(57)【要約】【課題】特定および個別化された療法の発見への前途有望なアプローチとしてこれらの転写モジュールを操縦するものを同定することを提供すること。【解決手段】本開示は、ＫＲＡＳバリアントとして公知である、ＫＲＡＳ癌遺伝子におけるＳＮＰの存在または不存在を決定することによって、がんを発生するリスクがある被験体を同定するための方法、がんの発症を予測するための方法、および化学療法／処置に対する被験体の応答を予測するための方法を提供する。本開示は、一般に、がん、リプロダクティブヘルス、および分子生物学の分野に関する。本開示は、遺伝マーカーの存在または不存在を決定することによって、がんを有する被験体を診断および予後判断するための方法を提供する。さらに、本開示は、遺伝マーカーの存在または不存在を決定することによって、処置に対する被験体の応答を決定するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）乳がんを発生するリスクがある被験体または患者の同定の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、該被験体においてＥＲ／ＰＲ陰性乳がんを発生する増加したリスクを示す、方法。
【請求項２】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、乳がんを発生するリスクがある被験体または患者におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）乳がんの発生の発症を予測する指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんの発生のより早期な発症を示す、方法。
【請求項３】
前記ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんが、ＨＥＲ２に対しても陰性であり、従って、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、基底型腫瘍または管腔型腫瘍である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはサイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）遺伝子によってコードされる転写産物またはタンパク質を発現する基底型腫瘍である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記乳がんが、乳がん１（ＢＲＣＡ１）遺伝子の低発現または発現陰性によってさらに特徴付けられる、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体または患者が、閉経期前である、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体または患者が、５１歳またはそれより若い、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項９】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）を有する被験体または患者の予後判定の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、対照と比較して低下した生存率を示す、方法。
【請求項１０】
前記被験体または患者が、閉経後、５２歳、または少なくとも５２歳である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対照が前記変異を保有しない、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記生存率が、全生存率、５年生存率、または１年生存率である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、プラチナベースの化学療法に対する上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）細胞の応答の予測の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで該変異の存在は、プラチナベースの化学療法に対する抵抗性を示す、方法。
【請求項１４】
前記ＥＯＣ細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥＯＣ細胞が、閉経後、５２歳、または少なくとも５２歳である被験体からエクスビボで評価される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＯＣ細胞がインビトロで評価され、そしてここで、該ＥＯＣ細胞は、ＢＧ１、ＣＡＯＶ３、もしくはＩＧＲ−ＯＶ１細胞系から単離されるか、繁殖されるか、または誘導される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記プラチナベースの化学療法が、カルボプラチンまたはパクリタキセルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記プラチナベースの化学療法が、アジュバント療法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する被験体または患者の予後判定の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで該変異の存在は、対照と比較して増加した生存率を示す、方法。
【請求項２０】
前記検出が、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）分析をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記結腸直腸がん（ＣＲＣ）が、早期ＣＲＣである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記結腸直腸がん（ＣＲＣ）が、１期または２期のＣＲＣである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記対照が、ＫＲＡＳバリアントを保有しない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記対照が、ＫＲＡＳ遺伝子において第二の変異を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記被験体または患者が、ＫＲＡＳ遺伝子において第二の変異を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体または対照が、ＢＲＡＦ遺伝子において１つまたはそれより多くの変異を保有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体または対照が、過剰メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａプロモーターを有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記生存率が、全生存率、５年生存率、または１年生存率である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、モノクローナル抗体単剤療法に対するがん細胞の応答を予測する指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、モノクローナル抗体単剤療法に対する感受性を示す、方法。
【請求項３０】
前記がん細胞が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記がん細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記モノクローナル抗体単剤療法がセツキシマブである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、化学療法とモノクローナル抗体療法との組み合わせに対するがん細胞の応答を予測する指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、該組み合わせに対する抵抗性を示す、方法。
【請求項３４】
前記がん細胞が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記がん細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
モノクローナル抗体単剤療法がセツキシマブである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記化学療法が、細胞毒性薬剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞毒性薬剤がイリノテカンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異、ならびにｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを、腫瘍の血管形成のリスク増加の予測の指標とするための方法であって、ここで
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異が、第一の患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そして
（ｂ）ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルが、第二の患者サンプルにおいて決定され、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、抗血管新生遺伝子の転写サイレンシングを示し、それにより該腫瘍の血管形成のリスク増加が予測される、
方法。
【請求項４０】
前記抗血管新生遺伝子がＳｐｒｏｕｔｙ２またはＳｅｍａ６Ａである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫由来のがん細胞を含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍が転移性である、請求項３９または４１に記載の方法。
【請求項４３】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異、およびｍｉＲ−２１０  ｍｉＲＮＡの発現レベルを、低酸素条件下におけるがん細胞の増加した生存または増殖の予測の指標とするための方法であって、
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異が、第一の患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そして
（ｂ）ｍｉＲ−２１０  ｍｉＲＮＡの発現レベルが、第二の患者サンプルにおいて決定され、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）における該ｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、低酸素条件下における該がん細胞の増加した生存または増殖を示すことを含む、
方法。
【請求項４４】
前記がん細胞が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異、および腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのメチル化状態を、がん細胞の増加した生存または増殖の予測の指標とするための方法であって、
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異が、第一の患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そして
（ｂ）腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのメチル化状態が、第二の患者サンプルにおいて決定され、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）プロモーターのメチル化の増加は、該がん細胞の増加した生存または増殖を示すことを含む、
方法。
【請求項４６】
前記腫瘍抑制遺伝子がＮｏｔｃｈ１である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記がん細胞が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
生存が、腫瘍形成の可能性を維持することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記がん細胞が、がん幹細胞である、請求項４５または４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
参考としての援用
２０１２年３月１６日に作成され、サイズが３２．２  ＫＢである「３４５９２−５１５００１ＵＳＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルの内容は、これによって、その全体が参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、部分的に、米国国立衛生研究所の一部門である国立研究資源センターによって提供された、臨床およびトランスレーショナル科学資金（ＣＴＳＡ）（助成金ＵＬ１  ＲＲ０２４１３９）の下で米国政府から支援されてなされた。
【０００３】
本発明は、部分的に、米国国立衛生研究所によって提供された助成金ＲＯ１  ＣＡ１３１３０１−０１Ａ１、米国国立衛生研究所によって提供された助成金ＣＡ１２４４８４（Ｋ０８）、米国国立衛生研究所によって提供された助成金ＲＯ１  ＣＡ１２２７２８、米国国立衛生研究所によって提供された助成金ＲＯ１  ＣＡ７４４１５、および米国国立衛生研究所の国立がん研究所および事務局によって提供された助成金ＲＣ４ＣＡ１５３８２８の下で米国政府によって支援されてなされた。
【０００４】
本発明において、上記政府は特定の権利を有する。
【０００５】
開示の分野
本開示は、一般に、がん、リプロダクティブヘルス、および分子生物学の分野に関する。本開示は、遺伝マーカーの存在または不存在を決定することによって、がんを有する被験体を診断および予後判断するための方法を提供する。さらに、本開示は、遺伝マーカーの存在または不存在を決定することによって、処置に対する被験体の応答を決定するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００６】
背景
がんの異質性は、患者における種々の危険因子、処置応答および転帰に反映される。予後判断の遺伝子発現マーカーは非常に多様であるが、いくつかのモジュール（例えば、ＤＮＡ修復欠損、免疫応答のシグネチャーまたは上皮から間葉への移行）は、一般的に、あるサブセットの腫瘍と関連があることが見出されている。従って、特定および個別化された療法の発見への前途有望なアプローチとしてこれらの転写モジュールを操縦するものを同定する必要性が当該分野に存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本開示に示される研究は、がんにおけるｍｉＲＮＡの役割に関する主要な命題に関する：癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子のｍｉＲＮＡによる調節の崩壊は、がんのリスク、腫瘍の発生、および処置に対する応答に影響を与える。ｍｉＲＮＡは、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を直接的または間接的に調節し得る。例えば、ＫＲＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲのｌｅｔ−７の相補部位６（ＬＣＳ６）に位置する１つのＳＮＰであるＫＲＡＳバリアントは、ｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡによるＫＲＡＳの調節を崩壊させる。この場合、ｌｅｔ−７によって媒介されるＫＲＡＳの調節は崩壊されるが、ＫＲＡＳバリアントの二次的な作用が存在する。ｌｅｔ−７／ＫＲＡＳ相互作用の上流の崩壊は、下流の因子への異常なシグナル伝達を永続させる。さらに、カノニカルＲＡＳ経路以外のシグナル伝達経路の構成要素が影響を受ける。ＫＲＡＳバリアントの存在は、血管新生、生存（低酸素条件下でさえ）、転移を増加させ、頻繁に使用される化学療法薬剤に対して抵抗性を与える。さらに、がん細胞におけるエピジェネティックな変化（例えば、腫瘍抑制遺伝子および細胞周期遺伝子のプロモーターのメチル化に対する変化）は、ＫＲＡＳバリアントに対して陽性であるがん細胞の、発生、生存、および処置に対する応答に影響を及ぼす。結局、ＫＲＡＳバリアントの細胞への影響（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＫＲＡＳにおける他の変異（例えば、ＫＲＡＳのコード領域における獲得変異が挙げられる）とは独立している。多くのがん細胞について、ＫＲＡＳバリアントの出現は、他のＫＲＡＳ変異の出現と互いに相容れない。ＫＲＡＳにおける獲得変異と違って、ＫＲＡＳバリアントは、生殖細胞系の変異である。従って、ＫＲＡＳバリアントは、腫瘍細胞生物学の遺伝性バイオマーカーである。
【０００８】
ＫＲＡＳバリアント変異の出現は、ＫＲＡＳの増加した発現および／または豊富さ、ならびにｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡの低減した発現をもたらす。ＫＲＡＳバリアントはまた、転写因子およびｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡ以外のｍｉＲＮＡの発現レベルに影響する。例えば、ＫＲＡＳバリアントは、抗血管新生遺伝子（例えば、Ｓｐｒｏｕｔｙ２およびＳｅｍａ６Ａ）を標的とする、ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７の上昇した発現レベルと統計学的に有意に関連する。従って、従来の化学療法薬剤に対する低い転帰および抵抗性は、ＲＡＳ経路だけではなく、腫瘍に血液および栄養素を引き込んで腫瘍中のがん細胞の生存を促進する血管新生経路をも介して、細胞増殖の活性化をもたらすというＫＲＡＳバリアントの能力から生じ得る。共通のアクチベーターを有する２つの異常な経路に直面しては、特定の化学療法薬剤の活性は、がんの進行に立ち向かうのに不十分であり得る。ＫＲＡＳバリアントを有する腫瘍におけるＲＡＳおよび他の経路の混乱状態（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）は、がん細胞および腫瘍のタイプ（例えば、乳がんおよび卵巣がん）の全体で保存される。
【０００９】
ＫＲＡＳバリアントは、種々のがんにおける好ましくない臨床的転帰に関連し、このがんとしては、結腸、卵巣、頭頸部がん、および肺がんが挙げられるが、これらに限定されない。この証拠は、ＫＲＡＳバリアントが、処置に対する患者の応答を決定することを示唆する。ＫＲＡＳバリアントの保有者が、標準的な化学療法薬剤に対して抵抗性がある場合には、患者の転帰はより悪い。本明細書中で示されるデータは、ＫＲＡＳバリアントが従来の化学療法薬剤に対する抵抗性を与え得る一方で、時には、モノクローナル抗体療法に対する上昇した感受性を与えることを実証する。例えば、ＫＲＡＳバリアントは、ＫＲＡＳ経路の上流の調節因子（ＥＧＦＲ）を標的とするセツキシマブが単独の処置として送達される場合のセツキシマブに対する患者の感受性を上昇させる。従って、ＫＲＡＳの上流にある標的に特異的な薬剤はうまくいくが、ＫＲＡＳの下流にある細胞周期チェックポイントを標的とする従来の化学療法薬剤は有効でない場合があることを、ＫＲＡＳバリアントの出現は示唆し得る。同様に、ＫＲＡＳバリアントは、プラチナベースの化学療法に対する抵抗性を与える。プラチナベースの薬剤は、ＤＮＡ分子を架橋してＤＮＡの複製を妨げ、最終的には、アポトーシスを誘発する。しかし、ＤＮＡ複製は、ＫＲＡＳ活性化の下流で起きるプロセスであり、従って、（特に、ＲＡＳ以外のシグナル伝達経路の補充を示すデータを考慮すると）有効ではない場合があり得る。
【００１０】
処置方法としての化学療法は患者には非常に過酷であるので、本明細書中で提供されるＫＲＡＳ腫瘍生物学についてのこれらの知見は、臨床的に顕著な価値がある。化学療法薬剤は、患者の不快感を増すだけではなく、化学療法剤がなければ機能している身体系に合併症をも導く副作用を示す。例えば、がん細胞を死滅させる化学療法薬剤はまた、患者の心臓に損傷を与えたりまたは弱くしたりする場合がある。従って、ＫＲＡＳバリアントは、既知の化学療法薬剤に対する抵抗性または感受性を決定するためのバイオマーカーである。患者がＫＲＡＳバリアントに対して陽性であれば、医師は、最適な処置を選ぶか、または有効ではない処置を少なくとも避けることができる。
【００１１】
本開示において、被験体および患者という用語は、交換可能に使用される。
【００１２】
本開示は、腫瘍の血管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のリスクの増加を予測する方法であって、（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、第一の患者サンプルにおいて検出する工程（ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジション（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を含むＳＮＰである）、および（ｂ）ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを、第二の患者サンプルにおいて決定する工程を含み、ここで、（ａ）における上記変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、抗血管新生遺伝子の増加した転写サイレンシングを示し、それにより上記腫瘍の血管形成の増加したリスクが予測される、方法を提供する。第一の患者サンプルと第二の患者サンプルとは、同じ患者から抽出される。さらに、第一の患者サンプルおよび第二の患者サンプルは、同じ体液、組織、または生検材料を含み得る。好ましくは、第二の患者サンプルは、腫瘍または腫瘍と物理的に接触している（すなわち、腫瘍を取り囲んでいる）非腫瘍組織領域から抽出されるかまたはそれに由来する。例えば、抗血管新生遺伝子は、Ｓｐｒｏｕｔｙ２またはＳｅｍａ６Ａであり得る。上記腫瘍は、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｎａｌ  ｐｅｌｖｉｓ  ａｎｄ  ｕｒｅｔｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ）、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ）、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｏｃｃｕｌｔ  ｐｒｉｍａｒｙ）、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん（ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん（ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫由来のがん細胞を含み得る。あるいは、または加えて、上記腫瘍またはがんは、転移性である。
【００１３】
本開示は、低酸素条件下におけるがん細胞の増加した生存または増殖を予測するための方法であって、（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、第一の患者サンプルにおいて検出する工程（ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰである）、および（ｂ）ｍｉＲ−２１０  ｍｉＲＮＡの発現レベルを、第二の患者サンプルにおいて決定する工程を含み、ここで、（ａ）における上記変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、低酸素条件下における上記がん細胞の増加した生存または増殖を予測する、方法を提供する。第一の患者サンプルと第二の患者サンプルとは、同じ患者から抽出される。さらに、第一の患者サンプルおよび第二の患者サンプルは、同じ体液、組織、または生検材料を含み得る。上記がん細胞は、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来し得る。
【００１４】
本開示は、がん細胞の増加した生存または増殖を予測するための方法であって、（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、第一の患者サンプルにおいて検出する工程（ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰである）、および（ｂ）腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのメチル化状態を、第二の患者サンプルにおいて決定する工程を含み、ここで、（ａ）における上記変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）プロモーターのメチル化の増加は、上記がん細胞の増加した生存または増殖を予測する、方法を提供する。第一の患者サンプルと第二の患者サンプルとは、同じ患者から抽出される。さらに、第一の患者サンプルおよび第二の患者サンプルは、同じ体液、組織、または生検材料を含み得る。必要に応じて、上記腫瘍抑制遺伝子は、Ｎｏｔｃｈ１である。生存は、腫瘍形成の可能性を維持することを含み得る。上記がん細胞は、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来し得る。必要に応じて、上記がん細胞は、がん幹細胞である。
【００１５】
乳がん
本開示は、侵襲性（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）形態およびハイリスクな形態の乳がんを発生するリスクがある被験体を同定するための方法、ならびにこれらの形態の発症を予測するための方法を提供する。本明細書中で提供されるデータは、エストロゲン受容体の発現の不足またはプロゲステロン受容体の発現の不足のいずれかによって特徴付けられる乳がん腫瘍の発生をもたらす検出可能なゲノム変異の輪郭を描くメカニズムの最初の開示を構成する。好ましい実施形態において、侵襲性でリスクが高い形態の乳がんは三重陰性乳がん（ｔｒｉｐｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）であり、これは、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）遺伝子の転写産物またはタンパク質の発現の不足によってさらに特徴付けられる。
【００１６】
本開示は、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）に陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）の乳がんを発生するリスクがある被験体を同定するための方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、変異の存在は、ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんを発生するより大きなリスクを示す、方法を提供する。
【００１７】
本開示は、乳がんを発生するリスクがある被験体において、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）に陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）の乳がんの発生の発症を予測するための方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、上記変異の存在は、ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんの発生のより早期な発症を示す、方法を提供する。
【００１８】
本明細書中に記載される方法の好ましい実施形態において、ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんはまた、ＨＥＲ２に対しても陰性であり、従って、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）である。三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）は、基底型（ｂａｓａｌ）または管腔型（ｌｕｍｉｎａｌ）のがんまたは腫瘍であり得る。これらの方法の特定の局面において、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはサイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）の遺伝子によってコードされる転写産物またはタンパク質を発現する基底型腫瘍である。他の局面において、ＥＲ／ＰＲ陰性またはＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２陰性の乳がんは、乳がん１（ＢＲＣＡ１）遺伝子の低発現または発現陰性によってさらに特徴付けられる。
【００１９】
被験体（患者）は、好ましくは、閉経期前の女性であるが、上記被験体は、任意の年齢であり得る。あるいは、または加えて、上記被験体は、５１歳未満であるが、上記被験体は、必要に応じて、１００歳未満、９０歳未満、８０歳未満、７０歳未満、６０歳未満、５０歳未満、４０歳未満、３０歳未満、２０歳未満、またはそれらの間の任意の数の年齢であり得る。
【００２０】
結腸直腸がん
本開示は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する被験体の予後判定の方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここでＫＲＡＳバリアントの存在は、対照と比較して増加した生存率を示す、方法を提供する。この方法の１つの局面において、検出する工程は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）分析をさらに含む。ＫＲＡＳバリアントは、結腸直腸がん細胞および患者における生存についての独立したマーカーであるが、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）分析は、二次的な分析として使用され得る。ＭＳＩは、ＣＲＣ患者における良好な予後判定の分子マーカーである（すなわち、ＭＳＩ腫瘍を有するＣＲＣ患者は、良好な予後を有すると考えられる）が、ＫＲＡＳバリアント状態の決定により、ＭＳＩ腫瘍を発生しているが、ＫＲＡＳバリアントについて陰性（または、換言すると野生型）である個体が、ＣＲＣにおいて、依然として好ましくない予後を有することが明らかになった。従って、本開示は、特にＣＲＣ患者が、がんの病期によって階層化される場合に、臨床的転帰またはＣＲＣの予後を予測するためのより優れた方法を提供する。
【００２１】
この方法の特定の実施形態において、結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、早期ＣＲＣである。好ましくは、結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、１期または２期のものである。
【００２２】
試験の被験体は、ＫＲＡＳ遺伝子において第二の変異を有し得る（ＫＲＡＳバリアントが第一の変異である）。
【００２３】
上記試験または対照の被験体は、ＢＲＡＦ遺伝子において１つまたはそれより多くの変異を保有し得る。あるいは、または加えて、上記試験または対照の被験体は、過剰メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａプロモーターを有し得る。
【００２４】
上記対照の被験体は、ＫＲＡＳバリアントを保有しない（すなわち、上記対照の被験体は、ＫＲＡＳバリアント変異について野生型である）。しかし、上記対照の被験体は、ＣＲＣを有していてもよく、またはがんのない個体であってもよい。さらに、上記対照の被験体は、ＫＲＡＳ遺伝子において、ＫＲＡＳバリアントではない第二の変異を有し得る。
【００２５】
この方法の特定の局面において、生存率は、全生存率（例えば、いくつかの例としては、がんの発生または診断の時から、被験体ががんで死ぬ（死亡）か、寛解期に入るか、または被験体は治ったもしくは全てのがん細胞がない状態（ｃｌｅａｎ）であると医師が断言するまでから計算した生存率が挙げられるが、これらに限定されない）、５年生存率、または１年生存率である。より短い生存期間は、例えば、がんの発生または診断のいずれかから、決定された時（例えば、１年または５年）までから計算される。
【００２６】
卵巣がんについての処置に対する応答
本開示は、上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）を有する被験体の予後判定の方法、さらに、プラチナベースの化学療法に対する被験体の応答を予測することによって処置を最適化する方法を提供する。本明細書中に記載される方法およびデータは、ＫＲＡＳ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ結合部位における特定のゲノムの変異（ＫＲＡＳバリアントとして公知である）を同定する。
【００２７】
本開示は、上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）を有する被験体の予後判定の方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで、ＫＲＡＳバリアントの存在は、対照と比較して低下した生存率を示す、方法を提供する。
【００２８】
上記方法は、全ての年齢の被験体および女性に適用され得るが、この方法の特定の実施形態において、試験の被験体は、閉経後、または５２歳もしくはそれより高齢である。対照の被験体としては、健康な個体、およびＥＯＣを有するがＫＲＡＳバリアントを保有しない女性が挙げられる。さらに、対照の被験体は、試験の被験体と同じ年に生まれた、または試験の被験体と同じ世代に属する女性の期待生存率に基づいた国の平均であり得る。好ましい実施形態において、この対照の値は、ＫＲＡＳバリアントを保有する個体を含まない。この方法の特定の局面において、生存率は、全生存率（例えば、いくつかの例としては、がんの発生または診断の時から、被験体ががんで死ぬ（死亡）か、寛解期に入るか、または被験体は治ったもしくは全てのがん細胞がない状態であると医師が断言するまでから計算した生存率が挙げられるが、これらに限定されない）、５年生存率、または１年生存率である。より短い生存期間は、例えば、がんの発生または診断のいずれかから、決定された時（例えば、１年または５年）までから計算される。
【００２９】
本開示はまた、プラチナベースの化学療法に対する上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで上記変異の存在は、プラチナベースの化学療法に対する抵抗性を示す、方法を提供する。上記ＥＯＣ細胞は、インビトロまたはエクスビボで評価され得る。上記ＥＯＣ細胞がエクスビボで評価される場合、上記細胞は、被験体から得られる。上記被験体は、任意の年齢であり得るが、好ましい実施形態において、上記被験体は、閉経後または少なくとも５２歳のいずれかである。あるいは、同じ実施形態において、上記被験体は、少なくとも３０歳、少なくとも３５歳、少なくとも４０歳、少なくとも４５歳、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳であるか、またはそれらの間の任意の年齢である。この方法の他の局面において、上記被験体は、閉経後ではないが、第二の医学的状態または医学的処置に起因して、同様のホルモンプロフィールを示す。例示的だが非限定的な閉経期ホルモンプロフィールとしては、例えば、被験体の血液または尿のサンプルの評価によって決定した場合の、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモンの低減したレベルが挙げられる。閉経期ホルモンプロフィールをもたらす、例示的だが非限定的な二次的な医学的状態は、少なくとも１つの卵巣の外科的除去（外科的閉経としても公知の卵巣摘出）、子宮摘出（特に、子宮の除去がファロピウス管および一方または両方の卵巣の除去と組み合わせられる場合）を必要とする頸部、子宮、または卵巣がんである。閉経期ホルモンプロフィールをもたらす例示的だが非限定的な第二の医学的状態は、化学療法および抗エストロゲン処置である。
【００３０】
ＥＯＣ細胞がインビトロで評価される場合、この細胞は、ＢＧ１、ＣＡＯＶ３、もしくはＩＧＲ−ＯＶ１細胞系から単離されるか、繁殖される（ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｄ）か、または誘導される。これらの細胞系は、卵巣がん細胞系の非限定的な例である。ＥＯＣ細胞は、任意の卵巣がん細胞系（ＫＲＡＳバリアント、有害なＢＲＣＡ１変異、有害なＢＲＣＡ２変異、またはそれらの任意の組み合わせを保有する細胞系が挙げられるが、これらに限定されない）から単離され得るか、繁殖され得るか、または誘導され得る。有害なＢＲＣＡ１変異またはＢＲＣＡ２変異は、その保有者ががん（好ましい実施形態においては、乳がんまたは卵巣がん）を発生するリスクまたは見込みを増加させる変異である。有害なＢＲＣＡ１変異またはＢＲＣＡ２変異はまた、その保有者がより若い年齢でがんを発生する（すなわち、がんのより早期な発症を経験する）リスクまたは見込みを増加させる変異であり、好ましい実施形態において、上記がんは、乳がんまたは卵巣がんである。
【００３１】
本明細書中に記載される方法について、好ましいプラチナベースの化学療法は、カルボプラチンまたはパクリタキセルであるが、プラチナベースの化学療法は、がんを処置または予防するためのプラチナまたはプラチナ塩を組み込む全ての化学療法薬剤を包含する。これらの方法の特定の局面において、プラチナベースの化学療法は、アジュバント療法である。従って、本明細書中に記載される方法は、単剤療法か、または他の公知の抗がん剤もしくは技術（例えば、照射および手術）との組み合わせ療法のいずれかとしてのプラチナベースの化学療法の使用に対する患者の応答を予測する。
【００３２】
結腸直腸がんについての処置に対する応答
本開示は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）または転移性ＣＲＣ（ｍＣＲＣ）を有する被験体の予後判定の方法、さらに単独での、または細胞毒性化学療法と組み合わせた、モノクローナル抗体療法に対する被験体の応答を予測することによって処置を最適化する方法を提供する。本明細書中に記載される方法およびデータは、ＫＲＡＳバリアントと称される、ＫＲＡＳ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ結合部位における特定のゲノムの変異を同定する。
【００３３】
本開示は、早期結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する、試験の被験体の予後判定の方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで上記変異の存在は、対照の被験体または進行したＣＲＣ（例えば、ＩＩＩ期、ＩＶ期、および転移性のＣＲＣが挙げられる）を有する被験体と比較して増加した生存率を示す、方法を提供する。
【００３４】
本開示は、進行した結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する患者の予後判定の方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここでＫＲＡＳバリアントの存在は、対照の被験体または早期ＣＲＣを有する被験体と比較して低減した生存率を示す、方法を提供する。進行したＣＲＣとしては、例えば、ＩＩＩ期、ＩＶ期、および転移性のＣＲＣが挙げられる。
【００３５】
本開示は、モノクローナル抗体単剤療法に対するがん細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで上記変異の存在は、モノクローナル抗体単剤療法に対する感受性を示す、方法を提供する。この方法の特定の実施形態において、上記がん細胞は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である。上記がん細胞は、インビトロまたはエクスビボで評価され得る。モノクローナル抗体単剤療法の非限定的な例は、セツキシマブである。
【００３６】
本開示は、化学療法とモノクローナル抗体単剤療法との組み合わせに対するがん細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで上記変異の存在は、上記組み合わせに対する抵抗性を示す、方法を提供する。この方法の特定の実施形態において、上記がん細胞は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である。上記がん細胞は、インビトロまたはエクスビボで評価され得る。モノクローナル抗体単剤療法の非限定的な例は、セツキシマブである。化学療法は、細胞毒性薬剤であり得る。上記細胞毒性薬剤の非限定的な例は、イリノテカンである。特定の実施形態において、ＫＲＡＳバリアントを保有する被験体の化学療法薬剤（例えば、イリノテカン）での処置は、ＫＲＡＳバリアントの増加した発現をもたらす。イリノテカン曝露後にＫＲＡＳバリアントがん細胞でのレポーター発現がＫＲＡＳ非バリアントがん細胞に対して比較される場合、野生型３’ＵＴＲレポーターの発現における変化は見出されなかった。しかし、ＫＲＡＳバリアント３’ＵＴＲレポーターにおける発現の統計学的に有意な増加が見出された（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。上記データは、イリノテカン曝露が、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を活性化する様式で細胞状況を変化させることを示す。
【００３７】
上記方法は、全ての年齢の被験体に適用され得るが、この方法の特定の実施形態において、試験の被験体は、新生児、子供、大人、または高齢者（６５歳またはそれより高齢）である。上記被験体は、閉経期前または閉経後（５２歳またはそれより高齢）であり得る。
【００３８】
対照または対照の被験体としては、健康な個体、およびＣＲＣを有するがＫＲＡＳバリアントを保有しない個体が挙げられる。さらに、対照の被験体は、試験の被験体と同じ年に生まれた、または試験の被験体と同じ世代に属する個体の期待生存率に基づいた国の平均であり得る。好ましい実施形態において、この対照の値は、ＫＲＡＳバリアントを保有する個体を含まない。この方法の特定の局面において、生存率は、全生存率（例えば、いくつかの例としては、がんの発生または診断の時から、被験体ががんで死ぬ（死亡）か、寛解期に入るか、または被験体は治ったもしくは全てのがん細胞がない状態であると医師が断言するまでから計算した生存率が挙げられるが、これらに限定されない）、５年生存率、または１年生存率である。より短い生存期間は、例えば、がんの発生または診断のいずれかから、決定された時（例えば、１年または５年）までから計算される。
【００３９】
本開示はまた、モノクローナル抗体ベースの療法に対する結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで上記変異の存在は、モノクローナル抗体ベースの療法に対する増加した感受性を示す、方法を提供する。上記ＣＲＣ細胞は、インビトロまたはエクスビボで評価され得る。モノクローナル抗体ベースの療法は、セツキシマブであり得る。
【００４０】
本開示はまた、細胞毒性化学療法に対する結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで上記変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで上記変異の存在は、細胞毒性化学療法に対する抵抗性を示す、方法を提供する。この方法の特定の実施形態において、上記ＣＲＣ細胞は、インビトロまたはエクスビボで評価され得る。細胞毒性化学療法は、イリノテカンであり得る。この方法の特定の実施形態において、細胞毒性化学療法は、モノクローナル抗体ベースの療法を含む組み合わせ療法である。モノクローナル抗体ベースの療法は、セツキシマブであり得る。
【００４１】
上記ＣＲＣ細胞がエクスビボで評価されるとき、上記細胞は、被験体から得られる。上記被験体は、任意の年齢であり得る。この方法の特定の実施形態において、上記被験体は、少なくとも３０歳、少なくとも３５歳、少なくとも４０歳、少なくとも４５歳、少なくとも５０歳、少なくとも５５歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳であるか、またはそれらの間の任意の年齢である。
【００４２】
上記ＣＲＣ細胞がインビトロで評価される場合、上記細胞は、確立された細胞系（ＮＣＩ−６０パネルに含まれる結腸または結腸直腸がん細胞系が挙げられる）から単離されるか、繁殖されるか、または誘導され得る。ＣＲＣ細胞は、任意の結腸または結腸直腸がん細胞系（単独、またはＫＲＡＳもしくは別の遺伝子における第二もしくは追加の変異との組み合わせのいずれかでＫＲＡＳバリアントを保有する細胞系が挙げられるが、これらに限定されない）から単離されるか、繁殖されるか、または誘導され得る。
【００４３】
この方法について、好ましいモノクローナル抗体単剤療法は、セツキシマブであるが、モノクローナル抗体単剤療法は、がんを処置または予防するために使用される任意のモノクローナル抗体を包含する。好ましくは、モノクローナル抗体は、部分的または完全に、ヒトまたはヒト化されている。この方法について、好ましい化学療法は、細胞毒性化学療法（例えば、イリノテカン）であるが、化学療法は、がんを処置または予防するために使用される任意の化学療法薬剤を包含する。この方法の特定の局面において、化学療法または細胞毒性化学療法は、アジュバント療法である。従って、この方法は、単剤療法か、または化学療法薬剤もしくはがんを処置もしくは予防するための他の公知の技術（例えば、照射および手術）との組み合わせ療法のいずれかとしてのモノクローナル抗体の使用に対する患者の応答を予測する。
【００４４】
例えば、本発明は以下を提供する。
【００４５】
（項目１）
エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）乳がんを発生するリスクがある被験体または患者を同定する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、該被験体においてＥＲ／ＰＲ陰性乳がんを発生する増加したリスクを示す、方法。
【００４６】
（項目２）
乳がんを発生するリスクがある被験体または患者におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）乳がんの発生の発症を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんの発生のより早期な発症を示す、方法。
【００４７】
（項目３）
前記ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんが、ＨＥＲ２に対しても陰性であり、従って、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００４８】
（項目４）
前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、基底型腫瘍または管腔型腫瘍である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００４９】
（項目５）
前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはサイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）遺伝子によってコードされる転写産物またはタンパク質を発現する基底型腫瘍である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５０】
（項目６）
前記乳がんが、乳がん１（ＢＲＣＡ１）遺伝子の低発現または発現陰性によってさらに特徴付けられる、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５１】
（項目７）
前記被験体または患者が、閉経期前である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５２】
（項目８）
前記被験体または患者が、５１歳またはそれより若い、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５３】
（項目９）
上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）を有する被験体または患者を予後判定するための方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、対照と比較して低下した生存率を示す、方法。
【００５４】
（項目１０）
前記被験体または患者が、閉経後、５２歳、または少なくとも５２歳である上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５５】
（項目１１）
前記対照が前記変異を保有しない、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５６】
（項目１２）
前記生存率が、全生存率、５年生存率、または１年生存率である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５７】
（項目１３）
プラチナベースの化学療法に対する上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含む、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで該変異の存在は、プラチナベースの化学療法に対する抵抗性を示す、方法。
【００５８】
（項目１４）
前記ＥＯＣ細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００５９】
（項目１５）
前記ＥＯＣ細胞が、閉経後、５２歳、または少なくとも５２歳である被験体からエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６０】
（項目１６）
前記ＥＯＣ細胞がインビトロで評価され、そしてここで、該ＥＯＣ細胞は、ＢＧ１、ＣＡＯＶ３、もしくはＩＧＲ−ＯＶ１細胞系から単離されるか、繁殖されるか、または誘導される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６１】
（項目１７）
前記プラチナベースの化学療法が、カルボプラチンまたはパクリタキセルである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６２】
（項目１８）
前記プラチナベースの化学療法が、アジュバント療法である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６３】
（項目１９）
結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する被験体または患者を予後判定する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで該変異の存在は、対照と比較して増加した生存率を示す、方法。
【００６４】
（項目２０）
前記検出する工程が、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）分析をさらに含む、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６５】
（項目２１）
前記結腸直腸がん（ＣＲＣ）が、早期ＣＲＣである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６６】
（項目２２）
前記結腸直腸がん（ＣＲＣ）が、１期または２期のＣＲＣである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６７】
（項目２３）
前記対照が、ＫＲＡＳバリアントを保有しない、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６８】
（項目２４）
前記対照が、ＫＲＡＳ遺伝子において第二の変異を有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００６９】
（項目２５）
前記被験体または患者が、ＫＲＡＳ遺伝子において第二の変異を有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７０】
（項目２６）
前記被験体または対照が、ＢＲＡＦ遺伝子において１つまたはそれより多くの変異を保有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７１】
（項目２７）
前記被験体または対照が、過剰メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａプロモーターを有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７２】
（項目２８）
前記生存率が、全生存率、５年生存率、または１年生存率である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７３】
（項目２９）
モノクローナル抗体単剤療法に対するがん細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、モノクローナル抗体単剤療法に対する感受性を示す、方法。
【００７４】
（項目３０）
前記がん細胞が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７５】
（項目３１）
前記がん細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７６】
（項目３２）
前記モノクローナル抗体単剤療法がセツキシマブである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７７】
（項目３３）
化学療法とモノクローナル抗体療法との組み合わせに対するがん細胞の応答を予測する方法であって、ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、患者サンプルにおいて検出する工程を含み、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、該組み合わせに対する抵抗性を示す、方法。
【００７８】
（項目３４）
前記がん細胞が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００７９】
（項目３５）
前記がん細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８０】
（項目３６）
モノクローナル抗体単剤療法がセツキシマブである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８１】
（項目３７）
前記化学療法が、細胞毒性薬剤である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８２】
（項目３８）
前記細胞毒性薬剤がイリノテカンである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８３】
（項目３９）
腫瘍の血管形成のリスクの増加を予測する方法であって、
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、第一の患者サンプルにおいて検出する工程であって、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰである、工程、および
（ｂ）ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを、第二の患者サンプルにおいて決定する工程を含み、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、抗血管新生遺伝子の転写サイレンシングを示し、それにより該腫瘍の血管形成のリスク増加を予測する、
方法。
【００８４】
（項目４０）
前記抗血管新生遺伝子がＳｐｒｏｕｔｙ２またはＳｅｍａ６Ａである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８５】
（項目４１）
前記腫瘍が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫由来のがん細胞を含む、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８６】
（項目４２）
前記腫瘍が転移性である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８７】
（項目４３）
低酸素条件下におけるがん細胞の増加した生存または増殖を予測する方法であって、
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、第一の患者サンプルにおいて検出する工程であって、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰである、工程、および
（ｂ）ｍｉＲ−２１０  ｍｉＲＮＡの発現レベルを、第二の患者サンプルにおいて決定する工程を含み、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）における該ｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、低酸素条件下における該がん細胞の増加した生存または増殖を予測することを含む、
方法。
【００８８】
（項目４４）
前記がん細胞が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００８９】
（項目４５）
がん細胞の増加した生存または増殖を予測する方法であって、
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、第一の患者サンプルにおいて検出する工程であって、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰである、工程、および
（ｂ）腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのメチル化状態を、第二の患者サンプルにおいて決定する工程を含み、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）プロモーターのメチル化の増加は、該がん細胞の増加した生存または増殖を予測することを含む、
方法。
【００９０】
（項目４６）
前記腫瘍抑制遺伝子がＮｏｔｃｈ１である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００９１】
（項目４７）
前記がん細胞が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００９２】
（項目４８）
生存が、腫瘍形成の可能性を維持することを含む、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００９３】
（項目４９）
前記がん細胞が、がん幹細胞である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００９４】
（項目１Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）乳がんを発生するリスクがある被験体または患者の同定の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、該被験体においてＥＲ／ＰＲ陰性乳がんを発生する増加したリスクを示す、方法。
【００９５】
（項目２Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、乳がんを発生するリスクがある被験体または患者におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性（ＥＲ／ＰＲ陰性）乳がんの発生の発症を予測する指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんの発生のより早期な発症を示す、方法。
【００９６】
（項目３Ａ）
前記ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんが、ＨＥＲ２に対しても陰性であり、従って、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００９７】
（項目４Ａ）
前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、基底型腫瘍または管腔型腫瘍である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００９８】
（項目５Ａ）
前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）またはサイトケラチン５／６（ＣＫ５／６）遺伝子によってコードされる転写産物またはタンパク質を発現する基底型腫瘍である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【００９９】
（項目６Ａ）
前記乳がんが、乳がん１（ＢＲＣＡ１）遺伝子の低発現または発現陰性によってさらに特徴付けられる、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１００】
（項目７Ａ）
前記被験体または患者が、閉経期前である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１０１】
（項目８Ａ）
前記被験体または患者が、５１歳またはそれより若い、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１０２】
（項目９Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）を有する被験体または患者の予後判定の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、対照と比較して低下した生存率を示す、方法。
【０１０３】
（項目１０Ａ）
前記被験体または患者が、閉経後、５２歳、または少なくとも５２歳である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１０４】
（項目１１Ａ）
前記対照が前記変異を保有しない、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１０５】
（項目１２Ａ）
前記生存率が、全生存率、５年生存率、または１年生存率である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１０６】
（項目１３Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、プラチナベースの化学療法に対する上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）細胞の応答の予測の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで該変異の存在は、プラチナベースの化学療法に対する抵抗性を示す、方法。
【０１０７】
（項目１４Ａ）
前記ＥＯＣ細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１０８】
（項目１５Ａ）
前記ＥＯＣ細胞が、閉経後、５２歳、または少なくとも５２歳である被験体からエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１０９】
（項目１６Ａ）
前記ＥＯＣ細胞がインビトロで評価され、そしてここで、該ＥＯＣ細胞は、ＢＧ１、ＣＡＯＶ３、もしくはＩＧＲ−ＯＶ１細胞系から単離されるか、繁殖されるか、または誘導される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１０】
（項目１７Ａ）
前記プラチナベースの化学療法が、カルボプラチンまたはパクリタキセルである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１１】
（項目１８Ａ）
前記プラチナベースの化学療法が、アジュバント療法である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１２】
（項目１９Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、結腸直腸がん（ＣＲＣ）を有する被験体または患者の予後判定の指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、ここで該変異の存在は、対照と比較して増加した生存率を示す、方法。
【０１１３】
（項目２０Ａ）
前記検出が、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）分析をさらに含む、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１４】
（項目２１Ａ）
前記結腸直腸がん（ＣＲＣ）が、早期ＣＲＣである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１５】
（項目２２Ａ）
前記結腸直腸がん（ＣＲＣ）が、１期または２期のＣＲＣである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１６】
（項目２３Ａ）
前記対照が、ＫＲＡＳバリアントを保有しない、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１７】
（項目２４Ａ）
前記対照が、ＫＲＡＳ遺伝子において第二の変異を有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１８】
（項目２５Ａ）
前記被験体または患者が、ＫＲＡＳ遺伝子において第二の変異を有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１１９】
（項目２６Ａ）
前記被験体または対照が、ＢＲＡＦ遺伝子において１つまたはそれより多くの変異を保有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２０】
（項目２７Ａ）
前記被験体または対照が、過剰メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａプロモーターを有する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２１】
（項目２８Ａ）
前記生存率が、全生存率、５年生存率、または１年生存率である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２２】
（項目２９Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、モノクローナル抗体単剤療法に対するがん細胞の応答を予測する指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、モノクローナル抗体単剤療法に対する感受性を示す、方法。
【０１２３】
（項目３０Ａ）
前記がん細胞が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２４】
（項目３１Ａ）
前記がん細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２５】
（項目３２Ａ）
前記モノクローナル抗体単剤療法がセツキシマブである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２６】
（項目３３Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異を、化学療法とモノクローナル抗体療法との組み合わせに対するがん細胞の応答を予測する指標とするための方法であって、ここでヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異は、患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そしてここで、該変異の存在は、該組み合わせに対する抵抗性を示す、方法。
【０１２７】
（項目３４Ａ）
前記がん細胞が、結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２８】
（項目３５Ａ）
前記がん細胞が、インビトロまたはエクスビボで評価される、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１２９】
（項目３６Ａ）
モノクローナル抗体単剤療法がセツキシマブである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１３０】
（項目３７Ａ）
前記化学療法が、細胞毒性薬剤である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１３１】
（項目３８Ａ）
前記細胞毒性薬剤がイリノテカンである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１３２】
（項目３９Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異、ならびにｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを、腫瘍の血管形成のリスク増加の予測の指標とするための方法であって、ここで
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異が、第一の患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そして
（ｂ）ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルが、第二の患者サンプルにおいて決定され、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）におけるｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、抗血管新生遺伝子の転写サイレンシングを示し、それにより該腫瘍の血管形成のリスク増加が予測される、
方法。
【０１３３】
（項目４０Ａ）
前記抗血管新生遺伝子がＳｐｒｏｕｔｙ２またはＳｅｍａ６Ａである、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１３４】
（項目４１Ａ）
前記腫瘍が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫由来のがん細胞を含む、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１３５】
（項目４２Ａ）
前記腫瘍が転移性である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１３６】
（項目４３Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異、およびｍｉＲ−２１０  ｍｉＲＮＡの発現レベルを、低酸素条件下におけるがん細胞の増加した生存または増殖の予測の指標とするための方法であって、
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異が、第一の患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そして
（ｂ）ｍｉＲ−２１０  ｍｉＲＮＡの発現レベルが、第二の患者サンプルにおいて決定され、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）における該ｍｉＲＮＡの発現レベルの上昇は、低酸素条件下における該がん細胞の増加した生存または増殖を示すことを含む、
方法。
【０１３７】
（項目４４Ａ）
前記がん細胞が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１３８】
（項目４５Ａ）
ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における変異、および腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのメチル化状態を、がん細胞の増加した生存または増殖の予測の指標とするための方法であって、
（ａ）ヒトＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補部位ＬＣＳ６における該変異が、第一の患者サンプルにおいて検出され、ここで該変異は、ＬＣＳ６の４位におけるウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）へのトランジションを含むＳＮＰであり、そして
（ｂ）腫瘍抑制遺伝子のプロモーターのメチル化状態が、第二の患者サンプルにおいて決定され、
ここで、（ａ）における該変異の存在、および対照と比較しての（ｂ）プロモーターのメチル化の増加は、該がん細胞の増加した生存または増殖を示すことを含む、
方法。
【０１３９】
（項目４６Ａ）
前記腫瘍抑制遺伝子がＮｏｔｃｈ１である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１４０】
（項目４７Ａ）
前記がん細胞が、ＡＩＤＳ関連のがん、乳がん、消化管／胃腸管のがん、肛門がん、虫垂がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、ランゲルハンス島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、肝がん、膵がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、内分泌系がん、副腎皮質癌腫、副甲状腺がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、甲状腺がん、眼のがん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、膀胱がん、腎臓（腎細胞）がん、陰茎がん、前立腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、精巣がん、尿道がん、ウィルムス腫瘍、他の小児腎臓腫瘍、胚細胞がん、中枢神経系がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、婦人科がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、妊娠性栄養膜腫瘍、卵巣上皮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、頭頸部がん、下咽頭がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、原発不明転移性扁平頸部がん、口のがん、鼻咽頭がん、口峡がん、副鼻腔および鼻腔がん、咽頭がん、唾液腺がん、喉のがん、筋骨格がん、骨がん、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、横紋筋肉腫、軟部肉腫、子宮肉腫、神経がん、脳のがん、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、髄芽腫、脊髄腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫、神経芽細胞腫、呼吸器がん、胸部がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫、胸腺腫、胸腺癌腫、皮膚がん、カポジ肉腫、黒色腫、またはメルケル細胞癌腫に由来する、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１４１】
（項目４８Ａ）
生存が、腫瘍形成の可能性を維持することを含む、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
【０１４２】
（項目４９Ａ）
前記がん細胞が、がん幹細胞である、上記項目のうちのいずれか一項に記載の方法。
（摘要）
本開示は、ＫＲＡＳバリアントとして公知である、ＫＲＡＳ癌遺伝子におけるＳＮＰの存在または不存在を決定することによって、がんを発生するリスクがある被験体を同定するための方法、がんの発症を予測するための方法、および化学療法／処置に対する被験体の応答を予測するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、研究群２からの全ての女性（Ａ）および閉経期前（５１歳以下）の女性（Ｂ）における乳がんサブタイプにおけるＫＲＡＳバリアントの分布を示す一対のグラフである。データは、乳がんサブタイプを有すると診断された症例の数／ＫＲＡＳバリアントについて試験された患者の数である。＊：全ての他のサブタイプに対してｐ＝０．０４４。†：全ての他のサブタイプに対してｐ＝０．０３３。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、三重陰性乳がんのＫＲＡＳバリアント陽性症例およびＫＲＡＳバリアント陰性症例におけるＢＲＣＡ１遺伝子発現を示す一対の箱ひげ図である。Ｙ軸は任意単位である。（Ａ）ＢＲＣＡ１プローブ１、ｐ＝０．０６。（Ｂ）ＢＲＣＡ１プローブ２、ｐ＝０．０１。
【図３】図３は、三重陰性乳がんのＫＲＡＳバリアント陰性症例と比較してＫＲＡＳバリアント陽性症例におけるｌｅｔ−７ファミリーのマイクロＲＮＡの発現を示す一連の箱ひげ図である。Ｙ軸は任意単位である。
【図４】図４は、ＬＩＭＭＡモデルによって分析された、三重陰性乳がん患者において、識別的発現をするＫＲＡＳバリアント遺伝子を示すヒートマップである。５０個の最も顕著な遺伝子が、クラスター化のために使用された；クラスター化についてｐ＜０．０００１。ＫＲＡＳバリアントサンプルは、濃い灰色であり、野生型サンプルは、薄い灰色である。白色は、未知のＫＲＡＳバリアント状態を有する。
【図５】図５は、ＥＲ／ＰＲ−閉経期前乳がん患者と比較してＥＲ／ＰＲ＋閉経期前乳がん患者におけるＫＲＡＳバリアントを示すグラフである。
【図６】図６は、三重陰性乳がん患者の腫瘍におけるＫＲＡＳバリアントに関連する遺伝子発現シグネチャーを示す一連の箱グラフ（ｂｏｘ  ｇｒａｐｈ）である。
【図７】図７は、ＫＲＡＳバリアントが、５２歳を超える年齢の閉経後の卵巣がん患者についての有意により悪い全生存率を予測することを示すグラフである。ＫＲＡＳバリアントを有する卵巣がん患者（ｎ＝５９）についての全生存率とＫＲＡＳバリアントを有さない卵巣がん患者（ｎ＝２２０）についての全生存率とが、カプラン−マイヤー解析を用いて比較された。ログランク検定による転帰は、５２歳を超える年齢のＫＲＡＳバリアント陽性ＥＯＣ患者について、有意に、より悪い（Ｐ＝０．０３９９）。
【図８】図８は、ＫＲＡＳバリアントがネオアジュバント化学療法後の最適未満の腫瘍縮小（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）に関連することを示すグラフである。ネオアジュバント化学療法後の外科的腫瘍縮小は、ＫＲＡＳバリアントを有する（ｎ＝２６）かまたは有さない（ｎ＝９０）卵巣がん患者（ｎ＝１１６）において比較される。Ｘ２分析によれば、ＫＲＡＳバリアント患者は、非バリアント患者よりも大きな残存疾患（ＲＤ：ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）があって、最適未満の腫瘍縮小をされる可能性が有意に高い（Ｐ＝０．０４４）。
【図９】図９Ａは、ＫＶ  ＥＯＣサンプルにおいて、非バリアントサンプルにおいてよりも高いスコアを示す、ＫＲＡＳバリアント（ＫＶ）三重陰性乳房腫瘍における５０個の識別的発現の遺伝子候補のシグネチャー（ＴＮＢＣ  ＫＲＡＳシグネチャー）である。図９Ｂは、ＫＶ  ＥＯＣ腫瘍において上方調節される、ＫＲＡＳ依存腫瘍（ＫＲＡＳ−ａｄｄｉｃｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ）（ＫＲＡＳ依存シグネチャー（ＫＲＡＳ  Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ））に関連する遺伝子のシグネチャーである。図９Ｃは、ＫＶ  ＥＯＣ腫瘍における上位２０遺伝子の識別的発現のシグネチャーであり、カルボプラチン感受性ＥＯＣ細胞およびカルボプラチン抵抗性ＥＯＣ細胞における識別的遺伝子発現の再分析を反映している。図９Ｄは、ＫＶ（濃い灰色）腫瘍サンプルと非バリアント（薄い灰色）腫瘍サンプルとの間での、上位の識別的に発現される遺伝子のヒートマップである。色の手引きは、青色（値０〜５）〜白色（約５）、および白色〜赤色（５〜１０）のスペクトルを示す。このヒートマップのカラー版については、Ｒａｔｎｅｒ  ＥＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（５  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１），１−８（その内容は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【図１０】図１０は、ＫＲＡＳバリアントが、細胞系におけるカルボプラチンおよびカルボプラチン／タキソール化学療法に対する抵抗性に関連することを示すグラフである。ＫＲＡＳバリアントを有する細胞系（ＢＧ１）およびＫＲＡＳバリアントを有さない細胞系（ＣＡＯＶ３）が化学療法を用いて処理された。そして、半数阻害濃度（ＩＣ５０）は、Ｙ軸に示され、化学療法薬剤はＸ軸に示される。より高いＩＣ５０は、試験された化学療法薬剤に対する抵抗性を表す。ＢＧ１＝ＫＲＡＳバリアント／ＢＲＣＡ野生型細胞系；ＣＡＯＶ３＝非バリアント／ＢＲＣＡ野生型細胞系；ＩＧＲ−ＯＶ１＝ＫＲＡＳバリアント／ＢＲＣＡ１変異体細胞系。エラーバーはＲＳＥである。
【図１１】図１１Ａは、非バリアント系ＣＡＯＶ３には影響を及ぼすことがなく、ＫＲＡＳバリアント系ＢＧ１においては細胞生存率が低減したことを示すグラフである（＊Ｐ＜０．００１）。ＫＲＡＳバリアントを有する細胞系（ＢＧ１）およびＫＲＡＳバリアントを有さない細胞系（ＣＡＯＶ３）は、選択的にバリアント対立遺伝子に結合するｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの組み合わせで処理された。図１１Ｂは、ＣＡＯＶ３（左）には影響を及ぼすことがなく、細胞生存率の低減と一致してＢＧ１（右）においてはＫＲＡＳタンパク質発現が低減したことを示すグラフである。ＫＲＡＳバリアントを有する細胞系（ＢＧ１）およびＫＲＡＳバリアントを有さない細胞系（ＣＡＯＶ３）は、選択的にバリアント対立遺伝子に結合するｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの組み合わせで処理された。異なるｓｉＲＮＡｓは、数字によって示される。
【図１２】図１２は、ＫＲＡＳバリアントを有する細胞系（ＢＧ−１およびＩＧＲＯＶ１）が、非バリアント細胞系（ＣａＯＶ３）と比較して、有意に、より低いレベルのｌｅｔ−７ｂを有することを示すグラフである。統計的な解析は、一元配置Ａｎｏｖａおよびチューキーの多重比較検定を用いて行われた。
【図１３】図１３Ａ〜Ｂは、ＫＲＡＳバリアント配列と非バリアント配列とのアラインメントを示す概略図である。パネルＡは、ＫＲＡＳの非バリアント配列を示す。パネルＢは、ＫＲＡＳバリアント配列を標的とする例示的なバリアントｓｉＲＮＡオリゴを示す。両方のパネルにおいて、下線を引かれた配列は、ｌｅｔ−７結合部位を示す。両方のパネルにおいて、四角で囲ったヌクレオチドは、野生型（非バリアント）ヌクレオチド（Ａ）またはＫＲＡＳバリアント一塩基多型（Ｂ）のいずれかを表す。ｓｉＲＮＡは、それらの３’末端から開始して示される。
【図１４】図１４は、全てのがんの病期における、ＫＲＡＳバリアントでかつ原因特異的な生存率（ｃａｕｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）についてのカプラン−マイヤー曲線である。
【図１５】図１５Ａは、早期（Ｉ期およびＩＩ期）ＣＲＣにおける、ＫＲＡＳバリアントでかつ原因特異的な生存率についてのカプラン−マイヤー曲線である。図１５Ｂは、ＩＩＩ期ＣＲＣにおける、ＫＲＡＳバリアントでかつ原因特異的な生存率についてのカプラン−マイヤー曲線である。図１５Ｃは、ＩＶ期ＣＲＣにおける、ＫＲＡＳバリアントでかつ原因特異的な生存率についてのカプラン−マイヤー曲線である。
【図１６】図１６Ａは、早期（Ｉ期およびＩＩ期）における、ＫＲＡＳバリアントで、ＫＲＡＳ変異で、かつ原因特異的な生存率についてのカプラン−マイヤー曲線である、Ｐ＝０．８７５。図１６Ｂは、ＩＩＩ期ＣＲＣにおける、ＫＲＡＳバリアントで、ＫＲＡＳ変異で、かつ原因特異的な生存率についてのカプラン−マイヤー曲線である。図１６Ｃは、ＩＶ期ＣＲＣにおける、ＫＲＡＳバリアントで、ＫＲＡＳ変異で、かつ原因特異的な生存率についてのカプラン−マイヤー曲線である。
【図１７】図１７は、早期（Ｉ期およびＩＩ期）ＣＲＣにおける、ＫＲＡＳバリアントで、ＭＳＩ状態で、かつ原因特異的な生存率についてのカプラン−マイヤー曲線である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法か、またはサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）処置としての化学療法と組み合わせて処置された患者におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン無増悪生存率（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）を示すグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法か、またはサルベージ処置としての化学療法と組み合わせて処置された患者におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図１９Ａ】図１９Ａは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法で処置された全ての患者におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂベースの組み合わせ化学療法で処置された全ての患者におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、全てのＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、全ての非ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法で処置された二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型患者の集団におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂベースの組み合わせ化学療法で処置された二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型患者の集団におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型非ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法で処置された全ての患者におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂベースの組み合わせ化学療法で処置された全ての患者におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、全てのＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、全ての非ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２２Ａ】図２２Ａは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法で処置された二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型患者の集団におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、サルベージ処置としての抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂベースの組み合わせ化学療法で処置された二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型患者の集団におけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６遺伝子型状態に従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型非ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異非ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン無増悪生存率を示すグラフである。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異非ＫＲＡＳバリアント保有者における療法のタイプに従ってメジアン全生存率を示すグラフである。
【図２４Ａ】図２４Ａは、化学療法薬剤イリノテカンでの処置後の野生型ＫＲＡＳおよびＫＲＡＳバリアントがん細胞における標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ルシフェラーゼ発現を示すグラフである。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、がん細胞がイリノテカンで処置された場合のイリノテカン濃度の関数として抑制倍率（ｆｏｌｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＫＲＡＳバリアント／ＫＲＡＳ野生型として表される）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１４４】
実施形態の説明
詳細な説明
がんに関連するＫＲＡＳ癌遺伝子の３’ＵＴＲにおけるｌｅｔ−７マイクロＲＮＡ相補部位における機能的なバリアント（ｒｓ６１７６４３７０）は、以前に同定された（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５３０２号、その内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される）。このバリアントとがん腫瘍生物学との関連性の調査報告は、本明細書に記載される。
【０１４５】
乳がん
乳房腫瘍は、ＥＲ（エストロゲン受容体）および／またはＰＲ（プロゲステロン受容体）陽性、増幅されたＨＥＲ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥＲＢＢ２）、および三重陰性腫瘍（すなわち、ＥＲ／ＰＲ陰性およびＨＥＲ２陰性）に分類される（Ｓｏｒｌｉｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１；９８：１０８６９−７４）。遺伝子発現および受容体のプロファイリングにより、乳がんは以下の４つの生物学的サブグループにさらに分類される：管腔型Ａ（ＥＲおよび／またはＰＲ受容体陽性、ＨＥＲ２陰性）腫瘍、管腔型Ｂ（ＥＲおよび／またはＰＲ受容体陽性、ＨＥＲ２陽性）、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２陽性、ＥＲ／ＰＲ陰性）、および基底型（三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）とも称される、ＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２陰性）腫瘍（Ｓｏｒｌｉｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１；９８：１０８６９−７４）。
【０１４６】
三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）は、他のサブタイプと比較して原因特異的な５年生存率がより悪い、最も侵襲性の高いサブクラスである（Ｈａｆｆｔｙ  ＢＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４：５６５２−５７）。最近の転写プロファイリング研究は、ＴＮＢＣ内にさらなる異質性が存在すること、およびこれらの腫瘍が、２つの大まかなサブグループ（ＥＧＦＲまたはサイトケラチン（ＣＫ）５／６を発現するＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２（三重）陰性腫瘍（従って、「基底型様」と呼ばれる）、およびＥＧＦＲまたはＣＫ５／６を発現しないＥＲ／ＰＲ／ＨＥＲ２（三重）陰性腫瘍）に類別され得ることを示唆する。基底型様三重陰性（ＴＮ）腫瘍はまた、非基底型形態よりも早期な年齢（すなわちより若い年齢）での発症およびＢＲＣＡ１（乳がん１（ＢＲｅａｓｔ  ＣＡｎｃｅｒ  １））の低発現によって特徴付けられる；基底型様表現型は、ＢＲＣＡ１変異の保有者の中では一般的である（Ｒａｋｈａ  ＥＡ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｓ  ＩＯ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００９；４１：４０−４７）。（ＥＲ陽性であり得る）異常な管腔型前駆細胞集団は、ＢＲＣＡ−１関連基底型腫瘍におけるトランスフォーメーションに対する標的である（Ｌｉｍ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００９；１５：９０７−１３）。予後判定の遺伝子発現マーカーは非常に多様であるが、いくつかのモジュール（例えば、ＤＮＡ修復の欠陥、免疫応答のシグネチャー、または上皮から間葉への移行）は、一般的に、これらの腫瘍のサブセットについて言及される（Ｂｉｌｄ  ＡＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；１１：Ｒ５５）。これらの転写モジュールを操縦する物の同定は、特定および個別化された療法の発見のための１つのアプローチである。
【０１４７】
三重陰性乳がん表現型と若い年齢での発症との関連性、および公知のリスクまたはリプロダクティブ因子との関連性の欠如（Ｙａｎｇ  ＸＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ  ２００７；１６：４３９−４３）は、このがんの発生に対する遺伝的リスクが存在することを示唆する（Ｂａｕｅｒ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００７；１０９：１７２１−２８）。この開示の前には、このような増加したリスクの遺伝マーカーはほとんど存在しなかった。ＢＲＣＡ１変異は、三重陰性腫瘍にしばしば関連するが、これらの変異は稀であり、三重陰性乳がんを有する患者の１０％〜１５％のみを占め、民族背景および家族歴に依存する（Ｙｏｕｎｇ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；９：８６；Ｎａｎｄａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ  ２００５；２９４：１９２５−３３）。
【０１４８】
本明細書において提供される研究は、米国コネチカット州からの組織学的に確認された乳がんを有する４１５人の患者および４５７人の対照（研究群１）におけるＫＲＡＳバリアントの度数分布、ならびに公知のエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびＨＥＲ２状態を有する６９０人のアイルランド人女性および３６０人の対照（研究群２）におけるこのバリアントと乳がんサブタイプとの関連性を決定した。研究群１および２についてのデータは、三重陰性乳がんを有する１４０人の女性および１１３人の対照のコホートについてプールされ、ＫＲＡＳバリアントと三重陰性乳がんリスクとの関連性、ならびに三重陰性乳がんを有する患者におけるゲノム全体のｍＲＮＡおよび特定のｍｉＲＮＡ発現を評価した。
【０１４９】
研究群１におけるＫＲＡＳバリアントの度数分布は、遺伝子型が判定された全ての個体の間では異ならなかったが、２０１人の閉経期前の対照のうちの２７人（１３％）がＫＲＡＳバリアントを有したのに対して、ＥＲ／ＰＲ陰性がんを有する２４人の閉経期前の女性のうち８人（３３％）はＫＲＡＳバリアントを有した（ｐ＝０．０１５）。研究群２において、ＫＲＡＳバリアントは、管腔型Ａサブグループについて４７８人のうち６４人（１３％）であり、管腔型Ｂサブグループについて８７人のうち１３人（１５％）であり、そしてＨＥＲ２陽性サブグループについて３５人のうち２人（６％）であるのと比較して、三重陰性乳がんを有する女性においては有意に富化された（９０人の症例のうち１９人の症例［２１％］）（ｐ＝０．０４４）。プールされた研究群における多変量解析は、ＫＲＡＳバリアントが閉経期前の女性における三重陰性乳がんに関連することを示した（オッズ比２．３０７、９５％  ＣＩ  １．２６１−４．２１９、ｐ＝０．００６７）。三重陰性乳がん腫瘍の遺伝子発現解析は、ＫＲＡＳバリアント陽性腫瘍が、著しく改変された遺伝子発現を有し、管腔型前駆細胞およびＢＲＣＡ１欠陥のシグネチャーが富化されることを示唆した。ｍｉＲＮＡ分析は、ＫＲＡＳバリアント腫瘍におけるｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ種の減少したレベルを示唆した。
【０１５０】
ＫＲＡＳバリアントは、閉経期前の女性における三重陰性乳がんの発生についての遺伝マーカーである。改変された遺伝子およびｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、三重陰性乳がんを有する患者の分子的および生物学的な階層化を可能にする。
【０１５１】
結腸直腸がん
ＫＲＡＳバリアントは、早期結腸直腸がん（ＣＲＣ）における予後判定のバイオマーカーである。さらに、ＫＲＡＳバリアントは、より高いレベルのＫＲＡＳ癌遺伝子タンパク質、およびより低いレベルの腫瘍抑制因子ｌｅｔｈａｌ−７（ｌｅｔ−７）ｍｉＲＮＡを誘導する。ＫＲＡＳバリアントの影響は、大規模なオランダの前向きコホート研究（ＮＬＣＳ）からの４０９人の早期（Ｉ期およびＩＩ期）症例、１８２人のＩＩＩ期症例および６９人のＩＶ期症例において、研究された。ＫＲＡＳバリアントを有する早期患者、特に追加のＫＲＡＳ変異をも有する早期患者は、より良好な予後を有した。この発見は、マイクロサテライト不安定性または他の予後判定の要因から独立している。さらに、ＣＲＣリスクにおけるＫＲＡＳバリアントの影響をまた、ＮＬＣＳからの１，８８６のサブコホートメンバーからのデータを用いることによって研究した。Ｇ対立遺伝子（すなわち、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子）は、総合的にＣＲＣを発生する見込みに関連しなかったが、進行した病期のＣＲＣにおいて富化されていた。このことは、それが、より進行した疾患を呈し得ることを予測し得ることを示唆する。この研究集団は、現在までに分析された唯一の非処置集団であるので、これらの結果は、ＫＲＡＳバリアントを有する結腸直腸がんの自然生物学への新たな見識を提供する。
【０１５２】
本明細書中で示されるデータが実証するように、ＫＲＡＳバリアントは、結腸直腸がん（ＣＲＣ）における新しいバイオマーカーであり、早期の患者における処置の決定を導く。ＫＲＡＳバリアントを有する早期ＣＲＣの症例は、より良好な転帰を有するが、進行した疾患においては、このより良好な転帰は、もはや存在しない。早期の患者について、ＫＲＡＳバリアント遺伝子型と少なくとも１つのＫＲＡＳ変異との組み合わせもまた、療法の意思決定において考慮されるべき、より良好な転帰の予後判定のバイオマーカーである。
【０１５３】
診断および治療の革新にもかかわらず、結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、欧米の世界におけるがんによる死亡の第二の主要な原因のままである。腫瘍−結節−転移システム（ＴＮＭ）は、現在、予後判定の情報を提供する標準ツールである。ＴＮＭシステムは、極端な場合（早期および後期のＣＲＣ）の予後については非常に予測精度が高い（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ）が、中間の病期についてはあまり予測精度が高くない。現在のガイドラインによれば、アジュバント化学療法は、早期の患者に与えられない（すなわち、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ＴＮＭによればＴ１−３−Ｎ０−Ｍ０である）。この群の早期の患者（すなわち、Ｔ１−３−Ｎ０−Ｍ０）における５年生存率は、７０％よりも高い。それにもかかわらず、早期の患者（Ｉ期およびＩＩ期）の２０％〜３０％は５年以内にＣＲＣで死亡するであろうので、これらの患者が前もって同定されて、それに応じて療法が適合された場合にはこれらの死亡が避けることができたのではないかという疑問が喚起される。以前に、分子マーカーの予後判定の影響を主張する数多くの研究が公開されてきた。これらの以前の報告での主張とは対照的に、これらの研究の結果は、一貫性がない。従って、本明細書中で記載される方法の開発の前には、どの分子改変が予後に影響を及ぼすのかという疑問は、依然として解明されていなかった（Ｓｍｉｔｓ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００８；９（１２）：１９０３−１６）。
【０１５４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、がんの発生および進行における重要な因子として同定されている。証拠は、単一のｍｉＲＮＡは、多くのｍＲＮＡを同時に調節し得ることを示唆する（Ｐａｒａｎｊａｐｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ．２００９；５８（１１）：１５４６−５４）。さらに、ｍｉＲＮＡは、腫瘍抑制因子および癌遺伝子の両方として働き得る（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００５；１２０（５）：６３５−４７）。ｍｉＲＮＡのｌｅｔｈａｌ−７（ｌｅｔ−７）ファミリーは、発見された最初のｍｉＲＮＡファミリーのうちの１つである。ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡの発現は、多くのがんにおいて改変される。例えば、肺がんにおいて、ｌｅｔ−７は、発現が乏しく（Ｃａｌｉｎ  ＧＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００４；１０１（９）：２９９９−３００４；Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４（１１）：３７５３−６）、ｌｅｔ−７の過剰発現は、インビトロ（Ｔａｋａｍｉｚａｗａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；６４（１１）：３７５３−６）、およびインビボ（Ｋｕｍａｒ  ＭＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００８；１０５（１０）：３９０３−８；Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．２００８；７（６）：７５９−６４）での細胞増殖を阻害し、このことは、ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡが、腫瘍抑制因子として働き得ることを示唆する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００５；１２０（５）：６３５−４７）。
【０１５５】
結腸がん細胞において、ｌｅｔ−７発現は、隣接する非がん組織と比較して、腫瘍組織において著しく低減される（Ａｋａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２００６；２９（５）：９０３−６）。さらに、ｌｅｔ−７ａ−１  ｍｉＲＮＡ前駆体のトランスフェクション後、細胞系において、ｌｅｔ−７発現は増加され、そしてＲＡＳ発現は低減された。このことは、ｌｅｔ−７が、結腸がん細胞の成長を調節することに関与することを示唆する（Ａｋａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．２００６；２９（５）：９０３−６）。
【０１５６】
ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における相補エレメントに結合することによって遺伝子発現を制御し得る。ｌｅｔ−７は、ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲにおける特定の部位に結合した後、ＲＡＳの下方調節を誘導する。ＫＲＡＳバリアントは、ＫＲＡＳ発現のｌｅｔ−７媒介調節に影響を及ぼす。バリアントＧ対立遺伝子（すなわち、ＫＲＡＳバリアント）の出現は、野生型と比較して、より高いＫＲＡＳレベル、およびより低いｌｅｔ−７レベルをもたらす。Ｇ対立遺伝子保有者は、中程度喫煙者における増加した肺がんリスク、増加した卵巣がんのリスク（特に閉経後の女性について）、乳がん（特に三重陰性乳がんサブタイプ）を発生する増加したリスク、および肺がんにおいてではなく、口腔のがん（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）において減少した生存率を有する。ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異ＣＲＣ、Ｇ対立遺伝子保有者（ＫＲＡＳバリアント保有者）は、後期ＣＲＣにおける減少した生存率、およびセツキシマブに対する改変された応答を示し、結腸がんにおけるＫＲＡＳバリアントの役割を実証した。早期ＣＲＣにおけるＫＲＡＳバリアント遺伝子型の役割は未解明だったので、本明細書中に示される実験およびデータは、大規模な前向きコホート研究からの４０９人の早期（ＴＮＭ  Ｉ期およびＩＩ期；Ｔ１−４、Ｎ０、Ｍ０）ＣＲＣ症例、１８２人のＩＩＩ期（Ｔ１−４、Ｎ１、Ｍ０）ＣＲＣ症例、および６９人のＩＶ期（Ｔ１−４、Ｎ０−１、Ｍ１）ＣＲＣ症例において予後に及ぼす影響を評価した。ＣＲＣリスクにおけるＫＲＡＳバリアント遺伝子型の影響はまた、ＮＬＣＳからの１，８８６のサブコホートメンバーからのデータを用いることによって評価された。
【０１５７】
この研究の結果は、ＫＲＡＳの３’ＵＴＲ領域におけるＬＣＳ６におけるＴ＞Ｇバリアントが早期（Ｉ期およびＩＩ期）ＣＲＣにおける予後に影響を及ぼすことを実証する。ＫＲＡＳバリアントは、症例の１６．４％において存在したが、一方、これは、世界人口のたった６％（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：８５３５−４０）、および欧州の家系の人の１２％〜１５％（Ｒａｔｎｅｒ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：６５０９−１５）においてしか見出されない。このＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）の増加した頻度は、進行した症例において見出され（早期は１４％、ＩＩＩ期およびＩＶ期においてはそれぞれ１９．２％および２１．４％）、これは以前に報告されたＩＩＩ期における頻度に匹敵する（Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０：４５８−６４）。Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）は、サブコホートメンバーの１８％において見出された。ＫＲＡＳバリアントと進行した結腸がんに伴って増加した提示との間で統計学的に有意な関連性が見出され、ＫＲＡＳバリアント保有者における結腸がんの自然生物学への価値ある見識を提供した。さらに、ＫＲＡＳバリアントを有する早期ＣＲＣ症例について、統計学的に有意な生存率の増加が見出された；ＫＲＡＳ変異患者の中で、Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）を保有する早期の患者は、誰もＣＲＣで死ななかった。ＫＲＡＳバリアントを有する早期ＣＲＣ症例についてのこの統計学的に有意な生存率の増加は、他の予後判定の要因（例えば、腫瘍の分化またはサブロケーション（ｓｕｂｌｏｃａｔｉｏｎ））から独立していた。Ｔ４腫瘍は、早期症例の研究群において稀であったので、ＫＲＡＳ野生型の中でより頻度が高いＩＩｂ期症例は、観察されたよりも悪い転帰の原因として除外される。統計学的に有意な影響は、ＩＩＩ期またはＩＶ期のいずれにおいても見出されなかったが、この結果は、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）およびＫＲＡＳ変異を有するＩＩＩ期症例についてのより悪い予後を示す。さらに、ＣＲＣリスクに対するＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）の影響が研究された。早期ＣＲＣの低減したリスクが見出されたが、進行した病期のＣＲＣのリスクに対する影響は見出されなかった。このことは、Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）が、ＣＲＣ全般を発生するより高い見込みに関連しないことを示した。
【０１５８】
以前の研究において、ＫＲＡＳにおける変異は、より好ましくない予後に関連付けられた。しかし、この論題における結果は一貫性がなく、さらに、これらの結果の臨床的関連性ははっきりしない（Ｓｍｉｔｓ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００８；９：１９０３−１６）。獲得ＫＲＡＳ変異は、先天性の変異であるＫＲＡＳバリアントと同じではなく、従って、腫瘍発生、生物学、および従って予後に対して異なる影響を有する。
【０１５９】
ＫＲＡＳバリアントが、早期ＣＲＣにおける増加した生存率に関連するという発見は、興味をそそる。以前の調査は、細胞老化が、癌遺伝子のＲａｓの過剰発現によって引き起こされ得、前悪性または良性新生物における成長停止の一因となり得たことを示唆している（Ｍｏｏｉ  ＷＪ  ａｎｄ  Ｐｅｅｐｅｒ  ＤＳ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００６；３５５：１０３７−４６）。腫瘍細胞老化は、ヒトのがんにおいて報告されている。前悪性結腸腺腫も、老化の特徴を表す（Ｃｏｌｌａｄｏ  Ｍ  ａｎｄ  Ｓｅｒｒａｎｏ  Ｍ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；１０：５１−７）。癌遺伝子誘導老化は、前悪性病変においてのみ役割を果たし得る。それにもかかわらず、ＫＲＡＳの生理学的レベルは、転写因子ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）の不存在において老化を誘導し得る（Ｖｉｃｅｎｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１０；１２０：３９４０−５２）。高いＫＲＡＳ遺伝子発現を有する肺がん患者は、ＷＴ１関連遺伝子の低減した発現を有する場合に良好な予後を有した（Ｖｉｃｅｎｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１０；１２０：３９４０−５２）。まとめると、これらの結果は、他の分子要因が細胞運命の決定に関与し得ること、および癌遺伝子誘導老化が、他の遺伝的標的またはエピジェネティック標的の改変された発現後に起こり得ることを意味する。癌遺伝子誘導老化はまた、ＣＲＣにおいて役割を果たし得た：ＫＲＡＳ−ＬＣＳ６遺伝子型は、進行した病期の腫瘍、または影響される他の遺伝マーカー（またはエピジェネティックマーカー）に基づいてより良好な予後を有する早期腫瘍のいずれかをもたらし得た。
【０１６０】
より良好な転帰は、ＫＲＡＳバリアントおよびＢＲＡＦ変異、またはＲＡＳＳＦ１Ａ過剰メチル化を有する早期（Ｉ期およびＩＩ期）症例について見出され、その両方は、Ｒａｓシグナル伝達経路に関与する。ＢＲＡＦ関連老化は、黒色腫において起こることが以前に報告されている（Ｍｉｃｈａｌｏｇｌｏｕ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３６：７２０−４）が、癌遺伝子誘導老化におけるＲＡＳＳＦ１Ａの可能な役割は実証されていない。本明細書中に記載される研究集団においてのように、ＫＲＡＳバリアントと、ＢＲＡＦ変異および／またはＲＡＳＳＦ１Ａ過剰メチル化との同時発生は、あまり一般的ではなく、従って、統計学的有意性に達しなかった。これらの（エピ）ジェネティック事象が組み合わさった場合、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）と、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、またはＲＡＳＳＦ１Ａの改変（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）との組み合わせを有する患者のより良好な転帰は、さらにより高められた。従って、Ｒａｓ経路からの遺伝子における（エピ）ジェネティック改変と組み合わせた、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）に起因する、Ｒａｓの過剰発現は、早期ＣＲＣにおける老化を誘導し得、それによって、生存率に影響を及ぼした。進行した病期の症例については、予後に影響を及ぼす漸増する数の分子経路が影響を受ける。
【０１６１】
ｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡは、ＫＲＡＳバリアントの存在下において、野生型と比較して、低減したｌｅｔ−７発現および増加したＫＲＡＳレベルでの腫瘍成長抑制作用を実証する（１３）。従って、ＫＲＡＳバリアントを有する患者は、例えば、口腔のがんにおいて示されるように、より悪い予後を有すると期待される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＢＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００９；３０：１００３−７）。ＣＲＣについて、処置された患者における転帰に及ぼすＫＲＡＳ遺伝子型の影響を研究する２つの報告がある（Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０：４５８−６４；Ｚｈａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２：１０４−９）。第一のものは、イリノテカンおよびセツキシマブで処置された、ＫＲＡＳバリアントを有するイリノテカン不応性転移患者の小さい集団の中での低い生存率、ならびにＫＲＡＳ変異と、ＢＲＡＦ変異の不存在との関連性を報告する（Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０：４５８−６４）が、これらの知見は、患者が最初に未処置であったので、この研究において再現され得なかった。第二のものは、転移性ＣＲＣにおいて、セツキシマブ単独に対してより良好な応答、およびＫＲＡＳ変異のないＫＲＡＳバリアントを有する患者におけるより長い生存率を報告するが、応答は、統計学的に有意ではなかった（Ｚｈａｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２：１０４−９）。本明細書中に示されるデータは、ＩＶ期ＫＲＡＳバリアント保有者においてより良好な予後を実証するが、この比較は、統計学的に有意ではなく、これは、ＩＶ期の患者の群が小さいことによって説明され得る。他の研究は、ＫＲＡＳ遺伝子型を評価するために生殖細胞系組織を使用したが、本明細書中に記載される研究は、ＫＲＡＳ遺伝子型を評価するために腫瘍ＤＮＡを使用した。正常組織および腫瘍組織の遺伝子型が、ＫＲＡＳバリアントについて同じであることは、よく記録されている。
【０１６２】
早期および進行した病期のＣＲＣにおける、見たところ不一致な結果は、がんの異なる病期における腫瘍の起源および進行に関して、ならびに早期ＣＲＣが、進行した病期と比較して分子的に異なる経路を介して発生し得るかどうかに関して疑問を提起する。ＫＲＡＳバリアントは、進行した病期の疾患を有する症例の中ではより一般的であるが、ＫＲＡＳバリアントを有する、早期と診断された患者は、より有利な転帰を有するようである。従って、このデータは、進行した病期の症例と比較して早期では異なる生物学を暗示する。早期ＫＲＡＳ野生型患者が好ましくない予後を有するという発見は、彼らがＭＳＩ腫瘍を有する場合でさえ、これらの患者が追加のアジュバント処置から利益を得るであろうことを示し得た。無作為化臨床試験を含むさらなる調査は、好ましくない予後を有するこれらの早期患者が、追加のアジュバント処置から利益を得るかどうかを評価することを必要とした。本明細書中に記載されるバイオマーカーおよび方法の発見の前には、ＭＳＩは、良好な予後についてのマーカーであると考えられていた（Ｂｏｌａｎｄ  ＣＲ  ａｎｄ  Ｇｏｅｌ  Ａ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０１０；１３８：２０７３−８７．ｅ３）が、この研究からのデータは、ＭＳＩ状態とは独立して、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子保有者についてのより良好な転帰を実証する。
【０１６３】
早期ＣＲＣ症例におけるＫＲＡＳバリアントの影響についての本明細書中に示される分析は、ＫＲＡＳ変異を有する早期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者についてのより良好な転帰を実証する。この研究において使用された集団は、一般に未処置である、現在までに研究された唯一の群であり、この研究から集められたデータが、ＫＲＡＳバリアントを有する早期ＣＲＣの自然生物学への価値ある見識を初めて提供する。結果的には、本明細書中に示された証拠は、ＫＲＡＳバリアント遺伝子型が、良好な予後を有するＣＲＣ患者を同定するために使用され得る早期ＣＲＣについての可能な予後判定のバイオマーカーであるという最初のしるしである。
【０１６４】
処置に対する応答
卵巣がん
上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）は、米国において上位から二番目の女性の骨盤生殖器官のがんであり、欧米世界におけるこのカテゴリーでは死亡率が最も高い。米国での女性におけるがんによる死亡の総合的な原因の第５位であり、この疾患により毎年１３，８５０人の女性が亡くなっている。処置に対する複数の新しいアプローチにもかかわらず、ＥＯＣによる高い死亡率は、何年間もの間、大きくは変わっておらず、５年全生存率はたった３０％〜３９％である（Ｐａｒｍａｒ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：２０９９−２１０６）。
【０１６５】
現在使用されているＥＯＣを処置するための標準的な化学療法レジメンは、前向き無作為化試験（Ｈｅｒｚｏｇ  Ｔ  ａｎｄ  Ｐｏｔｈｕｒｉ  Ｂ．（２００６）．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ３：６０４−６１１；Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ  Ｆ．（２００６）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ６：２５９−２６９；Ｉｏｒｉｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：８６９９−８７０７）に基づくカルボプラチンおよびパクリタキセルである（Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４６９９−４７０７）。一部の患者は、初めは、プラチナベースの化学療法に対して抵抗性であり（「プラチナ抵抗性」と称される）、６ヶ月間の処置の間に再発するが、これは、全てのＥＯＣ患者に与えられる第一選択処置である。ＥＯＣ患者の中でのプラチナ抵抗性を説明し得るＥＯＣ腫瘍における根本的な生物学的違いの改善された理解は、処置のより合理的な選択を可能にした（Ｐａｒｍａｒ  ＭＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：２０９９−２１０６；Ｐｆｉｓｔｅｒｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４６９９−４７０７；Ｈｅｒｚｏｇ  Ｔ  ａｎｄ  Ｐｏｔｈｕｒｉ  Ｂ．（２００６）．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ３：６０４−６１１）。
【０１６６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、事実上全てのがんのタイプにおいて異常に発現される、一クラスの２２ヌクレオチドの非コードＲＮＡであり、新規なクラスの癌遺伝子または腫瘍抑制因子として機能し得る。ＥＯＣにおいて、正常卵巣組織を悪性卵巣組織と区別すること（Ｉｏｒｉｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：８６９９−８７０７；Ｚｈａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：７００４−７００９）の他に、ｍｉＲＮＡ発現パターンは、ＥＯＣの病因において重要であること（Ｍｅｚｚａｎｚａｎｉｃａ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４２：１２６２−１２７２；ｖａｎ  Ｊａａｒｓｖｅｌｄ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４２：１２８２−１２９０）、ならびにＥＯＣ患者の変更された転帰（Ｅｉｔａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １１４：２５３−２５９）、および処置に対する応答（Ｌｕ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １２２：３６６−３７１）に関連することが示されている。ｍｉＲＮＡ発現の違いはまた、ＥＯＣにおける化学療法およびプラチナ抵抗性に関連付けられている（Ｅｉｔａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １１４：２５３−２５９；Ｌｕ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １２２：３６６−３７１；Ｃｈｅｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２９：１３０６−１３１１）。
【０１６７】
がんにおけるｍｉＲＮＡの重要性についてのさらなる見識は、ｍｉＲＮＡコード配列（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８５３５−８５４０）、および癌遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるｍｉＲＮＡ結合部位（Ｃｈｅｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２９：１３０６−１３１１；Ｃｈｉｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８５３５−８５４０）を崩壊させる、遺伝によって受け継がれた一塩基多型の発見から来ている。このような機能的なバリアントの例は、ＫＲＡＳバリアントと称されるｒｓ６１７６４３７０であり、これは、ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ相補部位におけるＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲに位置する。ｒｓ６１７６４３７０と上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）リスクとの間の関連性は、以前に報告された（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５３０２号、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３４１２号を参照のこと；それらの内容は、それらの全体がそれぞれ本明細書中で援用される）。さらに、提供される方法および例は、このバリアントが、上皮性卵巣がん（ＥＯＣ）における臨床的転帰および化学療法抵抗性のバイオマーカーであることを実証する。この証拠は、侵襲性腫瘍生物学および好ましくないがん特異的転帰との関連性という、腫瘍におけるＫＲＡＳバリアントの引き続いての機能的役割を支持する。
【０１６８】
ＫＲＡＳバリアントが有害なＢＲＣＡ変異の存在および不存在の両方においてＥＯＣにおける転帰のバイオマーカーとして働く可能性は、本明細書中で評価される。さらに、ＫＲＡＳバリアントＥＯＣ患者における変更された転帰の可能な原因は、ネオアジュバントプラチナベースの化学療法に対する応答を研究すること、プラチナ抵抗性を評価すること、およびＥＯＣ腫瘍遺伝子発現を評価することによって決定される。このデータは、この機能獲得型ＫＲＡＳバリアントの直接的標的化が、この病変を有するＥＯＣ細胞系において、細胞増殖および生存率を減少し得ることを実証する。
【０１６９】
ＫＲＡＳバリアントは、ＥＯＣを有する閉経後の（年齢が５２歳を超える）女性についての好ましくない転帰のバイオマーカーである。ＫＲＡＳバリアント関連卵巣がんにおける好ましくない転帰は、少なくとも部分的に、ＫＲＡＳバリアントと、ネオアジュバントプラチナベースの化学療法に対するより悪い応答に基づく、プラチナベースの化学療法に対しての抵抗性、およびＫＲＡＳバリアントを有する、アジュバントにより処置されたＥＯＣ患者における統計学的に有意に増加したプラチナ抵抗性との関連性に起因する。
【０１７０】
ＫＲＡＳバリアントＥＯＣ腫瘍と非バリアントＥＯＣ腫瘍との間の生物学的違いは、遺伝子発現データによって支持され、これは、ＫＲＡＳバリアント関連ＥＯＣにおいてＫＲＡＳ依存およびＡＫＴ媒介プラチナ抵抗性を示す。プラチナ抵抗性は、非バリアント系と比較して、ＫＲＡＳバリアントを有する卵巣がん細胞系においてインビトロでさらに確認された。ＫＲＡＳバリアント生殖細胞系病変におけるＫＲＡＳバリアント関連ＥＯＣの引き続いての依存についての証拠は、この変異の直接的標的化を介して示され、非バリアントＥＯＣ系と比較して、ＫＲＡＳバリアントＥＯＣ細胞系において、腫瘍の成長および細胞生存の両方の著しい阻害をもたらした。
【０１７１】
閉経後の女性についての、ＫＲＡＳバリアントと、低い生存率との関連性は、このバリアントに関連する基礎となる生物学に起因し得た。発見された関連性が、基礎となる生物学を反映するという仮説を支持して、ＫＲＡＳバリアントは、閉経後卵巣がんに関連付けられており（Ｒａｔｎｅｒ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６５０９−６５１５）、診断のメジアン年齢は５９歳付近である。相対的な生存率は、年齢によって変動し、より高齢な女性は、ＥＯＣの診断の５年以内に死亡する可能性が２倍高く、閉経後の女性が、より若い女性とは生物学的に異なる腫瘍を有し得る（ＡＣＳ  （２０１０）．Ｃａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｓ  ＆  ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１０．Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ．ＡＣＳ：Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ，ｐｐ  １−５６）という仮説をさらに支持する。さらに、ＫＲＡＳバリアントは、５２歳超の年齢の閉経前の女性におけるＴＮＢＣのリスクのバイオマーカーであることが示されている。従って、がんのリスクにおけるＫＲＡＳバリアントの役割、および異なる組織における生物学は、生理学的状態（例えば、閉経）に応答したｍｉＲＮＡ発現の変化に依存し得る。ＫＲＡＳバリアントを有する女性は、まず、乳がんについてのリスクがあり得、次に、引き続いて、閉経後の卵巣がんを発生するリスクがあり得る。
【０１７２】
ＫＲＡＳバリアントは既知の有害なＢＲＣＡ変異を有するＥＯＣ患者のコホートにおける好ましくない転帰を予測しないという発見は、ＢＲＣＡ変異がプラチナ感受性に関連するという事実によって部分的に説明され得る。プラチナ感受性に関連するＢＲＣＡ変異の帰結は、ＫＲＡＳバリアントによって引き起こされるかまたは悪化させられる、プラチナ薬剤に対する任意の抵抗性の下流で起こり得る。本明細書中に示される研究におけるより若い患者が、記録されていない有害なＢＲＣＡ変異を有したかもしれないことは可能である。あるいは、または加えて、本明細書中に示される研究におけるより若い患者はまた、より若い女性においてより頻繁に見られる他のサブタイプの卵巣がん（例えば、境界型腫瘍）を有したかもしれず、このことは、これらの患者の誤診をもたらし得る。本明細書中に提供されるデータは、広範囲に臨床的に注釈付けされたが、ＢＲＣＡ状態は、本発明者らのＥＯＣ患者の全てにおいて得られたわけではなく、そして、病理学報告は利用可能であったが、腫瘍組織は、再検討に利用可能ではなかった。ＫＲＡＳバリアントとＥＯＣにおける好ましくない転帰および療法に対する抵抗性との関連性を見出すことができなかった最近の研究は、臨床的情報が非常に限定された（すなわち、例えば、ＢＲＣＡ状態および卵巣がん特異的生存率のような要因が、それらの分析において利用可能でもなく、含まれもしなかった）ゲノム全体の関連性研究に使用される卵巣収集物を使用した（Ｐｈａｒｏａｈ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３７４２−３７５０）。
【０１７３】
同様の遺伝子誤発現パターンは、２つの異なるタイプのＫＲＡＳバリアント関連腫瘍において見出された。このことは、これらの腫瘍が、起源の組織にかかわらず、発癌において同様の経路を使用することを示した。ＫＲＡＳバリアント関連ＥＯＣ細胞系におけるＫＲＡＳバリアント病変の直接的標的化は、著しく高められた細胞死およびＫＲＡＳレベルの減少をもたらす。これらの発見は、この単一の非コード生殖細胞系病変に対するＫＲＡＳバリアント腫瘍の、引き続いての重大な依存を示唆する。腫瘍遺伝子発現を測定し、そして腫瘍獲得変異を決定することによってがんの処置を調整するための著しい努力がなされているが、がんにおける療法についての重大な標的であると以前に示されている生殖細胞バリアントは、あるとしてもほとんど存在しない。
【０１７４】
本明細書中で提供されるデータに基づけば、ＫＲＡＳバリアントは、卵巣がんにおいて重要である機能的がん変異であること、およびＫＲＡＳバリアントにより、それが関連する卵巣腫瘍の有意義なサブクラス分類を可能にすることが決定される。これらの発見は、卵巣がん患者の転帰を改善するのに有用である。
【０１７５】
結腸直腸がん
単剤療法として、または化学療法と組み合わせてのいずれかで使用される、上皮増殖因子受容体（抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ）を標的とする２つのモノクローナル抗体（セツキシマブおよびパニツムマブ）を転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）臨床的実施に組み込むことは、予め処置された患者において適度な臨床的利益を提供する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４；３５１（４）：３３７−３４５；Ｓａｌｔｚ  ＬＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；２２（７）：１２０１−１２０８；Ｓａｌｔｚ  ＬＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００；３４３（１３）：９０５−９１４；Ｖａｎ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；２５（１３）：１６５８−１６６４）。それにもかかわらず、それらの効力は、あるサブセットの患者に制限されることがすぐに明らかになった。非無作為化後ろ向き研究（Ａｍａｄｏ  ＲＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；２６（１０）：１６２６−１６３４；Ｄｅ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；１９（３）：５０８−５１５；Ｌｉｅｖｒｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６（８）：３９９２−３９９５；Ｌｉｅｖｒｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；２６（３）：３７４−３７９；Ｍｏｒｏｎｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２００５；６（５）：２７９−２８６；Ｓａｒｔｏｒｅ−Ｂｉａｎｃｈｉ  Ａ，ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００７；２５（２２）：３２３８−３２４５）、前向き無作為化試験の後ろ向き分析（Ｂｏｋｅｍｅｙｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９；２７（５）：６６３−６７１；Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．ＡｎｎＯｎｃｏｌ  ｓｕｐｐ．２００９；Ｋａｒａｐｅｔｉｓ  ＣＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００８；３５９（１７）：１７５７−１７６５；Ｔｏｌ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９；３６０（６）：５６３−５７２；Ｖａｎ  Ｃｕｔｓｅｍ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００９；３６０（１４）：１４０８−１４１７）、および大欧州コンソーシアム研究（Ｄｅ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２）は、腫瘍獲得ＫＲＡＳ変異が存在すると、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ療法に対する抵抗性が予測されること、ならびにその存在が、より悪い予後およびより短い生存率と関連することを実証した。ＫＲＡＳの変異状態は、今や数年間にわたって抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ処置の開始に必須となっているが、ＫＲＡＳ野生型腫瘍を有するｍＣＲＣ患者の約５０％〜約６５％は、これらの処置から利益を得られないので問題は未解決であり、このことは、抵抗性またはおそらく感受性の追加の遺伝的決定基が存在することを暗示する（Ｄｅ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；１９（３）：５０８−５１５；  Ａｌｌｅｇｒａ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９；２７（１２）：２０９１−２０９６；Ｄｅ  ＲＷ，ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２；Ｒｏｏｃｋ  ＷＤ，ｅｔ  ａｌ��Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０）。ますます増える証拠は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異が、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する抵抗性を与えることを示し（Ｄｅ  ＲＷ，  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２；Ｄｉ  ＮＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；２６（３５）：５７０５−５７１２；Ｌａｕｒｅｎｔ−Ｐｕｉｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９；２７（３５）：５９２４−５９３０；Ｓａｒｉｄａｋｉ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．ＩＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１；６（１）：ｅ１５９８０；Ｓｏｕｇｌａｋｏｓ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；１０１（３）：４６５−４７２）、他方、まだ完全には明らかでないが、ＰＩＫ３ＣＡ変異体腫瘍は、このような処置からほとんどまたは全く利益を得ない利益を得ないようである（Ｄｅ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２；Ｐｒｅｎｅｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；１５（９）：３１８４−３１８８；Ｓａｒｔｏｒｅ−Ｂｉａｎｃｈｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；  ６９（５）：１８５１−１８５７；Ｊｈａｗｅｒ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８（６）：１９５３−１９６１；Ｏｇｉｎｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００９；２７（９）：１４７７−１４８４）。
【０１７６】
腫瘍の遺伝的特徴付けに加えて、患者の生殖細胞ゲノムはまた、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ療法に対する抵抗性または感受性を与える役割を果たし得るという、ますます増える証拠が存在する。この考えを支持して、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩΙａ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦ、サイクリンＤ１、ならびにＣＯＸ−２についてコードする遺伝子における多型は、単剤療法として、および化学療法と組み合わせての両方で投与されるセツキシマブで処置されたｍＣＲＣ患者における転帰に関連付けられている。
【０１７７】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、それらの標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における部分的相補部位に結合することによって遺伝子発現を負に調節する、豊富なクラスの、高度に保存された、内在性で非コード性の、長さ１８〜２５ヌクレオチドの低分子ＲＮＡ分子である。ダイサーおよびドローシャＲＮアーゼＩＩＩエンドヌクレアーゼによって処理されると、成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を標的ｍＲＮＡへと差し向けることによってｍＲＮＡ翻訳を抑制し得る。ｍｉＲＮＡは、基本的生物学的プロセス（例えば、増殖、細胞分化、およびアポトーシス）に関与する多数の遺伝子を調節し、癌遺伝子または腫瘍抑制因子のいずれかとして挙動することによって、がんの発生および進行において重要なプレーヤーとして働く。７００よりも多くのｍｉＲＮＡ配列がヒトゲノムにおいて、現在までに確認されているが、この数は、２倍になると期待される。さらに、各ｍｉＲＮＡは、多くのｍＲＮＡを同時に調節することによって何百もの遺伝子を制御し得る。
【０１７８】
ｍＲＮＡに結合するｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルの調節プロセス、およびその後のタンパク質発現について重大であり、この調節は、ｍｉＲＮＡ標的部位において起こる一塩基多型（ＳＮＰ）によって影響され得る。これらのＳＮＰは、誤った結合部位を作り出すか、または正しいものを破壊（ａｂｏｌｉｓｈ）（排除）し得、ｍｉＲＮＡ調節に対する抵抗性をもたらし、がんのようなヒトの疾患において役割を果たすことが可能である別の種類の遺伝的変動性を反映する（または、がんのような特定の疾患についての増加したリスクを与える）。新たな調査は、これらの部位の系統的ゲノム評価、ならびに検出されたＳＮＰの機能的および生物学的関連に焦点を合わせており、このＳＮＰは急速に成長している個別化医療の領域において重要な分子マーカーである。このようなＳＮＰは、遺伝子発現だけではなく、腫瘍生物学ならびに薬物応答および薬物抵抗性にも影響を及ぼすと思われる。
【０１７９】
ｍｉＲＮＡのＬｅｔｈａｌ−７（ｌｅｔ−７）ファミリーは、最初に発見されたものの１つであり、その異なった発現は、多数のがんにおいて検出されている。ＫＲＡＳ癌遺伝子は、ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡファミリーの直接的標的であり、より正確には、ｌｅｔ−７は、ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）の特定の部位へ結合するとＫＲＡＳの下方調節を誘導することが示された。
【０１８０】
ＫＲＡＳバリアントは、ＫＲＡＳ  ３’−ＵＴＲ  ｍＲＮＡにおけるｌｅｔ−７相補部位（ＬＣＳ）において起こる機能的な一塩基多型（ＳＮＰ）である。このＳＮＰ（ｒｓ６１７６４３７０）は、成熟ｌｅｔ−７のＫＲＡＳ  ｍＲＮＡへの結合可能性を改変することが見出された、ＴからＧへの塩基置換からもたらされ、おそらく負のフィードバックループに起因して、インビトロでのＫＲＡＳ癌遺伝子タンパク質の増加した発現、およびインビボでのより低いｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡレベルの両方をもたらす。ＫＲＡＳ遺伝子の癌遺伝子性質と矛盾なく、このＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子とも称される）は、中程度喫煙者において増加した非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）リスク、三重陰性乳がんおよび女性のサブセットにおける卵巣がんの発生についての増加したリスクを与えることが示されている。さらに、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の増加した頻度は、小さいコホートにおけるＢＲＣＡ１保有者の中で検出された。さらに、頭頸部がんを有するがＮＳＣＬＣは有さないＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）保有者は、減少した全生存率を示した。統計学的に有意により悪い生存率およびプラチナ抵抗性がＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）を有する卵巣がん患者において見出された。まとめると、この証拠は、ＫＲＡＳバリアント（ＫＲＡＳ  ３’−ＵＴＲ  ＬＣＳ６  ＳＮＰとしても公知）の機能的および臨床的な重要性を実証する。
【０１８１】
現在までのｍＣＲＣ標的化抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ療法設定において、ＫＲＡＳバリアントは、小さい選択された集団を用いて２つの研究において評価されており、その結果は、矛盾し、対立している（Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０（５）：４５８−４６４；Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２（１）：１０４−１０９）。ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ野生型対立遺伝子を有し、サルベージイリノテカン−セツキシマブ組み合わせ療法で処置された患者集団における第一の研究（Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０（５）：４５８−４６４）においては、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）保有者は、統計学的に有意により悪い無増悪生存率（ＰＦＳ）および全生存率（ＯＳ）を有することが示された。対照的に、患者がサルベージセツキシマブ単剤療法に曝された第二の研究（Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２（１）：１０４−１０９））においては、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）保有者は、より長いＰＦＳおよびＯＳを示し、より良好な奏効率（ＯＲＲ）を有した。これらの研究は反対の結果を有するようであるが、これらの患者は、同一の処置をされたわけでなく、そして、実際には、セツキシマブに対するイリノテカン化学療法の追加もまた、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）保有者における好ましくない応答が予測されることが見出された（Ｗｉｎｄｅｒ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．［２７（１５Ｓ  Ｓｕｐｐｌ）］．２００９．Ａｂｓｔｒａｃｔ）。この証拠は、腫瘍獲得ＫＲＡＳタンパク質変異とは違って、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）保有者に与えられる療法の組み合わせが、セツキシマブに対する応答に識別的に影響を与えることを示す（Ｗｉｎｄｅｒ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．［２７（１５Ｓ  Ｓｕｐｐｌ）］．２００９．Ａｂｓｔｒａｃｔ）。これは、疾患において、このようなｍｉＲＮＡ結合部位バリアントがダイナミックに調節されるというデータに合致している。
【０１８２】
この研究において、他の分子マーカー（例えば、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異状態）とともにＫＲＡＳバリアントは、サルベージ抗ＥＧＦＲ  ＭｏＡｂ単剤療法または化学療法と組み合わせたＭｏＡｂを受けた一連の５５９人のｍＣＲＣ患者において評価される。本明細書中に示されるデータは、ＭｏＡｂ療法に対する応答を予測することにおけるＫＲＡＳバリアントの役割を明らかにする。この患者のコホート、ならびに細胞系において、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）は、細胞毒性化学療法の追加の利益なく、ＭｏＡｂ単剤療法に対する陽性応答を予測する。
【０１８３】
本明細書中に示された研究は、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法を受けた、転移性結腸がんを有する全てのＫＲＡＳバリアント保有者についてのメジアンＰＦＳにおいて統計学的に有意な改善（および二重野生型患者における改善されたＯＳに対する傾向）を実証する。さらに、ＫＲＡＳまたはＲＡＦ変異体患者をはじめとする、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂに対する応答において研究された全てのコホートについて、非ＫＲＡＳバリアント保有者と比較して、これらの患者の好ましい予後について統計学的有意性が見出された。この改善された予後は、化学療法の追加に依存しなかった。そして、実際に、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）保有者は、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ療法に加えての化学療法に利益がないと思われた。これは、全てのコホートにわたって抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂへの化学療法の追加から著しい利益を得た非ＫＲＡＳバリアント患者と対照的であり、化学療法の追加は、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法を受けたＫＲＡＳバリアント対立遺伝子保有者と同じレベルの彼らの予後をもたらした。細胞系研究は、ＫＲＡＳバリアント細胞系において非ＫＲＡＳバリアント細胞系と比較して組み合わせ療法の利益がなく、同じ影響を示した。これらの知見は、転移性結腸がんを有するＫＲＡＳバリアント対立遺伝子患者が、化学療法処置の毒性および時には、致命的な影響を避け得たこと、およびおそらく避けるべきであること、そして抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法単独で有意義に処置され得たことを初めて示唆する。
【０１８４】
主に欧州起源の患者の集団は、報告されたベースライン有病率と比較して、１９．５％というＫＲＡＳバリアントの増大した頻度を示した。ＫＲＡＳバリアントは、世界人口の６％で見出されるが、その頻度は、健常な白色人種において１０％を超越すると見積もられている。さらに、ＫＲＡＳバリアントの保有率は、ＮＳＣＬＣに苦しむ患者においてほぼ２０％まで実質的に増加し、増加したリスクの関連性を強調する。Ｇｒａｚｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ  （Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０（５）：４５８−４６４）によって研究された、欧州の家系の白色人種のｍＣＲＣ患者集団においては、（ＴＧおよびＧＧ遺伝子型の両方を組み込んでいる）ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）は患者の２５％において見出され、他方、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；  ２２（１）：１０４−１０９）による研究における、より異質性な集団においては、ＫＲＡＳバリアントの頻度は１５．３％であった。本明細書中に提供されるデータは、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子が、結腸がんを発生するリスクであることを見出さなかったが、ＫＲＡＳバリアントは、ＩＶ期疾患を有する患者において富化された。まとめると、この証拠は、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）は結腸がんの全てのタイプについてのリスクではないが、これは、進行し、転移性の結腸がんを発生する見込みに関連するということを示す。ＫＲＡＳバリアントは、セツキシマブ単剤療法で処置された場合に早期結腸がん患者、ならびに転移性結腸がん患者の両方において良好な予後を予測する。しかし、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）は、普遍的に致死である、結腸がんにおける転移性疾患の発生に関連し得る。
【０１８５】
以前の報告と比較して異なる、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異状態によるＫＲＡＳバリアント遺伝子型の分布は、この研究においてｍＣＲＣ患者集団に関して観察された。この研究において、ＫＲＡＳ遺伝子型は、ＫＲＡＳ野生型および変異群の中に同等に分布したが、ＢＲＡＦ変異群において、ＫＲＡＳバリアントの頻度は、統計学的に有意に増加した（すなわち、野生型と比較して２倍高い）。より後期のＣＲＣ発癌現象において、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子は、ＢＲＡＦ変異を保有する、分化度がより低く、より侵襲性の高いクローンの選択を媒介し得る。さらに、選択圧は、特定の療法に対する曝露に依存して、ＫＲＡＳバリアントの存在下においてＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ変異の発生に有利であり得る。ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）を有する患者は、患者がＫＲＡＳまたはＢＲＡＦ変異をも有していることに関係なく、セツキシマブで処置される場合に異なる予後を有しており、このことは、これらの群が、セツキシマブ処置の可能性について再評価を必要とすることを示唆している。
【０１８６】
処置に従って生存率の転帰が分析された場合、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法で処置された、患者集団全体および二重野生型患者集団において、ＫＲＡＳバリアント遺伝子型保有者は、統計学的に有意により長いＰＦＳを有した（それぞれ、ｐ＝０．０１９およびｐ＝０．０３９）。単剤療法患者集団全体において、ＫＲＡＳバリアント遺伝子型保有者は、野生型保有者の２８．８５週間と比較して、４５週間というより長いＯＳを有したが、それにもかかわらず、この差は、統計学的有意性に達しなかった。二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型患者集団において、統計学的有意性（ｐ＝０．０８７）に対する傾向が観察され、ＫＲＡＳバリアント保有者に有利なより長いＯＳがみられた（５５．４３週間対３５．７１週間）。
【０１８７】
ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）遺伝子型を有するセツキシマブ／イリノテカンで処置されたＫＲＡＳ変異患者は、ＬＣＳ６野生型遺伝子型を有する患者における１２週間と比較して６．４週間という著しくより悪いＰＦＳを示した（ｐ＝０．０３７、ログランク検定）。本発明者らの分析において、人々が多様な薬剤で処置された、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂベースの組み合わせ化学療法群において、ＫＲＡＳバリアント遺伝子型保有者とＫＲＡＳ野生型遺伝子型保有者との間の任意の集団におけるＰＦＳまたはＯＳにおいて統計学的有意差は見出されなかった。ＫＲＡＳまたはＲＡＦ変異を有するＫＲＡＳバリアント保有者において、化学療法対単剤療法をそれぞれ受けた場合、より悪い生存率（２３週間対２８週間）についての傾向があった。これらの知見は、ＫＲＡＳバリアント保有者における抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂベースの療法との組み合わせにおける特定の化学療法が有害であることを集合的に示し得る。
【０１８８】
他のがんの中でもＣＲＣの発生における重要な段階は、ｍｉＲＮＡの調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）である。過去数年間にわたって、ｍｉＲＮＡは、分子腫瘍学の舞台の中央に出されており、遺伝子調節を発明者らが見て理解する様式を実質的に変化させている。ＫＲＡＳバリアントは、がんのリスクに関連付けられた、ｍｉＲＮＡ結合部位における最初のＳＮＰであった。本明細書中に示されるデータは、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子遺伝子型を保有する患者が、非バリアント、またはＬＣＳ６野生型患者と生物学的に異なることを示す。ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子遺伝子型を保有する患者は、化学療法の追加による利益がなく、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法から利益を得る確率がより高く、そして総合的予後がより良好である。ＫＲＡＳバリアントを有する腫瘍は、ＫＲＡＳ経路の過剰発現を誘導するので、この経路の上流阻害は、これらの腫瘍を特異的に感作させ得る。このメカニズムは、腫瘍獲得ＫＲＡＳ変異体腫瘍においてｍｏＡｂ療法が効力がないことと矛盾すると思われるが、ＫＲＡＳバリアントが、腫瘍獲得ＫＲＡＳ変異と同じくらい高いレベルの、独立したＫＲＡＳ経路シグナル伝達を誘導しないことは可能である。
【０１８９】
ＫＲＡＳバリアント腫瘍は、ｍｏＡｂ単剤療法に対する細胞毒性療法の追加から利益を得ない。ＫＲＡＳバリアントは、ｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡによって調節され、化学療法は、ｌｅｔ−７のレベルを下げ、（特にＫＲＡＳバリアント存在下で）より高いＫＲＡＳ発現を可能にするので、化学療法での処置は、この対立遺伝子の活性化を増加し得、それにより、上流のｍｏＡｂ療法の能力を除去して、ＫＲＡＳ経路の活性化を克服し得る。ＫＲＡＳバリアントを含む、３’ＵＴＲ機能的バリアントが、改変された腫瘍生物学および処置に対する応答を予測する可能性は、患者のより良好なリスク階層化を可能にする。
【０１９０】
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびに５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、およびコード配列領域内の配列と塩基対合を形成してｍＲＮＡ切断および／または翻訳抑制を引き起こすことによって遺伝子発現を調節する、新規のクラスの低分子非コードＲＮＡである（Ｈｅ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３５：８２８−３３；Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ  Ａ．ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ  ＦＪ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００６；６：２５９−６９）。ｍｉＲＮＡは、これまでのところ研究された全てのがんにおいて誤調節されており、このがんとしては、乳がんおよび結腸直腸がんが挙げられるが、これらに限定されず、ここで特定のｍｉＲＮＡ改変（および特異的に減少したｌｅｔ−７）は、腫瘍開始細胞において見出されており、このことは、低ｌｅｔ−７がこれらの細胞の自己再生および増幅を可能にすること（Ｙｕ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ２００７；１３１：１１０９−２３）、およびがんのリスクを増加させることを示唆する。
【０１９１】
ｍｉＲＮＡは、包括的な遺伝子調節因子として働くので、ｍｉＲＮＡにおける遺伝によって受け継がれたバリエーションは、増加したがんのリスクに関連する。ｍｉＲＮＡコード配列を崩壊させる多型（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：５９７０−７７）または３’ＵＴＲ  ｍｉＲＮＡ結合部位が、乳がんおよび結腸直腸がんが挙げられるがこれらに限定されないがんのリスクの強力な予測因子であるという証拠が急速に増えつつある（Ｐｏｎｇｓａｖｅｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔ  Ｔｅｓｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ２００９；１３：３０７−１７；Ｔｃｈａｔｃｈｏｕ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００９；３０：５９−６４）。しかし、以前に同定されたｍｉＲＮＡ改変多型のどれも三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）、または腫瘍における改変された遺伝子および／もしくはｍｉＲＮＡ発現に関連付けられていない。
【０１９２】
「ＬＣＳ６−ＳＮＰ」または「ＫＲＡＳバリアント」と称される、ＫＲＡＳ癌遺伝子の３’ＵＴＲ内のｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ相補部位における新規の生殖細胞多型（ｒｓ６１７６４３７０）が最近同定された（国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６５３０２号、その内容は、その全体が本明細書中で参考として援用される）。
【０１９３】
このＫＲＡＳバリアントは、腫瘍における低濃度のｌｅｔ−７および肺がんにおける改変されたＫＲＡＳ調節に関連する（Ｃｈｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：８５３５−４０）。さらに、このＫＲＡＳバリアントは、頭頸部がんにおける好ましくないがん特異的転帰（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＢＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００９；３０：１００３−０７）、および結腸がんにおける改変された薬物応答（Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０：４５８−６４；Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２：１０４−０９）を予測する。このＫＲＡＳバリアントはまた、卵巣がんにおいて富化されており、遺伝性乳がんおよび卵巣がん（ＨＢＯＣ）を有する家族からの患者に最も頻繁に関連している（Ｒａｔｎｅｒ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：６５０９−１５）。本明細書中に提供される研究は、がんのリスクおよび腫瘍生物学におけるＫＲＡＳバリアントの役割をさらに評価した。
【０１９４】
本明細書中に提供されるデータは、例えば、「ＫＲＡＳバリアント」として公知であるＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲにおける生殖細胞多型が、閉経期前の女性について、三重陰性乳がんを発生する増加したリスクの遺伝マーカーであることを実証する。研究群１は小規模であり、既知のＥＲおよびＰＲ状態を有する患者において評価したのみだったので、この関連性は、完全な受容体状態を有するより大規模な症例対照において確認された。最も重要なことに、このデータは、ＫＲＡＳバリアントを有する三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）を有する患者の腫瘍は、ＫＲＡＳバリアントを有さない他の患者と比較して異なる遺伝子発現パターンを有することを実証しており、このことは、ＫＲＡＳバリアントが、腫瘍生物学に影響を及ぼし、腫瘍発生を変更することが公知である特定の経路を操縦することを実証する。従って、ＫＲＡＳバリアントは、予後を予測することならびに将来の処置決定を指示することの両方について有意義な生物学的サブグループへと腫瘍を分類し得る。
【０１９５】
ＫＲＡＳバリアントに関連するＴＮＢＣ腫瘍における減少したｌｅｔ−７発現の知見は臨床的に重要である。ＫＲＡＳ過剰発現は、ＮＦＫＢを通して、ｌｅｔ−７の負の調節因子であるｌｉｎ−２８の誘導をもたらし得、結果的に、ｌｅｔ−７発現の低下をもたらし得る（Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００９；１３９：１−１４；Ｍｅｙｌａｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００９；４６２：１０４−０８；Ｂａｒｂｉｅ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００９；４６２：１０８−１２）。これは、ＫＲＡＳバリアントに関連する、前悪性組織、最終的には、腫瘍においてｌｅｔ−７を低下させる、可能性のあるメカニズムを示唆する。さらにｌｅｔ−７は、乳房様幹細胞の増殖を調節し（Ｙｕ  Ｆ，Ｙａｏ  Ｈ，Ｚｈｕ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００７；１３１：１１０９−２３）、低いｌｅｔ−７発現または濃度は、この群の細胞の拡大を可能にし、それによって、ＫＲＡＳバリアントを有する女性における乳がんのリスクを増加させる。ＫＲＡＳバリアントと、閉経期前の女性のみにおけるＴＮＢＣのリスクとの関連性は、ＫＲＡＳバリアントとホルモン曝露との間の有意義な相互作用を示す。
【０１９６】
ＢＲＣＡ１変異を保有する乳房腫瘍の半分より多くが、三重陰性サブタイプ（ＴＮＢＣ）へと発達する（Ａｔｃｈｌｅｙ  ＤＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；２６：４２８２−８８）が、ＢＲＣＡ１変異は稀であり、従って、全てのＴＮＢＣ症例の約１０％〜約１５％しか占めない（Ｙｏｕｎｇ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９；９：８６；Ｎａｎｄａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ  ２００５；２９４：１９２５−３３）。ＫＲＡＳバリアントは、閉経期前ＴＮＢＣ患者の最大２３％において見出されるが、これらのコホートからのＢＲＣＡ変異保有者または若いＥＲ／ＰＲ陰性ＢＲＣＡ１変異保有者においては明らかに著しい富化はない（ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ−ｐｃｒ／ｍｉｒｎａ−ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ｈｔｍｌ（２００８年１月１日にアクセスした）において公的に利用可能であるｍｉＲＮＡプロファイリング）。ＫＲＡＳバリアントは、ＢＲＣＡ１変異体様遺伝子発現シグネチャーに関連しており、このことは、ＫＲＡＳバリアント、高ＫＲＡＳ発現および低ＢＲＣＡ１発現の存在下において、変異または他のメカニズムのいずれかを介して、増加した癌遺伝子のリスクが存在し得ることを示す。
【０１９７】
ＫＲＡＳバリアントは、インビトロでのＫＲＡＳ発現の調節、およびより高いＫＲＡＳ濃度の促進に影響を与える（Ｃｈｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：８５３５−４０）。ＫＲＡＳ癌遺伝子は、ＭＡＰＫ経路の重要な上流の媒介因子であり、その過剰発現は、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路の増加した活性化をもたらし得、それにより腫瘍形成を促進する。本明細書中に提供される研究は、ＫＲＡＳバリアントおよびＴＮＢＣを有する患者が、ＭＡＰＫ経路の活性化を示すことを実証する（表Ｘ）。乳がん細胞におけるＭＡＰＫの過剰活性化は、ＥＲ発現を低減してＥＲ陰性表現型をもたらし（Ａｔｃｈｌｅｙ  ＤＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００８；２６：４２８２−８８）、これは、ＫＲＡＳバリアントが、これらの組織学的ＥＲ陰性腫瘍におけるより低いエストロゲンシグナル伝達に関連するという発明者らの知見と一致する。ＭＡＰＫ活性化は、エストロゲン非依存腫瘍成長および抗エストロゲン処置に対する非感受性に関連付けられ（Ｏｈ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００１；１５：１３４４−５９）、ＫＲＡＳバリアントが、他の乳がんのサブタイプよりもＴＮＢＣの発生をもたらすメカニズムであり得る。
【０１９８】
ＫＲＡＳバリアントは、頭頸部がんを含む、いくつかのがんにおける好ましくない転帰のバイオマーカーである（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＢＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２００９；３０：１００３−０７）。ＫＲＡＳバリアントはまた、結腸がんにおける化学療法と組み合わせた標的化療法に対する好ましくない応答のバイオマーカーである（Ｇｒａｚｉａｎｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ  ２０１０；１０：４５８−６４）。ＫＲＡＳバリアント陽性ＴＮＢＣ患者が、管腔型前駆細胞シグネチャー、ならびにこのシグネチャー内の血管新生および転移性マーカーの識別的発現を有するという発見は、ＫＲＡＳバリアントを含む腫瘍が、ＴＮＢＣの侵襲性サブグループであることを実証する。
【０１９９】
本明細書中に提供される研究は、ＫＲＡＳバリアントが、独特の遺伝子発現パターンを維持する腫瘍に関連することを実証する。研究は進行中であるが、これらの研究からのデータは、これらの女性における、トランスフォーメーションおよび腫瘍発生に必要とされる重大な段階および経路への価値ある見識を提供する。これらは、がん生物学における機能獲得型ｍｉＲＮＡ崩壊多型のメカニズムを理解に対する有意義な段階であり、以前に発見されたがんのリスクの遺伝マーカーと比べて機能の点で独特である。
【０２００】
ＫＲＡＳバリアント
本開示は、本明細書中で「ＬＣＳ６  ＳＮＰ」または「ＫＲＡＳバリアント」と称されるＫＲＡＳの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＳＮＰの存在により、がんを発生する個体のリスクおよびがんについての処置に対する個体の応答が予測されるという予期しない発見に一部基づく。このＫＲＡＳバリアントは、ＬＣＳ６に位置し、その野生型およびバリアント配列は、以下に提供される。
【０２０１】
ＫＲＡＳバリアントは、以下の配列のうちの１つまたはそれより多くによって表され得る。例えば、ＫＲＡＳバリアントは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ｒｓ６１７６４３７０および以下の配列によって定義され得る
【０２０２】
【化１−１】
2013212052.tif 000002
（配列番号２２、ここでＳＮＰは、太字にされ、下線が引かれている）。
【０２０３】
ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、およびＮＲＡＳを含む３つのヒトＲＡＳ遺伝子が存在する。各遺伝子は、それらのｍＲＮＡ転写産物の３’ＵＴＲにおいて複数のｍｉＲＮＡ相補部位を含む。具体的には、各ヒトＲＡＳ遺伝子は、複数のｌｅｔ−７相補部位（ＬＣＳ）を含む。ｌｅｔ−７ファミリーのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、それらの標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に結合することによって、肺がん癌遺伝子発現を制御することにおいて重要である包括的な遺伝子調節因子を含む。
【０２０４】
具体的には、用語「ｌｅｔ−７相補部位」は、遺伝子または遺伝子転写産物における、ｌｅｔ−７ファミリーのメンバーのｍｉＲＮＡを結合する任意の領域を表すことを意味する。さらに、この用語は、遺伝子または遺伝子転写産物内の、ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡの配列に相補的である配列を包含する。用語「相補」は、各配列におけるヌクレオチドの大多数は、他の配列内でヌクレオチドの大多数にトランスで結合することが可能である、２つの配列間の結合の閾値を表す。
【０２０５】
ヒトＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲは、それぞれＬＣＳ１〜ＬＣＳ８と名前が付けられた８個のＬＣＳを含む。以下の配列について、チミン（Ｔ）が、ウラシル（Ｕ）の代わりに用いられ得る。ＬＣＳ１は、配列ＧＡＣＡＧＵＧＧＡＡＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧ（配列番号１）を含む。ＬＣＳ２は、配列ＡＵＵＡＧＵＧＵＣＡＵＣＵＵＧＣＣＵＣ（配列番号２）を含む。ＬＣＳ３は、配列ＡＡＵＧＣＣＣＵＡＣＡＵＣＵＵＡＵＵＵＵＣＣＵＣＡ（配列番号３）を含む。ＬＣＳ４は、配列ＧＧＵＵＣＡＡＧＣＧＡＵＵＣＵＣＧＵＧＣＣＵＣＧ（配列番号４）を含む。ＬＣＳ５は、配列ＧＧＣＵＧＧＵＣＣＧＡＡＣＵＣＣＵＧＡＣＣＵＣＡ（配列番号５）を含む。ＬＣＳ６は、配列ＧＡＵＵＣＡＣＣＣＡＣＣＵＵＧＧＣＣＵＣＡ（配列番号６）を含む。ＬＣＳ７は、配列ＧＧＧＵＧＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＡＣＣＵＣＧ（配列番号７）を含む。ＬＣＳ８は、配列ＡＧＵＧＣＵＵＡＵＧＡＧＧＧＧＡＵＡＵＵＵＡＧＧＣＣＵＣ（配列番号８）を含む。
【０２０６】
ヒトＫＲＡＳは、転写産物ａおよびｂによってコードされる２つの野生型形態を有し、それぞれ配列番号９および１０として以下に提供される。ＬＣＳ６  ＳＮＰを含む、各ヒトＫＲＡＳ転写産物の配列は、配列番号１１および１２として以下に提供される。
【０２０７】
ヒトＫＲＡＳの転写産物バリアントａは、以下のｍＲＮＡ配列によってコードされる（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０３３３６０および配列番号９）（非翻訳領域は太字にされ、ＬＣＳ６は下線が引かれている）：
【０２０８】
【化１−２】
2013212052.tif 000003
【０２０９】
【化２】
2013212052.tif 000004
【０２１０】
【化３】
2013212052.tif 000005
ヒトＫＲＡＳの転写産物バリアントｂは、以下のｍＲＮＡ配列によってコードされる（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００４９８５および配列番号１０）（非翻訳領域は太字にされ、ＬＣＳ６は下線が引かれている）：
【０２１１】
【化４】
2013212052.tif 000006
【０２１２】
【化５】
2013212052.tif 000007
ＬＣＳ６  ＳＮＰを含む、ヒトＫＲＡＳの転写産物バリアントａは、以下のｍＲＮＡ配列によってコードされる（配列番号１１）（非翻訳領域は太字にされ、ＬＣＳ６は下線が引かれ、ＳＮＰは大文字にされている）：
【０２１３】
【化６】
2013212052.tif 000008
【０２１４】
【化７】
2013212052.tif 000009
【０２１５】
【化８】
2013212052.tif 000010
ＬＣＳ６  ＳＮＰを含む、ヒトＫＲＡＳの転写産物バリアントｂは、以下のｍＲＮＡ配列によってコードされる（配列番号１２）（非翻訳領域は太字にされ、ＬＣＳ６は下線が引かれ、ＳＮＰは大文字にされている）：
【０２１６】
【化９】
2013212052.tif 000011
【０２１７】
【化１０】
2013212052.tif 000012
【０２１８】
【化１１−１】
2013212052.tif 000013
ＫＲＡＳバリアントは、ＬＣＳ６の配列番号６の４位での、Ｕの代わりにＧを用いる置換の結果である。このＫＲＡＳバリアントは、以下の配列を含む：
【０２１９】
【化１１−２】
2013212052.tif 000014
（強調のためにＳＮＰは太字にされている）（配列番号１３）。
【０２２０】
ＫＲＡＳバリアントは、ＫＲＡＳのｍｉＲＮＡ調節を崩壊させることによって改変されたＫＲＡＳ発現をもたらす。ＫＲＡＳバリアントの同定および特徴付けは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／６５３０２号（ＷＯ  ２００８／１５１００４）（その内容は、その全体が参考として援用される）においてさらに記載される。
【０２２１】
ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡ
ｌｅｔ−７ファミリーｍｉＲＮＡの発現は、ＫＲＡＳバリアントを保有する細胞において増加される。興味深いことに、ｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡは、ＫＲＡＳバリアントが位置するｌｅｔ−７相補部位に結合する。ＫＲＡＳバリアントの存在は、ｌｅｔ−７のＫＲＡＳへの結合に干渉する。干渉することによって、ＫＲＡＳバリアントは、ｌｅｔ−７がＫＲＡＳのＬＣＳ６に対してより強固にかまたはより弱くのいずれかで結合するように誘導する。ＫＲＡＳバリアントを含む細胞は、野生型の細胞と比較して、より低レベルのＫＲＡＳ  ｍＲＮＡ、および増加したレベルのＫＲＡＳタンパク質を有することが発見された。従って、理論によって縛られることを望まないが、細胞内でのＫＲＡＳバリアントの存在は、ＫＲＡＳに結合するｌｅｔ−７の能力に干渉し、タンパク質翻訳を阻害し得、より高いＫＲＡＳタンパク質レベルを可能にする。
【０２２２】
三重陰性乳がんにおけるＫＲＡＳバリアントの存在はまた、著しくより低いレベルのｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡに関連する。例えば、ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ発現は、２倍（２×）、３倍（３×）、４倍（４×）、５倍（５×）、６倍（６×）、７倍（７×）、８倍（８×）、９倍（９×）、１０倍（１０×）、２０倍（２０×）、５０倍（５０×）、１００倍（１００×）、２００倍（２００×）、５００倍（５００×）、１０００倍（１０００×）、またはそれらの間の任意の乗数で低くされる。あるいは、または加えて、三重陰性乳がんを有さない被験体から得られる細胞（すなわち、正常または対照の細胞）におけるｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ発現のレベルと比較した、三重陰性乳がんを有する被験体から得られる細胞におけるｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ発現の減少の統計学的有意差は、０．０５未満のｐ値、好ましくは０．０１未満のｐ値、または最も好ましくは０．００１未満のｐ値によって例示される。三重陰性乳がんを有する被験体から得られる細胞に存在するｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡ発現のレベルはまた、当該分野における公知の標準レベルと比較され得る。さらに、ｌｅｔ−７発現のレベルは、乳がんまたは具体的には三重陰性乳がんを有する被験体内の罹患細胞と非罹患細胞との間で比較され得、ここで、非罹患細胞は、内部対照として役立つ。
【０２２３】
例示的なｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ａ（ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ａ−２、ｌｅｔ−７ａ−３）、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ（ｌｅｔ−７ｆ−１およびｌｅｔ−７ｆ−２）、ｌｅｔ−７ｇ、およびｌｅｔ−７ｉが挙げられるが、これらに限定されない。以下の配列について、チミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）の代わりに用いられ得る。ｌｅｔ−７ａは、配列ＵＵＧＡＵＡＵＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＡＧＵ（配列番号１４）を含む。ｌｅｔ−７ｂは、配列ＵＵＧＧＵＧＵＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＡＧＵ（配列番号１５）を含む。ｌｅｔ−７ｃは、配列ＵＵＧＧＵＡＵＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＡＧＵ（配列番号１６）を含む。ｌｅｔ−７ｄは、配列ＵＧＡＵＡＣＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＡＧＡ（配列番号１７）を含む。ｌｅｔ−７ｅは、配列ＵＡＵＡＵＧＵＵＧＧＡＧＧＡＵＧＧＡＧＵ（配列番号１８）を含む。ｌｅｔ−７ｆは、配列ＵＵＧＡＵＡＵＧＵＵＡＧＡＵＧＡＵＧＧＡＧＵ（配列番号１９）を含む。ｌｅｔ−７ｇは、配列ＧＡＣＡＵＧＵＵＵＧＡＵＧＡＵＧＧＡＧＵ（配列番号２０）を含む。ｌｅｔ−７ｉは、配列ＵＧＵＣＧＵＧＵＵＵＧＵＵＧＡＵＧＧＡＧＵ（配列番号２１）を含む。
【０２２４】
ｌｅｔ−７ファミリーの追加のメンバーの配列は、（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）におけるｍｉＲＢａｓｅから公的に利用可能である。
【０２２５】
治療の方法
ＫＲＡＳバリアント変異の同定は、三重陰性乳がんを発生する増加したリスクを示す。本開示の文脈において、「リスク」は、特定の期間において事象が起こる確率に関連し、被験体の「絶対的」リスクまたは「相対的」リスクを意味し得る。絶対的リスクは、適切な時間コホートについての実見後測定（ａｃｔｕａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｐｏｓｔ−ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）に関して、または適切な期間にわたって追跡された統計学的に有効な歴史的コホートから引き出した指数値に関してのいずれかで測定され得る。相対的なリスクとは、低リスクコホートの絶対的リスクまたは平均人口のリスクのいずれかと比較された被験体の絶対的なリスクの比を指し、それは、臨床的危険因子がどのように評価されるかによって変動し得る。所定の試験結果についての陽性事象の、陰性事象に対する割合であるオッズ比もまた、無転換（ｎｏ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）のために一般的に使用される（オッズは、式ｐ／（１−ｐ）に従い、ここでｐは、事象の確率であり、（１−ｐ）は、無事象の確率である）。
【０２２６】
本開示の文脈において、「リスク評価」または「リスクの評価」は、事象または疾患状態が起こり得る、確率、オッズ、または見込み、１つの疾患状態から別のものへの事象または転換（すなわち、原発性腫瘍から転移性腫瘍もしくは転移性を発生するリスクがあるものへの、または原発性転移性事象のリスクがあるものから二次的転移性事象への、または１つのタイプの原発性腫瘍を発生するリスクがあるものから１つもしくはそれより多くの異なるタイプの原発性腫瘍を発生することへの）の出現率の予測を行うことを包含する。リスク評価はまた、以前に測定された集団に関して、絶対的または相対的期間のいずれかにおいて、将来の臨床的パラメーター、従来の研究所危険因子の値、またはがんの他の指数を予測することを含み得る。
【０２２７】
「増加したリスク」は、ＫＲＡＳバリアントを保有する個体が、ＫＲＡＳバリアントを保有さない個体と比較して増加した、がんを発生するかまたはがんを発生した確率を記載することを意味する。特定の実施形態において、ＫＲＡＳバリアント保有者は、ＫＲＡＳバリアントを保有しない個体よりも、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍、がんを発生しやすいかまたは有しやすい。
【０２２８】
好ましくない予後とは、個体が、特に侵襲性の、ハイリスクな、重篤な、もしくは遺伝によって受け継がれた形態のがん（例えば、三重陰性乳がん）の発生から生き延びる確率、または侵襲性の、ハイリスクな、重篤な、もしくは遺伝によって受け継がれた形態の発生もしくは進行から生き延びる確率が、より良性な形態の発生もしくは進行から生き延びる確率よりも低いことを意味する。
【０２２９】
好ましくない予後はまた、より満足しない回復、より長い回復期間、より侵襲性またはハイリスクな治療レジメ、またはがんもしくはその転移の再発の増加した確率を記載することを意味する。例えば、三重陰性乳がんまたはその転移は、乳がんサブタイプの最も悪い予後に関連しており、被験体についての好ましくない予後をもたらす。
【０２３０】
被験体、患者、および個体という用語は、明細書を通して交換可能に使用される。被験体は、好ましくは哺乳動物である。上記哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。被験体は、男性または女性である。被験体は、がん、がんの特定のタイプ（例えば、乳がん）、またはがんのサブタイプ（例えば、乳がんのサブタイプとしての三重陰性乳がん）を有すると以前に診断されていなくてもよい。上記被験体は、がん、がんの特定のタイプ（例えば、乳がん）、またはがんのサブタイプ（例えば、乳がんのサブタイプとしての三重陰性乳がん）についての１つまたはそれより多くの危険因子を示し得る。あるいは、上記被験体は、がん、がんの特定のタイプ（例えば、乳がん）、またはがんのサブタイプ（例えば、乳がんのサブタイプとしての三重陰性乳がん）についての危険因子を示さない。
【０２３１】
乳がん（三重陰性乳がんが挙げられる）の危険因子としては、ＫＲＡＳバリアントの存在；女性であること、加齢、肥満であること、出産経験がないことまたは母乳育児をしていないこと、より高いホルモンレベル、喫煙、放射線への曝露、乳がんの個人歴、乳がんの家族歴、および特定の乳房変化（例えば、線維嚢胞状態に関連する変化（インサイチュでの異型過形成および小葉癌腫が挙げられるが、これらに限定されない））が挙げられるが、これらに限定されない。三重陰性乳がんの発生に対する例示的な保護対策としては、定期的な運動、環境的誘引因子（例えば、喫煙、飲酒、肥満をもたらす高脂肪食、職業を介した放射線曝露）を避けること、子供を母乳で育てることを選ぶこと、および、最も重篤なリスクにある人について、予防的な左右の乳房切除術が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の被験体は、保護対策によってさらに緩和または変更され得る１つまたはそれより多くの危険因子を示し得る。
【０２３２】
本明細書中に記載される方法は、被験体からサンプルを得ることを提供する。上記サンプルは、核酸を含む任意の組織または体液であり得る。種々の実施形態としては、パラフィン埋包組織、凍結組織、外科用微細針吸引法、および乳房の細胞（管、小葉、または結合組織から採取された細胞が挙げられる）、リンパ節（センチネルリンパ節または腋窩リンパ節が挙げられる）、胸部または腹部の、筋肉または結合組織、臓器（潜在的転移性細胞についての任意の潜在的蓄積部位（例えば、脳、肝臓、腎臓、胃、腸、骨髄、膵臓、結腸、または肺）が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態としては、体液サンプル（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、腹水、漿液、および尿）が挙げられる。
【０２３３】
ＳＮＰ遺伝子型決定方法
ＫＲＡＳバリアントは、ヒトＫＲＡＳ遺伝子の３’ＵＴＲ内に起こる一塩基多型である。連鎖不平衡（ＬＤ）とは、２つまたはそれより多くの異なるＳＮＰ部位における、所定の集団における各対立遺伝子の個別の出現頻度から予期されるよりも大きい頻度での対立遺伝子（例えば、代替のヌクレオチド）の共遺伝を指す。独立して遺伝によって受け継がれた２つの対立遺伝子が一緒に出現すると予測される頻度は、第一の対立遺伝子の頻度に第二の対立遺伝子の頻度を掛けたものである。予測される頻度で一緒に起こる対立遺伝子は、「連鎖不平衡」にあると言われる。対照的に、ＬＤは、染色体に沿って２つの遺伝子座が物理的に近接していることに一般に起因する、２つの異なるＳＮＰ部位での対立遺伝子（複数可）間の任意の非無作為遺伝的関連性を指す。ＬＤは、２つまたはそれより多くのＳＮＰ部位が、所定の染色体上で互いに密接に物理的に近接しているときに起こり得、従って、これらのＳＮＰ部位における対立遺伝子は、複数の世代にわたって分離しないままである傾向があり、その結果、１つのＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（対立遺伝子）は、近くに位置する異なるＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（対立遺伝子）との非無作為関連性を示す。従って、ＳＮＰ部位のうちの１つを遺伝子型決定することは、ＬＤにある他のＳＮＰ部位を遺伝子型決定するのとほとんど同じ情報を与える。
【０２３４】
個体を遺伝障害（例えば、予後またはリスク）についてスクリーニングする目的については、特定のＳＮＰ部位が、障害をスクリーニングするのに有用であると見出されるならば、当業者は、このＳＮＰ部位とともにＬＤにある他のＳＮＰ部位もまた、この状態をスクリーニングするのに有用であることを認識する。２つまたはそれより多くのＳＮＰ間で様々な程度のＬＤに遭遇し得、その結果、いくつかのＳＮＰは他のものよりもより密接に（すなわち、より強いＬＤにおいて）関連する。さらに、ＬＤが染色体に沿って広がる物理的距離は、ゲノムの異なる領域間で異なり、従って、ＬＤが起こるために必要な２つまたはそれより多くのＳＮＰ部位間の物理的分離の程度は、ゲノムの異なる領域間で異なり得る。
【０２３５】
スクリーニングの適用については、実際の疾患を引き起こす（原因となる）多型ではないが、このような原因となる多型とともにＬＤにある多型（例えば、ＳＮＰおよび／またはハプロタイプ）もまた有用である。このような例において、原因となる多型とともにＬＤにある多型（複数可）の遺伝子型は、原因となる多型の遺伝子型のしるしとなり、結果として、原因となるＳＮＰ（複数可）によって影響される表現型（例えば、疾患）のしるしとなる。従って、原因となる多型とＬＤにある多型マーカーはマーカーとして有用であり、実際の原因となる多型（複数可）が未知である場合に特に有用である。
【０２３６】
ヒトゲノムにおける連鎖不平衡は、Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  ｂｌｏｃｋｓ  ａｎｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００３  Ａｕｇｕｓｔ；４（８）：５８７−９７；Ｇａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ａｎｄ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉａｌｌｅｌｉｃ  ｌｏｃｉ」，Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２００３  Ｊａｎｕａｒｙ；２４（１）：５７−６７；  Ａｒｄｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ」，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ａｐｒｉｌ；３（４）：２９９−３０９（ｅｒｒａｔｕｍ  ｉｎ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２  Ｊｕｌｙ；３（７）：５６６）；およびＲｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ」；Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００２  Ｆｅｂｒｕａｒｙ；６（１）：２４−３０に概説される。
【０２３７】
本開示のスクリーニング技術は、試験の被験体が、ＳＮＰまたは検出可能な形質を発生する増加したリスクまたは低減したリスクに関連するＳＮＰパターンを有するかどうか、または特定の多型／変異の結果として、個体が検出可能な形質に苦しんでいるかどうかを決定するために多様な方法論を用いることができ、例えば、ハプロタイピング、家族研究、単一精子ＤＮＡ解析（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、または体細胞の雑種についての個々の染色体の分析を可能にする方法が挙げられる。本開示の診断を用いて分析される形質は、病状および障害において一般的に観察される任意の検出可能な形質であり得る。
【０２３８】
特定のヌクレオチド（すなわち、対立遺伝子）が、１つまたはそれより多くのＳＮＰ位置（例えば、配列番号１１、１２、１３、または２２において開示される核酸分子におけるＳＮＰ位置）のそれぞれに存在することを決定するプロセスは、ＳＮＰ遺伝子型決定と称される。本開示は、ＳＮＰ遺伝子型決定の方法（例えば、多様な障害についてのスクリーニングすること、またはそれに対する素因を決定すること、または処置の形態に対する応答性、または予後を決定することにおいて使用するため、またはゲノムマッピングもしくはＳＮＰ関連分析などにおいて使用するための方法）を提供する。
【０２３９】
核酸サンプルは、どの対立遺伝子（複数可）が、目的の、任意の所定の遺伝領域（例えば、ＳＮＰ位置）に存在するかを決定するために、当該分野において周知の方法によって、遺伝子型決定され得る。隣接する配列は、ＳＮＰ検出試薬（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を設計するために使用され得、必要に応じて、キット形式に実装され得る。例示的なＳＮＰ遺伝子型決定方法は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｐｒｏｔｏｃｏｌ，  ｃｏｓｔ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｊ．２００３；３（２）：７７−９６；Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」，Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００３  Ａｐｒｉｌ；５（２）：４３−６０；Ｓｈｉ，「Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ」，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００２；２（３）：１９７−２０５；およびＫｗｏｋ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００１；２：２３５−５８に記載される。高スループットＳＮＰ遺伝子型決定のための例示的な技術は、Ｍａｒｎｅｌｌｏｓ，「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＳＮＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ」，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ．２００３  Ｍａｙ；６（３）：３１７−２１に記載される。一般的なＳＮＰ遺伝子型決定方法としては、ＴａｑＭａｎアッセイ、分子ビーコンアッセイ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ  ａｓｓａｙ）、核酸アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アレイ化プライマー伸長（ａｒｒａｙｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、均質プライマー伸長アッセイ、質量分析法による検出を伴うプライマー伸長、パイロシークエンシング、遺伝子アレイ上にてソートされる多重プライマー伸長、ローリングサークル増幅法でのライゲーション、均質ライゲーション、ＯＬＡ（米国特許第４，９８８，１６７号）、遺伝子アレイ上にソートされる多重ライゲーション反応、制限酵素断片長多型（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、一塩基伸長タグアッセイ、およびインベーダーアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は、検出メカニズム（例えば、発光または化学発光検出、蛍光検出、時間分解蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー移転、蛍光分極、質量分析法、および電気的検出）と組み合わせて使用され得る。
【０２４０】
多型を検出するための種々の方法としては、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖部位（ｄｕｐｌｅｘ）におけるミスマッチ塩基を検出するために切断薬剤からの保護が使用される方法（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２（１９８５）；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８５：４３９７（１９８８）；およびＳａｌｅｅｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、バリアント核酸分子と野生型核酸分子との電気泳動移動度の比較（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８６：２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；およびＨａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、および変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）を用いて変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける多型または野生型のフラグメントの移動をアッセアイすること（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。特定の場所における配列のバリエーションはまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳＩ保護）または化学的切断方法によって判定され得る。
【０２４１】
好ましい実施形態において、ＳＮＰ遺伝子型決定は、５’ヌクレアーゼアッセイとしても公知であるＴａｑＭａｎアッセイを用いて行われる（米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，５３８，８４８号）。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＰＣＲの間に増幅された特異的産物の蓄積を検出する。ＴａｑＭａｎアッセイは、蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを利用する。レポーター色素は、適切な波長での照射によって励起され、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれるプロセスを介して同じプローブにおいてエネルギーをクエンチャー色素へと移動する。プローブに付着した場合、励起されたレポーター色素は、シグナルを出さない。インタクトなプローブにおいてクエンチャー色素がレポーター色素に近接すると、レポーターに対する減少した蛍光を維持する。レポーター色素およびクエンチャー色素は、それぞれ、５’側の最も末端および３’側の最も末端にあり得、逆もまた同様である。あるいは、クエンチャー色素が内部ヌクレオチドに付着した場合、レポーター色素は、５’側の最も末端または３’側の最も末端にあり得、逆もまた同様である。さらに別の実施形態において、レポーターおよびクエンチャーの両方は、レポーターの蛍光が減少するような互いからの距離で内部ヌクレオチドに付着され得る。
【０２４２】
ＰＣＲの間に、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、プローブを切断し、それによって、レポーター色素とクエンチャー色素とを分離し、レポーターの増加した蛍光をもたらす。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加を監視することによって直接的に検出される。ＤＮＡポリメラーゼは、プローブが、ＰＣＲの間に増幅される標的ＳＮＰ含有鋳型とハイブリッド形成する場合に限り、レポーター色素とクエンチャー色素との間でプローブを切断し、上記プローブは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在する場合に限り、標的ＳＮＰ部位にハイブリッド形成するように設計される。
【０２４３】
好ましいＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブの配列は、本明細書中に提供されるＳＮＰおよび関連する核酸配列情報を用いて容易に決定され得る。多数のコンピュータープログラム（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  Ｃａｌｉｆ．））が最適なプライマー／プローブセットを迅速に得るために使用され得る。本開示のＳＮＰを検出するためにこのようなプライマーおよびプローブが、がんを含む多様な障害についての予後判定のアッセイにおいて有用であること、およびキット形式に容易に組み込まれ得ることは、当業者に明らかである。本開示はまた、当該分野において周知であるＴａｑｍａｎアッセイの改良を含む（例えば、分子ビーコンプローブ（米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号）および他のバリアント形式（米国特許第５，８６６，３３６号および同第６，１１７，６３５号）の使用）。
【０２４４】
多型の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はまた、ミスマッチ検出技術を用いて決定され得、この技術としては、リボプローブ（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：７５７５，１９８５；Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２，１９８５）およびヌクレオチドのミスマッチを認識するタンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質）（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２５：２２９−２５３，１９９１）を用いたＲＮアーゼ保護方法が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、バリアント対立遺伝子は、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５：８７４−８７９，１９８９；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｒ．Ｅｌｌｅｓ，ｅｄ．，ｐｐ．３２１−３４０，１９９６）、または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｉ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２６９９−２７０６，１９９０；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２３２−２３６，１９８９）によって同定され得る。
【０２４５】
ポリメラーゼ媒介プライマー伸長方法はまた、多型（複数可）を同定するために使用され得る。数個のこのような方法は、特許および特定の文献に記載されており、「遺伝子ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」方法（ＷＯ９２／１５７１２）およびリガーゼ／ポリメラーゼ媒介遺伝子ビット解析（米国特許第５，６７９，５２４号）が挙げられる。関連する方法は、ＷＯ９１／０２０８７、ＷＯ９０／０９４５５、ＷＯ９５／１７６７６、米国特許第５，３０２，５０９および同第５，９４５，２８３号に開示される。多型を含む伸長されたプライマーは、米国特許第５，６０５，７９８号に記載されるように質量分析法によって検出され得る。別のプライマー伸長方法は、対立遺伝子特異的ＰＣＲである（Ｒｕａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：８３９２，１９８９；Ｒｕａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，６８７７−６８８２，１９９１；ＷＯ  ９３／２２４５６；Ｔｕｒｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１６３５−１６４１，１９９５）。さらに、複数の多型部位は、Ｗａｌｌａｃｅら（ＷＯ８９／１０４１４）に記載されるように対立遺伝子特異的プライマーのセットを用いて核酸の複数の領域を同時に増幅することによって調べられ得る。
【０２４６】
ＫＲＡＳバリアントを遺伝子型決定するための別の好ましい方法は、ＯＬＡにおける２つのオリゴヌクレオチドプローブの使用である（例えば、米国特許第４，９８８，６１７号を参照のこと）。この方法において、１つのプローブは、その３’側の最も末端がＳＮＰ部位と整列されて、標的核酸のセグメントにハイブリッド形成する。第二のプローブは、標的核酸分子の隣接するセグメントに、第一のプローブに対して直接的に３’にハイブリッド形成する。２つの並列したプローブは、標的核酸分子にハイブリッド形成し、第一のプローブの最も３’側のヌクレオチドとＳＮＰ部位との間に完全な相補性が存在する場合に、連結剤（例えば、リガーゼ）の存在下でライゲーションする。ミスマッチが存在する場合、ライゲーションは起こらない。反応後、ライゲーションしたプローブは、標的核酸分子から分離され、ＳＮＰの存在のインジケーターとして検出される。
【０２４７】
以下の特許、特許出願、および公開国際特許出願（それらは、全てが本明細書中で参考として援用される）は、種々のタイプのＯＬＡを実施するための技術に付属する追加の情報を提供する：米国特許第６，０２７，８８９号、同第６，２６８，１４８号、同第５４９４８１０号、同第５８３０７１１号、および同第６０５４５６４号は、ＳＮＰ検出を行うためのＯＬＡ戦略を記載する；ＷＯ  ９７／３１２５６、およびＷＯ  ００／５６９２７は、ユニバーサルアレイを用いたＳＮＰ検出を行うためのＯＬＡ戦略を記載し、ここでジップコード（ｚｉｐｃｏｄｅ）配列は、ハイブリッド形成プローブのうちの１つに導入され得、結果として得られる産物、または増幅された産物は、ユニバーサルジップコードアレイにハイブリッド形成される；米国出願第ＵＳ０１／１７３２９（およびシリアル番号０９／５８４，９０５）は、ＰＣＲ後のＯＬＡ（またはＬＤＲ）を記載し、ここでジップコードは、ＯＬＡプローブに組み込まれ、増幅されたＰＣＲ産物は、電気泳動またはユニバーサルジップコードアレイの読出しによって決定される；米国出願第６０／４２７，８１８号、同第６０／４４５，６３６号、および同第６０／４４５，４９４号は、ＰＣＲ後のＯＬＡを用いた多重ＳＮＰ検出のためのＳＮＰｌｅｘ方法およびソフトウェアを記載し、ここでジップコードは、ＯＬＡプローブに組み込まれ、増幅されたＰＣＲ産物は、ｚｉｐｃｈｕｔｅ試薬とハイブリッド形成され、ＳＮＰの正体は、ｚｉｐｃｈｕｔｅの電気泳動の読出しから決定される。いくつかの実施形態において、ＯＬＡは、ＰＣＲ（または、核酸増幅の別の方法）の前に実施される。他の実施形態において、ＰＣＲ（または、核酸増幅の別の方法）は、ＯＬＡの前に実施される。
【０２４８】
ＳＮＰ遺伝子型決定のための別の方法は、質量分析法に基づく。質量分析法は、ＤＮＡの４つのヌクレオチドについてのそれぞれの独特な質量を利用する。ＳＮＰは、代替的なＳＮＰ対立遺伝子を有する核酸の質量の差を測定することによる質量分析法によって、明白に遺伝子型決定され得る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−−飛行時間）質量分析法テクノロジーは、分子質量（例えば、ＳＮＰ）の極めて正確な決定により好ましい。ＳＮＰ分析に対する数多くのアプローチは、質量分析法に基づいて開発されてきた。ＳＮＰ遺伝子型決定の好ましい質量分析法ベースの方法としては、他のアプローチ（例えば、従来のゲルベースの形式およびマイクロアレイ）と組み合わせても利用され得るプライマー伸長アッセイが挙げられる。
【０２４９】
代表的に、プライマー伸長アッセイは、標的ＳＮＰ位置から上流（５’）の鋳型ＰＣＲアンプリコンに対するプライマーを設計およびアニールすることを包含する。ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）および／またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物は、鋳型（例えば、（例えば、ＰＣＲによって）代表的に増幅されているＳＮＰ含有核酸分子）、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物に添加される。プライマーの伸長は、混合物中のｄｄＮＴＰのうちの１つに対するヌクレオチドの相補が鋳型において起こる最初の位置で終結する。プライマーは、すぐ隣接する（すなわち、プライマーの３’末端におけるヌクレオチドが標的ＳＮＰ部位の隣のヌクレオチドとハイブリッド形成する）ものか、またはＳＮＰ位置から２つもしくはそれより多くのヌクレオチド離れたものかのいずれかであり得る。プライマーが標的ＳＮＰ位置から数ヌクレオチド離れている場合、唯一の制限は、プライマーの３’末端とＳＮＰ位置との間の鋳型配列が、検出されるべきものと同じタイプのヌクレオチドを含むことができないということであり、そうでなければ、これが伸長プライマーの早発な終結を引き起こす。あるいは、ｄＮＴＰなしで、４つ全てのｄｄＮＴＰだけを反応混合物に添加する場合、プライマーは常に、標的ＳＮＰ位置に対応する１ヌクレオチドのみが伸長される。この例において、プライマーは、ＳＮＰ位置から上流の１ヌクレオチドに結合するように設計される（すなわち、プライマーの３’末端におけるヌクレオチドが、標的ＳＮＰ部位の５’側上の標的ＳＮＰ部位にすぐ隣接するヌクレオチドとハイブリッド形成する）。１ヌクレオチドのみの伸長は、伸長されたプライマーの質量全体を最小限にし、それにより代替的なＳＮＰヌクレオチド間の質量の差の分解を増加させるので、好ましい。さらに、質量タグ（ｍａｓｓ−ｔａｇｇｅｄ）ｄｄＮＴＰは、プライマー伸長反応において非修飾のｄｄＮＴＰの代わりに用いられ得る。これは、これらのｄｄＮＴＰで伸長されるプライマー間での質量の差を増加させ、それにより、増加した感度および正確性を提供し、異型接合の塩基位置を型に分類するのに特に有用である。質量タグはまた、集中的なサンプル調製手順の必要性を軽減し、質量分析計の必要な分解力を低減させる。
【０２５０】
伸長されたプライマーは、次にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって精製および分析されて、標的ＳＮＰ位置に存在するヌクレオチドの正体が決定され得る。分析の１つの方法において、プライマー伸長反応からの産物は、マトリックスを形成する光吸収結晶と組み合わせられる。上記マトリックスは、次にエネルギー源（例えば、レーザー）が当てられて、核酸分子を気相へとイオン化および脱離する。イオン化された分子は、次に、フライトチューブへと噴出され、検出器へと向かって上記チューブを下って加速される。イオン化事象（例えば、レーザーパルス）と、検出器と分子との衝突との間の時間がその分子の飛行時間である。飛行時間は、イオン化分子の質量電荷比（ｍ／ｚ）に正確に関連する。より小さいｍ／ｚを有するイオンは、より大きいｍ／ｚを有するイオンよりも早くチューブを下って進み、従って、より軽いイオンは、より重いイオンの前に検出器に到着する。飛行時間は次に、対応する、より正確なｍ／ｚへと変換される。この様式でＳＮＰは、単一の塩基位置において異なるヌクレオチドを有する核酸分子に固有の、質量のわずかな差、および対応する飛行時間の差に基づいて同定され得る。ＳＮＰ遺伝子型決定に関するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法と関連したプライマー伸長アッセイの使用に関するさらなる情報については、例えば、Ｗｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３；１７（１１）：１１９５−２０２を参照のこと。
【０２５１】
以下の参考文献は、ＳＮＰ遺伝子型決定のための質量分析法ベースの方法を記載するさらなる情報を提供する：Ｂｏｃｋｅｒ，「ＳＮＰ  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００３  Ｊｕｌｙ；１９  Ｓｕｐｐｌ  １：１４４−１５３；Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３；２１２：２４１−６２；Ｊｕｒｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ」，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；  ７７：５７−７４；およびＪｕｒｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ＭａｓｓＡｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２００２；１８７：１７９−９２。
【０２５２】
ＳＮＰはまた、直接的なＤＮＡシーケンシングによってスコア付けされ得る。多様な自動シーケンシング手順が利用され得（（１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）、質量分析法によるシーケンシングが挙げられる（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；およびＧｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９（１９９３）を参照のこと）。本開示の核酸配列は、当業者が、このような自動シーケンシング手順のためのシーケンシングプライマーを容易に設計することを可能にする。商業的機器（例えば、ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７、３１００、３７００、３７３０、および３７３０．ｔｉｍｅｓ．１  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））は、自動シーケンシングに関して当該分野において一般的に使用される。
【０２５３】
ＫＲＡＳバリアントを遺伝子型決定するために使用され得る他の方法としては、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）および変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）が挙げられる（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５（１９８５））。ＳＳＣＰは、Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．に記載されるように、一本鎖のＰＣＲ産物の電気泳動移動度の変化によって塩基の違いを同定する。一本鎖のＰＣＲ産物は、二本鎖のＰＣＲ産物を加熱するかまたはそうでなければ変性することによって生成され得る。一本鎖の核酸は、再び折りたたまれるか、または塩基配列に部分的に依存する二次構造を形成し得る。一本鎖増幅産物の異なる電気泳動の移動度は、ＳＮＰ位置における塩基配列の違いに関連する。ＤＧＧＥは、多型ＤＮＡに固有の異なる配列依存安定性および溶解特性、および変性剤濃度勾配ゲルにおける電気泳動の移動パターンにおける対応する差に基づいてＳＮＰ対立遺伝子を識別する（Ｅｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７）。
【０２５４】
配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）はまた、リボザイム切断部位の発生または損失に基づいてＳＮＰをスコア付けするために使用され得る。完全にマッチする配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイによって、または融点の差によってミスマッチ配列と区別され得る。ＳＮＰが制限酵素切断部位に影響を及ぼす場合、ＳＮＰは、制限酵素消化パターンの変更、およびゲル電気泳動によって決定される核酸フラグメント長における対応する変化によって同定され得る。
【０２５５】
ＳＮＰ遺伝子型決定は、例えば、ヒト被験体から生物学的サンプル（例えば、組織、細胞、体液、分泌物などのサンプル）を収集する工程、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または両方）を単離する工程、上記核酸を、標的核酸領域のハイブリッド形成および増幅が起こるような条件下で、標的ＳＮＰを含む、単離された核酸の領域に特異的にハイブリッド形成する１つもしくはそれより多くのプライマーと接触させる工程、および目的のＳＮＰ位置に存在するヌクレオチドを決定する工程、またはいくつかのアッセイにおいて、増幅産物の存在もしくは不存在を検出する工程（アッセイは、ハイブリッド形成および／もしくは増幅が、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在もしくは不存在である場合にのみ起こるように設計され得る）を含み得る。いくつかのアッセイにおいて、増幅産物のサイズが検出され、対照サンプルの長さと比較される；例えば、正常な遺伝子型と比較しての、欠失および挿入が増幅された産物のサイズの変化によって検出され得る。
【実施例】
【０２５６】
実施例１：三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）におけるＫＲＡＳバリアント
研究集団
この症例対照研究および遺伝子分析において、データを４つのコホートから評価した（表１）。ＫＲＡＳバリアント遺伝子型の度数分布を評価するために、エール（Ｙａｌｅ）乳がん研究からの個体（研究群１）を判定した。エール乳がん研究からの個体（研究群１）を、エールインスティテューションレビューボード（ｔｈｅ  Ｙａｌｅ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ）（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：５９７０−７７）によって承認された、米国コネチカットにおける乳がん症例対照研究に登録した。手短に言えば、患者は、３０歳〜８０歳であり、付随して（ｉｎｃｉｄｅｎｔ）組織学的に確認された乳がんを有し、がん歴（非黒色腫皮膚がん以外）がなかった。ＥＲ状態およびＰＲ状態を全ての症例について確立したが、ＨＥＲ２状態は知られておらず、入手可能でなかった。対照をエールニューヘイブン病院（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）か、またはアメリカ合衆国コネチカット州のトーランドカウンティのいずれかから召集した。エールニューヘイブン病院からの対照は、組織学的に確認された良性の乳房疾患に対して乳房関連手術を受けた。トーランドカウンティからの対照を、無作為番号ダイアル（ｒａｎｄｏｍ−ｄｉｇｉｔ  ｄｉａｌｉｎｇ）（６５歳未満の個体について）を介してか、またはヘルスケアファイナンス管理ファイル（ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｆｉｎａｎｃｅ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｆｉｌｅ）（＝６５歳）を通して同定した。インフォームドコンセントおよびがんの家族歴についてのデータ、妊娠歴（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ）、人口統計学的要因、および血液サンプルを全ての参加者から得た。４１５人の症例および４５７人の対照は、この研究に利用可能なＤＮＡサンプルを有し、これらは１９９０年と１９９９年との間に得られた。
【０２５７】
【表１】
2013212052.tif 000015
ＫＲＡＳバリアントと受容体状態および乳がんサブタイプとの関連性を定義するために、完全な受容体状態およびサブタイプ分類を有する、乳がんと診断された６９０人のアイルランド人女性のコホートを評価した。このコホート（研究群２）からの患者は、組織学的に確認された乳がんを有し、ゴールウェイ大学病院（Ｇａｌｗａｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（Ｇａｌｗａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ）倫理学委員会からの適切な倫理的な承認後にアイルランド西部から召集した。インフォームドコンセントおよび乳がんまたは卵巣がんの詳細な家族歴、および血液サンプルを全ての症例から得た。侵襲前の癌腫は別とした、全ての病期および組織学的タイプの乳がんの７１０人の症例。ＥＲ、ＰＲ、およびＨＥＲ２状態を、標準組織病理学分析および免疫組織化学の使用によって、全てのサンプルについて確立し、ＨＥＲ２の陽性度について蛍光インサイチュハイブリッド形成によって確認した。これらのサンプルを、受容体状態によって管腔型Ａ、管腔型Ｂ、ＨＥＲ２、または三重陰性乳がんと分類した（表２）。７１０人の患者のうちの６９０人は完全な情報を有し、彼らをこの研究において評価した。このコホートにおける３６０人の対照は、何らかのがんが自己報告された個人歴がなく、乳がんまたは卵巣がんのいずれの家族歴もない、同じ地理上の地域からの健常な女性であり、主に６０歳よりも高齢であった。症例および対照を、主に、２００６年７月〜２０１０年７月に召集した。
【０２５８】
【表２】
2013212052.tif 000016
ＫＲＡＳバリアントが三重陰性乳がんの発生の増加したリスクを予測したかどうかを確立するために、三重陰性乳がんを有する患者のコホートおよびエールからの対照（研究群３）、三重陰性乳がんを有する患者および研究群２からの対照、ならびに研究群１からの対照のプールされた分析を行った。研究群３における患者は、エールニューヘイブン病院またはブリッジポート病院（Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ，  ＣＴ，  ＵＳＡ）のいずれかにおいて処置を受けていた。エールヒューマンインベスティゲーション委員会（ｔｈｅ  Ｙａｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）による承認後、組織または唾液の標本を１５６人の患者から得た。完全なデータは、１９９０年〜２００７年に診断された１４０人の患者に関して利用可能であり、この研究に含まれた。三重陰性乳がんの１３０人の症例は、遺伝子およびｍｉＲＮＡ発現解析についての任意の処置の前に利用可能である腫瘍のサンプルを有し、そのうち７８人をまた、ＫＲＡＳバリアントについても遺伝子型決定した。このコホートにおける１１３人の対照は、エールニューヘイブン病院に示された健常な女性であり、非黒色腫皮膚がんを別としたがんの個人歴を有さず、２０００年と２００７年との間に召集された。全ての症例および対照についての医学的情報、年齢、民族起源、および家族歴を得た。表３は、これら３つのコホートについての基礎情報を要約する。
【０２５９】
【表３】
2013212052.tif 000017
ＫＲＡＳバリアントとＥＲ陰性腫瘍におけるＢＲＣＡ変異との関連性を評価するために、ロッテルダム集団の本発明者らの以前の研究からの乳がんおよび公知のＫＲＡＳバリアント状態を有するＢＲＣＡ１変異保有者を分析した。上記ロッテルダム集団は、記載されている（Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１０；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｌｙ  ３０．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１０５４９−０１０−１０８０−ｚ）が、手短に言えば、この集団は、ロッテルダムファミリークリニック（Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｃｌｉｎｉｃ）（Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を介してエラスムス大学（Ｅｒａｓｍｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）において調査者によって同定された、乳がんおよび記録されたＢＲＣＡ１変異を有するオランダ人の患者を含んでいた。
【０２６０】
手順
ＫＲＡＳ−バリアント遺伝子型決定アッセイ：カスタムＴａｑｍａｎ  ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイを用いて、全てのサンプルからのＤＮＡをＫＲＡＳバリアントについて遺伝子型決定した。バリアントＧ対立遺伝子について異型接合または同型接合のサンプルをＫＲＡＳ−バリアントについて陽性であると考えた（Ｃｈｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：８５３５−４０）。
【０２６１】
遺伝子発現解析：ＫＲＡＳバリアントについても試験されたエール三重陰性コホートからの７８人の患者においてゲノム全体のｍＲＮＡ発現を測定した。総ＲＮＡを、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ総核酸単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて組織標本から単離し、全ゲノムＤＡＳＬアッセイ（ＨｕｍａｎＲｅｆ−８  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対してハイブリッド形成した。データ処理および統計解析を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ／Ｒソフトウェアにおけるｌｕｍｉパッケージを用いて行った。３回の全ゲノムＤＡＳＬ実行からの遺伝子発現データを、一緒に組み合わせて処理した。３０％未満の検出可能なプローブ、およびサンプルの１０％未満において検出可能であるプローブを有するサンプルを、分位数標準化（ｑｕａｎｔｉｌｅ−ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）の前に捨てた。７４サンプルおよび１８３４５プローブが、フィルタリング後に残った。
【０２６２】
マイクロＲＮＡ分析：マイクロＲＮＡアレイを、製造者のプロトコル（ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ−ｐｃｒ／ｍｉｒｎａ−ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ｈｔｍｌにおいて公的に利用可能である、ｍｉＲＮＡプロファイリング（２００８年１月１日にアクセスした）に従ってＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＴおよびＴａｑＭａｎ低密度アレイヒトｍｉＲＮＡパネルリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。目的のｍｉＲＮＡの発現レベルを調べた。
【０２６３】
統計解析
ハーディ−ヴァインベルク平衡について、全ての症例および対照の遺伝子型分布を検定し、平衡であることを見出した。無条件ロジスティック回帰を行って各遺伝子型に関連する相対的リスクを見積もった。対照を年齢（連続）および民族起源（白人、黒人、ヒスパニック、または他）について調整した。集団を、閉経期状態によって階層化（５１歳以下、または５１歳超によって見積もった）し、対照について０、ＥＲ陽性および／またはＰＲ陽性腫瘍を有する症例について１、およびＥＲ／ＰＲ陰性腫瘍について２でコード化された３つのレベルの転帰変動要因での多項式ロジスティック回帰でのＥＲおよびＰＲ状態によって個別のリスクの見積もりを得た。ＥＲ／ＰＲ陰性疾患と比較して、ＥＲ陽性および／またはＰＲ陽性疾患の症例における各遺伝子型について得られたパラメーター見積もりを比較して、相互作用についてＷａｌｄカイ二乗検定を行った。
【０２６４】
研究群２における患者を乳がんのサブタイプに従って階層化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアを用いてカイ二乗検定を行って、ｐ値、オッズ比（Ｏｒ）および９５％信頼区間（ＣＩ）を計算した。ＫＲＡＳバリアントの低頻度に起因して、全ての遺伝的関連分析について優性モデルを使用した。
【０２６５】
カテゴリーの変動要因（例えば、民族起源、病期、および研究部位）をカイ二乗検定または両側フィッシャーの正確検定を用いて、そして連続変動要因（例えば、年齢）をｔ検定を用いて研究群間で比較した。ＯＲおよび９５％  ＣＩを、バイナリー帰結変動要因での無条件ロジスティック回帰モデルで三重陰性乳がんの対照および症例におけるＫＲＡＳバリアントについて計算した。対照および症例としてコード化されるバイナリー帰結変動要因での多変量ロジスティック回帰分析は、変動要因（ＫＲＡＳ−バリアント状態、年齢、民族起源、および研究部位）を含んでいた。集団をまた、年齢群によって階層化し、５１歳もしくはそれより若い患者（閉経期前の群）または５１歳以上（閉経後の群）について個別のロジスティック回帰分析を行った。統計解析をＳＡＳバージョン９．１．３で行った。
【０２６６】
発現セットの主成分分析に由来する、以前に公開された発現シグネチャーおよび軸に対応するように、経路活性化を測定した。生物学的産物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を遺伝子発現データセットにおける技術的な情報源から分離するために主成分分析を使用した。各構成成分を、ＲＮＡの質、バッチ作用の構造、および分布しているプローブの生物学的注釈付け（すなわち、指定した構成成分についての高い絶対投影値（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）を有する発現プロフィールを有するプローブ）に対する対応によって特徴付けた。遺伝子発現のシグネチャーを、遺伝子および特定の条件下におけるそれらの発現変化のリストとして提供する。このようなシグネチャーは、代表的にほぼ１００程度の複数のプローブの調和した識別的発現を必要とするので、ノイズ入りデータ（ｎｏｉｓｙ  ｄａｔａ）について特に価値がある。ｍＲＮＡを、２０年までの古さであるホルマリン固定のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）塊から抽出したので、シグネチャーアプローチでのデータセットの分析をジャスティファイ（ｊｕｓｔｉｆｙ）した（Ｋｉｂｒｉｙａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１０；１１：６２２）。Ｓシグネチャースコアを、遺伝子寄与（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）のそれぞれのシグネチャーベクターとこれらの遺伝子についてのサンプルの発現プロフィールとの間で計算した。ＫＲＡＳバリアントと、それぞれのシグネチャーによって記載された転帰との関連性を、ＫＲＡＳバリアントのシグネチャースコアと野生型サンプルとの間で対応のあるコルモゴロフ−スミルノフ検定によって分析した。識別的遺伝子発現を、オフセットとして技術的バッチアーティファクトを考慮して線形モデルで評価した。変化倍率のモデル当てはめおよび経験的なＢａｙｅｓｉａｎ誤差モデレーション（ｍｏｄｅｒａｔｉｏｎ）を、ＲについてのＬＩＭＭＡパッケージを用いて行った（Ｓｍｙｔｈ  ＧＫ．Ｌｉｍｍａ：ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ．Ｉｎ：Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００５：３９７−４２０）。
【０２６７】
ｍｉＲＮＡ発現を、それぞれ４６個のｍｉＲＮＡおよび２つの内部対照の８バッチにおいて分析した。マイクロＲＮＡ発現を、全ての発現したサンプルにまたがる幾何平均を用いて標準化した：ｍｉＲＮＡを、３５サイクル未満（ｃｔ＜３５）の後に閾値蛍光が検出される場合に発現していたと判断し、全ての発現したｍｉＲＮＡの幾何平均サイクル数を減算した。全てのサンプルの３分の２超において発現されなかったｍｉＲＮＡを除去し、その後、全ての残りの閾値サイクル（Ｃｔ）値にわたってスケールを標準化した。
【０２６８】
ＫＲＡＳバリアント遺伝子型の度数分布は、研究群１（表１および表４）からの遺伝子決定された症例と対照との間で異ならなかった。しかし、ＫＲＡＳバリアントは、ＥＲ／ＰＲ陰性腫瘍を有する閉経期前患者における乳がんと著しく関連があった（表４）。閉経後の女性について、この関連性は観察されなかった。２０１人の対照のうち２７人（１３％）ならびにＥＲおよび／またはＰＲについて陽性であるがんを有する４４人の閉経期前の女性のうち４人（９％）がＫＲＡＳバリアントを有したのと比較して、ＥＲ／ＰＲ陰性がんを有する２４人の閉経期前の女性のうち８人（３３％）がＫＲＡＳバリアントを有した（図５）。従って、ＫＲＡＳバリアントは、閉経期前の女性についての受容体陰性乳がんの発生の増加したリスクの遺伝子マーカーであり得た。
【０２６９】
【表４】
2013212052.tif 000018
研究群２において、４７８人の女性が管腔型Ａ乳がんを有し、８７人が管腔型Ｂ乳がんを有し、９０人が三重陰性乳がんを有し、３５人がＨＥＲ２陽性乳がんを有した。このコホートからの６９０人の乳がん症例のうち９８人の症例（１４％）がＫＲＡＳバリアントを有したが、乳がんのサブタイプ間で保有率は変動した：管腔型Ａについて４７８人の症例のうち６４人の症例（１３％）、管腔型Ｂについて８７人の症例のうち１３人の症例（１５％）およびＨＥＲ２陽性サブグループについて３５人の症例のうち２人の症例（６％）であるのと比較して、三重陰性乳がんを有する女性においてＫＲＡＳバリアントは統計学的に有意に富化された（９０人の症例のうち１９人［２１％］）（ｐ＝０．０４４；図１）。三重陰性乳がんとのこの関連性もまた、５１歳よりも若い女性において着目された（ｐ＝０．０３３、図１）。
【０２７０】
群２および３ならびに全３コホート（ｎ＝１１６０）にわたる対照からの三重陰性乳がんの症例の比較によって、ＫＲＡＳバリアントの保有率について症例間または対照間に統計学的有意差が見出された（表５）。研究群１および３からの対照において、研究群２においてよりも多くの非白人女性が存在し、多変量解析において、非白人女性におけるＫＲＡＳバリアントと三重陰性乳がんとの関連性の評価を可能にした。年齢、民族起源、および研究部位について制御した後、ＫＲＡＳバリアントは、多変量解析において、全ての女性について、三重陰性乳がんの発生の増加したリスクを予測しなかった（表６および表７）。しかし、ＫＲＡＳバリアントは、多変量解析において、このプールされた群において３６１人の閉経期前の女性における三重陰性乳がんの発生の統計学的有意差な増加したリスクに関連した（表６、表８、および表９）。
【０２７１】
【表５】
2013212052.tif 000019
【０２７２】
【表６】
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【０２７３】
【表７】
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【０２７４】
【表８】
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【０２７５】
【表９】
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ＢＲＣＡ１コード配列変異は、三重陰性乳がんのリスクに関連し、ＫＲＡＳバリアントは、乳がんを有するＢＲＣＡ１変異保有者において富化される（Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１０；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｌｙ  ３０．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１０５４９−０１０−１０８０−ｚ）ので、ＫＲＡＳバリアントと閉経期前三重陰性乳がんとの関連性が、ＢＲＣＡ１変異の保有者との関連性のみに起因するかどうかを決定した。ＢＲＣＡ試験された、コホート２および３からの三重陰性乳がんを有する３６人の女性のうち、２５人（６９％）は、ＢＲＣＡ陰性であり、１１人（３１％）は、ＢＲＣＡ陽性であった。これらの患者のうち、ＢＲＣＡ陽性である女性では３人（２７％）がＫＲＡＳバリアントを有したのと比較して、８人（３２％）のＢＲＣＡ陰性の女性がＫＲＡＳバリアントを有した。これらの知見は、ＫＲＡＳバリアントが、ＢＲＣＡ変異がなく、三重陰性乳がんを有する患者の独立した群に関連することを示唆する。
【０２７６】
ロッテルダム集団コホートにおいて、ＫＲＡＳバリアント状態とＥＲまたはＰＲ陰性状態との間での関連性が発見された（Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１０；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｌｙ  ３０．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１０５４９−０１０−１０８０−ｚ；Ｋｉｂｒｉｙａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１０；１１：６２２）が、この研究において、閉経後状態は考慮されていなかった。本明細書中に記載される研究の結果に関して、ロッテルダムコホートからの２６８人のＢＲＣＡ１変異保有者と比較して、ＥＲ／ＰＲ陰性乳がんを有する１２６人のＢＲＣＡ１変異保有者において、ＫＲＡＳバリアントの富化は観察されなかった（２１．８％対２３．５％、ｐ＝０．９５）。従って、ＫＲＡＳバリアントと閉経期前三重陰性乳がんとの関連性は、ＢＲＣＡ１変異との関連性から独立している。
【０２７７】
三重陰性乳がんにおけるＫＲＡＳバリアントと改変されたＢＲＣＡ１発現との間の潜在的な生物学的相互作用をさらに評価するために、研究群３からの７４個の三重陰性腫瘍において、ＢＲＣＡ１発現レベルを決定した（表１）。ＫＲＡＳバリアントを有するそれらの患者は、ＫＲＡＳバリアント陰性三重陰性腫瘍と比較して、ＢＲＣＡ１発現の統計学的に有意な減少を実証した（プローブ１［ＩＬＭＮ＿２３１１０８９］について、ｐ＝０．０６、およびプローブ２［ＩＬＭＮ＿１７３８０２７］についてｐ＝０．０１、図２）。さらに、ＫＲＡＳバリアントは、低減されたＢＲＣＡ１活性の遺伝子発現シグネチャーとの統計学的に有意な関連性を実証した（ｐ＝０．０４）（ｖａｎ‘ｔ  Ｖｅｅｒ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００２；４１５：５３０−３６）。本明細書中に提供されるデータは、ＫＲＡＳバリアントが、公知のＢＲＣＡ１変異を有する三重陰性乳がんを有する患者に限られていないが、ＫＲＡＳバリアント、改変されたＢＲＣＡ１発現または機能性、および三重陰性乳がんの発生との間に生物学的相互作用が存在し得ることを示す。
【０２７８】
ＫＲＡＳバリアント陽性である三重陰性乳がん腫瘍におけるシグナル伝達経路を、研究群３における患者からのＫＲＡＳバリアント陰性であるものと比較した。ＫＲＡＳ  ｍＲＮＡの分析はＫＲＡＳバリアント状態によって変動しなかったが、ＫＲＡＳの３’ＵＴＲに結合するｍｉＲＮＡの作用に関して、このデータは、他の刊行物と一貫している（Ｃｈｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：８５３５−４０；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００５；１２０：６３５−４７）。ＫＲＡＳバリアントを有する腫瘍において、ＮＲＡＳ変異（Ｃｒｏｏｎｑｕｉｓｔ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０２  ２５８１−９２）およびＭＡＰキナーゼ活性化シグネチャー（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  ＣＪ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；６６：３９０３−１１）（表１０）の両方の増加が見出された。このデータは、ＫＲＡＳバリアントが、カノニカルＲＡＳ経路の遺伝子発現を改変することを示す。さらに、このデータは、ＫＲＡＳバリアントが、それが関連する腫瘍において、引き続いての、改変された下流遺伝子発現をもたらすという初めてのインビボでの証拠を提供する。
【０２７９】
【表１０】
2013212052.tif 000024
ｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡの濃度は、ＫＲＡＳバリアントを有する肺の腫瘍において改変されるので、ＫＲＡＳバリアントを有する三重陰性乳がん腫瘍におけるｌｅｔ−７の濃度を調べた。このデータにより、ＫＲＡＳバリアント関連腫瘍における全てｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡファミリーメンバーのより低い濃度が実証された（図３）。
【０２８０】
どのようにＫＲＡＳバリアントが三重陰性乳がんの公知の遺伝子発現シグネチャーと統合するかを確立するために、このような腫瘍において識別的発現をする公知のシグネチャーを評価した。ＫＲＡＳバリアント腫瘍は、三重陰性および基底型腫瘍生物学の数個の特徴を有し、この特徴としては、発現セットに由来する主要な構成成分における低減したエストロゲンシグナル伝達が挙げられる（ｐ＝０．０４）。さらに、ＫＲＡＳバリアント腫瘍は、管腔型前駆細胞シグネチャーを有し（ｐ＝０．０４）、それは基底型様乳がんについての候補前駆細胞である（Ｌｉｍ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００９；１５：９０７−１３）（表１０および図６）。管腔型前駆細胞およびＢＲＣＡ変異様シグネチャー内で、細胞接着、組織侵入、増殖、および血管新生のマーカー（例えば、α５インテグリン、ＤＵＳＰ６、およびオーロラキナーゼＢ）は、識別的に調節をした（表１１）。この発見は、データセットについてＫＲＡＳバリアントを非バリアントに対して比較した線形モデルにおける識別的発現の遺伝子に基づいて、創傷治療について４１遺伝子のうち３つ（ｐ＝０．０２）、グリカン発現について１５１遺伝子のうち３つ（ｐ＝０．０５）、およびＭＥＫ活性化について１４８遺伝子のうち４つ（ｐ＝０．００９）において観察された機能的注釈付けによるわずかな富化と合う（図４、表１２および表１３）。
【０２８１】
【表１１】
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【０２８２】
【表１２】
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【０２８３】
【表１３】
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実施例２：種々のがん細胞系におけるＫＲＡＳバリアントの保有率
材料および方法
遺伝子型決定：ＮＣＩ−６０細胞系パネルからのＤＮＡを、ＮＣＩのＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍから得た。Ｔａｑｍａｎ遺伝子型決定を行って、以前に記載される（Ｂｕｓｓｅｙ  ＫＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００６；５：８５３−６７）ようにＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の存在を決定した。細胞を、凍結ストックから最大２０継代にわたって標準条件下で培養した（ｄｔｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｂｒａｎｃｈｅｓ／ｂｔｂ／ｉｖｃｌｓｐ．ｈｔｍｌ；Ｍｏｎｋｓ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９９１；８３：７５７−６６を参照のこと）。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液マキシキット手順（ｃａｔ．５１１９２）を用いてＤＮＡを単離した。
【０２８４】
統計解析：ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子データを数字でコード化した。１はＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の存在を表し、０はＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の不存在を表す。このパターンを、ＣＯＭＰＡＲＥ分析（Ｐａｕｌｌ  ＫＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９８９；８１：１０８８−９２４８）において、「種」として使用して、ＮＣＩ−ＤＴＰデータベースにおける、存在しているＮＣＩ−６０データセットにプローブした。相関は、例えば、ｍｉＲＮＡ測定およびＤＮＡメチル化測定を含んだ。正の相関は、例えば、バリアント対立遺伝子を有する細胞系が、ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡのより高い発現、またはより大きい百分率のＤＮＡメチル化を有する傾向があることを示す。逆に負の相関は、バリアント対立遺伝子を有する細胞系が、所定のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡのより低い発現、または示された遺伝子において、より低い百分率のＤＮＡメチル化を有する傾向があることを示す。これらのデータセットは、ｄｔｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ．において問い合わせまたはダウンロードされ得る。
【０２８５】
ＫＲＡＳバリアントの存在は、リスクの予測および腫瘍生物学、ならびに複数のがんにおける処置に対する応答についての遺伝マーカーである。ＫＲＡＳバリアントの存在は、ＫＲＡＳ  ３’ＵＴＲによる改変された調節をもたらす。この研究により、がん細胞におけるＫＲＡＳバリアントの生物学的重要性が解明される。本明細書中に提供されるデータにより、ＫＲＡＳバリアントの存在によって影響される例示的な分子経路が解明される。広い範囲のがんのタイプを同時に分析するために、がん細胞系（Ｂｌｏｗｅｒ  ＰＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００７；６：１４８３−９１；Ｌｉｕ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２０１０；９：１０８０−９１）の広範囲ＮＣＩ−６０パネルを使用した。種々の分子パラメーターを研究して、これらのがん細胞系においてどの分子事象がＫＲＡＳバリアントの存在に相関するかを決定した（Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｊａｎ  １５．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １１：２，３６１−３６６）。
【０２８６】
ＮＣＩ−６０パネルにおける６０細胞系のうちの７つは、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を含む（表１４）。細胞系のＮＣＩ−６０パネルが、ＫＲＡＳコード領域における獲得優性変異（ＫＲＡＳ変異）の存在、またはＫＲＡＳバリアントの存在のいずれかに基づいてカテゴリー化される場合、ＫＲＡＳバリアントを含んだ７つの細胞系全てがＫＲＡＳ活性化変異の存在について陰性であることを決定した。同様に、ＫＲＡＳコード配列変異を保有する細胞系は、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を欠いていた。従って、ＫＲＡＳコード変異またはＫＲＡＳバリアント対立遺伝子のいずれかの存在または出現は、これらの細胞系において互いに相容れない。さらに、この互いに相容れないことが、多様ながんのタイプに由来する細胞系において起こるので、この互いに相容れないことは、特定の組織のタイプに対して特異的ではない。むしろ、この互いに相容れないことは、起源に関わらず、これらのがん細胞系の一般的な特徴である。これらの結果は、これら２つの事象のいずれか単独の出現（すなわち、ＫＲＡＳバリアントの出現またはＫＲＡＳコード変異の出現）が、これらのがんのタイプにおいて、腫瘍形成に影響するのに十分であることを示す。これらの結果はまた、カノニカルコード配列変異によって引き起こされるＫＲＡＳ活性化のレベルが、３’ＵＴＲにおけるＫＲＡＳバリアントの存在によって誘導される増大したＫＲＡＳ発現に対して機能的に同等であることを示す。獲得ＫＲＡＳコード変異およびＫＲＡＳバリアントについての、この互いに相容れないことをまた、非小細胞肺がん患者において（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００８；６８：８５３５−４０）および卵巣がん患者において（Ｒａｔｎｅｒ  Ｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：６５０９−１５）見出されたが、結腸がん患者においては見出さなかった（Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２：４８４−５；Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２：１０４−９）。
【０２８７】
【表１４】
2013212052.tif 000028
ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を有する細胞系が、ｍｉＲＮＡの発現において保存された改変を示すかどうかを決定するために、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を含む７つの細胞系から生成されたｍｉＲＮＡ発現プロフィールにおいて、ＮＣＩ−６０パネルの残りの細胞系のｍｉＲＮＡ発現プロフィールと比較して統計解析を行った（Ｂｌｏｗｅｒ  ＰＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００７；  ６：１４８３−９１；  Ｇａｕｒ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；  ６７：２４５６−６８）。ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の存在は、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２７、およびｍｉＲ−２１０の増加した発現と統計学的に有意な正の相関を示す（表１５）。ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７は、同じクラスター、ならびに血管新生および転移の事前の進行から発現した（Ｚｈｏｕ  Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１１；  １０８：８２８７−９２）。例えば、ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７は、内皮細胞および高く血管形成された組織において富化された。さらに、ｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７は、抗血管新生機能を有する、Ｓｐｒｏｕｔｙ２およびＳｅｍａ６Ａの発現を減少させることによって、血管新生に不可欠であるシグナル伝達経路を増大させた。ｍｉＲ−２３またはｍｉＲ−２７のいずれかの機能をブロックすることは、インビトロでのＶＥＧＦに応答した毛管形成および移動の低減、ならびにインビボでの生後の網膜の減少した血管形成をもたらす（Ｚｈｏｕ  Ｑ，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１１；１０８：８２８７−９２）。ＫＲＡＳバリアントと、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２７の増加した発現との統計学的に有意な正の相関は、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を有する腫瘍細胞が、増大したレベルのｍｉＲ−２３およびｍｉＲ−２７の結果として、成長および転移性進行の傾向があることを示唆する。
【０２８８】
【表１５】
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ｍｉＲ−２１０の発現は、細胞におけるＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の存在と統計学的に有意に相関する。ｍｉＲ−２１０は、慢性低酸素症のマーカーである。さらに、ｍｉＲ−２１０は、乳房および黒色腫の腫瘍の増殖および転移、ならびに好ましくない予後に関連する。ｍｉＲ−２１０は、ＨＩＦタンパク質の直接的な転写標的である。ｍｉＲ−２１０の増大したレベルは、低酸素条件下での腫瘍細胞の生存に必要とされる。ｍｉＲ−２１０は、低酸素下での細胞周期停止に必要とされるＭＹＣのアンタゴニストである、ＭＮＴの発現を直接的に調節する。結果として、ｍｉＲ−２１０の増加したレベルは、腫瘍細胞における低酸素ストレス条件下での細胞周期停止のオーバーライドの一因となる。増加したｍｉＲ−２１０発現は、ＫＲＡＳバリアントの存在に関連するので、ＫＲＡＳバリアントを含む腫瘍細胞は、低酸素条件下で生存および増殖する。
【０２８９】
本明細書中に提供されるデータは、ＫＲＡＳバリアントが、数個のｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２７、およびｍｉＲ−２１０が挙げられる）の発現を制御する異常なシグナル伝達経路の一因となること、またはこれを開始することを実証する。ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−２７、およびｍｉＲ−２１０）の発現を調節するシグナル伝達経路の混乱は、腫瘍増殖および転移性トランスフォーメーションの開始、発生、維持、または増強をもたらす。
【０２９０】
遺伝子プロモーターのメチル化状態における変化が遺伝子発現の減少をもたらすので、プロモーターのメチル化は、多くのがんにおいて遺伝子発現をサイレンシングさせる１つのメカニズムである。具体的には、ＤＮＡメチル化は、しばしば遺伝子のプロモーター領域において、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化される場合に引き起こされるエピジェネティックな作用である。メチル化は、遺伝子の転写を媒介する分子によるプロモーターへの接近をブロックするので、プロモーターのメチル化は、遺伝子サイレンシングをもたらす。異なるがんは、明瞭なメチル化パターンを示し、その結果は、遺伝子発現シグネチャーにおける改変である。従って、ＫＲＡＳバリアントを有する腫瘍細胞系において、ＤＮＡメチル化パターンにおける改変があるかどうかを決定するために、これらの細胞系のメチル化状態を、ＮＣＩ−６０パネルにおける非ＫＲＡＳバリアント系と比較した（Ｅｈｒｉｃｈ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；  １０５：４８４４−９）。ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の存在は、多くの遺伝子（例えば、Ｎｏｔｃｈ１、サイクリンＤ３、およびＣＮＢＰ（ＺＮＦ９としても公知）が挙げられる）のプロモーターの増加したメチル化と統計学的に有意な正の相関を示す（表１６）。
【０２９１】
【表１６】
2013212052.tif 000030
がんにおけるＮｏｔｃｈ１発現の役割は、様々である。多くの腫瘍において、Ｎｏｔｃｈ１の過剰発現または活性化は、がんの進行および転移をもたらす。例えば、Ｎｏｔｃｈ１の活性化は、乳がん細胞の侵襲性および移動性の特徴付けにおける増加をもたらす。あるいは、ＭＹＣ背景におけるＮｏｔｃｈ１の過剰発現は、マウスの肺において腺腫を誘導し、肺腺癌腫の形成をもたらす。従って、この証拠は、Ｎｏｔｃｈ１が癌遺伝子として機能し得ることを示す。対照的に、Ｎｏｔｃｈ１はまた、腫瘍抑制因子としても機能し得る。例えば、Ｎｏｔｃｈ１における阻害性変異（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、頭頸部の扁平上皮癌腫において同定されている。マウスの皮膚のケラチノサイトにおけるＮｏｔｃｈ１の枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）は、化学的発癌物質またはがん遺伝子のＲａｓによる、高められた腫瘍形成をもたらす。ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）に対して陽性である子宮頸がんにおいて、Ｎｏｔｃｈ１発現は、正常な隣接する組織と比較して低減する。ＨＰＶ−陽性子宮頸がん、および神経芽細胞腫細胞（Ｚａｇｅ  ＰＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１）の活性化Ｎｏｔｃｈ１の過剰発現は、成長阻害をもたらす。ひとまとめに考えると、Ｎｏｔｃｈ１が多くのがんにおいて、異常に調節される（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅ）こと、そして、いくつかの例において、事実上の腫瘍抑制因子として機能し得ることを、この証拠は示す。Ｎｏｔｃｈ１プロモーターのメチル化は、ＫＲＡＳバリアント陽性がん細胞において増加するので、Ｎｏｔｃｈ１発現は、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を保有する細胞において減少され得、従って、ＫＲＡＳバリアント細胞系は、Ｎｏｔｃｈ１の腫瘍抑制作用を阻害することによって、それらの腫瘍形成の可能性を誘導または維持し得る。
【０２９２】
サイクリンＤ３は、細胞周期のＧ１／Ｓ移行に必要とされる細胞周期タンパク質のサイクリンファミリーのメンバーである。ＫＲＡＳバリアント細胞系において、サイクリンＤ３のプロモーターのメチル化は増加し、これは、サイクリンＤ３転写の抑制を示す。結果として、サイクリンＤ３がこれらの細胞系のトランスフォーメーションされた表現型に必要とされないか、またはサイクリンＤ３プロモーターのメチル化がサイクリンＤ３の転写抑制体をブロックするかのいずれかの、２つの例示的なメカニズムを証拠は示唆する。
【０２９３】
Ｎｏｔｃｈ１およびサイクリンＤ３と対照的に、ＺＮＦ９とも呼ばれるＣＮＢＰ（細胞性核酸結合タンパク質）は、がんの発生または進行のいずれにも関連しない。しかし、ＣＮＢＰ／ＺＮＦ９は、ＭＹＣプロモーターに結合する複合体の一部である。ＭＹＣの発現が異常に調節される場合、ＭＹＣは、がんの発生および進行の一因となる。ＫＲＡＳバリアントとＺＮＦ９のメチル化状態との関連性が、ＫＲＡＳバリアント細胞におけるがんの進行の一因となるメカニズムは、明らかではない。
【０２９４】
ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を含む７つの細胞系における遺伝子発現を、ＮＣＩ−６０パネルにおける残りの細胞系のプロフィールと比較し、これらの細胞系において遺伝子発現における特定の改変を決定した。表１７に示すように、発現の増大が、細胞系におけるＫＲＡＳバリアントの存在に統計学的に有意に相関する遺伝子は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼθ１（ＧＳＴＴ１）である。ＧＳＴＴ１遺伝子は、グルタチオン基をこれらの化合物に結合体化することによって、複合体代謝副産物、生体異物および薬物を解毒し、従って、それらをより可溶性および容易に細胞から排出されるようにする、ヒトフェーズＩＩ解毒酵素のグルタチオンＳトランスフェラーゼファミリーのメンバーをコードする。θ１アイソフォームは、いくつかのがんにおいて関連付けられている。例えば、ＧＳＴＴ１の増加した発現は、侵襲性の膀胱がんに統計学的に有意に相関する。他の異なる腫瘍タイプにおいて、遺伝的多型に起因して、ＧＳＴＴ１は、非機能的であるか、または存在せず、従って、毒性代謝物の蓄積または増加した蓄積の結果として、発癌現象および好ましくない予後判定の増加したリスクをもたらす。
【０２９５】
【表１７】
2013212052.tif 000031
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３（ＭＡＰＫ３）は、ＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーである。さらに、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３（ＭＡＰＫ３）の増加した発現は、がん細胞におけるＫＲＡＳバリアントに関連する。ＭＡＰＫ３は、細胞外の合図からのシグナルを変換し、細胞内プロセス（例えば、細胞増殖および分化）を調節する。例えば、リン酸化ＭＡＰＫ３の増加した発現は、侵襲性の結腸直腸腫瘍および転移性髄芽腫に関連している。ＫＲＡＳバリアント陽性がん細胞におけるＫＲＡＳの増加したレベルは、ＭＡＰＫ３  ｍＲＮＡにおける増加に関連する。少なくとも部分的に、増加したＭＡＰＫ３発現は、これらの細胞における増加した細胞増殖および新生物進行を誘導する。同様に、別のＭＡＰＫ（ＭＡＰ２Ｋ４）の発現は、ＫＲＡＳバリアント陽性発現プロフィールにおいて増加した。さらに、ＫＲＡＳおよびＭＡＰＫ（ＭＡＰＫ３および／またはＭＡＰ２Ｋ４）は、細胞増殖および／または新生物進行を誘導するかまたは高めるＫＲＡＳバリアントがん細胞におけるＫＲＡＳとＭＡＰＫシグナル伝達との間の相乗的な相互作用の一因となり得る。
【０２９６】
シナプトタグミン−１２の増加した発現およびインター−αグロブリンインヒビター−Ｈ１の増加した発現は、がん細胞系におけるＫＲＡＳバリアントの存在に正に相関する。正常条件下において、シナプトタグミンは、シナプス伝達の間にカルシウム依存膜輸送を調節する。シナプトタグミン−１２とがんとの関与の証拠はないが、シナプトタグミン−１２のファミリーメンバーであるシナプトタグミン−１３の過剰発現は、ラットの肝臓腫瘍細胞系に由来する細胞のトランスフォーメーションされた表現型を抑制する。ＫＲＡＳバリアント陽性がん細胞系におけるシナプトタグミン−１２の過剰発現は、がん細胞におけるシナプトタグミンに関与する新規経路の調節解除を示す。インター−α（グロブリン）インヒビターＨ１は、プラズマセリンプロテアーゼインヒビターの重鎖である。機能的に、インター−α（グロブリン）インヒビターＨ１は、細胞外マトリックスの安定性に必要とされる。がんにおけるインター−α（グロブリン）インヒビターＨ１の役割は、未探索のままであるが、最近の証拠は、インター−α（グロブリン）インヒビターＨ１の発現が種々の固形腫瘍（例えば、肺、結腸、および乳房の腫瘍が挙げられる）において、欠損しているか、または抑えられるかのいずれかであることを示す。
【０２９７】
実施例３：ＫＲＡＳバリアントおよび処置（卵巣がん）に対する患者の応答
材料および方法
全生存率分析コホート：既知のＢＲＣＡ変異のないＥＯＣと診断された女性からの、完全な臨床データおよびＤＮＡを、個々のインターナショナルレビューボード（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の承認下で以下の３つの機関から含めた。全てのプロトコルは、患者を、選択の偏りを避けるために、彼らの診断時に前向き収集した。参考文献は、これらの患者の以前の詳細な説明を示す：（１）イタリア、トリノ＃１（ｎ＝１９７）（Ｌｕ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７：１０１１７−１０１２２）、（２）イタリア、ブレッシア＃２（ｎ＝５９）（Ｒａｔｎｅｒ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：  ６５０９−６５１５）、および（３）エールニューヘイブン病院（ＹＮＨＨ）（ｎ＝１９８）。エールの患者を、エールメディカルスクール（ｔｈｅ  Ｙａｌｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）において２０００年と２００９年との間に診断された、新たに診断されたＥＯＣ患者の、２つ臨床試験において前向き収集した（表１８）。
【０２９８】
【表１８】
2013212052.tif 000032
公知の転帰を有する記録されたＢＲＣＡ変異体ＥＯＣ症例を以下の２つの機関から収集した：（１）ＹＮＨＨ（ｎ＝１７）および（２）シティーオブホープ包括がんセンター（ホームｔｈｅ  Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ｎ＝６２）（表１９）。
【０２９９】
【表１９】
2013212052.tif 000033
全ての１期卵巣がん患者がアジュバント化学療法を受けるわけではないので、１期腫瘍を有する患者についてサブステージ情報が利用可能ではない場合、これらの患者を分析から除外した。そうでなければ、２〜４期に１Ｂ期および１Ｃ期の腫瘍を含めた。境界型腫瘍の不注意な包含を最小限にするために、未知のグレードを有する腫瘍をこの分析から除外した。ネオアジュバント化学療法で処置される女性について、病理学的診断の日を処置の開始日と考えた。アジュバント化学療法で処置される女性について、手術の日を処置の開始日と考えた。野生型ＢＲＣＡを有するか、またはＢＲＣＡ変異について試験されていない３８６人の患者、および記録されたＢＲＣＡ変異を有する７９人の患者の総計は、上記パラメーターに適合し、２つの生存率分析に含んだ。
【０３００】
ネオアジュバント化学療法コホート：１９９６年と２０１０との間にＹＮＨＨで、ネオアジュバントプラチナベースの化学療法後、細胞減少手術を受けたＥＯＣを有する女性を、インターナショナルレビューボード（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）が承認したプロトコルにおいて同定した（ｎ＝１２５）（表２０）。このコホートの患者は、提示の際に最適な腫瘍縮小手術のためには腫瘍量が大きすぎることに起因して、主要な処置として化学療法を受けた。化学療法後、患者は、細胞減少手術および追加のアジュバント処置を受けた。ネオアジュバントプラチナ含有の組み合わせの４回またはそれより多くのサイクルで処置された患者のみを、この分析に含めた（ｎ＝１１６）。最適な細胞減少を、手術後に１ｃｍ未満の残りを測定する残存疾患と定義し、他方、最適未満の細胞減少を、手術の完了において１ｃｍ以上を測定する残存疾患と定義した。残存疾患に影響を与える要因としての手術の技量の偏りを避けるために、同じ外科医団によってエールで手術を受けた女性のみを含めた。
【０３０１】
【表２０】
2013212052.tif 000034
プラチナ抵抗性の分析のための患者：プラチナ抵抗性を、プラチナ含有アジュバント化学療法の完了から再発の日まで６ヶ月未満の無増悪生存率と定義した。無増悪生存率区間は、イタリア＃１、イタリア＃２、およびＹＮＨＨ患者（ｎ＝２９１）からの女性から利用可能であった。表２１は、これらの患者の臨床病理学的パラメーターを記載する。
【０３０２】
【表２１】
2013212052.tif 000035
ＫＲＡＳバリアントの検出：ＤＮＡを、腫瘍、血液、または唾液から標準方法を用いて単離した。ＫＲＡＳバリアントは、体細胞的に獲得されたとは思われないし、異種接合性の欠損を必要ともしない（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８５３５−８５４０）；それゆえに、例えば、血液および唾液は、試験するのに適しており、結果は、試験された組織に関わらず同一である。全てのサンプルにおいて、ＫＲＡＳバリアントに特異的なプライマーおよびＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）ＰＣＲアッセイを用いて、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子を検出した。遺伝子型決定を、ＣＯＨからのサンプル（彼らの施設において遺伝子型決定が行われたので）を除いて、ＹＮＨＨにおいて行った。集団の３％未満がＫＲＡＳバリアントの２つのコピーを保有する（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：  ８５３５−８５４０）。このように、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子の少なくとも１つのコピーを保有した患者をＫＲＡＳバリアント保有者として分類した。
【０３０３】
ＫＲＡＳバリアントを有する、および有さない、ＥＯＣの遺伝子発現解析：１６人の患者（９人の非バリアント、および７人のＫＲＡＳバリアント）から得られた新鮮凍結腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０プラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）において、プロファイリングした。全てのサンプルは、ＩＩＩＣ期またはＩＶ期である高グレード漿液上皮卵巣腫瘍からであった。画像をＭＡＳ５アルゴリズムで処理し、サンプルの少なくとも７５％において不存在であると判断されたプローブを除去した。強度の値をｌｏｇ変換し、分位数で標準化した。Ｒ統計ソフトウェア（Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，ｐｕｂｌｉｃｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ａｔ  ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）のためのＬＩＭＭＡパッケージに実装されるような、線形モデルおよび経験的Ｂａｙｅｓｉａｎ誤差モデレーション（ｍｏｄｅｒａｔｉｏｎ）を用いて、識別的遺伝子発現を５２歳以上の患者（ｎ＝６  非バリアントおよび４  ＫＲＡＳバリアント）から得られたサンプルにおいて評価した（Ｓｍｙｔｈ  Ｇ．（２００５）．Ｌｉｍｍａ．ｉｎ  Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３９７−４２０）。
【０３０４】
公開された結果と、このデータセットにおけるＫＲＡＳバリアントとの関連性を、異なるプラットフォームに対応した作用を減少させるためのシグネチャーアプローチを用いて評価した（Ｐａｒａｎｊａｐｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １２：３７７−３８６）。手短に言えば、シグネチャースコアを、これらの遺伝子について、遺伝子貢献のそれぞれのシグネチャーベクターと各サンプルの発現プロフィールとの間のピアソンの正の相関としてコンピューターで計算した。ＫＲＡＳバリアントおよび非バリアントのＥＯＣサンプルにおけるシグネチャースコア間の差を、両側コルモゴロフ−スミルノフ検定を用いて判定した。そうでないと示されない限り、それぞれの刊行物からの遺伝子リストをシグネチャーベクターとして使用した。Ｐｅｔｅｒｓら（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ４：１６０５−１６１６）による研究からのデータを、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＳＥ１９２６）から得、再分析して、プラチナ感受性サンプルとプラチナ抵抗性サンプルとの間の５０個の最も著しく識別的発現をする遺伝子からのシグネチャーを生成した。
【０３０５】
化学的感受性および細胞生存力アッセイ：単独、または組み合わせにおける薬物の活性を、高スループットＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存力アッセイによって決定した。これらのアッセイについて、１．２×１０３細胞を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＸＳリキッドハンドリングステーション（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を用いて、３８４ウェルプレートの各ウェルにプレートし、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートして、一晩、付着させた。リキッドハンドリングステーションを用いて、全ての薬物を培地において２：３または１：２に連続希釈し、５μｌのこれらの希釈物を、示された回数で適切なウェルに加えた。４つの複製ウェルを各薬物濃度のために使用し、追加の４つの対照ウェルには薬物のない希釈物対照を入れた。薬物とのインキュベーション期間の終わりに、５μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を各ウェルに加えた。細胞生存力を、残りの生存可能な細胞がリザズリンをレソルフィンへと生物還元させる能力によって評価した。レソルフィンの蛍光（５７９ｎｍ  Ｅｘ／５８４ｎｍ  Ｅｍ）をＳｙｎｅｒｇｙ  ４マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて測定した。蛍光データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）に移して、薬物を入れられていない４つの複製細胞ウェルに関する生存力百分率を計算した。ＩＣ５０を、ＸＬｆｉｔバージョン５．２（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ）を用いたＳ状平衡モデル回帰（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｍｏｄｅｌ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を用いて決定した。ＩＣ５０を、成長／生存力における５０％の減少に必要とされる薬物の濃度と定義した。全ての実験を、最低３回実施した。
【０３０６】
ＫＲＡＳバリアントの標的化：いわゆる「シード配列」に対応するｓｉＲＮＡガイド鎖の５’末端における６個のヌクレオチドの変動する位置に一塩基多型を置くことによって、低分子干渉ＲＮＡ配列を設計してＫＲＡＳバリアント配列を標的化した。Ｂｌａｓｔ検索を行って、交差反応性（ｃｒｏｓｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を最小限にした。ｓｉＲＮＡ配列のいくつかにおいて、ＤＮＡヌクレオチドを導入して、ガイド鎖のアルゴノートエフェクター複合体への好ましい組み込みに対する熱エネルギーの（ｔｈｅｒｍｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃ）特徴を最適化するか、またはバリアントに対する特異性を増加させた。
【０３０７】
実験において使用される低分子干渉ＲＮＡガイド鎖配列は、以下の通りである（小文字＝ＲＮＡ、大文字＝ＤＮＡ；ＧＳ＝ガイド鎖、ＰＳ＝パッセンジャー鎖）：
２−１  ＧＳ  ｕｇｃａｕｃａｃｕｕｇａｇｇｕｃａｇｇａｇ（配列番号２３）
２−１  ＰＳ  ｃｃｕｇａｃｃｕｃａａｇｕｇａｕｇｃａｃｃ（配列番号２４）
２−３  ＧＳ  ＴＧＣＡＴＣＡＣｕｕｇａｇｇｕｃａｇｇａｇ（配列番号２５）（２−１と同じパッセンジャー鎖）
３−２  ＧＳ  ｕｃａｕｃａｃｕｕｇａｇｇｕｃａｇｇａｇｕ（配列番号２６）
３−２  ＰＳ  ｕｃｃｕｇａｃｃｕｃａａｇｕｇａｕｇｃａｃ（配列番号２７）
使用される陰性対照をＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）（ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ）から購入した。これらの配列のＫＲＡＳバリアントに対するノックダウンの有効性および特異性を、二重ルシフェラーゼアッセイを用いて確認した（ＷＯ／２００９／１５５１００を参照のこと、その内容は、本明細書中で参考として援用される）。オリゴヌクレオチドの組み合わせを、標準条件を用いてアニーリングし、次に、標準プロトコルを用いて細胞へトランスフェクションした。ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率をアッセイし、実験を４連で行い、全ての系について、４つの独立した実験において繰り返した。以前に記載された（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：  ８５３５−８５４０）ように、細胞溶解物をトランスフェクション後７２時間で収集し、ＫＲＡＳタンパク質レベルをＫＲＡＳに特異的なプローブを用いて、ウエスタン分析によって測定した。
【０３０８】
統計：人口統計学的変動要因の有意性を判定するために、カテゴリー的変動要因について、カイ二乗検定または両側フィッシャーの正確検定を使用した。ｔ検定を連続変動要因（例えば、年齢）について使用した。カプラン−マイヤー方法（Ｋａｐｌａｎ  Ｅ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｒ  Ｐ．  （１９５８）．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｔａｔ  Ａｓｓｏｃ  ５３：  ４５７−４８１）を用いて、ＫＲＡＳバリアント患者およびＫＲＡＳ野生型患者の全生存期間を比較し、生存曲線の統計学的有意性をログランク検定（Ｍａｎｔｅｌ  Ｎ．（１９６６）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  ５０：１６３−１７０）によって決定した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデル（Ｃｏｘ  Ｄ．（１９７２）．Ｊ  Ｒ  Ｓｔａｔ  Ｓｏｃ  ３４：１８７−２２０）を、全生存率に及ぼす、ＫＲＡＳバリアント、ならびに人口統計学的変動要因および予後変動要因（例えば、年齢、病期、および組織学）の影響を判定するために使用した。多変量ロジスティック回帰分析（Ｃｏｘ  Ｄ．（１９７０）．Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｄａｔａ．  Ｍｅｔｈｕｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎ）を、最適未満の細胞減少の確率に及ぼす、ＫＲＡＳバリアントならびに他の人口統計学的要因および予後判定の要因の影響を決定するために使用した。多変量ロジスティック回帰分析（Ｃｏｘ  Ｄ．  （１９７０）．  Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｄａｔａ．Ｍｅｔｈｕｅｎ，Ｌｏｎｄｏｎ）を、プラチナ抵抗性の確率におけるＫＲＡＳバリアントと他の予後判定の要因との関連性を判定するために使用した。全ての統計学的分析をＳＡＳ  ９．１．３（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて、Ｒ  ２．１２．１（Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）において行った。
【０３０９】
データおよび結果
有害なＢＲＣＡ変異について試験して陰性であるか、または試験していないかのいずれかである４５４人のＥＯＣ患者におけるＫＲＡＳバリアントと全生存率との関連性を評価した。全体のコホートを考慮した場合、ＫＲＡＳバリアントは、カプラン−マイヤー解析によって、より悪い生存率を予測しなかった。ＫＲＡＳバリアントは、閉経後の卵巣がん（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８５３５−８５４０）ととても強く関連するので、５２歳以上の女性（ｎ＝２７９）における生存率を評価した。５２歳以上は、閉経期状態の適切な代用物であると考えられる。カプラン−マイヤー解析によって、非バリアントＥＯＣ患者（ｎ＝２２０、図７、ログランク  Ｐ＝０．０３９９、非ＫＲＡＳバリアント生存率メジアン（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｅｄｉａｎ）６０ヶ月、ＫＲＡＳバリアント生存率メジアン３４ヶ月）と比較して、閉経後のＫＲＡＳバリアントＥＯＣ患者（ｎ＝５９）において生存率を著しく減少させた。他の変動要因（年齢、病期、グレード、組織学、および処置センターが挙げられる）を、多変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルにおけるＫＲＡＳバリアント状態に含む場合、ＫＲＡＳバリアントは、ＥＯＣを有する閉経後の女性について減少した全生存率の統計学的に有意な予測子であった（表２２）；ＫＲＡＳバリアントについてのハザード比は、１．６７であった（９５％信頼区間：１．０９−−２．５７、Ｐ＝０．０１９）。
【０３１０】
【表２２】
2013212052.tif 000036
ＫＲＡＳバリアントと有害なＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２変異を保有するＥＯＣ患者（ｎ＝７９）の個別のコホートにおける生存率との関連性を評価した。ＢＲＣＡ変異を保有するＥＯＣ患者は、ＢＲＣＡ変異を有さないＥＯＣ患者よりも統計学的に有意に若かった（５２．７歳対６０．８歳、Ｐ＜０．０００１）。さらに、ＢＲＣＡ変異を有するＥＯＣ患者は、年齢、病期、グレード、および組織学について制御した多変量解析によれば、ＢＲＣＡ変異を有さないＥＯＣ患者よりも著しく長いメジアン生存率を有した（１２０ヶ月対５２ヶ月、Ｐ＝０．００３６）。多変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いた多変量解析において、ＫＲＡＳバリアントを有するかまたは有さないＢＲＣＡ変異を有するＥＯＣ患者間での生存率において有意差はない（表２３、ＫＲＡＳバリアントハザード比＝０．７５、９５％信頼区間：０．２１−２．７２、Ｐ＝０．６６）。この研究において、有害なＢＲＣＡ変異を有する閉経後のＥＯＣ患者において生存率におけるＫＲＡＳバリアントの影響を評価するには、患者が少なすぎた。
【０３１１】
【表２３】
2013212052.tif 000037
閉経後のＫＲＡＳバリアント陽性ＥＯＣ患者において、減少した生存率を説明するために、ＫＲＡＳバリアントの陽性度とプラチナベースの化学療法に対する応答との関連性を評価した。プラチナベースの化学療法は、ＥＯＣの処置において標準の第一選択化学療法である。第一に、エールニューヘイブン病院（ＹＮＨＨ）において、ネオアジュバントプラチナ含有化学療法で、その後、外科的細胞減少で処置されたＥＯＣを有する全ての女性（ｎ＝１１６）を評価した。手術（細胞減少）後の残存疾患を、化学療法に対する患者の応答の代理マーカーとして使用した。非バリアント患者（ｎ＝９０）ではたった３．３３％であったのと比較して、ＫＲＡＳバリアント患者（ｎ＝２６）では１５．４％が最適未満で細胞減少した（手術後４１ｃｍの残存疾患）ことが決定された（図８、Ｐ＝０．０４４）。ＫＲＡＳバリアントはまた、年齢、病期、グレード、および組織学について制御した多変量ロジスティック回帰モデルにおいて、ネオアジュバント化学療法および手術後の、最適未満の細胞減少に有意に関連した（表２４、オッズ比＝９．３６、９５％信頼区間：１．３４−−６５．２２、Ｐ＝０．０２４）。
【０３１２】
【表２４】
2013212052.tif 000038
ＫＲＡＳバリアントＥＯＣ患者に見られるネオアジュバントプラチナベースの化学療法に対する好ましくない応答の原因が、プラチナ化学療法に対する抵抗性に起因するかどうかを決定するために、利用可能な応答データ（ｎ＝２９１）を用いて、記録されたＢＲＣＡ変異がなく、プラチナ化学療法でアジュバントにより処置された全てのＥＯＣ患者におけるプラチナ抵抗性を評価した。プラチナ抵抗性（プラチナベースの化学療法を受けた６ヶ月以内での疾患再発としてこの実施例において定義される）が、ＫＲＡＳバリアント陽性ＥＯＣ患者において、非ＫＲＡＳバリアントＥＯＣ患者よりも著しく起こりやすいことが決定された（１６．６７％対７．５６％、Ｐ＝０．０３４）。ＫＲＡＳバリアントは、全ての年齢のＥＯＣ患者についてのプラチナ抵抗性について、細胞減少手術後に残っている残存疾患、病期、組織学、年齢、およびグレードについて制御した多変量ロジスティック回帰分析において、統計学的に有意な予測因子であった（表２５、オッズ比＝３．１８、９５％信頼区間：１．３１−−７．７２、Ｐ＝０．０１０６）。
【０３１３】
【表２５】
2013212052.tif 000039
遺伝子発現研究を、利用可能な新鮮凍結組織を有した卵巣がん患者の小さいコホートにおいて行い（ブレッシアコホート）、ＫＲＡＳバリアントを有する７つの漿液ＥＯＣサンプルと９つのＫＲＡＳバリアントを有さないものとの間で比較した（ｎ＝１６）。このコホート内で、ＥＯＣを有する５２歳超の閉経後のＥＯＣ患者において（ｎ＝１０）、ＫＲＡＳバリアント関連ＴＮＢＣに関連すると以前に見出された遺伝子シグネチャー（Ｐａｒａｎｊａｐｅ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １２：３７７−８６）をまた、ＫＲＡＳバリアント関連ＥＯＣにおいて上方調節した（図９ａ）。ＴＮＢＣにおける以前の分析と同様に、ＥＯＣ  ＫＲＡＳバリアント腫瘍におけるＫＲＡＳ関連下流経路の過剰発現が見出された。これは「ＫＲＡＳ依存」（Ｓｉｎｇｈ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １５：４８９−５００）と一貫している（図９ｂ）。
【０３１４】
プラチナ感受性シグネチャーと比較したプラチナ抵抗性シグネチャーを同定する遺伝子発現データの以前の分析を用いて（Ｐｅｔｅｒｓ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ４：  １６０５−１６１６）、ＫＲＡＳバリアントＥＯＣサンプルが、非バリアントＥＯＣサンプルと比較して、より低いカルボプラチン感受性シグネチャーを有することを決定した（図９ｃ）。ＡＫＴ経路の活性化が、頻繁にプラチナ抵抗性に関与することを示す知見と一致して、ＡＫＴ３が、ＫＲＡＳバリアントＥＯＣ腫瘍において、最も著しく上方調節された転写産物のうちの１つであることが決定された（図９ｄ）。
【０３１５】
ｍｉＲＮＡ発現データは腫瘍サンプルにおいて利用可能でなかったが、ＫＲＡＳバリアントを有する２つの細胞系（ＢＧ−１およびＩＧＲＯＶ１）におけるｌｅｔ−７ｂ  ｍｉＲＮＡの発現を、非ＫＲＡＳバリアント系（ＣＡＯＶ３）におけるｌｅｔ−７ｂの発現と比較した。ｌｅｔ−７ｂ  ｍｉＲＮＡの発現は、ＫＲＡＳバリアント陽性肺腫瘍（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８５３５−８５４０）および三重陰性乳房腫瘍（Ｐａｒａｎｊａｐｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １２：３７７−３８６）において改変される。
【０３１６】
ｌｅｔ−７ｂが、ＫＲＡＳバリアントを有する細胞において統計学的に有意により低いことが決定された（図１２）。
【０３１７】
ＫＲＡＳバリアントの存在下での改変された化学感受性を確認するために、ＫＲＡＳバリアントを有する、および有さない、ＥＯＣ細胞系を、異なる化学療法薬剤に対するそれらの感受性を試験するために使用した。例えば、ＫＲＡＳバリアント陽性／ＢＲＣＡ野生型（ＢＧ１）、非バリアント／ＢＲＣＡ野生型細胞系（ＣＡＯＶ３）、およびＫＲＡＳバリアント陽性／ＢＲＣＡ１変異体である細胞系（ＩＧＲ−ＯＶ１）である細胞系を試験した。ＫＲＡＳバリアント系（ＢＧ１）は、ＫＲＡＳバリアントを有さない細胞系であるＣＡＯＶ３と比較して、カルボプラチン（Ｐ＜０．０４）、およびカルボプラチン／パクリタキセル組み合わせ化学療法（Ｐ＜０．０００１）に対して統計学的に有意に抵抗性であることを決定した。対照的に、ＫＲＡＳバリアントおよび有害なＢＲＣＡ１変異を有する細胞系であるＩＧＲＯＶ１は、ＣＡＯＶ３と比較した場合、これらの薬剤に対して抵抗性ではなかった（図１０）。これらの結果は、ＫＲＡＳバリアントはプラチナ抵抗性に関連するが、有害なＢＲＣＡ変異の存在下では関連しないことを実証する、対応する臨床的結果と一致している。
【０３１８】
追加的に、カルボプラチン／パクリタキセル化学療法に失敗した患者について第２選択療法として頻繁に使用される薬物を評価した。これらの第２選択治療剤としては、ドキソルビシン、トポテカン、およびゲムシタビンが挙げられた。ＫＲＡＳバリアント系（ＢＧ１）は、非バリアント細胞系であるＣＡＯＶ３と比較して、これらの薬剤のそれぞれに対して有意に抵抗性であった（表２６）。
【０３１９】
【表２６】
2013212052.tif 000040
本明細書中に示されるデータは、ＫＲＡＳバリアント関連腫瘍におけるＫＲＡＳシグナル伝達の連続している使用を実証するので、ＫＲＡＳ−バリアントを直接的標的化する影響を評価した。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）／ｍｉＲＮＡ様複合体を、ＫＲＡＳバリアント転写産物中の改変された対立遺伝子に直接的に結合するが、非バリアント転写産物には結合しないように設計した（図１３）。ＫＲＡＳバリアントを標的とするこれらのオリゴヌクレオチド二重鎖部位をトランスフェクションすることが、ＢＧ１細胞系を保有するＫＲＡＳバリアントにおける細胞生存率の統計学的に有意な低減を引き起こすこと（Ｐ＜０．００１）、しかし、２つの非バリアントＥＯＣ細胞系であるＣＡＯＶ３（図１１ａ）、またはＳＫＯＶ３において作用がなかったことが決定された。この結果は、ＢＧ１におけるウエスタンブロットによるＫＲＡＳタンパク質レベルの中程度の低減に一致するが、処置後のＣＡＯＶ３（図１１ｂ）またはＳＫＯＶ３においては、一致しない。
【０３２０】
実施例４：早期結腸直腸がん（ＣＲＣ）における予後判定のバイオマーカーとしてのＫＲＡＳバリアント
材料および方法
試験集団：１９９４年まで、９２５の罹患ＣＲＣ症例（ＩＣＤ−Ｏ：１５３．０−１５４．１）を、５５歳と６９歳との間の１２０，８５２ｂ人の健常な人物において１９８６年に始まった治療食およびがんにおけるオランダコホート研究（ＮＬＣＳ：Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｄｉｅｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ）において同定した。罹患がん症例を、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ（ＮＣＲ）とＰＡＬＧＡ（組織病理学および細胞病理学の全国的な登録）との繋がりによって同定した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒａｎｄｔ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９９０；１９（３）：５５３−８）。ＮＬＣＳは、他のところに詳細に記載されている（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒａｎｄｔ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９９０；４３（３）：２８５−９５。８１５人のＣＲＣ症例は、ＰＡＬＧＡに関連し得、パラフィン包埋腫瘍組織をオランダ中の５４の病理学登録から収集した。十分な量の良質なＤＮＡを、７３４人（９０％）の症例について抽出した（Ｂｒｉｎｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００３；２４（４）：７０３−１０）。ベースラインにおいて、５０００人の健康な人物のサブコホートを、全体のコホートから無作為にサンプル化して、生命状態の２年ごとの追跡調査を介して、コホートのリスクがある人年（ｐｅｒｓｏｎｙｅａｒｓ）を見積もった。１，８８６人の人物について、頬の綿棒からのＤＮＡは、ＫＲＡＳバリアント遺伝子型決定に利用可能であった。
【０３２１】
データ収集：腫瘍の局在、病期、分化グレード、発生日（ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｄａｔｅ）、および診断後３ヶ月での処置における情報は、ＮＣＲを解して利用可能であった。２００５年５月までの生命状態を、系統学の中央局（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｇｅｎｅａｌｏｇｙ）および市の人口登録から回収し、全ての７３４人の症例について得ることができた。死因を、オランダ統計局（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）との繋がりを介して回収した。ＣＲＣ関連死を、結腸、直腸Ｓ状結腸、直腸、胃腸管（非特異的）、または肝臓の転移における癌腫の結果の死亡と定義した。胃腸管（非特定）または肝臓の転移の場合、ＮＣＲおよびＰＡＬＧＡからの情報を、死因として別の原発性がんの可能性を排除するために使用した。
【０３２２】
ＤＮＡ単離およびＫＲＡＳバリアント決定：それぞれの腫瘍組織塊の５μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、病理学者によって修正した。２０μｍの５つの切片をパラフィン除去（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎａｔｅ）し、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の使用説明書に従って用いてＤＮＡを抽出した。手短に言えば、細胞溶解溶液およびプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）を組織に添加し、５５℃で一晩インキュベートした。３７℃で７２時間にわたってＤＮＡを抽出し、タンパク質を除去し、１００％の２−プロパノールを用いてＤＮＡを沈殿させた。最終的に、ＤＮＡを水和バッファーにおいて再水和した。単離したＤＮＡを、ＫＲＡＳの３’ＵＴＲ内のｌｅｔ−７相補部位６（ＬＣＳ６）のＴ対立遺伝子またはＧ対立遺伝子（それぞれ野生型対立遺伝子およびバリアント対立遺伝子）を特異的に同定するように設計されたＴａｑＭａｎ  ＰＣＲアッセイを用いて増幅した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。腫瘍ＤＮＡを、遺伝子型を決定するために使用したが、正常組織の遺伝子型と腫瘍組織の遺伝子型とが、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子保有者において同じであることはよく記録されている（Ｃｈｉｎ  ＬＪ，ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８；６８（２０）：８５３５−４０）。
【０３２３】
ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異を、以前に記載されたように（Ｂｒｉｎｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００３；２４（４）：７０３−１０；ｄｅ  Ｖｏｇｅｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００８；２９（９）：１７６５−７３）、ネスティッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および直接シークエンシング（ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＫＲＡＳ）、ならびに制限断片長多型（ＢＲＡＦ）によって評価した。Ｗｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ（Ｗｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＤＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００６；３８（７）：７８７−９３）によって提案されるようにＲＡＳＳＦ１Ａ、Ｏ６−ＭＧＭＴ、ＣＨＦＲおよびＣＩＭＰマーカーのプロモーターメチル化を、亜硫酸水素ナトリウムおよびメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（ｄｅ  Ｖｏｇｅｌ  Ｓｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００８；２９（９）：１７６５−７３；２６．Ｈｅｒｍａｎ  ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６；９３（１８）：９８２１−６；Ｄｅｒｋｓ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｏｎｃｏｌ．２００４；２６（５−６）：２９１−９）を用いてゲノムＤＮＡの化学修飾によって判定した。ＭＳＩ状態を、以前に記載されたように（Ｓｕｒａｗｅｅｒａ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００２；１２３（６）：１８０４−１１）、ＢＡＴ−２６、ＢＡＴ−２５、ＮＲ−２１、ＮＲ−２２、およびＮＲ−２４を用いて決定した。主要な研究終点（すわなち、ＣＲＣ関連死）を見ないで、全てのアッセイを行い、分析した。
【０３２４】
統計解析：原因特異的生存率を、がんの診断からＣＲＣ関連死または追跡調査の終了までの時間と定義した。カプラン−マイヤー曲線およびログランク検定を、原因特異的生存率におけるＫＲＡＳバリアントの影響を見積もるために使用した。ＨＲおよび対応する９５％  ＣＩを、潜在的交絡因子について調整されたＣｏｘ比例ハザードモデルの使用によって評価した。因子を、それらがＣＲＣについて公知の予後判定の要因であり、粗ＨＲに１０％より多く影響する場合、可能性のある交絡因子と考えた。含まれた交絡因子は、診断時の年齢（連続）、性別、腫瘍分化グレード（高、中、低、および未分化）、および場所（近位、遠位、直腸Ｓ状結腸、および直腸）であった。比例ハザードの仮定を、シェーンフィールド残差およびｌｏｇ（−ｌｏｇ）ハザードプロットを用いて試験した。生存率の分析を診断後１０年に制限した（その時点より後にはＣＲＣに関連する死因が起こりそうもないので）。発生率比（ＲＲ）および９５％  ＣＩを、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて見積もった。標準誤差を、コホートからのサンプル化によって導入された追加の分散についてロバストＨｕｂｅｒ−Ｗｈｉｔｅサンドイッチ評価物（ｒｏｂｕｓｔ  Ｈｕｂｅｒ−Ｗｈｉｔｅ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）を用いて見積もった。全ての分析を、統計パッケージＳＴＡＴＡ１０．０を用いて行った。
【０３２５】
データおよび結果
この研究における患者は、よりしばしば、早期腫瘍（６２．０％）、または近位腫瘍もしくは遠位腫瘍（６５．３％；表２７）と診断された男性であった（５５．６％）。追跡調査の間、患者の４１．４％は、ＣＲＣで死亡した。ＫＲＡＳ−ＬＣＳ６バリアントは、早期（Ｉ期およびＩＩ期）患者の１４．０％において、ＩＩＩ期患者の１９．２％、およびＩＶ期患者の２１．４％において検出された（Ｐ＝０．１６０；Ｐｔｒｅｎｄ＝０．０６０）。ＫＲＡＳバリアント患者は、よりしばしば、進行した病期の疾患と診断された（４７．５％対野生型患者において３６．９％、Ｐ＝０．０４６）。他の統計学的有意差は、性別、診断時の年齢、分化グレード、腫瘍場所、ＭＳＩ、またはＫＲＡＳ（表２７）、ＢＲＡＦ（Ｐ＝０．６４０）、またはＲＡＳＳＦ１ＡプロモーターＣｐＧアイランドメチル化（Ｐ＝０．４２３）における変異について、野生型保有者とＫＲＡＳバリアント保有者との間に見出されなかった。期待されたように、ＩＩＩ期またはＩＶ期の疾患を有する患者は、よりしばしば、ＣＲＣで死亡し（Ｐ＜０．００１）、よりしばしば、好ましくない分化した腫瘍を有した（Ｐ＜０．００１）。進行した病期の患者は、よりしばしば、早期患者と比較して、近位腫瘍（Ｐ＝０．０３６）またはＭＳＳ腫瘍（Ｐ＝０．０４７）を有した。
【０３２６】
【表２７】
2013212052.tif 000041
ＩＶ期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者は、女性である可能性がより高く（６６．７％；Ｐ＝０．０９７）、他の病期におけるＧ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者と比較して、近位腫瘍（７１．４％；Ｐ＝０．００４）を示す可能性が高い（表２８）。
【０３２７】
【表２８】
2013212052.tif 000042
ＫＲＡＳバリアントは、早期ＣＲＣにおけるより良好な生存率に関連する。総集団におけるＫＲＡＳバリアントおよび原因特異的生存率について、カプラン−マイヤー解析において統計学的有意差は観察されなかった（ログランク検定、Ｐ＝０．８６４）（図１４）。
【０３２８】
生存率はがんの病期に依存するので、行われた分析を病期について階層化した。早期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者は、野生型症例と比較して、統計学的に有意により良好な生存率を示した（ログランク検定、Ｐ＝０．０３８；図１５Ａ）。この差は、進行した病期の症例については観察されなかった（図１ＢおよびＣ；ログランク、ＩＩＩ期およびＩＶ期症例について、それぞれ、Ｐ＝０．７７５および０．８７５）。
【０３２９】
ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異状態は、ＫＲＡＳバリアントと生存率との間の関連性を高める。図１６Ａは、ＫＲＡＳバリアントおよびＫＲＡＳ変異を有する早期（Ｉ期およびＩＩ期）ＣＲＣ症例についてのカプラン−マイヤー解析を示す。ＫＲＡＳ変異を有する２０人のＧ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者のうちの誰もＣＲＣに起因して死亡しなかった。ＫＲＡＳ野生型患者は、特に彼らがＫＲＡＳ変異を有する場合により好ましくない生存率を有した（ログランク検定、Ｐ＝０．０４３；ログランク検定  ＫＲＡＳ変異を有さないＫＲＡＳバリアント対立遺伝子保有者と比較したＫＲＡＳ変異を有するＫＲＡＳ−バリアント対立遺伝子保有者  Ｐ＝０．０１７）。この発見は、Ｔ期から独立していた；ＫＲＡＳ変異を有する１１５人のＫＲＡＳ野生型症例中、たった５人（４％）が高リスクＩＩｂ期（Ｔ４Ｎ０Ｍ０）と診断された。Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子）保有者中、どの患者もＩＩｂ期と診断されなかった。進行した病期の患者について、生存率の差が見出されなかった（図１６Ｂおよび１６Ｃ、ログランク検定、ＩＩＩ期についてＰ＝０．５３５およびＩＶ期についてＰ＝０．９８９））。ＩＩＩ期患者についての結果は、ＫＲＡＳ変異を有するＫＲＡＳ野生型患者が、より悪い予後を有することを示す。サブグループ分析は、早期ＫＲＡＳバリアント保有者についてのより良好な転帰が、主にＩＩ期症例において見出されたことを示した。Ｔ期について階層化された分析は、限定された患者数に起因して可能ではなかった。
【０３３０】
Ｇ対立遺伝子を保有するＢＲＡＦ変異したＣＲＣは、同様のより良好な転帰を示したが、ＫＲＡＳバリアントおよびＫＲＡＳ変異の両方を有する患者が少数であったこと（９患者）におそらく起因して、これは統計学的に有意ではなかった（ログランク検定、Ｐ＝０．１６６）。同様に、Ｒａｓ経路に関与する別の遺伝子である異常なＲＡＳＳＦ１Ａプロモーター過剰メチル化を有するＧ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子）保有者は、それほど統計学的に有意ではないが、ＲＡＳＳＦ１Ａ過剰メチル化を有さない野生型保有者と比較して、より良好な予後を有した（ログランク検定、Ｐ＝０．０６２）。ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＲＡＳＳＦ１Ａ状態を組み合わせた分析は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、およびＲＡＳＳＦ１Ａにおいて、追加の改変を有する早期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者が、より良好な予後を有することを示した（ログランク検定、Ｐ＝０．０２６）。対照的に、Ｒａｓ経路（例えば、ＭＧＭＴまたはＣＨＦＲ）に関与しない遺伝子のメチル化状態を加えるとき、生存率の差は観察されなかった（ＭＧＭＴ：ログランク検定、Ｐ＝０．２２０；ＣＨＦＲ：ログランク検定、Ｐ＝０．１１８）。
【０３３１】
ＫＲＡＳ変異状態と組み合わせたＫＲＡＳバリアントの生存率の影響は、他の予後判定の要因から独立している。多変量解析において、原因特異的生存率における統計学的有意差は、野生型と比較して、Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）を有する、早期症例（ＨＲ  ０．４６；９５％  ＣＩ：０．１８−１．１４）、ＩＩＩ期症例（ＨＲ  ０．９８、９５％  ＣＩ：０．５５−１．７４）、またはＩＶ期症例（ＨＲ  ０．４２；９５％  ＣＩ：０．１７−１．０６）について見出されなかったが、早期およびＩＶ期のＧ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者は、改善された生存率を実証した（表２９）。
【０３３２】
【表２９】
2013212052.tif 000043
ＫＲＡＳ変異を有する早期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者は、これらの患者のうちの誰もＣＲＣに起因して死亡しなかったので、良好な予後を有した。対照的に、生存率における統計学的有意差は、ＫＲＡＳバリアントを有する、ＫＲＡＳ非変異の早期症例（ＨＲ  ０．７７；９５％  ＣＩ：０．３０−１．９７）、ＩＩＩ期症例（ＨＲ  ０．９５；９５％  ＣＩ：０．４４−２．０５）、またはＩＶ期症例（ＨＲ  ０．３５；９５％  ＣＩ：０．１１−１．１３）とＫＲＡＳバリアントとの間で見出されなかった。しかし、ＫＲＡＳ変異を有するＩＩＩ期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者は、好ましくない予後を示した（ＨＲ  １．５２；９５％  ＣＩ：０．６６−３．５４）が、比較は統計学的に有意ではなかった。オランダのガイドラインは、ＮＬＣＳにおいて患者がＣＲＣと診断される時点でアジュバント処置を勧めなかったので、アジュバント処置を受けた患者の割合は非常に低かった。早期症例内で、９％がアジュバント化学療法を受けた。より進行した病期に関して、ＩＩＩ期患者の３１％およびＩＶ期患者の１９％がアジュバント化学療法を受けた。アジュバント化学療法処置患者の除外は、本発明者らの結論を変えなかった。実際には、アジュバント化学療法処置患者の除外は、ＫＲＡＳ変異を有する、早期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者とＩＩＩ期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者との間の差を増大させ（早期：ＣＲＣ関連死なし；ＩＩＩ期：ＨＲ  ２．３６  ９５％  ＣＩ：０．９９−５．６７）、ＩＩＩ期Ｇ対立遺伝子（ＫＲＡＳバリアント）保有者が疾患のより悪い自然経過を有することを意味した。しかし、この分析は、少数の患者に基づく。
【０３３３】
ＫＲＡＳバリアントの生存率の影響は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）から独立している。本明細書中に提供されるバイオマーカーおよび方法の開発の前に、ＭＳＩは、ＣＲＣにおける唯一の確立された分子予後判定マーカーであった。従って、ＫＲＡＳバリアント遺伝子型の作用を、ＭＳＩについて階層化された患者集団において研究した。良好な予後に関連する、ＭＳＩ腫瘍を有した患者の除外は、本明細書中に提供される結論を変えなかった；ＫＲＡＳバリアントを有するＭＳＩおよびＭＳＳ症例の両方は、良好な予後を有した。対照的に、ＫＲＡＳ野生型を有する患者は、たとえ、彼らがＭＳＩ腫瘍を有していても、好ましくない予後を有した（ログランク検定、Ｐ＝０．０３６）（図１７）。ＭＳＩ患者内での、性別、腫瘍サブロケーション、または分化グレードについて階層化された追加の分析は、限定された患者数に起因して可能ではなかった。
【０３３４】
進行した病期のＣＲＣのリスクは、ＫＲＡＳバリアントに関連しない。ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子が、進行した病期のＣＲＣについて素因をつくる可能性を研究するために、ＫＲＡＳ遺伝子型とＣＲＣリスクとの間の関連性を研究した。ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）は、サブコホートメンバーの１８％に見出された。ＣＲＣについて、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）を保有する場合、早期（Ｉ期およびＩＩ期）ＣＲＣを発生する低減したリスクが見出された（ＲＲ  ０．６８、９５％  ＣＩ：０．４９−０．９４）。進行した病期のＣＲＣ（ＩＩＩ期またはＩＶ期）を発生するリスクは、ＫＲＡＳ遺伝子型によって影響されなかった（ＲＲ  ＩＩＩ期：１．０２、９５％  ＣＩ：０．６８−１．５３；ＲＲ  ＩＶ期：１．１５、９５％  ＣＩ：０．６３−２．０９）。
【０３３５】
実施例５：ＫＲＡＳバリアント、転移性結腸直腸がんにおける患者転帰、および処置に対する応答
材料および方法
患者の特徴付け：総数５５９人のｍＣＲＣ患者（ルーヴェン大学病院（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｖｅｎ）において抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法および化学療法と組み合わせたＭｏＡｂで処置された３００人、ならびにセツキシマブベースのサルベージ組み合わせ化学療法（Ｄｅ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２）で処置されたパリ第５大学（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｐａｒｉｓ  Ｄｅｓｃａｒｔｅｓ）からの１４８人の患者、およびフルオロピリミジン、イリノテカン、およびオキサリプラチン含有計画（Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２（１）：１０４−１０９；Ｌｅｎｚ  ＨＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；２４（３０）：４９１４−４９２１）に失敗後、セツキシマブ単剤療法で処置された１１１人の以前に公開された（Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２（１）：１０４−１０９）ｍＣＲＣ患者）は、ＫＲＡＳバリアント多型の分析に利用可能であり、かつ分析に耐えられる組織を有した。上記患者集団におけるＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ遺伝子の変異状態は、公的に利用可能である（Ｄｅ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２；Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２（１）：１０４−１０９）。上記分子特徴付けはＯＲＲ、ＰＦＳ、およびＯＳに相関した。研究に入った５５９人のｍＣＲＣ患者から、ＫＲＡＳ  ３’−ＵＴＲ  ＬＣＳ６バリアントを、他の分子試験からの利用可能なＤＮＡの枯渇に起因して５１２人において決定した。
【０３３６】
遺伝的分析：患者の標本からのホルマリン固定のパラフィン包埋正常組織を肉眼的にメスの刃を用いて切開し、ＤＮＡを以前に記載されたように（Ｄｅ  ＲＷ，  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２；Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２（１）：１０４−１０９）単離した。ＤＮＡを、以前に記載されたように（Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１０）、フォワードプライマー：５’−ＧＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＧＡＡ−３’（配列番号２８）、リバースプライマー：５’−ＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＴ  Ｔ−３’（配列番号２９）、ＶＩＣレポータープローブ：５’−ＣＴＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＣＣＣＡ  Ｃ−３’（配列番号３０）、およびＦＡＭ  レポータープローブ：５’−ＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号３１）を用いて、ＫＲＡＳバリアント（ｒｓ６１７６４３７０）のＴ対立遺伝子またはバリアントＧ対立遺伝子を同定するために特異的に設計された特注のＴａｑｍａｎ遺伝子型決定アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて増幅した。ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異状態を以前に記載されたように（Ｄｅ  ＲＷ，  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；  １１（８）：７５３−７６２；  Ｚｈａｎｇ  Ｗ，  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；  ２２（１）：１０４−１０９）決定した。
【０３３７】
細胞系研究：ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）（ＨＣＣ２９９８）を有する細胞系、および対立遺伝子がなく、ＫＲＡＳ腫瘍獲得変異（ＨＴ−２９）がない細胞系を、単独かまたはセツキシマブと組み合わせた化学療法での処置の影響を評価するために研究した。細胞系をセツキシマブ（１００ｎＭ）、または、なし、およびイリノテカンの希釈物（１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ）で処理した。細胞をプレートし、プレート後、薬剤で２４時間処理し、培地を２４時間の曝露後に交換し、その後生存率を、ＭＴＴアッセイを用いて４８時間後にスコア付けした。
【０３３８】
統計解析：遺伝子型の分布を、ハーディ−ヴァインベルク平衡について検定し、カイ二乗検定はｐ＝０．８であった。ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子についての同型接合体の低頻度に起因して、ＫＲＡＳバリアント対立遺伝子について、異型接合（ＴＧ）または同型接合（ＧＧ）のいずれかである患者のサンプルを、ＬＣＳ６（ＫＲＡＳバリアントまたはＧ対立遺伝子）に対して陽性であると考え、少なくとも１つのＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）遺伝子型の１群として分析に入れた。ＰＦＳおよびＯＳを、以前に記載されたように（Ｄｅ  ＲＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；１１（８）：７５３−７６２；Ｚｈａｎｇ  Ｗ，ａｌ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；２２（１）：１０４−１０９）測定した。
【０３３９】
両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）フィッシャーの正確検定を、野生型（ｗｔ）ＴＴ遺伝子型の保有者と少なくとも１つのＧ対立遺伝子の遺伝子型（ＴＧおよびＧＧ）の保有者との間の割合を比較するために使用した。ＰＦＳおよびＯＳを、カプラン−マイヤー方法を使用して見積もり、それらと遺伝子型との関連性を、ログランク検定を使用して検定した。遺伝子型と客観的な応答との関連性を、分割表およびフィッシャーの正確検定によって決定した。ＫＲＡＳバリアントの可能な影響を完全に探索するために、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ遺伝子（二重野生型集団）において、およびＫＲＡＳバリアント集団において変異を含まない患者において、分析を全ｍＣＲＣ集団において行った。有意性のレベルを、０．０５未満の両側ｐ値に設定した。全ての統計学的検定を、統計パッケージＳＰＳＳバージョン１３を用いて行った。
【０３４０】
結果
全体の患者コホートにおけるＫＲＡＳ  ＬＣＳ６：これらの５１２人のｍＣＲＣ患者において、４０３人の、野生型ＬＣＳ６  ＴＴ遺伝子型の保有者（７２％）、１０２人（１８％）の、異型接合のＫＲＡＳバリアントＴＧ対立遺伝子の保有者、７人（１．３％）の同型接合のＫＲＡＳバリアントＧＧ対立遺伝子の保有者、従って、１０９人（１９．５％）の、少なくとも１つのＧ対立遺伝子遺伝子型の保有者が存在した。コドン１２、１３、および６１におけるＫＲＡＳ変異が、１８４人の患者（３３％）において見出され、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅは２９人の患者（５．３％）において見出された。全ての患者は、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂベースのサルベージ処置を受けていた（１６９人は、単剤療法として、３３７人は、化学療法と組み合わせて）。診断時の性別および年齢について、統計学的有意差は、ＫＲＡＳ野生型保有者とＫＲＡＳバリアント保有者との間に見出されなかった。５５９人の患者の特徴付けは、以前に公開されている（Ｄｅ  ＲＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；  １１（８）：７５３−７６２；  Ｚｈａｎｇ  Ｗ，  ａｌ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１１；  ２２（１）：１０４−１０９）。
【０３４１】
表３０に示されるように、ＫＲＡＳ遺伝子型の分布は、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異を含む患者の中で異なった。特に、少なくとも１つのＧバリアント対立遺伝子遺伝子型の百分率がＫＲＡＳ野生型および変異体群（各２０％）内で等しく分布した一方で、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）は、野生型の群（２０％）と比較して、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異した群（４０％）において２倍の頻度であり、統計学的有意差をもたらした（フィッシャーの正確検定  ｐ＝０．０３０）。
【０３４２】
【表３０】
2013212052.tif 000044
全体の患者コホートにおける転帰および生存率分析：全体としてのコホートにおいて、ＰＦＳおよびＯＳ情報、ならびにＬＣＳ６遺伝子型決定（それぞれ、ｎ＝５１０および５０３）を有する患者について、ＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者とＬＣＳ６  Ｇバリアント（ＫＲＡＳバリアント）遺伝子型保有者との間のメジアンＰＦＳおよびＯＳに関して、有意差は検出されなかった（図１８Ａおよび１８Ｂ）。同様に、ＰＦＳおよびＯＳにおける差は、二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型またはＫＲＡＳバリアント患者コホートにおいて観察されなかった。さらに、全体および二重野生型患者のコホートにおいて、ＫＲＡＳバリアント保有者と野生型保有者との間で、応答（ｎ＝４８３）および皮膚発疹（ｎ＝３５９）に関して、有意な相関は観察されなかった（表３１）。
【０３４３】
【表３１】
2013212052.tif 000045
処置に相関する無増悪生存率分析：ｍｏＡｂ単剤療法およびｍｏＡｂ組み合わせ療法を受けた患者を個別に分析した。ＬＣＳ６  ＳＮＰ遺伝子型決定および処置施与について評価可能である５０１人の患者のうち１６０人（３２％）が単剤療法として抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂを受けた。単剤療法の患者のうち、１２８人（８０％）がＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型の保有者であり、３２人（２０％）がＬＣＳ６  Ｇバリアント遺伝子型の保有者であった。複数の化学療法の組み合わせを受けた３４１人（６８％）の患者が存在した。組み合わせ処置の患者のうち、２６６人（７８％）がＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型の保有者であり、７５人（２２％）が、ＬＣＳ６少なくとも１つのＧバリアント遺伝子型の保有者であった。
【０３４４】
全単剤療法患者集団のメジアンＰＦＳは、１０．４３週間（９５％  ＣＩ：７．７３〜１３．１２週間）であり、統計学的有意差（ｐ＝０．０１９、ログランク検定）がＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者（７．８５週間（９５％  ＣＩ：３．８９７〜１１．８１７週間））とＬＣＳ６  Ｇバリアント（ＫＲＡＳバリアント）遺伝子型保有者（１６．８６週間（９５％  ＣＩ：１０．２〜２３．５１週間））との間で観察された（図１９Ａ）。全組み合わせ療法患者の集団のメジアンＰＦＳは、１８週間（９５％  ＣＩ：１５．８７〜２０．１２週間）であり、ＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者（１８．４３週間（９５％  ＣＩ：１６．１６〜２０．６９週間））とＬＣＳ６  Ｇバリアント遺伝子型保有者（１８週間（９５％  ＣＩ：９．９７〜２６．０２週間））との間で統計学的有意差は観察されなかった（ｐ＝０．７６０、ログランク検定）（図１９Ｂ）。ｍｏＡｂ療法［１６．８６週間、（９５％  ＣＩ：８．５５〜２５．１８週間）］対組み合わせ療法［１８週間、（９５％  ＣＩ：１３．３７〜２２．６４週間）］を受けたＫＲＡＳバリアント患者についてのＰＦＳ間で有意差は存在しなかった（ｐ＝０．２９１、ログランク検定）（図１９Ｃ）が、非ＫＲＡＳバリアント患者について、対組み合わせ療法（１９．２９週間、（９５％  ＣＩ：１７〜２１．５８週間）に対してｍｏＡｂ単剤療法（７．８６週間、（９５％  ＣＩ：３．９−１１．８２週間））についてＰＦＳ間で化学療法の追加での有意な利益が存在した［ｐ＜０．０００１、ログランク検定］（図１９Ｄ）。注目すべきことに、単剤療法の療法で処置されたＫＲＡＳバリアント患者対組み合わせ療法で処置された非ＫＲＡＳバリアント患者との間で、ＰＦＳにおける有意差は存在しなかった。
【０３４５】
二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型患者の集団において、単剤療法患者のメジアンＰＦＳは、１２週間（９５％  ＣＩ：８．３８〜１５．６１週間）であり、統計学的有意差（ｐ＝０．０３９、ログランク検定）は、ＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者（１０．４３週間（９５％  ＣＩ：６．７４〜１４．１１週間））とＬＣＳ６  Ｇバリアント遺伝子型保有者（１８週間（９５％  ＣＩ：５．１６〜３０．８３週間））との間で再び観察された（図２０Ａ）。二重野生型患者の集団において、組み合わせ療法患者のメジアンＰＦＳは、２８．７１週間（９５％  ＣＩ：２４．９８〜３２．４３週間）であり、統計学的有意差（ｐ＝０．３９、ログランク検定）は、ＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者（２８．３週間（９５％  ＣＩ：２４．１５〜３２．４５週間））とＬＣＳ６  Ｇバリアント遺伝子型保有者（２８．８５週間（９５％  ＣＩ：１４．８２〜４２．８７週間））との間で観察されなかった（図２０Ｂ）。組み合わせ療法［２８週間、（９５％  ＣＩ：１４．８３〜４２．８７週間）］と比較して、ｍｏＡｂ単剤療法［２３週間、（９５％  ＣＩ：９．５〜３６．５週間）］を受けたＬＣＳ６バリアント患者についてのＰＦＳ間で有意な改善は存在しなかった（ｐ＝０．０９６、ログランク検定）（図２０Ｃ）が、非ＬＣＳ６患者［ｐ＜０．０００１、ログランク検定］について、組み合わせ療法（２８．７１週間、（９５％  ＣＩ：２４．８〜３２．６週間））と比較してｍｏＡｂ単剤療法（１０．４３週間、（９５％  ＣＩ：６．７５〜１４．１５週間））についてのＰＦＳ間では存在した（図２０Ｄ）。ｍｏＡｂ単剤療法を受けているＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）患者と組み合わせ療法を受けている非ＫＲＡＳバリアント患者との間のＰＦＳで差はなかった。
【０３４６】
処置に相関する全生存率分析：全単剤療法患者の集団のメジアンＯＳは、３３．１４週間（９５％  ＣＩ：２６．７０〜３９．５７週間）であり、ＬＣＳ６野生型ＴＴ  遺伝子型保有者（２８．８５週間（９５％  ＣＩ：２２．５３〜３５．１８週間））とＬＣＳ６  Ｇバリアント遺伝子型保有者（４５週間（９５％  ＣＩ：３５．０２〜５４．９７週間））との間で統計学的有意差は観察されなかった（ｐ＝０．１３９、ログランク検定）（図２１Ａ）。全組み合わせ療法患者の集団のメジアンＯＳは、４４週間（９５％  ＣＩ：４０．１１〜４７．８８週間）であり、ＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者（４４週間（９５％  ＣＩ：４０．０６〜４７．９３週間）とＬＣＳ６少なくとも１つのＧバリアント遺伝子型保有者（４３週間（９５％  ＣＩ：２９．８〜５６．２週間）との間で統計学的有意差は観察されなかった（ｐ＝０．７５９、ログランク検定）（図２１Ｂ）。再度、ｍｏＡｂ単剤療法［４５週間、（９５％  ＣＩ：３５〜５５週間）］対組み合わせ療法［４３週間、（９５％  ＣＩ：２９．８〜５６．２週間）］を受けたＫＲＡＳバリアント患者についてのＯＳ間で有意な改善は存在しなかった（ｐ＝０．５７４、ログランク検定）（図２１Ｃ）が、非ＫＲＡＳバリアント患者［ｐ＜０．０００１、ログランク検定］について、ｍｏＡｂ単剤療法（２８．８６週間、（９５％  ＣＩ：２２．５３〜３５．１８週間）対組み合わせ療法（４４週間、（９５％  ＣＩ：４０〜４７．９３週間））についてのＯＳ間で化学療法追加の利益が存在した（図２１Ｄ）。再度、単剤療法で処置されたＬＣＳ６  Ｇバリアント保有者と組み合わせ療法で処置された非ＫＲＡＳバリアント保有者との間のＯＳにおける有意差は存在しなかった。
【０３４７】
二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型患者の集団において、単剤療法患者のメジアンＯＳは、３７週間（９５％  ＣＩ：３０．８２〜４３．１７週間）であり、統計学的有意差（ｐ＝０．０８７、ログランク検定）に対するトレンドを、ＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者（３５．７１週間（９５％  ＣＩ：３２．０３〜３９．４週間））とＬＣＳ６少なくとも１つのＧバリアント遺伝子型保有者（５５．４３週間（９５％  ＣＩ：３６．９８〜７３．８７週間））との間で観察した（図２２Ａ）。二重野生型患者の集団において、組み合わせ療法患者のメジアンＯＳは、５５週間（９５％  ＣＩ：４８．３〜６１．７週間）であり、ＬＣＳ６野生型ＴＴ遺伝子型保有者（５７週間（９５％  ＣＩ：４９．４〜６４．６週間））とＬＣＳ６少なくとも１つのＧバリアント遺伝子型保有者（５４週間（９５％  ＣＩ：４５．４６〜６２．５３週間））との間で統計学的有意差は観察されなかった（ｐ＝０．６４９、ログランク検定）（図２２Ｂ）。ｍｏＡｂ単剤療法［５５．４３週間、（９５％  ＣＩ：３７〜７３．８７週間）］対組み合わせ療法［５４週間、（９５％  ＣＩ：４５．４７〜６２．５４週間）］を受けたＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）患者についてのＯＳ間で有意な改善は存在しなかった（ｐ＝０．７０５、ログランク検定）（図２２Ｃ）が、非ＫＲＡＳバリアント患者［ｐ＜０．０００１、ログランク検定］について、組み合わせ療法（５７週間、（９５％  ＣＩ：４９．４〜６４．６週間））と比較したｍｏＡｂ単剤療法（３５．７１週間、（９５％  ＣＩ：３２〜３９．４週間））についてのＯＳ間では存在した（図２２Ｄ）。組み合わせ療法で処置された非ＬＣＳ６  保有者と、単剤療法で処置された二重野生型患者ＫＲＡＳバリアント保有者との間で有意差は存在しなかった。
【０３４８】
ＬＣＳ６バリアントは、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異した患者においての予後徴候である。ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ変異した患者の集団において、ＰＦＳおよびＯＳに関する統計学的有意差は、抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂ単剤療法および化学療法と組み合わせての両方で処置された患者において観察されなかった（データ示さず）。メジアンＰＦＳ時間は、ＫＲＡＳバリアント患者と非ＫＲＡＳバリアント患者との間で同一であり、ｍｏＡｂ単剤療法［６週間、（９５％  ＣＩ：０〜１３．２５週間）］対組み合わせ療法［１２週間、（９５％  ＣＩ：６．４５〜１７．５６週間）］を受けたＫＲＡＳバリアント患者についてのＰＦＳ間での有意な改善はなかった（ｐ＝０．６４１、ログランク検定）（図２３Ａ）。非ＫＲＡＳバリアント患者［ｐ＜０．０００１、ログランク検定］について、ｍｏＡｂ単剤療法（６週間、（９５％  ＣＩ：４．４６〜７．５３週間）対組み合わせ療法（１２週間、（９５％  ＣＩ：９．７２〜１４．２８週間）についてのＰＦＳ間において有意な改善が存在した（図２３Ｂ）。ＯＳについて、ｍｏＡｂ単剤療法［２８．４３週間、（９５％  ＣＩ：９．４７〜４７．３９週間）］対組み合わせ療法［２３週間、（９５％  ＣＩ：１０．８〜３５．１９週間）］を受けたＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）患者についてのＯＳ間で有意差は存在しなかった（ｐ＝０．３０３、ログランク検定）（図２３Ｃ）が、非ＫＲＡＳバリアント患者［ｐ＝０．００２、ログランク検定］について、組み合わせ療法（３１週間、（９５％  ＣＩ：２５．６５〜３６．３４週間））と比較してｍｏＡｂ単剤療法（２１．２９週間、（９５％  ＣＩ：１５〜２７．５５週間））についてのＯＳ間では存在した（図２３Ｄ）。
【０３４９】
ＫＲＡＳバリアントおよび応答：応答およびＫＲＡＳバリアント遺伝子型決定の両方について評価可能である４８３人の患者の全集団から、１４７人（３０．４％）が、単剤療法として抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂを受け、３３６人（６９．６％）が複数の化学療法の組み合わせを受けた。単剤療法群において、１２３人（８３．６％）の患者は、非応答者（ＳＤおよびＰＤ）（１０４人がＬＣＳ６野生型、１９人がＬＣＳ６バリアント（ＫＲＡＳバリアント）保有者）であり、２４人（１６．４％）が応答者（ＰＲおよびＣＲ）（１３人がＬＣＳ６野生型および１１人がＬＣＳ６バリアント（ＫＲＡＳバリアント）保有者）であった。応答者および非応答者群における野生型の遺伝子型の保有者の分布とＫＲＡＳバリアント遺伝子型の保有者の分布との間で、統計学的有意差が観察された（フィッシャーの正確検定  ｐ＝０．００２）。化学療法との組み合わせ群において、２５２人（７５％）の患者が、非応答者（ＳＤおよびＰＤ）であり、８４人（２５％）が応答者（ＰＲおよびＣＲ）であった。野生型の遺伝子型の保有者とＫＲＡＳバリアント遺伝子型保有者との間で統計学的有意差は観察されなかった（それぞれ１９７人対５５人の非応答者および６６人対１８人の応答者）（フィッシャーの正確検定  ｐ＝１）。
【０３５０】
２７０人の二重（ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ）野生型集団において、９０人（３３．３％）が単剤療法として抗ＥＧＦＲ  ｍｏＡｂを受け、１８０人（６６．６％）が、複数の化学療法の組み合わせを受けた。単剤療法群において、７１人（７８．８％）の患者は、非応答者（ＳＤおよびＰＤ）（６０人がＬＣＳ６野生型、および１１人がＬＣＳ６バリアント（ＫＲＡＳバリアント）保有者）であり、１９人（２１．２％）が応答者（ＰＲおよびＣＲ）（１０人がＬＣＳ６野生型、および９人がＬＣＳ６バリアント（ＫＲＡＳバリアント）保有者）であった。応答者および非応答者群における野生型の遺伝子型の保有者の分布とＫＲＡＳバリアント遺伝子型の保有者の分布との間で、統計学的有意差が観察された（フィッシャーの正確検定  ｐ＝０．０１０）。化学療法との組み合わせ群において、１０２人（５６．６％）の患者は、非応答者（ＳＤおよびＰＤ）であり、７８人（４３．４％）は応答者（ＰＲおよびＣＲ）であった。野生型の遺伝子型の保有者とＫＲＡＳバリアント遺伝子型保有者との間で統計学的有意差は観察されなかった（それぞれ、８１人対２１人の非応答者、および６２人対１６人の応答者）（フィッシャーの正確検定  ｐ＝１）。
【０３５１】
ｍｏＡｂ単剤療法および組み合わせ療法ならびにＬＣＳ６バリアントの影響の細胞系研究：ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）が、追加の細胞毒性療法に何の利益もなく、ｍｏＡｂ単剤療法に対する応答を予測することを確認するために、ＬＣＳ６  Ｇバリアントを有する、または有さない結腸がん細胞系における単剤療法対組み合わせ療法の影響を評価した。非ＫＲＡＳバリアント細胞系において、細胞毒性療法（照射ならびにイリノテカン化学療法の両方）へのセツキシマブの追加が、細胞毒性療法単独と比較して、細胞死を増加させたことを発見した。対照的に、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）を有する細胞系において、細胞毒性療法へのセツキシマブの追加による追加の細胞殺傷は存在せず、照射の場合、実際には、セツキシマブが添加されたときにより高い細胞生存率が存在した。これらの知見は、ＫＲＡＳバリアント（Ｇ対立遺伝子）保有者においては、セツキシマブと細胞毒性療法との組み合わせには利益がないという本発明者らのインビボでの知見と矛盾していない。
【０３５２】
他の実施形態
本開示は、その詳細な説明と共に記載されるが、先行する記載は、説明することを意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される、本開示の範囲を限定することを意図しない。他の局面、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０３５３】
本明細書中で参照された特許および特定の文献は、当業者に利用可能である知識を確立する。本明細書中に引用される全ての米国特許、および公開または非公開の米国特許出願は、参考として援用される。本明細書中に引用される全ての公開された外国の特許および特許出願は、本明細書により参考として援用される。本明細書中に引用される、受託番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩ提出物は、本明細書により参考として援用される。本明細書中に引用される全ての他の公開された参考文献、文書、原稿、および科学的文献は、本明細書により参考として援用される。
【０３５４】
この開示は、その好ましい実施形態に対する参考文献を用いて特に示され、記載されているが、そこにおける形式および詳細における種々の変化が、添付の特許請求の範囲によって包含される開示の範囲から外れることなくなされ得ることが当業者によって理解される。
【図６】
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【図７】
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【図１３】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図２４Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
2013212052.tif 000079
【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
2013212052.tif 000083
【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
2013212052.tif 000085
【図２４Ａ】
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【配列表】
2013212052000001.app
【外国語明細書】
2013212052000001.pdf