(57)【要約】【課題】医療及び医薬品開発の分野又はウイルス感染診断の分野において有効なリサーチツールを提供するために、シリカによってなる基材に対して、容易に保持又は固定化することのできる糖ペプチド誘導体を提供すること。【解決手段】下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する糖ペプチド誘導体。式１：2013231012.tif 000020【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する糖ペプチド誘導体。
式１：
【化１】
2013231012.tif 000015
【請求項２】
前記フッ素原子含有置換基が、下記式２に示される構造を含む、請求項１に記載の糖ペプチド誘導体。
式２：
【化２】
2013231012.tif 000016
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【請求項３】
下記式３に示される化合物と前記アミノ基が反応することにより得られる、請求項１又は２に記載の糖ペプチド誘導体。
式３：
【化３】
2013231012.tif 000017
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【請求項４】
前記遊離アミノ基のすべてのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
【請求項５】
前記糖ペプチドが、下記式４に示される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖ペプチド誘導体。
式４：
【化４】
2013231012.tif 000018
【請求項６】
下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入する工程、
式１：
【化５】
2013231012.tif 000019
前記フッ素原子含有置換基導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程を含む、糖ペプチド誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖ペプチド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命分子として、核酸（ＤＮＡ）及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。
【０００３】
例えば、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
中でも、インフルエンザウイルスは、ウイルス表面に存在するヘマグルチニンがヒトの喉や肺表面にあるＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌに結合することで開始される。そこでウイルス表面のヘマグルチニンと粘膜細胞上皮に存在するＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌとの結合認識機構を利用することでウイルス感染の防止又は迅速診断が可能になると考えられる。
【０００４】
従って、ウイルスに認識される糖鎖をビーズ等のシリカ含有粒子、不織布又はフィルターに固定することができれば、ウイルスと糖鎖との特異的相互作用を利用した、診断のためのバイオデバイスを簡便に製造することができる。また、このバイオデバイスをウイルスの濃縮に用いることで、感染初期における低濃度のインフルエンザウイルス液であっても高感度分析を可能にすることが期待される。
【０００５】
鶏卵卵黄中にはインフルエンザウイルスの受容体であるヒト型糖鎖と同一の糖ペプチドが存在することが報告されており、更にはその単離方法も報告されている（非特許文献１）。近年、脱脂卵黄を原料とする、ヒト型糖ペプチドのより効率的な製造方法も報告されている（特許文献１）。
【０００６】
また、有機ケイ素化学の分野では、シリカカチオンは固い酸（Ｈａｒｄ  ａｃｉｄ）として知られ、フッ素アニオンは固い塩基（Ｈａｒｄ  ｂａｓｅ）として知られている。そして、両者の結合で生じる「シリカ−フッ素結合」は「シリカ−酸素結合」よりも強固であることが知られている（非特許文献２）。酸素−ケイ素結合については、フッ化カリウムやテトラブチルアンモニウムフルオライド等のフッ素塩化合物により処理することで容易に酸素−ケイ素結合を切断することができることから、有機合成反応における水酸基の保護基として有用なトリメチルシリル基等のケイ素化合物による保護基の脱保護方法として用いられている。
【０００７】
特許文献２には、フッ素含有エチレンオキサイド共重合体が報告され、また、非特許文献３には、フッ素テイルを有する単糖類が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−１６２７６２号公報
【特許文献２】特開２０１１−８４５９５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １９９７，  Ｖｏｌ．１３３５，  ｐ．２３−３２
【非特許文献２】Ｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｏｆｔ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｂａｓｅｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７７
【非特許文献１】Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ２００５，  Ｖｏｌ．１２７，  Ｎｏ．３８，  ｐ．１３１６２−１３１６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、いずれの先行技術文献においても、糖ペプチドにおいて、シリカによってなる基材と糖ペプチドとを保持又は固定化するためのフッ素原子含有置換基が結合した誘導体は開示されていない。
本発明が解決しようとする課題は、医療及び医薬品開発の分野又はウイルス感染診断の分野において有効なリサーチツールを提供するために、シリカによってなる基材に対して、容易に保持又は固定化することのできる糖ペプチド誘導体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糖ペプチドにフッ素原子含有置換基を導入することで、シリカによってなる基材に対して、糖ペプチドを容易に保持又は固定化させることが可能となることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する糖ペプチド誘導体。
式１：
【化１】
2013231012.tif 000002
［２］
前記フッ素原子含有置換基が、下記式２に示される構造を含む、［１］に記載の糖ペプチド誘導体。
式２：
【化２】
2013231012.tif 000003
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
［３］
下記式３に示される化合物と前記アミノ基が反応することにより得られる、［１］又は［２］に記載の糖ペプチド誘導体。
式３：
【化３】
2013231012.tif 000004
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
［４］
前記遊離アミノ基のすべてのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する、［１］〜［３］のいずれかに記載の糖ペプチド誘導体。
［５］
前記糖ペプチドが、下記式４に示される、［１］〜［４］のいずれかに記載の糖ペプチド誘導体。
式４：
【化４】
2013231012.tif 000005
［６］
下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入する工程、
式１：
【化５】
2013231012.tif 000006
前記フッ素原子含有置換基導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程を含む、糖ペプチド誘導体の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、シリカによってなる基材に対して、糖ペプチドを容易に保持又は固定化させることが可能となる、新規な糖ペプチド誘導体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】製造例１において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】製造例１において製造された糖ペプチドの１Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】製造例１において再度ＯＤＳ樹脂で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】製造例２において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】実施例１において製造された糖ペプチド誘導体（１）のＨＰＬＣチャートを示す。
【図６】実施例２において製造された糖ペプチド誘導体（２）のＨＰＬＣチャートを示す。
【図７】参考例１において製造された糖ペプチド誘導体（３）のＨＰＬＣチャートを示す。
【図８】参考例２において製造された糖ペプチド誘導体（４）のＨＰＬＣチャートを示す。
【図９】実施例３において、マイクロタイタープレートに固定化された、それぞれ１ｘ１０−５Ｍ、１ｘ１０−６Ｍ、１ｘ１０−７Ｍに調製された糖ペプチド誘導体（１）〜（４）とＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。
【図１０】実施例４において、フッ化カリウム水溶液で希釈することで糖ペプチド誘導体（２）濃度がそれぞれ１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍに調製された溶液中でグラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。なお、図１０中、糖ペプチド誘導体（２）を除いたコントロール群を比較対照とする多重比較検定から＊は危険率５％未満で有意な差があることを、＊＊は危険率１％未満で有意な差があることを意味する。
【図１１】参考例３において、フッ化カリウム水溶液で希釈することで糖ペプチド誘導体（４）濃度がそれぞれ１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍに調製された溶液中でグラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。
【図１２】参考例４において、ＰＢＳで希釈することで糖ペプチド誘導体（２）濃度がそれぞれ１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍに調製された溶液中でグラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。
【図１３】実施例５において、ＰＢＳで希釈することで糖ペプチド誘導体（２）濃度がそれぞれ１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍに調製された溶液中でフッ素塩処理グラスフィルターを接触させた後、ＳＳＡレクチンとのＥＬＩＳＡによる結合評価を行った結果を示す。なお、図１３中、＊は、糖ペプチド誘導体（２）を除いたコントロール群を比較対照とする多重比較検定から危険率５％未満で有意な差があることを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１６】
（糖ペプチド誘導体）
本実施の形態における糖ペプチド誘導体とは、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する糖ペプチド誘導体である。
式１：
【化６】
2013231012.tif 000007
【００１７】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体において、糖ペプチド部分構造は、式１に示されるとおり、１１個の糖残基からなる２分岐複合型糖鎖を有し、また、２ヶ所の非還元末端にガラクトースに結合するシアル酸を有する。
ＮｅｕＡｃ、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、及びＭａｎは、糖の表記であり、それぞれ、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、及びマンノースを意味する。
糖は、Ｄ−糖であっても、Ｌ−糖であってもよく、Ｄ−糖とＬ−糖の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｄ−糖であることが好ましい。また、各糖は、各糖と実質的に等価な誘導体であってもよい。
【００１８】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体の糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基（Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）からなるペプチド鎖が結合している（配列番号１）。Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、ラセミ体などを含め、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。
【００１９】
本実施の形態において、「アミノ基にフッ素原子含有置換基が結合する」とは、アミノ基とフッ素原子含有置換基が結合することにより、糖ペプチドにフッ素原子含有置換基が導入され糖ペプチド誘導体を形成することを意味する。
Ｌｙｓ（リジン）は、側鎖に４−アミノブチル基を有するアミノ酸であり、式１に示される糖ペプチド中には、Ｌｙｓが２残基含まれるため、Ｎ末端のＬｙｓが２つのアミノ基を、ＡｓｎとＴｈｒに結合するＬｙｓが、１つのアミノ基を有する。
式１に示される糖ペプチドには、２つのＬｙｓに由来する合計３個の遊離アミノ基が存在し、フッ素原子含有置換基は、３ヶ所のアミノ基の少なくとも一つ、好ましくは二つ、さらに好ましくは三つに結合している。二つ以上のアミノ基にフッ素原子含有置換基が結合している場合、フッ素原子含有置換基は同一のものでも異なるものでもよい。
【００２０】
本実施の形態において、フッ素原子含有置換基としては、糖ペプチド誘導体において、アミノ基と結合し、フッ素原子を含有する置換基であれば特に限定されるものではないが、置換基内に、Ｃ−Ｆ結合を有する置換基であることが好ましい。
本実施の形態においては、フッ素原子含有置換基とは、糖鎖ペプチド誘導体におけるＬｙｓアミノ基に結合した部分構造となる構造を意味する。
フッ素原子含有置換基としては、例えば、下記式２に示される構造を含む。
式２：
【化７】
2013231012.tif 000008
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
ここで、ｍ及びｎについては、糖ペプチド誘導体の水に対する溶解性の観点から、ｍは４以下の整数であり、ｎは１５以下の整数であることが好ましく、ｎは１０以下の整数であることがより好ましい。シリカによってなる基材に対する保持又は固定化の効果の観点から、ｎは１以上の整数であり、３以上の整数であることが好ましい。
式２における左側のメチレン炭素から延びる実線は、他の原子との結合手を意味する。式２に示される構造において、かかる結合手を介して、Ｌｙｓアミノ基と直接結合していてもよく、アミノ基と結合し得る他の構造を介してアミノ基と結合していてもよい。
【００２１】
（糖ペプチド誘導体の製造方法）
本実施の形態の糖ペプチド誘導体は、式１に示される糖ペプチドのＬｙｓに由来する合計３個の遊離アミノ基の少なくとも一つのアミノ基に、フッ素原子含有置換基を導入することにより、製造することができる。
アミノ基にフッ素原子含有置換基を導入することにより、フッ素原子含有置換基がアミノ基に結合する。
【００２２】
本実施の形態においては、式１、好ましくは式４に示される糖ペプチドは抽出工程、沈殿工程、及び脱塩工程により、鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で選択的に、安価に糖ペプチドを精製することができるので、このようにして得られる糖ペプチドにフッ素原子含有置換基を導入することで、糖ペプチド誘導体を製造することができる。
式４：
【化８】
2013231012.tif 000009
【００２３】
本実施の形態においては、下記式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入する工程、
式１：
【化９】
2013231012.tif 000010
前記フッ素原子含有置換基導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程を含む、糖ペプチド誘導体の製造方法により、本実施の形態の糖ペプチド誘導体を得ることができる。
【００２４】
（導入工程）
導入工程とは、式１に示される糖ペプチドのＬｙｓ（リジン）に由来する合計３個の遊離アミノ基のうち少なくとも一つのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入する工程を意味する。
反応液のｐＨ、反応時間、反応温度、反応試薬の当量などの反応条件を選択することにより、３個のアミノ基に対しフッ素原子含有置換基を１〜３つのアミノ基に導入することができる。フッ素原子含有置換基の増加によるシリカ表面との反応性向上のために、フッ素原子含有置換基は好ましくは２ヶ所、より好ましくは３ヶ所全てのアミノ基に導入する。
【００２５】
フッ素原子含有置換基をアミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いることができる。
かかる縮合反応としては、例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドや、ニトロフェノール又はペンタフルオロフェノール等でカルボン酸を活性化させた活性エステルを、必要に応じて、反応試薬を溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等の有機溶媒と水との混合溶媒中で、有機アミン等の有機塩基、又は炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液若しくは炭酸緩衝液等の無機塩基の存在下、氷冷下又は室温下で１５分〜１８０分、必要に応じて１日反応させる方法が挙げられる。
フッ素原子含有置換基を導入するための反応試薬は、糖ペプチドのアミノ基（糖ペプチド１モルあたり３モルのアミノ基を有する）に対して過剰量、例えば、アミノ基に対して１．１〜５倍モル添加して、糖ペプチドのアミノ基にフッ素原子含有置換基を導入することができる。
【００２６】
かかる縮合反応に用いる、フッ素原子含有置換基を導入するための反応試薬として、下記式３又は下記式５に示される化合物が挙げられる。
【００２７】
式３：
【化１０】
2013231012.tif 000011
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【００２８】
式５：
【化１１】
2013231012.tif 000012
（式中、ｍは０〜４の整数であり、ｎは１〜１５の整数であり、Ｒはフッ素原子又は水素原子を示す。）
【００２９】
式３に示される化合物や式５に示される化合物と、式１に示される糖ペプチドとを反応させることにより、式３又は式５に示される化合物中の、フッ素原子含有置換基に相当する部分が、糖ペプチド中のアミノ基と結合し、糖ペプチド誘導体が合成される。
フッ素原子含有置換基は、アミノ基と、式３に示される化合物を用いた場合には、アミド結合により導入され、式５に示される化合物を用いた場合には、Ｃ−Ｎ結合により導入される。
フッ素原子含有置換基は、アミノ基と結合する際に、かかる結合は特に限定されるものではないが、アミノ基と結合し得る公知の結合を利用することができ、アミド結合、Ｃ−Ｎ結合、カーバメート結合、イミド結合などの結合によりフッ素原子含有置換基は導入される。
【００３０】
フッ素原子含有置換基に相当する反応試薬としては、フッ素原子含有置換基と、アミノ基と結合し得る脱離基とに相当する構造を有していることが好ましく、脱離基部分が脱離してアミノ基と求核置換反応することにより、フッ素原子含有置換基とアミノ基との結合が形成される。
【００３１】
反応試薬として、式３に示される化合物を用いた場合を例示して説明すると、下記式６に示される構造を有する糖ペプチド誘導体を得ることができる。
式６：
【化１２】
2013231012.tif 000013
式６中、アミド結合は、アミノ基とフッ素原子含有置換基との結合を意味し、破線で囲まれた部分が、フッ素原子含有置換基を意味する。
該フッ素原子含有置換基においては、式２に示される構造が、Ｃ＝Ｏ（カルボニル）基を介して、Ｌｙｓのアミノ基と結合している。
【００３２】
糖ペプチド誘導体を精製するためには、沈殿工程及びさらに必要に応じて脱塩工程を組み合わせることで達成される。
【００３３】
（沈殿工程）
沈殿工程とは、導入工程によるフッ素原子含有置換基導入後、反応液を水溶性有機溶媒に添加して糖ペプチド誘導体を沈殿させる工程を意味する。
沈殿工程により、精製度の向上した糖ペプチド誘導体を沈殿物として得ることができる。沈殿工程においては、抽出液に水溶性有機溶媒を添加して粗精製物として、沈殿物を沈殿させてもよい。
【００３４】
本実施の形態において、水溶性有機溶媒とは、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジエチルエーテル、ジオキサン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、ジメチルホルムアミド、及びジメチルスルホキシドからなる群から選択される溶媒が挙げられる。これら溶媒は、１種で用いてもよく、２種以上の混合溶媒として用いてもよい。
水溶性有機溶媒として炭素数１〜５のアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、抽出液をアルコールに添加してアルコール沈殿する工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）である。抽出工程で得られた、糖ペプチド誘導体を含有する抽出液をアルコールに添加することにより、抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチド誘導体を沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。沈殿工程は、アセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル等を添加したアルコール沈殿工程として行うこともできる。
【００３５】
以下、沈殿工程をアルコール沈殿工程として説明するが、アルコール以外の炭素数１〜５の水溶性有機溶媒を用いた沈殿工程においても同様に実施することができる。用いる水溶性有機溶媒量や沈殿させる際の溶媒温度などの条件は、溶媒ごとに適宜選択することができるが、以下に例示するアルコール沈殿工程と同様に設定することができる。
【００３６】
アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量は、特に限定されるものではないが、抽出液に対して、質量で２〜２０倍のアルコールを用いることができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールは、炭素数１〜５個のアルコールであればよく、好ましくは炭素数１〜３個のアルコールである。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、中でも毒性を含めた安全性の面からエタノールが好ましい。
本実施の形態において、アルコール沈殿工程において用いるアルコールは１種類であってもよいし、アルコールの混合物又は他の溶媒との混合物であってもよい。
アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。
【００３７】
糖ペプチド誘導体を含む沈殿物を分離する温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００３８】
アルコール沈殿工程で用いる、先の抽出工程により得られた抽出液は、ろ過することで、清澄な抽出液とすることもでき、また、減圧濃縮などにより濃縮した抽出液として用いてもよい。
【００３９】
アルコール沈殿工程において、糖ペプチド誘導体を含む沈殿物を分離する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られた糖ペプチド誘導体を含む沈殿物を、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された沈殿物を得ることができる。
【００４０】
（脱塩工程）
脱塩工程とは、沈殿工程で得られたフッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体を含有する沈殿物から塩を除去する工程を意味する。
脱塩工程は、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができるが、例えば、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することも可能である。脱塩工程としては、例えば、沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂に保持させて水で洗浄することにより脱塩することもできる。
【００４１】
沈殿物を樹脂に保持させる方法は、吸着、担持など公知の結合様式を利用した方法とすることができる。また、沈殿物は、水で洗浄する際に沈殿物が洗浄液と共に流出しない程度に、保持されていればよい。
また、樹脂としては、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂等が挙げられる。逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂とは、シリカゲル系、ポリマー系を代表的とする樹脂を意味し、ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）ポリマーゲル樹脂、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂、スチレンビニルベンゼン共重合体樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、化学結合型シリカゲル樹脂などが挙げられる。
化学結合型シリカゲル樹脂とは、例えば、多孔性シリカゲルにジメチルオクタデシルクロロシランの様なシランカップリング剤を反応させて製造するＯＤＳ樹脂などが挙げられ、シリカゲルに対し、同様の手法で異なるシリル化剤を用いることで、オクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル基からなる群から選択される基を化学結合させることで得られる樹脂等も挙げられる。また、炭素数２２のドコシル基又は炭素数３０のトリアコンチル基を結合して得られる樹脂であってもよい。
【００４２】
脱塩工程は、脱塩した後に樹脂に保持されている糖ペプチド誘導体を、有機溶媒水溶液により溶出する工程を含むことが好ましい。溶出工程を行うことにより糖ペプチド誘導体の純度を向上させることができる。
溶出工程では、例えば、糖ペプチド誘導体を保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることができる。また水洗浄の工程では、糖ペプチド誘導体ができるだけ、水と共に流出せず、有機溶媒水溶液による溶出工程によって溶出することが好ましい。
溶出工程に用いる有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有するものが挙げられる。有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜２０％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは０．５〜２０％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは１０％（ｖ／ｖ）以下、さらに好ましくは５％（ｖ／ｖ）以下である。
有機溶媒水溶液により糖ペプチド誘導体を溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき、有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
脱塩工程又は溶出工程を行う温度は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００４３】
樹脂を用いた脱塩方法以外で（例えば分離膜による方法で）脱塩工程を行った後の処理液中に含まれる糖ペプチド誘導体を精製する方法としては、公知のペプチド、糖質、糖ペプチド等の精製方法を用いることができるが、例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、ジメチルオクタデシル、メチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル、ドコシル、トリアコンチル基などを充填剤表面に固定化したものが用いられるが、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。
【００４４】
ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られた糖ペプチド誘導体中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖ペプチド誘導体を溶出する工程を含んでいてもよい。
糖ペプチド誘導体を添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することにより糖ペプチド誘導体の脱塩を行うことができる。
【００４５】
溶出された糖ペプチド誘導体は、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖ペプチド誘導体として得ることができる。
本実施の形態において、得られた糖ペプチド誘導体は、再度アルコール沈殿工程又は脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。
【００４６】
本実施の形態の糖ペプチド誘導体は、例えば、緩衝液中でシリカ支持体と接触させることで保持又は固定化することが容易であり、シアル酸含有糖鎖を固定化したシリカ含有粒子やフィルターを容易に製造することができ、この粒子等を用いてウイルス種の判別やウイルスの濃縮ができるので有用である。
本実施の形態においては、糖ペプチドのアミノ基に対しフッ素原子含有置換基を導入することで、シリカ基材（シリカ支持体）に対して糖ペプチドを容易に保持又は固定化することができると考えられる。
【００４７】
ここで模式的に記載するが、下記構造を有するシリカ基材は、フッ化カリウムやテトラブチルアンモニウムフルオライド等のフッ素塩化合物により処理することで容易に酸素−ケイ素結合を切断することができる。その結果、酸素はシラノールを生成し、シリカはＳｉ−Ｆ構造を生成する。フッ素塩化合物により処理されたシリカを含有する基材は、−Ｓｉ−Ｆ構造をシリカ基材中に有するため、フッ素原子含有置換基を有する糖ペプチド誘導体を保持又は固定化しやすくなると考えられる。これは、疎溶媒相互作用（ｓｏｌｖｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）であると考えられる。
【化１３】
2013231012.tif 000014
【００４８】
すなわち、本実施の形態の糖ペプチド誘導体はフッ素原子含有置換基を有するので、表面にシリカを有する支持体と接触させることで、糖ペプチド誘導体をシリカ基材に保持又は固定化することができ、また、グラスフィルター等のシリカに対しても保持又は固定化することができる。
また、糖ペプチド誘導体はプラスチックプレート等に固定化することができるという特徴を有するため、エキソグリコシダーゼ（エキソ型糖加水分解酵素）、エンドグリコシダーゼ（エンド型糖加水分解酵素）、トランスグリコシダーゼ（糖転移酵素）のスクリーニングにも使うことができる。
【００４９】
インフルエンザウイルス表面には、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼが存在する。インフルエンザウイルスは、これらのタンパク質の種類の違いによって鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型を含む１４４の亜種に分類されている。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面たんぱく質であるヘマグルチニンが細胞表面のシアル酸含有糖鎖を受容体として認識して結合することによって開始される。ヒトインフルエンザウイルスはＮ−アセチルノイラミン酸−α−２，６−ガラクトースを有する糖鎖に対し高い結合親和性を示す。このことから、本実施の形態におけるシアル酸含有糖固定化粒子又はグラスフィルターはインフルエンザウイルスとの親和性が強く、低濃度のインフルエンザウイルス液であっても濃縮効果が期待され、高感度分析を可能にすることが期待される。
【実施例】
【００５０】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００５１】
［ＨＰＬＣ分析］
１）糖ペプチドの分析例
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  （Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ  ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件１（製造例１）：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸）
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
測定条件２（製造例２）：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）→９０％（２０ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００５２】
２）糖ペプチド誘導体の分析例
測定条件：
グラジエント；２０％→１００％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００５３】
［１Ｈ−ＮＭＲ測定］
Ｄ２Ｏ  ０．４ｍＬに試料  ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で１Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００５４】
［ＬＣ／ＭＳ測定］
以下の測定条件でＬＣ／ＭＳ測定を行った。用いたＬＣ及びＭＳのシステムは以下のとおりである。
ＬＣ：アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  （Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；２０％→１００％（２０ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．０５％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ＭＳ：サーモエレクトロン製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ
【００５５】
［製造例１］鶏卵卵黄からの糖ペプチドの製造
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
得られた脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。
ＯＤＳ（オクタデシルシリル）樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び図２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式１に示される構造であることが分かった。
さらにＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。上記で得られた糖ペプチド５０ｍｇを水１ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで３０ｍｇの糖ペプチドを得た。得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９９％であった。
【００５６】
［製造例２］脱脂卵黄からの糖ペプチドの製造
脱脂卵黄粉末（キューピー製）２００ｇに蒸留水５００ｍＬを添加し、よく撹拌した。６，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清を更に６，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、上清を回収しその後、２００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール１．３Ｌに注加し、生じた沈殿物を、６，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水３００ｍＬに溶解し、再度エタノール１．５Ｌに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド２．５ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）１００ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド２．５ｇを水２０ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水２００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで２００ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果をそれぞれ図４に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により上記式１で表される構造であることが分かった。
【００５７】
［製造例３］
７１０ｍｇの４，４，４−トリフルオロ酪酸を１５ｍＬ塩化メチレンに溶解し、９５９ｍｇの水溶性カルボジイミド塩酸塩、６９１ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、５５０μＬのＮ−メチルモルホリン、６１ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え室温で終夜攪拌した。
反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加え、分液後、有機溶媒層を除去した。更に水層を酢酸エチルで洗浄後、１０％クエン酸水溶液を加え酸性にした後、水層から酢酸エチルで抽出した。有機溶媒層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮し４，４，４−トリフルオロ酪酸の粗精製コハク酸イミドエステル７２５ｍｇを得た。
【００５８】
［製造例４］
３３６ｍｇの４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸を１５ｍＬ塩化メチレンに溶解し、９５９ｍｇの水溶性カルボジイミド塩酸塩、６９１ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、５５０μＬのＮ−メチルモルホリン、６１ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え室温で終夜攪拌した。
反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加え、分液後、有機溶媒層を除去した。更に水層を酢酸エチルで洗浄後、１０％クエン酸水溶液を加え酸性にした後、水層から酢酸エチルで抽出した。有機溶媒層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮し４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル３３５ｍｇを得た。
【００５９】
［製造例５］
４４０ｍｇの酪酸を１５ｍＬ塩化メチレンに溶解し、９５９ｍｇの水溶性カルボジイミド塩酸塩、１１５０ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、５５０μＬのＮ−メチルモルホリン、６１ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え室温で終夜攪拌した。
反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加え、分液後、有機溶媒層を除去した。更に水層を酢酸エチルで洗浄後、１０％クエン酸水溶液を加え酸性にした後、水層から酢酸エチルで抽出した。有機溶媒層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮し酪酸の粗精製コハク酸イミドエステル７３２ｍｇを得た。
【００６０】
［製造例６］
５８０ｍｇのヘキサン酸を１５ｍＬ塩化メチレンに溶解し、９５９ｍｇの水溶性カルボジイミド塩酸塩、１１５０ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、５５０μＬのＮ−メチルモルホリン、６１ｍｇのＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを加え室温で終夜攪拌した。
反応液に飽和重曹水と酢酸エチルを加え、分液後、有機溶媒層を除去した。更に水層を酢酸エチルで洗浄後、１０％クエン酸水溶液を加え酸性にした後、水層から酢酸エチルで抽出した。有機溶媒層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮しヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル８３１ｍｇを得た。
【００６１】
［実施例１］糖ペプチド誘導体（１）の製造
製造例１と同様の手法で得られた糖ペプチド１０ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）１ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した製造例３で得られた４，４，４−トリフルオロ酪酸の粗精製コハク酸イミドエステル８．４ｍｇを加え１２時間反応を行った。
反応終了後、エタノールを加え８，０００ｒｐｍで５分遠心し、フッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体を沈殿させ、上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を０．５ｍＬ蒸留水に溶解し、再度エタノール−エーテル混合液９ｍＬに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心し沈殿を回収した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで糖ペプチド誘導体（１）８．４ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図５に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。
その結果、９．１分に検出されるピークは検出イオンが１６１９．１（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）及び１６１７．５（［Ｍ−２Ｈ］２−）であることから推定分子量３２３６．６であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個の４，４，４−トリフルオロ酪酸が導入された糖ペプチド誘導体であると推定された。
【００６２】
［実施例２］糖ペプチド誘導体（２）の製造
製造例１と同様の手法で得られた糖ペプチド１１ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）１．５ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後１ｍＬのＤＭＦに溶解した製造例４で得られた４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル１１．９ｍｇを加え１２時間反応を行った。
反応終了後、エタノールを加え８，０００ｒｐｍで５分遠心し、フッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体を沈殿させ、上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を０．５ｍＬ蒸留水に溶解し、再度エタノール−エーテル混合液１５ｍＬに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心し沈殿を回収した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで糖ペプチド誘導体（２）４．９ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図６に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。
その結果、１２．５分に検出されるピークは検出イオンが１７６９．４（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）及び１７６７．５（［Ｍ−２Ｈ］２−）であることから推定分子量３５３６．９であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個の４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロヘキサン酸が導入された糖ペプチド誘導体であると推定された。
【００６３】
［参考例１］糖ペプチド誘導体（３）の製造
製造例２と同様の手法で得られた糖ペプチド１１ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）１．５ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後０．５ｍＬのＤＭＦに溶解した製造例５で得られた酪酸の粗精製コハク酸イミドエステル１３．２ｍｇを加え１２時間反応を行った。
反応終了後、エタノールを加え８，０００ｒｐｍで５分遠心し、糖ペプチド誘導体を沈殿させ、上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を０．５ｍＬ蒸留水に溶解し、再度エタノール−エーテル混合液２５ｍＬに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心し沈殿を回収した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収後、水溶出によるＧＥヘルスケア製Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０）カラムによるゲルろ過精製を行い、糖ペプチド誘導体（３）１０．０ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図７に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。
その結果、３．９分に検出されるピークは検出イオンが１５３８．１  （［Ｍ＋２Ｈ］２＋）及び１５３６．５（［Ｍ−２Ｈ］２−）であることから推定分子量３０７４．６であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個の酪酸が導入された糖ペプチド誘導体であると推定された。
【００６４】
［参考例２］糖ペプチド誘導体（４）の製造
製造例１と同様の手法で得られた糖ペプチド１０ｍｇを水−ジメチルホルムアミド（２／１：体積比）１．５ｍＬに加え、さらに０．１ｍＬの１Ｍ重曹水を加えた。その後１ｍＬのＤＭＦに溶解した製造例６で得られたヘキサン酸の粗精製コハク酸イミドエステル１１ｍｇを加え１２時間反応を行った。
反応終了後、エタノールを加え８，０００ｒｐｍで５分遠心し、糖ペプチド誘導体を沈殿させ、上清を除去することで沈殿を回収した。得られた沈殿物を０．５ｍＬ蒸留水に溶解し、再度エタノール−エーテル混合液１５ｍＬに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心し沈殿を回収した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで糖ペプチド誘導体（４）９．０ｍｇを得た。
得られた糖ペプチド誘導体のＨＰＬＣによる測定結果を図８に示す。反応生成物についてＬＣ／ＭＳ測定を行った。その結果、１０．２分に検出されるピークは検出イオンが１５８０．２（［Ｍ＋２Ｈ］２＋）及び１５７８．５（［Ｍ−２Ｈ］２−）であることから推定分子量３１５８．７であり、糖ペプチドの３個のアミノ基に３個のヘキサン酸が導入された糖ペプチド誘導体であると推定された。
【００６５】
［実施例３］ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価
実施例１で得られた糖ペプチド誘導体（１）０．５９ｍｇ、実施例２で得られた糖ペプチド誘導体（２）０．７１ｍｇ、参考例１で得られた糖ペプチド誘導体（３）０．６２ｍｇ、参考例２で得られた糖ペプチド誘導体（４）０．６２ｍｇをそれぞれ秤量した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、それぞれの糖ペプチド誘導体濃度が１ｘ１０−５Ｍ、１ｘ１０−６Ｍ、１ｘ１０−７Ｍとなるように被検溶液を調製した。
ＮＵＮＣ製Ｆ９６、ＭＡＸＩＳＯＲＰマイクロタイタープレートに各糖ペプチド誘導体、各濃度群あたり３例で各ウエルあたり１００μＬずつ添加し、４℃で終夜静置した。さらに比較対照群としてＰＢＳ溶液群及びＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液群を各群３例で各ウエルあたり１００μＬずつ添加し、４℃で終夜静置した。
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれのウエルに対し、１０μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＪ−ＯＩＬＭＩＬＬＳ製ＳＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ  Ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を各ウエルあたり１００μＬ加え４℃で終夜静置した。
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれのウエルに対し、３．１３ｘ１０−６ｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）溶液を各ウエルあたり１００μＬ加えて室温下２時間静置した。
ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれのウエルに対し、クエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素水を混合して調製した発色基質溶液を１００μＬ加え発色させ、その後１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ添加することで反応を停止させ、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図９に示す。
その結果、糖ペプチド誘導体（２）及び糖ペプチド誘導体（４）は、糖ペプチド誘導体（１）及び糖ペプチド誘導体（３）に比べて有意に吸光度が高かった。更に糖ペプチド誘導体（１）及び糖ペプチド誘導体（３）、また糖ペプチド誘導体（２）及び糖ペプチド誘導体（４）のそれぞれの間には大きな差が見られなかった。
以上の結果からプレート上に固定化されたフッ素原子含有リンカー導入糖ペプチド誘導体群又は脂溶性リンカー導入糖ペプチド誘導体群は、その特異性がＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）と結合している可能性が示唆された。更にこのＳＳＡレクチンとの結合能を有することから、フッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体は、ヒト型インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンと結合する可能性が示唆された。
【００６６】
［実施例４］
＜フッ化カリウム水溶液存在下での糖ペプチド誘導体とグラスフィルターとの接触＞
実施例２で得られた糖ペプチド誘導体（２）を１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液で希釈し、糖ペプチド誘導体濃度がそれぞれ１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍとなるように被検溶液を調製した。
ＮＵＮＣ製４８穴細胞培養用プレートに１ウエルあたり１枚入れたミリポア製グラスフィルター（１０ｍｍφ、厚さ４７５μｍ）に対し、被検溶液を各濃度群あたり３例で各ウエルあたり３００μＬずつ添加し、４℃で終夜静置した。比較対照群としてミリポア製グラスフィルターに対し１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液を１群３例、１ウエルあたり３００μＬずつ添加し、４℃で終夜静置した。
＜ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価＞
次にレクチンとの反応を実施した。ＮＵＮＣ製４８穴細胞培養用プレート中にあるグラスフィルターをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれの４８穴細胞培養用プレートに入れ、各ウエルに対し、５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＪ−ＯＩＬＭＩＬＬＳ製ＳＳＡ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ  Ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を各ウエルあたり３００μＬ加え室温で１時間静置した。
グラスフィルターをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれの４８穴細胞培養用プレートに入れ、各ウエルに対し、３．１ｘ１０−８ｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ−ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を各ウエルあたり３００μＬ加え室温で１時間静置した。
グラスフィルターをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で洗浄後、それぞれの４８穴細胞培養用プレートに入れ、各ウエルに対し、クエン酸リン酸緩衝液、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び過酸化水素水を加えて調製した発色基質溶液を加え発色させ、その後１Ｎ  ＨＣｌを添加することで反応を停止させ、上清を９６穴プレートに移し、プレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１０に示す。
その結果、糖ペプチド誘導体（２）と１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液存在下で反応させたグラスフィルター群（１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ各群３例）は、１ｘ１０−１０Ｍ群を除き、１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液による比較対照群（１群３例）と比べて、吸光度（４９０ｎｍ）において有意に高いことが確認された。
このことからフッ化カリウム水溶液存在下で糖ペプチド誘導体（２）と接触したグラスフィルターは、糖ペプチド誘導体との結合が可能であり、その結果としてその特異性がＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）と結合している可能性が示唆された。
更に糖ペプチド誘導体（２）と反応させたグラスフィルターすなわちフッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体と反応させたグラスフィルターは、ＳＳＡレクチンとの結合能を有することから、ヒト型インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンと結合する可能性が示唆された。
【００６７】
［参考例３］
＜フッ化カリウム水溶液存在下での糖ペプチド誘導体とグラスフィルターとの接触＞
参考例２で得られた糖ペプチド誘導体（４）を１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液で希釈し、糖ペプチド誘導体濃度がそれぞれ１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍとなるように被検溶液を調製した。比較対照群として１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液を用い、実施例４と同様に実施した。
＜ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価＞
実施例４と同様にして、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１１に示す。
その結果、糖ペプチド誘導体（４）と１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液存在下で反応させたフッ素塩処理グラスフィルター群（１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、各１群３例）は、いずれの群も１ｘ１０−５Ｍフッ化カリウム水溶液による比較対照群（１群３例）と比べて、吸光度（４９０ｎｍ）において有意な差が無かった。
このことから糖ペプチド誘導体（４）と接触したフッ素塩処理グラスフィルターは糖ペプチド誘導体との結合が出来ず、その結果としてレクチンＳＳＡと出来ない可能性が示唆された。
【００６８】
［参考例４］
＜ＰＢＳ存在下での糖ペプチド誘導体とグラスフィルターとの接触＞
フッ化カリウム水溶液の代わりにＰＢＳで希釈した以外は、実施例４と同様に実施した。
＜ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価＞
実施例４と同様にして、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１２に示す。
その結果、糖ペプチド誘導体（２）とＰＢＳ存在下で反応させたグラスフィルター群（１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ各群３例）は、ＰＢＳによる比較対照群（１群３例）と比べて吸光度（４９０ｎｍ）において有意差が見られない事が確認された。
このことからＰＢＳ存在下で糖ペプチド誘導体（２）と接触したグラスフィルターは、糖ペプチド誘導体との結合が十分にできず、その結果としてレクチンＳＳＡと結合しない可能性が示唆された。
【００６９】
［実施例５］
＜フッ素塩処理グラスフィルターの製造＞
ミリポア製グラスフィルター（１０ｍｍφ、厚さ４７５μｍ）１００枚に対し１Ｍフッ化カリウム水溶液（ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝９０：１０）を３０ｍＬ加え４℃で終夜静置した。次いで、グラスフィルターを濾別し、ＭｅＯＨで洗浄後、減圧下乾燥し、フッ素塩処理グラスフィルターを得た。
＜ＰＢＳ存在下での糖ペプチド誘導体とフッ素塩処理グラスフィルターとの接触＞
糖ペプチド誘導体（２）をＰＢＳで希釈し、糖ペプチド誘導体濃度がそれぞれ１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍとなるように被検溶液を調製し、得られたフッ素塩処理グラスフィルターを用いた以外は、実施例４と同様に実施した。
＜ＥＬＩＳＡによるレクチンとの結合評価＞
実施例４と同様にして、４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１３に示す。
その結果、糖ペプチド誘導体（２）とＰＢＳ存在下で反応させたフッ素塩処理グラスフィルター群（１ｘ１０−７Ｍ１群３例）は、ＰＢＳによる比較対照群（１群３例）と比べて、吸光度（４９０ｎｍ）において有意に高いことが確認された。
このことから糖ペプチド誘導体（２）と接触したフッ素塩処理グラスフィルターは糖ペプチド誘導体との結合が可能であり、その結果としてその特異性がＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃであると報告されているレクチンＳＳＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａ）と結合している可能性が示唆された。
更に糖ペプチド誘導体（２）と反応させたグラスフィルターすなわちフッ素原子含有置換基が導入された糖ペプチド誘導体と反応させたグラスフィルターは、ＳＳＡレクチンとの結合能を有することから、ヒト型インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンと結合する可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の糖ペプチド誘導体は、医療及び医薬品開発の分野又はウイルス感染診断の分野における有効なリサーチツールとして産業上の利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１は、式１に示される糖ペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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