(57)【要約】【課題】クロマトグラムの検出ピークがブロードになることを防止し、感度が低下することを防止した液体クロマトグラフ及びそれを用いた分析方法を提供する。【解決手段】移動相を送液する移動相送液部と、前記移動相に試料を注入するインジェクタと、前記試料を分離する分離部と、前記分離部通過後の移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、前記分離部通過後の移動相と前記反応試薬とを混合するジョイント部と、前記混合後の前記移動相と前記反応試薬が通過する配管と、前記反応試薬と反応した試料を検出する検出器とを備え、前記配管の内径が０．１ｍｍ以下である液体クロマトグラフ及びそれを用いたポストカラム法による試料の分析方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相を送液する移動相送液部と、前記移動相に試料を注入するインジェクタと、前記試料を分離する分離部と、前記分離部通過後の移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、前記分離部通過後の移動相と前記反応試薬とを混合するジョイント部と、前記混合後の前記移動相と前記反応試薬が通過する配管と、前記反応試薬と反応した試料を検出する検出器とを備え、前記配管の内径が０．１ｍｍ以下である液体クロマトグラフ。
【請求項２】
請求項１に記載の液体クロマトグラフを用いることを特徴とするポストカラム法による試料の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ及びそれを用いた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ポストカラム法による高速液体クロマトグラフィーは、分離部から溶出された試料に１種類以上の反応試薬を混合し、試料を検出する方法であり、高い選択性を必要とする場合やＵＶ吸収を持たない物質の測定などに利用されている(例えば特許文献1)。
【０００３】
図５は、一般的なポストカラム法を用いた液体クロマトグラフＳの構成図である。ポストカラム法を用いた液体クロマトグラフは、移動相送液部１Ａ、試料を注入するためのインジェクタ２、分離カラム３、分離カラム３を恒温に保つカラムオーブン４、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬を合流させるジョイント部５、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬が反応試薬と混合し、反応しながら通過する配管である試薬混合反応部６、検出器７及び反応試薬送液部８Ａを備えている。試料は、インジェクタ２から注入され、移動相送液部１Ａから送液される移動相によって分離カラム３を含む分離部を通過する。分離カラム３を通過することにより、試料中の成分が分離される。
【０００４】
成分に分離された試料は、ジョイント部５において反応試薬送液部８Ａから送液される反応液と混合される。試料中の成分は、試薬との反応が進行する試薬混合反応部６を通過して、検出器７で検出される。検出器７の信号はデータ処理部９に送られてデータ処理が行われる。
【０００５】
液体クロマトグラフは、分離カラム３中のカラム充填剤の粒子径を２μｍ程度に小さくすることにより、分離能が向上する。カラム充填剤の粒子径を小さくする一方で、移動相の線流速を早くし、分離カラム３を短くすることにより、分離能を維持して分析時間を短縮することができる。しかし、分離カラム３内の圧損が大きくなるため、ポンプにかかる圧力は上昇する。
【０００６】
従来は、カラム充填剤の粒子径は３〜５μｍが想定され、ポンプの耐圧が４０ＭＰａ程度の液体クロマトグラフが普及していた。しかし、２００４年以降、カラム充填剤の粒子径が３μｍより小さいものを想定し、ポンプの耐圧が４０ＭＰａより大きい液体クロマトグラフ（以下、「超高速液体クロマトグラフ」と称する）が各社からラインアップされてきた。市販されている超高速液体クロマトグラフ用のカラムとしては、株式会社日立ハイテクノロジーズ製  LaChromUltra C18（充填剤の粒子径２μｍ）などがあり、耐圧上限は５０ＭＰａである。
【０００７】
なお、ポンプなど装置やカラムを日常用いるときには、耐圧上限値の半分、若しくはそれ以下で用いることが多い。現在、液体クロマトグラフは、耐圧４０ＭＰａ以下の高速液体クロマトグラフと４０ＭＰａより大きい超高速液体クロマトグラフの２つに分類される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平４−２９０５８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】三宅亮、富樫盛典、「マイクロリアクタによる化学生産プロセスの革新」日立評論、2006年、Vol.88、No.11、P.79
【非特許文献２】Irena BARANOWSKA, Andrzej WILCZEK and Jacek BARANOWSKI, ”Rapid UHPLC Method for Simultaneous Determination of Vancomycin, Terbinafine, Spironolactone, Furosemide and Their Metabolites: Application to Human Plasma and Urine.” Anal.Sci.,Vol26,P.756
【非特許文献３】中村洋  企画・編集、「液クロ実験How toマニュアル」、医学評論社、２００７、ｐ.３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ポストカラム法により検出を行う場合、試薬混合反応部の配管内径が同じ場合には、試薬混合反応部の内部容量を大きくすると、混合及び反応は十分行われるが、目的成分の拡散が起こって、クロマトグラムの目的成分の検出ピークが広がってブロードになる。これにより、装置である液体クロマトグラフの分離性能や感度の低下が生じる。一方、試薬混合反応部の配管内径が同じ場合に、試薬混合反応部の内部容量を小さくすると、混合及び反応が十分に行われず、クロマトグラムのベースラインノイズが増大してしまい、装置である液体クロマトグラフの感度の低下が生じる。
【００１１】
本発明は、上記のような状況に鑑み、良好な感度の液体クロマトグラフ及びそれを用いた分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明の液体クロマトグラフは、移動相を送液する移動相送液部と、前記移動相に試料を注入するインジェクタと、前記試料を分離する分離部と、前記分離部通過後の移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、前記分離部通過後の移動相と前記反応試薬とを混合するジョイント部と、前記混合後の前記移動相と前記反応試薬が通過する配管と、前記反応試薬と反応した試料を検出する検出器とを備え、前記配管の内径が０．１ｍｍ以下であることを特徴とする。また、本発明の分析方法は、上記液体クロマトグラフを用いることを特徴とするポストカラム法による試料の分析方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、良好な感度の液体クロマトグラフとそれを用いた分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態のポストカラム法を用いた液体クロマトグラフの構成図
【図２】従来のポストカラム法により検出したクロマトグラムの例
【図３】流路径と拡散時間との関係図
【図４】流路径が異なる試薬混合反応部（０．１ｍｍ、０．５ｍｍ）を使用し、ポストカラム法により検出したクロマトグラムの例
【図５】一般的なポストカラム法を用いた液体クロマトグラフの構成図
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態の液体クロマトグラフは、移動相を送液する移動相送液部と、前記移動相に試料を注入するインジェクタと、前記試料を分離する分離部と、前記分離部通過後の移動相に反応試薬を送液する反応試薬送液部と、前記分離部通過後の移動相と前記反応試薬とを混合するジョイント部と、前記混合後の前記移動相と前記反応試薬が通過する配管と、前記反応試薬と反応した試料を検出する検出器を備えている。
【００１６】
本発明の実施形態の液体クロマトグラフの具体的な実施態様について図１を用いて説明する。尚、この実施形態における液体クロマトグラフは、超高速液体クロマトグラフを踏まえたものであるが、高速液体クロマトグラフにおいても同様のことが言える。
図１は、本発明の実施形態のポストカラム法を用いた液体クロマトグラフＳの構成図である。本実施形態の液体クロマトグラフＳは、移動相送液部１Ａ、試料を注入するためのインジェクタ２、分離部としての分離カラム３、分離カラム３を恒温に保つカラムオーブン４、分離カラム３から溶出した試料と反応試薬を合流させるジョイント部５、分離カラム３から溶出した試料が反応試薬と混合し、反応しながら通過する配管である試薬混合反応部６、検出器７及び反応試薬送液部８Ａを備えている。
【００１７】
試料は、インジェクタ２から注入され、移動相送液部１Ａから送液される移動相とともに分離カラム３を通過し、試料中の種々の成分に分離される。
成分に分離された試料は、ジョイント部５において反応試薬送液部８Ａから送液される反応試薬と混合される。その後試薬混合反応部６を通過する間に反応が進行する。反応後の試料中の成分は、検出器７で検出される。検出器７の信号はデータ処理部９に送られてデータ処理が行われる。
【００１８】
移動相送液部１Ａは、移動相送液ポンプ１によって、移動相である液体を貯蔵した移動相容器１０からインジェクタ２に、移動相を送液する装置である。
インジェクタ２は、移動相に分析の対象物である試料を注入する装置である。
【００１９】
分離カラム３は、移動相中に存在する試料の成分を分離する分離部として一般的に使用される装置である。但し、試料を分離する機能を有した装置であれば、分離カラム３に限定される訳ではない。分離カラム３としては、充填型カラムやモノリスカラム等がある。分離カラム３のカラム充填剤としては、吸着型、分配型、イオン交換型等の種々のタイプのものを使用することができる。分離カラム３を恒温に保ち、再現性よく試料の分離ができるように、分離カラム３は、カラムオーブン４内に設置されていることが望ましい。
【００２０】
反応試薬送液部８Ａは、分離カラム３を通過後の移動相に、試料中の測定目的物質を誘導体化させるための反応試薬を送液する装置である。反応試薬を貯蔵する反応試薬容器１１と反応試薬をジョイント部５に送液するための反応試薬送液ポンプ８からなる。
【００２１】
ジョイント部５は、分離カラム３を通過後の移動相と反応試薬とを混合する装置である。
このジョイント部５から検出器７に至るまでの配管を、試薬混合反応部６とよぶ。ジョイント部５にて混合後の移動相と反応試薬が通過する配管である。試料は、反応試薬と混合し、反応しながらこの試薬混合反応部６を通過する。
【００２２】
ジョイント部５において移動相の液体に反応試薬を添加してから、反応試薬が移動相中に拡散し、移動相中の測定目的物質と反応し、反応が終了するまでには時間が必要である。そのため、ジョイント部５から検出器７に至るまでの時間を稼ぐために、さらに反応槽１２内にコンパクトに収納させるために、試薬混合反応部６を構成する配管の少なくとも一部をコイル状にして、反応が行われる経路の距離を稼ぐとともに、一端から他端までの試薬混合反応部６の差し渡しの長さを短くする、ということを行うことができる。このコイル状の配管のことを反応コイルとよぶ。
【００２３】
本実施形態においては、ジョイント部５で混合された後の移動相と反応試薬が通過する、試薬混合反応部６の配管の少なくとも一部または全部の配管の内径を０．１ｍｍ以下にしている。試料と反応試薬の反応は、実質的に反応コイル内で進行する。そのため、この反応コイルの配管の内径を０．１ｍｍ以下にしているが、反応コイルの前後の配管については、必ずしも内径が０．１ｍｍ以下でなくともよい。但し、反応コイルの前後の配管を含めた試薬混合反応部６の全ての配管の内径が、０．１ｍｍ以下であることが、より良好な感度を確保するためには望ましい。
【００２４】
試薬混合反応部６の配管の材質としては、耐圧および耐薬品性の点から、４フッ化エチレン、ポリエーテル・エーテル・ケトン樹脂、ステンレス等が好ましい。
【００２５】
試薬混合反応部６は、その内部で移動相中の測定目的物質と反応試薬とが反応する部位であるので、再現性よく試料の分離ができるように、恒温の反応槽１２内に収納されていることが望ましい。特に、反応試薬の反応が高い温度で行われる場合には、試薬混合反応部６を高温に保てる反応槽１２内に収納されていることが望ましい。
反応試薬と反応した試料は、検出器７で検出される。検出器７の信号はデータ処理部９に送られてデータ処理が行われる。
【００２６】
本実施形態の液体クロマトグラフＳは、システムや分離カラム３の耐圧が２０ＭＰａより大きいものが望ましい。また、液体クロマトグラフＳの各モジュールを接続する配管は、試料の拡散を最小限とするために最適化された配管を用い、最短に構成された装置であることが望ましい。試薬混合反応部の容積は最小に設計されたものであることが望ましい。
【００２７】
本実施形態では、混合後の移動相と反応試薬が通過する試薬混合反応部６の配管の内径を０．１ｍｍ以下とすることを特徴としている。このように、配管の流路径を小さくすることにより、分子拡散に要する時間が短縮され、また溶液中の熱伝導時間を短縮することが可能となる。その結果、クロマトグラムの検出ピークがブロードになることを防止し、感度の低下を防止することが可能となる。試薬混合反応部６の配管の内径は、小さくなればなるほど分子拡散に要する時間は短縮できる。しかし、内径が小さくなれば、各接続部にかかる圧力も大きくなるため、必要以上に内径を小さくすることは好ましくない。
【００２８】
以下、本発明の実施形態について、さらに詳細に説明する。
図２は、比較例の高速液体クロマトグラフを説明するためのクロマトグラムを示す図である。
反応試薬にフェニルヒドラジンを利用し、糖類などのカルボニル基を有する化合物の分析のためにポストカラム法を適用したクロマトグラムの一例を示している。縦軸は蛍光強度を、横軸は溶出時間を表す。
【００２９】
図２に示したクロマトグラムを得るときの分析条件を以下に示す。
分離カラム：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
充填剤：粒子径５μｍ、ポリマーアミノ基カラム
移動相：アセトニトリル、水およびリン酸の混合液
移動相流量：１．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
反応槽温度：１５０℃
試薬混合反応部６：内径０．５ｍｍ×９ｍ長
試薬混合反応部６の配管の材質：ポリエーテル・エーテル・ケトン樹脂
試料注入量：５０μＬ
反応試薬：フェニルヒドラジン
反応試薬流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：蛍光検出器（励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ）
【００３０】
この際、検出されるピーク幅は数ｍｉｎである。
試薬混合反応部６での滞留時間ｔ（ｍｉｎ）は、次式（１）で表される。
ｔ＝（Ｒ／２）２πＬ／ｖ      ・・・（１）
ここで、Ｒは流路径（ｍｍ）、Ｌは流路の長さ（ｍ）、ｖは流速（ｍＬ／ｍｉｎ）である。
【００３１】
本比較例ケースではＲ＝０．５ｍｍ、Ｌ＝９ｍ、ｖ＝１．４ｍＬ／ｍｉｎである。この場合の滞留時間は７５ｓｅｃであった。また、９ｍの試薬混合反応部６のうち１ｍ分は冷却のために使用されている。従って、この１ｍ分の滞留時間、約８ｓｅｃを除いた６７ｓｅｃ程度が、反応のための加熱・混合・反応に使用されている。
【００３２】
この際、液体同士の混合は、外部から攪拌操作されることなしに、分子拡散により混合されることになる。その際の拡散時間Ｔｄは非特許文献１によると次式（２）で表される。
Ｔｄ＝Ｒ２／Ｄ      ・・・（２）
ここで、Ｄは拡散係数である。
【００３３】
水の拡散係数を１×１０−５ｃｍ２／ｓｅｃとして、１／２Ｒ分の距離の拡散時間を計算すると６２．５ｓｅｃである。つまり、加熱・混合・反応における滞留時間６７ｓｅｃのほとんどが拡散時間に当てられていることが分かる。
【００３４】
一方で、一般的な超高速液体クロマトグラフを用いた場合のピーク幅は数ｓｅｃである(例えば非特許文献２）。
流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出する分析種のピーク幅が０．１ｍｉｎであった場合、そのピーク容量は１００μｌである。
【００３５】
分離カラム内での目的成分の検出ピークの広がりを分散σｃで表し、試薬混合反応部６内の検出ピークの広がりを分散σｅｘとし、この標準偏差をａとすると、両者の関係は次式（３）で表される（非特許文献３参照）。
（（１＋ａ）σｃ）２ ＝σｃ２ ＋σｅｘ２      ・・・（３）
【００３６】
例えば、完全分離している２つのピーク(分離度２)があった場合、データ解析可能な分離度１まで目的成分の検出ピークの広がりを許容すると、各ピークの広がりは２倍まで許容できる。
【００３７】
この場合、ａ＝１であり、σｅｘ＝１７３．２μＬとなる。これは流速１．０ｍＬ／ｍｉｎの場合に、滞留時間としては約１０ｓｅｃに相当する。
このように超高速液体クロマトグラフを用いた場合に、ピークの分離を損なうことなく検出を行うためには、試薬混合反応部６内での滞留時間が１０ｓｅｃ以内で十分な拡散を行わなければならない。
【００３８】
式（２）を用いて拡散時間を求めた結果を図３に示す。この図３から、拡散時間を１０ｓｅｃ以下にするためには、流路の内径を０．１ｍｍ以下にしなければならないことが分かる。
また、本実施形態のように反応が高温で行われる場合は、内径を小さくすることで、配管外部から配管内の液内部の熱伝導も効率化されることが期待できる。
【００３９】
このように内径を０．１ｍｍ以下にすることにより、目的成分の検出ピークが広がってブロードになることを防止し、かつ、感度が低下することを防止した超高速液体クロマトグラフを提供することができる。
【００４０】
［実施例］
以下に、先に説明した実施形態に基づいて、糖類などのカルボニル基を有する化合物の分析を行う実施例を説明する。
以下の実施例では、図１に示した構成の高速液体クロマトグラフを用いた。分析条件は、以下のとおりである。
【００４１】
分離カラム：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ
充填剤：粒子径５μｍ、ポリマーアミノ基カラム
移動相：アセトニトリル、水およびリン酸の混合液
移動相流量：１．４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
反応槽温度：１５０℃
試薬混合反応部６：内径０．１ｍｍ×９ｍ長もしくは内径０．５ｍｍ×１．２ｍ長
試薬混合反応部６の配管の材質：ステンレス
試料注入量：５０μＬ
反応試薬：フェニルヒドラジン
反応試薬流量：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：蛍光検出器（励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ）
【００４２】
分析の結果、得られたクロマトグラムを図４に示した。
図４では、配管の内径の違いによる検出ピークの違いを示すため、試薬混合反応部６の配管の内径０．１ｍｍの実施例のクロマトグラムと、試薬混合反応部６の配管の内径０．５ｍｍの比較例のクロマトグラムを併せて示した。この比較例は、上記の分析条件のうち、滞留時間が約１０秒となるように、試薬混合反応部６の配管の内径と長さを変更したものである。
【００４３】
この図４から分かるように、従来の、配管の内径０．５ｍｍの試薬混合反応部６を使用して、滞留時間を１０秒に設定した比較例の場合、溶液同士の混合不良によるノイズが大きく、ピーク強度も小さいことが分かる。これに対して、試薬混合反応部６の配管の内径を０．１ｍｍにした実施例では、ノイズが抑えられ、ピーク強度も高いことが分かる。
【００４４】
この結果から分かるように、本発明は、液体クロマトグラフの中でも、高速液体クロマトグラフにおいて、良好な感度の分析を可能とするものである。
さらに本発明は、上述したように、ピーク幅が数ｓｅｃであって、滞留時間１０ｓｅｃ以内で十分な拡散・混合・反応を行わなければならないような超高速液体クロマトグラフにおいて、その特徴がより一層発揮され得るものである。
【符号の説明】
【００４５】
Ｓ：液体クロマトグラフ
１Ａ：移動相送液部
１：移動相送液ポンプ
２：インジェクタ
３：分離カラム 
４：カラムオーブン
５：ジョイント部
６：試薬混合反応部
７：検出器
８Ａ：反応試薬送液部
８：反応試薬送液ポンプ
９：データ処理部
１０：移動相容器
１１：反応試薬容器
１２：反応槽
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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