(57)【要約】【課題】表皮細胞活性化作用を目的とした化粧料等の様々な用途に利用することが可能な表皮細胞活性化剤、並びにそれを含有する化粧料、皮膚外用剤及び抗シワ化粧料を提供する。【解決手段】本発明の表皮細胞活性化剤は、生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒として親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒として親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする表皮細胞活性化剤。
【請求項２】
前記中性プロテアーゼは、サーモリシンであることを特徴とする請求項１に記載の表皮細胞活性化剤。
【請求項３】
前記表皮細胞活性化剤は、表皮細胞増殖促進剤として用いられることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の表皮細胞活性化剤。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の表皮細胞活性化剤を含有する化粧料又は皮膚外用剤。
【請求項５】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の表皮細胞活性化剤を含有する抗シワ化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ローヤルゼリーエキス抽出時に用いる親水性有機溶媒等に対し不溶性の画分を中性プロテアーゼ処理することにより得られる酵素処理ローヤルゼリーを有効成分として含有する表皮細胞活性化剤に関する。また、それを含有する化粧料、皮膚外用剤及び抗シワ化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ローヤルゼリーは、羽化後３〜１５日の雌のミツバチが下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作るゼリー状の物質で、特有のタンパク質、脂肪酸及びミネラル等が含有されていることが知られている。ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、血清コレステロール低下作用、抗菌作用、放射線及び化学療法剤の副作用軽減作用、慢性疾患に対する作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。したがって、従来よりローヤルゼリーは、栄養価の高い健康食品のみならず、医薬品、化粧料等の用途にも用いられてきた。
【０００３】
従来より、ローヤルゼリーを利用する形態として、特許文献１に開示される方法が知られている。特許文献１は、生ローヤルゼリー又は乾燥ローヤルゼリーに例えば含水エタノールを添加して混合液を調製し、ローヤルゼリー中の可溶性成分を含水エタノール中に溶解させた後、これを濾過して得られるローヤルゼリーエキスの製造方法について開示する。ローヤルゼリーエキスはデセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質、ローヤルゼリーにのみ含有される特殊な水溶性タンパク質、アミノ酸、糖質、ミネラル等を含有している。
【０００４】
ところで、ローヤルゼリーエキス製造中に生成する抽出溶媒に不溶性の沈澱は、主としてタンパク質から構成される。従来、この不溶性の沈殿は、工程ロス、除菌濾過の障害の原因となるとともに、安定性低下等の品質低下の原因となるため、通常、抽出溶媒よりろ過除去され、ローヤルゼリーエキスの抽出残渣として破棄されることが多かった。
【０００５】
しかしながら、近年、例えば特許文献２に開示されるように、ローヤルゼリーエキス抽出後の抽出溶媒に不溶性の画分に対して、中性プロテアーゼを作用させることにより、抗酸化作用の向上効果等の生体に有用な作用効果が見出されるようになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−６０４５５号公報
【特許文献２】特開２００９−２９７７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ローヤルゼリーエキス抽出後の抽出溶媒に不溶性の画分に対して、中性プロテアーゼを作用させることにより、新たに表皮細胞活性化作用を有することを見出したことに基づくものである。
【０００８】
本発明の目的とするところは、表皮細胞活性化作用を目的とした化粧料等の様々な用途に利用することが可能な表皮細胞活性化剤、並びにそれを含有する化粧料、皮膚外用剤及び抗シワ化粧料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、請求項１に記載の表皮細胞活性化剤は、生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒として親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ローヤルゼリーを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の表皮細胞活性化剤において、前記中性プロテアーゼは、サーモリシンであることを特徴とする。
請求項３に記載の発明は、請求項１又は請求項２に記載の表皮細胞活性化剤において、前記表皮細胞活性化剤は、表皮細胞増殖促進剤として用いられることを特徴とする。
【００１１】
請求項４に記載の発明の化粧料又は皮膚外用剤は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の表皮細胞活性化剤を含有する。
請求項５に記載の発明の抗シワ化粧料は、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の表皮細胞活性化剤を含有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、表皮細胞活性化作用を目的とした化粧料等の様々な用途に利用することが可能な表皮細胞活性化剤、並びにそれを含有する化粧料、皮膚外用剤及び抗シワ化粧料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】酵素処理ローヤルゼリーの表皮細胞の呼吸活性化作用を示すグラフ。（ｎ＝５、各数値は平均±標準偏差を示す）。
【図２】三次元培養ヒト皮膚モデルを用いた酵素処理ローヤルゼリーの表皮細胞増殖活性化作用を示すグラフ。（ｎ＝３、各数値は平均±標準偏差を示す）。
【図３】酵素処理ローヤルゼリーの表皮細胞増殖活性化作用における三次元培養ヒト皮膚モデルの断面写真を示す。（ａ）試験試料としてコントロール（精製水）を投与した場合の三次元培養ヒト皮膚モデルの断面写真を示す。（ｂ）試験試料として酵素処理ローヤルゼリー０．５質量％投与した場合の三次元培養ヒト皮膚モデルの断面写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の表皮細胞活性化剤を具体化した実施形態を説明する。以下、ローヤルゼリーをＲＪと略記する。
本実施形態の表皮細胞活性化剤の有効成分である酵素処理ＲＪは、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種より抽出溶媒を用いて得られる不溶性の分画が原料として使用される。一方、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒を添加して得られる可溶性画分は、一般にＲＪエキスとよばれ、デセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質等が含有されている。本実施形態において使用される生ＲＪ及び乾燥ＲＪの産地は、中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、南アメリカ諸国、及びオセアニア諸国のいずれでも良い。生ＲＪ又はＲＪ粉末（生ＲＪを凍結乾燥処理等により乾燥させて粉末化したもの）のうち、取り扱い性の観点より、ＲＪ粉末が好ましい。
【００１５】
生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種に添加する抽出溶媒としては、親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒が使用される。親水性有機溶媒としては、例えばエタノール、メタノール、ブタノール及びプロパノール等の低級アルコール類、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類が挙げられる。これらの親水性有機溶媒を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中で、不溶性の高タンパク質分画の抽出効率、生体に対する適用性等の観点からエタノールが最も好ましい。含水親水性有機溶媒として例えば含水エタノールが使用される場合、抽出溶媒中におけるエタノールの濃度は、５０〜９９容量％が好ましく、８０〜９９容量％がより好ましく、９０〜９９容量％が最も好ましい。これらの抽出溶媒の添加量は、抽出効率の点から、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種の１重量部に対して１〜１０重量部が好ましく、２〜８重量部がより好ましく、３〜６重量部が最も好ましい。これらの抽出溶媒は、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種とともに混合及び撹拌される。
【００１６】
抽出の温度は、溶媒の揮発を防ぐ点から、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。抽出の時間は、収率の点から、１〜２４時間が好ましく、１．５〜１２時間がより好ましく、２〜６時間がさらに好ましい。得られた抽出物は、溶媒に可溶性の画分と沈殿物からなる不溶性の画分から構成される。これらの可溶性画分と不溶性画分は、公知の方法、例えば濾過処理、遠心分離を用いることにより、容易に分離することができる。
【００１７】
酵素処理ＲＪは、原料に抽出溶媒を添加して得られる可溶性画分であるＲＪエキスを分離した後の不溶性画分が原料として使用される。この抽出溶媒に不溶性の画分には、主としてタンパク質が高含有されている。以下、ＲＪエキス抽出原料に抽出溶媒を添加して得られる抽出溶媒に不溶性の画分を「高タンパクＲＪ」と呼ぶ。
【００１８】
酵素処理ＲＪは、高タンパクＲＪをタンパク分解処理することにより得られる。タンパク分解処理は、中性プロテアーゼを用いて高タンパクＲＪ中に含有されるタンパク質のペプチド結合を加水分解し、低分子化する処理である。中性プロテアーゼとしては、至適ｐＨを中性付近（好ましくはｐＨ５．０〜８．５、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５）に有するプロテアーゼを挙げることができる。中性プロテアーゼには、ペプチドの末端から加水分解するエキソ型プロテアーゼとペプチドの途中から分解するエンド型プロテアーゼとが存在するが、いずれのプロテアーゼも使用することができる。中性プロテアーゼとして、具体的には、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（バチルス・サーモプロテオライティクス・ロッコ（Bacillus thermoproteolyticus Rokko））由来の中性プロテアーゼであるサーモリシン、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼ、及びバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼを挙げることができる。これらの中で、酵素処理により表皮細胞活性化作用の向上効果の高いサーモリシン及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼが好ましく、サーモリシンがより好ましい。
【００１９】
サーモリシンは、金属プロテアーゼに分類され、至適ｐＨは約６．５〜８．５である。サーモリシンは、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン等の大きな疎水性側鎖を持つアミノ残基を含むペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼである。市販品としては、例えばサモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成社製）を挙げることができる。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりサーモリシンと同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。サーモリシンを用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは４０〜７５℃、さらに好ましくは５０〜７０℃の条件下で行われる。
【００２０】
アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼとして、市販品としては、例えばスミチームＦＰ（新日本化学工業社製）を使用することができる。スミチームＦＰは、エンド型とエキソ型プロテアーゼを含有し、タンパク質をアミノ酸レベルにまで高度に分解することができる。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりスミチームＦＰ（新日本化学工業社製）と同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。スミチームＦＰ（新日本化学工業社製）を用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは４０〜７５℃、さらに好ましくは４５〜６０℃の条件下で行われる。
【００２１】
バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼとして、市販品としては、例えばプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）を使用することができる。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇは、至適ｐＨは約５．０〜７．０である。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）と同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）を用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは３５〜７５℃、さらに好ましくは４０〜６０℃の条件下で行われる。
【００２２】
中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理は、高タンパクＲＪ、中性プロテアーゼ及び水（又は緩衝液）を含む反応液を、所定条件下でインキュベートすることにより実施される。タンパク質分解酵素処理の処理時間は、反応温度、酵素の力価等により適宜設定されるが、表皮細胞活性化作用を十分に高める観点及び経済性の観点から、好ましくは０．１〜６時間、より好ましくは０．５〜２時間である。また、表皮細胞活性化作用が逆に低下するおそれがある。なお、このタンパク質分解酵素処理は、前記インキュベート後の反応液を直ちに８５〜１００℃で５〜６０分間加熱して前記プロテアーゼを失活させることが望ましい。
【００２３】
前記反応液には、高タンパクＲＪに起因する粘度上昇を抑えてタンパク質分解酵素処理を迅速に進行させるための溶媒として、水又は緩衝液が含有されている。反応液は、高タンパクＲＪに起因する反応液の粘度上昇を十分に抑え、酵素処理を迅速に進行させる観点及び経済性の観点から、高タンパクＲＪの質量に対して好ましくは２〜１５倍量、より好ましくは２〜１４倍量、さらに好ましくは３〜１０倍量の水又は緩衝液が含有されていることが望ましい。
【００２４】
上記のように得られた酵素処理ＲＪは、高い表皮細胞活性化作用を有する。したがって、それらの作用効果を得ることを目的とした表皮細胞活性化剤として適用される。本実施形態の表皮細胞活性化剤の具体的な配合形態としては、上記の作用効果を得ることを目的とした皮膚外用剤、医薬品、医薬部外品、化粧料、飲食品、及び試験・研究用試薬等として適用することができる。皮膚は、外側から表皮、基底膜、及び真皮から主に構成される。本実施形態の表皮細胞活性化剤は、皮膚表面への塗布により、特にその作用効果を有効に発揮することができる。したがって、上記配合形態のうち、表皮細胞活性化作用を得ることを目的とした化粧料又は皮膚外用剤として適用されることが好ましい。尚、本実施形態の表皮細胞活性化剤を皮膚外用剤、化粧料、及び飲食品として適用する場合は、従来品と区別するために、上記作用・効果、例えば皮膚の表皮細胞の増殖促進、肌荒れ防止、かさつき防止、皮膚の老化抑制、シワやたるみの防止等の効果を得ることを目的とする旨の表示を付すことが好ましい。
【００２５】
本実施形態の表皮細胞活性化剤を化粧料に適用する場合、化粧料基材に配合することにより製造することができる。化粧料の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状等のいずれであってもよい。このような化粧料を肌に適用することにより、表皮細胞活性化の効果を得ることができる。化粧料基剤は、一般に化粧料に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される少なくとも一種が適宜配合される。
【００２６】
本実施形態の表皮細胞活性化剤を医薬品又は医薬部外品として使用する場合は、好ましくは皮膚外用剤の形態が採用される。剤形としては、特に限定されないが、例えば、軟膏、液剤、スプレー剤、シート剤、散剤、粉剤が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。その他、本実施形態の表皮細胞活性化剤を医薬品又は医薬部外品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、皮下注射、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。
【００２７】
本実施形態の表皮細胞活性化剤を飲食品に適用する場合、表皮細胞活性化剤を飲食品そのものとして、又は種々の食品素材又は飲料品素材に配合して使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。
【００２８】
本実施形態の表皮細胞活性化剤を表皮細胞活性化用の試薬の形態で実験用・研究用試薬として適用してもよい。表皮細胞が関係する生理作用のメカニズムの解明又は各種症状の治療法等の研究・開発等の分野において、好適に用いられる。
【００２９】
本実施形態の表皮細胞活性化剤中における上記有効成分（固形分）の含有量は、使用する溶媒等の他の含有成分、目的等に応じ、適宜決定されるが、前記有効成分による表皮細胞活性化作用を高める観点及び経済性の観点から、好ましくは０．０００１〜１０質量％含有する。
【００３０】
次に、上記のように構成された表皮細胞活性化剤の作用を説明する。
本実施形態の表皮細胞活性化剤は、高い表皮細胞活性化作用を有する。より具体的には、例えば表皮細胞増殖促進作用を発揮する。皮膚表面の表皮細胞の一般的な生理作用として、加齢とともにその増殖及び分裂能が、低下し、表皮層の厚みが徐々に薄くなっていくことが、従来より知られている。また、表皮細胞の増殖に働きかける生体因子、例えばＥＧＦ（Epidermal Growth Factor／上皮細胞成長因子）及び女性ホルモン（エストロゲン）は、加齢とともに生成量及び分泌量が減少していくことが知られている。表皮細胞の代謝機能の低下により、表皮細胞の再生能力（ターンオーバー）が低下し、肌荒れ、かさつき、皮膚の老化、シワやたるみが生ずる原因となっている。本実施形態の表皮細胞活性化剤は、ＥＧＦ様作用により、肌荒れ、かさつき、皮膚の老化、シワやたるみを抑制するための各種抑制剤として好ましく適用することができる。
【００３１】
また、ＥＧＦは、やけど、手術、ＵＶ照射等による皮膚の損傷から修復する際、ニキビ、アトピー等の皮膚病から回復する際にも、修復・回復を促進する作用を発揮することが知られている。したがって、やけど、ＵＶ照射等による皮膚損傷の修復、術後の傷の修復、ニキビ、アトピー等の皮膚病の治癒の各種促進剤として、好ましく適用することができる。
【００３２】
本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態において、生ＲＪ等に抽出溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ＲＪは、高い表皮細胞活性化作用を有している。したがって、表皮細胞活性化剤として、特に化粧料及び医薬品としての皮膚外用剤として好ましく適用することができる。
【００３３】
（２）本実施形態において、高タンパクＲＪを得るために、生ＲＪに配合する親水性有機溶媒は、エタノールが好ましく使用される。したがって、最終的に得られる酵素処理ＲＪを生体に対して容易に適用することができる。
【００３４】
（３）本実施形態において、高タンパクＲＪに適用する中性プロテアーゼは、サーモリシンが好ましく適用される。したがって、かかる酵素を用いた酵素処理によって表皮細胞活性化作用をより高めることができる。
【００３５】
（４）本実施形態において、表皮細胞活性化剤は、表皮細胞増殖促進剤として好ましく適用される。したがって、ＥＧＦ様作用により、肌荒れ、かさつき、皮膚の老化、シワやたるみを抑制するための各種抑制剤として好ましく適用することができる。また、やけど、ＵＶ照射等による皮膚損傷の修復、術後の傷の修復、ニキビ、アトピー等の皮膚病の治癒の各種促進剤として、好ましく適用することができる。
【００３６】
なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態における表皮細胞活性化剤は、酵素によるタンパク質分解処理後の反応液をそのまま化粧料又は皮膚外用剤等に適用してもよく、溶媒を蒸発させて濃縮処理して適用してもよく、乾燥及び粉末化して適用してもよい。
【００３７】
・上記実施形態における表皮細胞活性化剤は、ヒトに適用される化粧料及び皮膚外用剤等に対して適用することができるのみならず、ペット、家畜等の飼養動物に対して適用してもよい。
【００３８】
・高タンパク質画分は、不純物を取り除くために再度、抽出溶媒を用いて洗浄処理を行なってもよい。
【実施例】
【００３９】
以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（酵素処理ＲＪの調製）
中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））１ｋｇに抽出溶媒としてエタノール９９容量％の含水親水性有機溶媒２．５ｋｇを加えて室温（約２５℃）で２４時間攪拌し、生ＲＪ中の不溶性成分を沈殿させた。その後、攪拌抽出液を濾布で濾過して可溶性成分を溶解する溶媒と不溶性画分（高タンパクＲＪ）を分離した。この高タンパクＲＪには、主としてタンパク質が高含有されている。生ＲＪ１ｋｇより高タンパクＲＪ約０．７ｋｇ（固形分４８質量％）を得た。
【００４０】
前記高タンパクＲＪ１００ｇに水６６０ｍｌを加え、ｐＨ７に調整することにより、酵素処理用のＲＪ希釈液を調製した。次に、前記ＲＪ希釈液に、中性プロテアーゼを添加することにより、反応液を調整した。中性プロテアーゼとしてサーモリシンを使用した。
【００４１】
サーモリシンは、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成社製）を使用した。サモアーゼＰＣ１０Ｆは、９００００ＰＵ／ｇ以上の力価（１ＰＵ＝カゼイン（終濃度０．５％）にｐＨ７．２、３５℃で作用するとき、反応初期の１分間に１μｇのチロシンに相当する酸可溶性低分子分解産物を生成するのに必要な酵素量）を有している。サモアーゼＰＣ１０Ｆを上記酵素処理用のＲＪ希釈液に０．５ｇ添加することにより、反応液を調製した。
【００４２】
続いて、サモアーゼを添加した反応液を６５℃でインキュベートすることにより、タンパク質分解酵素処理を実施した。タンパク質分解酵素処理の開始から、４時間後に反応液をろ紙（アドバンテック東洋製Ｎｏ．２）で吸引ろ過後、凍結乾燥し、粉末状にした酵素処理ＲＪを調製した。ちなみに、前記タンパク質分解酵素処理の開始から終了までの反応液の温度及びｐＨを不定期に測定したところ、温度管理上の誤差や実験上の誤差の範囲内で、概ね初期反応温度及び中性領域の条件が継続的に維持されていたことを確認した。
【００４３】
（試験例１：表皮細胞活性化試験）
酵素処理ＲＪが、ヒトの表皮細胞の増殖に及ぼす影響について細胞呼吸活性を測定することにより評価した。陰性対照（コントロール）として、精製水を使用した。正常ヒト表皮ケラチノサイト（Ｌｏｎｚａ社製）をケラチノサイト増殖用培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２）で培養し、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整した後、１ウェル当たり１００μＬずつ９６穴マイクロプレートに播種した。２４時間後、酵素処理ＲＪを固形分濃度として０．１質量％及び１質量％それぞれ含有するケラチノサイト増殖用培地に交換し、３７℃２４時間培養した。培養後、ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩）を１ウェル当たり１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃３時間培養した。生細胞のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性に応じてテトラゾリウム環の開環により生ずるフォルマザンを２−プロパノールで抽出し、マイクロプレートリーダにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６００ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差を細胞呼吸活性として評価した。測定結果を、図１に示す。縦軸はコントロールの値を１とした場合の相対値を示す。
【００４４】
図１に示されるように、コントロール（精製水）に対して、サモアーゼを用いた酵素処理ＲＪは、濃度依存的に呼吸活性が増加していることが確認され、表皮細胞増殖作用又は表皮細胞賦活作用が有意に向上したことが確認された。酵素処理ＲＪが１質量％においては、コントロールに対し、１．５倍以上増加した。この結果より、生ＲＪの抽出溶媒に不溶性の画分である高タンパクＲＪを特定のプロテアーゼにより低分子化することにより、表皮細胞に対して良い影響を及ぼすことが確認された。
【００４５】
（試験例２：三次元培養ヒト皮膚モデルを用いた表皮細胞増殖活性化試験）
酵素処理ＲＪが、ヒトの表皮細胞の増殖に及ぼす影響について三次元培養ヒト皮膚モデルを用いて評価した。三次元培養ヒト皮膚モデルとしてＴＥＳＴＳＫＩＮ，ＴＭＬＳＥ−０１３，１週間培養タイプ（東洋紡社製）を使用した。この三次元培養ヒト皮膚モデルは、表皮細胞が分化し、表面から角質層、表皮層、及び真皮層が形成されており、実際のヒトの皮膚に対し、生理学的・構造的に近似している。ＴＥＳＴＳＫＩＮ，ＴＭＬＳＥ―０１３，１週間培養タイプは、表皮の形成が途中段階のものであり、特に培養分化形成の試験において、使用することができる。したがって、三次元培養ヒト皮膚モデルを使用した試験を行うことにより、生体に近い結果を得ることが可能となる。本試験において、陰性対照（コントロール）として、精製水を使用した。培養トレイにおいて、コントロールの他、試験試料として酵素処理ＲＪを固形分濃度として０．５質量％及び１質量％含む精製水の１００μＬをヒト皮膚モデルの表面に添加し、それぞれ４８時間培養した。尚、培養培地として、ＴＥＳＴＳＫＩＮ用培地（東洋紡社製）を使用した。培養後、表皮の厚さ及びヒアルロン酸について確認した。表皮の厚みは、組織切片をヘマトキシン染色後、顕微鏡観察することにより、測定した。測定結果を、図２に示す。尚、縦軸はコントロールの値を１００とした場合の相対値を示す。また、参考までに、本試験例において用いた染色後の組織断片の一部を図３に示す。
【００４６】
組織中のヒアルロン酸は、まず組織を凍結乾燥した後、凍結切片を４％パラホルムアルデヒドにより室温１時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄を行った。次に、０．３％過酸化水素／メタノール溶液中で４℃３０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼを不活性化させた。次に、ｂＨＡＢＰ（生化学バイオビジネス社製）を用いて、ヒアルロン酸を免疫染色した。免疫染色後の組織断片について、顕微鏡観察した。
【００４７】
図２に示されるように、コントロール（精製水）に対して、サモアーゼを用いた酵素処理ＲＪは、表皮の厚みが増加し、表皮細胞増殖作用が有意に向上したことが確認された。特に、酵素処理ＲＪが０．５質量％においては、コントロールに対し、約１．３倍増加した。尚、図３に示されるように、酵素処理ローヤルゼリー０．５質量％投与した場合において、表皮の厚みがコントロールに対し、増加していることが確認される。この結果より、生ＲＪの抽出溶媒に不溶性の画分である高タンパクＲＪを特定のプロテアーゼにより低分子化することにより、表皮細胞に対して良い影響を及ぼすことが確認された。尚、データの添付は省略するが、ヒアルロン酸の量は、各試験試料において差は見られなかった。
【００４８】
上記実施形態から把握できる技術的思想について以下に記載する。
（イ）前記有機溶媒は、エタノールであることを特徴とする前記表皮細胞活性化剤。かかる（イ）の構成によれば、生体に対し、より好ましく適用することができる。
【００４９】
（ロ）前記表皮細胞活性化剤は、肌荒れ防止剤、かさつき防止剤、皮膚の老化防止剤、たるみ抑制剤、皮膚損傷の修復促進剤、術後の傷修復促進剤、又は皮膚病の治癒促進剤として適用されることを特徴とする前記表皮細胞活性化剤。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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