(57)【要約】      （修正有）【課題】使用することで低濃度の検出対象物質（基質）を高精度かつ高感度に検出又は定量することが可能となる酵素センサ及びその製造方法を提供する。【解決手段】検出対象物質（基質）と反応して所定の物質を生成する酵素１５ａを用い、試料に含まれる検出対象物質（基質）を検出又は定量するために所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサであって、電極と、電極（具体的には、作用電極１２１）上に形成され、当該電極（作用電極１２１）と所定の物質との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層１３と、電子伝達体層１３上に形成され、所定の物質を選択的に透過する選択透過層１４と、選択透過層１４上に形成され、酵素１５ａを含むメソ多孔体酵素層１５と、を備えている。【選択図】図５
2013238398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質と反応して所定の物質を生成する酵素を用い、試料に含まれる前記基質を検出又は定量するために前記所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサにおいて、
電極と、
前記電極上に形成され、当該電極と前記所定の物質との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層と、
前記電子伝達体層上に形成され、前記所定の物質を選択的に透過する選択透過層と、
前記選択透過層上に形成され、前記酵素を含むメソ多孔体酵素層と、
を備えることを特徴とする酵素センサ。
【請求項２】
前記所定の物質は、過酸化水素であり、
前記選択透過層は、ナフィオン（登録商標）からなる層であることを特徴とする請求項１に記載の酵素センサ。
【請求項３】
前記メソ多孔体酵素層は、メソ多孔性シリカと、当該メソ多孔性シリカの細孔の内部に固定された前記酵素と、からなる層であり、
前記細孔のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酵素センサ。
【請求項４】
基質と反応して所定の物質を生成する酵素を用い、試料に含まれる前記基質を検出又は定量するために前記所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサの製造方法において、
基板上に、電極を形成する電極形成ステップと、
前記電極上に、当該電極と前記所定の物質との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層を形成する電子伝達体層形成ステップと、
前記電子伝達体層上に、前記所定の物質を選択的に透過する選択透過層を形成する選択透過層形成ステップと、
前記選択透過層上に、前記酵素を含むメソ多孔体酵素層を形成するメソ多孔体酵素層形成ステップと、
を有することを特徴とする酵素センサの製造方法。
【請求項５】
前記電極形成ステップでは、スクリーン印刷法によって前記電極を形成し、
前記電子伝達体層形成ステップでは、スクリーン印刷法によって前記電子伝達体層を形成し、
前記選択透過層形成ステップでは、スピンコート法によって前記選択透過層を形成し、
前記メソ多孔体酵素層形成ステップでは、スピンコート法によって前記メソ多孔体酵素層を形成することを特徴とする請求項４に記載の酵素センサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素センサ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、基質と反応して所定の物質を生成する酵素を用いた酵素センサが知られている。具体的には、例えば、血糖値や尿糖値の測定に利用される酵素センサとして、グルコースと反応して過酸化水素を生成するグルコース酸化酵素を用いた電流検出型のグルコースセンサが知られている。この電流検出型のグルコースセンサは、生成した過酸化水素を電極（作用極）で酸化して反応量を電流値として検出するよう構成されている。試料中のグルコース濃度は電流値に比例するので、グルコース濃度を定量することができる。
【０００３】
ところで、過酸化水素を酸化するためには比較的高い電圧を印加しなければならない。そのため、過酸化水素よりも低い電圧で酸化される活性物質（アスコルビン酸や酪酸など）が試料に含まれていると、過酸化水素だけでなく活性物質までも電極で酸化（すなわち、過酸化水素だけでなく活性物質にも応答）してしまい、過酸化水素を選択的に検出できないという問題が生じる。
この問題を、例えば、絶縁性基板上に電極が形成され、その基板上（電極が形成された面上）に過酸化水素のみを透過する選択透過膜が積層され、選択透過膜上に固定化酵素膜が形成されたセンサにより回避することが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３６９８３１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１は、選択透過膜を設けることで大きく感度が下がってしまうという問題がある。そのために、特許文献１は、測定範囲の広いセンサを得ること、具体的には、試料に含まれる検出対象物質（基質。特許文献１の場合はグルコース）の濃度が高濃度であっても検出又は定量可能なセンサを得ることが目的となっている。したがって、試料に含まれる検出対象物質の濃度が低濃度である場合には、特許文献１のようなセンサを用いて検出対象物質を高感度に検出又は定量することは困難である。
【０００６】
本発明の課題は、使用することで低濃度の検出対象物質（基質）を高精度かつ高感度に検出又は定量することが可能となる酵素センサ及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、請求項１に記載の発明は、
基質と反応して所定の物質を生成する酵素を用い、試料に含まれる前記基質を検出又は定量するために前記所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサにおいて、
電極と、
前記電極上に形成され、当該電極と前記所定の物質との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層と、
前記電子伝達体層上に形成され、前記所定の物質を選択的に透過する選択透過層と、
前記選択透過層上に形成され、前記酵素を含むメソ多孔体酵素層と、
を備えることを特徴とする。
【０００８】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の酵素センサにおいて、
前記所定の物質は、過酸化水素であり、
前記選択透過層は、ナフィオン（登録商標）からなる層であることを特徴とする。
【０００９】
請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載の酵素センサにおいて、
前記メソ多孔体酵素層は、メソ多孔性シリカと、当該メソ多孔性シリカの細孔の内部に固定された前記酵素と、からなる層であり、
前記細孔のサイズは、前記酵素のサイズの０．５〜２．０倍であることを特徴とする。
【００１０】
請求項４に記載の発明は、
基質と反応して所定の物質を生成する酵素を用い、試料に含まれる前記基質を検出又は定量するために前記所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサの製造方法において、
基板上に、電極を形成する電極形成ステップと、
前記電極上に、当該電極と前記所定の物質との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層を形成する電子伝達体層形成ステップと、
前記電子伝達体層上に、前記所定の物質を選択的に透過する選択透過層を形成する選択透過層形成ステップと、
前記選択透過層上に、前記酵素を含むメソ多孔体酵素層を形成するメソ多孔体酵素層形成ステップと、
を有することを特徴とする。
【００１１】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の酵素センサの製造方法において、
前記電極形成ステップでは、スクリーン印刷法によって前記電極を形成し、
前記電子伝達体層形成ステップでは、スクリーン印刷法によって前記電子伝達体層を形成し、
前記選択透過層形成ステップでは、スピンコート法によって前記選択透過層を形成し、
前記メソ多孔体酵素層形成ステップでは、スピンコート法によって前記メソ多孔体酵素層を形成することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、本発明の酵素センサ又は本発明の製造方法によって製造される酵素センサは、最上位にあるメソ多孔体層に高密度で酵素が固定化されているため、試料に含まれる検出対象物質（基質）の濃度が低濃度のために所定の物質の生成量が少ない場合でも、大きな出力が得られ、所定の物質を高感度に検出することができる。さらに、検出対象物質に対する出力が相対的に大きくなるため、検出対象物質（基質）と酵素の反応によって生成する所定の物質の生成量も相対的に大きくなり、選択透過層と組み合わせることによって、選択性も大幅に向上する。また、電子伝達体層を備えているとともに最上位にあるメソ多孔体層には酵素が高密度に固定化されているため、本発明の酵素センサ又は本発明の製造方法によって製造される酵素センサを使用することで、低濃度の検出対象物質（基質）を高精度かつ高感度に検出又は定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施形態の酵素センサを備える検出装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図２】実施形態の酵素センサの構成の一例を示す斜視図である。
【図３】（ａ）実施形態の酵素センサの構成の一例を示す模式図、（ｂ）実施形態の酵素センサの要部の構成の一例を示す模式図である。
【図４】図３（ａ）に示す酵素センサのIV−IV線における断面図である。
【図５】実施形態の酵素センサによって、検出対象物質（基質）と酵素の反応により生成する所定の物質を電気化学的に検出する原理について説明するための図である。
【図６】実施例で作製した酵素センサにおける応答電流値の印加電圧依存性を示す図である。
【図７】実施例で作製した酵素センサにおける応答電流値のｐＨ依存性を示す図である。
【図８】実施例で作製した酵素センサにおける応答電流値の測定結果を示す図である。
【図９】図８に基づき作成した検量線を示す図である。
【図１０】実施例で作製した酵素センサの選択性を示す図である。
【図１１】比較例の酵素センサの選択性を示す図である。
【図１２】比較例の酵素センサの選択性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図を参照して、本発明の実施形態を説明する。ただし、発明の範囲は、図示例に限定されない。
【００１５】
［検出装置の構成］
まず、本実施形態の酵素センサ１０を備える検出装置１の構成について説明する。
検出装置１は、検出対象物質（基質）と反応して所定の物質を生成する酵素１５ａを用い、所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサ１０を使用して、試料に含まれる検出対象物質（基質）を検出又は定量する装置である。
【００１６】
図１は、検出装置１の構成の一例を示すブロック図である。
検出装置１は、図１に示すように、主に、酵素センサ１０と、接続手段４０を介して酵素センサ１０と接続する電圧印加手段２０及び電流測定手段３０と、を備えて構成される。
電圧印加手段２０は、酵素センサ１０の電極１２に所定の電圧値の電圧を印加する。具体的には、電圧印加手段２０は、作用電極１２１と参照電極１２３との間に電圧を印加する。
また、電流測定手段３０は、電圧印加手段２０による電圧印加時に酵素センサ１０の電極１２に流れる電流値を応答電流値（後述）として測定する。
【００１７】
なお、図１では、接続手段４０から延びる１本のリード線に電圧印加手段２０及び電流測定手段３０が接続されているが、接続手段４０と電圧印加手段２０及び電流測定手段３０との接続の仕方はこれに限定されるものではない。具体的には、例えば、接続手段４０から延びる複数本のリード線のうち一部のリード線に電圧印加手段２０が接続されるとともに、他の一部のリード線に電流測定手段３０が接続されるよう構成することも可能である。
【００１８】
［酵素センサの構成］
本実施形態の酵素センサ１０は、検出対象物質（基質）と反応して所定の物質を生成する酵素１５ａを用い、試料に含まれる検出対象物質（基質）を検出又は定量するために所定の物質を電気化学的に検出するセンサである。
図２は、酵素センサ１０の構成の一例を示す斜視図である。図３（ａ）は、酵素センサ１０の構成の一例を示す模式図であり、図３（ｂ）は、酵素センサ１０の要部（具体的には、液溜形成部１６及び絶縁膜１７を除いた部分）の構成の一例を示す模式図である。また、図４は、図３（ａ）に示す酵素センサ１０のIV−IV線における断面図である。
【００１９】
酵素センサ１０は、図２、図３（ａ），（ｂ）、図４に示すように、主に、基板１１と、基板１１上に形成された電極１２（作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３）と、作用電極１２１上に形成された電子伝達体層１３と、電子伝達体層１３上に形成された選択透過層１４と、選択透過層１４上に形成されたメソ多孔体酵素層１５と、メソ多孔体酵素層１５の周囲に液溜を形成するための液溜形成部１６と、電極１２からの配線を保護するための絶縁膜１７と、を備えて構成される。
【００２０】
基板１１は、例えば、シリコン、セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）等からなる絶縁性基板である。
【００２１】
電極１２は、例えば、スクリーン印刷法によって基板１１上に形成された導電層である。
作用電極１２１としては、例えば、金、白金、銅、アルミニウム等の貴金属や、ＳｎＯ２、Ｉｎ２Ｏ３、ＷＯ３、ＴｉＯ２、グラファイト、グラフェン、グラッシカーボンなどを用いることができる。
対電極１２２としては、例えば、二極方式の場合は銀、三極方式の場合は銀やその他の金属を用いることができる。
参照電極１２３としては、例えば、カロメル電極、銀/塩化銀等を用いることができる。
【００２２】
なお、酵素センサ１０の電極方式は、作用電極と対電極と参照電極との三極方式に限定されるものではなく、作用電極と対電極との二極方式であっても良い。
また、電極１２は、スクリーン印刷法によって形成されたものに限定されるものではなく、電極１２の形成方法は適宜任意に変更可能である。具体的には、電極１２は、例えば、蒸着法、スパッタリング法等によって形成することも可能である。
【００２３】
また、作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３の大きさ、形状、構成には、特に制限はない。
具体的には、例えば、これらの電極は、市販の電解セル、測定セル等で使用する大きな電極であっても良いし、ディスク電極、回転リングディスク電極、ファイバー電極等であっても良いし、例えば、フォトリソグラフィー等の公知の微細加工技術により作製した微小電極（円盤電極、円筒電極、帯状電極、配列帯状電極、配列円盤電極、リング電極、球状電極、櫛型電極、ペア電極等）であっても良い。また、作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３はそれぞれ同じ大きさ、形状、構成であっても良いし、異なる大きさ、形状、構成であっても良い。
【００２４】
メソ多孔体酵素層１５は、検出対象物質（基質）と反応して所定の物質を生成する酵素１５ａを含む層である。
なお、本実施形態では、メソ多孔体酵素層１５に含まれる酵素１５ａとして、基質と反応して過酸化水素を生成する各種の酸化酵素（アルコールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ等）を用いるが、酵素１５ａはこれに限定されるものではない。酵素１５ａは、基質と反応して所定の物質を生成する酵素であれば適宜任意に変更可能であり、例えば、基質と反応してＮＡＤＨ（還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤ＋（酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）等を生成する各種の脱水素酵素（アセトアルデヒド脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、乳酸脱水素酵素等）などであっても良い。
また、メソ多孔体酵素層１５には、一種類の酵素１５ａのみが含まれていても良いし、複数種類の酵素１５ａが含まれていても良い。
また、メソ多孔体酵素層１５には、酵素１５ａの活性の発現を触媒するための補酵素等が含まれていても良い。
【００２５】
ここで、本実施形態において、酵素１５ａは、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に固定された状態でメソ多孔体酵素層１５に含まれていることとする。
すなわち、本実施形態のメソ多孔体酵素層１５は、メソ多孔性シリカ１５ｂと、当該メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に固定された酵素１５ａと、からなる層である。
なお、本実施形態では、細孔の内部に酵素１５ａが固定された粉末状のメソ多孔性シリカ１５ｂとバインダー１５ｃとを混合したものを選択透過層１４上に塗布することによってメソ多孔体酵素層１５を形成するようにしたが、メソ多孔体酵素層１５の形成方法は、これに限定されるものではない。例えば、細孔の内部に酵素１５ａが固定されていない粉末状のメソ多孔性シリカ１５ｂとバインダー１５ｃとを混合したものを選択透過層１４上に塗布してメソ多孔性シリカ層を形成し、当該メソ多孔性シリカ層の細孔の内部に酵素１５ａを固定することによってメソ多孔体酵素層１５を形成することも可能である。
また、メソ多孔性シリカ１５ｂの形状は、粉末状に限定されるものではなく、適宜任意に変更可能であり、顆粒状、シート状、バルク状、膜状等であっても良い。
【００２６】
本実施形態において、メソ多孔体酵素層１５に含まれるメソ多孔性シリカ１５ｂは、粉末状であり、例えば、ケイ酸やアルミナなどの各種金属酸化物、ケイ酸と他種の金属との複合酸化物等によって構成することができる。
例えば、ケイ酸により構成されるメソ多孔性シリカ１５ｂの作製においては、例えば、カネマイトのような層状シリケート、アルコキシシラン、シリカゲル、水ガラス、ケイ酸ソーダ等を好ましく用いることができる。
具体的には、メソ多孔性シリカ１５ｂは、例えば、無機材料を界面活性剤と混合反応させて、界面活性剤のミセルの周りに無機の骨格が形成された界面活性剤／無機複合体を形成させた後、例えば、４００℃〜６００℃で焼成したり有機溶剤で抽出したりする等して界面活性剤を除去することにより作製される。これにより、メソ多孔性シリカ１５ｂは、無機骨格中に、界面活性剤のミセルと同じ形状のメソポア細孔を有するものとなる。
【００２７】
メソ多孔性シリカ１５ｂの作製において、ケイ酸等のケイ素含有化合物を出発材料とする場合には、例えば、カネマイトのような層状シリケートを形成して、この層間にミセルを挿入し、そして、ミセルが存在しない層間をシリケート分子でつなぎ、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。
また、メソ多孔性シリカ１５ｂの作製において、水ガラス等のケイ素含有物質を出発材料とする場合には、例えば、ミセルの周囲にシリケート分子を集合させて重合させることによりシリカを形成し、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。この場合、通常、ミセルの形状は柱状となり、その結果、メソ多孔性シリカ１５ｂに、柱状の細孔が形成されることになる。
メソ多孔性シリカ１５ｂは、作製段階で、界面活性剤のアルキル鎖の長さを変えてミセルの径を変化させることによって、細孔の内径を制御することができる。また、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼン、トリプロピルベンゼン等の比較的疎水性の分子を添加することによって、ミセルを膨潤させ、さらに大きな内径の細孔を形成することもできる。
【００２８】
メソ多孔性シリカ１５ｂにおける細孔の配向は、ランダムであっても、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたものであってもよい。
メソ多孔性シリカ１５ｂの種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、大きな空隙率を持つという特徴を有する、例えば、ＫＳＷ、ＦＳＭ、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＨＯＭ等の公知の種類を採用することができる。
【００２９】
メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔のサイズは、当該メソ多孔性シリカ１５ｂに固定する酵素１５ａの立体構造の変化を防止可能な程度に設定されていることが好ましい。これにより、酵素１５ａの立体構造を維持することができ、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に固定された酵素１５ａ（すなわち、メソ多孔体酵素層１５に含まれる酵素１５ａ）を安定化することができる。
具体的には、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔のサイズは、酵素１５ａ（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素１５ａのサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素１５ａのサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。すなわち、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の直径（中心細孔直径）は、酵素１５ａの直径の０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素１５ａの直径の０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素１５ａの直径とほぼ同等であることが最も好ましい。なお、具体的な中心細孔直径の値は、酵素１５ａの直径との関係で決定されるので一律には規定できないが、例えば、１〜５０ｎｍ程度とすることができる。
【００３０】
ここで、酵素１５ａが多量体を形成する場合には、酵素１５ａのサイズ（径）は、多量体のサイズ（径）とすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
【００３１】
メソ多孔性シリカ１５ｂの比表面積は、例えば、２００〜１５００ｍ２程度である。
メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の深さは、２ｎｍ以上である。具体的には、好ましい深さの範囲は２０〜１０００ｎｍであり、より好ましい深さの範囲は５０〜５００ｎｍであり、最も好ましい深さの範囲は５０〜１５０ｎｍである。
メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔のピッチは、細孔のピッチを細孔の中心間の距離と定義すると、好ましいピッチは２〜５００ｎｍであり、より好ましいピッチは２〜１００ｎｍであり、最も好ましいピッチは２〜５０ｎｍである。
【００３２】
選択透過層１４は、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質を選択的に透過する層である。ここで、本実施形態では、酵素１５ａとして、基質と反応して過酸化水素を生成する酸化酵素を用いるので、所定の物質は、過酸化水素となる。
なお、選択透過層１４は、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質に応じて適宜任意に変更可能であり、例えば、本実施形態の場合（すなわち、所定の物質が過酸化水素である場合）は、ナフィオンからなる層を選択透過層１４とすることが好ましい。選択透過層１４は、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質を選択的に透過可能な層であれば良く、所定の物質を選択的に透過可能な分画分子量を有する層であっても良いし、所定の物質を選択的に透過可能なイオン交換機能を有する層であっても良いし、所定の物質を選択的に透過可能なように所定の分画分子量及び所定のイオン交換機能を有する層であっても良い。
【００３３】
電子伝達体層１３は、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質と電極１２（具体的には、作用電極１２１）との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む層である。
具体的には、電子伝達体層１３に含まれる電子伝達体としては、例えば、金属フタロシアニン、プルシアンブルー、メルドラブルー、カリウムフェロシアニド、フェリシアン化カリウム、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ＨＢＴ、ＡＢＴＳ、ビオルリン酸（violuric acid、Ｖｉｏ）、ＮＮＳ、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、４−アミノアンチピリン、ＨＯＢｔ等を用いることができる。
なお、電子伝達体層１３には、一種類の電子伝達体のみが含まれていても良いし、複数種類の電子伝達体が含まれていても良い。
【００３４】
液溜形成部１６は、分析領域（作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３が配置された平面視略円形状の領域）を取り囲む円筒状の部材である。基板１１の電極１２が形成された側の面上に液溜形成部１６を配置すると、液溜形成部１６の一方の開口端（下端）側が閉塞されるため、液溜形成部１６内に液体（例えば、検出対象物質（基質）を含む試料液）を溜めることができる。
【００３５】
ここで、本実施形態の酵素センサ１０によって、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応により生成する所定の物質を電気化学的に検出する原理の一例について、図５を参照して説明する。
図５は、検出対象物質（基質）を乳酸（Lactate）、メソ多孔体酵素層１５に含まれる酵素１５ａを乳酸オキシダーゼ、電子伝達体層１３に含まれる電子伝達体をコバルトフタロシアニンとした場合の原理である。
試料に基質（乳酸）が含まれている場合、メソ多孔体酵素層１５に含まれる酵素１５ａ（乳酸オキシダーゼ）は、当該基質（乳酸）と反応して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びピルビン酸（Pyruvate）を生成する。生成した過酸化水素は、選択透過層１４を透過して、電子伝達体層１３に含まれる電子伝達体（コバルトフタロシアニン）を介して効率的に電子（ｅ−）を電極１２（作用電極１２１）に渡し、酸素（Ｏ２）になる。この際、作用電極１２１と対電極１２２との間には、還元型のコバルトフタロシアニン（Ｃｏ＋ＰＣ）を酸化型のコバルトフタロシアニン（Ｃｏ２＋ＰＣ）に戻すために電流が流れる。当該電流の値（応答電流値）は、試料中の検出対象物質（基質）の量に比例するため、応答電流値を測定することにより、その測定された応答電流値から試料中の検出対象物質（基質）を検出又は定量することができる。
【００３６】
［酵素センサの製造方法］
次に、本実施形態の酵素センサ１０の製造方法の一例について説明する。
まず、基板１１上に、電極１２を形成する（電極形成ステップ）。具体的には、例えば、スクリーン印刷法によってガラスエポキシ基板等の基板１１上に所定の導電性インクを塗布して乾燥させることにより、基板１１上に電極１２（作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３）を形成する。なお、電極１２は、スクリーン印刷法によって形成されたものに限定されるものではなく、電極１２の形成方法は適宜任意に変更可能である。
【００３７】
次いで、電極（作用電極１２１）上に、電子伝達体層１３を形成する（電子伝達体層形成ステップ）。具体的には、例えば、カーボンインク等に電子伝達体を添加して電子伝達体含有インクを作製し、当該電子伝達体含有インクをスクリーン印刷法によって作用電極１２１上に塗布して乾燥させることにより、作用電極１２１上に電子伝達体層１３を形成する。なお、電子伝達体層１３は、スクリーン印刷法によって形成されたものに限定されるものではなく、電子伝達体層１３の形成方法は適宜任意に変更可能である。
【００３８】
次いで、基板１１の電極１２が形成された側の面のうち、分析領域（作用電極１２１、対電極１２２及び参照電極１２３が配置された平面視略円形状の領域）を除く部分に、絶縁膜１７を形成する（絶縁膜形成ステップ）。
次いで、絶縁膜１７上の、絶縁膜１７に形成された開口（分析領域を露出するための開口）の縁部に、円筒状の液溜形成部１６を固定する（液溜形成ステップ）。
【００３９】
次いで、電子伝達体層１３上に、選択透過層１４を形成する（選択透過層形成ステップ）。具体的には、例えば、ナフィオンやセルロース誘導体等のポリマーを所定の溶媒に添加してポリマー含有溶液を作製し、当該ポリマー含有溶液をスピンコート法によって電子伝達体層１３上に塗布して乾燥させることにより、電子伝達体層１３上に選択透過層１４を形成する。なお、選択透過層１４は、スピンコート法によって形成されたものに限定されるものではなく、選択透過層１４の形成方法は適宜任意に変更可能である。
【００４０】
次いで、選択透過層１４上に、メソ多孔体酵素層１５を形成する（メソ多孔体酵素層形成ステップ）。具体的には、例えば、酵素１５ａを含有する酵素溶液にメソ多孔性シリカ１５ｂを添加してシリカ含有酵素溶液を作製し、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に酵素１５ａを固定させるために当該シリカ含有酵素溶液を所定時間攪拌する。その後、当該シリカ含有酵素溶液にバインダー１５ｃ等を添加してシリカ・バインダー含有酵素溶液を作製し、そのシリカ・バインダー含有酵素溶液をスピンコート法によって選択透過層１４上に塗布して乾燥させることにより、選択透過層１４上にメソ多孔体酵素層１５を形成する。なお、メソ多孔体酵素層１５は、スピンコート法によって形成されたものに限定されるものではなく、メソ多孔体酵素層１５の形成方法は適宜任意に変更可能である。
【００４１】
以下、具体的な実施例によって本発明を説明するが、発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
最初に、乳酸オキシダーゼ（酵素１５ａ）を用い、試料に含まれる基質（乳酸）を検出又は定量するために過酸化水素（所定の物質）を電気化学的に検出する酵素センサ１０を作製した。
まず、スクリーン印刷法によってガラスエポキシ基板（基板１１）上にカーボンインクを塗布して６０℃で３０分間乾燥させることにより、作用電極１２１及び対電極１２２を形成するとともに、スクリーン印刷法によってガラスエポキシ基板（基板１１）上に銀／塩化銀インクを塗布して６０℃で３０分間乾燥させることにより、参照電極１２３を形成した。
ここで、本実施例では、１枚の基板１１から、酵素センサ１０（サイズ：縦１２ｍｍ×横２５ｍｍ）を複数得るために、１枚の基板１１に複数の電極１２を形成した。
【００４３】
次いで、カーボンインクにコバルトフタロシアニン（電子伝達体）を添加して電子伝達体含有インクを作製し、当該電子伝達体含有インクをスクリーン印刷法によって作用電極１２１上に塗布して６０℃で３０分間乾燥させることにより、電子伝達体層１３を形成した。
次いで、基板１１の電極１２が形成された側の面のうち、分析領域を除く部分に、絶縁性インクをスクリーン印刷法によって塗布し、その後、６０℃で３０分間乾燥させることにより、絶縁膜１７を形成した。
【００４４】
次いで、複数の電極１２等が形成された基板１１を、縦１２ｍｍ×横２５ｍｍの長方形に切断した。
次いで、絶縁膜１７上の、絶縁膜１７に形成された開口（分析領域を露出するための開口）の縁部に、円筒状の液溜形成部１６（サイズ：直径９．０ｍｍ×高さ１２ｍｍ×厚さ１．６ｍｍ）を固定した。
次いで、１０％ナフィオンをエタノールで希釈し、２．５％のアンモニアで中和してポリマー含有溶液（ナフィオン希釈液）を作製した。そして、当該ポリマー含有溶液を電子伝達体層１３上に２μＬ滴下し、スピンコーター（５００ｒｐｍ）で塗布して乾燥させることにより、ナフィオン層（選択透過層１４）を形成した。その後、ナフィオン層（選択透過層１４）の表面を蒸留水で洗浄した。
【００４５】
次いで、４０ｍｇの乳酸オキシダーゼ（酵素１５ａ）を４ｍＬのクエン酸バッファ（ｐＨ４．３）に溶解させて酵素溶液を作製し、当該酵素溶液に粉末状のメソ多孔性シリカ１５ｂを１００ｍｇ添加してシリカ含有酵素溶液を作製した。そして、当該シリカ含有酵素溶液を一晩ローテーターにて攪拌して、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に酵素１５ａが固定された乳酸オキシダーゼ−シリカ複合体を作製した。
ここで、本実施例で酵素１５ａとして用いる乳酸オキシダーゼの直径は約８ｎｍなので、本実施例では、メソ多孔性シリカ１５ｂとして、細孔のサイズが酵素１５ａのサイズとほぼ同等である、孔径８．０ｎｍのメソポーラスシリカＦＳＭ８．０を用いた。
また、本実施例では、１グラムの乳酸オキシダーゼ−シリカ複合体に、２３２．５ｍｇの乳酸オキシダーゼが固定されていることを確認した。
【００４６】
次いで、１０００μＬのシリカ含有酵素溶液（３２．５ｍｇの乳酸オキシダーゼ−シリカ複合体を含む）を２０％の変性ポバール溶液と混合して３０分程度攪拌し、その後、５０μＬの１０％アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）溶液を加えて５分程度攪拌して、シリカ・バインダー含有酵素溶液を作製した。そして、当該シリカ・バインダー含有酵素溶液をナフィオン層（選択透過層１４）上に２μＬ滴下し、スピンコーター（５００ｒｐｍ）で塗布して室温で３時間乾燥させることにより、メソ多孔体酵素層１５を形成した。その後、メソ多孔体酵素層１５の表面を蒸留水で洗浄することによって、メソ多孔性シリカ１５ｂの外表面に吸着している酵素（すなわち、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に固定されていない酵素）を洗い流した。
ここで、本実施例では、変性ポバール及びその架橋剤であるＡＤＨがバインダー１５ｃとして機能する。
【００４７】
次いで、作製した酵素センサ１０を、接続手段４０を介して電圧印加手段２０及び電流測定手段３０に接続することによって、検出装置１を作製した。
そして、作製した検出装置１を用い、アンペロメトリー法によって、本実施例で作製した酵素センサ１０を評価した。具体的には、液溜形成部１６内に９０μＬのリン酸バッファを滴下して電圧を印加し、電流値が安定するまで約１５０秒間待機した後、液溜形成部１６内に１０μＬの基質溶液（乳酸溶液）を滴下して応答電流値が安定するまで待機し、そして、安定した応答電流値を取得することによって、酵素センサ１０を評価した。
【００４８】
まず、本実施例で作製した酵素センサ１０の最適印加電圧値を求めた。
具体的には、リン酸バッファのｐＨを７．４とし、基質溶液の濃度（基質濃度）を１００μＭとして、応答電流値の印加電圧依存性を計測した。その結果を図６に示す。
図６に示すように、＋０．４Ｖ以下では応答電流値が小さいことが分かった。また、＋０．５Ｖ以上では定常電流値に到達するまでの時間が長すぎることも分かった。これにより、本実施例で作製した酵素センサ１０の最適印加電圧値として＋０．４５Ｖを選択した。
【００４９】
次に、本実施例で作製した酵素センサ１０の最適ｐＨを求めた。
具体的には、印加電圧値を＋０．４５Ｖとし、基質溶液の濃度を１００μＭとして、応答電流値のｐＨ（リン酸バッファのｐＨ）依存性を計測した。その結果を図７に示す。なお、図７の縦軸は、ｐＨ７．４での応答電流値を１００％とした場合の相対応答である。
図７に示すように、応答電流値はｐＨ７．０以下とｐＨ８．０以上とでは減少し、ｐＨ７．４付近で最大値をとることが分かった。これにより、本実施例で作製した酵素センサ１０の最適ｐＨ（至適ｐＨ）はｐＨ７．４付近であることが分かった。
【００５０】
次に、最適条件の下で、本実施例で作製した酵素センサ１０の感度の評価を行った。
具体的には、印加電圧値を＋０．４５Ｖとし、リン酸バッファのｐＨを７．４として、濃度が１．０μＭから２０００μＭまでの基質溶液（乳酸溶液）をそれぞれ滴下して、応答電流値を計測した。その結果を図８に示す。また、図８に基づき作成した検量線を図９に示す。
図９に示すように、本実施例で作製した酵素センサ１０は、１８．３μＭから１５００μＭまでの広い範囲で線形性を持つことが分かった。これにより、本実施例で作製した酵素センサ１０は、試料に含まれる検出対象物質（基質）の濃度が低濃度のために所定の物質の生成量が少ない場合でも、所定の物質を高感度に検出できる。その結果、本実施例で作製した酵素センサ１０を用いれば、試料に含まれる検出対象物質（基質）が１８．３μＭと低濃度であっても、検出対象物質（基質）を高精度に検出又は定量できることが分かった。これは、（１）検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質と作用電極１２１との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層１３を設けたこと、（２）メソ多孔性シリカ１５ｂの比表面積が非常に大きく酵素１５ａ（乳酸オキシダーゼ）を高密度に固定できること、（３）メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に酵素１５ａを固定することで酵素１５ａの活性が維持されていること、（４）最上位層がメソ多孔体酵素層１５であること、等の相乗効果によって得られたと考えられる。ここで、酵素センサ１０の感度には各層の形成順序が極めて重要であり、例えば、メソ多孔体酵素層１５の上に選択透過層１４を形成すると、基質のメソ多孔体酵素層１５への移動が選択透過層１４によって妨げられるため、感度が低下してしまう。
【００５１】
次に、最適条件の下で、本実施例で作製した酵素センサ１０の選択性の評価を行った。
具体的には、印加電圧値を＋０．４５Ｖとし、リン酸バッファのｐＨを７．４として、濃度が２００μＭの基質溶液（乳酸（L-Lactate）溶液）を滴下して、応答電流値を計測した。また、基質溶液に代えて、基質及び所定の物質（過酸化水素）以外の物質を含む溶液（濃度：２００μＭ）を滴下して、応答電流値を計測した。基質及び所定の物質（過酸化水素）以外の物質としては、アスコルビン酸（Ascorbic acid）、コレステロール（Cholesterol）、システイン（Cysteine）、グルコース（Glucose）、グルタミン酸（Glutamine acid）、尿素（Urea）、尿酸（Uric acid）をそれぞれ用いた。そして、基質溶液を滴下した時の応答電流値を１００％とした場合の相対応答を算出した。その結果を図１０に示す。
図１０に示すように、アスコルビン酸の相対応答は６．４％、尿酸の相対応答は２．３であり、通常は大きく干渉するアスコルビン酸や尿酸の影響を大幅に抑制できることが分かった。これにより、本実施例で作製した酵素センサ１０は、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質に対して高い選択性を有することが分かった。これは、（１）最上位にあるメソ多孔体層には高密度で酵素１５ａが固定化されているため、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質の生成量が少ない場合でも、大きな出力が得られ、検出対象物質に対する出力が相対的に大きくなること、（２）検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質を選択的に透過する選択透過層１４を設けたこと、（３）電子伝達体層１３を設けた（特に、電子伝達体としてコバルトフタロシアニンを含む電子伝達体層１３を設けた）ので過酸化水素の酸化が低電圧（＋０．４５Ｖ）で生じていること、等の相乗効果によって得られたと考えられる。
【００５２】
また、電子伝達体層１３と最上位にあるメソ多孔体層との組み合わせ効果を検証するために、（ａ）電子伝達体層１３を設けずに作用電極１２１上に直接ナフィオン層（選択透過層１４）を形成し、その上にメソ多孔性シリカ１５ｂを含まない酵素層を形成したセンサ（以下「比較用センサＡ」と称する。）と、（ｂ）作用電極１２１上に本実施例で作製した酵素センサ１０の場合と同様の方法で電子伝達体層１３とナフィオン層（選択透過層１４）とを形成し、その上にメソ多孔性シリカ１５ｂを含まない酵素層を形成したセンサ（以下「比較用センサＢ」と称する。）と、を作製した。
【００５３】
具体的には、メソ多孔性シリカ１５ｂを含まない酵素層は、３２．５ｍｇの乳酸オキシダーゼ（酵素１５ａ）を１０００μＬのクエン酸バッファ（ｐＨ４．３）に溶解させて酵素溶液を作製し、当該酵素溶液を２０％の変性ポバール溶液と混合して３０分程度攪拌し、その後、５０μＬの１０％アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）溶液を加えて５分程度攪拌して、バインダー含有酵素溶液を作製し、当該バインダー含有酵素溶液をナフィオン層（選択透過層１４）上に２μＬ滴下し、スピンコーター（５００ｒｐｍ）で塗布して室温で３時間乾燥させることにより形成した。
そして、本実施例で作製した酵素センサ１０の場合と同様の方法で、比較用センサＡ及び比較用センサＢの選択性の評価を行った。但し、比較用センサＡの印加電圧は＋０．７０Ｖ、比較用センサＢの印加電圧は＋０．４５Ｖとした。比較用センサＡの結果を図１１に、比較用センサＢの結果を図１２に示す。
【００５４】
図１１に示すように、比較用センサＡでは印加電圧が大きいために、他の電極活性物質の影響が大きく、選択性が悪いことが分かった。
また、比較用センサＢは、本実施例で作製した酵素センサ１０の場合（すなわち、酵素１５ａがメソ多孔性シリカ１５ｂに固定化されている場合）よりも乳酸に対する信号自体が小さく、図１２に示すように、選択性も十分でないことが分かった。
これにより、比較用センサＡや比較用センサＢと比較して、本実施例で作製した酵素センサ１０、すなわち、電子伝達体層と、高密度に酵素を固定化したメソ多孔体層と、を設けたセンサの場合は、選択性が大幅に増大しており、大きな効果が得られることが分かった。
【００５５】
以上説明した本実施形態の酵素センサ１０によれば、検出対象物質（基質）と反応して所定の物質を生成する酵素１５ａを用い、試料に含まれる検出対象物質（基質）を検出又は定量するために所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサ１０であって、電極１２と、電極１２（具体的には、作用電極１２１）上に形成され、当該電極１２（作用電極１２１）と所定の物質との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層１３と、電子伝達体層１３上に形成され、所定の物質を選択的に透過する選択透過層１４と、選択透過層１４上に形成され、酵素１５ａを含むメソ多孔体酵素層１５と、を備えている。
【００５６】
このように、本実施形態の酵素センサ１０は、最上位にあるメソ多孔体層に高密度で酵素１５ａが固定化されているため、試料に含まれる検出対象物質（基質）の濃度が低濃度のために所定の物質の生成量が少ない場合でも、大きな出力が得られ、所定の物質を高感度に検出することができる。さらに、検出対象物質に対する出力が相対的に大きくなるため、検出対象物質（基質）と酵素１５ａの反応によって生成する所定の物質の生成量も相対的に大きくなり、選択透過層１４と組み合わせることによって、選択性も大幅に向上する。また、電子伝達体層１３を備えているとともに最上位にあるメソ多孔体層には酵素１５ａが高密度に固定化されているため、本実施形態の酵素センサ１０を使用することで、低濃度の検出対象物質（基質）を高精度かつ高感度に検出又は定量することが可能となる。
【００５７】
また、以上説明した本実施形態の酵素センサ１０によれば、所定の物質は、過酸化水素であり、選択透過層１４は、ナフィオンからなる層である。
【００５８】
したがって、選択透過層１４が、高い選択性を有するので、妨害物質による影響が小さい高性能の酵素センサを実現することが可能である。
【００５９】
また、以上説明した本実施形態の酵素センサ１０によれば、メソ多孔体酵素層１５は、メソ多孔性シリカ１５ｂと、当該メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に固定された酵素１５ａと、からなる層であり、当該メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔のサイズは、酵素１５ａのサイズの０．５〜２．０倍である。
【００６０】
したがって、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に、酵素１５ａをしっかりと固定することができるので、酵素１５ａの立体構造の変化が防止され、優れた安定性を有し、且つ、長寿命の酵素センサを実現することが可能である。
また、メソ多孔性シリカ１５ｂは多孔質であり、比表面積が非常に大きい。したがって、メソ多孔性シリカ１５ｂを担体として用いると、高濃度に酵素１５ａを固定することができる。さらに、メソ多孔性シリカ１５ｂの細孔の内部に酵素１５ａをしっかりと固定することで、酵素１５ａは適度に分散された状態に維持されるため、酵素１５ａが凝集を起こして失活する等を回避することができる。すなわち、細孔のサイズが、酵素１５ａのサイズの０．５〜２．０倍に設定されているメソ多孔性シリカ１５ｂを担体として用いることで、高濃度に酵素１５ａを固定することができるとともに、酵素１５ａが凝集を起こして失活する等を避けることができるため、優れた感度を有する酵素センサを実現することが可能となる。
なお、メソ多孔体酵素層１５は、メソ多孔性シリカ１５ｂ以外のメソ多孔体（例えば、メソ多孔性カーボン）と、当該多孔質体の細孔の内部に固定された酵素１５ａと、からなる層であっても良い。この場合、当該多孔質体の細孔のサイズは、酵素１５ａのサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、酵素１５ａのサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、酵素１５ａのサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。
【００６１】
以上説明した本実施形態の酵素センサ１０の製造方法によれば、検出対象物質（基質）と反応して所定の物質を生成する酵素１５ａを用い、試料に含まれる検出対象物質（基質）を検出又は定量するために所定の物質を電気化学的に検出する酵素センサ１０の製造方法であって、基板１１上に、電極１２を形成する電極形成ステップと、電極１２（具体的には、作用電極１２１）上に、当該電極１２（作用電極１２１）と所定の物質との間の電子の受け渡しを促進するための電子伝達体を含む電子伝達体層１３を形成する電子伝達体層形成ステップと、電子伝達体層１３上に、所定の物質を選択的に透過する選択透過層１４を形成する選択透過層形成ステップと、選択透過層１４上に、酵素１５ａを含むメソ多孔体酵素層１５を形成するメソ多孔体酵素層形成ステップと、を有している。
したがって、使用することで低濃度の検出対象物質（基質）を高精度かつ高感度に検出又は定量することが可能となる酵素センサ１０を製造することができる。
【００６２】
また、以上説明した本実施形態の酵素センサ１０の製造方法によれば、電極形成ステップでは、スクリーン印刷法によって電極１２を形成し、電子伝達体層形成ステップでは、スクリーン印刷法によって電子伝達体層１３を形成し、選択透過層形成ステップでは、スピンコート法によって選択透過層１４を形成し、メソ多孔体酵素層形成ステップでは、スピンコート法によってメソ多孔体酵素層１５を形成する。
したがって、使用することで低濃度の検出対象物質（基質）を高精度かつ高感度に検出又は定量することが可能となる酵素センサ１０を、簡易かつ安価に製造することができる。
【００６３】
なお、今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【符号の説明】
【００６４】
１０  酵素センサ
１１  基板
１２  電極
１３  電子伝達体層
１４  選択透過層
１５  メソ多孔体酵素層
１５ａ  酵素
１５ｂ  メソ多孔性シリカ
【図１】
2013238398.tif 000003
【図２】
2013238398.tif 000004
【図３】
2013238398.tif 000005
【図４】
2013238398.tif 000006
【図５】
2013238398.tif 000007
【図６】
2013238398.tif 000008
【図７】
2013238398.tif 000009
【図８】
2013238398.tif 000010
【図９】
2013238398.tif 000011
【図１０】
2013238398.tif 000012
【図１１】
2013238398.tif 000013
【図１２】
2013238398.tif 000014