(57)【要約】【課題】軟骨欠損に対する細胞移植治療などに用いる足場（スキャホールド）を提供すること。【解決手段】羊膜細胞由来の細胞外マトリックスを多孔質ポリマーにコーティングした新規なスキャホールドを開発した。このスキャホールドは、羊膜細胞由来の細胞外マトリックスの含有成分の効果を十分に発揮させることでき、軟骨欠損の修復など生体組織の再生おいて有用性が高い。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
羊膜細胞由来の細胞外基質が担持された生体吸収性顆粒状多孔質体からなるハイブリッドスキャホールド。
【請求項２】
羊膜細胞が羊膜由来の不死化細胞である請求項１に記載のハイブリッドスキャホールド。
【請求項３】
羊膜由来の不死細胞が再生させる組織の細胞に分化誘導した細胞である請求項２に記載のハイブリッドスキャホールド。
【請求項４】
生体吸収性顆粒状多孔質体が乳酸−グリコール酸共重合体ブロックである請求項１〜３記載のハイブリッドスキャホールド。
【請求項５】
乳酸−グリコール酸共重合体ブロックの気孔率が８０％以上である請求項４のハイブリッドスキャホールド。
【請求項６】
羊膜細胞を生体吸収性顆粒状多孔質体に担持する第１工程、
生体吸収性顆粒状多孔質体に播種した羊膜細胞を培養し、羊膜細胞由来の細胞外基質を産生させる第２工程、
培養した細胞を脱細胞する第３工程からなるハイブリッドスキャホールドの作製方法。
【請求項７】
羊膜細胞が羊膜由来の不死化細胞である請求項６に記載のハイブリッドスキャホールドの作製方法。
【請求項８】
第２工程において、再生させる組織の細胞に分化誘導する処理を行う請求項６または７に基礎のハイブリッドスキャホールドの作製方法。
【請求項９】
生体吸収性顆粒状多孔質体が乳酸−グリコール酸共重合体ブロックである請求項６〜８記載のハイブリッドスキャホールドの作製方法。
【請求項１０】
生体吸収性顆粒状多孔質体の気孔率が８０％以上である請求項９のハイブリッドスキャホールドの作製方法。
【請求項１１】
羊膜細胞由来の細胞外基質が担持された生体吸収性顆粒状多孔質体からなるハイブリッドスキャホールドを使用した生体組織の再生方法。
【請求項１２】
羊膜細胞が羊膜由来の不死化細胞である請求項１１に記載の生体組織の再生方法。
【請求項１３】
羊膜由来の不死細胞が再生させる組織の細胞に分化誘導した細胞である請求項１２に記載のハイブリッドスキャホールドを使用した生体組織の再生方法。
【請求項１４】
生体吸収性顆粒状多孔質体が乳酸−グリコール酸共重合体ブロックである請求項１１〜１３記載の生体組織の再生方法。
【請求項１５】
生体吸収性顆粒状多孔質体の気孔率が８０％以上である請求項１４の生体組織の再生方法。
【請求項１６】
生体組織が、軟骨または骨である請求項１０〜１５に記載の生体組織の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療における細胞の足場（スキャホールド）に関し、特に羊膜由来細胞外基質をコーティングしたハイブリッドスキャホールドおよびそれを用いた生体組織、特に軟骨の再生方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胎児を包む羊膜は、厚い基底膜とヒト羊膜間葉系細胞（Human Amniptic
Mesenchymal cell:HAM）を含むコラーゲンスポンジ層と単層のヒト羊膜上皮細胞（Human
Amniptic Epithelial cell:HAE）から構成されている。羊膜細胞は、主要組織適合複合体（major
histocompatibility complex：MHC）クラスIIの発現がなく、免疫抑制因子（HLA-G，CD59）を産生することから、再生医療における細胞移植療法の細胞源として注目されている。
哺乳動物の羊膜の間質層には、I型コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチンなどのＨＡＭによって生成された豊富な細胞外基質（extracellular matrix：ECM）が含まれている。
ＥＣＭを含む羊膜は、ヒト関節軟骨修復のための足場（スキャホールド）として使用できること（非特許文献１）、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）を添加した培地で培養したヒト羊膜間葉系細胞は、軟骨細胞様細胞に分化すること（非特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Cell Tissue Bank 2010; 11: 183
【非特許文献２】Cloning Stem Cells 2009; 11: 19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
軟骨細胞様細胞に分化した羊膜細胞は、潜在的な軟骨容量があり、低免疫原性であること、羊膜細胞を得るため手段で倫理面の問題がない点など、ＨＡＭは、軟骨修復の理想的な細胞源である。
しかし、妊娠後期に単離されるヒト羊膜間葉系細胞は、成長の制限を受け、in vitroにおいては、通常の培養条件下では４〜５継代後に死ぬ。これは、短縮したテロメアおよび酸化ストレスを受けたＤＮＡ損傷に対応する早期老化に近因する細胞老化によるものである。従って、軟骨組織の再生のための培養されたヒト羊膜間葉系細胞を十分な量で確保することは難しい。
一方、例えば、軟骨欠損に対する細胞移植治療は、一定の効果が認められつつあるが、広範囲や急性期の損傷には未だ応用が困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、新たに羊膜細胞由来の細胞外基質（細胞外マトリックス）をコーティングしたポリマーのスキャホールドを用いることにより、ＨＡＭが軟骨修復などの細胞源として効率よく利用できることを見出した。
【０００６】
すなわち、本発明の第１の発明は、羊膜細胞由来の細胞外基質をコーティングした生体吸収性顆粒状多孔質体からなるスキャホールドである。
【０００７】
また、本発明の第２の発明は、羊膜細胞由来の細胞外基質をコーティングした生体吸収性顆粒状多孔質体からなるスキャホールドの作製方法である。
【０００８】
また、本発明の第３の発明は、羊膜細胞由来の細胞外基質をコーティングした生体吸収性顆粒状多孔質体からなるスキャホールドを使用したを用いる軟骨、骨などの生体組織の再生方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のハイブリッドスキャホールドは、生体吸収性顆粒状多孔質体に羊膜細胞由来の細胞外基質をコーティングしたことにより、再生組織の細胞のスキャホールドへの接着能を増強するともに、スキャホールド上での再生組織の細胞の増殖能を増強する。また、本発明のハイブリッドスキャホールドを利用した組織の修復は、緩徐な修復反応であり、繊維化や変性などを起こしにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ECM-PLGAの拡大写真である。未処理のPLGA（写真左）は、気孔がはっきり見えている。normal-media（10%FBS-DMEM）で2週間旋回培養したもの（写真中央）は、表面にECMが乗って光沢があり、表面の気孔はかなり埋まっている。chondrogenic-media （BMP-2を添加した軟骨分化培地）でさらに2週間培養したもの（写真右）は、ECMが厚くなり、色調が黄みがかっている。
【図２】ECM-PLGAの走査型電子顕微鏡写真である。ECM-PLGAは、未処理なものと比べて明らかにPLGAの気孔が詰まっており、表面がECMで覆われている。chondrogenic mediaで培養したものは、さらに厚いECMでで埋まっている。
【図３】ラット骨髄由来間葉系細胞のPLGA  scaffoldに対する接着能を示す図である
【図４】ラット骨髄由来間葉系細胞のPLGA  scaffoldに対する増殖能を示す図である。
【図５】ヌードラット膝関節軟骨損傷へのECMをコートしたPLGAの移植実験における軟骨修復の形態学的検討での、24週目のトルイジンブルー染色と免疫染色である。
【図６】ヌードラット膝関節軟骨損傷へのECMをコートしたPLGAの移植実験における軟骨修復の程度を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明で使用される羊膜細胞は、哺乳動物の発生過程において形成される、胎子と羊水を包む膜から採取される細胞である。哺乳動物には、ヒトをはじめとする霊長類の他、ウシ、ウマ、ヤギ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどが含まれる。
【００１２】
羊膜細胞は、通常の外科的手法により得ることができる。または、分娩後に廃棄される胎盤から得ることも可能である。ヒト羊膜細胞は、例えばインフォームドコンセントを得た妊婦から、帝王切開で得られた羊膜から採取することができる。
【００１３】
本発明で使用される羊膜細胞は、羊膜間葉系細胞、羊膜上皮系細胞のいずれであってもよい。好ましい細胞として上記の外科的手法または分娩後に廃棄される胎盤から採取された羊膜細胞から誘導された不死化羊膜細胞、特に、不死化羊膜間葉系細胞が挙げられる。
【００１４】
羊膜不死化間葉系細胞として、テロメラーゼ逆転酵素遺伝子、Ｂｍｉ−１遺伝子、パピローマウイルスＥ６遺伝子、パピローマウイルスＥ７遺伝子などの不死化遺伝子が導入されて不死化した羊膜由来間葉系細胞など、例えば、特開２０１０−４６０１９号公報に記載されたヒト羊膜間葉系由来の不死化羊膜細胞が挙げられる。具体的には、レトロウイルスでヒトパピローマウイルスＥ６／Ｅ７遺伝子とヒトテロメラーゼ逆転酵素遺伝子を組み込んだ不死化ヒト羊膜由来間葉系細胞が挙げられる。
【００１５】
本発明で使用される生体吸収性粒状多孔質体としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリリンゴ酸、ポリ−ε−ラクトンなどポリエステルの粒状物であり、好ましくは、乳酸−グリコール酸共重合体の粒状の多孔質物であり、顆粒多孔質体であることが好ましい。
また、顆粒多孔質体の気孔率は、８０％以上、好ましくは、８０〜９０％である
【００１６】
本発明のハイブリットスキャホールドは、以下の工程で作製すればよい。
工程１：羊膜細胞を生体吸収性顆粒状多孔質体に担持する
工程２：生体吸収性顆粒状多孔質体に担持した羊膜細胞を培養し、羊膜細胞由来の細胞外基質を産生させる
工程３：培養した細胞を脱細胞する
【００１７】
＜工程１＞
羊膜細胞を生体吸収性顆粒状多孔質体に担持するには、公知の方法を用いればよいが、例えば、羊膜間葉系由来の不死化細胞を、trypsin-Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)溶液などに懸濁し、乳酸−グリコール酸共重合体ブロックなど生体吸収性顆粒状多孔質体の担体に吸着させればよい。この場合、細胞数は、1×106〜1×108個／担体、好ましくは、1×107個／担体である。また、必要に応じ、担持後、5％CO2の大気下、37℃で5〜8時間培養すればよい。
【００１８】
＜工程２＞
羊膜細胞由来の細胞外基質（細胞外マトリックス）を産生させる工程は、生体吸収性顆粒状多孔質体に担持させた細胞を通常の細胞増殖用培地で培養する工程（工程２Ａ）と分化誘導用培地で培養する工程（工程２Ｂ）からなる。
通常の細胞増殖用培地での培養は、例えば、牛胎児血清（Fetal Bovine Serum;FBS）含有trypsin-Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)などで1〜3週間、好ましくは2週間、5％CO2の大気下、37℃で培養すればよい。
分化誘導用の培地としては、例えば、細胞増殖用培地に、骨形成タンパク質−２(BMP-2)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン様成長因子(IGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、コンドロモジュリン、デキサメタゾンなどを適宜選択し、添加した軟骨分化培地および骨分化培地などが挙げら、培養は、細胞増殖用培地での培養条件および期間と同様に実施すればよい。
【００１９】
＜工程３＞
培養した細胞の脱細胞は、公知の方法を用いればよいが、例えば、Ｘ線照射と凍結・融解を組み合わせた処理が挙げられる。具体的には、20〜40グレイ、好ましくは30グレイのＸ線を照射した後、凍結し、使用時に融解すればよい。
【００２０】
本発明のハイブリッドスキャホールドを生体組織の再生に使用するには、例えば、欠損した組織部位にハイブリッドスキャホールドを移植すればよい。移植方法は、公知の方法を用いればよい。
【実施例】
【００２１】
以下に実施例を挙げ、本発明について更に説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【００２２】
参考例１
＜ヒト羊膜間葉系細胞の単離と培養＞
ヒトの羊膜は、インフォームドコンセントの得られた帝王切開適応患者から得られる胎盤の卵膜から剥離して得た。羊膜の検査と使用は、富山大学の倫理委員会の承認を得た。
羊膜はリン酸塩緩衝液（PBS）で洗浄し、0.025%デオキシリボヌクレアーゼＩ（DNase I）および0.01%ヒアルロニダーゼ含有のPBSに浸し、細切して組織片とした。0.2％trypsin-Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)溶液に移し、93回／分の振盪速度で20分間処理後、ガーゼを用いて羊膜上皮細胞を回収した。組織片から上皮細胞が3×105以下の回収になるまで(上皮細胞が組織より無くなるまで)0.2%Trypsin-DMEMによる上記の処理を繰り返した。上皮が無くなった組織を0.075%コラゲナーゼおよび0.0075% DNase I含有のDMEMに移し、93回／分の振盪速度で20〜40分間処理後、ガーゼを用いて羊膜間葉系細胞（以下、細胞と称する。）を回収した。
【００２３】
得られた細胞は、2×103 cells/cmの密度になるように10cmの培養皿に植え付けた。牛胎児血清（Fetal Bovine Serum;FBS）および抗生物質をそれぞれ10%、1％づつ含む高グルコース-DMEMで5％CO2の大気下、37℃で培養した。初代培養のはじめの週、細胞がコンフルエントになる前に継代し、その後は同じ細胞密度で継代した。細胞の形態を観察し、写真に納めた。細胞を播き代える際に細胞数を計測し、細胞集団が倍加するレベル（PopulationDoublingLevel：PDL)を計算して増殖曲線を描いた。
【００２４】
＜羊膜不死化間葉系細胞＞
ヒト羊膜由来間葉系細胞に、ＨＰＶ１６Ｅ６遺伝子、ＨＰＶ１６Ｅ７遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、Ｂｍｉ−１遺伝子のいずれか、あるいはこれらを組み合わせて導入した。これら遺伝子の導入は、レトロウイルスベクターあるいはレンチウイルスベクターにてウイルス感染
法により行った。具体的には、特開2010-46019に記載の方法で作製された以下の細胞である。
【００２５】
１．ｉＨＡＭ１：HAM3/542:CSII-CMV-16E6E7(@p1)
ＨＡＭ３細胞に542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数１で感染し、延命した細胞。
本細胞は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM
AP-21610として寄託されている。
【００２６】
２．ｉＨＡＭ２：HAM3/542:CSII-CMV-16E6E7(@p1)/344:MSCVpurohTERT(@p2)
ＨＡＭ３細胞に542:CSII-CMV-16E6E7ウイルスを継代数１で感染した後、344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数２で感染し、puromycin1μg/mL存在下で薬剤選択した延命細胞（不死化細胞）。
本細胞は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM
AP-21611として寄託されている。
【００２７】
３．ｉＨＡＭ３：HAM4/136:LXSN-hbmi1(@p4)/344:MSCVpurohTERT(@p4)
ＨＡＭ４細胞に136:LXSN-hbmi1ウイルス及び344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数４で導入し、G418 800μg/mLおよびpuromycin1μg/mL存在下で薬剤選択した延命細胞(不死化細胞)。
本細胞は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号FERM AP-21612として寄託されている。
【００２８】
４．ｉＨＡＭ４：HAM4/344:MSCVpurohTERT(@p4)/96:LXSN-16E6E7(@p5)
ＨＡＭ４細胞に344:MSCVpurohTERTウイルスを継代数４で導入し、puromycin1μg/mL存在下で薬剤選択した後、96:LXSN-16E6E7ウイルスを継代数５で導入し、G418 800μg/mL存在下で薬剤選択した延命細胞(不死化細胞)。
本細胞は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM
AP-21613として寄託されている。
【００２９】
実施例１
＜HAM由来のECMでコーティングしたPLGA
scaffoldの作製＞
1×107個のiHAM4 344/96 (FERM FERM AP-21613)を1mLの10%DMEMに懸濁し、90％気孔率で2×2×2mmのPLGA(GC Corporation)に吸収させた後、ひっくり返して5〜8時間培養し、PLGA-iHAM複合体とした。
PLGA-iHAM複合体を6ウェルプレートへ移し、10%FBS-DMEMで2週間旋回培養後、BMP-2を添加した軟骨分化培地でさらに2週間培養した。培養後のPLGA-iHAM複合体（ECM-PLGAs）にX線を30Gy照射し、使用するまで-80℃で保存した。
【００３０】
実施例２
＜ECMをコートしたPLGAに対するラット間葉系幹細胞の接着と増殖＞
ECMをコートしたPLGA（ECM-PLGA）にラット間葉系幹細胞(rMSCs)を1×105/200μLの濃度で幡種し、10%FBS-DMEMあるいはそれに1ng/mlbFGFを添加して、96穴培養皿中に静置後、37℃、5%CO2で24時間旋回培養した。
rMSCsを播種したECM-PLGAを48穴培養皿に移し、上記条件にて旋回培養した。経時的に7日目、14日目の試料にMTT solutionを終濃度0.5mg/mL加えて37℃で4時間培養後、培地を捨ててPBSで洗浄、DMSOで細胞を懸濁し、吸光度計で540nmを計測してMTT値を得た。その値をECM-PLGAの重さで割り、MTT値／gとして標準化した。
結果を図３および図４に示す。
細胞接着と増殖の実験結果より  HAMが産生したECMはラット骨髄由来間葉系のPLGA  scaffoldに対する接着能と増殖能を増強した。
PLGA上での培養では培地中へのbFGFの添加の有無が増殖能に影響を与えたものの、ECM-PLGAではｂFGFの有無に影響を受けなかった。
7日目までの結果では  PLGAでbFGFを添加した場合よりも  ECM-PLGAでbFGFを添加しない場合のほうが高い増殖能を示した。
以上より、HAMの産生した基質に  細胞の接着と増殖を高めるという生理学的活性化作用があることが分かった
【００３１】
実施例３
＜ヌードラット膝関節軟骨損傷へのECMをコートしたPLGAの移植＞
10週齢の雄性ラット(F344/NJcl-rnu/rnu, CLEA japan, Inc)の膝蓋骨溝に medial para-patellar approachを経て、鋼線にて直径1.8
mmの直径で2 mmの深さの骨軟骨欠損を作製し、ECM-PLGAを移植した。
【００３２】
＜軟骨修復の形態学的検討＞
術後4、8、12、24週目に屠殺後、遠位大腿骨を切除し、4%パラフィンで固定、10%-EDTAで脱灰した。試料をパラフィンに包埋し、HE染色、トルイジンブルー染色を行った。さらにtype I collagen
(LB-1101, LSL社製)抗体 、Type II
collagen (F-57, 第一ファインケム社製)抗体による免疫染色を行った。図４に24週目のトルイジンブルー染色と免疫染色の結果を示す。
Wakitani et al.／Pineda et al.スコアの変法（表１）により、軟骨修復の程度を判定した。結果を図４に示す。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
ラットの骨軟骨欠損モデルを用いた修復実験おいて、No
treatment(empty control)群では主に線維軟骨で修復が起こるのに対し、ECM-PLGAでは時間がかかりるが、最終的には硝子軟骨で修復された。このことは、早急すぎる修復反応は、線維化をもたらすのに対し、ゆっくりとした修復により成熟した硝子軟骨が再生可能となったものと考えられる。さらに、ECMの生理学的活性効果と土台として用いたPLGAにより骨欠損部の強度が早期より保たれたこともその修復効果に寄与しているものと考えられる。
上記したECMでは、II型コラーゲンの発現を認めておらず、メタクロマジアもあまり強くは認められないにもかかわらず、完全な軟骨基質でなくても軟骨修復に効果のある。また、羊膜に含まれるコラーゲンやグリコサミノグリカン、接着因子、その他さまざまな基質成分が複合的にｒMSCの軟骨分化を促したと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明の生体吸収性顆粒状多孔質体に羊膜細胞由来の細胞外基質をコーティングしたハイブリッドスキャホールドは、再生組織の細胞のスキャホールドへの接着能を増強するともに、スキャホールド上での再生組織の細胞の増殖能を増強する。
また、本発明の生体吸収性顆粒状多孔質体に羊膜細胞由来の細胞外基質をコーティングしたハイブリッドスキャホールドを利用した組織の修復は、緩徐な修復反応であり、繊維化や変性などを起こしにくい。
従って、本発明のハイブリッドスキャホールドは、生体組織を再生に用いるスキャホールドとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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