(57)【要約】【課題】核酸反応を阻害しない核酸反応具を提供する。【解決手段】実施形態の核酸反応具は、基体と、前記基体の少なくとも１つの表面に互いに独立して配置された複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極上にそれぞれ固定されたプローブ核酸と、前記複数の第１の電極に対応して配置される検出信号取り出し部と、前記複数の第１の電極とそれらに対応する前記検出信号取り出し部とを接続するリードと、前記リード表面と前記基体の前記少なくとも１つの表面の露出部分とを覆う保護膜とを具備する。前記保護膜は、無機絶縁材料または有機絶縁材料から構成される。【選択図】図１
2013198422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と、前記基体の少なくとも１つの表面に互いに独立して配置された複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極上にそれぞれ固定されたプローブ核酸と、前記複数の第１の電極に対応して複数で配置される検出信号取り出し部と、前記複数の第１の電極とそれらに対応する前記検出信号取り出し部とを接続するリードと、前記リード表面と前記基体の前記少なくとも１つの表面の露出部分とを覆う保護膜とを具備し、前記保護膜が、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１である核酸反応具。
【請求項２】
更に、前記基体の前記少なくとも１つの表面の前記複数の第１の電極と同じ位置またはその近傍に配置された複数のプライマー固定化領域と、前記プライマー固定化領域に遊離可能に種類毎に固定された複数のプライマーセットを具備する請求項１に記載の核酸反応具。
【請求項３】
前記基体が板状形体である請求項１または２に記載の核酸反応具。
【請求項４】
前記第２の電極が、前記基体の前記少なくとも１つの表面の前記第１の電極が配置された領域とは異なる領域に互いに独立して配置される請求項３に記載の核酸反応具。
【請求項５】
更に、前記プローブ核酸固定化領域および前記プライマー固定化領域を含む領域を覆うように前記基体に取り付けられた被覆体を具備する請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸反応具。
【請求項６】
基体と、前記基体の前記少なくとも１つの表面の露出部分とを覆う保護膜と、前記保護膜上に互いに独立して配置された複数のプライマーセットとを具備し、前記保護膜が、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１である核酸反応具。
【請求項７】
前記保護膜が、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂を含む請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸反応具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、核酸反応具に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を増幅するための反応場では、プライマーと増幅されるべき核酸との間で増幅反応が行われる。ハイブリダイズが生じたことを検出することを利用する検出装置の反応場においては、プローブ核酸と検出されるべき核酸との間でハイブリダイゼーションが行われる。
【０００３】
プライマーと標的核酸との反応、およびプローブ核酸と標的核酸との反応は、核酸同士間で生じる核酸反応である。反応場においては、本来生じるべき反応が阻害されることなく行われる必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
核酸反応を阻害しない核酸反応具を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態の核酸反応具は、基体と、前記基体の少なくとも１つの表面に互いに独立して配置された複数の第１の電極と、前記複数の第１の電極上にそれぞれ固定されたプローブ核酸と、前記複数の第１の電極に対応して配置される検出信号取り出し部と、前記複数の第１の電極とそれに対応する前記検出信号取り出し部とを接続するリードと、前記リード表面と前記基体の前記少なくとも１つの表面の露出部分とを覆う保護膜とを具備する。前記保護膜は、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】核酸反応具を示す平面図。
【図２】核酸反応具を示す透視図。
【図３】核酸反応具を示す透視図。
【図４】核酸反応具を示す透視図。
【図５】核酸反応具を示す透視図。
【図６】チップ素材を示す図。
【図７】アレイ型プライマープローブチップを示す図。
【図８】アレイ型プライマープローブチップを示す図。
【図９】アレイ型プライマープローブチップを示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
現在、遺伝子検査技術の進展に伴い、臨床現場や犯罪捜査など、様々な場面で遺伝子検査が実施されている。これらの遺伝子検査では、複数の対象遺伝子を検出し、それらの結果を総合することで初めて有用なものとなることが多い。たとえば、臨床現場における病原菌特定などの目的での診断に利用される。その場合、その症状から感染が疑われる複数種の微生物、または各微生物の型が判定される。また、犯罪捜査現場における個人特定などの目的に利用される。その場合、全ての人がそのゲノム上に持っている複数の遺伝子座における繰り返し配列の繰り返し回数がそれぞれ検出される。各遺伝子座における繰り返し数が総合的に考慮され、高確率で個人が特定される。複数の対象遺伝子を検出する技術は非常に重要である。
【０００８】
そのような状況において開発されている核酸増幅装置および/または核酸検出装置の中には、核酸反応を阻害するものがあることが明らかになってきている。
【０００９】
本実施形態は、核酸反応を阻害しない核酸反応具を提供するものである。核酸反応具は、核酸増幅用反応具、核酸検出用反応具、核酸増幅検出用反応具であってよい。詳しくは、アレイ型プローブチップ、アレイ型プライマーチップおよびアレイ型プライマープローブチップであってもよい。
【００１０】
そのような核酸反応具は、反応場を構成する部材の表面に保護膜が形成される。ここで「反応場」とは、そこにおいて核酸反応が行われる場をいう。
【００１１】
保護膜は、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択される少なくとも１により構成される。
【００１２】
好ましい保護膜の例は、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂であり、またこれらを含む樹脂組成物であってもよい。また、ノボラック樹脂を使用する場合には、感光材を含まないことが好ましい。
【００１３】
保護膜は、核酸反応具の反応場を構成する部材の反応場に接するように形成されればよい。保護膜の形成は、保護膜材料の種類に応じてそれ自身公知の技術を利用して行えばよい。或いは保護膜は、反応場において、反応を阻害する可能性のある部材から問題となる物質が遊離することを防止するために適用されればよい。その場合、反応場に接触する部材の少なくとも一部分が保護膜で覆われればよい。
【００１４】
「標的配列」とは、プライマーセットにより増幅しようとする配列をいい、使用されるプライマーが結合する領域も含む。
【００１５】
「標的核酸」とは、標的配列を少なくとも含む配列であり、使用されるプライマーセットにより鋳型として使用される核酸であり、「鋳型核酸」とも称する。
【００１６】
「プライマーセット」とは、１つの標的核酸を増幅するために必要なプライマーの集合体である。例えば、ＰＣＲ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、１つの標的核酸を増幅するための１種類のフォワードプライマーと１種類のリバースプライマーとを含めばよい。また例えば、ＬＡＭＰ増幅用のプライマーセットの場合、１つのプライマーセットは、少なくとも１つの標的核酸を増幅するためのＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーを含めばよく、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、ＬＰプライマー、即ち、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーを含んでもよい。１つの反応具において増幅反応が行われる場合、そこにおいて行われる増幅は、一般的に１つの特定の増幅である。従って、ＬＡＭＰ増幅反応用の反応具の場合、１つの反応具に含まれる複数種類のプライマーセットとは、互いに異なる塩基配列からなる標的配列を増幅するための互いに異なるプライマーセットであってもよい。或いは、１つの反応具に含まれる複数種類のプライマーセットとは、特定の標的配列を増幅するための互いに異なるプライマーの組合せを有するプライマーセットであってもよい。
【００１７】
「目的配列」とは、当該アレイ型プライマープローブチップにより検出されるべき配列をいう。検出されるべき目的核酸は「目的配列」を含む。目的配列からなる核酸を「目的配列鎖」という。目的配列鎖は、その相補配列を含むプローブ核酸とハイブリダイズし、このハイブリダイズの有無または量が検出されて、目的核酸の有無または量が検出または測定される。
【００１８】
「ハイブリダイズ信号」とは、プローブ核酸とその相補配列とのハイブリダイズにより生じる信号であり、当該マイクロアレイの検出方式により、例えば、電流値、蛍光光度、発光光度などとして検出される検出信号を総称するものである。
【００１９】
「試料」とは、核酸反応具により増幅および/または検出されるべき核酸を含む物質であればよい。試料は、これらに限定するものではないが、例えば、血液、血清、白血球、尿、便、精液、唾液、組織、バイオプシー、口腔内粘膜、培養細胞、喀痰等であってよく、または何らかのそれ自身公知の手段によって、前記の何れかまたはその混合物から核酸成分に抽出されたものであってもよい。
【００２０】
以下に、核酸反応具の例を記載する。個々に示される例は、核酸反応具としてのアレイ型プローブチップ、アレイ型プライマーチップおよびアレイ型プライマープローブチップを記載する。
【００２１】
１．アレイ型プローブチップ
アレイ型プローブチップ１の実施態様の模式図を図１に示した。アレイ型プローブチップ１は、基体１１に電極１２を備える。電極１２の電気的情報を取り出すための信号取り出し部１３が各電極１２に対応する位置に配置される。電極１２と信号取り出し部１３はリード１４により接続される。プローブ核酸１５は、電極１２の表面に固定化される。電極１２表面を除く基体１１の表面およびリード１４の表面が保護膜１３により覆われている。
【００２２】
保護膜１３の形成は、所望の部位に対して塗布により行われてもよく、或いはパターニング、マスキングおよびエッチングなどの技術を利用して全体に保護膜を形成した後に所望の部位に所望の大きさおよび形状の保護膜を形成してもよい。少なくともリード１４を覆って、リード１４と反応液との接触を防止してもよい。或いは、少なくとも反応液と接触する領域に保護膜を形成してもよい。
【００２３】
基体１１は、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ２、ＳｉＮまたはＡｌ２Ｏ３などから製造することができるが、これに限定されない。好ましくは、自身電気的および化学的に不活性なそれ自身公知の何れかの材質により構成される。
【００２４】
電極１２の製造は、公知の手段によって行えばよい。電極は、特に限定されるものではないが、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムおよびタングステン等の金属単体およびそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボンのような炭素、およびこれらの酸化物又は化合物で製造することができる。
【００２５】
プローブ核酸１５の電極１２への固定化は、化学的結合により行われてもよく、プローブ核酸液のスポッティングと乾燥により行われてもよい。
【００２６】
プローブ核酸１５と試料核酸（図示せず）とのハイブリダイズにより生じるハイブリダイズ信号は、電極１２により伝達され、信号取り出し部１３から取り出される。
【００２７】
図１に示したアレイ型プローブチップ基体は、１０個の電極１２を備えるが、これに限定されず、1つの基体に配置される電極の数は任意に変更できる。また電極の配置パターンも図に示したものに限定されず、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。基体１１には、必要に応じて、参照電極および対極を設けてもよい。
【００２８】
基体２２は、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレート、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよいもよい。
【００２９】
基体２２が、容器形状を有する形状、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートの場合、容器内部に反応液が収納されて反応場が形成されてよい。更に、アレイ型プローブチップには蓋体が具備されてもよい。蓋体は、容器形状または板形状の基体２２の少なくともプローブ核酸１５が固定化された領域を覆うように構成されればよい。蓋体は、板状であってよい。板状の蓋体の一部に溝などの凹部が形成されていてもよい。蓋体の凹部と基体２２との間の空間に反応場が形成されてよい。
【００３０】
基体２２が、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状である場合、それらが反応液を含む更なる容器内部に浸漬されることにより反応場が形成されてもよく、基体２２に配置されたプローブ核酸が固定化された領域に反応液を載せることにより反応場が形成されてもよい。
【００３１】
２．アレイ型プライマーチップ
アレイ型プライマーチップの１例を図２（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を参照しながら説明する。
【００３２】
図２（ａ）は、アレイ型プライマーチップの１例の斜視図である。図２（ａ）に記載のアレイ型プライマーチップ２１は、その内壁に保護膜２０が形成されている容器２２を具備する。保護膜２０が形成された基体２２の底面２３には、互いに独立した複数の固定化領域２４が配置される。図２（ｂ）は固定化領域２４の部分を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つの固定化領域２４には１つの種類のプライマーセット２５が固定される。複数の固定化領域２４のそれぞれには、１組毎に複数のプライマーセット２５がそれぞれ固定される。
【００３３】
プライマーセット２５は、増幅しようとする標的核酸の種類に応じて複数種類が用意される。１つの固定化領域２４には、特定の１つの標的核酸を増幅するための１つのプライマーセット２５が固定される。例えば、ＰＣＲ増幅のためには、１つのプライマーセットには、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なフォワードプライマーとリバースプライマーとが含まれる。また、ＬＡＭＰ増幅のためには、1つのプライマーセットは、１種類の特定の標的核酸を増幅するために必要なＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、必要に応じてＦ３プライマー、Ｂ３プライマー、およびＬＰプライマーが含まれる。
【００３４】
プライマーセット２５は、反応場を提供するための液相と接触して遊離するように遊離可能な状態で固定化領域２４に固定される。プライマーセット２５の固定化領域２４への固定化は、例えば、１組のプライマーセットを含む溶液を１つの固定化領域２４に滴下し、その後乾燥させることにより達成することが可能である。更に、同様に、他の固定化領域２４について、それぞれ所望のプライマーセット２５を含む溶液を滴下および乾燥し、所望する数の複数のプライマーセットを基体２２に固定すればよい。これにより、基体２２の１つの面に独立して配置される全ての固定化領域２４にプライマーセット２５が固定される。しかしながら、プライマーセット２５の固定化領域２４への固定化は、反応場を提供するための液相と接触して遊離可能な状態で固定されればよい。従って、そのような固定化が可能なそれ自身公知の何れの固定化法が使用されてもよい。プライマーセットを含む溶液を滴下する方法の場合、プライマーセットを含む溶液は、例えば、水、緩衝液または有機溶剤などであってよい。
【００３５】
基体２２に配置される複数の固定化領域２４は、互いに独立して配置されればよい。独立して配置されるとは、反応場においてプライマーセット毎に開始および／または進行される増幅を妨げることのない間隔で配置されることである。例えば、隣り合う固定化領域２４は、互いに接して配置されてもよく、僅かな距離を隔てて互いに近傍に配置されてもよく、或いは、通常使用される所謂ＤＮＡチップなどの検出装置において固定化されるプライマーセットと同様な距離を隔てて互いに配置されてもよい。
【００３６】
例えば、隣り合う固定化領域２４の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００３７】
反応場を提供するための液相は、固定されたプライマーセットが遊離された後に、それらを用いて増幅反応を進行できる液相であればよく、例えば、所望の増幅に必要な反応液であってよい。
【００３８】
図２（ａ）および（ｂ）に示した核酸反応具は、基体２２が容器形状の例である。容器形状の基体２２は、例えば、チューブ、ウェル、チャンバー、流路、カップおよびディッシュ並びにそれらを複数個備えたプレート、例えば、マルチウェルプレートなどであってよい。また基体の材質は、どのような材質であってもよい。基体２２は、上述したアレイ型プローブチップと同様の基体材料を使用してよい。また、基体２２は板形状であってもよい。更に、アレイ型プライマーチップには蓋体が具備されてもよい。蓋体は、容器形状または板形状の基体２２の少なくともプライマー２５が固定化された領域を覆うように構成されればよい。蓋体は、板状であってよい。板状の蓋体の一部に溝などの凹部が形成されていてもよい。蓋体の凹部と基体２２との間の空間に反応場が形成されてよい。
【００３９】
核酸反応具はまた、図２（ｃ）に示すような板状の基体２２の少なくとも１つの面２３に配置されたプライマー固定化領域２４にプライマーセット２５が固定されてもよい。この場合、反応場は、少なくとも基体２２のプライマーセット２５が固定化された領域に対して、反応液を載せることにより形成されればよい。この場合、基体２２の面２３に凹部および/または凸部が形成されてもよく、或いはこれらの凹部および/または凸部により流路が形成されてもよい。プライマー固定化領域２４およびプライマーセット２５は、基体２２の凹部内に配置されてもよく、複数の凸部に囲まれた領域に配置されてもよい。また、基体２２が、反応容器を含む容器内に配置されることにより反応場が形成されてもよい。この場合、基体２２は、板状、球状、棒状およびそれらの一部分からなる形状であってよい。
【００４０】
保護膜の形成は、それ自身公知の何れの技術を利用してもよい。
【００４１】
図２（ａ）および（ｂ）では、固定化領域２４が基体２２の底面のみに配置された例を示したが、これに限定するものではない。基体２２の内部側の少なくとも一部分に配置されればよく、底面および内部側面、蓋体により形成される天井面のいずれか、または全てに配置されてもよい。
【００４２】
図３には、上記のアレイ型プライマーチップ３１を用いた核酸増幅反応の様子を示す図である。図３（ａ）は反応前のアレイ型プライマーチップ３１である。内面に保護膜が形成された基体３２の底面に配置された複数の固定化領域３３に複数のプライマーセット３４がそれぞれ固定されている。アレイ型プライマーチップ３１に反応液３６を添加し、それを収容した状態を図３（ｂ）に示す。
【００４３】
反応液３６は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでもよい。
【００４４】
図３（ｂ）に示すように、反応液３６を添加された後のアレイ型プライマーチップ３１では、図３（ｃ）に模式的に示すように、保護膜が形成された底面に固定されたプライマーセットが遊離し徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域３５で表す。遊離し、拡散していくプライマーセットは、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定化されたプライマーセットは、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセットを用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液３６により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域３５内のみで進行する場合には、領域３５が反応領域と解される。
【００４５】
上記の例では、プライマーセットのみが基体に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセットが種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーと共に基体に固定してもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーと一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなアレイ型プライマーチップにおいて、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。
【００４６】
３．アレイ型プライマープローブチップ
更なる実施形態の例を図４に示す。この実施形態は、上記の基体と、基体の少なくとも１面に固定化されたプローブ核酸と、遊離可能に固定化されたプライマーとを含む。この実施形態は、アレイ型プライマープローブチップと称してもよい。アレイ型プライマープローブチップは、プローブ核酸とプライマーとを１つの基体に備える核酸反応具である。基体についての構成は、上述したアレイ型プローブチップおよびアレイ型プライマーチップと同様であってよい。
【００４７】
図４（ａ）は、アレイ型プライマープローブチップの１例の斜視図である。図４（ａ）に記載のアレイ型プライマープローブチップ４１は、容器形状の基体４２を具備する。基体４２の内壁には保護膜４３が形成されている。基体４２の内部底面４４の保護膜４３上には、互いに独立した複数のプライマー固定化領域４５が配置される。複数のプライマー固定化領域４５に近接して、またそれぞれのプライマー固定化領域に対応して複数のプローブ固定化領域４６が配置される。
【００４８】
図４（ｂ）はプライマー固定化領域４５を拡大した模式図である。そこに示されるように、１つのプライマー固定化領域４５には１つの種類のプライマーセット４７が固定される。複数のプライマー固定化領域４５のそれぞれには、セット毎に複数のプライマーセット４５がそれぞれ固定される。
【００４９】
プライマーセット４７は上述したアレイ型プライマーチップと同様に固定されればよい。
【００５０】
図４（ｃ）は、プライマー固定化領域４５に近接して配置されたプローブ固定化領域４６の拡大図である。プローブ固定化領域４６には、検出されるべき所望の配列の相補配列を含むプローブ核酸４８が複数で固定化される。
【００５１】
検出されるべき所望の配列は、プローブ核酸の相補配列であってよい。プローブ固定化領域４５は、プローブ核酸４８とその目的配列とのハイブリダイズ信号が、複数のプローブ固定化領域４６間で独立して検出されるように配置される。
【００５２】
プローブ核酸４８のプローブ固定化領域４６への固定は、それ自身公知の所謂ＤＮＡチップにおいて基板表面に対してプローブ核酸を固定する一般的な何れの技術を利用してもよい。プローブ核酸４８の固定化の後にプライマーセット４７が固定されてもよく、プライマーセット４７を固定した後にプローブ核酸が固定化されてもよい。また、プライマーセット４７の固定とプローブ核酸４８の固定化を同時に行ってもよい。
【００５３】
例えば、隣り合うプローブ固定化領域４６の間の距離は、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００５４】
また例えば、プローブ固定化領域４６とプライマー固定化領域４５の間の距離は、０μｍ〜０．１μｍ、０．１μｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜１ｍｍ、１ｍｍ〜１０ｍｍ、またはそれ以上でもよく、好ましくは、１００μｍ〜１０ｍｍであってよい。
【００５５】
例えば、プローブ固定化領域４６とプライマー固定化領域４５の間の距離が０μｍである場合には、プローブ固定化領域４６とプライマー固定化領域４５は、基体表面の同じ位置にあると解されてよい。また、プローブ固定化領域４６がプライマー固定化領域４５に含まれてもよく、プライマー固定化領域４５がプローブ固定化領域４６に含まれてもよい。
【００５６】
図５に、このアレイ型プライマープローブチップ４１を用いて行われた核酸増幅反応後の反応場の様子を示す模式図である。図５（ａ−１）および（ｂ−１）は、反応前のアレイ型プライマープローブチップ４１である。基体４２の内壁には保護膜４３が形成されている。基体４２の内部の底面４４の保護膜４３上に配置された複数のプライマー固定化領域４５に複数のプライマーセット４７がそれぞれ固定されている。それぞれのプライマー固定化領域４５に対応して、それぞれの近傍にプローブ固定化領域４６が配置される。プローブ固定化領域４６には、複数のプローブ核酸４８が種類毎に固定化されている。
【００５７】
アレイ型プライマープローブチップ４１に反応液５０を添加し、それを収容した状態を図５（ａ−２）および（ｂ−２）に示す。
【００５８】
反応液５０は、所望の増幅反応に必要な成分を含めばよい。これらに限定するものではないが、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤を含んでよい。
【００５９】
反応場への試料の添加は、アレイ型プライマープローブチップ４１に反応液５０を添加する以前に反応液５０に予め添加することにより行ってもよく、反応液５０をアレイ型プライマープローブチップ４１に添加した後に行ってもよく、アレイ型プライマープローブチップ４１に反応液５０を添加する以前に試料をアレイ型プライマープローブチップ４１に添加することにより行ってもよい。
【００６０】
図５（ａ−２）および（ｂ−２）に示すように反応液５０を添加された後のアレイ型プライマープローブチップ４１では、図５（ａ−３）および（ｂ−３）に模式的に示すように、底面４４の保護膜４３上に固定されたプライマーセット４７が遊離し徐々に拡散する。遊離および拡散した領域を模式的に領域５１で示す。遊離し、拡散していくプライマーは、その近傍に存在する鋳型核酸、ポリメラーゼおよび基質などの増幅に必要な他の成分と出会い、増幅反応が開始される。種類毎に独立して複数固定されたプライマーセットは、その種類毎に独立して鋳型核酸について増幅反応を開始および進行することが可能である。それにより、複数種類のプライマーセットを用いた複数の鋳型配列についての増幅が、独立に、且つ同時に達成される。ここにおいて、「反応場」は、理論上、そこにおいて増幅反応の進行が可能な反応液５０により規定される領域、即ち、反応液が存在する領域という。また、反応場のうち、実際にそこにおいて増幅反応が開始され進行する領域を「反応領域」という。仮に実際に増幅反応が領域５１内のみで進行する場合には、領域５１が反応領域と解される。図５（ａ−３）の図は、全てのプライマー固定化領域４５に固定されたプライマーセットにより増幅反応が生じた場合の模式図である。図５（ｂ−３）は、固定されたプライマーセットにより、底部４４の保護膜４３上に形成された全てのプライマー固定化領域４５のうちの一部分、図５（ｂ−３）では３つの領域のみにおいて増幅が生じた場合の模式図である。
【００６１】
プローブ固定化領域４６は、領域５１において増幅された増幅産物中に目的配列を含む核酸が存在した場合、その核酸とハイブリダイズする。プローブ固定化領域４６に固定されたプローブ核酸４８は、対応するプライマー固定化領域４５における増幅産物とのみハイブリダイズするように固定される。即ち、１つのプローブ固定化領域４６に固定されたプローブ核酸４８は、対応するプライマー固定化領域４５における増幅産物とのみハイブリダイズするように距離を維持してそれぞれのプローブ固定化領域４６およびプライマー固定化領域４５が配置される。
【００６２】
プローブ核酸４８とその目的配列とのハイブリダイズの検出は、それ自身公知のハイブリダイズ信号の検出手段により行われてよい。例えば、予めプライマーに蛍光物質を付与してもよく、オキシヌクレオシド三リン酸などの基質に蛍光物質を付与してもよい。それらの蛍光物質からの蛍光強度を指標にハイブリダイズの有無および量が決定されてもよい。或いは、電気化学的手段によりハイブリダイズ信号が検出されてもよい。
【００６３】
ハイブリダイズの検出は、アレイ型プライマープローブチップ４１内部の洗浄後に実行されてもよく、洗浄を行わずに実行されてもよい。電気化学的手段により検出する場合には、インタカレータを用いてハイブリダイズ信号を検出してもよい。この場合、例えば、予め反応液５０にインタカレータを含ませておいてもよく、ハイブリダイズ反応が開始する前、ハイブリダイズ反応中、ハイブリダイズ反応後に添加してもよい。これらの場合、何れもアレイ型プライマープローブチップ４１内部の洗浄後に検出を行ってもよく、洗浄を行わずに検出を実行してもよい。ハイブリダイズ反応の開始、反応中、反応後の判定は、プライマー、プローブ核酸および鋳型核酸の配列、反応温度などの反応条件に応じて行ってもよく、予備実験により決定してもよい。
【００６４】
当該プライマーの長さは、これに制限されるものではないが、約５塩基以上、約６塩基以上、約７塩基以上、約８塩基以上、約９塩基以上、約１０塩基以上、約１５塩基以上、約２０塩基以上、約２５塩基以上、約３０塩基以上、約３５塩基以上、約４０塩基以上、約４５塩基以上または約５５塩基以上であってよく、約８０塩基以下、約７５塩基以下、約７０塩基以下、約６５塩基以下、約６０塩基以下、約５５塩基以下、約５０塩基以下、約４５塩基以下、約４０塩基以下、約３５塩基以下、約３０塩基以下、約２５塩基以下、約２０塩基以下、約２５塩基以下または約２０塩基以下であってもよく、これらの下限上限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。例えば、好ましい塩基長の例は、約１０塩基〜約６０塩基、約１３〜４０塩基、約１０〜３０塩基などであってよい。また、１つの固定化領域に同時に固定されるプライマーの長さは、全てのプライマーで同じであってもよく、全てのプライマーで異なっていてもよく、一部のプライマーが同じ長さであってもよく、一部のプライマーが異なる長さであってもよい。また、プライマーセット毎に異なってもよい。また、１つの固定化領域に固定されるプライマーセットが、種類毎に異なる長さであってもよく、１つの固定化領域に固定されるプライマーセットが全て同じ長さであってもよい。
【００６５】
プローブ核酸の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。プローブ核酸は、検出されるべき目的配列の相補配列を含む。プローブ核酸は、目的配列の相補配列に加えて更なる配列例えば、スペーサ配列などを含んでもよい。
【００６６】
標的配列の長さは、例えば、１０塩基〜１００塩基、１００塩基〜２００塩基、塩基２００〜３００塩基、３００塩基〜４００塩基、好ましくは１００塩基〜３００塩基であってよい。
【００６７】
目的配列の長さは、例えば、３塩基〜１０塩基、１０塩基〜２０塩基、２０塩基〜３０塩基、３０塩基〜４０塩基、４０塩基〜５０塩基、５０塩基〜６０塩基、好ましくは１０塩基〜５０塩基であってよい。
【００６８】
１つのプライマー固定化領域に固定されるプライマーセットの種類は、１種類の標的核酸を増幅するための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。
【００６９】
１つのプローブ固定化領域に固定されるプローブ核酸群の種類は、１種類の目的配列とハイブリダイズするための１種類であってもよく、２種類以上の標的核酸をそれぞれ増幅するために複数種類であってもよい。また、目的配列の部分が共通であり、更に他の目的配列とは異なる配列を含むプローブ核酸であってもよい。
【００７０】
１つのアレイ型プライマープローブチップに配置されるプライマー固定化領域の数の下限は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上、１２５以上、１５０以上、１７５以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、１０００以上、１５００以上、２０００以上であってよく、上限は、１００００以下、５０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、１０００以下、５００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下であってよく、これらの上限下限の何れかを組み合わせた範囲であってもよい。
【００７１】
１つのアレイ型プライマープローブチップに配置されるプライマー固定化領域とプローブ固定化領域の数は同じであっても異なっていてもよい。即ち、全てのプライマー固定化領域に対応するように同数のプローブ固定化領域が配置されてもよく、プライマー固定化領域の数がプローブ固定化領域の数よりも多くてもよく、プライマー固定化領域の数がプローブ固定化領域の数よりも少なくてもよい。また、増幅反応状態を確認するため、またはハイブリダイズ反応の状態を確認するためのポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールを含ませてもよい。このようなポジティブコントロールおよび／またはネガティブコントロールは、プライマーセットおよび／またはプローブ核酸についてそれぞれ設けてもよい。
【００７２】
上記の例では、プライマーセットのみが基体に固定化された例を示した。しかしながら、これに限定されるものではなく、プライマーセットが種類毎に各固定化領域に固定される条件において、増幅に必要な他の成分、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素、基質、基質および／または緩衝剤などをプライマーと共に基体に固定してもよい。その場合、固定しようとする物質をプライマーと一緒に所望の液体媒体に含ませて、上述の方法と同様に滴下および乾燥などにより固定すればよい。そのようなアレイ型プライマープローブチップにおいて、増幅反応を行う場合には、固定された成分に応じてそこに添加される反応液の組成が選択されればよい。
【００７３】
第４の実施形態のアレイ型プライマープローブチップを図６〜図９を参照しながら説明する。
【００７４】
（１）チップ素材
まず、電気化学的検出によりハイブリダイズ信号を検出するアレイ型プライマープローブチップのチップ素材の構成および製造方法の１例について図６（ａ）および（ｂ）を用いて説明する。図６（ａ）は、チップ素材の平面図であり、図６（ｂ）は、図６（ａ）のチップ素材の線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【００７５】
チップ素材９１は、矩形状の基板８１上にその長手方向に沿って配置された例えば４つの電極８４ａ〜８４ｄを備えている。各電極８４ａ〜８４ｄは、第１の金属薄膜パターン８２および第２の金属薄膜パターン８３をこの順序で積層した構造を有する。また、各電極８４ａ〜８４ｄは大矩形部８５と小矩形部８６を細線８７で連結した形状を有する。絶縁性の保護膜８８は、各電極８４ａ〜８４ｄを含む基板８１上に被覆されている。円形窓８９は、大矩形部８５に対応する絶縁性の保護膜８８部分に開口されている。矩形窓９０は、小矩形部８６に対応する絶縁性の保護膜８８部分に開口されている。電極８４ａの円形窓８９から露出する大矩形部８５は第１の作用極９２ａとして機能する。電極８４ｂの円形窓８９から露出する大矩形部８５は第２の作用極９２ｂとして機能する。電極８４ｃの円形窓８９から露出する大矩形部は対極９３として機能する。電極８４ｄの円形窓８９から露出する大矩形部は参照極９４として機能する。また、電極８４ａ〜８４ｄの矩形窓９０から露出する小矩形部８６はプローバー接触部として機能する。
【００７６】
このようなチップ素材は、次のような方法により作製することができる。
【００７７】
まず、基板８１上に第１の金属薄膜および第２の金属薄膜を例えば、スパッタリング法または真空蒸着法によりこの順序により堆積する。続いてこれらの金属薄膜を例えば、レジストパターンをマスクとして順次選択的にエッチングして、第１の金属薄膜パターン８２および第２の金属薄膜パターン８３をこの順序で積層した、例えば４つの電極８４ａ〜８４ｄを基板８１の長手方向に沿って形成する。これらの電極８４ａ〜８４ｄは、大矩形部８５と小矩形部８６を細線８７で連結した形状を有する。
【００７８】
次いで、電極８４ａ〜８４ｄを含む基板８１上に、保護膜８８を例えば、スパッタリング法またはＣＶＤ法により堆積する。続いて、各電極８４ａ〜８４ｄの大矩形部８５に対応する保護膜８８部分および小矩形部８６に対応する保護膜８８部分を、レジストパターンをマスクとして選択的にエッチングして、大矩形部８５に対応する絶縁性の保護膜８８部分に円形窓８９を、および小矩形部８６に対応する絶縁性の保護膜８８部分に矩形窓９０を開口する。それにより前述したチップ素材９１を作製する。
【００７９】
基板８１は、例えば、パイレックス（登録商標）ガラスのようなガラスまたは樹脂から作られる。
【００８０】
第１の金属薄膜は、第２の金属薄膜を基板８１に密着させるための下地金属膜として働き、例えば、Ｔｉから作られる。第２の金属薄膜は、例えば、Ａｕから作られる。
【００８１】
第１および第２の金属薄膜をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【００８２】
絶縁性の保護膜８８は、ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホン、並びにガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素および金属酸化物からなる群より選択されればよい。例えば、シリコン酸化膜のような金属酸化膜、シリコン窒化膜のような金属窒化膜であってもよい。
【００８３】
絶縁性の保護膜８８をパターニングするときのエッチングの例は、エッチングガスを用いるプラズマエッチングまたは反応性イオンエッチングを含む。
【００８４】
（２）アレイ型プライマープローブチップ
次に、上記（１）において製造されたチップ素材９１にプライマーセットとプローブ核酸を固定したアレイ型プライマープローブチップの構成および製造方法の１例を図７（ａ）および図７（ｂ）を参照しながら説明する。図７（ａ）はアレイ型プライマープローブチップの平面図であり、図７（ｂ）は図７（ａ）のアレイ型プライマープローブチップの線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【００８５】
チップ素材９１上に形成された電極８４ａの第１の作用極９２ａを第１のプローブ固定化領域とし、この第１のプローブ固定化領域に第１の目的配列の相補配列を含む第１のプローブ核酸９５ａを固定する。固定される第１のプローブ核酸９５ａは、その複数本を１つのプローブ核酸群として固定される。同様に、電極８４ｂの第２の作用極９２ｂを第２のプローブ固定化領域とし、この第２のプローブ固定化領域に第１の目的配列とは異なる第２の目的配列の相補配列を含む第２のプローブ核酸９５ｂを固定する。
【００８６】
プローブ核酸９５ａおよび９５ｂをプローブ固定化領域に固定する方法の例は、金電極を具備したチップ素材９１については３’末端にチオール基を第１のプローブ核酸９６ａに導入する方法などが含まれる。
【００８７】
次いで、第１の作用極９２ａの近傍に第１のプライマー固定化領域９６ａを、第２の作用極９２ｂの近傍に第２のプライマー固定化領域９６ｂを配置する。この第１のプライマー固定化領域９６ａ上に第１のプライマーセット９８ａを、第２のプライマー固定化領域９６ｂ上に第２のプライマーセット９８ｂを固定する。それによりアレイ型プライマープローブチップを作製する。
【００８８】
第１のプライマーセット９８ａは第１の標的配列を増幅するように設計された配列を有し、第２のプライマー固定化領域９６ｂは第１の標的配列とは異なる配列からなる第２の標的配列を増幅するように設計された配列を有する。
【００８９】
第１および第２のプライマーセット９８ａおよび９８ｂをそれぞれ第１および第２のプライマー固定化領域９６ａおよび９８ｂへの固定は例えば、水、緩衝液または有機溶剤のような液体にプライマーセットを含ませて滴下して、その後例えば、室温などの適切な温度条件下で乾燥するまでの時間例えば、室温の場合では１０分間放置することにより行う。
【００９０】
（３）使用時のアレイ型プライマープローブチップ
上記（２）において作製されたアレイ型プライマープローブチップの使用方法について図８および図９を参照しながら説明する。
【００９１】
図８（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップの平面図であり、図８（ｂ）は、図８（ａ）のアレイ型プライマープローブチップの線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。
【００９２】
本実施形態のアレイ型プライマープローブチップ９１を使用する場合、電極８４ａ〜８４ｄにそれぞれ形成された第１の作用極９２ａ、第２の作用極９２ｂ、対極９３および参照極９４、並びに第１のプライマー領域９６ａおよび第２のプライマー領域９６ｂが同じ１つの反応場に含まれるように反応液が維持される。そのために、例えば、シリコンゴムのようなシリコン樹脂および／またはフッ素樹脂などのような樹脂を例えば、押出成形、射出成形または型押成形および／または接着剤による接着などのそれ自身公知の何れかの樹脂成形法により成形された被覆体１０１が、アレイ型プライマープローブチップ９１の使用前にアレイ型プライマープローブチップ９１上に装着される。被覆体１０１が装着された後に、鋳型核酸１０３を含む反応液１０２がアレイ型プライマープローブチップ９１と被覆体１０１とにより形成される空間に添加される。
【００９３】
被覆体１０１が装着されたアレイ型プライマープローブチップ９１において、電極８４ａ〜８４ｄのそれぞれの矩形窓９０から露出する小矩形部８６は露出している。
【００９４】
被覆体１０１をアレイ型プライマープローブチップ９１に装着する例は、例えば、圧着、接着剤による接着などが含まれる。
【００９５】
次いで、反応液１０２は被覆体１０１がアレイ型プライマープローブチップ９１に装着された後に添加される。
【００９６】
アレイ型プライマープローブチップ９１と被覆体１０１とにより形成される空間に液体を添加する方法は、例えば、被覆体１０１の一部に開口部を予め設けておき、その開口部から添加してもよく、また先端の鋭利な例えば、針のような先端を有した注入器を用いて被覆体１０１の一部に差し込んで添加してもよい。
【００９７】
反応液１０２は、試料と、増幅試薬、例えば、ポリメラーゼなどの酵素、プライマーを起点とし新たなポリヌクレオチド鎖を形成する際に必要なでオキシヌクレオシド三リン酸などの基質、逆転写を同時に行う場合には、逆転写酵素およびそれに必要な基質など、更に、適切な増幅環境を維持するための塩類などの緩衝剤および例えば、ヘキスト３３２５８のような２本鎖核酸を認識して信号を生ずるインタカレータを含む。検査されるべき試料中に特定のプライマー固定化領域に固定されたプライマーセットにより増幅されるべき標的配列を含む鋳型核酸が存在した場合、そのプライマー固定化領域とそれに対応するプローブ固定化領域を含む反応場において増幅産物が形成される。その様子を模式的に図９に示す。
【００９８】
図９（ａ）は、反応場１１１において増幅産物が形成された状態を模式的に示す。図９（ａ）は、使用時のアレイ型プライマープローブチップの平面図であり、図９（ｂ）は、図９（ａ）のアレイ型プライマープローブチップの線Ｂ−Ｂに沿う断面図である。上述のように図８において添加された試料中には、第２のプライマーセット９８ｂが結合できる配列を含む核酸が含まれていたために、図９（ａ）および図９（ｂ）に示すように、反応場１１１に第２のプライマーセットは遊離および拡散し、鋳型核酸と出会った後に増幅反応が行われ、それにより増幅産物が形成される。第２のプライマーセット９８ｂによる増幅産物は、第２のプライマー固定化領域９７ｂの周辺に拡散し、第２のプローブ固定化領域９２ｂに到達する。到達した増幅産物が、目的配列を含む場合、第２のプローブ核酸９５ｂと増幅産物がハイブリダイズして２本鎖核酸を形成する。この２本鎖核酸に対して、反応液１０２に含まれるインタカレータが結合してハイブリダイズ信号を生じる。
【００９９】
ハイブリダイズ信号は、例えば、電極８４ａ〜８４ｄのそれぞれの矩形窓９０から露出する小矩形部８６にプローバーを接触させ、ヘキスト３３２５８のようなインタカレータの電流応答を測定することにより行われる。
【０１００】
電気化学的検出を利用するアレイ型プライマープローブチップを使用することによって、より簡単に且つ短時間に試料に含まれる標的核酸を増幅した後に、その増幅産物に含まれる目的核酸の検出を行うことが可能である。
【０１０１】
４．検出方法
アレイ型プローブチップおよびアレイ型プライマープローブチップを用いて核酸の検出を行う場合、次のように行ってよい。
【０１０２】
（ａ）電流検出方式
電気化学的に２本鎖核酸を検出する方法を説明する。この方法では、２本鎖核酸を特異的に認識する２本鎖認識体を用いる。２本鎖認識体の例には、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーターなどが含まれるが、これらに限定されない。更に、これらの物質を電気化学的に活性な金属錯体、例えばフェロセン、ビオロゲンなどで修飾することも可能である。
【０１０３】
２本鎖認識体の濃度はその種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲で使用する。この際には、イオン強度０．００１〜５の範囲でｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いればよい。
【０１０４】
ハイブリダイゼーション反応中又は反応後、反応溶液中に２本鎖認識体を添加する。ハイブリダイズによって２本鎖核酸が生じている場合は、２本鎖認識体がこれに結合する。そこで、例えば２本鎖認識体が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加して、２本鎖認識体に由来する反応電流値を測定することができる。この際、電位は定速で印加するか、あるいは、パルスで印加するかあるいな定電位を印加してもよい。測定の際に、例えばポテンショスタット、デジタルマルチメーター、およびファンクションジェネレーターなどの装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。例えば特開平１０−１４６１８３号公報に記載された公知の電気化学的検出手段が好適に用いられる。
【０１０５】
（ｂ）蛍光検出法
蛍光によって２本鎖核酸を検出する方法を説明する。プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーについて、予め蛍光学的に活性な物質で標識しておく。または、蛍光学的に活性な物質で標識した２次プローブ核酸を用いて検出する。或いは、複数の標識を使用してもよい。蛍光学的に活性な物質は、これらに限定されないが、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、もしくはローダミンなどの蛍光色素を含む。蛍光物質は、例えば蛍光検出器を用いて検出される。標識の種類に応じた適宜の検出装置を用い、標識された検出配列又は２次プローブ核酸を検出する。
【０１０６】
[例]
＜例１＞
核酸反応に対する保護膜の影響を検討するために、プライマーを固定化せずに流路を反応場として有する増幅用チップにおいて増幅反応を行った。その後、アレイ型プローブチップにより検出を行った。
【０１０７】
１．チップ素材の作製
ウェハサイズのパイレックスガラスを板状の基体（即ち、基板）として使用した。表面にスピンコーターで保護膜材料を塗布した。保護膜材料としてネガ型レジスト（エポキシ）、ポジ型レジスト（ノボラック、ポリオレフィン）、感光剤を含まない材料（ノボラック）を使用した。
【０１０８】
各材料を塗布した後、基板を乾燥オーブンに入れ１５０℃にてプレベークを実施し、膜を乾燥させた。
【０１０９】
続いて、ネガ型フォトレジスト材料の場合は、密着型露光機にて４００ｍJにて露光を行った後、現像処理を行った。ポジ型レジスト材料の場合は、露光処理は行わずに現像処理のみ行った。フォトレジスト以外の材料については、露光、現像処理は行わなかった。
【０１１０】
乾燥オーブンで１６０℃にてポストベークを行い、膜を完全に硬化させた。硬化後、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｒｙ  ｅｔｃｈｉｎｇ  （ＣＤＥ）処理２分行いチップ素材を形成した。
【０１１１】
２．増幅用チップ
予め流路を形成したシリコンゴムを前記チップ素材に取り付けた。これを増幅用チップとした。
【０１１２】
３．ＬＡＭＰ反応液の作製とＬＡＭＰ反応
使用したプライマーの塩基配列を表１に示す。
【表１】
2013198422.tif 000003
【０１１３】
ＬＡＭＰ反応液の組成を表２に示す。
【表２】
2013198422.tif 000004
【０１１４】
ＬＡＭＰ反応液に使用するＲｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅの組成を表３に示す。
【表３】
2013198422.tif 000005
【０１１５】
ＬＡＭＰ反応液に含まれる鋳型の塩基配列を表４に示す。
【表４】
2013198422.tif 000006
【０１１６】
増幅用チップの流路に、ＬＡＭＰ反応液を５０ｕＬ注入し、ペルチェ温度を６３℃に設定したジェネライザー内にセットし、１時間ＬＡＭＰ反応を行った。
【０１１７】
<ＬＡＭＰ増幅産物検出用ＤＮＡチップの作製>
４．アレイ型プローブチップ
アレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材の概略図を図６に示した。パイレックスガラス表面にチタンおよび金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極をガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により絶縁膜に円形窓および矩形窓を開口して作用極、対極、参照極およびプローバー接触部を露出させた。これをアレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材とした。
【０１１８】
２．アレイ型プローブチップの作製
表５に示すプローブ核酸（３’末端ＳＨ標識合成オリゴ）を合成した。
【表５】
2013198422.tif 000007
【０１１９】
プローブＤＮＡを３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液を調製して、この溶液１００ｎＬを作用極上にスポットした。４０℃にて乾燥し、超純水により洗浄後、作用極表面に残った超純水を除去し、チップ素材の作用極にプローブＤＮＡを固定した。
【０１２０】
ＤＮＡチップおよびＤＮＡチップ測定装置についての詳細は、以下の文献（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008）を参照されたい。
【０１２１】
<ＬＡＭＰ増幅産物の検出>
各保護膜の増幅反応に対する影響を試験するために、増幅用チップにおいて増幅されたＬＡＭＰ増幅産物をアレイ型プローブチップにより検出した。
【０１２２】
その結果を表６に示す。
【表６】
2013198422.tif 000008
【０１２３】
表６に示すように、ノボラック樹脂(ナフトキノン系感光剤含有)を保護膜として使用した場合は、ハイブリダイズ信号は陰性であった。ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂を保護膜として使用した場合には、ハイブリダイズ信号は陽性であった。
【０１２４】
従って、ノボラック樹脂(ナフトキノン系感光剤含有)は、増幅反応などの核酸反応に影響を及ぼすことが明らかになった。一方で、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂は、増幅反応などの核酸反応に影響を及ぼす可能性は低いことが明らかになった。
【０１２５】
ノボラック樹脂(ナフトキノン系感光剤含有)は、ポジ型レジストとして一般的に核酸反応を行うことを目的としたデバイスの製造において使用される１例である。そのような材料が、今回の試験において核酸反応に影響を及ぼすことが明らかになった。核酸反応を行うためのデバイスにおいては、核酸反応に影響を及ぼす材料を使用することは避ける必要がある。
【０１２６】
上記の結果から、ノボラック樹脂、エポキシ樹脂、ポリオレフィン樹脂およびシリコン樹脂は、核酸反応を行うことを目的としたデバイスにおいて使用することが好ましい材料であることが示された。
【０１２７】
＜例２＞
以下に、プライマー固定化領域に固定されたプライマーセットと、プライマー固定化領域の近傍のプローブ固定化領域に固定されたプローブ核酸としてのプローブＤＮＡとを含む電気化学的検出用のアレイ型プライマープローブチップを作製して使用した例を記載する。プローブ固定化領域は電極からなり、ハイブリダイズの存在に依存して生じる電流応答を検出するためのセンサーとして使用した。
【０１２８】
１．チップ素材の作製
アレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材の概略図を図６に示した。パイレックスガラス表面にチタン及び金の薄膜をスパッタリングにより形成した。その後、エッチング処理により、チタンおよび金の電極をガラス表面上に形成した。更にその上に絶縁膜を塗付して、エッチング処理により絶縁膜に円形窓および矩形窓を開口して作用極、対極、参照極およびプローバー接触部を露出させた。これをアレイ型プライマープローブチップ用のチップ素材とした。
【０１２９】
２．アレイ型プライマープローブチップの作製
まず、プローブＤＮＡを作用極上に固定した。使用したプローブＤＮＡの塩基配列を表７に示す。
【表７】
2013198422.tif 000009
【０１３０】
プローブＤＮＡ（Ａ）およびプローブＤＮＡ（Ｂ）をそれぞれ３μＭずつ含むプローブＤＮＡ溶液を調製して、この溶液１００ｎＬを作用極上にスポットした。４０℃にて乾燥し、超純水により洗浄後、作用極表面に残った超純水を除去し、チップ素材の作用極にプローブＤＮＡを固定した。
【０１３１】
次に、プライマーセットとして使用するプライマーＤＮＡを用意した。使用するプライマーＤＮＡは、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法による増幅のためのプライマーセットである。使用したプライマーＤＮＡの塩基配列を表８に示す。
【表８】
2013198422.tif 000010
【０１３２】
プライマーＤＮＡ（セットＡ）については、２００μＭのＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＬＰＦをそれぞれ準備し、０．１μＬ、０．１μＬ、０．０１２５μＬ、０．００１２５μＬおよび０．０５μＬをそれぞれに含む０．２７５μＬの溶液を用いて、対応するプローブＤＮＡ（Ａ）の近傍のプライマー固定化領域である作用極に固定した。具体的には、用意したそれぞれ０．２７５μＬのそれらの溶液を、それぞれプローブＤＮＡ（Ａ）が固定された対応する近傍の作用極にスポットし、６３℃で５分間乾燥させた。これにより、アレイ型プライマープローブチップを得た。
【０１３３】
３．ＬＡＭＰ反応液の作製
ＬＡＭＰ反応液の組成を表９示す。
【表９】
2013198422.tif 000011
【０１３４】
組成（１）から（４）には、共通して、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、リアクションミックスが含まれ、後述の鋳型溶液と合わせ総量が５０μＬとなるように蒸留水（即ち、ＤＷ）が添加されたものを使用した。組成（１）は、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によってＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ｂ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ｂを含む。組成（２）は鋳型を含まず、組成（３）はプライマーＤＮＡ（セットＡ）によりＬＡＭＰ法による増幅反応が生じて、且つプローブＤＮＡ（Ａ）とハイブリダイズして検出される鋳型Ａを含む。組成（１）は、鋳型Ａおよび鋳型Ｂを両方含むものを使用した。鋳型ＡおよびＢは、表１０に示す塩基配列を有する合成オリゴＤＮＡである。
【表１０】
2013198422.tif 000012
【０１３５】
４．アレイ型プライマープローブチップ上でのＬＡＭＰ増幅反応及び、プローブＤＮＡよる目的核酸の検出
図８に概略を示すように、プローブ固定化領域としての電極およびプライマーＤＮＡ固定化領域を含むように、反応容器を形成するための被覆体として成形されたシリコンゴムをアレイ型プライマープローブチップ上に装着し、予めシリコンゴムに設けられた穴から反応容器内にＬＡＭＰ反応溶液を注入後、蓋をした。これを６３℃に設定したプレート上に設置し、６０分間ＬＡＭＰ反応を行った。図９に概略を示すように、特定のプライマーについて、これが結合することが可能であり、且つそれが増幅すべき標的配列を含む鋳型がＬＡＭＰ反応溶液に含まれている場合、そのプライマーが固定された場所で局所的にＬＡＭＰ反応が進み、生じたＬＡＭＰ産物は近傍にあるプローブＤＮＡとハイブリダイズする。
【０１３６】
６０分間のＬＡＭＰ反応の後、４５℃で１０分間ハイブリダイゼーション反応を行い、４５℃で１０分間洗浄を行った。その後、洗浄溶液を除去し、７５μＭヘキスト３３２５８溶液を注入した。各プローブ核酸固定化作用極に電位を掃引し、プローブＤＮＡとＬＡＭＰ産物により形成された二本鎖に特異的に結合したヘキスト３３２５８分子の酸化電流を計測した。上記一連の反応は、以下の文献に記載のＤＮＡ自動検査装置にて実施した（SICE Journal of Control, Measurement, and System Integration, Vol. 1, No. 3, pp. 266-270, 2008）。
【０１３７】
５．検出結果
検出結果を表１１に示した。
【表１１】
2013198422.tif 000013
【０１３８】
鋳型Ｂが含まれるＬＡＭＰ反応溶液組成（１）を添加した場合、作用極２の近傍に固定されているプライマーＤＮＡ（セットＢ）によるＬＡＭＰ反応が進み、生じたＬＡＭＰ産物がプローブＤＮＡ（Ｂ）と反応して、その結果、７０ｎＡの電流値が得られた。
【０１３９】
一方、作用極２の近傍に固定されているプライマーＤＮＡ（セットＡ）ではＬＡＭＰ反応が進まず、電流値は得られなかった。
【０１４０】
これら２つの数値から、ＬＡＭＰ反応溶液には、鋳型Ｂが含まれていたことを判定することが可能であった。
【０１４１】
また、鋳型を含まないＬＡＭＰ反応溶液組成（２）を添加した場合、作用極１および２のそれぞれの近傍に固定されているプライマーＤＮＡ（セットＡ）、プライマーＤＮＡ（セットＢ）によるＬＡＭＰ増幅反応は進まず、電流値は得られなかった。
【０１４２】
以上の結果から、本実施例に記載したアレイ型プライマープローブチップを用いて、ＬＡＭＰ反応溶液中に含まれる鋳型を検出し、且つその配列を識別することが可能であることが示された。
【図１】
2013198422.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2013198422.tif 000022
【配列表】
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