(57)【要約】【課題】イネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができる、高温登熟性に優れた高温登熟性イネの提供。【解決手段】本発明の高温登熟性イネは、イネ種子をカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程と、前記カルス培養細胞を懸濁培養することによりイネゲノムの変異が生じた懸濁培養細胞を得る工程と、前記懸濁培養細胞を再分化することにより再分化個体を得る工程と、前記再分化個体から高温登熟性イネを選別する工程と、を含む育種方法により育種される。【選択図】図３Ａ
2013102698.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネ種子をカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程と、
前記カルス培養細胞を懸濁培養することによりイネゲノムの変異が生じた懸濁培養細胞を得る工程と、
前記懸濁培養細胞を再分化することにより再分化個体を得る工程と、
前記再分化個体から高温登熟性イネを選別する工程と、
を含む育種方法により育種されたことを特徴とする高温登熟性イネ。
【請求項２】
イネゲノムが、レトロトランスポゾンの活性化により変異して、高温登熟性及び高ＣＯ２登熟性を獲得する請求項１に記載の高温登熟性イネ。
【請求項３】
登熟期平均気温２８℃以上３５℃以下で生育させた時に得られる米の正常粒率が、４０％以上である請求項１から２のいずれかに記載の高温登熟性イネ。
【請求項４】
登熟期平均ＣＯ２濃度５５０ｐｐｍ以上６５０ｐｐｍ以下で生育させた時に得られる米の正常粒率が、４０％以上である請求項１から２のいずれかに記載の高温登熟性イネ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温登熟性イネに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化に伴うイネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇は、デンプン集積不良による米生産性の低下、品質の低下等の問題を引き起こしている。特に、新潟県などの良食味米・高品質米の生産地では、登熟期の気温上昇等によるイネの品質低下が、米生産農家の収入に直接影響するだけでなく、産地のブランドイメージを壊すことにもなりかねず、極めて深刻な問題となっており、高温登熟性に優れたイネが求められている。
【０００３】
このような問題を解決するために、例えば、イネ細胞を培養して突然変異を生じさせ、イネの品質を改良する方法が提案されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。しかしながら、これらの提案では、早生化、短桿化、短穂化、穂数型化、小粒化、味度低下等のイネが得られたにすぎず、高温登熟性に優れたイネを提供するには至っていない。
【０００４】
したがって、イネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができる、高温登熟性に優れた高温登熟性イネの開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｈｉｇｅｍｕｎｅ  Ａ．，Ｔａｍｕｒａ  Ｙ．，Ａｏｋｉ  Ｈ．,Ｌｉａｎｇ  Ｚ．−Ｗ．，Ｍｉｙａｏ  Ａ．，Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｙａｔｏｕ  Ｏ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｇｒａｉｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｏｓ１７  ｍｕｔａｎｔ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｒｉｃｅ．Ｈｏｋｕｒｉｋｕ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．３８：５０−５２（２００３）．
【非特許文献２】Ｔａｔｅｙａｍａ  Ｍ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｗ．，Ｍｉｋａｍｉ  Ｔ．，Ｎａｋａｈｏｒｉ  Ｔ．，ａｎｄ  Ｔｓｕｇａｗａ  Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒｉｃｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｏｈｏｋｕ  Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．５１：７−８（１９９８）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、イネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができる、高温登熟性に優れた高温登熟性イネを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、イネ種子をカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程と、前記カルス培養細胞を懸濁培養することによりイネゲノムの変異が生じた懸濁培養細胞を得る工程と、前記懸濁培養細胞を再分化することにより再分化個体を得る工程と、前記再分化個体から高温登熟性イネを選別する工程と、を含む育種方法により、イネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができる、高温登熟性に優れた高温登熟性イネを提供することができることを知見した。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  イネ種子をカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程と、前記カルス培養細胞を懸濁培養することによりイネゲノムの変異が生じた懸濁培養細胞を得る工程と、前記懸濁培養細胞を再分化することにより再分化個体を得る工程と、前記再分化個体から高温登熟性イネを選別する工程と、を含む育種方法により育種されたことを特徴とする高温登熟性イネである。
＜２＞  イネゲノムが、レトロトランスポゾンの活性化により変異して、高温登熟性及び高ＣＯ２登熟性を獲得する前記＜１＞に記載の高温登熟性イネである。
＜３＞  登熟期平均気温２８℃以上３５℃以下で生育させた時に得られる米の正常粒率が、４０％以上である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の高温登熟性イネである。
＜４＞  登熟期平均ＣＯ２濃度５５０ｐｐｍ以上６５０ｐｐｍ以下で生育させた時に得られる米の正常粒率が、４０％以上である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の高温登熟性イネである。
＜５＞  高温登熟性イネの品種が、コシヒカリである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の高温登熟性イネである。
＜６＞  イネ種子をカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程と、前記カルス培養細胞を懸濁培養することによりイネゲノムの変異が生じた懸濁培養細胞を得る工程と、前記懸濁培養細胞を再分化することにより再分化個体を得る工程と、前記再分化個体から高温登熟性イネを選別する工程と、を含むことを特徴とする高温登熟性イネの育種方法である。
＜７＞  カルス培養細胞を得る工程が、イネ種子（玄米）をＤＫＮ培地上でカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程である前記＜６＞に記載の高温登熟性イネの育種方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、イネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができる、高温登熟性に優れた高温登熟性イネを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の高温登熟性イネの育種方法の工程の一例を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の高温登熟性イネの一例を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、粒数の低下が見られた系統のイネの一例を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、品質低下が見られた系統のイネの一例を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、青未熟粒が多発した系統のイネの一例を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、不稔が生じた系統のイネの一例を示す図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、野生型のイネの一例を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の高温登熟性イネの評価結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の高温登熟性イネの評価結果を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の高温登熟性イネの評価結果を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明の高温登熟性イネの評価結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、野生型のイネの玄米品質の一例を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、野生型のイネの玄米品質の一例を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明の高温登熟性イネの玄米品質の一例を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本発明の高温登熟性イネの玄米品質の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（高温登熟性イネ）
本発明の高温登熟性イネは、高温耐性イネと称することもでき、イネ種子をカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程（カルス培養工程）と、前記カルス培養細胞を懸濁培養することによりイネゲノムの変異が生じた懸濁培養細胞を得る工程（懸濁培養工程）と、前記懸濁培養細胞を再分化することにより再分化個体を得る工程（再分化工程）と、前記再分化個体から高温登熟性イネを選別する工程（高温登熟性イネ選別工程）と、を含む育種方法により育種される。
【００１２】
＜カルス培養工程＞
前記カルス培養工程は、イネ種子をカルス培養することによりカルス培養細胞を得る工程である。
【００１３】
前記カルス培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イネ種子（玄米）を培地上でカルス培養する方法などが挙げられ、具体的には、殺菌したイネ種子（玄米）をカルス誘導培地（固体培地）に置床して暗所で培養してカルス誘導を行った後、カルス誘導した種子から芽と根を除去し、芽と根を除去したカルスをカルス選抜培地（固体培地）にて明所で培養する方法などが挙げられ、“Ｄａｉｇｅｎ  Ｍ．，Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｏ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｓａｗａ  Ｙ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｈｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｋｏｓｈｉｈｉｋａｒｉ．Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．５０：１９７−２０２（２０００）．”及び“Ｏｇａｗａ  Ｔ．，Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ．，Ｙａｎｏ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｈｋａｗａ  Ｙ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｉｔｒｉｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｌｌｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１８：５７６−５８１（１９９９）．”等の文献を参照して培養することができる。
【００１４】
前記カルス培養する際の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、２５℃〜３０℃が好ましい。
【００１５】
前記カルス培養する際の光量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、カルス誘導する際の光量として、１５，０００ルクス〜３０，０００ルクスが好ましく、カルス選抜する際の光量として、１５，０００ルクス〜３０，０００ルクスが好ましい。
【００１６】
前記カルス培養する際の培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＫＳＰ培地、ＤＫＮ培地などが挙げられるが、高温登熟性イネの育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、ＤＫＮ培地が好ましい。
【００１７】
前記カルス培養する際の培地のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な点で、ｐＨ５〜ｐＨ６が好ましい。
【００１８】
前記カルス培養する際の培地に添加するイネ種子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＪＡ等の市販品を用いてもよく、（独）農業生物資源研究所ゲノムリソースセンター等から入手してもよい。
【００１９】
前記カルス培養する際の培地に対するイネ種子の添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、固体培地プレート１枚（直径９０ｍｍ×２０ｍｍ）あたり、１５個〜２０個が好ましい。
【００２０】
前記カルス培養する際の培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適なカルス培養細胞を得ることができる点で、カルス誘導する際の培養期間としては、５日間〜１０日間が好ましく、カルス選抜する際の培養期間としては、１０日間〜６５日間が好ましい。
【００２１】
前記カルス培養に用いられる培養装置としては、培養温度及び光量を調節することができる装置であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グロースチャンバー（ＭＬＲ−３５０Ｔ、ＳＡＮＹＯ社製）などが挙げられ、培養容器としては、固体培地を形成することができる培養容器であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シャーレ、三角フラスコなどが挙げられる。
【００２２】
＜懸濁培養工程＞
前記懸濁培養工程は、前記カルス培養細胞を懸濁培養することによりイネゲノムの変異が生じた懸濁培養細胞を得る工程である。
【００２３】
前記懸濁培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記カルス培養で用いたカルス選抜培地（液体培地）を用いて前記カルス培養細胞を撹拌又は振盪しながら培養する方法などが挙げられ、“Ｄａｉｇｅｎ  Ｍ．，Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｏ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｓａｗａ  Ｙ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｈｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｋｏｓｈｉｈｉｋａｒｉ．Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．５０：１９７−２０２（２０００）．”及び“Ｏｇａｗａ  Ｔ．，Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ．，Ｙａｎｏ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｈｋａｗａ  Ｙ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｉｔｒｉｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｌｌｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１８：５７６−５８１（１９９９）．”等の文献を参照して培養することができる。
【００２４】
前記懸濁培養する際の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な培養変異を生じさせることができる点で、２５℃〜３０℃が好ましい。
【００２５】
前記懸濁培養する際の光量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な懸濁培養細胞を得ることができる点で、１５，０００ルクス〜３０，０００ルクスが好ましい。
【００２６】
前記懸濁培養する際の振盪条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な培養変異を生じさせることができる点で、６０ｒｐｍ〜８０ｒｐｍが好ましい。
【００２７】
前記懸濁培養する際の培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＫＳＰ培地、ＤＫＮ培地などが挙げられるが、高温登熟性イネの育種に好適な培養変異を生じさせることができる点で、ＤＫＮ培地が好ましい。
【００２８】
前記懸濁培養する際の培地のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な培養変異を生じさせることができる点で、ｐＨ５〜ｐＨ６が好ましい。
【００２９】
前記懸濁培養する際の培地に対する前記カルス培養細胞の播種量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な培養変異を生じさせることができる点で、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましい。
【００３０】
前記懸濁培養する際の培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な培養変異を生じさせることができる点で、５０日間〜１３０日間が好ましい。
【００３１】
前記懸濁培養に用いられる培養装置としては、培養温度及び光量を調節することができる装置であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グロースチャンバー（ＭＬＲ−３５０Ｔ、ＳＡＮＹＯ社製）などが挙げられ、培養容器としては、液体培地を振盪することができる培養容器であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、三角フラスコなどが挙げられる。
【００３２】
前記懸濁培養することにより変異するイネゲノムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な変異を生じさせることができる点で、イネゲノムのレトロトランスポゾン（逆転写酵素を使って転位するタイプのトランスポゾン（可動遺伝因子））が好ましく、これらの中でも、Ｔｏｓ１７、Ｋａｒｍａ、Ｌｕｌｌａｂｙがより好ましい。なお、前記変異が生じたことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する高温登熟性イネのゲノム及び比較のために野生型のイネのゲノムの各ゲノムを抽出して、ゲノミックＰＣＲにより各ゲノムを増幅させたものを、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、増幅断片長多型）解析することにより野生型のイネゲノムの変異が生じていることを確認する方法などが挙げられる。
【００３３】
前記懸濁培養することによりカルス培養細胞のイネゲノムに内在するレトロトランスポゾンが活性化される。前記レトロトランスポゾンが活性化されることにより、前記レトロトランスポゾンが変異する。本発明の高温登熟性イネは、このレトロトランスポゾンが変異したことにより得られることが示唆されている。
【００３４】
＜再分化工程＞
前記再分化工程は、前記懸濁培養細胞を再分化することにより再分化個体を得る工程である。
【００３５】
前記再分化する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記懸濁培養細胞を前記再分化個体形成培地（固体培地）に置床して明所で培養する方法などが挙げられ、“Ｄａｉｇｅｎ  Ｍ．，Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｏ．，ａｎｄ  Ｎａｇａｓａｗａ  Ｙ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｈｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐｏｎｉｃａ  ｒｉｃｅ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｋｏｓｈｉｈｉｋａｒｉ．Ｂｒｅｅｄ．Ｓｃｉ．５０：１９７−２０２（２０００）．”及び“Ｏｇａｗａ  Ｔ．，Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｈ．，Ｙａｎｏ  Ｈ．，ａｎｄ  Ｏｈｋａｗａ  Ｙ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｉｔｒｉｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｌｌｕｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１８：５７６−５８１（１９９９）．”等の文献を参照して培養することができる。
【００３６】
前記再分化する際の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、２５℃〜３０℃が好ましい。
【００３７】
前記再分化する際の光量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、１５，０００ルクス〜３０，０００ルクスが好ましい。
【００３８】
前記再分化する際の培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、ＫＳＰ培地、ＤＫＮ培地等にカイネチン、アブシシン酸、カザミノ酸、ソルビトール等を添加した培地、ＫＳＰ培地、ＤＫＮ培地などに、インドール酢酸、カザミノ酸、６−ベンジルアミノプリン等を添加した培地などが挙げられるが、高温登熟性イネの育種に好適な培養変異を生じさせることができる点で、ＤＫＮ培地を利用した培地が好ましい。
【００３９】
前記再分化する際の培地のｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、ｐＨ５〜ｐＨ６が好ましい。
【００４０】
前記再分化する際の前記懸濁培養細胞の播種量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が好ましい。
【００４１】
前記再分化する際の培養期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、高温登熟性イネの育種に好適な再分化個体を得ることができる点で、３０日間〜５０日間が好ましい。
【００４２】
前記再分化する際に用いられる培養装置としては、培養温度及び光量を調節することができる装置であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グロースチャンバー（ＭＬＲ−３５０Ｔ、ＳＡＮＹＯ社製）などが挙げられ、培養容器としては、固体培地を形成することができる培養容器であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シャーレ、三角フラスコなどが挙げられる。
【００４３】
＜高温登熟性イネ選別工程＞
前記高温登熟性イネ選別工程は、前記再分化個体から高温登熟性イネを選別する工程である。
【００４４】
前記高温登熟性イネを選別する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、登熟期平均気温を一定温度以上にしてイネを栽培し、得られた米の正常粒率を測定することにより選別する方法、登熟期平均ＣＯ２濃度を一定濃度以上にしてイネを栽培し、得られた米の正常粒率を測定することにより選別する方法などが挙げられる。
【００４５】
前記高温登熟性イネを選別する際の登熟期平均気温としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目的とする高温登熟性イネの選別に好適な点で、２８℃以上３５℃以下が好ましい。
【００４６】
前記高温登熟性イネを選別する際の登熟期平均ＣＯ２濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目的とする高温登熟性イネの選別に好適な点で、５５０ｐｐｍ以上６５０ｐｐｍ以下が好ましい。
【００４７】
前記正常粒率は、玄米全体に占める正常粒の百分率をいう。前記正常粒（整粒）は、豊満で左右乃至上下均整の取れた形状であり、側面の縦溝が浅く、全体が透明で、表面が光沢を有する。前記整粒判定は、目視あるいは市販の穀粒判別器（例えば、ＲＧＱＩ  １０Ｂ、(株)サタケ製）により行うことができる。
【００４８】
前記正常粒率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目的とする高温登熟性イネの選別に好適な点で、４０％以上が好ましく、６０％以上がより好ましい。
【００４９】
前記高温登熟性イネを選別する際の培養土としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、通常イネに用いられる培養土などが挙げられる。
【００５０】
＜高温登熟性イネの性質＞
本発明の高温登熟性イネは、前記高温登熟性イネの育種方法により好適に育種される。
本発明の高温登熟性イネは、登熟期平均気温２８℃以上３５℃以下で生育させた時に得られる米の正常粒率が、４０％以上であることが好ましい。また、本発明の高温登熟性イネは、登熟期平均ＣＯ２濃度５５０ｐｐｍ以上６５０ｐｐｍ以下で生育させた時に得られる米の正常粒率が、４０％以上であることが好ましい。換言すれば、高温乃至高ＣＯ２濃度でも良好に生育可能な高温耐熱性及び高ＣＯ２濃度耐性に優れたイネである。前記高温登熟性イネは、通常知られているイネと同様、日本では、花期が７〜８月、結実期は９月〜１０月であり、花の大きさが６ｍｍ程度、丈が５０ｃｍ〜９０ｃｍ程度である。
【００５１】
前記高温登熟性イネの生育期は、通常知られているイネの生育期と同様、栄養生長期（発芽から穂の基となるもの（穂の原基）ができるまでの期間）、生殖生長期（穂の原基ができてから出穂乃至開花までの期間）、登熟期（出穂乃至開花から成熟までの期間）に分類される。高温登熟性能を有さないイネでは、前記登熟期にイネを高温にさらすと、籾（イネの果実）のデンプン合成能力等が低下することが報告されている。これは、デンプン合成系酵素の発現が高温によって低下し、デンプンの分解酵素（α−アミラーゼ）の活性が高温によって上昇するためである。一方、本発明の高温登熟性イネは、登熟期に高温にさらされても、デンプン合成能力が低下せず、前記デンプンの分解酵素の活性が抑制される性質を有する。
【００５２】
前記高温登熟性イネの品種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、コシヒカリ、ひとめぼれ、あきたこまち、きらら３９７、はえぬき、ほしのゆめ、つがるロマン、ななつぼし、などが好適に挙げられる。これらの中でも、本発明の高温登熟性イネの育種方法により好適に育種することができる点で、コシヒカリが特に好ましい。
【００５３】
前記高温登熟性イネは、高温登熟性に優れるため、登熟期の異常高温や高ＣＯ２濃度にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができるため、地球温暖化に伴うイネの高温登熟障害の被害対策として好適に活用することができる。
【実施例】
【００５４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５５】
（実験例１）
＜高温登熟性イネの製造＞
−カルス培養工程−
イネをカルス培養することによりカルス培養細胞を得た。
イネのカルス培養は、以下のようにして行った。
籾摺り器を用いて、新潟県農業総合研究所から入手したコシヒカリ完熟種子の籾殻を剥き、１本の５０ｍＬファルコンチューブに、イネ種子（玄米）２００粒を入れた。このチューブに、７０質量％エタノールを１０ｍＬ入れ、１分間表面を殺菌し、その後滅菌蒸留水で洗浄した。更に、このチューブに１質量％の次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、振盪器を用いて１０分間穏やかに振盪した後、溶液を捨て、これを３回繰り返した。そして、約３０ｍＬの滅菌蒸留水で１０分間振盪し、この洗浄を３回繰り返した。表１に記載のＤＫＮカルス誘導培地（固体培地：９０ｍｍ×２０ｍｍシャーレ使用）に、洗浄後の玄米を埋めた。このとき、胚は上向きにし、培地から胚が３ｍｍ程度はみ出るように埋めた。また、培地プレート（９０ｍｍ×２０ｍｍシャーレ使用）１枚あたり、２０個となるように埋めた。これを２９℃、明所（２０，０００ルクス）で１週間培養してコシヒカリのカルスを誘導させた。次に、クリーンベンチ内で、ピンセットを用い、上述のカルス誘導した種子から芽と根を除去した。このカルス誘導した玄米を、ピンセットを用いて表１に記載のＤＫＮカルス選抜培地へ移し替えた後、２９℃の明所（２０，０００ルクス）で２カ月、１カ月、２週間の各期間で培養して、カルス培養細胞を得た。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
−懸濁培養工程−
前記カルス培養細胞を懸濁培養することにより懸濁培養細胞を得た。
カルス培養細胞の懸濁培養は、以下のようにして行った。
２カ月、１カ月、２週間培養した各カルス培養細胞を、表１に記載のＤＫＮカルス選抜培地の液体培地（三角フラスコ使用）（３００ｍＬ）を用いて、撹拌又は振盪しながら培養した。また、前記カルス培養細胞の前記液体培地に対する播種量が、２．７×１０７ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２、培養の振盪条件が、６０ｒｐｍとなるように懸濁培養した。そして、２９℃、明所（２０，０００ルクス）で６０日間培養してコシヒカリの懸濁培養細胞を得た。
【００５８】
−再分化工程−
前記懸濁培養細胞を再分化させることにより再分化個体を得た。
懸濁培養細胞の再分化培養は、以下のようにして行った。
２カ月、１カ月、２週間培養した各カルス培養細胞から得られた各懸濁培養細胞を表２に記載の再分化Ｉ培地（固体培地：９０ｍｍ×２０ｍｍシャーレ使用）に置床した。その後、２９℃の明所（２０，０００ルクス）で培養した。次に、新しい再分化Ｉ培地への植継ぎを３回ほど繰返し、３ｃｍ程度に成長した個体を再分化ＩＩ培地へ移して、２９℃の明所（２０，０００ルクス）で培養し、再分化個体を得た。その後、実験温室にて再分化個体を培養土（商品名：合成培土３号、製造会社名：ＪＡ社製）へ植替え、生育させた。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
−高温登熟性イネ選別工程−
前記再分化個体を生育させたイネから高温登熟性イネを選別した。
高温登熟性イネの選別方法は、以下のようにして行った。
前記培養変異が確認された培養変異系統４７９系統）について、実験温室水田（登熟期平均気温２６．６℃）で生育させ、玄米形質を調査した（図２Ａ〜Ｆ参照）。これらの系統のうち、図２Ａのように、粒数及び品質の低下が生じず、青未熟粒が多発せず、不稔が生じなかったイネを、コシヒカリ原種よりも品質が良い系統として１９系統を得た。なお、図２Ｂは、粒数の低下が見られた系統のイネ、図２Ｃは、品質低下が見られた系統のイネ、図２Ｄは、青未熟粒が多発した系統のイネ、図２Ｅは、不稔が生じた系統のイネを示し、図２Ｆは、野生型のイネを示す。これらのコシヒカリ原種よりも品質が良かった１９系統の中から、更に品質の良い系統を、３系統（ＮＮＫ２８６系統、ＮＮＫ３０６系統、及びＮＮＫ５０６系統）選択し、下記試験を行った。
【００６１】
＜高温登熟性イネ試験＞
５月上旬及び７月上旬に、鹿児島県農業開発総合センターの圃場において、コシヒカリ培養変異系統（ＮＮＫ３０６系統）及び野生（ＷＴ）型の苗（ｎ＝５）を栽培した。これらの正常粒率を調査した結果を、図３Ａ及び図４Ａ〜図４Ｄに示す。なお、圃場の登熟期の平均気温は、それぞれ２８．２℃、２６．２℃であった。
新潟県総合農業研究所作物研究センターの温水掛流し圃場及び一般圃場において、コシヒカリ培養変異系統（ＮＮＫ２８６系統、ＮＮＫ３０６系統、ＮＮＫ５０６系統）及び野生（ＷＴ）型の苗（ｎ＝４）を栽培した。これらの正常粒率を調査した結果を図３Ｂに示す。なお、各圃場の登熟期平均気温は２８．３℃、２７．１℃であった。
福岡県農業総合試験場の温水掛流し圃場において、コシヒカリ培養変異系統（ＮＮＫ３０６系統）及び野生（ＷＴ）型の苗（ｎ＝５）を栽培した。これらの正常粒率を調査した結果を図３Ｃに示す。なお、圃場の登熟期平均気温は２８．８℃であった。
【００６２】
＜高ＣＯ２登熟性イネ試験＞
独立行政法人農業環境技術研究所のＦＡＣＥ（Ｆｒｅｅ  Ａｉｒ  ＣＯ２  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）実験圃場において、コシヒカリ培養変異系統（ＮＮＫ３０６系統）及び野生（ＷＴ）型の苗（ｎ＝１２）を栽培した。これらの正常粒率を調査した結果を図３Ｄに示す。なお、圃場の登熟期平均気温は２５．９℃であり、ＦＡＣＥ実験圃場の平均ＣＯ２濃度（６００ｐｐｍ）は、一般実験圃場の平均ＣＯ２濃度（３７９ｐｐｍ）の約１．６倍であった。
【００６３】
＜結果＞
本発明の高温登熟性イネの育種方法により育種された３系統（ＮＮＫ２８６系統、ＮＮＫ３０６系統、ＮＮＫ５０６系統）は、イネの登熟期に平均気温２８℃以上に曝して栽培しても、正常粒率が４０％以上となることがわかった（図３Ａ〜Ｃ参照）。また、図４Ａ〜Ｄより、本発明の高温登熟性イネは、玄米品質の低下も見られず、イネの高温登熟性が改善されたことがわかった。また、本発明の高温登熟性イネの育種方法により育種されたＮＮＫ３０６系統は、イネの登熟期の平均ＣＯ２濃度を一般実験圃場の平均ＣＯ２濃度の約１．５倍に曝して栽培しても、品質低下が軽減され、正常粒率が６０％以上となることがわかった（図３Ｄ参照）。
【００６４】
最も結果の良かったＮＮＫ３０６系統については、ゲノム解析を行った。
ゲノム解析は、生育させた苗を、ＣＴＡＢ処理、フェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール抽出、エタノール沈殿することにより、ＮＮＫ３０６系統のイネゲノム及び野生型のイネゲノムの各ゲノムＤＮＡを抽出して、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、増幅断片長多型）解析することにより行った。
まず、各種制限酵素（ＤｒａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＭｓｐＩ、タカラバイオ社製）により切断したゲノムＤＮＡ断片に２種のオリゴマー（Ａｄａｐｔｅｒ１、Ａｄａｐｔｅｒ２−Ｍｓｐ１、Ａｄａｐｒｅｒ２−Ｈｉｎｄ３、Ａｄａｐｔｅｒ２−ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ、北海道システムサイエンス社に作製を依頼）をアニールさせることで作製したアダプターを結合させ、アダプター特異的にアニールするプライマー（ＡＰ１、北海道システムサイエンス社に作製を依頼）と、トランスポゾン特異的にアニールするプライマー（ＬＴＲ１、北海道システムサイエンス社に作製を依頼）を用いて、ＰＣＲ（ＰＣＲ条件；変性：９４℃、３０秒間、アニーリング：６９℃、３０秒間、伸長反応：７２℃、４分間、上記反応サイクル数７回、その後変性：９４℃、３０秒間、アニーリング：６１℃、３０秒間、伸長反応：７２℃、４分間、上記反応サイクル数３２回、ＰＣＲ装置；ＴＡＫＡＲＡ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  ＴＰ６５０、タカラバイオ社製）によりＤＮＡ断片を増幅させた。
次に、得られたＰＣＲ産物を鋳型にして、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ（ＰＣＲ条件；変性：９４℃、３０秒間、アニーリング・伸長反応：７２℃、４分間、上記反応サイクル数５回、その後変性：９４℃、３０秒間、アニーリング：６９℃、３０秒間、伸長反応：７２℃、４分間、上記反応サイクル数３２回、プライマー（ＬＴＲ２、ＡＰ２、北海道システムサイエンス社に作製を依頼）、ＰＣＲ装置；ＴＡＫＡＲＡ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  ＴＰ６５０、タカラバイオ社製）を行い、増幅断片を得た。なお、用いたオリゴマー、プライマー等の塩基配列を表３に示す。
【００６５】
【表３】
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【００６６】
ＡＦＬＰ解析により、ＮＮＫ３０６系統については、レトロトランスポゾンのイネゲノム上の位置が、変異したことがわかった（図１参照）。なお、図１は、ＤｒａＩで切断したＤＮＡをテンプレートに、アダプター特異的なＡＰ２プライマーとＴｏｓ１７特異的なＬＴＲ２プライマーを用いたＰＣＲ（ｎａｓｔｅｄ−ＰＣＲ）の電気泳動写真を含み、この電気泳動写真におけるレーン４が、ＮＮＫ３０６系統に該当する。これらの結果から、ＮＮＫ３０６系統は、カルス培養細胞の懸濁培養により、イネゲノムのレトロトランスポゾンが活性化され、高温登熟性及び高ＣＯ２登熟性を獲得したことが示唆された。
【００６７】
以上より、本発明の高温登熟性イネは、イネ自身の遺伝子により高温登熟性を獲得し、イネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができ、高温登熟性、及び高ＣＯ２登熟性に優れることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、イネ登熟期の気温上昇及びＣＯ２濃度上昇にさらされても、米生産性の低下を抑制することができ、高品質な良食味米を供給することができる、高温登熟性に優れた高温登熟性イネを提供することができるため、地球温暖化に伴うイネの高温登熟障害、及び高ＣＯ２登熟障害の被害対策として好適に活用することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【配列表】
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