(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便かつ精度良く胃癌の再発を判定できる実用的な方法を提供する。【解決手段】胃癌試料中に含まれる胃癌細胞に特異的なマーカー遺伝子の少なくとも一部の領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅するとともに標識して前記マーカー遺伝子の標識断片を取得するステップを含み、陰性コントロールプローブが固定された位置で測定された標識強度を基準として、マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置で測定された標識強度の結果が、所定の閾値を超えたとき、胃癌試料が陽性であると判定するステップを含む。【選択図】図１
2013102716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌試料中に含まれる胃癌細胞に特異的なマーカー遺伝子の少なくとも一部の領域をポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）により増幅するとともに標識して前記マーカー遺伝子の標識断片を取得するステップと、
前記マーカー遺伝子の標識断片と、植物由来の陰性コントロール核酸鎖とを混合させるステップと、
前記マーカー遺伝子を検出する少なくとも一以上のマーカー遺伝子検出用プローブと、前記陰性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合する陰性コントロールプローブとが所定の位置にそれぞれ固定された担体に、前記マーカー遺伝子の前記標識断片と前記陰性コントロール核酸鎖との混合物を接触させて、前記マーカー遺伝子検出用プローブと前記マーカー遺伝子の前記標識断片とをハイブリダイズさせるとともに、前記陰性コントロールプローブと前記陰性コントロール核酸鎖とをハイブリダイズさせるステップと、
ハイブリダイズさせる前記ステップの後に、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置、及び、前記陰性コントロールプローブが固定された位置の標識強度をそれぞれ測定するステップと、
前記陰性コントロールプローブが固定された位置で測定された前記標識強度を基準として、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置で測定された前記標識強度の結果が所定の閾値を超えたとき、前記胃癌試料が陽性であると判定するステップと、
を含むことを特徴とする胃癌の再発を判定する方法。
【請求項２】
前記陰性コントロール核酸鎖がシロイヌナズナ由来のＤＮＡ鎖であり、
前記陰性コントロールプローブが、配列番号１で表される塩基配列からなるシロイヌナズナ遺伝子検出用プローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子がＣＥＡ、ＴＦＦ１、ＦＡＢＰ１、ＣＫ２０、ＭＵＣ２０及びＴＡＣＳＴＤ１であり、
前記担体には、
配列番号２で表される塩基配列からなるＣＥＡ検出用プローブと、
配列番号３で表される塩基配列からなるＴＦＦ１検出用プローブと、
配列番号４で表される塩基配列からなるＦＡＢＰ１検出用プローブと、
配列番号５で表される塩基配列からなるＣＫ２０検出用プローブと、
配列番号６で表される塩基配列からなるＭＵＣ２検出用プローブと、
配列番号７で表される塩基配列からなるＴＡＣＳＴＤ１検出用プローブと、
が前記マーカー遺伝子検出用プローブとしてそれぞれ所定の位置に固定されており、
前記マーカー遺伝子の前記標識断片を取得する前記ステップにおいて、
配列番号１０及び１１で表される塩基配列からなるＣＥＡ増幅用プライマーと、
配列番号１２及び１３で表される塩基配列からなるＴＦＦ１増幅用プライマーと、
配列番号１４及び１５で表される塩基配列からなるＦＡＢＰ１増幅用プライマーと、
配列番号１６及び１７で表される塩基配列からなるＣＫ２０増幅用プライマーと、
配列番号１８及び１９で表される塩基配列からなるＭＵＣ２増幅用プライマーと、
配列番号２０及び２１で表される塩基配列からなるＴＡＣＳＴＤ１増幅用プライマーと、
を用いて前記胃癌試料中に含まれる前記マーカー遺伝子の少なくとも一部の領域を前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記マーカー遺伝子の前記標識断片を取得する前記ステップにおいて、前記マーカー遺伝子の少なくとも一部の領域を増幅しながら、微生物由来の陽性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域を前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、前記マーカー遺伝子の標識断片とともに前記陽性コントロール核酸鎖の標識断片を取得し、
ハイブリダイズする前記ステップにおいて、前記陽性コントロコール核酸鎖の前記標識断片と相補的に結合する陽性コントロールプローブがさらに固定された前記担体に、前記陽性コントロール核酸鎖の前記標識断片をさらに含む前記混合物を接触させて、前記陽性コントロールプローブと前記陽性コントロール核酸鎖の前記標識断片とをハイブリダイズし、
前記標識強度を測定する前記ステップは、前記陽性コントロールプローブが固定された位置における標識強度を基準として、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置、及び、前記陰性コントロールプローブが固定された位置の前記標識強度をそれぞれ測定する、請求項１乃至３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記陽性コントロール核酸鎖がλＤＮＡ鎖であり、
前記陽性コントロールプローブが、配列番号９で表される塩基配列からなるλＤＮＡ鎖検出用プローブであり、
前記マーカー遺伝子の前記標識断片を取得する前記ステップにおいて、前記マーカー遺伝子の少なくとも一部の領域とともに、配列番号２４及び２５で表される塩基配列からなるλＤＮＡ増幅用プライマーを用いて前記陽性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域を前記ポリメラーゼ連鎖反応により増幅する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカー遺伝子の前記標識断片を取得する前記ステップにおいて、蛍光標識された前記マーカー遺伝子の前記標識断片を取得し、
前記標識強度を測定するステップにおいて、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置、及び、前記陰性コントロールプローブが固定された位置の蛍光強度をそれぞれ測定する、請求項１乃至５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
胃癌細胞に特異的なマーカー遺伝子を検出する少なくとも一以上のマーカー遺伝子検出用プローブと、陰性コントロールプローブとが所定の位置にそれぞれ固定された担体と、
植物由来の陰性コントロール核酸鎖と、
を備え、
前記陰性コントロールプローブは、前記陰性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合し、
胃癌試料中に含まれる前記マーカー遺伝子の少なくとも一部の領域をポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＰＣＲ）により増幅するとともに標識して、取得された前記マーカー遺伝子の標識断片を前記マーカー遺伝子検出用プローブとハイブリタイズさせるとともに、前記陰性コントロールプローブと前記陰性コントロール核酸鎖とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ後に測定された前記陰性コントロールプローブが固定された位置の標識強度を基準として、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置の標識強度の結果が所定の閾値を超えたとき、前記胃癌試料が陽性であると判定することで胃癌の再発を判定するための胃癌再発判定用キット。
【請求項８】
前記陰性コントロール核酸鎖がシロイヌナズナ由来のＤＮＡ鎖であり、
前記陰性コントロールプローブが、配列番号１で表される塩基配列からなるシロイヌナズナ遺伝子検出用プローブである、請求項７に記載の胃癌再発判定用キット。
【請求項９】
前記マーカー遺伝子がＣＥＡ、ＴＦＦ１、ＦＡＢＰ１、ＣＫ２０、ＭＵＣ２０、及びＴＡＣＳＴＤ１であり、
前記担体には、
配列番号２で表される塩基配列からなるＣＥＡ検出用プローブと、
配列番号３で表される塩基配列からなるＴＦＦ１検出用プローブと、
配列番号４で表される塩基配列からなるＦＡＢＰ１検出用プローブと、
配列番号５で表される塩基配列からなるＣＫ２０検出用プローブと、
配列番号６で表される塩基配列からなるＭＵＣ２検出用プローブと、
配列番号７で表される塩基配列からなるＴＡＣＳＴＤ１検出用プローブと、
が前記マーカー遺伝子検出用プローブとしてそれぞれ所定の位置に固定されており、
前記マーカー遺伝子の一部の領域を増幅するためのプライマーセットとして、
配列番号１０及び１１で表される塩基配列からなるＣＥＡ増幅用プライマーセットと、
配列番号１２及び１３で表される塩基配列からなるＴＦＦ１増幅用プライマーセットと、
配列番号１４及び１５で表される塩基配列からなるＦＡＢＰ１増幅用プライマーセットと、
配列番号１６及び１７で表される塩基配列からなるＣＫ２０増幅用プライマーセットと、
配列番号１８及び１９で表される塩基配列からなるＭＵＣ２０増幅用プライマーセットと、
配列番号２０及び２１で表される塩基配列からなるＴＡＣＳＴＤ１増幅用プライマーセットと、
を備える、請求項７又は８に記載の胃癌再発判定用キット。
【請求項１０】
微生物由来の遺伝子配列からなる陽性コントロール核酸鎖と、
前記陽性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域を増幅させる陽性コントロール核酸鎖増幅用プライマーセットと、
をさらに備え、
前記担体には、陽性コントロールプローブが所定の位置に固定されており、
前記陽性コントロールプローブは、前記陽性コントロール核酸鎖増幅用プライマーセットにより増幅される前記陽性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合する、請求項９に記載の胃癌再発判定用キット。
【請求項１１】
前記陽性コントロール核酸鎖がλＤＮＡ鎖であり、
前記陽性コントロールプローブが配列番号９で表される塩基配列からなるλＤＮＡ検出用プローブであり、
前記陽性コントロール核酸鎖増幅用プライマーセットが、配列番号２４及び２５で表される塩基配列からなるλＤＮＡ鎖増幅用プライマーである、請求項１０に記載の胃癌再発判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌の再発を判定する方法、及び、これに用いる胃癌再発判定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップ技術を用いた、細胞診に換わる再発予測法が開発されている。
【０００３】
特許文献１には、ＴＦＦ１、ＴＦＦ２、ＦＡＢＰ１、ＣＫ２０、ＭＵＣ２、ＣＥＡ、ＴＡＣＳＴＤ１、ＭＡＳＰＩＮ、並びにＡＣＴＢの合計９種類の遺伝子の発現レベルの測定に基づき、胃癌の再発予測を行うことが記載されている。特許文献１の技術によれば、対象の癌患者から採取した試料を利用して対象の遺伝子の一部の領域をＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ増幅物と、合計９種類のプローブが固相上に配置されているアレイとをハイブリダイゼーションさせて、得られるアレイの結果から、均一で正確な胃癌の再発予測のためのデータ取得が可能になるとされている。
【０００４】
また、非特許文献１には、ＣＫ２０、ＦＡＢＰ１、ＴＦＦ１及びＭＡＳＰＩＮについてのマイクロアレイアッセイと免疫細胞化学的な結果が非常に一致していたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２２３３０３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４，１６９４−１７０２，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記文献の技術では、カットオフ値を定めるため、検査対象検体と同時に早期胃癌検体を用いた測定を行う必要があった。
【０００８】
例えば、特許文献１の技術では、早期胃癌症例３９例の最大輝度値を判定値としてこの判定値を上回る輝度値が得られた遺伝子について、「有意な発現があった」と判断している。
【０００９】
また、非特許文献１の技術では、早期癌サンプル３９例のＭＡＸ  ＳＤ（ｍａｘｉｍｕｍ  ｖａｌｕｅ  ｐｌｕｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）またはＡＶＧ  ２ＳＤ（ａｖｅｒａｇｅ  ｖａｌｕｅ  ｐｌｕｓ  ｔｗｉｃｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒｓ）をカットオフ値として設定し、結果として後者が有効であることを示している。
【００１０】
したがって、上記文献の技術では、４０例近くの早期胃癌の症例を検査ごとに使用しなければ的確な予後再発の判定を行うことが困難であり、実用的な方法ではでないという問題があった。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、検査対象検体と同時に早期胃癌検体を用いた測定を行わなくても、正確に胃癌の再発を判定できる、簡便かつ実用体な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、
胃癌試料中に含まれる胃癌細胞に特異的なマーカー遺伝子の少なくとも一部の領域をポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）により増幅するとともに標識して前記マーカー遺伝子の標識断片を取得するステップと、
前記マーカー遺伝子の標識断片と、植物由来の陰性コントロール核酸鎖とを混合させるステップと、
前記マーカー遺伝子を検出する少なくとも一以上のマーカー遺伝子検出用プローブと、前記陰性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合する陰性コントロールプローブとが所定の位置にそれぞれ固定された担体に、前記マーカー遺伝子の前記標識断片と前記陰性コントロール核酸鎖との混合物を接触させて、前記マーカー遺伝子検出用プローブと前記マーカー遺伝子の前記標識断片とをハイブリダイズさせるとともに、前記陰性コントロールプローブと前記陰性コントロール核酸鎖とをハイブリダイズさせるステップと、
ハイブリダイズさせる前記ステップの後に、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置、及び、前記陰性コントロールプローブが固定された位置の標識強度をそれぞれ測定するステップと、
前記陰性コントロールプローブが固定された位置で測定された前記標識強度を基準として、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置で測定された前記標識強度の結果が所定の閾値を超えたとき、前記胃癌試料が陽性であると判定するステップと、
を含むことを特徴とする胃癌の再発を判定する方法
が提供される。
【００１３】
また、本発明によれば、
胃癌細胞に特異的なマーカー遺伝子を検出する少なくとも一以上のマーカー遺伝子検出用プローブと、陰性コントロールプローブとが所定の位置にそれぞれ固定された担体と、
植物由来の陰性コントロール核酸鎖と、
を備え、
前記陰性コントロールプローブは、前記陰性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合し、
胃癌試料中に含まれる前記マーカー遺伝子の少なくとも一部の領域をポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＰＣＲ）により増幅するとともに標識して、取得された前記マーカー遺伝子の標識断片を前記マーカー遺伝子検出用プローブとハイブリタイズさせるとともに、前記陰性コントロールプローブと前記陰性コントロール核酸鎖とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ後に測定された前記陰性コントロールプローブが固定された位置の標識強度を基準として、前記マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置の標識強度の結果が所定の閾値を超えたとき、前記胃癌試料が陽性であると判定することで胃癌の再発を判定するための胃癌再発判定用キット
が提供される。
【００１４】
この発明によれば、植物由来の陰性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合する陰性コントロールプローブを担体に固定し、マーカー遺伝子検出用プローブと胃癌試料のＰＣＲ産物とをハイブリダイゼーションさせるとともに、陰性コントロールプローブと陰性コントロール核酸鎖とをハイブリダイゼーションさせて、マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置で測定された標識強度と陰性コントロールプローブの位置で測定された標識強度との対比の結果を用いて胃癌の予後を判定する。これにより、植物由来の核酸鎖が陰性コントロールとなるため、検査対象検体と早期胃癌検体とを同時に測定することなく、あらかじめ定めた閾値に基づき、胃癌の予後再発の判定を正確に行うことができる。したがって、簡便かつ実用的な胃癌の予後判定が実現可能になる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、簡便かつ精度良く胃癌の再発を判定できる実用的な方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施の形態に係る胃癌の再発を判定する方法を説明するフローチャートである。
【図２】実施の形態で用いるＤＮＡマイクロアレイのレイアウトの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１８】
図１は、本実施形態の胃癌の再発を判定する方法を説明するフローチャートである。本実施形態は、胃癌試料中に含まれる胃癌細胞に特異的なマーカー遺伝子の少なくとも一部の領域をＰＣＲにより増幅するとともに標識するステップ（Ｓ１０４）と、マーカー遺伝子の標識断片を取得するステップ（Ｓ１０５）と、マーカー遺伝子の標識断片と、植物由来の陰性コントロール核酸鎖とを混合させるステップ（Ｓ１０６）と、マーカー遺伝子を検出する少なくとも一以上のマーカー遺伝子検出用プローブと、陰性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合する陰性コントロールプローブとが所定の位置にそれぞれ固定された担体に、マーカー遺伝子の標識断片と陰性コントロール核酸鎖との混合物を接触させるステップ（Ｓ１０７）と、マーカー遺伝子検出用プローブとマーカー遺伝子の標識断片とをハイブリダイズさせるとともに、陰性コントロールプローブと陰性コントロール核酸鎖とをハイブリダイズさせるステップ（Ｓ１０８）と、Ｓ１０８の後に、マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置、及び、陰性コントロールプローブが固定された位置の標識強度をそれぞれ測定するステップ（Ｓ１０９）と、マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置で測定された標識強度と陰性コントロールプローブが固定された位置で測定された標識強度とを対比し、対比の結果が所定の閾値を超えたとき、胃癌試料が陽性であると判定するステップ（Ｓ１１０）と、を含む。
【００１９】
本実施形態において、植物由来の陰性コントロール核酸鎖としては、例えば、シロイヌナズナ、イネ、コムギ、ミヤコグサ、タバコなどの高等植物由来の核酸鎖を用いることができるが、中でもシロイヌナズナ由来の核酸鎖が好ましい。
【００２０】
以下、陰性コントロール核酸鎖として、シロイヌナズナ由来のＤＮＡ鎖（以下、「シロイヌナズナＤＮＡ鎖」ともいう。）を用いる例を挙げて各ステップについて具体的に説明する。
まず、本実施形態の方法を実行するための胃癌再発判定用キットを用意する。このキットは、少なくとも一以上のマーカー遺伝子検出用プローブと、シロイヌナズナＤＮＡ鎖を検出する配列番号１で表される塩基配列からなるシロイヌナズナ遺伝子検出用プローブ（以下、「シロイヌナズナプローブ」ともいう。）とが所定の位置にそれぞれ固定された担体と、シロイヌナズナＤＮＡ鎖とを備えている。
【００２１】
マーカー遺伝子検出用プローブは、好ましくは、６種の腫瘍マーカー遺伝子に対し、それぞれ特異的な配列を有するものである。６種の腫瘍マーカー遺伝子は、具体的には、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＴＦＥ１（ｔｒｅｆｏｉｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ  １）、ＦＡＢＰ１（Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）、ＣＫ２０（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ．  ２０）、ＭＵＣ２（腸型ムチン）及びＴＡＣＳＴＤ１（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  １）である。また、マーカー遺伝子を検出するためのプローブとしては、表１に示すものが例示できる。具体的には、配列番号２で表される塩基配列からなるＣＥＡ検出用プローブと、配列番号３で表される塩基配列からなるＴＦＦ１検出用プローブと、配列番号４で表される塩基配列からなるＦＡＢＰ１検出用プローブと、配列番号５で表される塩基配列からなるＣＫ２０検出用プローブと、配列番号６で表される塩基配列からなるＭＵＣ２検出用プローブと、配列番号７で表される塩基配列からなるＴＡＣＳＴＤ１検出用プローブである。
【００２２】
【表１】
2013102716.tif 000003
【００２３】
担体としては基板、ビーズ、繊維など様々な担体を用いることができる。基板の形状は板状には限られず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。また、基板は、一つの部材から構成されていてもよいし、複数の部材から構成されていてもよい。担体の材質としては、金属、ガラス、プラスチック、ポリマー、繊維等、を用いることができる。高感度で、かつ、同時に多項目の遺伝子を検出する方法としては、基板に検出用プローブを固定化したＤＮＡマイクロアレイが挙げられる。このＤＮＡマイクロアレイには、基板上の一定の区画内に複数のスポットを設けておき、各スポットにプローブをそれぞれ固定化しておき、マイクロアレイを形成しておくことが好ましい。
【００２４】
また、担体としては、高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板を用いてもよい。高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板は、所定の形状に加工された基板の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得ることができる。また、高分子物質を含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
【００２５】
担体として「高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板」を用いる場合、高分子物質としては、例えば、「リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質」を用いることができる。「リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質」は、例えば、特開２００６−１８７２７０の段落００３３〜００６６に記載のものを用いることができるが、中でも、下記一般式（２）で表される、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）が特に好ましい。
【００２６】
【化１】
2013102716.tif 000004
【００２７】
ただし、上記一般式（１）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数であり、ａが５〜２００、ｂが１０〜５００、ｃが１〜１００であることが好ましい。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
【００２８】
また、「高分子物質からなるコーティング層を表面に含む基板」を用いる場合、高分子物質からなるコーティング層を形成させる基板としては、プラスチック基板が、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
【００２９】
熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂；等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、基板の材料として好ましく用いられる。
【００３０】
ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。
【００３１】
担体へのシロイヌナズナプローブ及びマーカー遺伝子検出用プローブ（以下、単に「プローブＤＮＡ」ともいう。）の固定化方法は、特に限定されないが、担体として、ＰＭＢＮのコーティング層を表面に含む基板を用いる場合、例えば、ＰＭＢＮに含まれるｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル基とプローブＤＮＡとを反応させて共有結合を形成させることにより、基板表面でプローブＤＮＡを固定化することができる。
【００３２】
プローブＤＮＡを基板上に固定化する際には、プローブＤＮＡを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。このプローブＤＮＡを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。
【００３３】
また、点着後、基板表面に固定化されなかったプローブＤＮＡを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。洗浄後はプローブＤＮＡを固定化した以外の基板表面のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル基の不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行ってもよい。
【００３４】
また、基板に固定化するプローブＤＮＡには、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基はｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプローブＤＮＡを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上にプローブＤＮＡを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプローブＤＮＡの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＤＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
【００３５】
以上により、基板の表面上に表１に示すプローブが固定化されたＤＮＡマイクロアレイを得ることができる。
【００３６】
ＤＮＡマイクロアレイによる発現解析を行う場合には、より確度の高い判定を行うため、内部コントロールや外部コントロールを用いることが好ましい。本実施形態では、内部コントロールとして、ＡＣＴＢ（ベータアクチン）を用いることができる。また、外部コントロールとしては、陰性コントロールや陽性コントロールを用いることができ、上述のとおり本実施形態では、陰性コントロールとしてシロイヌナズナＤＮＡ鎖を用いることができ、陽性コントロールとしてλＤＮＡ鎖を用いることができる。ＡＣＴＢを内部コントロールとして用いる場合は、配列番号８で表される塩基配列からなるＡＣＴＢ検出用プローブを内部コントロールプローブとして担体に固定させることができる。ＡＣＴＢ検出用プローブの固定化もシロイヌナズナプローブやマーカー遺伝子検出用プローブの固定化と同様に行うことができる。
【００３７】
胃癌再発判定用キットには、マーカー遺伝子の一部の領域を増幅するためのプライマーセットを備えることが好ましい。こうすることで、審査腹腔鏡時の洗浄液もしくは術中腹腔内洗浄液から抽出したｍＲＮＡが少ない場合であっても、増幅させて有効な判定が可能になる。表１で示すプローブによって検出される各マーカー遺伝子のプライマー塩基配列を表２に示す。具体的には、配列番号１０、１１で表される塩基配列からなるＣＥＡ増幅用プライマーセット、配列番号１２、１３で表される塩基配列からなるＴＦＥ１増幅用プライマーセット、配列番号１４、１５で表される塩基配列からなるＦＡＢＰ１増幅用プライマーセット、配列番号１６、１７で表される塩基配列からなるＣＫ２０プライマーセット、配列番号１８、１９で表される塩基配列からなるＭＵＣ２プライマーセット、及び、配列番号２０、２１で表される塩基配列からなるＴＡＣＳＴＤ１プライマーセットが挙げられる。また、内部コントロールとしてＡＣＴＢを用いる場合は、配列番号２２、２３で表される塩基配列からなるプライマーセットにより、ＡＣＴＢの一部の領域を増幅させてもよい。なお、表２には、表１に示すプライマーにより増幅されるＰＣＲ産物の塩基長も併せて示す。
【００３８】
【表２】
2013102716.tif 000005
【００３９】
このようにして得られる胃癌再発判定用キットを用意した後、研究使用目的に対するインフォームド・コンセントが得られた胃癌患者から腹腔内洗浄液を回収し（Ｓ１０１）、これを遠心して浮遊成分である遊離細胞をペレット状に沈殿させた後、そのペレットからｍＲＮＡを抽出する（Ｓ１０２）。ｍＲＮＡの抽出方法は各種の方法が考案され、多くのメーカーによりキット化されており、本実施形態においてはいずれのキットも使用可能である。
【００４０】
ついで、胃癌試料中に含まれるｍＲＮＡは増幅させるため、ＲＴ−ＰＣＲを行う。具体的には、まず、逆転写酵素を用いた逆転写反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＲＴ）により、抽出したｍＲＮＡを鋳型として、例えば、ランダムヘキサマーやオリゴｄＴプライマー等のプライマーの存在下でデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を基質とし、抽出したｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを５'→３'方向に合成する。（Ｓ１０３）。
【００４１】
その後、得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅反応を行う（Ｓ１０４）。具体的には、合成したｃＤＮＡ、配列番号１０〜２５で表される塩基配列からなるプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼが働く至適塩濃度環境を作るためのバッファー溶液とを混合し、市販のＰＣＲ装置にセットする。使用するＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性を有するものであればよい。
【００４２】
その後、（１）ｃＤＮＡの熱変性（９４〜９６℃）、（２）配列番号１０〜２５で表される塩基配列からなるプライマーのアニーリング（５５〜６０℃）、（３）ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の合成（７２〜７４℃）の３段階の温度変化を、例えば、２０〜３０サイクル繰り返し、ｃＤＮＡを増幅する。
【００４３】
ここで、ＰＣＲ増幅反応は、ｄＮＴＰとともに、ラベル化したヌクレオチドモノマーを用いて実行する。ラベル方法は、蛍光体、光吸収体、放射性核種（Ｐ３２）、酵素標識などの方法が挙げられる。
例えば、蛍光ラベル化ヌクレオチドモノマーとしては、ｄＴＴＰの塩基の３位を蛍光ラベルしたＣｙ３−ｄＵＴＰが挙げられる。Ｃｙ３−ｄＵＴＰを用いた場合、鋳型ＤＮＡ断片のアデニン（Ａ）に対応する伸長（プライマー）側の位置にＣｙ３−ｄＵＴＰが挿入されたＰＣＲ産物を得ることができる。
また、放射性核種によるラベル化ヌクレオチドモノマーとしては、Ｐ３２−ＡＴＰ、Ｐ３２−ｄＡＴＰが挙げられる。
また、アミノアリルｄＵＴＰを用いてＰＣＲ増幅反応をし、反応後に、アミノアリルｄＵＴＰを含むＰＣＲ産物に対して、Ｃｙ３蛍光色素やアミノ基染色試薬（ＮＨＳ−試薬）を用いて発色させてもよい。
酵素標識の方法においては、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）化またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ：ステロイド系天然物）を結合した核酸（例えば、ｂｉｏｔｉｎ−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ）を使用して増幅した後、得られるＰＣＲ産物にアルカリフォスファターゼまたはアルカリフォスファターゼ処理しニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）液中で数時間反応させて発色させることもできる。
【００４４】
なお、Ｓ１０４では、逆転写反応で得られたｃＤＮＡとともに、陽性コントロール核酸鎖をバッファー溶液に混合して、増幅反応を行ってもよい。陽性コントロール核酸鎖としては、微生物由来の核酸鎖を用いることができ、具体的にはバクテリオファージ等のウイルス由来のものが挙げられる。陽性コントロールＤＮＡ鎖としてλＤＮＡ鎖を用いる場合、表２で示す配列番号２４及び２５で表される塩基配列からなるプライマーを用いてλＤＮＡ鎖の一部を増幅させることができる。この場合、λＤＮＡ鎖を検出するため、表１で示す配列番号９で表される塩基配列からなるλＤＮＡ検出用プローブをあらかじめ担体に固定しておく。このλＤＮＡ検出用プローブは、配列番号２４及び２５で表される塩基配列からなるプライマーにより増幅されるλＤＮＡ鎖の断片と相補的に結合できるように設計されている。
【００４５】
このようにして、標識したＰＣＲ産物（標識ＤＮＡ断片）を取得した後（Ｓ１０５）、得られた標識ＤＮＡ断片とシロイヌナズナＤＮＡ鎖とを混合する（Ｓ１０６）。標識ＤＮＡ断片とシロイヌナズナＤＮＡ鎖との混合は、ハイブリダイゼーションバッファー中で行うことが好ましい。ハイブリダイゼーションバッファーは、公知のものを用いることができるが、例えば、ＳＳＣ又はＳＳＰＥと、ＳＤＳと、ホルムアミドとの混合液を用いることができる。
【００４６】
ついで、混合した標識ＤＮＡ断片及びシロイヌナズナＤＮＡ鎖を、ハイブリダイゼーションバッファー、及び、プローブＤＮＡが固定化されたＤＮＡマイクロアレイとともにハイブリダイゼーション装置にセットし（Ｓ１０７）、例えば、４５℃〜６０℃で３〜２４時間、好ましくは３〜５時間、ハイブリダイゼーションする（Ｓ１０８）。
【００４７】
その後、マイクロアレイの洗浄後に、市販のマイクロアレイスキャナーを用いて標識強度を測定する（Ｓ１０９）。Ｓ１０４において、微生物由来のＤＮＡ鎖、特に、λＤＮＡを用いてマーカー遺伝子とともにＰＣＲ増幅させた場合は、λＤＮＡ鎖の標識強度を基準として各マーカー遺伝子の標識強度を測定してもよい。具体的には、λＤＮＡ検出用プローブが固定された位置における標識強度が所定の範囲になるように検出感度を制御する。こうすることで、アッセイ間のバラツキを補正することができる。
【００４８】
また、得られた標識強度の実測値に種々の補正をかけ、補正された実測値を真の測定値としてもよい。例えば、プローブＤＮＡが固定化されていない担体表面の標識強度をバックグラウンドとして測定結果から差し引いて、測定値としてもよい。
【００４９】
その後、得られた測定値に基づき胃癌試料の術後再発の判定を行う（Ｓ１１０）。ＤＮＡマイクロアレイによる発現解析を行う場合には、各プローブ、判定対象となるｍＲＮＡごとにしかるべき規格化を行い、各サンプル間で比較可能となる調整を行うことで、より確度の高い判定を行うことが出来る。
【００５０】
具体的には、各遺伝子の発現量（発現レベル）のカットオフ値を設定し、カットオフ値を上回った遺伝子数をカウントし、定めた数を上回るか下回るかにより判定を行う方法が有効である。そこで、本実施形態では、シロイヌナズナＤＮＡ鎖を陰性コントロールとし、これを基準として、カットオフ値（閾値）を導き出す。
【００５１】
閾値を導き出す方法は、医療機関において実際の検体を用いた解析により、経験的に、マーカー遺伝子ごとに、所定の閾値を定める。具体的には、臨床の所見やその他の測定値を合わせて所定の閾値が定められる。そして、シロイヌナズナ検出用プローブが固定された基板の位置における標識強度を基準として、各マーカー遺伝子の標識強度の相対値を算出する。各マーカー遺伝子の標識強度の相対値の算出法としては、シロイヌナズナ検出用プローブが固定された基板の位置における標識強度を１として、各マーカー遺伝子の標識強度の相対値を算出する方法や、シロイヌナズナ検出用プローブが固定された基板の位置における標識強度を０として、各マーカー遺伝子の標識強度の相対値を算出する方法が挙げられる。そして、１以上のマーカー遺伝子の標識強度の相対値が閾値を超えた場合に、結果を陽性、すなわち、予後不良（再発する、又は、再発の可能性が大きい）と判定する。一方、すべてのマーカー遺伝子の標識強度の相対値が閾値以下である場合は、結果を陰性、すなわち、予後良好（再発しない、又は、再発の可能性が小さい）と判定する。なお、陽性あるいは陰性の判定手段としては、これに限定されず、設定された閾値を超えたマーカー遺伝子が２以上の所定数あった場合に陽性と判断し、設定された閾値を超えたマーカー遺伝子がこの所定数に満たない場合を陰性と判定してもよいし、ある特定のマーカー遺伝子の標識強度の相対値が閾値を超えた場合に陽性と判断し、この特定のマーカー遺伝子の標識強度の相対値が閾値以下であった場合に陰性と判断してもよい。
【００５２】
また、Ｓ１０４において、内部コントロール（ＡＣＴＢ）や陽性コントロール（λＤＮＡ）を用いてＰＣＲ増幅を実行した場合は、ＡＣＴＢやλＤＮＡの測定結果も併せて考察することで、Ｓ１０２の抽出、又は、Ｓ１０８のハイブリダイゼーションがそれぞれ良好に進行したかどうかを判別することができる。具体的には、ＡＣＴＢの結果が陰性であり、かつ、λＤＮＡの結果が陰性である場合は、Ｓ１０２の抽出、及び、Ｓ１０８のハイブリダイゼーションのいずれもが不良であったことがわかる。また、ＡＣＴＢの結果が陽性である一方、λＤＮＡの結果が陰性であった場合は、Ｓ１０２の抽出は良好に進行したが、Ｓ１０８のハイブリダイゼーションの進行が不良であったことがわかる。ＡＣＴＢの結果が陰性であり、かつ、λＤＮＡの結果が陽性である場合は、Ｓ１０４のＰＣＲは良好に進行したが、Ｓ１０２の抽出の進行が不良であったことが分かる。
【００５３】
なお、本実施形態の判定方法とともに、通常、外科的切除治療症例、審査腹腔鏡症例において必須となっている細胞診の結果に加えて、リンパ節転移の有無、各種の癌マーカーなどの数値を参照し、状況によっては判定方法を使い分けるなど、総合的に胃癌細胞の有無を判断するとより効果的な判定が可能である。
【００５４】
つづいて、本実施形態の作用効果について説明する。本実施形態によれば、植物由来の陰性コントロール核酸鎖の少なくとも一部の領域に相補的に結合する陰性コントロールプローブを担体に固定し、マーカー遺伝子検出用プローブと胃癌試料のＰＣＲ産物とをハイブリダイゼーションさせるとともに、陰性コントロールプローブと陰性コントロール核酸鎖とをハイブリダイゼーションさせて、マーカー遺伝子検出用プローブが固定された位置で測定された標識強度と陰性コントロールプローブの位置で測定された標識強度との対比の結果を用いて胃癌の予後を判定する。これにより、植物由来の核酸鎖が陰性コントロールとなるため、検査対象検体と早期胃癌検体とを同時に測定することなく、あらかじめ定めた閾値に基づき、胃癌の予後再発の判定を正確に行うことができる。したがって、簡便かつ実用的な胃癌の予後判定が実現可能になる。
【００５５】
従来、胃癌の予後判定においては、対象検体と同時に、陰性コントロールとして腹腔内に癌細胞が存在しないものと考えられるＩａ期の早期癌検体を用いた測定を行い、早期癌検体の結果からカットオフ値を導き出す方法がとられていた。しかしながら、検査ごとに早期癌検体を用意しなければならず、実用性や倫理面で問題があった。
【００５６】
一方、本実施形態では、植物由来のＤＮＡ鎖を陰性コントロールとして用いて、精度よく胃癌の予後を判定できる。したがって、検査ごとに早期癌検体を用意する必要がなくなり、実用的である。特にシロイヌナズナＤＮＡ鎖を陰性コントロールとして用いることで、マーカー遺伝子との反応を無視できるレベルにすることができ、より精度よく胃癌の予後を判定することができる。なお、シロイヌナズナ遺伝子は、交差反応性が低いことが確認されている。また、シロイヌナズナＤＮＡ鎖は、入手が容易な点でもメリットがある。
【実施例】
【００５７】
以下、具体的な実施例を示し、本発明をさらに詳細に説明する。
【００５８】
＜実施例１＞
（１）プラスチック基板の製造
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ（Ｍｅｌｔ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。得られた基板を上記式（１）で表されるＰＭＢＮポリマー（ＭＰＣ基：ＢＭＡ基：ＮＰＭＡ基＝２３：７４：３（モル比））の０．３重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板を得た。なお、ＭＦＲは、ＪＩＳ  Ｋ  ７２１０：１９９９法記載の条件に準じて測定したものである。
【００５９】
（２）プローブＤＮＡ
５'末端がアミノ基で修飾された、胃癌再発に関するマーカー遺伝子６種類の特異配列を有するオリゴＤＮＡ鎖、およびコントロール遺伝子３種類を用意した。用意したプローブは表１に記載した９種類の遺伝子に対応したプローブである。各遺伝子に対応したプローブの配列番号は、ＣＥＡ検出用として配列番号２、ＴＦＦ１検出用として配列番号３、ＦＡＢＰ１検出用として配列番号４、ＣＫ２０検出用として配列番号５、ＭＵＣ２０検出用として配列番号６、ＴＡＣＳＴＤ１検出用として配列番号７である。また、内部コントロールとして配列番号８（ＡＣＴＢ鎖検出用）、陰性コントロールとして配列番号１（シロイヌナズナＤＮＡ鎖検出用）、陽性コントロールとして配列番号９（λＤＮＡ鎖検出用）である。
【００６０】
（３）基板へのプローブＤＮＡ固定
スポッティングバッファー（製品名：×２スポッティング液、住友ベークライト社製）を用いて、本実施例の（２）で用意したプローブＤＮＡを溶解し、１０μＭのプローブＤＮＡ溶液を調製した。この溶液をスポッター（日立ソフトウェアエンジニアリング社製ＭＡＲＫＳ−Ｉ）を用い、３００μｍ径スポットピンで、本実施例の（１）で作製したプラスチック基板（縦７５ｍｍ×横２５ｍｍ）の表面上にスポットした。スポットは、各プローブについて、Ｎ＝５でスポットした。プローブＤＮＡをスポットした基板を、８０℃で１時間加熱して、プローブＤＮＡを固定化させた。これによりプラスチック基板のポリマー表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡマイクロアレイを得た。スポットのレイアウトを図２に示す。
【００６１】
（４）ｍＲＮＡの回収
研究使用目的に対するインフォームド・コンセントが得られた胃癌術中患者に対し、通常行われる術式に従って５００ｍＬの生理食塩水を用いて腹腔内洗浄を行い、洗浄液を回収した。回収された腹腔内洗浄液のうち病理部に検査検体として提出するのに必要な分量を抜き取った余剰検体を検査対象検体とし、１５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去することによりペレット状になった沈殿成分を腹腔内浮遊細胞として回収した。回収した細胞を培養し、得られた細胞をニッポンジーン社製試薬Ｉｓｏｇｅｎに加えてホモジナイズし、少量のクロロホルムを入れ、９４２０ｒｐｍで１５分間遠心分離させ、上清を採取した。さらに採取量と等量のイソプロパノールを加え、１０分以上インキュベートした後、９４２０ｒｐｍで１０分間遠心して、ペレットを回収し、エタノール沈殿（７０％）によりｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡを１８９症例分用意し、進行癌サンプルとした。
【００６２】
（５）逆転写反応
逆転写反応を行うことにより上記抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製した。
上記抽出したｍＲＮＡを１μｇ／ｍＬに濃度調製し、調製したｍＲＮＡ１μＬと、２０μＭのランダムヘキサマー（製品名：Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ、タカラバイオ社製）１μＬと、１０ｍＭのｄＮＴＰ（ＧＥヘルスケア社製）１μＬと、精製水９μＬ、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII）１μＬ、及び、Ｒｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈ社製）１μＬを加え、４２℃で５０分加熱保持さらに７２℃で１５分加熱保持させ、一本鎖ｃＤＮＡを得た。
【００６３】
（６）マルチプレックスＰＣＲ反応
腹腔内洗浄液から得た一本鎖ｃＤＮＡを鋳型に検査対象となるマーカー遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲを行った。同一反応中に複数のプライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲ法によりｃＤＮＡの増幅を行った。同一のｃＤＮＡに対し、プライマーとして表２に示す配列番号１０〜２５の塩基配列からなるプライマーセットを用いた。
【００６４】
表２に示す配列番号１０〜２５の塩基配列からなるプライマーをＤＥＰＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｗａｔｅｒ中に各々濃度１０μＭで含むプライマー溶液を０．５μＬ、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＡｃｕｕＰｒｉｍｅ）０．５μＬ、λＤＮＡ鎖（タカラバイオ社製）をＰＣＲバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＡｃｕｕＰｒｉｍｅのキット内に含まれる）中に溶解させ２０μＬの反応液を調製した。また、ＰＣＲ産物の標識のために、アミノアリルｄＵＴＰ（Ａｍｂｉｏｎ社製）０．１μＬを基質として、ＰＣＲの反応溶液に加えた。
【００６５】
調製された反応液について、市販のサーマルサイクラー（製品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ  ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、（ｉ）熱変性９５℃１５秒、（ｉｉ）アニーリング６０℃４５秒、（ｉｉｉ）ＤＮＡ鎖の伸長反応７２℃３分のヒートサイクルで、２５サイクル行い、アミノアリル標識ＰＣＲ産物を得た。
【００６６】
精製は、チップごとにＤＮＡ精製キット（キアゲン社製ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ）を使用して上記ＰＣＲ産物の精製を行った。
【００６７】
（７）Ｃｙ３標識
得られたアミノアリル標識ＰＣＲ産物に対して、Ｃｙ３標識を行った。具体的には、本実施例の（６）で得られた調製ずみのアミノアリル標識ＰＣＲ産物を蛍光ラベル化試薬（ＧＥヘルスケア社製Ｃｙ３  Ｍｏｎｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｙｅ  Ｐａｃｋ）を使用してＣｙ３蛍光ラベル化し、さらにＤＮＡ精製キット（キアゲン社製ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ）を使用して精製を行い、Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物を得た。
【００６８】
（８）ハイブリダイゼーション
Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物４５μＬに対し、バッファー８５μＬを加え、さらに、シロイヌナズナＤＮＡ鎖（ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳ社製）を加え、ハイブリダイゼーション溶液を得た。得られたハイブリダイゼーション溶液の組成は、以下のとおりである。
［ハイブリダイゼーション溶液］
・３×ＳＳＰＥ    
・１０％ホルムアミド
・ ０．０５％ＳＤＳ
（３）で作製したＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製Ｈｙｂ４）にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った。具体的には、９５℃で５分熱変性させたハイブリダイゼーション溶液を実施例１で作製したＤＮＡマイクロアレイ上に分注し、５５℃で４時間反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、０．１％ＳＤＳを含んだ２×ＳＳＣ溶液、２×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの順でマイクロアレイの表面を洗浄して、ハイブリダイゼーション反応を終了した。
【００６９】
（９）測定
本実施例（８）で行ったハイブリダイゼーション反応終了後、スピンドライしたＤＮＡマイクロアレイについて、ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（Ａｘｏｎ社製ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ）を用いて、プローブがスポットされた位置ごとに蛍光強度を測定した。測定する際の受光感度（ＰＭＴ）は、λＤＮＡが固定されたスポットにおける蛍光強度が９００から１１００となるように調整した。蛍光強度の算出にあたっては、プローブごとに５個の測定値が得られるが、最高値及び最低値を除く中間の３個の測定値を平均化して、プローブごとに平均値を算出し、これを蛍光強度とした。進行癌サンプル全１８９症例について蛍光強度を測定した。
【００７０】
（１０）相対値を用いた再発予後判定
得られた蛍光強度の結果について、シロイヌナズナＤＮＡ鎖検出用プローブがスポットされた位置の蛍光強度を基準として各プローブが固定された位置における蛍光強度の比を算出した結果を表３−６に示す。また、各マーカー遺伝子の蛍光強度の相対値にそれぞれ閾値を設定し、その閾値を越えた場合には、陽性とし、下回る場合は、陰性とした。この閾値は、一般的なＤＮＡマイクロアレイのカットオフ値の設定が通常バックグランドの３倍であることに基づき設定した。ＴＦF１、ＦＡＢＰ１、ＣＫ２０、及び、ＭＵＣ２については、ＣＥＡやＴＡＣＳＴＤに比較して発現量が低く、また癌特有に発現するものであるため、これらの閾値は、ＣＥＡやＴＡＣＳＴＤの閾値の半分に設定した。具体的には、進行癌サンプルのマーカー遺伝子の閾値は、下記のとおり設定した。
ＣＥＡ            閾値：３
ＴＦＦ１          閾値：１．５
ＦＡＢＰ１        閾値：１．５
ＣＫ２０          閾値：１．５
ＭＵＣ２          閾値：１．５
ＴＡＣＳＴＤ      閾値：３
進行癌サンプル全１８９症例について陽性と判断されたマーカー遺伝子の数を表３−６に併せて示す。
【００７１】
【表３】
2013102716.tif 000006
【００７２】
【表４】
2013102716.tif 000007
【００７３】
【表５】
2013102716.tif 000008
【００７４】
【表６】
2013102716.tif 000009
【００７５】
＜実施例２＞
実施例１の（１）〜（８）の操作を行った。
ハイブリダイゼーション反応終了後、実施例１の（９）で示すように、プローブがスポットされた位置ごとに蛍光強度を測定した。得られた１８９症例の蛍光強度について、シロイヌナズナＤＮＡ鎖検出用プローブがスポットされた位置の蛍光強度をバックグラウンド値として、各プローブが固定された位置における蛍光強度からシロイヌナズナＤＮＡ鎖検出用プローブがスポットされた位置の蛍光強度を差し引いた結果を表７−１０に示す。また、各マーカー遺伝子の蛍光強度の相対値にそれぞれ閾値を設定し、その閾値を越えた場合には、陽性とし、下回る場合は、陰性とした。この閾値は、実施例１で説明したように、一般的なＤＮＡマイクロアレイのカットオフ値の設定が通常バックグランドの３倍であることに基づきＣＥＡ及びＴＡＣＳＴＤの閾値を設定し、ＴＦF１、ＦＡＢＰ１、ＣＫ２０、及び、ＭＵＣ２については、ＣＥＡ及びＴＡＣＳＴＤの閾値の約半分に設定した。そして、閾値を越えた場合には、陽性とし、下回る場合は、陰性とした。具体的には、進行癌サンプルのマーカー遺伝子の閾値は、下記のとおり設定した。
ＣＥＡ：          １３０
ＴＦＦ１：          ７０
ＦＡＢＰ１：        ７０
ＣＫ２０：          ７０
ＭＵＣ２：          ７０
ＴＡＣＳＴＤ１：  １３０
進行癌サンプル全１８９症例について陽性と判断されたマーカー遺伝子の数を表７−１０に併せて示した。
【００７６】
【表７】
2013102716.tif 000010
【００７７】
【表８】
2013102716.tif 000011
【００７８】
【表９】
2013102716.tif 000012
【００７９】
【表１０】
2013102716.tif 000013
【００８０】
＜比較例１＞
（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製
実施例１の（１）〜（３）の操作にしたがって、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。ただし、配列番号１で表される塩基配列からなるシロイヌナズナＤＮＡ鎖検出用プローブはＤＮＡマイクロアレイに固定しなかった。
（２）進行癌サンプルとＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーション
実施例１の（４）〜（７）の操作を行い、得られた進行癌サンプル１８９症例のＣｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物を本比較例１の（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイにそれぞれハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの条件及び操作は、実施例１の（８）に従った。ただし、Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物にシロイヌナズナＤＮＡ鎖は加えなかった。
（３）早期癌サンプルとＤＮＡマイクロアレイとのハイブリダイゼーション
細胞診により早期癌と判定された早期癌細胞２５症例について、実施例１の（４）〜（７）で示す方法と同様な操作を行ってＣｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物を用意し、比較例１の（１）で作製したＤＮＡマイクロアレイにハイブリダイズした。この場合も、ハイブリダイゼーションの条件及び操作は、実施例１の（８）に従い、Ｃｙ３蛍光ラベル化ＰＣＲ産物にシロイヌナズナＤＮＡ鎖は加えなかった。
（４）測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピンドライしたＤＮＡマイクロアレイについて、ＤＮＡマイクロアレイ用スキャナー（Ａｘｏｎ社製ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ）を用いて、プローブがスポットされた位置ごとに蛍光強度を測定した。測定する際の受光感度（ＰＭＴ）は、λＤＮＡが固定されたスポットにおける蛍光強度が１００から６００となるように調整した。蛍光強度の算出にあたっては、プローブごとに５個の測定値が得られるが、最高値及び最低値を除く中間の３個の測定値を平均化して、プローブごとに平均値を算出し、これを蛍光強度とした。全１８９症例、及び、早期癌サンプル２５症例について蛍光強度をそれぞれ測定した。
（５）再発予後判定
早期癌サンプルをハイブリダイズしたＤＮＡマイクロアレイの測定結果２５症例を用い、各マーカーについて、平均値＋その標準偏差×２をカットオフ値とした。具体的なカットオフ値を以下に示す。
ＣＥＡ：          ５６．９
ＴＦＦ１：        ５４．０
ＦＡＢＰ１：      ５５．３
ＣＫ２０：        ５３．１
ＭＵＣ２：        ４９．８
ＴＡＣＳＴＤ１：  ８５．１
進行癌サンプル１８９症例について、カットオフ値を超えたマーカー遺伝子を陽性と判断し、カットオフ値以下のマーカー遺伝子は、陰性とした。蛍光強度の結果を表１１−１４に示す。
【００８１】
【表１１】
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【００８２】
【表１２】
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【００８３】
【表１３】
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【００８４】
【表１４】
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【００８５】
＜細胞診＞
胃癌の術中腹腔内洗浄細胞診ガイドライン（日臨細胞誌４４（１）；９３−９７．２００１）に基づいて、進行癌サンプル１８９症例について、細胞診により判定を行った。各症例について回収した腹腔内浮遊細胞をスライドガラス上に載せ、引きガラスを用いて塗抹標本を作製した。速やかに塗抹標本を風乾燥させ、その後、メタノールによって３分間固定させた。ギムザ液と純水を１：２の割合で混合させ、混合液を用いて標本の染色を行った。３０分間染色させた後、純水で洗浄し、乾燥させて封じ、標本を完成させた。光学顕微鏡による標本観察で染色された癌細胞を探すことで、細胞診の判定を行った。細胞診では、クラス分類を行い、「１」は、陽性（再発する）とし、「０」は、陰性（再発しない）とした。結果を表１９−２６に示す。
【００８６】
＜リンパ節転移＞
進行癌サンプル全１８９症例について、胃癌部とともに外科的に切除した周辺リンパ節の病理診断により、リンパ節転移の有無の診断を行った。結果を表１９−２６に示す。表１９−２２では、リンパ節転移がある場合を陽性、ない場合を陰性とした。
【００８７】
また、進行癌サンプル全１８９症例の胃癌患者の術後経過については３年以上、平均４．５年にわたって追跡調査され、再発、及び死亡の有無の情報を得た。表１５−１８では、生死の結果も併せて示す。「ａｌｉｖｅ」は再発することなく生存、「再発」は再発するが生存、「ｄｅａｔｈ」は、再発による死亡を示す。また、表１９−２２では、各実施例及び各比較例において、陽性と判断されたマーカー遺伝子の数も併せて示す。表１９が実施例１の結果であり、表２０が実施例２の結果であり、表２１が比較例１の結果である。表１９−２１では再発した症例と死亡した症例数、及び、陽性あるいは陰性と判定された進行癌サンプル中の再発及び死亡症例数の割合（百分率）を各実施例及び各比較例の結果と対応づけて示す。表１９−２１では、各実施例及び各比較例で陽性マーカー遺伝子が１以上検出されたものを＋で示し、全く検出されなかったものを−で示す。
【００８８】
【表１５】
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【００８９】
【表１６】
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【００９０】
【表１７】
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【００９１】
【表１８】
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【００９２】
【表１９】
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【００９３】
【表２０】
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【００９４】
【表２１】
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【００９５】
表１９−２１で示すように、進行癌サンプル１８９症例中、リンパ節転移が陽性の１３２症例において、細胞診により検出できなかった９８症例中、実施例１，２、比較例１において陽性と判断された各２８、２７、３３症例の再発率、死亡率は、陰性だった各７０、７１、６５症例と比較して、ともに高く予後が悪かった。これら細胞診陰性・マイクロアレイ陽性症例において、実施例１、２の再発率は比較例１に比べて、各１５、１１ポイント高かった。死亡率では各１７、１６ポイント高かった。したがって、本発明によれば、早期癌患者の症例を同時に用いた従来の検査法よりも、いっそう精度よく胃癌の予後判定が行えることが明らかとなった。リンパ節転移陰性の５７症例についても、症例数は少ないもののマイクロアレイ陽性症例の再発率、死亡率ともに陰性症例に比べて高かった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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