(57)【要約】      （修正有）【課題】ホタル生物発光系における新規な発光基質の提供。【解決手段】以下の一般式I2013184909.tif 000028であって、式中、R1、R2およびR4〜R9は、それぞれ独立してH、H2N-、HS-またはC1-4アルキルであり、R3は、OHまたはNR11R12であり、式中R11およびR12は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、R10は、HまたはC1-4アルキルであり、XおよびYは、C、N、SまたはOであり、nは、0、1、2または3である。【選択図】図１
2013184909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式Iを有する化合物またはその塩：
【化１】
2013184909.tif 000025
式中、
R1、R2およびR4〜R9は、それぞれ独立してH、H2N-、HS-またはC1-4アルキルであり、
R3は、OHまたはNR11R12であり、式中R11およびR12は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
R10は、HまたはC1-4アルキルであり、
XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOであり、
nは、それぞれ独立して0、1、2または3である。
【請求項２】
以下の一般式IIを有する化合物またはその塩：
【化２】
2013184909.tif 000026
式中、
R3は、OHまたはNR11R12であり、式中R11およびR12は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
R10は、HまたはC1-4アルキルであり、
XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOである。
【請求項３】
R3は、N（CH3）2である、請求項１または2に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
以下の式を有する化合物またはその塩：
【化３】
2013184909.tif 000027
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物またはその塩を含む、ルシフェラーゼの発光基質。
【請求項６】
請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物またはその塩を含む、発光検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホタル生物発光系における発光基質として利用可能な化合物に関する。より詳細には、本発明は、ホタル生物発光系において長波長の発光波長を有する発光基質材料を提供可能な化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜ホタルルシフェリンについて＞
近年、生物学的事象および現象の可視化が重要視され、可視化のための材料の拡大が望まれてきている。これに伴い、標識技術にも多様化が求められている。特に分子イメージングのための標識技術は、診断および検査機器の進歩と相まって大きく発展している。たとえば、癌や心疾患などに対する個別化医療などの先端技術に応用するための標識技術が精力的に研究されている。また、計測技術の進歩に伴い、より高感度および高性能な機器や標識材料に対する需要が急速に高まっている。
【０００３】
可視化技術の中で、ホタル生物発光系は、発光効率が非常に高く、最も効率よくエネルギーを光に変換することができる系といわれている。また、生物発光の分子機構解釈も進んでいる。
【０００４】
このホタル生物発光は、発光基質であるルシフェリンが発光酵素ルシフェラーゼの作用で化学反応することによって光を放出することが知られている。この反応では、発光基質が発光酵素内でアデノシン三リン酸（ATP）および2価のマグネシウムイオン（Mg2+）の存在下で、アデニリル化（AMP化）されて、活性型基質であるアデニリル体へと誘導される。次に、これが酸素化されてペルオキシドアニオンとなり、高エネルギー過酸化物であるジオキセタノンへと変換される。不安定なジオキセタノンは、分解しながらプロトンと二酸化炭素とを放出し、励起1重項状態となる。このジアニオン型励起1重項状態からの発光は、黄緑色であり、これがホタルの発光であるとされている。また、発光後の生成物は、オキシルシフェリンと称される。
【０００５】
上記のように、ホタル生物発光は、発光効率が非常に高く、また生物発光の分子機構の解明が進んでいるため、ホタル生物発光系を利用した多岐にわたる発光材料が多くの企業から販売されている。しかし、ホタル生物発光関連の発光材料開発は、医学生化学的分野を中心に実用化が進んでいるため、一般にタンパク質（酵素）側からの研究開発は盛んであるが、低分子化合物（基質）側からのアプローチは非常に少ない。特に、発光基質の骨格変換を行ったような構造と活性の相関研究はほとんど存在しない。
【０００６】
さらに、発光酵素は組換え技術によって安価に供給できるにもかかわらず、キット製品などで供給されているホタル生物発光系を応用した発光標識材料は安価ではない。これは、発光基質がルシフェリンであることに起因する。現在、天然の発光基質であるD体のルシフェリンは、非天然アミノ酸であるD-システインから合成されているが、D-システインは、非常に高価である。
【０００７】
＜生物発光系を利用した長波長発光のニーズと状況＞
多現象を観測するために、標識を利用した検出系においても、多色発光が求められている。このため、検出系に利用できる標識材料の波長域は、幅広い方が望ましい。また、生体内深部標識における用途では、短波長光よりも長波長光のほうが優れた光透過性を有するという観点から、赤色発光標識材料が望まれている。たとえば、多色発光を利用した研究には、標識として450nm程度〜650nm以上の波長において、特に680nm以上において発光を有する標識材料が準備されることが望ましい。
【０００８】
現在、ホタル生物発光系のための発光基質として入手可能なものには、いくつかの発光波長をもつ基質が存在する。これらの基質の最短および最長の両端の波長として、セレンテラジン系の青色（約480nm）とホタル系の赤色（約613nm）が挙げられる。また、鉄道虫発光酵素を利用した、より長波長の赤色発光材料（約630nm）が、最近市販されている。しかし、長波長光のほうが優れた光透過性を有することから、これらの発光波長だけでなく、発光波長の最長の波長のさらなる拡張には、潜在的需要が見込まれる。
【０００９】
生物発光系を利用した赤色と青色発光の既存製品の例を以下に示す：
1．プロメガ株式会社：Chroma-Luc：約613nm（非特許文献1）
この系は、ヒカリコメツキ虫（クリックビートル）の突然変異体および天然型ホタル発光基質を利用した系である。
2．東洋紡績株式会社：MultiReporter Assay System-Tripluc：約630nm（非特許文献2）
この系は、鉄道虫赤色発光酵素および天然型ホタル発光基質を利用した系である。緑色発光ルシフェラーゼ（SLG、最大発光波長550nm）、橙色発光ルシフェラーゼ（SLO、580nm）および赤色発光ルシフェラーゼ（SLR、630nm）の色のルシフェラーゼ遺伝子を使用して発光色を変化させている。これは、異なる発光色を与える発光酵素を利用している。
3．東京大学：アミノルシフェリン：約610nm（特許文献1）
これは、ルシフェリン誘導体を開示している。
4．プロメガ株式会社：Chroma-Luc： 約480nm（非特許文献3）
この系は、セレンテラジンおよびウミシイタケルシフェラーゼを利用した系である。
5．アトー株式会社：ウミホタル生物発光  約460nm（非特許文献4）
セレンテラジン系基質およびウミホタルルシフェラーゼを利用した系である。
【００１０】
また、本発明者らも、特許文献2および特許文献3において、ルシフェリン類似化合物を開示している。これらの化合物は、ルシフェリンと同様の骨格を有する化合物である。
【００１１】
さらに、本発明者らは、特許文献4において、ルシフェリンとは異なる骨格を有するルシフェリン類似化合物が、様々な発光波長を有することを開示している。これらのルシフェリン類似化合物においても、さらに発光波長を長波長側にシフトさせることが望まれる。
【００１２】
さらに、本発明者らは、特許文献5において、ホタルルシフェリン類似構造を有する化合物であって、天然のホタルルシフェリンとは異なる発光波長で発光する化合物を開示している。これらの化合物のうちの1つは、現在アカルミネ（商標）として販売されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開2007-091695号公報
【特許文献２】国際公開公報WO2007/116687号
【特許文献３】特開2006-219381号公報
【特許文献４】特開2010-215795号公報
【特許文献５】特開2009-184932号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】プロメガ株式会社総合カタログ2008-9  12.6
【非特許文献２】Upload vol. 79, 2005 p 1-10, Toyobo Biochemicals for Lifescience 2006/2007 p4-67.
【非特許文献３】プロメガ株式会社総合カタログ2008-9  12.14
【非特許文献４】アトー株式会社総合カタログ2008-2009  p 247
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記した状況に鑑み、本発明は、ホタル生物発光系において長波長の発光波長を有する新規な発光基質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意検討した結果、新規な骨格を有する化合物が、ホタル生物発光系において長波長の発光波長を有することを新たに見いだした。
【００１７】
本発明は、以下の一般式Iを有する化合物またはその塩を提供する：
【００１８】
【化１】
2013184909.tif 000003
式中、
R1、R2およびR4〜R9は、それぞれ独立してH、H2N-、HS-またはC1-4アルキルであり、
R3は、OHまたはNR11R12であり、式中R11およびR12は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
R10は、HまたはC1-4アルキルであり、
XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOであり、
nは、それぞれ独立して0、1、2または3である。
【００１９】
本発明は、以下の一般式IIを有する化合物またはその塩を提供する：
【００２０】
【化２】
2013184909.tif 000004
式中、
R3は、OHまたはNR11R12であり、式中R11およびR12は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
R10は、HまたはC1-4アルキルであり、
XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOである。
【００２１】
また、本発明は、上記一般式IおよびIIにおいて、R3は、N（CH3）2である化合物またはその塩を提供する。
【００２２】
また、本発明は、上記一般式Iにおいて、R1、R2およびR4〜R9は、Hであり、R10は、Hであり、Xは、Nであり、Yは、Sであり、nは、0である以下の式（a）の化合物またはその塩を提供する：
【００２３】
【化２】
2013184909.tif 000005
【００２４】
また、本発明は、上記化合物またはその塩を含むルシフェラーゼの発光基質を提供する。
【００２５】
また、本発明は、上記化合物またはその塩を含む発光検出キットを提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、ホタル生物発光系において長波長の発光波長を有する新規な発光基質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明に係る化合物の一実施例における、Glowell G2の発光強度を100としたときの相対発光強度を示す図である。
【００２８】
【図２】本発明に係る化合物の一実施例における、ホタルルシフェリンの発光強度を100としたときの相対発光強度を示す図である。
【００２９】
【図３】本発明に係る化合物の一実施例における、Glowell G2の発光強度を100としたときの180秒積算値の相対発光強度を示す図である。
【００３０】
【図４】本発明に係る化合物の一実施例における、ホタルルシフェリンの発光強度を100としたときの180秒積算値の相対発光強度を示す図である。
【００３１】
【図５】本発明に係る化合物の一実施例の発光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、以下の一般式Iを有する化合物またはその塩を提供する。
【００３３】
【化３】
2013184909.tif 000006
式中、
R1、R2およびR4〜R9は、それぞれ独立してH、H2N-、HS-またはC1-4アルキルであり、
R3は、OHまたはNR11R12であり、式中R11およびR12は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
R10は、HまたはC1-4アルキルであり、
XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOであり、
nは、それぞれ独立して0、1、2または3である。
【００３４】
本明細書において、「C1-4アルキル」という用語は、1〜4炭素原子を含む飽和直鎖状または分枝鎖アルキル基、たとえばメチル、エチル、n-プロピル、イソ-プロピル、n-ブチル、イソ-ブチル、sec-ブチルおよびtert-ブチルをいう。
【００３５】
上記のように、R1、R2およびR4〜R9がC1-4アルキルであってもよいことは、当業者であれば容易に想到することができるであろう。また、R1、R2およびR4〜R9がH2N-およびHS-であってもよいことは、当業者であれば容易に想到することができるであろう。
【００３６】
上記のように、R3がOHであってもよいことは、当業者であれば容易に想到することができるであろう。たとえば、本発明者らによる上記特許文献4には、ルシフェリンの-OH基が-N（CH3）2基に置換されているルシフェリン類似化合物が、ホタル生物発光系の基質となり得る結果が示されている。本発明の化合物では、実施例においてR3が-N（CH3）2基である場合に活性を有することが示されている。したがって、R3がOHであっても、活性に影響を及ぼす可能性は低いと考えられる。
【００３７】
上記のように、R3がNR11R12である場合に、R11およびR12がHまたはC1-4アルキルであってもよいことは、当業者であれば容易に想到することができるであろう。
【００３８】
上記のように、R10がC1-4アルキルであってもよいことは、当業者であれば容易に想到することができるであろう。たとえば、本発明者らによる上記特許文献2には、ルシフェリンの複素環に結合したカルボキシル基がAMP化しているルシフェリン類似化合物が、ホタル生物発光系の基質となり得る結果が示されている。したがって、本発明の化合物においても、ルシフェリンの複素環と同様の複素環に結合したカルボキシル基を置換するこのような低級アルキルは、活性に影響を及ぼす可能性が低いと考えられる。
【００３９】
上記一般式Iにおいて、XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOであることができる。XおよびYのヘテロ原子がC、N、SまたはOであってもよいことは、当業者であれば容易に想到することができるであろう。たとえば、本発明者らによる上記特許文献2に記載された種々のルシフェリン類似化合物には、本発明の化合物と対応する部分が種々のヘテロ原子であるルシフェリン類似化合物が、ホタル生物発光系の基質となり得る結果が示されている。
【００４０】
上記のように、一般式Iにおいて、「n」として表されたオレフィン鎖単位が所望の長さに変更することができることは、当業者であれば容易に想到することができるであろう。また、一般式Iにおける2つのnは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４１】
一つの態様において、本発明は、以下の一般式IIを有する化合物またはその塩を提供する：
【００４２】
【化４】
2013184909.tif 000007
式中、
R3は、OHまたはNR11R12であり、式中R11およびR12は、それぞれ独立してHまたはC1-4アルキルであり、
R10は、HまたはC1-4アルキルであり、
XおよびYは、それぞれ独立してC、N、SまたはOである。
【００４３】
一つの態様において、本発明は、一般式IにおいてR3がN（CH3）2である、以下の一般式IIIを有する化合物を提供する。
【００４４】
【化５】
2013184909.tif 000008
【００４５】
別の態様において、本発明は、一般式IIにおいてR3は、N（CH3）2であり、R10は、Hであり、Xは、Nであり、Yは、Sであり、nは、0である式（a）の化合物を提供する：
【００４６】
【化６】
2013184909.tif 000009
【００４７】
上記式（a）で表される化合物は、長波長領域に発光活性を有し、また、広い発光スペクトルを有している。この化合物は、ホタル生物発光系においておよそ670nmの発光波長にて発光し、またその発光スペクトルは、700nmを超える領域にまで広がる広い裾野を有している。すなわち、上記式（a）で表される化合物は、発光スペクトルの幅が広く、既存の材料よりも長波長側に発光能があるといえる。そのため、本発明の化合物は、既存の材料より長波長側に発光波長を有する発光基質材料を得るためのリード化合物としても有用である。
【００４８】
本発明には、上述した化合物の塩が含まれる。「塩」とは、本発明の化合物において、該化合物のいずれかの部分が塩基を形成することができる場合にのみ想定される。
【００４９】
「塩」という表現には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸、亜燐酸、亜硝酸、クエン酸、ギ酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、フマル酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、パモ酸、ステアリン酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸、コハク酸、トリフルオロ酢酸および生きた生物に対して非中毒性であるその他のような無機酸または有機酸とのいずれかの塩、または式Iの化合物の性質が酸性である場合、アルカリまたはアルカリ土類塩基、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムその他のような無機塩基との塩も包含する。
【００５０】
本発明の化合物は、たとえば以下の実施例に記載した手順に従って製造することができる。より詳細な手順は、下記の実施例に記載してあるが、一般式Iの化合物は、たとえば以下の手順に従って製造することができる。
【００５１】
まず、任意の置換基を有する市販の安息香酸エステルをボロン酸誘導体とし、以下の反応式により、任意の置換基を有する市販のベンズルデヒド置換体等から誘導したスチレン型化合物と反応させ、任意の置換基を有する2個のベンゼン環が単結合またはオレフィン鎖でつながった化合物1を得る。
【００５２】
【化７】
2013184909.tif 000010
【００５３】
次に、以下の反応式により、化合物1をDIBAL-Hで還元し、続いて酸化（swan酸化等）することによってアルデヒドとし、化合物2を得る。
【００５４】
【化８】
2013184909.tif 000011
【００５５】
次に、化合物2にwittig試薬を反応させることにより増炭し二重結合を導入する。同様に還元・酸化および増炭を繰り返すことで、二重結合を任意の数に増やすことができる。この工程により、化合物3を得る。
【００５６】
次に、以下の反応式により、化合物3を80%含水エタノール溶媒中で水酸化ナトリウムと反応させて加水分解してカルボン酸とし、化合物4を得る。
【００５７】
【化９】
2013184909.tif 000012
次に、以下の反応式により、化合物4と市販のシステイン保護体5とを、4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）と反応させてアミド体とし、化合物6を得る。
【００５８】
【化１０】
2013184909.tif 000013
【００５９】
次に、以下の反応式により、アルゴン雰囲気下、トリフェニルホスフィンオキシドを無水トリフルオロメタンスルホン酸と反応させることで、化合物6を環化体へと誘導し、化合物7を得る。
【００６０】
【化１１】
2013184909.tif 000014
【００６１】
次に、以下の反応式により、メタノール中でトリフルオロ酢酸（TFA）により化合物7のtBu基を脱保護することによって、化合物8を得る。
【００６２】
【化１２】
2013184909.tif 000015
【００６３】
当業者であれば、上記一般式Iの化合物の置換基を所望の置換基と置き換えた開始物質から開始して、上記合成手順と同様の手順によって対応する化合物を合成することができることを理解するであろう。また、当業者であれば、上記合成手順の適切な工程において、化合物の置換基を所望の置換基に置換することができることをも理解するであろう。また、最後の工程において、カルボン酸部分を所望のエステルに置換することにより、対応するR10を有する化合物を得ることができるであろう。
【００６４】
本発明の化合物は、発光甲虫ルシフェラーゼ、ATPおよびMg2+の存在する系に添加することによって、発光甲虫ルシフェラーゼにより酸化して発光する。本発明の化合物は、単独で発光基質として利用可能であるが、必要に応じて、その他の発光基質と組み合わせて使用してもよい。本発明の化合物またはその塩は、ATPおよびMg2+と共にキット（発光検出キット）として提供することもできる。また、キットには、その他の発光基質や適切なpHに調製した溶液を含めることもできる。さらに、本発明の化合物またはその塩は、ATPおよびMg2+と共に本発明の化合物を適切なpHに調製した発光基質組成物を発光検出キットとして提供することもできる。
【００６５】
ホタル生物発光系は、水性系であるので、親水性有機化合物が存在していてもよい。たとえば、テトラフルオロ酢酸、酢酸およびギ酸などが存在していてもよい。本発明の化合物を発光系に応用する場合、好適な発光強度を得るためには、1μM以上の発光基質の濃度で使用されることが好ましく、たとえば5μM以上で使用される。また、発光系のpHは、4〜10、好ましくは6〜8であることが想定されるが、特に限定されない。必要に応じて、pHを安定化させるために、リン酸カリウム、トリス塩酸、グリシンおよびHEPESなどの緩衝剤を使用することができる。
【００６６】
また、本発明の化合物は、ホタル発光甲虫ルシフェラーゼ発光系において、種々の酸化酵素によって発光させることができる。ルシフェラーゼは、北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）および鉄道虫（Railroad worm）などの種々の生物から単離されており、それらのいずれを使用することもできる。使用可能な酸化酵素には、たとえばヒカリコメツキムシルシフェラーゼ、イリオモテボタルルシフェラーゼおよびフラビン含有モノオキシゲナーゼなどを含む。
【００６７】
本発明の化合物を発光基質とする生物発光は、発光系にコエンザイムA（CoA）、ピロリン酸またはMgイオン（Mg2+）が存在すると、その発光が増強されることが知られている。したがって、これらを発光甲虫ルシフェラーゼ発光系の発光増強剤として利用することができる。これらの化合物の発光増強効果は、発光系におけるCoA、ピロリン酸またはMg2+の濃度がそれぞれ5μM以上において顕著であり、濃度の増加にしたがって増強されることが知られている。
【００６８】
ホタル生物発光系を測定／検出に使用するためには、酵素の失活を防止してプラトーな発光挙動を示すように、発光を安定化させることが重要である。たとえば、ホタル生物発光系における発光の安定化には、Mg2+が有効である。発光系にMg2+が存在すると、立ち上がった後の減衰が抑制されるように発光挙動が変化する。特に、ピロリン酸およびMg2+が発光系に共存すると、発光挙動が大きく変化する。すなわち、発光安定化がきわめて顕著となり、発光基質に対して大過剰のピロリン酸およびMg2+が共存する場合の発光挙動は、急速に立ち上がり、これが維持されてプラトーな状態が形成される。Mg2+単独の場合、発光系のMg2+濃度が0.5mM以上において、発光安定化効果が顕著であり、Mg2+の濃度の増加にしたがって増強される。プラトーな発光挙動を達成するために、たとえば10μM以上、好ましくは100μM以上の濃度のピロリン酸マグネシウムを存在させることができる。また、ピロリン酸とMg2+との割合は、当量比である必要はない。ピロリン酸マグネシウムは、水溶性が低いものの、これを使用することにより、ピロリン酸およびMg2+をそれぞれ別個に供給することができる。これらは、遊離形態および塩の形態で発光系に供給することができる。使用可能なマグネシウム塩には、硫酸マグネシウムおよび塩化マグネシウムなどの無機酸塩、並びに酢酸マグネシウムなどの有機酸塩を含む。ピロリン酸塩には、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩、並びにマグネシウムおよびカルシウムなどのアルカリ土類金属との塩、鉄などとの塩を含む。これらは、水溶液状態で発光系に含めてもよい。また、酵素に対する影響を考慮して、発光系のpHは、2〜10になるように含めることが好ましい。
【００６９】
本発明の化合物は、化学発光における基質として使用してもよい。化学発光は、本発明の化合物を酸化して過酸化物を生成し、この過酸化物の分解物が励起状態の発光種となることによって生じる。酸化は、たとえばDMSO中でt-ブトキシカリウムを使用して空気酸化させることによって進行させることができる。化学発光の場合、ホタル生物発光系における発光よりも短波長の発光が想定される。
【００７０】
本発明の化合物は、生物学的測定／検出における発光標識として利用することができる。たとえば、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質および核酸などを標識するために使用することができる。本発明の化合物をこれらの物質に結合させるための手段は、当業者に周知である。たとえば、本発明の化合物は、当業者に周知の方法を使用して、目的の物質のカルボキシル基およびアミノ基に対して結合させることができる。
【００７１】
また、本発明の化合物は、発光基質の発光によって発光甲虫ルシフェラーゼ活性を検出することを利用した測定／検出に利用することができる。たとえば、本発明の化合物を、上記のような発光甲虫ルシフェラーゼとの反応に適した条件下で反応させる。次いで、該化合物からの発光を検出する。たとえば、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞または動物に対して本発明の化合物を投与することにより、インビボにおける標的遺伝子またはタンパク質の発現などを測定／検出することができる。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例において、本発明を具体的に説明してあるが、本発明は、これらの範囲に限定されるわけではない。
【００７３】
1）機器分析および測定装置
pH測定：東洋濾紙株式会社製pH試験紙UNIVを使用して測定した。また、pHメータとして、堀場社製pH/ION METER  F-23  を使用して測定した。
【００７４】
1H核磁気共鳴スペクトル（1H NMR）：日本電子社製Lambda-270型装置（270MHz）または、日本電子社製ECA500型装置(500MHz)を使用して測定した。“1H NMR（測定周波数，測定溶媒）：δケミカルシフト値（水素の数, 多重度, スピン結合定数）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ=0）を内部基準とし、ppで表記した。多重度は、s（単一線）、d（二重線）、t（三重線）、q（四重線）、m（多重線または複雑に重なったシグナル）で表示し、幅広いシグナルは、brと記した。スピン結合定数（J）は、Hzで記載した。
【００７５】
13C核磁気共鳴スペクトル（13C NMR）：日本電子社製Lambda-270型装置（67.8MHz）または、日本電子社製ECA500型装置(125MHz)を使用して測定した。“13C NMR（測定周波数，測定溶媒）：δケミカルシフト値（多重度）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）は、テトラメチルシラン（δ= 0）を内部基準とし、ppmで表記した。多重度は、s（単一線）、d（二重線）、t（三重線）、q（四重線）で表示した。
【００７６】
質量スペクトル（MS）：日本電子社製JMS-600H型質量分析計を用い、電子衝撃法（EI、イオン化エネルギー：70eV）により測定した。日本電子社製JMS-T100LC型TOF質量分析計AccuTOFを用い、エレクトロンスプレーイオン化法（ESI）により測定した。なお、装置の設定は、脱溶媒ガス250℃、オリフィス1温度80℃、ニードル電圧2000V、リングレンズ電圧10V、オリフィス１電圧85V、オリフィス2電圧5Vとした。サンプル送液は、インフュージョン法で行い、流速10μl/minとした。“MS（測定法）m/z質量数（相対強度）”と記載した。
【００７７】
比旋光度：日本分光社製DIP-1000型旋光計を使用して測定した。光源は、ナトリウムランプを使用し、セルは、円筒型ガラスセル（Φ10×100mm）を使用した。測定値は未補正であり、データは5回測定の平均値である。それぞれD体、L体について“DまたはL：[α]温度測定値（濃度, 測定溶媒）”と記載した。
【００７８】
2）クロマトグラフィー
分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）：E. Merck社製のTLCプレート、シリカゲル60F254（Art.5715）厚さ0.25mmを使用した。TLC上の化合物の検出はUV照射（254nmまたは365nm）および発色剤に浸した後に加熱して発色させることによって行った。発色剤としてはp-アニスアルデヒド（9.3ml）と酢酸（3.8ml）をエタノール（340ml）に溶解し、濃硫酸（12.5ml）を添加したものを使用した。
【００７９】
分取用薄層クロマトグラフィー（PTLC）：E. Merck社製のTLCプレート、シリカゲル60F254（Art.5744）厚さ0.5mmを用いるか、またはE. Merck社製の薄層クロマトグラフィー用シリカゲル60GF254（Art.7730）を20cm×20cmのガラスプレート上に、厚さ1.75mmに調整したものを使用して行った。
【００８０】
シリカゲルカラムクロマトグラフィー：E. Merck社製のシリカゲル60F254（Art.7734）を使用して行った。
【００８１】
3）基本操作
反応溶液の冷却は、冷媒を満たしたジュワー瓶に反応容器を浸して行った。室温〜4℃では、氷水、4〜-90℃では、液体窒素−アセトンを冷媒として用いた。反応後の抽出溶液の乾燥は、飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムまたは無水硫酸マグネシウムを加えることで行った。反応後の中和を樹脂で行ったものについては、オルガノ株式会社製陽イオン交換樹脂アンバーライトIR120B NAまたは陰イオン交換樹脂アンバーライトIRA400 OH AGを使用した。溶液の減圧濃縮は、アスピレーターの減圧下（20〜30mmHg）、ロータリーエバポレーターを使用して行った。痕跡量の溶媒の除去は、液体窒素浴で冷却したトラップを装着させた真空ポンプ（約1mmHg）を使用して行った。溶媒の混合比は全て体積比で表した。
【００８２】
4）溶媒
蒸留水は、アドバンテック東洋株式会社製GS-200型蒸留水製造装置を使用して蒸留およびイオン交換処理したものを使用した。
【００８３】
トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、N,N-ジメチルホルムアミド、2-ブタノンは、関東化学株式会社製の有機合成用脱水溶媒または特級溶媒を、モレキュラーシーブス（4A）を使用して乾燥させて使用した。
【００８４】
NMR測定用溶媒は、以下に示すものをそのまま使用した。CDCl3：ISOTEC Inc.製99.7 ATOM%D、0.03% TMS、CD3OD：ISOTEC Inc.製99.8 ATOM%D（〜0.7 ATOM%13C）、0.05% TMS。
【００８５】
〔実施例１〕
以下の合成スキームに従って、下記のビフェニル型化合物8を合成した。
【００８６】
【化１３】
2013184909.tif 000016
【００８７】
（ビフェニル誘導体2の合成）
【００８８】
【化１４】
2013184909.tif 000017
【００８９】
4-ヨード安息香酸エチル（250μl、1.5mmol）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（100mg、5％）、炭酸カリウム（539.0mg、3.8mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド（6ml）に溶解し、アルゴン雰囲気下にした。4-（N,N-ジメチルアミノ）フェニルボロン酸（1）（315.0mg、1.9mmol）を加え、90℃で14時間加熱攪拌した。さらに、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）（27mg、2％）、炭酸カリウム（125.0mg、0.90mmol）、4-（N,N-ジメチルアミノ）フェニルボロン酸（1）（97.0mg、0.58mmol）を加え、24時間攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［酢酸エチル］にて不溶物を除去した後、減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（4:1）→（0:1）］にて精製し、ビフェニル誘導体2（229.0mg、0.85mmol、56%）を白色固体として得た。
1H NMR（500MHz, CDCl3）
δ1.40（3H, t, J = 6.9Hz）, 3.00（6H, s）, 4.38（2H, q , J = 6.9Hz）, 6.79（2H, d, J = 9.2Hz）, 7.55（2H, d, J = 9.2Hz）, 7.61（2H, d, J = 8.0Hz）, 8.05（2H, d, J = 8.6Hz）
【００９０】
（カルボン酸3の合成）
【００９１】
【化１５】
2013184909.tif 000018
【００９２】
ビフェニル誘導体2（148.0mg、0.54mmol）をエタノール（6ml）に溶解し、1M水酸化ナトリウム水溶液（6ml）を加えて4時間還流した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（9ml）を加え中和した後、濾過し水で洗浄した。カルボン酸3（122.0mg、0.50mmol、92%）を黄色個体として得た。
1H NMR（500MHz, DMSO-D6）
δ2.91（6H, s）, 6.77（2H, d, J = 6.9Hz）, 7.54（2H, d, J = 7.5Hz）, 7.49（2H, d, J = 7.5Hz）, 7.89（2H, d, J = 7.5Hz）,
【００９３】
（システイン保護体5の合成）
【００９４】
【化１６】
2013184909.tif 000019
【００９５】
D-システインメチルエステル塩酸塩（4）（308mg、1.8mmol）とトリフェニルメタノール（515mg、1.98mmol）とにTFA（1.5ml）を加え溶解させた。室温で2時間撹拌した後、減圧濃縮し、陰イオン交換樹脂IRA400 OH AGを用いて中和した。樹脂をろ過し、得られた溶液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー［シリカゲル30g;ヘキサン−酢酸エチル（1:1）］にて精製し、システイン保護体5（658mg、1.7mmol、97%）を薄黄色油状として得た。
1H NMR 1H NMR（270MHz, CDCl3）
δ2.47（1 H, dd, J = 8.1, 13）, 2.60（1 H, dd, J = 5.1, 13）, 3.21（1 H, dd, J = 5.1, 8.1Hz）, 3.66（3 H, s）, 7.18-7.32（9 H, complex）, 7.40-7.54（6 H, complex）
【００９６】
（アミド体6の合成）
【００９７】
【化１７】
2013184909.tif 000020
【００９８】
カルボン酸3（15.0mg、0.062mmol）およびシステイン保護体5（31.2mg、0.082mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド（2ml）に溶解した。この溶液に4-（4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル）-4-メチルモルホリニウムクロリド（DMT-MM）（21.6mg、0.073mmol）を加え、この混合物を室温で3時間攪拌した。その後、ジクロロメタン（20ml×3）で抽出し、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（2:1）］にて精製し、アミド体6（32.9mg、0.054mmol、87%））を透明油状として得た。
1H NMR（500 MHz, CDCl3）
δ2.75（2H, complex）, 3.01（6H, s）, 3.75（3H, s）, 4.85（1H, dd, J = 12.6, 4.6Hz）, 6.81（2H, d, J = 8.6Hz）, 7.15-7.34（9H, complex）, 7.35-7.42（6H, complex）, 7.55（2H, d, J = 8.6Hz）, 7.63（2H, d, J = 8.0Hz）, 7.78（2H, d, J = 8.0Hz）
【００９９】
（環化体7の合成）
【０１００】
【化１８】
2013184909.tif 000021
【０１０１】
アミド体6（14.0mg、0.023mmol）とトリフェニルホスフィンオキシド（19.0mg、0.068mmol）をアルゴン雰囲気下、ジクロロメタン（1.5ml）に溶解させ、無水トリフルオロメタンスルホン酸（50μl、0.29mmol）を加え、2.5時間撹拌した。その後、ジクロロメタン（20ml×2）で抽出し、有機層を飽和食塩水（30ml）にて洗浄した。さらに、有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。得られた残渣を分取薄層クロマトグラフィー［20cm×20cm×1.75mm×1枚；ヘキサン−酢酸エチル（1:1）］にて精製し、環化体7（7.0mg、0.020mmol、86%）を黄色固体として得た。
1H NMR（500MHz, CDCl3）
δ3.00（6H, s）, 3.61-3.73（2H, complex）, 3.83（3H, s）, 5.29（1H, t, J = 9.2Hz）, 6.79（2H, d, J = 6.3Hz）, 7.54（2H, d, J = 5.9Hz）, 7.59（2H, d, J = 4.6Hz）, 7.87（2H, d, J = 4.6Hz）
【０１０２】
（ビフェニル型化合物8の合成）
【０１０３】
【化１９】
2013184909.tif 000022
【０１０４】
環化体7（7.7mg、0.023mmol）をTHF：蒸留水（2:1、2ml）に溶解した。この溶液に水酸化リチウム-水和物（2.0mg、0.047mmol）を加え、室温で30分撹拌した。反応混合物に酢酸エチル（30ml）を加え、生成物を水（20ml×2）で抽出した。さらに、水層を合わせ、１M塩酸を加え酸性にした後、酢酸エチル（20ml×2）で抽出した。その後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し、ビフェニル型化合物8（4.0mg、crude）を赤色固体として得た。
1H NMR（500MHz, CDCl3）
δ3.01（6H, s）, 3.73（2H, m）, 5.34（1H, t, J = 9.2Hz）, 6.80（2H, d, J = 8.0Hz）, 7.55（2H, d, J = 8.6Hz）, 7.62（2H, d, J = 8.5Hz）, 7.86（2H, d, J = 8.0Hz）
【０１０５】
〔実施例２：相対発光強度および生物発光スペクトルの測定〕
1）測定装置
（高速液体クロマトグラフィー（HPLC））
アジレント・テクノロジー株式会社製のAgilent 1100 series HPLCを使用した。装置の内訳は、デガッサー、クォータナリポンプ、マニュアルインジェクター、カラムコンパートメント、ダイオードアレイ検出器、蛍光検出器、ケミステーション（PC用ソフトウェア）である。用いたカラムはダイセル化学工業株式会社製CHIRALCELOD-RH（内径0.46cm、長さ15cm）である。
【０１０６】
（pH測定）
堀場製作所製F-23型ガラス電極式水素イオン濃度指示計を使用して行った。
【０１０７】
（発光光子量測定）
ATTO株式会社製Luminescencer Octa AB-2270を使用して測定した。
【０１０８】
（発光スペクトル測定）
ATTO株式会社製微弱発光蛍光スペクトル装置AB-1850を使用して測定した。測定したスペクトルは全て検出器の特性を補正したスペクトルである。
【０１０９】
2）試薬
超純水は、MILLIPORE製Milli-RX12αから採水したものを使用した。
【０１１０】
メタノール、t-ブタノールは、関東化学株式会社製の特級溶媒を使用した。
【０１１１】
ルシフェラーゼ（北米産ホタルPhotinus pyralis由来）は、Promega社製の組換え型を使用した。
【０１１２】
ATP-Mgは、Sigma社製のものを使用した。
【０１１３】
リン酸緩衝液は、和光純薬工業株式会社製のリン酸水素二カリウム・12水和物（特級）とリン酸二水素カリウム・2水和物（特級）を超純水に溶かし、pHを調節して用いた。
【０１１４】
カリウムt‐ブトキシドは、東京化成工業株式会社製のものを使用した。
【０１１５】
蒸留水、アセトニトリルは、関東化学株式会社製の高速液体クロマトグラフィー用溶媒を使用した。
【０１１６】
トリフルオロ酢酸は、和光純薬工業株式会社製のもの（特級）を使用した。
【０１１７】
比較対照として、和光純薬工業株式会社製のホタルルシフェリン（下記式（b））、和光純薬工業株式会社製のアカルミネ（商標）（下記式（c））を使用した。
【０１１８】
【化２０】
2013184909.tif 000023
【０１１９】
【化２１】
2013184909.tif 000024
【０１２０】
標準光源としてベルトールド社のGlowell G2（yellow）を使用した。
【０１２１】
3）試料調製
（基質溶液）
基質を電子天秤で秤量し希釈した。溶媒として、生物発光の測定の場合はリン酸緩衝液（50mM、pH6.0）を、化学発光測定の場合はt-ブタノールを使用した。
【０１２２】
（酵素溶液）
ルシフェラーゼを1μg/μlになるようにTris-HCl緩衝液（50mM、pH8.0）で希釈し小分けにした。これをストック溶液とし、必要量をその都度希釈して用いた。なお、ストック溶液は-80℃の冷凍庫に保存した。
【０１２３】
（ATP‐Mg溶液）
ATP-Mgを超純水で希釈した。
【０１２４】
4）相対発光強度
ホタルルシフェリン、アカルミネおよび実施例1のビフェニル型化合物8の相対発光強度を測定した。200μLポリスチレンチューブ内で、リン酸カリウム緩衝液（0.5M、pH8.0、20μl）、基質溶液（100μM、20μl）、酵素溶液（10μg/ml、20μl）、次いでATP-Mg溶液（200μM、40μl）を混合して発光強度測定を行った。
【０１２５】
その結果を図1〜4に示す。図１は、本発明に係る化合物の一実施例における、Glowell G2の発光強度を100としたときの相対発光強度を示し、図3は、このときの180秒積算値の相対発光強度を示す。図2は、本発明に係る化合物の一実施例における、ホタルルシフェリンの発光強度を100としたときの相対発光強度を示し、図4は、このときの180秒積算値の相対発光強度を示す。
【０１２６】
5）生物発光スペクトル
ホタルルシフェリン、アカルミネおよびビフェニル型化合物8の生物発光スペクトルを測定した。200μLポリスチレンチューブ内で、リン酸カリウム緩衝液（0.5M、pH8.0、5μl）、基質溶液（100μM、5μl）、酵素溶液（1mg/ml、5μl）、次いでATP-Mg溶液（200μM、10μl）を混合して発光スペクトル測定を行った。発光スペクトル測定の露光時間は、60秒とした。ただし、ホタルルシフェリンは、5秒で行った。
【０１２７】
その結果を図5に示す。図5は、本発明に係る化合物の一実施例の発光スペクトルを示す図である。図5に示すように、ホタルルシフェリンは565nmの発光極大波長を有し、アカルミネは673nmの発光極大波長を有していた。ビフェニル型化合物8は、670nmの発光極大波長を有していた。したがって、ビフェニル型化合物8は、天然のホタルルシフェリンよりも長波長側に発光極大波長を有していた。
【０１２８】
また、図5に示すように、ビフェニル型化合物8は、裾野が広い発光スペクトルを有していた。ビフェニル型化合物8の発光スペクトルは、700nmを超える領域にも裾野が広がっている。本化合物のようなビフェニル型の発光基質はこれまで例がなく、発光基質材料として全く新規な骨格である。したがって、本化合物は、より長波長側に発光波長を有する発光材料を得るためのリード化合物としても有用である。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、ホタル生物発光系において長波長の発光波長を有する新規な発光基質を提供することができるので、医療、ライフサイエンス分野などで広く有用な発光材料に好適に利用することができる。
【図１】
2013184909.tif 000029
【図２】
2013184909.tif 000030
【図３】
2013184909.tif 000031
【図４】
2013184909.tif 000032
【図５】
2013184909.tif 000033