(57)【要約】【課題】鼻過敏症、特に、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介した、インターロイキン９の発現増加によって生じるアレルギー性鼻過敏症を、安全且つ効果的に治療するための経口投与用予防・治療剤を提供すること。【解決手段】スプラタスト等のカルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬と、エピナスチン等のＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを有効成分として含有する医薬組成物を経口投与することによって、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介したインターロイキン９の発現増加が顕著に抑制され、鼻過敏症の症状を予防・治療することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬と、ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを有効成分として含有する経口投与用の鼻過敏症予防・治療剤。
【請求項２】
カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬が、スプラタスト又はその塩である請求項１記載の鼻過敏症予防・治療剤。
【請求項３】
スプラタスト又はその塩が、スプラタストトシル酸塩である、請求項２記載の鼻過敏症予防・治療剤。
【請求項４】
抗ヒスタミン薬が、エピナスチン又はその塩である請求項１〜３のいずれかに記載の鼻過敏症予防・治療剤。
【請求項５】
エピナスチン又はその塩が、エピナスチン塩酸塩である、請求項４記載の鼻過敏症予防・治療剤。
【請求項６】
スプラタストトシル酸塩と、エピナスチン塩酸塩とを有効成分として含有する請求項５記載の鼻過敏症予防・治療剤。
【請求項７】
鼻過敏症が、アレルギー性鼻過敏症である、請求項１〜６のいずれかに記載の鼻過敏症予防・治療剤。
【請求項８】
鼻過敏症が、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介した、インターロイキン９の発現増加によって生じるものである、請求項１〜７のいずれかに記載の鼻過敏症予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬と、ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを有効成分として含有する経口投与用の鼻過敏症予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
鼻過敏症は、反復性のくしゃみ、水性鼻漏、鼻閉（鼻づまり）等の鼻炎症状を呈する疾患であり、アレルギー性鼻過敏症と非アレルギー性鼻過敏症とに分類される。鼻過敏症のうちアレルギー性鼻過敏症は、外部環境中の原因物質に対して体の免疫システムが反応することによって引き起こされる。アレルギー性鼻過敏症はＩ型アレルギー性疾患であると考えられており、その発症には、血清中のＩｇＥ抗体レベルの上昇、局所肥満細胞の増加、局所及び血中の好酸球の増加、粘膜の非特異的過敏性亢進等が関与することが知られている。また、アレルギー性鼻過敏症の原因物質としては、室内塵、ダニカビ、花粉、草、樹木、動物等が知られており、通年性アレルギー性鼻過敏症の多くは室内塵やダニが原因であり、季節性アレルギー性鼻過敏症の多くは花粉が原因であると考えられている。
【０００３】
現在、鼻過敏症の治療には、抗ヒスタミン剤や抗アレルギー剤が広く用いられている。しかし、上述のように、鼻過敏症の原因は様々であり、患者によっては、現在の治療方法では十分な治療効果が認められない場合がある。このため、より効果的且つ安全な鼻過敏症の治療剤の開発が強く求められている。
【０００４】
特許文献１には、副交感神経遮断薬を有効成分とする鼻炎治療用固形内服医薬組成物が開示されており、さらに、該医薬組成物には、エピナスチンやスプラタスト等の抗アレルギー薬が含まれていてもよいとの記載がある。特許文献２には、脂質代謝改善剤であるパンテチンと、スプラタストとを含有するアレルギー性鼻炎の予防・治療用医薬組成物が開示されている。特許文献３には、スプラタストと、メントール等とを含む点鼻薬が開示されており、さらに、該点鼻薬には抗ヒスタミン剤が含まれていてもよいとの記載がある。特許文献４には、抗ヒスタミン剤であるメキタジンと、スプラタストとを含有するアレルギー性鼻炎の治療用医薬組成物が開示されている。しかし、特許文献１〜４のいずれにも、カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬と、ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを有効成分とする鼻過敏症の予防・治療剤については開示されていない。
【０００５】
また、非特許文献１には、和漢薬やスプラタストが鼻過敏症に対する治療効果を奏する可能性が示されている。さらに、非特許文献２には、スプラタストの投与によって、鼻過敏症モデルラットにおけるヒスチジン脱炭酸酵素発現及びヒスタミンレベルの上昇が抑制されること、抗ヒスタミン剤の投与によって、鼻過敏症モデルラットにおけるヒスタミンＨ１受容体遺伝子発現亢進が抑制されることが記載されている。さらに、非特許文献３には、スプラタストがヒスタミン受容体の発現を抑制することによって、鼻過敏症の症状を緩和することが記載されている。しかし、非特許文献１〜３には、スプラタストの鼻過敏症に対する治療効果を高めるために、スプラタストと、ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを組み合わせて使用することについては記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３９２９６１８号
【特許文献２】特開２０１１−２４６４５４号
【特許文献３】特開２００２−２０５９４２号
【特許文献４】国際公開パンフレットＷＯ２００５／０６３２５３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yakugaku Zasshi 127: 15-25 (2007)
【非特許文献２】国立大学法人徳島大学  平成１８年度共同研究プロジェクト成果報告書  Ｎｏ．１８０３０４（http://www.ccr.tokushima-u.ac.jp/kd/kd-h18/180304.pdf）
【非特許文献３】The Journal of Immunology 183: 2133-2141 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、鼻過敏症、特に、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介した、インターロイキン９の発現増加によって生じるアレルギー性鼻過敏症を、安全且つ効果的に治療するための経口投与用予防・治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、スプラタストが、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系の活性化によって誘導されるインターロイキン９の発現増加を抑制することを明らかにし、さらに、鼻過敏症モデルラットに、スプラタストとエピナスチンとを同時に経口投与することによって、鼻過敏症の症状が顕著に改善されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、（１）カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬と、ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを有効成分として含有する経口投与用の鼻過敏症予防・治療剤や、（２）カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬が、スプラタスト又はその塩である上記（１）記載の鼻過敏症予防・治療剤や、（３）スプラタスト又はその塩が、スプラタストトシル酸塩である、上記（２）記載の鼻過敏症予防・治療剤や、（４）抗ヒスタミン薬が、エピナスチン又はその塩である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の鼻過敏症予防・治療剤や、（５）エピナスチン又はその塩が、エピナスチン塩酸塩である、上記（４）記載の鼻過敏症予防・治療剤や、（６）スプラタストトシル酸塩と、エピナスチン塩酸塩とを有効成分として含有する上記（５）記載の鼻過敏症予防・治療剤や、（７）鼻過敏症が、アレルギー性鼻過敏症である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の鼻過敏症予防・治療剤や、（８）鼻過敏症が、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介した、インターロイキン９の発現増加によって生じるものである、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の鼻過敏症予防・治療剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれは、鼻過敏症、特に、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介した、インターロイキン９の発現増加によって生じるアレルギー性鼻過敏症を、安全且つ効果的に予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】イオノマイシン刺激によるＮＦＡＴ活性化誘導に及ぼすスプラタストの影響を、ゲルシフトアッセイによって調べた結果を示す図である。図１（Ａ）のレーン１は、無処置の細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合した実験区、レーン２は、無処置の細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドと、大過剰の標識していないＮＦＡＴ結合ヌクレオチドと混合した実験区、レーン３は、イオノマイシン刺激を行った細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合した実験区、レーン４は、スプラタスト処置後に、イオノマイシン刺激を行った細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合した実験区をそれぞれ示す。図１（Ｂ）のレーン１は、イオノマイシン処理した細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドと混合した実験区、レーン２は、イオノマイシン処理した細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを、１００μＭのスプラタスト存在下で反応させた実験区、レーン３は、イオノマイシン処理した細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを、２００μＭのスプラタスト存在下で反応させた実験区、レーン４は、イオノマイシン処理した細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを、５００μＭのスプラタスト存在下で反応させた実験区をそれぞれ示す。
【図２】イオノマイシン刺激によって誘導されるＮＦＡＴの核内移行に及ぼすスプラタストの影響を、免疫染色によって調べた結果を示す図である。図２の左写真は無処理のＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＮＦＡＴの局在を、中央写真はイオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＮＦＡＴの局在を、右写真はスプラタスト処理後にイオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＮＦＡＴの局在をそれぞれ示す。
【図３】イオノマイシン刺激によるＩＬ−９及びＩＬ−４遺伝子発現誘導に及ぼすスプラタストの影響を調べた結果を示す図である。図３（Ａ）は、イオノマイシン及び／又はスプラタストによって処理されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞における、ＩＬ−９ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した結果を、図３（Ｂ）は、イオノマイシン及び／又はスプラタストによって処理されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞における、ＩＬ−４ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した結果をそれぞれ示す。
【図４】抗原抗体刺激よるＴｈ２サイトカイン遺伝子発現誘導に及ぼすスプラタストの影響を調べた結果を示す図である。図４（Ａ）は、ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体により感作したＲＢＬ−２Ｈ３細胞をスプラタストにより処理し、その後、ＤＮＰ−ＨＳＡによりＩｇＥ受容体刺激を行い、かかる細胞におけるＩＬ−４ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した結果を示す。図４（Ｂ）は、ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体により感作したＲＢＬ−２Ｈ３細胞をスプラタストにより処理し、その後、ＤＮＰ−ＨＳＡによりＩｇＥ受容体刺激を行い、かかる細胞におけるＩＬ−５ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した結果を示す。図４（Ｃ）は、ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体により感作したＲＢＬ−２Ｈ３細胞をスプラタストにより処理し、その後、ＤＮＰ−ＨＳＡによりＩｇＥ受容体刺激を行い、かかる細胞におけるＩＬ−９ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した結果を示す。
【図５】イオノマイシン刺激によるＬ−９遺伝子発現亢進に及ぼすＭ−１の影響を調べた結果を示す図である。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、３００μＭのＭ−１によって処置し、２、１２、又は２４時間培養した後、１μＭのイオノマイシンで２時間刺激し、ＩＬ−９のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。
【図６】イオノマイシン刺激によるＬ−９遺伝子発現亢進に及ぼすＭ−１の影響を調べた結果を示す図である。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞に１００、２００、又は３００μＭのＭ−１によって処置し、２４時間培養後、１μＭのイオノマイシンで２時間刺激し、ＩＬ−９のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。
【図７】イオノマイシン刺激によって誘導されるＮＦＡＴの核内移行に及ぼすＭ−１の影響を、免疫染色によって調べた結果を示す図である。図７の左写真は無処理のＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＮＦＡＴの局在を、中央写真はイオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＮＦＡＴの局在を、右写真はＭ−１処理後にイオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞におけるＮＦＡＴの局在をそれぞれ示す。
【図８】イオノマイシン刺激によるＮＦＡＴの脱リン酸化に及ぼすＭ−１の影響を、ウエスタンブロット法によって調べた結果を示す図である。図８の上写真は、抗リン酸化ＮＦＡＴ抗体を用いて免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った結果を、下写真は、抗ＮＦＡＴ抗体を用いて免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った結果をそれぞれ示す。
【図９】In Vitroにおける、スプラタストのカルシニューリンのタンパク質脱リン酸化酵素活性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。In vitroにおいて、基質(RII phosphopeptide)、カルモジュリン、カルシニューリン、スプラタスト、ＩＮＣＡ−６を直接反応させて、カルシニューリンの活性をcalcineurin cellular activity assay kitを用いて測定した。
【図１０】In Vitroにおける、Ｍ−１のカルシニューリンのタンパク質脱リン酸化酵素活性に及ぼす影響を調べた結果を示す図である。In vitroにおいて、基質(RII phosphopeptide)、カルモジュリン、カルシニューリン、Ｍ−１、ＩＮＣＡ−６を直接反応させて、カルシニューリンの活性をcalcineurin cellular activity assay kitを用いて測定した。
【図１１】鼻過敏症モデルラットの鼻過敏症状におよぼすスプラタスト及び／又はエピナスチン投与の影響を調べた結果を示す図である。図１１（Ａ）は、鼻過敏症モデルラットのくしゃみ回数に及ぼすスプラタスト及び／又はエピナスチン投与の結果を示す。図１１（Ｂ）は、鼻過敏症モデルラットの鼻過敏症スコアに及ぼすスプラタスト及び／又はエピナスチン投与の結果を示す。また、図中、「コントロール」は、ＴＤＩによる感作を行っていない対照動物を用いてＴＤＩによる発作誘導を行った実験区、「ＴＤＩ」は、ＴＤＩによる感作を行った鼻過敏症モデルラットを用いてＴＤＩによる発作誘導を行った実験区をそれぞれ示し、さらに、「エピナスチン」は、ＴＤＩによる感作を行った鼻過敏症モデルラットにエピナスチンのみを投与した実験区を、「スプラタスト」は、ＴＤＩによる感作を行った鼻過敏症モデルラットにスプラタストのみを投与した実験区を、「併用」は、ＴＤＩによる感作を行った鼻過敏症モデルラットにエピナスチンとスプラタストとを同時に投与した実験区をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の鼻過敏症予防・治療剤としては、カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬と、ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを有効成分として含有する経口投与用の鼻過敏症治療剤であれば特に制限されるものではなく、上記カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬としては、カルシニューリンによるＮＦＡＴ脱リン酸化酵素活性を抑制することなく、カルシニューリンとＮＦＡＴとの相互作用抑制することによって、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を抑制するものであればどのようなものでもよいが、具体的には、例えば、スプラタスト又はその塩や、スプラタスト代謝物であるアクリルアニリド（Ｍ−１）等を好適に挙げることができる。上記スプラタスト又はその塩としては、特に制限されないが、スプラタストの遊離体又は薬学的に許容できる酸を作用させた酸付加塩であることが好ましく、具体的には、例えば、スプラタストトシル酸塩、スプラタスト塩酸塩、スプラタスト硫酸塩、スプラタストリン酸塩、スプラタスト臭化水素酸塩、スプラタストシュウ酸塩、スプラタストマレイン酸塩、スプラタストフマル酸塩、スプラタストリンゴ酸塩、スプラタスト酒石酸塩、スプラタストクエン酸塩、スプラタスト安息香酸塩、スプラタスト酢酸塩、スプラタスト乳酸塩、スプラタストｐ−トルエンスルホン酸塩、スプラタストメタンスルホン酸塩等を好適に挙げることができるが、中でも、スプラタストトシル酸塩を特に好適に挙げることができる。また、上記ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬としては、「ＰＫＣδの抑制」を主な作用とする抗ヒスタミン薬であればどのようなものであってもよく、具体的には、例えば、エピナスチン又はその塩や、クロルフェニラミン、カレバスチン、メピラミン、オキサトミド、フェキソフェナジン、セチリジン、ロラタジン、ジフェンヒドラミン、オロパタジン等を好適に挙げることができ、中でも、エピナスチン又はその塩を特に好適に挙げることができる。また、上記ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬には、メキタジンは含まれない。上記エピナスチン又はその塩としては、特に制限されないが、エピナスチンの遊離体又は薬学的に許容できる酸を作用させた酸付加塩であることが好ましく、具体的には、例えば、エピナスチン塩酸塩、エピナスチン臭素酸塩、エピナスチンシュウ酸塩、エピナスチン硝酸塩、エピナスチンスルホン酸塩、エピナスチンフマル酸塩、エピナスチンマレイン酸塩、エピナスチン硫酸塩、エピナスチンリン酸塩等を好適に挙げることができるが、中でも、エピナスチン塩酸塩を特に好適に挙げることができる。本発明の鼻過敏症予防・治療剤は、上記カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬から選択される１又は２以上の物質と、上記ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬から選択される１又は２以上の物質とを有効成分として含有するものであれば特に制限されないが、中でも、スプラタスト又はその塩と、エピナスチン又はその塩とを有効成分として含有する経口投与用の鼻過敏症治療剤であることが好ましく、スプラタストトシル酸塩と、エピナスチン塩酸塩とを有効成分として含有する経口投与用の鼻過敏症治療剤であることが特に好ましい。
【００１４】
本明細書において、「鼻過敏症」とは、反復性のくしゃみ、水性鼻漏、鼻閉（鼻づまり）のうちのいくつかの症状を呈することを特徴とするアレルギー性又は非アレルギー性の疾患を意味する。アレルギー性鼻過敏症の発症には、ＩｇＥの産生や、好酸球の分化・増殖を誘導する様々なサイトカインが関与していると考えられているが、中でも、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン９等のＴｈ２サイトカインは重要な役割を果たしていると考えられている。本発明の鼻過敏症予防・治療剤は、アレルギー性又は非アレルギー性の鼻過敏症の予防・治療剤として用いることができるが、アレルギー性の鼻過敏症の予防・治療剤として用いることが好ましく、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介した、インターロイキン９の発現増加によって生じるアレルギー性の鼻過敏症の予防・治療剤として用いることが特に好ましい。
【００１５】
本発明の鼻過敏症予防・治療剤は、１日当たり１回〜数回に分けて投与され、投与量は患者の年齢、体重、症状や投与形態により適宜増減される。本発明の鼻過敏症予防・治療剤が、スプラタスト又はその塩と、エピナスチン又はその塩とを有効成分として含有する経口投与用の鼻過敏症治療剤である場合には、成人１日当たりの服用量は、通常、スプラタストは５０〜６００ｍｇ／ｄａｙ、好ましくは３００ｍｇ／ｄａｙであり、エピナスチンは１０〜４０ｍｇ／ｄａｙ、好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｄａｙである。本発明の鼻過敏症予防・治療剤は、スプラタスト及びエピナスチンを、それぞれ単独で投与する場合と比較して低い用量で含むことができる。より具体的には、本発明の鼻過敏症予防・治療剤は、スプラタスト又はエピナスチンを単独で投与する場合と比較して、８割程度の用量で含むことができる。また、本発明の鼻過敏症予防・治療剤は、患者が鼻過敏症を発症する前、又は発症した後のいずれの時期に投与してもよいが、患者が鼻過敏症を発症する７〜１４日前に投与することがより好ましい。
【００１６】
本発明の鼻過敏症予防・治療剤には、必要に応じて他の生理活性成分を加えることができる。上記生理活性成分としては、特に制限されないが、例えば、解熱鎮痛消炎剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、喀痰溶解剤、中枢興奮剤、抗コリン剤、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、Ｔｈ２サイトカイン阻害剤、ロイコトリエン受容体拮抗剤、トロンボキサンＡ２受容体拮抗剤、ビタミン剤、制酸剤、生薬、和漢方薬等を好適に挙げることができる。また、本発明の鼻過敏症治療剤は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、チュアブル剤、発泡剤、ドロップ剤、口中溶解剤、ドライシロップ剤、分散剤、ゼリー剤、内服液剤などの経口用の形態であればどのような製剤としても用いることができる。これらの製剤は、常法により製造することができ、添加剤も通常の医薬品製造に使用されるものであれば、いずれも使用することができる。
【００１７】
また、本発明は、カルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬と、ＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬とを経口投与することを特徴とする鼻過敏症予防・治療方法や、鼻過敏症を予防又は治療するためのカルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬及びＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬や、経口投与用の鼻過敏症予防・治療剤の製造におけるカルシニューリン／ＮＦＡＴ抑制薬及びＰＫＣδを抑制する抗ヒスタミン薬の使用にも関する。
【００１８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
［イオノマイシン刺激によるＮＦＡＴ活性化誘導に及ぼすスプラタストの影響］
イオノマイシン刺激によるＮＦＡＴ活性化誘導に及ぼすスプラタストの影響を、ラット好塩基球性白血病細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞由来の核タンパク質抽出液を用いて調べた。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は、ＩｇＥ受容体を発現しており、ＩｇＥ受容体を刺激することによってヒスタミン遊離が引き起こされることが知られている。また、カルシウムイオノフォアであるイオノマイシンは炎症性サイトカインを促進することが知られている。
【００２０】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞から、以下のようにして核タンパク質抽出液を調製した。すなわち、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を３００μＬのバッファーＡにて懸濁し、氷上に１５分間放置した後、１８．７５μＬの１０％ＮＰ−４０を添加してボルテックスを用いて１０秒間撹拌した。この溶液を４℃、２，６００ｒｐｍで３分間遠心した後、３００μＬのバッファーＡで再度懸濁し、４℃、２，６００ｒｐｍで１分間遠心した。得られたペレットを１００μＬのバッファーＢにて懸濁し、ボルテックスを用いて２０秒間撹拌した後、氷上に１５分間放置した。この溶液を４℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、得られた上清を核タンパク質抽出液とした。上記バッファーＡ及びＢの組成は次の通りである。
バッファーＡ
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）    ３０μＬ
１Ｍ  ＫＣｌ                      ３０μＬ
０．５Ｍ  ＥＧＴＡ                ０．６μＬ
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ                ０．６μＬ
１Ｍ  ＤＴＴ                      ３μＬ
１００ｍＭ  ＰＭＳＦ              １５μＬ
滅菌超純水                        ２９２０μＬ
Ｔｏｔａｌ                        ３ｍｌ
バッファーＢ
１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）    ２０μＬ
１Ｍ  ＮａＣｌ                    ８０μＬ
０．５Ｍ  ＥＧＴＡ                ２μＬ
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ                ２μＬ
１Ｍ  ＤＴＴ                      １μＬ
１００ｍＭ  ＰＭＳＦ              １０μＬ
５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ            ２００μＬ
滅菌超純水                        ６８５μＬ
Ｔｏｔａｌ                        １ｍｌ
【００２１】
以上の方法によって、イオノマイシン及び／又はスプラタストによって処理したＲＢＬ−２Ｈ３細胞から核タンパク質抽出液を調製し、かかる核タンパク質抽出液と、ＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合してゲルシフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイには、ＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとして、ＩＬ−９遺伝子のＮＦＡＴ結合部位である5’-TCCCTCTGTAGGAAAATGAA-3’（配列番号１）及び3’-AGGGAGACAGCCTTTTACTT-5’（配列番号２）を用い、標識には３２Ｐを用いた。ゲルシフトアッセイの結果を図１に示す。
【００２２】
図１（Ａ）に、無処置のＲＢＬ−２Ｈ３細胞、イオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞、又は、５００μＭのスプラタストによって７２時間処置した後に、さらに、イオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞より調製した核タンパク質抽出液を用いたゲルシフトアッセイの結果を示す。図１（Ａ）のレーン１は、無処置の細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合した実験区、レーン２は、無処置の細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドと、大過剰の標識していないＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合した実験区、レーン３は、イオノマイシン刺激を行った細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合した実験区、レーン４は、スプラタスト処置後に、イオノマイシン刺激を行った細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを混合した実験区をそれぞれ示す。レーン２において、矢印で示されるバンドが消失していることから、このバンドが、ＮＦＡＴ結合ヌクレオチドによる特異的なバンドであることが示された。また、レーン４のバンドが、レーン３と比較して薄くなっていることから、スプラタスト処理によって、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の核内に含まれるＮＦＡＴが減少している可能性が示唆された。
【００２３】
図１（Ｂ）に、イオノマイシン処理したＲＢＬ−２Ｈ３細胞由来の核タンパク質抽出液と、３２Ｐ標識したＮＦＡＴ結合ヌクレオチドとを、０〜５００μＭのスプラタスト存在下で反応させた反応溶液を用いてゲルシフトアッセイを行った結果を示す。矢印は、ＮＦＡＴ結合ヌクレオチドによる特異的なバンドを示す。スプラタストを含む反応溶液におけるバンドの濃さは、スプラタストを含まない反応溶液（コントロール）と比較して変化しなかったことから、スプラタストはＮＦＡＴ結合オリゴヌクレオチドと転写因子との結合には影響しないこと明らかとなった。
【実施例２】
【００２４】
［ＮＦＡＴの核内移行に及ぼすスプラタストの影響］
イオノマイシン処理によって誘導されるＮＦＡＴの核内移行に及ぼすスプラタストの影響を、免疫染色によって調べた。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、５００μＭのスプラタスト存在下で７２時間培養し、さらに、１μＭのイオノマイシンで２時間刺激した後に、抗ＮＦＡＴｃ１抗体を用いてＮＦＡＴの免疫染色を行った。図２に示されるように、スプラタスト処理後にイオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞の核内のＮＦＡＴは、イオノマイシン刺激のみを行った細胞と比較して、著しく減少することが明らかとなった。
【実施例３】
【００２５】
［ＩＬ−９及びＩＬ−４遺伝子発現に及ぼすスプラタストの影響］
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、５００μＭのスプラタスト存在下で７２時間培養した後に、さらに、イオノマイシンで２時間刺激し、細胞中のＩＬ−９及びＩＬ−４のｍＲＮＡ発現量レベルの変化をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した。図３に示されるように、スプラタスト処理後にイオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞のＩＬ−９（図３（Ａ））及びＩＬ−４（図３（Ｂ））のｍＲＮＡ発現量は、イオノマイシン刺激のみを行った細胞と比較して、有意に減少することが明らかとなった。
【実施例４】
【００２６】
［Ｔｈ２サイトカイン遺伝子発現に及ぼすスプラタストの影響］
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）−ＩｇＥ抗体存在下で１２時間培養した後、１００ｎｇ／ｍｌの抗原（ＤＮＰ−ＨＳＡ）刺激を１時間行い、細胞中のＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−９ｍＲＮＡ発現レベルの変化をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した。スプラタストは抗原刺激の２４時間前に処置した。図４（Ａ）にＩＬ−４ｍＲＮＡ発現レベルの変化を、図４（Ｂ）にＩＬ−５ｍＲＮＡの発現レベルの変化を、図４（Ｃ）にＩＬ−９のｍＲＮＡ発現レベルの変化をそれぞれ示す。図４（Ａ）に示されるように、ＩＬ−４ｍＲＮＡ発現レベルに及ぼすスプラタストの顕著な影響は認められなかった。一方、図４（Ｂ）及び（Ｃ）に示されるように、ＩＬ−５及びＩＬ−９のｍＲＮＡ発現レベルは、ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体、ＤＮＰ−ＨＳＡ、及びスプラタストによって刺激した場合に、ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体及びＤＮＰ−ＨＳＡのみによって刺激した場合と比較して、有意に低下することが明らかとなった。
【実施例５】
【００２７】
［イオノマイシン刺激によるＬ−９遺伝子発現亢進に及ぼすＭ−１の影響］
実施例１〜４の結果から、スプラタストは、細胞と長時間反応させないとその効果を示さないことが明らかとなった。このような結果から、スプラタストの代謝産物が活性体である可能性が考えられた。スプラタストの主要な代謝物としてはアクリルアニリド（Ｍ−１）が知られている。そこで、イオノマイシン刺激によるＩＬ−９遺伝子発現亢進におけるＭ−１の効果について検討した。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、３００μＭのＭ−１によって処置し、２、１２、又は２４時間培養した後、１μＭのイオノマイシンで２時間刺激して、ＩＬ−９のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。その結果、図５に示されるように、Ｍ−１は、ＩＬ−９遺伝子発現を濃度依存的に抑制することが明らかとなった。さらに、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、１００、２００、又は３００μＭのＭ−１を処置し、２４時間培養後、１μＭのイオノマイシンで２時間刺激して、ＩＬ−９のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法で測定した。その結果、図６に示されるように、Ｍ−１のＩＬ−９遺伝子発現抑制作用は、スプラタストより短い処置時間で現れることが明らかとなった。
【実施例６】
【００２８】
［ＮＦＡＴの核内移行に及ぼすＭ−１の影響］
イオノマイシン処理によって誘導されるＮＦＡＴの核内移行に及ぼすＭ−１の影響を、免疫染色によって調べた。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞を、３００μＭのＭ−１存在下で２４時間培養し、さらに、１μＭのイオノマイシンで３０時間刺激した後に、抗ＮＦＡＴｃ１抗体を用いてＮＦＡＴの免疫染色を行った。図７に示されるように、Ｍ−１処理後にイオノマイシン刺激を行ったＲＢＬ−２Ｈ３細胞の核内のＮＦＡＴは、イオノマイシン刺激のみを行った細胞と比較して、減少することが明らかとなった。
【実施例７】
【００２９】
［イオノマイシン刺激によるＮＦＡＴの脱リン酸化に及ぼすＭ−１の影響］
イオノマイシンによって刺激された細胞においては、細胞内カルシウムが上昇してカルシニューリンが活性化され、その結果、ＮＦＡＴが脱リン酸化を受けて活性型になることが知られている。このような、イオノマイシン刺激によるＮＦＡＴの脱リン酸化に及ぼすＭ−１の影響を、抗リン酸化ＮＦＡＴ抗体を用いたウエスタンブロット法を用いて解析した。結果を図８に示す。図８の「コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）」レーンは、無処置のＲＢＬ−２Ｈ３細胞から調製された全細胞溶解液を、「Ｎｏｎｅ」レーンは１μＭのイオノマイシンで３０分刺激したＲＢＬ−２Ｈ３細胞から調製された全細胞溶解液を、「Ｍ−１」レーンは、３００μＭのＭ−１で２４時間処置後、さらに、イオノマイシンで刺激したＲＢＬ−２Ｈ３細胞から調製された全細胞溶解液を、「ＩＮＣＡ−６」レーンは、３０μＭのＩＮＣＡ−６で１０分処置後、さらに、イオノマイシンで刺激したＲＢＬ−２Ｈ３細胞から調製された全細胞溶解液をそれぞれ示す。また、図８の上写真は、抗リン酸化ＮＦＡＴ抗体を用いて免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った結果を、下写真は、抗ＮＦＡＴ抗体を用いて免疫ブロッティング（ＩＢ）を行った結果をそれぞれ示す。この結果から、Ｍ−１が、ＮＦＡＴの脱リン酸化を抑制することが明らかとなった。なお、実験には、ポジティブコントロールとしてＩＮＣＡ−６を使用した。ＩＮＣＡ−６は、カルシニューリンの活性を阻害することなく、ＮＦＡＴとカルシニューリンの相互作用を抑制してカルシニューリンによるＮＦＡＴの脱リン酸化を抑制する化合物である。
【実施例８】
【００３０】
［In Vitroにおける、スプラタスト及びＭ−１のカルシニューリン活性に及ぼす影響］
実施例１〜７の結果から、スプラタスト及びＭ−１は、カルシニューリンのタンパク脱リン酸化酵素活性を阻害しないことが示唆された。このことを、In vitro系においてさらに検討した。In vitroにおいて、基質(RII phosphopeptide)、カルモジュリン、カルシニューリン、スプラタスト、Ｍ−１、ＩＮＣＡ−６を直接反応させて、カルシニューリンの活性をcalcineurin cellular activity assay kitを用いて測定した。その結果、図９及び１０に示すように、１００〜５００μＭのスプラタスト、及び１００〜３００μＭのＭ−１は、In vitroにおいて、カルシニューリンのタンパク脱リン酸化酵素活性を阻害しないことが明らかとなった。以上の結果から、スプラタスト及びＭ−１は、カルシニューリンによるＮＦＡＴ脱リン酸化酵素活性を抑制せず、カルシニューリンとＮＦＡＴとの相互作用抑制することによって、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を抑制することが示唆された。
【実施例９】
【００３１】
［鼻過敏症ラットにおけるスプラタスト及びエピナスチン併用投与の効果］
Brown-Norway系雄性ラット（２００〜３００ｇ）の両側鼻前庭に、極細耳鼻用綿棒を用いて１０μＬの１０％のtoluene 2,4-diisocyanate(ＴＤＩ)−酢酸エチル溶液を１日１回連日２週間塗布することによって、ＴＤＩ感作を行った。ＴＤＩ感作後、１週間の無処置期間をおいた上で、１０％ＴＤＩ溶液の鼻前庭塗布にて鼻過敏症発作を誘発した。なお、上記のようにして作製された鼻過敏症モデルラットの対照動物として、ＴＤＩの代わりに酢酸エチルのみを、ＴＤＩ感作と同回数塗布したラットを作製した。１０％ＴＤＩ溶液の鼻前庭塗布によって鼻過敏症発作を誘発した鼻過敏症モデルラット、及び対照動物に、２４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのエピナスチン（エピナスチン塩酸塩、シグマ社製）及び８０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのスプラタスト（トシル酸スプラタスト、シグマ社製）を２週間連日経口投与した。ＴＤＩによる発作誘発後１０分間におけるくしゃみ回数をカウントした結果を図１１（Ａ）に、鼻過敏症のスコアの結果を図１１（Ｂ）にそれぞれ示す。鼻過敏症のスコアは以下に示す表に従ってスコア化した。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
図１１に示されるように、スプラタスト及びエピナスチンを併用投与した場合には、スプラタスト又はエピナスチンを単独で投与した場合と比較して、有意に鼻過敏症の症状改善作用が認められることが明らかとなった。特に、鼻過敏症スコアは、スプラタスト又はエピナスチン併用投与によって、９０％の改善効果が得られることが明らかとなった。以上の結果から、スプラタスト及びエピナスチンは、カルシニューリン／ＮＦＡＴシグナル伝達系を介した、インターロイキン９の発現増加によって生じる鼻過敏症の改善に優れた効果を奏することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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