(57)【要約】      （修正有）【課題】生鮮魚介類を前処理なしに非破壊で迅速に鮮度評価する方法を提供する。【解決手段】生鮮魚介類に含まれる補酵素の一種であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光の強度測定により、魚介類の生細胞の鮮度を非破壊で、前処理なしに生鮮魚介類の鮮度を評価する。生鮮魚介類に含まれる補酵素とアミノ酸の自家蛍光を同時に測定し、それらの蛍光の強度比から、生鮮魚介類の鮮度を評価する。誤差を小さくするために光学系の評価指標として、生物組織に含まれるアミノ酸の一種であるトリプトファンの自家蛍光を測定する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生鮮魚介類に含まれる補酵素の一種であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光の強度測定により、魚介類の生細胞の鮮度を非破壊で、前処理なしに生鮮魚介類の鮮度を評価することを特徴とする魚介類の鮮度評価方法。
【請求項２】
生鮮魚介類に含まれる補酵素とアミノ酸の自家蛍光を同時に測定し、それらの蛍光の強度比から、生鮮魚介類の鮮度を評価することを特徴とする魚介類の鮮度評価方法。
【請求項３】
補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸を用いて測定することを特徴とする請求項２記載の魚介類の鮮度評価方法。
【請求項４】
誤差を小さくするため光学系の評価指標として、生物組織に含まれるアミノ酸の一種であるトリプトファンの自家蛍光を測定することを特徴とする請求項２又は３記載の魚介類の鮮度評価方法。
【請求項５】
励起光源、試料ホルダー、蛍光検出器、生鮮魚介類に含まれる補酵素の蛍光とアミノ酸の自家蛍光を同時に測定する装置及びこれらの蛍光の強度比を測定する装置、光学系の評価に基づき誤差補正を行う装置を備えていることを特徴とする魚介類の鮮度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生鮮魚介類を前処理なしに非破壊で迅速に鮮度評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生鮮魚介類の鮮度は、Ｋ値を指標として評価されている。この従来法は、死後にＡＴＰから生成されるＡＴＰ関連物質に含まれるイノシン及びヒポキサンチンの合計割合をＫ値として、その大きさによって鮮度を評価するものであり、サンプリング後、前処理したものを液体クロマトグラフで成分分析を行ない、サンプル中のＡＴＰ関連物質の各成分量を加え合わせたものを分母とし、イノシン及びヒポキサンチンの合計量を分子として数値化を行なうものである。
【０００３】
この技術は、前処理に専門知識と技能が必要であり、一定以上の技術と経験がないと測定できないという問題がある。また、評価に要する時間については、試料の前処理及び前処理後の成分分析に数時間かかるため、鮮度を迅速に知りたい分野、例えば流通現場などでＫ値測定により鮮度評価することは困難であるという欠点を有する。
【０００４】
一方、光学的特性から鮮度を評価する方法が注目されている。例えば、生鮮食品や穀物については、フェノール化合物やリグニン、タンパク質の蛍光強度を指標にした鮮度評価方法（蛍光分光分析法）がある。この具体的な手法を開示した例として、本発明者らによる下記非特許文献１、２が存在する。
一般に、蛍光分析法は非破壊で迅速に、高感度分析が可能な優れた方法であり、自家蛍光測定を使うと前処理なしに鮮度評価ができると考えられる。しかしながら流通現場で使用することは難しい。
【０００５】
その理由は、高感度であるが故に、試料の形状など、測定光学系を乱す僅かの違いが蛍光に影響するためである。誤差を小さくするためには測定系を同一状態にする必要があるが、実現には励起光の照射角度、蛍光発生範囲、蛍光検出領域を常に一定に維持することを意味しており、例えば対象物が曲がっているもの、又は凹凸があるようなものを正確に固定するのは難しく、実用上問題が多い。
【０００６】
参考資料として、食品中（農産物）に含まれるフェノール化合物又はリグニンの自家蛍光の蛍光強度を測定する一方、該食品中に共存させた標準蛍光物質の強度も測定し、両者の蛍光強度との比を指標として、食品の状態を評価する方法が開示されている（特許文献１参照）。しかし、これらは、農産物を対象としているため、鮮度評価で検出する物質が異なり、生鮮魚介類の鮮度の評価の対象とすることができない。
【０００７】
この他、電気泳動枠にセットし、泳動用緩衝液で湿潤した泳動用ろ紙の原点に、除蛋白剤水溶液を用いてホモナイズした食肉片を静置して得た上澄液の一定量をマイクロピペットでスポット滴下し、直ちに電気泳動を行い、紫外線を照射して浮かび上がる核酸関連化合物のスポットの大きさと濃さを比較観察して、原点と移動の相対比較により食肉の鮮度を判定する方法が開示されている（特許文献２参照）。
【０００８】
また、魚肉類に含まれるＡＴＰ関連化合物の濃度比から魚介類の鮮度を測定する方法、具体的にはＦＩＡ法（流れ分析法）によりＫ１値を迅速に算出して魚介類の鮮度判定を短時間で行う方法が開示されている（特許文献３参照）。
さらに、特許文献４には、魚産物から少量のサンプルを切断し、細胞浸透性の色素及び細胞不透性の色素のうち少なくとも一方を含有する有効量の着色試薬をサンプルに加え、このサンプルを一定時間インキュベートし、このサンプルから放出される蛍光に基づいて、鮮度を判別する方法が開示されている。しかし、これらは、いずれも本願発明の目的に沿うものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−２０８７４５号公報
【特許文献２】特許第４２９１３８１号公報
【特許文献３】特許第２８５７６０７号公報
【特許文献４】特表２００８−５００８１０号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】菅原智明、他５名著、「蛍光分光分析による生鮮ホタテガイ貝柱の評価」平成２３年電気学会基礎・材料・共通部門大会予稿集（平成２３年９月２１日発行）、頁１７４
【非特許文献２】菅原智明、他５名著、「蛍光分光分析による生鮮イカ外套膜の評価」平成２３年電気・情報関係学会北海道支部連合大会予稿集（平成２３年１０月２２日発行）、頁１３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、従来技術の問題点を解決するため、魚介類の鮮度や品質などを前処理なしに、非破壊で迅速に鮮度評価する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために検討を行なった結果、以下の発明を提供する。
１）生鮮魚介類に含まれる補酵素の一種であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光測定により、魚介類の生細胞の鮮度を非破壊で、前処理なしに生鮮魚介類の鮮度を評価することを特徴とする魚介類の鮮度評価方法。
２）生鮮魚介類に含まれる補酵素とアミノ酸の自家蛍光を同時に測定し、それらの蛍光の強度比から、生鮮魚介類の鮮度を評価することを特徴とする魚介類の鮮度評価方法。
【００１３】
３）補酵素として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸を用いて測定することを特徴とする請求項２記載の魚介類の鮮度評価方法。
４）誤差を小さくするため光学系の評価指標として、生物組織に含まれるアミノ酸の一種であるトリプトファンの自家蛍光を測定することを特徴とする請求項２又は３記載の魚介類の鮮度評価方法。
【００１４】
５）励起光源、試料ホルダー、蛍光検出器、生鮮魚介類に含まれる補酵素の蛍光とアミノ酸の自家蛍光を同時に測定する装置及びこれらの蛍光の強度比を測定する装置、光学系の評価に基づき誤差補正を行う装置を備えていることを特徴とする魚介類の鮮度測定装置。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の鮮度評価方法は、光学系の評価指標によって蛍光測定精度を高めることができ、生鮮魚介類を前処理なしに非破壊で迅速に鮮度評価でき、魚介類の流通現場でも使用することが可能であるという優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ホタテガイ貝柱に波長３３０〜３９０ｎｍのＵＶ−Ａの紫外線を照射した場合の、青く光る生ホタテガイの貝柱の蛍光イメージを示す図である。
【図２】ホタテガイ貝柱に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光スペクトルを示す図である。
【図３】生ホタテガイ貝柱を１０℃で冷蔵したときの保存時間とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度との関係を示す図である。
【図４】トリプトファンの蛍光スペクトルを示す図である。
【図５】生ホタテガイ貝柱の３種の試料（試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｃ）について、トリプトファンの蛍光強度で規格化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を示す図である。
【図６】生鮮イカに波長３３０〜３９０ｎｍのＵＶ−Ａの紫外線を照射した場合の、青く光るイカの蛍光イメージを示す図である。
【図７】生鮮イカの冷蔵保存時間とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度との関係を示す図である。
【図８】生鮮イカの３種の試料（試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｃ）について、トリプトファンの蛍光強度で規格化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を示す図である。
【００１７】
【図９】生ホタテガイ貝柱のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸とトリプトファンの蛍光強度を示す図である。
【図１０】生ホタテガイ貝柱のトリプトファンの蛍光強度で規格化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を示す図である。
【図１１】生鮮イカのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸とトリプトファンの蛍光強度を示す図である。
【図１２】生鮮イカのトリプトファンの蛍光強度で規格化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の魚介類の鮮度評価方法は、生鮮魚介類に含まれる補酵素の一種であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の状態評価を指標として鮮度評価を非破壊で迅速に精度よく行なうことを特徴としている。
【００１９】
一般に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸はエネルギー代謝に関連する補酵素として知られている。生鮮魚介類については、これまでの検討によると、組織に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光が鮮度に強く依存し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸からの蛍光が鮮度低下とともに徐々に弱くなる。
したがって、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光の強度を測定することが、生鮮魚介類の鮮度を評価する上で、極めて有効な手段と言える。
【００２０】
蛍光分析は高感度であるため、僅かの鮮度の違いを検出することができるといった特徴がある。一方、蛍光測定結果の誤差を大きくする要因として光学系の誤差がある。流通現場で使用する評価機器には、誤差を小さくするために光学系の評価を行ない、その指標に基づいた鮮度評価が必要な場合がある。
【００２１】
魚介類に含まれるアミノ酸の一種であるトリプトファンの蛍光は、加熱や鮮度低下といった生物組織の劣化に対して変化が少ない。
このことから、本発明は、誤差を小さくするため光学系の評価指標として、生物組織に含まれるアミノ酸の一種であるトリプトファンの自家蛍光を同時測定することが有効である。
【００２２】
本発明の鮮度評価方法では、初めに光学系の評価を行なうため、生鮮魚介類に波長２８０〜３２０ｎｍのＵＶ−Ｂの紫外線を照射し、波長３３０〜３９０ｎｍの蛍光を測定し、強度値を光学系の指標とする。
次に、鮮度の基準となる波長３３０〜３９０ｎｍのＵＶ−Ａの紫外線を照射し、波長４３０〜４９０ｎｍの蛍光を測定する。この波長４３０〜４９０ｎｍの蛍光強度を光学系評価で測定された強度値で補正することで、精度よく鮮度評価することができる。
【００２３】
また、光学系の測定強度をある値に一定にするように、光照射強度の増減又は蛍光検出器の感度を調整することにより、蛍光強度の値を、そのまま鮮度評価とすることもできる。
励起光源から特定波長の光を選択する方法としては、分光器やバンドパスフィルターなどを使用し、ＵＶ−ＢやＵＶ−Ａを試料に照射するものがある。また分光器やバンドパスフィルターなしで紫外線ＬＥＤデバイスを使用することもできる。
【００２４】
蛍光測定では、特定波長の光を検出するため、分光器やカットオフフィルタなどを使用することができる。検出器については、光電子増倍管やＣＣＤデバイス、ＣＭＯＳ、フォトダイオードなど光検出器を利用することができる。
測定時間については、鮮度が時間変化することから、光学系の評価と鮮度基準値の測定は、同時に行なうことが望ましい。キセノンランプや紫外線ＬＥＤなどの紫外線強度の大きい光源を使用することで、同時に、光学系の評価用測定及び鮮度評価用測定の両方を数秒〜数十秒で終えることが可能である。
【００２５】
光学系については、照射用光源と蛍光測定用検出器を９０度に配置したもの以外にも、直線上や同軸上に配置したものを使用することも可能である。光学系の評価により補正するため、光学系の配置は自由にデザインできる。
【００２６】
本発明は、生鮮魚介類に含まれる補酵素とアミノ酸の自家蛍光を同時に測定し、それらの蛍光の強度比から、生鮮魚介類の鮮度を評価することができるが、トリプトファンの蛍光強度で規格化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を用いるのが望ましい。
【００２７】
規格化の方法としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度をトリプトファンの蛍光強度で割って得られる値とすることができる。
より正確な規格化の方法としては、トリプトファンの蛍光強度から光学系の補正係数（例えばトリプトファン蛍光強度の逆数）を求め、その補正係数を使って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を評価する手法を採ることもできる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明の特徴を具体的に説明する。以下の説明は本願発明の理解を容易にするためのものであり、これに制限されるものではない。すなわち、本願発明の技術思想に基づく変形、他の実施態様、他の例等は、いずれも本願発明に含まれるものである。
【００２９】
（実施例１）
ホタテガイ貝柱の鮮度評価の具体例を示す。活ホタテガイから貝柱を取り出し、貝柱に波長３３０〜３９０ｎｍのＵＶ−Ａの紫外線を照射した。
図１に、青く光る貝柱の蛍光イメージを示す。青色の蛍光は、補酵素の一種であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸に由来するものである。
図２に、ホタテガイ貝柱に含まれるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光スペクトルを示す。
図３に、生ホタテガイ貝柱を１０℃で冷蔵したときの保存時間とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度との関係を示す。
【００３０】
冷蔵保存時間が長くなるほど、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸に由来する蛍光は弱くなる。しかしながら、試料ごとの蛍光強度の違いは大きく、評価の精度は低い。
改善策として光学系を評価し、蛍光強度を補正するため、生鮮魚介類に含まれるアミノ酸の一種であるトリプトファンについて検討した。
【００３１】
貝柱に波長２８０〜３２０ｎｍのＵＶ−Ｂの紫外線を照射すると、波長３３０〜３９０ｎｍの蛍光が観測された。
図４に、生ホタテガイ貝柱に含まれるトリプトファンからの蛍光スペクトル及び蛍光強度の保存時間との関係（依存性）を示す。トリプトファンはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸に比べて安定な物質であるため、図４の右上図に示すように、冷蔵保存時間が長くなってもトリプトファンに由来する蛍光はあまり変化しない。
すなわち、トリプトファンの濃度は不変であるが、一方、光学系が異なると、トリプトファンの蛍光に違いが生じる。
【００３２】
例えば、サンプルの正面に光源と光検出器が配置されていると考えてみる。平らなサンプルだとすると、垂直に入射したときが最も明るい蛍光が観測される。つまり、蛍光強度はサンプルと光源、光検出器の位置関係に依存することになる。理想的にはサンプルの平らな部分を見つけ、その部分を蛍光測定する必要がある。しかし、この方法は簡便とは言ないし、現場では実行不可能と考えられる。したがって、トリプトファンの蛍光強度が異なるとき、光学的配置が理想状態からずれを生じているとみなして補正する必要がある。
【００３３】
図５に、光学系の違いを補正した鮮度指標の一例として、３種の試料（試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｃ）を用意し、トリプトファンの蛍光強度で規格化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を示す。
トリプトファンの蛍光強度（例えば２００）で、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度（例えば１５０）を割って得られる値（１５０／２００＝０．７５）を得ることができる。
【００３４】
より正確さを求める場合には、トリプトファンの蛍光強度から光学系の補正係数（例えばトリプトファン蛍光強度の逆数）を求め、その補正係数を使って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を評価することもできる。
従来法は、ばらつきが±３０％と大きいが、本実施例では±１１％にまで小さくなっており、本実施例によると評価精度を向上させることが可能である。
【００３５】
（実施例２）
次に、イカ外套膜の鮮度評価の具体例を示す。生鮮イカに波長３３０〜３９０ｎｍのＵＶ−Ａの紫外線を照射した。図６に、青く光るイカの蛍光イメージを示す。青色の蛍光は、補酵素の一種であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸に由来するものである。
【００３６】
図７に、生鮮イカの冷蔵保存時間とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度との関係を示す。ホタテガイ貝柱のときと同様に、冷蔵保存時間とともにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度は減少する。しかしながら、試料ごとの蛍光強度の違いは大きく、評価の精度は低い。
【００３７】
図８に、光学系の違いを補正した鮮度指標の一例として、３種の生鮮イカ試料（試料Ａ、試料Ｂ、試料Ｃ）を用意し、実施例１と同様に、トリプトファンの蛍光強度で規格化したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光強度を示す。
従来法では、ばらつきが１１％と大きいが、本実施例では５％にまで小さくなっており、本実施例によると評価精度を向上させることが可能であった。
【００３８】
（実施例３）
次に、生ホタテガイ貝柱の事例について説明する。図９に、生ホタテガイ貝柱のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸（NADH）とトリプトファンの蛍光強度を示す。高鮮度（保存０日）のサンプルについて、トリプトファンとNADHの蛍光強度には比例関係が成立する。また、低鮮度（保存３日後）のサンプルは、ばらつきが若干大きいものの、トリプトファンの蛍光強度とNADHの蛍光強度は比例している。
このことから、NADHの蛍光強度のみを比較する従来法よりも、トリプトファンの蛍光強度で規格化したNADHの蛍光強度を比較する本方法は、評価精度がより高くなる。
【００３９】
図１０に、ホタテガイ貝柱の測定結果を示す。棒グラフは平均値±標準偏差（バー）を表している。高鮮度（０ｄａｙ）の結果では、従来法による測定データの標準偏差（９．７％）よりも本方法の標準偏差（９．２％）の方が若干小さくなる。また、低鮮度（３ｄａｙ後）においても、従来法の標準偏差（１６．４％）と比べて本方法の標準偏差（１５．５％）の方が小さいことから、本実施例の方法によると高精度の評価が可能である。
【００４０】
（実施例４）
次に、生スルメイカの事例について説明する。図１１に、生スルメイカのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸（NADH）とトリプトファンの蛍光強度を示す。高鮮度（保存０日）のサンプルについて、トリプトファンとNADHの蛍光強度には比例関係が成立する。また低鮮度（保存３日後）のサンプルにおいてもトリプトファンの蛍光強度とNADHの蛍光強度は比例する。したがってNADHの蛍光強度のみを比較する従来法よりも、トリプトファンの蛍光強度で規格化したNADHの蛍光強度を比較する本方法は、評価精度がより高くなる。
【００４１】
図１２に、スルメイカの測定結果を示す。棒グラフは平均値±標準偏差（バー）を表している。高鮮度（０ｄａｙ）では、従来法による測定データの標準偏差（１８．６％）よりも本方法の標準偏差（１５．４％）方が小さくなる。また、低鮮度（３ｄａｙ後）においても、従来法の標準偏差（１８．６％）よりも本方法の標準偏差（１６．８％）方が小さくなることから、本実施例の方法によると高精度の評価が可能となる。
【００４２】
以上の実施例に示すように、生鮮魚介類に含まれる補酵素の一種であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光測定により、魚介類の生細胞の鮮度を非破壊で、前処理なしに生鮮魚介類の鮮度を評価することは、鮮度指標として有効である。
【００４３】
上記実施例については、軟体動物について説明してあるが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸及びトリプトファンを含有する魚介類全般に適用できることは言うまでもない。
さらに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸の蛍光測定のみの場合は、試料によってばらつきが大きくなる傾向があるが、トリプトファンの蛍光強度で規格化することにより、ばらつきを小さくでき、評価精度を向上させることができる。本願発明は、これらを包含するものである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の鮮度評価方法は、光学系の評価指標によって蛍光測定精度を高めることができ、生鮮魚介類を前処理なしに非破壊で迅速に鮮度評価でき、魚介類の流通現場でも使用することが可能であるという優れた効果を有するので、生鮮魚介類鮮度評価法として有用である
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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