(57)【要約】【課題】複数種類の標的配列の増幅および／または検出反応を独立して同時に行うことのできるマルチ核酸反応具、反応担体およびマルチ核酸反応方法を提供することである。【解決手段】実施形態によれば、マルチ核酸反応具は、液相の反応場を支持するように構成された支持体と、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に独立して固定され、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定化された増粘剤とを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液相の反応場を支持するように構成された支持体と、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に独立して固定され、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定された増粘剤とを具備するマルチ核酸反応具。
【請求項２】
前記支持体の前記反応場を支持する面に取り付けられた被覆体を更に具備する請求項１に記載のマルチ核酸増幅反応具であって、前記被覆体は、前記支持体の少なくとも全てのプライマー固定化領域を含む領域に対応する部分に形成された溝部と、前記溝部の一端と他端とにそれぞれ開口する貫通孔とを有し、前記被覆体の前記溝部と前記支持体の前記反応部を支持する面とによって、反応部が形成されるマルチ核酸反応具。
【請求項３】
更に、前記複数のプライマー固定化領域の近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化された複数のプローブ核酸とを具備する請求項１または２に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項４】
前記増粘剤が、寒天またはゼラチンである請求項１〜３の何れか１項に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項５】
前記増粘剤が、前記プライマーを覆うように固定されている請求項１〜４の何れか１項に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項６】
前記増粘剤が、前記プライマーと共に、前記プライマー固定化領域に固定されている請求項１〜４の何れか１項に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項７】
支持体と、前記支持体の少なくとも１つの表面の互いに独立した複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に固定化された、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定化された増粘剤とを具備するマルチ核酸反応担体。
【請求項８】
更に、前記複数のプライマー固定化領域の近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化された複数のプローブ核酸とを具備する請求項７に記載のマルチ核酸反応担体。
【請求項９】
前記増粘剤が、寒天またはゼラチンである請求項７または８に記載のマルチ核酸反応担体。
【請求項１０】
前記増粘剤が、前記プライマーを覆うように固定化されている請求項７〜９の何れか１項に記載のマルチ核酸反応担体。
【請求項１１】
前記増粘剤が、前記プライマーと共に、前記プライマー固定化領域に固定化されている請求項７〜９の何れか１項に記載のマルチ核酸反応担体。
【請求項１２】
板状の支持体と、前記支持体の１つの面に固定され、軸方向に伸びる溝部を前記支持体側の面に開口する被覆体と、前記被覆体の前記溝部と前記支持体の前記１つの面とにより構成される流路と、前記流路の一端に開口された第１の貫通孔と、前記流路の他端に開口された第２の貫通孔と、前記流路内壁のプライマー固定化領域にそれぞれ遊離可能に固定された複数のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定された増粘剤とを具備するマルチ核酸増幅反応具であって、前記複数のプライマーセットは、種類毎に独立してプライマー固定化領域に固定され、１つのプライマーセットは１つの標的核酸を増幅するための複数のプライマーを含むマルチ核酸反応具。
【請求項１３】
更に、前記複数のプライマー固定化領域の近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化された複数のプローブ核酸とを具備する請求項１２に記載のマルチ核酸反応具。
【請求項１４】
（ａ）板状の支持体と、前記支持体の１つの面に固定され、軸方向に伸びる溝部を前記支持体側の面に開口する被覆体と、前記被覆体の溝部と前記支持体の前記１つの面とにより構成される流路と、前記流路の一端に開口された第１の貫通孔と、前記流路の他端に開口された第２の貫通孔と、前記流路内壁に互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域にそれぞれ遊離可能に固定された複数のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定された増粘剤とを具備するマルチ核酸反応具を準備することと、
ここで、前記複数のプライマーセットは、種類毎に独立してプライマー固定化領域に独立して固定され、１つのプライマーセットは１つの標的核酸を増幅するための複数のプライマーを含む、
（ｂ）前記第１の開口部から、前記流路に対して標的核酸を含む反応液を添加することと、
（ｃ）前記標的核酸を増幅することと、
を具備するマルチ核酸反応方法。
【請求項１５】
（ａ）板状の支持体と、前記支持体の１つの面に固定され、軸方向に伸びる溝部を前記支持体側の面に開口する被覆体と、前記被覆体の溝部と前記支持体面の前記１つの面とにより構成される流路と、前記流路の一端に開口された第１の貫通孔と、前記流路の他端に開口された第２の貫通孔と、前記流路内壁に互いに独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域にそれぞれ遊離可能に固定された複数のプライマーセットとを具備するマルチ核酸反応具を準備することと、
ここで、前記複数のプライマーセットは、種類毎に独立してプライマー固定化領域に固定され、１つのプライマーセットは１つの標的核酸を増幅するための複数のプライマーを含む、
（ｂ）前記第１の開口部から、前記流路に対して標的核酸と増粘剤とを含む反応液を添加することと、
（ｃ）前記標的核酸を増幅すること、
を具備するマルチ核酸反応方法。
【請求項１６】
前記マルチ核酸反応具が更に、前記複数のプライマー固定化領域のそれぞれの近傍に配置された複数のプローブ固定化領域と、前記複数のプローブ固定化領域に固定化されたプローブ核酸とを具備し、
（ｅ）前記（ｃ）において得られた増幅産物と前記プローブ核酸とのハイブリダイズ信号を検出すること、
を更に具備する請求項１４または１５に記載のマルチ核酸反応方法。
【請求項１７】
前記プライマー固定化領域への前記プライマーセットが固定化された後に、前記増粘剤が、前記プライマー固定化領域に固定される請求項１４〜１６に記載のマルチ核酸反応方法。
【請求項１８】
前記プライマー固定化領域に対して、前記プライマーセットと前記増粘剤との混合物が固定化される請求項１４〜１６に記載のマルチ核酸反応方法。
【請求項１９】
前記反応液の添加が、１０ｍｍ／秒以上の流速により行われる請求項１４〜１８の何れか１項に記載のマルチ核酸反応方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、マルチ核酸反応具、マルチ核酸反応担体およびマルチ核酸反応方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や犯罪捜査など、様々な場面で遺伝子検査が実施されている。これらの遺伝子検査では、複数の対象遺伝子を検出し、それらの結果を総合することで初めて有用なものとなることが多い。例えば、臨床現場では病原菌特定などが行われる。その場合、患者の症状に基づいて感染が疑われる複数種の微生物、または各微生物の型が判定される。それにより、診断が行われる。犯罪捜査現場では、例えば、個人特定などが行われる。その場合、全ての人がそのゲノム上に持っている複数の遺伝子座における繰り返し配列について、繰り返しの回数が特定される。特定された複数の遺伝子座における繰り返し数から総合的に個人を特定する。それにより、高確率で個人を特定することができる。このように複数の対象遺伝子を検出する技術が非常に重要なものとなっている。
【０００３】
従来、複数の対象遺伝子を検出する場合、初めに特定の反応容器内で試料核酸の増幅が行われる。その後、得られた増幅産物についての検出が更なる検出用の反応装置内において行われる。
【０００４】
増幅は、主に次の複数または１つの反応容器内で行われる。複数の反応容器内で増幅を行う場合には、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器がそれぞれ用意される。１つの反応容器内で増幅を行う場合には、全ての対象遺伝子を検出するための試薬が１つの反応容器に収納されて、マルチ核酸増幅反応が行われる。検出されるべき核酸の検出は、一般的には、増幅産物をＤＮＡチップや電気泳動などに供することにより行われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、複数種類の標的配列の増幅および／または検出反応を独立して同時に行うことのできるマルチ核酸反応具、反応担体およびマルチ核酸反応方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態によれば、マルチ核酸反応具は、液相の反応場を支持するように構成された支持体と、前記液相により前記反応場が形成された際に、前記反応場に接する前記支持体の少なくとも１つの面に独立して配置された複数のプライマー固定化領域と、前記複数のプライマー固定化領域に種類毎に遊離可能に独立して固定され、複数種類の標的配列をそれぞれに増幅するように構成された複数種類のプライマーセットと、前記プライマー固定化領域に遊離可能に固定化された増粘剤とを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図。
【図２】マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図。
【図３】マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図。
【図４】マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図。
【図５】マルチ核酸増幅反応具の１例を示す図。
【図６】マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図。
【図７】マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図。
【図８】チップ素材の１例を示す図。
【図９】マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図。
【図１０】マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図。
【図１１】マルチ核酸増幅検出反応具の１例を示す図。
【図１２】マルチ核酸反応具の１例を示す図。
【図１３】マルチ核酸反応具により得られた実験結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【０００９】
１．定義
「マルチ核酸増幅」とは、増幅されるべき複数種類の標的配列を同時に増幅することをいう。「増幅」とは、プライマーセットを用いて鋳型核酸を連続して複製する工程をいう。使用可能な増幅法は、プライマーセットを用いて標的核酸を増幅する方法であれはよく、これらに限定するものではないが、例えば、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＴ−ＬＡＭＰ増幅、ＳＭＡＰ増幅およびＩＣＡＮ増幅などを含む。
【００１０】
「標的配列」とは、プライマーセットにより増幅しようとする配列をいい、使用されるプライマーが結合する領域をも含む。
【００１１】
「標的核酸」とは、標的配列を少なくとも含む配列であり、使用されるプライマーセットにより鋳型として使用される核酸であり、「鋳型核酸」とも称する。
【００１２】
「プライマーセット」とは、１つの標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの標的核酸を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。
【００１３】
２．マルチ核酸反応具
＜第１の実施形態＞
マルチ核酸反応具の１例を図１（ａ）および（ｂ）を参照しながら説明する。このマルチ核酸反応具は、複数種類の標的核酸をマルチ増幅するためのマルチ核酸増幅反応具の例である。
【００１４】
図１（ａ）は、マルチ核酸増幅反応具の１例の斜視図である。図１（ａ）に記載のマルチ核酸増幅反応具１は、容器形状の支持体２を有する。支持体２の底面には、互いに独立した複数の固定化領域３が配置される。図１（ｂ）は固定化領域３の部分を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つの固定化領域３には１つの種類のプライマーセット４が固定される。複数の固定化領域３のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット４がそれぞれ固定される。
【００１５】
プライマーセット４は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。１つの固定化領域３には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット４が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つの固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、1つの固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。
【００１６】
プライマーセット４は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態で固定化領域３に固定される。プライマーセット４の固定化領域３への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つの固定化領域３に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他の固定化領域３について、それぞれ所望のプライマーセット４を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセットを支持体２に固定すればよい。これにより、支持体２の１つの面に独立して配置される全ての固定化領域３にプライマーセット４が固定される。しかしながら、プライマーセット４の固定化領域３への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。
【００１７】
支持体２に配置される複数の固定化領域３は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合う固定化領域３は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプローブと同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。例えば、隣り合う固定化領域３の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００１８】
反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。
【００１９】
容器形態の支持体は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また支持体の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の支持体は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。
【００２０】
図１では、固定化領域３が支持体２の底面に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、支持体２の内部側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、底面および内部側面、天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。
【００２１】
＜マルチ核酸増幅反応具を用いた核酸の増幅反応＞
図２には、第１の実施形態と同様のマルチ核酸増幅反応具２１を用いた核酸増幅反応の様子を示す図である。図２（ａ）は反応前のマルチ核酸増幅反応具２１である。支持体２２の底面に配置された複数の固定化領域２３に複数のプライマーセット２４がそれぞれ固定されている。マルチ核酸増幅反応具２１に反応液２６を添加し、それを収容した状態を図２（ｂ）に示す。
【００２２】
反応液２６は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。
【００２３】
反応液は、固定されたプライマーセットが遊離された後に、プライマーセットと標的核酸との間の増幅反応が可能な液相であればよい。この反応液は、プライマーが固定化されている反応場（最初は空気で満たされている）に対し、増幅反応開始前に機械的に若しくは人為的に、何らかの手法で注入されればよい。固定化されたプライマーが遊離された後に局所的な拡散に留まるように、増幅反応を阻害しない増粘剤を含む反応液であることが好ましい。増粘剤についての詳細は後述する。
【００２４】
図２（ｂ）に示すように、反応液２６を添加された後のマルチ核酸増幅反応具では、図２（ｃ）に模式的に示すように、底面に固定されたプライマーが遊離し徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域２７で表す。遊離し、拡散していくプライマーは、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定化されたプライマーセットは、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセットを用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液２６により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域２７内のみで進行する場合には、領域２７が反応領域と解される。
【００２５】
上記の例では、プライマーセットのみが支持体に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセットが種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーと共に支持体に固定してもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーと一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなマルチ核酸増幅反応具において、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。
【００２６】
また、増幅反応をより効率的に達成するために、反応液の反応場への添加速度を制御する手段も有効である。例えば、プライマー固定化位置上を流れる反応液の流速は、１ｍｍ/秒以上が好ましく、さらには、１０ｍｍ/秒以上が好ましい。これにより、固定化されたプライマーセットの遊離が影響を受けるため、プライマーセットのより局所的な拡散が可能になる。しかしながら、プライマー固定化位置上を流れる反応液の流速は、反応場を規定する支持体および他の部材により構成される反応部の形状および大きさにより、任意の値を取り得る。
【００２７】
上述した第１の実施形態を用いてマルチ増幅反応を行う際に、使用する反応液に増粘剤を含ませることによって、より効率よくマルチ増幅反応を達成することが可能である。
【００２８】
反応液に増粘剤を含ませる方法は、反応液自体に増粘剤を添加してもよく、或いは、プライマーセットを支持体に固定する際に、プライマーセットを固定するための溶液に増粘剤を含ませることにより、使用されるべきプライマーセットと共にプライマー固定化領域に増粘剤を固定してもよい。或いは、プライマーを固定した後に、プライマー固定化領域に更に増粘剤を被覆することにより固定してもよい。更にまた、フィルム状の増粘剤を貼付するなどの手段でもよく、特に限定されない。
【００２９】
増粘剤を、反応液に含ませることにより、固定されたプライマーセットが反応液に遊離する速度、即ち、溶出速度を低下することが可能である。それにより、プライマーセットは、より長時間に亘り局所に留まる。その結果、固定されたプライマーセット毎の反応効率に左右されずに複数のプライマーセットによるマルチ増幅がより効率的に達成される。
【００３０】
増粘剤は、その比粘度がプライマーよりも大きい物質であり、且つ核酸増幅反応を阻害しない物質であることが好ましい。増粘剤の例は、樹液に由来する増粘剤、例えば、アーモンドガム、エレミ樹脂、ダンマル樹脂、アラビアガム、カラヤガム、トラガントガム、アラビノガラクタン、ガティガムおよびモモ樹脂など、豆類などの種子に由来する増粘剤、例えば、アマシードガム、グァーガム酵素分解物、タマリンド種子ガム、カシアガム、サイリュームシードガム、タラガム、カロブビーンガム＝ローカストビーンガム、サバクヨモギシードガム、トリアカンソスガム、グァーガムおよびセスバニアガムなど、海藻に由来する増粘剤、例えば、アルギン酸、フクロノリ抽出物、ファーセレランおよびカラギナンなど、果実類、葉および地下茎などに由来する増粘剤、例えば、アロエベラ抽出物、キダチアロエ抽出物、ペクチン、オクラ抽出物およびトロロアオイなど、微生物由来の増粘剤、例えば、アエロモナスガム、エンテロバクターガム、納豆菌ガム、アウレオバシジウム培養液、カードラン、プルラン、アゾトバクター・ビネランジーガム、キサンタンガム、マクロホモプシスガム、ウェランガム、ジェランガム、ラムザンガム、エルウイニア・ミツエンシスガム、スクレロガム、レバン、エンテロバクター・シマナスガムおよびデキストラン、並びに、その他増粘安定剤、例えば、酵母細胞膜、キチン、オリゴグルコサミン、微小繊維状セルロース、キトサン、微結晶セルロースおよびグルコサミンなどを含む。更に、増粘剤は、一般に飲食物添加物して使用される、例えば、寒天、大豆多糖類、ナタデココ、澱粉、コンニャクイモ抽出物、ゼラチンなどであってもよい。好ましくは、アガロースなどの寒天および/またはゼラチン、ポリエチレングリコールなどであるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
増粘剤を反応液に添加する場合、反応液の作製時に、反応液を作製するための溶媒に対して増粘剤を直接に溶解してもよい。または、先ず、溶媒に増粘剤を溶解して作製した増粘剤溶液を用意する。別途、反応に必要な他の成分を溶媒に溶解することにより反応液を作製する。得られた増粘剤溶液と反応液とを混合してもよい。溶媒は、水、塩水および緩衝液などであってよい。
【００３２】
プライマーセットを固定する溶液に増粘剤を添加する場合、増粘剤の濃度は、室温（２５℃）で液体であり、且つ反応場に滴下可能な状態であることが好ましい。増粘剤の濃度は、例えば、終濃度３０％〜０．０１％程度の範囲であればよい。例えばアガロースであれば、終濃度１０％〜０．０１％の範囲であればよく、さらには、５％〜０．０５％の範囲が好ましく、３％〜０．１％の範囲で混合することがより好ましい。プライマー固定領域に増粘剤を固定する場合も同様であってよい。
【００３３】
また、反応液に増粘剤を添加する場合、増粘剤の濃度は、室温（２５℃）で液体であることが好ましい。増粘剤の濃度は、例えば、終濃度３０％〜０．０１％程度の範囲であればよい。例えばアガロースであれば、終濃度１０％〜０．０１％の範囲であればよく、さらには、５％〜０．１％の範囲で混合することがより好ましい。
【００３４】
従来の方法では、それぞれの対象遺伝子を増幅するための反応容器を用意する方法の場合、対象遺伝子数の増加に伴って、必要な反応容器の数や、検査時の作業量が増加する。また、全ての対象遺伝子を検出するための試薬を１つの反応容器に入れる場合、増幅反応効率に偏りが生じるなどの原因から、対象遺伝子数に限界がある。また、従来のマルチ増幅の場合では、複数種のプライマーセットが溶出して拡散した場合、プライマー同士の非特異結合による増幅効率の低下、または、特性の良いプライマーセットのみが優先して増幅する恐れがあり、増幅反応の感度低下、増幅種類の制限などが生じる。このような問題も本実施形態により解消される。
【００３５】
＜第２の実施形態＞
上述では、反応液に増粘剤を含ませる例を示したが、反応液に増粘剤を含ませずに、少なくともプライマーセットが固定される領域に増粘剤を固定してもよい。第１の実施形態に増粘剤を固定する例を以下に記す。
【００３６】
増粘剤を支持体上に固定する場合、プライマーセットの固定の前であっても、プライマーセットの固定と同時であっても、プライマーセットを固定した後であってもよい。好ましくは、増粘剤は、プライマーセットの固定と同時またはプライマーセットの固定後に支持体に固定される。
【００３７】
プライマーセットの固定と同時に増粘剤を支持体に固定する場合、プライマーセットを溶解した液に対して増粘剤を溶解してもよい。或いは、先ず増粘剤を溶媒に溶解して増粘剤溶液を用意し、別途調製されたプライマーセット固定用の溶液と混合してもよい。得られたプライマーセットと増粘剤を含む溶液を、滴下および乾燥などにより固定すればよい。
【００３８】
プライマーセットの固定化前または後に、増粘剤溶液を固定する場合には、増粘剤を含む溶液を滴下、スプレー、印刷、刷毛で塗布または増粘剤溶液に支持体を浸漬した後に、乾燥などによりプライマー固定化領域を含む支持体表面に固定すればよい。
【００３９】
増粘剤溶液、またはプライマーセットと増粘剤とを含む溶液の乾燥方法は、ヒートブロック、ホットプレートおよびインキュベータなどを用いて、室温以上の温度で加熱することによる熱乾燥を行ってもよい。または、常温で放置し、自然乾燥を行ってもよい。或いは、真空乾燥や凍結乾燥を行ってもよい。例えばアガロースを用いる場合は、熱乾燥を行い、乾燥後の状態がフィルム状になっていることが好ましい。
【００４０】
固定に用いる増粘剤溶液中の増粘剤の濃度は、固定時の状態が室温（２５℃）で液体であり、且つ支持体上に滴下可能な状態であればよい。増粘剤を固定する際の増粘剤の濃度は、例えば、終濃度３０％〜０．０１％程度の範囲であればよい。例えばアガロースであれば、終濃度１０％〜０．０１％の範囲であればよく、さらには、５％〜０．０５％の範囲が好ましく、３％〜０．１％の範囲で混合することがより好ましい。
【００４１】
さらに、固定に用いる増粘剤溶液には、プライマーセットが含まれてもよく、プライマーセット以外にも、増幅反応に必要な他の物質が含まれていてもよい。
【００４２】
増粘剤の使用により、マルチ増幅反応における感度低下、増幅種類の制限などが解消される。
【００４３】
＜第３の実施形態＞
マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を、図３を参照しながら説明する。
【００４４】
図３は、マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を示す平面図である。図３に記載のマルチ核酸増幅反応具３１は、基板を支持体３２として用いる例である。支持体３２の１つの面には、互いに独立した複数の固定化領域３３が配置される。固定化領域３３には、図１と同様に、１つの固定化領域３３には１つの種類のプライマーセット３４が固定される。複数の固定化領域３３のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット３４がそれぞれ固定される。１つ固定化領域３３に含まれるプライマーセット３４の構成は、第１の実施形態と同様に１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要な異なる種類のプライマーを含む。更に、固定化領域３３には、プライマーセット３４を覆うように増粘剤３５がコーティングにより固定されている。
【００４５】
第２の実施形態を用いる増幅は、少なくとも支持体３２のプライマーセット３４が固定化された領域に対して、反応液を載せることにより反応場を形成すればよい。
【００４６】
固定化領域３３は、支持体３２表面に予め形成された凹部面、または凹部により形成される流路の内壁に配置されてもよい。
【００４７】
基板を支持体として使用する場合、その材質は、それ自身反応に関与しない材質であればより、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてもよい。また、支持体へのプライマーの固定化は、第1の実施形態と同様に行えばよい。
【００４８】
更にまた、第２の実施形態のマルチ核酸増幅反応具を、これを維持できる容器内に配置し、その容器内に反応液を添加することにより反応場を形成してもよい。またこの場合、支持体３２の両面にプライマーセット３４を固定してもよい。更に、プライマーセット３４を覆うように増粘剤３５がコーティングにより固定されてもよい。これにより、本マルチ核酸増幅反応具に対してより多くの種類のプライマーセットを固定することが可能になり、より多くの標的配列を増幅することが可能になる。この側面において、マルチ核酸増幅反応具は、少なくとも１表面に複数のプライマーセットを独立して固定した支持体であれば、どのような形状の支持体であってもよい。この場合の支持体の材質およびプライマーの固定化法は、第１の実施形態および第２の実施形態と同様であってよい。このようなマルチ核酸増幅反応具は、基体とその少なくとも１つの表面の互いに独立した固定化領域に種類毎に遊離可能に固定された複数種類のプライマーセットを具備するマルチ核酸増幅反応担体として用いられてもよい。この場合、基体の大きさおよび形状は実施者が任意に選択してよい。例えば、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよい。
【００４９】
増粘剤の固定は、プライマーセットと同時であっても、プライマーセットの固定化の前であってもよい。また、増粘剤の固定を行わずに、反応時に反応液に増粘剤を含ませてもよい。
【００５０】
＜第４の実施形態＞
（１）マルチ核酸増幅反応具
マルチ核酸増幅反応具の更なる１例を、図４を参照しながら説明する。図４に示すマルチ核酸増幅反応具４１は、流路を有する支持体を使用する例である。図４（ａ）は平面図であり、図４（ｂ）は、線ｍ−ｍ’で切断した断面図である。
【００５１】
マルチ核酸増幅反応具４１は、支持体４２の内部に形成された流路４４の底面に配置された互いに独立した複数の固定化領域４３に、種類毎に遊離可能に固定された複数のプライマーを具備する。
【００５２】
このマルチ核酸増幅反応具は、例えば、第１の基板と第２の基板を用いて製造される。まず、第１の基板の予め決定された固定化領域４３に、複数のプライマーセット４４と増粘剤の混合物４５が遊離可能に固定される。プライマーセット４４は種類毎に固定される。この固定化は、上述したように行うことが可能である。一方で、第２の基板には、所望の流路に形状に対応させて凹部４６を形成する。凹部４６の形成は、使用される基板の材質に応じてそれ自身公知の方法により行うことが可能である。また、固定化領域４３の配置は、第２の基板に形成された凹部４６により形成される流路内に含まれるように決定される。次に、第１の基板と第２の基板を一体化する。一体化により、凹部４６の内壁と第１の基板の第２の基板側の面とにより流路形状の反応部４７が形成される。この時、第２の基板の凹部４６が第１の基板側を向くように一体化される。また、第２の基板の凹部４６の一部に貫通孔（図示せず）が設けられてもよい。この貫通孔は、流路への反応液などの出し入れ口として利用されてよい。
【００５３】
第１の基板の材質と第２の基板の材質は同じであっても、異なってよい。また、第１の基板および第２の基板の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。
【００５４】
この実施形態では、流路を有した支持体の流路底面にプライマーセットを固定した例を示したが、流路の配置および形状はこれに限定されるものではない。また、プローブセットを固定化する面は流路を規定する何れの面であってもよく、流路を規定する全ての面にプローブセットが固定されてもよく、また複数の面に固定されてもよい。
【００５５】
或いは、予め凹部または溝を形成することにより流路を形成した第１の基板に、その流路の一部の壁面に配置されたプライマー固定化領域に対して、複数のプライマーセットを独立して固定してもよい。その後、シリコンゴムなどの蓋体を取り付けることにより、マルチ核酸増幅反応具が製造されてもよい。
【００５６】
（２）プライマー
当該プライマーの長さは、これに制限されるものではないが、約５塩基以上、約６塩基以上、約７塩基以上、約８塩基以上、約９塩基以上、約１０塩基以上、約１５塩基以上、約２０塩基以上、約２５塩基以上、約３０塩基以上、約３５塩基以上、約４０塩基以上、約４５塩基以上または約５５塩基以上であってよく、約８０塩基以下、約７５塩基以下、約７０塩基以下、約６５塩基以下、約６０塩基以下、約５５塩基以下、約５０塩基以下、約４５塩基以下、約４０塩基以下、約３５塩基以下、約３０塩基以下、約２５塩基以下、約２０塩基以下、約２５塩基以下または約２０塩基以下であってもよく、これらの下限上限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。例えば、好ましい塩基長の例は、約１０塩基〜約６０塩基、約１３〜４０塩基、約１０〜３０塩基などであってよい。また、１つの支持体に同時に固定されるプライマーの長さは、全てのプライマーで同じであってもよく、全てのプライマーで異なっていてもよく、一部のプライマーが同じ長さであってもよく、一部のプライマーが異なる長さであってもよい。また、プライマーセット毎に異なってもよい。また、１つの領域に固定されるプライマーセットが、種類毎に異なる長さであってもよく、１つの領域に固定されるプライマーセットが全て同じ長さであってもよい。
【００５７】
（３）マルチ核酸増幅と検出
図５に示すように、マルチ核酸増幅反応具５１は、支持体としてのチューブ５２と、チューブ５２の内面に独立して固定された複数のプライマーセットを備える。このようなチューブ型のマルチ核酸増幅反応具５１においても複数種類の標的核酸を増幅することが可能である。その後に、得られた増幅産物を異なる複数の核酸プローブ５６を固定したＤＮＡチップ５５などの装置に加え検出を行うことが可能である。このように実施形態に例を示したマルチ核酸増幅反応具は、検出用サンプルの調製を従来に比べてより簡便に且つ複数の増幅を独立して行うことが可能である。
【００５８】
（４）マルチ核酸増幅法
例として上述したようなマルチ核酸増幅反応具を使用して、複数の標的核酸を増幅する方法も１つの実施形態として提供される。
【００５９】
また、特定の容器、チューブ、ディッシュまたは流路を形成した基板などの支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程を含むマルチ核酸増幅反応も更なる実施形態として提供される。
【００６０】
そのようなマルチ核酸増幅反応は、例えば、所望の支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、複数種類のプライマーセットが１つの反応場に含まれるように増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液を添加することと、当該プライマーが固定された支持体を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うこととを具備してよい。
【００６１】
具体的な増幅反応は、増幅反応の種類に応じてそれ自身公知の技術を利用して行われてよい。
【００６２】
更に、マイクロビーズ、板小片または棒などの基体の表面に対して複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程を含むマルチ核酸増幅反応も更なる実施形態として提供される。
【００６３】
そのようなマルチ核酸増幅反応は、例えば、所望の基体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、基体を、増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液内に配置することと、反応液を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うこととを具備する。
【００６４】
＜第５の実施形態＞
（１）マルチ核酸増幅検出反応具
マルチ核酸反応具は、マルチ核酸増幅検出反応具として提供されてもよい。マルチ核酸増幅検出反応具は、上述のような第１の実施形態〜第４の実施形態に加えて、更にプローブ固定化領域およびそこに固定されたプローブ核酸を備える。マルチ核酸増幅検出反応具の例を次に説明する。
【００６５】
マルチ核酸増幅検出反応具の１例を図６（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を参照しながら説明する。
【００６６】
図６（ａ）は、マルチ核酸増幅検出反応具の１例の斜視図である。図６（ａ）に記載のマルチ核酸増幅検出反応具６１は、容器形状の支持体６２を有する。支持体６２の底面６３には、互いに独立した複数のプライマー固定化領域６４が配置される。複数のプライマー固定化領域６４に近接して、またそれぞれのプライマー領域に対応して複数のプローブ固定化領域６５が配置される。
【００６７】
図１（ｂ）はプライマー固定化領域６４の断面を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つのプライマー固定化領域６４には１つの種類のプライマーセット６６が固定される。複数のプライマー固定化領域６４のそれぞれには、種類毎に複数のプライマーセット６４がそれぞれ固定される。
【００６８】
プライマーセット６６は、目的とする複数の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類が用意される。１つのプライマー固定化領域６４には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１種類のプライマーセット６６が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅用の反応具の場合には、１つのプライマー固定化領域に、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びＬＰプライマーがそれぞれ複数本で含まれる。
【００６９】
プライマーセット６６は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態でプライマー固定化領域６４に固定される。プライマーセット６６のプライマー固定化領域６４への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つのプライマー固定化領域６４に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他のプライマー固定化領域６４について、それぞれ所望のプライマーセット６６を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセットを支持体６２に固定すればよい。これにより、支持体６２の１つの面に独立して配置される全ての固定化領域６４にプライマーセット６６が固定される。しかしながら、プライマーセット６６の固定化領域６４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。
【００７０】
支持体６２に配置される複数のプライマー固定化領域６４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合うプライマー固定化領域６４は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプローブ核酸と同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。
【００７１】
例えば、隣り合うプライマー固定化領域６４の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００７２】
反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。
【００７３】
容器形態の支持体６２は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また支持体の材質は、それ自身反応に関与しない材質であればよく、そこにおいて増幅反応を行うことが可能な材質であればよい。例えば、シリコン、ガラス、樹脂および金属などから任意に選択されてよい。また、容器形態の支持体は、商業的に入手可能な何れの容器を利用してもよい。
【００７４】
図１では、プライマー固定化領域６４が支持体６２の底面６３に配置された例を示したが、これに限定するものではなく、支持体６２の内部側面の少なくとも一部分に配置されてもよく、底面および内部側面、被覆体により規定される天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。
【００７５】
図６（ｃ）には、プライマー固定化領域６４に近接して配置されたプローブ固定化領域６５の拡大図である。プローブ固定化領域６５には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸６７が複数で固定される。
【００７６】
検出されるべき所望の配列は、目的配列であってよい。プローブ固定化領域６５は、プローブ核酸６７と目的配列鎖とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域６５間で独立して検出されるように配置される。
【００７７】
プローブ核酸６７のプローブ固定化領域６５への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対してプローブ核酸を固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。プローブ核酸６７の固定した後にプライマー６６を固定してもよく、プライマー６６を固定した後にプローブ核酸６７を固定してもよく、プライマー６６の固定とプローブ核酸６７の固定を同時に行ってもよい。
【００７８】
例えば、隣り合うプローブ固定化領域６５の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００７９】
また例えば、プローブ固定化領域６５とプライマー固定化領域６４の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００８０】
例えば、プローブ固定化領域６５とプライマー固定化領域６４の間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定化領域６５とプライマー固定化領域６４は、支持体表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定化領域６５がプライマー固定化領域６４に含まれてもよく、プライマー固定化領域６４がプローブ固定化領域６５に含まれてもよい。
【００８１】
（２）マルチ核酸増幅検出反応具を用いた核酸の増幅検出方法
図７には、第５の実施形態と同様のマルチ核酸増幅検出反応具７０を用いて行われた核酸増幅反応後の反応場の様子を示す模式図である。図７（ａ−１）および（ｂ−１）は、反応前のマルチ核酸増幅検出反応具７０である。支持体７１の底面７２に複数のプライマー固定化領域７３が配置される。複数のプライマー固定化領域７３の近傍にはプローブ固定化領域７４が配置される。複数のプライマー固定化領域７３には、複数のプライマーセット７５がそれぞれ固定されている。それぞれのプライマー固定化領域７３に対応して、それぞれの近傍に配置されたプローブ固定化領域７４には、複数のプローブ核酸７６が所望の種類毎に固定されている。
【００８２】
マルチ核酸増幅検出反応具７０に反応液７８を添加し、それを収容した状態を図２（ａ−２）および（ｂ−２）に示す。
【００８３】
反応液７８は、所望の増幅反応に必要な成分と増粘剤とを含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。
【００８４】
増粘剤は、実施例１と同様の種類の物質を同様の濃度で含めばよい。
【００８５】
反応場への試料の添加は、マルチ核酸増幅検出反応具７０に反応液７８を添加する以前に反応液７８に予め添加することにより行ってもよく、反応液７８をマルチ核酸増幅検出反応具７０に添加した後に行ってもよく、マルチ核酸増幅検出反応具７０に反応液７８を添加する以前に試料をマルチ核酸増幅検出反応具７０に添加することにより行ってもよい。
【００８６】
図７（ａ−２）および（ｂ−２）に示すように反応液７８を添加された後のマルチ核酸増幅検出反応具７０では、図７（ａ−３）および（ｂ−３）に模式的に示すように、支持体７１の内部の底面７２に固定されたプライマー７６が遊離し、徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域７９で示す。遊離し、拡散していくプライマーセット７６は、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、その後、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定されたプライマーセット７６は、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセット７６を用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液７８により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域７９内のみで進行する場合には、領域７９が反応領域と解される。図７（ａ−３）の図は、全てのプライマー固定化領域７３に固定されたプライマーセット７６により増幅反応が生じた場合の模式図である。図７（ｂ−３）は、固定されたプライマーセット７６により、底面７２に固定された全てのプライマー固定化領域７３のうちの一部分、図７（ｂ−３）では３つの領域のみにおいて増幅が生じた場合の模式図である。
【００８７】
プローブ固定化領域７４は、領域７９において増幅された増幅産物中に目的配列を含む核酸が存在した場合、その核酸とハイブリダイズする。プローブ固定化領域７４に固定されたプローブ核酸７７は、対応するプライマー固定化領域７３における増幅産物とのみハイブリダイズするように固定される。即ち、１つのプローブ固定化領域７４に固定されたプローブ核酸７７は、対応するプライマー固定化領域７３における増幅産物とのみハイブリダイズするように距離を維持して、それぞれのプローブ固定化領域７４およびプライマー固定化領域７３が配置される。
【００８８】
プローブ核酸７７と目的配列鎖とのハイブリダイズの検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段により行われてよい。例えば、予めプライマーセットに蛍光物質を付与してもよく、デオキシヌクレオシド三リン酸などの基質に蛍光物質を付与してもよい。それらの蛍光物質からの蛍光強度を指標にハイブリダイズの有無および量が決定されてもよい。或いは、電気化学的手段によりハイブリダイズ信号が検出されてもよい。
【００８９】
ハイブリダイズの検出は、マルチ核酸増幅検出反応具７０内部の洗浄後に実行されてもよく、洗浄を行わずに実行されてもよい。電気化学的手段により検出する場合には、インタカレータを用いてハイブリダイズ信号を検出してもよい。この場合、例えば、予め反応液７８にインタカレータを含ませておいてもよく、ハイブリダイズ反応が開始する前、ハイブリダイズ反応中、ハイブリダイズ反応後に添加してもよい。これらの場合、何れもマルチ核酸増幅検出反応具７０内部の洗浄後に検出を行ってもよく、洗浄を行わずに検出を実行してもよい。ハイブリダイズ反応の開始、反応中、反応後の判定は、プライマー、プローブ核酸および鋳型核酸の配列、反応温度などの反応条件に応じて行ってもよく、予備実験により決定してもよい。
【００９０】
当該プライマーの長さは、第４の実施形態において記載された長さと同じでよい。
【００９１】
プローブ核酸の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。プローブ核酸は、検出されるべき目的配列の相補配列を含む。プローブ核酸は、目的配列の相補配列に加えて更なる配列例えば、スペーサ配列などを含んでもよい。
【００９２】
標的配列の長さは、例えば、１０塩基〜１００塩基、１００塩基〜２００塩基、塩基２００〜３００塩基、３００塩基〜４００塩基、好ましくは１００塩基〜３００塩基であってよい。
【００９３】
目的配列の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。
【００９４】
１つのプライマー固定化領域７３に固定されるプライマーセット７６の種類は、１種類の標的核酸を増幅するための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。
【００９５】
１つのプローブ固定化領域７４に固定されるプローブ核酸７７群の種類は、１種類の目的配列とハイブリダイズするための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。また、目的配列の部分が共通であり、更に他の目的配列とは異なる配列を含むプローブ核酸であってもよい。
【００９６】
１つのアレイ型マルチ核酸増幅検出反応具７０に配置されるプライマー固定化領域７３の数の下限は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上であってよく、上限は、１００００以下、５０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下、５００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下であってよく、これらの上限下限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。
【００９７】
１つのマルチ核酸増幅検出反応具７０に配置されるプライマー固定化領域７３とプローブ固定化領域７４の数は同じであっても異なっていてもよい。即ち、全てのプライマー固定化領域７３に対応するように同数のプローブ固定化領域７４が配置されてもよく、プライマー固定化領域７３の数がプローブ固定化領域７４の数よりも多くてもよく、プライマー固定化領域７３の数がプローブ固定化領域７４の数よりも少なくてもよい。また、増幅反応状態を確認するため、またはハイブリダイズ反応の状態を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールを含ませてもよい。このようなポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールは、プライマーセットおよび／またはプローブ核酸について設けてよい。
【００９８】
上記の例では、プライマーセット７６のみが支持体７１に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセット７６が種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーセット７６と共に支持体７１に固定されてもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーセット７６と一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなマルチ核酸増幅検出反応具７０において、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。
【００９９】
また、上述の例では、増粘剤を反応液に添加する例を示したが、増粘剤を反応液に含ませずに、支持体７１に固定してもよい。固定は、上述の通りに行ってよい。
【０１００】
支持体７１は、容器形状に限定されるものではなく、上述したように、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよく、基体の大きさおよび形状は実施者が任意に選択してよい。また、第４の実施形態のように流路を有する基板を支持体７１として使用することは好ましい。
【０１０１】
＜第６の実施形態＞
第６の実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具を図８〜図１１を参照しながら説明する。
【０１０２】
（１）チップ素材
まず、電気化学的検出によりハイブリダイズ信号を検出するマルチ核酸増幅検出反応具のチップ素材の構成および製造方法の１例について図８（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図８（ａ）は、チップ素材の平面図であり、図８（ｂ）は、図８（ａ）のチップ素材の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１０３】
チップ素材９１は、矩形状の基板８１上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極８４ａ〜８４ｄを備えている。各電極８４ａ〜８４ｄは、第１の金属薄膜パターン８２および第２の金属薄膜パターン８３をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極８４ａ〜８４ｄは大矩形部８５と小矩形部８６を細線８７で連結した形状を有する。絶縁膜８８は、各電極８４ａ〜８４ｄを含む基板８１上に被覆されている。円形窓８９は、大矩形部８５に対応する絶縁膜８８部分に開口されている。矩形窓９０は、小矩形部８６に対応する絶縁膜８８部分に開口されている。電極８４ａの円形窓８９から露出する大矩形部８５は第１の作用極９２ａとして機能する。電極８４ｂの円形窓８９から露出する大矩形部８５は第２の作用極９２ｂとして機能する。電極８４ｃの円形窓８９から露出する大矩形部は対極９３として機能する。電極８４ｄの円形窓８９から露出する大矩形部は参照極９４として機能する。また、電極８４ａ〜８４ｄの矩形窓９０から露出する小矩形部８６はプローバー接触部として機能する。
【０１０４】
このようなチップ素材は、次のような方法により作製することができる。
【０１０５】
まず、基板８１上に第１の金属薄膜および第２の金属薄膜を例えば、スパッタリング法または真空蒸着法によりこの順序により堆積する。続いてこれらの金属薄膜を例えば、レジストパターンをマスクとして順次選択的にエッチングして、第１の金属薄膜パターン８２および第２の金属薄膜パターン８３をこの順序で積層した、例えば４つの電極８４ａ〜８４ｄを基板８１の長手方向に沿って形成する。これらの電極８４ａ〜８４ｄは、大矩形部８５と小矩形部８６を細線８７で連結した形状を有する。
【０１０６】
次いで、電極８４ａ〜８４ｄを含む基板８１上に、絶縁膜８８を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極８４ａ〜８４ｄの大矩形部８５に対応する絶縁膜８８部分および小矩形部８６に対応する絶縁膜８８部分をレジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部８５に対応する絶縁膜８８部分に円形窓８９を、および小矩形部８６に対応する絶縁膜８８部分に矩形窓９０を開口する。それにより前述したチップ素材９１を作製する。
【０１０７】
基板８１は、例えば、パイレックス（登録商標）ガラスのようなガラスまたは樹脂から作られる。
【０１０８】
第１の金属薄膜は、第２の金属薄膜を基板８１に密着させるための下地金属膜として働き、例えば、Ｔｉから作られる。第２の金属薄膜は、例えば、Ａｕから作られる。
【０１０９】
第１および第２の金属薄膜をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【０１１０】
絶縁膜８８は、例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜を挙げることができる。
【０１１１】
絶縁膜８８をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【０１１２】
（２）マルチ核酸増幅検出反応具
次に、上記（１）において製造されたチップ素材９１にプライマーセットとプローブ核酸を固定したマルチ核酸増幅検出反応具の構成および製造方法の１例を図９（ａ）および図９（ｂ）を参照しながら説明する。図９（ａ）はマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図９（ｂ）は図９（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１１３】
チップ素材９１上に形成された電極８４ａの第１の作用極９２ａを第１のプローブ固定化領域とし、この第１のプローブ固定化領域に第１の目的配列の相補配列を含む第１のプローブ核酸９５ａを固定する。固定される第１のプローブ核酸９５ａは、その複数本を１つのプローブ核酸群として固定される。同様に、電極８４ｂの第２の作用極９２ｂを第２のプローブ固定化領域とし、この第２のプローブ固定化領域に第１の目的配列とは異なる第２の目的配列の相補配列を含む第２のプローブ核酸９５ｂを固定する。
【０１１４】
プローブ核酸９５ａおよび９５ｂをプローブ固定化領域に固定する方法の例は、金電極を具備したチップ素材９１については３’末端にチオール基を第１のプローブ核酸９６ａに導入する方法などが含まれる。
【０１１５】
次いで、第１の作用極９２ａの近傍に第１のプライマー固定化領域９６ａを、第２の作用極９２ｂの近傍に第２のプライマー固定化領域９６ｂを配置する。この第１のプライマー固定化領域９６ａ上に第１のプライマーセット９８ａを、第２のプライマー固定化領域９６ｂ上に第２のプライマーセット９８ｂを固定する。それによりマルチ核酸増幅検出反応具を作製する。
【０１１６】
第１のプライマーセット９８ａは第１の標的配列を増幅するように設計された配列を有し、第２のプライマー固定化領域９６ｂは第１の標的配列とは異なる配列からなる第２の標的配列を増幅するように設計された配列を有する。
【０１１７】
第１および第２のプライマーセット９８ａおよび９８ｂをそれぞれ第１および第２のプライマー固定化領域９６ａおよび９８ｂへの固定は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような液体にプライマーセットを含ませて滴下して、その後例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。
【０１１８】
（３）使用時のマルチ核酸増幅検出反応具
上記（２）において作製されたマルチ核酸増幅検出反応具の使用方法について図１０および図１１を参照しながら説明する。
【０１１９】
図１０（ａ）は、使用時のマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【０１２０】
本実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具９１を使用する場合、電極８４ａ〜８４ｄにそれぞれ形成された第１の作用極９２ａ、第２の作用極９２ｂ、対極９３および参照極９４、並びに第１のプライマー領域９６ａおよび第２のプライマー領域９６ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または接着剤による接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法により成形された被覆体１０１が、マルチ核酸増幅検出反応具９１の使用前にマルチ核酸増幅検出反応具９１上に装着される。被覆体１０１が装着された後に、鋳型核酸１０３を含む反応液１０２がマルチ核酸増幅検出反応具９１と被覆体１０１とにより形成される空間に添加される。
【０１２１】
被覆体１０１が装着されたマルチ核酸増幅検出反応具９１において、電極８４ａ〜８４ｄのそれぞれの矩形窓９０から露出する小矩形部８６は露出している。
【０１２２】
被覆体１０１をマルチ核酸増幅検出反応具９１に装着する例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。
【０１２３】
次いで、反応液１０２は被覆体１０１がマルチ核酸増幅検出反応具９１に装着された後に添加される。
【０１２４】
マルチ核酸増幅検出反応具９１と被覆体１０１とにより形成される空間に液体を添加する方法は、例えば、被覆体１０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加してもよく、また先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用いて被覆体１０１の一部に差し込んで添加してもよい。
【０１２５】
反応液１０２は、試料と、増粘剤と、増幅試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤および例えば、ヘキスト３３２５８のような２本鎖核酸を認識して信号を生ずるインタカレータを含んでよい。検査されるべき試料中に特定のプライマー固定化領域に固定されたプライマーセットにより増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在した場合、そのプライマー固定化領域とそれに対応するプローブ固定化領域を含む反応場において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図１１に示す。
【０１２６】
図１１（ａ）は、反応場１１１において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図１１（ａ）は、使用時のマルチ核酸増幅検出反応具の平面図であり、図１１（ｂ）は、図１１（ａ）のマルチ核酸増幅検出反応具の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図１０において添加された試料中には、第２のプライマーセット９８ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図１１（ａ）および図１１（ｂ）に示すように、反応場１１１に第２のプライマーセットは遊離および拡散し、鋳型核酸と出会った後に増幅反応が行われ、それにより増幅産物が形成される。第２のプライマーセット９８ｂによる増幅産物は、第２のプライマー固定化領域９７ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定化領域９２ｂに到達する。到達した増幅産物が、目的配列を含む場合、第２のプローブ核酸９５ｂと増幅産物がハイブリダイズして２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸に対して、反応液１０２に含まれるインタカレータが結合してハイブリダイズ信号を生じる。
【０１２７】
ハイブリダイズ信号は、例えば、電極８４ａ〜８４ｄのそれぞれの矩形窓９０から露出する小矩形部８６にプローバーを接触させ、ヘキスト３３２５８のようなインタカレータの電流応答を測定することにより行われる。
【０１２８】
電気化学的検出を利用するアレイ型プライマープローブチップを使用することによって、より簡単に且つ短時間に試料に含まれる標的核酸を増幅した後に、その増幅産物に含まれる目的核酸の検出を行うことが可能である。
【０１２９】
＜目的核酸の検出方法＞
例として上述したようなマルチ核酸増幅検出反応具を使用して、複数の標的核酸を増幅して、ハイブリダイズ信号を指標として目的核酸を検出する方法も更なる実施形態として提供される。
【０１３０】
また、特定の容器、チューブ、ディッシュまたは流路を形成した基板などの支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程および／または１種類以上のプローブ核酸をプローブ固定化領域に固定する工程を含む目的核酸の検出方法も更なる実施形態として提供される。
【０１３１】
そのような目的核酸の検出方法は、例えば、所望の支持体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、複数のプライマー固定化領域の位置またはその近傍のプローブ固定化領域に、プローブ固定化領域毎にハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に、目的配列の相補配列を含む少なくとも１種類のプローブ核酸を固定することと、複数種類のプライマーセットが１つの反応場に含まれるように増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液を添加することと、例えば、反応液またはアレイ型プライマープローブチップへの添加などにより反応場に試料を持ち込むことと、当該プライマーが固定された支持体を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うことと、マルチ核酸増幅反応により生じた増幅産物と少なくとも１種類のプローブ核酸との間のハイブリダイズの有無および／または量を検出および／または測定することと、を具備してよい。また、前記反応液には増粘剤が含まれてよい。
【０１３２】
具体的な増幅反応は、増幅反応の種類に応じてそれ自身公知の技術を利用して行われてよい。
【０１３３】
具体的な検出手段は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段、例えば、蛍光標識を利用する蛍光強度の検出および／または測定、或いはインタカレータを利用する電流応答を検出および／または測定する方法を利用して行われてよい。
【０１３４】
更に、マイクロビーズ、板小片または棒などの基体の表面に対して複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定する工程と、複数のプライマー固定化領域の位置またはその近傍のプローブ固定化領域に、プローブ固定化領域毎にハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に、目的配列の相補配列を含む少なくとも１種類のプローブ核酸を固定することとを含む目的核酸の検出方法も更なる実施形態として提供される。
【０１３５】
そのような目的核酸の検出方法は、例えば、所望の基体の少なくとも１つの表面に対して、複数種類の標的核酸をそれぞれ増幅するために設計された複数種類のプライマーセットを遊離可能に固定することと、複数のプライマー固定化領域の位置またはその近傍のプローブ固定化領域に、プローブ固定化領域毎にハイブリダイズ信号を独立して検出可能に種類毎に、目的配列の相補配列を含む少なくとも１種類のプローブ核酸を固定することと、基体を、増幅に必要な試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液内に配置することと、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含む反応液を添加することと、反応液への添加により反応場に試料を持ち込むことと、反応液を加熱または冷却することによる温度調節など、増幅反応に適した反応環境を調節することと、それによりマルチ核酸増幅反応を行うことと、マルチ核酸増幅反応により生じた増幅産物と少なくとも１種類のプローブ核酸との間のハイブリダイズの有無および／または量を検出および／または測定することと、を具備する。また、反応液に増粘剤が含まれてもよい。
【０１３６】
例として実施形態に示したマルチ核酸増幅検出反応具によれば、異なる配列による干渉を受けずに複数種類の標的配列についての増幅を独立して同時に行うことができる。更に、増幅反応と同時または増幅反応に引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応場において、増幅反応により生じた増幅産物について目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。また、増粘剤の適用により、複数種類の標的配列について並行して行われる増幅反応が効率よく行われる。
【０１３７】
また、増粘剤の反応液への添加に代えて、増粘剤を上述した通りに支持体に固定してもよい。
【０１３８】
更に、増幅反応をより効率的に達成するために、反応液の反応場への添加を、注入速度２５ｍｍ／秒以上の速度で注入することが好ましい。これにより、固定化されたプライマーセットの遊離は影響を受けため、プライマーセットのより局所的な拡散が可能になる。
【０１３９】
従来の技術では、複数種類のプライマーを１つの容器内で使用してマルチプレックス増幅を行った場合、反応効率に偏りが生じ、種類の数に限りがあることが問題となっている。即ち、異なる種類のプライマー間で、必要な酵素やｄＮＴＰの取り合いが生じることがある。また、標的配列の配列やプライマーの配列により、反応特異性および／または反応効率に違いがでることもある。その場合、プライマーの種類によって増幅反応開始点が異なること、一部のプライマーセットについての増幅のみが開始され進行されること、或いは、一部のプライマーセットについての増幅が十分に達成されないことなどの問題が生じてしまう。このような従来の問題も、本明細書において開示される実施形態により解決される。
【０１４０】
即ち、実施形態を例に示したマルチ核酸増幅検出反応具を使用して増幅反応を行うと、固定した増幅試薬付近でのみ増幅反応が進行するため、同一容器中および／または同一溶液中でありながら、互いの増幅反応に干渉せず、各種ターゲットの増幅反応を独立に進行させることが可能であり、そのような増幅反応と同時または引き続いて、増幅反応を行ったのと同じ反応容器において目的核酸の有無および／または量を検出および／または測定することができる。また、ある程度個別の増幅反応が進行した後で、更に異なるプライマーセットを追加してもよく、第１の実施形態に示した容器形態のマルチ核酸増幅検出反応具と、上記のマルチ核酸増幅検出反応具とを組み合わせて使用してもよい。
【０１４１】
[例]
例１
第４の実施形態を用いて、プライマーの核酸状態を評価した。
【０１４２】
蛍光標識したプライマーセットを用意した。図１２に使用したマルチ核酸反応具１２１を示す。
【０１４３】
用意したプライマーセットを終濃度２００μＭとなるようにＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。この溶液に終濃度０．３％となるようにアガロースを溶解して固定溶液を調製した。支持体１２２としてガラス基板を使用した。この固定溶液を支持体１２２上の中央（図中、１２３で示す）と、支持体１２２の２点の隅部（図中、１２４および１２５で示す）の３点に滴下して室温に放置して乾燥した。その一面に溝１２６を形成したシリコンゴム板を被覆体１２７として使用した。被覆体１２７の溝１２６の二端にはそれぞれ貫通孔１２８および１２９が形成されている。支持体１２２のプライマーセットおよびアガロースを固定した領域が被覆体１２７の溝部１２６内に含まれるように、支持体１２２に被覆体１２７を接着した。これにより、マルチ核酸反応具を得た。このマルチ核酸反応具には、被覆体１２７の溝部１２６と支持体１２２の面とによって流路１３０が形成されている。
【０１４４】
被覆体１２７の２つの貫通孔をそれぞれ流入口１２８および排出口１２９として使用することにより行った。流入口１２８からＰＢＳを添加した。その後、プライマーの拡散状態を蛍光強度を指標にして観察した。
【０１４５】
対象として、アガロースを固定せずに蛍光標識したプライマーセットのみを上述と同様に固定して作製した対照用マルチ核酸反応具を用意した。この対照用マルチ核酸は農具にも同様に流入口ＡからＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加して、プライマーの核酸状態を蛍光強度を指標にして観察した。
【０１４６】
結果を図１３（ａ）および（ｂ）に示す。図１３（ａ）は、プライマーのみを固定した対照用マルチ核酸反応具において得られた結果である。図１３（ｂ）は、プライマーセットおよびアガロースを固定したマルチ核酸反応具において得られた結果である。
【０１４７】
対照用マルチ核酸反応具の方が、プライマーセットおよびアガロースを固定したマルチ核酸反応具よりもＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）添加により移動した距離が大きかった。この結果から、プライマーセットおよびアガロースを固定したマルチ核酸反応具により、より局所的なプライマーの拡散が可能となることが明らかになった。
【０１４８】
例２
第６の実施形態と同様の電気化学的検出用のマルチ核酸増幅検出反応具を作製した。
【０１４９】
（１）チップ素材の作製
図８に示すようなマルチ核酸増幅検出反応具用のチップ素材を形成した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極、即ち、作用極、対極、参照極およびプローブ用電極を露出させた。これをマルチ核酸増幅検出反応具のためのチップ素材とした。
【０１５０】
（２）マルチ核酸増幅検出反応具の作製
上記のように作製したチップ素材の作用極上にプローブＤＮＡを固定化した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列を表１に示す。
【表１】
2013198443.tif 000003
【０１５１】
配列番号１〜１３に示す１３種類のプローブＤＮＡ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）および（Ｍ）を上記のように作製したチップ素材に固定化した。プローブＤＮＡをそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液をそれぞれ調製した。これらの溶液の１００ｎＬを作用極上に各種類毎にスポットした。４０℃で乾燥後、超純水により洗浄した。その後、作用極表面に残った超純水を除去し、プローブＤＮＡがチップ素材の電極に固定化されたＤＮＡチップを作製した。
【０１５２】
次に上記でシリコンゴム板製の被覆体を用意した。被覆体の一面には、プローブ固定化領域に対応する位置に溝が形成されている。
【０１５３】
被覆体の溝の底面に対して複数のプライマーセットを固定した。プライマーセットの固定化領域は、先に固定したプローブＤＮＡの位置に対応する位置となるように調整した。
【０１５４】
まず、使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。プライマーＤＮＡの塩基配列を表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。
【表２Ａ】
2013198443.tif 000004
【０１５５】
【表２Ｂ】
2013198443.tif 000005
【０１５６】
【表２Ｃ】
2013198443.tif 000006
【０１５７】
プライマーＤＮＡ（セットＡ）、（セットＢ）、（セットＣ）、（セットＤ）、（セットＥ）、（セットＦ）、（セットＧ）、（セットＨ）、（セットＩ）、（セットＪ）、（セットＫ）、（セットＬ）、（セットＭ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３およびＬＰＦをそれぞれ準備した。ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰＦをそれぞれ０．０３６μＬ、０．０３６μＬ、０．００５μＬ、０．００５μＬおよび０．０１８μＬで含む０．１００μＬの溶液に対して、０．６％アガロース溶液を０．１００μＬ混合した。この水溶液を、被覆体であるシリコンゴムの溝部の底面のプライマー固定化領域に固定した。
【０１５８】
具体的には、用意したそれぞれ０．２００μＬのそれらの溶液を、被覆体の溝部の底部にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。スポットは、被覆体がＤＮＡチップに取り付けられたときに、それぞれのプローブＤＮＡが対応するプライマーセットと対向する位置になるように行った。被覆体の溝部と、プローブＤＮＡが固定化された面が対向するように、被覆体と上記で作製したチップ素材とを接着した。これにより、マルチ核酸増幅検出反応具を得た。被覆体であるシリコンゴムの溝部の２つの端部には、２つの貫通孔が開口されている。
【０１５９】
（３）ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を表３〜表６に示す。
【表３】
2013198443.tif 000007
【０１６０】
【表４】
2013198443.tif 000008
【０１６１】
【表５】
2013198443.tif 000009
【０１６２】
【表６】
2013198443.tif 000010
【０１６３】
組成（１）から（４）には、共通して、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。
【０１６４】
組成（１）には、鋳型Ａ、鋳型Ｃ、鋳型Ｅ、鋳型Ｇ、鋳型Ｉ、鋳型Ｋおよび鋳型Ｍが含まれる。
【０１６５】
鋳型Ａは、プライマーセットＡによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズする。鋳型Ｃは、プライマーセットＣによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｃ）とハイブリダイズする。鋳型Ｅは、プライマーセットＥによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物はプローブＤＮＡ（Ｅ）とハイブリダイズする。鋳型Ｇは、プライマーセットＧによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｇ）とハイブリダイズする。鋳型Ｉは、プライマーセットＩによってＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｉ）とハイブリダイズする。鋳型Ｋは、プライマーセットＫによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｋ）とハイブリダイズする。鋳型Ｍは、プライマーセットＭによってＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｍ）とハイブリダイズする。
【０１６６】
組成（２）は、鋳型Ｂ、鋳型Ｄ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈ、鋳型Ｊおよび鋳型Ｌを含む。
【０１６７】
鋳型Ｂは、プライマーセットＢによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズする。鋳型Ｄは、プライマーセットＤによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｄ）とハイブリダイズする。鋳型Ｆは、プライマーセットＦによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｆ）とハイブリダイズする。鋳型Ｈは、プライマーセットＨによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｈ）とハイブリダイズする。鋳型Ｊは、プライマーセットＪによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｊ）とハイブリダイズする。鋳型Ｌは、プライマーセットＬによりＬＡＭＰ増幅される。それにより生じる増幅産物は、プローブＤＮＡ（Ｌ）とハイブリダイズする。
【０１６８】
組成（３）は、鋳型Ａ、鋳型Ｂ、鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅ、鋳型Ｆ、鋳型Ｇ、鋳型Ｈ、鋳型Ｉ、鋳型Ｊ、鋳型Ｋ、鋳型Ｌおよび鋳型Ｍを全て含む。
【０１６９】
組成（４）は鋳型を含まない。
【０１７０】
鋳型Ａ、鋳型Ｂ、鋳型Ｃ、鋳型Ｄ、鋳型Ｅ、鋳型Ｆ、鋳型Ｇ、鋳型Ｈ、鋳型Ｉ、鋳型Ｊ、鋳型Ｋ、鋳型Ｌおよび鋳型Ｍの塩基配列を表７Ａ、表７Ｂおよび表７Ｃに示す。
【表７Ａ】
2013198443.tif 000011
【０１７１】
【表７Ｂ】
2013198443.tif 000012
【０１７２】
【表７Ｃ】
2013198443.tif 000013
【０１７３】
（４）マルチ核酸増幅検出反応具上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
被覆体であるシリコンゴム板に設けられた２つの貫通孔のうちの一方を流入口とした。シリコンゴム板に設けられた溝部とチップ素材の一面とにより構成される流路を反応部として、そこにおいて反応を行った。反応液がプライマー固定化位置上を流速２５ｍｍ／ｓｅｃで通過するよう、流入口から反応部にＬＡＭＰ反応溶液を注入した。その後速やかに、ＤＮＡ自動検査装置内にマルチ核酸増幅検出反応具を設置した。ＤＮＡ自動検査装置内のペルチェ上で６４℃６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。
【０１７４】
６０分間のＬＡＭＰ反応の後、５５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、３０℃で３分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、３５．５μＭヘキスト３３２５８溶液を流入口から注入した。
【０１７５】
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。
【０１７６】
（５）検出結果
検出結果を表８に示した。
【表８】
2013198443.tif 000014
【０１７７】
［ＬＡＭＰ反応溶液組成（１）の結果］
鋳型Ａ、鋳型Ｃ、鋳型Ｅ、鋳型Ｇ、鋳型Ｉ、鋳型Ｋ、鋳型Ｍを含むＬＡＭＰ反応溶液組成（１）を添加した場合の結果は次の通りである。
【０１７８】
電流値が得られたプローブＤＮＡは、プローブＤＮＡ（Ａ）、プローブＤＮＡ（Ｃ）、プローブＤＮＡ（Ｅ）、プローブＤＮＡ（Ｇ）、プローブＤＮＡ（Ｉ）、プローブＤＮＡ（Ｋ）およびプローブＤＮＡ（Ｍ）であった。これらのプローブＤＮＡ（Ａ）、プローブＤＮＡ（Ｃ）、プローブＤＮＡ（Ｅ）、プローブＤＮＡ（Ｇ）、プローブＤＮＡ（Ｉ）、プローブＤＮＡ（Ｋ）およびプローブＤＮＡ（Ｍ）の全てのプローブについて３０ｎＡ以上の電流値が得られた。
【０１７９】
従って、組成（１）のＬＡＭＰ反応液の場合、シリコンゴムの底面に固定されているプライマーセットＡ、プライマーセットＣ、プライマーセットＥ、プライマーセットＧ、プライマーセットＩ、プライマーセットＫおよびプライマーセットＭによるＬＡＭＰ反応が各々局所的に進行し、生じた増幅産物が、上記のプローブＤＮＡとハイブリダイズしたことが明らかとなった。
【０１８０】
一方、シリコンゴムの底面に固定されているプライマーＤＮＡがプライマーセットＢ、プライマーセットＤ、プライマーセットＦ、プライマーセットＨ、プライマーセットＪ、プライマーセットＬの場合には電流値は得られなかった。
【０１８１】
これらの結果より、実施形態のマルチ核酸増幅検出反応具により、ＬＡＭＰ反応溶液に含まれる鋳型Ａ、鋳型Ｃ、鋳型Ｅ、鋳型Ｇ、鋳型Ｉ、鋳型Ｋおよび鋳型Ｍがそれぞれに対応するプライマーセットに増幅され、且つ対応するプローブ核酸とハイブリダイズしたことが検出できた。
【０１８２】
この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、鋳型Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、ＫおよびＭが含まれていたことを判定することが可能である。
【０１８３】
［ＬＡＭＰ反応溶液組成（２）の結果］
また、鋳型Ｂ、鋳型Ｄ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈ、鋳型Ｊおよび鋳型Ｌを含むＬＡＭＰ反応溶液組成（２）を添加した場合の結果は次の通りである。
【０１８４】
組成（２）の反応溶液の添加により、プローブＤＮＡ（Ｂ）、プローブＤＮＡ（Ｄ）、プローブＤＮＡ（Ｆ）、プローブＤＮＡ（Ｈ）、プローブＤＮＡ（Ｊ）およびプローブＤＮＡ（Ｌ）の全てのプローブについて３０ｎＡ以上の電流値が得られた。
【０１８５】
従って、鋳型Ｂ、鋳型Ｄ、鋳型Ｆ、鋳型Ｈ、鋳型Ｊおよび鋳型Ｌは、シリコンゴムの底面に固定されているプライマーＤＮＡ、即ち、プライマーセットＢ、プライマーセットＤ、プライマーセットＦ、プライマーセットＨ、プライマーセットＪおよびプライマーセットＬによりそれぞれ局所的に増幅され、生じた増幅産物が、対応するプローブＤＮＡにハイブリダイズしたことが確認された。
【０１８６】
一方、シリコンゴムの底面に固定されているプライマーＤＮＡ、プライマーセットＡ、プライマーセットＣ、プライマーセットＥ、プライマーセットＧ、プライマーセットＩ、プライマーセットＫおよびプライマーセットＭ）では電流値は得られなかった。
【０１８７】
この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、鋳型Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌが含まれていたことを判定することが可能である。
【０１８８】
［ＬＡＭＰ反応溶液組成（３）の結果］
１３種類の鋳型が全て含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（３）を添加した場合の結果は次の通りである。
【０１８９】
全てのプローブＤＮＡについて、３０ｎＡ以上の電流値が得られた。これにより、シリコンゴムの底面に固定されている１３種類のプライマーＤＮＡによるＬＡＭＰ反応が各々局所的に進み、生じたＬＡＭＰ産物が１３種類のプローブＤＮＡと反応したことが明らかとなった。
【０１９０】
この結果から、ＬＡＭＰ反応溶液には、１３種類の鋳型が含まれていたことが判定することが可能である。
【０１９１】
また、鋳型を含まないＬＡＭＰ反応溶液組成（４）を添加した場合、シリコンゴムの底面に固定されている１３種類のプライマーＤＮＡによるＬＡＭＰ増幅反応は進まず、電流値は得られなかった。
【０１９２】
以上の結果から、本実施例に記載したアレイ型プライマープローブチップを用いて、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる複数種類の鋳型を検出し、且つその配列を識別することが可能であることが示された。
【０１９３】
例３
増粘剤の代わりに水を混合したプライマーを固定した以外は、例２と同様に試験を行った。即ち、４種類のＬＡＭＰ反応液は、上記増粘剤を添加した場合に用いた試薬と全く同一であり、含まれる鋳型の種類も等しいものを使用した。
【０１９４】
その結果を表９に示した。
【表９】
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【０１９５】
鋳型を含まないＬＡＭＰ反応液（４）では、何れのプローブＤＮＡについても電流値は検出されなかった。
【０１９６】
一方、ＬＡＭＰ反応液（１）、（２）および（３）を添加した結果であっても、そこに含まれる鋳型に由来する電流値が得られない場合もあった。これは、ＬＡＰＭ反応液（１）、（２）および（３）に含まれる鋳型の一部分についての増幅が得られなかったために、ＬＡＭＰ増幅による増幅産物が生じず、従って、プローブＤＮＡとのハイブリダイズが生じなかったためであると考えられる。また更に、電流値が得られたプローブＤＮＡについての電流値も、増粘剤をプライマーセットと共に固定した場合と比べて、得られた電流値は小さい値であった。
【０１９７】
これらの結果から、プライマーセットを固定化する際に増粘剤を添加しないと、プライマーＤＮＡの溶出範囲が広がり、本来得られるべき増幅反応が達成されない可能性が大きいことが示唆された。
【０１９８】
上記の例２および３の結果から次のことが示された。本例に記載されたように、実施形態に従うマルチ核酸増幅検出反応具においてプライマーセットの固定と共に増粘剤を添加することにより、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる複数種類の鋳型をより高精度に検出することが可能であり、且つその配列を識別することが可能であることが示された。
【０１９９】
例４
上述した例２の（１）において作製したチップ素材に対して増粘剤とプライマーセットを固定した。
【０２００】
増粘剤の調製方法を記載する。増粘剤として、ナカライテスク社製「Agarose-Super LM (melting temperature≦60℃)」を用いた。アガロースの場合、分子量や構造により固有の融解温度、ゲル化温度、再融解温度を有しており、特性に合わせて条件を設定する必要がある。
【０２０１】
アガロース０．６gを１００ｍＬのＤＷに添加し、よく混合した後に、８０℃で過熱することで完全に溶解させ、０．６％アガロース溶液を作製した。プライマー溶液と混合する際は、再度８０℃に過熱して完全に溶解させた後に、プライマーと等量ずつ混合し、アガロース濃度が終濃度０．３％となるよう調製した。
【０２０２】
上記のように調製した終濃度０．３％アガロース混合プライマー溶液を支持体上に滴下した。その後、４０℃に設定したホットプレート上で２分間加熱することで乾燥させた。乾燥後の状態がフィルム上になり、完全に固定化されていることを確認した後、使用するまで支持体と共に−２０℃で保管した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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