(57)【要約】【課題】簡便かつ高速にＳＭＳ活性を測定するための新規な測定方法、およびそれを利用したＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニング方法の提供。【解決手段】ＳＭＳによって生成したスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させ、該蛍光物質の蛍光強度を測定することを特徴とするＳＭＳ活性の新規測定方法、およびそれを利用したＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニング方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフィンゴミエリン合成酵素の活性測定方法であって、標識したセラミドまたは標識したホスファチジルコリンを使用しなくてもよく、かつスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリン合成酵素の活性を測定する方法。
【請求項２】
下記工程（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、セラミドとホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、スフィンゴミエリン合成酵素を失活させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後、工程（ｉ）で生じるスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させる工程、および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で生じる蛍光物質の蛍光強度を測定する工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ）が、スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、非標識のセラミドおよび非標識のホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程である請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体が、スフィンゴミエリン合成酵素発現昆虫細胞の膜画分である請求項１〜３記載の方法。
【請求項５】
スフィンゴミエリン合成酵素が、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１および／またはＳＭＳ２である請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】
スフィンゴミエリン合成酵素の活性を阻害または促進する被検物質のスクリーニング方法であって、下記工程（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）被検物質の存在下または非存在下、スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、セラミドとホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、スフィンゴミエリン合成酵素を失活させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後、工程（ａ）で生じるスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）で生じる蛍光物質の蛍光強度を測定する工程、および
（ｅ）該被検物質の存在下における該蛍光強度と、該被検物質の非存在下における該蛍光強度を比較して、該被検物質がスフィンゴミエリン合成酵素活性を阻害する物質であるか、あるいは、促進する物質であるかを判断する工程
を含むスクリーニング方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、被検物質の存在下または非存在下、スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、非標識のセラミドおよび非標識のホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程である請求項６記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体が、スフィンゴミエリン合成酵素発現昆虫細胞の膜画分である請求項６または請求項７記載の方法。
【請求項９】
スフィンゴミエリン合成酵素が、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１および／またはＳＭＳ２である請求項６〜８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴミエリン合成酵素の活性測定方法、およびその方法を用いたスフィンゴミエリン合成酵素活性の阻害薬または促進薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴミエリン合成酵素（以下、ＳＭＳと略記することがある。）は、ホスファチジルコリンのリン酸コリン部分をセラミドに転移してスフィンゴミエリンを生成するとともに、ジアシルグリセロールを生成する酵素であり、ＳＭＳ１とＳＭＳ２の２種類の存在が知られている。ＳＭＳは、セラミドとスフィンゴミエリンの代謝に関与するため、ＳＭＳ活性阻害薬は、細胞増殖抑制を必要とする疾患、例えば、白血病、癌、自己免疫疾患等の治療に、ＳＭＳ活性促進薬は、細胞増殖を必要とする疾患、例えば、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制等の治療に有用であることが報告されている（特許文献１参照）。
【０００３】
これまで、ＳＭＳの活性測定には、放射性または蛍光標識された基質（セラミドまたはホスファチジルコリン）を用いてＳＭＳの酵素反応を行った後、脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィー等で分離後、生成したスフィンゴミエリンの放射活性または蛍光量を測定する方法が利用されている（非特許文献１参照）。しかしながら、この方法では、操作が煩雑なため多くの時間を要し、ＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニングに利用することはできなかった。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１９２５３７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）３１１巻、３１〜４２頁（２０００年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
スフィンゴミエリン合成酵素（ＳＭＳ）活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニングに利用できる、ＳＭＳ活性を簡便かつ高速に測定する方法の構築が望まれていた。
【０００７】
従って、本発明の課題は、簡便かつ高速にＳＭＳ活性を測定するための新規な測定方法、およびそれを利用したＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、スフィンゴミエリン合成酵素の活性測定方法として、標識したセラミドまたは標識したホスファチジルコリンを使用しなくても良く、かつスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリン合成酵素の活性を測定できる新規の方法を見出した。すなわち、本発明は、図１に示すように、ＳＭＳによって生成したスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させ、次いで該蛍光物質の蛍光強度を測定することを特徴とするＳＭＳ活性の測定方法（以下、本発明方法と略記することがある。）に関する。本発明方法では、基質（セラミドまたはホスファチジルコリン）を標識する手間が不要であり、さらに従来の測定方法で操作を煩雑にしていた、脂質の抽出や薄層クロマトグラフィーを用いたスフィンゴミエリンの分離など多くの時間を要するステップを必要としないため、ＳＭＳ活性を簡便かつ高速に測定することができる。また、本発明方法は、高感度であり、ＳＭＳ活性の定量を行うことも可能である。また、驚くべきことに、本発明方法では、昆虫細胞の膜画分中におけるＳＭＳ活性を、哺乳類細胞の膜画分中におけるＳＭＳ活性よりも、高感度に測定できることを見出した。これまで、昆虫細胞の発現系は、発現効率や安定発現の向上を目的に利用されてきたが、本発明においては、活性測定時のバックグランドが低下するという新たな効果が昆虫細胞発現系の利用によって得られた。さらに、本発明者らは、本発明方法を利用した、ＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニング方法（以下、本発明のスクリーニング方法と略記することがある。）を見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）スフィンゴミエリン合成酵素の活性測定方法であって、標識したセラミドまたは標識したホスファチジルコリンを使用しなくてもよく、かつスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリン合成酵素の活性を測定する方法、
（２）下記工程（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、セラミドとホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の後、スフィンゴミエリン合成酵素を失活させる工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後、工程（ｉ）で生じるスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させる工程、および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で生じる蛍光物質の蛍光強度を測定する工程
を含む、前記（１）記載の方法、
（３）工程（ｉ）が、スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、非標識のセラミドおよび非標識のホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程である前記（１）または前記（２）記載の方法、
（４）スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体が、スフィンゴミエリン合成酵素発現昆虫細胞の膜画分である前記（１）〜（３）記載の方法、
（５）スフィンゴミエリン合成酵素が、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１および／またはＳＭＳ２である前記（１）〜（４）記載の方法、
（６）スフィンゴミエリン合成酵素の活性を阻害または促進する被検物質のスクリーニング方法であって、下記工程（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）被検物質の存在下または非存在下、スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、セラミドとホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、スフィンゴミエリン合成酵素を失活させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の後、工程（ａ）で生じるスフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）で生じる蛍光物質の蛍光強度を測定する工程、および
（ｅ）該被検物質の存在下における該蛍光強度と、該被検物質の非存在下における該蛍光強度を比較して、該被検物質がスフィンゴミエリン合成酵素活性を阻害する物質であるか、あるいは、促進する物質であるかを判断する工程
を含むスクリーニング方法、
（７）工程（ａ）が、被検物質の存在下または非存在下、スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体を用いて、非標識のセラミドおよび非標識のホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程である前記（６）記載の方法、
（８）スフィンゴミエリン合成酵素を含有する検体が、スフィンゴミエリン合成酵素発現昆虫細胞の膜画分である前記（６）または前記（７）記載の方法、
（９）スフィンゴミエリン合成酵素が、スフィンゴミエリン合成酵素ＳＭＳ１および／またはＳＭＳ２である前記（６）〜（８）記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ＳＭＳ活性を簡便かつ高速に測定することが可能となる。また、本発明方法を利用することで、ＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニングが可能となり、該ＳＭＳ活性を標的とした薬剤の新薬開発に大きく貢献できる。本発明は、ＳＭＳのサブタイプであるＳＭＳ１およびＳＭＳ２のいずれに対しても適用可能であり、いずれのサブタイプでも使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のスキームを示す。
【図２】ＳＭＳ１またはＳＭＳ２発現Ｓｆ９細胞の膜画分中のＳＭＳ活性を示す。縦軸は蛍光強度（ＲＦＵ）を示し、横軸は膜画分の蛋白量（μｇ）を示す。黒四角印はＳＭＳ１発現Ｓｆ９細胞の膜画分を用いた結果を、黒三角印はＳＭＳ２発現Ｓｆ９細胞の膜画分を用いた結果を、白丸印はｍｏｃｋの膜画分についての結果をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において、スフィンゴミエリン合成酵素（ＳＭＳ）（EC 2.7.8.27）としては、ＳＭＳ１とＳＭＳ２のいずれのサブタイプであってもよい。
【００１３】
本発明において、ＳＭＳを含有する検体としては、ＳＭＳを含むものなら特に制限されないが、例えば、単離されたＳＭＳ、ＳＭＳ発現細胞、ＳＭＳ発現細胞の膜画分等であり、好ましくはＳＭＳ発現細胞の膜画分である。
【００１４】
本発明において、ＳＭＳ発現細胞とは、ＳＭＳを発現している限り、特に制限されないが、例えば、ＳＭＳを元々発現する細胞やＳＭＳ発現遺伝子を導入した細胞等が挙げられる。好ましくは、ＳＭＳ発現遺伝子を導入した細胞であり、より好ましくはＳＭＳ発現遺伝子を導入した昆虫細胞（以下、ＳＭＳ発現昆虫細胞と略記することがある。）である。
【００１５】
ＳＭＳを含有する検体として、特に好ましくはＳＭＳ発現昆虫細胞の膜画分である。
【００１６】
本発明に利用される昆虫細胞としては、例えばヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM（商標）細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）等の他、カイコ幼虫個体が挙げられる。昆虫細胞として好ましくは、Ｓｆ細胞（例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞）であり、より好ましくはＳｆ９細胞である。
【００１７】
本発明において、ＳＭＳ発現昆虫細胞とは、ＳＭＳをコードするポリヌクレオチドを導入した昆虫細胞を意味する。
【００１８】
ＳＭＳをコードするポリヌクレオチドは、ＳＭＳまたはそれと実質的に同等のＳＭＳ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。
【００１９】
本発明において、ＳＭＳ１をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的には、下記（１）または（２）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（１）NCBI GENEBANKアクセッション番号:NM_147156.3塩基番号955〜2196で表される塩基配列（以下、塩基配列１と略記することがある。）、またはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）塩基配列１またはそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２０】
本発明において、ＳＭＳ２をコードするポリヌクレオチドとしては、具体的、下記（３）または（４）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（３）NCBI GENEBANKアクセッション番号: NM_152621.5塩基番号640〜1737で表される塩基配列（以下、塩基配列２と略記することがある。）、またはそれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）塩基配列２またはそれに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スフィンゴミエリン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。  
なお、本発明において、ポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、ＤＮＡおよびＲＮＡの双方が含まれる。また、ＤＮＡには、特に言及しない限り、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含まれる。ＲＮＡには、特に言及しない限り、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび合成ＲＮＡが含まれる。
【００２１】
（１）または（３）のポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ塩基配列１または塩基配列２に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法により得ることができる。また、ヒトｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲの鋳型として用い、例えば塩基配列１または塩基配列２を基に設計したプライマーを用いて、常法に従いＰＣＲを行うことによっても得ることができる。また、化学合成によっても得ることができる。
【００２２】
（２）または（４）のポリヌクレオチドは、塩基配列１または塩基配列２またはそれらに相補的な塩基配列のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。「あるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年)等に記載の方法によって得ることができる。
【００２３】
本発明において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃で加温した後、０．１ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃で洗浄した場合に、陽性のハイブリタイズのシグナルが観察される条件等が挙げられる。
【００２４】
（２）または（４）のポリヌクレオチドには、例えば、それぞれ塩基配列１または塩基配列２のヒトのポリヌクレオチドに対応するマウスやラットのような他生物種のポリヌクレオチドや、天然または非天然のアレル変異体等が含まれる。
【００２５】
（１）または（３）のポリヌクレオチドのヌクレオチドを置換して、（２）または（４）のポリヌクレオチドを定めるに当たっては、翻訳後に得られるアミノ酸が、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性、極性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するような塩基の置換を行うことができる。また、一つのアミノ酸が数個の翻訳コドンを有する場合、この翻訳コドン内での塩基の置換も勿論可能である。
【００２６】
さらに、これら（１）〜（４）のポリヌクレオチドに、精製、検出用のタグ、例えば従来公知のヒスチジンタグや、ＧＳＴタグをコードする塩基配列等を付加させてもよい。
【００２７】
昆虫細胞にＳＭＳをコードするポリヌクレオチドを導入し、ＳＭＳ発現昆虫細胞を製造する方法としては、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載の当該分野で周知慣用の方法を用いることができる。例えば、ＳＭＳのポリヌクレオチドを挿入したトランスファーベクターとバキュロウイルスを昆虫細胞にコトランスフェクションして昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ＳＭＳのポリペプチドを発現させる。
【００２８】
昆虫細胞へのコトランスフェクションの方法としては、リン酸カルシウム法（Ｃｅｌｌ，１１，２２３（１９８３））、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））等を挙げることができる。
【００２９】
バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＮＰＶ）等が挙げられる。好ましくは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、カイコガＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）であり、特に好ましくは、ＡｃＮＰＶである。
【００３０】
バキュロウイルスの昆虫細胞への感染方法としては、ＭＯＩ（感染多重度）が約０．１〜１００、好ましくは１〜１０、特に好ましくは１になるようにバキュロウイルスを昆虫細胞の培養液に添加する方法が用いられる。
【００３１】
トランスファーベクターの種類は特に限定されないが、例えばｐＰＳＣ８、ｐＦａｓｔＢａｃ等であり、好ましくはｐＰＳＣ８である。これらのトランスファーベクターは市販のものを用いることもできる。
【００３２】
発現したＳＭＳの量と質の確認は、それ自体公知の方法、例えば、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ. Biol. Chem.），267，19555-19559（1992）に記載の方法に従って行うことができる。
【００３３】
本発明のＳＭＳ発現昆虫細胞の膜画分としては、前記ＳＭＳ発現昆虫細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことを言う。細胞の破砕方法としては、例えばホモジナイザー（例えば、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｉｅｍ型ホモジナイザー）で細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーまたはポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社）による破砕、超音波による破砕、あるいはフレンチプレス等で加圧しながら細いノズルから細胞を噴出させることによる破砕等が挙げられる。また、細胞膜の分画方法としては、例えば、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法等の遠心力による分画法が挙げられる。
［ＳＭＳ活性の測定方法］
本発明のＳＭＳ活性測定方法は、（１）ＳＭＳを含有する検体を用いて、セラミドとホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程、（２）該スフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させる工程、（３）該蛍光物質の蛍光強度を測定する工程の３段階の操作からなる。
【００３４】
工程（１）のＳＭＳによる、セラミドとホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成する反応は、公知の反応であり、その条件等は公知の方法を考慮して適宜決定できる。例えば、適当なアッセイバッファー（好ましくは、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）中で、ＳＭＳを含有する検体とセラミド（好ましくはＣ６セラミド）とホスファチジルコリンを含有する基質溶液を混合し、３７度付近で約３０分〜約４時間、好ましくは１時間反応させることにより行うことができる。
【００３５】
工程（１）のセラミドとホスファチジルコリンは、標識されたものを使用しなくても良いため、非標識なものでも標識されたものでも構わないが、好ましくは非標識なものである。
【００３６】
工程（１）として好ましくは、ＳＭＳを含有する検体を用いて、非標識のセラミドと非標識のホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程である。
【００３７】
本発明において、セラミドとホスファチジルコリンは市販のものを使用でき、その混合比は、ＳＭＳ酵素反応が効率よく進むものならどのような比率でも構わないが、例えば、ホスファチジルコリンを重量比でセラミド１に対し、約０．１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１０の割合で用いる。
【００３８】
工程（１）のＳＭＳの酵素反応を行った後、工程（２）の酵素反応を行う前に、ＳＭＳを失活させる工程を含むことが適当である。ＳＭＳは、例えば、工程（１）の反応終了後の混合物に塩酸（好ましくは、０．１２５Ｎ塩酸）を加えることで失活させることができる。
【００３９】
ＳＭＳを失活させた反応混合物は、次いで工程（２）に用いられる。
【００４０】
工程（２）の反応は公知の反応であり、条件等は公知の方法を考慮して適宜決定できる。  
工程（２）の反応は、例えば、適当なアッセイバッファー（好ましくは、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）中で、前記ＳＭＳを失活させた反応混合物、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を混合し、３７度付近で約３０分〜約４時間、好ましくは１時間反応させることにより行うことができる。
【００４１】
工程（２）の蛍光試薬として好ましくは、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄである。ペルオキダーゼの存在下で、過酸化水素とＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄを反応させると、強い蛍光性の化合物（蛍光物質）であるレゾルフィンが生じる。
【００４２】
工程（３）の蛍光強度の測定は、公知の各種の方法で行うことができる。レゾルフィンを測定する場合には、例えば、モルキュラーデバイス社製Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ３により励起波長５３０〜５６０ｎｍ（好ましくは５５５ｎｍ）、検出波長５９０〜６００ｎｍ（好ましくは５９５ｎｍ）における蛍光強度を測定することができる。
【００４３】
上記蛍光強度は、ＳＭＳによって生成するスフィンゴミエリン量に依存するため、ＳＭＳ活性は、上記蛍光強度を指標に測定できる。
【００４４】
本発明において、ＳＭＳを含有する検体が、ＳＭＳ発現遺伝子を導入した細胞またはその膜画分である場合には、偽形質転換した細胞（ｍｏｃｋ）またはその膜画分を陰性対照として置き、陰性対照との差を算出することで、より正確にＳＭＳ活性を測定することができる。
【００４５】
本発明において、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄは、市販のものを使用できる。
［ＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬のスクリーニング方法］
本発明のＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬のスクリーニング方法は、（１）被検物質の存在下または非存在下、ＳＭＳを含有する検体を用いて、セラミドとホスファチジルコリンからスフィンゴミエリンを生成させる工程、（２）該スフィンゴミエリンを分離することなく、スフィンゴミエリナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび蛍光試薬を含む組成物と混合して蛍光物質を発生させる工程、（３）該蛍光物質の蛍光強度を測定する工程、（４）該被検物質の存在下における該蛍光強度と、該被検物質の非存在下における該蛍光強度を比較して、該被検物質がＳＭＳ活性を阻害する物質であるか、あるいは、促進する物質であるかを判断する工程の４段階の操作からなる。
【００４６】
（１）の被検物質の共存下でのＳＭＳの酵素反応は、被検物質を共存させること以外は、前記ＳＭＳ活性の測定方法の（１）の工程と同様に行うことができる。また、必要により、被検物質とＳＭＳを含有する検体のプレインキュベーションを行った後、セラミドとホスファチジルコリンを加えて、酵素反応を開始してもよい。プレインキュベーションを行う時間として、例えば約１０分〜６０分が挙げられる。
【００４７】
本発明において、被検物質は、低分子化合物でも、オリゴマーまたはポリマーで有っても良く、また単独でも複数の組み合わせでもよい。
【００４８】
本発明において、ＳＭＳを含有する検体としては、測定感度の観点から、ＳＭＳ発現昆虫細胞の膜画分が最適である。
【００４９】
（２）および（３）の工程は、前記ＳＭＳ活性の測定方法の（２）および（３）の工程と同様に行うことができる。
【００５０】
（４）の工程では、被検物質存在下における蛍光強度と、被検物質非存在下における蛍光強度を比較し、前者のほうの蛍光強度が低い場合（例えば、被検物質非存在下の蛍光強度と比較して、５％以上あるいは１０％以上低値である場合）には、その被検物質は、ＳＭＳ活性を阻害する物質であると決定することができる。また、被検物質存在下における蛍光強度と、被検物質非存在下における蛍光強度を比較し、前者のほうの蛍光強度が高い場合（例えば、被検物質非存在下の蛍光強度と比較して、５％以上あるいは１０％以上高値である場合）には、その被検物質は、ＳＭＳ活性を促進する物質であると決定することができる。
【実施例】
【００５１】
本発明を下記実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
実施例１：ＳＭＳ１発現昆虫細胞の膜画分の調整
（１）ＳＭＳ１発現ベクターの構築
ＳＭＳ１をコードするＤＮＡ（塩基配列１）をトランスファーベクター（ｐＰＳＣ８）にクローニングし、大腸菌ＤＨ５αで形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体から目的配列を有するクローンを選択した。
（２）コトランスフェクション
次に、２５ｃｍ２フラスコに播いた１．０ｘ１０６個のＳｆ９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１７１１）に、上記ＳＭＳ１発現ベクター約２μｇ、Ｌｉｎｅａｒ  ＡｃＮＰＶ  ＤＮＡ８５ｎｇ、及びＩｎｓｅｃｔ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（メルク社）５μＬを含むＳＦ９００ＩＩ（インビトロジェン社）２００μＬを加えた。２８℃で５日間培養後、培養上清を回収し、コトランスフェクション溶液とした。
（３）組換えウイルスの純化
組換えウイルスの純化はプラークアッセイ法で行った。上記コトランスフェクション液をＳＦ９００ＩＩで１０２、１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７倍に希釈し、直径６０ｍｍのシャーレに播いた２．０ｘ１０６個のＳｆ９細胞に１ｍＬずつ加え、室温で１時間穏やかに振盪した。シャーレのウイルス液を取り除き、０．５％  ＳｅａＫｅｍＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ（タカラバイオ社）を含むＳＦ９００ＩＩ４ｍＬをシャーレに流し込み、２８℃で８日間培養した。多角体の無いプラーク３個を培地ごと採取し、各々１ｍＬのＳＦ９００ＩＩに懸濁させ、組換えウイルス原液とした。
（４）組換えウイルス液の作成
２５ｃｍ２フラスコに播いた２．０ｘ１０６個のＳｆ９細胞に、上記組換えウイルス原液を０．５ｍＬ加え、２８℃で３日間培養した（第１代ウイルス液）。７５ｃｍ２フラスコに播いた６．０ｘ１０６個のＳｆ９細胞に、上記第１代ウイルス液を全量加え、２８℃で３日間培養した。培養後培養上清を回収し、３，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清と沈殿に分画した。この上清をウイルス液として回収した（第２代ウイルス液）。１．５ｘ１０６個／ｍＬになるようにＳＦ９００ＩＩで希釈したｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞を１２５ｍＬ三角フラスコ１本に５０ｍＬ用意した。これに第２代ウイルス液を０．５ｍＬ添加し、１３０ｒｐｍ、２８℃で３日間振盪培養した。培養後、１０，０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清と沈殿に分画した。この培養上清をウイルス液として回収し、第３代ウイルス液とした。
（５）ＳＭＳ１発現昆虫細胞の生産
１．５ｘ１０６個／ｍＬになるようにＳｆ９００ＩＩで希釈したｅｘｐｒｅｓＳＦ＋（登録商標）細胞１Ｌ相当を用意した。これに上記第３代ウイルス液をＭＯＩ（感染多重度）＝１となるよう添加し、１３０ｒｐｍ、２８℃で振盪培養した。４８時間後に細胞培養液を回収し、３，０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離を行い、細胞を回収した。
（６）ＳＭＳ１発現昆虫細胞の膜画分の調整
回収した細胞をホモジナイズ用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁後、ＰＨＹＳＣＯＴＲＯＮ（マイクロテック・ニチオン株式会社）でｏｕｔｐｕｔ ８、１０秒間の破砕を２０回行った。その後、４℃、５００ｘｇで３０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を次に４℃、１００，０００ｘｇで６０分間遠心し、得られた沈殿をホモジナイズ用緩衝液６ｍＬに再懸濁し、これを細胞膜画分とした。調製した膜画分は、適当量に分注して使用時まで−８０℃で保存した。
実施例２：ＳＭＳ２発現昆虫細胞の膜画分の調整
（１）ＳＭＳ２発現ベクターの構築
ＳＭＳ１をコードするＤＮＡ（塩基配列１）の代わりに、ＳＭＳ２をコードするＤＮＡ（塩基配列２）を用いて実施例１の（１）と同様の方法によりＳＭＳ２発現ベクターを構築した。
（２）ＳＭＳ２発現昆虫細胞の膜画分の調整
ＳＭＳ１発現ベクターの代わりに、ＳＭＳ２発現ベクターを用いて、実施例１の（２）〜（６）と同様の方法を用いて、ＳＭＳ２発現Ｓｆ９細胞の膜画分を調整した。
実施例３：ＳＭＳ発現昆虫細胞の膜画分中のＳＭＳ活性測定
（１）基質溶液（Ｃ６セラミドとホスファチジルコリンのコンプレックス（１：１０））の調整
１０ｍｇのＣ６セラミド（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を適量のクロロホルムに溶かし、１００ｍｇ相当のホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）のクロロホルム溶液を加え、ボルテックスした。窒素ガスを静かに吹き付けつつ３７℃でインキュベートし、クロロホルムを蒸発させた。１％オクチルβ−グルコシド溶液３３．３ｍｌ加え、ボルテックスとソニケーションを行い、溶液が均一で透明であることを確認した。適当量に分注して、使用時まで−２０℃で保存した。
（２）活性測定
９６ウェルプレートに、実施例１または実施例２で調整したＳＭＳ１またはＳＭＳ２発現Ｓｆ９細胞の膜画分、あるいは偽形質転換したＳｆ９細胞（ｍｏｃｋ）の膜画分２０μＬ、実施例３（１）で調整した基質溶液１０μＬ、アッセイバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．４、２５ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）７０μＬを加え、３７℃で１時間反応を行った。反応後、０．１２５Ｎ塩酸を１００μＬ添加し、酵素反応を停止した。次いで、この反応液２０μＬ、１Ｕ／ｍＬスフィンゴミエリナーゼ２．５μＬ、２５Ｕ／ｍＬアルカリ性ホスファターゼ０．２μＬ、３００Ｕ／ｍＬコリンオキシダーゼ０．１μＬ、１０００Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ０．２μＬ、１０ｍＭ  Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ０．７５μＬ、アッセイバッファー８６．２５μＬを混合し、３７℃で１時間反応を行った。一方、膜画分のみ、または基質のみを含有するウェルをブランクとした。
【００５２】
反応後、モルキュラーデバイス社製Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ３により、励起波長５５５ｎｍ、蛍光波長５９５ｎｍにおける蛍光強度を測定し、得られた結果から、ブランクを差し引いた値を、ＳＭＳ活性の指標とした。
【００５３】
結果を図２に示す。なお、図中、黒四角印はＳＭＳ１発現Ｓｆ９細胞の膜画分を用いた結果を、黒三角印はＳＭＳ２発現Ｓｆ９細胞の膜画分を用いた結果を、白丸印はｍｏｃｋの膜画分についての結果をそれぞれ示す。
【００５４】
図２から、ＳＭＳ１およびＳＭＳ２発現Ｓｆ９細胞の膜画分中のＳＭＳ活性はともに、膜画分の蛋白量に応じた上昇を示し、定量的な測定結果が得られた。また、ｍｏｃｋとの差を算出することにより、より正確にＳＭＳ活性を測定できることがわかった。
【００５５】
以上の結果から、本発明方法を用いることで、ＳＭＳ活性を簡便、かつ高速に測定できることが明らかとなった。また、本発明方法は、ＳＭＳ活性の阻害薬または促進薬の高速スクリーニングに利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明は、細胞増殖抑制を必要とする疾患、例えば、白血病、癌、自己免疫疾患等の治療に極めて有用であると考えられているＳＭＳ活性阻害薬や、細胞増殖を必要とする疾患、例えば、骨髄異形成症候群、骨髄移植後の造血抑制等の治療に極めて有用であると考えられているＳＭＳ活性促進薬を、簡便かつ高速にスクリーニングすることができる新規なＳＭＳ活性測定方法を提供するものであり、新規の医薬品を創出するのに有用である。
【図１】
2013017394.tif 000003
【図２】
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