(57)【要約】【課題】  優れた表皮の幹細胞性維持剤及び表皮細胞未分化状態維持剤を提供すること。【解決手段】シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の抽出物を有効成分とする表皮の幹細胞性維持剤；シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の抽出物を有効成分とする表皮細胞未分化状態維持剤。前記ヒリュウシダ属植物が、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）であるのが好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の抽出物を有効成分とする表皮の幹細胞性維持剤。
【請求項２】
前記ヒリュウシダ属植物が、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）である請求項１記載の表皮の幹細胞性維持剤。
【請求項３】
前記植物抽出物が、アルコール類又は含水アルコール類で抽出されたものである請求項１又は２記載の表皮の幹細胞性維持剤。
【請求項４】
前記植物抽出物が、前記アルコール類抽出物及び／又は含水アルコール類抽出物から回収された水溶性画分である請求項３記載の表皮の幹細胞性維持剤。
【請求項５】
シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の抽出物を有効成分とする表皮細胞未分化状態維持剤。
【請求項６】
前記ヒリュウシダ属植物が、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）である請求項５記載の表皮細胞未分化状態維持剤。
【請求項７】
前記植物抽出物が、アルコール類又は含水アルコール類で抽出されたものである請求項５又は６記載の表皮細胞未分化状態維持剤。
【請求項８】
前記植物抽出物が、前記アルコール類抽出物及び／又は含水アルコール類抽出物から回収された水溶性画分である請求項７記載の表皮細胞未分化状態維持剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮の幹細胞性維持剤及び表皮細胞未分化状態維持剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の構造は、最上層から「表皮」「真皮」「皮下組織」の３層にわかれている。皮膚は、加齢による免疫力の低下・気温等の外部環境の変化・紫外線・外界の刺激・異物の過剰摂取などによる様々な要因により機能は衰えてシワ・シミ・クスミ・タルミ・肌荒れ等の肌トラブルや老化現象が現れる。中でも表皮は基底層において表皮細胞が分裂／増殖すると共に、一定の周期で角質細胞へと分化していくことが知られている。この分化の過程はターンオーバー（新陳代謝）とも呼ばれ、正常に行われないとバリア機能が十分発揮せず皮膚全体の状態を維持する上で重要である。これまで、老化した表皮では、ターンオーバーが遅くなり、表皮全体が薄くなることが知られている。
【０００３】
近年、組織幹細胞の枯渇こそが、組織の再生能力を損なわせ、老化形質を示す原因であるという説が提唱されるようになってきた。
幹細胞は自分自身が増える自己複製能力と、他の細胞に分化する能力を備える細胞であることが知られている。そして、幹細胞は分裂により前駆細胞を生み出し、この前駆細胞はある特定の機能を有した分化細胞を生み出すことが知られている。
また、幹細胞は、脊髄にあり赤血球や白血球を作る造血幹細胞、肝臓にある肝幹細胞、毛包にある毛包幹細胞等、様々な場所に様々な種類が存在していることが知られている。
表皮は基底層において分裂／増殖と分化をおこなっており、表皮幹細胞の存在を強く示唆している。
【０００４】
特許文献１には、インドール誘導体等の幹細胞増殖剤が開示されているが、これによって骨髄間葉幹細胞を増殖させたことが確認されたに過ぎず、表皮幹細胞については全く述べられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１８０７６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
表皮細胞の幹細胞性を維持するような物質は知られていないのが実状である。しかしながら、表皮組織の恒常性を維持するためには、表皮幹細胞性を維持できることが重要である。
よって、本発明は、斯かる実状に鑑み、優れた表皮の幹細胞性維持剤及び表皮細胞未分化状態維持剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、表皮組織の恒常性を維持するためには、表皮幹細胞を維持することが不可欠と考え、三次元皮膚モデルを作成し、このときの各種被験物質の挙動を鋭意検討した。
表皮細胞の細胞賦活試験（例えば特開２０１１−１７３８３１号公報等参照）にて確認された物質に、老化防止作用があると言われている。しかし、このような表皮細胞の細胞賦活試験は、カルシウムフリー培地にて分化が抑えられた状態での表皮細胞の増殖の程度を確認しているに過ぎない。
むしろ、本発明者は、細胞賦活物質や抗酸化物質の探究ではなく、カルシウム存在下、表皮細胞が角質細胞へと促進的に分化していく際に、そのなかの表皮細胞の一部を未分化状態のまま長期間維持できる物質又は表皮幹細胞性を維持できる物質の探究が必要であると考えた。
さらに各種被験物質を鋭意検討した結果、本発明者は、シダ植物抽出物に、表皮の幹細胞性維持及び表皮細胞未分化状態維持作用があることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の抽出物を有効成分とする表皮の幹細胞性維持剤又は表皮細胞未分化状態維持剤を提供するものである。
【０００９】
前記ヒリュウシダ属植物が、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）であるのが好適である。
前記植物抽出物が、アルコール類又は含水アルコール類で抽出されたものであるのが好適である。また、前記植物抽出物が、前記アルコール類抽出物及び／又は含水アルコール類抽出物から回収された水溶性画分であるのが好適である。
前記アルコール類の炭素数が、１〜４であるのが好適である。
前記アルコール類が、メタノール、エタノール、１，３−ブタンジオールから選ばれる１種又は２種以上のものであるのが好適である。
前記アルコール類の濃度が、２０体積％以上であるのが好適である。
【００１０】
ここで、本開示では、カルシウム存在下でも、表皮の細胞が未分化状態で分裂増殖を続けることができることを「表皮の幹細胞性」と定義する。また、このような機能を有する表皮の細胞を「表皮幹細胞」と本開示では定義する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れた表皮の幹細胞性維持剤及び表皮細胞未分化状態維持剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】右側は、上皮再構築体に、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）の抽出物を添加して培養したときの経時的観察である。左側は、上皮再構築体に添加しなかったコントロール（対照）のときの経時的観察である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示のシダ植物抽出物は、シダ植物から抽出して得ることができるものである。
【００１４】
本開示における植物とは、シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）等のシダ植物が挙げられる。これに属するものとして、例えば、ブレクナム カペンセ（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｃａｐｅｎｓｅ）、ブレクナム ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）などが挙げられる。このうち、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）が好ましい。
本開示における植物は、これらの群から１種又は２種以上を選ぶことができる。
【００１５】
前記シダ植物の使用する部位は、いずれの部位を用いてもよく、例えば、根、茎、幹、葉、胞子等から選ばれる１種又は２種以上のものを用いることができる。このうち、地上部分のものを用いるのが好ましく、葉及び／又は茎を用いるのがより好ましい。これらの部位は、乾燥、細切、圧搾、又は発酵などの適宜の処理を施した後に、抽出を行ってもよい。
【００１６】
前記シダ植物の抽出方法は、特に限定されない。例えば、シダ植物の抽出方法の一例として、特開２００３−３２１３７７号公報等を挙げることが可能であるが、これに限定されるものではない。
抽出は、前記シダ植物を一定温度（低温、常温又は加温）下にて、所定期間、浸漬等にて抽出溶媒を用いて行えば良い。
前記抽出溶媒としては、特に限定されないが、例えば水；アルコール類；アセトン等のケトン類；エチルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエステル類等の一種又は二種以上を用いることができる。
前記アルコール類として、メタノール、エタノール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ブタンジオール等の液状多価アルコール等が挙げられる。前記アルコール類は、１価アルコール類又は２価アルコール類（例えば、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール等のブタンジオール）が好ましく、アルコール類の炭素数は１〜５程度であるのが好ましい。
この溶媒のうち、水及び／又はアルコール類（好適には炭素数１〜４）が好ましい。前記アルコール類は、メタノール、エタノール、ブタンジオール（好適には１，３−ブタンジオール）から選ばれる１種又は２種以上のものが好ましい。
さらに、前記溶媒として、水及び／又はエタノールがより好ましく、エタノール及び水−エタノール混合溶液が好ましい。
また、アルコール類濃度は、好ましくは２０体積％以上、より好ましくは４０体積％以上、さらに好ましくは７０〜１００体積％であるのが好適である。また、含水エタノールを用いる場合、エタノール濃度は７０〜９０体積％とするが好適である。
【００１７】
前記シダ植物の好ましい抽出方法の例としては、前記シダ植物をアルコール類濃度０〜１００体積％のアルコール類又は水−アルコール類混合液にて、室温（例えば５〜４０℃程度）で又は加温（４０℃以上）して０．５〜５日間抽出を行う方法が挙げられる。
前記アルコール類濃度は、好ましくは４０体積％以上、より好ましくは７０体積％以上である。前記抽出温度は、好ましくは６０℃以上、より好ましくは１００℃以下、さらに好ましくは７５〜９５℃である。水沸点に近い温度帯で有機溶媒抽出することによって、表皮の幹細胞性維持作用等の有効成分を効率良く抽出することが可能である。また、抽出期間を、０．５〜２日程度で行うことも可能である。
【００１８】
前記シダ植物抽出物のさらなる精製方法の例として、前記シダ植物粗抽出物を、アルコール類−水混合液又は水に混合した後、冷温（１〜１０℃程度）にて２日〜２週間静置して、沈殿した水不溶性画分（残渣）を除去して水溶性画分（上澄み液や濾過液など）を回収する方法が挙げられる。
このときのアルコール類の濃度は、好ましくは５０体積％以下であり、より好ましくは４０体積％以下、さらに好ましくは３０体積％以下であり、さらに好ましくは２０体積％以下の低濃度とするのが好適である。前記抽出物から水溶性画分を回収することによって、表皮の幹細胞性維持作用等の有効成分を効率良く抽出することを可能とする。また、処理期間を、４〜９日程度にするのが、前記抽出物中の水不溶性画分（残渣）を除去しやすいので、好適である。
さらに、得られた水溶性画分から、活性炭等の濾過剤を用いて夾雑物や着色物等の不純物を除去した後、乾固して、シダ植物抽出精製物を得るのが、より生理活性向上の点で好ましい。
【００１９】
前記のシダ植物抽出物は、そのまま有効成分として用いてもよいし、適宜の期間そのまま放置し、熟成させた後に用いることもできる。必要に応じて、さらに、抽出溶媒の留去、濾過やイオン交換樹脂等による脱臭、脱色等の精製処理を施した後に用いることもできる。又、液体クロマトグラフィー等の分離手段を用いて、活性の高い画分のみを用いることもできる。
【００２０】
前記シダ植物抽出物は、抽出液単独で又は異なる抽出方法にて得られた抽出液を混合して、そのまま用いるか、又は当該抽出物を希釈、濃縮又は乾燥させて、液状、粉末状又はペースト状に調製してもちいることもできる。
【００２１】
後記〔実施例〕に示すように、カルシウム存在下で三次元皮膚モデル（例えば再構築皮膚）の表皮細胞の分化が促進されている状態であっても、本開示のシダ植物抽出物によって、表皮細胞の未分化状態が長期間維持され、表皮細胞がさらに分裂／増殖することができた。すなわち、本開示のシダ植物抽出物は、三次元皮膚モデルの表皮細胞を幹細胞のような状態に維持することができた。
【００２２】
よって、本開示のシダ植物抽出物は、表皮幹細胞性維持作用及び表皮細胞の未分化状態維持作用を有するため、前記シダ植物を含有させて有効成分とする表皮幹細胞性維持剤、表皮細胞の未分化状態維持剤、老化防止剤等（以下、「表皮の幹細胞性維持剤等」ともいう。）として使用することが可能である。
また、本開示のシダ植物抽出物は、ヒトを含む動物に摂取、投与又は接触させて、表皮の表皮幹細胞性維持、表皮細胞の未分化状態維持、表皮組織恒常性維持及び老化防止等を図るために、使用することができる物質である。例えば、本開示のシダ植物抽出物は、予防、改善若しくは治療、スキンケア及び美容等の目的で使用することができる。また、本開示のシダ植物抽出物は、表皮細胞の未分化状態維持剤、表皮幹細胞性維持剤、表皮組織恒常性維持剤及び老化防止剤等の各種製剤に使用することができ、これら各種製剤の製造するために使用することが可能である。
従って、本開示のシダ植物抽出物は、表皮の表皮幹細胞性維持、表皮細胞の未分化状態維持、表皮組織恒常性維持及び老化防止等のために、皮膚外用剤、化粧品、医薬品、医薬部外品、食品や機能性食品（例えば特定保健用食品等）等に配合することが可能であり、本開示の表皮の表皮幹細胞性維持等は、これら皮膚外用剤、化粧品等として有用である。
【００２３】
本開示のシダ植物抽出物は、特に皮膚外用剤、化粧品、医薬部外品に用いるのが好ましく、皮膚に塗布などに接触させる製剤が好適である。
前記表皮の幹細胞維持剤等の製剤中におけるシダ植物抽出物の含有量は、好ましくは０．００００１〜５質量％であり、より好ましくは０．００１〜０．５質量％であり、さらに好ましくは０．０００１〜０．０５質量％である。
【００２４】
なお、前記表皮の幹細胞性維持等には、本開示のシダ植物抽出物に、必要に応じて、任意の成分を組み合わせて使用してもよい。好ましい他の成分としては、薬学的に許容される成分であればよく、例えば、細胞賦活剤、抗酸化剤、保湿剤、紫外線防止剤、溶剤（水、アルコール類等）、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、安定化剤、着色剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、香料等が挙げられ、これらを目的とする製剤に応じて配合すればよい。
また、前記表皮の幹細胞性維持剤等の形態は、特に限定されず、液状、ペースト状、ゲル状、固形状、粉末状等の何れの形態でもよい。
【００２５】
以下に、本開示の表皮の幹細胞性維持作用及び／又は表皮細胞未分化状態維持作用を有する被験物質の探索方法の好適な一例を挙げる。
本開示の探索方法は、カルシウム存在下、三次元皮膚モデル（例えば再構築皮膚）に被験物質を接触させて、培養を行う。この際に、カルシウム存在下で被験物質無添加のものを対照とするのが望ましい。
また、この被験物質を探索する際の培養条件として、カルシウムフリー培地と比較して、カルシウム濃度を高めるのが望ましく、これにより表皮細胞の分化が進行しやすくなるので、表皮の幹細胞性維持作用又は表皮細胞未分化状態維持作用を有する物質を探索しやすい。培地中のカルシウムの濃度は、１．２〜１．５ｍＭ程度であるのが好適である。
【００２６】
本開示の方法に使用する三次元皮膚モデルは、特に限定されず、例えば、三次元培養皮膚及び器官培養皮膚等が挙げられる。なお、器官培養皮膚は、器官を含む皮膚又はその中の器官を取り出し、それを培養するものを挙げることができ、またこの由来となるものは、後述の表皮細胞の由来のものを挙げることができる。
三次元皮膚モデルは、一般的に市販されているものを用いることも可能である。市販品としては、例えば、Epiderm(商標：MatTek corporation社製)、EPISKIN (登録商標：SkinEhic Laboratories社製)等が挙げられる。
また、三次元皮膚モデルは、公知の手法にて作成することも可能である。例えば、特願２０１０−２５２８１８号記載及び公知の手法（例えば、特開２００５−１６８３９８号公報等）にて作製したものを用いることも可能である。
【００２７】
前記三次元皮膚モデルの作製方法としては、例えば、表皮角化細胞を、培養インサートの液透過性膜の上に播種し、必要により浸漬培養、気液培養等を組み合わせて作製すること等が挙げられる。このとき播種する表皮細胞は、５×１０２〜５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度に（初期）増殖させたものが望ましい。さらにこれに真皮線維芽細胞を加えて、三次元皮膚モデルを作成することもできる。
【００２８】
前記表皮細胞は、特に限定されず、例えば、ヒト、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ウサギ等の哺乳類由来のものが挙げられる。
また、この表皮細胞は、皮膚（好適にはヒト新生児包皮）の表皮角化細胞、口腔粘膜の上皮細胞、目の角膜細胞等から採取すればよい。このうち、ヒトの皮膚状態を考慮する際にはヒト由来のものが好ましい。
前記液透過性膜としては、播種した表皮細胞が接着又は固定され、その上で表皮細胞が増殖でき、支持体となりうるものであれば、特に限定されない。例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等の基材が挙げられる。更に、この基材の膜に、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックスやポリＬ−リジン等の細胞の接着を補助するものをコーティングしてもよい。
なお、三次元皮膚モデル作製のための培養インサート等の培養容器を用いればよい。また、培養インサートの他に用いる支持体としては、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、表皮細胞が除去された無細胞化真皮等やフィーダ細胞として真皮線維芽細胞を組み込んだもの等が挙げられる。
【００２９】
前記三次元皮膚モデル作製方法の一例として、より詳細な説明を以下にするが、これに限定されるものではない。
増殖培養工程及び分化誘導工程を少なくとも含む三次元培養皮膚作製方法が挙げられる。
例えば、前記増殖培養工程としては、表皮細胞が培養インサート底面にコンフルエントになるまで、培養増殖用培地にて５体積％ＣＯ２濃度下で１〜１４日間程度培養すること等が挙げられる。
また前記分化誘導工程としては、培養増殖用培地から細胞分化用培地に変え、当該培地にて表皮細胞を６〜４８時間程度培養（浸漬）した後、更には、この表皮細胞表面を空気（大気）に暴露し、０．５〜３日間程度培養して、培養表皮細胞を分化誘導することなどが挙げられる。
【００３０】
なお、前記三次元培養皮膚作製方法には、前記増殖培養工程の前に、初期増殖工程を含ませてもよい。
初期増殖工程としては、調製された表皮細胞１０３〜１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を、培養増殖用培地にて、５体積％ＣＯ２濃度の湿潤下で、シャーレに対してサブコンフルエント又はコンフルエントになるまで増殖させること等が挙げられる。
【００３１】
ここで、前記培養増殖用培地として、例えば、ＭＣＤＢ１５３やこれをベースとした市販品等を使用してもよい。この培地のカルシウム濃度は、０．０５〜０．１ｍＭ程度であればよい。
また、前記細胞分化用培地として、例えば、１．２〜１．５ｍＭ程度のカルシウムを含む培地等の市販品を使用してもよい。
このときの培養温度は、由来に対応する培養可能な温度であればよく、例えばヒト由来の場合２０℃〜４０℃、好ましくは３７℃程度であればよい。
また、酸素濃度は３〜２５体積％の雰囲気下で培養することが好ましく、より好ましくは１８〜２２体積％である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げ、本発明（本技術）をさらに具体的に説明するが、本発明（本技術）はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００３３】
＜製造例１：ブレクナム・ディスカラー抽出物の調製＞
シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ  ｄｉｓｃｏｌｏｒ）の葉１００ｇを細切し、これに８０体積％含水エタノール２Ｌを加えて８５℃で加熱して１日間抽出を行った。抽出液を濾過後濃縮し、水とエタノールを添加して、エタノール濃度を２０体積％、全量を３００ｍLに調整した後に５℃に１週間静置し生じた沈殿を取り除いた。その後、活性炭を用いて濾過を行い、溶媒を留去して乾固し、固形分であるブレクナム・ディスカラー抽出物を得た。収量は３ｇであった。
【００３４】
＜上皮再構築皮膚の調製方法＞
表皮角化細胞（ヒト新生児包皮由来）を細胞増殖用培地（カルシウム濃度０．０７ｍＭ）にて１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製し、１００ｍｍシャーレに１０ｍＬ添加する。その後、５体積％二酸化炭素濃度のガス雰囲気下、３７℃、湿潤下にて、細胞が培養シャーレに対してサブコンフルエントもしくはコンフルエントになるまで増殖させた。増殖培地は２〜３日毎に交換した。
増殖した細胞をトリプシンを用いてシャーレから剥がし、回収した。回収した細胞は増殖培地にて５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、セルカルチャーインサート（材質：ポリカーボネート、孔径：０．４μｍ）にインサートの大きさに合わせ適量添加した。インサートは６０ｍｍシャーレに必要個数設置した後、インサートの外側にも増殖培地をインサート内の液面と同じ高さになるまで添加した。細胞を播種した後、インサート底面に対してコンフルエントになるまで増殖培地を用い、細胞がコンフルエントになるまで培養した。
細胞がコンフルエントになった後、培地を分化培地（カルシウム濃度１．２ｍＭ）に変え、１６時間培養し分化誘導を行った。その後インサート内の培地を吸出し、空気曝露を行い、三次元培養皮膚を得、ＰＢＳで洗浄した。
【００３５】
〔実施例１：上皮再構築皮膚の観察〕
三次元培養皮膚の上部に、製造例１のブレクナム・ディスカラー抽出物１０μｇ／ｍＬを添加し、カルシウム濃度１．２ｍＭの条件下で、培養を継続し、２、４及び６週間ごとに、断面像観察を行った（図１参照）。また、無添加のものを、コントロールとした。
ブレクナム・ディスカラー抽出物は、コントロールと比較して、早い段階で細胞が消失せず、すなわち未分化性、増殖性が失われることがなかった。そして、生細胞層が長期間維持された。このことから、ブレクナム・ディスカラー抽出物は、表皮細胞未分化状態維持作用を有することを確認でき、表皮の幹細胞性を維持できるものと考えた。
【００３６】
＜断面像観察方法＞
上皮再構築体を回収し、４％パラホルムアルデヒド溶液にて固定後、  三次元皮膚モデルを回収し、４％パラホルムアルデヒド溶液にて固定後、ＯＣＴコンパウンドにて凍結標本を作製した。凍結標本をミクロトームを用い約６μｍ厚の切片を作成し、ヘマトキシリン・エオシン染色にて染色し、顕微鏡観察により組織切片像を得た。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本技術は、以下の構成を取ることも可能である。
〔１〕  シダ目シシガシラ科（Ｂｌｅｃｈｎａｃｅａｅ）ヒリュウシダ属（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ）植物の抽出物を有効成分とする表皮の幹細胞性維持剤又は表皮細胞未分化状態維持剤。
〔２〕  前記ヒリュウシダ属植物が、ブレクナム・ディスカラー（Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｄｉｓｃｏｌｏｒ）である前記〔１〕記載の表皮の幹細胞性維持剤又は表皮細胞未分化状態維持剤。
〔３〕  前記植物抽出物が、アルコール類又は含水アルコール類で抽出されたものである前記〔１〕又は〔２〕記載の表皮の幹細胞性維持剤又は表皮細胞未分化状態維持剤。
〔４〕  前記植物抽出物が、前記アルコール類抽出物及び／又は前記含水アルコール類抽出物から回収される水溶性画分である前記〔１〕〜〔３〕の何れか１項記載の表皮の幹細胞性維持剤又は表皮細胞未分化状態維持剤。
〔５〕  前記〔３〕又は〔４〕記載のアルコール類が１価アルコール類及び／又は２価アルコール類であるのが好適である。
前記〔３〕又は〔４〕記載のアルコールの炭素数が、１〜４であるのが好適である。
前記〔３〕又は〔４〕記載のアルコール類が、メタノール、エタノール、１，３−ブタンジオールから選ばれる１種又は２種以上のものであるのが好適である。
前記〔３〕又は〔４〕記載のアルコール類の濃度が、２０体積％以上であるのが好適である。
【図１】
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