(57)【要約】【課題】新脈管形成阻害のためのモデルおよび方法の提供。【解決手段】本発明は、新脈管形成が阻害されるべき被験体を、致死量以下の光力学治療に供することによって、下層組織の生存度を維持しながら、新生脈管構造の形成を阻害する方法を提供する。本発明はまた、特定の標的組織における新脈管形成を阻害するための致死量以下のＰＤＴプロトコルを評価するためのモデルを提供する。本発明は、下層（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）組織の生存度が維持される条件下で、ＰＤＴが新生血管構造の形成を阻害するという発見に基づく処置の方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新脈管形成およびその阻害の分野にある。より詳細には、本発明は
、新たな血管の形成を阻害するための光力学治療の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
光力学治療（ＰＤＴ）は、悪性腫瘍を処置するための方法として最初に示唆さ
れた。この方法において、  被験体は、ポルフィリン誘導体またはフタロシアニ
ンのような光活性剤（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）を投与される；こ
の光活性剤は、腫瘍組織において優先的に局在すると考えられた。次いで、腫瘍
組織が、適切な波長の光で照射されそしてこの光活性剤によって吸収された場合
、光活性化された薬物の崩壊は、この薬物の再生および周囲の組織の破壊または
障害をもたらす。
【０００３】
腫瘍の処置におけるＰＤＴの使用は、長年にわたって確立されおり、ヘマトポ
ルフィリン誘導体（ＨＰＤ、ポルフィリンの混合物）および  ＨＰＤのより強力
な誘導体（ポルフィマーナトリウム（ｐｏｒｆｉｍｅｒ  ｓｏｄｉｕｍ））の使
用で開始された。これらは、例えば、米国特許第４，９３２，９３４号に記載さ
れる。腫瘍の処置に加えて、ＰＤＴは、米国特許第４，５７７，６３６号に記載
されるように、アテローム性動脈硬化症のプラークを処置するために、そして米
国特許第４，７５３，９５８号に記載されるように、皮膚疾患の処置において使
用されてきた。ＰＤＴはまた、米国特許第４，８７８，８９１号および米国特許
第４，７２７，０２７号に記載されるように、血液および体液から病原体を根絶
するために使用されてきた。
【０００４】
特に有用な光増感剤のグループ（「グリーンポルフィリン」と称される）は、
例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，１７１，７４９号に
記載される。
【０００５】
ＰＤＴは、一般に、標的化された領域への光活性剤のホーミングを必要とせず
に、米国特許第５，７７０，６１９に記載されるように、新生血管形成（ｎｅｏ
ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の破壊された領域および損なわれた領域にお
いて有効であることが見出されている。このことは、眼の疾患、特に、米国特許
第５，７９８，３４９号に記載されるように、加齢に関連した斑の退化の処置に
おける特定の適用を有する。眼の光力学的治療はまた、米国特許第５，７５６，
５４１号に記載されるように、視力を改善することが見出されている。光力学的
治療はまた、米国特許第５，７７７６，９６６号に記載されるように、そして、
米国特許第５，８０７，８８１号にさらに記載されるように、特定の白血球を選
択的に不活化する際に有用であることが見出されている。光力学的治療はまた、
米国特許第５，３６８，８４１号に開示されるように、罹患した関節に局所的に
与えられた場合、慢性関節リウマチを処置するのに有用であることが見出されて
いる。移植拒絶もまた、米国出願番号第０８／７５９，３１８号（特許査定）に
記載されるように、この技術を使用して、最小化される。
【０００６】
前述の特許文献の全ては、本明細書中に参考として援用される。
【０００７】
従って、ＰＤＴは、種々の状況において有用であることが見出されており、こ
の状況としては、新生血管形成、炎症、および免疫応答を含む状態の処置が挙げ
られる。しかし、これまでに、ＰＤＴが新生血管形成を予防および処置し得ると
いうことは明らかになっていない。従って、ＰＤＴは、今や、本発明の結果とし
て、以前に考えられていたよりずっと早い段階で、所望されない新生血管形成と
関連する状態の処置に有用であることが見出された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、細胞の生存度を維持する条件下で、存在する新生血管構造を破壊ま
たは損なう能力とは反対に、ＰＤＴが新生脈管構造の形成を阻害する驚くべき能
力に基づく。このことは、他の方法で有用であるとみなされているよりも早期の
処置に対して設計されそしてそれに基づく処置プロトコルにおけるＰＤＴの使用
を可能にする。従って、例えば、加齢に関連した黄斑変性（ＡＭＤ）の処置は、
ずっと早い時間で開始される。
【０００９】
従って、１つの局面において、本発明は、被験体における新生脈管構造の形成
を阻害するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：光活性化合
物をこの被験体に投与する工程、ならびにこの被験体の標的部分を照射する工程
であって、この標的部分が、新生血管構造の形成は、この光活性化合物によって
吸収される光の波長で予防されるべきであり、それにより、この標的領域におけ
る新生血管構造の形成が阻害され、ここで、光活性剤の濃度および放射の時間お
よび強度は、この新生血管構造が予防される組織が生存能を維持するようなもの
である、工程。このような標的領域が見出される特定の指標は、ＡＭＤの予防の
ための脈絡膜、および形成中の血管腫（ｈｅｍａａｎｇｉｏｍａｓ）における潜
在的な血管濃縮の領域を含む。この処置は、虹彩、網膜および角膜における新生
血管構造を予防するためにも有用である。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）  被験体の標的領域における新生脈管構造の形成を予防するた
めの方法であって、該方法は、以下：
該予防の必要な被験体に光活性剤を投与する工程；および
該被験体における標的領域に照射する工程であって、ここで該新生脈管構造の
形成が、該標的領域における該新生脈管構造の形成を阻害するに十分な時間かつ
十分な強度での、該光活性剤によって吸収される照射で予防される、工程、
を包含し、
ここで、光活性剤の濃度ならびに放射の時間および強度は、該新生脈管構造が
予防される組織が生存能を維持するものである、方法。
（項目２）  前記光活性剤がポルフィリン誘導体である、項目１に記載
の方法。
（項目３）  前記ポルフィリン誘導体が、ポルフィマーナトリウムまたは
グリーンポルフィリンである、項目２に記載の方法。
（項目４）  前記グリーンポルフィリンが、ＢＰＤ−ＭＡ、ＥＡ６または
Ｂ３である、項目３に記載の方法。
（項目５）  前記照射が、５０Ｊ／ｃｍ2未満の総エネルギーである、請
求項１に記載の方法。
（項目６）  前記被験体が、眼の新生血管形成に関連する病原性状態の危
険性にある、項目１に記載の方法。
（項目７）  前記被験体が、ＡＭＤの危険性に有る、項目６に記載の方
法。
（項目８）  被験体の標的領域における新生脈管構造の形成を予防するた
めの方法であって、該方法は、そのような予防の必要な被験体における該標的領
域を、該標的領域における該新生脈管構造の形成を阻害するに十分な時間かつ十
分なエネルギーを用いて、光活性剤によって吸収される照射を用いて照射する工
程を包含し、ここで、該光活性剤は、該被験体に投与されており、ここで、光活
性剤の濃度ならびに放射の時間および強度は、該新生脈管構造が予防される組織
が生存能を維持するものである、方法。
（項目９）  前記光活性剤がポルフィリン誘導体である、項目８に記載
の方法。
（項目１０）  前記ポルフィリン誘導体が、ポルフィマーナトリウムまた
はグリーンポルフィリンである、項目９に記載の方法。
（項目１１）  前記グリーンポルフィリンが、ＢＰＤ−ＭＡ、ＥＡ６また
はＢ３である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）  前記照射が、５０Ｊ／ｃｍ2未満のエネルギーである、請
求項８に記載の方法。
（項目１３）  前記被験体が、眼の新生血管形成に関連する病原性状態の
危険性にある、項目８に記載の方法。
（項目１４）  前記被験体が、ＡＭＤの危険性に有る、項目１３に記載
の方法。
（項目１５）  生存度を維持しながら新脈管形成を阻害する標的組織につ
いてのプロトコルを同定するための方法であって、該方法は、以下：
該組織を表す細胞の実質的に二次元培養を、該細胞が細管を形成する条件下で
、提供する工程；
マトリクスの部分を培養し、そして培養物を試験プロトコルに供する工程；
マトリクスの別の部分を、試験プロトコルの非存在下で培養する工程；
マトリクスの第１および第２の部分に関して、細管形成の量を評価し、そして
該部分における細管形成のレベルを比較する工程；ならびに
該第１および第２の部分の生存度を評価する工程であって、それにより、該試
験プロトコルの非存在下で培養された該第２の部分と比較した、該試験プロトコ
ルに供された該第１の部分における細管形成のレベルの減少、および該第１の部
分における生存細胞のパーセンテージが、該第２の部分における生存細胞のパー
センテージの少なくとも半分であることが、該組織の生存度を維持しながら新脈
管形成を阻害するような試験プロトコルを同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目１６）  支持マトリクスが内皮細胞からの細管形成を支持する、請
求項１５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、細管形成の画像を分析するためのカスタマイズされたマクロを示す。
【図２】図２は、ＥＣＶ３０４新脈管形成および生存度に対するゲニステインの効果を示すグラフである。
【図３】図３は、処置の２４時間後のＥＣＶ３０４新脈管形成および生存度に対するＰＤＴの効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明を実施する態様）
本発明は、下層（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）組織の生存度が維持される条件下で
、ＰＤＴが新生血管構造の形成を阻害するという発見に基づく処置の方法を提供
する。
【００１２】
このことは、内皮細胞（好ましくは、細胞株）の培養物がマトリクス支持体上
で本質的に二次元で培養され、その結果、細管形成が直接観察され得る、モデル
系の使用によって確認される。代表的には、マトリクス支持体が、二次元表面上
でコートされ、そして予め培養された細胞が、このマトリクス上に配置される。
好ましい内皮細胞株は、ＡＴＣＣから入手可能なヒト臍静脈細胞株（ＥＣＶ３０
４）である。細管の観察可能な培養および形成を支持し得る好ましいマトリクス
は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）であり、これは、マウス肉腫から抽出された
、可溶化された基底膜調製物であり、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅ
ｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって販売されている。しかし、任意の内皮細胞培養物お
よび任意の適切な培養支持マトリクスが使用され得る。例えば、成長および増殖
を支持する際のコラーゲンゲル支持体の使用は、周知である。
【００１３】
光力学的治療を評価する際の、このタイプのモデル系の有用性およびその使用
は重要である。なぜなら、適切なプロトコルは、簡単な様式において新脈管形成
を予防しそして生存度を維持するように最適化され得るからである。処置される
べき組織（例えば、角膜、網膜細胞、脈絡膜、または任意のほかの組織であり、
ここで、新生血管形成が予防されるべきである）を表す細胞もまた、この試験組
織として使用され得る。任意の所望の光増感剤に適切なパラメーターもまた、こ
の様式で確認され得る。
【００１４】
本発明の利点は、新生脈管構造が、新生脈管構造が予防されるべき組織の生存
度が維持される光力学的治療条件下で、予防され得ることである。従って、この
処置条件は、組織に対する致死量以下効果が、新生脈管構造形成に対する障壁が
得られる間維持されるように調節されなければならない。一般的には、この結果
を制御するパラメーターは光増感剤の性質および濃度、光増感剤によって吸収さ
れる放射線の強度、ならびに強度と組み合わせて、供給される総光エネルギーを
決定する照射時間である。よい強力な効果は、当然のことながら、光増感剤の濃
度、強度、および照射時間が増加される場合に得られる。１以上のこれらのパラ
メーターにおける減少は、残りのパラメーター（単数または複数）における増加
を許容する。
【００１５】
上記のように、処置の死亡率を決定する２つの基本的なパラメーター−−すな
わち、生存度が維持され得るか否かを決定するパラメーター−−は、薬物用量、
出力強度（放射度またはフルエンス率）および照射時間である。本出願において
、フルエンス率は、ｍＷ／ｃｍ2で測定され、そしてこの値×時間の積は、Ｊ／
ｃｍ2でエネルギーを提供する。プロトコルの設計において、薬物用量および総
光エネルギーのみを考慮することが代表的であるが、フルエンス率もまた重要で
あり得る。フルエンス率が低すぎる場合、光増感剤の活性化は持続しない；フル
エンス率が高すぎる場合、高熱損傷効果が生じる。また、いくつかのプロトコル
において、照射時間は一定であり、そして最小でなければならない。このことは
、例えば、ＡＭＤおよび再狭窄の処置における場合である。従って、これらのプ
ロトコルにおいて、フルエンス率は、他の方法で所望され得るより高い。
【００１６】
関連パラメーターの適切なバランスは、標的化されるべき特定の組織のための
モデル系において容易に得られ得る。このモデル系は、一般的には、以下のよう
に作用する：マトリクス支持体上に配置された細胞が、次いで、選択された特定
の細胞株に適切な培地を使用して維持される。この細胞は、試験プロトコルに供
される前の適切な時間、マトリクスに接着させられる。このプロトコルは、毛細
管様管（ＣＬＴ）の任意の可視形成の前に、またはＣＬＴの形成が完了する前の
任意の時間で、使用され得る。代表的には、管形成の開始は、約１〜４時間後に
観察され得るが、細管形成は、２４時間後または４８時間後でさえ、なお不完全
である。直接観察は、ＣＬＴを阻害する試験プロトコルの能力の定性的評価を提
供するに十分であり得るが、利用可能なコンピューター化技術を使用してこのプ
ロトコルの効果を定量することが好ましい。画像は増強されて、不規則な背景光
が補正され得、そして毛細管様構造の測定は、ラインツール（ｌｉｎｅ  ｔｏｏ
ｌ）に続いて、カスタマイズされたマクロを使用する画像分析を使用してなされ
る。例示的なマクロは、図４に示される。
【００１７】
任意のプロトコルは、次いで、このモデルを使用して試験される。新脈管形成
を阻害するための化合物の単純な添加は、容易に実行され得る。より複雑なプロ
トコル（例えば、ＰＤＴプロトコル）は、光活性剤の添加および光の投与を含む
。適切なコントロールは、ゲニステイン、または新脈管形成を阻害することが公
知の他の任意の化合物の添加を含む。
【００１８】
このモデル系を適用することにより、光力学的治療が、下層組織を破壊せずに
新脈管形成の進行および発端を阻害する際に有効である。
【００１９】
「致死量以下」の光力学的治療により、そのプロトコルが、処置される細胞の
集団の約５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは２５％未満を殺傷
することを意味する。従って、組織または細胞が「生存能（ｖｉａｂｌｅ）を維
持する」条件は、細胞自体または組織に含まれる細胞の５０％未満が、その処置
によって殺傷される条件をいう。
【００２０】
適切な光活性剤としては、以下のようなポルフィリンベースの材料が挙げられ
る：ポルフィマー（ｐｏｒｆｉｍｅｒ）ナトリウム、グリーンポルフィリン、ク
ロリンＥ６、そのヘマトポルフィリン誘導体、フタロシアニン、エチオプルプリ
ン（ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、テキサフィリンなど。特に好ましい光活性剤
は、例えば、上記に参照される米国特許第５，１７１，７４９号に記載されるＢ
ＰＤ−ＭＡと称されるグリーンポルフィリン、ならびにそれぞれ、米国特許出願
番号第０９／０８８，５２４号および同第０８／９１８，８４０号（この両方は
本明細書中で参考として援用される）に記載される、ＥＡ６およびＢ３である。
好ましいグリーンポルフィリンは、以下の基本構造を有する：
【００２１】
【化１】
2013189474.tif 000002
ここで、Ｒ4は、ビニルまたは１−ヒドロキシエチルであり、そしてＲ1、Ｒ2お
よびＲ3はＨまたはアルキルまたは置換されたアルキルである。
【００２２】
ＢＰＤ−ＭＡは、図１に示される構造を有し、ここでＲ1およびＲ2はメチルで
あり、Ｒ4はビニルであり、Ｒ3の一方はＨであり他方はメチルである。ＥＡ６は
、式２のものであり、ここでＲ1およびＲ2はメチルであり、そしてＲ3は両方と
も２−ヒドロキシエチル（すなわち、エチレングリコールエステル）である。Ｂ
３は、式２のものであり、ここでＲ1はメチルであり、Ｒ2はＨであり、そしてＲ
3は両方ともメチルである。ＥＡ６およびＢ３の両方において、Ｒ4はまたビニル
である。
【００２３】
式３および４の関連化合物もまた有用である；一般に、Ｒ4は、ビニルまたは
１−ヒドロキシエチルであり、そしてＲ1、Ｒ2およびＲ3はＨまたはアルキルま
たは置換されたアルキルである。
【００２４】
放射は、ＰＤＴの実行に適切な任意の都合よい手段を通じて供給され得る。こ
のモデル系において、放射は、蛍光球のような標準的な光源によって単純に、都
合よく供給される。被験体の処置のために、光ファイバーまたは送達のほかのよ
り専門化した手段が好ましい。選択される波長は、光活性化合物の選択に依存す
る；どの範囲の光が適切かは、光活性剤の吸収スペクトルから明らかである。こ
の選択はまた、都合よい光源の有用性に依存し得る。
【００２５】
供給される強度およびエネルギーレベルはまた、処置される状態の性質に依存
する。光エネルギーの代表的なレベルは、少なくとも１Ｊ／ｃｍ2の範囲である
。光力学的治療は、副作用として紅斑を生じ得る伝統的なエネルギーレベルで行
われ得るか、または周囲の光に等しいレベルとみなされる「低用量」レベルで行
われ得る。「通常の」ＰＤＴについて、光のフルエンス率は、一般的に、５０〜
２００Ｊ／ｃｍ2を超える間で変化する。しかし、「低用量」レベルでは、この
フルエンス率は、代表的には、それ未満である。適切な低用量レベルは、紅斑の
症状を最初に誘発するレベルを実験的に決定し、次いでこのレベルを１／４〜１
／６までエネルギーをカットすることによって、決定され得る。「低用量」ＰＤ
Ｔの説明は、例えば、本明細書中で参考として援用される、米国出願番号第０８
／８５６，９２１号に見出される。簡単に述べると、低用量ＰＤＴは、通常、１
０Ｊ／ｃｍ2未満、好ましくは５Ｊ／ｃｍ2未満、そしてより好ましくは１Ｊ／ｃ
ｍ2以下のエネルギーを含む。しかし、本出願において、いくらかより高いエネ
ルギーが所望され得る−−例えば、２５Ｊ／ｃｍ2の範囲。このエネルギーは、
いくつかの場合には、非常に低い照射レベルを有する適切なレベルにて、１００
μＷ／ｃｍ2〜５ｍＷ／ｃｍ2のオーダーで供給され得る。再度、本出願において
、致死量以下のＰＤＴについて、わずかに５０ｍＷ／ｃｍ2より低いいくらかよ
り高い強度が使用され得る。上記のように、生存度を維持するために、薬物濃度
と照射と時間との間の最適なバランスは、本発明に記載される系のような適切な
モデル系を用いて決定され得る。しかし、一般的には、このフルエンス率および
フルエンスは、伝統的なＰＤＴのものより低い。伝統的なＰＤＴは、より高い総
エネルギーおよびより高い流速量を使用する−−１００〜２００Ｊ／ｃｍ2のオ
ーダーのエネルギーおよび２００ｍＷ／ｃｍ2のオーダーの照射。伝統的なＰＤ
Ｔは、生存度が問題ではない場合に（例えば、腫瘍を処置する際に）新生脈管構
造を予防するために使用され得る。
【００２６】
ＰＤＴの適用は毛細管の形成を阻害し得る（すなわち、新脈管形成を阻害し得
る）ので、所望されない新脈管形成によって特徴付けられる任意の状態の予防お
よび処置において有用である。このような指標は、本明細書中に参考として援用
される、Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒ
ｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７）１７
：６０５−６１９、ならびにＦｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅ
ｍ（１９９２）２６７：１０９３１−１０９３４；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，  Ｎ
ｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９５）
３３３：１７５７−１７６３を含む多数の概説において要約されている；そして
黄斑変性のための抗脈管形成薬物治療の使用は、Ｇｕｙｅｒ，  Ｄ．Ｒ．，ら、
Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  （１９９７）  １２
：１０−１３によって概説されている。Ｐｅｐｐｅｒによる概説によって記載さ
れるように、新脈管形成の予防は、以下を含む広範な種々の指標において有用で
あり、これには、以下が挙げられる：多くの医学的特別事項（予防および処置を
含む）、血管奇形、心筋肥大、血液血管腫、化膿性肉芽腫、カポージ肉腫、神経
膠腫瘍、および増殖性網膜症、ならびにＡＭＤ。この方法はまた、腫瘍における
新生脈管構造を予防するために使用され得るが、これらの環境下では、光活性化
合物および照射の投与量レベルを調節して生存度を維持する必要はない。これら
の状況に適合した適切なプロトコルは、当業者に明らかである。
【００２７】
新生脈管構造を予防するための主要な適用は、眼の処置の領域においてである
。米国特許第５，７９８，３４９号において示されるように、伝統的な光力学的
治療は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）と関連する新生脈管構造を閉じるために使用
され得る。本出願に記載される致死量以下の光力学的治療は、次いで、再発を予
防するために、脈絡膜の幅広い領域において使用され得る。
【００２８】
以下の実施例は、本発明を例示することが意図され、限定することは意図され
ない。
【００２９】
（実施例１：細管形成に対するゲニステインの効果）
コントロールとして、本明細書中に使用されるモデルシステムの有効性を確認
するため、および種々の光増感剤について決定され得るパラメーターに基づくモ
デルを提供するために、新脈管形成の公知のインヒビターであるゲニステインを
、このアッセイにおける試験プロトコルとして使用した。
【００３０】
このアッセイに使用するための内皮細胞は、以下の通りである：ヒト臍静脈Ｅ
ＣＶ３０４  （ＡＴＣＣ）を２ｍＭ  ｌ−グルタミン  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）
、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１００μｇ／ｍｌ  
ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （Ｓｉｇ
ｍａ）、および  １０％  熱非働化ウシ血清ナトリウム  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ
）を補充したＭｅｄｉｕｍ  １９９  （Ｍ１９９、Ｓｉｇｍａ）を使用して、７
５ｃｍ2フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）において培養した。細胞を、３７℃にて、加
湿ＣＯ2（５％）チャンバ中に維持し、そして０．０５％  トリプシン／０．０
０５％  ＥＤＴＡ  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、１：４〜１：１０の比
にて、コンフルエンスに達するまで継代培養した。
【００３１】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）  を  
２〜３時間４℃にて融解し、次いで０．１２５または０．２５０ｍｌ／ウェルに
てプラスチック２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に分配した。このゲルを、
少なくとも１時間３７℃にて重合化させ、その後この細胞を適用した。
【００３２】
このアッセイのために、ＥＣＶ３０４細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）
を用いてコートした２４ウェルプレート上に、３．５×１０4細胞／ウェルの濃
度でプレーティングした。この細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をコート
したプレートに２４時間接着させ、次いで、２００μＭまでの種々の濃度のゲニ
ステインで処理した。ＣＬＴ発達の画像を、４８時間後に記録し、デジタル形式
に変換し、そして図１に例示したようなＯｐｔｉｍａ  ６．１ソフトウェアを使
用して分析した。画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ−３５顕微鏡を接続し
たＮｉｋｏｎカメラを用いて、明野照射下で取り込み、そしてＨｅｗｌｅｔｔ−
Ｐａｃｋａｒｄ  Ｓｃａｎ−Ｊｅｔ  ４Ｃ／Ｔを使用してデジタル形式に変換し
た。ＣＬＴの長さの合計を、分析ソフトウェアＯｐｔｉｍａ  ６．１を使用して
定量した。生存度もまた、標準的なＭＴＴアッセイを使用して４８時間後に評価
した。新脈管形成活性および生存度の両方の結果を、表１および２に示し、そし
て図１に例示する。
【００３３】
【表１】
2013189474.tif 000003
【００３４】
【表２】
2013189474.tif 000004
結果は、ゲニステインが、予測されるように、１２．５μＭ程度の低い濃度で
、新脈管形成を実質的に阻害することを示した。さらに、約２５〜５０μＭまで
のゲニステインの濃度では、細胞の生存度は、実質的に影響されなかった。
【００３５】
（実施例２：毛細管様細管形成に対するＰＤＴの効果）
このアッセイに使用するための内皮細胞を、以下の通りに調製した：ヒト臍静
脈内皮細胞株ＥＣＶ３０４（ＡＴＣＣ）を２ｍＭ  ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１００μ
ｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、  ２０ｍＭ  ＨＥＰＥ
Ｓ  （Ｓｉｇｍａ）、および  １０％  熱非働化ウシ血清ナトリウム  （Ｇｉｂ
ｃｏ  ＢＲＬ）を補充したＭｅｄｉｕｍ  １９９  （Ｍ１９９、Ｓｉｇｍａ）を
使用して、７５ｃｍ2フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）において培養した。細胞を、３
７℃にて、加湿ＣＯ2（５％）チャンバ中に維持し、そして０．０５％  トリプ
シン／０．００５％  ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、１：４〜１
：１０の比にて、コンフルエンスに達するまで継代培養した。
【００３６】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を２〜
３時間４℃にて融解し、次いで０．１２５または０．２５０ｍｌ／ウェルにてプ
ラスチック２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に分配した。このゲルを、少な
くとも１時間３７℃にて重合化させ、その後この細胞をプレーティングした。
【００３７】
ＥＣＶ３０４細胞（３．５×１０4細胞／ウェル）をプレーティングし、そし
て接着させ、分化させ、そして処置に先行して２４時間、毛細管様管（ＣＬＴ）
ネットワークを確立した。
【００３８】
滅菌蒸留水中で２．０ｍｇ／ｍｌにてリポソーム的に（ｌｙｐｏｓｏｍａｌｌ
ｙ）処方しそして再構築した光活性化合物（ＢＰＤ−ＭＡ）を、種々の濃度にて
３０分間添加した。このプレートを、血清を補充したＭ１９９を用いて注意深く
２回洗浄し、次いで、ＧＥ  １５Ａ−Ｒ蛍光管によって提供される１．０Ｊ／ｃ
ｍ2の蛍光赤色光（６９０ｎｍ）に曝露した。この光を、３０分間安定化させ、
次いで、較正した１４００光メーターを使用して測定した。ＣＬＴ形成の写真を
、上記のように、ＢＰＤ−ＭＡ処理２４時間後に、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒ
ｔ−３５顕微鏡を接続したＮｉｋｏｎカメラを用いて、明野照射下で得た。一旦
、画像を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＳｃａｎＪｅｔ  ４Ｃ／Ｔを使用
してデジタル形式に変換し、ＣＬＴの長さの合計を、分析ソフトウェアＯｐｔｉ
ｍｕｓ  ６．１（Ｏｐｔｉｍｕｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用して定量した。このソフ
トウェアを、図１に示す。
【００３９】
生存度もまた、決定した。細胞生存度を評価するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（
登録商標）の薄層で予めコートした９６ウェルプレートを、製造業者の指示のよ
うに、０．１ｍｌのＭ１９９を最低１時間用いて３７℃にて再構築した。ＥＣＶ
３０４細胞（８×１０3細胞／ウェル）を、各ウェルにおいて配置し、そして３
７℃にて２４時間インキュベートし、その後、上記のように、光力学的プロトコ
ルに曝露した。処置後約２４時間で、生存度を、標準的なＭＴＴアッセイ用いて
、決定した。新脈管形成活性および生存度の両方についての結果を、表３および
４ならびに図３に示す。
【００４０】
【表３】
2013189474.tif 000005
【００４１】
【表４】
2013189474.tif 000006
示したように、新脈管形成を、２００ｎｇ／ｍｌのＢＰＤ−ＭＡの濃度にて実
質的に阻害したが、生存度もまた減少した。しかし、新脈管形成を、低濃度ＢＰ
Ｄ−ＭＡ（２５ｎｇ／ｍｌと１００ｎｇ／ｍｌとの間）でさえ阻害したが、細胞
生存度は、これらの濃度にて実質的に影響されなかった。ＬＤ50（５０％細胞死
を提供する用量）を、１４０ｎｇ／ｍｌであることを計算したが、５０％ＣＬＴ
形成を予防するに必要な用量は、約５０ｎｇ／ｍｌ（ＩＤ50＝５０ｎｇ／ｍｌ）
である。
【００４２】
これらの結果を、図３においてグラフ形態で示す。生存度および新脈管形成指
数を、ＢＰＤ−ＭＡの濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対してプロットする。黒四角は、生
存度を表し、そして黒菱形は、新脈管形成指数を表す。見られるように、２５〜
１００ｎｇ／ｍｌにて、新脈管形成に対する効果は、生存度に対する効果よりも
ずっと大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2013189474.tif 000009
【外国語明細書】
2013189474000001.pdf