(57)【要約】【課題】  試料に含まれる成分の影響を回避し、偽陽性や偽陰性の発生を抑制可能な、甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する自己抗体（ＴＲＡｂ）測定試薬を提供すること。【解決手段】  甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を固定化した固相を含む試薬と、標識した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む試薬と、を含み、かつＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬にキレート剤および／または界面活性剤をさらに含んだＴＲＡｂ測定試薬により、前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を固定化した固相を含む試薬と、標識した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む試薬と、を含む、ＴＳＨＲに対する自己抗体（ＴＲＡｂ）を測定する試薬であって、
ＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬にキレート剤および／または界面活性剤をさらに含んだ、前記ＴＲＡｂを測定する試薬。
【請求項２】
甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を固定化した固相を含む試薬と、標識した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む試薬とが、それぞれ別の試薬である、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
少なくともＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬が凍結乾燥形態である、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
（１）甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を固定化した固相ならびにキレート剤および／または界面活性剤を含む試薬に試料を添加することで、固相に固定化したＴＳＨＲと試料中に含まれるＴＳＨＲに対する自己抗体（ＴＲＡｂ）との複合体を形成させる工程、
（２）標識した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む試薬を添加することで、（１）の複合体を形成しなかったＴＳＨＲと標識したＴＳＨとの複合体を形成させる工程、
（３）（２）で形成した複合体中の標識を検出する工程、
を含む試料中に含まれるＴＲＡｂを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する自己抗体（ＴＲＡｂ）の測定試薬に関するものである。特に本発明は、従来のＴＲＡｂ測定試薬と比較し、試料測定時の偽陽性または偽陰性の発生を抑制した試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺刺激ホルモンレセプター（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＳＨＲ）は、甲状腺細胞膜上に存在する分子量約１００ｋＤａの糖タンパクである甲状腺刺激ホルモン（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ、ＴＳＨ）の受容体であり、脳下垂体から分泌されるＴＳＨが甲状腺の細胞膜にあるＴＳＨＲに結合すると、甲状腺は代謝機能の調節ホルモンであるトリヨードサイロニン（Ｔ３）およびサイロキシン（Ｔ４）を分泌する。
【０００３】
バセドウ病や甲状腺機能低下症等の自己免疫性甲状腺疾患の患者血清中には、ＴＳＨＲに対する自己抗体（ＴＲＡｂ）が認められる。ＴＲＡｂは、ＴＳＨのＴＳＨＲへの結合を阻止するため、ＴＳＨ結合阻止抗体（ＴＳＨ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｇｉｏｂｕｌｉｎ、ＴＢＩＩ）ともよばれる。ＴＲＡｂには、ＴＳＨＲを刺激して甲状腺機能を亢進させるもの（甲状腺刺激抗体、ＴＳＡｂ）と、ＴＳＨのＴＳＨＲへの結合を阻害して甲状腺機能を低下させるもの（甲状腺刺激阻害抗体、ＴＳＢＡｂ）が知られており、自己免疫性甲状腺疾患の確定診断における補助マーカーとして有用である。
【０００４】
ＴＲＡｂの測定については、スミスらによって開発された液相法による１ステップ法（第１世代）（非特許文献１および２）から固相に結合したＴＳＨＲと標識したＴＳＨを用いた２ステップ法（第２世代）へと進化し、さらに近年、酵素標識抗ヒトＴＳＨＲモノクローナル抗体（Ｍ２２抗体）を用いた測定法が開発されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−１０６３９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７４，４０５−４２０，１９８１
【非特許文献２】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９，１０６−１２０，１９８８
【非特許文献３】ＴＳＨ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ−ｎｅｗ  ａｎｄ  ｏｌｄ  ａｓｓａｙｓ，ＲＳＲ  Ｌｔｄ．，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫学的手法を用いたＴＲＡｂ測定においては、試料中（例えば血液中）に含まれる成分により測定系に影響を及ぼし、正確な測定値を得られない現象（例えば、偽陽性や偽陰性）が発生する問題があった。そこで本発明の目的は、前記試料に含まれる成分による影響を回避し、偽陽性や偽陰性の発生を抑制可能なＴＲＡｂ測定試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討を行なった結果、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を固定化した固相を含む試薬と、標識した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む試薬と、を含む、ＴＳＨＲに対する自己抗体（ＴＲＡｂ）を測定する試薬であって、
ＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬にキレート剤および／または界面活性剤をさらに含んだ、前記ＴＲＡｂを測定する試薬である。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、ＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬と、標識したＴＳＨを含む試薬とが、それぞれ別の試薬である、前記第一の態様に記載の試薬である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、少なくともＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬が凍結乾燥形態である、前記第二の態様に記載の試薬である。
【００１２】
さらに本発明の第四の態様は、
（１）甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を固定化した固相ならびにキレート剤および／または界面活性剤を含む試薬に試料を添加することで、固相に固定化したＴＳＨＲと試料中に含まれるＴＳＨＲに対する自己抗体（ＴＲＡｂ）との複合体を形成させる工程、
（２）標識した甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む試薬を添加することで、（１）の複合体を形成しなかったＴＳＨＲと標識したＴＳＨとの複合体を形成させる工程、
（３）（２）で形成した複合体中の標識を検出する工程、
を含む試料中に含まれるＴＲＡｂを測定する方法である。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明のＴＲＡｂを測定する試薬は、
（Ａ）ＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬と、
（Ｂ）標識したＴＳＨを含む試薬と、
を少なくとも含んでいればよい。また前記（Ａ）の試薬と前記（Ｂ）の試薬は、両試薬を混合した態様としてもよく、それぞれ別の試薬とする態様としてもよい。ただし、前記（Ａ）の試薬と前記（Ｂ）の試薬とを別の試薬とする態様のほうが、偽陽性や偽陰性の発生をより抑えられる点で好ましい。さらに別の試薬とする態様とする場合、少なくとも前記（Ａ）の試薬を凍結乾燥形態とすると、保存安定性が向上するため好ましい。
【００１５】
本発明におけるキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸やクエン酸またはそれらの金属塩といった、当業者が通常用いるキレート剤の中から適宜選択すればよい。例えばエチレンジアミン四酢酸またはその金属塩をキレート剤として用いる場合、５ｍＭから５０ｍＭ（好ましくは１０ｍＭから２０ｍＭ）となるよう、ＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬に含ませればよい。
【００１６】
本発明における界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、ＮＰ−４０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ＭＥＧＡ−８（Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、ＭＥＧＡ−９（Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、ＭＥＧＡ−１０（Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、ｓｕｃｒｏｓｅ  ｌａｕｒａｔｅ（β−Ｄ−Ｆｒｕｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ  Ｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ）、ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅといった市販の非イオン性界面活性剤や、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）といった市販の両イオン性界面活性剤の中から適宜選択すればよい。また前記界面活性剤は単独で用いてもよいし、２種類以上を混合して用いてもよい。前記界面活性剤をＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬に含ませる場合、０．１％（ｗ／ｖ）から２％（ｗ／ｖ）（好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）から１％（ｗ／ｖ））の範囲で含ませればよい。
【００１７】
また本発明において、ＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬には、前述したキレート剤および／または界面活性剤のほかに、目的に応じて、ウシ血清アルブミン等の保剤、アスコルビン酸やビタミンＥ等の抗酸化剤、カルボキシメチルセルロース等の結合剤、セルロースやポリエチレングリコール等の湿潤剤、合成食用色素等の着色剤、ポリビニルピロリドン等の懸濁化剤、アルキルスルホン酸等の乳化剤、グリセリン等の溶解補助剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）塩酸塩等の緩衝剤、Ｄ−ソルビトールや塩化ナトリウム等の等張化剤、の中から一つ以上をさらに含んでもよい。
【００１８】
本発明において、ＴＳＨＲを固定化させる固相に特に限定はなく、ポリビニルアルコール、水酸基を導入したポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンなどの合成高分子製ビーズが例示できる。またマイクロタイタープレートのウェルそのものを前記固相として用いてもよい。なお前記ビーズに磁性体を含ませると、ＴＳＨＲを固定化した固相と試料中に含まれるＴＲＡｂとの複合体を、磁石により容易に分離することができるため、好ましい。ＴＳＨＲの固相への固定化方法についても特に限定はなく、ＴＳＨＲを直接固相に結合させてもよいし、抗ＴＳＨＲモノクローナル抗体等を介して間接的に結合させてもよい。
【００１９】
本発明において、ＴＳＨへ標識する物質は、当業者が通常用いる物質の中から適宜選択すればよく、アルカリ性ホスファターゼ等の酵素、蛍光物質、ラジオアイソトープ、発光物質が例示できる。またＴＳＨに直接物質を標識せず、ビオチン−アビジン等の反応を利用して間接的に前記物質を標識してもよい。標識物質の検出方法は、標識した物質に依存し、標識物質が酵素の場合は酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）を、標識物質が蛍光物質の場合は蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）を、標識物質がラジオアイソトープの場合は放射免疫測定法（ＲＩＡ）を、標識物質が発光物質の場合は発光免疫測定法（ＬＩＡ）を、それぞれ用いればよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のＴＲＡｂ（甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する自己抗体）測定試薬は、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を固定化した固相を含む試薬と、標識したＴＳＨを含む試薬と、を含み、かつＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬にキレート剤および／または界面活性剤をさらに含むことを特徴としており、これにより試料中（例えば血液中）に含まれる成分の影響を受けることなく、試料中に含まれるＴＲＡｂを測定することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、固相に固定化したＴＳＨＲ（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と酵素で標識したＴＳＨ（Ｔｈｙｒｏｉｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）とを用いた、競合法による酵素免疫測定法（ＥＩＡ）にてＴＲＡｂ（ＴＳＨＲに対する自己抗体）を測定した実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は、当該実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）特許文献１に記載の方法により組換えヒト甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）を調製した。
（２）（１）で調製したヒトＴＳＨＲを磁性ビーズ（東ソー製）に固定化して得られる固定化ヒトＴＳＨＲと、下記に示す溶液とを、試薬容器に添加し、当該容器を凍結乾燥することでＴＳＨＲを固定化した固相を含む試薬（試薬ＡからＤ）を作製した。
試薬Ａ：１次反応液（１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液）のみ
試薬Ｂ：１５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物（ナカライテスク製）を添加した１次反応液
試薬Ｃ：０．５％（ｗ／ｖ）ｓｕｃｒｏｓｅ  ｌａｕｒａｔｅ（同仁化学製）を添加した１次反応液
試薬Ｄ：１５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物および０．５％ｓｕｃｒｏｓｅ  ｌａｕｒａｔｅを添加した１次反応液
（３）（２）で作製した試薬に、試料を添加して３７℃で１０分間撹拌した。試料としては、甲状腺刺激ホルモン（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＴＳＨ）（東ソー製）で測定）、遊離サイロキシン（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＦＴ４）（東ソー製）で測定）、遊離トリヨードサイロニン（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ（ＦＴ３）（東ソー製）で測定）濃度が正常な健常人血清試料および、甲状腺刺激ホルモンレセプターに対する自己抗体（ＴＳＨレセプター抗体  ＣＴ「コスミック」（コスミック製）で測定）で参考正常値以上となったバセドウ病患者のＴＲＡｂ陽性患者血清試料を用いた。
（４）洗浄水で洗浄することで遊離の試料成分を除去後、アルカリ性ホスファターゼ標識アビジンとビオチン標識ＴＳＨ（シグマアルドリッチ製）を含む２次反応液(１％ＢＳＡ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛を含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）)を添加し、３７℃で１０分間撹拌した。
（５）洗浄水で洗浄することで遊離のアルカリ性ホスファターゼ標識アビジンとビオチン標識ＴＳＨを除去後、磁性ビーズに結合した酵素の活性を測定するために、基質（４−メチルウンベリフェリルりん酸）を添加し、蛍光物質（４−メチルウンベリフェロン）の生成速度(レート値)を市販のエンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−２０００（東ソー製））で測定した。ＴＲＡｂ量は陰性コントロール、すなわち試験試料中にＴＲＡｂが存在しない時の測定値を基準にし、ＴＲＡｂが存在することで抑制される度合（＝ＩＮＨ）で測定した。ＩＮＨ（％）は下記式に従って計算し、１０％以上をＴＲＡｂ陽性と判断した。
【００２３】
ＩＮＨ（％）＝
（陰性コントロールの測定値−試験試料の測定値）÷
（陰性コントロールの測定値―陽性コントロールの測定値）×１００
結果を表１に示す。固定化ヒトＴＳＨＲに１次反応液のみを添加して作製した試薬（試薬Ａ）では、一部の健常人検体（健常人ＥおよびＪ）で陽性判定となった。一方、１次反応液にキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（試薬Ｂ）または非イオン性界面活性剤であるｓｕｃｒｏｓｅ  ｌａｕｒａｔｅ（試薬Ｃ）を添加して作製した試薬では、当該健常人検体を含め全ての健常人検体が陰性判定（ＩＮＨが１０％未満）となった。さらに、１次反応液にキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸および非イオン性界面活性剤であるｓｕｃｒｏｓｅ  ｌａｕｒａｔｅを添加して作製した試薬（試薬Ｄ）では、ほぼ全ての健常人検体でＩＮＨが５％以下となり、ＴＲＡｂ陽性患者血清との区別がより明確となった。なおＴＲＡｂ陽性患者血清は、試薬ＡからＤ、いずれの試薬を用いても陽性判定となっており、エチレンジアミン四酢酸や非イオン性界面活性剤の添加により、試薬の感度に悪影響を与えないことがわかる。
【００２４】
【表１】
2013238502.tif 000002
実施例２
実施例１（２）において、固定化ヒトＴＳＨＲとともに試薬容器に添加する溶液を、下記に示す溶液に変更した他は、実施例１と同様の実験を行なった。
試薬Ａ：１次反応液（１％ＢＳＡを含むＴｒｉｓ緩衝液）のみ
試薬Ｃ：０．５％（ｗ／ｖ）ｓｕｃｒｏｓｅ  ｌａｕｒａｔｅ（同仁化学製）を添加した１次反応液
試薬Ｅ：０．５％（ｗ／ｖ）ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（同仁化学製）を添加した１次反応液
試薬Ｆ：０．５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学製）を添加した１次反応液
試薬Ｇ：０．５％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳＯ（同仁化学製）を添加した１次反応液
結果を表２に示す。固定化ヒトＴＳＨＲに１次反応液のみを添加して作製した試薬（試薬Ａ）では、一部の健常人検体（健常人Ｉ、ＫおよびＬ）で陽性判定となった。一方、１次反応液に非イオン性界面活性剤であるｓｕｃｒｏｓｅ  ｌａｕｒａｔｅ（試薬Ｃ）、ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ（試薬Ｅ）や、両イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳ（試薬Ｆ）、ＣＨＡＰＳＯ（試薬Ｇ）を添加して作製した試薬では、当該健常人検体を含め全ての健常人検体が陰性判定（ＩＮＨが１０％未満）となった。なおＴＲＡｂ陽性患者血清は、いずれの試薬を用いても陽性判定となっており、非イオン性界面活性剤や両イオン性界面活性剤の添加により、試薬の感度に悪影響を与えないことがわかる。
【００２５】
【表２】
2013238502.tif 000003