(57)【要約】【課題】ＥＬＩＳＡ法を利用して、口蹄疫ウイルスを血清型特異的に検出する方法を提供する。【解決手段】本発明の方法は、口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合する抗体、または口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型について特異的に検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体、または口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型について特異的に検出する、方法。
【請求項２】
口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ａ、ＣおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、ならびに口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＣおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型について特異的に検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記抗体のいずれもがモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記抗体のいずれもがポリクローナル抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない上記抗体が、ハイブリドーマの抗口蹄疫ウイルス血清型Ｃ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３Ｆ１（自己寄託株）によって産生される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない上記抗体が、ハイブリドーマの抗口蹄疫ウイルス血清型Ａｓｉａ１  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １２Ｃ７（自己寄託株）によって産生される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、または口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体が固定されている基材を備えている、ＥＬＩＳＡキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、当該抗体を用いて口蹄疫ウイルスを血清型に分けて検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫ウイルス（foot and mouth disease virus：ＦＭＤＶ）は、家畜の伝染病の１つである。口蹄疫ウイルスは、鯨偶蹄目（例えばウシ、ブタ、シカ、ヒツジ、ヤギなど）に属する動物を主な宿主としており、日本ではその感染疾患が家畜伝染病予防法において法定伝染病に指定されている。口蹄疫ウイルスは、周囲環境において容易に不活性化しないため伝播性が高く、感染した家畜の生産性を著しく低下させ、感染した幼獣において高い致死率を示す。特に高い伝播性に起因して、口蹄疫ウイルスに感染した家畜は、感染が確認され次第、殺処分に処される。また、口蹄疫ウイルスに感染した家畜が発見された地域、国家には家畜の移動制限が加えられるため、口蹄疫ウイルスは、畜産業に非常な経済的打撃を与え得る病原体として、世界的に認識されている。
【０００３】
口蹄疫ウイルスは、７つの血清型（Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３）に分類される。これらのうち血清型ＳＡＴ１、ＳＡＴ２およびＳＡＴ３は、アフリカのみで存在が確認されている。よって、他の地域では、血清型Ｏ、Ａ、ＣおよびＡｓｉａ１しか存在が確認されていない。
【０００４】
日本では口蹄疫ウイルスに感染した個体は、２０００年までおよそ１世紀にわたって確認されていなかった。しかし、２０００年および２０１０年に、口蹄疫ウイルスに感染した個体が確認された。このため、口蹄疫の流行に対する対処法を確立することの重要性が明らかに高まっている。上記対処法として最も重要なのは、感染の疑いのある家畜が、口蹄疫ウイルスに感染しているか否か、感染している場合にはその血清型が上記４つのうちのいずれであるかを決定することである。
【０００５】
一般的な決定方法としては、ＲＴ−ＰＣＲによって口蹄疫ウイルスの遺伝子を検出する方法である。この方法では、遺伝子の増幅が認められれば、陽性（口蹄疫ウイルスに感染している）と決定されるが、血清型を決定するには他の方法によってさらに試験する必要がある。よって、迅速に血清型を決定するという点では、単独にＲＴ−ＰＣＲを利用する方法は好ましくない。そこで、ＥＬＩＳＡを利用して口蹄疫ウイルスの血清型を決定する方法が検討されている（例えば、本発明者らによる非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】JOUNAL OF CLINICAL Microbiology, NOV. 2009, p.3663-3668
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、現状では特定の血清型の口蹄疫ウイルスのいずれかと特異的に結合し、他の血清型の口蹄疫ウイルスと結合しない抗体は、２種（血清型ＯまたはＡに特異的な抗体）しか見出されていない。よって、現状では、ＥＬＩＳＡによって血清型ＯおよびＡ以外の血清型の口蹄疫ウイルスを検出できない。このため、１ステップにおいて、口蹄疫ウイルスに対する感染の有無および血清型を決定できない。
【０００８】
よって、血清型ＣまたはＡｓｉａ１の口蹄疫ウイルスを検出可能なＥＬＩＳＡ法の開発が求められている。
【０００９】
以上の課題を鑑みて、本発明の目的は、血清型ＣまたはＡｓｉａ１の口蹄疫ウイルスのみを検出し得るＥＬＩＳＡ法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、本発明の方法は、口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体、または口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型について特異的に検出する。
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明の方法は、口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ａ、ＣおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、ならびに口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＣおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型について特異的に検出する。
【００１２】
上記方法において、上記抗体のいずれもがモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１３】
上記方法において、上記抗体のいずれもがポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００１４】
上記方法において、口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない上記抗体が、ハイブリドーマの抗口蹄疫ウイルス血清型Ｃ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３Ｆ１（自己寄託株）によって産生されることが好ましい。
【００１５】
上記方法において、口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない上記抗体が、ハイブリドーマの抗口蹄疫ウイルス血清型Ａｓｉａ１  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １２Ｃ７（自己寄託株）によって産生されることが好ましい。
【００１６】
上記課題を解決するために、本発明のＥＬＩＳＡキットは、口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、または口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体が固定されている基材を備えている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、血清型Ｃおよび血清型Ａｓｉａ１の口蹄疫ウイルスを、他の血清型のウイルスと区別して検出可能であるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のモノクローナル抗体および従来のモノクローナル抗体の抗原特異性の違いを示す図である。
【図２】本発明に係るＥＬＩＳＡを用いて口蹄疫ウイルスを検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の詳細について以下に説明する。
【００２０】
本発明の方法は、口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体、または口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型について特異的に検出する。したがって、本発明の方法を用いれば、他の血清型と交差反応することなく、血清型Ａｓｉａ１またはＣの口蹄疫ウイルスを検出可能である。
【００２１】
本発明の方法は、口蹄疫ウイルスの血清型Ｃと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１と特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＡおよびＣと特異的に結合しない抗体、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ａ、ＣおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体、ならびに口蹄疫ウイルスの血清型Ａと特異的に結合し、口蹄疫ウイルスの血清型Ｏ、ＣおよびＡｓｉａ１と特異的に結合しない抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型について特異的に検出することが特に好ましい。このような構成であれば、１ステップのＥＬＩＳＡアッセイによって、アッセイの対象に含まれている病原体が、口蹄疫ウイルスであるか、４つの血清型のいずれであるかを同時に決定することができる。
【００２２】
本発明の方法に使用される抗体はいずれも、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。しかし、より特異的な反応性および交差反応性を示すおそれの少なさという観点から、本発明の方法に使用される抗体はいずれもモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００２３】
本発明の方法に使用される抗体は、ハイブリドーマの抗口蹄疫ウイルス血清型Ａｓｉａ１  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １２Ｃ７（自己寄託株）によって産生されることが好ましい。また、本発明の抗体は、ハイブリドーマの抗口蹄疫ウイルス血清型Ｃ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３Ｆ１（自己寄託株）によって産生されることが好ましい。
【００２４】
ここで、これらのハイブリドーマはいずれも、ＢＳＬ３以上の病原体が付着している可能性が否定できないものとして、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターが行う特許出願に係る微生物の寄託等に関する規定第４条第１項第一号の規定に該当するため、同センターより受託証を交付できない旨が通知されている（寄託受託証不交付通知書の通知年月日：平成２３年８月１５日）。そこで、出願人は、これらのハイブリドーマを自己寄託株として自ら保存している。
【００２５】
また、口蹄疫ウイルスは、上述のように、家畜伝染病予防法において法定伝染病に指定されている疾患を直接的に引き起こす病原体である。さらに、これらのハイブリドーマおよびこれらから産生された抗体は、口蹄疫ウイルスが付着している可能性を完全に否定することができない。したがって、現時点では、農林水産省によって取扱いの許可を受けている独立行政法人農業・食品産業技術研究機構（出願人）の施設外に、これらのハイブリドーマおよび抗体を持ち出すことはできない。
【００２６】
以上のように、本発明の方法に使用される抗体およびハイブリドーマは、公衆の安全および法的規制に基づいて、適切と判断される第三者のみにしか分譲されず、また上記施設外への持ち出すことはできない。
【００２７】
本発明の方法は、上述のようにＥＬＩＳＡ法にしたがって、口蹄疫ウイルスを血清型特異的に検出する方法である。したがって、ＥＬＩＳＡ法に適用可能な、固相を提供し得る任意の基材に対して上述のような抗体を適宜付着させることによって、本発明の方法を実施し得る。つまり、本発明はまた、口蹄疫ウイルスを血清型特異的に検出可能な抗体が付着させられている基材を備えている、ＥＬＩＳＡキットに関する。
【００２８】
上記基材としては、複数のウェルを備えているプレートが一般的である。しかし、所望の抗体を付着させた後に、当該抗体に口蹄疫ウイルスを反応させ得、これに続いて標識化合物と結合されている口蹄疫ウイルスと特異的に結合する抗体を口蹄疫ウイルスに反応させ得る基材であれば、基材の種類は特に限定されない。
【００２９】
また、後述の実施例に述べられているＭＳＤ（monoclonal antibody based sandwich direct）−ＥＬＩＳＡは、本発明の方法として最も好適な手法である。よって、本発明の方法に使用され得る抗体を利用して実施可能な他のＥＬＩＳＡ法は、本発明の方法に包含される。
【実施例】
【００３０】
〔モノクローナル抗体（１３Ｆ１および１２Ｃ７）の作製〕
（ハイブリドーマの作製）
口蹄疫ウイルスのＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ株およびＣ／ＰＨＩ／７／８４株をＩＢ−ＳＲ−２細胞に接種し、一晩にわたって回転培養した。回収した培養液を４０００Ｇにおいて３０分間にわたって遠心した後に、上清を回収した。上清を飽和硫化アンモニウム溶液と等量混和し、一晩にわたって４℃において撹拌することによってウイルスを析出させた。析出させたウイルスを、４０００Ｇにおいて３０分間にわたって遠心して沈殿させ、上清を捨ててから適量のＰＢＳを用いて懸濁した。再び１７００００Ｇ（３２０００ｒｐｍ）において２時間にわたって遠心し、上清を除去し、１ｍｌのＰＢＳを用いてウイルスを懸濁した。シュークロース密度勾配（１５〜４５％）にウイルスの懸濁液を乗せ、２７００００Ｇ（４１０００ｒｐｍ）において１．５時間にわたって遠心を行い、所定の位置にあらわれた目的のバンドを回収することによって、１４６Ｓの完全粒子を精製した。
【００３１】
８〜１２週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に、上述のように精製した口蹄疫ウイルスのＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ株およびＣ／ＰＨＩ／７／８４株の完全粒子をそれぞれ接種した。初回免疫ではフロイントコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）および精製したウイルス液の等量混合物、追加免疫ではフロイントインコンプリートアジュバント（ヤトロン社製）および精製したウイルス液の等量混合物を、連結針を用いてミセル化させてエマルションを生成した。最終免疫後にマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とをポリエチレングリコール４０００（メルク社製）を用いて融合させ、ＨＡＴ培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含んでいる２０％ＦＣＳのＲＰＭＩ−１６４０培地（ニッスイ））を用いて９６ウェルプレートにおいて培養した。２週間後からはＨＴ選択培地（０．１ｍＭのヒポキサンチン１６μＭのチミジンを含んでいる２０％ＦＣＳのＲＰＭＩ−１６４０倍地（ニッスイ））を用いて培養した。
【００３２】
上述のように培養することによって、ハイブリドーマのコロニーを形成させ、ＥＬＩＳＡおよび口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色によって目的のモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングの詳細は以下の通りである。
【００３３】
ＥＬＩＳＡにおいて、ウサギ抗口蹄疫ウイルス抗体を、固相に吸着させ、血清型の口蹄疫ウイルスの完全粒子（Ｃ／ＰＨＩ／７／８４株またはＡｓｉａ１  Ｓｈａｍｉｒ株のいずれか）と反応させた。次いで、ウイルスを取り除いてからハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた。そして、培養上清を取り除いてからＨＲＰ標識したマウス抗ＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させて、吸光度を測定した。
【００３４】
口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色において、複数のウェルを有しているプレートにＩＢ−ＳＲ−２細胞を播種した後に口蹄疫ウイルスを血清型に分けて接種した。感染後の適当な時間（感染細胞がはがれない程度）に培養液を捨て、冷却したアセトンを用いて感染細胞を固定した。スクリーニングの各タイムポイントにおいて使用するまで、各プレートを−８０℃に保存しておいた。つまり、スクリーニング対象のハイブリドーマの１つに対して４種類の血清型に必要な分だけ感染細胞を準備した。保存しておいたプレートにスクリーニングするハイブリドーマの培養上清を加えてインキュベートした。上清を捨ててからＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応させた。標識抗体を捨ててから発色基質と反応させ、顕微鏡下において抗体の有無を判定した。
【００３５】
培養上清に抗体が存在しているハイブリドーマをＥＬＩＳＡによって特定し、さらにＥＬＩＳＡによるスクリーニングの結果が非特異的な反応ではないことを確認するために、口蹄疫ウイルス感染細胞を用いた免疫染色によって再度スクリーニングした。
【００３６】
スクリーニングによって選択したハイブリドーマを、標準的な方法にしたがってクローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を安定して産生している２種類のハイブリドーマを確立した。ハイブリドーマのそれぞれを抗口蹄疫ウイルス血清型Ａｓｉａ１  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １２Ｃ７（自己寄託株）、および抗口蹄疫ウイルス血清型Ｃ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３Ｆ１（自己寄託株）と名づけた。また、これらのハイブリドーマによって産生されているモノクローナル抗体のそれぞれを、１２Ｃ７（血清型Ａｓｉａ１の口蹄疫ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体）および１３Ｆ１（血清型Ｃの口蹄疫ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体）と名づけた。
【００３７】
（１２Ｃ７および１３Ｆ１の性質決定）
（１）ＥＬＩＳＡ法、（２）ウイルス中和試験および（３）口蹄疫感染細胞の免疫染色によって、得られたモノクローナル抗体の抗原特性および中和活性について調べた。（１）〜（３）は、以下の材料および手順を用いて行った。
【００３８】
（１）ＥＬＩＳＡ法
スクリーニングにおけるＥＬＩＳＡと同様の手順で行った。比較対象のモノクローナル抗体として、血清型Ｏおよび血清型Ａｓｉａ１の口蹄疫ウイルスと交差反応性を示す抗体（７Ｃ２）を使用した。以下の（２）および（３）についても同様に、７Ｃ２を比較対象として使用した。７Ｃ２については、JOUNAL OF CLINICAL Microbiology, NOV. 2009, p.3663-3668を参照すればよい。
【００３９】
（２）ウイルス中和試験
感染用の細胞としてＩＢ−ＳＲ−２細胞を使用した。定法にしたがって、ハイブリドーマの培養上清もしくは増殖用の培地のみ、およびウイルス液の混合液をインキュベートした後に、細胞に接種した。感染後５日目に染色して、培養上清とのウイルス液の混合およびインキュベーションによって、ウイルスの増殖を抑制したか否かを評価した。
【００４０】
（３）口蹄疫感染細胞の免疫染色
スクリーニングにおける免疫染色と同様の手順で行った。
【００４１】
（１）〜（３）の結果を図１に示す。図１に示すように、上述のようにして得られたモノクローナル抗体は、いずれも口蹄疫ウイルスの血清型Ｃまたは血清型Ａｓｉａ１のみを特異的に認識する。また、１２Ｃ７は口蹄疫ウイルスの血清型Ａｓｉａ１に対して中和活性を示した。
【００４２】
〔ＭＳＤ−ＥＬＩＳＡ〕
（使用する抗体）
本アッセイには、以下の６種の抗体を使用する。以降の記載において、抗体の種類は下記の番号と対応している。
１．血清型Ｏの口蹄疫ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体（７０Ｃ４）
２．血清型Ａの口蹄疫ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体（１６Ｃ６）
３．血清型Ｃの口蹄疫ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体（１３Ｆ１）
４．血清型Ａｓｉａ１の口蹄疫ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体（１２Ｃ７）
５．血清型Ｏ、Ａ、ＣおよびＡｓｉａ１のいずれの口蹄疫ウイルスも認識するモノクローナル抗体（７１Ｆ２）
６．血清型ＯおよびＡｓｉａ１の口蹄疫ウイルスと交差反応するモノクローナル抗体（７Ｃ２）
７．すべての血清型の口蹄疫ウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体（１Ｈ５）
抗体１、２および５〜７については、JOUNAL OF CLINICAL Microbiology, NOV. 2009, p.3663-3668を参照すればよい。
【００４３】
（モノクローナル抗体の精製）
使用するモノクローナル抗体をプロテインＧアフィニティーカラム（MAb Trap Kit; GH Healthcare 17-1128-01）にかけて、アッセイに使用するためのＩｇＧ画分のみを精製した。
【００４４】
（抗体懸濁液における緩衝液の置換）
抗体の精製によって得られたＩｇＧ画分を含んでいる抗体懸濁液における緩衝液を、Amicon ultra Centrifugal filter units(Millipore社、商品コード：UFC805024)を用いて、０．０１ＭのＰＢＳに置換した。
【００４５】
（ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体の作製）
Peroxidase Labeling Kit-SH（同仁化学、商品コード：LK09）を用いて、抗体１〜６をペルオキシダーゼによって標識した。
【００４６】
（ＭＳＤ−ＥＬＩＳＡの評価）
捕捉抗体としての抗体７を０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）によって０．２μｇ／５０μｌに希釈し、９６ウェルプレート（Immulon II HB Thermo）の各ウェルに５０μｌずつを分注し、４℃において一晩にわたって固相化させた。洗浄液（３００μｌ／ウェルの０．００２ＭのＰＢＳ）を用いて４回にわたって洗浄した後、異なる血清型の口蹄疫ウイルスを含んでいるサンプルを５０μｌずつ各ウェルに加え、１００ｒｐｍにおいて振とうしながら３７℃において１時間にわたって反応させた。ここで、０．０１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に０．０５％（ｖ/ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を加えたＡ液を、陰性対照として１つのウェルに入れておいた。固相化後の洗浄と同様に洗浄した後、Ｂ液（Ａ液に８％のスキムミルクが加えられている溶液）を各ウェルに加えて、室温において２０分間にわたって各ウェルをブロッキングした。Ｂ液を捨ててから洗浄せずに、Ｂ液を用いて５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識した抗体１〜６の５０μｌをウェルに加え、３７℃において４５分間にわたって反応させた。上記洗浄液を用いて８回にわたって洗浄した後、５０ｍＬの０．０５Ｍのリン酸クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に３０ｍｇのＯＰＤおよび３％(ｗ/ｖ)の過酸化水素を加えた発色基質を各ウェルに対して５０μｌずつ加えた。室温の暗所において１５分間にわたって反応させた後に、５０μｌの１．２５Ｍの硫酸を用いて反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによって４９２ｎｍおよび６９０ｎｍの波長を測定した。結果を図２に示す。
【００４７】
図２に示すよう、抗体１〜４は、それぞれが特異的に認識する血清型の口蹄疫ウイルスのみと反応していることが明らかである。これに対して、抗体６は、血清型Ａｓｉａ１だけでなく血清型Ｏとも反応していた。よって、本発明に係るＭＳＤ−ＥＬＩＳＡを用いれば、検出対象である口蹄疫ウイルスの血清型を迅速かつ正確に決定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明は、家畜に感染する口蹄疫ウイルスを血清型に分けて検出可能な技術に利用することができる。
【図１】
2013050356.tif 000002
【図２】
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