(57)【要約】【課題】パラゴムノキ根白腐病の早期発見のために、土壌や植物中に生息しているパラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラスを高感度かつ特異的に検出する方法の提供。【解決手段】微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのＩＴＳ領域中の特定の領域と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマーと、リバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号２７で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号２７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号２７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号２８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
リバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とするパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
【請求項２】
前記フォワードプライマーが、配列番号２７で表される塩基配列を３’末端に有している請求項１に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
【請求項３】
前記リバースプライマーが、配列番号２９で表される塩基配列からなる請求項１又は２に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
【請求項４】
検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号２７で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号２７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号２７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号２８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
リバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することを特徴とするパラゴムノキ根白腐病の診断方法。
【請求項５】
（Ｆ１−１）配列番号２７で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号２７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号２７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号２８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むことを特徴とするパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラス（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ）を特異的に検出し得るプライマー、並びに当該プライマーを用いてパラゴムノキ根白腐病菌を検出する方法、及びパラゴムノキ根白腐病を診断する方法に関する。  
【背景技術】
【０００２】
パラゴムノキ根白腐病は、原因菌であるリジドポラス・マイクロポラスが植物の根に感染することにより引き起こされる土壌病害の一種である（例えば、非特許文献１参照。）。病症が進行すると、感染した植物は枯れてしまう。特に、ゴムノキのプランテーションにおいては、最も深刻な土壌病害の１つであり、パラゴムノキ根白腐病の早期発見とパラゴムノキ根白腐病菌の防除が重要な課題となっている。しかし、現在のところ、立ち枯れ等の病徴が現れる前の早期にパラゴムノキ根白腐病を発見するための有効な手段は知られていない。
【０００３】
分子生物学的手法を利用して、感染が疑われる土壌や植物中に原因菌が存在しているか否かを調べることにより、早期に土壌病害を発見することができる。例えば特許文献１には、オイルパームの茎枯れ病の原因菌であるガノデルマ・ボニネンセ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）を、リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ）領域中のガノデルマ・ボニネンセに特異的な塩基配列を特異的に検出可能なプライマーを用いたＰＣＲを行うことによって検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−３１４１９９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S. Kaewchai, et.al., African Journal of Microbiology Research,  (2009) vol.3, pp.641-648.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、パラゴムノキ根白腐病の早期発見のために、土壌や植物中に生息しているパラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラスを高感度かつ特異的に検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、土中生息菌のｒＤＮＡ遺伝子群のＩＴＳ領域塩基配列のうち、パラゴムノキ根白腐病菌に特異的な領域の塩基配列を見出し、当該塩基配列を特異的に検出可能なプライマーを設計し、当該プライマーを用いて、検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、パラゴムノキ根白腐病菌を高感度かつ特異的に検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法、パラゴムノキ根白腐病の診断方法、及びパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーを提供するものである。
（１）  微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号２７で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号２７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号２７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号２８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
リバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とするパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
（２）  前記フォワードプライマーが、配列番号２７で表される塩基配列を３’末端に有している前記（１）に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
（３）  前記リバースプライマーが、配列番号２９で表される塩基配列からなる前記（１）又は前記（２）に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
（４）  検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかを含むフォワードプライマーと、リバースプライマーと、
を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することを特徴とするパラゴムノキ根白腐病の診断方法。
（５）  前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかを含むことを特徴とするパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー、及びこれらを用いたパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法により、感染が疑われる土壌や植物中に生息しているパラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラスを高感度かつ特異的に検出することができる。このため、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー及びパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法は、パラゴムノキ根白腐病の早期発見、診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域に基づいて作成した分子系統樹を示す。
【図２】図２は、ジャワ島Ｐｕｒｗａｋａｒｔａ分離株、既報のマレーシア株、及び比較対象として用いたNS-2株（スマトラ島ＮｏｒｔｈＳｕｍａｔｒａ分離株）のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列のアラインメント図を示す。
【図３】図３は、リジドポラス・マイクロポラス（ジャワ島Ｐｕｒｗａｋａｒｔａ分離株、スマトラ島ＮｏｒｔｈＳｕｍａｔｒａ分離株、マレーシア株）、近縁種であるＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｌｉｎｅａｔｕｓ、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ及びＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓのｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列のアラインメント図を示す。
【図４】図４は、本発明において用いられるプライマーの位置を示す。
【図５】図５は、実施例１におけるプライマーを用いて、リジドポラス・マイクロポラスP.2-1株（以下、Purwakarta.2-1株ともいう。）、並びに、農業生物資源ジーンバンクより購入したＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ及びＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓから抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図６】図６は、実施例１及び比較例１におけるプライマーを用いて、リジドポラス・マイクロポラスP.2-1株、並びに、農業生物資源ジーンバンクより購入したＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ及びＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓから抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったときの各菌の検出の有無を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜パラゴムノキ根白腐病菌の検出方法＞
本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法（以下、「本発明の検出方法」ということがある。）は、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域中のパラゴムノキ根白腐病菌に特異的な領域と特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて、微生物を含む試料から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする。当該試料中にパラゴムノキ根白腐病菌が存在していた場合には、ＰＣＲによってプライマー設計から期待される大きさのＰＣＲ産物が得られる。本発明においては、パラゴムノキ根白腐病菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズするプライマーをパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーとして用いることにより、パラゴムノキ根白腐病菌を特異的かつ高感度に検出することができる。
【００１２】
パラゴムノキ根白腐病菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズするプライマーを設計するために、本発明者らは、まず、パラゴムノキ根白腐病菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を調べた。具体的には、パラゴムノキ根白腐病にかかったパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が植えられているジャワ島の圃場（Ｐ）からパラゴムノキ根白腐病菌を単離した。この結果、インドネシアのＰの土壌から５株（P.2-1株、P.2-2株、P.2-3株、P.2-5株、P.2-6株）のリジドポラス・マイクロポラスが単離された。
また、比較対象として、スマトラ島の圃場（ＮＳ）から土壌から単離されたNS-2株を用いた。更に、農業生物資源ジーンバンクより、他のリジドポラス属菌（「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ」(ＭＡＦＦ番号：４２０１４９)、「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｌｉｎｅａｔｕｓ」(ＭＡＦＦ番号：４２０２３５)、「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓ」(ＭＡＦＦ番号：４２００４１)）を購入した。
【００１３】
１週間培養した上記分離株及び購入した菌株のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を解析し、得られた塩基配列を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及びＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に対して、ＢＬＡＳＴ検索を行い、得られた塩基配列と、登録されている既知の土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較した。これらに基づいて作成した分子系統樹を図１に示す。
【００１４】
比較対象として、リジドポラス・マイクロポラスのマレーシア株(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７０６（配列番号２），ＨＱ４００７０７（配列番号６），ＨＱ４００７０８（配列番号４），ＨＱ４００７０９（配列番号３）)を使用した。更にリジドポラス・マイクロポラス以外の土中生息菌としては、「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＹ５９３８６８)（配列番号５）、「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７１０)（配列番号７）、「Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ａｎｎｏｓｕｍ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ４５５４９６)（配列番号９）、「Ｈｅｔｅｒｏｂａｓｉｄｉｏｎ  ｐａｒｖｉｐｏｒｕｍ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＪ９０３３３０)（配列番号１０）「Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ  ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎｉｉ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＭ２６９７８５)（配列番号１１「Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ  ｓｐ．」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ８４０６７３（配列番号１２），ＥＵ８４０６７４（配列番号１３），ＥＵ８４０６７５（配列番号１４），ＥＵ８４０６７６（配列番号１５），ＥＵ８４０６７７（配列番号１６），ＥＵ８４０６７８（配列番号１７），ＥＵ８４０６８１（配列番号１８），ＥＵ８４０６８２)（配列番号１９）、「Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＪ５９６８０６)（配列番号２０）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｃｏｒｔｉｃｏｌａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＦ０１１１２２（配列番号２１），ＥＦ０１１１２３（配列番号２２），ＦＪ９０３３２７（配列番号２３））、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｐｏｐｕｌｉｎｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＦ０１１１２１）（配列番号８）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｌａｔｅｍａｒｇｉｎａｔｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＧＵ０６２２６７）（配列番号２４）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｓｕｂｐｏｐｕｌｉｎｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＪ６４４２８１（配列番号２５），ＦＪ６４４２８２（配列番号２６））を使用した。
【００１５】
その結果、多くの分離株は、既報のマレーシア株（ＨＱ４００７０６，ＨＱ４００７０７，ＨＱ４００７０８，ＨＱ４００７０９）と比べて、９４〜９９％と高い相同性（塩基配列の同一性）を示した。図１に示すように、すべての分離株は、リジドポラス・マイクロポラスのクラスターを形成し、近縁種のＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓとは異なるクラスターに位置していることが分かった。本願明細書の以降においては、代表株とし、P.2-1株（配列番号１）を用いた。
また、図２に示されるように、本発明において分離された株（ジャワ島Ｐｕｒｗａｋａｒｔａ分離株）においては、既報のマレーシア株、及び比較対象として用いたNS-2株（スマトラ島ＮｏｒｔｈＳｕｍａｔｒａ分離株）とは一部異なる塩基配列が認められ、リジドポラス・マイクロポラスの遺伝的多様性が示唆された。
【００１６】
分子系統樹において、リジドポラス・マイクロポラスが１つのクラスターを形成することは、リジドポラス・マイクロポラスに特異的な塩基配列が存在することを意味する。そこで、リジドポラス・マイクロポラス（ジャワ島Ｐｕｒｗａｋａｒｔａ分離株、スマトラ島ＮｏｒｔｈＳｕｍａｔｒａ分離株、マレーシア株）と、近縁種であるＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｌｉｎｅａｔｕｓ及びＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓのｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を解析し、リジドポラス・マイクロポラスのＩＴＳＩ領域（１８Ｓ  ｒＤＮＡと５．８Ｓ  ｒＤＮＡの間のＩＴＳ）の一部で、その他のＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ属菌とは異なるリジドポラス・マイクロポラスに特異的な塩基配列からなる領域（Ｓｐ−ＩＴＳ領域）を特定した（図３参照）。
【００１７】
本発明において特定されたＳｐ−ＩＴＳ領域に基づき、アンチセンス鎖のＳｐ−ＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズするプライマー（Ｓｐ−ＩＴＳプライマー）をパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーとして設計した。Ｓｐ−ＩＴＳプライマーは、フォワードプライマーとして用いられる。
ＰＣＲ産物の塩基対長が５０〜５００となるようにＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することによって、ＰＣＲ効率を高め、ＰＣＲ産物の検出を比較的容易に行うことができる。
そのため、リバースプライマーとしては、フォワードプライマーとの距離が５０〜５００塩基長程度となれば特に限定されず、任意のものが用いられるが、実験条件等が知られているという観点から、既報のプライマーであるＩＴＳ４プライマーが好ましい（White TJ, Burns T, Lee S, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for Phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds) PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic, San Diego, pp315-332）。
Ｓｐ−ＩＴＳプライマー及びＩＴＳ４プライマー間の距離（プライマー部分を含む。）は、約４５０塩基長である。図４に各プライマーの位置を示す。
表１に、Ｓｐ−ＩＴＳ領域のセンス鎖の塩基配列（配列番号２７）と、Ｓｐ−ＩＴＳ領域のアンチセンス鎖の塩基配列（配列番号２８）と、ＩＴＳ４プライマーの塩基配列（配列番号２９）と、をそれぞれ示す。
【００１８】
【表１】
2013198466.tif 000002
【００１９】
本発明においては、多種多様な土中生息菌の中からリジドポラス・マイクロポラスのみを特異的に精度よく検出することが重要である。このため、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー中のリジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域は、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
【００２０】
すなわち、本発明の検出方法は、微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、アンチセンス鎖のＳｐ−ＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマー（Ｓｐ−ＩＴＳプライマー）と、任意のリバースプライマー（Ｒｍｓｐ２プライマー）とを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００２１】
フォワードプライマーとして用いられるＳｐ−ＩＴＳプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ１−１）配列番号２７で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号２７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号２７で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号２８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００２２】
なお、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎｇーＡ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２３】
フォワードプライマーとして用いられるＳｐ−ＩＴＳプライマーは、アンチセンス鎖のＳｐ−ＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズする領域以外にも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域を有していてもよい。例えば、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのＳｐ−ＩＴＳ領域及び当該領域に隣接する短い領域を含む領域とハイブリダイズするプライマーも、Ｓｐ−ＩＴＳプライマーとして用いられる。具体的には、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域として、表２に示す配列番号３０で表される塩基配列又は当該塩基配列の配列番号２７で表される塩基配列を含む部分配列を有するプライマーが挙げられる。その他、配列番号３０で表される塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよく、配列番号３０で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列であってもよく、配列番号３１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であってもよい。なお、配列番号３０で表される塩基配列は、Ｓｐ−ＩＴＳ領域の５塩基上流側からＳｐ−ＩＴＳ領域の５塩基下流側までを含む領域（Ｓｐ−ＩＴＳ＿ｌｏｎｇ領域）であり、配列番号３１で表される塩基配列は、配列番号３０のアンチセンス鎖からなる領域である。
【００２４】
【表２】
2013198466.tif 000003
【００２５】
より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるＳｐ−ＩＴＳプライマーは、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号２７で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号２７で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
リバースプライマーとしては、特に限定されないが、配列番号２９で表される塩基配列からなることが好ましい。配列番号２７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２９で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、約４５０塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００２６】
フォワードプライマーとして用いられるＳｐ−ＩＴＳプライマー及びリバースプライマーとして用いられるＩＴＳ４プライマーは、いずれも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域の５’端側に、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとはハイブリダイズしないその他の塩基配列からなる領域を有していてもよい。当該その他の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列等、ＰＣＲプライマーに一般的に付加される塩基配列が挙げられる。
【００２７】
本発明の検出方法に供される微生物を含む試料は、特に限定されるものではないが、パラゴムノキ根白腐病菌が含まれていることが期待される又はそのおそれのある試料であることが好ましく、土壌又は植物であることがより好ましい。
【００２８】
検査対象となる土壌又は植物は、土壌又は植物であれば特に限定されるものではない。パラゴムノキ根白腐病菌による土壌病害が大きな問題となっていることから、本発明においては、パラゴムノキ等のゴムノキや、ゴムノキの圃場の土壌を検査対象とすることが好ましい。なお、パラゴムノキ根白腐病菌は感染する植物の種類が限定されることはないため、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー及びこれらを用いたパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法が、ゴムノキ以外の植物や、ゴムノキ以外の植物が植えられている土壌に対しても有効であることは、言うまでもない。なお、検査対象である土壌又は植物からのＤＮＡの抽出及び精製は、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。
【００２９】
本発明の検出方法は、特定のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーを用いる以外は、常法により実施することができる。すなわち、ＰＣＲに用いるポリメラーゼ、反応用バッファー、ｄＮＴＰ等の各種試薬は、当該技術分野で使用されている公知の試薬等を通常の態様で使用することができる。また、ＰＣＲの温度サイクル条件は、使用するポリメラーゼの特性及び用いるプライマーのＴｍ値等を考慮して適宜決定される。
【００３０】
また、ＰＣＲ産物の検出も、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。本発明の検出方法では、Ｓｐ−ＩＴＳプライマーを用いてＰＣＲを行うため、検査対象である土壌又は植物がパラゴムノキ根白腐病菌に汚染（感染）していた場合には、これらの土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合に、所定のリバースプライマーを用いることにより、４００〜４５０塩基長程度という検出が容易な大きさのＰＣＲ産物を得ることができる。このため、例えば、電気泳動法等の汎用されている簡便な手法により、ＰＣＲ産物を検出することができる。
【００３１】
本発明の検出方法により、パラゴムノキ根白腐病菌を特異的に検出することができる。このため、当該方法を用いることにより、実際に植えられている植物が立ち枯れ等の病徴を示す前に、当該植物又はそれが植えられている圃場の土壌がパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されているか否かを調べることができる。例えば、検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、Ｓｐ−ＩＴＳプライマー及び任意のリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することができる。
【実施例】
【００３２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
［実施例１］
ＩｎｓｔａＧｅｎｅＴＭＭａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、リジドポラス・マイクロポラスP.2-1株、並びに、農業生物資源ジーンバンクより購入したＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ及びＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓから染色体ＤＮＡを抽出した。
次いで、抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として、本発明の検出方法を行った。フォワードプライマーとして配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマー（Ｓｐ−ＩＴＳプライマー）を、リバースプライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマー（ＩＴＳ４プライマー）を用いてＰＣＲを行った。
具体的には、まず、２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ（７μＬ溶解液）に、２．５μＬのバッファー（タカラバイオ社製）、２．０μＬのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）（タカラバイオ社製）、１０ｐＭのＳｐ−ＩＴＳプライマー、１０ｐＭのＩＴＳ４プライマー、及び０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を添加し、さらに１２．８μＬの水を添加して２５μＬの反応溶液を調製した。当該反応溶液をＰＣＲ装置（Ｄｉｃｅ、タカラバイオ社製）にセットし、９４℃で３分間の変性工程後、１サイクルが９４℃で３０秒間、４０℃で２０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の伸長工程を行い、４℃で保存する温度条件で、ＰＣＲを行った。
【００３４】
ＰＣＲ後の各反応液を、２％のアガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図３に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。図３中、レーンＡはリジドポラス・マイクロポラスP.2-1株由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーンＢはＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーンＣはＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。尚、レーンＭは１００ｂｐマーカーをアプライしたレーンである。この結果、レーン１にのみ４５０塩基対長付近に１本のバンドが検出され、約４５０塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。その他のレーンでは全くバンドは検出されなかったことから、ＰＣＲ産物が得られなかったことが分かった。
【００３５】
［比較例１］
フォワードプライマーとして、菌類のユニバーサルプライマーとして用いられている配列番号３２で表される塩基配列からなるプライマー（ＩＴＳ１プライマー；図４参照。）を使用した以外は、実施例１と同様の方法でＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ後の各反応液を、２％のアガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った。比較例１の結果を、実施例１と対比して、図００に示す。リジドポラス・マイクロポラスP.2-1株、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ及びＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｖｉｎｃｔｕｓ由来のＤＮＡを鋳型とした反応液をアプライした全てのレーンにおいてバンドが検出された。
【００３６】
これらの結果から、Ｓｐ−ＩＴＳプライマーを用いた本発明の検出方法により、パラゴムノキ根白腐病菌を高感度かつ特異的に検出できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
パラゴムノキ根白腐病は産業上有用な植物、特にゴムノキにおいて重大な土壌病害であり、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーや検出用プローブ、及びこれらを用いたパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法は、パラゴムノキ根白腐病の早期発見や予防に有効である。よって、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー等は、特にパラゴムノキ等のゴムノキの栽培の分野で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図５】
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【配列表】
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