(57)【要約】【課題】短時間かつ低コストで作製でき、良好な取り扱い性を有し、安定して培養を行なうことができる、新規な皮膚感作性試験モデルおよびそのための新規なチャンバーを提供する。有効なパラメータが設定された新規な皮膚感作性試験法を提供する【解決手段】コラーゲンビトリゲル膜によって区切られた第１室と第２室とを備える、コラーゲンビトリゲル膜チャンバー、当該コラーゲンビトリゲル膜の第１室側に、コラーゲンビトリゲル膜側から樹状細胞層、表皮角化細胞層をこの順で備え、コラーゲンビトリゲル膜の第２室側に線維芽細胞層を備える、皮膚感作性試験モデル、ならびに、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する皮膚感作性試験法であって、６０％以上の細胞生存率を示した濃度の被検物質を用いる皮膚感作性試験法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚感作性試験モデルを構築するために用いられるチャンバーであって、
コラーゲンビトリゲル膜によって区切られた第１室と第２室とを備える、コラーゲンビトリゲル膜チャンバー。
【請求項２】
コラーゲンビトリゲル膜を挟んで設けられた第１の筒状体と第２の筒状体とを備え、
第１の筒状体の内部空間を前記第１室、第２の筒状体の内部空間を前記第２室とするように構成されている、請求項１に記載のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー。
【請求項３】
第１の筒状体と第２の筒状体とが取り外し可能である、請求項２に記載のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーを用いて構築された皮膚感作性試験モデルであって、
コラーゲンビトリゲル膜の第１室側に、コラーゲンビトリゲル膜側から樹状細胞層、表皮角化細胞層をこの順で備え、
コラーゲンビトリゲル膜の第２室側に、線維芽細胞層を備える、皮膚感作性試験モデル。
【請求項５】
被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する皮膚感作性試験法であって、
６０％以上の細胞生存率を示した濃度の被検物質を用いることを特徴とする、皮膚感作性試験法。
【請求項６】
被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する指標としてＧ−ＣＳＦを用いる、請求項５に記載の皮膚感作性試験法。
【請求項７】
被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する指標としてＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αから選ばれる少なくとも１種以上の被検物質の濃度依存的な増加を用いる、請求項６に記載の皮膚感作性試験法。
【請求項８】
請求項４に記載の皮膚感作性試験モデルを用いることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の皮膚感作性試験法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元皮膚モデル（以下、「皮膚感作性試験モデル」）を構築するために用いられるビトリゲルチャンバー（以下、「コラーゲンビトリゲル膜チャンバー」）およびそれを用いた皮膚感作性試験モデルに関する。本発明はまた、化学物質（以下、「被検物質」）が皮膚感作性を有するか否かを判定する皮膚感作性評価法（以下、「皮膚感作性試験法」）に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品、洗剤などの開発において、その主成分の原料、添加剤などとして材料を選択する場合、消費者の感受性によっては重篤なアレルギー反応を引き起こしてしまう場合もあるため、その材料に触れた消費者などにおいて皮膚免疫応答が惹起される性質を有する（「皮膚感作性」を有する）か否かを検出し、判別することが重要である。
【０００３】
天然物、化学物質の皮膚感作性を検出する方法としては、従来、モルモット、マウスなどの動物を用いる方法、培養細胞を用いる方法、さらには、ペプチドとの結合性を調べる方法などが開発されている。これらの方法は、いずれも、ヒトにおける皮膚感作性と８０％程度の相関があることが明らかにされており、天然物、化学物質の皮膚感作性の検出に有効であることが示されている。近年では、動物愛護の観点から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで皮膚感作性を評価する方法の開発のために、より生体に近い、三次元培養ヒト皮膚モデルおよび感作性ｉｎ  ｖｉｔｒｏで皮膚感作性を試験する方法を開発する試みが進められている。
【０００４】
たとえば、特開２００６−３３３７６３号公報（特許文献１）には、図９に模式的に示すような三次元培養ヒト皮膚モデル５１が提案されている。特許文献１に開示された皮膚モデル５１は、下から順に、線維芽細胞を含む支持体層５２、樹状細胞を含む支持体層５３および表皮角化細胞層５４を含む。好適には、三次元培養ヒト皮膚モデル５１は、支持体層５２が、少なくとも１つの孔を有する環状支持体（プラスチック製のアッセイリング）５５上に載せられ、また、支持体層５２上に載置されたガラスリング５６の内部に、支持体層５３および表皮角化細胞層５４が形成される。
【０００５】
また特許文献１には、上述したようなヒト皮膚モデル５１を培地中の被検物質と接触させ、皮膚モデル５１に生じた変化の有無または量を検出または測定する、被検物質の影響のアッセイ方法も開示されている。特許文献１では、このようなアッセイ方法において、培地中に放出されたサイトカインまたはＣＤ８６の発現を指標として、前記皮膚モデルに生じた変化の有無または量を検出または測定することが好ましいことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３３３７６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に開示された三次元培養ヒト皮膚モデル５１においては、線維芽細胞を含む支持体層５２としてコラーゲンゲルを用いており、これが線維芽細胞の増殖に伴い、モデルを作製するのに適当な大きさに収縮するためだけでも約１週間かかり、ヒト皮膚モデル５１の作製に全体で約３週間もの期間を要していた。また、上述のようにコラーゲンゲルを用いているため、高コストになっていた。
【０００８】
また、特許文献１に開示された三次元培養ヒト皮膚モデル５１において、線維芽細胞を含む支持体層５２は、環状支持体５５上に載せているだけである。このため、培養中に支持体層５２と環状支持体５５とがずれてしまうことがあり、安定した培養が困難であるという問題があった。
【０００９】
さらに、特許文献１に開示された三次元培養ヒト皮膚モデル５１では、支持体層５２上に、ガラスリング５６を載せているだけである。このため、支持体層５２とガラスリング５６との間から被検物質、細胞などが漏れてしまうことがあった。
【００１０】
また特許文献１には、被検物質の影響のアッセイ方法について、具体的に、ヒト皮膚モデルを用いたＣＤ８６発現および細胞傷害性に対する被検物質の影響を評価した結果が表１（特許文献１の段落〔００３６〕）に示されている。しかしながら、特許文献１の表１に示される結果からは、細胞毒性があってもなくてもＣＤ８６は発現しており、皮膚感作性の評価の条件として細胞生存率の影響は明らかではなかった。また、特許文献１の図５には、種々の被検物質を用いて２４時間インキュベーションした結果が示されているが、被検物質であるＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−４のいずれも、単独では、完全に区別することができていない。このように、皮膚感作性試験において有効なパラメータの設定が望まれていた。
【００１１】
本発明は、上述した課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、短時間かつ低コストで作製でき、良好な取り扱い性を有し、安定して培養を行なうことができる、新規な皮膚感作性試験モデルおよびそのための新規なチャンバーを提供することである。
【００１２】
また本発明は、有効なパラメータが設定された新規な皮膚感作性試験法を提供することもその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、皮膚感作性試験モデルを構築するために用いられるチャンバーであって、コラーゲンビトリゲル膜によって区切られた第１室と第２室とを備える、コラーゲンビトリゲル膜チャンバーに関する。
【００１４】
本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーは、コラーゲンビトリゲル膜を挟んで設けられた第１の筒状体と第２の筒状体とを備え、第１の筒状体の内部空間を前記第１室、第２の筒状体の内部空間を前記第２室とするように構成されていることが好ましい。
【００１５】
本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーは、第１の筒状体と第２の筒状体とが取り外し可能であることが好ましい。
【００１６】
本発明はまた、上述した本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーを用いて構築された皮膚感作性試験モデルであって、コラーゲンビトリゲル膜の第１室側に、コラーゲンビトリゲル膜側から樹状細胞層、表皮角化細胞層をこの順で備え、コラーゲンビトリゲル膜の第２室側に、線維芽細胞層を備える皮膚感作性試験モデルについても提供する。
【００１７】
本発明はさらに、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する皮膚感作性試験法であって、６０％以上の細胞生存率を示した濃度の被検物質を用いることを特徴とする皮膚感作性試験法についても提供する。
【００１８】
本発明の皮膚感作性試験法においては、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する指標としてＧ−ＣＳＦを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の皮膚感作性試験法において、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する指標としてＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αから選ばれる少なくとも１種以上の被検物質の濃度依存的な増加を用いることが、好ましい。
【００２０】
本発明の皮膚感作性試験法においては、上述した本発明の皮膚感作性試験モデルを用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーによれば、全体として約２週間という従来と比較して短い期間で、かつ、低いコストで皮膚感作性試験モデルを構築することが可能となる。また本発明の皮膚感作性試験モデルは、被検物質や細胞が漏洩してしまうことなく、優れた操作性で、信頼性および再現性に優れた皮膚感作性試験を好適に行なうことができる。さらに、本発明によれば、従来と比較して、評価の信頼性が向上された皮膚感作試験法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の好ましい一例のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は斜視図、図１（ｂ）は断面図、図１（ｃ）は分解斜視図である。
【図２】本発明の好ましい一例の皮膚感作性試験モデル１１を模式的に示す図である。
【図３】実験例１で作製した皮膚感作性試験モデルのコラーゲンビトリゲル膜４の周辺の切断面写真である。
【図４】コラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を用いて皮膚感作性試験モデル１１を構築する方法の一例を模式的に示す図である。
【図５】細胞生存率に与えるＤＮＣＢ濃度の影響について示すグラフであり、縦軸は細胞生存率（％）、横軸はＤＮＣＢ濃度（ｍＭ）である。
【図６】ＩＬ−４の分泌量とＤＮＣＢの濃度との関係を示すグラフであり、縦軸はＩＬ−４の分泌量（ｐｇ／ｍＬ）、横軸はＤＮＣＢの濃度（ｍＭ）である。
【図７】ＴＮＦ−αの分泌量とＤＮＣＢの濃度との関係を示すグラフであり、縦軸はＴＮＦ−αの分泌量（ｐｇ／ｍＬ）、横軸はＤＮＣＢの濃度（ｍＭ）である。
【図８】Ｇ−ＣＳＦの分泌量とＤＮＣＢの濃度との関係を示すグラフであり、縦軸はＧ−ＣＳＦの分泌量（ｐｇ／ｍＬ）、横軸はＤＮＣＢの濃度（ｍＭ）である。
【図９】従来の三次元培養ヒト皮膚モデル５１を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔１〕コラーゲンビトリゲル膜チャンバー
図１は、本発明の好ましい一例のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を模式的に示す図であり、図１（ａ）は斜視図、図１（ｂ）は断面図、図１（ｃ）は分解斜視図である。本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１は、図１に示すように、コラーゲンビトリゲル膜４によって区切られた第１室２と第２室３とを備える。コラーゲンビトリゲル膜は、生体内の結合組織に匹敵する高密度コラーゲン線維より構成される膜状のゲルであり、このようなコラーゲンビトリゲル膜４は、たとえば、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０７６００９に開示されているビトリゲル膜、YAKUGAKU ZASSHI 130(4) 565-574(2010)に記載のコラーゲンビトリゲル薄膜、コラーゲンビトリゲル（旭硝子株式会社製）などの市販品を好適に用いることができる。
【００２４】
本発明におけるコラーゲンビトリゲル膜４は、第１室２と第２室３との間を、気体、液体および分子量の小さな物質については通過させ得る一方で、ある程度分子量の大きな物質（たとえば、樹状細胞層を構成する樹状細胞、線維芽細胞層を構成する線維芽細胞など）については通過させない性質を有する。これにより、後述するように、本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を用いて、良好な取り扱い性を有しながら、安定した培養を行なうことが可能となる。
【００２５】
本発明に用いられるコラーゲンビトリゲル膜４は、その厚みについては特に制限されないが、１００ナノメートル〜２ミリメートルの範囲内であることが好ましく、数マイクロメートル〜数十マイクロメートルの範囲内であることがより好ましい。コラーゲンビトリゲル膜４の厚みが数マイクロメートル未満である場合には、透明性は向上するが膜強度が低下するという傾向にあり、また、コラーゲンビトリゲル膜４の厚みが数十マイクロメートルを超える場合には、膜強度は向上するが透明性が低下するという傾向にあるためである。
【００２６】
本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１において、第１室２および第２室３は、どのように形成されていてもよいが、コラーゲンビトリゲル膜４を挟んで設けられた第１の筒状体５と第２の筒状体６とを備え、第１の筒状体５の内部空間を前記第１室２、第２の筒状体６の内部空間を前記第２室３とするように構成されていることが、好ましい。第１の筒状体５および第２の筒状体６は、その断面形状は特に制限されず、円形状（真円形状、楕円形状）三角形状、四角形状などであってよいが、操作性が良好である点から、円形状であることが好ましい。図１には、同じ径を有する断面形状が円形状の第１の筒状体５と第２の筒状体６とを、コラーゲンビトリゲル膜４を挟むようにして、その軸線方向に沿って並べるようにした例が示されている。
【００２７】
本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１において、第１の筒状体５および第２の筒状体の形成材料６としては特に制限されるものではなく、たとえばガラス、アクリル、ポリメチルメタアクリル、アクリロニトリル・スチレン樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、プロピレン共重合体、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリ塩化ビニール、熱可塑性エラストマー、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリエーテルサルホン、ポリアリレート、ポリエーテルイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート共重合体、ポリフェニレンオキサイド、ポリテトラフルオロエチレン、フッ化エチレンプロピレン、エチレン−テトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフロライド、過フルオロアルコキシなどを挙げることができ、中でもアクリル、ポリメチルメタアクリル、アクリロニトリル・スチレン樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリサルフォン、ポリエーテルサルホン、ポリアリレート、ポリエーテルイミドが光透過性と耐久性が高いという理由から好ましく、さらにはアクリル、ポリスチレン、ポリプロピレンが特に好ましい。
【００２８】
図１に示す例において、第１の筒状体５の一方側の開口端を塞ぐようにコラーゲンビトリゲル膜４が設けられ、その上に、第２の筒状体６が上述のように軸線方向に沿って並ぶように設けられている。ここで、コラーゲンビトリゲル膜４は、必ずしも第１の筒状体５の一方側の開口端に設けられていなくともよく、第１の筒状体５の開口端より入り込んだ内壁に設けられてもよい（この場合、第１の筒状体の、第２の筒状体が設けられる側とは反対側の開口端からコラーゲンビトリゲル膜との間の空間が第１室となり、第２の筒状体の内部空間と、第１の筒状体の、第２の筒状体が設けられた側の開口端からコラーゲンビトリゲル膜との間の空間とが第２室となる）。
【００２９】
コラーゲンビトリゲル膜４は、第１の筒状体５に接着されていることが好ましく、当該接着に用い得る接着剤としては特に制限されないが、たとえばウレタン系、シアノアクリレート系、ゴム系、アクリル系、光硬化樹脂系などを挙げることができ、中でも細胞毒性を示さない、もしくは非常に低いという理由から、無溶媒性ウレタン系、医療用シアノアクリレート系などが好適な例として挙げられる。
【００３０】
本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１は、図１（ｃ）に示すように、第１の筒状体５と、第２の筒状体６とが取り外し可能であることが好ましい。これにより、後述するように、本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を用いた、効率的な皮膚感作性試験モデルの構築が可能となる。
【００３１】
〔２〕皮膚感作性試験モデル
図２は、本発明の好ましい一例の皮膚感作性試験モデル１１を模式的に示す図であり、図３は、後述する実験例１で実際に作製した皮膚感作性試験モデルのコラーゲンビトリゲル膜４の周辺の切断面写真（１０００倍）である。本発明は、図２および図３に示すような、コラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を用いて構築された皮膚感作性試験モデル１１であって、コラーゲンビトリゲル膜４の第１室２側に、コラーゲンビトリゲル膜４側から樹状細胞層１３、表皮角化細胞層１４をこの順で備え、コラーゲンビトリゲル膜４の第２室３側に、線維芽細胞層１２を備える皮膚感作性試験モデル１１についても提供する。
【００３２】
本発明の皮膚感作性試験モデル１１における線維芽細胞層１２は、具体的には実験例にて後述するように、コラーゲンビトリゲル膜４の第２室３側に、たとえば正常ヒト線維芽細胞ＮＨＳＦ４６などの線維芽細胞を播種し、培養して層状にすることで形成できる。線維芽細胞の播種量、培地、培養条件などは、当分野において知られている適宜の播種量、培地、培養条件を好適に採用することができ、特に制限されるものではない。この線維芽細胞層１２がない場合には、後述する実験例４で示されるように、皮膚感作性試験に用いた場合に、サイトカインなどの分泌量が顕著に少なくなり、定量限界以下となってしまう場合もある。
【００３３】
本発明の皮膚感作性試験モデル１１における樹状細胞層１３は、具体的には実験例にて後述するように、コラーゲンビトリゲル膜４の第１室２側に、たとえば正常ヒト樹状細胞ＮＨＤＣなどの樹状細胞を播種し、培養して層状にすることで形成できる。樹状細胞の播種量、培地、培養条件などは、当分野において知られている適宜の播種量、培地、培養条件を好適に採用することができ、特に制限されるものではない。この樹状細胞層１３がない場合には、サイトカインの分泌量が有意に少なくなるという不具合がある。
【００３４】
本発明の皮膚感作性試験モデル１１における表皮角化細胞層１４は、具体的には実験例にて後述するように、上述した樹状細胞層１３上に、たとえば正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（Ｆ）などの表皮角化細胞を播種し、培養して層状にすることで形成できる。表皮角化細胞の播種量、培地、培養条件などは、当分野において知られている適宜の播種量、培地、培養条件を好適に採用することができ、特に制限されるものではない。この表皮角化細胞層１４がない場合には、サイトカインなどの分泌量が顕著に少なくなり、定量限界以下となってしまう場合もある、皮膚のバリヤー機能が反映されず、被験物質の影響が過大に評価される可能性がある、というような不具合がある。
【００３５】
本発明の皮膚感作性試験モデル１１における表皮角化細胞層１４の厚みは特に制限されないが、皮膚のバリヤー機能が反映されるよう、角層が形成されていることが望ましい。
【００３６】
このような本発明の皮膚感作性試験モデル１１は、上述した本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を用いることで、たとえば特開２００６−３３３７６３号公報に記載された従来の三次元培養ヒト皮膚モデルのように線維芽細胞を含む支持体層を形成するために約１週間かけてコラーゲンゲルを収縮させる必要がなく、全体として約２週間で皮膚感作性試験モデル１１を作製することができ、また、コストも低くすることができる。また、本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１では、コラーゲンビトリゲル膜がチャンバーに接着されているため、これを用いた皮膚感作性試験を行なう際に、被検物質や細胞が漏洩してしまうことがない。また、コラーゲンビトリゲル膜がチャンバーに接着されているため、チャンバーをセットで取り扱うことができ、操作性に優れるという利点もある。このような本発明の皮膚感作性試験モデル１１を用いることで、信頼性および再現性に優れた皮膚感作性試験を好適に行なうことができる。
【００３７】
ここで、図４は、コラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を用いて皮膚感作性試験モデル１１を構築する方法の一例を模式的に示す図である。詳細は実験例にて後述するが、まず、図４（ａ）に示すように、コラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を第２筒状体６が上側となるようにプレート（たとえば６穴プレート）のウエル２１内に載置し、コラーゲンビトリゲル膜４の第２室３側に線維芽細胞を播種し、培養し、層状にして線維芽細胞層１２を形成する。その後、第２の筒状体６を取り外し、第１の筒状体５のコラーゲンビトリゲル膜４が設けられたのとは反対側（開口側）が上側となるように配置して、別のプレート（たとえば１２穴プレート）のウエル２２内に載置する。このような状態で、コラーゲンビトリゲル膜４の第１室２側に樹状細胞を播種し、培養し、層状にして樹状細胞層１３を形成する。その後、樹状細胞層１３上に、表皮角化細胞を播種し、培養し、層状にして表皮角化細胞層１４を形成する。このように、第１の筒状体５と第２の筒状体６とが取り外し可能なコラーゲンビトリゲル膜チャンバー１を用いることで、上述のように効率的かつ迅速に皮膚感作性試験モデル１１が構築できるという利点がある。
【００３８】
〔３〕皮膚感作性試験法
本発明はさらに、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する皮膚感作性試験法であって、６０％以上の細胞生存率を示した濃度の被検物質を用いることを特徴とする、皮膚感作性試験法についても提供する。特開２００６−３３３７６３号公報の表１には、ヒト皮膚モデルを用いたＣＤ８６発現および細胞傷害性に対する被検物質の影響と題された試験結果が示されているが、細胞毒性（Cytotoxicity）があってもなくてもＣＤ８６は発現しており、皮膚感作性試験の評価の条件として、生存率の影響が明らかではない。これに対し、本発明者らは、後述する実験例で立証されるように、細胞生存率が６０％未満の場合には、サイトカインの分泌量が極端に低下することから、６０％以上の細胞生存率が有効なパラメータとして設定し得ることを見出した。すなわち、本発明では、６０％以上の細胞生存率を示した被検物質の濃度を細胞毒性のカットオフ値として設定することで、評価の信頼性が向上された皮膚感作試験法が提供される。
【００３９】
本発明の皮膚感作性試験法はまた、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する指標としてＧ−ＣＳＦを用いることが好ましい。特開２００６−３３３７６３号公報の図５には、ヒト皮膚モデルを用いた、種々の被検物質の感作性（サイトカイン放出刺激活性）の評価試験の結果が示されているが、サイトカインとして例示されているＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−４は、いずれも単独では完全に区別できていない。本発明者らは、後述する実験例にて立証するように、Ｇ−ＣＳＦが、同一条件での試験でＩＬ−４よりも高い倍率で分泌されており、皮膚感作性の指標として有効性が高いことを見出した。このように、６０％以上の細胞生存率を示した濃度の被検物質を用い、かつ、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する指標としてＧ−ＣＳＦを用いることで、さらなる評価精度の向上が期待される。
【００４０】
本発明の皮膚感作性試験法は、被検物質が皮膚感作性を有するか否かを判定する指標としてＧ−ＣＳＦと共に、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αから選ばれる少なくとも１種以上の被検物質の濃度依存的な増加を併せて用いるようにすることが好ましい。このように複数の評価項目を導入し、総合的に判断する項目を提供することで、単一の評価指標の場合に生じやすい、バイオ実験特有の実験のばらつきによる判定の困難さを低減でき、評価精度がさらに向上された皮膚感作性試験法が提供できる。また、Ｇ−ＳＣＦと、被検物質の濃度依存性を指標として組み合わせることで、統計的有意差がなくても判定が可能になるという利点がある。
【００４１】
なお、本発明の皮膚感作性試験法は、どのような皮膚感作性試験モデルを用いてもよいが、操作性がよく、高い信頼性での試験結果が得られることから、上述した本発明の皮膚感作性モデルを用いて行なうことが好ましい。
【００４２】
以下、実験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
＜実験例１＞
（コラーゲンビトリゲル膜チャンバーの作製）
第１の筒状体、第２の筒状体として、アクリル製の外径１５ｍｍ、内径１１ｍｍ、長さ１５ｍｍ（第１の筒状体）もしくは５ｍｍ（第２の筒状体）の断面形状が真円状の２つの筒状体を用い、一方の筒状体（第１の筒状体）の開口端に、コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＡＣ（高研社製）をコラーゲンビトリゲル膜（厚み：１０〜３０μｍ）として用い、接着剤としてＵＭ７００（セメダイン社製）を用いて接着した。その後、他方の筒状体（第２の筒状体）を、コラーゲンビトリゲル膜を挟むようにして前記一方の筒状体（第１の筒状体）上に、その軸線方向に沿って並ぶように載置した。このようにして、コラーゲンビトリゲル膜を介して、第１の筒状体の内部空間を第１室、第２の筒状体の内部空間を第２室として備える、本発明のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーを作製した。
【００４４】
（皮膚感作性試験モデルの作製）
作製した２室型のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーを用い、第２室が上側となるように６穴プレートのウエル内に載置した。その状態で、コラーゲンビトリゲル膜チャンバーの第２室に、ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ（３５ｍｇ／Ｌのベンジルペニシリンと５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含む）に分散した正常ヒト線維芽細胞ＮＨＳＦ４６（独立行政法人理化学研究所細胞バンクより購入）０．２ｍＬを２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ播種した。４時間培養後、１２穴プレートの各ウエルに１ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ：Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２＝１：１）を加えた。
【００４５】
コラーゲンビトリゲル膜チャンバーから第２室を取り外し、反転させて（開口が上側となるように、第１室を備える第１の筒状体を配置して）１２穴プレートのウエル内に載置した。チャンバー内に培地（ＬＧＭ−３（Ｌｏｎｚａ社製）−５％ヒト血清（ＣＥＬＬｅｃｔ社製））０．５ｍＬに分散させた正常ヒト樹状細胞ＮＨＤＣ（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、Ｌｏｎｚａ社より購入）を播種した。４時間後、培地を１ｍＬのＥｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２（インビトロジェン社製）を加え、Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２  ０．２ｍＬに分散させた正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（Ｆ）（クラボウ（株）より購入）１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ播種し、一晩培養した。翌朝、培地を三次元培養用培地（ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２、ＬＧＭ−３−５％ヒト血清を等量混合させ、最終濃度１．８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｃａ２＋（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．２６４ｍｇ／ｍＬ）と０．０５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含有させて調製したもの）を１ｍＬに交換し、チャンバー内の培地を取り除いて正常ヒト表皮角化細胞の層（表皮角化細胞層）の表面を空気に曝し、１日おきに培地を交換しながら１３日間培養した。
【００４６】
このようにして、コラーゲンビトリゲル膜の第１室側に、コラーゲンビトリゲル膜側から樹状細胞層、表皮角化細胞層をこの順で備え、コラーゲンビトリゲル膜の第２室側に、線維芽細胞層を備える皮膚感作性試験モデルを作製した。
【００４７】
（皮膚感作性試験モデルを用いた細胞毒性試験）
ブランク用の上述のように作製したコラーゲンビトリゲル膜チャンバーを１２穴プレートに移した後、上述のように構築した皮膚感作性試験モデルを新しい１２穴プレートに移し、１ｍＬの三次元培養用培地を加えた後、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭまたは０．５ｍＭのＤＮＣＢ（ＤＭＳＯに溶解した０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍまたは０．５Ｍの溶液を三次元培養用培地で１０００倍希釈する）、溶媒対照（０．１％  ＤＭＳＯ）を３穴ずつ、ブランク（細胞を播種しないもの）を１穴曝露させ、１時間培養した。
【００４８】
皮膚感作性試験モデルを一旦別のプレートに移し、三次元培養用培地０．５ｍＬをモデル表面に添加して３回洗浄後、元のプレートに戻した。被検物質曝露２４時間後に培地を採取した後で三次元培養用培地で５倍希釈したテトラカラーワン試薬（バイオビジネス社製）を２ｍＬ（チャンバーの内側に０．５ｍＬ、外側に１．５ｍＬ）加えて２時間培養し、その後、チャンバーの内側と外側の試薬を混和し、９６穴プレートに１穴から０．２ｍＬずつの試薬を、３ウエルに移し、４９０ｎｍの吸光度を測定して、ブランク補正した各ウエルの吸光度より、下記の計算式より生存率を求めた。
【００４９】
生存率＝（Ａs490／Ａc490）×１００（％）
上記式において、Ａs490はサンプルの吸光度、Ａc490は溶媒対照の吸光度を指す。
【００５０】
図５は、細胞生存率に与えるＤＮＣＢ濃度の影響について示すグラフであり、縦軸は細胞生存率（％）、横軸はＤＮＣＢ濃度（ｍＭ）である。図５において、ｔｅｔｒａｃｏｌｏｒと注釈されているのが当該実験例１で得られた結果を示している。なお、データは、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎは３または２）であり、＊Ｐ＜０．０５である。
【００５１】
＜実験例２＞
（皮膚感作性試験モデルの作製）
実験例１と同様に作製した２室型のコラーゲンビトリゲル膜チャンバーを用い、第２室が上側となるように６穴プレートのウエル内に載置した。その状態で、コラーゲンビトリゲル膜チャンバーの第２室に、ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含む）に分散した正常ヒト線維芽細胞ＮＨＳＦ４６（独立行政法人理化学研究所細胞バンクより購入）０．２ｍＬを２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ播種した。３時間培養後、１２穴プレートの各ウエルに１ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ：Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２＝１：１）を加えた。
【００５２】
コラーゲンビトリゲル膜チャンバーから第２室を取り外し、反転させて（開口が上側となるように、第１室を備える第１の筒状体を配置して）１２穴プレートのウエル内に載置した。チャンバー内に培地（ＬＧＭ−３（Ｌｏｎｚａ社製）（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含む）ＬＧＭ−３〜５％ヒト血清（ＣＥＬＬｅｃｔ社製））０．５ｍＬに分散させた正常ヒト樹状細胞ＮＨＤＣ（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、Ｌｏｎｚａ社より購入）を播種した。３時間後、培地を１ｍＬのＥｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２（インビトロジェン社製）を加え、Ｅｐｉ−ｌｉｆｅ−ＫＧ２  ０．２ｍＬに分散させた正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫ（Ｆ）（クラボウ（株）より購入）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ播種し、一晩培養した。翌朝、培地を三次元培養用培地（ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２、ＬＧＭ５％  ヒト血清を等量混合させ、最終濃度１．８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｃａ２＋（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．２６４ｍｇ／ｍＬ）と０．０５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含有させて調製したもの）を１ｍＬに交換し、チャンバー内の培地を取り除いて正常ヒト表皮角化細胞の層（表皮角化細胞層）の表面を空気に曝し、１日おきに培地を交換しながら１３日間培養した。
【００５３】
このようにして、コラーゲンビトリゲル膜の第１室側に、コラーゲンビトリゲル膜側から樹状細胞層、表皮角化細胞層をこの順で備え、コラーゲンビトリゲル膜の第２室側に、線維芽細胞層を備える皮膚感作性試験モデルを作製した。
【００５４】
（皮膚感作性試験モデルを用いた細胞毒性試験）
ブランク用の上述のように作製したコラーゲンビトリゲル膜チャンバーを１２穴プレートに移した後、上述のように構築した皮膚感作性試験モデルを新しい１２穴プレートに移し、１ｍＬの三次元培養用培地を加えた後、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭまたは０．５ｍＭのＤＮＣＢ（ＤＭＳＯに溶解した０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍまたは０．５Ｍの溶液を三次元培養用培地で１０００倍希釈する）、溶媒対照（０．１％  ＤＭＳＯ）を３穴ずつ、ブランク（細胞を播種しないもの）を１穴曝露させ、１時間培養した。
【００５５】
皮膚感作性試験モデルを一旦別のプレートに移し、三次元培養用培地０．５ｍＬをモデル表面に添加して３回洗浄後、元のプレートに戻した。被検物質曝露２４時間後に培地を採取した後でＷＳＴ−８アッセイ用培地（ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２、ＬＧＭ−３〜５％  ヒト血清を等量混合させたもの）で１０倍希釈したＷＳＴ−８を２ｍＬ（チャンバーの内側に０．５ｍＬ、外側に１．５ｍＬ）加えて（ＣＯ２インキュベーター内で）２時間培養し、その後、チャンバーの内側と外側の試薬を混和した。９６穴プレートに１穴から０．２ｍＬずつの試薬を、３ウエルに移し、４５０ｎｍの吸光度を測定して、ブランク補正した各ウエルの吸光度より、下記の計算式より生存率を求めた。
【００５６】
生存率＝（Ａs450／Ａc450）×１００（％）
上記式において、Ａs450はサンプルの吸光度、Ａc450は溶媒対照の吸光度を指す。
【００５７】
上述した図５には、この実験例２の結果も、ＷＳＴ−８と注釈されて示されている。
＜実験例３＞
（サイトカイン分泌を利用した皮膚感作性試験）
サイトカインとして、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、Ｇ−ＣＳＦを用い、実験例１と同様に作製した皮膚感作性試験モデルを用いて、特開２００６−３３３７６３号公報に記載された方法に準拠して、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭまたは０．５ｍＭのＤＮＣＢの場合、溶媒対照（０．１％  ＤＭＳＯ）について、皮膚感作性試験を行なった。
【００５８】
サイトカイン分泌量の測定は、バイオ・ラッドラボラトリーズ株式会社の分析装置Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ２００と試薬キットであるＢｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ（商標）ＡｓｓａｙｓのヒトサイトカインＧＩ  １７−Ｐｌｅｘパネルを用いて、試薬キットのプロトコールに従って下記の手順で行った。
【００５９】
まず、サンプルを３次元培養液培地で２倍希釈し、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｂｅａｄｓを添加した９６穴のアッセイプレートに各サンプル５０μＬずつ２穴添加した。プレートにシールをし、アルミホイルで遮光した後に１１００ｒｐｍで３０秒間、続けて３００ｒｐｍで６０分間振盪した。洗浄バッファーを用いて３回洗浄した後、検出用ビオチンラベル抗体を２５μＬ添加し、プレートにシールをし、アルミホイルで遮光した後に１１００ｒｐｍで３０秒間、続けて３００ｒｐｍで３０分間振盪した。次に洗浄バッファーを用いて３回洗浄した後、ストレプトアビジン−フィコエリスリン溶液を５０μＬ添加し、プレートにシールをし、アルミホイルで遮光した後に１１００ｒｐｍで３０秒間、続けて３００ｒｐｍで１０分間振盪した。最後に洗浄バッファーを用いて３回洗浄した後、アッセイバッファーを１２５μＬ添加し、プレートにシールをし、アルミホイルで遮光した後に１１００ｒｐｍで３０秒間振盪し、直ちにアッセイプレートをＢｉｏ−Ｐｌｅｘ２００にセットしサイトカインの定量を行った。
【００６０】
図６はＩＬ−４、図７はＴＮＦ−α、図８はＧ−ＣＳＦについての分泌量とＤＮＣＢの濃度との関係を示すグラフであり、いずれも、縦軸は分泌量（ｐｇ／ｍＬ）、横軸はＤＮＣＢの濃度を示している。
【００６１】
＜実験例４＞
（サイトカイン分泌を利用した皮膚感作性試験）
サイトカインとしてＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮ−ｇおよびＧ−ＣＳＦを用い、０．２ｍＭのＤＮＣＢを用いた場合について、実験例１と同様にして作製した皮膚感作性試験モデル、ならびに、線維芽細胞層を設けなかったこと以外は同様にして作製した皮膚感作性試験モデルをそれぞれ用いて、実験例３と同様の手順によって、皮膚感作性試験を行なった。結果を表１に示す。なお、表１中、サイトカイン放出量の単位はｐｇ／ｍｌである。
【００６２】
【表１】
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【符号の説明】
【００６３】
１  コラーゲンビトリゲル膜チャンバー、２  第１室、３  第２室、４  ビトリゲル膜、５  第１の筒状体、６  第２の筒状体、１１  皮膚感作性試験モデル、１２  線維芽細胞層、１３  樹状細胞層、１４  表皮角化細胞層、２１  ウエル、２２  ウエル。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2013230090.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図３】
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