(57)【要約】【課題】血液検体中に希薄な濃度で存在する細菌等の細胞を濃縮し、後工程に提供するための前処理装置であって、後工程に対し非侵襲であるように血球等の夾雑物を除去し濃縮する装置を提供することを目的とする。【解決手段】血液検体中の血球を破壊する手段と、破壊した血球の破片を除去する手段と、血液検体中に含まれている可能性のある菌を濃縮する手段とを有し、血液検体中の菌を破壊せず、及び／又は菌の核酸を破壊しない非侵襲型検体処理装置である。【選択図】図１
2013221780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液検体中の血球を破壊する手段と、破壊した血球の破片を除去する手段と、血液検体中に含まれている可能性のある菌を濃縮する手段とを有し、血液検体中の菌を破壊せず、及び／又は菌の核酸を破壊しない非侵襲型検体処理装置。
【請求項２】
血液検体中の血球を破壊する手段が、熱による血球の表面膜の破壊である請求項１に記載の非侵襲型検体処理装置。
【請求項３】
血液検体中の血球を破壊する手段が、電気穿孔による血球の表面膜の破壊である請求項１に記載の非侵襲型検体処理装置。
【請求項４】
血液検体中の血球を除去する手段と、血液検体中に含まれている可能性のある菌を濃縮する手段とを有し、血液検体中の菌を破壊せず、及び／又は菌の核酸を破壊しない非侵襲型検体処理装置。
【請求項５】
血液検体中の血球を除去する手段が、菌を選択的に吸着するフィルタを使用することによる血球の除去である請求項４に記載の非侵襲型検体処理装置。
【請求項６】
血液検体中の血球を除去する手段が、血球を選択的に吸着するフィルタを使用することによる血球の除去である請求項４に記載の非侵襲型検体処理装置。
【請求項７】
菌を濃縮する手段が、超音波の定在波を発生させた流路に血液検体を通過させ、流路内において菌を偏在させる請求項１〜６のいずれかに記載の非侵襲型検体処理装置。
【請求項８】
菌を濃縮する手段が、菌を捕捉する構造を有する流路に血液検体を通過させ、前記菌を捕捉する構造に菌を捕捉させる請求項１〜６のいずれかに記載の非侵襲型検体処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液検体の処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
本来無菌である血液から迅速に細菌・真菌等を検出することは、重篤な感染症である敗血症・菌血症において非常に重要性が高い。一方、最終的には微生物の種を同定し、抗生剤に対する感受性を測定し、効果のある薬剤の種類及びその濃度を決定して治療方針を立てることが適正な抗菌薬治療につながる。以下、血液を対象とした従来の微生物検査の概要について説明する。まず、患者から採集した血液に関して血液培養検査を実施する。血液培養検査装置において血液培養を行い、陽性判定がなされた後に、塗抹検査を実施する。すなわち、存在している菌が球菌であるか又は桿菌であるかを顕微鏡にて観察し、さらにグラム染色液にて染色することによって菌がグラム陽性菌であるか又はグラム陰性菌であるかを判定する。続いて、培養ボトルから検体を培地に塗布して分離培養し、形成されたコロニーから菌懸濁液を調製し、同定・薬剤感受性検査装置の測定用デバイスに接種し、接種した菌を装置内で培養することによって存在する菌の同定及び薬剤感受性の評価を実施する。従来、上記の血液培養検査装置と同定・薬剤感受性検査装置とは別々に独立したものが使用され検査が行われている。
【０００３】
検体が血液以外である場合の細菌の同定・薬剤感受性検査は、概ね上記の血液の場合の手順から、血液培養の工程を除いたものと考えて良い。血液以外の検体とは、糞便、喀痰、尿等を指し、検体の培養を行わずに、顕微鏡による塗沫検査を実施する。すなわち、顕微鏡による球菌、桿菌の判定、及び検体をグラム染色液にて染色し、グラム陽性、陰性の判定を実施する。
【０００４】
血液検体において血液培養の工程が必要な理由の一つは、血液が、菌がそもそも存在しない無菌検体であるためである。重度の敗血症の患者であっても、その血液中の菌の数は１０個／ｍＬといわれる。血液以外の検体であれば、通常菌の濃度は十万個／ｍＬ以上である。血液中の菌の濃度は極めて希薄であるため、一昼夜の培養工程をなくしては、塗沫検査を実施したり、同定・薬剤感受性検査のための分離培養を実施することができない。
【０００５】
（特許文献１）には、検体中に希薄な濃度で存在する細胞を、自動的に濃縮する装置が開示されている。この従来技術では、バッチランに先んじて遠心分離により血球（赤血球）と血清とを分離し、バッチランを開始した後に、分離した血清を濃縮して細胞を抽出している。濃縮の方法は、目的の細胞と特異的に結合する抗体で修飾した磁性ビーズを添加し、希薄な濃度で存在する細胞を捕捉して、収集した細胞に蛍光色素による染色を施して識別するというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００５／０２８６６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（特許文献１）では、夾雑物と細胞を遠心分離によって分画している。なお、この遠心分離は、バッチランに先んじて実施する旨が記載されており、装置外で実施しているのか、装置内に遠心分離の機構を有しているのかは不明である。いずれにしても、操作者は、遠心分離の工程が終了した後に、バッチランを開始する行動が必要となる。操作者のウォークアウェイ時間を長くするには、夾雑物の分離と濃縮工程とは一つの操作でなされるべきである。また、（引用文献１）の発明の詳細な説明には、蛍光色素による染色と識別が記述されている。すなわち、（引用文献１）記載の発明は、「識別」をもって分析を終了する技術であり、識別後に菌種を同定するプロセスは考慮していない。同定・薬剤感受性検査等の後工程を考慮すると、それより前の各工程は後工程に対して非侵襲でなければならない。ここで、非侵襲とは、細菌の形状を維持し、核酸にダメージを与えないことを指す。菌の形状を識別したり、グラム判定を実施したりするためには、細菌（細胞）の形状を維持した状態でなければ識別、判定を実施することができない。又は、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）等の手法によって同定を行うために、増幅させる菌の核酸にダメージを与えないで識別を終了させることが必要である。
【０００８】
本発明は、血液検体中に希薄な濃度で存在する細菌等の細胞を濃縮し、後工程に提供するための前処理装置であって、後工程に対し非侵襲であるように血球等の夾雑物を除去し濃縮する装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明は、非侵襲に血球を除去する手段として、目的とする菌の細胞を破壊せずに血球のみを破壊し、破壊した後の破片（debris）をサイズ等の相違に基づき細胞と分離する。又は菌の細胞のみを吸着する物質でコートしたフィルタにより菌の細胞を捕捉して分離し、後に温度やｐＨの変化等により吸着を解放して細胞を回収する。もしくは、血球等の夾雑物のみを吸着する物質でコートしたフィルタにより、菌の細胞以外の夾雑物を捕捉する。
【００１０】
また、本発明は、非侵襲に菌を濃縮する手段として、血球を破壊し、その破片と菌の細胞とを含む検体、又は細胞のみを含む検体を流路に流し、例えば流れと垂直な方向に超音波の定在波を発生させ、細胞のみが中央付近に層流となって流れるようにし、菌の細胞が偏在する中央部分を分離収集する。あるいは、細菌を捕捉するためのかご状の構造（複数のピラー構造）を有する流路に、血球の破片と菌の細胞とを含む検体、又は細胞のみを含む検体を流し、細胞をピラー構造に捕捉させた後に少量のバッファ液を流すことにより細胞を少量の液中に回収する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、血液等の夾雑物の多い検体中に希薄な濃度で存在する菌の細胞を、後工程に対して非侵襲な状態で、夾雑物を除去し濃縮して取り出すことができるようになり、血液培養等の工程なしに、菌を観察したり、ＰＣＲ等の手法により菌を同定することが可能となる。
【００１２】
また、血液検体の採集後、迅速に（例えば１時間以内に）、従来の塗沫検査と同様の情報（球菌／桿菌の識別、グラム陽性／陰性菌の識別）を得ることができ、さらに、その後の同定分析により菌種の特定が可能となる。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る装置による血液検体の処理手順を示すフローチャートである。
【図２】本発明に係る検体処理装置の一実施形態を示す上面図である。
【図３】菌を濃縮する手段の一実施形態を説明するための概念図である。
【図４】菌を濃縮する手段の一実施形態を説明するための概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。
図１（ａ）は、血液検体中の菌を非侵襲に濃縮する処理手順を示すフローチャートである。図２は、これを実現するための検体処理装置の一実施形態の上面図である。図２中の矢印は機構系の移動方向を示す。
【００１５】
まず、図１（ａ）に示すように、血液検体中の血球を破壊する。具体的には、図２に示すように、採血後の血液を含んだ採血管を採血管ホールダ２０１にセットする。採血管ホールダ２０１には、随時複数の採血管をセットすることができる。続いて、採血管ホールダ２０１は、奥行き方向に移動してロボットアームＡ２０２のアクセス可能な位置に到達する。ロボットアームＡ２０２は、シリンジポンプを内蔵しており、採血管内の血液（１０ｍＬ程度）を吸引する。このシリンジ内は高温に保持されており、血液は吸引された後に保持された温度とほぼ等しくなる。保持する温度は、例えば７５℃とすることができるが、これに限定されるものではない。高温に保持された血液検体は、約１６秒で、ＣＤＢ（Cell Disintegrated Blood）と呼ばれる、全血内の赤血球及び白血球の表面膜がヒートショックで破壊された状態となる。ＣＤＢに関しては、Therapeutic Drug Monitoring 29, 505 (2007)に詳しく記載されているが、高温状態を長く維持するとタンパク質の変性が起こる恐れがあるため、保持する温度に対応した所定の時間内に血液検体を常温に戻さなければならない。７５℃で１６秒程度保持した状態では、血液検体中の菌は死滅しないので、この処理は菌にとって非侵襲であるといえる。血液検体を高温にさらす容器として用いるシリンジポンプのシリンジは、使い捨てであっても良い。この場合は、処理装置内部に使い捨てのシリンジ容器を交換するための駆動部が必要となる。また、シリンジ内ではなく、別容器に血液検体を移し替えた上で高温に暴露しても良い。
【００１６】
血液検体を７５℃で１６秒程度保持した後、シリンジポンプは速やかにＣＤＢ血液を１ｍＬ程度の小分けチューブ２０３に小分けする。この工程は、それ以降の分注処理の体積を小さくして処理を効率に行うためであるが必須ではない。小分けチューブ２０３のホールダは、処理装置の前後方向（図２の上下方向）に移動して、ロボットアームＢ２０４がアクセス可能な位置に到達する。
【００１７】
続いて、図１（ａ）に示すように、破壊した血球の破片を除去するプロセスに移る。ロボットアームＢ２０４はシリンジポンプを内蔵しており、小分けチューブ２０３内のＣＤＢ血液を吸引する（図３の吸引部３０１）。さらに、ロボットアームＢ２０４内には検体の分画部３０２を備えており、吸引部３０１は分画部３０２に移動して血球を破壊した血液検体を吐出する。分画部３０２には、幅は約３５０μｍ程度、深さ１２５μｍ程度の流路に、流れに垂直方向で且つ流路の幅方向に沿って超音波の定在波３０３が発生するように、約２ＭＨｚの超音波をピエゾトランスデューサによって印加する。検体中の音速は温度によって変わるので、超音波の定在波が発生するように、超音波の周波数又は検体の温度を調節する。血液検体の液温の調節は、ペルチェ素子等を用いて行う。定在波が発生すると、検体中の粒子がその粒子の径に応じて定在波の腹又は節の部分に移動する力を受けて（Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 492-506等を参照）、粒径の小さな血球の破片は流路の壁方向、破片よりも径の大きい菌の細胞は流路の中心方向に移動して流れる。この菌が偏在した中央の流れを回収することにより、不要な血球の破片の除去と菌の濃縮がなされることになる。なお、この超音波の定在波を利用した分画部３０２は、ロボットアームＢ２０４内にあることは必須ではない。検体処理装置上の所定の場所に別途設けても良い。また、分画部３０２は、同様の構造をシリーズでつなげて作用させることにより菌の濃縮率を高くすることもできる。さらに、超音波の定在波により、菌を特定の位置に捕捉しておき、バッファ液を流して菌を回収することで、菌を分散させる液体を生体由来のもの（血液）からｐＨ及び成分が管理されたバッファに置換することが可能である。
【００１８】
なお、上記の実施形態では、熱により血球の表面膜を破壊する場合（ヒートショック）について説明したが、電気穿孔法等を採用して血球の表面膜を破壊しても良い。この方法は、数キロボルト／ｃｍ程度の電圧を血液検体に印加して、血球の表面に穿孔する方法である。電圧を印加する流路等を微細化することにより、数キロボルトの電源は不要となり、数ボルト程度の電源で穿孔が実現可能となる。この電気穿孔法は、電場内の粒子の径が大きいほど低い電圧で穿孔され易い。したがって、赤血球と白血球の大きさが数十マイクロメートル、細菌の大きさが約１０マイクロメートルであることから細菌の細胞に穿孔せずに血球のみに穿孔し破壊することができる。
【００１９】
また、菌を濃縮する方法は、上記の実施形態のように分画部３０２において超音波の定在波を発生させる方法には限定されない。例えば、図４に示すように、分画部の流路に多数の微小なピラー４０１をかご状に形成したフィルタ構造を用いても良い。図４の矢印の方向に、血球を破壊した血液検体を流すと、血球の破片はピラー４０１の隙間をぬって排出される。径の大きい菌４０２は、ピラー４０１のかご状構造に捕捉される。全ての血液検体を流し終えた後に、十分に少ない量のバッファ液等を図４の矢印と逆向きに流すことによって、菌４０２が体積の少ない液中に回収され、濃縮がなされる。
【００２０】
菌の濃縮がなされた検体は、詳細は記述しないが図２に示す処理装置内の観察分析部２０５にて菌の形状、表面の組成を分析することができる。また、同定分析部２０６において菌種を同定することもできる。また、排出用チューブ２０７に移し、装置の外部に取り出して、別の装置の分析に供しても良い。本発明の検体処理装置は、これら観察分析部２０５、同定分析部２０６、排出用チューブ２０７等の全てを備えている必要はなく、目的に応じた機能を備えていれば良い。
【００２１】
続いて、本発明の別の実施形態を図１（ｂ）に基づき説明する。図１（ｂ）は、採集した血液検体の血球を、菌を選択的に吸着するフィルタを使用して除去する例である。血液検体をこのフィルタに通すことにより、又は血液検体にフィルタを浸して一定時間保持することにより、血液検体中の菌がフィルタに吸着する。血液検体を全量通過させた後、又は一定時間の浸漬・保持を終えた後に、フィルタの環境を変えることによって吸着力を小さくする。例えば、フィルタをバッファ液に浸して温度を上げたりｐＨを変化させると、吸着力が低下して菌がフィルタから剥がれ易くなる。そこで、少量のバッファ液にてフィルタをすすぎ、そのすすいだバッファ液を回収することによって血球等の夾雑物の除去と菌の濃縮が実現する。濃縮率をより高めたい場合は、回収したバッファ液をさらに図１（ａ）における菌の濃縮工程に供しても良い。使用するフィルタは、一般的には、菌を選択的に吸着する材料をフィルタ基材に塗布することによって得ることができる。塗布する材料としては、ポリウレタン（ＰＵ）系やポリアクリレート（ＰＡ）系の材料等から適宜選択することができる。あるいは、フィルタ全体が、菌を選択的に吸着する材料から形成されていても良い。
【００２２】
次に、本発明のさらに別の実施形態を図１（ｃ）に基づき説明する。図１（ｃ）は、採集した血液検体の血球等の夾雑物を、血球を選択的に吸着するフィルタを使用して除去する例である。このフィルタに血液検体を流すことにより、菌を除く赤血球、白血球、血小板等の夾雑物を吸着させる。フィルタは、血液中のそれぞれの夾雑物を吸着する複数のフィルタから構成しても良い。例えば、赤血球のみを吸着するフィルタ、白血球のみを吸着するフィルタ、血小板のみを吸着するフィルタを用意し、これらを直列に並べて作用させても良い。使用するフィルタは、一般的には、血球等を選択的に吸着する材料をフィルタ基材に塗布することによって得ることができる。あるいは、フィルタ全体が、血球等を選択的に吸着する材料から形成されていても良い。血球を吸着する材料としては、例えば、国際公開第２００５／１１３１３６号等に記載されているような白血球に吸着性を示すＰＵ系材料、特許第４１５６１０８号公報に記載されているような赤血球に吸着性を示す帯電させたイオン交換樹脂等を活用することができる。
【００２３】
フィルタを通過させた血液検体は、菌のみが浮遊した状態となっている。この検体を、図１（ａ）に示す濃縮工程に供して菌のさらなる濃縮を実施することができる。
【００２４】
以上、図１（ａ）〜（ｃ）の実施形態について説明したが、これらは全て、菌の形状を破壊することなく、及び／又は菌の核酸を破壊しない。したがって、位相差顕微鏡等による染色を必要としない非侵襲な観察又は表面分析と組み合わせることによって、観察／分析後の核酸に基づく同定が可能となる。また、本発明は、従来の血液培養工程を経ずに菌を濃縮するため、菌の識別を迅速に行うことができる。
【００２５】
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることが可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【符号の説明】
【００２６】
２０１    採血管ホールダ
２０２    ロボットアームＡ
２０３    小分けチューブ
２０４    ロボットアームＢ
２０５    観察分析部
２０６    同定分析部
２０７    排出用チューブ
３０１    吸引部
３０２    分画部
３０３    超音波の定在波
４０１    ピラー
４０２    菌
【図１】
2013221780.tif 000003
【図２】
2013221780.tif 000004
【図３】
2013221780.tif 000005
【図４】
2013221780.tif 000006