(57)【要約】      （修正有）【課題】蛍光サイトメトリー法（蛍光イメージングサイトメトリー法及び蛍光フローサイトメトリー法）による微生物等の検査方法及び検査装置において、生微生物以外の蛍光を発するものによる擬陽性を容易に低減することが可能な微生物等の検査方法及び検査装置を提供する。【解決手段】蛍光サイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置において、微生物等を蛍光色素で染色した後に、退色剤（抗酸化剤）を添加して、微生物等から遊離した蛍光色素を退色させる。微生物検査カセットを用いた蛍光フローサイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置においては、微生物等の染色を行う容器の下流に、微生物から遊離した蛍光色素を退色させる容器を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体液中の微生物を蛍光色素で染色し、励起光を照射して蛍光を検出することにより微生物等を計数する微生物等の検査方法において、微生物を蛍光色素で染色した後に、退色剤を添加し、励起光を照射して微生物等を計数することを特徴とする微生物等の検査方法。
【請求項２】
前記退色剤は抗酸化剤であることを特徴とする請求項１記載の微生物等の検査方法。
【請求項３】
前記抗酸化剤はＬ−アスコルビン酸であることを特徴とする請求項２記載の微生物等の検査方法。
【請求項４】
前記抗酸化剤の前記検体液に対する終濃度が、０．０１ｗｔ％〜１ｗｔ％であることを特徴とする請求項３記載の微生物等の検査方法。
【請求項５】
微生物を含む検体液が保持される検体容器、前記検体液と前記微生物を蛍光染色する染色液とが混合されて保持される染色容器、前記染色容器の混合液と退色液とが混合され保持される退色容器、微生物検出用流路、前記検体容器と前記染色容器、前記染色容器と前記退色容器、及び前記退色容器と前記微生物検出用流路をそれぞれ接続する流路を備えた微生物検査カセットと、
前記微生物検査カセットが装着され、前記微生物検査カセットを移動させるステージと、
前記微生物検査カセットと接続され、前記検体液を前記検体容器から前記染色容器に搬送し、前記染色容器から混合液を前記退色容器に搬送し、前記退色容器から混合液を検出液として前記微生物検出用流路に搬送する圧力を供給する圧力供給装置と、
前記微生物検出用流路に励起光を照射する光源、前記微生物検出用流路を流れる検出液からの蛍光を検出して電気信号に変換する光検出器を有する検出装置と、を有することを特徴とする微生物等の検査装置。
【請求項６】
前記微生物検査カセットは、前記退色容器内に退色液を保持していることを特徴とする請求項５記載の微生物等の検査装置。
【請求項７】
前記微生物検査カセットは、前記退色液が前記退色容器内の混合液の水位よりも下に位置するように保持されていることを特徴とする請求項５記載の微生物等の検査装置。
【請求項８】
前記微生物検査カセットは、前記退色液が前記退色容器内のガラス管内に保持されていることを特徴とする請求項５記載の微生物等の検査装置。
【請求項９】
染色液と混合した検体液に励起光を照射して検体液に含まれる微生物を電気信号として検出する微生物等の検査装置に用いられる微生物検査チップであって、
検体液が保持される検体容器と、
染色液を保持している染色容器と、
退色液を保持している退色容器と、
前記励起光が照射される微生物検出用流路と、
前記検体容器と前記染色容器、前記染色容器と前記退色容器及び前記退色容器と前記微生物検出用流路をそれぞれ接続する流路とを備えたことを特徴とする微生物検査チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物等の検査方法及び検査装置にかかり、特に、蛍光サイトメトリー法を用いた微生物等の検査方法及び検査装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生微生物数計測を行う微生物数測定装置には、蛍光サイトメトリー法を用いたものがある。蛍光サイトメトリー法には、蛍光イメージングサイトメトリー法と蛍光フローサイトメトリー法がある。
【０００３】
蛍光イメージングサイトメトリー法は、フィルタ上に固定した検体を蛍光色素によって染色し、蛍光画像を取得して検体を一個ずつ直接計測する粒子計測方法である。蛍光イメージングサイトメトリー法としては、例えば、特許文献１に記載されたものがある。特許文献１では、微生物と微生物以外の物質（夾雑物）とを第一の試薬で蛍光染色した後、第二の試薬で夾雑物をマスク染色する方法が記載されている。
【０００４】
また、蛍光フローサイトメトリー法は、蛍光色素によって染色した検体を含む流体が、小さな径の流路を通過するとき、検体を一個ずつ直接計測する粒子計測方法である。蛍光フローサイトメトリー法としては、例えば、特許文献２に記載されたものがある。特許文献２では、蛍光スペクトルが異なる二種類以上の生菌用蛍光色素により微生物を染色し、微生物から発せられる発光スペクトルが異なる蛍光を検出することにより微生物を計測している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−３４０６８４号公報
【特許文献２】特開２０１１−  ９２１０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
蛍光サイトメトリー法において、生微生物数計測を正確に行うためには、生微生物以外の蛍光を発するものによる擬陽性を低減することが重要である。
【０００７】
この擬陽性としては、脂肪、蛋白質などの夾雑物による擬陽性（夾雑物が非特異吸着により蛍光染色されて蛍光検出される場合）や、蛍光色素粒子による擬陽性（微生物の染色に使われなかった蛍光色素粒子が蛍光検出される場合。この場合、蛍光色素粒子が夾雑物であるとも言える。）がある。
【０００８】
特許文献１では、第一の試薬で蛍光染色された夾雑物を第二の試薬でマスク染色し、夾雑物による擬陽性を低減している。しかし、夾雑物から遊離している第一の試薬の蛍光色素（粒子状の蛍光色素）による擬陽性が生じ、そのため、蛍光色素液の吸引除去が必須である。蛍光色素液の吸引除去は煩雑な作業となり、また、蛍光フローサイトメトリー法の場合には、蛍光色素液の吸引除去によりこの擬陽性を低減することは困難である。
【０００９】
特許文献２では、複数の生菌用蛍光色素による多重染色によって、蛍光フローサイトメトリー法においても蛍光色素粒子の擬陽性を低減可能としている。しかし、特許文献２では、脂肪、蛋白質などの夾雑物に非特異吸着した蛍光色素による擬陽性について考慮されていない。
【００１０】
本発明の目的は、生微生物以外の蛍光を発するものによる擬陽性を容易に低減することが可能な微生物等の検査方法及び検査装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、蛍光サイトメトリー法（蛍光イメージングサイトメトリー法及び蛍光フローサイトメトリー法）による微生物等の検査方法及び検査装置において、微生物等を蛍光色素で染色した後に、退色剤を添加して、微生物等から遊離した蛍光色素を退色させることを特徴とする。
【００１２】
退色剤としては、好ましくは、抗酸化剤（酸化防止剤）が用いられる。
【００１３】
また、本発明は、微生物検査カセットを用いた蛍光フローサイトメトリー法による微生物等の検査方法及び検査装置においては、微生物等の染色を行う容器の下流に、微生物から遊離した蛍光色素を退色させる容器を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
蛍光サイトメトリー法において、夾雑物などの生微生物以外の蛍光を発するものによる擬陽性を容易に低減することが可能となり、生微生物数計測を正確に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例である微生物等の検査方法を示すフロー図である。
【図２】蛍光色素が抗酸化剤により退色する現象を示す図である。
【図３Ａ】本発明を適用しない場合の微生物と微生物以外の夾雑物とが混在する検体の蛍光写真を示す図である。
【図３Ｂ】本発明の一実施例を適用した場合の微生物と微生物以外の夾雑物とが混在する検体の蛍光写真を示す図である。
【図４】本発明の一実施例である微生物等の検査装置の概略構成を示す図である。
【図５Ａ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットにおける微生物検出用流路を含む断面例を示す図である。
【図５Ｂ】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットにおける微生物検出用流路を含む分解構造例を示す図である。
【図６】本発明の微生物等の検査装置を用いた分析工程の一例を説明する図である。
【図７】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの概略構成の一例を示す図である。
【図８】本発明の微生物等の検査装置に用いられる微生物検査カセットの概略構成の他の例を示す図である。
【図９】脂肪や蛋白質を豊富に含む食材について、擬陽性数の計数結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。なお、後述する実施の形態は一例であって、各実施の形態同士の組み合わせ、公知又は周知の技術との組み合わせや置換による他の態様も可能である。
【００１７】
なお、本発明は、微生物の検査の他に細胞の検査にも同様に適用可能であり、従って、本明細書及び特許請求の範囲において、「微生物等」とは「微生物及び／又は細胞」を意味する。そして、説明を簡単に説明するために、「微生物等」を単に「微生物」と表記する場合がある。また、本明細書及び特許請求の範囲において、「夾雑物」は微生物を検査する際の邪魔となる脂肪、蛋白質などの余計なものを意味する。
【００１８】
（Ａ）擬陽性の低減方法  
図１に本発明の一実施例である微生物等の検査方法の手順（擬陽性の低減方法の手順）を示す。まず、食品を滅菌水に懸濁して作製した検体に蛍光色素を添加し、検体中の微生物を蛍光染色する。次に、微生物の染色後に検体へ退色剤である抗酸化剤（酸化防止剤）を添加して、微生物の細胞膜外の蛍光色素を退色する。最後に、検体に励起光を照射して、蛍光色素で染色された微生物の蛍光検出を行う。蛍光検出には、微生物の蛍光発光を画像取得して光点を計数する蛍光イメージングサイトメトリー法や、検体を細い流れにして微生物を載せて光点を計測する蛍光フローサイトメトリー法がある。
【００１９】
図２に蛍光色素が抗酸化剤により退色する現象（色がだんだん薄くなる現象。色があせる現象。）を示す。図２は蛍光色素として全微生物用シアニン系青色蛍光色素を用い、抗酸化剤のＬ−アスコルビン酸を検体に対して０．０５ｗｔ％添加したときの蛍光強度の時間変化を示している。抗酸化剤添加前の蛍光強度が１００％とすると、図２より、抗酸化剤添加２分後では蛍光強度が５７％に低下し、抗酸化剤添加１０分後では蛍光強度が１０％に低下し、抗酸化剤添加１６分後では２％以下とほぼ蛍光強度が０となっているのが分かる。これにより、蛍光色素が抗酸化剤により退色しているのが分かる。
【００２０】
なお、ここでの検体は蛍光色素の量に十分なＤＮＡを添加した滅菌水を検体としている。また、蛍光色素の濃度は２μＭ（Ｍ：ｍｏｌ／Ｌ）とした。蛍光色素の量に対して抗酸化剤の量が少ないと、退色しきれずに擬陽性が多くなる。生菌を殺菌するくらい抗酸化剤の量が多いと、生菌が死菌になって擬陰性が多くなる。また、添加後の時間は、蛍光色素の量に対する抗酸化剤の量で変わる可能性がある。
【００２１】
図３Ａ及び図３Ｂに、微生物と微生物以外の夾雑物（脂肪や蛋白質など）とが混在する検体において、蛍光色素で染色して蛍光検出した場合（図３Ａ）と、蛍光色素で染色した後に抗酸化剤を添加して蛍光検出した場合（図３Ｂ）を示す。検体はハムをストマッキングしたものに大腸菌を添加したものである。検体に蛍光色素として全微生物用シアニン系青色蛍光色素を終濃度２μＭで添加したときの透過光画像が（1a）で、蛍光画像が（2a）である。検体に蛍光色素として全微生物用シアニン系青色蛍光色素を終濃度２μＭで添加した後、抗酸化剤のＬ−アスコルビン酸を検体に対して０．１ｗｔ％添加したときの透過光画像が（1b）で、蛍光画像が（2b）である。蛍光色素で染色しただけの透過光画像（1a）にはハム由来の夾雑物311aと微生物である大腸菌321aが確認でき、蛍光画像（2a）の同じ場所にもハム由来の夾雑物312aと微生物である大腸菌322aが確認できる。一方、蛍光色素で染色した後、抗酸化剤を添加した透過光画像（1b）にはハム由来の夾雑物311bと微生物である大腸菌321bが確認できるが、蛍光画像（2b）では同じ場所に微生物である大腸菌322bは確認できるが、ハム由来の夾雑物312bは確認できない。これは、微生物を染色した蛍光色素は、微生物の細胞膜内に取り込まれているため、抗酸化剤の影響を受けずに蛍光発光し、夾雑物に非特異吸着した蛍光色素は、抗酸化剤の影響を受けて退色したことを示している。
【００２２】
即ち、微生物や細胞は細胞膜（細胞壁）内に蛍光色素が入り込んで発光するのに対し、脂肪や蛋白質などでは表面に蛍光色素が吸着（非特異吸着）して発光するものと考えられる。退色液（抗酸化剤）は、細胞膜（細胞壁）を透過することが出来ないので、微生物や細胞を染色した蛍光色素は退色せず、脂肪や蛋白質に吸着している蛍光色素が退色することを本発明は利用している。言い換えれば、細胞膜（細胞壁）内に取り込まれていない蛍光色素を選択的に退色させるようにしたものである。光を照射することにより蛍光色素は退色するが、この場合、脂肪や蛋白質に吸着している蛍光色素は退色するが、細胞膜（細胞壁）内の蛍光色素も退色してしまい、従来、選択的に退色させるということは困難であった。本発明では、光照射というような一般的な退色とは異なる手法、即ち、退色剤（退色液）を添加することによって選択的に退色するようにしたものである。
【００２３】
以上のように、微生物の染色後に検体へ退色剤（抗酸化剤）を添加して、微生物の細胞膜外の蛍光色素（脂肪や蛋白質に吸着している蛍光色素など）を退色することにより、擬陽性を低減出来ることが分かる。従って、本発明では、蛍光色素液の吸引除去が不要であり煩雑な作業を伴わない。
【００２４】
なお、抗酸化剤としてＬ−アスコルビン酸を用いたが、抗酸化作用を有するものであれば、同様な効果が得られる。例えば、他の抗酸化剤としては、グルタチオン、N-アセチルシステイン、α-トコフェロール、ブチルヒドロキシアニソール、カテキン、クエルセチン、尿酸、ビリルビン、グルコース、フラボノイド セルロブラスミン、アルブミン、フェリチン、メタロチオネイン、スーパーオキシドディスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、カタラーゼ、チオレドキシンがあり、Ｌ−アスコルビン酸と同様の効果があると考えられる。
【００２５】
また、抗酸化剤の濃度が高いと微生物の細胞膜内の蛍光色素も退色することになるため、微生物を染色する蛍光色素の添加濃度と抗酸化剤の濃度を調整する必要がある。なお、抗酸化剤としてＬ−アスコルビン酸を用いた場合、Ｌ−アスコルビン酸の検体に対する終濃度の下限値は、０．０１ｗｔ％で擬陽性が低減し、０．００５ｗｔ％で擬陽性が低減しないことから０．０１ｗｔ％が好ましい。また、上限値はアスコルビン酸の菌へのダメージから求め、２ｗｔ％で菌の生存率が１０％以下になることから、上限値を１ｗｔ％が好ましい。尚、通常用いられる蛍光色素の濃度が２μＭ（Ｍ：ｍｏｌ／Ｌ）程度であり、上記範囲の抗酸化剤の濃度の場合、微生物の細胞膜内の蛍光色素を退色することはない。
【００２６】
（Ｂ）微生物検査装置の全体構成例  
図４に、本発明の一実施例に係る微生物検査装置１の構成図を示す。微生物検査装置１は、検体や試薬を内部に保持し、微生物計測に必要な工程を行うための機構を内部に備えた微生物検査カセット１０と、微生物計測に必要な工程を行うために、微生物検査カセット１０と連結したチップ連結管１４４１〜１４４４を介して、微生物検査カセット１０内の検体や搬送を制御するための圧力供給装置１４と、微生物検査カセット１０を保持し、微生物検査カセット１０の位置を調整するＸ−Ｙ可動ステージ（ホルダー）１２５と、微生物検査カセット１０内の微生物に励起光を照射し、微生物からの散乱光及び蛍光を電気信号に変換する検出装置１１で構成されている。微生物検査装置１に連結したシステム装置１８は、圧力供給装置１４に対する制御信号の出力と、検出装置１１から入力される電気信号に対する信号処理を実行する。なお、電気信号の処理により得られた計測結果は、システム装置１８に接続された出力装置１９に表示される。
【００２７】
圧力供給装置１４は、レギュレータ１４１１付のエアポンプ１４１を有する。エアポンプ１４１と微生物検査カセット１０の各通気口１５９１〜１５９４（図７）は、チップ連結管１４４１〜１４４４によって接続されている。チップ連結管１４４１〜１４４４には、バルブ１４２１〜１４２４がそれぞれ設けられている。バルブ１４２１〜１４２４を開閉することにより、微生物検査カセット１０の容器に所定の圧力の気体を供給し、又は、微生物検査カセット１０の容器を大気開放する。この圧力の制御により、微生物検査カセット１０内における検体や試薬の搬送を実現する。この圧力制御による微生物検査カセット１０内における検体や試薬の搬送は、特開２００８−１５７８２９号公報に詳述されている。
【００２８】
微生物検査カセット１０は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、検体中の微生物の染色するための染色液（試薬液）１５２１を保持し、検体と染色液を混合して反応させる染色容器１５２と、検体と染色液を混合した混合液を退色させるための退色液１５２２を保持し、混合液に退色液を混合して反応させる退色容器１５５と、励起光源１１１１，１１１２より励起光１１３を照射し、微生物を観測するための微生物検出用流路１７３を内部に備えた微生物検出部１７と、混合液と退色液を混合した検出液が微生物検出用流路１７３を通過して廃棄されるための検出液廃棄容器１５６と、検体容器１５１、染色容器１５２、退色容器１５５、微生物検出用流路１７３を連結し、検体１５１１や混合液や検出液が流動するための溶液用流路１５７１〜１５７４（図７）と、検体１５１１や混合液や検出液を気圧により流動させるため圧力供給装置１４と各容器を接続する通気用流路１５８１〜１５８４（図７）とで構成されている。
【００２９】
検出装置１１は、励起光源１１１１、１１１２と、散乱光検出部と、蛍光検出部１２０１〜１２０３とで構成される。このうち、散乱光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの散乱光１２４を検出するための散乱光検出器１２３と、励起光源１１２からの励起光１１３が散乱光検出器１２３に直接入射することを防ぐための遮光板１２２とから構成される。一方、蛍光検出部は、微生物検出用流路１７３を通過する微生物からの蛍光１２１を集光し、平行光にする対物レンズ１１４と、励起光１１３を微生物検出部１７の方向に反射する一方で蛍光１２１は透過するダイクロイックミラー１１２と、平行光を集光させるための集光レンズ１１８１，１１８２と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール１１９と、蛍光１２１の一部波長を反射し、残りの波長を透過するダイクロックミラー１１５１，１１５２と、蛍光１２１の一部波長を通過するバンドパスフィルタ１１７１〜１１７３と、バンドパスフィルタ１１７１〜１１７３を通過した光を検出する光検出器１２０１〜１２０３とで構成される。なお、照射部及び検出部は、互いの焦点が重なるように配置され、測定時には微生物検出用流路１７３を焦点の位置に調整できるように構成されている。
【００３０】
検出装置１１は、励起光源１１１２から出力された励起光１１３を微生物検出用流路１７３に照射し、微生物検出用流路１７３から生じる散乱光の光量と微生物検出部１７から生じる蛍光の光量をそれぞれ検出することにより、Ｘ−Ｙステージ１２５の可動位置と各光量との関係をプロファイルとして取得する。また、検出装置１１は、取得されたプロファイルに基づいてＸ−Ｙ可動ステージ１２５を可動制御し、微生物検査カセット１０（具体的には、微生物検出用流路１７３）を検出に適した位置に合わせる。即ち、散乱光検出部で検出される散乱光の光量が最大となる微生物検出用流路の位置を励起光の光軸と一致させ、蛍光検出部で検出される蛍光量が最大となる微生物検出用流路の位置に励起光の焦点を一致させる。この位置合わせについては特開２０１０−２５６２７８号公報に詳述されている。位置合わせについては、他の方法、例えば、特開２００９−２８１７５３号公報に記載の方法を用いても良い。この場合、微生物検査カセットに位置合わせ用試薬等の保持容器や溶液用流路、通気用流路等を設ける。
【００３１】
なお、本実施例では励起光源は２つであるが、蛍光色素の種類に応じて励起光源の数量を変更する場合がある。また、本実施例では蛍光検出部は３つであるが、蛍光色素の種類に応じて蛍光検出部の数量を変更する場合がある。
【００３２】
（Ｃ）微生物検査カセットの微生物検出部の構造例  
図５Ａ及び図５Ｂを用い、微生物検査カセット１０のうち微生物検出部１７の構造を説明する。図５Ａは、微生物検査カセット１０の本体１５と微生物検出部１７の接合部の断面図を示す。図５Ｂは、微生物検出部１７の分解斜視図を示す。
【００３３】
なお、本体１５と微生物検出部１７はそれぞれ別工程で作製され、それぞれを接合する。まず、微生物検出部１７の製造方法を説明する。微生物検出部１７はカバー部材１７１と流路部材１７２からなり、両者は共に薄い平板からなる。流路部材１７２には溝１７３１が形成されており、この溝１７３１の両端には貫通孔１７４１、１７５１が形成されている。溝１７３１が形成された面が張り合わせ面となるように、カバー部材１７１と流路部材１７２を張り合わせる。この貼り合わせにより微生物検出部１７が形成される。流路部材１７２の溝１７３１とカバー部材１７１によって微生物検出用流路１７３が構成される。流路部材１７２の貫通孔１７４１、１７５１によって、微生物検出用流路入口１７４と微生物検出用流路出口１７５が構成される。
【００３４】
一方、本体１５に形成された退色容器−微生物検出用流路間流路１５７３は、その下端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。同様に、微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４は、その上端にて流路方向を変更し、本体１５の表面に開口を形成している。退色容器−微生物検出用流路間流路１５７３の開口は、微生物検出用流路入口１７４に接続され、微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４の開口は、微生物検出用流路出口１７５に接続されている。
【００３５】
本体１５には検出用窓枠部１６１が形成されている。検出用窓枠部１６１は、貫通孔、又は、貫通溝である。検出用窓枠部１６１は、退色容器−微生物検出用流路間流路１５７３の開口と微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４の開口の間に形成されている。製造された微生物検出部１７は、前述したように、本体１５に装着される。図５Ａに示すように、本体１５の検出用窓枠部１６１の上に微生物検出用流路１７３が配置されるように、微生物検出部１７を装着する。
【００３６】
本実施例の場合、微生物検出用流路１７３の背後に、本体１５の貫通孔又は貫通溝である検出用窓枠部１６１が設けられる。従って、励起光１１３は、微生物検出部１７のみを照射し、本体１５を照射しない。このため、背景光の増加の原因となる本体１５からの反射光や自家蛍光は発生しない。微生物検出用流路１７３を通過した励起光１１３が、本体１５に照射されないためには、検出用窓枠部１６１を構成する貫通孔の断面は、励起光１１３の放射方向に沿って増加することが好ましい。
【００３７】
カバー部材１７１の厚さは、例えば０．０１μm〜１ｍｍとする。流路部材１７２の厚さは、例えば０．０１μm〜１ｍｍとする。微生物検出用流路１７３の断面形状は、例えば正方形、長方形、台形に形成する。微生物検出用流路１７３の断面寸法は、大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには小さいほうが良い。微生物検出用流路１７３の断面の一辺は、例えば１μｍ〜１ｍｍが好ましく、長さは例えば０．０１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましい。微生物検出用流路１７３に照射する励起光１１３の光軸は、微生物検出用流路１７３の方向ベクトルに対して垂直になる。
【００３８】
微生物検出部１７を構成する材料について説明する。微生物検査カセット１０はディスポーザブルである。すなわち、使用後、微生物検出部１７は本体１５と共に廃棄する。そのため、微生物検出部１７に用いる材料は、安価でなければならない。微生物検出部１７に用いる材料は、蛍光計測に好適なように、光学特性に優れている必要がある。すなわち、自家蛍光が低く、光透過性、面精度、屈折率などに優れていることが望ましい。微生物からの蛍光の検出を阻害しないためには、微生物検出部１７自身が発生する自家蛍光量が、微生物からの蛍光量に比べて十分小さいことが好ましい。
【００３９】
微生物検出部１７の表面に、曲面、凹凸等が存在すると、表面における光の屈折、又は、乱反射により微生物計測用流路１７３に照射される励起光１１３の光量が変動する。そのため、検出される蛍光量も変動し、計測精度が低下する。そのため、微生物検出部１７の表面は、所望の平面度を有する必要がある。微生物検出部１７は、凹凸が０．１ｍｍ以下の平面度を有することが好ましい。
【００４０】
このような条件を考慮すると、微生物検出部１７に用いる材料には、ガラス、石英、ポリメタクリル酸メチルエステル（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイト等が考えられる。微生物検出部１７は、これらの物質から選択された１種類以上の物質から形成される。
【００４１】
カバー部材１７１は単なる平板であるが、流路部材１７２は平板に溝及び貫通孔を形成したものである。従って、流路部材１７２は、微細加工が容易で、且つ、加工費が安価な材料によって形成される。ガラス、及び、石英は、光学特性が優れているが、微細加工が容易でない。すなわち、微細加工を行うと、加工費が高くなる。
【００４２】
そこで、この形態例の場合、カバー部材１７１をガラス又は石英によって構成し、流路部材１７２をポリメタクリル酸メチルエステル、ポリジメチルシロキサン、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリカーボネイトによって構成する。なお好ましくは、流路部材１７２をポリジメチルシロキサンによって構成する。この場合、カバー部材１７１と流路部材１７２の接合には、ポリジメチルシロキサンの自己接着性を利用する。
【００４３】
微生物検出部１７の自家蛍光量は、材料ばかりでなく、微生物検出部の厚さ寸法にも依存する。自家蛍光量を少なくするには、微生物検出部の厚さ寸法を小さくすれば良い。微生物検出部１７の厚さが小さいほど、微生物検出部１７から発生する自家蛍光量は少なくなる。しかしながら、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さ寸法を小さくすると、製造が困難になり、平面度が悪化する。必要な平面度を保ち、微生物の蛍光の検出を阻害しないように自家蛍光量を抑制するには、これらの部品の厚さ寸法は、所定の範囲に制限するする必要がある。
【００４４】
ガラス、石英、ポリジメチルシロキサンの自家蛍光量はほぼ同等である。そこで、カバー部材１７１をガラス又は石英によって製造する場合、その厚さは、例えば０．０５ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。流路部材１７２を、ポリジメチルシロキサンによって製造する場合、その厚さは例えば０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下が好ましい。
【００４５】
また、カバー部材１７１及び流路部材１７２を、シクロオレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルエステル、ポリエチレンテレフタラート、又は、ポリカーボネイトによって製造しても良い。この場合、ガラス、又は、石英によってカバー部材１７１を製造し、ポリジメチルシロキサンによって流路部材１７２を製造する場合より、単位体積当たりの自家蛍光量が約３倍以上増加する。そのため、カバー部材１７１及び流路部材１７２の厚さは例えば０．０１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下が好ましい。
【００４６】
（Ｃ）計測方法（検査方法）例  
以下、上述の微生物検査装置１を用いて、食品由来の検体中の生微生物数を計測する場合の実施例を説明する。図６に、微生物検査カセット１０を用いた生微生物数計測の工程をフローチャートで示す。また、図７に、微生物検査カセット１０の平面図を示す。
【００４７】
最初に微生物検査カセット１０の構成について説明する。微生物検査カセット１０は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、検体中の微生物の染色するための染色液（試薬液）１５２１を保持するための染色容器１５２と、退色液１５２２を保持するための退色容器１５５と、検体中に含まれる食品残渣を取り除くためのフィルタである食品残渣除去部１６０と、外部光源より励起光を照射し、微生物の蛍光を観測するための微生物検出用流路１７３と、微生物検出用流路１７３を通過した検出液を廃棄するための検出液廃棄容器１５６と、検体容器１５１、食品残渣除去部１６０、染色容器１５２、退色容器１５５、微生物検出用流路１７３を連結し、検体１５１１や混合液を流動させるための溶液用流路１５７１〜１５７４と、各容器内の検体１５１１や混合液を気圧により流動させるための通気口１５９１〜１５９４と、通気口１５９１〜１５９４と各容器を接続する通気用流路１５８１〜１５８４とを備える。
【００４８】
溶液用流路１５７１〜１５７４、通気口１５９１〜１５９４及び通気用流路１５８１〜１５８４は連結する容器の名称から、検体容器−染色容器間流路１５７１、染色容器−退色容器間流路１５７２、退色容器−微生物検出用流路間流路１５７３、微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７４、検体容器通気口１５９１、染色容器通気口１５９２、退色容器通気口１５９３、検出液廃棄容器通気口１５９４、検体容器通気流路１５８１、染色容器通気流路１５８２、退色容器通気流路１５８３、検出液廃棄容器通気流路１５８４とする。
【００４９】
検体容器１５１１と、食品残渣除去部１６０と、染色容器１５２と、退色容器１５５と、微生物検出用流路１７３と、検出液廃棄容器１５６は、溶液用流路１５７１〜１５７４により直列に連結されている。
【００５０】
微生物染色液１５２１は、微生物検査カセット１０内に前もって封入されている。退色液１５２２は、微生物検査カセット１０内に前もって封入されている。検体１５１１は、検査前に通気口１５９１から検体容器１５１に注入する（Ｓ９０１）。
【００５１】
検体容器１５１の体積は、検体１５１１の体積より大きい。染色容器１５２の体積は、検体１５１１と微生物染色液１５２１の合計体積より大きい。退色容器１５５の体積は、検体１５１１と微生物染色液１５２１と退色液１５２２の合計体積より大きい。また、検体容器−染色容器間流路１５７１の最高点は、検体容器１５１中の検体１５１１の水位より高くなるように形成される。これと同様に、染色容器−退色容器間流路１５７２の最高点は、検体１５１１と微生物染色色素１５２１の混合液の水位より高くなるように形成される。さらに、退色容器−微生物検出用流路間流路１５７３の最高点は、検体１５１１、微生物染色色素１５２１、退色液１５２２からなる検出液の水位より高くなるように形成される。
【００５２】
ここで使用した検体１５１１は、検査する食品に対し質量比９倍の滅菌水を加え、ストマッキング処理を行ったものである。
【００５３】
微生物染色液は、死微生物（死菌）を染色するための死微生物（死菌）染色液が１種以上と全微生物（全菌）を染色するための全微生物（全菌）染色液が１種以上の混合液であり、死微生物染色液には、例えば、死微生物用シアニン系蛍光色素（終濃度：０．０１μＭ〜１０μＭ）、ＰＩ（プロピディウムイオダイド）（終濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＥＢ（エチジウムイオダイド）（終濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）を使用し、全微生物染色液には、例えば、全微生物用シアニン系蛍光色素（終濃度：０．０１μＭ〜１０μＭ）、ＬＤＳ７５１（終濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＤＡＰＩ（４'、６−ヂアミジン−２'−フェニルインドール）（終濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＨＯＥＣＨＳＴ３３２５８（終濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）、ＨＯＥＣＨＳＴ３４５８０（終濃度：０．１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ）などを使用する。ここでは、死微生物染色液として死微生物用シアニン系橙蛍光色素を使用し、全微生物染色液として全微生物用シアニン系青蛍光色素とＬＤＳ７５１を使用する。色素溶媒にはＤＭＳＯ（ジメチルスルオキシド）、エタノール類、水などを使用する。なお、終濃度の単位のＭはmol/Lの意味である。また、終濃度は検体（生微生物の入っている液体）に対する濃度である。
【００５４】
退色液の主成分は抗酸化剤から成り、溶媒としてＤＭＳＯ（ジメチルスルオキシド）、エタノール類、水などを用いる。
【００５５】
微生物検査カセット１０を用いた生微生物数測定は、図６に示すように、微生物検査カセット１０を微生物検査装置(分析装置)１にセットした状態で開始される（Ｓ９０２）。この測定工程は、微生物検査カセット１０の位置合わせを行う位置合わせ工程（Ｓ９０７）と、検体から食品残渣を取り除いて検体中の微生物を染色した後に遊離した色素を退色する前処理工程（Ｓ９０３〜Ｓ９０６）と、生微生物数を実際に測定する計測工程（Ｓ９０８）とで構成される。
【００５６】
位置合わせ工程（Ｓ９０７）と前処理工程（Ｓ９０３〜Ｓ９０６）は独立した工程であるため並列して行い、両工程が終了した段階で計測工程（Ｓ９０８）を行う。続いて、各工程における各液体の移動について説明する。
【００５７】
前処理工程では、まず、検体１５１１が染色容器１５２に移動される（Ｓ９０３）。通気口１５９１を介して検体容器１５１に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。これにより、検体容器１５１内の気圧を上げる。同時に、染色容器通気口１５９２を介して染色容器１５２の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、検体１５１１は、染色容器１５２に入り、微生物染色液１５２１と混合される。混合には、バブリングを使用する（Ｓ９０４）。検体１５１１中の死微生物は、死微生物染色液（ここでは死微生物用シアニン系橙色蛍光色素を使用する。）と全微生物染色液（ここでは全微生物用シアニン系青色蛍光色素とＬＤＳ７５１を使用する。）により染色され、一方、検体１５１１中の生微生物は全微生物染色液のみにより染色される。
【００５８】
二液の混合液の水位は、染色容器１５２と退色容器１５５を連結する染色容器−退色容器間流路１５７２の最高点を越えず、さらに染色容器１５２中に入っている空気は、染色容器通気口１５９２を介して外部に放出される。染色容器１５２の気圧は大気圧と等しいため、二液の混合液は退色容器１５５に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、染色容器１５２に保持することができる。必要な時間は、例えば３〜６０分である。
【００５９】
このとき、混合液の退色容器１５５への流入を防ぐ目的で、各通気口１５９３〜１５９４に対して圧力供給装置１４からの圧力を加え、検体容器１５１の気圧より低い範囲まで退色容器１５５と検出液廃液容器１５６の気圧を上げても良い。
【００６０】
なお、染色中は、微生物検査カセット１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが望ましい。
【００６１】
また、検体１５１１が食品残渣除去部１６０を経て、染色容器１５２へ流動する際に、検体１５１１中の食品残渣は、食品残渣除去部１６０により検体１５１１から取り除かれる。なお、夾雑物は食品残渣除去部で取り除かれない微生物(細胞)以外のものとなる。
【００６２】
次に、検体１５１１、微生物染色液１５２１から成る混合液を、退色容器１５５に移動させる（Ｓ９０５）。通気口１５９２を介して染色容器１５２に対して圧力供給装置１４の圧力を加える。これにより、染色容器１５２内の気圧を上げる。同時に、通気口１５９３を介して退色容器１５５の内圧を大気圧に開放する。気圧差により、混合液は、退色容器１５５に入り、退色液１５２２と混合される。混合には、バブリングを使用する（Ｓ９０６）。これにより、混合液中の夾雑物（脂肪や蛋白質など）に非特異吸着した全微生物染色液が退色することにより、擬陽性の低減が図られる。
【００６３】
退色容器での保持時間は、９分〜２０分としている。保持時間は、生菌と非特異吸着の蛍光強度の差を光検出器で認識するために要する時間で十分であり、非特異吸着した蛍光色素を完全に退色させる程の時間を掛けなくても良い。
【００６４】
なお、この前処理工程と並行して、微生物検査カセット１０の位置合わせが実行される。
【００６５】
以上の動作が終了すると、検体１５１１と微生物染色液１５２１から成る検出液が微生物検出用流路１７３に移動され、検体中の生微生物が蛍光フローサイトメトリー法により計測される。（Ｓ９０８）。図４の場合、紙面垂直方向より、励起光１１３が照射される。このため、微生物を染色した色素からの蛍光と、微生物による散乱光が生じる。検出装置１１は、生微生物については全微生物染色液の２色の蛍光を検出し、死微生物については全微生物染色液の２色と死微生物染色液の１色の蛍光を検出する。このため、生微生物と死微生物とを判別して計数することが可能になる。また、散乱光の光量は微生物の大きさにより変わるため、微生物の大きさの判別も可能になる。
【００６６】
なお、染色液としては、全微生物染色液として１種としても良い。この場合、微生物検査装置は、１励起または２励起光源及び２蛍光検出となる。また、染色液は生菌だけを染める染色液もある。この場合、１励起光源、１蛍光検出となる。
【００６７】
図８は微生物染色液と退色液を容器内に図７とは別の方法により保持する微生物検査カセットの図を示す。内部の各容器及び流路の構成は、前述の図７と同等である。染色容器１５２にはホルダー１５２１Ｈに保持されたガラス管１５２１Ｇを配置し、ガラス管１５２１Ｇ内に微生物染色液をガラス管内の毛細管現象で保持している。組み立て順は、ガラス管１５２１Ｇをホルダー１５２１Ｈに保持し、ガラス管１５２１Ｇに微生物染色試薬を充填し、ホルダー１５２１Ｈをカセットの染色容器１５２に挿入して完成となる。ガラス管１５２１Ｇの上端位置は染色容器１５２内の検体液の水位以下に配置することにより、検体液が染色容器１５２内に流入したときにガラス管は検体液の水面下に位置することになり、ガラス管内の毛細管現象が失われ、ガラス管内の微生物染色試薬が検体に染み出る。検体液中に染み出た微生物染色試薬はバブリングにより混合され、検体液中の微生物等を染色する。このように、ガラス管を検体液の水位以下に配置することにより、ガラス管内の微生物染色試薬を容易に検体内へ染み出すことが出来る。
【００６８】
また、退色容器１５５にはホルダー１５２２Ｈに保持されたガラス管１５２２Ｇを配置し、ガラス管１５２２Ｇ内に退色液をガラス管内の毛細管現象で保持している。組み立て順は、ガラス管１５２２Ｇをホルダー１５２２Ｈに保持し、ガラス管１５２２Ｇに退色液を充填し、ホルダー１５２２Ｈをカセットの退色容器１５５に挿入して完成となる。ガラス管１５２Ｇの上端位置は退色容器１５５内の検体液（混合液）の水位以下に配置することにより、検体液と微生物染色試薬の混合液が退色容器１５５内に流入したときにガラス管は混合液の水面下に位置することになり、ガラス管内の毛細管現象が失われ、ガラス管内の退色液が検体液（混合液）に染み出る。混合液中に染み出た退色液はバブリングにより混合され、混合液中の夾雑物に非特異吸着した蛍光色素を退色する。このように、ガラス管を混合液の水位以下に配置することにより、ガラス管内の退色液を容易に混合液内へ染み出すことが出来る。
【００６９】
なお、ガラス管は内径０．６ｍｍ、長さ８ｍｍとしたが、内径０．１〜３ｍｍ、長さ１〜３０ｍｍとしても、同様の効果が得られる。
【００７０】
なお、本実施例では検査カセットに微生物染色試薬と退色液を検査カセット組み立て時に内包した例であるが、検査カセットに微生物染色試薬と退色液を内包する場所が設けていれば、検査カセット組み立て時には微生物染色試薬と退色液を内包せず、検査直前に微生物染色試薬と退色液を手作業または自動機にて充填しても本実施例と同様の効果が得られる。
【００７１】
また、本実施例では微生物染色試薬や退色液をガラス管に保持した例であるが、ガラス管の代わりに親水性海綿体構造でも同様の効果が得られる。特に、ガラス焼結体やメラミンスポンジが適している。
【００７２】
図９に脂肪や蛋白質を豊富に含む食材について、擬陽性の計数した結果を示す。なお、食材に含まれる生微生物は培養法により計測すると１００個／ｇ以下である。
【００７３】
同図に示した食材では、退色なしより退色ありの方が擬陽性数は百分の一〜一万分の一程度に低減されていることが分かる。
【００７４】
なお、測定条件は、検査する食品に対し質量比９倍の滅菌水を加えたストマッキング処理を行い、必要に応じて遠心分離を行った後に、カセットへ検体を注入し、死微生物染色液（ここでは死微生物用シアニン系橙色蛍光色素を使用する。）と全微生物染色液（ここでは全微生物用シアニン系青色蛍光色素とＬＤＳ７５１を使用する。）を用いた。混合容器内での保持時間（反応時間＝染色時間）は４０分で、退色容器での保持時間（退色時間）は９分〜２０分ある。
【００７５】
また、抗酸化剤として、Ｌ−アスコルビン酸の代わりにＮ−アセチルシステインを終濃度０．０２ｗｔ％としても同様の結果が得られる。
【００７６】
また、上述の実施例では、蛍光サイトメトリー法として蛍光フローサイトメトリー法を用いているが、蛍光イメージングサイトメトリー法にも本発明は適用可能である。蛍光イメージングサイトメトリー法では、図３Ａ、図３Ｂで示した方法に基づいて行われる。図３Ａ、図３Ｂでは、ハムのストマッキング処理を行った検体で蛍光画像のイメージから擬陽性数を算出した結果、退色なしでは十万個／ｇ、退色ありでは千個／ｇとなり、退色なしより退色ありの方が擬陽性数は百分の一程度に低減されていることが分かる。
【符号の説明】
【００７７】
１…微生物検査装置、１０…微生物検査カセット、１１…検出装置、１４…圧力供給装置、１７…微生物検出部、１８…システム装置、１９…出力装置、１１１１…短波長励起光源、１１１２…長波長励起光源、１１１３…励起光合成用ダイクロイックミラー、１１２…ダイクロイックミラー、１１３…励起光、１１４…対物レンズ、１１９…ピンホール、１２０…光検出器、１２１…蛍光、１２４…散乱光、１２５…Ｘ−Ｙ可動ステージ、１４１…エアポンプ、１４１１…レギュレータ、１５１…検体容器、１５１１…検体、１５２…染色容器、１５２１…微生物染色液、１５２１Ｈ…ホルダー、１５２１Ｇ…ガラス管、１５５…退色容器、１５２２…退色液、１５２２Ｈ…ホルダー、１５２２Ｇ…ガラス管、１５６…検出液廃棄容器、１５７１〜１５７４…溶液用流路、１５８１〜１５８４…通気用流路、１６１…検出用窓部、１７３…微生物検出用流路、１１５１…短波長蛍光分離用ダイクロイックミラー、１１５２…中波長蛍光分離用ダイクロイックミラー、１１７１…短波長バンドパスフィルタ、１１７２…中波長バンドパスフィルタ、１１７３…長波長バンドパスフィルタ、１１８１、１１８２…集光レンズ、１２０１…短波長用光検出器、１２０２…中波長用光検出器、１２０３…長波長用光検出器。
【図１】
2013046576.tif 000003
【図２】
2013046576.tif 000004
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2013046576.tif 000008
【図５Ｂ】
2013046576.tif 000009
【図６】
2013046576.tif 000010
【図７】
2013046576.tif 000011
【図８】
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【図９】
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