(57)【要約】【課題】連続的に生産しても乳酸の高い生産性を維持できる、糸状菌による乳酸の製造方法を提供すること。【解決手段】リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含む、乳酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含む、乳酸の製造方法。
【請求項２】
第１の発酵工程における乳酸の生産速度維持率が５０〜９５％となったときに、第１の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第２の発酵工程を有する、請求項１記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
第２の発酵工程後、第２の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第３の発酵工程を有する、請求項２記載の乳酸の製造方法。
【請求項４】
第１の発酵工程前に、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を調製する調製工程を有する、請求項１〜３の何れか１項に記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
糸状菌がリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属である、請求項１〜４の何れか１項に記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
炭素源が糖類である、請求項１〜５の何れか１項に記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
糖類がデンプンから得られる糖液、糖蜜、及びリグノセルロース系バイオマスから得られる糖液よりなる群から選ばれる１種以上である、請求項６に記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌類に含まれるリゾプス  オリザエ(Rhizopus oryzae)等の糸状菌は、菌糸塊（ペレット）となりやすい。このようなペレット状の糸状菌を乳酸の製造に用いると、発酵後の培地から生成物の分離が容易であり、かつ連続的な製造が可能となることが知られている（特許文献１）。例えば、リゾプス  オリザエ(Rhizopus oryzae)のペレットを用いて半回分式反応法により、乳酸を２５日間（２５サイクル）連続生産したとの報告がある（非特許文献１）。
【０００３】
また、糸状菌を、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンの濃度を、それぞれ５〜６０ｍＭ、５〜６０ｍＭ、２〜５０ｍＭ、０．５〜９ｍＭ、０．５〜１２ｍＭに制御した培地で培養することで、糸状菌の過度のパルプ化及び過度のペレット化が抑制され、パルプとペレットとの混合状態が維持され、その結果不飽和脂肪酸の収率が大幅に増大するとの報告もある（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−２５３８７１号公報
【特許文献２】国際公開第９８／２９５５８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 38巻 (2011) 565-571
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット又は固定化糸状菌を用いて発酵により乳酸を連続的に製造したところ、経時的にアルコールの生成が増加し乳酸の生産性が低下することが判明した。
したがって、本発明は、連続的に生産しても乳酸の高い生産性を維持できる、糸状菌による乳酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前述の乳酸の生産性低下の要因を究明すべく種々検討した結果、炭素源を含む液体培地中の特定成分の濃度を所定値未満に制御することで、糸状菌ペレット又は固定化糸状菌の菌糸形態が維持され、連続的に生産しても乳酸の高い生産性を維持できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含む、乳酸の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糸状菌ペレット又は固定化糸状菌の菌糸形態を維持しつつ、乳酸を連続的に生産しても高い生産性を維持できる、糸状菌による乳酸の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の乳酸の製造方法は、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体（以下、単に「菌体」とも称する）を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含むものである。
【００１１】
本発明に用いられる糸状菌としては、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属する微生物が挙げられ、中でも、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属が好ましい。具体的には、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、ムコール・マンドシュリクス（Ｍｕｃｏｒ ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｓ）が好ましく、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）がより好ましい。
【００１２】
本発明においては、糸状菌を糸状菌ペレット又は固定化糸状菌の形態で単独で用いても、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌の混合物として用いてもよい。ここで、本明細書において「ペレット」とは、液体培養により菌糸が自発的に形成した数百μｍ〜数ｍｍの大きさの菌糸塊をいう。また、「固定化糸状菌」とは、担体に保持又は包埋された糸状菌をいう。
糸状菌ペレット及び固定化糸状菌は、商業的に入手したものを使用しても、次の工程により調製したものを使用してもよい。
【００１３】
（糸状菌ペレットの調製工程）
糸状菌ペレットは、培養により調製することができる。
培地としては、糸状菌を生育可能な液体培地であれば、合成培地、天然培地及び天然成分を添加した半合成培地のいずれでもよい。培地には、炭素源、窒素源、無機塩等が含まれるのが一般的であるが、各成分組成は適宜選択可能である。また、培地中のリン酸イオン濃度は、糸状菌の培養に通常使用される培地のリン酸イオン濃度を適宜採用することが可能であり、０．００７質量％未満であることを要しない。
培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３０℃である。また、培地の初発ｐＨ（２５℃）は、好ましくは３〜７、より好ましくは４〜６である。
培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、その菌糸から菌体を形成させペレット化させる。この培養は、通常、好気的条件で行われる。通気条件は、好ましくは０．２５〜４ｖｖｍ、より好ましくは０．５〜２ｖｖｍである。培養期間は、糸状菌の胞子を液体培地に植菌後、好ましくは３０分〜７日間、より好ましくは０．５〜６日間、更に好ましくは１〜５日間である。また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、流動床培養槽等が挙げられる。
培養後、糸状菌ペレットは、培養液と共に培養槽から抜き出して、ろ別、遠心分離等の簡便な操作により分離回収し次工程に使用することができるが、培養槽に糸状菌ペレットを残し、同一培養槽で次工程を行うことも可能である。
また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
【００１４】
（固定化糸状菌の調製工程）
固定化糸状菌は、培養により調製することができる。
培養方法は、公知の方法を採用することができる。例えば、糸状菌の胞子を糸状菌固定化用担体の存在する液体培地に植菌後、胞子を発芽させて菌糸とし、担体内へ捕捉された菌糸から固定化糸状菌を調製する。糸状菌固定化用担体の材質としては、ウレタン系重合体、オレフィン系重合体、ジエン系重合体、縮合系重合体、シリコーン系重合体、フッ素系重合体等が挙げられる。糸状菌固定化用担体の形状としては、平板状、多層板状、波板状、四面体状、球状、紐状、網状、円柱状、格子状、円筒状等のいずれでもよい。糸状菌固定化担体の形態としては、発泡体、薄片体、シート体、中空体、樹脂成型体等が好ましく、発泡体がより好ましい。また、糸状菌固定化用担体のサイズとしては、０．１ｍｍ〜１０ｍｍが好ましく、０．５〜５ｍｍがより好ましく、０．７〜２ｍｍが更に好ましい。
なお、糸状菌の固定化に使用する培地及び培養槽としては前述の糸状菌ペレットと同様のものを使用することが可能であり、また培養条件についても前述の糸状菌ペレットと同様の条件を採用することができる。更に、培養後、固定化糸状菌は、糸状菌ペレットと同様の操作により分離回収し次工程に使用することができるが、培養槽に固定化糸状菌を残し、同一培養槽で次工程を行うことも可能である。
また、本工程は２以上の工程に更に分けて行うこともできる。
【００１５】
＜第１の発酵工程＞
本工程は、菌体を用いて炭素源を発酵させて乳酸を生産する工程である。乳酸は、Ｌ体、Ｒ体及びラセミ体のいずれでもよい。
【００１６】
本工程で使用する培地は、炭素源を含み、リン酸イオン濃度が所定値未満に制御されている液体培地であれば特に限定されず、窒素源、リン酸塩以外の無機塩、ビタミン等が含まれていてもよい。また、使用する炭素源に培養に適切な濃度の上記栄養源が含まれている場合には、炭素源のみを用いることも可能である。
【００１７】
本工程で使用する培地中のリン酸イオン濃度は、０．００７質量％未満であるが、糸状菌ペレットの菌糸形態を維持しつつ、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下である。他方、培地中のリン酸イオン濃度の下限値は特に限定されず、０質量％、すなわちリン酸イオンを含まなくてもよい。なお、「リン酸イオン濃度が０質量％」とは、酵素比色法により培地中のリン酸イオン濃度を測定したときに検出限界以下である場合も包含する概念である。また、リン酸イオン濃度の範囲としては、０〜０．００７質量％未満、好ましくは０〜０．００６質量％、より好ましくは０〜０．００５質量％、更に好ましくは０〜０．００４質量％、更に好ましくは０〜０．００３質量％である。このような範囲が好ましい理由は必ずしも明らかではないが、本発明者らは、糸状菌の過剰な増殖が抑制されて菌糸形態が維持されるものと推測する。なお、本工程で使用する培地中にリン酸イオンが含まれる場合には、リン酸イオンをリン酸塩の形態で含有することができる。リン酸塩の具体例としては、後述の第２の発酵工程において例示したものと同様のものを挙げることができる。
【００１８】
また、本工程で使用する培地には、炭素源が含まれるが、炭素源としては、糖類が挙げられる。具体的には、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース等を挙げることができる。これらは１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。中でも、乳酸の高い生産性の維持の観点から、グルコース、フルクトースが好ましい。
本工程においては、炭素源として、このような糖類を含有する糖液を使用することもできる。具体的には、でんぷんから得られる糖液、糖蜜（廃糖蜜）、リグノセルロース系バイオマスから得られる糖液が挙げられる。これらは１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。ここで、本明細書において「リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニンを主成分とするバイオマスを意味する。リグノセルロース系バイオマスとしては、具体例には、イナワラ、籾殻、麦わら、バガス、ヤシ殻、コーンコブ、雑草、木材、並びにそれらから製造されたパルプ及び紙等が挙げられる。また、でんぷんとしては、例えば、トウモロコシ等の雑穀類、大豆等の豆類の抽出物が挙げられ、糖蜜としては、例えば、サトウキビ、テンサイ等に由来するものが挙げられる。
【００１９】
培地中の初発の炭素濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは１質量％以上、より好ましくは３質量％以上、更に好ましくは５質量％以上であって、そして、好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下である。また、培地中の初発の炭素濃度の範囲としては、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは３〜３０質量％、更に好ましくは５〜２０質量％である。
【００２０】
本工程で使用する培地には、窒素源を含有することができる。窒素源としては、具体的には、尿素、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等の含窒素化合物が挙げられる。培地中の初発の窒素濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．０１〜１質量％、より好ましくは０．０２〜０．８質量％、更に好ましくは０．０４〜０．６質量％である。
本工程で使用する培地には、硫酸塩を含有することができる。硫酸塩としては、具体的には、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられる。培地中の初発の硫酸イオン濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００５〜０．０８質量％、更に好ましくは０．０１〜０．０４質量％である。
本工程で使用する培地には、マグネシウム塩を含有することができる。マグネシウム塩としては、具体的には、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。培地中の初発のマグネシウムイオン濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０〜０．５質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％、更に好ましくは０．００２〜０．１質量％である。
本工程で使用する培地には、亜鉛塩を含有することができる。亜鉛塩としては、具体的には、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、塩化亜鉛等が挙げられる。培地中の初発の亜鉛イオン濃度は、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０〜０．１質量％、より好ましくは０．００００１〜０．０１質量％、更に好ましくは０．００００５〜０．００５質量％である。
【００２１】
培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。また、培地のｐＨ（２５℃）は、菌体の生育や、乳酸の生産性の観点から、好ましくは２〜７、より好ましくは４〜６である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
培養方法は、嫌気的条件及び好気的条件のいずれかを適宜選択することができる。好気的条件における通気条件は、好ましくは０．２５〜４ｖｖｍ、より好ましくは０．５〜２ｖｖｍである。また、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができるが、乳酸の生産速度の向上の観点から、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床培養槽が好ましく使用される。
【００２２】
本工程は、例えば、菌体を上記の条件の培地に播種して行うことができる。また、調製工程後の菌体を培養槽に残し、これに上記の条件の培地を加えて行うこともできる。
本工程は、回分式、半回分式及び連続式のいずれで行ってもよいが、生産性向上の観点から、連続式が好ましい。
例えば、半回分式で行う場合、菌体と発酵液とを分離し、分離回収した菌体に培地を加えて更に発酵を行うことができる。また、連続式で行う場合、一定量の培地を発酵槽内に一定速度で供給するとともに、同量の発酵液を抜き取るという方法を採用することができる。その場合、発酵槽内の液面高さを一定に保つように、液面高さを液面センサー等により制御してもよい。また、発酵時に炭素源のみを供給することも可能であり、炭素源の供給は、流速で制御しても、グルコース濃度で制御してもよい。
【００２３】
＜第２の発酵工程＞
本発明においては、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から、第１の発酵工程後、第２の発酵工程を行うことができる。すなわち、第２の発酵工程は、第１の発酵工程における乳酸の生産速度維持率が５０〜９５％となったときに第１の発酵工程を終了し、第１の発酵工程で使用した菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う工程である。
【００２４】
本工程を行うことで、長期発酵生産によって低下した乳酸の生産性を回復することが可能である。本工程による乳酸生産性回復の機構は必ずしも明らかではないが、リンの欠乏によって活性の低下した菌糸を適度なリン酸の供給によって再活性しているものと考えられる。
【００２５】
本工程は、第１の発酵工程における乳酸の生産速度維持率が、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上であって、好ましくは９５％以下、より好ましくは９０％以下、更に好ましくは８５％以下となったときに行うことが、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から好ましい。乳酸の生産速度維持率の範囲としては、通常５０〜９５％であるが、好ましくは５０〜９０％、更に好ましくは６０〜９０％、更に好ましくは７０〜９０％、更に好ましくは７０〜８５％である。
【００２６】
ここで、「乳酸の生産速度維持率」とは、下記式（ｉ）により求められる値をいう。
Ｔ［％］＝Ｖｔ［ｇ／Ｌ／ｈ］／Ｖｉ［ｇ／Ｌ／ｈ］×１００      （ｉ）
【００２７】
〔式（ｉ）中、Ｔは乳酸の生産速度維持率［％］を示し、Ｖｔは試料の乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］を示し、Ｖｉは乳酸生産速度の管理値［ｇ／Ｌ／ｈ］を示す。〕
【００２８】
なお、式（ｉ）において、乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］とは、試料中の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を発酵時間（ｈ）で除した値である。また、乳酸生産速度の管理値（Ｖｉ）とは、第１の発酵工程に係る発酵液中の乳酸濃度と発酵時間との関係に基づいて定めた値である。乳酸生産速度の管理値は、実稼動に先立って予め求めておいた発酵液中の乳酸濃度と発酵時間との関係に基づいて決定してもよいし、実稼動中に取得した発酵液中の乳酸濃度と発酵時間との関係に基づいて決定してよい。この場合、液体培地中の炭素源から産生される乳酸濃度の理論値（ｇ／Ｌ）を参酌することができる。
【００２９】
乳酸生産速度の管理値（Ｖｉ）は、製造スケール等により一様ではないが、例えば、０．１ｇ／Ｌ／ｈ以上が好ましく、０．３ｇ／Ｌ／ｈ以上がより好ましく、０．５ｇ／Ｌ／ｈ以上が更に好ましく、そして４０ｇ／Ｌ／ｈ以下が好ましく、３０ｇ／Ｌ／ｈ以下がより好ましく、２０ｇ／Ｌ／ｈ以下が更に好ましい。乳酸生産速度の管理値（Ｖｉ）の範囲としては、好ましくは０．１〜４０ｇ／Ｌ／ｈ、より好ましくは０．３〜３０ｇ／Ｌ／ｈ、更に好ましくは０．５〜２０ｇ／Ｌ／ｈである。
【００３０】
本工程は、第１の発酵工程終了後、菌体と発酵液とを分離し、回収した菌体を、新たに調製した本工程に係る液体培地に播種して行ってもよいし、第１の発酵工程終了後、第１の工程で使用した液体培地にリン酸イオンを添加し所定のリン酸イオン濃度に調整して行ってもよい。
【００３１】
本工程で使用する培地は、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上０．１質量％以下である点を除いては、第１の発酵工程で使用する液体培地と同様であり、炭素源を含めば、窒素源、リン酸塩以外の無機塩、ビタミン等が含まれていてもよい。また、使用する炭素源に培養に適切な濃度の上記栄養源が含まれている場合には、炭素源のみを用いることも可能である。
本工程で使用する培地中のリン酸イオン濃度は、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から、好ましくは０．００７質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０３質量％以上である。また、本工程で使用する培地中のリン酸イオン濃度は、菌体の形態の維持の観点から、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０９質量％以下、更に好ましくは０．０８質量％以下である。培地中のリン酸イオン濃度の範囲としては、好ましくは０．００７〜０．１質量％、より好ましくは０．０１〜０．０９質量％、更に好ましくは０．０３〜０．０８質量％である。
本工程で使用する培地に含まれるリン酸イオンは、培地中にリン酸塩の形態で含有することができる。リン酸塩としては、具体的には、リン酸一水素二カリウム、リン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸二水素一ナトリウム等が挙げられる。
【００３２】
本工程の培養条件としては、培養温度が、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。また、培地のｐＨ（２５℃）は、菌体の生育や、乳酸の生産性の観点から、好ましくは２〜７、より好ましくは４〜６である。ｐＨ制御は、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、アンモニア等の塩基、硫酸、塩酸等の酸を用いて行うことができる。
培養方法は、嫌気的条件及び好気的条件のいずれかの培養方法を適宜選択することができる。好気的条件における通気条件は、好ましくは０．２５〜４ｖｖｍ、より好ましくは０．５〜２ｖｖｍである。
本工程では、培地の温度が２０℃以上４０℃以下、かつｐＨ（２５℃）が２以上７以下の条件を満たした時を本工程の開始時間とする。なお、好気的条件で行う場合には、前述の条件に加え、更に通気条件が０．２５ｖｖｍ以上４ｖｖｍ以下の条件を満たした時を本工程の開始時間とする。
【００３３】
本工程は、菌糸の活性化、乳酸の高い生産性維持の観点から、本工程開始後、好ましくは１時間以上、より好ましくは１２時間以上、更に好ましくは２４時間以上継続する。また、本工程は、固定化糸状菌の形態維持の観点から、本工程開始後、好ましくは２４０時間以内、より好ましくは１２０時間以内、更に好ましくは６０時間以内、更に好ましくは４８時間以内に終了する。本工程の発酵時間としては、好ましくは１〜２４０時間、より好ましくは１２〜１２０時間、更に好ましくは２４〜６０時間、更に好ましくは２４〜４８時間である。
【００３４】
＜第３の発酵工程＞
本発明においては、第２の発酵工程を行った場合には、乳酸のより高い生産性維持の観点から、第２の発酵工程後、第３の発酵工程を行うことが好ましい。すなわち、第３の発酵工程は、第２の発酵工程で使用した菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う工程である。
第２の発酵工程で使用した菌体は、第２の発酵工程終了後、菌体と発酵液とを分離して回収することが可能であり、また回収した菌体は、新たに調製した本工程に係る液体培地に播種すればよい。
本工程で使用する液体培地は、第１の発酵工程で使用する液体培地と同様であり、具体的な構成は前述の第１の発酵工程において説明したとおりである。
【００３５】
第３の発酵工程においては、乳酸の生産性が低下してきた場合に、再び第２の発酵工程を実施することで、乳酸の生産性を再活性化することが可能である。
【００３６】
＜菌体と発酵液の分離工程＞
発酵工程後の菌体と発酵液の分離は、発酵槽内でフィルタにより固液分離してもよいし、一度槽外に抜き出して液体サイクロンやろ過等の固液分離に供した後に菌体のみを発酵槽内に戻してもよい。
【００３７】
＜分離工程後の発酵液から乳酸を回収する工程＞
分離工程により得られた発酵液を濃縮した後、晶析法、イオン交換法、溶剤抽出法、乳酸をアルカリ土類金属塩として析出させた後析出物を酸分解する方法、あるいは乳酸エステルとして蒸留精製後加水分解する方法等により、発酵液から乳酸を分離し回収することができる。
【００３８】
上述した実施形態に関し、本発明は更に以下の乳酸の製造方法を開示する。
【００３９】
＜１＞
リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程を含む、乳酸の製造方法。
【００４０】
＜２＞
前記第１の発酵工程において、乳酸の生産速度維持率が好ましくは５０〜９５％となったときに、第１の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第２の発酵工程を有する、前記＜１＞記載の乳酸の製造方法。
＜３＞
前記乳酸の生産速度維持率が、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上であって、好ましくは９０％以下、更に好ましくは８５％以下である、前記＜２＞記載の乳酸の製造方法。
＜４＞
前記乳酸の生産速度維持率が、好ましくは５０〜９０％、更に好ましくは６０〜９０％、更に好ましくは７０〜９０％、更に好ましくは７０〜８５％である、前記＜２＞又は＜３＞記載の乳酸の製造方法。
＜５＞
前記乳酸の生産速度維持率が、好ましくは下記式（ｉ）により求められる値である、前記＜２＞〜＜４＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
Ｔ［％］＝Ｖｔ［ｇ／Ｌ／ｈ］／Ｖｉ［ｇ／Ｌ／ｈ］×１００      （ｉ）
〔式（ｉ）中、Ｔは乳酸の生産速度維持率［％］を示し、Ｖｔは試料の乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］を示し、Ｖｉは乳酸生産速度の管理値［ｇ／Ｌ／ｈ］を示す。〕
【００４１】
＜６＞
前記乳酸生産速度の管理値が、好ましくは０．１ｇ／Ｌ／ｈ以上、より好ましくは０．３ｇ／Ｌ／ｈ以上、更に好ましくは０．５ｇ／Ｌ／ｈ以上であって、好ましくは４０ｇ／Ｌ／ｈ以下、より好ましくは３０ｇ／Ｌ／ｈ以下、更に好ましくは２０ｇ／Ｌ／ｈ以下である、前記＜５＞記載の乳酸の製造方法。
＜７＞
前記乳酸生産速度の管理値が、好ましくは０．１〜４０ｇ／Ｌ／ｈ、より好ましくは０．３〜３０ｇ／Ｌ／ｈ、更に好ましくは０．５〜２０ｇ／Ｌ／ｈである、前記＜５＞又は＜６＞記載の乳酸の製造方法。
＜８＞
前記第２の発酵工程を、好ましくは１時間以上、より好ましくは１２時間以上、更に好ましくは２４時間以上継続し、好ましくは２４０時間以内、より好ましくは１２０時間以内、更に好ましくは６０時間以内、更に好ましくは４８時間以内に終了する、前記＜２＞〜＜７＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜９＞
前記第２の発酵工程を、好ましくは１〜２４０時間、より好ましくは１２〜１２０時間、更に好ましくは２４〜６０時間、更に好ましくは２４〜４８時間行う、前記＜２＞〜＜８＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１０＞
前記第２の発酵工程後、好ましくは第２の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第３の発酵工程を有する、前記＜２＞〜＜９＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
【００４２】
＜１１＞
前記第１の発酵工程前に、好ましくは糸状菌のペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を調製する調製工程を有する、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１２＞
前記糸状菌が好ましくはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１３＞
前記糸状菌が好ましくはリゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ・ｏｒｙｚａｅ）である、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１４＞
前記炭素源が好ましくは糖類である、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１５＞
前記糖類が好ましくはデンプンから得られる糖液、糖蜜、及びリグノセルロース系バイオマスから得られる糖液よりなる群から選ばれる１種以上である、前記＜１４＞に記載の乳酸の製造方法。
【００４３】
＜１６＞
前記第１の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下、更に好ましくは０質量％である、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１７＞
前記第１の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０〜０．００７質量％未満、より好ましくは０〜０．００６質量％、更に好ましくは０〜０．００５質量％、更に好ましくは０〜０．００４質量％、更に好ましくは０〜０．００３質量％である、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１８＞
前記第１の発酵工程で使用する液体培地中にリン酸イオンを含まないか（リン酸イオン濃度が０質量％）、あるいは液体培地中にリン酸イオンを含む場合には、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下である、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜１９＞
前記第２の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０９質量％以下、更に好ましくは０．０８質量％以下であって、好ましくは０．００７質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、更に好ましくは０．０３質量％以上である、前記＜２＞〜＜１８＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２０＞
前記第２の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．００７〜０．１質量％、より好ましくは０．０１〜０．０９質量％、更に好ましくは０．０３〜０．０８質量％である、前記＜２＞〜＜１９＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
【００４４】
＜２１＞
前記第３の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下、更に好ましくは０質量％である、前記＜１０＞〜＜２０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２２＞
前記第３の発酵工程で使用する液体培地中のリン酸イオン濃度が、好ましくは０〜０．００７質量％未満、より好ましくは０〜０．００６質量％、更に好ましくは０〜０．００５質量％、更に好ましくは０〜０．００４質量％、更に好ましくは０〜０．００３質量％である、前記＜１０＞〜＜２０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２３＞
前記第３の発酵工程で使用する液体培地中にリン酸イオンを含まないか（リン酸イオン濃度が０質量％）、あるいは液体培地中にリン酸イオンを含む場合には、好ましくは０．００６質量％以下、より好ましくは０．００５質量％以下、更に好ましくは０．００４質量％以下、更に好ましくは０．００３質量％以下である、前記＜１０＞〜＜２０＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２４＞
前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の炭素濃度が、好ましくは１質量％以上、より好ましくは３質量％以上、更に好ましくは５質量％以上であって、好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、更に好ましくは２０質量％以下で行う、前記＜１＞〜＜２３＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２５＞
前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の炭素濃度が、好ましくは１〜４０質量％、より好ましくは３〜３０質量％、更に好ましくは５〜２０質量％で行う、前記＜１＞〜＜２４＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２６＞
前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の窒素濃度が、好ましくは０．０１〜１質量％、より好ましくは０．０２〜０．８質量％、更に好ましくは０．０４〜０．６質量％で行う、前記＜１＞〜＜２５＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２７＞
前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の硫酸イオン濃度が、好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００５〜０．０８質量％、更に好ましくは０．０１〜０．０４質量％で行う、前記＜１＞〜＜２６＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜２８＞
前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発のマグネシウムイオン濃度が、好ましくは０〜０．５質量％、より好ましくは０．００１〜０．２質量％、更に好ましくは０．００２〜０．１質量％で行う、前記＜１＞〜＜２７＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
【００４５】
＜２９＞
前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、液体培地中の初発の亜鉛イオン濃度が、好ましくは０〜０．１質量％、より好ましくは０．００００１〜０．０１質量％、更に好ましくは０．００００５〜０．００５質量％で行う、前記＜１＞〜＜２８＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜３０＞
前記第１、第２及び第３の発酵工程のうちの１以上の工程を、好ましくは一定量の液体培地を発酵槽内に一定速度で供給するとともに、同量の発酵液を発酵槽外に抜き取る連続式にて行う、前記＜１＞〜＜２９＞のいずれか一に記載の乳酸の製造方法。
＜３１＞
リン酸イオン濃度が０．００７質量％未満に制御され、かつ炭素源を含む液体培地にて、糸状菌ペレット及び固定化糸状菌から選ばれる１種以上の菌体を用いて発酵により乳酸を得る第１の発酵工程において、乳酸の生産速度維持率が好ましくは５０〜９５％となったときに、前記第１の発酵工程で使用した前記菌体を用いて、リン酸イオン濃度が０．００７質量％以上１質量％以下であり、かつ炭素源を含む液体培地にて発酵を行う第２の発酵工程を含む、乳酸産生に使用する菌体の再活性化方法。
【実施例】
【００４６】
＜分析方法＞
［高速液体クロマトグラフ（HPLC）による各種成分の測定］
発酵液を０．００８５規定硫酸水溶液で適宜希釈し、孔径が０．２２μｍのセルロースアセテート製メンブレンフィルタ（ADVANTEC社製）を用いて濾過を行い、HPLC分析用サンプルとした。HPLCの分析条件は、次の通りである。
・カラム    ：ICSep ICE-ION-300
・溶離液    ：０．００８５規定 硫酸、０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・検出法    ：RI（HITACHI、L-2490）
・カラム温度：４０℃
・注入液量  ：２０μＬ
・保持時間  ：４０ｍｉｎ
【００４７】
この分析系における各成分の保持時間は、次の通りである。
・グルコース：１６ｍｉｎ
・乳酸      ：２３ｍｉｎ
・エタノール：３４ｍｉｎ
【００４８】
〔培養例１〕
＜糸状菌ペレットの調製＞
〔胞子懸濁液の調製〕
菌株は独立行政法人  製品評価技術基盤機構（NITE）より入手した糸状菌R.oryzae NBRC5384を使用した。糸状菌は、試験管内に形成させた斜面状寒天培地（Difco Potato Dextrose Agar、Becton, Dickinson and Company）上に菌体を画線／塗布し、２５℃にて静置培養し、定期的に継代を行った。菌体使用時には菌体増殖した試験管に１０ｍＬの滅菌蒸留水を添加後、タッチミキサにて４分間撹拌することで胞子を回収し、更に無菌の蒸留水を添加して希釈することで１×１０6 ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬに調整したものを胞子懸濁液とした。
【００４９】
〔糸状菌のペレット化〕
糸状菌ペレットの調製は以下の２段階の培養にて行った。
１段目の培養は、６０ｍＬのＰＤＢ培地（Difco Potato Dextrose Broth、Becton,Dickinsonand Company）を仕込んだ２００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを滅菌し、前述の方法で調製した胞子懸濁液を１×１０4個−胞子／ｍＬとなるように植菌して２７℃，１００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて３日間行った。
２段目の培養は、ペレット形成培地（グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、硫酸アンモニウム ０．１質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％）２Ｌを仕込んだ２Ｌ容エアリフト型発酵槽を滅菌し、１段目の培養液１２０ｍＬを植菌して２７℃、通気速度１ｖｖｍで空気を供給した条件にて１．５日間行った。ｐＨは３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（２５℃）６．０を維持した。
【００５０】
〔ペレットの回収〕
上記の各段で得られた糸状菌ペレット培養液を、ガーゼにてろ液のドリップが落ち着くまで１分ろ過し、ウエット状態の糸状菌ペレットを得た。２段目で得られたペレットは速やかに発酵性の評価に供した。
【００５１】
〔培養例２〕
〔糸状菌の担体固定化〕
固定化糸状菌の調製は以下の２段階の培養にて行った。
１段目の培養は、３０ｍＬの固定化培地（グルコース（和光純薬工業社製）５質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、尿素 ０．２質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％）、及び０．８ｍｍ角ポリウレタン発泡体(日清紡社製、APG)を５個仕込んだ１００ｍＬ三角フラスコを滅菌し、前述の糸状菌ペレットと同様の方法で調製した胞子懸濁液を２×１０4個−胞子／ｍＬとなるように植菌して３５℃，２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて１日間行った。
２段目の培養は、菌体増殖培地（グルコース（和光純薬工業社製）１０質量％、硫酸マグネシウム七水和物 ０．０２５質量％、硫酸亜鉛七水和物 ０．００９質量％、尿素 ０．１質量％、リン酸二水素一カリウム ０．０６質量％、炭酸カルシウム５質量％）１００ｍＬを仕込んだ５００ｍＬ容三角フラスコを滅菌し、１段目で担体に固定化した糸状菌を植菌して３５℃，２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて２日間行った。
【００５２】
〔固定化糸状菌の回収〕
上記の各段で得られた固定化糸状菌培養液を、ガーゼにてろ液のドリップが落ち着くまで１分ろ過し、ウエット状態の固定化糸状菌を得た。２段目で得られた固定化糸状菌は速やかに発酵性の評価に供した。
【００５３】
〔発酵例１〕
＜発酵性の評価＞
〔培養方法１〕
乳酸発酵培養液２Ｌを滅菌済の２Ｌ容エアリフト型発酵槽に添加し、続いて培養例１で調製した糸状菌ペレット全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、３５℃、通気速度１ｖｖｍで空気を供給した条件にて培養を行った。その後経時的にサンプリングを行いながら、１４日間培養を行った。ｐＨは３Ｎ水酸化ナトリウム溶液を適宜添加して、ｐＨ（２５℃）６．０を維持した。発酵時には発酵槽内に２Ｌ／日の速度で乳酸発酵培養液を連続的に供給するとともに、同量の発酵液を発酵槽外に抜き取った。なお、培養液の供給は、液面センサーにより回収液用のポンプを制御することで発酵液面を一定に保ちながら行った。培養後、発酵液内に設置した焼結フィルタにより糸状菌ペレットを槽内に残したまま、発酵液のみを回収した。
【００５４】
〔発酵例２〕
＜発酵性の評価＞
〔培養方法２〕
乳酸発酵培養液１００ｍＬを滅菌済の５００ｍＬ容三角フラスコに添加し、続いて培養例２で調製した固定化糸状菌全量（ウエット状態）を添加した。その直後に培養０時間目のサンプリングを行った後、３５℃、２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて２日間行った。発酵終了時にサンプリングを行った。その後、固定化糸状菌の回収を行い、再度滅菌した乳酸発酵培養液１００ｍＬを添加した５００ｍＬ容三角フラスコに回収した固定化糸状菌を添加し、３５℃、２００ｒ／ｍ（PRECI社、PRXYg-98R）の培養条件にて２日間行い、固定化糸状菌を回収した。その後、回収した固定化糸状菌を用いて同様の操作によるバッチ培養を繰り返し行った。
【００５５】
〔評価方法〕
発酵液の分析値から、（１）糖から乳酸への変換率（Ｐ［％］、（２）糖からエタノールへの変換率（Ｑ［％］）、（３）前記エタノール変換で発生する二酸化炭素への変換率（Ｒ［％］）の３項目を評価軸とした。各項目の算出式を表１及び式（１）〜（３）に示す。なお、式中、供給糖液のグルコース濃度をＧ0と定義した。また、式（４）に示すように中和剤による発酵液の希釈率をＳ[−]と定義した。フラスコを用いた発酵では培地中に予め添加した炭酸カルシウムで中和するため、希釈率Ｓを１とした。
【００５６】
【表１】
2013240321.tif 000002
【００５７】
糖から乳酸への変換率
Ｐ［％］＝Ｌ／（Ｇ0×Ｓ−Ｇ）×１００                    （１）
糖からエタノールへの変換率
Ｑ［％］＝Ｅ／（Ｇ0×Ｓ−Ｇ）×１００                    （２）
前記エタノール変換で発生する二酸化炭素への変換率
Ｒ［％］＝Ｑ×（ＣＯ2分子量／ＥｔＯＨ分子量）×１００    （３）
中和剤による発酵液の希釈率
Ｓ［−］＝１／（１＋（Ｌ／９０／３））                   （４）
【００５８】
乳酸の生産速度維持率
Ｔ［％］＝試料の乳酸生産速度［ｇ／Ｌ／ｈ］／乳酸生産速度の管理値［ｇ／Ｌ／ｈ］×１００
【００５９】
乳酸製造時のリン酸濃度低減の効果
〔実施例１〕
＜糸状菌ペレットの調製＞
上記培養例１により、糸状菌R.oryzae NBRC5384を用いて糸状菌ペレットを調製した。
＜発酵性の評価＞
グルコース、尿素、硫酸マグネシウム七水和物及び硫酸亜鉛七水和物を表２に示す濃度で溶解した乳酸発酵培養液を用いて、発酵例１に記載の発酵性の評価を行った。なお、グルコース源として、グルコース（和光純薬工業社製）を用いた。評価結果を表４に示す。
【００６０】
〔実施例２〕
１段目の培養でＰＤＢ培地に０．５質量％のソルビタンモノラウレート（商品名レオドールＳＰ−Ｌ１０、花王製）を添加した以外は実施例１と同一の条件で糸状菌ペレットの調製を行った。リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．００１４質量％（０．１５ｍＭ）にした、表２に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例１と同一の条件で発酵性の評価を行った。評価結果を表４に示す。
【００６１】
〔実施例３〕
リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．００３５質量％（０．３７ｍＭ）にした、表２に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例２と同一の条件で糸状菌ペレットの調製及び発酵性の評価を行った。評価結果を表４に示す。
【００６２】
〔比較例１〕
リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．００７０質量％（０．７３ｍＭ）にした、表３に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例１と同一の条件で糸状菌ペレットの調製及び発酵性の評価を行った。評価結果を表５に示す。
【００６３】
〔比較例２〕
リン酸二水素一カリウムを添加し、乳酸発酵培養液のリン酸イオン濃度を０．０４２質量％（４．４ｍＭ）にした、表３に示す乳酸発酵培養液を用いた以外は実施例１と同一の条件で糸状菌ペレットの調製及び発酵性の評価を行った。評価結果を表５に示す。
【００６４】
【表２】
2013240321.tif 000003
【００６５】
【表３】
2013240321.tif 000004
【００６６】
【表４】
2013240321.tif 000005
【００６７】
【表５】
2013240321.tif 000006
【００６８】
表４及び５から、培地のリン酸イオン濃度が本発明の範囲内であるとエタノールの生成が確認されなかったのに対し、リン酸イオン濃度が本発明の範囲外であるとエタノールが生成し、消費されたグルコースに対する乳酸変換率が大きく低下することが分かった。
【００６９】
〔実施例４〕
＜固定化糸状菌の調製＞
上記培養例２により、糸状菌R.oryzae NBRC5384を用いて固定化糸状菌を調製した。
＜発酵性の評価＞
グルコース、尿素、硫酸マグネシウム七水和物及び硫酸亜鉛七水和物を実施例１（表２）に示す濃度で溶解した乳酸発酵培養液を用いて、発酵例２に記載の発酵性の評価を５０日間（２５サイクル）行った。なお、グルコース源として、グルコース（和光純薬工業社製）を用いた。評価結果を表６に示す。
【００７０】
〔実施例５〕
＜固定化糸状菌の調製＞
上記培養例２により、糸状菌R.oryzae NBRC5384を用いて固定化糸状菌を調製した。
＜発酵性の評価＞
グルコース、尿素、硫酸マグネシウム七水和物及び硫酸亜鉛七水和物を実施例１（表２）に示す濃度で溶解した乳酸発酵培養液を用いて、発酵例２に記載の発酵性の評価を３６日間（１８サイクル）行い、固定化糸状菌を回収した。なお、乳酸生産速度の管理値は、１．６〔ｇ／Ｌ／ｈ〕に設定し、３６日後の乳酸生産速度は、１．３〔ｇ／Ｌ／ｈ〕であった。その後、回収した固定化糸状菌を用い、培養液を比較例２（表３）に示す乳酸発酵培養液に替えて２日間培養を行い、固定化糸状菌を回収した。次いで、回収した固定化糸状菌を用い、培養液を再び実施例１（表２）に示す乳酸発酵培養液に替えて発酵性の評価を１２日間（６サイクル）行った。なお、グルコース源として、グルコース（和光純薬工業社製）を用いた。評価結果を表６に示す。
【００７１】
【表６】
2013240321.tif 000007
【００７２】
表６から、固定化糸状菌を使用した場合においても、糸状菌ペレットと同様に乳酸変換率を高水準で維持したまま乳酸を生産できることが確認された。また、第１の発酵工程に係る乳酸生産速度が５０〜９５％に低下したときにリン酸イオン濃度の高い培地で一時的に発酵を行うと、菌体が活性化され、この活性化された菌体を用いて第１の発酵工程と同様の第３の発酵工程に供することで、より一層長期に亘って乳酸変換率と乳酸生産速度を高水準で維持したまま、乳酸を生産できることが分かった。