(57)【要約】【課題】ガンを含む疾患の処置のためのウイルスを提供すること。ガンを含む新生物疾患の処置のためのウイルスを提供すること。【解決手段】本発明は、ＩＦＮ媒介抗ウイルス応答を欠損する新生物細胞内で複製し得、それによりその死を引き起こすウイルス、ならびにガンおよび大きな腫瘍を含む新生物疾患の処置のための使用に関する。ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスがこの点に関して有用である。本発明はまた、治療のためのこのようなウイルスの選択、設計、精製および使用のための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）媒介抗ウイルス応答を欠損する新生物細胞内で複製し得、そしてその死を引き起こすウイルスに関する。ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスがこの点に関して有用である。本発明はまた、ガンおよび大きな腫瘍を含む新生物疾患の処置のためにこれらのウイルスを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ガンを含む新生物疾患は、ヒトの間で主な死因の一つである。米国において毎年１３０万人を超える新たな症例がガンと診断され、そして５５万人が死亡する。身体において二次部位に伝播する前に早期にガンを検出することは、宿主の生存の機会を非常に増加させる。しかし、ガンの早期検出は、いつも可能であるとは限らない。そして、可能である場合でも、高度に悪性のガンの症例においては特に処置は満足行くものではない。化学療法および照射を含むガン処置は、後期においては、特に新生物増殖が大きく、そして／または高度の腫瘍負荷を構成する場合にはほとんど有効ではない（Ｈｉｌｌａｒｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、第６１巻、第１号、１月／２月、１９７７、２９〜３６頁、Ｔａｎｎｏｃｋ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２：４９２１−４９２６、Ｄｅｃ．１９８２を参照のこと）。
【０００３】
種々のウイルスへの曝露に関連する腫瘍の後退が報告されている。記載されたウイルスの殆どがヒトにおいて病原性であり、そして流行性耳下腺炎および麻疹を含む。他の特定のウイルスの特定の型のガン細胞に対する効果もまた記載されている。Ｓｍｉｔｈら、（１９５６）Ｃａｎｃｅｒ、９：１２１１（アデノウイルの頸ガン腫に対する効果）；Ｈｏｌｚａｅｐｆｅｌら（１９５７）  Ｃａｎｃｅｒ、１０：５５７（上皮腫瘍に対するアデノウイルスの効果）；Ｔａｙｌｏｒら、（１９７０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４４、５１５（ウシエンテロウイルス−１の肉腫１に対する効果）；Ｓｈｉｎｇｕら、（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２：２０３１（ウシエンテロウイルスＭＺ−４６８のＦ６４７ａ白血病細胞に対する効果）；Ｓｕｓｋｉｎｄら、（１９５７）ＰＳＥＢＭ、９４、３０９（コクサッキーＢ３ウイルスのＨｅＬａ腫瘍細胞に対する効果）；Ｒｕｋａｖｉｓｈｎｉｋｏｖａら、（１９７６）Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ．２０、３８７（インフルエンザＡ株の腹水腫瘍に対する効果）。
【０００４】
最初期の参考文献は、天然痘または狂犬病に対して患者にワクチン接種をする目的で、生きた弱毒化ウイルスワクチンで処置した患者において部分的な腫瘍後退を記載した。ＤｅＰａｃｅ．Ｎ．Ｇ．（１９１２）Ｇｉｎｅｃｏｌｏｇｉａ、９、８２−８８；Ｓａｌｍｏｎ、Ｐ．およびＢａｉｘ（１９２２）Ｃｏｍｐｔ．Ｒｅｎｄ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．８６、８１９−８２０を参照のこと。腫瘍の部分的後退および白血病の後退もまた、天然に発症する麻疹感染の間に認められている。Ｐａｓｑｕｉｎｕｃｃｉ，Ｇ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ、１、１３６；Ｇｒｏｓｓ  Ｓ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ、１、３９７−３９８；Ｂｌｕｍｉｎｇ、Ａ．Ｚ．およびＺｉｅｇｌｅｒ、Ｊ．Ｌ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ、２、１０５−１０６を参照のこと。生きた流行性耳下腺炎ウイルスに意図的に感染させた９０人のガン患者の１つの研究において、部分的な腫瘍後退が７９例において認められた。Ａｓａｄａ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ、３４、１９０７−１９２８を参照のこと。これらのウイルスの副作用は一過性であるが、これらのヒト病原体での感染の重篤な後遺症が主要な関心事である。
【０００５】
ウイルスは、以下のように分類される（Ｍｕｒｐｈｙ  ＡおよびＫｉｎｇｓｂｕｒｙ  ＤＷ、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  第２版（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．編）、Ｒａｖｅｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、９〜３５頁）
ＲＮＡウイルス分類用の特徴        ウイルス科名称
ｓｓＲＮＡ、＋鎖                Ｐｉｃｏｒａｎｖｉｒｉｄａｅ
（ピコルナウイルス科）
非セグメント化      Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ
（カリシウイルス科）
非エンベロープ化
ｓｓＲＮＡ、＋鎖                Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ
（トガウイルス科）
非セグメント化      Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ
（フラビウイルス科）
エンベロープ化      Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ
（コロナウイルス科）
ｓｓＲＮＡ、−鎖                Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ
（ラブドウイルス科）
非セグメント化      Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ
（フィロウイルス科）
エンベロープ化      Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ
（パラミクソウイルス科）
ｓｓＲＮＡ、−鎖                Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ
（オルトミクソウイルス科）
セグメント化
エンベロープ化
ｓｓＲＮＡ、両鎖                Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ
（ブンヤウイルス科）
セグメント化        Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ
（アレナウイルス科）
エンベロープ化
ｄｓＲＮＡ、＋鎖                Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ
（レオウイルス科）
セグメント化        Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ
（ビルナウイルス科）
非エンベロープ化
ｓｓＲＮＡ、複製時にＤＮＡ工程  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ
（レトロウイルス科）
＋鎖
非セグメント化
エンベロープ化。
【０００６】
ＤＮＡウイルス
ｓｓ／ｄｓＤＮＡ、非エンベロープ化  Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ
（ヘパドナウイルス科）
ｓｓＤＮＡ、非エンベロープ化        Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ
（パルボウイルス科）
ｄｓＤＮＡ、非エンベロープ化        Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ
（パポバウイルス科）
Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ
（アデノウイルス科）
ｄｓＤＮＡ、エンベロープ化          Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ
（ヘルペスウイルス科）
Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ
（ポックスウイルス科）
Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ
（イリドウイルス科）。
【０００７】
ヘルペスウイルス科（またはヘルペスウイルス類）の中には、アルファヘルペスウイルス亜科（水痘ウイルス属および単純ヘルペスウイルス属（Ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ）を含む）、ベータヘルペスウイルス、およびガンマヘルペスウイルスが含まれる。
【０００８】
ニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）は、パラミクソウイルス科（またはパラミクソウイルス類）のメンバーである。ＮＤＶについての天然の宿主は、ニワトリおよび他の鳥類である。ＮＤＶは代表的に、動物宿主細胞の表面の特定の分子に結合し、細胞表面と融合し、そしてその遺伝物質をその宿主に注入する。ＮＤＶは、細胞破壊性ウイルスである。一旦細胞内に入ると、そのウイルス遺伝子は、宿主細胞に、そのウイルスのコピーを作らせるように指令し、これが宿主細胞の死をもたらし、他の細胞に感染するＮＤＶのコピーを放出する。他のいくつかのウイルスと異なり、ＮＤＶはいかなる重篤なヒトの疾患をももたらすことは知られていない。他の種類のウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−１、Ｂ型肝炎）とは異なり、パラミクソウイルスは、発ガン性であるとは知られていない。
【０００９】
腫瘍の一過性後退は、ＮＤＶに曝露された少数の患者において報告されている。Ｃｓａｔａｒｙ、Ｌ．Ｋ．（１９７１）Ｌａｎｃｅｔ、２、８２５を参照のこと。Ｃｓａｔａｒｙは、彼のニワトリにおいて、ニューカッスル病の流行の間にニワトリ農家における胃腸ガンの後退を認めた。類似の逸話的報告において、Ｃａｓｓｅｌ、Ｗ．Ａ．およびＧａｒｒｅｔｔ、Ｒ．Ｅ．（１９６５）Ｃａｎｃｅｒ、１８：８６３−８６８は、頸腫瘍へのＮＤＶの注射後の患者において、リンパ節に広がった原発性頸ガンの後退を認めた。腫瘍殺傷活性の機構は、免疫的であると考えられていたので、このウイルスの直接の腫瘍細胞傷害作用を検討するためには何ら研究がなされていなかった。代わりに、ＮＤＶの免疫調節作用に対して努力が集中されてきた。例えば、Ｍｕｒｒａｙ、Ｄ．Ｒ、Ｃａｓｓｅｌ、Ｗ．Ａ．、Ｔｏｒｂｉｎ、Ａ．Ｈ．Ｏｌｋｏｗｓｋｉ、Ｚ．Ｌ．およびＭｏｏｒｅ、Ｍ．Ｅ．（１９７７）Ｃａｎｃｅｒ、４０；６８０；Ｃａｓｓｅｌ、Ｗ．Ａ．、Ｍｕｒｒａｙ，Ｄ．Ｒ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ、Ｈ．Ｓ．（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ、５２、８５６；Ｂｏｈｌｅ、Ｗ．、Ｓｃｈｌａｇ、ＰＪ、Ｌｉｅｂｒｉｃｈ、Ｗ．Ｈｏｈｎｅｂｅｒｇｅｒ、Ｐ．，Ｍａｎａｓｔｅｒｓｋｉ，Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ、Ｐ．およびＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ、Ｖ．（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  ６６、１５１７−１５２３を参照のこと。
【００１０】
上記の引用においては、腫瘍後退のための特定のウイルスの選択は、偶然または試行錯誤に基づいていた。最近になってやっと、ガン処置におけるウイルスの使用のための合理的な機構に基づくアプローチがＤＮＡウイルスを使用して開発された。この型のアプローチの例は、特定の組織起源の腫瘍においてのみ複製する組換えアデノウイルスベクター（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｒ．ら、１９９７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：２５５９−２５６３）または特定のカギとなる調節タンパク質を欠くベクター（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、ＪＲ．ら、１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：３７３−３７６）の開発において見出される。最近の別のアプローチは、いくつかの腫瘍細胞において欠失する重要なタンパク質機能を回復するための複製非適合性組換えアデノウイルスベクターの使用であった（Ｚｈａｎｇ、ＷＷ、ら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ、１：５−１３）。最後に、単純ヘルペスウイルスもまた、腫瘍を特徴付ける、迅速に分裂する細胞において優先的に複製するように操作された（Ｍｉｎｅｔａ、Ｔ．ら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３９６３−３９６６）。
【００１１】
米国特許出願第０８／２６０，５３６号は、本明細書においてその全体が参考として援用され、これは、ＮＤＶまたは他のパラミクソウイルスのガン処置における使用を開示する。
【００１２】
（ウイルスＩＦＮトランスジーン発現）
ウイルス療法を用いるガンの処置に対する１つの一般的なアプローチは、腫瘍塊へ特定の遺伝子を送達するためのウイルスベクターの使用である。
【００１３】
組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、およびレトロウイルスは全て、インターフェロン遺伝子単独で、または他のサイトカイン遺伝子と組み合わせて発現させるために改変されてきた。
【００１４】
Ｚｈａｎｇら（（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：４５１３−４５１８）において、ヒトインターフェロンコンセンサス（すなわち、総合的な）遺伝子を発現する組換えアデノウイルスを使用して、ヌードマウス中のヒト乳ガン（または他の）異種移植片を処置した。著者らは、「低い病原性のウイルスを用いたウイルス腫瘍崩壊の組み合わせ、すなわち、ＩＦＮおよびＩＦＮ遺伝子治療に耐性であること自体は、特定の乳ガンにおいて、異なる種々の腫瘍型の処置への実り多いアプローチであり得た」ことを結論付けた。インターフェロン感受性ウイルスに関する本発明とは対照的に、Ｚｈａｎｇら（１９９６）は、腫瘍の処置においてインターフェロン耐性アデノウイルスの使用を教示する。
【００１５】
Ｚｈａｎｇら（（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：３１−３８）は、コンセンサスＩＦＮを発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、インビトロでヒト腫瘍細胞を形質導入して、次いで、ヌードマウスへ注射した。この形質導入された細胞は、腫瘍を形成しないか、または非形質導入コントロールよりも遅く増殖したかのいずれかであった。また、形質導入したヒト腫瘍細胞の、別の腫瘍塊、すなわち、形質導入していない腫瘍への注入によって、サイズが少し小さくなった。
【００１６】
Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉら（（１９９６）Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，３：１５−２３）において、ＩＦＮγ（および単独で、または組み合わせて発現される他のサイトカイン）を、マウス乳ガンモデルで試験した。マウスを、組換えワクシニアウイルスでウイルス的に改変した腫瘍細胞で免疫した。腫瘍細胞で再チャレンジした場合、ウイルス的に改変した細胞で免疫したマウスは、疾患がない状態の生存時間に実質的な改善が見られた。
【００１７】
Ｇａｓｔｌら（（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：６２２９−６２３６）は、腎ガン腫細胞をインビトロで形質導入するためにＩＦＮγ発現レトロウイルスベクターを使用した。これらの細胞は、より多量の、免疫系の機能のために重要な多くのタンパク質を生成したことが示された。
【００１８】
Ｒｅｓｔｉｆｏら（（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：１４２３−１４３１）は、ＩＦＮγ発現レトロウイルスベクターを使用してマウス肉腫細胞カブを形質導入し、このことは、腫瘍細胞株がＣＤ８＋  Ｔ細胞へウイルス抗原をより効率的に提示することを可能にした。
【００１９】
Ｈｏｗａｒｄら（（１９９４）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１６：１６７−１８７）は、マウスおよびヒト黒色腫細胞を形質導入するためにＩＦＮγ発現レトロウイルスベクターを使用した。これらの細胞は、免疫系に重要なタンパク質の発言を増加したことが観察された。これらの細胞はまた、形質導入していない親株と比較して、マウスにおいてあまり腫瘍形成性ではなく、そしてインビボで腫瘍特異的ＣＴＬ応答の活性化を生じた。
【００２０】
（インターフェロンの治療的用量のウイルスガン治療に対するアジュバントとしての使用）
ＩＦＮの免疫増強特性が公知であるために、いくつかの研究によって、他のウイルスガンワクチン治療と組み合わせて、ＩＦＮタンパク質を使用することを研究してきた。非特許文献１において、２０８人の患者が自己の、ＮＤＶ改変され、かつ致死的に照射された腎細胞ガン腫腫瘍細胞で免疫され、そして低用量のＩＬ−２またはＩＦＮαで同時処置した。著者らは、この処置レジメが、局所的に進行した腎細胞ガン腫を用いて、患者が通常の経過に対して改善を生じたことを述べた。この用量は、約３．３×１０3〜２．２×１
０5ＰＦＵ／ｋｇであった。これは、全身的アプローチとは対照的に、抗腫瘍免疫応答を
誘導するという目的を有する局所的投与であった。
【００２１】
非特許文献２は、ＩＦＮαを、マウスにおけるガンワクチン治療モデルとして組換えワクシニアウイルスとともに同時投与した。この研究は、ＩＦＮを受けていないマウスと比較して、ＩＦＮを受けたマウスの生存率に統計的な改善を示した。著者らは、ＩＦＮの有効性が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞のこれらの動物における誘導にあるとした。
【００２２】
非特許文献３は、結腸ガンのマウスモデルを使用して、ワクシニアウイルス結腸腫瘍崩壊（ＶＣＯ）ガン処置の有効性について、ＩＦＮαおよび／またはＩＬ−２の同時治療を試験した。Ａｒｒｏｙｏらは、ＶＣＯ＋ＩＬ−２＋ＩＦＮの三重の処置がこのマウスモデルにおいて最も有効であることを見出した。このアプローチは、抗腫瘍活性機構としての免疫化による。
【００２３】
ＩＦＮをこれらの研究で使用して、ガン細胞が免疫系によって認識される能力を増強した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｋｉｒｃｈｎｅｒら（１９９５）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１３：１７１−１７３
【非特許文献２】Ｔａｎａｋａら（１９９４）Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ.Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：２８３−２９３
【非特許文献３】Ａｒｒｏｙｏら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３１：３０５−３１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
（発明の目的）
本発明の目的は、ガンを含む疾患の処置のためのウイルスを提供することである。本発明のさらなる目的は、ガンを含む新生物疾患の処置のためのウイルスを提供することである。
本発明のさらなる目的は、候補ウイルスを、新生物疾患の治療で使用するために選択および／またはスクリーニングする方法を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、新生物疾患の処置においてウイルスの治療的有用性を増強するために、ウイルスを遺伝子操作するガイダンスを提供することである。  本発明のさらなる目的は、ウイルス殺傷に対する候補標的細胞の感受性を評価するという目的を有する、ウイルス治療のための潜在的な標的細胞をスクリーニングする方法を提供することである。
【００２７】
本発明のなおさらなる目的は、ウイルス治療の管理のガイダンスを提供することである。
【００２８】
本発明の目的は、大きな腫瘍を処置するための方法を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、精製されたウイルスおよびこれを得るための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
（発明の要旨）
本発明は、ウイルスを哺乳動物中の新生物に感染させる方法に関し、この方法は、アデノウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、イリドウイルス科、およびヘルペスウイルス科のＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスからなる群より選択される、インターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ウイルスを哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００３１】
本発明はまた、ウイルスを哺乳動物中の新生物に感染させる方法に関し、この方法は、インターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ウイルスを動物に全身投与する工程を包含する。
【００３２】
本発明はまた、哺乳動物におけるガンを含む新生物を処置する方法に関し、この方法は、アデノウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、イリドウイルス科、およびヘルペスウイルス科のＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスからなる群より選択される、治療的に有効な量のインターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ウイルスを動物に投与する工程を包含する。
【００３３】
本発明はまた、ウイルスを哺乳動物中の新生物に感染させる方法に関し、この方法は、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる遺伝子群より選択されるインターフェロンの抗ウイルス活性をブロッキングすることに関与する１つ以上のウイルス遺伝子における１つ以上の変異を有する、インターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ワクシニアウイルスを哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００３４】
本発明はまた、哺乳動物におけるガンを含む新生物を処置する方法に関し、この方法は、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる遺伝子群より選択されるインターフェロンの抗ウイルス活性をブロッキングすることに関与する１つ以上のウイルス遺伝子における１つ以上の変異を有する、治療的に有効な量のインターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ワクシニアウイルスを哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００３５】
本発明はまた、ウイルスを、哺乳動物中の少なくともサイズが１ｃｍの新生物に感染させる方法に関し、この方法は、哺乳動物中に（１）ＲＮＡウイルス；（２）ヘパドナウイルス；（３）パルボウイルス；（４）パポバウイルス；（５）ヘルペスウイルス；（６）ポックスウイルス；および（７）イリドウイルスからなる群より選択されるクローン性ウイルスを投与する工程を包含する。
【００３６】
本発明はまた、哺乳動物における新生物を処置する方法に関し、この方法は、哺乳動物中に新生物のサイズが少なくとも１ｃｍであって、（１）ＲＮＡウイルス；（２）ヘパドナウイルス；（３）パルボウイルス；（４）パポバウイルス；（５）ヘルペスウイルス；（６）ポックスウイルス；および（７）イリドウイルスからなる群より選択される治療的有効量のクローン性ウイルスを投与する工程を包含する。
【００３７】
本発明はまた、哺乳動物における腫瘍を処置する方法に関し、この方法は、治療的に有効な量の、腫瘍に対して細胞殺傷性のＲＮＡウイルスを哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、この哺乳動物は、少なくとも全体重の１．５％を含む全身腫瘍組織量を有する。
【００３８】
本発明はまた、腫瘍細胞または患者から新鮮に取り出した組織をスクリーニングして、ウイルスにより殺傷するための細胞または組織の感受性を決定する方法に関し、この方法は、インターフェロン感受性ウイルスを用いて細胞または組織を示差的細胞毒性アッセイに供する工程を包含する。
【００３９】
本発明はまた、哺乳動物中の抗新生物活性を有するウイルスを同定するための方法に関し、この方法は、ａ）ｉ）ＩＦＮ媒介抗ウイルス活性が欠損した細胞、およびｉｉ）ＩＦＮ媒介抗ウイルス活性がコンピテントな細胞に試験ウイルスを感染させる工程、ならびにｂ）試験ウイルスがＩＦＮ媒介抗ウイルス活性が欠損した細胞を、インターフェロン媒介抗ウイルス活性がコンピテントな細胞に対して、優先的に殺傷するか否かを決定する工程を包含する。
【００４０】
本発明はまた、抗新生物治療に使用するためのウイルスを作製する方法に関し、この方法は、ａ）ＩＦＮの抗ウイルス効果の不活化についてのウイルス機構を減少させるか、または取り除くことによって既存のウイルスを改変する工程、および必要に応じてｂ）弱毒化する変異を作製し、このことによって上記の既存ウイルスのより低い病原性が生じる工程を包含する。
【００４１】
本発明はまた、ＲＮＡウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、水痘ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａｖｉｒｕｓｅｓ）、βヘルペスウイルス、およびγヘルペスウイルスからなる群より選択されるウイルスで処置した哺乳動物におけるウイルス複製を制御する方法に関し、この方法は、抗ウイルス化合物を投与する工程を包含する。
【００４２】
本発明はまた、哺乳動物における新生物を処置または感染させる方法に関し、この方法は、哺乳動物に由来するサンプル（例えば、血清、腫瘍細胞、腫瘍組織、腫瘍切片）をイムノアッセイに供して、存在するウイルスレセプターの量を検出して、新生物がウイルスを結合し、かつ細胞溶解を引き起こさせることが可能であるか否かを決定する工程、およびレセプターが存在する場合、インターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ウイルス（これは、レセプターに結合する）を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００４３】
本発明はまた、ウイルスを哺乳動物における新生物に感染させる方法に関し、この方法は、脱感作する用量のインターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ウイルスを哺乳動物に全身的に投与する工程を包含する。
【００４４】
本発明はまた、ウイルスを哺乳動物中の新生物に感染させる方法に関し、この方法は、少なくとも４分間にわたって、インターフェロン感受性、複製コンピテントクローン性ウイルスを哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００４５】
本発明はまた、ウイルスを哺乳動物中の新生物に感染させる方法に関し、この方法は、ニューカッスル病ウイルスＭＫ１０７株、ニューカッスル病ウイルスＮＪ  Ｒｏａｋｉｎ株、シンドビスウイルス、および水疱性口内炎ウイルスからなる群より選択される複製コンピテントクローン性ウイルスを投与する工程を包含する。
【００４６】
本発明には以下が含まれる：
ｉ）ペレット化することなく超遠心によって精製されたパラミクソウイルス；
ｉｉ）タンパク質１ｍｇあたり、少なくとも２×１０9ＰＦＵのレベルまで精製された
パラミクソウイルス；
ｉｉｉ）タンパク質１ｍｇあたり、少なくとも１×１０10ＰＦＵのレベルまで精製されたパラミクソウイルス；
ｉｖ）タンパク質１ｍｇあたり、少なくとも６×１０10ＰＦＵのレベルまで精製されたパラミクソウイルス；
ｖ）タンパク質１ｍｇあたり、少なくとも２×１０9ＰＦＵのレベルまで精製されたＲ
ＮＡウイルス；
ｖｉ）タンパク質１ｍｇあたり、少なくとも１×１０10ＰＦＵのレベルまで精製されたＲＮＡウイルス；
ｖｉｉ）タンパク質１ｍｇあたり、少なくとも６×１０10ＰＦＵのレベルまで精製されたＲＮＡウイルス；
ｖｉｉｉ）インターフェロン感受性であって、かつタンパク質１ｍｇあたり、少なくとも２×１０9ＰＦＵのレベルまで精製された細胞殺傷ＤＮＡウイルス；
ｉｘ）ａ）Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒ遺伝子のうち１つ以上で、１つ以上の変異を有し、そしてｂ）チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ワクシニア増殖因子、チミジレートキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＵＴＰａｓｅをコードする遺伝子の１つ以上での変異を減少させる複製コンピテントワクシニアウイルス；
ｘ）Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群より選択される、２つ以上の遺伝子で、１つ以上の変異を有する、複製コンピテントワクシニアウイルス；
ｘｉ）インターフェロン感受性を増加したヘルペスウイルスが生じるために（２’−５’）Ａアナログの発現における改変を有するヘルペスウイルス；および
ｘｉｉ）インターフェロン感受性になったレオウイルスを生じるシグマ３で減少する変異を有するレオウイルス。
【００４７】
以下の方法が本発明にもまた含まれる：
ｉ）以下の工程を包含するＲＮＡウイルスを精製する方法；
ａ）クローン性ウイルスを生成する工程；およびｂ）ペレット化することなく超遠心によって上記のクローン性ウイルスを精製する工程；またはｃ）引き続いてゲル濾過クロマトグラフィーを用いる、または用いない接線流濾過によって上記のクローン性ウイルスを精製する工程、ならびに
ｉｉ）ペレット化することなく超遠心によってか、または引き続いてゲル濾過クロマトグラフィーを用いるもしくは用いない接線流濾過によってウイルスを精製する工程を包含するパラミクソウイルスを精製する方法。
【００４８】
本発明はまた、罹患した細胞が、インターフェロン媒介抗ウイルス応答の欠失を有し、治療的に有効な量のインターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ウイルスを哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物における疾患を処置する方法に関する。
本発明はまた、上記課題を解決するために、以下の項目を提供する。
（項目１）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ＲＮＡウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、複製能を有するクローン性ＲＮＡウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、そして該ウイルスはインターフェロンに対する感受性を有する、方法。
（項目３）  哺乳動物における新生物を処置する方法であって、該方法は、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ＲＮＡウイルスの治療的な有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目４）  前記ＲＮＡウイルスが、インターフェロンの非存在下に比較して、インターフェロンの存在下で、少なくとも１００分の１複製する、項目１に記載の方法。
（項目５）  前記ＲＮＡウイルスが、インターフェロンの非存在下に比較して、インターフェロンの存在下で、少なくとも１０００分の１複製する、項目１に記載の方法。
（項目６）  前記投与の工程が全身投与である、項目１に記載の方法。
（項目７）  前記新生物がガンである、項目１に記載の方法。
（項目８）  前記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目９）  前記クローン性ウイルスがプラーク精製された、項目１に記載の方法。
（項目１０）  前記クローン性ウイルスが組換えクローン性起源である、項目１に記載の方法。
（項目１１）  前記ＲＮＡウイルスが、パラミクソウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目１２）  前記パラミクソウイルスが、１ｍｇのタンパク質あたり、少なくとも２×１０9ＰＦＵのレベルにまで精製されている、項目１１に記載の方法。
（項目１３）  前記パラミクソウイルスが、１ｍｇのタンパク質あたり、少なくとも１×１０10ＰＦＵのレベルにまで精製されている、項目１１に記載の方法。
（項目１４）  前記パラミクソウイルスが、１ｍｇのタンパク質あたり、少なくとも６×１０10ＰＦＵのレベルにまで精製されている、項目１１に記載の方法。
（項目１５）  前記パラミクソウイルスが、ＰＦＵあたりの粒子比が、５以下のレベルにまで精製されている、項目１１に記載の方法。
（項目１６）  前記パラミクソウイルスが、ＰＦＵあたりの粒子比が、３以下のレベルにまで精製されている、項目１１に記載の方法。
（項目１７）  前記パラミクソウイルスが、ＰＦＵあたりの粒子比が、１．２以下のレベルにまで精製されている、項目１１に記載の方法。
（項目１８）  前記パラミクソウイルスが、トリパラミクソウイルス２型である、項目１１に記載の方法。
（項目１９）  前記パラミクソウイルスが、ＮＤＶである、項目１１に記載の方法。
（項目２０）  前記パラミクソウイルスが、流行性耳下腺炎ウイルスである、項目１１に記載の方法。
（項目２１）  前記パラミクソウイルスが、ヒトパラインフルエンザウイルスである、項目１１に記載の方法。
（項目２２）  前記ＲＮＡウイルスがラブドウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルスおよびコロナウイルスからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目２３）  前記トガウイルスがシンドビスウイルスである、項目２２に記載の方法。（項目２４）  前記レオウイルスがσ３での改変を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）  前記レオウイルスがσ１での弱毒性の変異を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２６）  前記レオウイルスが弱毒化ロタウイルスである、項目２２に記載の方法。（項目２７）  前記ロタウイルスがロタウイルスＷＣ３である、項目２６に記載の方法。（項目２８）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群より選択される１つ以上の遺伝子において１つ以上の変異を有する、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ワクシニアウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２９）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群より選択される１つ以上の遺伝子において１つ以上の変異を有する複製能を有するクローン性ワクシニアウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、そして、該ウイルスがインターフェロンに対する感受性を有する、方法。
（項目３０）  哺乳動物における新生物を処置する方法であって、該方法は、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ワクシニアウイルスの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、そして、該ウイルスは、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群より選択される１つ以上の遺伝子において１つ以上の変異を有する、方法。
（項目３１）  前記哺乳動物がヒトである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  前記ワクシニアウイルスが、ワクシニア増殖因子、チミジンキナーゼ、チミジレートキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、およびｄＵＴＰアーゼをコードする群より選択される遺伝子において弱毒化変異を有するワクシニアウイルスである、項目３０に記載の方法。
（項目３３）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、およびイリドウイルスからなる群より選択される、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ＤＮＡウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、およびイリドウイルスからなる群より選択される、複製能を有するクローン性ＤＮＡウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、そして該ウイルスがインターフェロンに対して感受性を有する、方法。
（項目３５）  哺乳動物における新生物を処置する方法であって、該方法は、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、およびイリドウイルスからなる群より選択される、インターフェロン感受性クローン性ＤＮＡウイルスの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３６）  前記哺乳動物がヒトである、項目３３に記載の方法。
（項目３７）  前記アデノウイルスウイルスが、該アデノウイルスがインターフェロン感受性になるようにＶＡ１転写物に改変を有する、項目３３に記載の方法。
（項目３８）  前記アデノウイルスウイルスが、Ａｄ−４、Ａｄ−７およびＡｄ−２１のワクチン株からなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ヘルペスウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目４０）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、複製能を有するクローン性ヘルペスウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、そして該ウイルスがインターフェロンに対する感受性を有する、方法。
（項目４１）  哺乳動物における新生物を処置する方法であって、該方法は、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ヘルペスウイルスの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目４２）  前記ヘルペスウイルスがベータヘルペスウイルス亜科またはガンマヘルペスウイルス亜科のメンバーである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）  前記ヘルペスウイルスが、ＨＳＶ−１ではないアルファヘルペスウイルス亜科のメンバーである、項目４１に記載の方法。
（項目４４）  前記哺乳動物がヒトである、項目４１に記載の方法。
（項目４５）  前記ヘルペスウイルスが、（２’−５’）Ａnアナログの発現が減少した
アルファヘルペスウイルス亜科のメンバーである、項目４１に記載の方法。
（項目４６）  前記ヘルペスウイルスが、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼをコードする遺伝子からなる群より選択される弱毒化変異、またはｂ’ａ’ｃ’反転反復遺伝子座に欠失を有するヘルペスウイルスである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）  前記ヘルペスウイルスがガンマ３４．５遺伝子において改変を有する、項目４５に記載の方法。
（項目４８）  前記ヘルペスウイルスがガンマ３４．５遺伝子において改変およびチミジンキナーゼをコードする遺伝子に弱毒化変異、またはｂ’ａ’ｃ’反転反復遺伝子座または機能的に類似の遺伝子座において欠失を有する、項目４１に記載の方法。
（項目４９）  前記ヘルペスウイルスがチミジンキナーゼ、およびリボヌクレオチドレダクターゼからなる群より選択される遺伝子に弱毒化変異、またはｂ’ａ’ｃ’反転反復遺伝子座において欠失を有するヘルペスウイルスである、項目４１に記載の方法。
（項目５０）  前記新生物が、肺ガン、結腸ガン、前立腺ガン、乳ガン、および脳腫瘍からなる群より選択されるガンである、項目１に記載の方法。
（項目５１）  前記新生物が、固形腫瘍である、項目１に記載の方法。
（項目５２）  前記脳腫瘍が神経膠芽腫である、項目５０に記載の方法。
（項目５３）  前記ウイルスが、インターフェロンのウイルス発現を可能にする、インターフェロンをコードする遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目５４）  前記ウイルスがプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目５５）  前記ウイルス投与の前、間または後にインターフェロンを投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目５６）  前記インターフェロンが、α−インターフェロン、β−インターフェロン、ω−インターフェロン、γ−インターフェロンおよび合成コンセンサス形態のインターフェロンからなる群より選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）  前記ウイルス投与の前、間または後にチロシンキナーゼインヒビターを投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目５８）  プリンヌクレオシドアナログ、チロシンキナーゼインヒビター、シメチジン、およびミトコンドリアインヒビターからなる化合物の群より選択される化合物をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５９）  前記ウイルス投与の前、間または後に化学療法薬剤を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６０）  前記ウイルス投与の前、間または後にサイトカインを投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６１）  前記ウイルス投与の前、間または後に免疫抑制剤を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６２）  インターフェロン、リバビリン、アシクロビル、およびガンシクロビルからなる群より選択される化合物のウイルス複製制御量を投与する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６３）  前記投与が静脈内投与または腫瘍内投与である、項目１に記載の方法。
（項目６４）  哺乳動物における少なくとも１ｃｍの大きさの新生物にウイルスを感染させる方法であって、該方法は、（１）ＲＮＡウイルス；（２）ヘパデナウイルス；（３）パルボウイルス；（４）パポバウイルス；（５）ヘルペスウイルス；（６）ポックスウイルス；および（７）イリドウイルスからなる群より選択されるクローン性ウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目６５）  哺乳動物における少なくとも１ｃｍの大きさの新生物を処置する方法であって、（１）ＲＮＡウイルス；（２）ヘパデナウイルス；（３）パルボウイルス；（４）パポバウイルス；（５）ヘルペスウイルス；（６）ポックスウイルス；および（７）イリドウイルスからなる群より選択されるクローン性ウイルスの治療有効量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目６６）  前記新生物は少なくとも３００ｍｍ3の体積である、項目６４に記載の方
法。
（項目６７）  前記ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、項目６４に記載の方法。
（項目６８）  前記パラミクソウイルスがＮＤＶである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）  前記哺乳動物がヒトである、項目６４に記載の方法。
（項目７０）  前記投与が静脈内投与または腫瘍内投与である、項目６４に記載の方法。（項目７１）  前記パラミクソウイルスが、１ｍｇのタンパク質あたり、少なくとも２×１０9ＰＦＵのレベルにまで精製されている、項目６４に記載の方法。
（項目７２）  前記ＮＤＶが亜病原性である、項目６８に記載の方法。
（項目７３）  前記新生物がガン性である、項目６５に記載の方法。
（項目７４）  哺乳動物における腫瘍を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の該腫瘍に対して細胞破壊性のＲＮＡウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含し、そして該哺乳動物が、該哺乳動物の総体重の少なくとも１．５％を含む腫瘍負荷を有する、方法。
（項目７５）  前記腫瘍が化学療法に応答しない、項目７４に記載の方法。
（項目７６）  患者から新たに取り出した腫瘍細胞または組織をスクリーニングして、ウイルスによる殺傷に対する該細胞または組織の感受性を決定する方法であって、インターフェロン感受性ウイルスを用いた示差的細胞傷害性アッセイに組織サンプルを供する工程、を包含する、方法。
（項目７７）  さらに、ｐ６８タンパク質キナーゼ、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｃ−Ｍｙｂ、ＩＳＧＦ−３、ＩＲＦ−１、インターフェロンレセプターおよびｐ５８からなる群より選択される、タンパク質またはタンパク質をコードするｍＲＮＡについて前記細胞または組織をスクリーニングする工程、を包含する、項目７６に記載の方法。
（項目７８）  哺乳動物における抗新生物活性を有するウイルスを同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該試験ウイルスを使用して、（Ｉ）インターフェロン媒介抗ウイルス活性を欠く細胞、および（ｉｉ）インターフェロン媒介抗ウイルス活性の能力を有する細胞に感染させる工程、ならびに
（ｂ）該試験ウイルスが、該インターフェロン媒介抗ウイルス活性を欠く細胞を、該インターフェロン媒介抗ウイルス活性の能力を有する細胞よりも優先的に殺傷するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目７９）  前記インターフェロン媒介抗ウイルス活性を欠く細胞がＫＢヒト頭部および頸部ガン細胞である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）  前記インターフェロン媒介抗ウイルス活性の能力を有する細胞がヒト皮膚線維芽細胞である、項目７８に記載の方法。
（項目８１）  抗新生物治療における使用のためにウイルスを作製する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）存在するウイルスを、インターフェロンの抗ウイルス効果の不活化についてのウイルス機構を減少または消失させることによって改変する工程；および必要に応じて、
（ｂ）弱毒化変異を作製する工程、
を包含する、方法。
（項目８２）  ウイルスで処置される哺乳動物におけるウイルス複製を制御する方法であって、該ウイルスは、ＲＮＡウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、パルボウイルス、ヘパドナウイルス、水痘ウイルス、ベータヘルペスウイルス、およびガンマヘルペスウイルスからなる群より選択され、そして、該方法は抗ウイルス化合物を投与する工程を包含する、方法。
（項目８３）  前記抗ウイルス化合物がインターフェロンである、項目８２に記載の方法。
（項目８４）  前記抗ウイルス化合物がリバビリン、アシクロビルおよびガンシクロビルからなる群より選択される、項目８２に記載の方法。
（項目８５）  前記抗ウイルス化合物が、前記ウイルスに対する中和抗体である、項目８２に記載の方法。
（項目８６）  ペレット化することなく超遠心分離よって精製した、パラミクソウイルス。
（項目８７）  少なくとも２×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパク質のレベルにまで精製された
、パラミクソウイルス。
（項目８８）  卵中で増殖され、そして混入する卵タンパク質を実質的に含まない、項目８７に記載のパラミクソウイルス。
（項目８９）  ５以下のＰＦＵあたりの粒子比を有する、項目８７に記載のパラミクソウイルス。
（項目９０）  ３以下のＰＦＵあたりの粒子比を有する、項目８７に記載のパラミクソウイルス。
（項目９１）  １．２以下のＰＦＵあたりの粒子比を有する、項目８７に記載のパラミクソウイルス。
（項目９２）  少なくとも１０10ＰＦＵ／ｍｇタンパク質のレベルにまで精製された、パラミクソウイルス。
（項目９３）  少なくとも６×１０10ＰＦＵ／ｍｇタンパク質のレベルにまで精製された、パラミクソウイルス。
（項目９４）  前記ウイルスが細胞破壊性である、項目８７に記載のパラミクソウイルス。
（項目９５）  前記パラミクソウイルスが、ニューカッスル病ウイルスである、項目８７に記載のパラミクソウイルス。
（項目９６）  前記ＮＤＶが細胞破壊性である、項目９５に記載のパラミクソウイルス。（項目９７）  前記ＮＤＶが亜病原性である、項目９５に記載のパラミクソウイルス。
（項目９８）  少なくとも２×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパク質のレベルにまで精製された
、ＲＮＡウイルス。
（項目９９）  前記ウイルスが複製コンピテントである、項目９８に記載のＲＮＡウイルス。
（項目１００）  インターフェロン感受性であって、そして少なくとも２×１０9ＰＦＵ
／ｍｇタンパク質のレベルにまで精製された、複製能を有する細胞破壊性ウイルス。
（項目１０１）  前記ウイルスがクローン性である、項目１００に記載の細胞破壊性ウイルス。
（項目１０２）  インターフェロン感受性であり、そして２×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパ
ク質のレベルにまで精製された、細胞破壊性ＤＮＡウイルス。
（項目１０３）  前記ウイルスがポックスウイルスである、項目１０２に記載の細胞破壊性ＤＮＡウイルス。
（項目１０４）  前記ポックスウイルスが、Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群より選択される１つ以上の遺伝子において１つ以上の変異を有するワクシニアウイルスである、項目１０３に記載の細胞破壊性ＤＮＡウイルス。
（項目１０５）  （ａ）Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒの１つ以上の遺伝子において１つ以上の変異、ならびに（ｂ）チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、ワクシニア増殖因子、チミジレートキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＵＴＰアーゼをコードする１つ以上の遺伝子において弱毒化変異を有する、複製コンピテントであるワクシニアウイルス。
（項目１０６）  Ｋ３Ｌ、Ｅ３ＬおよびＢ１８Ｒからなる群より選択される２つ以上の遺伝子において１つ以上の変異を有する、複製コンピテントであるワクシニアウイルス。
（項目１０７）  （２’−５’）Ａアナログの発現に改変を有する、ヘルペスウイルス。（項目１０８）  σ３での改変を有し、そして少なくとも２×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパ
ク質のレベルにまで精製されている、レオウイルス。
（項目１０９）  σ１およびσ３に変異を有する、レオウイルス。
（項目１１０）  ＲＮＡウイルスを精製する方法であって、以下の工程：
（ａ）クローン性ウイルスを生成する工程、および
（ｂ）ペレット化することなく超遠心分離によって該クローン性ウイルスを精製する工程、
を包含する、方法。
（項目１１１）  前記ＲＮＡウイルスが複製コンピテントである、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）  パラミクソウイルスを精製する方法であって、ペレット化することなく超遠心分離によって該ウイルスを精製する工程、を包含する、方法。
（項目１１３）  前記精製工程が、前記超遠心分離の前にさらに以下の工程：
（ａ）プラーク精製してクローン性ウイルスを生成する工程、
（ｂ）該クローン性ウイルスを卵に接種する工程、
（ｃ）該卵をインキュベートする工程、
（ｄ）該卵を冷却する工程、
（ｅ）該卵から尿膜腔液を採取する工程、および
（ｆ）該尿膜腔液から細胞砕片を除去する工程、
を包含する、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）  前記パラミクソウイルスウイルスがＮＤＶである、項目１１２に記載の方法。
（項目１１５）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させる方法であって、インターフェロン感受性の複製能を有するＲＮＡウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１６）  前記ウイルスがニューカッスル病ウイルス株ＭＬ１０７、ニューカッスル病ウイルス株ＮＪ  Ｒｏａｋｉｎ、シンドビスウイルス、および水疱性口内炎ウイルスからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１７）  哺乳動物における新生物にウイルスを感染させるための方法であって、該方法は、ニューカッスル病ウイルス株ＭＬ１０７、ニューカッスル病ウイルス株ＮＪ  Ｒｏａｋｉｎ、シンドビスウイルス、および水疱性口内炎ウイルスからなる群より選択されるクローン性ウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目１１８）  前記ウイルスが１を超える用量として投与される、項目１、２８または３３に記載の方法。
（項目１１９）  前記第一の用量が脱感作用量である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）  前記第一の用量が静脈内投与され、そして続く用量が静脈内に投与される、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）  前記第一の用量が静脈内投与され、そして続く用量が腹腔内投与される、項目１１９に記載の方法。
（項目１２２）  前記第一の用量が静脈内投与され、そして続く用量が動脈内投与される、項目１１９に記載の方法。
（項目１２３）  哺乳動物における新生物を処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物からのサンプルをイムノアッセイに供して、該サンプルに存在するウイルスレセプターの量を検出する工程と、該レセプターが存在する場合、該レセプターに結合する、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ウイルスを該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目１２４）  前記ウイルスがシンドビスウイルスであり、そして前記レセプターが高親和性ラミニンレセプターである、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）  前記ウイルスが、少なくとも４分間のコースにわたって投与される、項目１、２８または３３に記載の方法。
（項目１２６）  腫瘍腹水を処置する方法であって、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ウイルスを投与する工程を包含する、方法。
（項目１２７）  哺乳動物における疼痛を減少させる方法であって、インターフェロン感受性の複製能を有するクローン性ウイルスを投与する工程を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、ウイルス抗原発現における抗インターフェロンβ抗体の効果およびＮＨＥＫ（正常ヒト上皮ケラチノサイト）細胞における感染力価を示す。
【図２】図２は、異なる細胞（正常ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ９２２−ｓｋおよび２つの型の頭部および頚部ガン腫細胞（ＫＢおよびＨｅｐ２細胞））におけるウイルス抗原発現に対するインターフェロンβの効果を示す。
【図３】図３Ａは、ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞におけるウイルス抗原発現に対するインターフェロンの効果を示す。および図３Ｂは、ＫＢ細胞におけるウイルス抗原発現に対するインターフェロンの効果を示す。
【図４】図４は、ヒトＥＳ−２卵巣ガン腫細胞を有する無胸腺マウスおよび生理食塩水またはＮＤＶ株ＰＰＭＫ１０７のいずれかを用いて処置した無胸腺マウスについての生存曲線を示す。
【図５】図５は、多くのヒト腫瘍および正常細胞株のインターフェロン応答性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、どのウイルス複製が、インターフェロン（ＩＦＮ）媒介抗ウイルス応答が欠失した新生物細胞を選択的に殺傷するかによる新規な機構の発見に関する。本発明はまた、ガンおよび大きな腫瘍を含む新生物疾患の処置のためのウイルスの選択、設計、精製、および使用のための方法を提供する。本発明のウイルスは、ＩＦＮ媒介抗ウイルス応答のこれらの細胞中での選択的欠損に基づいて、新生物細胞中で選択的に複製し、新生物細胞を殺傷する。適切な用量のウイルスの投与によって、新生物細胞死が生じる一方で、インタクトなＩＦＮ媒介抗ウイルス応答を有する正常細胞はウイルスの複製が制限され、そして殺傷されない。
本発明の主題において、ガンのような新生物疾患を含む疾患の処置において使用するためのパラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ、および他のウイルス）の使用が含まれる。本発明はまた、新生物疾患の治療剤として使用するために適切な他のウイルスのスクリーニングおよび操作を教示する。本発明の別の実施態様は、ウイルス治療のための候補である腫瘍組織を同定するための方法を包含する。最終的に、本発明はまた、高度に精製されたウイルスの調製を記載する。
【００５１】
（ＮＤＶを含むインターフェロン感受性ウイルスの、新生物疾患を処置するための使用についての原理）
（ＮＤＶは、腫瘍細胞の選択的殺傷を示す）
ニューカッスル病ウイルスは、多くのヒト腫瘍細胞に対して選択的細胞傷害性効果を引き起こし、大部分の正常ヒト細胞に対してあまり顕著な効果を有さない。示差的な細胞傷害性アッセイにおいて、肉腫、黒色腫、乳ガン腫、卵巣ガン腫、膀胱ガン腫、結腸ガン腫、前立腺ガン腫、小細胞肺ガン腫および非小細胞肺ガン腫、ならびに神経膠芽腫に由来するヒトガン細胞は、多くの正常ヒト細胞（腎臓上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、および内皮細胞（図１を参照のこと））よりもＮＤＶに対して、約３倍〜４倍のオーダーでより感受性であることが発見された。示差的な細胞傷害性アッセイはまた、患者の細胞または腫瘍組織からの新鮮な単離物に適用され得る。
【００５２】
インビトロアッセイを使用して、実施例１に記載したようなＮＤＶの腫瘍殺傷活性を規定する。このアッセイは、５日間で試験した細胞培養物の５０％を殺傷するために必要なウイルスの量を測定する。実施例２および３は、インビボ実験の結果を示す。ここで、ウイルスがヒト腫瘍異種移植片を有する無胸腺マウスに、腫瘍内経路（実施例２）または静脈内経路（実施例３）のいずれかで投与された。これらの結果は、ＮＤＶが潜在的な化学療法剤の試験のために標準的な動物モデルにおける、種々のヒト腫瘍型の後退を引き起こし得る。
【００５３】
ＮＤＶが腫瘍内で特異的に複製するという証拠は、ウイルス抗原のための免疫組織化学染色（実施例２）によって示された。腫瘍内ウイルス注入の３０分以内に、腫瘍組織はウイルス抗原について陰性であった。しかし、処置の２日後まで、ウイルス抗原に対する強い免疫染色が腫瘍内で見られ、これは、腫瘍内でのウイルス複製を示す。重要なことに、ウイルス複製は、腫瘍組織に特異的であった。なぜなら、隣接する結合組織および皮膚は、ウイルス抗原について陰性であったからである。
【００５４】
重要なことに、ＮＤＶの効率的な複製は、ＵＶ不活化された非クローン性ウイルスを使用する研究において示されるように、ウイルスが感染した細胞を殺傷する能力に重要である（Ｌｏｒｅｎｃｅ，Ｒ．ら、１９９４  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，８６：１２２８−１２３３）。
【００５５】
ＮＤＶはまた、腫瘍内および静脈内投与の後に大きな腫瘍の後退を引き起こし得る（実施例４〜９）。無胸腺マウスにおける表皮内Ａ３７５ヒトメラノーマの大きな異種移植片（最大直径≧１０ｍｍ；腫瘍容積≧３００ｍｍ3）の腫瘍内ＮＤＶ処置は、高い割合の腫
瘍後退を導く（実施例４〜８）。無胸腺マウスにおける皮下ＨＴ１０８０ヒト線維芽肉腫の大きな異種移植片（最大直径≧１０ｍｍ）の静脈内ＮＤＶ処置は、６匹のマウスのうち５匹のマウスに完全なまたは部分的な腫瘍後退を導く（実施例９）。
【００５６】
（サイトカインのクラスＩインターフェロンファミリーは、ウイルス感染の重要な陰性モジュレーターである）
クラスＩのインターフェロンは、ＩＦＮα（造血起源の細胞において主に見られる）およびＩＦＮβ（線維芽細胞および上皮細胞において見られる）から構成される（Ｊｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．１９９０．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ．第３８３〜４１０頁、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：およびＳｒｅｅｖａｌｓａｎ，Ｔ．、１９９５、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α  ａｎｄ  β：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ、第３４７−３６４頁、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、第２版、Ｖ．Ｔ．Ｄｅ  Ｖｉｔａ，Ｊｒ．，Ｓ．ＨｅｌｌｍａｎおよびＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）。ＩＦＮの両方の型は、ウイルス複製の２本鎖ＲＮＡ中間体の分解を含む、明らかに一般的な作用機構および２本鎖ＲＮＡによって活性化されたタンパク質キナーゼの活性によって細胞性翻訳の阻害によって機能する（Ｊｏｋｌｉｋ，Ｗ．Ｋ．１９９０．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ．第３８３−４１０頁、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．第２版、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅら編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：およびその中に記載の参考文献）。いくつかのウイルス（インフルエンザ、ＥＢＶ、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニア）は、ＩＦＮ系の１つ以上の経路が不活化されることによる機構を進化させたため、ウイルスの有効な複製が可能になった（Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．１９９５．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：７５−７８）。
【００５７】
（広範な種々の腫瘍細胞は、ＩＦＮ依存性機構によってウイルス感染を制限する能力が欠失している）
ヒト頚部ガン腫細胞（ＨｅＬａ）は、ＩＦＮで前処置した後に水疱性口内炎ウイルスの複製の阻害に対して、非形質転換線維芽コントロール細胞株より、１／３００未満の感受性であった（Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉ  Ｒ．Ｋ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７：１６１−１６８）。本発明者らは、腫瘍形成性ヒト頭部および頚部ガン腫細胞（ＫＢ）および正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）の同時培養の感染は、両方の細胞型において最初にウイルス複製、次いで、継続される複製および腫瘍細胞の殺傷に対して正常細胞の感染の制限が生じることを発見した（実施例１０）。さらに、ＩＦＮは、培養培地に正常細胞によって分泌されており、腫瘍細胞は、抗ウイルス状態を確立するために産生されている濃度でＩＦＮに応答し得なかった。正常細胞に対して、腫瘍細胞のＮＤＶによる殺傷に対する異なる感受性によるＩＦＮの役割についてのさらなる証明は、正常線維芽細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）または正常上皮ケラチノサイト細胞（ＮＨＥＫ）がＩＦＮに対する中和抗体（実施例１１および１２）の存在下でＮＤＶでの感染に対してより感受性になることが示された、２つの別個の実験で得られる。最終的に、ＩＦＮの存在下での正常線維芽細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）およびヒト腫瘍細胞（ＫＢ）の並行感染は、正常細胞が腫瘍細胞より、添加したＩＦＮの抗ウイルス効果より、少なくとも１００倍感受性であったことを明らかにした（実施例１３および１４）。種々の腫瘍細胞株（合計９）の類似の試験は、細胞株のＮＤＶによる殺傷に対する相対的な感受性おける明らかな相関およびこの細胞株がインターフェロン媒介抗ウイルス応答を顕すことができないことを明らかにした（実施例２６）。
【００５８】
（インターフェロンおよび細胞増殖）
天然および組換え形態のα−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、ω−ＩＦＮ、およびγ−ＩＦＮならびに合成コンセンサス形態（例えば、Ｚｈａｎｇら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ，３：３１−３８に記載のとおり）を含むインターフェロン（ＩＦＮ）のいくつかの種が存在する。この発見を導く抗ウイルス活性に加えて、ＩＦＮは、いまや、細胞増殖および分化の正常な調節に重要な役割を果たすことが公知である。ＩＦＮは、ネガティブな増殖調節因子および正常細胞において腫瘍サプレッサタンパク質として作用することが示されているＩＦＮの活性の機能および調節に関与するいくつかの重要なタンパク質であると考えられている（Ｔａｎａｋａら、１９９４  Ｃｅｌｌ  ７７：８２９−８３９）。さらに、ＩＦＮの抗ウイルス活性を拮抗することが公知であるいくつかの他のタンパク質は、不適切に発現した場合、腫瘍形成能力を有することが示されている（以下を参照のこと。Ｂａｒｂｅｒ，ＧＮ，１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４２７８−４２８２）。多くのヒトガンに由来する細胞は、ＩＦＮをコードする遺伝子が欠失していることが示され（Ｊａｍｅｓ，ＣＤ，ら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：１６８４−１６８８）、そしてＩＦＮ機能が部分的または完全に損失していることがヒト頚部ガン腫（Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，Ｅ．ら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１４：１４７７−１４８６）、慢性リンパ性白血病（Ｘｕ，Ｂ．ら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１９４２−１９４９）、および悪性黒色腫細胞（Ｌｉｎｇｅ，Ｃ．ら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：４０９９−４１０４）において観察されたことが示された。
【００５９】
ＩＦＮ誘導タンパク質キナーゼ（ｐ６８）は、細胞およびウイルスタンパク質合成の重要な調節因子であることが示された。ｐ６８キナーゼの細胞の分化状態に対しての発現または活性と関連する相関が示された。従って、ほとんど分化していない細胞（例えば、多くのガンにおいて生じる細胞）は、ｐ６８機能が欠失している（Ｈａｉｎｅｓ、Ｇ．Ｋ．ら、１９９３  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌ．６３：２８９−９５）。ｐ６８活性を欠失している細胞は、一般的に、ウイルス媒介殺傷に対して感受性である。なぜなら、ｐ６８キナーゼは、ＩＦＮ誘導抗ウイルス状態の重要なエフェクターであるからである。ｐ６８の抗ウイルス活性は、ｐ５８と同定された細胞タンパク質と直接相互作用することによって拮抗され得る。ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてクローン性され、かつ過剰発現された場合、ｐ５８は、細胞に形質転換した表現型および固定依存性増殖を示させる（Ｂａｒｂｅｒ  ＧＮら、１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４２７８−４２８２）および多くのヒト白血病細胞株が、ｐ５８タンパク質を過剰発現することを示した（Ｋｏｒｔｈ  ＭＪら、１９９６  Ｇｅｎｅ  １７０：１８１−１８８）。分化していない細胞におけるウイルス殺傷に対する感受性は、より分化した表現形の誘導によって明らかになり得る（Ｋａｌｖａｋｏｌａｎｕ，ＤＶＲおよびＳｅｎ．Ｇ．Ｃ．１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３１６７−３１７１）。
【００６０】
（定義）
（インターフェロン媒介抗ウイルス応答においてコンピテントな細胞）
本明細書中で使用される用語「インターフェロン媒介抗ウイルス応答においてコンピテントな細胞」とは、低レベル（例えば、１ｍｌあたり１０ユニット）の外因性インターフェロンに、インターフェロンの非存在下と比較して、インターフェロン感受性ウイルスの複製を有意に減少させること（少なくとも１０分の１、より有利には少なくとも１００分の１、より有意には少なくとも１０００分の１、そして最も有利には、少なくとも１０，０００分の１）によって応答する細胞である。ウイルス複製の程度は、ウイルス（例えば、感染性ウイルス、ウイルス抗原、ウイルス核酸）の量を測定することによって決定される。ＣＣＤ９２２正常線維芽細胞は、インターフェロン媒介抗ウイルス活性応答においてコンピテントな細胞である。
【００６１】
（インターフェロン媒介抗ウイルス応答が欠失している細胞）
本明細書中で使用される用語「インターフェロン媒介抗ウイルス応答が欠失している細胞」とは、インターフェロン媒介抗ウイルス応答においてコンピテントな細胞についての上記の基準を満たさない、すなわち、低レベル（例えば、１ｍｌあたり１０ユニット）の外因性インターフェロンに、インターフェロンの非存在下と比較して、インターフェロン感受性ウイルスの複製を有意に減少させることによって応答しない細胞である。ＫＢ経口ガン腫細胞は、インターフェロン媒介抗ウイルス応答が欠失している細胞である。
【００６２】
（クローン性）
用語「クローン性」ウイルスの使用は、本明細書中以降、単一の感染性ウイルス粒子に由来するウイルスとして定義される。そのために、個々の分子クローンは、有意な核酸配列相同性を有する。例えば、配列相同性は、３００の連続するヌクレオチドに対して、ビリオンの集団に由来する少なくとも８つの個々の分子クローンが９５％を超える、より有利には９７％を超える、より有利には９９％を超える、そして最も有利には１００％を超える配列相同性を有する。
【００６３】
（細胞殺傷性）
本明細書中で使用される用語「細胞殺傷性」ウイルスとは、細胞に感染して、細胞死を生じさせるウイルスをいう。
【００６４】
（脱感作用量）
本明細書中で使用される語句「脱感作用量」とは、ウイルスの引き続く用量の副作用を低減させるために必要なウイルスの量をいう。
【００６５】
（示差的細胞傷害性アッセイ）
ウイルスを使用して腫瘍細胞または組織をスクリーニングするために、本明細書中で使用される語句「示差的細胞傷害性アッセイ」とは、（ａ）腫瘍細胞および１つ以上のコントロール細胞または組織のウイルス感染；（ｂ）感染の１日以上後の各サンプルについての細胞生存または死亡の決定（例えば、実施例１において詳述されるように細胞生存の色素指示薬の使用による）；および（ｃ）この結果に基づく、コントロールと比較して、ウイルスに対するサンプルの感受性の予測（例えば、実施例１に詳述されるＩＣ５０の決定による）をいう。
【００６６】
（新生物に感染する）
本明細書中で使用される用語「新生物に感染する」とは、ウイルス核酸が新生物細胞または組織へ進入することをいう。
【００６７】
（インターフェロン感受性）
本明細書中で使用される語句「インターフェロン感受性」ウイルス（例えば、ＮＤＶ）は、インターフェロンの非存在下と比較して、インターフェロンの存在下において有意にあまり複製しない（少なくとも１０分の１、有利には、少なくとも１００分の１、より有利には、少なくとも１０００分の１、最も有利には、少なくとも１０，０００分の１）ウイルスを意味する。これは、低レベルの外因性インターフェロン（例えば、１ｍｌあたり１０ユニット）の存在または非存在下において、インターフェロン媒介抗ウイルス応答においてコンピテントな細胞から得られたウイルス（例えば、感染性ウイルス、ウイルス抗原、ウイルス核酸）の量を測定することによって決定される。
【００６８】
（新生物および新生物疾患）
本明細書中で使用される「新生物」は、腫瘍、良性の増殖（例えば、コンジローム、乳頭腫）、および悪性の増殖（例えば、ガン）を含む組織の新たな増殖を意味する。本明細書中で使用される「新生物疾患」とは、新生物の存在によって表された疾患をいう。
【００６９】
（複製コンピテント）
本明細書中で使用される用語「複製コンピテント」ウイルスとは、新生物細胞中で感染性子孫を生成するウイルスをいう。
【００７０】
（卵タンパク質の夾雑が実質的にない）
用語「卵タンパク質の夾雑が実質的にない」とは、以下によって当業者によって実施されるように、オボアルブミンがウェスタンブロットにおいて検出不可能であるウイルス精製のレベルをいう：（１）１ウェル（幅３．３ｃｍ）あたり１．７×１０9ＰＦＵのウイ
ルスを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル（厚さ１ｍｍ）で泳動して；（２）ニトロセルロース膜にゲルからウイルスタンパク質を転写して；そして（３）ウサギ抗オボアルブミン（４ｍｇ／ｍｌの抗体濃度の１：２００希釈でのウサギＩｇＧ画分（Ｃａｐｐｅｌ，Ｉｎｃ．から）または等価なポリクローナル抗体）を使用してオボアルブミンについて免疫染色する。
【００７１】
（治療的に有効な量）
本明細書中で使用される用語「治療的に有効な量」とは、新生物疾患の処置をいう場合、所望の効果（例えば、新生物増殖の乾酪化、腫瘍後退、臨床状態の改善、または生存率の増加）を生じるウイルスの量をいう。
【００７２】
（本発明の化合物）
ウイルスの多様な群は、新生物細胞を選択的に殺傷するために使用される。天然または操作されたウイルスは、抗新生物剤として機能し得る。これらのウイルスは、ｉ）新生物細胞に感染して、新生物細胞死を生じ；ｉｉ）新生物細胞において複製コンピテントであり；そしてｉｉｉ）インターフェロンの抗ウイルス効果によって正常細胞の殺傷が制限される。
【００７３】
本発明の有利な実施態様において、上記の３つの特徴［（ｉ）新生物細胞に感染して、新生物細胞死を生じ；（ｉｉ）新生物細胞において複製コンピテントであり；そして（ｉｉｉ）インターフェロンの抗ウイルス効果によって正常細胞の殺傷が制限される］を有するウイルスはまた、インターフェロンを誘導する。
【００７４】
本発明の別の有利な実施態様において、上記の３つの特徴を有するウイルスはまた、ヒト新生物の後退を引き起こし；および／または以前から存在する免疫の存在のために標的ヒト集団で中和されない。
【００７５】
本発明の別の有利な実施態様において、上記の３つの特徴を有するウイルスは、腫瘍細胞に対して細胞殺傷性である。
【００７６】
パラミクソウイルス（本明細書中で使用される「パラミクソウイルス」とは、パラミクソウイルス科のメンバーをいう）は、本発明に従って使用されて、大きな腫瘍または高い腫瘍負荷を有する宿主を含む新生物の処置し得る。パラミクソウイルス科は、３つの属を含む：（１）パラミクソウイルス；（２）麻疹様ウイルス（麻疹ウイルス属）；および（３）ＲＳウイルス（肺炎ウイルス）。これらのウイルスは、ＲＮＡゲノムを含む。細胞殺傷性のパラミクソウイルス科ウイルス、特にパラミクソウイルス（例えば、ニューカッスル病ウイルス（「ＮＤＶ」）およびトリパラミクソウイルス２型のような他のトリパラミクソウイルス）は、本発明を実施する有利な方法である。これらのウイルスの弱毒化株は、特に本発明に従う新生物の処置のために特に有効である。
【００７７】
ＮＤＶは、本発明に従う特に有利なウイルスである。ＮＤＶは、ニワトリおよびニワトリ胚に対するその効果に従って、３つの異なるクラスに分類される。「低いビルレンス」株とは、長潜伏期性（ｌｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）をいい、最小致死量（ＭＬＤ）でニワトリ胚を殺傷するために９０〜１５０時間かかる；「中程度のビルレンス」株とは、亜病原性（ｍｅｓｏｇｅｎｉｃ）をいい、そしてＭＬＤでニワトリ胚を殺傷するために６０〜９０時間かかる；「高いビルレンス」株とは、短潜伏期性（ｖｅｌｏｇｅｎｉｃ）をいい、ＭＬＤでニワトリ胚を殺傷するために４０〜６０時間かかる。例えば、ＨａｎｓｏｎおよびＢｒａｎｄｌｙ，１９９５（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２：１５６−１５７）ならびにＤａｒｄｉｒｉら、１９９６（Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．９１８−９２０）を参照のこと。３つの全てのクラスが有用であり、有利には、ＮＤＶの亜病原性株（例えば、ＭＫ１０７株、ＮＪ  Ｒｏａｋｉｎ株、およびＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ−７０７２６株（実施例２１〜２３を参照のこと））である。他の亜病原性株の列挙については、例えば、ＳｃｈｌｏｅｒおよびＨａｎｓｏｎ、１９６８（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２：４０−４７）を参照のこと。
【００７８】
特定の目的のために、クローン性ウイルスを得て、特定のウイルス株の遺伝的均質性を確実にするかまたはそれを増加させ、そして欠失干渉粒子を取り除くことが望ましい。クローン性による欠失干渉粒子の除去は、感染性粒子あたりの全ウイルス粒子の数（例えば、粒子数／ＰＦＵ）によって評価される、最終産物の純度を増加させることが可能である。
【００７９】
クローン性ウイルスは、当業者に利用可能な任意の方法に従って生成され得る。例えば、プラーク精製は、クローン性ウイルスを得るために慣用的に利用される。例えば、Ｍａａｓｓａｂら、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｉｍｅｒ編、Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．１９９４、第７８−８０１頁を参照のこと。三重プラーク精製が特に望ましく、ここでプラークは、所望の特徴（例えば、好ましいサイズ、形状、外観、または親株の代表物を有する精製の各回で選択される。クローン性ウイルスを生成する別の手段は、当業者によって適用可能なＤＮＡ組換え技術による。クローン性ウイルスを得る別の手段は、限界希釈技術を適用する（例えば、ウイルスサンプルの希釈物を添加して、感受性細胞の単層を含む１ウェルあたり平均１つ未満の感染性ウイルス粒子を与える）。
【００８０】
本発明の有利な実施態様において、精製されたウイルスを使用して、新生物疾患を処置する。卵由来のウイルスの精製のための有利な方法は、以下のとおりである（ウイルスは、これらの方法のいずれの工程においてもペレット化されない）：
精製方法Ａ
ａ）クローン性ウイルスを生成する（例えば、プラーク精製）
ｂ）卵にクローン性ウイルスを接種する
ｃ）卵をインキュベートする
ｄ）卵を冷やす
ｅ）卵から尿膜腔液を回収する
ｆ）尿膜腔液から細胞砕片を除去する
ｇ）（例えば、不連続スクロース勾配を使用して）ペレット化することなく尿膜腔液を超遠心する。
【００８１】
本発明の別の実施態様において、さらなる工程が、（尿膜腔液からの）細胞砕片の除去後および超遠心の前に加えられ、この工程は以下からなる：
・尿膜腔液を凍結融解する
・（例えば、遠心分離によって）ウイルス懸濁液から夾雑物質を取り除く。
【００８２】
本発明の別の実施態様において、超遠心は、連続流（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｌｏｗ）超遠心によって達成される。
【００８３】
本発明の１つの実施態様は、複製コンピテントＲＮＡウイルスを精製する方法に関し、この方法は、以下を包含する：
ａ）クローン性ウイルスを生成する工程、および
ｂ）上記のクローン性ウイルスをペレット化することなく超遠心によって精製する工程。
【００８４】
本発明の別の実施態様は、パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）をペレット化することなく超遠心によって精製する工程を包含する、このウイルスを精製する方法を包含する。
【００８５】
必要に応じて、超遠心の前に、精製工程はさらに以下を包含する：
ａ）プラークを精製して、クローン性ウイルスを生成する工程、
ｂ）このクローン性ウイルスを卵に接種する工程、
ｃ）卵をインキュベートする工程、
ｄ）卵を冷やす工程、
ｅ）卵から尿膜腔液を回収する工程、および
ｆ）尿膜腔液から細胞砕片を除去する工程。
【００８６】
本発明の別の実施態様は、卵または細胞培養物から複製コンピテントクローン性ウイルスを精製する方法を包含し、この方法は、ウイルスをペレット化させる工程を伴わずに、超遠心工程を包含する。
【００８７】
本発明の別の実施態様は、連続接線流濾過（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）によってウイルスを精製する工程を包含する、パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）を精製する方法を包含する。
【００８８】
必要に応じて、ゲル濾過クロマトグラフィーによってウイルスをさらに精製し得、ここで、これらの工程の各々は、安定化緩衝液の存在下で行われる（実施例１５）：
ａ）プラーク精製して、クローン性ウイルスを生成する工程、
ｂ）このクローン性ウイルスを卵に接種する工程、
ｃ）卵をインキュベートする工程、
ｄ）卵を冷やす工程、
ｅ）卵から尿膜腔液を回収して、尿膜腔液を緩衝液で希釈する工程、
ｆ）尿膜腔液からＴＦＦによって細胞砕片を除去する工程
ｇ）ＴＦＦによってウイルスを精製する工程、および
ｈ）ゲル濾過クロマトグラフィーによってウイルスを精製する工程。
【００８９】
必要に応じて、ゲル濾過工程から得られたウイルスを、ＴＦＦを使用して濃縮し得る。
【００９０】
本発明の別の実施態様は、卵または細胞培養物から複製コンピテントクローン性ウイルスを精製する方法を包含し、この方法は、連続接線流濾過（ＴＦＦ）、次いで、必要に応じてゲル濾過クロマトグラフィー、次いで、必要に応じてＴＦＦによって精製して、ウイルスを濃縮する工程を包含する。
【００９１】
（クローン性ウイルス）
これらの方法を使用することによって、クローン性ウイルス（パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）を含む）を、少なくとも２×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、有利に
は、少なくとも３×１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、より有利には、少なくとも５×
１０9ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、より有利には、少なくとも１×１０10ＰＦＵ／ｍｇ
タンパク質まで、より有利には、少なくとも２×１０10ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、より有利には、少なくとも３×１０10ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、より有利には、少なくとも４×１０10ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、より有利には、少なくとも５×１０10ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、そして最も有利には、少なくとも６×１０10ＰＦＵ／ｍｇタンパク質まで、精製を可能にする。
【００９２】
これらの方法を使用することによって、クローン性ウイルス（パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）を含む）をＰＦＵあたりのウイルス粒子の数が、１０未満、より有利には、５未満、より有利には、３未満、より有利には２未満、最も有利には、１．２未満（ＰＦＵあたりのウイルス粒子のより少ない数は、より高い純度を示す）のレベルまで精製を可能にする。
【００９３】
（ＲＮＡウイルス）
別の実施態様において、この方法は、（クローン性ウイルスについての上記のレベルまで）以下を含むＲＮＡウイルスの精製を可能にする：（ａ）細胞殺傷性ＲＮＡウイルス；（ｂ）１本鎖ＲＮＡの非セグメント化、非エンベロープ化ウイルス；（ｃ）１本鎖ＲＮＡのセグメント化、エンベロープ化ウイルス；（ｄ）２本鎖ＲＮＡのセグメント化、非エンベロープ化ウイルス；および（ｅ）１本鎖ＲＮＡの非セグメント化、エンベロープ化ウイルス（例えば、パラミクソウイルス（例えば、ＮＤＶ）および例えば、レトロウイルス）
（ＤＮＡウイルス）
別の実施態様において、これらの方法は、（クローン性ウイルスについての上記のレベルまで）以下からなる群より選択されるインターフェロン感受性細胞殺傷性ウイルスの精製を可能にする：（ａ）エンベロープ化、２本鎖ＤＮＡウイルス（ポックスウイルスを含む）；（ｂ）非エンベロープ化、１本鎖ＤＮＡウイルス；および（ｃ）非エンベロープ化、２本鎖ＤＮＡウイルス。
【００９４】
（卵由来ウイルス）
別の実施態様において、これらの方法は、夾雑している卵タンパク質が実質的にないレベルまで卵由来ウイルスの精製を可能にする。ヒト治療に使用するためのウイルス調製物における卵タンパク質の量は、制限されることが好ましい。なぜなら、オボアルブミンのような主要な卵タンパク質はアレルゲンであるからである。
【００９５】
新生物疾患（ガンを含む）の処置において有用なウイルスは、表１に示される。これらのウイルスは、必要に応じて、天然に存在する変異物（特定の株または単離物）についてスクリーニングされ、親株に対して改変されたＩＦＮ産生を生じる。
【００９６】
【表１】
2013213058.tif 000002
本発明の別の実施態様において、候補ウイルス（天然に存在してもよいし、操作されていてもよい）は、新生物の処置において治療的有用性を提供する能力について試験される。１つの実施態様において、インターフェロン媒介抗ウイルス応答が欠失している細胞（例えば、ＫＢ頭部および頸部ガン腫細胞）の５０％を殺傷するために必要とされる候補ウイルスの量は、同様の数のインターフェロン媒介抗ウイルス応答においてコンピテントな細胞（例えば、正常皮膚線維芽細胞）の５０％を殺傷するために必要とされるウイルスの量と比較される。殺傷する量は、トリパンブルー排除またはＭＴＴアッセイを含む任意の数の手段によって定量される（例えば、実施例１を参照のこと）。インターフェロン媒介抗ウイルス応答においてコンピテントな細胞を殺傷するために必要とされる量に対して、インターフェロン媒介抗ウイルス応答が欠失している細胞を殺傷するために必要とされるウイルス量の有意な減少（例えば、少なくとも５分の１）は、試験されているウイルスが新生物の処置において治療的有用性に必要とされる活性を示すことを示す。他のＮＤＶウイルスおよびシンドビスウイルスは、このような腫瘍選択的殺傷を示す、天然に存在するウイルスである（実施例２１〜２３、および２５を参照のこと）。
【００９７】
抗ウイルス状態の確立に関与する因子の理解は、ウイルス治療に応答するようである腫瘍についてのスクリーニングアッセイの作製を可能にする。原理的に、患者由来の生検から得られた腫瘍組織は、ｐ６８キナーゼ、ｐ５８、または抗ウイルス状態もしくは細胞分化の調節に関与する他の因子の発現についてスクリーニングされる。他の因子としては、インターフェロン応答因子−１（ＩＲＦ−１）、インターフェロン刺激遺伝子因子−３（ＩＳＧＦ−３）、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、およびＩＦＮレセプターが挙げられるが、これらに限定されない。ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂまたはｐ５８の場合において、高レベル発現は、腫瘍組織または細胞がウイルス治療の処置候補であることを示す。ｐ６８、ＩＲＦ−１、ＩＳＧＦ−３、およびＩＦＮレセプターの場合において、低レベル発現は、腫瘍組織または細胞がウイルス治療の処置候補であることを示す。
【００９８】
本発明の別の実施態様において、患者の生検から得られた原発性腫瘍組織または細胞を、培養して拡大し、そして適切なウイルス治療による殺傷に対する感受性について試験する。１つの実施態様において、腫瘍組織培養物の５０％を殺傷するために必要とされるウイルスの量を、候補ウイルスのスクリーニングについて上記で記載されるように、正常細胞の培養物の５０％を殺傷するために必要とされる量と比較する。ウイルス剤による殺傷に対して、正常細胞と比較して腫瘍細胞の感受性の１０倍以上の増加は、腫瘍細胞がウイルス処置の細胞殺傷効果に対して特異的に感受性であることを示す。本発明のさらなる実施態様において、標的化された腫瘍細胞が、内因的または外因的に供給されたＩＦＮに応答する能力は、ＩＦＮ（αまたはβ形態、例えば、１ｍｌあたり１０ユニットを使用、実施例２７を参照のこと）の存在下で上記のスクリーニングを実施することによって決定される。
【００９９】
ウイルスの結合または侵入のために必要とされる細胞応答の理解は、高レセプター発現、従って増強されたインターフェロン感受性ウイルスに対する感受性を有する腫瘍についてのさらなるスクリーニングを可能にする。これは、ウイルス治療に応答する可能性がある患者についてのさらなるレベルのスクリーニングである。有利には、インターフェロン感受性ウイルスでの治療について、患者の腫瘍は、インターフェロンに耐性であり、そしてウイルスについての細胞レセプターの高い発現を有する。原則的に、患者由来の血清、腫瘍細胞、組織、または組織切片は、血清中または腫瘍細胞または腫瘍組織に存在するウイルスレセプターの量についてのイムノアッセイまたは免疫染色によってスクリーニングされる。例えば、シンドビスウイルスは、高親和性ラミニンレセプターを利用して、哺乳動物細胞に感染する（Ｗａｎｇら、１９９２、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，６６：４９９２−５００１）。この同じレセプターは多くの多様な型の転移性ガンにおいてより高い量で発現されることが公知である。ＰＡＮＣ−１腎ガン細胞株、および結腸腺ガン細胞株ＳＷ６２０は、高レベルの高親和性ラミニンレセプターｍＲＮＡを発現させ（Ｃａｍｐｏら、１９９２、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４１：１０７３０１９８３；Ｙｏｗら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８５：６３９４−６３９８）、シンドビスウイルスにより高く感受性であることが公知である（実施例２５）。対照的に、直腸腺ガン細胞株ＳＷ１４２３は、非常に低レベルの高親和性ラミニンレセプターｍＲＮＡを発現させ（Ｙｏｗら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８５：６３９４−６３９８）、そしてＳＷ６２０細胞よりも、ＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９による殺傷に対して、４桁を超えてより耐性であることが公知である。
【０１００】
ＮＤＶの既存の株または他のウイルス（ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスを含む）は、正常細胞の改変されたＩＦＮ応答（例えば、有利には、増加したＩＦＮ応答）のためにスクリーニングされるか、または操作される。強力なＩＦＮ応答を惹起する能力に加えて、他のウイルス特徴は、ウイルスをスクリーニングするか、またはウイルス中に操作される。改変されたレセプター特異性を有するウイルス（例えば、シンドビスウイルスＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９、実施例２５を参照のこと）または低い神経病原性が、本発明に含まれる（例えば、ＮＤＶウイルスＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、実施例２４を参照のこと）。有利には、本発明のウイルスは、細胞と細胞との直接的な接触によって伝播する能力を有する。
【０１０１】
本明細書中で記載した本発明は、ＮＤＶの指標に類似の様式において新生物の処置に有用であるウイルスの広範なグループ（表１を参照のこと）を含む。さらに、正常細胞においてＩＦＮ応答を不活化する機構の存在によって、使用するには天然には候補とならないウイルスは、上記の制限を回避するために必要に応じて操作される。未改変のままである場合、インターフェロン応答を不活化する機構を有するウイルスは、そのような機構を除いたウイルスよりも、正常な細胞に対してより毒性である。本発明は、（１）容易に操作され得るベクターの開発；および（２）治療用ウイルスのセットの作製を提供する。操作には、ＩＦＮを発現するトランスジーンのウイルス発現を可能にするＩＦＮ遺伝子の添加、またはＩＦＮ応答経路の他のアクチベーターが挙げられる。さらなる変更は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ（Ｂｌａｅｓｅ  ＲＭら、１９９４．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ：１１９０−１１９３）のようなプロドラッグ活性化酵素の操作された発現、および免疫系による腫瘍細胞の標的化を可能にする適切なマーカー抗原の発現を含む。さらなる変更は、それらのレセプターを有する標的細胞に対するレセプターリガンドの操作された発現を含む［例えば、それらのウイルスに感染された標的細胞に対する他のウイルスに対するレセプターの発現（Ｍｅｂａｓｔａｓｉｏｎら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ９０：８４１〜８４７；および  Ｓｃｈｎｅｌｌ  ＭＪら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ９０：８４９〜８５７を参照のこと）］。
【０１０２】
いくつかのニューカッスル病ウイルス株は、腫瘍細胞の選択殺傷を実証する。亜病原性のニューカッスル病ウイルスの第二株を用いる示差的細胞傷害性アッセイにおいて、腫瘍細胞は、正常細胞よりも、ウイルスにより殺傷される感受性が３桁大きいということが見出された（実施例２１）。さらに、第三の亜病原性ニューカッスル病ウイルス株が、示差的細胞傷害性アッセイで用いられた場合、腫瘍細胞は、ウイルスに殺されるには正常細胞よりも８０〜５０００倍大きい感受性であることが見出された（実施例２２）。これらの亜病原性ニューカッスル病ウイルス株の両方はまた、ヒト腫瘍異種移植片を有する胸腺欠損マウスへの腫瘍内投与後に、腫瘍成長の後退を生じた（実施例２３）。
【０１０３】
別の実験において、３つの異なるニューカッスル病ウイルス株の安全性を、胸腺欠損マウスおよび免疫能力のあるマウスにおいて、脳内注射後に試験した。この試験の結果は、３つのすべてのウイルス株が完全な免疫系を有するマウスにおいてよく寛容化されることを示した。胸腺欠損マウスの脳への脳内注射は、ウイルスの１つが他の２つより有意によく寛容化されることを示した（実施例２４）。これらの結果は、単独のウイルスファミリーにおいて、ウイルス特性における重要な差異が生じ得、そしてより大きい効力または増大する安全性が治療的に開拓され得ることを実証する。
【０１０４】
腫瘍崩壊性ウイルスでの処置後に有効力を増大させ、そして毒性を低下させる別の手段は、腫瘍細胞上で優先的に発現される特異的細胞表面レセプターを必要とするインターフェロン感受性ウイルスの使用を介する。シンドビスウイルスは、この型の制限の例を提供する。シンドビスウイルスは、高親和性ラミニンレセプターを用いて哺乳動物細胞に感染する（Ｗａｎｇら、（１９９２）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，４９９２−５００１）。示差的細胞傷害性アッセイにおいて、正常および腫瘍細胞がシンドビスウイルスに感染された場合、腫瘍形成性であり、そしてまた高親和性ラミニンレセプターを発現する細胞は、このウイルスによる殺傷に対して、他の細胞よりも感受性であることが見出された（実施例２５）。正常なケラチノサイトは、高親和性ラミニンレセプターを発現する（Ｈａｎｄら、（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５、２７１３−２７１９）が、このアッセイにおいて、シンドビスによる殺傷に対して抵抗性であった。
【０１０５】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、腫瘍崩壊性ウイルスによる腫瘍選択性殺傷の証拠を提供する、すなわち、腫瘍細胞におけるインターフェロン応答性の先天的な欠損は、インターフェロン感受性の複製能力のあるウイルスによる殺傷に対する感受性をこれらの細胞に与える。ＶＳＶは、外因性インターフェロンの存在下で非腫瘍形成性ヒトＷＩＳＨ細胞および腫瘍形成性ＨＴ１０８０またはＫＢ細胞に感染するために用いられた。
【０１０６】
以下は、天然に生じる抗インターフェロン活性を除去するように改変された場合、ウイルスガン治療に有用であるウイルスのリストである（表２を参照のこと）。破壊されるか、または減弱した内因性の抗インターフェロン活性を有した改変ウイルス（有利であって、必要性はないが、抗インターフェロン改変に加えて弱毒化される、表３を参照のこと）は、ガン治療に有用である。このリストは、以下に記載のウイルスを含むがこれに限定されない。通常のクラスのウイルスの間の類似性により、以下に列挙された各々の特定のウイルスについて同定された機構はまた、同一の、または機能的に類似の機構として、ウイルスのそのクラスの他のメンバーに存在する。ウイルスの広範な群は、括弧内に加えられる。抗インターフェロン活性の機能的な消失を有する以下のようなウイルスは（任意の手段を介して）、天然に存在する変異ならびに操作された欠失または点変異を含み、本発明の方法において有用である。
【０１０７】
２つ以上の機構を働かせるウイルスは、１つ、いくつか、またはすべての活性に変異を含むように必要に応じて改変される。いくつかの記載された活性についての変異は、通常の科学領域において利用可能である。
【０１０８】
野生型ウイルスの増殖速度と比べて、より遅い増殖をしている天然に存在するかまたは操作されたウイルスの単離は、特に有利である。なぜなら、より遅いウイルス増殖速度は、ウイルス複製が細胞または細胞集団を殺傷し得る前に、インターフェロン応答においてコンピテント細胞または細胞集団が、効率的な抗ウイルス状態を確立することを可能にするからである。
【０１０９】
感染した細胞においてインターフェロン反応の増大を生じるが新生物細胞においてはウイルス複製をなお可能にするウイルス特徴の特異的な変化としてウイルスの抗インターフェロン活性を無力にすることが、本発明に含まれる。
【０１１０】
表２は抗インターフェロン活性を除去するように操作をしたウイルスの存在を示す。
【０１１１】
表３はビルレンスが減弱するように操作をしたウイルスを列挙している。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
【表３】
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（新生物の処置）
本発明は、特にガンを有する動物における、新生物のウイルス治療に関する。有利な実施態様では、本発明は、最長部での測定サイズが１センチメートル（ｃｍ）以上である腫瘍の処置に関する。本明細書中で使用される「１ｃｍの腫瘍」は、腫瘍の少なくとも１辺の長さが１ｃｍであることを示す。このような腫瘍は、ウイルス治療で期待されたよりも感受性であり、サイズがより小さい腫瘍よりも感受性でないとしても、しばしばウイルスに対して少なくとも同程度感受性である。本発明のより有利な局面では、１ｃｍより大きい腫瘍が処置される（例えば２ｃｍ以上である腫瘍、約２ｃｍから約５ｃｍの腫瘍、および５ｃｍより大きい腫瘍）。
【０１１４】
本発明はまた、高い腫瘍荷重を有する宿主の処置のために用いられ得る。本明細書中で使用される句「腫瘍荷重（ｔｕｍｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）」は、体重のパーセントで示される体内の腫瘍の総量をいう。腫瘍荷重（例えば、総体重の約１％から約２％）を有する宿主のウイルス治療は、驚くほど有効である（例えば、全腫瘍負荷における腫瘍の後退および減少を生じる）。これは特に意外である。なぜなら、総体重のおよそ２％の腫瘍荷重（例えば、６０ｋｇのヒトでは１ｋｇの腫瘍）は、生命が耐えるにはほぼ最大ガン量であるからである。例えば、Ｃｏｔｒａｎら、Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第４版、ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、１９８９、２５２頁を参照のこと。実施例では、マウス宿主における黒色腫（例えば、Ａ３７５）について３９７ｍｍ3までの容積は、ニューカッスル病ウイルス（例えば、３プラークでの精製
ウイルス）での処置に対して完全な後退を示した。組織１０００ｍｍ3が１グラムと等し
いと仮定すると、３９７ｍｍ3の容積を有する腫瘍は、２０グラムのマウスにとっては全
体重のおよそ２％を含むことになる。
【０１１５】
以下、実施例４〜９に示すように、腫瘍後退は、少なくとも１ｃｍのサイズの腫瘍では得られ、一方、無処置の、コントロール動物は腫瘍荷重から数週間以内に死滅し始めた。したがって、このような罹患動物は、死亡の２週間内でさえ首尾よく処置された。このように、本発明にしたがって、その腫瘍荷重の終末に近い動物は、ウイルス治療で有効に処置され得る。結果的に、本発明は、従来の治療（例えば、メトトレキセート、５−フルオロウラシルのような化学療法、および放射線療法）に応答しない患者を処置するために用いられ得る。
【０１１６】
腹腔内経路を通した投与後のガンの処置のためのＮＤＶの効力はまた、試験された。卵巣ガンの腹水予防モデルを用いて、ヒトＥＳ−２卵巣腫瘍を有しているマウスへのＮＤＶの腹腔内注射は、生理食塩水で処置したマウスと比べて、生存を上昇させた（実施例１６）。ＥＳ−２細胞が、卵巣ガン腫瘍モデルにおいて、一旦腹水が形成されると開始される処置に関して用いられた場合、腹水液産生は、生理食塩水コントロールに比べて、ウイルス処置した動物では著明に減少した（実施例１７）。
【０１１７】
本発明の別の実施態様では、ウイルスの投与は、１）腫瘍関連症状の軽減（例えば、腹水液産生速度の減少、疼痛軽減、および閉塞性疾患の軽減であるが、これらに限定されない）ならびに２）生存の延長を生じる。
【０１１８】
２３人の患者は、静脈内経路によって、プラーク精製ＮＤＶ単離物を受けた（実施例２０）。処置応答には、明白な腫瘍の後退、４７％の患者における疾患の安定化および鎮痛薬の減少が挙げられる。
【０１１９】
（投与および処方）
本発明の１つの実施態様において、腫瘍細胞または組織は、インビトロにおいて、ウイルスに感受性である腫瘍を有する患者を決定するためにスクリーニングされる。患者から除去された腫瘍細胞（固形腫瘍では微小針吸引のような方法によって、または卵巣腹水腫瘍では穿刺によって）は、インビトロで増殖され、そしてウイルスとともにインキュベートされる。本発明のこの実施態様では、ウイルスがそれらの腫瘍細胞に対して高活性を有する場合、患者は治療のために選択される。
【０１２０】
本発明の有利な実施態様では、投与されたウイルスの量は、腫瘍の後退を生じる。本明細書中で使用される「後退（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）」は、腫瘍が縮少する（例えば、サイズ、量または容積において）ことを意味する。腫瘍サイズの減少は、種々の方法により実証され、この方法には、物理的試験、胸部撮影もしくは他のＸ線、超音波検査、ＣＴスキャン、ＭＲＩまたは放射線核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）スキャンニング手順が挙げられる。
【０１２１】
ガンを含む種々のタイプの新生物は、本発明にしたがって処置可能である。本発明のウイルスは、種々のガンの処置に有用であり、このガンには、肺ガン、乳ガン、前立腺ガン、結腸腺ガン、頸部ガン、子宮内膜ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、ウィルムス腫瘍、線維肉腫、骨肉種、黒色腫、滑膜肉腫、神経芽腫、リンパ腫、白血病、神経膠芽細胞腫を含む脳のガン、神経内分泌ガン、腎臓ガン、頭頸部ガン、胃ガン、食道ガン、弁のガン、肉腫、皮膚ガン、甲状腺、膵臓ガンおよび中皮腫が挙げられるがこれらに限定されない。本発明のウイルスはまた、種々の良性腫瘍の処置に有用であり、この良性腫瘍にはコンジローマ、パピローマ、髄膜腫およびアデノーマが挙げられるがこれに限定されない。
【０１２２】
ウイルスの治療的に有効な量が、新生物を有する宿主に投与される。投与されたウイルスの用量は、選択されたウイルス、新生物のタイプ、新生物細胞増殖もしくは転移、新生物の生物学部位もしくは体の部分、ウイルス株、投与の経路、投与のスケジュール、投与の様式、および任意の他の薬物の同一性もしくは哺乳動物へ投与される処置（例えば、放射線、化学療法もしくは外科処置）に依存して変わることは当業者には理解される。これらのパラメーターは、動物モデルにおける最大許容量決定を介して、および相対体表面積または体重の関数としてヒト投与量を測定することを介して規定される。特定の状況下で、ウイルスの１より多い用量が与えられることもまた理解される。ウイルスのこのような多回用量の間の至適間隔は、経験的に決定され得、そして当該分野の範囲内である。ＮＤＶは、一般にウイルスで約３×１０6〜約５×１０12ＰＦＵを投与される。局所投与（例
えば、腫瘍へ直接に）については、総量で約３×１０6〜約５×１０10ＰＦＵのウイルス
が代表的に用いられる。全身投与には、体表面積の１平方メートルあたり約１×１０8〜
約４×１０11ＰＦＵのウイルス量が用いられる。静脈投与には、１週あたり１回、１週あたり２回、および１週あたり３回の投与スケジュールが用いられる。本発明に従ってウイルスは、（必要に応じて化学療法剤と一緒に）例えば、腸内の、非経口の、経口の、経鼻の、直腸の、クモ膜下腔内の、静脈の（例えば、カテーテルを用いて）、皮下の、腫瘍内の（例えば、その腫瘍組織に直接的に、またはそれを灌流する血管に）、腫瘍周囲の、局所の、舌下の、口内の、局部の、筋肉内の、吸入による、経皮的な、膣の、動脈内の、頭蓋内の、皮内の、硬膜外の、全身的に、局部の、腹腔内の、胸膜腔内のなどの種々の経路で投与され得る。肺腫瘍では、気管支経路（例えば、気管支投与）が用いられ得る。胃腸の腫瘍の内視鏡的注射ならびに直腸の腫瘍の坐剤処置はまた、適切な場所で用いられる。
【０１２３】
ＮＤＶでのマウスの毒性試験は、静脈内ウイルス投与後の急性毒性が、サイトカイン媒介反応により生じるようであるということを示した。反復刺激に対するサイトカイン応答は、初回の誘導事象後に、脱感作されるか、またはダウンレギュレ−ションされることが公知である（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１、２３６６−２３７２）。ウイルスの脱感作用量を静脈内に注射されたマウスは、初回の注射でビヒクル単独を受けるマウスより、第二用量においておよそ１０倍多いウイルスを寛容し得た（実施例１８）。静脈内経路によるウイルス投与の速度は、毒性に有意に影響し得る。胸腺欠損マウスの２群は、緩慢に（０．２ｍｌを４分間かけて）、または迅速に（０．２ｍｌを３０秒かけて）のいずれかで投与されたＮＤＶの同一用量で静脈内処置された。各々の群における最大体重減少の比較は、迅速な注射に対して緩慢な注射を受けた各群では体重減少が５０％少ないことを示した（実施例１９）。
【０１２４】
臨床試験の１つのある集団では、患者は、１週のコースに渡ってプラーク精製ＮＤＶ単離物の３回注射を受けた（実施例２０）。これらの条件下で、初回用量の脱感作効果は、第二および第三用量に伴う毒性を減少させた。これらのデータは、動物試験で得られるデータに対応する実施例１８に示される。ガンの処置における、腫瘍崩壊性ウイルスの使用に関する１つの関心事は、治療に働き得る体液性免疫応答の潜在的阻害効果である。臨床試験において、１ケ月後に安定疾患を示す患者は、次いで、ＮＤＶに対する中和抗体の存在下で投与される処置の第二のコースに適合する。にもかかわらず、第二コースの投与後７日の患者尿中に感染ウイルスが見出され得、これは高用量のウイルス投与が中和抗体の効果に打ち勝ち得、そして患者内に感染を確立し得るという証拠を提供する。
【０１２５】
本発明の有利な実施態様において、脱感作用量は、より高い引き続く用量の前に与えられる。脱感作のために、１×１０8〜２．４×１０10ＰＦＵ／ｍ2のウイルス用量が用いられる。脱感作後に、３×１０8〜４×１０12ＰＦＵ／ｍ2のさらなるウイルス用量が用いられる。用量の間の時間枠は、脱感作用量と次の用量との間に時間枠を含み、これは１〜１４日であり、有利には１〜７日である。脱感作用量は、例えば、静脈内の、腸内の、非経口の、経口の、経鼻の、直腸の、クモ膜下の、静脈内の、皮下の、腫瘍内の、腫瘍周囲の、局部的な、舌下の、口内の、局所的な、筋肉内の、吸入による、経皮的な、膣の、動脈内の、頭蓋内の、皮内の、硬膜外の、全身的に、局部の、腹腔内の、胸膜腔内の、内視鏡的な、気管支内のなどの種々の経路で投与され得る。引き続く投与は同じ経路で脱感作用量としてまたは別の経路で、（例えば、静脈内の、腸内の、非経口の、経口の、経鼻の、直腸の、クモ膜腔内の、静脈の、皮下の、腫瘍内の、腫瘍周囲の、局部の、舌下の、口内の、局部的な、筋肉内の、吸入による、経皮的な、膣の、動脈内の、頭蓋内の、皮内の、硬膜外の、全身的に、局所の、腹腔内の、胸膜腔内の、内視鏡的な、気管支内のなど）投与され得る。
【０１２６】
必要に応じて、投与の１つ以上の経路が、連続してかまたは同時の方式で用いられ得る。同時かまたは連続的投与のための経路には、静脈内の、腸内の、非経口の、経口の、経鼻の、直腸の、クモ膜腔内の、静脈の、皮下の、腫瘍内の、腫瘍周囲の、局部の、舌下の、口内の、局部的な、筋肉内の、吸入による、経皮的な、膣の、動脈内の、頭蓋内の、皮内の、硬膜外腔の、全身的に、局部の、腹腔内の、胸膜腔内の、内視鏡的な、気管支内のなどが挙げられるがこれらに限定されない。例としては、静脈内脱感作用量の後の腹腔内用量の投与である。
【０１２７】
本発明の別の有利な実施態様において、ウイルスは、静脈内ポンプを用いることを含む緩慢な注入または４分から２４時間までのコースにわたる緩慢な注射により投与される。
【０１２８】
ウイルスおよび必要に応じて１つ以上の化学療法剤は、単回注射で、多回注射で、または持続的に投与される。ウイルスは化学療法剤投与の前に、同時に、または後に投与される（例えば、以下であるが、それらに限定されない：ブスルファン、シクロフォスファミド、メトトレキセート、シタラビン、ブレオマイシン、シスプラチン、ドキソルビシン、メルファラン、メルカプトプリン、ビンブラスチン、５−フルオロウラシル、タキソールおよびレチン酸）。本発明に従うウイルス治療は、必要に応じて、他の処置と組み合わされる。この処置には、手術、放射線、化学療法（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ｔｉｅｒｎｅｙら編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、１９９７、特に７８〜９４頁を参照のこと）、および生物学的治療が挙げられる。このウイルスは、（１）他の腫瘍崩壊性薬剤［例えば、以下であるがそれらに限らない：前立腺細胞特異的応答エレメントの転写コントロール下のその遺伝子の１つを有するアデノウイルス（Ｒｏｄｒｉｑｕｅｓ  Ｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５７：２５５９−２５６３を参照のこと）；ｐ５３に結合能のあるＥ１ｂポリペプチドをコードしないアデノウイルス（Ｂｉｏｓｃｈｏｆｆ、Ｊ．Ｒ．ら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：３７３−３７６を参照のこと）；機能性γ３４．５遺伝子産物を発現し得ない単純ヘルペスウイルス（Ｍｉｎｅｔａ、Ｔら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１：９３８−９４３を参照のこと）］；（２）サイトカイン（例えば、以下であるが、それらに限定されない：ＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子；腫瘍壊死因子ならびにＩＬ−１，ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のようなインターロイキン）；（３）ウイルスベクター［例えば、以下であるがそれに限定されない：ｐ５３をコードするアデノウイルス（Ｚｈａｎｇ、ＷＷら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５−１３を参照のこと）］；および（４）ガンワクチンのような生物学的薬剤の投与の前に、同時にまたは後に投与される。本発明の１つの実施態様では、治療は、ＩＦＮ機構を介して細胞傷害性および腫瘍選択性である抗原的に別のウイルスでの一連の処置からなる。この実施態様は、免疫学的干渉なしに、延長された期間にわたってウイルス治療を可能にする。
【０１２９】
別の実施態様は、ＮＤＶ（または他のウイルス）の投与の前の、同時の、または後の、ＩＦＮ（例えば、αＩＦＮ、βＩＦＮまたはγＩＦＮ）による患者の処置を含む。ＩＦＮは、例えば、Ｓｒｅｅｖａｌｓｏｕｎ、Ｔ、１９９５（Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、第二版、Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ、Ｊｒ．Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ  および  Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈ  ｌａｄｅｌｐｈｉａ、３４７〜３６４頁）に議論されるような、クラスＩ群（α、βおよびω）およびクラスＩＩ（γ）、ならびにその組換え型およびアナログから選択される。正常細胞は、これらの細胞により大きい安全性さえ与えるウイルス感染に対する増大したＩＦＮ応答でのＩＦＮ前処置に応答する。ＩＦＮシグナル伝達経路を欠く腫瘍細胞は、ウイルスによる殺傷に感受性のままである。このことは、より高い用量のウイルス治療でさえ使用されるのを可能にする。このＩＦＮは、ウイルス感染を処置するのに有効であることが公知の用量と方法についての標準臨床ガイドラインにしたがって投与される。本発明の別の実施態様では、ＩＦＮ応答経路に影響することが公知の他の薬物はまた、腫瘍細胞の感受性を増大させるため、またはウイルス感染の細胞破壊的な効果に対する正常細胞の抵抗性を増大させるために必要に応じて用いられる。このクラスの薬物には、チロシンキナーゼインヒビター、シメチジン、およびミトコンドリアインヒビターが挙げられるがこれらに限られない。低酸素および高体温はまた、インターフェロン応答性を調節することが公知である。
【０１３０】
本発明の別の実施態様では、サイクロスポリンＡ、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉａｐｒｉｍｅ）およびレフルノミド、種々のコルチコステロイド調製物、ならびに抗ＣＤ４０リガンド抗体（Ｆｏｙ、Ｔ．Ｍ．ら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１５６７−１５７５）のような免疫抑制剤がウイルスとともに投与される。あるいは、免疫刺激用化合物（例えば、リポペプチド）がウイルスとともに投与され得る。
【０１３１】
ウイルス感染に応答して産生されるインターフェロンの量が、１つ以上のヌクレオシドの細胞濃度を上昇させるヌクレオシド（Ｍａｃｈｉｄａ、Ｈ．１９７９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：６４３−６５０）、ヌクレオシド前駆体、または薬物の使用を通して上昇される独立した機構は、ウイルス治療への補助剤として、必要に応じて用いられる。
【０１３２】
プリンヌクレオシドアナログ（例えば、２−クロロデオキシアデノシンおよび２’デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｏｎｆｏｒｍｙｃｉｎ、）は、インビボでインターフェロン産生を減少させる。このような化合物は、腫瘍細胞対、正常細胞のインターフェロン感受性の差にさらにもたらすために用いられ、そしてウイルス治療の補助剤として必要に応じて用いられる。
【０１３３】
ひとつの局面において、ウイルスの有効量は、より小さい用量単位に細分化され得、同じ腫瘍の違う場所に同時に注射され得る。持続的な投与のために、所望の薬剤は、埋めこまれたミニポンプを介して投与されるか、または所望のポリマーに浸透し、そして次いで、緩徐なまたは遅延性の放出のために、所望の位置に（例えば、腫瘍に直接に）移植される。
【０１３４】
本発明のウイルスは、それを、少なくとも１つの賦形剤または補助剤とともに、そして所望であれば、１つ以上のさらなる活性化合物とともに、適切な用量形態に持ち込むことにより薬学的調製物として処方される。この調製物は、ヒト医薬および獣医学医薬の両方で利用される。適切な賦形剤は、例えば、腸投与または非経口投与に適切である有機および無機物質、例えば、水、生理食塩水、組織培養培地、緩衝液、リジン、クエン酸塩、グリセロール三酢酸およびその他の脂肪酸グリセリド、ゼラチン、大豆レシチン、炭水化物（例えば、マンニトール、スクロース、ラクトースまたはスターチ）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、セルロースもしくはタンパク質キャリア、または先の化合物の組み合わせ（例えば、マンニトール／リジン、またはマンニトール／リジン／スクロース）を含む。調製物は、殺菌されるか、および／または保存剤もしくは安定化剤のような添加剤を含む。非経口投与（例えば、全身または局所注入）には、ウイルス調製物は、例えば、水性懸濁物またはエマルジョンとして処方される。
【０１３５】
本発明はまた、哺乳類における疾患を処置する方法に関し、ここで疾患細胞は、インターフェロン媒介抗ウイルス応答に欠陥を有し、そしてこの方法は、哺乳類に、治療的に有効な量のインターフェロン感受性の、複製能力のある、クローンウイルスを投与する工程を包含する。例えば、インターフェロン応答を不能にするＢ型肝炎ウイルスのような多くのウイルスに感染した細胞が、本発明のウイルスに感受性である。ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）がインターフェロン応答を不能するという証拠がある。本発明のインターフェロン感受性ウイルスは、このような、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、エプスタイン−バールウイルス、ヒトパピローマウイルス、およびヘルペスウイルスに起因するウイルス感染のような慢性ウイルス感染を処置することにおいて有用である。
【０１３６】
本明細書で他に示されなければ、本発明のウイルス治療の詳細および条件は、その開示が全て本明細書に参考として援用される、米国特許出願第０８／２６０，５３６号に一致する。上記および図で引用したすべての出願、特許および刊行物の全体の開示が本明細書中に参考として援用される。
【０１３７】
以下の実施例は例示であり、本発明の方法および組成物を制限するものではない。当業者に明らかである、臨床治療で通常遭遇する種々の条件およびパラメーターのその他の適切な改変および適合は、本発明の思想および範囲内である。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１：ＰＰＭＫ１０７（ＮＤＶ株の三重プラーク精製単離株ＭＫ１０７）は、正常ヒト細胞と比較して多くのヒトガン細胞に対して選択的細胞傷害活性を示す。）
ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェルの組織培養デッシュ中でほぼ８０％集密まで増殖させた。増殖培地を取り除き、そしてＰＰＭＫ１０７を、１０6プラーク形成単位
（ＰＦＵ）／ウェル〜１０-1ＰＦＵ／ウェルの範囲にある１０倍希釈物で添加した。ウイルスを添加しないコントロールウェルは、各プレート上に含めた。ウイルスを、９０分間、ロッキングプラットホーム上で３７℃にて吸着させた。このインキュベーション期間の終わりに、ウイルス希釈物を除去し、そして１ｍｌの増殖培地で置き換えた。次いで、プレートを３７℃で５日間、５％ＣＯ2中でインキュベートし、次いで、細胞障害効果（Ｃ
ＰＥ）の量を定性的に評価した。細胞傷害性は、比色ＭＴＴ（２−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６、カタログ番号Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ５３７１１）を用いることにより、５７０ｎｍでモニターして定量化した。これは、ミトコンドリアの酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ、Ｔ．、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５）。ウイルスで処置したウェル中の生存率は、非処置コントロールウェル中の活性の百分率として表した。このデータを、コントロールの百分率としての生存率に対するＰＦＵ／ウェルとしてグラフにプロットした。ＩＣ５０は、生存細胞の量を５０％減少させるＰＦＵ／ウェル中のウイルスの量として計算した。
【０１３９】
結果を、表４、５および６に示す。ＰＰＭＭＫ１０７は、多様なセットのヒトガン細胞に対して高い程度の細胞傷害性活性を示し、３９の悪性株のうち３０が、正常ヒト細胞型の相対的非感受性に対して、１０００より小さいＩＣ５０値を有していた。ヒトガン細胞の大多数は、大部分の正常ヒト細胞型より２〜３オーダー低い大きさのＩＣ５０値を有していた。
【０１４０】
【表４】
2013213058.tif 000005
【０１４１】
【表５】
2013213058.tif 000006
【０１４２】
【表６】
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（実施例２：無胸腺症マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片（＜１０ｍｍおよび＞５ｍｍ）の腫瘍内処置のためのＰＰＭＫ１０７の使用）
無胸腺マウスに、１０百万ヒト腫瘍細胞を皮内注射した。腫瘍が５〜１０ｍｍの範囲のサイズに達した後、ＰＰＭＫ１０７（３×１０8ＰＦＵの用量）または生理食塩水の単回
注射を与えた。ほとんどすべての腫瘍型が、ＰＰＭＫ１０７で処置したマウスにおいて、５０％〜１００％の完全または部分的後退割合を示した（表７を参照のこと）。１つの例外は、Ｕ８７ＭＧ実験の場合である（実験Ｉ）：ＰＰＭＫ１０７で処置した９腫瘍の１つのみが完全に後退したが、さらに２つのウイルス処置腫瘍が３２％および２０％の後退を示し、そしてさらに２つのウイルス処置腫瘍が生理食塩水コントロールで処置した８つの腫瘍すべてより遅い増殖を示した。生理食塩水コントロールで処置された腫瘍では、腫瘍後退は実質的になかった：これらの実験のすべてにおいて（表７に列挙されたＡからＩ）、７３のコントロール腫瘍のうち１つのみが後退を示した。これらの結果は、多様な腫瘍型が腫瘍内ＰＰＭＫ１０７処置に対して応答を示したことを示す。
【０１４３】
腫瘍内ウイルス複製を調査するために、ウイルス抗原に対する免疫組織学的染色（ＮＤＶＰタンパク質に対するモノクロナル抗体を用いる）を、皮下ＨＴ１０８０線維肉腫モデルを用いて実施した。３×１０8ＰＦＵのＰＰＭＫ１０７の腫瘍内注入の３０分以内では
、腫瘍組織はウイルス抗原に対して陰性であった。しかし、処置後２日までに、ウイルス抗原に対する強い免疫染色が腫瘍内に見られ、腫瘍内のウイルス複製を示した。重要なことは、ウイルス複製は腫瘍組織に特異的であったことである。なぜなら、隣接する結合組織および皮膚はウイルス抗原に対して陰性であったからである。
【０１４４】
（実施例３：無胸腺症マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片（＜８．５ｍｍおよび＞５．５ｍｍ）の腫瘍内処置のためのＰＰＭＫ１０７の使用）
無胸腺マウスに、１０００万ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞を皮内注射した。腫瘍が５〜８ｍｍの範囲のサイズに達した後、ＰＰＭＫ１０７または生理食塩水の静脈内注射を行った。表８に示されるように、最も高いウイルス用量レベルで（１×１０9ＰＦＵ）、完
全な腫瘍後退が７匹のすべてのマウスで観察された。３×１０8および６×１０7の単回注射は、９０％を超える後退率を生じた。３×１０8のＩＶ単回注射は、５５％の腫瘍後退
率のみを示したが、この用量レベルの３回のＩＶ注射は、１００％の応答率を生じた。ＩＶ生理食塩水で処置したマウスは、腫瘍後退の証拠を示さなかった。これらの結果は、皮下ＨＴ１０８０腫瘍がＰＰＭＫ１０７を用いたＩＶ処置に非常に応答性であることを示す。
【０１４５】
【表７】
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【０１４６】
【表８】
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（実施例４：無胸腺マウスにおける大Ａ３７５メラノーマ異種移植片の腫瘍内処置にＰＰＭＫ１０７を用いる第１回目の実験）
無胸腺マウスに、１０００万ヒトＡ３７５ヒトメラノーマ細胞を皮内注射した。１０日後、種々のサイズの腫瘍を、ＰＰＭＫ１０７（３×１０8、９×１０8、および１．５×１０9ＰＦＵの用量）または生理食塩水の単回注射で処置した。一つが１０〜１１ｍｍの一
つの最大の大きさをもつ腫瘍について、９つのすべてが、ＰＰＭＫ１０７のこれらの用量を用いた腫瘍内処置に応答して後退した。その一方、１つが８〜９．５ｍｍの一つの最大の大きさをもつ腫瘍は、２４の内１２がウイルス治療に応答して完全に後退した（Ｐ＜０．００８；表９、セクションＡ）。生理食塩水で処置したマウスのいずれにも腫瘍後退は見られなかった。
【０１４７】
これらの同じ腫瘍は、腫瘍容積でソートされた場合にも、より大きな腫瘍容積の腫瘍において高いパーセントの完全な後退を示した。これらの用量のＰＰＭＫ１０７に応答して、完全後退が、容量＞３００ｍｍ2（３０４〜３９７ｍｍ3の範囲）の１７の腫瘍の内１４で、そして容量＜３００ｍｍ2の１６の腫瘍の内７で生じた（１４４〜２９５の範囲；Ｐ
＜０．０２３；表９、セクションＢ）。
【０１４８】
これらの結果は、少なくも１ｃｍ長の、または３００ｍｍ3容積の腫瘍が、腫瘍内ＰＰ
ＭＫ１０７処置に対して、より小さな腫瘍より感受性でない場合でも、少なくとも感受性であったことを示す。
【０１４９】
(実施例５：無胸腺マウスにおける大Ａ３７５メラノーマ異種移植片の腫瘍内処置にＰ
ＰＭＫ１０７を用いる第２回目の実験)
腫瘍を、腫瘍細胞接種後１０日目、実施例４のように確立した。処置は、種々の用量のＰＰＭＫ１０７（３×１０6ＰＦＵ、３×１０7、３×１０8、および１．５×１０9）または生理食塩水からなる。１つの最大の大きさが１０〜１１．５ｍｍの腫瘍について、完全または部分的（少なくとも５０％）後退が、これらの用量を用いてＰＰＭＫ１０７で処置した２８腫瘍のすべてで生じ、生理食塩水で処置したマウスのいずれにおいても後退がなかったことと対照的であった（表１０、セクションＡ）。
【０１５０】
これらの同じ腫瘍を腫瘍容積でソートした場合、３００ｍｍ3より大きい（範囲：３０
９〜５２５ｍｍ3）２６の腫瘍すべてが、ＰＰＭＫ１０７に応答して完全または部分的に
（少なくとも５０％）後退し、いずれも応答しなかった生理食塩水で処置したマウスと対照的であった（表１０、セクションＢ）。
【０１５１】
これらの結果は、少なくとも１ｃｍ長、または３００ｍｍ3容積の腫瘍が腫瘍内ＰＰＭ
Ｋ１０７処置に感受性であることを確認する。
【０１５２】
【表９】
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【０１５３】
【表１０】
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（実施例６  無胸腺症のマウスにおける巨大Ａ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内の処置に対してＰＰＭＫ１０７を用いる第３の実験）
腫瘍を、実施例４のように腫瘍細胞接種後１９日で確立した。腫瘍内の処置は、ＰＰＭＫ１０７の様々な投与量（３×１０8、３×１０6、３×１０5、３×１０4、３×１０3、
３×１０2ＰＦＵ）もしくは生理食塩水からなる。単一最大寸法が１２．５〜１４ｍｍの
腫瘍（体積範囲：６３２〜７８７ｍｍ3；平均体積６９８ｍｍ3）に関して、少なくとも５０％の腫瘍の緩解は、両方の生理食塩水処置マウスでの緩解なしとは対照的に、３×１０8ＰＦＵで処置された３匹のマウスのうち２匹で起こった（表１１）。１０〜１２ｍｍ（
体積範囲：３２０〜６００ｍｍ3；平均体積４１１ｍｍ3）の単一最大寸法の腫瘍を処置するために同一用量のＰＰＭＫ１０７（３×１０8ＰＦＵ）を使用して、８匹のマウスのう
ち７匹が少なくとも２５％の緩解を示した（緩解を示さなかった生理食塩水で処置されたマウスと比較して少なくとも２５％の緩解に関してＰ＜０．００１、表１１）。長さ１０〜１２ｍｍの腫瘍に関して少なくとも２５％の緩解はまた、３×１０6ＰＦＵ、３×１０5ＰＦＵ、３×１０4ＰＦＵ、および３×１０3ＰＦＵで処置されたマウスで見られたが、３×１０2ＰＦＵまたは生理食塩水で処置されたマウスでは見られなかった（表１１）。
【０１５４】
これらの結果は、少なくとも長さ１ｃｍまたは体積３００ｍｍ3の腫瘍が、腫瘍内ＰＰ
ＭＫ１０７処置に感応性であることを確認する。
【０１５５】
（実施例７  無胸腺症のマウスにおける巨大Ａ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内の処置に対してＰＰＭＫ１０７を用いる第４の実験）
最大寸法が１０〜１２ｍｍの腫瘍を、実施例４のように腫瘍細胞接種後、１３日で確立した。腫瘍内処置は、３×１０8ＰＦＵのＰＰＭＫ１０７または生理食塩水の単回の注射
からなる。ＰＰＭＫ１０７で処置された腫瘍の体積は、２９５〜６００ｍｍ3（平均の腫瘍体積４３７ｍｍ3）の範囲であった。それぞれの処置群のマウスの群は、腫瘍組織学に
関して０、２、３、４、７、および１４日で安楽死させた。最小の４日で観察したこれらのマウスに関して、ＰＰＭＫ１０７で処置された１２匹のマウスのうち１１匹は、生理食塩水の群における８匹のうち０匹と比較して少なくとも２５％の緩解を示した（Ｐ＜０．０００１、表１２）。ＰＰＭＫ１０７での処置後２日で、２つの腫瘍はすでに、緩解の徴候を示したが、緩解の程度は、２５％未満であった。
【０１５６】
【表１１】
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【０１５７】
【表１２】
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（実施例８  無胸腺症のマウスにおける巨大Ａ３７５黒色腫異種移植片の腫瘍内の処置に対してＰＰＭＫ１０７を用いる第５の実験）
最大寸法１０〜１２ｍｍの腫瘍を、実施例４のように腫瘍細胞接種後１２日で確立した。腫瘍内の処置は、３×１０8ＰＦＵのＰＰＭＫ１０７または生理食塩水の単回の注射か
らなる。ＰＰＭＫ１０７で処置されたこれらの腫瘍の体積は、３６１〜７５６ｍｍ3（平
均の腫瘍体積５５１ｍｍ3）の範囲であった。ＰＰＭＫ１０７で処置された１０匹のマウ
スのうち９匹は、生理食塩水の群での１０匹のうち０匹と比較して、少なくとも２５％の緩解を示した（Ｐ＜０．０００１、表１３）。
【０１５８】
（実施例９  巨大ＨＴ１０８０線維肉腫異種移植片の静脈内の処置に対してＰＰＭＫ１０７を用いる第１の実験）
無胸腺症のマウスに、１０００万個のＨＴ１０８０ヒト線維肉腫細胞を皮下注射した。６日後、腫瘍を、ＰＰＭＫ１０７（１．５×１０9ＰＦＵの用量で）または生理食塩水の
単回の注射で処置した。単一最大寸法１０〜１１ｍｍのこれらの腫瘍に関して、６個の腫瘍のうち５個が、生理食塩水で処置された腫瘍の０個と比較してＰＰＭＫ１０７の単回の静脈内注射への応答において完全にまたは部分的に緩解した（表１４、Ｐ＜０．０２５）。これらの結果は、少なくとも長さ１ｃｍの腫瘍は、静脈内ＰＰＭＫ１０７処置に感応性であることを示す。
【０１５９】
【表１３】
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【０１６０】
【表１４】
2013213058.tif 000015
（実施例１０  腫瘍細胞でなく正常細胞由来のＰＰＭＫ１０７感染の特異的除去）
ＮＤＶ株ＰＰＭＫ１０７によって殺傷される腫瘍特異性の機構を研究するために、代表的な腫瘍細胞を、以下の診断基準に基づき選択した：ａ）無胸腺マウスにおいて異種移植片として腫瘍を形成する能力；ｂ）腫瘍異種移植片が、ＰＰＭＫ１０７の投与後にインビボで特異的に殺傷される；ｃ）腫瘍細胞が、殺傷することに耐性な正常細胞の濃度よりも数ｌｏｇ低いウイルス濃度でインビトロでＰＰＭＫ１０７により殺傷されることを示す；およびｄ）共培養として存在した場合、腫瘍細胞が、正常細胞から容易に区別されなければならない。ＫＢ頭部および頚部ガン細胞を含む異種移植腫瘍は、ＰＰＭＫ１０７の単一な腫瘍内注射に対する応答における８３％完全な、または部分的な緩解を示し、正常原発性皮膚繊維芽細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）よりも、インビトロでＰＰＭＫ１０７により殺傷されることに対して、さらに４ｌｏｇを超えてより感応性であり、そして共培養として存在する場合、ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞から容易に識別される。
【０１６１】
従って、ＫＢおよびＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞の共培養を、０．０００５の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ、細胞あたりの添加されたウイルスの比）で感染し、そして感染の経過をウイルス抗原（ＮＤＶ  Ｐタンパク質）についての免疫組織化学染色により５日間追跡した。正常細胞の感染は、細胞単層の目視検査により決定されるような明白な細胞死をほとんど、もしくは全く伴わず２日でピークに達した。感染後３日目に、正常細胞におけるウイルスの発現の量は、顕著に減少したが、腫瘍細胞の感染は、明らかに明白であった。ウイルス性の抗原の量は、４日および５日目の正常細胞において実質的に消滅したが、腫瘍細胞における感染は、共培養に存在する大多数の腫瘍細胞の破壊を生じる腫瘍細胞の集団を通し、速やかに緩解した。
【０１６２】
従って、正常細胞は、感染され、そしてＩＦＮの抗ウイルス効果と一致した様式で感染は容易に一掃された。腫瘍細胞は、応答において抗ウイルス状態を確立し得ず、そして正常細胞により培地中に分泌されるＩＦＮの生理的に有効な濃度の存在にもかかわらず、衰えないウイルス増殖により殺傷された。
【０１６３】
（実施例１１：インターフェロンは正常ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞中のウイルス除去の重要な成分であることの証明）
インターフェロンは、ＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞がＰＰＭＫ１０７の感染を除去する能力を仲介しているという仮説を試験した。単独でまたは組み合せにより使用されるヒトインターフェロンαまたはヒトインターフェロンβに対するポリクローナル中和抗体を毎日、ＰＰＭＫ１０７に感染したＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞の培養に、０．０００５のｍｏｉで添加し、そして感染の進行は３日間続いた。この細胞中に存在するウイルス抗原の量は、中和抗体の濃度に比例して増加し、抗インターフェロンα抗体の効果よりも抗インターフェロンβ抗体の効果がより顕著であった。これは線維芽細胞はインターフェロンのβ形態を優勢に産生するという報告と一致する。
【０１６４】
インターフェロンに対する中和抗体の添加を介して、ＰＰＭＫ１０７の感染をより受けやすい正常な非感受性の細胞を作製する能力は、正常な細胞と腫瘍細胞との間のＰＰＭＫ１０７による殺傷に対する感受性の重要な相違は、正常な細胞にはインターフェロン仲介抗ウイルス応答を確立する能力があるが、腫瘍細胞にはないという仮説を支持する。
【０１６５】
（実施例１２：インターフェロンβは他の正常な細胞中のウイルス除去の重要な成分であることの証明）
本実験において、ＰＰＭＫ１０７による殺傷にかなり耐性であることが知られる別の正常細胞（ＮＨＥＫ、正常ヒト上皮細胞）は、感染細胞の培養へのポリクローナル抗インターフェロンβ抗体の添加を介してより感受性にされることを測定した。ＮＨＥＫ（正常ヒト上皮ケラチノサイト）細胞に、０．０００５または０．０５のいずれかのｍｏｉで感染させ、そして５日にわたり毎日抗体を添加した。
【０１６６】
低ｍｏｉ（０．０００５）で感染した培養では、ウイルス抗原発現の抗体依存増加率は感染後５日後に明確であったが、その実験においてはそれより前にはほとんど明確ではなかった。０．０５のｍｏｉでＰＰＭＫ１０７に感染した培養への抗体添加は、感染後４および５日でウイルス抗原において顕著な増加をもたらした。感染後２および３日での中和抗体の添加は、ウイルス抗原の蓄積をあまりほとんどもたらさなかった（図１）。
【０１６７】
高いｍｏｉサンプルからの培養上清液もまた、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫腫瘍細胞に関するプラークアッセイにより、存在する感染性ウイルスの量について滴定した：本発明者らの実験室における標準のアッセイ系。この分析の結果は、感染後５日で、ｍｏｃｋ処置コントロールと比較して、抗体処置培養における感染性ウイルスの量において、１９倍の増加があったことを証明した（図１）。
【０１６８】
これらの結果は、正常細胞がインターフェロン関連メカニズムを介してＰＰＭＫ１０７による殺傷から保護される一般的なメカニズムを示唆する。
【０１６９】
（実施例１３：腫瘍細胞および正常細胞におけるＰＰＭＫ１０７感染に対するインターフェロンβ効果の比較）
正常細胞（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）ならびに高度に（ＫＢ）または中程度に（ＨＥｐ２）ＰＰＭＫ１０７感受性の腫瘍細胞の感染に対する外来的に添加したインターフェロンβの効果の比較を行った。３種の細胞の別々の培養を、０．０００５のｍｏｉで感染前１日および感染後２日、２０、２００、または２０００ユニット／ｍｌでインターフェロンβを用いて処置した。
【０１７０】
感染後３日で、正常細胞中に存在する低レベルのウイルス抗原発現は、使用した全ての用量のインターフェロンで消失した。逆に、２または２００ユニット／ｍｌの濃度で高度に感受性のＫＢ腫瘍細胞に対するインターフェロンの添加は、ウイルス抗原発現の相対レベルを２分の１に減少し、１０００ユニット／ｍｌインターフェロンで完全に抑制した。中程度に感受性のＨＥｐ−２細胞は、使用した全てのインターフェロン用量でウイルス抗原発現を除去することによって外来インターフェロンに応答した（図２）。
【０１７１】
外来的に添加したインターフェロンβの抗ウイルス効果に対する、ＫＢおよびＣＣＤ９２２−ｓｋ細胞における感受性のパターンは、ＰＰＭＫ１０７による殺傷に対するこれらの細胞の感受性に反比例した。インターフェロンの効果に対して応答するＨＥｐ−２の能力は、これらの細胞がこの実験中に使用したインターフェロン濃度を効率的に利用し得ることを示す。同様に、インターフェロンの高い用量に対するＫＢ細胞の応答は、インターフェロン仲介抗ウイルス応答を確立する能力がないことは、インターフェロン経路における絶対欠損からではなく、むしろ正常細胞と比較して相対的な非感受性からもたらされることを示唆する。
【０１７２】
（実施例１４：ＰＰＭＫ１０７による正常および腫瘍細胞の感染に対する低濃度のインターフェロンβの効果）
この実験において、正常な（ＣＣＤ９２２−ｓｋ）および腫瘍（ＫＢ）細胞を、０．０５のｍｏｉでＰＰＭＫ１０７による感染の１日前および２日後に、低濃度のインターフェロンβ（０．２、および２０ユニット／ｍｌ）で処置した。
【０１７３】
これらの条件下で、この正常細胞はウイルス抗原の量の用量依存減少を経験したが、一方で腫瘍細胞において相対的なレベルのウイルス抗原は、外来的なインターフェロンの添加により影響を受けなかった（図３）。
【０１７４】
（実施例１５：ＰＰＭＫ１０７精製）
方法Ａ
ＰＰＭＫ１０７はトリプルプラーク精製により亜病原性ニューカッスル病ウイルス株Ｍａｓｓ−ＭＫ１０７から得た。約１０００ＰＦＵ（プラーク形成単位）の生ＰＰＭＫ１０７を、各１０日齢の胚発生したニワトリ卵の尿膜腔液腔中に接種した。３６℃４６時間インキュベーション後、この卵を冷却し、次いで尿膜腔液を収集した。細胞および細胞片を１７５０×ｇ３０分で遠心分離により尿膜腔液から除去した。次に清澄化した尿膜腔液（ウイルスを含む上清液）を２０％／５５％不連続ショ糖密度勾配に重層し、そして約１００，０００×ｇで３０分間遠心分離した。この精製したウイルスを２０％／５５％界面から収集し、および生理食塩水に対して透析してショ糖を除去した。
【０１７５】
方法Ｂ
別の有利な実施態様において、清澄化した尿膜腔液を−７０℃で凍結した。解凍後、この溶液を１〜４℃で一晩維持し、次いで汚染物質を遠心分離（１７５０×３０分間）によってウイルス懸濁液から除去した。この物質を、上述のように超遠心分離において不連続ショ糖密度勾配を使用してさらに処置した。
【０１７６】
方法Ｃ
別の有利な実施態様において、不連続ショ糖密度勾配上の超遠心分離は連続フロー遠心分離により達成した。
【０１７７】
方法Ｄ
別の有利な実施態様において、収集した尿膜腔液を５％マンニトールおよび１．０％ｌ−リジンを含有する緩衝液、ｐＨ８．０（ＭＬ緩衝液）で希釈し、そして０．４５μの通常孔サイズを有するフィルターを通すタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によりＭＬ緩衝液により清澄化し、そして交換した。ＭＬ緩衝液中に清澄化したウイルスを含有する透過物を収集し、そしてウイルスをＭＬ緩衝液中３００，０００ダルトンの名目上のカットオフを有するフィルターを通してＴＦＦにより精製した。ＭＬ緩衝液中の濃縮精製したウイルスをこの工程からの保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）として収集し、そしてＭＬ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ５００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲル透過カラムに適用する前にＭＬ緩衝液で再度希釈した。精製したウイルスを含有する画分を収集し、プールし、そして名目上のカットオフの３００，０００ダルトンを有するフィルターを通してＴＦＦによりＭＬ緩衝液を用いて再濃縮し得る。
【０１７８】
（結果）
＊クローンウイルス
プラーク精製によるＰＰＭＫ１０７の産生後、ビリオンの集団から８個の個々の分子クローンは、ＮＤＶの融合タンパク遺伝子内に３００を越える連続するヌクレオチドの同一の配列（例えば、１００％の相同性）を有することが分った。ＰＰＭＫ１０７は、高い程度の遺伝的均質性を有するクローンウイルスである。
【０１７９】
＊ＰＦＵ／ｍｇ  タンパク質
純度を測定する１つの定量手段はＰＦＵ／ｍｇタンパク質の測定による。より高い値ほど、より高い純度のレベルを示す。方法Ａを使用すると、少なくとも４．８×１０10のＰＦＵ／ｍｇ値を達成する（表１５を参照のこと）。方法Ｃを使用すると、少なくとも２．０×１０10のＰＦＵ／ｍｇタンパク質値を達成する。ＮＤＶの亜病原性株について、この純度測定についての文献値は見出されなかった。ＮＤＶの亜病原性株についての最善の評価は、ウイルス調製物である（ＮＤＶ  Ｍａｓｓ  ＭＫ１０７，ロットＲＵ２、Ｆａａｂｅｒｇ  ＫＳおよびＰｅｅｐｌｅｓ，ＭＥ，１９８８，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６２：５８６：ならびにＢｒａｔｔ，ＭＡ  および  Ｒｕｂｉｎ，Ｈ．１９６７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３：５９８−６０８のとおりに調製した）。このＲＵ２ロットは、１．３×１０9ＰＦＵ
／ｍｇタンパク質のＰＦＵ／ｍｇを有することが分った。方法Ａにより達成された純度値は、Ｐｅｅｐｌｅｓ法が達成した値よりも約４０倍良かった（表１５参照）。
【０１８０】
＊ＰＦＵあたりの粒子の比
純度を測定する別の定量手段は、ＰＦＵあたりの粒子の比の測定による。より低い値は、より高いレベルの純度を示す。粒子の計数を標準方法を使用する電子顕微鏡により行った。方法Ａまたは方法Ｂのいずれかを使用して、１に近いＰＦＵ値あたりの粒子が達成される（表１５）。
【０１８１】
【表１５】
2013213058.tif 000016
方法ＡおよびＣを使用するウイルス調製物はまた、ＮＤＶを汚染卵タンパク質が実質的にないレベルにまで精製し得た。方法Ａを使用するＰＰＭＫ１０７ロット７調製について、オボアルブミンは、（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法）ゲル（１ｍｍ厚）上に流した１ウェル（３．３ｃｍ幅）あたり１．７×１０9ＰＦＵ精製ウイルス；（２）転写用ニトロセルロース膜；および（３）ウサギ
抗オボアルブミン（４ｍｇ／ｍｌ抗体濃度の１：２００希釈でのＣａｐｐｅｌウサギＩｇＧ画分）を使用するウエスタンブロットで検出可能でなかった。方法Ｄを使用し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後銀染色するＰＰＭＫ１０７調製物について、オボアルブミンに対応するバンドは観察されなかった。
【０１８２】
（実施例１６：無胸腺マウスにおけるＥＳ−２卵巣ガン腹水による死を予防するためのＰＰＭＫ１０７の使用）
本実験において、全ての無胸腺マウス（雌性、ＮＣＲｎｕ／ｎｕ、８週齢）に１０6Ｅ
Ｓ−２細胞の腹腔内注射をした。７日後腹水が発生する前に、生理食塩水またはＰＰＭＫ１０７（１×１０9ＰＦＵ）を用いてそれらを腹腔内に処置した。図４に示すように、生
理食塩水と比較してＰＰＭＫ１０７で処置したマウスにおける生存は顕著に改善された。生理食塩水処置群における大多数のマウスは、処置後７日までに腹水を生じ、そして３８日までにこれらの全てのマウスは死んだ。顕著な対照的に、ＰＰＭＫ１０７で処置したマウスの９２％は３８日までなお生存し、そしてこれらマウスの２５％は長期間生存者であった（＞１２０日生存）。
【０１８３】
（実施例１７：腹水が存在する場合無胸腺マウスにおけるＥＳ−２卵巣ガンのＰＰＭＫ１０７処置）
本実験において、全ての無胸腺マウス（雌性、ＮＣＲｎｕ／ｎｕ、８週齢）に、１０6
ＥＳ−２細胞の腹腔内注射をした。１４日後、大多数のマウスが腹水を発生した時に、腹水を有さないマウスを排除し、そして腹水を有するマウスを７つの腹腔内処置群に無作為分離した（ＰＰＭＫ１０７−０日目一回処置；ＰＰＭＫ１０７  第１週にわたって２回処置；ＰＰＭＫ１０７−各週一回処置、ＰＰＭＫ１０７−各週２回処置；生理食塩水−０日目に１回処置；生理食塩水第１週にわたって２回処置；生理食塩水各週２回処置）。１×１０9ＰＦＵ／マウスの用量を、各ウイルス処置に使用した。最初の処置および任意のさ
らなる処置前、全てのマウスは腹腔液を排水した。０日目とは、最初の処置日をいう。
【０１８４】
各マウスについて腹水の程度を定量し、そして以下の点が認められた：
【０１８５】
【表１５Ａ】
2013213058.tif 000017
表１６に示されるように、すべての生理食塩水処置したマウスは、７および１０日目の両方において、ＰＰＭＫ１０７処置したマウスよりも、進行した腹水を有した。最初の処置後７日目に、各生理食塩水群は、３．５を超える平均腹水スコアを有した一方で、全てのＰＰＭＫ１０７処置した群は、３．０以下の平均腹水スコアを有した。同様に、最初の処置後１０日目に、各生理食塩水群は、４．５を超える平均腹水スコアを有した一方で、全てのＰＰＭＫ１０７処置群は、４．１以下の平均腹水スコアを有した。これらの結果は、腹水液生成は生理食塩水コントロールと比較してウイルス処置マウスにおいて顕著に減少したことを示す。
【０１８６】
【表１６】
2013213058.tif 000018
（実施例１８：ＰＰＭＫ１０７の後の投与の致死性を減少するためのＰＰＭＫ１０７の脱感作用量の使用）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７週齢）に生理食塩水または脱感作用量のＰＰＭＫ１０７（３×１０8ＰＦＵ／マウス）のいずれかで０日目に静脈内に注射した。２日後各セットのマ
ウスを、生理食塩水またはＰＰＭＫ１０７での静脈内投与（１×１０9、２．５×１０9、５×１０9、および１×１０10ＰＦＵ／マウスの用量で）について群にさらに再分した。
表１７に示したように、生理食塩水をマウスの前処置に使用した場合、２．５×１０9、
５×１０9、および１×１０10ＰＦＵで続いて投与されたマウスにおいて死を記録した。
５×１０9および１×１０10ＰＦＵの用量は生理食塩水で前処置したマウスに対して１０
０％致死性であった。対照的に、０日目に脱感作用量のＰＰＭＫ１０７を与えた後、１×１０10ＰＦＵまでの用量レベルで２日後にＰＰＭＫ１０７を注射したマウスの任意の群において死は見られなかった。これらのデータは、ＰＰＭＫ１０７がこの薬剤を用いる引き続きの投与の致死性を予防するために使用され得ることを示す。さらに、ＰＰＭＫ１０７の最大耐容性用量は、脱感作剤としてこのウイルスを使用する場合、約１桁上昇し得る。
【０１８７】
【表１７】
2013213058.tif 000019
（実施例１９：より遅い静脈内注射速度はＰＰＭＫ１０７の毒性を減少する）
２２の無胸腺マウス（８週齢）を、ケタミン／キシラジンの組み合せで麻酔し、そして注射プロセスの間その動きを阻害することを補助するための抑制装置に配置して、ＰＰＭＫ１０７の緩やかなまたは迅速な注射を可能にした。緩やかな注射群について、生理食塩水中０．２ｍＬの４×１０9ＰＦＵのＰＰＭＫ１０７を、４分間に渡り１０〜１５秒毎に
０．０１ｍＬを静脈内に注射した。迅速な注射群は同じ用量および容量を受けたが、３０秒間にわたってである。表１８に示すように、４分間にわたりＰＰＭＫ１０７のその容量を受けるマウスは３０秒で同じ静脈内投与を受けたマウスの半分の最大重量減少を有した（投与後２日目に記録）。これらの結果は、このような緩やかな速度で注射した場合ＰＰＭＫ１０７はほとんど毒性は無く、そして静脈内投与に関してより安全であることを示す。
【０１８８】
【表１８】
2013213058.tif 000020
（実施例２０：進行したガンを有する患者の処置におけるＰＰＭＫ１０７の使用）
ＰＰＭＫ１０７を、米国における第１期臨床試験において静脈内経路によって試験した。進行した固形腫瘍を有する２３人の患者（もはや確立した治療法を受け容れない）をＰＰＭＫ１０７で処置した。１７人のこれらの患者に初期処置過程の単回投与を与えた。６人の他の患者は、初期処置過程の１週間にわたり週に３回の投与を受けている。各患者腫瘍のサイズを、月に１度追跡調査した。少なくとも安定な疾患（任意の新たな病巣の非存在下で、全ての測定可能腫瘍の積和における２５％未満の増加および５０％未満の減少）を有する患者が、各月のさらなる処置過程に好適である。
【０１８９】
（触知可能な腫瘍の後退）
結腸ガンを有する６８歳の女性は、広範な転移のなかでも触知可能な腹の腫瘍を有した。ＰＰＭＫ１０７で単回静脈内処置後、この患者は、２週間過程にわたりこの単一の腹壁腫瘍の９１％後退を経験した（表１９）。投与後１日の腫瘍の測定（３．７５×３ｃｍ）は４×３ｃｍのベースライン測定と類似した。しかし投与後７日までに、この腫瘍は２×２ｃｍのサイズまで減少し、そしてＰＰＭＫ１０７投与後１４日までに１．５×１．５ｃｍのサイズまで減少し続けた。ＰＰＭＫ１０７処置前に、この腫瘍塊はＰＰＭＫ１０７投与前２週間で腫瘍容積において、１０６５％増加を伴い急速に増殖していた。この患者は、いたるところの増加する腫瘍の増殖のために本研究に踏み切った。
【０１９０】
【表１９】
2013213058.tif 000021
（ガンの安定化）
８人の他の患者（彼らは、すべて従来のガン治療で以前に腫瘍進行を有した）は、ＰＰＭＫ１０７投与後のそれらの進行したガンの安定化の形態において利益を経験した。安定な疾患を伴うこれらの患者は、腎臓ガン、膵臓ガン、乳ガンおよび肺ガンを含む種々の型のガンを伴う患者を代表する。ＰＰＭＫ１０７処置の３ヵ月後、進行しそして広範に転移した腎臓ガンを伴う６７歳の男性は、その時点で、新たな腫瘍の成長の徴候を何も伴わず、そして腫瘍サイズの増加の徴候を伴わない安定な疾患を有した。より多い用量のＰＰＭＫ１０７を伴う安定な疾患の利点についてのより高い速度が存在した：安定な疾患を伴う６患者のうち２患者（患者の３３％）は、最初の２回の単回用量レベル（５９億ＰＦＵ／ｍ2および１２０億ＰＦＵ／ｍ2）で、そして安定な疾患を伴う５患者のうち４患者（８０％の患者）は、最高の単回用量レベル（２４０億ＰＦＵ／ｍ2）（表２０）で。
【０１９１】
【表２０】
2013213058.tif 000022
（疼痛投薬の減少）
単回用量５９億ＰＦＵ／ｍ2用量レベルで患者は、麻薬疼痛投薬の減少によって認めら
れるようにガン疼痛の症候緩和の形態でＰＰＭＫ１０７処置からの利益を受けた。
【０１９２】
（脱感作）
第一の用量（５９億ＰＦＵ／ｍ2）からの明らかな脱感作効果が、次の用量（これもま
た５９億ＰＦＵ／ｍ2）で同じ週内に見られる。一般的に、第二および第三の用量から報
告された副作用は、はるかにより少なかった。例えば、この多用量治療レジメン（１週間にわたって、１週間あたり３用量）において最初の４患者は、アセトアミノフェンおよびイブプロフェンでの予防的解熱治療を受けたにもかかわらず、第一の用量後に熱を出した。これらの患者の大部分は、第二および第三の用量を受けた後は、彼らが解熱剤を受けなかった場合でさえ、熱を出さなかった。これは、１週間あたり３回のスケジュールでの第一の用量の投与が第二および第三の用量についての毒性を減少させたことを示す。
【０１９３】
（血清における中和抗体を介した投与）
フェーズＩ研究における用量範囲（≧５９億ＰＦＵ／ｍ2）を用いて、それらが中和抗
体を産生した場合でさえ、患者へ有効にウイルスを送達し得るという明らかな示唆もまた存在する。膵臓ガンを伴う７２歳の女性は、１２０億ＰＦＵ／ｍ2単回用量レベルで、Ｐ
ＰＭＫ１０７処置の開始から２ヶ月にわたって安定な疾患を有した。第２の単位（ＰＰＭＫ１０７の単回静脈用量からなる）を、その患者が中和抗体を患者の血清に産生した、第一の用量の１ヶ月後に投与した。この第二の単位の７日後に、患者の尿は、１ｍＬあたり少なくとも４０ＰＦＵの力価でＰＰＭＫ１０７について陽性であった。この結果は、この患者の血清におけるＰＰＭＫ１０７に対する中和抗体が、第二の処置単位では、そのウイルスを完全に阻害し得なかったことを示す。
【０１９４】
（実施例２１：ニューカッスル病ウイルスＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮでの細胞傷害性アッセイ結果のまとめ）
ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェル組織培養ディッシュ中で約８０％のコンフルエンスにまで増殖させる。増殖培地を除去し、そしてＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ（亜病原性ニューカッスル病ウイルス株Ｎｅｗ  Jｅｒｓｅｙ  Ｒｏａｋｉｎ−１９４６のプラーク
精製したクローン）を、１０7プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ウェル〜１ＰＦＵ／ウェル
の範囲にわたって１０倍希釈で添加した。ウイルスを添加しないコントロールウェルを各プレートに含ませた。ウイルスを、３７℃で揺れる台の上で９０分間にわたって吸着させた。インキュベーション時間の最後に、ウイルス希釈物を除去し、そして１ｍｌの増殖培地に置換した。次いで、プレートを３７℃で５日間５％ＣＯ2中でインキュベートした。
細胞傷害性を、比色ＭＴＴ（２−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６、カタログ番号Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  ５３７１１）を５７０ｎｍでモニターして用いて、定量した。これは、ミトコンドリア酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ、Ｔ．、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
６５：５５）。ウイルス処置したウェルにおける生存性を、処置していないコントロールウェル中の活性の割合として表現した。データを、ＰＦＵ／ウェル対生存性として、コントロールの割合としてグラフに示した。ＩＣ５０を、生存細胞の量の５０％減少を引き起こすＰＦＵ／ウェルにおけるウイルス量として計算した。
【０１９５】
【表２１】
2013213058.tif 000023
これらの結果（表２１）は、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮが、正常の皮膚線維芽細胞と比較して、少なくとも２つの異なるヒト腫瘍細胞（ＨＴ１０８０およびＫＢ）の腫瘍選択的殺傷を実証することを示す。２つの腫瘍細胞株についてのＩＣ５０値は、正常細胞についての８００〜５０００分の１の間の低さであった。
【０１９６】
（実施例２２：ニューカッスル病ウイルスＰＰＣＯＮＮ７０７２６での細胞傷害アッセイ結果のまとめ）
ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェル組織培養ディッシュにおいて約８０％のコンフルエンスにまで増殖させた。増殖培地を除去し、そしてＰＰＣＯＮＮ７０７２６（亜病原性ニューカッスル病ウイルス株Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ７０７２６−１９４６のプラーク精製したクローン）を、１０7プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ウェル〜１ＰＦＵ／ウ
ェルの範囲にわたって１０倍希釈で添加した。ウイルスを添加しないコントロールウェルを各プレートに含ませた。ウイルスを、３７℃で揺れる台の上で９０分間にわたって吸着させた。インキュベーション時間の最後に、ウイルス希釈物を除去し、そして１ｍｌの増殖培地に置換した。次いで、プレートを３７℃で５日間５％ＣＯ2中でインキュベートし
た。細胞傷害性を、比色ＭＴＴ（２−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６、カタログ番号Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ
５３７１１）を５７０ｎｍでモニターして用いて、定量した。これは、ミトコンドリア酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ、Ｔ．、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５）。ウイルス処置したウェルにおける生存性を、処置していないコントロールウェル中の活性の割合として表現した。データを、ＰＦＵ／ウェル対生存性として、コントロールの割合としてグラフに示した。ＩＣ５０を、生存細胞の量の５０％減少を引き起こすＰＦＵ／ウェルにおけるウイルス量として計算した。
【０１９７】
【表２２】
2013213058.tif 000024
これらの結果（表２２）は、ＰＰＣＯＮＮ７０７２６が、正常の皮膚線維芽細胞と比較して、少なくとも３つの異なるヒト腫瘍細胞（ＫＢ、Ｕ８７ＭＧ、およびＵ３７３ＭＧ）の腫瘍選択的殺傷を実証することを示す。２つの腫瘍細胞株についてのＩＣ５０値は、正常細胞についての８０〜５０００分の１の間の低さであった。
【０１９８】
（実施例２３：ＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、またはＰＰＣＯＮＮ７０７２６を用いた、無胸腺マウスにおけるＨＴ１０８０線維芽肉腫異種移植の腫瘍内処置）
この実験において、無胸腺マウス（雌性、ＮＣＲ  ｎｕ／ｎｕ、５〜６週齢）に、１０7  ＨＴ１０８０腫瘍細胞の皮下注射を与えた。４日後、腫瘍が６〜８．５ｍｍの範囲の
大きさに達すると、マウスを、生理食塩水、ＰＰＭＫ１０７（１×１０8ＰＦＵ）、ＰＰ
ＮＪＲＯＡＫＩＮ（１×１０8ＰＦＵ）、またはＰＰＣＯＮＮ７０７２６（１×１０8ＰＦＵ）で腫瘍内を処置した。表２３に示すように、腫瘍後退が、これらの３つのウイルス（ＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、およびＰＰＣＯＮＮ７０７２６）で処置したマウスで認められた。１２匹のマウスのＰＰＭＫ１０７処置後、４匹は、完全な腫瘍後退を経験し、そして６匹は、部分的な後退を経験した。１２匹のマウスのＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ処置後、１匹が完全な腫瘍後退を経験し、そして２匹が部分的な後退を経験した。１２匹のマウスのＰＰＣＯＮＮ７０７２６処置後、３匹が完全な腫瘍後退を経験し、そして２匹が部分的な後退を経験した。生理食塩水で処置した動物のいずれにおいても腫瘍後退は認められなかった。これらの結果は、ＮＤＶの３つの亜病原性株が腫瘍後退を引き起こし得ることを示す。
【０１９９】
【表２３】
2013213058.tif 000025
（実施例２４：免疫欠損無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスおよび免疫適合性異型接合性（ｎｕ／＋）マウスにおける脳内注射後のＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、およびＰＰＣＯＮＮ７０７２６の効果）
５６匹の無胸腺マウス（ｎｕ／ｎｕ）および５６匹の免疫適合性異型接合性（ｎｕ／＋）マウスに、生理食塩水、ＰＰＭＫ１０７、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ、またはＰＰＣＯＮＮ７０７２６のいずれかを、定位的脳内注射した。各型の８匹のさらなるマウスを処置していないコントロールとして用いた。ウイルスを、２つの用量のレベル（２×１０4または
３．５×１０6ＰＦＵ／マウス）の一方で用いた。表２４に示すように、２つの用量レベ
ルでの３つのウイルスの各々で処置した異型接合性ｎｕ／＋マウスのすべては、１匹のマウスが、低量ＰＰＣＯＮＮ７０７２６用量レベルで非神経的症状のために安楽死したことを除いて、３９日目まで生存した。ＰＰＭＫ１０７またはＰＰＣＯＮＮ７０７２６のいずれかで処置した無胸腺ｎｕ／ｎｕ動物は、その異型接合性よりも有意に短く生存した。これは、３．５×１０6ＰＦＵ／マウスのウイルス用量の最高のＰＰＭＫ１０７またはＰＰ
ＣＯＮＮ７０７２６について特に当てはまった。ここで、各ウイルス群の無胸腺動物の１３％（８匹中１匹）のみが３９日目まで生存した。対照的に、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮ処置した無胸腺マウスは、この同じ用量レベル（３．５×１０6ＰＦＵ．マウス）で７５％の
生存が存在した。これらのデータは、ＰＰＮＪＲＯＡＫＩＮが、他の２つのウイルス株よりも無胸腺マウスの脳においてより良好に寛容であることを示す。
【０２００】
【表２４】
2013213058.tif 000026
*この処置群における１匹の生存しなかったマウスは、非神経学的症状のために安楽死し
た。
【０２０１】
（実施例２５：シンドビスウイルスＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９での細胞傷害性アッセイ結果のまとめ）
ヒト腫瘍細胞および正常細胞を、２４ウェル組織培養ディッシュにおいて約８０％コンフルエンスにまで増殖させた。増殖培地を除去し、そしてＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９（Ｓｉｎｄｂｉｓ  Ａｒ−３３９のプラーク精製したクローン）を、１０7プラーク形
成単位（ＰＦＵ）／ウェル〜１ＰＦＵ／ウェルの範囲にわたって１０倍希釈で添加した。ウイルスを添加しないコントロールウェルを各プレートに含ませた。ウイルスを、３７℃で揺れる台の上で９０分間にわたって吸着させた。インキュベーション時間の最後に、ウイルス希釈物を除去し、そして１ｍｌの増殖培地に置換した。次いで、プレートを３７℃で５日間５％ＣＯ2中でインキュベートした。細胞傷害性を、比色ＭＴＴ（２−［４，５
−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６、カタログ番号Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  ５３７１１）を５７０ｎｍでモニターして用いて、定量した。これは、ミトコンドリア酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ、Ｔ．、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５）。ウイルス処置したウェルにおける生存性を、処置していないコントロールウェル中の活性の割合として表現した。データを、ＰＦＵ／ウェル対生存性として、コントロールの割合としてグラフに示した。ＩＣ５０を、生存細胞の量の５０％減少を引き起こすＰＦＵ／ウェルにおけるウイルス量として計算した。
【０２０２】
【表２５】
2013213058.tif 000027
*高親和性ラミニンレセプターについてｍＲＮＡを過剰発現することが公知である細胞
哺乳動物細胞上のシンドビスウイルスについての細胞レセプターは、高親和性ラミニンレセプターであり、これは、上皮系統の細胞上に主に発現されるが、しばしば、Ｐａｎｃ−１膵臓ガン株およびＳＷ６２０結腸腺ガン細胞株のような多くの転移性ガン細胞において過剰発現される（Ｃａｍｐｏら、（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４１、１０７３−１０８３；Ｙｏｗら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５、６３９４−６３９８）。対照的に、直腸腺ガン細胞株ＳＷ１４２３は、非常に低レベルの高親和性ラミニンレセプターｍＲＮＡを発現することが公知である（Ｙｏｗら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５．６３９４−６３９８）そして、ＳＷ６２０細胞よりも、ＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９による殺傷に対して、４桁を超える程度でより抵抗性である。これらの結果（表２５）は、腫瘍原性であり、そして高レベルの高親和性ラミニンレセプターを発現する細胞は、他の腫瘍または正常細胞よりも、シンドビスクローンＰＰＳＩＮＤＢＩＳ−Ａｒ３３９による殺傷に対してより感受性であることを示す。
【０２０３】
（実施例２６：インターフェロンの存在下での腫瘍原性細胞および非腫瘍原性細胞のＶＳＶ殺傷）
９６ウェルプレートにおいて、腫瘍原性ＫＢおよびＨＴ１０８０細胞（１ウェルあたり３×１０4細胞）ならびに非腫瘍原性のＷＩＳＨ細胞（１ウェルあたり２．５×１０4細胞）を、２８００〜２２単位／ｍｌの範囲で連続的に希釈したインターフェロンαの存在下で播種し、そして２４時間３７℃でインキュベートさせた。ついで、この細胞に、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ，Ｉｎｉｄｉａｎａ株）に、１０のｍｏｉで感染させた。コントロールを、インターフェロンを含まない細胞ならびにインターフェロンもウイルスも含まない細胞について含ませた。この細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。細胞傷害性を、比色ＭＴＴ（２−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６、カタログ番号Ｇ４０００、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  ５３７１１）を５７０ｎｍでモニターして用いて、定量した。これは、ミトコンドリア酵素活性を検出する（Ｍｏｓｍａｎ、Ｔ．、１９８３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５）。ウイルス処置したウェルにおける生存性を、ウイルスを受けていないコントロールウェル中の活性の割合として表現した。
【０２０４】
【表２６】
2013213058.tif 000028
これらの結果（表２６）は、ＶＳＶが、インターフェロン応答性を欠損する腫瘍細胞を選択的に殺傷し得ることを実証する（実施例２７を参照のこと）。ＷＩＳＨ細胞（ヒト羊膜細胞）は、インターフェロンバイオアッセイにおける使用について、それらがインターフェロンに効率的に応答する能力のために、充分に確立された細胞株である。
【０２０５】
（実施例２７：ＰＰＭＫ１０７による殺傷に対して感受性または抵抗性である細胞におけるインターフェロン応答）
個々の細胞株を、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてコンフルエント付近まで増殖させ、そして５〜５０００Ｕ／ｍｌの間のＩＦＮαＡで２４時間処置した。次いで、この培養物に、ＰＰＭＡ１０７を、１．０のｍｏｉで感染させ、そしてさらに２４時間培養した。化学固定後、ウイルス発現の量を、可溶性指標色素を用いて免疫組織化学によって定量した。ウイルス増殖の量を、インターフェロンで処置していないコントロール細胞に対する発現したＰ抗原の割合として表した（図５）。このアッセイにおいて、インターフェロン応答性細胞は、インターフェロンに対する応答においてウイルス抗原の少なくとも５０％の減少を示した。ＰＰＭＫ１０７に感受性である図５における細胞を実線によって示す；あまり感受性でない細胞を、破線によって示す。
【０２０６】
この実験の結果は、外因性インターフェロンの抗ウイルス活性に対する細胞株の抵抗性と、ＰＰＭＫ１０７よる殺傷に対するその細胞の相対感受性（グラフの凡例において細胞株の名称の隣の括弧内に示されるＩＣ５０によって示す、図５を参照のこと）との間の強度の相関を示す。例えば、５Ｕ／ｍｌのインターフェロンでの前処置の後、７のうち６（８６％）のインターフェロンに対して非応答性の細胞株が、ＰＰＭＫ１０７による殺傷に対して感受性であった；５００Ｕ／ｍｌのインターフェロンで前処置した場合には、すべて（４のうち４）の非応答性細胞株がＰＰＭＫ１０７による殺傷に対して感受性であった。上記のデータはまた、ＰＰＭＫ１０７または他のインターフェロン感受性ウイルスによる殺傷に対して感受性であるようである候補細胞を同定するスクリーニングアッセイの一例を示す。例えば、外因性インターフェロンで前処置した後に有意の（例えば、コントロールの５０％を超える）ウイルス抗原を発現する感染した細胞は、インターフェロン欠損であり、それゆえウイルスガン分解に対して感受性であるとみなされる。
【０２０７】
上記は、本発明の例示として意図されるが限定は意図しない。多数の変更および改変が本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得る。
【図１】
2013213058.tif 000029
【図２】
2013213058.tif 000030
【図３】
2013213058.tif 000031
【図４】
2013213058.tif 000032
【図５】
2013213058.tif 000033