(57)【要約】【課題】安全で簡便な方法で、発酵阻害物質を除去し、効率良く有機酸を製造する方法を提供することにある。【解決手段】下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む有機酸の製造方法。（ａ）：下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３０％を超えるセルロースを含有するリグノセルロース系バイオマスを粉砕し、当該セルロースＩ型結晶化度を０〜３０％に低減する工程        結晶化度（％）＝〔（Ｉc−Ｉa）／Ｉc〕×１００        （１）〔Ｉcは、Ｘ線回折における格子面（００２）（格子面間隔＝２２．４ｎｍ）の回折強度、及びＩａは、アモルファス部（格子面間隔＝２７．３ｎｍ）の回折強度を示す〕（ｂ）：（ａ）工程で得られる粉砕物を水で洗浄する工程（ｃ）：（ｂ）工程で得られる固形物を、加水分解酵素を用いて糖化物を得る工程（ｄ）：（ｃ）工程で得られる糖化物を糸状菌で発酵させて有機酸を得る工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む有機酸の製造方法。
（ａ）：下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３０％を超えるセルロースを含有するリグノセルロース系バイオマスを粉砕し、当該セルロースＩ型結晶化度を０〜３０％に低減する工程
結晶化度（％）＝〔（Ｉc−Ｉa）／Ｉc〕×１００        （１）
〔Ｉcは、Ｘ線回折における格子面（００２）（格子面間隔＝２２．４ｎｍ）の回折強度、及びＩａは、アモルファス部（格子面間隔＝２７．３ｎｍ）の回折強度を示す〕
（ｂ）：（ａ）工程で得られる粉砕物を水で洗浄する工程
（ｃ）：（ｂ）工程で得られる固形物を加水分解酵素により加水分解して糖化物を得る工程
（ｄ）：（ｃ）工程で得られる糖化物を糸状菌で発酵させて有機酸を得る工程
【請求項２】
（ａ）工程が、竪型ローラーミル、容器駆動媒体ミル、媒体攪拌式ミル及び圧密せん断ミルから選ばれる粉砕機を用いて行なわれる請求項１記載の有機酸の製造方法。
【請求項３】
容器駆動媒体ミルが、ロッド又はボールを充填した振動ミルである請求項２記載の有機酸の製造方法。
【請求項４】
（ａ）工程でアルカリを添加する請求項１〜３の何れか１項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項５】
アルカリの使用量が、リグノセルロース系バイオマス１００質量部に対して１〜５０質量部である請求項４に記載の有機酸の製造方法。
【請求項６】
アルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム又は水酸化カルシウムである請求項４又は５に記載の有機酸の製造方法。
【請求項７】
（ｂ）工程において、粉砕物の水溶性成分残存率が０．５以下になるまで水で洗浄する請求項１〜６のいずれか１項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項８】
水が、さらに水溶性溶媒を含有する、請求項１〜７のいずれかの有機酸の製造方法。
【請求項９】
（ｂ）工程において、（ａ）工程で得られる粉砕物と水からなる分散液の温度が０〜１００℃である請求項１〜８のいずれか１項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１０】
加水分解酵素がセルラーゼである請求項１〜９の何れか１項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１１】
セルラーゼが、トリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼである請求項１０記載の有機酸の製造方法。
【請求項１２】
有機酸が、乳酸又はフマル酸である請求項１〜１１の何れか１項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１３】
糸状菌が、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属する微生物である請求項１〜１２の何れか１項に記載の有機酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスからの有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスから燃料や化学品の原料を生産しようとする、バイオリファイナリーの研究・開発が注目を集めている。しかし、工業化されているバイオリファイナリーでは、主にトウモロコシやサトウキビなどの穀物に含まれるデンプン質または糖質を原料とするため、食糧の供給への影響が懸念されている。そこで、サトウキビバガスやイナワラ等の植物の非可食部に含まれるリグノセルロース系バイオマスが原料として注目され始めている。
【０００３】
リグノセルロース系バイオマスは主に植物の葉や茎に含まれており、セルロースにリグニン及びヘミセルロースが強固に結合する構造を有する。そのため加水分解反応の効率が著しく低く、加水分解は、化学的には強アルカリまたは強酸を用いて行う必要がある。
環境負荷の大きい強酸または強アルカリの使用を回避する方法として、リグノセルロース系バイオマスを粉砕後、加水分解酵素で加水分解する方法が知られている。しかし得られた糖液を原料として、有用物を発酵生産する場合、変換率の低下やラグタイムの発生等の阻害が起きるためその回避策が望まれている。その原因の一つとして、多糖類とエステルを形成している酢酸等の有機酸が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
特許文献１は、バイオマスを、アンモニアを含有する水溶液と接触させて固液分離し、酢酸等の阻害要因を分離し、残存固形物をその後の工程に使用するエタノール等のバイオマス生産物の製造方法を開示している。特許文献２は、バイオマスを糖化した後、膜ろ過により低分子の発酵阻害物質を除去する方法を開示している。また特許文献３は、糸状菌を菌体集合体のペレットとして培養し、乳酸を生産する方法を開示している。この方法では、発酵後、菌体と培地の分離が容易である旨を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１０−５３６３７６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０６７７８５号パンフレット
【特許文献３】特開平６−２５３８７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の方法では、危険なアンモニアを必要とするだけでなく、有機酸を目的とした場合、発酵後の有機酸の収量も十分ではない。特許文献２では、発酵阻害物質の分離に膜ろ過を必要とし、生産性が低い。さらに特許文献３では、発酵阻害物質を除去することについての記載は全くない。
【０００７】
バイオマス生産物として有機酸を工業的に大量生産するためには、安全で、簡便な方法で発酵阻害物質を除去する必要がある。
従って、本発明は、安全で簡便な手段で、発酵阻害物質を除去し、効率良く有機酸を製造する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、セルロース系バイオマスを酵素で加水分解し、次いで発酵を行う選択的な有機酸の製造法について検討してきたところ、セルロース系バイオマスを酵素加水分解に付す前の粉砕工程でセルロース結晶化度を３０％以下に低減するまで強力に粉砕すれば、その後のセルロースの加水分解が効率的に進行することを見出した。ところが、加水分解後の糖化物を発酵して有機酸の生産を行ったところ、有機酸の選択性が低く、多量のアルコールが副生してしまうことが判明した。
そこで発酵工程の有機酸の選択性を向上させるべく種々検討した結果、前記粉砕工程でセルロースの結晶化度を低下させると糖化反応は効率が向上するが、発酵工程の有機酸選択率は、高くなく、この特殊な粉砕工程の後に粉砕物を水で洗浄する工程を加えれば、全く意外にも有機酸の選択性が飛躍的に向上することを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む有機酸の製造方法を提供するものである。
（ａ）：下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３０％を超えるセルロースを含有するリグノセルロース系バイオマスを粉砕し、当該セルロースＩ型結晶化度を０〜３０％に低減する工程
結晶化度（％）＝〔（Ｉc−Ｉa）／Ｉc〕×１００        （１）
〔Ｉcは、Ｘ線回折における格子面（００２）（格子面間隔＝２２．４ｎｍ）の回折強度、及びＩaは、アモルファス部（格子面間隔＝２７．３ｎｍ）の回折強度を示す〕
（ｂ）：（ａ）工程で得られる粉砕物を水で洗浄する工程
（ｃ）：（ｂ）工程で得られる固形物を加水分解酵素により加水分解して糖化物を得る工程
（ｄ）：（ｃ）工程で得られる糖化物を糸状菌で発酵させて有機酸を得る工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、リグノセルロース系バイオマス由来の糖液から糸状菌を用いて、高い変換率、変換速度で安全、かつ簡便に有機酸を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、リグノセルロース系バイオマスを原料として有機酸を製造する方法であり、次の（ａ）工程〜（ｄ）工程を含む。
（ａ）：下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３０％を超えるセルロースを含有するリグノセルロース系バイオマスを粉砕し、当該セルロースＩ型結晶化度を０〜３０％に低減する工程
結晶化度（％）＝〔（Ｉc−Ｉa）／Ｉc〕×１００        （１）
〔Ｉcは、Ｘ線回折における格子面（００２）（格子面間隔＝２２．４ｎｍ）の回折強度、及びＩaは、アモルファス部（格子面間隔＝２７．３ｎｍ）の回折強度を示す〕
（ｂ）：（ａ）工程で得られた粉砕物を水で洗浄する工程
（ｃ）：（ｂ）工程で得られた固形物を加水分解酵素により加水分解して糖化物を得る工程
（ｄ）：（ｃ）工程で得られる糖化物を糸状菌で発酵させて有機酸を得る工程
【００１２】
＜原料のリグノセルロース系バイオマス＞
本発明において、「リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを主成分とするバイオマスを意味する。リグノセルロース系バイオマスとしては、上記成分を主成分として含むバイオマスであれば特に制限なく用いることができる。具体例としては、イナワラ、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、空果房等のパーム残渣並びにそれらから製造されたパルプ、及び紙などが挙げられる。さらに、食品産業、建築業、家庭から排出される廃棄物なども含まれうる。
本発明に用いられるリグノセルロース系バイオマスは、セルロース含有量が２０質量％以上、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは６０質量％以上のものである。本発明におけるセルロース含有量は、リグノセルロース系バイオマスから水を差し引いた残余の成分中のセルロース量及びヘミセルロース量の合計量を意味する。
市販のパルプの場合、セルロース含有量は、一般には７５〜９９質量％であり、他の成分はリグニン等を含む。また、市販のシート状パルプのセルロースＩ型結晶化度は、通常６０％以上である。
これらのリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースのセルロースＩ型結晶化度は３０％を超えるものである。
【００１３】
また、本発明に用いられるリグノセルロース系バイオマスの水分量は、次の（ａ）粉砕工程によりセルロースのセルロースＩ型結晶化度を容易に低下させることができ、その後の糖化物及び有機酸の生産を効率よく行うことできる観点から、２０質量％以下が好ましく、１５質量％以下がより好ましく、１０質量％以下が更に好ましい。
【００１４】
＜（ａ）粉砕工程＞
本発明においては、前記のリグノセルロース系バイオマスを粉砕し、リグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースのセルロースＩ型結晶化度（「結晶化度」ともいう）を０〜３０％に低減する。
【００１５】
〔セルロースＩ型結晶化度〕
本発明において調製される非晶化セルロースは、セルロースＩ型結晶化度を３０％以下に低下させたものである。セルロースＩ型結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、下記計算式（１）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉc−Ｉa）／Ｉc〕×１００    （１）
〔Ｉcは、Ｘ線回折における格子面（００２面）（格子面間隔＝２２．４ｎｍ）の回折強度、Ｉaは、アモルファス部（格子面間隔＝２７．３ｎｍ）の回折強度を示す〕
結晶化度が３０％以下であれば、セルロースの化学反応性が向上し、（ｃ）工程の加水分解が進行しやすくなる。この観点から、粉砕物の結晶化度としては、２５％以下が好ましく、２０％以下がより好ましく、１０％以下がより好ましく、分析でセルロースＩ型結晶が検出されない０％が更に好ましい。なお、計算式（１）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合のセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
ここで、セルロースＩ型結晶化度とは、セルロースの結晶領域量の全量に対する割合のことである。また、セルロースＩ型とは、天然セルロースの結晶形のことである。セルロースＩ型結晶化度は、セルロースの物理的、化学的性質とも関係し、その値が小さいほど、セルロースの結晶性が低く、非結晶部分が多い。そのため、本発明者の考察によれば、セルロースＩ型結晶化度を低下させることで、セルロースの伸び、柔軟性、水や溶媒に対する溶解性、化学反応性は上昇すると共に、次工程（ｂ）によりリグノセルロース系バイオマスから発酵阻害物質が除去されやすくなると考えられている。
【００１６】
このようにリグノセルロース系バイオマスに含まれるセルロースのセルロースＩ型結晶化度を低下させるには、公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、セルロース原料を小粒子径化することができる装置であればよい。
粉砕機の具体例としては、高圧圧縮ロールミルや、ロール回転ミルなどのロールミル、リングローラーミル、ローラーレースミル又はボールレースミルなどの竪型ローラーミル、転動ボールミル、振動ボールミル、振動ロッドミル、振動チューブミル、遊星ボールミル又は遠心流動化ミルなどの容器駆動媒体ミル、塔式粉砕機、攪拌槽式ミル、流通槽式ミル又はアニュラー式ミルなどの媒体攪拌式ミル、高速遠心ローラーミルやオングミルなどの圧密せん断ミル、乳鉢、石臼、マスコロイダー、フレットミル、エッジランナーミル、ナイフミル、ピンミル、カッターミルなどが挙げられる。これらの中では、リグノセルロース系バイオマスの粉砕効率及び生産性の向上の観点から、容器駆動式媒体ミル又は媒体攪拌式ミルが好ましく、容器駆動式媒体ミルがより好ましく、振動ボールミル、振動ロッドミル又は振動チューブミルなどの振動ミルが更に好ましく、振動ロッドミルが更に好ましい。
【００１７】
本発明の好ましい振動ロッドミルは、円柱形の空間を有し、該円柱形の空間の中心軸が略水平になるように配置され、かつ、該中心軸に対し略垂直な面内方向に振動可能に保持された容器（Ａ）と、該円柱形の空間の中心軸と略平行になるようにかつ振動可能に配置された１又は２本以上の棒状媒体であるロッド（Ｂ）とを備える。また、振動ボールミルは、１又は２個以上の球状媒体であるボール（Ｃ）を備える。
【００１８】
ロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）の材質としては、特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラス等が挙げられる。
ロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）の外径としては、好ましくは０．５〜２００ｍｍ、より好ましくは１〜１００ｍｍ、更に好ましくは５〜５０ｍｍの範囲である。
また、ロッド（Ｂ）としては、断面が四角形、六角形等の多角形、円形、楕円形等のものを用いることができる。
ロッド（Ｂ）の長さとしては、粉砕機の容器の長さよりも短いものであれば特に限定されない。ロッド（Ｂ）の大きさが上記の範囲であれば、所望の粉砕力が得られるとともに、ロッド（Ｂ）のかけら等が混入して粉末セルロースが汚染されることなく効率的にセルロースを非晶化させることができる。
【００１９】
ロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）の充填率は、振動ミルの機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは１０〜９７体積％、より好ましくは１５〜９５体積％の範囲である。充填率がこの範囲内であれば、セルロースとロッド又はボールとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、容器（Ａ）内部の円柱形の空間の容積に対するロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）の見かけの体積をいう。
【００２０】
本発明で用いられる振動ロッドミルとしては、中央化工機株式会社製の振動ミル、株式会社吉田製作所製の小型振動ロッドミル１０４５型、ドイツのフリッチュ社製の振動カップミルＰ−９型、日陶科学株式会社製の小型振動ミルＮＢ−Ｏ型等を用いることができる。
また、振動ボールミルとしては、振動ロッドミルと同様の装置、例えば中央化工機株式会社製の振動ミルなどを用いることができる。処理方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
粉砕処理がバッチ処理の場合、媒体をスムーズに振動させる観点から、容器（Ａ）内部の円柱形の空間に充填された被粉砕原料の体積が、当該空間の体積からロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）の体積を除いた容積（以下、粉砕容器内実体積と呼ぶ）の９９体積％以下であることが好ましく、９５体積％以下であることがより好ましく、９０体積％以下であることが更に好ましく、８０体積％以下であることが更に好ましい。
一方、被粉砕原料が少ないと、粉砕に関係のない容器（Ａ）及びロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）、並びにロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）同士の衝突が増え、粉砕効率が低下する。よって粉砕効率を向上させる観点から、充填された被粉砕原料の体積は、容器内実体積の１体積％以上であることが好ましく、２体積％以上であることがより好ましく、３体積％以上であることが更に好ましい。
ここで、容器（Ａ）内部の円柱形の空間に充填された被粉砕原料の体積とは、充填された被粉砕原料の重量を、該原料の見かけ比重で除して得られた体積を意味する。
粉砕処理が連続処理である場合には、被粉砕原料の容器（Ａ）内部の円柱形の空間の滞留量の好ましい様態は、粉砕処理がバッチ処理である場合の「被粉砕原料の充填量」を「被粉砕原料の、容器（Ａ）内部の円柱形の空間の滞留量」に、「充填された被粉砕原料の体積」を「容器（Ａ）内部の円柱形の空間に滞留している被粉砕原料の体積」に読み替えることを除き、同様である。
粉砕処理時の容器（Ａ）の振動数、振幅は特に限定されないが、振動数と振幅を増加させることで、容器（Ａ）及びロッド（Ｂ）又はボール（Ｃ）に与えられる加速度を大きくすることができ、被粉砕原料の粉砕速度を高めることができる。
粉砕速度を高める観点から、容器（Ａ）の振動数は、８Ｈｚ以上であることが好ましく、１０Ｈｚ以上であることがより好ましく、１２Ｈｚ以上であることが更に好ましい。また、容器（Ａ）の振幅は、５ｍｍ以上であることが好ましく、６ｍｍ以上であることがより好ましく、７ｍｍ以上であることが更に好ましい。
一方、装置負荷の観点から、容器（Ａ）の振動数は４０Ｈｚ以下であることが好ましく、３５Ｈｚ以下であることがより好ましく、３０Ｈｚ以下であることが更に好ましい。また、容器（Ａ）の振幅は、２５ｍｍ以下であることが好ましく、２０ｍｍ以下であることがより好ましく、１８ｍｍ以下であることが更に好ましい。
【００２１】
振動ロッドミル又は振動ボールミルの処理時間としては、振動ロッドミル又は振動ボールミルの種類、ロッド又はボールの種類、大きさ及び充填率等により一概に決定できないが、結晶化度を低下させる観点から、好ましくは０．０１〜５０ｈｒ、より好ましくは０．０５〜２０ｈｒ、更に好ましくは０．１〜１０ｈｒである。処理温度は、特に制限はないが、熱による劣化を防ぐ観点から、好ましくは５〜２５０℃、より好ましくは１０〜２００℃である。
【００２２】
また、本工程では、セルロースＩ型結晶化度を低下させ、その後の糖化物及び有機酸の生産を効率良く行うことができる観点から、アルカリを添加することが好ましい。好ましいアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウムが挙げられ、より好ましくは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムであり、更に好ましくは水酸化ナトリウムである。
本工程で添加するアルカリの態様としては粉状、粒状、塊状、溶媒に溶解させた溶液、又は溶媒に分散させた分散液が挙げられ、好ましくは粉状、粒状、又は塊状である。
アルカリの使用量は、セルロースＩ型結晶化度を低下させ、その後の糖化物及び有機酸の生産を効率良く行うことができる観点から、リグノセルロース系バイオマス１００質量部に対して、好ましくは１〜５０質量部であり、より好ましくは３〜３０質量部であり、更に好ましくは５〜１０質量部である。
【００２３】
上記の粉砕方法により、原料のリグノセルロース系バイオマスから、セルロースＩ型結晶化度が３０％以下の非晶化セルロースである粉砕物を効率よく得ることができ、振動ミル処理の際に、ミル内部に粉砕物が固着せずに、乾式にて処理することができる。
得られる粉砕物の平均粒径は、この粉砕物を（ｃ）工程での原料として用いる際の化学反応性及び取扱い性の観点から、好ましくは２０〜１５０μｍ、より好ましくは２５〜１５０μｍ、より好ましくは３０〜１００μｍである。特に平均粒径が２５μｍ以上であれば、非晶化セルロースを水等の液体と接触させたときに「ママコ」になることを抑えることができる。
なお、粉砕物の平均粒径は、レーザー回折散乱法により体積基準に従って求められる平均値をいう。
【００２４】
また、本発明における振動ミル処理には、ロッド又はボールを充填した振動ミルでの粉砕、非晶化をより効率的に行う観点から、嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3以上のリグノセルロース系バイオマスを用いることが好ましく、１２０ｋｇ／ｍ3以上がより好ましく、１５０ｋｇ／ｍ3以上が更に好ましい。この嵩密度が１００ｋｇ／ｍ3以上であれば、原料のリグノセルロース系バイオマスが適度な容積を有するために取扱い性が向上する。また、振動ミルへの原料仕込み量を多くすることができるので、処理能力が向上する。一方、この嵩密度の上限としては、取扱い性及び生産性の観点から、好ましくは５００ｋｇ／ｍ3以下、より好ましくは４００ｋｇ／ｍ3以下、更に好ましくは３５０ｋｇ／ｍ3以下である。これらの観点から、この嵩密度としては、好ましくは１００〜５００ｋｇ／ｍ3、より好ましくは１２０〜４００ｋｇ／ｍ3、更に好ましくは１５０〜３５０ｋｇ／ｍ3である。
【００２５】
本発明では、振動ミルに供給するリグノセルロース系バイオマスを前処理することが好ましい場合もある。そのような場合は、例えば、リグノセルロース系バイオマスを押出機で処理することで、リグノセルロース系バイオマスの嵩密度を、前述の好ましい範囲にすることができる。
リグノセルロース系バイオマスを押出機に投入する前には粗粉砕しておくことが好ましい。粗粉砕物の大きさとしては、好ましくは１〜５０ｍｍ、より好ましくは１〜３０ｍｍである。１〜５０ｍｍに粗粉砕することにより、押出機処理を効率良く容易に行うことができ、粉砕に要する負荷を軽減することができる。
【００２６】
＜（ｂ）洗浄工程＞
（ｂ）洗浄工程では、（ａ）工程で得られた粉砕物を水で洗浄する。水は、水溶性溶媒を含む水溶液、酸性水溶液、アルカリ水溶液であってもよい。
水溶性溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；超臨界二酸化炭素等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用でき、溶媒を変えて繰り返し行うことも可能である。
なかでも、（ｄ）工程で糸状菌の成長及び代謝を阻害する阻害要因を除去する観点、及びその他の阻害要因を除去する観点から、水が好ましい。
【００２７】
本工程で用いる水のｐＨは（ｄ）工程で糸状菌の成長及び代謝を阻害する阻害要因を除去する観点から、好ましくは４以上であり、より好ましくは６以上である。一方、安全性の観点から好ましくは１４以下、より好ましくは９以下、更に好ましくは８以下である。
本工程で用いる水のｐＨは、好ましくは４〜１４であり、より好ましくは４〜９であり、更に好ましくは６〜８である。
ｐＨの調整には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸アルカリ、炭酸水素アルカリ；水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物；炭酸カルシウム等の炭酸アルカリ土類金属等の無機アルカリ；塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等の無機酸、乳酸等の有機酸が好ましい。
【００２８】
（ｂ）工程の洗浄処理の程度は、水溶性成分残存率によって管理するのが好ましい。水溶性成分残存率とは、洗浄工程後の粉砕物中の水溶性成分の質量を、洗浄工程前の粉砕物中の水溶性成分の質量で割った値を云う。（ａ）工程で得られた粉砕物の洗浄は、当該水溶性成分残存率が十分に小さくなるまで行うのが好ましい。
例えば、（ａ）工程で得られた粉砕物を回分式撹拌槽などで洗浄する方法では、回分式撹拌槽などに入れた水中に粉砕物を分散し、分散液からろ過又は遠心分離により、ろ液又は上清を分離し、固形分を得る。好ましくは、固形分を再び回分式撹拌槽などで水中に分散し、上記の固液分離を行う操作を１〜ｎ回繰り返す。各回で加えた水、及びろ液又は上清の質量から下記式（２）により水溶性成分残存率を算出できる。
水溶性成分残存率  ＝  （ｖ1／ｗ1）×（ｖ2／（ｖ1＋ｗ2））×・・・×（ｖn／（ｖn-1＋ｗn））    （２）
ここで、ｗnは洗浄ｎ回目に添加した水の質量、ｖnは洗浄ｎ回目の固液分離操作後の沈殿画分に存在している液の質量である。ｖnは洗浄ｎ回目の固液分離操作後によって除去された液画分の質量をｍnとすると、ｖn＝ｖn-1＋ｗn−ｍnとして計算される（ただしｖ0＝０）。
式（２）は、粉砕物中の水溶性成分が沈殿物への分配や吸着することなく全て水相に溶解するという理想的な状態を仮定したときの洗浄効率を表している。本発明における阻害物質のすべてが当てはまるとは限らないが、この値によって概ね制御される。
また、（ａ）工程で得られた粉砕物をフィルタープレス等で連続して洗浄する方法では、水中に粉砕物を分散し、分散液をろ過してフィルターに残った固形分へ水を供給する操作を繰り返す。連続して洗浄する方法においては式（２）での計算が困難であるため、粉砕物中に含まれる水溶性成分をトレーサー物質として下記式（２’）より水溶性成分残存率を算出できる。この場合、水性成分が飽和溶解度や吸着、化学結合などにより完全に溶解していない場合には不適切であるため、別途可溶性のトレーサー物質を添加することで水溶性成分残存率を算出してもよい。水溶性成分の分析方法は、共存物質に影響を受けず且つその水溶性成分の分析方法に適していればどんな方法でもよく、吸光度、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、電気伝導度などがあげられる。
水溶性成分残存率（連続して洗浄する場合）  ＝  洗浄後のトレーサー物質質量／洗浄後のトレーサー物質質量  （２’）
【００２９】
本発明において、水溶性成分残存率は、（ｄ）工程で糸状菌の成長及び代謝を阻害する物質を除去し、有機酸の生産性を高める観点から、好ましくは０．５以下であり、より好ましくは０．４以下であり、更に好ましくは０．２以下であり、更に好ましくは０．１以下ある。一方、水溶性成分残存率は、水の使用量を抑制することによる環境負荷及び経済的観点から、好ましくは０．００１以上である。
また、水溶性成分残存率は、好ましくは０．００１〜０．５であり、より好ましくは０．００１〜０．４であり、更に好ましくは０．００１〜０．２であり、更に好ましくは０．００１〜０．１である。
【００３０】
より好ましい水溶性成分残存率にするには、（ａ）工程で得られた粉砕物の固形分１質量部に対し合計で１質量部以上の水で洗浄するのが好ましく、更に３質量部以上、更に５質量部以上、更に１０質量部以上の水で洗浄するのが好ましい。一方、環境負荷、及び経済的観点から、（ａ）工程で得られた粉砕物の固形分１質量部に対し合計で１００質量部以下の水で洗浄するのが好ましく、更に５０質量部以下、更に４０質量部以下、更に３０質量部以下の水で洗浄するのが好ましい。
また、（ｂ）洗浄工程では、（ａ）工程で得られた粉砕物の固形分１質量部に対し合計で１〜１００質量部、更に３〜５０質量部、更に５〜４０質量部、更に１０〜３０質量部の水で洗浄するのが好ましい。
【００３１】
本工程においては、（ｄ）工程で糸状菌の成長及び代謝を阻害する物質を除去し、有機酸の生産性を高める観点から、（ａ）工程で得られた粉砕物と水からなる分散液の温度は、好ましくは０℃以上であり、より好ましくは１０℃以上であり、更に好ましくは２０℃以上である。また、エネルギー効率の観点から、好ましくは１００℃以下であり、より好ましくは９０℃以下であり、更に好ましくは８０℃以下である。
また、（ａ）工程で得られた粉砕物と水からなる分散液の温度は、好ましくは０〜１００℃であり、より好ましくは１０〜９０℃であり、更に好ましくは２０〜８０℃である。
【００３２】
＜（ｃ）加水分解酵素を用いて糖化物を得る工程＞
（ｃ）工程では、（ｂ）工程で得られた固形物を加水分解酵素により加水分解して糖化物を得る。
本発明において（ｃ）工程に使用される加水分解酵素としては、セルロースやヘミセルロースに対して加水分解活性を有する酵素であれば特に制限はない。例えば、市販のセルラーゼ製剤やヘミセルラーゼ製剤、動物、植物、微生物由来のセルラーゼやヘミセルラーゼを使用することができる。
セルラーゼとしては、例えば、Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ、Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ（ノボザイムズ社）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  １０００、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  １５００、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（ジェネンコア社）等のトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ１４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２７）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ２５２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７４）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ１１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２６）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ４４０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２８）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ６５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３０）株由来のセルラーゼ、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、アスペルギルス  アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｌｅａｔｕｓ）、クロストリジウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム  ステルコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、クロストリジウム  ジョスイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ）、セルロモナス  フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、アクレモニウム  セルロリティクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｒｉｔｉｃｕｓ）、イルペックス  ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼ混合物、パイロコッカス  ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の耐熱性セルラーゼ等が挙げられる。
これらのなかで、効率良く糖を得ることができる点から、トリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼ、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼが好ましく、トリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼがより好ましく、Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ、Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２（ノボザイムズ社）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（ジェネンコア社）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社）、あるいはウルトラフロＬ（ノボザイムズ社）が更に好ましい。
【００３３】
また、ヘミセルラーゼとしては、例えば、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２９）株由来のキシナラーゼ、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、又はバチルス  アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐＨｉｌｕｓ）由来のキシラナーゼ、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、カルドセラム（Ｃａｌｄｏｃｅｌｌｕｍ）、又はサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属由来のキシラナーゼ等が挙げられる。
また、上記のセルラーゼ混合物中に含まれるヘミセルラーゼ活性を持つ酵素を利用することもできる。
【００３４】
加水分解酵素は、単独で用いることもできるが、更に効率的な糖の製造にはこれら酵素を組み合わせて用いることが効果的である。また、これらの酵素に対してβ−グルコシダーゼ等の特定のセルラーゼ成分を更に添加することによって糖製造の効率を向上させることもできる。添加するβ−グルコシダーゼの例としてはアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の酵素（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８やメガザイム社製β−グルコシダーゼ）やトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来の酵素、ペニシリウム  エメルソニイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来の酵素等が挙げられる。
【００３５】
（ｃ）工程は、まず、（ｂ）工程で得られた固形物を水性媒体に懸濁して懸濁液を調製する。水性媒体は加水分解酵素が失活しない範囲においては特に制限はないが、水、緩衝液、酸性水溶液、又はアルカリ性水溶液を用いることが好ましい。
【００３６】
（ｃ）工程の反応条件は、使用する酵素の特性に合わせて選択することが可能であるが、糖化物及び有機酸の生産性の観点から、基質濃度が５〜２００（ｇ／Ｌ）の基質懸濁液に対して、加水分解酵素を、好ましくは０．０１〜１０体積％相当、更に０．１〜２体積％相当となるように添加するのが好ましい。
また、ｐＨは、２〜１０、更にｐＨ３〜７、更に４〜６が好ましい。
また、反応温度は、好ましくは１０〜９０℃、より好ましくは２０〜７０℃、更に好ましくは４０〜６０℃である。また、反応時間は、３０分〜７日間、好ましくは０．５〜５日間である。
【００３７】
加水分解反応終了後の糖化物は、糖化物中の不溶物を適宜ろ過してもよいし、そのままの状態で次の工程（ｄ）に供しても構わない。
【００３８】
工程（ｃ）によって製造される糖化物に含まれる単糖の質量（以下、「全糖量」とも称する）は、有機酸の収率向上の観点から、加水分解反応に供した洗浄後のリグノセルロース系バイオマスの粉砕物の全質量に対して、好ましくは１０〜９０質量％であり、より好ましくは、２０〜８０質量％であり、更に好ましくは、３０〜７０質量％である。
単糖としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等が挙げられる。
【００３９】
＜（ｄ）糖化物を発酵させて有機酸を得る工程＞
（ｄ）工程では、（ｃ）工程で得られた糖化物を糸状菌で発酵させる。
（ｄ）工程で用いる培地は、（ｃ）工程で製造された糖化物を含む。
培地は、一般的には、炭素源、窒素源、および無機塩を含むが、（ｃ）工程で製造された糖化物中に培養に必要なこれらの栄養源が十分に含まれている場合には、適宜濃度を調節した上記糖化物のみを用いることもできるし、必要によって、糖化物のほかに栄養源を添加することによって培地を調製してもよい。
【００４０】
本工程では、上記培地に、有機酸を産生し得る糸状菌を添加し、培養することによって有機酸を生産する。本発明に係る有機酸は、酸性基としてカルボキシル基を有する化合物である。このような有機酸としては、例えば、乳酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、レブリン酸、プロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、クエン酸、コウジ酸、ジピコリン酸、及びアコニット酸が挙げられる。このうち、乳酸、フマル酸が好ましい。
上記有機酸はこれらを産生しうる糸状菌を培養することによって製造されうる。これらの糸状菌としては、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属する微生物が挙げられる。具体的には、Ｌ−乳酸やフマル酸を多量に生産する観点からリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）が好ましい。
【００４１】
培養温度は、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。また、培地のｐＨは、菌体の生育や、有機酸の生産性の観点から、好ましくは２〜７であり、より好ましくは４〜６である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア、硫酸や塩酸などを用いて行うことが好ましい。
【００４２】
培養方法は、嫌気的条件および好気的条件のいずれかの培養方法を適宜採用することができる。培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、流動床培養槽、及び充填床培養槽などが挙げられる。有機酸の生産速度の向上のためには、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽が好ましい。
また、発酵後の培地からの有機酸の分離が容易で、かつ連続的な生産が可能であるとの観点から、糸状菌はペレット（菌糸塊）を形成させて培養することが好ましい。
ペレット状の糸状菌の培養方法は、公知の方法を採用することができるが、例えば、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、その菌糸から菌体を形成させペレット化させる。培養後、糸状菌ペレットは、培養液と共に培養槽から抜き出して、培地からろ別、遠心分離等の操作により分離回収し（ｄ）工程に使用することができる。また、培養槽に糸状菌ペレットを残し、同一培養槽で（ｄ）工程を行うことも可能である。
【００４３】
当該培養によれば通常、有機酸以外にアルコールが副生する。しかし、本発明によれば（ａ）工程と（ｂ）工程を組み合わせることにより、有機酸が選択的に得られ、副生アルコール量が低減する。
【００４４】
（ｄ）工程の後、当該（ｄ）工程で得られた生成物を原料としてエステルを製造し、得られたエステルを蒸留する工程を行ってもよい。当該蒸留工程により、（ｄ）工程で得られた生成物から、有機酸以外の物を除去することができる。
【００４５】
（ｄ）工程で得られる有機酸とアルコールの質量比（有機酸／アルコール）は、有機酸の収量の観点から、好ましくは１．３以上であり、より好ましくは２．０以上であり、更に好ましくは３．０以上であり、更に好ましくは４．０以上である。
【００４６】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の製造方法を開示する。
【００４７】
＜１＞下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む有機酸の製造方法。
（ａ）：下記計算式（１）で示されるセルロースＩ型結晶化度が３０％を超えるセルロースを含有するリグノセルロース系バイオマスを粉砕し、当該セルロースＩ型結晶化度を０〜３０％に低減する工程
結晶化度（％）＝〔（Ｉc−Ｉa）／Ｉc〕×１００        （１）
〔Ｉcは、Ｘ線回折における格子面（００２）（格子面間隔＝２２．４ｎｍ）の回折強度、及びＩａは、アモルファス部（格子面間隔＝２７．３ｎｍ）の回折強度を示す〕
（ｂ）：（ａ）工程で得られる粉砕物を水で洗浄する工程
（ｃ）：（ｂ）工程で得られる固形物を、加水分解酵素により加水分解して糖化物を得る工程
（ｄ）：（ｃ）工程で得られる糖化物を糸状菌で発酵させて有機酸を得る工程
【００４８】
＜２＞リグノセルロース系バイオマスのセルロース含有量が、好ましくは２０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上、更に好ましくは６０質量％以上である＜１＞に記載の有機酸の製造方法。
＜３＞（ａ）工程が、好ましくは竪型ローラーミル、容器駆動媒体ミル、媒体攪拌式ミル及び圧密せん断ミルから選ばれる粉砕機、より好ましくは容器駆動媒体ミル又は媒体攪拌式ミル、更に好ましくは容器駆動媒体ミル、更に好ましくはロッド又はボールを充填した振動ミルを用いて行なわれる前記＜１＞又は＜２＞に記載の有機酸の製造方法。
＜４＞（ａ）工程でアルカリを添加する前記＜１＞〜＜３＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜５＞アルカリの使用量が、好ましくはリグノセルロース系バイオマス１００質量部に対して１〜５０質量部、より好ましくは３〜３０質量部、更に好ましくは５〜１０質量部である前記＜４＞に記載の有機酸の製造方法。
＜６＞アルカリが、好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム又は水酸化カルシウム、より好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム、更に好ましくは水酸化ナトリウムである前記＜４＞又は＜５＞に記載の有機酸の製造方法。
＜７＞（ａ）工程の粉砕後のセルロースＩ型結晶化度が、好ましくは２５％以下、より好ましくは２０％以下、更に好ましくは１０％以下、更に好ましくは０％である前記＜１＞〜＜６＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜８＞（ｂ）工程において、粉砕物の水溶性成分残存率が、好ましくは０．５以下、より好ましくは０．４以下、更に好ましくは０．２以下、更に好ましくは０．１以下になるまで水で洗浄する前記＜１＞〜＜７＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜９＞（ｂ）工程において、粉砕物の水溶性成分残存率が、好ましくは０．００１以上になるまで水で洗浄する前記＜１＞〜＜８＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１０＞（ｂ）工程において、粉砕物の水溶性成分残存率が、好ましくは０．００１〜０．５、より好ましくは０．００１〜０．４、更に好ましくは０．００１〜０．２、更に好ましくは０．００１〜０．１になるまで水で洗浄する前記＜１＞〜＜７＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１１＞（ｂ）工程において、（ａ）工程で得られる粉砕物の固形分１質量部に対し合計で、好ましくは１質量部以上、より好ましくは３質量部以上、更に好ましくは５質量部以上、更に好ましくは１０質量部以上の水で洗浄する、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１２＞（ｂ）工程において、（ａ）工程で得られる粉砕物の固形分１質量部に対し合計で、好ましくは１００質量部以下、より好ましくは５０質量部以下、更に好ましくは４０質量部以下、更に好ましくは３０質量部以下の水で洗浄する、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１３＞（ｂ）工程の洗浄処理において、（ａ）工程で得られる粉砕物の固形分１質量部に対し合計で、好ましくは１〜１００質量部、より好ましくは３〜５０質量部、更に好ましくは５〜４０質量部、更に好ましくは１０〜３０質量部の水で洗浄する、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１４＞（ｂ）工程において、（ａ）工程で得られる粉砕物と水からなる分散液の温度が、好ましくは０℃以上であり、より好ましくは１０℃以上であり、更に好ましくは２０℃以上である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１５＞（ｂ）工程において、（ａ）工程で得られる粉砕物と水からなる分散液の温度が好ましくは１００℃以下であり、より好ましくは９０℃以下であり、更に好ましくは８０℃以下である、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１６＞（ｂ）工程において、（ａ）工程で得られる粉砕物と水からなる分散液の温度が好ましくは０〜１００℃であり、より好ましくは１０〜９０℃であり、更に好ましくは２０〜８０℃である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１７＞水が、好ましくは水、水溶性溶媒を含む水溶液、酸性水溶液又はアルカリ水溶液であり、より好ましくは水又は水溶性溶媒を含む水溶液であり、更に好ましくは水である、前記＜１＞〜＜１６＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１８＞（ｃ）工程の加水分解酵素がセルラーゼである前記＜１＞〜＜１７＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜１９＞（ｃ）工程のセルラーゼが、好ましくはトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ１４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２７）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ２５２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７４）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ１１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２６）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ４４０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２８）株由来のセルラーゼ、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ６５９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３０）株由来のセルラーゼ、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、アスペルギルス  アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｌｅａｔｕｓ）、クロストリジウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム  ステルコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、クロストリジウム  ジョスイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ）、セルロモナス  フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、アクレモニウム  セルロリティクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｒｉｔｉｃｕｓ）、イルペックス  ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼ混合物、又はパイロコッカス  ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の耐熱性セルラーゼであり、より好ましくはトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼ、又はフミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼであり、更に好ましくはトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼである前記＜１８＞の有機酸の製造方法。
＜２０＞有機酸が、好ましくは乳酸、フマル酸、イタコン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、グルタル酸、レブリン酸、プロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、クエン酸、コウジ酸、ジピコリン酸又はアコニット酸であり、より好ましくは乳酸又はフマル酸である、前記＜１＞〜＜１９＞のいずれかの有機酸の製造方法。
＜２１＞糸状菌が、好ましくはリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属する微生物であり、より好ましくはリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）であり、更に好ましくはリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）である、前記＜１＞〜＜２０＞のいずれかの有機酸の製造方法。
【実施例】
【００４９】
＜分析方法＞
［結晶化度の算出］
株式会社リガク製の「Ｒｉｇａｋｕ  ＲＩＮＴ  ２５００ＶＣ  Ｘ−ＲＡＹ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ」を用いて以下の条件で測定し、上記計算式（１）に基づいてセルロースＩ型結晶化度を算出した。
測定条件は、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα−ｒａｄｉａｔｉｏｎ（波長λ＝０．１５４０５６ｎｍ），管電圧：４０ｋｖ，管電流：１２０ｍＡ，測定範囲：２θ＝５〜４５°で測定した。測定用サンプルは面積３２０ｍｍ2×厚さ１ｍｍのペレットを圧縮し作製した。Ｘ線のスキャンスピードは１０°／ｍｉｎで測定した。
Ｉcはとしては２θ＝２２．６°での回折強度、Ｉaとしては２θ＝１８．５°での回折強度を用いた。
【００５０】
［高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による各種成分の測定］
発酵液を０．００８５Ｎ硫酸水溶液で適宜希釈し、孔径が０．２２μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて濾過を行い、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣの分析条件は、カラム：ＩＣＳｅｐ    ＩＣＥ−ＩＯＮ−３００、溶離液：０．００８５Ｎ    硫酸、０．４ｍＬ／ｍｉｎ、検出法：ＲＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ、Ｌ−２４９０）、カラム温度：４０℃、注入液量：２０μＬ、保持時間：４０分であった。この分析系における各成分の保持時間は、グルコース：１６分、キシロース：１７分、乳酸：２３分、フマル酸：２７分、エタノール：３４分であった。
【００５１】
［水分量の測定］
水分量の測定は、電子式水分計（ＭＯＩＳＴＵＲＥＢＡＬＡＮＣＥ  ＭＯＣ−１２０Ｈ（島津製作所社製））を使用した。上記水分計に試料を設置して測定を開始し、設定温度である１２０℃に昇温して、その後１２０℃で保持した。３０秒間における試料の質量変化が０．０５％未満になった時を測定終了時とした。測定開始時から測定終了時までの質量減少率を水分量とした。
【００５２】
［水溶性成分残存率の算出］
粉砕物の洗浄を１〜３回行い、上記計算式（２）に基づいて水溶性成分残存率を算出した。
【００５３】
＜ペレット化糸状菌の調製＞
［胞子懸濁液の調製］
菌株は独立行政法人  製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）より入手した糸状菌Ｒ．ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ５３８４を使用した。糸状菌は、試験管内に形成させた斜面状寒天培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ、Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）上に菌体を画線／塗布し、室温にて静置培養し、定期的に継代を行った。菌体使用時には菌体増殖した試験管に１０ｍＬの滅菌蒸留水を添加後、タッチミキサにて４分間撹拌することで胞子を回収し、さらに無菌の蒸留水を添加して希釈することで１×１０6ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬに調整したものを胞子懸濁液とした。
【００５４】
［糸状菌のペレット化］
ペレット化糸状菌の調製は以下の２段階の培養にて行った。
１段目の培養は、６０ｍＬのＰＤＢ培地（Ｄｉｆｃｏ  Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｂｒｏｔｈ、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を仕込んだ２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを滅菌し、前述の方法で調製した胞子懸濁液を１×１０4個−胞子／ｍＬとなるように植菌して２７℃，１００ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）の培養条件にて３日間行った。
２段目の培養は、ペレット形成培地（グルコース（試薬）１０質量％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２５質量％、硫酸亜鉛７水和物０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％、リン酸二水素カリウム０．０６質量％）１００ｍＬを仕込んだ５００ｍＬ容三角フラスコを滅菌し、５．０ｇの炭酸カルシウム、並びに１段目の培養液４ｍＬを植菌して２７℃、１７０ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）の培養条件にて１．５日間行った。
【００５５】
［ペレットの回収］
上記で得られた糸状菌ペレット培養液を、ガーゼにてろ液のドリップが落ち着くまで１分程度ろ過し、ウエット状態の糸状菌ペレットを得た。得られたペレットは速やかに発酵性の評価に供した。
【００５６】
＜発酵性の評価＞
［培養方法］
リグノセルロース系バイオマスの酵素糖化液１００ｍＬ、並びに各種微量成分（硫酸マグネシウム７水和物０．０２５質量％、硫酸亜鉛７水和物０．００９質量％、硫酸アンモニウム０．１質量％、リン酸二水素カリウム０．０６質量％、炭酸カルシウム５．０質量％：いずれも終濃度として）を滅菌済の５００ｍＬ容三角フラスコに添加し、続いて＜ペレット化糸状菌の調製＞で調製した糸状菌ペレット１２．５ｇ（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、３５℃、１７０ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）の培養条件にて培養を行った。４８時間目に再度サンプリングを行った。
【００５７】
［評価方法］
０時間目、及び４８時間目の分析値から、（１）糖から乳酸への変換率（Ｐ［％］）、（２）糖からエタノールへの変換率（Ｑ［％］）、（３）生成される乳酸とエタノールの比率（Ｒ［％］）、（４）糖からフマル酸への変換率（Ｐ’［％］）、の４項目を評価軸とした。各項目の算出式を表１及び式（３）〜（６）に示す。
【００５８】
【表１】
2013230142.tif 000002
【００５９】
糖から乳酸への変換率
Ｐ［％］＝（Ｌ48−Ｌ0）／（Ｇ0＋Ｘ0）×１００        （３）
糖からエタノールへの変換率
Ｑ［％］＝（Ｅ48−Ｅ0）／（Ｇ0＋Ｘ0）×１００        （４）
糖から生成する乳酸とエタノールの比率
Ｒ［％］＝（Ｌ48−Ｌ0）／（Ｅ48−Ｅ0）×１００    （５）
糖からフマル酸への変換率
Ｐ’［％］＝（Ｆ48−Ｆ0）／（Ｇ0＋Ｘ0）×１００    （６）
【００６０】
（実施例１〜５）    乾式粉砕サトウキビバガスの水洗の効果
〔バイオマスの乾燥処理〕
サトウキビバガスを８０℃にて一晩乾燥させ、水分６質量％の乾燥サトウキビバガスを得た。サトウキビバガスのセルロース含有量は３８％、結晶化度は３７％であった。
【００６１】
〔（ａ）リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程〕
〔乾式粉砕処理〕
上記乾燥工程で得られた乾燥サトウキビバガスを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５８Ｌ）に５０ｇ投入し、ロッドとして、外径３０ｍｍ、長さ２１１ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５８体積％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｒ／ｍの条件で、０．５時間処理を行った。また、得られた粉砕物の温度は、処理に伴う発熱により、６５℃であった。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた粉砕物を前記振動ミルから取り出した。粉砕物の結晶化度は６％であった。また、体積基準の平均粒径は２５μｍであった。
【００６２】
〔（ｂ）粉砕物を洗浄する工程〕
実施例ごとに、粉砕物に対して１〜３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：粉砕された粉末５０ｇに蒸留水（Ｗ1  単位：グラム）を加え、室温にて１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、５〜１０分）にて固形物を沈降させた後上清（Ｗ2）を捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分に、洗浄１回目で捨てた上清と同重量（Ｗ2）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清（Ｗ3）を捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分に、洗浄２回目で捨てた上清と同重量（Ｗ3）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清（Ｗ4）を捨てた。
実施例１〜５におけるＷ1〜Ｗ4の値を表２示す。また、これらの値から算出された水溶性成分残存率を表３に示す。
【００６３】
【表２】
2013230142.tif 000003
【００６４】
〔（ｃ）洗浄工程で得られた固形物を加水分解酵素により加水分解して糖化物を得る工程〕
洗浄工程にて得られた沈殿画分（固形物）に総重量が２５０ｇとなるまで蒸留水を添加した後、糖化酵素（Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２、ノボザイム社、２．５ｍＬ）を添加し、５０℃、１５０ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて４．５日間糖化反応を行った。糖化反応終了液はろ紙（ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）と孔径０．２２μｍのメンブレンフィルタシステム（ＩＷＡＫＩ、Ｃａｔ  ｎｏ．８０３０−００１）にてろ過した。得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
【００６５】
〔（ｄ）糸状菌による糖化物の発酵工程〕
＜発酵性の評価＞で示した方法にて発酵性の評価を行った。結果を表３に示す。洗浄の度合いを変化させることにより乳酸とエタノールの生産割合が大きく変化し、洗浄度合いが高いほど乳酸生産の増加が認められた。
【００６６】
（比較例１）（ｂ）洗浄工程を行わずに、乾式粉砕サトウキビバガスを酵素糖化して得られた糖含有液の発酵
（ｂ）工程を行わない以外は、実施例１と同じ操作を行った。
（ｃ）工程後、得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
（ｄ）工程後に得られた結果を表３に示す。実施例１に比べて、乳酸への変換率とエタノールへの変換率の合計が低く、Ｒは小さかった。
【００６７】
（比較例２）
下記のようにサトウキビバガスのシュレッダー処理を行い、得られた破砕サトウキビバガスの水洗工程、及び水洗して得られたサトウキビバガスを乾燥する工程を行った。
次いで、サトウキビバガスに対して、実施例１〜５と同じく、（ａ）工程、（ｃ）工程、及び（ｄ）工程を行った。なお、（ａ）工程後に（ｂ）工程は行わなかった。
【００６８】
〔シュレッダー処理工程〕
サトウキビバガスをシュレッダー（ＣＯＭＩＸ、クロスカットシュレッダーＳ３３０）にかけて破砕した。
〔水洗工程〕
前記シュレッダー処理工程で得られた破砕サトウキビバガスに対して合計３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：サトウキビバガス５０ｇに蒸留水５００ｇを加え、室温にて１０分混合撹拌した。続いてガーゼを引いたヌッチェ上にてスラリーを吸引ろ過し、薬さじで押さえることにより２８５ｇの液体を分離し捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られたケーク画分に、５００ｇの蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にてろ過を行い、４８０ｇの液体を分離し捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られたケーク画分に、５００ｇの蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にてろ過分離を行い、４８０ｇの液体を分離し捨てた。
算出された水溶性成分残存率を表３に示す。
〔乾燥工程〕
上記水洗工程で得られたサトウキビバガスを８０℃にて一晩乾燥させ、水分６質量％の乾燥サトウキビバガスを得た。
（ｃ）工程及び（ｄ）工程で得られた結果を表３に示す。実施例１〜５に比べ、乳酸への変換率とエタノールへの変換率の合計が低く、エタノールの生産が高く、乳酸の生産が低く、Ｒは小さかった。
【００６９】
（実施例６）  乾式アルカリ混合粉砕サトウキビバガスの水洗の効果
（ａ）工程、（ｂ）工程及び（ｃ）工程を以下のように行った以外は実施例１〜５と同じ操作を行った。
［（ａ）リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程］
〔乾式アルカリ混合粉砕処理〕
乾燥サトウキビバガス５０ｇと水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製）４．４ｇを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５８Ｌ）に５０ｇ投入し、ロッドとして、外径３０ｍｍ、長さ２１１ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５８体積％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｒ／ｍの条件で、１時間処理を行った。処理終了後、得られた粉砕物を前記振動ミルから取り出した。粉砕物の結晶化度は２％であった。また、体積基準の平均粒径は３６μｍであった。
【００７０】
〔（ｂ）粉砕物を洗浄する工程〕
得られた粉砕物に対し３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：粉砕された粉末６０ｇに蒸留水５４０ｇを加え、室温にて１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、５〜１０分）にて固形物を沈降させた後上清を３６０ｇ捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分に５００ｇの蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清を５０２ｇ捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分に、５００ｇの蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清を４９８ｇ捨てた。算出された水溶性成分残存率を表３に示す。
【００７１】
［（ｃ）洗浄工程で得られた固形物に加水分解酵素を用いて糖化物を得る工程］
洗浄工程にて得られたケークに蒸留水添加し合計で２５０ｇ弱とし、塩酸にてｐＨを５．０へ調整した後に総重量が２５０ｇになるように蒸留水を添加した。ついで糖化酵素（Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２、ノボザイム社、２．５ｍＬ）を添加し、５０℃、１００ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて４日間糖化反応を行った。糖化反応終了液はろ紙（ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）と孔径０．２２μｍのメンブレンフィルタシステム（ＩＷＡＫＩ、Ｃａｔ  ｎｏ．８０３０−００１）にてろ過し、無菌的な液を得た。なお得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
また、＜発酵性の評価＞で示した方法にて発酵性の評価を行った結果を表３に示す。
【００７２】
（比較例３）  乾式アルカリ混合粉砕サトウキビバガスを酵素糖化して得られた糖含有液の発酵
（ｂ）工程を行わない以外は、実施例６と同じ操作を行った。
（ｃ）工程及び（ｄ）工程で得られた結果を表３に示す。実施例６に比べ、乳酸への変換率とエタノールへの変換率の合計が低く、エタノールの生産が高く、乳酸の生産が低く、Ｒは小さかった。
【００７３】
（比較例４）  サトウキビバガスを水洗後、乾式アルカリ混合粉砕を行い酵素糖化して得られた糖含有液の発酵
サトウキビバガスの水洗工程、及び水洗して得られたサトウキビバガスを乾燥する工程を以下のように（ａ）工程の前に行った。
次いで、サトウキビバガスに対して、実施例６と同じく、（ａ）工程、（ｃ）工程、及び（ｄ）工程を行った。なお、（ａ）工程後に（ｂ）工程は行わなかった。
【００７４】
〔水洗工程〕
（ａ）工程前のサトウキビバガスに対して合計３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：サトウキビバガス６０ｇに蒸留水５４０ｇを加え、室温にて約１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、５〜１０分）にて固形物を沈降させた後ガーゼを通して上清２０３ｇを捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分とガーゼ上の固形物とに、５４０ｇの蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、ガーゼを通して上清５２７ｇを捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分とガーゼ上の固形物とに、５４０ｇの蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、ガーゼを通して上清５２７ｇを捨てた。算出された水溶性成分残存率を表３に示す。
〔乾燥工程〕
上記水洗工程で得られたサトウキビバガスを８０℃にて一晩乾燥させ、水分６質量％の乾燥サトウキビバガスを得た。
（ｃ）工程及び（ｄ）工程で得られた結果を表３に示す。実施例６に比べ、乳酸への変換率とエタノールへの変換率の合計が低く、エタノールの生産が高く、乳酸の生産が低く、Ｒは小さかった。
【００７５】
（実施例７）  乾式粉砕ＥＦＢ（パームの実を取った後の果房）に対する水洗の効果
〔バイオマスの乾燥処理〕
シュレッダー処理（ＣＯＭＩＸ、クロスカットシュレッダーＳ３３０）したＥＦＢを８０℃にて一晩乾燥させ、水分５質量％の乾燥ＥＦＢを得た。ＥＦＢのセルロース含有量は３６％、結晶化度は４０％であった。
【００７６】
〔（ａ）リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程〕
〔乾式粉砕処理〕
得られた乾燥ＥＦＢを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５８Ｌ）に５０ｇ投入し、ロッドとして、外径３０ｍｍ、長さ２１１ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５８体積％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｒ／ｍの条件で、１．０時間処理を行った。また、得られた粉砕物の温度は、処理に伴う発熱により、７０℃であった。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた粉砕物を前記振動ミルから取り出した。粉砕物の結晶化度は０％であった。また、体積基準の平均粒径は２０μｍであった。
【００７７】
〔（ｂ）粉砕物を洗浄する工程〕
得られた粉砕物に対し３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：粉砕された粉末５０ｇに蒸留水５００ｇを加え、室温にて１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、５〜１０分）にて固形物を沈降させた後上清３６５ｇを捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分に、洗浄１回目で捨てた上清と同重量（３６５ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３６２ｇを捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分に、洗浄２回目で捨てた上清と同重量（３６２ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３６１ｇを捨てた。
算出された水溶性成分残存率を表３に示す。
【００７８】
〔（ｃ）洗浄工程で得られた固形物に加水分解酵素を用いて糖化物を得る工程〕
洗浄処理にて得られた沈殿画分に総重量が２８０ｇとなるまで蒸留水を添加した後、糖化酵素（Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２、ノボザイム社、２．５ｍＬ）を添加し、５０℃、１５０ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて４．５日間糖化反応を行った。糖化反応終了液はろ紙（ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）と孔径０．２２μｍのメンブレンフィルタシステム（ＩＷＡＫＩ、Ｃａｔ  ｎｏ．８０３０−００１）にてろ過した。なお得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
【００７９】
〔（ｄ）糸状菌による糖化物の発酵工程〕
＜発酵性の評価＞で示した方法にて発酵性の評価を行った。結果を表３に示す。
【００８０】
（比較例５）
（ｂ）工程を行わない以外は、実施例７と同じ操作を行った。
（ｃ）工程後、得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
（ｄ）工程後に得られた結果を表３に示す。実施例７に比べて、乳酸への変換率とエタノールへの変換率の合計が低く、Ｒは小さかった。
【００８１】
（実施例８）  乾式粉砕イナワラに対する水洗の効果
〔バイオマスの乾燥処理〕
鋏で５ｃｍ長に切断したイナワラを８０℃にて一晩乾燥させ、水分６質量％の乾燥イナワラを得た。イナワラのセルロース含有量は４０％、結晶化度は５４％であった。
【００８２】
［（ａ）リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程］
〔乾式粉砕処理〕
上記乾燥工程で得られた乾燥イナワラを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５８Ｌ）に５０ｇ投入し、ロッドとして、外径３０ｍｍ、長さ２１１ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３本を振動ミルに充填（充填率５８体積％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｒ／ｍの条件で、０．５時間処理を行った。また、得られた粉砕物の温度は、処理に伴う発熱により、６５℃であった。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた粉砕物を前記振動ミルから取り出した。粉砕物の結晶化度は７％であった。また、体積基準の平均粒径は２５μｍであった。
【００８３】
〔（ｂ）粉砕物を洗浄する工程〕
得られた粉砕物に対し３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：粉砕された粉末５０ｇに蒸留水５００ｇを加え、室温にて１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、５〜１０分）にて固形物を沈降させた後上清４１０ｇを捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分に、洗浄１回目で捨てた上清と同重量（４１０ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清４０６ｇを捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分に、洗浄２回目で捨てた上清と同重量（４０６ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清４１０ｇを捨てた。
算出された水溶性成分残存率表３に示す。
【００８４】
〔（ｃ）洗浄工程で得られた固形物に加水分解酵素を用いて糖化物を得る工程〕
実施例１〜５に記載の（ｃ）工程と同じ操作を行った。なお得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
【００８５】
〔（ｄ）糸状菌による糖化物の発酵工程〕
＜発酵性の評価＞で示した方法にて発酵性の評価を行った。結果を表３に示す。
【００８６】
（比較例６）
（ｂ）工程を行わない以外は、実施例８と同じ操作を行った。
（ｃ）工程後、得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
（ｄ）工程後に得られた結果を表３に示す。実施例８に比べて、乳酸への変換率とエタノールへの変換率の合計が低く、Ｒは小さかった。
【００８７】
実施例１乃至５と比較例１の結果から、（ａ）工程後に（ｂ）洗浄工程を行い、（ｃ）工程及び（ｄ）工程を行うと糖の乳酸への変換率が高くなることが分かった。
実施例１乃至５と比較例２の結果から、（ａ）工程前ではなく、（ａ）工程後に（ｂ）洗浄工程を行うと糖の乳酸への変換率が高くなることが分かった。
【００８８】
（実施例９）  乾式粉砕サトウキビバガスの水洗の効果（粉砕媒体の影響）
〔バイオマスの乾燥処理〕
サトウキビバガスを８０℃にて一晩乾燥させ、水分５質量％の乾燥サトウキビバガスを得た。サトウキビバガスのセルロース含有量は３８％、結晶化度は３７％であった。
【００８９】
〔（ａ）リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程〕
〔乾式粉砕処理〕
上記乾燥工程で得られた乾燥サトウキビバガスを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５８Ｌ）に５０ｇ投入し、粉砕媒体として、外径１０ｍｍ、材質ステンレスの球１５．４ｋｇを振動ミルに充填（充填率５８体積％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｒ／ｍの条件で、１．０時間処理を行った。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた粉砕物を前記振動ミルから取り出しした。粉砕物の結晶化度は０％であった。また、体積基準の平均粒径は３６μｍであった。
【００９０】
〔（ｂ）粉砕物を洗浄する工程〕
得られた粉砕物に対し３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：粉砕された粉末５０ｇに蒸留水５００ｇを加え、室温にて１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、１０分）にて固形物を沈降させた後上清３７３ｇを捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分に、洗浄１回目で捨てた上清と同重量（３７３ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３７３ｇを捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分に、洗浄２回目で捨てた上清と同重量（３７３ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３７２ｇを捨てた。
算出された水溶性成分残存率を表３に示す。
【００９１】
〔（ｃ）洗浄工程で得られた固形物に加水分解酵素を用いて糖化物を得る工程〕
洗浄工程にて得られた沈殿画分に総重量が２５０ｇとなるまで蒸留水を添加した後、糖化酵素（Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２、ノボザイム社、２．５ｍＬ）を添加し、５０℃、１００ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて４．５日間糖化反応を行った。糖化反応終了液はろ紙（ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）と孔径０．２２μｍのメンブレンフィルタシステム（ＩＷＡＫＩ、Ｃａｔ  ｎｏ．８０３０−００１）にてろ過した。なお得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
【００９２】
〔（ｄ）糸状菌による糖化物の発酵工程〕
＜発酵性の評価＞で示した方法にて発酵性の評価を行った。結果を表３に示す。実施例９の結果から、粉砕媒体がボールであっても（ｃ）洗浄工程の導入により糖の乳酸への変換率が高くなることが分かった。
【００９３】
（実施例１０）  乾式粉砕サトウキビバガスの水洗の効果（粉砕程度の影響）
〔バイオマスの乾燥処理〕
サトウキビバガスを８０℃にて一晩乾燥させ、水分５質量％の乾燥サトウキビバガスを得た。サトウキビバガスのセルロース含有量は３８％、結晶化度は３７％であった。
【００９４】
［（ａ）リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程］
〔乾式粉砕処理〕
上記乾燥工程で得られた乾燥サトウキビバガスを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５８Ｌ）に５０ｇ投入し、粉砕媒体として、外径３０ｍｍ、長さ２１１ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３  本を振動ミルに充填（充填率５８体積％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｒ／ｍの条件で、０．１７時間処理を行った。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた粉砕物を前記振動ミルから取り出しした。粉砕物の結晶化度は２１％であった。また、体積基準の平均粒径は３８μｍであった。
【００９５】
〔（ｂ）粉砕物を洗浄する工程〕
得られた粉砕物に対し３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：粉砕された粉末５０ｇに蒸留水５００ｇを加え、室温にて１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、１０分）にて固形物を沈降させた後上清３８０ｇを捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分に、洗浄１回目で捨てた上清と同重量（３８０ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３７９ｇを捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分に、洗浄２回目で捨てた上清と同重量（３７９ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３８０ｇを捨てた。算出された水溶性成分残存率を表３に示す。
【００９６】
〔（ｃ）洗浄工程で得られた固形物に加水分解酵素を用いて糖化物を得る工程〕
洗浄工程にて得られた沈殿画分に総重量が２５０ｇとなるまで蒸留水を添加した後、糖化酵素（Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２、ノボザイム社、２．５ｍＬ）を添加し、５０℃、１００ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて４．５日間糖化反応を行った。糖化反応終了液はろ紙（ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）と孔径０．２２μｍのメンブレンフィルタシステム（ＩＷＡＫＩ、Ｃａｔ  ｎｏ．８０３０−００１）にてろ過した。なお得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表３に示す。
【００９７】
〔（ｄ）糸状菌による糖化物の発酵工程〕
＜発酵性の評価＞で示した方法にて発酵性の評価を行った。結果を表３に示す。実施例１０の結果から、粉砕後の結晶化度が３０％以下であれば糖の乳酸への変換率が高いことが分かった。
【００９８】
【表３】
2013230142.tif 000004
【００９９】
（実施例１１）  乾式粉砕サトウキビバガスの水洗の効果（フマル酸生産への影響）
〔バイオマスの乾燥処理〕
サトウキビバガスを８０℃にて一晩乾燥させ、水分６質量％の乾燥サトウキビバガスを得た。サトウキビバガスのセルロース含有量は３８％、結晶化度は３７％であった。
【０１００】
［（ａ）リグノセルロース系バイオマスを粉砕する工程］
〔乾式粉砕処理〕
上記乾燥工程で得られた乾燥サトウキビバガスを振動ミル（中央化工機株式会社製、「ＭＢ−１」、容器全容量３．５８Ｌ）に５０ｇ投入し、粉砕媒体として、外径３０ｍｍ、長さ２１１ｍｍ、材質ステンレス、断面形状が円形のロッド１３  本を振動ミルに充填（充填率５８体積％）して、振幅８ｍｍ、円回転１２００ｒ／ｍの条件で、０．５時間処理を行った。
処理終了後、振動ミル内の壁面や底部にパルプの固着物等はみられなかった。得られた粉砕物を前記振動ミルから取り出しした。粉砕物の結晶化度は１３％であった。また、体積基準の平均粒径は２５μｍであった。
【０１０１】
〔（ｂ）粉砕物を洗浄する工程〕
得られた粉砕物に対し３回の洗浄操作を実施した。
洗浄１回目：粉砕された粉末５０ｇに蒸留水５００ｇを加え、室温にて１０分混合撹拌した。粉砕物と蒸留水からなる分散液の温度は室温であった。続いて遠心分離（遠心分離機：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＨＩＭＡＣ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ、ローター：Ｒ９Ａ、７０００ｒ／ｍ、１０分）にて固形物を沈降させた後上清３８４ｇを捨てた。
洗浄２回目：洗浄１回目で得られた沈殿画分に、洗浄１回目で捨てた上清と同重量（３８４ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３８４ｇを捨てた。
洗浄３回目：洗浄２回目で得られた沈殿画分に、洗浄２回目で捨てた上清と同重量（３８４ｇ）の蒸留水を添加して再び混合撹拌した後に１回目と同条件にて遠心分離を行い、上清３８４ｇを捨てた。
算出された水溶性成分残存率を表４に示す。
【０１０２】
〔（ｃ）洗浄工程で得られた固形物を加水分解酵素により加水分解して糖化物を得る工程〕
洗浄工程にて得られた沈殿画分に総重量が２５０ｇとなるまで蒸留水を添加した後、糖化酵素（Ｃｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２、ノボザイム社、２．５ｍＬ）を添加し、５０℃、１００ｒ／ｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ−９８Ｒ）にて４．５日間糖化反応を行った。糖化反応終了液はろ紙（ｎｏ．２、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）と孔径０．２２μｍのメンブレンフィルタシステム（ＩＷＡＫＩ、Ｃａｔ  ｎｏ．８０３０−００１）にてろ過した。なお得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表４に示す。
【０１０３】
〔（ｄ）糸状菌による糖化物の発酵工程〕
糸状菌としてＲ．ｏｒｙｚａｅ  ＮＢＲＣ４７４９株を用い、＜ペレット化糸状菌の調製＞に示した方法にて糸状菌ペレットを調製した。また、糸状菌ペレットを２０ｇ（ウエット状態の重量）用いたこと、バイオマスの酵素糖化液量が８０ｍＬであったこと以外は＜発酵性の評価＞に示した方法にて発酵性の評価を行った。結果を表４に示す。
実施例１１は比較例７に比べてフマル酸の生産性が高く、即ち洗浄を実施することによりフマル酸の生産性向上が認められた。
【０１０４】
（比較例７）（ｂ）洗浄工程を行わずに、乾式粉砕サトウキビバガスを酵素糖化して得られた糖含有液の発酵（フマル酸生産性への影響）
（ｂ）工程を行わない以外は、実施例１１と同じ操作を行った。
（ｃ）工程後、得られた液をＨＰＬＣにて分析を行った。得られた糖化物中のグルコースとキシロースの濃度の合計（Ｇ0＋Ｘ0）を表４に示す。
また、実施例１１と同じように発酵性の評価を行った結果を表４に示す。
比較例７は実施例１１に比べてフマル酸の生産性が低かった。
【０１０５】
【表４】
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