(57)【要約】      （修正有）【課題】ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症による感染症に対する予防作用を有する安全性の高い魚類用ワクチンを提供する。【解決手段】Ｎｏｃａｒｄｉａｓｅｒｉｏｌａｅ由来の、特定のアミノ酸配列、又はこれらの部分配列、若しくはこれらのアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、これらのアミノ酸配列の部分配列、を有するタンパク質。該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクターを含有する形質転換体、並びに、前記新規タンパク質、前記新規ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかを含有し、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有する安全性の高い魚類用ワクチン。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有することを特徴とする下記（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のタンパク質。
（Ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質、
（Ｃ）前記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質、
（Ｆ）前記（Ｄ）及び（Ｅ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
（Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質が、配列番号：６及び配列番号：８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有することを特徴とする下記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）前記（ｄ）及び（ｅ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｇ）配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｈ）配列番号：３で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡ、
（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡ、
（ｋ）前記（ａ）から（ｊ）のいずれかのＤＮＡ及び前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
（ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列が、配列番号：５及び配列番号：７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡである請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３から４のいずれかに記載のＤＮＡを有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項７】
請求項１から２のいずれかに記載のタンパク質を含有することを特徴とする魚類用ワクチン。
【請求項８】
請求項３から４のいずれかに記載のＤＮＡを含有することを特徴とする魚類用ワクチン。
【請求項９】
請求項５に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする魚類用ワクチン。
【請求項１０】
請求項６に記載の形質転換体を含有することを特徴とする魚類用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクターを含有する形質転換体、並びに、前記新規タンパク質、前記新規ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかを含有する魚類用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、水産資源保護などの観点から魚類の養殖の必要性がますます高くなっている。そのため魚類は、高密度で養殖されることが多く、飼育される環境の悪化が進み、細菌感染症が多発する傾向がある。これらの中でも、養殖のハマチ、ブリ、カンパチなどにおいてはノカルジア症の被害が問題となっている。
【０００３】
ノカルジア症は、ノカルジア属に属する細菌を原因菌とする感染症であり、ノカルジア症に感染した魚体は、外観上、体外上部に小隆起が生じ、魚体を開くと、内臓各部に白色の粟粒結節が認められる。症状の進行に伴い、腫瘍内部の膿が増大し、潰瘍となり、死に至ることがある感染症である（例えば、非特許文献１参照）。その感染速度も非常に速いものであり、重大な問題となっている。
【０００４】
魚類の細菌感染症への対応策として、抗生物質や合成抗菌剤が使用されているが、これらの薬剤は、耐性菌の出願や細菌の多剤耐性菌化によって効力を失うことがあり、また養殖魚肉中に抗菌剤が残存するため、安全性の面で問題である。
【０００５】
この問題に対し、広範囲にわたる魚病原因菌への抗菌作用を有し、魚介類に適用して魚病の予防及び治療をすることができる甘草抽出物由来の魚病原因菌に対する抗菌剤（特許文献１参照）や、魚類表面又は内部に付着乃至繁殖する細菌類の駆除を目的とした、有機酸を主成分とする魚類の病原性細菌類の駆除剤（特許文献２参照）などが提案されている。
しかし、これらの抗菌剤や駆除剤は、相当長期間の連続投薬を行わなければ効果が期待できず、経済的理由などから使用されておらず、養殖現場においては、病死魚の除去処分、収容尾数の分散、栄養の改善などの消極的処置しかとられていないのが現状である。
【０００６】
したがって、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症に対して優れた予防作用を有し、安全性の高い新たな魚類用ワクチンの提供が強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２９２３８５号公報
【特許文献２】特開２００７−２５４４６３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】狩谷  貞治ら，  魚病研究，  １９６８．７，  ３（１），  ｐ．１６〜２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症の原因菌であるノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクターを含有する形質転換体、並びに、前記新規タンパク質、前記新規ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかを含有し、ノカルジア属の細菌に対して優れた予防作用を有する安全性の高い魚類用ワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明において、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有することを特徴とする下記（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のタンパク質である。
（Ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質、
（Ｃ）前記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、
（Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質、
（Ｆ）前記（Ｄ）及び（Ｅ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
＜２＞  （Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質が、配列番号：６及び配列番号：８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するタンパク質である前記＜１＞に記載のタンパク質である。
＜３＞  ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有することを特徴とする下記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）前記（ｄ）及び（ｅ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｇ）配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｈ）配列番号：３で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡ、
（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡ、
（ｋ）前記（ａ）から（ｊ）のいずれかのＤＮＡ及び前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
＜４＞  （ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列が、配列番号：５及び配列番号：７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡである前記＜３＞に記載のＤＮＡである。
＜５＞  前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載のＤＮＡを有することを特徴とする組換えベクターである。
＜６＞  前記＜５＞に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体である。
＜７＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のタンパク質を含有することを特徴とする魚類用ワクチンである。
＜８＞  前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載のＤＮＡを含有することを特徴とする魚類用ワクチンである。
＜９＞  前記＜５＞に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする魚類用ワクチンである。
＜１０＞  前記＜６＞に記載の形質転換体を含有することを特徴とする魚類用ワクチンである。
＜１１＞  前記＜７＞から＜１０＞のいずれかに記載の魚類用ワクチンにより誘導されることを特徴とする抗体である。
＜１２＞  前記＜１１＞に記載の抗体を含有することを特徴とする医薬組成物である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症の原因菌であるノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクターを含有する形質転換体、並びに、前記新規タンパク質、前記新規ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかを含有し、ノカルジア属の細菌に対して優れた予防作用を有する安全性の高い魚類用ワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、試験例１においてノカルジア属細菌による攻撃後の各日数における生存率の結果を示す図である。縦軸：生存率（％）、横軸：攻撃後の日数（日）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質）
本発明の新規タンパク質は、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質である。前記タンパク質には、下記（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のタンパク質が含まれる。
（Ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質、（Ｃ）前記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、（Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質、（Ｆ）前記（Ｄ）及び（Ｅ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
【００１４】
（Ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、（Ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質であってもよく、（Ｃ）前記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、前記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、（Ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、（Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質であってもよく、（Ｆ）前記（Ｄ）及び（Ｅ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、前記（Ｄ）及び（Ｅ）のいずれかのタンパク質において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００１５】
本発明において、「アミノ酸配列の部分配列」とは、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記（Ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質又は前記（Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質の部分配列としては、８０アミノ酸残基〜１８０アミノ酸残基が好ましく、９０アミノ酸残基〜１７３アミノ酸残基がより好ましい。
これらの中でも、前記（Ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の、第２７番目のアミノ酸残基から第１９９番目のアミノ酸残基、又は、第１１０番目のアミノ酸残基から第１９９番目のアミノ酸残基を有することが好ましく、配列番号：６で表されるアミノ酸配列又は配列番号：８で表されるアミノ酸配列を有することが更に好ましく、配列番号：６で表されるアミノ酸配列又は配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなることが特に好ましい。
【００１６】
本発明において、「数個のアミノ酸」とは、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、アミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加される領域としては、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
なお、前記タンパク質は、前記（Ａ）から（Ｆ）のいずれかに記載のタンパク質におけるアミノ酸配列と配列同一性を有するものであってもよい。
前記配列同一性としては、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
【００１８】
前記アミノ酸配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：ｐ．２２６４−２２６８，  １９９０、及びＰｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：ｐ．５８７３−５８７７，  １９９３参照）により決定することができる。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌらによって開発されている（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：ｐ．４０３−４１０，  １９９０参照)。これらは、例えば、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）で利用することができる。
前記アミノ酸配列の同一性を分析するＢＬＡＳＴプログラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムが挙げられる。前記プログラムを用いて配列同一性を分析のする際のパラメーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デフォルト値を用いることができる。
【００１９】
＜アミノ酸配列の決定＞
前記タンパク質のアミノ酸配列を決定する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から適宜選択することができ、例えば、プロテインシーケンサー（例えば、株式会社島津製作所製）を用いて決定する方法、塩基配列から遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｙｘ（登録商標）−ＭＡＣ、株式会社ゼネティックス製）を用いて決定する方法などが挙げられる。
【００２０】
＜製造方法＞
前記タンパク質の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ノカルジア属の細菌の培養物から製造する方法（以下、「第１の形態」と称することがある。）、後述する本発明の形質転換体を用いて製造する方法（以下、「第２の形態」と称することがある。）などが挙げられる。
【００２１】
＜＜第１の形態＞＞
前記タンパク質の製造方法の第１の形態は、前記ノカルジア属の細菌を培養する工程（培養工程）と、前記培養物から前記タンパク質を採取する工程（採取工程）とを少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００２２】
−培養工程−
前記培養工程は、前記ノカルジア属の細菌を培養する工程である。
前記ノカルジア属の細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノカルジア・セリオレ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、ノカルジア  アステロイデス（Ｎ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア  ガーデニー（Ｎ．ｇａｒｄｎｅｉ）、ノカルジア  カンパチ（Ｎ．Ｋａｍｐａｃｈｉ）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記ノカルジア属の細菌は、ノカルジア・セリオレが好ましい。
【００２３】
前記ノカルジア属の細菌を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、野外から採取した魚類の皮下組織、筋肉、鰓、鰓蓋、内臓器官等の魚体内外から分離する方法などが挙げられる。また、前記ノカルジア属の細菌は、市販品を用いてもよく、各種微生物の保存機関などから入手したものを用いてもよい。
前記市販品の具体的な例としては、ＡＴＣＣ、各県の水産試験場などが挙げられる。前記保存機関から入手可能な前記ノカルジア属の細菌としては、例えば、ＡＴＣＣ４３９９３などが挙げられる。なお、前記ノカルジア属の細菌は、前記入手後、数回継代培養したものを用いてもよい。
前記分離したノカルジア属の細菌は、例えば、後述する形態的、生化学的特徴や、遺伝学的特徴によりノカルジア属の細菌であることを同定することができる。
【００２４】
前記培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、振盪培養法、静置培養法などが挙げられる。これらの中でも、前記ノカルジア属の細菌は好気性菌である観点から、振盪培養法が好ましい。
【００２５】
前記培養に用いる培地としては、特に制限はなく、公知の栄養培地の中から適宜選択することができる。前記培地は、液体培地であってもよく、寒天培地であってもよいが、液体培地が、前記タンパク質を多く製造できる点で好ましい。
前記栄養培地に添加する栄養源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、窒素源、炭素源、血清などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記窒素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
前記炭素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン等の炭水化物や脂肪などが挙げられる。
前記血清としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウシ胎児血清（ＢＳＡ）、ブタ血清などが挙げられる。
更に、前記窒素源、前記炭素源、前記血清以外にも、食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を培地に添加することもでき、その他必要に応じて微量の金属塩を培地に添加することもできる。
これらの材料は、前記ノカルジア属の細菌が利用し得るものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。
【００２６】
前記培地が無機塩を含有する場合、その塩濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０質量％〜４．５質量％が好ましく、０質量％〜０．５質量％がより好ましい。前記塩濃度が４．５質量％を超えると、前記ノカルジア属の細菌が十分に増殖せず、前記タンパク質を得ることができないことがある。
【００２７】
前記公知の栄養培地の具体的な例としては、小川培地、サブロー（ＳＡＢＯＵＲＡＵＤ）培地、ベネット（ＢＥＮＮＥＴＴ’Ｓ）培地、サウトン（ＳＡＵＴＯＮ）培地、デュボス（ＤＵＢＯＳ）培地、キルヒナー（ＫＩＲＣＨＩＮＥＲ）培地、ハートインフュージョン（Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地、ＴＳＢ（トリプケースソイブロス）培地、ＰＰＬＯ（マイコプラズマ寒天基礎）培地、ＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地などが挙げられる。
【００２８】
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜３７℃が好ましく、３０℃〜２０℃がより好ましく、２３℃〜２７℃が更に好ましい。前記温度が、１０℃未満又は３７℃を超えると、前記ノカルジア属の細菌が十分に増殖せず、前記タンパク質を得ることができないことがある。一方、前記温度が前記更に好ましい範囲であると、前記ノカルジア属の細菌が好適に増殖することができ、前記タンパク質を効率よく製造できる点で有利である。
【００２９】
前記培養の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１２時間〜１２０時間が好ましく、１８時間〜９６時間がより好ましい。前記培養の時間が１２時間未満であると、前記ノカルジア属の細菌が十分に増殖せず、前記タンパク質を得ることができないことがあり、１２０時間を超えると、菌体量が増えすぎて菌が死滅してしまうことがあり製造効率が悪くなることや、製造された前記タンパク質が分解されてしまうことがある。一方、前記培養の時間が前記より好ましい範囲であると、前記タンパク質を効率よく製造できる点で有利である。
【００３０】
−−形態的、生化学的特徴−−
前記ノカルジア属の細菌の一般的な菌体的性状は、以下のとおりである。
前記ノカルジア属の細菌は、魚類の患部から常法により採取し、３質量％小川培地に接種し、２５℃で培養すると、４日間〜５日間後にコロニーが出現し、約２週間培養後では、淡黄色〜橙黄色に変化をする、いぼ状に隆起した緻密な固いコロニーを形成する。コロニー出現初期は、表面平滑で周辺は円形を画くが、成長するにつれて表面にはしわが生じ、周辺は、鋸歯状となる。このコロニーを小川培地を用いて再分離培養し、純粋培養すると、分枝した糸状となる。気中菌糸を有し、非運動性である。長期培養した菌体においては、長桿状、短桿状、球状などの形態が認められる多形態である。液体培地で培養すると、液面上層によく成育する好気性菌である。ＺＩＥＨＬ−ＮＥＥＬＳＥＮ染色で弱抗酸性を示し、グラム陽性である。その他の菌体学的特徴は、狩谷  貞治ら，  魚病研究，  １９６８．７，  ３（１），  ｐ．１６〜２３に詳しく説明されている。
【００３１】
また、前記ノカルジア属の細菌は、ＰＣＲ法などにより遺伝学的特徴を調べることで同定することができる。前記遺伝学的特徴としては、例えば、前記ノカルジア属の細菌がノカルジア・セリオレである場合、ＤＤＢＪ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）に登録されているノカルジア・セリオレの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子であるＪＦ８３４０６６、ＪＦ８３４０６７、ＪＦ８３４０６８、ＪＦ８３４０６９との相同性が９５％以上のものなどが挙げられる。
【００３２】
−採取工程−
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記タンパク質が、菌体内又は菌体表面に生産された場合は、培養物から菌体を分離し、その菌体を超音波破砕等の公知の処理をすることにより、前記タンパク質を採取することができる。また、例えば、前記タンパク質が、培養液中に生産された場合は、遠心分離やろ過等により菌体を除去することにより、前記タンパク質を採取することができる。
【００３３】
採取した前記タンパク質は、更に精製することが好ましい。前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画法、各種クロマトグラフィー法、アルコール沈殿法、限外ろ過法などが挙げられる。
【００３４】
−その他の工程−
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質を保存するために凍結乾燥する工程、前記タンパク質の濃度を上げるために濃縮する工程などが挙げられる。
【００３５】
＜＜第２の形態＞＞
本発明のノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質の製造方法の第２の形態は、後述する本発明の形質転換体を培養する工程（培養工程）と、前記培養物から前記タンパク質を採取する工程（採取工程）とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００３６】
−培養工程−
前記培養工程は、後述する本発明の形質転換体を培養する工程である。
前記培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、振盪培養法、静置培養法などが挙げられる。
【００３７】
前記形質転換体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母や、大腸菌などが挙げられる。
【００３８】
前記培養に用いる培地としては、特に制限はなく、公知の栄養培地の中から適宜選択することができる。前記培地は、液体培地であってもよく、寒天培地であってもよいが、液体培地が、前記タンパク質を多く製造できる点で好ましく、また用いる形質転換体に応じて適宜選択することがより好ましい。
例えば、前記形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がアルコール酸化酵素プロモータであるピキア  パストリスを用いる場合、前記培地としては、例えば、酵母エキスと、ペプトンと、メタノールとを含む培地を用いることが好ましい。
また、例えば、形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がＧＡＬ１プロモータであるサッカロミセス  セルビシエ用いる場合、前記培地としては、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地を前培養の培地として用い、その後の培養の培地としては、ガラクトース及びラフィノースを炭素源とする液体最少培地を用いることが好ましい。
また、例えば、形質転換体として、組換えベクター中の発現制御配列がｌａｃ（ラクトース）プロモータである大腸菌を用いる場合、前記培地としては、例えば、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を含有する液体培地を用いることが好ましい。
【００３９】
前記培養の温度及び時間としても、特に制限はなく、用いる形質転換体に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
−採取工程−
前記採取工程は、前記培養工程で得られた培養物からノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質を採取する工程である。
前記採取の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記タンパク質が、菌体内又は菌体表面に生産された場合は、培養物から菌体を分離し、その菌体を超音波破砕などの公知の処理をすることにより、前記タンパク質を採取することができる。また、例えば、前記タンパク質が、培養液中に生産された場合は、遠心分離やろ過等により菌体を除去することにより、前記タンパク質を採取することができる。
【００４１】
採取した前記タンパク質は、更に精製することが好ましい。前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過などの方法が挙げられ、また、前記ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質に精製用のタグ配列が付加してある場合には、付加されたタグに対応する精製の方法を用いることもできる。
前記付加されたタグに対応する精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、付加されたタグが、ヒスチジン６残基の配列の場合、ニッケルカラムを用いた精製の方法を用いることができる。
【００４２】
−その他の工程−
前記その他の工程としては、本発明の効果を害しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記第１の形態に記載した工程などが挙げられる。
【００４３】
＜用途＞
本発明の新規タンパク質は、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するため、後述する魚類用ワクチンに好適に用いることができる。
また、前記新規タンパク質は、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有し、投与対象の免疫を賦活化することができ、投与対象に投与後、該投与対象の体内で抗体産生を誘導することができるため、予防組成物、免疫原性組成物、免疫賦活化組成物、ワクチン組成物などとしても好適に用いることができる。これらの予防組成物、免疫原性組成物、免疫賦活化組成物、ワクチン組成物には、後述する本発明の新規ＤＮＡが含まれていてもよい。
なお、本発明の新規タンパク質は、ノカルジア属の細菌において、病原性を発現するアミノ酸配列を含まないため、安全性が高い点で有利である。
【００４４】
（ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するＤＮＡ）
本発明の新規ＤＮＡは、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するＤＮＡである。
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｆ）前記（ｄ）及び（ｅ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｇ）配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、（ｈ）配列番号：３で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡ、（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、（ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡ、（ｋ）前記（ａ）から（ｊ）のいずれかのＤＮＡ及び前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００４５】
（ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、（ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、前記（ａ）及び（ｂ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、（ｄ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、（ｅ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、（ｆ）前記（ｄ）及び（ｅ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、前記（ｄ）及び（ｅ）のいずれかのＤＮＡにおいて、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであってもよく、（ｇ）配列番号：３で表される塩基配列を有するＤＮＡは、配列番号：３で表される塩基配列からなるＤＮＡであってもよく、（ｈ）配列番号：３で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡは、配列番号：３で表される塩基配列の部分配列からなるＤＮＡであってもよく、（ｉ）配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡは、配列番号：４で表される塩基配列からなるＤＮＡであってもよく、（ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡは、配列番号：４で表される塩基配列の部分配列からなるＤＮＡであってもよい。
【００４６】
本発明において、「塩基配列の部分配列」とは、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記（ｈ）配列番号：３で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡ又は前記（ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡの部分配列としては、２５０塩基〜６００塩基が好ましく、２７１塩基〜５２０塩基がより好ましい。
これらの中でも、前記（ｊ）配列番号：４で表される塩基配列の部分配列を有するＤＮＡは、配列番号：４で表される塩基配列の、第７８番目の塩基から第５９８番目の塩基、又は、第３２７番目の塩基から第５９８番目の塩基を有することが好ましく、配列番号：５で表されるＤＮＡ配列又は配列番号：７で表されるＤＮＡ配列を有することが更に好ましく、配列番号：５で表されるＤＮＡ配列又は配列番号：７で表されるＤＮＡ配列からなることが特に好ましい。
【００４７】
なお、本発明のノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、前記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡと配列同一性を有するものであってもよい。
前記塩基配列の同一性としては、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
前記塩基配列の同一性は、前記アミノ酸配列の同一性と同様にして決定することができる。前記塩基配列の同一性を分析するプログラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｂｌａｓｔｎプログラムが挙げられる。前記プログラムを用いて配列同一性を分析する際のパラメーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デフォルト値を用いることができる。
【００４８】
＜製造方法＞
前記ＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９７５，９８，５０３．参照）を用いる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８５，  ２３０，  ｐ．１３５０、Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８８，  ２３９，  ｐ．４８７参照）を用いる方法、前記ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  １９８７，  １５４，  ｐ．３５０参照）により変異を導入する方法、合成する方法などが挙げられる。
なお、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。一方、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合もある。本発明の前記ＤＮＡには、このような人工的に調製されたＤＮＡ、又は天然の変異ＤＮＡが含まれる。
【００４９】
前記ＤＮＡの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記ゲノムＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノカルジア症に感染した魚類等の本発明の前記タンパク質の遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリーを作製し、これを展開して、前記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡ、ゲノム上のその近傍の塩基配列などを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製する方法などが挙げられる。
また、前記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡ、ゲノム上のその近傍の塩基配列などに特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することもできる。
前記ゲノミックライブラリーに用いるベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ（大腸菌人工染色体）、ＰＡＣ（Ｐ１ファージ由来人工染色体）などが挙げられる。
【００５０】
前記ｃＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノカルジア症に感染した魚類などから抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、前記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡの情報を基に作製したプローブやプライマーを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製する方法などが挙げられる。
このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、前記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡもまた、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質をコードしている限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００５１】
前記ハイブリダイゼーション技術を用いる場合の反応条件としては、前記ＤＮＡを単離することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ストリンジェントな条件が好ましい。
前記ストリンジェントな条件としては、一般的なハイブリダイズ条件をいい、通常のＰＣＲにおけるアニーリング条件下で、鋳型となる標的核酸にハイブリダイズし、プライマーとして機能する条件、又は、標的核酸とプローブとのハイブリダイズにより検出可能な電圧や電流に変化を及ぼす条件をいう。
前記一般的なハイブリダイズ条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ナトリウム濃度が、２５ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、２５ｍＭ〜３００ｍＭがより好ましい。また、温度が、４２℃〜６８℃が好ましく、４２〜６５℃がより好ましい。このようなハイブリダイズ条件の具体的な例としては、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ塩化ナトリウム、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）、温度４２℃などが挙げられる。
本発明において、「ハイブリダイズ」とは、一本鎖ＤＮＡやＲＮＡの間で、互いに相補的な塩基配列を利用して人工的に二本鎖の雑種核酸分子を形成することをいう。
【００５２】
こうして単離されたＤＮＡは、前記（ａ）から（ｋ）のいずれかに記載のＤＮＡと高い配列同一性を有すると考えられる。
高い配列同一性とは、塩基配列全体で、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
このような塩基配列は、本発明の前記タンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質をコードしていると考えられる。
【００５３】
なお、前記塩基配列の配列同一性や、コードするタンパク質のアミノ酸配列の配列同一性を示すようなＤＮＡは、前記ようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群や公共データベースの中から、例えば、前述のＢＬＡＳＴプログラムを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００５４】
このようにして得られたＤＮＡが、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質をコードしていることは、後述する適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養し、得られたタンパク質について、前記アミノ酸配列の決定などの方法を用いることにより確認することができる。
【００５５】
＜用途＞
本発明の新規ＤＮＡは、ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するため、後述する魚類用ワクチンに好適に用いることができる。
また、前記新規ＤＮＡは、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有し、投与対象の免疫を賦活化することができ、投与対象に投与後、該投与対象の体内で抗体産生を誘導することができるため、予防組成物、免疫原性組成物、免疫賦活化組成物、ワクチン組成物などとしても好適に用いることができる。これらの予防組成物、免疫原性組成物、免疫賦活化組成物、ワクチン組成物には、本発明の前記新規タンパク質が含まれていてもよい。
なお、本発明の新規ＤＮＡは、ノカルジア属の細菌において、病原性を発現する塩基配列を含まないため、安全性が高い点で有利である。
【００５６】
＜ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用の確認＞
前記タンパク質又は前記ＤＮＡが、ノカルジア属の細菌による感染症に対して予防作用を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、魚類を用いた攻撃試験、投与対象個体の血中抗体量を測定する方法などが挙げられる。
前記魚類を用いた攻撃試験について、ノカルジア症を具体例として説明する。通常、魚類をノカルジア・セリオレで攻撃するとノカルジア症に感染し、これにより攻撃後の魚類の生存率が低下する。一方、前記薬理組成物を魚類に投与すると、免疫力が高まり、ノカルジア・セリオレの攻撃に耐え、生存率は低下しない。したがって、この生存率により予防作用を確認することができる。
【００５７】
（組換えベクター）
本発明の組換えベクターは、本発明の前記ＤＮＡを少なくとも含有し、必要に応じて、更にその他のＤＮＡを含有する。
【００５８】
前記ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記ベクターの具体的な例としては、酵母由来のプラスミド、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、λファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターなどが挙げられる。
また、前記ベクターは、本発明の前記ＤＮＡを発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
【００５９】
前記その他のＤＮＡとしては、本発明の効果を害しない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マーカー遺伝子、制御配列、精製用配列などが挙げられる。
【００６０】
前記マーカー遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤ等のように宿主の栄養要求性を相補する遺伝子、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子などが挙げられる。
前記制御配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロモータ配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが挙げられる。前記プロモータ配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、天然状態において本発明のＤＮＡの発現を制御している固有のプロモータ以外のプロモータも用いることができる。
前記精製用配列としては、例えば、ヒスチジンをコードする塩基配列などが挙げられる。
【００６１】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の前記ＤＮＡや、必要に応じて、更にその他のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。
ベクターに前記ＤＮＡを挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。
【００６２】
＜用途＞
本発明の組換えベクターは、本発明の前記ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するＤＮＡを含むため、後述する魚類用ワクチンに好適に用いることができる。
【００６３】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明のベクター（発現ベクター）を宿主中に導入することにより得ることができる。
【００６４】
前記宿主としては、本発明のノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質を発現しうるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピキア  パストリス、サッカロミセス  セレビシエ、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、Ｓｆ９等の昆虫細胞などが挙げられる。
【００６５】
前記ベクターを宿主中に導入する方法としては、特に制限はなく、前記宿主細胞の種類やベクターの大きさなどに応じて適宜選択することができる。
酵母へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法などが挙げられる。
細菌へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
動物細胞へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。
昆虫細胞へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００６６】
本発明の組換えベクターが宿主に導入されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
前記ＰＣＲ法としては、例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行い、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、組換えベクターが宿主に導入されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認することもできる。
【００６７】
＜用途＞
前記形質転換体は、本発明の前記ノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質の製造に用いることができ、得られたノカルジア属の細菌による感染症に対する予防作用を有するタンパク質は、後述する魚類用ワクチンに好適に用いることができる。
【００６８】
（魚類用ワクチン）
本発明の魚類用ワクチンは、前記ノカルジア症への魚類の感染を予防するためのワクチンであり、本発明の前記タンパク質、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかを含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００６９】
本発明の前記タンパク質、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかは、前記各項目に記載したとおりである。本発明の前記タンパク質、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかを含むワクチンを魚類に予防的に投与することにより、魚類体内に前記ノカルジア属の細菌に対する免疫を付与することができ、ノカルジア症を予防することができると考えられる。即ち、前記タンパク質、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかは、前記魚類用ワクチンの有効成分となり得る。
【００７０】
前記魚類用ワクチンにおける、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記魚類用ワクチンは、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかそのものであってもよい。
【００７１】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記医薬的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する本発明の医薬の項目に記載されるような各種担体などが挙げられる。また、ビタミンＥアセテート可溶化液、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、（鉱物）油エマルジョン、非イオン性界面活性剤、スクワレン、サポニン等のアジュバントを含んでいてもよい。
前記魚類用ワクチン中の、前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００７２】
＜剤型＞
前魚類用ワクチンの剤型としては、特に制限はなく、後述する所望の投与方法等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤などが挙げられる。
【００７３】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造する方法などが挙げられる。
前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。
【００７４】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００７５】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、混餌剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造する方法などが挙げられる。
【００７６】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造する方法などが挙げられる。
【００７７】
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
前記等張化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
【００７８】
＜投与＞
前記魚類用ワクチンの投与対象としては、魚類であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ブリ、ハマチ、カンパチ、ヒラマサ等のブリ属に属する魚類、ヒラメ、マダイ、カワハギ、金魚、鯉などが挙げられる。
前記魚類用ワクチンの投与方法としては、特に制限はなく、前記魚類用ワクチンの剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、腹腔内投与法、鰓に投与する方法などが挙げられる。前記投与方法が、経口投与法である場合、前記魚類用ワクチンを、魚類を飼育する水槽等に溶かし、魚類を該水槽に浸漬して投与してもよく、餌に混合して投与してもよい。
前記魚類用ワクチンの投与量、投与回数、投与時期としては、特に制限はなく、投与対象である魚類の年齢、体重、症状、投与方法、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００７９】
＜使用＞
前記魚類用ワクチンは、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併用されてもよい。また、前記魚類用ワクチンは、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００８０】
＜用途＞
前述のとおり、前記魚類用ワクチンは、前記ＤＮＡ、前記組換えベクター、及び前記形質転換体の少なくともいずれかを含有するため、該魚類用ワクチンを魚類に投与することにより、魚類の体内に前記ノカルジア属の細菌に対する抗体を産生させることができ、その後のノカルジア症の発症を防ぐことができると考えられる。即ち、前記魚類用ワクチンは、ノカルジア症の魚類への感染を予防するための魚類への投与（予防接種）に好適に利用可能である。
なお、前記魚類用ワクチンを魚類に投与することを含む、ノカルジア症への魚類の感染を予防するための予防接種方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８１】
また、前記魚類用ワクチンの投与により産生された抗体及び該抗体を含有する医薬組成物は、ノカルジア症の治療に好適に用いることができる。前記抗体及び前記医薬組成物も本発明の範囲内に含まれる。
前記医薬組成物としては、前記抗体を含んでいれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、更にその他の成分を含有していてもよい。
前記医薬組成物における前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記医薬的に許容され得る担体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、澱粉などが挙げられる。
前記医薬組成物における前記その他の成分としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬組成物は、前記抗体そのものであってもよい。
【実施例】
【００８２】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００８３】
＜ノカルジア・セリオレの分離＞
大分県産の約３ｋｇのブリの鰓の結節を１質量％小川寒天培地（組成：リン酸２水素カリウム３．２ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム３．２ｇ／Ｌ、蒸留水３２０ｍＬ／Ｌ、全卵液６４１ｍＬ／Ｌ、グリセリン１９ｍＬ／Ｌ、２％マラカイトグリーン１９ｍＬ／Ｌ）に接種し、２５℃で４日間〜５日間培養することにより、ノカルジア・セリオレを分離した。以下、この分離株を「分離株１」と称することがある。
分離株１を１質量％小川培地で２５℃にて５日間培養し、単一のコロニーから同様の方法で６回の継代培養を繰り返し、７代目のコロニーを得た。以下、前記７代目のクローンを「ＮＳ００１株」と称することがある。
【００８４】
−染色試験−
ＮＳ００１株を用いて塗抹標本を作製した。この塗抹標本をグラム染色した。その結果、グラム陽性の糸状菌が観察された。
【００８５】
−性状試験−
ＮＳ００１株を１質量％小川培地で２５℃にて培養した。培養開始から４日後にコロニーが出現し、２週間後に淡黄色〜橙黄色のいぼ状の緻密な固いコロニーが形成された。
【００８６】
−ＰＣＲ分析−
Ｍｉｙｏｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２００３，  Ｖｏｌ．３８，  ｐｐ．９３−９７に従い、ＮＳ−１プライマー及びＮＧ−１プライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドを用いて可視化した。その結果、目的の大きさに単一のバンドが認められた。
【００８７】
これらの菌体学的特徴より、ＮＳ００１株は、ノカルジア・セリオレであることが同定された。
【００８８】
（製造例１：ＤＮＡ及びタンパク質の製造）
＜ＮＳ００１ＤＮＡの調製＞
ＮＳ００１株をＬＢ培地（組成：イーストエクストラクト５ｍｇ／ｍＬ、トリプトン１０ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム１０ｇ／ｍＬ）で２５℃にて４日間培養し、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより菌体を回収した。上清を除去し、菌体に２０質量％塩化リゾチーム液を添加し、菌体を再浮遊させ、３７℃で７２時間反応させた。
反応後、フェノール・クロロホルム抽出法により定法に従いＤＮＡ抽出を行い、ＴＥバッファー（組成：１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。抽出したＤＮＡをＲＮａｓｅ（東洋紡績株式会社製）で処理し、ＮＳ００１ＤＮＡを調製した。
ＮＳ００１ＤＮＡ５０μｇを用い、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（東洋紡績株式会社製）で３７℃、約２０分間反応させた後、定法に従いフェノール・クロロホルム処理により酵素反応を停止した。
なお、塩化リゾチーム液は、塩化リゾチーム粉末（キューピー株式会社製）を２０質量％になるよう精製水で溶解することで調製した。
【００８９】
＜プラスミドベクターの調製＞
プラスミドｐＧＥＭ−３ｚｆ（＋）（アプライドバイオシステムズ社製）１μｇを用い、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社製）で３７℃にて一晩反応させた後、定法に従いフェノール・クロロホルム処理により酵素反応を停止した。制限酵素消化後のｐＧＥＭ−３ｚｆ（＋）にアルカリフォスファターゼ（タカラバイオ株式会社製）を添加し、定法に従ＢＡＰ処理を行い、プラスミドベクターを調製した。
【００９０】
＜発現ベクターの調製＞
前記酵素消化したＮＳ００１ＤＮＡと、前記プラスミドベクターとを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含むライゲーションキット（タカラバイオ株式会社製）を用いて、４℃にて一晩ライゲーションさせ、発現ベクターを調製した。
【００９１】
＜形質転換体の調製＞
大腸菌（ＪＭ１０９）に、前記発現ベクター０．１５μｇを添加し、氷上で３０分間静置し、次いで４２℃にて１分間静置し、再び氷上に３分間静置した。これを４０ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＬＢ培地（以下、「ＬＢ−Ａｍｐ（＋）」と称することがある。）に懸濁し、ＬＢ−Ａｍｐ（＋）の寒天培地に播種後、３７℃にて一晩培養した。
【００９２】
滅菌済みのメンブレン（ミリポア社製）を１０ｍＭ  ＩＰＴＧ（タカラバイオ株式会社製）を含む２×ＹＴ液体培地（組成：トリプシン１６ｍｇ／ｍＬ、イーストエクストラクト１０ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム５ｍｇ／ｍＬ）に浸し乾燥させた。このメンブレンを、前記培養後のコロニーの生えた寒天培地に重ねて転写した後、該メンブレンを新しいＬＢ−Ａｍｐ（＋）寒天培地に移し、３７℃で４時間培養した。このメンブレンをクロロホルムで１５分間処理し、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：１００ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、１．５質量％ウシ胎児血清（ＢＳＡ））に入れ、室温（２５℃）で一晩振盪した。次いで、メンブレンを５質量％スキムミルク液（ＢＤ社製）でブロッキングした後、５００培に希釈した抗ＮＳニワトリ血清（抗ＮＳニワトリ血清の調製方法は、下記に示す。）に浸し１時間反応させた。メンブレンをＴＮＴ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：１０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、２，０００倍に希釈したＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識抗ニワトリＩｇＧヤギ血清（インビトロジェン株式会社製）に浸し、１時間反応させた。次いで、４クロロ１ナフトール発色液（シグマ社製）で２０分間反応させた。発色した抗ＮＳニワトリ血清陽性のコロニーから２株を釣菌した。以下、「クローン１」及び「クローン２」と称することがある。
【００９３】
−抗ＮＳニワトリ血清の調製−
ＰＢＳ（組成：塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、塩化カリウム０．２ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム０．２４ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０））に懸濁したＮＳ００１株を湿菌量で２ｍｇ／ｍＬ用い、これに前記湿菌量と等量のＦＣＡ（フロインドの完全アジュバント：和光純薬工業株式会社製）を添加してエマルジョン化し、２２Ｇの注射針でニワトリ（雄雌混在、６週齢）の頸部後ろに、１羽当たり０．５ｍＬ皮下接種した。
ＰＢＳに懸濁したＮＳ００１株を湿菌量で２ｍｇ／ｍＬ用い、これに前記湿菌量と等量のＦＩＡ（フロインドの不完全アジュバント：和光純薬工業株式会社製）を添加してエマルジョン化し、ブースターを調製した。
このブースターを、最初のＮＳ００１株及びＦＣＡの接種から３週後及び５週間後に、前記ニワトリの頸部後ろに、１羽当たり１ｍＬ皮下接種した。
２回目のブースターの接種から１週後に、前記ニワトリの翼から、１羽当たり１０ｍＬ〜１２ｍＬの血液を採血し、３７℃にて一晩凝血させ、血清を浸出させた。これを２，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を５６℃にて３０分間非働化し、−８０℃で保存した。
【００９４】
クローン１及びクローン２をそれぞれＬＢ−Ａｍｐ（＋）液体培地で３７℃にて一晩培養後、１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより回収し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地に再浮遊した。これを３７℃にて３時間振盪培養し、菌体を１５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより回収した。回収した菌体に超音波破砕を施すことにより菌体からタンパク質を抽出し、この超音波破砕を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによりタンパク質を回収した。以下、クローン１より得られたタンパク質を「タンパク質１」、クローン２より得られたタンパク質を「タンパク質２」と称することがある。
【００９５】
＜タンパク質１及びタンパク質２のＤＮＡ塩基配列解析＞
クローン１由来のタンパク質１及びクローン２由来のタンパク質２の塩基配列は、以下の方法で解析した。
クローン１及び２から常法に従ってプラスミドを抽出し、下記に示すプライマー（配列番号：９〜２０）を用いてサイクルシーケンス反応を行った。サイクルシーケンス反応は、９８℃で２分間の反応後、９８℃で１０秒間、及び６０℃で４分間を３０サイクル行った。得られた反応物をそれぞれエタノール沈殿により精製した後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）により塩基配列を決定した。
これにより、クローン１のＤＮＡ塩基配列は、配列番号：３で表される塩基配列からなり、クローン２のＤＮＡ塩基配列は、配列番号：４で表される塩基配列からなることがわかった。
−プライマー配列−
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’          （配列番号：９）
５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’      （配列番号：１０）
５’−ＴＣＧＣＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＧＡＴＧＴ−３’  （配列番号：１１）
５’−ＴＧＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＡＴＡＴＣＧ−３’        （配列番号：１２）
５’−ＧＡＣＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＧＧＴＴＴＧＡＴ−３’  （配列番号：１３）
５’−ＡＧＧＴＴＣＧＣＴＧＧＧＣＡＧＧＧＣ−３’        （配列番号：１４）
５’−ＧＧＣＧＡＴＡＴＧＡＣＡＡＴＧＣＧＡ−３’        （配列番号：１５）
５’−ＣＴＣＡＣＧＧＴＴＴＣＧＡＧＴＡＴＣＧＣＴ−３’  （配列番号：１６）
５’−ＧＡＴＣＡＧＧＴＴＧＣＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴ−３’  （配列番号：１７）
５’−ＧＡＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣ−３’  （配列番号：１８）
５’−ＧＣＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＧＧ−３’        （配列番号：１９）
５’−ＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＧ−３’        （配列番号：２０）
【００９６】
＜タンパク質１及びタンパク質２のアミノ酸配列解析＞
配列番号：３で表される塩基配列及び配列番号：４で表される塩基配列から、遺伝情報処理ソフトウェア（Ｇｅｎｅｔｙｘ（登録商標）−ＭＡＣ、株式会社ゼネティックス製）によりアミノ酸配列を推定した。
これにより、タンパク質１のアミノ酸配列は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなり、タンパク質２のアミノ酸配列は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなることがわかった。
【００９７】
（製造例２：ワクチン１の製造）
クローン１をＬＢ−Ａｍｐ（＋）液体培地で３７℃にて一晩培養後、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより回収し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ培地に再浮遊した。これを３７℃にて３時間振盪培養し、菌体を８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより回収した。菌体をＰＢＳに再浮遊後、超音波破砕を施し、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、沈殿物を回収した。
クローン１由来の配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質１は、０．３質量％ホルマリンを含むＰＢＳに再浮遊し、０．３質量％のホルマリン（３０％ホルムアルデヒド水溶液）を含むＰＢＳにより、ＯＤ６３０における濁度が約１．５になるように調製し、タンパク質１由来のワクチンを得た。以下、タンパク質１由来のワクチンを「ワクチン１」と称することがある。
なお、ワクチン１（ＯＤ６３０における濁度が約１．５）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）染色によりバンドを視覚化し、画像解析により、ワクチン１に含まれる総タンパク質に占める該タンパク質の比率を明らかにした。ＤＣプロテインアッセイキット（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）で測定した総タンパク質量より算出した該タンパク質濃度は、３７．６μｇ／ｍＬであった。
【００９８】
（製造例３：ワクチン２の製造）
製造例２のワクチン１の製造において、クローン１に代えて、クローン２を用い、クローン２由来の配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質２を得たこと以外は、ワクチン１の製造と同様の方法で、タンパク質２由来のワクチン２を製造した。
なお、ワクチン１と同様の方法で測定したワクチン２の該タンパク質濃度は、１０９．３μｇ／ｍＬであった。
【００９９】
（製造例４：ワクチン３の製造）
クローン２由来の配列番号：４で表される塩基配列を鋳型として、下記に示す配列番号：２１で表されるプライマー配列及び配列番号：２２で表されるプライマー配列を用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号：５で表される塩基配列を増幅した。サイクルシーケンス反応は、９８℃で２分間の反応後、９８℃で１０秒間、及び６０℃で４分間を３０サイクル行った。得られた反応物をエタノール沈殿により精製した。
−プライマー配列−
５’−ｃｇｇａａｔｔｃＧＡＴＣＡＧＧＴＴＧＣＣＧＴＣＣＴＴ−３’  （配列番号：２１）
５’−ｃｇｇａｇｃｔｃＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＡＴＧＣＡＣＧＧＡＣ−３’  （配列番号：２２）
ただし、前記配列番号：２１で表されるプライマー配列及び前記配列番号：２２で表されるプライマー配列において、小文字は制限酵素サイトを表す。
【０１００】
精製した反応物を用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩにより３７℃で一晩酵素消化を行った。次いで、この酵素消化物とプラスミドｐＥＴ２１ａ（メルク社製）とを用いて、製造例１と同様の方法でＴ４  ＤＮＡリガーゼを含むライゲーションキットにより発現ベクターを調製した。次いで、製造例１と同様の方法で形質転換体を調製した。この形質転換体を、以下、「クローン３」と称することがある。
【０１０１】
製造例２のワクチン１の製造において、クローン１に代えて、クローン３を用い、クローン３由来の配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質３を得たこと以外は、ワクチン１の製造と同様の方法で、タンパク質３由来のワクチン３を製造した。
なお、ワクチン１と同様の方法で測定したワクチン３の該タンパク質濃度は、９１．７μｇ／ｍＬであった。
【０１０２】
（製造例５：ワクチン４の製造）
クローン２由来の配列番号：４で表される塩基配列を鋳型として、下記に示す配列番号：２３で表されるプライマー配列及び前記配列番号：２２で表されるプライマー配列を用いてサイクルシーケンス反応を行い、配列番号：７で表される塩基配列を増幅した。サイクルシーケンス反応は、９８℃で２分間の反応後、９８℃で１０秒間、及び６０℃で４分間を３０サイクル行った。得られた反応物をエタノール沈殿により精製した。
−プライマー配列−
５’−ｃｇｇａａｔｔｃＧＡＣＧＴＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＣ−３’  （配列番号：２３）
ただし、前記配列番号：２３で表されるプライマー配列において、小文字は制限酵素サイトを表す。
【０１０３】
精製した反応物を用いて、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩにより３７℃で一晩酵素消化を行った。次いで、この酵素消化物とプラスミドｐＥＴ２１ａ（メルク社製）とを用いて、製造例１と同様の方法でＴ４  ＤＮＡリガーゼを含むライゲーションキットにより発現ベクターを調製した。次いで、製造例１と同様の方法で形質転換体を調製した。この形質転換体を、以下、「クローン４」と称することがある。
【０１０４】
製造例２のワクチン１の製造において、クローン１に代えて、クローン４を用い、クローン４由来の配列番号：８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質４を得たこと以外は、ワクチン１の製造と同様の方法で、タンパク質４由来のワクチン４を製造した。
なお、ワクチン１と同様の方法で測定したワクチン４の該タンパク質濃度は、８０．９μｇ／ｍＬであった。
【０１０５】
（試験例１：ノカルジア属の細菌に対するワクチン効果の検討）
＜安全性試験＞
製造例２〜５で製造したワクチン１〜４を、ブリ（ニッスイ人工種苗、体重約６７ｇ）腹腔内に０．１ｍＬ投与し、エアレーションをした循環式水槽（２００Ｌ容、水温度２５℃±１℃）に入れ、１４日間飼育した。
ワクチン１を投与した群を「ワクチン１投与群」（ｎ＝１０）、ワクチン２を投与した群を「ワクチン２投与群」（ｎ＝３０）、ワクチン３を投与した群を「ワクチン３投与群」（ｎ＝２０）、ワクチン４を投与した群を「ワクチン４投与群」（ｎ＝２０）とそれぞれ称する。
また、対照として、ブリ（ニッスイ人工種苗、体重約６７ｇ、ｎ＝５０）にワクチンを投与することなく、ワクチン１投与群などと同様の条件で飼育したものを「対照群」とした。
なお、各群は、循環式水槽に（２００Ｌ容）に対して１０匹ずつ入れて試験を実施した。
【０１０６】
対照群及び各投与群について、飼育期間中、投与部位、体色、摂餌、及び遊泳を観察したところ、ワクチン１投与群、ワクチン２投与群、ワクチン３投与群、及びワクチン４投与群は、対照群と同様であり、異常を示した個体は認められなかった。これより、ワクチン１〜４は、安全性が高いことがわかった。
【０１０７】
＜攻撃試験＞
攻撃用菌体としては、ＮＳ００１株を、ＬＢ培地を用いて２５℃で９６時間培養した菌体を用いた。
前記安全性試験終了後（ワクチン投与から１４日目）に、対照群及び各投与群に、前記攻撃用菌体を１尾当たり０．１ｍｇ投与することにより攻撃した。攻撃後、更に１４日間前記安全性試験と同様の条件で飼育し、観察した。
攻撃０日目〜１４日目の各日数における生存率（％）を次式により算出した結果を表１及び図１に示す。
生存率（％）＝（各日数における各群の生存尾数／試験に用いた各群の尾数）×１００
【０１０８】
【表１】
2013183673.tif 000003
【０１０９】
表１及び図１の結果より、ワクチン１〜４はそれぞれ、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有し、ワクチンとして好適に使用できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の新規タンパク質、該タンパク質をコードする新規ＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、及び該組換えベクターを含有する形質転換体は、ハマチやブリなどの魚類の養殖におけるノカルジア症による感染症に対する予防作用を有するため、本発明の魚類用ワクチンに好適に利用可能である。
また、本発明の魚類用ワクチンは、ノカルジア症に対して優れた予防作用を有し、安全性が高いため、ハマチやブリなどの魚類の養殖に好適に利用可能である。
【図１】
2013183673.tif 000004
【配列表】
2013183673000001.app