(57)【要約】      （修正有）【課題】ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を単離精製し、そのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列を同定する。【解決手段】以下のいずれかのポリペプチドであって、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。（i）特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド；（ii）特定のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；（iii）特定のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び（iv）特定のアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのポリペプチドであって、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド：
（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
以下のいずれかの核酸であって、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号：２で表される塩基配列からなる核酸
（ｅ）配列番号：２で表される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が付加、置換又は欠失された塩基配列からなる核酸；
（ｆ）配列番号：２で表される塩基配列からなる核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸；及び
（ｇ）配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項２に記載の核酸が外因的に導入された遺伝子組換え作物。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項７】
ナリンゲニンと請求項１に記載のポリペプチドとを、メチル基ドナーの存在下でインキュベートする工程と、
得られたフラボノイド化合物を精製する工程と、
を含むサクラネチンの製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法で製造されたサクラネチンを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
イネは病原菌感染に対して様々な防御応答反応を示す。ファイトアレキシンと総称される抗菌性二次代謝産物の集積は、イネの代表的な防御応答反応の一つである。
イネの主要なファイトアレキシンの一つにフラボノイド型化合物のサクラネチンがある。サクラネチンは、イネにおいて、葉に対する紫外線照射、いもち病菌接種、塩化銅処理、ジャスモン酸処理などにより顕著に誘導され、いもち病菌に対して抗菌活性を有する。
【０００３】
サクラネチンは、動物の前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化させる活性を示すことや、インスリンへの感受性を高める作用があることも報告されており（文献）、糖尿病の予防や治療への応用が期待されている。また、リポキシゲナーゼ阻害による抗炎症作用も期待されている（文献）。
【０００４】
サクラネチンは、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ（NOMT）によりナリンゲニンから生合成される。NOMTは、これまでに、紫外線を照射した野生型のイネからNOMT活性を指標にして精製が試みられてきた（例えば特許文献１）。しかしながら、この方法で得られた活性画分の主要成分は、実際にはイネのコーヒー酸3-O-メチルトランスフェラーゼ（OsCOMT1）であることが後の研究で明らかとなった（非特許文献１）。OsCOMT1を大腸菌で発現させてもNOMT活性は示さず、OsCOMT1がイネin vivoにおいてNOMT活性を示す可能性は否定できないものの、少なくともin vitroにおいてはNOMT活性を示さないことが確認された。
【０００５】
NOMTを得てサクラネチンを大量に調製できれば、イネをはじめとする作物の病害抵抗性を増強することができ、サクラネチンの医薬品や食品への利用も現実的となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第００／５２１７４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Lin, F. et al., Journal of Pesticide Science vol.31, No.1, 47-53(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、NOMTを単離精製し、そのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列を同定すること等を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、まずOsCOMT1がイネin vivoにおいてはNOMT活性を有するかどうか検討するため、OsCOMT1の発現が著しく低下したT-DNA挿入変異株oscomt1の葉に紫外線を照射してサクラネチンの定量を行ったところ、野生型イネと同等の量を含むことがわかった。また、oscomt1変異株から抽出した粗酵素を用いて酵素活性を測定したところ、NOMT活性は野生型イネと同等であったのに対し、COMT活性は顕著に低下していた。これらの結果は、OsCOMT1はin vivoでもCOMT活性を有する酵素として機能しており、NOMT活性には寄与していないことを示しており、したがってイネにはOsCOMT1とは別にこれまでに同定されていないNOMTが存在することを示唆した。
そこで、本発明者らは、NOMT活性画分にNOMTと比較して大量のOsCOMT1が存在することにより、NOMTの精製が困難となっている可能性を考え、oscomt1を用いてNOMTの単離精製を試み、これに成功した。
すなわち、本発明は、
〔１〕以下のいずれかのポリペプチドであって、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド：
（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド；
〔２〕以下のいずれかの核酸であって、ナリンゲニン7-O-メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸：
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号：２で表される塩基配列からなる核酸
（ｅ）配列番号：２で表される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が付加、置換又は欠失された塩基配列からなる核酸；
（ｆ）配列番号：２で表される塩基配列からなる核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸；及び
（ｇ）配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸；
〔３〕上記〔２〕に記載の核酸を含む、発現ベクター；
〔４〕上記〔３〕に記載の発現ベクターを含む形質転換体；
〔５〕上記〔２〕に記載の核酸が外因的に導入された遺伝子組換え作物；
〔６〕上記〔１〕に記載のポリペプチドに対する抗体；
〔７〕ナリンゲニンと上記〔１〕に記載のポリペプチドを、メチル基ドナーの存在下でインキュベートする工程と、得られたフラボノイド化合物を精製する工程とを含むサクラネチンの製造方法；及び
〔８〕上記〔７〕に記載の方法で製造されたサクラネチンを含む組成物、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって得られたOsNOMT遺伝子をイネ等の作物に導入すれば、ナリンゲニンからサクラネチンへの変換を促進して、当該作物の病害抵抗性を増強することが可能である。また、かかる作物を医薬や食品に応用することも可能である。
また、本発明によれば、OsNOMTタンパク質を遺伝子組換え法により大量調製することができるので、サクラネチンの大量合成も可能となり、サクラネチンの医薬や食品への応用に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、LC-MS/MSを用いて、GST-1759、GST-2409を用いたNOMT反応溶液中に含まれるサクラネチンを検出した結果を示す。
【図２】図２は、キラルカラムを用いたLC-MS/MSにより、GST-OsNOMTにより生成されるサクラネチンのキラル分析を行った結果を示す。
【図３】図３は、GST-OsNOMTの速度論的パラメーター算出に用いたHanes-Woolfプロットを示す
【図４】図４は、GST-OsNOMT基質特異性の解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［ポリペプチド］
本発明に係るポリペプチドは、NOMT活性を有する以下のいずれかのポリペプチドである。
（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；及び
（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド。
【００１３】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列は、後述する実施例に記載されるとおり、本発明者らが今般OsNOMTと命名したタンパク質のアミノ酸配列である。
【００１４】
本明細書において「NOMT活性」とは、ナリンゲニンの7位の水酸基をメチル化してサクラネチンを合成する活性をいう。ポリペプチドにかかる活性があるか否かは、例えば実施例に記載された方法で、当業者が容易に確認することができる。本発明に係るポリペプチドはかかる活性を示す限り、他の活性を示すものであってもよい。
【００１５】
本明細書において、用語「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ
酸のみならず、非天然アミノ酸も含む。
【００１６】
本明細書において、「1又は数個のアミノ酸が付加、置換、又は欠失されているポリペプチド」という場合、欠失等されるアミノ酸の個数は、そのポリペプチドがNOMT活性を有する限り特に限定されないが、例えば、1〜9個、1〜5個、又は1〜3個とすることができる。あるいは全体の長さの10％以内、又は5％以内としてもよい。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログであり得る。欠失、付加、置換される場所は、ポリペプチドの末端であっても、中間であってもよく、1ヶ所であっても2ヶ所以上であってもよい。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドは、NOMT活性を有する限り、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するものも含む。配列同一性は、公知の方法に従って求めることができる。
なお、本明細書においてNOMT活性を有するポリペプチドには、その程度を問わずNOMT活性を有するポリペプチドが含まれるが、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の活性を有するものが含まれる。
【００１８】
本発明に係るポリペプチドは、NOMT活性を有する限り、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるものも含む。部分配列の長さは特に限定されない。かかる部分ポリペプチドは、遺伝子工学的手法で得ることもできるし、公知の固相または液相ペプチド合成法により合成することもでき、また本発明に係るポリペプチドを適当なぺプチダーゼや臭化シアンなどで切断することによっても得ることができる。
【００１９】
本発明に係るポリペプチドは、植物等の天然物から抽出されたものであってもよいし、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法によって作られたものであってもよく、遺伝子組換え法や無細胞系タンパク質合成方法によって作られたものであってもよい。
上記(ii)又は(iii)のポリペプチドは、例えば、後述する(e)〜(g)の核酸を挿入した発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することによって作ることができる。
【００２０】
本発明に係るポリペプチドは、そのC末端がカルボキシル基（-COOH）又はカルボキシレート基（-COO-）のみでなく、アミド（-CONH2）やエステル（-COOR）になっていてもよい。ここで、エステルのRとしては、例えば1〜10個好ましくは1〜6個の炭素数のアルキル基であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、飽和していても1つ以上の二重結合を含有してもよく、1つ以上の官能基を有していてもよい。また、N末端がホルミル基、アセチル基などのアシル基で保護されているものや、ピログルタミン酸化されているものも本発明に含まれる。N末端及びC末端以外のアミノ酸の側鎖上の置換基がアミド化、エステル化されているもの、ホルミル基やアセチル基などで保護されているもの、又、糖鎖が結合した糖タンパク質などの複合タンパク質も本発明に含まれる。
【００２１】
また、本発明に係るポリペプチドには、ポリペプチドの塩も含まれる。ポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（p-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
【００２２】
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化、糖鎖付加などの修飾が加えられたものであってもよい。他のペプチドやタンパク質と融合させたものであってもよい。融合させるペプチドまたはタンパク質としては、例えば、FLAG、Hisタグ、チオレドキシン、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン定常領域が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
［核酸］
本発明に係る核酸は、NOMT活性を有するポリペプチドをコードする以下のいずれかの核酸である。
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号：２で表される塩基配列からなる核酸
（ｅ）配列番号：２で表される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が付加、置換又は欠失された塩基配列からなる核酸；
（ｆ）配列番号：２で表される塩基配列からなる核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸；及び
（ｇ）配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸。
【００２４】
配列番号：２で表される塩基配列は、後述する実施例に記載されるとおり、本発明者らが今般OsNOMTと命名したタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの塩基配列である。
【００２５】
本明細書において「核酸」は、DNAであってもRNAであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。また、一本鎖の場合、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。本発明に係る核酸は、植物等の天然物から抽出されたものであってもよく、化学合成されたものであっても、PCR法等により増幅されたものであってもよい。
【００２６】
本発明に係る「核酸」は、本発明に係るポリペプチドをコードする限り、オープンリーディングフレームであっても、完全長cDNAであっても、イントロンを含んでいてもよい。本発明に係るポリペプチドをコードする核酸の例としては、OsNOMTのオープンリーディングフレーム（配列番号：２）や、cDNA（配列番号：３）が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る「核酸」は、本発明に係るポリペプチドをコードする限り、あらゆる変異体を含むことができる。かかる変異体としては、天然に存在するアレル変異体、天然には存在しない変異体、人為的に改変した変異体を含み、例えば、配列番号：２に記載された塩基配列からなる核酸において、1もしくは数個の塩基が付加、置換又は欠失された塩基配列からなるものや、1以上の塩基が修飾されたものであってもよい。欠失等される塩基の数は、当該核酸がコードするポリペプチドがNOMT活性を有する限り特に限定されないが、例えば、1〜9個、1〜5個、又は1〜3個とすることができる。あるいは全体の長さの10％以内、又は5％以内としてもよい。付加、置換される核酸は、天然の核酸であっても修飾された核酸であってもよい。また、欠失、付加、置換される場所は、核酸の末端であっても、中間であってもよく、1ヶ所であっても2ヶ所以上であってもよい。
【００２８】
配列番号：２に記載された塩基配列からなる核酸において、1もしくは数個の塩基が付加、置換又は欠失された塩基配列からなる核酸は、例えば、配列番号：２で表されるDNAに変異を導入することにより得られる。変異を導入する方法としては、部位特異的変異導入法（Site-directed mutagenesis）、適当な制限酵素を用いて付着末端を生じさせ、そのままDNAリガーゼで連結して数塩基の欠失を起こさせる方法、エラーが起こりやすい条件下でPCRにより増幅することで一定の領域にランダムな変異を入れる方法、Kunkel法、Eckstein法など公知の方法、又はそれに準じた方法を用いて変異を導入することができる。配列番号：２に記載された塩基配列からなる核酸において、1もしくは数個の塩基が付加、置換又は欠失された塩基配列からなる核酸には、細胞内で自然に誘発された変異を有する核酸も含まれる。
【００２９】
本発明に係る核酸には、NOMT活性を有する限り、配列番号：２で表される塩基配列からなる核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし得る核酸も含まれる。ストリンジェントな条件は、当業者が適宜選択することができるが、例えば、1×SSC、0.1％SDS、60℃といった条件とすることができる。ストリンジェンシーはSSCの濃度及び温度などでコントロールすることができ、高ストリンジェントな条件を選択すれば、より高い相補性を有する核酸を得ることができる。
【００３０】
本発明に係る核酸には、それがコードするポリペプチドがNOMT活性を有する限り、配列番号：２で表される塩基配列と少なくとも90％配列同一性を有する核酸も含まれる。配列同一性は、公知の方法に従って決定することができる。
【００３１】
また、本発明に係るポリペプチドが、他のペプチドやタンパク質との融合タンパク質である場合、本発明に係る核酸は、当該他のペプチドやタンパク質をコードする核酸と連結されていてもよい。
【００３２】
［発現ベクター］
本発明に係る「発現ベクター」は、本発明に係る核酸が挿入された発現ベクターを意味し、宿主細胞内で本発明に係る核酸を発現させることができるものであれば制限はなく、プラスミド、ファージ、コスミド等のいずれであってもよい。
なお、本明細書において「発現」とは、DNAの配列に基づいて転写酵素によりmRNAが合成される転写と、mRNAの配列情報に基づいてリボソームでアミノ酸が結合してタンパク質が合成される翻訳のいずれの過程も含む概念として用いられる。
【００３３】
プラスミドとしては、大腸菌や緑膿菌などのグラム陰性菌由来、枯草菌などのグラム陽性菌由来、Staphylococcus由来、酵母由来のものなどがあり、宿主に適合するよう選択される。例えば、pUC18、pUC19、pBluescript、pBR322、pBI121等が挙げられるがこれらに限定されない。薬剤耐性遺伝子や栄養要求性を有する遺伝子などの選択マーカーや、レポーター遺伝子を挿入しておくことにより、プラスミドの安定性や有用性を向上させることができる。選択マーカーとしては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン等が挙げられ、レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子や緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
ファージとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合に良く用いられるλファージ系やＭ１３ファージ系などが挙げられ、溶菌ファージであるか溶原ファージであるかを問わない。動物細胞を宿主とする場合は、ベクターとしてSV40、パピローマウィルス、ワクシニアウィルス、レトロウィルス、バキュロウィルスなどのウィルスDNAを用いたものが使用される。又、選択された宿主において本発明に係るポリペプチドが効率よく発現するよう、宿主に適したプロモーター配列、エンハンサー配列、シャインダルガーノ配列、シグナル配列、ポリＡシグナルなどを適宜選択し、ベクターに挿入することができる。
【００３５】
［形質転換体］
本発明は、本発明に係る発現ベクターで形質転換させた形質転換体も含む。本発明の形質転換体は、本発明に係る発現ベクターに適した宿主を選択し、この宿主にそのベクターを導入することにより得られる。
宿主としては、例えば大腸菌や緑膿菌などのグラム陰性菌、枯草菌などのグラム陽性菌、放線菌、酵母、糸状菌、動植物培養細胞（例えば、マウス、ラット、イネ、タバコ）、昆虫培養細胞（例えばカイコ）などが挙げられる。
ベクターの導入方法としては、宿主が大腸菌である場合には塩化カルシウム法、枯草菌を宿主とする場合にはコンピテントセル法や酢酸リチウム法、枯草菌、放線菌、酵母などにはプロトプラスト法、動植物細胞、酵母、細菌などに広く用いられる方法としてリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、DEAE-デキストランやポリブレンなどのポリマーと複合体を形成させる方法、植物細胞に用いられる方法として、アグロバクテリウムを用いる方法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法などから適宜選択することができる。又、カチオン性脂質のリポソームと複合体を形成させるリポフェクトアミン（Invitrogen社）を用いることもできる。
【００３６】
本発明に係る形質転換体を培養することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。形質転換体の培養は、宿主細胞の特性、発現するタンパク質の特性、プロモーターの特性などにより選択することができ、例えばMEM培地、DMEM培地、Williams E培地（Gibco社）等の公知の培地を使用することができる。また、例えば抗生物質耐性を有するプラスミドを用いた場合は、当該抗生物質を培地に添加することにより目的ポリペプチドの発現を調節することができ、又ラクトース依存性プラスミドを使用した場合はIPTGを培地に添加して発現を誘導することができる。
このようにして得た形質転換体を培養して発現させたポリペプチドは、通常のタンパク質の精製方法を用いて精製することができ、使用した発現系により、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過法、塩析、浸透圧ショック法、超音波処理などを組み合わせて精製することができる。クロマトグラフィー法としては、例えば、水溶液中で行うイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、有機溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、発現させたポリペプチドは、精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を用いて修飾を加えたり部分的にペプチドを除去したりすることもでき、これらの修飾されたポリペプチドも本発明に含まれる。タンパク質修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、プロテインキナーゼやグルコシダーゼなどが挙げられる。尚、当業者は、発現したタンパク質が遊離した状態であれば塩に、塩として得られた場合に遊離した状態に容易に変えることができる。
【００３７】
［遺伝子組換え作物］
本発明は、本発明に係る核酸が外因的に導入された遺伝子組換え作物も包含する。
遺伝子組換え作物は、本発明に係る発現ベクターを用いて植物細胞を形質転換し、安定的な形質転換体を選択し、導入された遺伝子が植物細胞の分裂とともに複製されること（一過性の遺伝子発現ではないこと）を確認し、かかる形質転換細胞から植物個体を分化・再生することによって得ることができる。
一過性の遺伝子発現ではない安定した形質転換体とするためには、例えば、本発明に係る核酸が植物の核ゲノムに挿入されるような方法で形質転換を行えばよい。
形質転換細胞から植物個体への分化・再生は、常法にしたがって行うことができるが、例えば、アグロバクテリウム法で形質転換したリーフディスクを、茎葉分化培地で培養してカルスを形成する。茎葉培地には、NAA、カイネチン、オーキシンやサイトカイニンなどの植物ホルモンや、選択マーカーに応じた抗生物質を添加してもよい。その後、カルスまたはカルスから分化したシュートを根分化培地で培養し、発根した幼植物体を土壌に移して栽培し、植物個体を得ることができる。
植物個体の例としては、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、トマト、キュウリ、ジャガイモ、キャベツ、ダイズ、ナタネ等を挙げることができるが、これらに限定されない。こうして得られた遺伝子組換え作物は、恒常的にあるいはストレスに応答してサクラネチンを高濃度に含有するものであるので、病害抵抗性に優れた作物とすることができ、また、得られた作物をそのままで、または加工して医薬や機能性食品に応用することも可能である。
【００３８】
［抗体］
本発明に係る抗体は、本発明に係るポリペプチドに特異的に結合するものであればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ヒト以外の哺乳動物を当該ポリペプチドで免疫することによって得た抗体のほか、ヒト抗体や、遺伝子組換えにより得られた抗体も含まれる。
本発明に係る抗体は、公知の方法またはそれに準じた方法により製造することができるが、以下に代表的方法を例示する。ポリクローナル抗体は、本発明に係るポリペプチドを用いて哺乳動物、好ましくはマウスやラット等のげっ歯目、ウサギ目、サルなどの霊長目の動物を免疫し、血清を得て、この血清を本発明に係るポリペプチド又はその部分ペプチドを固定したアフィニティーカラムに通して精製することにより得ることができる。
またモノクローナル抗体は、まず同様に哺乳動物を免疫し、この動物から得た抗体産生細胞と、増殖力の強いミエローマ細胞とを融合させ、個々の融合細胞を分離し、求める抗体の生産能を検定することによって、抗原の一つのエピトープに特異的に反応する抗体分子を1種だけ生産する細胞を選択し、この細胞を培養することによって製造することができる。
またモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするDNAをベクターに挿入し、このベクターを宿主に導入して産生させて遺伝子工学的方法で得ることもできる。ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を免疫すれば、ヒト抗体を産生することもでき、マウスのモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするcDNAとヒトのIgG遺伝子の定常部をコードする遺伝子を連結してこれをＢリンパ球に導入すればキメラ抗体分子を生産させることも可能であり、これらの抗体も本発明に含まれる。
本発明の抗体は、本発明に係るポリペプチドを特異的に認識して結合する限り、フラグメントや修飾された抗体であってもよい。抗体のフラグメントとしては例えば、F（ab）、F（ab'）2、Fcフラグメント、またはscFvなどが挙げられ、修飾された抗体としては例えばポリエチレングリコールなどの化合物と結合された抗体などが挙げられる。本発明の抗体は、本発明に係るポリペプチドの精製や検出、定量に用いることができ、また本発明に係るポリペプチドの生物学的活性を亢進または抑制する作用を有する場合には、アゴニスト又はアンタゴニストとなりうる。
本発明は、本発明の抗体を用いて、本発明に係るポリペプチドを定量する方法も含む。具体的には、本発明の抗体（フラグメントを含む）を適当な方法で標識し、この標識を検出及び／又は定量することにより、本発明に係るポリペプチドを検出及び／又は定量することができる。標識の方法には、放射性同位体や安定同位体を用いる同位体による方法と、抗体分子の末端を蛍光性の基や紫外部や可視部に吸収を持つ置換基で標識する置換基による方法、酵素標識して酵素活性を測定する方法などがある。標識する抗体は、本発明の抗体であってもよいし、また本発明の抗体を抗原として認識する二次抗体であってもよい。
【００３９】
［サクラネチンの製造方法］
本発明に係る、ナリンゲニンと本発明に係るポリペプチドとを、メチル基ドナーの存在下でインキュベートする工程と、得られたフラボノイド化合物を精製する工程とを含むサクラネチンの製造方法も含む。
本発明に係るポリペプチドは、NOMT活性を有するので、ナリンゲニンとメチル基ドナーの存在下でin vivoまたはin vitroでインキュベートすることにより、サクラネチンを大量に製造することができる。
メチル基ドナーとしては、例えば、S-アデノシルメチオニンが挙げられる。
ナリンゲニン及びS-アデノシルメチオニンは、種々の植物に含まれているので、上記製造方法は、例えば、植物細胞を本発明に係る核酸で形質転換することで行ってもよい。これにより、当該植物細胞にもともと含まれるナリンゲニン及びS-アデノシルメチオニンを基質としてサクラネチンが産生される。
また、大腸菌等の宿主に、ナリンゲニン又はその前駆体であるカルコンの生合成酵素等を導入して、ナリンゲニンを産生させることができる（例えば、Horinouchi, S. (2009) Curr. Opin. Biol. 13, 197-204.の方法）。この宿主を本発明に係る核酸で形質転換することによっても、サクラネチンを製造してもよい。大腸菌を用いる方法によれば、大腸菌を大量培養することにより、サクラネチンを大量生産することも可能である。
サクラネチンの精製は、公知の方法で行うことができる。
【００４０】
本発明は、上記方法で得られたサクラネチンを含む組成物も含む。かかる組成物は、医薬や食品に用いられる。医薬として用いられる場合、用途は特に限定されないが、糖尿病の予防または治療剤、および消炎剤として有用である。
【００４１】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
〔試薬〕
ナリンゲニン、コーヒー酸及びフェルラ酸は、関東化学株式会社（Tokyo, Japan）より購入した。
MALDI-TOF/TOFによる解析には全て分析グレードの試薬を用いた。4-スルホフェニルイソチオシアネート、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）、重炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウムは、Sigma社（St. Louis, MO, USA）から購入した。
【００４４】
〔植物材料、栽培条件、誘導〕
OsCOMT1のT-DNA挿入変異株(以下oscomt1)は、Salk Institute Genomic Analysis Laboratory (SIGnAL)の運営しているRice Functional Genomic Express Database (http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)で、OsCOMT1のTIGRローカスIDであるOs08g06100をクエリとして検索を行い、ポハン大学のPOSTECH BIOTECH CENTERにおけるPFG-2B-50240が、当該遺伝子のT-DNA挿入変異株であることを確認した上で、POSTECH BIOTECH CENTERから入手した。挿入されているT-DNA特異的な配列及びOsCOMT1特異的な配列由来のプライマーセット（下記表１）を用いたPCRジェノタイピングにより、T-DNA挿入のホモ接合変異体を、選択して用いた。
【表１】
2013183712.tif 000002
イネの栽培に際し、種子を2.5％次亜塩素酸ナトリウム溶液（関東化学）で30分間殺菌し、滅菌水で洗浄した。表面を殺菌した種子を、0.1％の液肥花工場（住化タケダ園芸, Tokyo, Japan）を含む0.7％寒天ゲル上で、10日間28℃で光を当ててインキュベートした。人工堆肥ボンソル１号（住友化学, Tokyo, Japan）に発芽種子を移植し、温室で栽培した（12時間明28℃-12時間暗25℃）。実験には播種後3ヶ月間栽培した植物を使用した。
イネの紫外線（UV）照射処理はクリンベンチ内のUVランプを用いて行った。サンプリングしたイネ地上部を蒸留水に浮かべ、クリンベンチのUVランプの下約20 cmの位置で20分間、UVを照射し続けた。UV処理後は植物を蒸留水に浮かべたまま28℃、明条件のインキュベーターに移し、必要に応じて48-72時間インキュベートを行った。
JA又は塩化銅処理は、96穴のプラスチックプレートで、イネの最上位展開葉の葉身から調製したリーフディスク（直径6 mm）を500 μMのJA溶液又は塩化銅溶液100 μlに浮かべて行った。
【００４５】
〔イネの葉からの粗酵素溶液の調製〕
特に記載されていない限り、すべての工程は4℃の低温室で行った。
ハサミで粗く刻んだ植物サンプルに、サンプル重の3倍量(w/v)程度のTGバッファー(後述)を添加し、植物体をポリトロンホモジナイザー(KINEMATICA)で破砕した。植物体の破砕後、4重のミラクロース(CALBIOCHEM)を用いて濾過を行い、植物残渣を取り除いた。その後濾液を10000×gで30分間遠心することで不溶性タンパク質を沈殿させ上清を回収し、これを粗酵素抽出液として以降の実験に用いた。
なお、TGバッファー（以下「バッファーA」と呼ぶ場合もある。）の組成と調製法は以下のとおりである。
【表２】
2013183712.tif 000003
<調製法>
1 MのTris-HCl溶液は予め低温室にて4℃の条件下でpH 8.5に調整したものを用いた。上記組成で調製した溶液を、超音波をかけながらアスピレーターを用いて陰圧にし、十分脱気を行って実験に用いた。
【００４６】
〔NOMT及びCOMT活性測定〕
NOMT、COMT活性は、粗酵素溶液（タンパク質量約500 ng）、300 μMナリンゲニンまたはコーヒー酸、300 μM S-adenosyl-L-methionine（SAM）、及び0.1 M Tris-HCl (pH 8.5; 5 mM DTTと1 mM EDTAを含む)を含む50 μlの反応溶液（以下「標準反応溶液」という。）を調製し反応産物として得られるサクラネチン、フェルラ酸を定量することで測定した。
上記標準反応溶液を28℃、暗所の条件にて18時間インキュベートした後、1 MのHClを5 μl加えて反応を停めた。生成物を、60 μlの酢酸エチルで3回抽出し、抽出液を濃縮乾固後、ファイトアレキシン抽出溶媒（エタノール：水：アセトニトリル：酢酸＝79：13.9：7：0.1， v/v/v/v）に溶解させた。サクラネチンとフェルラ酸をAPI-3000 LC/MS/MSで定量した。
HPLCとMS/MSの条件を以下に示す。
【表３】
2013183712.tif 000004
【表４】
2013183712.tif 000005
【００４７】
〔NOMTの精製〕
新鮮重200 g分のイネoscomt1変異株の地上部に対しUV照射を行い、照射後48時間の植物サンプルから620 mlの粗酵素溶液を得た。この粗酵素抽出液を用い、以下の3つの工程によりNOMTを精製した。特に記載されていない限り、以降のすべての工程は4℃の低温室で行った。
【００４８】
〔1〕硫安塩析によるタンパク質の濃縮
イネの粗酵素抽出液に対して、予め乳鉢乳棒を用いて十分に粉末状にした硫酸アンモニウム（関東化学）を108.7 mg加え、2時間穏やかに攪拌した後、10,000 gで30分遠心を行った。上清をきれいなビーカーに回収し、硫酸アンモニウム粉末77.5 mgを加え、先ほどと同様2時間穏やかに攪拌した後、10,000 gで30分遠心を行った。上清を除去し、ペレットに40 mlのTGバッファーを加えた。得られたタンパク質溶液48 mlを限界ろ過し（10 kDaカットオフ）、最終的に12 mlのTGバッファーに溶解し、次の精製に供した。
【００４９】
〔2〕陰イオン交換によるタンパク質の精製
陰イオン交換によるタンパク質の精製にはfast protein liquid chromatography (FPLC)システムであるAKTA (GEヘルスケア)を用いて行った。硫安塩析で得られた12 mlのタンパク質溶液の内10 mlをあらかじめTGバッファー平衡化したDEAEカラム（Hi PrepTM 16/10 DEAE FF, GE Healthcare, UK）に供した。カラムに供したタンパク質を、50 mlのTGバッファー（流速2 ml/min）で洗浄した後、50分間linear gradient（0-60% バッファーB (1 M KClを含むバッファーA)）で流速2 ml/minとして溶出を行った。続いて、カラムを100 mlの100％バッファーBで洗浄した。溶出液は5 mlずつ回収してNOMT活性を測定し、活性が強く確認されたフラクションを混合し、限界ろ過（10 kDaカットオフ）した後、最終的に6 mlのバッファーAに溶解した。
【００５０】
〔3〕Adenosine-agaroseを用いたアフィニティーカラムによるタンパク質の精製
Adenosine-agaroseを用いたアフィニティーカラムによるタンパク質の精製は既報(Plant Sci., 2000, 155, 213-221)に従い行った。Adenosine-agaroseは5'-AMP-agarose (5 ml, SIGMA)を蒸留水で洗浄した後、800 unitの仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（CIAP；Takara社）と、CIAPバッファー（10×）（pH 9.0）を全体で10 mlとなるように加えてインキュベートした。37℃で24時間穏やかに撹拌してゲルを脱リン酸化し、そのまま直径1.5 cm高さ9 cmのカラムに充填し、50 mlの蒸留水、1M KClを含むTGバッファーの順で洗浄し、最後に100 mlのTGバッファーで平衡化を行った。その後、1.8 mlのDEAE精製したタンパク質溶液を直接adenosine-agroseゲルカラムに供した。
カラムを50 mlのバッファーAで洗浄した後、50 mlのバッファーBで洗浄した。溶出は、25 mlの4 mM SAMを含むバッファーBで行った。5 mlずつフラクションを回収し、NOMT酵素活性を測定した。活性のあるフラクションを集めて混合し、限外ろ過（10 kDaカットオフ）し、最終的に1.2 mlのバッファーAに溶解した。このサンプルをSDS-PAGEに供した後、MALDI-TOF/TOF解析に供した。
【００５１】
〔ゲル内消化〕
各精製段階のタンパク質をSDS-PAGEに供したところ、アフィニティ精製後に新たに約40 kDaの位置にバンドが見出されたため、そのバンドに含まれるタンパク質についてMALD-TOF/TOFを用いたペプチドマスフィンガープリンティング法による同定を行った。それに先立ち、サンプル準備としてSDS-PAGEで得られたバンドのゲル内消化を行った。SDS-PAGEゲルのタンパク質のバンドを、Shevchenkoらの方法(Anal. Chem. 1996, 68:850-858)に従って、改変ブタトリプシン(Promega)を用いてゲル内消化した。ゲル断片を50％アセトニトリル（v/v）で洗浄してSDS、塩及び色素を除いた。洗浄し脱水したスポットから溶媒を減圧除去し、トリプシン溶液（8-10 ng/μl、50 mM重炭酸アンモニア中、pH8.7）で再水和し、37℃で8-10時間インキュベートした。
【００５２】
〔MALDI-TOF/TOFによる精製タンパク質の同定〕
ペプチドマスフィンガープリンティングによるタンパク質の同定は、MALDI-TOF/TOFを用いた。ゲル内消化したタンパク質サンプルは、Applied Biosystems 4700 proteomics analyzerを使用して、TOF/TOFTM ion opticsを用いて行った。MS及びMS/MSのデータは、200 HzのNd:YAGレーザを用い4000ショット集めた。MS/MSモードは、衝突エネルギー1 KeVで操作した。衝突ガスは空気とし単一の衝突が生じる条件とした。MS/MSデータは、装置に初期設定されたキャリブレーションで補正し、内部又は外部較正は行わなかった。シーケンスタグ検索はMASCOTを用いて行った。
以上の結果NOMT活性を有するタンパク質として、それぞれイネゲノム中のOs12g0240900、Os04g0175900にコードされる2種類のO-メチルトランスフェラーゼが同定された。なお、以降Os12g0240900、Os04g0175900それぞれのcDNA、ORF配列、もしくはそこから翻訳されるそれぞれのタンパク質のこと等をそれぞれ2409、1759と略記することがある。
【００５３】
〔5'-及び3'-RACE解析〕
得られた2種のNOMT候補遺伝子の内、Os04g0175900については完全長cDNAの情報が既に得られていたので、その配列に含まれるORFを以降の実験に用いた。Os12g0240900については予想遺伝子としてORF配列がイネゲノムデータベース上に登録されていたが、完全長cDNAが未取得であったため、予想ORF配列情報をもとに5'-及び3'-RACE実験を行い、完全長cDNA配列の取得を行った。
Sepasol-RNA I Super (Nakalai Tesque, Inc, Tokyo, Japan)を用い、UV照射した野生型イネ（cv. Nipponbare）の葉からのtotal RNAを抽出した。続いて、Absolutely mRNATM Purification Kit (Agilent Technologies, CA, USA)を用いてRNAを精製した。mRNAからのcDNA合成と、5'-及び3'-RACEは、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Lab., CA, USA)を使用して行った。5'-及び3'-RACEに用いたプライマーは下表のとおりである。
【表５】
2013183712.tif 000006
以上の実験からOs12g0240900 (上記OsNOMT)の完全長cDNA配列（1548 bp）を決定し、その配列に含まれるORFを以降の実験に用いた。
【００５４】
〔NOMT候補タンパク質の大腸菌発現〕
得られた2種のNOMT候補タンパク質の活性について検討するため、それぞれのORFをクローニングし大腸菌発現させ活性の評価を行った。以下にクローニングとベクターの構築、及び発現と活性測定の方法について示す。
【００５５】
〔1〕NOMT候補のクローニングと発現用ベクターの構築
Os04g0175900、Os12g0240900の大腸菌発現用のベクター構築に先立ち、これらORFのクローニングを行った。Os04g0175900、Os12g0240900のORFは、塩化銅処理後48時間の野生型イネ(cv. Nipponbare)から抽出したtotal RNAをもとに、SuperScript III First-Strand Synthesis System (invitrogen)を付属のプロトコルに従って用い逆転写を行うことで得られたcDNAを鋳型とし、TOPOクローニング用のCACC配列を付加した下記のプライマーセットを用いて、KOD FX NEO (TOYOBO, Tokyo, Japan)を付属の説明書に従って用いRT-PCRにより増幅した。directional TOPO cloning transfer vectorを構築するために、PCTの上流プライマーの5'末端に5'-CACC-3'を挿入した。
【表６】
2013183712.tif 000007
<反応条件>
94℃, 10 min→[94℃, 30 sec→55℃, 30 sec→68℃, 130 sec]×40→68℃, 5 min→4℃
【００５６】
PCR産物をアガロース電気泳動で精製した後、pENTR D-TOPO cloning kit (Invitrogen, CA, USA)を用いて、pENTR/D-TOPO vectorに挿入し、大腸菌のTOP10ケミカルコンピテントセルを形質転換した。
このベクターをLR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogene)を用いてpDEST15 (Invitrogene)と融合させることで、それぞれのO-メチルトランスフェラーゼのN末端にGSTタグを融合した組換えタンパク質の発現用ベクター、pDEST15-1759、及びpDEST15-2409を得た。
【００５７】
〔2〕NOMT候補の発現と活性測定
得られたpDEST15-1759、pDEST15-2409をそれぞれRosettaTM 2 (DE3) Competent Cells (Novagen)へと導入した。カルベニシリン（100 μg/ml）とクロラムフェニコール（34 μg/ml）を含む液体LB培地で、24時間37℃で前培養を行った。
その後、カルベニシリン（100 μg/ml）とクロラムフェニコール（34 μg/ml）を含むOvernight ExpressTM instant TB Medium (Novagen, WI, USA)で、20℃で48時間培養を行った。
遠心処理により細胞を回収し、TGバッファーに懸濁して氷上で大腸菌の超音波破砕を行った。10,000×gで15分遠心分離し、上清を可溶性タンパク質として回収した。
得られた可溶性タンパク質は、予めTGバッファーで平衡化したGSTrap HP (ベッドボリューム5 ml, GE Healthcare)カラムを装着したAKTA FPLCに供した。
タンパク質を吸着させたGSTrap HP カラムを25 mlのTGバッファー（流速2 ml/min）で洗浄した後、10 mMの還元グルタチオンを含むTGバッファー25 mlで組換えタンパク質を溶出させた。精製された組換えタンパク質を限界ろ過（10 kDaカットオフ）し、最終的に1 mlのTGバッファーに溶解した。これをNOMT活性測定、反応速度解析、及び基質特異性解析に供した。
【００５８】
〔組換えタンパク質を用いたNOMT活性測定〕
得られたGSTタグ融合の組換えタンパク質、GST-1759及びGST-2409についてNOMT活性測定を行った。上記した標準反応溶液から酵素を除いた物を30℃で5分間プレインキュベートした後、それに対し、得られたGST-1759もしくはGST-2409を1 pmol分添加することで反応を開始した。30℃で5 分間反応を行った後、反応溶液中に1 MのHClを5 μl添加することで反応を停止した。得られた生成物を酢酸エチルで抽出し、その抽出物を濃縮乾固し、100 μlのファイトアレキシン抽出溶媒を用いて再溶解した。得られたサンプル中に含まれるサクラネチンをLC-MS/MSを用いて検出した。その結果GST-1759を用いた反応溶液中からはサクラネチンが検出されなかったのに対し、GST-2409を用いた反応溶液中からは顕著にサクラネチンが検出された（図１）。
【００５９】
また、ナリンゲニン及びサクラネチンは2位に不斉炭素を有する光学活性物質であることが知られており、本実施例を通してラセミ体のナリンゲニンを用いた実験が行われているが、NOMT活性の見出されたGST-2409について、その立体選択性についての検討を行うために、キラルカラムを用いたLC-MS/MS解析を行った。ラセミ体のサクラネチン標品、いもち病菌接種を行ったイネ葉から抽出したサクラネチン、GST-2409を用いた反応産物それぞれについて、カラムにSUMICHIRAL OA-7500 (住化分析センター, Tokyo, Japan)を用い、0.1%酢酸を含む30％アセトニトリルによるアイソクラティックな条件で溶出を行い、API3000によるMS/MS分析を行った。その結果、ラセミ体のサクラネチン標品からは溶出時間54分、61分の時点でほぼ同じ面積の２つのピークが検出されたのに対し、いもち病菌接種を行ったイネ葉から抽出したサクラネチン、及びGST-2409を用いた反応産物からは溶出時間54分のピークが主要な物として検出され、それと比較して61分のピークはわずかであった（図２）。このことからGST-2409は、天然型の立体配置を有するサクラネチンを選択的に生産することが示された。
以上の結果からOs12g0240900にコードされるタンパク質がNOMT活性を有する物であることが確認され、このことから当該遺伝子及びタンパク質をOsNOMTと命名した。
【００６０】
〔反応速度解析〕
OsNOMTについて反応速度解析を行った。酵素を含まない標準反応溶液を30℃で5分プレインキュベートした後、1 pmolのGST-2409を加えて反応を開始させ、反応溶液を30℃で5分インキュベートした。1 M HClを5 μl加えて反応を停めた。得られた反応産物を60 μlの酢酸エチルで3回抽出し、蒸発乾固させ、最終的に100 μlのファイトアレキシン抽出溶媒に溶解させた。サクラネチンの含量をAPI-3000 LC-MS/MS systemを用いて測定した。速度論的パラメーターは、Hanes-Woolfプロットにより求めた（図３）。基質濃度の反応速度への影響を、種々の濃度のナリンゲニン(30, 24, 18, 12, 6 及び0 μM)を用いて調べた。本実験で用いたナリンゲニンはラセミ体であるのに対し、上記した通りOsNOMTには立体選択性があることが示されているので、用いたラセミ体のナリンゲニンの半分の量が反応に使われる基質として計算を行った。その結果、今回行った反応条件においてはナリンゲニンに対しKmが1.9±0.1 μM、kcatが1505±206/minであることが示された。
【００６１】
〔基質特異性解析〕
今回取得されたOsNOMTの基質特異性を確認するために、ナリンゲニンと共に様々なフラボノイド、イソフラボノイドを含むフェノール性化合物に対するGST-OsNOMTのメチル化活性を比較検討した。酵素及びSAMを除き、各フェノール性化合物の基質を終濃度300 μMに調製した標準反応溶液に対しGST-OsNOMTを1 pmol分添加し30℃で5分プレインキュベートした。
そこに45.9 pmol （購入試薬1 μl分）の S-[methyl-3H]-adenosyl-L-methionine (約444 GBq/mmol, 20.4 MBq/ml, PerkinElmer, MA, USA)を添加することで反応を開始した。10分間反応を行った後、5 μlの1 M HClを加えることで反応を停止した。反応溶液に150 μlの酢酸エチルを添加し十分に振盪を行い、酢酸エチル層75 μlを2.5 mlのクリアゾルI（ナカライテスク）に添加し、液体シンチレーションカウンターにて3Hの検出を行った。用いた各基質の構造と、ナリンゲニンを基質としたときの崩壊率(dpm)を100%としたときの各基質の崩壊率の割合を示した（図４）。
その結果GST-OsNOMTは他のフラボンやフラバノンに対してもメチル化活性を有するものの、今回調べた基質の中ではナリンゲニンに対して最も高いメチル化活性を示すことが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号：１は、OsNOMTのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２は、OsNOMTのオープンリーディングフレームのDNA配列を示す。
配列番号：３は、OsNOMTのcDNA配列を示す。
配列番号：４は、PCRジェノタイピングに用いたプライマーCOMT1T-DNA check FのDNA配列を示す。
配列番号：５は、PCRジェノタイピングに用いたプライマーCOMT1T-DNA check RのDNA配列を示す。
配列番号：６は、PCRジェノタイピングに用いたプライマーT-DNA Seq2 RB outer RのDNA配列を示す。
配列番号：７は、3'-RACE解析に用いたプライマー2409-3RACE-FのDNA配列を示す。
配列番号：８は、5'-RACE解析に用いたプライマー2409-5RACE-RのDNA配列を示す。
配列番号：９は、RT-PCRに用いたプライマー1759 pENTR ORF FのDNA配列を示す。
配列番号：１０は、RT-PCRに用いたプライマー1759 ORF RのDNA配列を示す。
配列番号：１１は、RT-PCRに用いたプライマー2409 pENTR ORF FのDNA配列を示す。
配列番号：１２は、RT-PCRに用いたプライマー2409 ORF RのDNA配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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