(57)【要約】【課題】  核酸コンストラクト及びそれを利用したナノ粒子の製造方法を提供する。【解決手段】  金属イオンまたは金属前駆体、及び核酸コンストラクトを含むナノ粒子であって、前記核酸コンストラクトは、２以上の一本鎖核酸を含み、前記２以上の一本鎖核酸は、それぞれ１０以上のヌクレオチド、及び２以上の隣接した断片を含み、前記断片の各々は、互いに異なる前記断片に相補的なものであり、前記断片は、それぞれ実質的に相補的な前記断片にハイブリダイズし、前記核酸コンストラクトは、複数の二本鎖断片を含み、前記金属または前記金属前駆体は、前記核酸コンストラクトのリン酸主鎖、または前記核酸コンストラクトの塩基に結合するものであるナノ粒子。【選択図】      図１Ａ
2013240323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンまたは金属前駆体、及び核酸コンストラクトを含むナノ粒子であって、
前記核酸コンストラクトは、２以上の一本鎖核酸を含み、前記２以上の一本鎖核酸は、それぞれ１０以上のヌクレオチド、及び２以上の隣接した断片を含み、前記断片の各々は、互いに異なる前記断片に相補的なものであり、前記断片は、それぞれ実質的に相補的な前記断片にハイブリダイズし、
前記核酸コンストラクトは、複数の二本鎖断片を含み、
前記金属または前記金属前駆体は、前記核酸コンストラクトのリン酸主鎖、または前記核酸コンストラクトの塩基に結合するものであるナノ粒子。
【請求項２】
前記金属イオンまたは前記金属前駆体の金属は、金、銀、銅、白金、パラジウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記核酸コンストラクトは、２ないし１０の一本鎖核酸を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記２以上の一本鎖核酸は、それぞれ２ないし５の前記断片を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記核酸コンストラクトは、２つの核酸鎖間に、架橋結合または挿入物質（intercalating  agent）を含み、前記断片が互いに実質的に相補的に結合するものであることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記の互いに隣接した断片は、リンカを含まないか、前記２以上の一本鎖核酸のうち、いずれにも相補的に結合しない１ないし５０のヌクレオチドからなるリンカをさらに含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記核酸コンストラクトは、Ｘ字形、Ｙ字形、線形または鉄アレイ状の二本鎖断片を含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記金属イオンまたは前記金属前駆体は、前記核酸コンストラクトのリン酸主鎖、または前記核酸コンストラクトの塩基に結合する金属層を形成するものであることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
請求項１ないし８のうちいずれか一項に記載のナノ粒子を２以上含むナノ粒子複合体であって、
２以上の前記ナノ粒子のうち１つの１末端が、他の前記ナノ粒子の１末端に結合するものであるナノ粒子複合体。
【請求項１０】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びその類似体からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項９に記載のナノ粒子複合体。
【請求項１１】
それぞれ２個以上の隣接した断片を含む２個以上の一本鎖核酸を混合する段階であって、それぞれの前記断片は、互いに異なる前記断片に相補的であり、前記断片は、それぞれ実質的に相補的な前記断片にハイブリダイズして核酸テンプレートになり、結果得られる前記核酸コンストラクトは、複数の二本鎖断片を含む段階と、
前記のハイブリダイズされた結果物にインターカレータを添加し、インターカレータが前記二本鎖断片に挿入される段階と、
前記核酸テンプレートを金属イオンと接触させる段階と、
前記金属イオンを還元させる段階と、を含むナノ粒子を製造する方法。
【請求項１２】
前記インターカレータは、ソラレン（psoralen）、臭化エチジウム（ethidium  bromide）、プロフラビン（proflavine）、ダウノマイシン（daunomycin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、サリドマイド（thalidomide）、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＪＯＪＯ−１、シアニン二量体（cyanine  dimers）、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、シアニン単量体（cyanine  monomers）、臭化エチジウム（ethidium  bromide）、エチジウム同種二量体（ethidium  homodimer）−１、エチジウム同種二量体（ethidium  homodimer）−２、エチジウム誘導体（ethidium  derivatives）、アクリジン（acridine）、アクリジンオレンジ（acridine  orange）、アクリジン誘導体（acridine  derivatives）、エチジウム−アクリジン異種二量体（ethidium-acridine  heterodimer）、エチジウムモノアジド（ethidium  monoazide）、ヨウ化プロピジウム（propidium  iodide）、ＳＹＴＯ染料、ＳＹＢＲ  Green１、ＳＹＢＲ染料、Ｐｉｃｏ  Green、ＳＹＴＯＸ染料、及び７−アミノアクチノマイシン（aminoactinomycin）Ｄからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ及びその類似体からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記テンプレートは、２ないし１０の一本鎖核酸を含むことを特徴とする請求項１１ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記一本鎖核酸は、それぞれ２ないし５の断片を含むことを特徴とする請求項１１ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記隣接した断片は、いずれの前記一本鎖核酸のヌクレオチドとも相補的な結合をしない１ないし５０のヌクレオチドからなるリンカをさらに含むことを特徴とする請求項１１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記金属イオンの金属は、金、銀、銅、白金、パラジウム及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項１１ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子製造用核酸コンストラクトテンプレート、該テンプレートを利用したナノ粒子の製造方法、及び該方法を利用して製造されたナノ粒子並びにナノ粒子複合体に関するのである。
【背景技術】
【０００２】
ナノ技術の到来は、多様な技術分野で活用され、進取的な成長を引き起こしている。ナノ技術は、例えば、ほぼ小分子の１個サイズに該当するナノメートル単位の物質を利用して所望の構造物を製造し、前記構造物を多様な分野に応用する技術をいう。
【０００３】
金属ナノ粒子は、それらの光物理的、化学的な性質を利用して、単一細胞及び単分子の検出のための生体分析や、既存のバイオセンサにナノ技術を適用して製造されたナノバイオセンサ開発に多く使用されている。また、金属ナノ粒子の表面プラズモン吸収特性と、周囲環境の変化に敏感に反応する特性とを利用して、金属ナノ粒子は、タンパク質−タンパク質相互作用、異なる生体分子間の相互作用、及びＤＮＡ配列解読のアッセイに使用することが適切でもある。特に、金ナノ粒子は、光を吸収し、それを熱に変換するので、これらの特性を利用して、標的細胞を破壊することにより、疾病治療にも使用される。それ以外に、パラジウムまたは白金などのナノ粒子の場合には、化学的触媒としても応用が可能である。
【０００４】
金属ナノ粒子の構造及び材料は、金属ナノ粒子の物理的性質を決定する最も重要な要素のうち二つである。金属ナノ粒子の構造を制御しようとする研究は、多く試みられた。ロッド（rod）状の金属ナノ粒子または不規則な分枝構造を有するナノ粒子が、金属イオンが還元されるとき、界面活性剤（surfactant）を添加して主に形成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一様態は、天然のまたは人工の生体分子を利用したナノスケール構造体及びナノスケール装置の製造、及び生体分子構造物の正確であって効率的な製造を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一様態は、金属イオンまたは金属前駆体、及び核酸コンストラクトを含むナノ粒子であって、前記核酸コンストラクトは、２以上の一本鎖核酸を含み、前記２以上の一本鎖核酸は、それぞれ１０以上のヌクレオチド、及び２以上の隣接した断片を含み、前記断片の各々は、互いに異なる前記断片に相補的なものであり、前記断片は、それぞれ実質的に相補的な前記断片にハイブリダイズし、前記核酸コンストラクトは、複数の二本鎖断片を含み、前記金属または前記金属前駆体は、前記核酸コンストラクトのリン酸主鎖、または前記核酸コンストラクトの塩基に結合するものであるナノ粒子を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一様態によると、ナノ粒子製造用テンプレート及びそれを利用して製造されたナノ粒子であって、効率的に製造された多様な形態の金属ナノ粒子を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】本発明の例示的な実施形態によるナノ粒子製造用核酸テンプレートの多様な形態を示した模式図である。
【図１Ｂ】本発明の例示的な実施形態によるナノ粒子製造用核酸テンプレートの多様な形態を示した模式図である。
【図１Ｃ】本発明の例示的な実施形態によるナノ粒子製造用核酸テンプレートの多様な形態を示した模式図である。
【図１Ｄ】本発明の例示的な実施形態によるナノ粒子製造用核酸テンプレートの多様な形態を示した模式図である。
【図２】本発明の例示的な実施形態によるＹ字形の核酸テンプレートを形成する過程を示した模式図である。
【図３】本発明の例示的な実施形態によって製造されたＹ字形核酸テンプレートの形成を確認した電気泳動写真である（Ｍ：マーカーレーン、１：レーン１、２：レーン２、３：レーン３）。
【図４】本発明の例示的な実施形態によって、ソラレンを添加して架橋結合されたＹ字形核酸テンプレートの形成を確認した電気泳動写真である（１：マーカーレーン、２：レーン１、３：レーン３、４：レーン４、５：レーン５、６：レーン６、７：レーン７）。
【図５】本発明の例示的な実施形態の製造方法によって製造されたＹ字形の金ナノ粒子を確認した電子顕微鏡写真であり、標識「ＡｕＮＰ」は、金ナノ粒子を意味する。
【図６】本発明の例示的な実施形態の製造方法によって製造されたＸ字形の金ナノ粒子を確認した電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の例示的な実施形態によれば、２以上の一本鎖核酸を含むものであり、前記２以上の一本鎖核酸は、それぞれ１０個以上の任意のヌクレオチドを有し、前記２以上の一本鎖核酸は、それぞれ２以上の互いに隣接した断片（segment）を含み、前記２以上の一本鎖核酸の一方の断片は、各々、他方の一本鎖核酸の断片と実質的に相補的な結合を行うナノ粒子製造用テンプレートを提供する。
【００１０】
用語「ナノ粒子（nanoparticle）」は、多様な形態の粒子を意味し、その幅が、約１ｎｍないし数十ｎｍの範囲であってもよい。ナノ粒子は、その幅よりさらに長く、その長さは、数ｎｍないし数百ｎｍの範囲であってもよい。
【００１１】
用語「核酸テンプレート（nucleic  acid  template）」、「核酸コンストラクト（nucleic  acid  construct）」または「核酸テンプレート・コンストラクト（nucleic  acid  template  construct）」は、相互交換的に使用されるものであり、ナノ粒子を製造するために使用され、テンプレートを利用してナノ粒子の構造をさらに精密に制御することができる。核酸テンプレート、核酸コンストラクトまたは核酸テンプレート・コンストラクトは、人工的に構成された核酸分子である。
【００１２】
用語「核酸（nucleic  acid）」は、「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」と混用され、それは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を意味する。また、特別に他の言及がない限り、ポリヌクレオチドは、天然のポリヌクレオチドの類似体（analogs）を含むものであると解釈される。一実施形態によれば、核酸は、ＤＮＡ（deoxyribonucleic  acid）、ＲＮＡ（ribonucleic  acid）、ＰＮＡ（peptide  nucleic  acid）、ＬＮＡ（locked  nucleic  acid）及びその類似体からなる群から選択されるものであるが、それらに限定するものではない。
【００１３】
一実施形態によれば、テンプレートは、例えば、２個ないし１０個、２個ないし８個、２個ないし６個、または２個ないし４個の一本鎖核酸を含んでもよい。
【００１４】
一実施形態によれば、一本鎖核酸は、例えば、２個ないし５個、２個ないし４個または２個ないし３個の断片を含んでもよい。
【００１５】
用語「断片（segment）」は、一本鎖核酸に含まれたポリヌクレオチドの一部分を指すものであり、１つの一本鎖核酸には、２以上の断片を含んでもよく、２以上の断片は、互いに異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。また、１つの一本鎖核酸内に含まれた断片は、他の一本鎖核酸に含まれた断片と実質的に相補的な結合が可能である。同一核酸中の断片は、１個ないし３個のヌクレオチドによって離隔されるか、あるいは互いに連続していてもよい。
【００１６】
用語「実質的に相補的」、「実質的に相補的に結合」または「実質的に相補的な結合」は、当業界に公知のストリンジェントな条件（stringent  conditions）下で、互いに異なる２個のポリヌクレオチドがハイブリダイズされることを意味する。ストリンジェントな条件は、温度、イオン強度（緩衝液濃度）及び有機溶媒のような化合物の存在などを調節して決定され、ハイブリダイズされる配列によって、異なるように決定される。例えば、厳格条件は、ａ）５０℃温度及び０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで洗浄するか、ｂ）ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ及び１０％デキストラン硫酸を含む）で５５℃でハイブリダイズした後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有０．１ｘＳＳＣで５５℃で洗浄する条件で行われる。
【００１７】
ナノ粒子を製造するための多様な形態のオリゴヌクレオチドまたは核酸テンプレート・コンストラクトは、一本鎖核酸の個数、及び一本鎖核酸に含まれる断片の個数に従って製造される。例えば、ナノ粒子を製造するための棒形（rod-type）のテンプレート・コンストラクトは、２個の一本鎖核酸のうちの一方の２個の断片が、リンカなしで、他方の２個の一本鎖核酸の断片に隣接するように配置される、相補的な２個の一本鎖核酸を使用して製造される（例えば、図１Ｃ参照）。代案として、Ｙ字形のテンプレート・コンストラクト（図１Ａ参照）は、それぞれ２個の断片を有する３個の一本鎖核酸を使用して製造され、ナノ粒子製造のためのＸ字形のテンプレート・コンストラクト（図１Ｂ参照）は、それぞれ２個の断片を有する４個の一本鎖核酸を使用して製造される。
【００１８】
一実施形態によれば、テンプレート・コンストラクトは、コンストラクトの安定性を向上させる一つ以上の要素を含んでもよい。例えば、核酸の相補的な鎖は、互いに架橋結合（cross-linked）される。一実施形態で、インターカレータ（intercalator）は、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＪＯＪＯ−１、シアニン二量体（cyanine  dimers）、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、シアニン単量体（cyanine  monomers）、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）、エチジウム同種二量体（ethidium  homodimer）−１、エチジウム同種二量体（ethidium  homodimer）−２、エチジウム誘導体（ethidium  derivatives）、アクリジン（ａｃｒｉｄｉｎｅ）、アクリジンオレンジ（acridine  orange）、アクリジン誘導体（acridine  derivatives）、エチジウム−アクリジン異種二量体（ethidium-acridine  heterodimer）、エチジウムモノアジド（ethidium  monoazide）、ヨウ化プロピジウム（propidium  iodide）、ＳＹＴＯ染料、ＳＹＢＲ  Green１、ＳＹＢＲ染料、Ｐｉｃｏ  Green、ＳＹＴＯＸ染料、及び７−アミノアクチノマイシン（aminoactinomycin）Ｄからなる群から選択される蛍光インターカレータを含んでもよいが、それらに限定されるものではない。他の実施形態で、ソラレン（psoralen）またはその誘導体、プロフラビン（proflavine）、ダウノマイシン（daunomycin）、ドキソルビシン（doxorubicin）またはサリドマイド（thalidomide）が使用される。
【００１９】
例示的な一実施形態で、インターカレータの方式として、核酸の２つの相補的な鎖間の架橋結合（cross-linking）は、相補的な二本鎖核酸にソラレンを挿入することにより、化学的に誘導され、その後、ここに紫外線Ａを照射して核酸の塩基間に共有結合を形成することができる。
【００２０】
一実施形態によれば、互いに隣接した断片は、リンカを含まないか、あるいはどの一本鎖核酸のヌクレオチドとも相補的な結合をしない１個ないし５０個の任意のヌクレオチドからなるリンカをさらに含んでもよい。すなわち、ヌクレオチド・リンカは、一本鎖核酸内に存在する２以上の隣接した断片間を連結させる役割を行い、前記断片とは異なり、互いに異なるいかなる一本鎖核酸とも相補的に結合しないので、さらに柔軟な形態のナノ粒子製造用テンプレートを製造することができる。
【００２１】
本発明の他の実施形態によれば、金属イオンまたは金属前駆体（precursor）が、テンプレート・コンストラクトに結合したものであるナノ粒子を提供する。金属イオンまたは金属前駆体は、核酸のうち、テンプレート・コンストラクト塩基の主鎖（backbone）に結合する。
【００２２】
前述のように、ナノ粒子製造用テンプレートは、２以上の一本鎖核酸が実質的に相補的な結合された二本鎖状のポリヌクレオチドからなっているので、テンプレートは、負電荷を帯びているリン酸主鎖（phosphate  backbone）を有することになる。従って、正電荷を帯びる金属イオンは、リン酸主鎖に電気的な引力によって結合することができるので、ナノ粒子製造用テンプレートの形状と同一形状のナノ粒子を形成することができる。また、特定金属前駆体は、核酸の塩基に結合することができる。その場合、電気引力による結合と同様に、核酸テンプレートの形状によって金属前駆体が結合することになり、還元後には、結果的に、テンプレートの形状と同一構造を有するナノ粒子が形成される。
【００２３】
例示的な実施形態で、金属は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、パラジウム（Ｐｄ）、及びその組み合わせから選択されるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明の他の実施形態によれば、ナノ粒子複合体は、２以上のナノ粒子を含み、２以上のナノ粒子の一方の一末端は、他方のナノ粒子の末端に結合されている。一実施形態によれば、テンプレートＤＮＡコンストラクトを使用して、Ｙ字形の金ナノ粒子及び銀ナノ粒子を製造した後、金ナノ粒子及び銀ナノ粒子の一末端を互いに結合させて、Ｙ字形の金ナノ粒子と銀ナノ粒子とが結合されたナノ粒子複合体を形成することができる。代案として、テンプレートＤＮＡコンストラクトに、互いに異なる金属前駆体を結合させた後、テンプレートの末端を結合させて還元することにより、互いに異なる金属からなるナノ粒子複合体が形成される。
【００２５】
本発明の他の実施形態によれば、それぞれ１０個以上の任意のヌクレオチドを有し、それぞれ２以上の互いに隣接した断片（segment）を含み、それぞれの断片は、互いに異なる一本鎖核酸に含まれた断片と実質的に相補的な結合を行う２以上の一本鎖核酸を混合してハイブリダイズさせる段階と、前記のハイブリダイズされた結果物に、インターカレータ（intercalator）のような安定化剤を添加し、一本鎖核酸間を架橋結合するか、あるいは一本鎖核酸のハイブリダイゼーションを介して作られた二本鎖核酸を安定化させて核酸テンプレートを製造する段階と、核酸テンプレートに金属イオンを接触させ、核酸テンプレートと同一形状のナノ粒子を形成させる段階と、を含むナノ粒子の製造方法を提供する。
【００２６】
ナノ粒子の製造方法について、各段階別に詳細に説明すれば、次の通りである：
まず、製造方法は、それぞれ１０個以上の任意のヌクレオチドを有し、それぞれ２以上の互いに隣接した断片を含み、それぞれの断片は、互いに異なる一本鎖核酸に含まれた断片と実質的に相補的な結合を行う２以上の一本鎖核酸を混合してハイブリダイズさせる段階、及び前記のハイブリダイズされた結果物に、インターカレータ（intercalator）を添加し、一本鎖核酸間を架橋結合するか、あるいは一本鎖核酸のハイブリダイゼーションを介して作られた二本鎖核酸を安定化させて核酸テンプレートを製造する段階を含んでもよい。
【００２７】
段階は、前述のテンプレート・コンストラクトを製造する過程について説明したものであり、２以上の一本鎖核酸での核酸の種類、一本鎖核酸の数及び断片については、ナノ粒子製造用テンプレートで説明したので、明細書の複雑性を防止するために省略する。
【００２８】
２以上の一本鎖核酸のうち１個の断片は、それぞれ塩基配列を含み、それは、その断片を他の一本鎖核酸の実質的に相補的なセグコントに混成化させ、従って、混成化段階は、２以上の一本鎖核酸のＴｍ値を考慮して、混成化がＴｍ値より低い温度で自発的に起きるように行われる。
【００２９】
また、製造方法は、前述のように、相補的な二本鎖構造の安定性を向上させるために、インターカレータ（intercalator）のような安定化剤が、ハイブリダイズされた結果物に添加される。インターカレータは、ハイブリダイズされていない一本鎖核酸間を架橋結合するか、あるいはハイブリダイゼーションによって修得された二本鎖核酸を安定化させることができる。一実施形態によれば、インターカレータは、ソラレン（psoralen）及びその誘導体、臭化エチジウム（ethidium  bromide）、プロフラビン（proflavine）、ダウノマイシン（daunomycin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、サリドマイド（thalidomide）、ＹＯＹＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯＰＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＬＯＬＯ−１、ＪＯＪＯ−１、シアニン二量体（cyanine  dimers）、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、シアニン単量体（cyanine  monomers）、エチジウム同種二量体（ethidium  homodimer）−１、エチジウム同種二量体（ethidium  homodimer）−２、エチジウム誘導体（ethidium  derivatives）、アクリジン（acridine）、アクリジンオレンジ（acridine  orange）、アクリジン誘導体（acridine  derivatives）、エチジウム−アクリジン異種二量体（ethidium-acridine  heterodimer）、エチジウムモノアジド（ethidium  monoazide）、ヨウ化プロピジウム（propidium  iodide）、ＳＹＴＯ染料、ＳＹＢＲ  Green１、ＳＹＢＲ染料、Ｐｉｃｏ  Green、ＳＹＴＯＸ染料、及び７−アミノアクチノマイシン（aminoactinomycin）Ｄからなる群から選択されるものであるが、それらに限定されるものではない。
【００３０】
最後に、製造方法は、核酸テンプレートに、金属イオンまたは金属前駆体を接触させて還元剤を添加する段階を含んでもよい。
【００３１】
一実施形態によれば、金属イオンは、例えば、金、銀、銅、白金、パラジウム及びその組み合わせからなる群から選択される金属イオンまたは金属前駆体であるが、それらに限定するものではない。
【００３２】
製造された核酸テンプレートは、リン酸主鎖を含み、負電荷を帯びている。従って、核酸テンプレートに金属イオンを接触させ、核酸と金属イオンとの結合を誘導するのに十分な結合時間を与え、核酸テンプレート・コンストラクトに結合していない金属イオンを除去し、還元剤を添加することにより、金属イオンが金属に還元されながら、核酸テンプレート・コンストラクト上で金属が形成されるので、核酸テンプレートと実質的に同一形状のナノ粒子が形成される。代案として、核酸の塩基に結合する金属前駆体を、核酸テンプレートに接触させた後、還元させてテンプレートの形状と同一構造を有するナノ粒子を形成することができる。
【００３３】
以下、１以上の実施形態について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、一つ以上の実施形態について例示的に説明するためのものであり、発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
図１Ａないし図１Ｄは、１つの例示的な実施形態によるナノ粒子製造用核酸テンプレートの多様な形態を示したものである。図１Ａは、Ｙ字形の核酸テンプレートを図示したものであり、３個の一本鎖核酸１０１ないし１０３、及びそれぞれの一本鎖核酸に含まれた６個の断片２０１ないし２０６を示している。また、図１Ｂは、Ｘ字形の核酸テンプレートを図示したものであり、４個の一本鎖核酸１０４ないし１０７、及びそれぞれの一本鎖核酸に含まれた８個の断片２０７ないし２１４を示している。図１Ａまたは図１Ｂに図示されたように、一本鎖核酸に含まれたそれぞれの断片は、互いに異なる一本鎖核酸内の、それぞれ実質的に相補的な断片に結合またはハイブリダイズし、Ｙ字形の核酸テンプレート（断片２０１及び２０３，２０２及び２０６，２０４及び２０５の相補的な結合による）、またはＸ字形の核酸テンプレート（断片２０８及び２０９，２１０及び２１１，２１２及び２１３，２１４及び２０７の相補的な結合による）を形成することができる。
【００３５】
図１Ｃは、一字形の核酸テンプレートを図示したものであり、２個の一本鎖核酸１０８及び１０９、及びそれぞれの一本鎖核酸に含まれた４個の断片２１５ないし２１８を示している。一字形の核酸テンプレートは、２個以上が集まって１１字形の核酸テンプレートを構成することができる。また、図１Ｄは、鉄アレイ（dumbbell）状の核酸テンプレートを図示したものであり、４個の一本鎖核酸１１０ないし１１３、及びそれぞれの一本鎖核酸に含まれた全１０個の断片２１９ないし２２８を示している。図１Ｃまたは図１Ｄに図示されたように、一本鎖核酸に含まれたそれぞれの断片は、互いに異なる一本鎖核酸内の断片と実質的に相補的な断片に結合またはハイブリダイズし、一字形の核酸テンプレート（断片２１５及び２１７，２１６及び２１８の相補的な結合による）、または鉄アレイ状の核酸テンプレート（断片２１９及び２２８，２２０及び２２５，２２１及び２２２，２２３及び２２４，２２６及び２２７の相補的な結合による）を形成することができる。
【００３６】
Ｙ字形、Ｘ字形、一字形及び鉄アレイ状の核酸テンプレートは、１つの例示に過ぎず、一本鎖核酸及び一本鎖核酸内の断片の数により、多様な形態の核酸テンプレートを形成することができる。また、形成された核酸テンプレートを利用して、下記実施例により、Ｙ字形、Ｘ字形、一字形及び鉄アレイ状のような多様な形態の金属ナノ粒子を製造することができる。
【００３７】
実施例１：Ｙ字形のナノ粒子製造用核酸テンプレートの製造
Integrated  ＤＮＡ  Technologiesに依頼して製造された配列番号１ないし配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドを、それぞれ０．１ｍＭずつ等モル濃度で混合した後、ハイブリダイゼーション過程を遂行して、Ｙ字形のナノ粒子製造用核酸テンプレートを製造した。図２は、製造されたＹ字形の核酸テンプレートを形成する過程を模式図で示したものであり、ハイブリダイゼーションは、次のような過程で遂行した：
混合したポリヌクレオチドを９５℃で２分間放置した後、６５℃に温度を下げて２分間放置した。その後、６０℃に温度を下げて５．５分間放置した後、１℃に温度を下げて３０秒間放置する過程を反復し、混合したポリヌクレオチドの温度が２０℃になるようにした。その後、温度を４℃に下げてハイブリダイゼーションを完了した。完了したポリヌクレオチドは、その後、ナノ粒子製造に使用するまで、４℃または−２０℃に保管した。
【００３８】
ハイブリダイゼーション過程は、１ｘＴＥ（ｐＨ８．０）緩衝液内で遂行され、時によって、緩衝液にＮａＣｌを添加して１００ｍＭ濃度になるようにした。温度調節は、Eppendorf社のthermal  cyclerを利用した。
【００３９】
製造したナノ粒子製造用核酸テンプレートを、電気泳動を介して確認した。図３から分かるように、製造過程を介して、配列番号１ないし配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズされたＹ字形のポリヌクレオチドを確認することができた（レーン３）。一方、図３でレーン１は、配列番号１の塩基配列を有する一本鎖のポリヌクレオチドを、レーン２は、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチドとの一部断片（segment）が互いにハイブリダイズされた形態のポリヌクレオチドを示している。
【００４０】
実施例２：核酸鎖間に架橋結合（crosslinking）されたナノ粒子製造用核酸テンプレートの製造
実施例１で製造されたＹ字形の核酸テンプレート・コンストラクトとソラレン（psoralen）とを、１：１００のモル濃度比率で混合した後、１時間撹拌しながら、ＵＶ（ultraviolet）（３６５ｎｍ）を照射した。その後、混合物から、結合していないソラレンを濾過して除去し、ソラレンが結合されたポリヌクレオチドを蒸溜水に懸濁し、核酸鎖間に架橋結合されたナノ粒子製造用核酸テンプレートを完成した。
【００４１】
図４は、実施例１で製造されたＹ字形のナノ粒子製造用核酸テンプレート（レーン３）と、実施例２で製造された核酸テンプレート（レーン４）とを比較した電気泳動結果を示している。図４で、用語「ＩＳＣＹ−ＤＮＡ」は、ソラレンと結合された核酸テンプレートを示す。図４から分かるように、核酸鎖間に架橋結合されたナノ粒子製造用核酸テンプレートのバンドが、さらに凝縮された形態であることから見るとき、ソラレンによって架橋結合されたＹ字形の核酸テンプレートが、均一な形状を有しているということ予想することができた。
【００４２】
実施例３：Ｙ字形のナノ粒子製造
実施例２で製造された核酸鎖間に架橋結合されたＹ字形のナノ粒子製造用核酸テンプレートと、ＨＡｕＣｌ４水溶液とを、１：１００のモル濃度比率で撹拌しながら混合した後、１２時間常温でインキュベーションした。その後、混合物から、結合していない金イオンを濾過して除去し、金イオンが結合されたポリヌクレオチドを蒸溜水に懸濁した。懸濁液に、還元剤（ＮａＢＨ４）を、１：１０のモル濃度比率で添加して撹拌して混合した後、５分ないし１時間、常温でインキュベーションした。その後、水で透析するか、還元剤と同一モル濃度比率で、ＨＣｌ溶液を添加して還元過程を終了させ、Ｙ字形の金ナノ粒子を製造した。
【００４３】
製造されたＹ字形の金ナノ粒子をＵＶ／Ｖｉｓ分光計（spectroscopy）と透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）とを利用して観察した。図５から分かるように、１サイドの長さが約１０ｎｍほどであるＹ字形の金ナノ粒子を確認することができた。
【００４４】
また、Ｙ字形の核酸テンプレートの代わりに、Ｘ字形の核酸テンプレートを利用して、実施例と同一方法で製造したＸ字形の金ナノ粒子の透過電子顕微鏡写真を図６に示した。結果から見て、実施例と同一方法で、多様な形態の核酸テンプレートを利用して、多様な形態の金属ナノ粒子を製造することができるということを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の核酸コンストラクト及びそれを利用したナノ粒子の製造方法は、例えば、ナノ粒子製造関連の技術分野に効果的に適用可能である。
【符号の説明】
【００４６】
101,102,103,104,105,106,107,108,109,110,111,112,113  一本鎖核酸
114  配列番号１のポリヌクレオチド
115  配列番号２のポリヌクレオチド
116  配列番号３のポリヌクレオチド
201,202,203,204,205,206,207,208,209,210,211,212,213,214,215,216,217,218,219,220,221,222,223,224,225,226,227,228  断片
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2013240323.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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