(57)【要約】 【課題】核酸の増幅反応の効率を向上させる核酸検出用デバイス及び核酸検出装置を提供する。【解決手段】実施形態によれば、核酸検出用デバイスは、第１面に溝部を備える第１の部材を備える。前記溝部は、核酸サンプルが反応するための流路型チャンバを備える。前記流路型チャンバの断面積は、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の断面積よりも大きい。【選択図】図１
2013198417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１面に溝部を備える第１の部材を備え、
前記溝部は、核酸サンプルが反応するための流路型チャンバを備え、
前記流路型チャンバの断面積は、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の断面積よりも大きい、
核酸検出用デバイス。
【請求項２】
前記流路型チャンバの深さは、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の領域の深さよりも深い、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
【請求項３】
前記流路型チャンバの幅は、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の領域の幅よりも広い、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
【請求項４】
前記流路型チャンバの断面積及び前記流路型チャンバ以外の前記溝部の断面積は、前記第１面と直交する面に基づいた断面積である、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
【請求項５】
複数の前記流路型チャンバは、複数種類の標的配列をそれぞれ増幅するように構成された複数種類のプライマーセットを保持する、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
【請求項６】
前記流路型チャンバは、壁面に前記プライマーセットを保持する、請求項１記載の核酸検出用デバイス。
【請求項７】
前記第１の部材の前記第１面と対向し、前記溝部と対向する位置に核酸検出用の電極を備える第２の部材を備える、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の核酸検出用デバイス。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の核酸検出用デバイスを用いる核酸検出装置であって、
前記電極からの電流値に基づいて核酸を検出する核酸検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、微細な流路にて核酸の増幅反応を行う核酸検出用デバイス及び核酸検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、医療分野では、遺伝子による病気の診断或いは予防が可能となりつつある。これは遺伝子診断と呼ばれ、病気の原因となるヒトの遺伝子欠陥、変化を検出することで病気の発症前もしくは極めて初期段階での病気の診断や予測をすることが出来る。また、ヒトゲノムの解読とともに、遺伝子型と疫病との関連に関する研究が進み、各個人の遺伝子型に合わせた治療（テーラーメイド医療）も現実化しつつある。従って、遺伝子の検出並びに遺伝子型の決定を簡便に行うことは非常に重要となっている。さらにこれらの遺伝子検査は、複数種類の遺伝子を検出することで総合的な判断を行う場合が多いため、複数種類の対象遺伝子を、同時に短時間で検出することは極めて重要である。
【０００３】
以上の目的から、核酸を検出するための装置として、1つのデバイス内において複数試薬が関わる複数の反応を順次行うことができるμ−ＴＡＳと呼ばれるデバイスが盛んに研究開発されてきた。これらは試薬保持領域、反応領域、センサ領域などから成り、それらをつなぐ流路を備えることが特徴である。
【０００４】
複数種の遺伝子を同時に1つのデバイス内で検出する場合、複数の対象遺伝子を増幅するために複数の別々の増幅用容器を用意する方法、もしくは、全ての対象遺伝子の増幅反応をひとつの反応容器に入れてマルチ核酸増幅反応を行う方法、のいずれかが考えられる。しかしながら、検出したい対象遺伝子種が多くなった場合に、いずれの方法でもデバイス化が困難になるという問題がある。つまり複数の別々の増幅容器を用意する方法では、複数の増幅容器を多く用意する必要がありデバイスが複雑になる、またマルチ核酸増幅反応を行う方法では、対象遺伝子数が多くなると、遺伝子増幅反応の競合が発生し、増幅効率が大きく低下するという問題がある。
【０００５】
上記問題の解決手段の１つとして、１つの反応場において、複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセットを用いて同時に独立して（独立した領域で）増幅反応させ、得られた各増幅産物の量を独立して測定することで目的核酸の有無を決定する核酸検出用デバイスがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許４１２７６７９号公報
【特許文献２】特開２００８−２６３９５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述のような１つの反応場において複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセットを用いて同時に独立して増幅反応させることを想定した核酸検出用デバイスは、例えば、以下のような課題がある。
【０００８】
課題の１つは、核酸検出用デバイスの増幅領域におけるプライマーセットの保持の困難性である。プライマーセットは、核酸検出用デバイスの増幅領域に保持するためにプライマーセットを含む溶液を各増幅領域に滴下させる。しかしながら、この溶液は、プライマーセットを保持させる過程で、容易に動いてしまう。したがって、核酸検出用デバイスは、各増幅領域におけるプライマーセットの保持位置を正確に規定できないという問題がある。
【０００９】
他の課題は、プライマーセットの流出である。予め増幅領域に保持したプライマーセットは、標的核酸を含む溶液を増幅領域に導入した場合に、その保持位置から隣接する増幅領域に流出してしまう恐れがある。
【００１０】
他の課題は、プライマーセット及び増幅産物の動きによる増幅反応の阻害である。プライマーセット及び増幅産物は、増幅反応中に、溶液の流れにより、拡散する。隣接した別の増幅領域から対象外のプライマーセット及び増幅産物が流れてくると、増幅領域では、増幅反応が阻害される恐れがある。
【００１１】
他の課題は、保護膜からの溶出物による増幅反応の阻害である。増幅反応は、増幅産物の検出センサを内包する領域で行われる。しかしながら、センサの保護膜からの溶出物が増幅反応を阻害する恐れがある。
【００１２】
本発明の目的は、核酸の増幅反応の効率を向上させる核酸検出用デバイス及び核酸検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
実施形態によれば、核酸検出用デバイスは、第１面に溝部を備える第１の部材を備える。前記溝部は、核酸サンプルが反応するための流路型チャンバを備える。前記流路型チャンバの断面積は、前記溝部における前記流路型チャンバ以外の断面積よりも大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図２】第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図３】第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図４】第１の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図５】実施例１に係る支持体の概略図。
【図６】実施例１に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図７】実施例１に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図８】実施例１に係る核酸増幅反応の結果を示すグラフ。
【図９】第２の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図１０】第２の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図１１】第２の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図１２】第２の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図１３】第２の実施形態に係る核酸検出用デバイスの概略図。
【図１４】実施例２に係る核酸検出用デバイスの概略図及び核酸増幅反応の結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、図面を参照しながら、種々の実施形態について説明する。なお、実施形態を通して共通の構成には同一の符号を付すものとし、重複する説明は省略する。また、各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際の装置と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【００１６】
（第１の実施形態）  
第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１の１例を図１を参照しながら説明する。図１（ａ）は、核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。核酸検出用デバイス１は、１つの反応場において複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセット３１を用いて同時に独立して増幅反応させるために用いられる。
【００１７】
核酸検出用デバイス１は、支持体（第２の部材）１１、被覆体（第１の部材）１２を備える。支持体１１は、被覆体１２と接する面に略平面を備える。なお、第１の実施形態では、支持体１１、被覆体１２の順で並ぶ方向を積層方向という。被覆体１２は、支持体１１と接する面（第１面）に、溝部１２１を備える。溝部１２１は、支持体１１と接する面に設けられている。溝部１２１は、被覆体１２及び、これと接する支持体１１により、内部は密閉される。被覆体１２及び支持体１１で密閉された溝部１２１は、各種溶液の流路として機能する。溝部１２１は、１例として、各種溶液の入口１２１ａから出口１２１ｂにかけて曲線状に蛇行した形状であるが、特に限定されない。溝部１２１は、入口１２１ａから出口１２１ｂにかけて略同じ幅で形成されている。溝部１２１は、例えば等間隔で複数のチャンバ（流路型チャンバ）１２１１が相互に配置されている。チャンバ１２１１は、核酸の増幅反応が行なわれ、後述する電極（センサ）と核酸サンプルが反応するために用いられる。チャンバ１２１１は、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域（部分）よりも、積層方向に凹んだ形状で形成されている。つまり、チャンバ１２１１の深さは、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の深さよりも深く形成されている。逆に言えば、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の深さは、チャンバ１２１１の深さよりも浅い。したがって、チャンバ１２１１の断面積は、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の断面積よりも大きい。なお、チャンバ１２１１の断面積及び溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の断面積は、被覆体１２における溝部１２１が設けられた面と直交する面に基づいた断面積である。溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の断面積は、チャンバ１２１１の断面積の例えば９０％以下であることが好ましいが、特に限定されるものではない。なお、チャンバ１２１１は、プライマー固定化領域２１と対応する。プライマー固定化領域２１は、例えば、チャンバ１２１１の上面部（チャンバ１２１１以外の領域よりも積層方向に凹んだ部分）に形成されている。複数のプライマー固定化領域２１は、互いに独立して溝部１２１に配置される。
【００１８】
なお、支持体１１及び被覆体１２の材質は、同じであっても異なっていても良い。また、支持体１１及び被覆体１２の材質は、支持体１１及び被覆体１２自身が増幅反応等に関与しない材質であれば良い。支持体１１及び被覆体１２は、溝部１２１内で増幅反応を行うことが可能な材質であれば良い。支持体１１及び被覆体１２は、例えば、シリコン、ガラス、樹脂及び金属などから任意に選択されても良い。
【００１９】
次に、プライマー固定化領域２１における、核酸を増幅させるためのプライマーセット３１の固定（保持）について説明する。チャンバ１２１１は、流路壁面にプライマーセット３１を保持する。なお、プライマー固定化領域２１は、チャンバ１２１１の位置と対応するため、適宜チャンバ１２１１と読み替えても良い。プライマーセット３１は、図１に示すように、チャンバ１２１１における積層方向の上面部近傍（プライマー固定化領域２１）に、反応場を提供するための液相と接触すると遊離するような状態で固定される。複数のチャンバ１２１１（プライマー固定化領域２１）は、標的核酸の種類ごとに複数のプライマーセット３１がそれぞれ固定される。つまり、複数のチャンバ１２１１（プライマー固定化領域２１）は、複数種類の標的配列をそれぞれ増幅するように構成された複数種類のプライマーセットを保持する。プライマーセット３１の固定化は、例えば、溝部１２１が鉛直方向の上方を向くように被覆体１２のみを準備し、１つのプライマー固定化領域２１にプライマーセット３１を含む溶液を滴下し、その後乾燥させることで可能である。なお、プライマーセット３１の保持方法は、乾燥によるものに限らず、その他凍結乾燥等の手法を用いても良い。
【００２０】
上述のように、チャンバ１２１１は溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域よりも深く形成されているため、プライマー固定化領域２１に局所的に滴下されたプライマーセット３１を含む溶液は、チャンバ１２１１以外の領域に容易に動くことはない。したがって、隣接したプライマー固定化領域２１は、異なったプライマーセット３１を独立して保持可能となる。
【００２１】
次に、複数のプライマーセット３１がそれぞれ異なるプライマー固定化領域２１に固定された核酸検出用デバイス１への反応液の添加について説明する。図２（ａ）は、核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図２（ｂ）は、図２（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。図２は、核酸検出用デバイス１に反応液を添加した状態を示す。なお、図２に示す核酸検出用デバイス１は、反応液が溝部１２１に添加された以外は図１と同様である。
【００２２】
反応液は、核酸増幅反応に必要な成分を含んでいれば良い。反応液は、これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なデオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでいても良い。
【００２３】
図２に示すように、入口１２１ａから反応液を添加した後、プライマー固定化領域２１に固定されたプライマーセット３１は、遊離、拡散し始める。プライマーが遊離および拡散した領域は、模式的に図２中にプライマー遊離・拡散領域２２で示される。
【００２４】
反応液が核酸検出用デバイス１に導入された時、遊離、拡散するプライマーセット３１は、容易に隣接するその他のプライマー固定化領域２１に流出しないことが望まれる。つまり、プライマー遊離・拡散領域２２は、プライマー固定化領域２１（言い換えるとチャンバ１２１１）と対応することが望ましい。
【００２５】
核酸検出用デバイス１は、反応液導入時において、チャンバ１２１１におけるプライマーセット３１が固定された部分（チャンバ１２１１以外の領域よりも積層方向に凹んだ部分）近傍の流速を大幅に低減させることができる。そのため、核酸検出用デバイス１は、プライマーセット３１が隣接するその他のプライマー固定化領域２１に流出することを防止できる。したがって、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１は、隣接したプライマー固定化領域２１のプライマーセット３１をそれぞれ独立させることができる。
【００２６】
さらに、増幅反応中においても、ある増幅領域（プライマー固定化領域２１（チャンバ１２１１）に対応する領域）におけるプライマーセット３１及び生成された増幅産物は、その他の増幅領域へ拡散せず、独立して増幅領域内に位置することが望まれる。核酸検出用デバイス１は、チャンバ１２１１以外の領域における溝部１２１の深さ（流路断面積）は、チャンバ１２１１の深さ（流路断面積）よりも浅い（小さい）。そのため、核酸検出用デバイス１は、増幅反応中において、ある増幅領域におけるプライマー及び生成された増幅産物が、その他の増幅領域へ拡散することを抑制することができる。したがって、第１の実施形態に係る核酸検出用デバイス１は、複数種類のプライマーセット３１を用いた複数の鋳型配列についての増幅を、独立に（局所的に）、且つ同時に高効率で達成可能である。
【００２７】
局所的に得られた増幅産物の具体的な検出手段は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段、例えば、蛍光標識を利用する蛍光強度の検出および／または測定、或いはインタカレータを利用する電流応答を検出および／または測定する方法を利用して行われてよく、限定されない。
【００２８】
次に、核酸検出用デバイス１によるハイブリダイズ信号の検出について説明する。図３（ａ）は、核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図３（ｂ）は、図３（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。なお、図３に示す核酸検出用デバイス１は、支持体１１がプローブ固定化領域１１１を備える以外は図１と同様である。プローブ固定化領域１１１は、例えば、プライマー固定化領域２１（チャンバ１２１１）に対向する位置に支持体１１に配置されるが、特に限定するものではなく、チャンバ１２１１内であればどのような形態であってもよい。プローブ固定化領域１１１は、例えば、ハイブリダイズ信号を検出する電極（核酸検出用の電極）が設けられる領域である。つまり、プローブ固定化領域１１１における核酸検出用の電極は、被覆体１２における支持体１１と接する面と対向し、溝部１２１（特にプライマー固定化領域２１（チャンバ１２１１））と対向する位置に配置される。
【００２９】
プローブ固定化領域１１１は、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸が複数固定される。核酸検出用デバイス１は、プライマー固定化領域２１にて増幅反応を行った後、引き続きプローブ固定化領域１１１にてハイブリダイズ信号を得ることができる。
【００３０】
次に、図３に示す核酸検出用デバイス１に反応液を導入し、増幅反応を行った場合について説明する。図４（ａ）は、核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図４（ｂ）は、図４（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。図４は、核酸検出用デバイス１に反応液を添加した状態を示す。なお、図４に示す核酸検出用デバイス１は、反応液が溝部１２１に添加された以外は図３と同様である。核酸検出用デバイス１では、反応液が導入されると、鋳型核酸が存在する場合、対応した遊離、拡散したプライマーセット３１により鋳型核酸が増幅され、増幅産物３２が生じる。増幅反応で生じる増幅産物３２は、図４に示すように局所的にチャンバ１２１１内で生成される。核酸検出用デバイス１は、増幅産物３２がプローブ固定化領域１１１に固定されたプローブと反応することでハイブリダイズ信号を得ることができる。
【００３１】
（実施例１）
以下に、第１の実施形態に係る核酸検出デバイス１を用いた核酸検出の例を具体的に説明する。本実施例１では、被覆体１２としてシリコンゴム製のパッキン１２ａを使用し、パッキン１２ａ一面のプライマー固定化領域２１にプライマーセット３１を固定した。図５は、実施例１に係る支持体１１の１例を示す概略図である。実施例１では、支持体１１
として、プローブ固定化領域１１１を電極１１１ａとした電気化学的検出用のアレイ型チップ（基板）１１ａを用い、ハイブリダイズの存在に依存して生じる電流応答を検出するセンサーとして使用した。なお、パッド部１１２ａは、配線１１３ｂを介して電極１１１ａのハイブリダイズ信号を核酸検出装置（図示せず）に伝達するためのものである。つまり、核酸検出装置は、各電極１１１ａからの電流値に基づいて核酸を検出する。
【００３２】
１．核酸検出用デバイスの準備
１−１  電気化学的検出用アレイ型チップの作製
電気化学的検出用アレイ型チップ１１ａは、パイレックス（登録商標）ガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極パターンをガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により電極１１１ａを露出させた。
【００３３】
次に上記チップ素材上の各電極１１１ａ（図５中Ａ−Ｅ、ＮＣ（ネガティブコントロール））に、表１に示す６種類の核酸プローブ（配列Ａ〜Ｅ、ＮＣ）を固定化した。各核酸プローブを含む溶液を各電極１１１ａに滴下し、その後余分な核酸プローブを洗浄除去することで固定化した。
【表１】
2013198417.tif 000003
【００３４】
１−２  プライマー固定済みパッキン１２ａの作製、核酸検出用デバイスの組立
まずプライマーセット３１として使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Loop-mediated Isothermal amplification（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセット３１である。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表２に示す。プライマーＤＮＡを含んだ溶液を、それぞれ対応するプローブＤＮＡが固定された領域に対向するパッキン１２ａの底面にスポットし、４０℃で２分間乾燥させた。これにより、プライマー固定済みパッキン１２ａを得た。このパッキン１２ａをアレイ型チップ１１１ａに取り付け、図６に示した核酸検出用デバイス１を得た。図６（ａ）は、実施例１に係る核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図６（ｂ）は、図６（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。
【表２】
2013198417.tif 000004
【００３５】
２．核酸の検出
２−１  鋳型溶液の準備
表３のように、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄの３種類の鋳型とＬＡＭＰ増幅用試薬とを混合した鋳型溶液を準備した。
【表３】
2013198417.tif 000005
【００３６】
鋳型溶液には、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。鋳型溶液は、表４に示すように、プライマーＤＮＡ（セットＡ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ａと、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｂと、プライマーＤＮＡ（セットＤ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｄ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｄと、を含む。
【表４】
2013198417.tif 000006
【００３７】
２−２  鋳型溶液の添加
２−１にて準備した鋳型溶液を、核酸検出用デバイス１に５０μＬ添加した。
【００３８】
２−３  核酸の反応
以下に示す条件にて、核酸検出用デバイス１の流路領域を加熱或いは冷却し、各種反応を行った。図７（ａ）は、実施例１に係る核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図７（ｂ）は、図７（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。図７に示すように、特定のプライマーについて、増幅すべき標的配列を含む鋳型がＬＡＭＰ反応溶液に含まれている場合、そのプライマーが固定された場所で局所的にＬＡＭＰ反応が進み、生じた増幅産物３２はその近傍にあるプローブＤＮＡとハイブリダイズする。
【００３９】
核酸増幅反応：６４℃、６０分
ハイブリダイゼーション反応：５０℃、１０分
洗浄反応：３０℃、５分
電流検出用試薬（ヘキスト33258）反応：２５℃、３分
２−４  核酸の検出
各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した。
【００４０】
結果
得られた結果を図８に示す。図８は、実施例１に係る核酸増幅反応の結果を示すグラフである。鋳型を添加した遺伝子Ａ、Ｂ、Ｄに対応するプローブＡ、Ｂ、Ｄを固定化した電極Ａ、Ｂ、Ｄにおいて、ＮＣよりも大きな電流値が得られた。一方、鋳型が添加されていない遺伝子Ｃ、Ｅに対応する電極Ｃ、Ｅの電流値は、ＮＣと同程度となった。このことから、鋳型溶液中の鋳型を確実に検出できたことが明らかとなった。
【００４１】
（第２の実施形態）  
第２の実施形態について図面を参照し、詳細に説明する。なお、第１の実施形態で説明した構成と同一の構成については、同符号を付して説明を省略する。第２の実施形態に係る核酸検出用デバイス１の１例を図９を参照しながら説明する。図９（ａ）は、核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図９（ｂ）は、図９（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。核酸検出用デバイス１は、１つの反応場において複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセット３１を用いて同時に独立して増幅反応させるために用いられる。第２の実施形態は、溝部１２１の形状が第１の実施形態と異なる。
【００４２】
溝部１２１は、入口１２１ａから出口１２１ｂにかけて、積層方向に略同じ深さで形成されている。溝部１２１は、所定間隔でチャンバ１２１１が複数配置されている。チャンバ１２１１の幅は、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の幅よりも広い形状で形成されている。逆に言えば、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の幅は、チャンバ１２１１の幅よりも狭い。なお、チャンバ１２１１は、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域よりも幅が広ければよく、積層方向と直交する方向に円弧状に突出していても、角状に突出していても良い。したがって、チャンバ１２１１の断面積は、溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の断面積よりも大きい。なお、チャンバ１２１１の断面積及び溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の断面積は、被覆体１２における溝部１２１が設けられた面と直交する面に基づいた断面積である。溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域の断面積は、チャンバ１２１１の断面積の最大値の例えば９０％以下であることが好ましいが、特に限定されるものではない。なお、チャンバ１２１１は、プライマー固定化領域２１と対応する。プライマー固定化領域２１は、溝部１２１における積層方向の上面部近傍に形成されている。複数のプライマー固定化領域２１は、互いに独立して溝部１２１に配置される。
【００４３】
上述のように、チャンバ１２１１は溝部１２１におけるチャンバ１２１１以外の領域よりも幅が広く形成されているため、プライマー固定化領域２１に局所的に滴下されたプライマーセット３１を含む溶液は、チャンバ１２１１以外の領域に容易に動くことはない。したがって、隣接したプライマー固定化領域２１は、異なったプライマーセット３１を独立して保持可能となる。
【００４４】
次に、複数のプライマーセット３１がそれぞれ異なるプライマー固定化領域２１に固定された核酸検出用デバイス１への反応液の添加について説明する。図１０（ａ）は、核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。図１０は、核酸検出用デバイス１に反応液を添加した状態を示す。なお、図１０に示す核酸検出用デバイス１は、反応液が溝部１２１に添加された以外は図９と同様である。反応液は、第１の実施系形態と同様の成分であっても良い。
【００４５】
図１０に示すように、入口１２１ａから反応液を添加した後、プライマー固定化領域２１に固定されたプライマーセット３１は、遊離、拡散し始める。プライマーが遊離および拡散した領域は、模式的に図２中にプライマー遊離・拡散領域２２で示される。核酸検出用デバイス１は、チャンバ１２１１以外の領域における溝部１２１の幅（流路断面積）は、チャンバ１２１１の幅（流路断面積）よりも狭い（小さい）。そのため、核酸検出用デバイス１は、増幅反応中において、ある増幅領域におけるプライマー及び生成された増幅産物が、その他の増幅領域へ拡散することを抑制することができる。したがって、第２の実施形態に係る核酸検出用デバイス１は、複数種類のプライマーセット３１を用いた複数の鋳型配列についての増幅を、独立に（局所的に）、且つ同時に高効率で達成可能である。
【００４６】
なお、図９、１０に示す例では、プライマーセット３１がチャンバ１２１１の上面部近傍の流路壁面に固定された例について説明したが、これに限定されるものではない。図１１は、チャンバ１２１１（プライマー固定化領域２１）におけるプライマーセット３１の他の固定場所について示す核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。プライマーセット３１は、積層方向と直交するチャンバ１２１１の流路壁面に固定されても良い。つまり、プライマーセット３１は、チャンバ１２１１において、チャンバ１２１１以外の溝部１２１の領域よりも積層方向と直交する方向に突出した部分に設けられている。
【００４７】
図１１に示すようにプライマーセット３１がチャンバ１２１１に固定された場合、核酸検出用デバイス１は、反応液導入時において、チャンバ１２１１におけるプライマーセット３１が固定された部分（チャンバ１２１１以外の溝部１２１の領域よりも積層方向と直交する方向に突出した部分）近傍の流速を大幅に低減させることができる。そのため、核酸検出用デバイス１は、プライマーセット３１が隣接するその他のプライマー固定化領域２１に流出することを防止できる。したがって、第２の実施形態に係る核酸検出用デバイス１は、隣接したプライマー固定化領域２１のプライマーセット３１をそれぞれ独立させることができる。
【００４８】
なお、図９、１０、１１に示す例では、各チャンバ１２１１同士を接続する溝部１２１の部分は、最短距離で接続する直線形状で構成されているが、これに限定されるものではない。図１２は、各チャンバ１２１１同士を接続する溝部１２１の他の形状について示す核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図１２に示す例では、各チャンバ１２１１同士を接続する溝部１２１の部分は、直線形状よりも流路の距離が長くなるような形状（例えば曲線形状）で構成されている。したがって、図１２に示す溝部１２１は、図９、１０、１１に示す直線形状で各チャンバ１２１１同士を接続する溝部１２１の構成と比較して、各チャンバ１２１１同士の独立性を高めることができ、効率の良い核酸増幅を行うことができる。なお、ここでは、第２の実施形態に関して、各チャンバ１２１１同士を接続する溝部１２１の構成について説明したが、第１の実施形態についても、図１２に示すような構成を適用することで、上述の効果を得ることができる。
【００４９】
局所的に得られた増幅産物の具体的な検出手段は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段、例えば、蛍光標識を利用する蛍光強度の検出および／または測定、或いはインタカレータを利用する電流応答を検出および／または測定する方法を利用して行われてよく、限定されない。
【００５０】
次に、核酸検出用デバイス１によるハイブリダイズ信号の検出について説明する。図１３（ａ）は、核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図１３（ｂ）は、図１３（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。なお、図１３に示す核酸検出用デバイス１は、支持体１１がプローブ固定化領域１１１を備える以外は図９と同様である。プローブ固定化領域１１１は、特に限定するものではないが、例えば、チャンバ１２１１（プライマー固定化領域２１）に対向する位置に支持体１１に配置される。プローブ固定化領域１１１は、ハイブリダイズ信号を検出する電極が設けられる領域である。
【００５１】
プローブ固定化領域１１１は、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸が複数固定される。核酸検出用デバイス１は、プライマー固定化領域２１にて増幅反応を行った後、引き続きプローブ固定化領域１１１にてハイブリダイズ信号を得ることができる。
【００５２】
なお、支持体１１が特にインターカレータを利用する電流検出方式センサである場合、増幅反応時の加熱に伴うセンサ保護膜からの溶出物によって増幅阻害が起きる。しかしながら、第２の実施形態に係る核酸検出デバイス１は、増幅・検出領域（チャンバ１２１１）以外の溝部１２１を細く（幅を狭く）した構成なので、プローブ固定化領域１１１に設けられるセンサとの接液面積を減少させることができるため、増幅阻害物の溶出を効果的に抑制することができる。
【００５３】
（実施例２）
上述した第２の実施形態に係る核酸検出用デバイス１での核酸検出は、例えば以下のように実施される。検査の対象となる核酸を含む反応液を、ピペット等の器具にて核酸検出用デバイス１に形成される溝部１２１１に導入する。反応液が導入されると、鋳型核酸が存在する場合、対応した遊離拡散したプライマーセット３１により鋳型核酸が増幅され、増幅産物が生じる。
【００５４】
図１４（ａ）は、実施例２に係る核酸検出用デバイス１の１例の平面図である。図１４（ｂ）は、図４（ａ）における線Ｘ−Ｘに沿う核酸検出用デバイス１の断面図である。図１４（ｃ）は、実施例２に係る核酸増幅反応の結果を示すグラフである。図１４（ｃ）は、図１４（ａ）、（ｂ）に示す核酸検出用デバイス１の領域Ａ、Ｂ及びＤ（各チャンバ１２１１）において増幅反応が生じ、かつ増幅産物が対応するプローブ核酸の配列に相補的な目的配列を含む場合に得られる結果を示す。図１４（Ｃ）に示すように、領域Ａ、Ｂ、Ｄについて得られる電流値は、ＮＣのものよりも大きい。一方で、領域Ｃ、Ｅについて得られる検出信号は、ＮＣと同程度である。このことから、鋳型溶液中の鋳型を確実に検出できたことが明らかとなった。なお、検出信号は、特に隣接した領域Ａ、Ｂにおいても得られている。したがって、第２の実施形態に係る核酸検出用デバイス１は、隣接領域同士での干渉はなく、独立して核酸の増幅反応から検出まで行うことができた。以上のように、実施例２によれば、第２の実施形態に係る核酸検出用デバイス１を用いて、複数種類の標的核酸を、同時にかつ独立して増幅反応を行い、検出まで行うことができることが示された。
【００５５】
上述の本実施形態によれば、核酸検出用デバイスの増幅領域におけるプライマーセットの保持の困難性、プライマーセットの流出、プライマーセット及び増幅産物の動きによる増幅反応の阻害、保護膜からの溶出物による増幅反応の阻害のうち少なくとも１つの課題を解決することができる。したがって、複数種類の標的核酸を複数種類のプライマーセットを用いて同時に独立して増幅反応させる核酸検出用デバイス及びこれを用いた核酸検出装置は、効率的な増幅反応及び検出を同時にかつ独立して実現することが可能となる。
【００５６】
なお、第１の実施形態に係るチャンバ１２１１の形状と第２の実施形態に係るチャンバ１２１１の形状を組み合わせることも可能である。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００５８】
１…核酸検出用デバイス、１１…支持体、１２…被覆体、１２ａ…パッキン、２１…プライマー固定化領域、２２…プライマー遊離・拡散領域、３１…プライマーセット、３２…増幅産物、１１１ａ…電極、１１２ａ…パッド部、１１３ａ…配線、１２１…溝部、１２１ａ…入口、１２１ｂ…出口、１２１１…チャンバ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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