(57)【要約】      （修正有）【課題】物質が有する神経栄養性能力を、できるだけ簡便且つ正確に、そしてハイスループット化が容易に可能な検定方法の開発。【解決手段】ＮＸＦ遺伝子のプロモーター領域に存在することにより脳由来神経栄養因子による当該ＮＸＦ遺伝子の発現を誘導する機能を有するエレメントを２個以上含むオリゴヌクレオチドであり、前記エレメントが下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。＜塩基配列群＞（１）塩基配列（5’-GTGACTCA-3’）（２）塩基配列（5’-ATGACTCA-3’）、及び、その利用（例えば、物質が有する神経栄養性能力の検定方法等）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＸＦ遺伝子のプロモーター領域に存在することにより脳由来神経栄養因子による当該ＮＸＦ遺伝子の発現を誘導する機能を有するエレメントを２個以上含むオリゴヌクレオチドであり、前記エレメントが下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
＜塩基配列群＞
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号２で示される塩基配列
【請求項２】
配列番号１で示される塩基配列からなるエレメントと配列番号２で示される塩基配列からなるエレメントとの両者を含むことを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記エレメントを２個含むことを特徴とする請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３で示される塩基配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号４で示される塩基配列であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドが有する塩基配列の下流に、最小プロモーターが有する塩基配列を含むことを特徴とする脳由来神経栄養因子応答性のプロモーター。
【請求項７】
レポーター遺伝子に、請求項６記載の脳由来神経栄養因子応答性のプロモーターを、機能可能な形で連結させて得られることを特徴とする遺伝子構築物。
【請求項８】
請求項７記載の遺伝子構築物を含むことを特徴とする形質転換細胞。
【請求項９】
脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子が発現可能であることを特徴とする請求項８記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
物質が有する神経栄養性能力の検定方法であり、
（ａ）請求項８又は９記載の形質転換細胞と被験物質とを、前記形質転換細胞に導入されたレポーター遺伝子の転写物量を増加させうるような条件下で、接触させる第一工程、
（ｂ）第一工程後、３時間以上６０時間以下の範囲内での、前記形質転換細胞内に蓄積された、又は、培養液中に分泌され培養液中に蓄積された、レポーター遺伝子産物の量を測定する第二工程、
（ｃ）第二工程により測定されたレポーター遺伝子産物の量を、対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度を評価する第三工程を有することを特徴とする検定方法。
【請求項１１】
対照値が、被験物質に接触していない前記形質転換細胞におけるレポーター遺伝子産物の量であることを特徴とする請求項１０記載の検定方法。
【請求項１２】
第一工程において、前記形質転換細胞に導入されたレポーター遺伝子の転写物量を増加させうるような条件が、脳由来神経栄養因子の存在下での接触であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の検定方法。
【請求項１３】
脳由来神経栄養因子の存在量が、１ng/ml以上５０ng/ml以下の範囲内であることを特徴とする請求項１２記載の検定方法。
【請求項１４】
物質が有する神経栄養性能力の検定方法であり、
（ａ）脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子を発現する細胞と被験物質とを、前記細胞核内に請求項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子が出現させうる条件下で、接触させる第一工程、
（ｂ）第一工程後、１０分間以上１２時間以下の範囲内での、細胞核内に蓄積された蛋白質画分を抽出し、得られた核抽出物の中に存在する、請求項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量を測定する第二工程、
（ｃ）第二工程により測定された請求項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量を、対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度を評価する第三工程を有することを特徴とする検定方法。
【請求項１５】
対照値が、被験物質に接触していない前記細胞における核抽出物の中に存在する、請求項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量であることを特徴とする請求項１５記載の検定方法。
【請求項１６】
第一工程において、前記細胞核内に請求項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子が出現させうる条件が、脳由来神経栄養因子レセプター蛋白質と当該蛋白質の標準リガンドである脳由来神経栄養因子との接触であることを特徴とする請求項１４又は１５記載の検定方法。
【請求項１７】
脳由来神経栄養因子の存在量が、１ng/ml以上５０ng/ml以下の範囲内であることを特徴とする請求項１６記載の検定方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１７のいずれかの請求項記載の検定方法により評価された、被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度に基づき神経栄養性能力を有する物質を選抜する工程を含むことを特徴とする神経栄養性能力を有する物質の探索方法。
【請求項１９】
ＮＸＦ遺伝子のプロモーター領域に存在することにより脳由来神経栄養因子による当該ＮＸＦ遺伝子の発現を誘導する機能を有し、下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列であることを特徴とするエレメント。
＜塩基配列群＞
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号２で示される塩基配列
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NXF遺伝子のプロモーター領域に存在する機能エレメントを含有するオリゴヌクレオチドおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳由来神経栄養因子（BDNF； Brain-derived neurotrophic factor）は、標的細胞表面上にある脳由来神経栄養因子レセプター蛋白質（TrkB）に結合し、神経細胞の生存・成長・シナプスの機能亢進等の神経細胞の機能を調節するなど、神経細胞系の正常な機能に不可欠な液性蛋白質である。
脳由来神経栄養因子は、神経細胞が変性していく神経変性疾患と一般に呼ばれる神経難病（アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性末梢神経病、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、各種ニューロパチー、外傷性神経障害、更には網膜変性疾患等の病態等が含まれる。）の治療薬、神経の再生の促進薬、神経細胞死を防ぐ薬となる可能性が考えられている（特開2002-293741; 鵜飼渉、小野哲、１，２−エタンジオール誘導体又はその塩を含有する脳由来神経栄養因子の作用増強剤、並びに、１，２−エタンジオール誘導体又はその塩と脳由来神経成長因子とを含有する医薬組成物）。
従来、物質が有する神経栄養性能力の検定方法としては、例えば、細胞表面上の脳由来神経栄養因子レセプターのリン酸化を、物質の存在下、非存在下で測定し比較する方法等が知られている。（例えば、特許文献1参照）
また、神経系の細胞に、脳由来神経栄養因子を添加する、又は、グルタミン酸刺激、浸透圧刺激、脱分極刺激等の種々の刺激を加えると、NXFと呼ばれる神経細胞に発現する遺伝子のプロモーターが活性化されNXF遺伝子発現が誘導されてくることが開示されており（非特許文献1および非特許文献２参照）、物質が有する神経栄養性能力の程度を知るために、物質を神経系の細胞に作用させた際のNXF遺伝子の誘導量を測定することは有用な知見を与える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第2561604号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J.Biol.Chem.2009.284(2),p1057-1063.Ooe, N. et al.
【非特許文献２】Biochem.Biophys.Res.Commun.2009.378,p761-765.Ooe, N. et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のような従来方法を利用した、物質が有する神経栄養性能力の検定方法は、その工程が煩雑で比較的高度な手技が要求されハイスループットスクリーニング化をすることが容易ではなく、また、脳由来神経栄養因子以外のグルタミン酸刺激、浸透圧刺激、脱分極刺激等の種々の刺激をも同時に検出してしまう等の点から、十分に満足できるものではなかった。
そこで、物質が有する神経栄養性能力を、できるだけ簡便且つ正確に、そしてハイスループット化が容易に可能な検定方法の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる状況の下、本発明者は鋭意検討した結果、NXF遺伝子のプロモーター領域に存在する機能エレメントを見出すことに成功し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．ＮＸＦ遺伝子のプロモーター領域に存在することにより脳由来神経栄養因子による当該ＮＸＦ遺伝子の発現を誘導する機能を有するエレメントを２個以上含むオリゴヌクレオチドであり、前記エレメントが下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチド（以下、本発明オリゴヌクレオチドと記すこともある。）；
＜塩基配列群＞
（１）配列番号１で示される塩基配列（5’-GTGACTCA-3’）
（２）配列番号２で示される塩基配列（5’-ATGACTCA-3’）
２．配列番号１で示される塩基配列からなるエレメントと配列番号２で示される塩基配列からなるエレメントとの両者を含むことを特徴とする前項１記載のオリゴヌクレオチド；
３．前記エレメントを２個含むことを特徴とする前項１又は２記載のオリゴヌクレオチド；
４．配列番号３で示される塩基配列（5’-GGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTTTAGCAGCGGCCAGGAG-3’）であることを特徴とする前項１〜３のいずれかの前項記載のオリゴヌクレオチド；
５．配列番号４で示される塩基配列（5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）であることを特徴とする前項１〜３のいずれかの前項記載のオリゴヌクレオチド；
６．前項１〜５のいずれかの前項記載のオリゴヌクレオチドが有する塩基配列の下流に、最小プロモーターが有する塩基配列を含むことを特徴とする脳由来神経栄養因子応答性のプロモーター（以下、本発明プロモーターと記すこともある。）；
７．レポーター遺伝子に、前項６記載の脳由来神経栄養因子応答性のプロモーターを、機能可能な形で連結させて得られることを特徴とする遺伝子構築物（以下、本発明遺伝子構築物と記すこともある。）；
８．前項７記載の遺伝子構築物を含むことを特徴とする形質転換細胞（以下、本発明形質転換細胞と記すこともある。）；
９．脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子が発現可能であることを特徴とする前項８記載の形質転換細胞；
１０．物質が有する神経栄養性能力の検定方法であり、
（ａ）前項８又は９記載の形質転換細胞と被験物質とを、前記形質転換細胞に導入されたレポーター遺伝子の転写物量を増加させうるような条件下で、接触させる第一工程、
（ｂ）第一工程後、３時間以上６０時間以下の範囲内での、前記形質転換細胞内に蓄積された、又は、培養液中に分泌され培養液中に蓄積された、レポーター遺伝子産物の量を測定する第二工程、
（ｃ）第二工程により測定されたレポーター遺伝子産物の量を、対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度を評価する第三工程を有することを特徴とする検定方法（以下、本発明検定方法１と記すこともある。）；
１１．対照値が、被験物質に接触していない前記形質転換細胞におけるレポーター遺伝子産物の量であることを特徴とする前項１０記載の検定方法；
１２．第一工程において、前記形質転換細胞に導入されたレポーター遺伝子の転写物量を増加させうるような条件が、脳由来神経栄養因子の存在下での接触であることを特徴とする前項１０又は１１記載の検定方法；
１３．脳由来神経栄養因子の存在量が、１ng/ml以上５０ng/ml以下の範囲内であることを特徴とする前項１２記載の検定方法；
１４．物質が有する神経栄養性能力の検定方法であり、
（ａ）脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子を発現する細胞と被験物質とを、前記細胞核内に前項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子が出現させうる条件下で、接触させる第一工程、
（ｂ）第一工程後、１０分間以上１２時間以下の範囲内での、細胞核内に蓄積された蛋白質画分を抽出し、得られた核抽出物の中に存在する、前項１〜５のいずれかの前項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量を測定する第二工程、
（ｃ）第二工程により測定された前項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量を、対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度を評価する第三工程を有することを特徴とする検定方法（以下、本発明検定方法２と記すこともある。）；
１５．対照値が、被験物質に接触していない前記細胞における核抽出物の中に存在する、前項１〜５のいずれかの前項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量であることを特徴とする前項１５記載の検定方法；
１６．第一工程において、前記細胞核内に前項１〜５のいずれかの前項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子が出現させうる条件が、脳由来神経栄養因子レセプター蛋白質と当該蛋白質の標準リガンドである脳由来神経栄養因子との接触であることを特徴とする前項１４又は１５記載の検定方法；
１７．脳由来神経栄養因子の存在量が、１ng/ml以上５０ng/ml以下の範囲内であることを特徴とする前項１６記載の検定方法；
１８．前項１０〜１７のいずれかの前項記載の検定方法により評価された、被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度に基づき神経栄養性能力を有する物質を選抜する工程を含むことを特徴とする神経栄養性能力を有する物質の探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
１９．ＮＸＦ遺伝子のプロモーター領域に存在することにより脳由来神経栄養因子による当該ＮＸＦ遺伝子の発現を誘導する機能を有し、下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列であることを特徴とするエレメント（以下、本発明エレメントと記すこともある。）；
＜塩基配列群＞
（１）配列番号１で示される塩基配列（5’−ＧＴＧＡＣＴＣＡ−３’）
（２）配列番号２で示される塩基配列（5’-ATGACTCA-3’）
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、NXF遺伝子のプロモーター領域に存在する機能エレメントを含有するオリゴヌクレオチドおよびその利用、具体的には例えば、物質が有する神経栄養性能力を、できるだけ簡便且つ正確に、そしてハイスループット化が容易に可能な検定方法等が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒト神経系由来細胞株SK-N-SHに対し、NXF遺伝子プロモーター領域（-4.9kbpから-150bpまでのそれぞれのプロモーターDeletion mutant）により制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションし、培養液中に脳由来神経栄養因子を加えない場合(-)、100ng/mlの脳由来神経栄養因子を加えた場合（＋BDNF）のレポーター活性を示す図である。ここでのレポーター活性値は従って、ルシフェラーゼを制御する各NXFプロモーター(Deletion Mutants)の活性を示す。縦軸は相対活性で表示されている（RLU: Relative light unit）。横軸の表示：-4.9kbpは、NXF遺伝子の転写開始点から上流-4.9kbpまでを含むマウスNXFのプロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトである。-4.4kbpは同様にNXFの転写開始点から上流-4.9kbpまでを含むマウスNXFのプロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトである。以下同様である。
【０００９】
【図２】ヒト神経系由来細胞株SK-N-SHに対し、-4.9kbpと横軸に表示されている群ではNXF遺伝子の転写開始点から上流-4.9kbpまでを含むマウスNXFのプロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクト、TATAと表示されている群では最小プロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクト、そしてMuta11〜Muta18と表示されている群ではNXF遺伝子プロモーター領域の各種Deletion mutant（NXF遺伝子プロモーター上流-3.4kbpから-2.9kbpの領域を順次欠失させたDeletion mutant:Muta11〜Muta18）により制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションし、培養液中に脳由来神経栄養因子を加えない場合(-)、100ng/mlの脳由来神経栄養因子を加えた場合（＋BDNF）、のそれぞれのレポーター活性を示す図である。縦軸は相対活性で表示されている（RLU: Relative light unit）。この検討結果から、Muta15にありMuta16には無い短い塩基配列である、塩基番号３で示される塩基配列（5’-GGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTTTAGCAGCGGCCAGGAG-3’）がNXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導を司る同遺伝子プロモーター上の責任エレメントを含有することがわかる（活性発現に必須な最小限の塩基配列以外の周辺配列も含む）。
【００１０】
【図３】本実験は、図２の検討で判明したNXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導を司る同遺伝子プロモーター上の責任エレメントを含有する短い領域の中で、どの個々の塩基が脳由来神経栄養因子応答性を与えるのに不可欠かを更に検討し、そのコアとなるエレメントを特定した結果である。  まず横軸一群目の‘Wild’においては、ヒト神経系由来細胞株SK-N-SHに対し、図２の検討で判明したNXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導を司る同遺伝子プロモーター上の責任エレメント前後の短い塩基配列（活性発現に必須な最小限の塩基配列以外の周辺配列も含む）である、配列番号４で示される塩基配列（5’- GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）を最小プロモーターを持つルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ上流に組み込み構築したレポーターコンストラクト（Wild）を、ヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションし、培養液中に脳由来神経栄養因子を加えない場合(-)、100ng/mlの脳由来神経栄養因子を加えた場合（＋BDNF）、のそれぞれのレポーター活性が示されている。このWildのレポーターの代わりに、上記のオリゴヌクレオチドに対してシステマチックに順次変異を導入した二本鎖オリゴヌクレオチド（以下、最後にリストを示した）を、最小プロモーターを持つルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ上流に組み込み構築したコンストラクト（Mutant1〜47）を用いてヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションして同じ検討を行ったのが二群目からの結果である。  以下小文字下線部がWildの塩基配列に対して変異を導入した箇所である。
【００１１】
Mutant 1:（配列番号５）
5’-tGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 2: （配列番号６）
5’-ttAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 3: （配列番号７）
5’-tttGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 4: （配列番号８）
5’-ttttAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 5: （配列番号９）
5’-GttttGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 6: （配列番号１０）
5’-GGttttAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 7: （配列番号１１）
5’-GGAttttGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 8: （配列番号１２）
5’-GGAGttttTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 9: （配列番号１３）
5’-GGAGAtttaGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 10: （配列番号１４）
5’-GGAGAGttTtGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 11: （配列番号１５）
5’-GGAGAGAtTttGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 12: （配列番号１６）
5’-GGAGAGAGTtttGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 13: （配列番号１７）
5’-GGAGAGAGTttttTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 14: （配列番号１８）
5’-GGAGAGAGTGtttaGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 15: （配列番号１９）
5’-GGAGAGAGTGGttatACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 16: （配列番号２０）
5’-GGAGAGAGTGGGtattCTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 17: （配列番号２１）
5’-GGAGAGAGTGGGGatttTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 18: （配列番号２２）
5’-GGAGAGAGTGGGGTtttaCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 19: （配列番号２３）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGttatAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 20: （配列番号２４）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGAtattGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 21: （配列番号２５）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACatttCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 22: （配列番号２６）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTttttCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 23: （配列番号２７）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCttttAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 24: （配列番号２８）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAttttGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 25: （配列番号２９）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGttttGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 26: （配列番号３０）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCttttCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 27: （配列番号３１）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCttttCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 28: （配列番号３２）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAttttAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 29: （配列番号３３）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGttttGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 30: （配列番号３４）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGttttGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 31: （配列番号３５）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCttttATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 32: （配列番号３６）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCttttTGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 33: （配列番号３７）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAtttaGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 34: （配列番号３８）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGttatACTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 35: （配列番号３９）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGtattCTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 36: （配列番号４０）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGAatttTCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 37: （配列番号４１）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATtttaCACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 38: （配列番号４２）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGttatACACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 39: （配列番号４３）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGAtattCACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 40: （配列番号４４）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACatttACTGACAGTATTTT-3’
Mutant 41: （配列番号４５）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTttttCTGACAGTATTTT-3’
Mutant 42: （配列番号４６）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCttttTGACAGTATTTT-3’
Mutant 43: （配列番号４７）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCAtttaGACAGTATTTT-3’
Mutant 44: （配列番号４８）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACttatACAGTATTTT-3’
Mutant 45: （配列番号４９）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACAtattCAGTATTTT-3’
Mutant 46: （配列番号５０）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACatttAGTATTTT-3’
Mutant 47: （配列番号５１）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTttttGTATTTT-3’
【００１２】
この実験の検討結果から、NXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導を司る同遺伝子プロモーター上の責任エレメントを含む短い塩基配列である、配列番号４で示される塩基配列（5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）
の中の必要不可欠なコア配列は、以下の太字下線部２箇所であることが明らかとなった。
【００１３】
（配列番号４）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００１４】
【図４】5’末端をビオチンラベルした２本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号４：5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）を用いたゲルシフトアッセイの結果を示す図である。ラット大脳皮質初代培養ニューロンを培養開始14日後、培養液中に終濃度100ng/mlの脳由来神経栄養因子を添加し、30分後、2時間後、3時間後、そして対照としてVehicle添加で脳由来神経栄養因子無処理、のそれぞれの細胞を回収し、その細胞核抽出物をゲルシフトアッセイに供した。ここで用いたビオチンラベルオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイにより、脳由来神経栄養因子処理依存的に、Shifted bandで示される陽性シグナルを検出することができた。このShifted bandは、脳由来神経栄養因子処理に応答して用いたオリゴヌクレオチドに特異的に結合する因子が核内に出現することを意味し、このように上記現象を用いて脳由来神経栄養因子活性を簡便に且つ正確に検出することができた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、「神経栄養」及び「神経栄養性能力」とは、例えば、末梢神経系において、運動神経細胞、感覚神経細胞、坐骨神経細胞等を生存維持・増強する作用や再生・修復促進する作用、及び、当該作用を有すること、また中枢神経系において、前脳基底野コリン作動性神経細胞、小脳顆粒細胞、大脳皮質神経細胞、海馬神経細胞、中脳黒質神経細胞等が形成する神経組織を保護する作用、及び、当該作用を有すること等を意味する。具体的には例えば、脳由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子様低分子物質、脳由来神経栄養因子様活性増強低分子物質として知られている物質が有する作用等を挙げることができる。そして当該作用を有する物質は、神経細胞が変性していく神経変性疾患と一般に呼ばれる神経難病（アルツハイマー病や筋異種浮く性側索硬化症、糖尿病性末梢神経病、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、各種ニューロパチー、外傷性神経障害さらには網膜変性疾患等の病態等が含まれる。）の治療薬、神経の再生の促進薬、神経細胞死を防ぐ薬となる可能性がある。
【００１６】
本発明において、「NXF遺伝子」とは、NPAS4遺伝子と記載されることもある。NXF遺伝子は核内においてその標的となる遺伝子群の発現を調節する遺伝子転写調節因子であり、そのcDNA配列及び蛋白質配列は、例えばGenbank Accession No. AB049469,  AB050103,  AB049835等に報告されており、またマウスのNXFゲノム遺伝子はGenbank Accession No. AB054577で報告されている既知の遺伝子である。
【００１７】
本発明において遺伝子の「プロモーター」とは、遺伝子のｍRNAの転写を制御するｍRNAの転写開始点周辺のゲノム上の領域を意味する。その位置は遺伝子の蛋白質をコードする領域の５’上流にある場合もあるし、３’下流にある場合、イントロンにある場合等がある。遺伝子のプロモーター領域は、細胞型特異的遺伝子発現又は組織特異的遺伝子発現等に関わる領域や、細胞内シグナル等に応答して遺伝子発現を引き起こす領域、転写を促進するためのエンハンサーと呼ばれる領域、そして基本的な遺伝子の転写開始に最低限必要な最小プロモーター等を全て含む。
【００１８】
本発明において、「オリゴヌクレオチド」とは、通常、2bp〜150bp程度の長さの塩基配列を有するものを意味する。なかでも、16bp〜100bp程度の長さのものが好ましい。
【００１９】
本明細書において、DNAの調製やベクターの調製等の分子生物学的な手法、蛋白質の抽出やゲルシフトアッセイ、レポーターアッセイ等は、特に明記しない限り、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) )、新生化学実験講座（日本生化学会編;  東京化学同人）等の実験書に記載される方法又はそれに準じた方法により行うことができる。
【００２０】
本発明オリゴヌクレオチドは、ＮＸＦ遺伝子のプロモーター領域に存在することにより脳由来神経栄養因子による当該ＮＸＦ遺伝子の発現を誘導する機能を有するエレメントを２個以上含むオリゴヌクレオチドであり、前記エレメントが下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列であることを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
＜塩基配列群＞
（１）配列番号１で示される塩基配列（5’-GTGACTCA-3’）
（２）配列番号２で示される塩基配列（5’-ATGACTCA-3’）
【００２１】
本明細書で開示された塩基配列に基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller.M. et al.,  Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することができる。また、NXF遺伝子のプロモーター領域内に存在する同塩基配列を持つヌクレオチド部分を通常の制限酵素処理やPCR法といった常法でその部分だけを取り出すことにより調製することもできる。
このようにして得られた本発明オリゴヌクレオチドは、例えば、通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えば、pGL2、pGL3、pGL4（Promega社製）等の市販のルシフェラーゼレポーター基本ベクター等にクローニングすることができる。この際、ルシフェラーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子等のこれまで知られているレポーター遺伝子の種類は目的に応じていずれのものを採用してもかまわないが、なかでも、ルシフェラーゼが好ましい。これらのレポーター基本ベクター中のレポーター遺伝子の蛋白質翻訳領域の上流に、アッセイ時に用いる宿主細胞で機能可能な最小プロモーターを機能可能な形で結合させ、そのさらに上流に本発明オリゴヌクレオチド（NXFプロモーター上の機能エレメント）を連結させることにより、本発明遺伝子構築物（例えば、レポータープラスミドコンストラクト）を作製することができる。
【００２２】
上記の「最小プロモーター」とは、通常、TATAboxと呼ばれるTATAAAから基本的に成る10bp以内のエレメントとその10〜30bp下流に通常は存在する転写開始点の周辺配列との二つから基本的に構成されるものを意味する。本発明で用いられる「最小プロモーター」は、哺乳類の種々の遺伝子で既に報告されているものを採用すればよい。なかでもβグロビンの最小プロモーター等の採用実績の多いものを利用することが好ましい。または、上述の市販のレポーター基本ベクターに、予めレポーター遺伝子の翻訳領域の上流に組み込まれている基本プロモーターをそのまま利用してもよい。
本発明オリゴヌクレオチドが有する塩基配列の下流に、最小プロモーターが有する塩基配列を組み込む際には、直接結合させてもよいし、または、最小プロモーターが有する塩基配列と本発明オリゴヌクレオチドが有する塩基配列との間に、若しくは、本発明オリゴヌクレオチドが有する塩基配列の上流に、任意の塩基配列を持ったポリヌクレオチドを組み込んでもよい。但し、得られる本発明遺伝子構築物の神経栄養性物質に対する選択性を確保するために、その任意の塩基配列を持ったポリヌクレオチドは神経栄養性刺激以外の増殖因子刺激や浸透圧刺激、cAMP、Ca刺激等の他の細胞刺激に応答性を有する塩基配列でないことが必要である。好ましくは本発明オリゴヌクレオチドが有する塩基配列と最小プロモーターが有する塩基配列は直接結合させるのがよい。
【００２３】
このようにして得られた本発明遺伝子構築物を宿主細胞に導入することにより、本発明形質転換細胞を取得することができる。本発明遺伝子構築物を宿主細胞に導入する方法としては、例えば、宿主細胞に応じたリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等の通常の導入方法を適用することができる。本発明形質転換細胞としては、外部から導入したレポーター遺伝子等を細胞の染色体上に安定的に組み込んだ安定形質転換細胞であってもよいし、又は、一過的に導入した形質転換細胞であってもよい。仮に安定形質転換細胞を選抜する場合には、例えば、本発明遺伝子構築物と必要に応じて脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドを、細胞選抜用マーカー遺伝子と共に宿主細胞に導入し、当該マーカー遺伝子の性質に応じた方法で細胞を培養すればよい。具体的には例えば、前記マーカー遺伝子が、宿主細胞に致死活性を示す選抜薬剤に対する薬剤耐性を付与する遺伝子である場合には、当該薬剤を添加した培地を用いて、本発明遺伝子構築物（及び脳由来神経栄養因子レセプターを発現していない宿主細胞の場合には、脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドとの両者）が染色体上に安定的に取り込まれて細胞から両者が脱落していない細胞クローンを選抜すればよい。薬剤耐性付与遺伝子と選抜薬剤との組み合わせとしては、例えば、ネオマイシン耐性付与遺伝子とネオマイシンとの組み合わせ、ハイグロマイシン耐性付与遺伝子とハイグロマイシンとの組み合わせ、ブラストサイジンS耐性付与遺伝子とブラストサイジンSとの組み合わせ等を挙げることができる。また、前記マーカー遺伝子が宿主細胞の栄養要求性を相補する遺伝子である場合には、当該栄養素を含まない最小培地を用いて細胞選抜を行えばよい。前記マーカー遺伝子が染色体上に安定的に取り込まれて生き残った細胞クローンのうち、本発明遺伝子構築物（及び脳由来神経栄養因子レセプターを発現していない宿主細胞の場合には、脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドとの両者）が染色体上に安定的に取り込まれたクローンの選抜には、候補細胞クローンのゲノムDNAを通常の遺伝子工学的方法に準じて調製し、調製されたゲノムDNAから、導入された本発明遺伝子構築物（及び脳由来神経栄養因子レセプターを発現していない宿主細胞の場合には、脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドとの両者）の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるPCRや、同部分塩基配列から設計したプローブに用いるサザンハイブリダイゼーション等の方法を利用することにより、本発明遺伝子構築物（及び脳由来神経栄養因子レセプターを発現していない宿主細胞の場合には、脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドとの両者）が染色体上に安定的に取り込まれたことを確認すればよい。
【００２４】
用いられる宿主細胞に関して、レポーターアッセイ等の目的でレポーター遺伝子、脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子等の遺伝子を細胞に導入する場合には、用いられる細胞は、株化された哺乳類の培養細胞であることが好ましい。より好ましい細胞としては、例えば、神経系の培養株化細胞であって本来脳由来神経栄養因子レセプターを発現していないがトランスフェクションにより容易に脳由来神経栄養因子レセプターを強制発現させることができるSK-N-SH細胞やSH-SY-5Y細胞等を挙げることができる。
【００２５】
本発明検定方法１は、物質が有する神経栄養性能力の検定方法であり、
（ａ）本発明形質転換細胞と被験物質とを、前記形質転換細胞に導入されたレポーター遺伝子の転写物量を増加させうるような条件下で、接触させる第一工程、
（ｂ）第一工程後、３時間以上６０時間以下の範囲内での、前記形質転換細胞内に蓄積された、又は、培養液中に分泌され培養液中に蓄積された、レポーター遺伝子産物の量を測定する第二工程、
（ｃ）第二工程により測定されたレポーター遺伝子産物の量を、対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度を評価する第三工程を有することを特徴とする。
【００２６】
好ましい対照値としては、例えば、被験物質に接触していない前記形質転換細胞におけるレポーター遺伝子産物の量等を挙げることができる。また、第一工程において、前記形質転換細胞に導入されたレポーター遺伝子の転写物量を増加させうるような好ましい条件としては、例えば、脳由来神経栄養因子の存在下での接触等を挙げることができる。尚、脳由来神経栄養因子の好ましい存在量としては、例えば、１ng/ml以上５０ng/ml以下の範囲内を挙げることができる。
【００２７】
具体的には例えば、本発明形質転換細胞を用いて、当該形質転換細胞と被験物質とを培養液中で接触させ、その状態で、例えば、３時間以上６０時間以下の範囲内でインキュベートする。得られた形質転換細胞から、例えば、市販のレポーターアッセイ用の細胞溶解剤(Promega社製等)を利用して、細胞抽出物を調製し、それに含まれるレポーターの活性を、例えば、市販のレポーター酵素の基質液を用いて測定する。その際の測定値が神経栄養性能力の検定指標となる。より具体的には例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いた場合には、各処理群の形質転換細胞から調製された細胞抽出物に、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン又は市販のルシフェラーゼ用発光基質（Promega社製等）を添加すると、細胞抽出物中のルシフェラーゼ量に比例した強度で発光する。従って、この発光強度をルミノメーター等の測定装置で測定することにより、ルシフェラーゼの量、ひいてはルシフェラーゼ（レポーター）遺伝子を発現させるプロモーターの活性を知ることが出来る。被験物質と並行して「対照物質」となり得るポジテイブコントロール又はネガテイブコントロールを用いて本発明検定方法を実施することにより、本発明検定方法でいう「対照値」とすることが好ましい。ここで「ポジテイブコントロール」とは、神経栄養性能力を有する任意の物質を表す。具体的には例えば、脳由来神経栄養因子、脳由来神経栄養因子をmimicする物質、脳由来神経栄養因子の活性を増強する物質等を挙げることができる。細胞内在性の脳由来神経栄養因子が働いている組織部位のみで神経栄養性能力を有するという観点では、脳由来神経栄養因子の活性を増強する物質の方が好ましい。また「ネガテイブコントロール」としては、被験物質に含まれる溶媒、バックグラウンドとなる試験系溶媒等を挙げることができる。「対照物質」をネガテイブコントロールとする場合、神経栄養性能力が対照物質のレポーターの活性の測定値よりも大きければ、当該被験物質は神経栄養性能力を有すると評価すればよい。この場合、その活性値の差が10% 以上、好ましくは30%以上差があることをもって判定を下すことが好ましい。一方、被験物質のレポーターの活性の測定値がネガテイブコントロールの場合のレポーター測定値と同等又は小さければ、当該被験物の神経栄養性能力は無いと評価することができる。この場合、その活性値の差が10% 以上、より好ましくは30%以上差があることをもって判定を下すことが好ましい。また、対照物質をポジテイブコントロールとする場合、被験物質を評価した時のレポーター測定値と対照物質の場合のレポーター測定値（即ち、対照値）とを比較することにより、被験物の神経栄養性能力を評価すればよい。この場合、被験物質の場合の測定値がポジテイブコントロールの測定値と比較し、ポジテイブコントロールの場合の測定値の1/10以上、好ましくは1/5以上の値を示すことをもって被験物質が神経栄養性能力を持つと判定を下すことが好ましい。被験物質が、例えば、神経に内在する脳由来神経栄養因子等の活性を増強するタイプの物質である場合は、脳由来神経栄養因子等の内在性神経栄養性物質単独の場合の測定値に対して、それに被験物質が共存した場合の測定値が、10% 以上、より好ましくは30%以上増加したことをもって、当該被験物質は神経栄養性能力を有すると判定することが好ましい。
このようなレポーターアッセイを利用した本発明検定方法１において、本発明形質転換細胞と接触させる被験物質の濃度としては、低分子化合物である場合、例えば、約0.01μM〜約10μMの範囲を挙げることができる。例えば、脳由来神経栄養因子等の内在性神経栄養性物質を共存下に被験物質の活性を測定する場合には、共存させるその内在性神経栄養性物質の濃度としては、例えば、1ng/ml〜50ng/mlの範囲を好ましく挙げることができる。尚、当該形質転換細胞と被験物質とを接触させる時間としては、例えば、３時間以上６０時間以下の範囲内を挙げることができる。具体的には例えば、pGL4.10ベクター（Promega社製）の系統のベクターをルシフェラーゼレポーター遺伝子のホストベクターとして用いる場合には、好ましくは、１２時間以上２４時間以下の範囲内を挙げることができる。また、pGL4.11ベクター（Promega社製）の系統のベクターをルシフェラーゼレポーター遺伝子のホストベクターとして用いる場合には、好ましくは。４時間以上６時間以下の範囲内を挙げることができる。
【００２８】
本発明検定方法２は、物質が有する神経栄養性能力の検定方法であり、
（ａ）脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子を発現する細胞と被験物質とを、前記細胞核内に前項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子が出現させうる条件下で、接触させる第一工程、
（ｂ）第一工程後、１０分間以上１２時間以下の範囲内での、細胞核内に蓄積された蛋白質画分を抽出し、得られた核抽出物の中に存在する、前項１〜５のいずれかの前項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量を測定する第二工程、
（ｃ）第二工程により測定された前項１〜５のいずれかの請求項記載のオリゴヌクレオチドに結合する因子の量を、対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度を評価する第三工程を有することを特徴とする。
【００２９】
好ましい対照値としては、例えば、被験物質に接触していない前記細胞における核抽出物の中に存在する、本発明オリゴヌクレオチドに結合する因子の量等を挙げることができる。また、第一工程において、前記細胞核内に本発明オリゴヌクレオチドに結合する因子が出現させうる好ましい条件が、脳由来神経栄養因子レセプター蛋白質と当該蛋白質の標準リガンドである脳由来神経栄養因子との接触等を挙げることができる。尚、脳由来神経栄養因子の好ましい存在量としては、例えば、１ng/ml以上５０ng/ml以下の範囲内を挙げることができる。
【００３０】
このような本発明オリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイ法において用いられる細胞としては、例えば、脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子を発現する哺乳類細胞や、脳由来神経栄養因子レセプター遺伝子を導入することにより脳由来神経栄養因子レセプターを強制的に発現させた哺乳類細胞等を挙げることができる。哺乳動物から採取された脳組織等の神経組織（即ち、細胞の集団としての生体試料）又はこれら組織から分離された細胞若しくはその培養細胞等のいずれの形態での細胞であってもよい。好ましい細胞としては元々脳由来神経栄養因子レセプターを発現しているマウスやラット由来の初代培養神経細胞等を挙げることができる。尚、脳初代培養神経細胞は、例えば、黒木登志夫、許南治編集、培養細胞実験ハンドブック（発行所：羊土社）、p225-229、2004年8月5日（ISBN4-89706-884-3）等に記載される通常の方法に従って調製することができる。
実際の脳内の細胞に近いと思われるより好ましい細胞としては、例えば、哺乳動物から採取された脳組織がスライスされて得られる生体試料（細胞の集団としての生体試料）等を挙げることができる。勿論、これらの生体試料はそのままの状態で用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画等の種々の操作により調製された試料であってもよい。尚、本発明において「哺乳動物」として、いかなる哺乳動物でも用いることができるが、実験動物としては非ヒト哺乳動物が好ましい。このような哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ウマ、ネコ等が挙げられるが、なかでも個体発生に要する期間及び生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯類哺乳動物を好ましく挙げることができる。
【００３１】
本発明オリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイ法である本発明検定方法２を実施する際には、上述の細胞にまず被験物質及び対照物質を接触させる。被験物質と並行して「対照物質」となり得るポジテイブコントロール又はネガテイブコントロールを用いて本発明検定方法２を実施することにより、本発明検定方法２でいう「対照値」とすることが好ましい。例えば、培養細胞である場合には、培養液中に被験物質又は対照物質を加えインキュベートする。ネガテイブコントロールの対照としては、例えば、被験物質を溶解させる際に用いた溶媒を用いればよい。尚、細胞の集団としての生体試料（組織）である場合には、被験物質と細胞とを接触させる際に、被験物質を塗布するなどしてもよい。場合によっては哺乳動物個体に被験物質を投与することにより、細胞と被験物質との接触をさせてもよい。それらの細胞と被験物質を接触させる際の細胞表面における被験物質の濃度としては、低分子化合物である場合、例えば、約0.01μM〜約10μMの範囲を挙げることができる。また、例えば、脳由来神経栄養因子等の内在性神経栄養性物質を共存下に被験物質の活性を測定する場合には、共存させるその内在性神経栄養性物質の濃度としては、例えば、１ng/ml〜５０ng/mlの範囲を挙げることができる。その脳由来神経栄養因子等を接触系内に存在させるためには、脳由来神経栄養因子を内在する細胞を用いてもよいし、また、細胞と被験物とを接触させる系内に更に脳由来神経栄養因子を外的付加により存在させることもできる。
尚、ゲルシフトアッセイを行う場合の細胞と被験物質とを接触させる時間としては、例えば、培養細胞の場合には、例えば、１０分間〜１２時間の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、３０分間〜３時間の範囲を挙げることができる。次いで、被験物質と細胞を接触させる操作後、培養細胞の場合には遠心分離等により培養液から被験物質を接触させた細胞を集め、集められた細胞を、例えば、細胞核抽出物を調製するための市販のキット（例えばActive Motief社製  Nuclear Extract Kit #40410）を用いて処理することにより、細胞核抽出物を調製する。得られた細胞核抽出物とビオチンで末端ラベルされた本発明オリゴヌクレオチドと、NaCl又はKCl 100mMと1mM MgCl2、50ng/μlのPoly ｄI-dC（ロッシュダイアグノステックス社製）を存在させた通常のBuffer、例えば、20mM  HEPES中で混合した後、得られた混合物をpH7、4℃〜37℃、好ましくは25℃程度の温度で、1分間〜1時間、好ましくは１０分間〜２０分間インキュベートする。この際のBufferは、市販のゲルシフトアッセイキット（例えばCell signaling社製  Gelshift Chemiluminescent EMSA ＃37341）に付属するBinding bufferをそのまま用いてもよい。この混合物を、例えば、0.5XTBE Buffer（ニッポンジーン社製）で作製した4%アクリルアミド（39:1）ゲル等のNative PAGEゲルにアプライし電気泳動する。電気泳動の条件としては、ゲル作製時に用いた、例えば、0.5XTBEをBufferにして、例えば、30mA定電流の条件で電気泳動すればよい。電気泳動後のゲルをナイロンメンブレン（例えば、Invitrogen社製iBlot DNA trasfer stacks）と密着させ、セミドライブロッテイング装置（例えば、Invitrogen社製iBlot）を用いてゲルに電気泳動されたオリゴヌクレオチドをナイロンメンブレンに転写させる。この際の装置の条件は、それぞれのブロッテイング装置に推奨されている条件に従えばよい。具体的には例えば、Invitrogen社製iBlotであればプリセットされたプログラムNo.8を用いて８分間で転写を行う。次いで、このオリゴヌクレオチドが転写されたメンブレンを、UVクロスリンカー（例えば、ATTO社製DNA-FIX）を用いて、例えば、254nm波長で120mJ/cm2の条件でDNAをメンブレンに固定化する。次に、得られたメンブレンを、例えば、市販のゲルシフトアッセイキット（例えば、Cell signaling社製  Gelshift Chemiluminescent EMSA ＃37341）に付属するBlocking Buffer中で、室温、15分間〜30分間インキュベートする。得られたメンブレンを取り出し、同キットに付属するストレプトアビジンHRP液を添付説明書通り添加し、室温で１５分間〜３０分間インキュベートする。次に、同キット付属のWash Buffer中で、室温、５分間インキュベートを4回程度繰り返した後、得られたメンブレンを洗浄する。洗浄後のメンブレンを取り出し、当該メンブレンに、キット付属のHRP基質液を添加し、生じた化学発光イメージを、例えば、富士フィルム社製LAS-4000で取得する。Freeのビオチンラベルされた本発明オリゴヌクレオチドは、ゲル中で最も早く電気泳動される。一方、被験物質に神経栄養性物質、例えば、脳由来神経栄養因子が含まれている場合には、その被験物質で処理された細胞の核内に、本発明オリゴヌクレオチドに特異的に結合する蛋白質が出現し、その蛋白質が、本発明オリゴヌクレオチド及び核抽出物をインキュベートしている間に、本発明オリゴヌクレオチド：蛋白質の複合体を形成する。形成された複合体は、Freeの本発明オリゴヌクレオチドよりも全体が大きく、Native PAGEゲルの網目を通る際の抵抗が大であるために、最も遅れて電気泳動される。その結果として、ゲル中の本発明オリゴヌクレオチドの分布を、上記のイメージャーで取得すると、電気泳動が遅れたバンドが出現する。被験物質に神経栄養性物質が含まれない場合、及び、ネガテイブコントロールの対照の場合には、そのバンドはほとんど認められない。この際のバンド強度は、例えば、イメージャーの定量機能を用いて定量することも可能である。このようにして、被験物質の接触により対照ではほとんど認められない当該電気泳動が遅れた特徴的なバンドの出現の有無、又は、バンド強度が被験物質の接触により対照の場合よりも増大することを指標にして、被験物質に神経栄養性物質が含まれるかどうか、神経栄養性作用を有するか否かの検定を行うことができる。
【００３２】
本発明検定方法における被験物質としては、特に限定は無く、核酸、ペプチド、蛋白質、有機化合物、無機化合物等であり、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子有機化合物、合成ペプチド、合成核酸、天然化合物等を挙げることができる。被験物質の形態に特に限定は無く、固体、液体、基材との混合物、分散液又は溶液等として用いることができる。分散液若しくは溶液とする場合、水、pH緩衝液、生理食塩水、有機溶媒（通常エタノールやジメチルスルホキシドが用いられる。）等を用いる。細胞と接触させる際には、例えば、細胞に重篤な影響を及ぼさない形態、媒体を用いるのが好ましい。尚、被験物が細胞毒性不純物を含むことが予想される場合等には、前記不純物を除く操作を行っておくことが好ましい。また基材としてはグリセリン、スクワラン等の油等が挙げられ主に塗布用の被験物を調製し組織抽出物を用いたゲルシフトアッセイを実施するために用いられる。
【００３３】
更に、上記のような本発明検定方法は、神経栄養性能力を有する物質の探索等に利用することができる。即ち、本発明探索方法は、本発明検定方法により評価された、被験物質が有する神経栄養性能力の有無若しくはその存在程度に基づき神経栄養性能力を有する物質を選抜する工程を含むことを特徴とする。
選抜された神経栄養性能力を有する物質は、例えば、神経栄養性薬剤の有効成分として利用することができる。因みに、約3,000,000〜4,000,000人のアメリカ人は、アルツハイマー病に悩まされていることが知られており、従ってそのアルツハイマー症を代表とする神経変性疾患と一般に呼ばれる神経難病を治療するための薬剤の探索は、社会的に非常に重要である（Mattson MP., Scheff SW., Endogenous neuroprotection factors and traumatic brain injury: mechanisms of action and implications for therapy. J Neurotrauma. 1994; 11(1):3-33.）。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。
【００３５】
実施例１
まず、約1x10７のヒト神経芽腫由来の培養細胞SK-N-SH（ATCCより購入）を、15%FBSと1mMピルビン酸ナトリウムおよび１X MEM NEAA（GIBCO社製＃11140）とを含むDMEM培地（日水製薬製）を用いて37℃にて5％CO2存在下に、直径約10cmのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシンではがし、24wellプレートに5x105/wellの割合で播き直し、6時間後に以下のトランスフェクションに供した。トランスフェクションはLipofectamine2000試薬（Invitrogen社製）を用いて、その添付説明書に従って行った。0.1μg/wellの脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと「各群のそれぞれのレポーター遺伝子コンストラクト」0.7μg/wellを混合したものを50μlのOptiMEM（Invitrogen社製）で希釈し、またそれとは別に2μl/wellのLipofectamine2000試薬を50μlのOptiMEM（Invitrogen社製）で希釈し、その両者をすばやく混合して得られた混合物を室温で30分間インキュベートした後、その全量100μl/wellを24穴プレート上に培養された細胞の培養液に添加した。24時間後に100ng/ｍｌの終濃度になるように脳由来神経栄養因子（和光純薬製）を培養液に添加し（図中の実験データグラフで「＋BDNF」と表示されている実験区）、または、その対照として脳由来神経栄養因子を溶解させるために用いた溶媒(水)を同量添加し（図中の実験データグラフで「（−）」と表示されている実験区）、次いで５時間後に培養液に等量の細胞溶解性ルシフェラーゼ発光基質液（Steady Glow,  Promega社製）を添加して、ルミノメーター（LB960,ベルトールド社製）を用いて各Wellの発光量を1秒づつ測定した。各実験区は、N=2またはN=4でその平均値を求め、その値の相対値（Relative light unit:RLU.）を図中の実験データのグラフの縦軸に表示した。
脳由来神経栄養因子レセプターcDNAは、Genbankに登録されているヒト脳由来神経栄養因子レセプター（trkB）のcDNA配列(Genbank accession No. NM＿006180の配列情報を参考に設計したPCRクローニング用プライマー（配列番号５２：5’-atgtcgtcctggataaggtggcatggacccgccat-3’、及び、配列番号５３：5’-ctagcctagaatgtccaggtagaccggagatgcct-3’）を用いたPCR法により、ヒトBrain ｃDNAライブラリーよりPCRクローニングした。同PCR時の条件はcDNAライブラリー0.1μgを鋳型にし、95℃5分一回、次に「95℃30秒68℃4分」の2stepのサイクルを35サイクルであった。こうして得たcDNAをpCDNA3.1（＋）ベクター（Invitrogen社製）の発現プロモーターの下流のマルチクローニングサイト中の平滑末端化したHindIIIサイトに当該cDNAをサブクローニングしたものを脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドとして用いた。インサートの方向が発現するように正しく導入されていること、及び、インサート配列にPCR由来の変異が入っていないことはSequencingにより確認した。
「各群のそれぞれのレポーター遺伝子コンストラクト」は以下のようにして作製した。以下にリストアップするPCRのプライマーの組み合わせで、マウスのゲノムDNA（Clontech社製）1μgを鋳型にPCRを行うことによりヒトのNXF遺伝子のプロモーター領域の一部をPCRクローニングした。その際のPCRの条件は、95℃5分一回、次に「95℃30秒68℃5分」の2stepのサイクルを35サイクルであった。実験（図３参照）で用いた「各群のそれぞれのレポーター遺伝子コンストラクト」の作製の場合は、NXF遺伝子のプロモーター領域の一部に一連の変異を導入したものを化学合成にて得たオリゴヌクレオチド（一本鎖の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングで2本鎖にしたもの）を用いた。その塩基配列は以下にリストアップした。こうして得たNXF遺伝子のプロモータ-領域の一部、または、その塩基配列に変異を入れたインサートDNAを、最小プロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つpGL4.24ベクターの最小プロモーターの直上に存在するマルチクローニングサイトの平滑末端化したNheIサイトに導入した。インサートの方向が発現するように正しく導入されていること、及び、インサート配列にPCR由来の変異が入っていないことはSequencingにより確認した。これをそれぞれ試験区で用いる「各群のそれぞれのレポーター遺伝子コンストラクト」として用いた。尚、図２の試験区として「TATA」と表記されている群で用いたレポーター遺伝子コンストラクトは、最小プロモーターを持つpGL4.24ベクターをそのまま用いている。図１〜図３の横軸に表示されているそれぞれの試験区で用いた「各群のそれぞれのレポーター遺伝子コンストラクト」を作製するために使用したPCRプライマー、及び、化学合成にて得たオリゴヌクレオチド（２本鎖の片方の鎖の配列のみを表示してある。）のリスト：
【００３６】
-4.9kbp:
（配列番号５４）5’-AGGAACAGAAAGCTCTGAGTTCTCCCAGAACATTC-3’
（配列番号５５）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００３７】
-4.4kbp:
（配列番号５６）5’-TGAGGGGTGATGACCCTCTAGAGCCCCAATAAAGC-3’
（配列番号５７）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００３８】
-3.9kbp:
（配列番号５８）5’-ATAGATGGTGCAAAAACCAACGAATGGCGTCCTAG-3’
（配列番号５９）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００３９】
-3.4kbp:
（配列番号６０）5’-GCTGCATGTTCACCCAGTAAGTTTGGCTGTGAATA-3’
（配列番号６１）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４０】
-2.9kbp:
（配列番号６２）5’-CCCTTCCCTACCCCCTCCCTTGCCCCTTTCTAGAA-3’
（配列番号６３）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４１】
-2.4kbp:
（配列番号６４）5’-CCCAGAGATAGAATGGTTGTCTAGCATACACAGAG-3’
（配列番号６５）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４２】
-1.9kbp:
（配列番号６６）5’-TCTTCCCATACCCCCTGCTTTTCACTCCACGTTGC-3’
（配列番号６７）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４３】
-1.4kbp:
（配列番号６８）5’-GGTGGGGTGATGCAAAGGCCACACTACAAAGACAA-3’
（配列番号６９）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４４】
-930bp:
（配列番号７０）5’-CCAGCCCGCCGGAGAGACTGGGGCTCGCAAGAGGG-3’
（配列番号７１）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４５】
-450bp:
（配列番号７２）5’-GCAGAGGACCAAGCCCCTTCTCATCCTTTGCCTCC-3’
（配列番号７３）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４６】
-150bp:
（配列番号７４）5’-ACCCCCCCTCCCCAGCCAGTGGCTCCCTCTGCAGC-3’
（配列番号７５）5’-CTCCTGACAGGCGTGGGGGGCTCGTTTTTAGAGACGG-3’
【００４７】
Muta11:
（配列番号７６）5’-GCTGCATGTTCACCCAGTAAGTTTGGCTGTGAATA-3’
（配列番号７７）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００４８】
Muta12:
（配列番号７８）5’-TACACACACACACACACACACACACACACACACAC-3’
（配列番号７９）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００４９】
Muta13:
（配列番号８０）5’-TCTCCCAACTTTGTCCACTTTCCCATAACCAAAGG-3’
（配列番号８１）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００５０】
Muta14:
（配列番号８２）5’-TTCCAATTCTGTTTTGCTGCTGCTGCTGCCGCCGC-3’
（配列番号８３）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００５１】
Muta15:
（配列番号８４）5’-GGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGA-3’
（配列番号８５）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００５２】
Muta16:
（配列番号８６）5’-CTCTCTAGCGTGCCAGCCGCCCCCCTCCTCCTGCT-3’
（配列番号８７）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００５３】
Muta17:
（配列番号８８）5’-ATATAAATAGCTCTTCTCCCACGGCCTGAAGCTGC-3’
（配列番号８９）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００５４】
Muta18:
（配列番号９０）5’-AGTTAAAAATAGTTTCATGGAGGTGGGAGGCAAGA-3’
（配列番号９１）5’-ATCATCTTAGTTCGACTACTCTGATTCAAGTTGAG-3’
【００５５】
Wild:
（配列番号９２）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００５６】
T-Muta 1:
（配列番号９３）5’-TTTTAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００５７】
T-Muta 2:
（配列番号９４）5’-GGAGTTTTTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００５８】
T-Muta 3:
（配列番号９５）5’-GGAGAGAGTTTTGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００５９】
T-Muta 4:
（配列番号９６）5’-GGAGAGAGTGGGTTTTCTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００６０】
T-Muta 5:
（配列番号９７）5’-GGAGAGAGTGGGGTGATTTTGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００６１】
T-Muta 6:
（配列番号９８）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCATTTTGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００６２】
T-Muta 7:
（配列番号９９）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCATTTTAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００６３】
T-Muta 8:
（配列番号１００）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCTTTTTGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００６４】
T-Muta 9:
（配列番号１０１）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATTTTTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００６５】
T-Muta 10:
（配列番号１０２）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTTTTACTGACAGTATTTT-3’
【００６６】
T-Muta 11:
（配列番号１０３）5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACTTTT ACAGTATTTT-3’
【００６７】
実験（図１参照）においては、ヒト神経系由来細胞株SK-N-SHに対し、上述のように構築した、NXF遺伝子プロモーター領域（-4.9kbpから-150bpまでのそれぞれのプロモーターDeletion mutant）により制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションし、培養液中に脳由来神経栄養因子を加えない場合(-)、100ng/mlの脳由来神経栄養因子を加えた場合（「＋BDNF」）のレポーター活性を示した。ここでのレポーター活性値は、ルシフェラーゼを制御する各NXFプロモーター(Deletion Mutants)の活性を示す。縦軸は相対活性で表示されている（RLU: Relative light unit）。横軸の表示：-4.9kbpは、NXF遺伝子の転写開始点から上流-4.9kbpまでを含むマウスNXFのプロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトである。-4.4kbpは同様にNXFの転写開始点から上流-4.9kbpまでを含むマウスNXFのプロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトである。以下同様である。
この実験の検討結果から、-3.4kbpの場合から-2.9kbpにかけて、脳由来神経栄養因子応答性に大きな低下が認められた。従って、-3.4kbpの領域にはあって、-2.9kbpには無い領域、即ち、約500bpの領域が、NXF遺伝子プロモーター全体に脳由来神経栄養因子応答性を与える責任エレメントを含むことが分かった。
【００６８】
次にこの500bpを更に細分化して、その責任エレメントの範囲を狭めた検討結果が図２に示されている。この実験においても、ヒト神経系由来細胞株SK-N-SHに対し、-4.9kbpと横軸に表示されている群ではNXF遺伝子の転写開始点から上流-4.9kbpまでを含むマウスNXFのプロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクト、TATAと表示されている群では最小プロモーターで制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクト、そしてMuta11〜Muta18と表示されている群ではNXF遺伝子プロモーター領域の各種Deletion mutant（NXF遺伝子プロモーター上流-3.4kbpから-2.9kbpの領域を順次欠失させたDeletion mutant:Muta11〜Muta18）により制御されるルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションし、培養液中に脳由来神経栄養因子を加えない場合(-)、100ng/mlの脳由来神経栄養因子を加えた場合（「＋BDNF」）、のそれぞれのレポーター活性を検討した。縦軸は相対活性で表示されている（RLU: Relative light unit）。この検討結果から、Muta15にありMuta16には無い短い塩基配列である、配列番号３で示される塩基配列（5’-GGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTTTAGCAGCGGCCAGGAG-3’）がNXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導を司る同遺伝子プロモーター上の責任エレメントを含有することがわかった（活性発現に必須な最小限の配列以外の周辺配列もまだここでは含む）。
【００６９】
次にこの塩基配列のどの塩基がNXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導のために不可欠かを変異導入法で活性が低下するか否かという方法で、塩基配列中の最重要のコア配列について検討した結果が図３に示されている。この実験では、まず横軸一群目の‘Wild’においては、ヒト神経系由来細胞株SK-N-SHに対し、図２の検討で判明したNXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導を司る同遺伝子プロモーター上の責任エレメントを含む短い塩基配列（活性発現に必須な最小限の塩基配列以外の周辺配列もここでは含む）である、配列番号４で示される塩基配列（5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）を最小プロモーターを持つルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ上流に組み込み構築したレポーターコンストラクト（Wild）を、ヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションし、培養液中に脳由来神経栄養因子を加えない場合(-)、100ng/mlの脳由来神経栄養因子を加えた場合（「＋BDNF」）、のそれぞれのレポーター活性が示されている。このWildのレポーターの代わりに、上記の本発明オリゴヌクレオチドに対して、以下の最後のリストに示すようにシステマチックに順次変異を導入した二本鎖オリゴヌクレオチドを、最小プロモーターを持つルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ上流に組み込み構築したコンストラクト（Mutant 1〜Mutant 47：配列番号５〜配列番号５１）を用いてヒト脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと共にトランスフェクションして同じ検討を行ったのが二群目からの結果である。
【００７０】
この実験の検討結果から、NXF遺伝子の脳由来神経栄養因子による発現誘導を司る同遺伝子プロモーター上の責任エレメントを含む短い塩基配列（活性発現に必須な最小限のコア配列以外の周辺配列も含む）である、配列番号４で示される塩基配列（5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）の中の必要不可欠なコア配列は、以下の太字下線部2箇所であることが判明した。
【００７１】
（配列番号４）
5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’
【００７２】
このようにして、NXF遺伝子プロモーターに存在する、その脳由来神経栄養因子応答性に不可欠な最小限の機能エレメントの同定が成された。
【００７３】
実施例２
まず、約1x10７のヒト神経芽腫由来の培養細胞SK-N-SH（ATCCより購入）を、15%FBSと1mMピルビン酸ナトリウムおよび１X MEM NEAA（GIBCO社製＃11140）とを含むDMEM培地（日水製薬製）を用いて37℃にて5％CO2存在下に、直径約10cmのシャーレ（ファルコン社製）を用いて培養した。翌日、培養された細胞をトリプシンではがし、24wellプレートに5x105/wellの割合で播き直し、6時間後に以下のトランスフェクションに供した。トランスフェクションはLipofectamine2000試薬（Invitrogen社製）を用いて、その添付説明書に従って行った。0.1μg/wellの脳由来神経栄養因子レセプター発現プラスミドと「本発明オリゴヌクレオチドを最小プロモーターの上流に有するレポーター遺伝子コンストラクト」0.7μg/wellを混合したものを50μlのOptiMEM（Invitrogen社製）で希釈し、またそれとは別に2μl/wellのLipofectamine2000試薬を50μlのOptiMEM（Invitrogen社製）で希釈し、その両者をすばやく混合して得られた混合物を室温で３０分間インキュベートした後、その全量100μl/wellを24穴プレート上に培養された細胞の培養液に添加した。24時間後に脳由来神経栄養因子ミミック化合物試験区では、10μMの終濃度になるように化合物溶液（DMSO溶液）を培養液に添加し、脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験区では終濃度10ng/mlの脳由来神経栄養因子と共に10μMの終濃度になるように化合物溶液（DMSO溶液）を培養液に添加し、脳由来神経栄養因子ミミック化合物試験対照区では、化合物溶解に用いた溶媒DMSOのみを化合物溶液添加時と同じ量（培養液中でDMSO濃度0.1%）培養液に添加し、脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験対照区では、10ng/mlの脳由来神経栄養因子と共に化合物溶解に用いたDMSO溶液を脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験区と同じ量（培養液中でDMSO濃度0.1%）培養液に添加した。5時間後に培養液に等量の細胞溶解性ルシフェラーゼ発光基質液（Steady Glow,  Promega社製）を添加して、ルミノメーター（LB960,ベルトールド社製）を用いて各Wellの発光量を1秒づつ測定する。各実験区は、N=4でその平均値を求め、その値の相対値（Relative light unit:RLU.）を図中の実験データのグラフの縦軸に表示する。以上の検討により、脳由来神経栄養因子ミミック化合物試験区とその対照区のレポーター活性とを比較することにより、被験物質が神経栄養性能力を有するかどうかを検定することができる。また脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験区とその対照区とのレポーター活性を比較することにより、被験物質が脳由来神経栄養因子活性を増強するタイプの神経栄養性能力を有するかどうかを検定することができる。
上記で用いた「NXF遺伝子プロモーターに存在する当遺伝子に脳由来神経栄養因子応答性を与える責任エレメントを含むオリゴヌクレオチドを最小プロモーターの上流に有するレポーター遺伝子コンストラクト」は実施例１で記載したWildの試験区で用いたものと同じものを使用した。
【００７４】
実施例３
妊娠18日SDラット（購入先：チャールズリバー）の腹部を切開した後、胎児を取り出した。取り出された胎児の頭部をHBSS(+)培地（ナカライテスク社製）入りシャーレに入れ、実体顕微鏡（ライカ社製）下で大脳皮質を取り出した。切り出された大脳皮質を神経細胞分散液（住友ベークライト社製）中で、同製品の添付取扱説明書に従って、酵素処理しながら、細胞分散処理を行うことにより脳細胞を調製した。このように調製された脳細胞を、2% B-27 supplement（GIBCO社製）、１X GlutaMAX（GIBCO社製）が追加的に添付されたNeurobasal medium培地（GIBCO社製）を用いて、スミロンセルタイトPLプレート（住友ベークライト社製）上で、37℃、5%  CO2存在下で培養した。播種3日後に培地交換を一度行い、培養を継続し3日毎に同様に培地交換を行い、培養14日後の細胞を以下の実験において大脳皮質初代培養ニューロンとして利用した。
ラット大脳皮質初代培養ニューロンに対して、培養液中に終濃度100ng/mlの脳由来神経栄養因子を添加し、30分後、2時間後、3時間後、そして対照としてVehicle（水）添加をした、脳由来神経栄養因子無処理の試験区、のそれぞれの細胞を300G  5分の遠心により回収し、細胞核抽出物を調製するための市販のキット（Active Motief社製  Nuclear Extract Kit #40410）を用いて添付説明書通りに処理することにより、細胞核抽出物を調製した。得られた細胞核抽出物と5’末端をビオチンラベルした本発明2本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号４：5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）と、KCl 100mMと、1mM MgCl2と、50ng/μlのPoly ｄI-dC（ロッシュダイアグノステックス社製）とを用い、市販のゲルシフトアッセイキット（Cell signaling社製  Gelshift Chemiluminescent EMSA ＃37341）の付属Buffer中で添付説明書通りにゲルシフト結合反応を行った。反応条件は、25℃、15分間であった。付属のDye液を添加した後、0.5XTBE Buffer（ニッポンジーン社製）で作製した4%アクリルアミド（39:1）ゲルにアプライし電気泳動した。電気泳動条件はゲル作製時に用いた0.5XTBEをBufferにして、30mA定電流の条件で約40分間であった。電気泳動後のゲルをナイロンメンブレン（Invitrogen社製iBlot DNA trasfer stacks）と密着させ、セミドライブロッテイング装置(Invitrogen社製iBlot)を用いてゲルに電気泳動されたオリゴヌクレオチドをナイロンメンブレンに転写した。この際の装置の条件はInvitrogen社製iBlotのプリセットされたプログラムNo.8を用いて8分間であった。次に、このオリゴヌクレオチドが転写されたメンブレンを、UVクロスリンカー（ATTO社製DNA-FIX）を用いて、254nm波長で120mJ/cm2の条件でDNAをメンブレンに固定化した。次にこのメンブレンを上記のゲルシフトアッセイキット（Cell signaling社製  Gelshift Chemiluminescent EMSA ＃37341）に付属するBlocking Buffer中で室温、30分間インキュベートした。次にこのメンブレンを取り出し、同キットに付属するストレプトアビジンHRP液を添付説明書通り添加した後、室温で30分間インキュベートした。次に、同キット付属のWash Buffer中で室温、５分間インキュベートを4回繰り返してメンブレンを洗浄した。洗浄後のメンブレンを取り出し、このメンブレンに、キット付属のHRP基質液を添加することにより、生じた化学発光イメージを富士フィルム社製LAS-4000で取得した。
図４で示したようにFreeのビオチンラベルされた本発明オリゴヌクレオチドは、ゲル中で最も早く電気泳動された。この図中では最も下方にあたる。一方、脳由来神経栄養因子で処理した試験区（図中では「BDNF addition」と表記されている）において脳由来神経栄養因子処理30分後、2時間後、3時間後では、図中で（−）と表示されている対照区と比較して、オリゴヌクレオチド：蛋白質の複合体の形成を示すシフトバンド（図中ではShifted bandと表示されている）が検出された。そのバンドの強度は脳由来神経栄養因子処理後3時間が最も高かった。
このようにして、本発明オリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイにより、脳由来神経栄養因子処理依存的なShifted bandで示される陽性シグナルを検出することで、被験物質（この場合脳由来神経栄養因子溶液）に含まれる脳由来神経栄養因子の存在を検定することができた。
【００７５】
実施例４
妊娠18日SDラット（購入先：チャールズリバー）の腹部を切開した後、胎児を取り出した。取り出された胎児の頭部をHBSS(+)培地（ナカライテスク社製）入りシャーレに入れ、実体顕微鏡（ライカ社製）下で大脳皮質を取り出した。切り出された大脳皮質を神経細胞分散液（住友ベークライト社製）中で、同製品の添付取扱説明書に従って、酵素処理しながら、細胞分散処理を行うことにより脳細胞を調製した。このように調製された脳細胞を、2% B-27 supplement（GIBCO社製）、１X GlutaMAX（GIBCO社製）が追加的に添付されたNeurobasal medium培地（GIBCO社製）を用いて、スミロンセルタイトPLプレート（住友ベークライト社製）上で、37℃、5%  CO2存在下で培養した。播種3日後に培地交換を一度行い、培養を継続し3日毎に同様に培地交換を行い、培養14日後の細胞を以下の実験において大脳皮質初代培養ニューロンとして利用した。
ラット大脳皮質初代培養ニューロンに対して、培養液中に、脳由来神経栄養因子ミミック化合物試験区では、10μMの終濃度になるように化合物溶液（DMSO溶液）を培養液に添加し、脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験区では終濃度10ng/mlの脳由来神経栄養因子と共に10μMの終濃度になるように化合物溶液（DMSO溶液）を培養液に添加し、脳由来神経栄養因子ミミック化合物試験対照区では、化合物溶解に用いた溶媒DMSOのみを化合物溶液添加時と同じ量（培養液中でDMSO濃度0.1%）培養液に添加し、脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験対照区では、10ng/mlの脳由来神経栄養因子と共に化合物溶解に用いたDMSO溶液を脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験区と同じ量（培養液中でDMSO濃度0.1%）培養液に添加した。3時間後、それぞれの試験区の細胞を300G  5分の遠心により回収し、細胞核抽出物を調製するための市販のキット（Active Motief社製  Nuclear Extract Kit #40410）を用いて添付説明書通りに処理することにより、細胞核抽出物を調製した。得られた細胞核抽出物と5’末端をビオチンラベルした2本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号４：5’-GGAGAGAGTGGGGTGACTCAGCCAGGCCAGGATGACTCACACTGACAGTATTTT-3’）と、KCl 100mMと1mM MgCl2、50ng/μlのPoly ｄI-dC（ロッシュダイアグノステックス社製）を用い、市販のゲルシフトアッセイキット（Cell signaling社製  Gelshift Chemiluminescent EMSA ＃37341）をの付属Buffer中で添付説明書通りにゲルシフト結合反応を行った。反応条件は、25℃、15分間であった。付属のDye液を添加した後、0.5XTBE Buffer（ニッポンジーン社製）で作製した4%アクリルアミド（39:1）ゲルにアプライし電気泳動した。電気泳動条件は、ゲル作製時に用いた0.5XTBEをBufferにして、30mA定電流の条件で約40分間であった。電気泳動後のゲルをナイロンメンブレン（Invitrogen社製iBlot DNA trasfer stacks）と密着させ、セミドライブロッテイング装置(Invitrogen社製iBlot)を用いてゲルに電気泳動されたオリゴヌクレオチドをナイロンメンブレンに転写した。この際の装置の条件はInvitrogen社製iBlotのプリセットされたプログラムNo.8を用いて8分間であった。次に、このオリゴヌクレオチドが転写されたメンブレンを、UVクロスリンカー（ATTO社製DNA-FIX）を用いて、254nm波長で120mJ/cm2の条件でDNAをメンブレンに固定化した。次にこのメンブレンを上記のゲルシフトアッセイキット（Cell signaling社製  Gelshift Chemiluminescent EMSA ＃37341）に付属するBlocking Buffer中で室温、３０分間インキュベートした。次にこのメンブレンを取り出し、同キットに付属するストレプトアビジンHRP液を添付説明書通り添加した後、室温で30分間インキュベートした。次に、同キット付属のWash Buffer中で室温、５分間インキュベートを4回繰り返してメンブレンを洗浄した。洗浄後のメンブレンを取り出し、このメンブレンに、キット付属のHRP基質液を添加することにより、生じた化学発光イメージを富士フィルム社製LAS-4000で取得する。
以上の検討により、脳由来神経栄養因子ミミック化合物試験区とその対照区のShifted陽性バンド強度を比較することにより、被験物質が神経栄養性能力を有するかどうかを検定することができる。また脳由来神経栄養因子活性増強化合物試験区とその対照区とのShifted陽性バンド強度を比較することより、被験物質が脳由来神経栄養因子活性を増強するタイプの神経栄養性能力を有するかどうかを検定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、NXF遺伝子の転写プロモーター上の機能エレメントと、それを利用した、物質が有する神経栄養性能力の検定方法等、神経栄養性物質の探索方法等が提供可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号５
Mutant 1での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号６
Mutant 2での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号７
Mutant 1での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号８
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号９
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１０
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１１
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１３
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１４
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１５
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１６
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１７
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１８
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１９
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２０
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２１
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２２
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２３
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２４
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２５
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２６
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２７
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２８
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２９
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３０
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３１
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３２
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３３
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３４
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３５
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３６
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３７
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３８
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３９
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４０
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４１
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４２
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４３
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４４
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４５
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４６
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４７
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４８
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号４９
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５０
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５１
での機能エレメントのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５２
TrkBのcDNAをクローニングするために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５３
TrkBのcDNAをクローニングするために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５４
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-4.9kbp用）
配列番号５５
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-4.9kbp用）
配列番号５６
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-4.4kbp用）
配列番号５７
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-4.4kbp用）
配列番号５８
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-3.9kbp用）
配列番号５９
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-3.9kbp用）
配列番号６０
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-3.4kbp用）
配列番号６１
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-3.4kbp用）
配列番号６２
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-2.9kbp用）
配列番号６３
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-2.9kbp用）
配列番号６４
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-2.4kbp用）
配列番号６５
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-2.4kbp用）
配列番号６６
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-1.9kbp用）
配列番号６７
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-1.9kbp用）
配列番号６８
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-1.4kbp用）
配列番号６９
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-1.4kbp用）
配列番号７０
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-930bp用）
配列番号７１
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-930bp用）
配列番号７２
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-450bp用）
配列番号７３
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-450bp用）
配列番号７４
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-150bp用）
配列番号７５
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（-150bp用）
配列番号７６
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta11用）
配列番号７７
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta11用）
配列番号７８
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta12用）
配列番号７９
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta12用）
配列番号８０
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta13用）
配列番号８１
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta13用）
配列番号８２
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta14用）
配列番号８３
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta14用）
配列番号８４
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta15用）
配列番号８５
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta15用）
配列番号８６
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta16用）
配列番号８７
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta16用）
配列番号８８
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta17用）
配列番号８９
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta17用）
配列番号９０
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta18用）
配列番号９１
ＰＣＲプライマーのために設計されたオリゴヌクレオチド（Muta18用）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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