(57)【要約】【課題】デハロコッコイデス属細菌を活性を高く維持したまま凍結保存することができるデハロコッコイデス属細菌の保存方法を提供する。【解決手段】デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を凍結保護材を添加することなく嫌気雰囲気下で凍結保存用容器に密封し、凍結して保存するデハロコッコイデス属細菌の保存方法。嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスが例示される。凍結保護材としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン、澱粉、デキストラン、トレハロース又は脱脂粉乳が例示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を凍結保護材を添加することなく嫌気雰囲気下で凍結保存用容器に密封し、凍結して保存するデハロコッコイデス属細菌の保存方法。
【請求項２】
請求項１において、該嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスは、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスのいずれかであることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の保存方法。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記凍結保護材がグリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン、澱粉、デキストラン、トレハロース脱脂粉乳からなる群の１種以上であることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デハロコッコイデス属細菌の保存方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
塩素化エチレンに汚染された土壌や地下水の浄化方法として、デハロコッコイデス属細菌を用いたバイオオーグメンテーション技術が期待されている。バイオオーグメンテーションによる塩素化エチレン処理は、塩素化エチレン分解菌であるデハロコッコイデス属細菌を土壌や地下水中に注入して塩素化エチレンを脱塩素するというものである。デハロコッコイデス属細菌は、特許文献１，２等に記載の方法などによって培養される。
【０００３】
デハロコッコイデス属細菌は、純化された状態および他の微生物を含む混合培養液の状態のいずれにおいても、活性を低下させることのない凍結保存方法が分かっていなかった。このため、バイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌を含む培養液を保存する場合、常にデハロコッコイデス属細菌を培養し続けるか、新しい培地に植え継ぐ必要があった。
【０００４】
一般に、菌体の凍結保存にはグリセロールストックと呼ばれる方法が広く用いられている。これはグリセリンを溶かした溶液と培養液を混合して−８０℃以下で凍結させるものである。グリセリン濃度は１０〜５０％程度であり、混合液は液体窒素で満たされた容器内に保管するか、−８０℃の冷凍庫に保管して凍結させる（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２１３４２７
【特許文献２】特開２０１１−２４４７６９
【特許文献３】特表２００８−５０９６６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者による検討の結果、グリセリンはデハロコッコイデス属細菌の活性に悪影響を及ぼすことが分かった。本発明は、デハロコッコイデス属細菌を活性を高く維持したまま凍結保存することができるデハロコッコイデス属細菌の保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のデハロコッコイデス属細菌の保存方法は、デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を凍結保護材を添加することなく嫌気雰囲気下で凍結保存用容器に密封し、凍結して保存するものである。
【０００８】
嫌気雰囲気を構成する嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスが例示される。
【０００９】
凍結保護材としては、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン、澱粉、デキストラン、トレハロース又は脱脂粉乳が例示される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のように、デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を凍結保護材を添加することなく凍結して保存した場合、グリセリン等の凍結保護材を添加する場合に比べてデハロコッコイデス属細菌の活性が高く維持される。
【００１１】
よって本発明の保存方法に基づいて凍結したデハロコッコイデス属細菌培養液を解凍することにより、活性の高いデハロコッコイデス属細菌培養液を得ることができる。そのため、デハロコッコイデス属細菌を常時培養する手間が解消され、培養液の維持管理費用を節約することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明では、デハロコッコイデス属細菌の培養液を凍結保護材を添加することなく凍結して保存する。デハロコッコイデス属細菌を培養するには、培地に植種源としての地下水や土壌を添加する。
【００１３】
植種源としての地下水や土壌は、バイオスティミュレーションによる汚染の浄化が進行し且つ浄化の過程において塩素化エチレン分解細菌が顕著に増殖している汚染現場から採取されたものが好ましい。採取した地下水及び／又は土壌を培養容器に収容する。植種源として地下水を用いる場合、そのまま培養容器に投入してもよいが、水等で希釈した後に投入してもよい。また、植種源として土壌を用いる場合、そのまま培養容器に投入し液体培地中に懸濁してもよいが、適当な溶媒（例えば、水）に懸濁した後に培養容器に収容してもよい。
【００１４】
培養容器は、培地に対して化学的に安定であることが好ましい。培地に塩素化エチレンを含有させるため、培養容器はガラス製であることが好ましい。
【００１５】
植種源を培養容器に収容した後、有機栄養源としてクエン酸、酵母エキス等が添加される。なお、培地はクエン酸及びクエン酸塩の少なくとも一方を培養時の濃度として０．１〜２０ｇ／Ｌ含むことが望ましい。また、培地に酵母エキスを培養時の濃度として１〜１０００ｍｇ／Ｌ程度含有させると成長促進効果があり望ましい。ビタミン類を添加しても良い。デハロコッコイデス属細菌の増殖のために、培地に塩素化エチレン類を加える。塩素化エチレンは、ＰＣＥ（テトラクロロエチレン）、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ（ジクロロエチレン）、ＶＣ（塩化ビニル）等を利用でき、培養時の濃度として１〜１００ｍｇ／Ｌ（１０〜１０００μＭ）、特に１〜１０ｍｇ／Ｌ（１０〜１００μＭ）程度含有することが好ましい。培養温度は１５〜３０℃、特に２５〜３０℃が好ましい。培地のｐＨは６．０〜８．５程度の中性域であることが望ましい。静置培養あるいは１０〜１００ｒｐｍ程度の緩速攪拌を行う。デハロコッコイデス属細菌の増殖をさらに促進させるためには分子状水素を添加しても良い。
【００１６】
なお、培地の無機塩とビタミンについては一般の嫌気性菌の培養用の組成でよく、例えば培地はメタン菌培養に用いられるｗｏｌｉｎ培地（Ｗｏｌｉｎら、1963、Formation of methane by bacterial
extracts. The journal of Biological Chemistry, 238. 2882-2886.）であってもよい。
【００１７】
デハロコッコイデス属細菌は、偏性嫌気性微生物であるため、酸素の存在下では速やかに死滅する。従って、地下水や土壌の採取、移送、培養容器への添加等の一連の操作において、嫌気性条件を保持することが好ましい。気相を嫌気性ガスで満たすと共に、培地の環境を嫌気性とするために、硫化ナトリウム及び塩化第一鉄を培地に添加することが好ましい。デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、培地中の硫化ナトリウム及び塩化第一鉄の濃度は、それぞれ５ｍｇ／Ｌ〜５００ｍｇ／Ｌ程度が好ましい。
【００１８】
培地には嫌気度を調べるための指示薬であるレサズリンが添加されてもよい。
【００１９】
デハロコッコイデス属細菌を集積培養する場合、塩素化エチレンの９０％以上がエチレンに分解されるまで培養を行うのが好ましい。塩素化エチレン及びその分解中間物質（例えばシス−１，２−ジクロロエチレン及び塩化ビニル）の検出は、例えば、培養容器中の気相を少量採取し、ガスクロマトグラフィー分析することにより行われる。
【００２０】
気相の塩素化エチレン濃度を定期的に測定し、塩素化エチレンが初期濃度の９０％以上分解された後、気相が窒素ガス単独または窒素ガスを７割以上含み酸素を含まない嫌気性ガスで満たされた容器内でガラス瓶を開封し、凍結保護材を添加することなく培養液を凍結保存用チューブに移す。嫌気性ガスとしては、窒素ガス単独、窒素ガスと二酸化炭素の混合ガス、又は窒素ガスと二酸化炭素と水素の混合ガスが例示される。
【００２１】
次いで、凍結保存用チューブを取り出し、冷凍庫又は液体窒素で満たされた容器内に移し、培養液を凍結させて保管する。
【００２２】
本発明において、凍結保護材としてはグリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン、澱粉、デキストラン、トレハロース又は脱脂粉乳が例示されるが、これに限定されない。
【実施例】
【００２３】
以下、実験例、実施例及び比較例について説明する。
【００２４】
＜デハロコッコイデス属細菌に対するグリセリンの阻害性についての実験例＞
密閉されたガラス瓶（雰囲気ガスは窒素：二酸化炭素：水素＝７０:２０:１０）に、あらかじめグリセリン溶液を０，１０，又は３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）になるように添加した合成培地（８０ｍＬ）を入れ、約１０ｍｇ／Ｌ（１８０ｕＭ）のＶＣガス（塩素化エチレンモノマー）を添加した後、デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を１％植菌して、３０℃で静置培養をおこなった。なお培地は、無機塩とビタミンを含み、クエン酸三ナトリウム二水和物を５００ｍｇ／ｌ含む。試験はＮ＝２でおこない、一定時間後にＶＣガス濃度を測定し、分解率を求めた。
【００２５】
結果を表１に示す。グリセリン添加濃度１０％においてＶＣ分解速度の低下が認められ、３０％ではＶＣ分解活性が失活した。この実験結果より、グリセリンはデハロコッコイデス属細菌に対し阻害性を有することが認められた。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
［実施例１］
i)  上記実験例と同様の合成培地（８０ｍＬ）を含む密閉されたガラス瓶（雰囲気ガスは窒素：二酸化炭素：水素＝７０:２０:１０）に、約１０ｍｇ／Ｌ（１８０ｕＭ）のＶＣガスを添加した後、デハロコッコイデス属細菌を含む培養液を１％植菌して、３０℃で静置培養をおこなった。
ii)  気相のＶＣ濃度を定期的に測定し、ＶＣが初期濃度の９０％以上分解された後、気相が混合ガス（窒素：二酸化炭素：水素＝７０:２０:１０）で満たされた容器内でガラス瓶を開封し、培養液を凍結保存用チューブに移した。
iii)  この凍結保存用チューブを取り出し、液体窒素で満たされた容器内に保管した。
iv)  １か月間経過した後、容器から凍結保存用チューブを取り出し、気相が混合ガス（窒素：二酸化炭素：水素＝７０:２０:１０）で満たされた容器内で自然解凍した。
v)  自然解凍した培養液を微生物源として、i)と同様の培養をおこなった。気相のＶＣ濃度を測定した結果、培養１２日目にはＶＣ分解率１００％となった。
【００２８】
以上の事から、デハロコッコイデス属細菌を活性を低下させることなく凍結保存できることが認められた。
【００２９】
［比較例１］
実施例１と同様に培養した培養液と２０％のグリセリン溶液を１：１で混合した後、凍結保存した。
【００３０】
１か月間経過した後、実施例と同様に自然解凍した培養液を微生物源として、実施例１のi)と同様の培養をおこなった。気相のＶＣ濃度を測定した結果、培養１２日経過してもＶＣ分解率は０％であった。
【００３１】
［比較例２］
実施例１と同様に培養した培養液と６０％のグリセリン溶液を１：１で混合した後、凍結保存した。
【００３２】
１か月間経過した後、実施例と同様に自然解凍した培養液を微生物源として、実施例１のi)と同様の培養をおこなった。気相のＶＣ濃度を測定した結果、培養１２日経過してもＶＣ分解率は０％であった。
【００３３】
以上の比較例１，２より、グリセリン溶液を用いて凍結保存した場合、デハロコッコイデス属細菌の活性が著しく低下することが認められた。