(57)【要約】【課題】標的となるＲＮＡ鎖を選択的に検出することが可能な新規のＲＮＡ検出用試薬、及びそのようなＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬を提供すること。【解決手段】標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドと、一端が上記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基と縮合した二価のリンカーユニットと、当該二価のリンカーユニットの他端に結合した蛍光発色ユニットと、当該蛍光発色ユニットに結合した下記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットと、を備えたＲＮＡ検出用試薬を使用する。2013198426.tif 000036【選択図】図１
2013198426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドと、一端が前記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基と縮合した二価のリンカーユニットと、前記二価のリンカーユニットの他端に結合した蛍光発色ユニットと、前記蛍光発色ユニットに結合した下記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットと、を備えたＲＮＡ検出用試薬。
【化１】
2013198426.tif 000031
（上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はアルキル基であり、ｍ及びｎはそれぞれ独立に０〜４の整数である。また、上記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットは、波線を付した単結合により前記蛍光発色ユニットに結合される。）
【請求項２】
前記蛍光発色ユニットが、ヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基である請求項１記載のＲＮＡ検出用試薬。
【請求項３】
下記一般式（２）で表される請求項１又は２記載のＲＮＡ検出用試薬。
【化２】
2013198426.tif 000032
（上記一般式（２）中、Ｎｕは前記オリゴヌクレオチドから５’−末端の水酸基を除いてなる基であり、Ｘはヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基である前記蛍光発色ユニットであり、Ｌは２価の有機基である前記リンカーユニットであり、Ｒ１は上記一般式（１）と同様である。なお、上記一般式（２）において、ＮｕとＬとの間に存在する酸素原子は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基から水素原子を除いたあとに残る酸素原子を意味する。）
【請求項４】
下記一般式（３）で表される請求項１〜３のいずれか１項記載のＲＮＡ検出用試薬。
【化３】
2013198426.tif 000033
（上記一般式（３）中、Ｎｕは前記オリゴヌクレオチドから５’−末端の水酸基を除いてなる基であり、Ｘはヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基である前記蛍光発色ユニットであり、Ｒ１は上記一般式（１）と同様であり、Ｒ２は水素原子又はアルキル基であり、Ｚは二価の基又は単結合であり、ｎは１〜１８の整数である。なお、上記一般式（３）において、ＮｕとＺとの間に存在する酸素原子は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基から水素原子を除いたあとに残る酸素原子を意味する。）
【請求項５】
上記一般式（３）におけるＺが−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）Ｏ−である請求項４記載のＲＮＡ検出用試薬。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のＲＮＡ検出用試薬を検査対象に添加し、当該検査対象に紫外線又は可視光線を照射した際に、前記ＲＮＡ検出用試薬の有する蛍光が増強するか否かを観察することにより前記検査対象内に標的となるＲＮＡが含まれるか否かを判断する検査方法。
【請求項７】
下記一般式（４）で表される、ＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬。
【化４】
2013198426.tif 000034
（上記一般式（４）中、Ｘはヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基であり、Ｌは２価の有機基であり、Ｒ１は水素原子又はアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にボロン酸の保護基であって、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して環を形成してもよく、Ｒ５は亜リン酸基の保護基であり、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立にアルキル基であって、Ｒ６及びＲ７は互いに結合して環を形成してもよい。）
【請求項８】
下記一般式（５）で表される請求項７記載の試薬。
【化５】
2013198426.tif 000035
（上記一般式（５）中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は上記一般式（４）と同様であり、Ｒ２は水素原子又はアルキル基であり、ｎは１〜１８の整数である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ検出用試薬、検査方法及びＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの解析は、ゲノムを構成するＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分子の塩基配列を決定することから始まる。しかしながら、塩基配列のデータからだけでは、どこにどのような遺伝子があり、さらに特定の遺伝子が細胞内のどの場所で発現しているか等といった情報は得られない。そこで、ＤＮＡから転写して作られるｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ（ｍＲＮＡ；ＲＮＡはリボ核酸の略である。）や、これを翻訳して作られるタンパク質等といった遺伝子産物の解析をはじめ、生物種間で塩基配列がどれだけ似ているのか等の比較、さらに大腸菌や発芽酵母等の実験生物を使用した様々なアプローチによって解析された個々の遺伝子に関するデータ等をもとにゲノムの解析が進められる。
【０００３】
細胞核中のＤＮＡのもつ遺伝情報はＲＮＡへと転写される。通常、転写されたＲＮＡは細胞質内へと移動し、タンパク質に翻訳される。こうした転写や翻訳の調節に様々な生体高分子が関わっていることが既に知られているが、近年、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（ｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡ；ｎｃＲＮＡとも呼ばれる。）がこれらの調節を含めた遺伝子調節に大きな役割を果たしていることがわかってきている。ｎｃＲＮＡは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡの総称であり、ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）等が挙げられる。
【０００４】
近年になり、人間を初めとする高等生物の細胞内では上記転写や翻訳に関する複雑な調節が行われているという証拠が得られてきている。これらは、ＲＮＡが、生物学において従来考えられてきたよりも広い領域で、特に遺伝子調節に用いられているという可能性を指摘するものでもある。例えば、ＦｉｒｅやＭｅｌｌｏｗらによって発見された、ｎｃＲＮＡの一種がもたらすＲＮＡｉ現象は、線虫から人間に至るまで多くの生物で見られるものであり、他の遺伝子を制御するという重要な役割を果たしている。現在では、このＲＮＡｉ現象を利用した遺伝子ノックアウト方法が分子生物学の研究において広く用いられる手法となっている（非特許文献１及び２を参照）。
【０００５】
このような背景のもと、種々のｎｃＲＮＡについて細胞内での働きを探ること等を目的として、ＲＮＡを検出する手法の開発が盛んに行われている（例えば、特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５３３３２４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｋａｚａｋｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２０，５６３−５７３（２００２）
【非特許文献２】Ｏｔａ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，３６，４０−４５（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、以上の状況に鑑みてなされたものであり、標的となるＲＮＡ鎖を選択的に検出することが可能な新規のＲＮＡ検出用試薬、及びそのようなＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドの５’−末端に、結合基であるリンカーユニットを介して、蛍光発色基からなる蛍光発色ユニット、及び３級アミノ基とフェニルボロン酸基とを備えたボロン酸ユニットを結合させた化合物をＲＮＡ検出用試薬として使用すると、溶液中で、標的となるＲＮＡが存在するときには、そうでないときに比べてＲＮＡ検出用試薬からの蛍光が増強されることを見出した。本発明は、以上の知見に基づき完成されたものであり、以下のものを提供する。
【００１０】
（１）本発明は、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドと、一端が前記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基と縮合した二価のリンカーユニットと、前記二価のリンカーユニットの他端に結合した蛍光発色ユニットと、前記蛍光発色ユニットに結合した下記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットと、を備えたＲＮＡ検出用試薬である。
【化１】
2013198426.tif 000003
（上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はアルキル基であり、ｍ及びｎはそれぞれ独立に０〜４の整数である。また、上記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットは、波線を付した単結合により前記蛍光発色ユニットに結合される。）
【００１１】
（２）前記蛍光発色ユニットは、ヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基であることが好ましい。
【００１２】
（３）上記ＲＮＡ検出用試薬は、下記一般式（２）で表されることが好ましい。
【化２】
2013198426.tif 000004
（上記一般式（２）中、Ｎｕは前記オリゴヌクレオチドから５’−末端の水酸基を除いてなる基であり、Ｘはヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基である前記蛍光発色ユニットであり、Ｌは２価の有機基である前記リンカーユニットであり、Ｒ１は上記一般式（１）と同様である。なお、上記一般式（２）において、ＮｕとＬとの間に存在する酸素原子は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基から水素原子を除いたあとに残る酸素原子を意味する。）
【００１３】
（４）上記ＲＮＡ検出用試薬は、下記一般式（３）で表されることが好ましい。
【化３】
2013198426.tif 000005
（上記一般式（３）中、Ｎｕは前記オリゴヌクレオチドから５’−末端の水酸基を除いてなる基であり、Ｘはヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基である前記蛍光発色ユニットであり、Ｒ１は上記一般式（１）と同様であり、Ｒ２は水素原子又はアルキル基であり、Ｚは二価の基又は単結合であり、ｎは１〜１８の整数である。なお、上記一般式（３）において、ＮｕとＺとの間に存在する酸素原子は、前記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基から水素原子を除いたあとに残る酸素原子を意味する。）
【００１４】
（５）上記一般式（３）におけるＺは、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）Ｏ−であることが好ましい。
【００１５】
（６）本発明は、上記ＲＮＡ検出用試薬を検査対象に添加し、当該検査対象に紫外線又は可視光線を照射した際に、上記ＲＮＡ検出用試薬の有する蛍光が増強するか否かを観察することにより上記検査対象内に標的となるＲＮＡが含まれるか否かを判断する検査方法でもある。
【００１６】
（７）本発明は、下記一般式（４）で表される、ＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬でもある。
【化４】
2013198426.tif 000006
（上記一般式（４）中、Ｘはヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基であり、Ｌは２価の有機基であり、Ｒ１は水素原子又はアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立にボロン酸の保護基であって、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して環を形成してもよく、Ｒ５は亜リン酸基の保護基であり、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立にアルキル基であって、Ｒ６及びＲ７は互いに結合して環を形成してもよい。）
【００１７】
（８）上記試薬は、下記一般式（５）で表されることが好ましい。
【化５】
2013198426.tif 000007
（上記一般式（５）中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は上記一般式（４）と同様であり、Ｒ２は水素原子又はアルキル基であり、ｎは１〜１８の整数である。）
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、標的となるＲＮＡ鎖を選択的に検出することが可能な新規のＲＮＡ検出用試薬、及びそのようなＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、実施例における、（Ｕ１２）＋（Ｂ１２）、（Ｔ１２）＋（Ｂ１２）及び（Ｂ１２）単独についての蛍光スペクトルであり、（ａ）はｐＨ７．０における蛍光スペクトルであり、（ｂ）はｐＨ７．５における蛍光スペクトルであり、（ｃ）はｐＨ８．０における蛍光スペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明のＲＮＡ検出用試薬、当該ＲＮＡ検出用試薬を使用した検査方法、及びＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬についての一実施形態をそれぞれ説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲において適宜変更を加えて実施することができる。
【００２１】
本発明のＲＮＡ検出用試薬は、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドと、一端が前記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基と縮合した二価のリンカーユニットと、当該二価のリンカーユニットの他端に結合した蛍光発色ユニットと、上記蛍光発色ユニットに結合した下記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットと、を備える。本発明のＲＮＡ検出用試薬によれば、任意の塩基配列を持つＲＮＡを選択的に検出することができる。
【００２２】
【化６】
2013198426.tif 000008
（上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はアルキル基であり、ｍ及びｎはそれぞれ独立に０〜４の整数である。また、上記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットは、波線を付した単結合により前記蛍光発色ユニットに結合される。）
【００２３】
本発明のＲＮＡ検出用試薬は、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドの５’−末端側に、上記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットが結合された蛍光発色ユニットを備える。まず、本発明のＲＮＡ検出用試薬の作用を説明するために、模式的な化学反応図を下記に示す。下記の化学反応図では、一例として、蛍光発色ユニットとしてアントラセン骨格を用い、上記一般式（１）におけるＲ１がメチル基であり、上記一般式（１）におけるｍ及びｎが１である場合を示したが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
【化７】
2013198426.tif 000009
【００２５】
上記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットは、フェニルボロン酸と３級アミノ基とを備え、フェニルボロン酸が標的となるＲＮＡの３’−末端に存在するｃｉｓ−２，３−ジオール構造と結合を形成する。しかし、通常、フェニルボロン酸とＲＮＡの３’−末端ジオールとの間の溶液中での結合形成反応は解離側に大きく偏った平衡反応であり、ＲＮＡを含む溶液にフェニルボロン酸が単独で存在していたとしても、そのフェニルボロン酸はＲＮＡと結合を形成することができない。本発明のＲＮＡ検出用試薬では、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドの５’−末端側に上記のボロン酸ユニットを配することにより、当該相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドが標的となるＲＮＡと二重鎖を形成してこれを捕捉した際に、上記ボロン酸ユニットが標的となるＲＮＡの３’−末端側に配置される。これにより、ボロン酸ユニットが標的となるＲＮＡの３’−末端ジオールとの間で結合を形成させる機会を大きく増加させる。つまり、標的となるＲＮＡがボロン酸ユニットの周囲に濃縮されたのと同じ状況となり、上記平衡反応が結合形成側に大きく傾くことになる。その一方で、溶液中に標的とならないＲＮＡが存在していたとしても、このＲＮＡは、ＲＮＡ検出用試薬に含まれるオリゴヌクレオチドによって捕捉されないので、ボロン酸ユニットと当該ＲＮＡとの平衡反応は解離側に大きく偏ったままであり、ボロン酸ユニットに含まれるフェニルボロン酸と結合しない。
【００２６】
そして、上記のようにボロン酸ユニットが標的となるＲＮＡの３’−末端側に結合すると、ＲＮＡ検出用試薬は、その事実を蛍光発光として発信する。次に、このメカニズムについて説明する。
【００２７】
上述のように、ボロン酸ユニットには３級アミノ基が含まれ、この３級アミノ基は、ボロン酸ユニットに含まれるフェニルボロン酸と蛍光発色ユニットとの間に挟まれて存在する。この３級アミノ基の窒素原子に含まれる非共有電子対の電子は、励起光が照射された際に、光誘起電子移動（Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＰＥＴ）現象により、近隣に存在する蛍光発色ユニットに移動して当該蛍光発色ユニットからの蛍光を消失させる。しかしながら、上記のように、ボロン酸ユニットに含まれるフェニルボロン酸が標的となるＲＮＡの３’−末端と結合すると、ＰＥＴ現象が生じなくなり、励起光が照射された際に蛍光発色ユニットからの蛍光が生じることになる。これは、あたかも蛍光が増強されたかのように観察されることになる。
【００２８】
このような作用により、本発明のＲＮＡ検出用試薬は、標的となるＲＮＡが存在すると、当該ＲＮＡと結合してその事実を蛍光発光として発信することができる。すなわち、本発明のＲＮＡ検出用試薬は、励起光が照射された際に、溶液中に標的となるＲＮＡが存在すれば蛍光を増強させ、溶液中に標的となるＲＮＡが存在しなければ蛍光を増強させない。以上のような作用により、本発明のＲＮＡ検出用試薬は、標的となるＲＮＡの存在の有無を検出することができる。
【００２９】
標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドは、標的となるＲＮＡと二重鎖を形成することで、これを捕捉する認識部位として機能する。既に述べたように、この認識部位は、標的となるＲＮＡを捉えるとともに、標的となるＲＮＡの３’−末端側のｃｉｓ−２，３−ジオール構造をボロン酸ユニットの側へ配向させる働きをもつ。
【００３０】
標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドは、標的となるＲＮＡの塩基配列に基づいて塩基配列が決定され、この決定された塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドの自動合成機（ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機）等により合成される。オリゴヌクレオチドの自動合成機によるオリゴヌクレオチドの合成は、既に確立された手法であり、本発明における上記標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドもそのような手法に基づいて合成すればよい。
【００３１】
なお、言うまでもないが、相補的なオリゴヌクレオチド同士は、一方のオリゴヌクレオチドの５’−末端側と他方のオリゴヌクレオチドの３’−末端側とが組み合い、かつ、一方のオリゴヌクレオチドの３’−末端側と他方のオリゴヌクレオチドの５’−末端側とが組み合うように、ペアとなる塩基同士が結合して二重鎖を形成する。これも言うまでもないが、ペアになる塩基とは、互いに、Ｃ（シトシン）及びＧ（グアニン）、又はＡ（アデニン）及びＵ若しくはＴ（ウラシル若しくはチミン）の組み合わせとなるような塩基のことをいい、一方の塩基配列のある位置にＣＧＡＵの塩基配列が存在すれば、他方の塩基配列におけるそれと対応する位置にはＧＣＵＡという塩基配列が存在することになる。
【００３２】
標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドの５’−末端側の水酸基には、二価のリンカーユニットの一端側が縮合して結合される。このリンカーユニットの他端側には、後述する蛍光発色ユニットが結合される。これにより、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド（すなわち認識部位）の５’−末端側と蛍光発光ユニットとがリンカーユニットを介して互いに結合される。
【００３３】
二価のリンカーユニットとしては、特に限定されない。このようなリンカーユニットとしては、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド（すなわち認識部位）及び蛍光発色ユニットと結合するための結合基を両端に備えた、ヘテロ原子を有してもよい炭素鎖を例示することができる。この場合、両端の結合基は互いに独立に決定可能であり、そのような結合基としては、エーテル結合、エステル結合、リン酸ジエステル結合、アミド結合、カーボネート結合、ウレタン結合、アルキレン基等が例示されるが特に限定されない。
【００３４】
ヘテロ原子を有してもよい炭素鎖は、鎖中に炭素原子でない原子を何個でも有してもよい炭素鎖であり、炭素鎖には単結合の他、二重結合や三重結合も含まれてよい。また、炭素鎖の端がヘテロ原子であってもよい。ヘテロ原子を有してもよい炭素鎖に含まれる原子数としては、特に限定されないが、１〜２５個程度を例示することができる。なお、ヘテロ原子を有してもよい炭素鎖は、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド（すなわち認識部位）と蛍光発色ユニットとの間の結合部分に相当するので、その始点は、上記認識部位の５’−末端に存在する酸素原子（すなわち５’−末端水酸基から水素原子を除いたあとに残る酸素原子）に結合している原子となり、終点は、蛍光発色ユニットに結合している原子となる。
【００３５】
蛍光発色ユニットとしては、紫外光や可視光といった光の照射を受けて蛍光を発する基であって、これに近接して設けられた窒素原子からのＰＥＴ現象により蛍光が消光する基が用いられる。このような基としては、ヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基が挙げられる。「二価の有機基」である理由は、蛍光発色ユニットが上記二価のリンカーユニットと結合されるとともに後述のボロン酸ユニットにも結合されるためである。
【００３６】
ヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物としては、アントラセン、ナフタセン、ペンタセン、ベンゾピレン、クリセン、ピレン、トリフェニレン、ペリレン、フルオレセイン等が例示される。これらの中でも、アントラセンやピレンを好ましく例示できる。
【００３７】
ボロン酸ユニットは、上述の蛍光発色ユニットに結合されるユニットであり、下記の一般式（１）で表される。既に説明したように、ボロン酸ユニットにはフェニルボロン酸基と３級アミノ基とが含まれる。フェニルボロン酸基は、標的となるＲＮＡの３’−末端に存在するｃｉｓ−２，３−ジオール構造と結合を形成させるために用いられる。そして、本発明のＲＮＡ検出用試薬に光が照射された際、フェニルボロン酸基がフリーのときには、３級アミノ基に含まれる非共有電子対電子のＰＥＴにより蛍光発色ユニットの蛍光が消光され、フェニルボロン酸が結合を形成しているときには、上記ＰＥＴが生じないので蛍光発色ユニットからの蛍光が観察される。こうして、本発明のＲＮＡ検出用試薬は、溶液中に標的となるＲＮＡの存在の有無を検出することができる。
【００３８】
【化８】
2013198426.tif 000010
【００３９】
上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又はアルキル基であり、ｍ及びｎはそれぞれ独立に０〜４の整数である。また、上記一般式（１）で表されるボロン酸ユニットは、波線を付した単結合により上記蛍光発色ユニットに結合される。なお、上記一般式（１）において、ボロン酸基は、ボロン酸基が結合するベンゼン環における置換可能な炭素原子のいずれに結合してもよい。Ｒ１としては、メチル基が好ましく例示される。
【００４０】
本発明のＲＮＡ検出用試薬は以上の構成を備えるが、本発明のＲＮＡ検出用試薬の好ましい一例として、下記一般式（２）で表される化合物を挙げることができる。
【００４１】
【化９】
2013198426.tif 000011
【００４２】
上記一般式（２）中、Ｎｕは、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドから５’−末端の水酸基を除いてなる基である。Ｘは、ヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基であり、上記蛍光発色ユニットである。Ｌは２価の有機基である上記リンカーユニットである。Ｒ１は上記一般式（１）と同様である。なお、上記一般式（２）において、ＮｕとＬとの間に存在する酸素原子は、上記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基から水素原子を除いたあとに残る酸素原子である。各ユニットの詳細については、既に説明した通りである。上記一般式（２）におけるＬ（リンカーユニット）をより具体的に示したＲＮＡ検出用試薬の一例として、下記一般式（３）で表される化合物を挙げることができる。
【００４３】
【化１０】
2013198426.tif 000012
【００４４】
上記一般式（３）中、Ｎｕは、上記の通り、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドから５’−末端の水酸基を除いてなる基である。Ｘは、上記の通り、ヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基であり、上記蛍光発色ユニットである。Ｒ１は、上記一般式（１）と同様であり、Ｒ２は水素原子又はアルキル基であり、Ｚは二価の基又は単結合であり、ｎは１〜１８の整数である。なお、上記一般式（３）において、ＮｕとＺとの間に存在する酸素原子は、上記オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基から水素原子を除いたあとに残る酸素原子である。
【００４５】
上記一般式（３）において、リンカーユニットに相当する部分は、ＺからＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ２）ＣＨ２までとなる。このリンカーユニットは、結合基としてＺ及びメチレン基を備えることになる。リンカーユニットにおける炭素鎖は、アルキレン基及びアミド基となる。
【００４６】
リンカーユニットにおける一方の結合基であるＺとしては、−Ｐ（＝Ｏ）（−ＯＨ）Ｏ−を好ましく挙げることができる。この場合、Ｎｕで表されるオリゴヌクレオチドと、リンカーユニット、蛍光発色ユニット及びボロン酸ユニットからなるその他の部分とは、リン酸ジエステル結合（ホスホジエステル結合）により連結されることになる。例えば、上記一般式（３）におけるＺからボロン酸ユニットまでに相当する構造をもつホスホアミダイド化合物を用意し、Ｎｕで表されるオリゴヌクレオチドを自動合成機で合成する際の最終工程として当該ホスホアミダイド化合物を作用させる工程を実行すれば、Ｚがホスホジエステル結合に相当するものになる。このような手法によれば、本発明のＲＮＡ検出用試薬をオリゴヌクレオチドの自動合成機で合成できるので好ましい。次に、本発明のＲＮＡ検出用試薬の合成方法の一例として、上記ホスホアミダイド化合物を使用した合成方法について説明する。
【００４７】
この合成方法では、下記一般式（４）で表されるホスホアミダイド化合物を、ＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬として用いる。このようなＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬も本発明の一つである。下記一般式（４）で表されるホスホアミダイド化合物は、上述のリンカーユニット、蛍光発色ユニット及び保護基を有するボロン酸ユニットに相当する部分を含んだものであり、オリゴヌクレオチドの５’−末端に作用させることにより、当該オリゴヌクレオチドにこれらのユニットを導入することができる。すなわち、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドの５’−末端に下記一般式（４）で表されるホスホアミダイド化合物を作用させてから脱保護を行うことにより、本発明のＲＮＡ検出用試薬が合成される。
【００４８】
【化１１】
2013198426.tif 000013
【００４９】
上記一般式（４）中、Ｘは、ヘテロ原子を有してもよい縮合多環芳香族化合物から水素原子でもよい置換基を２つ除いて得られる二価の有機基である。このＸは、上述の蛍光発色ユニットに相当する。Ｌは、２価の有機基であり、上述のリンカーユニットに相当する。Ｒ１は、水素原子又はアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立にボロン酸の保護基である。なお、Ｒ３及びＲ４は互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ５は、亜リン酸基の保護基であり、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立にアルキル基である。なお、Ｒ６及びＲ７は、互いに結合して環を形成してもよい。
【００５０】
ボロン酸の保護基であるＲ３及びＲ４としては、公知のボロン酸保護基を特に限定なく挙げることができる。このような保護基として、Ｎ−メチルイミノ二酢酸エステル（ＭＩＤＡ保護基とも呼ぶ。）を好ましく挙げることができる。ＭＩＤＡ保護基は、ボロン酸ユニットに含まれるフェニルボロン酸にＮ−メチルイミノ二酢酸を作用させることで導入される。また、ＭＩＤＡ保護基を有するボロン酸化合物が各種市販されているので、これを用いて上記化合物（４）のホスホアミダイド化合物を合成してもよい。ＭＩＤＡ保護基についての理解を助けるために、ＭＩＤＡ保護基が導入されたフェニルボロン酸の化学式を下記に示す。下記化学式からも理解できるように、ボロン酸の保護基としてＭＩＤＡ保護基を用いる場合、上記一般式（４）におけるＲ３及びＲ４は、互いに結合して環を形成することになる。
【００５１】
【化１２】
2013198426.tif 000014
【００５２】
ＭＩＤＡ保護基は塩基性条件下で容易に脱保護される。そのため、オリゴヌクレオチドの自動合成機を用いて、オリゴヌクレオチド部分及びフェニルボロン酸基に保護基を有する状態で固相担体上に合成された本発明のＲＮＡ検出用試薬を、塩基性条件下で固相担体から切り出す際に、これらの保護基が全て脱離して本発明のＲＮＡ検出用試薬が得られる。
【００５３】
亜リン酸基の保護基であるＲ５は、特に限定されない。このような保護基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基等のアルキル基や、シアノエチル基等が例示される。それぞれ独立にアルキル基であるＲ６及びＲ７は、特に限定されない。このようなアルキル基としてはイソプロピル基を例示できる。なお、Ｒ６及びＲ７は、互いに結合して環を形成してもよい。
【００５４】
上記一般式（４）におけるＬ（リンカーユニット）をより具体的に示したホスホアミダイド化合物の一例として、下記一般式（５）で表される化合物を挙げることができる。
【００５５】
【化１３】
2013198426.tif 000015
【００５６】
上記一般式（５）中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、上記一般式（４）と同様である。Ｒ２は、水素原子又はアルキル基であり、メチル基が好ましく例示される。ｎは、１〜１８の整数である。
【００５７】
このようなホスホアミダイド化合物として、さらに具体的には、下記化学式（６）で表される化合物を挙げることができる。
【００５８】
【化１４】
2013198426.tif 000016
【００５９】
次に、上記ホスホアミダイド化合物の合成経路の一例を下記に示す。なお、下記では、本発明のＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬の一例として上記化学式（６）で表されるホスホアミダイド化合物についての合成経路を示したが、本発明は上記化学式（６）で表されるホスホアミダイド化合物に限定されるものではない。
【００６０】
【化１５】
2013198426.tif 000017
【００６１】
【化１６】
2013198426.tif 000018
【００６２】
上記合成経路にて、Ｂｏｃとはｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル基を表し、Ｂｏｃ２Ｏとは二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを表し、ＳＯ３−ｐｙｒｉｄｉｎｅとは三酸化硫黄−ピリジン錯体を表し、ＴＥＡはトリエチルアミンを表し、ＭＩＤＡはＮ−メチルイミノ二酢酸を表し、ＤＩＰＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを表す。
【００６３】
上記のホスホアミダイド化合物は、ホスホアミダイド法が適用されるオリゴヌクレオチドの自動合成機において、ＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬として用いることができる。オリゴヌクレオチドの自動合成機において使用されるホスホアミダイド法は、固相法であり、固相である担体粒子の表面に、ホスホアミダイド化合物の縮合反応を利用してオリゴヌクレオチドを化学合成する方法である。本発明のＲＮＡ検出用試薬を合成する手順としては、まず、公知のホスホアミダイド法に従って、標的となるＲＮＡと相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、当該オリゴヌクレオチドの５’−末端の水酸基が脱保護された状態で上記のホスホアミダイド化合物を作用させることにより、オリゴヌクレオチドの５’−側の末端にリンカーユニット、蛍光発色ユニット及びボロン酸ユニットを導入し、最後に、塩基性条件下にて、固相担体の表面からオリゴヌクレオチドを切り出すことが挙げられる。この切り出しの際に、オリゴヌクレオチドに付加された各種の保護基や、フェニルボロン酸に付加された保護基が脱離して、本発明のＲＮＡ検出用試薬が得られる。要するに、本発明のＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬は、オリゴヌクレオチドを伸長させる際に使用されるヌクレオシドのホスホアミダイドと同様にホスホアミダイド部位を有するので、ヌクレオシドのホスホアミダイドと同様に自動合成機に適用することが可能である。したがって、自動合成機を適切にプログラムすることにより、オリゴヌクレオチドが所望の長さとなった後に本発明のＲＮＡ検出用試薬を合成する試薬を自動的に反応系内に投入し、オリゴヌクレオチドの５’−側の末端にリンカーユニット、蛍光発色ユニット及びボロン酸ユニットを導入することが可能である。
【００６４】
以上、本発明のＲＮＡ検出用試薬及びＲＮＡ検出用試薬を合成するための試薬について説明したが、本発明のＲＮＡ検出用試薬を検査対象に添加し、当該検査対象に紫外線又は可視光線を照射した際に、ＲＮＡ検出用試薬の有する蛍光が増強するか否かを観察することにより、上記検査対象内に標的となるＲＮＡが含まれるか否かを判断する検査方法もまた、本発明の一つである。このような検査方法については、上記本発明のＲＮＡ検出用試薬の説明で既に述べたので、ここでの説明を省略する。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を示すことにより本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００６６】
［合成例１］ｔｒａｎｓ−ジスピロ［オキシラン−２，９’（１０Ｈ）−アントラセン−１０’，２’’−オキシラン］（８）の合成
【化１７】
2013198426.tif 000019
【００６７】
市販のアントラキノン（７）（６．２ｇ、３０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）１２０ｍＬに溶解させ、系内をアルゴンガスで置換した後、水素化ナトリウム（２．２ｅｑ、２．４ｇ、６６ｍｍｏｌ、純度６０％）を加え、室温・遮光下で撹拌し、そこに乾燥ＤＭＳＯ８０ｍＬに溶解させたトリメチルスルホニウムヨージド（２．２ｅｑ、１３．４ｇ、６６ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。５時間後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ−）で反応の進行を確認し、ガラスフィルターで濾過した。濾液を氷水３００ｍＬに加え、１時間撹拌した。析出した固体を濾取し、水で洗浄し、目的物である化合物（８）を黄色固体（４．９ｇ、２０．６ｍｍｏｌ、収率６９％）として得た。
化合物（８）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：７．４２−７．４０（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−１，４，５，８），７．３２−７．２９（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），３．１２（ｓ，４Ｈ，Ｏ−ＣＨ２）
【００６８】
［合成例２］１０−ヒドロキシメチル−９−アントラアルデヒド（９）の合成
【化１８】
2013198426.tif 000020
【００６９】
化合物（８）（４．９ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル４００ｍＬに溶解させ、臭化リチウム（２．０ｅｑ、３．６ｇ、４１．２ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で撹拌した。９１時間後、ＴＬＣで反応の進行を確認し、反応溶液を室温まで冷却し、さらに−４０℃で３０分間冷却した。析出した固体を濾取し、水で洗浄し、目的物である化合物（９）を黄色固体（３．３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、収率６７％）として得た。
化合物（９）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１１．４６（ｓ，１Ｈ，ＣＨ＝Ｏ），８．９５（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｎ−１，８），８．６１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ，Ａｎ−４，５），７．７４−７．６５（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），５．５７（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），５．４９（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）
【００７０】
［合成例３］（１０−メチルアミノメチルアントラセン−９−イル）メタノール（１０）の合成
【化１９】
2013198426.tif 000021
【００７１】
化合物（９）（３．３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）にメタノール１５０ｍＬ、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）７０ｍＬ、及びメチルアミンの４０％水溶液３０ｍＬを加え、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した。その溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（２．８ｅｑ、１．５ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）を加え、さらに４時間撹拌し、ＴＬＣで反応の進行を確認した。溶媒を減圧下で留去し、酢酸エチルに溶解させ、水で洗浄した後、飽和食塩水で洗浄した。洗浄に使用した水系液からも酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過して溶媒を留去し、目的物である化合物（１０）を黄色固体（３．３ｇ、１３．２ｍｍｏｌ、収率９５％）として得た。
化合物（１０）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．４９−８．４３（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−１，４，５，８），７．６１−７．５４（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），５．４３（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２），５．３０（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），４．５９（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２）
【００７２】
［合成例４］（１０−ヒドロキシメチルアントラセン−９−イルメチル）メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１）の合成
【化２０】
2013198426.tif 000022
（上記化学式中、Ｂｏｃは、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル基を表す。以下、同様である。）
【００７３】
化合物（１０）（３．３ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）にメタノール１８０ｍＬ及び二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２．１ｅｑ、６．４ｍＬ、２７．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で６４時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認し、溶媒を減圧下で留去し、残渣を酢酸エチルに溶解させ、水で２回、１０％炭酸ナトリウム水溶液で１回、塩化ナトリウム水溶液で２回洗浄した。洗浄に使用した水系液からも酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を減圧下で留去し、目的物である化合物（１１）を淡黄色泡状固体（４．０ｇ、１１．５ｍｍｏｌ、収率８７％）として得た。
化合物（１１）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５４−８．５０（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−１，４，５，８），７．５９−７．５８（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），５．４６−５．４５（ｍ，４Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），５．３５（ｍ，１Ｈ，ＯＨ），２．３８（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），１．５８−１．４７（ｂｒ，９Ｈ，Ｈ−Ｂｏｃ）
【００７４】
［合成例５］（１０−ホルミルアントラセン−９−イルメチル）メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１２）の合成
【化２１】
2013198426.tif 000023
【００７５】
化合物（１１）（４．０ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＳＯ４０ｍＬに溶解させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）４０ｍＬを加え、アルゴン雰囲気下、室温で撹拌し、そこに乾燥ＤＭＳＯ３５ｍＬに溶解させた三酸化硫黄−ピリジン錯体（ＳＯ３−ｐｙｒｉｄｉｎｅ、７．０ｅｑ、１２．６ｇ、８０．５ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。１時間後、ＴＬＣで反応の進行を確認し、反応液を氷水１００ｍＬに注いだ。反応液を分液ロートに洗い移し、酢酸エチルで抽出し、水で２回、１０％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で２回洗浄した。洗浄に使用した水系液からも酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で留去することにより、目的物である化合物（１２）を黄色あめ状固体（５．１ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）として定量的に得た。
化合物（１２）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１１．４６（ｓ，１Ｈ，ＣＨ＝Ｏ），８．９２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｎ−４，５），８．６３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｎ−１，８），７．７４−７．６１（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），５．５４（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），２．４０（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），１．７５−１．４８（ｂｒｓ，９Ｈ，Ｈ−Ｂｏｃ）
【００７６】
［合成例６］メチル−（１０−メチルアミノメチルアントラセン−９−イルメチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１３）の合成
【化２２】
2013198426.tif 000024
【００７７】
化合物（１２）（５．１ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）にメタノール１２０ｍＬ、ＴＨＦ１２０ｍＬ、及びメチルアミンの４０％水溶液６０ｍＬを加え、アルゴン雰囲気下、室温で３０分間撹拌した。その溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（４．０ｅｑ、２．２ｇ、５４．４ｍｍｏｌ）を加え、さらに２時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認し、溶媒を減圧下で留去した。残渣を酢酸エチルに溶解させ、水で３回洗浄した。洗浄に使用した水系液からも酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過して溶媒を留去し、目的物である化合物（１３）を黄色固体（４．０ｇ、１１．１ｍｍｏｌ、収率７６％）として得た。
化合物（１３）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５４−８．４９（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−１，４，５，８），７．６１−７．５５（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），５．４６（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），４．５６（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），２．３７（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），１．４７（ｂｒ，９Ｈ，Ｈ−Ｂｏｃ）
【００７８】
［合成例７］ｔｅｒｔ−ブチル（（１０−（（６−ヒドロキシ−Ｎ−メチルヘキサンアミド）メチル）アントラセン−９−イル）メチル）（メチル）カルバメート（１４）の合成
【化２３】
2013198426.tif 000025
【００７９】
化合物（１３）（２．０ｇ、５．０ｍｍｏｌ）にメタノール３０ｍＬを加えて溶解させ、６−ヒドロキシカプロン酸（１．２ｅｑ、７８６ｍｇ、６．０ｍｍｏｌ）及び４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム（３．０ｅｑ、４．２ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、系内をアルゴン置換し、室温で４５分間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認し、溶媒を減圧下で留去した。残渣を酢酸エチルに溶解させ、水で２回、塩化ナトリウム水溶液で２回洗浄した。洗浄に使用した水系液からも酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を減圧下で留去し、目的物である化合物（１４）を黄色泡状固体（１．９ｇ、３．９７ｍｍｏｌ、収率７９％）として得た。
化合物（１４）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５２（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−１，４，５，８），７．５４（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），５．５９（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），５．４５（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），４．３１（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），３．３５（ｍ，２Ｈ，ＯＨに結合したＣＨ２），２．４９（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．３５（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．２９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，Ｏ＝Ｃ−ＣＨ２），１．４６（ｂｒ，１５Ｈ，Ｈ−Ｂｏｃ，ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）
【００８０】
［合成例８］６−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｎ−（（１０−（（メチルアミノ）メチル）アントラセン−９−イル）メチル）ヘキサンアミド（１５）の合成
【化２４】
2013198426.tif 000026
【００８１】
化合物（１４）（１．９ｇ、３．９７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン８０ｍＬに溶解させ、トリフルオロ酢酸３０ｍＬを加え、系内をアルゴン置換し、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認し、溶媒を減圧下で留去した。残渣をクロロホルムに溶解させ、水で１回、塩化ナトリウム及び炭酸ナトリウムの水溶液で２回洗浄した。洗浄に使用した水系液からもクロロホルムで抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を減圧下で留去し、目的物である化合物（１５）を黄色あめ状固体（１．１ｇ、２．８８ｍｍｏｌ、収率７３％）として得た。
化合物（１５）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．４４（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−１，４，５，８），７．５６（ｍ，４Ｈ，Ａｎ−２，３，６，７），５．５７（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），４．７７（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），４．３０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），３．３３（ｍ，２Ｈ，ＯＨに結合したＣＨ２），２．５８（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．４５（ｓ，３Ｈ，ＮＨに結合したＣＨ３），２．２９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，Ｏ＝Ｃ−ＣＨ２），１．５４−１．３２（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）
【００８２】
［合成例９］化合物（１６）の合成
【化２５】
2013198426.tif 000027
【００８３】
化合物（１５）（１．１ｇ、２．９９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）２５ｍＬに溶解させ、４−ホルミルフェニルボロン酸−Ｎ−メチルイミノ二酢酸エステル（１．２ｅｑ、９３７ｍｇ、３．５９ｍｍｏｌ）及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１．４ｅｑ、８８９ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ）を加え、系内をアルゴン置換し、室温で２３時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認した後、反応溶液に酢酸エチルを加えて抽出し、有機層を水で２回、塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄した。洗浄に使用した水系液からも酢酸エチルで１０回抽出した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、溶媒を減圧下で留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を減圧下で留去し、少量のジクロロメタンに溶解させ、再沈殿法により目的物と副生成物とを分離し、濾液を減圧下で濃縮し、目的物である化合物（１６）を淡黄色泡状固体（１．１ｇ、１．７３ｍｍｏｌ、収率５８％）として得た。
化合物（１６）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５４（ｍ，２Ｈ，Ａｎ−１，８）８．４０（ｄ，２Ｈ，Ａｎ−４，５），７．５２（ｍ，４Ｈ，ｐｈｅｎｙｌ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｎ−２，７），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ，Ａｎ−３，６），５．５６（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），４．４７（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），４．３２（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），４．２５（ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），４．０２（ｄ，Ｊ＝１７．０Ｈｚ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），３．６５（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），３．３４（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＯＨに結合したＣＨ２），２．４９（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．４０（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．２８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，Ｏ＝Ｃ−ＣＨ２），２．０４（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），１．５３−１．２８（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）
【００８４】
［合成例１０］ホスホアミダイド化合物（６）の合成
【化２６】
2013198426.tif 000028
【００８５】
化合物（１６）（４００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンで共沸脱水し、乾燥トルエンでピリジンを共沸除去した後、系内をアルゴン置換し、ジクロロメタンに溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２．４ｅｑ、２６８μＬ、１．５４ｍｍｏｌ）及び２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイド（１．２ｅｑ、１９１μＬ、０．７７ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認した後、溶媒を減圧下で留去した。残渣をクロロホルムに溶解させ、炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、塩化ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機層を集め、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、濾過し、溶媒を減圧下で留去した。残渣をアセトニトリルに溶解させ、リサイクル分取ＨＰＬＣで精製した。目的物を含むフラクションを集め、溶媒を減圧下で留去し、目的物である化合物（６）を淡黄色泡状固体（２４６ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、収率４７％）として得た。
化合物（６）の各物性値は、以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．５４（ｍ，２Ｈ，Ａｎ−１，８），８．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｎ−４，５），７．５３（ｍ，４Ｈ，ｐｈｅｎｙｌ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ａｎ−２，３），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ，Ａｎ−６，７），５．６６（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），４．５１（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），３．９５（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），３．８５（ｍ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２），３．７７（ｍ，２Ｈ，Ｏ−ＣＨ２），３．７２（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），３．５９（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ），２．６２（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−ＣＮ），２．５６（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．４７（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ＝Ｏ），２．２４（ｓ，３Ｈ，Ｎ−ＣＨ３），１．７４−１．２７（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２），１．１８（ｍ，１２Ｈ，ｉ−Ｐｒ）
３１Ｐ  ＮＭＲ（２４３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１４７．８
【００８６】
［実施例１］オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドの自動合成機を用いて、下記（Ｂ１２）、（Ｔ１２）及び（Ｕ１２）で表す配列を有する３種のオリゴヌクレオチドを合成した。（Ｂ１２）にて「Ｂ」の符号で示したものは、オリゴヌクレオチドの５’−末端に付加された、下記化学式で表されるリンカーユニット、蛍光発色ユニット及びボロン酸ユニットである。これは、自動合成機によりオリゴヌクレオチドの合成が完了した後に化合物（６）を作用させることにより、オリゴヌクレオチドの５’−末端に付加されたものである。なお、ＲＮＡが溶液中で比較的不安定であることに鑑み、下記（Ｂ１２）、（Ｔ１２）及び（Ｕ１２）では、ＤＮＡにおけるヌクレオチドを由来としたオリゴヌクレオチドとした。但し、（Ｕ１２）のみ、３’−末端のヌクレオチドをウリジン（Ｕ）とすることで３’−末端をＲＮＡと同様の構造とし、これをＲＮＡの模擬オリゴヌクレオチドとして用いた。（Ｂ１２）及び（Ｔ１２）は、互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、（Ｂ１２）及び（Ｕ１２）は、互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。つまり、（Ｂ１２）は、標的となるＲＮＡ（ＲＮＡの模擬オリゴヌクレオチドであるＵ１２）と相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドと、二価のリンカーユニットと、蛍光発色ユニットとボロン酸ユニットとを備える本発明のＲＮＡ検出用試薬である。
【００８７】
５’  Ｂ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ３’  （Ｂ１２）
５’      ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ３’  （Ｔ１２）
５’      ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＴＧＣ  ＧＴＵ  ３’  （Ｕ１２）
【００８８】
【化２７】
2013198426.tif 000029
（上記化学式において、波線は、「Ｂ」に結合したオリゴヌクレオチド鎖を表す。）
【００８９】
なお、オリゴヌクレオチドの自動合成では、自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）上、ホスホアミダイド法に従った固相合成法を用いた。オリゴヌクレオチドを合成するための各種ホスホロアミダイドユニットは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社からの市販品を用いた。固相担体（ＣＰＧ；ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｒａｓｓ）に結合されたヌクレオシド保護体（１μｍｏｌ）から出発し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の推奨するプロトコールに、若干の修正を加えたプロトコールを用いた。すなわち、化合物（６）のアミダイドユニットの縮合時間を３００秒とし、通常用いられる天然型アミダイドユニットのそれよりも長時間の縮合時間とした。（Ｔ１２）及び（Ｕ１２）については、５’−末端にＤＭＴｒ基（ジメトキシトリチル保護基）を残した状態で合成を終了した。合成終了時、アルゴンガスを１００秒間通じて固相担体を乾燥させた。完全保護オリゴヌクレオチドの結合した固相担体をバイアル瓶に移し、固相担体からオリゴヌクレオチドの切り出しを行った。この切り出し操作により、合成されたオリゴヌクレオチドが固相担体から切り出されるとともに、オリゴヌクレオチドに結合していた全ての保護基が脱離することになる。切り出しの操作は、（Ｔ１２）及び（Ｕ１２）については２８％アンモニア水溶液を用い、（Ｂ１２）については０．４Ｍ水酸化ナトリウムメタノール溶液を用い、固相担体を綿栓濾過により取り除き、精製操作を行った。その後、逆相シリカゲル担体を用いたＨＰＬＣにより、目的物の分取を行った。得られた各オリゴヌクレオチドは、ＵＶ測定及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳＳにて分析を行い、目的物であることを確認した。下記に、（Ｂ１２）の固相担体からの切り出し操作における化学反応式を示す。下記の化学反応式において、黒丸で示したものは固相担体を表し、Ｂａｓｅは核酸塩基を表し、Ｂｐｒｏは保護基を有する核酸塩基を表す。
【００９０】
【化２８】
2013198426.tif 000030
【００９１】
［蛍光測定試験］
オリゴヌクレオチド鎖の末端にジオール構造を有する（Ｕ１２）、及びオリゴヌクレオチド鎖の末端にジオール構造が存在しない（Ｔ１２）のそれぞれについて、これらと相補的なオリゴヌクレオチド鎖を備えた（Ｂ１２）を加えた際の蛍光スペクトルを測定した。この測定は、ｐＨが（ａ）７．０、（ｂ）７．５及び（ｃ）８．０のリン酸緩衝溶液にてそれぞれ行った。その測定結果を図１に示す。なお、図１では、（Ｂ１２）＋（Ｕ１２）、（Ｂ１２）＋（Ｔ１２）、及び対照用として（Ｂ１２）単独のそれぞれについての蛍光スペクトルを示している。なお、蛍光スペクトルの測定は、励起光の波長を３７９ｎｍとし、（Ｕ１２）、（Ｔ１２）及び（Ｂ１２）のそれぞれの濃度を２μＭとし、１ＭＮａＣｌＯ４を含んだ１００ｍＭリン酸緩衝溶液中にて実施した。
【００９２】
図１に示すように、（Ｂ１２）＋（Ｔ１２）における蛍光スペクトルは、相補鎖を加えていない（Ｂ１２）単独の場合の蛍光スペクトルとほぼ同様だった。すなわち、（Ｔ１２）を相補鎖とした場合には、ボロン酸エステルが形成されないため、ＰＥＴの解消が起こらず、蛍光強度に変化が見られないと考えられる。一方、（Ｕ１２）＋（Ｂ１２）における蛍光スペクトルは、（Ｂ１２）単独の場合や（Ｔ１２）＋（Ｂ１２）の場合に比べて、強度が増加した。このことは、本発明のＲＮＡ検出用試薬である（Ｂ１２）が、（Ｕ１２）の３’−末端におけるｃｉｓ−２，３−ジオール構造を認識してボロン酸エステルを形成した結果、ＰＥＴが解消され、蛍光が回復したことによりもたらされていると考えられる。つまり、本発明のＲＮＡ検出用試薬によれば、標的となるＲＮＡが溶液中に存在するか否かを蛍光強度の観察により判断できることが理解される。
【図１】
2013198426.tif 000037