(57)【要約】      （修正有）【課題】リステリア・モノサイトゲネスに結合するＤＮＡ分子、ならびにその用途の提供。【解決手段】特定配列のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子からなる、リステリア・モノサイトゲネスに結合する核酸分子、および、該核酸分子を含むリステリア・モノサイトゲネスに結合する結合剤。本ＤＮＡ分子はリステリア・モノサイトゲネスの特異的な検出、および、食品管理、食品衛生等の分野において、新たな研究用ツールとして有用である。【選択図】図２
2013128442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするリステリア  モノサイトゲネスに結合する核酸分子。
（ａ）配列番号１〜１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リステリア  モノサイトゲネスに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リステリア  モノサイトゲネスに結合するポリヌクレオチド
配列番号１    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTTTCGGCGTTTCGGGTTGGGTGTGGTGGGTCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号２    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTGCGATGGGGTGCTGTGGGGGGGGCCTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号３    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACGCGGAGGGGGGTGTTGTGGGGAGGCCTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号４    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACCGGGTGGGGGGGTCGGGTCATGTTAGACGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号５    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTTCGTCTTTCTTTGGTCCTATAATCTCGCTCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号６    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTCGTCGGGGTTGCTGTGGGGTGGGTCTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号７    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTGGGTATGGGGTGCTGTGGGGGGGTCTCGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号８    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACGCGGGGTGAACTGCGGGGGCGGTCGGGGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号９    GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACCTGTGGCTCGTGGGGGTGGAGGGGTCCGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号１０  GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACACAGGCGCGATAACGGGTGGGGGTGGTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号１１  GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACATCGCTGGGGTGTTGTGGGGTGGGACAGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
配列番号１２  CCGGGTGGGGGGGTCGGGTCATGTTAGACGGCAATAA
配列番号１３  CCGGGTGGGGGGGTCGGGTCATGT
配列番号１４  CCGGGTGGGGGGGTCGGGTC
配列番号１５  TCGGGGTTGCTGTGGGGTGGGTCTGGGCA
配列番号１６  CTGGGTATGGGGTGCTGTGGGGGGGTC
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
請求項１または２記載の核酸分子を含むことを特徴とする、リステリア  モノサイトゲネスに結合する結合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア  モノサイトゲネスに結合するＤＮＡ分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリアは、自然界に広範囲に存在するグラム陽性桿菌であり、８種類の菌が存在する。このうち、リステリア  モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、生野菜、乳製品、食肉等を介してヒトに感染し、ヒトに対する病原性を示すことが報告されている。リステリア  モノサイトゲネスは、例えば、４℃等の低温でも増殖可能なため、食品衛生上問題となる。このため、衛生管理上、リステリア  モノサイトゲネスの検出が重要視されている。
【０００３】
細菌の検出方法としては、一般に、培養検体について、生化学的試験、ＰＣＲによる解析、イムノクロマト法による解析等を行う方法が知られている。しかしながら、リステリア  モノサイトゲネスに関して、これらの方法を適用した場合、例えば、検出に時間を要し、特異性が不十分という問題がある。また、近年、リステリア  モノサイトゲネス由来のＥカドヘリンに対するアドヘシンであるＩｎｌＡ（リステリア  モノサイトゲネスが細胞内に侵入する時に関与する分子）に結合する核酸分子が報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、リステリア  モノサイトゲネスの特異的な検出のためには、新たなツールが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７６４５５８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明の目的は、リステリア  モノサイトゲネスに結合する新たな核酸分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のＤＮＡ分子は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするリステリア  モノサイトゲネスに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１〜１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リステリア  モノサイトゲネスに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リステリア  モノサイトゲネスに結合するポリヌクレオチド
【０００７】
本発明の結合剤は、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする、リステリア  モノサイトゲネスに対する結合剤である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の核酸分子によれば、リステリア  モノサイトゲネスに結合可能である。このため、本発明のＤＮＡ分子によれば、前記リステリア  モノサイトゲネスを検出できる。したがって、本発明のＤＮＡ分子は、例えば、食品衛生等の分野において、新たな研究用ツールとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明におけるポリヌクレオチドの推定二次構造を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施例１において、リステリア  モノサイトゲネスに対する各ＤＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例２において、ｐ６０タンパク質に対する各ＤＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜核酸分子＞
本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするリステリア  モノサイトゲネスに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１〜１６の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、リステリア  モノサイトゲネスに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなり、リステリア  モノサイトゲネスに結合するポリヌクレオチド
【００１１】
本発明において、「リステリア  モノサイトゲネスに結合する」とは、例えば、リステリア  モノサイトゲネスに対する結合能を有している、または、リステリア  モノサイトゲネスに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子とリステリア  モノサイトゲネスとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）が使用できる。
【００１２】
本発明の核酸分子は、例えば、リステリア  モノサイトゲネス由来ｐ６０タンパク質に結合してもよい。本発明において、リステリア  モノサイトゲネス由来ｐ６０タンパク質は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ０５４５８７にアミノ酸配列が開示されている。
【００１３】
本発明において、「前記ｐ６０タンパク質に結合する」とは、例えば、前記ｐ６０タンパク質に対する結合能を有している、または、前記ｐ６０タンパク質に対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子と前記ｐ６０タンパク質との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）が使用できる。
【００１４】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡアプタマーともいう。本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。
【００１５】
前記（ａ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記配列番号１〜１６のいずれかの塩基配列を含むポリヌクレオチドでもよいし、前記配列番号１〜１６のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。配列番号１〜１６のポリヌクレオチドを以下に示す。
P60-109（配列番号１）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTTTCGGCGTTTCGGGTTGGGTGTGGTGGGTCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-105（配列番号２）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTGCGATGGGGTGCTGTGGGGGGGGCCTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-149（配列番号３）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACGCGGAGGGGGGTGTTGTGGGGAGGCCTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-122（配列番号４）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACCGGGTGGGGGGGTCGGGTCATGTTAGACGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-159（配列番号５）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTTCGTCTTTCTTTGGTCCTATAATCTCGCTCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-199（配列番号６）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTCGTCGGGGTTGCTGTGGGGTGGGTCTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-197（配列番号７）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACTGGGTATGGGGTGCTGTGGGGGGGTCTCGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-207（配列番号８）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACGCGGGGTGAACTGCGGGGGCGGTCGGGGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-251（配列番号９）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACCTGTGGCTCGTGGGGGTGGAGGGGTCCGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-236（配列番号１０）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACACAGGCGCGATAACGGGTGGGGGTGGTGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-195（配列番号１１）
GGAAATCCTGCGGTCGTCTAAACATCGCTGGGGTGTTGTGGGGTGGGACAGGGCAATAACGCTGACTGTGCTGGT
P60-122-s1（配列番号１２）
CCGGGTGGGGGGGTCGGGTCATGTTAGACGGCAATAA
P60-122-s2（配列番号１３）
CCGGGTGGGGGGGTCGGGTCATGT
P60-122-s3（配列番号１４）
CCGGGTGGGGGGGTCGGGTC
P60-199-s1（配列番号１５）
TCGGGGTTGCTGTGGGGTGGGTCTGGGCA
P60-197-s1（配列番号１６）
CTGGGTATGGGGTGCTGTGGGGGGGTC
【００１６】
前記（ｂ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、前記リステリア  モノサイトゲネスに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００１７】
前記（ｃ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）の塩基配列に対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【００１８】
前記（ｃ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【００１９】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよいが、好ましくは同じである。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２〜１２であり、より好ましくは２〜６であり、さらに好ましくは２である。
【００２０】
前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドがあげられ、その構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１〜２４塩基長であり、好ましくは１２〜２４塩基長であり、より好ましくは１６〜２４塩基長であり、さらに好ましくは２０〜２４塩基長である。
【００２１】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【００２２】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
【００２３】
本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【００２４】
前記ポリヌクレオチドの推定二次構造を、図１に例示する。なお、本発明は、これには制限されない。図１には、配列番号１（Ｐ６０−１０９）、配列番号２（Ｐ６０−１０５）、配列番号６（Ｐ６０−１９９）および配列番号７（Ｐ６０−１９７）の推定二次構造を示す。
【００２５】
本発明の核酸分子は、例えば、修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記核酸分子における前記修飾化ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００２６】
前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化リボヌクレオチド残基および修飾化デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されたものがあげられる。前記糖残基は、例えば、リボース残基またはデオキシリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【００２７】
前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２−チオウラシル、２−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００２８】
本発明の核酸分子は、例えば、前記構成単位として人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記核酸分子における前記人工核酸モノマー残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における塩基は、例えば、前述と同様である。
【００２９】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、例えば、ポリ（Ａ）配列、ポリ（Ｔ）配列等があげられる。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられ、リボヌクレオチド残基が好ましい。本発明の核酸分子を、例えば、担体に固定化する際、前記付加配列を介して、前記担体に前記核酸分子を固定化することが好ましい。
【００３０】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法、遺伝子工学的手法等の公知の方法等により合成できる。
【００３１】
本発明の核酸分子は、前述のように、前記リステリア  モノサイトゲネスに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記リステリア  モノサイトゲネスへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。
【００３２】
本発明の核酸分子によれば、前記リステリア  モノサイトゲネスを検出できる。前記リステリア  モノサイトゲネスの検出方法は、特に制限されず、前記リステリア  モノサイトゲネスと前記核酸分子との結合を検出することによって、行える。
【００３３】
＜結合剤＞
本発明の結合剤は、前述のように、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とするリステリア  モノサイトゲネスに対する結合剤である。本発明の結合剤は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の結合剤は、例えば、リステリア  モノサイトゲネスに対する結合剤であってもよい。本発明の結合剤を使用すれば、前述のように、例えば、前記リステリア  モノサイトゲネスの検出等を行うことができる。
【実施例】
【００３４】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００３５】
［実施例１］
リステリア  モノサイトゲネスに結合可能なＤＮＡアプタマーを作製し、各ＤＮＡアプタマーについて、リステリア  モノサイトゲネスに対する結合能を確認した。
【００３６】
（１）ＤＮＡアプタマー
実施例１のアプタマーとして、前記Ｐ６０−１０５（配列番号２）、Ｐ６０−１４９（配列番号３）、Ｐ６０−１５９（配列番号５）、Ｐ６０−１２２（配列番号４）、Ｐ６０−１９５（配列番号１１）、Ｐ６０−１９７（配列番号７）、Ｐ６０−１９９（配列番号６）、Ｐ６０−２０７（配列番号８）、Ｐ６０−２３６（配列番号１０）、Ｐ６０−２５１（配列番号９）、Ｐ６０−１２２−ｓ３（配列番号１４）、Ｐ６０−１９７−ｓ１（配列番号１６）、Ｐ６０−１９９−ｓ１（配列番号１５）を使用した。
【００３７】
（２）標的細菌
標的細菌として、リステリア  モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ＃７６４４）を使用した。
【００３８】
（３）ＥＬＬＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ａｓｓａｙ）
９６穴プレート（商品名Ｉｍｍｕｎｏ  ９６  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ  ＭａｘｉＳｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社製）に、炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で希釈した１０μｇ／ｍＬの加熱処理したリステリア  モノゲネス（ＡＴＣＣ＃７６４４、１０の８乗ＣＦＵ／ｍＬ）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩吸着させた。前記各ウェルに、２００μＬのＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ、１％  スクロース、１％  ＢＳＡ）を２００μＬ加え、室温で３時間インキュベートした。インキュベート後、前記各ウェルを２００μＬの洗浄液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で３回洗浄し、菌体プレートを作製した。
【００３９】
次いで、前記ＤＮＡアプタマーのうち、Ｐ６０−１０５（配列番号２）、Ｐ６０−１４９（配列番号３）およびＰ６０−１５９（配列番号５）のＤＮＡアプタマーの３’末端に、それぞれ、２４塩基のポリｄアデニン（ポリｄＡ）を付加して、ポリｄＡ付加ＤＮＡアプタマーを調製した。前記ポリｄＡ付加ＤＮＡアプタマーを変性した後、５’末端をビオチン化した２４塩基のビオチン化ポリｄチミンを等モル数、混合した。これにより、前記ポリｄＡ付加ＤＮＡアプタマーと、前記ビオチン化ポリｄチミンのポリチミン（ポリｄＴ）との相補的な結合により、ビオチン標識ＤＮＡアプタマーを作製した。また、前記ＤＮＡアプタマーのうち、Ｐ６０−１０５（配列番号２）、Ｐ６０−１４９（配列番号３）およびＰ６０−１５９（配列番号５）以外の各ＤＮＡアプタマーの３’末端または５’末端を、それぞれビオチン化し、ビオチン標識ＤＮＡアプタマーを作製した。
【００４０】
そして、希釈溶液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で、前記ビオチン標識ＤＮＡアプタマーを１μｍｏｌ／Ｌに希釈した後、前記各ウェルに１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。続いて、前記各ウェルを前記洗浄液で洗浄した後、１０００倍希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳＡ−ＨＲＰ：ＧＥ社製、＃ＲＰＮ１２３１Ｖ）を１００μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。さらに、前記各ウェルを前記洗浄液で洗浄した後、ＴＭＢ−Ｅ基質（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ．製）を１００μＬ添加し、室温で２０分間反応（発色）させた。その後、前記各ウェルに１００μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ  硫酸を加え、反応を停止した後、プレートリーダーで波長４５０ｎｍの吸光度（参照波長は６２０ｎｍ）を測定した。
【００４１】
また、コントロールとして、前記ビオチン標識ＤＮＡアプタマーに代えて、ビオチン化ポリチミンを使用して、同様に吸光度を測定した（ｂｉｏｔｉｎ−ｐｏｌｙｄＴ）。また、ブランクとして、前記ビオチン標識ＤＮＡアプタマーを添加しないウェルを作製し、同様に吸光度を測定した（Ｂｌａｎｋ）。
【００４２】
これらの結果を、図２に示す。図２は、リステリア  モノサイトゲネスに対する各アプタマーの結合能を示すグラフである。図２において、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度（参照波長は６２０ｎｍ）である。図２において、「ｐｏｌｙＡ−」は、ポリｄＡを付加し、ビオチン化ポリｄＴを介してビオチン化したアプタマーの結果であり、「ｂｉｏｔｉｎ−」は、直接ビオチン化したアプタマーの結果である。
【００４３】
図２に示すように、前記ビオチン標識ＤＮＡアプタマーは、コントロール（ｂｉｏｔｉｎ−ｐｏｌｙｄＴ）およびブランク（Ｂｌａｎｋ）よりも高い吸光度を示した。この結果から、前記ＤＮＡアプタマーは、前記リステリア  モノサイトゲネスに結合することがわかった。
【００４４】
［実施例２］
ｐ６０タンパク質に結合可能なＤＮＡアプタマーを作製し、各ＤＮＡアプタマーについて、ｐ６０タンパク質に対する結合能を確認した。
【００４５】
（１）ＤＮＡアプタマー
実施例２のＤＮＡアプタマーとして、Ｐ６０−１０５（配列番号２）、Ｐ６０−１０９（配列番号１）、Ｐ６０−１２２（配列番号４）、Ｐ６０−１４９（配列番号３）、Ｐ６０−１５９（配列番号５）、Ｐ６０−１９５（配列番号１１）、Ｐ６０−１９７（配列番号７）、Ｐ６０−１９９（配列番号６）、Ｐ６０−２３６（配列番号１０）、Ｐ６０−２５１（配列番号９）を使用した。
【００４６】
（２）標的タンパク質
標的タンパク質として、リステリア  モノゲネス由来のｐ６０タンパク質の全長を大腸菌で発現、精製して使用した。
【００４７】
（３）ＥＬＬＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ａｓｓａｙ）
加熱処理したリステリア  モノゲネスに代えて、炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で希釈した１０μｇ／ｍＬの前記リステリア  モノサイトゲネス由来ｐ６０タンパク質を、９６穴プレート（商品名Ｉｍｍｕｎｏ  ９６  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ  ＭａｘｉＳｏｒｐ：Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で一晩吸着させた。その後、前記各ウェルに、２００μＬの前記洗浄液で洗浄後、ブロッキングバッファー（商品名Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒｅｅ  （ＴＢＳ）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ：ＰＩＥＲＣＥ社製、＃３７５７０）を２００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記各ウェルを２００μＬの前記洗浄液で３回洗浄した。その後は、前記実施例１と同様にして、吸光度測定を行った。
【００４８】
これらの結果を、図３に示す。図３は、ｐ６０タンパク質に対する各ＤＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図３において、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度（参照波長は６２０ｎｍ）であり、３回の測定に基づく平均値±偏差（ＳＤ）を示す。図３において、「ｐｏｌｙＡ−」は、ポリｄＡを付加し、ビオチン化ポリｄＴを介してビオチン化したアプタマーの結果であり、「ｂｉｏｔｉｎ−」は、直接ビオチン化したアプタマーの結果である。
【００４９】
図３に示すように、前記ビオチン標識ＤＮＡアプタマーは、コントロール（ｐｏｌｙｄＴ）およびブランク（Ｂｌａｎｋ）よりも高い吸光度を示した。この結果から、前記ＤＮＡアプタマーは、前記ｐ６０タンパク質に結合することがわかった。また、ｐｏｌｙＡ−Ｐ６０−１０５とｂｉｏｔｉｎ−Ｐ６０−１０５の結果から、ポリｄＡを付加し、ビオチン化ポリｄＴを介してビオチン化したアプタマーの方が、より優れた結合力を示すことがわかった。
【００５０】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の核酸分子によれば、リステリア  モノサイトゲネスと結合可能である。このため、本発明のＤＮＡ分子によれば、前記リステリア  モノサイトゲネスを検出できる。このため、本発明のＤＮＡ分子は、例えば、食品衛生等の分野において、新たな研究用ツールとしても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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