(57)【要約】  【課題】本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の悪性度を診断するためのマーカーおよび方法、および該診断に用いられる組成物、ならびにＧＩＳＴの処置に用いられる組成物を提供することを目的とする。  【解決手段】消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の悪性度判定の指標を得るための方法であって、試料における１または２以上のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定するステップを含む、前記方法、該方法に用いられる組成物、ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤を含む組成物を提供することにより、上記課題が解決された。【選択図】図３Ｂ
2013128434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の悪性度判定の指標を得るための方法であって、試料における１または２以上のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現が、ＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現が、少なくともｍｉＲ−１９６ａ（配列番号１）の発現を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現が、少なくともＨＯＴＡＩＲ（配列番号２）の発現を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
さらにＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現を測定するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現が、ＨＯＸＣ遺伝子の発現である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現が、ＨＯＴＡＩＲの発現である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
測定が、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲによって行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現産物と特異的に結合する成分を含む、ＧＩＳＴの悪性度診断用組成物。
【請求項１０】
ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現産物と特異的に結合する成分が、該ＨＯＸ関連遺伝子領域の配列もしくはその一部分を有する核酸、またはＨＯＸ関連遺伝子領域の配列もしくはその一部分と相補的な配列を有する核酸である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ｍｉＲ−１９６ａ（配列番号１）である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ＨＯＴＡＩＲ（配列番号２）である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１３】
１または２以上の請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物を含む、ＧＩＳＴの悪性度診断用キット。
【請求項１４】
ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤を含む、ＧＩＳＴ処置用医薬組成物。
【請求項１５】
ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ＨＯＸＣ関連遺伝子領域である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ＨＯＴＡＩＲである、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤が、ＨＯＸ関連遺伝子領域に対するｓｉＲＮＡを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の悪性度を診断するためのマーカーおよび方法、および該診断に用いられる組成物、ならびにＧＩＳＴの処置に用いられる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）は、消化管の間葉腫瘍の中でも最も一般的なものである。ＧＩＳＴは主に胃（６０％）および小腸（２５％）において発生するが、結腸および直腸（５％）、食道（２％）ならびに他の臓器（３％）などでも発生する。免疫組織化学的には、ＧＩＳＴはＫＩＴおよびＣＤ３４陽性であり、他の神経および平滑筋細胞マーカーに対しては陰性であるか可変的に陽性である。ＫＩＴおよびＣＤ３４の発現は、小腸腸壁に存在し、消化管運動を制御する小腸カハール細胞（ＩＣＣ）の特性である。したがってＧＩＳＴはＩＣＣまたはＩＣＣの前駆細胞由来であると考えられている。
【０００３】
ＫＩＴ変異の活性化は８０％から９０％のＧＩＳＴにおいて同定され、血小板由来増殖因子受容体アルファ（ＰＤＧＦＲＡ）遺伝子の変異は、約５％のＧＩＳＴにおいて観察される。そうした中で、メシル酸イマチニブ（かつてのＳＴＩ５７１）がチロシンキナーゼ阻害剤として開発され、これはＢＣＲ−ＡＢＬ、ＫＩＴおよびＰＤＧＦＲの活性阻害を示す。メシル酸イマチニブは現在慢性骨髄性白血病および転移性ＧＩＳＴの両方の処置に用いられている。
【０００４】
ＧＩＳＴの生物学的ポテンシャルを予測することは難しく、悪性化能力を有する腫瘍をより正確に特定することができる変数を定義するために、多大な努力が為されてきた。ほとんどの分類体系において、悪性化能力の予測因子は腫瘍サイズおよび分裂速度であり、さらにより可変な度合いとしては、増殖指数または腫瘍部位である。他の潜在的なおよび有望なＧＩＳＴ悪性度のマーカーは分子変化である。上述の通り、多数のＧＩＳＴは、活性化されたＫＩＴまたはＰＤＧＦＲＡ変異を呈する。しかしながら、変異ステータス自体だけでは、ＧＩＳＴの多様な生態を完全に説明することはできず、高リスクのＧＩＳＴの進行には追加の分子変化が必要であると考えられている。例えば、ＣＤ２６（ＤＰＰ４によってコードされる）の発現は、胃のＧＩＳＴを有する患者の低い生存率と強く関連し、疾患の悪性進行に関与していることを示唆している（非特許文献１）。さらに、反復ＤＮＡ配列（repetitive DNA elements）の低メチル化が、悪性ＧＩＳＴにおいて優位に観察されることおよび網羅的な低メチル化が染色体異常の増加と関与していることが示された（非特許文献２）。
【０００５】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、部分的に相補的な部位とのベースペアリングを通じて標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または直接的な分解を誘導することにより、遺伝子発現を制御する低分子非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは生物種間で高度に保存されており、発生、分化、細胞増殖およびアポトーシスなどを含む様々な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。これらのプロセスにおけるｍｉＲＮＡの役割と合致して、多くの研究において、癌におけるｍｉＲＮＡ発現の広範な変化が実証されている。網羅的なｍｉＲＮＡ発現プロファイルならびに特異的なｍｉＲＮＡの発現が、疾患の予後および臨床成績に関係していることもまた示されている。しかしながら今日まで、ＧＩＳＴのｍｉＲＮＡ発現は、少数のグループにしか研究されておらず、予後マーカーとしての役割を果たす特異的ｍｉＲＮＡは未だに同定されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yamaguchi et al., J. Clin Oncol, 26:4100-4106
【非特許文献２】Igarashi et al., Clin. Cancer Res. 2010;16:5114-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の悪性度を診断するためのマーカーおよび方法、および該診断に用いられる組成物、ならびにＧＩＳＴの処置に用いられる組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、何がＧＩＳＴの悪性化能力に寄与しているのかを調査するため、ＧＩＳＴにおける網羅的なｍｉＲＮＡ発現パターン調査を行ったところ、マイクロＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ（以下、ｍｉＲ−１９６ａとする。）の上方制御が、ＧＩＳＴ患者のリスクの高さおよび予後の悪さに関係していることを見出した。そしてｍｉＲ−１９６ａの過剰発現がＨＯＸ関連遺伝子および転移関連非コードＲＮＡの過剰発現を伴うという新たな知見を得、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の悪性度判定の指標を得るための方法であって、試料における１または２以上のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定するステップを含む、前記方法。
［２］ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現が、ＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現である、［１］に記載の方法。
［３］ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現が、少なくともｍｉＲ−１９６ａ（配列番号１）の発現を含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現が、少なくともＨＯＴＡＩＲ（配列番号２）の発現を含む、［１］または［２］に記載の方法。
【００１０】
［５］さらにＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現を測定するステップを含む、［３］に記載の方法。
［６］ＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現が、ＨＯＸＣ遺伝子の発現である、［５］に記載の方法。
［７］ＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現が、ＨＯＴＡＩＲの発現である、［５］または［６］に記載の方法。
［８］測定が、マイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲによって行われる、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
【００１１】
［９］ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現産物と特異的に結合する成分を含む、ＧＩＳＴの悪性度診断用組成物。
［１０］ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現産物と特異的に結合する成分が、該ＨＯＸ関連遺伝子領域の配列もしくはその一部分を有する核酸、またはＨＯＸ関連遺伝子領域の配列もしくはその一部分と相補的な配列を有する核酸である、［９］に記載の組成物。
［１１］ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ｍｉＲ−１９６ａ（配列番号１）である、［９］または［１０］に記載の組成物。
［１２］ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ＨＯＴＡＩＲ（配列番号２）である、［９］または［１０］に記載の組成物。
【００１２】
［１３］１または２以上の［９］〜［１２］のいずれか１つに記載の組成物を含む、ＧＩＳＴの悪性度診断用キット。
［１４］ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤を含む、ＧＩＳＴ処置用医薬組成物。
［１５］ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ＨＯＸＣ関連遺伝子領域である、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］ＨＯＸ関連遺伝子領域が、ＨＯＴＡＩＲである、［１４］または［１５］に記載の医薬組成物。
［１７］ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤が、ＨＯＸ関連遺伝子領域に対するｓｉＲＮＡを含む、［１４］〜［１６］のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、ＧＩＳＴの悪性度を診断することが可能な分子マーカーを提供することができる。そしてこの分子マーカーを用いた本発明の方法により、従来では侵襲性が高く、確実ではなかったＧＩＳＴの悪性度の診断を、簡便かつ的確に行うことができる。特に、従来ＧＩＳＴのマーカーとして知られていたＣＤ２６は胃のＧＩＳＴにのみしか用いられなかったが、本発明のマーカーは胃以外のＧＩＳＴにも適用可能である。さらに、本発明のマーカーとしてｍｉＲＮＡを用いる場合、パラフィン包埋試料やホルマリン固定した試料から容易に検出することができるため、試料の調製などが非常に簡便となる。
【００１４】
また、本発明らによって見出された新たな事実であるｍｉＲ−１９６ａの上方制御に伴い、ＨＯＸ遺伝子領域の発現もまた上方制御されるため、かかる遺伝子領域にコードされる遺伝子や非コードＲＮＡもまた本発明のマーカーとして用いることができる。ＨＯＸ関連遺伝子、とくにＨＯＸＣ遺伝子やＨＯＸＣ関連遺伝子領域にコードされる非コードＲＮＡであるＨＯＴＡＩＲは、ＧＩＳＴの処置にも用いることができ、ＧＩＳＴ処置用の新規組成物を提供することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、ＧＩＳＴにおけるｍｉＲＮＡの発現特性を表す。左図は、３２個のＧＩＳＴ標本からのｍｉＲＮＡマイクロアレイ結果の、教師なし階層的クラスタリング分析結果である。行はプローブセットを表し、列は患者を表す。リスク分類および腫瘍部位は下部に記載してあるとおりである。１６個のＧＩＳＴからアレイＣＧＨを通じて得られた染色体１４ｑの状態もまた、下部に示してある。１４ｑ３２．３１に位置するｍｉＲＮＡは、左側の赤い棒線で示してある。右図は、左図において赤い棒線で示された部分を拡大したものである。左図と同様、リスク分類、腫瘍位置、１４ｑ染色体の状態が下に示してある。各図の下部においてカラーバーで示したとおり、正規化データと比較して発現が上昇しているものは赤で示され、発現が低下しているものは青で示され、変化のないものは黄色で示されている。一部の試料において、左図の赤い棒線で示されたマイクロＲＮＡの発現が顕著に上方制御されており、これらのマイクロＲＮＡが発現上昇している試料群は、階層的クラスタリングによって独立したクラスタを形成すると分析された。
【００１６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、分布図分析の結果を表す。上図は低リスク（ｎ＝１０）対高リスク（ｎ＝１４）のプロットであり、下図は中リスク（ｎ＝８）対高リスク（ｎ＝１４）のプロットである。これによりｍｉＲ−１９６ａが高リスクＧＩＳＴにおいて過剰発現していることが明らかとなった。マイクロアレイデータは正規化され、対数変換（底は２）されている。ｍｉＲ−１９６ａの発現は円でハイライトされている。
【図１Ｃ】図１Ｃは、３２個のＧＩＳＴ標本のマイクロアレイ分析から得られた、ｍｉＲ−１９６ａ発現レベルを表すグラフである。リスク分類は下部に示されている。
【００１７】
【図２Ａ】図２Ａは、マイクロアレイ分析を通じて、およびTaqManＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝３２）を通じて検出された、ＧＩＳＴ標本におけるｍｉＲ−１９６ａ発現レベルの間の相関を表すプロットである。マイクロアレイデータは正規化され、対数変換（底は２）されており、ＲＴ−ＰＣＲ結果は内在性Ｕ６ｓｎＲＮＡ発現を用いて正規化されている。ピアソン相関係数およびＰ値は示されたとおりである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＧＩＳＴにおけるｍｉＲ−１９６ａ発現の上方制御が高リスク度と関連することを示す図である。左は発見コホートにおける低（ｎ＝１４）、中（ｎ＝１４）および高（ｎ＝２３）リスクＧＩＳＴにおける、TaqManＲＴ−ＰＣＲを用いたｍｉＲ−１９６ａ発現の比較であり、中央は検証コホートにおける非常に低または低（ｎ＝４６）、中（ｎ＝２５）および高（ｎ＝２６）リスクＧＩＳＴにおける、TaqManＲＴ−ＰＣＲを用いたｍｉＲ−１９６ａ発現の比較であり、右図は全ての試料におけるｍｉＲ−１９６ａ発現の比較である。結果は内在性Ｕ６ｓｎＲＮＡで正規化されている。
【００１８】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＧＩＳＴにおけるｍｉＲ−１９６ａ発現の上方制御が悪い予後と関連することを示す図である。左から順に発見コホート、検証コホート、全ＧＩＳＴ患者における生存率に対するｍｉＲ−１９６ａ発現の効果を示すカプラン・マイヤー曲線である。図中highはｍｉＲ−１９６ａ／Ｕ６≧１．４であり、lowはｍｉＲ−１９６ａ／Ｕ６＜１．４である集団を意味する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、食道、胃、小腸、および直腸結腸に位置するＧＩＳＴにおけるｍｉＲ−１９６ａ発現の比較である。
【００１９】
【図３Ａ】図３Ａは、ＧＩＳＴの遺伝子発現特性がｍｉＲ−１９６ａとＨＯＸＣ遺伝子との間に強い相関があることを示す図の１つであり、ｍｉＲ−１９６ａ発現と相関する遺伝子発現特性のヒートマップである。行はプローブセットを表し、列は患者を表す。全４９４７プローブセットのうち、ｍｉＲ−１９６ａが過剰発現している（ｎ＝７）およびしていない（ｎ＝７）ＧＩＳＴの間で異なって発現している（＞２倍の変化）ものを選択した後、階層的クラスタリングを行った。各図の下部においてカラーバーで示したとおり、正規化データと比較して発現が上昇しているものは赤で示され、発現が低下しているものは青で示され、変化のないものは黄色で示されている。ｍｉＲ−１９６ａ発現状態は、過剰発現している患者は赤丸で、過剰発現していない患者は青丸で下部に示してある。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＨＯＸ遺伝子クラスタ内の、ｍｉＲ−１９６ａファミリーの位置を表す模式図である。
【００２０】
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＨＯＸＢ（左図）およびＨＯＸＣ（右図）発現データを用いた階層的クラスタリング分析の結果である。各図の下部においてカラーバーで示したとおり、正規化データと比較して発現が上昇しているものは赤で示され、発現が低下しているものは青で示され、変化のないものは黄色で示されている。ｍｉＲ−１９６ａ発現状態は、過剰発現している患者は赤丸で、過剰発現していない患者は青丸で下部に示してある。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＨＯＸＡ（上図）およびＨＯＸＤ（下図）発現データを用いた階層的クラスタリング分析の結果である。各図の下部においてカラーバーで示したとおり、正規化データと比較して発現が上昇しているものは赤で示され、発現が低下しているものは青で示され、変化のないものは黄色で示されている。ｍｉＲ−１９６ａ発現状態は、過剰発現している患者は赤丸で、過剰発現していない患者は青丸で下部に示してある。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ｍｉＲ−１９６ａの発現レベルおよびＨＯＸＣ遺伝子発現レベルまたはＨＯＴＡＩＲ発現レベルの間の相関を示す図である。ｍｉＲ−１９６ａの発現はTaqManＲＴ−ＰＣＲを用いて分析され、内在性Ｕ６ｓｎＲＮＡに対して正規化されている。ＨＯＸＣおよびＨＯＴＡＩＲについてのマイクロアレイデータは正規化および対数変換（底は２）されている。ピアソン相関係数およびＰ値は示されたとおりである。
【００２１】
【図３Ｆ】図３Ｆは、ｍｉＲ−１９６ａの発現レベルおよびＨＯＸＢ遺伝子発現レベルの間の相関を示す図である。ｍｉＲ−１９６ａの発現はTaqManＲＴ−ＰＣＲを用いて分析され、内在性Ｕ６ｓｎＲＮＡに対して正規化されている。ＨＯＸＢについてのマイクロアレイデータは正規化および対数変換（底は２）されている。ピアソン相関係数およびＰ値は示されたとおりである。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ＧＩＳＴ標本（ｎ＝２７）における染色体１２および１７のアレイＣＧＨの結果を表す。増幅を示した遺伝子座を赤で、欠損を示した遺伝子座を緑で表してあり、ｍｉＲ−１９６ａの発現状態は、過剰発現している患者は赤丸で、過剰発現していない患者は青丸で下部に示してある。いずれのＧＩＳＴもＨＯＸＢ（１７ｑ２１）またはＨＯＸＣ（１２ｑ１３）の遺伝子座において増幅を示していないことから、これらのＧＩＳＴにおけるＨＯＸＢおよびＨＯＸＣの発現上昇は単なる物理的なコピー数の増大に起因するものではないことが示唆される。
【００２２】
【図４Ａ】図４Ａは、マイクロアレイ分析およびTaqManＲＴ−ＰＣＲ（ｎ＝３２）を用いて検出された、ＧＩＳＴ標本におけるＨＯＴＡＩＲ発現レベルの間の相関を表すプロットである。マイクロアレイデータは正規化され、対数変換（底は２）されており、ＲＴ−ＰＣＲ結果は内在性ＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化されている。ピアソン相関係数およびＰ値は示されたとおりである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、悪性ＧＩＳＴにおけるＨＯＴＡＩＲの上方制御の様子を表す図の１つであり、ＧＩＳＴ標本パネル（ｎ＝５２）におけるＨＯＴＡＩＲの上方制御のTaqManＲＴ−ＰＣＲ分析を表すグラフである。結果は内在性ＧＡＰＤＨ発現を用いて正規化され、リスク分類は下部に示されている。
【００２３】
【図４Ｃ】図４Ｃは、TaqManＲＴ−ＰＣＲを用いて検出された、ＨＯＴＡＩＲおよびｍｉＲ−１９６ａ発現のレベルの間の相関を表す図である。ピアソン相関係数およびＰ値は示されたとおりである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、TaqManＲＴ−ＰＣＲを用いて検出された、ＧＩＳＴ標本におけるＨＯＴＡＩＲ発現と、マイクロアレイ分析を通じて検出されたＨＯＸＣ発現のレベルとの間の相関を表す図である。ピアソン相関係数およびＰ値は示されたとおりである。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＧＩＳＴ患者の全生存に対するＨＯＴＡＩＲ発現の効果を示すカプラン・マイヤー曲線である。図中highはＨＯＴＡＩＲ／ＧＡＰＤＨ≧０．０００２であり、lowはＨＯＴＡＩＲ／ＧＡＰＤＨ＜０．０００２である集団を意味する。
【００２４】
【図５Ａ】図５Ａは、ｍｉＲ−１９６ａとその予測される標的遺伝子との関係を表す図である。左図はｍｉＲ−１９６ａを過剰発現するＧＩＳＴにおいて下方制御されている遺伝子（＞２倍の変化）の数および計算上予測されるｍｉＲ−１９６ａ標的遺伝子の数についてのベン図である。右図は、ＧＩＳＴ試料において下方制御されていた９５個のｍｉＲ−１９６ａ標的遺伝子（１３９個のプローブセット）のヒートマップである。ｍｉＲ−１９６ａ発現状態は上部に示され、代表的な標的遺伝子は右部に示されている。正規化データと比較して発現が上昇しているものは赤で示され、発現が低下しているものは青で示され、変化のないものは黄色で示されている。ｍｉＲ−１９６ａが高発現している試料群において、ＨＯＸファミリー遺伝子やＡＮＸＡ１といった遺伝子の発現が下方制御されていることがわかる。
【００２５】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＯＴＡＩＲとＨＯＴＡＩＲ誘導性ＰＲＣ２の標的遺伝子として従前知られた遺伝子との関係を表す図である。左図はＨＯＴＡＩＲを過剰発現するＧＩＳＴにおいて下方制御されている遺伝子（＞２倍の変化）の数およびＨＯＴＡＩＲ誘導性ＰＲＣ２の標的遺伝子として従前知られた遺伝子の数についてのベン図である。右図は、ＧＩＳＴ試料において下方制御されていた１４４個のＨＯＴＡＩＲ誘導性ＰＲＣ２標的遺伝子（１８６個のプローブセット）のヒートマップである。ＨＯＴＡＩＲ発現状態は上部に示され、代表的な標的遺伝子は右部に示されている。正規化データと比較して発現が上昇しているものは赤で示され、発現が低下しているものは青で示され、変化のないものは黄色で示されている。ＨＯＴＡＩＲが高発現している試料群において、ＥＰＨＡ７、ＷＮＴ５Ａ、ＪＡＭ２などといったタンパク質が下方制御されていることがわかる。
【００２６】
【図６Ａ】図６Ａは、ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞におけるTaqManアッセイの結果である。左図はｍｉＲ−１９６ａの結果であり、右図はＨＯＴＡＩＲの結果である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞におけるＨＯＸＣクラスター遺伝子のクロマチン特徴を表す。下に示した遺伝子の転写開始領域におけるトリメチル化ヒストンＨ３リジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）修飾はＣｈＩＰ−ＰＣＲにより解析された。ＨＯＸＣ１３の５ｋｂ上流の非遺伝子領域をコントロールとして示している。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞におけるｍｉＲ−１９６ａの機能解析である。上図は、抗ｍｉＲ−１９６ａ阻害分子でトランスフェクトしたＧＩＳＴ−Ｔ１細胞またはネガティブコントロールを用いた細胞バイアビリティアッセイを示す。細胞バイアビリティはトランスフェクションの４８時間後に決定した。下図は、抗ｍｉＲ−１９６ａ阻害分子でトランスフェクトしたＧＩＳＴ−Ｔ１細胞またはネガティブコントロールを用いたマトリゲル侵襲アッセイを示す。右に示されているのは、膜毎の３つの無作為な顕微鏡野の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。
【００２７】
【図６Ｄ】図６Ｄは、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮＴ）またはＨＯＴＡＩＲを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＯＴ）でトランスフェクトしたＧＩＳＴ−Ｔ１細胞における、ＨＯＴＡＩＲについてのTaqManアッセイを示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ｓｉＣＯＮＴまたはｓｉＨＯＴでトランスフェクトしたＧＩＳＴ−Ｔ１細胞を用いた細胞バイアビリティアッセイを示す。細胞バイアビリティアッセイは、トランスフェクションの４８時間後に決定された。結果は８回の繰り返しの平均を示してあり、エラーバーは標準偏差を表す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ｓｉＣＯＮＴまたはｓｉＨＯＴでトランスフェクトしたＧＩＳＴ−Ｔ１細胞を用いたマトリゲル浸潤アッセイを示す。右に示されているのは、膜毎の３つの無作為な顕微鏡野の平均であり、エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は１つの側面において、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の悪性度判定の指標を得るための方法であって、試料における１または２以上のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定するステップを含む、前記方法に関する。
本発明で用いる場合、消化管間質腫瘍（gastrointestinal stromal tumor、ＧＩＳＴともいう）とは、胃や腸などの消化管の壁に発生する間葉系腫瘍のことをいい、消化管壁の筋肉の層にあるカハール介在細胞が異常増殖して腫瘍となったものであると考えられている。通常の消化器系癌が粘膜上皮から発生するのに対し、ＧＩＳＴは粘膜の下の筋肉層に発生する点で大きく異なり、したがって同じ腫瘍ではあっても、その性質も特徴も癌とは全く異なる。ＧＩＳＴは主に胃および小腸で発生するが、直腸および結腸、食道あるいは他の器官でも発生し得る。本発明において、ＧＩＳＴの発生部位は消化管内であればいかなる部位でもよいが、好ましくは食道、胃、小腸および大腸であり、より好ましくは胃および小腸、最も好ましくは胃である。
【００２９】
ＧＩＳＴ治療の第一選択肢は通常外科的切除であり、その後切除したＧＩＳＴの「リスク」に応じた経過観察が行われる。通常このリスクは、腫瘍径や細胞分裂速度などを基準に分類される。腫瘍径が大きいおよび／または細胞分裂が活発であるほど転移や再発の可能性が高く、高リスクに分類される。本発明において「悪性度」とは、転移や再発のリスクの高さをいい、リスクと同義として扱われる。悪性度の分類としては、従来使用されている分類をそのまま用いてもよいし、用いる指標に依存して適切な分類法で分類されてもよい。
【００３０】
悪性度判定の指標は、何を計測するかに依存して変化し得、これに限定するものではないが、例えば、特定の遺伝子の発現を計測する場合は転写産物であるｍｉＲＮＡやｍＲＮＡの発現量、翻訳産物であるタンパク質の発現量などが指標になり得る。また、直接これらの発現量を測定してもよいし、例えば発現産物を蛍光標識や放射線標識した後、蛍光強度や放射線強度を計測するなど、別の指標に基づいて間接的に測定してもよい。かかる間接的な指標もまた、本発明の指標に包含され得る。当業者であれば、本発明に包含される指標について、直ちに理解することができるだろう。
本発明において、「発現」とは、あるＤＮＡ配列が対応する相補的なＲＮＡに転写されること、または対応するコードされたポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されることをいう。また本発明において「遺伝子領域」という語は、コード領域および非コード領域を含む、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するために必要なゲノム上に存在するＤＮＡ配列の領域をいう。したがって「遺伝子領域の発現」とは、特定の遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するために必要なＤＮＡ配列またはその一部が、当該配列またはその一部に相補的なＲＮＡに転写されるか、または特定の遺伝子によってコードされるタンパク質またはその一部に翻訳されることをいう。例えば「ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現」といった場合、コード領域も非コード領域も含め、ＨＯＸ遺伝子またはそのホモログ遺伝子がコードされているゲノム領域に存在する任意のＤＮＡ配列の発現を言う。したがってコード領域にコードされるタンパク質そのものやスプライシング後のｍＲＮＡまたはそれらの断片はもちろん、非コード領域に由来するｍｉＲＮＡなどの非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）なども含まれる。
【００３１】
「遺伝子領域の発現を測定する」とは、特定の遺伝子領域に該当するＤＮＡ配列に由来する任意の発現産物の存在や発現量を測定することをいう。測定の方法は、当該技術分野において知られた任意の方法を用いてよく、これに限定するものではないが例えば、転写産物であるＲＮＡの存在を確認するためのマイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、など、発現量を測定するためのリアルタイムＰＣＲ、など翻訳産物であるタンパク質の存在を測定するための免疫組織染色、ウェスタンブロッティングなど、発現量を測定するための紫外線吸光法、蛍光染色法などが挙げられる。
【００３２】
一態様において、本発明の方法は、ＧＩＳＴを罹患しているか、または罹患している疑いのある対象において、ＧＩＳＴの悪性度を診断するための指標を得る方法を含む。したがって、ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定される試料は、好ましくは測定の対象に由来する試料である。試料としては、これに限定するものではないが、例えば手術により切除された試料、バイオプシーのために採取された試料、対象から採取された血液試料などが挙げられる。また、パラフィン包埋やホルマリン固定などの処理が行われた試料であっても本発明の方法に用いることが可能であるが、採取後フレッシュな状態の試料でももちろん可能である。
【００３３】
本発明において、「対象」は、ＧＩＳＴに罹患するリスクを有するあらゆる動物を意味し、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類であり、最も好ましくはヒトである。
上記態様にかかる本発明の方法により、対象におけるＧＩＳＴの発症、転移、再発のリスクを診断することも可能である。したがってかかる診断方法も本発明に包含される。
【００３４】
本発明において「ＨＯＸ関連遺伝子領域」は、ホメオボックス遺伝子またはそのホモログがコードされたゲノム領域のことをいい、これに限定するものではないが、例えば脊椎動物では、ＨＯＸＡ、ＨＯＸＢ、ＨＯＸＣおよびＨＯＸＤの４つのＨＯＸクラスタ領域のことを意味する。本発明の一態様において、ＨＯＸ関連遺伝子領域は、好ましくはＨＯＸＢ関連遺伝子領域および／またはＨＯＸＣ関連遺伝子領域である。特に好ましいのはＨＯＸＣ関連遺伝子領域である。本明細書中、例えば「ＨＯＸＣ遺伝子」という場合、ＨＯＸＣ関連遺伝子領域（「ＨＯＸＣクラスタ」と互換的に用いられる）中にコードされた遺伝子を意味する。ＨＯＸＣ遺伝子としては、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３が知られている。
【００３５】
本発明の好ましい態様として、ＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現が、ＨＯＴＡＩＲの発現である。ＨＯＴＡＩＲはHOX transcript antisense intergenic RNAの略称であり、ＨＯＸＣクラスタに存在する非コードＲＮＡである。ＨＯＴＡＩＲは、ポリコーム抑制性複合体２（polycomb repressive complex 2：ＰＲＣ２）と相互作用し、ＨＯＸＤクラスタの遺伝子発現をトランスに制御することで知られている（Rinn et al., Cell 129, 1311-23. (2007)）。近年、乳癌においてＨＯＴＡＩＲを過剰発現させると、ＰＲＣ２が８００以上の遺伝子プロモーターとして機能し、ヒストンのＨ３Ｋ２７におけるメチル化および標的遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングに導くことが示され、本発明者らにより、高リスクのＧＩＳＴにおいてもＨＯＴＡＩＲが特異的に強発現していることが初めて示された。したがって、試料中のＨＯＸＣ関連遺伝子領域、特にＨＯＴＡＩＲの発現を測定し、ネガティブコントロール中の発現と比較して発現が有意に高い場合、当該試料中のＧＩＳＴは高リスクＧＩＳＴであると判定できる。コントロールとしては、高リスクＧＩＳＴではないことが既知であるものであればいかなるものも用いることができ、これに限定するものではないが、例えば同一対象の採取部位の正常組織、他の分類方法において高リスクではないと分類されたＧＩＳＴなどが挙げられる。
【００３６】
ＨＯＸ関連遺伝子領域は、様々な領域の発現産物が相互に別の領域の発現を制御していると考えられている。例えば、ｍｉＲ−１９６ａは、下流のＨＯＸＢ８やＨＯＸＣ８などの発現を制御していることが知られている。したがって、ある好ましい態様において、１つの試料中において、２以上のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定する。
【００３７】
本発明の別の好ましい態様として、ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現が、ｍｉＲ−１９６ａの発現である。ｍｉＲ−１９６ａは、ＨＯＸＢおよびＨＯＸＣクラスタに存在し、ＨＯＸ８Ｂ、ＨＯＸ８Ｃ、ＨＯＸ８Ｄなどの発現を制御するマイクロＲＮＡである。近年、ｍｉＲ−１９６ａは乳癌や食道癌において強発現していること、大腸癌ＳＷ４８０においてｍｉＲ−１９６ａを強制発現させると、浸潤性、転移性などが増大することなどが報告されている（例えばLuthra et al., Oncogene., 2008;27:6667-78、Li et al., Cancer Res., 2010;70:7894-904, Schimanski et al., World J. Gastroenterol, 2009 15(17):2089-2096など）。一方で、悪性のメラノーマにおいては発現が低下し、ｍｉＲ−１９６ａを強制発現させることにより、侵襲性が低下することも報告されている（Mueller et al., Int J. Cancer, Volume 129, Issue 5, pages 1064-1074）。本発明者らによって、高リスクのＧＩＳＴにおいてｍｉＲ−１９６ａが特異的に強発現していることが初めて示された。したがって、試料中のｍｉＲ−１９６ａの発現を測定し、ネガティブコントロール中の発現と比較して発現が有意に高い場合、当該試料中のＧＩＳＴは高リスクＧＩＳＴであると判定できる。コントロールとしては、高リスクＧＩＳＴではないことが既知であるものであればいかなるものも用いることができ、これに限定するものではないが、例えば同一対象の採取部位の正常組織、他の分類方法において高リスクではないと分類されたＧＩＳＴなどが挙げられる。
【００３８】
癌においては、ｍｉＲ−１９６ａの発現と悪性化にはある種の相関があると考えられているものの、上記の通り癌種によって悪性度と発現量が異なっていることから、その役割については明確になっておらず、癌種によって異なっていることが予想される。ｍｉＲ−１９６ａは下流のＨＯＸＢ７およびＨＯＸＣ８の発現を下方制御することが知られており、これらが同時に強発現している例は知られていなかったが、本発明者らは、高リスクのＧＩＳＴにおいてはｍｉＲ−１９６ａとＨＯＸＣ関連遺伝子領域が同時に強発現していることを新たに見出した。したがって本発明の一態様において、複数のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定するステップが含まれる。かかる態様において、好ましくは測定されるＨＯＸ関連遺伝子領域の少なくとも１つはｍｉＲ−１９６ａである。より好ましい態様においては、少なくともｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＸＣ関連遺伝子領域の発現を測定するステップを含む。さらに好ましい態様において、少なくともｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＸＣ遺伝子の発現を測定するステップを含む。別のさらに好ましい態様においては、少なくともｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＴＡＩＲの発現を測定するステップを含む。
【００３９】
本発明の方法は、例えば生検試料などを用いて行うことができる。試料から上記指標を生検試料はしばしばホルマリン固定、パラフィン包埋されるため、これらの処理後も安定的に検出可能である、マイクロＲＮＡの発現を検出することが好ましい。したがって、マイクロＲＮＡを簡便に検出する手段であるマイクロアレイまたはＲＴ−ＰＣＲによって行われることが好ましい。
さらに本発明には、上記指標を得るための方法において得られた指標を用いて、ＧＩＳＴの悪性度を診断する方法も包含する。
【００４０】
本発明は、別の側面において、上記側面における診断方法に用いることができる診断用組成物も包含する。診断用の指標は、上述の通り、ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定することで得られるので、本発明の診断用組成物は、遺伝子領域の発現を測定することができる成分を含む。遺伝子領域の発現を測定することができる成分は、測定する発現産物に依存して変化し得、当業者は適宜選択することが可能である。かかる成分としては、発現産物に特異的に結合することができる成分であれば何でもよく、発現産物が転写産物である場合は、これに限定するものではないが例えば、転写産物ＲＮＡに相補的な配列を有する核酸、転写産物と特異的に結合するプローブなどが挙げられ、発現産物が翻訳産物である場合は、これに限定するものではないが例えば、翻訳産物タンパク質に特異的に結合する抗体などが挙げられる。本発明の方法において計測される発現産物としては転写産物ＲＮＡが好ましいので、診断用組成物に含まれる成分としても好ましくは、ＨＯＸ関連遺伝子領域の配列もしくはその一部分、またはＨＯＸ関連遺伝子領域の配列もしくはその一部分と相補的な配列を有する核酸である。かかる核酸としては、これに限定するものではないが例えば、ＨＯＸタンパク質をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ、ＨＯＴＡＩＲやｍｉＲ−１９６ａなどのｎｃＲＮＡに対するｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
【００４１】
ある好ましい態様において、本発明の診断用組成物は、ｍｉＲ−１９６ａの発現産物と特異的に結合する成分を含有する。これにより、ｍｉＲ−１９６ａの発現産物の存在を測定することが可能である。ｍｉＲ−１９６ａの発現産物と特異的に結合する成分としては、これに限定するものではないが例えば、ｍｉＲ−１９６ａ（配列番号１）またはその一部分と相補的な配列を有する核酸である。
別の好ましい態様において、本発明の診断用組成物は、ＨＯＴＡＩＲの発現産物と特異的に結合する成分を含有する。これにより、ＨＯＴＡＩＲの発現産物の存在を測定することが可能である。ＨＯＴＡＩＲの発現産物と特異的に結合する成分としては、これに限定するものではないが例えば、ＨＯＴＡＩＲ（配列番号２）またはその一部分と相補的な配列を有する核酸である。
上述の通り、ある好ましい態様においては、２以上のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を測定する。したがって、本発明の診断用組成物も、２種以上のＨＯＸ関連遺伝子領域の発現産物と特異的に結合する成分を含み得る。特定の好ましい態様において、本発明の診断用組成物は、ｍｉＲ−１９６ａと特異的に結合する成分およびＨＯＴＡＩＲと特異的に結合する成分を含むことができる。
【００４２】
また本発明の一態様において、上記診断用組成物を含む、ＧＩＳＴの悪性度診断用キットも包含される。診断用キットに含まれる他の要素としては、これに限定するものではないが例えば、組成物を梱包する容器、上記診断用組成物の調製方法や使用方法などが記載された説明書等などが含まれてよい。また、本発明のキットは、本発明の組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水、生理食塩水、緩衝液などを含んでいなくてもよい。
【００４３】
本発明は、高リスクのＧＩＳＴにおいて、ＨＯＸ関連遺伝子領域が高発現していることに基づくものであり、ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制することにより、ＧＩＳＴのリスクを低減させることができると考えられる。したがって、ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤を含む、ＧＩＳＴのリスクを低減させるための組成物も本発明に包含される。「ＧＩＳＴのリスクを低減させる」とは、ＧＩＳＴの転移や再発の危険性を低減させることをいい、より好ましくは、ＧＩＳＴを処置することをいう。したがって好ましくは、ＧＩＳＴのリスクを低減させるための組成物は、ＧＩＳＴ処置用医薬組成物である。
【００４４】
抑制するＨＯＸ関連遺伝子領域は、高リスクのＧＩＳＴに特徴的に発現している遺伝子領域であればいかなるものでもよいが、好ましくはＨＯＸＣ関連遺伝子発現領域であり、より好ましくはＨＯＴＡＩＲである。
本発明において「遺伝子領域の発現を抑制する」とは、遺伝子領域の発現産物が本来の機能を発揮することを妨げることをいう。したがって、転写や翻訳そのものを妨げることによって発現産物の生成自体を妨げてもよいし、発現産物が有する機能を阻害してもよい。発現そのものを妨げる例としては、これに限定するものではないが、例えば、転写因子の機能を抑制するなどが挙げられる。発現産物の機能を阻害する例としては、これに限定するものではないが、例えば、ｓｉＲＮＡなどによって転写産物を分解する、抗体やリガンドなどにより翻訳産物の機能を阻害する、特異的酵素などにより翻訳産物を不活性型に変化させるなどが挙げられる。
【００４５】
「ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤」は、当該技術分野において遺伝子領域の発現を抑制すると知られたいかなる剤も用いることができる。「遺伝子領域の発現」には転写も翻訳も含まれるため、どちらが抑制されても構わないが、転写産物、すなわちＲＮＡの状態で効果を発揮するｎｃＲＮＡも含まれることから、好ましくは転写を抑制する。中でも特定のＲＮＡを選択的に抑制できることから、ｓｉＲＮＡがより好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、ＨＯＸ関連遺伝子領域の発現を抑制する剤の他に、例えば薬学的に許容可能な担体、溶媒、他のＧＩＳＴ処置用化学治療剤など、当該技術分野において知られた、許容可能な任意の追加の成分を含んでよい。担体としては、これに限定するものではないが、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター、リポソームなどが挙げられる。溶媒としては、これに限定するものではないが、例えばＰＢＳ、蒸留水等の希釈剤、生理食塩水などが挙げられる。他のＧＩＳＴ処置用化学治療剤としては、これに限定するものではないが、例えばイマチニブ、スニチニブ、ニロチニブなどが挙げられる。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、経腸、静脈内、筋肉内、皮下、局所、肝内、胆管内、肺内、気道内、気管内、気管支内、経鼻、直腸内、動脈内、門脈内、心室内、骨髄内、リンパ節内、リンパ管内、脳内、髄液腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。当業者であれば以上の記載から、日常的な実験によって適切な用法、用量および許容可能な追加成分を決定し、剤形化することが可能であろう。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明について、さらに具体的に説明するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。当業者として通常の知識および技術を有するものは、本発明の精神を逸脱しない範囲で、下記実施例で示された態様に多様な改変を行うことができるが、かかる改変された態様も本発明に含まれる。
【００４９】
実験および結果
以下の実施例において、ＤＮＡコピー数は、アレイベース比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）で分析した。アレイＣＧＨは以下の通り行った。すなわち、新鮮な凍結保存ＧＩＳＴ標本からの５００ｎｇのゲノムＤＮＡおよび性別を合わせた正常対照ＤＮＡ（Promega, Madison, WI, USA）をGenome DNA Enzymatic Labeling Kit（Agilent Technologies）を用いてそれぞれＣｙ５およびＣｙ３で標識し、その後Human Genome CGH Microarray Kit 105A（G4412A；Agilent Technologies）にハイブリダイズさせた。Agilent Genomic Workbench ソフトウェア（Agilent Technologies）に含まれるADM-2アルゴリズムを、ＤＮＡコピー数異常を同定するのに用いた。コピー数欠失はｌｏｇ２比＜−０．５として定義し、コピー数増幅はｌｏｇ２比＞０．５として定義した。
【００５０】
以下の実施例においてトリメチル化ヒストンＨ３リジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）はクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）を用いて分析した。ＣｈＩＰは以下の通り行った。すなわち、細胞をホルマリンによってクロマチンを固定し、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体で免疫沈降後、ＨＯＸＣ遺伝子領域をＰＣＲ増幅することで、ＨＯＸＣ遺伝子領域のＨ３Ｋ４ｍｅ３状態を定量的に解析した。
【００５１】
以下の実施例において、統計的分析は以下の通り行った。
発現データの分布は対数正規分布に従うと見られているため、全ての遺伝子発現レベルは後続の統計的分析のために対数変換された。幾何平均はしたがって、発現レベルの要約統計量として算出された。連続変数の比較は、ｔテストまたは事後多重比較（ゲイムス−ハウエルテスト）での一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて行った。ピアソンの相関係数は２つの変数の相関の強さを記述するために計算された。カテゴリー変数の比較はフィッシャーの直接確率検定を用いて行われた。予後因子と遺伝子発現レベルとの間の関連性を査定するため、ロジスティックまたはＣｏｘ回帰分析を行った。これらの回帰分析のため、最適なカットオフ値を採用して、臨床学的因子について調節したまたは調節していない、オッズ比およびハザード比を計算した。カプラン・マイヤー曲線をプロットし、遺伝子発現ステータスによって層別化した２つのグループを比較した。全ての統計的分析はSPSS Statistics 18（IBM Corporation, Somers, NY, USA）を用いて行った。
【００５２】
例１．腫瘍試料の採取
計５６の新鮮な凍結保存したＧＩＳＴ標本を、札幌医科大学病院、恵佑会札幌病院および大阪大学病院から得た。加えて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片である１００個のＧＩＳＴ標本を、新潟大学病院から得た。標本収集の前に、全ての患者からインフォームドコンセントを得、本研究は各々の施設内倫理委員会に承認された。リスク度は、Fletcher et al.（Hum. Pathol. 2002;33:459-65）にて提案されたとおりのリスク決定システムにしたがって査定された。すなわち、径が＜２ｃｍであり、かつ４００倍の高倍率視野（ＨＰＦ）での観察において細胞分裂数が＜５／５０視野（以下＜５／５０ＨＰＦのように記す）であるものを「非常に低リスク」、径が２〜５ｃｍであり、かつ細胞分裂数が＜５／５０ＨＰＦであるものを「低リスク」、径が＜５ｃｍであり、かつ細胞分裂数が６〜１０／５０ＨＰＦであるもの、または径が５〜１０ｃｍであり、かつ細胞分裂数が＜５／５０ＨＰＦであるものを「中リスク」、径が＞５ｃｍであり、かつ細胞分裂数が＞５／５０ＨＰＦであるもの、または径が＞１０ｃｍであるもの、または細胞分裂数が＞１０／５０ＨＰＦであるものを「高リスク」と分類した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、新鮮な凍結保存組織標本から、mirVana miRNA Isolation Kit（Ambion, Austin, TX, USA）を用いて抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを、ＦＦＰＥ組織標本から、RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE（Ambion）を用いて抽出した。腫瘍組織は病理学者によって再調査され、肉眼解剖された（macrodissected）；本研究では顕微解剖は行われなかった。新鮮な凍結保存組織標本からは、ゲノムＤＮＡを標準的なフェノール−クロロホルム法を用いて抽出した。ＦＦＰＥ組織標本からは、QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００５３】
例２．ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析
単色マイクロアレイベースのｍｉＲＮＡ発現分析を、取扱説明書（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）にしたがって行った。簡潔には、新鮮な凍結保存のＧＩＳＴ組織からの１００ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを、miRNA Labeling Reagent（Agilent Technologies）を用いてラベリングし、その後ラベルしたＲＮＡを、８５９のヒトｍｉＲＮＡおよび８０のウイルスｍｉＲＮＡをカバーするHuman miRNA Microarray V3（Rel 12.0, G4470C; Agilent Technologies）とハイブリダイズさせた。一度ハイブリダイズさせたら、アレイをAgilent G2565BA Microarray Scanner（Agilent Technologies）を用いてスキャンし、データをFeature Extraction software ver. 10.7（Agilent Technologies）を用いて解析した。次にマイクロアレイデータをGeneSpring GX software ver. 11（Agilent Technologies）にインポートし、変位値正規化（quantile normalization）を行った。試料を、そのリスク度にしたがって３つのグループに分類し、散布図分析を行って、リスク度間で異なって発現しているｍｉＲＮＡを同定した。その後正規化したマイクロアレイデータをTaqManアッセイ結果と、GraphPad PRISM ver. 5（GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA）を用いて比較した。このｍｉＲＮＡマイクロアレイデータのGene Expression Omnibus登録番号はＧＳＥ３１７４１である。
【００５４】
上記ｍｉＲＮＡマイクロアレイ分析を、３２個の新鮮な凍結保存ＧＩＳＴ標本（低リスク１０個、中リスク８個および高リスク１４個）で行った。９３９個のプローブセットのうち、試験された試料のいずれにも検出可能なシグナルが存在しなかったために４７０個が除外された。残りの４６９個のプローブセットを用いた教師なし階層的クラスタリング（unsupervised hierarchical clustering）は、染色体１４ｑ３２．３１上にコードされるｍｉＲＮＡを豊富に発現するＧＩＳＴが、分離したクラスタを形成することを明らかにした（図１Ａ）。さらに本発明者らは、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルとアレイＣＧＨの結果とを比較することにより、このクラスタは１４ｑ欠失のない腫瘍において豊富であることを見出した。これらの結果は、１４ｑ欠失とＧＩＳＴにおける１４ｑ上に位置するｍｉＲＮＡ発現との逆相関を示す最近の報告と整合し、発明者らのマイクロアレイ分析の信頼性を示唆するが、クラスタリング分析はリスク分類に基づいた腫瘍の区別をしなかった。
【００５５】
続いて散布図分析を行い、発明者らは、低または中リスクのＧＩＳＴと比較して、高リスクのＧＩＳＴにおいてｍｉＲ−１９６ａが顕著に上方制御されていることを見出した（図１Ｂ）。図１Ｃに示すように、ｍｉＲ−１９６ａは、試験された１つを除く全ての低または中リスクＧＩＳＴにおいて検出されなかった一方で、半分以上の高リスク腫瘍において上方制御されていた。ｍｉＲ−１９６ａの上昇した発現は、胃および小腸のＧＩＳＴの両方で観察された。
【００５６】
例３．ｍｉＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ｍｉＲ−１９６ａの発現を、TaqMan microRNA Assays（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて分析した。簡潔には、特異的ステムループＲＴプライマーを用いて５ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを逆転写し、その後特異的プライマーおよびTaqManプローブでＰＣＲを用いて増幅および検出した。ＰＣＲは7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて３度行い、比較デルタＣｔ分析にはSDS v1.4ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いた。U6 snRNA（RNU6B; Applied Biosystems）が内因性コントロールとしての役割を果たした。
【００５７】
ＧＩＳＴにおけるｍｉＲ−１９６ａの上方制御の臨床的意義を査定するため、発明者らは、マイクロアレイで最初に分析された３２個の標本を含む５６個の新鮮な凍結保存ＧＩＳＴ標本（発見コホート）で上記の通りTaqManアッセイを行った。患者の臨床病理学的特徴は、以下の表１にまとめてある。
【表１】
2013128434.tif 000003
TaqManアッセイの結果は、マイクロアレイから検出可能なシグナルがなかったものにおいてTaqManアッセイで試料中の低レベルのｍｉＲ−１９６ａ発現を明らかにしたものの、マイクロアレイのデータと高度に整合していた（図２Ａ）。
【００５８】
ｍｉＲ−１９６ａが、他のグループと比較して、高リスクＧＩＳＴにおいて顕著に上方制御されている（Ｐ＝０．００４、one-way ANOVA）（図２Ｂ、表２）という発見もまた、マイクロアレイの結果と整合する。加えて、ロジスティック回帰分析は、ｍｉＲ−１９６ａの上方制御と高リスク分類との間の関連がｍｉＲ−１９６ａ／Ｕ６≧０．４のカットオフ値を採用した場合に最も高くなることを明らかにした（オッズ比１３．７；９５％信頼区間３．４〜５４．６；Ｐ＜０．００１）（表３）。
【表２】
2013128434.tif 000004
【表３】
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【００５９】
生存データを３２人の患者から得、Ｃｏｘハザード分析は、カットオフ値１．４を採用したときの、上昇したｍｉＲ−１９６ａ発現を有する患者の最高ハザード比を明らかにした（表４）。カプラン・マイヤー分析は、その効果には統計的有意差はなかったが、高レベルのｍｉＲ−１９６ａを発現するＧＩＳＴを有する患者での低い生存率を示した（図２Ｃ）。
【表４】
2013128434.tif 000006
【００６０】
次に、TaqManアッセイを用いて、１００個のＦＦＰＥ・ＧＩＳＴ標本からなる検証コホート（表１）を分析した。上に概説した発見と整合するとおり、ｍｉＲ−１９６ａの上方制御が、高リスクＧＩＳＴと関連していることが観察された（図２Ｂ、表２および３）。さらにカットオフ値（ｍｉＲ−１９６ａ／Ｕ６≧１．４）を用いることにより、Ｃｏｘハザード分析は、高レベルのｍｉＲ−１９６ａ発現を呈する患者についての上昇したハザード比を明らかにし（表４）、カプラン・マイヤー分析は、同一の患者についてのより短い生存時間を示した（図２Ｃ）。これらの結果は、新鮮な凍結保存およびＦＦＰＥ・ＧＩＳＴ標本の両方における、ｍｉＲ−１９６ａ発現の予後的重要性を確認する。
【００６１】
最後に発見コホートおよび検証コホートにおけるＧＩＳＴ試料を組み合わせ、ｍｉＲ−１９６ａの臨床病理学的意義を検査した。ｍｉＲ−１９６ａの発現は、高リスク度（図２Ｂ、表２、表３）、臨床転帰の不良（図２Ｃ、表４）、腫瘍サイズ、細胞分裂回数および転移（表５）と正に相関した。興味深いことに、ｍｉＲ−１９６ａの発現は年齢または性別と関連しなかったが、腫瘍位置と強く関連した（表５）。
【表５】
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【００６２】
ｍｉＲ−１９６ａ発現の中央値は、食道からのＧＩＳＴ標本において最低であり、ＧＩＳＴ部位が消化管の口腔側から肛門側へと動くにつれて増大した（Ｐ＜０．００１）（表５、図２Ｄ）。重要なことに、ｍｉＲ−１９６ａ発現の平均レベルは小腸においての方が胃においてより高かったが、どちらの組織においても高リスク度と正に相関していた（表６）。
【表６】
2013128434.tif 000008
【００６３】
例３．遺伝子発現マイクロアレイ分析
単色マイクロアレイベースの遺伝子発現分析を、取扱説明書（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）にしたがって行った。簡潔には、７００ｎｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを増幅し、Quick Amp Labeling Kit One-Color（Agilent Technologies）を用いてラベルし、その後合成ｃＤＮＡを、１９４１６遺伝子をカバーする４１０００個のプローブセットを含むWhole Human Genome Oligo DNAマイクロアレイ（G4112F; Agilent Technologies）とハイブリダイズさせた。マイクロアレイデータはGeneSpring GX ver.11（Agilent Technologies）にインポートし、７５％点シフト正規化を実施した。試料をｍｉＲ−１９６ａ発現ステータスにしたがって２グループに分類し、グループ間でそれぞれ異なって発現する遺伝子（＞２倍の変化）を抽出した。その後、階層的クラスタリング、ジーンオントロジー分析、および遺伝子セット分析（ＧＳＡ）を行った。このマイクロアレイデータのGene Expression Omnibus登録番号はＧＳＥ３１８０２およびＧＳＥ３２０６４である。
【００６４】
ＧＩＳＴにおける、ｍｉＲ−１９６ａの上方制御と網羅的な遺伝子発現プロファイルとの間の関係を分析するため、低い（ｎ＝７、平均ｍｉＲ−１９６ａ／Ｕ６＝０．１）または高い（ｎ＝７、平均ｍｉＲ−１９６ａ／Ｕ６＝１５．７）ｍｉＲ−１９６ａ発現を示す、年齢、性別、腫瘍位置を併せたＧＩＳＴ標本を選択し、遺伝子発現マイクロアレイ分析にかけた（表７）。
【表７】
2013128434.tif 000009
【００６５】
４９４７個のプローブセット（３２０６個の固有遺伝子に対応）について、ｍｉＲ−１９６ａ過剰発現するＧＩＳＴとそうでないＧＩＳＴとの間で、発現が２倍以上異なるものがあった。これらのうち、３５３６個のプローブセット（２２４８個の固有遺伝子）が、ｍｉＲ−１９６ａを過剰発現する腫瘍において低減した発現を示した。４９４７個のプローブセットを用いた階層的クラスタリング分析は、ｍｉＲ−１９６ａ発現ステータスを基礎としてはっきりと腫瘍を差別化し（図３Ａ）、ジーンオントロジー分析は、異なって発現している遺伝子のうち、「免疫システム」、「細胞膜」および「細胞間情報伝達」に関する遺伝子が強く過剰発現していることを示唆した（表８）。
【表８−１】
2013128434.tif 000010
【００６６】
【表８−２】
2013128434.tif 000011
【００６７】
異なって発現する遺伝子をさらに特徴づけるため、遺伝子セット分析（ＧＳＡ）を実施し、ＨＯＸ遺伝子セットについて最高の濃縮度スコア（enrichment score）を得た（表９）。
【表９】
2013128434.tif 000012
【００６８】
ｍｉＲ−１９６ａは、それぞれＨＯＸＢおよびＨＯＸＣクラスタ内に位置する、ｍｉＲ−１９６ａ−１およびｍｉＲ−１９６ａ−２という２つのパラロガスな遺伝子座にコードされている（図３Ｂ）。ＨＯＸＣ遺伝子についての発現データを用いた階層的クラスタリング分析は、ＧＩＳＴ試料を２つのグループに区別し、複数のＨＯＸＣ遺伝子における高い発現とｍｉＲ−１６９ａの上方制御との間に完璧な対応関係を観察した（図３Ｃ）。他のＨＯＸクラスタは、ｍｉＲ−１９６ａとの相互関係は明確には示さなかったものの、遺伝子発現量とクラスタリング分析による分類にはある程度の相関が見出された（図３Ｃ、３Ｄ）。
【００６９】
次に、各ＨＯＸ遺伝子のマイクロアレイシグナルとｍｉＲ−１９６ａの発現とを比較し、多数のＨＯＸＣ遺伝子（ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ６およびＨＯＸＣ５）の発現レベルとｍｉＲ−１９６ａの発現レベルとの間に強い正の相関があることを見出した（図３Ｅ）。殊に、大型遺伝子間非コードＲＮＡ（large intergenic non-coding RNA：ｌｉｎｃＲＮＡ）をコードし、ＨＯＸＣ遺伝子に対してアンチセンス配向に位置する、ＨＯＴＡＩＲの発現が、ｍｉＲ−１９６ａと同時に上方制御されていることもまた見出した（図３Ｃおよび３Ｅ）。ｍｉＲ−１９６ａ発現のレベルはまた、ｍｉＲ−１９６ａ−１の近傍に存在するＨＯＸＢ遺伝子（ＨＯＸＢ１３およびＨＯＸＢ９）の発現レベルとも、ＨＯＸＣ遺伝子のものほど顕著な相関ではなかったものの、相関していた（図３Ｆ）。
【００７０】
ＨＯＸＣ遺伝子の発現パターンと、同じ遺伝子座においてコードされる非コードＲＮＡの発現パターンとの間の類似性は、ＧＩＳＴにおけるこれらの遺伝子の活性化に関与する共通の制御メカニズムを示唆する。しかしながら、２７個のＧＩＳＴ標本のアレイＣＧＨ分析は、どのＨＯＸ遺伝子座における増幅または欠失も検出せず、その過剰発現が、ｍｉＲ−１９６ａまたはＨＯＸ遺伝子発現とは無関係であり、遺伝子増幅に起因するということはあり得なそうだということになる（図３Ｇ）。
【００７１】
例４．ＨＯＴＡＩＲの定量的ＲＴ−ＰＣＲ
一本鎖ｃＤＮＡはSuperscript III逆転写酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて調整した。ＨＯＴＡＩＲの定量的ＲＴ−ＰＣＲは、TaqMan Gene Expression Assay（Assay ID, Hs03296631_m1；Applied Biosystems）および7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて行った。ＧＡＰＤＨ（Assay ID, Hs99999905_m1; Applied Biosystems）が内因性コントロールとしての役割を果たした。
【００７２】
最近の研究は、ＨＯＴＡＩＲが原発性乳癌において過剰発現し、転移に関連することを示した。ＧＩＳＴにおけるその臨床的意義を検査するため、発見コホート試料について上記TaqMan分析を行った。ＨＯＴＡＩＲについてのマイクロアレイシグナルは、TaqMan分析の結果と高度に整合した（図４Ａ）。ＨＯＴＡＩＲは、低または中リスクＧＩＳＴと比較して、もっぱら高リスクＧＩＳＴにおいて上方制御されており（Ｐ＝０．０１８）（図４Ｂ）、その発現はｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＸＣ遺伝子群の発現と正に相関している（図４ＣおよびＤ）。加えて、ロジスティック回帰分析は、ＧＩＳＴにおける高レベルのＨＯＴＡＩＲ発現（ＨＯＴＡＩＲ／ＧＡＰＤＨ≧０．０００２）は転移と強く関連している（年齢および性別調整したオッズ比８．２；９５％信頼区間１．４〜４８．４；Ｐ＝０．０２１）ことを明らかにした。Ｃｏｘハザード分析は、高ＨＯＴＡＩＲ発現した患者での上昇したハザード比（表１０）を提示し、およびカプラン・マイヤー分析は、その効果は統計的に顕著とはいえないものの、同患者の低い全生存を示した（図４Ｅ）。ＦＦＰＥ標本においてもＨＯＴＡＩＲ発現を分析しようと試みたものの、これらの試料中ではＨＯＴＡＩＲの発現もＧＡＰＤＨの発現も検出できず、これはおそらくＲＮＡの質が不十分であることに起因すると考えられる。
【表１０】
2013128434.tif 000013
【００７３】
例５：ｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＴＡＩＲの機能的役割
ＧＩＳＴにおけるｍｉＲ−１９６ａの機能的役割を検査するため、TargetScan ver. 5.1によって計算上予測されるｍｉＲ−１９６ａの標的遺伝子について、遺伝子発現マイクロアレイデータを検索した。ｍｉＲ−１９６ａが過剰発現しているＧＩＳＴにおいて発現が低減している２２４８個の遺伝子のうち、９５個が予測される標的に対応した（図５Ａ、表９）。
【表１１−１】
2013128434.tif 000014
【００７４】
【表１１−２】
2013128434.tif 000015
【００７５】
【表１１−３】
2013128434.tif 000016
【００７６】
【表１１−４】
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【００７７】
【表１１−５】
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【００７８】
【表１１−６】
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【００７９】
この遺伝子リストには、実験的に確認されたｍｉＲ−１９６ａの標的遺伝子であるＡＮＸＡ１（アネキシンＡ１）も含まれていた。加えて、ＨＯＸＢ８を含むいくつかのＨＯＸ遺伝子の発現が、ｍｉＲ−１９６ａを過剰発現するＧＩＳＴにおいて低減しており、このことはｍｉＲ−１９６ａがＨＯＸＢ８のｍＲＮＡを開裂するという過去の知見と整合する（図５Ａ）。ジーンオントロジー分析は、ＧＩＳＴにおいて低減した発現を示す予測標的遺伝子のうち、「タンパク質結合」、「コラーゲン」および「細胞外マトリクス」に関係する遺伝子が多く含まれることを提示した（表１２）。
【表１２】
2013128434.tif 000020
【００８０】
正常な線維芽細胞において、ＨＯＴＡＩＲは、ポリコーム抑制性複合体２（ＰＲＣ２）と相互作用してＨＯＸＤ遺伝子発現を抑制する。乳癌細胞において、ＨＯＴＡＩＲの過剰発現により、ＰＲＣ２が８００以上の遺伝子プロモーターとして機能し、ヒストンのＨ３Ｋ２７におけるメチル化および標的遺伝子のエピジェネティックなサイレンシングに導くことが示された。そこで得られたマイクロアレイデータを、報告されているＨＯＴＡＩＲ誘導性ＰＲＣ２標的遺伝子について検査した。マイクロアレイについて分析した１４のＧＩＳＴのうち、ｍｉＲ−１９６ａを強発現する腫瘍の７つ全てにおいてＨＯＴＡＩＲ発現が上昇しており（平均ＨＯＴＡＩＲ／ＧＡＰＤＨ＝０．００２５４）、一方ｍｉＲ−１９６ａが弱くしか発現していない全ての腫瘍において、ＨＯＴＡＩＲ発現はほとんどまたは全くなかった（平均ＨＯＴＡＩＲ／ＧＡＰＤＨ＝０．００００１）。高ＨＯＴＡＩＲ発現するＧＩＳＴにおいて下方制御されている遺伝子と、ＨＯＴＡＩＲ誘導性ＰＲＣ２標的として以前に報告された遺伝子との間に、統計的に顕著な関連性が見出された（Ｐ＝１．１５×１０−１４）。ＨＯＴＡＩＲを過剰発現するＧＩＳＴにおいて、１４４個のＨＯＴＡＩＲの標的遺伝子の発現が低減されていることが見出された（図５Ｂ、表１３）、ジーンオントロジー分析は、これらの遺伝子のうち「細胞間情報伝達」、「シグナル伝達」および「細胞膜」に関する遺伝子が際だって多いことを明らかにした（表１４）。
【００８１】
【表１３−１】
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【００８２】
【表１３−２】
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【００８３】
【表１３−３】
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【００８４】
【表１３−４】
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【００８５】
【表１３−５】
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【００８６】
【表１３−６】
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【００８７】
【表１３−７】
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【００８８】
【表１３−８】
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【００８９】
【表１４】
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これらの結果は、ｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＴＡＩＲの過剰発現が、その標的遺伝子の発現を調節することにより、悪性進行に寄与し得ることを示唆する。
【００９０】
例６：ｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＴＡＩＲの阻害
（１）ｍｉＲＮＡ阻害剤およびｓｉＲＮＡ分子のトランスフェクション
ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞は日本人女性の複数の悪性ＧＩＳＴから確立された細胞株であり、その詳細はTaguchi et al., Lab Invest. 2002 May;82(5):663-5に記載されている。ｍｉＲ−１９６ａの阻害のため、細胞（６ウェルプレート中３×１０５個）に１００ｐｍｏｌのAnti-miR miRNA Inhibitors（Ambion）またはAnti-miR miRNA Inhibitors Negative Control #1（Ambion）を、Lipofectamine2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした。ＨＯＴＡＩＲのＲＮＡｉのため、ＨＯＴＡＩＲに対する３つの異なるステルスｓｉＲＮＡ（配列番号３〜５）をInvitrogenで作り、その後該３つの混合物をトランスフェクションに用いた。細胞（６ウェルプレート中３×１０５個）に１００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡまたはStealth RNAi Negative Control Medium GC（Invitrogen）を、Lipofectamine2000（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出、細胞バイアビリティアッセイ、およびマトリゲル侵襲アッセイをトランスフェクション後４８時間で行った。
【００９１】
（２）細胞バイアビリティアッセイ
ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞を上述の通りトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、形質転換細胞を９６ウェルプレートに、５×１０３個／ウェルの密度で播種した。さらに２４時間インキュベートした後、Cell Counting kit-8（Dojindo, Tokyo, Japan）を用いて、取扱説明書にしたがって細胞バイアビリティアッセイを行った。
【００９２】
（３）マトリゲル侵襲アッセイ
ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞を上述の通りトランスフェクトした。２４時間のインキュベーション後、５００μＬの無血清ＤＭＥＭに懸濁した１×１０５個の形質転換細胞懸濁液をBD BioCoat Matrigel Invasion Chambers（BD Biosciences）の最上部に添加し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を事前添加し、７００μＬの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りＤＭＥＭをプレートの下層ウェルに添加した。さらに２４時間インキュベートした後、侵入した細胞を、１％トルイジンで染色し、膜毎に３つの無作為に選択された顕微鏡視野において直接計数することにより定量した。
【００９３】
（４）結果
上述の通り、培養ＧＩＳＴセルラインを利用して、ｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＴＡＩＲの上方制御がＧＩＳＴの悪性度に関与するかを決定した。まずｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＴＡＩＲの両方がＧＩＳＴ−Ｔ１細胞で発現していることを確認した（図６Ａ）。加えて、ＣｈＩＰ−ＰＣＲを用いたクロマチンステータスの分析は、活性遺伝子転写のマーカーであるトリメチル化ヒストンＨ３リジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）の、複数のＨＯＸＣ遺伝子およびＨＯＴＡＩＲの転写開始部位における上昇を明らかにした（図６Ｂ）。次に、ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞に抗ｍｉＲ−１９６ａ阻害分子をトランスフェクトした後、細胞バイアビリティおよびマトリゲル侵襲アッセイを行った。ｍｉＲ−１９６ａの阻害は、細胞増殖においては効果が観察されなかったものの、細胞侵襲を中程度に抑制した（図６Ｃ）。最後に、ＨＯＴＡＩＲを標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトすることにより、ＨＯＴＡＩＲ発現を妨げた（図６Ｄ）。ＨＯＴＡＩＲのノックダウンは、細胞増殖に顕著には影響しなかったものの、ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞の侵襲を抑制した（図６ＥおよびＦ）。さらに、遺伝子発現マイクロアレイ分析は、ＰＣＤＨ１０、ＳＥＭＡ６ＡおよびＳＴＫ１７Ｂを含む報告されているＨＯＴＡＩＲ標的遺伝子の多くが、ＨＯＴＡＩＲのノックダウンにより上方制御されていたことを明らかにした（表１５）。全部で、１４２４遺伝子がｓｉＨＯＴにより上方制御（＞２倍）されていることが見出され、ジーンオントロジー分析は「核」、「染色体」および「膜結合オルガネラ」に関連する遺伝子が多く含まれることを明らかにした（表１６および１７）。これらの結果は、ＨＯＴＡＩＲが多数の遺伝子の転写を調節し得、ＧＩＳＴ細胞中で以前には同定されていなかった役割を果たし得ることを示す。
【００９４】
【表１５−１】
2013128434.tif 000030
【表１５−２】
2013128434.tif 000031
【表１５−３】
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【００９５】
【表１６−１】
2013128434.tif 000033
【表１６−２】
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【表１６−３】
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【００９６】
【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【００９７】
【表１６−７】
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【表１６−８】
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【表１６−９】
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【００９８】
【表１６−１０】
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【表１６−１１】
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【表１６−１２】
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【００９９】
【表１６−１３】
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【表１６−１４】
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【表１６−１５】
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【０１００】
【表１６−１６】
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【表１６−１７】
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【表１６−１８】
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【０１０１】
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【０１０２】
考察
近年の研究結果が、ＧＩＳＴの遺伝子発現特性が腫瘍の悪性度および薬物感受性の予測因子となるであろうことを提示していたにもかかわらず、ｍｉＲＮＡ発現特性の臨床的意義は未だ完全には理解されていなかった。今回、ｍｉＲ−１９６ａの上方制御が高リスク度、転移およびＧＩＳＴ患者の悪い予後に強く関連すること、さらに、ｍｉＲ−１９６ａの過剰発現は、複数のＨＯＸＣ遺伝子および転移関連ｌｉｎｃＲＮＡであるＨＯＴＡＩＲの上方制御を伴うことを見出した。本発明者らの知る限りにおいて、これはヒト悪性腫瘍における直列に並んだＨＯＸ遺伝子および非コードＲＮＡの同時的過剰発現を示した最初の報告である。
【０１０３】
多くの研究が、ｍｉＲ−１９６ａが悪性化に関係していると考えていたが、その役割は腫瘍型の間で異なり得る。ｍｉＲ−１９６ａの上方制御が、食道腺癌およびその前癌病変、バレット食道および異形成において観察され、ｍｉＲ−１９６ａはバレット食道の悪性進行における潜在的マーカーであると提示されている。ｍｉＲ−１９６ａの強発現はまた、膵臓腺癌およびグリア芽腫患者における悪い予後とも関連している。加えて、機能的分析は、食道癌、乳癌および子宮内膜癌の細胞におけるｍｉＲ−１９６ａの発現が、ＡＮＸＡ１の下方制御を通じて増殖を促進し、アポトーシスを抑制することを実証した。これらの結果は、ｍｉＲ−１９６ａが、癌における腫瘍形成に寄与することを提示する。一方で、ｍｉＲ−１９６ａはメラノーマにおいて顕著に下方制御されており、その再発現は、ＨＯＸＣ８を標的とすることによってメラノーマ細胞の浸潤性挙動を阻害する。同様に、ｍｉＲ−１９６ａはＨＯＸＣ８を抑制し、乳癌細胞の浸潤および転移を阻害する。したがって、ｍｉＲ−１９６ａは、異なる起源の腫瘍において逆の効果を奏するように見受けられる。
【０１０４】
ＨＯＸ遺伝子は、高度に保存されているホメオボックススーパーファミリーのサブグループであり、発生、分化、アポトーシスおよび血管形成を含む様々な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。ヒトにおいては、３９個のＨＯＸ遺伝子を含む４つのＨＯＸクラスタが同定されており、様々な悪性腫瘍において、これらの発現の調節異常が観察されている。癌におけるＨＯＸの役割は完全にはわかっていないが、その異常発現は腫瘍発生および転移を促進するパスウェイに影響すると考えられている。例えば、ＨＯＸＣ８のｍＲＮＡは前立腺癌細胞において過剰発現しており、腫瘍細胞増殖および転移に関連している。加えて、ＨＯＸＣ５およびＨＯＸＣ８のｍＲＮＡは子宮頸癌細胞において上方制御されており、最近の研究は、ＨＯＸＣ１０が子宮頸癌の増殖および浸潤において鍵となる役割を果たすことを提示した。
【０１０５】
癌におけるｍｉＲ−１９６ａ発現とＨＯＸ発現との間の関連性もまた報告されている。悪性メラノーマ細胞におけるｍｉＲ−１９６ａの低減した発現は、ＨＯＸＢ７の上方制御、続いて細胞移動の主要な調節因子であるＢＭＰ４の活性化へと繋がる。上述の通り、ｍｉＲ−１９６ａはまた、メラノーマおよび乳癌細胞において、ＨＯＸＣ８を下方制御することにより、浸潤および転移を阻害する。総括すると、これらの結果は、ｍｉＲ−１９６ａがこれらの腫瘍型においてＨＯＸ遺伝子を標的とすることにより、腫瘍抑制因子として作用することを提示する。対照的に本開示では、悪性ＧＩＳＴにおいては、ｍｉＲ−１９６ａおよびＨＯＸＣ遺伝子の両方が同時に上方制御されていることを実証する。
【０１０６】
本開示の知見は、ＨＯＸクラスタ内に埋め込まれたｍｉＲＮＡの発現パターンは、哺乳動物の胚発生の間のＨＯＸ遺伝子の発現パターンと酷似していることを示す最近の報告を想起させる。今後の実験において、ＧＩＳＴ細胞におけるｍｉＲ−１９６ａの直接の標的を実験的に確認しなければならないが、網羅的遺伝子発現分析は、ｍｉＲ−１９６ａを過剰発現するＧＩＳＴにおいて、ＡＮＸＡ１を含む複数のｍｉＲ−１９６ａ標的の発現が低減していることを明らかにした。加えて、ｍｉＲ−１９６ａを過剰発現するＧＩＳＴ細胞におけるその阻害は、細胞浸潤を適度に抑制する。総合すると、本実施例の結果は、ｍｉＲＮＡと同調したＨＯＸＣ遺伝子の上方制御が、ＧＩＳＴの悪性度に寄与し得ることを示唆し得る。
【０１０７】
最近、ｍｉＲ−１９６ａ−２における共通の配列変異体（rs11614914、Ｃ→Ｔ）が、乳癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、胃癌および頭頸部癌の低減したリスクと関連することが示された。加えて、この一塩基多型（ＳＮＰ）におけるＣＣホモ接合性は、成熟ｍｉＲ−１９６ａの発現増大およびＮＳＣＬＣ患者における低い生存率に関連する。さらに、他の研究において、Ｃ→Ｔ変異は、乳癌細胞におけるｍｉＲ−１９６ａ前駆体の成熟形態へのプロセシングを中断させることができることを示した。これらの結果は、ｍｉＲ−１９６ａが腫瘍形成効果を発揮し、Ｃ→Ｔ変異がｍｉＲ−１９６ａ発現を低下させ、癌リスクも低減へと導くという仮説を支持し得る。対照的に、頭頸部癌においては、ｍｉＲ−１９６ａ−２遺伝子型およびその発現の間には統計的に顕著な相関は見出されなかった。
【０１０８】
ｍｉＲ−１９６ａ−２遺伝子は、ｍｉＲ−１９６ａおよびｍｉＲ−１９６ａ＊という２つの成熟ｍｉＲＮＡをコードし、ＳＮＰrs11614914はｍｉＲ−１９６ａ＊がコードする配列に位置し、このことは、成熟ｍｉＲ−１９６ａ＊のその標的遺伝子への結合に遺伝子型が影響し得ることを提示する。しかしながら、今回のマイクロアレイ分析では、ｍｉＲ−１９６ａ＊発現は、リスク度に関係なく、どのＧＩＳＴ標本においても検出されなかった。ｍｉＲ−１９６ａ−２遺伝子型とＧＩＳＴリスクとの関係を解明するためには、さらなる研究が必要である。
【０１０９】
ＨＯＴＡＩＲはＨＯＸＣクラスタ内に位置し、ヒストン修飾酵素複合体と直接的に相互作用することによって、その標的遺伝子を抑制することで知られるｌｉｎｃＲＮＡをコードする。エピジェネティックな遺伝子制御は、ヒストンＨ３リジン４（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）のジまたはトリメチル化が活性遺伝子プロモーター内に上昇するヒストン修飾と緊密に関連する。加えて、ヒストンＨ３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７）のトリメチル化は遺伝子サイレンシングのマーカーである。正常なアダルトの線維芽細胞において、ＨＯＴＡＩＲはヒストンＨ３Ｋ２７メチラーゼＥＺＨ２、ＳＵＺ１２およびＥＥＤからなるＰＲＣ２複合体によってＨＯＸＤ遺伝子座を抑制する。ＨＯＴＡＩＲは、ＰＲＣ２およびＬＳＤ１／ＣｏＲＥＳＴ／ＲＥＳＴを含む複数の抑制因子複合体のスキャフォールドとして働くこともまた、最近示された。ＬＳＤ１はＨ３Ｋ４の脱メチル化を特異的に媒介し、標的遺伝子の抑制へと導くデメチラーゼである。
【０１１０】
ＨＯＴＡＩＲはまた、癌転移にも強く関与している。乳癌細胞において、ＨＯＴＡＩＲは、全ゲノムに亘るＰＲＣ２複合体の再標的化を誘導し、複数の腫瘍抑制因子および転移抑制因子遺伝子のサイレンシングに導く。ＨＯＴＡＩＲの過剰発現はまた、肝移植後の肝細胞癌患者における再発の予測因子でもある。本開示において、ＨＯＴＡＩＲの上方制御がＧＩＳＴの攻撃性および転移と緊密に関連することが観察された。加えて、ＧＩＳＴ−Ｔ１細胞を用いた機能的解析は、ＲＮＡｉ媒介性のＨＯＴＡＩＲのノックダウンが細胞侵襲を抑制したことを示した。これらの結果は、ＨＯＴＡＩＲの上方制御がＧＩＳＴにおける攻撃性を促進するメカニズムの１つであることを強く示している。興味深いことに、ＨＯＴＡＩＲの枯渇はＧＩＳＴ細胞における遺伝子発現プロファイルに顕著な変化を誘導し、このことは、ＨＯＴＡＩＲが以前に報告された標的遺伝子以外の遺伝子領域も制御し得ることを示している。ゲノム規模でのヒストン修飾分析を含むさらなる研究は、ＧＩＳＴの悪性進行においてＨＯＴＡＩＲが果たす未だ同定されていない役割を明らかにするだろう。
【０１１１】
ＧＩＳＴにおけるＨＯＸクラスタ遺伝子および非コードＲＮＡの上方制御の根底にあるメカニズムは依然として未知である。アレイＣＧＨ分析ではどのＨＯＸ遺伝子座においても染色体異常は検出されず、このことは遺伝子増幅が過剰発現の原因ではなさそうであることを示す。新たな証拠は、ＤＮＡメチル化およびヒストン修飾の異常が、癌におけるｍｉＲＮＡ異常調節に緊密に関連していることを示唆し、このことはエピジェネティック変化が遺伝子活性化の原因であり得ることを提示する。はっきりさせねばならないことは多数残っているが、悪性ＧＩＳＴにおいて、ＨＯＸＣクラスタ内にコードされる非コードＲＮＡが有用な予測マーカーであると同時に新規な治療標的となることができることが実証された。ｍｉＲＮＡはＦＦＰＥ標本中においてもよく保存されているため、ｍｉＲ−１９６ａはリスク査定において信頼できるバイオマーカーたり得る。本発明はまた、高リスクＧＩＳＴにおいてＨＯＴＡＩＲが顕著に上方制御されている証拠を提供し、このことはこのｌｉｎｃＲＮＡが有用なバイオマーカーであり得るのと同時に、新規な治療標的であり得ることを示唆する。さらに、ＧＩＳＴにおけるＨＯＸＣ遺伝子座活性化の原因および機能についてのさらなる研究は、ＧＩＳＴ患者の治療における新たな戦略を提供し得る。
【０１１２】
参考文献
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【産業上の利用可能性】
【０１１３】
以上述べたとおり、本発明によって、ＧＩＳＴの悪性度を簡便に判定することができるようになるだけでなく、ＧＩＳＴの治療、特に外科的処置を施した後も転移や再発のリスクの高い、高リスクのＧＩＳＴを処置することができる治療薬が提供できることとなる。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【配列表】
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