(57)【要約】      （修正有）【課題】インフルエンザウイルス感染症の診断において、型別確定診断を短時間でかつ高感度にて行いうる手段を提供する。【解決手段】センシング部に標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いる。該ＦＥＴセンサに試料溶液を供給することによって、センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、ポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の浮遊拡散部が蓄積する電荷量を電位変化として検出する。検出された電位変化に基づいて、試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定する。【選択図】図１４
2013050426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ型またはＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて形成された、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部と、
前記入力ダイオード部から浮遊拡散部までの間に形成されるべき導通チャネルの始端および終端にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定された入力ゲートおよび出力ゲートと、
前記チャネルの中間部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部と、
前記浮遊拡散部の、前記チャネルから離れた側に連なる前記基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたリセットゲートと、
前記リセットゲートにおける前記浮遊拡散部から離れた側の前記基板表面部に形成された、基板と逆型の拡散領域からなるリセットダイオード部とを備え、
前記センシング部に、標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記センシング部に供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を電位変化として検出する工程と、
検出された前記電位変化に基づいて、前記試料溶液中の前記インフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定する工程と、
を含む、ＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項２】
Ｐ型またはＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて形成された、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部と、
前記入力ダイオード部から浮遊拡散部までの間に形成されるべき導通チャネルの中間部および終端部にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定された入力ゲートおよび出力ゲートと、
前記チャネルの入力端に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部と、
前記浮遊拡散部の、前記チャネルから離れた側に連なる前記基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたリセットゲートと、
前記リセットゲートにおける前記浮遊拡散部から離れた側の前記基板表面部に形成された、基板と逆型の拡散領域からなるリセットダイオード部とを備え、
前記センシング部に、標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記センシング部に供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を電位変化として検出する工程と、
検出された前記電位変化に基づいて、前記試料溶液中の前記インフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定する工程と、
を含む、ＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の検出方法であって、
前記ＦＥＴ型センサを一単位の素子として、これが同一半導体基板上において複数個並列的に形成されてなる並列ＦＥＴ型センサを用い、
この際、前記並列ＦＥＴ型センサにおいて、前記素子の入力ゲートと、リセットゲートおよびリセットダイオードとが、それぞれ、すべての前記素子間に延びる単一の入力ゲートと、単一のリセットゲートおよび単一のリセットダイオードとから共通的に形成されてなる、検出方法。
【請求項４】
Ｐ型またはＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を形成するとともに、前記浮遊拡散部を第１ドレインと第２ドレインに二分割するとともに、前記入力ダイオード部を前記二分割に対応する部分を有する共通ソースとして、これらのソース−ドレイン間の基板表面部に第１および第２の互いに並列したチャネルが形成されるようにし、
前記第１および第２ドレインを構成する浮遊拡散部の、前記二チャネルと背反する側に、同部と小間隔を置いて、基板と逆型の拡散領域からなる共通リセットダイオードを形成するとともに、前記小間隔内の基板表面上に絶縁膜を介して共通リセットゲートを固定し、
前記第１チャネルの両端に対応した基板表面上の位置に、それぞれ絶縁膜を介して入力ゲートおよび出力ゲートを固定するとともに、同チャネルの中間部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介してイオン感応膜からなる第１センシング部を固定し、
前記第２チャネルの中間部、および終端部にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して入力ゲートおよび出力ゲートをそれぞれ固定するとともに、同チャネルの始端部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介してイオン感応膜からなる第２センシング部を固定し、
前記第１および第２センシング部に、標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記第１および第２センシング部に供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記第１および第２センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、前記浮遊拡散部の前記第１および第２ドレイン電位リセット後において蓄積する電荷量を電位変化として検出する工程と、
検出された前記電位変化に基づいて、前記試料溶液中の前記インフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定する工程と、
を含む、ＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法。
【請求項５】
半導体基板上に、その基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を所定の間隔で形成し、その間隔内の基板表層部に形成されるベき導通チャネルの中間または始端に対応する基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されかつ表面に露出した金膜を有するセンシング部を備え、
前記センシング部の近傍における基板表面に、少なくとも１個の比較電極が絶縁膜を介して固定されてなり、
前記金膜に前記一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記センシング部および前記比較電極を含む領域に同一の前記試料溶液を供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を、前記比較電極の電位を基準として測定することで、前記一本鎖核酸と前記インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程と、
を含む、検出方法。
【請求項６】
半導体基板上に、その基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を所定の間隔で形成し、その間隔内の基板表層部に形成されるべき導通チャネルの中間または始端に対応する基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されかつ表面に露出した金膜を有するセンシング部を備え、
前記金膜に前記一本鎖核酸が固定化されてなり、
前記センシング部の上方において、前記金膜の直上に位置する測定電極と、前記金膜に固定化された前記一本鎖核酸に電気的に影響しない距離だけずらして配置された比較電極とが設けられてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記センシング部に供給する工程と、
前記測定電極および前記比較電極を下降させて前記試料溶液中に没入させ、かつ前記測定電極が前記金膜に固定化された前記一本鎖核酸とハイブリダイズした前記インフルエンザウイルスＲＮＡの末端を吸着する程度の電位を前記測定電極および前記比較電極に印加し、前記測定電極と接地電位との間に流れる電流を、前記比較電極に流れる電流を基準として測定することで、前記一本鎖核酸と前記インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程と、
を含む、検出方法。
【請求項７】
半導体基板上に、その基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を所定の間隔で形成し、その間隔内の基板表層部に形成されるべき導通チャネルの中間または始端に対応する基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部を備え、
前記センシング部の近傍における基板表面に、金電極および比較電極を絶縁膜を介して固定するとともに、前記金電極に標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記センシング部および前記金電極を含む領域に同一の前記試料溶液を供給する工程と、
前記金電極に固定化された前記一本鎖核酸のハイブリダイゼーションにより形成されるべき二重螺旋間に侵入させるための挿入剤を添加する工程と、
前記金電極に所定の電圧を印加することにより前記二重螺旋間の挿入剤と前記金電極との間に流れる酸化・還元電流に基づいて前記試料溶液のｐＨを変化させる工程と、
前記ｐＨの変化に応じた深さとなるポテンシャル井戸からの汲み出し電荷量を、前記比較電極の電位を基準として測定することで、前記一本鎖核酸と前記インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程と、
を含む、検出方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の検出方法であって、
一対のＦＥＴ型センサが同一の半導体基板上に併設されてなり、前記一対のＦＥＴ型センサの周縁を一括して包囲する電気化学的に不活性な外周壁と、前記センサ間を仕切って両端が外周壁に内接する仕切り壁を設けたことにより、それぞれの前記センサ上に供給される前記試料溶液が互いに流通しないように構成されてなるセンサ群を用いることを特徴とする、検出方法。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載の検出方法を行うための、前記ＦＥＴ型センサを含むインフルエンザウイルスＲＮＡ検出装置。
【請求項１０】
請求項９に記載のインフルエンザウイルスＲＮＡ検出装置の、ヒトインフルエンザウイルス型別迅速診断への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＥＴ型センサを用いたインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスを病原体とするインフルエンザ感染症は、現代においてもその強烈な伝播力によって大きな流行を繰り返す伝染病であり、社会に莫大な被害を及ぼしている。インフルエンザウイルスは急性の呼吸器感染症を引き起こし、その臨床症状は、急激な発熱、頭痛、関節痛、全身倦怠などの全身症状とともに、鼻汁、咳などの風邪にみられる種々の呼吸器症状および３８℃以上の高熱を伴うのが特徴である。健常人では通常１〜２週間程度で治癒するが、乳幼児、高齢者や呼吸器・循環器・腎臓に慢性疾患を持つ患者、糖尿病などの代謝疾患や免疫機能が低下している患者などでは、細菌などによる二次感染や肺炎を併発して死に至る場合も少なくない。また、呼吸器の局所感染にとどまらず、インフルエンザ脳炎・脳症などに代表される重症神経系合併症といった極めて重篤な症例も報告されている。このほか、腹痛、悪心・嘔吐、下痢などの消化器症状がみられることもあり、特に小児では注意を要する。診断する上で注意すべき大きな特徴は、呼吸器症状に比べて、熱その他の全身症状が顕著である点である。
【０００３】
従来、インフルエンザウイルス感染症を診断するための手段としては、簡便で低感度のテープ法と、高感度であるが煩雑な遺伝子検査法（遺伝子増幅法）とが存在するものの、簡便迅速で高感度な型別確定診断技術がなく、インフルエンザの重症化や院内感染拡大の危険性を抱えていた。より詳細には、現在、インフルエンザウイルスの確定診断に用いられている遺伝子検査法は、ラボにおける測定仕様となっており、その煩雑性からベッドサイドや外来のようにオンサイトでの患者に対する迅速および個別の診断には適さない。また、感染症の患者の診断は、１種類の感染源に対して多くの検体についてまとめて行うよりも、１検体について連続して多数の候補ウイルス・細菌の存在の有無を判断することが必須である。特に、新型インフルエンザやパンデミックを想定した場合、かような技術はトリアージに必須な診断法である。すなわち、迅速な型別診断による振り分け（トリアージ）こそが、感染症を拡大させるか封じ込めるかの分かれ道になっているにもかかわらず、これを実現するための技術はいまだ開発されていないのが現状である。また、緊急時の院外での診断に対応可能な、バッテリー駆動性のハンディポータブル型機材の開発等の応用的技術の提案も皆無である。
【０００４】
ところで、従来、集積回路技術を用いた化学センサとして、電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）の原理による種々のセンサが開発されている。このＦＥＴ型センサは、電気化学的な電位変化を検出するものであり、例えば、水素イオン濃度を検出するものはイオンセンシティブＦＥＴ（ＩＳＦＥＴ）と呼ばれている。本発明者らは以前に、このＩＳＦＥＴのセンシング部に、試料中の検体と反応もしくは結合し、または検体の反応の触媒となる物質を固定することで、前記反応または結合に基づくイオン濃度の変化を正確に検出しうるＦＥＴ型センサを提案している（特許文献１を参照）。また、この特許文献１では、当該ＦＥＴ型センサの用途として、ある試料中の検体の有無やその含有量等を正確に検出することや、標的とする塩基配列を検出することなどを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００３／０４２６８３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した特許文献１の開示によれば、標的とする検体ＤＮＡと相補性を有する一本鎖核酸（プローブ）をセンサのセンシング部に固定することで、検体ＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを高感度に検出することができる、とされている。
【０００７】
しかしながら、特許文献１には具体的なＤＮＡ固定化のための手法等の開示がない。また、特許文献１には、具体的な実施例等の開示もない。さらには、インフルエンザウイルス感染症の診断の際に必要とされるような型別確定診断を短時間でかつ高感度にて行うことについても何ら開示がなされていない。
【０００８】
このように、インフルエンザウイルス感染症の診断において、型別確定診断を短時間でかつ高感度にて行うことを可能とするような技術の開発は、依然として強く望まれているのが現状である。
【０００９】
本発明は、従来の技術における上述したような問題に鑑みなされたものであり、インフルエンザウイルス感染症の診断において、型別確定診断を短時間でかつ高感度にて行いうる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した従来技術における課題は、以下のものにより解決されうる：
（１）Ｐ型またはＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて形成された、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部と、
前記入力ダイオード部から浮遊拡散部までの間に形成されるべき導通チャネルの始端および終端にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定された入力ゲートおよび出力ゲートと、
前記チャネルの中間部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部と、
前記浮遊拡散部の、前記チャネルから離れた側に連なる前記基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたリセットゲートと、
前記リセットゲートにおける前記浮遊拡散部から離れた側の前記基板表面部に形成された、基板と逆型の拡散領域からなるリセットダイオード部とを備え、
前記センシング部に、標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記センシング部に供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を電位変化として検出する工程と、
検出された前記電位変化に基づいて、前記試料溶液中の前記インフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定する工程と、
を含む、ＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法；
（２）Ｐ型またはＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて形成された、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部と、
前記入力ダイオード部から浮遊拡散部までの間に形成されるべき導通チャネルの中間部および終端部にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定された入力ゲートおよび出力ゲートと、
前記チャネルの入力端に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部と、
前記浮遊拡散部の、前記チャネルから離れた側に連なる前記基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたリセットゲートと、
前記リセットゲートにおける前記浮遊拡散部から離れた側の前記基板表面部に形成された、基板と逆型の拡散領域からなるリセットダイオード部とを備え、
前記センシング部に、標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記センシング部に供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を電位変化として検出する工程と、
検出された前記電位変化に基づいて、前記試料溶液中の前記インフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定する工程と、
を含む、ＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法；
（３）上記（１）または（２）に記載の検出方法であって、
前記ＦＥＴ型センサを一単位の素子として、これが同一半導体基板上において複数個並列的に形成されてなる並列ＦＥＴ型センサを用い、
この際、前記並列ＦＥＴ型センサにおいて、前記素子の入力ゲートと、リセットゲートおよびリセットダイオードとが、それぞれ、すべての前記素子間に延びる単一の入力ゲートと、単一のリセットゲートおよび単一のリセットダイオードとから共通的に形成されてなる、検出方法；
（４）Ｐ型またはＮ型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて、基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を形成するとともに、前記浮遊拡散部を第１ドレインと第２ドレインに二分割するとともに、前記入力ダイオード部を前記二分割に対応する部分を有する共通ソースとして、これらのソース−ドレイン間の基板表面部に第１および第２の互いに並列したチャネルが形成されるようにし、
前記第１および第２ドレインを構成する浮遊拡散部の、前記二チャネルと背反する側に、同部と小間隔を置いて、基板と逆型の拡散領域からなる共通リセットダイオードを形成するとともに、前記小間隔内の基板表面上に絶縁膜を介して共通リセットゲートを固定し、
前記第１チャネルの両端に対応した基板表面上の位置に、それぞれ絶縁膜を介して入力ゲートおよび出力ゲートを固定するとともに、同チャネルの中間部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介してイオン感応膜からなる第１センシング部を固定し、
前記第２チャネルの中間部、および終端部にそれぞれ対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介して入力ゲートおよび出力ゲートをそれぞれ固定するとともに、同チャネルの始端部に対応した基板表面上の位置に、絶縁膜を介してイオン感応膜からなる第２センシング部を固定し、
前記第１および第２センシング部に、標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記第１および第２センシング部に供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記第１および第２センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、前記浮遊拡散部の前記第１および第２ドレイン電位リセット後において蓄積する電荷量を電位変化として検出する工程と、
検出された前記電位変化に基づいて、前記試料溶液中の前記インフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定する工程と、
を含む、ＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法；
（５）半導体基板上に、その基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を所定の間隔で形成し、その間隔内の基板表層部に形成されるベき導通チャネルの中間または始端に対応する基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されかつ表面に露出した金膜を有するセンシング部を備え、
前記センシング部の近傍における基板表面に、少なくとも１個の比較電極が絶縁膜を介して固定されてなり、
前記金膜に前記一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記センシング部および前記比較電極を含む領域に同一の前記試料溶液を供給する工程と、
前記試料溶液の供給によって前記センシング部に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を、前記比較電極の電位を基準として測定することで、前記一本鎖核酸と前記インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程と、
を含む、検出方法；
（６）半導体基板上に、その基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を所定の間隔で形成し、その間隔内の基板表層部に形成されるべき導通チャネルの中間または始端に対応する基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されかつ表面に露出した金膜を有するセンシング部を備え、
前記金膜に前記一本鎖核酸が固定化されてなり、
前記センシング部の上方において、前記金膜の直上に位置する測定電極と、前記金膜に固定化された前記一本鎖核酸に電気的に影響しない距離だけずらして配置された比較電極とが設けられてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記試料溶液を前記センシング部に供給する工程と、
前記測定電極および前記比較電極を下降させて前記試料溶液中に没入させ、かつ前記測定電極が前記金膜に固定化された前記一本鎖核酸とハイブリダイズした前記インフルエンザウイルスＲＮＡの末端を吸着する程度の電位を前記測定電極および前記比較電極に印加し、前記測定電極と接地電位との間に流れる電流を、前記比較電極に流れる電流を基準として測定することで、前記一本鎖核酸と前記インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程と、
を含む、検出方法；
（７）半導体基板上に、その基板と逆型の拡散領域からなる入力ダイオード部および浮遊拡散部を所定の間隔で形成し、その間隔内の基板表層部に形成されるべき導通チャネルの中間または始端に対応する基板表面上の位置に、絶縁膜を介して固定されたイオン感応膜からなるセンシング部を備え、
前記センシング部の近傍における基板表面に、金電極および比較電極を絶縁膜を介して固定するとともに、前記金電極に標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸が固定化されてなるＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法であって、
前記センシング部および前記金電極を含む領域に同一の前記試料溶液を供給する工程と、
前記金電極に固定化された前記一本鎖核酸のハイブリダイゼーションにより形成されるべき二重螺旋間に侵入させるための挿入剤を添加する工程と、
前記金電極に所定の電圧を印加することにより前記二重螺旋間の挿入剤と前記金電極との間に流れる酸化・還元電流に基づいて前記試料溶液のｐＨを変化させる工程と、
前記ｐＨの変化に応じた深さとなるポテンシャル井戸からの汲み出し電荷量を、前記比較電極の電位を基準として測定することで、前記一本鎖核酸と前記インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出する工程と、
を含む、検出方法；
（８）上記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の検出方法であって、
一対のＦＥＴ型センサが同一の半導体基板上に併設されてなり、前記一対のＦＥＴ型センサの周縁を一括して包囲する電気化学的に不活性な外周壁と、前記センサ間を仕切って両端が外周壁に内接する仕切り壁を設けたことにより、それぞれの前記センサ上に供給される前記試料溶液が互いに流通しないように構成されてなるセンサ群を用いることを特徴とする、検出方法。
【００１１】
（９）上記（５）〜（８）のいずれか１項に記載の検出方法を行うための、前記ＦＥＴ型センサを含むインフルエンザウイルスＲＮＡ検出装置；
（１０）上記（９）に記載のインフルエンザウイルスＲＮＡ検出装置の、ヒトインフルエンザウイルス型別迅速診断への使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、インフルエンザウイルス感染症の診断において、型別確定診断を短時間でかつ高感度にて行いうる手段が提供されうる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の第１実施形態に係るＦＥＴ型センサを示す断面図（Ａ）およびポテンシャル状態を示す模式図（Ｂ）である。
【図２】本発明のＦＥＴ型センサの各部に電圧を印加しかつ出力電位を検出するタイミングを示す電圧波形図である。
【図３】本発明の第１実施形態に係るＦＥＴ型センサのポテンシャル状態の推移を示す模式図である。
【図４】本発明の第２実施形態に係るＦＥＴ型センサを示す断面図（Ａ）およびポテンシャル状態を示す模式図（Ｂ）である。
【図５】本発明の第２実施形態に係るＦＥＴ型センサのポテンシャル状態の推移を示す模式図である。
【図６】本発明の第１実施形態および第２実施形態に係るＦＥＴ型センサの複合形式を示す模式的水平断面図である。
【図７】本発明のＦＥＴ型センサの応用形態の基本構造を示す概略平面および電気回路図である。
【図８】応用形態に係るセンサ構造として構成された電極吊り下げ降下方式を示す部分断面図である。
【図９】イオン感応膜として窒化膜または五酸化タンタル膜を用い、センシング部周辺の金パッドの少なくとも１つに標的インフルエンザウイルスＲＮＡと相補的な一本鎖核酸が固定化されてなる方式のＦＥＴ型センサの部分断面図である。
【図１０】一対のＦＥＴ型センサを同一の半導体基板上に併設し、その一対のＦＥＴ型センサの周縁を一括して包囲する電気化学的に不活性な外周壁と、それらのセンサ間を仕切って両端が外周壁に内接する仕切り壁を設けた構造を略示する平面図である。
【図１１】実施例で用いたイメージセンサの全体を示す写真である。
【図１２】実施例において、イメージセンサの全ピクセルを４つの象限に分割した様子を説明するための説明図である。
【図１３】実施例で計測された信号の出力強度を、ＲＮＡサンプルの希釈系列におけるインフルエンザウイルスＲＮＡの濃度に対してプロットしたグラフである。なお、当該グラフの横軸は滴下した６０μＬ中のベースサンプル(0.64pfu/60μＬ)の濃度を１としたときの相対値である。
【図１４】実施例において、インフルエンザウイルスＲＮＡサンプルを滴下したときの各象限の出力信号の信号強度をイメージングした写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＦＥＴ型センサを用いた試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法に係る。以下、添付の図面に基づき、本発明の実施の形態を具体的に説明する。より詳細には、以下では、試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの検出方法に用いられるＦＥＴ型センサの構成が相違するいくつかの実施形態に分けて、本発明の実施の形態を説明する。
【００１５】
（第１実施形態）
図１は、本発明の第１実施形態に係る検出方法に用いられるＦＥＴ型センサを示す断面図（Ａ）および基本ポテンシャル状態を示す模式図（Ｂ）であり、図２は動作状態における各ポテンシャル状態を順次に示す模式図である。図１のＡにおいて、１は典型的にはシリコン製のＰ-型の半導体基板であり、半導体基板１の表側には、互いに所定間隔を置いてＮ+型拡散層からなる電荷供給部としての入力ダイオード２および浮遊拡散部（ＦＤ）３が形成され、さらに浮遊拡散部３から小間隔を置いてリセットダイオード４が形成される。半導体基板１上には、この場合、Ｎ+型拡散層上も含めＳｉＯ2またはＳｉ3Ｎ4からなる絶縁膜５が形成される。
【００１６】
入力ダイオード２と浮遊拡散部３との間における半導体基板１の表面部には、次に述べるゲート構造との関連において導通チャネル（ｎ型反転層）が形成され、その結果、入力ダイオード２をソースとし、浮遊拡散部３をドレインとするＦＥＴ型センサが構成される。絶縁膜５上には、チャネル始端部に対応する入力ダイオード２の隣接位置において入力ゲート６が、またチャネル終端部に対応する浮遊拡散部３の隣接位置において出力ゲート７が、それぞれポリシリコン、またはアルミニウムからなる蒸着層より形成され、さらに浮遊拡散部３とリセットダイオード４との間においてリセットゲート８が同様の蒸着層より形成される。
【００１７】
入力ゲート６、出力ゲート７およびリセットゲート８の上面と、これらのゲートを支持したゲート外の絶縁膜５上には、典型的にはＳｉ3Ｎ4蒸着層からなる被着膜１０が形成される。Ｓｉ3Ｎ4膜はＳｉＯ2膜に比べて構造が緻密で、酸素の拡散係数が小さいため、それ自身が入／出力ゲート６、７間に形成する凹部をセンシング部９として、良好なイオン感応膜を構成する。イオン感応膜としてはＳｉ3Ｎ4の他、ＳｉＯ2やＡｕ等も用いることができる。このセンシング部９のイオン感応膜には、検出方法において標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうる一本鎖核酸（プローブ）が、固定化される（図示せず）。ここで、センシング部９のイオン感応膜に固定化される一本鎖核酸（プローブ）の具体的な形態について特に制限はなく、標的とするインフルエンザウイルスＲＮＡとハイブリダイゼーションしうるものが適宜選択されうる。この一本鎖核酸（プローブ）は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、安定性等の観点からは、好ましくはＤＮＡが用いられる。また、一本鎖核酸（プローブ）の塩基長についても特に制限はないが、通常は２０〜２５塩基程度である。ここで、一本鎖核酸（プローブ）として用いられうるＤＮＡの塩基配列の一例を以下に示す。
【００１８】
【表１】
2013050426.tif 000003
【００１９】
また、センシング部９のイオン感応膜に一本鎖核酸（プローブ）を固定化する具体的な手法についても特に制限はなく、従来公知の常法が好ましく用いられうる。一例として、プローブおよび適当な固定化剤（例えば、６−ＨＨＴ（６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール）など）を含む固定化溶液を、センシング部９のイオン感応膜に適量滴下し、乾燥させるという手法が例示されるが、これに限定されることはない。
【００２０】
本実施形態において、好ましくは、入力ダイオード２および浮遊拡散部３の外側における半導体基板の表面部には、リーク電流を低減するためのチャネルストッパとして、Ｐ-基板よりアクセプタ密度が高く、Ｎ＋拡散部からなるこれらの入力ダイオード２および浮遊拡散部３のドナー密度と拮抗しうるＰ＋拡散部（図示せず）を設け、入力ダイオード２および浮遊拡散部３から電荷がチャネル外に漏洩するのを防止することができる。
【００２１】
なお、半導体基板１の表面において、入力ダイオード２およびリセットダイオード４の外側には、絶縁膜５と同様なシリコン酸化膜等からなる比較的厚いマスク層１１が形成され、前述したセンシング部９を形成する蒸着膜１０は、このマスク層１１にも被さり、さらに被着膜１０上にはセンシング部９を除き、例えばリンガラスからなる保護膜１２と、その保護膜１２上において外表面を面一にした外装膜１３が被着形成される。
【００２２】
図の左側より、入力ダイオード２、入力ゲート電極６および出力ゲート電極７、浮遊拡散部３、リセットゲート８およびリセットダイオード４の上面には、各々アルミニウム等からなる電極リードが形成され、それらの電極リードを介して測定シーケンスに従った電圧が印加され、または検出（浮遊拡散部３の電位）される。浮遊拡散部３は電極リード端子Ｖoutを、それ自体、同一半導体基板１に組み込むことも可能なソースフォロワ増幅器を含む電位検出および増幅回路１４の入力に接続される。
【００２３】
続いて、図１に示すようなＦＥＴ型センサを用いた検出方法の操作について説明する。
【００２４】
まず、検出方法の対象であるインフルエンザウイルスＲＮＡを含む疑いのある試料溶液を、ＦＥＴ型センサのセンシング部９に供給する（試料溶液供給工程）。
【００２５】
試料溶液供給工程において用いられる試料溶液について特に制限はなく、被験者の体液（唾液、鼻汁、咽頭ぬぐい液、血清など）が好ましく用いられる。また、試料溶液供給工程において試料溶液をＦＥＴ型センサのセンシング部９に供給するための具体的な手法についても特に制限はなく、通常は適量の試料溶液を滴下すればよい。
【００２６】
続いて、試料溶液の供給によってセンシング部９に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の浮遊拡散部３が蓄積する電荷量を電位変化として検出する（検出工程）。ここで、図２は、検出工程において検出を行なうために、イオン濃度の測定シーケンスに従って上記の各電極リードより各部に電圧を加えるタイミングを示している。
【００２７】
図２を参照すれば、検出工程ではまず、供給された試料溶液中に、可変電圧源Ｅrからの参照電圧Ｖrefを印加し、これを基準とした試料溶液のイオン化によるイオン感応膜電位を生じさせる。
【００２８】
センシング部９以外の各部電極リードへの直流電圧の印加回路（図示せず）において、図２に示す初期状態（ｔ0〜ｔ1）では電荷供給部である入力ダイオード２に約５Ｖの逆バイアス電圧Ｖinが、また入力ゲート６には直流電圧Ｖgin（約２Ｖ）が印加され、出力ゲート７はＶgout＝０に維持される。この場合、やや遅れてリセットゲート８に数ミリ秒程度のリセット電圧パルスＶgrが印加され、隣接する浮遊拡散部３の電位Ｖoutは、その間Ｖddに引き寄せられる形でやや上昇するが、ここではその前後における電位の変化（すなわち、蓄積電荷）は存在しないものとする。
【００２９】
図１のＢは、上記の初期状態における本実施形態のＦＥＴ型センサの、各部ポテンシャルと電荷量を、図１のＡの各部と対応して示しており、入力ダイオード２への逆バイアス電圧Ｖinが５Ｖのとき、その部分の残存電荷量Ｑ1は僅かであり、入力ゲート６の直流電圧Ｖgin（略２．０Ｖ）による障壁レベルの下方に止まる。またセンシング部９における参照電圧Ｖrefは、試料溶液（典型的には水溶液）を介してセンシング部９の直下の半導体基板１の表面の電位を一定にし、これがポテンシャル井戸の深さ（底面レベル）ｂ0を定める初期設定値となるが、この時点ではゲート障壁を越えて流入する電荷は存在しない。
【００３０】
次に、時間ｔ1に達すると、入力ダイオード２の逆バイアス電圧Ｖinを、時間ｔ2に達するまでの数ミリ秒間、１Ｖに下げる。この逆バイアス電圧Ｖinの低下は、相対的な電荷供給をもたらし、その貯留上限レベルは約２Ｖの入力ゲート障壁を越えて、０Ｖの出力ゲート７による障壁上端の近くに達する。このため、供給された電荷（この場合、電子）は入力ダイオード２、入力ゲート６下方の半導体表面、およびセンシング部９下方の半導体表面におけるポテンシャル井戸にも流入する。この状態（初期電荷供給）は、図３のＡに示すとおりである。
【００３１】
時間ｔ2に達すると、入力ダイオード２の逆バイアス電圧Ｖinが５Ｖに復帰し、数ミリ秒間持続する。図３のＢに示すように、電荷Ｑ2のかなりの部分は、電源回路に戻され、センシング部９下方のポテンシャル井戸の上方に溜まっていた電荷は、入力ゲート６による障壁にすりきられて入力ダイオード２に戻り、電源回路への還流に加わり、障壁側部のポテンシャル井戸内には、底面レベルｂ0の深さに応じた量の電荷が残存する。このポテンシャル井戸に残留した電荷の量は、試料溶液のイオン濃度に従ったセンシング部９の表面電位の変化量に応じたものとなる。
【００３２】
なお、センシング部９に供給された試料溶液中のプラスイオン（陽イオン）濃度が高くなると、センシング部９の表面電位が変化し、センシング部９直下の半導体基板１の表面電位は初期設定値より低くなる。その結果、ポテンシャル井戸の底面レベルは、例えば図示のｂ1まで深くなる。プラスイオン濃度が低くなるか、またはマイナスイオン（陰イオン）の濃度が高くなった場合には、逆に底面レベルが上昇することは明らかである。
【００３３】
次に、出力ゲート７に電圧Ｖgoutを５Ｖ印加すると、この出力ゲート７が開いて、予めリセットされていた浮遊拡散部３に電荷が転送される（図３のＣ）。ここで、浮遊拡散部３の容量をセンシング部９の容量より小さくしておけば、図示するように、浮遊拡散部３の電位変化量は大きくなる。図２において、浮遊拡散部３の電位変化は、その無電荷時の定常電位Ｖoutから、電荷の流入に伴って最初は急勾配で降下し、徐々に緩やかとなってＧnd電位に接近した電位で安定する。
【００３４】
電荷が転送された後、出力ゲート７に印加する電圧Ｖgoutが０Ｖに下がり、出力ゲート７が閉じられる（図３のＤ）。このようにしてｔ1〜ｔ3のサイクルを繰り返すと、入力ダイオード２からポテンシャル井戸への電荷供給／入力ゲート６によるすりきり／出力ダイオード７の開放によるポテンシャル井戸残留電荷の浮遊拡散部３への転送というステップが順次実行され、浮遊拡散部３には次々と転送電荷が累積されることになる。
【００３５】
この累積電荷量は、大きな電位変化として、図１のＡに示す浮遊拡散部３からのＶout出力端子より、電位検出および増幅回路に入力されるセンサ出力信号ＳＯ（図２）となる。浮遊拡散部３はその電位を読み取られた後、リセットゲート電圧Ｖgrの印加により隣接するリセットゲート８が開かれるため、＋Ｖdd電位に接続されたリセットダイオード４への導通チャネルを通じて、蓄積電荷を放流し、再び初期電位に設定される（図３のＥ）。
【００３６】
以上のように構成されたＦＥＴ型センサにおいては、浮遊拡散部３へｎ回、転送を行った場合、時間累積を行わない場合と比較してｎ倍になり、ノイズは√ｎ倍にしかならない。よってＳ／Ｎ比は√ｎ倍に上昇し、感度が高くなるのである。したがって、センシング部９の表面電位の変化に基づくセンシング部９直下のポテンシャル井戸の深さの変化が微量であっても、その変化を確実に検出し、試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡとセンシング部９に固定化された一本鎖核酸（プローブ）とのハイブリダイゼーションに基づくイオン濃度の変化を電位変化として高感度に検出することができる。
【００３７】
これにより、ＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅させることなく、簡便に、短時間かつ低コストで、試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定することができる（判定工程）。
【００３８】
さらに、この第１実施形態に係るＦＥＴ型センサを同一半導体基板１上に複数個含み、それぞれのセンサのセンシング部９に、異なる標的インフルエンザＲＮＡと相補的な一本鎖核酸を各別に固定することにより、一度に複数のハイブリダイゼーションの発生の有無を検出することができ、簡便に、短時間に、試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定することも可能である。
【００３９】
（第２実施形態）
図４は、本発明の第２実施形態に係る検出方法に用いられるＦＥＴ型センサを示す断面図（Ａ）および基本ポテンシャル状態を示す模式図（Ｂ）であり、図５は動作状態における各ポテンシャル状態を順次に示す模式図である。図中、図１および図３と同一部分は同一符号を付して説明を簡略化し、または省略する。
【００４０】
第２実施形態に係るＦＥＴ型センサは、第１実施形態と同様にＰ-型半導体基板の表面側に所定の間隔を置いて形成された、基板と逆型（すなわち、Ｎ+型）の拡散領域からなる入力ダイオード部２および浮遊拡散部３と、リセットダイオード４を有し、浮遊拡散部３とリセットダイオード４との間の絶縁膜５上には同じくリセットゲート８を有することにより、浮遊拡散部３のためのリセットトランジスタを構成したものであるが、入力ダイオード部２と浮遊拡散部３との間の絶縁膜５上の構造が、第１実施形態とは次のように相違する。
【００４１】
まず、入力ゲート６'および出力ゲート７'は、入力ダイオード部２から浮遊拡散部３までの間に形成されるべき導通チャネルの中間部および終端部にそれぞれ対応した絶縁膜９上に固定され、両ゲート６'および７'を隣接させるため、比較的細幅で高さを持たせた出力ゲート７'が、比較的広幅の入力ゲート６'の当該隣接側を覆う被着膜１０によって、このゲート６'と絶縁された構造となっている。出力ゲート７'は底面が半導体基板１上の絶縁膜５に接するとともに、その上方部が被着膜１０および保護膜１２を貫通し、上端が外装膜１３内に位置する高さを有している。
【００４２】
これによって生じた入力ダイオード２と入力ゲート６'との間の基板表面上の位置、すなわち形成されるべき反転チャネルの入力端に対応した位置には、底面をなす絶縁膜５とともにイオン感応膜となる入力ゲート６'側の絶縁膜５と、入力ダイオード２側の被着膜１０および保護膜１２の断層と、に挟まれて凹部をなすセンシング部９'が形成される。
【００４３】
続いて、図２に示すようなＦＥＴ型センサを用いた検出方法の操作について説明する。
【００４４】
第１実施形態と同様に、まず、可変電圧源からセンシング部９'内の水溶液に参照電圧Ｖrefを印加し、センシング部９'の直下の半導体基板１の表面の電位を一定にする。これがポテンシャル井戸入口の初期設定値となる。次に、図２に示すように、入力ゲート６'に適当な直流電圧Ｖgin（例えば、２．０Ｖ）を印加し、その直下の半導体基板１の表面電位を固定するとともに、電荷供給部としての入力ダイオード２に逆バイアス電圧Ｖin＝５Ｖを、またリセットゲート８に電圧Ｖgrを印加し、浮遊拡散部３の電位の初期値を設定する。このとき、出力ゲート７'の電圧は０Ｖである。
【００４５】
入力ダイオード２の電圧Ｖin＝５Ｖは十分な逆バイアスとして、同ゲート内に残留する電荷を図４Ｂに示すようにごく僅かに抑え、この電荷プールの上端は、センシング部９'のレベルに届かず、したがってセンシング部９'以降には侵入しない。この場合、水溶液中のマイナスイオン濃度が高くなると、センシング部９'の表面電位が変化し、このセンシング部９'の直下の半導体基板１の表面の電位は前記初期設定値ｂ0よりも上がり（図４のＢのｂ2）、逆に、マイナスイオン濃度が低くなるか、またはプラスイオン濃度が高くなると、表面電位はｂ0よりも下がる（図示せず）。
【００４６】
入力ダイオード２に印加する電圧Ｖinが５Ｖから１．０Ｖに下がると、逆バイアスが緩和された分、電荷プール量が多くなり、そのレベルは、この場合センシング部９'直下の基板表面電位ｂ0（ポテンシャル井戸入口レベル）を越え、この入力ダイオード２からの電荷が入力ゲート６'直下のポテンシャル井戸に供給される（図５のＡ）。
【００４７】
再度、入力ダイオード２に印加する電圧Ｖinが５Ｖに上がると、センシング部９'直下の表面電位のレベルで電荷がすりきられ、このレベル下におけるポテンシャル井戸の容量分だけ電荷が残存し、それ以外の電荷は入力ダイオード２を経て、当該ダイオード２に残留する分を残し、電源に還流する（図５のＢ）。この場合も、ポテンシャル井戸に残留した電荷の量はマイナスイオン濃度によって変化し、センシング部９'の表面電位の変化量がこの電荷の量に変換されたことは明らかである。
【００４８】
次に、出力ゲート７'に電圧Ｖgoutが５Ｖ印加されると、このゲート７'が開いて、電荷が予めリセット電位に維持された浮遊拡散部３に転送される（図５のＣ）。
【００４９】
この電荷の転送後、出力ゲート７'に印加する電圧Ｖgoutが０Ｖに下がり、出力ゲート７が閉じられる（図５のＤ）。
【００５０】
このようにして図５のＢ〜Ｄに示す過程を繰り返し行なうことにより、センシング部９'の表面電位の変化量が浮遊拡散部３の電荷量として累積される。そして、浮遊拡散部３に蓄積された電位変化量は、Ｖoutとして、電位検出および増幅回路１４に入力され、指示されかつ記録その他の処理に用いられる。
【００５１】
浮遊拡散部３はその電位を読み取られた後、リセットゲート電圧Ｖgrの印加により隣接するリセットゲート８が開かれるため、＋Ｖdd電位に接続されたリセットダイオード４への導通チャネルを通じて、蓄積電荷を放流し、再び初期電位に設定される（図５のＥ）。
【００５２】
以上のように構成されたポテンシャル井戸入口調整型センサにおいても、ｎ回、転送を行った場合、時間累積を行わない場合と比較してＳ／Ｎ比は√ｎ倍に上昇し、感度が高くなることは明らかである。したがって、センシング部９の表面電位の変化に基づくセンシング部９直下のポテンシャル井戸の深さの変化が微量であっても、その変化を確実に検出し、試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡとセンシング部９に固定化された一本鎖核酸（プローブ）とのハイブリダイゼーションに基づくイオン濃度の変化を電位変化として高感度に検出することができる。
【００５３】
ここで、図１および図３に示す第１実施形態に係るセンサを想起すると、そのセンサではマイナスイオン濃度が高くなった場合、またはプラスイオン濃度が低くなった場合に、電荷を貯留するポテンシャル井戸の深さが浅くなるかまたは無くなり、したがって、浮遊拡散部３に転送されかつ残留する電荷の量が少なくなるか、または存在しなくなるものであった。
【００５４】
一方、第２実施形態においては、入力ダイオード２に隣接したセンシング部９'直下の基板表面電位が上がり、これと隣合った入力ゲート６直下の基板表面電位との差が逆に大きくなり、この入力ゲート６直下部分にポテンシャル井戸を構成せしめたものであり、相対的にマイナスイオン濃度が高い試料に対しては、第１実施形態と比較して検出感度がより高くなるか、または第１実施形態では検出できなかった試料を検出することが可能となるものである。したがって、センシング部９'に標的インフルエンザウイルスＲＮＡと相補的な一本鎖核酸（プローブ）を固定した場合、負に帯電した核酸同士の結合であり、マイナスイオン濃度が高くなるハイブリダイゼーションの発生をより高感度に検出することができる。
【００５５】
さらに、この第２実施形態に係るＦＥＴ型センサを同一半導体基板１上に複数個含み、それぞれのセンサのセンシング部９'に、異なる標的インフルエンザＲＮＡと相補的な一本鎖核酸を各別に固定することにより、一度に複数のハイブリダイゼーションの発生の有無を検出することができ、簡便に、短時間に、試料溶液中のインフルエンザウイルスＲＮＡの有無およびその濃度を判定することも可能である。
【００５６】
（その他の実施形態）
上述した第１実施形態および第２実施形態においては、入／出力ゲート間にセンシング部を形成し、リセットトランジスタ機能をも組み込んだ形式（第１形式）のＦＥＴ型センサと、入／出力ゲートを近接させて出力側に寄せ、入力ダイオード／入力ゲート間にセンシング部を形成し、リセットトランジスタ機能をも組み込んだ形式（第２形式）のＦＥＴ型センサとを、それぞれ単独で用いた場合、およびそれぞれ同一形式のＦＥＴ型センサを複数個用いた場合について言及したが、本発明のその他の実施形態として、さらにこれらの複合型ともいうべき形式（第３形式）のＦＥＴ型センサを形成することができる。
【００５７】
この第３形式のＦＥＴ型センサは、プラスイオンおよびマイナスイオンの双方に渡る測定範囲の広いＦＥＴ型センサであり、図６はそのセンサ構造の要部水平断面を示しており、図１および図４に示した各ＦＥＴ型センサを並列配置したものであるといえる。よって、それらのものと同一機能を果たす部分については同一の参照数字を付してある。
【００５８】
通常はＰ-型半導体からなる基板１の表面側には、所定の間隔を置いて基板１と逆型（すなわち、Ｎ+型）の拡散領域からなる共通入力ダイオード部２と、浮遊拡散部３が形成されるとともに、浮遊拡散部３は第１ドレイン３ａ（第１形式における浮遊拡散部）と第２ドレイン３ｂ（第２形式における浮遊拡散部）とに二分割され、前記入力ダイオード部２を前記二分割ドレインに対応する部分を有する共通ソースとして、これらのソース−ドレイン間の基板表面部に第１および第２の互いに並列したチャネルが形成されるようになっている。
【００５９】
また、第１および第２ドレイン３ａ、３ｂを構成する浮遊拡散部３の、前記二チャネルと背反する側には、当該浮遊拡散部３と小間隔を置いて、同じくＮ+型の拡散領域からなる共通リセットダイオード４が形成されるとともに、その小間隔内の基板絶縁膜（図示せず）上に共通リセットゲート８が固定される。
【００６０】
第１チャネルの両端に対応した基板絶縁膜上の位置には、それぞれ第１形式における入力ゲート６および出力ゲート７を固定するとともに、同チャネルの中間部（入／出力ゲート間）に対応した基板絶縁膜上の位置には、イオン感応膜からなるセンシング部９が固定される。結局、この第１チャネル及びリセットトランジスタからなるＦＥＴ型センサ部の縦断面（例えば、図６のＡ−Ａ矢視断面）構造は図１のＡと同じになる。
【００６１】
また、第２チャネルの中間部および終端部に対応した基板絶縁膜上の位置には、第２形式における入力ゲート６'および出力ゲート７'をそれぞれ固定するとともに、同チャネルの始端部（入力ダイオード２／入力ゲート６'間）に対応した基板絶縁膜上には、イオン感応膜からなるセンシング部９'が形成される。このような第２チャネルおよびリセットトランジスタからなるＦＥＴ型センサ部の縦断面（例えば、図６のＢ−Ｂ矢視断面）構造は図４のＡと同じになる。
【００６２】
上記のように構成すれば、第１チャネルおよび第２チャネル上の各センシング部９，９'に作用する正／負イオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの電荷汲み出し回数に応じ、前記浮遊拡散部３の第１および第２ドレインが電位リセット後において蓄積する電荷量を、電位変化として検出することができる測定範囲の広いＦＥＴ型センサが得られる。
【００６３】
上述した第３形式の複合型センサの応用形態として、この複合型センサ構造を同一半導体基板上において、複数個形成すれば、これによって試料溶液中の、複数の標的インフルエンザＲＮＡを同時に効率よく検出することができる。
【００６４】
なお、上述した第３形式の複合型センサ構造から得られる構造原理として、第１実施形態および第２実施形態において示した第１形式および第２形式のセンサ構造を、その構造ごとに同一半導体基板上に複数配置する場合には、少なくとも入力ダイオードと、リセットゲートおよびリセットダイオードを共通体として、構造および制御を単純化することができる。
【００６５】
本発明は以上の実施形態を総括した上で、次のようなセンサの応用構造および測定方法を構成したものである。まず、応用構造の基本形態は図７に模式的に示すとおりである。
【００６６】
（応用例１）
図７において、破線円１５は前述した半導体基板の表面絶縁層上に形成されたイオン感応膜からなるセンシング部９または９'と、少なくともその周辺を含む基板表面（絶縁膜）の領域を包囲する試料溶液収容範囲である。この範囲１５内に含まれるべき（絶縁膜の下に隠れている）ゲート電極や、基板と逆型のダイオードその他の拡散層（この場合、Ｎ+層）については、センサ出力に関わる浮遊拡散部３のみを代表的に破線枠で示し、センサ全体像との関係を想起せしめるものとする。
【００６７】
Ｓｉ3Ｎ4等のイオン感応膜からなるセンシング部９または９'上には、部分的に金膜（または金膜に準ずる電気化学的安定性と導電性を有する材料の膜；以下同じ）１６を形成し、センシング部９または９'の近傍部（図では左側および左下側）には、例えば三個の金パッド（または金パッドに準ずる電気化学的安定性と導電性を有する材料のパッド；以下同じ）１７ａ、１７ｂ、１７ｃが固定され、スイッチ１８ａ、１８ｂ、１８ｃを介してそれぞれ測定用電圧または比較用電圧を、電池Ｅroより印加するようになっている。電池Ｅroの他端子（この場合、マイナス側）は基板Ｐの裏面、すなわち接地電位に接続される。
【００６８】
上記の構造を用いて、標的インフルエンザウイルスＲＮＡと相補的な一本鎖核酸の末端を金膜に固定化するとともに、センシング部および比較電極を含む領域に同一の試料溶液を供給し、試料溶液の供給によってセンシング部９または９'に作用するイオン濃度に応じて変化したポテンシャル井戸の深さと、そのポテンシャル井戸からの汲み出し回数に応じ、電位リセット後の前記浮遊拡散部が蓄積する電荷量を、比較電極の電位を基準として測定することで、一本鎖核酸と標的インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無を検出することが可能である。
【００６９】
（応用例２）
本発明は、さらなる応用形態に係るセンサ構造として、図８に示すような電極吊り下げ降下方式を構成する。半導体基板１上の少なくともセンシング部（好ましくは半導体の導通チャネルの中間に対応する導通チャネル９）を含む領域を包囲した絶縁膜５上には、周壁１５'が、エポキシガラス等の電気化学的に不活性な材料によって立設・形成されている。そして、好ましくは金製の測定電極１９ａおよび比較電極１９ｂは、リニアスケール等により、測定電極１９ａがセンシング部９または９'内の金膜１６の真上となる位置にもたらされてから、降下して試料溶液内に没入するように構成される。これらの電極は電源Ｅroによる電圧を、スイッチ２０ａおよび２０ｂを介して半導体基板１の裏面（接地電位）との間に印加されるか、または、金膜１６からＥroのマイナス側に直結するためのスイッチ２０ｃをさらに閉じることによって、その際に流れる電流を電流計Ａにより測定できるようになっている。
【００７０】
上記の変形構造において、金膜１６には標的インフルエンザウイルスＲＮＡと相補的な一本鎖核酸の末端を固定化するとともに、試料溶液を周壁１５'の範囲内に収容してセンシング部９または９'に供給する。この際、センシング部の上方において、測定電極１９ａは金膜１６の直上に位置するように設けられ、比較電極１９ｂは、金膜１６に固定化された一本鎖核酸に電気的に影響しない距離だけずらして配置されている。
【００７１】
試料溶液を供給した後にスイッチ２０ａを閉じることで、試料溶液中に没入した測定電極１９ａに、適当な電圧（例えば、１０ｍＶ〜５Ｖ）が印加される。これによりハイブリダイズした標的インフルエンザウイルスＲＮＡの自由端末端が測定電極１９ａに吸着される。これにより、ハイブリダイズした二本鎖核酸は電気的に直結され、電源Ｅroによる電圧が両端間に印加されることで通電する。次にスイッチ２０ａを開き、スイッチ２０ｂを閉じて測定電極１９ａと同レベルの溶液内に位置する比較電極１９ｂに流れる電流を基準値として測定する。
【００７２】
したがって、このセンサ構造では、ＦＥＴ型センサ本来のポテンシャル井戸における電荷蓄積量の測定によることは勿論、ハイブリダイズした二本鎖核酸からなる回路の通電電流として測定電極に流れる電流、または接地電位との間の電圧によってもハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００７３】
（応用例３）
この例では、応用例１で用いたセンサ構造と異なり、図９に示すように、センシング部９"のイオン感応膜として窒化膜または五酸化タンタル膜を用い、その膜上の金パッド（図示せず）は用いない。センシング部９"周辺の金パッド（総括して１７で示す）の少なくとも１つには標的インフルエンザウイルスＲＮＡと相補的な一本鎖核酸を固定化する。なお、この例では、試料溶液を収容するための外周壁１５'を有するほか、他の構造は応用例１（図７）に示すものと同じである。
【００７４】
検出方法の実施においては、センシング部９"および金電極を含む外周壁１５'内の領域に試料溶液を供給することにより、その金電極上に固定化された一本鎖核酸に相補的な標的インフルエンザウイルスＲＮＡが存在すれば、ハイブリダイゼーションが生じる。この状態で、ハイブリッド形成された二本鎖核酸があれば、その二重螺旋間に侵入しうる挿入剤、例えば「ヘキスト３３２５８」として市販されているもの２１を、試料溶液に添加する。
【００７５】
その後、金パッド１７に、マイナス側を接地接続された電源Ｅroの正電圧を、外装膜１３上のアルミニウムリード膜２２を介して印加すると、挿入剤２１は金パッド１７と導通した核酸骨格の電気抵抗分だけ降下した電位となるために酸化され、これによって挿入剤２１から金パッド１７にかけて酸化・還元電流が生じると考えられる。
【００７６】
この結果、当該ハイブリッド核酸の近辺で２Ｈ+＋２ｅ＝Ｈ2の反応が起こり、溶液相全体のｐＨ値は低下する。なお、水溶液中に浮遊した挿入剤２１には核酸骨格による電圧はかからず、酸化は実質的に生じないとみなすことができる。同一センサ内、もしくは隣接・配列センサ間に渡って、このようなＤＮＡ固定用金パッドは、数１０〜数１００個配置することができ、どの金パッドに電圧を加えたときにｐＨが変わったかで、標的ＲＮＡの鑑別をすることができる。
【００７７】
また、核酸を固定化しない、センシング部周辺の金パッドは比較電極として用いられる。ｐＨ値は、ｐＨ変化に応じた深さとなるポテンシャル井戸からの汲み出し電荷量を、比較電極の電位を基準として測定され、その測定値は前記一本鎖核酸と標的インフルエンザウイルスＲＮＡとのハイブリダイゼーションの有無の指標となる。
【００７８】
さらに、挿入剤２１から金パッド１７にかけて流れる酸化・還元電流は、電源Ｅroからの電圧印加回路中に微小電流計（図示せず）を挿入することによっても測定することができる。
【００７９】
（応用例４）
本発明はまた、図１０に示すように、上記のいずれかの方法を実施するにあたり有利なセンサ構造として、一対のＦＥＴ型センサ２３、２４を同一の半導体基板１上に併設し、その一対のＦＥＴ型センサの周縁を一括して包囲する電気化学的に不活性なアクリルガラス等からなる外周壁２５と、それらのセンサ２３、２４間を仕切って両端が外周壁２５に内接する仕切り壁２６を設けたものである。
【００８０】
これにより、各センサ２３、２４上に供給される試料溶液が互いに流通しないため、同一基板上で隣接した２つのセンサのうち、一方のセンサのみに標的インフルエンザウイルスＲＮＡと相補的な一本鎖核酸を固定し、他方のセンサには何も固定化せずに同一の試料溶液を用い、当該他方のセンサにより溶液・物性等の経時ドリフトを測定し、このドリフト値を当該一方のセンサの測定値から差し引いて、正確に試料溶液中の標的インフルエンザウイルスＲＮＡと一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを検出することが可能となる。勿論、２つセンサにおいて異なった試料溶液を収容し、互いに影響なく、各別の測定を行うことも可能である。
【００８１】
以上、本発明の好ましい実施形態およびその応用例について詳細に説明したが、本発明の他の形態によれば、上述した検出方法を行うためのインフルエンザウイルスＲＮＡ検出装置もまた、提供される。この検出装置は、上述したＦＥＴ型センサを含むものであればその他の具体的な形態について特に制限はなく、当業者によって適宜設計されうる。また、後述する実施例においても示されるように、このインフルエンザウイルス検出装置においては、複数の異なる標的配列に対応するように複数の測定部（例えば、２〜１０個など）を含ませることができる。したがって、かような検出装置によれば、複数の異なる標的配列の検出を一度に短時間で（１０分程度で）行うことが可能となる。特に、ヒトのインフルエンザ型をベッドサイド等のオンサイトで迅速にかつ確定的に判別することができ、ひいては診断の正確度も向上させうることから、本発明により提供される検出方法および検出装置は、従来提案されている技術に対して非常に高い優位性を有するものであるといえる。なお、言い換えれば、本発明の他の形態により、上述したインフルエンザウイルスＲＮＡ検出装置の、ヒトインフルエンザウイルス型別迅速診断への使用なる発明もまた、提供される。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
（ＦＥＴ型センサ）
本実施例では、上述した第１実施形態の原理を有するＦＥＴ型センサが３２×３２＝１０２４ピクセル配置されてなるイメージセンサを用いて標的インフルエンザウイルスＲＮＡの検出を試みた。ここで、本実施例で用いたイメージセンサの全体を示す写真を図１１に示す。ここで、センシング部９を構成するイオン感応膜としては、Ｓｉ3Ｎ4の表面に金を３．０×１０-3Ｐａの成膜圧力にて２０ｎｍの厚みで蒸着したものを用いた。なお、各ピクセルのサイズは４０μｍ×４０μｍである。
【００８４】
また、イメージセンサの１０２４ピクセルを図１２に示すように４つの象限に分割し、各象限に含まれるそれぞれのＦＥＴ型センサ（ピクセル）には、異なる一本鎖核酸（プローブ）を固定化した。プローブの固定化は、プローブ２μＭおよび固定化剤である６−ＨＨＴ（６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール）２０μＭを含む固定化溶液１μＬを各象限に滴下することにより行なった。なお、各象限のＦＥＴ型センサ（ピクセル）に固定化したプローブは以下の通りである。
【００８５】
【表２】
2013050426.tif 000004
【００８６】
（インフルエンザウイルスＲＮＡサンプルの調製）
PR-8 H1N1ヒトインフルエンザウイルスのＲＮＡを含む希釈液（0.2% Triton X-100、60%硫安、基準ＤＮＡ（ウイルスおよびヒト遺伝子以外の配列））を、ウイルスＲＮＡ濃度の異なる希釈系列として調製した。調製した各希釈系列について、リアルタイムPCRによりウイルスコピー数を測定した。なお、測定の際の標準コピー数としては、PR-8インフルエンザウイルスのM1遺伝子のcDNAを組み込んだプラスミド（TOPO TA Cloning Kit Dual Promoter pCR II-TOPO Vecter (Invitrogen, USA)）による標準コピー数を用いた。なお、コントロール溶液として、インフルエンザウイルスＲＮＡを含まないこと以外は上記と同様の溶液を調製した。
【００８７】
（センサを用いた標的インフルエンザウイルスＲＮＡの検出）
まず、上述したＦＥＴ型センサ（図１１および図１２に示すもの）の各象限にコントロール溶液を室温にて６０μＬずつ滴下し、センサが出力する信号を電位として計測した。
【００８８】
一方、同一のセンサの各象限に、上記で調製した希釈液のいずれかの濃度の希釈系列を室温にて６０μＬずつ滴下し、RNAlaterにより固定して、１０分間後にセンサが出力する信号を電位として計測した。そして、上記で計測したコントロール溶液についての計測出力（電位）との差分（電位差）として、センサの浮遊拡散部が蓄積した電荷量を算出し、これに基づき滴下サンプル中の標的インフルエンザウイルスＲＮＡの存在の有無およびその量を検出した。なお、上記で調製した希釈液のそれぞれの濃度について、同様の計測を行なった。また、計測信号は画素選択用の水平・垂直CMOSシフトレジスタ（図１２）により外部に読み出された。
【００８９】
結果を図１３に示す。図１３は、上記で計測された信号の出力強度を、ＲＮＡサンプルの希釈系列におけるインフルエンザウイルスＲＮＡの濃度に対してプロットしたグラフである。なお、図１３において、横軸は滴下した６０μＬ中のベースサンプル(0.64pfu/60μＬ)の濃度を１としたときの相対値である。また、ＲＮＡサンプルを滴下したときの各象限の出力信号の信号強度をイメージングした写真を図１４に示す。
【００９０】
図１３および図１４に示すように、象限１および象限２の出力信号は、象限３および象限４の出力信号の３倍以上を示すという有意な差が見られ、標的インフルエンザウイルスＲＮＡとこれに相補的なプローブとのハイブリダイゼーションによる出力信号のみが選択的に増幅されて出力されていることが確認された。
【００９１】
また、センサの検出限界に対応する象限１および象限２の出力信号の大きさ（下限値）は、サンプル中の標的インフルエンザウイルスＲＮＡのコピー数が数百コピー（例えば、２００〜５００コピー）程度であるサンプル濃度に対応していた。言い換えれば、本実施例では、ベースサンプルを10,000倍に希釈したサンプルまで、象限間の有意差をもって検出することができた（本センサの雑音レベルは0.7mVである）。
【００９２】
このように、本発明に係る検出方法によれば、標的とするインフルエンザウイルス(PR-8:H1N1)のＲＮＡについて、きわめて薄いサンプル濃度であっても、複数のプローブとの反応性を同時に解析することができた。これらの結果は、配置するプローブの種類を増やすことで、多数のインフルエザウイルスＲＮＡの存在の有無およびその量を１０分間で同時に解析することが可能であることを示している。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
〔配列番号：１〕
ヒトPR-8:H1N1インフルエンザウイルスＲＮＡの検出に用いられるプローブＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：２〕
ヒトPR-8:H1N1インフルエンザウイルスＲＮＡの検出に用いられるプローブＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：３〕
トリインフルエンザウイルスＲＮＡの検出に用いられるプローブＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：４〕
トリインフルエンザウイルスＲＮＡの検出に用いられるプローブＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：５〕
ブタインフルエンザウイルスＲＮＡの検出に用いられるプローブＤＮＡの塩基配列を表す。
〔配列番号：６〕
ブタインフルエンザウイルスＲＮＡの検出に用いられるプローブＤＮＡの塩基配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2013050426.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2013050426.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
2013050426.tif 000016
【図１３】
2013050426.tif 000017
【図１４】
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【配列表】
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