(57)【要約】【課題】３５℃以上の温度条件下、好ましくは３８℃〜４０℃の温度条件下でも効率よくエタノールの発酵生産が可能な高温耐性酵母菌株やその育種方法、及びかかる高温耐性酵母菌株を用いたエタノールを含有するもろみ発酵物の製造方法を提供すること。【解決手段】サッカロマイセス属（Saccharomyces）に属するエタノール発酵酵母を、２５℃以上の培養温度で流加培養することにより、エタノール発酵させてエタノール濃度１５％以上の発酵もろみを製造する工程（ａ）；工程（ａ）で生残した酵母菌体を１０％以上のエタノールを含む寒天培地で３７℃以上で培養し、生育したコロニーを候補菌株として選抜する工程（ｂ）；工程（ｂ）で選抜した候補菌株を液体培地中３８〜４２℃で培養し、炭酸ガス発生量の多寡を基準として二次選抜する工程（ｃ）；により高温耐性変異酵母株を作製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えたことを特徴とする高温耐性変異酵母株の作製方法。
（ａ）サッカロマイセス属（Saccharomyces）に属するエタノール発酵酵母を、２５℃以上の培養温度で流加培養することにより、エタノール発酵させてエタノール濃度１５％以上の発酵もろみを製造する工程；
（ｂ）工程（ａ）で生残した酵母菌体を１０％以上のエタノールを含む寒天培地で３７℃以上で培養し、生育したコロニーを候補菌株として選抜する工程；
【請求項２】
工程（ｂ）に続いて、以下の工程（ｃ）をさらに備えたことを特徴とする請求項１記載の高温耐性変異酵母株の作製方法。
（ｃ）工程（ｂ）で選抜した候補菌株を液体培地中３８〜４２℃で培養し、炭酸ガス発生量の多寡を基準として二次選抜する工程；
【請求項３】
工程（ａ）におけるエタノール発酵として、３０℃以上の培養温度で流加培養することを特徴とする請求項１又は２記載の高温耐性変異酵母株の作製方法。
【請求項４】
工程（ａ）において、１７％以上の発酵もろみを製造することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の高温耐性変異酵母株の作製方法。
【請求項５】
工程（ｂ）において、寒天培地で３９〜４２℃で培養することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の高温耐性変異酵母株の作製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載の作製方法により得られる高温耐性変異酵母株。
【請求項７】
高温耐性変異酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｈ２０２３−４（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２６１）。
【請求項８】
請求項６又は７記載の高温耐性変異酵母株を用いて流加培養によりエタノール発酵を行うことを特徴とするもろみ発酵物の製造方法。
【請求項９】
３８〜４０℃の温度条件下でエタノール発酵を行うことを特徴とする請求項８記載のもろみ発酵物の製造方法。
【請求項１０】
１５〜２５℃で対数増殖期前期〜対数増殖期中期まで静置培養し、その後２８〜３２℃で対数増殖期後期〜定常期初期まで振盪培養した培養物を、前培養物として用いることを特徴とする請求項８又は９記載のもろみ発酵物の製造方法。
【請求項１１】
２０〜３０℃で対数増殖期後期〜定常期初期まで振盪培養し、その後０〜１０℃で３〜６０日静置した培養物を、前培養物として用いることを特徴とする請求項８又は９記載のもろみ発酵物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母細胞に高温耐性を付与して高温条件下においてもエタノール生産が可能な突然変異株の育種方法及びこれを用いたエタノールを含有する発酵もろみの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類製造やバイオエタノール製造をはじめエタノール製造に酵母は広く利用されており、これらにおいては様々な条件下でエタノール生産性を高めることが重要となっている。酒類製造分野の清酒醸造では近年の地球温暖化の影響を受け原料米の高温障害による原料利用率の低下や、冬期においても温暖なことから醪の冷却による製造コストの上昇が問題となっており、また、比較的高温で発酵させる焼酎醸造においてはエタノール収得量の向上のための対策が望まれている。また、バイオエタノール製造分野においては発酵温度を高くすることで、原料利用率の向上及び糖化液の冷却・もろみの発酵熱除去のための冷却コストの削減が望まれている。そのため、より高温条件下で発酵力の強いエタノール生産酵母が望まれている。
【０００３】
高温耐性を有する酵母の取得方法は自然界からの発酵能と高温耐性を有する酵母の選抜・単離や変異処理や遺伝子組み換え技術による高温耐性酵母への改良によって行われており、このようにして取得された酵母を用いたエタノールの製造方法などが開示されている。例えば、フェルラ酸脱炭酸能を有し、優れたクエン酸耐性を有すると共に、同クエン酸濃度の高い環境下における高温（４０℃）での増殖能が高い、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）に属する新規醸造用酵母を用いた焼酎および泡盛の製造法（特許文献１）や、セルロース分解酵素の少なくとも２種を発現する形質転換クルイベロマイセス属酵母をバイオマスと混合し、培養することにより高温でセルロースからエタノールを生産する方法（特許文献２）や、エタノール発酵性ホモタリズム酵母から得た耐熱性および耐酸性を備えたエタノール発酵性ヘテロタリズム酵母（特許文献３）や、スクリーニング工程を経て選抜された、３５℃以上という高温条件下でも効率よくエタノール発酵生産が可能なザイモモナス・モビリスの野外分離株を用いたエタノール生産方法（特許文献４）や、３７℃以上の温度条件下、好ましくは４０−４９℃以上の温度条件下でも効率よくエタノール発酵生産が可能なクルイベロマイセス属酵母を用いたエタノール生産方法（特許文献５）が知られている。しかしながら、これらの発明は高温耐性のみに注目し、エタノール生産性が高くないものも多く、高温耐性と高エタノール発酵能を合わせ有する酵母の効率的な取得方法を提供するものではなかった。そのため、エタノール発酵生産技術分野において適用可能な高温耐性と発酵能を同時に有する酵母の効率的な育種技術及び、育種された酵母によるエタノール発酵生産技術の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−６７８１２公報
【特許文献２】特開２０１１−１６０７２７公報
【特許文献３】特開２００９−１７１９１２公報
【特許文献４】特開２００９−６０８３６公報
【特許文献５】再表２００８／０６２５５８公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
酵母はバイオエタノール製造をはじめ、酒類製造等で広く利用されており、目的により変異処理を施され様々な形質をもつ変異株が取得されている。バイオエタノール製造では原料の液化・糖化を高温（６０℃以上）で行われており、その後エタノール発酵性の微生物によりエタノールを含有する発酵もろみを製造し、これを蒸留して純粋なエタノールが生産されている。そのため、各工程でのエネルギー削減を目的として、高温（４０℃程度）でもエタノール発酵可能な発酵微生物の探索や改良が行われている。また、清酒醸造では醪後期に酵母の死滅を防止して、酒質の低下を抑える目的でエタノール耐性に優れた酵母菌株の育種がなされてきた。さらに、焼酎醸造では発酵温度が比較的高い（２５〜３２℃程度）ことから、エタノール収率を向上させる目的で高温耐性酵母の取得が試みられてきた。
【０００６】
また、サッカロミセス属酵母は従来からエタノールの発酵生産に利用されており、その改良も従来からなされている。バイオエタノール製造分野における近年の改良技術では遺伝子工学的手法を用いて、糖化同時発酵を酵母菌株のみで行えるようにするものや、サッカロミセス属酵母が資化できない糖を資化できるよう改良されている。しかしながら、このような改良を行ってもサッカロミセス属酵母が効率的にエタノール発酵できる温度領域は３０℃付近であり、この温度領域では糖化反応が十分でない場合が多い。また、この温度領域でのエタノールの発酵生産では発酵槽を適温に保つために、発酵熱を除去する冷却設備を必要とする場合が多い。
【０００７】
本発明の課題は、３５℃以上の温度条件下、好ましくは３８℃〜４０℃の温度条件下でも効率よくエタノールの発酵生産が可能な高温耐性酵母菌株やその育種方法、及びかかる高温耐性酵母菌株を用いたエタノールを含有するもろみ発酵物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これまでのエタノール耐性を有する酵母菌株の取得方法は、親株となる酵母菌株を液体培地で２５〜３０℃で４８時間程度振盪培養し、得られた酵母菌体に変異処理を施すか、又はそのまま用いて、エタノールの添加された寒天培地に塗布し、生育してきたコロニーから選抜する方法や、親株となる酵母菌株を液体培地で２５〜３０℃で４８時間程度振盪培養し、得られた酵母菌体を高濃度（２０％程度）のエタノール処理液に浸し、１ヶ月程度４℃に静置し、生き残った菌体をエタノール耐性酵母として得る方法が行われていた。これらの方法においては、処理される酵母菌体は単発酵しかしていないため、エタノール濃度はせいぜい１０％程度しか生産した経験がない菌体であるため、エタノール耐性はあっても、１５％を超える濃度のエタノール生産性については並行複発酵を利用した小仕込み試験で確認するしかなかった。また、小仕込み試験では発酵温度を極端に高く設定できないため、高温条件下でのエタノール生産性の検討は非常に難しかった。
【０００９】
また、自然界より高温耐性菌株をスクリーニングして分離する方法は、多くの属、種の微生物を検討し、有効な菌株についてはその属、種を明確にする必要があり、非常に煩雑である上に、エタノールを効率的に生産する方法についても検討する必要があり、有用なエタノール生産性微生物を得るには時間がかかるという問題があった。
【００１０】
他方、本発明者らは、高濃度エタノール製造技術の開発を目的として流加培養システムを構築し、かかる流加培養システムを応用して高濃度（１８％以上）エタノールを短期間（４日以内）に製造できる技術開発を行ってきた（平成１９年度  佐賀県工業技術センター  研究報告書「 エタノールの高濃度連続生産システムの開発に関する研究」参照）。しかし、さらに高濃度のエタノールを効率よく製造するためには発酵に使用する酵母に高温耐性を付与することが有効であるとの仮説を立ててみた。また、開発した流加培養システムは様々な条件でエタノール発酵できることから、本システムを用いることで効率よく高温耐性酵母を育種できると考えられた。そこで、清酒酵母（協会９０１号）を親株として変異処理を行い、この処理した菌体を流加培養システム用いて３０℃でエタノール発酵を行わせた。得られた発酵もろみ中に生き残った菌体を１５％のエタノールを含む寒天培地上に塗布し、３８、３９、４０、４２℃で培養して生育してきたコロニーを高温耐性株として取得した。取得した高温耐性株を、流加培養システムを用いて３０℃で発酵試験を行ったところ、親株よりも死滅開始するエタノール濃度及び到達エタノール濃度が向上していることが確認された。また、３９℃でも同様の実験を行い、約１２％の高濃度のエタノールを含有する発酵もろみを得ることができた。さらに、酵母菌株の高温耐性を強化する前培養条件（酒母の製造条件）についても検討し、特定の前培養条件で得られた酒母を用いると、４０℃の発酵温度でも１０．７％のエタノールを製造可能なことから、優れたエタノール生産性と高温耐性を同時に有することがわかった。本発明は以上の知見に基づき完成するに到ったものである。
【００１１】
このように本発明では、流加培養システムを用いることでエタノール濃度が１７％以上になるまで発酵させて（ほぼ１００％死滅する条件）生き残った酵母菌体に高温処理しており、処理された酵母菌体は高濃度エタノールを生産した経験を持つため、比較的容易に高温耐性となった変異株の取得ができる。また、流加培養システムは自由に発酵温度を設定できることから、高温条件下でのエタノール生産性の検討が容易にできる。
【００１２】
すなわち本発明は、［１］（ａ）サッカロマイセス属（Saccharomyces）に属するエタノール発酵酵母を、２５℃以上の培養温度で流加培養することにより、エタノール発酵させてエタノール濃度１５％以上の発酵もろみを製造する工程；（ｂ）工程（ａ）で生残した酵母菌体を１０％以上のエタノールを含む寒天培地で３７℃以上で培養し、生育したコロニーを候補菌株として選抜する工程；の工程（ａ）及び（ｂ）を順次備えたことを特徴とする高温耐性変異酵母株の作製方法や、［２］工程（ｂ）に続いて、（ｃ）工程（ｂ）で選抜した候補菌株を液体培地中３８〜４２℃で培養し、炭酸ガス発生量の多寡を基準として二次選抜する工程；の工程（ｃ）をさらに備えたことを特徴とする前記［１］記載の高温耐性変異酵母株の作製方法や、［３］工程（ａ）におけるエタノール発酵として、３０℃以上の培養温度で流加培養することを特徴とする前記［１］又は［２］記載の高温耐性変異酵母株の作製方法や、［４］工程（ａ）において、１７％以上の発酵もろみを製造することを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか記載の高温耐性変異酵母株の作製方法や、［５］工程（ｂ）において、寒天培地で３９〜４２℃で培養することを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか記載の高温耐性変異酵母株の作製方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、［６］前記［１］〜［５］のいずれか記載の作製方法により得られる高温耐性変異酵母株や、［７］高温耐性変異酵母株であるサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Ｈ２０２３−４（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２６１）や、［８］前記［６］又は［７］記載の高温耐性変異酵母株を用いて流加培養によりエタノール発酵を行うことを特徴とするもろみ発酵物の製造方法や、［９］３８℃〜４０℃の温度条件下でエタノール発酵を行うことを特徴とする前記［８］記載のもろみ発酵物の製造方法や、［１０］１５〜２５℃で対数増殖期前期〜対数増殖期中期まで静置培養し、その後２８〜３２℃で対数増殖期後期〜定常期初期まで振盪培養した培養物を、前培養物として用いることを特徴とする前記［８］又は［９］記載のもろみ発酵物の製造方法や、［１１］２０〜３０℃で対数増殖期後期〜定常期初期まで振盪培養し、その後０〜１０℃で３〜６０日静置した培養物を、前培養物として用いることを特徴とする前記［８］又は［９］記載のもろみ発酵物の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、エタノール生産性に優れ、同時に高温耐性を有する酵母菌株の取得方法及び取得した高温耐性酵母、並びに該耐性酵母を用いたエタノールの製造方法に関するもので、本発明の高温耐性酵母を使用することで、３０℃で８４時間の培養で１８．８％、３９℃で４７時間の培養で１２．０％、４０℃で４５時間の培養で１０．７％の各エタノール濃度の発酵もろみを製造することができる。また、特定の条件で前培養して酵母の耐性を強化することで、より高い濃度のエタノールを含有する発酵もろみを得ることができる。このように、本発明の高温耐性酵母は、３８℃から４０℃といった高温条件下でも効率よくエタノールの発酵生産が可能であり、酒類製造分野では発酵温度を高く設定して原料利用率を向上させたり、醪の冷却に要するコストを低減できると期待され、また、バイオエタノール製造のようなエタノール発酵生産分野では、発酵熱を除去するための装置が小型化又は不要となるため、発酵生産設備の簡素化等が可能となり、設備コストの低減やエタノールの発酵生産の効率化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】流加培養システムの概略図である。
【図２】親株（協会９０１号）及び本発明の高温耐性酵母（Ｈ２０２３−４株）による発酵経過（３０℃）を示す図である。
【図３】本発明の高温耐性酵母（Ｈ２０２３−４株）による発酵経過（３９℃）を示す図である。
【図４】本発明の高温耐性酵母（Ｈ２０２３−４株）を用いた前培養条件の違いによる発酵経過（４０℃）を示す図である。
【図５】親株（協会９０１号）を用いた前培養条件の違いによる発酵経過（４０℃）を示す図である。
【図６】３０℃で２４時間振盪培養した酒母を用いた、本発明の高温耐性酵母（Ｈ２０２３−４株）による発酵経過（４０℃）を示す図である。
【図７】１５℃で６０時間静置培養し、その後３０℃で１２時間振盪培養し耐性強化した酒母を用いた、本発明の高温耐性酵母（Ｈ２０２３−４株）による発酵経過（４０℃）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の高温耐性変異酵母株の作製方法としては、サッカロマイセス属（Saccharomyces）に属するエタノール発酵酵母を、２５℃以上の培養温度で流加培養することにより、エタノール発酵させてエタノール濃度１５％以上の発酵もろみを製造する工程（ａ）と、工程（ａ）で生残した酵母菌体を１０％以上のエタノールを含む寒天培地で３７℃以上で培養し、生育したコロニーを候補菌株として選抜する工程（ｂ）とを順次備えた方法であれば特に制限されず、また、本発明の高温耐性変異酵母株としては、上記本発明の高温耐性変異酵母株の作製方法によって得られる高温耐性変異酵母株であれば特に制限されないが、具体的に、高温耐性変異酵母株Ｈ２０２３−４（受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２６１、受領機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター、受領日：平成２４年２月２７日）を挙げることができる。さらに、本発明のもろみ発酵物の製造方法としては、上記本発明の高温耐性変異酵母株を用いて流加培養によりエタノール発酵を行う方法であれば特に制限されず、上記エタノール発酵酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を例示することができ、特に清酒醸造に用いられる清酒酵母や焼酎醸造に用いられる焼酎酵母を好適に例示することができ、これら酵母はあらかじめ変異処理が施された変異株であってもよい。
【００１７】
本発明の高温耐性変異酵母株の作製方法における工程（ａ）は、高温耐性を付与したサッカロマイセス属に属するエタノール発酵酵母菌株（親株）に変異処理（化学的，物理的処理）を施し、又は、そのまま使用して、２５℃以上、好ましくは３０℃から３２℃の培養温度で流加培養することにより、エタノール発酵させてエタノール濃度１５％以上、好ましくは１７％から１８％の発酵もろみを製造する工程（この工程で増殖した大部分の酵母は死滅する）であり、また工程（ｂ）は、工程（ａ）で生残した酵母菌体、例えば得られた発酵もろみを静置して酵母菌体を沈降させ、デカントにより酵母菌体を約２０倍に濃縮し、この濃縮菌体の０．１ｍＬを１０％以上のエタノールを含む寒天培地で３７℃以上、好ましくは３９℃から４２℃で培養し、生育したコロニーを候補菌株として選抜する工程であるが、さらに、工程（ｂ）で選抜した候補菌株を液体培地中３８〜４２℃で培養し、炭酸ガス発生量の多寡を基準として二次選抜する工程（ｃ）を備えることが好ましい。
【００１８】
発酵もろみの製造やもろみ発酵物における流加培養は、エタノール発酵酵母が資化及び発酵し得る糖類又は該糖類の含有物を原料として、エタノール発酵酵母に発酵阻害を与えない糖濃度に調整した開始培養液と、該開始培養液の糖濃度より高い糖濃度の流加糖液とを調製し、開始培養液にエタノール発酵酵母を接種してエタノール発酵を行わせ、発酵液の糖濃度を直接的又は間接的にモニターしながら流加糖液を発酵液に添加して、発酵液の糖濃度を制御しながらエタノール発酵を継続し、エタノール発酵全期間の３０〜８０％の時間内に流加糖液の添加を終了することにより行われる。
【００１９】
また、エタノール発酵に用いられる糖原料としては、エタノール発酵酵母が資化及び発酵し得る糖類や該糖類の含有物であれば特に制限されず、具体的にはグルコース、フラクトース、マルトース、スクロース、キシロース、ガラクトース、セロビオース又はでんぷん糖化液、糖蜜、サトウキビ又は砂糖ダイコンのしぼり汁などが挙げられ、特にグルコースや糖蜜を好適に例示することができ、これらは２種以上併用することができる。また、発酵培地には、通常のエタノール発酵に添加される窒素源等の各種栄養源を適宜添加することもできる。培地の通気攪拌条件としては、呼吸よりもエタノール発酵が進行する通気量、たとえば０．０２〜０．１ｖｖｍの通気を行う微酸素条件が好ましく、攪拌速度は高濃度糖の流加培地が速やかに拡散し、なおかつ酵母菌体にダメージを与えない速度、たとえば１５０〜５００ｒｐｍが好ましい。
【００２０】
これらの糖原料を用いて開始培養液を調製するには、酵母菌株により異なるが、発酵阻害を与えない糖濃度とすることが重要であり、具体的に糖濃度を、５０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは、１００〜２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１２０〜２２０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、１５０〜２００ｇ／Ｌに調製する。
【００２１】
開始培養液に流加する糖液は、目標とするエタノール濃度を達成できる糖濃度と流加液量が必要であり、糖濃度は開始培養液の糖濃度より高い糖濃度に調製しておく必要がある。具体的に糖濃度を、３００〜８００ｇ／Ｌ、好ましくは４００〜７００ｇ／Ｌ、より好ましくは４００〜６００ｇ／Ｌに調製することができる。一方、流加液量については、流加培地の液量が多すぎるとより希釈されるため発酵期間が長くなり、少なすぎると流加培地の濃度が上がりすぎて、拡散が悪くなることから、開始培養液量の０．２〜１．２倍、好ましくは０．４〜０．９倍、より好ましくは０．５〜０．７倍がよく、開始培養液の糖濃度と液量から流加する糖液の糖濃度と液量を決定する必要がある。このときの平均糖濃度は３００〜３２０ｇ／Ｌになるようにする必要があり、例えば、開始培養液として２００ｇ／Ｌの糖液１Ｌの時、流加する糖濃度５００ｇ／Ｌである場合の糖液は、５３０〜６６０ｍＬ程度となる。
【００２２】
エタノール発酵全期間の３０〜８０％の時間内、好ましくは３５〜７０％の時間内、より好ましくは４０〜６０％の時間内に流加糖液の添加を終了すると、高濃度エタノールを製造することができる。そして、流加糖液の添加の終了時をエタノール発酵全期間の３０％より少なくすると高糖圧迫により酵母菌体が発酵阻害を受けるために、エタノール発酵が十分行われず、高濃度エタノールを得ることができず、また、エタノール発酵全期間の７０％を越えるまで続けると、エタノール発酵速度が低下しているところで流加培地が供給されることになり、生成エタノールが流加培地によって希釈されることでエタノール濃度が下がり、所定の高濃度エタノールを得るために長期間を要することになる。したがって、エタノール発酵全期間の８０％までが流加糖液の添加終了時間の上限である。
【００２３】
発酵液の糖濃度をモニターする方法としては、直接的又は間接的な方法により行ってよく、直接的に行うにはバイオセンサーを用いる方法等があり、また、間接的に行う方法には、発酵液の糖濃度を屈折式ブリックス（Ｂｒｉｘ）計をはじめとする屈折率計や、振動式密度計、粘度計を用いる方法を採用することができる。これらの機器は発酵期間中継続して糖濃度をモニターできるようフローセル方式もしくは発酵槽内に直接設置する方式を採用することができる。また、糖液を流加して糖濃度を一定に保つための制御方式はオン／オフ制御、ＰＩＤ制御、ＰＩ制御などさまざまな制御方式を用いることができる。本発明においては、発酵液の糖濃度を屈折式ブリックス（Ｂｒｉｘ）計を用いることが簡便に制御しうる点で好ましい。屈折式ブリックス計は、予め濃度のわかっているショ糖液で目盛りをつけたもので、ブリックス（Ｂｒｉｘ）値とは、水溶液中に含まれる可溶性固形分のパーセント濃度を示したものである。可溶性固形分とは糖を始めとして、塩類、タンパク質、酸など水に溶ける物質すべてであり、測定値はそれらの合算値となる。したがって、この屈折式ブリックス（Ｂｒｉｘ）計を用いる方法は、エタノール発酵開始時はグルコース濃度と一致するが、エタノール発酵が進行しエタノール濃度が上昇するにつれてグルコース濃度よりも高い値として検出されるものの、使用・保守が簡便なことから有利に用いることができる。
【００２４】
本発明のもろみ発酵物の製造方法により製造された高濃度エタノールは、エタノール飲料として、蒸留処理を経て、車のガソリンに代わる代替エネルギー或いは石油化学原料等の工業用エタノールとして利用され得る。
【００２５】
流加培養に用いられる流加培養システムとしては、発酵槽、流加糖液貯留槽、発酵槽内の発酵液に通気する通気手段、発酵槽内の発酵液を攪拌する攪拌手段、発酵槽内の発酵液の糖濃度を直接的又は間接的にモニターする検知手段、検知手段からの信号に基づいて流加糖液貯留槽から流加糖液を発酵槽に流加させる制御手段を備えた装置であれば特に制限されず、例えば、図１に示す装置を具体的に挙げることができ、図１において、１は流加糖液貯留槽、２は流量計、３は発酵槽、４はリレーユニット、５はフローセルタイプの屈折式糖度計、６は制御用コンピュータ、７と８は送液ポンプ、９はエアポンプ、１０は発酵槽内の撹拌手段を表す。
【００２６】
発酵槽３は、エアポンプ９により流量計２で測定された所定量の酸素を流入する通気手段と、発酵液を撹拌するための撹拌手段１０と、フローセルタイプの屈折式糖度計５のフローセルに発酵液が流入、流出して糖度を検知するための検知手段、及び流加糖液貯留槽より高濃度の糖液を発酵槽に流加するため流加手段を備えており、いずれもポンプを介して高濃度糖液や検知手段に用いる糖液の流出入を行っている。発酵槽に通気される酸素量は、酵母の種類、酵母の状態、培地の種類、発酵温度等により異なるが微酸素状態となるような量である。撹拌は、撹拌翼を有する撹拌棒を駆動装置により回転させるが、酸素量と同様に酵母の種類及び酵母の状態、流加糖液の糖濃度（粘度）等により異なるが、通常２５０ｒｐｍ前後が好ましい。
【００２７】
先ず、発酵槽３に所定濃度の発酵性糖液（開始培養液）を仕込み、更に酵母を仕込んだ後に温度を所定温度に保ちつつ撹拌手段１０により穏やかに撹拌しつつ発酵を開始させる。発酵期間全般にわたりフローセルタイプの屈折式糖度計５により測定された糖濃度を所定の糖濃度になるようにモニターしながら制御用コンピュータ６により、リレーユニット４を動作させ送液ポンプ８の電源をＯＮ、ＯＦＦさせることにより、開始培養液の糖濃度より高い高濃度糖液が収容された流加糖液貯留槽１よりポンプ８を介して糖液が適宜流加される。例えば、フローセルタイプの屈折式糖度計５においては、経時的に所定の間隔で測定するが、例えば１０秒間隔、さらには、これより短いとより正確に測定できる。このように常に正確な糖濃度を測定し、その測定値に基づいて所望の糖液の流加、糖濃度の維持、或いは糖液の流加を終了することができる。所定の時間発酵後、高濃度糖液の流加を終了させて、その後も発酵を続け、エタノールの生成具合をみて発酵を終了させる。
【００２８】
本発明のもろみ発酵物の製造方法は、本発明の高温耐性変異酵母株を用いて流加培養によりエタノール発酵を行う方法であり、培養温度は特に限定されないが、３０℃以上、好ましくは３５℃以上、特に３８℃〜４０℃の温度条件下で流加培養によりエタノール発酵を行うことが好ましい。また、流加培養には、前培養条件による耐性強化処理を施した酒母（前培養物）を用いることが好ましい。かかる酒母の製造においては、培養温度を１５〜２５℃として対数増殖期中期、好ましくは対数増殖期前期まで培養して、その後に３０℃として６〜１２時間で定常期初期、好ましくは対数増殖期後期まで培養するか、あるいは、培養温度を２０〜３０℃として定常期初期、好ましくは対数増殖期後期まで培養した後に０〜１０℃、好ましくは０〜６℃の低温で３〜６０日、好ましくは５〜３０日処理することにより、酵母の耐性を強化することができる。このようにして得られる前培養物を、本発明の高温耐性変異酵母株の作製方法の工程（ａ）のエタノール発酵に供することもできる。かかる耐性強化により、高温発酵時におけるエタノール生産性が向上し、高温耐性及びエタノール耐性を強化することができる。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、ブリックスの測定には、フローセルタイプに改良した屈折式ブリックス計（アタゴ社製、ＲＸ−５０００）を使用し、エタノール濃度の測定には、ガスクロマトグラフ（島津製作所製、ＧＣ９Ａ、ＦＩＤ検出器）を用い、全量注入法による絶対検量線法で求め、菌体密度は、培養液の１ｍＬをあらかじめ重量を測定したマイクロテストチューブに採取して、１５０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離を行いその上澄みを除去後、その湿重量を測定して先の空重量を差し引くことで求めた。
【実施例１】
【００３０】
［酵母高温耐性変異株の取得］
清酒酵母である協会９０１号酵母をスラントから１白金耳取り、グルコース濃度を１５％に変更したＭＹ１５培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース１５％）７．５ｍＬに接種して３０℃で１８時間から３６時間振盪培養し、その培養液を７．５ｍＬの新しいＭＹ１５培地３本にそれぞれ０．１ｍＬずつ接種し、２８℃で１８時間振盪培養した。この培養液３本を９００ｍＬの２ＭＹ１５培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス０．６％、ペプトン１．０％、グルコース１５％）に添加し、流加培養システムを用いて培養温度を２８．５℃として発酵させた。培養開始後Ｂｒｉｘが１．０低下した段階から１／２ＭＹ５５培地（酵母エキス０．１５％、麦芽エキス０．１５％、ペプトン０．２５％、グルコース５５％）６００ｍＬをＢｒｉｘ値を一定に保ちながら流加して、培地のＢｒｉｘ値が低下しなくなるまで発酵を続けた。発酵終了後、発酵もろみのエタノール濃度を測定してエタノール濃度が１７％以上（１７．８％）に達していることを確認し、製造した発酵もろみを別の容器に移して４℃で１週間以上静置して浮遊している菌体を沈降させた。菌体が沈降した後、デカントにより上清部分を別の容器に移して菌体懸濁液の濃縮を行った。濃縮した菌体懸濁液０．１ｍＬを１０％のエタノールを含むＭＹプレート（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース１．０％、寒天２．０％）に塗布し、３９℃、４０℃、４２℃で培養して生育してきたコロニーを高温耐性変異株の候補菌株として取得した。得られた候補菌株を７．５ｍＬの２ＭＹ２０培地（酵母エキス０．６％、麦芽エキス０．６％、ペプトン１．０％、グルコース２０％）に接種して３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃における炭酸ガス発生量を測定し、最も高い温度で、炭酸ガス発生量の多い菌株を高温耐性変異株（Ｈ２０２３−４株）として取得した。
【実施例２】
【００３１】
［３０℃における発酵］
Ｈ２０２３−４株をスラントより１白金耳取り、これを１０ｍＬのＭＹ２０培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、グルコース２０％）に接種し、２５℃で約６０時間振盪培養を行った。さらに、１０ｍＬの２ＭＹ２０培地３本にそれぞれこの培養液０．１ｍＬを接種して３０℃で１２時間振盪培養を行い、２ＭＹ１５培地９００ｍＬに添加し、流加培養システムを用いて培養温度を３０℃として発酵させた。培養開始後Ｂｒｉｘが１．０低下した段階から１／２ＭＹ５５培地６００ｍＬをＢｒｉｘ値を一定に保ちながら流加して、培地のＢｒｉｘ値が低下しなくなるまで発酵を続けた。その結果を図２に示す。
【００３２】
図２に示すように、Ｈ２０２３−４株を使用すると８４時間で約１９％のエタノールを含有する発酵もろみの製造が可能なことがわかる。また、親株ではエタノール濃度が約１６％に達すると菌体密度の低下が始まっているのに対し、Ｈ２０２３−４株では約１８％までは菌体密度の低下はほとんどなく、Ｈ２０２３−４株の高温耐性が向上していることがわかる。
【実施例３】
【００３３】
［３９℃における発酵］
上記実施例２と同様の方法でＨ２０２３−４株の３９℃におけるエタノール生産性を確認した。開始培地は３０℃の場合と同様に９００ｍＬの２ＭＹ１５培地を用い、流加培地として１５０ｍＬの１／２ＭＹ５０培地（酵母エキス０．１５％、麦芽エキス０．１５％、ペプトン０．２５％、グルコース５０％）を用いた。その結果を図３に示す。
【００３４】
図３に示すように、３９℃といった高温環境下でも４７時間でエタノール濃度１２％の発酵もろみの製造が可能であった。
【実施例４】
【００３５】
［前培養条件の影響（高温耐性変異株）］
高温環境化での発酵試験を行っていると時としてエタノール生産性が低下する場合があった。その原因を考察すると前培養条件が影響していると考えられた。そこで、高温耐性Ｈ２０２３−４株を用いて、２ＭＹ２０培地における前培養条件について検討した。前培養として、（１）３０℃で７２時間静置培養したもの、（２）３０℃で６０時間静置培養した培養液０．１ｍＬを７．５ｍＬに接種し、３０℃で１２時間振盪培養したもの、（３）３０℃で６０時間静置培養後、４℃で１２時間静置したもの、（４）３０℃で２４時間振盪培養、４℃で７２時間静置した培養液０．１ｍＬを７．５ｍＬに接種し、３０℃で１２時間振盪培養したもの、（５）３０℃で２４時間振盪培養後、４℃で７２時間静置したもの、（６）３０℃で１４時間振盪培養後、４℃で８２時間静置した培養液０．１ｍＬを７．５ｍＬに接種し、３０℃で１２時間振盪培養したもの、（７）３０℃で１４時間振盪培養後、４℃で８２時間静置したもの、（８）１５℃で９６時間静置培養した培養液０．１ｍＬを７．５ｍＬに接種し、３０℃で１２時間振盪培養したもの、（９）１５℃で６０時間静置培養後、３０℃で１２時間振盪培養したもの、（１０）１５℃で１０８時間静置培養したもの、（１１）１５℃で６０時間静置培養後、３０℃で１２時間振盪培養し、その後４℃で４５日間静置したもの、（１２）１５℃で６０時間静置培養後、３０℃で１２時間振盪培養し、その後４℃で４５日間静置した培養液０．１ｍＬを７．５ｍＬに接種し、３０℃で１２時間振盪培養したもの、のそれぞれの培養液０．１ｍＬを２ＭＹ２０培地に接種して、４０℃における炭酸ガス発生量を経時的に測定した。その結果を図４に示す。
【００３６】
図４に示したように、前培養条件を変えることで炭酸ガス発生量（エタノール生産性）が変化することがわかる。そのため、高温条件下で効率よくエタノールの発酵生産を行うためには上記（５）、（７）、（９）の前培養条件に準ずる耐性強化処理が必要となる。
【実施例５】
【００３７】
［前培養条件の影響（親株）］
実施例４の効果が耐性株にのみ特徴的な現象かを確認するため、親株の協会９０１号酵母についても確認した。前培養条件等は実施例４の（９）に準じて行った。その結果を図５に示す。
【００３８】
図５に示したように、親株でも同様の効果があることがわかった。しかも、耐性変異株に比較し、その効果はさらに高いものであった。したがって、前培養条件による耐性強化処理はより耐性の弱い株に対して効果的であるといえる。
【実施例６】
【００３９】
［耐性強化処理の効果確認（対照）］
耐性強化処理の効果を確認するために、流加培養システムを用いた発酵試験を行った。試験の条件は発酵温度を４０℃に変更する以外は実施例３に準じて行った。まず対照として、前培養条件を３０℃で２４時間の一定温度とした。すなわち、高温耐性Ｈ２０２３−４株を用い、２ＭＹ２０培地において３０℃で２４時間振盪培養した培養液３０ｍＬを開始培地である９００ｍＬの２ＭＹ１５培地に添加し、流加培地として１５０ｍＬの１／２ＭＹ５０培地を用いた。その結果を図６に示す。
【００４０】
この前培養条件では菌体密度があまり上昇ぜず、高温により菌体がダメージを受けていると考えられた。そのため、４８時間経過後も発酵もろみのエタノール濃度は約９％と低いものであった。
【実施例７】
【００４１】
［耐性強化処理の効果確認］
次に、前培養条件を実施例４の（９）に準じて調製した培養液を用いて実施例６と同じ条件で発酵試験を行った。すなわち、高温耐性Ｈ２０２３−４株を用い、２ＭＹ２０培地において１５℃で６０時間静置培養し、その後３０℃で１２時間振盪培養した培養液３０ｍＬを開始培地である９００ｍＬの２ＭＹ１５培地に添加し、流加培地として１５０ｍＬの１／２ＭＹ５０培地を用いた。その結果を図７に示す。
【００４２】
実施例６と異なり、菌体密度は上昇し、菌体へのダメージが少ないことがわかった。そのため、４５時間で１０％を超えるエタノール濃度の発酵もろみを得ることができた。
【符号の説明】
【００４３】
１ 流加糖液貯留槽
２ 流量計
３ 発酵槽
４ リレーユニット
５ フローセルタイプの屈折式糖度計
６ 制御用コンピュータ
７ 送液ポンプ
８ 送液ポンプ
９ エアポンプ
１０ 撹拌手段
【図１】
2013198407.tif 000002
【図２】
2013198407.tif 000003
【図３】
2013198407.tif 000004
【図４】
2013198407.tif 000005
【図５】
2013198407.tif 000006
【図６】
2013198407.tif 000007
【図７】
2013198407.tif 000008