(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブを提供する。【解決手段】特定の配列を有する蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ及び多型検出方法。特定のプローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ること、前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させ、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること、前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること、及び前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型の存在を検出することを含む多型検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ｐ１〜Ｐ１１’より選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１１’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
下記Ｐ１−１〜Ｐ１１’−１より選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の多型検出用プローブ；
（Ｐ１−１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’−１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１１−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１１’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記２２６番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１３９番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６５番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ４又はＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６７番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ５又はＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６４番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ６又はＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６３番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ７又はＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６１番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ８又はＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６０番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ９又はＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４４番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ１０又はＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４８番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、又は
前記Ｐ１１又はＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１５１番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有する請求項１又は請求項２に記載の多型検出用プローブ。
【請求項４】
前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記２２６番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１３９番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６５番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有し、
前記Ｐ４又はＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６７番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ５又はＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６４番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ６又はＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６３番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ７又はＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６１番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ８又はＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６０番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ９又はＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４４番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有し、
前記Ｐ１０又はＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４８番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有し、又は
前記Ｐ１１又はＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１５１番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有する請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項５】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するかまたは増加する請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項６】
前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項７】
前記プローブが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２２からなる群より選ばれる少なくとも１種の塩基配列を有する請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の多型検出用プローブ。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載のプローブを用いることによりＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
【請求項９】
（Ｉ）請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載のプローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、請求項８に記載の多型検出方法。
【請求項１０】
さらに、（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出することを含む請求項９に記載の多型検出方法。
【請求項１１】
さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅する工程を含む請求項９又は請求項１０に記載の多型検出方法。
【請求項１２】
請求項８〜請求項１１のいずれか１項に記載の多型検出方法により、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて抗がん剤の薬効を判定することを含む、抗がん剤の薬効の判定方法。
【請求項１３】
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のプローブを含む、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出する多型検出用試薬キット。
【請求項１４】
さらに、前記プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを含む請求項１３に記載の多型検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、腫瘍形成に重要な役割を担うシグナル経路を調節するＰＩ３キナーゼをコードする。腫瘍組織中においてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異が多く見られることが知られており、なかでも、Ｇ１６２４Ａ（Ｅ５４２Ｋ）変異、Ｇ１６３３Ａ（Ｅ５４５Ｋ）変異及びＡ３１４０Ｇ（Ｈ１０４７Ｒ）変異は、高頻度で見られることが知られている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００３】
上記３箇所に変異がある場合には、切除不能な大腸がんの治療薬として利用されているセツキシマブ等に代表される抗ＥＧＦＲ抗体薬の効果が得られないことが報告されている（例えば、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００４】
セツキシマブのような分子標的薬は非常に高価であり、また間質性肺炎等の重篤な副作用を生じる可能性がある。そのため、薬効に関わる遺伝子変異を投薬前に測定し、薬効が期待できる患者に選択的に薬剤を投与することは極めて重要である。このような、遺伝子変異を正確にかつ短時間、低コストで簡便に測定する方法が待ち望まれている。
【０００５】
現在遺伝子の多型を測定する方法としては、変異を含む領域をＰＣＲ法で増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、蛍光色素の発光の減少量を測定し融解曲線分析の結果に基づいて塩基配列の変異を解析する方法が知られている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１１９２９１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ.（２００４）Ａｐｒ２３;３０４（５６７０）:５５４
【非特許文献２】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ.（２００５）Ｆｅｂ １７;２４（８）:１４７７-８０
【非特許文献３】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００９）; ６９: （５）. Ｍａｒｃｈ １, ２００９
【非特許文献４】ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．（２０１１） Ｍａｒ２５;１１:１０７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１及び非特許文献３では、ＰＩＫ３Ａの変異をダイレクトシークエンス法で検出している。しかし、ダイレクトシークエンス法では、ＰＣＲを行った後、シークエンス反応を行い、シークエンサーで電気泳動を行わなければならないなど、手間やコストを要する。また、増幅産物を処理する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。
【０００９】
非特許文献２では、ＰＩＫ３ＣＡの変異を、ＰＣＲ-ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法とダイレクトシークエンス法とを組み合わせて検出している。しかし、ＰＣＲ-ＳＳＣＰ法では、ＰＣＲを行った後に増幅産物を電気泳動する必要があり、手間やコストを要する。また、増幅産物を処理する必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。
【００１０】
非特許文献４では、ＰＩＫ３ＣＡの変異をＱＩＡＧＥＮのキットを用いて、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ＡＲＭＳ法により検出している。しかし、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ＡＲＭＳ法では、キットの購入が必要となる。また、キットの他にも別途リアルタイムＰＣＲ装置を必要とし、コストを要する。さらに、変異毎に異なる試薬と反応チューブが必要であり、手間とコストを要する。
【００１１】
特許文献１では、核酸プローブを用いる方法により、多型を検出している。しかし、特許文献１には、核酸プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的配列にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分において形成される核酸プローブと標的配列とのハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧとＣのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。そのため、特許文献１に記載の方法では、変異型毎に適正なる配列を有する核酸プローブを使用する必要がある。
また、本発明者の検討により、核酸プローブの配列において、ＧＣの含量が高すぎると消光プローブが十分に機能しないことも明らかになった。
これらの現状を踏まえ、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出のためのさらなる技術開発が待ち望まれていた。
【００１２】
本発明は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することを課題とする。また、本発明は、当該多型検出方法を用いた薬効判定方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、当該多型検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計することにより、消光プローブを用いる融解曲線分析によりＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出できるとの知見を得た。本発明は、かかる知見に基づいて達成されたものである。
本発明は以下のとおりである。
＜１＞  下記Ｐ１〜Ｐ１１’より選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブ；
（Ｐ１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１１’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
＜２＞  下記Ｐ１−１〜Ｐ１１’−１より選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドである＜１＞に記載の多型検出用プローブ；
（Ｐ１−１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’−１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１１−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１１’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
＜３＞  前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記２２６番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１３９番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６５番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ４又はＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６７番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ５又はＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６４番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ６又はＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６３番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ７又はＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６１番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ８又はＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６０番目の塩基に対応する塩基を５’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ９又はＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４４番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、
前記Ｐ１０又はＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４８番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有し、又は
前記Ｐ１１又はＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１５１番目の塩基に対応する塩基を３’末端から数えて１番目〜３番目の位置のいずれかに有する＜１＞又は＜２＞に記載の多型検出用プローブ。
＜４＞  前記Ｐ１又はＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記２２６番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ２又はＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１３９番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ３又はＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６５番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有し、
前記Ｐ４又はＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６７番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ５又はＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６４番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ６又はＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６３番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ７又はＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６１番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ８又はＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１６０番目の塩基に対応する塩基を５’末端に有し、
前記Ｐ９又はＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４４番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有し、
前記Ｐ１０又はＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１４８番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有し、又は
前記Ｐ１１又はＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドが、蛍光色素で標識された前記１５１番目の塩基に対応する塩基を３’末端に有する＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜５＞  前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、且つ標的配列にハイブリダイズしたときの蛍光強度が、ハイブリダイズしないときの蛍光強度に比べて、減少するかまたは増加する＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜６＞  前記プローブが、融解曲線分析用のプローブである＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜７＞  前記プローブが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２からなる群より選ばれる少なくとも１種の塩基配列を有する＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の多型検出用プローブ。
＜８＞  ＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のプローブを用いることによりＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出する多型検出方法。
＜９＞  （Ｉ）＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のプローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ることと、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定することと、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定することと、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型の存在を検出することと、
を含む、＜８＞に記載の多型検出方法。
＜１０＞  さらに、（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出することを含む＜９＞に記載の多型検出方法。
＜１１＞  さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅する工程を含む＜９＞又は＜１０＞に記載の多型検出方法。
＜１２＞  ＜８＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載の多型検出方法により、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて抗がん剤の薬効を判定することを含む、抗がん剤の薬効の判定方法。
＜１３＞  ＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のプローブを含む、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出する多型検出用試薬キット。
＜１４＞  さらに、前記プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅するためのプライマーを含む＜１３＞に記載の多型検出用試薬キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を、高い感度で、簡便に検出することを可能にする多型検出用プローブ、これを用いる多型検出方法を提供することができる。また、本発明は、当該多型検出方法を用いた薬効判定方法を提供することができる。さらに本発明は、当該多型検出用プローブを用いた多型検出用試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（Ａ）は、核酸混合物の融解曲線の一例であり、（Ｂ）は微分融解曲線の一例である。
【図２】（Ａ）〜（Ｎ）は、本発明の実施例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【図３】本発明の実施例２にかかる試料の微分融解曲線である。
【図４】（Ａ）〜（Ｈ）は、本発明の比較例１にかかる試料の微分融解曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明にかかるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ということがある）は、下記Ｐ１〜Ｐ１１’より選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである：
（Ｐ１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１’）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ２’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ３’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ４’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ５’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ６’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ７’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ８’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ９’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１０’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、
（Ｐ１１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１１’）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されているオリゴヌクレオチド。
本発明にかかるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出方法は、前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを少なくとも１種用いてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出することを含む方法である。
本発明にかかる薬剤の薬効判定方法は、前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出方法によりＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出すること、及び検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を判定することを含む方法である。
本発明にかかる多型検出用試薬キットは、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブを含むものである。
【００１７】
本発明における「ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子」は、既に公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩのアクセッションＮｏ．ＮＧ０１２１１３の５０００１〜９１１９０の配列を意味する。
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、細胞の分化、発達、増殖、維持の調節に重要な役割を持つＰＩ３キナーゼ−Ａｋｔシグナル経路のＰＩ３キナーゼをコードしている。
【００１８】
配列番号１の塩基配列は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ＮＧ０１２１１３の７４５４１〜７４９６０の塩基配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン９に該当する核酸の塩基配列の一部に相当する。
配列番号２の塩基配列は、配列番号１に示す２３２番目の塩基Ｇ（グアニン）がＡ（アデニン）に変異した塩基配列である（以下、「Ｇ１６２４Ａ」ともいう）。
配列番号３の塩基配列は、配列番号１に示す２４１番目の塩基ＧがＡに変異した塩基配列である（以下、「Ｇ１６３３Ａ」ともいう）。
【００１９】
配列番号４の塩基配列は、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰのアクセッションＮｏ．ＮＧ０１２１１３の９０６２１〜９０９２０の塩基配列であり、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン２０に該当する核酸の塩基配列の一部に相当する。
配列番号５の塩基配列は、配列番号４に示す１５５番目の塩基ＡがＧに変異した塩基配列である（以下、「Ａ３１４０Ｇ」ともいう）。
【００２０】
本発明において、検出対象となる試料中の試料核酸、多型検出用プローブ又はプライマーの個々の配列に関して、これら互いの相補的な関係に基づいて記述された事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、各配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な当該配列について本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、当業者にとっての技術常識の範囲内で、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、明細書全体を読み替えるものとする。
【００２１】
本発明において、「Ｔｍ値」とは、二本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。即ち、二本鎖核酸、例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度をいう。
本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端を１番目として数える。同様に「５’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端を１番目として数える。
【００２２】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本明細書において変異とは、野生型の塩基配列の一部の塩基が置換、欠失、重複又は挿入されることによって生じる新たな塩基配列を意味する。また、多型とは、変異によって生じる塩基配列の多型を意味する。
以下、本発明について説明する。
【００２３】
＜ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブ＞
本発明のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型検出用プローブ（以下、単に「多型検出用プローブ」ともいう）は、前記Ｐ１〜Ｐ１１’より選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブである
【００２４】
本発明における前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと相同性が認められる蛍光標識オリゴヌクレオチドも本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドに包含される。
具体的には、本発明において相同性が認められる蛍光標識オリゴヌクレオチドとは、前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、好ましくは８０％以上の同一性を示す。
また、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。８０％以上の同一性を示すことにより、変異型のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高い等の利点がある。
【００２５】
また、本発明における前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示すものであれば、前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドも本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドに包含される。
【００２６】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）  に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件とは、例えば、カリウム濃度は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びマグネシウム濃度は約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件があげられる。本発明の条件の１例としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中においてハイブリダイゼーションを行う条件が、挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
【００２７】
さらに、本発明における前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドに塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドも本発明における蛍光標識オリゴヌクレオチドに包含される。
当該塩基が挿入、欠失又は置換した蛍光標識オリゴヌクレオチドは、前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドと同等程度の作用を示せばよく、塩基が挿入、欠失又は置換されている場合、その挿入、欠失又は置換の位置は、特に限定されない。挿入、欠失又は置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、蛍光標識オリゴヌクレオチド全体の長さによって異なるが、例えば１塩基〜１０塩基、好ましくは１塩基〜５塩基が挙げられる。
【００２８】
前記蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける、オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチドの他、修飾されたオリゴヌクレオチドも含まれる。
前記オリゴヌクレオチドの構成単位としては、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、人工核酸等が挙げられる。前記人工核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；ペプチド核酸であるＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）；架橋化核酸であるＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等が挙げられる。
前記オリゴヌクレオチドは、前記構成単位のうち、一種類から構成されてもよいし、複数種類から構成されてもよい。
【００２９】
前記Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいては、蛍光標識された塩基が、オリゴヌクレオチドの末端から数えて１〜３番目のいずれかの位置に存在することが好ましく、オリゴヌクレオチドの末端に存在することがより好ましい。これにより、例えば、多型検出感度がより向上する。また、Ｐ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドを生産性よく得ることができる。
【００３０】
以下、前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドから順に、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドの詳細について説明する。
【００３１】
本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列の２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１種の多型を検出することができるプローブである。
【００３２】
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の野生型では、配列番号１に示される配列のうち２３２番目に対応する塩基は、Ｇ（グアニン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異しており（以下、「Ｇ１６２４Ａ」ともいう）、当該塩基は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の１６２４番目の塩基に該当する。
【００３３】
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の野生型では、配列番号１に示される配列のうち２４１番目に対応する塩基は、Ｇ（グアニン）であるが、変異型においてはＡ（アデニン）に変異しており（以下、「Ｇ１６３３Ａ」ともいう）、当該塩基は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の１６３３番目の塩基に該当する。
【００３４】
本発明における前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号３で示される塩基配列のうち２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、２２６番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
【００３５】
検出感度の観点より、本発明における前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号３で示される塩基配列のうち２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。同一性が８０％より低い場合には、変異型のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が低くなる。
【００３６】
また、配列番号１に示す塩基配列の２４１番目の塩基における多型検出の観点から、Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号３で示される塩基配列のうち２２６番目〜２４１番目の塩基を含む、塩基長１６〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する塩基配列である態様も挙げられる。
検出感度の観点より、Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号３で示される塩基配列のうち２２６番目〜２４１番目の塩基を含む塩基長１６〜５０の塩基配列に対して、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性又は９９％以上の同一性を示してもよい。８０％以上の同一性を示すことにより、変異型のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を含む試料核酸に対する検出感度が高い等の利点がある。
【００３７】
本発明における前記Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号３で示される塩基配列のうち２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、２２６番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
ハイブリダイゼーションや、ストリンジェントな条件については既述の事項を適用する。以下同様である。
【００３８】
また、配列番号１に示す塩基配列の２４１番目の塩基における多型検出の観点から、Ｐ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号３で示される塩基配列のうち２２６番目〜２４１番目の塩基を含む、塩基長１６〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列である態様がより好ましい。
【００３９】
本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが７ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下する。
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１４ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、又は１６ｍｅｒ〜２５ｍｅｒとしうる。１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００４０】
前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、蛍光標識オリゴヌクレオチドがその相補鎖（標的配列）と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を、所望の値に調整することができる。
【００４１】
本発明における前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表１に示すが、本発明はこれらに限定されない。なお、表中において、大文字は多型を示す塩基を表す。以下同様である。
また、表１中、下線を付したシトシンは、配列番号１〜３に示す塩基配列中、２２６番目のシトシンを表す。
【００４２】
【表１】
2013081450.tif 000002
【００４３】
また、本発明の前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、２２６番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００４４】
本発明の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。その中でも標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。
【００４５】
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ  Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、３’末端もしくは５’末端がシトシン（Ｃ）となるように設計され、その末端のＣがグアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドであることが挙げられる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００４６】
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅを用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｂｅａｃｏｎ法又はＭＧＢ  Ｐｒｏｂｅ法などを挙げることができる。
【００４７】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。
このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。
【００４８】
また前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、例えば、３'末端にリン酸基が付加されてもよい。蛍光標識オリゴヌクレオチドの３'末端にリン酸基を付加させておくことにより、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に抑制できる。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができる。その際、３'末端にリン酸基が付加された蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることで、これを増幅反応の反応液中に共存させることができる。
また、３'末端に前述のような標識化物質（蛍光色素）を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００４９】
前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型、特にＧ１６２４Ａ及びＧ１６３３Ａからなる群より選ばれる多型の少なくとも一方の多型を検出するＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブとして使用することができる。
また、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
なお、本発明に係る前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、２２６番目の塩基に対応するシトシンが蛍光色素で標識された塩基を用いる以外は、オリゴヌクレオチドの合成方法として知られている公知の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って作製することができる。
【００５０】
前記Ｐ１及びＰ１’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ１−１及びＰ１’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ１−１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１’−１）配列番号１〜配列番号３のいずれか１つに示す塩基配列において、２２６番目〜２３２番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、２２６番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を認識するオリゴヌクレオチド。
なお、「配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を認識する」とは、「配列番号１における２３２番目及び２４１番目からなる群より選ばれる少なくとも１つの多型を示す塩基に結合する」と同義である。
【００５１】
以下、前記Ｐ２〜前記Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドについて説明するが、上述した前記Ｐ１及びＰ１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドについての説明と重複する部分については、上述の説明を引用するものとする。
【００５２】
本発明における前記Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４に示す塩基配列の１５５番目の塩基における多型を検出することができるプローブである。
【００５３】
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の野生型では、配列番号４に示される配列のうち１５５番目に対応する塩基は、Ａであるが、変異型においてはＧに変異しており（以下、「Ａ３１４０Ｇ」ともいう）、当該塩基は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の３１４０番目の塩基に該当する。
【００５４】
本発明における前記Ｐ２の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１３９番目の塩基に対応する塩基はシトシンである。同一性については、前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける説明を引用するものとする。
本発明における前記Ｐ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１３９番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
【００５５】
本発明における前記Ｐ３の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１６５番目の塩基に対応する塩基はシトシンである。同一性については、前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける説明を引用するものとする。
本発明における前記Ｐ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１６５番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
【００５６】
本発明の前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１７ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが１７ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１７ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１８ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。１７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度がさらに高くなる等の傾向がある。
【００５７】
本発明の前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１１ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが１１ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１１ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。１１ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００５８】
前記Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、蛍光標識オリゴヌクレオチドがその標的配列と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を所望の値とすることができる。
【００５９】
本発明における前記Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表２に示すが、本発明はこれらに限定されない。
また、表２の配列番号８中、下線を付したシトシンは、配列番号４又は５に示す塩基配列中、１３９番目のシトシンを表す。表２の配列番号９及び１０中、下線を付したシトシンは、配列番号４又は５に示す塩基配列中、１６５番目のシトシンを表す。
【００６０】
【表２】
2013081450.tif 000003
【００６１】
本発明の前記Ｐ２及びＰ２’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１３９番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１６５番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
【００６２】
前記Ｐ２、Ｐ２’、Ｐ３及びＰ３’の蛍光標識オリゴヌクレオチドはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型、特にＡ３１４０Ｇ変異を検出するＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブとして使用することができる。
また、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
【００６３】
前記Ｐ２及びＰ２’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ２−１及びＰ２’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ２−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ２’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において、１３９番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１７〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１３９番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００６４】
前記Ｐ３及びＰ３’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ３−１及びＰ３’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ３−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び、
（Ｐ３’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６５番目の塩基を含む塩基長１１〜５０の塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６５番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００６５】
本発明における前記Ｐ４〜前記Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４に示す塩基配列に相補的な塩基配列における多型を検出することができるプローブであり、特に配列番号４に示す塩基配列の１５５番目の塩基における多型を検出することができる。
【００６６】
本発明における前記Ｐ４の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１６７番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。同一性については、前記Ｐ１の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける説明を引用するものとする。以下同様である。
本発明における前記Ｐ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１６７番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
【００６７】
本発明における前記Ｐ５の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１６４番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
本発明における前記Ｐ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１６４番目の塩基に対応する塩基はシトシンであることを要する。
【００６８】
本発明における前記Ｐ６の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであることを要する。
本発明における前記Ｐ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであることを要する。
【００６９】
本発明における前記Ｐ７の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
本発明における前記Ｐ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
【００７０】
本発明における前記Ｐ８の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
本発明における前記Ｐ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
【００７１】
本発明における前記Ｐ９の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
本発明における前記Ｐ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
【００７２】
本発明における前記Ｐ１０の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
本発明における前記Ｐ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
【００７３】
本発明における前記Ｐ１１の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する。なお、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
本発明における前記Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号４又は配列番号５で示される塩基配列のうち１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする。なお、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンである。
【００７４】
本発明の前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１３ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが１３ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１３ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１４ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。１３ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００７５】
本発明の前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１０ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが１０ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００７６】
本発明の前記Ｐ６及びＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、９ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ６及びＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが９ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ６及びＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、９ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。９ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００７７】
本発明の前記Ｐ７及びＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ７及びＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが７ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ７及びＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００７８】
本発明の前記Ｐ８及びＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、６ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ８及びＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが６ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ８及びＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００７９】
本発明の前記Ｐ９及びＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１２ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ９及びＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが１２ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ９及びＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１２ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向ある。
【００８０】
本発明の前記Ｐ１０及びＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、８ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ１０及びＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが８ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ１０及びＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、８ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。８ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００８１】
本発明の前記Ｐ１１及びＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、５ｍｅｒ〜５０ｍｅｒであることを要する。前記Ｐ１１及びＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さが５ｍｅｒ未満や、５０ｍｅｒより長い場合には、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が低下してしまい好ましくない。
また、本発明の前記Ｐ１１及びＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さとしては、７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ、１０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ、１３ｍｅｒ〜２５ｍｅｒにすることができる。７ｍｅｒ〜４０ｍｅｒという範囲にすることにより、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。
【００８２】
前記Ｐ４〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドの塩基長を変化させることで、蛍光標識オリゴヌクレオチドがその標的配列と形成するハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を所望の値とすることができる。
【００８３】
本発明のＰ１〜Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチが、野生型の試料核酸とハイブリダイズした場合のＴｍ値と、変異型の試料核酸とハイブリダイズした場合のＴｍ値との差は、１．５℃以上、２．０℃以上、５．０℃以上、９．０℃以上にすることができる。
【００８４】
前記Ｔｍ値の差を大きくする方法としては、例えばプローブがハイブリダイズする領域に対応する塩基配列に対して、ミスマッチとなる塩基を該プローブに含める方法などが挙げられる。具体的には、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ（１９９７）ｖｏｌ１５  ｐ．３３１−３３５等に記載の方法が挙げられる。
【００８５】
本発明における前記Ｐ４〜前記Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおける塩基配列の一例を表３に示すが、本発明はこれらに限定されない。
また、表３において、下線を付したシトシンは、配列番号４又は５に示す塩基配列中、以下に示す塩基番号に該当するシトシンを示す。配列番号１１は１６７番目、配列番号１２は１６４番目、配列番号１３は１６３番目、配列番号１４は１６１番目、配列番号１５は１６１番目、配列番号１６は１６０番目、配列番号１７は１４４番目、配列番号１８は１４８番目、配列番号１９は１５１番目、配列番号２０は１４４番目及び１６１番目、配列番号２１は１４８番目及び１６４番目、配列番号２２は１６３番目のシトシンを表す。
【００８６】
【表３】
2013081450.tif 000004
【００８７】
本発明の前記Ｐ４及びＰ４’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１６７番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ５及びＰ５’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１６４番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ６及びＰ６’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１６３番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ７及びＰ７’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１６１番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ８及びＰ８’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１６０番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ９及びＰ９’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１４４番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ１０及びＰ１０’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１４８番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
本発明の前記Ｐ１１及びＰ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、１５１番目の塩基（シトシン）が蛍光色素で標識されていることを要する。
前記Ｐ４〜前記Ｐ１１’の蛍光標識オリゴヌクレオチドはＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型、特にＡ３１４０Ｇ変異を検出するＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブとして使用することができる。
また、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブとして使用することができる。
【００８８】
前記Ｐ４及びＰ４’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ４−１及びＰ４’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ４−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ４’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６７番目の塩基を含む塩基長１３〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６７番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００８９】
前記Ｐ５及びＰ５’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ５−１及びＰ５’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ５−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ５’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６４番目の塩基を含む塩基長１０〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００９０】
前記Ｐ６及びＰ６’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ６−１及びＰ６’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ６−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ６’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６３番目の塩基を含む塩基長９〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６３番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００９１】
前記Ｐ７及びＰ７’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ７−１及びＰ７’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ７−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ７’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６１番目の塩基を含む塩基長７〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００９２】
前記Ｐ８及びＰ８’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ８−１及びＰ８’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ８−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ８’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目〜１６０番目の塩基を含む塩基長６〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１６０番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００９３】
前記Ｐ９及びＰ９’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ９−１及びＰ９’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ９−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ９’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４４番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長１２〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４４番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００９４】
前記Ｐ１０及びＰ１０’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ１０−１及びＰ１０’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ１０−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１０’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１４８番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長８〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１４８番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００９５】
前記Ｐ１１及びＰ１１’蛍光標識オリゴヌクレオチドのより好ましい態様としては、以下のＰ１１−１及びＰ１１’−１蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
（Ｐ１１−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド、及び
（Ｐ１１’−１）配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５１番目〜１５５番目の塩基を含む塩基長５〜５０の塩基配列に相補的な塩基配列の相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズし、１５１番目の塩基に対応する塩基がシトシンであり、該シトシンが蛍光色素で標識されており、且つ配列番号４における１５５番目の多型を認識するオリゴヌクレオチド。
【００９６】
＜プライマー＞
後述するＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出方法では、検出対象となるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型を含む配列をＰＣＲ法により増幅する場合には、プライマーが用いられる。
本発明において使用しうるプライマーは、目的とする検出対象となるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型の部位である、Ｇ１６２４Ａ変異、Ｇ１６３３Ａ変異及びＡ３１４０Ｇ変異からなる群より選ばれる多型の少なくとも１つの多型を示す塩基を含む核酸を増幅可能であれば特に制限されない。
【００９７】
ＰＣＲ法に適用するプライマーは、本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅できるものであれば特に制限されず、配列番号１〜配列番号５で示される塩基配列から、当業者であれば適宜設計することができる。プライマーの長さ及びＴｍ値は、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒ及び４０℃〜７０℃、又は１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒ及び５５℃〜６０℃にすることができる。
また、プライマーセットの各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍ値はほぼ同一（又は、Ｔｍ値の両プライマーでの差が５℃以内）であることが挙げられる。
【００９８】
以下に本発明の多型検出方法における本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列の増幅に使用できるプライマーの例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。表４において、ＹはＣ又はＴを表す。
【００９９】
【表４】
2013081450.tif 000005
【０１００】
本発明の多型検出用プローブがハイブリダイズする領域を含む塩基配列を増幅する際には、感度及び効率の観点より、表４に示す各オリゴヌクレオチドのうち、ＰＩＫ３ＣＡ ｅｘ９Ｆ及びＰＩＫ３ＣＡ ｅｘ９Ｒと、ＰＩＫ３ＣＡ Ａ３１４０Ｇ Ｆ及びＰＩＫ３ＣＡ Ａ３１４０Ｇ Ｒとを、それぞれ一対のプライマーセットとして用いることが挙げられる。
【０１０１】
多型の検出方法は前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして利用する方法であれば、特に制限されない。前記蛍光標識ヌクレオチドをプローブとして用いる多型検出方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した多型検出方法について、以下に説明する。
【０１０２】
＜多型検出方法＞
本発明にかかるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出方法は、前記ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用プローブを少なくとも１種用いて、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出することを含むＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出方法である。
本発明にかかる多型検出方法によれば、前記多型検出用プローブを少なくとも１種含むことにより、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を簡便に、感度よく検出可能にする。
また、本発明の多型検出方法は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型の検出方法であって、下記工程（Ｉ）〜工程（ＩＶ）を含むことができ、下記工程（Ｖ）を含んでいてもよい。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
【０１０３】
（Ｉ）前記多型検出用プローブ及び試料中の一本鎖核酸を接触させて、前記蛍光標識オリゴヌクレオチド及び前記一本鎖核酸をハイブリダイズさせてハイブリッドを得ること。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることにより、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定すること。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいてハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を測定すること。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型の存在を検出すること（。
（Ｖ）前記多型の存在に基づいて、前記試料中の一本鎖核酸における、多型を有する一本鎖核酸の存在比を検出すること。
【０１０４】
また、本発明においては、上記工程（Ｉ）〜（ＩＶ）又は上記工程（Ｉ）〜（Ｖ）に加えて、さらに、工程（Ｉ）のハイブリッドを得る前又は工程（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に、核酸を増幅することを含んでいてもよい。
なお、（ＩＩＩ）でＴｍ値を測定することには、ハイブリッドの解離温度を測定することだけでなく、ハイブリット形成体の融解時に温度に応じて変動する蛍光シグナルの微分値の大きさを測定することを含んでもよい。
【０１０５】
本発明において、試料中の核酸は、一本鎖核酸でもよいし二本鎖核酸であってもよい。前記核酸が二本鎖核酸の場合は、例えば、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることに先立って、加熱により前記試料中の二本鎖核酸を融解（解離）させて一本鎖核酸とすることを含むことが挙げられる。二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離することによって、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【０１０６】
本発明において、検出対象である試料に含まれる核酸は、例えば、生体試料に元来含まれる核酸でもよいが、検出精度が向上できることから、生体試料に元来含まれている核酸を鋳型としてＰＣＲ等によりＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異した部位を含む領域を増幅させた増幅産物であることが挙げられる。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０ｍｅｒ〜１０００ｍｅｒ、又は８０ｍｅｒ〜２００ｍｅｒにすることができる。また、試料中の核酸は、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【０１０７】
本発明において、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は特に制限されない。試料中のＤＮＡに対して例えば１倍以下が挙げられる。また、十分な検出シグナル確保の観点より、前記試料中の核酸に対する、本発明の多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、０．１倍以下としうる。
ここで、試料中の核酸とは、例えば、検出目的の多型が発生している検出対象核酸と前記多型が発生していない非検出対象核酸との合計でもよいし、検出目的の多型が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記多型が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中の核酸における前記検出対象核酸の割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下としうる。また、前記多型検出用プローブの添加割合（モル比）は、検出対象核酸（検出対象配列を含む増幅産物）に対して、５倍以下、又は３倍以下としうる。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上、０．０１倍以上、又は０．１倍以上としうる。
【０１０８】
前記ＤＮＡに対する本発明の多型検出用プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【０１０９】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、前記多型検出用プローブに付加した標識のシグナルに基づくシグナルであって、一本鎖ＤＮＡと前記多型検出用プローブとのハイブリッド形成の状態に応じて変動するシグナルを測定することが挙げられる。このため、前記多型検出用プローブとして、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用することが挙げられる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとしては、例えば、標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）する蛍光標識オリゴヌクレオチド、または標的配列にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、標的配列にハイブリダイズしているときの蛍光強度が増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。
前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際には蛍光シグナルを示さないか、蛍光シグナルが弱いが、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルを示すようになるか、蛍光シグナルが増加する。
また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによって蛍光シグナルを示し、加熱によりプローブが解離すると蛍光シグナルが減少（消失）する。したがって、この蛍光標識に基づく蛍光シグナルの変化を蛍光標識特有の条件（蛍光波長等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。
【０１１０】
次に、本発明の多型検出方法について、蛍光色素に基づくシグナルの変化を検出する方法について具体的例を挙げて説明する。なお、本発明の多型検出方法は、前記多型検出用プローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【０１１１】
核酸増幅を行う際の鋳型となる核酸を含む試料としては、核酸、特にＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を含んでいればよく、特に制限されない。例えば、大腸や肺等の組織、白血球細胞等の血球、全血、血漿、喀痰、口腔粘膜懸濁液、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、乳、腹水液、パラフィン包埋組織、胃液、胃洗浄液、尿、腹膜液、羊水、細胞培養などの任意の生物学的起源に由来する又は由来しうるものを挙げられる。なお、試料の採取方法、核酸を含む試料の調製方法等は、制限されず、いずれも従来公知の方法が採用できる。また、鋳型となる核酸は、該起源から得られたままで直接的に、あるいは該サンプルの特性を改変するために前処理した後で使用することができる。
例えば、全血を試料とする場合、全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができる。例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【０１１２】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む多型検出用プローブを添加する。
前記多型検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、適当な溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものが挙げられる。
【０１１３】
前記多型検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ等の増幅処理を行う場合、増幅処理の後に増幅産物に対して添加してもよいし、増幅処理前に添加してもよい。
このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３'末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが挙げられる。
【０１１４】
核酸増幅の方法としては、例えばポリメラーゼを用いる方法等が挙げられる。その例としては、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法等が挙げられる。ポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが挙げられる。用いるプローブ及びポリメラーゼに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍ値を解析するだけで多型の有無を判定できるので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要がなく、自動化も容易である。
【０１１５】
またＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常用いられるＤＮＡポリメラーゼを特に制限なく用いることができる。例えば、ＧｅｎｅＴａｑ（ニッポンジーン社製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ等を挙げることができる。
ポリメラーゼの使用量としては、通常用いられている濃度であれば特に制限はない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼを用いる場合、例えば、反応溶液量５０μｌに対して０．０１Ｕ〜１００Ｕの濃度とすることができる。これにより、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型の検出感度が高まるなどの傾向がある。
【０１１６】
またＰＣＲ法は、通常用いられる条件を適宜選択することで行うことができる。
なお、増幅の際、リアルタイムＰＣＲによって増幅をモニタリングし、試料に含まれるＤＮＡ（検出対象配列）のコピー数を調べることもできる。すなわち、ＰＣＲによるＤＮＡ（検出対象配列）の増幅に従ってハイブリッドを形成するプローブの割合が増えるので蛍光強度が変動する。これをモニタリングすることで、試料に含まれる検出対象配列（正常ＤＮＡまたは変異ＤＮＡ）のコピー数や存在比を検出することができる。
【０１１７】
本発明の多型検出方法においては、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドと、試料中の一本鎖核酸とを接触させて、両者をハイブリダイズさせる。試料中の一本鎖核酸は、例えば、上記のようにして得られたＰＣＲ増幅産物を解離することで調製することができる。
【０１１８】
前記ＰＣＲ増幅産物の解離（解離工程）における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されない。例えば、８５℃〜９５℃である。加熱時間も特に制限されない。加熱時間は、例えば１秒〜１０分、又は１秒〜５分としうる。
【０１１９】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０℃〜５０℃である。
【０１２０】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１μＭ〜１μＭ、又は０．１μＭ〜０．５μＭとしうる。前記蛍光標識オリゴヌクレオチドの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲であり、例えば、０．００１μＭ〜１０μＭ、又は０．００１μＭ〜１μＭとしうる。
【０１２１】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記蛍光標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光シグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、解離した状態に比べて蛍光強度が減少（または消光）する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッドを徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１２２】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃、又は２５℃〜７０℃としうる。終了温度は、例えば、４０℃〜１０５℃としうる。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１℃／秒〜２０℃／秒、又は０．３℃／秒〜５℃／秒としうる。
【０１２３】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における微分値（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、ハイブリッド形成によりシグナル強度が増加するプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【０１２４】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッドを加熱して、温度上昇に伴う蛍光シグナル変動（好ましくは蛍光強度の増加）を測定するが、この方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッドを形成する際の前記温度降下に伴う蛍光シグナル変動を測定してもよい。
【０１２５】
具体例として、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が大きいが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記加熱した試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
他方、ハイブリッド形成によりシグナルが増加する標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離状態にあるため蛍光強度が小さい（または消光）が、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光強度が増加するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【０１２６】
＜薬効判定方法＞
本発明の薬効判定方法は、上述した多型検出方法によりＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出すること、及び、前記検出結果に基づいて抗がん剤に対する耐性又は抗がん剤の薬効を判定することを含む。
上述した多型検出方法では、本発明における多型検出用プローブを用いて、感度よく且つ簡便にＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出するので、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子におけるこの多型に基づいて抗がん剤の判定を感度よく且つ簡便に行うことができる。
【０１２７】
また、多型の有無や変異配列と正常配列の存在比に基づいて抗がん剤に対する耐性や抗がん剤の薬効を判定することができる。そして、本発明の抗がん剤の薬効判定方法は、変異の有無や変異配列の存在比に基づいて、抗がん剤の投与量の増加、他の抗がん剤への変更等への切り替え等の疾病の治療方針を決定するのに有用である。
また、判定対象となる抗がん剤としては、具体的には、セツキシマブ、パニツムバブ等が挙げられる。
【０１２８】
＜多型検出用試薬キット＞
本発明のＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出するためのＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型検出用試薬キットは、上述した多型検出用プローブを含む。
この多型検出用試薬キットには、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のうち、Ｇ１６２４Ａ変異、Ｇ１６３３Ａ変異及びＡ３１４０Ｇ変異からなる群より選ばれる多型の少なくとも１つの多型を簡便にかつ感度よく検出することが可能な既述の多型検出用プローブの少なくとも１種を含むことにより、例えばＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型の検出をより簡便に行うことができるなどの傾向がある。
【０１２９】
また、本発明における多型検出用試薬キットは、上述の検出対象となるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子多型を含む塩基配列を増幅するためのプライマーをさらに含んでいてもよい。これにより、本発明における多型検出用試薬キットは、精度よくＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型の検出を行うことができる。
なお、多型検出用試薬キットに含まれ得るプローブ及びプライマーについては、前述した事項をそのまま適用することができる。
【０１３０】
多型検出用プローブとして２種以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む場合、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドは混合された状態で含まれていても、別個に含まれていてもよい。
２種以上の前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは発光波長が互いに異なる蛍光色素で標識化されていてもよい。
このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの蛍光標識オリゴヌクレオチドについての検出を同時に行うことも可能になる。
【０１３１】
また、本発明における検出用試薬キットは、前記プローブ及び前記プライマーの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。また、プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
なお、「別個に収容」とは、各試薬が非接触状態を維持できるように区分けされたものであればよく、必ずしも独立して取り扱い可能な個別の容器に収容される必要はない。
多型部位を含む配列（プローブがハイブリダイズする領域）を増幅するためのプライマーセットを含むことで、例えば、より高感度に多型を検出することができる。
【０１３２】
さらに本発明の多型検出用試薬キットは、前記多型検出用プローブを使用して、検出対象である核酸を含む試料について微分融解曲線を作成し、そのＴｍ値解析を行って、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出することが記載された取扱い説明書、又は検出用試薬キットに含まれる若しくは追加的に含むことが可能な各種の試薬について記載された使用説明書を含むことができる。
【実施例】
【０１３３】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【０１３４】
［実施例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表５に記載した処方の検査用試薬を用いてＴｍ解析を行い、表６に記載の各蛍光標識オリゴヌクレオチドの多型検出用プローブの性能を確認した。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。また、表中において、大文字は多型を示す塩基を表す。以下同様である。
鋳型としては、表７に記載の鋳型（オリゴＤＮＡ）を使用した。
【０１３５】
【表５】
2013081450.tif 000006
【０１３６】
【表６】
2013081450.tif 000007
【０１３７】
【表７】
2013081450.tif 000008
【０１３８】
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜８０℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。蛍光色素としてＴＡＭＲＡを用いたので、励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１３９】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図２を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。図中、菱形で表すパターンは、鋳型として、配列番号４に示す塩基配列において１５５番目の塩基（Ｙ）がＴである、配列番号３５に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果と、１５５番目の塩基（Ｙ）がＴに相補的なＡである配列番号３７に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。図中、四角で表すパターンは、鋳型として、１５５番目の塩基（Ｙ）がＣである、配列番号３６に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果と、１５５番目の塩基（Ｙ）がＣに相補的なＧである配列番号３８に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。
【０１４０】
また、図２中（Ａ）は、配列番号８に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｂ）は、配列番号９に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｃ）は、配列番号１０に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｄ）は、配列番号１４に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｅ）は、配列番号１１に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｆ）は、配列番号１２に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｇ）は、配列番号１３に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｈ）は、配列番号１６に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｉ）は、配列番号１７に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｊ）は、配列番号１８に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｋ）は、配列番号１９に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｌ）は、配列番号２０に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｍ）は、配列番号２１に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｎ）は、配列番号２２に示す本発明に係るプローブを用いた場合の結果を示す。
【０１４１】
図２の結果より、本発明に係る蛍光標識オリゴヌクレオチドをプローブとして用いることにより、配列番号４又は配列番号５に示す塩基配列において１５５番目の塩基の多型を検出できることが明らかとなった。
【０１４２】
［実施例２］
サンプルとして表８に示す核酸混合液（４μｌ/反応液）又は精製ヒトゲノム（１００コピー/反応液）用いて自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ-ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）を用いてＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。ＰＣＲ反応液の処方を表９に示す。
【０１４３】
【表８】
2013081450.tif 000009
【０１４４】
【表９】
2013081450.tif 000010
【０１４５】
ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒及び５８℃で３０秒を１サイクルとして、５０サイクル繰り返した。
Ｔｍ解析は、ＰＣＲの後、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜７５℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。
【０１４６】
多型検出用プローブ及びプライマーは表１０に示す。
【０１４７】
【表１０】
2013081450.tif 000011
【０１４８】
蛍光色素Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅの励起波長は３６５ｎｍ〜４１５ｎｍであり、検出波長は４４５ｎｍ〜４８０ｎｍである。蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの励起波長は４２０ｎｍ〜４８５ｎｍであり、検出波長は５２０〜５５５ｎｍである。蛍光色素ＴＡＭＲＡの励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１４９】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図３を得た。
図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
【０１５０】
Ａ３１４０Ｇは野生型のとき（Ｗｔサンプル）は４５℃付近にひとつのピークが見られたが、変異型を含む場合（Ｍｔサンプル（１）及びＭｔサンプル（２））は５７℃にもピークが見られた。Ｇ１６２４ＡとＧ１６３３Ａは野生型のとき（Ｗｔサンプル）は４８℃付近にひとつのピークが見られたが、変異型を含む場合（Ｍｔサンプル（１）及びＭｔサンプル（２））は５５℃付近にもピークが見られた。
以上の結果より、本発明のプローブを用いることによりＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の多型を検出できることが明らかとなった。
【０１５１】
［比較例１］
全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（商標）、アークレイ社製）と、下記表１１に記載した処方の検査用試薬を用いてＴｍ解析を行い、表１２に記載の各蛍光標識オリゴヌクレオチドの多型検出用プローブの性能を確認した。なお、プローブ中の３’末端の括弧内は蛍光色素の種類を示す。
鋳型としては、表１３に記載の鋳型（オリゴＤＮＡ）を使用した。
【０１５２】
【表１１】
2013081450.tif 000012
【０１５３】
【表１２】
2013081450.tif 000013
【０１５４】
【表１３】
2013081450.tif 000014
【０１５５】
Ｔｍ解析は、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理し、続けて温度の上昇速度１℃／３秒で、４０℃〜８０℃まで温度を上昇させ、その間の経時的な蛍光強度の変化を測定した。蛍光色素としてＴＡＭＲＡを用いたので、励起波長は５２０ｎｍ〜５５５ｎｍであり、検出波長は５８５ｎｍ〜７００ｎｍである。それぞれの波長により、蛍光標識プローブに由来する蛍光強度の変化をそれぞれ測定した。
【０１５６】
Ｔｍ解析によって、プローブの蛍光値の変化量を示す図４を得た。図中、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量(ｄ蛍光強度増加量/ｔ)を表し、横軸は温度（℃）をそれぞれ表す。
図中、菱形で表すパターンは、鋳型として、配列番号４に示す塩基配列において１５５番目の塩基（Ｙ）がＴである、配列番号３５に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果と、１５５番目の塩基（Ｙ）がＴに相補的なＡである配列番号３７に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。
図中、四角で表すパターンは、鋳型として、１５５番目の塩基（Ｙ）がＣである、配列番号３６に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果と、１５５番目の塩基（Ｙ）がＣに相補的なＧである配列番号３８に示す人工オリゴ配列を用いた場合の結果を示す。
【０１５７】
また、図４中（Ａ）は、配列番号２７に示すプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｂ）は、配列番号２８に示すプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｃ）は、配列番号２９に示すプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｄ）は、配列番号３０に示すプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｅ）は、配列番号３１に示すプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｆ）は、配列番号３２に示すプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｇ）は、配列番号３３に示すプローブを用いた場合の結果を示し、（Ｈ）は、配列番号３４に示すプローブを用いた場合の結果を示す。
【０１５８】
図４の結果より、本発明の多型検出用プローブを使用しない場合には、少なくとも一方のピークが不明瞭であるか、又はピーク間の温度差が小さいため野生型と変異型の区別をつけることが困難であるなどの理由から、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出することができないことが明らかになった。なお、比較例１で用いた蛍光標識オリゴヌクレオチドは、数多く存在する検出不可能なプローブの代表例を示したものにすぎない。
【０１５９】
以上の通りであるので、本発明によれば、高い感度で、簡便にＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における多型を検出することができることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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