(57)【要約】      （修正有）【課題】容易に合成することができ、収量や収率の高いシクロデキストリン二量体、このシクロデキストリン二量体が水溶性ポルフィリンを包接してなり、酸素、一酸化炭素、シアン化物イオンとの親和性が高い包接錯体、及びこの包接錯体を有効成分として含有する人工血液用酸素輸液、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤の提供。【解決手段】式（１）で示されるシクロデキストリン二量体。該シクロデキストリン二量体が水溶性金属ポルフィリンを包接してなる包接錯体。さらに、該包接錯体を有効成分として含有する人工血液用酸素輸液、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤。2013231111.tif 000015【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式（１）で示されるシクロデキストリン二量体。
【化１】
2013231111.tif 000012
（式中、ｍは１又は２の何れかの数字を表し、ｎは１、２又は３の何れかの数字を表す）
【請求項２】
ｍ＝１、かつｎ＝２である請求項１に記載のシクロデキストリン二量体。
【請求項３】
請求項１から２の何れかに記載のシクロデキストリン二量体が水溶性金属ポルフィリンを包接してなる包接錯体。
【請求項４】
水溶性金属ポルフィリンが、下記の化学式（２）又は（３）で示される請求項３に記載の包接錯体。
【化２】
2013231111.tif 000013
【化３】
2013231111.tif 000014
（式中、R1及びR2は、それぞれカルボキシル基、スルホニル基、水酸基の何れかを表し、MはFe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+の何れかを表す）
【請求項５】
水溶性金属ポルフィリンが、5,10,15,20‐テトラキス（4‐スルホナトフェニル）ポルフィリン（II）鉄錯体である請求項４に記載の包接錯体。
【請求項６】
水溶性金属ポルフィリンが、5,10,15,20‐テトラキス（4‐スルホナトフェニル）ポルフィリン（III）鉄錯体である請求項４に記載の包接錯体。
【請求項７】
請求項３から請求項５の何れかに記載の包接錯体を、有効成分として含有する人工血液用酸素輸液。
【請求項８】
請求項３から請求項５の何れかに記載の包接錯体を、有効成分として含有する一酸化炭素除去剤。
【請求項９】
請求項３、請求項４又は請求項６の何れかに記載の包接錯体を、有効成分として含有す
るシアン解毒剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、シクロデキストリン二量体、この二量体を配位子とする包接錯体、及びこの包接錯体を有効成分とする人工血液用酸素輸液等に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸素の運搬を担うヘモグロビン、酸素の貯蔵を担うミオグロビンなどの金属蛋白質は、活性中心を構成する金属錯体（ヘム）や金属イオンとそれを立体的に取り囲む蛋白質からなり、生体において重要な働きを果たしている。そこで、従来から金属蛋白質の活性中心の構造に注目し、これを人工的に合成した分子を用いて模倣する試みを数多くの研究者が行っている。
【０００３】
例えば、発明者らは、環状オリゴ糖の一種であるβ-シクロデキストリンをパーメチル化し、ピリジンを有するリンカーで連結したシクロデキストリン二量体（以下、Py3CDと省略する。）と水溶性鉄ポルフィリンからなる包接錯体（以下、hemoCDと省略する。）が、ヘモグロビンと同様に、水中で酸素分子を可逆的に吸脱着できることを報告している（特許文献１、特許文献２、非特許文献１〜非特許文献４を参照。）
【０００４】
なお、この包接錯体は一酸化炭素とも結合することが分かっており、一酸化炭素除去剤として利用することも検討されている（特許文献３を参照。）。また、この包接錯体はシアン化物イオンとは結合し難く、シアン解毒剤として利用できないものの、この包接錯体と類縁化合物がシアン解毒剤として利用できることが分かっている（特許文献４及び非特許文献５を参照。）
【０００５】
しかし、hemoCDの原料となるPy3CDの合成は煩雑であり、収量や収率も低いとの問題点があった。また、Py3CDは、２つのシクロデキストリン部位を結びつけるリンカー部位に硫黄原子（S）を含んでおり、活性酸素種による酸化を受け易いとの問題点もあった。さらに、Py3CDと水溶性ポルフィリンとからなる包接錯体は、その自動酸化反応を充分に抑制できないという問題点もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−００２０７７号公報
【特許文献２】特許第４８０３６３１号公報
【特許文献３】特開２０１０−１９４４７５号公報
【特許文献４】特開２０１２−０２０９４０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kano, K.; Kitagishi, H.; Kodera, M.; Hirota, S. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, p.435-438
【非特許文献２】Kano, K.; Kitagishi, H.; Dagallier, C.; Kodera, M.; Matsuo, T.; Hayashi, T.; Hisaeda, Y.; Hirota, S. Inorg. Chem. 2006, 45, p.4448-4460
【非特許文献３】北岸 宏亮、加納 航治、人工血液、2009年、17巻、4号、p. 160-168
【非特許文献４】Kano, K.; Chimoto, S.; Tamaki, M.; Itoh, Y.; Kitagishi, H. Dalton Trans. 2012, 41, p.453-461
【非特許文献５】Watanabe, K.; Kitagishi, H.; Kano, K. ACS Med. Chem. Lett. 2011, 2, p.943-947
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、この発明は、容易に合成することができ、収量や収率の高いシクロデキストリン二量体、このシクロデキストリン二量体が水溶性ポルフィリンを包接したものであり、酸素、一酸化炭素、シアン化物イオンと親和性が高い包接錯体、及びこの包接錯体を有効成分として含有する人工血液用酸素輸液、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、鋭意検討の結果、シクロデキストリン分子とリンカー分子との間にある硫黄原子を酸素原子に置き換えれば、前記問題点を解決できることを見出し、この発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、この発明の請求項１に記載のシクロデキストリン二量体は、下記の化学式（１）で示されるものである。
【化１】
2013231111.tif 000002
（式中、ｍは１又は２の何れかの数字を表し、ｎは１、２又は３の何れかの数字を表す）
【００１１】
請求項２に記載のシクロデキストリン二量体は、請求項１に記載のシクロデキストリン二量体であって、ｍ＝１、かつｎ＝２のものである。
【００１２】
請求項３に記載の包接錯体は、請求項１に記載のシクロデキストリン二量体が水溶性金属ポルフィリンを包接したものである。
【００１３】
請求項４に記載の包接錯体は、請求項３に記載の包接錯体であって、水溶性金属ポルフィリンが下記の化学式（２）又は（３）で示されるものである。
【化２】
2013231111.tif 000003
【化３】
2013231111.tif 000004
（式中、R1及びR2は、それぞれカルボキシル基、スルホニル基、水酸基の何れかを表し、MはFe2+、Fe3+、Mn2+、Co2+、Zn2+の何れかを表す）
【００１４】
請求項５に記載の包接錯体は、請求項４に記載の包接錯体であって、水溶性金属ポルフィリンが5,10,15,20‐テトラキス（4‐スルホナトフェニル）ポルフィリン鉄（II）錯体のものである。
【００１５】
請求項６に記載の包接錯体は、請求項４に記載の包接錯体であって、水溶性金属ポルフィリンが5,10,15,20‐テトラキス（4‐スルホナトフェニル）ポルフィリン鉄（III）錯体のものである。
【００１６】
請求項７に記載の人工血液用酸素輸液、請求項８に記載の一酸化炭素除去剤は、請求項３から請求項５の何れかに記載の包接錯体を有効成分として含有するものである。また、請求項９に記載のシアン解毒剤は、請求項３、請求項４又は請求項６の何れかに記載の包接錯体を有効成分として含有するものである。
【発明の効果】
【００１７】
この発明のシクロデキストリン二量体は合成が容易であり、その収率も高い。また、この発明のシクロデキストリン二量体は活性酸素種による酸化を受け難く、自動酸化反応が起こり難い。したがって、この発明の包接錯体やこの包接錯体を有効成分とするこの発明の人工血液用酸素輸液等は、従来のものよりも安価で、酸素親和性等の特性も優れている。そのため、この発明の人工血液用酸素輸液等が臨床で利用されるようになれば、より多くの患者を治療してその生命を救うことができ、公共福祉の向上に貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、この発明にかかるシクロデキストリン二量体及び包接錯体の合成経路の概略を示す。
【図２】図２（ａ）は各酸素分圧におけるhemoCD1の紫外可視吸光スペクトルの測定結果を示している（25℃）。また、図２（ｂ）は波長433nmにおける吸光度変化を酸素分圧に対してプロットした結果を示している。
【図３】図３（ａ）は各酸素分圧におけるhemoCD1の紫外可視吸光スペクトルの測定結果を示している（37℃）。また、図３（ｂ）は波長433nmにおける吸光度変化を酸素分圧に対してプロットした結果を示している。
【図４】図４（ａ）は各一酸化炭素分圧におけるhemoCD1の紫外可視吸光スペクトルの測定結果を示している（25℃）。また、図４（ｂ）は波長421nmにおける吸光度変化を酸素分圧に対してプロットした結果を示している。
【図５】図５（ａ）はhemoCD1-O2の自動酸化反応に伴う吸収スペクトルの変化を示し、図５（ｂ）は吸光度変化の対数f(t)を測定時間tに対してプロットした結果を示している。
【図６】図６は、hemoCD2とシアン化物イオンとの結合において、擬一時速度定数kobsCN-をシアン化ナトリウム濃度[NaCN]に対してプロットした結果を示している。
【図７】図７は、hemoCD2とアジ化物イオンとの結合において、擬一時速度定数kobsN3-をアジ化ナトリウム濃度[NaN3]に対してプロットした結果を示している。
【図８】図８（ａ）は、hemoCD2をアジ化ナトリウム水溶液で滴定して、紫外可視吸収スペクトルの変化を測定した結果を示す（37℃）。また、図８（ｂ）は、397nm及び422nmにおける吸光度変化をアジ化ナトリウム濃度[NaN3]に対してプロットした結果を示す。
【図９】図９（ａ）は、hemoCD2-シアン化物イオン錯体へのアジ化ナトリウム（NaN3）の添加に伴う可視紫外吸収スペクトルの経時変化を測定した結果を示す。また、図９（ｂ）は、波長419nmにおける吸光度変化を時間に対してプロットした結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
この発明は、シクロデキストリン二量体、これを配位子とする包接錯体、及びこの包接錯体を有効成分とする人工血液用酸素輸液、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤に関する。そこで、これらについて以下に詳説する。
【００２０】
１.シクロデキストリン二量体
シクロデキストリン二量体は、化学式（１）で示すように、全ての水酸基がメチル化した２つのシクロデキストリン分子がピリジンを含有するリンカーを介して結合した物質である。また、リンカーと２つのシクロデキストリン分子とはエーテル結合している。このように、シクロデキストリン分子とリンカーとがエーテル結合しているため、シクロデキストリン二量体のリンカー部位は酸化しない。
【００２１】
シクロデキストリン二量体を構成するシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンの何れかである。中でも、シクロデキストリンがβ−シクロデキストリンであるｎ＝２が好ましい。さらに、鉄ポルフィリンの鉄周辺がシクロデキストリンによって完全に遮蔽され、外部の水による求核攻撃を受け難くなるように、リンカー分子はｍ＝１であることが好ましい。
【００２２】
なお、このシクロデキストリン二量体は、例えば、部分メチル化シクロデキストリン（2,6-di-O-Me-β-CD）と水素化ナトリウムとを反応させてナトリウムアルコキシドを生成し、このナトリウムアルコキシドとハロゲン化アルキルであるリンカー分子とをウィリアムソン合成してエーテル（シクロデキストリン二量体）を生成したのち、生成したシクロデキストリン二量体の水酸基をメチル化することによって、製造できる。
【００２３】
この方法で製造する場合、シクロデキストリン二量体を合成したのち、シクロデキストリン原料と生成物であるシクロデキストリン二量体とは、カラムクロマトグラフィーなどによって分離できるので、シクロデキストリン原料は無駄なく利用できる。また、シクロデキストリン二量体の全ての水酸基は天然の立体配座を保持したままメチル化できる。
【００２４】
２．包接錯体
この発明の包接錯体は、この発明のシクロデキストリン二量体が水溶性金属ポルフィリンを包接したものであり、シクロデキストリン二量体と水溶性金属ポルフィリンとを水系溶媒中で混合することによって製造できる。
【００２５】
ここで、水溶性金属ポルフィリンとは、中心に金属イオンを配位して水に溶けるポルフィリン系化合物のことであり、かつ、化学式（１）で示されるシクロデキストリン二量体で包接できるものである。
【００２６】
具体的には、前記の化学式（２）、化学式（３）の化合物、より具体的には5,10,15,20-テトラキス（4-スルホナトフェニル）ポルフィリン鉄錯体（以下、「FeTPPS」と省略する。）、5,15-ビス（3,5-ジカルボキシラトフェニル）-10,20-ジフェニルポルフィリン鉄錯体（以下、「Fe-trans-2DC」と省略する。）などが挙げられる。なお、これらの化合物は、例えば公知の方法により合成してもよく、市販品（例えば、Frontier scientific社、東京化成工業株式会社など）を使用してもよい。
【００２７】
３．人工血液用酸素輸液、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤
この発明の人工血液用酸素輸液、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤は、前記包接錯体を有効成分として含有するものであり、有効成分のほか公知の製剤用担体を含んでいてもよい。なお、人工血液用酸素輸液は液体製剤であるが、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤については特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよい。
【００２８】
具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、点滴剤、外用液剤、塗布剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。中でも、投与してから薬効が得られるまでの時間が短いことから、注射剤、点滴剤の液体製剤が好ましい。なお、医薬用組成物中の有効成分の割合、患者への医薬用組成物の投与量は、剤形や患者の年齢、体重、疾患の程度に応じて、任意に選択すればよい。
【００２９】
人工血液用酸素輸液等を注射剤、点滴剤等の非経口剤として製造する場合には、有効成分である包接錯体と、注射用蒸留水、生理食塩水希釈剤、ブドウ糖水溶液等の希釈剤から、公知の方法によって製造することができる。なお、必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤に再調製することもできる。さらに、必要に応じて、等張化剤、安定剤、無痛化剤を加えてもよい。
【００３０】
また、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤を錠剤等の経口剤として製造する場合には、公知の賦型剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤等とともに、公知の製造方法により製造できる。
【００３１】
さらに、一酸化炭素除去剤、シアン解毒剤は、公知のDDS技術、例えば、リポソームなどの運搬体に封入して、体内投与してもよい。この場合、標的部位の細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、これらの薬剤を標的部位に効率よく運ぶことができる。
【００３２】
以下、この発明について実施例に基づいてより詳細に説明する。なお、この発明の特許請求の範囲は、以下の実施例によって、如何なる意味においても制限されない。
【実施例１】
【００３３】
１.シクロデキストリン二量体の合成
この発明にかかるシクロデキストリン二量体を、図１に記載の合成経路にしたがって合成した。その詳細を以下に説明する。なお、図１中のA〜Gは、β‐シクロデキストリンを構成する環状に結合した7つのグルコースを識別するために付したものであり、リンカーと結合するグルコースをAで示している。
【００３４】
（１）bisCDの合成
50mL反応容器に還流冷却管を取り付け、その内部をアルゴンで置換した。反応容器に乾燥THF 20mL及び乾燥2,6-di-O-methyl-β-cyclodextrin 1.0g(0.75mmol、ナカライテスク)を加えた。反応容器を氷浴に移したのち、ヘキサンで洗浄後したのち真空乾燥した水素化ナトリウム 0.14g(5.8mmol)を反応容器に加えた。反応溶液から気泡の発生がおさまるまで待って、反応溶液を1時間加熱還流した。反応容器に3,5-bis(chloromethyl)pyridine hydrochloride 0.04g(0.19mmol、和光純薬)を3回に分けて1時間毎に加え、18時間加熱還流した。
【００３５】
加熱還流が終了したのち、反応容器にメタノール10mLを加え、溶媒を減圧留去した。残渣を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液40mLに溶かし、30mLのクロロホルムで6回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して、溶媒を減圧留去し、黄色固体（粗精製物）を得た。
【００３６】
粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム/アセトン(1/1)混合溶媒により、原料（2,6-di-O-methyl-β-cyclodextrin及び3,5-bis(chloromethyl)pyridine hydrochloride）を溶出した。その後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーから、クロロホルム/メタノール(15/1)混合溶媒によって、目的物であるbisCDを溶出した。溶出液から混合溶媒を減圧留去し、白色固体であるbisCDを得た（収量0.42g、収率40%）。なお、BisCDは質量分析計(MS)の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
【００３７】
MS(MALDI-TOF,positive mode):2787.4([M+Na]+=2787.2),2801.4([M+CH3+Na-H]+=2801.2),2815.4([M+2CH3+Na-2H]+=2815.2).
【００３８】
（２）Py3OCDの合成
アルゴン雰囲気下において、滴下漏斗を取り付けた50mL反応容器に、bisCD 0.34g (0.123mmol)、無水DMF 15mL及び無水THF 7mLを加えた。反応容器を氷浴に移したのち、ヘキサンで洗浄したのち真空乾燥した水素化ナトリウム0.25g（10.4mmol）を反応容器に加えて、3時間撹拌した。ヨウ化メチル0.31g（2.2mmol）を無水DMF 5mLに溶解し、この溶解液を滴下漏斗を使用して、反応容器中の反応溶液に少しずつ滴下した。滴下終了後、反応容器を氷浴から室温に戻し、18時間撹拌した。
【００３９】
反応終了後、反応容器に10mLのメタノールを加え、溶媒を減圧留去した。残渣を40mLの炭酸水素ナトリウム飽和水溶液に溶かし、30mLのクロロホルムで6回抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。
【００４０】
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム/メタノール（40/1）混合溶媒により、目的物であるPy3OCDを含む画分を得た。得られた画分を、リサイクル分取HPLCシステム（LC‐9201、カラム：JAIGEL‐GS310、何れも日本分析工業、展開溶媒：メタノール）を使用して、より精密に分画した。溶出液から混合溶媒を減圧留去し、白色固体であるPy3OCDを得た（収量213mg、収率59%）。なお、Py3OCDは、核磁気共鳴分光法（1H NMRと13C NMR）、質量分析計(MS)及び元素分析の測定結果から同定した。その結果を以下に示す。
【００４１】
1H NMR(δ/ppm,500MHz,CDCl3,TMS):3.12-3.26(m,14H),3.26-3.72(m,162H),3.72-3.91(m,28H),4.01(d,2H),4.78(d,2H),5.13(m,14H),7.86(s,1H),8.59(s,2H).13C NMR(δ/ppm,125MHz,CDCl3,TMS): 59, 62, 71, 72, 80, 81, 82, 99. HRMS(MALDI-TOF,positive mode):2955.1([M+Na]+=2955.4),2971.1([M+K]+=2971.4)).Elemental analysis: C,52.68; H,7.58; N,0.61 (C131H231NO73= C,52.65; H,7.79; N,0.47).
【実施例２】
【００４２】
２.包接錯体の調製
実施例１で合成したシクロデキストリン二量体（Py3OCD）と水溶性ポルフィリンから、図１に示すようにして、鉄（II）錯体であるhemoCD1及び鉄（III）錯体であるhemoCD2のストック溶液を調製した。具体的には以下のようにして調製した。なお、水溶性ポルフィリンであるFeTPPS(Frontier Scientific)及び他の試薬は、市販品をそのまま使用した。
【００４３】
（１）鉄（II）錯体（hemoCD1）のストック溶液
Py3OCD（3.6×10-4M）と鉄(III)ポルフィリンFe(III)TPPS（3.0×10-4M）を含む1mLの50mMリン酸緩衝水溶液（pH7.0）に、2mgのNa2S2O4を加えて鉄(II)へと還元した。還元した溶液をゲルろ過カラム（Sephadex G-25 superfine,16×25mm2,HiTrap（登録商標）脱塩用カラム、Amersham Biosciences）に充填して、50mMリン酸緩衝水溶液（pH7.0で溶出させて赤色のバンドのみを分取し、過剰に加えたNa2S2O4を取り除いた。なお、一連の操作は空気下で行った。そのため、精製後のhemoCD1は空気中のO2と結合した酸素錯体hemoCD1-O2である。
【００４４】
（２）鉄（III）錯体（hemoCD2）のストック溶液
Py3OCD（3.6×10-4M）と鉄(III)ポルフィリンFe(III)TPPS（3.0×10-4M）とを、1mLの50mMリン酸緩衝水溶液（pH7.0）に加えることによって調製した。
【実施例３】
【００４５】
３．包接錯体の酸素親和性
包接錯体hemoCD1の酸素親和性を求めた。具体的には、以下のようにして50％のhemoCD1が酸素と結合するときの酸素分圧（P1/2O2）を求め、従来からある包接錯体と比較した。なお、P1/2O2の値が小さいほど酸素との親和性は高くなる。
【００４６】
吸光セル中の50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に一定の比で酸素と窒素を混合したガスを吹き込んで飽和させた。飽和させたリン酸緩衝液に実施例２で調製したhemoCD1のストック溶液を加えた。吸光セルに2分間同じ混合ガスを吹き込んだのち、吸光セルを密封して紫外可視吸収スペクトルを測定した。なお、紫外可視吸光スペクトルは、25℃と37℃の２つの温度、0〜127torrの異なる酸素分圧で測定した。測定結果を図２（ａ）及び図３（ａ）に示す。
【００４７】
さて、50％のhemoCD1が酸素と結合するときの酸素分圧P1/2O2、酸素分圧PO2、一定波長における吸光度変化（ΔA）には、下記の数式（１）の関係があることが分かっている。そこで、得られた紫外可視吸収スペクトルから、波長433nmにおける吸光度変化（ΔA433）を酸素分圧（PO2）に対してプロットし（図２（ｂ）及び図３（ｂ））、数式（１）の解析を行なってhemoCD1のP1/2O2を決定した。
【００４８】
【数１】
2013231111.tif 000005
【００４９】
その結果、hemoCD1の酸素親和性P1/2O2は、25℃において17.6±1.7torr、37℃においてP1/2O2＝40.2±4.1torrであることが分かった。この値は3回測定した結果の平均値である。
【００５０】
さて、ヘモグロビンのT状態では、25℃におけるP1/2O2は26torr（非特許文献３を参照。）であり、37℃におけるP1/2O2は40torr（小松晃之、石原星児、土田英俊人、人工血液、2003年、11巻、3号、pp.167-172.を参照。）であることは既に分かっている。また、類縁化合物であるhemoCDの25℃におけるP1/2O2が、10torrことも既に分かっている（非特許文献４を参照。）。したがって、hemoCD1の酸素親和性は、hemoCDよりも低く、ヘモグロビンのT状態のP1/2O2と近い値を示すことが分かった。
【００５１】
さらに、ヘモグロビンの生体内酸素運搬効率TO2（110torrと40torrのおける鉄(II)の酸素化割合の差）は22%であることが分かっている（前記小松らの文献を参照。）。プロットした曲線より、hemoCD1のTO2は25%であることが分かり、ヘモグロビンよりも高いTO2を持つことが分かった。以上の結果から、hemoCD1は、生体内の酸素運搬体として有用であると考えられる。
【実施例４】
【００５２】
４.包接錯体の一酸化炭素親和性
包接錯体hemoCD1の一酸化炭素親和性を求めた。具体的には、以下のようにして50％のhemoCD1が一酸化炭素と結合するときの酸素分圧（P1/2CO）を求め、従来からある包接錯体と比較した。具体的には、以下のようにして比較した。なお、P1/2COの値が小さいほど一酸化炭素との親和性は高くなる。
【００５３】
0.0931%のCOを含む窒素（N2）と酸素（O2）とを種々の比率で混合したガスを、2.8×10-6MのhemoCD1を含む50mMリン酸緩衝水溶液（pH7.0）に導入して飽和させたのち、紫外可視吸収スペクトルを測定した（25℃）。その結果を図４（ａ）に示す。
【００５４】
さて、50％のhemoCD1が一酸化炭素と結合するときの一酸化炭素分圧P1/2CO、一酸化炭素分圧PCO、一定波長における吸光度変化（ΔA）には、下記の数式（２）の関係があることが分かっている。そこで、得られた紫外可視吸収スペクトルから、波長421nmにおける吸光度変化（ΔA421）を一酸化炭素分圧（PO2）に対してプロットし（図４（ｂ））、数式（２）の解析を行なってhemoCD1の酸素錯体（hemoCD1-O2）と一酸化炭素錯体（hemoCD1-CO）が等量となるときのCO分圧を決定した。
【００５５】
【数２】
2013231111.tif 000006
【００５６】
その結果、hemoCD1-O2とhemoCD1-COが等量となるときのCO分圧が0.0234torrであり、O2分圧が735torrであることが分かった。これらの値から、hemoCD1-O2とhemoCD1-COが等量となるときのCO分圧とO2分圧の比（M値）を計算したところ、M=3.14×104であることが分かった。最後に、hemoCD1の一酸化炭素親和性を示すP1/2COの値を、P1/2O2とM値から、P1/2CO=(5.60±0.9)×10-4torr（25℃）と決定した。なお、この値は3回測定した結果の平均値である。
【００５７】
hemoCD及びヘモグロビンのR状態におけるP1/2COは、それぞれ1.5×10-5torr及び1.3×10-3torrであることが分かっている（非特許文献２を参照。）。このことから、hemoCD1の一酸化炭素親和性はhemoCDと比べて約37倍小さく、ヘモグロビンのR状態と比べて約2倍大きいことが分かった。実施例３とこの実施例の結果から、hemoCD1はhemoCDと比べてより効率的に酸素を運搬できることが分かった。
【実施例５】
【００５８】
５．酸素錯体（hemoCD1-O2）の自動酸化
酸素錯体（hemoCD1-O2）のhemoCD2への自動酸化反応の一次速度定数kox及びhemoCD1-O2の半減期（t1/2=ln2/kox）を測定して、酸素錯体（hemoCD1-O2）の安定性を調べた。具体的には、以下のようにして測定した。
【００５９】
まず、吸光セル中の50mMリン酸緩衝液（pH7.0）に、実施例２で調製したhemoCD1のストック溶液を加えて、紫外可視吸光スペクトルの経時変化を測定した（25℃）。なお、このときのhemoCD1の全濃度は3.1×10-6Mであった。その結果を図５（ａ）に示す。
【００６０】
つぎに、hemoCD1-O2のhemoCD2への自動酸化反応において、433nmにおける吸光度変化と測定時間tにおける吸光度変化の対数f(t)との間に、下記の数式（３）に示す一次反応速度式が成立するとして解析した。すなわち、測定時間tに対して吸光度変化の対数f(t)をプロットした。その結果を図５（ｂ）に示す。
【００６１】
【数３】
2013231111.tif 000007
【００６２】
その結果、hemoCD1-O2の自動酸化反応における一次速度定数Koxは(1.37±0.31)x10-2 h-1（25℃）であり、その半減期t1/2は52.6±5.8h（25℃）であることが分かった。なお、これらの値は4回測定した結果の平均値である。
【００６３】
さて、hemoCD-O2のt1/2は30.1h（非特許文献２を参照。）であることが報告されており、ヘモグロビンのt1/2は60hであることが報告されている（非特許文献３を参照）。すなわち、hemoCD1-O2のt1/2はhemoCD-O2のt1/2よりも1.7倍長いこと、すなわちより安定していることが分かった。以上の結果から、hemoCD1の酸素錯体は自動酸化反応に対して安定しており、人工血液用酸素輸液の有効成分に適していることが分かった。
【実施例６】
【００６４】
６．hemoCD2のシアン化物イオン結合定数の決定
hemoCD2のシアン解毒剤としての有用性を調べるため、hemoCD2のシアン化物イオン結合定数（KCN-）を決定した。具体的には、（１）hemoCD2のアニオン結合速度定数の決定、（２）hemoCD2のN3-結合定数の決定、（３）hemoCD2のシアン化物イオン結合定数の決定の順で決定した。以下にその詳細について説明する。
【００６５】
（１）hemoCD2のアニオン結合速度定数（konCN-及びkonN3-）の測定
hemoCD2のシアン化物イオン(CN-)とアジ化物イオン(N3-)との結合速度定数(konX-)、解離速度定数(koffX-)を求めた。具体的には以下のようにして求めた。
【００６６】
50mMリン酸緩衝水溶液（pH7.0）中のhemoCD2（5.0×10-6M）を、過剰量のアニオン種（NaCN又はNaN3）を含むシアン化ナトリウム水溶液又はアジ化ナトリウム水溶液で滴定して、その紫外可視吸収スペクトルの変化を37℃で測定した。
【００６７】
つぎに、422nmにおける吸光度変化から、擬一次速度定数kobsを求め、アニオン濃度に対して擬一次速度定数kobsをプロットした。プロットした結果を図６及び図７に示す。なお、シアン化物イオンは、中性水溶液中において大部分がシアン化水素として存在するため、シアン化水素の酸解離過程とシアン化物イオンの配位過程を含むkobsが得られる。
【００６８】
さて、擬一次速度定数kobsは、結合速度定数(konX-)、解離速度定数(koffX-)、及びアニオン濃度[X-]を使用して、数式（４）で表される。
【００６９】
【数４】
2013231111.tif 000008
【００７０】
そこで、図６及び図７のグラフの傾きと数式（４）から、hemoCD2のシアン化物イオンとの結合速度定数konCN-は736M-1s-1（37℃）、hemoCD2のアジ化物イオンとの結合速度定数konN3-は3811M-1s-1（37℃）と決定した。なお、これらの値は5回測定した結果の平均値である。
【００７１】
さて、ヘモグロビンの鉄(III)価体（metHb）、ヒドロキソコバラミン及びhemoCD2の類縁化合物であるFe(III)PIm3CD（特許文献４を参照。）のシアン化物イオン結合速度定数konCN-は、それぞれ320M-1s-1、81.5M-1s-1及び193M-1s-1であることが既に報告されている（非特許文献５を参照。）。したがって、hemoCD2は、これらのシアン化物イオンレセプターと比較して、それぞれ約2倍、9倍及び4倍速くシアン化物イオンを捕捉できることが分かった。
【００７２】
（２）hemoCD2のN3-結合定数（KN3-）の決定
hemoCD2のN3-結合定数を決定した。具体的には次のようにして決定した。まず、50mMリン酸緩衝水溶液（pH7.0）中のhemoCD2（5.0×10-6M）を、過剰量のアジ化物イオンを含むアジ化ナトリウム水溶液で滴定して、その紫外可視吸収スペクトルの変化を37℃で測定した。その結果を図８（ａ）に示す。つぎに、397nm及び422nmにおける吸光度変化をアジ化ナトリウム濃度に対してプロットした。その結果を図８（ｂ）に示す。
【００７３】
さて、hemoCD2とアジ化物イオンとの錯形成に伴う吸光度変化は、下記の数式（５）に示す関係があることが分かっている（日本化学会生体機能関連化学部会編,生体機能関連化学実験法,2章,p.20-21,化学同人,2003年、を参照。）。そこで、図８と数式（４）から、結合定数KN3-を計算したところ、KN3-は(4.89±0.05)×104M-1(37℃)であることが分かった。なお、この値は3回測定した結果の平均値である。
【００７４】
【数５】
2013231111.tif 000009
【００７５】
（３）hemoCD2のシアン化物イオン結合定数の決定
hemoCD2のシアン化物イオン結合定数を決定した。具体的には次のようにして決定した。まず、5.0×10-6M hemoCD2と1.0×10-5M NaCNとを含む50mMリン酸緩衝水溶液（pH7.0）に、2.0×10-2MのNaN3を添加して、その紫外可視吸収スペクトルを37℃で測定し、419nmにおける吸光度の変化をプロットした。図９（ａ）に紫外可視吸収スペクトルを示し、図９（ｂ）に419nmにおける吸光度の変化を示す。つぎに、図９（ｂ）のグラフから、hemoCD2のシアン化物イオンからアジ化物イオンへの配位子交換における一次速度定数kexを、(2.55±0.17)×10-4 s-1と決定した。なお、この値は3回測定した結果の平均値である。
【００７６】
さて、擬一次速度定数kexと、hemoCD2のシアン化物イオン解離速度定数koffCN-と、シアン化物イオン結合速度定数konCN-と、アジ化物イオン結合定数KN3-との間には、以下の数式（６）の関係が成り立つことが分かっている（Dou, Y.; Olson, J. S.; Wilkinson, A. J.; Ikeda-Saito, M. Biochemistry 1996, 35, 7107-7113.を参照。）。
【００７７】
【数６】
2013231111.tif 000010
【００７８】
数式（６）のうち、konCN-はこの実施例の（１）から、KN3-はこの実施例の（２）から、kexは前記のように、既知の値である。そこで、（６）から、シアン化物イオンの解離速度定数koffCN-を(3.30±0.17)×10-4 s-1と決定した。
【００７９】
また、シアン化物イオン結合定数KCN-は、結合速度定数konCN-および解離速度定数koffCN-との間には、数式（７）の関係がある。そこで、数式（７）と既に決定しているkonCN-とkoffCN-から、KCN-を2.23×106M-1(37℃)と決定した。
【００８０】
【数７】
2013231111.tif 000011
【００８１】
さて、metHb及びFe(III)PIm3CDのKCN-は、それぞれ8.14×105M-1、2.61×106M-1であることが報告されている（非特許文献５を参照。）。また、ヒドロキソコバラミンの血清中におけるKCN-は、1.3×104M-1であることが報告されている（非特許文献５を参照。）。したがって、hemoCD2は、これらのシアン化物イオンレセプターと比べて、それぞれ約3倍、約0.9倍及び約170倍のKCN-を持つことが分かった。
【００８２】
以上のように、（１）から、hemoCD2のシアン化物イオン結合速度定数konCN-は、既存のシアン化物イオンレセプターと比べ大きな値を示すことが分かった。また、（３）から、hemoCD2のシアン化物イオン結合定数KCN-も既存のシアン化物イオンと同等以上であることが分かった。これらの結果から、hemoCD2が既存のシアン化物イオンレセプターよりも優れたシアン化物イオン捕捉能を持つことが分かった。
【図１】
2013231111.tif 000016
【図２】
2013231111.tif 000017
【図３】
2013231111.tif 000018
【図４】
2013231111.tif 000019
【図５】
2013231111.tif 000020
【図６】
2013231111.tif 000021
【図７】
2013231111.tif 000022
【図８】
2013231111.tif 000023
【図９】
2013231111.tif 000024