことが好ましい。
【００６３】
次に、データ処理方法の実施例について、図１を参照して説明する。明視野画像で撮像される粒子吸着位置の面積を予め設定する。例えば、当該面積を１００μｍ□（すなわち、１００μｍ×１００ μｍ）に設定する。撮像装置４１にて取得した画像は、データ格納部４８に格納される。次に、当該画像を演算処理部４９に取り出し、画像処理を施して、当該画像に含まれる磁性粒子の個数を算出する。例えば、撮像された粒子の個数が５００個であるとき、吸着粒子密度は５００個／１００μｍ□となる。算出された吸着粒子密度は、データ格納部に格納される。このとき算出される磁性粒子の個数は、発光標識物質の結合の有無を問わず、粒子吸着位置に吸着して撮像された全ての磁性粒子の個数である。従って、算出される吸着粒子密度は、発光標識物質が結合していない磁性粒子も含む、撮像された全ての磁性粒子の密度である。
【００６４】
次に、ミラー４３により光路を切り替えた上で、明視野画像を撮像したときと同じ粒子吸着位置の面積内に含まれる全ての磁性粒子による発光量を取得する。発光量は、例えば光検出器で検出する電流量（単位はカウント）などの値で表し、２，５００カウント／１００μｍ□のようになる。検出された発光量は、データ格納部４８に格納される。
【００６５】
吸着粒子密度及び発光量は、データ格納部４８から演算処理部４９に取り出され、演算処理部４９において、この２つの値から、磁性粒子１個当たりの平均発光量が算出される。上記の例では、２，５００カウント／５００個＝５カウント／個となる。算出した磁性粒子１個当たり平均発光量は、データ格納部４８に格納される。
【００６６】
免疫分析の分析対象物質は、血清などの生体液中で非常に広範囲な濃度を取り得る。そのため免疫分析装置では、検出のダイナミックレンジが広いこと（例えば、１０6オーダ）が要求される。本発明では、例えば下記の方法により、検出のダイナミックレンジを広くすることができる。
【００６７】
磁性粒子の粒径や、撮像する明視野画像の撮像対象領域の面積などを規定することにより、１枚の明視野画像中に撮像される磁性粒子の個数、すなわち吸着粒子密度を調整する。例えば吸着粒子密度を０〜１０，０００個／１００μｍ□（１０4オーダ）の範囲に調整する。一方、分析試料に含まれる分析対象物質の濃度の増減に応じて、磁性粒子の表面に結合する発光標識物質の濃度も増減し、この結果、各磁性粒子の発光量も増減する。光検出器の検出感度や露光時間などを規定することにより、１個の磁性粒子の発光量を調整する。例えば１個の磁性粒子の発光量を０〜１００カウント／個（１０2オーダ）の範囲に調整する。以上の調整により本発明では、吸着粒子密度で１０4オーダ、１個の磁性粒子の発光量で１０2オーダ、合わせて１０6オーダにわたる検出のダイナミックレンジを確保することができる。
【００６８】
ここで、蛍光免疫分析法（レーザー光を粒子吸着位置の下方から照射する場合）、蛍光免疫分析法（対物レンズを通してレーザー光を照射する場合）、化学発光免疫分析法、化学発光酵素免疫分析法の各分析法における分析サイクルの違いについて説明する。
【００６９】
最初に、蛍光免疫分析法において、レーザー光を粒子吸着位置の下方から照射する場合（第１の蛍光免疫分析法）の分析サイクルについて、図１に示されている装置構成を例に簡単に説明する。
【００７０】
試料液吸引期間では、磁石１１を流路１５内の粒子吸着位置１３の下部に移動させる。そして、シッパーノズル２４を試料液容器３２に挿入し、試料液を吸引しチューブ２１内に流入させる。続く磁性粒子吸着期間では、試料液を流路１５内に通過させる。それによって磁性粒子１０が流路１５内の粒子吸着位置１３に磁気吸着する。この場合、磁性粒子１０の表面には、蛍光免疫分析法で使用される標識物質が結合している。次に、画像撮像期間では、ミラー駆動機構４２によりミラー４３の位置を調整し、粒子吸着位置１３から撮像装置４１に至る光路を選択する。その後、照明４５を点灯し、ミラー４６を介して粒子吸着位置１３に照明光を照射する。この状態で、撮像装置４１により磁性粒子１０の明視野画像を撮像する。
【００７１】
発光検出期間では、磁石１１を流路１５から遠ざけ、レーザー光の光路を遮らないようにすると共に、ミラー駆動機構４２によりミラー４３の位置を調整し、粒子吸着位置１３から光検出器３９に至る光路を選択する。その後、レーザー光源１８から磁性粒子１０にレーザー光を照射し、磁性粒子表面に結合した標識物質が発する蛍光を光検出器３９により検出する。検出終了後、レーザー光の照射を停止する。なお、流路１５及び粒子吸着位置１３は、レーザー光の波長に対して実質的に透明である材料、例えばガラス、石英、プラスチックなどで製作するのが好ましい。
【００７２】
続く洗浄期間では、洗浄液をチューブ２１を介して吸引し、流路１５内を通過させる。リセット期間において、ポンプ２５内の液を、廃液容器３４に排出する。そして予備吸引期間において、緩衝液を吸引し、チューブ２１及び流路１５内を緩衝液で満たす。
【００７３】
次に、蛍光免疫分析法において、対物レンズを通してレーザー光を照射する場合（第２の蛍光免疫分析法）の分析サイクルについて、図６に示した装置構成を例に説明する。この場合、発光検出期間における操作だけが、上記第１の蛍光免疫分析法と異なり、他の期間における操作は上記第１の蛍光免疫分析法と同じである。
【００７４】
第２の蛍光免疫分析法の発光検出期間には、磁石１１の位置は、流路１５から遠ざけてもよいし、または、流路１５内の粒子吸着位置１３の下部に近付けたままでもよい。ミラー駆動機構４２によりミラー４３の位置を調整して、粒子吸着位置から光検出器３９に至る光路を選択する。そして、レーザー光源１８から固定ミラー５０、対物レンズ４４を介して、磁性粒子１０にレーザー光を照射し、磁性粒子表面に結合した標識物質が発する蛍光を光検出器３９により検出する。検出終了後、レーザー光の照射を停止する。なお、レーザー光源１８から照射されるレーザー光は、ミラー４３，４６を透過するものとする。
【００７５】
化学発光免疫分析法の分析サイクルは、発光検出期間における操作が上記第１の蛍光免疫分析法と異なるが、他の期間における操作は上記第１の蛍光免疫分析法と実質的に同じである。なお、磁性粒子吸着期間において流路１５内の粒子吸着位置１３に磁気吸着した磁性粒子１０の表面には、化学発光免疫分析法で使用される標識物質が結合している。
【００７６】
化学発光免疫分析法の発光検出期間には、磁石１１を、流路１５内の粒子吸着位置１３の下部に近付けたまま、ミラー駆動機構４２によりミラー４３の位置を調整して、粒子吸着位置１３から光検出器３９に至る光路を選択する。その後、発光試薬容器５１から発光試薬を吸引し、チューブ２１を介して、流路１５内に導入する。発光試薬は、標識物質の化学発光を誘起する試薬である。そして、磁性粒子表面に結合した標識物質が発する化学発光を光検出器３９により検出する。
【００７７】
化学発光酵素免疫分析法の分析サイクルは、発光検出期間における操作が上記第１の蛍光免疫分析法と異なるが、他の期間における操作は上記第１の蛍光免疫分析法と実質的に同じである。なお、磁性粒子吸着期間において流路１５内の粒子吸着位置１３に磁気吸着した磁性粒子１０の表面には、化学発光酵素免疫分析法で使用される標識物質が結合している。
【００７８】
化学発光酵素免疫分析法の発光検出期間には、磁石１１を、流路１５内の粒子吸着位置１３の下部に近付けたまま、ミラー駆動機構４２によりミラー４３の位置を調整して、粒子吸着位置１３から光検出器３９に至る光路を選択する。その後、発光試薬容器５１から発光試薬を吸引し、チューブ２１を介して、流路１５内に導入する。発光試薬は、標識物質中の酵素と反応して発光する発光基質である。そして、磁性粒子表面に結合した標識物質中の酵素と反応した発光試薬が発する化学発光を光検出器３９により検出する。
【００７９】
次に、本発明の試料分析装置及び試料分析方法の具体的な適用例及びその効果について、説明する。ここでは、図１に示した試料分析装置と、平均粒径２．８μｍの磁性粒子を使用した。フローセル中の粒子吸着位置１３の、溶液流れ方向の幅は５ｍｍとした。また、溶液流れ方向の磁石の幅は３ｍｍとした。粒子吸着位置１３の上流端を原点とする座標をとり、座標２ｍｍから５ｍｍまでの幅３ｍｍの範囲に、フローセル下側から磁石１１を設置した。試料液ａと試料液ｂの２種類の試料液を調製した。試料液ａと試料液ｂは、磁性粒子及び分析対象物を含んでいる。試料液ａと試料液ｂは、同じ濃度の磁性粒子を含んでいるが、試料溶液ａの分析対象物質の濃度は、試料溶液ｂのその濃度よりも大きい。
【００８０】
最初、ミラー４３を図２に示す位置に保持し、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４を経て撮像装置４１に至る光路を選択し、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０の明視野画像を撮像した。この画像から、粒子吸着位置１３における吸着粒子密度（単位は、個／１００μｍ□）を算出した。次に、ミラー４３を図３に示す位置に保持し、粒子吸着位置１３から対物レンズ４４及びミラー４３を経て光検出器３９に至る光路を選択し、明視野画像と同じ視野で、粒子吸着位置１３に吸着した磁性粒子１０の表面の発光標識物質からの発光量（単位は、カウント／１００μｍ□）を測定した。この操作を、磁性粒子の濃度と分析対象物質の濃度とが十分に大きくない試料溶液ａと試料溶液ｂについて、複数回行った。
【００８１】
図８は、吸着粒子密度と発光量の関係を示す図である。試料液ａにおける吸着粒子密度と発光量の関係を示すプロット（図８中の６１で示す）は直線となった。この直線６１の傾きは、試料液ａにおける、磁性粒子１個あたりの平均発光量を示し、本実施例では、５カウント／粒子となった。一方、試料液ｂで同様の測定を行った結果、吸着粒子密度と発光量の関係を示すプロット（図８中の６２で示す）は同じく直線となり、この直線６２の傾きは３カウント／粒子となった。
【００８２】
以上の結果から、同一の試料液では、粒子吸着位置内のいずれの位置で測定した場合でも、磁性粒子１個あたりの平均発光量は等しいことがわかる。また、分析対象物質濃度の異なる試料液では、分析対象物質濃度の増減に対応して、磁性粒子１個あたりの平均発光量が増減することがわかる。従って、本実施例で開示した方法によれば、粒子吸着位置に吸着した少数の磁性粒子の明視野画像及び発光量を用いて算出した、磁性粒子１個当たりの平均発光量に基づいて、試料液中の分析対象物質の定量分析を行うことができる。
【００８３】
なお、本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００８４】
１０  磁性粒子
１１  磁石
１３  粒子吸着位置
１４  流路壁
１５  流路
１６  スライド機構
１７  集光レンズ
１８  レーザー光源
２１  チューブ
２２  チューブ
２３  チューブ
２４  シッパーノズル
２５  ポンプ
２６  アーム
３０  バルブ
３１  バルブ
３２  試料液容器
３３  洗浄液容器
３４  廃液容器
３５  洗浄機構
３６  反応ユニット
３７  コントローラ
３８  信号線
３９  光検出器
４０  緩衝液容器
４１  撮像装置
４２  ミラー駆動機構
４３  ミラー
４４  対物レンズ
４５  照明
４６  固定ミラー
４７  照明ユニット
４８  データ格納部
４９  演算処理部
５０  固定ミラー
５１  発光試薬容器
【図１】
2013238420.tif 000003
【図２】
2013238420.tif 000004
【図３】
2013238420.tif 000005
【図４】
2013238420.tif 000006
【図５】
2013238420.tif 000007
【図６】
2013238420.tif 000008
【図７】
2013238420.tif 000009
【図８】
2013238420.tif 000010