(57)【要約】      （修正有）【課題】至適pHを中性付近にシフトさせた変異型マルチ銅オキシダーゼ、および、それを用いた燃料電池の提供。。【解決手段】ABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))を基質とし、酸素分子を4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒し、ABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))を基質とし、酸素分子を4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒する活性を有する、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ由来の変異型マルチ銅オキシダーゼ、および、該変異型マルチ銅オキシダーゼをカソード電極に使用したバイオ燃料電池。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列における、４１５番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換及び/又は４１８番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のリシンへの置換を有するアミノ酸配列を含み、ABTS （2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate)）を基質とし、酸素分子を4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒する活性を有する、変異型マルチ銅オキシダーゼ。
【請求項２】
枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼに対して変異を導入したものであることを特徴とする請求項１記載の変異型マルチ銅オキシダーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２記載の変異型マルチ銅オキシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項１又は２記載の変異型マルチ銅オキシダーゼをカソード電極に使用したバイオ燃料電池。
【請求項５】
カソード電極とアノード電極とが電解質を介して対向した構造を有することを特徴とする請求項４記載のバイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチ銅オキシダーゼにおける特定の部位に置換型変異を有する変異型マルチ銅オキシダーゼ、当該変異型マルチ銅オキシダーゼをコードする遺伝子及び当該マルチ銅オキシダーゼを用いたバイオ燃料電池に関する。
【背景技術】
【０００２】
マルチ銅オキシダーゼ（bilirubin oxidase）は、分子内に酵素活性に必要な4原子の銅を含むタンパク質で、種々の基質から取り出した電子を用いて、酸素分子を4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒する酸化還元酵素である。マルチ銅オキシダーゼは、特許文献１乃至４に記載されるように、バイオ燃料電池におけるカソード電極や、各種バイオセンサーの電極材料として使用されている。また、特許文献１乃至３に示すように、マルチ銅オキシダーゼに対して１以上のアミノ酸置換変異を導入することで、固定化の際の活性低下を防止したり、熱安定性を向上させたり、反応過電圧が小さくするといった機能を改変する試みが提案されている。
【０００３】
一方、バイオ燃料電池とは、酵素燃料電池とも呼称され、酵素や微生物による化学反応により発生した電気エネルギーを利用するものである。バイオ燃料電池は、一般の電池と同様にカソード電極及びアノード電極が電解質を介して対向した構造を有し、燃料としてメタノールやエタノールのようなアルコール類又はグルコースのような糖類を用いる。
【０００４】
特許文献５には、マルチ銅オキシダーゼの一種であるラッカーゼについて、アミノ酸置換等の変異を導入することで至適pHを変化させることが開示されている。ただし、特許文献５に開示されたラッカーゼは、Rhizoctonia solani由来ラッカーゼ及びMyceliophthora thermophila由来ラッカーゼである。また、特許文献６には、ミロセシウム属由来のマルチ銅オキシダーゼに対して所定のアミノ酸置換変異を導入することで、酵素の耐熱性を向上させることが開示されている。
【０００５】
また、非特許文献１には、Bacillus halodurans由来のマルチ銅オキシダーゼが開示されている。当該マルチ銅オキシダーゼは、フェノールを基質とするときに至適pHが高いことが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2009-158480号公報
【特許文献２】特開2008-161178号公報
【特許文献３】特開2010-183857号公報
【特許文献４】特開2009-044997号公報
【特許文献５】EP 0850306
【特許文献６】特願2004-089042号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, (2004) Volume 65, p. 177-182
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、マルチ銅オキシダーゼとしては、至適pHが2〜3（中には至適pHが4〜5のものもある）であるものが一般的であった。化成品やバイオ燃料電池などでの利用を考えると至適pHはpH7付近であることが好ましく、公知のマルチ銅オキシダーゼの至適pHを中性側にシフトする技術が望まれていた。
【０００９】
上述した実情に鑑み、中性付近に至適pHを有する変異型マルチ銅オキシダーゼ、これをコードする遺伝子及びこれを用いたバイオ燃料電池を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、マルチ銅オキシダーゼの特定の部位におけるアミノ酸置換変異が、至適pHを中性側にシフトさせることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列における、４１５番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換及び/又は４１８番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のリシンへの置換を有するアミノ酸配列を含み、ABTS（2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate)）を基質とし、酸素分子を4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒する活性を有する。
【００１２】
また、本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼに対して変異を導入したものであることが好ましい。
【００１３】
一方、本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子は、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含むものである。すなわち、本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列における、４１５番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換及び/又は４１８番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のリシンへの置換を有するアミノ酸配列を含み、ABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))を基質とし、酸素分子を4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするものである。
【００１４】
さらに、本発明に係るバイオ燃料電池は、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼをカソード側電極に使用したものである。すなわち、本発明に係るバイオ燃料電池は、正極と負極とが電解質を介して対向した構造を有し、上記正極に触媒として本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼを備えるものである。ここで、変異型マルチ銅オキシダーゼは、公知の手法により電極状に固定化することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、新規な置換型変異を有するため、変異前と比較して至適pHが中性付近にシフトしているといった特徴を有している。本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼを用いたバイオ燃料電池は、中性付近において高活性を示すため、優れた電池特性を達成することができる
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明が適用できる従来公知のマルチ銅オキシダーゼについてアミノ酸配列を比較した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
<マルチ銅オキシダーゼ>
本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、マルチ銅オキシダーゼにおける特定のアミノ酸残基を置換したアミノ酸配列を有する。ここで、マルチ銅オキシダーゼとは、分子内に酵素活性に必要な4原子の銅を含むタンパク質で、種々の基質から取り出した電子を用いて、酸素分子を4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒する活性（以下、マルチ銅オキシダーゼ活性と称する）を有するものであれば特に限定されない。なお、マルチ銅オキシダーゼは、種々の物質を基質として上記マルチ銅オキシダーゼ活性を示す。基質としては、一例としてABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzoline-6-sulfonate))を挙げることができる。すなわち、マルチ銅オキシダーゼ活性とは、ABTSから電子を取り出し、酸素分子から4電子還元し、水分子を生成する反応を触媒する活性と言い換えることもできる。また、基質としては、ビリルビンを挙げることもできる。なお、マルチ銅オキシダーゼのなかでも、ビリルビンを基質とし、ビリルビンと酸素分子から、二分子のビリベルジンと水分子を生成する反応を触媒する活性を有するものをビリルビンオキシダーゼと称する。
【００１８】
その他、基質としては、フェロセン、フェリシアン化アルカリ金属（フェリシアン化カリウム、フェリシアン化リチウム、フェリシアン化ナトリウム等）又はこれらのアルキル置換体（メチル置換体、エチル置換体、プロピル置換体等）、フェナジンメトサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、β−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、フェナジンエトサルフェート、ビタミンＫ、ビオローゲン、Ｏｓ錯体（例えば、特表２００３−５１４８２３号公報、特表２００３−５１４９２４号公報に記載のもの等）等の酸化還元性の有機又は無機化合物等を用いることができる。また、基質としては、例えば、Os、Fe、Ru、Co、Cu、Ni、V、Mo、Cr、Mn、Pt、W等の金属元素又はこれら金属のイオンを中心金属とする金属錯体や；キノン、ベンゾキノン、アントラキノン、ナフトキノン等のキノン類；ビオローゲン、メチルビオローゲン、ベンジルビオローゲン等の複素環式化合物等が挙げられる。さらに、基質としては、特開2011-124090号公報及び特開2009-245930号公報においてカソード（正極）に固定される電子伝達メディエーターとして記載される各種化合物を使用することができる。
【００１９】
マルチ銅オキシダーゼとしては、植物由来の酵素であっても良いし、動物由来の酵素であっても良いし、微生物由来の酵素であっても良い。微生物由来のマルチ銅オキシダーゼとしては、例えば、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のマルチ銅オキシダーゼ、Myrothecium verrucaria由来のマルチ銅オキシダーゼを挙げることができる。
【００２０】
枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼ遺伝子塩基配列及び当該遺伝子によりコードされるマルチ銅オキシダーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。また、Myrothecium verrucaria由来のマルチ銅オキシダーゼ遺伝子によりコードされるマルチ銅オキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号３に示す。なお、このMyrothecium verrucaria由来のマルチ銅オキシダーゼについては、そのN末端側が欠損したタイプのものが配列データベースにAccession番号「3ABC_B」として開示されている。このAccession番号「3ABC_B」として開示されたタイプのMyrothecium verrucaria由来のマルチ銅オキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２１】
本発明において使用可能なマルチ銅オキシダーゼは、配列番号２、３及び４に示したアミノ酸配列からなるものに限定されず、例えば、配列番号２、３及び４に示すアミノ酸配列において詳細を後述する置換対象アミノ酸残基を除く、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、マルチ銅オキシダーゼ活性を示すものであってもよい。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から３０個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記マルチ銅オキシダーゼをコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA社製）を用いて変異が導入される。
【００２２】
また、本発明においては、配列番号２、３及び４に示すアミノ酸配列に対して、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、マルチ銅オキシダーゼ活性を有するタンパク質もギマルチ銅オキシダーゼとして使用することもできる。ここで、配列類似性の値は、blastアルゴリズムを実装したコンピュータプログラムを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２３】
さらに、本発明においては、配列番号１に示す塩基配列の一部又は全部に対して相補的なポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされたタンパク質であって、マルチ銅オキシダーゼ活性を有するタンパク質をマルチ銅オキシダーゼとして使用することができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下で結合を維持することを意味する。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００２４】
また、マルチ銅オキシダーゼとしては、上述した枯草菌由来のもの及びMyrothecium verrucaria由来のものに限定されず、いかなる生物種由来のものであっても本発明を適用することができる。例えば、遺伝子情報が格納されたデータベースを検索することで、種々の生物種由来のマルチ銅オキシダーゼについて、そのアミノ酸配列等を特定することができる。
【００２５】
なお、本発明においてマルチ銅オキシダーゼとしては、上述した活性を有する限り、如何なる名称で呼称されたものであってもよい。例えば、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、マルチカッパーオキシダーゼ、及びブルーカッパーオキシダーゼ等の呼称が知られている。
【００２６】
<置換変異>
本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、上述した各種生物由来のマルチ銅オキシダーゼにおける所定のアミノ酸残基を置換し、アミノ酸置換前と比較して至適pHが中性付近にシフトしたものである。ここで、置換対象のアミノ酸残基は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼを基準として、N末端から数えた数値として特定することができる。しかしながら、配列番号２に示すアミノ酸配列を基準として具体的数値で特定された置換対象のアミノ酸残基は、マルチ銅オキシダーゼの種類によっては異なる数値で表されることとなる。したがって、『配列番号２に示すアミノ酸配列におけるX番目のアミノ酸残基』と表記した場合、配列番号２に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するマルチ銅オキシダーゼについてはX番目とはならず、異なる数値として表現されることとなる。
【００２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列における所定のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む複数のアミノ酸配列についてマルチプルアラインメント解析を行うことで特定することができる。マルチプルアラインメント解析は、特に限定されないがCLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラム（国立遺伝学研究所のDDBJで使用できる（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html））を用いて当業者が容易に実施することができる。なお、ペアワイズアライメント解析法を用いて、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して他の異なるアミノ酸配列をアラインメントし、配列番号２に示すアミノ酸配列における所定のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を当該他の異なるアミノ酸配列において特定することもできる。
【００２８】
枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼ（配列番号２）及びMyrothecium verrucaria由来のマルチ銅オキシダーゼ（配列番号３及び４）についてマルチプルアラインメント解析した結果を図１に示す。図１に示すマルチプルアライメントにおいて、１行目及び２行目がMyrothecium verrucaria由来のマルチ銅オキシダーゼであり、３行目が枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼである。なお、これら具体的なマルチ銅オキシダーゼ以外の他のマルチ銅オキシダーゼについても、同様にマルチプルアラインメント解析に供することができ、枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼ（配列番号２）を基準として特定のアミノ酸残基の位置を特定することができる。
【００２９】
以下の説明において、置換対象アミノ酸は、配列番号２に示すアミノ酸配列、すなわち枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼを基準として表記する。しかし、上述したように、アミノ酸の位置を表す数値は、マルチ銅オキシダーゼの種類に応じて異なる数値となる点に留意する。本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、以下に説明するアミノ酸残基に置換変異を有する変異型マルチ銅オキシダーゼ、及び当該変異型マルチ銅オキシダーゼに対して更に異なる置換変異を有する変異型マルチ銅オキシダーゼが含まれる。
【００３０】
<変異型マルチ銅オキシダーゼ>
本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列における、４１５番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換及び/又は４１８番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基のリシンへの置換を有している。図１には、４１５番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基及び４１８番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基を枠で囲っている。図１に示すように、配列番号２に示すアミノ酸配列における４１８番目のトレオニンはMyrothecium verrucaria由来のマルチ銅オキシダーゼにおいても保存されている。
【００３１】
ここで、置換後のアミノ酸残基は、４１５番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基がヒスチジンであり、４１８番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基がリシンである。このような置換変異を有することにより変異型マルチ銅オキシダーゼの至適pHは中性付近にシフトすることとなる。なお、至適pHが中性付近にシフトするとは、pH5での酵素活性を100％としpH7での残存活性が、変異導入前のマルチ銅オキシダーゼと比較して10％程度上昇することを意味する。変異型マルチ銅オキシダーゼ及び置換変異前のマルチ銅オキシダーゼの酵素活性は、従来公知の手法を適宜使用することができる。例えば、基質として2,2’-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウム塩（ABTS）を含む所定のpHの緩衝液中で測定対象のマルチ銅オキシダーゼを作用させ、ABTSの反応物による吸光度変化を測定する。これにより、上述した残存活性を測定することができ、所定のアミノ酸置換変異が至適pHを中性付近にシフトさせる効果を有するかいなか判断することができる。
【００３２】
<変異型マルチ銅オキシダーゼの製造> 
上述した本発明に係る変異型マルチ銅オキシダーゼは、従来公知のタンパク質の製造方法を利用することによって取得することができる。変異型マルチ銅オキシダーゼが真核生物由来である場合には、例えば酵母を宿主としたタンパク質製造システムを利用して変異型マルチ銅オキシダーゼを取得することができる。また、変異型マルチ銅オキシダーゼが原核生物由来の場合、例えば、大腸菌を宿主としたタンパク質製造システムや、無細胞タンパク質製造システムを利用して変異型マルチ銅オキシダーゼを取得することができる。
【００３３】
より具体的には、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼをコードする遺伝子を準備する。例えば、T. クンケル（Kunkel）の部位特異的変異導入法（Kunkel, T. A. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488-492 (1985)）、Gapped duplex法等を適用して、野生型のマルチ銅オキシダーゼ遺伝子に対して所定の位置に突然変異を導入し、変異型マルチ銅オキシダーゼをコードする遺伝子を準備することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K(宝酒造社製)やMutan-G(宝酒造社製)）などを用いて、あるいは、宝酒造社製のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて、例えば野生型のマルチ銅オキシダーゼ遺伝子に対して変異を導入することで、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼをコードする遺伝子を準備することもできる。
【００３４】
特に、本発明において変異型マルチ銅オキシダーゼとしては、枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼに対して変異を導入したものを製造することが好ましい。枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼは他のマルチ銅オキシダーゼと比較して非常に高い耐熱性を示すためである。また、原核生物である枯草菌由来のマルチ銅オキシダーゼは、真核生物由来のマルチ銅オキシダーゼと異なり糖鎖修飾などが不要であり、大腸菌を利用したタンパク質生産システムや無細胞タンパク質製造システムを利用して簡易に製造することができるため好ましい。
【００３５】
酵母を宿主としたタンパク質製造システムを利用する場合、変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子は、一般的に利用されている発現ベクターの形で酵母に導入することができる。ベクターは典型的には、選択マーカー遺伝子、クローニング部位及び制御領域（プロモーター及びターミネーター）を有している。このベクターは、本技術分野においてよく知られており商業的に入手可能である。ベクターに含まれるプロモーターは、酵母において機能しうるならば、構成的発現プロモーター及び誘導型プロモーターのいずれでも良い。プロモーターが機能しうるとは、宿主酵母内において変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子の転写が可能であることを意味する。プロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００３６】
本発明では、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子を発現可能に組み込んだ発現ベクターを定法に従って導入し、当該変異型マルチ銅オキシダーゼを生産する。発現ベクターを導入する方法としては、従来公知の各種方法、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００３７】
また、大腸菌を宿主としたタンパク質製造システムを利用する場合、変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子は、一般的に利用されている発現ベクターの形で大腸菌に導入することができる。ベクターは典型的には、選択マーカー遺伝子、クローニング部位及び制御領域（プロモーター及びターミネーター）を有している。このベクターは、本技術分野においてよく知られており商業的に入手可能である。例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp1A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5等）などを使用することができる。さらに、ファージDNAとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt100、gt11、zap）、φX174、M13mp18又はM13mp19などを使用することができる。なお、宿主としては、大腸菌のみならず枯草菌を使用することもできる。
【００３８】
さらにまた、無細胞タンパク質製造システムを利用する場合、変異型マルチ銅オキシダーゼ遺伝子は、当該システムに適した発現ベクターの形で使用する。無細胞タンパク質製造システムとしては、例えば、大腸菌、小麦胚芽ウサギ網状赤血球などを破砕し、膜成分を遠心分離で除いた細胞抽出液を使用することができる。また、いわゆるＰＵＲＥシステムと呼称される無細胞タンパク質製造システムを利用することもできる。
【００３９】
酵母を使用する場合、大腸菌等を使用する場合及び/又は無細胞タンパク質製造システムを使用する場合のいずれにおいても、定法に従って変異型マルチ銅オキシダーゼを精製することができる。変異型マルチ銅オキシダーゼの精製には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上またはDEAEなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、 SDS-PAGE、硫酸アンモニュウム沈殿法、ゲルろ過等の手法を単独で又は組み合わせて使用できる。
【００４０】
<変異型マルチ銅オキシダーゼの利用形態> 
以上で説明した変異型マルチ銅オキシダーゼは、従来、マルチ銅オキシダーゼが使用されている反応系のいずれにも優れた代替物として利用することができる。特に、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼは、変異導入前のマルチ銅オキシダーゼと比較すると、至適pHが中性付近にシフトしている。したがって、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼは、化成品として又はバイオ燃料電池のカソード電極に使用することができる。
【００４１】
変異型マルチ銅オキシダーゼをカソード電極に使用する場合、通常、電極として使用される材料（例えば、多孔質カーボン材料など）に変異型マルチ銅オキシダーゼを固定化しても良い。
【００４２】
なお、上述した変異型マルチ銅オキシダーゼは、如何なる構成、構造の燃料電池に適用することができる。燃料電池としては、例えば、正極と負極とが電解質を介して対向した構造を有するものを挙げることができる。なお、燃料電池における燃料としては、多糖類（二糖、三糖、四糖などのオリゴ糖を含む）や単糖類を使用することができる。多糖類を使用する場合には、多糖類の加水分解などの分解を促進し、グルコースなどの単糖類を生成する分解酵素を併用することが好ましい。多糖類としては、具体的には、例えば、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、マルトース、スクロース、ラクトースなどが挙げられる。これらは単糖類が二つ以上結合したものであり、いずれの多糖類においても結合単位の単糖類としてグルコースが含まれている。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕
（１）Site-directed Mutagensisによる変異遺伝子の作製
1-1.部位特異的変異導入
KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO社製）を用いて、プロトコールに従ってB. subtilis由来のマルチ銅オキシダーゼ遺伝子（BOD遺伝子）に部位特異的に変異を導入した。使用したprimerの配列は表１に示した。また、使用したB. subtilis由来のBOD遺伝子の塩基配列を配列番号１に示した。また、当該BOD遺伝子がコードするマルチ銅オキシダーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００４５】
【表１】
2013081409.tif 000003
【００４６】
1-2.変異遺伝子の取得
形質転換により得られた組換え体を4ml LB培地+50μg/mlアンピシリンで培養し、QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)を用いてプラスミドを抽出した。その後、ダイターミネーター法によるシークエンスを行って、BOD遺伝子に所期の変異が導入されていることを確認した。
【００４７】
（２）組換え体BODの性状評価
2-1.大腸菌S30による組換え体BODの合成
2-1-1.鋳型DNAの調製
以下の条件でPCRを実施し、無細胞翻訳系に使用する鋳型DNAを調整した。使用したprimerの配列は表２に示した。
【００４８】
【表２】
2013081409.tif 000004
【００４９】
PCRの反応液組成を表３に示した。
【００５０】
【表３】
2013081409.tif 000005
【００５１】
なお、本PCRの反応サイクルは、94℃で2分間の後、94℃で15秒間→53℃で30秒間→68℃で2分間を１サイクルとして２５サイクル行い、その後、68℃で2分間、その後4℃とした。PCRの終了後、反応液をMinElute PCR Purification Kit(QIAGEN社製) を用いて精製し、これを鋳型DNAを調整とした。
【００５２】
2-1-2.無細胞翻訳系による組換え体BODの合成
大腸菌B株由来のS30画分を用いて、以下の条件で翻訳を実施した。反応液組成を表４に示す。
【００５３】
【表４】
2013081409.tif 000006
【００５４】
なお、表４に示したアミノ酸ミックスの組成を表５に示した。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
翻訳反応は、サーマルサイクラーを使用して25℃で1.5時間反応させた。続いて、翻訳産物に11.12μl 2mM Cu/50mM HEPES-KOH(pH 7.5)溶液を添加して4℃で一晩置き、銅を吸着させた。
【００５７】
2-2.S30中でのpH5とpH7の条件下での活性測定
反応液に含まれるBOD活性を以下の条件で測定した。反応液組成を表６に示す。
【００５８】
【表６】
2013081409.tif 000008
【００５９】
サーマルサイクラーを使用して、反応液を37℃で20分間反応した後、infinite M200 (TECAN社製）を用いてA420を測定した。pH7の条件で反応したときのA420の値と、pH５の条件で反応したときのA420の値から[pH7 A420/pH5 A420]を算出した結果を下記表７に示した。なお、野生型のマルチ銅オキシダーゼでは[pH7 A420/pH5 A420]の値が26%となっている。したがって[pH7 A420/pH5 A420]の値が26%から有意に上昇していれば、至適pHが中性付近にシフトしたことを意味する。
【００６０】
【表７】
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【００６１】
表７に示すように、４１５番目のトレオニンをヒスチジンに置換した変異型マルチ銅オキシダーゼ及び４１８番目のトレオニンをリシンに置換した変異型マルチ銅オキシダーゼは、至適pHが中性付近にシフトしていることが判った。一方、これらトレオニン残基の近傍に位置する４１６番目のアルギニンや４１７番目のグリシンを他のアミノ酸に置換しても、至適pHが中性付近にシフトすることはなかった。
【００６２】
また、実験の詳細を説明しないが、４１５番目のトレオニンをヒスチジン以外の他のアミノ酸に置換した変異型マルチ銅オキシダーゼ及び４１８番目のトレオニンをリシン以外の他のアミノ酸に置換した変異型マルチ銅オキシダーゼを同様にして作製し、[pH7 A420/pH5 A420]の値を算出した結果を表８に示す。
【００６３】
【表８】
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【００６４】
表８に示すように、４１５番目のトレオニンについては、ヒスチジン以外のアミノ酸へ置換したとしてもマルチ銅オキシダーゼの至適pHを中性付近にシフトさせるといった効果は見られなかった。同様に、４１８番目のトレオニンについても、リシン以外のともに、アミノ酸へ置換したとしてもマルチ銅オキシダーゼの至適pHを中性付近にシフトさせるといった効果は見られなかった。
【００６５】
以上の結果より、マルチ銅オキシダーゼにおいて、４１５番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基をヒスチジンに置換するか、４１８番目のトレオニンに相当するアミノ酸残基をリシンに置換することで、至適pHが中性付近にシフトした変異型マルチ銅オキシダーゼを作製できることが明らかとなった。
【図１】
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【配列表】
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