(57)【要約】      （修正有）【課題】ラセミ化を抑制しつつ、迅速かつ高収率でペプチドを製造し得る方法の提供。【解決手段】嵩高いアミノ酸残基を有するペプチドの製造方法であって、アミノ基（−ＮＨ２）を有する化合物（ａ）と、嵩高いアミノ酸残基を有し且つアミノ基が保護されたアミノ酸（ｂ）及び／又はＣ末端に嵩高いアミノ酸残基を有し且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｃ）とを、溶媒中、一般式（１）：2013230988.tif 000008（式中、Ｒ１は同一又は異なって低級アルキル基であり、Ｒ２は低級アルキル基であり、Ｘはハロゲン原子、ＢＦ４−又はＢＦ６−である。）で表される化合物の存在下、マイクロ波を照射して反応させる。【選択図】図１
2013230988.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嵩高いアミノ酸残基を有するペプチドの製造方法であって、アミノ基（−ＮＨ２）を有する化合物（ａ）と、嵩高いアミノ酸残基を有し且つアミノ基が保護されたアミノ酸（ｂ）及び／又はＣ末端に嵩高いアミノ酸残基を有し且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｃ）とを、溶媒中、一般式（１）：
【化１】
2013230988.tif 000007
（式中、Ｒ１は同一又は異なって低級アルキル基であり、Ｒ２は低級アルキル基であり、Ｘはハロゲン原子、ＢＦ４−又はＢＦ６−である。）
で表される化合物の存在下、マイクロ波を照射して反応させることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記アミノ酸（ｂ）及び前記ペプチドフラグメント（ｃ）を構成する嵩高いアミノ酸残基を有するアミノ酸が、それぞれ、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Cys(Trt)、His(Trt)、Cys（Bzl）、Cys(pMeOBzl)、Cys（pMeBzl）、His（Bom）、His（Tos）、His（Z）、Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Tyr(tBu)、Tyr(Bzl)、Tyr(Cl2Bzl)、Arg(Pmc)、Arg(Pbf)又はArg(Mts)である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アミノ基を有する化合物（ａ）が、カルボキシル基が保護されたアミノ酸、Ｎ末端のアミノ基以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント、該アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずにレジンと結合した化合物、該アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずに長鎖脂肪族アンカー又は疎水性タグと結合した化合物である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
溶媒がアミド系溶媒である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
一般式（１）で表される化合物の使用量が、化合物（ａ）に含まれるアミノ基１モルに対し、１〜１０モル量である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
一般式（１）で表される化合物が、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMTMM）である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
さらに保護基を除去することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミ化率の低いマイクロ波を用いたペプチド合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、生理機能や生化学機能において極めて重要な役割を果たす物質である。こられの機能を解明したり、医薬品を探索したりするために、液相及び固相ペプチド合成が広く用いられてきている。
【０００３】
ペプチド合成は、通常、縮合剤の存在下でアミノ酸を縮合反応させる工程を繰り返して実施される。例えば、固相合成の場合、アミノ基を有する樹脂に、保護されたアミノ基を有し遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸を縮合し、次いでアミノ基の保護基を脱保護し遊離のアミノ基とする、この操作を繰り返してペプチド鎖を伸張していく手法が採用される。特に、この固相合成においては、迅速且つ高収率で反応が進行することが求められる。しかし、一般に、嵩高い残基を有するアミノ酸、例えば、フェニルアラニン（Phe）、チロシン（Tyr）、トリプトファン（Trp）、チオールがトリチル基で保護されたシステイン（Cys(Trt)）、イミダゾリル基の窒素がトリチル基で保護されたヒスチジン（His(Trt)）や、当該嵩高い残基を有するアミノ酸を有する保護ペプチドフラグメントの縮合反応では、一般に、反応が遅く収率も低いという問題があった。
【０００４】
この問題を解決するため、近年、マイクロ波を用いたペプチド合成が開発されてきている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜９等）。この方法では、マイクロ波の高エネルギーを利用した反応促進効果、ペプチド鎖凝集抑制効果等により、迅速（短時間）かつ高収率で所望のペプチド結合を形成することができるという特徴を有している。
【０００５】
しかし、このマイクロ波を用いたペプチド合成では、高エネルギーを利用するがゆえ、アミノ酸のラセミ化（又はエピ化）が起きやすいという問題があり、特に、上述した嵩高い基を有するアミノ酸やそれを有する保護ペプチドフラグメントを縮合する場合には、非常に高い確率でラセミ化が起きることが知られている。この方法では、原料アミノ酸の立体を保持した精密なペプチド合成という観点から大いに改善の余地があった。
【０００６】
そのため、嵩高い基を有するアミノ酸の縮合反応において、ラセミ化率が低く、迅速かつ高収率でペプチド結合を形成し得る手法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2005-15483号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kappe CO, Stadler A. Microwaves in Organic and Medicinal Chemistry. Wiley-VCH: Weinheim, Germany. 2005.
【非特許文献２】Kappe CO, Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. 2004; 43, 6250-6284.
【非特許文献３】Lidstrom P, Tierney J, Wathey B, Westman J. Microwave assisted organic synthesis-a review. Tetrahedron 2001; 57, 9225-9283.
【非特許文献４】Olivos HJ, Alluri PG, Reddy MM, Salony D, Kodadek T. Microwave-assisted solid-phase syntheisis of peptides. Org. Lett. 2002; 4: 4057-4059.
【非特許文献５】Erdelyi M, Gogoll A. Rapid microwave-assisted solid-phase peptide synthesis, Synthesis 2002; 11, 1592-1596.
【非特許文献６】Yu HM, Chen ST, Wang KT. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 1992; 57: 4781-4784.
【非特許文献７】Collins JM, Collins MJ. Novel method for enhanced solid-phase peptide synthesis using microwave energy. Biopolyners 2003; 71: 361.
【非特許文献８】Galanis AS, Albericio F, Grotli M. Solid-phase peptide synthesis in water using maicrowave assisted heating. Org. Lett. 2009, 20, 4488-4491. Murray JK, Gellman DH, Application of microwave irradiation to the synthesis of 14-helical β-peptides. Org. Lett. 2005; 7: 1517-1520.
【非特許文献９】Bacsa B, Horvati K, Bosze S, Andreae F, Kappe OC, J. Org. Chem. 2008; 73: 7532-7542.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、嵩高い基を有するアミノ酸又はそれを有する保護ペプチドフラグメントを原料に用いてマイクロ波を照射しペプチドを製造する方法において、ラセミ化を抑制しつつ、迅速かつ高収率でペプチドを製造し得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、驚くべきことに、嵩高い残基を有するアミノ酸又はそれを有する保護ペプチドフラグメントの縮合反応において、縮合剤として、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMTMM）を用いてマイクロ波を照射して縮合反応することにより、反応を促進できかつラセミ化を効果的に抑制できることを見出した。かかる知見に基づきさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下のペプチドの製造方法を提供する。
【００１２】
項１  嵩高いアミノ酸残基を有するペプチドの製造方法であって、アミノ基（−ＮＨ２）を有する化合物（ａ）と、嵩高いアミノ酸残基を有し且つアミノ基が保護されたアミノ酸（ｂ）及び／又はＣ末端に嵩高いアミノ酸残基を有し且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｃ）とを、溶媒中、一般式（１）：
【００１３】
【化１】
2013230988.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ１は同一又は異なって低級アルキル基であり、Ｒ２は低級アルキル基であり、Ｘはハロゲン原子、ＢＦ４−又はＢＦ６−である。）
で表される化合物の存在下、マイクロ波を照射して反応させることを特徴とする製造方法。
【００１５】
項２  前記アミノ酸（ｂ）及び前記ペプチドフラグメント（ｃ）を構成する嵩高いアミノ酸残基を有するアミノ酸が、それぞれ、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Cys(Trt)、His(Trt)、Cys（Bzl）、Cys(pMeOBzl)、Cys（pMeBzl）、His（Bom）、His（Tos）、His（Z）、Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Tyr(tBu)、Tyr(Bzl)、Tyr(Cl2Bzl)、Arg(Pmc)、Arg(Pbf)又はArg(Mts)である項１に記載の製造方法。
【００１６】
項３  前記アミノ基を有する化合物（ａ）が、カルボキシル基が保護されたアミノ酸、Ｎ末端のアミノ基以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント、該アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずにレジンと結合した化合物、該アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずに長鎖脂肪族アンカー又は疎水性タグと結合した化合物である項１又は２に記載の製造方法。
【００１７】
項４  溶媒がアミド系溶媒である項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【００１８】
項５  一般式（１）で表される化合物の使用量が、化合物（ａ）に含まれるアミノ基１モルに対し、１〜１０モル量である項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１９】
項６  一般式（１）で表される化合物が、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMTMM）である項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【００２０】
項７  さらに保護基を除去することを特徴とする項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の嵩高いアミノ酸残基を有するペプチドの製造方法によれば、アミノ基（−ＮＨ２）を有する化合物（ａ）と、嵩高いアミノ酸残基を有し且つアミノ基が保護されたアミノ酸（ｂ）及び／又はＣ末端に嵩高いアミノ酸残基を有し且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｃ）とを、一般式（１）で表される化合物を縮合剤に用いて、マイクロ波を照射して反応させることにより、迅速かつ高収率でペプチドを得ることができ且つラセミ化を効果的に抑制することができる。かかる製造方法を用いることにより、原料のアミノ酸やペプチドの光学純度を保持したペプチドの精密合成が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１のＨＰＬＣ分析結果である。
【図２】比較例２のＨＰＬＣの分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）縮合反応
本発明の嵩高いアミノ酸残基を有するペプチドの製造方法は、アミノ基を有する化合物（ａ）と、嵩高いアミノ酸残基を有し且つアミノ基が保護されたアミノ酸（ｂ）及び／又はＣ末端に嵩高いアミノ酸残基を有し且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｃ）とを、溶媒中、一般式（１）で表される化合物の存在下、マイクロ波を照射して反応させることを特徴とする。
【００２４】
本発明の製造方法により、一般に、反応性の低い嵩高い残基を有するアミノ酸を用いた場合でも、迅速かつ高収率でペプチドを製造することができ、しかもラセミ化を大幅に抑制することができる。
【００２５】
本明細書において、アミノ酸とは広くアミノ基及びカルボキシル基を有する化合物を意味し、例えば、α−、β−、γ−アミノ酸が挙げられ、好ましくはα−アミノ酸である。アミノ酸は、天然型及び非天然型の両方を包含する。
【００２６】
本明細書において、ペプチドフラグメントとは２以上のアミノ酸が縮合した化合物を意味し、例えば、２以上のα−アミノ酸が縮合した化合物が挙げられる。
【００２７】
ここで、「アミノ基（−ＮＨ２）を有する化合物（ａ）」としては、広くアミノ基を有する化合物であれば特に限定はなく、例えば、カルボキシル基が保護されたアミノ酸（必要に応じ、アミノ酸残基に反応性官能基を有する場合、当該基が保護されていてもよい）、Ｎ末端のアミノ基（−ＮＨ２）以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント、該アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずにレジンと結合した化合物、該アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずに長鎖脂肪族アンカー又は疎水性タグと結合した化合物等が挙げられる。
【００２８】
ここで、「カルボキシル基が保護されたアミノ酸」におけるカルボキシル基の保護基としては、例えば、ｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル等が挙げられる。
【００２９】
「カルボキシル基が保護されたアミノ酸」のアミノ酸残基の反応性官能基としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、グアニジノ基、メルカプト基等が挙げられる。
【００３０】
「Ｎ末端のアミノ基以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント」における反応性官能基としては、Ｃ末端のカルボキシル基、及び該ペプチドフラグメントを構成するアミノ酸残基に含まれる反応性官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、グアニジノ基、メルカプト基等）を意味する。これらの反応性官能基は、公知の保護基で保護することができる。
【００３１】
「アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずにレジンと結合した化合物」におけるレジンとしては、ペプチド固相合成に用いられる水不溶性の固相担体として用いられるものであれば特に限定はなく、広く公知のレジンを採用することができる。レジンの例としては、スチレン樹脂、アクリルアミド樹脂、ポリエチレングリコール−アクリルアミド複合樹脂、ポリオキシエチレングラフテッドスチレン樹脂などが挙げられる。これらはジビニルベンゼンで架橋されていてもよい。これらは１種単独又は２種以上組み合わせてもよい。
【００３２】
レジンの中には固相担体と縮合反応の反応点とを連結するリンカーを有しているものもあり、これも使用でき、合成条件に応じて適宜選択できる。リンカーは公知のリンカーを広く使用できる。リンカーの例としては、クロロメチル、ヒドロキシメチル、ベンズヒドリルアミン、アミノメチル、4-ベンジルオキシベンジルアルコール、4-メチルベンズヒドリルアミン、フェニルアセトアミドメチル、4-ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル、4-（2’,4’-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ、2-クロロトリチルクロライド、4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（HMPA）、4-ヒドロキシメチル安息香酸（HMBA）、2,4-ジメトキシ-4-ヒドロキシベンゾフェノンなどが挙げられる。これらは１種単独でも又は２種以上組み合わせてもよい。
【００３３】
「アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずに長鎖脂肪族アンカー又は疎水性タグと結合した化合物」における長鎖脂肪族アンカー、疎水性タグとは、ペプチド液相合成において既知の水不溶性のアンカー、晶析性タグであれば特に限定はなく広く公知のものを使用できる。アンカーとして、例えば、（９−フルオレニルメチルチオ）脂肪酸化合物などが挙げられ、疎水性タグとして、長鎖脂肪鎖を使用するシクロアルカン類などを挙げることができる。長鎖脂肪族アンカー又は疎水性タグの中には、担体と縮合反応の反応点とを連結するリンカーを有しているものもあり、これも使用でき、合成条件に応じて適宜選択できる。上記の鎖脂肪族アンカー又は疎水性タグと結合した化合物は、有機相溶二相系で広く使用することができる。
【００３４】
前記化合物（ａ）としては、固相ペプチド合成に適した、該アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がリンカーを介して又は介さずにレジンと結合した化合物が好適である。
【００３５】
「嵩高いアミノ酸残基を有し且つアミノ基が保護されたアミノ酸（ｂ）」及び「Ｃ末端に嵩高いアミノ酸残基を有し且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｃ）」における「嵩高いアミノ酸残基」とは、例えばα−アミノ酸の場合、式：−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−で示されるアミノ酸残基の基Ｒが嵩高い基であることを意味する。基Ｒはアミノ酸が本来有する残基及び当該残基が保護された基のいずれをも包含する。該「嵩高いアミノ酸残基を有するアミノ酸」としては、例えば、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Cys(Trt)、His(Trt)、Cys（Bzl）、Cys(pMeOBzl)、Cys（pMeBzl）、His（Bom）、His（Tos）、His（Z）、Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Tyr(tBu)、Tyr(Bzl)、Tyr(Cl2Bzl)、Arg(Pmc)、Arg(Pbf)、Arg(Mts)等が挙げられ、特にCys(Trt)、His(Trt)、Val、Pheが挙げられる。
【００３６】
「嵩高いアミノ酸残基を有し且つアミノ基が保護されたアミノ酸（ｂ）」におけるアミノ基の保護基としては特に限定はなく、例えば、９−フルオレニルメトキシカルボキシ基(Fmoc基)、t−ブトキシカルボニル基(Boc基)等が挙げられる。
【００３７】
「Ｃ末端に嵩高いアミノ酸残基を有し且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｃ）」における反応性官能基としては、Ｃ末端のカルボキシル基を除き、該ペプチドフラグメントを構成するアミノ酸残基に含まれる反応性官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、グアニジノ基、メルカプト基等）を意味する。これらの反応性官能基は、公知の保護基で保護することができる。
【００３８】
前記アミノ酸（ｂ）及び／又はペプチドフラグメント（ｃ）の使用量は、通常、前記化合物（ａ）のアミノ基１モルに対し、１〜１０モル量、好ましくは１〜８モル量、より好ましくは１〜５モル量である。なお、化合物（ａ）が、アミノ酸又はペプチドフラグメントのＣ末端がレジンとリンカーを介して又は介さずに結合した化合物の場合には、化合物（ａ）のアミノ基１モルとは当該化合物（ａ）に含まれるアミノ基のモル量に換算した値である。
【００３９】
一般式（１）：
【００４０】
【化２】
2013230988.tif 000004
【００４１】
（式中、Ｒ１は同一又は異なって低級アルキル基であり、Ｒ２は低級アルキル基であり、Ｘはハロゲン原子、ＢＦ４−又はＢＦ６−である。）
で表される化合物は、縮合剤（又はカップリング試薬）として機能する。
【００４２】
Ｒ１で示される低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等のＣ１−６アルキルが挙げられ、好ましくはＣ１−３アルキルであり、より好ましくはメチル又はエチルである。
【００４３】
Ｒ２で示される低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等のＣ１−６アルキルが挙げられ、好ましくはＣ１−３アルキルであり、より好ましくはメチルである。
【００４４】
Ｘで示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００４５】
一般式（１）で表される化合物のうち、好ましくは、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMTMM）、即ち、下記式：
【００４６】
【化３】
2013230988.tif 000005
【００４７】
で示される化合物である。
【００４８】
本発明では、一般式（１）で表される化合物（特にDMTMM）を縮合剤として用いマイクロ波を照射することにより、縮合に関与するアミノ酸（特に、前記アミノ酸（ｂ）及び／又はペプチドフラグメント（ｃ））のラセミ化を抑制しつつ迅速且つ高収率でペプチドを合成することができる。
【００４９】
一般に、ペプチド合成に用いられる縮合剤としては、DPPA等のアジド化合物；DCC、DIC、EDC等のカルボジイミド；CDI等のイミダゾリウム；BOP、PyBOP等のホスホニウム塩；HBTU、TBTU、HATU等のグアニジウム塩等の極めて多数の縮合剤が知られている。しかし、本発明のように、一般式（１）で表される化合物（特にDMTMM）を縮合剤に用いて、嵩高いアミノ酸残基を有するアミノ酸又はペプチドフラグメントを、マイクロ波照射下において反応させることにより、迅速且つ立体を保持してペプチドを合成できるという作用効果は予想外のものである。
【００５０】
一般式（１）で表される化合物（特にDMTMM）の使用量は、通常、前記化合物（ａ）のアミノ基１モルに対し、１〜１０モル量、好ましくは１〜８モル量、より好ましくは１〜５モル量である。
【００５１】
本発明は、通常、溶媒中で実施することができる。用い得る溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒；N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、N,N-ジメチルアセトアミド（DMA）、N-メチルピロリドン（NMP）等のアミド系溶媒：DMSO等のスルホキシド系溶媒；ヘキサン、シクロヘキサン等の飽和炭化水素系溶媒等、又はこれらの混合溶媒等が挙げられる。このうち、マイクロ波のエネルギーを効果的に吸収し反応を促進でき、原料及び生成物の溶解性又は膨潤性が良好である等の観点から、アミド系溶媒又はスルホキシド系溶媒等の非プロトン性極性溶媒が好ましく、さらにDMF、DMA、NMP等アミド系溶媒が好ましく、特にDMF又はNMPが好ましい。なお、DMFとシクロヘキサンの混合溶媒も用いることができる。
【００５２】
マイクロ波を照射する方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、前記化合物（ａ）、前記アミノ酸（ｂ）及び／又はペプチドフラグメント（ｃ）、一般式（１）で表される化合物及び溶媒を含む混合物を、マイクロ波反応装置内でマイクロ波を照射して反応させることができる。使用するマイクロ波の周波数は、通常900〜25000 MHz（好ましくは915 MHz、2450 MHz、5800 MHz、22125 MHz、より好ましくは2450 MHz）であり、出力は、通常1〜1000 W（好ましくは10〜200 W、より好ましくは50〜100 W、特に好ましくは70 W）であり、反応温度は通常40〜100℃（好ましくは50〜95℃）であり、反応時間は通常1〜15分（好ましくは1〜10分）である。
（２）アミノ基の保護基の脱保護反応
本発明は、上記（１）縮合反応で得られた化合物の保護されたアミノ基から、当該アミノ基の保護基を除去する工程も包含する。
【００５３】
保護されたアミノ基から保護基を除去する方法は、ペプチド合成において公知の方法を採用することができる。保護基除去剤としては、使用している保護基、レジン（固相担体）、リンカー等を考慮し、適宜選択すればよい。例えば、Fmocの除去には、ピペリジン、ピペラジン、フッ化テトラブチルアンモニウム等を含有するN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）溶液（好ましくは20％ピペリジンのDMF溶液）を使用することができる。水酸化ナトリウム含有含水エタノール（例；0.1M NaOH含有90％含水エタノール）等を使用することができる。その他の保護基除去剤としては、塩酸、25％臭化水素酢酸溶液、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸（TFA）などが挙げられる。また、縮合反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化、反応条件などもまた公知の基あるいは、公知の手段から適宜選択しうる。
【００５４】
さらに、上記（１）及び（２）の反応を繰り返し、上記（１）で縮合する前記アミノ酸（ｂ）及び／又はペプチドフラグメント（ｃ）の種類を同じに又は異ならせることにより、同種又は異種のアミノ酸を伸張させることができる。この場合、前記アミノ酸（ｂ）に代えて、嵩高いアミノ酸残基を有せずアミノ基が保護されたアミノ酸（ｄ）（例えば、Ｎ保護グリシン、Ｎ保護アラニン等）に任意に置き換えてもよく、また、ペプチドフラグメント（ｃ）に代えて、Ｃ末端に嵩高いアミノ酸残基を有せず且つ当該Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）以外の反応性官能基が保護されたペプチドフラグメント（ｅ）に任意に置き換えてもよい。
【００５５】
前記化合物（ａ）がレジンを含有する場合には固相合成法が適用することができ、最終的に得られた化合物からレジンとペプチドとを切断し、必要に応じアミノ酸残基の保護基を除去して所望のペプチドを得ることができる。ペプチドの単離及び精製工程は公知の方法を採用することができる。
【実施例】
【００５６】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５７】
実施例１（Gly-Cys-Phe-NH2の合成）
Fmoc-Rink amide 樹脂 (155 mg, 0.1 mmol)を、ポリプロピレン(PP)製固相合成用反応容器に入れ、DMFで数回洗浄し膨潤させた。表1に示す合成プロトコルに従って、順次Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OHを縮合させた。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
縮合反応は、Fmoc保護アミノ酸 (0.5 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロライド（DMTMM）（87.5 mg、0.5mmol）、およびN-メチルモルホリン（NMM）(55 μl、0.5 mmol)を溶解したDMF溶液3 mlを樹脂に加え、マイクロ波反応装置（μ-Reactor Ex、周波数2.5 GHz）内で、オープンな条件下、最大出力が70W以下のマイクロ波(MW)を照射し、80℃、5分間撹拌して行った。
【００６０】
Fmoc基の脱保護は、20% ピペリジン-DMF溶液 3 mlを樹脂に加え、オープンな条件下、最大出力が70W以下のMWを照射し、80℃、5分間撹拌して行った。
【００６１】
ペプチド鎖構築の後、樹脂をジクロロメタン（DCM）で2回洗浄した後、減圧下乾燥し、保護ペプチド樹脂を得た。
【００６２】
続いて、樹脂にエタンジチオール-水-トリイソプロピルシラン-TFA（各2%-2%-1%-95%）を3 ml加え、室温下2時間撹拌して、最終脱保護および樹脂からのペプチドの切断を行った。反応後、吸引濾過により樹脂を除き、得られたTFA溶液に冷ジエチルエーテルを加え、沈殿を得た。沈殿を数回冷ジエチルエーテルで洗浄後、減圧乾燥し、白色粉末の粗ペプチドを得た。
【００６３】
得られた粗ペプチドについて、HPLC分析を行い、ラセミ化の検証を行った。さらにHPLCで精製、凍結乾燥して、Gly-Cys-Phe-NH2を白色非晶質物質として得た。
・ラセミ化率：2.2 % (図１を参照)
・収率 38 mg (86%)
【００６４】
実施例２
実施例１において、反応溶媒をDMFから水に代えたこと以外は、同じ条件で反応を行った。
・ラセミ化率：5.2 %
・収率 32 mg (74%)
【００６５】
比較例１
実施例１において、縮合反応においてマイクロ波(MW)を照射しないこと以外は、同じ条件で反応を行った。しかし、嵩高いFmoc-Phe-OH及びFmoc-Cys(Trt)-OHの縮合反応では、それぞれ80℃、5分間では反応は終結せず、反応が終結するまでに3時間を要した。Fmoc-Gly-OHの縮合反応では、80℃、5分間では反応は終結せず、反応が終結するまでに2時間を要した。
【００６６】
比較例２
実施例１において、縮合反応において、縮合剤としてDMTMMに代えて O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）を用い、塩基としてNMMに代えてジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を用いること以外は、同じ条件で反応を行った。
・ラセミ化率：11.3 % (図２を参照)
・収率：31 mg (71 %)
【００６７】
比較例３
実施例１において、縮合反応において、縮合剤としてDMTMMに代えてO-(7-アザベンゾトリアゾール-1-yl)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HATU）を用い、塩基としてNMMに代えてジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を用いること以外は、同じ条件で反応を行った。この場合、ラセミ化率は比較例２とほぼ同様であった。
【００６８】
比較例４
実施例１において、縮合反応において、縮合剤としてDMTMMに代えてHBTUを用い、塩基としてNMMに代えてジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を用い、添加剤としてHOBtを用いること以外は、同じ条件で反応を行った。
・ラセミ化率：18.4 %
・収率：13 mg (28 %)
以上の結果より、実施例１ではマイクロ波を照射して縮合剤としてDMTMMを用いることにより、短時間かつ高収率でラセミ化が殆どないペプチドを製造することができた。実施例１及び２より、アミド系溶媒（DMF）及び水のいずれでもラセミ化を抑えることが確認され、特にアミド系溶媒がその効果が高いことが確認された。比較例２〜４より、DMTMMに代えて汎用されている縮合剤HBTU及びHATUを用いた場合には、ラセミ化が起きやすいことが確認された。
【図１】
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【図２】
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