(57)【要約】【課題】生物学的サンプル内で、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を過剰発現する形成異常細胞を、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を検出可能なレベルで発現する他の細胞から識別するための方法を提供すること。【解決手段】上記の方法は、少なくとも１つの単一の細胞内での少なくとも２つのマーカー分子の同時発現を、細胞学的試験手順または組織学的試験手順で決定する工程を包含し、ここで、少なくとも１つのマーカー分子は、ＩＮＫ４ａ遺伝子によってコードされる発現産物であって、かつ、少なくとも１つのさらなるマーカー分子は、細胞増殖マーカーであって、ここで、少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物の過剰発現およびこの単一の細胞内での検出可能なレベルでの活性な細胞増殖に対する少なくとも１つのマーカーの発現は、この細胞の形成異常状態の指標である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物と細胞増殖に関する少なくとも１つのマーカーとの同時検出に基づいた、形成異常（ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ）の改善された診断方法に関する。特に本発明は、それぞれの細胞の増殖特性を特徴付けるのに適したマーカーの検出によって、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を過剰発現する形成異常細胞を、形成異常せずにＩＮＫ４ａ遺伝子産物を過剰発現する細胞から識別する方法を提供する。増殖特性の特徴付けは、活発な細胞増殖に特徴的なマーカーもしくはマーカーのセットおよび／または遅延したかもしくは中断した細胞増殖に特徴的なマーカーもしくはマーカーのセットの検出を包含し得る。従って、本明細書に提示された方法は、組織学的かつ細胞学的な試料における形成異常の特異的な診断を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルにおけるｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現の検出は、肛門性器の病変（例えば、子宮頚の癌腫（特許文献１；非特許文献１を参照のこと））の検出において有用なマーカーであると証明されている。ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的免疫化学染色に基づいた方法は、組織切片および細胞学的サンプルにおける感度が良く、かつ特異的な形成異常細胞の同定を可能にする。
【０００３】
組織の免疫組織化学的検査において、形成異常細胞および新生物細胞は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体媒介性染色手順を使用して染色され得る。従って、新生物病変の組織学的な診断は、肛門性器病変における細胞の形質転換に特徴的な分子マーカーに基づいた染色手順によって支持される。これらの手順における、細胞が新生物細胞であるか否かの診断は、ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的染色に基づくだけでなく、組織学的情報にもまた依存している。
【０００４】
このことは、サンプルの約２０〜３０％において、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｔｉｃ）細胞が、ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体とある程度の免疫反応性を示し、従ってその手順の過程で染色されるという事実に起因する。しかし、これらの化生細胞から産生される染色パターンは、新生物病変から提供されるパターンとは異なる。化生細胞は、斑点状または限局的な染色パターンを生じるが、新生物病変は、散在性の染色パターンを生じる。さらに、化生細胞の染色強度は、大部分は、新生物細胞の染色強度より小さい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第００／０１８４５号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｌａｅｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２００１）９２、２７６〜２８４
【発明の概要】
【０００７】
形成異常および／または新生物形成の初期の検出のためのスクリーニング試験に使用される一般的な方法は、組織学に基づいた試験は使用せず、むしろ細胞学的な試験手順に依存している。しかし、特に、組織の構造に関する入手可能な組織学的な情報が存在しない場合（例えば、細胞学的試験において）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ過剰発現のみに関する試験は、偽陽性の結果につながり得る。これは、ｐ１６ＩＮＫ４ａを検出可能な程度に上昇したレベルで発現する化生細胞の画分は組織学的基準によっては分化し得ないためである。
【０００８】
ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現を示す細胞の割合は、形成異常の出現の過程で増加する。従って、新生物段階または前新生物（ｐｒｅ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）段階において、新生物細胞または前新生物細胞の制限された集団のみがサンプル中に存在する場合、ｐ１６ＩＮＫ４ａの免疫反応性は弱いこともある。この弱い免疫反応性は、化生細胞によって引き起こされるレベルとほぼ同じレベルとなることもある。形成異常のより後期の段階では、ｐ１６ＩＮＫ４ａの全体の免疫反応性は、より強く、そのため、新生物病変は、細胞学的試験形式においてでさえ、化生から容易に識別可能である。このことは、ｐ１６ＩＮＫ４ａを発現する化生細胞の存在が新生物細胞の存在と混同される場合、この手順は、偽陽性の結果を生じるという問題につながり得る。
【０００９】
特にスクリーニング試験において、初期段階の新形成の検出が望ましい場合、この状態は、全く好ましくない。このことは、ｐ１６ＩＮＫ４ａに基づいた診断が組織学的試験における有用なツールであることが証明され、そして、細胞学に基づいたスクリーニング手順における適用がこれらの確立された手順を向上し得るので、特にあてはまる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
細胞学的試験形式における偽陽性の結果を減少させるためおよびｐ１６ＩＮＫ４ａに媒介される肛門性器病変の診断の忠実度をさらに向上させるために、新生物病変および形成異常病変から化生病変を識別する方法が所望される。新生物病変および前新生物病変から化生病変を識別するための方法は、本発明に基づいて特許請求された実施形態において提供される。
【００１１】
ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現に基づいた試験手順における新生物病変からの化生の識別を支持するために、新生物の細胞および組織ならびに／または前新生物の細胞および組織で発現し、かつ、１つの化生細胞内でＩＮＫ４ａ遺伝子産物と同時に発現しないマーカー分子が所望される。
【００１２】
当該分野に存在する問題の解決策が、本発明に基づいて特許請求された方法によって提供される。本発明につながる実験の過程において、本発明者らは、細胞増殖に対する少なくとも１つのマーカー（例えば、Ｋｉ６７、Ｋｉ−Ｓ２、ｍｃｍ５またはｍｃｍ２）と組み合わせたｐ１６ＩＮＫ４ａの存在または非存在の検出および／またはｐ１６ＩＮＫ４ａのレベルの検出の組み合わせが、当該分野に存在する問題を解決し得ることを発見した。
【００１３】
形成異常の改善された診断のための分子マーカーの組合せの使用に関する、当該分野における２、３の文書が存在する。ＷＯ０２０８７６４において、ＨＰＶマーカーと細胞増殖またはウイルス活性に対するマーカーとの組合せを使用する子宮頚悪性腫瘍の改善された診断のための方法が開示される。ｐ１６ＩＮＫ４ａは、この発明との関連において、ＨＰＶマーカーと組み合わせられるべきウイルス活性マーカーとして言及されている。
【００１４】
ＥＰ１２１７３７７において、１つより多いマーカー分子の検出によって媒介される子宮頚悪性腫瘍の自動検出のための方法が開示される。いくつかの規定されたマーカーの組合せは、この文書内で挙げられる。この文書には、組合せに対する適切なマーカーの選択に関する開示は存在しない。この適用における組合せの目的は、生物学的細胞学的試料における染色パターンの自動化された分析の忠実度を改善することである。この文書は、ｐ１６ＩＮＫ４ａと他の腫瘍マーカーとの組合せにも言及している。
【００１５】
ＷＯ０２０５９６１６は、子宮頚悪性腫瘍の改善された診断のための細胞周期の乱れの検出方法を開示する。この文書は、形成異常細胞が、細胞周期制御における乱れを示すので、細胞におけるＧ１後物質と一緒にサイクリンＥ型タンパク質を検出する手段によって同定され得ることを開示する。
【００１６】
「Ｋｉ６７，Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ，ａｎｄ  ｐ１６ＩＮＫ４ａ  Ａｒｅ  Ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ」（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２５（７）：８８４〜８９１、２００１）において、Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｋｅａｔｉｎｇは、子宮頚形成異常の診断の過程におけるｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｋｉ６７およびサイクリンＥの使用の相補性を開示する。この文書は、形成異常および状態の検出における各単一マーカーの問題を言及し、細胞学的試料が試験下に存在する場合には特に、サイクリンＥと組み合わせたｐ１６ＩＮＫ４ａが単一マーカー分子の欠点を克服するために適している場合があると言及している。増殖細胞に特徴的なマーカー（例えば、Ｋｉ６７）と合わせたｐ１６ＩＮＫ４ａの使用を教示する開示は、示されていない。この文書は、診断方法における使用のためのｐ１６ＩＮＫ４ａの組合せを教示しない；さらに、この開示は、子宮頚の鑑別診断におけるＫｉ６７の限定された使用に関係し、従って、子宮頚悪性腫瘍の診断におけるこのマーカーの使用から離れて教示する。
【００１７】
当該分野では、ｐ１６ＩＮＫ４ａポジティブ非形成異常細胞をｐ１６ＩＮＫ４ａポジティブ形成異常細胞から識別するための改善された識別方法に使用するための、ｐ１６ＩＮＫ４ａを細胞増殖に特徴的なマーカーと組み合わせた使用を教示する開示は存在しない。ＷＯ０２０５９６１６は、形成異常細胞増殖の検出におけるｐ１６ＩＮＫ４ａの使用についてのてがかりを与えない。ＥＰ１２１７３７７は、分析プロセスの自動化以外に、検出の過程における腫瘍マーカーの組合せの目的を教示しない。子宮頚試料における、例えば、化生細胞からの形成異常細胞の識別のような特異的な識別目的についての組合せの利点に関係する開示は存在しない。
【００１８】
本発明の発明者らは、種々の形成異常において過剰発現するｐ１６ＩＮＫ４ａがいくつかの他の非形成異常細胞においても検出され得るという当該分野に存在する欠点を克服することを追求した。非形成異常ｐ１６ＩＮＫ４ａポジティブ細胞とｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する形成異常細胞との間の識別は、それぞれの細胞の増殖特徴に基づいたものであり得る。正常に制御された細胞では、ｐ１６ＩＮＫ４ａはｃｄｋ４を阻害し、従って増殖を阻害する。対照的に、形成異常細胞では、この調節は、弱められる。従って、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、その極めて高い発現レベルにも関わらず、細胞増殖の阻害を導かない。
【００１９】
本発明の発明者らは、ｐ１６ＩＮＫ４ａと細胞増殖に特徴的なマーカーとの同時検出によって、形成異常細胞が制御された細胞増殖を示す細胞から識別され得ることを見出した。正常細胞において、ｐ１６ＩＮＫ４ａの上昇したレベルが細胞増殖を阻害するという事実に起因して、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する細胞は、それらが活発な細胞増殖の特徴を示す場合、形成異常であるとして分類され得る。
【００２０】
本発明は、細胞増殖マーカーと同時にｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子を生物学的サンプル中で発現する細胞の存在または非存在の検出に基づいた組織学的試験手順または細胞学的試験手順において、生物学的サンプル中の新生物病変、前新生物病変および／または形成異常病変を、上昇したレベルのｐ１６ＩＮＫ４ａを示す非形成異常細胞から識別するための方法に関する。細胞増殖に対して適したマーカーは、例えば、Ｋｉ６７、Ｋｉ−Ｓ２、Ｋｉ−Ｓ５、ｍｃｍ５またはｍｃｍ２であってもよい。本発明の１つの実施形態において、細胞増殖に対するマーカーのタンパク質またはｍＲＮＡは、サンプルにおける初期形成異常病変または前新生物病変からの化生の識別のためのマーカーとして役目を果たし得る。
【００２１】
本発明の１つの局面は、生物学的サンプルにおいて、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を過剰発現する形成異常細胞を、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を検出可能なレベルで発現する他の細胞から識別するための方法を提供することであり、この方法は、細胞学的試験手順または組織学的試験手順において、少なくとも１つの単一細胞内で同時発現する少なくとも２つのマーカー分子を決定する工程を包含し、ここで、少なくとも１つのマーカー分子は、ＩＮＫ４ａ遺伝子によってコードされる発現産物であって、かつ、少なくとも１つのさらなるマーカー分子は細胞増殖マーカーであって、ここで、少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物の過剰発現およびこの単一細胞内の免疫化学的に検出可能なレベルでの活発な細胞増殖に対する少なくとも１つのマーカーの発現は、細胞の形成異常の指標であって、ここで、この単一の細胞内での少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物の過剰発現および老化、細胞分化の終点、アポトーシスまたは細胞周期の停止に対する少なくとも１つのマーカーの検出可能なレベルでの発現は、細胞の非形成異常状態の指標である。
【００２２】
本発明の第２の局面は、本明細書に開示された方法に基づいて、サンプル中の形成異常を決定するための試験キットに関する。
【００２３】
本発明につながる実験の間に、特定の状況下で、非形成異常細胞はｐ１６ＩＮＫ４ａに対する免疫反応性を示し得ることが見いだされた。発明者らは、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物のレベルの上昇に反応して、細胞増殖の順序付けた制御を示すこれらの細胞が、成長停止を受けることを見出した。従って、これらの個々の細胞は、細胞増殖のマーカーに対して免疫反応性を示さない。対照的に、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する形質転換した細胞は、細胞増殖の無調節な制御を示し、増殖の停止によってｐ１６ＩＮＫ４ａの上昇したレベルには反応しない。従って、これらの形成異常細胞は、細胞増殖に対するマーカーとｐ１６ＩＮＫ４ａとの同時発現を示す。従って、発明者らはｐ１６ＩＮＫ４ａと細胞増殖に対するマーカーとの同時検出が、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する停止した細胞（例えば、化生細胞）から形成異常細胞を識別するのに役立ち得ることを見出した。
【００２４】
種々の形成異常におけるｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現は、他のいくつかの非形成異常細胞でもまた検出され得るという発見により、本発明の発明者らは、それぞれの細胞の増殖特徴に基づいて、非形成異常ｐ１６ＩＮＫ４ａポジティブ細胞とｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する形成異常細胞とを識別する技術を確立した。正常に制御された細胞では、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、ｃｄｋ４を阻害し、従って細胞増殖を阻害するのに対して、形成異常細胞では、これはあてはまらない。従って、形成異常細胞において、ｐ１６ＩＮＫ４ａはその極めて高い発現レベルにも関わらず、細胞増殖の阻害をもたらさない。
【００２５】
本明細書に開示された方法は、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物（例えば、ｐ１６ＩＮＫ４ａ）の細胞増殖に特徴的なマーカーとの同時検出によって、形成異常細胞が、正常に制御された細胞増殖を示す細胞から識別され得るという事実に基づいている。
【００２６】
用語マーカーならびにマーカー分子とは一般的に、本明細書中では、増殖マーカー遺伝子発現産物ならびにＩＮＫ４ａ遺伝子発現産物に関して使用される。
【００２７】
本文を通して遺伝子に対して示される名称は一部、任意の生物体から発見された遺伝子またはタンパク質に関する。本発明との関連では、この名称は、本明細書で開示された方法について特に問題になっている生物体内の指定されたマーカーのそれぞれの相同物を与える。本発明の特定の実施形態において、この生物体は哺乳動物であって、１つの実施形態では、ヒトであり得る。本発明のこのような１つの実施形態では、指定されたマーカーは、それぞれの名称のマーカーのヒトホモログである。
【００２８】
一般的に、本文を通して、種々の文法形態の用語「（細胞）増殖マーカー」または「細胞増殖のためのマーカー」は、タンパク質マーカーならびに核酸マーカーを称するために使用される。マーカー（例えば、「複製タンパク質」）のタンパク質名称が本明細書中で使用される場合、この使用は、換喩的であり、かつ特定のタンパク質をコードする核酸マーカー分子についてのタンパク質に関係することも理解される。
【００２９】
本発明に基づく有用なマーカーは、遺伝子から転写された任意の分子かまたはそのような転写産物から翻訳された任意の分子であり得る。従って、本発明に関して使用される遺伝子産物としては、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）およびポリペプチド（例えば、タンパク質、プロテオグリカン、ペプチドなど））が挙げられ得る。本発明に関して使用される発現産物（単数または複数）としては、任意のリーディングフレーム、スプライシング改変体を含む順方向または逆方向の遺伝子座の任意の転写産物が挙げられる。従って、本明細書中で使用される場合、発現産物は、特定の遺伝子座の核酸によってコードされる任意の別の産物を含む。
【００３０】
本発明に関して使用される場合、ＩＮＫ４ａをコードする遺伝子産物とは、ＩＮＫ４ａ遺伝子座から転写された任意のｍＲＮＡかまたはこのようなｍＲＮＡから翻訳された任意のポリペプチドであり得る。本発明の１つの実施形態において、ＩＮＫ４ａ遺伝子によってコードされる発現産物は、約５〜４０ｋＤａの分子量またはその間の任意の値の分子量を示し、好ましくは、約１０〜２０ｋＤａまたはその間の任意の値の分子量を示し、最も好ましくは、約１４〜約１９ｋＤａまたはその間の任意の値の分子量を、それぞれ示し得る。
【００３１】
本発明に基づいた方法に適したＩＮＫ４ａ遺伝子産物としては、例えば、遺伝子産物（例えば、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ１４ＡＲＦ）が挙げられ得る。
【００３２】
本発明に関して使用される場合、用語「（細胞）増殖マーカー」または「細胞増殖に関するマーカー」は、細胞の増殖状態に特徴的である当該分野で公知の任意のマーカー分子を含み得る。増殖状態は例えば、遅延した細胞増殖、停止した細胞増殖、老化した細胞、分化末期の細胞、アポトーシス細胞などの活発に増殖する細胞の状態であり得る。本発明の１つの実施形態において、細胞増殖マーカーは、活発な細胞増殖に特徴的なマーカー分子である。本発明の別の実施形態において、増殖マーカー分子は、停止した細胞、分化末期の細胞、老化細胞またはアポトーシス細胞に対して特徴的な分子であり得る。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明に関して使用される増殖マーカーは、ＤＮＡ複製に関与する遺伝子（例えば、前開始複合体のタンパク質または複製フォークのタンパク質）を含み得る。このような分子としては、例えば、真核生物のヘリカーゼまたはＭＣＭタンパク質（ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７）、ＷＯ００５０４５１およびＷＯ０２１７９４７に開示されるタンパク質ＴＰ（ＨＥＬＡＤ１、Ｐｏｍｆｉｌ２、Ｕｎｃ−５３とも称される）、複製プロセスに関与するキナーゼまたはホスファターゼ（例えば、ＣＤＣ６プロテインキナーゼ、ＣＤＣ７プロテインキナーゼ、Ｄｂｆ４プロテインホスファターゼ、ＣＤＣ１４プロテインホスファターゼ、ＣＤＣ４５およびＭＣＭ１０が挙げられ得る。さらなる増殖マーカーとしては、進行中の複製フォークに関与するタンパク質（例えば、ＰＣＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼδ、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）、複製因子Ｃ（ＲＦＣ）、ＦＥＮ１）が挙げられ得る。
【００３４】
他の実施形態において、増殖マーカーは、細胞増殖の維持に必要な分子（例えば、Ｋｉ６７、Ｋｉ−Ｓ５またはＫｉ−Ｓ２）を含み得る。この実施形態において、タンパク質は、例えば、細胞周期全体を通して存在し得る。それらが活発な細胞増殖に特徴的であって、かつ、停止状態の細胞、分化末期状態の細胞、アポトーシス細胞または老化状態の細胞では顕著に発現しない場合、それらは、本発明に基づいた方法を実施するために有用である。本明細書で使用される場合、Ｋｉ６７、Ｋｉ−Ｓ２およびＫｉ−Ｓ５は、それぞれの抗体ならびにこれらの抗原をコードする核酸によって検出されるタンパク質マーカー分子を称する。
【００３５】
別の実施形態において、本発明に基づいた方法において使用するための細胞増殖マーカーは、遅延したかまたは停止した細胞増殖に特徴的なマーカー分子（例えば、老化マーカー、細胞周期停止マーカー、分化末期細胞に特徴的なマーカーまたはアポトーシスマーカー）であり得る。このような分子としては、例えば、ｐ２１、ｐ２７、カスパーゼ、ＢＡＤ、ＣＤ９５、ｆａｓリガンド、ｐａｒｐタンパク質などが挙げられる。
【００３６】
本発明に関して使用される場合、識別とは、サンプルが１つの方向または別の方向のどちらに分類されるかの評価を含む。本発明の１つの実施形態において、識別は、組織または組織の構成要素が形成異常であるかまたは形成異常ではないかの評価に関する。従って、識別は、本明細書で使用される場合、生物学的サンプルの細胞の増殖特徴についての判断である。
【００３７】
本発明の１つの実施形態において、識別は、活発な細胞増殖に特徴的なマーカーの発現の検出と同時に行なうＩＮＫ４ａ遺伝子産物の発現の検出を含む。この場合、両方のマーカー分子を同時発現する細胞は、形成異常として分類される。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、識別は、静止したか、停止したかまたは遅延した細胞増殖に特徴的なマーカーの発現の検出と同時に行なうＩＮＫ４ａ遺伝子産物の検出を含む。この場合、両方のマーカー分子を同時発現する細胞は、非形成異常として分類される。
【００３９】
本発明の特定の実施形態において、２つより多いマーカー分子の存在もしくは非存在および／またはそのレベルを検出することが有用である。１つの実施形態において、１つのＩＮＫ４ａ遺伝子発現産物は、細胞増殖に対する２つ以上のマーカーと合わせて検出される。このことは、サンプル中のＩＮＫ４ａ遺伝子産物を発現する細胞の増殖特性の同定を向上させるのに有用である。いくつかの増殖マーカーは、細胞周期の特定の相に限定されるかまたは細胞に少量しか存在しない。この事実のために、いくつかの場合、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を発現する増殖細胞の検出は、２つ以上の増殖マーカーの検出によって改善され得る。このような場合、例えば、増殖性細胞周期全体の間に発現される１つの増殖は、特異的細胞周期相に特徴的であるマーカーと同時に検出され得る。例えば、Ｋｉ６７、ＫｉＳ５またはＫｉ−Ｓ２は、ｍｃｍ５、ｍｃｍ２、ＰＣＮＡ、ｒｐＡ、ｒｆＣなどと一緒に検出され得る。他の場合には、例えば、ＤＮＡ複製に関与するタンパク質は、Ｋｉ６７、Ｋｉ−Ｓ５またはＫｉ−Ｓ２と一緒に検出され得る。なお別の場合には、Ｋｉ６７は、Ｋｉ−Ｓ２と一緒に検出され得る。これらの例は、例示的な組合せの可能性を意図し、包括的ではないことが理解されるべきであり、そのため、増殖マーカーの他の種々の組合せが同様に有用であり、本発明に基づいた方法の手順において適していることが理解されるべきである。
【００４０】
場合によっては、２つ以上の細胞増殖マーカー分子の組合せが、本明細書に開示された方法に適用され得る。別の実施形態において、細胞周期のより長い期間にわたってまたは全細胞周期にわたってでさえ、または活発に増殖する細胞において検出され得る２つ以上のマーカー分子は、本明細書に開示された方法と合わせて検出され得る。１つより多い細胞増殖マーカー分子の組合せは、一般的に、細胞の増殖特性の検出の感受性の改善に対して有用であり得る。
【００４１】
本発明の特定の実施形態において、組合せはさらに、他のマーカー分子（例えば、老化マーカー分子、停止細胞に対するマーカー、分化末期細胞に対するマーカー、アポトーシス細胞に対するマーカー、ウイルス感染に対するマーカーもしくは細胞内のウイルス活性に対するマーカーまたはマーカーとしての細胞周期調節タンパク質）を含み得る。ＨＰＶ感染と関連する形成異常を伴なう特定の実施形態において、ＨＰＶと関連したマーカー分子またはウイルス活性に対するマーカーの検出は、形成異常の検出のために有用であり得る。サンプルのＨＰＶ感染の検出に有用な方法は、当業者に公知である。これらの方法は、ＨＰＶ薬剤に特異的なプローブを使用する方法を包含し得るか、または、核酸増幅反応を使用し得る。ウイルス感染の検出は、ＩＮＫ４ａおよび増殖マーカー分子の検出と同時に、またはそれに続いて実施され得る。
【００４２】
本発明に関して使用される場合、形成異常とは、軽い形成異常から重篤な形成異常およびその前段階、ならびに癌腫（例えば、インサイチュ癌腫または浸潤癌腫および散在する腫瘍細胞）をいう。従って、形成異常とは、本明細書中で使用される場合、初期段階および前段階の形成異常および癌腫も含む。
【００４３】
形成異常なし（本明細書中で使用される場合、非形成異常の）でＩＮＫ４ａ遺伝子産物を過剰発現する細胞は、本明細書中で言及される場合、例えば、化生細胞、老化細胞、分化末期細胞、上昇したレベルのＩＮＫ４ａ遺伝子産物を示す細胞周期の特定の段階の細胞を含み得る。特定の細胞において、上昇したレベルのＩＮＫ４ａ遺伝子産物はさらに、外部シグナル（例えば、ホルモン、伝達物質など）に対する反応として誘発され得る。本発明の１つの実施形態において、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を過剰発現する非形成異常細胞としては、例えば、化生細胞、子宮内膜細胞などが挙げられる。
【００４４】
ＩＮＫ４ａをコードする遺伝子産物および／または本発明に基づく増殖マーカー遺伝子産物の発現レベルの検出方法は、例えば、生物学的サンプルにおける非常に少量の特異的生物学的分子の検出に適し得る任意の方法である（しかし、必ずしもその必要はない）。本発明に基づいた検出反応は、核酸のレベルの検出かまたはポリペプチドのレベルの検出のどちらかである。
【００４５】
本発明に関して使用される場合、マーカー分子は、そのマーカーが適切な検出手順（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫化学染色、ハイブリッドキャプチャーアッセイ（ｈｙｂｒｉｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ）など）の過程において検出され得るならば、検出可能であると言われる。マーカー分子の発現のレベルは、適切なレポーター反応（例えば、色素に基づいた（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｂａｓｅｄ）免疫化学染色もしくは蛍光に基づいた免疫化学染色または顕微鏡分析または自動化分析のためのインサイチュハイブリダイゼーション手順）を用いて検出可能になされ得る。当業者に公知のレポーターシグナルを増強するための適切な方法が、本発明に基づく方法の過程において適用され得る。従ってそのマーカーは、染色が、意味のある染色結果を産生するための免疫化学染色手順において本質的に得られるそれぞれのバックグラウンド染色に取って代わる場合、検出可能であると言われる。
【００４６】
マーカー分子は、これらの分子を特異的に識別する試薬を使用して検出され得る。ＩＮＫ４ａ遺伝子産物および／または増殖マーカー遺伝子産物に対する検出反応は、初期マーカー分子を識別するかまたは他の分子を識別するために使用される先行分子を識別するかのどちらかの検出試薬との１つ以上の反応を含み得る。
【００４７】
本発明の特定の実施形態において、１つの単一のマーカー分子の検出のために、２つ以上のプローブが使用され得る。例えば、２つ以上の異なった結合物質（例えば、抗体）または１つの単一のマーカー分子に対して指向されたオリゴヌクレオチドプローブ（異なったエピトープまたは異なった配列に対して指向され得る場合）が本明細書に開示された方法の過程において使用され得る。
【００４８】
異なった遺伝子産物の検出は、１つの反応容器もしくは封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）、または種々の封じ込めを同時にもしくは後に使用して実施され得る。従って、異なった遺伝子産物が、両方の産物を同時に発現する１つの細胞で同時に検出され得る。他に、細胞において単一のマーカーをそれぞれ検出するために、遺伝子産物を同時に発現する細胞が、分離検出反応（空間的、または時間的に分離）に使用され得る。別の実施形態では、どれか１つのマーカーを発現する細胞が存在し得る。種々の細胞におけるマーカー分子の検出も、時間および／または空間において、同時に、または別々に実施され得る。
【００４９】
検出反応はさらに、マーカー分子遺伝子産物の存在もしくは非存在および／またはそのレベルを示すレポーター反応を含み得る。レポーター反応は、例えば、着色化合物を産生する反応、生物発光反応、蛍光反応、一般に、放射線放射反応などであり得る。
【００５０】
特定の実施形態において、種々のレポーターシグナルを産生する薬剤によって種々のマーカー分子が識別され得、従ってシグナルとは、識別され得るマーカー分子をいう。本発明の１つの好ましい実施形態において、２つ以上のＩＮＫ４ａ遺伝子産物および／または増殖マーカー遺伝子産物の発現の検出は、同時に行なわれる。この場合、レポーター反応は、例えば、種々の検出される分子に対する種々の蛍光標識を使用し得る。
【００５１】
しかし、本発明に関して、どれか１つの増殖マーカーまたはＩＮＫ４ａマーカー遺伝子産物が細胞で発現しているか否かについて必ずしも回答しなくてもよい。特定の実施形態において、問題は、何らかの増殖マーカーおよび／またはＩＮＫ４ａ遺伝子産物が発現するか否かである。そのような実験の過程において、増殖マーカーの存在の指標として同一の蛍光シグナルを生じる手順が選択され得る。この手順は、細胞増殖特徴（活発な細胞増殖に対して特徴的な種々のマーカー）の検出感度を改善するために適切である。場合によっては、その手順は、細胞増殖に特徴的である３つ、４つまたはそれより多いマーカー分子に対する１つの検出可能なシグナルを与えるために適用され得る。類似または同一の手順が、特定の条件下では、ＩＮＫ４ａ遺伝子発現産物にあてはまり得る。場合によっては、種々の増殖マーカー分子に対する種々の染色シグナルが所望され得ることが理解されるべきである。この手順は、それぞれの実験の必需品に適用され得る。
【００５２】
本発明の特定の実施形態において、１つ以上（例えば、２つの異なる）ＩＮＫ４ａ遺伝子産物の組合せは、１つ以上、例えば、２つのセット、３つのセット、４つのセット、５つのセットまたはそれより多いセットの細胞増殖に対するマーカーの組合せを用いて検出され得る。場合によっては、細胞増殖に対するマーカー分子の検出は、１つのレポーターシグナルのみを与え得る。他の場合には、細胞増殖に対する各単一マーカーが特定のレポーターシグナルを与え得るかまたはマーカー分子の群が特定のレポーターシグナルを与え得る。
【００５３】
免疫反応性の存在の指標のためのシグナルは、当該分野で公知の種々の方法によって産生される呈色（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）シグナルであり得る。あるいは、蛍光シグナルが使用され得るか、またはさらに蛍光シグナルと組み合わせて使用され得る。適切なレポーターシグナルとしては、例えばフルオレセイン、ローダミンなどのような蛍光標識が挙げられる。
【００５４】
本発明に基づく検出反応のための適用可能な形式は、ブロッティング技術（例えば、ウエスタンブロット、サザンブロット、ノーザンブロット、免疫細胞化学手順または免疫組織化学手順）であり得る。ブロッティング技術は、当業者に公知であって、例えば、電気ブロット、半乾燥ブロット、真空ブロットまたはドットブロットとして実施され得る。免疫細胞／組織化学染色手順は、当業者に公知であって、結合物質媒介性ポリペプチドの検出ならびにインサイチュハイブリダーゼーション技術を含み得る。両方の異なる技術が、同時にさえ適用され得る。特定の実施形態において、核酸のハイブリッドキャプチャーが、検出のために使用され得る。増幅反応もまた、例えば核酸分子の検出に適用可能である。
【００５５】
本発明の１つの実施形態において、ＩＮＫ４ａおよび／または増殖マーカー遺伝子産物のレベルの検出は、サンプル中に存在するそれぞれの核酸（例えば、ｍＲＮＡ）またはそのフラグメントの検出によって行なわれる。核酸分子の検出のための手段は、当業者に公知である。核酸の検出のための手段は、例えば、検出されるべき分子の相補的核酸プローブに対する結合反応、核酸に対して結合特異性を有するタンパク質またはこの核酸を特異的に識別し、結合する他の任意の物により行われ得る。１つの実施形態において、サンプル中の核酸に対するオリゴヌクレオチドプローブのインサイチュハイブリダイゼーションが、発現産物またはマーカーの検出のために使用され得る。
【００５６】
本発明に関して使用される場合、プローブは、分子に特異的に結合する任意の薬剤であり得る。核酸の場合には、プローブは特定の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであり得る。１つの実施形態において、プローブは、例えば、プライマーであり得る。ポリペプチドまたはタンパク質の検出の場合には、本明細書中で使用されるプローブは、例えば、結合剤（例えば、抗体）であり得る。本発明の特定の実施形態において、プローブは、検出可能に標識され得る。この標識は、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート剤または酵素を含む群から選択され得る。プローブは、当該分野で公知の任意の検出手順（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション手順の過程、ハイブリッドキャプチャーアッセイの過程、免疫化学染色反応の過程、ブロッティング技術の過程など）に適用され得る。
【００５７】
この方法は、インビトロだけでなく、インサイチュで直接的にも（例えば、染色反応検出の過程において）実施され得る。本発明に基づいた方法で実施されるサンプル中のマーカーｍＲＮＡを検出する別の方法は、核酸の増幅反応であって、これは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応のような量的な様式で実施され得る。本発明の好ましい実施形態において、形成異常または腫瘍のサンプル（細胞サンプルまたは組織サンプル）中のマーカーｍＲＮＡのレベルを定量するために、リアルタイムＲＴ  ＰＣＲが使用され得る。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＩＮＫ４ａおよび／または増殖マーカー遺伝子産物のレベルの検出は、タンパク質またはそのフラグメントの発現のレベルを決定することによって行われる。タンパク質レベルにおけるマーカー遺伝子産物の検出は、例えば、特定のマーカーポリペプチドの検出に特異的な結合剤を含有する試薬において行われ得る。
【００５９】
この結合剤は、多くの異なった検出技術（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降）において使用され得る。一般に、ポリペプチド結合剤ベースの検出は、インビトロと同様にインサイチュで（例えば、免疫化学染色反応の過程において、）直接実行され得る。生物学的サンプル中の特定のポリペプチドの量を決定するための他の任意の方法は、本発明に従って決定される。
【００６０】
本発明に関する使用のための免疫細胞化学画像化手順は、例えば、細胞学的調製物または組織学的調製物の、呈色（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）色素または蛍光色素を用いた染色工程を包含し得る。染色工程は、例えば、検出されるべき分子の、一次結合剤による結合工程を包含し得、この一次結合剤は、それ自体が標識され得る二次結合剤によって検出される。特定の実施形態において、一次結合剤は核酸結合剤またはタンパク質結合剤（例えば、抗体）であり得、そして二次結合剤は、例えば、一次結合剤を識別する二次抗体であり得る。
【００６１】
細胞化学染色または組織化学染色の染色工程を実行するための、当該分野で公知の任意の方法が、本発明に従った方法の過程で適用され得る。
【００６２】
ｐ１６ＩＮＫ４ａポリペプチドまたはｐ１４ＡＲＦポリペプチドのようなＩＮＫ４ａポリペプチド、および例えば、ｍｃｍ５ポリペプチド、ｍｃｍ２ポリペプチド、ＫＩ６７ポリペプチド、Ｋｉ−Ｓ５ポリペプチド、ＰＣＮＡポリペプチドまたはＫｉ−Ｓ２ポリペプチドのような増殖マーカーポリペプチドのレベルの検出のために、本発明に関して使用される結合剤としては、抗体および抗原結合フラグメント、二機能性ハイブリッド抗体、最小抗原結合エピトープを含むペプチド模倣物、抗ｃｕｌｌｉｎｅ（抗ｃａｌｉｎｅＴＭ）などが挙げられ得る。
【００６３】
本明細書中で開示されるタンパク質と検出可能レベルで反応する場合、そして他のタンパク質と有意に反応しない場合、抗体または抗原結合剤は、特異的に反応すると言われる。本発明に従う抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。本明細書中で使用される場合、抗体またはモノクローナル抗体という用語は、インタクトな分子および抗体フラグメントを意味する。さらに、本発明の抗体としては、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。
【００６４】
本発明に従い、結合剤は、単離されて使用されてもまたは組み合わせて使用されてもよい。組み合わせによって、より高い程度の感受性を達成することが可能である。抗体という用語は、好ましくは、明らかなモノクローナル抗体調製物と同様、異なったエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体から本質的に成る抗体に関する。
【００６５】
モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドのフラグメントを含む抗原から、当業者に公知の種々の技術のいずれかを用いて作製される；例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。このような技術の１つにおいて、抗原ポリペプチドまたはその合成部分を含むイムノゲンが、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）のいずれかに最初に注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変のないイムノゲンとして寄与し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、このペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）と結合する場合、より高い免疫反応が誘発され得る。イムノゲンは、好ましくは１回以上の追加免疫を組み込んだ所定の計画に従って哺乳動物宿主内に注射され、そしてこの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、このような血清から、例えば、適切な固体支持体に結合したポリペプチドを使用するアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。
【００６６】
本発明の文脈において、どの１つの増殖マーカーが細胞内で発現するか否かは、必ずしも答えられなければならない訳ではない。特定の実施形態において、主な疑問は、なんらかの増殖マーカーが発現されるか否かであり得る。このような実験の過程において、増殖マーカーの存在の指標と同じ蛍光シグナルを与える手順が、選択された。この手順は、細胞増殖特徴の検出の感度を改善するために適する。この手順が適用され得る場合、３、４、またはより多くの細胞増殖特徴的マーカー分子について検出可能な１つのシグナルを与える。同様に、特定の環境下で、ＩＮＫ４ａ遺伝子発現産物について、同じことがあてはまることがある。異なった増殖マーカー分子について、異なった染色シグナルであり得る場合が、所望であり得ることが理解されなければならない。この手順は、関連する実験の必要性のために適用され得る。
【００６７】
ＩＮＫ４ａ遺伝子産物および／または増殖マーカー遺伝子産物は、本発明に従って、同時に検出され得る。この文脈において、本発明に従って、同時とは、文字通り同じ時間または同じ試験手順の間を意味するべきであり、これにより、単一の検出工程が、一時的に継続する。
【００６８】
本発明に従う検出手順は、細胞または細胞区画の呈色染色または蛍光染色を与える細胞化学染色手順をさらに包含し得る。このような染色手順は、当業者に公知であり、そして例えば、細胞学的試料における亜細胞領域の好酸性構造または好塩基性構造（例えば、核、ミトコンドリア、ゴルジ、細胞質など）についての、特定の分子（染色体、脂質、糖タンパク質、多糖類など）の染色工程を包含する。例えば、ＤＡＰＩ、キナクリン（Ｑｕｉｎａｃｒｉｎ）、クロモミシン（Ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ）などのような蛍光色素が、使用され得る。さらに、例えば、アザン（Ａｚａｎ）、アクリジン−オレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎ−ｏｒａｎｇｅ）、ヘマトキシリン、エオシン、スダン赤（Ｓｕｄａｎ−ｒｅｄ）、チアジン染色（トルイジン青（Ｔｏｌｕｉｄｉｎ−ｂｌｕｅ）、チオニン）のような呈色色素が、適用され得る。他の実施形態において、以下のような染色手順が、本明細書中で開示される方法の過程において使用され得る：パップ染色、ギムザ染色、ヘマトキシリン−エオシン染色、バン−ギーセン（ｖａｎ−Ｇｉｅｓｏｎ）染色、シッフ染色（シッフ試薬を用いる）、金属（例えば、硝酸銀を使用する染色手順における銀）の沈殿を使用する染色手順または例えば、ターンブル青（または他の不溶の金属シアン化物）の染色のような不溶染色。挙げた色素および染色方法は、適用可能な方法の例であるべきであり、そして当該分野で公知の任意の他の方法が、本明細書中で開示される方法に適用され得ることが、理解されなければならない。
【００６９】
染色手順は、光学顕微鏡検査のための呈色染色または蛍光顕微鏡条件下の検査のための蛍光染色を生成し得る。本発明の放射線放出手順の別の実施形態において、サンプル中の細胞学的状態を画像化するために、放射線の透過を減じる物質または他の造影剤を使用する手順（例えば、（微小）オートラジオグラフィー像の作製または（微小）Ｘ線写真撮影のような手段による最適な像の作製）が、本発明に従う方法のために有用であり得る。
【００７０】
全ての染色および画像化手順が、顕微鏡的手順における分析についてのみでなく、フローサイトメトリー、自動化（コンピューター化またはコンピューター補助の）顕微鏡分析、または染色細胞学的試料の分析のための任意の他の方法のような自動化分析手順における分析のためにも、使用され得る。
【００７１】
異なった手順の染色結果または画像化結果の分析は、１つの分析工程または異なったその後の工程群において実行され得る。例えば、試料の光学顕微鏡検査は、試料の蛍光顕微鏡検査の前または後に行われ得る。蛍光顕微鏡観察において、異なった励起波長の異なった染色の分析は、同時にまたは引き続いて分析され得る。他の画像化方法は、名を挙げた手順と同時にまたは引き続いて使用され得る。
【００７２】
異なった染色方法の組み合わせが適切である、種々の状況があり得る。例えば、十分な細胞学的染色結果が免疫化学的染色によって達成され得ない場合、一般的細胞学的染色技術のさらなる適用が、適切であり得る。
【００７３】
本発明の方法に従うサンプルは、細胞を含む任意のサンプルを含み得る。サンプルは、例えば、分泌物、スメア（ｓｍｅａｒ）、体液、および細胞サンプルまたは組織サンプルを含み得る。
【００７４】
本発明の１つの実施形態において、サンプルは、肛門性器道、気道、または皮膚およびその付属器の細胞を含む。特定の実施形態において、細胞は、子宮頸、膣、外陰、陰茎、肛門、直腸、気管支、肺、腹膜、腹膜腔（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｓｐａｃｅ）、鼻咽頭腔、口腔または皮膚の細胞であり得る。本発明の特定の実施形態において、サンプルは、組織学的サンプル、試料、または細胞学的サンプル（例えば、スメア、スワッブ（ｓｗａｂ）、洗浄液、細胞を含む体液（痰、分泌液、唾液など））であり得る。本発明の特定の実施形態において、サンプルは、乳糖腫ウイルスに感染している細胞を含み得る。特定の実施形態におけるサンプルとしては、子宮頸のスメア、気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ）などが挙げられる。
【００７５】
本発明の特定の特別な実施形態において、サンプルは、細胞学的試料の単層または薄層の調製物として調製され得る。細胞学における単層または薄層の調製物の調製に関連する方法は、当業者に周知である。１つの実施形態において、調製物は、例えば、ＴｈｉｎＰｒｅｐ技術を含み得る。他の方法としては、従来的なスメアまたは細胞学的試料の調製のために細胞の懸濁液を使用する方法が、挙げられる。
【００７６】
サンプルの調製は、例えば、組織のサンプル、体液のサンプル、細胞のサンプルを患者から取得する工程を包含し得る。本発明に従って、サンプルの調製はまた、サンプルのさらなる調製の幾つかの工程（例えば、解剖物（ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）の調製、細胞懸濁物の調製、検査されるべき細胞の顕微鏡スライドへの塗り広げすなわち塗布、組織アレイの調製、ポリペプチドまたは核酸の単離、ペプチドもしくは核酸を固定した固相の調製または決定されるべき分子が共有結合または非共有結合したビーズ、膜、またはスライドの調製）を包含し得る。
【００７７】
本発明の特定の実施形態において、本方法は、自動化様式において行われ得る。方法の自動化は、顕微鏡的手段による固相表面上の組織学的試料または細胞学的試料の自動化染色および自動化分析によって達成され得る。別の実施形態において、自動化は、溶液内の細胞の染色のフローサイトメトリー分析を包含し得る。
【００７８】
本発明の方法が適用され得る形成異常病変は、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物（例えば、ｐ１６ＩＮＫ４ａまたはｐ１４ＡＲＦ）の過剰発現によって特徴付けられる任意の形成異常病変を含む。特定の実施形態において、これらの病変は、ＨＰＶのような乳糖腫ウイルスによる感染に伴う形成異常である。１つの実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６８などのような、高危険度ＨＰＶサブタイプであり得る。１つの実施形態において、本発明に従って検出され得る形成異常病変としては、肛門性器病変、気道の病変、頭部および首の病変、または皮膚およびその付属器の病変が挙げられる。このような病変としては、例えば、肛門または直腸の形成異常、外陰の形成異常、膣の形成異常、子宮頸または陰茎の形成異常、気管支、肺、口腔または鼻咽頭腔の形成異常が、挙げられる。
【００７９】
本発明の別の局面は、本発明に従う方法を実践するキットを試験することである。このキットは、例えば、診断キットまたは研究キットであり得る。
【００８０】
本発明に従うキットは、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を検出するために適した、少なくとも１つの薬剤を含む。
【００８１】
従って、本発明に従うキットは、以下を含み得る：
１つ以上のＩＮＫ４ａ遺伝子産物の検出のための試薬
１つ以上の増殖マーカー遺伝子産物の検出のための試薬
検出反応を行うために一般に使用される試薬および緩衝液（例えば、緩衝液、レポー
ター反応物（色素など）、キャリア物質他）
ポジティブコントロール反応を行うためのＩＮＫ４ａ遺伝子産物サンプル
ポジティブコントロール反応を行うための増殖マーカー遺伝子産物サンプル。
【００８２】
マーカー遺伝子産物の検出のための試薬としては、マーカー遺伝子産物に結合可能な任意の薬剤が挙げられ得る。このような試薬としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ペプチド核酸、糖タンパク質、プロテオグリカン、多糖類または脂質が挙げられ得る。
【００８３】
ポジティブコントロールを行うためのＩＮＫ４ａ遺伝子産物サンプルおよび増殖マーカー遺伝子産物サンプルとしては、例えば、適用可能形態（例えば、溶液または塩）の核酸、適用可能形態のペプチド、組織切片サンプルまたはポジティブ細胞が挙げられ得る。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態において、マーカー遺伝子産物の検出は、ポリペプチドのレベルにおいて実施される。この実施形態において、結合剤は、例えば、マーカー遺伝子産物またはそのフラグメントに特異的な抗体であり得る。
【００８５】
試験キットの別の実施形態において、マーカー遺伝子産物の検出は、核酸レベルにおいて実施される。本発明のこの実施形態において、検出のための試薬は、例えば、核酸プローブまたは該マーカー核酸に対する逆相補的なプライマーであり得る。
【００８６】
本発明は、新生物病変および／または形成異常病変および前新生物病変の識別のための方法を提供し、これらは、ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰発現の評価によって、やはり検出可能にｐ１６ＩＮＫ４ａを発現する他の細胞から、組織学的試験手順および／または細胞学的試験手順の過程で同定され得る。この方法は、２つ以上のＩＮＫ４ａ遺伝子産物の発現された遺伝子産物の検出に基づく。
【００８７】
従って、解決するべき問題は、形成異常細胞および悪性増殖能を有さない他の細胞との間を識別するための方法の提供である。この方法は、形成異常の任意の段階で適用され得、ｐ１６ＩＮＫ４ａ過剰発現に基づく細胞学的診断方法が、化生細胞の同定のためのさらなる情報を必要とする場合、特に初期段階では有用で有り得る。
【００８８】
その上、本発明は、本発明に従う方法を行うキットを提供する。
【００８９】
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
生物学的サンプル内で、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を過剰発現する形成異常細胞を、ＩＮＫ４ａ遺伝子産物を検出可能なレベルで発現する他の細胞から識別するための方法であって、この方法は、少なくとも１つの単一の細胞内での少なくとも２つのマーカー分子の同時発現を、細胞学的試験手順または組織学的試験手順で決定する工程を包含し、ここで、少なくとも１つのマーカー分子は、ＩＮＫ４ａ遺伝子によってコードされる発現産物であって、かつ、少なくとも１つのさらなるマーカー分子は、細胞増殖マーカーであって、ここで、少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物の過剰発現およびこの単一の細胞内での検出可能なレベルでの活性な細胞増殖に対する少なくとも１つのマーカーの発現は、この細胞の形成異常状態の指標であって、ここで、この単一の細胞内における少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物の過剰発現、および老化、細胞末期分化、アポトーシスまたは細胞周期停止についての少なくとも１つのマーカーの検出可能なレベルでの発現は、細胞の非形成異常状態の指標である、方法。
（項目２）
２つ以上の細胞増殖マーカーのセットが検出される、項目１に記載の方法。
（項目３）
少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物が、１３ｋＤａと１９ｋＤａとの間の分子量を有する、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物が、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ１４ＡＲＦを含む群から選択される、項目１〜３に記載の方法。
（項目５）
少なくとも１つの細胞増殖マーカーが、細胞増殖の維持に必要な増殖なマーカー、ＤＮＡ複製に関係する増殖マーカー、進行中の複製フォークのメンバーであるかもしくは進行中の複製フォークのメンバーをコードする増殖マーカー、老化マーカー、細胞周期停止マーカーおよびアポトーシスマーカーを含む群から選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
上記細胞増殖の維持に必要な遺伝子産物が、Ｋｉ６７分子、Ｋｉ−Ｓ５分子およびＫｉ−Ｓ２分子を含む群から選択される分子である、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記ＤＮＡ複製に関係する遺伝子産物が、ヘリカーゼもしくはそのサブユニット、細胞分裂サイクル（ｃｄｃ）分子、ホスファターゼ分子およびキナーゼ分子を含む群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記ヘリカーゼまたはそのサブユニットが、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７およびＨＥＬＡＤ１を含む群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記ｃｄｃ分子、キナーゼおよびホスファターゼが、ＣＤＣ６、ＣＤＣ７、プロテインキナーゼ、Ｄｂｆ４、ＣＤＣ１４プロテインホスファターゼ、ＣＤＣ４５およびＭＣＭ１０を含む群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目１０）
進行中の複製フォークに関係する上記分子が、ＰＣＮＡおよびＰＯＬＤを含む群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目１１）
上記遺伝子産物が、ポリペプチドまたは核酸分子である、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
少なくとも１つのさらなるマーカー分子が診断または予後の評価の改善のためにさらに検出される、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
上記さらなるマーカー分子が少なくとも１つのさらなる増殖マーカー分子である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記さらなるマーカー分子が、老化マーカー、アポトーシスマーカー、細胞周期停止マーカー、細胞の末期分化に対するマーカー、ウイルス感染に対するマーカー、ウイルス活性に対するマーカー、細胞周期調節タンパク質、細胞増殖の維持に必要な遺伝子産物、ＤＮＡ複製に関係する遺伝子産物、進行中の複製フォークのメンバーである遺伝子産物を含む群から選択される、項目１２または項目１３に記載の方法。
（項目１５）
ＤＡＰＩ、キナクリン、クロモマイシン、アザン、アクリジン−オレンジ、ヘマトキシリン、エオシン、スダン赤、トルイジン青およびチオニンからなる群から選択される少なくとも１つの色素を使用するさらなる細胞学的な染色手順、または、ＰＡＰ染色、ギムザ染色、ヘマトキシリン−エオシン染色、ワンギーソン染色、シッフ染色、金属沈殿物による染色、ターンブル青染色および金属シアン化物による染色を含む群から選択される染色方法が適用される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
上記形成異常細胞が癌性病変または前癌性病変の細胞である、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
上記形成異常細胞が乳頭腫ウイルスと関連する形成異常の細胞である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記乳頭腫ウイルスが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６６およびＨＰＶ６８を含む群から選択される危険性の高いヒト乳頭腫ウイルスである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記病変が、肛門性器道の病変、気道の病変ならびに皮膚およびその付属器の病変を含む群から選択される、項目１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
上記病変が、子宮頚の病変、膣の病変、外陰の病変、陰茎の病変、肛門の病変、直腸の病変、気管支の病変、肺の病変、腹膜腔の病変、鼻咽頭腔の病変、口腔の病変または皮膚の病変を含む群から選択される、項目１７または項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記生物学的サンプルが、肛門性器道、気道または皮膚およびその付属体に由来する細胞を含有するサンプルである、項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
上記細胞が、子宮頚、膣、外陰、陰茎、肛門、直腸、気管支、肺、鼻咽頭腔、口腔または皮膚に由来する細胞である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記生物学的サンプルが、細胞学的調製物または組織学的調製物である、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
上記ＩＮＫ４ａ遺伝子産物および／または上記細胞増殖マーカー分子の検出が、検出されるべきそれぞれの分子を少なくとも１つ特異的に識別する少なくとも１つのプローブを使用して実施される、項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
少なくとも１つのプローブが検出可能に標識される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
少なくとも１つの標識が、放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート剤または酵素からなる群から選択される項目２５に記載の方法。
（項目２７）
少なくとも１つのプローブがタンパク質および／または核酸である、項目２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
少なくとも１つのプローブがＩＮＫ４ａをコードする遺伝子産物または細胞増殖マーカー遺伝子産物に対して指向された抗体である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
免疫細胞化学染色手順を包含する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
少なくとも１つのプローブがＩＮＫ４ａ遺伝子産物または細胞増殖マーカー遺伝子産物に特異的にハイブリダイズする核酸である、項目２５または項目２６に記載の方法。
（項目３１）
インサイチュハイブリダーゼーション反応を包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
核酸増幅反応を包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記核酸増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたはＬＣＲである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
核酸プローブおよびポリペプチドプローブを使用する検出反応が同時に実施される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、生物学的サンプル中の少なくとも１つのＩＮＫ４ａ遺伝子産物および少なくとも１つの細胞増殖マーカー遺伝子産物の存在もしくは非存在および／または過剰発現のレベルの検出のための少なくとも１つ以上のプローブを備える、診断キットまたは研究キット。
（項目３６）
上記ＩＮＫ４ａ遺伝子産物が、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｐ１４ＡＲＦを含む群から選択される、項目３５に記載のキット。
（項目３７）
上記細胞増殖マーカー遺伝子産物が、ＣＤＣ６、ＭＣＭ３、ＭＣＭ３、ＭＣＭ４、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＣＤＣ７プロテインキナーゼ、Ｄｂｆ４、ＣＤＣ１４プロテインホスファターゼ、ＣＤＣ４５およびＭＣＭ１０、Ｋｉ６７、Ｋｉ−Ｓ２、ＰＣＮＡまたはＰＯＬＤを含む群から選択される、項目３５または項目３６に記載のキット。
（項目３８）
項目３５〜３７に記載のキットであって、このキットは、以下
ａ．ポジティブコントロール反応を行なうためのｐ１６ＩＮＫ４ａサンプル
ｂ．ポジティブコントロール反応を行なうためのｐ１４ＡＲＦサンプル
ｃ．ポジティブコントロール反応を行なうためのＫｉ６７サンプル
ｄ．ポジティブコントロール反応を行なうためのＫｉ−Ｓ２サンプル
ｅ．ポジティブコントロール反応を行なうためのＭＣＭ５サンプル
ｆ．ポジティブコントロール反応を行なうためのＭＣＭ２サンプル
ｇ．ポジティブコントロール反応を行なうためのＰＣＮＡサンプル
ｈ．ｐ１６ＩＮＫ４ａの存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための試薬
ｉ．ｐ１４ＡＲＦの存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための試薬
ｊ．Ｋｉ６７の存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための試薬
ｋ．Ｋｉ−Ｓ２の存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための試薬
ｌ．ＭＣＭ５の存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための試薬
ｍ．ＭＣＭ２の存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための試薬
ｎ．ＰＣＮＡの存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための試薬
ｏ．ポジティブコントロール反応を実施するためのＩＮＫ４ａ遺伝子産物の１つ以上のサンプル
ｐ．ポジティブコントロール反応を実施するための細胞増殖マーカー遺伝子産物の１つ以上のサンプル
ｑ．他のＩＮＫ４ａ遺伝子産物の存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための１つ以上の試薬
ｒ．他の細胞増殖マーカー遺伝子産物の存在もしくは非存在および／またはレベルの検出のための１つ以上の試薬
の内の少なくとも１つをさらに備える、キット。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】子宮頸の組織学的試料の蛍光染色；図１は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体を使用する重篤な形成異常の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例１を参照のこと；ｐ１６ＩＮＫ４ａについての免疫反応性は、緑色蛍光を与える。病変のほぼ全ての細胞は、細胞質および核において、拡散的にポジティブに染まる。
【図２】子宮頸の組織学的試料の蛍光染色；図２は、Ｋｉ６７に対する抗体を使用する重篤な形成異常の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例１を参照のこと；Ｋｉ６７についての免疫反応性は、赤色蛍光を与える。形成異常の多くの細胞は、Ｋｉ６７についてポジティブな核を示す。
【図３】子宮頸の組織学的試料の蛍光二重染色；図３は、Ｋｉ６７に対する抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体を使用する重篤な形成異常の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例１を参照のこと；Ｋｉ６７についての免疫反応性は、赤色蛍光を与える；ｐ１６ＩＮＫ４ａについての免疫反応性は、緑色蛍光を与える；赤色蛍光と緑色蛍光の重なりは、黄色蛍光を与える。形成異常の多くの細胞は、Ｋｉ６７およびｐ１６ＩＮＫ４ａについてポジティブである核を示し、黄色蛍光を生じる。
【図４】子宮頸の組織学的試料の蛍光染色；図４は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体を使用する扁平上皮化生の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例１を参照のこと；ｐ１６ＩＮＫ４ａについての免疫反応性は、緑色蛍光を与える。化生の幾つかの細胞は、細胞質および核において、拡散的にポジティブに染まる。
【図５】子宮頸の組織学的試料の蛍光染色；図５は、Ｋｉ６７に対する抗体を使用する扁平上皮化生の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例１を参照のこと；Ｋｉ６７についての免疫反応性は、赤色蛍光を与える。扁平上皮化生の多数の細胞がＫｉ６７についてポジティブな核を示す。ｐ１６ＩＮＫ４ａをポジティブに発現することが同定されている領域は、Ｋｉ６７についてのいかなるポジティブの染色も示さず、これは、それらの領域における抗原の発現の欠損を示す。
【図６】子宮頸の組織学的試料の蛍光二重染色；図６は、Ｋｉ６７に対する抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体を使用する扁平上皮化生の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例１を参照のこと；Ｋｉ６７についての免疫反応性は、赤色蛍光を与える；ｐ１６ＩＮＫ４ａについての免疫反応性は、緑色蛍光を与える；赤色蛍光と緑色蛍光の重なりは、黄色蛍光を与える。ｐ１６ＩＮＫ４ａをポジティブに発現する領域は、Ｋｉ６７についてのいかなるポジティブの染色も示さず、これは、それらの領域における抗原の発現の欠損を示す。試料において、黄色蛍光を生じる細胞は存在しない。
【図７】子宮頸の組織学的試料の呈色二重染色；図７は、Ｋｉ６７に対する抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体を使用する重篤な形成異常の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例６を参照のこと；Ｋｉ６７についての免疫反応性は、赤色核染色を与える；ｐ１６ＩＮＫ４ａについての免疫反応性は、細胞全体にわたって茶色の染色を与える；二重染色は、赤色の核を有する茶色の細胞を与える。形成異常の多くの細胞は、核についてＫｉ６７ポジティブでありそしてｐ１６ＩＮＫ４ａについてポジティブであることを示し、従って、赤色の核を有する茶色の細胞のパターンを生じる。
【図８】子宮頸の細胞学的試料の呈色二重染色；図８は、Ｋｉ６７に対する抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体を使用する重篤な形成異常の染色を示す；実験の詳細に関しては実施例７を参照のこと；Ｋｉ６７についての免疫反応性は、赤色核染色を与える；ｐ１６ＩＮＫ４ａについての免疫反応性は、細胞全体にわたって茶色の染色を与える；二重染色は、赤い核を有する茶色の細胞を与える。形成異常の多くの細胞は、核についてＫｉ６７ポジティブでありそしてｐ１６ＩＮＫ４ａポジティブであることを示し、従って、赤い核を有する茶色の細胞のパターンを生じる。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
以下の実施例は、例示の目的でのみ提示されており、本明細書中で開示される発明の範囲を限定することを意図しない。例示の目的のために、本明細書中で開示される方法は、組織学的調製物を用いて例証される。組織学的実施例は、どの方法において染色される細胞が、形成異常または化生として分類されるか否かを判定することを助ける。プロトコル適切な様式に改変することによって、この方法を、容易に細胞学的試料に移行し得る。これらの改変は、当業者に公知である。
【００９２】
（実施例１：子宮頸のサンプルにおけるｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７の過剰発現の免疫蛍光検出（二重染色））
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した子宮頸の組織サンプルの切片を、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７に特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色した。
【００９３】
組織切片を、キシレンおよび段階的なエタノ−ル中でのインキュベーションを通して再水和し、Ａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔに移した。抗原検索（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）で、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７について行った。その結果、スライドを９５℃〜９８℃の湯浴中で４０分間熱した。スライドを、室温まで２０分間冷却し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ：コード番号Ｓ３００６）に移した。
【００９４】
二次抗体（種：ヤギ）の非特異結合を避けるために、試料を、１０％ヤギ血清と共に３０分間室温でインキュベートした。
【００９５】
次いで、スライドを、一次抗体であるマウス抗ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体（３．４８μｇ／ｍｌ）およびウサギ抗Ｋｉ６７（１：２５）と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、スライドを洗浄緩衝液でリンスし、そして新鮮な緩衝液浴中に５分間置いた。過剰な緩衝液を捨て、そして各試料を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８が結合したヤギ抗マウス抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６が結合したヤギ抗ウサギ抗体を含有する二次試薬２００μｌで覆い、次いで、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを以前のように２回洗浄し、そして蛍光のための特別なマウンティング培地（ｓｐｅｃｉａｌ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）で直接マウントした。
【００９６】
スライドの顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対して免疫反応性でありかつＫｉ６７についても免疫反応性である細胞が、形成異常病変のサンプルとして顕微鏡的に同定され得るサンプル中にのみ見出され得ることを明らかにする。化生に由来するｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的反応によって染色された細胞は、Ｋｉ６７に特異的な反応によって染色されない。細胞増殖マーカー染色の顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰増殖する化生細胞が、Ｋｉ６７に対する抗体に対して免疫反応性でないことを示す。対照的に、形成異常組織領域を含むサンプルは、Ｋｉ６７に免疫反応性であり、かつｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体に免疫反応性である細胞を含む。従って、形成異常とは対照的に、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）において、Ｋｉ６７特異的抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体を用いて二重染色される細胞は存在しない。
【００９７】
図１〜６は、子宮頸の重篤な形成異常および扁平上皮化生についてのＫｉ６７に対する抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体を用いた染色結果を示す。Ｋｉ６７についての免疫反応性は、赤色蛍光を与え、ｐ１６ＩＮＫ４ａについての免疫反応性は、緑色蛍光を与え、そして赤色および緑色の蛍光の重なりは、黄色の蛍光を与える。形成異常試料（図１〜３）において、形成異常の多くの細胞は、Ｋｉ６７について核がポジティブであること、およびｐ１６ＩＮＫ４ａについてポジティブであることを示し、従って、黄色蛍光を生じる（図３参照）。対照的に、化生試料（図４〜６）において、ｐ１６ＩＮＫ４ａをポジティブに発現する領域は、Ｋｉ６７に対していかなるポジティブな染色も示さず、これらの領域において抗原の発現を欠くことを示す。二重染色は、この試料において観察され得（図６）、その結果、この試料において黄色蛍光を生じる細胞はない。
【００９８】
この結果は、Ｋｉ６７に特異的な試薬による細胞の二重染色が、形成異常からのｐ１６ＩＮＫ４ａ過剰発現する化生の識別を可能にすることを示す。
【００９９】
（実施例２：インサイチュハイブリダイゼーションによる、子宮頸のサンプル中のｐ１４ＡＲＦおよびｍｃｍ２を同時発現する細胞の検出）
子宮頸のスメアを、インサイチュ染色反応において、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびｍｃｍ２のｍＲＮＡレベルについて半定量的に分析し得る。染色反応は、以下のように行う：
再水和のために、スプレー固定したスメア（ｓｐｒａｙ−ｆｉｘｅｄ  ｓｍｅａｒ）を、新鮮な５０％  ＥｔＯＨにおいて震盪デバイス上でインキュベートする。固定手順によって産生されたＰＥＧフィルムを、徹底したリンスによって除去する。次いで、スメアをａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ中でリンスする。スメアを、プロテイナーゼＫ（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１０分間インキュベートする。次いで、スライドを洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）に移し、そして最後に、細胞を含む領域を脂質ペンシル（ｌｉｐｉｄ−ｐｅｎｃｉｌ）で囲った。
【０１００】
ハイブリダイゼーション混合物を、５０μｌの調製済み（ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｕｓｅ）ハイブリダイゼーション緩衝液（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄａｎｍａｒｋ）と約５〜１０ｐｍｏｌのプローブとを混合することにより調製する。プローブは、それぞれのｍＲＮＡに対して相補的な配列のビオチン標識化オリゴヌクレオチドおよびジゴキシゲニン標識化オリゴヌクレオチドである。
【０１０１】
ハイブリダイゼーション混合物を、９５℃まで加熱し、そしてその後、３７℃で平衡化する。煮沸手順の後、スメアを各５０μｌのハイブリダイゼーション混合物とともに４２℃で４時間インキュベートする。サンプルを、過剰量の洗浄緩衝液中で（２×ＳＳＣ中３７℃で１５分間を２回、１×ＳＳＣ中３７℃で１５分間を１回）洗浄する。次いで、スメアを２×ＳＳＣ中で室温で２回リンスする。この洗浄手順後、解剖物をブロッキング緩衝液（ＮＥＮ，Ｂｌｏｃｋｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）と共に室温で３０分間インキュベートする。次いで、続けて１：１００希釈（ブロッキング緩衝液中、上記参照）ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびモノクローナルマウスＨＲＰ標識化抗ジゴキシゲニン抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に１時間インキュベーションする。次いで、スメアを１×ＰＢＳ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において室温で１０分間２回洗浄し、続けて１×ＰＢＳ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ  ９．２）で室温で１０分間の洗浄工程を１回行う。次いで、ＥＬＦ  ９７ホスフェート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて室温で１０秒間〜７分間の染色反応を行う。過剰な基質を、１×ＰＢＳ／０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で室温で１０分間３回洗浄する。第２の染色工程において、切片を、Ｔｙｒａｍｉｄｅｓ−Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ５９４と共に１０秒間〜７分間インキュベートする。過剰な基質を、１×ＰＢＳ／０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で室温で１０分間３回洗浄する。最後に、スメアをＨ２Ｏｄｅｓｔ．中に浸し、そして蛍光マウンティング培地（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で包埋する。次いで、染色した解剖物を、蛍光顕微鏡によって分析し得る。
【０１０２】
スライドの顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現についてポジティブでありかつｍｃｍ２を発現する細胞が、顕微鏡的に形成異常病変のサンプルとして同定され得るサンプルにおいてのみ見出され得ることを明らかにする。ｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的反応（化生として同定可能である）によって染色された細胞は、ｍｃｍ２特異的反応によって染色されない。ｍＲＮＡハイブリダイゼーションの顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する化生細胞が、ｍｃｍ２のｍＲＮＡを有意に発現しないことを示す。対照的に、形成異常細胞は、ｍｃｍ２に特異的なプローブおよびｐ１６ＩＮＫ４ａに対するプローブでのインサイチュハイブリダイゼーションによって染色され得る。従って、形成異常細胞におけるのとは対照的に、化生細胞において、Ｋｉ６７特異的プローブおよびｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的プローブを用いた観察され得る二重染色は、存在しない。
【０１０３】
この結果は、ｍｃｍ２について特異的な試薬を用いた細胞の二重染色は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する化生の形成異常からの識別を可能にする。
【０１０４】
（実施例３：子宮頸のサンプルにおけるｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ−Ｓ２の過剰発現の免疫蛍光検出（二重染色））
Ｍｅｒｃｋｏｆｉｘ（登録商標）固定した子宮頸の細胞学的サンプル（従来的なスメアおよび液体ベースの細胞学（ＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（登録商標）））を、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ−Ｓ２に特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色した。
【０１０５】
従来的なスメアおよび液体ベースの細胞学的サンプル（ＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（登録商標））を、エタノール（５０％）中で１０分間再水和し、そしてＡｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ中に移した。抗原検索を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）で、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７について行った。次いで、スライドを９５℃〜９８℃の湯浴中で４０分間加熱した。スライドを、室温まで２０分間冷却し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ：コード番号Ｓ３００６）に移し、そして最後に、サンプルを脂質ペンシル（ｌｉｐｉｄ−ｐｅｎｃｉｌ）で囲った。
【０１０６】
二次抗体（種：ヤギ）の非特異結合を避けるために、試料を、１０％ヤギ血清と共に３０分間室温でインキュベートした。
【０１０７】
次いで、スライドを、一次抗体であるマウス抗ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体（クローンＥ６Ｈ４）（３．４８μｇ／ｍｌ）およびウサギ抗Ｋｉ−Ｓ２（１：２５）と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、スライドを洗浄緩衝液でリンスし、そして新鮮な緩衝液浴中に５分間置いた。過剰な緩衝液を捨て、そして各試料を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８が結合したヤギ抗マウス抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６が結合したヤギ抗ウサギ抗体を含有する二次試薬２００μｌで覆い、次いで、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを以前のように２回洗浄し、そして蛍光のための特別なマウンティング培地（ｓｐｅｃｉａｌ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）で直接マウントした。
【０１０８】
スライドの顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対して免疫反応性でありかつＫｉ−Ｓ２についても免疫反応性である細胞は、形成異常細胞として顕微鏡的に同定され得ることを明らかにする。化生に由来するｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的反応によって染色された細胞は、Ｋｉ−Ｓ２に特異的な反応によって染色されず、熟練した病理学者によって化生起源であるかまたは子宮内膜起源であるかのどちらかに分類され得る。細胞増殖マーカー染色の顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する化生細胞が、Ｋｉ−Ｓ２に対する抗体に対して免疫反応性でないことを示す。対照的に、形成異常細胞は、Ｋｉ−Ｓ２に免疫反応性であり、そしてｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体に免疫反応性である。従って、形成異常細胞におけるのとは対照的に、化生において、Ｋｉ−Ｓ２特異的抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体を用いて二重染色され得る細胞は存在しない。
【０１０９】
この結果は、Ｋｉ−Ｓ２に特異的な試薬を用いる細胞の二重染色が、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する化生細胞を形成異常細胞から識別することを可能にすることを示す。
【０１１０】
（実施例４：小細胞肺癌と診断された個体の気管支肺胞洗浄液のサンプルにおけるｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡの過剰発現の免疫蛍光検出（二重染色））
患者の気管支肺胞洗浄液試料に含まれる細胞を、ＴｈｉｎＰｒｅｐ技術に従って調製した。小細胞肺癌と診断された患者の洗浄液のＭｅｒｃｋｏｆｉｘ（登録商標）固定した細胞学的サンプルを、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡに特異的な抗体を用いて免疫蛍光染色した。
【０１１１】
この実験において、２つの増殖マーカーＰＣＮＡとＫｉ６７とに対する免疫反応性に由来する染色の間を識別しない手順を使用した。本発明の文脈において、細胞において、どれか１つの増殖マーカーが発現されるか否かを必ずしも答えなければいけない訳ではない。主な疑問は、何らかの増殖マーカーが発現されるか否かである。このように、実験の過程において、増殖マーカーの存在の指標である同じ蛍光シグナルを生じる手順を選択した。この手順は、細胞増殖特徴の検出感度を改善するために適している。場合によっては、この手順を、３つ、４つまたはそれより多い細胞増殖を特徴付けるマーカー分子についての１つの検出可能シグナルを与えるように適用し得る。同様に、特定の状況下で、ＩＮＫ４ａ遺伝子発現産物についても同じことがいえることがある。場合によっては、異なった増殖マーカー分子についての異なった染色シグナルが、所望され得ることが理解されなければならない。この手順は、それぞれの実験の必需品に適用され得る。
【０１１２】
組織切片を、キシレンおよび段階的なエタノ−ル中でのインキュベーションを通して再水和し、Ａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔに移した。従来的なスメアおよび液体ベースの細胞学サンプル（ＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（登録商標））を、エタノール（５０％）中で１０分間再水和し、そしてＡｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ中に移した。抗原検索を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）で、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡについて行った。次いで、スライドを９５℃〜９８℃の湯浴中で４０分間加熱した。スライドを、室温まで２０分間冷却し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ：コード番号Ｓ３００６）に移し、そして最後に、サンプルを脂質ペンシル（ｌｉｐｉｄ−ｐｅｎｃｉｌ）で囲った。
【０１１３】
二次抗体（種：ヤギ）の非特異結合を避けるために、試料を、１０％ヤギ血清と共に３０分間室温でインキュベートした。
【０１１４】
次いで、スライドを、一次抗体であるマウス抗ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体（３．４８μｇ／ｍｌ）、ウサギ抗Ｋｉ６７およびウサギ抗ＰＣＮＡ（各１：２５）と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、スライドを洗浄緩衝液でリンスし、そして新鮮な緩衝液浴中に５分間置いた。過剰な緩衝液を捨て、そして各試料を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８が結合したヤギ抗マウス抗体およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６が結合したヤギ抗ウサギ抗体を含有する二次試薬２００μｌで覆い、次いで、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを以前のように２回洗浄し、そして蛍光のための特別なマウンティング培地（ｓｐｅｃｉａｌ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）で直接マウントした。
【０１１５】
スライドの顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対して免疫反応性でありかつＫｉ６７またはＰＣＮＡについても免疫反応性である細胞は、小細胞肺癌の細胞として顕微鏡的に同定され得ることを明らかにする。化生に由来するｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的反応によって染色された細胞は、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡに特異的な反応によっては染色されない。細胞増殖マーカー染色の顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する化生細胞が、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡに対する抗体に対して免疫反応性でないことを示す。対照的に、形成異常細胞を含むサンプルは、Ｋｉ６７／ＰＣＮＡに免疫反応性であり、かつｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体に免疫反応性である細胞を含む。従って、形成異常におけるのとは対照的に、化生において、Ｋｉ６７およびＰＣＮＡならびにｐ１６ＩＮＫ４ａに特異的な抗体を用いて三重染色され得る細胞は存在しない。
【０１１６】
この結果は、Ｋｉ６７／ＰＣＮＡに特異的な試薬を用いた細胞の三重染色が、ｐ１６Ｉ
ＮＫ４ａ過剰発現非形成異常細胞を形成異常細胞から識別することを可能にすることを示
す。
【０１１７】
（実施例５：子宮頸由来細胞におけるｍｃｍ５  ｍＲＮＡ、ｐ１４ＡＲＦタンパク質およびＫｉ６７タンパク質の同時検出による形成異常細胞のフローサイトメトリー検出）
子宮頸の細胞学的サンプル（ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中の細胞懸濁物）を、ｐ１４ＡＲＦ特異的抗体およびＫｉ−６７特異的抗体、ならびにｍｃｍ−５についてのオリゴプローブを用いて蛍光染色し、３色蛍光ＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０１１８】
細胞を遠心分離し、上清をデカントし、そして１００ｍｌのＰｅｒｍｅａｆｉｘ（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｒａｉｔａｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間、固定および透過処理した。細胞を、滅菌したＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中で洗浄し、ペレットにし、そして１００ｍｌのＰｅｒｍｅａｆｉｘ中に室温で１時間再懸濁した。細胞を滅菌したＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中で洗浄し、ペレットにし、そして滅菌したＰＢＳ中に再懸濁した。これらを、ＰＥ結合体化抗ｐ１４ＡＲＦ抗体およびＰＥ−Ｃｙ５−結合体化抗Ｋｉ６７抗体と共に、＋４℃で１時間インキュベートした。細胞を滅菌したＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中で洗浄し、ペレットにし、そして１００ｍｌのＰｅｒｍｅａｆｉｘ中に室温で３０分間再懸濁した。細胞を滅菌したＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離によってペレットにし、次いで、２×標準クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）中で再度洗浄した。遠心分離後、細胞ペレットを５００ｎｇの５−カルボキシ−フルオレセイン両端標識ｍｃｍ５特異的オリゴヌクレオチドプローブ含有のハイブリダイゼーション溶液（２×ＳＳＣ、３０％ホルムアミド、超音波処理したサケ精子、酵母運搬ＤＮＡ）中に再懸濁した。細胞間ハイブリダイゼーションを４２℃で１時間実行し、その後、続けて２×ＳＳＣ、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中および１×ＳＳＣ、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で、４２℃で洗浄した。細胞を、分析のためにＰＢＳ（ｐＨ  ８．３）中に再懸濁し、そしてフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＩＳ）で分析した。各分析につき、３０．０００〜１００．０００のゲート通過事象（ｇａｔｅｄ  ｅｖｅｎｔ）を収集した。データ分析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＩＳ）を用いて行った。
【０１１９】
フローサイトメーター分析は、ｐ１４ＡＲＦに対して免疫反応性でありかつＫｉ−６７および／またはｍｃｍ５のオリゴプローブについても免疫反応性である細胞が、子宮頸の形成異常病変を有する患者のサンプルにおいてのみ見出され得ることを明らかにする。形成異常病変を有さない女性由来のサンプルは、ｐ１４ＡＲＦとＫｉ６７またはｍｃｍ５との同時染色を示さなかった。この結果は、Ｋｉ６７および／またはｍｃｍ５に特異的な試薬を用いた細胞の二重染色または三重染色が、ｐ１４ＡＲＦ過剰発現形成異常細胞からのｐ１４ＡＲＦ過剰発現非形成異常細胞の識別を可能にすることを示す。
【０１２０】
（実施例６：子宮頸の組織学的サンプルにおけるｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７の過剰発現の免疫酵素学的検出（連続的二重染色））
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した子宮頸の組織サンプルの切片を、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７に特異的な抗体を用いて免疫酵素学的二重染色した。
【０１２１】
組織切片を、キシレンおよび段階的なエタノ−ル中でのインキュベーションを通して再水和し、Ａｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔに移した。抗原検索を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７について行った。次いで、スライドを９５℃〜９８℃の湯浴中で４０分間加熱した。スライドを、室温まで２０分間冷却し、洗浄緩衝液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）に移した。
【０１２２】
内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％  Ｈ２Ｏ２（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で室温で５分間ブロックした。
【０１２３】
室温で５分間スライドを洗浄した後、これらを、一次抗体であるマウス抗ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体（ＭＴＭ）と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液でリンスし、そして新鮮な緩衝液浴中に５分間置いた。過剰な緩衝液を捨て、そして各試料を２００μｌの二次試薬（ＥｎＶｉｓｉｏｎヤギ抗マウス−ペルオキシダーゼ／ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で覆い、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを以前のように３回洗浄した。ＤＡＢ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用し、スライドを基質色素原（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）複合体と共に室温で１０分間インキュベートすることにより、呈色可視化した。反応を脱イオン化水中で停止させ、スライドを洗浄緩衝液中に置いた。
【０１２４】
洗浄後、スライドを二次抗体（ウサギ抗ヒトＫｉ６７抗体（Ｄｉａｎｏｖａ，ｃｌｏｎｅ  Ａｂ−３））と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液でリンスし、新鮮な緩衝液浴中に５分間置いた。過剰な緩衝液を捨て、そして各試料を２００μｌの二次試薬（ヤギ抗ウサギ−アルカリホスファターゼ標識／ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で覆い、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを以前のように３回洗浄した。ＦａｓｔＲｅｄ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を使用し、スライドを基質色素原複合体と共に室温で３０分間インキュベートすることにより、呈色可視化した。反応を脱イオン化水中で停止させた。
【０１２５】
ヘマトキシリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）による室温で２分間の対比染色後、スライドを水道水の流水中で室温で１０分間インキュベートし、次いで、水性マウンティング培地（Ａｑｕａｔｅｘ／ＭＥＲＣＫ）でマウントした。
【０１２６】
スライドの顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対して免疫反応性でありかつＫｉ６７についても免疫反応性である細胞は、形成異常病変のサンプルとして顕微鏡的に同定され得るサンプル中にのみ見出され得ることを明らかにする。化生に由来するｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的反応によって染色された細胞は、Ｋｉ６７に特異的な反応によって染色されない。細胞増殖マーカー染色の顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰発現する化生細胞が、Ｋｉ６７に対する抗体に対して免疫反応性でないことを示す。対照的に、形成異常組織領域を含むサンプルは、Ｋｉ６７に免疫反応性であり、そしてｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体に免疫反応性である細胞を含む。従って、形成異常におけるのとは対照的に、化生において、Ｋｉ６７特異的抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体を用いて二重染色され得る細胞はない。
【０１２７】
図７において示される結果は、Ｋｉ６７およびｐ１６ＩＮＫ４ａに特異的な試薬を用いた細胞の二重染色が、呈色染色手順においてもまた、特異的二重染色パターンを可能にすることを示す。
【０１２８】
（実施例７：子宮頸の細胞学的サンプルにおけるｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７の過剰発現の免疫酵素学的検出（連続的二重染色））
Ｍｅｒｃｋｏｆｉｘ（登録商標）固定した子宮頸の細胞学的サンプル（従来的なスメアおよび液体ベースの細胞学的サンプル（ＴｈｉｎＰｒｅｐｓ（登録商標）））を、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７に特異的な抗体を用いて免疫酵素学的二重染色した。
【０１２９】
従来的なスメアおよび液体ベースの細胞学的サンプルを、エタノール（５０％）中で室温で１０分間再水和し、そしてＡｑｕａ  ｂｉｄｅｓｔ中に移した。抗原検索を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で、ｐ１６ＩＮＫ４ａおよびＫｉ６７について行った。次いで、スライドを９５℃〜９８℃の湯浴中で４０分間加熱した。スライドを、室温まで２０分間冷却し、洗浄緩衝液に移した。
【０１３０】
内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％  Ｈ２Ｏ２で室温で５分間ブロックした。
【０１３１】
スライドを洗浄した後、これらを、一次抗体であるマウス抗ヒトｐ１６ＩＮＫ４ａ抗体と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液でリンスし、そして新鮮な緩衝液浴中に５分間置いた。過剰な緩衝液を捨て、そして各試料を２００μｌの二次試薬（ＥｎＶｉｓｉｏｎヤギ抗マウス−ペルオキシダーゼ）で覆い、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを以前のように３回洗浄した。ＤＡＢ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用し、スライドを基質色素原複合体と共に室温で１０分間インキュベートすることにより、呈色可視化した。反応を脱イオン化水中で停止させ、スライドを洗浄緩衝液中に置いた。
【０１３２】
洗浄後、スライドを二次抗体（ウサギ抗ヒトＫｉ６７抗体（Ｄｉａｎｏｖａ，ｃｌｏｎｅＡｂ−３））と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液でリンスし、新鮮な緩衝液浴中に５分間置いた。過剰な緩衝液を捨て、そして各試料を２００μｌの二次試薬（ヤギ抗ウサギ−アルカリホスファターゼ標識／ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で覆い、室温で３０分間インキュベートした。次いで、スライドを以前のように３回洗浄した。ＦａｓｔＲｅｄ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を使用し、スライドを基質色素原複合体と共に室温で３０分間インキュベートすることにより、呈色可視化した。反応を脱イオン化水中で停止させた。
【０１３３】
ヘマトキシリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）による室温での２分間の対比染色後、スライドを水道水の流水中で室温で１０分間インキュベートし、次いで、水性マウンティング培地（Ａｑｕａｔｅｘ／ＭＥＲＣＫ）でマウントした。
【０１３４】
スライドの顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａに対して免疫反応性でありかつＫｉ６７についても免疫反応性である細胞は、それらの形態学に基づいて形成異常細胞と同定されることを明らかにする。化生に由来するｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的反応によって染色された細胞は、Ｋｉ６７に特異的な反応によって染色されない。細胞増殖マーカー染色の顕微鏡検査は、ｐ１６ＩＮＫ４ａを過剰増殖する化生細胞が、Ｋｉ６７に対する抗体に対して免疫反応性でないことを示す。対照的に、形成異常細胞は、Ｋｉ６７に免疫反応性であり、そしてｐ１６ＩＮＫ４ａに対する抗体に免疫反応性である。従って、化生細胞とは対照的に、形成異常細胞における１細胞の二重染色は、Ｋｉ６７特異的抗体およびｐ１６ＩＮＫ４ａ特異的抗体を用いて産生され得る。
【０１３５】
図８において示される結果は、Ｋｉ６７およびｐ１６ＩＮＫ４ａに特異的な試薬を用いた細胞の二重染色が、呈色染色手順においてもまた、特異的二重染色パターンを可能にすることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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