(57)【要約】      （修正有）【課題】骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる血糖代謝改善剤およびそれを配合した経口組成物を提供する。【解決手段】サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物に優れた骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる効果が存在することを見出し、運動による血糖値の低下作用を増強させるだけでなく、運動しなくても運動したときと同様な効果を得ることができる血糖代謝改善剤を見出した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物からなる血糖代謝改善剤。
【請求項２】
請求項１に記載の血糖代謝改善剤を配合したことを特徴とする経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖代謝改善剤に関する。より詳細には、セイヨウヤナギ抽出物を含む骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる血糖代謝改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高カロリー食の普及や日常の運動量の低下などの生活習慣要因により、中高年層だけでなく若年層においても糖尿病を発症する若しくはインスリン抵抗性を示す人が増えている。また、脂肪細胞の蓄積がインスリン抵抗性を引き起こすことも知られており、運動量も低下する老齢者においても糖尿病発症のリスクが高い。このように、日常生活の変化や老齢化社会への移行に伴い、糖尿病患者が年々爆発的に増加する傾向にあり、糖尿病予備軍である血糖代謝の異常を有する人も糖尿病患者の数倍以上存在すると考えられている。実際、国民健康・栄養調査や糖尿病実態調査でも同様な傾向が明らかにされており、わが国
の糖尿病患者の増加は深刻といえる。この状況において、糖尿病が根本的な治癒ができない疾病であることから、糖尿病患者においては、病態を悪化させない、また、インスリン抵抗性を示す人に対しては、糖尿病を発症させない取組みを実行することが重要である。
【０００３】
血糖値を正常範囲で推移させ、糖尿病の発症予防や治療を行う方法としては、食事療法、運動療法および薬物療法が存在し、その単独の又は組み合わせた方法が採用されている。しかし、摂取カロリーを制限する食事療法や一定時間以上実行することが必要な運動療法は、継続的に実行できない場合が多く、特に老齢者では、基礎代謝量が大幅に低下しているだけでなく、運動能力の大幅な低下に伴う運動量の減少も深刻であり、前記の方法だけで対処することが難しい場合が増加している。一方、薬物療法も医療費増大防止の観点から満足できる対処方法とはいえず、また、予防的には採用しにくい方法である。そこで、血糖の代謝に大きな影響を与えている骨格筋における糖代謝に着目し、従来処置される治療法や予防法と併用若しくは単独で、糖尿病発症予防効果や糖尿病病態改善効果を飛躍的に増強させる手段の開発が試みられている。
【０００４】
血管（血液）から骨格筋へ糖を取り込む機序として、骨格筋を収縮させることで細胞内のＡＭＰキナーゼがリン酸化され活性化し、最終的には細胞質内のグルコーストタンスポーター４が細胞膜中に移動し、骨格筋細胞内へ糖が取り込まれる場合が知られている。さらに、この骨格筋細胞内への糖の取り込みは、骨格筋の収縮が無くても、ＡＭＰキナーゼを活性化させることでも生じることが判っていることから、運動しなくても運動した場合と同じような効果を得られる可能性がある。この点に着目し、ＡＭＰキナーゼを活性化させる物質を経口摂取することで、血中の糖濃度を低減させる試みが提案されている。（特許文献１、２）
【０００５】
さらに、血管（血液）から骨格筋へ糖を取り込む別の機序として、血中のインスリンが骨格筋の間質を介して細胞膜表面にあるインスリン受容体に結合し、Ａｋｔのリン酸化による活性化などの情報伝達分子の活性化により、最終的には細胞質内のグルコーストタンスポーター４が細胞膜中に移動し、骨格筋細胞内へ糖が取り込まれることも知られている。この機序においては、インスリンが骨格筋に分布する毛細血管から骨格筋間質に移行するまでの経路も重要な役割を担っている。骨格筋毛細血管のe-NOS活性化等を介した拡張機能亢進や血管新生による毛細血管密度の増加により、毛細血管の表面積と血流量の増加が起こることで、細胞へのインスリン移行が亢進し、糖代謝が改善されることがわかっている。（非特許文献１）
【０００６】
ＡＭＰキナーゼを介した前者の機序とインスリンを介した後者の機序はお互い独立して作用し、かつ両者共に、大きな糖の取り込み効果を発現させることが期待できる。健常人では、これら２つの機序が共に発現しているが、糖尿病患者やインスリン抵抗性を有する人においては、後者の機序が低下している、若しくは失われていることから、この２つの機序を合わせて発現させる若しくはそれらの機能を亢進させることにより、より健常者に近い状態を実現させることができる可能性がある。しかし、未だこれら２つの機序を併せて発現させる方法は知られておらず、具体的な解決方法の提案が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−３７３２３号公報
【特許文献２】特開２０１１−３７７３２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ, １３, ２９４−３０７,２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる血糖代謝改善剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、かかる事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことにセイヨウヤナギ抽出物に優れた骨格筋における糖代謝機能を改善または向上させる効果が存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、項１および２の血糖代謝改善剤およびそれを配合した経口組成物を提供するものである。
項１．サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物からなる血糖代謝改善剤。
項２．項１に記載の血糖代謝改善剤を配合したことを特徴とする経口組成物。 
【発明の効果】
【００１２】
本発明の血糖代謝改善剤は、ＡＭＰキナーゼの活性化を誘導することから、運動による血糖値の低下作用を増強させるだけでなく、運動しなくても運動したときと同様な効果を得ることが可能である。さらに、摂取時期を限定することなく本発明の血糖代謝改善剤を摂取することで食後高血糖を改善することが可能となる。また、骨格筋毛細血管密度を高めることから、インスリン抵抗性の改善効果も得ることも可能である。したがって、糖尿病患者や糖尿病予備軍だけでなく、高齢者や寝たきりの人など十分な運動量が確保できない人においても血糖値を下げ、糖尿病の発症を予防したり、糖尿病の病態を改善する効果が期待できる。さらに運動前・中・後の摂取により運動の効果を高める運動効果促進剤としても有用である。また、本発明の摂取によりＡＭＰキナーゼを活性化することで、抗老化効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、マウス骨格筋細胞株を用いたＡＭＰキナーゼの活性測定結果を示す。
【図２】図２は、マウスにセイヨウヤナギ抽出物を経口摂取させた時の耐糖能低下の改善作用の試験結果を示す。
【図３】図３は、マウスにセイヨウヤナギ抽出物を経口摂取させた時の耐糖能低下の改善作用の試験結果（曲線下面積）を示す。
【図４】図４は、マウスにセイヨウヤナギ抽出物を経口摂取させた時の骨格筋中の総ＡＭＰＫに対するリン酸化ＡＭＰＫの発現比を示す。
【図５】図５は、マウスにセイヨウヤナギ抽出物を経口摂取させた時の骨格筋中におけるＧＡＰＤＨあたりのＴｉｅ−２の発現比率を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明における血糖代謝改善剤は、サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物を特徴とするものである。以下に詳しく説明する。なお、本願明細書において配合比率は、特に断りのない限り配合質量比率を表す。
【００１５】
本発明のセイヨウヤナギ抽出物の製造に使用するセイヨウヤナギは、サリックス・ダフノイデス（Salix daphnoides、セイヨウエゾヤナギ）、サリックス・プルプレア(Salix
purpurea、セイヨウコリヤナギ)、サリックス・フラギリス（Salix  fragilis、ポッキリヤナギ）、サリックス・アルバ（Salix  alba、セイヨウシロヤナギ、White  Willow）であり、こられ単独若しくは二種以上を混合して使用できる。本発明のセイヨウヤナギ抽出物は、例えば、欧州薬局方およびドイツ薬局方に規格に適合する「Salicis  cort  extract（Frutarom Switzerland Ltd.社製）」を使用できる。具体的には、「Salicis  cort  extract（Frutarom  Switzerland  Ltd.社製）」は、「Salix  purpurea、Salix  daphnoidesおよびSalix  fragilisの樹皮および/または新芽・若枝を、水を用いて抽出して得られた粉末状のエキス」である。  
【００１６】
本発明の血糖代謝改善剤は経口組成物として摂取することができる。経口組成物としては、医薬品、医薬部外品のほか、糖尿病、高血糖、耐糖能異常、インスリン抵抗性、動脈硬化、肥満、体脂肪蓄積、脂質代謝異常、生活習慣病、脂肪肝等の予防・改善や糖代謝亢進、抗老化の生理機能をコンセプトとした機能性飲食品、疾病者用食品、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品などとすることができる。抗老化作用には皮膚の老化抑制をコンセプトとした食品への応用も可能である。さらには、筋肉の毛細血管の密度を上げることによる筋肉の弱体化を防止する食品としても期待できす。賦これら経口組成物の剤形形態としては特に限定するものではないが、例えば、ハードカプセル、ソフトカプセル、サプリメント、チュアブル錠、飲料、粉末飲料、顆粒、フィルムなどの形態のほか、飲食品として使用する場合、例えば、茶系飲料、スポーツ飲料、美容飲料、果汁飲料、炭酸飲料、アルコール飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、水や湯、炭酸水等で希釈する濃縮タイプの飲料等の飲料、水や湯等に溶解または懸濁させて飲用する粉末や顆粒、タブレット等の乾燥固形物、タブレット菓子、ゼリー類、スナック類、焼き菓子、揚げ菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、グミなどの菓子類、スープ類、めん類、米飯類、シリアル等などの食品形態にすることもできる。このうち通常の生活においては、サプリメントタイプ、チュアブル錠、ワンショットドリンクタイプなどの形態が好ましく、運動効果を高める目的で摂取する場合には、スポーツ飲料などの飲料の形態が最も好ましい。血糖代謝改善剤は、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤などの場合は、通常、乾燥物換算でこれら経口組成物に対して、０．０１〜９５質量％、好ましくは５〜９５質量％、最も好ましくは２５〜９０質量％配合する。セイヨウヤナヤギ抽出物を安定に配合するために、ビタミンＢ類、ビタミンＥ、ビタミンＣなどを合わせて配合することもできる。上記以外の飲食品やペットフードの場合は、通常、０．００１〜５０質量％、好ましくは０．０１〜４０質量％、最も好ましくは０．０３〜２５質量％配合する。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下特に断りのない限り「％」は「質量％」を示す。
【００１８】
ＡＭＰキナーゼのリン酸化活性測定
下記にしたがって、ELISA法を用いたＡＭＰキナーゼのリン酸化活性の測定を行った。マウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を６穴細胞培養プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清および１％殺菌剤を添加したＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％二酸化炭素存在下で３日間培養した。細胞がコンフルエントになった状態で１％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地に交換し、さらに培養して完全に分化させた。さらに、培地を新しいものに交換したうえで、被験物質を投与し３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養した。被検物質として、「Salicis  cort extract（図表では「ＷＢＥ」と略する。）（Frutarom Switzerland Ltd.社製）」、およびポジティブコントロールとしてＡＩＣＡＲ（最終濃度２ｍＭ）を用いた。ＰＢＳ（−）で二度細胞を洗浄後、フォスファタ-ゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦを添加した細胞溶解バッファー（Invitrogen）を１５０μＬ加え、セルスクレイパーで細胞溶解液を回収した。細胞溶解液を超音波処理後、遠心分離にて上清を回収した。上清は測定に用いるまで−８０℃で保存した。上清のタンパク質濃度を測定し、サンプル間のタンパク濃度を一定に調整した。調整後、ＡＭＰＫα  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Invitrogen）を用いて、ＡＭＰＫを測定した。活性の度合は、コントロール（サンプル無添加）群を１００とした相対値で示した。測定結果を表１、図１に示す。
【００１９】
【表１】
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表中、ハイフンは測定していないことを示す。
【００２０】
表１、図１に示したとおり、セイヨウヤナギ抽出物は、明らかに０．０２および０．０５質量％の濃度においてＡＭＰキナーゼのリン酸化活性を有することが判った。
【００２１】
グルコーストレランステスト
下記にしたがって、セイヨウヤナギ抽出物を経口摂取させたマウスにおけるグルコーストレランステスト（腹腔内ブドウ糖負荷試験：ｉＰＧＴＴ）を行った。
「Salicis  cort extract（Frutarom Switzerland Ltd.社製）」を、最終濃度が０．２５％（ｗ/ｗ）となるように添加した高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ+ＷＢＥ）および高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ：ともにオリエンタル酵母工業社製）を作成し、各々ペレット状に成型した。１２匹のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウス（５週令：日本チャールス・リバー社）を1週間の予備飼育の後、１群６匹に分けて高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ）およびセイヨウヤナギ抽出物配合高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ+ＷＥＢ）を１日に約３ｇ与え、１８週間飼育を行った。飼育後、グルコーストレランステストを実施した。グルコーストレランステストは、２gブドウ糖／kg body weightを腹腔内に注射し、０、３０、６０、９０、１２０分後に尾静脈血にてフリースタイルフリーダムライト（アボット社製）を用いて血糖値を測定した。さらに、1週間絶食させた後のマウスを、麻酔下で下腿部の骨格筋サンプルを採取し、凍結保存した。血糖値の測定結果を図２に示す。また、０分から１２０分までの各曲線下の面積（ＡＵＣ：Area under the curve）を図３に示す。なお、検定は各群を独立サンプルとして統計解析ソフトＰＡＳＷ  statistics 18を用いてstudent`s t testにより行った。図中の「*」、「**」および「***」は、各々、５％、１％もしくは０．１％の危険率で有意差を認めたことを示す。
【００２２】
図２、３に示したとおり、高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ）に０．２５％（ｗ/ｗ）のセイヨウヤナギ抽出物を添加した場合、添加しない場合に比べてグルコース負荷後の血糖値の上昇を有意に抑制したことから、セイヨウヤナギ抽出物は耐糖能低下の改善作用を有することがわかった。
【００２３】
ウエスタンブロッティングによる骨格筋ＡＭＰキナーゼ活性化、Ｔｉｅ−２の測定
前記試験で採取した骨格筋サンプルを凍結粉砕し、その一部をＴ−ＰＥＲ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中で超音波処理後、遠心分離により上清のタンパク質定量を行い、各サンプル間のタンパク質量をあわせた。濃度調整した上清タンパクにＬａｎｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＳＤＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え、９８℃で加熱変性させ、電気泳動用サンプルを調整した。４８μｇタンパク量の泳動用サンプルを７．５％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ｉｂｌｏｔシステム（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてニトロセルロース膜に転写した。転写された膜を５％スキムミルム溶液でブロッキング処理後、常法にしたがい、１次抗体、２次抗体と反応させた後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を検出試薬としてＬＡＳ４０００ｍｉｎｉシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてバンドを検出した。バンドの発色強度を画像解析ソフト（ＩｍｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ社製）により数値化した後、ＡＭＰキナーゼ活性として、総ＡＭＰＫ（ｔＡＭＰＫ）に対するリン酸化ＡＭＰＫ（ｐＡＭＰＫ）の発現比を求めた。得られた結果を図４に示す。さらに、血管マーカーであるＴｉｅ−２値について、内在性コントロールであるＧＡＰＤＨを用いて補正するために、ＧＡＰＤＨに対するＴｉｅ−２値を求めた。得られた結果を、ＨＦＨＳ群における値を１００とした場合の相対値として図５に示す。
【００２４】
図４に示したとおり、セイヨウヤナギ抽出物は、骨格筋中のＡＭＰキナーゼのリン酸化活性を有することがわかった。また、図５に示したとおり、骨格筋中のＴｉｅ−２の増加したことから、柿葉エキスには血管申請の亢進も有し、骨格筋組織における血流量および毛細血管密度を増大させる作用があることがわかった。
【００２５】
以下、本発明に係る血糖代謝改善剤を配合した経口組成物の実施例の処方を挙げるが、本発明は下記の処方に限定されるものではない。なお、特に指定の無いかぎり配合量は質量部を示す。
【００２６】
処方例１：スポーツ飲料  
成    分                                      配合量
セイヨウエゾヤナギ水抽出物（粉末）                ０．３
果糖                                              ８
食塩                                              ２
重曹                                              ２
水                                                残部
合    計                                    ５００
【００２７】
処方例２：粉末茶  
成    分                                      配合量
セイヨウコリヤナギ水抽出物（粉末）                ２２
香料                                                ３
デキストリン                                      ７５
合    計                                      １００
【００２８】
処方例３：チュアブル錠  
成    分                                      配合量
ポッキリヤナギ水抽出物（粉末）                  １００
キシリトール                                    ２８５
アスパルテーム                                      ４
ステアリン酸マグネシウム                          １０
香料                                                １
合    計                                      ４００
【００２９】
処方例４：チューイングガム  
成    分                                      配合量
セイヨウシロヤナギ水抽出物（粉末）              １００
ガムベース                                      ５００
キシリトール                                  １０００
還元パラチノース                                ７００
香料                                            ２００
合    計                                    ２５００
【００３０】
処方例５：焼き菓子  
成    分                                      配合量
セイヨウシロヤナギ水／エタノール抽出物（粉末）  ０．３
薄力粉                                        １７．８５
ベーキングパウダー                              ０．３
米油                                            ２．４
還元水あめ                                      ９
香料                                            ０．１５
合    計                                    ３０
【００３１】
処方例６：ゼリー飲料  
成    分                                      配合量    
セイヨウヤナギエキス末                          ０．３５
オリゴ糖シロップ                              ２７
還元水あめシロップ                            ２７
濃縮果汁                                        ７．２
グルコマンナン                                  ５．４
ｐＨ調整剤                                      ４．５
ゲル化剤                                        ２．７
香料                                            ０．４５
水                                              残部
合    計                                  １００
【００３２】
処方例７：ショットドリンク  
成    分                                      配合量  
セイヨウシロヤナギ水／エタノール抽出物            ０．３
オリゴ糖シロップ                                １５
還元水あめシロップ                              １５
濃縮果汁                                          ４
ｐＨ調整剤                                        ２．５
安定化剤                                          １
香料                                              ０．２５
スクラロース                                      ０．０２
水                                                残部  
合    計                                    １００
【００３３】
処方例８：カプセル剤  （300ｍｇ/個）  
成    分                                      配合量
セイヨウエゾヤナギ水抽出物(粉末)                １５０
コーンスターチ                                    ６０
セルロース                                        ６０
トコフェロール                                      ６
乳糖                                              ２３
安定化剤                                            １
合    計                                      ３００  
【００３４】
処方例９：錠剤（250ｍｇ錠）
成    分                                      配合量
ポッキリヤナギ水抽出物（粉末）                  １５０
コーンスターチ                                    ２５
セルロース                                        ２５
ビタミンＣ                                        ５０
合    計                                      ２５０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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