(57)【要約】【課題】誘電泳動を利用する従来の細胞識別方法よりも、表面抗原を発現している細胞のマイクロバンドアレイ電極上への捕捉率が高い、新規な細胞識別方法を提供すること。【解決手段】細胞懸濁液の導電率を200mS/m〜500mS/mとし、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のすべてのバンド電極と対向する導電性基板との間に50kHz以上500kHz以下の周波数と15Vpp以上20Vpp以下の振幅（印加電圧強度）とを有する交流電圧を印加する。その後、片側の電極への交流電圧印加を停止する。それにより、マイクロバンドアレイ電極表面に固定された抗体と反応せずに捕捉されなかった細胞だけを、片側のバンドアレイ電極上へと効率よく移動及び集積させることが可能となる。【選択図】図８
2013238463.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路型デバイスを利用し、表面に特定抗原を発現している細胞を誘電泳動によって識別する細胞識別方法であって、
前記マイクロ流路型デバイスは、
基板と、
基板上に配置される交互くし型マイクロバンドアレイ電極と、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極が露出するように前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極上に配置される絶縁性薄膜と、
前記絶縁性薄膜上に配置されるスペーサーと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極に対向するように前記スペーサー上に配置される導電性基板とを備え、
前記基板表面の少なくともバンド電極間には細胞表面に発現する抗原に対する抗体が固定化されており、
前記方法は、
細胞を含有する導電率200mS/m以上500mS/m以下の試料液を調製する工程Ａと、
前記試料液を前記マイクロ流路型デバイスのバンド電極上に導入する工程Ｂと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のすべてのバンド電極と前記導電性基板との間に50kHz以上500kHz以下の周波数と15Vpp以上25Vpp以下の振幅とを有する交流電圧を印加する工程Ｃと、
前記工程Ｃ後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅ０と、
前記工程Ｅ０後、前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の印加を停止する工程Ｄと、
前記工程Ｄ後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅと、
を順に有する方法。
【請求項２】
前記工程Ｄの前に、前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の振幅を、工程Ｃの振幅の85％〜100％の間で周期的に変動させる工程Ｄ０をさらに有する、請求項１に記載の細胞識別方法。
【請求項３】
前記表面に特定抗原を発現している細胞が白血球であり、前記基板表面に固定される抗体が抗CD33抗体である、請求項１又は２に記載の細胞識別方法。
【請求項４】
前記導電性基板がインジウムスズ酸化物から構成される基板である、請求項１乃至３に記載の細胞識別方法。
【請求項５】
前記工程Ｄ０の実行時間が1秒以上30秒以下である、請求項２に記載の細胞識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘電泳動による細胞操作技術を利用し、特定の抗原を表面に発現している細胞を、細胞群の中から簡便かつ迅速に識別する、細胞識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球細胞の表面抗原は、細胞表膜表面に存在するタンパク質であり、それぞれが固有の機能を有する。表面抗原の発現パターンは、細胞の種類、状態、成熟度又は分化度によって異なり、発現パターンを知ることは医学的及び生物学的に極めて重要な知見となる。細胞の表面抗原発現パターンを解析するイムノフェノタイピングには、抗体を使用した手法が有効である。
【０００３】
イムノフェノタイピングに利用されるモノクローナル抗体は、CD分類（cluster of differentiation）されている。測定対象とする表面抗原に対する抗体を細胞に捕捉させれば、細胞群の中から抗体が反応した細胞を識別することが可能となる。例えば、イムノフェノタイピングにより細胞の成熟度又は分化度を知ることができ、細胞分化の基礎研究においては重要な指標となる。このように、臨床診断、特に白血病診断においては、CD抗体を用いたイムノフェノタイピングが不可欠となっている。
【０００４】
これまでに、白血病の分類、進行度、又は白血病細胞の帰属を決定する際に指標となるCD抗原については、多くの知見が蓄積されている。CD33抗原もそのうちの１つである。CD33は、細胞間接着因子の一種であると推測されている67kDaの膜貫通型糖タンパク質であり、骨髄球性の細胞に発現するために骨髄性白血病の陽性マーカーとして用いられている。具体的には、イムノフェノタイピングを行い、CD33又はCD13が陽性でCD19及びCD20が陰性であれば、骨髄性白血病と診断される。
【０００５】
イムノフェノタイピングの従来法としては、フローサイトメトリー（FCM）を利用する方法、磁気細胞分離装置（MACS）を利用する方法、抗体アレイを利用する方法が挙げられる（非特許文献１〜６）。FCMを利用する方法は、免疫蛍光染色法に基づいた識別方法であり、細胞表面抗原を蛍光分子で標識した抗体によってラベルし、溶液中を流れる細胞にレーザー光を照射し、蛍光を発する細胞が光学的に計測される。表面抗原を異なる種類の蛍光分子でラベルすることにより、複数種の表面抗原を対象に同時計測が可能となる。FCMは、精密な分析結果が得られるために、イムノフェノタイピング手法の基準となっているが、免疫蛍光染色操作には1時間以上を要する。また、それぞれの抗体について濃度及び反応時間の最適化を行う必要があり、操作が煩雑である。さらに、フローサイトメーターは、大型の自動化機器であるため非常に高価な装置であり、熟練した技術者が操作する必要もある。
【０００６】
MACSを利用する方法は、細胞表面抗原を磁性微粒子で標識し、強力な磁場のカラムに導入することにより、磁性微粒子で修飾された細胞の溶出を遅らせることにより、目的とする表面抗原を発現せず、磁気微粒子によって標識されていない細胞画分は、カラムを素通り早く溶出され、磁性微粒子で修飾された細胞は遅く溶出されるため、両者を分離することが可能となる。しかし、この方法では、発現細胞の存在比を知るためには、それぞれの画分の細胞濃度を計測する必要がある。また、分離の状況をリアルタイムで観測することはできず、複数種類の表面抗原への適用も困難である。
【０００７】
抗体アレイを利用する方法では、ガラス上の金薄膜又はニトロセルロース膜のような基板に数十種類の抗体をそれぞれスポット状に固定化し、抗体アレイを作製する。その抗体アレイ上に細胞を播種し、30分程度のインキュベーションを行うことにより。細胞が基板表面にスポット固定された抗体と接触し、その場所に固定化された抗体に対応する表面抗原を発現している細胞は、免疫反応により基板表面に捕捉される。一方、対応する表面抗原を発現していない細胞は捕捉されず、後続する洗浄行程で基板表面から除去される。細胞の捕捉された位置情報及びスポット固定化された抗体の種類から、細胞群において、どのような表面抗原を発現している細胞がどのくらいの比率で存在しているかを知ることができる。
【０００８】
抗体アレイを用いる方法は、簡便かつ安価で、パラレル化が容易な優れた方法である。しかし、抗体アレイ上に添加した細胞懸濁液中の細胞を積極的に移動させていないため、沈降した細胞の表面濃度とスポットの大きさとを最適化する必要がある。また、細胞が沈降し、細胞表面の抗原と基板表面の抗体とが免疫反応を起こすためには、30分程度のインキュベーション時間を要する。さらに、非捕捉細胞の除去は、手作業による洗浄操作によって行う必要があるために、操作に時間がかかるだけでなく、熟練した技術者が操作する場合でなければ、論文で発表されている70％〜90％という高い細胞捕捉率を達成することは極めて困難である。
【０００９】
そこで、本発明者等は、誘電泳動による細胞操作を用いることにより、細胞を迅速に識別できる方法を開発した（非特許文献７）。非特許文献７に開示されている細胞識別方法では、表面抗原としてCD33を発現しているHL60細胞を対象として、抗CD33抗体を固定化した交互くし型マイクロバンドアレイ電極を組み込んだマイクロ流路デバイスを用い、HL60細胞を正の誘電泳動による引力を利用して迅速にマイクロバンドアレイ電極表面に移動させる。これにより、細胞と抗体を強制的に接触させて、免疫反応による結合を促し、HL60細胞をマイクロバンドアレイ電極表面に不可逆的に捕捉する。
【００１０】
次に、マイクロバンドアレイ電極に印加している交流電圧の周波数を切り替え、負の誘電泳動による電極からの斥力を利用して、免疫反応を起こさずにマイクロバンドアレイ電極表面に捕捉されなかったHL60細胞を、バンド電極間へと除去する。それによって、CD33を発現しているHL60細胞のみがバンド電極間の表面に保持される。このようにして、表面抗原発現細胞の識別と空間的な分離とが行われる。
【００１１】
非特許文献７に開示される細胞識別方法は、わずか数分で表面抗原発現細胞を識別可能であり、均一な力で非捕捉細胞を除去できるために再現性にも優れる。また、蛍光ラベルが不要であり、操作が簡便で、所要時間も短いという特徴がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Alvin Y. Liu.,CANCER RESEARCH., 60, 2000, 3429-3434
【非特許文献２】Larissa Belov. et al.,CANCER RESEARCH., 61, 2001, 4483-4489
【非特許文献３】In KapKo. et al., Biomaterials., 26 (2005) 687-696
【非特許文献４】In KapKo. et al., Biomaterials., 26 (2005) 4882-4891
【非特許文献５】Koichi Kato. et al.,Anal. Chem., 2007, 79, 8616-8623
【非特許文献６】GulnazStybayeva et al., Anal. Chem., 2010, 82, 3736-3744
【非特許文献７】Hironobu Hatanaka, Tomoyuki Yasukawa, Fumio Mizutani, Anal. Chem., 2011, 83(18), 7207-7212.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、ほぼ100％のHL60細胞の表面にCD33抗原が発現しているにも関わらず、非特許文献７に開示される細胞識別方法では、マイクロバンドアレイ電極表面に捕捉される細胞は半数未満であった。そのため、細胞の診断方法として利用されることを考慮すると、測定精度が十分ではなく、さらなる細胞捕捉率の向上が必要とされた。
【００１４】
本発明は、非特許文献７に開示されている細胞識別方法よりも、表面抗原を発現している細胞のマイクロバンドアレイ電極表面への捕捉率が高く、かつ、簡便な新規細胞識別方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
HL60細胞の誘電泳動挙動では、低周波数領域で負の誘電泳動、高周波数領域で正の誘電泳動が作用する。また、溶媒導電率の増加により、正の誘電泳動と負の誘電泳動の切り替わる周波数（交差周波数）が高周波数側へシフトし、正の誘電泳動力は減少する。このため、免疫反応が効果的に進行する200mS/m以上の導電率を有する溶媒を細胞懸濁液として用いた場合には、細胞に正の誘電泳動は作用せず、負の誘電泳動のみが作用することになる。
【００１６】
本発明者等は、非特許文献７に開示されている細胞識別方法の改良について鋭意検討した結果、使用している細胞懸濁液の導電率が80mS/mであり、免疫反応が効果的に進行する導電率と比較して小さいことが、細胞捕捉率が低い原因であることを突き止めた。そして、細胞懸濁液の導電率を200mS/m〜500mS/mとし、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のすべてのバンド電極と対向する導電性基板との間に50kHz以上500kHz以下の周波数と15Vpp以上25Vpp以下の振幅とを有する交流電圧を印加する工程と、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の印加を停止する工程とを順次行うことにより、上記課題を解決し得ることを見出した。
【００１７】
また、本発明者等は、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、すべてのバンド電極に印可する工程の振幅（印加電圧強度）の85％〜100％の間で周期的に変動させる工程を行うことによって、さらに細胞捕捉率を向上させ得ることも見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
具体的に、本発明は、
マイクロ流路型デバイスを利用し、表面に特定抗原を発現している細胞を誘電泳動によって識別する細胞識別方法であって、
前記マイクロ流路型デバイスは、
基板と、
基板上に配置される交互くし型マイクロバンドアレイ電極と、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極が露出するように前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極上に配置される絶縁性薄膜と、
前記絶縁性薄膜上に配置されるスペーサーと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極に対向するように前記スペーサー上に配置される導電性基板とを備え、
前記基板表面の少なくともバンド電極間には細胞表面に発現する抗原に対する抗体が固定化されており、
前記方法は、
細胞を含有する導電率200mS/m以上500mS/m以下の試料液を調製する工程Ａと、
前記試料液を前記マイクロ流路型デバイスのバンド電極上に導入する工程Ｂと、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のすべてのバンド電極と前記導電性基板との間に50kHz以上500kHz以下の周波数と15Vpp以上20Vpp以下の振幅とを有する交流電圧を印加する工程Ｃと、
前記工程Ｃ後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅ０と、
前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の印加を停止する工程Ｄと、
前記工程Ｄ後、交互くし型マイクロバンドアレイを観察し、電極間ギャップに存在する細胞数を測定する工程Ｅと、
を順に有する方法に関する。
【００１９】
本発明の細胞識別方法は、非特許文献７に開示されている発明とは、使用されるマイクロ流路型デバイスは共通するが、細胞を含有する試料液（細胞懸濁液）の導電率が異なり、さらに、工程Ｃと工程Ｄの組み合わせにおいて、負の誘電泳動のみによって細胞を移動させる点でも異なる。
【００２０】
前記工程Ｄの前に、前記交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、一つおきとなる半数のバンド電極と前記導電性基板との間の交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の85％〜100％の間で周期的に変動させる工程Ｄ０をさらに有することが好ましい。
【００２１】
工程Ｄ０によって、細胞が振とうされ、細胞と基板表面に固定された抗体とが接触する機会が増し、細胞捕捉率の向上が図れる。
【００２２】
前記表面に特定抗原を発現している細胞は白血球であり、前記基板表面に固定される抗体は抗CD33抗体であることが好ましい。
【００２３】
前記導電性基板は、インジウムスズ酸化物から構成される基板（ITO基板）であることが好ましい。
【００２４】
ITO基板は、透明であるため、一般的な透過型光学顕微鏡を用いて、工程Ｅを行うことが可能である。ただし、反射型光学顕微鏡を用いれば、ITO基板のように透明でない導電性基板を有しないマイクロ流路型デバイスであっても、交互くし型マイクロバンドアレイ電極上に存在する細胞の位置を観察することは可能である。
【００２５】
前記工程Ｄ０の実行時間は、30秒以上120秒以下であることが好ましい。細胞の非特異的な吸着による発現していない細胞の捕捉が進行するからである。なお、前記工程Ｄ０の実行時間は、30秒以上60秒以下であることがより好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、特定の抗原を表面に発現している細胞を、非特許文献７に開示されている方法よりも高い捕捉率で、細胞群の中から簡便かつ迅速に識別することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】マイクロ流路型デバイスの構造（導電性基板以外）を説明する上面図である。
【図２】図１のＸ−Ｘ断面図である。
【図３】交互くし型マイクロバンドアレイ電極の作製方法を説明する概念図である。
【図４】作製された交互くし型マイクロバンドアレイ電極の光学顕微鏡写真を示す。
【図５】すべてのバンド電極と導電性基板との間に200kHzの交流電圧を印加電圧強度20Vppとなるように印加した場合の実験結果であり、(A)は上下電極間に発生している電気力線の状態を示し、(B)はバンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。
【図６】バンド電極ａ１及びａ２と導電性基板との間に周波数200kHz、振幅（印加電圧強度）20Vppの交流電圧を印加し、バンド電極ｂ１及びｂ２と導電性基板との間には交流電圧の印加を停止した場合の実験結果であり、(A)は上下電極間に発生している電気力線の状態を示し、(B)はバンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。
【図７】(A)は図５(A)に示される状態における電場強度解析結果を示す。(B)は図５(B)に示される状態における電場強度解析結果を示す。
【図８】本発明の細胞識別方法において、細胞を分離及び識別する原理を説明する概念図を示す。
【図９】(A)は、実施例１の工程Ｃにおけるバンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。(B)は、実施例１の工程Ｄ後におけるバンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。(C)は、抗CD33抗体の替わりに抗マウスIgG抗体を固定した場合におけるバンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。
【図１０】(A)は、工程Ｃにおける印加電圧強度と細胞捕捉率の関係をプロットしたグラフを示す。(B)は、抗マウスIgG抗体を固定化し、電極ａのバンド電極への印加電圧強度を15Vppとした場合における、バンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。
【図１１】(A)は、試料液の工程細胞の混合比と、細胞捕捉率との関係をプロットしたグラフを示す。(B)は、実施例２の工程Ｄ後におけるバンド電極付近の蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１２】工程Ｄ０における電極ａのバンド電極への印加電圧の振幅の変化を示す。
【図１３】(A)は、電極ａのバンド電極と電極ｂのバンド電極の印加電圧強度を、共に20Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。(B)は、電極ａのバンド電極の印加電圧強度のみ18Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。(C)は、電極ａのバンド電極の印加電圧強度のみ15Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。
【図１４】(A)は、図１２(A)の電圧印加状態におけるバンド電極部付近の光学顕微鏡写真を示す。(B)は、図１２(B)の電圧印加状態におけるバンド電極部付近の光学顕微鏡写真を示す。(C)は、図１２(C)の電圧印加状態におけるバンド電極部付近の光学顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の実施に形態について、適宜図面を参照しながら説明する。本発明は、以下の記載に限定されない。
【００２９】
＜マイクロ流路型デバイスの構造＞
図１は、本発明で使用されるマイクロ流路型デバイスの構造を説明する上面図を示す。図２は、図１のＸ−Ｘ断面図である。図１では、最上部に設置される導電性基板は省略されている。マイクロ流路型デバイス１は、ガラス基板２、電極ａ（符号３）及び電極ｂ（符号４）から構成される交互くし型マイクロバンドアレイ電極をベースとしている。電極ａは、バンド電極ａ１〜ａ４を有し、電極ｂは、バンド電極ｂ１〜ｂ４を有している。電極ａ及び電極ｂの有するバンド電極の数は、４つに限定されない。電極ａの接続部３ｃ及び電極ｂの接続部４ｃには、リード線７ａ及びリード線７ｂがそれぞれ接続されている。リード線７ａ及びリード線７ｂは、それぞれ、交流電源発生装置に独立して接続されている。交互くし型マイクロバンドアレイ電極としては、電極間ギャップが細胞サイズ以上である市販の交互くし型マイクロバンドアレイ電極を使用し得る。
【００３０】
交互くし型マイクロバンドアレイ電極の上には、バンド電極ａ１〜ａ４及びバンド電極ｂ１〜ｂ４が交差している部分が開口するように、絶縁性薄膜５が設けられている。図１では、絶縁性薄膜５は枠状となっているが、電極ａのリード部３ｄ及び電極ｂのリード部４ｄを覆っていれば足りる。絶縁性薄膜５の上部には、スペーサー６ａ及びスペーサー６ｂが設けられている。そして、スペーサー６ａ及びスペーサー６ｂの上部には、図２に示されるように、導電性基板８が設けられている。導電性基板８は、導電性薄膜８ａ及びガラス基板８ｂから構成されており、導電性薄膜８ａが下向きとなるように配置される。導電性薄膜は、ITOであることが好ましい。導電性薄膜８ａには、リード線９が接続されており、これはアースに接続されている。
【００３１】
＜交互くし型マイクロバンドアレイ電極の作製例＞
図３は、交互くし型マイクロバンドアレイ電極の作製方法を説明する概念図である。まず、ITO薄膜（厚さ250nm、規格抵抗値7Ω/sq）が形成されたガラス基板（ITO基板）を、ガラスカッターを用いて切り出した（寸法：20mm×30mm）。切り出された基板を、アセトン、次いでイソパノール中で、それぞれ10分間超音波洗浄し、窒素ブロアを用いて乾燥させた（図３(A)）。
【００３２】
ITO基板のITO薄膜上に、ポジ型のフォトレジスト（Shipley社、S1818）をスピンコート（3000rpm、30秒）した（図３(B)）。その後、ITO基板をホットプレート上で焼成（60℃で1分間、その後95℃で10分間）した後、室温で穏やかに除熱した。
【００３３】
電極パターンを有するフォトマスクを通して、Hgランプ（6mW/cm2以上、30秒間）を照射した（図３(C)）。基板をディベロッパ（Shipley社、Microposit（登録商標)MF CD-26）に30秒程度浸漬するとともにピペッティングし、電極パターンの現像（ディベロップ）を行った（図３(D)）。イオン交換水で基板をすすぎ、自然乾燥させた。その後、さらに焼成（120℃、60分）した。
【００３４】
フォトレジストで被覆されていない部分のITO薄膜を、ケミカルエッチングにより除去した。具体的には、透明導電薄膜用エッチング液（関東化学株式会社、混酸ITO-02）にITO基板を浸漬し、5〜30分超音波処理することによって、ケミカルエッチングを行った（図３(E)）。基板をイオン交換水ですすぎ、自然乾燥させた。その後、基板をアセトン及びイソパノール中でそれぞれ5分間超音波処理することによって、レジストを基板上から除去した（図３(F)）。その後、窒素ブロアを用いて基板を乾燥させた。
【００３５】
溶液と電極の不必要な接触は、予期せぬ対流現象や電気化学現象を生む可能性がある。このため、露出させる必要の無い導電部分を、ネガ型のフォトレジストによって被覆し、絶縁処理を行った。基板にネガ型のフォトレジスト（化薬マイクロケム株式会社、SU-8 3005）をスピンコート（3000rpm、50秒）した（図３(G)）。その後、焼成（65℃で1分間、その後95℃で3分間）を行い、室温で穏やかに除熱した。
【００３６】
次に、フォトマスクを通してHgランプ（6mW/cm2以上、30秒間）を照射した（図３(H)）。焼成（65℃で1分間、その後95℃で2分間）を行った後、室温で穏やかに除熱した。基板を現像液（化薬マイクロケム株式会社、SU-8 Developer）に5分間浸漬させ、現像を行った（図３(I)）。基板をイソプロパノールですすぎ、自然乾燥させた後、焼成（140℃、30分間）を行った。
【００３７】
電極部分の接続部（図１の３ｃ及び４ｃ）にカーボンペーストを介して銅線（図１の７ａ及び７ｂ）を接続し、140℃で30分間焼成した。最後に、接続部をアラルダイドで被覆し、室温で除熱した。
【００３８】
図４は、作製された交互くし型マイクロバンドアレイ電極（ITO-IDA電極）のうち、バンド電極部周辺の光学顕微鏡写真を示す。バンド電極幅は12μm、電極間ギャップ（バンド電極間の距離）は50μm、バンド電極長は2mm、バンド電極数は片側の電極（電極ａ又は電極ｂ）について5本である。
【００３９】
＜マイクロ流路型デバイスの作製例＞
作製された交互くし型マイクロバンドアレイ電極は、図１示されるように、絶縁性薄膜５が上部に設けられている。この絶縁性薄膜５の上に、2枚のスペーサー（材質：ポリエステルフィルム、寸法：8mm×3mm、厚さ35μm、日東電工株式会社、型番5603）を、図１に示される位置へと貼り付けた。さらに、2枚のスペーサーの上に、リード線を接続したITO電極基板（導電性基板である対向ITO電極基板、寸法10mm×25mm、三容真空工業株式会社、硝子上ITO膜）を重ねた。交互くし型マイクロバンドアレイ電極のガラス基板と、ITO電極基板との隙間は、試料液を供給した際に、試料液が交互くし型マイクロバンドアレイ電極のガラス基板とITO電極基板との両方に接触した状態となるように調整されなければならない。
【００４０】
＜試料液（細胞懸濁液）の調製／工程Ａ＞
250mM スクロース水溶液と9.57mM PBS（Phosphate Buffered Saline）を混合し、誘電泳動用培地（DEP培地）を調製した。このDEP培地の誘電率は、400mS/mである。HL60細胞をこのDEP培地に懸濁させ（3.0×107cells/mL）、試料液とした。DEP培地の誘電率は、スクロース水溶液とPBSとの混合割合を変えることによって、調整可能である。なお、細胞表面抗原と抗体との反応結合性の理由から、DEP培地の誘電率は、200mS/m以上500mS/m以下とすることが好ましく、400mS/m以上500mS/m以下とすることがより好ましい。
【００４１】
＜試料液のマイクロ流路型デバイスへの導入／工程Ｂ＞
試料液3μLをマイクロピペットに採取した。マイクロピペットの先端部を、図２に示されるバンド電極ａ１〜ｂ３と導電性基板８との間の隙間に差し込み、マイクロ流路型デバイスのバンド電極上へと試料液を供給した。試料液は、交互くし型マイクロバンドアレイ電極のガラス基板とITO電極基板との隙間に、両者に接触した状態で保持された。なお、導電性薄膜８ａを酸素プラズマアッシング処理（100W、1分間）して親水化することにより、デバイス内への細胞懸濁液の導入が容易となる。
【００４２】
（負の誘電泳動のみによる細胞の移動及び集積）
試料液を供給されたマイクロ流路型デバイスについて、まず上下電極間（図２における電極ａ１〜ｂ３と導電性基板８との間）に周波数100kHz、振幅（印加電圧強度）20Vppの交流電圧を印加した。図５(A)は、このときの上下電極間に発生している電気力線の状態を示す。また、図５(B)は、このときのバンド電極付近の光学顕微鏡写真（マイクロ流路型デバイスを上方から撮影した写真）を示す。
【００４３】
交流電圧印加前は、HL60細胞は、上下電極間に保持されている試料液中に分散している。図５(A)に示されるように、すべてのバンド電極と導電性基板との間に、交流電圧を印加した場合には、隣り合うバンド電極間電極における電気力線が「疎」となる。その結果、HL60細胞は、図５(B)に示されるように、隣り合うバンド電極間に集積された。集積は、約3秒で完了した。
【００４４】
次に、交互くし型マイクロバンドアレイ電極の片側への交流電圧の印加を停止し（印加電圧強度を0Vppに切り替え）、片側は振幅20Vppのままにして、上下電極間に交流電圧を印加した。図６(A)は、このときの上下電極間に発生している電気力線の状態を示す。また、図６(B)は、このときのバンド電極付近の光学顕微鏡写真（マイクロ流路型デバイスを上方から撮影した写真）を示す。図６(A)及び図６(B)では、ａ１及びａ２のバンド電極に印加されている交流電圧は20Vpp、ｂ１及びｂ２のバンド電極に印加されている交流電圧は0Vppとなっている。
【００４５】
図６(A)に示されるように、一つおきとなる半数のバンド電極（図６(A)及び図６(B)では、電極ｂのバンド電極）と導電性基板との間の交流電圧の印加を停止した場合には、隣り合うバンド電極間電極に電気力線が発生し、交流電圧の印加を停止したバンド電極上方の電気力線が「疎」となる。その結果、HL60細胞は、図６(B)に示されるように、交流電圧の印加を停止したバンド電極上方に移動及び集積させられた。HL60細胞の移動及び集積は、約20秒で完了した。
【００４６】
図７(A)は、図５(A)に示される状態における電場強度解析結果を示す。ここでいう電場強度は、バンド電極ａ１〜ｂ３に+10Vの電圧が印加された瞬間の電場強度を示している。電場強度の分布は、有限要素解析ソフト（COMSOL Multiphysics TM 3.2）を用いて計算した。隣り合う電極間の中央が最も電場強度の弱い領域となり、DEP培地が作用したHL60細胞は、この領域に集積すると考えられる。図７(A)に示される解析結果は、図５(B)に示される実験結果と一致していた。
【００４７】
図７(B)は、図６(A)に示される状態における電場強度解析結果を示す。電極ｂ１及びｂ２の上方が最も電場強度の弱い領域となり、DEP培地が作用したHL60細胞は、この領域に集積すると考えられる。図７(B)に示される解析結果は、図６(B)に示される実験結果と一致していた。
【００４８】
ここで、細胞表面に発現している特定抗原に対する抗体をバンド電極間に固定化することにより、特定抗原を発現している細胞と、特定抗原を発現していない細胞とを分離及び識別することが可能となる。図８は、本発明の細胞識別方法において、細胞を分離及び識別する原理を説明する概念図を示す。
【００４９】
図８(A)は、図５(A)及び図５(B)に示される状態において、CD33抗原を表面に発現している細胞（左側の細胞）が、バンド電極間に固定された抗CD33抗体によって捕捉される様子を説明する概念図である。交流電圧印加前、細胞は、上下電極間に保持されている試料液中に分散しているため、バンド電極間に固定された抗CD33抗体との結合はほとんど起こらない。図５(A)及び図５(B)に示される状態では、細胞は、隣り合うバンド電極間に集積されるため、CD33抗原を表面に発現している細胞は、バンド電極間に固定された抗CD33抗体によって捕捉される。CD33抗原を表面に発現していない細胞（右側の細胞）は、バンド電極間に固定された抗CD33抗体によって捕捉されない。
【００５０】
次に、図６(A)及び図６(B)に示される状態にすると、左側の細胞は、抗CD33抗体によって捕捉されているために移動されず、右側の細胞だけがバンド電極ｂ１上方に移動及び集積される。その結果、CD33抗原を表面に発現している細胞と、CD33抗原を表面に発現していない細胞とが分離される。その後、図8(A)に示された隣り合うバンド電極間に存在する細胞の位置と、図8(B)に示された交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極（電極ｂのバンド電極）上に存在する細胞の位置を観察し、その存在比率を求めることにより、細胞捕捉率を算出する。この細胞捕捉率によって、細胞集団の中における表面抗原を発現した細胞の割合を判断することが可能となる。
【００５１】
ここで、細胞捕捉率とは、図８(A)の段階で隣り合うバンド電極間に存在する細胞の数に対する、図８(B)の段階で隣り合うバンド電極間に存在する細胞の割合を意味する。
【００５２】
本発明の細胞識別方法では、細胞の集積及び異なる位置への移動及び集積に負の誘電泳動のみを利用している。電場に曝されることにより、細胞に何らかの影響が生じている可能性があるが、細胞への影響を考慮すると、低電場領域に細胞が集積する負の誘電泳動のみを用いる本発明の細胞識別方法は、正の誘電泳動と負の誘電泳動とを利用する非特許文献１に開示されている細胞識別方法よりも、細胞への影響が少ないといえる。また、細胞自身にとっても、より生体内の環境に近い高導電率（高塩強度）下におかれるほうが良いため、この意味においても、本発明の細胞識別方法は、正の誘電泳動と負の誘電泳動とを利用する非特許文献１に開示されている細胞識別方法よりも優れているといえる。
【００５３】
［実施例１］
上述したマイクロ流路型デバイスについて、交互くし型マイクロバンドアレイ電極間の表面に抗CD33抗体を固定した。交互くし型マイクロバンドアレイ電極を、エポキシシランの一種である3-(glycidoxypropyl)trimethoxysilaneのエタノール溶液（2質量％）に浸漬し、1時間、室温で静置して、アミノ基と容易に反応するエポキシ基を交互くし型マイクロバンドアレイ電極の表面に導入した。電極基板をエタノールで洗浄した後、交互くし型マイクロバンドアレイ電極を抗CD33抗体の50mM炭酸バッファー（抗体濃度0.1 mg/mL、pH9.6）に浸漬し、16時間、4℃で静置し、交互くし型マイクロバンドアレイ電極表面に抗CD33抗体を固定化した。PBSで洗浄後、細胞の非特異吸着を抑制するために牛血清アルブミン（BSA）を含有する炭酸バッファー（BSA濃度10mg/mL）に交互くし型マイクロバンドアレイ電極を浸漬し、24時間、4℃で静置し、未反応のエポキシ基をブロッキングした。最後にリン酸緩衝液（PBS、pH7.4）で洗浄し、使用するまで交互くし型マイクロバンドアレイ電極をPBSに浸漬し、4℃で保存した。
【００５４】
抗CD33抗体を固定化したマイクロ流路型デバイスを用いて、上記と同様にして工程Ａ及び工程Ｂを行った。
【００５５】
＜交流電圧の一定な印加／工程Ｃ＞
まず、マイクロ流路型デバイスを透過型光学顕微鏡にセットし、200倍の倍率でバンド電極部付近を観察した。その後、上下電極間に100kHz、20Vppの交流電圧を印加した。すなわち、図５(A)に示されるように、すべてのバンド電極とITO電極基板との間に、100kHz、20Vppの交流電圧を印加した。すると、負の誘電泳動が作用し、図９(A)に示されるように、電極間の中央付近にHL60細胞が集積した。この集積は5秒以内に完了したが、1分間この電圧印加を続けた。このとき、HL60細胞表面上のCD33抗原と、電極基板表面に固定化されている抗CD33抗体との免疫反応により、CD33発現細胞は、電極間ギャップの中央付近に固定化されたと考えられる。
【００５６】
＜バンド電極付近の観察／工程Ｅ０＞
電極間ギャップに集積した細胞数を計測した。
【００５７】
＜一部電極への印加の停止／工程Ｄ＞
次に、抗CD33抗体に捕捉されていない細胞を電極間ギャップから除去するために、図６(A)に示されるように、片側の電極（電極ｂ）への交流電圧の印加を停止し、残りの電極（電極ａ）への交流電圧の印加は、振幅（印加電圧強度）20Vppのまま維持した。すると、図９(B)に示されるように、一部の細胞は、速やかに電極ｂ（図９(B)ではｂ１及びｂ２）の上方に移動及び集積し、その他の細胞は電極間の中央付近に保持されたままであった。振幅（印加電圧強度）を切り替えてから20秒程度で細胞の移動及び集積は完了し、それ以上の挙動は示されなかった。
【００５８】
一方、抗CD33抗体の代わりに、抗マウスIgG抗体を同様の方法によって固定化したマイクロ流路型デバイスを作製し、工程Ａ〜工程Ｄを行ったところ、図９(C)に示されるように、ほとんどの細胞が電極ｂ（図９(C)ではｂ１及びｂ２）上に集積された。このように、表面にCD33抗体を発現していない細胞はバンド電極間に保持されないため、表面にCD33抗体を発現している細胞とは、明らかに挙動が異なることが確認された。
【００５９】
＜細胞捕捉率の算出／工程Ｅ＞
工程Ｄ終了後、電極間ギャップに残っている細胞数を計測し、細胞捕捉率（％）を算出した。実施例１の細胞捕捉率は、68.3±3.2％であったのに対し、抗マウスIgG抗体を固定化した場合の細胞捕捉率は、4.2±1.4％であった。これらの結果から、本発明の細胞識別方法は、迅速かつ高い捕捉効率を持つ表面抗原発現細胞の検出方法であることが確認された。
【００６０】
（工程Ｃ及び工程Ｄにおける印加電圧強度）
図１０(A)は、工程Ｃにおける印加電圧強度と細胞捕捉率の関係をプロットしたグラフを示す。工程Ｄは、実施例１と同じ条件とした。電圧強度の増加に伴って細胞捕捉率が増加し、電圧強度15Vpp以上であれば、細胞捕捉率が50％以上となることが確認された。印加電圧強度20〜25Vppにかけては、抗CD33抗体と抗マウスIgG抗体を用いた場合で、ほぼ同様に細胞捕捉率が増加した。これは、非特異吸着のみが増加していることを示している。このことから、細胞集積のための振幅（印加電圧強度）は15〜25Vppとすることが好ましいと考えられた。工程Ｄにおける振幅を変化させて実験を繰り返した結果、細胞集積のための振幅は、18〜22Vppとすることがより好ましいと考えられた。
【００６１】
図１０(B)は、抗マウスIgG抗体を固定化したマイクロ流路型デバイスを用い、実施例１と同様にしてHL60細胞を集積した後、電極ａのバンド電極へ印加する交流電圧の振幅（印加電圧強度）を15Vppとし、電極ｂのバンド電極への交流電圧印加を停止することにより、非捕捉細胞の除去（工程Ｄに相当する工程）を行った際の、バンド電極付近の光学顕微鏡写真を示す。非捕捉細胞がバンド電極ｂ１及びｂ２の周辺に、幅の広いラインパターンを形成しているために、電極間ギャップの中央付近に捕捉されている細胞と、電極上に存在する細胞とを識別しがたい。これは、印加電圧強度が小さく、誘電泳動力が小さいためである。
【００６２】
一方、電極ａのバンド電極へ印加する交流電圧の振幅（印加電圧強度）を20Vppとした場合には、捕捉細胞と非捕捉細胞とは、空間的に分離された。また、細胞の非特異的吸着量を表わす抗マウスIgG抗体を用いた際の細胞捕捉率は、4.2％とわずかな値であった。以上のことから、非捕捉細胞除去のために印加電圧強度25Vppよりも上昇させたとしても、抗CD33抗体を用いた際の特異的捕捉率が大きく下がり、もともと微小な非特異的吸着量は少し減少するのみであると推測される。
【００６３】
［実施例２］
＜工程Ａ＞
HL60細胞を1μg/mLの5(and6)-carboxyfluoresceindiacetate, succinimidyl ester （CFSE）で染色した。CFSEは、細胞内部を緑色に染める細胞遊走追跡用の蛍光試薬である。その後、HL60細胞を10μg/mLの抗CD33抗体で処理し（20分間、37℃）、CD33抗原が抗体によりブロックされたHL60細胞（緑色の蛍光を発する）を作製した。この蛍光標識HL60細胞は、CD33抗原が抗CD33抗体によって既に占有されているため、バンド電極間の基板に固定された抗CD33抗体には捕捉されないと考えられる。この蛍光標識HL60細胞（CD33陰性細胞）と、通常のHL60細胞（CD33陽性細胞）とを混合し、8種類の試料液を作製した。試料液の調製方法は、実施例１と同様とした。
【００６４】
上記8種類の試料液について、実施例１と同様にして、工程Ｂ〜工程Ｅを行った。
【００６５】
図１１(A)は、試料液の工程細胞の混合比と、細胞捕捉率との関係をプロットしたグラフを示す。図１１(A)において、横軸の混合比は、通常のHL60細胞の混合比（％）を示している。CD33陽性細胞の混合比と細胞捕捉率との間には、比例関係が認められた。図１１(B)は、混合比50％の場合のおけるバンド電極付近の蛍光顕微鏡写真を示す。緑色の蛍光を有していない通常のHL60細胞（CD33陽性細胞）は、その多くが電極間ギャップに捕捉されていた。一方、緑色の蛍光を有する蛍光標識HL60細胞（CD33陰性細胞）は、ほぼ全て電極ｂのバンド電極（図１１(B)では電極ｂ１及びｂ２）上に集積されていた。
【００６６】
このように、本発明の細胞識別方法は、目的とする抗原を表面に発現している細胞と、発現していない細胞が混合されている場合であっても、両者を識別することが可能であった。
【００６７】
［実施例３］
実施例１と同一条件で、工程Ａ〜工程Ｅ０を行った。
【００６８】
＜一部電極の印加電圧強度の周期的変動／工程Ｄ０＞
交互くし型マイクロバンドアレイ電極のバンド電極のうち、片側の電極（電極ｂのバンド電極）については工程Ｃと同様に、ITO電極基板との間に、100kHz、20Vppの交流電圧を印加した。残りの半数の電極（電極ａのバンド電極）については、ITO基板との間の交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の90％と100％（18Vppと20Vpp）の間で周期的に変動させた。電極ａのバンド電極の印加電圧強度の切り替えは、1分間の工程Ｄ０のうち、5秒毎に行った。
【００６９】
工程Ｄ０の後、実施例１と同様にして、工程Ｄ及び工程Ｅを行った。その結果、実施例３の細胞捕捉率は、83.9±7.1％であった。また、抗CD33抗体の替わりに抗マウスIgG抗体を固定化した場合の細胞捕捉率は、4.3±1.3％であった。上述したように、実施例１の細胞捕捉率は、68.3±3.2％であったが、工程Ｄの前に工程Ｄ０を行うことによって、非特異的吸着量はほとんど増加せず、HL60細胞の細胞捕捉率のみ15.6％増加した。
【００７０】
（誘電泳動による細胞振とう操作を利用した細胞捕捉率の向上）
HL60細胞のCD33抗原の発現率は99.9％以上であるが、実施例１における細胞捕捉率68.3％は、発現率と比較して20％以上低い。試料液の培地を400mS/mとした場合、導電率は最大に近い免疫反応の効率を与える。つまり、培地の導電率以外の因子によって、細胞捕捉が制限されていると考えられる。その原因としては、立体障害によって、細胞表面の抗原と基板表面に固定化された抗体とが接触していない可能性が挙げられる。
【００７１】
図１２は、工程Ｄ０における電極ａのバンド電極への印加電圧の振幅の変化を示す。工程Ｃにおいては、電極ｂのバンド電極と同様に、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅は+10V〜-10Vである（20Vpp）。次に、Ｐ点以降は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅は+9V〜-9Vである(18Vpp)。そして、Ｑ点以降は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅は+10V〜-10Vである（20Vpp）。すなわち、Ｐ点以前は、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の100％、Ｐ点からＱ点までは工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の90％、Ｑ点以降は工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の100％となっている。
【００７２】
図１３(A)は、電極ａのバンド電極（ａ１及びａ２）と電極ｂのバンド電極（ｂ１〜ｂ３）へ印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、共に20Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。図１３(B)は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）のみ18Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。図１３(C)は、電極ａのバンド電極へ印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）のみ15Vppとした場合の電場強度領域の分布を示す。電極ａのバンド電極に印加される交流電圧の印加電圧強度が低下するにつれて、形成される電場のパターンが変化し、最も弱い電場強度領域がバンド電極間ギャップの中央から電極ａ１及びａ２側へと少しシフトした。その後、電極ａのバンド電極と電極ｂのバンド電極へ印加される交流電圧の印加電圧強度を、共に20Vppに戻した場合、電場強度領域の分布も図１３(A)の状態に戻った。
【００７３】
図１４(A)は、図１２(A)の電圧印加状態におけるバンド電極部付近の光学顕微鏡写真を示す。写真中央の点線は、バンド電極間ギャップの中央を示している。図１３(A)の状態では、HL60細胞はバンド電極間ギャップの中央に位置している。しかし、図１３（B）の電圧印加状態では、HL60細胞はバンド電極間ギャップの中央よりも左側に移動しており、図１３（C）の電圧印加状態では、図１４（B）よりも、HL60細胞はさらに左側に移動していた。電極ａのバンド電極の印加電圧強度を20Vppに戻すと、HL60細胞は、図１４(B)及び図１４(C)に示される位置から、図１４(A)に示される位置（バンド電極間ギャップの中央）に戻った。なお、印加電圧強度変化に伴うHL60細胞の移動は、１〜2秒程度で完了することが確認された。
【００７４】
誘電泳動により基板表面に集積化されている細胞は、最初に基板表面に接触したときの状態を保っており動かないと予想される。このため、細胞と基板の最初の接触時に、表面抗原と固定化された抗体とが立体的な障害により接触しなかった場合、免疫反応による細胞捕捉は進行しないと予想される。そこで、工程Ｄ０において、基板表面に集積させた細胞を誘電泳動によって振とうし、細胞表面上の抗原と基板表面に固定化された抗体との接触機会を増やすことで、細胞捕捉率が増加したと推察された。
【００７５】
［比較例１］
工程Ｄ０において、電極ａのバンド電極とITO基板との間に印加される交流電圧の振幅（印加電圧強度）を、工程Ｃの振幅（印加電圧強度）の75％と100％（15Vppと20Vpp）の間で周期的に変動させる以外、すべて実施例３と同様の操作を行った。その結果、HL60細胞の細胞捕捉率は、44.5±6.0％であり、実施例１及び非特許文献７の細胞識別方法の細胞捕捉率よりも低い値となった。また、抗CD33抗体の替わりに抗マウスIgG抗体を固定化した場合には、HL60細胞の細胞捕捉率は3.6±0.8％であった。
【００７６】
印加電圧強度が15Vppの場合、18Vppの場合に比べて、電場強度が最も低い領域が大きくシフトし、細胞が大きく移動する。すなわち、振とう操作中、細胞により大きな誘電泳動力が作用している。そのため、一旦基板表面に固定された抗体と結合した細胞が、基板表面から剥離された可能性がある。工程Ｄ０における印加電圧強度は、工程Ｃの印加電圧強度の85％と100％の間（工程Ｃが20Vppの場合には、17Vppと20Vppの間）で周期的に変動させることが好ましく、90％と100％の間（工程Ｃが20Vppの場合には、18Vppと20Vppの間）で周期的に変動させることがより好ましいと考察された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の細胞識別方法は、細胞識別に要する操作時間が2分間程度という短時間であり、30分以上を要する抗体アレイ法と比較し、極めて迅速であるといえる。また、操作が簡便で熟練を要さないため、再現性も非常に高い。さらに、細胞母集団中の、目的の表面抗原を発現している細胞のサブポピュレーションを知ることも可能である。
【００７８】
本発明の細胞識別方法は、生化学、分子生物学又は臨床診断のような技術分野において有用である。
【符号の説明】
【００７９】
１：マイクロ流路型デバイス
２：ガラス基板
３：電極ａ
ａ１〜ａ４：電極ａのバンド電極
３ｃ：電極ａの接続部
３ｄ：電極ａのリード部
４：電極ｂ
ｂ１〜ｂ４：電極ｂのバンド電極
４ｃ：電極ｂの接続部
４ｄ：電極ｂのリード部
５：枠状の絶縁性薄膜
６ａ，６ｂ：スペーサー
７ａ，７ｂ：リード線
８：導電性基板
８ａ：導電性薄膜
８ｂ：ガラス基板
９：導電性基板のリード線
【図１】
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【図２】
2013238463.tif 000004
【図３】
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【図１２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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