(57)【要約】【課題】  少なくとも１５ヌクレオチドにわたって互いに相補的である２本の別個のＲＮＡ鎖を含む経口投与用の低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）であって、ここで各鎖は４９ヌクレオチド以下であり、そしてここでその鎖の少なくとも１本は少なくとも一つの化学的修飾を含有するｓｉＲＮＡを提供すること。【解決手段】  少なくとも１５ヌクレオチドにわたって互いに相補的である２本の別個のＲＮＡ鎖を含む経口投与用の低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）であって、ここで各鎖は４９ヌクレオチド以下であり、そしてここでその鎖の少なくとも１本は少なくとも一つの化学的修飾を含有するｓｉＲＮＡは、血管形成障害を処置するために使用することができること見いだした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１５ヌクレオチドにわたって互いに相補的である２本の別個のＲＮＡ鎖を含み、ここで各鎖は４９ヌクレオチド以下であり、そしてここで少なくとも１つの鎖の３’末端は３’炭素での修飾を含み、そしてここで該修飾は
【化１】
2013128488.tif 000039
である、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）。
【請求項２】
少なくとも１５ヌクレオチドにわたって互いに相補的である２本の別個のＲＮＡ鎖を含み、ここで各鎖は４９ヌクレオチド以下であり、そしてここで各鎖の３’末端は３’炭素での修飾を含み、そしてここで該修飾は
【化２】
2013128488.tif 000040
である、ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
該各鎖の３’末端で最初に塩基対形成している２個のヌクレオチドが修飾されている、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
該各鎖の３’末端で最初に塩基対形成している２個のヌクレオチドが２’−メトキシエチルリボヌクレオチド残基である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
該２本の鎖が少なくとも１９ヌクレオチドにわたって互いに相補的である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
各鎖が１９ヌクレオチドである、請求項５に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡの両方の末端がブラント末端である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
各鎖が１９ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
該２本の鎖が１９ヌクレオチドにわたって互いに完全に相補的であり、ｓｉＲＮＡがブラント末端である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
少なくとも１つのさらなるヌクレオチドが修飾されている、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１１】
標準的な胃酸アッセイにおいて、同一ヌクレオチド配列を有する未修飾ｓｉＲＮＡよりも大きな安定性を有する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１２】
標準的な胃酸アッセイにおいて、３０分暴露後に５０％以上である安定性を有する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
標準的な血清アッセイにおいて、同一ヌクレオチド配列を有する未修飾ｓｉＲＮＡよりも大きな安定性を有する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
標準的な血清アッセイにおいて、３０分暴露後に５０％以上である安定性を有する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１５】
標準的な腸洗浄液アッセイにおいて、同一ヌクレオチド配列を有する未修飾ｓｉＲＮＡよりも大きな安定性を有する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１６】
同一ヌクレオチド配列の未修飾ｓｉＲＮＡと比較してバイオアベイラビリティーが強化されている、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１７】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
医薬として使用するための、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
該各鎖の３’末端で最初に塩基対形成している２個のヌクレオチドが修飾されており、各修飾されたヌクレオチドは、アミド結合であるヌクレオシド内結合を有する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２０】
非経口的に投与される医薬として使用するための、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２１】
該各鎖の３’末端で最初に塩基対形成している２個のヌクレオチドが修飾されており、各修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、ボラノホスホノエートおよびアミド結合の中から選択される修飾されたヌクレオシド内結合を有するヌクレオチドの中から選択される、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２２】
ｓｉＲＮＡの１個の末端がブラント末端である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２３】
５’末端または３’末端の少なくとも一つに１から６ヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２４】
経口的、局所的、非経口的、吸入もしくはスプレーにより、または直腸、経皮、皮下、血管内、静脈内、筋肉内、腹腔内もしくはくも膜下腔内、または注入技術的に投与される医薬として使用するための、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
ＲＮＡ干渉は当初植物において転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）として見出された、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が引き金となる高度に保存されたメカニズムであり、そしてｄｓＲＮＡに相同な遺伝子の転写を下方調節できる１。ｄｓＲＮＡは最初にダイサーにより低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される２１−２３ヌクレオチドの短い二重鎖にプロセシングされる２。それはＲＮＡ誘起サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれているので、ＲＩＳＣの構成成分であるアルゴノート２により標的ｍＲＮＡを相同性の領域の中央で切断することにより遺伝子サイレンシングを媒介することができる３。Elbashir et al（２００１）４では、合成ｓｉＲＮＡの直接導入によりショウジョウバエのみならず哺乳動物細胞においてもＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシングが媒介されることが実証された。それ以来ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは標的同定および標的バリデーション研究の双方で、強力でそして広く用いられる分子生物学的手段になってきている。動物実験での遺伝子サイレンシングのためのｓｉＲＮＡの使用は限られた量の動物モデルでしか記載されていない。未修飾ｓｉＲＮＡは眼において局所的に５、中枢神経系において髄腔内または小脳内に６、および呼吸器系ウイルスの阻止のために鼻内に７送達された。未修飾ｓｉＲＮＡの静脈内水力学的尾静脈注射もまた研究されている。この研究法により、主に肝臓への急速な送達が可能になる８。未修飾ｓｉＲＮＡの全身投与に関しては非常に限られた数の研究しか報告されていない。Duxbury et al９は接着斑キナーゼを標的とする未修飾ｓｉＲＮＡを正所性腫瘍異種移植片マウスモデルに静脈内投与し、そして腫瘍成長阻害およびゲムシタビンに対する化学増感を観察した。Soutscheck et alはアポリポタンパク質Ｂを内在的にサイレンシングするための高度に化学的に修飾されたｓｉＲＮＡの全身使用を報告した。ほとんどの抗ＡｐｏＢ  ｓｉＲＮＡの高用量の５０ｍｇ／ｋｇでの腹腔内投与によりＡｐｏＢタンパク質レベルおよびリポタンパク質濃度が低下した１０。これらの実例にもかかわらず、全身送達時のｓｉＲＮＡのインビボ使用は、このテクノロジーを標的バリデーションまたは治療適用に広く適用できるようにするために、改良を必要とする。実際、未修飾ｓｉＲＮＡは、主に血流で豊富なヌクレアーゼによる酵素消化に供される。ｓｉＲＮＡの薬理学的特性を改善するために、いくつかのグループはこれらの試薬の化学的修飾を調査した。記載された研究法はその中でも非常に様々で、そして系統的な研究は依然実施されていないが、結果の概要により化学的修飾に対するｓｉＲＮＡの寛容性を決定することが可能になる。ホスホロチオエート１１またはボラノホスフェート１２、２’−Ｏ−メチル１３、２’−Ｏ−アリル１４、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）および２’−デオキシフルオロヌクレオチド１５またはロックされた核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）１６のようないくつかの化学が調査されている。これらの研究により、修飾に関する寛容性は化学依存性のみならず、位置依存性でもあることが強調された。
【発明の概要】
【０００２】
本発明は改善された薬理学的特性を有する最小限に修飾されたｓｉＲＮＡを提供する。最小限に修飾されたｓｉＲＮＡは、３’エキソヌクレアーゼ消化を防御するために各鎖の３’末端で修飾された１９塩基対二本鎖ＲＮＡであり：２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡの３’−ジデオキシヌクレオチドオーバーハングが一般的な３’−ヒドロキシプロピルホスホジエステル部分により置き換えられており、そして各鎖の３’末端で最初に塩基対形成している２個のヌクレオチドの修飾が血清安定性をさらに強化する。成体マウスに腹腔内または経口適用した場合、修飾されたｓｉＲＮＡは成長因子誘起の血管形成モデルにおいてより高度な効力を表し、それは血清安定性の増大に相関する。
【０００３】
発明の要旨
一つの態様では、本発明は経口投与用の低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）を提供し、該ｓｉＲＮＡは少なくとも１５ヌクレオチドにわたって互いに相補的である２本の別個のＲＮＡ鎖を含み、ここで各鎖は４９ヌクレオチド以下であり、そしてここでその鎖の少なくとも１本は少なくとも一つの化学的修飾を含有する。
【０００４】
一つの実施態様では、ｓｉＲＮＡは少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含む。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは少なくとも１個の３’末端キャップを含む。
別の実施態様では、該修飾されたヌクレオチドは２’アルコキシリボヌクレオチド、２’アルコキシアルコキシリボヌクレオチド、ロックされた核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’−フルオロリボヌクレオチド、モルホリノヌクレオチドの中から選択される。
別の実施態様では、該修飾されたヌクレオチドはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、ボラノホスホノエートおよびアミド結合の中から選択される修飾されたヌクレオシド内結合を有するヌクレオチドの中から選択される。
別の実施態様では、該２本のＲＮＡ鎖は互いに完全に相補的である。
別の実施態様では、該ｓｉＲＮＡは５’末端または３’末端の少なくとも一つに１から６ヌクレオチドオーバーハングを含む。
【０００５】
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは少なくとも１個の３’キャップを含有し、それは３’炭素を介して３’末端に抱合された化学的部分であり、かつ式Ｉ：
【化１】
2013128488.tif 000002
［式Ｉ］
（式中、
ＸはＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は独立してＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルであり、ここでアルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルをさらなるヘテロ原子および官能基、好ましくはＮ、ＯもしくはＳの群から選択されるヘテロ原子またはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、カルボン酸もしくはエステルの群から選択される官能基により置換することができ；
またはＲ１およびＲ２は式Ｙ−Ｚのものでよく、ここでＹはＯ、Ｎ、Ｓであり、そしてＺはＨ、アルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルであり、ここでアルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルをさらなるヘテロ原子、好ましくはＮ、ＯもしくはＳの群から選択されるヘテロ原子により置換することができる）
の化合物の中から選択される。
【０００６】
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは少なくとも１５ヌクレオチドにわたってＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ３、Ｔｉｅ２、ｂＦＧＦＲ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＦａｓまたはＩＧＦ２ＲのｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡに相補的である少なくとも１本の鎖を含有する。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは配列番号：１−９００から選択される配列を含む少なくとも１本の鎖を含有する。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは配列番号：９０１−９３０からなる群から選ばれる。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは標準的な胃酸アッセイにおいて、同一ヌクレオチド配列を有する未修飾ｓｉＲＮＡよりも大きな安定性を有する。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは標準的な胃酸アッセイにおいて、３０分暴露後に５０％以上である安定性を有する。
【０００７】
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは標準的な血清アッセイにおいて未修飾ｓｉＲＮＡよりも大きな安定性を有する。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは標準的な血清アッセイにおいて３０分暴露後に５０％以上である安定性を有する。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは標準的な腸洗浄液アッセイにおいて未修飾ｓｉＲＮＡよりも大きな安定性を有する。
別の実施態様では、ｓｉＲＮＡは同一ヌクレオチド配列の未修飾ｓｉＲＮＡと比較して経口バイオアベイラビリティーが強化されている。
【０００８】
一つの態様では、本発明は一つまたはそれより多い前記の特性を有するｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は医薬品として使用するための任意の一つまたはそれより多い前記の特性を有するｓｉＲＮＡを提供する。
別の態様では、本発明は血管形成障害の処置用医薬品の製造における任意の一つまたはそれより多い前記の特性を有するｓｉＲＮＡの使用を提供する。
別の態様では、本発明はインビトロで血管形成過程を阻害するための任意の一つまたはそれより多い前記の特性を有するｓｉＲＮＡの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１ａ】図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅ：未修飾ｓｉＲＮＡ  ｐＧｌ３−ｓｉＲＮＡ（マウス血清中の野生型ｓｉＲＮＡ）の代謝分解；ａ−ｃ）マウス血清中０分、３０分および１８０分インキュベートした後の未修飾ｓｉＲＮＡのイオン交換−ＨＰＬＣ分析；３７℃で３０分インキュベートした後のイオン交換ＨＰＬＣにおける主要なピークを単離し、そしてＬＣ−ＭＳに再注入した、ｄ）検出された分子量およびその割り当ての表；ｅ）ＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図１ｂ】図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅ：未修飾ｓｉＲＮＡ  ｐＧｌ３−ｓｉＲＮＡ（マウス血清中の野生型ｓｉＲＮＡ）の代謝分解；ａ−ｃ）マウス血清中０分、３０分および１８０分インキュベートした後の未修飾ｓｉＲＮＡのイオン交換−ＨＰＬＣ分析；３７℃で３０分インキュベートした後のイオン交換ＨＰＬＣにおける主要なピークを単離し、そしてＬＣ−ＭＳに再注入した、ｄ）検出された分子量およびその割り当ての表；ｅ）ＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図１ｃ】図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅ：未修飾ｓｉＲＮＡ  ｐＧｌ３−ｓｉＲＮＡ（マウス血清中の野生型ｓｉＲＮＡ）の代謝分解；ａ−ｃ）マウス血清中０分、３０分および１８０分インキュベートした後の未修飾ｓｉＲＮＡのイオン交換−ＨＰＬＣ分析；３７℃で３０分インキュベートした後のイオン交換ＨＰＬＣにおける主要なピークを単離し、そしてＬＣ−ＭＳに再注入した、ｄ）検出された分子量およびその割り当ての表；ｅ）ＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図１ｄ】図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅ：未修飾ｓｉＲＮＡ  ｐＧｌ３−ｓｉＲＮＡ（マウス血清中の野生型ｓｉＲＮＡ）の代謝分解；ａ−ｃ）マウス血清中０分、３０分および１８０分インキュベートした後の未修飾ｓｉＲＮＡのイオン交換−ＨＰＬＣ分析；３７℃で３０分インキュベートした後のイオン交換ＨＰＬＣにおける主要なピークを単離し、そしてＬＣ−ＭＳに再注入した、ｄ）検出された分子量およびその割り当ての表；ｅ）ＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図１ｅ】図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅ：未修飾ｓｉＲＮＡ  ｐＧｌ３−ｓｉＲＮＡ（マウス血清中の野生型ｓｉＲＮＡ）の代謝分解；ａ−ｃ）マウス血清中０分、３０分および１８０分インキュベートした後の未修飾ｓｉＲＮＡのイオン交換−ＨＰＬＣ分析；３７℃で３０分インキュベートした後のイオン交換ＨＰＬＣにおける主要なピークを単離し、そしてＬＣ−ＭＳに再注入した、ｄ）検出された分子量およびその割り当ての表；ｅ）ＥＳＩ−ＭＳスペクトル。
【図２】図２：四つの二本鎖ＲＮＡ型式の説明：野生型（または未修飾）ｓｉＲＮＡ、ＭＯＥ  ｏ／ｈ  ｓｉＲＮＡ、Ｃ３−ｓｉＲＮＡおよびＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ。
【００１０】
【図３】図３：マウス胃酸中三つの異なる型式でのｓｉＲＮＡの安定性。試料をマウス胃酸中３７℃で２μＭの濃度でインキュベートした。親化合物のバンドを定量することにより親化合物の消失を２−６時間にわたって追跡した。レーン１−７：胃酸中ｔ＝０、５、１０、１５、３０、６０および１２０分の野生型ｓｉＲＮＡレーン８：ｄｓＲＮＡラダー（３０、２１、１９、１６、１３、１０塩基対）レーン９−１５：胃酸中ｔ＝０、５、１０、１５、３０、６０および１２０分のＣ３  ｓｉＲＮＡレーン１６：ｄｓＲＮＡラダー（３０、２１、１９、１６、１３、１０塩基対）レーン１７−２４：胃酸中ｔ＝０、５、１０、１５、３０、６０および１２０分のＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ
【００１１】
【図４】図４：腸洗浄液中四つの異なる型式でのｓｉＲＮＡの安定性。試料を肝ミクロソーム中３７℃で５μＭの濃度でインキュベートした。（左から右に）レーン１：ｄｓＲＮＡラダー（３０、２１、１９、１６、１３、１０塩基対）レーン２−７：腸洗浄液中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分の野生型ｓｉＲＮＡレーン８−１３：腸洗浄液中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分のｍｏｅ  ｏ／ｈ  ｓｉＲＮＡレーン１４−１９：腸洗浄液中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分のＣ３  ｓｉＲＮＡレーン２０−２５：腸洗浄液中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分のＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ
【００１２】
【図５】図５：肝ミクロソーム中四つの異なる型式でのｓｉＲＮＡの安定性。試料をラット腸洗浄液からの腸液中３７℃で２μＭの濃度でインキュベートした。（左から右に）レーン１：ｄｓ
【図６】図６：マウス血清中四つの異なる型式でのｓｉＲＮＡの安定性。試料をマウス血清中３７℃で２μＭの濃度でインキュベートした。親化合物のバンドを定量することにより親化合物の消失を６時間にわたって追跡した。（左から右に）レーン１：ｄｓＲＮＡラダー（３０、２１、１９、１６、１３、１０塩基対）ＲＮＡラダー（３０、２１、１９、１６、１３、１０塩基対）レーン２：野生型ｓｉＲＮＡ未処理レーン３：ｍｏｅ  ｏ／ｈ  ｓｉＲＮＡ未処理レーン４：Ｃ３  ｓｉＲＮＡ未処理レーン５：Ｃ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ未処理レーン６−９：肝ミクロソーム中２−５と同一、ｔ＝０レーン１０−１３：肝ミクロソーム中２−５と同一、ｔ＝６０分レーン１４−１７：上澄Ｓ１２中２−５と同一、ｔ＝０レーン１８−２１：上澄Ｓ１２中２−５と同一、ｔ＝６０分レーン２−７：マウス血清中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分の野生型ｓｉＲＮＡレーン８−１３：マウス血清中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分のｍｏｅ  ｏ／ｈ  ｓｉＲＮＡレーン１４−１９：マウス血清中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分のＣ３  ｓｉＲＮＡレーン２０−２５：マウス血清中ｔ＝０、１５、３０、６０、１８０および３６０分のＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ
【００１３】
【図７】図７：抗ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡ（２個の独立した配列）の三つの型式の細胞内（in cellulo）での特徴付け。野生型ｓｉＲＮＡ、Ｃ３−ｓｉＲＮＡおよびＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡを３濃度（１、５、１０ｎＭ）でＭＳ１細胞にトランスフェクトした。ＦＡＣＳによりＶＥＧＦＲ２細胞表面レベルを測定することによりサイレンシング効力を評価した。
【００１４】
【図８ａ】図８ａおよび８ｂ：成長因子誘起血管形成「寒天チャンバー（Agar Chamber）」マウスモデルにおける野生型ｓｉＲＮＡ、Ｃ３−ｓｉＲＮＡおよびＣ３−Ｍｏｅ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。図８ａは１、５および２５μｇ／マウス／日の対照、未修飾ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡおよびＣ３修飾ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡの結果を示す。図８ｂは０.２、１および５μｇ／マウス／日での対照、Ｃ３修飾ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡおよびＣ３−ＭＯＥ  ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡを示す。各例で２つの抗ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡのプールを毎日３日間腹腔内に与えた。
【図８ｂ】図８ａおよび８ｂ：成長因子誘起血管形成「寒天チャンバー（Agar Chamber）」マウスモデルにおける野生型ｓｉＲＮＡ、Ｃ３−ｓｉＲＮＡおよびＣ３−Ｍｏｅ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。図８ａは１、５および２５μｇ／マウス／日の対照、未修飾ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡおよびＣ３修飾ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡの結果を示す。図８ｂは０.２、１および５μｇ／マウス／日での対照、Ｃ３修飾ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡおよびＣ３−ＭＯＥ  ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡを示す。各例で２つの抗ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡのプールを毎日３日間腹腔内に与えた。
【００１５】
【図９ａ】図９：Ｂ１６同種移植片メラノーマ腫瘍マウスモデルに５および２０μｇ／マウス／日で腹腔内（ｉ.ｐ.）に与えられた抗ＶＥＧＦＲ２  Ｃ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。図９ａは、修飾されたＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡでのｉ.ｐ.処置が腫瘍発達を有意に低下させることを示す。図９ｂもまたＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡの２０μｇ／マウスのｉ.ｐ.注射が有意な腫瘍成長の阻害を招くことを示す。
【図９ｂ】図９：Ｂ１６同種移植片メラノーマ腫瘍マウスモデルに５および２０μｇ／マウス／日で腹腔内（ｉ.ｐ.）に与えられた抗ＶＥＧＦＲ２  Ｃ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。図９ａは、修飾されたＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡでのｉ.ｐ.処置が腫瘍発達を有意に低下させることを示す。図９ｂもまたＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡの２０μｇ／マウスのｉ.ｐ.注射が有意な腫瘍成長の阻害を招くことを示す。
【００１６】
【図１０】図１０：成長因子誘起血管形成マウスモデルにおけるＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。抗ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡを２０μｇ／マウス／日を毎日３日間経口的に与えた。
【図１１ａ】図１１：成長因子誘起血管形成マウスモデルにおけるＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。抗Ｔｉｅ２  ｓｉＲＮＡを毎日腹腔内（１および０.２μｇ／マウス／日）または経口的に（２０および５μｇ／マウス／日）３日間経口与えた。図１１ａ：切除組織の重量；図１１ｂ：Ｔｉｅ２タンパク質ノックダウン。
【図１１ｂ】図１１：成長因子誘起血管形成マウスモデルにおけるＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。抗Ｔｉｅ２  ｓｉＲＮＡを毎日腹腔内（１および０.２μｇ／マウス／日）または経口的に（２０および５μｇ／マウス／日）３日間経口与えた。図１１ａ：切除組織の重量；図１１ｂ：Ｔｉｅ２タンパク質ノックダウン。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は哺乳動物における血管形成障害を処置するための組成物および方法に関する。特に本発明は哺乳動物への経口投与時に血管形成障害を処置するために使用することができる低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）に関する。
血管形成は以下の標的／遺伝子を含む血管内皮細胞を標的とする：ＶＥＧＦＲ−１（GenBank受入番号ＡＦ０６３６５）；ＶＥＧＦＲ−２（GenBank受入番号ＡＦ０６３６５８）；ＶＥＧＦＲ−３（GenBank受入番号（ＮＭ＿００２０２０）；Ｔｉｅ２（ＴＥＫ）（GenBank受入番号ＮＭ＿０００４５９）；ｂＦＧＦＲ（GenBank受入番号Ｍ６０４８５）；ＩＬ８ＲＡ（GenBank受入番号Ｌ１９５９１）；ＩＬ８ＲＢ（GenBank受入番号Ｌ１９５９３）；Ｆａｓ（GenBank受入番号Ｘ８９１０１）；ＩＧＦ２Ｒ（GenBank受入番号ＮＭ＿０００８７６）。
【００１８】
本発明によるｓｉＲＮＡ分子はＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）を媒介する。「ＲＮＡｉ」なる用語は当分野において周知であり、そして一般的に標的遺伝子に相補的である領域を有するｓｉＲＮＡによる、細胞における一つまたはそれより多い標的遺伝子の阻害を意味すると理解される。ＲＮＡｉを媒介するその能力に関してｓｉＲＮＡを試験するための種々のアッセイが当分野において公知である（例えばElbashir et al., Methods ２６：１９９−２１３（２００２）参照）。本発明によるｓｉＲＮＡの遺伝子発現に及ぼす影響は、本発明によるＲＮＡ分子で処理されていない細胞と比較した場合、典型的には少なくとも１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％まで阻害される標的遺伝子の発現に至る。
【００１９】
本発明による「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉リボ核酸」は以下の態様を含む当分野において公知の意味を有する。ｓｉＲＮＡは生理学的条件下で相補的領域に沿ってハイブリダイズする２本の鎖のリボヌクレオチドからなる。鎖は別個であるが、特定の実施態様では、分子リンカーにより結合し得る。個々のリボヌクレオチドは未修飾天然発生リボヌクレオチド、未修飾天然発生デオキシリボヌクレオチドでよいか、またはそれらは本明細書の他の部分で記載されるような化学的に修飾された、もしくは合成性でよい。
【００２０】
本発明によるｓｉＲＮＡ分子は標的遺伝子のｍＲＮＡの領域と実質的に同一である二本鎖領域を含む。標的遺伝子の対応する配列に対して１００％同一性を有する領域が適当である。この状態は「完全に相補的」と称される。しかしながらその領域はまた、標的化されるｍＲＮＡの領域の長さに依存して、標的遺伝子の対応する領域と比較して１、２または３個の誤対合を含有してもよく、そしてそのようなものは完全に相補的ではないかもしれない。一つの実施態様では、本発明のＲＮＡ分子は１個の所定の遺伝子を特異的に標的化する。望ましいｍＲＮＡのみを標的化するために、ｓｉＲＮＡ試薬は標的ｍＲＮＡに対して１００％相同性、および細胞または生物に存在する全てのその他の遺伝子に対して少なくとも２個の誤対合したヌクレオチドを有し得る。具体的な標的配列の発現を有効に阻害するために、十分な配列同一性を有するｓｉＲＮＡを分析および同定するための方法が当分野において公知である。当分野において公知の配列比較およびアラインメントアルゴリズムにより配列同一性を最適化し（Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press,（１９９１）およびそこに引用された参照文献を参照のこと）、そして例えばBESTFITソフトウェアプログラムでデフォルトパラメーターを用いて実行されるようなSmith−Watermanアルゴリズム（例えばUniversity of Wisconsin Genetic Computing Group）によりヌクレオチド配列間の差異パーセントを計算することができる。
【００２１】
ＲＮＡｉ試薬の有効性に影響を及ぼす別の因子は標的遺伝子の標的領域である。ＲＮＡｉ試薬による阻害に有効な標的遺伝子の領域を実験方法により決定することができる。適当なｍＲＮＡ標的領域はコード化領域であろう。５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲおよびスプライスジャンクションのような未翻訳領域もまた適当である。例えばElbashir S.M. et al, EMBO J., ２０：６８７７−６８８８（２００１）に記載されるようなトランスフェクションアッセイをこの目的のために実施することができる。当分野では当業者に周知である多くのその他の適当なアッセイおよび方法が存在する。
【００２２】
本発明にしたがって、標的に相補的なｓｉＲＮＡの領域の長さは１０から１００ヌクレオチド、１２から２５ヌクレオチド、１４から２２ヌクレオチドまたは１５、１６、１７もしくは１８ヌクレオチドでよい。対応する標的領域に対する誤対合が存在する場合、相補的領域の長さは一般的に幾分長くなることが要求される。
ｓｉＲＮＡはオーバーハングした末端（標的に対して相補的であってもなくてもよい）、または標的配列にではなくそれ自体に相補的なさらなるヌクレオチドを担持し得るので、ｓｉＲＮＡの各別個の鎖の全体の長さは１０から１００ヌクレオチド、１５から４９ヌクレオチド、１７から３０ヌクレオチドまたは１９から２５ヌクレオチドでよい。
【００２３】
「各鎖が４９ヌクレオチド以下である」なる語句は、全ての修飾または未修飾ヌクレオチドを含むが、鎖の３’または５’末端に付加され得る任意の化学的部分を含まない、鎖の連続したヌクレオチドの全数を意味する。鎖に挿入された短い化学的部分は計数されないが、２本の別個の鎖を結合するために設計された化学的リンカーは連続したヌクレオチドを創成するとは考えられない。
「５’末端または３’末端の少なくとも一つにおける１から６ヌクレオチドオーバーハング」なる語句は生理学的条件下で２本の別個の鎖から形成される相補的ｓｉＲＮＡの構造を指す。末端ヌクレオチドがｓｉＲＮＡの二本鎖領域の一部である場合、ｓｉＲＮＡはブラント末端と考えられる。一つまたはそれより多いヌクレオチドが末端で対形成されない場合、オーバーハングが創成される。オーバーハングの長さはオーバーハングするヌクレオチドの数により測定される。オーバーハングするヌクレオチドはいずれかの鎖の５’末端または３’末端のいずれかでよい。
【００２４】
本発明によるｓｉＲＮＡは少なくとも１本の鎖に少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含むことにより、インビボで経口送達に適当な高い安定性を付与する。故に本発明によるｓｉＲＮＡは少なくとも１個の修飾されたまたは非天然リボヌクレオチドを含有する。多くの公知の化学的修飾についての冗長な記載は公開ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００３７０９１８号に示され、そして本明細書で繰り返さない。経口送達のための適当な修飾をさらに具体的に本明細書の実施例および記載にて示す。適当な修飾には、限定するものではないが糖部分に対する修飾（すなわち例えば２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥのような糖部分の２’位置（Martin et al., Helv. Chim. Acta, ７８：４８６−５０４（１９９５））すなわちアルコキシアルコキシ基）または塩基部分（すなわち代替ヌクレオチド鎖の別の具体的な塩基と対形成する能力を維持する非天然または修飾された塩基）が含まれる。その他の修飾には、限定するものではないがリン酸エステル基の置換（隣接するリボヌクレオチドを例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートと連結させる）を含むいわゆる「バックボーン」修飾が含まれる。最後に、時に本明細書では３’キャップまたは５’キャップと称される末端修飾が重要である。表１にて説明されるようにキャップは、ｓｉＲＮＡに安定性を付与することが見出されている「Ｔ−Ｔ」のようなさらなるヌクレオチドの単純な付加からなってよい。キャップは当業者に公知である錯体化学からなってよい。
【００２５】
以下の実施例で用いられる一つの実施態様では、３’キャップは３’炭素を介して３’末端に抱合された化学的部分であり、かつ式Ｉ：
【化２】
2013128488.tif 000003
［式Ｉ］
（式中、
ＸはＯまたはＳであり、
Ｒ１およびＲ２は独立してＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルであり、ここでアルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルをさらなるヘテロ原子および官能基、好ましくはＮ、ＯもしくはＳの群から選択されるヘテロ原子またはＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、カルボン酸もしくはエステルの群から選択される官能基により置換することができ；
またはＲ１およびＲ２は式Ｙ−Ｚのものでよく、ここでＹはＯ、Ｎ、Ｓであり、そしてＺはＨ、アルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルであり、ここでアルキル、アリール、アルキル−アリール、アリール−アルキルをさらなるヘテロ原子、好ましくはＮ、ＯもしくはＳの群から選択されるヘテロ原子により置換することができる）
の化合物の中から選択される。
【００２６】
糖部分での修飾の実例には２’アルコキシリボヌクレオチド、２’アルコキシアルコキシリボヌクレオチド、ロックされた核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’−フルオロリボヌクレオチド、モルホリノヌクレオチドが挙げられる。
ヌクレオシド内結合を修飾することもできる。ヌクレオシド内結合の実例にはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダートおよびアミド結合が挙げられる。
Ｒ１はＯＨでよい。
Ｒ１およびＲ２は一緒に１から２４個のＣ原子、１から１２個のＣ原子、２から１０個のＣ原子、１から８個または２から６個のＣ原子を含み得る。別の実施態様では、Ｒ１およびＲ２は独立してＯＨ、低級アルキル、低級アリール、低級アルキル−アリール、低級アリール−アルキルであり、ここで低級アルキル、低級アリール、低級アルキル−アリール、低級アリール−アルキルを前記で定義されるようなさらなるヘテロ原子および官能基により置換することができる。別の実施態様では、Ｒ１およびＲ２は双方ともＯＨではない。
【００２７】
有機ラジカルまたは化合物に関連する「低級」なる用語は７個以下の炭素原子、好ましくは１−４個の炭素原子を含む分岐しているかまたは分岐していなくてよい化合物またはラジカルを意味する。低級アルキルは、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルおよび分岐したペンチル、ｎ−ヘキシルおよび分岐したヘキシルを表す。
アルコキシの実例にはＯ−Ｍｅｔ、Ｏ−Ｅｔｈ、Ｏ−ｐｒｏｐ、Ｏ−ｂｕｔ、Ｏ−ｐｅｎｔ、Ｏ−ｈｅｘが挙げられる。
【００２８】
少なくとも１個の修飾されたまたは非天然リボヌクレオチドを含有するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡの合成のための方法は周知であり、そして当業者に容易に利用可能である。例えば種々の合成化学が公開ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２００５０２１７４９号および第ＷＯ２００３７０９１８号（双方共に出典明示により本明細書の一部とする）に示されている。反応を溶液中または好ましくは固相でポリマーに支持された試薬を使用することにより実施でき、続いてＲＮＡｉを媒介することができるｓｉＲＮＡ分子が形成される条件下で合成されたＲＮＡ鎖を組み合わせる。
【００２９】
本発明は経口送達に適当である少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含有するするｓｉＲＮＡを提供する。機能的な表現ではこれは、ｓｉＲＮＡは経口投与時に適当な薬物動態および体内分布を有し、関連する標的組織への送達を達成するであろうということを意味する。とりわけこれには血清安定性、免疫応答の欠如、および薬物様の挙動が必要とされる。本明細書の別の部分で開示される標準的な胃酸アッセイおよび標準的な血清アッセイに基づいてｓｉＲＮＡのこれらの様相の多くを予想することができる。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ＲＮＡｉにより少なくとも１個の標的遺伝子を阻害することができる本発明によるｓｉＲＮＡを細胞に導入することを含む標的遺伝子の阻害のための方法を提供する。また、各々別の標的領域に特異的である１を超える種のｓｉＲＮＡを同時にまたは逐次的に細胞に導入することができる。
【００３１】
本発明は任意の型の標的遺伝子またはヌクレオチド配列に限定されるものではない。例えば標的遺伝子は細胞遺伝子、内因性遺伝子、病原体関連遺伝子、ウイルス遺伝子または発癌遺伝子でよい。実施例のいくつかは、経口送達された本発明のｓｉＲＮＡが脈管形成、血管新生または血管形成の部位に蓄積され得ることを強調しているので、血管形成遺伝子は本発明に特に重要である。本発明に特に興味深いこれらの部位での血管形成遺伝子の最新のリストはAngioDB：血管形成および血管形成関連分子Tae−Kwon Sohn、Eun−Joung Moon１、Seok−Ki Lee１、Hwan−Gue Cho２およびKyu−Won Kim３のデータベース、Nucleic Acids Research, ３０（１）：３６９−３７１（２００２）およびオンラインhttp：／／angiodb.snu.ac.kr／に列挙される。特に重要な遺伝子は詳細に分析されており、そして本明細書の別の部分に示されている。
【００３２】
別の態様では、本発明はまた細胞における標的遺伝子の発現を阻害するための試薬を含むキットを提供し、ここで該キットは本発明によるｄｓＲＮＡを含む。キットはインビトロまたはインビボで本発明によるｄｓＲＮＡの導入を実施して、試料または対象を試験するのに必要な少なくとも一つの試薬を含む。好ましい実施態様では、かかるキットはまたキットの構成成分が使用される手順を詳記する説明書をも含む。
【００３３】
「血管形成障害の処置」とはこの開示で使用される際には、血管新生、脈管形成および／または血管形成の生理学的および病理学的過程を伴う疾患の処置のための医薬組成物における本発明の修飾されたｓｉＲＮＡの使用を意味する。このようにこれらの医薬組成物は、限定するものではないが癌腫瘍成長および転移、新生物、眼血管新生（黄斑変性症、糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、未熟児網膜症、脈絡膜血管新生を含む）、関節リウマチ、骨関節炎、慢性喘息、敗血症性ショック、炎症性疾患、滑膜炎、骨および軟骨破壊、パンヌス成長、骨棘形成、骨髄炎、乾癬、肥満、血管腫、カポジ肉腫、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化巣断裂を含む）、子宮内膜症、疣贅、多毛症、ケロイド瘢痕、アレルギー性浮腫、機能不全性子宮出血、卵胞嚢胞、卵巣過剰刺激、子宮内膜症、骨髄炎、炎症性および感染性過程（肝炎、肺炎、糸球体腎炎）、喘息、鼻ポリープ、移植、肝臓再生、白質軟化症、甲状腺炎、甲状腺肥大、リンパ球増殖性障害、血液学的悪性腫瘍、血管奇形および子癇前症を含む血管新生、脈管形成または血管形成の阻害を必要とする疾患、症状および障害を処置するために有用である。
【００３４】
本明細書で使用される際には、「処置」とは、疾患、障害もしくは症状の過程を阻害もしくは低減させるため、疾患、障害もしくは症状の病徴を阻害もしくは低減させるため、または疾患、障害もしくは症状の発症もしくはさらなる発達を予防的に防御するために取る行動を意味する。「処置する」とはその認識動詞である。
【００３５】
本発明の治療薬の有効用量は疾患状態を処置するために必要とされるその用量である。有効用量は疾患の型、使用される組成物、投与の経路、処置されている哺乳動物の型、考慮される具体的な哺乳動物の身体的特徴、併用薬、および医学の分野において当業者に認識されるその他の因子に依存する。一般的に効力に依存して０.１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の量のｓｉＲＮＡが投与される。本発明の核酸分子およびその処方を経口的、局所的、非経口的に、吸入もしくはスプレーにより、または直腸に従来の無毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／またはベヒクルを含有する投薬単位処方で投与できる。非経口的なる用語は、本明細書で使用される際には、経皮、皮下、血管内（例えば静脈内）、筋肉内、腹腔内もしくはくも膜下腔内注射、または注入技術等を含む。加えて、本発明の核酸分子および薬学的に許容される担体を含む医薬用処方が提供される。一つまたはそれより多い本発明の核酸分子は、一つまたはそれより多い無毒性の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバント、ならびに所望によりその他の活性成分を伴って存在できる。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物を経口使用に適当な形態、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップもしくはエリキシルにできる。
【００３６】
経口使用を意図される組成物を、医薬組成物の製造に関して当分野において公知の任意の方法にしたがって調製することができ、そしてかかる組成物は医薬的に洗練され、そして口当たりのよい調製物を提供するために一つまたはそれより多いかかる甘味剤、着香剤、着色剤または保存剤を含有できる。錠剤は錠剤の製造に適当である無毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する。これらの賦形剤は例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；顆粒化および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；および滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクでよい。錠剤はコーティングされていなくてよいか、またはそれらを公知の技術によりコーティングすることができる。経口使用のための処方を、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合される硬質ゼラチンカプセルとして、または活性成分が水もしくは油性溶媒、例えば落花生油、液体パフィンもしくはオリーブ油と混合される軟質ゼラチンカプセルとして提示することもできる。水性懸濁液は水性懸濁液の製造に適当な賦形剤との混合物中に活性成分を含有する。
【００３７】
本発明の組成物の経口投与は胃または腸に直接的に、最も重要には患者による嚥下制御投薬形態によるが、またかかる送達のその他の機械的および補助的手段による物質を投与するための全ての標準的な技術を含む。
【００３８】
約０.１ｍｇから約１４０ｍｇ／ｋｇ体重／日のオーダーの投薬量レベルが前記で指示された症状の処置において有用である（約０.５ｍｇから約７ｇ／対象／日）。単回投薬形態を生成するための担体材料と組み合わすことができる活性成分の量は、処置される宿主および投与の特定の様式に依存して異なる。一般的に投薬単位形態は約１ｍｇから約５００ｍｇの間の活性成分を含有する。任意の特定の対象に関する具体的な用量レベルは用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与の時間、投与の経路、ならびに排出の速度、薬物の組み合わせおよび治療を行っている特定の疾患の重篤度を含む種々の因子に依存することは理解される。
【００３９】
本発明の治療薬の治療効果をその他の薬剤との組み合わせにより強化することができる。典型的にはかかるその他の薬剤には血管形成障害のような類似の疾患の処置に使用されることが知られている薬剤が含まれよう。これに代えて、かかる薬剤を使用して本発明の治療薬により引き起こされる副作用または望ましくない影響を低減させることができる。
【００４０】
本発明のｓｉＲＮＡはまた重要な調査用途をも有する。かかる研究の一つにはインビトロでの血管形成過程への調査が含まれる。「インビトロでの血管形成過程」とは動物全身を用いない血管形成または脈管形成を研究するための任意の過程を意味する。このように血管形成のマーカーまたは指標を使用して血管形成過程の工程を研究するインビトロまたはエキソビボ方法およびアッセイはここに含まれる。
【００４１】
ＲＮＡ鎖ヌクレオチド配列
表１で同定されるｓｉＲＮＡ鎖配列は以下の標的に対する適当なｓｉＲＮＡ配列として同定されている：ＶＥＧＦＲ−１（GenBank受入番号ＡＦ０６３６５）；ＶＥＧＦＲ−２（GenBank受入番号ＡＦ０６３６５８）；ＶＥＧＦＲ−３（GenBank受入番号（ＮＭ＿００２０２０）；Ｔｉｅ２（ＴＥＫ）（GenBank受入番号ＮＭ＿０００４５９）；ｂＦＧＦＲ（GenBank受入番号Ｍ６０４８５）；ＩＬ８ＲＡ（GenBank受入番号Ｌ１９５９１）；ＩＬ８ＲＢ（GenBank受入番号Ｌ１９５９３）；Ｆａｓ（GenBank受入番号Ｘ８９１０１）；ＩＧＦ２Ｒ（GenBank受入番号ＮＭ＿０００８７６）。
【００４２】
表１：ヒトＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｔｉｅ２、ｂＦＧＦＲ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、Ｆａｓ、ＩＧＦ２Ｒに対するｓｉＲＮＡ
【表１】
2013128488.tif 000004
【表２】
2013128488.tif 000005
【表３】
2013128488.tif 000006
【表４】
2013128488.tif 000007
【表５】
2013128488.tif 000008
【表６】
2013128488.tif 000009
【表７】
2013128488.tif 000010
【表８】
2013128488.tif 000011
【表９】
2013128488.tif 000012
【表１０】
2013128488.tif 000013
【表１１】
2013128488.tif 000014
【表１２】
2013128488.tif 000015
【表１３】
2013128488.tif 000016
【表１４】
2013128488.tif 000017
【表１５】
2013128488.tif 000018
【表１６】
2013128488.tif 000019
【表１７】
2013128488.tif 000020
【表１８】
2013128488.tif 000021
【表１９】
2013128488.tif 000022
【表２０】
2013128488.tif 000023
【表２１】
2013128488.tif 000024
【表２２】
2013128488.tif 000025
【表２３】
2013128488.tif 000026
【表２４】
2013128488.tif 000027
【表２５】
2013128488.tif 000028
【表２６】
2013128488.tif 000029
【表２７】
2013128488.tif 000030
【表２８】
2013128488.tif 000031
【表２９】
2013128488.tif 000032
【表３０】
2013128488.tif 000033
【００４３】
ＲＮＡ鎖ヌクレオチドの化学的修飾
本発明によるｓｉＲＮＡは少なくとも１本のＲＮＡ鎖に少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを含み得る。様々な可能性のある修飾されたヌクレオチドを本明細書の別の部分で開示する。本発明による使用のための有用な修飾および修飾の組み合わせを表２に示す：
【００４４】
表２：化学的修飾および配列構造
【表３１】
2013128488.tif 000034
Ｎ＝任意の未修飾ＲＮＡヌクレオチド
ｎ＝未修飾ＤＮＡヌクレオチド
Ｎｐ＝修飾されたＲＮＡヌクレオチド
ｓ＝ホスホロチオエートヌクレオシド内結合の同定
ｏ／ｈ＝オーバーハング
【００４５】
ｓｉＲＮＡ鎖の３’末端の３’位置に付加された以下の修飾は時に「３’末端キャップ」と称され、本発明の有用な実施態様としても認識され、そして本発明によるいずれかのｓｉＲＮＡと共に使用され得る：
【００４６】
【化３】
2013128488.tif 000035
【００４７】
本発明による活性を有する具体的な化合物には以下の表３に示されるものが含まれる：
表３：実施例で使用されるｓｉＲＮＡの配列および化学
【表３２】
2013128488.tif 000036
【表３３】
2013128488.tif 000037
【表３４】
2013128488.tif 000038
【実施例】
【００４８】
実施例
以下の実施例は本発明の態様を説明し、そして以下に列挙される請求の範囲に含まれる実施態様を限定することを意図されるものではない。さらに下の結果および考察のセクションは、以下のプロトコールにしたがって行われ、そして以下の材料を用いる実験に言及する。具体的に記載されていない材料およびプロトコールは当業者に日常的に利用可能であると考えられる。
【００４９】
実施例１
ｓｉＲＮＡの調製
標準的な２’−Ｏ−ＴＯＭホスホアミダイトテクノロジーにより一本鎖ｓｉＲＮＡ誘導体を合成し、そしてOasis（登録商標）ＨＬＢ抽出プレート（Waters）により精製した。センス−およびアンチセンス鎖ｓｉＲＮＡをハイブリダイゼーションバッファー（１００ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍＭ  Hepes、ｐＨ７.６）中で混合し、９０°Ｃで３分間熱変性し、そして３０°Ｃで６０分間アニーリングした。ｓｉＲＮＡ二重鎖の１００μＭ原液を−２０°Ｃで保存した。
【００５０】
実施例２
血清中でのインキュベーションおよびＩＥ−ＨＰＬＣ（ＬＣ−ＭＳ）による分析
標準的な血清アッセイでは、２０μＭの各ｓｉＲＮＡ６μｌを血清またはＣＳＦ  ５４μｌと混合し、そしてインキュベーター中３７°Ｃで加熱した、冷却した混合物５０μｌを分析用ＤＮＡ−ｐａｃ  ＰＡ−１００カラム（Dionex）に負荷し、そして１：１０アセトニトリル：バッファー（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ６.５）溶液中ＮａＣｌグラジエント（３０分で０−０.６Ｍ）で分析した。
ＬＣ−ＭＳ分析用に各ｓｉＲＮＡ  １００μｌ（２０μＭまたは５０μＭ）を滅菌ウシ胎仔血清（GIBCO）９００μｌと混合し、３７°Ｃでインキュベートし、そして以前に指示されたように（ＮａＣｌグラジエントを除く：９分で０Ｍ−０.３６Ｍ／１２分で０.３６Ｍ−０.６Ｍ）ＨＰＬＣにより分離した。分解生成物をＮＡＰカラムで脱塩し、そしてＬＣ−ＥＳＩ−−ＭＳにより分析した。
【００５１】
実施例３
胃酸中でのインキュベーション
標準的な胃酸アッセイを準備するために、体重１８から２０ｇ（６から８週齢）のＦＶＢおよびＣ５７ＢＬ６マウスをCharles River Laboratories（Les Oncins, France）から入手した。ＣＯ２を用いて動物を屠殺し、そして次に胃を即座に回収した。胃液および胃の内容物を収集し、そしてプールし、次いで遠心ろ過装置（Ultrafree MC, Millipores）に負荷した。製造者の推奨にしたがってフィルターユニットを１０分間回転させた。マウス胃液に相当するろ液を回収し、等分し、そしてさらなる実験の前に凍結した。
各アッセイ用に、２０μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を９倍容量の前記されたような胃酸で希釈し、そして３７°Ｃで０、５、１０、１５、３０、６０および１２０分間インキュベートした。
【００５２】
実施例４
腸洗浄液中のインキュベーション
標準的な腸洗浄液アッセイを準備するために、雄Wistarラットを絶食させ、イソフルランで麻酔した。１０ｍｌ生理食塩水（０.５ｍｌ／分）、続いて水２０ｍｌ（１ｍｌ／分）で小腸（十二指腸、空腸、回腸）を原位置で灌流することにより腸洗浄液を入手した。収集された流出液を遠心し（３０００×ｇ、１５分、２２°Ｃ）、そして上澄を１.２μｍフィルターに通し、そして−２０°Ｃで保存した。
各アッセイ用に、２０μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を９倍容量の腸洗浄液で希釈し、そして３７°Ｃで０、１５、３０、６０、１８０および３６０分間インキュベートした。
【００５３】
実施例５
マウス肝ミクロソーム中のインキュベーション
標準的な肝ミクロソームアッセイでは、２５０μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液１０μｌに、タンパク質２０ｍｇ／ｍｌのマウス肝ミクロソーム（GEntest ４５２７０１ Charge １１）２５μｌ、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７.４）３６５μｌ、ＵＤＰＧＡコファクター（水中２４ｍＭ）５０μｌ、ＮＡＤＰＨ  ５０μｌを加えた。ｔ＝０分およびｔ＝６０分に凍結することによりインキュベーションをクエンチした。
【００５４】
実施例６
ラットＳ１２上澄中のインキュベーション
標準的なラットＳ１２上澄アッセイ用に２５０μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液１０μｌをタンパク質２９.９ｍｇ／ｍｌのラット肝臓Ｓ１２  １７μｌ、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７.４）３７３μｌ、ＵＤＰＧＡコファクター（水中２４ｍＭ）５０μｌ、ＮＡＤＰＨ  ５０μｌに加えた。ｔ＝０分およびｔ＝６０分に凍結することによりインキュベーションをクエンチした。
【００５５】
実施例７
マウス血清中のインキュベーション
標準的なマウス血清中インキュベーション用に２０μＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を９倍容量のネズミ血清（Harlanヌードマウス）で希釈し、そして３７°Ｃで０、１５、３０、６０、１８０および３６０分間インキュベートした。
【００５６】
実施例８
ゲル電気泳動安定性アッセイ
振盪およびドライアイス上で衝撃凍結（shock-frozen）の直後にインキュベーション溶液の１０μｌアリコートを取り、混合物を３７°Ｃでインキュベートし、そしてアリコートを種々の時点で衝撃凍結した。負荷バッファー（Elchrom Sc., Cham, Switzerland）３０μｌ（各々１５μｌ）中でアリコートを解凍し、そしてＳＦ５０ゲル（Elchrom Sc., Cham, Switzerland）上、１２０Ｖ、８°Ｃで２４０分間分離した。バンドをSYBR  Gold（Molecular Probes）で染色し、そしてBIORAD ChemiDoc（商標）ＸＲＳシステムで写真を撮った。
【００５７】
実施例９
細胞培養
１.５％ゼラチンコートした培養皿でＬ−グルタミンおよび１０％熱不活化ＦＣＳ（AMIMED, Switzerland）を補充したＤＭＥＭ高グルコース（４.５ｇ／ｌ）中でマウス不死化内皮細胞系ＭＳ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２２７９）を成長させた。HiPerfect（QIAGEN）を用いて製造者の手順にしたがって２４ウェル型式でＭＳ１細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした（４検体ずつ、ｓｉＲＮＡ最終濃度は１０ｎＭまたは指示されたとおりであった）。
【００５８】
実施例１０
ＦＡＣＳ分析
トランスフェクトされていない、およびｓｉＲＮＡトランスフェクトされたＭＳ１細胞をＦＡＣＳによりＶＥＧＦＲ２レベルに関して分析した。簡単には、２検体ずつまたは３検体ずつのウェルからの細胞をトリプシン処理し、各条件に関してプールし、次いでＰＢＳ＋１０％ＦＣＳで２回洗浄し、そして氷上で１０分間インキュベートした後にＲＰＥ抱合抗ＶＥＧＦＲ２  Ａｂ（１μｇ／１０６セル；Avas １２α１、BD Pharmingen）を添加した。ＲＰＥ標識したアイソタイプＩｇＧ２αをＦＡＣＳ対照（BD Pharmingen）として使用した。Cell Quest Software（Becton−Dickinson）を用いてFACScaliburでＦＡＣＳ獲得および分析を実施した。
【００５９】
実施例１１
動物研究
雌ＦＶＢマウス（６から８週齢）をCharles River Laboratories（Les Oncins, France）から入手した。耳のマーキングによりマウスを識別し、そして通常の条件下で群を維持し（ケージあたり動物６匹）、そして毎日観察した。処置群あたり６匹のマウスを使用し、そして動物保護のためのスイス動物保護法を厳密に順守して全ての動物実験を実施した。
【００６０】
参照チャンバーモデルは出版物に記載されている（例えばWood J, Bold G, Buchdunger E, et al. ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、血管内皮成長因子受容体チロシンキナーゼの新規のおよび強力な阻害剤は経口投与後に血管内皮成長因子誘起応答および腫瘍成長を損なう。Cancer Res ６０：２１７８−８９（２０００））。簡単には、ペルフルオロ−アルコキシ−Teflon（Teflon（登録商標）−ＰＦＡ、直径２１ｍｍ×８ｍｍ、５５０μｌ容量）から作られた多孔性組織チャンバーを、３μｇ／ｍｌ組換えヒトＶＥＧＦおよび指示されたようなｓｉＲＮＡを補充したまたは補充していない０.８％寒天（ＢＢＬ（登録商標）Ｎｒ. １１８４９、Becton Dickinson, Meylan, France）および２０Ｕ／ｍｌヘパリン（Novo Nordisk A／S, Bagsvaerd, Denmark）で充填した。充填手順の前に溶液を４２℃で維持した。３％イソフルラン（Forene（登録商標）、 Abbott AG, Cham, Switzerland）吸入を用いてマウスを麻酔した。皮下移植用に、尾の付け根に皮膚の小切開を作成して移植用外套針の挿入を可能にした。動物の背の小切開を通して無菌条件下でチャンバーを移植した。創傷クリップ（Autoclip ９ｍｍ  Clay Adams）により皮膚切開を閉じた。必要とされる用量に依存して、ｓｉＲＮＡを「注射用の品質等級」の０.９％生理食塩水で希釈し、次いで動物にｉ.ｐ.（２００μｌ／用量）または経管によるｐ.ｏ.（１００μｌ／用量）のいずれかで送達した。チャンバー移植の２から４時間前にマウスに最初の投与を行い；次いで毎日２日間処置した。特記しない場合、移植後３日にマウスを屠殺し、チャンバーを切除し、そして各移植片の周囲に形成された血管新生化された線維性組織を注意深く除去した。マウスの一般状態をモニタリングするために体重を用いた。一元配置分散分析、続いてダネット検定を用いて統計分析を行った。
【００６１】
実施例１２
Ｂ１６メラノーマ異種移植片モデル
抗血管形成治療に応答することが以前に同定されている同系Ｂ１６／ＢＬ６ネズミメラノーマモデル（例えばLaMontagne K, Littlewood−Evans A, Schnell C, O’Reilly T, Wyder L, Sanchez T, Probst B, Butler J, Wood A, Liau G, Billy E, Theuer A, Hla T, Wood J. 、ＦＴＹ７２０によるスフィンゴシン−１−リン酸受容体の拮抗作用が血管形成および腫瘍脈管化を阻害する。Cancer Res. ６６（１）：２２１−３１（２００６ Jan １））を使用して標準的なまたは修飾されたｓｉＲＮＡの抗腫瘍活性を評価した。腫瘍細胞（１μｌ、５×１０４／μｌ）を同系雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両耳の背側耳介に皮内注射した。原発腫瘍面積（ｍｍ２）の測定を腫瘍細胞接種後７、１４および２１日にコンピューター支援画像分析ソフトウェア（ＫＳ−４００  ３.０撮像システム、Zeiss）および具体的に設計されたマクロを用いて実施した。７日から２１日まで「注射用の品質等級」の０.９％生理食塩水で希釈したｓｉＲＮＡを、ｉ.ｐ.（２００μｌ／用量）または経管によるｐ.ｏ.（１００μｌ／用量）のいずれかでマウスに１日１回投与した。２１日にマウスを屠殺し、そして頭部リンパ節転移を重量測定し、そして次に凍結した。
これらの結果では、用いる実際のｓｉＲＮＡ配列および化学は表３を参照して決定できる。
【００６２】
マウス血清中野生型ｓｉＲＮＡを双方の３’末端から分解する
ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチド分解は大部分が３’エキソヌクレオチド分解性である。その終端での芳香族または親油性残基の導入によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾はそのヌクレオチド分解を遅延させる１７。この代謝経路もまたｓｉＲＮＡに優勢であるかどうかを検証するために、未修飾ｓｉＲＮＡ（野生型ｓｉＲＮＡ）をマウス血清中３７°Ｃで３時間までインキュベートした。
用いられた未修飾ｓｉＲＮＡ配列はｐＧｌ３−ｓｉＲＮＡであった（表３参照）。
混合物を強陰イオン交換ＨＰＬＣで、ｔ＝０分、ｔ＝３０分、ｔ＝１８０分で分析した。
【００６３】
図１ａ、１ｂおよび１ｃで示されるように、ｔ＝３０分でブラント末端化ｓｉＲＮＡに相当する明確なピークが観察された。ｔ＝３時間までに実質的な分解が観察された。図１ｄおよび１ｅはＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析により同定された代謝物を説明する。この分析により双方の鎖の３’オーバーハングおよび３’末端の最初に塩基対形成するリボヌクレオチドの喪失に相当するいくつかの代謝物の存在が明らかにされる。ガイド鎖の５’末端リボヌクレオチドの消化もまた観察された。
【００６４】
図１は血清中の未修飾ｓｉＲＮＡの分解経路を示唆する。ＤＮＡオーバーハングがもしかすると３’エキソヌクレアーゼにより最初に消化される。ＬＣ−ＭＳでは、双方の鎖の最初に塩基対形成する３’リボヌクレオチドおよびまたガイド鎖の最初に５’塩基対形成するリボヌクレオチドの喪失に相当するさらなる代謝物もまた検出された。
【００６５】
３’修飾ｓｉＲＮＡは胃腸管を通して安定である
２’−メトキシエチルリボヌクレオチドオーバーハング（ＭＯＥ  ｏ／ｈ  ｓｉＲＮＡ）を有するｓｉＲＮＡ、ヒドロキシプロポキシホスホジエステル部分でキャップされたブラント末端化ｓｉＲＮＡ（Ｃ３−ｓｉＲＮＡ）および各鎖の３’末端で２個の最初に塩基対形成するヌクレオチドが２’−メトキシエチルリボヌクレオチド残基により修飾されたヒドロキシプロポキシホスホジエステル３’キャップｓｉＲＮＡ（Ｃ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ）を合成した。これらの化合物を図２で図式的に説明する。
最初にｓｉＲＮＡをマウス胃酸中２時間インキュベートした（図３）。Ｃ３  ｓｉＲＮＡおよびＣ３−ＭＯＥ  sＲＮＡ場合、分解は観察されなかったが、野生型ｓｉＲＮＡの分解は３０分後に観察された。
【００６６】
ラットの腸洗浄液から得られた腸液中の安定性により１５分後にほぼ完了する野生型ｓｉＲＮＡの分解が明らかにされたが、ＭＯＥ  ｏ／ｈ  ｓｉＲＮＡ、Ｃ３−ｓｉＲＮＡおよびＣ３−Ｍｏｅ  ｓｉＲＮＡの親化合物は６０分間観察された（図４）。
肝臓中の安定性を肝ミクロソームアッセイおよびＳ１２アッセイ（代表的な肝臓細胞質酵素活性）を用いて評価した。結果を図５に示す。双方の場合で、インキュベーションの６０分後に分解は観察されなかった。
【００６７】
最後に、ｓｉＲＮＡをマウス血清中２μＭで、３７°Ｃで６時間までインキュベートすることにより試験した（図６の結果）。親化合物の安定性をゲル電気泳動により追跡した。修飾されたｓｉＲＮＡ（Ｃ３  ｓｉＲＮＡ、ＭＯＥ  ｏ／ｈ  ｓｉＲＮＡのＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ）の場合、有意な分解は観察されなかったが、野生型ｓｉＲＮＡでは観察された。
この研究は野生型（未修飾）ｓｉＲＮＡがマウス胃酸中およびマウス血清中で代謝されることを示している。３’末端修飾されたｓｉＲＮＡの場合、胃腸管で分解は観察されなかった。したがって３’修飾されたｓｉＲＮＡは野生型ｓｉＲＮＡよりも高い経口バイオアベイラビリティーを有している可能性がある。
【００６８】
全身送達された３’修飾されたｓｉＲＮＡはインビボ成長因子誘起血管形成モデルにおいてさらに活性である１８
最初に、修飾されたｓｉＲＮＡ（Ｃ３−ｓｉＲＮＡおよびＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡ）が標的遺伝子を下方調節する能力を、細胞内（in cellulo）で抗ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＭＳ１細胞のＶＥＧＦＲ２表面レベルを測定することにより検査した。
野生型ｓｉＲＮＡとして二つの抗ＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡ、Ｃ３−ｓｉＲＮＡおよびＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡのプールを腹腔内投与した。結果を図７に示す。プールされた野生型ｓｉＲＮＡは２５μｇ／マウス／日の高用量でＶＥＧＦ誘起の脈管化を有意に低減させた。Ｃ３−ｓｉＲＮＡでは５倍低い用量で同一レベルの阻害が観察された。Ｃ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡプールの場合、脈管化された組織重量の有意な低下が最低の０.２μｇ／マウス／日を含む全被験用量で観察された。
【００６９】
図８ａおよび８ｂは、腹腔内に与えられた場合、ＶＥＧＦＲ２−Ｃ３およびＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡの双方がマ１μｇ／マウス／日の用量を下回って活性であった。
Ｂ１６同種移植片メラノーマ腫瘍マウスモデルに腹腔内に与えられた（ｉ.ｐ.）抗ＶＥＧＦＲ２  Ｃ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡのインビボ試験。図９ａは、修飾されたＶＥＧＦＲ２−Ｃ３−ＭＯＥ−ｓｉＲＮＡでのｉ.ｐ.処置が腫瘍発達を有意に低減させることを示している。図９ｂもまたＶＥＧＦＲ２−Ｃ３−ＭＯＥ−ｓｉＲＮＡの２０μｇ／マウスのｉ.ｐ.注射の結果、腫瘍成長の有意な阻害に至ることを示している。
【００７０】
血管形成障害の処置のためのｓｉＲＮＡの経口送達
図１０は２０μｇ／マウス／日の用量で経口的に与えられたＶＥＧＦＲ２−Ｃ３−ＭＯＥ−ｓｉＲＮＡ１は脈管化重量を基底レベル（例えば成長因子誘導を伴わない重量）まで低下させたことを示している。用いられた実際のｓｉＲＮＡ配列は表３で言及される。
抗Ｔｉｅ２  Ｃ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡもまた成長因子誘起血管形成モデルにおいて腹腔内および経口送達の双方で試験した。図１１ａおよび１１ｂは経口的に与えられた、Ｔｉｅ２で志向される双方のＣ３−ＭＯＥ  ｓｉＲＮＡは２０μｇ／マウス／日で活性であったことを示している。用いられた実際のｓｉＲＮＡ配列は表３を参照して決定できる。
データにより、さらなる内部修飾を伴うかまたは伴わない３’末端修飾されたｓｉＲＮＡは経口投与時に妥当な用量で治療効果を実証できることが示される。
【００７１】
参照文献
１．  ａ）Y. Tomari et al. Genes and Development １９（２００５）, ５１７；ｂ）P. Shankar et al. JAMA １１（２００５）, １３６７；ｃ）Y. Dorsett et al. Nature Reviews ３（２００４）, ３１８
２．  ａ）P.D. Zamore et al. Cell １０１,（２０００）,  ２５；ｂ）S.M. Hammond et al.  Nature ４０４（２０００）,  ２９３
３．  ａ）G. Meister et al. Molecular Cell  １５（２００４）, １８５.
４．  S.M. Elbashir et al. Genes Dev. １５（２００１）, １８８.
５．  S.J. Reich et al. Molecular Vision ９（２００３）, ２１０.
６．  ａ）Dorn et al. Nucleic Acids Research ３２（２００４）, e４９；ｂ）D. R.Thakker et al. PNAS １０１（２００４）, １７２７０；ｃ）D.R. Thakker et al. Molecular Psychiatry  １０（２００５）, ７１４
７．  V. Bitko et al. Nature Medicine １１（２００５）, ５０.
８．  E. Song et al. Nature Medicine ９（２００３）, ３４７.
９．  D.A.Braasch et al. Biochemistry ４２（２００３）, ７９６７.
１０．  Harborth, Antisense Nucleic Acid Drug Devt, ２００３
１１．  A.H.S. Hall et al. Nucleic Acids Research ３２（２００４）, ５９９１.
１２．  M. Amarzguioui et al. Nucleic Acids Research ３１（２００３）, ５８９.
１３．  F. Czauderna et al. Nucleic Acids Research ３１（２００３）, ２７０５.
１４．  T. Prakash et al. Journal of Medicinal Chemistry  ４８（２００５）,  ４２４７.
１５．  J. Elmen et al. Nucleic Acids Research ３３（２００５）, ４３９.
１６．  A.S. Boutorin, L.V. Guskova, E.M. Ivanova, N.D. Kobetz, V.F. Zafytova, A.S. Ryte, L.V. Yurchenko and V.V. Vlassov FEBS Lett. ２５４（１９８９）, p. １２９
１７．  J. Wood et al. Cancer Research ６０（２０００）, ２１７８.
１８．  K. LaMontagne et al. Cancer Res. ６６（２００６）, ２２１.
【図１ａ】
2013128488.tif 000041
【図１ｂ】
2013128488.tif 000042
【図１ｃ】
2013128488.tif 000043
【図１ｄ】
2013128488.tif 000044
【図１ｅ】
2013128488.tif 000045
【図２】
2013128488.tif 000046
【図３】
2013128488.tif 000047
【図４】
2013128488.tif 000048
【図５】
2013128488.tif 000049
【図６】
2013128488.tif 000050
【図７】
2013128488.tif 000051
【図８ａ】
2013128488.tif 000052
【図８ｂ】
2013128488.tif 000053
【図９ａ】
2013128488.tif 000054
【図９ｂ】
2013128488.tif 000055
【図１０】
2013128488.tif 000056
【図１１ａ】
2013128488.tif 000057
【図１１ｂ】
2013128488.tif 000058
【配列表】
2013128488000001.app