(57)【要約】【課題】テレフタル酸の新規合成方法を提供すること。【解決手段】フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する工程、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する工程、フェニル酢酸をトルエンに変換する工程、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する工程、およびｐ−トルイル酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する工程、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する工程、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する工程、マンデル酸を安息香酸に変換する工程、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。【選択図】図１２
2013128460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する工程、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する工程、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。
【請求項２】
テレフタル酸生産能を有し、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する酵素、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する酵素、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を炭素源を含む培地中で培養してテレフタル酸を培地または菌体内に蓄積させ、テレフタル酸を培地または菌体内から回収することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
【請求項３】
フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する工程、マンデル酸を安息香酸に変換する工程、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。
【請求項４】
テレフタル酸生産能を有し、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する酵素、マンデル酸を安息香酸に変換する酵素、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を炭素源を含む培地中で培養してテレフタル酸を培地または菌体内に蓄積させ、テレフタル酸を培地または菌体内から回収することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
【請求項５】
フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する工程、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する工程、フェニル酢酸をトルエンに変換する工程、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する工程、およびｐ−トルイル酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。
【請求項６】
ｐ−トルイル酸生産能を有し、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を、炭素源を含む培地中で培養してｐ−トルイル酸を製造し、得られたｐ−トルイル酸をテレフタル酸に変換することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
【請求項７】
フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する工程、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する工程、フェニル酢酸をトルエンに変換する工程、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する工程を含む、ｐ−トルイル酸の製造方法。
【請求項８】
ｐ−トルイル酸生産能を有し、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を、炭素源を含む培地中で培養してｐ−トルイル酸を製造することを特徴とする、ｐ−トルイル酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はテレフタル酸の製造方法に関する。本発明はまた、ｐ−トルイル酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にテレフタル酸は、石油の2次製品であるパラキシレンと酢酸やマンガン塩、コバルト塩などを触媒に酸化させて製造されているが、石油枯渇化の懸念や価格の上昇圧力、環境問題に対する消費者の関心などから、バイオマス由来によるテレフタル酸の製造法の研究が行われている。
例えば、米国Ｄｒａｔｈｓ社は大腸菌を遺伝子工学的に処理してグルコースなどの植物由来バイオマスからムコン酸を製造し、化学的に、同じくバイオ法で生産されたエチレンとディールスアルダー法により縮合し、シクロヘキセン１，４−ジカルボン酸を合成し、続いてベンゼン環の脱水素反応を行うことにより、テレフタル酸を製造する方法を検討している（特許文献１）。
また、Ｇｅｖｏ社は、バイオマス由来のイソブタノールを化学的に変換させることでバイオマス由来のパラキシレンを製造する検討を実施している（特許文献２）。パラキシレンは、既存の方法によりテレフタル酸へと変換することができる。
また、マサチューセッツ大学及びＡｎｅｌｌｏｔｅｃｈ社は、バイオマスを無酸素状態で加熱することによって、パラキシレンを含む芳香族化合物をバイオマスから生産することができることを示し、これから既存の方法により、バイオマス由来のテレフタル酸を製造する方法を開発している（特許文献３）。
さらに、天然のテルペン類であるリモネンを化学的にパラシメン（ｐ−ｃｙｍｅｎｅ）に変換し、さらに2段階の酸化反応によってテレフタル酸を合成できることも知られている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１４８０８１号
【特許文献２】ＵＳ２０１１００８７０００
【特許文献３】ＵＳ２００９０２２７８２３
【特許文献４】ＵＳ２０１００１６８４６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規なテレフタル酸の合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、出発化合物から目的化合物までの新規の化合物の合成経路を選択するために、化合物の化学構造を数値に変換する変換部と、前記化合物のペアを作成し、前記化合物のペアの一方の化合物についての前記数値から他方の化合物についての前記数値を減算することにより差分値を算出する算出部と、前記化合物のペアに関する反応が既知である前記化合物ペアの前記差分値と、前記化合物のペアに関する反応が未知である前記化合物ペアの前記差分値とを比較し、前記差分値が一致する前記化合物ペアの未知反応を仮想反応として決定する決定部と、前記化合物を示すノードと、前記既知反応及び前記仮想反応のそれぞれを示すエッジと、によって前記化合物の合成経路を作成する作成部と、出発化合物から目的化合物までの合成経路を、作成された前記化合物の合成経路から選択する選択部と、を備える合成経路作成装置を見出し、特許出願を行った（特願２０１０−２８
１７９４号および特願２０１１−１７９５７３号）。
【０００６】
そして、今回、この合成経路作成装置を用い、テレフタル酸の合成経路の探索を行ったところ、新たに３つの合成経路を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は、以下を提供する。
[１]フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する工程、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する工程、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。
[２]テレフタル酸生産能を有し、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する酵素、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する酵素、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を炭素源を含む培地中で培養してテレフタル酸を培地または菌体内に蓄積させ、テレフタル酸を培地または菌体内から回収することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
[３]フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する工程、マンデル酸を安息香酸に変換する工程、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。[４]テレフタル酸生産能を有し、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する酵素、マンデル酸を安息香酸に変換する酵素、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を炭素源を含む培地中で培養してテレフタル酸を培地または菌体内に蓄積させ、テレフタル酸を培地または菌体内から回収することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
[５]フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する工程、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する工程、フェニル酢酸をトルエンに変換する工程、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する工程、およびｐ−トルイル酸をテレフタル酸に変換する工程を含む、テレフタル酸の製造方法。
[６]ｐ−トルイル酸生産能を有し、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を、炭素源を含む培地中で培養してｐ−トルイル酸を製造し、得られたｐ−トルイル酸をテレフタル酸に変換することを特徴とする、テレフタル酸の製造方法。
[７]フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する工程、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する工程、フェニル酢酸をトルエンに変換する工程、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する工程を含む、ｐ−トルイル酸の製造方法。
[８]ｐ−トルイル酸生産能を有し、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素の活性を有する微生物を、炭素源を含む培地中で培養してｐ−トルイル酸を製造することを特徴とする、ｐ−トルイル酸の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
これまで知られているバイオマス由来のテレフタル酸製造法は、例えばパラキシレンなどの中間産物までをバイオ法により生産し、後に化学合成法によりテレフタル酸へと変換するものであり、製造プロセスが複雑になるため、投入エネルギーやプラント建設コストが高くなる懸念がある。
本発明によれば、バイオマスからテレフタル酸もしくはｐ−トルイル酸を直接バイオ法によって製造することができ、製造プロセスの簡略化による製造コスト低減が期待できる。また、プロセスに関わる投入エネルギー低減化も期待できるため従来法に比べ大きな利点があるといえる。本発明方法によって得られたテレフタル酸は、PETなどのポリエステルの製造に好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】合成経路作成装置１の構成図
【図２】ＫＥＧＧのデータベースに登録されている炭素（Ｃ）を有する化合物についてのatom typesをグループ化した場合の例を示す図
【図３】ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物についてのatom typesをグループ化した場合の例を示す図
【図４】化合物（3-Hydroxypropionate）の化学構造式に含まれている部分構造の個数及び部分構造の結合状態の個数をカウントした場合の例を示す図
【図５】合成経路作成装置１の機能構成図
【図６】仮想反応法による化合物合成経路の作成のフローを示す図
【図７】グラフを図形によって表現した場合の例を示す図
【図８】合成経路の情報を示す図
【図９】最適化法による化合物合成経路の作成のフローを示す図
【図１０】化合物の合成経路の例を示す図
【図１１】合成経路の情報の出力例を示す図
【図１２】本発明で見出されたテレフタル酸の合成経路を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００１１】
＜テレフタル酸の製造方法〜１＞
本発明のテレフタル酸の製造方法の第一の態様は、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する工程（工程１ａ）、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する工程（工程１ｂ）、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程（工程１ｃ）を含む。
【００１２】
工程１ａは、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にフェニルアラニンを用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００１３】
ここで、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する酵素としては、フェニルアラニンアンモニアリアーゼが挙げられる。この酵素については、例えば、Biochemistry. 2007
Jan 30;46(4):1004-12.に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、例えば、 同文献に記載されたような方法で、Anabaena属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００１４】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００１５】
公知の配列としては特に制限されないが、Anabaena variabilis由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするGenBank受入番号: FW572332.1の塩基配列（配列番号１）が例示される。ただし、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する活性を有する
蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、GenBank受入番号: FW572332.1の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００１６】
工程１ｂは、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にトランス桂皮酸を用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００１７】
ここで、トランス桂皮酸を安息香酸に変換するに変換する酵素としては、Enoyl-CoA hydratase（EC 4.2.1.17）、3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase（EC 1.1.1.35）、および3-Ketoacyl-CoA thiolase（EC 2.3.1.16）の酵素群が挙げられる。大腸菌では、Enoyl-CoA hydratase、3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase活性を有するタンパク質はfadB遺伝子に、3-Ketoacyl-CoA thiolase活性を有するタンパク質はfadA遺伝子にそれぞれコードされており、これらがオペロンを形成していることが知られている（DiRusso CC. J Bacteriol. 1990 Nov; 172(11):6459-68.）。これらの酵素については、例えば、同文献に記載の方法に従って活性を測定することができ、該活性を指標として、例えば、大腸菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。また、これらの酵素は、必要に応じて、トランス桂皮酸を安息香酸に変換しやすいように基質特異性を改変させてもよい。
【００１８】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００１９】
公知の配列としては特に制限されないが、上記fadB遺伝子（配列番号３）およびfadA遺伝子（配列番号５）が例示される。ただし、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記fadBおよびfadA遺伝子の塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、fadBおよびfadA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００２０】
工程１ｃは、安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質に安息香酸を用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００２１】
ここで、安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素としては、ベンゼン環にカルボキシル基を付加する酵素が挙げられる。この酵素については、例えば、Environmental Microbio
logy (2010) 12(10), 2783-2796に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、同文献に記載されたような方法で、Clostrida属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００２２】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００２３】
公知の配列としては特に制限されないが、表１に記載のAbcAおよびAbcD遺伝子が例示される（Microbiology (2010) 12(10), 2783-2796）。ＡｂｃＤ及びＡｂｃＡ遺伝子はオペロンを形成し、コードする蛋白質はヘテロ複合体を形成して、酵素反応を行っていると考えられている。ただし、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、表１に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【表１】
2013128460.tif 000003
【００２４】
工程１ａ〜１ｃについては、各工程を各反応を触媒する酵素、または各反応を触媒酵素の活性を有する微生物を用いて別々に行ってもよいが、各反応を触媒する酵素全て、または各反応を触媒する全ての酵素の活性を有する微生物を用い、同一反応系で、出発物質であるフェニルアラニンからテレフタル酸への変換反応を行うことが好ましい。
【００２５】
すなわち、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する活性、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する活性、および安息香酸をテレフタル酸に変換する活性を有する微生物の菌体もしくはその処理物を、フェニルアラニンを含む反応液中に加え、通常２０〜４０℃で反応させることによりテレフタル酸を生成させることができる。必要に応じて、補酵素等を加えることが好ましい。
【００２６】
なお、微生物は微生物の処理物を用いてもよい。処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることもできる。
【００２７】
また、テレフタル酸生産能を有し、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する酵素活性、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する酵素活性、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素活性を有する微生物を用い、グルコースなどの炭素源から発酵法によりテレフタル酸を製造することもできる。この場合、微生物の培養に用いる培地及び培養条件は、使用する微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。培養は、用いる微生物の生育に好適な条件で行われる。通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２〜９６時間実施する。なお、「テレフタル酸生産能を有し」とは炭素源を含む培地中で培養したときに、該炭素源を資化して培地または菌体内にテレフタル酸を蓄積しうる能力を有することをいう。例えば、公知のフェニルアラニン生産菌において、フェニルアラニンをトランス桂皮酸に変換する酵素活性、トランス桂皮酸を安息香酸に変換する酵素活性、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素活性を高めることで、テレフタル酸生産能を付与することができる。
【００２８】
炭素源は、上記微生物が資化しうる炭素源であれば特に限定されないが、例えば、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が用いられる。
また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加してもよい。
【００２９】
テレフタル酸は当該技術分野において周知の方法、例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより、培地から回収および精製することができる。
【００３０】
＜テレフタル酸の製造方法〜２＞
本発明のテレフタル酸の製造方法の第二の態様は、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する工程（工程２ａ）、マンデル酸を安息香酸に変換する工程（工程２ｂ）、および安息香酸をテレフタル酸に変換する工程（工程２ｃ）を含む。
【００３１】
工程２ａは、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にフェニルピルビン酸を用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００３２】
ここで、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する酵素としては、hydroxymandelate
synthase（ＨＭＳ）（EC1.13.11.46）が挙げられる。この酵素については、例えば、J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 5389-5390に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、同文献に記載されたような方法で、Amycolatopsis属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００３３】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００３４】
公知の配列としては特に制限されないが、Amycolatopsis orientalis 由来のhydroxymandelate synthaseをコードするGenBank受入番号AJ223998.1:14957..16030の塩基配列（配列番号１１）が例示される。ただし、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、GenBank受入番号AJ223998.1の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。なお、必要に応じて、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換しやすいように蛋白工学的手法などを用いて基質特異性を改変してもよい。また、hydroxymandelate synthaseと立体構造がよく類似している4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （EC 1.13.11.27）もフェニルピルビン酸をマンデル酸に変換するために使用することができる。
【００３５】
工程２ｂは、マンデル酸を安息香酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にマンデル酸を用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００３６】
ここで、マンデル酸を安息香酸に変換する酵素としては、マンデル酸経路の反応を触媒する酵素群が挙げられる。すなわち、(S)-Mandelate dehydrogenaseによって(S)-マンデル酸をベンゾイルギ酸に変換（EC 1.1.99.31）、Benzoylformate decarboxylaseによるベンゾイルギ酸の脱炭酸によってベンズアルデヒドとし（EC 4.1.1.7）、さらにBenzaldehyde dehydrogenaseによってベンズアルデヒドから安息香酸を得る（EC 1.2.1.28、1.2.1.7）。これらの酵素をコードする遺伝子は様々な微生物種で見出されており、いずれの微生物由来の酵素も利用することができる。例えばPseudomonas putidaでは、(S)-Mandelate dehydrogenaseはmdlB遺伝子（配列番号１３）に、Benzoylformate decarboxylaseはmdlC遺伝子（配列番号１５）に、NAD+-dependent benzaldehyde dehydrogenaseはmdlD遺伝子（配列番号１７）にそれぞれコードされている（Tsou AY. et al Biochemistry. 1990 Oct 23; 29(42):9856-62.）。またPseudomonas stutzeriでは、Benzoylformate decarboxylaseがdpgB遺伝子に、NAD+/NADP+-dependent benzaldehyde dehydrogenaseがdpgC遺伝子にそれぞれコードされている（Saehuan C. et al Biochim Biophys Acta. 2007 Nov; 1770(11):1585-92.）。
【００３７】
また(S)-マンデル酸から安息香酸を生成する経路として、抗生物質のクロロビオシンやノボビオシンの生合成経路の反応も候補として挙げられる。Streptomyces roseochromogenes由来のCloRは、クロロビオシンのRing A部位となる3-dimethylallyl-4-hydroxybenzoate（3DMA-4HB）の合成に関与し、3-dimethylallyl-4-hydroxymandelic acid（3DMA-4HMA）を脱炭酸することで3DMA-4HBに変換することが報告されている（Pojer F. et al J Biol Chem. 2003 Aug 15; 278(33):30661-8.）。CloRが基質とする3DMA-4HMAには3位にジメチルアリル基、4位に水酸基が存在するという点で(S)-マンデル酸と異なるが、CloRが(S)-マンデル酸を基質として許容する可能性はある。また必要に応じてCloRの基質特異性を改変させることも有効な手段となり得る。またStreptomyces spheroides由来のNovRは、Streptomyces roseochromogenes由来のCloRと95%の相同性を有しており、ノボビオシンのRing A部位となる3DMA-4HBの合成に関与すると考えられている（Keller S. et al Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006 Dec; 62(Pt 12):1564-70.）。NovRもCloRと同様、(S)-マンデル酸から安息香酸を生成させる酵素の候補となる。
【００３８】
これらの酵素については、例えば、上述した文献に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、同文献に記載されたような方法で、Pseudomonas属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００３９】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００４０】
公知の配列としては特に制限されないが、上述したような公知酵素をコードする塩基配列が例示される。ただし、マンデル酸を安息香酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、上記塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、マンデル酸を安息香酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００４１】
工程２ｃは、安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質に安息香酸を用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００４２】
ここで、安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素としては、ベンゼン環にカルボキシル基を付加する酵素が挙げられる。この酵素については、例えば、Environmental Microbiology (2010) 12(10), 2783-2796に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、同文献に記載されたような方法で、Clostrida属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００４３】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００４４】
公知の配列としては特に制限されないが、表２に記載のAbcAおよびAbcD遺伝子が例示さ
れる。ＡｂｃＤ及びＡｂｃＡ遺伝子はオペロンを形成し、コードする蛋白質はヘテロ複合体を形成して、酵素反応を行っていると考えられている。ただし、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、表に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【表２】
2013128460.tif 000004
【００４５】
工程２ａ〜２ｃについては、各反応を別々に行ってもよいが、各工程を各反応を触媒する酵素、または各反応を触媒酵素の活性を有する微生物を用いて別々に行ってもよいが、各反応を触媒する酵素全て、または各反応を触媒する全ての酵素の活性を有する微生物を用い、同一反応系で、出発物質であるフェニルピルビン酸からテレフタル酸への変換反応を行うことが好ましい。
【００４６】
すなわち、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する活性、マンデル酸を安息香酸に変換する活性、および安息香酸をテレフタル酸に変換する活性を有する微生物の菌体もしくはその処理物を、フェニルピルビン酸を含む反応液中に加え、通常２０〜４０℃で反応させることによりテレフタル酸を生成させることができる。必要に応じて、補酵素等を加えることが好ましい。
【００４７】
なお、微生物は微生物の処理物を用いてもよい。処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることもできる。
【００４８】
また、テレフタル酸生産能を有し、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する酵素活性、マンデル酸を安息香酸に変換する酵素活性、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素活性を有する微生物を用い、グルコースなどの炭素源から発酵法によりテレフタル酸を製造することもできる。この場合、微生物の培養に用いる培地及び培養条件は、使用する微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。培養は、用いる微生物の生育に好適な条件で行われる。通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２〜９６時間実施する。なお、「テレフタル酸生産能を有し」とは炭素源を含む培地中で培養したときに、該炭素源を資化して培地または菌体内にテレフタル酸を蓄積しうる能力を有することをいう。例えば、公知のフェニルピルビン酸生産菌において、フェニルピルビン酸をマンデル酸に変換する酵素活性、マンデル酸を安息香酸に変換する酵素活性、および安息香酸をテレフタル酸に変換する酵素活性を高めることで、テレフタル酸生産能を付与することができる。
なお、培地成分やテレフタル酸の回収および精製方法は上述したとおりである。
【００４９】
＜テレフタル酸の製造方法〜３＞
本発明のテレフタル酸の製造方法の第三の態様は、フェニルアラニンをフェニルアセト
アミドに変換する工程（工程３ａ）、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する工程（工程３ｂ）、フェニル酢酸をトルエンに変換する工程（工程３ｃ）、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する工程（工程３ｄ）、およびｐ−トルイル酸をテレフタル酸に変換する工程（工程３ｅ）を含む。
【００５０】
工程３ａは、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にフェニルアラニンを用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００５１】
フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素としては、L-Phenylalanine oxidase（EC1.13.12.9）が挙げられる。この酵素については、例えば、Suzuki H et al (2004) J Biochem 136(5):617-27に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、例えば、J. Biochem. (Tokyo) 92 (1982) 1235-1240.に記載されたような方法で、シュードモナス属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００５２】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌（エシェリヒア属細菌）、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００５３】
公知の配列としては特に制限されないが、Pseudomonas sp. P-501のL-Phenylalanine oxidaseをコードするGenBank受入番号: AB167410の塩基配列（配列番号１９）が例示される。ただし、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる（以下、同様）。また、GenBank受入番号: AB167410の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００５４】
工程３ｂは、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にフェニルアセトアミドを用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００５５】
ここで、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素としては、アミダーゼ（EC 3.5.1.4）が挙げられる。この酵素については、例えば、J Bacteriol 178(12):3501-7やJ. Microbiol. Biotechnol.18(3) 552-9に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、同文献に記載されたような方法で、ロドコッカス属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００５６】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００５７】
公知の配列としては特に制限されないが、Rhodococcus erythropolis由来のamidaseをコードするGenBank受入番号: EU029986.1の塩基配列（配列番号２１）が例示される。ただし、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、GenBank受入番号: EU029986.1の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。また、その他のRhodococcus 由来アミダーゼ遺伝子も複数報告があり、これらもフェニルアセトアミドをフェニル酢酸へ変換するために使用できる。
【００５８】
工程３ｃは、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にフェニル酢酸を用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００５９】
ここで、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素としては、４−ヒドロキシフェニル酢酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.83）が挙げられる。この酵素については、例えば、Eur. J. Biochem 268 1363-1372やBiochemistry 2006 45 9584-92に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、同文献に記載されたような方法で、クロストリジウム属やトルモナス属、ラクトバチラス属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００６０】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００６１】
公知の配列としては特に制限されないが、表３に記載のGenBank受入番号の塩基配列が例示される。すなわち、Clostridium difficle のHpdBとHpdC蛋白質はヘテロ複合体を形成して脱炭酸酵素の本体となり、HpdA蛋白質は活性化因子として働くことが示されているのでこれらの遺伝子群を使用することができる。また、Clostridium scatologenesのCsdB
, CsdC, CsdA遺伝子群も使用できる。加えてトルエン分解菌であるTolumonas auensisは全ゲノムが報告されており（Lucus S et al (2009) EMBL database Accession No CP001616）、Tolumonas auensis の遺伝子群も使用することができる。
ただし、フェニル酢酸をトルエンに変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、これら塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、表３に記載のGenBank受入番号の（塩基配列によってコードされる）アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、フェニル酢酸をトルエンに変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【００６２】
【表３】
2013128460.tif 000005
【００６３】
また４−ヒドロキシフェニル酢酸脱炭酸酵素(4.1.1.61)は４−ヒドロキシベンゼンを基質としてフェノールを生成するが、この酵素でもフェニル酢酸をトルエンに変換する反応が可能であると考えられ、いくつか遺伝子配列が報告されており表４に記載する。
【表４】
2013128460.tif 000006
【００６４】
他にも、オキサロ酢酸脱炭酸酵素(EC 4.1.1.3)はオキサロ酢酸をピルビン酸と二酸化炭素に切断する反応を行い、同時にナトリウムポンプを持ち、切断時に得られたエネルギーを濃度勾配に変換するのでフェニル酢酸をトルエンに変換する反応に使用できると考えられる。なお、この酵素はビオチンと亜鉛イオンを要求する。表５に例示する。
【表５】
2013128460.tif 000007
【００６５】
同様のナトリウムポンプ系を有している酵素で、マロン酸脱炭酸酵素(EC 4.1.1.61)もフェニル酢酸をトルエンに変換する反応を実施できる可能性が高い。表６に例示する。
【表６】
2013128460.tif 000008
【００６６】
工程３ｄは、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素、または該酵素の活性を有する微生物を用いて行う。反応は基質にトルエンを用いて、好ましくは２０〜４０℃で行い、必要に応じて補酵素等を加える。
【００６７】
ここで、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素としては、ベンゼン環にカルボキシル基を付加する酵素が挙げられる。この酵素については、例えば、Environmental Microbiology (2010) 12(10), 2783-2796に記載の方法に従って活性を測定することができる。そして該活性を指標として、同文献に記載されたような方法で、Clostrida属細菌などから精製することができる。なお、部分精製酵素や該酵素の活性を有する画分を使用してもよい。また、遺伝子組み換えによって作製される組換え酵素を用いてもよい。
【００６８】
該酵素の活性を有する微生物としては、天然に該酵素の活性を有する微生物でもよいし、遺伝子改変等により該酵素の活性を付与された微生物であってもよい。微生物の種類は特に限定されないが、大腸菌、コリネ型細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、リゾビウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、サクシノバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、糸状菌、酵母等が例示される。該酵素の活性が付与された微生物は、公知の配列をもとに該酵素をコードするDNAを取得し、これを上記微生物に、ベクターや相同組換えなどを利用した形質転換法等により導入することで得ることができる。また、宿主微生物の染色体上の該酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換することによっても該酵素の活性を有する微生物を得ることができる。
【００６９】
公知の配列としては特に制限されないが、表７に記載のAbcAおよびAbcD遺伝子が例示される。ＡｂｃＤ及びＡｂｃＡ遺伝子はオペロンを形成し、コードする蛋白質はヘテロ複合体を形成して、酵素反応を行っていると考えられている。ただし、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する活性を有する蛋白質をコードする限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAのようなホモログであってもよい。また、表に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の同一性を有し、トルエンをｐ−トルイル酸に変換する活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
【表７】
2013128460.tif 000009
【００７０】
工程３ｅではｐ-トルイル酸からテレフタル酸への変換を行う。ｐ-トルイル酸からテレフタル酸への変換は、例えば、米国特許第３，０８９，９０６号（１９６３）などに記載の方法が知られている。メタノール等を反応系に共存させることで得たｐ-トルイル酸エステルを合成し、これを酸化反応でジメチルテレフタル酸に変換させさらに高純度に精製した上でテレフタル酸を取得することができる。
【００７１】
工程３ａ〜３ｄについては、各工程を、各反応を触媒する酵素、または各反応を触媒する酵素の活性を有する微生物を用いて別々に行ってもよいが、各反応を触媒する酵素全て、または各反応を触媒する全ての酵素の活性を有する微生物を用い、同一反応系で、出発物質であるフェニルアラニンからｐ-トルイル酸への変換反応を行うことが好ましい。
【００７２】
すなわち、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する活性、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する活性、フェニル酢酸をトルエンに変換する活性、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する活性を有する微生物の菌体もしくはその処理物を、フェニルアラニンを含む反応液中に加え、通常２０〜４０℃で反応させることによりｐ-トルイル酸を生成させることができる。必要に応じて、補酵素等を加えることが好ましい。
【００７３】
なお、微生物は微生物の処理物を用いてもよい。処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物等が挙げられる。また、常法により担体に固定化した菌体、該処理物、酵素等を用いることもできる。
そして、得られたｐ-トルイル酸をテレフタル酸に変換することで、テレフタル酸を得ることができる。
【００７４】
一方、ｐ−トルイル酸生産能を有し、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素活性、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素活性、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素活性、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素活性を有する微生物を用い、グルコースなどの炭素源から発酵法によりｐ−トルイル酸を製造し、得られたｐ−トルイル酸をテレフタル酸に変換することによってテレフタル酸を製造することもできる。この場合、微生物の培養に用いる培地及び培養条件は、使用する微生物の種類に応じて適宜設定することができるが、炭素源、窒素源、無機塩及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。培養は、用いる微生物の生育に好適な条件で行われる。通常、培養温度１０℃〜４５℃で１２〜９６時間実施する。ｐＨは微生物の生育および物質生産に好ましい範囲に適宜調節することが好ましい。なお、「ｐ−トルイル酸生産能を有し」とは炭素源を含む培地中で培養したときに、該炭素源を資化して培地または菌体内にｐ−トルイル酸を蓄積しうる能力を有することをいう。例えば、公知のフェニルアラニン生産菌において、フェニルアラニンをフェニルアセトアミドに変換する酵素活性、フェニルアセトアミドをフェニル酢酸に変換する酵素活性、フェニル酢酸をトルエンに変換する酵素活性、およびトルエンをｐ−トルイル酸に変換する酵素活性を高めることで、ｐ−トルイル酸生産能を付与することができる。
なお、培地成分やテレフタル酸の精製方法は上述したとおりである。ｐ−トルイル酸も当該技術分野において周知の方法、例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィーなどにより、培地から回収および精製することができる。
【００７５】
参考例
以下、本発明においてテレフタル酸の合成経路を見い出すために使用した合成経路作成装置について、図面に基づいて説明する。
【００７６】
〈合成経路作成装置１の構成〉
図１は、合成経路作成装置１の構成図である。図１に示すように、合成経路作成装置１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２、メモリ３、ハードディスク駆動装置４、可搬媒体駆動装置５、入力装置６、表示装置７及び外部インターフェース８を有している。
【００７７】
ＣＰＵ２は、メモリ３に格納されているコンピュータプログラムを実行するとともに、メモリ３に格納されているデータを処理することにより、合成経路作成装置１を制御する。メモリ３は、ＣＰＵ２で実行されるプログラムやＣＰＵ２で処理されるデータを記憶する。メモリ３は、揮発性のＲＡＭ（Random Access Memory）と、不揮発性のＲＯＭ（Read Only Memory）とを含む。
【００７８】
ハードディスク駆動装置４は、メモリ３にロードされるプログラムを記憶する。また、ハードディスク駆動装置４は、ＣＰＵ２で処理されるデータを記憶する。可搬媒体駆動装置５は、例えば、ＣＤ（Compact Disc）、ＤＶＤ（Digital Versatile Disk）、ＨＤ−ＤＶＤ（High Definition−ＤＶＤ）、ブルーレイディスク等の可搬媒体の駆動装置である
。また、可搬媒体駆動装置５は、フラッシュメモリ等の不揮発性メモリを有するカード媒体の入出力装置であってもよい。可搬媒体駆動装置５によって駆動される可搬媒体は、例えば、ハードディスク駆動装置４にインストールされるコンピュータプログラム、入力データ等を保持する。入力装置６は、例えば、キーボード、マウス、ポインティングデバイス、ワイヤレスリモコン等である。
【００７９】
表示装置７は、ＣＰＵ２で処理されるデータやメモリ３に記憶されるデータを表示する。表示装置７は、例えば、液晶表示装置、プラズマディスプレイパネル、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）、エレクトロルミネッセンスパネル等である。
【００８０】
外部インターフェース８は、合成経路作成装置１を外部ネットワークに接続する。外部インターフェース８は、例えば、モデム、ターミナルアダプタ等の通信装置を備えており、合成経路作成装置１と外部ネットワーク上の機器との通信の制御を行う。外部ネットワークは、例えば、インターネットやローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）である。また、電話線、専用線、光通信網、通信衛生などの通信回線により外部ネットワークを構成してもよい。
【００８１】
合成経路作成装置１は、出発化合物から目的化合物までの化合物合成経路を作成する。化合物合成経路の作成は、仮想反応法及び最適化法の２種類がある。仮想反応法及び最適化法では、化合物を独自の表現方法によって定義する。
【００８２】
〈化合物を独自の表現方法によって定義する手順の一例〉
まず、化合物を独自の表現方法によって定義する手順の一例について説明する。この手順においては、化合物の化学構造式に含まれている部分構造を所定の基準に従って分類し、化合物の化学構造式に含まれている部分構造を文字列として定義する。所定の基準は、化合物構造について厳密に定義した基準であってもよいし、化合物構造の類似性を考慮した基準であってもよい。また、所定の基準は、官能基別（alkane、alkeneなど）に基づいた基準であってもよい。例えば、ＫＥＧＧ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）のデータベースに登録されているatom typesに従って、化合物の化学構造式に含まれている部分構造を分類してもよい。また、例えば、ＫＥＧＧのデータベースに登録されているatom typesをグループ化し、グループ化されたatom typesに従って、化合物の化学構造式に含まれている部分構造を分類してもよい。
【００８３】
ＫＥＧＧのデータベースに登録されている炭素（Ｃ）を有する化合物についてのatom typesをグループ化した場合の例を図２に示す。図２では、化学反応類似性に基づいて、atom typesのグループ化が行われているが、官能基別（alkane、alkeneなど）に基づいて、atom typesのグループ化を行ってもよい。図２のＣ1a、Ｃ1b、Ｃ1c及びＣ1dは、ＫＥＧＧのデータベースに登録されているatom typesに割り当てられた識別番号である。図２のＣ2aやＣ3a等についても同様である。図２のＣ01は、Ｃ1a、Ｃ1b、Ｃ1c及びＣ1dをグループ化したデータ（情報）に割り当てられた識別番号である。図２のＣ02やＣ03等についても同様である。
【００８４】
図３は、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物についてのatom typesをグループ化した場合の例である。図３の識別番号Ａのフィールドには、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物についてのatom typesに割り当てられた識別番号が入力されている。図３の識別番号Ｂのフィールドには、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物についてのatom typesをグループ化したデータに割り当てられた識別番号が入力されている。
【００８５】
図４は、化合物（3-Hydroxypropionate）の化学構造式に含まれている部分構造の個数及び部分構造の結合状態の個数をカウントした場合の例である。図４では、化合物（3-Hydroxypropionate）の化学構造式に含まれている部分構造の個数が、部分構造の種類毎にカウントされ、また、化合物（3-Hydroxypropionate）の化学構造式に含まれている部分構造の結合状態の個数が、部分構造の種類及び結合状態の種類毎にカウントされている。
【００８６】
図４の符号１０１で示すフィールドには、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物についてのatom typesをグループ化したデータに割り当てられた識別番号が入力されている。図４の符号１０２で示すフィールドには、化合物の化学構造式に含まれている部分構造の個数を、部分構造の種類毎にカウントした後の数値が入力されている。また、図４の符号１０２で示すフィールドには、化合物の化学構造式に含まれている部分構造の結合状態の個数を、部分構造の種類及び結合状態の種類毎にカウントした後の数値が入力されている。なお、図４において、一重結合は−で表記され、二重結合は＝で表記され、三重結合は％で表記されている。図４の符号１０２で示すフィールドに入力されている数値を連続的に並べたものを、ＵＦ（Universal Feature）と表記する。図４に示すように、化合物のＵＦは、化合物の化学構造式に含まれている部分構造の個数を示す原子情報と、化合物の化学構造式に含まれている部分構造の結合状態の個数を示す結合情報とから構成
されている。
【００８７】
〈合成経路作成装置１の機能構成〉
図５は、合成経路作成装置１の機能構成図である。図５に示す合成経路作成装置１は、ユーザの操作を受け付けて合成経路作成装置１を操作する操作部１０と、化合物データベース１１、既知反応データベース１２、部分構造データベース１３、共通構造データベース１４、ＵＦデータベース１５、差分データベース１６、１７及び仮想反応データベース１８を有する記憶部２０と、各種の処理を実行する制御部２１と、各種の情報を表示する表示部２２とを備える。これらの各機能部は、ＣＰＵ２、メモリ３等やＣＰＵ２で実行されるコンピュータプログラムによって実現される。
【００８８】
〈化合物データベース１１〉
化合物データベース１１には、化合物の名称と、化合物の化学構造式のデータとが関連付けて格納される。例えば、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物の名称及び化合物の化学構造式のデータを関連付けて、化合物データベース１１に格納してもよい。また、化合物データベース１１には、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物に加えて目的化合物（非天然化合物を含む）の化合物の名称と、化合物の化学構造式のデータとが関連付けて格納されてもよい。また、例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ、ＢＲＥＮＤＡ、ＭｅｔａＣｙｃなどの代謝物データベースに登録されている化合物の名称と、化合物の化学構造式のデータとを関連付けて、化合物データベース１１に格納してもよい。これに限らず、種々の化学物質データベースに登録されている化合物の名称と、化合物の化学構造式のデータとを関連付けて、化合物データベース１１に格納してもよい。
【００８９】
化合物データベース１１に格納されている化合物について、化合物（例えば、化合物Ａ）から化合物（例えば、化合物Ｂ）が合成されることが知られている化合物ペアにおける反応を、既知反応と表記する。既知反応であるか否かについては、ユーザが設定することが可能であるが、例えば、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている反応については、既知反応であるとしてもよい。
【００９０】
化合物データベース１１に格納されている化合物について、化合物（例えば、化合物Ａ）から化合物（例えば、化合物Ｂ）が合成されることが知られている化合物ペアを、既知化合物ペアと表記する。この時、化合物Ａと化合物Ｂとの間に中間体である化合物Ａ’が存在していてもよい。
【００９１】
化合物データベース１１に格納されている化合物について、或る化合物（例えば、化合物Ｃ）から或る化合物（例えば、化合物Ｄ）が合成されることが知られていない化合物ペアにおける反応を、未知反応と表記する。化合物データベース１１に格納されている化合物について、或る化合物（例えば、化合物Ｃ）から或る化合物（例えば、化合物Ｄ）が合成されることが知られていない化合物ペアを、未知化合物ペアと表記する。
【００９２】
〈既知反応データベース１２〉
既知反応データベース１２には、既知化合物ペアにおける各化合物の名称と、既知化合物ペアにおける反応方向と、既知反応酵素とが、関連付けて格納される。既知反応酵素は、複数であってもよい。
【００９３】
例えば、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物ペアにおける各化合物の名称と、化合物ペアの反応における反応方向と、化合物ペアにおける反応に用いられる酵素とを関連付けて、既知反応データベース１２に格納してもよい。また、例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ、ＢＲＥＮＤＡ、ＭｅｔａＣｙｃなどの代謝物データベースに登録されている化合物ペアにおける各化合物の名称と、化合物ペアにおける反応方向と、化合物ペアにおける反
応に用いられる酵素とを関連付けて、既知反応データベース１２に格納してもよい。また、大腸菌の代謝反応データベースに登録されている化合物ペアにおける各化合物の名称と、化合物ペアにおける反応方向と、化合物ペアにおける反応に用いられる酵素とを関連付けて、既知反応データベース１２に格納してもよい。これに限らず、種々の化学物質データベースに登録されている化合物ペアにおける各化合物の名称と、化合物ペアにおける反応方向と、化合物ペアにおける反応に用いられる酵素とを関連付けて、既知反応データベース１２に格納してもよい。
【００９４】
〈部分構造データベース１３〉
部分構造データベース１３には、化合物の化学構造式の部分データと、化合物の化学構造式の部分データに割り当てられた識別番号とが格納される。化合物の化学構造式の部分データは、所定の基準に従い、化合物の化学構造式から一部分の化学構造を抽出することによって作成されたデータである。例えば、ＫＥＧＧのデータベースに登録されているatom typesに基づいて、化合物データベース１１に登録されている化合物の化学構造式から一部分の化学構造を抽出することによって、化合物の化学構造式の部分データを作成してもよい。化合物の化学構造式の部分データに割り当てられた識別番号を、構造番号と表記する。例えば、図２の例であれば、Ｃ1a、Ｃ1b、Ｃ1c及びＣ1dが、構造番号に相当する。
【００９５】
〈共通構造データベース１４〉
共通構造データベース１４には、化合物の化学構造式の部分データをグループ化したデータと、グループ化したデータに割り当てられた識別番号とが格納される。化合物の化学構造式の部分データをグループ化したデータに割り当てられた識別番号を、共通構造番号と表記する。例えば、図２の例であれば、Ｃ01が共通構造番号に相当する。
【００９６】
〈ＵＦデータベース１５〉
ＵＦデータベース１５には、化合物のＵＦが、化合物の名称と関連付けて格納される。
【００９７】
〈化合物のＵＦの作成〉
制御部２１は、化合物データベース１１に格納されている化合物のＵＦを作成する。そして、制御部２１は、作成した化合物のＵＦを、化合物の名称と関連付けてＵＦデータベース１５に格納する。
【００９８】
なお、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物のＵＦ及び化合物の名称については、化合物のＵＦが同一であるが、化合物の名称が異なる場合がある。例えば、図２の例を用いて化合物Ａ及び化合物Ｂが分類され、化合物Ａについては、Ｃ1aが２個、化合物Ｂについては、Ｃ1aが１個、Ｃ1bが１個であったとする。Ｃ1a及びＣ1bは、グループ化されているので、化合物Ａ及び化合物Ｂは、共にＣ01が２個あるとして、化合物のＵＦが作成される。そのため、化合物のＵＦが同一であるが、化合物の名称が異なる場合がある。この場合、ＵＦデータベース１５には、化合物のＵＦに対して、複数の化合物の名称が関連付けて格納されている。
【００９９】
上記では、制御部２１は、共通構造データベース１４を参照して、化合物のＵＦを作成している。すなわち、制御部２１は、化合物の化学構造式の部分データをグループ化したデータと、共通構造番号とを参照して、化合物のＵＦを作成している。しかし、これに限定されず、制御部２１は、部分構造データベース１３を参照して、化合物のＵＦを作成してもよい。すなわち、制御部２１は、化合物の化学構造式の部分データと、構造番号とを参照して、化合物のＵＦを作成してもよい。
【０１００】
〈差分データベース１６〉
差分データベース１６には、化合物ペアのＵＦの差分と、化合物ペアにおける各化合物
の名称とが、関連付けて格納される。例えば、化合物ＡのＵＦから化合物ＢのＵＦを減算した値が、化合物ペアのＵＦの差分である。なお、差分データベース１６には、化合物ペアにおける各化合物の名称に代えて、化合物ペアにおける各化合物のＵＦを格納してもよい。
【０１０１】
〈差分データベース１６に格納されるＤＦの作成〉
制御部２１は、ＵＦデータベース１５に格納されている全ての化合物についてペアを作成し、作成した化合物ペアのＵＦの差分を算出する。化合物ペアのＵＦの差分を、ＤＦ（Difference Feature）と表記する。
【０１０２】
制御部２１は、ＵＦデータベース１５に格納されている全ての化合物ペアで反応が生じると仮定して、ＵＦデータベース１５に格納されている全ての化合物についてペアを作成する。例えば、ＵＦデータベース１５に化合物Ａ、Ｂ及びＣが格納されている場合、制御部２１は、化合物Ａと化合物Ｂとのペア、化合物Ａと化合物Ｃとのペア、化合物Ｂと化合物Ｃとのペアを作成する。また、例えば、化合物Ａと化合物ＢとのペアについてのＤＦを算出する場合、制御部２１は、化合物ＡのＵＦから化合物ＢのＵＦを減算した値と、化合物ＢのＵＦから化合物ＡのＵＦを減算した値とを算出する。そして、制御部２１は、ＤＦと化合物ペアにおける各化合物の名称とを関連付けて差分データベース１６に格納する。
【０１０３】
〈差分データベース１７〉
差分データベース１７には、既知化合物ペアのＵＦの差分と、既知化合物ペアにおける各化合物の名称と、既知反応酵素とが、関連付けて格納される。なお、差分データベース１７には、既知化合物ペアにおける各化合物の名称に代えて、既知化合物ペアにおける各化合物のＵＦを格納してもよい。
【０１０４】
〈差分データベース１７に格納されるＤＦの作成〉
制御部２１は、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物のうち既知化合物ペアのＵＦの差分を算出する。既知化合物ペアのＵＦの差分を、既知ＤＦと表記する。例えば、化合物Ａから化合物Ｂを合成する反応が既知反応である場合、制御部２１は、化合物ＢのＵＦから化合物ＡのＵＦを減算することにより、既知ＤＦを算出する。そして、制御部２１は、既知ＤＦと、既知化合物ペアにおける各化合物の名称と、既知反応酵素とを関連付けて差分データベース１７に格納する。制御部２１は、既知化合物ペアにおける各化合物の名称、既知反応酵素については、既知反応データベース１２に格納されているデータを用いる。
【０１０５】
〈仮想反応法による化合物合成経路の作成〉
図６を参照して、仮想反応法による化合物合成経路の作成のフローを説明する。図６のフローは、操作部１０を介してユーザから仮想反応法による化合物合成経路の作成の指示を受け付けることにより開始される。この際、操作部１０を介してユーザから出発化合物及び目的化合物の指定を受け付けるようにしてもよい。
【０１０６】
図６のＳ６０１の処理において、制御部２１は、化合物データベース１１に格納されている化合物のＵＦを作成する。すなわち、制御部２１は、化合物データベース１１に格納されている化合物の化学構造式に含まれている部分構造の個数を、部分構造の種類毎にカウントするとともに、化合物の化学構造式に含まれている部分構造の結合状態の個数を、部分構造の種類及び結合状態の種類毎にカウントすることにより、化合物の化学構造式を数値に変換する。また、図６のＳ６０１の処理において、制御部２１は、作成したＵＦと、化合物の名称とを関連付けてＵＦデータベース１５に格納する。図６のＳ６０１の処理を実行する制御部２１が、変換部として機能する。
【０１０７】
次に、図６のＳ６０２の処理において、制御部２１は、ＵＦデータベース１５に格納されている全ての化合物についてペアを作成し、作成した化合物ペアのＤＦを算出する。制御部２１は、算出したＤＦと、化合物ペアにおける各化合物の名称とを関連付けて差分データベース１６に格納する。
【０１０８】
また、図６のＳ６０２の処理において、制御部２１は、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物ペアのうち既知化合物ペアについての既知ＤＦを算出する。制御部２１は、算出した既知ＤＦと、既知化合物ペアにおける各化合物の名称と、既知反応酵素とを関連付けて差分データベース１７に格納する。図６のＳ６０２の処理を実行する制御部２１が、算出部として機能する。
【０１０９】
そして、図６のＳ６０３の処理において、制御部２１は、差分データベース１６に格納されているＤＦと、差分データベース１７に格納されている既知ＤＦとを比較する。
【０１１０】
次いで、図６のＳ６０４の処理において、制御部２１は、差分データベース１６に格納されているＤＦのうち、差分データベース１７に格納されている既知ＤＦと一致するＤＦについての未知化合物ペアにおける未知反応を仮想反応として決定する。既知ＤＦと一致するＤＦについての未知化合物ペアにおける未知反応は、起こり得ると予測される。なお、制御部２１は、差分データベース１６に格納されているＤＦのうち、差分データベース１７に格納されている既知ＤＦと一致するＤＦについての既知化合物ペアにおける既知反応については、仮想反応として決定しない。
【０１１１】
また、図６のＳ６０４の処理において、制御部２１は、差分データベース１６に格納されているＤＦと差分データベース１７に格納されている既知ＤＦとが一致する場合、一致する既知ＤＦと関連付けられている既知反応酵素を、仮想反応に用いられる酵素として決定する。制御部２１は、既知ＤＦと関連付けられている既知反応酵素が複数ある場合、複数の既知反応酵素を仮想反応に用いられる酵素として決定する。図６のＳ６０３及びＳ６０４の処理を実行する制御部２１が、決定部として機能する。
【０１１２】
次に、図６のＳ６０５の処理において、制御部２１は、仮想反応に関しての化合物ペアの各化合物の名称と、仮想反応に用いられる酵素とを関連付けて、仮想反応データベース１８に格納する。
【０１１３】
そして、図６のＳ６０６の処理において、制御部２１は、既知反応データベース１２及び仮想反応データベース１８に基づいて、化合物の合成経路を作成する。この場合、制御部２１は、既知化合物ペアの各化合物及び仮想反応に関しての化合物ペアの各化合物を示すノード（頂点）と、既知反応及び仮想反応を示すエッジ（辺）とによって、化合物の合成経路を作成する。すなわち、制御部２１は、既知化合物ペアの各化合物及び仮想反応に関しての化合物ペアの各化合物をノード、既知反応及び仮想反応をエッジとして、全ての反応を含むグラフ（ネットワーク）を構築することにより、化合物の合成経路を作成する。制御部２１は、既知化合物ペアの各化合物及び既知反応については、既知反応データベース１２を参照し、仮想反応に関しての化合物ペアの各化合物及び仮想反応については、仮想反応データベース１８を参照する。図６のＳ６０６の処理を実行する制御部２１が、作成部として機能する。
【０１１４】
グラフは、形式的にノードの集合Ｖと、ノード同士を結ぶエッジの集合Ｅからなる順序対Ｇ＝（Ｖ，Ｅ）として定義される。順序対Ｇは、グラフに含まれる化合物が、各反応を通してどのように隣接しているか（ネットワークを形成しているか）を表現するものである。グラフは、図形によって表現してもよいし、配列の各要素をノードとした配列処理によって表現してもよい。
【０１１５】
グラフを図形によって表現した場合の例を図７に示す。図７では、既知化合物ペアの各化合物及び仮想反応に関しての化合物ペアの各化合物が、ノード２０１−２０７によって示され、既知反応及び仮想反応が、エッジ３０１−３０７によって示されている。また、図７では、実線のエッジが既知反応を示しており、破線のエッジが仮想反応を示している。
【０１１６】
次いで、図６のＳ６０７の処理において、制御部２１は、出発化合物から目的化合物までの合成経路を、図６のＳ６０６の処理で作成された化合物の合成経路から探索する。制御部２１は、所定数以下の反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路を、図６のＳ６０６の処理で作成された化合物の合成経路から探索してもよい。制御部２１は、深さ優先探索又は幅優先探索等により、出発化合物から目的化合物までの合成経路を、図６のＳ６０６の処理で作成された化合物の合成経路から探索してもよい。制御部２１は、出発化合物又は原料化合物を開始点、目的化合物を終点とする方法（順方向探索法）、又は、目的化合物を開始点、出発化合物又は原料化合物を終点として経路探索を行う方法（逆方向探索）を実施してもよい。原料化合物は、目的化合物を合成する場合において原料となる化合物である。経路探索の目的に応じて、順方向探索法又は逆方向探索法の何れの方法を実施するかを決定してもよい。原料化合物の指定は、操作部１０を介してユーザから受け付けることにより行ってもよい。
【０１１７】
次に、図６のＳ６０８の処理において、制御部２１は、出発化合物から目的化合物までの合成経路を、図６のＳ６０６の処理で作成された化合物の合成経路から選択する（手順１）。図６のＳ６０８の処理において、手順１に代えて、制御部２１は、所定の数以下の反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路を、図６のＳ６０６の処理で作成された化合物の合成経路から選択してもよい（手順２）。図６のＳ６０８の処理において、手順１に代えて、制御部２１は、所定の数又は所定の範囲数の反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路を、図６のＳ６０６の処理で作成された化合物の合成経路から選択してもよい（手順３）。図６のＳ６０８の処理を実行する制御部２１が、選択部として機能する。
【０１１８】
例えば、図７において、ノード２０１を原料化合物、ノード２０３を出発化合物、ノード２０５を目的化合物とする場合、ノード２０３、２０４、２０５と、エッジ３０３、３０４とから構成される合成経路、及び、ノード２０３、２０７、２０５と、エッジ３０６、３０７とから構成される合成経路が、出発化合物から目的化合物までの合成経路として選択される。ノード２０４及び２０７は、中間化合物である。
【０１１９】
そして、図６のＳ６０９の処理において、制御部２１は、図６のＳ６０８の処理で選択された出発化合物から目的化合物までの合成経路のうち、所定の数以下の仮想反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路を抽出する（手順Ａ）。図６のＳ６０９の処理において、手順Ａに代えて、制御部２１は、図６のＳ６０８の処理で選択された出発化合物から目的化合物までの合成経路のうち、所定の数又は所定の範囲数の仮想反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路を抽出してもよい（手順Ｂ）。
【０１２０】
次いで、図６のＳ６１０の処理において、制御部２１は、図６のＳ６０９の処理で抽出された出発化合物から目的化合物までの合成経路について、熱力学的な実行可能性を判定する。
【０１２１】
熱力学的な実行可能性の判定は、図６のＳ６０９の処理で抽出された出発化合物から目的化合物までの合成経路に含まれる各反応における自由エネルギー変化を、例えば、Biophys. J. Vol.92, No.7, pp1792-1805(2007)に記載された方法により計算し、計算結果に基づいて各反応の向きを決定することにより行われる。図６のＳ６０９の処理で抽出された出発化合物から目的化合物までの合成経路に含まれる各反応が、正方向の反応及び可逆反応である場合、制御部２１は、図６のＳ６０９の処理で抽出された出発化合物から目的化合物までの合成経路について熱力学的な実行可能性があると判定する。また、図６のＳ６０９の処理で抽出された出発化合物から目的化合物までの合成経路に含まれる各反応に逆反応が存在する場合、制御部２１は、図６のＳ６０９の処理で抽出された出発化合物から目的化合物までの合成経路について熱力学的な実行可能性がないと判定する。
【０１２２】
次に、図６のＳ６１１の処理において、制御部２１は、図６のＳ６０９の処理で抽出された出発化合物から目的化合物までの合成経路のうち、熱力学的に実行可能性のある合成経路を抽出する。図６のＳ６１０及びＳ６１１の処理を実行する制御部２１が、熱力学判定部として機能する。
【０１２３】
そして、図６のＳ６１２の処理において、制御部２１は、図６のＳ６１１の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物のモル理論収率（％）を算出する。この場合、制御部２１は、図６のＳ６１１の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物について、原料化合物からのモル理論収率（％）を算出してもよい。制御部２１は、図６のＳ６１１の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物について、原料化合物からのモル理論収率（％）を算出する場合、既知反応データベース１２を参照して、原料化合物から出発化合物までの合成経路を作成する。そして、制御部２１は、原料化合物から出発化合物までの合成経路及び図６のＳ６１１の処理で抽出された合成経路を用いて、図６のＳ６１１の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物について、原料化合物からのモル理論収率（％）を算出する。原料化合物の指定は、操作部１０を介してユーザから受け付けることにより行ってもよい。この場合、制御部２１は、既知反応データベース１２に格納されている大腸菌の代謝反応に関するデータを参照して、原料化合物から出発化合物までの合成経路を作成してもよい。モル理論収率の計算は、例えば、Biotechnology and Bioengineering, Volume 42, p.59-73 (1993)に記載の方法により実施することができる。
【０１２４】
次いで、図６のＳ６１３の処理において、制御部２１は、図６のＳ６１２の処理で算出されたモル理論収率（％）が閾値以上であるか（又は閾値より大きいか）否かを判定する。閾値は、例えば、０％や１００％や２００％等の任意の値を設定することが可能である。
【０１２５】
次に、図６のＳ６１４の処理において、制御部２１は、図６のＳ６１１の処理で抽出された合成経路のうち、図６のＳ６１２の処理で算出されたモル理論収率（％）が閾値以上である（又は閾値より大きい）目的化合物を合成する合成経路を抽出する。図６のＳ６１２、Ｓ６１３及びＳ６１４の処理を実行する制御部２１が、モル理論収率判定部として機能する。
【０１２６】
そして、図６のＳ６１５の処理において、制御部２１は、図６のＳ６１４の処理で抽出された合成経路について、実用的な合成経路を抽出する。実用的な合成経路の抽出は、合成経路に含まれる各反応の炭素数の変化や炭素数の大小を評価すること、個別の仮想反応酵素の改変の難易度などを考慮して行ってもよい。
【０１２７】
また、制御部２１は、図６のＳ６０８の処理で選択された出発化合物から目的化合物までの合成経路における仮想反応を、事前に得られる情報等を参考にして、改変の実績のある酵素反応に予め限定するようにしてもよい。更に、制御部２１は、図６のＳ６０８の処理で選択された出発化合物から目的化合物までの合成経路における仮想反応の実現有無を評価して、合成経路を絞り込むようにしてもよい。この場合、化合物の部分構造の比較を
取り入れて、仮想反応の実現有無の評価を行ってもよい。
【０１２８】
なお、制御部２１は、図６のＳ６０９の処理を省略してもよいし、図６のＳ６１０及びＳ６１１の処理を省略してもよいし、図６のＳ６１２からＳ６１４の処理を省略してもよいし、図６のＳ６１５の処理を省略してもよい。また、制御部２１は、図６のＳ６０９の処理と、図６のＳ６１０及びＳ６１１の処理と、図６のＳ６１２からＳ６１４の処理と、図６のＳ６１５の処理と、を実行する順番を変更してもよい。例えば、制御部２１は、図６のＳ６１０及びＳ６１１の処理を実行した後に、図６のＳ６０９の処理を実行するようにしてもよい。
【０１２９】
次に、図６のＳ６１６の処理において、制御部２１は、図６のＳ６１５の処理で抽出された合成経路と、合成経路に含まれる出発化合物、中間化合物及び目的化合物の各名称と、合成経路における各反応で用いられる酵素とを、含む情報を出力する。この場合、制御部２１は、図６のＳ６１５の処理で抽出された合成経路における各反応について、既知反応であるか又は仮想反応であるかを特定して、図６のＳ６１５の処理で抽出された合成経路の情報を出力する。制御部２１は、合成経路における各反応で用いられる酵素として、酵素ＥＣ番号を用いてもよい。
【０１３０】
例えば、制御部２１は、図８に示すグラフ８０及び表８１によって、図６のＳ６１５の処理で抽出された合成経路の情報を出力してもよい。図８に示すように、出発化合物（化合物Ａ）から中間化合物（化合物Ｂ）を合成する反応が既知反応であることが特定され、中間化合物（化合物Ｂ）から目的化合物（化合物Ｃ）を合成する反応が仮想反応であることが特定されている。また、図８では、既知反応に用いられる酵素として既知反応酵素Ａ、Ｂが割り当てられ、仮想反応に用いられる酵素として既知反応酵素Ｂ、Ｃが割り当てられている。
【０１３１】
制御部２１は、図６のＳ６１４の処理で抽出された合成経路について、図６のＳ６１２の処理で算出されたモル理論収率（％）が大きい順に順位付けを行ってもよい。更に、制御部２１は、図６のＳ６１６の処理で出力される情報に、図６のＳ６１２の処理で算出されたモル理論収率（％）が大きい順に順位付けを行った合成経路についての情報を追加してもよい。
【０１３２】
制御部２１は、図６のＳ６１６の処理で出力した情報を、データベース化して記憶部２０に記憶するようにしてもよい。また、図６のＳ６１６の処理で出力した情報を、表示部２２に表示するようにしてもよい。
【０１３３】
制御部２１が、化合物の化学構造を所定の基準に従ってＵＦに変換するとともに、化合物ペアの一方の化合物についてのＵＦから他方の化合物についてのＵＦを減算することによりＤＦを算出する。制御部２１が、既知化合物ペアの既知ＤＦと、未知化合物ペアのＤＦとを比較し、既知化合物ペアの既知ＤＦと一致するＤＦについての未知化合物ペアの未知反応を仮想反応と決定する。制御部２１が、既知化合物ペアの各化合物及び仮想反応に関しての化合物ペアの各化合物を示すノードと、既知反応及び仮想反応を示すエッジとによって、化合物の合成経路を作成する。制御部２１が、出発化合物から目的化合物までの合成経路を、既知化合物ペアの各化合物及び仮想反応に関しての化合物ペアの各化合物を示すノードと、既知反応及び仮想反応を示すエッジとから構成される化合物の合成経路から選択する。化合物を示すノード、既知反応及び仮想反応を示すエッジによって作成された化合物の合成経路から、出発化合物から目的化合物までの新規の化合物の合成経路を選択することが可能となる。
【０１３４】
制御部２１が、既知化合物ペアの既知ＤＦと、未知化合物ペアのＤＦとを比較し、未知
化合物ペアのＤＦと一致する既知化合物ペアの既知ＤＦと関連付けられている既知反応酵素を、仮想反応に用いられる酵素として決定する。選択された出発化合物から目的化合物までの化合物の合成経路に含まれる仮想反応に既知反応酵素を用いることが可能となる。
【０１３５】
〈最適化法による化合物合成経路の作成〉
図９を参照して、最適化法による化合物合成経路の作成のフローを説明する。図９のフローは、操作部１０を介してユーザから最適化法による化合物合成経路の作成の指示を受け付けることにより開始される。この際、操作部１０を介してユーザから出発化合物及び目的化合物の指定を受け付けるようにしてもよい。
【０１３６】
図９のＳ９０１の処理において、制御部２１は、化合物データベース１１に格納されている化合物のＵＦを作成する。すなわち、制御部２１は、化合物データベース１１に格納されている化合物の化学構造式に含まれている部分構造の個数を、部分構造の種類毎にカウントするとともに、化合物の化学構造式に含まれている部分構造の結合状態の個数を、部分構造の種類及び結合状態の種類毎にカウントすることにより、化合物の化学構造式を数値に変換する。また、図９のＳ９０１の処理において、制御部２１は、作成したＵＦと、化合物の名称とを関連付けてＵＦデータベース１５に格納する。図９のＳ９０１の処理を実行する制御部２１が、変換部として機能する。
【０１３７】
次に、図９のＳ９０２の処理において、制御部２１は、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物ペアのうち既知化合物ペアについての既知ＤＦを算出する。制御部２１は、算出した既知ＤＦと、既知化合物ペアにおける各化合物の名称と、既知反応酵素とを関連付けて差分データベース１７に格納する。図９のＳ９０２の処理を実行する制御部２１が、第１算出部として機能する。
【０１３８】
そして、図９のＳ９０３の処理において、制御部２１は、目的化合物についてのＵＦから出発化合物についてのＵＦを減算することにより、出発化合物と目的化合物との化合物ペアのＵＦの差分を算出する。出発化合物と目的化合物との化合物ペアのＵＦの差分を、Difference Totalと表記する。出発化合物及び目的化合物の指定は、操作部１０を介してユーザから受け付けることにより行われる。図９のＳ９０３の処理を実行する制御部２１が、第２算出部として機能する。
【０１３９】
次いで、図９のＳ９０４の処理において、制御部２１は、整数計画法を用いて、複数の既知ＤＦの合計値とDifference Totalの値とが一致するように、差分データベース１７から複数の既知ＤＦを抽出する。この場合、制御部２１は、既知ＤＦの個数を限定して、差分データベース１７から複数の既知ＤＦを抽出するようにしてもよい。例えば、制御部２１は、差分データベース１７から所定数以下又は所定数の既知ＤＦを抽出するようにしてもよい。整数計画法を用いて、適切な条件を指定することにより、短い計算時間で幅広い組み合わせの中から探索を実施することができる。ただし、制御部２１は、整数計画法に代えて、他の方法を用いてもよい。
【０１４０】
制御部２１は、図９のＳ９０４の処理を所定回数繰り返すことにより、複数の既知ＤＦを含む組（グループ）を作成する。複数の既知ＤＦを含む組を、ＤＦ組合せ群と表記する。制御部２１は、図９のＳ９０４の処理を繰り返すごとに、差分データベース１７から、複数の既知ＤＦをランダムに抽出することにより、１種類又は複数種類のＤＦ組合せ群を作成する。
【０１４１】
図９のＳ９０４の処理において、制御部２１は、差分データベース１７から、複数の既知ＤＦを抽出し、抽出した複数の既知ＤＦを用いてＤＦ組合せ群を作成するようにしてもよい。そして、制御部２１は、図９のＳ９０４の処理を所定回数繰り返すことにより、１
種類又は複数種類のＤＦ組合せ群を作成するようにしてもよい。この場合、制御部２１は、図９のＳ９０４の処理を繰り返すごとに、差分データベース１７から、複数の既知ＤＦをランダムに抽出するようにしてもよい。
【０１４２】
次に、図９のＳ９０５の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０４の処理で作成されたＤＦ組合せ群について、出発化合物及び目的化合物と、ＤＦ組合せ群に含まれる複数の既知ＤＦとによって、化合物の合成経路を作成する。制御部２１は、図９のＳ９０４の処理で複数種類のＤＦ組合せ群が作成されている場合、各ＤＦ組合せ群について、化合物の合成経路を作成する。図９のＳ９０４及びＳ９０５の処理を実行する制御部２１が、作成部として機能する。
【０１４３】
出発化合物及び目的化合物と、ＤＦ組合せ群に含まれる複数の既知ＤＦとからなる化合物の合成経路の例を、図１０に示す。図１０に示すように、ＤＦ組合せ群に含まれる複数の既知ＤＦの組合せは６通りである。
【０１４４】
そして、図９のＳ９０６の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦを算出する。制御部２１は、中間化合物のＵＦを、以下の手順によって算出する。
【０１４５】
例として、図１０のＤＦ組合せ群における“出発化合物，既知ＤＦ１，既知ＤＦ２，既知ＤＦ３，目的化合物”の化合物の合成経路について説明する。また、出発化合物から中間化合物Ａが合成され、中間化合物Ａから中間化合物Ｂが合成され、中間化合物Ｂから目的化合物が合成される場合について説明する。まず、制御部２１は、目的化合物のＵＦから既知ＤＦ３を減算することにより、中間化合物ＢのＵＦを算出する。次に、制御部２１は、中間化合物ＢのＵＦから既知ＤＦ２を減算することにより、中間化合物ＡのＵＦを算出する。このように、制御部２１は、目的化合物のＵＦから各既知ＤＦを逐次減算することにより、図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦを算出する。
【０１４６】
図９のＳ９０６の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０４の処理で作成されたＤＦ組合せ群に含まれる複数の既知ＤＦの全組合せについて、図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦを算出する。制御部２１は、図９のＳ９０４の処理で複数種類のＤＦ組合せ群が作成されている場合、各ＤＦ組合せ群について、化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦを算出する。図９のＳ９０６の処理を実行する制御部２１が、第３算出部として機能する。
【０１４７】
次いで、図９のＳ９０７の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路について、出発化合物から目的化合物までの合成経路として成立するか否かを判定する。制御部２１は、図９のＳ９０５の処理で複数の化合物の合成経路が作成されている場合、各合成経路について、出発化合物から目的化合物までの合成経路として成立するか否かを判定する。
【０１４８】
出発化合物から目的化合物までの合成経路として成立するか否かの判定の例を説明する。
〔判定例１〕図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦがマイナスの値を有する場合、制御部２１は、その中間化合物を含む化合物の合成経路については、出発化合物から目的化合物までの合成経路として成立しないと判定する。中間化合物のＵＦがマイナスの値を有する場合、その中間化合物は化合物として成立しないので、制御部２１は、その中間化合物を含む化合物の合成経路については、出発化合物から目的化合物までの合成経路として成立しないと判定する。
【０１４９】
〔判定例２〕制御部２１は、図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦの原子情報と結合情報とを比較する。そして、図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦの原子情報と結合情報との間で矛盾がある場合、制御部２１は、その中間化合物を含む化合物の合成経路については、出発化合物から目的化合物までの合成経路として成立しないと判定する。すなわち、中間化合物の化学構造式に含まれている部分構造の個数と、中間化合物の化学構造式に含まれている部分構造の結合状態の個数とが整合しない場合、制御部２１は、その中間化合物を含む化合物の合成経路については、出発化合物から目的化合物までの化合物の合成経路として成立しないと判定する。
【０１５０】
次に、図９のＳ９０８の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０５の処理で作成された化合物の合成経路のうち、図９のＳ９０７の処理で出発化合物から目的化合物までの合成経路として成立すると判定された化合物の合成経路を抽出する。
【０１５１】
そして、図９のＳ９０９の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路について、化合物の合成経路に含まれる化合物の合成で用いられる酵素を決定する。この場合、制御部２１は、差分データベース１７を参照して、化合物の合成経路に含まれる化合物の合成で用いられる酵素を決定する。差分データベース１７には、既知ＤＦと既知反応酵素とが関連付けて格納されている。したがって、制御部２１は、差分データベース１７に格納されている既知ＤＦと関連付けて格納されている既知反応酵素を、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる各既知ＤＦに対して割り当てることにより、化合物の合成経路に含まれる化合物の合成で用いられる酵素を決定する。制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる各既知ＤＦに対して、差分データベース１７に格納されている複数の既知反応酵素を割り当てるようにしてもよい。
【０１５２】
次いで、図９のＳ９１０の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路のそれぞれについて、化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦに基づいて、化合物の合成経路に含まれる中間化合物の名称を決定する。この場合、制御部２１は、ＵＦデータベース１５を参照して、化合物の合成経路に含まれる中間化合物の名称を決定する。制御部２１は、化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦと、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物のＵＦとが一致する場合、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物のＵＦと関連付けられている化合物の名称を、化合物の合成経路に含まれる中間化合物の名称として決定する。化合物のＵＦに対して複数の化合物の名称が関連付けられてＵＦデータベース１５に格納されている場合、制御部２１は、化合物の合成経路に含まれる中間化合物について、複数の名称を決定する。
【０１５３】
制御部２１は、化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦと、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物のＵＦとが一致しない場合、化合物の合成経路に含まれる中間化合物の名称を決定せずに、その中間化合物に所定の番号を割り当てる。化合物の合成経路に含まれる中間化合物の名称を決定せずに、所定の番号が割り当てられた中間化合物を、仮想化合物と表記する。
【０１５４】
例えば、化合物データベース１１に、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物の名称及び化合物の化学構造式のデータを関連付けて格納する場合がある。この場合、ＵＦデータベース１５には、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物のＵＦのみが格納される。ＵＦデータベース１５に、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物のＵＦのみが格納される場合、化合物の合成経路に含まれる中間化合物のＵＦと、ＵＦデータベース１５に格納されている化合物のＵＦとが一致しない可能性がある。
【０１５５】
また、図９のＳ９１０の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路のそれぞれについて、化合物の合成経路に含まれる各反応が、既知反応であるか仮想反応であるかを決定する。化合物の合成経路に含まれる各反応が、既知反応であるか仮想反応であるかは、以下の処理によって決定される。
【０１５６】
制御部２１は、差分データベース１７から、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる中間化合物の既知ＤＦと関連付けられている既知化合物ペアを抽出する。制御部２１は、抽出した既知化合物ペアの各化合物の名称と、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる化合物ペアの各化合物の名称とが一致する場合、一致する化合物ペアの反応を既知反応と決定する。制御部２１は、抽出した既知化合物ペアの各化合物の名称と、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる化合物ペアの各化合物の名称とが一致しない場合、一致しない化合物ペアの反応を仮想反応と決定する。また、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に仮想化合物が含まれている場合、仮想化合物から他の化合物を合成する反応、及び、仮想化合物を合成する反応を仮想反応と決定する。
【０１５７】
次に、図９のＳ９１１の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物までの合成経路について、熱力学的な実行可能性を判定する。
【０１５８】
熱力学的な実行可能性の判定は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる各反応における自由エネルギー変化を計算し、計算結果に基づいて各反応の向きを決定することにより行われる。図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる各反応が、正方向の反応及び可逆反応である場合、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路について熱力学的な実行可能性があると判定する。また、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる各反応に逆反応が存在する場合、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路について熱力学的な実行可能性がないと判定する。
【０１５９】
そして、図９のＳ９１２の処理において、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路のうち、熱力学的に実行可能性のある合成経路を抽出する。図９のＳ９１１及びＳ９１２の処理を実行する制御部２１が、熱力学判定部として機能する。
【０１６０】
図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に仮想化合物が含まれている場合、制御部２１は、仮想化合物の名称を決定した後に、図９のＳ９１１及びＳ９１２の処理を実行する。制御部２１は、外部ネットワーク上の機器が備えるデータベースを参照することにより仮想化合物の名称を決定してもよい。例えば、ＵＦデータベース１５に、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物のＵＦのみが格納される場合、制御部２１は、ＰｕｂＣｈｅｍ、ＢＲＥＮＤＡ、ＭｅｔａＣｙｃなどの代謝物データベースを参照することにより仮想化合物の名称を決定してもよい。また、制御部２１は、表示部２２を介して仮想化合物の名称をユーザに問い合わせ、操作部１０を介してユーザから仮想化合物の名称の入力を受け付けることにより、仮想化合物の名称を決定してもよい。
【０１６１】
熱力学的に実行可能性のある合成経路であるか否かは、化合物の化学構造を把握する必要がある。そのため、制御部２１は、図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に含まれる化合物の名称を決定し、化合物の名称から化合物の化学構造を把握して、熱力学的に実行可能性のある合成経路の判定を行っている。制御部２１は、化合物データベース１１を参照することにより、化合物の化学構造を把握してもよい。制御部２１は、外部ネットワーク上の機器が備えるデータベースを参照することにより、化合物の化学構造を把握してもよい。制御部２１は、表示部２２を介して化合物の化学構造をユーザに問い
合わせ、操作部１０を介してユーザから化合物の化学構造データの入力を受け付けることにより、化合物の化学構造を把握してもよい。
【０１６２】
次いで、図９のＳ９１３の処理において、制御部２１は、図９のＳ９１２の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物のモル理論収率（％）を算出する。この場合、制御部２１は、図９のＳ９１２の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物について、原料化合物からのモル理論収率（％）を算出してもよい。制御部２１は、図９のＳ９１２の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物について、原料化合物からのモル理論収率（％）を算出する場合、既知反応データベース１２を参照して、原料化合物から出発化合物までの合成経路を作成する。そして、制御部２１は、原料化合物から出発化合物までの合成経路及び図９のＳ９１２の処理で抽出された合成経路を用いて、図９のＳ９１１の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物について、原料化合物からのモル理論収率（％）を算出する。原料化合物の指定は、操作部１０を介してユーザから受け付けることにより行ってもよい。この場合、制御部２１は、既知反応データベース１２に格納されている大腸菌の代謝反応に関するデータを参照して、原料化合物から出発化合物までの合成経路を作成してもよい。モル理論収率の計算は、例えば、Biotechnology and Bioengineering, Volume 42, p.59-73 (1993)に記載の方法により実施することができる。
【０１６３】
次に、図９のＳ９１４の処理において、制御部２１は、図９のＳ９１３の処理で算出されたモル理論収率（％）が閾値以上であるか（又は閾値より大きいか）否かを判定する。閾値は、例えば、０％や１００％や２００％等の任意の値を設定することが可能である。
【０１６４】
そして、図９のＳ９１５の処理において、制御部２１は、図９のＳ９１２の処理で抽出された合成経路のうち、図９のＳ９１３の処理で算出されたモル理論収率（％）が閾値以上である（又は閾値より大きい）目的化合物を合成する化合物の合成経路を抽出する。図９のＳ９１３、Ｓ９１４及びＳ９１５の処理を実行する制御部２１が、モル理論収率判定部として機能する。図９のＳ９０８の処理で抽出された化合物の合成経路に仮想化合物が含まれている場合であっても、制御部２１は、図９のＳ９１３、Ｓ９１４及びＳ９１５の処理を実行することは可能である。未知の仮想化合物を基質または生産物とする変換反応が合成経路に含まれる場合でも、仮想化合物のＵＦには仮想化合物を構成する部分構造（原子）の数情報が含まれるため、変換反応に伴う変化（分子数の増減）を把握することできる。
【０１６５】
次いで、図９のＳ９１６の処理において、制御部２１は、図９のＳ９１５の処理で抽出された合成経路について、実用的な合成経路を抽出する。実用的な合成経路の抽出は、合成経路に含まれる各反応の炭素数の変化や炭素数の大小を評価すること、個別の仮想反応酵素の改変の難易度などを考慮して行ってもよい。
【０１６６】
なお、制御部２１は、図９のＳ９１１及びＳ９１２の処理を省略してもよいし、図９のＳ９１３からＳ９１５の処理を省略してもよいし、図９のＳ９１６の処理を省略してもよい。また、制御部２１は、図９のＳ９１１及びＳ９１２の処理と、図９のＳ９１３からＳ９１５の処理と、図９のＳ９１６の処理と、を実行する順番を変更してもよい。例えば、制御部２１は、図９のＳ９１３からＳ９１５の処理を実行した後に、図９のＳ９１１及びＳ９１２の処理を実行するようにしてもよい。
【０１６７】
次に、図９のＳ９１７の処理において、制御部２１は、図９のＳ９１６の処理で抽出された合成経路と、合成経路に含まれる出発化合物、中間化合物及び目的化合物の各名称及び各ＵＦと、合成経路における各反応で用いられる酵素と、を含む情報を出力する。この場合、制御部２１は、図９のＳ９１６の処理で抽出された合成経路における各反応につい
て、既知反応であるか又は仮想反応であるかを特定して、図９のＳ９１６の処理で抽出された合成経路の情報を出力する。制御部２１は、合成経路における各反応で用いられる酵素として、酵素ＥＣ番号を用いてもよい。図９のＳ９１６の処理で抽出された合成経路に仮想化合物が含まれている場合、制御部２１は、中間化合物の名称に代えて、中間化合物に割り当てられた所定の番号を、図９のＳ９１７の処理で出力される情報に追加する。
【０１６８】
例えば、制御部２１は、図１１に示す表１２１及び１２２によって、図９のＳ９１６の処理で抽出された合成経路と、合成経路に含まれる出発化合物、中間化合物及び目的化合物の各名称及び各ＵＦと、合成経路における各反応で用いられる酵素と、を出力してもよい。図１１は、２つの合成経路が出力された場合の例である。
【０１６９】
表１２１及び表１２２では、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが化合物の名称であり、VC00001
が仮想化合物に割り当てられた所定の番号である。表１２１において、出発化合物から中間化合物Ａを合成する反応、及び、中間化合物Ａから中間化合物Ｂを合成する反応が既知反応であることが特定されている。また、表１２１において、中間化合物Ｂから目的化合物を合成する反応が仮想反応であることが特定されている。表１２２において、出発化合物から中間化合物Ａを合成する反応が既知反応であることが特定されている。また、表１２２において、中間化合物Ａから中間化合物Ｃを合成する反応、及び、中間化合物Ｃから目的化合物を合成する反応が仮想反応であることが特定されている。
【０１７０】
表１２１及び１２２の既知反応酵素Ａ及びＢは、ＵＦ３によって特定される化合物とＵＦ４によって特定される化合物とのペアの反応に用いられる酵素である。表１２１及び１２１の既知反応酵素Ｃ及びＤは、ＵＦ５によって特定される化合物とＵＦ６によって特定される化合物とのペアの反応に用いられる酵素である。表１２１及び１２２の既知ＤＦ１は、ＵＦ３からＵＦ４を減算した値、及び、ＵＦ５からＵＦ６を減算した値の２つのパターンがある。すなわち、ＵＦ３からＵＦ４を減算した値と、ＵＦ５からＵＦ６を減算した値とは、同一の値である。したがって、表１２１及び１２２では、出発化合物から中間化合物Ａを合成する反応で用いられる酵素として、既知反応酵素Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤが割り当てられている。
【０１７１】
表１２１の既知反応酵素Ｅ及びＦは、ＵＦ７によって特定される化合物とＵＦ８によって特定される化合物とのペアにおける反応に用いられる酵素である。表１２１の既知ＤＦ２は、ＵＦ７からＵＦ８を減算した値である。したがって、表１２１では、中間化合物Ａから中間化合物Ｂを合成する反応で用いられる酵素として、既知反応酵素Ｅ及びＦが割り当てられている。
【０１７２】
表１２１の既知反応酵素Ｇ及びＨは、ＵＦ９によって特定される化合物とＵＦ１０によって特定される化合物とのペアの反応に用いられる酵素である。既知反応酵素Ｉ及びＪは、ＵＦ１１によって特定される化合物とＵＦ１２によって特定される化合物とのペアの反応に用いられる酵素である。表１２１の既知ＤＦ３は、ＵＦ９からＵＦ１０を減算した値、及び、ＵＦ１１からＵＦ１２を減算した値の２つのパターンがある。すなわち、ＵＦ９からＵＦ１０を減算した値と、ＵＦ１１からＵＦ１２を減算した値とは、同一の値である。したがって、表１２１では、中間化合物Ｂから目的化合物を合成する反応で用いられる酵素として、既知反応酵素Ｇ、Ｈ、Ｉ及びＪが割り当てられている。
【０１７３】
表１２２の既知反応酵素Ｋ及びＬは、ＵＦ１５によって特定される化合物とＵＦ１６によって特定される化合物とのペアにおける反応に用いられる酵素である。表１２２の既知ＤＦ４は、ＵＦ１５からＵＦ１６を減算した値である。したがって、表１２２では、中間化合物Ａから中間化合物Ｃを合成する反応で用いられる酵素として、既知反応酵素Ｋ及びＬが割り当てられている。
【０１７４】
表１２２の既知反応酵素Ｍ及びＮは、ＵＦ１７によって特定される化合物とＵＦ１８によって特定される化合物とのペアの反応に用いられる酵素である。既知反応酵素Ｏ及びＰは、ＵＦ１９によって特定される化合物とＵＦ２０によって特定される化合物とのペアの反応に用いられる酵素である。表１２２の既知ＤＦ５は、ＵＦ１７からＵＦ１８を減算した値、及び、ＵＦ１９からＵＦ２０を減算した値の２つのパターンがある。すなわち、ＵＦ１７からＵＦ１８を減算した値と、ＵＦ１９からＵＦ２０を減算した値とは、同一の値である。したがって、表１２２では、中間化合物Ｃから目的化合物を合成する反応で用いられる酵素として、既知反応酵素Ｍ、Ｎ、Ｏ及びＰが割り当てられている。
【０１７５】
制御部２１は、図９のＳ９１５の処理で抽出された合成経路について、図９のＳ９１３の処理で算出されたモル理論収率（％）が大きい順に順位付けを行ってもよい。更に、制御部２１は、図９のＳ９１７の処理で出力される情報に、図９のＳ９１３の処理で算出されたモル理論収率（％）が大きい順に順位付けを行った合成経路についての情報を追加してもよい。
【０１７６】
制御部２１は、図９のＳ９１７の処理で出力した情報を、データベース化して記憶部２０に記憶するようにしてもよい。また、制御部２１は、図９のＳ９１７の処理で出力した情報を、表示部２２に表示するようにしてもよい。
【０１７７】
制御部２１が、化合物の化学構造を所定の基準に従ってＵＦに変換するとともに、化合物ペアの一方の化合物についてのＵＦから他方の化合物についてのＵＦを減算することによりＤＦ（第１差分値）を算出する。制御部２１が、目的化合物についてのＵＦから出発化合物についてのＵＦを減算することにより出発化合物と目的化合物とのペアのＤＦ（第２差分値）を算出する。制御部２１が、出発化合物から目的化合物までの合成経路における第１差分値の合計値と、第２差分値とが一致するように化合物の合成経路を作成する。化合物の合成経路は、出発化合物及び目的化合物と、複数の第１差分値とから構成される。
【０１７８】
出発化合物及び目的化合物と、複数の第１差分値とから構成される化合物の合成経路を作成することにより、出発化合物から目的化合物までの新規の化合物の合成経路を作成することが可能となる。作成された出発化合物から目的化合物までの合成経路に含まれる化合物は、既知化合物であってもよいし、仮想化合物（未知化合物）であってもよい。したがって、仮想化合物を含む合成経路を作成することが可能となる。作成された出発化合物から目的化合物までの合成経路に含まれる化合物ペアにおける反応は、既知反応であってもよいし、仮想反応（未知反応）であってもよい。したがって、仮想反応を含む合成経路を作成することができる。
【０１７９】
作成された出発化合物から目的化合物までの合成経路に含まれる第１差分値に対して既知反応酵素が割り当てられている。出発化合物から目的化合物までの化合物の合成経路に含まれる仮想反応に既知反応酵素を用いることができる。
【０１８０】
以下、実施例について説明する。ただし、本発明の実施形態は、以下の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０１８１】
１．合成経路作成プログラムを利用したテレフタル酸（ＴＰＡ）合成経路の作成法
合成経路作成プログラム（上記参考例記載）を利用したＴＰＡ合成経路の作成の具体例を説明する。
ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物の名称及び化合物の化学構造式のデー
タと、ＫＥＧＧのデータベースに登録されている化合物に加えて目的化合物（非天然化合物を含む）の化合物の名称及び化合物の化学構造式のデータとを使用して、１３２１３個の化合物の名称及び化合物の化学構造式のデータを化合物データベース１１に格納した。ＫＥＧＧのデータベースの全化合物についてKEGG ATOM TYPEで表記されたKC F フォーマットデータをＫＥＧＧデータベースからダウンロードすることにより、化合物データベース１１に化合物の名称及び化合物の化学構造式のデータを格納した。ＫＥＧＧデータベースに登録されていない化合物は、ＫｅｇＤｒａｗツールを使用してKCFフォーマットに変換した。
上記条件において、出発化合物としてフェニルアラニンを指定し、目的化合物としてＴＰＡを指定して、化合物の合成経路の作成を開始した。制御部２１が、図６のＳ９０１の処理を行うことにより、化合物のＵＦが作成され、ＵＦデータベース１５に格納された。制御部２１が、図６のＳ９０２の処理を行うことにより、約１億７４００万個の既知ＤＦが算出され、差分データベース１６に格納された。
制御部２１が図６のＳ６０３及びＳ６０４の処理を行うことにより、約１３万４０００個の未知反応が仮想反応として決定され、制御部２１により図６のＳ６０５の処理が行われた。制御部２１が、図６のＳ６０６の処理を行うことにより、既知反応および仮想反応を含むグラフ（ネットワーク）が作成された。
制御部２１が図６のＳ６０７の処理を行うことにより、出発化合物を開始点、目的化合物を終点とする順方向探索法により、作成された合成経路の探索が行われた。
４以下の反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路を選択するという条件下で、制御部２１が図６のＳ６０８の処理を行うことにより、４以下の反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路が選択された。３以下の仮想反応ステップを含む出発化合物から目的化合物までの合成経路を抽出するという条件下で、制御部２１が図６のＳ６０９の処理を行うことにより、７８４７個の化合物の合成経路が、出発化合物から目的化合物までの合成経路として抽出された。
制御部２１が図６のＳ６１０及びＳ６１１の処理を行うことにより、７８４７個の化合物の合成経路のうち１９６個の化合物の合成経路が、熱力学的に実行可能性のある合成経路として抽出された。原料化合物としてグルコースが指定され、制御部２１が図６のＳ６１２の処理を行うことにより、原料化合物から出発化合物までの合成経路が作成された。この場合、制御部２１は、既知反応データベース１２に格納されている大腸菌の代謝反応に関するデータを参照する。そして、制御部２１が図６のＳ６１２の処理を行うことにより、図６のＳ６１１の処理で抽出された合成経路によって合成される目的化合物について、原料化合物からのモル理論収率（％）が算出された。原料化合物としてグルコースが指定され、原料化合物からのモル理論収率（％）が０％以上である目的化合物を合成する化合物の合成経路を抽出するという条件下で、制御部２１が図６のＳ６１３、Ｓ６１４および、Ｓ６１５の処理を行うことにより、２個の化合物の合成経路が実用的な合成経路として抽出された（図１２）。
【０１８２】
２．合成経路作成プログラムを利用したｐ−トルイル酸合成経路の作成法
目的化合物をｐ−トルイル酸と指定すること以外は上記実施例と同様の操作により、ｐ−トルイル酸の合成経路の探索を実施した。制御部２１が図６のＳ６０９の処理を行うことにより、４９４４個の化合物の合成経路が、出発化合物から目的化合物までの合成経路として抽出された。制御部２１が図６のＳ６１０及びＳ６１１の処理を行うことにより、４９４４個の化合物の合成経路のうち４９３個の化合物の合成経路が、熱力学的に実行可能性のある合成経路として抽出された。さらに、制御部２１が図６のＳ６１３、Ｓ６１４および、Ｓ６１５の処理を行うことにより、１個の化合物の合成経路が実用的な合成経路として抽出された（図１２）。
【０１８３】
３．テレフタル酸をバイオ法で合成する微生物を作成する具体例１（Ｒ７−Ｒ３−Ｒ４）
テレフタル酸を生産する能力を有する大腸菌株は一般的な分子生物学的手法（Ausubel e
t al, Current Protocol in Molecular Biology (2003); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (2001) など）を用いることにより、次の手順で作成することができる。
Anabaena variabilis由来ＰＡＬ遺伝子(GenBank受入番号FW572332.1)とClostrida bacterium由来ＡｂｃＤＡオペロン(GenBank受入番号: GU357991.1 GU357992.1 )を連結した上で、この連結遺伝子を大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）のｌａｃプロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＰＡＬ−ＡｂｃＤＡを構築する。さらに、このプラスミドＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することによりＰＡＬとＡｂｃＤＡを保持する組み換え大腸菌株を作製し、この大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＰＡＬ−ＡｂｃＤＡと命名する。Ｒ３のベータ酸化反応は大腸菌が保有する一連の酵素群（fadBA）により実施される。
ＪＭ１０９／ｐＰＡＬ−ＡｂｃＤＡは当業者に周知の方法（日本生物工学会編,生物工学実験書(2002); Vogel H. et al, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd Ed.(2007) など）により培養することができる。例えば、２０g/Lのグルコース、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した最小合成培地１００ｍｌに大腸菌ＪＭ１０９／ｐＰＡＬ−ＡｂｃＤＡを播種し、フラスコを用いることで、３７℃で２４時間以上培養することができる。ジャーファーメンターを使用して培養を実施する際は、基質の供給速度、攪拌回転数、通気量、ｐＨなどを適正な範囲で制御することができる。必要に応じて、嫌気条件、微好気条件、好気条件を選択することができる。また、回分培養、半回分培養、連続培養などの形態を自由に選択することができる。
培養液中のＴＰＡの濃度は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）などにより測定することができる。
また、ＰＡＬおよびＡｂｃＤＡ遺伝子が発現していることの確認は、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、免疫ブロット法などの当業者に周知の方法により調べることができる。
一般的な分子生物学的手法（Ausubel et al, Current Protocol in Molecular Biology
(2003); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (2001) など）により、大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＰＡＬ−ＡｂｃＤＡは改良することができ、ＴＰＡの生産性を改善することができる。例えば、ＴＰＡ生産経路の律速反応となっている酵素に関して、遺伝子コピー数を増やすこと、コドン最適化、または酵素活性部位近辺のアミノ酸置換により酵素活性を増加させ、ＴＰＡの生産性を改善することができる。また、副生成物を生産する反応を触媒する酵素の遺伝子を破壊することなどでＴＰＡの生産性を改善することもできる。また、ＮＴＧや紫外線による変異処理を行いＴＰＡ生産性が向上した菌体を選抜することを繰り返し行う方法を利用することもできる。
【０１８４】
４．テレフタル酸をバイオ法で合成する微生物を作成する具体例２（Ｒ５−Ｒ６−Ｒ４）
テレフタル酸（以下ＴＰＡ）を生産する能力を有する大腸菌株は一般的な分子生物学的手法（Ausubel et al, Current Protocol in Molecular Biology (2003); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (2001) など）を用いることにより、次の手順で作成することができる。
Amycolatopsis orientalis由来ＨＭＳ遺伝子(GenBank受入番号AJ223998.1)、Pseudomonas putida由来ｍｄｌＢＣＤ遺伝子(GenBank受入番号: AY143338.1)、Clostrida bacterium由来ＡｂｃＤＡ遺伝子(GenBank受入番号: GU357991.1 GU357992.1  )を連結した上で、この連結遺伝子を大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ社製）のｌａｃプロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＨＭＳ−ｍｄｌＢＣＤ−ＡｂｃＤＡを構築する。3種類のＤＮＡ配列を1つのベクターに組み込むことが困難な場合には、ｐＵＣ系のプラスミドと和合性をもつプラスミド、例えばｐＭＶ１１９にうち１つのＤＮＡ断片を導入してもよい。例えば、ＡｂｃＤＡ遺伝子のみｐＭＶ１１９に導入してｐＭＶ−ＡｂｃＤＡを構築、残りのＨＭＳ遺伝子、ｍｄｌＢＣＤ遺伝子をｐＵＣ19に導入したｐＨＭＳ−ｍｄｌＢＣＤをそれぞれ構築することも可能である。さらに、作製したプラスミドＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することによりＨＭＳ、ｍｄｌＢＣＤ、ＡｂｃＤＡを保持する組換え大腸菌株を作製し、この大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＨＭＳ−ｍｄｌＢＣＤ−ＡｂｃＤＡと命名する。
ＪＭ１０９／ｐＨＭＳ−ｍｄｌＢＣＤ−ＡｂｃＤＡは当業者に周知の方法（日本生物工学会編,生物工学実験書(2002); Vogel H. et al, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd Ed.(2007) など）により培養することができる。例えば、２０g/Lのグルコース、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、必要あれば５０μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した最小合成培地１００ｍｌに大腸菌ＪＭ１０９／ｐＨＭＳ−ｍｄｌＢＣＤ−ＡｂｃＤＡを播種し、フラスコを用いることで、３７℃で２４時間以上培養することができる。ジャーファーメンターを使用して培養を実施する際は、基質の供給速度、攪拌回転数、通気量、ｐＨなどを適正な範囲で制御することができる。必要に応じて、嫌気条件、微好気条件、好気条件を選択することができる。また、回分培養、半回分培養、連続培養などの形態を自由に選択することができる。
培養液中のＴＰＡの濃度は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）などにより測定することができる。
また、ＨＭＳ、ｍｄｌＢＣＤおよびＡｂｃＤＡ遺伝子が発現していることの確認は、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、免疫ブロット法などの当業者に周知の方法により調べることができる。
一般的な分子生物学的手法（Ausubel et al, Current Protocol in Molecular Biology
(2003); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (2001) など）により、大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＨＭＳ−ｍｄｌＢＣＤ−ＡｂｃＤＡは改良することができ、ＴＰＡの生産性を改善することができる。例えば、ＴＰＡ生産経路の律速反応となっている酵素に関して、遺伝子コピー数を増やすこと、コドン最適化、または酵素活性部位近辺のアミノ酸置換により酵素活性を増加させ、ＴＰＡの生産性を改善することできる。また、副生成物を生産する反応を触媒する酵素の遺伝子を破壊することなどでＴＰＡの生産性を改善することもできる。また、ＮＴＧや紫外線による変異処理を行いＴＰＡ生産性が向上した菌体を選抜することを繰り返し行う方法を利用することもできる。
【０１８５】
５．微生物で合成したｐ-トルイル酸を化学変換することによりＴＰＡを合成する具体例（Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１−Ｒ２−化学変換）
ｐ-トルイル酸を生産する能力を有する大腸菌株は一般的な分子生物学的手法（Ausubel
et al, Current Protocol in Molecular Biology (2003); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (2001) など）を用いることにより、次の手順で作成することができる。
Pseudomonas sp.由来Ｐｒｏｐａｏ遺伝子(GenBank受入番号: AB167410.1) , Rhodococcus erythropolis.由来のアミダーゼをコードするDNA配列(GenBank受入番号: EU022986.1)の連結遺伝子を大腸菌プラスミドベクターｐＨＳＧ２９９（タカラバイオ社製）のｌａｃプロモーター下流側に組み込んだプラスミドｐＯｘｙ−Ａｍｉを構築する。一方、Clostridium difficle由来ＨｐｄＡＢＣオペロン（GenBank受入番号NC013316.1）及びClostrida bacterium由来ＡｂｃＤＡ遺伝子(GenBank受入番号: GU357991.1 GU357992.1)の連結遺伝子を大腸菌プラスミドベクターｐＭＷ119(ニッポンジーン社製)に組み込んだプラスミドｐＨｓｄＡＢＣ−ＡｂｃＤＡを構築する。導入する遺伝子とプラスミドの組み合わせはこれ以外にも実施が可能であり最適な条件を見出すことが肝要である。さらにこれらのプラスミドＤＮＡで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換することにより大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＯｘｙ−Ａｍｉ−ＨｓｄＡＢＣ−ＡｂｃＤＡを作製する。
ＪＭ１０９／ｐＯｘｙ−Ａｍｉ−ＨｓｄＡＢＣ−ＡｂｃＤＡは当業者に周知の方法（日
本生物工学会編,生物工学実験書(2002); Vogel H. et al, Fermentation and Biochemical Engineering Handbook, 2nd Ed.(2007) など）により培養することができる。例えば、２０g/Lのグルコース、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した最小合成培地１００ｍｌに大腸菌ＪＭ１０９／ｐＯｘｙ−Ａｍｉ−ＨｓｄＡＢＣ−ＡｂｃＤＡを播種し、フラスコを用いることで、３７℃で２４時間以上培養することができる。ジャーファーメンターを使用して培養を実施する際は、基質の供給速度、攪拌回転数、通気量、ｐＨなどを適正な範囲で制御することができる。必要に応じて、嫌気条件、微好気条件、好気条件を選択することができる。また、回分培養、半回分培養、連続培養などの形態を自由に選択することができる。
培養液中のｐ-トルイル酸の濃度は、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）などにより測定することができる。
また、各遺伝子が発現していることの確認は、ノーザンブロット法、リアルタイムＰＣＲ法、免疫ブロット法などの当業者に周知の方法により調べることができる。
一般的な分子生物学的手法（Ausubel et al, Current Protocol in Molecular Biology
(2003); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition (2001) など）により、大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＯｘｙ−Ａｍｉ−ＨｓｄＡＢＣ−ＡｂｃＤＡは改良することができ、ｐ-トルイル酸の生産性を改善することができる。例えば、ｐ-トルイル酸生産経路の律速反応となっている酵素に関して、遺伝子コピー数を増やすこと、コドン最適化、または酵素活性部位近辺のアミノ酸置換により酵素活性を増加させ、ｐ-トルイル酸の生産性を改善することできる。また、副生成物を生産する反応を触媒する酵素の遺伝子を破壊することなどでｐ-トルイル酸の生産性を改善することもできる。また、ＮＴＧや紫外線による変異処理を行いｐ-トルイル酸の生産性が向上した菌体を選抜することを繰り返し行う方法を利用することもできる。
ｐ-トルイル酸からＴＰＡへの変換は、例えば、米国特許第３，０８９，９０６号（１９６３）などに記載の方法が知られている。メタノール等を反応系に共存させることで得たｐ-トルイル酸エステルを合成し、これを酸化反応でジメチルテレフタル酸に変換させさらに高純度に精製した上でテレフタル酸を取得することができる。
【符号の説明】
【０１８６】
１    合成経路作成装置
２    ＣＰＵ（Central Processing Unit）
３    メモリ
４    ハードディスク駆動装置
５    可搬媒体駆動装置
６    入力装置
７    表示装置
８    外部インターフェース
１０  操作部
１１  化合物データベース
１２  既知反応データベース
１３  部分構造データベース
１４  共通構造データベース
１５  ＵＦデータベース
１６、１７  差分データベース
１８  仮想反応データベース
２０  記憶部
２１  制御部
２２  表示部
【図１】
2013128460.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013128460.tif 000017
【図９】
2013128460.tif 000018
【図１０】
2013128460.tif 000019
【図１１】
2013128460.tif 000020
【図１２】
2013128460.tif 000021
【配列表】
2013128460000001.app