(57)【要約】      （修正有）【課題】医薬品の中間体として有用な光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの効率的かつ工業的な製造方法を提供する。【解決手段】２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルにポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または該生物体の処理物を作用させて還元することにより、光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する。ポリペプチドは、キャンディダ属、ロードトルーラ属、デボシア属、オガタエア属、ブレブンディモナス属、ラクトバシラス属、サーモアナエロビウム属、ロドコッカス属、スポロボロマイセス属、スポリディオボラス属からなる群より選ばれた微生物由来のものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（９）；
【化１２】
2013046572.tif 000013
（式中、Ｒは炭素数１〜６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７〜１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。ｎは０〜８の整数を表す。＊１、＊２は不斉炭素を表す。）で表される光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であって、一般式（８）；
【化１３】
2013046572.tif 000014
（式中、Ｒ，ｎは前記に同じ。）で表される２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、ポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
ｎが１である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
ポリペプチドが、キャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、デボシア（Devosia）属、オガタエア（Ogataea）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項１もしくは請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記式（９）で表される光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルが、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルである、請求項１もしくは請求項２に記載の製造方法。
【請求項５】
ポリペプチドが、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
ポリペプチドが下記（ａ１）、（ａ２）、および（ａ３）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項４に記載の製造方法：
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
前記（ａ１）、（ａ２）、および（ａ３）からなる群から選択されるポリペプチドを産生する生物体が、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）および（Ａ４）からなる群から選択されるＤＮＡを導入された組換え生物である、請求項４に記載の製造方法：
（Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ、
（Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ前記式（８）とＮＡＤＰＨに作用して前記式（９）とＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ４）、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
組換え生物が Escherichia coli（大腸菌）である請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記式（９）において、＊１が（Ｓ），＊２が（Ｓ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、オガタエア（Ogataea）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、請求項１もしくは請求項２に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記式（９）において、＊１が（Ｓ），＊２が（Ｒ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、デボシア（Devosia）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、請求項１もしくは請求項２に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記式（９）において、＊１が（Ｒ），＊２が（Ｓ）の絶対立体配置であり、かつポリペプチドがキャンディダ（Candida）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものである、請求項１もしくは請求項２に記載の製造方法。
【請求項１２】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドを更に作用させる請求項１〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
上記（ａ１）、（ａ２）、または（ａ３）のポリペプチドに加えて、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの生産能を付与された組換え生物を用いる、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素である請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
Ｒが炭素数１〜４の置換もしくは無置換のアルキル基である、請求項１〜１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
Ｒがメチル基もしくはエチル基である、請求項１〜１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６いずれかに記載の方法にて製造した一般式（９）；
【化１４】
2013046572.tif 000015
（式中、Ｒは炭素数１〜６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７〜１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。ｎは０〜８の整数を表す。＊１、＊２は不斉炭素を表す。）で表される２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルとアンモニアを反応させ、式（３）；
【化１５】
2013046572.tif 000016
（式中、＊１、＊２は前記に同じ）で表される２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミド体を得ることを特徴とする製造方法。
【請求項１８】
前記式（３）で表される２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドを、晶析精製することを特徴とする請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
式（３）中に存在するジアステレオマー含量が、モル比で５．０モル％以下である請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
式（３）中に存在するジアステレオマー含量が、モル比で２．０モル％以下である請求項１７又は１９記載の製造方法。
【請求項２１】
請求項１７〜２０いずれかに記載の方法にて製造した前記式（３）；
【化１６】
2013046572.tif 000017
（式中、＊１、＊２は前記に同じ）で表される２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドを塩基存在下、ハロゲン化剤と反応させ、一般式（２）；
【化１７】
2013046572.tif 000018
（式中、Ｒ’は炭素数１〜６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７〜１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。＊１、＊２は前記に同じ）で表される２−アミノシクロアルカノール誘導体、もしくは式（２）’；
【化１８】
2013046572.tif 000019
（式中、＊１、＊２は前記に同じ。）で表される２−アミノシクロアルカノールを得ることを特徴とする製造方法。
【請求項２２】
＊１、＊２がともに（Ｒ）の立体配置である請求項１７〜２１いずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルの製造方法に関する。光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルは、医薬品、農薬等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。
【０００３】
２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを水素化ホウ素ナトリウムなどで２位のカルボニル基を還元すると、２つの不斉炭素が生じるため、４種類の立体異性体（シス（ｃｉｓ）体の（１Ｒ，２Ｓ体）と（１Ｓ，２Ｒ）体、トランス（ｔｒａｎｓ）体の（１Ｓ，２Ｓ）体と（１Ｒ，２Ｒ）体）の混合した２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルが生成する。
【０００４】
医薬品や農薬等の合成原料として有用なのは、特定の立体の光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルであり、他の立体異性体が含有しているとそれは不純物となる。そのため、不要な立体異性体をできるだけ含まない、目的にあった立体の光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの効率的な製造技術が求められている。
【０００５】
光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法の一つに、微生物菌体や酵素を触媒とした２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルの不斉還元法が挙げられる。
【０００６】
光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、例えば、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルの製造方法については、以下が報告されている。
【０００７】
クレブジラ・ニウモニエ（Klebsiella pneumoniae）（特許文献１、非特許文献１）、ゲオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum）、ムコール・ラセモサス（Mucor racemosus）、ムコール・サーシネロイデス（Mucor circinelloides）、クニングガメラ・グロエオスポロイデス（Cunninghamella gloeosporoides）（非特許文献２）、還元酵素ＫＲＥＤ１０２、ＫＲＥＤ１０３、ＫＲＥＤ１０６（非特許文献３）を用いた２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元では、主として（１Ｒ，２Ｓ）体の２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルが生成すると報告されている。
【０００８】
また、還元酵素ＫＲＥＤ１０７、ＫＲＥＤ１３１（非特許文献３）を用いた２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元では、主として（１Ｓ，２Ｒ）体の２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルが生成すると報告されている。
【０００９】
また、アブシディア・グラウカ（Absidia glauca）、リゾプス・アーリズス（Rhizopus arrhizus）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）（非特許文献２）、還元酵素ＫＲＥＤ１１３（非特許文献３）を用いた２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元では、主として（１Ｓ，２Ｓ）体の２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルが生成すると報告されている。
【００１０】
以上のように、微生物や酵素を用いた２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルの不斉還元例はあるものの、特定の微生物や酵素を用いた還元反応に限られており、特に、還元反応での主生成物が（１Ｒ，２Ｒ）体の２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとする報告はこれまでに全く存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特平５−１９２１８７
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Biosci. Biotech. Biochem., 60(5), 760-764,(1996)
【非特許文献２】Tetrahedron Letters, 27(23), 2631-2634,(1986)
【非特許文献３】Tetrahedron, 62, 901-905,(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、医薬品の中間体として有用な光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルを効率的かつ工業的に製造することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの簡便かつ効率的な製造方法を開発すべく検討を重ねた結果、特定のポリペプチドを２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに作用させて不斉還元することにより、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルの特定の立体異性体を効率的に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。
【００１６】
本発明は、光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、好ましくは２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルの製造方法であって、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、ポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元することを特徴とする方法である。ポリペプチドとしては、キャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、デボシア（Devosia）属、オガタエア（Ogataea）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のポリペプチドがあげられる。
【００１７】
また、本発明は、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であり、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルにポリペプチド、好ましくはスポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のポリペプチド、を作用させることを特徴とする方法である。
【００１８】
また、本発明は、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であって、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、ポリペプチド、好ましくは下記（ａ１）、（ａ２）、および（ａ３）からなる群から選択されるポリペプチド、該ポリペプチドを産生する生物体、または、該生物体の処理物を作用させて、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元することを特徴とする方法である：
（ａ１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド、
（ａ３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチド。
【００１９】
また、上記の（ａ１）、（ａ２）、および（ａ３）からなる群から選択されるポリペプチドを産生する生物体が、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、および（Ａ４）からなる群から選択されるＤＮＡを導入された組換え生物であることが好ましい。
（Ａ１）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ、
（Ａ２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ３）配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ａ４）、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００２０】
上記製造方法において、組換え生物が Escherichia coli（大腸菌）であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明は、（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であり、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、キャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、オガタエア（Ogataea）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属からなる群から選ばれた微生物由来のポリペプチドを作用させることを特徴とする方法である。
【００２２】
また、本発明は、（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であり、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、キャンディダ（Candida）属、デボシア（Devosia）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属からなる群から選ばれた微生物由来のポリペプチドを作用させることを特徴とする方法である。
【００２３】
また、本発明は、（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法であり、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに、キャンディダ（Candida）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属からなる群から選ばれた微生物由来のポリペプチドを作用させることを特徴とする方法である。
【００２４】
上記のいずれの製造方法においても、還元型補酵素再生能を有するポリペプチドを更に作用させることが好ましい。
【００２５】
また、本発明は、上記の方法で得られる２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルとアンモニアを反応させることを特徴とする、２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドの製造方法に関する。
【００２６】
また、本発明は、上記で得られる２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミドを塩基条件下でハロゲン化剤と反応させることを特徴とする２−アミノシクロアルカノールの製造方法に関する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の方法によれば、光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル、特に光学活性２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルを効率的かつ工業的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明について実施形態を用いて詳細に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２９】
なお、本発明で製造する光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルとは、２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの４種類の立体異性体に占める目的の立体異性体の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上の２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルである。これについては後に詳説する。
【００３０】
本発明で用いるポリペプチド
本発明で用いるポリペプチドは、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに作用して光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを生成する活性を有するものであれば、いずれを用いても良い。本ポリペプチドの取得方法は、後で詳述する。
【００３１】
以下、本発明で用いるポリペプチドについて、（１Ｒ、２Ｒ）体の２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造に用いるポリペプチドを例に用いて詳説する。なお、他の立体異性体の２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造に用いるポリペプチドについても、以下の内容が適応できる。
【００３２】
本発明で用いるポリペプチドとしては、例えば（１Ｒ、２Ｒ）体の２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる（（ａ１）のポリペプチド）。また、本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい（（ａ２）のポリペプチド）。これらのポリペプチドは、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限りは、上記ポリペプチドに包含される。
【００３３】
ここで「複数個のアミノ酸」とは、例えば、５０個、好ましくは３０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸を意味する。
【００３４】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している領域を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、公知の微生物由来のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。
【００３５】
置換、挿入、欠失及び／または付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。
【００３６】
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Pro, Phe 
（第２群：中性極性アミノ酸）Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr
（第３群：酸性アミノ酸）Glu, Asp
（第４群：塩基性アミノ酸）His, Lys, Arg。
【００３７】
また、本発明で用いるポリペプチドとしては、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドであってもよい（（ａ３）のポリペプチド）。
【００３８】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性は８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９８％以上もしくは９９％以上がより最も好ましい。
【００３９】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。
【００４０】
２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。例えば、ヒスチジンタグやＨＡタグのようなタグ配列を付加しても良い。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。
【００４１】
また、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性のレベルが低下する場合であっても、実質的に同等の活性があれば、本発明のポリペプチドに包含される。ここで「実質的に同等の活性」とは、元の活性に対して、例えば５０％以上、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上あるいは９５％以上の活性を言う。活性の測定は、後述の方法で実施できる。
【００４２】
本発明で用いるポリペプチドの取得方法
本発明で用いるポリペプチドは、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルを還元して、光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを生成する能力を有する微生物から取得できる。該ポリペプチドを有する微生物は、例えば、以下の方法で見出すことができる。
【００４３】
微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下で２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルと反応させる。反応後、溶剤などで抽出を行い、ガスクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーなどで分析することにより、生成する２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの生成量、４種類の立体異性体の組成比を確認すればよい。
【００４４】
微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃〜３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。
【００４５】
微生物からの本発明に用いるポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。そして、熱処理、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明に用いるポリペプチドを単離する。
【００４６】
単離したポリペプチドの２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルに対する還元活性は、評価したいポリペプチドと２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルとを作用させた後に、２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの生成をガスクロマトグラフィーなどで分析することにより評価できる。また、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステル還元活性、例えば、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性については、以下の簡便な方法でも評価できる。
【００４７】
［２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対する還元活性の測定方法］
２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステル１０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、および粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出する。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する酵素活性を１Ｕと定義する。ＮＡＤＰＨのかわりにＮＡＤＨを用いても良い。
【００４８】
本発明で用いるポリペプチドの起源は限定されるものではないが、好ましくはキャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、デボシア（Devosia）属、オガタエア（Ogataea）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものである。
【００４９】
（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはスポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、スポリディオボラス（Sporidiobolus）属からなる群より選ばれた微生物由来のものが好ましい。
【００５０】
スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属酵母としては、例えば、スポロボロマイセス・アルビダス（Sporobolomyces albidus）、スポロボロマイセス・アルボルベスセンス（Sporobolomyces alborubescens）、スポロボロマイセス・アルバス（Sporobolomyces albus）、スポロボロマイセス・アンタークティカス（Sporobolomyces antarcticus）、スポロボロマイセス・ビスフォフィア（Sporobolomyces bischofiae）、スポロボロマイセス・ブルーミ（Sporobolomyces blumeae）、スポロボロマイセス・コルニカラー（Sporobolomyces carnicolor）、スポロボロマイセス・コプロフィラス（Sporobolomyces coprophilus）、スポロボロマイセス・コプロスマ（Sporobolomyces coprosmae）、スポロボロマイセス・コプロスミコーラ（Sporobolomyces coprosmicola）、スポロボロマイセス・コラリフォーミス（Sporobolomyces coralliformis）、スポロボロマイセス・ディメナエ（Sporobolomyces dimmenae）、スポロボロマイセス・ディオスピロリス（Sporobolomyces diospyroris）、スポロボロマイセス・ドラコフィラス（Sporobolomyces dracophyllus）、スポロボロマイセス・エロンガタス（Sporobolomyces elongatus）、スポロボロマイセス・ファルカタス（Sporobolomyces falcatus）、スポロボロマイセス・フォリーコラ（Sporobolomyces foliicola）、スポロボロマイセス・グラシリス（Sporobolomyces gracilis）、スポロボロマイセス・グリセオフラバス（Sporobolomyces griseoflavus）、スポロボロマイセス・ホルサチカス（Sporobolomyces holsaticus）、スポロボロマイセス・イノシトフィラス（Sporobolomyces inositophilus）、スポロボロマイセス・インターメディウス（Sporobolomyces intermedius）、スポロボロマイセス・クルイベリ−ニエリー（Sporobolomyces kluyveri-nielii）、スポロボロマイセス・ラクトフィラス（Sporobolomyces lactophilus）、スポロボロマイセス・ラクトサス（Sporobolomyces lactosus）、スポロボロマイセス・リンデラ（Sporobolomyces linderae）、スポロボロマイセス・ロファセリ（Sporobolomyces lophatheri）、スポロボロマイセス・マグニスポラス（Sporobolomyces magnisporus）、スポロボロマイセス・マルシラエ（Sporobolomyces marcillae）、スポロボロマイセス・ミスカンチ（Sporobolomyces miscanthi）、スポロボロマイセス・ナガノエンシス（Sporobolomyces naganoensis）、スポロボロマイセス・ノバジアランディカス（Sporobolomyces novazealandicus）、スポロボロマイセス・ナイランディ（Sporobolomyces nylandii）、スポロボロマイセス・オドラタス（Sporobolomyces odoratus）、スポロボロマイセス・オドラス（Sporobolomyces odorus）、スポロボロマイセス・オガサワレンシス（Sporobolomyces ogasawarensis）、スポロボロマイセス・オリジコーラ（Sporobolomyces oryzicola）、スポロボロマイセス・パラロセウス（Sporobolomyces pararoseus）、スポロボロマイセス・ファフィ（Sporobolomyces phaffii）、スポロボロマイセス・フィラダス（Sporobolomyces phylladus）、スポロボロマイセス・フィロマティス（Sporobolomyces phyllomatis）、スポロボロマイセス・ポルアッシ（Sporobolomyces pollaccii）、スポロボロマイセス・プーンスーキー（Sporobolomyces poonsookiae）、スポロボロマイセス・プニセウス（Sporobolomyces puniceus）、スポロボロマイセス・ピロシ（Sporobolomyces pyrrosiae）、スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、スポロボロマイセス・ルバー（Sporobolomyces ruber）、スポロボロマイセス・ルバーリムス・バー・アルバス（Sporobolomyces ruberrimus var. albus）、スポロボロマイセス・ル��ーリムス・バー・ルバーリムス（Sporobolomyces ruberrimus var. ruberrimus）、スポロボロマイセス・サリシナス（Sporobolomyces salicinus）、スポロボロマイセス・サルモネウス（Sporobolomyces salmoneus）、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmonicolor）、スポロボロマイセス・サシコーラ（Sporobolomyces sasicola）、スポロボロマイセス・シバタナス（Sporobolomyces shibatanus）、スポロボロマイセス・シングラリス（Sporobolomyces singularis）、スポロボロマイセス・スブルンネス（Sporobolomyces subbrunneus）、スポロボロマイセス・スブロセウス（Sporobolomyces subroseus）、スポロボロマイセス・シジギー（Sporobolomyces syzygii）、スポロボロマイセス・タウポエンシス（Sporobolomyces taupoensis）、スポロボロマイセス・テヌイス（Sporobolomyces tenuis）、スポロボロマイセス・ツガエ（Sporobolomyces tsugae）、スポロボロマイセス・バーミキュラタス（Sporobolomyces vermiculatus）、スポロボロマイセス・ウェイマニ（Sporobolomyces weijmanii）、スポロボロマイセス・ザンザス（Sporobolomyces xanthus）、スポロボロマイセス・ヤマトアヌス（Sporobolomyces yamatoanus）、スポロボロマイセス・ユチコーラ（Sporobolomyces yuccicola）、スポロボロマイセス・ユンナネンシス（Sporobolomyces yunnanensis）、などが挙げられる。
【００５１】
スポリディオボラス（Sporidiobolus）属酵母としては、例えば、スポリディオボラス・ジョンソニ（Sporidiobolus johnsonii）、スポリディオボラス・ミクロスポラス（Sporidiobolus microsporus）、スポリディオボラス・パラロセウス（Sporidiobolus pararoseus）、スポリディオボラス・ルイネニエ（Sporidiobolus ruineniae）、スポリディオボラス・ルイネニエ・バー・コプロフィラス（Sporidiobolus ruineniae var. coprophilus）、スポリディオボラス・サルモニカラー（Sporidiobolus salmonicolor）、などが挙げられる。
【００５２】
また、新たに自然界から分離した新種のスポロボロマイセス（Sporobolomyces）属やスポリディオボラス（Sporidiobolus）属酵母なども挙げられる。
【００５３】
好ましくは、スポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmonicolor）、スポリディオボラス・サルモニカラー（Sporidiobolus salmonicolor）などが挙げられる。
【００５４】
（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはキャンディダ（Candida）属、ロードトルーラ（Rhodotorula）属、オガタエア（Ogataea）属、サーモアナエロビウム（Themoanaerobium）属からなる群から選ばれた微生物由来のものが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）、ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Rhodotorula glutinis var. dairenensis）、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea minuta var. minuta）、サーモアナエロビウム・ブロッキ（Themoanaerobium brockii）由来のポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）由来の還元酵素ＣＲ酵素（実施例４）、ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Rhodotorula glutinis var. dairenensis）NBRC0415 由来の還元酵素ＲＲＧ（実施例５）、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea minuta var. minuta）NBRC0975 由来の還元酵素（実施例６）などである。これら酵素の理化学的性質、アミノ酸配列、取得方法については、ＣＲ酵素は国際公報ＷＯ０１／０４０４５０、ＲＲＧ酵素は国際公報ＷＯ０３／０９３４７７、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea minuta var. minuta）NBRC0975 由来の還元酵素は国際公報ＷＯ０６／０１３８０１、に記載されている。
【００５５】
（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはキャンディダ（Candida）属、デボシア（Devosia）属、ブレブンディモナス（Brevundimonas）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マリス（Candida maris）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas diminuta）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバシラス・ケフィア（Lactobacillus kefir）由来のポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、キャンディダ・マリス（Candida maris）NBRC10003由来の還元酵素ＦＰＤＨ（実施例９）、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）NBRC13584 由来のＲＤＲ還元酵素（実施例１０）、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas diminuta）NBRC13584由来の還元酵素（実施例１１）などである。これら酵素の理化学的性質、アミノ酸配列、取得方法については、ＦＰＤＨ酵素は国際公報ＷＯ０１／０５９９６、ＲＲＧ酵素は国際公報ＷＯ０４／０２７０５５、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas diminuta）NBRC13584 由来の還元酵素は国際公報ＷＯ０７／１１４２１７、に記載されている。
【００５６】
（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルを製造する場合は、用いるポリペプチドとしてはキャンディダ（Candida）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属からなる群から選ばれた微生物由来のものが好ましい。より好ましくは、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来のポリペプチドである。特に好ましいポリペプチドは、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）NBRC1977由来の還元酵素（実施例１４）、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）NBRC708由来の還元酵素（実施例１５）などである。これら酵素の理化学的性質、アミノ酸配列、取得方法については、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）NBRC1977由来の還元酵素は国際公報ＷＯ０８／０６６０１８、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）NBRC708由来の還元酵素は特開２００３−２８９８７４、に記載されている。
【００５７】
上記の微生物は、例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。
・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）。
・独立行政法人理化学研究所  バイオリソースセンター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒351-0198  埼玉県和光市広沢2-1）
・German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH（ＤＳＭＺ）（Marschroder Weg 1b, D-38124 Brunswick, Germany）。
【００５８】
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。天然よりクローニングされたＤＮＡ、ｃＤＮＡの他、合成によって得られるＤＮＡも含まれる。
【００５９】
該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。
【００６０】
なお、本明細書において後述する、ＤＮＡクローニング、ベクターの調製及び形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施することができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。
【００６１】
まず、先の「本発明で用いるポリペプチドの取得方法」で記載した方法により単離された本発明で用いるポリペプチドを、適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。
【００６２】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。もしくは、該ポリペプチドの起源となる微生物のｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製する。これらのＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）等を用いて行うことができる。
【００６３】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバース（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、その全体の配列を決定することができる。
【００６４】
このようにして得られる本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号１に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ（（Ａ２）のＤＮＡ）が挙げられる。具体的には、配列表の配列番号２に示すＤＮＡ（（Ａ１）のＤＮＡ）を挙げることができる。
【００６５】
また、本発明で用いるＤＮＡとしては、配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ３）のＤＮＡ）。
【００６６】
また、本発明で用いるＤＮＡとしては、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい（（Ａ４）のＤＮＡ）。
【００６７】
ここで、「配列表の配列番号２に記載のＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつ２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。
【００６８】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃で相補鎖形成を行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．３倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．０５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
【００６９】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００７０】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡと、配列同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰＨに作用して（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルとＮＡＤＰを生成する活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。
【００７１】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG Wisconsin Package（Program Manual for The Wisconsin Package, Version8, 1994年9月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medison, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England）、及び、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland）。
【００７２】
本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物
本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物としては、例えば、上記で述べた（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）、または（Ａ４）のいずれかに記載のＤＮＡを導入された組換え生物を挙げることができる。
【００７３】
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して作製したポリペプチド発現ベクターを用いて宿主生物を形質転換すれば、本発明で用いるポリペプチドを生産する組換え生物が得られる。この生物が生育しうる培地を用いて培養することにより、本発明のポリペプチドを発現させることができる。更に、本発明で用いるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入する方法なども利用できる。
【００７４】
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
【００７５】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例２参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）などが挙げられる。
【００７６】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。
【００７７】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【００７８】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００７９】
本発明で用いるポリペプチドを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限されないが、宿主ベクター系の開発されている生物が好ましい。
【００８０】
利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、及びラクトバチルス（Lactobacillus）属などの細菌；ロドコッカス（Rhodococcus）属及びストレプトマイセス（Streptomyces）属などの放線菌；サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、ピキア（Pichia）属、及びキャンディダ（Candida）属などの酵母；ノイロスポラ（Neurospora）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、及びトリコデルマ（Trichoderma）属などのカビなどが挙げられる。
【００８１】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕などの昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率からは微生物が好ましく、細菌がより好ましく、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）（通称は大腸菌）が特に好ましい。
【００８２】
本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターは、公知の方法により宿主生物に導入できる。
【００８３】
例えば、ベクターｐＵＣ１１８に配列番号２に示すＤＮＡを導入して作成されたプラスミドｐＵＣＡＲ２（Applied and Environmental Microbiology, 65(12), 5207-5211, (1999)）を、宿主微生物である大腸菌に導入する場合、市販の E. coli コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した組換え生物 E. coli、例えば E. coli JM109（ｐＵＣＡＲ２）（実施例１参照）、が得られる。
【００８４】
また、本発明で用いるポリペプチド及び後述する還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた組換え生物も育種することができる。すなわち、本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。また、本発明で用いるポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても、本発明で用いるポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを同一菌体内で生産する組換え生物が育種できる。
【００８５】
ポリペプチドもしくは組換え生物を用いた光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造
上記ポリペプチドもしくは該ポリペプチドを発現させた組換え生物を用いて、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステル（８）；
【００８６】
【化１】
2013046572.tif 000002
【００８７】
を還元して光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）；
【００８８】
【化２】
2013046572.tif 000003
【００８９】
を製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。
【００９０】
前記式（８）、（９）中、ｎは０〜８の整数を表す。中でも好ましくは０〜４であり、さらに好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。ｎ＝１の場合、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステルは、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルであり、生成物である光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルは２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルである。
【００９１】
前記式（８）、（９）中、Ｒは炭素数１〜６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７〜１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。炭素数１〜４の置換もしくは無置換のアルキルとしては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基としては例えば、フェニル基、ｐ−メチルフェニル基、ｏ−メチルフェニル基、ｍ−メチルベンジル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等が挙げられる。炭素数７〜１１のアラルキル基としては例えば、ベンジル基、ｐ−メチルベンジル基、ｏ−メチルベンジル基、ｍ−メチルベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−トリフルオロメチルベンジル基等が挙げられる。中でも好ましくは炭素数１〜４の置換もしくは無置換のアルキル基であり、さらに好ましくはメチル基、エチル基である。
【００９２】
前記式（９）中、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
【００９３】
なお、本発明で製造する光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）とは、２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの４種類の立体異性体（シス（ｃｉｓ）体の（１Ｒ，２Ｓ体）と（１Ｓ，２Ｒ）体、トランス（ｔｒａｎｓ）体の（１Ｓ，２Ｓ）体と（１Ｒ，２Ｒ）体の４種類）に占める目的の立体異性体の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上の２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルである。
【００９４】
前記式（９）に占める（１Ｒ，２Ｒ）体及び（１Ｓ，２Ｓ）の比率は、例えば、以下のように決定できる。
【００９５】
分析したい前記式（９）が、例えば、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの場合、下記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより、トランス体比（４つの立体異性体に占めるトランス体（（１Ｓ，２Ｓ）体と（１Ｒ，２Ｒ）体）の割合）を下記式により決定することができる。
［トランス体比（％）］＝［トランス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００
【００９６】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：ＵＬＢＯＮ  ＨＲ−２０Ｍ（０．２５ｍｍ（内径）×２５ｍ；信和化工社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）、溶出時間：２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（トランス体）約１５．７分、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（シス体）約８．１分、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エチル  約８．８分。
【００９７】
また、トランス体に占める（１Ｒ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルを塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、下記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより容易に算出できる。
【００９８】
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＡＤ−Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学社製）、カラム温度：３０℃、検出波長：２４５ｎｍ、移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７０／３０、保持時間：（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約７．２分、（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約９．２分、（１Ｓ，２Ｓ）-２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約１５．３分、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約１７．０分。
【００９９】
上記の２つの分析結果より、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エステルに占める（１Ｒ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｓ）体の比率が容易に算出可能である。
【０１００】
生成した前記式（９）に占める（１Ｓ，２Ｒ）体及び（１Ｒ，２Ｓ）の比率は、以下のように決定できる。
【０１０１】
分析したい前記式（９）が、例えば、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの場合、上記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより、シス体比（４つの立体異性体に占めるトランス体（（１Ｓ，２Ｒ）体と（１Ｒ，２Ｓ）体）の割合）を下記式により決定することができる。
［シス体比（％）］＝［シス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００
【０１０２】
また、シス体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は、例えば、前記式（９）が２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの場合、塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、上記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより容易に算出できる。
【０１０３】
上記の２つの分析結果より、前記式（９）に占める（１Ｓ，２Ｒ）体もしくは（１Ｓ，２Ｒ）体の比率が容易に算出可能である。
【０１０４】
前記式（８）を前記式（９）へ変換する場合は、適当な溶媒、例えば１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）など、中に前記式（８）を加え、ＮＡＤＰＨやＮＡＤＰ+、ＮＡＤＨやＮＡＤ+等の補酵素、及び該組換え生物の培養物及び／またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。
【０１０５】
ここで、処理物とは、例えば、菌体破砕物、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物であり、該ポリペプチドの触媒活性が残存している物を意味する。
【０１０６】
反応は５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜７０％、より好ましくは０．５〜５０％の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。
【０１０７】
また更に、トリトン（ナカライテスク株式会社製）、スパン（関東化学株式会社製）、ツイーン（ナカライテスク株式会社製）などの界面活性剤を反応液に添加することも効果的である。更に、基質及び／または還元反応の生成物であるアルコール体による反応の阻害を回避する目的で、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロピルエーテル、トルエン、ヘキサンなどの水に不溶な有機溶媒を反応液に添加してもよい。更に、基質の溶解度を高める目的で、メタノール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドなどの水に可溶な有機溶媒を添加することもできる。
【０１０８】
還元反応により生成した光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの採取は、特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ｎ−ブタノール、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、減圧加熱等の操作により溶剤を留去すると良い。さらには、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば高純度の前記式（９）を容易に得ることができる。
【０１０９】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチド
本発明で用いるポリペプチドの生産能を有する組換え生物を用いて、２−オキソシクロアルカンカルボン酸エステル（８）を還元して光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）を合成する場合、補酵素としてＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨが必要となる。上記のように、反応系にＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを必要な量だけ添加しても実施しうる。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤ+もしくはＮＡＤＰ+）を還元型（ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ）に変換する能力（以後還元型補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明で用いるポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。還元型補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素が用いられる。
【０１１０】
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者により形質転換された組換え生物を触媒とした場合は、還元型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような組換え生物は、先述の方法により得られる。
【０１１１】
光学活性−２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルから他の化合物への変換
上記記載の方法にて製造した光学活性２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステル（９）；
【０１１２】
【化３】
2013046572.tif 000004
【０１１３】
より、医薬品中間体として特に有用な２−アミノシクロアルカノール誘導体（２）；
【０１１４】
【化４】
2013046572.tif 000005
【０１１５】
、もしくは光学活性−２−アミノシクロアルカノール（２）’；
【０１１６】
【化５】
2013046572.tif 000006
【０１１７】
を製造することができる。
【０１１８】
前記式（９）において、Ｒは炭素数１〜６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７〜１１の置換もしくは無置換のアラルキル基を表す。炭素数１〜４の置換もしくは無置換のアルキルとしては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基としては例えば、フェニル基、ｐ−メチルフェニル基、ｏ−メチルフェニル基、ｍ−メチルベンジル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等が挙げられる。炭素数７〜１１のアラルキル基としては例えば、ベンジル基、ｐ−メチルベンジル基、ｏ−メチルベンジル基、ｍ−メチルベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−トリフルオロメチルベンジル基等が挙げられる。中でも好ましくは炭素数１〜４の置換もしくは無置換のアルキル基あり、さらに好ましくはメチル基、エチル基である。
【０１１９】
前記式（９）は、上記した微生物や酵素を用いた対応するケトエステルの還元反応により取得できる。
【０１２０】
前記式（２）において、Ｒ’としては例えば、炭素数１〜６の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数７〜１１の置換もしくは無置換のアラルキル基等が挙げられる。炭素数１〜４の置換もしくは無置換のアルキル基としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。炭素数６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基としては例えば、フェニル基、ｐ−メチルフェニル基、ｏ−メチルフェニル基、ｍ−メチルベンジル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−トリフルオロメチルフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等が挙げられる。炭素数７〜１１のアラルキル基としては例えば、ベンジル基、ｐ−メチルベンジル基、ｏ−メチルベンジル基、ｍ−メチルベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−トリフルオロメチルベンジル基等が挙げられる。中でも好ましくは炭素数１〜４の置換もしくは無置換のアルキル基、炭素数７〜１１のアラルキル基であり、さらに好ましくはメチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、ベンジル基である。
【０１２１】
前記式（９）より前記式（２）もしくは前記式（２）’を製造するルートとしては、前記式（９）とアンモニアを反応させることで、２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アミド（３）を製造し、続いて転位反応を行うＨｏｆｍａｎｎ転位ルート、もしくは、前記式（１）より２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸アジド（４）を経由し転位反応を行うＣｕｒｔｉｕｓ転位ルートが挙げられる（図１参照）。Ｃｕｒｔｉｕｓ転位は爆発危険性の伴うアジド化合物を使用するため、好ましくはＨｏｆｍａｎｎ転位を行うルートである。
【０１２２】
【化６】
2013046572.tif 000007
【０１２３】
前記式（９）、（２）、（２）’（３）、（４）において、ｎは０〜８の整数を表す。中でも好ましくは０〜４であり、さらに好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。
【０１２４】
前記式（９）、（２）、（２）’（３）、（４）中、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
【０１２５】
以下、これら二つのルートについて詳細に説明する。
【０１２６】
Ｈｏｆｍａｎｎ転位反応を用いるルート
本ルートは、前記式（９）とアンモニアを反応させることで前記式（３）を製造し、続いて転位反応を行うことで前記式（２）もしくは前記式（２）’を製造するルートである。
【０１２７】
まず、前記式（９）とアンモニアを反応させ前記式（３）を製造する方法について述べる。
【０１２８】
前記式（９）において、Ｒは前記に同じである。
【０１２９】
用いるアンモニアは溶媒に希釈したものを用いても良いし、希釈することなく用いても良い。希釈する溶媒としてはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール系溶媒溶液、水溶液等が挙げられる。中でも好ましくはメタノール溶液又は水溶液である。
【０１３０】
アンモニアを希釈して用いる場合、その濃度は特に限定しないが、好ましくは５〜４０重量％溶液であり、より好ましくは１０〜３０重量％溶液であり、さらに好ましくは１５〜２８重量％である。
【０１３１】
用いるアンモニアの当量は特に限定しないが、前記式（９）に対して好ましくは１〜３０当量であり、より好ましくは５〜２５当量であり、さらに好ましくは１０〜２０当量である。
【０１３２】
反応温度は、通常、−５０〜１２０℃の範囲内で行えばよい。好ましくは０〜１００℃の範囲内であり、更に好ましくは２０〜１００℃の範囲内である。
【０１３３】
反応は常圧（１気圧）下に行うこともできるが、密閉された反応缶を用いて加熱することにより加圧条件下に行うことができる。
【０１３４】
用いる溶媒としては、特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒、ヘキサメチルベンゼン、トルエン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、クロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、ブチロニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ブタノール、オクタノール等のアルコール系溶媒、水などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。中でも好ましくは、アルコール系溶媒、炭化水素系溶媒、水であり、さらに好ましくは、トルエン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、水である。
【０１３５】
反応終了後、反応液を濃縮することで粗生成物を取得することができる。また、一般的な後処理を行って組成物を取得しても良い。一般的な後処理としては例えば、水および一般的な抽出溶媒、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行う。得られた抽出液から、減圧加熱等の操作により反応溶媒および抽出溶媒を留去すると、目的化合物が得られる。
【０１３６】
このようにして得られる目的物は、そのまま次工程で使用しても良いが、晶析精製、分別蒸留、カラムクロマトグラフィー等、一般的な手法により精製を加え、さらに純度を高めても良い。
【０１３７】
粗生成物に前記式（３）のジアステレオマーが含まれる場合、医薬品中間体として十分な品質の前記式（２）もしくは前記式（２）’を取得するためにも晶析操作を行う方が好ましい。即ち、前記式（３）を含む粗生成物の晶析を行うことで、ジアステレオマーを除去することができる。
【０１３８】
ジアステレオマーとしては特に限定しないが、例えば、前記式（３）において好ましい立体配置、すなわち、＊１、＊２ともに（Ｒ）の場合、ジアステレオマーは（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロアルカンアミド及び／又は（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロアルカンアミドである。
【０１３９】
晶析溶媒としては特に限定されず、例えば、ヘキサメチルベンゼン、トルエン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、クロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、ブチロニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ブタノール、オクタノール等のアルコール系溶媒、水などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。中でも好ましくは、エステル系溶媒とアルコール系溶媒の組合せであり、さらに好ましくは酢酸エチルとメタノールの組合せである。
【０１４０】
晶析に用いる溶媒の量としては前記式（９）で表される化合物に対して１〜２００倍重量であり、好ましくは１〜５０倍重量である。
【０１４１】
晶析時の温度は−１０℃〜１２０℃の範囲内であり、好ましくは−１０℃〜７０℃の範囲内であり、もっとも好ましくは−１０℃〜５０℃の範囲内である。
【０１４２】
晶析の方法としては特に限定せずどのような方法をとっても良い。例えば、前記式（９）で表される化合物を含む粗生成物に晶析溶媒を添加し、均一溶液となるまで加熱したのち、冷却し結晶化させる方法でも良いし、粗生成物を適量の富溶媒にて溶解した後、貧溶媒を添加することで結晶化させても良い。また、前記式（９）で表される化合物を含む粗生成物を富溶媒と貧溶媒の混合液に溶解した後、濃縮留去等により良溶媒を除去する方法で結晶化させても良い。さらに上述した方法に種晶添加等の操作を適宜組み合わせることができる。
【０１４３】
晶析によって取得した前記式（９）中に含まれるジアステレオマーの含量はモル比で１０．０モル％以下であり、好ましくは５．０モル％以下であり、さらに好ましくは２．０モル％以下である。
【０１４４】
このようにして得られる前記式（３）で表される化合物の結晶は、例えば、遠心分離、加圧ろ過、減圧ろ過等により固液分離、更に、必要に応じてケーキ洗浄を行い、湿体として取得することができる。また、さらに減圧乾燥を行うことで、乾燥晶を取得することができる。
【０１４５】
取得した結晶を次工程の反応に用いる場合、乾燥晶として使用しても良いし、湿体のまま用いても良い。
【０１４６】
次に前記式（３）を塩基存在下、ハロゲン化剤を反応させることにより前記式（２）もしくは化合物（２）’を製造する方法について述べる。
【０１４７】
用いる塩基は、無機塩基であっても良いし、有機塩基であっても良い。無機塩基としては例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム等の金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム等の炭酸塩等が挙げられる。
【０１４８】
有機塩基としては特に限定しないが、第三級アミンが好ましい。第三級アミンとしては例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミンなど炭素数１〜１２のトリアルキルアミンや、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ．Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの炭素数１〜４のアルキル基とアリール基又はヘテロアリール基からなる第三級アミン、ピリジン、ピコリン、ルチジンなどの含窒素有機塩基、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−１，２−エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−１，６−ヘキサンジアミンなど炭素数１〜１０のＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−α，ω−アルキルジアミンなどが挙げられる。
【０１４９】
これらの塩基は単独で用いても良いし、複数を同時に使用しても良い。中でも、安価で入手が容易である点から、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。
【０１５０】
用いる塩基の量としては、前記式（３）に対して１当量以上使用すれば良く、好ましくは１〜１０当量であり、さらに好ましくは１〜５当量である。
【０１５１】
本反応に用いられる塩基は、溶媒に希釈することなく用いても良いし、希釈して用いても良い。
【０１５２】
本反応に用いられるハロゲン化剤としては、例えば、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム、次亜臭素酸ナトリウム、塩素、臭素、ヨウ素、Ｎ−クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、Ｎ−ヨードスクシンイミド(ＮＩＳ)、Ｎ−クロロイソシアヌル酸等が挙げられる。中でも好ましくは次亜塩素酸ナトリウム、次亜臭素酸ナトリウムであり、さらに好ましくは次亜塩素酸ナトリウムである。
【０１５３】
これらハロゲン化剤は、そのまま用いても良いし、水又は有機溶媒に希釈されたものを用いても良い。特に次亜塩素酸ナトリウムを用いる場合は、通常、水溶液のものが用いられる。
【０１５４】
また、ハロゲン化剤は系内で調製する方法をとっても良い。例えば、メタノール溶媒中、臭素とナトリムメトキシドを反応させることで、次亜臭素酸ナトリウムのメタノール溶液を調製することができる。
【０１５５】
本反応に用いるハロゲン化剤の量としては、前記式（３）に対して１当量以上使用すれば良く、好ましくは１〜１０当量であり、さらに好ましくは１〜５当量である。
【０１５６】
反応温度は、通常−３０〜１２０℃の範囲内であり、好ましくは−２０〜８０℃である。さらに好ましくは−１０〜６０℃である。
【０１５７】
本工程に用いる溶媒としては、特に限定されず、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒、ヘキサメチルベンゼン、トルエン、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ），ジイソプロピルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒、クロロベンゼン、塩化メチレン、クロロホルム、１，１，１−トリクロロエタン等のハロゲン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、ブチロニトリル等のニトリル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ブタノール、オクタノール等のアルコール系溶媒、水などが挙げられる。これらは単独で用いてもよく、２種以上を併用しても良い。中でも、エーテル系溶媒、アルコール系溶媒、水が好ましく、さらに好ましくは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、水である。
【０１５８】
本反応は水存在下で行うことにより、前記式（２）’を得ることができる。また、アルコール（５）；
【０１５９】
【化７】
2013046572.tif 000008
【０１６０】
存在下に行うことにより、前記式（２）を得ることができる。
【０１６１】
前記式（２）、（５）中、Ｒ’は前記に同じである。
【０１６２】
反応終了後、反応液から粗生成物を取得するためには、一般的な後処理を行えばよい。例えば、一般的な抽出溶媒、例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、塩化メチレン、トルエン、ヘキサン等を用いて抽出操作を行う。得られた抽出液から、減圧加熱等の操作により反応溶媒および抽出溶媒を留去すると、目的化合物が得られる。さらに、反応終了後、減圧加熱等の操作により反応溶媒を留去もしくは溶媒置換等をおこなってから、上記と同様の操作を行っても良い。
【０１６３】
上記のようにして合成される２−アミノシクロペンタノール（２）’；
【０１６４】
【化８】
2013046572.tif 000009
【０１６５】
より、一般式（６）
【０１６６】
【化９】
2013046572.tif 000010
【０１６７】
で表されるＮ−保護−２−アミノシクロペンタノール誘導体を取得することができる。
【０１６８】
前記式（６）中、Ｒ4は炭素数１〜１５の置換又は無置換のアルキルオキシカルボニル基、炭素数７〜１２の置換又は無置換のアラルキルオキシカルボニル基、又は炭素数２〜１２の置換又は無置換のアシル基を表す。置換基としては、Ｒにおいて記載したものと同様のものが挙げられる。炭素数１〜１５の置換又は無置換のアルキルオキシカルボニル基としては例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、メトキシカルボニル基（Ｍｏｃ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等が挙げられる。炭素数７〜１２の置換又は無置換のアラルキルオキシカルボニル基としては例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。炭素数２〜１２の置換又は無置換のアシル基としては例えば、アセチル基、ベンゾイル基等が挙げられる。中でも好ましくは、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、メトキシカルボニル基（Ｍｏｃ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、アセチル基であり、さらに好ましくはｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）である。
【０１６９】
前記式（６）中、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
【０１７０】
前記式（２）’より前記式（６）へと誘導する方法については、一般的な保護を行う条件で実施すれば良い。例えばＴｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版）ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ社出版に記載の脱保護法に従い、実施することができる。
【０１７１】
例えば、適当な溶媒中、塩基存在下、二炭酸ｔ−ブチルを作用させることで、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護をおこなうことが出来るし、適当な溶媒中、塩基存在下、ベンジルオキシカルボニルクロリドを作用させることで、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）保護を行うことができる。
【０１７２】
前述した方法により単離した前記式（２）’を用いて前記式（６）へと誘導しても良いし、単離操作を行うことなく、前記式（２）’を含む反応液をそのまま用いて前記式（７）へと誘導しても良い。
【０１７３】
Ｃｕｒｔｉｕｓ転位反応を用いるルート
次に前記式（９）より前記式（４）を経由し、前記式（２）もしくは前記式（２）’を製造するＣｕｒｔｉｕｓ転位ルートについて説明する。
【０１７４】
前記式（９）より前記式（２）を製造するためには、一般的なＣｕｒｔｉｕｓ転位の反応条件を用いれば良い。例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｎａｍｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｅｌｓｅｖｉｒ  Ｉｎｃ社出版に記載の方法に従い、実施することができる。
【０１７５】
本反応において、前記式（９）の加水分解反応によって製造できる２−ヒドロキシアシクロアルカンカルボン酸（１）；
【０１７６】
【化１０】
2013046572.tif 000011
【０１７７】
を用いることもできる。
【０１７８】
前記式（１）は上記製造方法により製造した２−ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの酸や塩基を用いた一般的な加水分解により取得可能である。例えば、酵素を用いた還元反応により製造した２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルエステルを水−メタノールの混合溶媒中、水酸化ナトリウムを作用させることで製造できる。
【０１７９】
本反応は水存在下で行うことにより、前記式（２）’を製造することができる。また前記アルコール（５）存在下に行うことにより、前記式（２）を製造することができる。
【０１８０】
例えば、ベンジルアルコール存在下、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸（１）とジフェニルリン酸アジドを反応させることで、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−２−ヒドロキシシクロペンタノールを製造することができる。
【０１８１】
前記式（９）中、Ｒは前記に同じである。
【０１８２】
前記式（２）（５）中、Ｒ’は前記に同じである。
【０１８３】
前記式（１）、（２）、（２）’、(４)、(９)において、ｎは０〜８の整数を表す。中でも好ましくは０〜３であり、さらに好ましくは１〜３であり、最も好ましくは１である。
【０１８４】
前記式（１）、（２）、（２）’、(４)、（９）において、＊１、＊２は不斉炭素を表す。＊１、＊２にそれぞれ独立して（Ｓ）の立体配置であっても良いし、（Ｒ）の立体配置であっても良い。中でも好ましくは＊１、＊２ともに（Ｒ）の立体配置である。
【０１８５】
通常、前記式（４）は単離することなく反応に用いられる。前記式（４）の製造方法は特に限定されず、上記したＣｕｒｔｉｕｓ転位の一般的に用いる条件の他に、前記式（９）とヒドラジンを反応させることでヒドラジド（７）；
【０１８６】
【化１１】
2013046572.tif 000012
【０１８７】
を製造した後、続いて亜硝酸塩を作用させることによって製造しても良い。
【０１８８】
前記式（７）中、ｎ、＊１、＊２は前記に同じである。
【実施例】
【０１８９】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。
【実施例１】
【０１９０】
スポロボロマイセス・サルモニカラー（Sporobolomyces salmonicolor）由来のポリペプチド（ＡＲII）を生産する大腸菌 E. coli JM109（ｐＵＣＡＲ２）
Applied and Environmental Microbiology, 65(12), 5207-5211, (1999) に記載の方法で、プラスミドｐＵＣＡＲ２（ベクタープラスミドｐＵＣ１１８にポリペプチドＡＲIIの構造遺伝子を導入したプラスミド）を有する大腸菌 E. coli J
M109（ｐＵＣＡＲ２）を育種した。E. coli JM109（ｐＵＣＡＲ２）およびベクタープラスミドｐＵＣ１１８を有する組換え大腸菌 E. coli HB101（ｐＵＣ１１８）（比較例）を、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２０時間振盪培養した。
【０１９１】
上記の培養で得られたそれぞれの培養液について、遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。これら無細胞抽出液の２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性を測定した。
【０１９２】
２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステルに対する還元活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、２−オキソシクロペンタンカルボン酸メチル５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨ０．２５ｍＭ、および粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ+に酸化する酵素活性を１Ｕと定義した。
【０１９３】
E. coli HB101（ｐＵＣ１１８）（比較例）の２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性は、０．１Ｕ／ｍｇ以下であるのに対して、ＡＲIIを発
現させた E. coli HB101（ｐＵＣＡＲ２）の２−オキソシクロペンタンカルボン酸エステル還元活性は３．３Ｕ／ｍｇであった。
【０１９４】
以上のように、ポリペプチドＡＲIIは、目的の２−オキソシクロペンタンカル
ボン酸エステルに対して還元活性を有した。
【実施例２】
【０１９５】
組換え生物 E. coli HB101（ｐＵＣＡＲ２）を用いた（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
E. coli  HB101（ｐＵＣＡＲ２）を実施例１と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１８０ｍｌを得た。この無細胞抽出液１８０ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ"Ａｍａｎｏ"II、天野エンザイム社製）２２５０Ｕ、グルコース１２．５ｇ、ＮＡＤＰ+２２ｍｇ、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エチルを３．６ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後２時間目に３．６ｇ、４．７５時間目に１．８ｇの２−オキソシクロペンタンカルボン酸エチルを追加添加し、２７時間攪拌して反応させた。反応後に、反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記のガスクロマトグラフィーの条件で分析し、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率とトランス体比を測定した。その結果、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は１００％であり、そのトランス体比は７６．４％であった。なお、トランス体比（％）は以下の式で算出した。
［トランス体比（％）］＝［トランス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００。
【０１９６】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：ＵＬＢＯＮ  ＨＲ−２０Ｍ（０．２５ｍｍ（内径）×２５ｍ；信和化工社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）、溶出時間：２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（トランス体）約１５．７分、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル（シス体）約８．１分、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エチル  約８．８分。
【０１９７】
また反応液から生成物をトルエンで抽出後、溶媒を留去することで８．３５ｇの２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルが得られた。得られた２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルを塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、下記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより光学純度を分析した。その結果、（１Ｒ，２Ｒ）体の光学純度は９９．３％ｅ．ｅ．であった。
【０１９８】
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＡＤ−Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学社製）、カラム温度：３０℃、検出波長：２４５ｎｍ、移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７０／３０、保持時間：（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約７．２分、（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約９．２分、（１Ｓ，２Ｓ）-２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約１５．３分、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチル  約１７．０分。
【０１９９】
２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルのトランス比および光学純度の分析結果より、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｒ）体の割合は７６．１％であった。
【実施例３】
【０２００】
組換え生物 E. coli HB101（ｐＵＣＡＲ２）を用いた（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルの製造
E. coli  HB101（ｐＵＣＡＲ２）を実施例１と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１２００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１２００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ"Ａｍａｎｏ"II、天野エンザイム社製）１５０００Ｕ、グルコース１６４ｇ、ＮＡＤＰ+１１５ｍｇ、２−オキソシクロペンタンカルボン酸メチルを２５ｇ添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で攪拌した。反応開始後１．５時間目、３時間目および６時間目に各２５ｇ、９．５時間目に１２．５ｇの２−オキソシクロペンタンカルボン酸メチルを追加添加し、２７時間攪拌して反応させた。反応後に、反応液の一部をサンプリングし、酢酸エチルで抽出した。抽出液を下記のガスクロマトグラフィーの条件で分析し、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルへの変換率とトランス体比を測定した。その結果、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルへの変換率は９８％であり、そのトランス体比は８３．１％であった。
【０２０１】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：ＵＬＢＯＮ  ＨＲ−２０Ｍ（０．２５ｍｍ（内径）×２５ｍ；信和化工社製）、検出：ＦＩＤ、カラム温度：１３０℃、注入温度：２００℃、検出温度：２００℃、キャリアーガス：ヘリウム（１３０ｋＰａ）、溶出時間：２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル（トランス体）約１４．３分、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル（シス体）約７．６分、２−オキソシクロペンタンカルボン酸メチル  約８．０分。
【０２０２】
また反応液から生成物をトルエンで抽出後、溶媒を留去することで９５．８ｇの２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルが得られた。得られた２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルを塩基条件下にてジニトロベンゾイルクロライドを作用させて誘導体化し、下記条件の高速液体クロマトグラフィーの条件で分析することにより光学純度を分析した。その結果、（１Ｒ，２Ｒ）体の光学純度は９８．８％ｅ．ｅ．であった。
【０２０３】
［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＡＤ−Ｈ（４．６μｍ（内径）×２５０ｍｍ；ダイセル化学社製）、カラム温度：３０℃、検出波長：２４５ｎｍ、移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７０／３０、保持時間：（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル  約９．５分、（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル  約１３．４分、（１Ｓ，２Ｓ）-２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル  約１９．１分、（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル  約２２．４分。
【０２０４】
２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルのトランス比および光学純度の分析結果より、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｒ）体の割合は８２．６％であった。
【実施例４】
【０２０５】
キャンディダ・マグノリエ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
２ｍｌの１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、グルコース４６ｍｇ、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）NBRC0705 から調製したＣＲ酵素（国際公報ＷＯ０１／０４０４５０パンフレット、実施例１参照）１００Ｕ、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ"Ａｍａｎｏ"II、天野エンザイム社製） ２５Ｕ、ＮＡＤＰ+ １ｍｇ、２−オキソシクロペンタンカルボン酸エチル２０ｍｇ を加えて、３０℃で２４時間攪拌した。実施例２に記載の方法で、反応後の２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率、トランス体比、その光学純度を測定した。その結果、変換率は４５％で、トランス体比は５７．６％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で９３．６％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は５５．８％であった。
【実施例５】
【０２０６】
ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ロードトルーラ・グルチニス・バー・ダイレネンシス（Rhodotorula glutinis var. dairenensis）NBRC0415 から調製した還元酵素ＲＲＧ（国際公報ＷＯ０３／０９３４７７パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９９％で、トランス体比は９７．９％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は９７．９％であった。
【実施例６】
【０２０７】
オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、オガタエア・ミヌータ・バー・ミヌータ（Ogataea minuta var. minuta）NBRC0975 から調製した還元酵素（国際公報ＷＯ０６／０１３８０１パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９８％で、トランス体比は７０．０％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は７０．０％であった。
【実施例７】
【０２０８】
キャンディダ・ボイディニ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・ボイディニ（Candida boidinii）由来のアルコール脱水素酵素ＣＰ（Julich Fine chemicals 社製）２０ｍｇを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は６０％で、トランス体比は７５．０％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は７５．０％であった。
【実施例８】
【０２０９】
サーモアナエロビウム・ブロッキ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、サーモアナエロビウム・ブロッキ（Themoanaerobium brockii）由来のアルコール脱水素酵素（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製）５０ｍｇを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は１００％で、トランス体比は８０．４％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｓ）体で１００％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｓ）体の割合は８０．４％であった。
【実施例９】
【０２１０】
キャンディダ・マリス由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・マリス（Candida maris）NBRC10003 から調製した還元酵素ＦＰＤＨ（国際公報ＷＯ０１／０５９９６パンフレット、実施例１４参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９５％で、シス体比は９７．４％であった。なお、シス体比（％）は以下の式で算出した。
［シス体比（％）］＝［シス体のエリア］／（［トランス体のエリア］+［シス体のエリア］）×１００
【０２１１】
また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９９．１％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９７．０％であった。
【実施例１０】
【０２１２】
デボシア・リボフラビナ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、デボシア・リボフラビナ（Devosia riboflavina）NBRC13584 から調製した還元酵素ＲＤＲ（国際公報ＷＯ０４／０２７０５５パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９６％で、シス体比は９５．７％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９９．５％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９５．５％であった。
【実施例１１】
【０２１３】
ブレブンディモナス・ディミヌータ由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ブレブンディモナス・ディミヌータ（Brevundimonas diminuta）NBRC13584 から調製した還元酵素（国際公報ＷＯ０７／１１４２１７パンフレット、実施例４参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は８０％で、シス体比は９３．４％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９８．６％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９２．７％であった。
【実施例１２】
【０２１４】
ラクトバシラス・ブレビス由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）由来のアルコール脱水素酵素（Julich Fine chemicals 社製）１００μｌを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９８％で、シス体比は９８．７％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９９．５％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９８．５％であった。
【実施例１３】
【０２１５】
ラクトバシラス・ケフィア由来のポリペプチドを用いた（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ラクトバシラス・ケフィア（Lactobacillus kefir）由来のアルコール脱水素酵素（Fluka 社製）５０ｍｇを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は９８％で、シス体比は９７．７％であった。また、光学純度は（１Ｓ，２Ｒ）体で９８．５％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｓ，２Ｒ）体の割合は９７．０％であった。
【実施例１４】
【０２１６】
キャンディダ・マルトーサ由来のポリペプチドを用いた（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）NBRC1977から調製した還元酵素（国際公報ＷＯ０８／０６６０１８パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は４０％で、シス体比は９８．２％であった。また、光学純度は（１Ｒ，２Ｓ）体で９９．０％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｓ）体の割合は９７．７％であった。
【実施例１５】
【０２１７】
キャンディダ・パラプシロシス由来のポリペプチドを用いた（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）NBRC708から調製した還元酵素（特開２００３−２８９８７４パンフレット、実施例１参照）１００Ｕを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は４０％で、シス体比は９８．２％であった。また、光学純度は（１Ｒ，２Ｓ）体で９９．０％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｓ）体の割合は９７．７％であった。
【実施例１６】
【０２１８】
ロドコッカス・エリスロポリス由来のポリペプチドを用いた（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの製造
ＣＲ酵素のかわりに、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来のアルコール脱水素酵素（Julich Fine chemicals 社製）１００μｌを用いて、実施例４と同様に反応を実施した。２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルへの変換率は４０％で、シス体比は９９．８％であった。また、光学純度は（１Ｒ，２Ｓ）体で９７．５％ｅ．ｅ．であることから、２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸エチルの４種類の立体異性体に占める（１Ｒ，２Ｓ）体の割合は９８．６％であった。
【実施例１７】
【０２１９】
（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミドの製造
実施例３に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸メチル（７３．３４ｇ，０．５２ｍｏｌ）と２０重量％ＮＨ３／ＭｅＯＨ溶液（６５８．２０ｇ，７．７４ｍｏｌ）をオートクレーブ中、密閉下、バス温８０℃にて４８時間の攪拌を行った。反応終了後、常温下にオートクレーブを開封し、内溶液をロータリーエバポレーターを用いて全量が１１０．１４ｇとなるまで濃縮した。濃縮液に酢酸エチル（４９０ｇ）を添加した後、析出した固体をろ過操作により取得し、表題化合物を得た（収量３５．１７ｇ，収率５３％）。１Ｈ−ＮＭＲより(１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミド中に存在するジアステレオマーは、モル比で２．０％であった。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）１．５４−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．９０−２．０４（ｍ，２Ｈ），２．５１−２．５７（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｄｔ，１Ｈ）
【実施例１８】
【０２２０】
（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノシクロペンタノールの製造
実施例１７に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸アミド（３４．００ｇ，０．２６ｍｏｌ）を水（１７０ｇ）に希釈し、バス温０℃下、３０重量％水酸化ナトリウム水溶液（７０．２０ｇ，０．５３ｍｏｌ）を３５分間かけて滴下した。続いて同温下、１３重量％次亜塩素酸ナトリウム水溶液（２２６．１０ｇ，０．４０ｍｏｌ）を２．５時間かけて滴下した。同温下、３０分間の攪拌を行った後、バス温４０℃下、さらに１時間の攪拌を行った。反応液を２０℃まで冷却した後、３５重量％塩酸を添加することで、系内のｐＨを６．８に調整した。反応液の標準品（（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノシクロペンタノール塩酸塩）と比較したガスクロマトグラフィー定量分析を行った結果、表題化合物の含有が確認された（収量２７．６１ｇ，収率８０％）。
【実施例１９】
【０２２１】
（１Ｒ，２Ｒ）−２−（ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）シクロペンタノール
実施例１７に記載した方法にて取得した（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノシクロペンタノールの水溶液（ｎｅｔ量：２７．６１ｇ，０．２１ｍｏｌ）に３０重量％水酸化ナトリウム水溶液を加え、系内のｐＨを１０．４に調整した。バス温２０℃下、ジ炭酸ｔ−ブチル（６８．９４ｇ，０．３２ｍｏｌ）を添加した。反応中、系内のｐＨが低下するため、適宜３０重量％ＮａＯＨを添加し、ｐＨ＝１０±０．５に調整した。同温にて１４時間の攪拌を行った後、濃塩酸を加え、系内のｐＨを４．０とした。トルエンを用いて２回抽出し（７０ｇ×２）、得られた有機層を水（７０ｇ）にて洗浄した。反応液の標準品と比較したガスクロマトグラフィー定量分析を行った結果、表題化合物の含有が確認された（収量３９．０４ｇ，収率９３％）。ロータリーエバポレーターを用いて、有機層を全量が１４５．５５ｇとなるまで濃縮した。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）１．３３−１．３９（ｍ，１Ｈ），１．４５(ｓ，９Ｈ)，１．６１−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ），１．９７−２．１４（ｍ，２Ｈ），３．５９−３．６６（ｍ，１Ｈ），３．９６−４．００（１Ｈ，ｍ），４．０６（ｂｒ，１Ｈ），４．７１（ｂｒ，１Ｈ）
【実施例２０】
【０２２２】
（１Ｒ，２Ｒ）−２−アミノシクロペンタノール塩酸塩
実施例１９に記載して方法にて取得した）（１Ｒ，２Ｒ）−２−（ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ）シクロペンタノールのトルエン溶液（ｎｅｔ量：３８．６０ｇ，０．１９ｍｏｌ）に対して、バス温５０℃下、２９．５重量％塩化水素／イソプロパノール溶液（１１８．５２ｇ，０．９６ｍｏｌ）を１．５時間かけて滴下した。同温下にて１．０時間、バス温２０℃下に１．０時間、バス温１０℃下に３．０時間の攪拌を行った後、ろ過操作により析出固体を取得した。取得固体をトルエン（２１．７０ｇ）とイソプロパノール（３８．２０ｇ）の混合液にて洗浄後、減圧乾燥を行い、表題化合物を得た（収量２０．５０ｇ，収率７８％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）１．４３−１．５７（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．７１(ｍ，２Ｈ)，１．８５−２．０３（ｍ，２Ｈ），３．０９−３．１４（ｍ，１Ｈ），３．９６−４．０２（ｍ，１Ｈ），５．２０−５．２１（ｄ，１Ｈ），８．０８（ｂｒ，３Ｈ）
【配列表】
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