(57)【要約】【課題】デハロコッコイデス属細菌を活性を高く維持して培養することができるデハロコッコイデス属細菌の培養方法を提供する。【解決手段】デハロコッコイデス属細菌を嫌気雰囲気下で培養する方法において、気相中のエチレン濃度を液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌ以下とすることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガスが例示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デハロコッコイデス属細菌を嫌気雰囲気下で培養する方法において、
気相中のエチレン濃度を液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌ以下とすることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
【請求項２】
請求項１において、該嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスは、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスのいずれかであり、
前記嫌気雰囲気中のエチレン濃度が液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌ以下となるように嫌気性ガスを通気するか又は培養液を曝気することを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デハロコッコイデス属細菌の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
塩素化エチレンに汚染された土壌や地下水の浄化方法として、デハロコッコイデス属細菌を用いたバイオオーグメンテーション技術が期待されている。バイオオーグメンテーションによる塩素化エチレン処理は、塩素化エチレン分解菌であるデハロコッコイデス属細菌を土壌や地下水中に注入して塩素化エチレンを脱塩素するというものである。
【０００３】
デハロコッコイデス属細菌は、特許文献１，２等の記載の方法などに記載されているように、有機栄養源、ビタミン類、無機塩等と、塩素化エチレンとを含んだ培地を用い、窒素／二酸化炭素混合ガス等の嫌気雰囲気下で培養される。
【０００４】
本発明者による検討の結果、デハロコッコイデス属細菌の培養中に嫌気雰囲気中のエチレンガス濃度が数百ｍｇ／Ｌ（例えば５００ｍｇ／Ｌ）に達することがあることが分かった。そこで、エチレンガスの影響を調べた結果、嫌気雰囲気中のエチレンガス濃度が液中換算濃度で５０ｍｇ／Ｌを超えると（より顕著には２５０ｍｇ／Ｌを超えると）デハロコッコイデス属細菌の活性に悪影響が生じることが分かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２１３４２７
【特許文献２】特開２０１１−２４４７６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、デハロコッコイデス属細菌を活性を高く維持して培養することができるデハロコッコイデス属細菌の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、デハロコッコイデス属細菌を嫌気雰囲気下で培養する方法において、気相中のエチレン濃度を液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌ以下とすることを特徴とするものである。
【０００８】
なお本発明における液中換算濃度とは、塩化ビニルやエチレンなど対象物質が液中に全て溶解したと仮定して換算した濃度のことを指すものとする。実際には気相中の濃度を測定し、ヘンリー則を用いて測定値を液中換算濃度に換算する。
液中濃度＝Ｃｗ（ｍｇ／Ｌ）、気相中濃度＝Ｃａ（ｍｇ／Ｌ）とし、気相と液相との間の化学物質の分配平衡定数をＫａとした場合、ヘンリー則により以下の式（１）が成り立つ。  
Ｋａ＝Ｃａ／Ｃｗ      ・・・（１）
塩化ビニルとエチレンのＫａは、実験値として、それぞれ１．２６４、９．４３５であるから、気相中の濃度Ｃａをガスクロマトグラフィーで測定すれば、式（１）に基づいてそれぞれのＣｗを求め、さらに、以下の式（２）によって液中換算濃度を求めることができる。  
液中換算濃度＝（Ｃａ×気相容積［Ｌ］＋Ｃａ／Ｋａ×液容積［Ｌ］÷液容積［Ｌ］      ・・・（２）
【０００９】
嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスが例示される。
【００１０】
嫌気雰囲気中のエチレン濃度を液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌ以下とするには、嫌気性ガスを通気するか又は培養液を曝気して雰囲気中のエチレンガスを希釈することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明者が種々研究を重ねたところ、デハロコッコイデス属細菌をエチレンの液中換算濃度が２５０ｍｇ／Ｌ以下の嫌気雰囲気下で培養すると、デハロコッコイデス属細菌の活性の低下が低減されることが見出された。本発明はかかる知見に基くものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例の結果を示すグラフである。
【図２】比較例の結果を示すグラフである。
【図３】実験装置の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明では、デハロコッコイデス属細菌をエチレンの液中換算濃度が２５０ｍｇ／Ｌ以下の嫌気雰囲気下で培養する。この嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスが好適であるが、これに限定されない。
【００１４】
デハロコッコイデス属細菌の培養を開始するには、培地に植種源としての地下水や土壌を添加する。
【００１５】
植種源としての地下水や土壌は、バイオスティミュレーションによる汚染の浄化が進行し且つ浄化の過程において塩素化エチレン分解細菌が顕著に増殖している汚染現場から採取されたものが好ましい。採取した地下水及び／又は土壌を培養容器に収容する。植種源として地下水を用いる場合、そのまま培養容器に投入してもよいが、水等で希釈した後に投入してもよい。また、植種源として土壌を用いる場合、そのまま培養容器に投入し液体培地中に懸濁してもよいが、適当な溶媒（例えば、水）に懸濁した後に培養容器に収容してもよい。
【００１６】
培養容器は、培地に対して化学的に安定であることが好ましい。培地に塩素化エチレンを含有させるため、培養容器はガラス製であることが好ましい。
【００１７】
植種源を培養容器に収容した後、水素や、有機栄養源としてクエン酸、乳酸、酵母エキス等が添加される。なお、培地はクエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一方を培養時の濃度として０．１〜２０ｇ／Ｌ含むことが望ましい。例えばクエン酸塩を供給して培養する場合は、クエン酸塩を１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ−培養液／ｄａｙの割合で連続的に添加する。また、培地に酵母エキスを培養時の濃度として１〜１０００ｍｇ／Ｌ程度含有させると成長促進効果があり望ましい。ビタミン類を添加しても良い。デハロコッコイデス属細菌の増殖のために、培地に塩素化エチレン類を加える。塩素化エチレンは、ＰＣＥ（テトラクロロエチレン）、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ（ジクロロエチレン）、ＶＣ（塩化ビニル）等を利用でき、培養時の液中換算濃度として１〜１００ｍｇ／Ｌ（１０〜１０００μＭ）、特に１０〜５０ｍｇ／Ｌ（１００〜５００μＭ）程度含有することが好ましい。
【００１８】
培養温度は１５〜３０℃、特に２５〜３０℃が好ましい。培地のｐＨは６．０〜８．５程度の中性域であることが望ましい。静置培養あるいは１０〜１００ｒｐｍ程度の緩速攪拌を行う。
【００１９】
なお、培地の無機塩とビタミンについては一般の嫌気性菌の培養用の組成でよく、例えば培地はメタン菌培養に用いられるｗｏｌｉｎ培地（Ｗｏｌｉｎら、1963、Formation of methane by bacterial
extracts. The journal of Biological Chemistry, 238. 2882-2886.）であってもよい。
【００２０】
デハロコッコイデス属細菌は、偏性嫌気性微生物であるため、酸素の存在下では速やかに死滅する。従って、地下水や土壌の採取、移送、培養容器への添加等の一連の操作において、嫌気性条件を保持することが好ましい。気相を嫌気性ガスとすると共に、培地の環境を嫌気性とするために、硫化ナトリウム及び塩化第一鉄を培地に添加することが好ましい。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、培地中の硫化ナトリウム及び塩化第一鉄の濃度は、それぞれ５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度が好ましい。
【００２１】
培地には嫌気度を調べるための指示薬であるレサズリンが添加されてもよい。
【００２２】
嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガスの混合ガスが例示される。混合ガス中の窒素ガスの割合は７０％以上特に８０％以上であることが好ましい。本発明では、嫌気雰囲気中のエチレンガス濃度を液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以下とする。このようにエチレンガス濃度を低くするためには、上記嫌気性ガスを通気するか、又は培地を曝気することが好ましい。エチレンガスの検出は、例えば、培養容器中の気相を少量採取し、ガスクロマトグラフィー分析することにより行われる。エチレンガス濃度が液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌを超えそうになったならば、又は超えたならば直ちに上記嫌気性ガスの通気又は培地の曝気を行うのが好ましい。ただし、連続的にかかる通気又は曝気を行ってもよい。
【００２３】
本発明では、連続的に培養液のｐＨを測定し、ｐＨ７．０以下のときには窒素ガスを通気し、ｐＨ８．０以上のときには上記混合ガスを通記することにより、ｐＨを７．０〜８．０に調整することが好ましい。
【００２４】
デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、塩素化エチレンの９０％以上がエチレンに分解されるまで培養を行うのが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実験例、実施例及び比較例について説明する。なお、実施例中のガス濃度は全て液中換算濃度である。
【００２６】
＜デハロコッコイデス属細菌に対するエチレンガスの阻害性についての実験例＞
密閉されたガラス瓶（雰囲気ガスは窒素）にエチレンガスを添加しないか又はエチレンガスが１０、５０、１００、２５０又は５００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。各ガラス瓶に合成培地（８０ｍＬ）を添加し、約１０ｍｇ／Ｌ（１８０ｕＭ）のＶＣガス（塩素化エチレンモノマー）を添加した後、デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を１％植菌して、３０℃で静置培養をおこなった。なお培地は、無機塩とビタミンを含み、クエン酸三ナトリウム二水和物を５００ｍｇ／Ｌ含む。試験はＮ＝２でおこない、一定時間後にＶＣガス濃度を測定し、分解率を求めた。
【００２７】
結果を表１に示す。エチレンガス添加濃度０〜５０ｍｇ／ＬまではＶＣ分解速度に優位な差は確認されなかった一方、エチレンガス添加濃度１００ｍｇ／Ｌでは６日後においてＶＣの分解速度が半減し、エチレンガス添加濃度２５０ｍｇ／ＬではＶＣ分解速度は１／３以下に低下したものの、１８日後にはＶＣの分解率はほぼ１００％に達した。これに対し、エチレン添加濃度５００ｍｇ／Ｌでは１８日経過後もＶＣの分解率は５７％であった。
【００２８】
これにより気相中のエチレンガスが５０ｍｇ／Ｌより高くなるとデハロコッコイデスの活性に阻害性があることが明らかになった。またエチレンガスが２５０ｍｇ／Ｌ以下であれば活性の低下が低減されることが分かった。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
［実施例１］
図３に示すように、撹拌機１ａを備えた１０Ｌの発酵槽１（雰囲気は窒素ガス）に上記実験例と同様の合成培地（クエン酸三ナトリウム二水和物含有量は２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）とＶＣガスを６ｍｇ／Ｌ添加し、密閉した。発酵槽１には、窒素ガスで洗浄後にガスを抜いた２Ｌ容のガスパック２が接続されている。クエン酸三ナトリウム二水和物０．１Ｍと硫化ナトリウム９水和物０．４ｍＭとを含む液が容器３からポンプ４を介して発酵槽１にクエン酸三ナトリウム二水和物として０．１ｍｍｏｌ／Ｌ−培養液／ｄａｙにて連続的に供給した。この容器３には窒素ガスを封入した１Ｌ容のガスパック５が接続されている。発酵槽の上部にはパージガスの給気管６、気相中の希釈ガスの排気管７が接続され、それぞれコック６ａ，７ａが介設されている。また給気管６は一端を液相中に配置し、排気管７の一端は気相中に配置する。ＶＣガスを６ｍｇ／Ｌ−培養液添加した後、デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を１０％植菌して、３０℃で５０ｒｐｍで撹拌しながら培養をおこなった。
【００３１】
気相のＶＣ濃度及びエチレンガス濃度を定期的に測定した。培養液を１０ｍＬ程度採取して定量ＰＣＲ法によりデハロコッコイデス属細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ（ＤＨＣ−１６Ｓ
ｒＤＮＡ）のコピー数を測定した。
【００３２】
ＶＣ濃度が０．６ｍｇ／Ｌ以下の場合には再度ＶＣガスを約６ｍｇ／Ｌになるように添加した。
【００３３】
培養１１日目にエチレンガス濃度が５０ｍｇ／Ｌを超えたため、コック６ａ、７ａを開として混合ガス（窒素：炭酸ガス＝８：２）を給気管６を通じて液中に曝気してパージをおこない、発酵槽１内の気相中エチレンガス濃度を１０ｍｇ／Ｌ以下に希釈し、希釈されたガスを排気管７を通じて放出した。パージが完了した後、コック６ａ、７ａを閉にした。培養１８日目にも同様の処理をおこなった。
【００３４】
ＶＣガス，エチレンガス（ＥＴＨ）、およびＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡの測定結果を図１に示す。培養２５日目でＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡは５×１０８ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに到達した。
【００３５】
［比較例１］
ガスパージを行わないこと以外は実施例１と同様の培養試験を行った。エチレンガス濃度は培養１１日目に５０ｍｇ／Ｌを超え、１５日目には１００ｍｇ／Ｌを超えたが、パージを実施しなかった。ＶＣガス，エチレンガス（ＥＴＨ）、およびＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡの測定結果を図２に示す。ＤＨＣ−１６Ｓ  ｒＤＮＡは培養２５日目で１×１０８ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ程度にしか達しなかった。
【００３６】
以上の実施例及び比較例１より、発酵槽内の気相中のエチレンガス濃度を液中換算濃度で２５０ｍｇ／Ｌ以下とすることにより、デハロコッコイデス属細菌の活性を高く保って培養できることが認められた。
【符号の説明】
【００３７】
１  発酵槽
２，５  ガスパック
３  容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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