(57)【要約】      （修正有）【課題】耐アルカリ性及び防汚性に優れるアクリルアミド系ポリマー粒子。【解決手段】下記式（１）で表される構造を含むポリマー粒子。2013238446.tif 000012〔式（１）中、Ｒ1は炭素数２〜８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕【選択図】図１
2013238446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される構造を含むポリマー粒子。
【化１】
2013238446.tif 000010
〔式（１）中、Ｒ1は炭素数２〜８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕
【請求項２】
ポリマー粒子が、（メタ）アクリルアミド系モノマー、スチレン系モノマー、Ｎ−ビニルアミド系モノマー、ビニルケトン系モノマー、アクリロニトリル系モノマー及びエポキシ基含有不飽和モノマーから選ばれるモノマーに由来する構造単位を更に有する請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
（メタ）アクリルアミド系モノマーが、下記式（３）で表されるものである請求項２に記載の粒子。
【化２】
2013238446.tif 000011
〔式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す。〕
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の粒子にリガンドを固定化したアフィニティクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
リガンドが、イムノグロブリン結合タンパク質である請求項５に記載のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の充填剤が充填されているクロマトグラフィーカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリマー粒子に関する。詳しくは、アクリルアミド系ポリマー粒子、該ポリマー粒子を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤及びクロマトグラフィーカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体医薬等に代表されるバイオ医薬品の分野では、タンパク質等の目的物質の発現技術が著しく進展し、それに伴いクロマトグラフィー等による精製工程での生産性の向上が求められている。
【０００３】
タンパク質等の生体高分子の精製を効率よく行うため、クロマトグラフィー用担体には、高流速での使用を可能にする高い耐圧性能、リガンドを導入した場合の生体高分子に対する十分な結合容量が求められる。従来、クロマトグラフィー用担体として、シリカ等の無機材料や、ポリ（メタ）アクリルエステル類、ポリ（メタ）アクリルアミド類等の合成ポリマーの他、多糖類等の天然ポリマーが用いられている。
【０００４】
上記天然ポリマーとしては、通常アガロース、セルロースのような多糖類が用いられ、特に、高度架橋されたアガロース粒子は、高い親水性を有し、リガンド結合性が高く、また担体を洗浄するために利用されるアルカリ性溶液に対して耐性を有することから、汎用性が高い。しかしながら、天然ポリマーは強度が十分でない、天然物由来であることから純度が低いという欠点がある。
【０００５】
これに対して、シリカ粒子や合成ポリマー粒子は、強度が大きく高流速での使用に適している。しかしながら、リガンド等を導入した場合に生体高分子の結合容量が小さい傾向があり、耐アルカリ性が低いという問題もある。また、ゲルの着色性をはじめ非特異的な相互作用を抑えるという点でより親水性の高い粒子が求められている。
【０００６】
また、（メタ）アクリルアミドモノマーは、有機溶剤への溶解性が低いものが多く、ポリ（メタ）アクリルアミド粒子の調製には、一般的に逆相懸濁により重合する方法か、保護基等で疎水化処理したモノマーを重合する方法が採用されている（特許文献１〜３）。しかしながら、逆相懸濁重合は、多量の有機溶剤を必要とし、粒子調製の工程が複雑であるという問題があり、疎水化処理した場合には重合後に親水性基に変換する二次処理を行わなければならない。
なお、特許文献４および５には、三級アクリルアミド系架橋モノマーを用いた重合体の歯科材料としての利用が報告されているものの、これらは何れも歯の欠損を補う組成物を開示するものであって、ポリマー粒子に関するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００３−５１１６５９号公報
【特許文献２】特表２００９−５０３２０３号公報
【特許文献３】特開２００６−１１１７１７号公報
【特許文献４】特開２００２−２１２０１９号公報
【特許文献５】特表２００９−５４２７４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、耐アルカリ性及び防汚性に優れるアクリルアミド系ポリマー粒子、該ポリマー粒子を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤及びクロマトグラフィーカラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アクリルアミド系ポリマーについて種々検討したところ、特定の三級アクリルアミド系架橋モノマーを用いて調製される、下記式（１）で示される三級の架橋アクリルアミド基を有するアクリルアミド系ポリマーの粒子が、耐アルカリ性及び防汚性に優れ、クロマトグラフィー用担体として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記式（１）で表される構造を含むポリマー粒子を提供するものである。
【００１１】
【化１】
2013238446.tif 000003
【００１２】
〔式（１）中、Ｒ1は炭素数２〜８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕
【００１３】
また、本発明は、上記ポリマー粒子を担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤を提供するものである。
更に、本発明は、上記ポリマー粒子にリガンドを固定化したアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を提供するものである。
更に、本発明は、上記充填剤が充填されているクロマトグラフィーカラムを提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のポリマー粒子は、耐アルカリ性及び防汚性に優れ、且つリガンドを固定化した場合には生体高分子に対する結合容量が大きく、クロマトグラフィー用担体として有用である。
したがって、本発明によれば、耐アルカリ性及び防汚性に優れ、且つリガンドを固定化した場合には生体高分子に対する結合容量が大きいクロマトグラフィーカラム用充填剤及びクロマトグラフィーカラムを提供できる。
また、本発明のポリマー粒子は、順相懸濁重合により調製が可能であることから、粒径、ポアサイズの調整が容易であり、複雑な手順を踏まずに簡易に製造できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１のポリマー粒子のＳＥＭ写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のポリマー粒子は、下記式（１）で表される、三級の架橋アクリルアミド基を有する。なお、ポリマー粒子とは粒子状のポリマーを意味する。
【００１７】
【化２】
2013238446.tif 000004
【００１８】
〔式（１）中、Ｒ1は炭素数２〜８のアルキレン基を示し、Ｒ2及びＲ3は炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｒ2及びＲ3が一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。但し、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上である。〕
【００１９】
ここで、Ｒ1で示される炭素数２〜８のアルキレン基としては、直鎖状でも分岐状でもよく、例えばエタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基等が挙げられる。アルキレン基の炭素数は好ましくは３〜８であり、より好ましくは３〜６である。
【００２０】
Ｒ2及びＲ3で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル基又はエチル基が好ましく、Ｒ2及びＲ3が共にメチル基又はエチル基であるのがより好ましく、エチル基であるのが更に好ましい。
【００２１】
また、Ｒ2及びＲ3は一緒になって隣接する窒素原子及びＲ1と共に複素環を形成していてもよい。斯かる複素環基としては、２−メチルピペラジン−１，４−ジイル基、２−エチルピペラジン−１，４−ジイル基、２，５−ジメチルピペラジン−１，４−ジイル基、２，５−ジエチルピペラジン−１，４−ジイル基、１，４−パーヒドロジアゼピン−１，４−ジイル基、６−メチル−１，４−パーヒドロジアゼピン−１，４−ジイル基、６−エチル−１，４−パーヒドロジアゼピン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
【００２２】
また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の炭素数の合計は５以上であるが、リガンドを固定化した場合の結合容量及び耐アルカリ性の観点から、好ましくは５〜１５であり、より好ましくは５〜１２であり、更に好ましくは６〜１０であり、特に好ましくは７〜９である。
【００２３】
本発明のポリマー粒子は、上記式（１）で表される三級の架橋アクリルアミド基を誘導する化合物（Ａ）（以下、単に「三級アクリルアミド系架橋モノマー（Ａ）」ともいう。）を含むモノマー部を重合し、ポリマー部を形成することにより製造することができる。ポリマー部は、三級アクリルアミド系架橋モノマー（Ａ）を重合して形成されたものであってもよく、或いは三級アクリルアミド系架橋モノマー（Ａ）と共重合可能な他のモノマー（Ｂ）を重合して形成された共重合体であってもよい。
【００２４】
上記三級アクリルアミド系架橋モノマー（Ａ）は、下記式（２）で表されるものである。
【００２５】
【化３】
2013238446.tif 000005
【００２６】
〔式（２）中の各記号は前記と同義である。〕
【００２７】
三級アクリルアミド系架橋モノマー（Ａ）の好適な具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−１，３−ビス（アクリルアミド）プロパン（ＤＥＡＡＰ）、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−１，６−ビス（アクリルアミド）ヘキサン（ＤＥＡＡＨ）、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−１，４−ビス（アクリルアミド）ブタン、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−１，５−ビス（アクリルアミド）ペンタン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，３−ビス（アクリルアミド）プロパン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，６−ビス（アクリルアミド）ヘキサン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，４−ビス（アクリルアミド）ブタン、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−１，５−ビス（アクリルアミド）ペンタン等が挙げられる。
【００２８】
他の共重合可能なモノマー（Ｂ）としては、非架橋性（単官能）モノマー、架橋性（多官能）モノマーのいずれも使用することができ、これらを併用してもよい。
【００２９】
上記非架橋性モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド系モノマー、スチレン系モノマー、Ｎ−ビニルアミド系モノマー、ビニルケトン系モノマー、アクリロニトリル系モノマーが好ましい。
【００３０】
上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡＭ）、ジエチルアクリルアミド（ＤＥＡＡＭ）、プロピルアクリルアミド、イソプロピルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン等が挙げられる。
【００３１】
上記（メタ）アクリルアミド系モノマーの中でも、下記式（３）で表されるものが好ましい。
【００３２】
【化４】
2013238446.tif 000006
【００３３】
〔式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す。〕
【００３４】
上記Ｒ4としては水素原子が好ましい。また、Ｒ5及びＲ6としては炭素数１〜４のアルキル基が好ましい。該アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。アルキル基の炭素数は好ましくは１又は２である。
【００３５】
また、上記スチレン系モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、４−メトキシスチレン、４−エトキシスチレン、１，２−ジヒドロキシ−３−（４−ビニルベンジルオキシ）プロパン等が挙げられる。
また、上記Ｎ−ビニルアミド系モノマーとしては、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルプロパミド、Ｎ−ビニルブタミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルプロパミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルブタミド、Ｎ−エチル−Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−ビニルプロパミド、Ｎ−エチル−Ｎ−ビニルブタミド、Ｎ−プロピル−Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−プロピル−Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−プロピル−Ｎ−ビニルプロパミド、Ｎ−プロピル−Ｎ−ビニルブタミド、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−ビニルプロパミド、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−ビニルブタミド等が挙げられる。
また、上記ビニルケトン系モノマーとしては、アクロレイン、メチルビニルケトン、エチルビニルケトン、プロピルビニルケトン、イソプロピルビニルケトン、メタクリロレイン、イソプロペニルメチルケトン、イソプロペニルエチルケトン、イソプロペニルプロピルケトン、イソプロペニルイソプロピルケトン等が挙げられる。
また、上記アクリロニトリル系モノマーとしては、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等が挙げられる。
これら非架橋性モノマーの中でも、（メタ）アクリルアミド系モノマーが好ましい。
【００３６】
また、上記架橋性モノマーとしては、二官能モノマーが好ましく、エポキシ基含有不飽和モノマーがより好ましい。例えば、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート（Ｍ１００）、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（ＶＢＧＥ）、グリシジルアクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。二官能モノマーとして、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルアクリルアミドなどの水酸基含有不飽和モノマー；ダイアセトンアクリルアミド、２−アセトアセトキシエチルメタクリレートなどのカルボニル基含有不飽和モノマー；メタクリル酸、４−ビニル安息香酸などのカルボン酸基含有不飽和モノマー；ジビニルベンゼン、ビス（アクリロイル）ピペラジンなどの架橋性不飽和モノマーも使用することができる。
【００３７】
なお、上述のようなモノマー（Ｂ）の中でも、アルカリ耐性の観点から、カルボン酸エステル結合を有さないものが好ましい。
【００３８】
また、モノマー部の組み合わせとしては、上記式（２）で表されるモノマーと上記非架橋性モノマーと上記架橋性モノマーとの組み合わせが好ましい。中でも、上記式（２）で表されるモノマーと（メタ）アクリルアミド系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせ、式（２）で表されるモノマーとＮ−ビニルアミド系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせ、式（２）で表されるモノマーとビニルケトン系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせが好ましく、上記式（２）で表されるモノマーと（メタ）アクリルアミド系モノマーとエポキシ基含有不飽和モノマーとの組み合わせがより好ましい。
【００３９】
また、式（１）で表される三級の架橋アクリルアミド基の合計含有量は、リガンドを固定化した場合の結合容量とカラム圧力とのバランスの点から、ポリマー粒子中、２０〜９９質量％が好ましく、５０〜９０質量％がより好ましい。なお、モノマー（Ｂ）に由来する構造単位の合計含有量は、上述の三級アクリルアミド系架橋モノマー（Ａ）以外の残余の量である。
また、モノマー（Ｂ）として非架橋性モノマーと架橋性モノマーを併用する場合、ポリマー粒子中の非架橋性モノマーに由来する構造単位の合計含有量は、上記架橋アクリルアミド基１００質量部に対し、１〜８０質量部が好ましく、１．５〜５０質量部がより好ましく、１．５〜１０質量部が更に好ましい。
一方、ポリマー粒子中の架橋性モノマーに由来する構造単位の合計含有量は、上記架橋アクリルアミド基１００質量部に対し、１〜８０質量部が好ましく、５〜２５質量部がより好ましい。
【００４０】
本発明のポリマー粒子の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．０３〜１０００μｍであり、より好ましくは１０〜６００μｍであり、さらに好ましくは４０〜１００μｍである。また、本発明のポリマー粒子の平均粒径の変動係数は、好ましくは３０％以下であり、より好ましくは２５％以下であり、さらに好ましくは１〜２０％である。
また、本発明のポリマー粒子は、平滑粒子、多孔質粒子のいずれでもよい。比表面積は、平滑粒子の場合は、その平均粒径から自ずと規定されるが、多孔質粒子の場合は、その細孔分布から調整することができる。本発明の多孔質粒子の比表面積は、好ましくは１〜１０００ｍ2／ｇであり、より好ましくは３０〜１５０ｍ2／ｇである。
平均粒径及び比表面積は、フロー式粒子像分析装置や水銀ポロシメータ等により後述する実施例に記載の方法で測定できる。
【００４１】
なお、本発明のポリマー粒子としては、カラムに充填した状態で、０．５規定水酸化ナトリウム水溶液で２３℃、２２時間浸漬したときの溶出液中の燃焼触媒酸化方式ＴＯＣ計による全有機炭素が２００ｐｐｍ以下であるものが好ましい。
【００４２】
本発明のポリマー粒子は、懸濁重合又は乳化重合等、水系媒体中に油溶性の液滴を分散させた状態で上記モノマーを重合することによって製造することができるが、粒径、ポアサイズの調整が容易である点から、懸濁重合法で製造するのが好ましい。
【００４３】
懸濁重合法で粒子を製造する場合、例えば、モノマー及び必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（有機モノマー溶液）を水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合開始剤を添加し重合させることにより多孔質粒子を得、次いで、多孔化剤（及び必要に応じて未反応モノマー）を例えば蒸留、抽出、洗浄等により除去することで、多孔質粒子を得ることができる。なお、重合開始剤は加熱前に添加してもよい。
【００４４】
重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。重合開始剤の使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して０．１〜５質量部程度である。
【００４５】
多孔化剤は、多孔質粒子を製造するために使用され、油滴内の重合において、モノマーと共に存在し、非重合成分として孔を形成する役割を有する。多孔化剤は、多孔質表面において容易に除去可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、各種の有機溶剤や混合モノマーに可溶の線状重合物等が挙げられ、これらを併用してもよい。なお、平滑粒子を製造する場合、通常、多孔化剤は使用しない。
【００４６】
多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、テトラクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００４７】
有機溶媒を多孔化剤として用いる場合、多孔化剤の使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して５０〜５００質量部程度である。
【００４８】
水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
水系媒体の使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、１０〜２０００質量部程度である。
【００４９】
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、燐酸カルシウム、塩化ナトリウム等の分散安定剤を使用してもよい。分散安定剤の使用量は、通常、水１００質量部に対して０．１〜５質量部程度である。
【００５０】
また、反応系内には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩などのアニオン性界面活性剤を始め、各種界面活性剤を乳化剤として添加することもできる。
また、亜硝酸塩、ヨウ化カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅又は塩化第二鉄等の重合禁止剤、ドデシルメルカプタン等の重合補助剤を添加することも可能である。
【００５１】
また、重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよい。好ましい重合温度は、１０時間半減期温度＋２０℃を中心に、上下２０℃以内が好ましく、さらに好ましくは上下１０℃以内である。例えば、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いた場合には、１０時間半減期が約６０℃であるため、８０℃を中心とし上下２０℃以内の６０〜１００℃が好ましく、７０〜９０℃がさらに好ましい。また、重合時間は通常２〜２０時間、好ましくは４〜１０時間である。
【００５２】
そして、本発明のポリマー粒子は、耐アルカリ性及び防汚性（特に耐着色性）に優れ、クロマトグラフィー用担体として有用である。
また、リガンドを固定化したアフィニティクロマトグラフィー用の充填剤に用いた場合の生体高分子に対する結合容量が大きく、生化学分野でのアフィニティクロマトグラフィー用担体として極めて有用であり、抗原又は抗体等の一次プローブとしてのタンパク（例えば、プロテインＡ等のイムノグロブリン結合タンパク質）を結合させたタンパク結合粒子として利用可能である。
【００５３】
本発明のクロマトグラフィーカラム用充填剤は、上記ポリマー粒子を担体とするものである。本発明のポリマー粒子はリガンドを固定化した場合の生体高分子に対する結合容量が大きいため、上記充填剤はアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。斯様な充填剤としては、上記ポリマー粒子にリガンドを固定化したものが挙げられ、リガンドとしては、標的物に対して適度なアフィニティを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントや融合体を用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。イムノグロブリンの分離または精製に好適なリガンドとしては、例えばプロテインＡおよびプロテインＧであり、さらに好ましくはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインである。
また、本発明のクロマトグラフィーカラムは上記充填剤が充填されているものである。該カラムはアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５５】
実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。
＜平均粒径、変動係数＞
平均粒径（体積平均粒径）および変動係数は、固形分濃度が２．５％程度となるように水で希釈した検体について、シスメックス社製フロー式粒子像分析装置（型番  ＦＰＩＡ−３０００）を用いてトータルカウント５００個にセットして求めた。
＜比表面積＞
比表面積は、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール溶媒中で真空乾燥して得られた検体について、島津製作所社製オートポアＩＶ９５２０を用いて、細孔径範囲で１０〜５０００ｎｍを測定範囲とする条件により測定した。
【００５６】
実施例１
（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レファインケミカル社製）０．９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（興人社製）０．９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（興人社製）０．９ｇ及びＮ，Ｎ’−ジエチル−１，３−ビス（アクリルアミド）プロパン（ＪＳＲ社製）６．１ｇを、２−オクタノン（東洋合成工業社製）とアセトフェノン（井上香料製造所社製）の７：３混合液（質量比）１８．１ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。
一方、ポリビニルアルコール（クラレ社製：ＰＶＡ−２１７）２．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製：エマール１０Ｇ）０．２ｇ、硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）２．５ｇ及び亜硝酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１．２ｇを純水２４５ｇに添加し、攪拌して水溶液を調製した。この水溶液を５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下３６０ｒｐｍで攪拌を開始した。次いで、セパラブルフラスコに上記有機モノマー溶液を添加し、温水バスにより加熱し、液温が８５℃になったところで２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．１ｇを添加し、３．５時間攪拌を行った。反応物を冷却した後、５００ｍＬポリプロピレン製ビンに移しポリマー粒子を沈降させ、デカンテーションにより上澄み液を捨て、残ったポリマー粒子を水とエタノールで洗浄した。
得られたポリマー粒子は、平均粒径４６μｍ、変動係数１５％、比表面積９４ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。得られたポリマー粒子のＳＥＭ写真を図１に示す。
【００５７】
実施例２
Ｎ，Ｎ’−ジエチル−１，３−ビス（アクリルアミド）プロパンの代わりにＮ，Ｎ’−ジエチル−１，６−ビス（アクリルアミド）ヘキサン（ＪＳＲ社製）を使用し、２−オクタノンとアセトフェノンの混合液の代わりに２−オクタノンを使用し、攪拌速度を２８０ｒｐｍに変更した以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
得られたポリマー粒子は、平均粒径３９μｍ、変動係数１４％、比表面積６２ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。
【００５８】
実施例３
（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテルの代わりに３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート（ダイセル製：サイクロマーＭ１００）を使用し、２−オクタノンとアセトフェノンの混合液の質量比を７：３から６：４に変更し、上記ポリビニルアルコール、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム及び亜硝酸ナトリウムに加えて更にポリビニルアルコール（クラレ社製：ＰＶＡ−４０５）０．５ｇを用いて水溶液を調製し、有機モノマー溶液を添加する温度を室温から８５℃に変更し、攪拌速度を３７５ｒｐｍに変更した以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
得られたポリマー粒子は、平均粒径５２μｍ、変動係数１５％、比表面積９４ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。
【００５９】
実施例４
３，４−エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレートの代わりにグリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）０．４ｇを使用し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドの使用量を１．１ｇに変更し、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドの使用量を１．１ｇに変更し、２−オクタノンとアセトフェノンの混合液の質量比を６：４から４：６に変更し、攪拌速度を３４５ｒｐｍに変更した以外は、実施例３と同様にしてポリマー粒子を製造した。
得られたポリマー粒子は、平均粒径５６μｍ、変動係数１２％、比表面積９７ｍ2／ｇの多孔質粒子であった。
【００６０】
比較例１
Ｎ，Ｎ’−ジエチル−１，３−ビス（アクリルアミド）プロパンの代わりにＮ，Ｎ’−ジメチル−ビス（アクリルアミド）エタン（ＪＳＲ社製）を使用し、２−オクタノンとアセトフェノンの混合液の質量比を７：３から５：５に変更した以外は、実施例１と同様にして有機モノマー溶液を調製した。
次いで、実施例１と同様にして調製した水溶液を５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下３００ｒｐｍで攪拌を開始し、これに上記有機モノマー溶液を添加し、温水バスにより加熱し、液温が８５℃になったところで２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．１ｇを添加した。
その結果、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−ビス（アクリルアミド）エタンが水溶液に分散せずに溶解し、順相懸濁重合をすることができなかった。
【００６１】
比較例２
（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル０．６ｇ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド１．３ｇ及び１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）４．４ｇをアセトフェノン２６．０ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。
一方、ポリビニルアルコール１．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．１ｇ、硫酸ナトリウム２．６ｇ及び亜硝酸ナトリウム１．３ｇを純水２６３ｇに添加し、攪拌して水溶液を調製した。
上記有機モノマー溶液と水溶液を用いたこと、および攪拌速度を４５０ｒｐｍに変更したこと以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
得られたポリマー粒子は、平均粒径５５μｍ、変動係数２６％、比表面積１００ｍ2／ｇであった。
【００６２】
比較例３
グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１．０ｇ、グリセリン１−メタクリレート（日油社製）２．０ｇ及びグリセロール１，３−ジメタクリレート（新中村化学工業社製）６．９ｇを２−オクタノンとアセトフェノンの３：７混合液（質量比）２０．３ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。
一方、ポリビニルアルコール０．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム０．１ｇ、炭酸ナトリウム０．２ｇ及び亜硝酸ナトリウム１．２ｇを純水２４８ｇに添加し、攪拌して水溶液を調製した。
上記有機モノマー溶液と水溶液を用いたこと、および攪拌速度を４００ｒｐｍに変更したこと以外は、実施例１と同様にしてポリマー粒子を製造した。
得られたポリマー粒子は、平均粒径が５０μｍ、変動係数１７％、比表面積は１０４ｍ2／ｇであった。
【００６３】
比較例４
（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル０．９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド０．９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド０．９ｇ及びビス（アクリルアミド）メタン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製）６．１ｇを、２−オクタノンとアセトフェノンの７：３混合液（質量比）１８．１ｇに添加したところ、有機モノマーが混合液に溶解せず、順相懸濁重合を行うことができなかった。
【００６４】
試験例１  生体高分子結合容量測定試験
以下の表１に示す各ポリマー粒子にＰｒｏｔｅｉｎＡを固定化し、ヒトポリクローナルＩｇＧに対する動的結合容積をＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒ、カラム容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）、溶出先端１０％ブレークスルーのときの吸着量により測定した。結果を表１に示す。
【００６５】
【表１】
2013238446.tif 000007
【００６６】
表１に示すように、実施例１のポリマー粒子は、ＰｒｏｔｅｉｎＡを固定化した場合の生体高分子結合容量が大きい。
【００６７】
試験例２  耐アルカリ性試験
ＧＥヘルスケア社製ｔｒｉｃｏｒｎカラム（内径０．５ｃｍ）に、充填層高さが４ｃｍとなるように以下の表２に示すポリマー粒子を充填し、２３℃の恒温室に設置したＧＥヘルスケア社製クロマトグラフィーシステム（商品名ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ）にカラムを接続した。次いで、１０ｍＬの純水を１ｍＬ／分の速度で通液して洗浄した後、１０ｍＬの０．５規定水酸化ナトリウム水溶液を１ｍＬ／分の速度で通液して停止させ、そのまま、２２時間静置することによりアルカリ分解成分を溶出させた。次いで、０．５規定水酸化ナトリウム水溶液を１ｍＬ／分の速度で通液してカラム内の溶出液０．８ｍＬを採取し、直ちに０．１規定塩酸９．２ｍＬで酸性化した。島津製作所社製燃焼触媒酸化方式ＴＯＣ計（型番ＴＯＣ−５０００）を用いて、３０μＬのインジェクション容量で前記酸性化した液中の全有機炭素量を測定し、この値を１２．５倍して酸性化による希釈を補正した。結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2013238446.tif 000008
【００６９】
表２に示すように、実施例１のポリマー粒子は耐アルカリ性に優れる。
【００７０】
試験例３  耐着色性試験
ＧＥヘルスケア社製ｔｒｉｃｏｒｎカラム（内径０．５ｃｍ）に、充填層高さが４ｃｍとなるように以下の表３に示すポリマー粒子を充填し、２３℃の恒温室に設置したＧＥヘルスケア社製クロマトグラフィーシステム（商品名ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ）にカラムを接続した。次いで、０．００１５質量％のフェノールレッドを含む２０ｍＭリン酸Ｎａ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ  ７．５）を４ｍＬ通液した後、２０ｍＭリン酸Ｎａ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．５）を４ｍＬ通液して洗浄し、目視観察でカラムが着色してないものを○、着色しているものを×と記録した。
【００７１】
【表３】
2013238446.tif 000009
【００７２】
表３に示すように、実施例１のポリマー粒子は耐着色性に優れる。
【図１】
2013238446.tif 000013