(57)【要約】【課題】短時間での止血が可能となる高性能な医療用材料を提供し、かつ取扱い性及び生産性に優れた止血材を提供する。【手段】式（１）で示されるペプチドフラグメントとポリマーとを含有するナノファイバーを含む、止血材。―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）n―      （１）（式（１）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは５〜９０００の整数である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドとポリマーとを含有するナノファイバーを含む、止血材。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）n―      （１）
（式（１）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは５〜９０００の整数である。）
【請求項２】
前記ナノファイバー中の前記ポリペプチドの含有量が２．５〜９０重量％である、請求項１に記載の止血材。
【請求項３】
前記ポリマーが天然コラーゲン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸から選択される１種又は２種以上である、請求項１または２に記載の止血材。
【請求項４】
前記ナノファイバーが不織布の形態である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の止血材。
【請求項５】
前記不織布に支持基材が積層している、請求項４に記載の止血材。
【請求項６】
前記支持基材がポリウレタン層である、請求項５に記載の止血材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成コラーゲンナノファイバーを含む止血材に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノメートルスケール（１ｎｍ〜１０００ｎｍ）の直径を有する繊維は、マイクロメートルスケール以上の直径を有する繊維とは異なる材料特性を示すことから、一般にナノファイバーと称されて他の繊維とは区別されている。ナノファイバーは単位質量あたりの材料表面積、いわゆる比表面積が非常に大きいことから、機能分子キャリヤ材料、流体との接触反応材料、衣料用素材、産業資材製品、生活資材製品、環境資材製品、燃料電池や二次電池の電極や隔膜、再生医療用材料、超高性能フィルター、電子ペーパー、ウエアラブルセル、防護服等への応用が検討され、さまざまな分野で研究開発が盛んに行われている。また、ナノスケールの材料が細胞へ与える影響などが注目を集めており、各種ナノファイバーを利用した医療用材料に関する研究も数多く報告されている。
【０００３】
ところで、タンパク質の一種であるコラーゲンは、汎用的な医用材料として幅広く用いられている。天然の一型コラーゲン分子は三アミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ、Ｙは様々なアミノ酸で、ＸはＰｒｏ、ＹはＨｙｐである場合が多い）の繰り返しから成る特徴的な一次構造を有する。このポリペプチドが同じ向きに３本寄り集って形成された３重らせんの三次構造をとり、コラーゲン繊維を形成する。
一方、コラーゲン様ペプチドとして創出された、三アミノ酸残基Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ（Ｙはプロリンまたはヒドロキシプロリン）の繰り返し構造からなる合成コラーゲン分子も、三重らせん構造をとることが報告されており、種々の機能性材料としての研究がなされている（特許文献１）。
【０００４】
特に、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙで表されるペプチドユニットを含む合成コラーゲンとトロンビンとを含む止血材であって凍結乾燥して得たスポンジ状の止血材が報告されている（特許文献２）。
しかしながら、特許文献２に開示される止血材は血液凝固因子であるトロンビンを必須成分として含んでおり、合成コラーゲン自体の止血機能については未知であった。また、止血材としての取扱い性や生産性をより向上させることも望まれる。
【０００５】
合成コラーゲンからなるナノファイバーは、アミノ酸残基の配列制御、さらには、それらの化学修飾性などを利用して、高機能性あるいは多機能性を持った材料になり得ると考えられる。また、かかるナノファイバーを止血材の材料として適用すれば、取扱い性が向上すると考えられる。
しかしながら、天然コラーゲン分子とは異なり、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙのみからなる単純な繰り返し構造であるため、かかる合成コラーゲンは高分子ペプチドでありながら分子鎖間の相互作用に乏しく、易水溶性を呈する。そのため、天然コラーゲン繊維様の長繊維の形成はこれまで達成されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０７５５８９号パンフレット
【特許文献２】特開２００５−７４０７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記の状況に鑑み、合成コラーゲンをナノファイバー化しそれを止血材とすることにより、高い止血能を有する医療用材料であって、取扱い性および生産性の向上した材料を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、合成コラーゲンとポリマーとをエレクトロスピニング法により紡糸することにより合成コラーゲンのナノファイバー化に成功し、かかるナノファイバーを止血材の材料とすることにより本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］式（１）で示されるペプチドフラグメントを有するポリペプチドとポリマーとを含有するナノファイバーを含む、止血材。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）n―      （１）
（式（１）中、Ｙはヒドロキシプロリンまたはプロリン、ｎは５〜９０００の整数である。）
［２］前記ナノファイバー中の前記ポリペプチドの含有量が２．５〜９０重量％である、［１］に記載の止血材。
［３］前記ポリマーが天然コラーゲン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸から選択される１種又は２種以上である、［１］または［２］に記載の止血材。
［４］前記ナノファイバーが不織布の形態である、［１］〜［３］のいずれかに記載の止血材。
［５］前記不織布に支持基材が積層している、［４］に記載の止血材。
［６］前記支持基材がポリウレタン層である、［５］に記載の止血材。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、合成コラーゲンを含有するナノファイバーから、血液との接触により凝血因子が素早く患部に放出され、短時間での止血が可能となる高性能な医療用材料が提供される。また、合成コラーゲンがナノファイバー化されることにより、止血材への加工が容易かつ汎用性が高くなり、止血材の取扱い性および生産性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】止血実験に用いる不織布の加工を表す図（ａ）及び写真（ｂ）である。
【図２】ポリウレタンフィルム積層不織布を表す図（ａ）及び写真（ｂ）である。
【図３】実施例１の試料を用いた止血実験（擦過傷）を示す写真である。
【図４】実施例１の試料を用いた止血実験（切創）を示す写真である。
【図５】実施例２の試料を用いた止血実験（擦過傷）を示す写真である。
【図６】実施例２の試料を用いた止血実験（切創）を示す写真である。
【図７】実施例３の試料を用いた止血実験（擦過傷）を示す写真である。
【図８】実施例３の試料を用いた止血実験（切創）を示す写真である。
【図９】比較例１の試料を用いた止血実験（切創）を示す写真である。
【図１０】比較例２の試料を用いた止血実験（切創）を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略語で記述する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
なお、本明細書におけるペプチド鎖のアミノ酸配列は、定法に従い、Ｎ末端のアミノ酸残基を左側に、Ｃ末端のアミノ酸残基を右側に位置させて記載する。
【００１２】
本発明の止血材は、合成コラーゲンとポリマーとを含有するナノファイバーを含む。従来、合成コラーゲンはナノファイバー化が困難であったが、本発明者らはポリマーを紡糸基材とすることにより合成コラーゲンをエレクトロスピニング法により紡糸することに成功した。
以下に、合成コラーゲンとポリマーとを含有するナノファイバーの取得方法について詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞合成コラーゲン
本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンは、次式（１）で示されるペプチドフラグメント（以降、ポリＰＹＧと記す）を有するポリペプチドである（以降、合成コラーゲンと記す場合もある）。
―（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）n―      （１）
ここでＹはヒドロキシプロリンまたはプロリンであり、ヒドロキシプロリンは、例えば４Ｈｙｐであり、trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが好ましい。
また、式（１）中、繰り返し数ｎは５〜９０００の整数である。ｎがこの範囲であることにより、ポリペプチドは３重らせん構造形成をとり、ナノファイバー形成が容易となる。また、３重らせん構造の安定性の観点からｎは５〜１０００がより好ましく、１０〜５００がさらに好ましい。
本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンのポリペプチド鎖は、直線状または１以上の分岐を有していてもよい。分岐を有する場合、分岐点以降に３重らせん構造が形成されていてもよく、さらにその３重らせん構造の後ろに分岐を有していてもよい。
なお、ポリペプチドが３重らせん構造をとっているか否かは、ポリペプチド溶液について円二色性スペクトルを測定することにより確認することができる。具体的には、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果、および波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す場合、そのポリペプチドは３重らせん構造をとっていると考えられる。
また、本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンのポリペプチド鎖どうしは、互いに架橋されていてもよい。
【００１４】
本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンの重量平均分子量は、特に限定されるものではないが、紡糸溶液の調製、紡糸の効率、及び３重らせん構造の安定性の観点から５７０〜７００万が好ましく、２８５０〜３０万がより好ましい。
ここで、合成コラーゲンの重量平均分子量は、例えば特開２００３-３２１５００号公
報に記載されている、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲ １０／３０（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４））分子量標準としてＧｅｌＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＬＭＷ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ及びＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＨＭ
Ｗ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を使用したゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法、あるいは、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｅｐｔｉｄｅ ＰＥ ７．５／３００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、
流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４））、分子量標準としてＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ＬＭＷ Ｃａｌ
ｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）とヒトインシュリン
、グリシンを用いたゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる方法により測定することができる。別の方法として、カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ６０００ＰＷ ＸＬ−ＣＰ ８．０ ｘ ３００ｍｍ（東ソー製）、移動相２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4・Ｈ3ＰＯ4（ｐＨ３．０）
：ＭｅＯＨ＝８：２、カラム温度４０℃、流速０．５ｍＬ/ｍｉｎ、検出はＵＶモニター
による２１５ｎｍ及び示差屈折系、分子量標準として分子量５００００から１６０００００のプルラン（昭和電工製）および分子量１１９０００００のデキストラン（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ ＧｍｂＨ）によるＨＰＬＣゲルパーミエーシ
ョンクロマトグラフィーにより測定できる。また、このＨＰＬＣゲルパーミエーションクロマトグラフィーの検出器にＷｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ、Ｏｐｔｏｌａｂ ｒＥＸを用いる事で、ゲル浸透クロマトグラフ/多角度レーザー光散乱検出器（ＧＰＣ−ＭＡＬＳ）法としても測定する事ができる。本明細書において合成コラーゲンの重量平均分子量は、これらの方法によって測定された値である。
【００１５】
本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンのポリペプチドは、ポリＰＹＧのみからなるものであってもよいが、３重らせん構造の安定性を損なわず、また本発明の効果を損なわない範囲において、ポリＰＹＧの他にアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを含んでもよい。
アミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択された少なくとも１種が挙げられる。ペプチドフラグメントとしては、前記アミノ酸残基の１種以上が複数個結合したペプチドが挙げられる。アルキレンとしては、直鎖状、分岐状のいずれでもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数１〜１８のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数２〜１２のアルキレンが好ましい。
本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンのポリペプチドは、ポリＰＹＧとポリＰＹＧの他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレンを、重量比においてポリＰＹＧ：他のアミノ酸残基もしくはペプチドフラグメントまたはアルキレン他のペプチドフラグメント＝１：９９〜１００：０、好ましくは１０：９０〜１００：０の範囲で有する。
【００１６】
本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンのポリペプチドは、ナノファイバーの紡糸を阻害しない限り、無機酸（塩酸、硫酸等）、有機酸（酢酸、乳酸、マレイン酸、シュウ酸、クエン酸等）、金属（ナトリウム、カリウム等）、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミン等）との塩であってもよい。本発明のナノファイバーにおける合成コラーゲンのポリペプチドの塩化合物は、単独または二種類以上の組合せであってもよい。
【００１７】
ポリＰＹＧを有するポリペプチドは、いずれの方法により得られたものであってもよい。
例えば、既知の固相合成法または液相合成法により取得したポリＰＹＧを構成するアミ
ノ酸からなるペプチドオリゴマーを用いて、縮合反応を行う方法により好ましく取得できる。
上記ペプチドオリゴマーの縮合反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、原料となるペプチドオリゴマーを溶解（一部または全部を溶解）または懸濁可能なものであればよく、通常、水または有機溶剤が使用できる。具体的には、水、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミド等）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド等）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン等）、ニトリル類（アセトニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフラン等）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等）、およびこれらの混合溶媒等である。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが好ましく使用される。
【００１８】
また、上記ペプチドオリゴマーの縮合反応は、脱水剤（脱水縮合剤、縮合助剤）の存在下で行うことが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、脱保護とアミノ酸結合とを繰返す煩雑な処理を経ることなく、二量化や環化を抑制しつつ円滑に縮合反応が進行する。
【００１９】
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に限定されるものではなく、例えば、カルボジイミド系縮合剤（ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ＝ＷＳＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(ＷＳＣＩ
・ＨＣｌ)、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等）、フルオロホスフェート系
縮合剤（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（ＢＯＰ））等）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）が例示できる。
これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）である。
【００２０】
脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）の範囲である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル、好ましくは５〜２５０モル、さらに好ましくは１０〜１２５モルの範囲である。
【００２１】
縮合助剤は、縮合反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類（例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類）、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類）、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）等のトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルが例示できる。
これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類（ＨＯＮＳｕ等）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類（ＨＯＢｔ等）である。
縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モルの範囲である。
【００２２】
脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用することが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔまたはＨＯＯＢｔ）、ＷＳＣＩ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯＢｔ）が挙げられる。
【００２３】
上記ペプチドオリゴマーの縮合反応においては、反応溶液のｐＨを調節してもよく、通常、反応溶液のｐＨは中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）に調整される。ｐＨの調節は、通常、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど）、有機塩基、無機酸（塩酸など）や有機酸を用いて行うことができる。
また、縮合反応に関与しない塩基を反応溶液に添加してもよい。縮合反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、本ペプチドオリゴマーの総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。
【００２４】
以上のようにして得られたポリペプチドには、反応に用いた試薬が残存している。これはナノファイバーの紡糸工程に影響するため、除去することが好ましい。残存している試薬の除去は、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いることができる。
【００２５】
また、ポリペプチドの安定性および取扱いの容易さから考えると、反応溶媒を保存溶媒に置換することが好ましい。反応溶媒から目的とする保存溶媒への置換は、透析法においては目的とする保存溶媒を透析外液として使用することにより、カラム法においては目的とする保存溶媒を移動相として用いることにより置換することができる。
保存溶媒としては、得られた有効成分ポリペプチドの物理的性質等の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。ただし、ナノファイバーの紡糸工程に影響を与える物質を含有しないことが好ましい。
【００２６】
＜２＞ポリマー
本発明の止血材の材料となるナノファイバーに含有されるポリマーは、ナノファイバーの紡糸における紡糸基材となる。ポリマーを紡糸基材とすることにより、これまでナノファイバー化が困難であった合成コラーゲンをエレクトロスピニング法にて紡糸することが可能となる。その結果、合成コラーゲンを含有する均一かつ長い繊維状のナノファイバーを得ることができ、止血材への加工が容易となる。
本発明のナノファイバーにおけるポリマーは、生体適合性があり、かつ紡糸基材として用いることができるものであれば特に限定されず、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリグリコール酸、天然コラーゲンなどから選択される１種または２種以上好ましい。
本発明におけるポリマーの重量平均分子量は、特に限定されないが、５万〜１００万であることが好ましく、６万〜９０万であることがより好ましい。なお、かかる重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフ法、光散乱法で測定することができる。
【００２７】
＜３＞溶媒
本発明のナノファイバーを紡糸する際、合成コラーゲンとポリマーとは溶媒に溶解させる。
かかる溶媒としては、合成コラーゲンやポリマーを溶解し、かつ紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、水、エタノール、メタノー
ル、イソプロパノール、アセトン、スルホランアセトン、プロパノール、ジクロロメタン、蟻酸、ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロアセトン、メチルエチルケトン、クロロホルム、イソプロパノール、トルエン、テトラヒドロフラン、ベンゼン、ベンジルアルコール、１，４−ジオキサン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、塩化メチレン、フェノール、ピリジン、トリクロロエタン、酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、１−メチル−２−ピロリドン、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、ジメチルカーボネート、アセトニトリル、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、ブチレンカーボネート、１，４−ブチロラクトン、ジエチルカーボネート、ジエチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、１，３−ジオキソラン、エチルメチルカーボネート、メチルホルマート、３−メチルオキサゾリジン−２−オン、メチルプロピオネート、２−メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。溶媒は一種を単独で用いてもよく、複数の溶媒の混合物であってもよい。
【００２８】
＜４＞その他の任意成分
本発明のナノファイバーを製造する際に調製する紡糸溶液は、前述した必須成分の他に、紡糸を妨げない限りにおいて任意の成分を含有してもよい。かかる任意成分としては、接着剤、電解質などが挙げられる。
接着剤を添加すると、製造されたナノファイバーどうしが接触点で接着されるので、ナノファイバーを不織布の形態で得る際に強力で摩擦によるケバ立ちの少ない柔軟な不織布とすることができる。接着剤としては、製造されたナノファイバーどうしを接着でき、かつ紡糸溶液の溶媒に可溶であれば特に限定されないが、例えばホットメルト樹脂からなる接着剤、エラストマー系の接着剤、アクリル系接着剤、エポキシ系接着剤、ビニル系接着剤などが挙げられる。エラストマー系の接着剤としては、ポリクロロプレンゴム、スチレン・ブタジエンゴム、ブチルゴム、アクリロニトリル・ブタジエンゴム、エチレン・プロピレンゴム、クロロスルフォン化ポリエチレンゴム、エピクロルヒドリンゴムが例示される。接着剤を添加する場合は紡糸溶液中の合成コラーゲンとポリマーとの総量に対して０．５〜１０重量％添加されることが好ましい。
【００２９】
電解質を添加することによって紡糸溶液表面の電荷密度を上げることが出来、結果として紡糸性を向上させることが可能となる。電解質としては、紡糸溶液に可溶で、紡糸溶液中で電離するものであれば特に限定はされないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸二水素ナトリウム、炭酸マグネシウムが例示される。電解質を添加する場合は、紡糸溶液中の合成コラーゲンあるいはポリマーが塩析しない程度が望ましく、紡糸溶液中の合成コラーゲンとポリマーとの総量に対して０．５〜１０重量％添加されることが好ましい。
【００３０】
＜５＞ナノファイバーの製造方法
本発明のナノファイバーは、溶媒に合成コラーゲンとポリマーとを溶解させて紡糸溶液を調製する工程と、該紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法により紡糸する工程により製造することができる。
紡糸溶液は、合成コラーゲンとポリマーとはそれぞれ溶媒に溶解させて各溶液を混合して調製してもよいし、いずれか一方を溶媒に溶解させた溶液に他方を添加して溶解させて調製してもよい。また、調製の際は、合成コラーゲンを変性させない限りにおいて、適宜加温、攪拌等を行ってもよい。
紡糸溶液中の合成コラーゲンの濃度は０．１〜２．０重量％であることが好ましく、０．５〜１．０重量％であることがより好ましい。また、紡糸溶液中のポリマーの濃度は０．１〜２０重量％であることが好ましく、０．５〜１０重量％であることがより好ましい。合成コラーゲンやポリマーの濃度をこのような範囲にすることにより、紡糸溶液中においてポリマー−ポリマー間またはポリマー−合成コラーゲン間に相互作用が生じ、連続繊
維が形成されやすくなる。
紡糸溶液における合成コラーゲンとポリマーとの配合比率は、均一なナノファイバーをある程度の長さで得るためには、重量比で２０：１〜１：１００であることが好ましく、１０：１〜１：４０であることがより好ましい。
【００３１】
紡糸工程は、前記紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法（電界紡糸法）により行う。これによりナノスケールの微細かつ均一な径を有する繊維を製造でき、比表面積の大きな繊維材料を得られるうえ、不織布としての取得も容易であるため、高性能かつ取扱い性に優れた止血材材料への適用に好適となる。
エレクトロスピニング法は、周知の手段によって行うことができ、具体的には、紡糸溶液を充填したノズルとコレクター（基板）の間に電圧を印加した状態で、ノズルから紡糸溶液を吐出させて、コレクター上に繊維を回収する。エレクトロスピニング法を行う条件は、特に限定されず、紡糸溶液の種類や得られるナノファイバーの用途等に応じて適宜調整すればよい。本発明の方法における一般的な条件としては、例えば、印加電圧は８〜３０ｋＶ、吐出速度は０．０１〜１．００ｍＬ／時、ノズルとコレクターの間の垂直距離は１００〜２００ｍｍとすることができ、ノズルは２２〜２５Ｇの径のものを使用することができる。紡糸環境は、相対湿度１０〜４０％、温度を１０〜２５℃とすることが好ましいが、特段厳密に制御を行わなくてもよい。
【００３２】
上記製造方法により、直径５ｎｍ〜５０μｍの繊維を得ることができる。また、紡糸条件の設定・調整により、平均して２００〜３００ｎｍの長く途切れないナノファイバーを得ることができる。また、ナノファイバー中に、塊状のビーズを含まないか含まれても少ない、均一なナノファイバーを得ることができる。
また、ナノファイバー中の合成コラーゲンの含有量は、止血能の確保の観点から、１〜９０重量％であることが好ましく、２．５〜９０重量％であることがより好ましい。かかる含有量の調製は、前述した紡糸溶液の調製の際に任意に調節することができる。
【００３３】
かくして得たナノファイバーを用いて、本発明の止血材とすることができる。本発明の止血材は、トロンビン等の凝血因子を他に含有せずとも十分な止血能を有するが、必要に応じて他の凝血剤や添加物などを含有させてもよく、特に制限されない。例えば、トロンビン、フィブリノーゲン、酸化セルロース等の止血成分や、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等の細胞接着性タンパク質や、抗線溶作用を示すアプロチニンやアミノカプロン酸、トラネキサム酸等を、本発明の止血材に含めることができる。また、安定剤（アルブミンやＬアルギニン塩酸塩等のアミノ酸類を含む）、抗菌剤、保存剤、その他ビタミン類や生理学的に許容される塩類など種々の添加物を本発明の止血材に含めてもよい。
また、本発明の止血材は、上記ナノファイバーを、取扱い性及び加工性の良さから、不織布の形態にすることが好ましい。取扱い性の観点から、不織布の厚さは０．０１〜０．５ｍｍであることが好ましく、０．１〜０．３ｍｍであることがさらに好ましい。
また、不織布形態の止血材は、支持基材がさらに積層している形態であることが、止血能をより向上させる観点から好ましい。かかる支持基材の形態は、フィルム、不織布、ゲル、板など特に限定されず、その材料も特に限定されないが、例えばポリウレタン等のポリマーが取扱い性上好ましい。かかる支持基材層は任意の方法で形成することができる。例えば、ポリウレタン製のフィルムを不織布の片面に積層・貼付することにより形成できる。また、かかる支持基材の厚さは、取扱い性および止血能の観点から、０．０１〜０．２ｍｍであることが好ましく、０．１〜０．３ｍｍであることがさらに好ましい。
また、本発明の止血材は、ナノファイバーまたはその不織布をそのまま止血用途に供してもよいが、ナノファイバーまたはその不織布を適切な支持体に設置した形状に加工することにより、さらに取扱い性を向上させることができる。例えば、図１に示すように、紡糸の際に用いたコレクター基板を支持体に適用して、患部に合わせた大きさや形状とする
ことができる。
【００３４】
本発明の止血材を用いて止血する場合は、止血材を擦過傷や切創などの止血が必要な患部に接触させて使用する。この場合、患部に止血材を圧迫しながら接触させてもよいし、圧迫はしなくてもよい。止血材と血液との接触により、止血材に含まれる比表面積の大きいナノファイバーから、凝血因子である合成コラーゲンが素早く放出され、数秒〜数十秒スケールの短時間で止血することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
≪ナノファイバーの不織布の作製≫
エレクトロスピニング法にて、実施例１〜３及び比較例１〜２のナノファイバー不織布を作製した。
＜実施例１＞ＳＣ／ＰＥＧブレンドナノファイバー不織布
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）の０．５重量％水溶液と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；重量平均分子量５００，０００、和光純薬社製）の１０重量％水溶液とをそれぞれ調製し、ＳＣ：ＰＥＧ＝２：１（体積比）で混合し紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとアルミホイル製コレクターとの間（垂直距離２００ｍｍ）に高電圧発生装置により８ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．０１ｍＬ／時でコレクター上に押し出し、均一に分散した不織布として回収した。なお、紡糸環境の湿度は乾燥窒素を灌流することにより制御し、紡糸中は常に相対湿度１５％以下に保持した。また、紡糸環境の温度は制御せず、室温下で紡糸を行った。
上記のごとく紡糸したＳＣ／ＰＥＧブレンドナノファイバー中の合成コラーゲンの含有量は９．１ 重量％であった。紡糸コレクターであるアルミホイルを、不織布の支持枠状
に加工した（図１）。
【００３７】
＜実施例２＞ＳＣ／ＰＥＧブレンドナノファイバーポリウレタンフィルム積層不織布
実施例１と同様の操作を行いＳＣ／ＰＥＧブレンドナノファイバー不織布を作製し、さらに不織布の表面にポリウレタンフィルムを張り付けて、ポリウレタンフィルム積層不織布とした（図２）。
【００３８】
＜実施例３＞ＳＣ／ＰＶＡブレンドナノファイバー不織布
合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）の０．５重量％水溶液と、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；平均重合度１，５００、けん化度７８〜８２ｍｏｌ％、和光純薬社製）の２０重量％水溶液とをそれぞれ調製し、ＳＣ：ＰＶＡ＝１：１（体積比）で混合し紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとアルミホイル製コレクターとの間（垂直距離１８０ｍｍ）に高電圧発生装置により１２ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．０８ｍＬ／時でコレクター上に押し出し、均一に分散した不織布として回収した。なお、紡糸環境の湿度は乾燥窒素を灌流することにより制御し、紡糸中は常に相対湿度１５％以下に保持した。また、紡糸環境の温度は制御せず、室温下で紡糸を行った。
上記のごとく紡糸したＳＣ／ＰＶＡブレンドナノファイバー中の合成コラーゲンの含有量は２．４重量％であった。紡糸コレクターであるアルミホイルを、不織布の支持枠状に加工した（図１）。
【００３９】
＜比較例１＞ＮＣナノファイバー不織布
天然コラーゲン（ＮＣ；ＮＭＰコラーゲンＰＳ／ＩＰ、ニッポンハム株式会社製）を、
１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ；和光純薬社製）に１００ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させて、紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとアルミホイル製コレクターとの間（垂直距離１００ｍｍ）に高電圧発生装置により１４ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．０６ｍＬ／時でコレクター上に押し出し、均一に分散した不織布として回収した。なお、紡糸環境の湿度は乾燥窒素を灌流することにより制御し、紡糸中は常に相対湿度１５％以下に保持した。また、紡糸環境の温度は制御せず、室温下で紡糸を行った。
上記のごとく紡糸したＮＣナノファイバー不織布についても、紡糸コレクターであるアルミホイルを、不織布の支持枠状に加工した（図１）。
【００４０】
＜比較例２＞ＰＶＡナノファイバー不織布
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；平均重合度１，５００、けん化度 ７８〜８２ｍｏｌ
％、和光純薬社製）の２０重量％水溶液を調製し、紡糸溶液とした。２５Ｇステンレスニードルとアルミホイル製コレクターとの間（垂直距離１８０ｍｍ）に高電圧発生装置により１２ｋＶの電圧を印加した。紡糸溶液を前記ニードルに接続したシリンジに充填し、吐出速度０．０４ｍＬ／時でコレクター上に押し出し、均一に分散した不織布として回収した。なお、紡糸環境の湿度は乾燥窒素を灌流することにより制御し、紡糸中は常に相対湿度１５％以下に保持した。また、紡糸環境の温度は制御せず、室温下で紡糸を行った。
上記のごとく紡糸したＰＶＡナノファイバー不織布についても、紡糸コレクターであるアルミホイルを、不織布の支持枠状に加工した（図１）。
【００４１】
≪止血実験≫
上記のごとく作製したナノファイバー不織布を試料として用いて、止血性能を観察した。実験手順は以下の通りである。
白兎の肝臓表面に外科用メスを用いて約１０ｍｍ2の擦過傷（すりきず）を作って出血
させ、無処置では出血が続くことを確認した。擦過傷全体を覆うように試料を貼付した。このとき試料上部からの圧迫などはしなかった。
また、白兎の肝臓表面に外科用メスを用いて約１５ｍｍの切創（きりきず）を作って出血させ、無処置では出血が続くことを確認した。切創全体を覆うように試料を貼付した。このとき試料上部からの圧迫などはしなかった。
実施例１〜３及び比較例１〜２のナノファイバー不織布について、実験結果を次に説明する。
【００４２】
＜試験例１＞ＳＣ／ＰＥＧブレンドナノファイバー不織布
擦過傷を作った後、無処置では出血が続いたが（図３ａ）、実施例１で作成した試料を貼付したところ（図３ｂ）、試料の血液に接触した部分は接触と同時に溶解し、すばやく肝臓表面に密着した（図３ｃ）。擦過傷への試料貼付後少なくとも３０秒以内に肝臓外部への血液漏出は停止した（図３ｄ）。目視観察においては、試料は不織布形態を維持しておらず、擦過傷表面において薄いゲル状の膜を形成していた（図３ｄ）。このゲル状層の下部では出血は継続しているように見られ、ゲル状層から多少の血液の漏れが確認された。
また、切創を作った後、無処置では出血が続いたが（図４ａ）、試料を貼付したところ（図４ｂ）、試料の血液に接触した部分は接触と同時に溶解し、すばやく肝臓表面に密着し、薄いゲル状層を形成した（図４ｃ）。貼付した試料中の合成コラーゲンの量が血液量に対して十分ではなかったために完全な止血には至らず、拍動とともにゲル層の裂け目から多少の血液が漏れ出ていた。しかしながら、試料と接触した血液はすばやく凝固して薄いゲル層を形成し、ゲル層からのさらなる漏血を防ぐことが確認された。試料と血液との接触による血液凝固反応とゲル層の形成はほぼ同時に起こると考えられ、この反応に要する時間はおそらく数秒以内であろうと推察された。
【００４３】
＜試験例２＞ＳＣ／ＰＥＧブレンドナノファイバーポリウレタンフィルム積層不織布
擦過傷を作った後、無処置では出血が続いた（図５ａ）。アルミホイルを剥離して不織布面を露出させた実施例２で作成した試料を貼付した後、サポートフィルムを取り去った（図５ｂ）。試料の血液に接触した部分は接触と同時に溶解し、すばやく肝臓表面に密着した（図５ｃ）。擦過傷への試料貼付後少なくとも３０秒以内に肝臓外部への血液漏出は停止した（図３ｄ）。試料貼付１分後には出血する様子は認められなかった。また、このときポリウレタンフィルムを通して出血部位を視認することが可能であった。試料貼付３分後に擦過傷からポリウレタンフィルムを剥離したところ、肝臓表面にゲル状層が形成されていることが確認された。ポリウレタンフィルムを除去した後に少量の出血が認められた。
また、切創を作った後、無処置では出血が続いたが（図６ａ）、アルミホイルを剥離して不織布面を露出させた試料を貼付した後（図６ｂ）、サポートフィルムを取り去った（図６ｃ）。試料の血液に接触した部分は接触と同時に溶解し、すばやく肝臓表面に密着した（図６ｃ）。試料貼付１分後には出血する様子は認められなかった。ポリウレタンフィルムを通して出血部位を視認することが可能であった。試料貼付後５分が経過した後に出血が停止したことを確認し、患部からポリウレタンフィルムを剥離したところ、肝臓表面にゲル状層が形成されていることが確認された（図６ｄ）。ポリウレタンフィルムを除去した後も出血は認められなかった。
【００４４】
＜試験例３＞ＳＣ／ＰＶＡブレンドナノファイバー不織布
擦過傷を作った後、無処置では出血が続いたが（図７ａ）、実施例３で作成した試料を貼付したところ（図７ｂ）、試料の血液に接触した部分は接触と同時に溶解し、すばやく肝臓表面に密着した。擦過傷への試料貼付後少なくとも６０秒以内に肝臓外部への血液漏出は停止した（図７ｃ）。目視観察においては、試料は不織布形態を維持しておらず、擦過傷表面において薄いゲル状の膜を形成していた（図７ｃ）。
また、切創を作った後、無処置では出血が続いたが（図８ａ）、試料を貼付したところ（図８ｂ）、試料の血液に接触した部分は接触と同時に溶解し、すばやく肝臓表面に密着し、薄いゲル状層を形成した。しかしながら、貼付した試料中の合成コラーゲンの量が血液量に対して十分ではなかったために完全な止血には至らず、拍動とともにゲル層の裂け目から多少の血液が漏出した（図８ｃ）。肝臓表面の別部位に、血液漏出量の少ない新たな切創を作って再度止血実験を試みたところ、ゲル層の形成とともに素早い止血効果を確認することができた（図８ｄ）。
【００４５】
＜比較試験例１＞ＮＣナノファイバー不織布
切創を作った後、無処置では出血が続くことを確認し（図９ａ）、比較例１で作成した試料からアルミホイルを剥離して、切創全体を覆うように貼付した（図９ｂ）。不織布は血液と接触すると直ちに吸水、軟化して肝臓表面に密着したが、血液が凝固する様子は認められず、試料貼付後にも血液漏出は続いた（図９ｃ）。
【００４６】
＜比較試験例２＞ＰＶＡナノファイバー不織布
切創を作った後、無処置では出血が続くことを確認し（図１０ａ）、比較例２で作成した試料からアルミホイルを剥離して、切創全体を覆うように貼付した（図１０ｂ）。不織布は血液と接触すると直ちに溶解して肝臓表面に密着した。しかしながら、肝臓表面にゲル状層が形成されているものの、合成コラーゲン含有試料とは異なり、血液が凝固する様子は認められなかった（図１０ｃ）。
【００４７】
≪血液凝固試験≫
実施例１のＳＣ／ＰＥＧブレンドナノファイバー不織布と、ＳＣ／ＰＥＧ凍結乾燥スポンジを用いて、Ｌｅｅ−Ｗｈｉｔｅ法により血液凝固実験を行った。なお、ＳＣ／ＰＥＧ
凍結乾燥スポンジは、合成コラーゲン（ＳＣ；ＪＮＣ株式会社製）の０．５重量％水溶液と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；重量平均分子量５００，０００、和光純薬社製）の１０重量％水溶液とをそれぞれ調製し、ＳＣ：ＰＥＧ＝２：１（体積比）で混合した後、テフロン（登録商標）容器に滴下し、−８０℃で凍結して凍結乾燥して製造した。
血液凝固実験手順は以下の通りである。
耳静脈への１．６ｍＬの麻酔薬を注射により、ウサギを眠らせた。３．１３％クエン酸水溶液２ｍＬの入ったシリンジ（５０ｍＬサイズ、１８Ｇニードル使用）に心採血し（約２０ｍＬ）、クエン酸処理血液とした。
表１に示す仕込み量で試料を入れたガラスチューブを準備し、該クエン酸処理血液を各ガラスチューブに１ｍＬずつ入れた後、すべてのガラスチューブへ素早く塩化カルシウム水溶液を３０μＬずつ添加して、軽く振盪撹拌して３７℃の恒温槽へ浸漬した。ａ列のガラスチューブを１５〜３０秒毎に取り出して、傾斜させて凝固の様子を確認した。ａ列のガラスチューブで凝固が確認された後、静置していたｂ列のガラスチューブでも同様に凝固の様子を観察した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
各ガラスチューブにおける凝固時間の測定結果を表２に示す。測定ａ、ｂのいずれにおいても、ナノファイバー不織布の凝固時間は凍結乾燥スポンジよりも約３０秒短かった。
これより、合成コラーゲンをナノファイバー化することによって血液凝固効率が向上することがわかった。その理由としては、ナノファイバーが有する表面積が大きいため、血液との接触面積が大きくなることに起因すると推察される。
【００５０】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、短時間での止血が可能となる高性能な医療用材料が提供される。また、ナノファイバー化した合成コラーゲンを止血材の材料とすることにより、止血材への加工が容易かつ汎用性が高くなり、止血材の取扱い性および生産性が向上し、産業上非常に有用である。
【図１】
2013198559.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2013198559.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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