(57)【要約】【課題】血管内皮細胞の血管内皮型一酸化窒素産生酵素を活性化することで、血管内における一酸化窒素の産生量を亢進させる、長期間摂取しても高い安全性に懸念のない血管内皮機能改善剤を提供すること。【解決手段】サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物からなる血管内皮機能改善剤を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物からなる血管内皮機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管内皮機能改善剤に関し、より詳細には、セイヨウヤナギ抽出物からなる血管内皮機能改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮は、血液成分などの血管透過性、血管の収縮や弛緩反応、凝固線溶系に関与することによる血液凝固性の調節、血小板機能の制御などさまざま重要な機能を有している。これらの機能は、血管内皮細胞がさまざまな生理活性因子を産生、分泌することと深く関係している。特に、生理活性因子の一つである一酸化窒素は、前記の血管の収縮や弛緩反応、凝固線溶系に関与することによる血液凝固性の調節などと極めて深い関係にあり、血管組織の恒常性を維持する重要な因子である。一酸化窒素を血管内皮細胞が産生、分泌する際には、血管内皮型一酸化窒素産生酵素（以下、［ｅ-ＮＯＳ］と略することがある。）が重要な役割を果たしており、この酵素活性が抑制されると高血圧症、脂質異常症、上昇高脂血症、動脈硬化、血栓症、糖尿病、糖尿病合併症などの発生に影響を与えることがわかっている。加えて、ｅ-ＮＯＳの活性は、高血圧症、脂質異常症、上昇高脂血症、動脈硬化、血栓症、糖尿病、糖尿病合併症などによって血管内皮細胞が障害を受けると低下し、更に疾病の進行を促進させることも知られている。これらは慢性的な疾患であり、その予防や治療には長期間を要する必要がある。従って、長期間にわたって安全かつ効果的に、ｅ-ＮＯＳの活性低下を防止し、または活性を向上できる技術の開発が望まれている。
【０００３】
この要望に対して、従来より種々の技術が提案されている。例えば、血管内皮成長因子や同因子のレセプターアゴニストを使用する方法（特許文献１）、ペプチドを使用する方法（特許文献２）、フェネチルニコチンアミド誘導体を使用する方法（特許文献３）、プテリン誘導体を使用する方法（特許文献４）、ポリシロキサン誘導体を使用する方法（特許文献５）、ＨＭＧ-ＣｏＡリダクターゼ阻害剤とγ-オリザノールやグルタチオンを併用する方法（特許文献６，７）などが挙げられる。しかし、これらは何れも合成された化合物を活用する技術であり、それらの技術を実施する場合には医師や薬剤師などの専門家の指示や指導を受ける必要があったり、長期間使用する場合に副作用が発生する恐れがあったり、予防的に長期間使用することが出来なかったりするなどの課題点があり、より安全性が高く、手軽に長期間使用できる効果的な技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００３−５１３１０５号公報
【特許文献２】特表２００８−５４４７４７号公報
【特許文献３】特開２００７−２７７０９６号公報
【特許文献４】特開２００３−２７７２６５号公報
【特許文献５】特開２００８−２８０２６０号公報
【特許文献６】特開２０１０−１５０２８８号公報
【特許文献７】特開２００６−１１７６４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、長期間摂取しても高い安全性に懸念のない、血管内皮細胞由来のｅ-ＮＯＳを活性化することで一酸化窒素の産生量を亢進させる、血管内皮機能改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、驚くべき事に、特定のセイヨウヤナギの抽出物に優れたｅ-ＮＯＳ活性化効果が存在することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は例えば以下の項１に係る血管内皮機能改善剤を包含する。
項１．サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物からなる血管内皮機能改善剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の血管内皮機能改善剤は、古くから欧州で食経験があるセイヨウヤナギから構成されることから、長期に渡って摂取しても副作用を生じるなどの安全性上の懸念が全くない。この血管内皮機能改善剤を継続して摂取することにより、高血圧症、脂質異常症、上昇高脂血症、動脈硬化症、血栓症、糖尿病、糖尿病合併症などの発症予防やこれらの症状を緩和させる効果を期待することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞にセイヨウヤナギ熱水エキスを作用させたときの細胞中における総ｅ-ＮＯＳあたりのリン酸化ｅ-ＮＯＳ（以下、ｐ-ｅ-ＮＯＳと略することがある。）測定結果を示す。
【図２】図２は、マウスにセイヨウヤナギ熱水エキスを経口摂取させたときの骨格筋中におけるＧＡＰＤＨあたりのリン酸化ｅ-ＮＯＳ測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
【００１１】
本発明の血管内皮機能改善剤は、サリックス・ダフノイデス、サリックス・プルプレア、サリックス・フラギリス、サリックス・アルバから選ばれる一種以上からなるセイヨウヤナギの抽出物を特徴とするものである。以下に詳しく説明する。
【００１２】
本発明のセイヨウヤナギ抽出物の製造に使用するセイヨウヤナギは、サリックス・ダフノイデス（Salix daphnoides、セイヨウエゾヤナギ）、サリックス・プルプレア(Salix
purpurea、セイヨウコリヤナギ)、サリックス・フラギリス（Salix fragilis、ポッキリヤナギ）、サリックス・アルバ（Salix  alba、セイヨウシロヤナギ、White Willow）であり、これらを単独若しくは二種以上を混合して使用できる。本発明のセイヨウヤナギ抽出物は、例えば、欧州薬局方およびドイツ薬局方に規格に適合する「Salicis  cort extract（Frutarom Switzerland Ltd.社製）」を使用できる。具体的には、「Salicis  cort extract（Frutarom Switzerland Ltd.社製）」は、「Salix purpurea、Salix daphnoidesおよびSalix fragilisの樹皮および/または新芽・若枝を、水を用いて抽出して得られた粉末状のエキス」である。  
【００１３】
本発明の血管内皮機能改善剤はそのまま使用でき、必要に応じて、カプセル化、顆粒化することが出来る。また、所期の効果を損なわない限り、通常の経口組成物に配合することで使用することもできる。前記経口組成物としては、医薬品組成物、医薬部外品組成物、口腔用組成物および食品組成物が挙げられる。本発明の血管内皮機能改善剤を配合したこれらの経口組成物は、血管内皮機能を改善することで、高血圧症、脂質異常症、上昇高脂血症、動脈硬化症、血栓症、糖尿病、糖尿病合併症などの発症や症状を緩和させる効果が期待できることから、これらの疾病を発症している人や発症するリスクの高い人（例えば、遺伝的なリスクを有している人、メタボリックシンドロームや肥満に該当する人、それぞれの疾病において「境界域」に該当する「血圧が高めの人」、「血中性脂肪の気になる人」、「コレステロールが高めで気になる人」、「食後の血糖値が気になる人」）用の経口組成物として使用できる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
血管内皮細胞におけるｅ−ＮＯＳの活性化
血管内皮細胞由来のｅ−ＮＯＳは、自身がリン酸化されることで活性化し、一酸化窒素の産生を亢進することが知られていることから、血管内皮細胞を用いたリン酸化ｅ−ＮＯＳ量を測定することで血管内皮機能改善効果を評価した。
具体的には下記の手順に従って、評価した。
評価には  ヒト臍帯静脈内皮細胞（human umbilical vein endothelial cells; HUVECs）を用いた。具体的には、Atherosclerosis, 205, 404-412（2009)に記載の方法に準じて培養を実施した。HUVECsは37℃、5% CO2存在下で、10%FBS、10 mM グルタミン（Gibco社製)、10 nM FGF（科研製薬社製)、100 U/ml ペニシリン、100 g/ml ストレプトマイシン（Gibco社製) を含有するMCDB131培地（Sigma Aldrich社製) にて培養し継代を行った。継代数4のHUVECsをType Ｉ  コラーゲンでコートした6well培養フラスコ（住友ベークライト社製) に8.7 × 104 / wellの濃度で播種した。細胞がコンフルエントになった後、2%のFBSを含有するMCDB131培地（FGF非含有) に交換し一晩培養後、被験物質を2%FBS含有MCDB131培地（FGF非含有) に目的の濃度になるよう溶解することによって投与した。被検物質としては、「Salicis  cort extract（Frutarom Switzerland Ltd.社製）」を用いた。２時間培養した後に、培養した細胞を冷ＰＢＳ（-）で洗浄し、氷上でプロテアーゼ阻害剤（Thermo Scientific社製)およびホスファターゼ阻害剤（Thermo Scientific社製)を添加したM-PER buffer (Thermo Scientific社製) を用いて細胞を回収した。回収した細胞を遠心分離後、ＳＤＳサンプル緩衝液（Thermo  Scientific社製) を添加し、加熱することでタンパク質変性した。その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動を行い、分離したタンパク質をトランスブロットTurboシステムを利用してPVDF膜に転写した。タンパク質を転写したPVDF膜を５％スキムミルクを含む０．０５％ツイーン−２０含有ＰＢＳにてブロッキングし、次いで、定法に従い、1次抗体としてマウス抗リン酸化ｅ-ＮＯＳ抗体（BD Bioscience社製)、ウサギ抗ｅ-ＮＯＳ抗体（Cell Signaling Technology社製)、２次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Invitrogen社製)、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Santa Cruz社製）と反応させた後、基質としてSuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate、もしくは、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Scientific社製）を用いてPVDF膜を化学発光させ、LAS4000mini（GE Healthcare社製）システムによりリン酸化ｅ-ＮＯＳと総ｅ-ＮＯＳの発光強度を数値化し、血管内皮細胞の生理活性機能の指標になりうるリン酸化ｅ−ＮＯＳ/総ｅ−ＮＯＳ値を求めた。
測定結果を、表１および図１に示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
表１に示したとおり、セイヨウヤナギ抽出物は、血管内皮機能改善効果を有することが知られている緑茶エキス（J.Biol.Chem.,28,13736-13745(2007)）に比べて、多くのリン酸化ｅ-ＮＯＳを産生しており、血管内皮機能をより活性化していることがわかった。
【００１７】
マウス筋肉におけるリン酸化ｅ-ＮＯＳ/ＧＡＰＤＨ比の測定  
下記にしたがって、セイヨウヤナギ熱水エキス（粉末）をマウスに経口摂取させた。セイヨウヤナギ熱水エキスは、最終濃度が０．２５％（ｗ/ｗ）となるように添加した高脂肪高ショ糖飼料（Ｆ２ＷＴＤ）および高脂肪高ショ糖飼料（ともにオリエンタル酵母工業（株）社）を作成し、各々ペレット状に成型した。１６匹のＣ５７ＢＬ/６Ｊマウス（５週令：日本チャールス・リバー社）を1週間の予備飼育の後、１群８匹に分けて高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ）およびセイヨウヤナギ熱水エキス配合高脂肪高ショ糖飼料（ＨＦＨＳ+ＷＬ）を１日に約３ｇ与え、５ヶ月間飼育を行った。飼育後１６時間絶食させ、麻酔下で下腿部の骨格筋サンプルを採取し、凍結保存した。 
前記で採取した骨格筋サンプルを凍結粉砕し、その一部をＴ-ＰＥＲ 緩衝液(Thermo Scientific社製)中で超音波処理後、遠心分離により上清を得た。得られた上清のタンパク質定量を行い、各サンプル間の蛋白量を一定にあわせた。
濃度調整した上清タンパクにＳＤＳサンプル緩衝液（Thermo  Scientific社製）を添加し、加熱することでタンパク質変性した。その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動を行い、分離したタンパク質をトランスブロットTurboシステムを利用してPVDF膜に転写した。タンパク質を転写したPVDF膜を５％スキムミルクを含む０．０５％ツイーン−２０含有ＰＢＳにてブロッキングし、次いで、定法に従い、1次抗体としてマウス抗リン酸化ｅ-ＮＯＳ抗体（BD Bioscience社製)、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（Millipore社製)、２次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Invitrogen社製)と反応させた後、基質としてSuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Scientific社製）を用いてPVDF膜を化学発光させ、LAS4000mini（GE Healthcare社製）システムによりリン酸化ｅ−ＮＯＳとＧＡＰＤＨの発光強度を数値化し、血管内皮細胞の生理活性機能の指標になりうるリン酸化ｅ−ＮＯＳ/ＧＡＰＤＨ値を求めた。各群の値ＨＦＨＳ群を1.0として相対的に示した。
測定結果を、表２および図２に示す。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
図２に示したとおり、セイヨウヤナギ熱水抽出エキスは、骨格筋中血管のｅ−ＮＯＳリン酸化を増加させることがわかった。
【図１】
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【図２】
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