(57)【要約】【課題】骨芽細胞の増殖を促進させ、また、破骨細胞の分化ならびに破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を有するので、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化剤、及び該骨強化剤を含有する飲食品、飼料、医薬等の骨強化用製品を提供することを課題とする。【解決手段】ホエイタンパク質加水分解物を有効成分として含有することを特徴とする骨強化剤。特にホエイタンパク質加水分解物が分子量分布１０ｋＤａ以下でメインピーク２００Ｄａ〜３ｋＤａ、ＡＰＬ（平均ペプチド鎖長）は２〜８、遊離アミノ酸含量は２０％以下、及び、抗原性はβ−ラクトグロブリンの抗原性の１／１０，０００以下の特徴を有することにより、低アレルゲン性で、苦味の少ない骨強化剤とすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエイタンパク質加水分解物を有効成分とする骨強化剤。
【請求項２】
前記ホエイタンパク質加水分解物の分解率が２５％以上であることを特徴とする請求項１記載の骨強化剤。
【請求項３】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、以下の特徴を有するものである請求項１乃至２に記載の骨強化剤。
（Ａ）分子量が１０ｋＤａ以下、メインピークが２００Ｄａ〜３ｋＤａである。
（Ｂ）ＡＰＬ（平均ペプチド鎖長）は２〜８である。
（Ｃ）遊離アミノ酸含量が２０％以下である。
（Ｄ）抗原性がβ−ラクトグロブリンの抗原性の１／１０，０００以下である。
【請求項４】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をｐＨ６〜１０、５０〜７０℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする請求項１乃至３に記載の骨強化剤。
【請求項５】
前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をｐＨ６〜１０、２０〜５５℃においてタンパク質加水分解酵素を用いて酵素分解し、これを５０〜７０℃に昇温させ、ｐＨ６〜１０、５０〜７０℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて未分解のホエイタンパク質を熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする請求項１乃至３に記載の骨強化剤。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の骨強化剤を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨強化作用に優れ、骨芽細胞を増殖させ、また、破骨細胞の分化や該細胞による骨吸収を抑制する作用を有し、骨粗鬆症や骨折治療、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有効で、且つ苦みが少なく、安定性及び安全性に優れた骨強化剤に関する。本発明は、さらに該骨強化剤を含有する、骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、世界的規模で、高齢化等に伴い、骨粗鬆症や骨折あるいは腰痛などの種々の骨に関連する疾患が増加しており、大きな社会問題となっている。これは、カルシウムの摂取不足やカルシウム吸収能力の低下、閉経後のホルモンのアンバラスなどが原因であるとされている。骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防するためには、若齢期から骨芽細胞による骨形成を促進して体内の骨量をできるだけ増加させ、最大骨量や骨強度（骨密度＋骨質）を高めることが有効であるとされている。なお、骨質とは、骨の微細構造や代謝回転、微小骨折、石灰化を指すものである。また、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防する方法としては、破骨細胞による骨吸収を抑制することも考えられる。骨はバランスのとれた吸収と形成を絶えず繰り返している（リモデリング）が、閉経後のホルモンのバランス変化等により、骨吸収が骨形成を上回り、これが骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の原因となる。したがって、破骨細胞による骨吸収を抑制して骨強度を一定に保つことにより、結果的に骨を強化することが可能である。
【０００３】
このような現状から、骨を強化する目的で、炭酸カルシウムやリン酸カルシウム、乳酸カルシウムなどのカルシウム塩ならびに乳清カルシウムや牛骨粉、卵殻などの天然カルシウム剤を、それぞれ単独で医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取する、あるいは、これらのカルシウム剤をカゼインホスホペプチドやオリゴ糖などのカルシウム吸収促進効果を有する物質と共に医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取している。しかしながら、これらのカルシウム塩や天然カルシウム剤を飲食品に添加して摂取した場合、カルシウムの吸収率は50％以下であり、半分以上のカルシウムが吸収されず体外に排出されてしまうといわれている。また、体内に吸収されたカルシウムも、その形態や同時に摂取される他の栄養成分の種類によって骨への親和性が異なるので、必ずしも骨代謝の改善や骨強化作用を示さないこともある。
【０００４】
その他、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、女性ホルモン製剤や活性型ビタミンＤ3製剤 やビタミンＫ2製剤、ビスフォスフォネート製剤、カルシトニン製剤などが知られており、抗ＲＡＮＫＬ抗体などの新薬開発が進められている。しかし、これらの医薬品を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食欲不振などの副作用を伴うことがある。さらに、これらの物質は安全性及びコストなどの面から、現在のところ飲食品に添加することができない状況にある。したがって、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の疾病の性質から、長期的に経口摂取することができ、骨形成促進的及び／または骨吸収抑制的に作用して骨強度を高め、その予防または治療効果が期待できるような骨強化剤や骨強化剤を含有する飲食品、飼料の開発が望まれている。
【０００５】
乳タンパク質の加水分解物は、牛乳や乳製品における食物アレルギーを防止するために様々な商品に用いられている。特に、牛乳のホエイタンパク質は、母乳のタンパク質と異なり、アレルゲンになると考えられており、これを防止するためにホエイタンパク質を酵素で加水分解することが知られ、特許文献１や特許文献２、特許文献３が知られている。また、ホエイタンパク質には、株化骨芽細胞の増殖を促進すること（非特許文献１）や、卵巣摘出ラットにおいて骨破断強度を高めること（非特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平２−００２３１９
【特許文献２】特開平２−１３８９９１
【特許文献３】特開平４−１１２７５３
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biochemical and Biophysical Research Communication. 1996; 223: 445-449
【非特許文献２】Nutrition Research. 1997; 17: 1709-1720
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、安全性が高く、骨芽細胞の増殖を促進させ、また、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化剤を提供することを課題とする。また、本発明は、骨芽細胞の増殖を促進させ、また、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化剤を配合した骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討を進めたところ、ホエイタンパク質の加水分解物が骨強化作用を有することを見出した。
すなわち本発明は、以下の様態を含むものである。
（１）ホエイタンパク質加水分解物を有効成分とする骨強化剤。
（２）前記ホエイタンパク質加水分解物の分解率が２５％以上であることを特徴とする（１）記載の骨強化剤。
（３）前記ホエイタンパク質加水分解物が、以下の特徴を有するものである（１）乃至（２）記載の骨強化剤。
（Ａ）分子量分布は１０ｋＤａ以下、メインピーク２００Ｄａ〜３ｋＤａである。
（Ｂ）APL（平均ペプチド鎖長）は２〜８である。
（Ｃ）遊離アミノ酸含量が２０％以下である。
（Ｄ）抗原性がβ−ラクトグロブリンの抗原性の１／１０，０００以下である。
（４）前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をｐＨ６〜１０、５０〜７０℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする（１）乃至（３）に記載の骨強化剤。
（５）前記ホエイタンパク質加水分解物が、ホエイタンパク質をｐＨ６〜１０、２０〜５５℃においてタンパク質加水分解酵素を用いて酵素分解し、これを５０〜７０℃に昇温させ、ｐＨ６〜１０、５０〜７０℃において耐熱性のタンパク質加水分解酵素を用いて未分解のホエイタンパク質を熱変性させながら酵素分解し、加熱して酵素を失活させて得られるものであることを特徴とする（１）乃至（３）に記載の骨強化剤。
（６）（１）乃至（５）のいずれかに記載の骨強化剤を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の骨強化剤は、骨芽細胞の増殖を促進させ、また、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用が顕著であり、該骨強化剤は、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である。また、本発明の骨強化剤は、ホエイタンパク質を原料としているため、簡便且つ経済的に容易に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の骨強化剤の有効成分であるホエイタンパク質加水分解物は、例えば特許文献３に記載の方法によって得ることができる。この方法では、ホエイタンパク質をｐＨ６〜１０、５０〜７０℃とし、これに耐熱性のタンパク質加水分解酵素を加えて熱変性させながら酵素分解し、これを加熱して酵素を失活させることによって得られる。なお、上記酵素分解を行う前に、ホエイタンパク質をｐＨ６〜１０、２０〜５５℃においてタンパク質加水分解酵素を用いて酵素分解し、これを冷却することなく直ちに上記条件で酵素分解すると収率を一層高めることができる。    
【００１２】
また、上記のように調製したホエイタンパク質加水分解物を、分画分子量１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、好ましくは、２ｋＤａ〜１０ｋＤａの限外濾過（ＵＦ）膜及び/又は分画分子量１００Ｄａ〜５００Ｄａ、好ましくは１５０Ｄａ〜３００Ｄａの精密濾過（ＭＦ）膜から選ばれる方法で濃縮することも可能である。このような膜処理により、ホエイタンパク質加水分解物の平均分子量を３００〜５００Ｄａとすることによって、さらに苦味を軽減し、透明性を向上させることが可能である。
【００１３】
本発明におけるホエイタンパク質は、ウシやヤギ、ヒツジ、ヒト等の哺乳類の乳から調製したホエイ、その凝集物、粉末、あるいは精製タンパク質をいい、これを酵素反応させる時は水溶液の状態で使用する。
【００１４】
特許文献３に記載の方法によってホエイタンパク質加水分解物を調製する場合、前述の溶液をｐＨ６〜１０に調整するが、通常ホエイタンパク質はこの範囲のｐＨになっているので格別ｐＨの調整を行う必要はないが、必要な場合は、塩酸、クエン酸及び乳酸等の酸溶液あるいは苛性ソーダ、水酸化カルシウム及び燐酸ソーダ等のアルカリ溶液を用いてｐＨ６〜１０とする。加熱は５０〜７０℃で行うが、耐熱性のタンパク質加水分解酵素は、この温度で添加するよりも、むしろ加熱前から加え酵素分解を行った方が収率の面から好ましい。
【００１５】
また、一般的なプロテアーゼの至適温度は４０℃以下であるが、耐熱性のタンパク質加水分解酵素の至適温度は４５℃以上であり、耐熱性のタンパク質加水分解酵素としては、従来このような至適温度を有する耐熱性のタンパク質加水分解酵素として知られているものであれば特に制限なく使用できる。このような耐熱性のタンパク質加水分解酵素としては、パパイン、プロテアーゼＳ(商品名)、プロレザー(商品名)、サモアーゼ(商品名)、アルカラーゼ(商品名)、プロチンＡ(商品名)等を例示することができる。耐熱性のタンパク質加水分解酵素は、８０℃で３０分加熱して残存活性が約１０％あるいはそれ以上になるものが望ましい。また、単独よりも複数の酵素を併用する方が効果的である。反応は、３０分〜１０時間程度行うことが好ましい。
【００１６】
最後に、反応液を加熱して酵素を失活させる。酵素の失活は、反応液を１００℃以上で１０秒間以上加熱することにより行うことができる。
【００１７】
そして反応液を遠心分離して上清を回収し、上清を乾燥して粉末製品とする。なお、遠心分離した時に生ずる沈殿物は上清に比べ低アレルゲン化の程度が小さいので、これを除去した方が好ましいが、勿論反応液をそのまま乾燥して使用しても差し支えない。得られたホエイタンパク質加水分解物のＡＰＬ（平均ペプチド鎖長）は、ＴＮＢＳ（２， ４， ６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法等の方法によって測定することができる。また、ホエイタンパク質加水分解物の分子量分布は、Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＳＥＣ）法等の方法で測定することができ、その遊離アミノ酸含量は、７５％エタノール等で遊離アミノ酸を抽出して、アミノ酸分析装置等で測定することができる。さらに、ホエイタンパク質加水分解物の分解率は、遊離のアミノ基を修飾して測定するオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）法等で測定することができる。
【００１８】
本発明のホエイタンパク質加水分解物は、そのまま骨強化剤として使用してもよいが、必要に応じて、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることも出来る。また、さらに限外濾過(ＵＦ)膜や精密濾過（ＭＦ）膜処理により得られたホエイタンパク質加水分解物についても、そのまま骨強化剤として使用することも可能であり、そのまま乾燥しても使用できる。また、常法に従い、製剤化して用いることもできる。さらに、これらを製剤化した後に、これを栄養剤やヨーグルト、乳飲料、ウエハース等の飲食品、栄養組成物、飼料及び医薬品に配合することも可能である。
【００１９】
本発明の骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料及び骨強化用医薬品とは、このホエイタンパク質加水分解物のみを含む場合の他に、安定剤や糖類、脂質、フレーバー、ビタミン、ミネラル、フラボノイド、ポリフェノール等、他の飲食品、飼料及び医薬に通常含まれる原材料等を含有することができる。また、ホエイタンパク質加水分解物に加えて、他の骨強化作用を示す成分、例えば、ビタミンＤやビタミンＫ、大豆イソフラボン、乳塩基性タンパク質（ＭＢＰ）等とともに使用することも可能である。また、そのような骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を原材料として、他の飲食品等に通常含まれる原材料等を配合して調製することも可能である。
【００２０】
骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料及び骨強化用医薬品におけるホエイタンパク質加水分解物の配合量は、特に制限はないが、成人一人一日あたりホエイタンパク質加水分解物を２ｍｇ以上経口的に摂取させるためには、飲食品、飼料及び医薬の形態にもよるが、全質量に対して一般に０．００１〜１０％（重量/重量）、好ましくは０．１〜５％（重量/重量）含有していることが好ましい。
【００２１】
本発明の骨強化剤は、上記の有効成分に適当な助剤を添加して任意の形態に製剤化して、経口投与が可能な骨強化組成物とすることができる。製剤化に際して、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤又は賦形剤を用いることができる。賦形剤としては、例えばショ糖、乳糖、デンプン、結晶性セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシルメチルセルロースカルシウム等の１種又は２種以上を組み合わせて加えることができる。
【００２２】
以下に実施例、比較例及び試験例を示し、本発明について詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
ホエイタンパク質１０％水溶液１Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・ホエイタンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・ホエイタンパク質を加え、ｐＨ８に調整し、５５℃において６時間ホエイタンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収し、これを乾燥してホエイタンパク質加水分解物（実施例品１）を得た。得られたホエイタンパク質加水分解物の分子量分布は１０ｋＤａ以下、メインピークは１．３ｋＤａ、ＡＰＬは７．２、すべての構成成分に対する遊離アミノ酸含量は１８．９％であった。Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ法によってβ−ラクトグロブリンに対する抗原性の低下を測定したところ１／１０，０００以下で、分解率は２８％、収率（酵素反応液を遠心分離し、仕込み量の乾燥重量に対する上清の乾燥重量の比率（％））は８０．３％、苦味度は２であった。このようにして得られたホエイタンパク質加水分解物は、そのまま本発明の骨強化剤として使用可能である。
【実施例２】
【００２４】
ホエイタンパク質１０％水溶液１Ｌに、パパイン５０Ｕ／ｇ・ホエイタンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)１５０Ｕ／ｇ・ホエイタンパク質を加え、ｐＨ８、５０℃で３時間酵素分解を行った。これを５５℃に昇温させ、この温度で３時間維持し、タンパク質を変性させるとともに、タンパク質の酵素分解を行い、１００℃で１５秒間以上加熱して酵素を失活させた。この反応液を分画分子量１０ｋＤａのＵＦ膜(ＳＴＣ社製)及び分画分子量３００ＤａのＭＦ膜(ＳＴＣ社製)で処理を行い、濃縮液画分を回収し、これを乾燥してホエイタンパク質加水分解物（実施例品２）を得た。得られたホエイタンパク質加水分解物の分子量分布は１０ｋＤａ以下、メインピークは５００Ｄａ、ＡＰＬは３．０、すべての構成成分に対する遊離アミノ酸含量は１５．２％であった。Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ法によってβ−ラクトグロブリンに対する抗原性の低下を測定したところ１／１０，０００以下で、分解率は３２％、収率６５．４％、苦味度は２であった。このようにして得られたホエイタンパク質加水分解物は、そのまま本発明の骨強化剤として使用可能である。
【実施例３】
【００２５】
特開平４−６９３１５号公報で報告されている方法により、ホエイタンパク質の加水分解物を調製した。ホエイタンパク質１２０ｇを精製水１，８００ｍｌに溶解し、１Ｍカセイソーダ溶液でｐＨを７．０に調整した。次いで、６０℃で１０分間加熱して殺菌し、４５℃に保持してアマノＡ（天野エンザイム社製）２０ｇを添加し、２時間反応させた。８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、凍結乾燥し、ホエイタンパク質加水分解物（実施例品３）を得た。得られたホエイタンパク質加水分解物の分子量分布は１４ｋＤａ以下、メインピークは３．１ｋＤａ、ＡＰＬは１７．２、すべての構成成分に対する遊離アミノ酸含量は１３．２％であった。Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ法によってβ−ラクトグロブリンに対する抗原性の低下を測定したところ１／５，０００以下で、分解率は１８％、収率は８０．６％、苦味度は２であった。このようにして得られたホエイタンパク質加水分解物は、そのまま本発明の骨強化剤として使用可能である。
【実施例４】
【００２６】
特開平４−６９３１５号公報で報告されている方法により、ホエイタンパク質の加水分解物を調製した。ホエイタンパク質１２０ｇを精製水１，８００ｍｌに溶解し、１Ｍカセイソーダ溶液でｐＨを７．０に調整した。次いで、６０℃で１０分間加熱して殺菌し、４５℃に保持してアマノＡ（天野エンザイム社製）２０ｇを添加し、８時間反応させた。80℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、凍結乾燥し、ホエイタンパク質加水分解物（実施例品４）を得た。得られたホエイタンパク質加水分解物の分子量分布は１０ｋＤａ以下、メインピークは１．８ｋＤａ、ＡＰＬは１０．０、すべての構成成分に対する遊離アミノ酸含量は１９．３％であった。Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ法によってβ−ラクトグロブリンに対する抗原性の低下を測定したところ１／１０，０００以下で、分解率は２５％、収率は８０．６％、苦味度は２であった。このようにして得られたホエイタンパク質加水分解物は、そのまま本発明の骨強化剤として使用可能である。
【００２７】
[比較例１]
特開平４−６９３１５号公報で報告されている、以下のカゼインの加水分解物を調製し、比較試料とした。カゼイン２００ｇを精製水２，０００ｍｌに懸濁し、１Ｍカセイソーダ溶液でｐＨを８．０に調整して完全に溶解した。次いで、８０℃で１０分間加熱して殺菌し、５０℃に保持してパンクレアチンＦ（天野エンザイム社製）２０ｇ及びアマノＡ（天野エンザイム社製）２０ｇを添加し、１０時間反応させた。８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、凍結乾燥し、カゼイン加水分解物（比較例品１）を得た。得られたカゼイン加水分解物の分子量分布は１０ｋＤａ以下、メインピークは１．４ｋＤａ、ＡＰＬは７．８、すべての構成成分に対する遊離アミノ酸含量は１９．８％であった。Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ法によってβ−ラクトグロブリンに対する抗原性の低下を測定したところ１／１０，０００以下で、分解率は２７％、収率は７７．８％、苦味度は２であった。
【００２８】
[比較例２]
特開平４−６９３１５号公報で報告されている、以下のカゼインの加水分解物を調製し、比較試料とした。カゼイン２００ｇを精製水２，０００ｍｌに懸濁し、１Ｍカセイソーダ溶液でｐＨを８．０に調整して完全に溶解した。次いで、８０℃で１０分間加熱して殺菌し、４０℃に保持してパンクレアチンＦ（天野エンザイム社製）１５ｇを添加し、５時間反応させた。８０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、凍結乾燥し、カゼイン加水分解物（比較例品２）を得た。得られたカゼイン加水分解物の分子量分布は１２ｋＤａ以下、メインピークは２．５ｋＤａ、ＡＰＬは１３．８、すべての構成成分に対する遊離アミノ酸含量は１５．１％であった。Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ法によってβ−ラクトグロブリンに対する抗原性の低下を測定したところ１／５，０００以下で、分解率は２０％、収率は７９．１％、苦味度は２であった。
【００２９】
［試験例１］
(動物実験)
実施例品１、３、４のホエイタンパク質加水分解物及び比較例品１、２のカゼイン加水分解物を使用して、骨強化作用について評価した。実験には６週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスを使用した。生理食塩水を投与する群（Ａ群）、実施例品１のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重１ｋｇあたり２ｍｇ投与する群（Ｂ群）、実施例品１のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重１ｋｇあたり５ｍｇ投与する群（Ｃ群）、実施例品１のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重１ｋｇあたり１０ｍｇ投与する群（Ｄ群）、実施例品３のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重１ｋｇあたり１０ｍｇ投与する群（Ｅ群）、実施例品４のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重１ｋｇあたり１０ｍｇ投与する群（Ｆ群）、比較例品１のカゼイン加水分解物をマウス体重１ｋｇあたり１０ｍｇ投与する群（Ｇ群）、比較例品２のカゼイン加水分解物をマウス体重１ｋｇあたり１０ｍｇ投与する群（Ｈ群）の８試験群（各群１０匹ずつ）にわけた。それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して２週間飼育した。実施例品１、３、４及び比較例品１、２は、それぞれ生理食塩水に懸濁して、それぞれＢ〜Ｈ群に経口投与した。試験終了時に、マウスの右足の脛骨の骨密度を３ＤマイクロＸ線ＣＴ（（株）リガク）を用いて測定した。その結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
2013184961.tif 000002
【００３１】
この結果、２週間投与後の脛骨の骨密度は、実施例品１、３、４のホエイタンパク質加水分解物をマウス体重１ｋgあたり、それぞれ２ｍｇ以上経口投与した群では、対照群に比べ、有意に骨密度が上昇した。一方、比較例１、２のカゼイン加水分解物を１０ｍｇ経口投与した群では、対照群と同様の骨密度を示した。この結果から、本発明のホエイタンパク質加水分解物には骨強化作用があることがわかった。また、この骨強化作用は、ホエイタンパク質加水分解物をラット体重１ｋｇ当たり最低２ｍｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。
【００３２】
［試験例２］
（動物実験）
実施例品２のホエイタンパク質加水分解物及び比較例品１のカゼイン加水分解物を使用して、骨強化作用について評価した。実験には５１週齢のＳＤ系雌ラットを用いた。ラットを６匹ずつ６群に分け、５群は卵巣摘出手術を施し、残りの１群は疑似手術を施した。４週間の回復期間を設け、卵巣摘出手術を施したラットに実施例品２及び比較例品１をラット体重１ｋgあたり、それぞれ２ｍｇ、または、１０ｍｇになるよう１日１回ゾンデで経口投与する、あるは、いずれの実施例品や試験例品も含まない溶媒である生理食塩水のみを１日１回ゾンデで経口投与（対照群；０ｍｇ）して１６週間飼育した。また、４週間の回復期間の後、疑似手術を施したラットには、対照群と同様に、生理食塩水のみを１日１回ゾンデで経口投与（疑似手術群；０ｍｇ）した。投与終了後（１６週目）に、ラットの右大腿骨の骨強度を骨強度測定装置（ＲＸ−１６００、アイテクノ）により測定した。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
2013184961.tif 000003
【００３４】
この結果、実施例品２をラット体重１ｋgあたり、２ｍｇ、または、１０ｍｇ、１６週間経口投与した群では、対照群に比べ、有意に骨破断強度が上昇し、その値は疑似手術群と同レベルであった。一方、比較例品１をラット体重１ｋgあたり、２ｍｇ、または、１０ｍｇ、１６週間経口投与した群では、対照群と同様の骨破断強度を示した。この結果から、本発明のホエイタンパク質加水分解物には骨強化作用があることがわかった。また、この骨強化作用は、ホエイタンパク質加水分解物をラット体重１ｋｇあたり最低２ｍｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。
【００３５】
［試験例３］
実施例品１〜４のホエイタンパク質加水分解物及び比較例品１、２のカゼイン加水分解物について、骨芽細胞増殖効果を調べた。株化骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を９６穴の平板細胞培養プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地で２４時間培養した。培地を全て除いた後、ウシ胎児血清を含まないα−ＭＥＭ培地を９０μｌずつ添加し、実施例品１〜４及び比較例品１、２を１０μｌずつ添加して、さらに２４時間培養を続けた。Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）付属のブロモデオキリウリジン（ＢｒｄＵ）を添加し２時間培養後、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体と反応させ、基質である３,３',５,５'-テトラメチルベンジジンを添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することで、細胞内に取り込まれたＢｒｄＵ量を測定することにより骨芽細胞増殖活性を求めた。その結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
2013184961.tif 000004
【００３７】
この結果、培地に実施例品１〜４のホエイタンパク質加水分解物を添加した場合は、生理食塩水を培地に添加した場合に比べ、有意に骨芽細胞の増殖が促進した。一方、比較例品１、２のカゼイン加水分解物を培地に添加した場合は、骨芽細胞の増殖は認められなかった。この結果から、本発明のホエイタンパク質加水分解物には骨芽細胞の増殖促進作用があることがわかった。 
【００３８】
［試験例４］
実施例品１〜４のホエイタンパク質加水分解物及び比較例品１、２のカゼイン加水分解物について、破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた。５日齡のウサギの脛骨及び大腿骨を摘出し、軟組織を除去した後、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で機械的に細切した破骨細胞を含む全骨髄細胞を１０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように結晶性リン酸カルシウムプレート（Ｃｏｒｎｉｇ社製）のウェル上に撒き込み、培養した。培養２時間後に、新しい培地へと交換した後、実施例品１〜４及び比較例品１、２を溶解した溶液を１０％濃度となるように添加して７２時間培養した。そして、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加することで細胞を取り除いた後、リン酸カルシウムプレートのウェル上にできた骨吸収窩（ピット）を実体顕微鏡下で撮影し、画像解析によってその面積を測定することにより破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた（瀬野悍二ら，研究テーマ別動物培養細胞マニュアル，ｐｐ．１９９−２００， １９９３) 。その結果を表４に示す。
【００３９】
【表４】
2013184961.tif 000005
【００４０】
この結果、培地に実施例品１〜４のホエイタンパク質加水分解物を添加した場合は、生理食塩水を培地に添加した場合に比べ、有意にピットの面積が減少した。一方、比較例品１、２のカゼイン加水分解物を培地に添加した場合は、ピットの面積は減少しなかった。この結果から、本発明のホエイタンパク質加水分解物には破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があることがわかった。
【実施例５】
【００４１】
（骨強化用錠剤の調製）
表５に示す配合で原材料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して本発明の骨強化用錠剤を製造した。なお、この錠剤１ｇ中には、実施例品１のホエイタンパク質加水分解物が５０ｍｇ含まれていた。
【００４２】
【表５】
2013184961.tif 000006
【実施例６】
【００４３】
（骨強化液状栄養組成物の調製）
実施例品２のホエイタンパク質加水分解物５０ｇを４，９５０ｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫ ＲＯＢＯ ＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで３０分間撹拌混合して実施例品２ホエイタンパク質加水分解物含量５０ｇ／５ｋｇのホエイタンパク質加水分解物溶液を得た。このホエイタンパク質加水分解物溶液５．０ｋｇに、カゼイン５．０ｋｇ、大豆タンパク質５．０ｋｇ、魚油１．０ｋｇ、シソ油３．０ｋｇ、デキストリン１７．０ｋｇ、ミネラル混合物６．０ｋｇ、ビタミン混合物１．９５ｋｇ、乳化剤２．０ｋｇ、安定剤４．０ｋｇ、香料０．０５ｋｇを配合し、２００ｍｌのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機 (第１種圧力容器、ＴＹＰＥ: ＲＣＳ−４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所製)で１２１℃、２０分間殺菌して、本発明の骨強化用液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。なお、この骨強化用液状栄養組成物には、１００ｇあたり、実施例品２ホエイタンパク質加水分解物が１００ｍｇ含まれていた。
【実施例７】
【００４４】
（骨強化用飲料の調製）
脱脂粉乳３００ｇを４０９ｇの脱イオン水に溶解した後、実施例品１のホエイタンパク質加水分解物１ｇを溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ Ｔ−２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９，５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、酸味料２ｇ、還元水飴２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、本発明の骨強化用飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。なお、この骨強化用飲料には、１００ｍｌあたり実施例品１のホエイタンパク質加水分解物が１００ｍｇ含まれていた。
【実施例８】
【００４５】
（イヌ用骨強化飼料の調製）
実施例品２のホエイタンパク質加水分解物２ｋｇを９８ｋｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫ ＩＩ １６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで４０分間撹拌混合して実施例品２ホエイタンパク質加水分解物含量２ｇ／１００ｇのホエイタンパク質加水分解物溶液を得た。このホエイタンパク質加水分解物溶液１０ｋｇに大豆粕１２ｋｇ、脱脂粉乳１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、本発明のイヌ用骨強化飼料１００ｋｇを製造した。なお、このイヌ用骨強化飼料には、１００ｇあたり実施例品２ホエイタンパク質加水分解物が２００ｍｇ含まれていた。