(57)【要約】【課題】  ストークスシフトが大きく、かつ、相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸存在下における蛍光強度値が大きく、蛍光増感率も高い、オリゴヌクレオチド誘導体を提供すること。【解決手段】  一般式（１ａ）【化１】2013046586.tif 000034で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体により前記課題を解決する。【選択図】  図１
2013046586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１ａ）
【化１】
2013046586.tif 000027
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｒ７およびＲ８は各々独立に９−アデニル基、９−グアニル基、１−シトシニル基または１−チミニル基を表し、Ｘ−は対アニオンを表す。ｌは１から８の整数を表し、ｍは１から４の整数を表し、ｎは１から４の整数を表す。Ｂ１はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｑは０から３０の整数を表し、ｑが２以上の時、複数のＢ１は同一または相異なっていてもよい。Ｂ２はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｒは０から３０の整数を表し、ｒが２以上の時、複数のＢ２は同一または相異なっていてもよい。ただし、ｑとｒの和は１５以上３０以下である。Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項２】
一般式（１ａ）が、下記一般式（１ｃ）
【化２】
2013046586.tif 000028
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｒ７−１およびＲ８−１は各々独立に９−アデニル基または１−チミニル基を表し、Ｘ−は対アニオンを表し、ｌは１から８の整数を表す。Ｂ３はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｓは０から２７の整数を表し、ｓが２以上の時、複数のＢ３は同一または相異なっていてもよい。Ｂ６はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｔは０から２７の整数を表し、ｔが２以上の時、複数のＢ６は同一または相異なっていてもよい。ただし、ｓとｔの和は９以上２４以下である。Ｂ４は同一または相異なってアデニンまたはチミンを表し、Ｂ５は同一または相異なってアデニンまたはチミンを表す。Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
Ｒ６−１、Ｒ６−２およびＲ６−３が水素原子であり、Ｒ６−４がメトキシ基である、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項４】
Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４が水素原子である、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項５】
Ｒ６−１およびＲ６−４がメトキシ基であり、Ｒ６−２およびＲ６−３が水素原子である、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項６】
一般式（１ａ）が、下記一般式（１ｂ）
【化３】
2013046586.tif 000029
（式中、Ｒ６−１およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｘ−は対アニオンを表し、ｌは１から８の整数を表し、Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表される請求項１に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項７】
ｌが４である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項８】
Ｒ６−１が水素原子で、Ｒ６−４がメトキシ基である、請求項６または７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項９】
Ｒ６−１およびＲ６−４が水素原子である、請求項６または７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項１０】
Ｒ６−１およびＲ６−４がメトキシ基である、請求項６または７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項１１】
一般式（２ｄ）
【化４】
2013046586.tif 000030
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｙはヨウ素原子、臭素原子または塩素原子を表し、Ｘ１はハロゲン原子、炭素数１から８のアルコキシスルホニルオキシ基、メチルスルホニルオキシ基またはトリフルオロメチルスルホニルオキシ基を表し、ｌは１から８の整数を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を、一般式（６）
【化５】
2013046586.tif 000031
（式中、Ｒ７およびＲ８は各々独立に９−アデニル基、９−グアニル基、１−シトシニル基または１−チミニル基を表し、ｍは１から４の整数を表し、ｎは１から４の整数を表す。Ｂ１はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｑは０から３０の整数を表し、ｑが２以上の時、複数のＢ１は同一または相異なっていてもよい。Ｂ２はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｒは０から３０の整数を表し、ｒが２以上の時、複数のＢ２は同一または相異なっていてもよい。ただし、ｑとｒの和は１５以上３０以下である。Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表されるオリゴヌクレオチド誘導体と、還元剤の存在下反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
【化６】
2013046586.tif 000032
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３、Ｒ６−４、Ｒ７、Ｒ８、ｌ、ｍ、ｎ、ｑ、ｒ、Ｚ、Ｂ１およびＢ２は前記と同じ意味を表し、Ｘ−は対アニオンを表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド誘導体と、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸とで二本鎖核酸を形成させ、
該二本鎖核酸の形成に伴う前記オリゴヌクレオチド誘導体の蛍光特性の変化を測定する、標的核酸の検出方法。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかに記載の第一のオリゴヌクレオチド誘導体と、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する第一の標的核酸とで二本鎖核酸を形成させるとともに、
一般式（２ｄ）
【化７】
2013046586.tif 000033
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｙはヨウ素原子、臭素原子または塩素原子を表し、Ｘ１はハロゲン原子、炭素数１から８のアルコキシスルホニルオキシ基、メチルスルホニルオキシ基またはトリフルオロメチルスルホニルオキシ基を表し、ｌは１から８の整数を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩とは異なる蛍光波長を示す蛍光色素を化学結合で結合した第二のオリゴヌクレオチド誘導体と、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する第二の標的核酸とで二本鎖核酸を形成させ、
前記二本鎖核酸の形成に伴う第一および第二のオリゴヌクレオチド誘導体の蛍光特性の変化を測定する、
第一および第二の標的核酸の検出方法。
【請求項１４】
第二のオリゴヌクレオチド誘導体における、化学結合で結合した蛍光色素がオキサゾールイエローである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴヌクレオチド誘導体と、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸とで二本鎖核酸を形成させる際、該標的核酸を増幅させながら二本鎖核酸を形成させ、前記オリゴヌクレオチド誘導体が有する蛍光特性の変化を経時的に測定する、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドと２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合することで得られるオリゴヌクレオチド誘導体、該誘導体の製造方法、および該誘導体を用いた、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する核酸の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子診断技術の発達に伴い、遺伝子を検出する技術の重要性が増している。二本鎖ＤＮＡやＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド等の二本鎖核酸の検出には、従来よりエチジウムブロミドやオキサゾールイエロー等の蛍光色素を用いた検出が用いられている（非特許文献１）。また、それらの蛍光色素とオリゴヌクレオチドを化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体は、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（標的核酸）と二本鎖核酸を形成することができ、該二本鎖核酸の形成に伴い蛍光増感を示すことから、遺伝子診断において遺伝子やウイルス等の検出に用いられる（特許文献１）。特に、エチジウムブロミド類縁体である３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジニウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体は、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブとして広く用いられている。（特許文献２、非特許文献１）。
【０００３】
なお、２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合した、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体はこれまでに全く報告されておらず、新規の化合物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１３１４７号公報
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ９７／２７３２９号
【特許文献３】特開２０００−３１６５８７号公報
【特許文献４】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献５】欧州公開特許第３７３９６０号公報
【特許文献６】特開平８−２１１０５０号公報
【特許文献７】特開２０００−１４４００号公報
【特許文献８】特開２００１−０３７５００号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，９２０−９２８（１９９４）
【非特許文献２】Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，１１，２１−３５（１９８９）
【非特許文献３】Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１４，１２４７−１２５２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したように、エチジウムブロミド類縁体である３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジニウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体は、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（標的核酸）を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブとして従来より用いられているものの、蛍光強度値が小さく、二本鎖核酸の形成に伴う蛍光強度値の増加割合、いわゆる蛍光増感率が低いという問題点があった。
【０００７】
そこで本発明の課題は、ストークスシフトが大きく、かつ、相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸存在下における蛍光強度値が大きく、蛍光増感率も高い、オリゴヌクレオチド誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を鑑み鋭意検討を重ねた結果、本発明の２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体が、ストークスシフトが大きく、かつ、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（標的核酸）存在下における蛍光強度値が大きく、蛍光増感率も高いため、該標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブとして有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、一般式（１ａ）
【００１０】
【化１】
2013046586.tif 000003
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｒ７およびＲ８は各々独立に９−アデニル基、９−グアニル基、１−シトシニル基または１−チミニル基を表し、Ｘ−は対アニオンを表す。ｌは１から８の整数を表し、ｍは１から４の整数を表し、ｎは１から４の整数を表す。Ｂ１はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｑは０から３０の整数を表し、ｑが２以上の時、複数のＢ１は同一または相異なっていてもよい。Ｂ２はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｒは０から３０の整数を表し、ｒが２以上の時、複数のＢ２は同一または相異なっていてもよい。ただし、ｑとｒの和は１５以上３０以下である。Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体に関する。
【００１１】
また本発明は、一般式（１ｃ）
【００１２】
【化２】
2013046586.tif 000004
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｒ７−１およびＲ８−１は各々独立に９−アデニル基または１−チミニル基を表し、Ｘ−は対アニオンを表し、ｌは１から８の整数を表す。Ｂ３はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｓは０から２７の整数を表し、ｓが２以上の時、複数のＢ３は同一または相異なっていてもよい。Ｂ６はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｔは０から２７の整数を表し、ｔが２以上の時、複数のＢ６は同一または相異なっていてもよい。ただし、ｓとｔの和は９以上２４以下である。Ｂ４は同一または相異なってアデニンまたはチミンを表し、Ｂ５は同一または相異なってアデニンまたはチミンを表す。Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体に関する。
【００１３】
また本発明は、一般式（１ｂ）
【００１４】
【化３】
2013046586.tif 000005
（式中、Ｒ６−１およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｘ−は対アニオンを表し、ｌは１から８の整数を表し、Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体に関する。
【００１５】
また本発明は、一般式（２ｄ）
【００１６】
【化４】
2013046586.tif 000006
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｙはヨウ素原子、臭素原子または塩素原子を表し、Ｘ１はハロゲン原子、炭素数１から８のアルコキシスルホニルオキシ基、メチルスルホニルオキシ基またはトリフルオロメチルスルホニルオキシ基を表し、ｌは１から８の整数を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を、一般式（６）
【００１７】
【化５】
2013046586.tif 000007
（式中、Ｒ７およびＲ８は各々独立に９−アデニル基、９−グアニル基、１−シトシニル基または１−チミニル基を表し、ｍは１から４の整数を表し、ｎは１から４の整数を表す。Ｂ１はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｑは０から３０の整数を表し、ｑが２以上の時、複数のＢ１は同一または相異なっていてもよい。Ｂ２はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表し、ｒは０から３０の整数を表し、ｒが２以上の時、複数のＢ２は同一または相異なっていてもよい。ただし、ｑとｒの和は１５以上３０以下である。Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）で表されるオリゴヌクレオチド誘導体と、還元剤の存在下反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
【００１８】
【化６】
2013046586.tif 000008
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３、Ｒ６−４、Ｒ７、Ｒ８、ｌ、ｍ、ｎ、ｑ、ｒ、Ｚ、Ｂ１およびＢ２は前記と同じ意味を表し、Ｘ−は対アニオンを表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体の製造方法に関する。
【００１９】
また本発明は、本発明の２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体と、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸とで二本鎖核酸を形成させ、該二本鎖核酸の形成に伴う前記オリゴヌクレオチド誘導体の蛍光特性の変化を測定することで標的核酸を検出する方法に関する。
【００２０】
また本発明は、本発明の２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体と、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する第一の標的核酸とで二本鎖核酸を形成させるとともに、一般式（２ｄ）
【００２１】
【化７】
2013046586.tif 000009
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は各々独立に水素原子またはメトキシ基を表し、Ｙはヨウ素原子、臭素原子または塩素原子を表し、Ｘ１はハロゲン原子、炭素数１から８のアルコキシスルホニルオキシ基、メチルスルホニルオキシ基またはトリフルオロメチルスルホニルオキシ基を表し、ｌは１から８の整数を表す。）で表される２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩とは異なる蛍光波長を示す蛍光色素を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体と、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する第二の標的核酸とで二本鎖核酸を形成させ、前記二本鎖核酸の形成に伴う各オリゴヌクレオチド誘導体の蛍光特性の変化を測定することで標的核酸を検出する方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体は、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（標的核酸）と二本鎖核酸を形成することで蛍光増感を示すことから、前記標的核酸を特異的に検出するオリゴヌクレオチドプローブとして用いることができる。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体が有する蛍光特性は、同一波長領域で励起することができ、かつ、従来よりオリゴヌクレオチドプローブとして用いられている、３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジニウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体よりも、蛍光強度値が顕著に高く、蛍光増感率も大きい。よって、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は標的核酸を検出する上で極めて有用な新規化合物であり、遺伝子診断等の臨床診断分野での利用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例８にて、化合物１−１をオリゴヌクレオチド誘導体として用いたときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図２】実施例８にて、化合物１−３をオリゴヌクレオチド誘導体として用いたときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図３】実施例９にて、化合物１−１をオリゴヌクレオチド誘導体として用いたときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図４】実施例９にて、化合物１−４をオリゴヌクレオチド誘導体として用いたときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図５】実施例９にて、化合物１−５をオリゴヌクレオチド誘導体として用いたときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図６】実施例９にて、化合物１−６をオリゴヌクレオチド誘導体として用いたときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図７】実施例１０にて、化合物１−１とプローブＢを添加した核酸増幅反応における蛍光強度（５２０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図８】実施例１０にて、化合物１−１とプローブＢを添加した核酸増幅反応における蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図９】実施例１０にて、化合物１−３とプローブＢを添加した核酸増幅反応における蛍光強度（５２０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【図１０】実施例１０にて、化合物１−３とプローブＢを添加した核酸増幅反応における蛍光強度（６１０ｎｍ）の経時変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体（以下、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体という）中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３およびＲ６−４は水素原子またはメトキシ基を表す。中でもＲ６−２およびＲ６−３は蛍光強度が強い点で水素原子が好ましい。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体中、Ｒ７は９−アデニル基、９−グアニル基、１−シトシニル基、１−チミニル基のいずれかを表す。中でも蛍光強度が強い点で９−アデニル基または１−チミニル基が好ましく、１−チミニル基がさらに好ましい。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体中、Ｒ８は９−アデニル基、９−グアニル基、１−シトシニル基、１−チミニル基のいずれかを表す。中でも蛍光強度が強い点で９−アデニル基または１−チミニル基が好ましく、９−アデニル基がさらに好ましい。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体中、Ｘ−で表される対アニオンとしては、塩素アニオン、臭素アニオン、ヨウ素アニオン等のハロゲンアニオン、メトキシスルホニルオキシアニオン、エトキシスルホニルオキシアニオン、プロポキシスルホニルオキシアニオン、ブトキシスルホニルオキシアニオン、ペントキシスルホニルオキシアニオン、ヘキサノキシスルホニルオキシアニオン、ヘプタノキシスルホニルオキシアニオン、オクタノキシスルホニルオキシアニオン等の炭素数１から８のアルコキシスルホニルオキシアニオン、メチルスルホニルオキシアニオン、トリフルオロメチルスルホニルオキシアニオン、酢酸アニオン、リン酸アニオン、水酸化物イオン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエチルスルホニルオキシアニオンを例示することができる。なお、分子内のカルボン酸アニオンまたはリン酸アニオンが対アニオンになっていてもよい。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体中、ｌは１から８の整数のいずれかを表す。中でも蛍光強度が強い点でｌは３から６のいずれかが好ましく、特に４が好ましい。
【００３１】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体中、ｍは１から４の整数のいずれかを表す。中でも蛍光強度が強い点でｍは２が好ましい。
【００３２】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体中、ｎは１から４の整数のいずれかを表す。中でも蛍光強度が強い点でｎは２が好ましい。
【００３３】
次に、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（１ａ）の製造方法について詳細に説明する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（１ａ）は、下記スキームにより製造することができる。
【００３４】
【化８】
2013046586.tif 000010
（式中、Ｒ６−１、Ｒ６−２、Ｒ６−３、Ｒ６−４、Ｒ７、Ｒ８、Ｘ−、ｌ、ｍ、ｎは前記と同じ意味を表す。Ｘ１はハロゲン原子、炭素数１から８のアルコキシスルホニルオキシ基、メチルスルホニルオキシ基またはトリフルオロメチルスルホニルオキシ基を表し、Ｙはヨウ素原子、臭素原子または塩素原子を表す。Ｂ１はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表す。ｑは０から３０の整数を表し、ｑが２以上の時、複数のＢ１は同一または相異なっていてもよい。Ｂ２はアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを表す。ｒは０から３０の整数を表し、ｒが２以上の時、複数のＢ２は同一または相異なっていてもよい。ただし、ｑとｒの和は１５以上３０以下である。Ｚは水酸基またはアミノ基を表す。）
前記スキームのうち、Ｘ１で表されるハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を例示することができる。また、Ｘ１で表される炭素数１から８のアルコキシスルホニルオキシ基としては、メトキシスルホニルオキシ基、エトキシスルホニルオキシ基、プロポキシスルホニルオキシ基、ブトキシスルホニルオキシ基、ペントキシスルホニルオキシ基、ヘキサノキシスルホニルオキシ基、ヘプタノキシスルホニルオキシ基、オクタノキシスルホニルオキシ基を例示することができる。中でも調製が容易な点でヨウ素原子がＸ１として好ましい。
【００３５】
前記スキームのうち、Ｙはヨウ素原子、臭素原子または塩素原子を表す。中でも収率がよい点でヨウ素原子がＹとして好ましい。
【００３６】
前記スキームのうち工程−１は、２−メチルベンゾチアゾリウム塩（４ａ）と４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（５ａ）を縮合させ、２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩（２ｄ）を製造する工程である。
【００３７】
工程−１の原料である２−メチルベンゾチアゾリウム塩（４ａ）は、例えば文献記載の方法（Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，１１，２１−３５（１９８９）：非特許文献２）を参考に、対応する２−メチルベンゾチアゾール誘導体から調製することができる。
【００３８】
工程−１の反応は、縮合剤の存在下に行なうことが必須である。縮合剤としては、塩基または脱水剤を用いることができる。本工程の縮合剤として用いることができる塩基としては、ピペリジン、ピロリジン、モルフォリン等の有機塩基を例示することができる。また、本工程の縮合剤として用いることのできる脱水剤としては、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸等の酸無水物を例示することができる。中でも収率のよい点で、ピペリジンまたは無水酢酸が縮合剤として好ましい。
【００３９】
工程−１の反応は反応を阻害しない溶媒であれば、溶媒中で行なってもよい。本工程で用いることができる溶媒として、具体的には、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン等の非プロトン性極性溶媒、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等のアルコール系溶媒、水を例示することができ、これらの溶媒の中から２種類以上を混合して用いてよい。また前述した縮合剤である、ピペリジン、ピロリジン、モルフォリン等の有機塩基、無水酢酸、無水トリフルオロ酢酸等の酸無水物を溶媒として用いてもよい。
【００４０】
工程−１の反応で、２−メチルベンゾチアゾリウム塩（４ａ）と４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（５ａ）とのモル比に特に制限はないが、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率がよい点で１：１から１：３の範囲がさらに好ましい。
【００４１】
工程−１の反応において、２−メチルベンゾチアゾリウム塩（４ａ）と縮合剤とのモル比に特に制限はないが、縮合剤を溶媒として用いない場合には、１：１から１：１０の範囲が好ましく、中でも収率がよい点で１：１から１：３の範囲がさらに好ましい。
【００４２】
工程−１の反応において、反応温度は−７８℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率がよい点で室温から１２０℃の範囲が好ましい。
【００４３】
工程−１の反応で得られる２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩（２ｄ）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定はないが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。
【００４４】
工程−２は、２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩（２ｄ）とオリゴヌクレオチド誘導体（６）とを反応させ、本発明の２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体（１ａ）を製造する工程である。
【００４５】
工程−２の原料であるオリゴヌクレオチド誘導体（６）は、例えば文献記載の方法（特開２０００−３１６５８７号公報：特許文献３）を参考に、下記スキームにより調製することができる。化合物（１３）から化合物（１４）への変換工程の条件を選ぶことにより、オリゴヌクレオチド誘導体（６）の置換基Ｚは、水酸基またはアミノ基に作り分けることができる。
【００４６】
【化９】
2013046586.tif 000011
（式中、Ｒ７、Ｒ８、ｍ、ｎ、ｑ、ｒ、Ｂ１、Ｂ２およびＺは前記と同じ意味を表す。）
工程−２の反応は、還元剤の存在下に行なうことが必須であり、還元剤としては、水素化ホウ素ナトリウム、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、２−メルカプトエチルアミン、ジチオエリスリトール、還元型グルタチオン、システイン、モノチオリン酸および亜硫酸塩等を用いることができる。
【００４７】
工程−２の反応は反応を阻害しない溶媒であれば、溶媒中で行なってもよい。工程−２で用いることができる溶媒としては、トリス−塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等の緩衝液を例示することができる。また、これらの緩衝液に、０％から８０％の割合でジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ヘキサメチルリン酸トリアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等、水と混和可能な有機溶媒を混合して用いてもよい。なお、前記有機溶媒の割合を０％から２０％の範囲とすると好ましい。
【００４８】
工程−２の反応において、２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩（２ｄ）とオリゴヌクレオチド誘導体（６）とのモル比に特に制限はなく、２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩（２ｄ）を大過剰に用いてもよい。
【００４９】
工程−２の反応において、オリゴヌクレオチド誘導体（６）と還元剤とのモル比に特に制限はなく、還元剤を大過剰に用いてもよい。
【００５０】
工程−２の反応において、反応温度は０℃から１００℃の範囲から適宜選ばれた温度で行なうことができる。中でも収率がよい点で室温から６０℃の範囲が好ましい。
【００５１】
工程−２で得られた本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（１ａ）は、必要に応じて反応終了後、反応溶液から精製することができる。精製する方法には特に限定はないが、溶媒抽出、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、分取液体クロマトグラフィー、再結晶または昇華等の汎用的な方法で目的物を精製することができる。
【００５２】
なお、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（１ａ）のカウンターアニオン（Ｘ−）は、工程−２の反応において、反応に用いる緩衝液中の陰イオンまたは分子内の陰イオンとアニオン交換反応が起こる場合がある。しかしながら、いずれのカウンターアニオン（Ｘ−）であっても、オリゴヌクレオチドプローブとしての性能に影響はない。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（１ａ）は、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（標的核酸）と二本鎖核酸を形成することで、形成前と比較し蛍光特性が変化する（すなわち、蛍光強度値が増大する）ため、該標的核酸を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドプローブとして用いることができる。なお該標的核酸の由来に特に限定はなく、例えば、ＰＣＲ等に代表される核酸増幅反応により合成されたポリヌクレオチドであってもよいし、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであってもよいし、血液、組織、細胞等から抽出されたポリヌクレオチドであってもよいし、食品、土壌、排水等から抽出されたポリヌクレオチドであってもよい。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と標的核酸とで二本鎖核酸を形成させる際の溶媒に特に制限はないものの、緩衝液を用いることが好ましい。用いることのできる緩衝液としては、トリス−塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液を例示することができる。なお、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と標的核酸とで形成される二本鎖核酸の熱的安定性を向上させるために、前述の緩衝液に任意の濃度で無機塩またはカルボン酸塩を添加してもよい。該無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化マグネシウム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムを例示することができ、該カルボン酸塩としては、酢酸マグネシウム、酢酸マンガンを例示することができる。これらの無機塩およびカルボン酸塩のうち２種類以上を混合して用いてもよい。無機塩またはカルボン酸塩の添加濃度は０Ｍから５Ｍの範囲が好ましい。さらに、緩衝液に混和可能な有機溶媒を０％から８０％の割合で添加してもよい。該有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ヘキサメチルリン酸トリアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコール、グリセリンを例示することができ、これらの有機溶媒のうち２種類以上を混合して用いてもよい。有機溶媒の割合は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と標的核酸とで安定的に二本鎖核酸を形成できる点で、０％から２０％の範囲が好ましい。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と標的核酸とで二本鎖核酸を形成させる温度は、形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ値）以下であればよく、具体的には、一般的な標的核酸の場合、０℃から８０℃の範囲の中から、形成される二本鎖核酸のヌクレオチド配列および二本鎖核酸を形成させる際の溶媒の組成を考慮の上、適宜設定すればよい。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の蛍光特性は、蛍光色素部位、すなわち２−（４−アミノスチリル）ベンゾチアゾリウム塩部位に依存し、４００ｎｍから６００ｎｍの非常に幅広い波長領域で励起可能であり、その際、５２５ｎｍから６７５ｎｍの波長領域の蛍光を生じる。なお、最大励起波長は５４０ｎｍ付近であり、最大蛍光波長は５９０ｎｍ付近である。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、標的核酸の増幅反応を行なう際、増幅反応液中に共存させることができる。これにより、該標的核酸を増幅させながら本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と二本鎖核酸を形成させることができ、該二本鎖核酸の形成に伴う本発明のオリゴヌクレオチド誘導体が有する蛍光特性の変化（蛍光強度値の変化）を経時的に測定することで、該標的核酸のリアルタイム検出が可能となる。標的核酸のリアルタイム検出方法の一例として、標的核酸増幅反応中のある時点で測定した反応液中の蛍光強度値を反応前の反応液中の蛍光強度値で割った値（蛍光増感率）が一定の値（しきい値）を超えた場合、標的核酸検出と判定する方法がある。
【００５８】
また本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いた標的核酸のリアルタイム検出は、密閉容器内にて一段階で行なうことができる。すなわち標的核酸のリアルタイム検出を行なう際、当該検出に必要な試薬（標的核酸増幅試薬および標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ）の全てを容器内に収容し、標的核酸を含む試料を添加した後、当該容器を密閉することで、後から試薬を添加する操作や不要な試薬を除去する操作なしに、標的核酸をリアルタイムに検出（標的核酸の増幅および検出）することができる。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いた標的核酸のリアルタイム検出における、標的核酸の増幅方法に特に制限はなく、一例として特許文献４から６に記載された方法を採用することができる。さらに具体的には、標的ＲＮＡに対し相同的なヌクレオチド配列を有する第一のプライマーと、標的ＲＮＡに対し相補的なヌクレオチド配列を有する第二のプライマー（該プライマーのうちいずれか一方は、その５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるプライマーの組合せを用いて、
（１）逆転写酵素によりプロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡを生成し、
（２）当該二本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ逆転写産物を生成し、
（３）当該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記二本鎖ＤＮＡを生成する、
ＲＮＡ増幅反応させる際に、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を当該増幅反応系中に共存させ、当該誘導体が有する蛍光特性の変化（蛍光強度値の変化）を経時的に測定することで、標的ＲＮＡをリアルタイム検出することができる。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（第一のオリゴヌクレオチド誘導体）に、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体とは蛍光波長の異なる蛍光色素を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体（第二のオリゴヌクレオチド誘導体）をさらに添加することで、第一のオリゴヌクレオチド誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する第一の標的核酸と、第二のオリゴヌクレオチド誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する第二の標的核酸を同時に検出することができる。なお、第一および第二の標的核酸をリアルタイム検出することも可能であり、その具体例として、第一の標的ＲＮＡに対し相同的なヌクレオチド配列を有する第一のプライマーと第一の標的ＲＮＡに対し相補的なヌクレオチド配列を有する第二のプライマー（該プライマーのいずれか一方は、その５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるプライマーの組合せと、第二の標的ＲＮＡに対し相同的なヌクレオチド配列を有する第一のプライマーと第二の標的ＲＮＡに対し相補的なヌクレオチド配列を有する第二のプライマー（該プライマーのいずれか一方は、その５’末端にプロモーター配列が付加されている）からなるプライマーの組合せとを用いて、前記（１）から（３）に記載のＲＮＡ増幅反応させる際に、第一および第二のオリゴヌクレオチド誘導体を増幅反応系中に共存させ、各誘導体が有する蛍光特性の変化（蛍光強度値の変化）をそれぞれ経時的に測定することで、第一および第二の標的ＲＮＡを独立にリアルタイム検出することができる。
【００６１】
第二のオリゴヌクレオチド誘導体において、化学結合で結合する蛍光色素に特に制限はなく、例えばオキサゾールイエローやチアゾールオレンジがあげられる。中でも検出感度が良い点で、オキサゾールイエローが蛍光色素として好ましい。
【実施例】
【００６２】
次に本発明を実施例および参考例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６３】
実施例１
【００６４】
【化１０】
2013046586.tif 000012
一本鎖オリゴヌクレオチド（化合物６−１）（配列番号１）（４．４ｎｍｏｌ）を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ５．１）２７５μＬに溶解し、１Ｍジチオスレイトール水溶液２５μＬを添加した。１時間後、反応液に（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドのＤＭＦ−０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）溶液（１ｍｇ／ｍＬ，５００μＬ）を添加した。２時間後、反応液をｎ−ブタノールで洗浄し、得られた水層を濃縮した後、エタノールを添加し、−７８℃で３０分静置した。析出した固体を遠心濃縮により集めた。得られた沈殿物をＨＰＬＣ（ＯＤＳ−１２０Ｔ、東ソー株式会社製）により精製し、目的の化合物（化合物１−１）（２．４ｎｍｏｌ）を得た。得られた化合物１−１のＴＯＦ−Ｍａｓｓ測定を行なったところ、化合物１−１のカチオン部位の分子量：７５５７．４１に対応するピークが７５５７．６０に観測され、目的とするオリゴヌクレオチド誘導体の生成を確認した。
【００６５】
実施例２
【００６６】
【化１１】
2013046586.tif 000013
（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドの代わりに（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４，７−ジメトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドを用いた以外は実施例１と同様の反応を行ない、目的とするオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−２）（１．９ｎｍｏｌ）を得た。
【００６７】
実施例３
【００６８】
【化１２】
2013046586.tif 000014
（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドの代わりに（Ｅ）−２−［２−（４−ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）ベンゾチアゾリウム＝ヨージドを用いた以外は実施例１と同様の反応を行ない、目的の化合物（化合物１−３）（０．９ｎｍｏｌ）を得た。得られた化合物１−３のＴＯＦ−Ｍａｓｓ測定を行なったところ、化合物１−３のカチオン部位の分子量：７５２７．４０に対応するピークが７５２８．３４に観測され、目的物とするオリゴヌクレオチド誘導体を確認した。
【００６９】
実施例４
【００７０】
【化１３】
2013046586.tif 000015
（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドの代わりに（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードプロピル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドを用いた以外は実施例１と同様の反応を行ない、目的とするオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−４）（１．０ｎｍｏｌ）を得た。
【００７１】
実施例５
【００７２】
【化１４】
2013046586.tif 000016
（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドの代わりに（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードペンチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドを用いた以外は実施例１と同様の反応を行ない、目的とするオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−５）（０．６ｎｍｏｌ）を得た。
【００７３】
実施例６
【００７４】
【化１５】
2013046586.tif 000017
（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドの代わりに（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードヘキシル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージドを用いた以外は実施例１と同様の反応を行ない、目的とするオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−６）（０．４ｎｍｏｌ）を得た。
【００７５】
実施例７  標的核酸の検出
実施例１から３で合成した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１、化合物１−２、化合物１−３）を用いて、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の検出を行なった。
【００７６】
ａ）方法
以下の組成の測定条件で、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１、化合物１−２、化合物１−３）に、標的核酸Ｄ（ＤＮＡ１、配列番号２）または標的核酸Ｅ（ＲＮＡ１、配列番号３）をそれぞれ添加し、蛍光スペクトルを測定した。また同様に、一本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号４）と３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジニウム塩を化学結合で結合することで得られるオリゴヌクレオチド誘導体（プローブＡ）に、標的核酸Ｆ（ＤＮＡ２、配列番号５）または標的核酸Ｇ（ＲＮＡ２、配列番号６）をそれぞれ添加し、同様の条件で蛍光スペクトルを測定し、これを本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の比較対照とした。
【００７７】
【化１６】
2013046586.tif 000018
標的核酸Ｄ（ＤＮＡ１）の塩基配列：
５’−ｄ（ＧＴＣＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＧＧＣ）−３’
（配列番号２）
標的核酸Ｅ（ＲＮＡ１）の塩基配列：
５’−ｒ（ＧＵＣＧＵＡＵＧＧＵＡＵＵＡＵＵＵＡＧＧＧＧＣ）−３’
（配列番号３）
標的核酸Ｆ（ＤＮＡ２）の塩基配列：
５’−ｄ（ＣＴＧＣＴＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡ）−３’
（配列番号５）
標的核酸Ｇ（ＲＮＡ２）の塩基配列：
５’−ｒ（ＣＵＧＣＵＡＵＣＣＡＣＣＣＵＣＡＡＡＣＡ）−３’
（配列番号６）
測定溶液：
リン酸バッファー（ｐＨ７．４）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ
、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）
オリゴヌクレオチド誘導体の濃度：０．１μＭ
標的核酸の濃度：０．１μＭ
測定温度：４３℃
ｂ）結果
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１、化合物１−２、化合物１−３）および比較対照のオリゴヌクレオチド誘導体（プローブＡ）のみでの最大励起波長、最大蛍光波長および蛍光強度、ならびに標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）添加時の各オリゴヌクレオチド誘導体の最大蛍光波長、蛍光強度、蛍光増感率（標的核酸添加時の蛍光強度値をオリゴヌクレオチド誘導体のみでの蛍光強度値で割った値）を表１に示す。
【００７８】
【表１】
2013046586.tif 000019
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸の添加により大きな蛍光増感を示すことがわかる。具体的には、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１、化合物１−２、化合物１−３）に該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸を添加したときの蛍光強度値は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体のみのときと比較し増大しており、その蛍光増感率は、標的核酸が一本鎖ＤＮＡのときでそれぞれ３．３倍、２．０倍、２．８倍であり、標的核酸が一本鎖ＲＮＡのときでそれぞれ２．４倍、２．５倍、３．１倍であった。また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１、化合物１−２、化合物１−３）は、比較対照のオリゴヌクレオチド誘導体（プローブＡ）との比較で、蛍光強度値が著しく増大しており、蛍光増感率も増大していた。
【００７９】
以上の結果より、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、従来より核酸検出に用いられた蛍光色素である、３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジニウム塩をオリゴヌクレオチドと化学結合で結合して得られたオリゴヌクレオチド誘導体（プローブＡ）と比較し、オリゴヌクレオチド誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸の添加による、蛍光強度値の有意な増大および蛍光増感率の増加が確認できる。
【００８０】
実施例８  核酸増幅反応系における標的核酸のリアルタイム検出
実施例１および３で合成した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１および１−３）を用いて、核酸増幅反応により増幅した標的核酸のリアルタイム検出を行なった。核酸増幅反応にはＴＲＣ法（特許文献７、特許文献８および非特許文献３）を用いた。
【００８１】
ａ）方法
ａ−１）化学合成した標的核酸Ａ（配列番号７）を希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて、１０４コピー／５μＬになるように希釈し、これを標的核酸試料Ａとして用いた。
【００８２】
標的核酸Ａの塩基配列：
５’−ｄ（ＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴＡＧＣＣＣＣＴＡＡＡ
ＴＡＡＴＡＣＣＡＴＡＣＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＣＡＴ
ＡＣＧＡＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＣＧ）−３’
（配列番号７）
ａ−２）以下の組成からなる反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記の標的核酸試料Ａまたは水を５μＬ添加した。
【００８３】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号８）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号９）
８０ｎＭ  オリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１または１−３）
１０％  ＤＭＳＯ
０．０１％  コール酸ナトリウム
第一のプライマーの配列：
５’−ｄ（ＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＧＧＡ
ＡＡＧＧＴＣＴＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴＡＣ）−３’
（配列番号８）
第二のプライマーの配列：
５’−ｄ（ＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＡＡＡＧＣＧＣ）−３’
（配列番号９）
ａ−３）前記反応液を４６℃で５分間保温後、あらかじめ４３℃で２分間保温した以下の組成からなる酵素液５μＬを添加した。
【００８４】
酵素液の組成
２．０％  ソルビトール
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
３．６μｇ  牛血清アルブミン
ａ−４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能つき蛍光分光光度計を用いて４６℃で反応させると同時に、反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ）を経時的に１０分間測定した。
【００８５】
ｂ）結果
化合物１−１または１−３を添加したときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度の経時変化を示した図をそれぞれ図１および２に示す。なお図１および２において、白四角は試料として水を添加したときの蛍光強度を、黒三角は試料として標的核酸試料Ａを添加したときの蛍光強度を、それぞれ示している。いずれの化合物を用いた場合も、試料として水を添加したときは蛍光強度の変化が確認できなかったのに対し、標的核酸試料Ａを添加したときは標的核酸の増幅に伴い蛍光強度が増大した。酵素液添加１０分後の蛍光増感率（酵素液添加１０分後の溶液の蛍光強度値を酵素液添加前の溶液の蛍光強度値で割った値）は化合物１−１を用いたときで３．１倍、化合物１−３を用いたときで３．３倍であり、標的核酸の有無により蛍光強度値の明確な差が確認できた。このことから、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、核酸増幅反応により増幅された、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸をリアルタイムに検出できることがわかる。
【００８６】
実施例９  核酸増幅反応系における標的核酸のリアルタイム検出
実施例１、４、５および６で合成した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１、１−４、１−５および１−６）を用いて、核酸増幅反応により増幅した標的核酸のリアルタイム検出を行なった。核酸増幅反応には実施例８と同様、ＴＲＣ法を用いた。
【００８７】
ａ）方法
ａ−１）以下の組成からなる反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに実施例８のａ−１）で調製した標的核酸試料Ａまたは水を５μＬ添加した。
【００８８】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号８）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号９）
８０ｎＭ  オリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１、１−４、１−５または１−
６）
１３％  ＤＭＳＯ
ａ−２）上記反応液を４３℃で５分間保温後、あらかじめ４３℃で２分間保温した、実施例８のａ−３）に記載の酵素液５μＬを添加した。
【００８９】
ａ−３）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能つき蛍光分光光度計を用いて４３℃で反応させると同時に、反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ）を経時的に１０分間測定した。
【００９０】
ｂ）結果
化合物１−１、１−４、１−５または１−６を添加したときの、核酸増幅反応に伴う蛍光強度の経時変化を示した図をそれぞれ図３から６に示す。なお図３から６において、白四角は試料として水を添加したときの蛍光強度を、黒三角は試料として標的核酸試料Ａを添加したときの蛍光強度を、それぞれ示している。いずれの化合物を用いた場合も、試料として水を添加したときは蛍光強度の変化が確認できなかったのに対し、標的核酸試料Ａを添加したときは標的核酸の増幅に伴い蛍光強度が増大した。酵素液添加１０分後の蛍光増感率（酵素液添加１０分後の溶液の蛍光強度値を酵素液添加前の溶液の蛍光強度値で割った値）は化合物１−１を用いたときで２．３倍、化合物１−４を用いたときで１．８倍、化合物１−５を用いたときで２．０倍、化合物１−６を用いたときで２．０倍であり、標的核酸の有無により蛍光強度値の明確な差が確認できた。このことから、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、核酸増幅反応により増幅された、該誘導体が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸をリアルタイムに検出できることがわかる。
【００９１】
実施例１０  核酸増幅反応系における２種類の標的核酸の同時検出
実施例１および３で合成した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１および１−３）と、オキサゾールイエローを化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体（プローブＢ、配列番号１０）とを用いて、核酸増幅反応により増幅した二種類の標的核酸のリアルタイム検出を行なった。核酸増幅反応には実施例８と同様、ＴＲＣ法を用いた。
【００９２】
【化１７】
2013046586.tif 000020
ａ）方法
ａ−１）標的核酸試料として、下記３種類の標的核酸試料を用意した。
【００９３】
（ｉ）実施例８のａ−１）で調製した標的核酸試料Ａ、
（ｉｉ）標的核酸Ｂ（配列番号１１）を希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて、１０４コピー／５μＬになるように希釈した標的核酸試料Ｂ、
標的核酸Ｂの塩基配列：
５’−（ＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＧＣＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡ
ＡＡＡＧＧＡＴＡＣＧＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＣＧ
ＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＴＴＣＣＧ）−３’
（配列番号１１）
（ｉｉｉ）標的核酸Ａ（配列番号７）と標的核酸Ｂ（配列番号１１）を希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて、各核酸の終濃度が１０４コピー／５μＬになるように混合／希釈した標的核酸試料Ｃ
ａ−２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｃｉｄｕａｌ  Ｄｏｍｅ  Ｃａｐ  ＰＣＲ  Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注し、これに標的核酸試料Ａ、標的核酸試料Ｂ、標的核酸試料Ｃまたは水を５μＬ添加した。
【００９４】
反応液の組成：濃度は酵素液添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  塩化マグネシウム
１００ｍＭ  塩化カリウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
１μＭ  第一のプライマー（配列番号８）
１μＭ  第二のプライマー（配列番号９）
２０ｎＭ  オリゴヌクレオチド誘導体（プローブＢ）
８０ｎＭ  オリゴヌクレオチド誘導体（化合物１−１または１−３）
１０％  ＤＭＳＯ
０．０１％  コール酸ナトリウム
ａ−３）上記反応液を４６℃で５分間保温後、あらかじめ４０℃で２分間保温した、実施例８のａ−３）に記載の酵素液５μＬを添加した。
【００９５】
ａ−４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能つき蛍光分光光度計を用いて４６℃で反応させると同時に、反応溶液の蛍光強度（励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長Ａ：５２０ｎｍ、蛍光波長Ｂ：６１０ｎｍ）を経時的に１０分間測定した。
【００９６】
ｂ）結果
化合物１−１およびプローブＢを添加したときの核酸増幅反応に伴う蛍光強度の経時変化を示した図をそれぞれ図７（蛍光波長Ａ）および８（蛍光波長Ｂ）に示し、化合物１−３およびプローブＢを添加したときの核酸増幅反応に伴う蛍光強度の経時変化を示した図をそれぞれ図９（蛍光波長Ａ）および１０（蛍光波長Ｂ）に示す。なお図７から１０において、白四角は試料として水を添加したときの蛍光強度を、黒三角は試料として標的核酸試料Ａを添加したときの蛍光強度を、黒丸は試料として標的核酸試料Ｂを添加したときの蛍光強度を、×は試料として標的核酸試料Ｃを添加したときの蛍光強度を、それぞれ示している。いずれの場合も、試料として水を添加したときは蛍光強度の変化が確認できなかったのに対し、標的核酸試料Ａを添加したときは標的核酸の増幅に伴い蛍光波長Ｂの蛍光強度のみが増大し、標的核酸試料Ｂを添加したときは標的核酸の増幅に伴い蛍光波長Ａの蛍光強度のみが増大し、標的核酸試料Ｃを添加したときは標的核酸の増幅に伴い蛍光波長Ａの蛍光強度と蛍光波長Ｂの蛍光強度がともに増大した。蛍光波長Ａの蛍光強度はプローブＢに対して相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸Ｂに由来する蛍光強度であり、蛍光波長Ｂの蛍光強度は本発明のオリゴヌクレオチド誘導体に対して相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸Ａに由来する蛍光強度である。各オリゴヌクレオチド誘導体（本発明のオリゴヌクレオチド誘導体およびプローブＢ）が有するヌクレオチド配列と相補的な配列を有する標的核酸（標的核酸Ａおよび標的核酸Ｂ）の有無により、各蛍光波長（蛍光波長Ａおよび蛍光波長Ｂ）における蛍光強度値に明確な差がみられたことから、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、該誘導体と蛍光波長が異なる蛍光色素を化学結合で結合したオリゴヌクレオチド誘導体と併用することで、核酸増幅反応にて増幅された二種類の標的核酸を、それぞれ独立してリアルタイム検出できることが示された。
【００９７】
参考例１
【００９８】
【化１８】
2013046586.tif 000021
アルゴン雰囲気下、３−（３−ヨードプロピル）−４−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム＝ヨージド（３５．９ｍｇ，０．０７６ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（１４．０ｍｇ，０．０９４ｍｍｏｌ）と無水酢酸（１．０ｍＬ）の混合物を、１１０℃で一晩撹拌した。反応混合物にトルエン（５．０ｍＬ）を加えて減圧濃縮を行ない、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製することにより、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（３−ヨードプロピル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージド（１６．７ｍｇ，収率３６％）を黒紫色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．０４（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ），５．１０−４．９０（ｍ，２Ｈ），４．０９（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．１２（ｓ，６Ｈ），２．４１−２．３７（ｍ，２Ｈ）．
参考例２
【００９９】
【化１９】
2013046586.tif 000022
アルゴン雰囲気下、３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム＝ヨージド（１．３６ｇ，２．７８ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（４１６．６ｍｇ，２．７９ｍｍｏｌ）と無水酢酸（１２．０ｍＬ）の混合物を、１１０℃で一晩撹拌した。反応混合物にトルエン（５．０ｍＬ）を加えて減圧濃縮を行ない、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製することにより、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージド（１．４１ｇ，収率８２％）を紫色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．０７（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）５．１０−５．００（ｍ，２Ｈ），４．０７（ｓ，３Ｈ），３．４０−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｓ，６Ｈ），２．００−１．９０（ｍ，４Ｈ）．
参考例３
【０１００】
【化２０】
2013046586.tif 000023
アルゴン雰囲気下、３−（５−ヨードペンチル）−４−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム＝ヨージド（３９．６ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（２０．２ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）と無水酢酸（１．０ｍＬ）の混合物を、１１０℃で一晩撹拌した。反応混合物にトルエン（２．０ｍＬ）を加えて減圧濃縮を行ない、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製することにより、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（５−ヨードペンチル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージド（１１．２ｍｇ，収率２４％）を黒紫色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．０６（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），４．９６−４．９３（ｍ，２Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ），３．３０−３．２９（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｓ，６Ｈ），１．９０−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．６０−１．５０（ｍ，２Ｈ）．
参考例４
【０１０１】
【化２１】
2013046586.tif 000024
アルゴン雰囲気下、３−（６−ヨードヘキシル）−４−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム＝ヨージド（３８．６ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）、４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（１６．６ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）と無水酢酸（１．０ｍＬ）の混合物を、１１０℃で一晩撹拌した。反応混合物にトルエン（２．０ｍＬ）を加えて減圧濃縮を行ない、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製することにより、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（６−ヨードヘキシル）−４−メトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージド（１２．９ｍｇ，収率２７％）を黒紫色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．０３（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），４．９４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０７（ｓ，３Ｈ），３．２９（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１２（ｓ，６Ｈ），１．９０−１．７０（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．４０（ｍ，４Ｈ）．
参考例５
【０１０２】
【化２２】
2013046586.tif 000025
アルゴン雰囲気下、３−（４−ヨードブチル）−４，７−ジメトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム＝ヨージド（２０１ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）と４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（５９．０ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の無水酢酸（１．０ｍＬ）懸濁液を、１１０℃で一晩撹拌を行なった。反応混合物を室温に戻した後減圧濃縮を行ない、得られた粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］により精製することで、（Ｅ）−２−［４−（ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）−４，７−ジメトキシベンゾチアゾリウム＝ヨージド（２２５ｍｇ，収率８９％）を暗赤色粉状として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１３（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），４．９４（ｍ，２Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），３．３８−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．１１（ｓ，６Ｈ），１．９６−１．８０（ｍ，４Ｈ）．
参考例６
【０１０３】
【化２３】
2013046586.tif 000026
アルゴン雰囲気下、３−（４−ヨードブチル）−２−メチルベンゾチアゾリウム＝ヨージド（１０３．４ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）と４−（ジメチルアミノ）ベンズアルデヒド（４０．２ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）の無水酢酸（２．０ｍＬ）溶液を、１１０℃で一晩撹拌を行なった。反応混合物を室温に戻した後減圧濃縮を行ない、得られた粗成生物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］により精製することで、（Ｅ）−２−［２−（４−ジメチルアミノ）スチリル］−３−（４−ヨードブチル）ベンゾチアゾリウム＝ヨージド（４６．８ｍｇ，収率３５％）を紫色の固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ８．３１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．７８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），４．８３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．３６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．１２（ｓ，６Ｈ），１．９６−１．９１（ｍ，４Ｈ）．
【図１】
2013046586.tif 000035
【図２】
2013046586.tif 000036
【図３】
2013046586.tif 000037
【図４】
2013046586.tif 000038
【図５】
2013046586.tif 000039
【図６】
2013046586.tif 000040
【図７】
2013046586.tif 000041
【図８】
2013046586.tif 000042
【図９】
2013046586.tif 000043
【図１０】
2013046586.tif 000044
【配列表】
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