(57)【要約】      （修正有）【課題】学習・記憶能力の増強剤の提供。【解決手段】（a）ビフィズス菌、及び（b）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種含有する、学習・記憶能力の増強剤を使用することにより、学習・記憶能力向上、学習・記憶能力低下の予防、及び加齢に伴う学習・記憶能力低下の予防を図ることが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）ビフィズス菌、及び（b）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せを含む、学習・記憶能力の増強剤。
【請求項２】
腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分が、アラニン、アルギニン、セリン、プロリン、リシン、γ−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、リンゴ酸、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシン、バリン、ロイシン、アデニン、ウラシル、イノシン、フマル酸、ニコチン酸、ヒポキサンチン、又はこれらの組み合わせから選択される物質、の組合せからなる請求項１に記載の増強剤。
【請求項３】
顆粒剤、粉剤、錠剤、カプセル剤、及びマイクロカプセル剤のいずれかの形態である、請求項１又は２に記載の増強剤。
【請求項４】
胃内及び小腸上中部で溶解せず、小腸下部及び大腸で溶解する被覆層を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の増強剤。
【請求項５】
食品添加剤として使用する請求項１〜４のいずれか１項に記載の増強剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の増強剤を含有する食品。
【請求項７】
食品がヨーグルトである請求項６に記載の食品。
【請求項８】
機能性食品若しくは健康食品である請求項６又は７に記載の食品。
【請求項９】
１種以上のポリアミン、あるいはビフィズス菌及び１種以上のポリアミンを含む学習・記憶能力の増強用の高ポリアミン食品。
【請求項１０】
食品がヨーグルトである請求項９に記載の食品。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１に記載の増強剤を含有する医薬品。
【請求項１２】
（a）ビフィズス菌、及び（b）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せを有効成分として含む、学習・記憶能力の増強剤。
【請求項１３】
学習・記憶能力の増強剤を製造するための、（ａ）ビフィズス菌、及び（ｂ）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する少なくとも１種の成分、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せの使用。
【請求項１４】
腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分が、アラニン、アルギニン、セリン、プロリン、リシン、γ−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、リンゴ酸、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシン、バリン、ロイシン、アデニン、ウラシル、イノシン、フマル酸、ニコチン酸、ヒポキサンチン、又はこれらの組み合わせから選択される物質、の組合せからなる請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
学習・記憶能力の増強剤を製造するための、１種以上のポリアミン、あるいはビフィズス菌及び１種以上のポリアミンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、学習・記憶能力向上のための食品、学習・記憶能力低下を予防する食品、及び加齢に伴う学習・記憶能力低下を予防する食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
学習と記憶はヒトの知的活動には欠かせないものである。近年の我が国における高齢化は、老化に伴う学習・記憶能力が低下した高齢者の増加をもたらしており、症状が現れた高齢者およびその家族のＱＯＬを低下させている。アルツハイマー型認知症のように特徴的な疾病由来の学習・記憶障害をターゲットとした薬剤や治療法は医学的見地から研究されているが、老化に伴う学習・記憶能力の低下予防に関する知見は殆ど存在しない。
腸管内のポリアミン濃度は健康と関わりが強く、疾病予防や寿命伸長等の作用があることが明らかになりつつある。例えば、腸内のポリアミン濃度を高めることによって、腸管バリア機能が充実する（回復）こと、抗変異原性作用が発揮されること、アトピー性皮膚炎が軽減されること、そして腸管から吸収されたポリアミンによる全身性の慢性炎症が抑制されること等が知られている（非特許文献１）。
【０００３】
また、上記のようなポリアミンの作用に着目し、腸内のポリアミン濃度を高める検討が行われている。ポリアミンを経口的に摂取した場合、その殆どが小腸上部で速やかに吸収されることが報告されている（非特許文献２）。従って、ポリアミンを単に経口摂取するだけでは腸内のポリアミン濃度を高めることは困難である。また、プロバイオティクスを投与することによって腸内のポリアミン濃度を高めることができると報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
細菌のポリアミン濃度の制御機構に関しては、モデル生物の大腸菌を用いた研究により、細胞膜に複数のポリアミントランスポーター（輸送タンパク質）を有しており、培養条件や対数増殖期等の菌のフェーズによってポリアミンの吸収・放出が変動することが明らかになっている。しかしながら、細菌によるポリアミンの吸収又は放出を調節する物質の存在については、コハク酸が大腸菌によるポリアミンの吸収を阻害することが報告されている（非特許文献４）。
我々はこれまで、核酸の安定化や細胞の分化・増殖、抗炎症効果や抗変異原作用が強いポリアミンに着目し研究を進めてきた。その結果、プロバイオティクスを用いて腸内ポリアミン濃度を高めることで大腸バリア機能が高まり、炎症が抑えられ、寿命が伸びることを確認した（非特許文献５）。さらに、腸内ポリアミン濃度を高める物質として複数のアミノ酸を中心に複数の物質の存在を確認した（特許文献１）。また、別グループにより、高ポリアミン食摂取でマウスの寿命が伸びたことが報告されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】松本光晴（2009）．腸内増殖型ビフィズス菌LKM512の腸内代謝産物を介した保健機能．Milk Science, 58: 143-152
【非特許文献２】Uda, K., Tsujikawa, T., Fujiyama, Y. and Bamba, T. (2003) Rapid absorption of luminal polyamines in a rat small intestine ex vivo model. J. Gastroenterol. Hepatol. 18, 554-559
【非特許文献３】Matsumoto, M., Ohishi, H. & Benno, Y. (2001) Impact of LKM512 yogurt on improvement of intestinal environment of the elderly. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 31, 181-186.
【非特許文献４】壺井雄一、栗原新、小田晋平、熊谷英彦、鈴木秀之．大腸菌の新規プトレッシンインポーターPuuPに関する研究、2006年日本農芸化学会大会講演要旨集p. 108
【非特許文献５】Matsumoto M, Kurihara S, Kibe R, Ashida H, Benno Y (2011) Longevity in mice is promoted by probiotic-induced suppression of colonic senescence dependent on upregulation of gut bacterial polyamine production. PLoS One 6: e23652.
【非特許文献６】Soda K, Dobashi Y, Kano Y, Tsujinaka S, Konishi F (2009) Polyamine-rich food decreases age-associated pathology and mortality in aged mice. Exp Gerontol 44: 727-732.
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特願２０１０−２５２６３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、学習・記憶能力の向上及び学習・記憶能力の低下予防とポリアミンとの関係についてはこれまで何ら知見が見当たらなかった。
本発明者は、腸内ポリアミン濃度を上昇させる、あるいはポリアミン濃度の高い食品を摂取することが、学習・記憶能力の向上に有効であるか否かを検討した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような事情に鑑み、本発明者は、腸内ポリアミン濃度の上昇と学習・記憶能力の向上について鋭意検討を重ねた結果、ビフィズス菌及び腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種、のいずれか一方、あるいは双方の組合せ、あるいはポリアミン濃度の高い食品を長期間摂取することにより学習・記憶能力の向上が認められることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明は、以下を提供する。
（１）（a）ビフィズス菌、及び（b）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せを含む、学習・記憶能力の増強剤。
（２）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分が、アラニン、アルギニン、セリン、プロリン、リシン、γ−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、リンゴ酸、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシン、バリン、ロイシン、アデニン、ウラシル、イノシン、フマル酸、ニコチン酸、ヒポキサンチン、又はこれらの組み合わせから選択される物質、の組合せからなる（１）に記載の増強剤。
（３）顆粒剤、粉剤、錠剤、カプセル剤、及びマイクロカプセル剤のいずれかの形態である、（１）又は（２）に記載の増強剤。
（４）胃内及び小腸上中部で溶解せず、小腸下部及び大腸で溶解する被覆層を有する、（１）〜（３）のいずれか１に記載の増強剤。
（５）食品添加剤として使用する（１）〜（４）のいずれか１に記載の増強剤。
（６）（１）〜（５）のいずれか１に記載の増強剤を含有する食品。
（７）食品がヨーグルトである（６）に記載の食品。
（８）機能性食品若しくは健康食品である（６）又は（７）に記載の食品。
（９）１種以上のポリアミン、あるいはビフィズス菌及び１種以上のポリアミンを含む学習・記憶能力の増強用の高ポリアミン食品。
（１０）食品がヨーグルトである（９）に記載の食品。
（１１）（１）〜（４）のいずれか１に記載の増強剤を含有する医薬品。
（１２）（a）ビフィズス菌、及び（b）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せを有効成分として含む、学習・記憶能力の増強剤。
（１３）学習・記憶能力の増強剤を製造するための、（ａ）ビフィズス菌，及び（ｂ）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する少なくとも１種の成分、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せの使用。
（１４）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分が、アラニン、アルギニン、セリン、プロリン、リシン、γ−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、リンゴ酸、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシン、バリン、ロイシン、アデニン、ウラシル、イノシン、フマル酸、ニコチン酸、ヒポキサンチン、又はこれらの組み合わせから選択される物質、の組合せからなる（１３）に記載の使用。
（１５）学習・記憶能力の増強剤を製造するための、１種以上のポリアミン、あるいはビフィズス菌及び１種以上のポリアミンの使用。
【発明の効果】
【００１０】
腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分若しくは当該成分を含有する食品を摂取することにより容易に学習・記憶能力の向上及び学習・記憶能力の低下予防を図ることが可能になる。このような効果は、これまでの知見からは全く予期し得なかったことである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】糞便の抽出物中のポリアミンと当該抽出物中に検出された成分の濃度上の相関関係の一例を示す図である。（Ａ）はγ−アミノ酪酸とプトレッシンとの相関関係、及び（Ｂ）はリンゴ酸とスペルミジンとの相関関係を示す図である。
【図２】糞便抽出物中の成分がバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）によるポリアミンの生成に与える影響を示す図である。（Ａ）〜（Ｃ）は、各成分が（Ａ）プトレッシン、（Ｂ）スペルミジン、又は（Ｃ）スペルミンの生成に与える影響を示す図である。各成分が与える影響を対照に対する比で示した。
【図３】糞便抽出物中の成分がブラウティア・プロダクタ（Blautia producta）によるポリアミンの生成に与える影響を示す図である。（Ａ）〜（Ｃ）は、各成分が（Ａ）プトレッシン、（Ｂ）スペルミジン、及び（Ｃ）スペルミンの生成に与える影響を示す図である。各成分が与える影響を対照に対する比で示した。
【図４】モリス水迷路プローブ試験結果（雌性マウス投与6ヶ月=20ヶ月齢）を示す図及びグラフである。図中Ａは、マウスの遊泳モニター軌跡の例を示す。右上の二重丸がゴールでプールを４分割して右上のエリアを遊泳していた時間を測定した。左図が試験食投与で学習効果が得られた個体、右図が対照（アルギニンとビフィズス菌（ＬＫＭ５１２）を含む飼料を与えなかったマウス）群で学習効果が得られなかった個体の典型例である。図中Ｂは、ゴール付近（右上エリア）の滞在時間の比較を示すグラフである。試験前は差が無かったが４ヶ月後には差が認められた。*ｐ＜０．０５。なお、マウスの遊泳モニター軌跡は、ビデオカメラ式行動解析装置で測定した。なお、試験食とはアルギニンとＬＫＭ５１２（ビフイズス菌の一種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis（ビフィドバクテリウム  アニマリス  亜種  ラクティス）；寄託番号：FERM P-21998）とを含む飼料を意味する。
【図５】モリス水迷路の試験の詳細（雌性マウス投与6ヶ月=20ヶ月齢）を示すグラフである。各々左側の棒グラフは試験食群、右側の棒グラフは対照群のゴールへの到達時間を表す。試験食群は３日目に２５秒台になるが、対照群は７日かかる。なお、時間の測定にはビデオカメラ式行動解析装置を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「学習・記憶能力を増強するための食品」とは、学習・記憶能力を向上するための食品、学習・記憶能力低下を予防する食品、及び加齢に伴う学習・記憶能力低下を予防する食品のいずれか１つを意味するか、あるいは、これらの食品を包括する概念を意味する。
【００１３】
本発明において使用される「ビフィズス菌」の種類は特に限定されず、腸内ポリアミン濃度を上昇させるどのようなビフィズス菌でも使用することができる。本発明の学習・記憶能力の増強剤に添加するビフィズス菌の量は１０７ｃｆｕ／ｋｇ・体重〜１０１２ｃｆｕ／ｋｇ・体重、好ましくは、１０8ｃｆｕ／ｋｇ・体重〜１０１２ｃｆｕ／ｋｇ・体重、特に好ましくは、１０９ｃｆｕ／ｋｇ・体重〜１０１１ｃｆｕ／ｋｇ・体重である。なお、「ｃｆｕ」はコロニー形成単位（colony forming unit）の略記である。
【００１４】
本明細書において、「腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分」とは、腸内細菌に作用してポリアミンの生成を促進させる成分をいう。そのような成分としては、例えば、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、単糖、脂質、脂肪酸（飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸）、有機酸、ビタミン、及びこれらの類縁体が挙げられる。好ましくはアミノ酸、モノヌクレオチド、有機酸、ビタミン、及びこれらの類縁体が挙げられる。このような成分の具体例として、アラニン、アルギニン、セリン、プロリン、リシン、γ−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシン、バリン、ロイシン、アデニン、ウラシル、イノシン、ヒポキサンチン、リンゴ酸、フマル酸、ニコチン酸、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらの成分から１種若しくは２種以上の成分を選択して、本発明の増強剤の有効成分とすることができる。
【００１５】
本明細書において、「腸内ポリアミン濃度増強食品」とは、（ａ）ビフィズス菌、及び（ｂ）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せを含有する食品を意味する。
【００１６】
本明細書において、「ポリアミン食品」とは、ポリアミンを添加した食品を意味する。
本明細書において、「高ポリアミン食品」とは、ポリアミンの含有量がダイズのポリアミン含有量の１．２倍〜２．５倍である食品を意味する。例えば、ポリアミンの含有量がダイズのポリアミン含有量の約２倍である食品が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「長期間摂取」における「長期間」とは、（ａ）ビフィズス菌、及び（ｂ）腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分を少なくとも１種、のいずれか一方、あるいは（ａ）及び（ｂ）の組合せを含有する食品か、あるいはビフィズス菌単独か、あるいは高ポリアミン食品を少なくとも週３回、３ヶ月間以上摂取することを意味する。
【００１８】
本明細書において、「ポリアミン」とは、分子中にアミノ基を２個以上持つ低分子の塩基性物質をいう。ポリアミンは、DNA、RNA、タンパク質の合成と安定化、及び細胞の分化と増殖等に関与することが知られており、生体にとって必須の生理活性物質である。本明細書でいうポリアミンとは、上記のポリアミンのうち、哺乳類の生体内に存在するポリアミンを特に意味する。そのようなポリアミンとは、例えば、プトレッシン、スペルミジン、及びスペルミンが挙げられる。しかし、本発明においては、特に毒性がない限り、いかなるポリアミンも使用することができる。
本発明において、「腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分」の代わりに、ポリアミン自体を使用しても同様の効果を得ることができる。即ち、ポリアミンそのもの（例えば、高ポリアミン食品）を長期間摂取することにより学習・記憶能力の向上が認められる。
【００１９】
本発明で使用する腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分は、腸内細菌によるポリアミンの生成の促進上有効量で投与されることが好ましい。ヒトを投与対象とした場合、そのような有効量とは、大腸内に当該成分が体重１ｋｇ当たり１〜１０ｍｇ存在するような量である。例えば、体重６０ｋｇのヒトに換算すると、アルギニンの場合について言えば、大腸内存在量は０．３ｇ程度で良い。通常、アミノ酸のようなポリアミンの生成を促進する成分やポリアミン自体は、そのまま摂取すると、胃、小腸上部及び小腸中部で吸収されるため、小腸下部及び大腸まで必要量到達しない。したがって、粉末等の形でそのまま摂取するとかなり大量のポリアミンの生成を促進する成分やポリアミンを摂取しなければならない。そのため、実際に摂取する場合は、ビフィズス菌やポリアミンの生成を促進する成分やポリアミンを、胃、小腸上部及び小腸中部で溶解しないコーティングを施したカプセルやマイクロカプセルに封入するか、ビフィズス菌やポリアミンの生成を促進する成分やポリアミンを含む錠剤の表面を胃、小腸上部及び小腸中部で溶解しないコーティングを施すことが好ましい。
【００２０】
本明細書でいう「腸内細菌」とは、動物の腸内に住みつくいずれの菌をも包含する。腸内菌の主要な割合を占めるのは細菌であるが、酵母やカビ等も存在する。年齢や個体によって菌叢は変動するが、主な細菌としては、クロストリディウム・コッコイデス（Clostridium coccoides）グループ、クロストリディウム・レプタム（Clostridium leptum）グループ、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）グループ、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、アトポビウム（Atopobium）クラスター等が挙げられる。特に、クロストリディウム・コッコイデスグループとバクテロイデス・フラギリスグループの細菌全体に占める割合は高く、少なくともこの２グループで５０％以上を占めることが知られている。クロストリディウム・コッコイデスグループとしては、例えばクロストリディウム・クロストリディフォルムス（Clostridium clostridiiformes）、ブラウティア・プロダクタ（Blautia producta）（旧名：ルミノコッカス・プロダクタス（Ruminococcus productus））、及びユウバクテリウム・レクターレ（Eubacterium rectale）が挙げられる。バクテロイデス・フラギリスグループとしては、例えばバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニフォルミス（Bacteroides uniformis）、及びバクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）が挙げられる。
【００２１】
本発明の増強剤は、医薬組成物又は食品（特に、機能性食品、健康食品、サプリメントなど）として継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒剤（ドライシロップを含む）、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、錠剤（チュアブル剤などを含む）、散剤（粉末剤）、丸剤などの各種の固形製剤、又は内服用液剤（液剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）などの液状製剤などの形態で調製することができ、成分の安定性や摂取の簡便さの点からカプセル剤又は錠剤の形態が好ましいが、特に限定されるものではない。
【００２２】
カプセル剤又は錠剤の形態の本発明の代謝活性化剤は、医薬又は食品として許容される公知の添加物を用いて製造することができ、医薬又は食品の分野で採用されている通常の製剤化手法を適用することができる。例えば、錠剤は、各成分を処方に従って添加配合し、粉砕、造粒、乾燥、整粒、及び混合を行い、得られた調製混合物を打錠することによって調製することができる。
【００２３】
製剤化のための添加物としては、限定はされないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、流動化剤、分散剤、湿潤剤、防腐剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤などが挙げられる。また、液剤の形態にする場合は、ペクチン、キサンタンガム、グアガムなどの増粘剤を配合することができる。また、コーティング剤を用いてコーティング錠剤にしたり、ペースト状の膠剤とすることもできる。さらに、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。
【００２４】
本発明の組成物は、必要に応じ、従来公知の着色剤、保存剤、香料、風味剤、コーティング剤などの成分を配合して調製することもできる。
また、本発明の組成物は、１以上の追加成分を配合して調製してもよい。追加成分の例としては、抗酸化剤、血糖降下剤、抗コレステロール剤、免疫賦活剤、ビタミン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ミネラル分（鉄、亜鉛、マグネシム、ヨードなど）、脂肪酸（EPA、DHAなど）等を挙げることができる。
【００２５】
本発明の別の側面では、投与方法に適した形態を有する学習・記憶能力の増強剤を提供する。投与方法としては、例えば、経口投与及び非経口投与が挙げられる。本明細書において「経口投与に適した形態」というときは、例えば、錠剤、ロゼンジ、硬質又は軟質カプセル、水性又は油性懸濁液、乳液、分散性粉末又は顆粒、シロップ又はエリキシルが挙げられる。また「非経口投与に適した形態」としては、直腸投与に適した形態である。「直腸投与に適した形態」としては、例えば座薬、浣腸薬が挙げられる。
【００２６】
本発明の増強剤を経口投与する場合、ポリアミンの生成を促進する成分の大部分が小腸上部及び小腸中部において吸収されることにより、腸内細菌によるポリアミンの生成が十分に促進されない可能性がある。ここで、腸の構造をヒトを例にして説明すると、おおまかに３つの領域、小腸上中部、小腸下部、及び大腸、に区分することができる。そして、腸内における上記で説明した主要な細菌：クロストリディウム・コッコイデスグループ、クロストリディウム・レプタムグループ、バクテロイデス・フラギリスグループ、ビフィドバクテリウム属、アトポビウムクラスター等は主として大腸部分に存在している。このような理由から、本発明の学習・記憶能力の増強剤を経口で投与する場合には、小腸上部及び小腸中部における有効成分の吸収を抑制することが、発明の効果を発揮させる上でより好ましい。
【００２７】
また、本発明において使用されるビフィズス菌は、偏性嫌気性菌で一般的に酸に弱く、通性嫌気性菌で発酵に利用されている乳酸菌とは性状が大きく異なり、工業的には極めて「扱いにくい」、「死滅しやすい」細菌である。したがって、ビフィズス菌を酸から守るために、ビフィズス菌を封入したカプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒等は少なくとも胃内で溶解しないことが望ましい。もし、カプセル、マイクロカプセル、顆粒等にビフィズス菌を単独で封入する場合には、それらの表面に腸溶性被膜を施すことが望ましい。腸溶性被膜に用いられる材料としては、例えば、セラック、酢酸セルロース、モノフタル酸エステル、サリチル酸フェニル、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ケラチン等を挙げることができる。
【００２８】
従って、本発明の別の側面では、胃内及び小腸上部及び小腸中部で溶解せず、小腸下部及び大腸で溶解する、経口投与用の学習・記憶能力の増強剤を提供する。そのような増強剤としては、顆粒剤、粉剤、錠剤、カプセル剤、及びマイクロカプセル剤等が挙げられる。一態様として、本発明に係る腸内細菌によるポリアミン生成を促進する成分を封入することによってカプセル剤を調製してもよい。カプセル剤は、使用目的に応じて大きさを任意に調節することができる。例えば、カプセル剤を食品等に混合して使用する場合には、食品本来の食感にできるだけ影響を与えないように小さなカプセルを使用してもよい。そのような場合、例えば、直径１ｍｍ以下のマイクロカプセルを使用することが挙げられる。一方、カプセル剤をサプリメントとして使用する場合には、サプリメントとして一般的な大きさを採用してもよい。さらに、腸内細菌によるポリアミン生成を促進する成分に加えて、その他の成分をカプセル剤に含有させてもよい。その他の成分としては、例えば、本発明の効果を維持、増強、及び／又は補完する作用を有するものを挙げることができる。具体例としては、乳酸菌等が挙げられる。
【００２９】
本発明の増強剤は、例えば、飲料、発酵食品、菓子類、パン類、スープ類等の各種食品又はその添加成分として；又はドッグフード、キャットフードなどの各種ペットフード又はその添加成分として使用することができる。これらの食品の製造方法は、本発明の効果を損なわないものであれば特に限定されず、各用途で当業者によって使用されている方法に従えばよい。本発明の増強剤が適用できる食品は、例えば、生物が日常的に摂取する食品だけでなく、特定保健用食品、栄養機能食品、特別用途食品等の機能性食品にも適用できる。本発明の増強剤が適用可能な食品の例としては、牛乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズ、バター、プリン、ババロア、アイスクリーム、ビスケット、クッキー、飴、キャンディー、フルーツジュース、緑茶、紅茶、烏龍茶、コーヒー、ココア、サプリメント、及び豆乳等が挙げられる。固形食品に加える場合には、例えば顆粒剤、及び粉剤等の形態で加えることが好ましい。また、飲料、ペースト状食品の場合には、例えばマイクロカプセルの形態で加えることが好ましい。
【００３０】
本発明に係る腸内細菌によるポリアミンの生成を促進する成分の探索は、自然界に存在する物質、任意に合成した化合物のライブラリー等、いずれを対象にしてもよいが、一例として、動物の代謝産物を対象にすることができる。一態様を以下に示す。
【００３１】
腸内の全代謝産物を解析（メタボローム解析）することによって、腸内のポリアミン濃度を制御する可能性のある成分を探索することができる。健康な成人から採取した糞便をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で抽出し、当該抽出液をろ過フィルターで処理したものを
腸内の全代謝産物として解析用のサンプルとする。当該サンプルをメタボローム解析に供し、ピークを検出する。当該ピークの情報として、質量電荷比（ｍ／ｚ）、泳動時間（Migration  time: MT）、及びピーク面積値を得る。各ピーク面積値の内部標準の面積値に
対する相対値を算出し、腸内の代謝産物中のポリアミン含量との相関性を検討する。これとは別に、各ピークについてのｍ／ｚ及びＭＴ値に基づいて、対応する成分を同定する。
【００３２】
上記の探索によってポリアミン濃度と正の相関を有する成分が見出された場合は、当該成分が腸内のポリアミン濃度の増強効果を有するのか評価する必要がある。そのような評価において、例えば、腸内細菌によるポリアミンの生成を指標とすることができる。一態様を以下に示す。
【００３３】
腸内で最も優勢に存在する常在菌、例えば、クロストリディウム・コッコイデスグループやバクテロイデス・フラギリスグループに属する細菌を前培養し、適切な液体培地に所定の濃度で懸濁する。一方、上記の探索で見出された成分を所定の濃度で含有する液体培地を調製し、上記の細菌を懸濁した培地を所定量で接種し、嫌気的に培養する。所定時間後の培養液を回収して上清を得る。当該上清をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理し、ＴＣＡを除去する。その後蛍光標識し、ポリアミンに相当する蛍光ピークを検出する。対照との比較において、ポリアミンの濃度を１．２倍以上に増強させる成分を、腸内細菌によるポリアミンの生成を促進させる効果を有するものとして判断する。
【実施例】
【００３４】
以下の具体例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらは、本発明の理解をより容易にするために記載されたものであって、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００３５】
［試験例１］  ポリアミンの濃度を増強させる可能性のある成分の探索
腸内全代謝産物解析（メタボローム解析）を用いて、腸内のポリアミン濃度を増強する可能性のある成分を糞便から探索した。
【００３６】
食事由来成分による影響を低くするため、２０〜３０歳代の健康な成人男性１２名に全く同じメニューの食事を１日３回（朝昼晩、約２３００ｋｃａｌ／ｄａｙ）、４日間に渡って与えた。５日目の朝の糞便を採取し、PBSで５倍に希釈した。当該希釈液を分子量５０００の限界ろ過フィルターで処理後、ＣＥ−ＴＯＦＭＳによるメタボローム解析に供した。当該メタボローム解析は、ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社に委託した。解析条件を以下に示す。
【００３７】
１．陽イオン性代謝物質（カチオンモード）
装置：Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies社）；
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm；
測定条件；
Run buffer : Cation Buffer Solution ( p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution ( p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid ( p/n : H3301-1020)。
【００３８】
２．陰イオン性代謝物質（アニオンモード）
装置：Agilent CE-TOFMS system（Agilent Technologies 社）；
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm；
測定条件；
Run buffer : Anion Buffer Solution ( p/n : H3302-1021)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution ( p/n : H3302-1022)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid ( p/n : H3301-1020)。
【００３９】
ＣＥ−ＴＯＦＭＳによって検出されたピークは、自動積分ソフトウェアのMasterHands ver.2.1.0.1（慶應義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比（
ｍ／ｚ）、泳動時間（Migration  time: MT）、及びピーク面積値を得た。当該各ピーク
面積値を内部標準の面積値で割り、相対値を算出し個体間の比較を行った。各ピークの相対値と、上記の方法で同様に算出したポリアミン（プトレッシン、スペルミジン、スペルミン）の相対値を比較検討した。一方、検出された各ピークについてのｍ／ｚ及びＭＴの値をＨＭＴ代謝物質データベースと照合することにより、各ピークに対応する成分を同定した。
【００４０】
解析の結果、糞便の抽出物からカチオン１２５成分、アニオン９６成分が検出された。これらの成分とポリアミンの濃度上の相関性の有無を検討した。その一例を図１に示す。
当該検討により、プトレッシンの濃度と危険率５％以下で正の相関性を有する成分が２８種類、スペルミジンの濃度と危険率５％以下で正の相関性を有する成分が２３種類存在することが示された（表１）。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
［試験例２］  腸内のポリアミン濃度の増強効果
試験例１においてポリアミンと濃度上の有意な相関性を示した成分が、腸内の常在菌によるポリアミンの生成を促進するか検討した。
【００４３】
上記成分の中から、コストや安全性等の様々な観点を考慮して、次の成分を選択し、試験を行った：  アラニン、セリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、アルギニン、プロリン、リジン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、アデニン、イノシン、ヒポキサンチン、ウラシル、キサンチン、ニコチン酸、リンゴ酸、フマル酸。
【００４４】
腸内で最も優勢に存在するクロストリディウム・コッコイデスグループやバクテロイデス・フラギリスグループから、試験に使用する腸内常在菌を選択した。バクテロイデス・フラギリスグループとしてバクテロイデス・テタイオタオミクロンJCM 5827T及びクロス
トリディウム・コッコイデスグループとしてブラウティア・プロダクタJCM 1471T（旧名
：ルミノコッカス・プロダクツ）を用いた（独立行政法人  理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室より入手）。これら菌株をそれぞれEggerth Gagnon（EG）寒天培地にて３７℃で４８時間前培養し、GAM液体培地（日水製薬株式会社）にＯＤ６６０値
が０．５になるよう懸濁した。
【００４５】
一方、上記試験例１で選択した成分を希釈して１０％（ｗ／ｖ）水溶液を調整した。一部の有機酸、即ちフマル酸、アスパラギン酸、イノシン、アデニン、ヒポキサンチン、キサンチン、イソロイシン、ニコチン酸、ロイシン、バリン、チロシン、及びウラシルは、水酸化ナトリウムで中和しながら溶解することによって１０％（ｗ／ｖ）水溶液を調整した。当該１０％（ｗ／ｖ）水溶液をそれぞれＧＡＭ液体培地に添加し、各成分を０．２％（ｗ／ｖ）で含有するＧＡＭ液体培地を調製した。当該液体培地の液量の１％に相当する量で上記菌株の懸濁液を当該液体培地に添加し、アネロパック・ケンキ（商標）（三菱ガス化学株式会社）を用いる嫌気培養を行なった（３７℃、２４時間）。培養２４時間後に培養液を回収し、遠心分離にかけて上清を得た。当該上清を以下の分析に使用するまで−２０℃で保存した。
【００４６】
当該上清をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（最終濃度１３．３％）で処理した後、ジエチルエーテルで２回処理することによってＴＣＡを除去した。さらに９−フルオレニルメチルクロロホルメート（ＦＭＯＣ）を用いて蛍光標識し、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）システム（Ｗａｔｅｒｓ）にて測定した。データ解析はＥｍｐｏｗｅｒ（商標）２（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。各培養液のポリアミン濃度は、対照に対する相対値として算出した。対照は上記成分の代わりに蒸留水を添加した以外は、同様の処理を施したものである。
【００４７】
試験に供した成分が、バクテロイデス・テタイオタオミクロンによるポリアミンの生成に与える影響を図２に示した。プトレッシンの濃度は、アラニン、アルギニン、及びイノシンの添加によっておよそ１．２倍、セリンの添加によっておよそ１．２５倍、ロイシンの添加によっておよそ１．４倍、及びアデニンの添加によっておよそ２．０倍に増加した（図２（Ａ））。スペルミジンの濃度は、イソロイシンの添加によっておよそ１．２５倍、ニコチン酸の添加によっておよそ１．５倍、γ−アミノ酪酸、イノシン、及びヒポキサンチンの添加によっておよそ２．０倍、アラニンの添加によっておよそ２．５倍、アデニンの添加によっておよそ３．２倍、そしてリンゴ酸の添加によっておよそ４．５倍に増加した（図２（Ｂ））。スペルミンの濃度は、リンゴ酸、アスパラギン酸、チロシン、ロイシン、アデニン、及びキサンチンの添加によっておよそ１．２５倍、イソロイシン、イノシン、フマル酸、及びヒポキサンチンの添加によっておよそ１．５倍、ニコチン酸の添加によっておよそ１．８倍、ウラシルの添加によっておよそ２．０倍、そしてバリンの添加によっておよそ２．３倍に増加した（図２（Ｃ））。
【００４８】
一方、試験に供した成分が、ブラウティア・プロダクタによるポリアミンの生成に与える影響を図３に示した。プトレッシンの濃度は、イノシンの添加によっておよそ１．２倍、ロイシンの添加によっておよそ１．２５倍、アデニン及びヒポキサンチンの添加によっておよそ１．３倍、γ−アミノ酪酸、ウラシル、及びキサンチンの添加によっておよそ１．５倍に増加した（図３（Ａ））。スペルミジンの濃度は、アデニンの添加によっておよそ１．２倍、そしてリンゴ酸の添加によっておよそ１．５倍に増加した（図３（Ｂ））。スペルミンの濃度は、アルギニン、プロリン、及びヒポキサンチンの添加によっておよそ１．３倍、チロシン、イノシン、及びニコチン酸の添加によっておよそ１．５倍、アラニン、セリン、リジン、及びアスパラギン酸の添加によっておよそ１．８倍、γ−アミノ酪酸、ロイシン、及びアデニンの添加によっておよそ２．３倍、リンゴ酸の添加によっておよそ２．８倍、そしてバリンの添加によっておよそ３．０倍に増加した（図３（Ｃ））。
【００４９】
図２及び図３の結果を併せて考えると、アラニン、アルギニン、セリン、プロリン、リジン、γ−アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、リンゴ酸、アスパラギン酸、イソロイシン、チロシン、バリン、ロイシン、アデニン、ウラシル、イノシン、フマル酸、ニコチン酸、ヒポキサンチン、及びキサンチンが、プトレッシン、スペルミジン、及びスペルミンのいずれかの濃度を対照と比べて１．５倍以上に増加させることが示された。特にアラニン、γ−アミノ酪酸、リンゴ酸、バリン、ロイシン、及びアデニンは、プトレッシン、スペルミジン、及びスペルミンのいずれかの濃度を２．０倍以上に増加させる高い効果を有していることが示された。
【００５０】
以上の試験例の結果を総合すれば、本発明に係る成分は、腸内の常在菌であるバクテロイデス・テタイオタオミクロン及びブラウティア・プロダクタに対してポリアミンの生成を促進させる効果があることが明らかである。そして、当該成分は、これら菌株が属するクロストリディウム・コッコイデスグループやバクテロイデス・フラギリスグループに属する他の菌株に対しても同様の効果を発揮することが示唆される。クロストリディウム・コッコイデスグループやバクテロイデス・フラギリスグループを合わせると、ヒト腸内の菌叢の５０％程度を占める最優勢菌群となることから、本発明に係る成分は生体内において高い効果を発揮することが考えられる。
【００５１】
［実施例１］  モリス水迷路試験
（使用動物）マウス
８ヶ月齢の雌性ＩＣＲリタイアマウス（繁殖にのみ使用したマウス）１５０匹を購入し、６ヶ月間予備飼育後１４ヶ月齢から投与をスタートした（スタート時点で１２８匹、）。１２時間サイクルでの明暗、気温２５度、湿度５０％で制御された実験室で通常飼育し、飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母）および水道水は自由摂取とした。試験食（Arg 10 mg/mice + LKM512 109 cfu/miceをＰＢＳに懸濁）群６２匹と対照群（ＰＢＳのみ投与）６６匹の２群に分けて実施した。試験食は週に３回（基本的には月、水、金曜日）投与した。本試験は協同乳業株式会社研究所実験動物指針に則り実施した。
【００５２】
（実施方法）
水迷路実験はMorrisの常法に準じた。すなわち、装置は水を張った円形タンク（直径１２０ｃｍ  深さ３０ｃｍ）とマウスが回避できるためのプラットホーム（直径１０ｃｍ  高さ１８ｃｍ）からなっている。プラットホームは透明なアクリル製で、水面下１cmになるように２２±２℃の水を張った。また、円形タンクの壁面を東西南北の４つの区域に分け、４分割の東北（上側の右側）の区画の中央にプラットホームを設置した。背景を一定にして静かな環境下でstep１−３までの実験を行った。
【００５３】
ステップ１：予備訓練セッション
訓練セッションを行う前日に1回行った。円形タンクの北東の区画の中央に水面より数ｃｍ高い位置にプラットホームを固定しておき、マウスを１０秒間プラットホームにのせた。マウスをプラットホームから離して１５秒泳がせた後、プラットホームに戻るように誘導した。この一連の操作を1匹のマウスにつき３回繰り返した。
【００５４】
ステップ２：訓練セッション
マウスを1日３回円形タンクの異なる３点から入水させた。入水からプラットホームに到達するまでの時間を測定した。６０秒たってもプラットホームに到達しない場合は、強制的にプラットホームまで移動させ、１０秒間放置しその位置を記憶させた。この場合におけるマウスの到達時間を６０秒とした。試行は１日３回（試験の間隔は３時間以上空ける）行い、合計７日間を訓練セッションとした。
【００５５】
ステップ３：プローブテスト
訓練セッション終了の翌日にプローブテストを行った。プラットホームを取り除き、訓練セッションと同様に３回円形タンクの異なる３点からマウスを入水させ、６０秒間の遊泳行動を記録した。３回の各区画の滞在時間を平均し、プラットホームを置いていた区画の滞在時間の割合から空間認識・記憶能を評価した。
【００５６】
（結果）
雌性マウスの投与前（１２ヶ月齢）と６ヶ月投与後（２０ヶ月齢）のプローブ試験の結果を示す（図４）。投与前の試験飼料群と対照群の間に差は無かったが、投与6ヶ月後には試料群の方が有意に（ｐ＜０．０５）ゴール付近の滞在時間が長かった。また、学習期間中のゴールまでの到達時間でも、試験食群が非常に早く学習・記憶することが確認され、３日目で２５秒台に到達するのに対し、対照群は７日間かかった。（図５）。以上の結果から、試験食摂取で健康寿命の重要な要素と考えられる学習記憶能力が維持されることがわかった。なお、試験食群の投与半年後の糞便中ポリアミン濃度の上昇は確認しており、生体へのポリアミン供給量は増えているのは確実である。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、今後の高齢化時代に予想される学習・記憶能力が低下した高齢者の増加に対する有効策となり得るものである。また、学習・記憶能力の低下が懸念される高齢者並びに高齢者予備軍が、本発明の増強剤をサプリメントのような機能性食品の形態で、あるいは、本発明の増強剤を含むヨーグルト等の食品として摂取することによって学習・記憶能力の低下を予防する効果を期待することができる。他方、実際に学習・記憶能力が低下してしまった高齢者が、本発明の増強剤をサプリメントのような機能性食品の形態で、あるいは、ヨーグルト等の食品に含有させた形で容易に摂取することが可能である。これによって、老化に伴い学習・記憶能力が低下してしまった高齢者およびその家族のＱＯＬの低下を防ぐことが期待される。したがって、本発明は来る高齢化時代において極めて産業的価値の高い有用な発明である。
【図１】
2013184956.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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