(57)【要約】【課題】簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する化学品製造装置および連続発酵法による化学品の製造方法を提供する。【解決手段】本発明の化学品製造装置１００は、発酵原料から化学品を含有する発酵液への変換を行う発酵槽１と、発酵液から濾過液として化学品を回収する分離膜モジュール２と、分離膜モジュール２に発酵液を供給するための発酵液供給ライン３と、分離膜モジュール２から排出される発酵液を発酵槽１に還流するための発酵液還流ライン４と、分離膜モジュール２内に気体を供給し、発酵液供給ラインに接続される気体供給装置５と、分離膜モジュール２から排出される発酵液から気体を分離し、発酵駅還流ラインに接続される気体分離装置６と、を備えることを特徴とする。【選択図】図１
2013212053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の発酵により発酵原料から化学品を含有する発酵液への変換を行う発酵槽と、
発酵液から濾過液として化学品を回収する分離膜モジュールと、
前記発酵槽と前記分離膜モジュールの１次側に連通し、前記分離膜モジュールに発酵液を供給するための発酵液供給ラインと、
前記分離膜モジュールの１次側と前記発酵槽に連通し、前記分離膜モジュールから排出される発酵液を前記発酵槽に還流するための発酵液還流ラインと、
前記発酵液供給ラインに接続され、前記分離膜モジュール内に気体を供給する気体供給装置と、
前記発酵液還流ラインに接続され、前記分離膜モジュールから排出される発酵液から気体を分離する気体分離装置と、
を備えることを特徴とする化学品製造装置。
【請求項２】
発酵槽内の発酵液中で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成する生成工程と、
前記生成工程で生成した化学品を含む発酵液を分離膜モジュールに供給する発酵液供給工程と、
前記発酵液供給工程で供給された発酵液を濾過して、前記化学品を含んだ透過液を分離する濾過工程と、
前記濾過工程で濾過されない非透過液を前記発酵槽内に還流する還流工程と、
前記分離膜モジュールに気体を供給する気体供給工程と、
前記分離膜モジュールから排出される気体を随伴する非透過液から気体を分離する気体分離工程と、
を含むことを特徴とする連続発酵による化学品の製造方法。
【請求項３】
前記気体供給工程において、前記分離膜モジュール内の気体線速度が３００ｃｍ／ｓ以下になるように気体を供給すること
を特徴とする請求項２に記載の連続発酵による化学品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学品製造装置および連続発酵による化学品の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法である発酵法は、大きく（１）回分発酵法（Ｂａｔｃｈ発酵法）および流加発酵法（Ｆｅｄ-Ｂａｔｃｈ  ｏｒ  Ｓｅｍｉ-Ｂａｔｃｈ発酵法）と（２）連続発酵法（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ発酵法）とに分類することができる。上記（１）の回分発酵法および流加発酵法は、設備的には簡素であり、短時間で培養が終了し、また、純菌培養による生産物発酵においては培養菌以外の雑菌による汚染が起きる可能性が低いというメリットがある。しかし、時間の経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、生産物阻害や浸透圧の上昇などの影響により生産性および収率が低下する。このため、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持するのは困難である。
【０００３】
一方、連続発酵法は、発酵槽内における目的物質の蓄積を回避する事により、上述の回分および流加発酵法に比べ長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できる。従来の連続培養は、発酵槽へ新鮮培地を一定速度で供給し、これと同量の培養液を槽外へ排出することによって、発酵槽内の液量を常に一定に保つ培養法である。回分培養では初発基質濃度が消費されると培養が終了するが、連続培養では理論的には無限に培養を持続できる。連続培養に関して、最近では、中空糸膜などの有機高分子分離膜を用いた連続培養装置が提案されている（特許文献１、２参照）。
【０００４】
しかし、このような分離膜は濾過運転を通じて濾過面にＳＳ（Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ  Ｓｏｌｉｄ）や吸着物が付着することで濾過能力が低下し、必要な濾過液量が得られなくなることがある。微生物や培養細胞の目詰まりの抑制方法については、多孔性分離膜の洗浄や濾過条件の設定などに関する技術が、いくつか提案されている。
例えば、分離膜の洗浄方法としては、分離膜を温水で逆洗浄する方法（特許文献３）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０７／０９７２６０号
【特許文献２】特開２００８−２１２１３８号公報
【特許文献３】特開２０００−３１７２７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献３に記載の方法では、逆洗浄は発酵液を希釈するので、連続発酵法による生産性を高く維持することが難しい。
【０００７】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡便な操作方法で、長時間にわたり安定して高生産性を維持する化学品製造装置および連続発酵法による化学品の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った結果、分離膜モジュールの下部、または発酵槽と分離膜モジュールとを連通する配管から、分離膜モジュール内に気体を供給するとともに、分離膜モジュールから発酵槽に還流する配管の途中に気体分離装置を設け、これによって気体を随伴する発酵液から気体を分離することで、膜の閉塞を低減して長期間安定した膜運転を行いながら、過剰な気体が発酵槽に還流することに起因する連続発酵の不安定化を抑制し、長期的な連続発酵、即ち、安定的に化学品が生産できることを見出した。
【０００９】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の化学品製造装置は、微生物の発酵により発酵原料から化学品を含有する発酵液への変換を行う発酵槽と、発酵液から濾過液として化学品を回収する分離膜モジュールと、前記発酵槽と前記分離膜モジュールの１次側に連通し、前記分離膜モジュールに発酵液を供給するための発酵液供給ラインと、前記分離膜モジュールの１次側と前記発酵槽に連通し、前記分離膜モジュールから排出される発酵液を前記発酵槽に還流するための発酵液還流ラインと、前記発酵液供給ラインに接続され、前記分離膜モジュール内に気体を供給する発酵液供給ラインに接続される気体供給装置と、前記発酵液還流ラインに接続され、前記分離膜モジュールから排出される発酵液から気体を分離する気体分離装置と、を備えることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、発酵槽内の発酵液中で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成する生成工程と、前記生成工程で生成した化学品を含む発酵液を分離膜モジュールに供給する発酵液供給工程と、前記発酵液供給工程で供給された発酵液を濾過して、前記化学品を含んだ透過液を分離する濾過工程と、前記濾過工程で濾過されない非透過液を前記発酵槽内に還流する還流工程と、前記分離膜モジュールから排出される気体を随伴する非透過液から気体を分離する気体分離工程と、を含むことを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の連続発酵による化学品の製造方法は、前記気体供給工程において、前記分離膜モジュール内の気体線速度が３００ｃｍ／ｓ以下になるように気体を供給することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の実施の形態にかかる化学品製造装置の構成を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態にかかる化学品製造装置で用いられる気体分離装置の一例を示す概略断面図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態の変形例にかかる化学品製造装置の構成を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための最良の形態（以後、「実施の形態」と称する）を説明する。なお、以下の説明で参照する図面は模式的なものであって、同じ物体を異なる図面で示す場合には、寸法や縮尺等が異なる場合もある。
【００１４】
１．化学品製造装置
本発明の実施の形態にかかる化学品製造装置の一例について、図１を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態にかかる化学品製造装置の概略図である。図１に示すように、化学品製造装置１００は、原料を発酵させて化学品を生成する発酵槽１と、発酵液を濾過して化学品を含んだ透過液を分離する分離膜モジュール２と、を備える。発酵槽１と分離膜モジュール２とは、発酵液供給ライン３および発酵液還流ライン４によって接続され、循環系を形成している。また、化学品製造装置１００は分離膜モジュール２に気体を供給する気体供給装置５と、分離膜モジュール２から排出される気体を随伴する非透過液から気体を分離する気体分離装置６とを有している。気体供給装置５は発酵液供給ライン３に接続されており、気体分離装置６は発酵液還流ライン４上に設けられている。発酵液還流ライン４は、分離膜モジュール２と気体分離装置６とを接続する配管４ａと、気体分離装置６と発酵槽１とを接続する配管４ｂとからなる。本発明の実施の形態では、発酵液供給ライン３は分離膜モジュール２の下部に、発酵液還流ライン４は分離膜モジュール２の上部に接続されているので、分離膜モジュール２には下部から発酵液が供給、上部から発酵液が排出される。
【００１５】
気体供給装置５により分離膜モジュール２内に気体を導入することにより、気体が分離膜モジュール２内を通過する際に発生する液体及び気体の揺れによって、分離膜の表面に付着している物質を分離膜の表面からスクラビング洗浄することができる。気体供給装置５を発酵液供給ライン３に接続することにより、気体を随伴した発酵液が分離膜モジュール２の発酵液を供給する１次側に導入される。導入された気体を随伴した発酵液により分離膜モジュール２の分離膜表面が洗浄され、分離膜モジュール２の分離膜面閉塞が抑制される。また、気体を随伴する発酵液は、分離膜モジュール２から発酵液還流ライン４（配管４ａ）へ排出され、気体分離装置６において発酵液と気体に分離される。気体が分離された発酵液は、発酵液還流ライン４（配管４ｂ）を介して発酵槽１へ還流される。気体分離装置６により気体を分離した発酵液を発酵槽１に還流させることが可能となるため、発酵槽１内での発酵が過剰な気体によって阻害され、発酵効率が低下するといったリスクが生じにくくなる。
【００１６】
発酵槽１は、その内部に発酵液が入れられるように構成されている。具体的には、発酵槽１は、耐圧性、耐熱性および耐汚れ性に優れる材質で作られる。発酵槽１には、円筒型、多角筒型、俵型など様々な形状が適用可能である。発酵槽１は、発酵原料、細胞、その他発酵に必要な固体、液体または気体を注入して撹拌することができ、必要に応じて滅菌でき、さらに密閉することが可能な形状を備えればよい。発酵液の撹拌効率の観点からは、発酵槽１は円筒型もしくは俵型であることが好ましい。発酵槽１内は、発酵槽の外部から発酵槽内部に雑菌が入り増殖することを防ぐため、加圧状態に維持されることが好ましい。発酵槽１内の気圧を管理するために、後述の発酵槽圧力計２２等の装置が設けられる。
【００１７】
分離膜モジュール２は、容器内に多数の中空糸膜または平膜等の分離膜を備えるように構成されている。分離膜モジュール２の詳細については、後述する。
【００１８】
発酵槽１と分離膜モジュール２は、発酵液供給ライン３および発酵液還流ライン４によって接続されている。発酵槽１から、発酵液供給ライン３を介して発酵液を分離膜モジュール２に送液するため、発酵液供給ライン３の途中に循環ポンプ７が設けられている。
【００１９】
化学品製造装置１００は、制御装置５０を備える。制御装置５０は、各種の演算を行うことができる。また制御装置５０は、各種センサーの検知結果、使用者の入力、および各種設定に基づいて、化学品製造装置１００内の各部の動作を制御する。
【００２０】
化学品製造装置１００はさらに温度制御装置８、攪拌装置９、ｐHセンサー・制御装置１０、レベルセンサー・制御装置１１、中和剤供給ポンプ１２、培地供給ポンプ１３、発酵槽気体供給装置２０、発酵槽圧力調整バルブ２１、発酵槽圧力計２２を発酵工程に主に関与する装置として備える。
【００２１】
温度制御装置８は、温度センサーおよび温度調整部を備える。温度センサーは発酵槽１内の発酵液の温度を検知する。温度センサーによる検知結果が一定の範囲を示すように、制御装置による制御を受けて、温度調整部が動作する。こうして、発酵槽１内の温度が一定に維持されることで、発酵または細胞の増殖に適した温度環境が維持される。温度調整部は、加熱および冷却の一方又は両方の機能を有することができる。
【００２２】
撹拌装置９は、発酵槽１内の発酵液を撹拌することで、適切な発酵環境を維持する。
【００２３】
ｐＨセンサー・制御装置１０は、発酵槽１内の発酵液のｐＨを検知し、ｐＨが所定の範囲を逸脱した際に、中和剤供給ポンプ１２を動作させて発酵槽内に中和剤を供給し、ｐＨが所定の範囲内になったら、中和剤供給ポンプ１２を停止するように制御する。中和剤供給ポンプ１２は中和剤槽と発酵槽１とを接続する配管上に設置されており、中和剤を発酵槽１内に添加する。なお、中和剤としては酸およびアルカリが用いられる。
【００２４】
レベルセンサー・制御装置１１は、発酵槽１内の発酵液の液面の高さを検知し、液面の高さが所定の範囲の下限値を下回ったときに、培地供給ポンプ１３を動作させて発酵槽１内に培地を供給し、液面の高さが所定の範囲内になったら、培地供給ポンプ１３を停止するように制御する。培地供給ポンプ１３は培地槽と発酵槽１とを接続する配管上に設置されており、培地を発酵槽１内に添加する。
【００２５】
発酵槽気体供給装置２０は、発酵槽１内に気体を供給する。供給された気体は、回収され、再び発酵槽気体供給装置２０により発酵槽１内に供給されてもよい。
【００２６】
発酵槽圧力調整バルブ２１は、制御装置５０の制御に基づいて、発酵槽圧力計２２が検出した発酵槽１内の気圧が上限に達すると発酵槽１内の空気を外部に放出する。こうして、発酵槽１内の圧力が適切に保たれる。なお、雑菌混入を抑制するために、発酵槽１内の圧力は、外気圧よりも高く保たれることが好ましい。
【００２７】
化学品製造装置１００はさらに、差圧センサー１４、濾過ポンプ１５、濾過バルブ１６、逆洗ポンプ１７、逆洗バルブ１８を濾過工程に主に関与する装置として備える。
差圧センサー１４は、分離膜モジュール２の１次側と２次側に接続され、膜間差圧を検知する。分離膜モジュール２において、発酵液が通液されるのが１次側であり、濾過液が通液されるのが２次側である。
【００２８】
分離膜モジュール２の２次側は、濾過液を収容する濾過液タンクと接続されており、分離膜モジュール２と濾過液タンクの間には濾過ポンプ１５が、分離膜モジュール２と濾過ポンプ１５の間には濾過バルブ１６が設けられている。さらに、分離膜モジュール２の２次側には、分離膜モジュール２を洗浄するための洗浄液を収容する洗浄液タンクが接続されており、必要に応じて分離膜モジュール２の２次側から１次側に洗浄液を通液させる、逆圧洗浄（逆洗ともいう）が実施できるようになっている。分離膜モジュール２と洗浄液タンクの間には逆洗ポンプ１７が、分離膜モジュール２と逆洗ポンプ１７の間には逆洗バルブ１８が設けられている。分離膜モジュール２の２次側には、圧力計、流量計、滅菌用装置、滅菌用フィルタなどが設置されていてもよい。
【００２９】
気体供給装置５は、分離膜モジュール２のスクラビングを可能とするために、発酵液供給ライン３上に接続されることが好ましい。発酵液供給ライン３上に循環ポンプ７が設けられている場合、気体供給装置５と発酵液供給ライン３が接続される箇所は、発酵槽１と循環ポンプ７の間、および循環ポンプ７と分離膜モジュール２の間のいずれであってもよい。
【００３０】
気体供給装置５には、気体流量を測定するための流量計（図示なし）が設けられていることが好ましい。流量計の値を元に、後述する気体線速度を算出することも可能である。
【００３１】
気体供給装置５には、気体供給装置バルブ１９が設けられていることが好ましい。気体供給装置バルブ１９は、制御装置５０と連動させて開度を調整できるものであることが好ましい。
【００３２】
気体供給装置５から供給される気体は、その量が多いほどスクラビングの効果が高まるため、洗浄効率の観点では気体供給量が多いことが好ましい。しかし、気体を随伴した発酵液が発酵槽１に循環すると、発酵槽１内における発酵液の酸素移動容量係数（ＫＬａ）が変動し、その結果として発酵液中の微生物、培養細胞の活性が低下してしまう懸念がある。また、発酵槽１内に多量の気泡が生じることにより、発酵槽１内のセンサー類が正しく発酵液の性状を検知できず、連続発酵の制御が正しく行われない懸念もある。したがって、本実施の形態にかかる化学品製造装置１００では、この懸念を解消するために、気体分離装置６を発酵液還流ライン４上に設けている。これにより、分離膜モジュール２から排出された気体随伴発酵液から気体を分離し、気体分離後の発酵液を発酵槽１に還流させる。分離された気体は、系外に排出されてもよく、また、気体分離装置６と気体供給装置５を配管で接続し、気体を再利用してもよい。
【００３３】
気体分離装置６は、気体随伴発酵液から気体を分離できるものであれば、不連続式、連続式のいずれであってもよく、装置の大きさや発酵液性状、発酵液に含まれる気体の量等を勘案して好適なものを選択して用いてよい。
【００３４】
非連続式とは、気体随伴発酵液を一定量溜めてから気体分離処理を行い、気体分離後の発酵液を発酵槽１に還流させるものを示す。不連続式装置の例としては、容器内に気体随伴発酵液を収め、容器内を減圧して脱泡するものや、容器を遠心分離機によって遠心分離するものが例示できる。これらは、脱泡効率に優れる反面、気体随伴発酵液を移液する際にコンタミネーションが生じる懸念がある。
【００３５】
一方、連続式とは、気体随伴発酵液を連続的に供給し、気体分離後の発酵液を連続的に発酵槽１へ還流させるものを示す。連続式装置の例としては、スクリューデカンタ、サイクロンなどの遠心力を用いる装置や、バッファタンクなどの比重差を用いる装置が例示できる。これらは、コンタミネーションのリスクが低い反面、気体分離能力が不連続式のものに劣ったり、装置内が複雑な構成をしているため滅菌処理が困難であるなどの懸念がある。
【００３６】
また、図２のように、非連続式の気体分離装置６を複数組み合わせて、気体分離処理後の発酵液の排出が連続的に行われるようにしてもよい。図２に記載の気体分離装置６は、３つの気体分離装置が、発酵液の貯留、脱泡、排出を時間差で順次行うようにした装置であり、気体分離装置６から排出される発酵液の液量が一定となるように制御可能となる。気体分離装置６の構成の詳細は、その動作と共に後述する。
【００３７】
供給する気体の気泡の大きさについては特に限定されないが、気泡が過剰に微細であると分離膜モジュール２内におけるスクラビングの効果が小さくなり、また、気体分離装置６における気体の分離効率も低下することから、気泡はある程度大きいほうがよい。気泡の大きさの調整は、気体供給装置５の気体供給口の形状を適宜変更することで可能となる。気体供給口は、塩化ビニル製またはステンレス製の配管に、空気吐出孔を設けることで形成されていてもよいし、多孔性のゴム、セラミック、メンブレンを用いた散気管なども使用することができる。気体供給口の大きさは、規定した量の気体が供給可能で、かつ、発酵液による詰まりが発生しない大きさであればよい。発酵系の中に雑菌が入らないように、気体供給口に滅菌用フィルタなどを設置することもできる。
【００３８】
２．分離膜モジュール
分離膜モジュール２は、分離膜と、分離膜を収容するケースとを備える。
分離膜モジュール２に用いられる分離膜は、有機膜、無機膜のいずれであってもよい。分離膜は、発酵液の濾過に使用でき、気体による洗浄に対して耐久性を持つ膜であればよい。例えば、分離膜として、ポリフッ化ビニリデン製、ポリスルホン製、ポリエーテルスルホン製、ポリテトラフルオロエチレン製、ポリエチレン製、ポリプロピレン製、セラミックス製の膜が挙げられる。特に、発酵液による汚れが発生しにくく、かつ洗浄がしやすく、さらに気体による洗浄に対する耐久性に優れているポリフッ化ビニリデン製の分離膜が好ましい。
【００３９】
分離膜は、発酵液の中の細胞を効果的に分離するため、平均細孔径が０．００１μｍ以上１０μｍ未満の細孔を有する多孔性膜であることが好ましい。また、分離膜の形状は、平膜、中空糸膜などいずれの形状のものも採用することができるが、分離膜モジュールの単位体積あたりの膜面積が広い中空糸膜が好ましい。膜の平均孔径は、ＡＳＴＭ：Ｆ３１６−８６記載の方法（別称：ハーフドライ法）にしたがって決定される。なお、このハーフドライ法によって決定されるのは、膜の最小孔径層の平均孔径である。
【００４０】
なお、ハーフドライ法による平均孔径の測定の標準測定条件は、以下のとおりである。
使用液体：エタノール
測定温度：２５℃
昇圧速度：１ｋＰａ／秒
【００４１】
平均孔径［μｍ］は、下記式より求まる。
平均孔径［μｍ］＝（２８６０×表面張力[ｍＮ／ｍ]）／ハーフドライ空気圧力[Ｐａ]
エタノールの２５℃における表面張力は２１．９７ｍＮ／ｍである（日本化学会編、化学便覧基礎編改訂３版、ＩＩ-８２頁、丸善（株）、１９８４年）ので、本発明における標準測定条件の場合は、
平均孔径［μｍ］＝６２８３４．２／（ハーフドライ空気圧力[Ｐａ]）
にて求めることができる。
【００４２】
分離膜が中空糸膜である場合、外圧式、内圧式のいずれの中空糸膜でも好適に用いることができる。外圧式中空糸膜は、膜の外表から中空部に向かって濾過される中空糸膜であり、内圧式中空糸膜は、膜の中空部から外表に向かって濾過される中空糸膜である。外圧式中空糸膜の外径は、０．５ｍｍ以上３．０ｍｍ以下であることが望ましい。外径が０．５ｍｍ以上であることで、中空糸膜中に流れる濾過液の抵抗を比較的小さく抑えられる。また、外径が３ｍｍ以下であることで、発酵液または気体による外圧により中空糸膜がつぶれることを抑制できる。
【００４３】
内圧式中空糸膜の内径は、０．５ｍｍ以上３．０ｍｍ以下が望ましい。内径が０．５ｍｍ以上であることで、中空糸膜中に流れる発酵液の抵抗を比較的小さく抑えることができる。また、内径が３ｍｍ以下であることで、膜表面積を確保することができるので、使用モジュール本数の増大を抑制することができる。
【００４４】
分離膜モジュール２のケースは、耐圧性に優れる材質で作られており、円筒型、多角筒型など、発酵液をモジュールの１次側へ供給することができる形状であれば良い。発酵液の流れやハンドリング性を考慮すると、ケースは円筒型であることが好ましい。
【００４５】
３．化学品の製造方法
本実施形態の製造方法は、連続発酵により化学品を製造する方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｆ）を備える：
（ａ）発酵槽内の発酵液中で細胞を培養することにより、原料を発酵させて化学品を生成する生成工程
（ｂ）前記生成工程で生成した化学品を含む発酵液を分離膜モジュールに供給する発酵液供給工程
（ｃ）前記発酵液供給工程で供給された発酵液を濾過して、前記化学品を含んだ透過液を分離する濾過工程
（ｄ）前記濾過工程で濾過されない非透過液を前記発酵槽内に還流する還流工程
（ｅ）前記分離膜モジュールに気体を供給する気体供給工程
（ｆ）前記分離膜モジュールから排出される気体を随伴する非透過液から気体を分離する気体分離工程
各工程について、以下に説明する。なお、工程（ａ）〜（ｃ）は細胞の連続培養工程または連続発酵工程と言い換えられてもよい。
【００４６】
３−１．化学品の生成工程（ａ）
［細胞］
本書において、「細胞」とは、微生物および培養細胞、ならびに真核細胞および原核細胞を包含する概念である。微生物としては、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母；大腸菌、乳酸菌、コリネ型細菌などの細菌；糸状菌；放線菌等が用いられる。培養細胞は、多細胞生物由来の細胞であり、例えば動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。化学品の製造に用いられる細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
真核細胞は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造を持ち、細胞核（以下、単に「核」と称する）を有さない原核生物とは明確に区別される。化学品の製造には、真核細胞のうちで酵母を好ましく用いることができる。化学品の製造に好適な酵母としては、例えば、サッカロミセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母と、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母が挙げられる。
【００４７】
原核細胞は、細胞内に細胞核（核）と呼ばれる構造をもたず、細胞核（核）を有する真核生物とは明確に区別される。細胞は、目的とする化学品、原料、培養条件等に応じて選択される。
Ｌ−アミノ酸を生産する細胞として、例えば、発酵工業においてよく使用される大腸菌やコリネ型細菌などの細菌が挙げられる。
【００４８】
具体的には、Ｌ−リジン生産菌としては、エシェリシア属、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属する細菌等が挙げられる。この中でも特に好ましい細菌は、エシェリシア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバムおよびブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムである。
【００４９】
Ｌ−アミノ酸の生産能力を持つ微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。一例として、特開平２−２１９５８２号公報に記載されているＬ−スレオニン生産性の向上したプロビデンシア・レトゲリ、および特表平３−５００４８６号公報に記載されているＬ−アラニン生産性の向上したコリネバクテリウム・グルタミカム等が挙げられる。
【００５０】
発酵液中に含まれる化学品の分離および精製は、従来知られている濾過、濃縮、蒸留および晶析などの方法を組み合わせて行うことができる。以下では、発酵により得られる化学品の一例として、乳酸を製造する場合について述べる。
【００５１】
乳酸を製造する場合、真核細胞であれば酵母、原核細胞であれば乳酸菌を用いることが好ましい。このうち酵母は、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を細胞に導入した酵母が好ましい。特に、５０％以上の対糖収率を示す乳酸菌が好ましい。対糖収率とは、消費した全糖量に対する乳酸の生産量の比率である。
【００５２】
乳酸菌としては、例えば、野生型株では、乳酸を合成する能力を有するラクトバチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチラス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バゴコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アトポビウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびスポロラクトバチルス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌が挙げられる。
【００５３】
また、乳酸の対糖収率が高い乳酸菌、または得られる乳酸の光学純度が高い乳酸菌を選択して用いることができる。例えば、Ｄ−乳酸を選択して生産する能力を有する乳酸菌としてはスポロラクトバチルス属に属するＤ−乳酸生産菌が挙げられ、好ましい具体例として、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）またはスポロラクトバチルス・イヌリナス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｕｌｉｎｕｓ）が使用できる。さらに好ましくは、スポロラクトバチルス・ラエボラクティカス  ＡＴＣＣ  ２３４９２、ＡＴＣＣ  ２３４９３、ＡＴＣＣ  ２３４９４、ＡＴＣＣ  ２３４９５、ＡＴＣＣ  ２３４９６、ＡＴＣＣ  ２２３５４９、ＩＡＭ  １２３２６、ＩＡＭ  １２３２７、ＩＡＭ  １２３２８、ＩＡＭ  １２３２９、ＩＡＭ  １２３３０、ＩＡＭ  １２３３１、ＩＡＭ  １２３７９、ＤＳＭ  ２３１５、ＤＳＭ  ６４７７、ＤＳＭ  ６５１０、ＤＳＭ  ６５１１、ＤＳＭ  ６７６３、ＤＳＭ  ６７６４、ＤＳＭ  ６７７１などとスポロラクトバチルス・イヌリナスＪＣＭ  ６０１４などが挙げられる。
【００５４】
また、Ｌ−乳酸の対糖収率が高い乳酸菌としては、例えば、ラクトバシラス・ヤマナシエンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｙａｍａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバシラス・アニマリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ラクトバシラス・アジリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｉｌｉｓ）、ラクトバシラス・アビアリエス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｖｉａｒｉｅｓ）、ラクトバシラス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・デルブレッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ）、ラクトバシラス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、ラクトバシラス・サリバリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバシラス・シャーピイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｈａｒｐｅａｅ）、ラクトバシラス・デクストリニクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）などが挙げられ、これらを選択して、Ｌ−乳酸の生産に用いることが可能である。
【００５５】
また、Ｄ−乳酸を製造する場合、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（以下、Ｄ−ＬＤＨともいうことがある）の酵素活性が増強された野生型株の細胞を用いることも好ましい。酵素活性を増強させる方法としては、従来知られている薬剤変異による方法も用いることができる。また、細胞に、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を組み込むことによりＤ−乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を増強することもできる。つまり、化学品の生成には、組換え細胞も好適に用いられる。
【００５６】
組換え細胞を用いてＤ−乳酸を製造する場合、宿主細胞としては、原核細胞である大腸菌、乳酸菌、および真核細胞である酵母などが好ましく、酵母が特に好ましい。
【００５７】
Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、およびバシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）、カブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）、ミナミカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｇｉｇａｓ）、およびマルオカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）由来の遺伝子が好ましく、バシラス・ラエボラクティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｅｖｏｌａｃｔｉｃｕｓ）、およびアメリカカブトガニ由来の遺伝子がさらに好ましい。
【００５８】
また、Ｌ−乳酸を製造する場合、乳酸生産能力を人為的に付与された、あるいは乳酸生産能力を人為的に増強された細胞を用いることができる。例えば、細胞に、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子（以下、「Ｌ−ＬＤＨ」と称することがある）を導入することで、Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強することができる。Ｌ−乳酸生産能力を付与、あるいは増強する方法としては、従来知られている薬剤変異による方法を用いることができる。細胞にＬ−ＬＤＨを組み込むことによりＬ−乳酸生産能力を増強することもできる。つまり、組換え細胞も好適に用いられる。
【００５９】
組換え細胞を用いてＬ−乳酸を製造する場合、宿主細胞としては、原核細胞である大腸菌および乳酸菌；および真核細胞である酵母などが好ましい。酵母は特に好ましく用いられる。また、酵母のうちサッカロマイセス属（Ｇｅｎｕｓ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がさらに好ましい。
【００６０】
Ｌ−ＬＤＨは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびピルビン酸を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）およびＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしていればよく、特定の配列には限定されない。例えば、Ｌ−ＬＤＨとして、対糖収率の高い乳酸菌由来、ほ乳類由来、またはカエル由来の遺伝子を用いることができる。ほ乳類由来の遺伝子としては、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好適に用いることができる。また、カエル由来の遺伝子としては、特にコモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属するカエル由来のＬ−ＬＤＨを用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−ＬＤＨを好ましく用いることができる。
【００６１】
Ｄ−ＬＤＨ、Ｌ−ＬＤＨには、遺伝的多型性の遺伝子、および変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいう。変異誘発は、例えば、部位特異的変異導入用キット（Ｍｕｔａｎ―Ｋ（タカラバイオ社製））を用いる方法、およびランダム変異導入用キット（ＢＤ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などにより実行される。また、ヒトまたはカエル由来のＬ−ＬＤＨは、ＮＡＤＨとピルビン酸をＮＡＤ＋とＬ−乳酸に変換する活性を持つタンパク質をコードしているならば、塩基配列の一部に欠失または挿入が存在していても構わない。
【００６２】
［培地］
発酵原料（以下、単に「原料」と称する。）とは、発酵によって目的の化学品を生じる物質である。原料は、細胞、培養条件、および目的とする化学品等に応じて、変更可能である。
培養に用いられる培地は、原料を含むと共に、細胞の生育を促し、目的とする発酵生産物である化学品を良好に生産させ得る成分を含む。本書では、特に限定しない限り、「培地」とは液体培地を指す。培地は、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を含有する。
【００６３】
上記の炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類；これら糖類を含有する澱粉、澱粉加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ケーンジュース；甜菜糖蜜またはケーンジュースからの抽出物もしくは濃縮液；甜菜糖蜜またはケーンジュースの濾過液；シラップ（ハイテストモラセス）；甜菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された原料糖；菜糖蜜またはケーンジュースからの精製もしくは結晶化された精製糖；酢酸やフマル酸等の有機酸；エタノールなどのアルコール類；並びにグリセリンなどが使用される。ここで糖類とは、多価アルコールの最初の酸化生成物であり、アルデヒド基またはケトン基をひとつ持ち、アルデヒド基を持つ糖をアルドース、ケトン基を持つ糖をケトースと分類される炭水化物のことを指す。
【００６４】
また、上記の窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源が使用され、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００６５】
また、上記の無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜使用することができる。
【００６６】
［発酵液］
発酵液とは、培地およびその中で培養されている細胞を含み、培養の結果として生成された化学品を含み得る。
分離膜モジュール２により得られる濾液には、実質的に細胞は含まれないが、説明の便宜上、濾液も発酵液と称することがある。
【００６７】
［培養］
化学品製造装置１００では、発酵槽１内へ原料を導入しつつ、発酵槽１内から発酵液を引き抜くことで、連続培養が行われる。
【００６８】
培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って、細胞濃度を高くした後に、連続培養を開始しても良い。この際、必要に応じて、細胞の引き抜きを行うこともできる。化学品の製造では、細胞濃度を高くした後に、高濃度の細胞を接種し、培養開始とともに連続培養を行っても良い。
【００６９】
原料の導入について説明する。図１では、培養実行中に培地供給ポンプ１３が稼働することで、発酵槽１内に培地が導入され、その結果として原料が導入される。
培養実行中、原料の導入は停止されずに常に行われていてもよいし、状況に応じて原料の導入と停止とが切り替えられてもよい。例えば、上述したように、培地の導入の開始および停止が、レベルセンサー制御装置１１の検出結果に基づいて行われてもよいし、図示しないタイマの計測結果に基づいて一定の時間毎に行われてもよい。なお、原料の導入が自動で行われる形態だけでなく、手動で行われる形態も、本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７０】
次に、発酵液の引き抜きについて説明する。発酵液中の細胞の濃度は、発酵液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが、効率よい生産性を得るのに好ましい。
【００７１】
化学品製造装置１００は、循環系によって発酵液を引き抜くことで、化学品の回収を行いつつ、細胞濃度を高く維持しながら、連続培養を行うことができる。循環系を用いた発酵液の引き抜きの詳細については、後述する。
【００７２】
発酵槽１には、発酵液供給ライン３、発酵液還流ライン４の他に、引き抜き用の流路が接続されていてもよく、発酵液の引き抜きが、この引き抜き用の流路を通じて行われてもよい。このとき、発酵液の液体部分だけでなく、細胞も引き抜かれてもよい。
【００７３】
培養中に、発酵槽１に新たな細胞が導入されてもよい。細胞の導入は、手動で行われてもよいし、自動的に行われてもよい。
【００７４】
発酵槽１においては、原料の供給と発酵液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料の供給および発酵液の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。
【００７５】
連続培養操作は、管理上、通常、単一の発酵槽１で行うことが好ましい。しかしながら、細胞を増殖させつつ生産物を生成する連続発酵培養法であれば、発酵槽１の数は問わない。発酵槽１の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽１を用いることもあり得る。その場合、複数の発酵槽１を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても、高い生産性が得られる。
【００７６】
図１の化学品製造装置１００においては、発酵槽１内の発酵液は、撹拌装置９によって撹拌され、さらに、温度制御装置８、ｐＨセンサー制御・装置１０、レベルセンサー・制御装置１１、発酵槽気体供給装置２０等によって、発酵に適した条件が維持される。
【００７７】
細胞の培養は、通常、ｐＨが３以上１０以下で、温度が１５℃以上６５℃以下の範囲で行うことができる。発酵液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた範囲内に調整される。化学品製造装置１００においては、ｐＨセンサー・制御装置１０によってｐＨが自動制御され、温度制御装置８によって温度が自動制御される。
【００７８】
３−２．発酵液の供給（ｂ）および濾過工程（ｃ）
濾過工程により、発酵液から連続的に化学品を回収することができ、かつ培養を継続することができる。具体的には、図１においては、循環ポンプ７によって、発酵液が発酵槽１から引き抜かれ、発酵液供給ライン３を通って分離膜モジュール２に供給される。発酵液は、分離膜モジュール２によって、非透過液と透過液とに分離される。
【００７９】
循環ポンプ７によりクロスフローを発生させ、分離膜モジュール２ではクロスフロー濾過が行われる。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、膜濾過方法として全量濾過が採用されてもよい。ただし、全量濾過を採用すると、分離膜モジュール２内に濁質が堆積しやすくなる。濁質が膜面に堆積すると、濾過工程においてこの濁質から水分が除去され、濁質が乾燥して表面に強固に付着してしまう。乾燥した濁質の洗浄は落ちにくいだけでなく、分離膜の表面も傷つけてしまう懸念がある。よって、分離膜モジュール２内に濁質を堆積させにくい、クロスフロー濾過を行うことが好ましい。分離膜モジュール２内にクロスフローを発生させることで、濁質を分離膜モジュール２外に排出できるだけでなく、発酵液の剪断力により、分離膜表面の濁質を剥がして除去することができるからである。クロスフローにさらにスクラビングを組み合わせることによって、より高い洗浄効率を実現することができる。
【００８０】
濾過の駆動力は、発酵槽１と分離膜モジュール２との液位差（水頭差）を利用するサイホンによって得られてもよいし、循環ポンプ７により発生する膜間差圧によって得られてもよい。また、濾過の駆動力として、分離膜モジュール２の２次側に吸引ポンプが設置されてもよい。図１の形態では、濾過ポンプ１５が吸引ポンプに該当する。
【００８１】
循環ポンプ７を使用する場合には、吸引ポンプ（濾過ポンプ１５）の圧力により膜間差圧を制御することができる。さらに、分離膜モジュール２の１次側に導入する気体または液体の圧力によっても膜間差圧を制御することができる。分離膜モジュール２の１次側の圧力と２次側の圧力との差を膜間差圧として検出し、この膜間差圧に基づいて、循環ポンプ７および濾過ポンプ１５の制御等を行うことができる。
【００８２】
図１の構成では、循環ポンプ７によって、発酵槽１から分離膜モジュール２へ発酵液が供給される。また、差圧センサー１４および制御装置５０によって検知された膜間差圧に応じて、循環ポンプ７および濾過ポンプ１５の動作が制御されることで、分離膜モジュール２に供給される発酵液の量が適切に調整される。
【００８３】
濾過は連続的に行うこともできるし、間欠的に行うこともできる。間欠的に濾過を行う場合、例えば濾過を５〜１２０分間継続して実行する毎に、所定の時間（例えば０．１〜１０分間）濾過を停止することができる。より好ましくは、濾過を５〜１０分間継続するごとに、０．２５〜３分間濾過を停止する。後述するように、スクラビングは、濾過停止中に行っても良いし、濾過中に行っても良い。
【００８４】
３−３．発酵液の還流工程（ｄ）
発酵液中の細胞は分離膜を透過しないので、分離膜モジュール２を通過した非透過液（透過しなかった液体）では、細胞濃度が高められている。非透過液が発酵槽還流ライン４を通って発酵槽１に戻されることで、発酵槽１内に細胞が保持される。分離膜モジュール２の分離膜を透過した濾液は装置外に排出される。
こうして、発酵槽１内の細胞濃度は高く保たれ、かつ化学品が連続的に培養系から分離される。
【００８５】
３−４．第１の気体供給工程（ｅ）
第１の気体供給工程（ｅ）は、図１の構成においてエアスクラビングとして実行される。上述したように、図１に示す構成では、気体供給装置５によって、スクラビング用の気体が供給される。気体の供給によって、分離膜モジュール２内の分離膜から、汚れが除去される。
スクラビング開始時には、気体供給装置バルブ１９が、制御装置５０の制御により、または手動により開かれる。スクラビング停止時には、同様に、制御装置５０の制御または手動により、気体供給装置バルブ１９が閉じられる。
【００８６】
スクラビング時には、同時に分離膜モジュール２への液体の供給も行われる。スクラビングによる洗浄効果と、分離膜モジュール２における液体の流れによる洗浄効果とが合わさることで、高い洗浄効果が得られる。
【００８７】
特に図１の構成では、スクラビング時に、分離膜モジュール２に発酵槽１から発酵液が供給される。具体的には、スクラビング用の気体が供給されているときに、循環ポンプ７が稼働する。このとき、発酵液の濾過が同時に行われていてもよいが、発酵液の濾過を同時に行わないほうが、濁質が膜表面に付着しようとする作用が弱くなり、洗浄効果がより高まる。よって、洗浄効果を高めたいときには濾過を行わないことが好ましい。発酵液を濾過しない場合、濾過バルブ１６は開閉いずれの状態であってもよい。濾過バルブ１６が開のときには、濾過ポンプ１５が停止していればよい。
【００８８】
こうして、発酵液の流れによる剪断力とスクラビングによる洗浄効果とにより、高い洗浄効果が得られる。なお、気体供給時に分離膜モジュール２に供給される液体は、発酵液に限定されるものではない。発酵液以外には、例えば細胞の入っていない培地等、発酵を阻害しないような液体を用いることができる。
【００８９】
気体供給装置５に用いる気体供給源としては、ガスボンベ、ブロアー、コンプレッサー、あるいは配管によって供給される圧縮ガスなどが例示できる。一定の圧力で気体を供給することが可能な装置、または、圧縮された気体を収容しており、一定の圧力で気体を供給することが可能なタンクであれば前述のものには限定されない。
【００９０】
発酵槽１内で好気性発酵が行われる場合は、スクラビングによって供給される気体は、酸素を含有する気体であることが好ましく、純酸素であってもよい。また、酸素の濃度は、発酵に悪影響のない気体、例えば、空気、窒素、二酸化炭素、メタン、または前記気体らの混合気体などを混合することで、調整可能である。酸素の供給速度を上げるときは、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、発酵液を加圧する、撹拌速度を上げる、あるいは通気速度を上げるなどの手段を用いることができる。
【００９１】
一方で、発酵槽１内で嫌気性発酵が行われる場合は、酸素の供給速度を下げる必要があれば、二酸化炭素、窒素、メタンおよびアルゴンなど、酸素を含まないガスを空気に混合して供給することも可能である。
【００９２】
分離膜モジュール２に供給される気体の線速度vは、分離膜の断面積あたりの気体の供給量であり、分離膜モジュール２が外圧式の場合は、下記の式（１）から求められる。
【数１】
2013212053.tif 000003
ここで、Vは単位時間当たりの気体供給量、Sは分離膜モジュール容器の内部断面積、pは分離膜モジュールの充填率(%)である
【００９３】
分離膜モジュール２が内圧式中空糸膜により得られる場合は、気体線速度の式は（２）のようになる。
【数２】
2013212053.tif 000004
ここで、Rは中空糸膜の外径、rは中空糸膜の内径を表している。
【００９４】
なお、充填率pについては、好ましい膜充填率の値は、濾過対象液の性状によって異なるが、一般的には２０％以上であり、５５％以下である。分離膜モジュール２内における膜充填率を下げると、分離膜モジュール２内の１次側において通液抵抗が小さくなるため好ましいが、単位体積あたりの膜面積が小さくなってしまう。膜充填率を上げると、分離膜モジュール２内の単位体積あたりの膜面積を大きくできるが、１次側の通液抵抗が増大してしまう。
【００９５】
図１の構成では、流量計（図示なし）で計測された気体供給量を、上記式（１）に当てはめることで、分離膜モジュール２に供給される気体の線速度を求めることができる。
【００９６】
制御装置５０によって気体線速度の制御を行う場合は、線速度が後述する適正範囲になるように気体供給装置バルブ１９の開閉を調整することができる。また、気体供給装置バルブ１９の開度を手動で調整してもよい。
【００９７】
気体の線速度が高いほど、分離膜モジュール２内におけるスクラビングの効果が高くなるが、気体の線速度を高くしすぎると、分離膜の揺動性が過度に高まり、分離膜表面同士が擦れあい、擦過傷を生じる懸念がある。そのため、気体の線速度の好ましい範囲は３００ｃｍ／ｓ以下であり、より好ましくは２００ｃｍ／ｓ以下、さらに好ましくは１５０ｃｍ／ｓ以下である。
【００９８】
また、気体線速度が低すぎると分離膜の揺動が不十分になるため、スクラビングの効果が十分に得られないことがある。そのため、気体線速度の好ましい範囲は３０ｃｍ／ｓ以上であり、より好ましくは５０ｃｍ／ｓ以上、さらに好ましくは７０ｃｍ／ｓ以上である。
【００９９】
スクラビングの実行条件、すなわちスクラビング実行のタイミング、頻度、１回のスクラビング当たりの時間等は、具体的に限定されるものではない。スクラビングの実行条件は、膜間差圧、膜間差圧の変化、発酵槽内の圧力、供給する気体の種類、培養される細胞の種類、製造される化学品の種類、および原料の種類等の様々な条件に応じて変更可能である。例えば、スクラビングは、連続して行っても良いし、前回のスクラビング終了から所定時間が経過する毎に行われてもよいし、分離膜モジュール２への発酵液の供給量、つまり濾過量または膜間差圧が所定の値に達する毎に行われてもよい。スクラビング開始時および終了時を決定するために、化学品製造装置１００は、図示しないタイマ等の計測器が設けられていてもよい。
【０１００】
例えば、スクラビング洗浄頻度は、０．１回／時間以上３６０回／時間以下が好ましく、より好ましくは１２回／時間以上１２０回／時間以下である。スクラビング洗浄頻度が３６０回／時間以下であることで、発酵液の発泡による不具合、濾過膜への損傷、および運転コストの上昇などの問題が発生しにくい。また、スクラビングの洗浄頻度が０．１回／時間以上であることで、洗浄効果を充分に得ることができ、発酵槽内の圧力を充分に高く維持できるので雑菌混入を抑制することができる。
【０１０１】
１回のスクラビング洗浄時間は、スクラビング洗浄頻度、膜間差圧、膜間差圧の変化、発酵槽内の圧力、化学品の生産速度により決定される。
【０１０２】
スクラビング洗浄を間欠的に行う場合の洗浄時間は、５秒以上１時間以下／回の範囲であり、より好ましくは１０秒以上６００秒以下／回である。スクラビング洗浄時間が１時間以内であることで、濾過膜の損傷および乾燥、並びに運転コストの上昇などの問題の発生が抑制される。また、スクラビング洗浄時間が５秒以上であることで、洗浄効果を充分に得ることができると共に、発酵槽内の圧力低下を抑制することができるので、雑菌の混入を抑制することができる。なお、スクラビング洗浄時間に応じて、気体の線速度を調整することが可能である。
【０１０３】
３−５．気体分離工程（ｆ）
分離膜モジュール２内には、気体供給装置５により、３００ｃｍ／ｓ以下の気体線速度となるように、多量の気体が供給されることで、高いスクラビング効果を得られることは前述の通りである。その一方で、多量の気体を随伴した発酵液は、分離膜モジュール２から排出され、発酵液還流ライン４を経て発酵槽１に還流されるが、発酵槽１内に多量の気体が還流すると、発酵液の発泡量が多くなるので、泡が発酵液を伴って排気口から溢れたり、レベルセンサー制御装置１１の周囲に泡が多量に付着することにより、発酵槽１内の液面の位置が正しく検知されないといった問題が起きる懸念がある。
【０１０４】
化学品製造装置１００は、上述したように、発酵槽１の中から外に空気を逃がすための発酵槽圧力調整バルブ２１および排気口を備えるが、この排気口から装置系外に排出可能な気体の量には限度があるため、気体随伴発酵液から、予め気体の大半を除去しておくことが好ましい。この気体の大半を除去する方法として、発酵液還流ライン４上に設けられた気体分離装置６を用いる。
【０１０５】
以下、図２に例示した気体分離装置６を用いて、気体随伴発酵液から気体を分離する方法について述べる。気体分離装置６は、図２に示すように複数の分離槽を有するものでも、単一の分離槽を有するものであってもよい。気体分離装置６は、図２に示すように、３つの気体分離槽６１、６２、６３を並列に接続したものである。気体分離槽６１、６２、６３には、配管４ａを介し、分離膜モジュール２の１次側から排出された気体随伴発酵液が供給されるとともに、配管４ｂを介し、気体分離槽６１、６２、６３から排出された、気体分離後の発酵液を発酵槽１に還流する。気体分離槽６１、６２、６３と配管４ａとの間には、気体随伴発酵液を供給する分離槽を選択制御するコック６４が配置され、気体分離槽６１、６２、６３と配管４ｂとの間には、気体分離後の発酵液を排出する分離槽を選択制御するコック６５が設置される。コック６４、６５を介して、気体分離槽６１、６２、６３の何れか１つと、発酵槽還流ライン４とが接続されるようになっている。
また、気体分離槽６１、６２、６３には、減圧ポンプ６６が接続されており、気体分離槽６１、６２、６３と減圧ポンプ６６とを接続する配管には、コック６７、６８が設けられている。コック６７、６８はともに、減圧される気体分離槽６１、６２、６３を選択制御するものである。
【０１０６】
ここでは、気体分離槽６１に注目して気体を分離する方法について述べる。まず、気体分離槽６１に気体随伴発酵液が供給され、かつ槽外に気体随伴発酵液が排出されないようにコック６４，６５を操作する。その後、気体随伴発酵液が所定の量だけ貯留されたら、コック６４を操作して、気体随伴発酵液を供給する分離槽を選択制御、例えば、気体分離槽６２に供給し、気体分離槽６１への供給を停止する。その後、コック６７，６８を操作して、減圧ポンプ６６と気体分離槽６１とを接続し、減圧脱泡を行う。減圧脱泡が完了したら、コック６５を操作して、気体分離槽６１から発酵液を排出する。３つの気体分離槽６１、６２、６３について、発酵液の貯留、脱泡、排出が時間差で順次行われるように制御すると、気体を分離した発酵液の排出が連続的に行われるようになり好ましい。
【０１０７】
また、気体分離装置６は、発酵液還流ライン４に直接接続されるほか、図３に示すように、発酵液還流ライン４のバイパス４ｃ上に設けてもよい。気体供給装置５により分離膜モジュール２に間欠的に気体が供給される場合、気体供給装置５による気体供給に同期して、分離膜モジュール２から排出された発酵液を、バイパス４ｃを介して気体分離装置６に供給するように制御すれば、気体随伴発酵液のみを選択的に気体分離装置６で処理できるようになるため、装置の無駄な運転を抑制することが可能となる。
【０１０８】
３−６．第２の気体供給工程
化学品の製造方法は、工程（ｅ）とは別に、発酵槽１に気体を供給する工程をさらに備えてもよい。図１の構成では、発酵槽１へ気体を供給する工程は、発酵槽気体供給装置２０および撹拌装置９によって実行可能である。
【０１０９】
特に、気体供給装置５によるスクラビング洗浄が間欠的に行われる場合、スクラビングのための気体の供給を停止している間に、発酵槽１へ気体を供給することで、微生物の生育に必要な気体の供給量を維持することができる。このとき、気体の供給速度をどの程度大きくするかは、発酵の条件等に応じて適宜決定され、制御装置５０等によって自動または手動で変更可能である。
【０１１０】
３−７．逆洗工程
化学品の製造方法は、分離膜モジュール２の分離膜を逆洗する工程をさらに備えてもよい。図１の構成では、分離膜モジュール２の２次側から、逆洗ポンプ１７を用いて分離膜モジュール２に洗浄液を投入することができる。
【０１１１】
逆洗実行時には、濾液を溜める濾液槽に洗浄液が流入しないように、濾過が停止される。すなわち、濾過バルブ１６が閉じ、かつ濾過ポンプ１５が停止する。この状態で、逆洗バルブ１８が開き、逆洗ポンプ１７が稼働することで、逆洗が行われる。
逆洗を停止するときには、逆洗バルブ１８が閉じ、逆洗ポンプ１７が停止する。この状態で濾過バルブ１６が開き、濾過ポンプ１５が稼働することで、濾過が実行される。
【０１１２】
これらの制御は、制御装置５０により実行可能である。逆洗の開始時および終了時を決定するために、化学品製造装置１００は、図示しないタイマ等の計測器を備えてもよい。
逆洗に使用される洗浄液としては、発酵に悪影響がなく、かつ、分離膜の洗浄ができる液体、例えば、水、濾過液、発酵培地または発酵培地に添加する成分の一部、または、塩酸、硫酸、硝酸、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、次亜塩素酸ナトリウムの水溶液またはそれらの混合液体などが挙げられる。
【０１１３】
４．化学品
本書に述べる製造方法によって得られる化学品は、細胞が発酵液中に生産する物質である。化学品としては、例えば、アルコール、有機酸、ジアミン、アミノ酸および核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。また、上記製造方法は、酵素、抗生物質および組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。
例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−ブタンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロール等が挙げられる。
【０１１４】
また、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸およびクエン酸等を挙げることができる。また、ジアミンとしてはカダベリン、核酸であればイノシン、グアノシンおよびシチジン等を挙げることができる。
【０１１５】
アミノ酸としては、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシン等が挙げられ、特に、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジンおよびＬ−グルタミン酸が好適である。
【実施例】
【０１１６】
以下、実施例を示して本発明についてより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例では、図１に示す化学品製造装置１００または図１の化学品製造装置１００において、気体分離装置６を配置しないものを使用した。
【０１１７】
以下の実施例および比較例では、化学品として、Ｄ−乳酸（実施例１〜７および比較例１〜２）およびＬ−リジン（実施例８〜１４および比較例３〜４）を連続発酵により製造した。
【０１１８】
［Ａ．Ｄ−乳酸濃度の測定方法］
培養液中に含まれるＤ−乳酸濃度の測定は、次の方法で行った。Ｄ−乳酸を含む培養液を１００μＬ取り、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
移動相：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ  ビストリス、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃
検量線は、濃度既知のＤ−乳酸を標品として分析を行い、横軸にＤ−乳酸濃度、縦軸に検出ピーク面積をプロットして作成した。
【０１１９】
［Ｂ．Ｌ−リジン濃度の測定方法］
培養液中に含まれるＬ−リジン濃度の測定は、次の方法で行った。測定するＬ−リジンを含む培養液を２５μＬ取り、そこに４００μＬのＮａＨＣＯ３（７５ｍＭ）および内標として２５μＬの１，４−ブタンジオール（２ｇ／Ｌ）を加えた。上記の溶液に、１５０μｌの０．２Ｍジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）を添加後、３７℃で１時間反応させた。
その溶液５０μｌをアセトニトリル１ｍＬに溶解し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した上清１０μｌを以下の条件でＨＰＬＣにより分析した。
【０１２０】
・カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  Ｃ１８  ＴＹＰＥ  ＳＧ１２０（資生堂）
・移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４５：５５（流速１ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：ＵＶ（３６０ｎｍ）
・温度：２３℃
検量線は、濃度既知のＬ−リジンを標品として分析を行い、横軸にＬ−リジン濃度、縦軸にＬ−リジン面積／１，４−ブタンジオール（内標）面積の面積比をプロットして作成した。
【０１２１】
［Ｃ．グルコースの測定方法］
グルコース濃度の測定には、“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【０１２２】
［Ｄ．膜濾過モジュールの製作］
東レ（株）製加圧式ポリフッ化ビニリデン中空糸膜モジュール“ＨＦＳ１０２０”を解体して、中空糸膜のうち、接着固定されていない部分のみを切り出した。この中空糸膜は外圧式である。こうして切り出されたポリフッ化ビニリデン中空糸膜をケース内に収容し、接着固定することで、分離膜モジュールを作製した。ケースとしては、ポリカーボネート樹脂の成型品を用いた。作製されたた膜濾過モジュールの容量は０．０２Ｌであり、有効濾過面積は２００平方ｃｍであった。
【０１２３】
［Ｅ．連続発酵によるＤ−乳酸の製造に用いられる遺伝子組換え株の作製］
Ｄ−乳酸生産能力をもつ微生物として、ＰＤＣ１遺伝子、ＳＥＤ１遺伝子、およびＴＤＨ３遺伝子座にアメリカカブトガニ由来のｌｄｈ遺伝子が導入された酵母を作製した。具体的には、ＷＯ２０１０／１４０６０２に記載の方法により、遺伝子改変を行った。得られた菌株を、ＳＵ０４２株と称する。ＳＵ０４２株を用いて、後述するようにＤ−乳酸の連続発酵を行った。
【０１２４】
［Ｆ．連続発酵によるＬ−リジンの製造に用いられる遺伝子組換え株の作製］
Ｌ−リジン生産能力をもつ微生物として、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２（以下、ＡＴＣＣ  １３０３２株と略す。）のホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＯＭ）遺伝子破壊株の作製を行った。具体的には、特開２００８−２１２１３８に記載の方法により、遺伝子改変を行った。得られた菌株を、コリネバクテリウム・グルタミカム  ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株（以下、ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株と略す。）と称する。ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を用いて、後述するようにＬ−リジンの連続発酵を行った。
【０１２５】
［Ｇ．連続発酵によるＤ−乳酸の製造］
図１の化学品製造装置１００（気体分離装置６あり、なし）を用いて、Ｄ−乳酸の連続発酵を実施した（実施例１〜７および比較例１〜２）。分離膜には、［Ｄ］で作製した中空糸膜を利用した。Ｄ−乳酸連続発酵における運転条件として共通の条件は下記のとおりである。
【０１２６】
共通条件
・微生物：ＳＵ０４２株
・培地：乳酸発酵培地（表１）
・発酵液容量：３．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０２（Ｌ）
・温度：３２（℃）
・発酵槽撹拌速度：４００（ｒｐｍ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽１、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌した。
・ｐＨ調整：５Ｎ水酸化カルシウム水溶液によりｐＨ４．５に調整
・循環ポンプ流量：３Ｌ／ｍｉｎ
・濾過速度：４００ｍＬ／ｈ（一定）
・発酵槽気体供給装置２０による気体供給量：１２５ｍＬ／ｍｉｎ
【０１２７】
【表１】
2013212053.tif 000005
【０１２８】
［Ｈ．気体分離装置］  気体分離装置６は、図２に記載の気体分離装置６を用いた。気体分離装置６の装置概要は以下の通りである。
気体分離槽６１、６２、６３形状：円筒状
気体分離槽６１、６２、６３容積：１８００ｍＬ（有効容積１５００ｍＬ）
減圧ポンプ６６運転条件：気体分離槽６１、６２、６３の内圧が０．１気圧になるように調整した。
また、コック６４、６５、６７、６８の切り替えは、１つの気体分離槽に有効容積分の発酵液が貯留されるタイミングに合わせて実施した。
【０１２９】
（比較例１）
変更条件
・気体分離装置６なし
・スクラビング気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：０ｃｍ／ｓ
まず、５ｍＬの乳酸発酵培地を投入した試験管に、ＳＵ０４２株を植菌した。これを温度３０℃、で２４時間振とう培養した（前々培養）。培地が入った発酵装置の発酵槽１に、得られた前々培養液を入れて植菌し、発酵槽１を付属の攪拌装置９によって攪拌し、発酵槽１の温度調整、ｐＨ調整を行い、２４時間培養を行った(前培養)。前培養完了後直ちに、前培養時の運転条件に加え、乳酸発酵培地の連続供給を行い、発酵槽１内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、乳酸発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。
適宜、濾過液中の生産されたＤ−乳酸濃度および残存グルコース濃度は［Ａ］および［Ｃ］に示す方法により測定した。
比較例１の発酵成績を、表２に記載する。気体供給装置５による気体供給および気体分離装置６による気体分離を行わない比較例１では４００時間の連続発酵が可能であった。
【０１３０】
（比較例２）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・スクラビング気体供給量：２１００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：７２．９ｃｍ／ｓ
気体分離装置６による気体分離を行わない比較例２では、多量の気体を随伴したまま発酵液が発酵槽１に還流することによって、発酵槽１の中に多量の気泡が発生した。そのため、レベルセンサー制御装置１１が正常に作動せず、培地の供給がとまってしまい、連続発酵が実施できなかった。
【０１３１】
（実施例１）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６としては［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：９５０ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：３３．０ｃｍ／ｓ
実施例１の発酵成績を、表２に記載する。実施例１では４００時間の連続発酵が可能であった。
また、比較例１と比べて、Ｄ−乳酸の生産速度がやや向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例１より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例１では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例２と比べて発酵槽１内の発泡が少なくなり、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１３２】
（実施例２）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６としては［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：１５００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：５２．１ｃｍ／ｓ
実施例２の発酵成績を、表２に記載する。実施例２では４００時間の連続発酵が可能であった。
また、比較例１と比べて、Ｄ−乳酸の生産速度がやや向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例１より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例２では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例２と比べて発酵槽１内の発泡が少なくなり、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１３３】
（実施例３）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６としては［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：２１００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：７２．９ｃｍ／ｓ
実施例３の発酵成績を、表２に記載する。実施例３では４００時間の連続発酵が可能であった。
また、比較例１と比べて、Ｄ−乳酸の生産速度がやや向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例１より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例３では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例２と比べて発酵槽１内の発泡が少なくなり、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１３４】
（実施例４）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６としては［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：４３００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：１４９．３ｃｍ／ｓ
実施例４の発酵成績を、表２に記載する。実施例４では４００時間の連続発酵が可能であった。
また、比較例１と比べて、Ｄ−乳酸の生産速度がやや向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例１より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例４では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例２と比べて発酵槽内の発泡が少なくなり、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１３５】
（実施例５）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６としては［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：５７００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：１９７．９ｃｍ／ｓ
実施例５の発酵成績を、表２に記載する。実施例５では４００時間の連続発酵が可能であった。
また、比較例１と比べて、Ｄ−乳酸の生産速度がやや向上し、膜間差圧の上昇速度も比較例１より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例５では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例２よりも多量の気体を供給しているが、発酵槽内の発泡は比較例２よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１３６】
（実施例６）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６としては［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：８５００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：２９５．１ｃｍ／ｓ
実施例６の発酵成績を、表２に記載する。実施例６では４００時間の連続発酵が可能であった。
また、比較例１と比べて、Ｄ−乳酸の生産速度がやや向上し、膜間差圧の上昇速度は比較例１より非常に緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例６では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例２よりも多量の気体を供給しているが、発酵槽１内の発泡は比較例２よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１３７】
（実施例７）
以下の条件以外は比較例１と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６としては［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：９５００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：３２９．９ｃｍ／ｓ
実施例７の発酵成績を、表２に記載する。実施例７では４００時間の連続発酵が可能であった。
また、比較例１と比べて、Ｄ−乳酸の生産速度がやや向上し、膜間差圧の上昇速度は比較例１より非常に緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例７では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。ただし、実施例６と膜間差圧の上昇速度が同等であることから、スクラビング気体の供給量を増やすことによる膜面洗浄効果の向上は頭打ちになったと考えられる。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例２よりも多量の気体を供給しているが、発酵槽１内の発泡は比較例２よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１３８】
【表２】
2013212053.tif 000006
【０１３９】
［Ｇ．連続発酵によるＬ−リジンの製造］
図１に記載の化学品製造装置１００（気体分離装置６あり、なし）を用いて、Ｌ−リジンの連続発酵を実施した（実施例８〜１４および比較例３〜４）。分離膜モジュール２には、［Ｄ］で作製した中空糸膜モジュールを利用した。Ｌ−リジン連続発酵における運転条件として以下の実施例および比較例に共通の条件は下記のとおりである。
【０１４０】
共通条件
・微生物：コリネバクテリウム・グルタミカム  ｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株
・培地：Ｌ−リジン発酵培地（表２）
・発酵液容量：３．０（Ｌ）
・中空糸膜ＭＤ容量：０．０２（Ｌ）
・温度：３０（℃）
・発酵槽撹拌速度：３５０（ｒｐｍ）
・滅菌：中空糸膜モジュールを含む発酵槽１、および使用培地は総て１２１℃、２０ｍｉｎのオートクレーブにより高圧（２気圧）蒸気滅菌した。
・ｐＨ調整：２８％アンモニア水溶液によりｐＨ７.３に調整
・循環ポンプ流量：３Ｌ／ｍｉｎ
・濾過速度：１７０ｍＬ／ｈ（一定）
・発酵槽気体供給装置２０による気体供給量：７５ｍＬ／ｍｉｎ
【０１４１】
【表３】
2013212053.tif 000007
【０１４２】
（比較例３）
変更条件
・気体分離装置６なし
・スクラビング気体供給量：０ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：０ｃｍ／ｓ
まず、５ｍｌのＢＹ培地（０．５％イーストエキストラクト（yeast  extract）、０．７％ミートエキストラクト（meat  extract）、１％ペプトン、０．３％塩化ナトリウム）を投入した試験管に、寒天培地から掻き取ったｄｅｌｔａ−ＨＯＭ株を植菌した。これを温度３０℃、で２４時間振とう培養した（前々培養）。得られた前々培養液を、表２に示した培地を５０ｍＬ投入した５００ｍＬの三角フラスコに全量植菌し、３０℃で前培養を行った。得られた前培養液を、３ＬのＬ−リジン発酵培地が投入された化学品製造装置１００に植菌し、２４時間培養を行った。その後、発酵槽１内の培養液量が一定となるように供給量を制御しながら、Ｌ−リジン発酵培地を連続供給することで、連続培養を行った。
適宜、濾過液中の生産されたＬ−リジン濃度および残存グルコース濃度は［Ｂ］および［Ｃ］に示す方法により測定した。
比較例３の発酵成績を、表４に記載する。気体供給装置５による気体供給および気体分離装置６による気体分離を行わない比較例３では２００時間の連続発酵が可能であった。
【０１４３】
（比較例４）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。
・スクラビング気体供給量：８５００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：２９５．１ｃｍ／ｓ
気体分離装置６による気体分離を行わない比較例４では、多量の気体を随伴したまま発酵液が発酵槽１に還流することによって、発酵槽１の中に多量の気泡が発生した。そのため、レベルセンサー制御装置１１が正常に作動せず、培地の供給がとまってしまい、連続発酵が実施できなかった。
【０１４４】
（実施例８）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６は［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：９５０ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：３３．０ｃｍ／ｓ
実施例８の発酵成績を、表４に記載する。実施例８では２００時間の連続発酵が可能であった。
比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が高くなり、膜間差圧の上昇速度も比較例３より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例８では、連続発酵による化学品生産効率の向上と、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、発酵槽１内の発泡は比較例４よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１４５】
（実施例９）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６は［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：１５００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：５２．１ｃｍ／ｓ
実施例９の発酵成績を、表４に記載する。実施例９では２００時間の連続発酵が可能であった。
比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が高くなり、膜間差圧の上昇速度も比較例３より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例９では、連続発酵による化学品生産効率の向上と、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、発酵槽１内の発泡は比較例４よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１４６】
（実施例１０）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６は［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：２１００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：７２．９ｃｍ／ｓ
実施例１０の発酵成績を、表４に記載する。実施例１０では２００時間の連続発酵が可能であった。
比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が高くなり、膜間差圧の上昇速度も比較例３より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例１０では、連続発酵による化学品生産効率の向上と、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、発酵槽１内の発泡は比較例４よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１４７】
（実施例１１）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６は［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：４３００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：１４９．３ｃｍ／ｓ
実施例１１の発酵成績を、表４に記載する。実施例１１では２００時間の連続発酵が可能であった。
比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が高くなり、膜間差圧の上昇速度も比較例３より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例１１では、連続発酵による化学品生産効率の向上と、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、発酵槽１内の発泡は比較例４よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１４８】
（実施例１２）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６は［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：５７００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：１９７．９ｃｍ／ｓ
実施例１２の発酵成績を、表４に記載する。実施例１２では２００時間の連続発酵が可能であった。
比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が高くなり、膜間差圧の上昇速度も比較例３より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例１２では、連続発酵による化学品生産効率の向上と、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、発酵槽１内の発泡は比較例４よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１４９】
（実施例１３）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６は［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：８５００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：２９５．１ｃｍ／ｓ
実施例１３の発酵成績を、表４に記載する。実施例１３では２００時間の連続発酵が可能であった。
比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が高くなり、膜間差圧の上昇速度も比較例３より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例１３では、連続発酵による化学品生産効率の向上と、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。なお、気体分離装置６を設けたことにより、発酵槽１内の発泡は比較例４よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１５０】
（実施例１４）
以下の条件以外は比較例３と同様の条件下で、連続発酵を行った。気体分離装置６は［Ｈ］に記載の装置を用いた。
・気体分離装置６有り
・スクラビング気体供給量：１１０００ｍＬ／ｍｉｎ
・気体線速度：３８１．９ｃｍ／ｓ
実施例１４の発酵成績を、表４に記載する。実施例１４では２００時間の連続発酵が可能であった。
比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が高くなり、膜間差圧の上昇速度も比較例３より緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例１３では、連続発酵による化学品生産効率の向上と、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。また、比較例３と比べて、Ｌ−リジンの生産速度が若干低くなったが、膜間差圧の上昇速度は比較例３より非常に緩やかになることがわかった。すなわち、上記条件での気体供給および気体分離を行う実施例１４では、スクラビングによる膜面洗浄効果が現れていることが確認できた。ただし、実施例１３と膜間差圧の上昇速度が同等であることから、スクラビング気体の供給量を増やすことによる膜面洗浄効果の向上は頭打ちになったと考えられる。なお、気体分離装置６を設けたことにより、比較例４よりも多量の気体を供給しているが、発酵槽１内の発泡は比較例２よりも少なくなっており、液面制御が正常に行われ、長期間運転が可能であることが確認できた。
【０１５１】
【表４】
2013212053.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明は、気体を分離膜モジュールに供給して分離膜をスクラビングするとともに、分離膜モジュールから排出された発酵液から気体を分離するという簡便な方法により、培養に必要とした微生物以外の雑菌による汚染が起きる可能性を抑制しつつ、分離膜モジュール運転の長期安定性と発酵成績を向上させることができるため、広く発酵工業において利用され、発酵生産物である化学品を低コストで安定に生産することが可能となる。
【符号の説明】
【０１５３】
１  発酵槽
２  分離膜モジュール
３  発酵液供給ライン
４  発酵液還流ライン
５  気体供給装置
６  気体分離装置
７  循環ポンプ
８  温度制御装置
９  攪拌装置
１０  ｐＨセンサー・制御装置
１１  レベルセンサー・制御装置
１２  中和剤供給ポンプ
１３  培地供給ポンプ
１４  差圧センサー
１５  濾過ポンプ
１６  濾過バルブ
１７  逆洗ポンプ
１８  逆洗バルブ
１９  気体供給装置バルブ
２０  発酵槽気体供給装置
２１  発酵槽圧力調整バルブ
２２  発酵槽圧力計
６１、６２、６３  気体分離槽
６４、６５、６７、６８  コック
６６  減圧ポンプ
１００、１００Ａ  化学品製造装置
【図１】
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【図２】
2013212053.tif 000010
【図３】
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