(57)【要約】【課題】新たな腎疾患治療薬を提供することにある。【解決手段】Notch２受容体アゴニスト抗体を有効成分とする腎疾患治療薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Notch２受容体アゴニスト抗体を有効成分とする腎疾患治療薬。
【請求項２】
腎疾患が、ネフローゼ症候群及び／又は糸球体硬化を形成する腎疾患である請求項１記載の腎疾患治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ネフローゼ症候群は、高度の蛋白尿により低蛋白血症を来たす腎疾患群の総称であり、種々の原因で生じるが、微小変化群、巣状糸球体硬化症、膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎等の腎疾患により生じることが多い。ネフローゼ症候群及び糸球体硬化症の治療は、蛋白質・塩分制限などの食事療法、抗凝固薬、免疫抑制薬、脂質代謝改善薬、ステロイド療法等が行なわれている。
しかし、これらの療法に抵抗性の患者も多く、治療抵抗性の場合、慢性腎不全になる例も多い。
【０００３】
一方、Notch経路は、神経、造血、血管、体節、腎臓などの分化過程に関係するシグナル伝達経路である。Notchには、哺乳類では、５種のリガンドと４種の受容体があり、Notchの受容体にリガンドが結合すると細胞表面のNotchタンパクは、あるプロテアーゼに切断されて、細胞内ドメインが細胞質へ遊離して核内のＣＢＦ１と結合することで標的遺伝子の転写活性が行なわれる。最近、Notch２受容体のアゴニスト抗体は、Notch２受容体を介したNotch経路を賦活化するアゴニスト抗体であることが報告されている（非特許文献１）。しかし、Notch２受容体アゴニスト抗体と腎疾患との関係は全く知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Immunol. 2010; 184:4673-4678
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、新たな腎疾患治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、ネフローゼ症候群および糸球体硬化症を含む腎疾患のモデルであるダウノルビシン誘発ネフローゼ症候群・糸球体硬化モデルマウスに、Notch２受容体アゴニスト抗体を投与したところ、尿蛋白の抑制及び糸球体硬化の抑制が認められ、Notch２受容体アゴニスト抗体がネフローゼ症候群及び／又は糸球体硬化を形成する腎疾患の治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、Notch２受容体アゴニスト抗体を有効成分とする腎疾患治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の腎疾患治療薬を用いれば、ネフローゼ症候群を呈する腎疾患、特にネフローゼ症候群、糸球体硬化を形成する腎疾患の治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＡＤＲ投与培養ポドサイトにおけるNotch２受容体アゴニスト抗体の４８時間後の細胞死抑制効果を示す。
【図２】ＡＤＲ腎症マウスモデルに対するNotch２受容体アゴニスト抗体の尿蛋白抑制効果を示す。
【図３】ＡＤＲ腎症マウスモデルに対するNotch２受容体アゴニスト抗体の糸球体硬化抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の腎疾患治療薬の有効成分は、Notch２受容体アゴニスト抗体である。
Notch２受容体アゴニスト抗体は、Notch２受容体に特異的に結合し、アゴニスト活性を示すものであれば、その抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１１】
本発明で使用される抗Notch２受容体アゴニスト抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗Notch２受容体アゴニスト抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００１２】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、Notch２受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００１３】
抗原であるNotch２受容体は、公知の手段、例えば遺伝子組み換え手段により得ることができる。このNotch２受容体タンパク質又はその断片を感作抗原として用いることができる。
【００１４】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、もしくはウサギ、サル等が使用される。
【００１５】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００１６】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００１７】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
【００１８】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００１９】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００２０】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）溶液を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００２１】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
【００２２】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【００２３】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００２４】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００２５】
Notch２受容体アゴニスト抗体としては、非特許文献１に記載された抗体を使用することもできる。
【００２６】
Notch２受容体アゴニスト抗体は、後記実施例に示すように、ＡＤＲ（ダウノルビシン：商品名  アドリアマイシン）投与培養ポドサイトにおける細胞死を抑制し、またＡＤＲ腎症マウスにおける蛋白尿及び糸球体硬化を顕著に抑制する。ＡＤＲ腎症は、ダウノルビシンをマウスの尾静脈より１回静脈注射することで蛋白尿と糸球体硬化が誘発されることから、ヒトネフローゼ症候群、糸球体硬化モデルとして有用であることが知られている（Am. J. Nephrol., 2011; 33:p537-549）。このＡＤＲ誘発ネフローゼ症候群・糸球体硬化モデルマウスは、ＡＤＲにより直接的にポドサイト障害を起こし、ポドサイトにアポトーシスを誘導することで、糸球体内のポドサイト数が減少し、糸球体硬化が誘導される。従って、Notch２受容体アゴニスト抗体は、ネフローゼ症候群、糸球体硬化症等の糸球体硬化を伴う腎疾患の治療薬として有用である。
【００２７】
本発明の腎疾患治療薬は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００２８】
経口投与用には、Notch２受容体アゴニスト抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００２９】
非経口投与用には、Notch２受容体アゴニスト抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、Notch２受容体アゴニスト抗体を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、本発明の治療薬は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、Notch２受容体アゴニスト抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、Notch２受容体アゴニスト抗体を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。座剤処方は、本発明の治療剤をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、Notch２受容体アゴニスト抗体は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００３０】
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、本発明の腎疾患治療薬は、Notch２受容体アゴニスト抗体として１日あたり体重１kgあたり、約０．００１mgから１０００mgの範囲、好ましくは約０．０１mgから１０mgの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。
【００３１】
本発明の腎疾患治療薬は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、特に限定されず、経口投与でもよい。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００３３】
実施例１
Notch２受容体アゴニスト抗体は、順天堂大学免疫学講座八木田秀雄准教授から譲り受けたHMN2-29を用いた。この抗体は、International Immunology, Vol.20, No.6, pp.763-773の記載に従って製造されたものである。
ＡＤＲにより障害を誘発した培養ポドサイトにNotch２受容体アゴニスト抗体を添加し、その影響を検討した。すなわち、ＡＤＲ投与によって培養ポドサイトに細胞死を起こし、Notch２受容体アゴニスト抗体を投与することによって細胞死が増加または減少するかどうかを、lactate dehydrogenase(ＬＤＨ)assayで計測されるCytotoxicityを調べることによって検討した。
ＡＤＲ投与群（ＡＤＲ０．２５μg／mL投与）と、ＡＤＲ／Notch２アゴニスト抗体同時投与群（ＡＤＲ０．２５μg／mL投与、Notch２受容体アゴニスト抗体５０μg／mL投与：ＡＤＲ＋Ｎ２）の４８時間後の細胞死を比較した。その結果を図１に示す。その結果、ＡＤＲ／Notch２受容体アゴニスト抗体同時投与群では、ＡＤＲ投与群に比べて、有意にCytotoxicityを減少することが出来、細胞死が抑制されたことを確認した。
【００３４】
実施例２
（１）Am. J. Nephrol., 2011; 33:p537-549に記載の方法に準じてＡＤＲ腎症を作成した。すなわち、ＡＤＲをマウスの尾静脈より１０mg／kg、１回注射し、その後、蛋白尿を経時的に測定した。また、２８日後にマウスの腎を採取し、糸球体硬化の割合を測定した。なお、Notch２受容体アゴニスト抗体は、ＡＤＲと同時に1回、又はＡＤＲ投与後７日目から１週間ごとに３回、1回１００μgを腹腔内注入により投与した。
【００３５】
その結果、図２に示すように、ＡＤＲ投与群（ＡＤＲ）に比べＡＤＲ／Notch２受容体アゴニスト抗体投与群では、初期同時投与群（ＡＤＲ＋Ｎ２）、ＡＤＲ投与後７日目以降投与群（ＡＤＲ＋Ｎ２−７）ともに尿蛋白が抑制された。
また、図３に示すように、ＡＤＲ投与群（ＡＤＲ）に比べＡＤＲ／Notch２受容体アゴニスト抗体投与群では、初期同時投与群（ＡＤＲ＋Ｎ２）、ＡＤＲ投与後７日目以降投与群（ＡＤＲ＋Ｎ２−７）ともに優位に糸球体硬化形成が抑制された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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