(57)【要約】      （修正有）【課題】多数の細胞に同時に針状物を挿入し細胞解析を同時に行うことが可能で、さらに多数の細胞の中から標的細胞のみをつり上げ分離することも可能な部材であって、細胞にダメージを与えず、しかも挿入効率がよい細胞挿入部材を提供する。【解決手段】フォトリソグラフィーとドライエッチング及びウエットエッチング法を用いて、支持体上に、長さ１０〜５０μｍ、直径（針状物の１／２長さの部分）２００〜３００ｎｍ、かつ針状物先端側の最大直径が、針状物の１／２長さの部分の直径の１０〜３０％大きい形状を有する針状物が、支持体上に多数配列した細胞挿入部材を得る。【選択図】図２
2013183706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上に針状物が１個の動物細胞に対して１〜３本挿入される一定間隔で配置された細胞挿入部材であって、針状物と支持体は、IV型半導体材料からなる基板から一体加工され、針状物の長さは１０〜５０μｍ、直径は、針状物の１／２長さの部分で２００〜３００ｎｍであり、かつ針状物先端側の最大直径が、針状物の１／２長さの部分の直径の１０〜３０％大きいことを特徴とする、上記細胞挿入部材。
【請求項２】
標的細胞のつり上げ分離に使用することを特徴とする、請求項１に記載の細胞挿入部材。
【請求項３】
以下のａ）〜ｄ）の工程からなる請求項１又は２に記載の細胞挿入部材の製造方法。
ａ）IV型半導体材料からなる基板にフォトレジストをコーティングする工程
ｂ）直径１〜４μｍの独立した円形の繰り返しパターンを有するフォトマスクを上
記基板のフォトレジスト上に配置し、光照射、現像剤による処理を行い、上記
基板上のフォトレジストにフォトマスクに対応するパターンを描画する工程、
ｃ）ドライエッチングにより、上記基板における、フォトレジストにより描画され
た円形部分に対応する部分以外の領域を掘り下げる工程、
ｄ）上記ｃ）の工程を経た基板上のフォトレジストを除去後、熱酸化し、さらにフ
ッ酸系ウエットエッチング剤によるウエットエッチングを行う工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の細胞に複数のナノニードルを挿入し、細胞を同時に解析するか、あるいはさらに標的細胞のみをつり上げ分離する操作を行うナノニードルアレイ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の分離技術としては、最近利用されている手段として、ＦＡＣＳ（Fluoresence
activated cell sorting）がある。この手段は、蛍光標識抗体を用いて、細胞試料中の標的細胞のみを標識するものであり、細胞試料を液流として流しつつレーザー光を照射して、細胞試料中の個々の細胞から発する蛍光を測定して、上記標的細胞を識別し、該標的細胞のみをソーティングするものである。
【０００３】
しかし、この手段は、細胞表面の抗原を標的とするものであり、細胞内部に産生するタンパク質等の細胞内物質を指標に細胞を識別分離するものではない。ＦＡＣＳでは、遺伝子組み換えにより蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現させる方法により細胞内部のタンパク質を指標にすることも可能であるが、移植治療に用いる等の目的で天然の細胞の分離を目的とする場合には遺伝子組み換え細胞は適用できない。また、ＦＡＣＳでは、個々の細胞の蛍光測定結果とソーティングとを連動させるための極めて精密な制御機構を必要とし、極めて高価なものとならざるを得ないほか、蛍光標識抗体を用いなければならない問題点も有していた。
【０００４】
一方、本発明者は、遺伝子等を先端に固定したナノレベルの針状物を細胞に挿入し、細胞の応答を観察する手法を開発しており（特許文献１参照）、この手法をさらに展開し、針状物を細胞挿入後、標的細胞のみをつり上げ分離する手法も既に提示している。この手法は、細胞内のマーカー物質と選択的に結合する、例えば抗体等の物質を固定化した針状物を、細胞培養基板上の各細胞に挿入して、上記マーカー物質と選択的に結合する物質を介して細胞内のマーカー物質を針状物に結合させた後、該針状物を引き上げて、上記マーカー物質を含有する細胞のみを選択して釣り上げ分離するものである（特許文献２参照）。
【０００５】
この方法は、細胞中のマーカー物質と該マーカー結合物質と選択的に結合する物質との結合に基づく細胞と針状物との結合力を、細胞の基板に対する接着力よりも大きく、かつ、抗体固定化針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的な吸着力が、細胞の基板に対する接着力より小さく設定するもので、これにより、標的タンパク質を含む特定の細胞のみを識別すると同時に、上記針状物により標的細胞を釣り上げることを可能とするものである。
【０００６】
すなわち、細胞と基板との接着力は、通常２０〜４０ｎＮであるが、上記本発明者が開発した手法によって、トリプシン、キモトリプシン、パパイン等の蛋白分解酵素、あるいは、ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase）阻害剤、ブチリルオキサゾリジノン化合物、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、フィブロネクチン結合阻害剤等がなどの接着タンパク質発現阻害剤等による細胞の処理によって、細胞と基板の接着力を２ｎＮ以下に低下させ、一方、上記針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的吸着力は、通常２００ｐＮ程度であるので、細胞とマーカー結合物質固定化針状物との接着力を２ｎＮ以上に調節することにより、多くの細胞から、目的のマーカー物質を発現する標的細胞のみを選択的に釣り上げ分離することを可能としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３―３２５１６１号公報
【特許文献２】特開２０１１−１８２７６１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、多数の細胞に同時に針状物を挿入し細胞解析を同時に行うことが可能で、さらに多数の細胞の中から標的細胞のみをつり上げ分離することも可能な部材であって、細胞にダメージを与えず、しかも挿入効率がよい、直径がナノレベルの針状物（以下、ナノニードルという場合がある。）が支持体上に多数配列した細胞挿入用部材を、極めて効率的に提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究の結果、フォトリソグラフィーとドライエッチング及びウエットエッチング法を用いて、支持体上に多数の高アスペクト比の針状物が配列した細胞分離部材を一体成形する手法を新たに開発した。またこの方法によれば、極めて能率的に細胞挿入部材が製造できるとともに、得られた細胞挿入部材は、その挿入による細胞分離効率も高いことも見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【００１０】
（１）支持体上に針状物が１個の動物細胞に対して１〜３本挿入される一定間隔で配置さ
れた細胞挿入部材であって、針状物と支持体は、IV型半導体材料からなる基板から
一体加工され、針状物の長さは１０〜５０μｍ、直径は、針状物の１／２長さの部
分で２００〜３００ｎｍであり、かつ針状物先端側の最大直径が、針状物の１／２
長さの部分の直径の１０〜３０％大きいことを特徴とする、上記細胞挿入部材。
（２）標的細胞のつり上げ分離に使用することを特徴とする、上記(１)の細胞挿入部材。
（３）以下のａ）〜ｄ）の工程からなる上記(１)又は(２)に記載の細胞挿入部材の製造方法。
ａ）IV型半導体材料からなる基板にフォトレジストをコーティングする工程
ｂ）直径１〜４μｍの独立した円形の繰り返しパターンを有するフォトマスクを上
記基板のフォトレジスト上に配置し、光照射、現像剤による処理を行い、上記
基板上のフォトレジストにフォトマスクに対応するパターンを描画する工程、
ｃ）ドライエッチングにより、上記基板における、フォトレジストにより描画され
た円形部分に対応する部分以外の領域を掘り下げる工程、
ｄ）上記ｃ）の工程を経た基板上のフォトレジストを除去後、熱酸化し、さらにフ
ッ酸系ウエットエッチング剤によるウエットエッチングを行う工程。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞挿入部材は、支持体上に多数のナノニードルを配置したものであり、各ナノニードルの最大直径は４００ｎｍ以下であり、長さが１０μｍ以上あるので、ナノニードルを細胞に挿入しても細胞にダメージを与えず、高い挿入効率を有する。
したがって、これらナノニードルに遺伝子あるいは遺伝子発現に関与する物質等を固定化し、基板上の配列した多数の細胞に、同時に多数のナノニードルを挿入することが可能であり、これにより、多数の細胞において、細胞が生きた状態で、遺伝子の発現状態を同時に解析可能となる。
【００１２】
一方、本発明の細胞挿入部材は、各ナノニードルに抗体等のマーカー物質と結合する物質を固定化しておくことにより、マーカー物質を発現している細胞のみを選択的に釣り上げ分離する細胞分離用部材としても使用できる。
すなわち、本発明の細胞挿入部材には多数のナノニードルが一定間隔に配置されているため、上記マーカー物質と特異的に結合する物質を固定化した多数のナノニードルを、培養基板上の多数の細胞に一度に挿入した後、引き上げ操作を行って、細胞内のマーカー物質とナノニードルに固定化したマーカー物質との結合を介して、標的細胞を選択的につり上げることがき、分離操作を極めて能率的に行うことができる。
【００１３】
さらに、各ナノニードルは先端部が太く、細胞の釣り上げ時の抜け落ちが抑制できるとともに、マーカー物質の固定化量も増大させることができ、この点でも細胞釣り上げ時の脱落を防止できる。なお、本発明の針状物は先端が太くはなっているが、上記したように、それでも充分細く、細胞のダメージを増大させることはほとんどない。実際に本発明のナノニードルを用いて１００回以上の細胞挿入操作を行っても、細胞を殺傷することなく、安全に細胞操作を行うことが可能であった。
【００１４】
また、本発明の細胞挿入部材は無機材料基板から支持体と針状物を一体加工することにより得られたものであり、支持体上の各ナノニードルは、細胞挿入に耐える十分な機械的強度を有する。
一方、本発明の製造方法によれば、上記のような良好な性能を有する細胞挿入部材を、極めて精度よく、効率的に製造できる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の細胞挿入部材を用いた標的細胞の釣り上げ分離の態様を表す概念図
【図２】本発明の細胞挿入部材を水平から３０°傾けて撮影した走査型電子顕微鏡写真である。上は３００倍、下は１５０００倍の観察像である。スケールバーはそれぞれ１００μｍ、３μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の細胞挿入部材は、ナノニードルが支持体上に複数配置されたものである（以下、この細胞挿入部材をナノニードルアレイという場合がある。）。この細胞挿入部材は、例えば細胞アレイのような、多数の細胞が配置された細胞基板とセットで用いられるものである。
【００１７】
本発明ナノニードルアレイのナノニードルは支持体と一体加工されたものであり、ナノニードルの配置密度は、培養基板上の細胞の配置状態に応じて種々変更可能ではあるが、各動物細胞に一本のナノニードルを挿入する場合、例えば、支持体１０ｍｍ角に１万〜５万本である。各ナノニードルの長さ（支持体面からの高さ）は、１０〜５０μｍ、直径は、針状物の１／２長さの部分で２００〜３００ｎｍである。このナノニードルの形状は、先太りの野球のバット様の形状をしており、ナノニードルの最大直径は、針状物１／２長さの部分の直径の１０〜３０％大きい形状となっている。
【００１８】
本発明の効率的な細胞挿入は、針状物の直径と長さによって決定される。針状物の直径が１００〜４００ｎｍ、長さ１０μｍ以上の場合に、ヒト、マウス、ラット等の様々な動物由来の体細胞に対して、８０％以上の高い挿入効率が得られるが、本発明の各ナノニードルの最大直径でも４００ｎｍ以下であり、高い挿入効率が達成できる。なお、挿入効率とは針状物の細胞への接近動作の試行回数に対する針状物の細胞膜貫通の達成割合をいう。
【００１９】
また、本発明のナノニードルは培養基板上の各細胞に対して、１本づつ配置してもよいが、さらに、一つの細胞に対し２本あるいは３本づつ、各細胞の配置間隔と対応させて配置してもよい。特に、３本配置する場合は、培養基板表面に対し、三角形、好ましくは正三角形になるように配置するのが好ましい。
このようなナノニードルの配置によれば、細胞解析用のプローブとして同一細胞内での異なる複数箇所でのデータを同時測定でき、また、細胞挿入操作時の横ずれを防止するという機能も発揮できる。さらに、標的細胞のつり上げ分離の際、ナノニードルの細胞保持力の増大にも寄与する。
【００２０】
このような本発明のナノニードルアレイは、以下のａ）〜ｄ）の工程を含む製造方法により得られる。
ａ）フォトレジストのコーティング工程
IV型半導体材料からなる基板を、フォトレジストでコーティングする。このフォトレジスト（感光性樹脂）としては、ポジ型、ネガ型のいずれも使用でき、IV型半導体基板としては、Ｓｉ、ＳｉＣ、Ｇｅ等の無機材料からなるものが挙げられる。
【００２１】
ｂ）マスクパターンの現像工程
上記フォトレジストによりコーティングされた基板上にマスクパターンが印画されたフォトマスクを配置し、光照射し、現像剤で処理する。
フォトマスクは、合成石英ガラス等の透明材料上に、直径１〜４μｍの独立した円形の繰り返しパターンを有し、該パターン中の各円形部分の位置は、用いる培養基板上の細胞の位置と対応するものとすればよく、決まったものではないが、各円形部分の間隔は、通常、５０〜１００μｍに設定すればよい。
フォトマスクとしては、例えば、クロム、酸化クロム、エマルジョン等を含有するものを用いることができる。ポジ型のフォトレジストを用いる場合、マスク剤は、フォトマスクの各円形部分に塗布し、ネガ型のフォトレジストを用いる場合は、各円形部分を残して、他の領域にマスク剤を塗布する。
光照射手段としては、マスクアライナ、ステッパなど等を用いることができ、現像剤としては、ポジ型フォトレジストの場合は、ＴＭＡＨ（テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド）等のアルカリ溶液が用いられ、ネガ型フォトレジストの場合は、有機溶剤が用いられる。このような現像剤により、ポジ型のフォトレジストの場合は、マスクされた円形部分が残り他の領域は除去され、ネガ型フォトレジストに場合は、マスクされた領域は除去され、マスクされなかった円形部分が残る。いずれの場合であっても、シリコン基板上に残存したフォトレジストによる独立した円形の繰り返しパターンが描画される。
【００２２】
ｃ）ドライエッチング工程
この繰り返しパターンが描画された基板は、ドライエッチングにより、フォトレジストにより描画された円形部分に対応する部分以外の領域を掘り下る。ドライエッチングは、例えば、誘導結合プラズマエッチング装置を用いて、該装置に上記パターンが描画された基板を収納し、該装置にエッチングガスと保護ガスを交互に繰り返し導入（例えば６０〜１２０サイクル）してエッチングすることにより行う。エッチングガスとしては、例えば、ＳＦ６、ＩＦ５、ＣＨＦ３、ＣＦ４等のエッチングガスが用いられ、エッチング側壁を保護するための上記保護ガスとしては、Ｃ４Ｈ８が用いられる。他に本発明に使用できるドライエッチング装置としては誘導結合プラズマ（Inductively Coupled Plasma，ＩＣＰ）ドライエッチング装置等がある。
このドライエッチングにより、直径２〜３μｍのピラーが配設されたマイクロピラーアレイが得られるが、本発明の細胞分離部材に使用できるレベルとはほど遠く、ドライエッチングでは限界があるため、さらに以下のｄ）工程を行う。
【００２３】
ｄ）ウエットエッチング工程
上記得られたマイクロアピラーから、アッシャーによりフォトレジストを除去し、ついで、１１００℃以上、１０〜２０時間の湿潤条件で熱酸化して、酸化層を作製した後、フッ酸系のウエットエッチング剤を用いてウエットエッチングを行い、本発明の上記ナノニードルアレイを得る。
フッ酸系ウエットエッチング剤としては、例えば、フッ酸あるいはフッ酸とフッ化アンモニウムを混合した緩衝フッ酸等を用いることができる。
本発明のナノニードルの上記独特の先太り形状は、このようなウエットエッチング処理を付加したことにより初めて得られたものである。
【００２４】
本発明のナノニードルアレイは、各ナノニードルに、例えば、遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質等を固定化し、各細胞中の遺伝子の発現状態を検出、測定するために用いることができる。
上記遺伝子等をナノニードルアレイの各ナノニードルに固定し、各ナノニードルが培養基板上の各細胞の位置に合致するようにナノニードルアレイを位置あわせし、下降させることにより、各ナノニードルを同時に個々の細胞に挿入する。
遺伝子あるいは遺伝子の発現に関与する物質等の固定化は、例えば、物理的吸着、固定化アビジンを利用したアビジンビオチン結合の利用等が挙げられるが、例えば素材がシリコン系の場合は、ナノニードル表面を酸化処理した後、各種シラン化剤を用いて官能基を形成させ、この官能基を利用して共有結合で固定化することができる。
【００２５】
各細胞における遺伝子の発現状態の検出は、ナノニードルアレイを引き上げた後、基板上の個々の細胞について別途行ってもよいが、遺伝子の発現状態の検出、測定においては、例えば、モレキュラービーコンのような機能性プローブを針状物表面に修飾しておけば、針状物が細胞に挿入された状態で細胞内の遺伝子発現を生きたまま測定し、経時的に同時多数の細胞の解析を行うことができる。
上記モレキュラービーコンは、両端に蛍光物質とクエンチャーとを有するステム・ループ構造を有するＤＮＡで、ループ部分に解析する遺伝子とハイブリダイズ可能な配列を有するものである。
【００２６】
固定化する遺伝子としては、例えば、ガンの増殖抑制遺伝子であり、試験薬剤の存在下、細胞の挿入試験を行い、固定化されたマーカー遺伝子が発現すれば、上記薬剤は効果を有すると評価できる。また、分化に関与する各遺伝子をナノニードルに固定化し、試験薬剤の存在下、分化に関与する各遺伝子の発現状態の変化を測定することができる。同様に例えば分化遺伝子の発現に関与する物質を固定化した場合には、該物質により分化遺伝子の発現状態がどの様に変化するかも検出・測定できる。
【００２７】
モレキュラービーコン等の修飾では、例えばビオチン化されたモレキュラービーコンを用いる。針状物表面を、シランカップリング反応を用いた化学修飾によりビオチン化し、ストレプトアビジンを介した結合によって、ビオチン化モレキュラービーコンを固定化する。モレキュラービーコン修飾針状物が細胞に挿入された際、細胞内に該モレキュラービーコンの標的であるmRNAが発現している場合、モレキュラービーコンとのハイブリダイズにより針状物表面における蛍光が上昇する。この蛍光を、共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影、解析することによって、細胞内のmRNAを検出・測定することが可能である。
【００２８】
一方、本発明のナノニードルアレイは、特に多数の細胞の中から、標的細胞を選択的に分離するための、細胞分離用部材として有用である。
これらを用いる細胞分離の概要は図１に示される。
本発明のナノニードルアレイを細胞分離用部材として使用する場合、各ナノニードルには、細胞内のマーカー物質と選択的に結合する物質、例えば抗体等を固定化する。固定化法については上記したとおりである。ついで、ナノニードルアレイを、各ナノニードルが基板上の各細胞に対応するように位置決めした後、ナノニードルアレイを下降させ、各ナノニードルと基板上の各細胞に挿入して、上記マーカー物質と上記選択的に結合する物質を介して細胞内のマーカー物質をナノニードルに結合させた後、該ナノニードルアレイを引き上げて、上記マーカー物質を含有する細胞のみを選択して釣り上げ分離する。これらの多数の細胞へのナノニードルの挿入、標的細胞のつり上げは、ナノニードルアレイの一度の下降、上昇でなされる。細胞が多数であり、高効率な回収を必要としない場合には、細胞の配置とナノニードルアレイの位置合わせを行う必要は無い。
【００２９】
マーカー物質とマーカー結合物質の結合を介した、ナノニードルと細胞の結合力は、マーカー結合物質の固定化量の増大、あるいは固定化剤の選択、あるいは細胞挿入後のナノニードルの細胞内滞留時間の調整等により、５ｎＮ以上に調節可能である。さらに、上記した各細胞に対しナノニードルを複数配置した場合には、つり上げ時の細胞に対する保持力を増大することができる。
【００３０】
しかし、細胞と基板との接着力は、通常２０〜４０ｎＮであり、また、上記針状物とマーカー物質を発現していない細胞との非特異的吸着力は、通常２００ｐＮ程度であるので、細胞と細胞培養基板との接着力は、下限は２００ｐＮを超え、好ましくは５００ｐＮ以上であり、上限は少なくとも５ｎＮ未満、好ましくは３ｎＮ以下、さらに好ましくは２ｎＮ以下にする。この接着力の調節は、上述したようにトリプシン等の蛋白分解酵素、あるいは、ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase）阻害剤、ブチリルオキサゾリジノン化合物、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、フィブロネクチン結合阻害剤等がなどの接着タンパク質発現阻害剤等による細胞の処理によってなされるが、本発明者は、キレート剤を含有する、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びＢＡＭ（Biocompatible Anchor for Membrane）−ＢＳＡ複合体の混合物からなる被膜形成剤で培養基板をコーティングする手法も開発している、この被膜形成剤においては、ＢＳＡとＢＳＡ−ＢＡＭ複合体との混合比率を変えることにより、所望の接着力に調節することができる。
【００３１】
このナノニードルの形状は、先太りの野球のバット様の形状をしており、ナノニードルの最大直径は、針状物１／２長さの部分の直径の１０〜３０％大きい形状となっている。このような形状を有するナノニードルは、先細りの通常の針状物に比べて、細胞釣り上げ時の細胞の抜け落ちしにくい形状であり、マーカー固定化量も増大できるので、釣り上げ時の細胞脱落を有効に抑制できる。また、動物細胞の大きさは通常１０〜３０μｍであり、上記先端側の直径増大程度では、細胞に対するダメージ増大はほとんどない。
【実施例】
【００３２】
実施例１
直径４インチ、厚さ０.４ｍｍのシリコンウエハに対して、フォトレジスト凝着助触媒としてＨＭＤＳをスピンコートした後に、ポジ型フォトレジストであるＴＳＭＲ−Ｖ９０をスピンコートした。直径２〜３μｍ程度の円形のマスクパターン（クロム）がガラス基板上に５０〜１００μｍ間隔に配列されたフォトマスクを用いて、マスクアライナーにより光照射、2.38% NMD-3による現像処理でレジストにパターンを作製した。
【００３３】
その後、誘導結合プラズマ（Inductively Coupled Plasma，ＩＣＰ）ドライエッチング装置ＭＵＣ−２１（ＳＴＳ）を用いたドライエッチング加工により、フォトレジストが除去された部分を掘り下げることによって、直径２〜３ミクロンのピラーが配列された基板（マイクロピラーアレイ）を作製した。
エッチングにおける導入ガスの条件は、エッチングＳＦ６(４５０ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｃ／ｍｉｎ)３秒、保護Ｃ４Ｆ８(１３５ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｃ／ｍｉｎ)２秒を６０〜１２０サイクル繰り返した。
フォトレジストをアッシャーで除去した後に、マイクロピラーアレイを１１００℃、２０時間の湿潤条件で熱酸化し、酸化層を作製し、その後に、２０％緩衝フッ酸によるウエットエッチングを行い、酸化層を除去した。これによって。直径３００ｎｍ以下、長さ１０μｍ以上のナノニードルが１０ｍｍ角に１万本以上配列されたナノニードルアレイを得た（図２）。
作製されたナノニードルアレイは培養細胞に対して接近動作を行った際に効率よく挿入されることが確認されている。
【図１】
2013183706.tif 000003
【図２】
2013183706.tif 000004