(57)【要約】      （修正有）【課題】スダチの有効成分による、生活習慣病（メタボリックシンドローム）の予防及び／又は改善剤の提供。【解決手段】スダチに含まれる有効成分であるスダチチンに、ＰＰＡＲγ、アディポネクチン及びＧＬＵＴ４の発現促進効果があることが見出された。この効果に基づいたスダチチンを有効成分とする、ＰＰＡＲγ、アディポネクチン及びＧＬＵＴ４の発現促進剤、更に、生活習慣病（メタボリックシンドローム）の予防及び／又は改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スダチチンを有効成分とする、アディポネクチンおよびＧＬＵＴ４の発現促進剤。
【請求項２】
請求項１の発現促進剤を含有する、メタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
【請求項３】
上記メタボリックシンドロームが糖尿病である、請求項２のメタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
【請求項４】
糖尿病が２型糖尿病である、請求項２または３のメタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
【請求項５】
タボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤が機能性食品である、請求項２〜４のいずれかに記載のタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
【請求項６】
スダチチンを有効成分とする、ＰＰＡＲγのプロモーター活性を増大させることに基く、ＰＰＡＲγの発現促進剤。
【請求項７】
スダチチンを有効成分とする、Ｓｉｒｔ１の発現促進剤。
【請求項８】
請求項７の発現促進剤を含有する、メタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スダチチンを有効成分とする、メタボリックシンドロームの予防及び／又は治療剤に関するものである。特に、スダチチンを有効成分とする、ＰＰＡＲγ活性化剤に関するものであり、スダチチンの優れたＰＰＡＲγ活性化作用による、アディポネクチンの分泌とＧＬＵＴ４の産生の優れた促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
柑橘類には、多くのポリメトキシフラボノイドが含まれており、これらのポリメトキシフラボノイドには、糖尿病や高脂血症と言った生活習慣病の予防と改善をもたらす効果があることが知られている（特許文献1と２）。
このポリメトキシフラボノイドの中で、特に沖縄特産のシイクワサー（Ｃｉｔｒｕｓ  ｄｅｐｒｅｓｓａ  ＨＡＹＡＴＡ）に多量に含まれる、ノビレチンの薬理効果が盛んに研究され報告されている（特許文献３と４）。
しかしながら、ノビレチンの４’，５，７位のトリデメチル体であるスダチチンに関しては、ほとんど研究がなされていない。それは、他の柑橘類にはほとんど存在せず、徳島特産のスダチにだけ、多く含有されるからであると考えられる。
一方、特許文献１には、スダチの乾燥果皮・果肉絞り粕粉末に、血糖上昇抑制作用や血中脂質改善作用があることが記載されている。また、特許文献５には、スダチから抽出される化合物にＳｉｒｔ１／Ｓｉｒｔ２の活性化作用があることが報告されている。しかし、スダチチン自体の効果については、ほとんど言及されておらず、非特許文献１で、抗菌活性が強いことが知られているだけであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−７７１３９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００２／０８７５６７公報
【特許文献３】ＷＯ２００６／０４９２３４公報
【特許文献４】ＷＯ２０１０／１３４３７３公報
【特許文献５】特開２００９−１２６７９９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．，２００６，６９（８），１１７７−１１７９
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００７；３５７（２）：３７１−３７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、スダチチンの新たな用途を見出すことを目的とするものであり、特に、スダチチンを有効成分とするメタボリックシンドロームに対する治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、以下の化学式（１）に示すようにスダチチンがノビレチン（２）の４’，５，７位のトリデメチル体であることに着目し、構造（水酸基とメトキシ基）の相違がもたらす効果の相違を検討した。
【０００７】
【化１】
2013173719.tif 000002
【０００８】
【化２】
2013173719.tif 000003
【０００９】
これまでの知見によれば、ノビレチンがペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲγ２）の遺伝子発現を増大させ、その結果、脂肪細胞からのアディポネクチンとＧＬＵＴ４の分泌量が有意に増加することになると報告されている（特許文献３と４）。更に、ノビレチンによって、ｃＡＭＰ応答因子結合蛋白（ＣＲＥＢ）と細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＰＫ）の活性化が起こり、ＰＰＡＲγ２の転写因子Ｃ／ＥＢＰβの発現量増加が起きる。その結果、ＰＰＡＲγ２の発現量が増大すると報告されている（非特許文献２）。ノビレチンによって増加したＰＰＡＲγ２は、転写因子として働いてアディポネクチンやＧＬＵＴ４の発現を促進すると考えられている。その結果、ノビレチンは、脂肪細胞の分化やアディポネクチンの分泌等が促進され、その結果、高血糖とインスリン抵抗性が改善されるといった抗糖尿病効果を示すことが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０  ｊｕｎ  １；７９（１１）：１６７４−８３，２０１０）。
そこで、本発明者らは、上記ノビレチンの作用効果と作用機序を考慮し、スダチチンの効果と作用機序の解明を行い、次の知見を得た。
ａ）効果：
スダチチンは、ＰＰＡＲγの遺伝子発現を増大させ、アディポネクチンの遺伝子発現とＧＬＵＴ４の遺伝子発現を増大させる。
アディポネクチンの遺伝子発現量に関するスダチチンの用量相関（ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は、図３に示されるように１〜３０μＭをピークにするベル型曲線を描くが、ノビレチンの場合には、ベル型曲線を示さず、用量依存的に直線的に増大する。
ｂ）作用機序：
アディポネクチンの遺伝子発現量に関する用量相関が、スダチチンとノビレチンで異なるが、アディポネクチンの増大はノビレチンと同様にＰＰＡＲγ２の増加に基くものであることが分かった。
なお、抗糖尿病効果に対するスダチチンとノビレチンの作用機序の相違は、ＩＬ−６（慢性的な炎症反応に起因しインスリン抵抗性の引き金となる因子）とＨＳＬ（トリアシルグリセロールとコレステロールエステルの分解酵素）の遺伝子発現において差が見られ、ノビレチンでは遺伝子発現が抑制されるが、スダチチンでは影響を与えないことが分かった。更に、スダチチンの影響により、図８に示されるようにＳｉｒｔ１の発現が増加することが明らかとなった。
Ｓｉｒｔ１は、Ｆｏｘｏ１を脱アセチル化し、Ｆｏｘｏ１の転写活性化、Ｃ／ＥＢＰαとのコンプレックス形成促進を介して、アディポネクチンの転写を促進する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：３９９１５−３９９２４（２００６））ことが知られている。このように、スダチチンは、ＰＰＡＲγ２を介した経路だけではなく、Ｓｉｒｔ１を介した経路でもアディポネクチンの発現促進効果を示すことが明らかになった。
以上の知見に基いて、本発明者らは、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）スダチチンを有効成分とする、アディポネクチンおよびＧＬＵＴ４の発現促進剤。
（２）上記（１）の発現促進剤を含有する、メタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
（３）上記メタボリックシンドロームが糖尿病である、上記（２）のメタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
（４）糖尿病が２型糖尿病である、上記（２）または（３）のメタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
（５）タボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤が機能性食品である、上記（２）〜（４）のいずれかに記載のタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
（６）スダチチンを有効成分とする、ＰＰＡＲγ２のプロモーター活性を増大させることに基く、ＰＰＡＲγ２の発現促進剤。
（７）スダチチンを有効成分とする、Ｓｉｒｔ１の発現促進剤。
（８）上記（７）の発現促進剤を含有する、メタボリックシンドロームの予防及び／又は改善剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスダチチンは、ＰＰＡＲγ２とＳｉｒｔ１の発現促進を介して、アディポネクチンおよびＧＬＵＴ４の発現を促進させる。即ち、アディポネクチンの分泌促進により、脂肪細胞の肥大化を抑制し、また肥大化しつつある脂肪細胞を正常化させることができる。また、ＧＬＵＴ４の発現促進により、血中のグルコースの脂肪細胞への取り込みを正常化できる。このことから、スダチチンは、インスリン抵抗性を改善できる作用を有しており、本発明の発現促進剤により、２型糖尿病や動脈硬化及び肥満等の糖尿病性症状の改善を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】スダチチン１０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を２４時間刺激した時のＰＰＡＲγ２の遺伝子発現の変化を表わした図である。
【図２】スダチチン３０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を４８時間刺激した時のＰＰＡＲγ２の遺伝子発現の変化を表わした図である。図１の２４時間刺激の結果と対比すると、約２．２倍変化が増大した。
【図３】スダチチン１〜１００μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を２４時間刺激した際のアディポネクチン遺伝子発現の変化を表わした図である。
【図４】スダチチン３０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を４８時間刺激した際のアディポネクチン遺伝子発現の変化を表わした図である。
【図５】スダチチン３０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を７２時間刺激した際のアディポネクチン遺伝子発現の変化を表わした図である。図４の４８時間刺激の結果と対比すると、約１０分の１に減少した。
【図６】スダチチン３０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を４８時間刺激した際のＧＬＵＴ４遺伝子発現の変化を表わした図である。
【図７】スダチチン３０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を７２時間刺激した際のＧＬＵＴ４遺伝子発現の変化を表わした図である。図６の４８時間刺激の結果と対比すると、約１０分の１に減少した。
【図８】ＧＷ９６６２で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を刺激し、スダチチン３０μＭ（３０μＭ  ＳＤ）を用いた場合のアディポネクチン遺伝子発現の変化を表わした図である。
【図９】スダチチンがＰＰＡＲγ２のプロモーターに作用しているか否かを確認するためのルシフェラーゼアッセイ試験の結果を表わした図である。スダチチン１０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を４８時間刺激した場合、ルシフェラーゼ活性がわずかに増加したが、スダチチン３０μＭを用いて同じことを行なった場合、１．５倍と有意に増加している（図９（Ａ））。また、スダチチン３０μＭを用いて、０、２、６、１２、２４、４８時間刺激したところ、１２時間以降にルシフェラーゼ活性の有意な増加が見られている（図９（Ｂ））。
【図１０】スダチチン３０μＭを用いて、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を４８時間刺激した際のＳｉｒｔ１遺伝子発現の変化を表わした図である。
【図１１】ｗｅｓｔｅｒｎ食（４０％高脂肪食）をＣ５７ＢＬ／６マウス（５週齢）に５週間与えることで肥満モデルマウスを作製し、この肥満モデルマウスにスダチチンを投与した結果を表わした図である。（Ａ）は、体重の増加を表わし、（Ｂ）は摂食量の変化を表わしている図である。（Ｃ）は、スダチチンを１２週間投与した上記肥満モデルマウスの白色脂肪細胞量を臓器部位ごとに比較した図である。肝臓、皮下脂肪、内臓脂肪、褐色脂肪の臓器ごとに、スダチチンの投与の有無で白色脂肪細胞の量がどのように変化するかを評価した。肝臓、皮下脂肪、内臓脂肪は、スダチチンの投与で有意に減少した。ＣＣはコントロール群でスダチチンを投与しないグループを表わし、ＣＳはコントロール群でスダチチンを投与したグループを表わす。ＷＣは肥満モデルマウスでスダチチンを投与しないグループを表わし、ＷＳは肥満モデルマウスでスダチチンを投与したグループを表わす。
【図１２】スダチチンを４週間投与した上記肥満モデルマウスの白色脂肪細胞量を臓器部位ごとに比較した図である。筋肉、皮下脂肪、内臓脂肪の臓器ごとに、スダチチンの投与の有無で白色脂肪細胞の量がどのように変化するかを評価し、また、体脂肪率と総脂肪量の変化を評価した。皮下脂肪と内臓脂肪の重量が、スダチチンの投与で有意に減少した。ＣＣはコントロール群でスダチチンを投与しないグループを表わし、ＣＳはコントロール群でスダチチンを投与したグループを表わす。ＷＣは肥満モデルマウスでスダチチンを投与しないグループを表わし、ＷＳは肥満モデルマウスでスダチチンを投与したグループを表わす。
【図１３】図１２で得られた脂肪細胞の細胞サイズを評価したところ、スダチチン投与群で有意に脂肪細胞のサイズが小さくなっていた。
【図１４】スダチチンを６週間投与した上記肥満モデルマウスにグルコース負荷試験を行った結果を表わした図である。（Ａ）では、スダチチンの投与群で血糖値は改善されており、３０〜９０分で有意な血糖値の低下が見出された。（Ｂ）では、インスリン投与後の血糖値の変化を表わしたものであり、スダチチンの投与群でインスリン抵抗性が改善されていることが示されている。
【図１５】図１４の血糖値以外に、血清中性脂肪（ｓｅｒｕｍ  ＴＧ）、血清遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、血清総コレステロール（Ｔ−ｃｈｏｌ）を評価した結果を表わした図である。遊離脂肪酸がスダチチン投与群で有意に低い値を示した。ＣＣはコントロール群でスダチチンを投与しないグループを表わし、ＣＳはコントロール群でスダチチンを投与したグループを表わす。ＷＣは肥満モデルマウスでスダチチンを投与しないグループを表わし、ＷＳは肥満モデルマウスでスダチチンを投与したグループを表わす。
【図１６】ｗｅｓｔｅｒｎ食をＣ５７ＢＬ／６マウス（５週齢）に１２週間与えた肥満モデルマウスでは、高インスリン血症及び高レプチン血症を示すが、スダチチンの投与群では、血清インスリン値、血清レプチン値は有意に低下していた（（Ａ）と（Ｂ）を参照）。血清アディポネクチン濃度は、ｗｅｓｔｅｒｎ食の摂取と加齢に伴い減少したが、スタチチンの投与群では有意に改善されていた（（Ｃ）を参照）。ＣＣはコントロール群でスダチチンを投与しないグループを表わし、ＣＳはコントロール群でスダチチンを投与したグループを表わす。ＷＣは肥満モデルマウスでスダチチンを投与しないグループを表わし、ＷＳは肥満モデルマウスでスダチチンを投与したグループを表わす。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の「アディポネクチン」とは、２４４個のアミノ酸からなる脂肪組織から分泌されるホルモンであり、骨格筋および肝臓において、ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ：ＡＭＰＫ）を活性化することによって、脂肪の燃焼および糖の取り込みを促進する作用を有している。このアディポネクチンは、小型脂肪細胞において多く分泌されるが、脂肪細胞が肥大化すると、その分泌量が減少することが知られている。
肥満などにより、脂肪細胞が肥大化すると、アディポネクチンの分泌量が減少し、２型糖尿病、動脈硬化症などの生活習慣病を発症する原因になると考えられている。
【００１４】
本発明の「ＧＬＵＴ４」とは、体内の糖質の代謝に関する細胞膜上の糖輸送担体（グルコーストランスポーター：ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ＧＬＵＴ）であり、グルコーストランスポーターの量によってグルコースの取り込み量が規定されている。筋肉や脂肪組織における主なグルコーストランスポーターがグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）である。このＧＬＵＴ４は、通常は細胞内部に存在しており、インスリン刺激によって細胞膜上に移動（トランスロケーション）し、グルコースがその担体を通して細胞内に取り込まれる。また、ＧＬＵＴ４を少量でも過剰発現させたトランスジェニックマウスは、高脂肪食による糖尿病になりにくいことが報告されており（Ｉｋｅｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：３０８６−３０８９，１９９５）、ＧＬＵＴ４の発現を促進させるものは、糖尿病の予防・治癒に有効と考えられている。
【００１５】
本発明の「ＰＰＡＲγ２」とは、ＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）は核内受容体の１種であり、合計３つのサブタイプの一つのγ型である。ヒトとマウスのγ型遺伝子には２つのプロモーターが存在するため、スプライシングの違いによってＮ末端の異なるＰＰＡＲγ１とＰＰＡＲγ２の２種類の蛋白質が生じる。ＰＰＡＲγ、特にＰＰＡＲγ２は脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている。これにより、ＰＰＡＲγ２の遺伝子の発現を促進することにより脂質代謝を改善し、更に糖尿病の予防、治療作用を有することが示唆されている。
【００１６】
本発明の「メタボリックシンドローム」とは、内臓脂肪の蓄積によりインスリン抵抗性（インスリンの働きの低下）が起こり、糖代謝異常（耐糖能異常、糖尿病）、脂質代謝異常（高中性脂肪血症、低ＨＤＬコレステロール血症）、高血圧などの動脈硬化の危険因子が、一個人に集積している症状をいい、内臓脂肪型肥満に加えて、高血糖、高血圧、脂質異常のうちいずれか２つ以上をあわせもった状態をいう。具体的には、糖尿病や動脈硬化疾患の初期症状ということになる。
本発明の「機能性食品」とは、疾患や病状に対する改善効果を持った食品のことを言う。本発明の機能性食品としては、スダチチンを含有するものであれば、特に限定はなく、スダチチンを含有するものであれば、スダチの果実、果皮等のものであっても、使用することができる。本発明に係る食品の具体例としては、例えば、いわゆる栄養補助食品（サプリメント）としてスダチチンを含む錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。更に、スダチチンを含む調味料、菓子、パン、惣菜、飲料水等を挙げることができる。本発明の機能性食品はヒトを対象とするものであることはいうまでもないが、ヒトに限定されるものではなく、広く動物全般を対象とすることができる。特に、生活習慣病や肝機能障害に陥っているイヌやネコ等の愛玩動物は対象として好適である。
【００１７】
本発明の「Ｓｉｒｔ１」とは、細胞核内および細胞質に存在し、ＮＡＤ＋依存性蛋白脱アセチル化酵素の一つであり、ＳＩＲＴ１の酵素活性は、レスベラトロール、ブテイン、ピセアンタンノール、フィセチン、ケルセチンといった、トランススチルベン構造を有するポリフェノールによって活性化することが知られている。ＳＩＲＴ１を活性化させると、細胞死の予防、細胞老化の抑制、細胞の寿命延長、癌発生の予防等に有用であることが報告され、様々なＳＩＲＴ１活性化剤が検討されている。
本発明のスダチチンは、発現促進剤や予防及び／又は改善剤として薬品（医薬品および医薬部外品を含む。）の素材として使用することができる。例えば、薬品製剤用の原料に、本発明のスダチチンを適宜配合して製造することができる。尚、上記薬品は、ヒトに用いても良いし、ヒト以外の哺乳類動物に用いても良い。本発明のスダチチンに配合しうる製剤原料としては、例えば、賦形剤（ブドウ糖、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、デンプン、炭酸カルシウム、結晶セルロース、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等）、結合剤（蒸留水、生理食塩水、エタノール水、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（アルギン酸ナトリウム、カンテン、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖、アラビアゴム末、ゼラチン、エタノール等）、崩壊抑制剤（白糖、ステアリン、カカオ脂、水素添加油等）、吸収促進剤（第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等）、吸着剤（グリセリン、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、硅酸等）、滑沢剤（精製タルク、ステアリン酸塩、ポリエチレングリコール等）などが挙げられる。
【００１８】
本発明によるスダチチンの投与方法は、一般的には、錠剤、丸剤、軟・硬カプセル剤、細粒剤、散剤、顆粒剤等の形態で経口投与することが望ましい。また、水溶性製剤は、液剤として経口的に投与することができる。さらに非経口投与であってもよい。非経口剤として投与する場合は、本発明のスダチチンをエタノールや水など適当な可溶化剤に分散させた後、パップ剤、ローション剤、軟膏剤、チンキ剤、クリーム剤などの剤形で適用することができる。
スダチチンの投与量は、投与方法、病状、患者の年齢等によって変化し得るが、大人では、通常、１日当たり有効成分として５〜２００ｍｇ程度を投与することができる。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２０】
（実施例１）スダチチンによるＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡの発現促進効果
分化後８−１２日目の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を用いて、ＤＭＳＯまたはスダチチンを含む培養液で培養し、ＲＴ−ＰＣＲでＰＰＡＲγ２の遺伝子発現を以下のように測定した。
（１）試験材料：
ａ）試薬：ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ペニシリン／ストレプトマイシン及びトリプシン−ＥＤＴＡの０．２５％，０．０５％溶液は、ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入した。トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）はカイマンケミカル（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から購入し、１００％ＤＭＳＯで１ｍＭに調製した。
ｂ）スダチチン（（３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−１−フェニルプロパノン））はマイクロ波照射法によりスダチの皮から精製（徳島県立工業技術センターより提供）され、３．０６ｍｇを１ｍｌ  ＤＭＳＯに溶解した１０ｍＭのスダチチン溶液と、３０．６ｍｇを１ｍｌ  ＤＭＳＯに溶解した１００ｍＭのスダチチン溶液を調製した。
ｃ）ＲＴ−ＰＣＲ試薬として、Ｔａｋａｒａ  Ｐｒｉｍｅ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ｒｅｇａｎｄ  ｋｉｔ、ＲＮＡ  ｉｓｏ  ｐｌｕｓについては、タカラバイオから購入した。ＯＮＰＧは和光（Ｗａｋｏ）から購入した。
ＤＭＥＭ、ウシ膵臓由来のインスリン、デキサメサゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ）、ＩＢＭＸ、ＧＷ９６６２（２−ｃｈｌｏｒｏ−５−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚａｎｉｌｉｄｅ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入し、上記インスリンは１ｍｇ／ｍｌ（１０ｍＭ  ＨＣｌ）に、デキサメサゾンは０．３９ｍｇ／ｌ（１００％  ＥｔＯＨ）に、ＩＢＭＸは１１．５ｍｇ／ｍｌ（１００ｍＭ  ＮａＯＨ）に調製し、ＧＷ９６６２は１．３８３５ｍｇを１ｍｌＤＭＳＯに溶かして５ｍＭＧＷ９６６２溶液を調製した。
【００２１】
（２）試験方法：
ａ）培養細胞と分化：
３Ｔ３−Ｌ１マウス繊維芽細胞は１０ｃｍ  ｄｉｓｈを使用し、１０％ＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを付加したＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含む）で培養された。コンフルエンスに達した２日後、分化培地（ＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳ、１％ＩＢＭＸ、０．１％デキサメサゾン、１％インスリン、０．１％トログリタゾン）で４８時間細胞を培養することによって分化導入をおこなった。細胞は分化後８−１２日間ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、
１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で培養され実験に使用された。
ｂ）ＲＮＡ抽出とＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡ合成：
総ＲＮＡはＲＮＡ  ｉｓｏ  ｐｌｕｓを用いて、分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から抽出した。ＲＮＡ濃度は分光光度計（ＮＡＮＯＤＲＯＰ  ８０００，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使って測定し、０．５μｇＤＮＡがＴａｋａｒａ  Ｐｒｉｍｅ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ｒｅｇａｎｄ  ｋｉｔを使って逆転写反応を使い合成された。
ｃ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析：
定量的ＲＴ−ＰＣＲは５０ｎｇ  ＤＮＡを使ってＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）で行われた。サンプルは、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を使って定量化された。ＰＣＲは次の条件下で行われた：９５℃×１５ｍｉｎ、４０×（９５℃×１ｓ、６１℃×７ｓ、７２℃×１１ｓ）。ＰＣＲプライマーの塩基配列は次の表の通りである。定量化データは、Ｒｏｔｅｒ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ６．０で分析された。標的遺伝子の発現を標準化するために３６ｂ４の発現が用いられた。
【００２２】
【表１】
2013173719.tif 000004
【００２３】
（３）評価結果：
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を１０μＭスダチチンまたは０．１％ＤＭＳＯ（コントロール）を付加した培地で２４時間刺激した。スダチチンを付加した培地の細胞ではコントロール群に比べて、ＰＰＡＲγ２（１．４７倍±０．１１、ｐ＜０．０５）が有意に増加していた（図１参照）。更に、３０μＭスダチチンで４８時間刺激したところ、ＰＰＡＲγ２（３．２４倍±０．５８、ｐ＜０．０１）は有意に増加した（図２参照）。７２時間刺激では、ＰＰＡＲγ２（０．８３倍±０．２６、ｐ＝０．２８）も有意ではないが低下する傾向がみられた。
なお、結果は、平均±ＳＤの標準誤差として表した。有意差検定には、ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定を基本的に使用し、濃度依存性の反応は、Ｔｕｋｅｙ’ｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｔｅｓｔに従う分散の一元配置分析ＡＮＯＶＡを使用した。ｐ＜０．０５の危険率を有意とみなした。
【００２４】
（実施例２）スダチチンによるアデイポネクチン、ＧＬＵＴ４、Ｓｉｒｔ１のｍＲＮＡの発現促進の効果
実施例１と同様にして、ＲＴ−ＰＣＲで、アデイポネクチン、ＧＬＵＴ４、Ｓｉｒｔ１の遺伝子発現を測定した。なお、測定に使用したＰＣＲプライマーの塩基配列は次の表の通りである。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
スダチチンの添加濃度と刺激時間に依存して、ｍＲＮＡの発現量が変化することが実施例１で示されたので、アディポネクチンについて、スダチチンの濃度効果を評価した。２４時間の刺激では、１０μＭの濃度で遺伝子の増加が認められ、３０μＭまでは遺伝子の増加が見られたが、１００μＭになれば逆に低下することが示された（図３を参照）。
そこで、３０μＭスダチチンで４８時間刺激したところ、アディポネクチンのｍＲＮＡは２．３２倍±０．２６（ｐ＜０．０５）となって、有意に増加した（図４参照）。しかし、時間を延長して７２時間刺激では逆に０．２３倍±０．２２（ｐ＜０．０１）となって、遺伝子の発現は有意に低下することが示された(図５参照)。
【００２７】
ＧＬＵＴ４についても同様に、３０μＭスダチチンで４８時間刺激したところ、ＧＬＵＴ４のｍＲＮＡは３．０４倍±０．３７（ｐ＜０．０５）となって、有意に増加した（図６参照）。しかし、時間を延長して７２時間刺激では逆に０．３２倍±０．２１（ｐ＜０．０１）となって、遺伝子の発現は有意に低下することが示された(図７参照)。
Ｓｉｒｔ１についても、３０μＭスダチチンで４８時間刺激したところ、Ｓｉｒｔ１のｍＲＮＡが１．８７倍±０．３１（ｐ＜０．０１）となって、有意に増加することが示された（図１０参照）。
【００２８】
（実施例３）アディポネクチンとＧＬＵＴ４の遺伝子発現増加に、スダチチンによるＰＰＡＲγ２の遺伝子発現増加が影響することの確認試験
３０μＭスダチチン刺激で得られたアディポネクチンやＧｌｕｔ４のｍＲＮＡ発現増加が、ＰＰＡＲγ２を介して行われているかどうかを調べるために、ＰＰＡＲγ２の阻害剤であるＧＷ９６６２とスダチチンを同時に刺激し、アディポネクチンやＧｌｕｔ４のｍＲＮＡ発現が増加するかどうかを調べた。
（１）試験方法：
分化後８−１２日目の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を０．１％ＤＭＳＯ（コントロール）、０．１％ＤＭＳＯ＋５μＭ  ＧＷ９６６２、３０μＭスダチチン＋ＤＭＳＯ、３０μＭスダチチン＋５μＭ  ＧＷ９６６２をそれぞれ付加した培地で４８時間培養し、ＲＴ−ＰＣＲで解析をおこなった。
（２）試験結果：
図８に示されるように、３０μＭスダチチン刺激で増加したアディポネクチンの発現は、ＧＷ９６６２によって有意に抑制された。またＧｌｕｔ４においても、有意ではないがスダチチンによる発現増加がＧＷ９６６２により抑制される傾向にあった。
以上のように、スダチチンは、ＰＰＡＲγ２を介して、アディポネクチンとＧＬＵＴ４の発現を増加させることが示された。
【００２９】
（実施例４）スダチチンがＰＰＡＲγ２のプロモーター活性を増加させることの確認試験
スダチチンがＰＰＡＲγ２のプロモーター活性を上げるか否かを調べるために、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、形質転換とルシフェラーゼアッセイを行った。
（１）試験方法：
ＨＥＫ２９３細胞は、ＦｕＧＥＮＥ６形質導入試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて形質転換させた。即ち、ＨＥＫ２９３細胞を２４穴のｄｉｓｈに撒き、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地５０−８０％コンフルエンスになるまで培養した。上記細胞に、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ、ＰＰＡＲ・２  ＰＬ１／ＰＧＬ３  ｂａｓｉｃ、ｐＣＭＶβの試薬を使用し、形質導入を行なった。２４時間後、１０％ＦＢＳ、スダチチンを付加したＤＭＥＭと交換し、０−４８時間培養させた後、細胞はＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ってルシフェラーゼ活性の測定を行なった。なお、同時に形質導入したＯＮＰＧによるβ−ｇａｌ発現による活性を測定することで形質導入の効率を補正した。
（２）試験結果：
ＤＭＳＯ（コントロール）、スダチチン（１０μＭ、３０μＭ）でそれぞれ刺激したところ、図９（Ａ）に示されるように、コントロールと比較して、１０μＭスダチチンでは１．４３倍±０．２２（Ｐ＜０．０５）、３０μＭスダチチンでは１．６５倍±０．１８（ｐ＜０．０１）にルシフェラーゼ活性が有意に増加していた。なお、１０μＭと３０μＭのスダチチン濃度の間では、増加効果に有意差はなかった（ｐ＝０．０７）。
次に、ＤＭＳＯ（コントロール）、スダチチン３０μＭ（１２ｈｒ、２４ｈｒ、４８ｈｒ）でそれぞれ刺激したところ、図９（Ｂ）に示すように、コントロールと比較して、１２時間で２．８６倍±０．３６（Ｐ＜０．０１）、２４時間で３．２４倍±０．３７（ｐ＜０．０１）、４８時間で２．８４倍±０．３０（ｐ＜０．０１）となり、スダチチンで刺激した細胞でＰＰＡＲγ２のプロモーターのルシフェラーゼ活性が増加していることが示された。
以上のことから、スダチチンは、アディポネクチン、Ｇｌｕｔ４、ＰＰＡＲγ２、Ｓｉｒｔ１の発現増加作用を持ち、アディポネクチンやＧｌｕｔ４の発現増加にはＰＰＡＲγ２のプロモーター活性の増加が関与しているということが示された。
【００３０】
（実施例５）肥満モデルマウスにおけるスダチチン投与の効果
スダチチンを肥満モデルマウスに投与することにより、脂質代謝と糖代謝がスダチチンによって改善されることを評価した。
（１）脂質代謝改善の評価試験：
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｗｅｓｔｅｒｎ食（４０％高脂肪食）を５週齢より与えることでｎｏｒｍａｌ  ｃｈｏｗ群に比べて投与５週目より有意に体重増加がみられた。高脂肪食を与えながら１日１回５ｍｇ／ｋｇのスダチチンを投与した群では体重増加が抑制され、スダチチン投与５週目より対照群に対して有意に低値を示した（図１１（Ａ）を参照）。一方でｎｏｒｍａｌ  ｃｈｏｗ群ではスダチチンを投与しても体重に変化はなかった。摂餌量については、ｎｏｒｍａｌ  ｃｈｏｗ群とｗｅｓｔｅｒｎ群で摂餌差はなく、そのためエネルギー摂取量はｗｅｓｔｅｒｎ群で増加した。スダチチン投与によって摂餌量が変化することはｎｏｒｍａｌ  ｃｈｏｗ群とｗｅｓｔｅｒｎ群両群においてなかった（図１１（Ｂ）を参照）。
スダチチン１２週間投与後の解剖時における白色脂肪重量は、Ｎｏｒｍａｌ  ｃｈｏｗ群ではスダチチン投与の影響はなかったが、ｗｅｓｔｅｒｎ群においてはスダチチン投与によって、肝臓、白色脂肪組織である皮下脂肪と内臓脂肪有意に減少し、褐色脂肪では差がなかった（図１１（Ｃ）を参照）。
さらに高脂肪食下におけるスダチチン投与は白色脂肪の増大を抑制することでその重量増加を抑制していることを検討した。スダチチンを投与後４週間の時点でマウスのＸ線ＣＴスキャンを行ったところ、皮下脂肪及び内臓脂肪の重量に有意な差があった（図１２を参照）。さらに脂肪細胞の大きさを比較するとスダチチン投与群で有意に小さく（図１３（Ａ）と（Ｂ）を参照）、浸潤も少ない傾向があった。
（２）糖代謝改善の評価試験：
上記の肥満モデルマウスにスダチチンを６週間投与し、グルコース負荷試験を行った。ｗｅｓｔｅｒｎ食摂取により耐糖能異常を示し、スダチチン投与群で改善傾向にあり、３０分、９０分で有意な血糖値の低下が認められた（図１４（Ａ）を参照）。さらにインスリン負荷試験においては、インスリン投与後１５，３０，６０，９０分後の血糖値がスダチチン投与群で有意に低く、ｗｅｓｔｅｒｎ食摂取により誘導されたインスリン抵抗性がスダチチン投与によって改善されることが示唆された（図１４（Ｂ）を参照）。また、血清中性脂肪及び肝臓、筋肉組織中の中性脂肪を評価すると、スダチチン投与群で低値を示し、一方で血清総コレステロールには有意な減少はみられなかったが、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）はスダチチン投与群において有意に低値を示した（図１５）。
さらに肥満状態が改善されていることを明らかにするため、血清インスリン値及びレプチン値を測定した。１２週間のｗｅｓｔｅｒｎ食摂取によりマウスは高インスリン血症及び高レプチン血症を示したが、共にスダチチン投与で有意に低下を示していた（図１６（Ａ）と（Ｂ）を参照）。逆に、内臓脂肪量と逆相関するとされるアディポネクチン濃度はＷｅｓｔｅｒｎ食の摂取と加齢に伴い減少したが、スダチチン投与によって有意に改善されていた（図１６（Ｃ）を参照）。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明で用いられるスダチチンは、徳島特産のスダチにのみ多く含まれるものであって、長年摂食されて来ていることから、安全性に問題がなく、また、苦味もあまりない。それ故、本発明のスダチチンを有効成分とする、アディポネクチンとＧＬＵＴ４の発現促進剤は、生活習慣病であるメタボリックシンドロームの予防及び／又は改善の治療剤として、長期服用が可能である。更には苦味が少ないことから、機能性食品として、メタボリックシンドロームの患者に長期間摂取可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１３】
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【図１６】
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