(57)【要約】      （修正有）【課題】幅広い用途に活用できかつ効果的に時計遺伝子の発現を調節する物質の提供。【解決手段】カリオフィレンオキサイド、および下記構造式を有する化合物より成る群から選択される１以上を有効成分とする時計遺伝子発現調節剤。2013184921.tif 000005（ＸはＣＨ３、ＮＨ２またはＮＨＣＨ３である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリオフィレンオキサイド、および下記構造式を有する化合物より成る群から選択される１以上を有効成分とする時計遺伝子発現調節剤。
【化１】
2013184921.tif 000004
（ＸはＣＨ３、ＮＨ２またはＮＨＣＨ３である。）
【請求項２】
前記時計遺伝子がBmalまたはPeriodである請求項１記載の時計遺伝子発現調節剤。
【請求項３】
請求項１または２記載の時計遺伝子発現調節剤を含む概日リズム調整剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時計遺伝子の発現調節剤、ならびにそれを含む概日リズム調整剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
地球上の殆ど全ての生物は体内に約２４時間周期で自律振動する「生体時計」を持っている。生体時計は、概日リズム（サーカディアンリズム）という生物学的な日周変動を引き起こし、生物の睡眠・覚醒サイクルをはじめ、体温、血圧、ホルモン分泌、代謝、さらには、心身の活動、摂食などの、様々な生体現象（活動）の日周変動を支配すると考えられている。近年、概日リズムの乱れが、睡眠障害、皮膚疾患、生活習慣病、さらには欝病等の精神神経疾患など、様々な心身の症状または疾患の発症要因として指摘されている。
【０００３】
図１に示すように、生体時計は、「時計遺伝子（クロックジーン）」と呼ばれる遺伝子群を含むリズム発生システムにより制御されており、哺乳類の場合、CLOCK, BMAL1, PERIOD, CRYPTOCHROMEの４つのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写の促進/抑制により形成されるフイードバックループが時計分子機構の中核（コア）をなし、このフイードバックループが約２４時間のリズムを刻むことにより、概日リズムが形成される。
【０００４】
時計遺伝子は、転写因子として他の遺伝子の発現リズムを直接制御し、さらに、ホルモン分泌の調節等を介して間接的により多くの遺伝子の日周発現を制御しており、生体における時計遺伝子の発現リズムが乱れると、生体器官の働きや内分泌系に障害があらわれ、高血圧などの生活習慣病をはじめ様々な疾病を引き起こすことが明らかとなっている（非特許文献１）。例えば、肥満の人は時計遺伝子の発現に異常があることが報告されており、また鬱病や癌などとの関連性も報告されている。さらに、時計遺伝子が皮膚の様々な生理機能の概日リズムを調節していることもわかってきており、正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いた実験において、タイプIコラーゲン遺伝子が、時計遺伝子Period2と同様の発現パターンで概日リズムをもって発現されていることが報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
概日リズムの制御中枢（中枢時計）は視床下部の視交叉上核に存在しているが、肝臓、腎臓、皮膚など末梢組織においても時計遺伝子が発現し、同様のシステムで概日リズムを形成することが明らかになっている。末梢の時計遺伝子は、視交叉上核からのシグナルによりその発現が調節されているが、さらに、グルココルチコイド、カテコラミン、アンジオテンシンIIなどのシグナル刺激因子が、末梢組織や細胞の時計遺伝子の発現を直接制御して生理リズムを作り出していることもわかってきた。近年、皮膚線維芽細胞などの培養細胞において、グルココルチコイド、フォルスコリンまたは血清等の刺激因子を加えて発現リズムを同調させて時計遺伝子発現の概日リズムをin vitroで誘導し、その発現を指標として概日リズムを評価することが行われている(非特許文献３−５)。
【０００６】
さらに、そのようなヒト皮膚線維芽細胞を用いた評価系で、ヒノキエキス、クロレラエキス等の生薬およびジュニパーオイル、ラベンダーオイル等の精油がBmal時計遺伝子の発現を調節し、またアルニカエキス、コウホネエキス等の生薬およびジュニパーオイル、セダーオイル等の精油がPeriod時計遺伝子の発現を調節し得ることが報告されている（特許文献１および２）。
【０００７】
上述したように、時計遺伝子の発現を調節することにより、それにより制御されている生体の様々な行動リズムや生理機能の概日リズムを調整することが可能であり、幅広い用途に活用できかつ効果的に時計遺伝子の発現を調節できる新規薬剤の開発が尚強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１２２０４０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１１／１２２０４１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Hastings M., O’Neill JS., and Maywood ES., (2007) Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. Journal of Endocrinology, 195; 187-198
【非特許文献２】泉香津代ほか、概日リズムを持つ皮膚生理遺伝子の探索、日本分子生物学会  第３２回年会  要旨2P-0009
【非特許文献３】Okamura H., (2004) Clock genes in cell clocks: Roles, Actions, and Mysteries. Journal of Biological Rhythms, 19 (5); 388-399
【非特許文献４】Balsalobre A., Damiola F., and Schibler U., (1998) A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell, 93; 929-937
【非特許文献５】Yagita K., Tamanini F., van der Horst G., and Okamura H., (2001) Molecular mechanisms of the biological clock in cultures fibroblasts. Science, 292; 278-281
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記のような事情に鑑み、時計遺伝子の発現を調節できる新規薬剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、培養細胞において、カリオフィレンオキサイド、ならびに安息香酸メチル（メチルベンゾエート）誘導体が、Bmal、Period等の時計遺伝子の発現を促進させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明の時計遺伝子発現調節剤は、カリオフィレンオキサイド、および下記構造式を有する化合物より成る群から選択される１以上を有効成分とする。
【化１】
2013184921.tif 000002
（ＸはＣＨ３、ＮＨ２またはＮＨＣＨ３である。）
これら特定の化合物が時計遺伝子の発現を調節できることは今まで全く知られていなかった。
【００１３】
本発明の時計遺伝子発現調節剤は、限定はされないが、例えば、Bmal遺伝子（Bmal1, Bmal2）、Period遺伝子（Period1, Period2, Period3）、Clock遺伝子、Cryptochrome遺伝子、albumin site D-binding protein (Dbp)遺伝子、E4BP4遺伝子、Npas2遺伝子、Rev-erb遺伝子、中でも、生体時計のコア遺伝子であるBmal、Period、Clockおよび／またはCryptochrome遺伝子、特にBmalおよびPeriod遺伝子の発現を調節する。
【００１４】
本発明において、遺伝子発現調節とは、遺伝子の発現を促進させることに加え、遺伝子の発現リズム（位相または周期）を調節することを含む。
【００１５】
本発明の概日リズム調整剤は、上記の時計遺伝子発現調節剤を含む。上述したように、時計遺伝子は、直接または間接的に、生体器官の働きや内分泌系に関与する様々な遺伝子の日周発現を制御しており、生体時計のコア遺伝子であるBmal、Period等の時計遺伝子の発現を調節することにより、それにより制御されている生体の様々な行動リズムや生理機能の概日リズムを調整することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の時計遺伝子発現調節剤は、医薬、医薬部外品、化粧料、食品、雑貨、衣料等様々な態様で使用でき、効果的に時計遺伝子の発現を調節して、概日リズムの不調に起因する様々な心身の症状または疾患を改善することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】時計遺伝子による概日リズム発生システムのコアループ部分を示す概略図
【図２】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、コルチゾールによる時計遺伝子発現の概日リズムの誘導を示すグラフ
【図３Ａ】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、試験物質による時計遺伝子Bmal1の発現調節を示すグラフ
【図３Ｂ】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、試験物質による時計遺伝子Per1の発現調節を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の時計遺伝子発現調節剤は、カリオフィレンオキサイド、または上記の安息香酸メチル（メチルベンゾエート）誘導体を有効成分とする。それら化合物はいずれも既知化合物であるが、以下に簡単に説明する。
【００１９】
カリオフィレンオキサイド（(1R,4R,6R,10S)-4,12,12-トリメチル-9-メチレン-5-オキサトリシクロ[8.2.0.04,6]ドデカン）は、分子量２２０．３５の無色液体または無色結晶で、カリオフィレンまたはイソカリオフィレンを酢酸ナトリウム存在下過酢酸を用い0〜5度でエポキシ化することにより得られる。天然には、コパイバオイル、グローブ油、ラベンダー油等に存在することが知られている。
【００２０】
また、本発明で用いられる安息香酸メチル誘導体である2-メチル安息香酸メチルは分子量150.18の無色液体である。2-アミノ安息香酸メチルは分子量１５１．１７の液体で、メタノール120部にアントラニル酸８０部を加え、４０度以下で濃硫酸１００部を徐々に加え、７５〜８３度で反応を完結し、メタノール回収後、炭酸ナトリウム１１０部、水２４０部の溶液中に加えて中和し水洗後蒸留により精製することにより得られる。O-ニトロトルエンからの合成法もある。天然には、ネロリ、イランイラン花精油等に存在することが知られている。2-メチルアミノ安息香酸メチルは分子量１６５．２の無色液体で、天然にはオレンジの果皮、マンダリン油等に存在することが知られている。
【００２１】
本発明の時計遺伝子発現調節剤は、上記化合物の１種または２種以上を含む。本発明において、上記化合物は天然由来のものであっても、あるいは合成されたものであってもよい。
【００２２】
本発明の時計遺伝子発現調節剤は、単独で用いてもよいが、他の時計遺伝子の発現調節作用を有する薬剤と組み合せて使用してもよい。
【００２３】
さらに、本発明の時計遺伝子発現調節剤および概日リズム調整剤は、それらを単独で用いてもよいが、様々な対象物に含めることができる。その対象物の種類に応じて、上記の必須成分の他に、任意の構成要素をさらに含めることができる。
【００２４】
例えば、対象物が皮膚外用剤である場合には、その剤形（例えば、液剤、粉末剤、顆粒剤、エアゾール剤、固形剤、ジェル剤、パッチ剤、坐剤等）や、製品形態（例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等）に応じて、通常そのような皮膚外用剤に含まれる任意の成分を、上記の時計遺伝子発現調節剤と共に含んでいてよい。皮膚外用剤は、皮膚（頭皮、頭髪、爪も含む）に対して適用する組成物全般を包括する概念であり、例えば、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪化粧料、皮膚もしくは毛髪洗浄料等の化粧料や、軟膏剤、パッチ剤、坐剤、歯磨等の種々の医薬品ないし医薬部外品等を含む。その剤形も特に限定されず、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層など、任意の剤型を含む。皮膚外用剤が化粧料である場合、例えば、香水、オードトワレ、オーデコロン、クリーム、乳液類、化粧水、ファンデーション類、粉白粉、口紅、石鹸、シャンプー・リンス類、ボディーシャンプー、ボディーリンス、ボディーパウダー類、浴剤類等が挙げられる。
【００２５】
また、例えば、芳香剤、消臭剤、アロマキャンドル、インセンス、文房具、財布、バッグ、靴等の任意の雑貨類や、例えば下着、洋服、帽子、ストッキング、靴下等の任意の衣類、あるいは例えば散剤、顆粒、錠剤、カプセル剤等様々な形態のサプリメント（栄養補助食品）、菓子、飲料等の任意の食品等に、本発明の時計遺伝子発現調節剤を含めることができ、また吸入医薬品や空間散布剤のような吸入製品において用いてもよい。
【００２６】
尚、本発明の時計遺伝子発現調節剤の使用態様を例示したが、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を達成できる限り、任意の態様で用いることができる。また、本発明の時計遺伝子発現調節剤の他に、具体的な態様に応じて、他の概日リズム調整作用を有する薬剤を、本発明の効果を損なわない限り配合することができる。
【００２７】
対象物中における本発明の時計遺伝子発現調節剤の配合量は、用いる化合物の種類や形態、対象物等によって適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、対象物の全質量に対して、０．００００１〜１００質量％であり、より好適には、０．０００１〜５０質量％であり、さらに好適には、０．０００１〜２０質量％である。
【００２８】
尚、本発明の時計遺伝子発現調節剤または概日リズム調整剤やそれを配合した対象物の具体的な適用は、概日リズムの調整に関連するものであれば特に限定されない。例えば、時差ぼけ症候群、交代勤務症候群、睡眠相遅延症候群、非２４時間型睡眠・覚醒症候群、概日リズム睡眠障害を有する鬱状態など、さらにはそれら概日リズム障害に付随する不眠、体調不調、注意欠損、意欲低下、肌荒れなどの諸症状の予防、改善または治療等に適用できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。尚、培養細胞として、皮膚線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、色素細胞、脂肪細胞、神経細胞など各種細胞を用いることができるが、本実施例ではヒト皮膚線維芽細胞を用いて評価を行なった。いずれの生物種および細胞種においても時計遺伝子のコアシステムは共通であるため、ヒト皮膚線維芽細胞での評価結果は、他の生物種および細胞種にも反映できると考えられる。また、時計遺伝子としてBmal、Period、Clock、Cryptochrome、albumin site D-binding protein (Dbp)、E4BP4、Npas2、Rev-erb等の存在が知られているが、本実施例では代表として、コアシステムに関わるBmalおよびPeriodの発現を測定した。尚、BmalとしてBmal1および Bmal2、またPeriodとしてPer1, Per2, Per3の存在が知られているが、同じ遺伝子群で同様の挙動を示すと考えられており、それぞれbmal1およびPer1で代表させた。下記の実施例では、ヒトBmal1(hBmal1)およびヒトPer1（hPer1）の発現を測定した。また、下記で用いる試験物質は市販品を購入したものを使用した。
【００３０】
培養ヒト皮膚線維芽細胞を用いた時計遺伝子発現の概日リズムの誘導
培養ヒト皮膚線維芽細胞を用いた系で時計遺伝子発現の概日リズムを誘導できることを確認した。
【００３１】
培養ヒト皮膚線維芽細胞は、正常成人皮膚由来線維芽細胞を購入し（Cell Application, Inc）、実験に用いた。10%FBS、20mM HEPES、Glutamax、抗菌剤を添加したDMEM培地に播種し、37℃、5%CO2にて培養した。培養６日目に、コルチゾール50ng/mlを添加して２時間処理した後、経時的に細胞をサンプリングした。市販のRNA抽出キットを使用して細胞からRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法によりhBmal1およびhPer1遺伝子の発現量を測定した。また同様に、ハウスキーピング遺伝子であるRPLP0の発現量を定量して内部標準として用い、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。
【００３２】
生体内で、コルチゾール等のグルココルチコイドは末梢組織等の生体時計の調節に関与し、朝起床時にコルチゾールの血中濃度が上昇して生体時計をリセットすると考えられている。培養細胞では通常、個々の細胞がばらばらのタイミングでリズムを刻んでいるが、コルチゾールのようなシグナル刺激因子で刺激することにより、時計遺伝子発現リズムを同調させて概日リズムを誘導することができる。
【００３３】
hBmal1およびhPer1を測定した結果を図２に示す。コルチゾールで刺激することにより、いずれも約２４時間周期の概日リズムを刻んで発現されることを確認できた。
【００３４】
時計遺伝子発現調節効果の評価
上記の結果から、培養ヒト皮膚線維芽細胞評価系において、時計遺伝子はコルチゾールによる刺激により概日リズムを刻むことが認められた。発現量が高い時間帯での評価が望ましいため、hBmal1は刺激の１６時間後、hPer1は刺激の２時間後における遺伝子発現量をそれぞれ指標として、試験物質の時計遺伝子発現調節効果を評価した。
【００３５】
上記と同様の方法により、正常成人皮膚由来線維芽細胞（Cell Application, Inc）を播種し、培養６日目に、各薬剤を50ppmとなるように添加して、２時間後および１６時間後に細胞をサンプリングした。尚、コントロールとして、試験物質の代わりに同量のエタノールを添加した。市販のRNA抽出キットを使用して細胞からRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法によりhBmal1およびhPer1遺伝子の発現量を測定した。また同様に、ハウスキーピング遺伝子であるRPLP0の発現量を定量して内部標準として用い、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。得られた値について、Dunnettの多重比較検定を行い、コントロールと比較して片側５％の危険率で有意差があるものを効果有りと判定した。
【００３６】
図３Ａに、試験物質の添加１６時間後のhBmal1遺伝子の相対発現量を示し、図３Ｂに、試験物質添加２時間後のhPer1遺伝子の相対発現量を示す。
【００３７】
また、下記の表１に、１６時間後のhBmal1遺伝子および２時間後のhPer1遺伝子の相対発現量を示す。
【表１】
2013184921.tif 000003
【００３８】
カリオフィレンオキサイド、２−メチル安息香酸メチル、２−メチルアミノ安息香酸メチル、およびアミノ安息香酸メチル（メチルアンスラニレート）は、コントロールと比較してhBmal1遺伝子およびhPer1遺伝子の発現量を共に有意に高め、それら化合物が時計遺伝子発現を調節し得ることが示された。
【００３９】
(配合例)
以下、本発明の時計遺伝子発現調節剤の配合例を示すが、本発明の実施は以下に限定されるものではない。尚、下記において配合量は全て製品全量に対する質量％で表す。
【００４０】
フレグランス
（１）アルコール                                                  ７５．０
（２）精製水                                                      残余
（３）ジプロピレングリコール                                        ５．０
（４）本発明の時計遺伝子発現調節剤：カリオフィレンオキサイド      １０．０
（５）酸化防止剤                                                    ８．０
（６）色素                                                          適量
（７）紫外線吸収剤                                                  適量
【００４１】
ルームフレグランス
（１）アルコール                                                  ８０．０
（２）精製水                                                        残余
（３）酸化防止剤                                                    ５．０
（４）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチル安息香酸メチル        ３．０
（５）３−メチル−３メトキシブタノール                              ５．０
（６）ジベンジリデンソルビトール                                    ５．０
【００４２】
インセンス
（１）タブ粉                                                        ７５．５
（２）安息香酸ナトリウム                                            １５．５
（３）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル    ５．０
（４）ユーカリオイル                                                  １．０
（５）精製水                                                        残余
【００４３】
入浴剤
（１）硫酸ナトリウム                                                ４５．０
（２）炭酸水素ナトリウム                                            ４５．０
（３）ラベンダーオイル                                                ９．０
（４）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−アミノ安息香酸メチル          １．０
【００４４】
マッサージ用ジェル
（１）エリスリトール                                                  ２．０
（２）カフェイン                                                      ５．０
（３）オウバク抽出物                                                  ３．０
（４）グリセリン                                                    ５０．０
（５）カルボキシビニルポリマー                                        ０．４
（６）ポリエチレングリコール４００                                  ３０．０
（７）エデト３ナトリウム                                              ０．１
（８）ポリオキシレン（１０）メチルポリシロキサン共重合体              ２．０
（９）スクワラン                                                      １．０
（１０）水酸化カリウム                                                ０．１５
（１１）本発明の時計遺伝子発現調節剤：カリオフィレンオキサイド        ０．５
（１２）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチル安息香酸メチル        ０．５
【００４５】
マッサージクリーム
（１）固形パラフィン                                                  ５．０
（２）ミツロウ                                                      １０．０
（３）ワセリン                                                      １５．０
（４）流動パラフィン                                                ４１．０
（５）１．３−ブチレングリコール                                      ４．０
（６）モノステアリン酸グリセリン                                      ２．０
（７）ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル                  ２．０
（８）ホウ砂                                                          ０．２
（９）カフェイン                                                      ２．０
（１０）防腐剤                                                        適量
（１１）酸化防止剤                                                    適量
（１２）本発明の時計遺伝子発現調節剤：カリオフィレンオキサイド        ０．５
（１３）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル  ０．５
（１４）精製水                                                        残余              
【００４６】
芳香性繊維
キュプロアンモニウムセルロース溶液（セルロース濃度１０重量％、アンモニウム濃度７重量％、銅濃度３．６重量％）に、本発明の時計遺伝子発現調節剤を内包したマイクロカプセル（粒子径５０μｍ以下、マイクロカプセルに占める化合物の割合は５０重量％）をセルロース重量に対して０．１〜２０重量％の範囲内で添加、混和した後、通常の湿式紡糸方法に従って紡糸し、精錬工程、乾燥工程を経て、芳香性繊維を得た。
【００４７】
顆粒
（１）スクラロース                                                    ０．１
（２）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−アミノ安息香酸メチル          ０．１
（３）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチル安息香酸メチル          ０．１
（３）香味料                                                          ５．０
（４）賦形剤（セオラス）                                            １０．０
（５）マルチトール                                                    残余
【００４８】
錠剤（チュアブルタイプ）
（１）イノシトール                                                  １１．０
（２）マルチトール                                                  ２１．０
（３）スクロース                                                      ０．５
（４）鮭白子抽出物（ＤＮＡ  Ｎａ）                                    ０．１
（５）酵母抽出物                                                      ０．１
（６）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−アミノ安息香酸メチル          ０．１
（７）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル    ０．１
（７）香味料                                                          ５．０
（８）賦形剤                                                          残余
【００４９】
タブレット
（１）潤沢剤（ショ糖脂肪酸エステル等）                                １．０
（２）アラビアガム水溶液（５％）                                      ２．０
（３）酸味料                                                          １．０
（４）着色料                                                          適量
（５）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチル安息香酸メチル          ０．１
（５）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル    ０．１
（６）糖質（粉糖またはソルビトール等）                                残余
【００５０】
キャンディー
（１）砂糖                                                          ５０．０
（２）水飴                                                          ４７．９５
（３）有機酸                                                          ２．０
（４）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−アミノ安息香酸メチル          ０．０５
【００５１】
ガム
（１）砂糖                                                          ４３．０
（２）ガムベース                                                    ３０．９５
（３）グルコース                                                    １０．０
（４）水飴                                                          １６．０
（５）本発明の時計遺伝子発現調節剤：２−メチル安息香酸メチル          ０．０５
【００５２】
これら配合例の製品は、それぞれの製品形態の典型的な使用態様における使用テストにより、時計遺伝子遺伝子の発現を調節して、生体の概日リズムを調整することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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