(57)【要約】【課題】  迅速な分析が可能であるとともに、実際の反応系に適用可能で汎用性の高い、酵素反応の阻害剤活性分析方法、および、分析キットを提供することを目的とする。【解決手段】  キナーゼ反応阻害剤の活性を分析する方法であって、分析対象物質の存在下で、キナーゼ、基質、ＡＴＰ、蛍光色素を封入したリポソーム、カチオン性ポリマーおよび両親媒性アニオンを含む反応液の蛍光発光強度測定を行うことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キナーゼ反応阻害剤の活性を分析する方法であって、
分析対象物質の存在下で、
キナーゼ、基質、ＡＴＰ、蛍光色素を封入したリポソーム、カチオン性ポリマーおよび両親媒性アニオンを含む反応液の
蛍光発光強度測定を行うことを特徴とする酵素反応の阻害剤活性分析方法。
【請求項２】
前記カチオン性ポリマーとしてポリアリルアミンを用い、前記両親媒性アニオンとしてドデシルホスフェイトを用いる、請求項１記載の阻害剤活性分析方法。
【請求項３】
前記キナーゼが、プロテインキナーゼである、請求項１または２記載の阻害剤活性分析方法。
【請求項４】
前記キナーゼ反応阻害剤の添加濃度を変えて、経時的に蛍光発光強度を測定する、請求項１から３のいずれか一項に記載の阻害剤活性分析方法。
【請求項５】
キナーゼ反応阻害剤の活性を分析する分析キットであって、
少なくとも、キナーゼ、基質、ＡＴＰ、蛍光色素を封入したリポソーム、カチオン性ポリマーおよび両親媒性アニオンからなることを特徴とする、酵素反応の阻害剤活性分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素反応の阻害剤活性分析方法、および、分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素反応の阻害剤のスクリーニングは、酵素反応を利用する多くの産業分野や医薬品開発において重要なステップであり、酵素の活性を迅速かつ容易で、しかも、安価に分析できるシステムが求められている。酵素反応の追跡には、液体クロマトグラフィ、放射性同位元素や蛍光色素によるラベリング等の方法が用いられている。しかし、液体クロマトグラフィでは、結果が出るまでに時間がかかり、また、酵素反応における基質に応じて、移動層、固定層、検出方法などを変更しなければならないという欠点がある。また、放射性同位元素や蛍光色素によるラベリングでは、反応溶液中から目的とする基質を単離しなければならず、操作が煩雑になるという問題点があった。そこで、特定の残基を置換した人工ペプチド基質を用いて、リン酸化または脱リン酸化を迅速に検出する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−１０４３５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献１記載の方法では、前記人工ペプチドの合成は容易なものではない。また、基質として特定の残基を置換したものを用いることに起因した、実際の反応系との反応速度の変化等についても検討の必要がある。そこで、本発明は、迅速な分析が可能であるとともに、実際の反応系に適用可能で汎用性の高い、酵素反応の阻害剤活性分析方法、および、分析キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明の酵素反応の阻害剤活性分析方法は、
キナーゼ反応阻害剤の活性を分析する方法であって、分析対象物質の存在下で、キナーゼ、基質、ＡＴＰ、蛍光色素を封入したリポソーム、カチオン性ポリマーおよび両親媒性アニオンを含む反応液の蛍光発光強度測定を行うことを特徴とする。
【０００６】
また、本発明の分析キットは、キナーゼ反応阻害剤の活性を分析する分析キットであって、少なくとも、キナーゼ、基質、ＡＴＰ、蛍光色素を封入したリポソーム、カチオン性ポリマーおよび両親媒性アニオンからなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、迅速な分析が可能であるとともに、実際の反応系に適用可能で汎用性の高い、酵素反応の阻害剤活性分析方法、および、分析キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明におけるメカニズムを説明する図である。
【図２】図２は、本発明における蛍光発光現象のメカニズムを説明する図である。
【図３】図３は、分析結果における蛍光強度の規格化を説明するグラフである。
【図４】図４は、プロテインキナーゼＡの阻害剤であるＨ−８９の添加量を変えて測定を行って得られた酵素の反応曲線である。
【図５】図５は、プロテインキナーゼＡの阻害剤である６−２２ａｍｉｄｅの添加量を変えて測定を行って得られた酵素の反応曲線である。
【図６】図６は、プロテインキナーゼＡの阻害剤であるＤａｐｈｎｅｔｉｎの添加量を変えて測定を行って得られた酵素の反応曲線である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の阻害剤活性分析方法において、前記カチオン性ポリマーとしてポリアリルアミンを用い、前記両親媒性アニオンとしてドデシルホスフェイトを用いることが好ましい。
【００１０】
本発明の阻害剤活性分析方法において、前記キナーゼが、プロテインキナーゼであることが好ましい。
【００１１】
本発明の阻害剤活性分析方法において、前記キナーゼ反応阻害剤の添加濃度を変えて、経時的に蛍光発光強度を測定することが好ましい。
【００１２】
つぎに、本発明について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の記載により制限されない。
【００１３】
本発明は、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）等のカチオン性のポリマーが、ドデシルホスフェイト（ＤＰ）等の両親媒性アニオンと錯形成したときに、蛍光色素を内封したリポソームの脂質二分子膜を透過し、それに伴って蛍光色素がリポソームの外部に放出されたときに観測される蛍光発光現象を応用したものである。なお、蛍光色素を内封したリポソームは、内部の蛍光色素の濃度が高く濃度消光が起こる。そのため、蛍光色素がリポソーム外部へ放出されたときに蛍光発光が観察されることになる。図１に、本発明のメカニズムの説明図を、図２に、前記蛍光発光現象のメカニズムの説明図を示す。プロテインキナーゼの反応で用いられるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）は、ＰＡＡと強く相互作用してＰＡＡとＤＰとの錯形成を抑制するため、蛍光発光が観測されない。プロテインキナーゼ反応によりＡＴＰが消費されアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）が生成すると、ＡＤＰはＡＴＰに比べてＰＡＡとの錯形成能が弱いため、ＰＡＡとＤＰとの錯形成がされて、蛍光発光が回復する。
【００１４】
ところで、酵素反応の阻害剤は、酵素と相互的に作用し酵素の活性を低下させる合成物または天然に存在する化合物である。阻害剤は生体内外において酵素と同じくらい重要であり、その利用法は農薬や除草剤として用いられているだけでなく、生体調節や生体防御などのために働くことが多いため、医薬品としても利用されている。医薬品の半分は酵素反応阻害剤であるとも言われている。したがって、医薬品の開発において酵素の阻害剤の活性分析は、重要な役割を担っている。
【００１５】
前記キナーゼ反応において、キナーゼ反応を阻害する阻害剤が存在する場合には、ＡＴＰが消費されず、ＡＤＰは生成しない。そこで、阻害剤としての活性分析を行いたい物質（分析対象物質）の存在下で、キナーゼ、基質およびＡＴＰを含む酵素反応溶液に、蛍光色素を封入したリポソームと、カチオン性ポリマーと、両親媒性アニオンとを混合した反応液の蛍光発光強度測定を行うと、前記分析対象物質が阻害剤活性を有する場合には、ＡＴＰは消費されず蛍光発光が観測されないこととなる。一方、前記分析対象物質が阻害剤活性を有しない場合には、ＡＴＰは消費され、蛍光発光が観測されることとなる。このように、分析対象物質の存在下で前記反応液の蛍光発光強度を測定するだけで、容易に阻害剤の活性分析を行うことができる。
【００１６】
本発明に用いることのできるキナーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えば、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ、グリセロキナーゼ、酢酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ等があげられる。基質としては、前記キナーゼに応じて異なるが、特に限定されるものではなく、例えば、キナーゼがＰＫＡである場合には、下記化学式（Ｉ）で表わされるｋｅｍｐｔｉｄｅを用いることができ、ヘキソキナーゼである場合には、Ｄ−グルコースを用いることができる。
【化１】
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【００１７】
本発明で用いるカチオン性ポリマーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ポリアリルアミン（ＰＡＡ）、ポリアルギニン、ポリリシン等があげられる。また、両親媒性アニオンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ドデシルホスフェイト（ＤＰ）、ドデシルサルフェート、ラウレート、ピレンアセテート、ピレンブチレート等があげられる。これらの中でも、ＰＡＡとＤＰとの組み合わせで用いることが好ましい。ＰＡＡとＤＰは結合して複合体を形成すると、リポソームの脂質二分子膜に対する高い透過性を有する。そして、ＰＡＡとＤＰとの親和性は、ＰＡＡとＡＴＰとの親和性に比べて低く、ＡＴＰの存在下では、ＰＡＡとＡＴＰとが結合する。ＰＡＡとＡＴＰとが結合した複合体は、リポソームの脂質二分子膜を透過せずブロックされる。そのため、ＰＡＡとＡＴＰとが結合した複合体が形成される場合には、前記膜透過に伴う蛍光色素のリポソーム外部への放出は起こりにくくなり、蛍光発光現象が観察されにくくなる。すなわち、ＡＴＰの存在下では、前記膜透過に伴う蛍光発光の強度が減少する。一方、ＰＡＡとの親和性が比較的低いＡＤＰの存在下では、ＤＰはＰＡＡと結合できるので、前記膜透過に伴う蛍光発光が生じる。
【００１８】
上記においては、ＰＡＡとＤＰとの組み合わせにおけるメカニズムを説明したが、ポリアルギニンとＤＰとの組み合わせ、ポリアルギニンとピレンアセテートとの組み合わせにおいても、良好に阻害剤の活性分析を行うことができる。
【００１９】
本発明の阻害剤活性分析方法では、前記キナーゼ反応阻害剤の添加濃度を変えて、経時的に蛍光発光強度を測定することで、反応阻害活性を定量的に評価することも可能である。
【００２０】
本発明で用いる蛍光色素を封入したリポソーム、カチオン性ポリマー、両親媒性アニオンの各水溶液は、室温で長期間の保存が可能であり、調製済みの各水溶液をキットとして提供することができる。キナーゼ阻害剤の候補となる物質を加えた酵素反応溶液と、キットに付属の各水溶液を混ぜ合わせて蛍光発光を調べることで、プロテインキナーゼ阻害剤としての活性を評価できる。蛍光発光の検出法としては、蛍光分光光度計を用いて蛍光強度を定量的に測定する方法の他、紫外線の照射下で溶液から発せられる蛍光を目視により評価することも可能である。また、マイクロプレートを用いて多くの検体を一度に評価することもでき、多数の阻害剤ライブラリーを対象としたスクリーニングにも応用することができる。上記のとおり、本発明の阻害剤活性分析方法では、定量的な分析も可能であるが、定性的に阻害剤候補のスクリーニングをする段階で、特に有効に使用することができる。
【実施例】
【００２１】
つぎに、以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。なお、本発明は、下記の実施例によってなんら限定ないし制限されない。また、各実施例における各種特性および物性の測定および評価は、下記の方法により実施した。
【００２２】
［蛍光色素封入リポソームの調製］
蛍光色素封入リポソームを調製するにあたって、Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ、下記化学式（ＩＩ）、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社）をリン脂質として選択した。ＤＰＰＣを用いたリポソームは、その脂質膜の相転移温度が高く（Ｔｃ＝４１℃）、ＤＰＰＣリポソームは室温で長期間安定にその形状を保つことができる。そこで、これを用いて、蛍光物質（蛍光色素）としてＣａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＣＦ、ＳＩＧＭＡ（−Ａｌｄｒｉｃｈ）社）を封入した粒径１００ｎｍのＤＰＰＣの一枚膜リポソーム（ＤＰＰＣ−ＬＵＶ⊃ＣＦ；ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｌｏａｄｅｄ  ＣＦ）を、エクストルージョン法によって調製した。
【化２】
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【００２３】
まず１０ｍＬナス型フラスコにＤＰＰＣを２５．０ｍｇ量りとり、メタノール／クロロホルム＝１／１混合溶媒１．０ｍＬに溶解させた。ロータリーエバポレーターによって溶媒を留去した後、真空ポンプによって減圧下で２時間かけて溶媒を十分に除去し、フラスコの壁面に脂質のフィルムを形成させた。ここにカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）を含む緩衝液（ＢｕｆｆｅｒＡ）１ｍＬを加えてフィルムを溶解させ、６０℃の水浴上で３０ｍｉｎ．加熱することでリポソームを生成させた。懸濁液を凍結解凍（ドライアイス−アセトン：−７８℃；温浴：６０℃、５サイクル）し、リポソーム作製用装置（「Ｍｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ」、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）とポリカーボネートメンブレンフィルター（孔径：１００ｎｍ）とを使用して、エクストルージョンを１５サイクル行い、１００ｎｍのリポソームを調製した。最後に、ゲルろ過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０、移動相：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ；１０７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ＝７．４）によって、封入されなかったＣＦを除去し、目的のリポソームを得た。ここで、ＢｕｆｆｅｒＡは、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＳＩＧＭＡ（−Ａｌｄｒｉｃｈ）社）を３５．７５ｍｇ、ＫＣｌを１１．１８ｍｇ、ＣＦを２８２．２ｍｇ量りとり、蒸留水を少量加え、ここへＣＦが全て溶解するまでＫＯＨを加えた後、蒸留水とＫＯＨを加え全量を１５ｍＬ、ｐＨを７．４に調整した緩衝液である。
【００２４】
［ストック溶液の調製］
蛍光色素を封入したリポソーム（ＬＵＶ⊃ＣＦ）、カチオン性ポリマー（ＰＡＡ）、両親媒性アニオン（ＤＰ）は、それぞれストック溶液を調製して用いた。
ＬＵＶ⊃ＣＦ（ストック溶液：ｃ．ａ．５ｍＭ）
前記にて調製した蛍光色素封入リポソームは、小分けしてストックし、冷暗所で保存した。
【００２５】
ＤＰ（ｍｏｔｈｅｒ  ｓｔｏｃｋ：５０ｍＭ、ストック溶液：０．５ｍＭ）
１３．２ｍｇのＤＰを、ＢｕｆｆｅｒＢに溶解させた。その際、ＤＰの２ｅｑ．のＫＯＨを加えた。なお、溶液中で凝集して活性を失う可能性があるため、ストック溶液は１．５カ月、ｍｏｔｈｅｒ  ｓｔｏｃｋは半年を目安に再調製した。溶液は室温で保管した。ここで、ＢｕｆｆｅｒＢは、ＨＥＰＥＳを２３８３ｍｇ、ＫＣｌを７９７７．９ｍｇ量りとり、蒸留水１Ｌに溶解させ、２ＭのＫＯＨを適量加え、ｐＨを７．４に調整した緩衝液である。
【００２６】
ＰＡＡ（ｍｏｔｈｅｒ  ｓｔｏｃｋ：１．２８ｍＭ、ストック溶液：１２．８μＭ）
所定量のＰＡＡを前記ＢｕｆｆｅｒＢで溶解させた。溶液は室温で保管した。
【００２７】
［プロテインキナーゼＡ反応阻害剤（Ｈ−８９）の活性評価］
基質ペプチドとしてｋｅｍｐｔｉｄｅを用い、活性評価を行った。サンプル管で温めた緩衝溶液に、ｋｅｍｐｔｉｄｅ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ、ＭｇＣｌ２を順に加え、そこにプロテインキナーゼＡの阻害剤であるＨ−８９を加えた。Ｈ−８９は、下記化学式（ＩＩＩ）で表わされる。
【化３】
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【００２８】
前記混合液を３０分間プレインキュベートした後、ＡＴＰを加えて酵素反応を開始した。ＰＫＡ反応の条件は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍＬ  ＰＫＡ、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ｃＡＭＰ、１．５ｍＭ  ｋｅｍｐｔｉｄｅ、１．０ｍＭ  ＡＴＰ、ｐＨ＝７．０、３０℃、１０００μＬ、サンプリング量：３０μＬで行った。反応液を、反応開始から逐次サンプリングして、緩衝液が入ったキュベット（ＢｕｆｆｅｒＢ、６０℃、１８９０μＬ）に加えた。この操作により、サンプリングした反応液の酵素反応は停止する。ここに、ＬＵＶ⊃ＣＦ（ストック溶液２０μＬ）を静かに加えて、攪拌しながら温度を一定のまま蛍光強度の時間変化をプロットした。続いて、測定開始から６０秒後に、ＰＡＡ（ストック溶液２０μＬ）、１２０秒後にＤＰ（ストック溶液４０μＬ）を加えた。さらに、３００秒後に界面活性剤（「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」（ナカライテスク））、ストック溶液（蒸留水）：１．２％（ｗ／ｖ）、４０μＬ）を加え、リポソームを破壊し、蛍光色素をすべて放出させた。その間の蛍光強度の時間変化を追跡した（励起波長λｅｘ＝４９２ｎｍ、検出波長λｅｍ＝５１７ｎｍ）。測定は、分光蛍光光度計（ＪＡＳＣＯ製「ＦＰ−６２００」）を用いて行った。得られる結果の一例を図３に示す。得られた結果から、両親媒性アニオン（ＤＰ）を加える直前の蛍光強度を０にするために、下記式１によって蛍光強度を相対蛍光強度Ｉに規格化した。そして、反応開始から逐次サンプリングして測定したデータにつき、酵素の反応時間を横軸に、相対蛍光強度を縦軸にプロットしたものを下記式２によって回帰曲線を求め、酵素の反応曲線を得た。そして、得られた酵素の反応曲線から阻害剤の活性評価を行った。
【００２９】
【数１】
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ここで、Ｉｍｉｎは両親媒性アニオンを加える直前の蛍光強度、ＩｍａｘはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加してＣＦをすべて放出させたあとの蛍光強度、ＩｔはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加える直前の蛍光強度をそれぞれ示す。Ｉｔを規格化したものが相対蛍光強度Ｉであり、Ｉを膜透過の活性として評価した。
【００３０】
【数２】
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式２において、ｔ１／２は、次の蛍光強度を示す酵素反応時間である。
［（相対蛍光強度が一定となった時の蛍光強度）＋（酵素反応時間ｔ＝０での相対蛍光強度）］×１／２
【００３１】
図４に、Ｈ−８９の添加量を変えて測定を行って得られた酵素の反応曲線を示す。図４において、酵素反応時間の起算点（ｔ＝０）は、ＡＴＰを加えた時点である。図４は、Ｈ−８９（阻害剤）の濃度が濃くなるに従って酵素の反応速度が低下すること、すなわち、プロテインキナーゼの活性が添加した阻害剤に起因して低下していることを示している。このように、本発明の方法によりＨ−８９がプロテインキナーゼを阻害する様子を検出することができた。
【００３２】
［プロテインキナーゼＡ反応阻害剤（６−２２ａｍｉｄｅ）の活性評価］
基質ペプチドとしてｋｅｍｐｔｉｄｅを用い、活性評価を行った。サンプル管で温めた緩衝溶液に、ｋｅｍｐｔｉｄｅ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ、ＭｇＣｌ２を順に加え、そこにプロテインキナーゼＡの阻害剤である６−２２ａｍｉｄｅを加えた。６−２２ａｍｉｄｅは、下記化学式（ＩＶ）で表わされる。
【化４】
2013212103.tif 000008
【００３３】
前記と同様に、酵素の反応曲線を得て、得られた酵素の反応曲線から阻害剤の活性評価を行った。図５に、６−２２ａｍｉｄｅの添加量を変えて測定を行って得られた酵素の反応曲線を示す。図５において、酵素反応時間の起算点（ｔ＝０）は、ＡＴＰを加えた時点である。図５は、６−２２ａｍｉｄｅ（阻害剤）の濃度が濃くなるに従って酵素の反応速度が低下すること、すなわち、プロテインキナーゼの活性が添加した阻害剤に起因して低下していることを示している。このように、本発明の方法により６−２２ａｍｉｄｅがプロテインキナーゼを阻害する様子を検出することができた。
【００３４】
［プロテインキナーゼＡ反応阻害剤（Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ）の活性評価］
基質ペプチドとしてｋｅｍｐｔｉｄｅを用い、活性評価を行った。サンプル管で温めた緩衝溶液に、ｋｅｍｐｔｉｄｅ、プロテインキナーゼＡ、ｃＡＭＰ、ＭｇＣｌ２を順に加え、そこにプロテインキナーゼＡの阻害剤であるＤａｐｈｎｅｔｉｎ（７，８−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ）を加えた。Ｄａｐｈｎｅｔｉｎは、下記化学式（Ｖ）で表わされる。
【化５】
2013212103.tif 000009
【００３５】
前記と同様に、酵素の反応曲線を得て、得られた酵素の反応曲線から阻害剤の活性評価を行った。図６に、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎの添加量を変えて測定を行って得られた酵素の反応曲線を示す。図６において、酵素反応時間の起算点（ｔ＝０）は、ＡＴＰを加えた時点である。図６は、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎ（阻害剤）の濃度が濃くなるに従って酵素の反応速度が低下すること、すなわち、プロテインキナーゼの活性が添加した阻害剤に起因して低下していることを示している。このように、本発明の方法によりＤａｐｈｎｅｔｉｎがプロテインキナーゼを阻害する様子を検出することができた。
【００３６】
この方法を用いて、各種の阻害剤候補について、どの阻害剤候補の阻害活性が高いかを、簡単に評価することができる。例えば、図４と図５の酵素の反応曲線を比較すると、Ｈ−８９を用いた場合、添加量が２００μＭで相対蛍光強度が３７％付近まで低下しているが、６−２２ａｍｉｄｅを用いた場合は、添加量が２μＭで相対蛍光強度が３０％付近まで低下する結果となっている。すなわち、この実験系では、６−２２ａｍｉｄｅのほうがＨ−８９よりも、キナーゼ反応阻害剤としての活性が高いことがわかる。また、図４と図６の酵素の反応曲線を比較すると、Ｈ−８９を用いた場合、添加量が２５μＭで相対蛍光強度が５５％付近まで低下しているが、Ｄａｐｈｎｅｔｉｎを用いた場合は、添加量が０．１μＭで相対蛍光強度が５５％付近まで低下している。すなわち、この実験系では、ＤａｐｈｎｅｔｉｎのほうがＨ−８９よりも、キナーゼ反応阻害剤としての活性が高いことがわかる。
【００３７】
また、各種の阻害剤候補について、例えば、同一濃度で添加したときの反応曲線を得ることで、どの阻害剤候補の阻害活性が高いかを、簡単に評価することができる。なお、反応曲線を作成しなくても、例えば、肉眼で観察可能な程度に明らかに蛍光強度が低下するような場合、目視によって阻害活性を判断することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明によると、迅速な分析が可能であるとともに、実際の反応系に適用可能で汎用性の高い、酵素反応の阻害剤活性分析方法、および、分析キットを提供することができる。本発明で提供される酵素反応の阻害剤活性分析方法および分析キットは、多種類の酵素反応に適用が可能である。検出に必要な操作も溶液を混ぜ合わせるだけで、蛍光として視覚的に検出できるため、キット化等により簡便で汎用的な検出装置の提供が可能となる。さらに、リポソームは冷蔵で保存することで長期間、安定に保管でき、かつそのほかの試薬も安価に市販されているため、今後ハイスループット・スクリーニングへの応用ができ、医薬品の開発などに利用が可能である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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