(57)【要約】【課題】植物への遺伝子導入効率を持続的に向上させたアグロバクテリウム菌の提供。【解決手段】ゲノム中の、インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子の下流に1コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が導入されている、形質転換アグロバクテリウム菌。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中の、インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして発現する遺伝子の下流に1コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が導入されている、形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項２】
インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子が、ATU3181領域又はATU1219領域である、請求項１に記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項３】
1コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子の導入部位が、ATU3181領域とATU3182領域の間、又はATU1219領域とATU1220領域との間に位置する、請求項２に記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項４】
1コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子がプロモーターの制御下に配置されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項５】
2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が導入されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項６】
プロモーターの制御下にタンデムに配置された2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が2セット以上導入されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項７】
プロモーターの制御下にタンデムに配置された3コピーのACCデアミナーゼ遺伝子が2セット以上導入されている、請求項１〜５のいずれか１項記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項８】
ACCデアミナーゼ遺伝子が細菌由来である、請求項１〜７のいずれか１項記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項９】
ACCデアミナーゼ遺伝子と共に他の外来遺伝子が、前記インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子の下流に導入されている、請求項１〜８のいずれか１項記載の形質転換アグロバクテリウム菌。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の形質転換アグロバクテリウム菌を用いて、植物への遺伝子導入を行うことを特徴とする、形質転換植物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物への遺伝子導入効率が向上したアグロバクテリウム及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
根粒菌属であるアグロバクテリウム菌を介した遺伝子導入法（アグロバクテリウム法）は、植物の形質転換のために広範に用いられている。一方で、アグロバクテリウム法による遺伝子組換え植物の作出においては、植物の種類によっては遺伝子導入効率が大きく低下することがあるのが現状である。
【０００３】
特許文献１は、アグロバクテリウム菌にエチレン生産を抑制する能力を付与するACCデアミナーゼ遺伝子を含むプラスミドを保持させることにより、植物への遺伝子導入効率を向上させたアグロバクテリウム菌（スーパーアグロバクテリウム）を開示している。しかし、アグロバクテリウム菌に導入したプラスミドを安定に保持させるためには、通常、アグロバクテリウム菌を培養する培地に抗生物質を加えて細胞選択を行う必要がある。これは、そのような細胞選択を行わない場合、導入したプラスミドが高頻度に欠落してしまうためである。このため、ACCデアミナーゼ遺伝子を含むプラスミドを保持するアグロバクテリウム菌について高い遺伝子導入効率を長期間維持するためには、細胞選択のための培養が必須であり、安定した品質を保ちにくいだけでなく膨大な労力を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３１２３４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、植物への遺伝子導入効率を持続的に向上させたアグロバクテリウム菌を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、アグロバクテリウム菌の特定のゲノム領域にACCデアミナーゼ遺伝子を所定の様式で導入することにより、高い遺伝子導入効率を長期間維持可能なアグロバクテリウム菌を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] ゲノム中の、インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子の下流に1コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が導入されている、形質転換アグロバクテリウム菌。
[2] インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子が、ATU3181領域又はATU1219領域である、上記[1]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[3] 1コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子の導入部位が、ATU3181領域とATU3182領域の間、又はATU1219領域とATU1220領域との間に位置する、上記[2]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[4] 1コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子がプロモーターの制御下に配置されている、上記[1]〜[3]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[5] 2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が導入されている、上記[1]〜[4]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[6] プロモーターの制御下にタンデムに配置された2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が2セット以上導入されている、上記[1]〜[5]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[7] プロモーターの制御下にタンデムに配置された3コピーのACCデアミナーゼ遺伝子が2セット以上導入されている、上記[1]〜[5]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[8] ACCデアミナーゼ遺伝子が細菌由来である、上記[1]〜[7]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[9] ACCデアミナーゼ遺伝子と共に他の外来遺伝子が、前記インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子の下流に導入されている、上記[1]〜[8]の形質転換アグロバクテリウム菌。
[10] 上記[1]〜[9]の形質転換アグロバクテリウム菌を用いて、植物への遺伝子導入を行うことを特徴とする、形質転換植物の作製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アグロバクテリウム菌の遺伝子導入能力を向上させ、かつその高い能力を長期間維持することを可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、アグロバクテリウム菌のゲノム上の遺伝子座に対してACCデアミナーゼ遺伝子の導入部位を規定する相同配列の設計位置の概要を示す。Ａは第1染色体上の遺伝子ATU1219に対して設計した相同配列、Ｂは第2染色体上の遺伝子ATU3181に対して設計した相同配列を示す。図中の斜線ボックスが相同配列、白ボックスが各遺伝子（ORF）を示す。
【図２】図２は、ATU1219領域に対する相同配列断片の塩基配列（配列番号１３）を示す。この配列は、Genbankに登録されている（アクセッション番号NC_003062）全長2,841,580 bpの第１染色体配列上では1,213,728位〜1,214,146位の配列に相当する。図中にATU1219領域（ORF）に含まれる範囲を示す。
【図３】図３は、ATU3181-ATU3182領域に対する相同配列断片の塩基配列（配列番号１４）を示す。この配列は、Genbankに登録されている（アクセッション番号NC_003063）全長2,075,577bpの第２染色体配列上では191,100位〜192,604位の配列に相当する。図中にATU3181領域（ORF）及びATU3182領域（ORF）に含まれる範囲を示す。
【図４】図４は、ACCデアミナーゼ遺伝子を含む核酸断片（acdS断片）の塩基配列（配列番号１７）を示す。図中にlacプロモーター、リボソーム結合配列（二重下線部）、ACCデアミナーゼ遺伝子（ORF）の範囲を示す。
【図５】図５は、転写終結配列を含む核酸断片（amp-term断片）の塩基配列（配列番号２３）を示す。
【図６】図６は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む核酸断片の塩基配列（配列番号２６）を示す。図中にゲンタマイシン耐性遺伝子（ORF）の範囲を示す。
【図７】図７は大腸菌の複製起点領域を含む核酸断片（ori断片）の塩基配列（配列番号２９）を示す。
【図８】図８は、ACCデアミナーゼ遺伝子導入用の相同組換えベクターの作製手順の概要を示す。
【図９】図９は、導入したACCデアミナーゼ遺伝子をサザンブロット法で検出した結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、各菌株におけるACCデアミナーゼ遺伝子導入部位付近の遺伝子マップを示す。
【図１１】図１１は、菌株1219_acdS、及び3181_acdSの生育曲線を示す。灰色四角が1219_acdS、白三角が3181_acdSを示す。黒ひし形はコントロールであるpACDS/C58C1RifRを示す。
【図１２】図１２は、ネガティブコントロール株を作製するための相同組換えベクターの作製手順の概要を示す。
【図１３】図１３は、1コピー又は複数コピーのACCデアミナーゼ遺伝子を含む相同組換えベクターの作製手順の概要を示す。
【図１４】図１４は、導入した1コピー又は複数コピーのACCデアミナーゼ遺伝子をサザンブロット法で検出した結果を示す写真である。
【図１５】図１５は、形質転換アグロバクテリウム菌における導入遺伝子の保持率を示す、選択培地での生存率を示したグラフである。Ａは継代数＝１０、Ｂは継代数＝２０の時点の結果である。
【図１６】図１６は、菌体3181_1PacdS、3181_3PacdS、3181_5PacdS、及び3181_3Px2acdS（継代数：0、10、20回）から抽出したゲノム中のACCデアミナーゼ遺伝子を、サザンブロット法によって検出した結果を示す写真である。Ａ：3181_1PacdS、Ｂ：3181_3PacdS、Ｃ：3181_5PacdS、及びＤ：3181_3Px2a菌株3181_negacon cdS。
【図１７】図１７は、、3181_1PacdS、3181_3PacdS、3181_5PacdS、及び3181_3Px2acdSにおけるACCデアミナーゼ酵素の発現量をウエスタンブロット法で検出した結果を示す写真である。
【図１８】図１８は、アグロバクテリウム菌由来の粗酵素抽出液について、ACCデアミナーゼの酵素活性を示すα-ケト酪酸の蓄積量の変化を示すグラフである。
【図１９】図１９は、dnakプロモーターの制御下にACCデアミナーゼ遺伝子を含む増幅断片の塩基配列（配列番号５０）を示す。図中にdnaKプロモーター、dnaKの5’非翻訳領域、リボソーム結合配列（二重下線部）、ACCデアミナーゼ遺伝子（ORF）の範囲を示す。
【図２０】図２０は、アグロバクテリウム菌ゲノムに組み込んだdnakプロモーターの制御下のACCデアミナーゼ遺伝子からの発現量をウェスタンブロット解析で調べた結果を示す写真である。
【図２１】図２１は、アグロバクテリウム菌株による遺伝子導入を示すGUS染色が認められたトマト外植片の出現頻度を示す。ＡのグラフはGUS染色度合いによって出願頻度を段階分けして示した。ＢはGUS染色度合いの段階分けの基準を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、植物のゲノム中に遺伝子を導入するために用いるアグロバクテリウム菌のゲノムの所定の部位にACCデアミナーゼ遺伝子を含む核酸断片を所定の様式で導入することにより、ACCデアミナーゼ遺伝子を含む核酸断片をアグロバクテリウムゲノム中で安定に維持させ、形質転換に用いる際にはその遺伝子導入効率を安定して向上させるようにする方法を提供する。本発明は、そのようにして作製される形質転換アグロバクテリウム菌（次世代スーパーアグロバクテリウム）を提供する。
【００１１】
本発明においてアグロバクテリウム菌のゲノムに導入するACCデアミナーゼ遺伝子はACCデアミナーゼをコードする。ACCデアミナーゼは、エチレン生合成中間体であるACC（1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸）をα−ケト酪酸とアンモニアに分解し、それにより細胞内でのエチレン生産を抑制することができる。植物は病原菌に対する防御作用としてエチレンを生成し、エチレンはアグロバクテリウム菌の細胞への接着効率を抑制する作用を有することから、ACCデアミナーゼの作用によりエチレン生成を抑制することで、アグロバクテリウム菌の細胞感染を促進し、結果としてアグロバクテリウム菌を介した細胞への遺伝子導入効率を高めることができる。エチレン生成は植物に広く共通した防御反応機構である。
【００１２】
本発明で用いるACCデアミナーゼ遺伝子は、ACC分解活性を有する酵素をコードする限り任意の生物種由来の遺伝子であってよく、例えば、シュードモナス属菌（Pseudomonas sp. ACP株、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas entomophila PS-PJH株等）、パノニバクター属菌（Pannonibacter phragmatetus PB-Rt1.等）、エンテロバクター属菌（Enterobacter cloacae LH-R2等）、リゾビウム属菌（Rhizobium sp. QR1等）、アクロモバクター属菌（Achromobacter sp等）、シノリゾビウム属菌（Sinorhizobium sp. BL3株等）、メソリゾビウム属菌（Mesorhizobium loti等）のような細菌をはじめとする土壌微生物由来のACCデアミナーゼ遺伝子を好適に用いることができる。一実施形態として、例えばPseudomonas sp. ACP株由来の配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子、例えば配列番号１９に示す塩基配列をオープンリーディングフレーム（ORF）として有する遺伝子をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。あるいは、配列番号１９に示す塩基配列（全長）に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有し、かつACCデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。また配列番号２０に示すアミノ酸配列において1〜50個、好ましくは1〜10個、例えば1〜5個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつACCデアミナーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。例えば、ACCデアミナーゼ（例えば、配列番号２０に示すアミノ酸配列からなる）のN末端に1〜50個、例えば1〜33個のアミノ酸が付加されたタンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子をACCデアミナーゼ遺伝子として用いてもよい。
【００１３】
本発明では、アグロバクテリウム法による植物形質転換に使用可能な任意のアグロバクテリウム菌のゲノムに、ACCデアミナーゼ遺伝子を導入すればよい。使用するアグロバクテリウム菌は、限定するものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ビチス（Agrobacterium vitis）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）、及びアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）等のアグロバクテリウム法に使用可能なアグロバクテリウム菌であってよい。具体的には、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58株、アグロバクテリウム・ビチス（Agrobacterium vitis）S4株、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）A4株、及びアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）K84株、並びにそれらの派生株、また植物形質転換用に使用されている他の菌株を好適に使用することができ、例えば、C58C1RifR、GV3850、EHA101、EHA105、AGL1、LBA4404、K84N6株が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。植物形質転換に利用するためには、植物細胞への遺伝子導入に関与するvir領域を持つヘルパープラスミドを有しているアグロバクテリウム菌が特に好ましい。
【００１４】
本発明において、ACCデアミナーゼ遺伝子を導入する、アグロバクテリウム菌のゲノム中の位置は、インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子近傍（好ましくはその遺伝子の下流）であることが好ましい。ACCデアミナーゼ遺伝子を導入する位置は、遺伝子のORF中であってもよいが、ORFとORFの間であることがより好ましい。インドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子としては、限定するものではないが、例えばATU3181領域や、ATU1219領域が挙げられる。一実施形態では、ACCデアミナーゼ遺伝子の導入部位は、インドール-3-酢酸により発現抑制される遺伝子である、ATU3181領域（ORF）とATU3182領域（ORF）の間、又はATU1219領域（ORF）とATU1220領域（ORF）との間に位置することが特に好ましい。ATU3181領域及びATU1219領域をはじめとするアグロバクテリウム菌のゲノム上の個々の遺伝子座の位置及び配列の情報は、例えばWood DW, et al., (2001) Science, Vol.294: 2317-2323等によって報告されており、Agrobacterium.orgデータベース（http://depts.washington.edu/agro/；http://agro.vbi.vt.edu/data/tumefaciensall）やGenbankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）からも自由に入手できる。当業者にはこれらの遺伝子座は周知である。例えば、ATU1219領域は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）では第１染色体（環状染色体）上にある、推定上のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）である。アグロバクテリウム・ツメファシエンスC58株のATU1219領域は配列番号１の塩基配列からなり、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。ATU1219領域の下流にはメチルトランスフェラーゼをコードするATU1220領域が存在し、C58株のATU1220領域は配列番号３の塩基配列からなり、配列番号４のアミノ酸配列をコードする。一方、ATU3181領域は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）では第２染色体（線状染色体）上にある、推定上のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）である。C58株のATU3181領域は配列番号５の塩基配列からなり、配列番号６のアミノ酸配列をコードする。ATU3181領域の下流には推定上のタンパク質をコードするATU3182領域が存在し、C58株のATU3182領域は配列番号７の塩基配列からなり、配列番号８のアミノ酸配列をコードする。なおATU3182領域は、ATU3181領域とはゲノム上で逆配向に配置されており、すなわち逆鎖がセンス鎖になっている。アグロバクテリウム菌のATU1219領域、ATU1220領域、ATU3181領域、及びATU3182領域の塩基配列は、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７の塩基配列からなる遺伝子でありうる。
【００１５】
本発明では、ACCデアミナーゼ遺伝子は、導入されたアグロバクテリウム菌のゲノム中で、ACCデアミナーゼ遺伝子の発現誘導のためにプロモーター（好ましくは外来性プロモーター）の制御下に配置されていることが好ましい。ここで用いるプロモーターは、細菌、特にアグロバクテリウム菌で機能しうる任意のプロモーターであってよく、構成的プロモーターであっても誘導性プロモーターであってもよいし、一過性プロモーターであってもよいし、臓器、組織又は細胞特異的プロモーターであってもよい。本発明においてアグロバクテリウム菌におけるACCデアミナーゼ遺伝子の発現誘導に好適に使用可能なプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、dnakプロモーター、trpプロモーター、araBプロモーター、Pzt−1プロモーター、recAプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーター等が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００１６】
ACCデアミナーゼ遺伝子は、アグロバクテリウム菌のゲノム中に、1コピー以上、好ましくは2コピー以上、限定するものではないが典型的には30コピー以下、例えば3コピー〜10コピー導入されうる。2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が該ゲノム中の上記位置に導入されることが好ましい。
【００１７】
一実施形態では、プロモーターの制御下に2コピー以上、好ましくは2コピー〜10コピーのACCデアミナーゼ遺伝子がタンデムに配置されていることが好ましい。本発明において「ACCデアミナーゼ遺伝子がタンデムに配置」とは、2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子が同じプロモーターの制御を受ける程度に短い間隔（例えば100 bp以下、好ましくは50 bp以下）で同配向で連結されていることを意味する。本発明において、プロモーターの制御下に2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子がタンデムに配置されている場合、その連結された遺伝子間にはリボソーム結合配列は存在しているが、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の転写翻訳制御配列は存在しない。また、制限酵素部位は存在してもよい。本発明の好適な実施形態では、1つのプロモーターの制御下に3コピーのACCデアミナーゼ遺伝子をタンデムに配置することにより、それ以上のコピー数のACCデアミナーゼ遺伝子を1つのプロモーターの制御下にタンデムに配置したのと同等レベルのACCデアミナーゼ発現量を得ることができる。
【００１８】
さらなる実施形態では、プロモーターの制御下に2コピー以上（例えば2コピー〜10コピー）のACCデアミナーゼ遺伝子がタンデムに配置されている領域（タンデムリピート）が2セット以上、例えば2セット〜20セット、好ましくは2〜5セット、アグロバクテリウム菌のゲノム中の上記位置に（好ましくは連結して）導入されていることも好ましい。プロモーターの制御下に2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子がタンデムに配置されている領域（タンデムリピート）が、2セット以上連結されている場合、それらの連結された領域間には転写終結配列が含まれることも好ましい。
【００１９】
本発明では、ACCデアミナーゼ遺伝子は、プロモーターに加えてリボソーム結合配列やターミネーター配列、及び／又はプロモーターの上流側に配置される転写終結配列等と共にゲノム中に導入されることも好ましい。好ましい一実施形態では、プロモーターの制御下に配置された1コピーのACCデアミナーゼ遺伝子を含むDNA断片であってプロモーターとACCデアミナーゼ遺伝子の間にリボソーム結合配列を含むDNA断片が、アグロバクテリウム菌のゲノム中に導入される。好ましい別の実施形態では、プロモーターの制御下に2コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子を含むDNA断片であってプロモーターと1コピー目のACCデアミナーゼ遺伝子の間及びACCデアミナーゼ遺伝子の各コピー間にリボソーム結合配列を含むDNA断片が、アグロバクテリウム菌のゲノム中に導入される。
【００２０】
ACCデアミナーゼ遺伝子はまた、1つ又は2つ以上の他の外来遺伝子（マーカー遺伝子等）と共に、ゲノム中に導入されていることも好ましい。ACCデアミナーゼ遺伝子は、他の外来遺伝子よりも上流に配置されることが好ましい。他の外来遺伝子としては、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を好適に用いることができるが、蛍光タンパク質をコードする遺伝子等のレポーター遺伝子を用いてもよい。あるいは、アグロバクテリウム菌のゲノム中で安定的に保持させたい任意の遺伝子（例えば、植物に作用する任意の酵素をコードする遺伝子など）を、他の外来遺伝子として、ACCデアミナーゼ遺伝子と共にゲノム中に導入してもよい。本発明において「他の外来遺伝子」とは、ACCデアミナーゼ遺伝子以外の遺伝子であって、タンパク質又は機能性RNAをコードしており、宿主細胞ゲノム上の導入部位には天然に存在しない遺伝子を意味する。ACCデアミナーゼ遺伝子と共に他の外来遺伝子がゲノム中に導入される場合、ACCデアミナーゼ遺伝子と他の外来遺伝子の間には転写終結配列が存在することが好ましい。
【００２１】
転写終結配列は、mRNAの転写終結のシグナルとして機能し得る配列であれば特に限定されない。例えば各遺伝子がその下流に天然に有している転写終結配列を利用してもよいし、公知の任意の遺伝子の下流に存在する転写終結配列をPCR増幅等を用いて調製して用いてもよい。具体例としては、例えば、アンピシリン薬剤耐性遺伝子の転写終結配列が挙げられる。
【００２２】
ACCデアミナーゼ遺伝子のゲノム中の導入部位には、ゲノムへの遺伝子導入の際に用いた手法に応じて、さらに、ベクターの複製起点や、相同組換えを引き起こすためにアグロバクテリウムゲノム配列に対して設定して用いた相同配列も、一緒に組み込まれていてもよい。
【００２３】
ACCデアミナーゼ遺伝子のアグロバクテリウム菌のゲノム中のインドール-3-酢酸により発現抑制されモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子の下流への導入は、当業者には周知の部位特異的遺伝子導入法を利用して行うことができる。
【００２４】
具体的には、例えば、相同組換えに基づく部位特異的遺伝子導入法を利用することができる。単一交差法による相同組換えを利用した部位特異的遺伝子導入の例では、まず、遺伝子を導入する部位を選択した上で、その導入部位を含むゲノム上の配列に対し、相同組換えを惹起するような相同配列を設計する。本発明において「相同配列」とは、相同組換えを引き起こすことを意図する配列と同一の配列又は高い相同性（例えば、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性）を有する配列を含む塩基配列をいう。例えば、アグロバクテリウム菌のATU1219領域とATU1220領域との間にACCデアミナーゼ遺伝子を導入する場合には、相同配列の例として配列番号１３に示される塩基配列を含むものを好適に使用することができる。アグロバクテリウム菌のATU3181領域とATU3182領域との間にACCデアミナーゼ遺伝子を導入する場合には、相同配列の例として配列番号１４に示される塩基配列を含むものを好適に使用することができる。そのような相同配列の核酸断片を作製し、その下流にACCデアミナーゼ遺伝子を含めた相同組換えベクターを作製する。相同組換えベクターの具体的構成は、常法に基づいて、相同組換えが部位特異的に生じ、ゲノム中に組み込まれた際にACCデアミナーゼ遺伝子が機能するように設計すればよい。相同配列は、特に限定するものではないが、例えば50bp〜3000bp長でありうる。典型的には、相同組換えベクターは、相同配列、転写終結配列、プロモーター、リボソーム結合配列、ACCデアミナーゼ遺伝子、転写終結配列、プロモーター、マーカー遺伝子、転写終結配列、及び大腸菌複製起点を、5'から3'方向にこの順番で含みうる。ACCデアミナーゼ遺伝子は、上記と同様に、2コピー以上をプロモーターの制御下にタンデムに配置したもの（タンデムリピート）であってもよいし、そのようなタンデムリピートが2セット以上連結されたものであってもよい。タンデムリピートが2セット以上連結されたものについては、上記と同様に、リピート間に転写終結配列が含まれることが好ましく、それらのタンデムリピートはそれぞれのプロモーターの発現制御下にある。相同組換えベクターは、通常、リボソーム結合配列も有している。相同組換えベクターを構築するためのそれらの核酸配列の連結は、ライゲーション法やfusion PCR法により常法に従って行うことができる。
【００２５】
このようにして作製される相同組換えベクターを、アグロバクテリウム菌に導入することにより、相同組換えを引き起こしてゲノムへの遺伝子導入を引き起こすことができる。相同組換えベクターのアグロバクテリウム菌への導入は、典型的にはエレクトロポレーション法により行うことができる。相同組換えベクターを導入したアグロバクテリウム菌を、例えば相同組換えベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子が耐性を示す抗生物質等の薬剤を含む培地で培養することにより、形質転換細胞を選択することができる。選択した形質転換細胞についてはそのゲノム中の遺伝子導入部位について配列解析やサザンブロット解析を行うことにより、ゲノム中の当該部位への特異的遺伝子導入を確認することができる。
【００２６】
以上のようにしてアグロバクテリウム菌のゲノム中のインドール-3-酢酸により発現抑制される遺伝子下流に導入された、ACCデアミナーゼ遺伝子及び場合によりそれと共に導入された他の外来遺伝子は、継代を重ねても長期間安定的にゲノム中に維持され、マーカー遺伝子による細胞選択等を行わなくても非常に高い（好ましくは100％近い）保持率を維持できる。
【００２７】
このようにして得られた形質転換アグロバクテリウム菌は、ACCデアミナーゼ遺伝子の機能による高い遺伝子導入効率を長期間維持することができる。またACCデアミナーゼ遺伝子と共に有用遺伝子を上記遺伝子導入部位に導入することにより、その有用遺伝子の発現に基づく望ましい機能をアグロバクテリウム菌に長期間にわたり安定に付与することができる。
【００２８】
得られた形質転換アグロバクテリウム菌を用いれば、植物への遺伝子導入を高効率に行うことができる。この本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌を用いた植物への遺伝子導入は、通常のアグロバクテリウム法の手順に従って行うことができる。具体的には例えば、植物形質転換用のT-DNA領域を有するプラスミド（通常はバイナリーベクター）の右側及び左側ボーダー配列の間のプロモーター及びターミネーターの制御下に、植物に導入する遺伝子を組み込み、そのプラスミドを本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌に常法により導入する。プラスミドを導入した本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌においては、植物細胞への遺伝子導入に関与するvir領域を持つヘルパープラスミドと、植物に導入する遺伝子を含むT-DNA領域を有するプラスミドが共存するようにする。そのため、本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌が元々ヘルパープラスミドを有していない場合には、vir領域を持つヘルパープラスミドを当該菌に導入する。次いでその形質転換アグロバクテリウム菌を、植物組織、植物細胞（カルス等）又は種子等に接種し共存培養して感染させ、T-DNA領域中の遺伝子を植物細胞中のゲノムに導入させる。この方法による形質転換は、アグロバクテリウム菌が感染可能な任意の植物について実施することができる。例えば、本発明に係るアグロバクテリウム菌を用いて形質転換を行う植物は、双子葉植物であっても単子葉植物であってもよい。該当植物としては、特に限定されないが、例えば、ナス科［ナス（Solanum melongena L.）、トマト（Solanum lycopersicum）、ピーマン（Capsicum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ（Capsicum annuum L.）、タバコ（Nicotiana tabacum L.）等］、イネ科［イネ（Oryza sativa）、コムギ（Triticum aestivum L.）、オオムギ（Hordeum vulgare L.）、トウモロコシ（Zea mays L.）、ソルガム（Sorghum bicolor (L.) Moench）、エリアンサス（Erianthus spp）、ギニアグラス（Panicum maximum Jacq.）、ミスカンサス（Miscanthus spp）、サトウキビ（Saccharum officinarum L.）、ネピアグラス（Pennisetum purpureum Schumach）、パンパスグラス（Cortaderia argentea Stapf.）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne L.）、イタリアンライグラス（Lolium multiflorum Lam.）、メドウフェスク（Festuca pratensis Huds.）、トールフェスク（Festuca arundinacea Schreb.）、オーチャードグラス（Dactylis glomerata L.）、チモシー（Phleum pratense L.）等］、アブラナ科［シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、アブラナ（Brassica campestris L.）、ハクサイ（Brassica pekinensis Rupr.）、キャベツ（Brassica oleracea L. var. capitata L.）、ダイコン（Raphanus sativus L.）、ナタネ（Brassica campestris L., B. napus L.）等］、マメ科［ダイズ（Glycine max）、アズキ（Vigna angularis Willd.）、インゲン（Phaseolus vulgaris L.）、ソラマメ（Vicia faba L.）等］、ウリ科［キュウリ（Cucumis sativus L.）、メロン（Cucumis melo L.）、スイカ（Citrullus vulgaris Schrad.）、カボチャ（C. moschata Duch., C. maxima Duch.）等］、ヒルガオ科［サツマイモ（Ipomoea batatas）等］、ユリ科［ネギ（Allium fistulosum L.）、タマネギ（Allium cepa L.）、ニラ（Allium tuberosum Rottl.）、ニンニク（Allium sativum L.）、アスパラガス（Asparagus officinalis L.）等］、シソ科［シソ（Perilla frutescens Britt. var. crispa）等］、キク科［キク（Chrysanthemum morifolium）、シュンギク（Chrysanthemum coronarium L.）、レタ���（Lactuca sativa L. var. capitata L.）等］、バラ科［バラ（Rose hybrida Hort.）、イチゴ（Fragaria x ananassa Duch.）等］、ミカン科［ミカン（Citras unshiu）、サンショウ（Zanthoxylum piperitum DC.）等］、フトモモ科［ユーカリ（Eucalyptus globulus Labill）等］、ヤナギ科［ポプラ（Populas nigra L. var. italica Koehne）等］、アカザ科［ホウレンソウ（Spinacia oleracea L.）、テンサイ（Beta vulgaris L.）等］、リンドウ科［リンドウ（Gentiana scabra Bunge var. buergeri Maxim.）等］、ナデシコ科［カーネーション（Dianthus caryophyllus L.）等］の植物が挙げられる。
【００２９】
本発明に係るアグロバクテリウム菌を介してゲノム中に目的の遺伝子が組み込まれた植物組織、植物細胞（カルス等）、又は種子等については、公知の方法で植物体に再生させることができる。例えば、目的の遺伝子が組み込まれた形質転換植物細胞を、従来知られている植物組織培養法に従って選択培地で培養し、生存したカルスを再分化培地（適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）を含む）で培養することにより、形質転換植物体を再生することができる。植物形質転換法の詳細は、『島本功、岡田清孝  監修  「新版  モデル植物の実験プロトコール  遺伝学的手法からゲノム解析まで」（2001） 秀潤社』などの一般的な教科書の記載や、Hiei Y. et al., "Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA." Plant J. (1994) 6, 271-282; Hayashimoto, A. et al., "A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants." Plant Physiol. (1990) 93, 857-863等の文献を参照すればよい。このように、本発明に係る形質転換アグロバクテリウム菌を用いて、植物細胞に高効率で目的の遺伝子を導入し、形質転換植物を効率よく作製することができる。本発明は、このような形質転換植物の作製方法も提供する。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［実施例１］アグロバクテリウムゲノム中へのACCデアミナーゼ遺伝子の導入
本実施例では、ACCデアミナーゼ遺伝子を相同組換え法によりアグロバクテリウムゲノム中に導入した。
【００３２】
そのために用いる相同組換えベクターは、アグロバクテリウム菌のゲノム中の配列と相同な配列（相同配列）、転写終結配列、lacプロモーター、ACCデアミナーゼ遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、大腸菌の複製起点（origin）領域（ColE1ori）を含むように作製した。
【００３３】
まず、単一交差（single crossover）法による相同組換えを介して部位特異的遺伝子導入が引き起こされるように、ACCデアミナーゼ遺伝子挿入部位として選択したゲノム上の遺伝子配列に対して相同配列を設計した。ACCデアミナーゼ遺伝子挿入部位としては、２つの部位、すなわちアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens；A. tumefaciens）のゲノム上のATU1219領域及びATU3181領域下流を選択した。ATU1219領域及びATU3181領域は、いずれもインドール-3-酢酸によって発現が抑制される遺伝子として報告されている（Yuan, Z.C., et al., Cell Microbiol., 10, 2339-2354 （2008））。ATU1219領域及びATU3181領域は、インドール-3-酢酸によって発現が抑制される遺伝子の中から、ORFやオペロンの構造を検討した上で、オペロンを形成していない遺伝子、すなわちモノシストロニックmRNAとして転写される遺伝子のうちの好適な候補として選択された。
【００３４】
ゲノム上のそれら遺伝子座と相同配列の位置を図１に示す。相同配列を含む核酸断片は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1RifR株（特開2005-312345号公報）のゲノムDNAを鋳型として、ATU1219領域を含む配列、及びATU3181-ATU3182領域から、それぞれPCRにより増幅した。PCRに使用したプライマーは、ATU1219領域を含む配列についてはATU1219_For（5’-GGAAGTGCAATCAATGTTGC-3’（配列番号９））とATU1219_Rev（5’-AAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGCACACGATGCCATATCCTGC-3’（配列番号１０））、ATU3181-ATU3182領域についてはATU3181_For（5’-CCTTCTCAACCACATCCTCG-3’（配列番号１１））とATU3181_Rev（5’-AAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGGCGTGAAGGCCTCAGTATCG-3’（配列番号１２））である。ATU1219領域を含む配列について得た相同配列の増幅断片（相同配列断片）は、Genbankに登録されている（アクセッション番号NC_003062）全長2,841,580 bpの第１染色体配列上では1,213,728位〜1,214,146位に相当する配列番号１３に示す塩基配列を有するものであった（図２）。ATU3181-ATU3182領域について得た相同配列の増幅断片（相同配列断片）は、Genbankに登録されている（アクセッション番号NC_003063）全長2,075,577 bpの第２染色体配列上の191,100位〜192,604位に相当する配列番号１４に示す塩基配列を有するものであった（図３）。
【００３５】
ACCデアミナーゼ遺伝子を含む核酸断片は、シュードモナス（Pseudomonas）sp. ACP株由来のACCデアミナーゼ遺伝子がクローン化されたpBBRacdSベクター（nonaka et al., Appl. Environ. Microbiol., 74, 2526-2528 (2008)）を鋳型として、プライマーacdS-for（5’-TCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGAGCGCAACGCAATTAATG-3’（配列番号１５））及びacdS-rev（5’-GCTGTCAAACATGAGAATTCAACTGCCTTAAAAAAATTAC-3’（配列番号１６））を用いてPCRにより増幅した。得られた増幅断片（acdS断片）には、lacプロモーターを含む5’非翻訳領域（リボソーム結合配列を含む）、lacZ由来の33アミノ酸がN末端に付加されているACCデアミナーゼをコードする配列、及びACCデアミナーゼ遺伝子の転写終結配列が含まれており、その塩基配列を図４及び配列番号１７に示した。なおACCデアミナーゼのN末端に付加されたlacZ由来の33アミノ酸は、ACCデアミナーゼの活性には影響を及ぼさない。N末端に付加された33アミノ酸を除いたACCデアミナーゼのアミノ酸配列を配列番号２０に、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１９に示す。
【００３６】
転写終結配列を含む核酸断片は、pUC18ベクターからアンピシリン薬剤耐性遺伝子の転写終結領域を二つのプライマーamp-ter_for（5’-GGTGGTGATGTCGAATGGCGCTGTCAGACCAAGTTTACTC-3’（配列番号２１））及びamp-ter_rev（5’-GCTGTCAAACATGAGAATTCAGCAGCAGATTACGCGCAGA-3’（配列番号２２））を用いてPCRによって増幅した。得られた増幅断片（amp-term断片）の塩基配列は図５及び配列番号２３に示す。
【００３７】
ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む核酸断片は、pBBR1MCS-5ベクター（Kovach. ME., et al., (1995) Gene 166: 175-176）を鋳型として、２つのプライマーgen_res-for2（5’-AGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTGCACACCGTGGAAACGGATG-3’（配列番号２４））、gen-res_rev2（5’-GGCCGCCGCGATCATCAAGG-3’（配列番号２５））を用いてPCRによって増幅した。得られた増幅断片（マーカー遺伝子断片）の塩基配列は図６及び配列番号２６に示す。
【００３８】
大腸菌の複製起点領域を含む核酸断片は、pBR322ベクターを鋳型として、プライマーpBRori_for（5’-AGGCGGTAATACGGTTATCC-3’（配列番号２７））及びpBRori_rev（5’-CGGGGAGTCAGGCAACTATG-3’（配列番号２８））を用いてPCRで増幅した。得られた増幅断片（ori断片）の塩基配列は図７及び配列番号２９に示す。
【００３９】
続いて、以上のようにして得られた相同配列断片（ATU1219領域を含む配列又はATU3181-ATU3182領域）、amp-term断片、acdS断片及びマーカー遺伝子断片をfusion PCR法によりこの順番で連結した。まず、PCR反応液中に相同配列断片とamp-term断片を加え、プライマーATU1219_For又はATU3181_Forと、プライマーamp-ter_revを用いてPCRを行ってそれらの断片を連結させた。次に、PCR反応液中にacdS断片とマーカー遺伝子断片を加え、プライマーacdS_for及びgen-res_rev2を用いてPCRを行い、それらの断片を連結させた。最後にそれぞれのPCRで得られた連結断片を１つのPCR反応液中に加え、プライマーATU1219_For又はATU3181_For、及びgen-res_rev2を用いてPCRを行うことで連結した。このようにして上記の4つの断片をfusion PCR法によって一つの断片につなげることに成功した後、両末端をリン酸化した。その後、リン酸化断片をori断片とライゲーションし、大腸菌DH5αでクローニングして、相同組換えベクターを作製した。以上の相同組換えベクターの作製手順の概要を図８に示す。
【００４０】
作製した相同組換えベクターを用いて、アグロバクテリムゲノム上にACCデアミナーゼ遺伝子を導入した。相同組換えベクターのアグロバクテリウムC58C1RifR株への導入はエレクトロポレーション法により行った。形質転換した菌株は、抗生物質ゲンタマイシンを含む寒天培地で細胞選択を行い、得られた菌のゲノムをPCR増幅し、ACCデアミナーゼ遺伝子と相補的な配列を持つDIG標識したDNAプローブを用いたサザンブロット法で検出し（図９）、さらに配列解析を行った。これにより、ACCデアミナーゼ遺伝子がアグロバクテリウムゲノムのATU1219-ATU1220間、又はATU3181-ATU3182間に導入された菌株（それぞれ、1219_acdS、3181_acdS）が作製された。それぞれの菌株においてACCデアミナーゼ遺伝子が導入された付近の遺伝子マップを図１０に示す。
【００４１】
作製したアグロバクテリウム菌株1219_acdS、及び3181_acdSの生育曲線を常法により測定した。コントロールとしてACCデアミナーゼ遺伝子を含むpBBRacdSベクターを保持したアグロバクテリウム菌pACDS/C58C1RifR（nonaka et al., Appl. Environ. Microbiol., 74, 2526-2528 (2008)）についても同様に測定した。結果を図１１に示す。ACCデアミナーゼ遺伝子をATU1219領域、ATU3181-ATU3182間領域に挿入しても、菌の生育には影響がないことが示された。
【００４２】
［実施例２］ネガティブコントロール株を作製するための相同組換えベクターの構築
ATU3181-ATU3182間領域にゲンタマイシン薬剤耐性遺伝子を導入したネガティブコントロール株を作製するための相同組換えベクターを構築した。
【００４３】
pBBR1MCS-5ベクターを鋳型としてゲンタマイシン耐性遺伝子を２つのプライマーgen_res-for1（5’-ATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTGCACACCGTGGAAACGGATG-3’（配列番号３０））及びgen-res_rev2（5’-GGCCGCCGCGATCATCAAGG-3’（配列番号２５））を用いてPCRによって増幅した（マーカー遺伝子_2断片）。それ以外の相同配列断片、amp-term断片、ori断片は実施例１に記載したとおりにPCRで調製した。
【００４４】
相同配列断片、amp-term断片、マーカー遺伝子_2断片をfusion PCR法によって連結した。具体的には、実施例１と同様にして相同配列断片とamp-term断片を連結した断片とマーカー遺伝子_2断片をPCR反応液中に加え、プライマーATU3181_For及びgen-res_rev2を用いてPCRを行うことで、3つの断片を連結した。連結したPCR断片をリン酸化し、ori断片とライゲーションした後、大腸菌DH5αでクローニングした。この相同組換えベクターの作製の概要を図１２に示す（p3181_negacon）。
【００４５】
［実施例３］アグロバクテリウム菌のゲノム上にACCデアミナーゼ遺伝子を複数導入するための相同組換えベクターの構築
実施例２で作製した相同組換えベクターp3181_negaconのamp-term断片−マーカー遺伝子_2断片間にACCデアミナーゼ遺伝子を導入するため、２つのプライマーrec_NdeI（5’-CGTTGCATATGAGCAGCAGATTACGCGCAG-3’（配列番号３１））及びgen_res-for2（5’-AGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTGCACACCGTGGAAACGGATG-3’（配列番号２４））を用いてp3181_negaconを鋳型としてPCRを行った。得られたPCR断片のマーカー遺伝子上流にACCデアミナーゼ遺伝子のための転写終結配列を付加した。付加する配列は、pBBR1MCS-5ベクターを鋳型としてrec_EcoRI（5’-CGACAGAATTCCAGCCTGAATGGCGAATGG-3’（配列番号３２））とacdS-rev（5’-GCTGTCAAACATGAGAATTCAACTGCCTTAAAAAAATTAC-3’（配列番号１６））の２つのプライマーを用いてPCRにより増幅した。得られた２つのPCR断片をPCR反応液中に加え、プライマーrec_EcoRI及びrec_NdeIを用いてfusion PCR法により連結し、得られたPCR産物を制限酵素NdeI及びEcoRIで消化した（図１２の「p3181ベクター断片」）。
【００４６】
さらに、ACCデアミナーゼ遺伝子を複数連結させるのに必要な断片をPCRで調製するため、pBBR1MCS-5ベクターのNcoI−XbaI部位にpBBRacdSベクターからPCRで増幅したACCデアミナーゼ遺伝子を挿入することにより、新たにpBBRacdSv3ベクターを構築した。PCRに用いたプライマーはacdS-NcoI（5’-CCACGGTGTGCGTCCATGGG-3’（配列番号３３））及びacdS-SpeI（5’-GCTAACTAGTTCAGCCGTCTCGGAAG-3’（配列番号３４））である。得られたPCR産物は、制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、ライゲーションした。
【００４７】
ACCデアミナーゼ遺伝子を1コピー導入するための相同組換えベクターの作製では、pBBRacdSv3ベクターを鋳型としてPCR法によりACCデアミナーゼ断片を調製した。調製したACCデアミナーゼ断片にはlacプロモーター、及びリボソーム結合配列が含まれる。PCRは、acds_NdeI（5’-CGTGTCATATGGCTCACTCATTAGGCACCC-3’（配列番号３５））、acdS_EcoRI（5’-CGTAAGAATTCTCACTATAGGGCGAATTGG-3’（配列番号３６））を用いて行い、得られたPCR産物は制限酵素NdeI及びEcoRIで消化した。p3181ベクター断片とライゲーションした後、大腸菌DH5αでクローニングし、ACCデアミナーゼ遺伝子を1コピー含む相同組換えベクターp3181_1PacdSを作製した（図１３、p3181_1PacdS）。
【００４８】
次にゲノム上にACCデアミナーゼ遺伝子を3コピー導入するための相同組換えベクターを作製すべく、pBBRacdSv3ベクターを鋳型として3種類のPCR産物を調製した。1つ目のPCR産物（1st_acdS）はプライマーacds_NdeI及び1st_acdS-RBamHI（5’-TCACTATAGGGCGAATTGGGGATCCACCGCGGTGGCGGCC-3’（配列番号３７））を用いてPCR増幅した。2つ目のPCR産物（2nd_acdS）はプライマー2nd_acdS-FBamHI（5’-GTGGAATTGTGAGCGGATGGATCCTTCACACAGGAAACAGC-3’（配列番号３８））及び2nd_acdS-RXbaI（5’-TCACTATAGGGCGAATTGGTCTAGAACCGCGGTGGCGGCC-3’（配列番号３９））を用いてPCR増幅した。3つ目のPCR産物（3P_acdS）はプライマー3rd_acdS-FXbaI（5’-GTGGAATTGTGAGCGGATTCTAGATTCACACAGGAAACAGC-3’（配列番号４０））及びacdS_EcoRIを用いてPCR増幅した。なお調製した1st_acdS断片にはlacプロモーター及びリボソーム結合配列が含まれているが、2nd_acdS、3P_acdS断片にはリボソーム結合配列が含まれるがlacプロモーターは含まれない。それぞれのPCR産物は制限酵素で消化した。使用した制限酵素は1st_acdSについてはNdeI及びBamHIを、2nd_acdSについてはBamHI及びXbaIを、3P_acdSについてはXbaI及びEcoRIである。1st_acdS、2nd_acds、3P_acdS及びp3181ベクター断片の4つの断片を１つの反応液中で同時にライゲーションした後、大腸菌DH5αでクローニングし、ACCデアミナーゼ遺伝子を3コピー含む相同組換えベクターp3181_3PacdSを作製した（図１３のp3181_3PacdS）。
【００４９】
さらに、ACCデアミナーゼ遺伝子を5コピー導入するための相同組換えベクターを作製すべく、pBBRacdSv3ベクターを鋳型として新たに3種類のPCR産物を調製した。1つ目のPCR産物（3rd_acdS）は3rd_acdS-FXbaI（5’-GTGGAATTGTGAGCGGATTCTAGATTCACACAGGAAACAGC-3’（配列番号４１））及び3rd_acdS-RNcoI（5’-TCACTATAGGGCGAATTGGCCATGGACCGCGGTGGCGGCC-3’（配列番号４２））を用いてPCR増幅した。2つ目のPCR産物（4th_acdS）は4th_acdS-FNcoI（5’-GTGGAATTGTGAGCGGATCCATGGTTCACACAGGAAACAGC-3’（配列番号４３））及び4th_acdS-RPstI（5’-TCACTATAGGGCGAATTGGCTGCAGACCGCGGTGGCGGCC-3’（配列番号４４））を用いてPCR増幅した。調製した3rd_acdS、4th_acdS、5P_acdS断片にはリボソーム結合配列が含まれるがlacプロモーターは含まれない。3つ目のPCR産物（5th_acdS）は5P_acdS-FPstI（5’-GTGGAATTGTGAGCGGATCTGCAGTTCACACAGGAAACAGC-3’（配列番号４５））及びacdS_EcoRIを用いてPCR増幅した。得られたそれぞれのPCR産物は制限酵素で消化した。使用した制限酵素は3rd_acdSについてはXbaI及びNcoI、4th_acdSについてはNcoI及びPstI、5P_acdSについてはPstI及びEcoRIである。クローニングに用いるベクター領域は、p3181_3PacdSをXbaI及びEcoRIで消化して調製した。ベクター領域と3rd_acdS、4th_acdS、及び5P_acdS断片を１つの反応液中で同時にライゲーションした後、大腸菌DH5αでクローニングし、ACCデアミナーゼ遺伝子を5コピー含む相同組換えベクターp3181_5PacdSを作製した（図１３のp3181_5PacdS）。
【００５０】
さらに、ACCデアミナーゼ遺伝子を3コピー連結した断片を２セット連結した断片をアグロバクテリウムゲノム上に導入するための相同組換えベクター（p3181_3Px2acdS）を構築した。まず、p3181_5PacdSベクターを制限酵素NcoI及びPstIで消化した。次に、p3181_3PacdSを鋳型とし、プライマーPlac_NcoI_tandem（5’-GCAACCATGGCTGTCAGACCAAGTTTACTC-3’（配列番号４６））及び4th_acdS-RPstIを用いて2コピーのACCデアミナーゼ遺伝子がタンデムに連結した断片をPCRで増幅した。得られたPCR産物を制限酵素NcoI及びPstIで消化した後、p3181_5PacdSベクターの上記消化断片とライゲーションし、大腸菌DH5αでクローニングして、ACCデアミナーゼ遺伝子を3コピー×2セット含む相同組換えベクターp3181_3Px2acdSを作製した（図１３のp3181_3Px2acdS）。
【００５１】
［実施例４］アグロバクテリウムゲノム上への複数のACCデアミナーゼ遺伝子の導入
実施例３で作出した相同組換えベクターを用いて、アグロバクテリウムC58C1RifR株のATU3181-ATU3182間に、ACCデアミナーゼ遺伝子及びマーカー遺伝子を含む断片を導入した。相同組換えベクターのアグロバクテリウムへの導入はエレクトロポレーション法により行った。形質転換した菌株は、抗生物質ゲンタマイシンを含む寒天培地で選択し、得られた菌のゲノムをPCR増幅し、ACCデアミナーゼ遺伝子と相補的な配列を持つDIG標識したDNAプローブを用いたサザンブロット法で検出し（図１４）、配列解析を行って、予想通りにACCデアミナーゼ遺伝子及びゲンタマイシン耐性遺伝子を含む断片がゲノムのATU3181-ATU3182間に導入されていることを確認した。
【００５２】
［実施例５］導入した遺伝子の安定性の確認
ゲノム上に導入したACCデアミナーゼ遺伝子が、プラスミドで保持した場合よりも安定に保持されることを示すために、抗生物質を含まない培地で継代培養を行う条件下でアグロバクテリウム菌における導入遺伝子の保持率を評価した。
【００５３】
まず、形質転換アグロバクテリウム菌pACDS/C58C1RifR、3181_1PacdS、3181_3PacdS、3181_5PacdS、及び3181_3Px2acdSを、それぞれ、抗生物質アンピシリン100 mg/Lとゲンタマイシン50 mg/Lを含む寒天培地に広げ、28℃で培養することでシングルコロニーを得た。得られたシングルコロニーをLB培地（アンピシリン100 mg/L、ゲンタマイシン50 mg/Lを含む）に植菌し、28℃で振盪培養した。対数増殖期後期の培養液を新たなLB培地（アンピシリン100 mg/Lを含有）に植菌することで継代培養を行った。この継代培養の操作を20回行い、得られた菌液を、ゲンタマイシンが含まれる寒天培地と含まない寒天培地に播き、コロニー形成単位（CFU）を測定した。ゲンタマイシンを含まない寒天培地でのCFU値に対する、ゲンタマイシンを含む寒天培地でのCFU値のパーセンテージ（生存率）を求めた結果を図１５に示した。図１５においてカラムとエラーバーはそれぞれ、平均値と標準偏差を示している。この生存率は、導入遺伝子を保持しているアグロバクテリウム菌の割合を示している。
【００５４】
その結果、ゲノム上の上記部位にACCデアミナーゼ遺伝子及びゲンタマイシン耐性遺伝子を導入した形質転換アグロバクテリウム菌（3181_1PacdS、3181_3PacdS、3181_5PacdS、及び3181_3Px2acdS）は、20回継代培養してもほぼ100%の菌が導入遺伝子を保持していることが示された。一方、導入遺伝子をプラスミドで保持していたアグロバクテリウム菌pACDS/C58C1RifRについては、10回継代後の菌液の試験で50％近くの菌がプラスミドを欠落しており、20回継代した菌液では90％近くの菌がプラスミドを欠落していることが明らかとなった。
【００５５】
さらに、継代培養した菌体3181_1PacdS、3181_3PacdS、3181_5PacdS、及び3181_3Px2acdS（継代数：0、10、20回）からゲノムを抽出し、ゲノム上に導入したACCデアミナーゼ遺伝子の安定性について、サザンブロット法によって解析した。それぞれの抽出ゲノムDNAをEcoRI及びBamHIで消化した後、ACCデアミナーゼ遺伝子と相補的な配列を持つDIG標識したDNAプローブで検出を行った（図１６）。調べた全ての菌株において、継代数が増えてもDNAプローブで検出されたバンドパターンに変化が見られなかったことから、ゲノム上に導入したACCデアミナーゼ遺伝子は安定に保持されていることが明らかとなった。
【００５６】
［実施例６］形質転換アグロバクテリウム菌のACCデアミナーゼの発現量測定と機能解析
本実施例では、ゲノム上に導入したACCデアミナーゼ遺伝子から発現するACCデアミナーゼ酵素の発現量と酵素活性について評価した。
【００５７】
ゲノム中にACCデアミナーゼ遺伝子を導入した菌株（3181_negacon、3181_1PacdS、3181_3PacdS、3181_5PacdS、及び3181_3Px2acdS）を抗生物質アンピシリン100 mg/L、ゲンタマイシン50 mg/Lを含むLB培地で振盪培養した。対数増殖期後期で菌体を集菌した。集菌した菌体は0.1 M Tris-HCl緩衝液で洗浄した後、ライゼート緩衝液（0.1 M Tris-HCl、0.1% SDS、0.1% Triton-X100）で懸濁した。懸濁した菌液を氷上で冷やしながら超音波破砕機を用いて破砕した。破砕液を遠心して、その上清を粗酵素抽出液とした。この粗酵素抽出液をSDS-PAGEで泳動し、ウサギ由来の抗A. tumefaciens C58 ACCデアミナーゼ抗体を用いてウエスタンブロット法により、ACCデアミナーゼ酵素の発現量を解析した。コントロールとしてウサギ由来の抗B. subtilis DnaK抗体により、菌内で発現しているDnaKタンパク質を検出した。図１７にウエスタンブロット法による結果を示す。
【００５８】
検出されたシグナル強度から、ゲノム中に導入したACCデアミナーゼ遺伝子のコピー数が1コピー（3181_1PacdS）から3コピー（3181_3PacdS）に増えると、ACCデアミナーゼの発現量が高くなったことが示された。一方、ACCデアミナーゼ遺伝子が3コピーから5コピー（3181_5PacdS）に増えても、ACCデアミナーゼの発現量は3181_3PacdSでの発現量と同等であり、発現量の増加は確認されなかった。しかし、ACCデアミナーゼ遺伝子を3コピー連結した断片を2セット繋げた3181_3Px2acdSは、3181_3PacdS及び3181_5PacdSよりも高いACCデアミナーゼ発現量を示すことが明らかになった。したがって、ゲノム中に4コピー以上のACCデアミナーゼ遺伝子を導入する場合には、プロモーターの制御下に1〜3コピーのACCデアミナーゼ遺伝子を連結した断片をタンデムにつなげることで、ACCデアミナーゼの発現量を効率的に増大させることができることが示された。
【００５９】
さらに、上記の形質転換アグロバクテリウムにおいて発現しているACCデアミナーゼの酵素活性を測定するために、ACCデアミナーゼの触媒作用により1-アミノシクロプロパンカルボン酸（ACC）から生成されるα-ケト酪酸の量を測定した。上記通り調製した粗酵素抽出液にACCを20 mMに、ピリドキサール−5’リン酸（PLP）を4 mMになるように加え、30℃で保温した。一定時間後に反応液に100%（w/v）トリクロロ酢酸（TCA）溶液を加えてタンパク質を失活させ、反応を停止させた。この反応液に同等量の0.1%  2,4-ジニトロフェニルヒドラジン（DNPH）溶液を加えて15分間、30℃で保温した。その後、反応液と同等量の3 N 水酸化ナトリウム溶液を加えて呈色反応を停止した。その呈色反応液中に蓄積されたα-ケト酪酸を340 nmの吸収波長で検出した。粗酵素抽出液との反応時間とα-ケト酪酸の蓄積量の経時変化を図１８のグラフに示した（n=4、平均値±標準偏差）。粗酵素抽出液中のACCデアミナーゼ量が増えるにつれて、α-ケト酪酸の蓄積量が増加する傾向が示されたことから、ゲノムに導入されたACCデアミナーゼ遺伝子から発現されているACCデアミナーゼは酵素活性を持つことが確認された。
【００６０】
［実施例７］プロモーター及びリボソーム結合配列の検討
上記の実施例でACCデアミナーゼ遺伝子の発現誘導に使用した、プロモーター及びリボソーム結合配列を含むE. coliのlacオペロン由来の転写制御配列を、アグロバクテリウム菌遺伝子由来のものに置換して、ACCデアミナーゼの発現量が向上するか評価を行った。
【００６１】
まず、アグロバクテリウム菌のハウスキーピング遺伝子であるdnak遺伝子のプロモーター配列とリボソーム結合配列を含む5’非翻訳領域を用いて、ACCデアミナーゼを発現できるベクターを構築した。dnaK遺伝子の5’非翻訳領域は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスC58C1RifR株のゲノムを鋳型としてdnak-fusF（5’-GCATCCATGGCTTGATGGCTATGCTTCTGC-3’（配列番号４７））及びdnak-fusR（5’-cgtaatcatggtcatgctcttctctccttg-3’（配列番号４８））の２つのプライマーを使用してPCR法で増幅した。dnaKの5’非翻訳領域と連結するACCデアミナーゼ遺伝子（ORF）は、pBBRacdSv3ベクターを鋳型としてPlac-ATG（5’-ATGACCATGATTACGCCAAGC-3’（配列番号４９））及びacdS_EcoRIの２つのプライマーを使用してPCR法で増幅した。これら２つのPCR断片を１つのPCR反応液中に加え、dnak-fusF及びacdS_EcoRIの２つのプライマーを用いてfusion PCR法で連結した。得られた連結断片の塩基配列を図１９及び配列番号５０に示す。連結断片を制限酵素NcoI及びSacIで消化し、制限酵素NcoI及びSacIで消化したpBBR1MCS-5ベクターとライゲーションし、大腸菌DH5αでクローニングして、dnakプロモーターの制御下にACCデアミナーゼ遺伝子を含む相同組換えベクターpdnak_ACDSを作製した。
【００６２】
アグロバクテリウム菌C58C1RifR株にpdnak_ACDSを導入してゲノムにACCデアミナーゼ遺伝子を組み込んだ形質転換菌pdnak_ACDS/C58C1RifRと、ACCデアミナーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを保持するpACDS/C58C1RifRを、それぞれ、LB培地（100 mg/L アンピシリン、50 mg/L ゲンタマイシン含有）で28℃で振盪培養し、対数増殖期後期で菌体を集菌した。粗酵素抽出液は実施例６に記載したようにして菌体から抽出し、ウエスタンブロット法でACCデアミナーゼ酵素の発現量を解析した。図２０にウエスタンブロットの結果を示す。検出したシグナル強度を比較すると、dnakプロモーターの制御下で発現させたACCデアミナーゼ量も、lacプロモーターからのACCデアミナーゼ発現量と同程度に高いことが示された。
【００６３】
［実施例８］植物への遺伝子導入効率の評価
ACCデアミナーゼをゲノム中に導入したアグロバクテリウム菌（3181_3PacsS、及び3181_3Px2acdS）を用いて、植物への遺伝子導入能力の評価を行った。
【００６４】
まず、上記実施例で構築した形質転換アグロバクテリウム菌株3181_negacon、3181_3PacdS、及び3181_3Px2acdS、並びにACCデアミナーゼ遺伝子をプラスミドで保持するアグロバクテリウム菌株pACDS/C58C1RifR、空のpBBR1MCS-5ベクターを保持するアグロバクテリウム菌株pMCS/C58C1RifRに、植物への遺伝子導入のマーカーとなるGUS遺伝子を持つpIG121-Hmベクター（Hiei et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)）を形質導入した。
【００６５】
得られた5つのアグロバクテリウム菌株を用いて、トマト（Solanum lycopersicum‘Money Maker’）へのGUS遺伝子の導入効率を評価した。トマトの種子をMS 1.5%ショ糖培地へ無菌播種し、生育させて得られた子葉の上下を切り落とし、2分割した切片をトマト外植片として使用した。アグロバクテリウム菌液は、植菌したLB培地（100 mg/L アンピシリン、50 mg/L ゲンタマイシン、100 mg/L カナマイシン含有）中で28℃で振盪培養した。得られた菌液を遠心して集菌した。集菌した菌体をMS液体培地で懸濁し、菌体密度がO.D.600=0.5になるように調製した。調製した菌液にトマト外植片を20分間浸した後、28℃、暗条件で72時間共存培養を行った。共存培地は、MS培地に3% グルコース、200 μM アセトシリンゴン、1.5 μg/L ゼアチンを加えている。
【００６６】
共存培養終了後、トマトの子葉外植片をGUS染色し、遺伝子導入効率を評価した。共存培養後のトマトの子葉外植片をEDTA（10 mM）、フェリシアンカリウム（5mM）、フェロシアン化カリウム（5 mM）、トライトンX-100（0.1%）、及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-グルクロニド（X-Glu）（0.5 mg/L）を含んだ100 mMリン酸緩衝液へ浸し、37℃で一晩インキュベートした。これにより、GUS遺伝子が導入された細胞では、GUS遺伝子発現産物の機能により、基質X-Gluが分解され、濃青色に染色される。染色度合いを観察するために、37℃で一晩インキュベートした後、トマト外植片をリン酸緩衝液から70%エタノールへ移し、GUS染色反応を停止するとともに、クロロフィルを脱色した。70%エタノールを2回交換し、最終的にはトマト外植片を100%エタノールに浸漬した。完全にクロロフィルが抜けた後、濃青色に染色された外植片の出現頻度を評価した。その際に染色レベルを0-5にふり分け、それぞれの出現頻度を評価した。その結果を図２１に示す。
【００６７】
ゲノム中にACCデアミナーゼを導入した菌株へのGUS遺伝子導入（pIG121-Hm/3181_3PacdS、及びpIG121-Hm/3181_3Px2acdS）を比較すると、GUSスポットが観測された外植片の枚数、及び1枚当たりのGUSスポットの出現頻度が、導入したACCデアミナーゼのコピー数が増えるにつれて増加する傾向が明らかになった。アグロバクテリウムゲノム上に保持させるACCデアミナーゼ遺伝子のコピー数を増やすことで、植物への遺伝子導入の能力が優れた菌株を作製できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の方法は、アグロバクテリウム法に基づく植物形質転換法の遺伝子導入効率を持続的に向上させるために用いることができる。この方法は、遺伝子導入が困難とされている植物への遺伝子導入において有利に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１及び２： ATU1219
配列番号３及び４： ATU1220
配列番号５及び６： ATU3181
配列番号７及び８： ATU3182
配列番号９： プライマー ATU1219_For
配列番号１０： プライマー ATU1219_Rev
配列番号１１： プライマー ATU3181_For
配列番号１２： プライマー ATU3181_Rev
配列番号１３： ATU1219に対する相同配列
配列番号１４： ATU3181-3182に対する相同配列
配列番号１５： プライマー acdS-for
配列番号１６： プライマー acdS-rev
配列番号１７： acdS断片
配列番号１８： 33アミノ酸付加acdS
配列番号１９： acdSコード配列
配列番号２０： acdS
配列番号２１： プライマー amp-ter_for
配列番号２２： プライマー amp-ter_rev
配列番号２３： amp-term断片
配列番号２４： プライマー gen_res-for2
配列番号２５： プライマー gen_res-rev2
配列番号２６： ゲンタマイシン耐性遺伝子含有断片
配列番号２７： プライマー pBRori_for
配列番号２８： プライマー pBRori_rev
配列番号２９： 大腸菌複製起点領域含有断片
配列番号３０： プライマー gen_res-for1
配列番号３１： プライマー rec_NdeI
配列番号３２： プライマー rec_EcoRI
配列番号３３： プライマー acdS-NcoI
配列番号３４： プライマー acdS-SpeI
配列番号３５： プライマー acds_NdeI
配列番号３６： プライマー acdS_EcoRI
配列番号３７： プライマー 1st_acdS-RBamHI
配列番号３８： プライマー 2nd_acdS-FBamHI
配列番号３９： プライマー 2nd_acdS-RXbaI
配列番号４０： プライマー 3rd_acdS-FXbaI
配列番号４１： プライマー 3rd_acdS-FXbaI
配列番号４２： プライマー 3rd_acdS-RNcoI
配列番号４３： プライマー 4th_acdS-FNcoI
配列番号４４： プライマー 4th_acdS-RPstI
配列番号４５： プライマー 5P_acdS-FpstI
配列番号４６： プライマー Plac_NcoI_tandem
配列番号４７： プライマー dnak-fusF
配列番号４８： プライマー dnak-fusR
配列番号４９： プライマー Plac-ATG
配列番号５０： dnak_ACDS断片
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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