(57)【要約】      （修正有）【課題】固相支持媒体を使用した核酸の検出感度を向上させ、リステリア・モノサイトゲネスや腸管出血性大腸菌などの検出が明確であり信頼性の高い核酸の検出方法およびその検出キットを提供する。【解決手段】基板１上に重ねて一体に設けた多孔性のメンブレンからなる固相支持媒体２に、標識用プローブを展開可能に保持するガラス繊維不織布製の保持部３および捕捉用プローブの結合域４を設けたテストストリップを用い、ＰＣＲ法により増幅させ一本鎖化した試料中の標的ＤＮＡ含有液を、予め捕捉用プローブを蛋白質を介して結合させ、標識用プローブを保持させた前記固相支持媒体に含浸して、前記標的ＤＮＡを捕捉用プローブおよび標識用プローブにハイブリダイズさせることにより、標的ＤＮＡを前記固相支持媒体上で識別される前記標識によって検出する、核酸の検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在する標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させ、増幅した標的ＤＮＡを一本鎖化し、この一本鎖の標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチドからなる捕捉用プローブを、予め固相支持媒体に蛋白質を介して結合させておくと共に、標識付きの相補的オリゴヌクレオチドからなる標識用プローブを予め前記固相支持媒体に保持しておき、その後、前記固相支持媒体に前記一本鎖の標的ＤＮＡの含有液を含浸して前記標的ＤＮＡを捕捉用プローブおよび標識用プローブにハイブリダイズさせることにより、標的ＤＮＡを前記固相支持媒体上で識別される前記標識によって検出する核酸の検出方法。
【請求項２】
上記固相支持媒体に対して蛋白質を介して予め結合させた捕捉用プローブが、固相支持媒体に対して可溶性蛋白質を介して予め結合させた捕捉用プローブである請求項１に記載の核酸の検出方法。
【請求項３】
上記固相支持媒体が、クロマトグラフ媒体からなり、このクロマトグラフ媒体の展開方向の上流側に前記標識用プローブを配置し、かつ下流側に前記捕捉用プローブを配置しておくことにより、上流側から一本鎖の標的ＤＮＡを前記標識用プローブとハイブリダイズした状態で展開し、下流側で前記捕捉用プローブにハイブリダイズした標的ＤＮＡを前記標識によって検出する請求項１または２に記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
標的ＤＮＡが、有害微生物の遺伝子である請求項１〜３のいずれかに記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
標的ＤＮＡが、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｈｌｙ遺伝子である請求項４に記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段が、試料中の標的ＤＮＡを配列番号１または２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することである請求項５に記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
上記標識用プローブまたは捕捉用プローブに用いる相補的オリゴヌクレオチドが、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドである請求項５または６に記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
標的ＤＮＡが、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素遺伝子である請求項４に記載の核酸の検出方法。
【請求項９】
ベロ毒素遺伝子が、ベロ毒素１型遺伝子もしくはベロ毒素２型遺伝子またはこれら両方のベロ毒素遺伝子である請求項８に記載の核酸の検出方法。
【請求項１０】
固相支持媒体に標識用プローブおよび捕捉用プローブを保持するテストストリップ、並びに展開用緩衝液を必須構成用品とする請求項１〜９のいずれかに記載の核酸の検出方法に用いる核酸の検出キット。
【請求項１１】
固相支持媒体に標識用プローブおよび捕捉用プローブを保持するテストストリップ、標的ＤＮＡのＰＣＲ用増幅プライマー並びに展開用緩衝液を必須構成用品とする請求項１〜９のいずれかに記載の核酸の検出方法に用いる核酸の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、試料中に存在する細菌等の核酸の検出方法およびその検出キットに関し、特にリステリア・モノサイトゲネスなどの有害微生物等を検出する検査に適用できる核酸の検出方法およびその検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、細菌等のうち、食中毒菌その他の有害微生物を試料から検出する方法として、生化学的性状から判断するものではなく、遺伝子レベルでの判別方法として、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)で有害微生物の遺伝子配列の特定領域を増幅し、増幅産物の有無を電気泳動によって確認する検査方法が知られている（特許文献１）。
【０００３】
例えば、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)は、食中毒症状の感染を起こすことが古くから知られている人畜共通感染の有害微生物であり、哺乳類、鳥類などの動物の糞便を介して自然界に広く分布し、それらを介して汚染された種々の食品により食中毒症状の感染が起こると考えられている。特に家畜の健康保菌に関連して動物性食品の汚染が高いとされており、外国では牛乳、チーズ、食肉を介した集団食中毒も発生している。
【０００４】
また、細菌類や原虫などの微生物による感染症の有無を検査するために、検出対象の微生物の遺伝子配列の特定領域を標的核酸とし、これをＲＮＡの１本鎖核酸として増幅し、この増幅産物をクロマトグラフィーにより検出する方法が知られている（特許文献２）。
【０００５】
上記核酸検出方法におけるクロマトグラフィーでは、「増幅産物をメンブレンに結合した増幅産物と相補的な第１のオリゴヌクレオチドプローブ及び着色高分子担体で標識した相補的な第２のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせて検出する工程及び検出像を目視判定により評価する工程」を有している。
【０００６】
また、上記クロマトグラフィーでは、捕捉用オリゴヌクレオチドプローブは、結合対象となるメンブレンが化学的に修飾されており、これに反応する官能基を有するものを採用し、例えばカルボキシル基で修飾されたメンブレンに対して、５’あるいは３’末端をアミノ化した合成オリゴヌクレオチドを採用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２７４９３４号公報
【特許文献２】特許第４２６８９４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記した従来の核酸の検出方法では、標的核酸から１本鎖核酸としてＲＮＡを増幅し、この増幅産物をクロマトグラフィーにより検出しており、１本鎖ＲＮＡはヒドロキシル基が比較的不安定な構造で反応性もあるため、ＤＮＡを増幅する場合と比較するとＲＮＡは不安定で確実に検出することが容易なことでなく、すなわち核酸の検出感度は不安定であるという問題点がある。
【０００９】
また、ＲＮＡの増幅産物を検出する場合、例えばリステリア・モノサイトゲネスのように毒性物質を産生する可能性のあるものでは、生菌が検出されなくても過去に産生した毒性物質を含有している場合があり、生菌の有無を確認するだけでは食品に含まれる毒性物質によるリスクを見逃してしまう可能性がある。
【００１０】
また、増幅産物を、メンブレンに結合した増幅産物と相補的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる際、例えばカルボキシル基で修飾されたメンブレンに対して末端をアミノ化したオリゴヌクレオチドを採用し、各オリゴヌクレオチドプローブはメンブレンに対して１箇所ずつの官能基との化学的結合で結合しているに過ぎない。
そのため、単位面積あたりの着色高分子担体の結合数が少なく標識の識別感度が高くなりにくいという問題点がある。
【００１１】
そこで、この発明の課題は、上記した従来技術の問題点を解決し、固相支持媒体を使用した核酸の検出感度を向上させ、生菌の検出ばかりでなく過去の汚染の可能性を含めて確実に検出できる核酸の検出方法とし、また捕捉用プローブがクロマトグラフなどの固相支持媒体にできるだけ密集して固定されるようにして固相支持媒体上の特定区域に明確に標識用プローブを検出できるようにし、特にリステリア・モノサイトゲネスなどの有害微生物の検出が明確で信頼性の高い核酸の検出方法およびその検出キットとすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、この発明では、試料中に存在する標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させ、増幅した標的ＤＮＡを一本鎖化し、この一本鎖の標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチドからなる捕捉用プローブを、予め固相支持媒体に蛋白質を介して結合させておくと共に、標識付きの相補的オリゴヌクレオチドからなる標識用プローブを予め前記固相支持媒体に保持しておき、その後、前記固相支持媒体に、前記一本鎖の標的ＤＮＡの含有液を含浸して、前記標的ＤＮＡを捕捉用プローブおよび標識用プローブにハイブリダイズさせることにより、標的ＤＮＡを前記固相支持媒体上で識別される前記標識によって検出する核酸の検出方法としたのである。
【００１３】
上記した工程からなるこの発明の核酸の検出方法では、試料中に存在する標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させるので、ＲＮＡを増幅する場合と比べて安定性の良いＤＮＡを増幅するため、確実な判定が行なえるようになり、すなわち核酸の検出感度が安定する。
【００１４】
また、増幅したＤＮＡを検出することにより、過去に産生した毒性物質の含有の可能性を含めて検出でき、食品に含まれる有害微生物（菌類）の存在をより確実に確認することができる。
【００１５】
標的ＤＮＡは、検査や調査の目的に応じて設定することが可能であるが、例えばヒト等の生体に対して病原性のある有害微生物のＤＮＡを検査することにより、害を避ける対策をとることができる。
【００１６】
標的遺伝子となる有害微生物の遺伝子の例として、食中毒症状を起こすリステリア・モノサイトゲネスの毒性物質産生に関わるｈｌｙ遺伝子、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素遺伝子を挙げることができる。
【００１７】
上記の場合においてベロ毒素遺伝子が、ベロ毒素１型遺伝子もしくはベロ毒素２型遺伝子またはこれら両方のベロ毒素遺伝子である核酸の検出方法とすることもできる。さらにまた、ベロ毒素１型遺伝子と９９％以上遺伝子配列が一致していることが知られている志賀赤痢菌の志賀毒素遺伝子を標的遺伝子とすることもできる。
【００１８】
また、固相支持媒体に蛋白質を介して捕捉用プローブを結合すると、ポリペプチドからなる高分子の蛋白質粒子に対し、多数の捕捉用プローブが集合して高密度に結合するため結合した標識の識別が容易になり検出感度が向上する。
【００１９】
このような作用を充分に奏するように、上記固相支持媒体に対して蛋白質を介して予め結合させた捕捉用プローブとしては、固相支持媒体に対して充分な結合性を有している牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やイムノグロブリンＧなどの可溶性蛋白質を介して結合させる捕捉用プローブであることがより好ましい。
【００２０】
上記した検出方法では、標的ＤＮＡを前記固相支持媒体上で識別される前記標識を利用して周知の方法によって検出することができ、例えば、予め前記固相支持媒体に保持しておいた標識用プローブのうち、標的ＤＮＡにハイブリダイズされずに残った標識用プローブを洗浄などによって除去または分離してもよく、固相支持媒体の形状としてはシート状、棒状、球状他の粒子状など、様々な形態を採用することができる。
また上記した核酸の検出方法において、上記固相支持媒体としてクロマトグラフ媒体を採用しても良い。
【００２１】
その場合、クロマトグラフ媒体の展開方向の上流側に前記標識用プローブを配置し、かつ下流側に前記捕捉用プローブを配置しておくことにより、上流側から一本鎖の標的ＤＮＡを含有する液体を前記標識用プローブとハイブリダイズした状態で展開し、下流側で前記捕捉用プローブにハイブリダイズした標的ＤＮＡを前記標識によって検出する核酸の検出方法とすることができる。
【００２２】
また、上記した核酸の検出方法において、標的ＤＮＡが、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｈｌｙ遺伝子などの有害微生物の遺伝子である場合、このような有害微生物による汚染の可能性を効率よく確実に判定できるように明確で信頼性の高い核酸の検出方法になる。
【００２３】
上記のリステリア・モノサイトゲネスの検出方法について、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段が、試料中の標的ＤＮＡを配列番号１または２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することにより、標的ＤＮＡの増幅効率が向上し、検出効率を向上することができる。
【００２４】
また、上記標識用プローブまたは捕捉用プローブに用いる相補的オリゴヌクレオチドが、配列番号４または配列番号５で示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドである上記の核酸の検出方法とすることにより、リステリア・モノサイトゲネスの検出方法について、増幅産物を特異的にかつ高感度に検出することができる。
【００２５】
また、上記したいずれかの核酸の検出方法に用いる核酸の検出キットであって、固相支持媒体に標識用プローブおよび捕捉用プローブを保持するテストストリップ、並びに展開用緩衝液を必須構成用品とするもの、または上記の標的ＤＮＡのＰＣＲ用増幅プライマーを含めて必須構成用品とする核酸の検出キットとすることにより、リステリア・モノサイトゲネスその他の有害微生物等の核酸の検出が明確であり、信頼性の高い核酸の検出ができる検出キットになる。
【００２６】
また、上記した核酸の検出方法での標的ＤＮＡが、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素遺伝子である場合において、試料中の標的ＤＮＡのベロ毒素１型遺伝子をＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段が、配列番号９で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号１０で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することができる。
【００２７】
さらに、核酸の検出方法が上記同様の場合において、試料中の標的ＤＮＡのベロ毒素２型遺伝子をＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段が、配列番号１１で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号１２で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することができる。
【００２８】
また、上記した核酸の検出方法において、ベロ毒素１型遺伝子の標識用プローブまたは捕捉用プローブに用いる相補的オリゴヌクレオチドが、配列番号１３、１４もしくは１５で示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドを採用することができる。
【００２９】
また、上記した核酸の検出方法において、ベロ毒素２型遺伝子の標識用プローブまたは捕捉用プローブに用いる相補的オリゴヌクレオチドが、配列番号１７もしくは１９で示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドを採用することができる。
【発明の効果】
【００３０】
この発明は、試料中に存在する標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させ、捕捉用プローブを予め固相支持媒体に蛋白質を介して結合させておき、標識用プローブを予め前記固相支持媒体に保持し、前記固相支持媒体に標的ＤＮＡの含有液を含浸して前記標的ＤＮＡを捕捉用プローブおよび標識用プローブにハイブリダイズさせ、標的ＤＮＡを前記固相支持媒体上で標識によって検出するので、核酸の検出感度が向上し、生菌の検出ばかりでなく過去の汚染の有無を含めて検出でき、また捕捉用プローブが固相支持媒体上の特定区域に密集して固定されるので、標識用プローブの検出感度が向上し、特にリステリア・モノサイトゲネス、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)その他の有害微生物等の検出が明確になり、信頼性の高い核酸の検出方法となる利点がある。
【００３１】
また、核酸の検出方法に用いる標識用プローブおよび捕捉用プローブ、固相支持媒体並びに展開用緩衝液を具備する標的核酸の検出キットまたはさらに標的ＤＮＡのＰＣＲ用増幅プライマーを含めて具備する検出キットとすることにより、リステリア・モノサイトゲネス、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)その他の有害微生物等の核酸の検出が明確であり、信頼性の高い核酸の検出ができる検出キットになるという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施形態の核酸の検出キットに用いるテストストリップの斜視図
【図２】テストストリップの機能を経時的かつ模式的に示す説明図
【図３】テストストリップの機能を経時的かつ模式的に示す説明図
【図４】テストストリップの機能を経時的かつ模式的に示す説明図
【図５】ＰＣＲプライマーの増幅効率を配列番号別に示すアガロースゲル電気泳動図
【図６】実施例１７で作製したテストストリップによる検出実験の判定結果（クロマトグラフ）を示す図面代用写真
【発明を実施するための形態】
【００３３】
この発明の核酸の検出方法の詳細な工程およびそれに用いるキットについて、以下に添付図面を参照して説明する。
図１に示すように、この発明の実施形態の核酸の検出方法は、プラスチック製の基板１上に重ねて一体に設けた多孔性のメンブレンからなるクロマトグラフ媒体としての固相支持媒体２に、標識用プローブを展開可能に保持するガラス繊維不織布製の保持部３および捕捉用プローブの結合域４（検出時に識別されるバンドで示す）を帯状に設けたテストストリップを用いている。
なお、図中の符号５は標準核酸の検出部（別途設けた標準核酸捕捉用プローブの結合域）であり、符号６はガラス繊維不織布製の含浸用パッド、符号７は把持部用パッドであり、符号３ａはプラスチック製の展開スタートライン基準板である。
【００３４】
図２以下に模式的に示される標識用プローブ８は、一本鎖の標的ＤＮＡ９に対してハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチド１０に、着色ラテックス１１の標識を一体化したものからなり、予めテストストリップの展開方向の上流部分の保持部３に含浸し、さらに乾燥させた状態で保持している。
【００３５】
また、上記同様に模式的に示す捕捉用プローブ１２は、一本鎖の標的ＤＮＡ９にハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチド１３からなり、クロマトグラフ媒体２の展開方向の下流側の所定位置である結合域４に蛋白質１４を介して予め結合している。
【００３６】
このようなテストストリップに用いる展開液は、試料中に存在する標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させてから、さらに加熱処理やアルカリ処理などにより一本鎖化したものを含有している。そして、この一本鎖の標的ＤＮＡを含む展開用の緩衝液を標識用プローブの保持部３および含浸用パッド６に含浸し、これらに含まれる標的ＤＮＡ含有液を固相支持媒体２の下流に移動させ、すなわち展開させて標的ＤＮＡの検出を行なう。
【００３７】
図３に示すように、標的ＤＮＡ９を含有する展開用緩衝液をテストストリップの端部の保持部３および含浸用パッド６に含浸し、さらに固相支持媒体２の下流側に展開させると、先ず上流側の標識用プローブの保持部３で、標的ＤＮＡ９は標識用プローブ８にハイブリダイズし、さらに展開されて図４に示すように、下流側の所定幅の帯状区域に固定されている捕捉用プローブ１２とハイブリダイズして帯状のバンドとして定着する。
【００３８】
このようにすると、展開液中に一本鎖の標的ＤＮＡが存在する場合には、捕捉用プローブにハイブリダイズした標的ＤＮＡを前記標識の所定区域における色彩の顕著化、例えば肉眼で識別可能なバンドなどの識別容易化によって検出することができる。
また、このとき試料中に標準核酸を添加しておき、上記同様の手法で標準核酸のバンドを検出しておくことは、適切な条件で検出が行なわれたことを確認するために好ましい。
【００３９】
このような核酸の検出方法に用いる核酸の検出キットは、基板１上の固相支持媒体２に標識用プローブおよび捕捉用プローブを保持したテストストリップ、展開に用いられる緩衝液および検査用試料の調製に用いられる標的ＤＮＡのＰＣＲ用増幅プライマーを必須構成用品として構成することができる。
【００４０】
また、上記検出キットは、必要に応じて基板１上の固相支持媒体２に標識用プローブおよび捕捉用プローブを保持したテストストリップおよび展開に用いられる緩衝液を必須構成用品のセットとして構成することもできる。
【００４１】
この発明の実施形態を検出の工程と検出キットの構成材についてさらに詳細に説明する。
先ず、検査対象の試料としては、標的核酸を含有する可能性のあるものであればよく、特に制限はないが、食中毒症状を起こす有害微生物を検査する場合には、食肉、食肉加工品、乳製品などの食品を挙げることができる。
【００４２】
この発明に用いる標的核酸としては、特に限定されるものではなく、検出目的の血液細胞その他の細胞、培養細胞株、菌株、細菌その他の微生物、ウィルスなどの検出を目的とし、それらに含まれる核酸が挙げられる。
【００４３】
また、食中毒症状を起こす周知の有害微生物について、その遺伝子を構成する所定の核酸を標的核酸として採用すれば、食品産業や保健衛生などにおけるこの発明の利用価値を高めることができる。
【００４４】
上記した有害微生物の例としては、サルモネラ属菌、カンピロバクター、病原性（腸管出血性）大腸菌、セレウス菌、ノロウィルス、ロタウィルス、腸炎ビブリオ菌、エロモナス属菌、ウェルシュ菌またはリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、赤痢菌(志賀赤痢菌等)などが挙げられる。
【００４５】
［ＰＣＲ法による二本鎖核酸の増幅］
標的ＤＮＡを試料より抽出し、ＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅するが、抽出は特に限定される方法でなくてもよく、市販の抽出キットを用いても良い。
【００４６】
また、標的ＤＮＡが、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｈｌｙ遺伝子である場合には、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段が、試料中の標的ＤＮＡを配列番号１または２で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することであることが増幅効率の向上のために好ましいことである。
【００４７】
上記した配列番号のリステリア・モノサイトゲネス用のＰＣＲプライマーは、公知のプライマーセット（特開２００７−２７４９３４号公報の段落００２０〜００２２に記載）から、増幅産物の塩基長が１５０〜３５０ｂｐであり、しかも増幅効率が良いものを選択して採用したものである。
【００４８】
図５にリステリア・モノサイトゲネス用のＰＣＲプライマーの増幅効率を比較するため、アガロースゲル電気泳動試験の所定位置に現れたバンドの濃さを比較する結果を示した。
【００４９】
また、上記同様にＰＣＲ法による二本鎖核酸の増幅を行なうとき、標的ＤＮＡが、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素遺伝子１型（以下、ＶＴ１と表記する場合がある）については、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段が、試料中の標的ＤＮＡを配列番号９で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号１０で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することであることが増幅効率の向上のためにも好ましいことである。
【００５０】
また、標的ＤＮＡが、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素遺伝子２型（以下、ＶＴ２と表記する場合がある）については、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段が、試料中の標的ＤＮＡを配列番号１１で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号１２で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅することであることが増幅効率の向上のためにも好ましいことである。
【００５１】
このように標的ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ工程は常法に準じて行うことができ、既に市販されているＰＣＲ装置などを用いて行うことができる。
より詳細には、例えば、ＰＣＲ反応に使用される反応液は、市販のＰＣＲ測定キットなどに添付されている反応液を使用すればよい。
【００５２】
また、ＰＣＲ反応に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは９０〜９８℃の温度で活性を保持するものであれば、何れの生物種由来でもよい。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばGeneTaq、TaKaRaTaq、ExTaqHSなどが例示できる。
【００５３】
ＰＣＲ条件としては、熱変性の温度は９０〜９８℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４５サイクル行って増幅させる。
プライマーセットの使用量は、特に制限されないが、０．０１〜５μＭで使用することが好ましい。
【００５４】
次に、このようなプライマーセットを用いて増幅した標的ＤＮＡを加熱処理やアルカリ処理などにより一本鎖化し、さらに展開する。
展開に用いる緩衝液は、できれば一本鎖ＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションが速やかに確実に起こりやすい特性を有する緩衝液を使用することが好ましいが、例えばクエン酸緩衝液（同仁化学研究所製：４×ＳＳＣ)、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液、２５％ホルムアミドなどを含めた周知（または市販）の展開液を用いることも可能である。
【００５５】
次に、固相支持媒体に標識用プローブおよび捕捉用プローブを保持する工程について説明する。
［プローブの作成］
この発明に用いる標識用プローブおよび捕捉用プローブは、いずれも標的ＤＮＡにハイブリダイズする相補性を有するオリゴヌクレオチドであり、例えば標的ＤＮＡが、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｈｌｙ遺伝子である場合には、以下の配列番号４、５で示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドを採用することが好ましい。
【００５６】
また、ベロ毒素１型遺伝子の標識用プローブまたは捕捉用プローブに用いる相補的オリゴヌクレオチドについては、例えば配列番号１３、１４もしくは１５で示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドを採用することができる。
【００５７】
さらにまた、ベロ毒素２型遺伝子の標識用プローブまたは捕捉用プローブに用いる相補的オリゴヌクレオチドについては、例えば配列番号１７もしくは１９で示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドを採用することができる。
【００５８】
これらプローブの選択に当たり、以下のようにして標的核酸の塩基配列から選択し、候補にあげられた相補的オリゴヌクレオチドを評価することができる。
例えば、リステリア・モノサイトゲネスの遺伝子ｈｌｙについての塩基配列や、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素遺伝子（ベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）についてはこれと９９％以上一致する志賀赤痢菌の産生する志賀毒素（ＳＴＸ）の遺伝子を使用することができる）を公的データベース（ＮＣＢＩ）からダウンロードし、整列させた上で、保存性の高い領域からプローブを選択し、検出感度を比較してラインの吸光度が高く、他の遺伝子、例えば１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅産物でのラインが検出されないものを選択する。
【００５９】
具体的には、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)検出用の標識用プローブまたは捕捉用プローブとしては、配列番号４、５、７、８に示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列が挙げられる。
さらに、後述する実施例の結果からみると、検出感度を比較して選択すると配列番号４、５の塩基配列からなる相補的オリゴヌクレオチドの組み合わせが、標識用プローブおよび捕捉用プローブに用いるものとして適切である。
【００６０】
腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)検出用の標識用プローブまたは捕捉用プローブとしては、配列番号１３〜１５もしくは配列番号１７、１９に示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列が挙げられる。
【００６１】
この場合、後述する実施例の結果からみると、配列番号１３〜１５に示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列は、ベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）について有効であり、配列番号１７、１９に示される塩基配列またはこれらの相補的塩基配列は、ベロ毒素２型遺伝子（ＶＴ２）について有効である。
【００６２】
(1)標識用プローブおよび標識
リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)検出用の標識用プローブについては、配列番号４または５に示される相補的オリゴヌクレオチドまたはこれらの相補的塩基配列に対し、標識を結合したものをこの発明に用いる標識付きの相補的オリゴヌクレオチドからなる標識用プローブとして採用し、これを固相支持媒体に重ねて設けるガラス繊維製不織布などの保持用部材に含浸し、その後、乾燥させて保持する。
【００６３】
ベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）検出用の標識用プローブについては、配列番号１３〜１５に示される相補的オリゴヌクレオチドまたはこれらの相補的塩基配列を用い、またはベロ毒素２型遺伝子（ＶＴ２）検出用の標識用プローブについては、配列番号１７、１９に示される相補的オリゴヌクレオチドまたはこれらの相補的塩基配列に対し、標識を結合したものをこの発明に用いる標識付きの相補的オリゴヌクレオチドからなる標識用プローブとして採用し、これを固相支持媒体に重ねて設けるガラス繊維製不織布などの保持用部材に含浸し、その後、乾燥させて保持する。
【００６４】
なお、標識としては、特に限定されることなく、金コロイドや顔料で着色された高分子担体（ラテックス）を採用することが好ましく、青や赤色のポリスチレンラテックスは周知な標識であり、さらに官能基としてカルボキシル基を有する標識とすればアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドに結合性が優れる。
【００６５】
このように標識と相補的オリゴヌクレオチドとの結合は、通常、官能基を用いて結合させることが簡便であり好ましい。また、アビジン・ビオチン、ストレプトアビジン・ビオチン、ハプテン・抗ハプテン抗体などの結合性を利用して標識に利用することができる。
【００６６】
標識の大きさは、多孔性の固相支持媒体に三次元網目状に形成されている孔より小径のもの（通常５００ｎｍ以下）を採用し、標識用プローブが、固相支持媒体内を緩衝液や洗浄液と共に通過することを妨げないようにする。
【００６７】
(2)捕捉用プローブ
捕捉用プローブについてもリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)検出用の標識用プローブについては、配列番号４または５に示される相補的オリゴヌクレオチドまたはこれらの相補的塩基配列であって、前記した標識用プローブに使用したものとは異なる相補的オリゴヌクレオチドについて、一端に蛋白質を結合したものを採用できる。
【００６８】
ベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）検出用の標識用プローブについては、配列番号１３〜１５に示される相補的オリゴヌクレオチドまたはこれらの相補的塩基配列を用い、またはベロ毒素２型遺伝子（ＶＴ２）検出用の標識用プローブについては、配列番号１７、１９に示される相補的オリゴヌクレオチドまたはこれらの相補的塩基配列であって、前記した標識用プローブに使用したものとは異なる相補的オリゴヌクレオチドについて、一端に蛋白質を結合したものを採用できる。
【００６９】
このような捕捉用プローブは、固相支持媒体に蛋白質を介して結合させる。ベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）検出用のものと、ベロ毒素２型遺伝子（ＶＴ２）検出用のものを同一の固相支持媒体の展開方向上流側と下流側に間隔を空けて配置し、すなわち２本のラインとして識別できるように配置しておくことにより、一つの固相支持媒体でＶＴ１およびＶＴ２を同時に検出できるテストストリップを構成できる。
【００７０】
なお、ＶＴ１検出用の補足用プローブと、ＶＴ２検出用の補足用プローブをそれぞれ固定した固相支持媒体とすれば、ＶＴ１検出またはＶＴ２検出の専用テストストリップになることは勿論である。
【００７１】
ここで、この発明に用いる固相支持媒体としては、標的ＤＮＡの含有液である展開液を含浸して展開可能な連続した３次元の網目構造または同様な多孔性を有する繊維製不織布または多孔性メンブレンを採用できるものである。固相支持媒体の材質としては、ニトロセルロースやナイロン製のものが挙げられ、クロマトグラフ媒体として使用可能なものが好ましい。
このような固相支持媒体に対し、捕捉用プローブは、前述のように蛋白質を介して結合し、固定されている。
【００７２】
この発明に用いる蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やイムノグロブリンＧを代表例とし、血清アルブミン、リポ蛋白質、糖蛋白質、α，β，γ−グロブリン、オボアルブミン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）その他の可溶性蛋白質などを採用することができる。
【００７３】
このように蛋白質を用いると、高分子の蛋白質の単位粒子当たり多数の捕捉用プローブが集合して高密度に結合することが可能であるため、捕捉用プローブが固相支持媒体上の特定区域に高い密度で固定されるので、標識用プローブが高感度に検出できるようになる。
【００７４】
例えば、ビーズ状の多数のニトロセルロース粒子からなる固相支持媒体を使用して核酸を検出する場合には、固相支持媒体に標的ＤＮＡの含有液を含浸して前記標的ＤＮＡを捕捉用プローブおよび標識用プローブにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしなかった標識用プローブを洗浄により除去すれば、標的ＤＮＡが存在する場合にのみ固相支持媒体上で標識の色などによる目視検出が可能である。
【００７５】
また、固相支持媒体が、クロマトグラフ媒体である場合には、展開方向の上流側に前記標識用プローブを配置し、かつ下流側に前記捕捉用プローブを配置しておくことにより、上流側から一本鎖の標的ＤＮＡを前記標識用プローブとハイブリダイズした状態で展開させ、下流側で前記捕捉用プローブにハイブリダイズした標的ＤＮＡを前記標識によって検出することができる。
【実施例】
【００７６】
［実施例１〜８］
標的ＤＮＡをリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｈｌｙ遺伝子とし、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段として、試料中の標的ＤＮＡを配列番号１で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号３で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した。
【００７７】
得られた増幅した標的ＤＮＡを９５℃で５分間加熱後、急冷し、一本鎖化した。
テストストリップとして、前述の図１に示す形態のものを用い、表１に示す配列番号の標識用プローブと捕捉用プローブを用い、展開したときに検出されるラインの吸光度を測定することにより、増幅産物の検出量を比較した。
【００７８】
【表１】
2013198482.tif 000003
【００７９】
表１の結果からも明らかなように、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｈｌｙ遺伝子の検出を目的とした場合に、配列番号４、５、７、８のいずれの組み合わせでも検出可能であったが、特に配列番号４、５の組み合わせで標識用プローブと捕捉用プローブを構成すると、標的の増幅産物を高感度に検出していることが確認された。他の遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）に由来する増幅産物を供試した場合はラインが検出されず、ｈｌｙに由来する増幅産物を特異的に検出していることが確認された。
【００８０】
また、実施例１と全く同様にして、リステリア属の他菌種並びに他属の菌種から抽出したゲノムＤＮＡに対して増幅産物の検出量を調べ、ｈｌｙ遺伝子に由来する増幅産物の検出の有無を調べた結果を表２に示した。
【００８１】
【表２】
2013198482.tif 000004
【００８２】
表２の結果からも明らかなように、実施例１による検出方法では、間違いなくリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のみを特異的に検出していることが確認された。
【００８３】
［実施例９〜１４、比較例１〜６］
標的ＤＮＡをベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）とし、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段として、試料中の標的ＤＮＡを配列番号９で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号１０で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した。
【００８４】
得られた増幅した標的ＤＮＡを９５℃で５分間加熱後、急冷し、一本鎖化した。
テストストリップとして、前述の図１に示す形態のものを用い、表３に示す配列番号の標識用プローブと捕捉用プローブを用い、展開したときに検出されるラインの吸光度を測定することにより、増幅産物の検出量を比較した。
【００８５】
【表３】
2013198482.tif 000005
【００８６】
表３の結果からも明らかなように、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）の検出を目的とし、標識用プローブと捕捉用プローブを構成するに当たり、配列番号１３、１４、１５のいずれの組み合わせでも良好に検出可能なテストストリップ（実施例９〜１４）になり、特に配列番号１３、１５の組み合わせで標識用プローブと捕捉用プローブを構成する実施例１０、１３は、標的の増幅産物を特に高感度に検出していると認められた。
【００８７】
一方、標識用プローブと捕捉用プローブを構成するに当たり、配列番号１６のプローブをいずれか一方または両方に用いた比較例１〜６のテストストリップでは、陽性コントロールの吸光度は低くなり、識別のための使用に耐える感度に達しなかった。
【００８８】
［実施例１５、１６、比較例７〜１０］
標的ＤＮＡをベロ毒素２型遺伝子（ＶＴ２）とし、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段として、試料中の標的ＤＮＡを配列番号１１で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号１２で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した。
【００８９】
得られた増幅した標的ＤＮＡを９５℃で５分間加熱後、急冷し、一本鎖化した。
テストストリップとして、前述の図１に示す形態のものを用い、表４に示す配列番号の標識用プローブと捕捉用プローブを用い、展開したときに検出されるラインの吸光度を測定することにより、増幅産物の検出量を比較した。
【００９０】
【表４】
2013198482.tif 000006
【００９１】
表４の結果からも明らかなように、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素２型遺伝子（ＶＴ２）の検出を目的とし、配列番号１７、１９を標識用プローブと捕捉用プローブに用いた実施例１５、１６は、良好に検出可能なテストストリップとなり、標的の増幅産物を高感度に検出できることが認められた。
【００９２】
なお、標識用プローブと捕捉用プローブを構成するに当たり、配列番号１８のプローブをいずれかに用いた比較例７〜１０のテストストリップは、陽性コントロールの吸光度は低く、識別のための使用に耐える感度に達しなかった。
【００９３】
［実施例１７〜２２］
標的ＤＮＡを腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)のベロ毒素１型遺伝子およびベロ毒素２型遺伝子の両方の遺伝子とし、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段として、試料中の標的ＤＮＡを配列番号９、１１で示される塩基配列からなるフォワードプライマーを用い、かつ配列番号１０、１２で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した。
【００９４】
得られた増幅した標的ＤＮＡを９５℃で５分間加熱後、急冷し、一本鎖化した。
テストストリップとして、前述の図１に示す形態のものを用い、表５に示す配列番号の標識用プローブと捕捉用プローブを用い、展開したときに検出されるラインの吸光度を測定することにより、増幅産物の検出量を比較し、その結果を表６に示した。
【００９５】
【表５】
2013198482.tif 000007
【００９６】
【表６】
2013198482.tif 000008
【００９７】
表５、６の結果からも明らかなように、腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)の検出を目的とし、実施例１７〜２２において配列番号１３〜１５をベロ毒素１型の標識用プローブと捕捉用プローブに用い、配列番号１７または１９をベロ毒素２型の標識用プローブと捕捉用プローブに用いると、良好に検出可能なテストストリップとなり、標的の増幅産物を高感度に検出できることが認められた。
【００９８】
また、実施例１７をテストストリップとした場合の腸管出血性大腸菌の検出実験を行ない、実施例９〜１６と同様にして、ベロ毒素１型遺伝子（ＶＴ１）またはベロ毒素２型遺伝子（ＶＴ２）を標的ＤＮＡとし、ＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させ、（ａ）ベロ毒素１型のＰＣＲ増幅産物を含ませたライン判定用試料、（ｂ）ベロ毒素２型のＰＣＲ増幅産物を含ませたライン判定用試料、（ｃ）ベロ毒素１型、同２型のいずれのＰＣＲ増幅産物も含まないライン判定用コントロール試料をそれぞれ作製した。
次に、実施例１７をテストストリップにしてこれらの試料を展開し、その結果のクロマトグラフを図６の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示した。
【００９９】
図６中に示すラインａは、ベロ毒素１型の検出ラインを示しており、ラインｂはベロ毒素１型の検出ラインを示し、ラインｃはコントロールラインを示している。
このように実施例１７のテストストリップは、腸管出血性大腸菌のベロ毒素１型および同２型をそれぞれに対応する捕捉用プローブが配置された位置において、特異的に検出することが確認された。
【０１００】
また、実施例１７の標識用プローブと捕捉用プローブを用い、多種類の菌種および菌株について、増幅産物の検出量（産生能）と展開したときに検出されるラインの吸光度を測定することにより、吸光度とベロ毒素１型およびベロ毒素２型の産生能には相対関係があり、前記吸光度を測定することによって腸管出血性大腸菌(enterohaemorrhagic E.coli)を特異的に検出しているものと確認された。
【符号の説明】
【０１０１】
１  基板
２  固相支持媒体
３  保持部
３ａ  展開スタートライン基準板
４  捕捉用プローブの結合域
５  標準核酸の検出部
６  含浸用パッド
７  把持部用パッド
８  標識用プローブ
９  一本鎖のＤＮＡ
１０、１３  相補的オリゴヌクレオチド
１１  着色ラテックス
１２  捕捉用プローブ
１４  蛋白質
【図１】
2013198482.tif 000009
【図２】
2013198482.tif 000010
【図３】
2013198482.tif 000011
【図４】
2013198482.tif 000012
【図５】
2013198482.tif 000013
【図６】
2013198482.tif 000014
【配列表】
2013198482000001.app