(57)【要約】【課題】ミュータンス菌などの病原菌ＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬を高速で簡便にスクリーニング可能な病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムを提供する。【解決手段】本発明の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムは、大腸菌ＡＴＰ合成酵素の発現プラスミドｐＢＷＵ１３から膜内在性ｃサブユニットの遺伝子を除いた第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃと、大腸菌及び病原菌ＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット遺伝子をｐＭＷ２１８ベクターにそれぞれ連結した第２、第３発現プラスミドを構築し、それぞれ形質転換した大腸菌株をコハク酸液体培地に播種して病原菌ＡＴＰ合成酵素に対し選択的に作用する抗菌薬を探索する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌ＡＴＰ合成酵素の全てのサブユニットを発現するプラスミドｐＢＷＵ１３から膜内在性ｃサブユニットの遺伝子を除いた第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃと、
大腸菌及び病原菌のＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット遺伝子をそれぞれｐＭＷ２１８ベクターに連結した第２及び第３発現プラスミドと、を構築する段階を有することを特徴とする病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項２】
前記病原菌は、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）であり、
前記第２及び第３発現プラスミドは、それぞれＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８及びＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８であることを特徴とする請求項１記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項３】
前記第１及び第２発現プラスミドをＡＴＰ合成酵素の全サブユニット遺伝子が欠損した大腸菌ＤＫ８株に導入して、酸化的リン酸化によるＡＴＰ合成を行い、コハク酸培地で増殖可能とし、病原菌のＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット遺伝子が相補できることを確認する段階を有することを特徴とする請求項１又は請求項２記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項４】
前記プラスミドｐＢＷＵ１３を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＳｐｈ  Ｉで切断して、ａサブユニットからδサブユニット遺伝子までを含むＤＮＡの領域をｐＵＣ１８ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉサイトにクローニングする段階、
ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＰＣＲ突然変異誘発）でｃサブユニット遺伝子の前後にＳｐｅ  ＩとＮｇｏＭ  IVサイトを挿入する段階、
前記作製したプラスミドをＳｐｅ  ＩとＮｇｏＭ  IVで切断して平滑末端とし、再度つなぎ合わせてｃサブユニット遺伝子の領域を除去する段階、
このプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉで切断して得たＤＮＡ断片を、ｐＢＷＵ１３のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉサイトに挿入し、第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを得る段階、を有することを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項５】
前記プラスミドｐＢＷＵ１３を鋳型として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）法でｃサブユニット遺伝子の領域を増幅したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１８ベクターのＨｉｎｃ  ＩＩサイトにクローニングして第２発現プラスミドを得る段階をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項６】
前記病原菌ＡＴＰ合成酵素の全ての遺伝子領域をクローニングしたプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法でｃサブユニット遺伝子の領域を増幅したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１８ベクターのＨｉｎｃ  ＩＩサイトにクローニングして第３発現プラスミドを得る段階をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項７】
前記大腸菌ＤＫ８株のコンピテントセルにＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット以外を発現する第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを形質転換し、プラスミドを保持しているクローンを培養してＤＫ８Δｃ株を得る段階、
前記ＤＫ８Δｃ株のコンピテントセルを作製し、大腸菌のｃサブユニットを発現する第２発現プラスミドあるいは病原菌のｃサブユニットを発現する第３発現プラスミドを形質転換してそれぞれ２つの試験用大腸菌株を作製する段階、をさらに有することを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項８】
前記病原菌は、ミュータンス菌であり、
前記２つの試験用大腸菌株は、それぞれＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株、及びＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株であることを特徴とする請求項７記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項９】
前記病原菌のｃサブユニットを形質転換した時にコハク酸寒天培地で増殖し、病原菌のｃサブユニットが大腸菌ｃサブユニットの機能を相補できることを確認する段階をさらに有することを特徴とする請求項７又は請求項８記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【請求項１０】
前記形質転換した一方の大腸菌株を播種したコハク酸液体培地に、有効性を検討する化合物溶液を添加し、増殖の指標として濁度を測定し、増殖が阻止される薬剤の濃度を検討する実験を行うとともに、
比較対象として、前記他方の大腸菌株についても同様の測定実験を行い、病原菌のＡＴＰ合成酵素に対して選択的に作用する抗菌薬を探索する段階をさらに有することを特徴とする請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰ合成酵素を欠損した大腸菌に、病原菌のＡＴＰ合成酵素を発現させ、これを用いて病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬をスクリーニングするシステムに関し、特に病原菌ＡＴＰ合成酵素のｃサブユニットを大腸菌酵素のｃサブユニットと置き換えた発現系を構築する段階を含む病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＰ合成酵素は、呼吸鎖複合体によって形成されたプロトン濃度勾配と膜電位からなるプロトン駆動力を用いて、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）とリン酸からＡＴＰ（アデノシン三リン酸）  の合成を行う酵素であり、逆反応であるＡＴＰ分解を触媒するＡＴＰアーゼの一種である。ＡＤＰは、アデニン、リボース、及び二つのリン酸分子からなる化学物質である。リン酸は、高エネルギーリン酸結合をしており、ＡＴＰからＡＤＰとリン酸に分かれる際に放出されるエネルギーは生体内での主要なエネルギー源となっている。
【０００３】
ＡＴＰアーゼのすべてが生物のＡＴＰ合成に用いられるわけではなく、ＡＴＰアーゼのうちイオン輸送性ＡＴＰアーゼの一群がＡＴＰ合成酵素を含んでいる。イオン輸送性ＡＴＰアーゼは、  ほとんどの生物によってＡＴＰ合成に用いられるＦ型ＡＴＰアーゼ、イオンの能動輸送に用いられるＡＴＰ消費型であるＰ型ＡＴＰアーゼ、  液胞  （ｖａｃｕｏｌｅ）  に存在してプロトンの能動輸送に用いられるV型ＡＴＰアーゼ、  古細菌の用いるＡＴＰ合成酵素であるＡ型ＡＴＰアーゼの四つに分類される。イオン輸送性ＡＴＰアーゼは、そのすべてが電気化学的ポテンシャルを用いたＡＴＰの合成が可能である。しかし、上記イオン輸送性ＡＴＰアーゼの中で、生物がＡＴＰの合成に用いているのはＦ型及びＡ型であり、Ｆ型ＡＴＰアーゼはほぼ全生物が所持するＡＴＰ合成酵素の代表的なものである。
【０００４】
ＡＴＰ合成酵素は、細菌から真核細胞（生物）まで広く分布しており、真核生物ではミトコンドリア内膜や葉緑体チラコイド膜に、原核生物では細胞膜にそれぞれ存在しており、呼吸鎖複合体と共役している。電子顕微鏡によりミトコンドリア内膜の内側にキノコ状の構造体としてＡＴＰ合成酵素が確認できる。
【０００５】
ＡＴＰ合成酵素の構造がよく判っているのはＦ型ＡＴＰアーゼのみである。Ｆ型ＡＴＰアーゼは、Ｆｏ（エフオー）とＦ１（エフワン）の２つの部位からなり、それぞれの部位のサブユニット名及びその数は以下の通りである（原核生物型）。
Ｆ１部位：α（３個）、β（３個）、γ（１個）、δ（１個）、ε（１個）
Ｆｏ部位：ａ（１個）、ｂ（２個）、ｃ（９〜１２個、不定）
真核生物のＦ型ＡＴＰアーゼには、Ｆ１部位のサブユニットとしてα、β、γ、δ、εと阻害因子（ＩＦ）が存在し、Ｆｏ部位には最大で１０種類のサブユニットが存在するといわれている。
【０００６】
Ｆ１部位は、εサブユニットを基部としてγサブユニットが幹状に結合し、その周囲をα及びβサブユニットが囲うように交互に配置されており、γサブユニットを幹とすれば、α、βは葉の部分に相当する。δサブユニットは、α、βサブユニットの頂点に位置しており、Ｆ１部位のαとβサブユニットをＦｏ部位のｂサブユニットに固定していると思われる。Ｆ１部位は、活性を保ったまま界面活性剤なしで可溶化することが可能であり、実験が行い易い。Ｆ１部位は立体構造が１９９４年にＷａｌｋｅｒらによって決定されており、その反応機構も明らかになっている。
【０００７】
Ｆｏ部位は、膜を貫通しており、ｃサブユニットがリング状に配置され、ａサブユニットがその横に位置して、ｂサブユニットの基部となっている。ｂサブユニットは、Ｆ１部位のδサブユニットと結合しＦ１部位を固定していると考えられている。Ｆｏ部位は膜貫通型であるために活性型が得られにくく、界面活性剤で可溶化しても元の性状を保てないことが多いため、未だ立体構造は不明でサブユニット構成もはっきりしない。
【０００８】
Ｆ１部位はＡＴＰ合成と分解の活性中心があり、その反応は次式で表される。
【化１】
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Ｆ１部位の活性中心ではＡＴＰの合成及び分解を両方向に触媒することが可能である。
【０００９】
一方、Ｆｏ部位はプロトンを透過させる機能があり、次式で表される。
【化２】
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プロトン電気化学的ポテンシャルを用いたＡＴＰ合成の反応は次の収支式で表される。
【化３】
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プロトンが３分子通過するごとに、１分子のＡＴＰの合成が行われる。この反応は逆反応も可能であり、ＡＴＰの分解エネルギーを用いて、Ｈ＋を膜外に能動輸送することも可能である。
【００１０】
ＡＴＰ合成酵素がＡＴＰの合成を生物体内で行っていることは古くから知られていたが、その反応素過程は分子生物学など生物学的学問が目覚しく発展した極最近に明らかになりつつある。ＡＴＰ合成酵素の反応素過程を説明する革新的な説として、ポール・ボイヤーと吉田賢右による「回転触媒仮説」が挙げられる（１９９７年、ネイチャー  ｖｏｌ．  ３８６，ｐｐ．２９９〜３０２参照）。
【００１１】
ＡＴＰ合成の素過程は、以下のようなモデルが提唱されている。
（１）カラ型βサブユニットは「開いた」構造をとっている。
（２）１個目のプロトンがＦｏ部位を通過する（ｏｕｔからｉｎに）。
（３）Ｆｏ部位は細胞内側から見て１２０°左回転を行う。
（４）それに伴い、Ｆｏ部位に結合したＦ１部位も１２０°の左回転を行う。
（５）そのときＡＤＰがβサブユニットに入ることにより「閉じた」構造へ変化する。
（６）２個目のプロトンがＦｏ部位を通過し、さらに１２０°回転する。
（７）回転した  Ｆ１  部位にてβサブユニットに入ったＡＤＰにリン酸化反応が起きる。
（８）３個目のプロトンがＦｏ部位を通過し、さらに左１２０°回転する。
βサブユニットは「開いた」構造をとり、ＡＴＰを放出してカラ型の（１）に戻る。
【００１２】
このように、３個のプロトンがＦｏ部位をｏｕｔからｉｎに通過する毎に、Ｆ１部位がＡＤＰのリン酸化を行う。現時点ではＦ１部位の回転は再現よく確認されているが、Ｆｏ部位の回転はいまだ確認されていない。しかし，ｃサブユニットの立体構造から回転子であることが提案されており、おそらく回転していると考えられている。また、逆反応については、Ｆ１部位の細胞内側から見て右回転がＦｏ部位に伝わり、ＡＴＰ合成酵素全体が右回転する仕組みとなっていると考えられている。
【００１３】
１２０°の回転を行うことは一分子観測の実験でも確認されており、例えば２０ｎｍｏｌ／Ｌの低濃度のＡＴＰ存在下ではアクチンフィラメントが１２０°毎に回転している様子が観察されている。また、ＡＴＰ合成酵素が「間違えて逆回転する」現象も観察されている。
【００１４】
ＡＴＰ合成酵素に対する理解は極めて進んだとされているが、幾つかの点が明らかになっていない。Ｆｏ部位の構造解析、反応素過程が現時点での課題ともいえる。
【００１５】
本発明者は、ＡＴＰ合成酵素を欠損した大腸菌に、病原菌のＡＴＰ合成酵素を発現させることができれば、大腸菌の増殖を指標に、病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬を高速で簡便にスクリーニングすることが可能となることに着目した。特に、虫歯の原因菌で、さらに細菌性心内膜炎を引き起すことが知られているミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ：ミュータンス菌と略称）に対し、ＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬の開発スクリーニングシステムを構築すべく注力し、研究蓄積を図ってきた（非特許文献１参照）。図１１に大腸菌ＦｏＦ１の構造を模式的に示す。
【００１６】
Ｆｏのｃサブユニットには２回の膜貫通ヘリックスがあり，ヘリックス同士をつなぐ中央部分は細胞質側を向いている。γとεサブユニットを結合したｃサブユニットのリングが回転子として、他のサブユニットでできている固定子に対して回転することが示唆されている。ｃサブユニットリングの回転が、細胞膜の一方の側から他方の側へのプロトン輸送に必須と推定されているが、プロトン輸送の分子機構はＡＴＰ合成・分解の触媒機構に比べると詳細は明らかではない。プロトン輸送に関与する残基としてｃサブユニットのＡｓｐ−６１とａサブユニットのＡｒｇ−２１０が同定されている。
【００１７】
現在，多くの細菌のＡＴＰ合成酵素のサブユニット遺伝子の配列が決定され、それら配列情報が登録されている。代表的な細菌のｃサブユニットの配列を比較するため並べて図１２に示す。
【００１８】
ｃサブユニットの２回の膜貫通ヘリックス（ＴＭ１とＴＭ２）は細胞質を向く中央のリンカー配列により連結され、サブユニット全体としては丁度ヘアピンのような構造をとっている。リンカー配列に存在する保存された残基は、図１２の囲みで示す配列の通り、Ｆ１の結合に関与するものと推定されている。一方、ｃサブユニットの２番目の膜貫通領域（ＴＭ２）に存在する保存された酸性残基は、プロトン輸送に必須の残基である。大腸菌などではＡｓｐ残基であるが、他の多くの種ではＧｌｕ残基となっている。
【００１９】
図１２から明らかなように、大腸菌（Ｅｃｏ）やねずみチフス菌（Ｓｔｍ）、赤痢菌（Ｓｆｌ）のｃサブユニットには、ＴＭ１及びＴＭ２の両膜貫通領域にＡｓｐ残基以外の親水性残基は存在せず、最も疎水的である。
【００２０】
これに対して、他の細菌種のｃサブユニットでは，膜貫通領域のＴＭ１やＴＭ２に親水性残基が散在する。例えばマイコプラズマ（Ｍｐｎ）では、Ｇｌｕ残基のほかにＳｅｒ残基が６個もＴＭ２に存在する。このように親水的なＴＭ２がどのような機構で膜内に挿入されるのかは、検討すべき課題である．
【００２１】
さらに興味深いのは、保存された酸性残基以外にもＴＭ１やＴＭ２に酸性残基が存在することである。ＴＭ１に酸性残基が余分に存在するのは、７種のバクテリアＬｌａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３）、Ｓｐｒ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６）、Ｓｍｕ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９）、Ｍｔｕ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ）、Ｆｎｕ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、Ｔｍａ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）及びＭａｃ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）である。Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ（Ｃｔｅ）とＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ（Ｔｍａ）には、２個目の酸性残基がＴＭ２に存在する。これらの細菌のＴＭ２に存在する２個の酸性残基は、図１３に示すように、膜内に埋込まれたヘリックス中で近傍に位置する可能性がある。
【００２２】
ＴＭ１やＴＭ２に存在する余分の酸性残基がプロトン輸送やプロトンによる制御に関与しているのかどうかを明らかにすることは、ＡＴＰ合成酵素の作動機構と調節を理解する上にも重要と考えられる。
【００２３】
ｃサブユニットは、複数個がリング状に並んでＦｏを構成している。ｃサブユニットの一次構造の多様性に加え（図１２）、リングを構成するｃサブユニットモノマーの数にも、表１に示すように、多様性がある。
【表１】
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【００２４】
ホウレン草の葉緑体では、１つのリングに１４個のｃサブユニットが存在する。一方、酵母のミトコンドリアでは１０個、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｔａｒｔａｒｉｏｕｓやＰｒｏｐｉｏｎｉｇｅｎｉｕｍ  ｍｏｄｅｓｔｕｍでは１１個、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓでは１５個のｃサブユニットがリング当り存在する。大腸菌ＡＴＰ合成酵素の場合には、構造解析が済んでいないので分子生物学的検討結果によるが、ｃサブユニットのリングは１０個のサブユニットモノマーでできていると推定されている。Ｉ．ｔａｒｔａｒｉｏｕｓやＰ．ｍｏｄｅｓｔｕｍのサブユニット数がＮａ＋を輸送することと関係しているのかどうかは、明らかでない。
【００２５】
ＦｏＦ１はＡＴＰの加水分解エネルギーを利用して、膜内外にプロトンの濃度勾配を形成する。このためＦ型プロトンポンプとも称される。構造的に類似するV型プロトンポンプの場合も、同様のサブユニットがリング状に配置している。Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅでは、２回のヘアピン構造をとるｃサブユニットモノマーが１０個集合してリングを形成している。
【００２６】
しかし、カルボキシ末端側のヘアピンの膜貫通領域にのみプロトン輸送する保存された酸性残基が存在する。古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉでは、大腸菌のｃサブユニットに対応する配列が１３個連結している。すなわち、１３個のヘアピンが連結した１本のポリペプチド鎖がリングを形成しているようで、そのヘアピン１つ１つに保存された酸性残基が存在している。
【００２７】
このようなｃサブユニットの一次構造とリングの多様性は、ＡＴＰ合成酵素が共通の回転機構で作動していても、進化の過程で多様な調節様式を獲得してきていることを示唆している。
【００２８】
ｃサブユニットリングの回転に加え、ｃサブユニットモノマーとａサブユニットそれぞれの膜貫通ヘリックスが互いの軸を中心にして回転することが、プロトン輸送と回転子の回転につながると推定されている。しかし、実際の分子機構の解明には多くの検討が必要である。明らかなのは、ｃサブユニットのＡｓｐ−６１とａサブユニットのＡｒｇ−２１０（大腸菌の残基番号）がプロトン輸送に決定的な役割を担っていることである。
【００２９】
先に述べたように、７種の細菌Ｌｌａ、Ｓｐｒ、Ｓｍｕ、Ｍｔｕ、Ｆｎｕ、Ｔｍａ及びＭａｃでは、ｃサブユニットのＴＭ２に加えてＴＭ１にも酸性残基が存在している（図１２参照）。大腸菌を用いて、ｃサブユニットの２つの膜貫通領域（ＴＭ１及びＴＭ２）にそれぞれ酸性残基が存在するＦｏでは、プロトンがどのように輸送されるのかという点に注目した検討を行っている。
【００３０】
ＴＭ１の酸性残基に相当するＩｌｅ−２８のみならず、Ａｌａ−２４を酸性残基に置換して、表２に示すように、ＡＴＰの加水分解に共役したプロトン輸送が測定された。
【表２】
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【００３１】
ＴＭ１に酸性残基を導入すると（Ａｓｐ−２４／Ａｓｐ−６１、Ａｓｐ−２８／Ａｓｐ−６１、Ｇｌｕ−２８／Ａｓｐ−６１）、反転膜小胞を用いて測定したプロトン輸送はｐＨ依存的になる。すなわち膜小胞の懸濁液のｐＨがアルカリ性よりも中性の方が、プロトン輸送活性が高くなった。さらに、ＴＭ２の酸性残基Ａｓｐ−６１をＴＭ１に移すこともできる。Ａｌａ−２４をＡｓｐ−２４とし、６１番目のＡｓｐ残基をＡｓｎ、Ｇｌｙ又はＳｅｒにした場合もＡＴＰ合成酵素は機能した。しかし、この時のプロトン輸送はｐＨ依存的とはならなかった。
【００３２】
最近、ジアリルキノリンやメフロキン（図１４）に耐性を示す結核菌や肺炎双球菌の遺伝子変異が明らかにされている。興味深いことに、耐性を与える変異はこれら細菌のＡＴＰ合成酵素のｃサブユニットやａサブユニットの遺伝子に起きていた（図１５参照）。しかも、変異した残基はプロトンを輸送するｃサブユニットのＡｓｐ−６１やａサブユニットのＡｒｇ−２１０の近傍に位置していた。
【００３３】
大腸菌では、ｃサブユニットのＡｌａ−２４やＩ−２８が置換すると架橋剤ＤＣＣＤ（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）に対して抵抗性を獲得する。これらの事実は、化学薬品の結合部位がｃサブユニットの２つの膜貫通領域（ＴＭ１とＴＭ２）や、ａサブユニットのカルボキシ末端の２つの膜貫通領域に存在する可能性を示唆している。
【００３４】
Ｆｏのｃサブユニットやａサブユニットのアミノ酸残基が耐性菌で特異的に置換しているという事実は、ＡＴＰ合成酵素、特にそれらのサブユニットが抗菌薬の標的になり得るということを示している。１つの薬剤では耐性菌を生じても、標的が異なる複数の薬剤を用いることで耐性が生じるのを克服することが可能である。結核菌ＡＴＰ合成酵素のｃサブユニットに対するジアリルキノリンの効果は立体特異的であるので、結合部位の解析は医薬品開発のみならず複雑なＡＴＰ合成酵素の構造と機能の解明にも役立つはずである。
【００３５】
そして、最近、結核菌のＡＴＰ合成酵素の場合、膜内在性のサブユニットに抗菌薬が結合して菌の増殖が抑制されることが、報告されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３６】
【特許文献１】特表２００８−５１５３９５号公報
【非特許文献】
【００３７】
【非特許文献１】前田正知、「Ｈ＋輸送性ＡＴＰ合成酵素研究の薬学的新展開」、ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １３０（２）１９１−１９７（２０１０）、２０１０  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
例えば、ミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素の全サブユニット遺伝子を大腸菌ＤＫ８株に発現させ、ＡＴＰ合成酵素として機能させることはできない。また、他の病原菌についてもそのような系はない。一部のサブユニット遺伝子を大腸菌の遺伝子と置き換えて機能するのは、膜表在性のβサブユニット遺伝子である。しかし、８種のサブユニットからなるＡＴＰ合成酵素を、全体で交換することは種が違うためにうまくいかない。
【００３９】
また、他の病原菌についてもＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬の開発スクリーニング系はまだ見当たらない。一部のサブユニット遺伝子を大腸菌の遺伝子と置き換えて機能するのは、膜表在性のβサブユニット遺伝子である。しかし、抗菌薬の標的として注目される膜内在性のサブユニット遺伝子では未だ成功していない。
【００４０】
本発明者は、種々のバクテリアのｃサブユニットに注目し、ｃサブユニットのリング及びａサブユニットを標的とする特異的な阻害薬開発の可能性について研究し、ミュータンス菌の他に、黄色ブドウ球菌、ネズミ結核の原因菌のＡＴＰ合成酵素ｃサブユニットの発現と相補性の検討を行っている。その結果、黄色ブドウ球菌、ネズミ結核の原因菌のｃサブユニットは、大腸菌のｃサブユニットの機能を相補することはできなかった。現在のところ、ミュータンス菌のｃサブユニットが機能を発揮するために必要な配列を同定している。
【００４１】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ミュータンス菌などの病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬を高速で簡便にスクリーニングすることが可能な病原菌のＡＴＰ合成酵素の発現系を構築することを含む病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
上記目的を達成するため、本発明の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムは、大腸菌ＡＴＰ合成酵素の全てのサブユニットを発現するプラスミドｐＢＷＵ１３から膜内在性ｃサブユニットの遺伝子を除いた第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃと、大腸菌及び病原菌のＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット遺伝子をそれぞれｐＭＷ２１８ベクターに連結した第２及び第３発現プラスミドと、を構築する段階を有することを特徴とする。
【００４３】
また、前記病原菌は、ミュータンス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）であり、前記第２及び第３発現プラスミドは、それぞれＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８及びＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８であることを特徴とする。
【００４４】
また、前記第１及び第２発現プラスミドをＡＴＰ合成酵素の全サブユニット遺伝子が欠損した大腸菌ＤＫ８株に導入して、酸化的リン酸化によるＡＴＰ合成を行い、コハク酸培地で増殖可能とし、病原菌のＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット遺伝子が相補できることを確認する段階を有することを特徴とする。
【００４５】
また、前記プラスミドｐＢＷＵ１３を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＳｐｈ  Ｉで切断して、ａサブユニットからδサブユニット遺伝子までを含むＤＮＡの領域をｐＵＣ１８ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉサイトにクローニングする段階、ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＰＣＲ突然変異誘発）でｃサブユニット遺伝子の前後にＳｐｅ  ＩとＮｇｏＭ  IVサイトを挿入する段階、前記作製したプラスミドをＳｐｅ  ＩとＮｇｏＭ  IVで切断して平滑末端とし、再度つなぎ合わせてｃサブユニット遺伝子の領域を除去する段階、このプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉで切断して得たＤＮＡ断片を、ｐＢＷＵ１３のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉサイトに挿入し、第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを得る段階を有することを特徴とする。
【００４６】
また、前記プラスミドｐＢＷＵ１３を鋳型として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）法でｃサブユニット遺伝子の領域を増幅したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１８ベクターのＨｉｎｃ  ＩＩサイトにクローニングして第２発現プラスミドを得る段階をさらに有することを特徴とする。
【００４７】
また、前記病原菌ＡＴＰ合成酵素の全ての遺伝子領域をクローニングしたプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法でｃサブユニット遺伝子の領域を増幅したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１８ベクターのＨｉｎｃ  ＩＩサイトにクローニングして第３発現プラスミドを得る段階をさらに有することを特徴とする。
【００４８】
また、前記大腸菌ＤＫ８株のコンピテントセルにＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット以外を発現する第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを形質転換し、プラスミドを保持しているクローンを培養してＤＫ８Δｃ株を得る段階、前記ＤＫ８Δｃ株のコンピテントセルを作製し、大腸菌のｃサブユニットを発現する第２発現プラスミドあるいは病原菌のｃサブユニットを発現する第３発現プラスミドを形質転換してそれぞれ２つの試験用大腸菌株を作製する段階、をさらに有することを確認する段階をさらに有することを特徴とする。
【００４９】
また、前記病原菌は、ミュータンス菌であり、前記２つの試験用大腸菌株は、それぞれＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株、及びＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株であることを特徴とする。
【００５０】
また、前記病原菌のｃサブユニットを形質転換した時にコハク酸寒天培地で増殖し、病原菌のｃサブユニットが大腸菌ｃサブユニットの機能を相補できることを確認する段階をさらに有することを特徴とする。
【００５１】
さらに、前記形質転換した一方の大腸菌株を播種したコハク酸液体培地に、有効性を検討する化合物溶液を添加し、増殖の指標として濁度を測定し、増殖が阻止される薬剤の濃度を検討する実験を行うとともに、比較対象として、前記他方の大腸菌株についても同様の測定実験を行い、病原菌のＡＴＰ合成酵素に対して選択的に作用する抗菌薬を探索する段階をさらに有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００５２】
本発明によれば、例えば虫歯の原因菌であるミュータンス菌などの病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬を高速で簡便にスクリーニングすることが可能な病原菌のＡＴＰ合成酵素の発現系を構築することにより病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムを提供できる効果がある。
【００５３】
これにより、ＡＴＰ合成酵素を欠損した大腸菌に、他の病原菌のＡＴＰ合成酵素を発現させることにより、大腸菌の増殖を指標に、それらの病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬を高速で簡便にスクリーニングすることが可能となる新規的な医療方法を切り開く端緒となる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の一実施形態の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムの流れを示すフローチャートである。
【図２】図１の病原菌がミュータンス菌である場合のミュータンス菌ＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムの流れを示すフローチャートである。
【図３】図２のミュータンス菌ＡＴＰ合成酵素の全ての遺伝子領域をクローニングする手順を示すフローチャートである。
【図４】本発明に係る一実施形態のミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素の発現系を構築する手順の第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを構築する手順の前半部を概念的に示す構造図である。
【図５】図４に引続き、ミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素の発現系を構築する手順の第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを構築する手順の後半部を概念的に示す構造図である。
【図６】（ａ）は図４のＡＴＰ合成酵素の全てのサブユニットを発現するプラスミドｐＢＷＵ１３、（ｂ）はプラスミドベクターｐＵＣ１８の拡大構造図である。
【図７】図４のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｐｈ  Iで切断したＤＮＡ断片をｐＵＣ１８に組み込み、Ｓｐｅ  Ｉ、  ＮｇｏＭ  IVサイトを挿入したプラスミドＤＮＡの拡大構造図である。
【図８】図７に引続き、図５のＳｐｅ  I−ＮｇｏＭ  IVでｃサブユニットが除去されたプラスミドＤＮＡの拡大構造図である。
【図９】図５の発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃの拡大構造図である。
【図１０】図２における段階Ｓ８〜Ｓ１１の大腸菌及びミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素ｃサブユニットの遺伝子領域をクローニングする詳細な手順を示すフローチャートである。
【図１１】大腸菌ＦｏＦ１の構造を模式的に示す構造図である。
【図１２】代表的な細菌のｃサブユニットの配列比較図である。
【図１３】Ｃ．  ｔｅｐｉｄｕｍ、  Ｅ．  ｃｏｌｉ  及び  Ｍ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｃサブユニットのＴＭ２膜内外へリックスのヘリカルホイール図である。
【図１４】肺炎連鎖状球菌のＡＴＰ合成酵素のＦｏのａ及びｃサブユニットをターゲットとする抑制剤であるジアリルキノリン及びメフロキンの構造図である。
【図１５】病原菌のＡＴＰ合成酵素のＦｏのａ及びｃサブユニットにおける変異によりジアリルキノリン及びメフロキン抵抗が付与される配列図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明のミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムを実施するための形態の具体例を、添付図面を参照しながら説明する。
【００５６】
本発明に係る一実施形態の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムは、図１に示すように、大腸菌ＡＴＰ合成酵素の各サブユニットのうちｃサブユニット以外を発現する第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを構築する段階（Ｓ０１）と、大腸菌ｃサブユニットを発現する第２発現プラスミドを構築する段階（Ｓ０２）と、病原菌ｃサブユニットを発現する第３発現プラスミドを構築する段階（Ｓ０３）と、大腸菌ＤＫ８株に第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃと第２発現プラスミドもしくは第３発現プラスミドをそれぞれ形質転換した複数の試験用大腸菌株を作製する段階（Ｓ０４）と、ＡＴＰ合成酵素ｃサブユニットの相補性を検討する段階（Ｓ０５）と、各種の化合物ライブラリーを用いて、病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬のスクリーニングを行う段階（Ｓ０６）と、を有する。
【００５７】
段階Ｓ０１においては、大腸菌ＡＴＰ合成酵素の発現プラスミドｐＢＷＵ１３から膜内在性ｃサブユニットの遺伝子を除いて第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを得る。
【００５８】
引続き、段階Ｓ０２において、大腸菌のＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット遺伝子をｐＭＷ２１８ベクターに連結して第２発現プラスミドを得る。
【００５９】
次いで、段階Ｓ０３において、病原菌のＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット遺伝子をｐＭＷ２１８ベクターに連結して第３発現プラスミドを得る。
【００６０】
さらに、段階Ｓ０４において、大腸菌ＤＫ８株のコンピテントセルに第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを形質転換し、プラスミドを保持しているクローンを培養してＤＫ８Δｃ株を得る。
【００６１】
そして、ＤＫ８  Δｃ株のコンピテントセルを作製し、第２、第３発現プラスミドのｃサブユニットを発現する発現プラスミドを形質転換して複数の試験用大腸菌株を作製する。
【００６２】
次いで、段階Ｓ０５において、野生型の病原菌  ｃサブユニットを形質転換した時にコハク酸寒天培地で増殖し、野生型の病原菌  ｃサブユニットが第２発現プラスミドから発現した  ｃサブユニットの機能を相補できることを確認する。
【００６３】
次に、段階Ｓ０６において、前記形質転換した大腸菌株の一つを播種したコハク酸液体培地に、有効性を検討する化合物溶液を添加し、増殖の指標として濁度を測定し、増殖が阻止される薬剤の濃度を検討する。
【００６４】
そして、比較対象として、他の大腸菌株についても同様の測定実験を行い、病原菌のＡＴＰ合成酵素に対して選択的に作用する抗菌薬を探索する。
【実施例１】
【００６５】
本発明に係る一実施形態における病原菌がミュータンス菌（以下、Ｓ．ｍｕｔａｎｓと略称する）である場合の実施例１のミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムは、図２に示すように、大腸菌ＡＴＰ合成酵素の各サブユニットのうちｃサブユニット以外を発現する第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを構築する段階（Ｓ０１：Ｓ１〜Ｓ７）と、大腸菌のｃサブユニットを発現する第２発現プラスミドＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８を構築する段階（Ｓ０２：Ｓ８、Ｓ９）と、Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｃサブユニットを発現する第３発現プラスミドＳ．  ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８を構築する段階（Ｓ０３：Ｓ１０、Ｓ１１）と、大腸菌ＤＫ８株に第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃと第２発現プラスミドＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８もしくは第３発現プラスミドＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８を形質転換した試験用大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株を作製する段階（Ｓ０４：Ｓ１２〜Ｓ１３）と、ＡＴＰ合成酵素ｃサブユニットの相補性を検討する段階（Ｓ０５：Ｓ１４）と、各種の化合物ライブラリーを用いて、ミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬のスクリーニングを行う段階（Ｓ０６：Ｓ１５）と、を有する。
【００６６】
〔第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃの構築〕
大腸菌ＡＴＰ合成酵素の各サブユニットのうちｃサブユニット以外を発現する第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを次の手順により構築した（Ｓ０１）。
【００６７】
まず、図２及び図４に示すように、大腸菌ＡＴＰ合成酵素の発現プラスミドｐＢＷＵ１３（Ｍｏｒｉｙａｍａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、２２１４１−２２１４６）を制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉで切断して（Ｓ１）、ａサブユニットからδサブユニット遺伝子までを含むＤＮＡの領域をｐＵＣ１８ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉサイトにクローニングした（Ｓ２）。
【００６８】
次に、ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓでｃサブユニット遺伝子の前後にＳｐｅ  ＩとＮｇｏＭ  IVサイトを挿入した（Ｓ３）。
【００６９】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）法は、現代の分子生物学において、その進歩に最も貢献した実験法の１つで、遺伝子クローニングの時間と労力を大幅に少なくし、極めて微量のＤＮＡ  サンプルから特定のＤＮＡ  断片を短時間に大量に増幅することができる公知の方法である。また、その操作の簡便さから、現在では基礎研究のみならず臨床遺伝子診断から食品衛生検査、犯罪捜査に至るまで社会の中でも幅広い分野に応用されている。
【００７０】
ＰＣＲ法は、対象とするＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）、２種のプライマー、耐熱性のポリメラーゼを、ヌクレオチドを含む緩衝液に溶かす。その溶液を３段階に温度を変化させながら反応させる。温度変化は専用の装置（サーマルサイクラー）で行うので、操作自体は簡単である。例えば、図示しないが、９５℃ではＤＮＡ  が熱変性して一本鎖になり、５５℃ではプライマーが相補領域に結合し（アニーリング）、７２℃では複製反応が起こる。これが１サイクルに当り、ＤＮＡが２倍に増幅される。このサイクルを２２回行うと、計算上は１００万倍になる。実際には３０  サイクル程度行うが、１００万倍から１０００万倍にまで増幅される。
【００７１】
ＰＣＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓは、現在公知となっているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社の商品名）のシステムを使用し、変異の入ったプライマーを用いてＰＣＲでプラスミド全体を一周増幅する。その後そのままｔｒａｎｓｆｏｒｍ（形質転換）すると、ＰＣＲで増幅されｍｕｔａｔｉｏｎ（突然変異：生物の遺伝情報（ＤＮＡあるいは染色体）に変化が起きること）の入ったものを持つクローンが得られる。
【００７２】
次いで、図２及び図５に示すように、作製したプラスミドをＳｐｅ  ＩとＮｇｏＭ  IVで切断して平滑末端とし（Ｓ４）、再度繋ぎ合せてｃサブユニット遺伝子の領域を除去した（Ｓ５）。
【００７３】
このプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉで切断して得たＤＮＡ断片（Ｓ６）を、ｐＢＷＵ１３のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＳｐｈ  Ｉサイトに挿入した。この発現プラスミドをｐＢＷＵ１３Δｃとした（Ｓ７）。
【００７４】
〔第２発現プラスミドＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８の構築〕
大腸菌ＡＴＰ合成酵素のｃサブユニットを発現する発現プラスミドＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８を、図２及び図１０に示すように、次の手順により構築した（Ｓ０２）。
【００７５】
ｐＢＷＵ１３を鋳型として、ＰＣＲ法でｃサブユニット遺伝子の領域を増幅してＤＮＡ断片を得た（Ｓ８）。
【００７６】
ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１８ベクターのＨｉｎｃ  ＩＩサイトにクローニングして、第２発現プラスミドＥ．  ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８を得た（Ｓ９）。
【００７７】
図６（ａ）、（ｂ）にそれぞれ発現プラスミドｐＢＷＵ１３、プラスミドベクターｐＵＣ１８の拡大構造図、図７に図４のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｐｈ  Iで切断されたＤＮＡ断片の拡大構造図、図８に図７に引続き図５のＳｐｅ  I−ＮｇｏＭ  IVでサブユニットが除去されたＤＮＡ断片の拡大構造図、図９に図４の第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃの拡大構造図をそれぞれ示す。
【００７８】
〔第３発現プラスミドＳ．  ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８の構築〕
ミュータンス菌ＡＴＰ合成酵素のｃサブユニットを発現する第３発現プラスミドＳ．  ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８を、図２及び図１０に示すように、次の手順により構築した（Ｓ０３）。
【００７９】
ミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素の全ての遺伝子領域をクローニングしたプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法でｃサブユニット遺伝子の領域を増幅し、ＤＮＡ断片を得た（Ｓ１０）。
【００８０】
次に、このＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１８ベクターのＨｉｎｃ  ＩＩサイトにクローニングした。この発現プラスミドをＳ．  ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８とした（Ｓ１１）。
【００８１】
相補性の実験の結果、ミュータンス菌ｃサブユニットが機能するためには、プロモーターＰ３配列が必要なことが明らかとなった。この領域を欠失すると相補実験で菌の生育が起こらなくなる。
【００８２】
前記段階Ｓ８〜Ｓ１１における大腸菌及びミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素ｃサブユニットの遺伝子領域をクローニングする手順は、図３に示すように、次の通り行った。
【００８３】
まず、ミュータンス菌ＡＴＰ合成酵素の全ての遺伝子領域をＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３断片に３分割し、ミュータンス菌のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法で増幅した（Ｓ１０ａ）。このとき使用したプライマーは、それぞれＳＭ１−Ｌ／Ｒ、ＳＭ２−Ｌ／Ｒ、ＳＭ３−Ｌ／Ｒとした。
【００８４】
これらのプライマー配列は、つぎの通りである。
ＳＭ１−Ｌ：ａｃａａａｃｃｔｇｃａａａａｔａｇｇａｃ
ＳＭ１−Ｒ：ｃａａｃｇａａａｇａｔｃｔｔｃｃａｇａａ
ＳＭ２−Ｌ：ａａｃｔｔｇａａｇｃｃｔｔｔａｃａｃａｇ
ＳＭ２−Ｒ：ｔｇｇａｇｔｃａａｃｔｇａｔｇｇｔｔｔａ
ＳＭ３−Ｌ：ａｇｔａｇｃｃｔｔｔｇａａｔｔａｃｇｔｇ
ＳＭ３−Ｒ：ｔｃｃａｃｔｔｔｇｃｇａａａａｃｔａａｇ
ＳＭＳＤＦ：ｔｔｇａａｔｔｃａａｇｃｔｔｔｃａａａｇｔｔｃｔｇｇｃ
ＳＭＳＤＲ：ｔｔｇａａｔｔｃｃｔｃｔａｃｃｃｔｔｔｇｔｔｇｔｔａａｔｔａｃ
【００８５】
各ＰＣＲ産物を精製後、制限酵素Ｓｍａ  Ｉで切断したｐＧＥＭ−３Ｚｆ＋ベクターに組み込みクローニングした（Ｓ１０ｂ）。
【００８６】
次に、ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３を連結するために、ＳＭ１を組込んだプラスミドはＥｃｏＲ  ＩとＢｓａＨＩで、ＳＭ２を組込んだプラスミドはＢｓａＨＩとＳｐｈ  Ｉで、ＳＭ３を組込んだプラスミドはＳｐｈ  ＩとＸｂａ  Ｉでそれぞれ切断した（Ｓ１０ｃ）。
【００８７】
それぞれの目的産物（ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３）をアガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲ  ＩとＸｂａ  Ｉで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  （＋）ベクターにライゲーションして組込んだ。このプラスミドには、ミュータンス菌ＡＴＰ合成酵素の全ての遺伝子領域ＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３が、順に連結して組込まれている（Ｓ１０ｄ）。
【００８８】
次にＳＭ１、ＳＭ２、ＳＭ３を連結したプラスミドをＢｓｓＨ  ＩＩで切断し平滑末端化し（Ｓ１０ｅ）、目的産物を精製してｐＢＷＵ１３をＰｖｕ  ＩＩで切断して大腸菌ＡＴＰ合成酵素遺伝子を除去したベクターに組込んだ（Ｓ１０ｆ）。
【００８９】
このプラスミドをＥｃｏＲ  Ｉで切断し、大腸菌ＡＴＰ合成酵素オペロン由来のプロモーターＰ３を組込んだ（Ｓ１０ｈ）。
【００９０】
この組込むためのプロモーターＰ３は、プライマーＳＭＳＤＦ／ＳＭＳＤＲを使用してＰＣＲ法で増幅しＥｃｏＲ  Ｉで切断した（Ｓ１０ｇ）。本発明では、この作製したプラスミドをミュータンス菌ＡＴＰ合成酵素の全ての遺伝子領域をクローニングしたプラスミドとして、ミュータンス菌ｃサブユニット遺伝子を増幅するためのＰＣＲの鋳型に使用した。
【００９１】
〔試験用大腸菌株の作製〕
試験用大腸菌株であるＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株は、大腸菌ＤＫ８株に第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃと、第２発現プラスミドＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８あるいは第３発現プラスミドＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８と、をそれぞれ形質転換した株である。ＤＫ８株は、ＡＴＰ合成酵素の全てのサブユニット遺伝子を欠損した大腸菌株である。そのため、ＡＴＰ合成酵素を発現せず、グルコース寒天培地では生育できるが、コハク酸寒天培地ではできない。
【００９２】
上記試験用大腸菌株は、図２に示すように、次の手順により構築した（Ｓ０４）。
【００９３】
まず、ＤＫ８株のコンピテントセルにＡＴＰ合成酵素のｃサブユニット以外を発現する第１発現プラスミドｐＢＷＵ１３Δｃを形質転換して、プラスミドを保持しているクローンを培養した。この株をＤＫ８  Δｃ株とした（Ｓ１２）。
【００９４】
次にＤＫ８  Δｃ株のコンピテントセルを作製し、大腸菌のｃサブユニットを発現する第２発現プラスミドＥ．ｃｏｌｉ  ｃ  ｐＭＷ２１８あるいはミュータンス菌のｃサブユニットを発現する第３発現プラスミドＳ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ｐＭＷ２１８をそれぞれ形質転換して試験用大腸菌株、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株を作製した（Ｓ１３）。
【００９５】
〔ＡＴＰ合成酵素ｃサブユニットの相補性の検討〕
ミュータンス菌ｃサブユニットが大腸菌ｃサブユニットの機能を相補できるかを検討した（Ｓ０５）。ＡＴＰ合成酵素欠損ＤＫ８株に二種類の発現プラスミドを形質転換することで、様々な種類のｃサブユニットの機能について調べることが可能となる。
【００９６】
ここでは、野生型のミュータンス菌ｃサブユニットが大腸菌ｃサブユニットの機能を相補できるかを検討し、本発明で構築した発現系が機能するかを検討した（Ｓ１４）。このｃサブユニット相補性の検討に際し、次の組成の１００ｍｍ  ｄｉｓｈ寒天培地を作製した。
〈機能相補試験用寒天培地〉
コハク酸寒天培地
試薬・最終濃度
リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）：３４ｍＭ
リン酸一水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）：６４ｍＭ
硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）：２０ｍＭ
硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）：１μＭ
硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）：１μＭ
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）：１０μＭ
硫酸マグネシウム：０．３ｍＭ
コハク酸二ナトリウム：２０ｍＭ
チミン：５０μｇ／ｍｌ
チアミン：２μｇ／ｍｌ
イソロイシン：５０μｇ／ｍｌ
バリン：５０μｇ／ｍｌ
寒天：１．５％
ｐＨは７．５に調整した。
また、グルコース寒天培地では、コハク酸の代わりに０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを使用した。
【００９７】
その結果、野生型のミュータンス菌ｃサブユニットを形質転換した時にコハク酸寒天培地で増殖した。このことから、野生型のミュータンス菌ｃサブユニットは、大腸菌ｃサブユニットの機能を相補できることが明らかとなった。また、本発明がミュータンス菌ｃサブユニットの機能評価が可能なシステムであることが示された。
【００９８】
〔ＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬のスクリーニング〕
各種の化合物ライブラリーを用いて、ミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬のスクリーニングに用いる（Ｓ０６）。
【００９９】
前記作製したプラスミドを形質転換した大腸菌株Ｓ．ｍｕｔａｎｓ  ｃ  ＋  Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株をコハク酸液体培地に播種し、そこに、有効性を検討する化合物溶液を添加し、増殖の指標として濁度を測定し、増殖が阻止される薬剤の濃度を検討した。比較対象として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃ  ＋Δｃ  ｉｎ  ＤＫ８株についても同様の測定を行い、ミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素に対して選択的に作用する抗菌薬を探索した（Ｓ１５）。
【０１００】
この抗菌薬のスクリーニングに際し、スクリーニング用液体培地として次の組成の液体培地を９６ｗｅｌｌ培養プレートに用意した。
〈スクリーニング用液体培地〉
コハク酸液体培地
試薬・最終濃度
リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）：３４ｍＭ
リン酸一水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）：６４ｍＭ
硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）：２０ｍＭ
硫酸鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）：１μＭ
硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）：１μＭ
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）：１０μＭ
硫酸マグネシウム：０．３ｍＭ
コハク酸二ナトリウム：２０ｍＭ
チミン：５０μｇ／ｍｌ
チアミン：２μｇ／ｍｌ
イソロイシン：５０μｇ／ｍｌ
バリン：５０μｇ／ｍｌ
ｐＨは７．５に調整した。
また、グルコース液体培地では、コハク酸の代わりに０．５％（ｗ／ｖ）グルコースを使用した。
【０１０１】
ミュータンス菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬のスクリーニング方法は次の通りである。
（１）試験用大腸菌株（試験用株と比較用株）をＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）で前培養しておく。
（２）９６ｗｅｌｌプレートへ試験用培地と、形質転換した大腸菌株の前培養液を添加する。
（３）各ｗｅｌｌへ有効性を検討する化合物溶液を様々な濃度で添加する。（全体量：約１５０μｌ）
（４）２５℃もしくは３７℃で静置して培養する。
（５）一定時間経過後にマイクロプレートリーダーで濁度（ＯＤ６３０）を測定する。
（７）この濁度から、各候補化合物の発育阻止の程度を測定する。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬スクリーニングシステムは、ＡＴＰ合成酵素を欠損した大腸菌に、例えばミュータンス菌などの病原菌のＡＴＰ合成酵素を発現させることにより、大腸菌の増殖を指標に、その病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬を高速で簡便にスクリーニングすることができ、他の病原菌のＡＴＰ合成酵素を標的とする抗菌薬を高速で簡便にスクリーニングする可能性を示唆することから広範な医療業界に貢献できる端緒となる。
【図１】
2013212077.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年4月9日(2013.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
これらのプライマー配列は、つぎのとおりである。
ＳＭ１−Ｌ（配列番号１）：ａｃａａａｃｃｔｇｃａａａａｔａｇｇａｃ
ＳＭ１−Ｒ（配列番号２）：ｃａａｃｇａａａｇａｔｃｔｔｃｃａｇａａ
ＳＭ２−Ｌ（配列番号３）：ａａｃｔｔｇａａｇｃｃｔｔｔａｃａｃａｇ
ＳＭ２−Ｒ（配列番号４）：ｔｇｇａｇｔｃａａｃｔｇａｔｇｇｔｔｔａ
ＳＭ３−Ｌ（配列番号５）：ａｇｔａｇｃｃｔｔｔｇａａｔｔａｃｇｔｇ
ＳＭ３−Ｒ（配列番号６）：ｔｃｃａｃｔｔｔｇｃｇａａａａｃｔａａｇ
ＳＭＳＤＦ（配列番号７）：ｔｔｇａａｔｔｃａａｇｃｔｔｔｃａａａｇｔｔｃｔｇｇｃ
ＳＭＳＤＲ（配列番号８）：ｔｔｇａａｔｔｃｃｔｃｔａｃｃｃｔｔｔｇｔｔｇｔｔａａｔｔａｃ