(57)【要約】【課題】より完璧なＩｇ  Ｖ遺伝子生殖系列配列を安定的に含む（特に生殖系列Ｖλ配列を有する）トランスジェニック動物を提供すること。【解決手段】本発明は、１つ以上のヒトλ軽鎖遺伝子座を有するトランスジェニック動物に関する。本発明はまた、ヒトλ軽鎖遺伝子座を含んでいるトランスジェニック動物を作製する方法および組成物に関する。本発明はさらに、使用する方法およびヒトλ軽鎖遺伝子座を含んでいるトランスジェニック動物に由来する組成物に関する。ヒトλ遺伝子座は、ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子を、６０％以上、好ましくは７０％または８０％以上、より好ましくは９０％または９５％以上、そしてさらにより好ましくは１００％または約１００％含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載のトランスジェニックマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように設計される、トランスジェニック非ヒト動物に関する。特に、本発明に従う動物は、複数の可変ＶＨ遺伝子領域およびＶλ遺伝子領域を含み、かつＶκ遺伝子領域を含み得る、ヒトＩｇ遺伝子座を保有する。都合のいいことに、複数の可変領域遺伝子の含有は、その動物によって産生されるヒト抗体の多様性を増大させる。さらに、このような領域の含有は、動物のＢ細胞発達を高め、そして再構築する。これにより、この動物は、ヒトＩｇλ軽鎖を含む高親和性抗体を分泌する、豊富な成熟Ｂ細胞を保有する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
メガ塩基の大きさのヒト遺伝子座をＹＡＣにクローン化して再構築し、そしてこれをマウス生殖系列に導入し得ることは、非常に大型かまたは大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的な構成部分を明らかにするため、およびヒト疾患の有用なモデルを産生するための、強力なアプローチを提供する。さらに、このような技術（マウス遺伝視座とヒトの対応するヒト遺伝子座との置換）の利用は、発生の間のヒト遺伝子産物の発現および制御、他の系との連絡、ならびに疾患誘発および進行におけるその関係において、独特の洞察を提供し得る。
【０００３】
このような戦略の一適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」である。ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の、内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスへの導入は、抗体のプログラムされた発現および抗体のアセンブリの基礎を成すメカニズム、およびＢ細胞発達におけるその役割を研究する機会を提供する。
【０００４】
さらに、マウス体液性免疫系をヒト化する戦略は、完全なヒト抗体産生の理想的な供給源を提供する。特にモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、ヒト疾患における抗体治療の期待の実現に向けた重要な指標（マイルストーン）である。完全なヒト抗体は、非ヒト（例えば、げっ歯類）または非ヒト由来Ｍａｂに特有の免疫原応答およびアレルギー応答を、最小化することが期待され、そして従って、投与される抗体の効能および安全性を上昇させる。完全なヒト抗体の使用は、くり返しの抗体投与を必要とする慢性および再発のヒト疾患（炎症、自己免疫、および癌など）の処置において大きな進歩を提供することが期待され得る。
【０００５】
非ヒトトランスジェニック動物をヒト化し、完全ヒトモノクローナル抗体を産生する戦略は、有害な免疫原効果を減少させるために改変された完全ヒト抗体（すなわち、ヒト抗体）を得る他の方法で、遭遇する問題を避けるためにもまた、重要である。有用であるが、ヒト化技術は、多くの不利な点（労力を必要とするプロトコルおよび特異性の変化の可能性、および／または可変領域の起源エピトープへの親和性、および可変領域への残留非ヒト配列の夾雑（宿主の拒絶を生じ得る）などが挙げられる）を有する。効能のあるヒトモノクローナル抗体の、インビトロでの作製もまた、困難であることが証明されている。さらに、インビトロで作製されるヒトモノクローナル抗体のほとんどは、時折免疫複合体形成を伴い、炎症を増強するＩｇＭである。
【０００６】
非ヒトトランスジェニック動物において完全なヒト抗体を作製する目標に向かう１つの適切なアプローチは、ヒトＩｇ遺伝子座の挿入された大型のフラグメントからヒト抗体を産生する、内因性抗体産生の欠損した系統を、設計することである。大型のフラグメントは、大きな可変遺伝子多様性、ならびに抗体産生および抗体発現の適切な制御のために必要な配列を保存するという利点を有する。抗体の多様化および選択の宿主機構、ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容の欠落を利用することにより、これらの操作された細胞株において再産生されるヒト抗体のレパートリーは、任意の目的の抗原（ヒト抗原を含む）に対する高親和性抗体を含む。従って、望ましい特異性を有する抗原特異的ヒトＭａｂは、容易に産生され、そして例えばハイブリドーマ技術を使用して、選択される。
【０００７】
この遺伝的戦略の成功は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統の産生と関連して、証明された。例えば、Ｇｒｅｅｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照のこと。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）（同上）においてコア可変領域および定常領域を含む、ヒト重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座の、それぞれ２４５ｋｂおよび１９０ｋｂの大きさの生殖系列構造フラグメントを用いて、設計された。ヒトＩｇ含有ＹＡＣは、抗体の再編成および抗体の発現の両方について、マウス系と両立し得ることが証明された。さらに、ヒト遺伝子座は、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子と置換され、Ｂ細胞の発達を支える能力および完全なヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生させる能力により、証明された。
【０００８】
このアプローチは、米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１６２，９６３号および同第６，１５０，５８４号；および国際特許出願ＷＯ９６／２２３８０号および同ＷＯ９８／２４８９３号において、さらに議論され、かつ、描写される。欧州特許ＥＰ０４６３１５１Ｂ１、ならびに国際特許出願ＷＯ９４／０２６０２号、ＷＯ９６／３４０９６号、およびＷＯ９６／３３７３５号もまた、参照のこと。上記の特許および特許出願のそれぞれの開示は、本明細書によりその全体が参考として援用される。
【０００９】
完全なヒト抗体を作製するための代替のアプローチは、Ｉｇ「小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）」を、利用する。小遺伝子座アプローチにおいて、外因性Ｉｇ遺伝子座は、その外因性遺伝子由来の部分（個々の遺伝子）の含有を通じて、模倣される。従って、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および第二の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物に挿入するための、目的の構築物に形成される。このアプローチは、以下において記載される：特許文献１（Ｓｕｒａｎｉら）、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，６２５，８２５号（両方ともＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙ，ならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願第０７／５７４，７４８号（１９９０年８月２９日出願）；同第０７／５７５，９６２号（１９９０年８月３１日出願）；同第０７／８１０，２７９号（１９９１年１２月１７日出願）；同第０７／８５３，４０８号（１９９２年３月１８日出願）；同第０７／９０４，０６８号（１９９２年６月２３日出願）；同第０７／９９０，８６０号（１９９２年１２月１６日出願）；同第０８／０５３，１３１号（１９９３年４月２６日出願）；同第０８／０９６，７６２号（１９９３年７月２２日出願）；同第０８／１５５，３０１号（１９９３年１１月１８日出願）；同第０８／１６１，７３９号（１９９３年１２月３日出願）；同第０８／１６５，６９９号（１９９３年１２月１０日出願）；および同第０８／２０９，７４１号（１９９４年３月９日出願）；これらの開示は、本明細書により参考として援用される。以下もまた、参照のこと：国際特許出願ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９２／２２６４５号、および同第ＷＯ９２／０３９１８号、これらの開示は、その全体が、本明細書により参考として援用される。さらに以下もまた、参照のこと：Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）、Ｃｈｅｎら（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）、Ｃｈｏｉら（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒら（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎら（１９９５）、これらの開示は、その全体が、本明細書により参考として援用される。
【００１０】
小遺伝子座アプローチの利点は、Ｉｇ遺伝子座の部分を含む構築物が産生され得、そして動物に導入され得る迅速さである。しかし、小遺伝子座アプローチの大きな欠点は、理論的には、少数のＶ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子およびＪ領域遺伝子だけの含有を通して、不十分な多様性が導入されることである。確かに、公表された報告（米国特許第６，３００，１２９号を含む）は、小遺伝子座アプローチによって産生された動物における、Ｂ細胞の発達および抗体産生について記載する（小遺伝子座アプローチは阻止されたようである）。
【００１１】
従って、実質的に完全なヒト抗体レパートリーを有するトランスジェニック動物を得るために以前産生されたトランスジェニック動物より、完全なＩｇ遺伝子座を含む、非ヒトトランスジェニック動物の産生の必要が存在する。他のＩｇ遺伝子座のトランスジェニック非ヒト動物への導入は、より広い抗体の多様性を許容し得、この動物のより完璧な免疫レパートリーを再構築するのに適している。従って、より完璧なＩｇ  Ｖ遺伝子生殖系列配列を安定的に含む（特に生殖系列Ｖλ配列を有する）トランスジェニック動物を提供することが、望ましい。さらに、このような内因性Ｉｇのノックアウトバックグラウンドに対する遺伝子座を提供することが、望ましい。このようなレパートリーを産生し得る動物は、ハイブリドーマなどの不死化細胞を作製するために使用され得、この不死化細胞は、診断および治療の両目的のための、完全なヒトモノクローナル抗体を作製する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，５４５，８０７号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、実質的に完全なヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）λ遺伝子座を保有する、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。ヒトλ遺伝子座は、ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子を、６０％以上、好ましくは７０％または８０％以上、より好ましくは９０％または９５％以上、そしてさらにより好ましくは１００％または約１００％含む。このようなパーセンテージは、好ましくは、機能的可変領域遺伝子のパーセンテージをいい、好ましい実施形態において、動物は哺乳動物である。
【００１４】
別の実施形態において、トランスジェニック動物は、さらにヒトＩｇ重鎖遺伝子座またはヒトκ軽鎖遺伝子座を含む。好ましくは、この重鎖遺伝子座は、ヒト重鎖可変領域を、約２０％以上、より好ましくは約４０％以上、より好ましくは約５０％以上、そしてさらにより好ましくは約６０％以上、含む。より好ましくは、この重鎖遺伝子座は、ヒト重鎖可変領域を、約７０％、８０％、９０％、もしくは９５％以上含むか、または、ヒト重鎖可変領域を、１００％もしくは実質的に１００％含む。ヒトκ軽鎖に関しては、この遺伝子座は、好ましくはヒトκ軽鎖可変領域遺伝子を、約２０％以上、より好ましくは約４０％以上、より好ましくは約５０％以上、そしてさらにより好ましくは約６０％以上、含む。より好ましくは、このヒトκ軽鎖遺伝子座は、ヒトκ軽鎖可変領域を、約７０％、８０％、９０％、もしくは９５％以上含むか、または、ヒトヒトκ軽鎖可変領域を、１００％もしくは実質的に１００％含む。
【００１５】
さらに、このような動物は、好ましくは、ＤＨ領域全体、ＪＨ領域全体、およびヒトμ定常領域、を含み、そしてさらに追加のアイソタイプの産生のための他のヒト定常領域をコードする遺伝子を、備えられ得る。このようなアイソタイプは、γ１、γ２、γ３、γ４、αをコードする遺伝子、およびεコード遺伝子を、含み得る。追加の定常領域は、同じトランスジーン（すなわち、ヒトμ定常領域から下流）上に含まれ得るか、あるいは、このような他の定常領域は、別の染色体上に含まれ得る。このような他の定常領域は、同じ染色体上に（トランスジーンをコードするヒトμ定常領域を含む染色体として）含まれる場合、他のアイソタイプへのシス−交換が達成され得ることが、理解される。一方、このような他の定常領域が、トランスジーンをコードするμ定常領域を含む染色体と異なった染色体上に含まれる場合、他のアイソタイプへのトランス−交換が達成され得る。このような編成は、広範に列挙された抗原に対する抗体の産生のための、非ヒトトランスジェニック動物の設計および構築において、非常な融通性を許容する。
【００１６】
特定の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、機能的な内因性免疫グロブリンを、付加的に産生しない。これは、当該分野に公知である方法または本明細書中に記載される方法を使用して、内因性重鎖遺伝子座、ならびにλおよびκの内因性軽鎖遺伝子座を不活性化（例えば、ノックアウト）することにより、達成され得る。例えば、内因性遺伝子は、領域を置き換えるかまたは欠失する相同組換えベクターの利用を通して、不活性化され得る。このような技術は、以下において詳細に記載される：米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１６２，９６３号、および同第６，１５０，５８４号、ＷＯ９８／２４８９３号、ならびにＧｒｅｅｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）などの出版物。好ましい実施形態において、トランスジェニック動物はマウスである（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスを含む）。
【００１７】
別の実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、実質的に不活性な内因性重鎖遺伝子座および内因性κ軽鎖遺伝子座を含むが、活性な内因性λ軽鎖遺伝子座を含む。出願人は、トランスジェニックマウスにおけるλ軽鎖の内因性の発現は、充分に低く、ヒトλ軽鎖を含む抗体の産生を妨げないことを見出している。
【００１８】
好ましい実施形態において、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、改変されたゲノムを有し、ここで、このゲノム改変は、少なくとも１つの不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子座を含み、これにより、この哺乳類は、正常なＢ細胞の発達を示さない。この活性化内因性免疫グロブリン遺伝子座は、以下：実質的な生殖系列構造に挿入されたヒトλ軽鎖Ｉｇ遺伝子座であり、ヒトλ定常領域、複数のＪλ遺伝子および複数のＶλ遺伝子を含む、ヒトλ軽鎖Ｉｇ遺伝子座；実質的な生殖系列構造に挿入されたヒト重鎖Ｉｇ遺伝子座であり、ヒトμ定常領域ならびにその制御配列および交換配列、複数のヒトＪＨ遺伝子、複数のヒトＤＨ遺伝子、ならびに複数のヒトＶＨ遺伝子を含む、ヒト重鎖Ｉｇ遺伝子座；ならびに、実質的な生殖系列構造に挿入されたヒトκ軽鎖Ｉｇ遺伝子座であり、ヒトκ定常領域、複数のＪκ遺伝子および複数のＶκ遺伝子を含む、ヒトκ軽鎖Ｉｇ遺伝子座、であり、ここで、挿入されたＶλ遺伝子、ＶＨ遺伝子、Ｖκ遺伝子の数は、哺乳類における正常なＢ細胞の発達を実質的に回復させるために、充分である。
【００１９】
好ましい実施形態において、重鎖Ｉｇ遺伝子座は、ヒトの全てのサブタイプ（γ、α、δ、およびε）からなる群から選択される、第二の定常領域を含む。存在する場合、ＶＨ遺伝子の数は、好ましくは約２０より大きい。別の好ましい実施形態において、Ｖκ遺伝子の数は、約１５より大きい。好ましい実施形態において、ＤＨ遺伝子の数は、約２０より大きく、ＪＨ遺伝子の数は、約４より大きく、ＶＨ遺伝子の数は、約２０より大きく、Ｊκ遺伝子の数は、約４より大きく、Ｖκ遺伝子の数は、約１５より大きく、そしてＶλ遺伝子の数は、約１５より大きく、より好ましくは約２０または約２５より大きく、そしてさらにより好ましくは約３０より大きい。別の実施形態において、機能的なＪλ−Ｃλ対の数は、４である。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の集団において、Ｉｇ遺伝子座が、異なった機能的抗体配列の組み合わせを約１×１０５以上コードし得るように、ＤＨ遺伝子の数、ＪＨ遺伝子の数、ＶＨ遺伝子の数、Ｊκ遺伝子の数、Ｖκ遺伝子の数、Ｊλ遺伝子の数およびＶλ遺伝子の数は、選択される。好ましい実施形態において、集団におけるＢ細胞の発達は、野生型と比較して平均で約５０％以上、より好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、再構築される。
【００２１】
別の局面に従い、本発明は、トランスジェニック非ヒト哺乳類を提供し、ここで、この哺乳類は、ヒト免疫グロブリン分子を産生し得るが、機能的な内因性免疫グロブリン分子を実質的に産生し得ないように改変されたゲノムを有し、ここで、この哺乳類のゲノムは、少なくとも約１×１０６の異なった機能的なヒト免疫グロブリン配列の組み合わせの抗体のレパートリーをコードする、充分な、ヒトＶλ遺伝子、Ｊλ−Ｃλ遺伝子対、ＶＨ遺伝子、ＤＨ遺伝子、ＪＨ遺伝子、Ｖκ遺伝子、およびＪκ遺伝子を、含む。好ましい実施形態において、ヒトＶλ遺伝子、ヒトＶＨ遺伝子およびヒトＶκ遺伝子の数は、哺乳類における正常なＢ細胞の発達を、実質的に回復させるのに、充分である。好ましい実施形態において、哺乳類の集団におけるＢ細胞の発達は、野生型と比較して平均で約５０％以上、より好ましくは約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、再構築される。
【００２２】
別の局面において、本発明は、不活性化された内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座（挿入されたヒト重鎖Ｉｇ遺伝子座であって、実質的に全てのヒト重鎖遺伝子座を含むか、または実質的にヒト重鎖遺伝子座の核酸配列に対応する核酸配列を含む、遺伝子座；挿入されたヒトκ軽鎖Ｉｇ遺伝子座であって、実質的に全てのκ軽鎖遺伝子座を含むか、または実質的にκ軽鎖遺伝子座の核酸配列に対応する核酸配列を含む、遺伝子座；および挿入されたヒトλ軽鎖Ｉｇ遺伝子座であって、実質的に全てのλ軽鎖遺伝子座を含むか、または実質的にｙＬの核酸配列に対応する核酸配列を含む、遺伝子座）を含む改変されたゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳類を提供する。さらなる局面において、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、不活性化された内因性κ軽鎖Ｉｇ遺伝子座および／または不活性化された内因性λ軽鎖Ｉｇ遺伝子座を、さらに含む。
【００２３】
本発明は、さらに、不活性化された内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座（挿入されたヒト重鎖Ｉｇ遺伝子座であって、実質的に全てのヒト重鎖遺伝子座に対応する核酸配列を含むが、ヒトγ２定常領域を欠いている、遺伝子座；挿入されたヒトκ軽鎖Ｉｇ遺伝子座であって、実質的にκ軽鎖遺伝子座の核酸配列に対応する核酸配列を含む、遺伝子座；および挿入されたヒトλ軽鎖Ｉｇ遺伝子座であって、実質的に全てのヒトλ軽鎖遺伝子座を含むか、または実質的にλ軽鎖遺伝子座の核酸配列に対応する核酸配列を含む、遺伝子座）を含む改変されたゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳類を提供する。さらなる局面において、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、不活性化された内因性κ軽鎖Ｉｇ遺伝子座および／または不活性化された内因性λ軽鎖Ｉｇ遺伝子座を、さらに含み得る。
【００２４】
別の局面において、本発明は、改変されたゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を産生する方法を、提供する。ここで、この方法は、ヒトλ軽鎖Ｉｇ遺伝子座またはその一部分を細胞に導入する工程、必要に応じてヒト重鎖Ｉｇ遺伝子座および／またはヒトκ軽鎖Ｉｇ遺伝子座を細胞に導入する工程、ならびにこの細胞を操作し、トランスジェニック非ヒト動物を産生する工程を、包含する。好ましい実施形態において、免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）を使用して、導入される。本発明はまた、トランスジェニックマウスおよびこの方法を通じて生成される、そのマウス由来のトランスジェニック子孫も、提供する。
【００２５】
別の局面に従い、本発明は、改変されたゲノムを有するトランスジェニック動物を提供し、このゲノムは、挿入されたヒト重鎖Ｉｇトランスジーン、挿入されたヒトλ軽鎖Ｉｇトランスジーンおよび挿入されたヒトκ軽鎖Ｉｇトランスジーンを含み、ここで、このトランスジーンは、ヒト様連結の多様化を可能にするヒト可変遺伝子の選択された組を含み、そしてヒト様相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の長さを有する。好ましい実施形態において、ヒト様連結多様重鎖は、平均７．７塩基のＮ付加長を含む。別の好ましい実施形態において、ヒト様重鎖ＣＤＲ３の長さは、約２残基から約２５残基の間（平均約１４残基）を有する。
【００２６】
本発明はまた、不死化細胞株およびそれにより産生されるヒト抗体を作製する方法を提供し、この方法は、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を抗原で免疫する工程；リンパ球を回収しそして不死化し、不死化細胞集団を得る方法；１０９Ｍ−１より高い親和性で抗原に特異的に結合する、ヒト抗体を分泌する特定の細胞集団を同定しそして単離する工程；およびこの細胞集団から抗体を単離する工程を、包含する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の非ヒトトランスジェニック動物由来のヒトλ軽鎖分子を含むポリクローナル抗体も、提供する。好ましい実施形態において、このポリクローナル抗体は、ヒト重鎖を、さらに含む。
【００２８】
本発明はまた、全長ヒトλ軽鎖Ｉｇ遺伝子座を含む核酸分子も、提供する。本発明はまた、本発明のトランスジェニック動物またはトランスジェニック細胞により産生される抗体由来のヒトλ軽鎖をコードする核酸分子も、提供する。
【００２９】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１)
Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物。
（項目２)
ヒトλ軽鎖遺伝子座の一部分を含むトランスジェニック動物であって、該一部分が、該遺伝子座の少なくとも５００ｋｂを含む、トランスジェニック動物。
（項目３)
前記動物が実質的に不活性化された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合またはホモ接合である、項目１または２に記載のトランスジェニック動物。
（項目４)
前記動物が実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合またはホモ接合である、項目１または２に記載のトランスジェニック動物。
（項目５)
前記動物が実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合またはホモ接合である、項目１または２に記載のトランスジェニック動物。
（項目６)
前記動物がさらにヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、該遺伝子座がＶ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子またはそれらの一部分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目７)
前記動物がさらにヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、該遺伝子座がＶ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子またはそれらの一部分を含む、項目１〜６のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目８)
前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が前記トランスジェニック動物によって発現され得る、項目１〜７のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目９)
前記トランスジェニック動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である、項目１〜８のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目１０)
前記トランスジェニック動物がマウスである、項目１〜９のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目１１)
前記トランスジェニック動物が、前記ヒトλ軽鎖遺伝子座をＶＪ組換えのために標的化する、項目１〜１０のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目１２)
前記ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が前記トランスジェニック動物によって発現され得る、項目６に記載のトランスジェニック動物。
（項目１３)
前記ヒトκ遺伝子座が前記トランスジェニック動物によって発現され得る、項目７に記載のトランスジェニック動物。
（項目１４)
前記ヒトλ遺伝子座が発現に効果的である、項目１〜１３のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目１５)
前記実質的に不活性化された内因性遺伝子座が、遺伝子損傷導入の結果である、項目３〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目１６)
前記遺伝子損傷が前記内因性遺伝子座のＪ領域内である、項目１５に記載のトランスジェニック動物。
（項目１７)
前記内因性軽鎖遺伝子座の前記実質的不活性化が、遺伝子損傷を該内因性軽鎖遺伝子座の定常領域内に含む、項目４〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物。
（項目１８)
前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が６００ｋｂと０．９Ｍｂとの間である、項目２に記載のトランスジェニック動物。
（項目１９)
前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が７００ｋｂと０．９Ｍｂとの間またはそれ以上であり、かつ完全なヒトＩｇλ遺伝子座を含む、項目２に記載のトランスジェニック動物。
（項目２０)
前記ヒトλ軽鎖遺伝子座が８００ｋｂと０．９Ｍｂとの間またはそれ以上であり、かつ完全なヒトＩｇλ遺伝子座を含む、項目２に記載のトランスジェニック動物。
（項目２１)
トランスジェニック動物であって、以下：
ａ．  実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座；
ｂ．  実質的に不活性化された内因性κ軽鎖遺伝子座；
ｃ．  Ｖ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、ヒト重鎖遺伝子座；
ｄ．  Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、ヒトκ軽鎖遺伝子座；および
ｅ．  Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座；
を、含むトランスジェニック動物。
（項目２２)
項目２１に記載のトランスジェニック動物であって、再構築された一次Ｂリンパ球および二次リンパ球の集団をさらに含み、ここで、該集団のレベルが、野生型動物のレベルの５〜２０％、野生型動物のレベルの２０〜４０％、野生型動物のレベルの４０〜６０％、野生型動物のレベルの６０〜８０％、野生型動物のレベルの８０〜１００％、および野生型動物のレベルの１００〜２００％からなる群から選択される、トランスジェニック動物。
（項目２３)
トランスジェニック動物由来の抗原に対するヒト抗体を含む抗血清を産生する方法であって、該方法は、以下：
ａ．  項目１〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を、該抗原を用いて免疫する工程；
ｂ．  該トランスジェニック動物において、該抗原に対する免疫応答を誘導する工程；および
ｃ．  該トランスジェニック動物から血清を回収する工程、
を、包含する、方法。
（項目２４)
トランスジェニック動物由来の抗原に対するヒト抗体を単離する方法であって、該方法は、以下：
ａ．  項目１〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を、該抗原を用いて免疫する工程；
ｂ．  該トランスジェニック動物において、該抗原に対する免疫応答を誘導する工程；
ｃ．  該トランスジェニック動物から血清を回収する工程；および
ｄ．  該トランスジェニック抗体を該血清から精製する工程、
を、包含する、方法。
（項目２５)
項目２４の方法により得られる抗体であって、該抗体が１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍおよび１×１０−１３Ｍ、からなる群から選択される値より低い、解離定数を有する、抗体。
（項目２６)
抗原に対するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生する細胞株を産生する方法であって、該方法は、以下：
ａ．  項目１〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物を、該抗原を用いて免疫する工程；
ｂ．  該トランスジェニック動物において、該抗原に対する免疫応答を誘導する工程；
ｃ．  該トランスジェニック動物からＢリンパ球を単離する工程；
ｄ．  該Ｂリンパ球を不死化する工程；
ｅ．  個々の該不死化Ｂリンパ球のモノクローナル集団を作製する工程；および
ｆ．  該不死化Ｂリンパ球をスクリーニングし、該抗原に対する抗体を同定する工程、を、包含する、方法。
（項目２７)
前記不死化細胞が、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、サル細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、モルモット細胞、または鳥細胞の由来である、項目２６に記載の方法。
（項目２８)
項目２６または項目２７に記載の方法により産生される、単離されたモノクローナル抗体。
（項目２９)
項目１〜２７のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物に由来する、一次細胞またはその子孫細胞。
（項目３０)
項目１〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物に由来する、不死化細胞またはその子孫細胞。
（項目３１)
項目２９または項目３０に記載の不死化細胞またはその子孫細胞であって、該不死化細胞がＢリンパ球起源の細胞である、不死化細胞またはその子孫細胞。
（項目３２)
項目３１に記載の不死化細胞またはその子孫細胞であって、該不死化細胞がハイブリドーマである、不死化細胞またはその子孫細胞。
（項目３３)
Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、トランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座をＶＪ組換えのために標的化し、そして、ここで該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座を発現し得る、トランスジェニックマウス。
（項目３４)
ヒトλ軽鎖遺伝子座の一部分を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該一部分が該遺伝子座の少なくとも５００ｋｂを含み、ここで、該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座をＶＪ組換えのために標的化し、そして、ここで該トランスジェニックマウスが、該ヒトλ軽鎖遺伝子座を発現し得る、トランスジェニックマウス。
（項目３５)
トランスジェニック動物を産生する方法であって、該方法は、以下：
ａ．  （１）ＹＡＣが組み込まれた酵母スフェロプラストであって、該ＹＡＣは、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座または該ヒトλ軽鎖遺伝子座の少なくとも５００ｋｂを含むその一部分、および選択可能なマーカーを含む、酵母スフェロプラストを、（２）宿主動物の胚幹細胞と融合条件下で合わせる工程であって、それによって該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分および選択可能なマーカーが該胚幹細胞のゲノム中に組み込まれる、工程；
ｂ．  該選択可能マーカーが組み込まれた胚幹細胞を選択する工程であって、それにより、該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその一部分を含む細胞を選択する工程；
ｃ．  該選択された胚幹細胞を宿主胚盤胞内に送達し、該胚盤胞を偽妊娠動物レシピエントに移植する工程；
ｄ．  該胚盤胞を発生させ、該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を有するキメラ動物を産生する工程；および
ｅ．  該キメラ動物を、同種の動物と交配させ、該キメラ動物から該ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分が遺伝した該トランスジェニック動物を産生する工程、
を、包含する、方法。
（項目３６)
前記選択可能マーカーが、ＨＰＲＴ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ｆｌ−ｇａｌ、またはＧＰＴである、項目３５に記載の方法。
（項目３７)
前記胚幹細胞が、内因性重鎖、κ軽鎖および／またはλ軽鎖の発現を欠損する、項目３５に記載の方法。
（項目３８)
前記交配させる工程が、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分についてヘテロ接合のトランスジェニック動物を産生し、そして該ヘテロ接合動物が、ヒトλ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合の別のトランスジェニック動物と交配され、ヒトλ軽鎖遺伝子座についてホモ接合のトランスジェニック動物を産生する、項目３５に記載の方法。
（項目３９)
前記ＹＡＣが、６００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、項目３５に記載の方法。
（項目４０)
前記ＹＡＣが、７００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、項目３５に記載の方法。
（項目４１)
前記ＹＡＣが、８００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む、項目３５に記載の方法。
（項目４２)
項目３５〜４１のいずれか１項に記載の方法によって産生されるトランスジェニック動物。
（項目４３)
前記トランスジェニック動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥からなる群から選択される、請求項４２に記載のトランスジェニック動物。
（項目４４)
実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を含む非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞であって、該部分が、該ヒトλ軽鎖遺伝子座の少なくとも５００ｋｂを含む、非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目４５)
項目４４に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞であって、さらに、該非ヒト胚幹細胞または該その子孫細胞の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子座のＪ領域および／または定常領域において、遺伝的損傷を含む、非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目４６)
前記遺伝的損傷がヒト免疫グロブリン配列の挿入である、項目４５に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目４７)
前記遺伝的損傷が、選択可能マーカー遺伝子により、１つ以上の前記内因性免疫グロブリン遺伝子座の標的化された破壊から生じる、項目４５に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目４８)
前記選択可能マーカー遺伝子が、ＨＰＲＴ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ｆｌ−ｇａｌ、またはＧＰＴである、項目４７に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目４９)
前記遺伝的損傷が１つ以上の前記内因性免疫グロブリン遺伝子座の欠失を含む、項目４５に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目５０)
前記幹細胞またはその子孫細胞が前記遺伝的損傷についてホモ接合である、項目４６に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目５１)
前記遺伝的損傷が免疫グロブリン重鎖Ｊ領域内である、項目４６に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目５２)
前記遺伝的損傷が、相同組換えによる、前記内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部分の、前記実質的に完全なヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座との置換を含む、項目４６に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目５３)
前記非ヒト胚幹細胞または前記その子孫細胞の、免疫グロブリン遺伝子座の内因性の両コピーにおける遺伝的損傷を含み、該遺伝的損傷が、該免疫グロブリン遺伝子座の両コピーの再編成不能を生じる、項目４６に記載の非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞。
（項目５４)
一次親と二次親を交雑させる工程、およびその子孫を回収する工程を包含する、トランスジェニック動物を産生する方法であり、ここで、該一次親が、以下：
ａ．  実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座；
ｂ．  実質的に不活性化された内因性κ軽鎖遺伝子座；
ｃ．  Ｖ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒト重鎖遺伝子座；および
ｄ．  Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒトκ軽鎖遺伝子座、
を、含み、ここで、該二次親が、Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座を含み、ここで、該子孫が、以下：
ａ．  実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座；
ｂ．  実質的に不活性化された内因性κ軽鎖遺伝子座；
ｃ．  Ｖ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒト重鎖遺伝子座；
ｅ．  Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含むヒトκ軽鎖遺伝子座；および
ｆ．  Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座、
を、含む、トランスジェニック動物を産生する方法。
（項目５５)
項目５４に記載の方法により産生される、トランスジェニック動物。
（項目５６)
前記トランスジェニック動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である、項目５４に記載の方法により産生されるトランスジェニック動物。
（項目５７)
項目１〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、ヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする、核酸分子。
（項目５８)
項目５７に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、前記ヒトλ軽鎖を産生するＢリンパ球またはその子孫細胞から単離された、核酸分子。
（項目５９)
前記Ｂリンパ細胞の前記子孫細胞がハイブリドーマである、項目５８に記載の単離された核酸分子。
（項目６０)
項目５７に記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、前記ヒト抗体の１〜３の間のＣＤＲ領域を、コードする配列を含む、核酸分子。
（項目６１)
項目５７〜６０のいずれか一項に記載の核酸分子またはそのフラグメントを含む、ベクター。
（項目６２)
項目６１に記載のベクターであって、該ベクターが、前記核酸分子に作動可能に連結された発現制御配列をさらに含む、ベクター。
（項目６３)
ヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする項目１〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、ここで、該軽鎖が、目的の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖である、核酸分子。
（項目６４)
項目６３に記載の単離された核酸分子であって、該核酸分子が、前記ヒトλ軽鎖または前記その抗原結合部位を産生するＢリンパ球またはその子孫細胞から単離された、核酸分子。
（項目６５)
項目６４に記載の単離された核酸分子であって、前記Ｂリンパ球の前記子孫細胞がハイブリドーマである、核酸分子。
（項目６６)
項目６３に記載の単離された核酸分子であって、該単離された核酸分子が、前記ヒト抗体の１〜３の間のＣＤＲ領域を、コードする配列を含む、核酸分子。
（項目６７)
項目６３〜６６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目６８)
項目６７に記載のベクターであって、該ベクターが、さらに前記核酸に作動可能に連結された発現制御配列を含む、ベクター。
（項目６９)
単離された宿主細胞であって、該細胞は、以下：
ａ）  ヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする、項目１〜２２のいずれか１
項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、ここで、該軽鎖が、目的の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖である、核酸分子；または
ｂ）  該核酸分子を含むベクター、
を、含む、細胞。
（項目７０)
単離された宿主細胞であって、該細胞は、以下：
ａ）  ヒト重鎖またはその抗原結合部位およびヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする、項目１〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物から単離された核酸分子であって、ここで、該重鎖および該軽鎖が、目的の抗原に特異的に結合する抗体を形成する、核酸分子；または
ｂ）  該核酸分子を含むベクター、
を、含む、細胞。
（項目７１)
項目６９または項目７０に記載の単離された細胞であって、該細胞が、ハイブリドーマ細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、および哺乳類細胞からなる群から選択される、細胞。
（項目７２)
項目７１に記載の細胞であって、該哺乳類細胞が、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、サル細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、モルモット細胞、または鳥細胞である、細胞。
（項目７３)
項目７１に記載の細胞であって、該哺乳類細胞が、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＮＳ／０細胞、またはＣＯＳ細胞である、細胞。
（項目７４)
トランスジェニックマウスから同定され、そして目的の抗原に特異的に結合する、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖もしくはその抗原結合部位、または該ヒト免疫グロブリンλ軽鎖もしくはその該抗原結合部位およびヒト免疫グロブリン重鎖もしくはその抗原結合部位の両方を、組換え的に産生する方法であって、項目６９〜７３のいずれか１項に記載の宿主細胞を、前記核酸分子が発現する条件下で培養する工程を包含する、方法。
（項目７５)
項目６３に記載の核酸分子を含む、非ヒトトランスジェニック動物であって、該非ヒトトランスジェニック動物が該核酸分子を発現する、トランスジェニック動物。
（項目７６)
目的の抗原に特異的に結合するヒト抗体の、免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合部位をコードする単離された核酸分子、および免疫グロブリンλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする単離された核酸分子を含む、非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物が該核酸分子を発現する、トランスジェニック動物。
（項目７７)
項目７５〜７６のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物であって、該動物が、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である、トランスジェニック動物。
（項目７８)
項目７５〜７６のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物であって、前記単離された核酸分子またはその部分の発現から生じるヒト抗体が、該動物のＢリンパ球細胞またはその子孫細胞由来の細胞の表面上で発現する、トランスジェニック動物。
（項目７９)
項目７５〜７６のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物であって、前記単離された核酸分子またはその部分の発現から生じるヒト抗体が、該動物のリンパ液、血液、乳、唾液、または腹水に分泌される、トランスジェニック動物。
（項目８０)
項目１〜５のいずれか１項に記載のトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物の集団の少なくとも９５％が、少なくとも３世代にわたってヒトλ軽鎖遺伝子座を維持する、トランスジェニック動物。
（項目８１)
項目２１に記載のトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物の集団の少なくとも９５％が、少なくとも３世代にわたって、前記ヒトλ軽鎖遺伝子座、該ヒトλ軽鎖遺伝子座および前記ヒト重鎖遺伝子座を維持する、トランスジェニック動物。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、３０の機能的Ｖλ遺伝子、および７つのＪλ−Ｃλ対（その内、４つが機能的である）を含む、ヒト免疫グロブリンλ遺伝子座を示す。
【図２】図２は、ヒト免疫グロブリンλ遺伝子座のＹＡＣ（ｙＬと呼ばれる）への再構築を示す。
【図３】図３は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）−ＫＬ系統におけるヒトＩｇλおよびヒトＩｇκの発現を示す図である。
【図４】図４は、実施例８に記載される融合実験の概要を提示する。
【図５】図５は、ネイティブＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）−ＫＬマウスにおけるヒト抗体の血清レベルを示す図である。
【図６−１】図６Ａ〜Ｇは、ヒト生殖系列免疫グロブリンλ遺伝子の、胚幹細胞（ＥＳ細胞）およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統への組込みを証明する、サザンブロット分析である。
【図６−２】図６Ａ〜Ｇは、ヒト生殖系列免疫グロブリンλ遺伝子の、胚幹細胞（ＥＳ細胞）およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統への組込みを証明する、サザンブロット分析である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ヒト生殖系列λＩｇ軽鎖遺伝子座またはその一部分を含むマウスの幾つかの系統の産生および特徴づけを、本明細書中で、記載する。本発明者らはまた、ヒト生殖系列κ軽鎖遺伝子座またはその部分およびヒト生殖系列重鎖遺伝子座またはその部分をさらに含む、トランスジェニック動物の産生も、記載する。従って、本発明は、対応するマウス遺伝子座と機能的に置き換えるための、大型の、複雑なヒトＩｇ遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物を、提供する。本発明はまた、ヒトλ生殖系列遺伝子座を含むＹＡＣの使用、およびメガ塩基の大きさのＹＡＣのトランスジェニック動物（特にトランスジェニックマウス）への、成功した導入により、トランスジェニック非ヒト動物を、産生する方法も、提供する。本発明はまた、トランスジェニック動物を生じる胚幹細胞、および胚幹細胞を作製する方法も、提供する。本発明は、さらに、トランスジェニック動物により産生される、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体を提供し、そしてモノクローナル抗体を作製する不死化細胞（例えばハイブリドーマ）に関わる組成物および方法を、提供する。
【００３２】
（定義）
本明細書中の用語は、概して、当業者によって理解されるような、通常の意味を有している。以下の用語は、本明細書中で使用される場合、以下のような一般的意味を有することを、意図する：
「抗体レパートリー」は、動物またはヒトにおける、それぞれ異なった抗体種の総合を意味する。抗体レパートリーにおける多様性は、特に、免疫グロブリン遺伝子組換え、免疫グロブリン遺伝子連結多様性、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ活性、エキソヌクレアーゼ活性、レセプター校正、および体細胞過剰突然変異から、生じる。
【００３３】
「Ｂリンパ球細胞またはその子孫細胞」は、Ｂリンパ球系統を継ぐかまたはＢリンパ球になることが決まっている、任意の細胞を意味する。例としては、最初期Ｂリンパ球幹細胞にはじまり記憶Ｂ細胞までのＢ細胞発生経路における全てのＢリンパ球、プラスマ細胞、およびハイブリドーマのような任意の不死化細胞株が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３４】
「胚幹細胞（ＥＳ細胞）」は、多能または万能の細胞を意味し、この細胞は、胚盤胞に注射される場合、出生前、出生後、または成体の、多くのまたは全ての組織に、寄与し得る。胚盤胞注射から生じる動物は、その体細胞および／または生殖細胞が、しばしば胚盤胞および注射されたＥＳ細胞の両方に由来するため、「キメラ」動物と呼ばれる。
【００３５】
「不死化細胞」は、インビトロまたはインビボで無限に増殖および分裂するように改変されている細胞をいう。細胞を不死化する方法としては、癌原遺伝子を用いる形式転換、癌原ウイルスを用いた感染、不死化細胞を選択する条件下での培養、発癌性化合物または変異化合物に対する暴露、別の不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞）との融合、および腫瘍抑制遺伝子の不活性化が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３６】
「スフェロプラスト」は、インビトロで細胞壁を剥がれ、これにより、他の細胞（例えば、ＥＳ細胞）と融合しやすい、露出された原形質膜を有する、酵母細胞をいう。
【００３７】
「生殖系列構造」は、任意の体細胞遺伝子再編成が起こる前の、免疫グロブリン遺伝子セグメントの編成または配置をいう。
【００３８】
「遺伝的損傷」は、遺伝子または遺伝子座における、任意の天然の断裂または不自然な断裂をいう。遺伝的損傷は、遺伝子もしくは遺伝子座の発現の減少または非存在を生じ、あるいはその生来の機能を失わせた遺伝子産物の発現を生じる。遺伝的損傷としては、遺伝子または遺伝子座をコードする配列の標的化された断裂、遺伝子または遺伝子座の発現に関連するシス制御因子の改変、遺伝子または遺伝子座の発現に関連するトランス制御因子の改変、および遺伝子または遺伝子座を有する染色体全体またはその領域の大きな断裂が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３９】
「シス制御エレメント」は、一般に、同じ染色体上の遺伝子配列の、誘導的発現または構造的発現を、特異的条件下または特定の細胞において、制御する配列をいう。発現制御配列が制御する細胞過程の例としては、遺伝子転写、体細胞遺伝子組換え、ｍＲＮＡスプライシング、タンパク質翻訳、免疫グロブリンアイソタイプ変換、タンパク質糖化、タンパク質開裂、タンパク質分泌、細胞内タンパク質局在および細胞外タンパク質ホーミングが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４０】
「実質的に完全なトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座」は、宿主動物以外の動物由来の、免疫グロブリン遺伝子座の５０％と１００％との間をいう。好ましい実施形態において、実質的に完全なトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座は、宿主動物以外の動物由来の、免疫グロブリン重鎖遺伝子座または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の７５％と１００％との間をいう。より好ましい実施形態において、実質的に完全なトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座は、宿主動物以外の動物由来の、免疫グロブリン重鎖遺伝子座または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の９０％と１００％との間または９５％と１００％との間をいう。さらにより好ましい実施形態において、実質的に完全なトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座は、宿主動物以外の動物由来の、免疫グロブリン重鎖遺伝子座または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の９８％と１００％との間をいう。
【００４１】
「実質的に不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子座」は、その免疫グロブリン重鎖遺伝子座または免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内に遺伝的損傷を有する動物であって、その動物における遺伝子座の発現の欠失を生じる動物をいう。好ましい実施形態において、不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子座による発現は、野生型の発現レベルの０％と３０％との間である。より好ましい実施形態において、不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子座による発現は、野生型の発現レベルの０％と１５％との間である。最も好ましい実施形態において、不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子座による発現は、野生型の発現レベルの、およそ０％から５％、より好ましくは０％から１％である。
【００４２】
核酸配列は、（ａ）その核酸配列を含む核酸分子がヒトＩｇ重鎖遺伝子座、ヒトＩｇλ軽鎖遺伝子座またはヒトＩｇκ軽鎖遺伝子座を含む核酸分子と、高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする場合および／または（ｂ）その核酸配列を含む核酸分子がヒトＩｇ重鎖遺伝子座、ヒトＩｇλ軽鎖遺伝子座またはヒトＩｇκ軽鎖遺伝子座を含む核酸分子と実質的な配列類似性を示す場合に、ヒトＩｇ重鎖遺伝子座、ヒトＩｇλ軽鎖遺伝子座またはヒトＩｇκ軽鎖遺伝子座の核酸配列と、「実質的に対応する」、「実質的に対応している」または「実質的に同様である」。「高いストリンジェンシー」または「高度にストリンジェント」な条件の例は、６×ＳＳＰＥまたは６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性剪断化サケ精子ＤＮＡの緩衝液中、ハイブリダイゼーション温度４２℃で１２時間〜１６時間、ポリヌクレオチドを別のポリヌクレオチドをインキュベートし（ここで、１方のポリヌクレオチドがメンブレンなどの個体表面に接着され得る）、その後、１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの洗浄緩衝液を使用して、５５℃で２回洗浄する、方法である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（既出）ｐｐ．９．５０−９．５５も、参照のこと。実質的な配列類似性は、任意の周知の配列同一性アルゴリズムによって測定される場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を用いて、別の核酸（またはその相補鎖）と最適に並べられた場合、核酸配列同一性が、塩基対の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは約９５％、９７％、９８％または９９％であることを示す。このアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０のプログラム、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などである。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含む）は、試験配列と探索配列と間で最も重複する領域の、アラインメントおよび配列同一性百分率を、提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６６：２２７−２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：７１−８４（１９９８）；本明細書中で参考として援用される）。
【００４３】
酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、ベクターを複製させ、インビボで酵母細胞中で維持させる、酵母染色体のエレメントから構築されるクローニング媒体を、言及する。酵母のエレメントは、セントロメア、自律複製配列、一対のテロメア、酵母選択可能マーカー、かつ通常は、細菌の複製起点、ならびに細菌におけるＹＡＣベクターアームの複製および選択のための選択可能マーカーを、含む。少なくとも２０００ｋｂまでのＤＮＡ挿入部分は、ＹＡＣを使用して、クローン化され得、維持され得る。
【００４４】
「トランスジェニック動物」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の実質的部分を保有する動物をいう。しばしば、トランスジェニック動物は、その内因性免疫グロブリンを発現をさせない、相同的に標的される内因性免疫グロブリン遺伝子座を保有する。一例としては、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウス（例えば、本明細書中で記載されるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−Ｌ系統およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬ系統）が、挙げられる。これは、トランスジェニックヒト免疫グロブリン遺伝子の体細胞再編成、ヒト可変遺伝子の過剰変異、免疫グロブリン遺伝子発現、および免疫グロブリンアイソタイプ変換をし得る。従って、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統のマウスは、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を利用して、抗原負荷に対し、効果的な体液応答を示し得る。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統のマウスにおいて産生される抗体は、完全にヒト抗体であり、この動物それ自体またはその子孫から、この動物それ自体またはその子孫から抽出された培養細胞から、およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＬおよびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬのＢリンパ球株またはその子孫細胞から作製されるハイブリドーマから、単離され得る。その上、特定の抗原負荷に対して生じる免疫グロブリンをコードする、再編成されたヒト遺伝子配列は、当該分野に周知である組換え手段によって、単離され得る。
【００４５】
「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンまたは特定の結合についてインタクトな抗体と競合するその抗原結合部位をいう。抗原結合部位は、組換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により、産生され得る。抗原結合部位としては、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）および特異的な抗原結合を付与するするのに充分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。
【００４６】
「トランスジェニック抗体」は、外来免疫グロブリン遺伝子座によりコードされる抗体をいう。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＬおよびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬ系統のマウスにおいて、ヒト抗体遺伝子座は、トランスジェニック抗体をコードする。
【００４７】
「トランスジェニックモノクローナル抗体」は、トランスジェニック動物由来のクローニングされた不死化細胞（例えば、ハイブリドーマ）において産生される均質な抗体集団をいう。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＬおよびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬ系統のマウスから作製されるハイブリドーマは、トランスジェニックモノクローナル抗体を産生する。
【００４８】
用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、「単離された抗体」または「単離された免疫グロブリン」は、その起源または誘導源の故に、（１）そのネイティブの状態に含まれる、天然に含まれる組成物を伴わない（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まない（３）異なった種の細胞によって発現される、または（４）天然に生じない、それぞれ、タンパク質、ポリペプチド、抗体または免疫グロブリンである。従って、化学的に合成されたポリペプチドまたは抗体、または天然起源の細胞と異なる細胞系で合成されたポリペプチドまたは抗体は、天然に混在していた成分から、「単離」されている。タンパク質または抗体はまた、当該分野に周知である、タンパク質精製技術を使用する単離により、天然に伴う成分を、実質的に非含有であり得る。単離される抗体は、そのネイティブな状態において混在する、他の天然に混在する抗体を非含有な抗体であり得る。単離される抗体の例としては、抗原を用いてアフィニティー精製されたヒト抗体、プロテインＡまたはプロテインＬ、ハイブリドーマまたは他の細胞株によりインビトロで合成されたヒト抗体、およびトランスジェニックマウス由来のヒト抗体が、挙げられる。
【００４９】
タンパク質、ポリペプチド、抗体または免疫グロブリンは、サンプルの少なくとも約６０％から７０％が１つの種類のタンパク質、タンパク質、ポリペプチド、抗体または免疫グロブリンを示す場合、それぞれ、「実質的に純粋である」か、「実質的に均質である」かまたは「実質的に精製されている」。実質的に純粋なタンパク質、ポリペプチド、抗体または免疫グロブリンは、代表的には、サンプルの約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％  Ｗ／Ｗであり、より普通には約９５％、そして好ましくは９９％以上純粋である。純度または均質性は、当該分野で周知の多くの手段（タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後の当該分野で周知の色素によりゲル染色上の一本のポリペプチドバンドの可視化など）によって、示され得る。特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは精製の分野で周知の他の手段によって、より高度な分析が、提供され得る。
【００５０】
（抗体の構造）
基礎抗体構造単位は、テトラマーを構成することで知られる。それぞれのテトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖の対からなり、それぞれの対は、１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）および１つの「重鎖」（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。従って、インタクトなＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性抗体または二種特異性抗体を除き、２つの結合部位は、同一である。分泌性ＩｇＭについては、基礎単位は、二価抗体のペンタマーである。従って、５量体ＩｇＭは、それぞれ、１０の結合部位を有する。分泌性ＩｇＡについては、基礎単位は、二価抗体のテトラマーである。従って、４量体ＩｇＡは、それぞれ、４つの結合部位を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う、約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に最初に応答する、定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、またはイプシロン（ε）に分類され、そして抗体のアイソタイプを、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥにそれぞれ定義する。軽鎖および重鎖の内部において、可変領域および定常領域が、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖もまた、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を、参照のこと（全ての目的で、全体が参考として援用される）。それぞれの軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【００５１】
全ての鎖は、同じ一般的構造の比較的保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。ＦＲは、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）によって、連結される。それぞれの対の２つの鎖由来のＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの連結を可能にする。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の両鎖は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。それぞれのドメインのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【００５２】
（Ｂ細胞の発達）
Ｂ細胞の発達は、骨髄において、Ｄ遺伝子とＪ遺伝子との間の欠失組換えを用いて、始める。その後、Ｖ遺伝子が、ＤＪを再結合してＶＤＪを形成する。このＶＤＪは、転写され、スプライシングされたＶＤＪＣμ転写物を、産生する。転写物が読み取り枠内である場合、次いで、μ鎖が、翻訳によって合成される。同様に、そして一般に、ＶＨＤＪＨの再結合およびμ鎖と軽鎖の代替物との対形成の後で、Ｉｇ軽鎖遺伝子座は、Ｖ遺伝子セグメントおよびＪ遺伝子セグメントを再編成する。骨髄における成功したＢ細胞の発達は、細胞表面上にＩｇＭκまたはＩｇＭλを発現するＢ細胞を生じる。マウスにおいて、Ｂ細胞の９５％がＩｇＭκを発現し、５％がＩｇＭλを発現する：ヒトにおいては、およそＢ細胞の６０％がＩｇＭκを発現し、４０％がＩｇＭλを発現する。
【００５３】
これらのＩｇＭ産生Ｂ細胞は、第一免疫レパートリーを形成し、そして外来抗原の認識についての、免疫サーベイランスを行う。マウスにおいてまたはヒトにおいて、このＩｇＭ産生Ｂ細胞は、その後、ＩｇＭアイソタイプからＩｇＧアイソタイプもしくはＩｇＡアイソタイプ、またはＩｇＥアイソタイプへ、アイソタイプクラス変換を行う。クラス変換の頻度は、免疫応答の間、増加する。マウスおよびヒトは、４つの異なったＩｇＧアイソタイプについての遺伝子を有する。これらは、マウスにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３であり、ヒトにおいてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４である。ヒトは、２つのＩｇＡアイソタイプ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、そして１つのＩｇＥアイソタイプを有する。マウスにおいて、平均で、６５００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１、４２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａおよび１２００μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ｂ、ならびに２６０μｇ／ｍｌのＩｇＡが、存在する。ヒトにおいては、ＩｇＧ総量の、約７０％がＩｇＧ１、１８％がＩｇＧ２、８％がＩｇＧ３および３％がＩｇＧ４である。ヒトにおけるＩｇＡ総量の、約８０％がＩｇＡ１および２０％がＩｇＡ２である。
【００５４】
（ヒトλ免疫グロブリン遺伝子座）
ヒトλＩｇ遺伝子座は０．９Ｍｂにおよぶ。ここには、約６９のＶλ遺伝子セグメントが存在し、その３６は読み取り枠を有する。これらのうち３０は、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）由来の転写物において検出されている。Ｖλ遺伝子は、３つのクラスターに別れる（５’から３’に向かって、Ｃクラスター、Ｂクラスター、およびＡクラスターと名付けられる）。クラスターＡは、１４の機能するＶλ遺伝子セグメントを含み、発現するレパートリーの６２％に相当する。クラスターＢは、１１の機能するＶλ遺伝子セグメントを含み、発現するレパートリーの３３％に相当する。そして、クラスターＣは、５の機能するＶλ遺伝子セグメントを含み、発現するレパートリーの５％に相当する。発現されたレパートリーは、ヒトＰＢＬによって発現されるレパートリーにおけるＶλ遺伝子の発現の頻度に基づく。例えば、Ｉｇｎａｔｏｖｉｃｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８：６９−７７（１９９７）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。１０のＶλ遺伝子ファミリーが、これらのクラスターに存在する。最も大きなファミリーであるＶλＩＩＩは、２３のメンバーを有し、そのうちの８が機能する。ヒトλ遺伝子座において、７つのＪλ−Ｃλ対が存在し、そのうち４つが機能する。
【００５５】
（ヒト抗体およびそれを産生するトランスジェニック動物の使用）
マウス抗体またはラット抗体のヒト患者への投与は、通常、効果がない。何故なら、抗体中のマウス由来の配列またはラット由来の配列の存在は、抗体の迅速なクリアランスか、または抗体に対する免疫応答の産生が、患者によって導かれるからである。ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変領域および／または定常領域を保有する抗体に関わる問題の中のいくつかを避ける。ヒト由来の細胞を使用するヒトモノクローナル抗体の作製は問題があったため、ヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物を開発することが、望ましかった。
【００５６】
ヒトＩｇ  ＹＡＣトランスジーンの宿主染色体への組込みは、際立った遺伝的安定性を提供する。組込まれたヒトＩｇ  ＹＡＣトランスジーンは、トランスジェニック動物の全ての体組織および生殖系列組織において、安定的に発現され、メンデル遺伝の予測されるパターンにより世代から世代へと伝達され、そして培養細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞）において、安定的に維持される。対照的に、宿主細胞（例えば、マウスＥＳ細胞）の核に挿入された、自在に分離するヒトトランス染色体は、遺伝的に不安定であることが公知で、失われる。キメラマウスは、これらのＥＳ細胞に由来し得、そして時折、トランス染色体を子孫に伝える。これらのキメラマウスに由来する「トランス染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃ）」マウスは、トランス染色体を保有する幾つかの細胞およびトランス染色体を失っている細胞の、体性モザイクである。欠失は、マウス有糸分裂紡錘体およびマウス減数分裂紡錘体による、トランス染色体上におけるヒトセントロメアの非能率的な捕捉、ならびにその後の、有糸分裂および減数分裂の間のトランス染色体の異常分離により、起こりやすい。さらに、トランス染色体マウス由来のハイブリドーマもまた、不安定であると予測される。
【００５７】
ヒトの重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の、メガ塩基の大きさの、生殖系列構造ＹＡＣフラグメントは、トランスジェニックマウスに導入されていて、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ＩＩａ  マウスを産生する。Ｍｅｎｄｅｚら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｃｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、およびＷＯ９８／２４８９３号を、参照のこと。これらの全ては、本明細書でその全体が参考として援用される。
【００５８】
本明細書中で提供される本発明は、ヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物の提供による、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の開発に基礎を置く。一実施形態において、本発明は、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座またはその一部分を含む、マウスを提供する。別の実施形態において、トランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座を、さらに含む。好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスは、実質的に不活性化された内因性の重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座を、さらに含む。また別の好ましい実施形態において、トランスジェニックマウスは、実質的に不活性化された内因性の重鎖遺伝子座、κ軽鎖遺伝子座を、およびλ軽鎖遺伝子座を、さらに含む。ヒトにおいて、およそ４０％の抗体がλ軽鎖を含み、残りの６０％がκ軽鎖を含む。従って、ヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニックマウスは、ヒトにおいて見出されるのに近いか、または実施的に同じ規模の、ヒト抗体レパートリーを、産生し得るはずである。
【００５９】
（ヒトλ軽鎖遺伝子座を含むＹＡＣおよび宿主細胞）
本発明の一実施形態において、本発明は、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を含むＹＡＣを、提供する。一般に、ＹＡＣは、酵母セントロメア、複製起点、テロメア、および目的のＤＮＡを含む。種々のセントロメアまたはテロメア（特に、酵母第４染色体および酵母第５染色体由来のセントロメア）が使用され得る。一般に、ＹＡＣは、選択可能マーカーを有し、このマーカーは、ＹＡＣが組み込まれている細胞の選択またはスクリーニングを可能にする。一実施形態において、ＨＰＲＴ遺伝子（より具体的にはヒトＨＰＲＴ遺伝子）が、選択可能マーカーとして使用され得る。何故なら、ＨＰＲＴ遺伝子は、ＹＡＣを有するＨＰＲＴ欠失ＥＳ細胞を、効果的に選択させるからである。他の、使用され得る公知の選択可能マーカーまたはスクリーニング可能マーカーとしては、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ｆｌ−ｇａｌ、およびＧＰＴが、挙げられる。
【００６０】
ヒトλ軽鎖遺伝子座の全てまたは一部分を含むＹＡＣは、本明細書の以下の教示の当該分野に公知の任意の方法により、得られ得る。一実施形態において、ＹＡＣは、既存の（Ｃｅｎｔｅｒ  ｄ’Ｅｔｕｄｅ  ｄｕ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ  Ｈｕｍａｉｎ（Ｃ．Ｅ．Ｐ．Ｈ．），Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；または他の学術的供給源または市販の供給源から得られるような）ＹＡＣライブラリーをスクリーニングすることにより、単離される。あるいは、ＹＡＣは、当該分野に周知の技術または本明細書中に記載される技術により、容易に調製され得る。ヒトλ軽鎖遺伝子座のゲノム配列は、公知であり、その部分は、ＰＣＲ、制限酵素切断およびその後の単離、機械的断片化およびその後の単離または当該分野で公知の任意の他の方法を使用して、ヒトゲノムＤＮＡから、単離され得る。目的の核酸挿入部位を含むＹＡＣを調製する典型的な方法は、Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）において、見出され得る。Ｖｏｌ．３，Ｃｈａｐｔｅｒ５（本明細書中で、参考として援用される）を参照のこと。
【００６１】
ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分は、１つ以上のＹＡＣクローン内に、含まれ得る。ヒトλ軽鎖遺伝子座が、多数のＹＡＣクローンにまたがる場合、インタクトなヒトλ軽鎖遺伝子座は、相同性重複領域を有するＹＡＣ間の相同的組換えにより、再構築され得る。後述の例を参照のこと。代替の実施形態において、ヒトλ軽鎖遺伝子座の一部分のみが、使用され得る。
【００６２】
好ましい実施形態において、ＹＡＣは、５００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ遺伝子座を、含む。より好ましい実施形態において、ＹＡＣは、６００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ遺伝子座を含み、さらにより好ましくは７００ｋｂと０．９Ｍｂとの間、およびその上より好ましくは８００ｋｂと０．９Ｍｂとの間である。さらにより好ましい実施形態において、ＹＡＣは、およそ０．９Ｍｂのヒトλ遺伝子座を、含む。ＹＡＣはまた、実質的にヒトλ軽鎖遺伝子座と類似の、λ軽鎖遺伝子座を含み得る。
【００６３】
多くの異なった種類の宿主細胞が、本発明の実施において、使用され得る。一実施形態において、宿主細胞は、ＹＡＣ  ＤＮＡを染色体中に組み込み得る細胞である。好ましい実施形態において、宿主細胞は、トランスジェニック動物の形成に関わり得る。より好ましい実施形態において、宿主細胞は、ＥＳ細胞または卵母細胞であり、好ましくはＥＳ細胞である。このようなＥＳ細胞は、代表的には、培養にて拡張され、生存状態を維持され、外来のＤＮＡの組込み後の選択のための手段を提供し、宿主（生殖系列を含む）を再集団化させる能力を有する。本発明により提供されるＥＳ細胞は、任意の非ヒト宿主の由来であり得るが、好ましくは、哺乳類または鳥類由来である。一実施形態において、げっ歯類（ラットおよびマウス）が、ヒトλ軽鎖遺伝子座の組込みのためのＥＳ細胞を、提供し得る。他の実施形態は、通常の実験動物または家畜に由来するＥＳ細胞を含む。これらの動物としては、ウサギ、ブタ、ハムスター、ウマ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、モルモット、または鳥（ニワトリ、七面鳥など）が、挙げられる。
【００６４】
ＥＳ細胞は、１つ以上の変異を有する。例えば、特定の表現型を欠くか、または優性の表現型を有し得る。本発明における特に重要なものは、ＨＰＲＴ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ｆｌ−ｇａｌ、および／またはＧＰＴを用いて選択され得るＥＳ細胞である。
【００６５】
ＥＳ細胞はまた、実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座、κ軽鎖遺伝子座、および／またはλ軽鎖遺伝子座も、有し得る。好ましい実施形態において、ＥＳ細胞は、実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の両方を含む。別の好ましい実施形態において、ＥＳ細胞は、実質的に不活性化された内因性λ軽鎖遺伝子座を含む。
【００６６】
（細胞および動物を作製する方法）
本発明はまた、ヒトλ軽鎖遺伝子座を、非ヒト宿主細胞および非ヒト動物に導入する方法も、提供する。ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を有するＹＡＣは、酵母スフェロプラスト：ＥＳ細胞融合、微小注入実験およびリポフェクションなどの種々の方法により、宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞または卵細胞）に導入され得る。例えば、実施例３およびＢｉｒｒｅｎら（既出）ｐｐ．５４６−５５０を、参照のこと。好ましい実施形態において、本発明は、目的のＹＡＣを含む酵母細胞が、ＥＳ細胞と融合する方法を提供する。ＥＳ細胞へのＹＡＣの導入の後、細胞は、本明細書の以下の教示に従い当該分野に公知の方法を使用して、細胞のゲノムへのＹＡＣの組込みについて、選択されるか、またはスクリーニングされる。
【００６７】
従って、本発明は、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を含む非ヒトＥＳ細胞またはその子孫細胞を、提供する。好ましい実施形態において、ＥＳ細胞または子孫細胞は、実質的に完全な生殖系列ヒトλ軽鎖遺伝子座を、含む。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、ＥＳ細胞はさらに、非ヒト胚幹細胞またはその子孫細胞の１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子座のＪ領域および／または定常領域において、遺伝的損傷を含む。より好ましい実施形態において、遺伝的損傷は、免疫グロブリン重鎖Ｊ領域において、存在する。より好ましい実施形態において、遺伝的損傷は、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の両コピーのＪ領域に存在する。別の好ましい実施形態において、遺伝的損傷は、内因性軽鎖Ｊ領域に存在する。より好ましい実施形態において、遺伝的損傷は、内因性κ軽鎖遺伝子座の１つまたは両コピーの、定常領域および／またはＪ領域に存在する。別の実施形態において、遺伝的損傷は、内因性λ軽鎖遺伝子座の１つまたは両コピーの、定常領域および／またはＪ領域に存在する。別の実施形態において、遺伝的損傷は、１つ以上の内因性の重鎖遺伝子座、κ軽鎖遺伝子座、またはλ軽鎖遺伝子座の欠失を含む。さらに、好ましい実施形態において、遺伝的損傷は、内因性の重鎖遺伝子座、κ軽鎖遺伝子座、および／またはλ軽鎖遺伝子座の少なくとも一部分と、対応する実質的に完全なヒト重鎖遺伝子座、κ軽鎖遺伝子座、および／またはλ軽鎖遺伝子座との、相同性組換えによる置換を含む。
【００６９】
より好ましい実施形態において、非ヒトＥＳ細胞またはその子孫細胞は、非ヒトＥＳ細胞またはその子孫細胞の内因性の免疫グロブリン遺伝子座の両コピーにおいて、遺伝的損傷をさらに含む。遺伝的損傷は、内因性免疫グロブリン遺伝子座の両コピーの再編成不能を生じる。
【００７０】
別の好ましい実施形態において、遺伝的損傷は、トランスジェニック遺伝子の挿入である。より好ましい実施形態において、遺伝的損傷は、選択可能マーカー遺伝子により、１つ以上の内在的免疫グロブリン遺伝子座の、標的化された断裂から生じる。別の好ましい実施形態において、選択可能マーカーは、ＨＰＲＴ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ｆｌ−ｇａｌ、およびＧＰＴである。別のより好ましい実施形態において、幹細胞まやはその子孫細胞は、遺伝的損傷についてのホモ接合体である。
【００７１】
（ヒトλ軽鎖を含むトランスジェニック動物を作製する方法）
選択およびスクリーニングの後、ＥＳ細胞は、本発明のトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。後述の実施例３を参照のこと。一実施形態において、宿主動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ハムスター、ウマ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはモルモットから選択されるトランスジェニック動物である。好ましい実施形態において、宿主動物は、マウスである。別の実施形態において、宿主動物は、動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座において１つ以上の遺伝的損傷を含む、トランスジェニック動物である。より好ましい実施形態において、宿主動物は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）系統である。
【００７２】
本発明は、トランスジェニック動物を産生する方法を提供し、この方法は、以下を包含する：
ａ．融合条件下において、（ａ）実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分、および選択可能マーカーを含むＹＡＣを組込んでいる酵母スフェロプラストと、（ｂ）宿主動物のＥＳ細胞を、合わせる工程；
ｂ．選択可能マーカーを組込んでいるＥＳ細胞を選択し、それによりヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を選択する工程であって、ここで、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分および選択可能マーカーは、胚幹細胞のゲノム内に組込まれる、工程：
ｃ．選択されたＥＳ細胞を、宿主胚盤胞に送達し、この胚盤胞を偽妊娠動物レシピエントに移植する工程；
ｄ．胚盤胞を発生させ、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分を有するキメラ動物を産生する工程；および
ｅ．  キメラ動物を、同種の動物と交配させ、トランスジェニック動物を産生する工程であって、このトランスジェニック動物が、ヒトλ軽鎖遺伝子座またはその部分をキメラ動物から受け継いでいる、工程。
【００７３】
好ましい実施形態において、ヒトλ軽鎖遺伝子座は、実質的に全長の生殖系列配列である。別の好ましい実施形態において、選択的マーカーは、ＨＰＲＴ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ｆｌ−ｇａｌ、またはＧＰＴである。別の好ましい実施形態において、ＥＳ細胞は、内因性の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリンλ軽鎖および／免疫グロブリンκ軽鎖の発現を、欠失している。より好ましい実施形態において、ＥＳ細胞は、ヒト重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座を、さらに含む。別の好ましい実施形態において、この方法は、工程（ｅ）のヘテロ接合体トランスジェニック動物を、別のヒトλ軽鎖遺伝子座についてのトランスジェニック動物ヘテロ接合体と交配させ、ヒトλ軽鎖遺伝子座についてのトランスジェニック動物ホモ接合体を産生する工程を、さらに含む。
【００７４】
さらに好ましい実施形態において、ヒトλ軽鎖遺伝子座についてのトランスジェニック動物ヘテロ接合体は、実質的に不活性化された内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座および免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座、ならびに、必要に応じて実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を有し、そしてヒト重鎖遺伝子座およびヒトκ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物と、交配される。好ましい実施形態において、ヒトκ軽鎖遺伝子座およびヒトλ軽鎖遺伝子座は、それぞれＶ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子および定常領域遺伝子を含み、そしてヒト重鎖は、Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子および定常領域遺伝子を含む。ヒトλ軽鎖遺伝子座、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の存在についてのトランスジェニック動物ヘテロ接合体は、選択され、互いに交配される。ヒトλ軽鎖、ヒト重鎖およびκ軽鎖の発現の存在についてのトランスジェニック動物ホモ接合体が、次いで、選択される。
【００７５】
好ましい実施形態において、トランスジェニック動物の子孫は、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９またはＦ１０の世代の、１匹以上の動物である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅの特別な利点の1つは、一般に安定的であることであり、すなわち、ヒト
免疫グロブリン遺伝子は、マウスの中で欠失されることなく、世代にわたって維持される。このマウスから作製される細胞株または他の産物もまた、安定的である。好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック動物の集団の少なくとも９５％は、少なくとも３世代、より好ましくは５世代、さらにより好ましくは７世代または１０世代にわたって、遺伝的に安定である。別の好ましい実施形態においては、集団の少なくとも９８％または１００％が、遺伝的に安定である。
【００７６】
別の好ましい実施形態において、上で記載される方法が、トランスジェニック動物を提供するために使用され、ここで、このトランスジェニック動物は、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である。一般に、この方法は、ＹＡＣを目的の種由来のＥＳ細胞に導入する（例えば、スフェロプラスト融合によって）工程、ＥＳ細胞を胚盤胞に導入し、キメラ抗体を作製する工程、そして次に適切な交配を行い、ヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物を得る工程、を包含する。例えば、米国特許第５，９９４，６１９号を、参照のこと。
【００７７】
（ヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物）
組込まれたヒトλ軽鎖遺伝子座を有する宿主動物は、機能する抗体を産生することに関する、必要な酵素および他の因子を提供する。従って、生殖系列再編成、スプライシング、体細胞変異などと関わるこれらの酵素および他の因子は、宿主において働き、実質的に内因性抗体が存在しない状態において、完全なトランスジェニック抗体を、作製する。
【００７８】
従って、本発明は、ヒトλ軽鎖を発現し得る、ヒトλ軽鎖遺伝子座を含むキメラ動物およびトランスジェニック動物を、提供する。好ましい実施形態において、本発明は、ヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物を、提供し、ここで、このヒトλ軽鎖遺伝子座は、安定的にこの非ヒト動物において組込まれ、生殖系列伝達し得る。この動物は、ヒト遺伝子座についてのヘテロ接合体またはホモ接合体になり得るが、好ましくはホモ接合体になる。これらの動物は、完全なヒト抗体およびそのフラグメントを産生すること、薬物のスクリーニング、遺伝子療法、ヒト疾患の動物モデル、および遺伝的制御の動物モデルを含む、広範な種々の目的で使用され得る。
【００７９】
一実施形態において、本発明は、Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子、および定常領域遺伝子を含む、実質的に完全なヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物を、提供する。別の実施形態において、本発明は、５００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物を、提供する。より好ましい実施形態において、このトランスジェニック動物は、６００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含み、より好ましくは７００ｋｂと０．９Ｍｂとの間、さらにより好ましくは、８００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。より好ましい実施形態において、このトランスジェニック動物は、およそ０．９Ｍｂのヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。
【００８０】
好ましい実施形態において、ヒトλ軽鎖遺伝子座を含む動物は、実質的に不活性化された内因性重鎖遺伝子座についてのヘテロ接合体またはホモ接合体である。別の好ましい実施形態においては、この動物は、実質的に不活性化された内因性κ軽鎖遺伝子座についてのヘテロ接合体またはホモ接合体である。別の好ましい実施形態においては、この動物は、実質的に不活性化された内因性λ軽鎖遺伝子座についてのヘテロ接合体またはホモ接合体である。別の好ましい実施形態においては、この動物は、Ｖ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子および定常領域遺伝子を含むヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、さらに含む。別の好ましい実施形態においては、この動物は、Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子および定常領域遺伝子を含むトランスジェニック免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を、さらに含む。
【００８１】
より好ましい実施形態において、本発明は、以下を含むトランスジェニック動物を、提供する：実質的に不活性化された内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座および免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座、ならびに、必要に応じて、実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座；Ｖ領域遺伝子、Ｄ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子および定常領域遺伝子を含むヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座；Ｖ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子および定常領域遺伝子を含むヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座；およびＶ領域遺伝子、Ｊ領域遺伝子および定常領域遺伝子を含むヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座。好ましい実施形態において、この実施形態のトランスジェニック動物は、５００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。より好ましい実施形態において、このトランスジェニック動物は、６００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含み、より好ましくは７００ｋｂと０．９Ｍｂとの間、さらにより好ましくは、８００ｋｂと０．９Ｍｂとの間のヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。さらにより好ましい実施形態において、このトランスジェニック動物におけるヒトλ軽鎖遺伝子座は、実質的に全ての全長ヒトλ軽鎖遺伝子座を含む。
【００８２】
別の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、ヒトλ軽鎖遺伝子座をＶＪ組換えのために標的化し、そしてヒトλ軽鎖遺伝子座を発現させ得る。好ましい実施形態において、ヒト重鎖遺伝子座は、トランスジェニック動物において、発現され得る。別の好ましい実施形態において、ヒトκ軽鎖遺伝子座は、トランスジェニック動物において、発現され得る。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座および／またはκ軽鎖遺伝子座の実質的な不活性化は、遺伝子座への遺伝的損傷の導入の結果である。より好ましい実施形態において、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の実質的な不活性化は、内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座および免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のＪ領域に遺伝的損傷を含む。別の好ましい実施形態において、内因性軽鎖遺伝子座の実質的な不活性化は、内因性軽鎖遺伝子座の定常領域および／またはＪ領域に遺伝的損傷を含む。
【００８４】
好ましい実施形態において、このトランスジェニック動物は、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である。より好ましい実施形態において、このトランスジェニック動物は、マウスまたはラットである。さらにより好ましい実施形態において、このトランスジェニック動物は、マウスである。
【００８５】
ヒトλ軽鎖遺伝子座が、トランスジェニック動物に導入されることが好ましいが、本明細書の教示を理解する当業者はまた、ヒト以外の種由来のλ軽鎖も、トランスジェニック動物に導入し得る。望ましい種の例としては、類人猿、サル、他の非ヒト霊長類、ペット用動物（イヌおよびネコなど）、および農業的に有用な動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、およびブタなど）が、挙げられる。
【００８６】
実質的に不活性化された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む動物は、Ｂリンパ球免疫グロブリンレセプターを産生し得ず、Ｂリンパ球系細胞の発達における初期の遮断を生じる。トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座は、この欠損を補い、Ｂリンパ球細胞またはその子孫細胞を発達させる。従って、好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるトランスジェニック動物は、実質的に不活性化された免疫グロブリン遺伝子座を含み、再構築された一次Ｂリンパ球または二次Ｂリンパ球の集団をさらに含む。ここで、集団のレベルは、野生型動物のレベルの５％〜２０％、野生型動物のレベルの２０％〜４０％、野生型動物のレベルの４０％〜６０％、野生型動物のレベルの６０％〜８０％、野生型動物のレベルの８０％〜１００％、または野生型動物のレベルの１００％〜２００％である。
【００８７】
（抗体の産生と抗体産生細胞）
本発明のトランスジェニック動物、またはこれに由来するＢリンパ球は、ヒトλ軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を産生するために、使用され得る。さらに、本発明の動物に由来するＢリンパ球は、モノクローナル抗体を産生する細胞株を作製するために使用され得る。一実施形態において、Ｂリンパ球は、不死化される。不死化は、当該分野で公知の任意の手段によって達成され得る。この手段としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：骨髄腫細胞との融合によるハイブリドーマの産生；癌原遺伝子を用いたトランスフェクション；腫瘍ウイルスによる感染；および腫瘍抑制遺伝子の不活性化。不死化細胞は、抗体の産生のために連続的な培養により増殖させられ得るか、あるいは、目的の抗体を含む腹水の産生のために適した宿主動物の腹膜に導入され得る。
【００８８】
あるいは、目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする再編成された遺伝子は、本発明の免疫化トランスジェニック動物由来の一次細胞、またはこのような一次細胞に由来する不死化細胞から単離され得、組換え的に発現される。再編成された抗体遺伝子は、適切なｍＲＮＡから逆転写され、ｃＤＮＡを産生し得る。重鎖および軽鎖をコードする核酸分子は、ベクター上に含まれる発現系に挿入され得、標準的な組換え宿主細胞にトランスフェクションされ得る。以下で記載されるように、種々のこのような宿主細胞が、使用され得、その主な判定基準は、発現制御配列との適合性である。
【００８９】
抗体の産生は、次いで、改変された組換え宿主細胞を、宿主細胞の増殖と、コード配列の発現に適切な条件下で培養することにより行われる。抗体は、次いで培養物から回収される。好ましくは、発現系は、シグナルペプチドを含むように設計され、それにより、発現された抗体は、培養液中に分泌される。しかし、細胞内産生もまた、可能である。
【００９０】
好ましい一実施形態において、本発明のトランスジェニック動物は、目的の抗体で免疫化され、一次細胞（例えば、脾臓細胞、または末梢血細胞）が、免疫化トランスジェニック動物から単離され、そして所望の抗原に特異的な抗体を産生する細胞それぞれが、同定される。それぞれの細胞由来のポリアデニル化ｍＲＮＡが、単離され、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が、可変領域配列にアニールするセンスプライマー（例えば、ヒトＶＨ遺伝子またはＶλ遺伝子のＦＲ１領域の大部分または全てを認識する縮重プライマー）、および定常領域配列または連結領域配列にアニールするアンチセンスプライマーを使用して、行われる。ＶＨｃＤＮＡまたはＶλｃＤＮＡは、次いで、クローン化され、任意の適切な宿主細胞（例えば、骨髄腫細胞）において、それぞれの免疫グロブリン定常領域（重鎖およびλ定常ドメインなど）を有するキメラ抗体として、発現される。Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−４８（１９９６）（本明細書中で、参考として援用される）を、参照のこと。
【００９１】
別の実施形態において、所望の抗原に対して様々な親和性を有する抗体のレパートリーを含むライブラリーを産生するための、ファージディスプレイ技術が、有利である。このようなレパートリーの産生のために、免疫化動物由来のＢ細胞を不死化することは、不要である。むしろ、一次Ｂ細胞が、ＤＮＡの供給源として、直接的に使用され得る。Ｂ細胞（例えば、脾臓由来のＢ細胞）から得られたｃＤＮＡの混合物は、発現ライブラリー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにトランスフェクトされたファージディスプレイライブラリー）を調製するために、使用される。生じた細胞は、望ましい抗原に対する免疫反応性について、試験される。このようなライブラリー由来の高親和性ヒト抗体を、同定するための技術は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：３２４５−３２６０（１９９４）；Ｎｉｓｓｉｍら（同書）ｐｐ．６９２−６９８およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓら，同書，１２：７２５−７３４によって、記載される。最後に、ライブラリーから得られた、抗原に対する所望の大きさ（ｍａｇｎｉｔｕｒｅ）の結合親和性を生じるクローンが同定され、そして、このような結合の原因である産物をコードするＤＮＡが、回収され、標準的組換え発現により操作される。ファージディスプレイライブラリーはまた、事前に操作されたヌクレオチド配列を使用して構築され得、そして同様の様式で、スクリーニングされ得る。一般に、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡは、独立的に供給されるか、またはファージライブラリーにおいて結合し、産生のためのＦｖアナログを形成する。
【００９２】
ファージライブラリーは、次いで、抗原および適切なクローンから回収された遺伝物質に対して最高の親和性を有する抗体について、スクリーニングされる。さらに回数を重ねたスクリーニングは、単離された元の抗体の、親和性を増大させ得る。
【００９３】
一実施形態において、本発明は、ポリクローナルヒト抗血清、およびヒトλ軽鎖を含む単離されたポリクローナル抗体を、産生する方法を、提供する。この方法は、目的の抗原を用いて本発明のトランスジェニック動物を免疫化する工程、トランスジェニック動物においてこの抗原に対する免疫応答を誘導する工程、この動物から血清を単離し、ポリクローナルヒト抗血清を得る工程、および、必要に応じて、抗血清からポリクローナル抗体を単離する工程を、包含する。当該分野に周知の技術を用いて、単離された抗血清および単離されたポリクローナル抗体が得られ得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら（既出）を、参照のこと。一実施形態において、抗体は、例えば、Ｆｃ結合部分を有するアフィニティカラム（プロテインＡまたはプロテインＧなど）を使用して、単離される。当該分野に公知の方法を使用して、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）を、さらに産生し得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら（既出）を、参照のこと。
【００９４】
本発明は、特定の抗原に対するヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生する細胞株を、産生する方法を提供する。この方法は、以下の工程を、包含する：
ａ．  本明細書中に記載されるトランスジェニック動物を、目的の抗原を用いて免疫する工程；
ｂ．  このトランスジェニック動物において、この抗原に対する免疫応答を誘導する工程；
ｃ．  このトランスジェニック動物からＢリンパ球を単離する工程；
ｄ．  このＢリンパ球を不死化する工程；
ｅ．  個々の不死化Ｂリンパ球のモノクローナル集団を作製する工程；および
ｆ．  この不死化Ｂリンパ球をスクリーニングし、抗原に対する抗体を同定する工程、を、包含する、方法。
【００９５】
好ましい実施形態において、不死化する工程は、Ｂリンパ球と、ＮＳＯ−ｂｃｌ２株（Ｓ．Ｒａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５５４８−５５５１（１９９４））またはＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣから入手可能）などの適切な骨髄腫細胞株とを融合させ、ハイブリドーマ細胞株を産生することによって、達成される。別の実施形態において、不死化Ｂリンパ球は、細胞により産生された上清を、望ましい抗体の存在についてアッセイすることにより、スクリーニングされる。アッセイ工程は、代表的に、ＥＬＩＳＡまたは放射免疫測定法（ＲＩＡ）であるが、任意のスクリーニング方法が、使用され得る。好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される方法により産生される、単離されたモノクローナル抗体を、提供する。
【００９６】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるトランスジェニック動物に由来する、一次細胞またはその子孫細胞を、提供する。本発明はまた、本明細書中に記載されるトランスジェニック動物に由来する、不死化細胞またはその子孫細胞も、提供する。好ましい実施形態において、不死化細胞またはその子孫細胞は、Ｂリンパ球の起源の細胞である。より好ましい実施形態においては、不死化細胞は、ハイブリドーマである。別の好ましい実施形態において、不死化細胞は、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、サル細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、モルモット細胞、または鳥細胞に由来する。
【００９７】
本発明は、上で記載されるトランスジェニック動物によって産生される抗体レパートリーを提供し、この抗体は、７×１０５〜１×１０１１の、異なった抗体の種を含む。別のより好ましい実施形態において、抗体レパートリーは、１×１０５〜１×１０７の、異なった抗体の種を含む。別のより好ましい実施形態において、抗体レパートリーは、１×１０７〜１×１０９の、異なった抗体の種を含む。別のより好ましい実施形態において、抗体レパートリーは、１×１０９〜１×１０１１の、異なった抗体の種を含む。
【００９８】
本発明は、本明細書中で記載されるトランスジェニック動物に由来する抗体を提供し、ここで、この抗体は、１×１０−７Ｍ未満の解離定数を有する。好ましい実施形態において、この解離定数は１×１０−８Ｍ未満、より好ましくは１×１０−９Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１０Ｍ未満、より好ましくは１×１０−１１Ｍ未満、そしてさらにより好ましくは１×１０−１２Ｍ未満または１×１０−１３Ｍ未満である。一般に、抗体は、１×１０−７Ｍ〜１×１０−１２Ｍの解離定数を、有する。
【００９９】
抗体の特異性（すなわち、抗原の広範なスペクトルおよびその独立したエピトープの広範なスペクトルに対する抗体を産生する能力）は、ヒトの重鎖（ＶＨ）遺伝子座、κ軽鎖（Ｖκ）遺伝子座およびλ軽鎖（Ｖλ）遺伝子座における可変領域遺伝子に依存することが、予測される。ヒト重鎖ゲノムは、免疫グロブリン分子のヒト重鎖の可変領域をコードする、およそ９５のＶＨ遺伝子（そのうち４１が機能的な遺伝子である）を、含む。ヒトκ軽鎖遺伝子座は、およそ４０のＶκ遺伝子（そのうち２５が機能的な遺伝子である）を含み、そしてヒトλ軽鎖遺伝子座は、およそ６９のＶκ遺伝子（そのうち３０が機能的な遺伝子である）を含み、再編成されたヒトＩｇλ転写物において、使用されることが見出されている。ヒト重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座は、多くの異なった機能的Ｊ領域をさらに含み、およびヒト重鎖については、多くの異なった機能的Ｄ領域をさらに含む。表１を参照のこと。
【０１００】
本発明に従い、ヒトλ軽鎖遺伝子座の全てまたは一部分を含む、トランスジェニックマウスもまた、提供される。ここで、この部分は、６０％より大きく、より好ましくは７０％または８０％より大きく、そしてさらにより好ましくは９０％または９５％より大きい。好ましくは、ヒトλ遺伝子座は、少なくとも２つ以上の、好ましくは３つ全てのλ遺伝子クラスターを含む。好ましい実施形態において、λ遺伝子座は、Ｖλ遺伝子ファミリーＩ、ＩＶ−ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ由来の遺伝子を含む。より好ましい実施形態において、λ遺伝子座は、全ての１０のＶλ遺伝子ファミリー由来の遺伝子を含む。
【０１０１】
本発明は、ヒト重鎖遺伝子座の実質的な部分を有するトランスジェニックマウスをさらに含む。その上さらに、このトランスジェニック動物は、ヒトκ軽鎖遺伝子座を含む。従って、好ましい実施形態においては、ヒトのＶＨ遺伝子およびＶκ遺伝子の１０％以上が、存在する。より好ましくは、ＶＨ遺伝子およびＶκ遺伝子の約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％またはさらに７０％またはそれ以上が、存在する。好ましい実施形態において、Ｖκ軽鎖遺伝子座の近位の領域由来の３２の遺伝子、ＶＨ重鎖遺伝子座上の６６の遺伝子、およびＶλ軽鎖遺伝子座上の６９の遺伝子を含む構築物が、使用される。理解されるように、遺伝子は、配列順に（すなわち、ヒトゲノムにおいて見出される順序で）、もしくは非配列順で（すなわち、ヒトゲノムにおいて見出される以外の順序で）、またはこれらの組み合わせで、含まれ得る。従って、一例として、ＶＨ遺伝子座、Ｖκ遺伝子座およびＶλ遺伝子座のいずれかの配列部分全体が、使用され得るか、もしくは、ＶＨ遺伝子座、Ｖκ遺伝子座およびＶλ遺伝子座における種々のＶ遺伝子は、全体の配列編成を維持しつつ、省略され得るか、または、ＶＨ遺伝子座、Ｖκ遺伝子座およびＶλ遺伝子座におけるＶ遺伝子は、再配列され得る。好ましい実施形態において、挿入された遺伝子座全体が、実質的に、ヒトにおいて見出されるような生殖系列構造において、提供される。ＶＨ遺伝子座、Ｖκ遺伝子座およびＶλ遺伝子座由来の遺伝子の様々な群を含むことは、増大された抗体特異性、および結局は増大された抗体親和性に導く。
【０１０２】
さらに、好ましくは、このようなマウスは、ＤＨ領域全体、ＪＨ領域全体、ヒトμ定常領域を含み、かつ追加の抗体のアイソタイプをコードするため、またはこれらのアイソタイプを産生するための他のヒト定常領域を、付加的に備え得る。このようなアイソタイプは、γ１、γ２、γ３、γ４、α、ε、およびδをコードする遺伝子、ならびに適切な交換配列または調節配列を有する他の定常領域コード遺伝子を、含み得る。理解されるように、そして以下でより詳細に議論されるように、種々の交換配列または調節配列は、任意の特異的な定常領域選択に関連して、適切に利用され得る。
【０１０３】
表１は、ランダムなＶ−Ｄ−Ｊ連結およびκ軽鎖との組み合わせに厳格に基づいた、ヒトにおいて起こり得る抗体の組み合わせの多様性を示す（Ｎ−付加、欠失または体細胞突然変異を考慮しない）。これらの考察に基づき、任意の特異的なアイソタイプの、１×１０−６の抗体の組み合わせが、ヒトにおいて起こり得る。
【０１０４】
【表１】
2013198489.tif 000002
【０１０５】
【表２】
2013198489.tif 000003
表１において提供された計算は、Ｎ−付加または体細胞突然変異を計算に入れていない。従って、本発明に従うマウスは、実質的な抗体多様性を提供することが、理解される。
【０１０６】
ヒトλ軽鎖遺伝子座の可変領域を含むことによる可変領域の種類および数の増加は、抗体の多様性および抗体の特異性を増大させる。本発明に従うトランスジェニック動物は、従って、それぞれの抗原または免疫原において、広範な群のエピトープを含む広範な群の抗原に対して、免疫応答を引き起こし得る。本発明に従って産生される抗体はまた、増大された親和性を保有する。
【０１０７】
（核酸、ベクター、宿主細胞および抗体を作製する組換え方法）
本発明は、トランスジェニック動物から単離された核酸分子を提供し、ここで、この単離された核酸分子は、ヒトλ軽鎖ポリペプチドまたはその抗原結合部位をコードする。好ましい実施形態において、この核酸分子は、ヒトλ軽鎖を産生するＢリンパ球またはその子孫細胞から単離される。好ましい実施形態において、Ｂリンパ球の子孫細胞は、ハイブリドーマである。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、ヒト抗体の１〜３の間のＣＤＲ領域をコードする配列を含む。好ましい実施形態において、単離された核酸は、ヒトλ軽鎖ポリペプチドまたは目的の特定の抗原に結合するその抗原結合部分をコードする。
【０１０８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される核酸分子またはそのフラグメントを含むベクターを、提供する。より好ましい実施形態において、このベクターは、核酸分子に作動可能に連結された発現制御配列を、さらに含む。本発明はまた、トランスジェニック動物から単離された核酸分子またはこの核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞も、提供する。ここで、この核酸分子は、目的の抗原に特異的に結合するヒトλ軽鎖またはその抗原結合部位を、コードする。
【０１０９】
本発明はさらに、トランスジェニック動物から単離された、ヒト重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子ならびにヒトλ軽鎖もしくは目的の抗原に結合するその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、またはこれらの核酸分子を含むベクターを含む単離された宿主細胞を提供する。
【０１１０】
好ましい実施形態において、宿主細胞は、ハイブリドーマ細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞および哺乳類細胞である。より好ましい実施形態において、宿主細胞は、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、サル細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、モルモット細胞、または鳥細胞である。より好ましい実施形態において、哺乳類細胞細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＮＳ／０細胞、またはＣＯＳ細胞である。
【０１１１】
本発明は、トランスジェニック動物から同定され、そして目的の抗原に特異的に結合する、ヒトλ軽鎖もしくはその抗原結合部位、またはヒトλ軽鎖およびヒト重鎖もしくはこれらの抗原結合部位の両方を、組換え的に産生する方法を、提供する。この方法は、本明細書中で記載される、宿主細胞を核酸分子が発現される条件下で培養する工程を、包含する。
【０１１２】
本発明は、本明細書中で記載される核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供し、ここで、この非ヒトトランスジェニック動物は、この核酸分子を発現する。
【０１１３】
本発明は、目的の抗原に特異的に結合するヒト抗体の、免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合部位をコードする単離された核酸分子、および免疫グロブリンλ軽鎖またはその抗原結合部位をコードする単離された核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供し、ここで、この動物は、この核酸分子を発現する。好ましい実施形態において、本明細書中で記載される非ヒトトランスジェニック動物は、マウス、ラット、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ハムスター、ウサギ、ウマ、ヒツジ、モルモット、または鳥である。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子またはその一部分の発現によって生じるヒト抗体は、動物のＢリンパ球またはその子孫細胞に由来する細胞の表面上において、発現される。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子またはその一部分の発現によって生じるヒト抗体は、動物のリンパ球、血液、乳、唾液、または腹水に分泌される。
【０１１４】
以下の実施例は、説明として提示されるのであって、限定としては提示されない。本明細書中で使用される手段および一般的方法は、Ｂｉｒｒｅｎら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（本明細書中で参考として援用される）において記載される。ＹＡＣのクローニング、単離、操作および分析についての手段および一般的方法は、Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌｕｍｅ３，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５およびＡｐｐｅｎｄｉｃｅｓ  １−５（本明細書中で参考として援用される）において記載される。
【実施例１】
【０１１５】
（ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列を含むＹＡＣの同定）
ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の部分および全てのＶλおよびＣλについてのプローブを含むＹＡＣは、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＲＣ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫ）から得た。Ｌ１  ＹＡＣおよびＬ２  ＹＡＣを、最初に、以下の目的で分析した：（１）正確なヒト免疫グロブリンλ遺伝子座の存在を確認するため；（２）免疫グロブリンλ遺伝子配列の安定性を評価するため；（３）免疫グロブリンλ遺伝子配列の方向付けの決定するため；（４）ＹＡＣにおける酵母マーカーの存在を確認するため。
【０１１６】
ＹＡＣを含む酵母を、ＳＣ−ＵＲＡ寒天培地上に、個別のコロニーを得るために線状に培養し（Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．５８６−８７を参照）、そして３〜４日、３０℃で、コロニーが出現するまでインキュベートした。単一のコロニーを、５ｍＬのＳＣ−ＵＲＡ液体培地中に接種し、飽和するまで増殖させた。凍結ストックおよびＤＮＡ調製物を、作製した（酵母プラグ）。Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．３９１−３９５を参照のこと。
【０１１７】
ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ＤＮＡの存在および完全性を確認するため、ＣＨＥＦ−ＤＲＩＩ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、非切断のＬ１およびＬ２のＹＡＣ  ＤＮＡを、パルスフィールドゲル電気泳動法（ＰＦＧＥ）にかけた。ＤＮＡを、０．８％アガロース／０．５×ＴＢＥゲルを通して２００ボルトで電気泳動し、そしてサイズマーカーとして使用した重合体化λＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０）と比較した。ゲルを、交流の６０秒パルスに１５時間晒し、次いで９０秒パルスに１０時間晒した。電気泳動の後、ゲルを、ＥｔＢｒを用いて染色し、撮影し、０．２Ｎ  ＨＣｌ中で脱プリン化させ、そしてＮａＯＨを用いて変性させた。
【０１１８】
ゲル中のＹＡＣ  ＤＮＡを、ナイロンメンブレン（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ，ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）にトランスファーし、そしてメンブレンを、標準的技術を使用してプローブ検出し（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｌ１  ＹＡＣおよびＬ２  ＹＡＣのサイズを決定した。このプローブは、ｐＹＡＣ４（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ０１０８６）の５．４ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（ヌクレオチド６００８〜１１４５４）の３２Ｐ−標識化ＴＲＰ遺伝子であった。サザンブロット分析は、Ｌ１  ＹＡＣが、およそ１Ｍｂであり、Ｌ２  ＹＡＣが、およそ４５０ｋｂであることを、明らかにした。その上、Ｌ１  ＹＡＣにおける免疫グロブリンλ軽鎖配列が、４８時間の間、安定であることを見出した（Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．５８６−８７を参照）。
【０１１９】
ＹＡＣの大規模構造の分析に続き、Ｌ１  ＹＡＣおよびＬ２  ＹＡＣのＤＮＡ分子を、ＥｃｏＲＩ切断およびサザンブロッティングにより分析し、生殖系列Ｖλ遺伝子の存在を確認した。Ｌ１  ＹＡＣ  ＤＮＡをＭｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌから得られたＶλ配列を用いてプローブ検出した時、Ｆｒｉｐｐｉａｔら（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：９８７−９９１（１９９５））の開示により予想されたのと一致するバンドを観察し、Ｌ１  ＹＡＣが、Ｖλ遺伝子の大半を有することを、確認した。プローブは、当業者によって容易に産生され得る。例えば、Ｆｒｉｐｐｉａｔら，ｐｇ．９８４（既出）、Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：２５０−２６１（１９９７）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０−２３２（１９９６），ｐｐ．２２６−２２９を、参照のこと。これらは、Ｖλ遺伝子に由来するプローブを記載する。しかし、Ｌ１  ＹＡＣは、Ｖλ／ＪＣ連結部の３’末端の再編成（ＡｓｃＩ部位の欠失により明らかになった）、および、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０−２３２（１９９６））の従来技術により、Ｖλ遺伝子（３ａ２、２ａ１  ４ｃ、３ｑおよび３ｒ）の欠失を含む。図１を参照のこと。
【０１２０】
Ｌ２  ＹＡＣをＶλ配列によりプローブ検出した時、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の３’末端から、Ｌ１  ＹＡＣの３’末端上で再編成された生殖系列Ｖλ領域を含む１１Ｖλ遺伝子を、検出した。Ｌ２  ＹＡＣはまた、生殖系列Ｊλ遺伝子およびＣλ遺伝子も含むことが、見出された。
【０１２１】
Ｌ１およびＬ２のＹＡＣアームの方向付けを、サザンブロット分析により、決定した。Ｌ１  ＹＡＣ  ＤＮＡおよびＬ２  ＹＡＣ  ＤＮＡを、ＰｍｅＩ、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＲｓｒＩＩ、およびＭｌｕＩを用いて切断した。切断したＤＮＡを、ＰＦＧＥにより分離し、そして次いでナイロンメンブレンにトランスファーした（本質的に上で記載されるように）。このブロットを、Ｃλ配列、免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー、アンピシリン遺伝子配列、およびＵＲＡ３遺伝子配列を用いて連続的にプローブ検出し、そして参考の方向付けと比較した。Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｇｅｎｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：２５０−２６１（１９９７）を、参照のこと。Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．４１７−４２０もまた、参照のこと。Ｌ１  ＹＡＣアームおよびＬ２  ＹＡＣアームの方向付けは、互いに反対であり、従って、直接の組換えには適切でない。
【実施例２】
【０１２２】
（全長ヒト生殖系列免疫グロブリンλ遺伝子座を含むＹＡＣ構築物）
生殖系列ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の全体を単一のＹＡＣ上で再構築するため、Ｌ２  ＹＡＣ配列を、Ｌ１  ＹＡＣ配列と、適切な向きで再結合しなければならなかった。λ遺伝子座におけるヌクレオチドに番号をつけるため、完全なヌクレオチド配列（Ｋａｗａｓａｋｉ（既出））を使用した。Ｋａｗａｓａｋｉのコンティーグ地図に、Ｇｅｎｂａｎｋ（Ａｗｗｗ．ｎｃｂｉ，ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＧｅｎｂａｎｋＳｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌ）からアクセスし、近接の１Ｍｂの核酸配列内に、ベクターＮＴＩソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて再集合させた。この配列は、第一Ｖλ遺伝子の５’およそ１２５ｋｂを含み、そして３’エンハンサーまでを含む。
【０１２３】
（ｐＹＡＣ−５’およびｐＹＡＣ−３’の構築物）
第一工程は、Ｌ２  ＹＡＣを、Ｌ１  ＹＡＣとの組換えに適切な、短縮されたアームを含むように、改変する工程であった。図２を参照のこと。本発明者らは、Ｌ２  ＹＡＣの５’末端および３’末端の両方についての標的ベクター（それぞれｐＹＡＣ−５’およびｐＹＡＣ−３’）を構築し、１１５ｋｂのＹＡＣを形成した。
【０１２４】
ｐＹＡＣ−５’を構築し、Ｌ２  ＹＡＣの５’末端を標的化するため、Ｌ２  ＹＡＣ  ＤＮＡの１，３３０ｂｐのフラグメント部分を、ＰＣＲによって増幅させ、次いで、ｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローン化させた。ＰＣＲのために使用した５’プライマー配列は、５’−ＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＴＴＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＧ−３’および方向限定クローニングのための合成ＲｓｒＩＩ部位を、含んだ。使用した３’プライマー配列は、５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＡＴＣＴＴ−３’および方向限定クローニングのための合成ＦｓｅＩ部位を、含んだ。
【０１２５】
標的ベクターをｐＹＡＣ４において構築した。このｐＹＡＣ４は、ＹＡＣを構築するために一般的に使用されるベクターであり、ＡＲＳ配列、ＣＥＮ配列、テロメア配列、ＵＲＡ配列およびＴＲＰ配列を含む（ＫｕｈｎおよびＬｕｄｗｉｇ，Ｇｅｎｅ  １４１：１２５−７（１９９４）を参照のこと）。ｐＹＡＣ−５’を構築するため、ｐＹＡＣ４をＮｏｔＩで切断し、そしてアニールされたリンカー（制限酵素サイトＮｏｔＩ（不活性化）−ＲｓｒＩＩ−ＮｒｕＩ−ＣｌａＩ−ＦｓｅＩ−ＮｏｔＩ、ならびに配列５’−ＧＧＣＣＡＴＣＧＧＡＣＣＧＴＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＴＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣ−３’、および５’−ＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＴＣＧＡＴＴＣＧＣＧＡＣＧＧＴＣＣＧＡＴ−３’を有する）と連結させた。これは、ＲｓｒＩＩ、ＮｒｕＩ、ＣｌａＩ、ＦｓｅＩおよびＮｏｔＩ部位を含む、多数のクローニング部位を有する、ｐＹＡＣ４由来ベクターを産生した。リンカーの方向を、ＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ切断により、確認した。次いで、Ｌ２  ＹＡＣ  ５’相同性フラグメントを、ＲｓｒＩＩ／ＦｓｅＩカセットとしてｐＣＲ２．１から単離し、そしてｐＹＡＣ由来ベクターのＲｓｒＩＩ部位およびＦｓｅＩ部位に連結させた。ｐＹＡＣ−５’の方向付けおよび挿入部分を、制限切断分析によって確認した。
【０１２６】
ｐＹＡＣ−３’を構築するため、３’エンハンサーのＬ２  ＹＡＣ  ３’の１，３１０ｂｐフラグメントを、ＰＣＲにより増幅させ、ｐＣＲ２．１クローニングベクター内にクローン化させた。ＰＣＲのための５’プライマー配列は、５’−ＡＣＧＣＧＴＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＣＡＧＧＣＣＴ−３’および方向限定クローニングのための合成ＭｌｕＩ部位を含んだ。３’プライマー配列は、５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’および方向限定クローニングのための合成ＦｓｅＩ部位を含んだ。ｐＹＡＣ４を、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩを用いて切断し、そしてＣＥＮ領域、ＡＲＳ領域、およびＴＲＰ領域ならびにテロメア領域を含む５．５ｋｂベクターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法により単離し、アニールされたリンカー（制限酵素サイトＮｏｔＩ（不活性化）−ＢｇｌＩＩ−ＦｓｅＩ−ＮｒｕＩ−ＣｌａＩ−ＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ（不活性化）、ならびに配列５’−ＧＧＣＣＡＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＣＧＣＧＡＡＴＣＧＡＴＡＣＧＣＧＴＧＣ−３’、および５’−ＧＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＴＣＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴ−３’を有する）と連結させた。次いで、Ｌ２  ＹＡＣ  ３’相同性フラグメントを、ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩカセットとして単離し、そして生じたベクターのＮｏｔＩ部位およびＢａｍＨＩ部位に連結させた。生じた中間産物プラスミドを、ｐＹＡＣ−３’ｉｎｔ２と名付け、制限切断分析によって確認した。リンカーは方向限定的にクローン化させたため、リンカーの向きは確認しなかった。
【０１２７】
ｐＹＡＣ４と異なり、ｐＹＡＣ−３’ｉｎｔ２は、ＵＲＡアームを欠き、およそ５ｋｂ短い。ｐＹＡＣ−３’ｉｎｔ２を、ＡａｔＩＩを用いて切断し、ＡａｔＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＡａｔＩＩリンカーを、ＡａｔＩＩ部位にクローン化させた。最終的なｐＹＡＣ−３’標的ベクターを構築するため、生じたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて切断し、（これによりＴＲＰ遺伝子の部分を除去し、）そしてｐＬＵＳプラスミド由来のＬＹＳ２遺伝子（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７７４０７；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：４９４３−４９４８（１９９１））を含む４．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩカセットと連結させた。
【０１２８】
（クローン６−２３の構築）
Ｌ２  ＹＡＣを含む酵母を、ｐＹＡＣ−５’標的ベクターおよびｐＹＡＣ−３’標的ベクターを用いて、形質転換させた。酵母を、まずＳＣ−ＵＲＡ液体培地中で２４時間、３０℃でインキュベートし、次いで、ＹＰＤＡ培地中で４〜５時間、３０℃でインキュベートした。細胞を、ＢａｍＨＩ直鎖化ｐＹＡＣ−３’およびｐＹＡＣ−５’由来の５ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＦｓｅＩフラグメント（ＵＲＡアーム）と同時に、ＬｉＡｃ形質転換手順を使用して、形質転換した。Ｓｃｈｅｉｓｔｌら，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３３９−３４６（１９８９）を、参照のこと。形質転換株を、ＳＣ−ＬＹＳ寒天培地上でプレート培養（室温で４〜５日、クローンが出現するまでインキュベートする）した。
【０１２９】
クローンを選び取り、そしてＳＣ−ＬＹＳプレートおよびＳＣ−ＴＲＰプレート上で増殖させ、ＹＡＣ組換え体（ＵＲＡ＋、ＬＹＳ＋、ＴＲＰ−）を同定した。図２を参照のこと。クローンの回収後、ＹＡＣ  ＤＮＡを、単離し、ＰＰＧＥにより試験して改変されたＬ２ＹＡＣの大きさを見積もり、そしてＶλプローブを使用したサザンブロット分析により、Ｃλ遺伝子（ＨｉｎｄＩＩＩ切断およびＢａｍＨＩ切断）、Ｖλ遺伝子（ＥｃｏＲＩ切断）、およびλエンハンサー（ＳｔｕＩ切断）の存在を確認した。短縮されたＬ２  ＹＡＣは、およそ１１５ｋｂの大きさであり、クローン６−２３と名付けられた。図２を参照のこと。
【０１３０】
（クローン６−２３の遺伝的分析）
ＹＡＣ６−２３を、ＹＰＨ９２５株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２  ｌｙｓ２−８０１  ａｄｅ２−１０１  ｈｉｓ３，ＡＴＣＣ  ＃９０８３４）内に送達した。ＹＰＨ９２５および６−２３ＹＡＣ（ＭＡＴａ）を、ＹＰＤＡプレート上で、およそ１ｃｍ２のパッチに、３０℃で一晩増殖させた。翌朝、これらをＹＰＤＡプレート上で合わせ、３０℃で６時間、増殖させた。生じた一倍体と二倍体との混合物を、ＳＣ−ＵＲＡ−ＬＹＳ−ＨＩＳプレートに移した。このプレートは、生じた二倍体ではなく、両一倍体に対する選択を提供する（一倍体中の２つのＨＩＳ対立遺伝子の相補性による）。この細胞を、個々のコロニーが現れるまで、２日間３０℃でインキュベートした。６つの独立したコロニーを選び出し、ＹＰＤＡプレート上のおよそ１ｃｍ２のパッチで増殖させ、一晩インキュベートし、胞子形成プレート上にレプリカをプレート培養し、そして室温で４〜５日インキュベートした。Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．４９５−５０１を、参照のこと。
【０１３１】
細胞を、胞子形成について顕微鏡的に試験した（胞子形成は、５％以上であった）。胞子形成された細胞を、ＳＣ−ＵＲＡ−ＬＹＳプレート上で４〜５日増殖させた。このプレートは、カナバニンおよびシクロヘキシミドを用いて補強されたプレートであり、これにより、二倍体の形成を防ぎ、そして６−２３ＹＡＣを保有する細胞を選択した。さらなる分析のために、コロニーを選び出し、ＳＣ−ＬＹＳ培地中で増殖させた。
【０１３２】
接合型を、接合クローン（ｍａｔａ  ｃｌｏｎｅ）を同定するために設計されたＰＣＲアッセイにより、調べた。Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．４４２を参照のこと。プライマー配列は、５’−ＡＧＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＧＴＴＡＴＧＧ−３’；５’−ＧＣＡＣＧＧＡＡＴＡＴＧＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＧ−３’；および５’−ＡＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡＡＧＡＧＴＴＴＧ−３’であった。Ｈｕｘｌｅｙら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：５６３−５６９（１９９０）を、参照のこと。クローンのおよそ半分は、ａ接合型（ａ−ｍａｔｉｎｇ  ｔｙｐｅ）であり、そして半分は、ａ接合型であった。
【０１３３】
ＭＡＴａクローンがインタクトな６−２３ＹＡＣに保有されることを確認するため、これらをＰＦＧＥおよびサザンブロット分析により（上の実施例１において記載されるように）、さらに分析した。この結果は、６−２３  ＹＡＣがインタクトであり続け、そして株がＬ１  ＹＡＣクローンと接合する準備ができていたことを、示した。
【０１３４】
６−２３クローンを、カナバニン（ＣＡＮ）およびシクロヘキシミド（ＣＹＨ）に対する耐性について、さらに分析した。カナバニンおよびシクロヘキシミドは、Ｌ１  ＹＡＣ保有クローンの接合の後の一倍体の選択、および胞子形成のために使用した。Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｐ．４９５−５０１を参照のこと。
【０１３５】
（ｂｃｌ−ａのｐＹＡＣ−５’への導入）
ＥＳ細胞への導入およびトランスジェニックマウスの生殖系列への導入の後に、免疫グロブリンλＹＡＣのコピーの数を決定するため、短縮されたｂｃｌ−ａ遺伝子もまた、ｐＹＡＣ−５’の中にクローン化させた。遺伝子を、配列５’−ＧＧＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＡＣＴＴ−３’の第一プライマー、および配列５’−ＣＣＣＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＧＴＧＡ−３’の第二プライマーを使用したマウスＤＮＡのＰＣＲ増幅により、得た。ＰＣＲ増幅された産物を、次いで、ｐＣＲ２．１クローニングベクターに、クローン化させた。ｂｃｌ−ａ遺伝子を含むプラスミドを、次いで、ＮｓｉＩを用いて切断し、ＮｓｉＩ−ＮｓｉＩフラグメントを捨て、そしてこのプラスミドを連結させ、１７３ｂｐ  ｂｃｌ−ａ配列を作製した。ｐＣＲ２．１における分断されたｂｃｌ−ａ遺伝子の向きを、制限切断分析により、決定した。
【０１３６】
生じたプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いて切断し、末端をＫｌｅｎｏｗフラグメントを用いて埋め、そしてＡｐａＩを用いて切断した。１７０ｂｐ  ｂｃｌ−ａフラグメントを、単離し、ｐＹＡＣ−５’ベクターのＮｒｕＩ部位およびＡｐａＩ部位にクローン化させた（上の実施例２で記載したように）。
【０１３７】
（ＨＰＲＴのＬ１  ＹＡＣへの導入）
非ヒト動物ＥＳ細胞を、ＹＡＣを保有する酵母スフェロプラストと融合させ、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を有するＥＳ細胞を作製することは、内因性ＨＰＲＴ機能について陰性であるＥＳ細胞における選択のための哺乳類選択可能マーカー（例えば、ＨＰＲＴ）を含むＹＡＣにより、容易にされる。従って、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のマウスＥＳ細胞への導入の、効果的な検出を支持するＹＡＣを作製するため、ＨＰＲＴをＬ１  ＹＡＣに導入するための標的ベクターを、構築した。選ばれた戦略はまた、最も５’側のＶλ遺伝子（Ｖλ１〜Ｖλ２７）の直ぐ上流の、およそ２２ｋｂの領域の標的化により、Ｌ１  ＹＡＣの短縮を生じる。ＡＤＥ選択可能マーカーおよびＨＰＲＴ選択可能マーカーを含むｐＲＥＰプラスミド（Ｍｅｎｄｅｚら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６：２９４−３０７（１９９５））を、ＢａｍＨＩを用いて部分的に切断し、突出末端をＫｌｅｎｏｗを用いて埋めて平滑末端を作り、再連結させた。消失したＢａｍＨＩ部位を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いた切断により、決定した。ＡＤＥ２遺伝子およびＨＰＲＴ遺伝子を、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩカセットとして、ｐＹＡＣ−５’のＢａｍＨＩ／ＮｒｕＩ部位にクローン化させた。
【０１３８】
次に、Ｖλ１〜Ｖλ２７の５’領域由来の９５０ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｌ１  ＹＡＣから増幅させた。この配列は、配列５’−ＣＧＧＡＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＣＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＴＡ−３’を有し、かつＲｓｒＩＩ部位を有する５’プライマー、および配列５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＴ−３’を有し、かつＦｓｅＩ部位を有する３’プライマーを用いたＰＣＲにより、増幅させた。このフラグメントを、ｐＹＡＣ−５’プラスミドのＲｓｒＩＩ部位およびＦｓｅＩ部位に、クローン化させた。このベクターを、次いで、ＮｏｔＩを用いて直線化させ、Ｌ１  ＹＡＣを有する酵母に、ＬｉＡｃ形質転換法を用いて、形質転換させた。転換された酵母細胞を、ＳＣ−ＡＤＥプレート上でプレート培養し、標的化ＹＡＣを選択した。コロニーを選び出し、酵母クローンにおけるＹＡＣを、ＰＦＧＥおよびサザンブロット分析により、（上の実施例１で記載したように）分析した。Ｖλ遺伝子、Ｊλ遺伝子およびＣλ遺伝子の内容は、元のＬ１
ＹＡＣ（上述）と同一であることが、見出された。
【０１３９】
（完全なλ軽鎖遺伝子座を含むＹＡＣの産生）
完全なヒト生殖系列免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含むＹＡＣを、６−２３株をＨＰＲＴおよびｂｃｌ−ａを含むＬ１  ＹＡＣを含む酵母クローン（上述）と接合させることにより、産生した。酵母細胞を、ＳＣ−ＨＩＳ−ＬＹＳ−ＡＤＥ上にプレート培養して一倍体を除去し、そしてクローンを選び出し、ＰＦＧＥおよびサザンブロット分析により、（実施例１において上で記載したように）解析した。この分析は、両ＹＡＣが存在することを明らかにし、そして全てのλ遺伝子エレメントが存在することを確認した。完全なヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含むＹＡＣの産生のための減数分裂を誘導するため、胞子形成プレート上で増殖した二倍体を、次いで、ＳＣ−ＡＤＥ−ＬＹＳ＋ＣＹＨ＋ＣＡＮプレートに移した。Ｂｉｒｒｅｎら（既出）Ｖｏｌ．３，ｐｇ．４９５を参照のこと。
【０１４０】
クローンを選び出し、そしてＰＦＧＥおよびサザンブロット分析により、上の実施例１で記載したように、分析した。生殖系列構造において、ヒトλ軽鎖遺伝子座全体を含むＹＡＣを、同定し、ｙＬと名付けた。２０のクローンが富栄養培地（ＹＰＤＡ）および選択培地（ＳＣ−ＡＤＥ−ＬＹＳ）において増殖した場合、不安定性は観察されなかった。
【実施例３】
【０１４１】
（遺伝し得るヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を保有するマウスの産生）
酵母クローンのスフェロプラストを、Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ  ２０Ｔ（１．５ｍｇ  ｍｌ−１）を用いて産生し、次いで、３Ｂ１ＥＳ細胞と融合し、ＥＳ／酵母細胞融合体（ＥＳＹ）を作製した（例えば、Ｊａｋｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−８（１９９３）およびＷＯ９８／２４８９３号において、記載される。これらは両方とも、本明細書中において、参考として記載される）。細胞を、ＨＡＴ培地を用いて、融合後４８時間から、選択を始めた。クローンを選び出し、広げた。ＥＳ細胞株を、次いで、サザンブロットによって、ヒトＩｇλＹＡＣの存在および完全性について、上の実施例２において作製されたＹＡＣにまたがるプローブを用いて、分析した。
【０１４２】
７つのＥＳ細胞株がヒトＩｇλＹＡＣインタクトを含むことが、見出された。ＥＳＹ陽性細胞クローンを広げ、当該分野で周知の技術を用いて、適切なマウス胚盤胞（例えば、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）内に注射した。注射した胚盤胞を、偽妊娠Ｃ５７ＢＬ／６代理母の子宮内に置いた。キメラ動物は、被膜色によって同定した。キメラマウスを、Ｃ５７Ｂ６メスと交配させた。ＥＳ細胞ゲノムの生殖系列の伝達を、生じた子孫の被膜色により、検出した。アグーチの被膜色の仔は、ＥＳ細胞ゲノムの生殖系列伝達を示す（黒い被膜色の仔は、ＥＳ細胞ゲノムを伝達されていない）。
【０１４３】
キメラマウスのアグーチ色の子孫を、そのゲノムにおけるヒトＩｇλＹＡＣの存在について、分析した。尾の生検を、アグーチの仔から採取し、ＤＮＡを、標準的技術を使用して回収し、得られたＤＮＡをＰＣＲにより、ヒトＩｇλＤＮＡの存在について分析した。トランスジェニックの仔を、インタクトなヒトＩｇλトランスジーンの保有と完全性について、実施例１に概ね示されたプローブを使用したサザンブロット分析により、分析した。
【実施例４】
【０１４４】
（ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスの産生）
ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子、κ軽鎖遺伝子、およびλ軽鎖遺伝子、ならびに実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスを作製するために、実施例３において記載される方法により作製されたトランスジェニックマウスを、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子を含み、かつ実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を有するマウスと、交配させた。使用され得るマウスとしては、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｉ系統（例えば、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）およびＷＯ９８／２４８９３を参照）、Ｌ６系統（例えば、ＷＯ９８／２４８９３号を参照）、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＩＩａ系統（例えば、ＷＯ９８／２４８９３号を参照）および認識不能交換領域を含むマウス（例えば、ＷＯ００／７６３１０号）が、挙げられる（これらの文献はすべて、参考として援用される）。米国特許第５，９３９，５９８号および同第６，１６２，９６３号も、参照のこと（両方とも、参考として援用される）。Ｆ１世代のマウスは、１リットルの混合された遺伝子型を含んだ。さらなる交配を行い、望ましい遺伝子型を得た。ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子、κ軽鎖遺伝子、およびλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスを、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬと名付けている。ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスを、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−Ｌと名付けている。
【０１４５】
あるいは、上の実施例２において作製されたＹＡＣを保有するスフェロプラストは、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子および／または実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を含むマウス由来のＥＳ細胞と、融合される。これらのＥＳ細胞は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）系統またはＤＩ系統（例えば、米国特許第５，９３９，５９８号および同第６，１６２，９６３号ならびにＷＯ９８／２４８９３（本明細書中で参考として援用される）を、参照のこと。）の由来であり得る。生じたＥＳＹ細胞は、次いで、胚盤胞内に注射され、偽妊娠マウスに移植され、そして時期まで育てられる（実施例３に記載のように）。
【実施例５】
【０１４６】
（ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスの産生）
別の実施形態において、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびλ軽鎖遺伝子、インタクトなマウスκ鎖遺伝子またはλ鎖遺伝子、ならびに実質的に不活性化された内因性免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子またはλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスが、作製される。実施例３において記載された方法により作製されたトランスジェニックマウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子および実質的に不活性化された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子を含むマウスと、交配させられる。これらのマウスは、例えば、米国特許第５，９３９，５９８号および同第６，１６２，９６３号に記載される。Ｆ１世代のマウスは、１リットルの混合された遺伝子型を含んだ。望ましい遺伝子型を得るために、さらなる交配が行われ得る。
【０１４７】
あるいは、上の実施例２において作製されたＹＡＣを保有するスフェロプラストは、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子またはλ軽鎖遺伝子を含むマウス由来のＥＳ細胞と、融合させられる。生じたＥＳＹ細胞は、次いで、胚盤胞内に注射され、偽妊娠マウスに移植され、そして時期まで育てられる（実施例３に記載のように）。
【実施例６】
【０１４８】
（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬマウスによる、Ｂ細胞の発達およびヒト抗体の産生）
さらにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬトランスジェニックマウスを特徴付けるため、末梢血液および脾臓リンパ球が、８〜１０週齢のマウスおよびコントロールから、単離される。この細胞は、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍ（Ａｃｃｕｒａｔｅ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上で精製され、そして精製された抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６  Ｆｃ  レセプター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５３１４２）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で処理され、Ｆｃレセプターへの非特異的結合を遮断される。次に、細胞は、種々の抗体を用いて染色され、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）にて分析される。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬ細胞を染色するために使用される抗体のパネルとしては、以下が挙げられる：Ｃｙ−５標識ラット抗マウスＣＤ１９（Ｃａｌｔａｇ，＃ＲＭ７７０６）；ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＭ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５５７８２）；ＰＥ標識抗ヒトＩｇＭ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，＃３４１５５Ｘ）；ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇλ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，＃５５５７９６）；ＰＥ標識抗ヒトＩｇκ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，＃５５５７９２）；ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇλ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５５３４３４）。
【０１４９】
コントロール野生型１２９ｘＢ６マウスの染色のために使用された抗体としては、Ｃｙ−５標識ラット抗ＣＤ１９（Ｃａｌｔａｇ，＃ＲＭ７７０６）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＭ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，＃５５３４０８）；ＦＩＴＣ抗マウスκ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，＃５５０００３）；ＰＥ抗マウス（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，＃５５９９４０）が、挙げられた。
【０１５０】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＧ１系統およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅＧ２系統の由来の１〜４匹の動物の脾臓およびリンパ節に由来する、ヒトλ軽鎖およびヒトκ軽鎖の両方を作るリンパ球を、フローサイトメトリを使用して、評価し、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ２およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ１（κ軽鎖しか作らない）および野生型Ｂ６／１２９マウスと比較した。ヒトλ軽鎖およびヒトκ軽鎖の両方を作るＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、ＸＭＧ２−ＫＬおよびＸＭＧ１−ＫＬであり、これらは、それぞれヒトＩｇＧ２およびヒトＩｇＧ１を作る。ＸＭＧ２−ＫＬマウスおよびＸＭＧ１−ＫＬマウスは、Ｂ細胞の区画における効果的な再構築、およびヒトＩｇλ鎖の実質的な発現を、示した。ヒトＩｇκおよびヒトＩｇλの両方を発現するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統において、ヒトＩｇκ：ヒトＩｇλの比率は、ヒトにおいて見られるように、およそ６０：４０であった。従って、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子、κ軽鎖遺伝子、およびλ軽鎖遺伝子を含むトランスジェニックマウスは、有意にヒトの抗体および免疫系の発達を示す。
【実施例７】
【０１５１】
（非免疫化マウスにおける、ヒト抗体の血清レベル）
ヒト抗体の決定のためのＥＬＩＳＡを、非免疫化マウス血清において、行った。免疫アッセイにおけるより詳しい情報および手順については、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃａｐｔｅｒ１４，“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｐａｇｅｓ  ５５３−６１４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）（本明細書中で参考として援用される）を、参照のこと。
【０１５２】
ヒト免疫グロブリンの濃度は、以下の捕捉抗体を使用して、決定される：ヒトのγＩｇ、κＩｇ、μＩｇ、およびλＩｇについて、それぞれ、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ，Ｈ１０５００）、ヤギ抗ヒトＩｇκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０６０−０１）、ヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０２０−０１）、ヤギ抗ヒトＩｇλ（Ｃａｌｔａｇ，Ｈ１６５００）、そしてマウスλＩｇを捕捉するために、ヤギ抗マウスλ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０６０−０１）。
【０１５３】
ＥＬＩＳＡ実験において使用された抗体の検出は、ヤギ抗マウスＩｇλ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｃａｌｔａｇ，Ｍ−３３６０７）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ，Ｈ１０５０７）、マウス抗ヒトＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９０２０−０５）、ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０６０−０５）、ヤギ抗ヒトＩｇλ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０７０−０５）であった。ヒトおよびマウスのＩｇの定量のための標準物質は、以下であった：ヒトＩｇＧ２（Ａｂｇｅｎｉｘ，ｈＩｇＧ２）、ヒトＩｇＧ２κ（Ａｂｇｅｎｉｘ，ｈＩｇＧ２／κ）、ヒトＩｇＧ２λ（Ｓｉｇｍａ，１−４２６４）、ヒトＩｇＭκ（Ｃａｌｔａｇ，１３０００）、ヒトＩｇＭλ（Ｃａｌｔａｇ，１３２００）およびマウスＩｇＧ２Ｈλ（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−６０３４）。
【０１５４】
ヒトＩｇλ鎖の有意の発現を、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ１およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ２（ヒトＩｇκおよびヒトＩｇλの両方を作る）の血清において検出した。完全なヒトＩｇＧ２λ抗体およびＩｇＧ１λ抗体を、検出した。図５を参照のこと。
【実施例８】
【０１５５】
（ヒトモノクローナル抗体の産生）
（免疫化およびハイブリドーマ産生）
６週齢のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ２−κ／λの４匹の群を、組換えヒトＭＣＰ−１または１０７ヒトＣＥＭ細胞のどちらかを１０μｇ用いて、足裏において皮下的に免疫化した。６週齢のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ１−κ／λの４匹の群を、組換えＭＮ−Ｆｃを１０μｇ用いて、足裏において皮下的に免疫化した。抗原を、最初の免疫化のためにＴｉｔｅｒｍａｘ  Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ；かｔ。＃Ｔ２６８４）、および追加の免疫のためにａｌｕｍ（リン酸アルミニウムゲルアジュバント；Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  ａ／ｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓａｒｇｅｎｔ  Ｐｕｌｐ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，ｃａｔ＃１４５２−２５０により、配布される）において、従来技術に従い、乳化した（Ｈａｒｌｏｗら（既出）ｐａｇｅｓ  ５３−１３８（本明細書中で参考として援用される）などに記載される）。免疫化を、週に２回ずつ３週間、少なくとも５ブースター免疫（ｂｏｏｓｔ）、行った。
【０１５６】
マウスは、最後の抗原または細胞（リン酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）中）の注射を、リンパ節排出物由来のリンパ球と骨髄腫細胞との融合の４日前に受けた。脾臓リンパ球細胞の単離およびその後の融合を、従来技術（Ｈａｒｌｏｗら（既出）ｐａｇｅｓ  ５３−１３８（本明細書中で参考として援用される）など）に従って行った。
【０１５７】
あるいは、電気細胞融合もまた、行われ得る。リンパ節リンパ球を、電気細胞融合のために、磁気カラムを使用したＴ細胞除去を通してＢ細胞を富化することにより、調製した。ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ．＃５１４４４−７９Ｐに、グルコースを４５００ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウムを１００ｍｇ／Ｌを加えたもので、Ｌ−グルタミンは加えない）を、１億個のリンパ球につき０．９ｍｌ、細菌ペレットに加えた。細胞を、穏やかに、しかし完全に、再懸濁した。ＣＤ９０＋磁気ビーズ（マウスＣＤ９０＋磁気ビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｃａｔ．＃４９１−０１）を、１億個の細胞につき１００μｌ加え、そして穏やかによく混合した。細胞を、磁気ビーズと共に、４℃で１５分間インキュベートした。インキュベーションの間、磁気カラムを、３ｍｌのＤＭＥＭで事前洗浄した。１５分間のインキュベーションの後、１０８までの陽性細胞（または２×１０９までの総細胞）を含む磁気的標的化細胞懸濁液を、ＬＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ｃａｔ．＃４２４−０１）上にピペット滴下した。細胞懸濁液を、流し通し、そして流出液をＣＤ９０陰性画分として、回収した。このカラムを３ｍｌのＤＭＥＭで３回洗浄し、その総溶出液をＣＤ９０陰性画分として回収した（これらの細胞のほとんどは、Ｂ細胞である）。
【０１５８】
Ｂ細胞について強化されたリンパ球を、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫と電気融合により融合させ、そしてヒポキサンチン／アザセリン（ＨＡ）（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃Ａ９６６６）選択にかけた。電気細胞融合について、骨髄腫細胞を、滅菌遠心チューブ（回収される細胞の数に基づき、５０ｍｌまたは２５０ｍｌのどちらかのチューブ）中で遠心分離により回収し、そしてＤＭＥＭ中に再懸濁した。骨髄腫細胞およびＢ細胞を、１：１の割合で合わせ、５０ｍｌコニカルチューブ中でよく混合した。細胞を、遠心分離を通してペレット化させた。２〜４ｍｌのプロナーゼ溶液（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，ｃａｔ．＃５３７０２；０．５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ中）を、加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁した。酵素処理は、２分以上進めさせず、３〜５ｍｌのウシ胎児血清によって反応を止めた。電気融合（ＥＣＦ）溶液（０．３Ｍショ糖（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃Ｓ７９０３）、０．１ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃Ｓ７９０３）、０．１ｍＭ酢酸カルシウム（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃Ｓ４７０５）、０．２２ミクロンフィルターによりフィルター滅菌した）を、加え、総容量４０ｍｌとし、そして細胞を遠心分離によりペレット化した。上清を除去し、そして細胞を、少量のＥＣＦ溶液中に穏やかに再懸濁し、次いで、より多いＥＣＦ溶液を、総量４０ｍｌまで加えた。細胞を混合し、計数し、遠心によりペレット化した。細胞ペレットを少量のＥＣＦ溶液で再懸濁し、２×１０６細胞／ｍｌに調整した。
【０１５９】
電気細胞ジェネレーターは、Ｍｏｄｅｌ  ＥＣＭ２００１，Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。２ｍｌ  電気細胞融合チャンバシステム（２ｍｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を、融合に使用した。電気細胞融合条件は：
並列条件：電圧＝５０Ｖ、時間＝５０秒
膜破壊：電圧＝３０００Ｖ、時間＝３０マイクロ秒
融合後保持時間：３秒
電気細胞融合後、細胞懸濁液を、滅菌条件下で融合チャンバから注意深く取り除き、そして同量（またはそれ以上）のハイブリドーマ培地を含む滅菌チューブに移し、１５〜３０分間、３７℃のインキュベーター内でインキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化した。細胞を、少量の１／２強度ＨＡ培地中に、穏やかに完全に再懸濁し、９６ウェルプレートにつき５×１０６Ｂ細胞、そしてウェルにつき２００μｌの容量でプレート培養するために、１／２ＨＡ培地を用いて、適切な容量に調整した。細胞を、９６ウェル内にピペット滴下した。７日目または１０日目に、培地１００μｌをそれぞれのウェルから除き、１００μｌの１／２ＨＡ培地と置換した。あるいは、リンパ球は、ポリエチレングリコール融合を通して、骨髄腫細胞と融合され、上述のように、ＨＡＴ選択を受け得る（Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１））。
【０１６０】
培養１０〜１４日後、ハイブリドーマ上清を、抗原特異的なＩｇＧ２κ、ＩｇＧ２λのモノクローナル抗体について、スクリーニングした。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１２−５６５−１３６）を、ＣＤ１４７−Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ、ＣＥＭ群について）、ＭＣＰ−１（２μｇ／ｍｌ）およびＭＮ−ｈｉｓ（２μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェル用いて、コーティング緩衝液（０．１Ｍ  カーボネート緩衝液、ｐＨ９．６，ＮａＨＣＯ３）中でコートし、４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、洗浄緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ＰＢＳ中）を用いて、プレートを３回洗浄した。それぞれのウェルに、ブロッキング緩衝液（０．５％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．０１％  チメロサール）を２００μｌ／ウェル加え、そして室温で一時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、それぞれのプレートに、５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ培養上清、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールを加え、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、それぞれのプレートに、１００μｌ／ウェルの検出抗体ＧＴ抗ｈｕＩｇＧｆｃ−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ，Ａｃｔ．＃Ｈ１０５０７）を加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、それぞれのプレートに、１００μｌ／ウェルの現像液（１０ｍｌ  基質緩衝液、１ｍｇ  ＯＰＤ（ｏ−フェニルエデジアミン、Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ−７２８８）、１０μｌ  ３０％  Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ））を加えた（この溶液は使用前に新しく作った）。反応を１０分間進め（コントロールウェルが辛うじて色を呈し始めるまで）、次いで、５０μｌ／ウェルの停止液（２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を、加えた。ＯＤ値を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー上で、波長４９２ｎｍで読んだ。
【０１６１】
Ｉｇ軽鎖の用法を決定するための二次スクリーニングについて、一次スクリーニングにおけるポジティブなウェルに相当する３組のサンプルを、スクリーニングした。１組はｈＩｇＨＧ検出のため、１組はｈＫ検出のため、そしてもう１組はｈΛ検出のためである。二次スクリーニングにおける検出抗体は、ＧＴ抗ｈＩｇκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．＃２０６０−０５）およびＧＴ抗ｈＩｇλ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．＃２０７０−０５）であった。
【０１６２】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ−ＫＬ系統は、完全なヒトＩｇＧλモノクローナル抗体を産生した。免疫グロブリンについては、ＣＥＭ細胞およびＭＣＰ−１タンパク質（両方とも、完全なヒトＩｇＧ２κおよびヒトＩｇＧ２λの抗原特異的モノクローナル抗体である）が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ２−ＫＬマウスから、得られた。組換えＭＮ−ＦＣ融合タンパク質については、１つのｍＡｂ（完全なヒトＩｇＧ１λ）が、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  Ｇ１−ＫＬマウスから、得られた。
【実施例９】
【０１６３】
（ヒト軽鎖λＹＡＣ組込みの特徴付け）
ゲノムＤＮＡを、ＥＳ細胞株および３Ｂ１細胞株から、Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄら（Ｇｒｏｓｓ−Ｂｅｌｌａｒｄ，Ｍ．，Ｏｕｄｅｔ，Ｐ．，およびＣｈａｍｂｏｍ，Ｐ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：３２−３８（１９７３））の方法に従ったフェノール／クロロホルム抽出によって、調製した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統由来のゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮｅａｓｙ  ９６  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃａｔ．Ｎｏ．６９５８２）を使用して、尾の断片から抽出した。それぞれのサンプルの１０μｇを、ＥｃｏＲＩ（Ｖλプローブを用いたハイブリダイゼーション用）、ＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩ（Ｃλプローブ用）およびＳａｃＩ（λ３’エンハンサープローブ用）を用いて切断した。切断されたＤＮＡのサンプルを、０．７％アガロースゲル（ＳＥＡＫＥＭ  ＭＥ，ＦＭＣ）上で、０．５×Ｔｒｉｓ／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中で、１６時間泳動した。ＤＮＡをＧＥＮＥＳＣＲＥＥＮ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）ナイロンメンブレンに、標準的アルカリトランスファー法により、トランスファーした。ＤＮＡプローブ（以下で示される）を、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１５８５５９２）を使用して放射性標識した。ハイブリダイゼーションを、６５度で時間行った。低ストリンジェンシー洗浄を、６５℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を使用して、１時間行った。２回の高ストリンジェンシー洗浄を、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、６５℃で行った。洗浄したメンブレンを、−７０℃で、裏に増感紙をあて、Ｘ線フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に晒した。
【０１６４】
ヒトＶλ遺伝子を検出するために使用したＶλファミリー特異的プローブは、Ｖλ２ａ２、Ｖλ３Ｐ、Ｖλ５ｃ、Ｖλ７ａ、およびＶλ８ａ、Ｃλならびにλ３’エンハンサーであった。ＶλプローブおよびＣλプローブは、既に記載されている（Ｐｒｉｐｐｉａｔら，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｒｉｎ  λ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２２ｑ１１．２．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４，９８３−９９１（１９９５）；Ｕｄｅｙ，Ｊ．Ａ．およびＢｌｏｍｂｅｒｇ，Ｂ．，Ｈｕｍａｎ  λ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｌｏｃｕｓ：Ｏｒｉｇｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｊ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：６３）。４５０ｂｐ  λ  ３’エンハンサープローブを、ヒトゲノムＤＮＡから、順プライマー５’−ＧＡＴＡＡＧＡＧＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡ−３’および逆プライマー５’−ＧＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣ−３’を使用して、増幅した。
【０１６５】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅにおけるヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の起源を、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、決定した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅにおけるＶλおよびＣλの完全性を、５つの富遺伝子クラスター内に存在する幾つかの異なったＶλおよびＣλのファミリー特異的セグメントとハイブリダイズさせる、ＥｃｏＲＩ切断ＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、決定した。図６Ａ〜Ｇを参照のこと。λ３’エンハンサー領域もまた、決定した（示さない）。全てのＶλプローブおよびＣλプローブのハイブリダイゼーションパターンを、ヒトゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションパターンおよびλＹＡＣのハイブリダイゼーションパターンと比較した。サザンブロット分析は、ヒトゲノムＤＮＡにおうて同定されたＶλ遺伝子それぞれが、ＥＳ細胞に組み込まれたλＹＡＣ、および３種のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統の尾から抽出されたゲノムＤＮＡにおいて、存在することを明らかにした。
【０１６６】
特に、ヒトゲノムＤＮＡ、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統Ｇ４  ３ＣＩＬ３、Ｇ２  ＸＭＧ２Ｌ３およびＧ１  ３Ｂ３Ｌ３から抽出されたゲノムＤＮＡ、ならびにＥＳ細胞株Ｖ８．５Ａから抽出されたゲノムＤＮＡを、抽出し、そしてＥｃｏＲＩ（図６Ａ〜Ｄ）、ＰｓｔＩ（図６Ｅ）、またはＰｖｕＩＩ（図６Ｆ）を用いて、上述のように切断した。ポジティブコントロールとして、１μｇのＹＡＣを、３Ｂ１（ヒトλ遺伝子座を含まないマウス）のゲノムＤＮＡの１０μｇに添加し、同じ酵素で切断した。ネガティブコントロールとして、３Ｂ１のゲノムＤＮＡの１０μｇを、同じ酵素で切断した。これらのサンプルを、上述のように、サザンブロット分析した。使用したプローブは、以下である：Ｖλ２については、Ｖλ２ａ２プローブ（図６Ａ）；Ｖλ３については、Ｖλ３ｐプローブ（図６Ｂ）；Ｖλ５については、Ｖλ５Ｃプローブ（図６Ｃ）；Ｖλ７については、Ｖλ７ａプローブ（図６Ｄ）；Ｖλ８については、Ｖλ８ａプローブ（図６Ｅ）；Ｃλについては、上述のＣλプローブ。ＥｃｏＲＩ切断、ＰｓｔＩ切断またはＰｖｕＩＩ切断をしたＤＮＡのサザンブロット分析は、全ての分析したサンプルについて、一様なハイブリダイゼーションバンドのパターンを示した。図６Ａ〜Ｇを、参照のこと。Ｖλ、Ｃλおよびλ３’エンハンサーの、同一のハイブリダイゼーションバンドの存在は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統に組み込まれたλＹＡＣが、全ての遺伝子座を含むことを、確認した。試験したＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統の３つ全てにおいて、λＹＡＣは、明らかな欠失または再編成がなく、伝達されていた。さらに、Ｖλ３プローブを使用するハイブリダイゼーションパターンは、１０の機能的Ｖセグメントおよび１３の偽遺伝子からなる、最大のＶλＩＩＩファミリーを検出した。従って、サザンブロット分析は、ＨｕＩｇλ  ＹＡＣの遺伝子座全体の１Ｍｂは、Ｖλ遺伝子、７対のＪλセグメント−Ｃλセグメント、および３’λエンハンサーを、正しい生殖系列構造において、含むことを示す。
【実施例１０】
【０１６７】
（抗体応答におけるＩｇλの利用法）
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ  ＫＬを、種々の抗原を用いて免疫化した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅにより産生された抗体を、特徴付け、どの抗体がκ軽鎖を有するか、およびどの抗体がλ軽鎖を有するかを、決定した。産生された種々の抗体におけるκ軽鎖とλ軽鎖の比率は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅによって産生された抗体において、およそ６０：４０であると予想される。なぜなら、ヒトにおいて、およそ４０％の抗体がλ軽鎖を含み、６０％の抗体が、κ軽鎖を含むためである。驚くべきことに、幾つかの抗原およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統について、Ｉｇλが、いくつかの免疫応答を支配していた。表３（Ｉｇλ優性応答を太字で示す）を、参照のこと。
【０１６８】
【表３】
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本明細書において引用された全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物またはそれぞれ個々の特許出願が、詳細に、そして独立して参考として援用されるように、本明細書中で参考として援用される。
【０１６９】
上述の発明は、理解を明瞭にする目的で、図面および実施例としてある程度詳細に記載されているが、本発明は、添付の請求の精神または範囲から逸脱することなく、本発明の特定の変化および改変が、なされ得ることが本発明の教示から見て当業者に容易に明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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