(57)【要約】【課題】ゼニゴケ目生物においてプロスタグランジン類の生合成に関わるシクロオキシゲナーゼを高発現させるためのゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクター、該発現ベクターをゼニゴケ目生物に導入してなるゼニゴケ目生物形質転換体、該ゼニゴケ目生物形質転換体の抽出物を用いるin vitroでのプロスタグランジン類の製造方法等を提供する。【解決手段】（Ａ）シクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡと、その上流に位置する（Ｂ）ゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡとを含むゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）下記の（ａ１）〜（ａ５）のいずれかのＤＮＡと、その上流に位置する（Ｂ）下記の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかのＤＮＡとを含むことを特徴とするゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクター。
（ａ１）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ａ２）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された配列からなり、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ３）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ５）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個〜複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ｂ１）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ２）配列番号４に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｂ３）配列番号４に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｂ４）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ若しくは該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
【請求項２】
請求項１に記載の形質転換用発現ベクターをゼニゴケ目生物に発現可能に導入してなることを特徴とするゼニゴケ目生物形質転換体若しくは該形質転換体と同一の性質を有する該ゼニゴケ目生物形質転換体の子孫となるゼニゴケ目生物形質転換体、又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織。
【請求項３】
請求項２に記載のゼニゴケ目生物形質転換体又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織から得られる繁殖材料。
【請求項４】
請求項２に記載のゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させてプロスタグランジン類を製造する工程を含むことを特徴とするプロスタグランジン類生産方法。
【請求項５】
アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸が、請求項２に記載のゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から分離及び精製されたものである請求項４に記載のプロスタグランジン類生産方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の生産方法を利用するプロスタグランジン製剤の製造方法であって、以下の（Ｉ）〜（ＩＸ）の工程を含むことを特徴とするプロスタグランジン製剤の製造方法。
（Ｉ）請求項２に記載のゼニゴケ目生物形質転換体の作出、及びゼニゴケ目生物形質転換体種苗の継代培養を含む工程
（ＩＩ）栽培マットへの前記ゼニゴケ目生物形質転換体の種苗の移植を含む工程
（ＩＩＩ）前記種苗を移植した栽培マットの縦型栽培装置への設置、及び該縦型栽培装置による該形質転換体の連続栽培を含む工程
（ＩＶ）連続栽培におけるゼニゴケ目生物形質転換体の種苗への散水、及び光照射を含む工程
（Ｖ）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の収穫を含む工程
（ＶＩ）前記（Ｖ）で収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からの脂肪酸の抽出、及び該脂肪酸からのアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の回収を含む工程
（ＶＩＩ）前記（Ｖ）で収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させるプロスタグランジン類の生産を含む工程
（ＶＩＩＩ）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物とアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸との反応物からのプロスタグランジン類の分離及び精製を含む工程
（ＩＸ）精製したプロスタグランジン類を用いるプロスタグランジン製剤の製造を含む工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロスタグランジン（以下、「ＰＧ」と略記することもある）類生合成に関わる遺伝子であるシクロオキシゲナーゼ遺伝子をゼニゴケ目生物中で高発現させることができる形質転換用発現ベクター、該ベクターにより形質転換させたゼニゴケ目生物形質転換体（以下、「スーパーゼニゴケ」と略記することもある）、該ゼニゴケ目生物形質転換体を用いるＰＧ又はＰＧ製剤の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
エイコサノイドの１分類であるプロスタグランジン類には、末梢血管拡張作用、血小板凝集抑制作用、細胞保護作用、血管新生作用などがあり、いわゆるリポＰＧ剤としてこれらの治療剤として用いられている。
【０００３】
アラキドン酸（以下、「ＡＡ」と略記することもある）などの高度不飽和脂肪酸は、ヒト等において神経系を中心として細胞膜脂質に多く含まれている。これら高度不飽和脂肪酸から、シクロオキシゲナーゼの反応により、プロスタグランジン類といった薬理学的に非常に重要な生理活性物質が生合成されている。これら生合成代謝経路は、アラキドン酸カスケードと呼ばれている。例えばヒトの生体内では、プロスタグランジン類は、ＡＡ又はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）より、シクロオキシゲナーゼの反応により生合成されると考えられている。これらの反応では、まずホスホリパーゼによりＡＡ又はＥＰＡが細胞膜脂質より細胞内に遊離され、該ＡＡ又はＥＰＡがシクロオキシゲナーゼにより２分子の酸素により酸化され、プロスタグランジン類に変換される。
【０００４】
このように、生理活性物質であるプロスタグランジン類等が、動物細胞で生合成されていることは、報告されている。血液中のプロスタグランジン類が定量分析用に調製されている。
【０００５】
現在、プロスタグランジン類は、化学合成法により、ラクトンから全化学合成により生産されている。このため生産コストが高いという問題点が挙げられる。
【０００６】
上記の問題点を解決するために、安価で安定に供給でき、環境にも優しい植物を用いた生産方法がクローズアップされている。例えば、ゼニゴケ形質転換用のベクターの構築について報告されている（非特許文献１）。また、ゼニゴケを含む植物用栽培床及び植物栽培法（非特許文献２、及び特許文献１及び２）が報告されている。さらに、ゼニゴケを含む蘚苔類からの油脂類抽出法についても報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−８８３１４号公報
【特許文献２】特開２０１１−４１５３９号公報
【特許文献３】特開２０１１−５２０８６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Plant Biotechonology 28, 493-496(2011)
【非特許文献２】Plant Biotechonology 28, 489-492(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ゼニゴケ目生物においてプロスタグランジン類の生合成に関わるシクロオキシゲナーゼを高発現させるためのゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクター、該発現ベクターをゼニゴケ目生物に導入してなるゼニゴケ目生物形質転換体、該ゼニゴケ目生物形質転換体の抽出物を用いるin vitroでのプロスタグランジン類の製造方法を提供することである。本発明はまた、前記ゼニゴケ目生物形質転換体の作出から、該形質転換体の抽出物を用いるin vitroでのプロスタグランジン類の製造、生成したプロスタグランジン類の分離及び精製、並びにプロスタグランジン類を用いる製剤の製造の一連の工程を含むプロスタグランジン製剤の製造方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討した結果、ゼニゴケ目生物細胞において外来遺伝子を安定に高発現させるベクターを開発及び構築した（Plant Biotechonology 28, 493-496(2011)）。さらに、このベクターによりオゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼをコードする遺伝子（配列番号３等）をゼニゴケに導入して形質発現させることにより、ゼニゴケ形質転換体（スーパーゼニゴケ）を作出した。そして、このゼニゴケ形質転換体の細胞抽出物をin vitroでアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸と反応させると、プロスタグランジン類を高収量で産生できることを見出した。具体的には、ゼニゴケ形質転換体の細胞抽出物をin vitroでアラキドン酸と反応させると、反応液中に生成されるプロスタグランジン類の量は、ゼニゴケ形質転換体中に蓄積されるプロスタグランジン量の約２０００倍も多かった。さらに、ゼニゴケ目生物はアラキドン酸、エイコサペンタエン酸等の脂肪酸類を生合成しており（Plant Biotechonology 28, 489-492(2011)）、前記シクロオキシゲナーゼをコードする遺伝子が発現可能に導入されたゼニゴケ目生物形質転換体も、プロスタグランジン合成の基質であるアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸等の脂肪酸を生合成しているので、このようなゼニゴケ目生物形質転換体から抽出したアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を基質として用いることにより、効率が良く、環境によりやさしい循環型のプロスタグランジン類製造方法とすることができるという効果も奏することを見出した。
【００１１】
本発明者らはさらに、前記ゼニゴケ目生物形質転換体を、縦型栽培装置により、例えば植物工場等で栽培することにより、安定、かつ安価にプロスタグランジン類を製造することができることを見出した。前記遺伝子が発現可能に導入されたゼニゴケ目生物形質転換体によるプロスタグランジン類生産方法及びゼニゴケ目生物形質転換体抽出物による反応系は、製薬産業及び各種素材産業等において、プロスタグランジン類を生産する上で、薬等の原料や試薬の供給に極めて有用である。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔６〕を包含する。
〔１〕（Ａ）下記の（ａ１）〜（ａ５）のいずれかのＤＮＡと、その上流に位置する（Ｂ）下記の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかのＤＮＡとを含むことを特徴とするゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクター。
（ａ１）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ａ２）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された配列からなり、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ３）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ５）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個〜複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ｂ１）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ２）配列番号４に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｂ３）配列番号４に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｂ４）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ若しくは該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
〔２〕前記〔１〕に記載の形質転換用発現ベクターをゼニゴケ目生物に発現可能に導入してなることを特徴とするゼニゴケ目生物形質転換体若しくは該形質転換体と同一の性質を有する該ゼニゴケ目生物形質転換体の子孫となるゼニゴケ目生物形質転換体、又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織。
〔３〕前記〔２〕に記載のゼニゴケ目生物形質転換体又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織から得られる繁殖材料。
〔４〕前記〔２〕に記載のゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させてプロスタグランジン類を製造する工程を含むことを特徴とするプロスタグランジン類生産方法。
〔５〕アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸が、前記〔２〕に記載のゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から分離及び精製されたものである前記〔４〕に記載のプロスタグランジン類生産方法。
〔６〕前記〔４〕又は〔５〕に記載の生産方法を利用するプロスタグランジン製剤の製造方法であって、以下の（Ｉ）〜（ＩＸ）の工程を含むことを特徴とするプロスタグランジン製剤の製造方法。
（Ｉ）前記〔２〕に記載のゼニゴケ目生物形質転換体の作出、及びゼニゴケ目生物形質転換体種苗の継代培養を含む工程
（ＩＩ）栽培マットへの前記ゼニゴケ目生物形質転換体の種苗の移植を含む工程
（ＩＩＩ）前記種苗を移植した栽培マットの縦型栽培装置への設置、及び該縦型栽培装置による該形質転換体の連続栽培を含む工程
（ＩＶ）連続栽培におけるゼニゴケ目生物形質転換体の種苗への散水、及び光照射を含む工程
（Ｖ）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の収穫を含む工程
（ＶＩ）前記（Ｖ）で収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からの脂肪酸の抽出、及び該脂肪酸からのアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の回収を含む工程
（ＶＩＩ）前記（Ｖ）で収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させるプロスタグランジン類の生産を含む工程
（ＶＩＩＩ）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物とアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸との反応物からのプロスタグランジン類の分離及び精製を含む工程
（ＩＸ）精製したプロスタグランジン類を用いるプロスタグランジン製剤の製造を含む工程
【００１３】
本明細書中、アラキドン酸を基質とするプロスタグランジン類とは、アラキドン酸から合成されるプロスタグランジンを意味する。エイコサペンタエン酸を基質とするプロスタグランジン類とは、エイコサペンタエン酸から合成されるプロスタグランジンを意味する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るゼニゴケ目生物形質転換体は、その増殖又は生育に伴いプロスタグランジン類を生産し、しかも細胞内で合成したプロスタグランジン類を細胞内に蓄積すると言う効果を奏する。このため、プロスタグランジン類を効率よく生産できる。このような本発明に係るゼニゴケ目生物形質転換体を用いると、医薬品の有効成分等として有用なプロスタグランジン類の生産コストを著しく低減でき、しかも、より環境にやさしい生産プロセスを実現することができる。つまり本発明によれば、環境にやさしい生産プロセスで、プロスタグランジン類を効率よく安価に生産することができるという効果を奏する。さらに、ゼニゴケ目生物形質転換体の抽出物を用いたin vitro反応系によりプロスタグランジン類を効率よく大量生産できることから、プロスタグランジン類をより安価に、工業的に効率よく供給できるという効果も奏する。こうして得られたプロスタグランジン類は、薬理活性物質、健康食品の原料等として、活用できるという効果を奏する。さらに、前記ゼニゴケ目生物形質転換体の作出から、該形質転換体の抽出物を用いるin vitroでのプロスタグランジン類の製造、生成したプロスタグランジン類の分離及び精製、並びにプロスタグランジン類を用いる製剤の製造の一連の工程を含むプロスタグランジン製剤の製造方法は、栽培生産を一貫して行える省スペース及び省エネ型の新しい植物工場に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明のゼニゴケ目生物形質転換体を用いる植物工場の一態様によるプロスタグランジン製剤製造の流れの概略を示す図である。
【図２】図２は、ゼニゴケ目生物においてシクロオキシゲナーゼをコードする遺伝子を高発現させるベクターの作製手順の一例を示した図である。
【図３】図３は、ゼニゴケ目生物形質転換体に蓄積する高度不飽和脂肪酸及びプロスタグランジン類の抽出、分離及び精製の手順の一例を示す図である。
【図４】図４は、ゼニゴケ目生物形質転換体に蓄積するプロスタグランジン類の抽出、分離、及び回収の手順の一例を示す図である。
【図５】図５は、ゼニゴケ目生物形質転換体抽出物を用いたin vitro反応により生成したプロスタグランジン類の抽出、分離及び精製工程の一例を示す図である。
【図６】図６は、栽培マットを備える栽培パネルの構造の一例を示す断面図である。
【図７】図７は、植え付け前の栽培パネルの写真（Ａ）、及びゼニゴケ形質転換体を植え付けて数週間栽培後の栽培パネルの写真（Ｂ）である。
【図８】図８は、縦型栽培装置の一例を示す側面図である。
【図９】図９は、縦型栽培装置の一例を示す平面図である。
【図１０】図１０は、縦型栽培装置の一例を示す正面図である。
【図１１】図１１は、縦型栽培装置の架台の一例を示す正面図（イ）、側面図（ロ）である。
【図１２】図１２は、循環装置を示す説明図である。
【図１３】図１３は、ゼニゴケ目生物形質転換体の栽培方法の流れの一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
（１）ゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクター
本発明のゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクターは、（Ａ）下記の（ａ１）〜（ａ５）のいずれかのＤＮＡ（以下、（Ａ）のＤＮＡともいう）と、その上流に位置する（Ｂ）下記の（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかのＤＮＡ（以下、（Ｂ）のＤＮＡともいう）を含むものである。
（ａ１）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ａ２）配列番号３に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された配列からなり、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ３）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ又は該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードするＤＮＡ
（ａ５）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個〜複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するオゴノリ目生物由来のたんぱく質をコードするＤＮＡ
【００１７】
（ｂ１）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ２）配列番号４に示される塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換、欠失、挿入、及び／又は付加された配列からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｂ３）配列番号４に示される塩基配列の一部からなり、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
（ｂ４）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ若しくは該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ
【００１８】
本明細書中、「１〜複数個」における「複数個」とは、通常２〜３０個程度、好ましくは２〜１５個程度、より好ましくは２〜１０個程度、さらに好ましくは２〜６個程度、最も好ましくは２個である。
【００１９】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも約９０％の同一性、好ましくは少なくとも約９５％の同一性、特に好ましくは約９７％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９８％の同一性が配列間に存在するときのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
【００２０】
上記ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A lLaboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同な遺伝子を取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、市販のＤＩＧ（ジゴキシゲニン）ハイブリダイゼーションバッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて行うことなどが挙げられる。
【００２１】
前記（ａ１）〜（ａ５）のＤＮＡは、アラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とし、２分子の酸素により基質を酸化するシクロオキシゲナーゼ活性を有するたんぱく質をコードするＤＮＡである。前記（Ａ）のＤＮＡは、好ましくは、（ａ１）又は（ａ４）のＤＮＡであり、より好ましくは（ａ１）のＤＮＡである。前記（ａ１）〜（ａ５）のＤＮＡをシクロオキシゲナーゼ遺伝子ともいう。
【００２２】
本発明において、前記アラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するたんぱく質は、好ましくは、少なくともアラキドン酸を基質とするシクロオキシゲナーゼ活性を有するたんぱく質である。シクロオキシゲナーゼ活性を有するたんぱく質は、アラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を基質としてもよい。
本発明に係るシクロオキシゲナーゼ遺伝子は、好ましくは、オゴノリ目生物由来である。より好ましくはオゴノリ(Gracilaria vermiculophylla)由来である。
【００２３】
前記（ａ１）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡは、オゴノリ(Gracilaria vermiculophylla)に由来する遺伝子である。配列番号３のＤＮＡは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質をコードする。配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質は、２分子の酸素によりアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を酸化するシクロオキシゲナーゼである。
【００２４】
本発明におけるシクロオキシゲナーゼ遺伝子は、オゴノリ目生物等から取得することができる。
上記「オゴノリ目生物」は、すなわち、海藻オゴノリは、原生生物界、紅色植物門(Rhodophyta)に属し、オゴノリ目、オゴノリ科、オゴノリ属に分類され、オゴノリ目にはオゴノリのほかに、カバノリ、シラモ、ツルシラモが知られている。オゴノリ目生物でプロスタグランジン類の蓄積が報告されている（Bull. of the Jpa. Society of Science Fisheries 50(3), p465-469, 1984）。
【００２５】
これらの生物からシクロオキシゲナーゼ遺伝子を取得することは現在の技術水準を持ってすれば容易である。例えば、近縁生物の同じ機能を有する酵素をコードする遺伝子は、クロスハイブリダイゼーションすることが一般に知られている。
【００２６】
シクロオキシゲナーゼ遺伝子を取得する方法も特に限定されるものではないが、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（サブトラクションクローニング）を利用する方法を挙げることができる。この方法では、公知の技術に従って、試験管内での直接的ハイブリダイゼーションを繰り返し、目的のｃＤＮＡ（本発明の遺伝子）を濃縮すればよい。
【００２７】
上記ディファレンシャルスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。これによって得られたクローンは、制限酵素地図の作製及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、シクロオキシゲナーゼ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００２８】
また、シクロオキシゲナーゼ遺伝子を取得する方法として、公知の技術により、本発明におけるシクロオキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、シクロオキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、シクロオキシゲナーゼ遺伝子の塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。
【００２９】
また、例えば、上記プローブの配列を、上述したオゴノリ目生物間で良好に保存されている領域の中から選択し、他のオゴノリ目生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記たんぱく質と同様の機能を有する相同分子又は類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる。
【００３０】
あるいは、シクロオキシゲナーゼ遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、シクロオキシゲナーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号１又は配列番号３）のうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明におけるシクロオキシゲナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。ＰＣＲ、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、行うことができる。また、シクロオキシゲナーゼ遺伝子は、ＤＮＡ合成機によって合成することもできる。
【００３１】
上記方法により得られた遺伝子によりコードされるたんぱく質がシクロオキシゲナーゼ活性を有することは、例えば、E. coli、酵母等に該遺伝子を導入してたんぱく質を生産させ、調製したたんぱく質画分を用いて、それらの酵素活性をin vitroで分析することにより確かめることができる。
シクロオキシゲナーゼ活性の測定は、通常、Hashimoto et al,J. Biol. Chem.254,829-836,(1979)に記載の方法に従って行うことができる。
【００３２】
前記（Ｂ）のＤＮＡは、ゼニゴケ目生物細胞において５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡである。５’ＵＴＲ活性を有するとは、ある遺伝子の上流側（５’側）に位置する場合に、転写されたｍＲＮＡの翻訳効率を上昇させ、当該遺伝子を高発現させる機能を有することを意味する。
【００３３】
（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかのＤＮＡが、前記（Ａ）のＤＮＡ（シクロオキシゲナーゼ遺伝子）の上流に位置することにより、該ベクターをゼニゴケ生物細胞内に導入した場合に、細胞内で該シクロオキシゲナーゼ遺伝子を高発現させることができる。
【００３４】
前記（ｂ１）の配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP) 遺伝子の5’UTRである。前記（ｂ４）のＤＮＡは、好ましくは配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡ若しくは該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつゼニゴケ目生物細胞において５’ＵＴＲ活性を有するゼニゴケ目生物由来のＤＮＡである。
【００３５】
（ｂ１）〜（ｂ４）のＤＮＡは、ゼニゴケ目生物由来のものであることが好ましい。（Ｂ）のＤＮＡは、好ましくは（ｂ１）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡである。
【００３６】
本明細書中「ゼニゴケ目生物」とは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)に限定されるものでなく、ゼニゴケ亜綱ゼニゴケ目（Marchantiales）に属する生物が含まれる。ゼニゴケ亜綱ゼニゴケ目（Marchantiales）に属する生物としては、例えば、ハマグリゼニゴケ科、ミカズキゼニゴケ科、ジャゴケ科、アズマゼニゴケ科、ジンガサゴケ科、ジンチョウゴケ科、ヤワラゼニゴケ科、ウキゴケ科、ゼニゴケ科等の植物が挙げられる。ゼニゴケ目生物は、好ましくは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)である。
【００３７】
前記５’−ＵＴＲ活性を有する（ｂ１）〜（ｂ４）のＤＮＡは、例えば、ゼニゴケ目生物等の植物、動物、微生物等から取得することができる。前記５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ断片の取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、ゼニゴケ目生物から（ｂ１）〜（ｂ４）のＤＮＡを取得する方法として、代表的な方法として次に示す各方法を挙げることができる。なお、前記ＤＮＡは、例えば下記方法においてゼニゴケ目生物以外の植物、動物、微生物等のESTライブラリー等を使用して、ゼニゴケ目生物以外の生物から取得することもできる。
【００３８】
例えば、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡは、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)のADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP)遺伝子の5’ UTRであり、ゼニゴケから以下の方法等により単離することができる。
タバコにおいて、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)遺伝子の5’ UTR配列が、外来遺伝子の安定な発現に有効であることが知られている (Nagaya S et al., J. Biosci. Bioeng., 89, 231-235 (2000))。そこで、既知のADH遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索する。次に、得られたESTクローンの配列を含むゲノムクローンを、５’−ＵＴＲ活性を有する（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列（例えば、配列番号４の塩基配列）の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゼニゴケのゲノムライブラリーよりスクリーニングする。このようなプローブとしては、例えば、配列番号４の塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列及び長さのものを用いてもよい。このような方法を用いて、ゼニゴケADH様UDP-グルコース脱水素酵素 (UDP)遺伝子の5’ UTR（配列番号４）等を単離することができる。
【００３９】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、通常、マキサム−ギルバート法、ジデオキシ法等の公知手法により、又はBigDye（登録商標）ターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems社）、BcaBEST（登録商標）ジデオキシシークエンシングキット(Takara社)等を用いた自動塩基配列決定装置により行うことができる。なお、変異の導入は、公知の手法により(Ito, W.(1991) Gene 102: 67-70)、又は市販のキット（Takara社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット）を用いて行うことができる。
【００４０】
一旦その下流にある遺伝子の高発現能を有する５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡの塩基配列が確定されると、その後はＰＣＲ等の増幅手段を用いて該ＤＮＡを取得することができる。例えば、５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。ＰＣＲ、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、行うことができる。また、該５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡが適当なベクターにクローニングされている場合には、インサートとしてマルチクローニングサイトに挿入されている該ＤＮＡの５’及び３’方向外側の、ベクター起源の塩基配列を含むプライマーを用いたＰＣＲによって、又は５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡの塩基配列を含むＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、前記５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡ合成機による化学合成によって５’−ＵＴＲ活性を有するＤＮＡを得ることもできる。
【００４１】
本発明のゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクターは、本発明の効果を奏することになる限り、前記（Ａ）のＤＮＡ、及びその上流に位置する（Ｂ）のＤＮＡ以外のＤＮＡを含んでもよい。例えば、（Ａ）のＤＮＡの下流に、ゼニゴケ目生物内で機能するターミネーターを有することが好ましい。また、ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターを含んでもよい。ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターを含む場合、該プロモーターは、（Ｂ）のＤＮＡの上流に位置することが好ましい。
【００４２】
ゼニゴケ目生物細胞内で機能するターミネーターは特に限定されず、ゼニゴケ目生物由来のものであってもよく、他の生物由来のものであってもよい。例えば、ＮＯＳターミネーター、ＯＣＳターミネーター等が挙げられる。
【００４３】
ゼニゴケ目生物細胞内で機能するプロモーターとしては特に限定されず、ゼニゴケ目生物由来のものであってもよく、他の生物由来のものであってもよい。例えば、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター（CaMV35Sプロモーター）、植物由来rbcS遺伝子プロモーター等が挙げられる。中でも、導入したシクロオキシゲナーゼたんぱく質をコードする遺伝子がゼニゴケ目生物において恒常的に発現することが好ましいことから、構成的プロモーターを用いることが好ましく、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター等がより好ましい。
【００４４】
本発明の発現ベクターには、例えば、薬剤耐性遺伝子等が組み込まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子として、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４５】
本発明の発現ベクターの作製方法は、遺伝子工学の分野で公知の方法を用いて行えばよい。発現ベクターは、通常、基礎となるベクター（以下の説明では、便宜上、基礎ベクターと称する）のマルチクローニングサイトに、前記（Ａ）のＤＮＡ、（Ｂ）のＤＮＡ等を組み込んで構築すればよい。
【００４６】
基礎ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ゼニゴケ目生物細胞中で形質発現可能なベクターを適宜選択すればよい。ここで、上記基礎ベクターとしては、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。すなわち、ゼニゴケ目生物細胞中で確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列等を選択し、これと前記（Ａ）のＤＮＡ、（Ｂ）のＤＮＡを各種プラスミド等の基礎ベクターに組み込んだものを形質転換用発現ベクターとして用いればよい。
【００４７】
（２）ゼニゴケ目生物形質発現体
本発明の形質転換用発現ベクターをゼニゴケ目生物に発現可能に導入してなる、ゼニゴケ目生物形質発現体も、本発明に包含される。ゼニゴケ目生物細胞は、好ましくは、ゼニゴケ細胞である。
ここで「ゼニゴケ目生物形質発現体」とは、ゼニゴケ目生物の細胞、組織、器官のみならず、植物個体（植物体）を含む意味である。「ベクター又は遺伝子が発現可能に導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、宿主細胞内に発現可能に導入されることを意味する。
【００４８】
前記ゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクターをゼニゴケ目生物細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。例えば、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、パーティクルガン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このようなゼニゴケ目生物の形質転換体を作製する技術については、例えば、Plant Cell Physiol., 49, p1048 (2008)等に記載されている。
形質転換用発現ベクターが導入されるゼニゴケ目生物細胞には、種々の形態の植物組織、葉状体の切片、カルス、培養細胞などが含まれる。
【００４９】
形質転換用発現ベクターが導入されたゼニゴケ目生物形質転換体が一旦得られれば、該ゼニゴケ目生物形質転換体の植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることができる。また、当該ゼニゴケ目生物形質転換体、又は、その子孫、あるいは、クローンから、繁殖材料、例えば、葉状体、杯状体、胞子、仮根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該ゼニゴケ目生物形質転換体を量産することが可能である。したがって、本発明には、前記形質転換用発現ベクターがゼニゴケ目生物に発現可能に導入されたゼニゴケ目生物形質転換体若しくは該形質転換体と同一の性質を有する該ゼニゴケ目生物形質転換体の子孫となるゼニゴケ目生物形質転換体、又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織も含まれる。さらに、本発明には、該ゼニゴケ目生物形質転換体又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織から得られる繁殖材料も含まれる。該ゼニゴケ目生物形質転換体又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織から繁殖材料を得る方法としては、公知の方法を使用できる。前記形質転換用発現ベクターにより前記（Ａ）のシクロオキシゲナーゼ遺伝子が導入されたゼニゴケ目生物形質転換体又はゼニゴケ目生物形質転換体の組織を増殖又は生育させる方法、ゼニゴケ目生物形質転換体細胞から植物体を再生させる方法、栽培する方法等については特に限定されるものではなく、ゼニゴケ目生物に通常使用される方法、条件等を用いることができる。
【００５０】
前記（Ａ）の遺伝子がゼニゴケ目生物に発現可能に導入されてなるゼニゴケ目生物形質転換体は、その増殖又は生育に伴いプロスタグランジン類を生産し、しかも細胞内で合成したプロスタグランジン類を細胞内に蓄積する。
【００５１】
前記（Ａ）の遺伝子が植物に発現可能に導入されてなる、ＡＡ又はＥＰＡを基質とするプロスタグランジン類組成が改変されたゼニゴケ目生物形質転換体、該ゼニゴケ目生物形質転換体と同一の性質を有する該形質転換体の子孫となるゼニゴケ目生物形質転換体、該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織、及び、該ゼニゴケ目生物形質転換体又は該ゼニゴケ目生物形質転換体の組織から得られる繁殖材料も本発明に含まれる。「プロスタグランジン類組成が改変された」とは形質転換前のゼニゴケ目生物におけるプロスタグランジン類組成と形質転換後におけるゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織のプロスタグランジン類組成とが異なっていることを意味する。例えば、（１）本来プロスタグランジン類組成にＡＡ又はＥＰＡを基質とするプロスタグランジン類が含まれていなかったゼニゴケ目生物を前記形質転換用発現ベクターで形質転換することにより、作出されたゼニゴケ目生物形質転換体のプロスタグランジン類組成にＡＡ又はＥＰＡを基質とするプロスタグランジンが含まれる場合、（２）形質転換前と比較して、プロスタグランジン類組成におけるＡＡ又はＥＰＡを基質とするプロスタグランジンの含量が増加した場合等を挙げることができる。
【００５２】
（３）ゼニゴケ目生物形質転換体によるプロスタグランジン類の生産
前記ゼニゴケ目生物形質転換体においては、その増殖又は生育に伴い細胞内にプロスタグランジン類が生成する。細胞内で合成されたプロスタグランジン類は、ゼニゴケ目生物形質転換体の細胞内に蓄積する。このため、前記ゼニゴケ目生物形質転換体を、培養又は栽培することにより、プロスタグランジン類を生産することができる。
【００５３】
ゼニゴケ目生物形質転換体がゼニゴケ培養細胞又はゼニゴケ組織である場合、培養は、通常の植物培養培地、例えばＭ５１Ｃ培地（Takenaka et al., Transgenic Research, 9, 179−185（2000））等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。ゼニゴケ目生物形質発現体が植物体である場合は、ガラスハウス、植物工場等で栽培又は水耕培養することができる。また、例えば、ゼニゴケ目生物の繁殖形態として無性生殖（栄養生殖）によることが好ましい。つまりゼニゴケ目生物については、その形質発現体を、無性生殖（栄養生殖）により増殖又は生育させると、生長速度が早く植物工場システムとしても大量生産が可能であるため好ましい。ゼニゴケ目生物を栽培するための植物用栽培床及び植物栽培方法については、公知の方法を使用できる。また、ゼニゴケ目生物は、栽培マット、栽培トレイ等の栽培床に着生すると、垂直方向にも生育するため、縦型栽培装置等を用いて栽培することもできる。例えば、特開２０１０−０８８３１４号公報に記載の方法（縦型多段式栽培棚を用いマット方式による栽培装置）等も使用することができる。
【００５４】
ゼニゴケ目生物形質発現体を培養又は栽培する条件及び時間は、適宜選択すればよい。例えば、液体培養の温度は、通常約１５〜３０℃、好ましくは約２０〜３０℃である。培養する時間は、通常約３日〜６日が好ましく、４日〜５日がより好ましい。固体培養又は栽培の温度は、通常約１５〜３０℃、好ましくは約２０〜３０℃である。培養又は栽培する時間は、通常約３週間〜８週間が好ましく、４週間〜７週間がより好ましい。
【００５５】
培養又は栽培終了後、培養物、ゼニゴケ目生物形質転換体の組織又はゼニゴケ目生物形質転換体よりプロスタグランジン類を回収（分離及び精製）する。プロスタグランジン類の回収方法は、通常の精製手段を用いることができる。例えば、培養物、植物組織又は植物体に、通常、磨砕処理等を行って上記培養物、植物組織又は植物体の抽出液を調製し、その後は公知の精製手法によりプロスタグランジン類を精製する。また、プロスタグランジン類を回収する場合は、前記培養物、ゼニゴケ目生物形質転換体の組織又はゼニゴケ目生物形質転換体から、後述するようにまず脂肪酸を抽出した後、その残渣からプロスタグランジン類を分離及び精製することが好ましい。
【００５６】
ゼニゴケ目生物形質転換体により製造されるプロスタグランジン類としては、例えばアラキドン酸から生産される（アラキドン酸を基質とする）プロスタグランジン類として、プロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）、プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）等のプロスタグランジン（ＰＧ）等が挙げられる。エイコサペンタエン酸から生産される（エイコサペンタエン酸を基質とする）プロスタグランジン類として、例えば、プロスタグランジンＨ３（ＰＧＨ３）、プロスタグランジンＧ３（ＰＧＧ３）、プロスタグランジンＥ３（ＰＧＥ３）等のプロスタグランジンが挙げられる。中でも本発明のゼニゴケ目生物形質転換体は、プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）、プロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）、プロスタグランジンＨ３（ＰＧＨ３）、プロスタグランジンＧ３（ＰＧＧ３）、プロスタグランジンＥ３（ＰＧＥ３）等のプロスタグランジン（ＰＧ）の製造に好適に用いられる。
【００５７】
上記のようにシクロオキシゲナーゼ遺伝子を含む形質転換用発現ベクターをゼニゴケ目生物細胞に導入してなる形質転換体により、高効率で、しかも低コストかつ環境にやさしい生産プロセスでプロスタグランジン類を生産することができる。
【００５８】
（４）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物を用いるプロスタグランジン類の生産方法
前記ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させることにより、効率よくプロスタグランジン類を製造することができる。前記ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させてプロスタグランジン類を製造する工程を含むプロスタグランジン類生産方法も、本発明に包含される。
ゼニゴケ目生物形質転換体の組織としては特に限定されず、葉状体、胞子、カルス等が挙げられる。中でも、葉状体、カルス等が好適に用いられる。
【００５９】
ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物を得る方法は特に限定されず、例えば、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織を水又は緩衝液中、好ましくは緩衝液中で磨砕して得られる摩砕物を抽出物として用いることができる。摩砕に用いるゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織は、凍結等して用いてもよい。緩衝液は特に限定されないが、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）−塩酸緩衝液（トリス塩酸緩衝液）、MES-NaOH緩衝液等を用いることができる。中でも、トリス塩酸緩衝液等が好ましい。この抽出に用いる緩衝液には、フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）等のプロテアーゼ阻害剤を添加することが好ましい。また、このように得た摩砕物に、さらに遠心分離を行い、生じた上清を集めることによっても、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物を得ることができる。すなわち本発明におけるゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物として、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織を水又は緩衝液中で摩砕した摩砕物、又はその上澄み等を用いることができる。ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物は、所望により水又は緩衝液で希釈して用いることができる。
【００６０】
このようにして得られた抽出物は、そのままプロスタグランジン類生産のためのin vitroでの反応に用いることができるが、さらに抽出を進めてタンパク質画分を分離し、このタンパク質画分を抽出物として、プロスタグランジン類製造のために用いることもできる。タンパク質画分の分離は、公知の方法により行うことができ、例えば以下の方法等が挙げられる。すなわち、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物に硫酸アンモニウムを添加した後、析出したタンパク質を遠心分離により集める。次に、これを前記緩衝液に溶解し、さらに透析やゲル濾過により、この溶液から塩類や低分子を取り除くことにより、タンパク質画分を分離することができる。
【００６１】
基質であるアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸としては、市販されているもの等を使用できるが、後述するゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から分離及び精製されたものを好適に使用することができる。
【００６２】
プロスタグランジン類生産のためのin vitroでの反応は、水又は緩衝液（好ましくは緩衝液）中に、前記抽出物及びアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を添加した反応液中で行うことが好ましい。緩衝液は特に限定されず、トリス塩酸緩衝液等を用いることができる。前記ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物は、例えば反応液中にタンパク質濃度が０．２μｇ／μＬ〜１．５μｇ／μＬ程度となるように添加することが好ましく、０．３μｇ／μＬ〜１．２μｇ／μＬ程度がより好ましい。基質であるアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の添加量は、反応液中に０．１ｍＭ〜１ｍＭ程度となるように添加することが好ましく、０．５ｍＭ〜１ｍＭ程度がより好ましい。
【００６３】
プロスタグランジン類生産のためのin vitroでの反応の条件は特に限定されないが、例えば、反応を行う温度は約５〜２５℃とすることが好ましく、約５〜２０℃がより好ましい。反応液のｐＨは、約６〜８が好ましく、約７〜８がより好ましい。ｐＨの調整は、酸又はアルカリを用いて行うことができる。
反応時間は適宜設定すればよいが、通常約１０分〜１時間が好ましく、３０分〜１時間程度がより好ましい。
【００６４】
反応液に生成したプロスタグランジン類は、公知の手法により分離及び精製することができる。通常、有機溶媒による抽出法、高圧高温水蒸気蒸留法、カラムクロマトグラフィー等の１又は２以上を組み合わせて行うことができる。抽出に用いる溶媒は、例えば、ヘキサン、酢酸エチル等が好ましい。例えば、Methods in Enzymology, 432, 59-82(2007)に記載の方法に従って反応液中のプロスタグランジン類を分離及び精製することができる。反応液からプロスタグランジン類を分離及び精製する方法の１例を、図５に示す。
【００６５】
本発明により製造されるプロスタグランジン類としては、例えば、プロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）、プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）等のアラキドン酸から生産される（アラキドン酸を基質とする）プロスタグランジン（ＰＧ）が挙げられる。また、プロスタグランジンＧ３（ＰＧＧ３）、プロスタグランジンＨ３（ＰＧＨ３）、プロスタグランジンＥ３（ＰＧＥ３）等のエイコサペンタエン酸から生産される（エイコサペンタエン酸を基質とする）プロスタグランジン（ＰＧ）が挙げられる。中でも本発明の方法は、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）等の製造に好適である。
【００６６】
（５）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からのアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の分離及び精製
前記ゼニゴケ目生物形質転換体は、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸等の脂肪酸を生合成する。本発明においては、前記in vitroでの反応において基質として使用するアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸として、前記ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から分離及び精製されたものを使用することができる。このように前記形質転換体又はその組織から分離及び精製したアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を用いることにより、環境によりやさしい循環型のプロスタグランジン類製造方法とすることができるため、好ましい。
【００６７】
ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を分離及び精製する方法は特に限定されない。例えば、まずゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から該形質転換体又は組織中に含まれる脂肪酸を抽出し、次いで該脂肪酸からアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を分離及び精製する方法等が好ましい。
【００６８】
本発明においては、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から該形質転換体又は組織中に含まれる脂肪酸を抽出する際、例えば、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織を予備乾燥させ、その後に脂肪酸を抽出することが好ましい。予備乾燥の手段としては、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織にマイクロ波を照射する方法が好ましい。このような方法によれば、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を分解させずに効率よく抽出できるため好ましい。
【００６９】
本発明者らは、ゼニゴケ目生物形質転換体及びその組織に含まれる脂肪酸の抽出効率を上げるために前処理方法を検討した。前処理方法としては、液体窒素による凍結処理、ホモジナイズ処理とこれまでにない新規の方法としてマイクロ波処理を検討した。それぞれの抽出液のTLCによる分析結果は、いずれの方法でもアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸が確認され、特にホモジナイズ処理による抽出液のそれが最も顕著であった。しかし、マイクロ波処理では、「瞬間的に温度が上がるため分解酵素を無力化できる」、「他の方法に比べて調整範囲が広い」などの利点を含むため、この方法が前処理方法として好適であることを見出した。
【００７０】
マイクロ波を照射するゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織は、採取したたままの「生」の状態、又は採取した形質転換体又はその組織の表面の水分を蒸発させた「半生」の状態のものが好ましく、半生の状態のものがより好ましい。採取したゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織を、例えば約１０〜５０℃の温度下で通常約１〜２０時間、好ましくは約６〜１２時間自然乾燥させることにより、半生の状態のゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織を得ることができる。
【００７１】
予備乾燥のためのマイクロ波は、約１〜１０ＧＨｚとすることが好ましく、水は２．４５ＧＨｚをよく吸収するため、約２．４〜２．５ＧＨｚがより好ましい。マイクロ波照射装置は特に限定されず、公知のものを使用することができ、例えば、特開２０１１−５２０８６号公報に記載されたもの等を使用することができる。マイクロ波の照射時間は、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の量等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、生又は半生の状態のものを予備乾燥させる場合には、照射前と比較して照射後のゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の質量が２〜２０％程度となるまで予備乾燥することが好ましい。
【００７２】
予備乾燥させたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からの脂肪酸の抽出は、公知の抽出法、例えば、有機溶媒による抽出、高温高圧水蒸気蒸留による抽出等により行うことができる。中でも、高温高圧水蒸気蒸留による抽出が好ましい。高温高圧水蒸気蒸留は、常法に従って行うことができ、水蒸気を蒸留室に充填し、蒸留したものを冷却することにより行うことができる。有機溶媒による抽出を行う場合、ヘキサン等の溶媒を用いて行うことができる。脂肪酸を抽出した後の残渣には、通常ゼニゴケ目生物形質転換体が生合成したプロスタグランジン類が含まれる。
【００７３】
抽出した脂肪酸には、通常、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸等が含まれる。抽出した脂肪酸からアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を分離及び精製する方法は特に限定されず、公知の精製方法、例えばカラムクロマトグラフィー等により行うことができる。得られたアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸は前記プロスタグランジン類生産のためのin vitroでの反応の基質として好適に用いられる。ゼニゴケ目生物形質転換体に蓄積するアラキドン酸の分離回収方法の手順の一例を図３に示す。
【００７４】
（６）脂肪酸を抽出した残渣からのプロスタグランジン類の分離及び精製
上述したように、本発明のゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織には、通常、ゼニゴケ目生物形質転換体が生合成したプロスタグランジン類が含まれるため、該形質転換体又はその組織から脂肪酸を抽出した後の残渣には、通常プロスタグランジン類が含まれる。本発明においては、前記残渣からもプロスタグランジン類を分離及び精製することができる。プロスタグランジン類の分離及び精製方法は特に限定されず、公知の方法、例えば、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー等により行うことができる。前記残渣からプロスタグランジン類を分離回収する方法の手順の一例を、図４に示す。
【００７５】
（７）プロスタグランジン製剤の製造方法
本発明は、前記（４）に記載のプロスタグランジン類の生産方法を利用するプロスタグランジン製剤の製造方法も包含する。本発明のプロスタグランジン製剤の製造方法は、以下の（Ｉ）〜（ＩＸ）の工程を含む。
（Ｉ）前記ゼニゴケ目生物形質転換体の作出、及びゼニゴケ目生物形質転換体種苗の継代培養を含む工程
（ＩＩ）栽培マットへの前記ゼニゴケ目生物形質転換体の種苗の移植を含む工程
（ＩＩＩ）前記種苗を移植した栽培マットの縦型栽培装置への設置、及び該縦型栽培装置による該形質転換体の連続栽培を含む工程
（ＩＶ）連続栽培におけるゼニゴケ目生物形質転換体の種苗への散水、及び光照射を含む工程
（Ｖ）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の収穫を含む工程
（ＶＩ）前記（Ｖ）で収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からの脂肪酸の抽出、及び該脂肪酸からのアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の回収を含む工程
（ＶＩＩ）前記（Ｖ）で収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させるプロスタグランジン類の生産を含む工程
（ＶＩＩＩ）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物とアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸との反応物からのプロスタグランジン類の分離及び精製を含む工程
（ＩＸ）精製したプロスタグランジン類を用いるプロスタグランジン製剤の製造を含む工程
【００７６】
以下、工程（Ｉ）〜工程（ＩＸ）の順で本発明を詳細に説明する。例えば、工程（Ｉ）〜（ＩＸ）を一貫して閉鎖系の植物工場等により行うと、形質転換体の作出、栽培からプロスタグランジン類の抽出、及び製剤の製造までを一貫して行うことができ、効率よくプロスタグランジン類製剤を製造することができる。また、ゼニゴケ目生物形質転換体の栽培に縦型栽培装置を用いることから、省スペースで大量に形質転換体を栽培することができ、さらにプロスタグランジン類の基質（原料）となるアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸も形質転換体により生産することができるため、省エネ型、及び循環型の生産プロセスを実現できる。本発明においては、本発明の効果を奏することになる限り、工程（Ｉ）〜（ＩＸ）以外の工程を適宜行ってもよい。
【００７７】
（７−１）ゼニゴケ目生物形質転換体の作出、及びゼニゴケ目生物形質転換体種苗の継代培養を含む工程（Ｉ）
上述したゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクターによりゼニゴケ目生物を形質転換することにより、前記ゼニゴケ目生物形質転換体を作出することができる。ゼニゴケ目生物形質転換体及びその製造方法、並びにそれらの好ましい態様等は、上述した通りである。このシクロオキシゲナーゼ遺伝子を高発現する当該ゼニゴケ目生物形質転換体は、プロスタグランジン類製造のための植物工場システムの構築に好適に利用することができる。ゼニゴケ目生物形質転換体の種苗の継代培養の方法は特に限定されないが、例えば、成熟したゼニゴケ目生物形質転換体に生じる無性芽を採取し、生育・継代することにより行うことが好ましい。このように無性芽を用いて継代培養することにより、容易にかつ大量にゼニゴケ目生物形質転換体を増殖させることができる。このような継代培養法は、例えば、後述する縦型栽培装置を用いる自動縦型連続栽培用の無性芽を用いた簡便な種苗の前培養法として好適である。
【００７８】
（７−２）栽培マットへの前記種苗の移植を含む工程（II）
栽培マットとしては、縦型栽培装置に使用することができ、ゼニゴケ目生物形質転換体が着生することができるものであれば特に限定されない。より具体的には、ゼニゴケ目生物形質転換体の根（仮根）が絡みつけるものが好ましい。また、保水のために水を含むことができるものが好ましい。このような栽培マットとして、例えば、不織布製のマット、ウレタン製のマット等が好ましい。栽培マットは、さらに保水層等を有するものであってもよい。栽培マットとして、例えば特開２０１０−８８３１４号公報に記載された植物栽培用床等も好適に使用することができる。通常、ゼニゴケ目生物形質転換体の種苗が栽培マットに着生するまでは、該栽培マットを横に寝かして種苗を育成させ、着生後に栽培マットを立てた状態で縦型栽培装置に設置する。
【００７９】
ゼニゴケ目生物形質転換体の種苗の栽培マットへの移植は、工程（Ｉ）で得たゼニゴケ目生物形質転換体の種苗を前記栽培マットにのせ（植えつけ）、例えば約１５〜３０℃の温度下で、１日２〜２４回程度水を散布して、種苗を育成させることにより行うことができる。植えつけるゼニゴケ目生物形質転換体の種苗には、ゼニゴケ目生物形質転換体の無性芽、その切片等を用いることが好ましい。通常、約３〜７日で該種苗が栽培マットに着生する。植え付け後、水溶性肥料等を散布して施肥してもよい。
【００８０】
また、ゼニゴケ目生物形質転換体の種苗を栽培マットに植えつけた後、栽培マット上の種苗の上をステンレス網等の支持網で覆うことが好ましい。支持網は、その網目（空隙）からゼニゴケ目生物の葉状体が突き抜けられる程度の大きさの網目を有するものであればよく、材質や網目の形状等は特に限定されない。例えば、ステンレス製の網、網戸用ネット等が好ましい。支持網は、栽培マットの上に直接設置することが好ましい。また、後述する縦型栽培装置に設置した場合に支持網が栽培マットから脱離しないように、枠体（フレーム）又は支持体等により支持網と栽培マットとを固定することが好ましい。
【００８１】
本発明においては、栽培マットの上に前記支持網を有し、かつ栽培マットを収納する栽培トレイ、栽培トレイや支持網を固定する枠体（フレーム）又は支持体等を備える栽培パネルを用いることが好ましい。
【００８２】
本発明に用いられる栽培パネルの好ましい態様の１例の断面図を、図６に示す。図６の栽培パネルは、枠体３と、枠体３に固定された支持網２及び栽培トレイ４と、栽培トレイ４に収容された栽培マット１から構成されている。この栽培パネルでは、支持網２の裏面に栽培マット１が積層され、栽培マット１は栽培トレイ４に収容されている。枠体３は、上下、左右の框を矩形に組んだもので、内側の側面には栽培トレイ４を嵌め込む凹型の溝３ａが連続して設けられている。栽培マット１の表面（上面）側には凹部１ａが形成されており、支持網２と凹部によって植物収容空間が形成されている。植えつけの際には、支持網２を外した状態で、この凹部１ａにゼニゴケ目生物の種苗５を収容した状態で植えつけ、その後に支持網２を積層し、枠体３で支持網２と栽培トレイ４とを固定する。この状態で栽培することにより、支持網２の表面から成長したゼニゴケ目生物が突出する。この突出部分については刈り取って収穫し、刈取り後の栽培パネルを用いて再度縦型栽培装置で栽培することによって、凹部１ａに残ったゼニゴケ目生物形質転換体を支持網２の表面から再度突出させる。
【００８３】
枠体３と支持網２とを固定する方法は特に限定されず、例えば、支持網２をネジ（図６中には示さず）等で枠体３に固定すればよい。また、栽培トレイは、図６に示す例では枠体３の凹型の溝３ａに嵌め込んで固定されているが、枠体として溝を有さないものを用いてもよく、その際には、ネジ等で枠体に固定してもよい。
【００８４】
栽培トレイ４の材質等は特に限定されず、栽培マットを収容でき、縦型栽培装置において収容した栽培マットを支持することができるものであればよく、プラスチック製のトレイ、金属製のトレイ、不織布製のトレイ等を使用できる。中でも、軽量であることから、不織布製のもの等が好ましい。また、栽培トレイは、黒色等の遮光性が高いものが好ましい。栽培マットに植えつけられたゼニゴケ目生物の根は、栽培トレイ側に伸長する。根を遮光すると、根の生育がよくなるため好ましい。枠体３の材質は特に限定されないが、例えば、アルミニウム合金等を使用することができる。
【００８５】
図７に、図６に断面図を示す栽培パネルの一例の写真を示す。図７のＡは、ゼニゴケ目生物形質転換体を植え付ける前の栽培パネルを上から撮影した写真である。図７のＡでは網は示していない。図７のＢは、ゼニゴケ目生物形質転換体を図７のＡの栽培パネルに植え付け後、縦型栽培装置で数週間栽培した後の写真である。
【００８６】
本発明者らは以前に、アルミフレームの支持材とステンレス網を基本とする栽培トレイを考案したが、夏期栽培において不織布にカビが発生することや、着生が十分でないゼニゴケが縦型栽培中に脱落する欠点が明らかになった。そこで、前記栽培マットにゼニゴケを植付けてステンレス網等の支持網で押さえ、該網から突出てくる葉状体を収穫する方法を新たに考案した。前記栽培トレイを用いる栽培において、より効率的に大量連続栽培を行うために、無菌培養したゼニゴケ目生物形質転換体に依存しない栽培方法の確立を目指した。まず、栽培マットを改良し、支持網の下にゼニゴケ目生物形質転換体を植え付け、支持網の上部に伸長した葉状体だけを収穫できるようにした。その結果、葉状体が支持網を突き抜け、伸長、生長することを見出した。
【００８７】
さらにこのように葉状体だけを収穫すると、収穫時、網の下にセニゴケの生長点が残ることにより、一度栽培マットに種苗を植えつけると、複数回の栽培及び収穫が可能となっただけでなく、栽培中のゼニゴケ目生物形質転換体から飛び散った無性芽も施肥栽培を行うことにより、葉状体にまで生育させることができた。また、マット栽培にて収穫したゼニゴケ目生物形質転換体の葉状体を再度栽培マットに植付けても、同様に栽培、収穫できることを見出した。以上のように、後述の散水方法、無性芽からの栽培に必要な施肥を組み合わせることにより、ゼニゴケ目生物形質転換体の大量栽培、連続栽培が可能となった。
【００８８】
（７−３）前記種苗を移植した栽培マットの縦型栽培装置への設置、及び該縦型栽培装置による該形質転換体の連続栽培を含む工程（ＩＩＩ）
本発明においては、上述した種苗を移植した栽培マットを縦型栽培装置に設置し、該装置を作動させて形質転換体を連続栽培することが好ましい。上述した栽培マットを備える栽培パネルを使用すると、栽培パネルごと縦型栽培装置に設置することができるため好ましい。縦型栽培装置で連続栽培することにより、省スペースでゼニゴケ目生物形質転換体を大量生産することができる。
【００８９】
本発明者らは、基礎実験用に小型の縦型栽培装置を試作し、ゼニゴケが縦型で栽培できることを確認した後、スケールアップした多段棚を試作した。この多段栽培棚は、例えば、１架台に栽培トレイを両面で１２枚セットでき、移動可能な架台２０セットからなるものであった。さらに、ゼニゴケ栽培面に均一に自然光を入射させるため栽培架台を横移動させる装置を組込むと、回転移動する架台（栽培棚）の栽培マットに均一に散水でき、かつ散水量が最小となる架台（栽培棚）の最適な移動速度は、約0.6〜0.7ｍ/分であった。これらの多段横型育苗棚と多段縦型栽培棚（以下、栽培装置）は、いずれも、当初目標の床面積に対して10倍以上のゼニゴケ栽培を可能とした（例えば、特開２０１０−８８３１４号公報）。
【００９０】
本発明において、縦型栽培装置としては、循環型の栽培装置が好ましい。このような栽培装置として、例えば特開２０１０−８８３１４号公報に記載された縦型栽培装置等を好適に用いることができる。本発明において使用し得る循環型の縦型栽培装置の一例として、特開２０１０−８８３１４号公報に記載された縦型栽培装置を図８〜１２に示す。
【００９１】
以下の説明においては、栽培マット１を縦型栽培装置に設置する場合を例に挙げて説明するが、好ましくは、栽培マット１の代わりに、上述したような栽培マット１を備える栽培パネルを縦型栽培装置に設置する。
上述した栽培マット１を設置する縦型栽培装置９は、図８〜１０に示すように、複数枚の栽培マット１を立てたまま一体化して保持する架台１０と、複数枚の架台１０を吊り下げながら循環移動する循環装置１１とから構成してあることが好ましい。
【００９２】
架台１０は、図１１に示すように、鉛直に立てた栽培マット１をその裏面同士が向かい合いながら且つ縦横に並列させて保持する架台本体１２と、架台本体１２を循環装置１１に吊下げる吊下げ片１３とから構成するものであることが好ましい。
【００９３】
架台本体１２は、通常、左右に間隔をあけて設けられる縦枠１４と、左右の縦枠１４の前面及び後面に対して上下に間隔をあけて架設する横枠１５とから構成するものであることが好ましい。
【００９４】
縦枠１４は、通常、上下に延長する薄い帯板である。また、横枠１５は、通常、水平に延長する横架材であって、栽培マット１の上側又は下側をくわえる断面コ字状の溝枠１６と、溝枠１６の内側片１６ａから延長する連結片１７とから構成してあることが好ましい。連結片１７は、上向き又は下向きに開口する溝枠１６の開口方向と反対側に延長し、縦枠１４及び裏面側の連結片１７にまとめてビス留め等して取り付けられる。横枠１５は、水平状態で固定されるので、溝枠１６の左右端部が栽培マット１の出入り口となる。したがって、栽培マット１を水平に移動させることによって、上下の溝枠１６に嵌め込むようにして出し入れできる。
【００９５】
吊下げ片１３は、断面Ｔ字状であって、最も上の横枠１５よりも上側で左右の縦枠１４にビス留め等して固定される。
【００９６】
循環装置１１は、図１０、図１２に示すように環状のガイドレール１８と、ガイドレール１８に沿って走行する複数のスライダ１９と、スライダ１９をガイドレール１８に沿って移動させる図示しない駆動装置と、ガイドレール１８及び駆動装置を固定するフレーム２０とから構成してあることが好ましい。
【００９７】
ガイドレール１８は、フレーム２０から間隔をあけて垂下する複数のガイドレールサポート１８ａと、複数のガイドレールサポート１８ａにスペーサ１８ｃを介して固定する平面視環状（トラック状）のレール本体１８ｂとを備えている。レール本体１８ｂは帯板を鉛直に立てたまま環状とし、その帯板の上下をスライダ１９の一対のローラ１９ｂで挟ませるものである。ローラ１９ｂは帯板の長手方向に沿って回転する。
【００９８】
スライダ１９は、架台１０の吊下げ片１３をその幅中央部においてビス等で着脱可能に取り付けるＬ字状のハンガー１９ａと、ハンガー１９ａの上下に間隔をおいて回転可能に支持された上下一対のローラ１９ｂと、上側のローラ１９ｂの上方でレール本体１８ｂに沿わせて平面視環状に配置する無端チェーン１９ｃと、無端チェーンの軸端面に固定するアタッチメント１９ｅと、アタッチメント１９ｅを介して無端チェーン１９ｃとハンガー１９ａを連結する接合板１９ｄとから構成してある。無端チェーン１９ｃには、その延長方向に間隔をあけて全てのスライダ１９のハンガー１９ａが固定されている。
【００９９】
駆動装置は、図示しないが、トラック状に張られた無端チェーン１９ｃに巻き掛けたスプロケットと、そのスプロケットを回転させるモータ機構とから構成してある。
【０１００】
フレーム２０は、ガイドレール１８を地上から浮かせて支持するもので、地上に起立する複数のポスト２０ａと、複数のポスト２０ａの上部に支持される吊下げ枠２０ｂとから構成してある。吊下げ枠２０ｂは、縦横にビームを組んであり、ガイドレールサポート１８ａを吊下げて支持するものである。
【０１０１】
上述した縦型栽培装置９は、次の要領で動作する。駆動装置のモータ機構を駆動すると、スプロケットが回転し、無端チェーン１９ｃが循環する。すると、無端チェーン１９ｃに固定してあるスライダ１９が架台１０と一緒にガイドレール１８に沿って移動して循環する。
【０１０２】
前記循環型の縦型栽培装置を用いると、ゼニゴケ目生物形質転換体を連続栽培することができる。連続栽培の際の条件は、例えば、温度は、好ましくは約１５〜３０℃、より好ましくは約２０〜３０℃である。
【０１０３】
前記栽培マット１、縦型栽培装置９を用いた植物栽培方法の好ましい態様は、例えば次の通りである。図１３に示すようにまず、作業者は、栽培マット１を横に寝かして水平な状態とし、マット上にゼニゴケ目生物形質転換体の種苗５を適当な間隔ごとに載せる。図示しないが、この際、上述したように栽培マット１の上を支持網で覆い、固定することが好ましい。次に、棚２１の棚板２２の上に栽培マット１を水平な状態を保ったまま載せる。そして、必要なだけ散水し、必要に応じて周囲に配置した照明から光を当てる。この育成環境下に、例えば通常約３〜７日、好ましくは約１週間、栽培マット１を置いておく。そうすると、ゼニゴケ目生物形質転換体の根（仮根）が栽培マット１に絡まる。このようにしてゼニゴケ目生物形質転換体の仮根が栽培マット１に絡まると、栽培マット１を鉛直に立ててもゼニゴケ目生物形質転換体が外れ落ちなくなる。
【０１０４】
仮根が栽培マット１に絡まったことを確認した後に、縦型栽培装置９が設置された育成環境に移す。仮根が絡まった栽培マット１を、架台１０の上下に対向する溝枠１６間に挿入し、架台１０の前面及び後面に複数枚の栽培マット１を縦横に並列させて保持する。架台１０によって一体化した前後の栽培マット１は、根が向かい合う状態となることが好ましい。この架台１０の吊下げ片１３をスライダ１９に取り付けると、架台１０が立った状態となる。スライダ１９に架台１０を取り付ける作業を繰り返すことによって、縦型栽培装置９には架台１０が整列して保持される。そして、この育成環境下において、後述するように散水、及び光を当てる。この育成環境下に栽培マット１を配置して、ゼニゴケが十分に成長した時期に支持網から突出ている葉状体を収穫する（後述する工程（Ｖ））。
【０１０５】
（７−４）連続栽培におけるゼニゴケ目生物形質転換体の種苗への散水、及び光照射を含む工程（ＩＶ）
本発明者らは、栽培棚の移動を利用し、栽培棚が一回転する間、散水ノズルから散水を行い、補助散水として超音波ミストを使用する散水方法を見出した。さらに、生育が促進されるために、効率的光照射法として、様々な光質をゼニゴケに照射した結果、550nm（緑色光）と610nm（赤色光）にピーク波長がある蛍光灯を照射した場合に、生育が促進される傾向を見出した（Plant Biotechonology 28, 489-492(2011)）。
【０１０６】
前記縦型栽培装置により栽培を行う際には、適宜種苗に散水を行うことが好ましい。散水は、例えば、散水ノズル等を用いて行うことができる。また、補助散水として超音波ミストを使用することも好ましい。散水の回数、タイミング等は特に限定されないが、例えば、栽培マットが乾燥する前に一日２〜４回等が好ましい。また、ゼニゴケ目生物形質転換体に、緑色光と赤色光にピーク波長がある光を照射することが好ましい。光源は特に限定されないが、例えば、550nm（緑色光）と610nm（赤色光）にピーク波長がある蛍光灯を照射することが好ましい。このような光を照射することにより、ゼニゴケ目生物形質転換体の生育が促進される。光照射のタイミング、照射時間、照射量等は、例えば、約４０〜５０μmolm-2s-1の光量に足りない時だけ補光することが好ましい。また、特開２０１１−４１５３９号公報に記載されている青色光を照射することも好ましい。これにより、ゼニゴケ目生物形質転換体が生成するエイコサペンタエン酸の量が増加する。
【０１０７】
縦型栽培装置による栽培においては、適宜施肥を行うことが好ましい。施肥は、水溶性肥料を水に溶解させた溶液を栽培マット、ゼニゴケの表面に散布して行うことが好ましい。水溶性肥料は、ゼニゴケ目生物を無性芽からの栽培する際に用いることができるものであればよく、市販品を使用することができ、例えば、ピータース水溶性肥料（商品名、ハイポネックス社）等を使用できる。施肥は、通常、植付14日目程度から1〜3日に１回行うことが好ましい。また、例えば、散水直後の散布等が効果的である。散水を午前中に行う場合には、午前中の散水直後の散布がより好ましい。例えば、ピータース水溶性肥料（商品名、ハイポネックス社）品名/15-11-29PLを用いる場合には、該肥料を濃度1.5％に調整して使用することが好ましい。
【０１０８】
（７−５）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の収穫を含む工程（Ｖ）
生育したゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織を収穫する方法は特に限定されない。好ましくは、ゼニゴケ目生物形質転換体の葉状体を収穫する。
例えば、前記栽培マットの上をステンレス網等の支持網で覆った場合、植付けから通常約３〜５週後には、栽培マットを覆う支持網からゼニゴケ葉状体が突き出てくるので、それを収穫適期にヘラで削り取る収穫法等が簡便で効率が良いため好ましい。また、このように葉状体を削り取っても、収穫後には新たな葉状体が再生し、繰り返し収穫できるため好ましい。
通常、収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の一部を後述する工程（ＶＩ）に用い、その残りを工程（ＶＩＩ）に用いる。
【０１０９】
（７−６）工程（Ｖ）で収穫されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からの脂肪酸の抽出、及び該脂肪酸からのアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の回収を含む工程（ＶＩ）
ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から該形質転換体又は組織中に含まれる脂肪酸を抽出し、次いで該脂肪酸からアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を分離及び精製する方法、及びその好ましい態様等は、前記（５）で述べた通りである。得られたアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸は、in vitro反応によるプロスタグランジン類の生産において基質として使用される。図３に、ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織からの脂肪酸の抽出、及び該脂肪酸からのアラキドン酸の分離及び精製の手順に一例を示す。また、上述したように、脂肪酸を抽出した後の残渣は、通常プロスタグランジン類を含むものである、本発明においては、前記残渣から上述した方法等によりプロスタグランジン類を分離及び精製することが好ましい。ここで精製されたプロスタグランジン類も、後述するプロスタグランジン製剤の製造に好適に用いられる。
【０１１０】
（７−７）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させるプロスタグランジン類の生産を含む工程（VII）
工程（VII）で使用されるゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織は、前記工程（VI）でアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の回収のために使用されたゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織とは、別に収穫されたものである。
ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物にアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を基質として添加してin vitroで反応させる方法、及びその好ましい態様等は、上述したゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物を用いるプロスタグランジン類の生産方法（前記（６））と同様である。工程（VII）で添加するアラキドン酸、エイコサペンタエン酸は、好ましくは工程（VI）で前記ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織から分離及び精製されたものである。
【０１１１】
（７−８）ゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織の抽出物とアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸との反応物からのプロスタグランジン類の分離及び精製を含む工程（ＶＩＩＩ）
生成したプロスタグランジン類は、公知の手法により分離及び精製することができる。通常、有機溶媒による抽出法、高圧高温水蒸気蒸留法、カラムクロマトグラフィー等の１又は２以上を組み合わせて行うことができる。抽出に用いる溶媒は、例えば、ヘキサン、酢酸エチル等が好ましい。プロスタグランジン類の分離及び精製は、例えば、Methods in Enzymology, 432, 59-82(2007)に記載の方法に従って行うことができる。反応液からプロスタグランジン類を分離及び精製する方法の１例を、図５に示す。
【０１１２】
（７−９）精製したプロスタグランジン類を用いるプロスタグランジン製剤の製造を含む工程（ＩＸ）
プロスタグランジン製剤の形態は特に限定されず、カプセル剤、錠剤等が挙げられるが、カプセル剤が好ましい。プロスタグランジン製剤の製造方法は特に限定されず、所望により公知の賦形剤、添加剤等を配合し、公知の方法により所望する剤型の製剤を製造することができる。
【０１１３】
以下に、カプセル剤の製造方法の一例を説明する。プロスタグランジン類は室温で容易に分解をするため、得られたプロスタグランジン類にdl-α-トコフェロールと軽質無水ケイ酸を添加した混合末を作製し、酸化による分解を抑制することが好ましい。dl-α-トコフェロールの配合量は、例えば、プロスタグランジン類１に対して、質量比で好ましくは６〜１程度、より好ましくは５〜１．１程度とする。軽質無水ケイ酸の配合量は、例えば、プロスタグランジン類１に対して、質量比で好ましくは０．９〜１．１程度、より好ましくは０．９５〜１．０５程度とする。上記混合末を公知の手法により、カプセルに充填する。カプセルは、硬カプセルでも軟カプセルでもよいが、硬カプセルが好ましい。例えば、ゼラチン等のカプセルを使用することが好ましい。
【０１１４】
例えば、前記工程（Ｉ）〜（ＩＸ）を一貫して閉鎖系植物工場等で行うことにより、省スペースで、省エネ型、かつ環境にやさしい生産プロセスで、かつ効率よくプロスタグランジン製剤を大量生産することができる。
図１に、本発明のプロスタグランジン製剤の製造方法に使用される閉鎖系の植物工場の一例を示す。図１中の矢印は、プロスタグランジン製剤製造の流れを示す。例えば、工場の一画で作出され継代培養された形質転換体の種苗（工程（Ｉ））は、栽培マットに移植される（工程（ＩＩ））。該種苗が着生した栽培マットは、循環型の縦型栽培装置に設置され、連続栽培される（工程（ＩＩＩ））。この連続栽培においては、上述したように形質転換体に散水及び光照射するため（工程（ＩＶ））、縦型栽培装置を設置する一画は、作業の便宜上工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を行う一画とは仕切られた一画であることが好ましい。生育したゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織は適宜収穫され（工程（Ｖ））、その一部からアラキドン酸又はエイコサペンタエン酸を回収する（工程（ＶＩ））。アラキドン酸又はエイコサペンタエン酸の回収に使用しなかったゼニゴケ目生物形質転換体又はその組織は、プロスタグランジン類生産のためのin vitroの反応（工程（ＶＩＩ））に使用される。in vitroの反応により生成したプロスタグランジン類は、分離及び精製され（工程（ＶＩＩＩ））、プロスタグランジン類製剤の製造に使用される（工程（ＩＸ））。
【実施例】
【０１１５】
以下にいくつかの実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものでなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに本発明は技術的実施形態に限定されるものではなく、請求項等にしめした種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１６】
（実施例１）
シクロオキシゲナーゼ遺伝子組換え形質転換用高発現ベクター
オゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼ遺伝子をゼニゴケ形質転換体で高発現させるための形質発現ベクター（CaMV35S-5’UTR-GvCOX-tNOS）を作製した。
【０１１７】
オゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼ遺伝子のBamHI及びSacI断片の作製方法
オゴノリのシクロオキシゲナーゼ遺伝子（GvCOX遺伝子）の翻訳領域（配列番号３）を含むｃＤＮＡ（配列番号１）を、BamHIあるいはSacI配列を付加したプライマー(GvCOX F: ggatccATGGTGTTCAACAACTTCC（配列番号５）と GvCOX R: gagctcTACACAGGGTTATTCTTC（配列番号６）)を用いて、オゴノリ(Gracilaria vermiculophylla)から抽出したRNAに対するRT-PCR反応により得た。配列番号１に示される塩基配列のうち１５４ないし１８４２番目の塩基配列（配列番号３）が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるたんぱく質に翻訳される領域である。このｃＤＮＡ（配列番号１）をBamHI及びSacIで消化してオゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼ遺伝子のBamHI及びSacI断片を作製した。
【０１１８】
XbaI及びBamHIサイトを付加したゼニゴケ由来UDP遺伝子（ADH様 UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子と相同性のある遺伝子）の5’-UTR断片の作製方法
ゼニゴケ由来UDP遺伝子（ADH様 UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子と相同性のある遺伝子）の5’-UTR配列の塩基配列を、配列番号４に示す。この配列の取得方法としては、まず既知のADH遺伝子のアミノ酸配列と相同性を示すクローンを、ゼニゴケのESTライブラリーより探索した。次に、得られたESTクローンの配列から、XbaIあるいはBamHI配列を付加したプライマー(MpUDP 5’-UTR F: cctctagaGGGCGACCGTCAGGGTTTCTC（配列番号７）と MpUDP 5’-UTR R: ccggatccGGGCGACCGTCAGGGTTTCTC（配列番号８）)を作製し、ゼニゴケのゲノムDNAに対するPCR反応によってこの配列を増幅し、得ることができた。このようにして、XbaIサイト及びBamHIサイトを付加したゼニゴケ由来UDP遺伝子（ADH様 UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子と相同性のある遺伝子）の5’UTR断片(331 bp)を作製した。
【０１１９】
シクロオキシゲナーゼ遺伝子をゼニゴケ細胞で発現させるための、基礎ベクター p35SSRDXG（プロメガ社製）からの組換え形質発現ベクターを、まず、XbaI及びBamHIで消化し、これに上記で製造したXbaIサイト及びBamHIサイトを付加したゼニゴケ由来UDP遺伝子（ADH様 UDP-グルコース脱水素酵素遺伝子と相同性のある遺伝子）の5’-UTR断片(331 bp)を導入し、プラスミドCaMV35S-5’UTR-GUS-tNOSを作製した。プラスミドCaMV35S-5’UTR-GUS-tNOSをBamHI及びSacIで消化し、次いでこれにオゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼ遺伝子のBamHI及びSacI断片を導入し、ゼニゴケ形質転換用のＧｖＣＯＸ発現ベクターCaMV35S-5’UTR-GvCOX-tNOSを作製した。手順の概要を、図２に示す。図２中、「5’UTR」はゼニゴケ由来UDP遺伝子の5’-UTR断片であり、「GvCOX」はオゴノリ由来のシクロオキシゲナーゼ遺伝子であり、「p35S」は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターであり、「GUS」はβグルクロニダーゼ遺伝子であり、「tNOS」はＮＯＳターミネーターである。
【０１２０】
（実施例２）
ＧｖＣＯＸ発現ベクター（CaMV35S-5’UTR-GvCOX-tNOS）を導入したゼニゴケ形質転換体（スーパーゼニゴケ）の作製
ゼニゴケ（Marchantia polymorpha）に、アグロバクテリウム感染法により、実施例１で作製したＧｖＣＯＸ発現ベクターCaMV35S-5’UTR-GvCOX-tNOSを導入した。アグロバクテリウム感染法によるベクターの導入は、Ishizaki et al., Plant Cell Physiol., 49, 1084-1091.（2008）に記載された方法に従って行った。なお、ゼニゴケは、プロスタグランジンを産生しない植物である。実施例１で作製したＧｖＣＯＸ発現ベクター（CaMV35S-5’UTR-GvCOX-tNOS）を導入したゼニゴケ（形質転換ゼニゴケ）を、本発明の植物工場で、図６に示す栽培パネルにおいて、ウレタン製の栽培マット１に植え付けたのち、図８に記載する縦型栽培装置で、約１５〜２５℃で６週間生育させ、形質転換ゼニゴケ（以下、スーパーゼニゴケともいう）を得た。
【０１２１】
（実施例３）
実施例２により得られたスーパーゼニゴケの抽出液を用いたプロスタグランジン類の生産
実施例２で得られた形質転換ゼニゴケ（スーパーゼニゴケ）0.2ｇを、液体窒素中で凍結後、乳棒で粉末状になるまで破砕した。抽出バッファー（100mM Tris(pH7.5)、5mM EDTA、0.5mM PMSF、1μM ヘマチン）400μLを加え、融解しながら、さらにすりつぶした。
【０１２２】
破砕液全量を２５℃で５分間静置した。破砕液に最終濃度１ｍＭとなるようにアラキドン酸を添加して２５℃で３０分間反応させた。次に最終濃度５ｍＭのＳｎＣｌ２を添加して反応を停止した。反応液（in vitro反応生成物）は−８０℃にて保存した。この反応液1.5Ｌから、後述する実施例６と同様の方法でプロスタグランジンF2αを精製した。得られたプロスタグランジンF2αの量は、約２２mgであった。
【０１２３】
（実施例４）
スーパーゼニゴケ中の総脂肪酸及びアラキドン酸の回収（図３）
実施例２で得たスーパーゼニゴケを９時間自然乾燥後、マイクロ波処理（周波数、２．４５ＧＨｚ；入射電力、７５０Ｗ；処理時間、１４分）を行った。得られた乾燥物１００ｇをヘキサン５００ｍＬで抽出し、得られた上澄み液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学株式会社製、商品名：シリカゲル60N）に供し、混合溶媒（シクロヘキサン：酢酸エチル：メタノール（容積比３０：１０：１１）で溶出する画分（Ｆ１画分）を分取した。残渣は実施例５に記載の方法で、プロスタグランジン類の精製に供した。
【０１２４】
上記のＦ１画分をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（富士シリシア化学株式会社製、商品名：オクタデシルシリルシリカゲル（クロマトレックス））に供し、移動相として混合溶媒（アセトニトリル：水：酢酸（容積比９０：１０：１））を用い、溶出した画分（Ｆ２画分）を分取した。
【０１２５】
得られたＦ２画分を以下の条件でＨＰＬＣ（ウォーターズ社製、製品名：X-Bridge prep C18 OBD(19 x 150mm, 5mm)）に供し、混合溶媒（アセトニトリル：水：トリフロフルオロ酢酸（容積比７０：３０：０．１））で分取し、アラキドン酸画分とした。得られたアラキドン酸画分を、実施例６のin vitro反応の基質に供した。
【０１２６】
ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。約１８分のピークを分取した。
検出器：紫外吸収光度計（測定波長：210nm）
分析カラム：X-Bridge C18 (4.6 × 150 mm、5mm、Waters)
分析流速：0.8 mL/分
カラム温度：40℃
移動相：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸（容積比700:300:1）
【０１２７】
（実施例５）
スーパーゼニゴケに蓄積したプロスタグランジンF2αの回収（図４）
実施例４に記載のヘキサン抽出の残渣をアセトンで２回濾過し、上澄み液（上澄み画分）を得た。この上澄み画分を、次にシリカゲルカラムクロマトグラフィー（関東化学株式会社製、商品名：シリカゲル60N）に供し混合溶媒（酢酸エチル：アセトン：酢酸（容積比７：３：１））で溶出する画分（Ｆ３画分）を分取した。このＦ３画分（フラクション３）をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（富士シリシア化学株式会社製、商品名：オクタデシルシリルシリカゲル（クロマトレックス））に供し、混合溶媒（アセトニトリル：水：酢酸（容積比５０：５０：１））で溶出させて、画分（Ｆ４画分）を分取した。得られたＦ４画分（フラクション４）を以下の条件でＨＰＬＣ（ウォーターズ社製、製品名：X-Bridge prep C18 OBD(19 × 150mm、5mm)）に供し、溶媒（アセトニトリル：水：トリフルオロ酢酸（容積比３５：６.５：０.１））でプロスタグランジンF2αを含む画分を分取した。得られたプロスタグランジンF2αの量は、22ng/gFW（生重量）であった。
【０１２８】
（実施例６）
実施例２と同様の方法で、ゼニゴケ（Marchantia polymorpha）にゼニゴケ形質発現組換えベクター（後述のCaMV35S-5’UTR-GvCOX-tNOS）を導入した形質転換ゼニゴケ（スーパーゼニゴケ）作製した。このスーパーゼニゴケを、ハイグロマイシン（１０μｇ/ｍＬ）を含む０Ｍ５１Ｃ寒天培地上で、２５℃にて１カ月間生育させた。生育した形質転換ゼニゴケから２０ｇ（生重量）の葉状体を採取した。直径１６ｃｍの乳鉢に採取したゼニゴケを入れ、さらに約１００ｍＬの液体窒素を乳鉢に加えて、ゼニゴケを凍結した後、乳棒を用いて粉末状になるまで２０分間破砕した。次に４０ｍＬの抽出液（100mM Tris(pH7.5)、5mM EDTA、0.5mM PMSF、1μM ヘマチン）を乳鉢に添加してさらに１０分間破砕し、ゼニゴケ抽出液を調製した。
【０１２９】
ゼニゴケ抽出液を５０ｍＬのサンプルチューブ２本に分注し、最終濃度１ｍＭとなるようにアラキドン酸を添加した。サンプルチューブを振とう培養器（タイテック  ＢｉｏＳｈａｋｅｒ  ＢＲ−４３ＦＬ）を用いて２０℃の条件下３０分間１００ｒｐｍの回転速度で振とうを行い、プロスタグランジンの合成反応を行った。反応後のサンプルは−８０℃にて保存した。
上記の操作を繰り返すことによってスーパーゼニゴケ５００ｇ分について合成反応を行い、実施例７のプロスタグランジンの抽出、精製工程に供した。
【０１３０】
（実施例７）
in vitro反応生成物からのプロスタグランジンF2α（PGF2α）分離、精製（図５）
実施例６で得られたin vitro反応生成物１．５Ｌをヘキサンで３回抽出した。上層画分（アラキドン酸）は上記実施例４（図３）のアラキドン酸回収の工程に供し、アラキドン酸を回収した。下層画分を酢酸エチル１Ｌにて３回分画し、上層画分（酢酸エチル層）を得た。
【０１３１】
より詳細には、以下の操作を行った。
１）実施例６で得られたスーパーゼニゴケ５００ｇの抽出液にアラキドン酸を添加して反応させた液１．５Ｌに、１−ヘキサン１Ｌを加えて振り混ぜた後、１−ヘキサン層を分取した。１−ヘキサン層を除いた水層に１−ヘキサン１Ｌを加えて同様に操作した。更にこの操作をもう１回繰り返した。得られた１−ヘキサン層は合わせ、室温・減圧下で溶媒を留去した。得られた１−ヘキサン層の濃縮物はアラキドン酸やエイコサペンタエン酸を含んでいた。
【０１３２】
２）１−ヘキサン層を除いた水層に酢酸エチル１Ｌを加えて振り混ぜた後、酢酸エチル層（上層）を分取した。残った水層に酢酸エチル１Ｌを加えて同様に操作した。更にこの操作をもう１回繰り返した。得られた酢酸エチル（上層画分（酢酸エチル層））は合わせ、室温・減圧下で溶媒を留去して酢酸エチル抽出物を得た。
【０１３３】
３）得られた酢酸エチル抽出物はオープンカラムクロマトグラフィー（担体：シリカゲル６０Ｎ（球状、中性）、関東化学）に付し、酢酸エチル／アセトン／酢酸（１００）混液（（容積比）７：３：１）で溶出させ、溶出液を１００ｍＬずつ分取した。溶出液を薄層クロマトグラフィー（下記条件１）で検出して、PGF2αの溶出部を集め、室温・減圧下で濃縮してＦ５画分とした。
【０１３４】
（条件１）
薄層板：ＨＰＴＬＣプレートシリカゲル 60F254 (Merk)；展開溶媒：酢酸エチル／アセトン／酢酸（１００）混液（（容積比）６：４：１）；検出試薬：希硫酸噴霧；１０５℃、５分間加熱、ＵＶ３６５ｎｍ。
【０１３５】
４）次にPGF2αの溶出部の濃縮物（Ｆ５画分）をオープンカラムクロマトグラフィー（担体：オクタデシルシリルシリカゲル（商品名クロマトレックス、富士シリシア化学）に付し、アセトニトリル／水／酢酸（１００）混液（（容積比）５０：５０：１）で溶出させ、得られ溶出液は１０ｍＬずつ分取した。溶出液を薄層クロマトグラフィー（条件１）で検出して、PGF2αの溶出部を集め、室温・減圧下で濃縮した。
【０１３６】
次ぎに溶出液に用いた酢酸を除去するため、得られた濃縮液に水を等量加え、さらに酢酸エチル２００Ｌを加えて振り混ぜ、酢酸エチル層を分取した。この操作をもう１回繰り返した。得られた酢酸エチル層は合わせ、室温・減圧下で溶媒を留去し、濃縮物（Ｆ６画分）を得た。
【０１３７】
得られたＦ６画分をＯＤＳカラムを用いるＨＰＬＣ、溶媒（水：アセトニトリル：トリフルオロ酢酸（容積比６５０：３５０：１））で分取し、プロスタグランジン（ＰＧ）F2α画分を得た。
【０１３８】
Ｆ６画分からのPGF2αの精製方法の詳細は、以下の通りである。
５）濃縮物（Ｆ６画分）を下記条件２で分取するHPLCを繰返し、PGF2αを精製した。分取液は室温・減圧下で濃縮し、オープンカラムクロマトグラフィー（担体：オクタデシルシリルシリカゲル（クロマトレックス）、富士シリシア化学）に付し、水をカラムに加えトリフルオロ酢酸を溶出させた。pH試験紙を用いて、水溶出液が中性になるまで、カラムに水を流した。次にメタノールで流出させた。メタノール流出液は室温・減圧下で溶媒を留去し、PGF2α画分を得た。
【０１３９】
（条件２）
[分取HPLCの操作条件]
検出器：紫外吸収光度計 (測定波長：210 nm)；分取カラム：X-Bridge prep C18 OBD (19 × 150 mm, 5 mm, Waters)；分取流速：12 mL/分、カラム温度：40℃；移動相：水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸混液（650：350：1）。
得られたPGF2αは以下の条件３でHPLCの純度検定を行い、純度99％以上であることを確認した。
【０１４０】
（条件３）
[分析HPLCの操作条件]
検出器：紫外吸収光度計 (測定波長：210 nm)；分析カラム：X-Bridge C18 (4.6 × 150 mm、5 mm、Waters)；分析流速：0.8 mL/min；カラム温度：40℃；移動相：水/アセトニトリル/トリフルオロ酢酸混液（（容積比）650：350：1）。
【０１４１】
得られたプロスタグランジンF2αの量は、22mgであった。この画分を下記実施例８のカプセル剤の製造工程に供し、カプセル剤を製造した。
【０１４２】
（実施例８）
以下の配合で（１）〜（３）のプロスタグランジンF2α混合末を作製した
（１）プロスタグランジンF2α      50.0 ｍｇ
（２）dl-α-トコフェロール        31.7 ｍｇ
（３）軽質無水ケイ酸              50.9 ｍｇ
次に、以下の配合で（１）〜（４）の混合末を作製し、硬カプセルに充填した。この方法により、１カプセルにプロスタグランジン類約1mgを含む小型のカプセル剤１４カプセルを作製することができた。
（１）プロスタグランジンF2α混合末      38.7 ｍｇ
（２）結晶セルロース                  361.3 ｍｇ
（３）含水二酸化ケイ素                50.0 ｍｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム        50.0 ｍｇ
【０１４３】
実施例５〜７の結果から、スーパーゼニゴケの抽出物をin vitroでアラキドン酸と反応させることにより、スーパーゼニゴケを培養してプロスタグランジン類を製造する場合と比較して、約２０００倍以上の量のプロスタグランジン類を製造できた。
なお、例えば実施例６において、アラキドン酸の代わりにエイコサペンタエン酸を用いて反応を行うと、プロスタグランジンＥ３等を製造することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明のゼニゴケ目生物形質転換用発現ベクターを用いると、ゼニゴケ目生物によいプロスタグランジンを効率よく製造することができることになる。本発明のシクロオキシゲナーゼ遺伝子が発現可能に導入されたゼニゴケ目生物形質転換体は、製薬産業及び各種素材産業等において、プロスタグランジン類を生産する上で、薬等の原料や試薬の供給等に極めて有用である。特に、本発明のゼニゴケ目生物形質転換体の抽出物を用いると、in vitroの反応によってプロスタグランジン類を効率よく大量生産することができるので、製薬分野等において非常に有用である。
【符号の説明】
【０１４５】
１  栽培マット
１ａ  凹部
２  支持網
３  枠体
３ａ  凹型の溝
４  栽培トレイ
５  ゼニゴケ目生物切片
９  縦型栽培装置
１０  架台
１１  循環装置
１２  架台本体
１３  吊下げ片
１４  縦枠
１５  横枠
１６  溝枠
１６ａ  内側片
１７  連結片
１８  ガイドレール、
１８ａ  ガイドレールサポート
１８ｂ  レール本体
１８ｃ  スペーサ
１９  スライダ
１９ａ  ハンガー
１９ｂ  ローラ
１９ｃ  無端チェーン
１９ｄ  接合板
１９ｅ  アタッチメント
２０  フレーム
２０ａ  ポスト
２０ｂ  吊下げ枠
２１  棚
２２  棚板
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2013183639.tif 000011
【図１】
2013183639.tif 000012
【図６】
2013183639.tif 000013
【図７】
2013183639.tif 000014
【配列表】
2013183639000001.app