(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞で、１）遺伝子導入による効率的分化誘導法、２）目的細胞の高純度単離、３）腫瘍化（未分化／癌源細胞）克服、を可能とする独自開発のアデノウイルスベクター（ＡＤＶ）技術を提供する。【解決手段】ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞の胚様体を形成させるステップにおいて、Ｍｅｓｐ１を導入することを特徴とする、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を誘導する方法、ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ；及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を分化した細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞の識別方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップにおいて、Ｍｅｓｐ１を導入することを特徴とする、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を誘導する方法。
【請求項２】
ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップにおいて、ＧＡＴＡ４及びＭＥＦ２Ｃを導入しないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、Ｇ−ＣＳＦの存在下で培養するステップを備える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップにおいて、Ｍｅｓｐ１と共に、ＧＡＴＡ４及びＭＥＦ２Ｃを導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
更に、Ｇ−ＣＳＦの非存在下で培養するステップを備える、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｍｅｓｐ１の導入が、アデノウイルスベクターにより行われることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アデノウイルスベクターが、ＣＡプロモータの下流にＭｅｓｐ１遺伝子が結合した発現カセットを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アデノウイルスベクターによりＭｅｓｐ１を導入することが、ＭｅｓＰ１発現アデノウイルスベクターをＭＯＩ３で細胞に感染させることを備える、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップが、９６ｗｅｌｌプレート中の１×１０３〜３×１０３細胞のヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞を使用することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
９６ｗｅｌｌプレートが、低接着９６ｗｅｌｌプレートである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞中の分化細胞のみにおいて特異的に外来遺伝子を発現させる方法。
【請求項１２】
ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記外来遺伝子が標識遺伝子である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標識遺伝子が、蛍光タンパク質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ；及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を分化した細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞の識別方法。
【請求項１７】
前記外来遺伝子が細胞死を誘導する遺伝子である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に細胞死を誘導する遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記細胞死を誘導する遺伝子を発現させることにより、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞を除去する方法。
【請求項１９】
ＣＡプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞、及び該ヒト多能性幹細胞から分化した細胞の両細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
【請求項２０】
ＣＡプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＡプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、未分化・分化のいずれの状態でも分化状態非依存的に前記ヒト多能性幹細胞に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
外来遺伝子が標識遺伝子である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
標識遺伝子が蛍光タンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＡプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；前記ヒト多能性幹細胞及び前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ；及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を、前記ヒト多能性幹細胞に由来する細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞に由来する細胞の識別方法。
【請求項２５】
更に、ＣＡプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットを導入した前記ヒト多能性幹細胞を生体内に移植するステップを備えることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法を備える、再生医療における移植細胞の同定方法又は追跡方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）やヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）というヒト多能性幹細胞は、その分化多能性から再生医学をはじめ、創薬や疾患モデル細胞への応用など様々な分野において、その利用が期待されている。さらに、再生医療への応用において、神経変性疾患、脊髄損傷、脳梗塞、心筋症などの疾患を、細胞移植等を用いて治療できる可能性を秘めている。これらの目的にヒト多能性幹細胞を利用するために必須となるのは、外来遺伝子（目的の遺伝子）を高効率で導入して、その発現を安定的に確実に得られる技術である。しかしマウスの多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）と異なり、ヒト多能性幹細胞に関しては、未だ決定的な高効率の遺伝子導入技術というのは確立していない。またヒト多能性幹細胞における導入された外来遺伝子の発現調節の詳細、例えば安定的に強い発現を誘導できるプロモータの選択など、系統だった研究がなされておらず、ほとんど未知の状態である。
我々はマウスＥＳ細胞への新しい遺伝子導入・発現技術として、アデノウイルスベクターが有用であることを初めて明らかにし、それを活用した分化した目的細胞の単離技術を発明した（胚性幹細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法及び単離又は可視化用キット＜特許第４６２４１００号＞；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  １４，  ６７３−６８３．  ２００６）。
しかしながらヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞はマウスとは生物学特性や培養技術において異なるところが大きいところも分かって来ており、このアデノウイルスベクターでの遺伝子導入系は培養技術が違うためそのまま適応できず、また機能するのかは予想困難であり、さらには発現調節の適切なプロモータは何か、全く分からない状態である。例えば「マウスＥＳ細胞の未分化維持の決定的因子として未分化維持培養に用いるＬＩＦが、ヒト多能性幹細胞においては未分化維持培養には無効である」、「マウスＥＳ細胞は未分化状態での培養ならびに継代時に単細胞の状態にできるのに対し、ヒト多能性幹細胞は基本的に細胞塊のままの状態でしか未分化維持培養や継代はできない（最近、ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを使用することで孤立単細胞化（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ化）にして継代培養できることが発見されたが、そのメカニズムは不明）」などである。重要なことは、これら、マウスとヒトの多能性幹細胞の違いは現象として分かっているだけで、そのメカニズムは未だほとんど解明されていないこと、またこのような違いとメカニズムが不明という理由のために、一般にヒトの多能性幹細胞の培養技術はマウス多能性幹細胞に比べて煩雑で高度な専門技術を必要とし、比較的簡単なマウス多能性幹細胞の培養技術とは異なる。よって前述のように、ヒト多能性幹細胞に対する決定的な遺伝子導入技術は確立されておらず、アデノウイルスベクターも機能するかも予想できず、また真に有用な発現調節プロモータもわからない状態である。
【０００２】
マウスの発生において、心臓原基は７．５日胚の中胚葉から発生するが、この運命決定は隣接する臓側内胚葉から分泌されるＦＧＦ２やＢＭＰ−２／４などにより促進され、またＷｎｔシグナルにより抑制される。さらに心臓が発達する発生１０日目には心臓組織でＧ−ＣＳＦＲ（顆粒球コロニー刺激因子受容体）が発現していることが報告されている（Ｓｈｉｍｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。ＥＳ細胞を心筋へと分化させる際は、このような心臓発生を再現させるように、胚様体（ＥＢ；ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）を形成させ、さらにいくつかの液性因子（ＦＧＦ−２，ＢＭＰ４，Ｇ−ＣＳＦ）を分化誘導中の培地に加えることで、心筋分化を促進させている（例えばＦＧＦ−２；  Ｙｏｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９，  Ｍｏｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０，  ＢＭＰ−４；  Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ．２０１１，  Ｇ−ＣＳＦ；  Ｓｈｉｍｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。またマウスＥＳ細胞においては、ＥＢ形成時の細胞数を変えることにより、どの胚葉へ分化しやすくなるのかが異なることが報告されている（Ｋｏｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。
心筋細胞誘導では、肝細胞誘導のように細胞の発生段階に応じた転写因子を順次ウイルスベクター等でＥＳ細胞へ発現させて分化誘導を行う（Ｉｎａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）といった報告の例はまだ無い。心筋分化に関与する様々な因子が報告されており、心筋分化に係わる心筋特異的転写因子の存在が明らかにされている。例えば心臓の発生に最初に関与する転写因子Ｍｅｓｐ１は、まず原腸陥入期に予定中胚葉域に発現し、上皮間葉移行を引き起こすこと  （Ｌｉｎｄｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）、また心筋分化を抑制するＷｎｔシグナルを抑えているＤｋｋ−１の発現を直接誘導し心臓誘導に大きく関与すること（Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）  などから心血管系制御因子とされる（Ｂｏｕｄｕｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）。また発生６．５〜７日目のマウス胚中胚葉に、クロマチン・リモデリング因子Ｂａｆ６０ｃ、転写因子Ｇａｔａ４とＴｂｘ５を導入すると心筋に特徴的なマーカーの発現し、拍動心筋細胞が誘導されたことなどから、これら三つの因子が心筋分化にかかわる一群の遺伝子発現の司令塔として機能する心筋特異的転写因子の可能性が示唆されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。さらにマウス線維芽細胞に転写因子Ｇａｔａ４，  Ｔｂｘ５，  ＭＥＦ２Ｃを導入すると心筋細胞が誘導されること（Ｉｅｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）なども報告されている。ただし後述のように、同論文ではＭＥＳＰ１遺伝子は当初スクリーニングで見出した候補の１３遺伝子には含まれておらず、また実際ＭＥＳＰ１はｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇでの心筋細胞分化誘導には必須ではなかった、と記載されている。さらに同様に重要な心筋特異的転写因子のＮｋｘ２．５遺伝子を導入した場合は、このｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇでの心筋細胞への分化誘導は阻害されている。つまりこのように、過去の論文は単に個々の心筋特異的な転写因子が心筋の発生において重要であることを述べているに過ぎず、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞にＭＥＳＰ１、ならびにどの心筋転写因子を導入したからといって、心筋細胞の分化誘導が促進されることを示唆しているのではない。つまり遺伝子導入した場合に、心筋細胞の分化誘導が促進される、効果がない、むしろ阻害される、といういずれも結果も予測困難である。
【０００３】
本発明者らは、アデノウイルスベクターを用いて、簡単にヒト多能性幹細胞に特異的に高効率な遺伝子導入できる技術を発明した。さらに、ヒト多能性幹細胞の未分化状態と分化状態で、導入された外来遺伝子を常時安定的に強発現できるプロモータ、そして未分化状態では発現消失でき分化状態では発現誘導できるプロモータの使用用途を発明した。実際、これらの遺伝子導入の方法はマウスＥＳ細胞とは全く異なる内容で、驚くことに、発現調節プロモータの機能動態の様式はマウスＥＳ細胞とは全く異なるものであった。
【０００４】
すなわち、本発明は、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞で、１）遺伝子導入による効率的分化誘導法、２）目的細胞の高純度単離、３）腫瘍化（未分化／癌源細胞）克服、を可能とする独自開発のアデノウイルスベクター（ＡＤＶ）技術に関する。１）ＡＤＶで複数の転写因子の至適時期導入による、効率的細胞分化誘導法を心筋細胞で確立した。２）膜マーカー不在の細胞種の単離の従来技術は、目的細胞特異的プロモータ（ＣＳ−Ｐ）下に蛍光蛋白を安定発現するＥＳ／ｉＰＳ細胞株の作製だが、多くがＣＳ−Ｐの低活性で機能しなかった。我々は、ＣＳ−Ｐ活性に依存せず目的細胞を簡単・確実に可視化・同定可能なＡｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（ＡＣＴ−ＳＣ）法を開発し、従来技術で不能だったＮｋｘ２．５，  αＭＨＣの各プロモータで未分化（拍動前）、成熟の各心筋細胞をマウスＥＳ細胞から単離している。１）と併せ、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞へのＡＤＶ導入・発現系を改良し、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞での標準化できる目的細胞単離技術を開発している。３）癌治療において「多因子で癌特異化／治療可能な増殖制御型ＡＤＶ（ｍ−ＣＲＡ）」の作製法を独自開発し、ＳｕｒｖｉｖｉｎやＴＥＲＴなどの癌特異的プロモータを搭載したｍ−ＣＲＡでの、癌への遺伝子・ウイルス療法を開発してきた。今回ｍ−ＣＲＡ技術で、癌幹細胞の治療、さらにはＥＳ／ｉＰＳ細胞の腫瘍化細胞の除去への新技術を開発した。新ＡＤＶ技術はヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の画期的研究を可能とし、具体的に１）−３）は腫瘍化阻止（安全性確保）という臨床化に重要な新技術と期待できる。
【０００５】
本発明のように、ヒトのＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞に、アデノウイルスベクターで遺伝子導入し、前述記載のような方法で、心筋分化誘導を上昇したという先行文献は存在しない。特に注意すべきは、ヒト細胞で実証しないといけないということである。さらに重要なことは、心筋特異的転写因子が個体発生での心筋の発生に関与しているといっても、Ｍｅｓｐ１以外にも、Ｇａｔａ４，Ｍｅｆ２ｃ，Ｔｂｘ５，Ｎｋｘ２．５など数多くの心筋特異的転写因子が存在するので、ＭＥＳＰ１を選択する理由はない。またヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞に心筋特異的転写因子、あるいはその中のＭＥＳＰ１遺伝子を導入したからといって、心筋分化誘導の効率が上昇するとは単純に期待することは想像できない。例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から心筋細胞の分化誘導をした論文ではないが、最近、ｃａｒｄｉａｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔからＧａｔａ４，  Ｍｅｆ２ｃ，  Ｔｂｘ５の３つの転写因子で心筋細胞を直接分化誘導した（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇ）論文があるが（Ｃｅｌｌ．  ２０１０  Ａｕｇ  ６；１４２（３）：３７５−８６）、これは単純にどの転写因子でも同様の結果がでるものではなかった。中には心筋の初期の発生に極めて重要と考えられている心筋特異的転写因子のＮｋｘ２．５遺伝子を導入した場合は、このｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇでの心筋細胞への分化誘導は阻害されている。また同論文で、ＭＥＳＰ１遺伝子は当初スクリーニングで見出した候補の１３遺伝子にいっておらず、また実際ＭＥＳＰ１はｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｉｎｇでの心筋細胞分化誘導には必須ではなかった、と記載されている。このように、本願の内容は過去の論文を組み合わせても促進される、効果ない、むしろ阻害される、といういずれも結果も予測困難であり、ＭＥＳＰ１、ならびにどの心筋転写因子を導入したからといって、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の分化誘導の効率が上昇することは予測できない。
【０００６】
より具体的には、本発明は、アデノウイルスベクターと本願の感染方法により外来遺伝子をヒト多能性幹細胞に導入することが可能となり、ヒト多能性幹細胞で目的の遺伝子の発現を人為的に調節できる技術に関する。例えば、蛍光蛋白質などの遺伝子を発現させることでヒト多能性幹細胞を可視化することができる。例えば再生医療における移植細胞の同定、追跡などが可能となる。例えば、ヒト多能性幹細胞の分化に関連する遺伝子を強発現、あるいは発現消失させることにより、目的の細胞種、組織種への分化誘導を行うことができる。
また、別の態様において、本発明は、ＲＳＶプロモータ（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）、ＣＭＶプロモータ（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ）による、ヒト多能性幹細胞中の分化細胞のみにおいて特異的に外来遺伝子を発現させる技術、方法に関する。例えば、蛍光蛋白質などの遺伝子をＲＳＶ，ＣＭＶプロモータに繋いでヒト多能性幹細胞に導入すれば、「未分化と分化の状態の細胞を簡単に判別する」ことが可能となる。例えば、ＲＳＶ、ＣＭＶプロモータにより、ヒト多能性幹細胞の分化状態の細胞のみに（未分化細胞特異的に）外来遺伝子（目的遺伝子）を発現することができる。例えば、細胞死誘導の遺伝子をＲＳＶ，  ＣＭＶプロモータの下流につないでヒト多能性幹細胞に導入すれば、分化細胞を除去して、未分化細胞だけを純化することが可能となる。例えば、ＲＳＶ，  ＣＭＶプロモータで目的遺伝子を発現させることで、ヒト多能性幹細胞由来の分化細胞だけに特異的に、その目的遺伝子の影響を与えることができる。
更に別の態様において、本発明は、ＣＡプロモータ（ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）により、ヒト多能性幹細胞において、未分化状態、分化状態いずれでも確実に効率よく外来遺伝子を発現させる物質、方法、技術に関する。例えば、蛍光蛋白質などの遺伝子をＲＳＶ，ＣＭＶプロモータに繋いでヒト多能性幹細胞に導入すれば、分化状態に関わらず、多能性幹細胞由来の細胞を識別できる。これは例えば、再生医療における移植細胞の同定、追跡などが可能となる。例えば、ＣＡプロモータで目的遺伝子を発現させることで、ヒト多能性幹細胞に分化状態に関わらず（未分化状態から分化状態まで一貫して；分化状態によって作用が不安定や中断されることなく）、目的遺伝子の影響を与えることができる。
【０００７】
より詳細には、本発明は、以下の発明に関する：
（１）  ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップにおいて、Ｍｅｓｐ１を導入することを特徴とする、ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を誘導する方法。
（２）  ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップにおいて、ＧＡＴＡ４及びＭＥＦ２Ｃを導入しないことを特徴とする、（１）に記載の方法。
（３）  更に、Ｇ−ＣＳＦの存在下で培養するステップを備える、（２）に記載の方法。
（４）  ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップにおいて、Ｍｅｓｐ１と共に、ＧＡＴＡ４及びＭＥＦ２Ｃを導入することを特徴とする（１）に記載の方法。
（５）  更に、Ｇ−ＣＳＦの非存在下で培養するステップを備える、（４）に記載の方法。
（６）  Ｍｅｓｐ１の導入が、アデノウイルスベクターにより行われることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  アデノウイルスベクターが、ＣＡプロモータの下流にＭｅｓｐ１遺伝子が結合した発現カセットを含む、（６）に記載の方法。
（８）  アデノウイルスベクターによりＭｅｓｐ１を導入することが、ＭｅｓＰ１発現アデノウイルスベクターをＭＯＩ３で細胞に感染させることを備える、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）  ヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞のＥＢを形成させるステップが、９６ｗｅｌｌプレート中の１×１０３〜３×１０３細胞のヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞を使用することを特徴とする、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）  ９６ｗｅｌｌプレートが、低接着９６ｗｅｌｌプレートである、（９）に記載の方法。
（１１）  ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞中の分化細胞のみにおいて特異的に外来遺伝子を発現させる方法。
（１２）  ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、（１１）に記載の方法。
（１３）  ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える（１２）に記載の方法。
（１４）  前記外来遺伝子が標識遺伝子である、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）  標識遺伝子が、蛍光タンパク質である、（１４）に記載の方法。
（１６）  ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ；及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を分化した細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞の識別方法。
（１７）  前記外来遺伝子が細胞死を誘導する遺伝子である、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）  ＲＳＶプロモータ又はＣＭＶプロモータの下流に細胞死を誘導する遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；前記ヒト多能性幹細胞を培養し、前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記細胞死を誘導する遺伝子を発現させることにより、ヒト多能性幹細胞培養物中の分化細胞を除去する方法。
（１９）  ＣＡプロモータを用いることを特徴とする、ヒト多能性幹細胞、及び該ヒト多能性幹細胞から分化した細胞の両細胞において外来遺伝子を発現させる方法。
（２０）  ＣＡプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットを使用することを特徴とする、（１９）に記載の方法。
（２１）  ＣＡプロモータの下流に前記外来遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；及び、前記ヒト多能性幹細胞を培養し、未分化・分化のいずれの状態でも分化状態非依存的に前記ヒト多能性幹細胞に前記外来遺伝子を発現させるステップを備える請求項２０に記載の方法。
（２２）  外来遺伝子が標識遺伝子である、（１９）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法。
（２３）  標識遺伝子が蛍光タンパク質である、（２２）に記載の方法。
（２４）  ＣＡプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットをヒト多能性幹細胞に導入するステップ；前記ヒト多能性幹細胞及び前記ヒト多能性幹細胞から分化した細胞に特異的に前記標識遺伝子を発現させるステップ；及び、前記標識遺伝子を発現している細胞を、前記ヒト多能性幹細胞に由来する細胞として判定することを備える、ヒト多能性幹細胞に由来する細胞の識別方法。
（２５）  更に、ＣＡプロモータの下流に標識遺伝子を結合した発現カセットを導入した前記ヒト多能性幹細胞を生体内に移植するステップを備えることを特徴とする、（２４）に記載の方法。
（２６）  （２５）に記載の方法を備える、再生医療における移植細胞の同定方法又は追跡方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明のｉＰＳ細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法を模式的に示す説明図である。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲの結果。ＮＰＰＡでは二本バンドが検出されたが、上のバンドはゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物（５２８ｂｐ）であり、ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物（４０８ｂｐ）は下のバンドにあたる。Ａ；  分化誘導１４日目の細胞群。Ｂ；  分化誘導２１日目の細胞群。Ｃ；  分化誘導３５日目の細胞群。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲの結果。ＥＳ細胞での発現を１としたときの相対値。表２の結果をグラフ化。図４のＡ，Ｂ，Ｃがそれぞれ図５のＡ，Ｂ，Ｃと対応。
【実施例】
【０００９】
ＡＣＴ−ＳＣ法を用いた、分化細胞純化方法を確立するための前段階として、効率的な心筋細胞誘導法について検討した。
【００１０】
実施例１．マウスＥＳ細胞での心筋分化誘導
マウスＥＳ細胞（Ｄ３−ｆｅｅｄｅｒ  ｆｒｅｅ）をトリプシンで分散させた後、１  ×１０３／ｗｅｌｌまたは３×１０３／ｗｅｌｌで低接着９６ｗｅｌｌプレートに播種し、ＥＢ形成を行った。ＥＢ形成時にＭｅｓＰ１またはＥＧＦＰ発現アデノウイルスベクター（ＡｄＶ−ＣＡ−ＭｅｓＰ１又はＡｄＶ−ＣＡ−ＥＧＦＰ）をＭＯＩ３で感染させた。播種３日後に２４ｗｅｌｌまたは４８ｗｅｌｌ  ｇｅｌａｔｉｎ  ｃｏａｔ  ｐｌａｔｅにＥＢを移し、接着培養を行った。またＥＢ形成６日後に０．７５ｎｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦを培地に添加した。ＥＢ作成１０日後に０の出現したｗｅｌｌ数をカウントした。
【００１１】
実施例２．ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の心筋分化誘導
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ１）またはｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）の培養液にＲｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｙ−２７６３２を終濃度１０μＭになるように添加した。ＣＯ２インキュベータで１時間培養したのち、ＣＴＫ処理を行って細胞コロニーを剥がした。細胞塊懸濁液を１５ｍＬ遠心管に回収し、５分ほど静置し、細胞塊がある程度沈んだのを確認して上清を吸引除去した  （ＭＥＦの除去）。ＰＢＳ（−）で細胞塊を懸濁した後、１０００ｒｐｍで３分遠心を行い、上清を可能な限り吸引除去した。Ａｃｃｕｔａｓｅをφ６ｃｍ  ｄｉｓｈ一枚あたり０．５ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベータに５〜１０分静置した。ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地を加え、ピペッティングにより細胞塊をｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌに分散させた。１０００ｒｐｍで３分遠心し、上清を吸引除去した後、１０μＭ    Ｙ−２７６３２を含むＥＢ形成培地（１０％ＦＣＳ，０．５μＭ  ２ＭＥを含むαＭＥＭ培地）で細胞を懸濁した。
【００１２】
実施例２−１．心筋分化誘導における心筋関連遺伝子導入効果の検討
ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌに分散させたヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞にアデノウイルスベクターによりＭｅｓｐ１またはＥＧＦＰを導入した。細胞を１００μＬのＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（−ｂＦＧＦ）に懸濁し、ＭＯＩ１または３のアデノウイルスベクターを加え、ＣＯ２インキュベータに１時間静置  （１５分おきに軽くＶｏｌｔｅｘを行い懸濁した）し、ウイルス感染を行った。使用したアデノウイルスベクターはＡｄＶ−ＣＡ−Ｍｅｓｐ１またはＡｄＶ−ＣＡ−ＥＧＦＰである。１時間後、ＰＢＳ（−）１ｍＬを加え３０００ｒｐｍで５分遠心し、上清を吸引除去し、ＥＢ形成培地１ｍＬで細胞を懸濁した。細胞懸濁液を３０００ｒｐｍで５分遠心し、上清をできる限り吸引除去し、１０μＭ    Ｙ−２７６３２を含むＥＢ形成培地で懸濁した後、５０μＬ（２ｘ１０４）／ｗｅｌｌで、低接着９６ｗｅｌｌプレートに播種し、ＥＢ形成を行った。播種４日後にＧＡＴＡ４およびＭＥＦ２Ｃの導入を行った。培地をできるだけ取り除いたのち、１．５ｘ１０５ｐｆｕ／ｍＬに調整したウイルス液をｗｅｌｌあたり１５μＬ（１．５ｘ１０５ｐｆｕ／ｗｅｌｌ）加えた。ＣＯ２インキュベータで１時間静置し、アデノウイルスベクター感染を行った後、ウイルス液を取り除き、ＥＢ形成培地５０μＬを加えた。使用したアデノウイルスベクターはＡｄＶ−ＣＭＶ−ＧＡＴＡ４およびＡｄＶ−ＣＭＶ−ＭＥＦ２Ｃである。播種６日後２．５ｎｇ／ｍＬのＧ−ＣＳＦを添加し、播種１０日目にゼラチンコートした２４ｗｅｌｌ  または４８ｗｅｌｌにＥＢを移し、接着培養へと移行した。３〜４日に一度培地交換を行い、拍動細胞の出現したｗｅｌｌ数を確認した。
【００１３】
実施例２−２．心筋分化誘導時における細胞数の検討
ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌに分散させたヒトＥＳ細胞を１×１０３〜３×１０４／ｗｅｌｌの濃度で低接着９６ｗｅｌｌプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）９６Ｍプレート，住友ベークライト（株））に播種し、ＥＢ形成を行った。播種７日目にゼラチンコートした２４ｗｅｌｌプレートにＥＢをｐｌａｔｉｎｇした。ＥＢ作製１４，２１，３５日目（Ｄａｙ１４，２１，３５）に３ｗｅｌｌずつ細胞塊を回収し、Ｓｅｐａｓｏｌ（登録商標）−ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ  （Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を用いてプロトコールに従ってＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、ＲＮＡ  １μｇをｏｌｉｇｏ  ｄＴを用いて逆転写反応を行い、１ｓｔ  ｃＤＮＡ鎖を合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＥＸ−Ｔａｑを用いてＰＣＲを行った。
【００１４】
実施例３．ＲＴ−ＰＣＲ
Ｓｅｐａｓｏｌ（登録商標）−ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ  Ｇ  （Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）のプロトコールに従って抽出したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）のプロトコールに従って、１μｇのＲＮＡをｏｌｉｇｏ  ｄＴを用いて逆転写反応を行い、１ｓｔ  ｃＤＮＡ鎖を合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型としてＥＸ−Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲを行い、心筋関連遺伝子の発現量を確認した（半定量ＰＣＲ）。使用したＰｒｉｍｅｒと得られるＤＮＡ断片長は表１の通りである。
【００１５】
【表１】
2013240308.tif 000002
【００１６】
＜結果と考察＞
（ヒトＥＳ細胞の心筋分化誘導（１）心筋関連遺伝子およびＧ−ＣＳＦの影響についての検討）
心筋関連遺伝子のＭｅｓｐ１，ＧＡＴＡ４およびＭＥＦ２Ｃと心筋誘導に効果的であると報告されているＧ−ＣＳＦの影響についての検討を行った。２×１０４／ｗｅｌｌの細胞からスタートしたＥＢ形成において、ＥＢ形成時にＭｅｓｐ１を導入したグループのうち、Ｇ−ＣＳＦを添加したサブグループ（表２，Ａ）もしくはＭｅｓｐ１に加えＧＡＴＡ４とＭＥＦ２Ｃを導入し、Ｇ−ＣＳＦ添加を行わなかったサブグループ（表２，Ｂ）において、拍動細胞出現率が高い結果となった。Ｍｅｓｐ１を発現させてＧ−ＣＳＦを添加することでＧＡＴＡ４やＭＥＦ２Ｃなどの心筋分化因子の発現量が高くなり拍動細胞の出現率が高くなるのではないかと考えられる。またＭｅｓｐ１，ＧＡＴＡ４およびＭＥＦ２Ｃを細胞に導入し、さらにＧ−ＣＳＦを添加したサブグループでは拍動細胞の出現率が低かったことから、心筋関連遺伝子の過剰発現誘導は、心筋分化にあまり良い影響を与えない可能性が考えられる。
【００１７】
【表２】
2013240308.tif 000003
【００１８】
心筋細胞誘導においては肝細胞誘導のように分化に従い経時的に遺伝子を導入しなくても、上記のようにＭｅｓＰ１導入とＧ−ＣＳＦ添加である心筋誘導に効率的であることが判った。そこで続いてＭｅｓＰ１の導入量（ＭＯＩ１または３）とＧ−ＣＳＦ添加の影響について検討したところ、Ｍｅｓｐ１（ＭＯＩ３）＋Ｇ−ＣＳＦの組み合わせにおいて、拍動細胞の出現率が高い傾向が見られた（表３）。ＭｅｓＰ１の発現量やＧ−ＣＳＦ添加のタイミング、さらに他の因子の添加等についてさらに検討する必要がある。
【００１９】
【表３】
2013240308.tif 000004
【００２０】
マウスＥＳ細胞での心筋誘導実験
（１回目）
３×１０３／ｗｅｌｌでＥＢ作製を行った。１０日後のｂｅａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌの出現ｗｅｌｌ数を表４に示す。
【００２１】
【表４】
2013240308.tif 000005
【００２２】
ｃｏｎｔｒｏｌ群（ＡｄＶ−ＣＡ−ＥＧＦＰ）では、Ｇ−ＣＳＦの影響はなくどちらも４０％前後のｗｅｌｌにｂｅａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌが出現した。一方、Ｍｅｓｐ１を発現させたＥＢにおいては、Ｇ−ＣＳＦを添加したｗｅｌｌは逆にｂｅａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌの出現が減るという現象が見られた。これはＳｈｉｍｏｊｉら（２０１０）の結果と異なる結果となった。彼らはＥＢを形成方法は、今回用いた数を決めて９６ｗｅｌｌで作製する方法ではなく、分散培養させたＥＳ細胞を浮遊培養条件下で培養しＥＢを作製しているため、ＥＢを作製するスタートのＥＳ細胞の数が異なっている。そのことがＧ−ＣＳＦの感受性と関係しているものと考える。ＥＢ形成時の細胞数については、Ｋｏｉｋｅら  （２００７）により、１×１０３と４×１０３とでは分化傾向が異なる（ＥＢ形成５日後のＥＢにおいて、１×１０３ではＮｋｘ２．５やαＭＨＣの発現が高い（すなわち、心筋に分化する傾向が強い）のに対し、４×１０３ではＴＴＲやＡＦＰといった内胚葉系のマーカー発現が強い傾向にある）ことが報告されている。Ｇ−ＣＳＦの添加は分化誘導を始めてからの日数によってその効果の現れ方が異なる（Ｓｈｉｍｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）ことから、おそらく分散培養からのＥＢ形成におけるＧ−ＣＳＦ添加のタイミングと今回用いたＥＢ形成法におけるＧ−ＣＳＦ添加のタイミングが異なるために、効果が見られない、もしくは負の影響が見られた、という結果になったものと考える。
【００２３】
続いてＥＢ形成時の細胞数を１×１０３にした場合、Ｇ−ＣＳＦおよびＭｅｓｐ１の影響を調べた。その結果を表５に示す。
【００２４】
【表５】
2013240308.tif 000006
【００２５】
一回目（浮遊培養後、形成されたＥＢを４８ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅで接着培養）では、Ｍｅｓｐ１の発現の有無、Ｇ−ＣＳＦの処理の有無にかかわらず、ほとんどの細胞でｂｅａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌが出現した。アデノウイルスベクターの感染による影響を考え、二回目は非感染細胞も加え、またＥＢを２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅで培養させたが、やはりほとんどのｗｅｌｌでｂｅａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌが出現した。この結果から、マウスＥＳ細胞を用いた心筋分化誘導では、液性因子や遺伝子発現よりもまずＥＢを作製する際の細胞数が大きく影響することが示された。これはＫｏｉｋｅら（２００７）の結果と一致する。またデータは示していないが、Ｇ−ＣＳＦ（＋／−）やＭｅｓｐ１（＋／−）により拍動する領域の広さにあまり違いは見られなかった。
【００２６】
（ヒトＥＳ細胞の心筋分化誘導（２）  ＥＢ形成時の細胞数の検討）
マウスＥＳ細胞で得られた結果から、分化傾向にＥＢ形成時の細胞数が大きな影響を示すことから、まず細胞数と分化傾向について検討を行った。１ｗｅｌｌあたり１×１０３，３×１０３，１×１０４，３×１０４のヒトＥＳ細胞を９６ｗｅｌｌプレートに播種した。ＥＢ形成４日目の様子を図２に示す。
【００２７】
これらのＥＢを七日目にゼラチンコートした２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにひとつずつ移し、接着培養へと移行させた。ＥＢ形成１０日目（接着培養３日目）のＥＢを図３に示す。スタートの細胞数が異なるため、大きさは異なるものの、１×１０３，３×１０３，１×１０４のＥＢ由来の細胞は球状のＥＢが崩れて、中央が隆起し、外側に一層の細胞が広がっていく、似たような形態を取っていた。一方、３×１０４のＥＢ由来分化細胞はどれも球状のＥＢの形をある程度保ったまま、外側に一層の細胞が広がっていくという、異なる形態を取っており、細胞数による違いが観察された。拍動細胞は１×１０３，３×１０３で観察されたが、１×１０４、３×１０４のｗｅｌｌでは観察されなかった（表６）。
【００２８】
【表６】
2013240308.tif 000007
【００２９】
さらに、これらの細胞がどの胚葉に分化する傾向が強いのかについて解析するために、ＲＴ−ＰＣＲにより心筋関連因子の発現解析を行った（図４Ａ−Ｃ）。さらに得られたＲＴ−ＰＣＲの結果からそれぞれの遺伝子発現量を定量した（Ｎａｎｏｇ，Ｎｋｘ２．５，αＭＨＣ，  ＮＰＰＡのそれぞれの発現量をＨＰＲＴで補正し、さらにＥＳ細胞での発現量を１としたときの、各細胞での発現量を比較した；図５Ａ−Ｃ，  表７）
【００３０】
【表７】
2013240308.tif 000008
【００３１】
これらの結果からヒトＥＳ細胞の場合、３×１０３または１×１０３の細胞からＥＢを形成させることで、より効率的に心筋へ分化する傾向があると考えられる。これまでのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を用いた心筋誘導では、細胞塊の状態で浮遊培養を行う方法や、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌで懸濁させた状態でφ１０ｃｍ  ｄｉｓｈで浮遊培養を行う方法が用いられてきたが、このように低接着９６ｗｅｌｌを用いて、ＥＢ形成時の細胞数を検討した例はない。これまで行われてきた心筋誘導法では、ＥＢ形成初期条件が一定でないため、ＥＢ形成のコントロールが難しく、サイズや形が不均一なＥＢになってしまうため、その後の分化培養においてバラつきが生じるという問題があった。このようなＥＢを用いると、薬剤添加や遺伝子導入といった心筋誘導条件の検討を行うのにあたり、十分な効率が得られない、再現性を欠くといった課題があった。今回のＥＢ形成条件検討により、３×１０３の細胞からスタートすることが心筋誘導に適した条件であることが判った。これまでは１−２×１０４の細胞からＥＢを形成し実験を行ってきた。これは心筋誘導にはあまり適さない条件ではあったけれど、Ｍｅｓｐ１導入やＧ−ＣＳＦ添加により心筋誘導に効果があったことから、今後は３×１０３からＥＢ形成を行い、Ｍｅｓｐ１遺伝子導入およびＧ−ＣＳＦ添加と組み合わせることで、より高い誘導効率が得られることが期待される。
【００３２】
実施例４．ヒトとマウスのＥＳ細胞に対するアデノウイルスベクターでの遺伝子導入（図６）
アデノウイルスベクターはＥ１領域欠損の非増殖型ベクターで、ＲＳＶ，ＣＭＶ，ＣＡの各プロモータでＬａｃＺ遺伝子を発現するＡｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺ，Ａｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺ，Ａｄ．ＣＡ−ＬａｃＺの３種類を用いた。これらのウイルスの作製法、調整法、一般の癌細胞での特性は、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７：１５５−１６３  ２００３に報告しており、それに従っている。各ウイルスベクターを３×１０８ＰＦＵ／ｍＬ（ＰＦＵ；  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ，感染力を持つウイルス数／１ｍＬあたり）でヒトとマウスのＥＳ細胞に１時間感染後、Ｘ−ｇａｌ染色にてＬａｃＺ遺伝子の発現を見た。マウスＥＳ細胞の培養は、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１４，６７３−６８３．２００６に報告した方法に従っている。Ｒ１のＥＳ細胞は、フィーダー細胞としてマイトマイシン処理したマウス胎児線維芽細胞（ｍＥＦ）との共培養で、Ｄ３のＥＳ細胞はフィーダー細胞無しで培養している。ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳ）はｍＥＦと競売している。
結果は、図６の通りである（ＮＣはウイルス感染なし、ｍＥＦ上のＥＳ細胞は矢印頭、で示している）。Ａｄ．ＣＡ−ＬａｃＺは、全ての種類のＥＳ細胞、ならびにｍＥＦ細胞ともに、強いＬａｃＺ遺伝子発現がみられた。Ａｄ．ＣＭＶ−Ｌａｃ．ＺとＡｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺは、マウスＥＳ細胞では、ｍＥＦとの共培養の有無に関わらず、ＥＳ細胞でＬａｃＺの強い発現がみられる。これとは対象的に、ヒトＥＳ細胞では、共培養のｍＥＦ細胞では強いＬａｃＺの発現がみられるのとは対称的に、ＬａｃＺの発現が全くみられない。一方、Ａｄ．ＣＡ−ＬａｃＺは、マウス、ヒトのＥＳ細胞とも、強いＬａｃＺの発現を認めた。このように、ヒトＥＳ細胞では、マウスＥＳ細胞とは全く異なりを示し、ＲＳＶ，ＣＭＶの各プロモータは未分化状態では活性が消失するものである。
【００３３】
実施例５．アデノウイルスの受容体のｈＣＡＲ遺伝子発現と、ヒトＥＳ細胞と癌細胞株でのアデノウイルス遺伝子導入の比較（図７）
アデノウイルス受容体のｈＣＲＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現を、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ）、代表的な癌細胞株のＨｅＬａ細胞（子宮頸癌）、ＨｅｐＧ２（肝芽腫）で調べた（図７  ａ）。ＧＡＰＤＨはコントロールのハウスキーピング遺伝子。いずれの細胞でもｈＣＡＲの発現がみられ、ＫｈＥＳ細胞では、むしろＨｅＬａ細胞よりｈＣＡＲ発現は高かった。次に、ヒトＥＳ細胞には１×１０８ＰＦＵ／ｍＬ、癌細胞には３０ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；感染ウイルス数／細胞数）でのアデノウイルスを実施例４と同様に感染させてＸ−ｇａｌ染色をした（図７ｂ）。癌細胞ではいずれにおいても、いずれのアデノウイルスでもＬａｃＺ発現がみられた。一方、Ａｄ．ＲＳＶ−ＬａｃＺとＡｄ．ＣＭＶ−ＬａｃＺは、ｍＥＦ細胞で強い発現みられるのに、ヒトＥＳ細胞では発現がみられなかった。Ａｄ．ＣＡ−ＬａｃＺはヒトＥＳ細胞、ｍＥＦ細胞とも、ＬａｃＺの強い発現を認めた。
このように実施例４と同様の傾向が実施例５でも確認できた。つまり、ＲＳＶ，  ＣＭＶの各プロモータは、癌細胞株、未分化のマウスＥＳ細胞、ｍＥＳ細胞ではプロモータ活性を示す一方、ヒトＥＳ細胞では未分化状態では活性を全く示さない。一方、ＣＡプロモータは、癌細胞株、未分化のマウスＥＳ細胞、ｍＥＳ細胞だけでなく、未分化のヒトＥＳ細胞のいずれでも高いプロモータ活性を示して外来遺伝子の発現誘導ができることが確認できた。
【００３４】
実施例６．ファイバー改変型のアデノウイルスベクターによるヒトＥＳ細胞と癌細胞株での遺伝子導入効率の変化（図８）
癌や一般の正常細胞へのアデノウイルス遺伝子導入において、ｈＣＡＲが低発現だったり、遺伝子導入効率の低い細胞には、アデノウイルスのファイバーを改変してファイバーノブにＲＧＤペプチドを付加すれば、導入効率が上昇する場合が多いことが報告されている。よって実施例４及び５で確認した、ヒトＥＳ細胞の未分化でも機能するＣＡプロモータで蛍光分子のＥＧＦＰ遺伝子を発現する、野生型のファイバーのＡｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰと、ファイバーをＲＧＤペプチド付加に改変したＡｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ／Ｆ−ＲＧＤの二つで同様の比較実験を行った。感染４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した。
結果は、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ／Ｆ−ＲＧＤでむしろ共培養のｍＥＦ細胞への遺伝子導入効率が上昇する一方で、マウス、ヒトのどちらのＥＳ細胞とも、遺伝子導入効率は上昇しなかった。
よって以降の実験は、Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰで行うこととした。
【００３５】
実施例７．アデノウイルス量依存的な遺伝子導入効率（図９）
アデノウイルスの量を変えてＡｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰにて同様のプロトコールでヒトＥＳ細胞に感染、遺伝子導入実験を行った。奇麗なウイルス量依存的な遺伝子導入効率の変化が確認できた。
これまでの実験で、ＲＳＶ，ＣＭＶプロモータはヒトＥＳ細胞では未分化ではプロモータ活性が消失し、分化細胞（癌細胞株、正常の分化細胞であるｍＥＦ細胞）ではプロモータ活性がみられることがわかった。一方、ＣＡプロモータを使えば、アデノウルスベクターで遺伝子導入された後にも、未分化状態のヒトＥＳ細胞でもプロモータ活性が高く維持されることが分かった。
一方で、アデノウイルスベクターで簡単に高効率でヒトＥＳ細胞に遺伝子導入し、ＣＡプロモータで高発現できる一方で、共培養のｍＥＦ細胞にも同等かそれ以上にアデノウイルスが感染して遺伝子導入・発現することも分かった。フィーダー細胞なしでも培養可能にできるマウスＥＳ細胞とは異なり、ヒトＥＳ細胞においては、未分化維持にはｍＥＦ細胞のようなフィーダー細胞との共培養が一般には必要である。よってアデノウイルスベクターではヒトＥＳ細胞だけでなくフィーダー細胞にも遺伝子が導入されてしまうため、ヒトＥＳ細胞特異的に遺伝子を導入し発現させることが不可能である。
これを解決する方法を以下のように開発した。
【００３６】
実施例８．新しいアデノウイルスベクターによるヒトＥＳ細胞への高効率で、ヒトＥＳ細胞特異的な遺伝子導入法「無フィーダー感染法」の確立（図１０）
図１０のプロトコール１は、前述した一般的なアデノウイルスの感染・遺伝子導入の方法である。つまり、フィーダー細胞と共培養のヒトＥＳ細胞の培地を抜いて、最小量のアデノウイルス液を加えて１時間培養した後、新鮮な培地と交換するという方法であり、詳しくは以下である。
１）２、３日前に、２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅへヒトＥＳ細胞を蒔き込む。
２）感染に必要な１．０×１０５−３．０×１０８  ｐｆｕ／ｍｌとなるアデノウイルスベクター量を計算する。
３）ヒトＥＳ細胞用培地へアデノウイルスベクター溶液を必要量添加して、アデノウイルスベクター−ヒトＥＳ細胞用培地（希釈系列など）を調整する。
４）ヒトＥＳ細胞用培地を吸引除去後、アデノウイルスベクター溶液を２００μｌ（細胞表面が乾かないよう浸る液量が必要）添加し、ｗｅｌｌ全体に行き渡るように広げる。
５）３７℃、５．０％ＣＯ２インキュベータへ移し、１５分毎に培養皿を振盪・混和して、アデノウイルスベクター溶液をｗｅｌｌ全体に行き渡らせる。
６）アデノウイルスベクター感染開始から６０分後、アデノウイルスベクター−ヒトＥＳ細胞用培地を吸引除去する。５００μｌの新しいヒトＥＳ細胞用培地を添加して、培養を続ける。
７）少なくとも感染後、２４時間で導入遺伝子の発現を確認することができる。
【００３７】
これに対し、図１０ｂに示した新しいプロトコール２（無フィーダー感染法）の詳細は以下である。
（１）ヒトＥＳ細胞を２４ウェル培養皿に培養する。
（２）細胞解離液０．２５ｍｌ（２４ウェル培養皿の１ウェルあたり）をｄｉｓｈに加え、細胞表面全体に液が行き渡るようにした後、３７℃、３．０％  ＣＯ２インキュベータで５分間加温する。
（３）細胞の状態を顕微鏡で観察する（コロニーの周辺が捲れ上がってくる）。
（４）ヒトＥＳ細胞培地を１．０ｍｌ添加し、ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ（ピペットで吸ったり戻したりする）によって細胞を剥がす。更に数回のｐｉｐｅｔｔｉｎｇによってコロニーを適当なサイズに砕く。
（５）細胞懸濁液からＦｅｅｄｅｒ細胞を取り除くために、（４）の細胞懸濁液をゼラチンでコートした１２ウェル培養皿上でインキュベーションする。３７℃、５．０％  ＣＯ２インキュベータで３０−６０分間静置する。
（６）フィーダー細胞を除いた細胞浮遊液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ（一般的な実験用の小型の１．５ｍＬ蓋付きのチュープであればよい）中に集める。
（７）約１７０×ｇ（１０００ｒｐｍ）、５分間遠心する。
（８）上澄み（ｓｕｐ）をできるだけ除く。  ヒトＥＳ細胞が濃縮されたペレット（ｐｐｔ）が残る。
（９）別のチューブで、目的のウイルス感染濃度となるようにアデノウイルスベクターを添加したヒトＥＳ細胞用培地、５０−１００μＬを調整する。
（１０）（８）で得られたヒトＥＳ細胞ペレット（ｐｐｔ）に、９）のアデノウイルスベクター−ヒトＥＳ細胞用培地を５０−１００μＬ（凝集塊が十分に浸るようウイルス溶液は最低５０  μｌ必要）添加して、細胞を懸濁する。（エッペンドルフチューブ中でウイルス感染）。
（１１）３７℃、５．０％  ＣＯ２インキュベータで１時間のインキュベーション（細胞塊が沈むので、１５分毎に混和する）
（１２）ヒトＥＳ用培地を１．０ｍＬ添加し、約１７０×ｇ（１０００ｒｐｍ）、３分間遠心する。
（１３）ウイルス粒子を含んだ上澄み（ｓｕｐ）をできるだけ除く。（Ｗ０）
（１４）ヒトＥＳ用培地１．０ｍＬを添加し、約１７０×ｇ（１０００ｒｐｍ）、３分間遠心する。
（１５）上澄み（ｓｕｐ）をできるだけ除く。（Ｗ１）
（１６）必要に応じて、Ａｄｖを除くために、１４）−１５）を３〜５回繰り返す。（Ｗ３−５）
（１７）アデノウイルスベクター感染後のヒトＥＳ細胞ペレットへ培地を加え、軽く懸濁する。
（１８）新たに用意したフィーダー細胞へアデノウイルス感染後のＥＳ細胞懸濁液を加え、３７℃、５．０％  ＣＯ２インキュベータでインキュベーション。（最終濃度５．０ｎｇ／ｍｌの濃度でｂＦＧＦを添加する。）
（１９）通常培養を行ない鏡検する。
【００３８】
この二つのプロトコールの結果は以下の通りである（図１１）。Ｗは洗浄を表しており、Ｗ０〜Ｗ５は洗浄無し〜洗浄５回を表している。図１１ａはフィーダーのｍＥＦ細胞でＥＧＦＰ発現する割合を示しており、これが高いとヒトＥＳ細胞よりもむしろｍＥＦ細胞にアデノウイルスがトラップされていることを示唆している。
まずプロトコール１（図１１ｂ）では、これまでの実験と同様に、ヒトＥＳ細胞だけでなく、共培養のフィーダーのｍＥＦ細胞にも高率に遺伝子導入されていた。２回の洗浄にて若干のフィーダー細胞への遺伝子導入は減った。一方、プロトコール２の無フィーダー感染法では、フィーダー細胞への遺伝子導入が劇的に減少していた（図１１  ａ，  ｃ）。さらに洗浄を重ねるに従いフィーダー細胞への感染・遺伝子導入がさらに劇的に減少して行き、５回の洗浄では僅か２〜３％のｍＥＦ細胞が遺伝子導入されただけとなった。
【００３９】
次に、ヒトＥＳ細胞の未分化状態を確認した。
【００４０】
実施例９．アデノウイルスベクターでの遺伝子導入後の未分化マーカの発現（図１２）
免疫細胞染色により、ヒトＥＳ細胞の未分化マーカーの発現を調べた。図１２に示したように、ＴＲＡ−１−６０，ＳＴＡＴ３、Ｏｃｔ３／４などの未分化マーカーを、アデノウイルスでＥＧＦＰ遺伝子が導入されたヒトＥＳ細胞は、依然高発現していること、つまりアデノウイウルスによる遺伝子導入でヒトＥＳ細胞の未分化性維持に影響がなかったことが確認された。
【００４１】
以上のように、ヒトＥＳ細胞において、「アデノウイルスベクターと無フィーダー感染法とＣＡプロモータ」を使うことで、非常に簡単に高効率でヒトＥＳ細胞に特異的に遺伝子導入し、未分化細胞でも（分化に関係なく）安定的に強発現させることができる技術を発明できた。
【００４２】
次に、さらにもう一つのヒト多能性幹細胞であるヒトｉＰＳ細胞において、この「アデノウイルスベクターと無フィーダー感染法とＣＡプロモータ」の技術の有効性を確証するとともに、方法の最適化を行った。また方法は以下に詳細示す様に基本的には上記のヒトＥＳ細胞での実験と同様だが、最近発見されたＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒでの処理（メカニズムは不明であるが、細胞を塊からｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ化させた場合の細胞死を劇的に抑制できる）なども加味し、最適化した。以下、従来のプロトコール１を基本と「接着感染法」、新しいプロトコール２を「無フィーダー感染法」と呼び、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞における遺伝子導入効率を比較した。
【００４３】
実施例１０．「接着感染法」と「無フィーダー感染法」での、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞における遺伝子導入効率の比較実験
まず「接着感染法」のプロトコールの詳細は以下であり、これに従い感染をさせ実験を行った。
【００４４】
＜「接着感染法」のプロトコール＞
第一日目：細胞準備  
培地は３）〜８）まではＲｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ添加ＥＳ細胞培地（ｂＦＧＦ含有）を使用する。またマトリゲルでコートした１２ｗｅｌｌを用意する。
前日からＲｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒで処理しておいたヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞より培地を取り除き、ＣＴＫ液（２．５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ  １０ｍｌ、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（１０ｍｇ／ｍｌ）１０ｍｌ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＳＲ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌ、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２  １ｍｌ、ＰＢＳ  ５９ｍｌ）を加え、３７℃  ５−７分静置する。
細胞を観察し、コロニーの縁が剥がれ掛けていたらＣＴＫを取り除く。剥がれ方が不十分な場合はさらに３分  ３７℃静置する。
２ｍＬの培地を加え、コロニーをなるべく壊さないように２ｍＬピペットで剥がす。剥がした細胞は１５ｍＬ  ｔｕｂｅに移す。もう一度２ｍＬの培地を培養皿に加え、残っている細胞をチューブに移す。
３−５分ほど静置し、細胞塊がある程度チューブの下に沈んだら上清を取り除く。このときｍＥＦ細胞もほとんど取り除かれる。４ｍＬ  ＰＢＳ（−）を加え、遠心１０００ｒｐｍ×３分。
ＰＢＳ（−）を取り除き、Ａｃｃｕｔａｓｅ  ０．５ｍＬを加え、３７℃で５分静置。
１ｍＬの培地を加え、Ｐ１０００でピペッティングし、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌにする。
細胞浮遊液を１５ｍＬ  ｔｕｂｅに回収し、細胞数をカウントする。
８×１０４／ｗｅｌｌでマトリゲル１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種。培地はＲｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加したｍＥＦコンディション培地（ＣＭ）を使用する。
【００４５】
第二日目：ウイルス感染
前日に播種したＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞をカウントする。今回は、５×１０５／ｗｅｌｌであった。
Ａｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰ（２．５×１０７ＰＦＵ／μＬ）を使用し、ｂＦＧＦを含まないＥＳ培地に交換し、ウイルス液を各ＭＯＩ（１，３，１０）になるように希釈調整して加え、３７℃で感染１時間後、ウイルス液を取り除き、１ｗｅｌｌあたり１ｍＬの新しいＣＭを加える。
【００４６】
第三日目：解析
以下に述べる解析を行った。
【００４７】
次に「無フィーダー感染法」のプロトコールの詳細は以下であり、これに従い感染をさせ実験を行った。
【００４８】
＜「無フィーダー感染法」のプロトコール＞
第一日目：細胞準備  
細胞の調整方法は、「接着感染法」  の１）〜７）までは同一である。
細胞数をカウント後、３．２×１０５ずつ１．５ｍＬチューブに移す。
３０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心後、ｂＦＧＦを含まないＥＳ培地に懸濁する。
【００４９】
第二日目：ウイルス感染
前述のＡｄ．ＣＡ−ＥＧＦの希釈ウイルス液を、各ＭＯＩ（１，３，１０）で加え、３７℃  １時間静置する。感染１時間後、３０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心し、ウイルス粒子を含む上清を取り除く。Ｒｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ添加ＥＳ細胞培地（ｂＦＧＦ含有）１ｍＬを添加し、３０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心後、ウイルス粒子を含む上清を取り除く。Ｒｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ添加ＣＭ（ｂＦＧＦ＋）を添加し、Ｒｏｃｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ添加ＣＭ（ｂＦＧＦ＋）を加えた１２  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（マトリゲル処理）に２５０ｍＬずつ播種する。
【００５０】
第三日目：解析
以下に述べる解析を行った。
【００５１】
＜結果＞
以下に、解析の結果を示す。
（１）蛍光顕微鏡での観察
「接着感染法」の方はほぼコンフルエントな状態まで細胞が増殖し、ＭＯＩ１０では９０％以上でＥＧＦＰの発現が観察された（図１３）。
一方、「無フィーダー感染法」では、生存細胞数が極めて少ないが、生存細胞はＭＯＩ１でもほとんどの細胞でＥＧＦＰが発現しているように観察された。（図１４）。
ＫｈＥＳ１：  ヒトＥＳ細胞
２０１Ｂ７：  ヒトｉＰＳ細胞
２５３Ｇ１：  ヒトｉＰＳ細胞
（２）フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）解析
ＥＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳにて解析した。ＦＡＣＳの細胞の調整法は以下の通りである。
細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄後、１５０μＬの０．２５％ＴＥを加え、３７℃５分静置する。０．５ｍＬの１０％胎胎仔血清−ＤＭＥＭ（ｍＥＦ用培地）を加え、ピペッティングする。５０００ｒｐｍ×３ｍｉｎ遠心して細胞を集める。生細胞と死細胞を区別するために核染色のＰＩストック（０．０５ｍｇ／ｍｌ）をＥＳ培地で５０倍に希釈し、この培地でＥＳ細胞を懸濁する（０．５ｍＬ／サンプル）。ＦＡＣＳ解析を行う。結果は図１５、図１６の通りである。
「接着感染法」の結果が図中のａｄｈｅｓｉｏｎで、「無フィーダー感染法」の結果が図中のｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎで表されている。
同じＭＯＩ数で比較すると、「接着感染法」（ａｄｈｅｓｉｏｎ）に比べ、「無フィーダー感染法」（ｓｕｓｐｅｎｄ）が遙かに高い導入効率を示した。ＭＯＩ３で感染させた場合でも約９７％の細胞がＥＧＦＰを発現しており、ＭＯＩ１でも約８６％の細胞がＥＧＦＰ陽性だった。
さらに低いＭＯＩ（０．１，１）も交えて、幅広くＭＯＩの違いでの遺伝子導入効率を調べたが、いずれのＭＯＩでも「接着感染法」より「無フィーダー感染法」の方が遺伝子導入効率が高く、特に低いＭＯＩではその差は顕著にみられた（図１７）。
【００５２】
＜ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞での感染＞
次に、ヒトＥＳ細胞だけでなく、ヒトｉＰＳ細胞での遺伝子導入効率を調べた（図１８，  図１９）。
まず、「接着感染法」の結果は、いずれの細胞も、感染無しのコントロール（ＮＣ）ではＥＧＦＰ陽性細胞みられておらず、疑陽性（ＥＧＦＰの自家発光など）なく、うまく実験と解析が行われていることが示されている（図１８）。
細胞間で多少の効率の差はあるものの、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞（２種類）の合計３種類のいずれの細胞とも、高い導入効率を示した（図１９）。
前述までの詳細な検討で、「無フィーダー感染法」は「接着感染法」より高い遺伝子導入効率を示すことが明らかなので、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞の「無フィーダー感染法」での遺伝子導入効率は、低いＭＯＩ（０．１，０．３，１）で同様にＦＡＣＳで調べた（図２０）。このような極めて低いＭＯＩでも、極めて高い遺伝子導入効率を得ることができた。ＭＯＩは、アデノウイルス産生細胞である２９３細胞での力価測定から換算した感染力価のウイルスが一個の細胞あたりどれだけの遺伝子導入を示したかである。つまりその値がＭＯＩ１で７０％だとしたら、最も感染効率のいい２９３細胞が１０個中１０個に感染する感染ウイルス量で、１０個中７個に感染するということであり、これは極めて高い遺伝子導入効率を達成できたといえる。例えば、我々が以前調べた代表的な７種類の癌細胞株でのアデノウイルス遺伝子導入効率では、最高野結果だった肝芽種のＨｅｐＧ２細胞（肝細胞系の癌細胞は最も高いアデノウイルス遺伝子導入効率を示すことは他の多くの論文で示されている）でさえＭＯＩ１での遺伝子導入効率は約３０％であることからも（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ  ２７：  ７７−８５，  ２００５）、本願の発明でヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞に極めて高い遺伝子導入効率を達成できたことは客観的に実証できた。
【００５３】
本願実施例で使用した配列は以下の通りである。
ＣＡプロモータ  ６４６ｂｐ
ａｃｔａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａｃｇｇｇｇｔｃａｔｔａｇｔｔｃａｔａｇｃｃｃａｔａｔａｔｇｇａｇｔｔｃｃｇｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａａｔｇａｃｇｔａｔｇｔｔｃｃｃａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｃｇａｇｇｔｇａｇｃｃｃｃａｃｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｃａｔｃｔｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａａｔｔｔｔｇｔａｔｔｔａｔｔｔａｔｔｔｔｔｔａａｔｔａｔｔｔｔｇｔｇｃａｇｃｇａｔｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｃｇｇａｇａｇｇｔｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｃａａｔｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｃｔｃｃｇａａａｇｔｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｔａｔａａａａａｇｃｇａａｇｃｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｃｇｇ
ＣＭＶプロモータ
ＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧＡＣＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＣＴＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＣＣＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴ
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４８１ａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔ
５４１ａｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａ
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６６１ａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃ
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７８１ｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔｃｔｃｔｇｇｃｔａａｃｔａｇａｇａａｃｃｃａ
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９０１ｇａｇｃｔｃｇｇａｔｃｃａｃｔａｇｔａａｃｇｇｃｃｇｃｃａｇｔｇｔｇｃｔｇｇａａｔｔｃｔｇｃａｇａｔａｔｃｃａｔｃａｃａ
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１１４１ｔｔａｃａｔｇｇｔａａｃｇｃｇｇｃｃｔｃｔｔｃｔｔａｔｔｔａｔｇｇｃｇａｃａｔｇｔｔｇｔｇｃｃａｃａｔａｔｔｇａｇｃｃａ
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６７８１ａａａｇｃａｔｔｔｔｔｔｔｃａｃｔｇｃａｔｔｃｔａｇｔｔｇｔｇｇｔｔｔｇｔｃｃａａａｃｔｃａｔｃａａｔｇｔａｔｃｔｔａｔ
６８４１ｇｇｔａｃｔｇｔａａｃｔｇａｇｃｔａａｃａｔａａ
【図１】
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【図１６】
2013240308.tif 000010
【図１７】
2013240308.tif 000011
【図１９】
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【図２０】
2013240308.tif 000013
【図２】
2013240308.tif 000014
【図３】
2013240308.tif 000015
【図４】
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【図５】
2013240308.tif 000017
【図６】
2013240308.tif 000018
【図７】
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【図８】
2013240308.tif 000020
【図９】
2013240308.tif 000021
【図１０】
2013240308.tif 000022
【図１１】
2013240308.tif 000023
【図１２】
2013240308.tif 000024
【図１３】
2013240308.tif 000025
【図１４】
2013240308.tif 000026
【図１５】
2013240308.tif 000027
【図１８】
2013240308.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成24年6月27日(2012.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【図１】図１は、本発明のｉＰＳ細胞から分化した目的細胞の選別的単離又は可視化方法を模式的に示す説明図である。
【図２】図２は、ヒトＥＳ細胞の心筋分化誘導（２）  ＥＢ形成時の細胞数の検討における、ＥＢ形成４日目の様子を示す。
【図３】図３は、ヒトＥＳ細胞の心筋分化誘導（２）  ＥＢ形成時の細胞数の検討における、ＥＢ形成１０日目（接着培養３日目）の様子を示す。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲの結果。ＮＰＰＡでは二本バンドが検出されたが、上のバンドはゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ産物（５２８ｂｐ）であり、ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物（４０８ｂｐ）は下のバンドにあたる。Ａ；  分化誘導１４日目の細胞群。Ｂ；  分化誘導２１日目の細胞群。Ｃ；  分化誘導３５日目の細胞群。
【図５】ＲＴ−ＰＣＲの結果。ＥＳ細胞での発現を１としたときの相対値。表２の結果をグラフ化。図４のＡ，Ｂ，Ｃがそれぞれ図５のＡ，Ｂ，Ｃと対応。
【図６】ヒトとマウスのＥＳ細胞に対するアデノウイルスベクターでの遺伝子導入の結果を示す図である。ＮＣはウイルス感染なし、ｍＥＦ上のＥＳ細胞は矢印頭で示す。
【図７】図７ａは、アデノウイルス受容体のｈＣＲＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現を、ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ）、代表的な癌細胞株のＨｅＬａ細胞（子宮頸癌）、ＨｅｐＧ２（肝芽腫）で調べた結果を示す図である。ＧＡＰＤＨはコントロールのハウスキーピング遺伝子を示す。図７ｂは、ヒトＥＳ細胞には１×１０８ＰＦＵ／ｍＬ、癌細胞には３０ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；感染ウイルス数／細胞数）でのアデノウイルスを実施例４と同様に感染させてＸ−ｇａｌ染色をした結果を示す図である。
【図８】ファイバー改変型のアデノウイルスベクターによるヒトＥＳ細胞と癌細胞株での遺伝子導入効率の変化を調べた結果を示す図である。
【図９】アデノウイルスの量を変えてＡｄ．ＣＡ−ＥＧＦＰにて同様のプロトコールでヒトＥＳ細胞に感染、遺伝子導入実験を行った結果を示す図である。
【図１０】図１０ａ（プロトコル１）は、一般的なアデノウイルスの感染・遺伝子導入の方法を示す。つまり、フィーダー細胞と共培養のヒトＥＳ細胞の培地を抜いて、最小量のアデノウイルス液を加えて１時間培養した後、新鮮な培地と交換する方法を示す。図１０ｂ（プロトコル２）は、新しいプロトコール２（無フィーダー感染法）を示す。
【図１１】図１０に示す二つのプロトコルによる実験の結果を示す図である。Ｗは洗浄を示し、Ｗ０〜Ｗ５は洗浄無し〜洗浄５回を示す。図１１ａはフィーダーのｍＥＦ細胞でＥＧＦＰ発現する割合を示す。  図１１ｂは、プロトコール１の結果を示す。図１１ｃは、プロトコール２の無フィーダー感染法の結果を示す。
【図１２】図１２は、アデノウイルスベクターでの遺伝子導入後、免疫細胞染色により、ヒトＥＳ細胞の未分化マーカーの発現を調べた結果を示す図である。
【図１３】ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞における遺伝子導入効率の比較実験における、「接着感染法」の蛍光顕微鏡での観察の結果を示す。
【図１４】ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞における遺伝子導入効率の比較実験における、「無フィーダー感染法」の蛍光顕微鏡での観察の結果を示す。
【図１５】ＥＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳにて解析した結果を示す図である。図中、「ａｄｈｅｓｉｏｎ」は「接着感染法」の結果を示し、「ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ」は「無フィーダー感染法」の結果を示す。
【図１６】ＥＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳにて解析した結果を示すグラフである。グラフ中、「ａｄｈｅｓｉｏｎ」は「接着感染法」の結果を示し、「ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ」は「無フィーダー感染法」の結果を示す。
【図１７】さらに低いＭＯＩ（０．１，１）も交えて、幅広くＭＯＩの違いでの遺伝子導入効率をＦＡＣＳにて解析した結果を示すグラフである。
【図１８】ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞での遺伝子導入効率をＦＡＣＳにて解析した結果を示す図である。
【図１９】ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞での遺伝子導入効率をＦＡＣＳにて解析した結果を示すグラフである。
【図２０】ヒトＥＳ細胞及びヒトｉＰＳ細胞でのさらに低いＭＯＩ（０．１，１）も交えて、幅広くＭＯＩの違いでの遺伝子導入効率をＦＡＣＳにて解析した結果を示すグラフである。