(57)【要約】【課題】正常値よりも高い心拍数の対象のみならず正常心拍数の対象においても心拍数低下効果を有し、かつ通常の食生活において摂取しやすく長期連用が可能な心拍数低下剤を提供すること。【解決手段】本発明は、ポルチーニ子実体又はその抽出物を有効成分とする心拍数低下剤を提供する。本発明の心拍数低下剤は、正常値よりも高い心拍数の対象において顕著な心拍数低下効果を示すだけでなく、正常心拍数の対象に対しても穏やかな安定した心拍数低下効果を示すため、長期連用しても安全な、心拍数低下手段を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポルチーニ子実体又はその抽出物を有効成分とする心拍数低下剤。
【請求項２】
経口投与用であり、投与量がポルチーニ乾燥子実体換算で0.1 g/60 kg/日〜20 g/60 kg/日である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
経口投与用であり、投与量がポルチーニ乾燥子実体換算で2.5 g/60 kg/日〜10 g/60 kg/日である、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
抽出物が熱水抽出物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポルチーニ由来成分を含有する心拍数低下剤に関し、より具体的にはポルチーニ子実体又はその抽出物を有効成分とする心拍数低下剤に関する。
に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレスは、不安性障害等の神経症や、胃炎等の消化器系疾患、狭心症等の循環器系障害、心身症といった様々な疾患の引き金になることが知られている。近年、うつ病等のストレス性疾患患者の増加等、ストレスは益々深刻な問題となってきており、リラックスした状態を作り出しストレスをうまく解消することが重要となっている。
【０００３】
心拍数低下はリラックスした状態と関連する可能性があると考えられている。非特許文献１には、リラックスした状態では副交感神経が優位になり心拍数が低下することが記載されている。また非特許文献２及び３には、カモミール茶やテアニンの摂取によりリラックスし、心拍数が低下することが記載されている。
【０００４】
一方、非特許文献４には、安静時心拍数の高い人は、心血管系死亡率が高いだけでなく、全死亡率が高いことが報告されている。また、非特許文献５には、80 bpmを越える心拍数が心血管系の合併症、罹患率、及び死亡率のリスクを増加させること、また80〜85 bpm以上の心拍数を頻脈の基準と考えるべきであることが記載されている。さらに、非特許文献６には、健常者の安静時心拍数は、ほぼ80 bpm未満であることが記載されている。従って、頻脈の基準は80 bpm以上が妥当であり、このような人では、安静時心拍数を低下させることにより死亡率が低下する可能性がある。
【０００５】
従来より、キノコ類の中には、薬理作用を有する物質を含むものがあることが知られているが、心拍数低下効果に関する報告は多くない。非特許文献７には、自然発症高血圧（SHR）ラットにおいて血圧上昇に伴い心拍数の増加が認められるが、ヒメマツタケ熱水抽出物0.05 g/kg/日の投与により血圧が低下し、それに伴って心拍数の低下が生じたことが記載されている。ただし、降圧効果と心拍数低下は必ずしも相関がある訳ではなく、例えば、特許文献１には、エリンギ細胞融合株乾燥子実体の熱水抽出物（用量：10、15、20 g/60 kg/日）の継続摂取により、血圧は低下したが、心拍数は低下しなかったことが記載されている。またキノコ類全般が心拍数低下効果を有するという訳でもなく、例えば非特許文献８には、シイタケ菌糸体エキスは血圧や心拍数に大きな影響を与えなかったことが記載されている。
【０００６】
ポルチーニは、スープやパスタの材料として、またはそのままソテーして食される、食用キノコである。独特の上品な香りを有しており、特にヨーロッパにおいて食材としてよく使用されている。また菌根菌であるため、人工栽培が成功しておらず、高級食材として扱われている。
これまでに、ポルチーニの有する生理活性として抗酸化活性が知られているが、心拍数低下効果を有するか否かについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2002-176975号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】FoodStyle21, 10, 5, 41-43, 2006
【非特許文献２】バイオフィードバック研究, 28, 62-70, 2001
【非特許文献３】Biol Psychol, 74, 39-45, 2007
【非特許文献４】Am Heart J, 125, 1148-1154, 1993
【非特許文献５】Prog Cardiovasc Dis, 52, 6-10, 2009
【非特許文献６】日本未病システム学会雑誌, 11, 51-53, 2005
【非特許文献７】和漢医薬学雑誌, 16, 201-207, 1999
【非特許文献８】応用薬理, 23, 661-667, 1982
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、正常値よりも高い心拍数の対象のみならず正常心拍数の対象においても心拍数低下効果を有し、かつ通常の食生活において摂取しやすく長期連用が可能な心拍数低下剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、正常値よりも心拍数が高い自然発症高血圧ラットのみならず正常心拍数のラットに対しても、ポルチーニ由来の成分が心拍数低下効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］ポルチーニ子実体又はその抽出物を有効成分とする心拍数低下剤。
［２］経口投与用であり、投与量がポルチーニ乾燥子実体換算で0.1 g/60 kg/日〜20 g/60 kg/日である、［１］に記載の剤。
［３］経口投与用であり、投与量がポルチーニ乾燥子実体換算で2.5 g/60 kg/日〜10 g/60 kg/日である、［１］又は［２］に記載の剤。
［４］抽出物が熱水抽出物である、［１］〜［３］のいずれかに記載の剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の心拍数低下剤は、正常値よりも高い心拍数の対象において顕著な心拍数低下効果を示すだけでなく、正常心拍数の対象に対しても穏やかな安定した心拍数低下効果を示す。そのため、長期連用しても安全な、心拍数低下手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ポルチーニ抽出物投与開始後の心拍数の推移を示す。
【図２】図２は、図１のデータを元に算出した心拍数の時間曲線下面積（AUC）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明におけるポルチーニは、イタリア料理、ポーランド料理などでよく使用されている、食用キノコである。その形態は、傘の裏にひだの代わりにスポンジ状の構造があることにより特徴付けられる。また乾燥しても消失しない独特の芳香を有する。本発明におけるポルチーニは、上記形態的特徴及び芳香を有し、市場においてポルチーニとして取引されるものであれば特に限定されない。またポルチーニは、樹木の根に菌根を作って共生する菌根菌であり、通常、ハラタケ目（Agaricales）イグチ科（Boletaceae）ヤマドリタケ属（Boletus spp.）に分類される、Boletus edulis、B. aereus、B. aestivalis、B. pinophilus、B. reticulatusなどの複数の種を含む一群の担子菌である（Hall R et al., Economic Botany, 52, 44-56, 1998; Dentinger BTM et al., Mol Phylogenet Evol, 57, 276-1292, 2010）。また同じ種名が与えられた担子菌の中には、その由来（採取された地域）の違いにより更に複数のグループに分類される複数の担子菌が含まれる。ポルチーニはヨーロッパ、アジア、北米、中米、北アフリカ等、様々な地域で天然に採取されるが、本発明におけるポルチーニはいずれの地域で採取されたものであってもよく、またそれらの変異体であってもよい。尚、本明細書中、ポルチーニは、通常菌の分類上の名称を指すが、文脈によりその子実体（キノコ）を意味する場合もある。
【００１５】
本発明において、ポルチーニは、好ましくは、ヤマドリタケ属に属する担子菌である。対象とする担子菌がヤマドリタケ属に属するか否かは、例えば、Internal Transcribed Spacers（ITS）領域（ITS1-5.8S rRNA-ITS2）の塩基配列データと既知種の配列データとを比較し系統解析を行って決定することができる。系統解析及び系統樹の作成方法は、例えば以下の手順に従って行なう。
【００１６】
まず当該担子菌から鋳型となるゲノムDNAを抽出する。担子菌からDNAを抽出する方法は公知であり、いずれの方法を使用してもよい。市販の試薬やキット（例えば、DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen社））なども好適に使用され得る。
【００１７】
次にポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりITS領域を増幅する。PCRにおいて使用されるプライマーの配列は、少なくともヤマドリタケ属に属する全ての既知担子菌のITS領域が増幅されるよう適宜設計することができるが、生物種を超えて保存された配列からなるプライマー（ユニバーサルプライマー）を使用することもできる。またPCRの条件は特に限定されず、通常用いられる範囲内で適宜選択することができる。市販のPCR用試薬（例えば、Takara Ex Taq （タカラバイオ社）など）を使用して、添付の説明書に従って反応を行うことができる。
【００１８】
PCRで増幅されたDNA断片は、必要に応じてスピンカラムなどを用いて精製されたのち、その塩基配列が決定される。塩基配列の決定は定法に従って行なうことができる。
【００１９】
決定された塩基配列は、適当な遺伝子配列データベースおよび相同性検索プログラムを用いて、既知の担子菌ITS領域の塩基配列またはその部分配列とのホモロジー検索を行うことにより、最も高い相同性を示す既知配列を抽出することができる。例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）のホームページを通じて、BLASTが利用できる。プログラムとしてblastnを選択し、決定された塩基配列をクエリーとして検索を実施すれば、高い相同性を示す既知配列が抽出され出力される。担子菌のITS領域の塩基配列のデータセットを含む限り、いかなる他の遺伝子配列データベースも利用することができる。また、上記以外の自体公知の相同性検索プログラムを用いることもできる。
【００２０】
相同性検索の結果、対象とする担子菌のITS領域の配列が、ヤマドリタケ属に属さない担子菌の既知配列よりもヤマドリタケ属に属する担子菌の既知配列とより高い相同性を示す場合、当該担子菌をヤマドリタケ属に属する担子菌として同定することができる。例えば、後述の実施例に記載のポルチーニは、ITS領域において、ヤマドリタケ属に属する担子菌Boletus aestivalis (=reticulatus)の既知配列と99％の高い相同性を示すため、ヤマドリタケ属に属する担子菌として同定される。
【００２１】
或いは、増幅したDNAの塩基配列に基づき分子進化系統樹を推定し、対象とする担子菌の分類学的位置を特定することもできる。分子進化系統樹解析ソフトはインターネット等でも公開されており、それらを利用することができる（CLUSTAL W等）。系統樹解析の結果、対象とする担子菌がヤマドリタケ属に属する担子菌と同じクラスターにある場合、当該担子菌をヤマドリタケ属に属する担子菌として同定することができる。
【００２２】
本発明の心拍数低下剤（以下、本発明の剤とも称する）は、ポルチーニ子実体又はその抽出物を有効成分とする。
本発明において子実体とは、通常傘と柄とを有する、菌類が胞子形成のために作る構造である。いわゆるキノコであり、食用とされる部分である。本発明におけるポルチーニ子実体は、人工栽培したものであっても天然から採取されたものであってもよい。ただし、ポルチーニは菌根菌であり、これまでその子実体の純粋培養は成功しておらず、現在のところ入手可能な子実体は全て天然から採取されたものである。ポルチーニ子実体は、生のものであっても乾燥したもの（例えば、水分5％以下）であってもよいが、入手の容易さから通常乾燥したものが使用される。ポルチーニ乾燥子実体は更に粉砕して粉末としてもよい。またポルチーニ子実体には、適宜殺菌処理（例えば90℃以上、6.5分間の蒸気殺菌など）を施してもよい。
ポルチーニ乾燥子実体は、料理材料として容易に商業的に入手可能である。
【００２３】
ポルチーニ子実体の抽出物は、自体公知の方法により調製することができる。例えば、粉砕などにより組織を破壊したポルチーニ子実体（例えば、乾燥粉末）に、抽出溶媒を加えて適宜撹拌し、ろ過や遠心分離により抽出液と残渣に分離することにより行なうことができる。抽出溶媒としては、水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）が挙げられるが、好ましくは水またはアルコールであり、最も好ましくは水である。抽出は、常温下で行なってもよいが、抽出効率を高めるため、加熱下（例えば、80℃で2時間）で行なうことが好ましく、特に抽出溶媒が水である場合には加熱下で抽出を行なうこと（即ち、熱水抽出）が好ましい。加熱下で抽出を行なった場合、抽出効率を高めるため、そのまま室温まで放冷するのが好ましい。また抽出は、常圧下で行なっても加圧下で行なってもよい。
残渣から分離した抽出液は、そのまま本発明の剤の有効成分とすることができるが、更に濃縮するか又は溶媒を除去して乾燥させてもよい。濃縮又は溶媒の除去は、自体公知の方法で行うことができ、例えば、凍結乾燥、スプレードライなどにより行なうことができる。また濃縮又は乾燥後の抽出物に所望の量の溶媒（例えば、水など）を添加して、所望の濃度に調整してもよい。
【００２４】
本発明は、ポルチーニが心拍数低下効果を有することを初めて見出したことに基くものである。ここで「心拍数低下効果」とは、被験対象の心拍数を統計学上有意に（具体的には、p<0.05）降下させるか、又は心拍数が上昇傾向にある被験対象における心拍数の上昇を抑制し統計学上有意に（具体的には、p<0.05）低いレベルに維持する効果をいう。心拍数の統計分析は、一回の測定値について行なってもよいし、一定期間の測定値に基いて算出した曲線下面積（AUC）について行なってもよい。被験対象は、正常心拍数の対象であっても、正常心拍数よりも高い心拍数の対象（頻脈の対象）であってもよいが、本発明の剤は、頻脈の対象に対してより顕著な心拍数低下効果を示す傾向がある。
ここで「正常心拍数」とは、疾患（例えば、呼吸器疾患、心疾患、精神疾患、発熱等）を有さず、死亡のリスクが少ないとされる、安静時における心拍数であり、対象の種、年齢等によって異なり得る。例えば、ヒトにおいては、50〜80 bpmの場合、正常心拍数であるといえる。対象の心拍数が、正常心拍数の範囲よりも高い場合、頻脈であるといえる。
心拍数低下効果の有無は、被験対象の心拍数を自体公知の任意の方法で測定し、コントロール（例えば、被験試料非投与群）と比較することによって調べることができる。
【００２５】
本発明の剤は、高血圧や不整脈の対象（例えば、高血圧症患者や不整脈患者など）などの頻脈の対象に対して顕著な心拍数低下効果を示し、本発明の剤を投与しない場合の心拍数と比較して、通常1〜20％程度、好ましくは3〜15％程度、より好ましくは5〜13％程度低下させる。また正常心拍数の対象に対しても心拍数低下効果を示すが、急激な低下や徐脈のような異常な低下をもたらすものではなく、穏やかな効果であり、通常1〜12％程度、好ましくは2〜10％程度、より好ましくは3〜7％程度の心拍数の低下である。心拍数を正常心拍数から1〜12％程度低下させることで、リラックスした状態を作り出し得る。従って、本発明の剤は、頻脈の対象に対して心拍数低下又は心拍数の上昇抑制に使用することができるだけでなく、正常心拍数の対象に対しても適度な心拍数低下をもたらすことでリラックスした状態を作り出すために使用することができる。
【００２６】
本発明の剤の投与量は、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、通常ポルチーニ乾燥子実体換算で0.1 g/60 kg/日以上、好ましくは1 g/60 kg/日以上、より好ましくは2.5 g/60 kg/日以上である。投与量が0.1 g/60 kg/日未満であると、心拍数低下効果が得られにくくなる傾向がある。また、投与量の上限値には特に限定はないが、通常 20 g/6O kg/日以下、好ましくは10 g/6O kg/日以下である。20 g/6O kg/日を超えると、心拍低下効果が飽和する傾向がある。従って、本発明の剤の投与量は、通常0.1 g/60 kg/日〜20 g/6O kg/日、好ましくは2.5 g/60 kg/日〜10 g/6O kg/日である。
ここで本発明の剤の有効成分がポルチーニ子実体の抽出物である場合、「ポルチーニ乾燥子実体換算」とは、本発明の剤の重量を、本発明の剤に含まれる当該抽出物の調製に供した乾燥子実体の重量に換算することを意味する。
【００２７】
本発明の剤は、種々の形態、例えば、医薬品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、いわゆる健康食品、サプリメント又は飼料として提供することができる。また本発明の剤を、添加剤（例えば食品添加剤）として所望の飲食品に添加することもできる。
ここで特定保健用食品は、その食品が持つ健康機能の表示が認められる食品（食品毎に厚生労働省の許可を必要とする）をいい、栄養機能食品は、栄養成分の機能を明記できる食品（厚生労働省が作成した規格基準を満たす必要がある）をいい、いわゆる健康食品は、上記保健機能食品以外の食品一般を意味し、健康補助食品等を含む。
【００２８】
本発明の剤は、既知製剤又は将来開発される製剤の形態、例えば、経口投与又は非経口投与の形態で投与されるが、経口投与が簡便で好ましい。経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、錠剤、（マイクロ）カプセル剤等の固形剤や、シロップ・ジュース等の溶液剤や乳・懸濁剤等が例示される。また、非経口投与剤としては、注射、経腸、経皮、吸入用の製剤が例示される。
【００２９】
これらの製剤の製造には、自体公知の方法又は将来開発される方法を適宜に採用することができる。製剤の製造に際しては、各製剤の剤型に応じて、適宜の医薬上許容される担体、例えば通常の製剤用物質を補助剤として使用することができる。製剤用物質としては、例えば、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を挙げることが出来る。
【００３０】
本発明の剤が経口投与用である場合には、本発明の効果を妨げない範囲内で、例えば以下のような添加物を配合してもよい：糖質（グルコース、スクロース、でん粉など）、脂質（植物油、魚油、動物脂など）、タンパク質（大豆タンパク、乳タンパクなど）、ミネラル（カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩などの無機塩類）、ビタミン類（チアミン、ナイシン、ビタミンＣ、カロテンなど）等の栄養成分；食品としての機能（味、食感、安全性など）を付与するのに適当なスクロース、アスパルテーム、アセスルファムK、グルタミン酸ナトリウム等の嬌味成分；顆粒化、粉末化、固体化して摂取し易くするなどの目的での糖質、無機塩類等の賦形成分；エチルアルコール、酢酸、酢酸ナトリウム、グリシンなどの静菌性成分；カラメル色素、アナトー色素、ベニバナ色素、パプリカ色素、紅麹色素、ブドウ色素などの天然物由来色素、各種合成色素などの色素。また、本発明の剤をより経口投与しやすい食品形態として提供するために、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、みりん、粉末酒、砂糖、食塩、各種エキス、各種エキス粉末などの調味料素材と配合して提供することも可能である。これらに限らず、その他の、当該分野で常用されている添加物や食品素材を配合することもできる。
【００３１】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３２】
方法
ポルチーニ抽出物の調製法
ポルチーニ乾燥子実体粉末（雲南緑華食品有限公司）10 gと滅菌水600 mlをリービッヒ冷却管付き三角フラスコに加え、80℃の湯浴中で2時間抽出後、室温まで放冷した。この溶液をろ紙でろ過し、ろ液を凍結乾燥した（抽出効率46.2％）。凍結乾燥物を、抽出前のポルチーニ乾燥子実体換算で、2.5、5、および10 g/600 mlとなるよう精製水にて溶解し、各濃度の熱水抽出物とした。
尚、当該ポルチーニ乾燥子実体のITS領域の塩基配列は、Boletus aestivalis (=reticulatus) SU90のDNA塩基配列（GenBankアクセション番号：DQ131611）と99％の相同性を示した。従って、当該ポルチーニ乾燥子実体は、ヤマドリタケ属に属する担子菌の子実体であることが確認された。
【００３３】
継続投与試験
日本チャールスリバー（株）より購入した6週齢、体重約160 gの雄性自然発症高血圧ラット（SHR）および正常血圧のウィスター京都ラット（WKY）を、MF粉末（オリエンタル酵母工業（株）製）に8％NaClを添加した飼料で2週間予備飼育した。その後、各個体の血圧値を測定し、SHRラットおよびWKYラットのそれぞれについて平均値がほぼ等しくなるように、SHRラットでは1群5頭の4群、またWKYラットでは1群5頭の2群に割り付けた。対照区（0 g/体重60 kg）として抽出物を含まない精製水を用い、SHRラットに対しては、体重100 g当り1 mlの2.5、5、または10 g/600 mlの抽出物（それぞれ2.5、5、10 g抽出前ポルチーニ量/体重60 kgに相当、以後2.5、5、10 g/60 kgと記載）、また、WKYラットに対しては、10 g/600 mlの抽出物（10 g/60 kg）を毎日1回ゾンデにより胃内経口投与した。群分け後は、NaCl無添加のMF粉末飼料と飲料水を自由摂取させ、26週齢（投与18週目）まで飼育し、毎週1回心拍数を測定した。飼育室の環境は、温度26±2℃、湿度50％、白色蛍光灯で1日12時間の採光下（7〜19時明期）とした。
【００３４】
心拍数測定
各ラットを38℃の加温器中で数分間加温し順応させた後、非観血式自動血圧測定装置（ソフトロン社製BP-98A）を用いて、ラットの尾脈波から心拍数を測定した。測定値は3回測定した値の平均値とした。測定は、抽出物を投与する前に実施した。
【００３５】
統計解析
各データは、平均値±標準誤差で示し、統計解析にはSPSS13.0J（日本アイ・ビー・エム株式会社）を用いた。SHRラットを用いた評価とWKYラットを用いた評価について、それぞれで分散分析を行った。これにより、有意差が認められた場合、SHRラットを用いた評価では、各時間について0 g/60 kgを対照として群間でDunnet検定を行い、WKYラットを用いた評価では、各時間について群間でt検定を実施した。統計学的有意水準は、p<0.05とした。
【００３６】
結果
図１に熱水抽出物投与開始後の心拍数の推移を示した。SHRラットを用いた評価では、二元配置分散分析で有意差が認められた（p=0.035）。図１中、投与群に対して有意差が認められた非投与群（0 g/60 kg）のデータを、a（vs. 2.5 g/60 kg）、b（vs. 5 g/60 kg）、c（vs. 10 g/60 kg）で示した。SHRラットにおける心拍数は、2.5 g/60 kgでは投与10週目において、5 g/60 kgでは投与2、3、5、7、9〜18週目において、10 g/60 kgでは投与3、5、7、9〜16、18週目において、0 g/60 kgに対し有意に低値を示した。一方、WKYラットを用いた評価では、二元配置分散分析で有意差は認められなかった（p=0.727）。
【００３７】
図２に、図１のデータを元に算出した心拍数の時間曲線下面積（AUC）を示した。SHRラットを用いた評価では、一元配置分散分析で有意差が認められ（p<0.001）、0 g/60 kgに対し、全ての用量で有意に低値を示した（図２中、*（p<0.05）及び***（p<0.001））。WKYラットを用いた評価においても群間に有意差が認められ、0 g/60 kgに対し、10 g/60 kgは有意に低値を示した（図２中、*（p<0.05））。
【００３８】
以上の結果から、本発明の心拍数低下剤は、頻脈の対象に対して優れた心拍数低下効果を示す一方、正常心拍数の対象に対しては急激な心拍数の低下や徐脈のような異常な低下ではなく、適度な心拍数低下をもたらすことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の心拍数低下剤は、心拍数が高い対象の心拍数を低下させるか、心拍数が上昇傾向にある対象の心拍数の上昇を予防するか、又は正常心拍数の対象の心拍数を適度に低く維持するための、医薬品、保健機能食品などの原料として有用である。
【図１】
2013221009.tif 000002
【図２】
2013221009.tif 000003