(57)【要約】【課題】ホルモン療法耐性乳癌細胞株、及びこれを用いた薬剤スクリーニング方法を提供する。【解決手段】ＧＦＰ遺伝子を発現しうるホルモン療法耐性乳癌細胞に被験物質を接触させる工程と、この細胞を培養し、細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現を測定する工程と、前記被検物質が細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現の低減をもたらしたかどうかを判定する工程とを含み、前記細胞が、エストロゲン非依存性、かつ、エストロゲンレセプター（ＥＲ)活性依存性である細胞株、エストロゲン非依存性、かつ、ＥＲ活性非依存性である細胞株、エストロゲン非依存性、ＥＲ活性非依存性、かつ、成長因子（ＧＦ）依存性であり、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲを発現する細胞株、アンドロゲン代謝産物依存性である細胞株、及び／又はアロマターゼ阻害剤（ＡＩ）非感受性、かつ、ＥＲ活性依存性である細胞株、のいずれか１以上であることを特徴とする、乳癌治療剤スクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモン療法に耐性を示す乳癌の治療剤をスクリーニングする方法であって、エストロゲン応答配列の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を発現しうるホルモン療法耐性乳癌細胞に被験物質を接触させる工程と、この細胞を培養し、細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現を測定する工程と、前記被検物質と接触させていない前記ホルモン療法耐性乳癌細胞を同じ条件下で培養及び測定した結果と比較して前記被検物質が細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現の低減をもたらしたかどうかを判定する工程とを含み、
前記ホルモン療法耐性乳癌細胞が、
エストロゲン非依存性、かつ、エストロゲンレセプター（ＥＲ)活性依存性である細胞株（タイプ１）、
エストロゲン非依存性、かつ、ＥＲ活性非依存性である細胞株（タイプ２）、
エストロゲン非依存性、ＥＲ活性非依存性、かつ、成長因子（ＧＦ）依存性であり、ＨＥＲ２及び上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を発現する細胞株（タイプ３）、
アンドロゲン代謝産物依存性である細胞株（タイプ４）、及び／又は
アロマターゼ阻害剤（ＡＩ）非感受性、かつ、ＥＲ活性依存性である細胞株（タイプ５）、
のいずれか１以上であることを特徴とする、乳癌治療剤スクリーニング方法。
【請求項２】
前記ホルモン療法耐性乳癌細胞として、タイプ１〜タイプ５のうち２以上の細胞株を用いてそれぞれの細胞を別々に被験物質に接触させる、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記ホルモン療法耐性乳癌細胞が、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４２であるタイプ１細胞、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４３であるタイプ２細胞、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４４であるタイプ３細胞、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４５であるタイプ４細胞、及び／又は
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４６であるタイプ５細胞、
である、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４２である細胞。
【請求項５】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４３である細胞。
【請求項６】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４４である細胞。
【請求項７】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４５である細胞。
【請求項８】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４６である細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルモン療法耐性乳癌細胞株、及びそれを用いた乳癌治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲンは、乳癌の発生及び増殖に深く関係する女性ホルモンであり、乳癌細胞の多くはエストロゲン依存性に増殖するホルモン依存性腫瘍である。乳癌細胞がエストロゲンを受容すると、エストロゲンレセプター（ＥＲ）を介して細胞増殖に関わるシグナル伝達系が活性化され、細胞増殖が促進されて癌が進展する。
【０００３】
乳癌患者の７０％以上の乳癌はエストロゲンレセプター（ＥＲ)陽性であり、ホルモン療法の治療対象である。
【０００４】
乳癌治療薬としてのホルモン剤は、大きく２種類に分類される。一つは、エストロゲンレセプターの阻害作用を示す薬剤（抗エストロゲン剤；タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ラロキシフェンなど）であり、もう一つは、エストロゲン合成酵素であるアロマターゼを阻害する薬剤（アロマターゼ阻害剤（ＡＩ）；アナストロゾール、レトロゾール、エグゼメスタンなど）である。
【０００５】
しかし、これらの薬剤はいずれも、やがて耐性を獲得されてしまうという問題がある。ホルモン療法を受けた乳癌患者のうち１／３は、癌がホルモン治療に耐性を獲得し、再発する。再発後は、化学療法が行われるが、予後が不良であり、治療が困難である。したがって、ホルモン療法耐性の獲得が、臨床上、重大な問題となっており、耐性機序の解明と新たな治療方法が望まれている。
【０００６】
現在、ホルモン療法耐性機構として、（１）増殖因子シグナルカスケードの亢進、（２）ＨＥＲ２の発現増加によるシグナルカスケードの亢進、（３）エストロゲン非依存的なＥＲ活性化、（４）アンドロゲン代謝産物によるＥＲ活性化、（５）薬物代謝能や薬物排出能の亢進などが考えられている（非特許文献１：医学のあゆみ  Vol.230(1)p.31-36（2009)）。
【０００７】
ホルモン療法耐性機序の解明及び新たな治療剤の開発のため、種々の試みが行われている。例えば、国際公開ＷＯ２００６−１２９７３５号公報（特許文献１；「遺伝子導入細胞及び細胞分析法」）には、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ）を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子の転写開始点上流に配置した発現レポーター遺伝子を安定導入したＥＲ陽性乳癌細胞株を用いて、患者から採取した組織切片から、当該患者にとってアロマターゼ阻害剤（ＡＩ）が有効か否かを評価する方法が開示されている。非特許文献１（医学のあゆみ  Vol. 230(1) p.31-36 （2009)）には、エストロゲン枯渇条件下で細胞を培養し、エストロゲン枯渇耐性株を取得したことが開示されている。
【０００８】
しかし、これらの細胞株の詳細な特徴及び挙動や、ホルモン療法耐性機序に基づく新たな治療剤の開発は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６−１２９７３５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】医学のあゆみ  Vol.230 (1) p.31-36 （2009)
【非特許文献２】Cancer Sci., vol. 100 (1), p.1773-1778 (2009)
【非特許文献３】Cancer Res, vol.65, p.4653-4662 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、乳癌のホルモン療法耐性について考えられている種々の耐性機序をカバーする細胞株を提供すること、及びこれらの細胞を用いたホルモン療法耐性細胞に効果的な薬剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、ＧＦＰ遺伝子を発現レポーターとして安定導入したＥＲ陽性乳癌細胞株を親株として、長期間のホルモン療法を模倣した培養方法でＧＦＰを指標としてＡＩ耐性株を得ることにより、異なる耐性機序を有する５種類のホルモン療法耐性乳癌細胞株を樹立した。
【００１３】
したがって、本発明によれば、
〔１〕  ホルモン療法に耐性を示す乳癌の治療剤をスクリーニングする方法であって、エストロゲン応答配列の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を発現しうるホルモン療法耐性乳癌細胞に被験物質を接触させる工程と、この細胞を培養し、細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現を測定する工程と、前記被検物質と接触させていない前記ホルモン療法耐性乳癌細胞を同じ条件下で培養及び測定した結果と比較して前記被検物質が細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現の低減をもたらしたかどうかを判定する工程とを含み、
前記ホルモン療法耐性乳癌細胞が、
エストロゲン非依存性、かつ、エストロゲンレセプター（ＥＲ)活性依存性である細胞株（タイプ１）、
エストロゲン非依存性、かつ、ＥＲ活性非依存性である細胞株（タイプ２）、
エストロゲン非依存性、ＥＲ活性非依存性、かつ、成長因子（ＧＦ）依存性であり、ＨＥＲ２及び上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を発現する細胞株（タイプ３）、
アンドロゲン代謝産物依存性である細胞株（タイプ４）、及び／又は
アロマターゼ阻害剤（ＡＩ）非感受性、かつ、ＥＲ活性依存性である細胞株（タイプ５）、
のいずれか１以上であることを特徴とする、乳癌治療剤スクリーニング方法；
〔２〕  前記ホルモン療法耐性乳癌細胞として、タイプ１〜タイプ５のうち２以上の細胞株を用いてそれぞれの細胞を別々に被験物質に接触させる、前記〔１〕記載のスクリーニング方法；
〔３〕  前記ホルモン療法耐性乳癌細胞が、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４２であるタイプ１細胞、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４３であるタイプ２細胞、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４４であるタイプ３細胞、
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４５であるタイプ４細胞、及び／又は
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４６であるタイプ５細胞、
である、前記〔１〕又は〔２〕記載のスクリーニング方法；
〔４〕  受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４２である細胞；
〔５〕  受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４３である細胞；
〔６〕  受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４４である細胞；
〔７〕  受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４５である細胞；
〔８〕  受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４６である細胞、
が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞株によれば、ホルモン療法耐性乳癌の各種メカニズムに対して有効な治療方法の選択が可能となる。すなわち、本発明の５種類の細胞株は、乳癌のホルモン療法耐性の獲得に関して考えられる耐性機序のほとんどをカバーするものであり、想定されるＡＩ耐性の機序を解明するツールとして有用である。また、本発明の細胞の増殖阻害やＧＦＰ活性阻害を指標にして、従来のホルモン療法耐性細胞又はホルモン療法耐性患者に効果的な薬剤のスクリーニング及び開発が可能となる。さらに、本発明の細胞は、乳癌患者の治療選択（薬物療法）の指針となりうる。具体的には、ホルモン療法耐性乳癌のなかには、他のホルモン療法剤が有効と考えられるケース、他のホルモン療法剤と分子標的薬との併用が有効と考えられるケース、ホルモン療法剤の効果は期待できないが分子標的薬又は化学療法が適切と考えられるケース等が混在している。したがって、ホルモン療法耐性乳癌の患者について、どのようなケースに該当するかを本発明の細胞を指標としてタイピングすることにより、各タイプに対して有効な治療法を選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、タイプ１及び２細胞のエストロゲン非依存性の増殖を表す図である。１０％ＤＣＣ−ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した後、細胞を５×１０３個／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播き、種々の濃度のエストロゲンを含有するエストロゲン枯渇培地で４日間培養し、細胞数をカウントした。コントロールの細胞数に対する相対値（平均±ＳＤ）で示す。
【図２】図２は、タイプ１及び２細胞に対する抗エストロゲン薬の効果を表す図である。１０％ＤＣＣ−ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した細胞に、各抗エストロゲン薬（１μM  フルベストラント（Ｆｕｌ）、１μM  ４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）又は３μM  トレミフェン（Ｔｏｒ））又はコントロールとしてエタノール（ＥｔＯＨ）を添加して４日間培養した後、細胞数をカウントした。コントロールの細胞数に対する相対値で示す。
【図３】図３は、タイプ３細胞の増殖因子依存性を表す図である。パネルＡは各増殖因子の存在下（１００ng/mL）で１０日間培養後の細胞数（ＰＢＳを添加したコントロールを１とした相対値；平均±ＳＤ）、パネルＢはそれらの細胞のクリスタルバイオレット染色像を表す。
【図４】図４は、タイプ３細胞のＥＲ及びエストロゲン応答性遺伝子の発現を表す図である。ＴＥ８細胞はエストロゲン枯渇培地で３日間培養後エストロゲンを添加して１日培養したもの、タイプ３細胞は増殖因子培地で培養したものを用いた。パネルＡはＥＲαのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）、パネルＢはＥＲαのウェスタンブロッティング（タンパク）、パネルＣはエストロゲン応答性遺伝子ＥＧＲ３及びＰｇＲのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）の結果をそれぞれ表す。
【図５】図５は、タイプ３細胞のＨＥＲ２の発現を表す図である。パネルＡはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ）、パネルＢはウェスタンブロッティング（タンパク）の結果をそれぞれ表す。
【図６】図６は、タイプ３細胞のヒトホスホＲＴＫアレイキットによるリン酸化膜レセプター解析の結果を表す図である。パネルＡはＴＥ８細胞（普通培地）、パネルＢはタイプ３（Ｕ２５）細胞（増殖因子培地）のライセートを用いた結果を、それぞれキットの陽性コントロールに対する相対比で表す。
【図７】図７は、タイプ３細胞における分子標的薬及び抗エストロゲン薬の効果を表す図である。パネルＡ：細胞を１×１０４個／ウェルの密度で２４ウェルに播き、増殖因子培地で培養した。抗ＨＥＲ２薬であるトラスツズマブ（１５０mg/mL）、抗ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２薬であるラパチニブ（５μM）、抗ＥＧＦＲ薬であるゲフィチニブ（５μM）、抗ＥＧＦＲ薬であるエルロチニブ（５μM）を、それぞれプレートに添加し、３日後に細胞数をカウントした。パネルＢ：細胞を１．５×１０４個／ウェルの密度で２４ウェルに播き、増殖因子培地で培養した。タモキシフェン（１μM）、トレミフェン（３μM）を抗エストロゲン薬としてそれぞれプレートに添加した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。
【図８】図８は、アンドロゲン代謝産物依存性及びエストロゲン枯渇耐性細胞の選択を表す図である。ＴＳ添加ステロイド枯渇培地で３ヶ月培養した後、ＧＦＰを発現する５個のクローンを選択した。各工程でＧＦＰ陽性細胞の比率によって評価したＥＲ活性を示す。Ｖ３Ｔ及びＢ６Ｔ細胞株は、ステロイド枯渇培地においてもＥＲ活性を示し、ＥＲが構成的に活性化されていることが示された。Ｒ７ＴのＥＲ活性はレトロゾールによって抑制され、アロマターゼ依存性であることが示された。Ｇ１Ｔ及びＲ６ＴのＥＲ活性はステロイド枯渇培地で阻害されたが、レトロゾールによって阻害されなかった。これらの細胞はタイプ４（ＡＤ−ＥＤＲ）細胞株として樹立された。
【図９】図９は、タイプ４細胞におけるＤＨＴ増殖誘導がＳＥＲＭによってブロックされることを表す図である。タイプ４細胞においては、１００nM  ＤＨＴによる増殖誘導が１００nM  タモキシフェン（ＯＨＴ）又は３μM  トレミフェン（ＴＯＲ）、又は１μM  フルベストラント（ＩＣＩ）によって効率的にブロックされたが、１００nM  レトロゾール（Ｌｅｔ）によってはブロックされなかった。
【図１０】図１０は、アロマターゼ発現ベクターｐＮＨ−ＣＭＶ／ＡＲＯＭ−ＢＳＤの構造を表す図である。
【図１１】図１１は、タイプ５細胞のレトロゾール添加時のＥＲ活性を表す図である。テストステロン（１００nM）、レトロゾール（１００nM）添加時のＥＲ活性をルシフェラーゼアッセイで測定した。
【図１２】図１２は、タイプ５細胞におけるレトロゾール感受性を表す図である。Ｅ１０−Ａｒｏｍ、ＬＲ３を３日間エストロゲン枯渇培養後、２４ウェル培養プレートに１．０×１０４個／ウェル播種、テストステロン（０．１〜１００nM）、レトロゾール（１００nM）を添加し、４日後に細胞数を測定した。
【図１３】図１３は、タイプ５細胞におけるエストロンスルフェート（Ｅ１Ｓ）代謝関連遺伝子の発現を表す図である。ＬＲ３において、Ｅ１ＳをＥＳに変換する酵素であるＳＴＳ（パネルＡ）と、Ｅ１Ｓを細胞内に取り込むトランスポーターであるＯＡＴＰ−Ａ（パネルＢ）のｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【図１４】図１４は、タイプ５細胞におけるＥ１Ｓ及びＳＴＸ６４（ＳＴＳ阻害剤）感受性を表す図である。Ｅ１０−Ａｒｏｍ、ＬＲ３を３日間エストロゲン枯渇培養後、２４ウェル培養プレートに１．０×１０４個／ウェル播種、Ｅ１Ｓ（０、１００nM〜１０μM）単独あるいはＳＴＸ６４（１００nM）と組み合わせて添加し、４日後に細胞数を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の細胞株は、提唱されている各種のホルモン療法耐性メカニズムを表すものであり、タイプ１〜５に分けられる。
５種類の細胞株のうち、タイプ１、４、５はＥＲ発現株（ＧＦＰ陽性）、タイプ２、３はＥＲ非発現株（ＧＦＰ陰性）に分類される。
【００１７】
ホルモン療法耐性細胞の作製
本発明の細胞株は、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ）の下流にレポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を含むベクターで形質転換した乳癌細胞を、ホルモン療法を模した特定の培養条件下で長期培養し、所望の性質を示すものを選択することにより作製することができる。
これらの細胞は、ＥＲが活性化されるとＧＦＰを発現して蛍光を発するため、細胞が生きたままの状態でＥＲＥ活性を視覚的に捉えることができる。
本発明のタイプ１〜タイプ５のそれぞれの細胞の取得のための具体的手順は、実施例において詳述するとおりである。
【００１８】
タイプ１細胞株
タイプ１細胞株（ＧＦＰ陽性）は、ＥＲの過剰発現及びいくつかのＥＲ標的遺伝子の構成的な高発現を示す。ＨＥＲ２発現の有意な誘導は示さない。総合的なリン酸化プロテオミクス解析により、タイプ１細胞では、細胞内リン酸化シグナル経路が動的変化をしていることがわかった。
抗エストロゲン薬により、タイプ１細胞株の生育は阻害される。
本発明のタイプ１細胞は、ＥＲαの過剰発現を示し、エストロゲンに対し過敏性を示すが、エストロゲンに対する細胞増殖依存性は親細胞よりもはるかに低い。ＥＲαの過剰発現は、タイプ１細胞の生存のためにエストロゲン非依存性を補完すると思われる。
さらに、ＭＡＰキナーゼ経路の有意な誘導が観察された。タイプ１（ＧＦＰ陽性）細胞は、細胞間リン酸化経路の変化が示唆されており、特に、ＰＫＡ経路は、エストロゲン非依存性ＥＲ活性化に重要と考えられる。
【００１９】
タイプ２細胞株
タイプ２細胞株（ＧＦＰ陰性）は、ＥＲ及びその標的遺伝子の顕著なダウンレギュレーションを示す。さらに、細胞内シグナル伝達因子ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の構成的活性化が観察される。タイプ２細胞株については、ＭＡＰキナーゼ経路の有意な誘導が観察された。
【００２０】
抗エストロゲン薬により、タイプ２細胞株の生育は阻害されない。一方、タイプ２細胞株では、ＪＮＫ阻害剤又はＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）標的薬により生育が阻害される。ＪＮＫ経路は、ホルモン療法耐性乳癌の新規な治療標的でありうる。
【００２１】
タイプ２細胞は、エストロゲン非依存性及びＥＲ非依存性増殖メカニズムを獲得した細胞である。これらの細胞株は、リン酸化ＪＮＫの強い誘導及びＡＰ-１転写活性の有意な活性化を示した。ＪＮＫ経路は、種々の癌の増殖及び発展に重要な役割を果たすことが報告されているので、これらの細胞のエストロゲン及びＥＲ非依存性は、このシグナル経路の構成的活性化によって獲得された可能性がある。
【００２２】
タイプ１及びタイプ２についてのこれらの結果は、ＥＲ陽性乳癌細胞が、ＥＲ依存性及び非依存性の複数のメカニズムによってエストロゲン枯渇耐性を獲得しうることを示す。
【００２３】
タイプ３細胞株
タイプ３細胞株は、エストロゲン枯渇培地では生存できず、増殖因子（特にＥＧＦ及びＴＧＦ−α）を添加したエストロゲン枯渇培地で生存することができる。当初はＧＦＰ蛍光を強く発していたが、短期間のうちにＧＦＰ発現を消失した。また、ＥＲ発現も劇的に低下し、機能を失った。さらに、増殖因子レセプターによる細胞内シグナル伝達は、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ及びＪＮＫ経路の分子を増大させた。
タイプ３細胞は、ＥＧＦＲ標的薬により有意に増殖が阻害される。これらの結果から、タイプ３細胞は、エストロゲン非依存性、かつ増殖因子依存性の細胞増殖メカニズムを獲得したことが示唆される。さらに、細胞内シグナル経路は、タイプ３細胞においては、親細胞であるＴＥ８と比較して変化している。
【００２４】
タイプ４細胞株
タイプ４細胞株は、アンドロゲン代謝産物依存性、かつエストロゲン枯渇耐性である。タイプ４細胞株は、アンドロゲンからの局所的エストロゲン産生を再現するストローマ細胞（間質細胞）との共培養においてレトロゾール（Ｌｅｔ）耐性ＥＲ活性を示し、ＡＩ耐性モデルとして使用することができる。タイプ４細胞株は、アンドロゲン又は３β−ジオールの存在下で増大したＥＲ活性及び増殖を示し、これはレトロゾールによって阻害されない。リアルタイムＰＣＲ解析によって、タイプ４細胞におけるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）代謝酵素３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼタイプ１（３β−ＨＳＤタイプ１：ＨＳＤ３Ｂ１）のｍＲＮＡ発現の増大及びアンドロゲンレセプター（ＡＲ）発現の低減が示された。さらに、タイプ４細胞においては、アンドロゲン又は３β−ジオールによってエストロゲン応答性遺伝子ＰｇＲ及びＥＧＲ３の発現が誘導されるが、アンドロゲン応答性遺伝子ＫＬＫ３は誘導されない。これらのデータから、増大したＤＨＴ代謝及びＡＲシグナルの中断がアロマターゼ阻害剤によって誘導されるエストロゲン枯渇及びアンドロゲン過剰条件に対する適応性を与えることが示唆される。
【００２５】
アンドロゲン又は３β−ジオールによって誘導されるＥＲ活性の解析により、タイプ４細胞株の３β−ジオールに対する過敏性及びアンドロゲン耐性が示された。ｍＲＮＡ発現の定量的解析により、タイプ４細胞における増大したＤＨＴ代謝及びアンドロゲンシグナルの中断のため、アンドロゲン又は３β−ジオールがアロマターゼ非依存的に、よりエストロゲニックな挙動を示すことが示唆された。言い換えれば、エストロゲン性アンドロゲン代謝産物による低減したＡＲシグナル及び増大したＥＲシグナルは、アロマターゼ活性に依存せずに、エストロゲン枯渇条件への適合性をこれらの細胞株に与えうる。タイプ４細胞株に対する、３β−ＨＳＤタイプ１の特異的阻害剤であるトリロスタンの有効性は認められなかった。３β−ＨＳＤタイプ１は、ＤＨＴを３β−ジオールに代謝する唯一の酵素ではないため、ＤＨＴは他の酵素で代謝され、トリロスタンによってその活性が抑制される３β−ＨＳＤタイプ１が補償されると考えられる。タイプ４細胞についてのインビトロでのデータは、アンドロゲン又はその代謝産物によって誘導されるＥＲ活性化及びアンドロゲンシグナル中断がＡＩ耐性において重要な役割を果たすこと、及びＡＲ又はアンドロゲン代謝酵素の発現レベルが臨床的乳癌におけるＡＩ耐性の生物学的マーカーとして有用であることを示唆する。
【００２６】
ＥＲ依存性を維持するいくつかのクローンがＡＩ処理を模した条件下で樹立され、これらのタイプ４細胞のＤＨＴによる増殖誘導は選択的エストロゲンレセプター調節剤（ＳＥＲＭ）によって効率的に阻害されるが、レトロゾールによっては阻害されない。これらの知見から、ＡＩの後にＳＥＲＭを連続して使用することの有効性が支持される。
【００２７】
タイプ４細胞株は、インビトロでのＡＩ耐性のメカニズムを研究するために有用であり、ＡＩ耐性進行乳癌についての診断マーカー及び新規治療戦略の開発に有用である
【００２８】
タイプ５細胞株
タイプ５細胞株は、エストロゲン依存性、かつＥＲ依存性のレトロゾール(Ｌｅｔ)耐性細胞である。親細胞であるＭＣＦ―７―Ｅ１０ａｒｏｍは、テストステロン存在下でＥＲ活性及び増殖を示し、これがＬｅｔによって阻害されるが、タイプ５細胞株は阻害されない。タイプ５細胞株は、エストロン（Estrone；Ｅ１）スルフェート（Ｅ１Ｓ）に対する感受性が親細胞よりも高く、またリアルタイムＰＣＲ解析によって、Ｅ１Ｓを細胞内に取り込むトランスポーターであるＯＡＴＰ―Ａ、及びＥ１ＳをＥ１に変換する酵素であるステロイドスルファターゼ（Steroid sulfatase；ＳＴＳ）のｍＲＮＡの発現の増大が示された。さらに、Ｅ１Ｓによって誘導される細胞増殖は、ＳＴＳ阻害剤であるＳＴＸ６４により阻害されることが確認された。これらのデータから、タイプ５細胞株はＳＴＳやＯＡＴＰ―Ａの発現を増大させ、アロマターゼ非依存的にエストロゲンを産生する経路を亢進することで、Ｌｅｔ耐性を獲得していることが示唆される。また、タイプ５細胞株についてのインビトロでのデータは、ＳＴＳやＯＡＴＰ―Ａによるエストロゲン産生の増大がＡＩ耐性において重要な役割を果たすこと、及びＳＴＳ阻害剤のＡＩ耐性患者への有用性や、ＳＴＳやＯＡＴＰ―Ａの発現レベルが臨床的乳癌におけるＡＩ耐性の生物学的マーカーとして有用であることを示唆する。
【００２９】
本発明の細胞株のうち、以下のものは、２０１１年７月８日付けで独立行政法人  産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  つくばセンター中央第６）に寄託された。
タイプ１：クローンＡ２（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４２）。
タイプ２：クローンＡ４（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４３）。
タイプ３：クローンＵ２５（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４４）。
タイプ４：クローンＧ１Ｔ（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４５）。
タイプ５：クローンＬＲ３（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２２１４６）。
【００３０】
スクリーニング方法
本発明の細胞株を用いて、ホルモン療法耐性乳癌に対して有効な治療剤をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の細胞株に被験物質を接触させる工程と、細胞を培養する工程と、細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現を測定する工程とを含む。その結果、前記被検物質と接触させていない以外は同様に処理した本発明の細胞株と比較して細胞の増殖及び／又はＧＦＰの発現が低減していれば、その被検物質は細胞増殖を抑制したと判定することができる。
【００３１】
細胞と被検物質との接触は、培地に被検物質を添加することにより容易に行うことができる。被検物質との接触は、短時間のパルスで行ってもよく、培養期間中を通じて培地に存在させてもよい。したがって、接触と培養とは同時に行うことができる。培地としては、必要に応じて以下に説明する普通培地、エストロゲン枯渇培地、又はこれらに所定の添加物を添加した培地等を使用することができる。細胞の増殖は、常法により細胞数をカウントすること等により、行うことができる。ＧＦＰの発現は、例えば、蛍光顕微鏡下で蛍光を発する細胞の比率を測定すること等により測定することができる。
【００３２】
スクリーニングに用いる本発明の細胞株としては、タイプ１〜タイプ５のいずれか１以上のタイプであればよいが、２以上を用いて各タイプに対する同じ被検物質の効果の差を調べることができる。また、２以上を用いていずれか１つのタイプにのみ有効な被検物質を選択することができる。
【００３３】
本発明の細胞は、上述のようにしてインビトロでの薬剤スクリーニングに用いることができるのに加えて、これらの細胞を動物に移植してそれぞれの機序のモデル動物を作製し、より個体に近い実験系で薬剤の効果を評価するために使用することができる。
【００３４】
また、新規な薬剤を見出すことだけでなく、既存薬剤の投与順序や併用の組合せ等に関しても、最適な方法を見出すために、上記と同様のインビトロ又はインビボ実験を行うことができる。
【００３５】
治療選択法
また、本発明の細胞は、個々の患者に最適な治療選択を可能にするための情報を提供することができる。具体的には、ホルモン療法耐性乳癌のなかには、他のホルモン療法剤が有効と考えられるケース、他のホルモン療法剤と分子標的薬との併用が有効と考えられるケース、ホルモン療法剤の効果は期待できないが分子標的薬又は化学療法が適切と考えられるケース等が混在していると考えられる。したがって、ホルモン療法耐性乳癌の患者について、どのようなケースに該当するかを本発明の細胞を指標としてタイピングすることにより、各タイプに対して有効な治療法を選択することができる。例えば、タイプ１についてはリン酸化ＥＲ、タイプ２についてはｐＪＮＫ、タイプ３についてはＨＥＲ２、タイプ４についてはＡＲ、及びタイプ５についてはＳＴＳといったタンパク又は遺伝子の発現を指標として患者から採取した乳癌組織片がどの対応に該当するかを例えば免疫染色等によってタイピングし、該当したタイプの細胞に対して有効性の高い治療法をその患者の最適な治療法として選択することができる。
【実施例】
【００３６】
Ｉ．ホルモン療法耐性乳癌細胞株の樹立
１．樹立に使用した親細胞
親細胞として、ｐｄ２ＥＧＦＰ−１ベクター（Clontech）において半減期の短いＧＦＰのｃＤＮＡの上流にエストロゲン応答配列（ＥＲＥ）を配したレポータープラスミド（特許文献１）を安定的に導入したＥＲ陽性ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７−Ｅ１０細胞（「Ｅ１０細胞」と呼ぶことがある；特許文献１）を、タイプ１、２、４細胞株の樹立のために用いた。同じプラスミドを導入したＥＲ陽性ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ−ＴＥ８細胞（「ＴＥ８細胞」と呼ぶことがある）を、タイプ３細胞株の樹立のために用いた。ＴＥ８細胞は以下のIII．に記載する方法で作製した。
タイプ５細胞株の樹立のための親細胞としては、以下のＶ．に記載するとおりに作製したＥ１０−Ａｒｏｍを用いた。
【００３７】
２．細胞培養法
細胞の通常の培養には、１０％ＦＣＳ（Tissue Culture Biologicals）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（SIGMA）（「普通培地」と呼ぶことがある）を用いた。
耐性株のエストロゲン枯渇培養には、１０％デキストラン被覆チャコール処理ＦＣＳ（ＤＣＣ−ＦＣＳ；Tissue Culture Biologicals）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（GIBCO）を添加したフェノールレッド無含有ＲＰＭＩ１６４０培地（GIBCO）（「枯渇培地」又は「エストロゲン枯渇培地」と呼ぶことがある）を用いた。
【００３８】
細胞は、すべて５％ＣＯ２、３７℃に調整したＣＯ２インキュベーターで培養した。
【００３９】
特に記載がない場合、実験結果は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。
【００４０】
３．試薬等
エストラジオール、タモキシフェン（４−ヒドロキシタモキシフェン（4-hydroxytamoxifen））、テストステロン、ＤＨＴ、３β−ジオール、デキサメタゾンは、Sigma-Aldrich Corpから購入した。抗ＥＲ抗体（Ｈ−１８４)は、Santa Cruz Biotechnology Inc.、抗ヒトｅｒｂＢ２抗体はDako Cytomationからそれぞれ入手した。抗ＥＧＦＲ (Ｖ２７９)、抗Ａｋｔ、抗リン酸化Ａｋｔ (Ｔｈｒ３０８)、抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫ、抗４４／４２ ＭＡＰＫ (Ｅｒｋ１／２)、抗リン酸化４４／４２ ＭＡＰＫ(Ｅｒｋ１／２) (Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４)、抗リン酸化Ｃ−Ｒａｆ (Ｓｅｒ２５９)、抗β−チューブリン抗体は、Cell Signaling Technologyから入手した。
トラスツズマブ（Trastuzumab ；商品名「ハーセプチン」)及びエルロチニブ（erlotinib；商品名「タルセバ」）は中外製薬 (Tokyo, Japan)から、ラパチニブ（lapatinib）はGlaxoSmithKline plc. (Brentford, UK)から、ゲフィチニブ（gefitinib；商品名「イレッサ」）はアストラゼネカ(Osaka, Japan)から、トレミフェン（toremifen）は日本化薬(Tokyo, Japan)から、それぞれ入手した。レトロゾールはノバルティスファーマ（Tokyo, Japan）から、フルベストラントはアストラゼネカから、それぞれ入手した。トリロスタン（３β−ＨＳＤタイプ１阻害剤）はTronto Research Chemicals（North York, Canada）から、及びバイカルタミド（アンドロゲンレセプター阻害剤）はLKT Laboratories（St. Paul, MN, USA）から、それぞれ入手した。
【００４１】
４．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
それぞれの条件下で培養した細胞から商品名「Isogen」（Nippon Gene）を用いて総ＲＮＡを抽出し、商品名「RNA PCR kit」（Takara Shuzo）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、商品名「StepOne real-time PCR system」（Applied Biosystems）を用いて標準プロトコールにしたがって行った。目的の遺伝子の発現を、内部標準としてのＧＡＰＤＨ又はＲＰＬ１３Ａに対する相対値として算出した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で示した。
【００４２】
５．ウェスタンブロッティング
１００mmディッシュで増殖させた細胞を氷冷生理食塩水で洗浄し、ホスファターゼ阻害剤カクテル(「Phos STOP」、Roche)及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）を含む１mLのリシスバッファー（「Complete Lysis-M」、Roche Diagnotics GmbH）で溶解させた。５分後、ライセートをパルスソニケーションに供し、１４，０００rpmで１０分間遠心分離した後、１０％ポリアクリルアミドゲル（Wako）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質をＰＶＤＦ膜（GE Healthcare Bioscience）に転写した。この膜を、一次抗体（５％ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０含有中）と反応させた。次に、西洋ワサビ結合二次抗体を適用した。化学発光基質（「Immunsutar AP substrate」、 BIO-RAD）と反応させた後、目的のタンパクのバンドを、Ｘ線フィルムを感光させることにより可視化した。
【００４３】
６．ルシフェラーゼアッセイ
ＥＲＥ活性を、商品名「Dual-Luciferase Reporter System」（Promega）を用いて、基本的にBiochem Biophys Res Commun 2001, 285:340-347に記載された方法に従って測定した。枯渇培地で３日間培養後、５×１０４個の細胞を６cmディッシュに播き、同じ培地中で４８時間培養した。０．５μgのエストロゲンレポータープラスミド（Ｔｋ−ＥＲＥ−Ｌｕｃi）及び０．０５μgのコントロールベクター（ｐＲＬ―ＴＫ, Promega）を３００μLの無血清培地中で５μLの商品名「TransIt」LT-1試薬(Takara Bio)と混合し、製造業者の指示書に従ってトランスフェクションを行った。薬剤の存在下又は非存在下で２４時間細胞を培養した後、商品名「Dual-Luciferase Reporter System」（Promega）を製造業者の指示書に従って用いてルシフェラーゼ活性を測定し、コントロールに対する相対値を算出した。
【００４４】
II．  タイプ１細胞株及びタイプ２細胞株の作製及び特徴づけ
１．タイプ１細胞株及びタイプ２細胞株の樹立
普通培地で培養していたＥ１０細胞を枯渇培地に播種し、長期的にエストロゲン枯渇培養した。大部分の細胞は増殖が止まり死に至ったが、一部の細胞は、エストロゲン枯渇耐性を獲得し、増殖してコロニーを形成した。これを蛍光顕微鏡で観察し、より強い蛍光を発しているもの（タイプ１細胞株；クローンＡ１、Ａ２、Ｃ５）と、蛍光を消失しているもの（タイプ２細胞株；クローンＡ４、Ｃ７、Ｋ２）とを選択し、顕微鏡下でマイクロピペットを用いて剥離して、９６ウェル培養プレートに単離した。その後、２４ウェル培養プレート、６cmディッシュ、１０cmディッシュ、と段階的に大きな培養容器に移しつつ細胞数を増やし、継続的に枯渇培養を続け、安定的なエストロゲン枯渇耐性細胞株（タイプ１、タイプ２を総称して、「Ｅ１０−ＥＤＲ細胞」（estrogen depletion resistant cells）と呼ぶことがある）を樹立した。
【００４５】
２．細胞増殖におけるエストロゲン依存性
親株であるＥ１０細胞（枯渇培地で３日間培養し、ステロイドを枯渇させたもの）及びＥ１０−ＥＤＲ細胞を、５×１０３細胞／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに播き、種々の濃度のエストロゲンの存在下及び非存在下で培養した。４日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ処理によって回収した。細胞をパーティクルカウンター（「CDA-500 Sysmex automated cell counter」(Sysmex Corporation)でカウントした。
【００４６】
結果を、第１日における細胞数に対する相対値で示す（図１）。タイプ１（Ａ１、Ａ２、Ｃ５）、タイプ２（Ａ４、Ｃ７、Ｋ２）ともに、親株（Ｅ１０）と比較して細胞増殖におけるエストロゲン（Ｅ２）に対する依存性が明らかに低下していた。
【００４７】
３．タイプ１及びタイプ２細胞株に対する抗エストロゲン剤の効果
タイプ１及びタイプ２細胞の細胞増殖に対する抗エストロゲン剤の影響を検討した。枯渇培地で培養した細胞に、各抗エストロゲン薬（１μM  フルベストラント（Ｆｕｌ）、１μM  ４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＴ  Ｔａｍ）又は３μM  トレミフェン（Ｔｏｒ））又はコントロールとしてエタノール（ＥｔＯＨ）を添加して４日間培養した後、細胞数をカウントした。
【００４８】
結果を図２に示す。タイプ１細胞（Ａ１、Ａ２及びＣ５）は、エストロゲン非依存性であるが、ＥＲをブロックする薬剤である抗エストロゲン薬（タモキシフェン、トレミフェン、フルベストラント）によって増殖が阻害された。一方、これらの抗エストロゲン薬は、タイプ２細胞（Ａ４、Ｃ７及びＫ２）に対しては、トレミフェンがＣ７及びＫ２の増殖を少し阻害したものの、顕著な増殖抑制効果を示さなかった。
【００４９】
これらの結果は、ホルモン療法のための抗エストロゲン薬はタイプ１細胞には有効であるが、タイプ２細胞にはあまり有効ではないことを示す。また、タイプ１細胞においては、抗エストロゲン剤フルベストラントの添加によりＧＦＰ活性が強力に阻害されることから、これらのＧＦＰ発現においてＥＲαが大きく寄与することが示唆された。
【００５０】
４．タイプ１細胞及びタイプ２細胞のその他の特徴
ＥＲ活性は、タイプ１細胞において高く、タイプ２細胞において低かった。リアルタイムＰＣＲにより、内在性ＥＲα標的遺伝子の発現を調べたところ、タイプ１細胞（Ａ１、Ａ２及びＣ５）は実質的にｐＳ２、ＰｇＲ、ＩＧＦＢＰ４及びＥＧＲ３を発現したが、タイプ２細胞（Ａ４、Ｋ２及びＣ７）は、これらのＥＲ標的遺伝子のｍＲＮＡの有意な発現を示さなかった。したがって、タイプ１細胞においては、エストロゲンに依存してＥＲ転写活性が構成的に活性化されているが、タイプ２細胞においては、ＥＲ転写活性がほとんど失われている。
ＥＲαのｍＲＮＡ及びタンパク質は、タイプ１細胞においては強く誘導されていたが、タイプ２細胞においてはほとんど認められなかった。タイプ１細胞において、ＥＲαのＳｅｒ１１８、Ｓｅｒ１６７、及びＳｅｒ３０５でのリン酸化の顕著な変化は認められなかった。
いずれの細胞株も、ＨＥＲ２発現についてはアップレギュレーションが認められなかった。
【００５１】
細胞内リン酸化経路に関与する代表的なタンパク質のウェスタンブロットを行い、タイプ２細胞株（Ａ４及びＫ２）においてＪＮＫが構成的に活性化されていることがわかった。Ａ４及びＫ２のＡＰ−１ルシフェラ−ゼ活性は、Ｅ１０細胞よりも有意に高かった。
【００５２】
さらに、ＪＮＫ阻害剤（SP600125）は、タイプ１細胞よりもタイプ２細胞においてより効果的に増殖を阻害した。これらの結果から、タイプ２細胞においてはＪＮＫ関連シグナル経路が生存に重要であることが示唆された。
【００５３】
III．  タイプ３細胞株の作製及び特徴づけ
１．親株（Ｔ４７Ｄ−ＴＥ８細胞）の樹立
Ｔ４７Ｄ−ＴＥ８細胞は、ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１３３）から、Ｅ１０細胞の作製に用いたものと同じＥＲＥ−ＧＦＰ遺伝子を担持するプラスミドを公知の方法にしたがって導入することにより樹立した（非特許文献３：Yamaguchi Y. et al., Cancer Res, 2005, 65: 4653-4662）。
Ｔ４７Ｄ−ＴＥ８細胞は、普通培地で培養した。
【００５４】
２．タイプ３細胞株の樹立
エストロゲン枯渇条件下での長期培養によりＴ４７Ｄ−ＴＥ８細胞から取得した細胞は、ホルモン療法で治療された乳癌のモデルを表す。
親株としてＴ４７Ｄ−ＴＥ８細胞を用いて、上記IIの１．と同様の方法により、タイプ３細胞株を樹立した。ただし、Ｔ４７Ｄ−ＴＥ８細胞は、通常の枯渇培地ではすべて死滅してしまうため、培養時は常に増殖因子カクテル（２０ng/ml  ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α、２０ng/ml  ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１β、２０ng/ml  ＥＧＦ、２０ng/ml  ＨＧＦ、２０ng/ml  ＩＧＦ−１、２０ng/ml  ＴＧＦ−α（R&D systems））を添加した培地（増殖因子培地）を用いて３ヶ月以上培養した。
【００５５】
Ｔ４７Ｄ−ＴＥ８細胞は、エストロゲン枯渇培地では死滅したが、増殖因子培地では生存し、いくつかのコロニーを形成した。強力なＥＲ活性を有するものを得るために、より強い蛍光を発するコロニーを選択し、さらに７〜１８週間、増殖因子培地で個別に培養した。この過程で、一部のコロニーは死滅し、最終的に３１個のコロニーが得られた（タイプ３細胞；「ＴＥ８−ＥＤＲ細胞」と呼ぶことがある）。これらの細胞は、当初は強力な蛍光を発したが、その後６〜８週間のうちに蛍光を失った。したがって、ＥＲ活性を失ったことが示唆された。増殖因子のないエストロゲン枯渇培地で得られ、ＥＲ活性を維持したＥＤＲ細胞を考慮すると、ＴＥ８−ＥＤＲ細胞は、増殖因子の添加によってＥＲ活性を失ったと考えられる。
【００５６】
タイプ３細胞として最終的に得られた３１個のクローンのうち、Ｕ３、Ｕ８、Ｕ２３及びＵ２５細胞の特徴を解析した。
【００５７】
３．タイプ３細胞の増殖因子依存性
各増殖因子（１００ng/mL）を個別に含むエストロゲン枯渇培地で１０日間培養することにより、タイプ３細胞（クローンＵ２５）が増殖因子カクテルに含まれるどの増殖因子に依存しているかを調べた。
【００５８】
結果を図３に示す。タイプ３細胞の増殖は、ＥＧＦとＴＧＦ−αに依存していることがわかった。細胞数は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αを添加した場合に、それぞれコントロールの７．５倍及び６．４倍に増大し、他の増殖因子（ＳＤＦ−α、ＳＤＦ−β、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１）を添加した場合には２倍となった（パネルＡ）。クリスタルバイオレット染色によっても、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αによる細胞数の増大が顕著であることが示された（パネルＢ）。ＥＧＦ及びＴＧＦ−αは、同じレセプター（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１）を利用して増殖因子のシグナルを細胞内システムに伝達すると考えられている。したがって、タイプ３細胞の生存及び増殖にＥＧＦＲが関与することが示された。
【００５９】
４．タイプ３細胞におけるＥＲ及びＨＥＲ２の発現
タイプ３細胞においてはＥＲの発現が低下し、乳癌で重要な治療の標的となっているＨＥＲ２の発現が上昇していることを以下のようにして確認した。
タイプ３細胞におけるＥＲα及びエストロゲン応答性遺伝子の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより調べた。
【００６０】
結果を図４に示す。通常培地のＴＥ８親細胞と比較して、タイプ３細胞（Ｕ３、Ｕ８、Ｕ２３、Ｕ２５）のＥＲαのｍＲＮＡ発現は、顕著に低減していた（パネルＡ）。ウェスタンブロッティングにより検出したところ、タイプ３細胞のＥＲαタンパク質発現も低減していた（パネルＢ）。さらに、エストロゲン応答性遺伝子ＥＧＲ３及びＰｇＲのｍＲＮＡも低減していた（パネルＣ）。
【００６１】
したがって、タイプ３細胞は、ＥＲ発現及び機能的活性を失っており、その生存及び増殖はエストロゲン非依存性であると考えられる。
【００６２】
次に、ＥＧＦＲは他のＨＥＲファミリーレセプターと２量体を形成するため、同様にＨＥＲ２の発現を調べた。ＨＥＲ２過剰発現は、乳癌の２０〜３０％で観察されるため、乳癌の診断、サブタイピング、治療に重要な因子である。
【００６３】
結果を図５に示す。タイプ３細胞（Ｕ３、Ｕ８、Ｕ２３、Ｕ２５）におけるＨＥＲ２  ｍＲＮＡは、ＴＥ８親細胞と比較して有意に増大していた（パネルＡ）。ＨＥＲタンパク質の発現も増大していた（パネルＢ）。これらの結果は、ＨＥＲ２が、ＥＧＦＲと協働してシグナル伝達する増殖因子により増大したことを示唆する。
【００６４】
５．ホスホ−ＲＴＫアッセイによる解析
ＥＧＦＲは種々の膜レセプターと２量体を形成するため、さらにヒトホスホ−ＲＴＫアレイアッセイキット（Human Phospho-RTK Array Kits (R&D Systems)）を用いて、細胞膜レセプターの網羅的発現解析を行った。サンプルとして、増殖因子培地で培養したタイプ３細胞及び枯渇培地で３日間の後エストロゲンを添加して１日培養した親細胞（ＴＥ８細胞）を用いた。このキットは、４２項目の膜型レセプターに対する一次抗体が固定されているメンブレンに細胞ライセートを結合させ、細胞に存在するこれらのリン酸化されたレセプターチロシンキナーゼ二次抗体で検出する。
【００６５】
結果を図６に示す。タイプ３細胞株におけるＨＥＲファミリー全体の発現増加がみられた。
ＴＥ８親細胞において、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＥｒｂＢ４のリン酸化レセプターが検出された（パネルＡ）。これらのレセプターに加えて、タイプ３細胞（クローンＵ２５）では、リン酸化されたＥｒｂＢ３及びインスリンレセプターが検出された（パネルＢ）。この結果は、タイプ３細胞が、さらなるレセプターを利用して種々の増殖因子依存性経路を確保する可能性を示す。
【００６６】
６．タイプ３細胞の増殖に対する分子標的薬及び抗エストロゲン薬の効果
タイプ３細胞は増殖因子依存性が高く、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２が増殖において重要な役割を果たすので、ＨＥＲ２及び／又はＥＧＦＲに対する分子標的薬の細胞増殖に対する効果を調べた。また、抗エストロゲン薬の効果も同様に調べた。
【００６７】
増殖因子培地において培養したタイプ３細胞（クローンＵ２５）に、薬剤を加え、３日間培養した。次に、細胞数をカウントした。薬剤として、１５０mg/mlトラスツズマブ（trastuzumab；抗ＨＥＲ２薬）、５μMラパチニブ（lapatinib；抗ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２薬）、５μMゲフィチニブ（gefitinib；抗ＥＧＦＲ薬）、５μMエルロチニブ（erlotinib ；抗ＥＧＦＲ薬）をそれぞれ用いた。陰性コントロールとしてＤＭＳＯを添加した。抗エストロゲン薬であるタモキシフェン及びトレミフェンは、それぞれ１μM及び３μMで用いた。
【００６８】
結果を図７に示す。トラスツズマブは、ＨＥＲ２陽性乳癌に臨床的に使用される抗ＨＥＲ２薬であり、臨床試験では３年生存率を改善した。ラパチニブは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を共に標的とする阻害剤であり、乳癌の新薬として期待されている。ゲフィチニブ及びエルロチニブは、ＥＧＦＲを標的とする薬剤である。パネルＡに示すように、ＥＧＦＲを標的とする薬剤、ラパチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブは、細胞増殖を有意に阻害したが、トラスツズマブの効果はそれより劣っていた。タモキシフェン及びトレミフェンの効果も同様に調べたが、これらの薬剤は効果を示さなかった（パネルＢ）。これらの結果から、ＥＤＲ細胞の増殖はＥＧＦＲを阻害することにより有意に低減するが、ＨＥＲ２又はＥＲ機能の阻害によっては低減せず、ＥＧＦＲが増殖に重要であることがわかった。
【００６９】
結果として、タイプ３細胞は、容易にエストロゲン依存性経路を失い、エストロゲン非依存性かつＥＲ非依存性経路を獲得したことが示唆された。タイプ３細胞における細胞内シグナル経路は、親細胞であるＴＥ８におけるそれと異なっており、親細胞がエストロゲン依存性であって主にエストロゲン依存性経路を使うのに対し、タイプ３細胞は、エストロゲン依存性経路を失い、増殖因子依存性経路を使うようになっている。この経路は、主にＥＧＦＲ及びＨＥＲ２のような増殖因子レセプターに関与し、ＰＩ３Ｋ経路が特に重要である。
【００７０】
IV．  タイプ４細胞株の作製及び特徴づけ
１．タイプ４細胞株の樹立
上記II．のタイプ１細胞の樹立法と同様の手順を、１００nMテストステロン（ＴＳ）を添加した枯渇培地で行い、Ｅ１０細胞から複数の安定株を樹立した。ＧＦＰ発現による蛍光を示すコロニーをピックアップして個別に培養した。このうち、純粋な枯渇培地で蛍光が低下し、テストステロン１００nM及び３β−ジオール（Androgen metabolites  5α-androstane-3β,  17β-diol）１００nMの添加で再び蛍光を発し、その後のレトロゾール１００nMの添加によって蛍光が減弱しないものを、アンドロゲン代謝産物依存性エストロゲン枯渇耐性細胞株（「ＡＤ−ＥＤＲ」（Androgen metabolite dependent EDR cells）と呼ぶことがある)(タイプ４細胞)とした。
【００７１】
以下の条件下でＥＲ活性の評価を行った。各クローンのＥＲ活性は、培養中のＧＦＰ陽性細胞の比率によって評価した。まず、ステロイド枯渇ＴＳ添加培養におけるＥＲ活性を評価した（i）。次に、ステロイド枯渇培養で３日間培養後、同様にＥＲ活性を評価し、構成的に活性化されたＥＲを有するＧＦＰ陽性クローンを排除した（ii）。継続的に、１００nM ＴＳ及び１００ nM ３β-ジオールを各培地に添加し、２４時間の時点でＥＲ活性を確認した（iii）。最終的に、１００nMレトロゾールの添加後もＥＲ活性を有しているクローンを、タイプ４（ＡＤ−ＥＤＲ）細胞株と名づけた（iv）。同時に、これらの細胞株において、ＥＲ活性が１μMフルベストラントによって阻害されることを確認した（v）。タイプ４細胞株は、１００nM ＴＳを添加したステロイド枯渇培地で維持した。
【００７２】
タイプ４細胞株は、アンドロゲン又はその代謝産物に依存してＥＲ活性を示すと考えられ、ストローマ細胞との共培養においてレトロゾール耐性ＥＲ活性を示した。共培養は、乳癌細胞とストローマ細胞とを可溶性因子が通過しうる膜を隔てて接するようにし、別個に増殖させたもので、ストローマ細胞のアロマターゼによってアンドロゲンから局所的にエストロゲンが合成される微細環境を模したものである。
【００７３】
ＴＳ添加ステロイド枯渇培地で３ヶ月培養後、ＧＦＰを発現する５つのクローンが得られた。各処理工程でのＥＲ活性を図８にまとめて示す。
【００７４】
５つのうち、Ｇ１Ｔ及びＲ６Ｔは、ＥＲ活性がステロイド枯渇培地では阻害されたがレトロゾールによって阻害されなかったため、アンドロゲン又はその代謝産物に依存するＥＲ活性を示すものとして、タイプ４細胞として選択された。
樹立されたタイプ４細胞（Ｇ１Ｔ、Ｒ６Ｔ）は、アンドロゲンで活性化され、アロマターゼ阻害剤は無効であり、フルベストラントによってＥＲ活性が阻害される。このことは、アンドロゲンがエストロゲンに変換されて作用するのではなく、直接エストロゲンレセプターを活性化していることを示唆している。
【００７５】
クローンＶ３Ｔ及びＢ６Ｔは、増殖因子レセプター経路又はその他のメカニズムにより構成的に活性化されたＥＲを有すると考えられた。これは、３日間のステロイド枯渇条件においてもＥＲ活性を維持したためである。クローンＲ７Ｔは、ＥＲ活性がレトロゾールによって抑制されるため、ＴＳからアロマターゼによって供給されるエストロゲンに依存するＥＲ活性を有すると考えられる。
【００７６】
２．テストステロン（ＴＳ）、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）又は３β−ジオール存在下でのＥＲ活性及び増殖
定義されたホルモン条件下でのアッセイのために、細胞を数回洗浄した後、枯渇培地で３日間培養した。その後、細胞を枯渇培地中で２４ウェル培養プレートに１０４個／ウェルの密度で播き、所定の濃度のＴＳ、ＤＨＴ、３β−ジオール、エストラジオール（Ｅ２）又はコントロールとしてエタノールを、１００nM  レトロゾール、１μM  フルベストラント、所定の濃度のトリロスタン又はバイカルタミド（bicalutamide）、１００nM  ＯＨＴ又は３μM  ＴＯＲの存在下又は非存在下で、各ウェルに添加し、４日間培養した。各ウェルの細胞を回収してカウントし、コントロールに対する相対値を算出した。残りの細胞をＥＲ活性の評価に使用した。
【００７７】
タイプ４細胞は、ＴＳ、ＤＨＴ又は３β−ジオールの存在下で増大したＥＲ活性及び増殖を示した。Ｅ２による増殖誘導では親細胞であるＥ１０細胞とタイプ４細胞とで有意差がなかった。低濃度のＴＳ及びＤＨＴ（１nM又は１０nM）はすべての細胞株の増殖を阻害したが、タイプ４細胞は、１００nM  ＴＳ又は１００nM  ＤＨＴによって親細胞よりも増大した増殖を示した。１００nM  ３β−ジオールによる増殖誘導は、両細胞株において１nM  Ｅ２と匹敵するものであった。タイプ４細胞株は、親細胞よりも、低濃度（１nM又は１０nM）の３β−ジオールによって増大した増殖を示した。
【００７８】
３．タイプ４細胞株におけるＤＨＴ代謝酵素の発現及びアンドロゲンシグナル伝達の中断
アンドロゲン産生酵素及びホルモンレセプターのｍＲＮＡ発現を調べた。また、ＴＳ、ＤＨＴ又は３β−ジオールによるエストロゲン応答性遺伝子及びアンドロゲン応答性遺伝子の誘導も調べた。普通培地又は１００nM  テストステロンを添加した枯渇培地で３日間培養した細胞から総ＲＮＡを抽出し、各種遺伝子について、内部標準としてＲＰＬ１３Ａに対する相対的なｍＲＮＡ発現量を測定した。
タイプ４細胞株（Ｇ１Ｔ、Ｒ６Ｔ）は、ＤＨＴ代謝酵素である３β−ヒドロキシステロイドジヒドロゲナーゼ１型（ＨＳＤ３Ｂ１）の増大した発現及びアンドロゲンレセプター（ＡＲ）の低減した発現を示した。アルド−ケトレダクターゼ（ＡＫＲ１Ｃ３）はＧ１Ｔにおいてアップレギュレーションされていた。アロマターゼ（ＣＹＰ１９）及び１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ２型（ＨＳＤ１７Ｂ２)はすべての細胞株で検出されなかった。
タイプ４細胞は、親細胞であるＥ１０細胞と比較して、ＴＳ、ＤＨＴ又は３β−ジオールにより増大したエストロゲン応答性遺伝子ＰｇＲ及びＥＧＲ３の発現を示した。さらに、タイプ４細胞においては、ＴＳ、ＤＨＴ又は３β−ジオールによってエストロゲン応答性抗アポトーシスタンパクＢｃｌ−２が誘導された。
これらの結果から、タイプ４細胞においては、ＤＨＴ代謝がアップレギュレーションされており、アンドロゲンシグナル伝達がほとんど停止していることが示唆された。さらに、タイプ４細胞においては、ＴＳ又はＤＨＴがより効率的に３β−ジオールに代謝されること、及び３β−ジオールがより効率的にエストロゲン様作用を示すことが示唆された。
【００７９】
４．タイプ４細胞株に対する抗エストロゲン剤の効果
タイプ４細胞におけるＤＨＴによる増殖誘導は、アロマターゼに依存せずに産生されるＤＨＴ代謝産物３β−ジオールによるＥＲ活性化に起因する。そこで、臨床適用可能な選択的エストロゲンレセプター調節剤（ＳＥＲＭ）であるＯＨＴ及びＴＯＲ（これらはＥＲαリガンドの結合を阻害する）がフルベストラント（ＩＣＩ又はＦｕｌ）と同様にＤＨＴ誘導細胞増殖を阻害するかどうかを調べた。具体的には、１００nM  ＤＨＴ添加と同時にＯＨＴ（１μM）又はＴＯＲ（３μM）を、Ｇ１Ｔ細胞及びＲ６Ｔ細胞にそれぞれ添加して、４日後、細胞数を計測して増殖能を評価した。
結果を図９に示す。予想どおり、エストロゲンレセプターをブロックする抗エストロゲン剤であるＯＨＴ又はＴＯＲによってＩＣＩと同様にタイプ４細胞の増殖を効率的に阻害したが、アロマターゼ阻害剤であるレトロゾール（Ｌｅｔ）は無効であることが示された。
これらの結果は、タイプ４細胞株がアンドロゲン耐性及び３β−ジオールに対する過敏性を示すことを示唆する。さらに、これらの特性は、アロマターゼ活性には依存しなかった。
【００８０】
５．ＥＲ活性
ＥＲＥ−ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、１００nM  ＤＨＴはタイプ４細胞においてＥＲ活性を誘導したが、親細胞においては誘導しなかったことがわかった。タイプ４細胞においては、１００nM  ３β−ジオールにより誘導されたＥＲ活性は、親細胞における活性の２倍高かった。ＴＳにより誘導されるＥＲ活性はこのアッセイではすべての細胞株で検出されなかったが、ＥＲＥ−ＧＦＰレポーターアッセイではタイプ４細胞において増大したＥＲ活性が検出された。
ＴＳ、ＤＨＴ又は３β−ジオールによって誘導されたＥＲ活性は、１μM  フルベストラントによって阻害されたが、１００nM  レトロゾールによっては阻害されなかった。同様の結果は、すべての細胞株の増殖において得られた。
【００８１】
V．  タイプ５細胞株の作製及び特徴づけ
１．親株（Ｅ１０−Ａｒｏｍ細胞）の樹立
Ｅ１０細胞にブラストシジン（ＢＳＤ）耐性遺伝子を持つアロマターゼ発現ベクター（ｐＮＨ−ＣＭＶ／ＡＲＯＭ−ＢＳＤ；図１０）を導入し、ブラストシジン（１０μg/mL）添加普通培地で形質転換細胞を選択した。生き残ったコロニーを顕微鏡下でマイクロピペットを用いて剥離し、９６ウェル培養プレートに単離した。その後、２４ウェル培養プレートに移し、その際に培地をブラストシジン添加普通培地からテストステロン１００nM添加枯渇培地に交換した。
この細胞は自身でアロマターゼを産生しテストステロンをエストラジオールに変換できるので、テストステロン添加枯渇培地でも増殖できる。さらに６cmディッシュ、１０cmディッシュと段階的に大きな培養容器に移しつつ細胞数を増やし、継続的にテストステロン添加枯渇培地で培養を続け、安定的なアロマターゼ発現Ｅ１０細胞株(Ｅ１０−Ａｒｏｍ)を樹立した。
【００８２】
２．タイプ５耐性株の作製
このＥ１０−Ａｒｏｍ細胞を親株として用い、アロマターゼ阻害剤であるレトロゾール１００nM及びテストステロン１００nM添加枯渇培地で３ヶ月間培養を続け、タイプ１細胞の樹立法と同様にコロニーを形成させた。このうち、レトロゾール１００nM及びテストステロン１００nM添加枯渇培地で蛍光が低下せず、純粋な枯渇培地で蛍光が低下するものを選択的にクローニングし、レトロゾール耐性ＭＣＦ−７−Ｅ１０Ａｒｏｍ−ＬＲ細胞(Letrozole resistant cells)(タイプ５細胞）とした（クローンＬＲ２、ＬＲ３）。
【００８３】
３．ＬＲ細胞におけるレトロゾール添加時のＥＲ活性
樹立したレトロゾール耐性細胞８株について、テストステロン  １００nM、レトロゾール  １００nM添加時のＥＲ活性をルシフェラーゼアッセイで測定した。
【００８４】
結果を図１１に表す。この中で、特にＬＲ３は親株であるＥ１０−Ａｒｏｍに比べてレトロゾール添加時にも高いＥＲ活性を維持していた。
【００８５】
４．ＬＲ細胞におけるレトロゾール感受性の検討
レトロゾール添加時に特に高いＥＲ活性を示していたＬＲ３について、レトロゾール感受性の検討を行った。
親株であるＥ１０−Ａｒｏｍ、ＬＲ３を３日間エストロゲン枯渇培養後、２４ウェル培養プレートに１．０×１０４個／ウェル播種、テストステロン（０．１〜１００nM）、レトロゾール（１００nM）を添加し、４日後にSysmex CDA-500にて細胞数を測定した。
【００８６】
結果を図１２に表す。ＬＲ３は、Ｅ１０Ａｒｏｍに比べて、レトロゾール添加時にも高い細胞増殖能を維持していた。
【００８７】
５．ＬＲ細胞におけるエストロンスルフェート（ＥＩＳ）代謝関連遺伝子の発現
ＬＲ３において、Ｅ１ＳをＥＳに変換する酵素であるＳＴＳと、Ｅ１Ｓを細胞内に取り込むトランスポーターであるＯＡＴＰ−ＡのｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【００８８】
結果を図１３に表す。ＬＲ３は、Ｅ１０−Ａｒｏｍと比較してＳＴＳ、ＯＡＴＰ−Ａ共に発現が上昇していることが確認された。
【００８９】
６．ＬＲ細胞におけるＥＩＳ、ＳＴＸ６４（ＳＴＳ阻害剤）感受性の検討
耐性獲得におけるＳＴＳの関与が示唆されたので、ＬＲ３のＥ１ＳとＳＴＳ阻害剤であるＳＴＸ６４に対する感受性を検討した。
親株であるＥ１０−Ａｒｏｍ、ＬＲ３を３日間エストロゲン枯渇培養後、２４ウェル培養プレートに１．０×１０４個／ウェル播種、Ｅ１Ｓ（０、１００nM〜１０μM）単独あるいはＳＴＸ６４（１００nM）と組み合わせて添加し、４日後にSysmex CDA-500にて細胞数を測定した。
【００９０】
結果を図１４に表す。ＬＲ３は、Ｅ１０ＡｒｏｍよりもＥ１Ｓに対する感受性が高まっていることが確認された。さらに、ＬＲ３においてＥ１Ｓによって誘導された細胞増殖は、ＳＴＸ６４添加で親株と同程度まで抑制されることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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