(57)【要約】      （修正有）【課題】未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化を誘導を促進する新規分化誘導促進方法及び新規分化誘導促進剤を提供すること。【解決手段】未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進するための分化誘導促進剤は、制御性Ｔ細胞に分化することができる未分化Ｔ細胞を、ラクトフェリンの存在下で分化誘導することを特徴とする、更に未分化Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進させる遺伝子発現亢進方法であって、前記未分化Ｔ細胞に、ラクトフェリンを投与することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進するための分化誘導促進剤であって、
ラクトフェリンを有効成分として含有する分化誘導促進剤。
【請求項２】
前記未分化Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性の細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の分化誘導促進剤。
【請求項３】
未分化Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進させるための遺伝子発現亢進剤であって、
ラクトフェリンを有効成分として含有する遺伝子発現亢進剤。
【請求項４】
前記未分化Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性の細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子発現亢進剤。
【請求項５】
請求項１または２に記載の分化誘導促進剤、または請求項３または４に記載の遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有することを特徴とする、免疫抑制剤
【請求項６】
未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進方法であって、
前記制御性Ｔ細胞に分化することができる未分化Ｔ細胞を、ラクトフェリンの存在下で分化誘導することを特徴とする、方法（ヒト個体中で分化誘導する場合を除く。）。
【請求項７】
未分化Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進させる遺伝子発現亢進方法であって、
前記未分化Ｔ細胞に、ラクトフェリンを投与することを特徴とする、方法（ヒト個体中で分化誘導する場合を除く。）。
【請求項８】
前記未分化Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性の細胞であることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分化誘導促進剤、遺伝子発現亢進剤、分化誘導促進方法及び遺伝子発現亢進方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイン遺伝子のノックアウトマウスやＴ細胞受容体の変異マウスでは、自然発生的な大腸炎が観察される（非特許文献１〜２参照）。これらのことから、異物に対する免疫反応は、Ｔｈ１／Ｔｈ２などの異なるヘルパーＴ細胞のバランスにより調節されていることが示唆されている。  
ヘルパーＴ細胞のうち、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫反応を抑制することで、免疫寛容の維持や炎症の抑制に重要な役割を果たしている。従って、Ｔｒｅｇを分化誘導する技術は、炎症性疾患や自己免疫性疾患など、免疫の過剰反応が原因である疾患の治療に役立つことが期待される。  
これまで、Ｔｒｅｇを分化誘導する物質として、ＴＧＦ−βやニコチン・スタチンなどが知られている（非特許文献３〜４参照）。in vivoでは、ラクトバチルス・プランタラムやラクトバチルス・ロイテリを摂取することによって、リンパ球におけるＴｒｅｇの割合が増加することが知られている（非特許文献５〜６参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ma et al., J. Exp. Med. vol.182 p.1567-1772, 1995
【非特許文献２】Macdonald, Curr. Biol. vol.4 p.261-263, 1994
【非特許文献３】Galitovskiy et al., J. Immunol. vol.187 p.2677-2787, 2011
【非特許文献４】Meier et al., Expert. Rev. Cardiovasc. Ther. vol.6 p.987-997, 2008
【非特許文献５】Karimi et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med. vol.179 p.183-193, 2009
【非特許文献６】Enomoto et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. vol.73 p.457-460, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、未分化Ｔ細胞に対し、制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進する新規分化誘導促進方法及び新規分化誘導促進剤、並びにｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｐ３(Ｆｏｘｐ３)遺伝子発現亢進剤及びＦｏｘｐ３遺伝子発現亢進方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施態様は、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進するための分化誘導促進剤であって、ラクトフェリンを有効成分として含有するものである。
【０００６】
本発明の他の一実施態様は、未分化Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進させるための遺伝子発現亢進剤であって、ラクトフェリンを有効成分として含有するものである。
【０００７】
本発明のさらに他の一実施態様は、前記分化誘導促進剤、前記遺伝子発現亢進剤を有効成分として含有することを特徴とする、免疫抑制剤である。
【０００８】
本発明のさらなる一実施態様は、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進する分化誘導促進方法であって、前記制御性Ｔ細胞に分化することができる未分化Ｔ細胞を、ラクトフェリンの存在下で分化誘導することを特徴とする方法である。
【０００９】
本発明のさらなる一実施態様は、未分化Ｔ細胞において、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進させる遺伝子発現亢進方法であって、前記未分化Ｔ細胞に、ラクトフェリンを投与することを特徴とする方法である。
【００１０】
これらの方法において、ヒト個体中で分化誘導する場合を除いてもよい。  
なお、前記未分化Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性、ＣＤ２５陰性、ＣＤ６２Ｌ陽性の細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によって、未分化Ｔ細胞に対し、制御性Ｔ細胞への分化を誘導する新規分化誘導促進方法及び新規分化誘導促進剤、並びにＦｏｘｐ３遺伝子の発現を亢進するための遺伝子発現亢進剤及び遺伝子発現亢進方法を提供することとなった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施例において、未分化Ｔ細胞を、ウシ・ラクトフェリンを含有した培地で分化誘導し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の割合を解析した結果を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施例において、未分化Ｔ細胞を、ウシ・ラクトフェリンを含有した培地で分化誘導し、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を解析した結果を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施例において、未分化Ｔ細胞を、ウシ・ラクトフェリンを含有した培地で分化誘導して得られた細胞が、制御性Ｔ細胞として機能することを示すグラフである。
【図４】本発明の一実施例において、未分化Ｔ細胞を、ウシ・ラクトフェリンを含有した培地で分化誘導して得られたＴ細胞（ＬＦＴｒｅｇ）をマウスに移入し、炎症性腸疾患を誘発した時の（Ａ）腸の観察写真（スケールバーの長さは１ｃｍ）、（Ｂ）腸の長さ、（Ｃ）糞便の状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.; J. S. Bonifacino, M. Dasso, J. B. Harford, J. Lippincott-Schwartz, K. M. Yamada (Ed.), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを改変した方法を用いた。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合、特に説明が無い場合にはそれらに添付のプロトコールを用いた。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施の形態を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾できることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
本発明によると、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化を誘導する際、ラクトフェリンの存在下で分化誘導を促進することができる。この未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導促進は、in vivoで行なってもin vitroで行なってもよい。
【００１６】
分化誘導促進をin vivoで行なう場合、動物個体にラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤を投与する。投与方法は特に限定されず、経口投与であっても非経口投与であっても構わない。投与する対象の動物は特に限定されず、ヒトであっても、ヒト以外の動物であっても構わない。投与量は、その動物の年齢、性別、身長、体重などによって、投与者が、適宜決定することができる。
【００１７】
このようなラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤の剤形は、特に限定されず、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。この製剤化は、従来使用されている製剤添加物を用いて、常法で行うことができる。製剤添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤などの既存の添加物を用いることができる。
【００１８】
こうして、ラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤を投与することによって、動物個体内で未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進することができる。従って、ラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤は、その動物個体内で免疫反応を抑制する免疫抑制剤として用いることができる。このような免疫抑制剤は、体内の免疫を抑制することにより治療することができる疾患、例えば、炎症、自己免疫病、膠原病、全身性エリテマトーデス、リウマチ、各種のアレルギー、などの治療や、拒絶反応の抑制などに、用いることができる。また、他の免疫抑制剤とともに、動物個体に投与されてもよい。
【００１９】
分化誘導促進をin vitroで行なう場合、未分化Ｔ細胞を培養している培養液にラクトフェリンを含有する分化誘導促進剤を添加し、細胞を分化誘導条件下において、分化誘導すればよい。分化誘導促進剤の添加量は特に限定されないが、１μＭ以上であることが好ましく、１０μＭ以上であることがより好ましい。分化誘導条件は、当業者に周知の条件を選択すればよく、例えば、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体による刺激であってもよい。
【実施例】
【００２０】
（１）未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７−１０週齢）から脾臓を抽出し、圧迫により破砕することで細胞懸濁液を調製した。懸濁液をセルストレイナー（ＢＤバイオサイエンス社）に通し非破砕組織断片を除去した後、ＡＣＫ緩衝液に懸濁して溶血させ、ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ・アルドリッチ社）で希釈し、遠心して細胞を回収した。細胞を０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含有するリン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、ＣＤ４陽性−ＣＤ６２Ｌ陽性細胞をＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク社）で単離し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、未分化Ｔ細胞とした。  
抗ＣＤ３ｅ抗体（２μｇ／ｍＬ）（イーバイオサイエンス社）でコートした２４ウエルの細胞培養用プレートに１×１０６個の未分化Ｔ細胞を播種し、抗ＣＤ２８抗体（最終濃度２μｇ／ｍＬ）（イーバイオサイエンス社）を添加した。同時に、ウシ・ラクトフェリン（フォンテラ・ジャパン社）を最終濃度０．１、１、１０μＭになるように添加し、７２時間培養した。なお、陰性対照として、ウシ・ラクトフェリンを含まない培地を用い、陽性対照として、組換えヒトＴＧＦ−β１（２ｎｇ／ｍＬ：Ｒ＆Ｄシステム社）を含有した培地を用いて培養を行なった。
【００２１】
（２）Ｆｏｘｐ３タンパク質をマーカーとした解析
（１）に従って分化誘導した細胞を回収し、フィコエリスリン標識抗Ｆｏｘｐ３抗体（イーバイオサイエンス社）およびＦｏｘｐ３染色セット（イーバイオサイエンス社）を用いて染色した。染色後、フローサイトメーター（ガリオス：ベックマンコールター社）を用いて、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の割合を測定した。なお、Ｆｏｘｐ３は、制御性Ｔ細胞分化のマスター因子であり、広く認められた制御性Ｔ細胞のマーカーである。  
その結果、図１に示すように、１０μＭのウシ・ラクトフェリンを含有した培地では、Ｆｏｘｐ３陽性細胞が約６−７倍に増加していた。このように、ウシ・ラクトフェリンには、未分化Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化誘導を促進する作用がある。
【００２２】
（３）Ｆｏｘｐ３ｍＲＮＡをマーカーとした解析
（１）に従って分化誘導した細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社）を用いてＲＮＡを抽出した。スーパースクリプトIII（ライフテクノロジーズ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、ライトサイクラー（ロッシュ・ダイアクノスティクス社）を用いたリアルタイムＰＣＲ法により遺伝子発現を定量した。Ｆｏｘｐ３の発現解析には、
フォワードプライマー：5’―TACTTCAAGTTCCACAACATGCGACC―3’（配列番号１）
リバーズプライマー：5’―CGCACAAAGCACTTGTGCAGACTCAG―3’（配列番号２）
を用い、内部標準としてのヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の発現解析には、
フォワードプライマー：5’―AGCCTAAGATGAGCGCAAGT―3’（配列番号３）
リバーズプライマー：5’―TTACTAGGCAGATGGCCACA―3’（配列番号４）
を用いた。そして、陰性対照におけるＦｏｘｐ３ｍＲＮＡの発現を１とした時の、発現の相対量を算出した。  
その結果、図２に示すように、１０μＭのウシ・ラクトフェリンを含有した培地では、Ｆｏｘｐ３のｍＲＮＡ発現量が約６０−７０倍に増加した。このように、ウシ・ラクトフェリンには、未分化Ｔ細胞に対し、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現を促進する作用がある。
【００２３】
（４）分化誘導された制御性Ｔ細胞の機能評価
（１）に従って分化誘導した細胞を回収した。この細胞が、制御性Ｔ細胞として機能することを確認するため、ＣＤ４陽性−ＣＤ６２Ｌ陽性細胞をレスポンダー細胞とし、分化誘導した細胞とレスポンダー細胞を様々な割合で混合して、レスポンダー細胞の増殖応答に対する抑制活性を評価した。
【００２４】
まず、ＢＡＬＢ/ｃマウスより調製した脾臓細胞から、ＣＤ４陽性細胞をＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）により除いた後、２０μｇ/ｍＬマイトマイシンＣ（ナカライテスク社）および１０％ウシ胎児血清を含有したＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ・アルドリッチ社）で１時間、３７℃で処理した。１０％ウシ胎児血清を含有した ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、同培地に懸濁後、抗原提示細胞として、２×１０５ずつ９６ウエルの丸底プレートに播種した。次に、（１）と同様にＣＤ４陽性−ＣＤ６２Ｌ陽性細胞を単離し、レスポンダー細胞として５×１０４ずつ加えた。さらに（１）の方法で分化誘導した細胞を、レスポンダー細胞に対し１：１〜１：８の割合となるように加えた。抗ＣＤ３ｅ抗体（終濃度２μｇ／ｍＬ：イーバイオサイエンス社）、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で７２時間、３７℃で培養した後、トリチウムチミジンを終濃度９２．５ｋＢｑ／ｍＬで添加し、さらに１８時間培養した。細胞を回収し、トリチウムの取り込みを液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉ−ｃａｒｂ３１００ＴＲ・パーキンエルマー社）により測定した。なお、陰性対照として、レスポンダー細胞だけを培養したもの、およびウシ・ラクトフェリン非存在下で分化誘導した細胞と、レスポンダー細胞を混合培養したものを用いた。また、陽性対照として組換えヒトＴＧＦ−β１を添加して分化誘導した細胞とレスポンダー細胞を混合培養したものを用いた。
【００２５】
その結果、図３に示すように、ラクトフェリンを含有した分化誘導培地で得られた細胞は、ラクトフェリンを含有しない分化誘導培地で得られた細胞に比べ、レスポンダー細胞の増殖に対するより強力な抑制作用を有していた。このように、ラクトフェリン存在下で分化誘導した細胞は、制御性Ｔ細胞としての性質を有する。
【００２６】
（５）ラクトフェリン存在下で分化誘導されたＴ細胞による大腸炎症状の緩和
７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー・ジャパン社）に、（１）と同様に、ラクトフェリン存在下で分化誘導したＴ細胞（ＬＦＴｒｅｇ）を、１匹あたり２×１０６個、マウスの尾静脈に注射して移入した。１時間後に、２０ｍｇ／ｍＬのトリニトロベンゼンスルフォン酸（ＴＮＢＳ：和光純薬）１００μＬを、アニマルフィーディングニードルを装着した注射器を用いて直腸に注入することにより、炎症性腸疾患を誘発した。なお、各群の個体数は１２から１５であり、陰性対照はＴＮＢＳに代わって５０％エタノールを直腸に注入したマウスである。ＴＮＢＳ投与４日後、大腸の長さを測定した。
【００２７】
図４Ａに、切除した大腸の外見の様子を示す。図４Ｂは、切除した大腸の長さを比較したグラフである。このように、ＬＦＴｒｅｇを移入したマウスでは、ＴＮＢＳを単独で投与したマウスと比較して、大腸の長さが有意に（ｐ＜０．０５）長かった。（統計量の比較には、スチューデントのｔ検定を用いた。）大腸の短縮の程度は、大腸粘膜の肥厚の程度を反映し、大腸炎の指標として利用されることから、ＬＦＴｒｅｇの移入により、大腸炎の症状が緩和されたことがわかる。
【００２８】
一方、ＴＮＢＳ注入後２日目に、各群のマウスの糞便の状態を肉眼で観察し、正常便を（１）、軟便を（２）、下痢便を（３）、水様便を（４）としたスコアで評価し、各群ごとに、そのスコアをグラフにプロットした。図４Ｃに示すように、ＬＦＴｒｅｇの移入により下痢の症状が有意に（ｐ＜０．０５）緩和された。（統計量の比較には、マン・ホイットニーのＵ検定を用いた。）  
このように、ラクトフェリン存在下で分化誘導したＴ細胞は、抗炎症効果を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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