(57)【要約】【課題】パラゴムノキから、一度の操作で、多量の乳管細胞を生きたまま単離することができる方法を提供する。【解決手段】本発明の乳管細胞を単離する方法は、（ａ）パラゴムノキのサンプルを酵素液に接触させてなる酵素処理液を調製して、前記サンプルを酵素処理し、酵素消化液を得る工程、（ｂ）前記工程（ａ）で得られた酵素消化液を遠心分離し、上清を得る工程、（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた上清を濾過し、上清から乳管細胞懸濁液を得る工程、を含むことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（ａ）パラゴムノキのサンプルを酵素液に接触させてなる酵素処理液を調製して、前記サンプルを酵素処理し、酵素消化液を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた酵素消化液を遠心分離し、上清を得る工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた上清を濾過し、上清から乳管細胞懸濁液を得る工程
【請求項２】
前記サンプルは、師部組織がむき出しになるようにその表面が削り取られたものである請求項１に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【請求項３】
前記酵素液は、セルラーゼ、マセロザイム、及びペクトリアーゼを含む請求項１または２に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【請求項４】
前記酵素液は、セルラーゼを１〜５％、マセロザイムを０．５〜３％、及びペクトリアーゼを０．０１〜１％含有する請求項３に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【請求項５】
前記酵素処理の時間は、３〜１０時間である請求項１〜４のいずれか一項に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）において、３０分〜１時間おきに酵素処理中の酵素処理液をピペッティングする工程を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）において、４００〜８００ｒｐｍの速度で遠心分離する請求項１〜６のいずれか一項に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）において、ポアサイズ５０〜６０μｍのメッシュフィルターを用いる請求項１〜７のいずれか一項に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を生きたまま単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、弾性を有する高分子であり、主にパラゴムノキの乳管（ｌａｔｉｃｉｆｅｒ）細胞内で造られているラテックスという乳液を収穫し、これに所望の加工をすることにより製造される。乳管細胞からなる乳管組織は、パラゴムノキの樹皮内の形成層の外側に年に数層発達する。ラテックスの収穫は、一般的に、タッピングパネルと呼ばれる幹の一定範囲に、定期的にナイフ等を用いて溝状に傷をつけて（タッピング）、切断された乳管組織から流出するラテックスを回収することにより行われている。
【０００３】
天然ゴムは、ゴム製品の主原料として、様々な用途において幅広くかつ大量に用いられている。このため、より高収率でラテックスを得る方法の開発が求められている。
パラゴムノキからのラテックスの収穫は、パラゴムノキを植林してから、４〜６年目の未成熟木に対し、タッピングを実施することにより開始される。ラテックスの収穫を開始してから、１０〜１２年目ごろにパラゴムノキのラテックス収穫量は最大に達する。
【０００４】
このようにラッテクスの収穫には、数年単位の年月を要する。従って、高収率でラテックスを得る方法を、比較的短期間で開発するためには、パラゴムノキから、ラテックス生産細胞である乳管細胞を単離し、乳管細胞の増殖機構を分子レベルで解析する必要がある。
【０００５】
パラゴムノキから乳管細胞を単離する方法としては、例えば非特許文献１に記載された方法が挙げられる。非特許文献１に記載された方法は、具体的には、パラゴムノキの表皮を取り除いた茎部をセルリシンとマセラーゼを含む酵素液処理により細胞壁消化し、酵素液を含まない細胞懸濁液に懸濁することにより、乳管細胞を単離する方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｏｕｔｅａｕ  Ｆら、Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ.、 第３１巻、第２１５〜２２８頁、１９９３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献１に記載された方法は、個々の細胞の膜の性質を調べるための少量の乳管細胞取得の方法である。乳管細胞の増殖機構を分子レベルで解析するには、より多量の乳管細胞を必要とするため、乳管細胞を単離する方法としては、未だ改良の余地がある。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、パラゴムノキから、一度の操作で、多量の乳管細胞を生きたまま単離することができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素処理の工程に遠心分離の工程を加え比重の軽い細胞を選択的に集め、さらに細胞サイズの小さい葉肉細胞プロトプラストは通すが、細胞が融合して形成されている乳管細胞は通さないフィルター濾過処理を加えることで、一度の操作で多量の乳管細胞を生きたまま単離できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するパラゴムノキから乳管細胞を単離する方法を提供するものである。
（１）以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（ａ）パラゴムノキのサンプルを酵素液に接触させてなる酵素処理液を調製して、前記サンプルを酵素処理し、酵素消化液を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた酵素消化液を遠心分離し、上清を得る工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた上清を濾過し、上清から乳管細胞懸濁液を得る工程
（２）前記サンプルは、師部組織がむき出しになるようにその表面が削り取られたものである（１）に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（３）前記酵素液は、セルラーゼ、マセロザイム、及びペクトリアーゼを含む（１）または（２）に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（４）前記酵素液は、セルラーゼを１〜５％、マセロザイムを０．５〜３％、及びペクトリアーゼを０．０１〜１％含有する（３）に記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（５）前記酵素処理の時間は、３〜１０時間である（１）〜（４）のいずれかに記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（６）前記工程（ａ）において、３０分〜１時間おきに酵素処理中の酵素処理液をピペッティングする工程を有する（１）〜（５）のいずれかに記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（７）前記工程（ｂ）において、４００〜８００ｒｐｍの速度で遠心分離する（１）〜（６）のいずれかに記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
（８）前記工程（ｃ）において、ポアサイズ４０〜６０μｍのメッシュフィルターを用いる（１）〜（７）のいずれかに記載のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、パラゴムノキから、一度の操作で、多量の乳管細胞を生きたまま単離することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から乳管細胞を単離する方法は、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）パラゴムノキのサンプルを酵素液に接触させてなる酵素処理液を調製して、前記サンプルを酵素処理し、酵素消化液を得る工程
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた酵素消化液を遠心分離し、上清を得る工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた上清を濾過し、上清から乳管細胞を得る工程
各工程について説明する。尚、各工程は無菌的環境で行われ、酵素液等の試薬は、濾過滅菌されたものが用いられる。
【００１３】
まず、工程（ａ）において、パラゴムノキのサンプルを酵素処理液に溶解し、酵素処理し、酵素消化液を得る。
【００１４】
本発明に用いられるパラゴムノキ（Ｈａｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）は、ラテックス（主にポリイソプレン）を産生し、乳管細胞を有するトウダイグサ科の植物である。パラゴムノキは、工業用天然ゴム原料として汎用されている。
【００１５】
工程（ａ）において、パラゴムノキのサンプルに用いられる組織としては、その表皮が木化していないものが好ましく、葉、葉柄、若しくは、木化していない茎、又は、これらからなる当年枝がより好ましい。これらのサンプルは、５〜１０ｃｍに切りそろえられ、以降の無菌操作に備えて、７０％メタノールを含ませたキムタオル等により当年枝表面を拭くことでその表面が滅菌されていることが好ましい。
【００１６】
工程（ａ）において、パラゴムノキのサンプルとしては、師部組織がむき出しになるようにその表面が削り取られたものであることが好ましい。削り取られる深さとしては、茎や枝部の太さによって異なるが、例えば表皮から０．５ｍｍの深さが一般的である。サンプルの表面に師部組織がむき出しになっていることにより、酵素処理の際に酵素が師部組織に接触しやすくなり、師部組織が酵素によって消化されやすくなる。
更に、パラゴムノキのサンプルとしては、師部組織のみをとり集めたものが、酵素処理の効率化の観点からより好ましい。
【００１７】
次いで、工程（ａ）において、パラゴムノキを酵素液に接触させてなる酵素処理液を調製して、前記サンプルを酵素処理する。酵素処理は、サンプル中の細胞壁を分解し、細胞を単離するために行われる。前記酵素液は、細胞間解離酵素と細胞壁分解酵素とを含むことが好ましい。酵素液中の細胞間解離酵素の濃度としては、１〜４％が好ましく、１〜２％がより好ましい。また、酵素液中の細胞壁分解酵素の濃度としては、１〜４％が好ましく、３〜４％がより好ましい。
細胞間解離酵素としては、ペクチナーゼ、マセロザイムが挙げられ、ペクトリアーゼ、マセロザイムが好ましい。細胞壁分解酵素としては、セルラーゼが挙げられる。酵素処理に用いられる酵素液は、セルラーゼ、マセロザイム、及びペクトリアーゼの組合せがより好ましい。
細胞に与えるダメージを最低限に抑えつつ、効率よく細胞を単離する観点から、酵素液は、セルラーゼを１〜５％含有することが好ましく、３〜４％含有することがより好ましく、マセロザイムを０．５〜３％含有することが好ましく、１〜２％含有することがより好ましく、ペクトリアーゼを０．０１〜１％含有することが好ましく、０．１〜０．５％含有することがより好ましい。
サンプルに対する酵素液量としては、サンプル１〜５ｇに対して、２０〜３０ｍｌが好ましい。酵素処理の時間や酵素液中の濃度によっては、かかる範囲以外でもよい。
【００１８】
また、かかる酵素処理により得られる細胞はプロトプラストであるため、細胞の浸透圧を調節する観点から、前記酵素液は、マニトールやソルビトールを含有することが好ましい。
酵素処理に用いられる酵素液のｐＨとしては、植物プロトプラスト細胞の維持育成の至適ｐＨ±０．５のｐＨが好ましく、５．６〜５．８がより好ましい。
このように、酵素液にサンプルを溶解することにより、酵素処理液が得られる。
【００１９】
酵素処理の温度としては、植物プロトプラスト細胞の維持育成の至適温度±２℃の温度が好ましく、２０〜３０℃がより好ましく、２５〜２７℃が特に好ましい。２０℃以上の場合には、至適温度に近いことから、酵素の活性を高めることができ、４０℃以下の場合には、酵素処理する細胞に熱によるダメージを与えるおそれが少ない。
酵素処理の時間としては、用いる酵素液中の酵素の濃度との兼ね合いによるが、細胞に与えるダメージを最低限に抑えつつ、効率よく細胞を単離する観点から、３〜１０時間が好ましく、３〜５時間がより好ましい。
また、効率よく酵素反応を行う観点から、酵素処理は、震とうしながら行われることが好ましい。
【００２０】
更に、工程（ａ）において、３０分〜１時間おきに酵素処理中の酵素処理液をピペッティングする工程を有することが好ましい。ピペッティングの具体的な方法としては、先端を切断したピペットを用いて、酵素処理中の酵素処理液を吸い取り、吐き出すという操作を繰り返す方法が挙げられる。かかる工程を有することにより、細胞間の解離が促進される。
【００２１】
工程（ａ）により、酵素処理液中のサンプルは消化され、ばらばらに解離された乳管細胞を含む酵素消化液が得られる。
【００２２】
次いで、工程（ｂ）において、前記工程（ａ）で得られた酵素消化液を遠心分離し、上清を得る。
【００２３】
工程（ｂ）において、乳管細胞の比重が小さく、乳管細胞が水に浮く性質を利用して、酵素消化液中の細胞消化残渣及び乳管細胞以外の細胞と、乳管細胞と、を遠心分離する。遠心分離の速度としては、４００〜８００ｒｐｍが好ましく、遠心分離する時間としては、
３〜５分が好ましい。
【００２４】
工程（ｂ）により、細胞消化残渣、及び乳管細胞以外の細胞の大半が沈澱し、これらと分離された乳管細胞を、上清中に得ることができる。
【００２５】
次いで、工程（ｃ）において、前記工程（ｂ）で得られた上清を濾過し、上清から乳管細胞懸濁液を得る。
【００２６】
工程（ｂ）で得られた上清中には、沈澱せずに上清に分画された乳管細胞以外の細胞が少量存在するため、かかる細胞を工程（ｃ）において排除する必要がある。乳管細胞の直径は、０．２〜０．２２μｍである一方、乳管細胞以外の細胞の直径は、２０〜４０μｍである。従って、乳管細胞のみを単離するために、濾過に用いられるメッシュフィルターのポアサイズは、４０〜６０μｍであることが好ましく、５０〜６０μｍであることがより好ましい。
濾過としては、減圧装置を用いて減圧濾過する方法が一般的である。
【００２７】
工程（ｃ）により、乳管細胞以外の細胞の混入がほとんどなく、純度の高い乳管細胞懸濁液を得ることができる。
【００２８】
また、濾過した後に、ナイロンメッシュフィルター上の残渣を再度等張液に懸濁し、再度ナイロンメッシュフィルターを用いて濾過し、この濾過液を乳管細胞懸濁液に加えてもよい。これにより、乳管細胞の回収率を上げることができる。
【００２９】
本発明によれば、パラゴムノキから、一度の操作で、多量の乳管細胞を生きたまま単離することができる。本発明によって単離された乳管細胞は、乳管細胞内の遺伝子発現を調べるためのｍＲＮＡ取得源として用いられる他、細胞壁が消化されたプロトプラストの状態であるため、ポリエチレングリコールや電気穿孔といった遺伝子導入法による遺伝子導入実験にも用いられる。さらに、適切な培地を用いることで、単離された乳管細胞を３週間以上培養することも可能である。
従って、本発明によって単離された乳管細胞は、乳管細胞の増殖の機構の解析に適している。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
［実験例１］
濾過滅菌された試薬を用いて、以下の操作を無菌的環境で行った。
パラゴムノキから表皮が木化していない当年枝部分を５〜１０ｃｍ採取し、その表面を７０％メタノールを含ませたキムタオルで拭くことにより滅菌処理した。採取した当年枝部分の表皮を０．５ｍｍの深さで、ナイフを用いて削り取り、当年枝部分の師部組織をむき出しにした。
次いで、若い茎ナイフを用いて、当年枝部分から師部組織のみを採取し、この師部組織５ｇをＫＭＣ等張液に浸した後、セルラーゼ・マセロザイム・ペクトリアーゼを含む酵素液３０ｍｌに置換し、室温で震とうしながら酵素処理を４時間行った。酵素処理の間３０分おきに、先端部を切断したピペットを用いて、消化中の師部組織をピペッティングし、酵素消化液を得た。
次いで、酵素消化液に対して、遠心分離機を用いて、８００ｒｐｍ、５分の低速遠心分離を行い、上清を回収した。この上清をポアサイズ０．２２μｍのナイロンメッシュフィルターを用いて濾過し、乳管細胞懸濁液を得た。更に、ナイロンメッシュフィルター上の残渣をＫＭＣ等張液に懸濁し、再度ナイロンメッシュフィルターを用いて濾過し、この濾過液を前記乳管細胞懸濁液に加えた。合計で、サンプル１ｇ当たり、５×１０５個の乳管細胞を得た。
得られた乳管細胞懸濁液中の乳管細胞の生死の判定を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ染色により行い、青く染まらないものを生存乳管細胞と判定した。また、Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  ｗｈｉｔｅ染色により、細胞壁が消化されたプロトプラストかどうかの判定を行った。乳管細胞懸濁液中の乳管細胞の生存率は、９０％だった。また、生存している細胞のほぼ１００％が乳管細胞が消化されたプロトプラストであった。
【００３２】
以上の結果から、本発明の乳管細胞を単離する方法によれば、パラゴムノキから、一度の操作で多量の乳管細胞を生きたまま単離できることが明らかである。