(57)【要約】【課題】親生物、特に親植物の遺伝的構成を保存する方法を提供すること。【解決手段】雑種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト生物を、ヘテロ接合性非ヒト生物から生成する方法であって、ａ）ヘテロ接合性開始生物を提供すること、ｂ）前記生物に第２分裂復元から生じるＳＤＲ−０細胞を生成させること、ｃ）前記ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物をすること、および、ｄ）かくして得られた前記ＳＤＲ−０生物から前記ホモ接合性生物を生成することを含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
雑種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト型生物を、ヘテロ接合性非ヒト型生物から生成する方法であって、
ａ）ヘテロ接合性開始生物を提供すること、
ｂ）前記生物に第２分裂復元から生じるＳＤＲ−０細胞を生成させること、
ｃ）前記ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物を再生すること、および
ｄ）かくして得られた前記ＳＤＲ−０生物から前記ホモ接合性生物を生成すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ＳＤＲ−０細胞が、前記開始生物に干渉することなく生成される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＤＲ−０細胞を生成する前記生物が、平均以上の第２分裂復元を示すよう選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＤＲ−０細胞を生成する前記生物が、平均以上の第２分裂復元を示すよう遺伝子組み換えされる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子組み換えが、一過性のものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子組み換えが、前記生物における第２分裂復元事象の数を増やす遺伝的要素のゲノムへの安定した組み込みによるものである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＤＲ−０細胞を生成する前記生物が、平均以上の第２分裂復元を示すよう、環境ストレスにさらされる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記環境ストレスが、温度ストレス、ＮＯ２、亜酸化窒素Ｎ２Ｏ、またはそれらの組み合わせから選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ホモ接合性生物が、倍加半数体技術、近親交配、第２分裂復元、またはそれらの組み合わせによって生成される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
雑種を生成する方法であって、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法により生成された第１のホモ接合性生物を第２のホモ接合性生物に交配することを含む方法。
【請求項１１】
得られる雑種が前記ヘテロ接合性開始生物に類似するよう、前記第２のホモ接合性生物が前記第１のホモ接合性生物に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘテロ接合性開始生物との類似性が、前記開始生物のヘテロ接合性の少なくとも５０％を有する雑種を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘテロ接合性の類似性が、５０％〜１００％の間のいずれかのパーセンテージである請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヘテロ接合性の類似性が、５０％〜６０％の間、好ましくは６０％〜７０％の間、より好ましくは７０％〜８０％の間、さらに好ましくは８０％〜９０％の間、最も好ましくは９０％〜１００％の間のいずれかのパーセンテージである請求項１１ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
得られる雑種が前記ヘテロ接合性開始生物より優れるよう、前記第２のホモ接合性生物が選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２のホモ接合性生物が、その染色体のサブセットのみが前記第１のホモ接合性生物の対応する染色体に対して相補的になるよう選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記染色体の残りの部分が、前記第１のホモ接合性生物と第２のホモ接合性生物との間で同一である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所望の遺伝的背景を有する生物に形質を遺伝子移入する方法であって、
ａ）所望の遺伝的背景を有する第１の生物を、所望の形質を有する第２の生物と交配してヘテロ接合性開始生物を得る工程、
ｂ）前記生物に第２分裂復元から生じるＳＤＲ−０細胞を生成させる工程、
ｃ）前記ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物を再生する工程、
ｄ）所望の前記形質および前記背景を有する前記ＳＤＲ−０生物を選択する工程、および
ｅ）選択された前記ＳＤＲ−０生物からホモ接合性生物を生成する工程
を含む方法。
【請求項１９】
前記ＳＤＲ−０細胞が、請求項２ないし８のいずれかにおいて定義された通りに得られる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ホモ接合性生物が、倍加半数体技術、近親交配、第２分裂復元、またはそれらの組み合わせによって生成される請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択が、視覚的検査に基づいて、または分子マーカーの手段によって行われる請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記生物が、植物である請求項１ないし２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１ないし９のいずれかに記載の方法によって得られ得るホモ接合性非ヒト生物。
【請求項２４】
請求項１０ないし２１のいずれかに記載の方法によって得られ得る雑種非ヒト生物。
【請求項２５】
植物である、請求項２３または２４に記載の非ヒト生物。
【請求項２６】
請求項２３、２４あるいは２５に記載の生物の子孫。
【請求項２７】
請求項２３、２４あるいは２５に記載の生物の細胞または請求項２６に記載の子孫の細胞。
【請求項２８】
請求項２３、２４あるいは２５に記載の生物の組織または請求項２６に記載の子孫の組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雑種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト生物を、ヘテロ接合性非ヒト生物から生成する方法に関する。本発明は、特に植物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
植物育種は、人類の基本的な業の一つであり、世界中の人々に食糧を供給する栽培種を提供する上で極めて重要である。植物育種の歴史は古く、元々は局所的選択圃場において能力の優れた植物を選択し、増殖させることをベースとしていた。
【０００３】
現代の植物育種は、遺伝学の知識に高く依存しており、倍加半数体（ＤＨ）（Haploids  in  Crop  Improvement  II  eds;    Palmer  C,  Keller  W,  and  Kasha  K  (2005)  in:  Biotechnology  in  Agriculture  and  Forestry  56  Eds;  Nagata  T,  Lorz  H,  and  Widholm  J.  Springer-Verlag  Berlin  Heidelberg  New  York,  ISBN  3-500-22224-3 を参照）や分子マーカー（De  Vienne  ed.  (2003)  "Molecular  Markers  in  Plant  Genetics  and  Biotechnology."  Science  publishers  Inc.  Enfield,  NH  USA.  ISBN  1-57808-239-0 を参照）等の方法によって技術的に支持されている。
【０００４】
有性生殖における遺伝的メカニズムは、変化する環境において種の生存の機会を増強する遺伝的変異を増大させるために進化してきた。この点において、減数分裂組み換え、独立した染色体分配(chromosome assortment)、および交配システムは、主な寄与因子である。しかしながら、植物育種において、これらのメカニズムは、特に遺伝的にヘテロ接合性の植物が高度な農業または園芸価値を有すると確認された場合においては、逆効果を生じ得る。遺伝因子の再分配は、遺伝的に類似せず不均一な植物の生成をもたらし、その結果、商業的に望ましい形質の喪失をもたらす。
【０００５】
この効果に対抗するために、植物育種家は数々のテクノロジーを利用することができる。１つの可能性は、植物を栄養的に繁殖させることであり、栄養繁殖は有糸分裂のみを介して増殖が起こるため、該植物の遺伝的構成の完全な保存をもたらす。多くの植物種では、植物を栄養的に繁殖させるためにインビトロの組織培養が用いられているが、インビボの挿し木生産のような他の方法も適用することができる。
【０００６】
種子による繁殖と比較した場合の栄養繁殖の不利な点は、労働集約的であり、そのためにコストがかかるという事実である。さらに、物流上の(logistic)問題を引き起こす長期間の植物の保管は困難であり、かつ、ウィルスのような病原体が植物体に感染するリスクが、種子から繁殖した植物体の場合に比べて非常に大きい。
【０００７】
また別の方法では、栄養繁殖は、一般的にアポミクシスと称される無性種子の形成によって達成され得る。多くの種で自然発生するアポミクシスは、遺伝子工学によって、有性繁殖する植物種において誘発することができる。しかしながら、現時点では、アポミクシスの異なる段階、すなわちアポマイオシス、単為生殖、および自立的胚乳発生に関与している遺伝子は、未だ同定されておらず、かつ、複雑な様式で相互作用し得るものである。このため、植物育種のためのアポミクシス技術のポテンシャルは、既に長い間広範に認識されているが、依然として概念の証明が待たれている。
【０００８】
また、さらに別の方法として、ＷＯ０３０１７７５３に開示される逆育種技術を使うことができる。逆育種は、遺伝子工学による減数分裂組み換えの抑制と、その後の非組み換え親染色体を含む胞子から生じる倍加半数体（ＤＨ）の生成に基づいている。これら倍加半数体は、減数分裂において生じた独立した親染色体の分配の結果、遺伝的構成に関して異なるものである。したがって、元の開始植物の遺伝的構成を復元するためにＤＨもしくはそれから生じる系統のいずれを交配によって組み合わせるべきかを決定するには、染色体あたり一つの共優性多型マーカーを使うことで十分である。このように、逆育種技術の適用は、たとえ遺伝的構成が不明であっても、選択された稔性を有するあらゆる植物の種子による遺伝的保存を可能にする。
【０００９】
しかしながら、この技術の不利点は、減数分裂組み換えの完全な抑制がキアズマの欠如およびそれによる減数分裂Ｉ中の不適切な染色体分離をもたらし、これが配偶子の異数性およびそれによる生存力の減少をもたらし得る、という事実である。減数分裂Ｉにおいてキアズマが全く形成されない場合、すべての染色体は、独立した５０％の確率でいずれか一方の極に移動する。これは、完全な染色体相補対(chromosome complement)を有する胞子を生成する理論上の確率が、（１／２）ｘ（ｘ：半数体染色体の数）であることを意味している。したがって、均衡の取れた配偶子の頻度は、半数体染色体の数が増えるにつれて減少する。
【００１０】
多くの作物種は、比較的少ない染色体数を有している（例えば、キュウリは半数体ゲノム当たり７個の染色体を有しており、ホウレンソウは６個のみである）が、最大の野菜作物の一つであり、半数体ゲノム当たり１２個の染色体を有するトマトのように、比較的多い染色体数を有する経済的に重要な種もある。この技術的な制約は、逆育種技術の効率を著しく低下させている。したがって、有性子孫における遺伝的構成の保存を可能にする代替の方法に関する明確な必要性が当該技術分野において存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際特許公開０３０１７７５３号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Haploids  in  Crop  Improvement  II  eds;    Palmer  C,  Keller  W,  and  Kasha  K  (2005)  in:  Biotechnology  in  Agriculture  and  Forestry  56  Eds;  Nagata  T,  Lorz  H,  and  Widholm  J.  Springer-Verlag  Berlin  Heidelberg  New  York,  ISBN  3-500-22224-3．
【非特許文献２】De  Vienne  ed.  (2003)  "Molecular  Markers  in  Plant  Genetics  and  Biotechnology."  Science  publishers  Inc.  Enfield,  NH  USA.      ISBN  1-57808-239-0．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記事情に鑑みて、本発明の目的は、親生物、特に親植物の遺伝的構成を保存する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明をもたらした研究では、例えば『ＳＤＲ−０』と呼ばれる第２分裂復元（ＳＤＲ）の結果として得られるような、非還元胞子から再生された植物を用いることにより、このような方法を提供することができる、という驚愕の事実が発見された。また、この方法は、菌類や魚類など、植物以外の他の非ヒト生物においても実行され得るものであり、かつ、配偶子などのような他の生殖細胞でも実行され得るものである。
【００１５】
したがって、本発明は、雑種を得るために交配され得るホモ接合性非ヒト生物を、ヘテロ接合性非ヒト生物から生成する方法であって、ａ）ヘテロ接合性開始生物を提供すること、ｂ）前記生物に第２分裂復元から生じるＳＤＲ−０細胞を生成させること、ｃ）前記ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０生物をすること、および、ｄ）かくして得られた前記ＳＤＲ−０生物から前記ホモ接合性生物を生成することを含む方法に関するものである。
【００１６】
この方法は、ここでは「近逆育種」と呼ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】正常な減数分裂を示す図である。
【図１Ｂ】正常な減数分裂を示す図である。
【図２】ＳＤＲ事象を示す図である。
【図３Ａ】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す図である。
【図３Ｂ−１】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す図である。
【図３Ｂ−２】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す図である。
【図３Ｂ−３】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す図である。
【図３Ｂ−４】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す図である。
【図３Ｂ−５】図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じる胞子／配偶子の構成を示す図である。
【図４】倍加された染色体セットを示す図である。
【図５】キュウリにおける典型的なＦ２植物のＡＦＬＰパターンを示す図である。
【図６】キュウリにおける典型的なＤＨ系統のＡＦＬＰ分析を示す図である。
【図７】キュウリにおける典型的なＳＤＲ−０植物のＡＦＬＰ分析を示す図である。
【図８Ａ】光顕微鏡を通して観測される寒冷処理された植物の花粉を示す図である。
【図８Ｂ】光顕微鏡を通して観測される対照植物の花粉を示す図である。
【図９】光顕微鏡を介して観察された２倍体小胞子および通常の半数体小胞子を示す図である。
【図１０】非還元配偶子から生じたブラッシカ・オレラセア植物のＡＦＬＰ指紋を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
非還元胞子は、第２減数分裂の欠落の結果として、選択的に形成される。このような自然現象は、第２分裂復元またはＳＤＲとして知られている。ＳＤＲは、植物の有性生殖において通常の減数分裂事象と同時に生じ得る。本発明の近逆育種技術は、特に、天然のまたは操作されたＳＤＲを介して生成された非還元胞子を再生のために特異的に選択することによって、ＳＤＲ事象を利用している。この結果生じる植物は、ＳＤＲ−０植物と呼ばれ、概ねホモ接合性が高く、好ましい実施形態では、ＤＨを生成するのに用いられている。しかし、ＳＤＲ−０植物のホモ接合性レベルも、近親交配（自殖）の工程または二次ＳＤＲ事象、あるいはそれらの組み合わせを介して増大させ得る。
【００１９】
開始植物の父性ゲノムと母性ゲノムとの間で多型である分子マーカーは、遺伝的構成に関して本質的に相補的であり、かつ、交配によって元の開始植物の遺伝的構成の近完全な復元をもたらすＳＤＲ−０植物およびそれから生じるＤＨを同定するために使用し得る。
【００２０】
かかる復元は、ＳＤＲ−０事象の形成およびそれから生じるＤＨの形成における減数分裂組換えの結果として、「近完全」である。かかる復元された雑種は、元の開始雑種植物と異なるだけでなく、ある程度互いに遺伝的に異なるものである。しかしながら、この変異は、ＤＨが通常の減数分裂事象から生じる場合と比較すると、著しく減少したものである。さらに、該ＤＨは遺伝的に固定されており、これはさらなる選択のための余地が全くないことを意味する。
【００２１】
この過程の中にＳＤＲ事象を組み込むことの利点は、遺伝的相補性に関する選択が２段階の工程において起こることである。第１の工程は、染色体のセントロメアを含む近位領域に集中する。第２の工程は、染色体の遠位端、すなわち組み換えによって交換された領域に向けられている。この遅発性の遺伝的固定は、複雑さを減少させ、特に、分子マーカーが選択に利用できる場合には、相補性の高い遺伝子型を見つける確率を増大させる。
【００２２】
このアプローチのさらなる利点は、ＳＤＲが、有性生殖中に生じ、かつ、有性生殖過程への干渉をさらに必要とせずに用いることができる天然の過程であるという事実である。
【００２３】
図１および図２は、正常な減数分裂事象（ＤＨの形成がそれに続く）とＳＤＲ事象との間の差異を模式的に示す。両図において、４個の染色体ペアが描写されており、相同体がそれぞれ明るい棒(rod)状構造及び暗い棒状構造で示され、棒上の黒丸がセントロメアを表す。これらの図は、本発明の原理を単に説明するためのものである。実際には関与する染色体の数が関与する種に依存しているということは、当業者にとっては自明である。したがって、交差点(crossing-over point)は、その数／染色体、およびその染色体上の位置に関して可変である。
【００２４】
図１は、正常の減数分裂と、双方の減数分裂が起こった後の染色体の（自発的あるいは誘導されたものであり得る）倍加を示している。この場合、交差は、１ペアにつき２つの親染色体および２つの組換え染色体の発生をもたらしている。さらに、各ペアの２つの相同染色体の独立した組み合わせにより、多くの遺伝的に異なる胞子／配偶子が形成され得ることは、明らかである。
【００２５】
図１には、この過程の３つの任意な結果のみが描写されている。このような胞子から植物を再生した後に、ＤＨを得ることができる。ＤＨの生成は、現代の植物育種において最も重要なものであり、ほとんどの作物について確立した技術として適用される。２倍体胞子から再生された植物は、正常の減数分裂事象から生じる自発的または誘導された倍加胞子からの最初の再生体として、ＤＨ−０、すなわち倍加半数体とさらに命名される。「ＳＤＲ−０」という用語は、第２減数分裂を欠いた細胞または胞子からの最初の再生体に用いられる。ＤＨ−０植物は、これを自家受粉すると、遺伝的に１００％同一で、且つ、全ての対立遺伝子において完全に固定された子孫（ＤＨ−１）植物をもたらす。よって、ＤＨ−０植物において形成された胞子（配偶子）は、減数分裂および組換えを再度受けたものであるが、遺伝的再配列は起こり得ない。したがって、この事は、このいわゆる『純系』が、分離が全く起こり得ないという事実によって不滅のものになることを意味している。しかし、かかる系統は、低温や高温などの異なる条件下、または、例えば異なる気候区分で生育させると、表現型上異なる外観を示すことがある。しかし、観察することができる差異は、系統の全ての『メンバー』に有効であり、言い換えれば『系統内』の変異がない、ということである。しかしながら、異なる純系（ＤＨ−１）の間には差異があり得、これは『系統間』変異と呼ばれる。
【００２６】
図２は、ＳＤＲ事象を示す。自発的なまたは誘導された染色体倍加が減数分裂完了後に起こる図１とは対照的に、２倍体胞子の生成は、第２減数分裂の欠如によって引き起こされる。
【００２７】
ＤＨと２倍体ＳＤＲ植物との間の基本的な差異は、ＳＤＲ植物においてはヘテロ接合性セグメントが異なる染色体に存在しているのに対して、ＤＨは完全にホモ接合性であるという事実によって説明される。ＳＤＲ植物において、全ての染色体ペアが、それらのセントロメア領域に関してホモ接合であるということは、さらに注目すべき点である。ヘテロ接合性が存在する場合には、それは染色体の遠位端に存在している。このことは、第１減数分裂の欠如を特徴とし、全ての染色体ペアについてセントロメア領域におけるヘテロ接合性をもたらす第１分裂復元またはＦＤＲと呼ばれる別の異常減数分裂事象とは対照をなすものである。
【００２８】
図２に示される理論的なケースでは、それぞれＤＨおよびＳＤＲの発現のために用いられた開始植物（ドナー植物）は、完全にヘテロ接合性である相同染色体を含んでいる。これは、それらの染色体に保持されている遺伝子の全ての対立遺伝子が多型であることを意味している。しかしながら、実際には、これは非常に可能性が低いものであるため、このケースは、最も極端なヘテロ接合状態を例示している。
【００２９】
図２より、ＳＤＲ事象に関して、各染色体ペアの交差点が、ホモ接合性の遺伝子座とヘテロ接合性の遺伝子座の比率を決定することが明らかである。この比率は、平均によりテロメアに向けて配置された交差位置を有するＳＤＲ事象においては増加し、一方、平均的によりセントロメア側に向けて交差位置が配置されている場合には減少する。十分な分子マーカーを利用できれば、これらの交差点を各ＳＤＲ事象について容易に決定することができる。
【００３０】
各染色体腕における交差の程度は、セントロメアの位置によって制限される。残留ヘテロ接合性が比較的少ない場合には、ＳＤＲ事象はヘテロ接合性の形態であることを除いてＲＩＬおよびＢＩＬの生成に類似するということにさらに注目すべきである。
【００３１】
ＳＤＲは、非還元胞子／配偶子の形成をもたらす、より広いクラスの現象の一形態にすぎない。ヴェイルレックス（Veilleux,  Plant  Breeding  Reviews  3,  253-288  (1985)）は、非還元配偶子が形成されるメカニズムについて説明し、作物植物における非還元配偶子の発生リストを提供している。当時、主に２つの異なるクラスの非還元配偶子、すなわちＳＤＲとＦＤＲが認識されていた。近年、第３のクラスの非還元配偶子が不定減数分裂復元(Indeterminate Meiotic Restitution)またはＩＭＲと名付けられて公開された（Lim  et  al.  (2001)  Theor.  Appl.  Genet.  103:219-230）。
【００３２】
本発明の目的については、ＳＤＲのみが関連している。ＳＤＲは、前掲のヴェイルレックス（Veilleux）、および他の独立した研究（Lim  K  et  al.  (2004)  Breeding  Science  54:  13-18）によって提示されるリストによって証明されている通り、広範な作物において自然に生じる。興味深いことに、コショウにおいて、該植物を１１℃に４８時間さらすことによって、ＳＤＲ２ｎ配偶子（花粉）の頻度が（平均で）１％未満から１０．５％まで増加するということが見出された（Zhang  X  et  al.  (2002)  Journal  of  Horticultural  Science  &  Biotechnology  78:  (1)  84-88）。ＳＤＲ発生の最大頻度は、８１．３％であると測定された。すなわち、外部刺激によって、ＳＤＲ事象の数を増加させることが可能である。
【００３３】
２ｎ胞子または配偶子の発生は、雄性配偶体には限定されず、雌性配偶体のレベルで起こるという証拠も存在する。例えば、ザゴルチェヴァ（Zagorcheva  L  Genetics  and  Plant  Breeding  9(5),  386-399  (1976)）は、キュウリにおける大胞子および大配偶子形成の偏りの発生を報告した。
【００３４】
近逆育種は、ヘテロ接合性開始植物の遺伝的構成を復元するために、ＳＤＲの結果である非還元胞子の発生を活用する。基本的に、オリジナル雑種植物を復元するために、各染色体のセントロメア領域に関して相補的であるＳＤＲ−０植物の選択を開始する。これは、多型分子マーカーを用いて各染色体におけるセントロメア領域を遺伝子型決定することによって達成することができる。ＳＤＲ−０再生体は各染色体のセントロメア領域に関してホモ接合性であるため、完全にまたは部分的に相補的な植物は、この方法によって容易に同定することができる。１つのランダムなＳＤＲ−０植物を選択した場合に、相補的なＳＤＲ−０植物（セントロメアの相補性に基づき、かつ、残留ヘテロ接合性は考慮しない）を見出す確率は、染色体の数をｘとすると（１／２）ｘである。
【００３５】
元の親系統を復元しようとする場合、一方の親を見つける確率は、（１／２）ｘ−１であり、かつ、他方の親についての確率は、（１／２）ｘである。また、前述のように、この「親に近い」系統は、両方の親について遺伝子移入セグメントが生成される戻し交雑自殖系統（ＢＩＬ）であると考えることもできる。その後、これらの相補的植物は、元の雑種植物の遺伝子型を復元するために交雑することができる。
【００３６】
しかしながら、減数分裂組み換えにより、ＳＤＲ−０植物の染色体腕の末端領域がヘテロ接合（１染色体腕あたり単一の交差の場合）になっているため、復元された雑種では分離が生じ、いくらかのレベルの非均一性をもたらし得る。組み換えが比較的末端の染色体位置で生じ、それにより遺伝子含量が少ないため、または、対立遺伝子変異が表現型変異にあまり寄与していないために、相補的ＳＤＲ事象の遠位の領域に位置する遺伝情報が表現型変異に対してあまり寄与していない場合には、復元された雑種は比較的均一である。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、減数分裂組み換えが染色体の最も端のテロメア領域においてのみ生じるＳＤＲ−０事象が生成される。このような事象では、染色体は、物理的に組み換えられるが、遺伝的には組み換えられない。
【００３８】
遺伝的に完全にホモ接合である復元雑種植物を得るために、ＤＨは、相補的ＳＤＲ−０事象の各々から生成される。図３に模式的に示されるこの原理は、図２のＳＤＲ−０事象３から再生された植物において生じ得る胞子／配偶子の構成を示している。
【００３９】
形成された胞子は再生され得、かつ、染色体倍加により、ＤＨが生成され得る。分子マーカーを用いることによって、親系統のいずれか一方に遺伝的に非常に類似しているＤＨを選択することができる。これは、倍加された染色体セットによって図４に示されている。
【００４０】
分離により、これらの倍加半数体植物の染色体の遠位端（組み換え切断点(break point)からテロメアまで）は、平均で各親の遺伝情報の５０％を含んでいる。相補的ＳＤＲ−０事象から生じる、無作為に選択された２つの倍加半数体植物が交配を介して組み合わされる場合には、復元された雑種植物において、近位腕領域が１００％のヘテロ接合性であるのに対して、遠位腕領域は５０％のヘテロ接合性である。ＳＤＲ−０事象は平均で６０％のホモ接合性であると推測されるので（Carputo,  D.  et  al.  (2003)  Genetics  163,  287-294）、相補的事象を伴う復元は、平均で８０％のヘテロ接合性（１００％×６０％＋５０％×４０％）と２０％のホモ接合性をもたらす。近位および遠位の交差点の間のホモ接合性は、この領域に関してホモ接合性であったＳＤＲ−０再生体の遺伝子型に偏っており、一方、遠位の交差点より遠位側では、ホモ接合性は、両方の親の遺伝子型に関して同一である。
【００４１】
ヘテロ接合性のパーセンテージに関する上記数字が極値を表していること、すなわち、１００％のヘテロ接合性である（その染色体上にある遺伝子の全ての対立遺伝子が多型であることを意味する）植物から開始していることは、当業者にとって明らかである。実際には、これは非常に可能性が低いものであるため、ヘテロ接合性のパーセンテージは、平均するとより低くなる。
【００４２】
また、本発明は、雑種を生成する方法であって、本発明により生成された第１のホモ接合性生物を第２のホモ接合性生物に交配することを含む方法にさらに関する。本発明によれば、元の雑種の遺伝的構成を復元することが可能であり、一方で、さらに、元の雑種の遺伝的構成に接近する変異体を得ることができる。
【００４３】
第一の実施形態において、得られる雑種がヘテロ接合性開始生物に類似するよう、第２のホモ接合性生物は、第１のホモ接合性生物に対して少なくとも部分的に相補的である。適切には、ヘテロ接合性開始生物との類似性は、開始生物のヘテロ接合性の少なくとも５０％を有する雑種を含んでいる。好ましくは、ヘテロ接合性の類似性は、５０％〜１００％の間のいずれかのパーセンテージであり、より具体的には、ヘテロ接合性の類似性は、５０％〜６０％の間のいずれかのパーセンテージであり、好ましくは６０％〜７０％の間であり、より好ましくは７０〜８０％の間であり、さらに好ましくは８０％〜９０％の間であり、最も好ましくは９０％〜１００％の間である。特定のパーセンテージが明確に言及されてはいないが、「いずれかのパーセンテージ」という用語は、上述された範囲内のあらゆる割合を対象とすることが意図されている。
【００４４】
また別の方法では、第２のホモ接合性生物は、得られる雑種が元のヘテロ接合性開始生物より優れるよう選択される。「元のヘテロ接合性開始生物」は、請求項１の工程ａ）で用いられる生物である。
【００４５】
復元された雑種植物におけるその親の起源、ならびにホモ接合性の相対的レベルの変異は、各々の親の各染色体腕内の交差点に依存している。分子マーカーを用いることにより、両方のＳＤＲ−０事象、ならびにそれらから生じる、交雑によってホモ接合性のレベルが比較的低いＦ１雑種をもたらすＤＨを、選択することができる。
【００４６】
この実施形態において、ＳＤＲ−０事象については、平均してより遠位の交差を有するものを選択すべきだが、ＤＨについては、最も相補的であるものを選択すべきである。
【００４７】
しかし、一方で、いずれかの親に偏り得るＦ１雑種にホモ接合性を導入するために、近位および遠位の交差点の間の距離が比較的大きい事象を選択することが望ましい。
【００４８】
以上のことから、近逆育種が、植物育種家による広範囲にわたる雑種の復元を可能にする一方で、ホモ接合性である対立遺伝子の異なるレベルおよび起源による顕著な変異が、元の（開始）雑種植物の能力の改良をもたらし得る実験的なＦ１雑種の間で得られることは、明白である。
【００４９】
また、染色体の所与のサブセットについてのみ相補的である雑種を生成することが可能である。これは、セントロメアの遺伝子型に基づいて、所望の染色体ペアに関して相補的であるとともに、他のものに関しては同一であるＳＤＲ−０事象を選択することによって、実行し得る。いわゆる近置換系統から生成されるかかる雑種は、非相補的染色体ペアに関してホモ接合性が高く、相補的染色体ペアと比較して同様のレベルのヘテロ接合性を染色体の遠位領域において有する。最も極端な形態では、完全に非相補的な倍加半数体を交配することができ、これはヘテロ接合性が染色体の末端部分に制限されている雑種植物をもたらす。
【００５０】
近逆育種技術に関してＳＤＲを利用するために、ＳＤＲ事象の自発的発生を使用することができ、あるいは例えば遺伝子工学を介してＳＤＲ事象を誘発させることができる。
【００５１】
本発明の別の形態は、戻し交配に関連している。戻し交配は、当業者にとっては周知である植物育種用語であり、所望の遺伝的構成（いわゆる遺伝的背景）を有する植物系統に特定の形質を遺伝子移入する手法をいう。この手法の所望の成果は、開始植物系統に対して遺伝的にほぼ同一であるが、所望の形質の基礎となる遺伝因子のみが組み換えを介して加えられる植物系統である。この目的を達成するために、所望の遺伝的背景および所望の形質を有する植物が交配され、かつ、その子孫は、該形質ならびにできるだけ多くの遺伝的背景を有する植物について選択される。各戻し交配サイクルに伴って所望の遺伝的背景の増大は平均して半分になるため、実際には、戻し交配手法を完遂するには４ないし５回の育種サイクルを要する。
【００５２】
近逆育種は、ホモ接合状態に至るための手法がわずか２つの工程しか要しないため、戻し交配を加速することができる。最初の工程は、従来の戻し交配手法、すなわち、所望の遺伝的背景および所望の形質を有する植物の交配と同一である。得られる雑種は、表現型またはマーカー利用に基づく所望の形質、ならびに遺伝的背景に対して特異的なセントロメアマーカーに基づく所望の遺伝的背景に関して選択されるＳＤＲ事象を発現させるために用いられる。
【００５３】
第２の工程は、分子マーカーを用いて遺伝的背景の最大量について選択されるＤＨの生成を含む。近逆育種は、ホモ接合に達するための手法を固定する(fasten)ものであるが、２つの選択工程を許容する。十分な遺伝マーカーが利用できる場合には、育種サイクルを消費する時間数を著しく削減できるため、所望の戻し交配生成物を従来の方法と比べてずっと効率的に得ることができる。
【００５４】
本発明の近逆育種方法を用いて、細胞質雄性不捻性（ＣＭＳ）を、所望の背景に非常に効率的に遺伝子移入することができる。ＣＭＳ移入に近逆育種を適用するためには、ＣＭＳドナーと稔性ドナーの染色体間の差異をより容易に決定できるよう、ＣＭＳドナー系統は、好ましくは、多くの核遺伝マーカーに関して、雄性不稔性に変換されなければならない系統とは遺伝的に類似しないものである。
【００５５】
純系または所望の自殖系統（ホモ接合性または近ホモ接合性）を、類似の系統だがＣＭＳ背景を伴うものに変換するためには、最初の交配は、所望の系統の花粉による前記ＣＭＳの受粉によって成される。その結果生じるＦ１子孫は、ＣＭＳと所望の系統の染色体の５０％とを含む。Ｆ１子孫植物は、亜酸化窒素などの化学物質による処理または低温などのストレス条件のいずれかによって、雌性発生においてＳＤＲ減数分裂を起こすよう誘導される。また、ＳＤＲは、雌性発生において自発的にも発生し得る。
【００５６】
雄性発生が適用される場合には、雄性不稔を誘導する細胞質の効果を抑制することができる回復遺伝子を使用しなければならない。
【００５７】
得られるＳＤＲ−０植物は、Ｆ１雑種のセントロメア領域に関して多型であるＤＮＡマーカーを用いて遺伝的に分析される。ＣＭＳに変換されなくてはならない系統のセントロメア領域をもっぱら含むＳＤＲ−０植物が選択される。ゲノムをカバーする多数の識別マーカーが利用可能な場合には、平均して染色体上の最も近位の交差点を有するＳＤＲ−０事象を選択することができる。これは概ね、選択された系統を単一の工程でＣＭＳに変換する。必要に応じて、この戻し交配サイクルを繰り返すことができる。
【００５８】
ＳＤＲ事象の自発的発生は、熱ショックまたは低温ショックのような特定の非生物的ストレス条件によって増強し得る。このようなストレス条件は、非還元型２倍体胞子の形成を増強することが知られている（Zhang  X  et  al.  (2002)  Journal  of  Horticultural  Science  &  Biotechnology  78:  (1)  84-88）。また、亜酸化窒素（Ｎ２Ｏ）ガスを適用することによって、２ｎ花粉の形成を誘発することが可能である（Okazaki,  K.  et  al.  (2005)  Euphytica,  143,  101-114）。
【００５９】
２倍体胞子が雄性減数分裂を介して生成される場合、フローサイトメトリーおよび蛍光励起細胞分取を介してこれらの細胞を濃縮することが可能である。かかる技術は、当業者によく知られており、過去に小胞子に適用されている（Deslauriers  C  et  al.,  (1991)  Flow  cytometric  characterisation  and  sorting  of  cultured  Brassica  napus  microspores.  Biochem.  Biophys.  Acta:  1091,  165-172）。
【００６０】
また、２倍体の胞子あるいは花粉は、それらの半数体同等物(peer)よりもサイズが大きいことが知られている（Lernmi  G  and  Negri  V.  (1994)  Research  on  2n  pollen  production  in  Lotus  tenuis  an  I.M.G.V.  of  Perugia  University.  Lotus  newsletter  Vol;  25,  pp  24-27）。驚くべきことに、２倍体胞子が半数体胞子と物理的に異なるという事実のみによって、フローサイトメトリーおよび蛍光励起細胞分取を介して２倍体胞子を特異的に濃縮することが可能となる。
【００６１】
さらに、２倍体胞子の形成をもたらす環境条件の最適化は、異なる選別技術を用いて容易に行うことができる。
【００６２】
非還元胞子の再生は、還元胞子の再生に類似した様式の棘受粉(prickle pollination)により、雄性発生、雌性発生、または単為生殖を介して生じる。棘受粉による単為生殖が適用される場合、２倍体花粉、特に胚乳中の父性ゲノムに対する母性ゲノムの割合の変化に関して耐性の低い種を用いることは有利であり得る。全ての作物ではないとしても、ほとんどの作物に関して、これらの再生プロトコルは学術文献に記載されており、かつ、当業者にとっては周知である。
【００６３】
２倍体胞子から植物が再生されると、ＳＤＲあるいはＦＤＲ事象に関する診断基準である染色体ペアのセントロメア領域のホモ接合性あるいはヘテロ接合性を判断するために、分子マーカーを利用し得る。かかる方法により、ＳＤＲ事象を容易に選択することができる。
【００６４】
減数分裂の第２細胞分裂に関わる遺伝子機能への干渉を可能にする、異なる遺伝的アプローチが当業者に周知である。かかる干渉は、突然変異誘発または遺伝子組み換えのいずれかを介するものであり得る。遺伝子組み換えのアプローチは、ＳＤＲ型の２倍体胞子をもたらす減数分裂の第２分裂を改変するＤＮＡフラグメントの安定な又は一過性の導入を目的としている。この改変は、減数分裂の過程に関与している遺伝因子、特に第２細胞分裂に関与している遺伝因子への干渉を介して生じ得る。この干渉は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）に基づく、遺伝子発現の特異的下方調節を介して確立させ得る。ＰＴＧＳは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）またはウイルス誘導性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を介して達成し得る。
【００６５】
さらに別のアプローチでは、この干渉は、ＳＤＲをもたらす減数分裂の第２減数分裂に対して優性阻害効果を発揮するタンパク質の過剰発現を介して確立させることができる。
【００６６】
採用されたアプローチの如何にかかわらず、標的遺伝子は、分子レベルで知られている必要がある。ジャガイモの、ＳＤＲ型の減数分裂をもたらす多数の劣性突然変異体（ｐｃｐｃ，ｏｓｏｓ，ｆｃｆｃ型）が記載されている（Carputo,  D.  et  al.  (2003)  Genetics  163,  287-294）。トウモロコシに関しても、elongate 1 突然変異が減数分裂ＩＩの欠如をもたらしている（Barell,  PJ  and  Grossniklaus,  U.  (2005)  Plant  J.  43,  309-320）。
【００６７】
これらの具体例において突然変異した遺伝子は、分子レベルではまだ特定されていないが、当業者は、そのようにすることができ、よって、これらおよび他のまだ未知の遺伝子は、分子抑制技術を用いて標的の種におけるＳＤＲを達成するための優れた候補である。本発明は、近逆育種の一般的原理に関するものであり、開始生物においてＳＤＲを誘導する全ての可能な実施形態が記載されているわけではないという事実は、本発明とは関連しない。
【００６８】
上記した遺伝子の代替物は、シロイヌナズナに関して記載され、突然変異により異常な形態の減数分裂をもたらすＤＵＥＴ（Venkata  Reddy  et  al.  (2003)  Development  130,  5975-5987）やＣＹＣ１；２（Wang  et  al.  (2004)  Plant  Physiology  136,  4127-4135）のような遺伝子において見つけることができる。
【００６９】
これらの突然変異における２倍体減数分裂生成物は、ＳＤＲ様であり、このことから、ＤＵＥＴおよびＣＹＣ１；２ならびに他の植物種におけるそれらの機能的相同体は、ＳＤＲ型の減数分裂をもたらす候補標的遺伝子である。
【００７０】
さらに別の候補標的遺伝子は、ノックアウトにより減数分裂後の細胞分裂の欠如をもたらすTETRASPORE/STUD（Yang  et  al  (2003)  Plant  J.  34,  229-240）である。tetraspore/stud突然変異体の小胞子の２倍体再生体は、ＳＤＲ様のものであり得る。
【００７１】
ＳＤＲ−０植物が得られると、それらをさらに分子的に特徴決定することができる。まず、セントロメア領域のハプロタイプを決定することができ、これがＳＤＲ−０植物間における相同染色体の相補性のレベルについての見識を提供する。適用に応じて、完全にまたは部分的に相補的であるＳＤＲ−０植物を選択することができる。その後、ＳＤＲ植物は、より緻密なハプロタイプ・マップを生成するために使用し得る。これは、当業者にとって周知である分子タイピング技術を用いることで達成し得る。例としては、ＲＦＬＰ（"制限断片長多型"  Beckmann,  J.  S.  and  Soller,  M  (1983)  Theor.  and  Appl.  Genet.  67,  35-43）、ＲＡＰＤ（"ランダム増幅多型DNA"  Welsh,  J.  and  McClelland,  M.  (1990)  Nucleic  Acids  Res.  19,  961-866）、ＡＦＬＰ（"増幅断片長多型"  Vos,  P.  et  al  (1995)  Nucleic  Acids  Res.  23,  4407-4414）、あるいはＳＦＰ（単一特徴多型(Single  Feature  Polymorphism)  Borovitz,  J.  et  al  (2003)  Genome  Research  13,  513-523）がある。これらの技術は、ＤＮＡ多型の性質に関する予備知識がなくても使うことができる。
【００７２】
例えばＳＮＰなどのように、ＤＮＡ多型が特徴決定される場合には、多くのＳＮＰ検出技術を使用することができる（Kwok,  P.  Y.  and  Chen,  X  (2003)  Curr.  Issues  Mol.  Biol.  5,  43-60）。ハプロタイプ・マップは、ＤＨ生成に関して植物を選択するのに使用し得る。得られたＤＨは、ＳＤＲ−０開始植物においてヘテロ接合性である領域についてハプロタイプ決定される。かかる分析は、Ｆ１雑種におけるヘテロ接合性／ホモ接合性の割合を操作するために用い得る遺伝的情報を提供し、かつ、Ｆ１雑種のゲノムのホモ接合性領域に係る、親の起源のいずれかについて選択する可能性を提供する。
【００７３】
２つのホモ接合性生物の少なくとも１つの相補的な組み合わせ（交配後に開始生物を「再合成」できる組み合わせ）を見つける確率は、所与の種の半数体染色体数ｘと、ＳＤＲが起こったヘテロ接合性開始生物から生成されるホモ接合性生物の数ｋの関数である。
【００７４】
所与の作物種の半数体染色体数をｘで表す場合、交差点の近位であってセントロメア領域を含む染色体領域のみを考慮すると、その作物種の植物から得られるＳＤＲ−０遺伝子型の最大数は、２ｘである。この集団からランダムに選択される１つのＳＤＲ−０植物のペア、またはそれらから生じるＤＨが、交配によって、ＳＤＲ−０事象を生成した遺伝子型（元の遺伝子型）とほぼ同一の遺伝子型を有するＦ１雑種をもたらす確率は、（２ｘ−１）／２ｘである。総数ｋのＳＤＲ−０植物が生成される場合、交配され得る２つの遺伝的に異なるＳＤＲ−０植物またはそれらから生じるＤＨ植物の組み合わせ数は、１／２ｋ（ｋ−１）である。ランダムに選択される２つのＳＤＲ−０植物またはそれらから生じるＤＨ植物の組み合わせが相補的である確率は、（１／２）ｘである。したがって、ランダムに選択される２つのＳＤＲ−０植物またはそれらから生じるＤＨ植物の組み合わせが相補的でない確率は、１−（１／２）ｘ＝（２ｘ−１）／２ｘである。ＳＤＲ−０植物またはそれらから生じたＤＨ植物がｋ個の場合、（１／２）ｋ（ｋ−１）個の組み合わせが生成され、これにより、このＳＤＲ−０集団またはそれらから生じるＤＨ植物において、相補的な植物が見つからない確率は、（（２ｘ−１）／２ｘ）（（１／２）ｋ（ｋ−１））であり、この結果、２つのＳＤＲ−０植物またはそれらから生じるＤＨ植物の少なくとも１つの相補的な組み合わせが見つかる確率は、１−（（２ｘ−１）／２ｘ）（（１／２）ｋ（ｋ−１））である。この分析の結果は、以下の表１に示される。
【表１】
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【００７５】
この分析は、キュウリのような半数体染色体数が７である植物種に関しては４８個のＳＤＲ−０植物またはそれらから生じるＤＨ植物を用いて、カリフラワーのような半数体染色体数が９である植物種に関しては１２８個を用いて、ならびにトマト、メロンおよびアマトウガラシ(sweet pepper)のような半数体染色体数が１２である植物種に関しては２５６個を用いて、元の遺伝子型が、本発明によってＦ１雑種として高確率で概ね再合成され得ることを示している。これらの数字は、これらの作物種に対して近逆育種を適用するために必要なＳＤＲ−０植物の数が比較的少なく、この結果、特に工業環境においては、この数の生成が非常に実現しやすいという事実を示している。半数体染色体数が既知であるあらゆる作物種においてかかる計算を行い得ることは、当業者にとって明らかである。
【００７６】
本明細書中で使用される「ＳＤＲ−０植物または細胞」は、非還元配偶子から生じる植物および配偶子に関連していることを意図している。この非還元配偶子は、第２分裂復元（ＳＤＲ）事象の結果であり得るが、２倍体をもたらす異常な形態の減数分裂の産物でもあり得る。
【００７７】
したがって、本発明は、例えば遺伝子型を復元するため、近相補的親系統を生成するため、近染色体置換系統を作り出すため、ならびにホモおよびヘテロ接合性のゲノムセグメントの導入によってＦ１雑種を最適化するために、ＳＤＲまたはＳＤＲ様の非還元配偶子から再生される生物、特に植物、およびそれらの子孫を使用するための手段を提供する。
【００７８】
本発明は、以下の図を参照する後述の非限定的実施例によってさらに説明される。
【００７９】
図５は、キュウリの典型的なＦ２植物のＡＦＬＰパターンを示す。全ての横線は、１つの植物個体を表している。全ての垂直の欄は、連鎖群を表している。薄灰色のセグメントは、ヘテロ接合性の領域を表し、黒色および暗い領域は、それぞれホモ接合性の領域を表している。
【００８０】
図６は、キュウリにおける典型的なＤＨ系統のＡＦＬＰ分析を示す。全ての横線は、１つの植物個体を表している。全ての垂直の欄は、連鎖群を表している。ＤＨ系統においては、予想どおり黒色および暗い領域のみが存在し、薄灰色セグメントは存在していない。
【００８１】
図７は、キュウリにおける典型的なＳＤＲ−０植物のＡＦＬＰ分析を示す。全ての横線は、１つの植物個体を表している。全ての垂直の欄は、連鎖群を表している。薄灰色セグメントは、ヘテロ接合性の領域を表している。黒色および暗い領域は、それぞれホモ接合性の領域を表している。
【００８２】
図８は、低温で処理されたコショウ植物体から採取された花粉を示す。図８Ａは、光顕微鏡を通して観測される、寒冷処理された植物の花粉を示し、一方、図８Ｂは、対照植物の花粉を示す。
【実施例】
【００８３】
実施例１
「雌性発生によって得られるキュウリ(Cucumis sativus L.)における比較的低いレベルのヘテロ接合性の発生についての実証」
【００８４】
欧州特許出願第３７４７５５号に従ってキュウリにおいて半数体および倍加半数体を作成することにより、期待される倍加半数体のうち、いくらかのパーセンテージが、半数体大胞子を起源とするものではなく非還元大胞子（２ｎ）から生じたものであるということが、ＡＦＬＰ分析（欧州特許出願０５３４８５８に従って実行）を用いることによって発見された。このことは、最初に推定された倍加半数体（図６）がヘテロ接合性セクタをまだ含んでいる点が示されている図５、図６および図７において十分に実証されており、この点は当然ながら真性倍加半数体では起こり得ないことである。
【００８５】
この実施例は、キュウリにおける雌性発生を介してＤＨが得られるが、さらにヘテロ接合性であるいくつかの領域を示す植物が得られる、ということを示している。このヘテロ接合性のレベルは、Ｆ２世代と比べると著しく低減され、このことから、おそらくＳＤＲ様のメカニズムによって引き起こされている可能性が最も高い。
【００８６】
実施例２
「アマトウガラシ（Capsicum annuum L.）における非還元胞子／配偶子の形成の増進」
【００８７】
非還元胞子／配偶子形成の頻度を増加させるために、誘導因子として低温ストレスを適用した。この目的のために、チャンら（Zhang  et  al.  (2002)  Journal  of  Horticultural  Science  &  Biotechnology  78(1),  84-88）に従って、前減数分裂花芽を含み、２３℃で生育するアマトウガラシの顕花植物を、１１℃に５日間曝露した。この低温ショックの後に、芽を採取し、解剖用の鉗子およびメスを用いて葯を開くことにより、花粉を摘出した。その後、花粉を顕微鏡のスライドガラス上に移し、１滴のアセトカルミンを用いて生存染色した。カバーガラスを、光顕微鏡法を用いて調査される懸濁液の上に置いた。対照物として、２３℃で生育させたアマトウガラシ植物体から花粉を採取した。
【００８８】
図８は、寒冷処理植物（図８Ａ）と対照植物（図８Ｂ）から採取された花粉の形態の代表例を示す。同図に示すように、非還元胞子から生じたことを示す増大したサイズを有する花粉の数は、寒冷処理植物において顕著に増大している。この特定の実施例では、寒冷処理により非還元胞子のパーセンテージが最大で２５まで上昇すると推定された。以上のように、温度ストレスによる非還元胞子の形成の増強は、大いに実現可能であることが示される。
【００８９】
実施例３
「フローサイトメトリーによるブロッコリー（Brassica oleracea L.）の自然発生２倍体胞子の濃縮」
【００９０】
ブロッコリー（および他の植物種）に関しては、２倍体胞子が半数体胞子よりも大きいことが知られている。フローサイトメトリーを用いて２倍体胞子を濃縮できるか否かを判断するために、２倍体および４倍体植物から得られた胞子の様々な混合物を作成した。胞子は、花芽（３〜４ｍｍのサイズ）を緩衝液（８．２ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．９ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝７．４）中で粉砕し、その後１１０μｍのフィルタを介してろ過することによって、単離した。細胞を、抽出緩衝液で２度洗浄し、計数した。
【００９１】
半数体細胞と２倍体細胞の比が１：１、１０：１、および１００：１である混合物を作成した。分類は、粒度、生命力、およびサイズのパラメータに基づいて実行された。２倍体細胞の濃縮は、全ての比において、かつ、３つのパラメータの各々に基づいて得られた。次の実験では、半数体小胞子の天然の集団を、上述したパラメータに基づいて分類した。２倍体小胞子を分類することが可能であり、２倍体小胞子は小胞子集団において０．７％の頻度で存在すると推定される、ということが見出された。図９は、光顕微鏡を介して観察された、この実験で得られた精製された２倍体小胞子（下段横列）を、通常の半数体小胞子と比較して示している。写真は、TNO Leiden（オランダ）のエム・ヴェンニック技師（Ing. M. Vennik）のご厚意により、得られたものである。
【００９２】
実施例４
「候補標的遺伝子Tetrasporeを下方制御するのに利用可能なＲＮＡ干渉ベクターの構築」
【００９３】
特定の植物種における候補標的遺伝子の活性を下方制御するために、ＲＮＡ干渉を用いることができる。その目的のため、植物において発現すると折り畳まれて相同なＲＮＡの特異的分解を引き起こすヘアピン構造を形成することができるＲＮＡ分子が形成されるよう、シロイヌナズナのTetrasporeのＤＮＡフラグメントを、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬ（Wesley  et  al.  (2001)  The  Plant  Journal  27,  581-590）の中に挿入した。
【００９４】
ｐＫＡＮＮＩＢＡＬベクターは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの下流で、かつ、オクトピンシンターゼのポリアデニル化シグナルより上流に位置するイントロンを含んでいる。そのイントロンの両側には、ＲＮＡ干渉標的に対応するＤＮＡの左右の腕を互いに逆方向に容易に挿入することができる多重クローニング部位が配されている。転写されると、該イントロンはスプライシングによって取り除かれ、かつ、該左右の腕は互いに折り畳まれて二重鎖ＲＮＡを形成する。
【００９５】
遺伝子の５’末端（５８８ｂｐ、フォワードプライマー：５’−ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＣＣ  ＧＴＴ  ＡＡＧ−３’、リバースプライマー：５’−ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＣＴ  ＡＣＣ  ＡＣＴ  ＴＣ−３’）および遺伝子の中間部分（６７９ｂｐ、フォワードプライマー：５’−ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＴＣ−３’、リバースプライマー：５’−ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＡＧ−３’）に対応する２つのｃＤＮＡ断片を単離した。制限酵素認識部位を各フラグメントの両側に生成し、これにより、ｃＤＮＡフラグメントを逆方向反復としてｐＫＡＮＮＩＢＡＬに挿入することを可能にした。両フラグメントにおける左腕は、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして操作し、一方、両フラグメントの右腕は、ＨｉｎｄＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとして操作する。最終工程では、植物の形質転換のための選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子を含んでいるｐＡＲＴ２７と呼ばれるバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ中に、両方のTetraspore配列を逆方向反復として含む完全なヘアピンカセットを別々に挿入する。Ｔ−ＤＮＡの完全性を、配列解析によって確認した。
【００９６】
かくして得られる、５’フラグメントについてはｐＲＺ２２６と命名され、３’フラグメントについてはｐＲＺ２１９と命名されたバイナリーベクターを、三系交雑法（triparental mating procedure）を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）へ導入する。クローニングされた候補標的遺伝子のフラグメントとＲＮＡ干渉によって下方制御される必要がある特定の遺伝子との間において、配列類似性が低すぎる場合には、上述の方法を、下方制御される必要がある遺伝子に対して十分に相同であるＤＮＡフラグメントを含んでいる類似コンストラクトを生成するために用いることができる。
【００９７】
実施例５
「ｐＲＺ２２６およびｐＲＺ２１９を用いたシロイヌナズナの形質転換」
【００９８】
植物形質転換ベクターｐＲＺ２２６とｐＲＺ２１９を含んでいるアグロバクテリウム・ツメファシエンス株Ｃ５８を、ベクターについて選択するためのストレプチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびスペクチノマイシン（３００ｍｇ／Ｌ）、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８のバックグラウンドについて選択するためのリファンピシン（４０ｍｇ／Ｌ）およびゲンタマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含んでいるＬＢ培地において、２９℃で終夜培養した。
【００９９】
遺伝子組み換え植物を生成するために、概ねデヒューら（Desfeux  et  al.  (2000)  Plant  Physiology  123,  895-904）に記載される通りに、シロイヌナズナの花浸漬法を用いた。バクテリア細胞を、花浸漬溶液（１リットルＭｉｌｌｉＱ水あたり５０ｇのショ糖と５００マイクロリットルのｓｉｌｗｅｔｔ Ｌ−７７界面活性剤）中に再懸濁させた。複数の花芽を含む抽薹植物を、１．０〜１．５のＯＤ値でアグロバクテリウム細胞を含んでいる浸漬溶液中に、緩やかに攪拌しながら５〜１０秒間浸した。接種後、植物を、暗い光条件の下で高い湿度を保つためにプラスチック容器中に１日間収容し、その後、該植物上で種子を成長させた。
【０１００】
表面消毒した種子を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１／２濃度(half-strength)のＭＳプレート上に重ねられた０．１％のアガロース中において発芽させることにより、形質転換体を選択した。カナマイシン抵抗性の実生を、温室内の土に移した。
【０１０１】
実施例６
「ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）における自然発生的ＳＤＲ事象」
【０１０２】
遠縁交雑(wide cross)を介して赤キャベツ（Brassica oleracea）上で生成される、オグラ型細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）を有する雑種を、元の赤キャベツＣＭＳ植物と表現型上ほぼ同一であって、それ故インビボ雌性発生の産物である２倍体植物の発生についてスクリーニングした。これらの植物はその表現型に基づいて真の雑種植物と容易に区別され得るものであり、実際に低い頻度で同定された。
【０１０３】
かかる植物は、自然に倍加した還元配偶子、または非還元配偶子から、単為発生を介して生じるものである。これらの可能性を区別するために、かかる植物から得たＤＮＡを、ＡＦＬＰ（欧州特許５３４８５８号に従って実行）を用いて分析した。この分析は、この植物が非還元配偶子を起源としていることを示唆する比較的低い頻度でのヘテロ接合性座の存在を実証した。この実施例は、ブラッシカ・オレラセアにおけるインビボ雌性発生を通じて、ＳＤＲ様メカニズムによって引き起こされる可能性の高い比較的低いレベルのヘテロ接合性を有する植物が得られることを示している。
【０１０４】
図１０は、非還元配偶子から生じたブラッシカ・オレラセア植物のＡＦＬＰ指紋を示す。灰色線は、一方の親からのホモ接合性マーカーを示し、濃灰色は、他方の親からのものを示している。薄灰色は、雑種型のマーカー座を示している。
【０１０５】
実施例７
「トウモロコシの近逆育種」
【０１０６】
トウモロコシのゲノムにおける核酸の組み込みは、当該技術分野において公知の常套手法であり、かつ、これを達成する方法は、既に開示されている（欧州特許８０１１３４号、米国特許５，４８９，５２０号、欧州特許９７．１１４６５４．３号）。これらの特許出願に開示される形質転換方法のいずれかを用いて、第２減数分裂に関与する１または複数の遺伝子、特にelongate 1（Barell,  PJ  and  Grossniklaus,  U.,  (2005)  Plant  J.  43,  309-320）に対する特定の阻害効果を付与し、かつ、結果としてＳＤＲ型の異常減数分裂事象の発生をもたらす核酸配列を導入した。得られるＳＤＲ事象の頻度は、遺伝子組み換え核酸配列が組み込まれるゲノム部位が異なることの結果として、独立した形質転換体の間でしばしば異なる。
【０１０７】
別の実験では、ＳＤＲ胞子の頻度は、トウモロコシ植物の低温処理によって、または、カトウ・エーおよびバーチラー（Kato,  A  and  Birchler,  JA  (2006)  J.  Hered.  1,  39-44）に記載される通りに亜酸化窒素ガスを適用することによって、増大した。
【０１０８】
上記阻害核酸の活性、または、低温もしくは亜酸化窒素処理の適用の結果、ＳＤＲ型である多数の小胞子、各大胞子がそれぞれ生成された。
【０１０９】
かくして生成された細胞集団を、ＳＤＲ小胞子が正常の半数体小胞子に比べてサイズが大きいという事実に基づいて、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞分取を用いることにより、ＳＤＲ小胞子の存在について濃縮した。
【０１１０】
ＳＤＲ事象の結果として生成された小胞子または大胞子は、染色体の２倍体セットを含んでいる。これらの２倍体小胞子または大胞子は、ＳＤＲ−０再生体を生成するための開始材料であった。
【０１１１】
また、半数体トウモロコシ植物は、半数体誘導因子による自然のまたは人工的な受粉の後にも得られている。この場合、半数体胚を含む種子が得られる（Rotarenco  V  (2002)  Production  of  matroclinous  maize  haploids  following  natural  AND  artificial  pollination  with  a  haploid  inducer,  Maize  Genetics  Cooperation  News Letter  76:  16）。また、ＤＨトウモロコシ植物を生成する上記手順は、ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０トウモロコシ胚を生成するためにも適用されており、かかる胚の形成は、この実施例において特定された処理によって誘導されるものである。また、ＳＤＲ−０穀粒の内胚乳において母性および父性ゲノム間の適正なバランスを得るために、４倍体誘導系統をも用いた。
【０１１２】
ＳＤＲを誘導するために遺伝子組み換えが適用される特定の実験では、単一コピーの導入遺伝子を含む形質転換体が好適であった。第２減数分裂を大きく阻害する核酸コンストラクトを含む遺伝子導入系統を得た後、この系統を、反復形質転換事象を避けるために、交配に用いた。その場合、半数体配偶子を含む正常な花粉の頻度は低かったが、交配に用いるには十分であった。
【０１１３】
さらなる実験では、例えばデキサメタゾンにより化学的に誘導できるプロモーターによって制御される阻害核酸コンストラクトを用いた（Bohner,  S.  et  al.  (1999)  Plant  J.  19,  87-95）。
【０１１４】
次いで、トウモロコシにおける半数体を、小胞子から得た（Pescitelli  S  and  Petolino  J,  (1988)  Plant  Cell  Reports  7:  441-444;  Coumans  M  et  al.,  (1989)  Plant  Cell  Reports  7:  618-621;  Pescitelli  S  et  al.,  (1989)  Plant  Cell  Reports  7:  673-676;  Buter  B  (1997)  In  vitro  haploid  production  in  maize.  In:  In  Vitro  Haploid  Production  in  Higher  plants,  vol  4,  37-71.  Kluwer  Academic  Publishers.  Eds.  S  Jain,  S  Sopory  &  R  Veilleux）。
【０１１５】
半数体トウモロコシ植物は、半数体誘導因子による自然のおよび人工的な受粉の後にも得られた（Rotarenco  V  (2002)  Maize  Genetics  Cooperation  News  Letter  76:  16）。この場合、半数体胚を含む種子が得られた。
【０１１６】
ＤＨトウモロコシ植物を生成する上記手順は、ＳＤＲ−０細胞からＳＤＲ−０トウモロコシ植物を生成するのに適用され、その形成は、遺伝子組み換えによって、またはこの実施例において特定された他の処理によって誘導されるものである。
【０１１７】
オリジナル開始植物の各染色体のセントロメア領域において多型である分子マーカーを用いて、ＳＤＲ−０トウモロコシ植物を、各染色体のセントロメア領域について遺伝的に特徴決定した。多型の検出には、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ｔａｑｍａｎ法から選択される様々な技術を使用した。
【０１１８】
これにより、セントロメア領域のマーカースコアに関し、全ての染色体ペアについて相補的であるＳＤＲ−０トウモロコシ植物の組み合わせが同定された。そして、このＳＤＲ−０トウモロコシ植物の組み合わせを、各ＳＤＲ−０相補的植物において倍加半数体植物を生成するために使用した。各々の相補的ＳＤＲ−０植物から得られる個々のＤＨを、対で交配した。すなわち、トウモロコシＦ１雑種を生成するのに用いられる２つのＤＨは、相補的ＳＤＲ−０事象のいずれか一方を起源としている。これらの交配は、相互に行った。これにより生成されたＦ１雑種を、対照として開始Ｆ１雑種を用いる農業生産力についての圃場試験において評価した。
【０１１９】
本発明に係る近逆育種によって得られた雑種の農業生産力は、元の雑種の生産力と同等であることが判明した。
【０１２０】
実施例８
「キュウリの近逆育種」
【０１２１】
雌性発生は、キュウリにおいてよく確立された技術であり、欧州特許０３７４７５５号に記載される方法に従って実行される。欧州特許０３７４７５５号に従って適用した場合に、雌性発生において生じる自発的なＳＤＲ事象は、いくらかの残留ヘテロ接合性を有する２倍体再生体の形成をもたらした。これらのＳＤＲ−０キュウリ植物を、欧州特許５３４８５８号において提供される方法に従って実行されるＡＦＬＰ分析を用いて同定した。
【０１２２】
これにより得られたＳＤＲ−０キュウリ植物を、元の開始植物の各染色体のセントロメア領域において多型である分子マーカーを用いて、各染色体のセントロメア領域について遺伝的に特徴決定した。多型の検出には、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、ｔａｑｍａｎ法から選択される既知の技術を使用した。この結果、セントロメア領域のマーカースコアに関し、全ての染色体ペアについて相補的であるＳＤＲ−０キュウリ植物の組み合わせが同定された。このＳＤＲ−０キュウリ植物の組み合わせを、欧州特許０３７４７５５号に記載される方法に従って、各々の相補的ＳＤＲ−０植物においてＤＨ植物を生成するために使用した。
【０１２３】
自発的に生じるＳＤＲ事象を捨て、真の倍加半数体植物のみをさらなる工程において用いた。半数体植物が得られた場合、染色体数を、例えばコルヒチンを適用することによって倍加させる。染色体倍加は、自発的にも起こり得る。各々の相補的ＳＤＲ−０植物から得られる個々のＤＨ植物を、対で交配した。すなわち、キュウリＦ１雑種を生成するのに用いた２つのＤＨは、相補的ＳＤＲ−０事象のいずれか一方を起源としていた。これらの交配は、相互に行った。これにより生成されたＦ１雑種を、対照として開始Ｆ１雑種を用いる農業生産力についての試験において評価した。
【０１２４】
本発明に係る近逆育種によって得られた雑種の農業生産力は、元のＦ１雑種の生産力と同等であることが判明した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図３Ｂ−３】
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【図３Ｂ−４】
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【図３Ｂ−５】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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