(57)【要約】【課題】セルロース原料から糖を効率よく製造することができる、生産性に優れる糖の製造方法を提供する。【解決手段】下記工程（１）及び工程（２）を有し、該工程（１）及び／又は工程（２）を窒素含有化合物（Ａ）の存在下で行う、糖の製造方法である。工程（１）：セルロース原料を無機塩基性化合物（Ｂ）の存在下で粉砕処理し、セルロース粉砕物を得る工程工程（２）：工程（１）で得られたセルロース粉砕物を酵素で糖化処理する工程【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）及び工程（２）を有し、該工程（１）及び／又は工程（２）を窒素含有化合物（Ａ）の存在下で行う、糖の製造方法。
工程（１）：セルロース原料を無機塩基性化合物（Ｂ）の存在下で粉砕処理し、セルロース粉砕物を得る工程
工程（２）：工程（１）で得られたセルロース粉砕物を酵素で糖化処理する工程
【請求項２】
工程（１）を窒素含有化合物（Ａ）の存在下で行う、請求項１記載の糖の製造方法。
【請求項３】
窒素含有化合物（Ａ）が、アルキル基を有する第１級〜第３級アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、第４級アンモニウム塩、アミン部位を有するポリマー、アミン部位を有するポリマーと酸との付加塩、及び第４級アンモニウム塩部位を有するポリマーからなる群から選択される１種以上である、請求項１又は２に記載の糖の製造方法。
【請求項４】
無機塩基性化合物（Ｂ）が、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物及び硫化物からなる群から選択される１種以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項５】
窒素含有化合物（Ａ）の使用量が、セルロース原料中のホロセルロースを構成するアンヒドログルコース単位に対して、窒素原子換算で０．００１〜１倍モルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項６】
無機塩基性化合物（Ｂ）の使用量が、セルロース原料中のホロセルロースを構成するアンヒドログルコース単位に対して０．０１〜１０倍モルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【請求項７】
工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース粉砕物を酸で中和する工程を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境問題への取り組みなどから、セルロースを含有するバイオマス材料から糖を製造し、それを発酵法などでエタノールや乳酸などへ変換する試みがなされている。セルロースを含有するバイオマス材料をセルラーゼなどの酵素により処理し、該セルロースを糖化して糖を製造する方法においては、その前処理工程として、該セルロースの結晶構造を非晶化させる処理を行うことや、脱リグニン化を行うことが有用である。例えば特許文献１には、前処理工程として、塩化リチウム／ジメチルアセトアミドなどのセルロース溶剤を用いてセルロースを非晶化させることが開示されている。
また、特許文献２及び３には、バイオマスに含まれるセルロースを酵素により糖化する方法において、前処理工程として過酸化水素を使った熱水処理を行い、そこに含まれるリグニンを分解、除去させる方法が知られている。
【０００３】
一方、セルロースの糖化方法としては、特定のセルラーゼを用いて糖化する方法が知られている（特許文献４）。また、セルロース含有原料を、ロッドを充填した振動ミルで処理して、セルロースＩ型結晶化度を低減した非晶化セルロースを調製した後に、該非晶化セルロースにセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼを作用させて、セルロース含有原料から糖を製造する方法が知られている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２２３１５２号公報
【特許文献２】特開２００７−７４９９２号公報
【特許文献３】特開２００７−７４９９３号公報
【特許文献４】特開２００３−１３５０５２号公報
【特許文献５】特開２００９−１７１９５１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１〜４に記載の方法は、糖化効率、生産性において満足できるものではない。特許文献５に記載の方法は、優れた糖化効率を達成できるが、更に糖化効率を向上させることが求められている。
本発明は、セルロース原料から糖を効率よく製造することができる、生産性に優れた糖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、セルロース原料から糖を製造する方法において、特定条件下で前処理工程を行い、かつ窒素含有化合物を使用することで、前記課題を解決できることを見出した。
すなわち本発明は、下記工程（１）及び工程（２）を有し、該工程（１）及び／又は工程（２）を窒素含有化合物（Ａ）の存在下で行う、糖の製造方法（以下、「本発明の製造方法」ということがある。）を提供する。
工程（１）：セルロース原料を無機塩基性化合物（Ｂ）の存在下で粉砕処理し、セルロース粉砕物を得る工程（以下、単に「工程（１）」ということがある。）
工程（２）：工程（１）で得られたセルロース粉砕物を酵素で糖化処理する工程（以下、単に「工程（２）」ということがある。）
【発明の効果】
【０００７】
本発明の糖の製造方法によれば、酵素処理によるセルロースの糖化効率を向上させることができ、セルロース原料から糖を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［糖の製造方法］
本発明の糖の製造方法は、後述する工程（１）及び工程（２）を有し、糖化効率向上の観点から、該工程（１）及び／又は工程（２）を窒素含有化合物（Ａ）（以下、単に「（Ａ）成分」ともいう。）の存在下で行う。（Ａ）成分を用いることにより、糖化効率が向上する理由は明らかではないが、セルロース原料の小粒径化、セルロースの低分子量化、比表面積の増加、非晶化及びリグニン等の夾雑物の除去が行われるためと推測される。
本発明の製造方法において、糖化効率の更なる向上の観点から、工程（１）を（Ａ）成分の存在下で行うことが好ましい。
【０００９】
（窒素含有化合物（Ａ））
本発明において「窒素含有化合物」とは、窒素原子を１つ以上含有する化合物をいう。窒素含有化合物としては、アンモニア、アミン、アンモニア又はアミンと酸との付加塩、ならびに第４級アンモニウム塩からなる群から選択される１種以上が挙げられる。
【００１０】
前記アミンとしては、メチルアミン、ブチルアミン、２−エチルヘキシルアミン、ラウリルアミン、ステアリルアミン等の１級アミン；ジメチルアミン、ジブチルアミン、ジオクチルアミン、ジステアリルアミン等の２級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ラウリルジメチルアミン、ジステアリルメチルアミン等の３級アミン；ピロリジン、ピペリジン、モルホリン等の環状アミン、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ジエチレントリアミン、ピペラジン等の多価アミン；エタノールアミン、トリエタノールアミン、２−アミノ−２−メチルプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等のヒドロキシアミンが挙げられる。
また、ピリジン、ピロール、キノリン、イミダゾール等の芳香族アミン；グアニジン、アミジン等が挙げられる。
【００１１】
前記アンモニア又はアミンとの付加塩を形成する酸としては、塩酸、リン酸、硫酸などの無機酸、酢酸、プロピオン酸、ラウリン酸、ステアリン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、アジピン酸、フマル酸、クエン酸などの有機酸が挙げられる。水も酸の一種としてアンモニアと作用し、アンモニウムヒドロキシドを生成しうる。
アンモニア又はアミンと酸との付加塩としては、好ましくはオクチルアンモニウムクロリド、ラウリルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリドなどの第１級〜第３級アンモニウム塩や、塩化アンモニウム、アンモニウムヒドロキシドなどの無機アンモニウム塩が挙げられる。中でも、糖化効率向上の観点、及びセルロース原料の粉砕効率向上の観点から、アルキル基を有する第１級〜第３級アンモニウム塩及び無機アンモニウム塩が好ましく、無機アンモニウム塩がより好ましく、塩化アンモニウムが更に好ましい。
なお、前記アルキル基は、糖化効率向上の観点から、炭素数１〜３０であることが好ましく、炭素数６〜２２であることがより好ましい。
【００１２】
前記第４級アンモニウム塩としては、テトラメチルアンモニウムクロリド、テトラプロピルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、塩化コリン等が挙げられる。中でも、糖化効率向上の観点、及び粉砕効率向上の観点から、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、テトラメチルアンモニウムクロリド、及びジメチルジアリルアンモニウムクロリドが好ましい。
【００１３】
また、本発明に用いられる窒素含有化合物（Ａ）は、ポリマーであってもよい。該ポリマーとしては、アミン部位を有するポリマー、アミン部位を有するポリマーと酸との付加塩、及び第４級アンモニウム塩部位を有するポリマーが挙げられる。「アミン部位」における窒素原子は、１級〜３級のいずれでもよい。また、「アミン部位を有するポリマーと酸との付加塩」とは、前述した酸が前記アミン部位に付加した構造を少なくとも１つ有するポリマーをいう。
かかるポリマーの具体例としては、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド重合体、ジアリルメチルアミン塩酸塩・二酸化硫黄共重合体等のアリルアミンポリマー；ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート重合体、トリメチルアンモニオエチル（メタ）アクリレート重合体等の（メタ）アクリレート重合体、ポリ（４−ビニルピリジン）、ビニルメチルイミダゾリニウムクロリド等の芳香族アミン重合体、ポリエチレンイミン等が挙げられる。中でも、糖化効率向上の観点、及び粉砕効率向上の観点から、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド重合体、及びジアリルアミン塩酸塩・二酸化硫黄共重合体からなる群から選択される１種以上が好ましい。なお、これらのポリマーは、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
上記ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、糖化効率向上の観点から、１００，０００以下であることが好ましく、１，０００〜５０，０００であることがより好ましい。なお、上記ポリマーの重量平均分子量は、実施例に記載の方法により測定される値である。
【００１４】
以上より、窒素含有化合物（Ａ）としては、糖化効率向上の観点、及び粉砕効率向上の観点から、アルキル基を有する第１級〜第３級アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、第４級アンモニウム塩、アミン部位を有するポリマー、アミン部位を有するポリマーと酸との付加塩、及び第４級アンモニウム塩部位を有するポリマーからなる群から選択される１種以上であることが好ましく、塩化アンモニウム、テトラメチルアンモニウムクロリド、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリド、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド、ジメチルジアリルアンモニウムクロリドの重合体、及びジアリルアミン塩酸塩・二酸化硫黄共重合体からなる群から選択される１種以上であることがより好ましい。
【００１５】
後述する工程（１）及び／又は工程（２）における（Ａ）成分の使用量は、セルロース原料中のホロセルロースをすべてセルロースとして仮定した場合に、該セルロースを構成するアンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）に対して、窒素原子換算で０．００１〜１倍モルであることが好ましく、０．００２〜０．５倍モルであることがより好ましく、０．００５〜０．３倍モルであることが更に好ましく、０．００５〜０．２倍モルであることがより更に好ましい。（Ａ）成分の使用量が０．００１倍モル以上であれば糖化効率が向上する。また、該使用量が１０倍モル以下であれば、セルロース原料の粉砕効率向上の観点から好ましい。
なお、本発明において、工程（１）及び工程（２）の両方を（Ａ）成分の存在下で行う場合には、上記でいう（Ａ）成分の使用量とは、工程（１）及び工程（２）における（Ａ）成分の合計使用量を意味する。また、本発明において、ホロセルロースとは、セルロース及びヘミセルロースを意味する。
【００１６】
後述する工程（１）及び／又は工程（２）において、窒素含有化合物（Ａ）を添加する際の形態には特に制限はないが、粉砕効率の観点、製造時の取り扱い性の観点、及び（Ａ）成分を均一に分散させる観点から、セルロース原料中又はセルロース粉砕物中に、固体、液体、又は水溶液の状態で添加することが好ましい。
窒素含有化合物（Ａ）の添加方法には特に限定はなく、工程（１）で用いる無機塩基性化合物（Ｂ）や工程（２）で用いる酵素と同時に添加してもよく、個別に添加してもよい。また、（Ａ）成分を一括添加してもよく、分割添加してもよい。一括添加する場合は、セルロース原料中又はセルロース粉砕物中に（Ａ）成分を均一に分散させる観点から、セルロース原料中又はセルロース粉砕物中に（Ａ）成分を添加した後に撹拌混合するか、撹拌しながら（Ａ）成分を添加して混合することが好ましい。
【００１７】
＜工程（１）＞
工程（１）は、セルロース原料を、無機塩基性化合物（Ｂ）の存在下で粉砕処理し、セルロース粉砕物を得る工程である。
工程（１）において、好ましくは水分量が所定量以下の条件下で、セルロース原料を、無機塩基性化合物（Ｂ）と共に粉砕することにより、セルロースの低分子量化、比表面積の増加、非晶化及びリグニンの脱離が促進され、糖化効率が向上すると推測される。この際、窒素含有化合物（Ａ）を添加することで、さらに糖化効率を向上させることもできる。
【００１８】
（セルロース原料）
セルロース原料の種類には特に制限はなく、カラマツやヌマスギ、ヒノキなどの針葉樹、アブラヤシ、クヌギなどの広葉樹から得られる各種木材；木材から製造されるウッドパルプ、綿の種子の周囲の繊維から得られるコットンリンターパルプなどのパルプ類；新聞紙、ダンボール、雑誌、上質紙などの紙類；バガス（サトウキビの搾りかす）、パーム空果房（ＥＦＢ）、稲わら、とうもろこし茎などの植物茎・葉・果房類；籾殻、パーム殻、ココナッツ殻などの植物殻類などが挙げられる。
上記のうち、糖化効率の向上の観点、入手容易性及び原料コストの観点から、木材、植物茎・葉・果房類が好ましく、バガス、ＥＦＢ、アブラヤシ（幹部）がより好ましく、バガスが更に好ましい。
【００１９】
本発明に用いられるセルロース原料は、ホロセルロース含有量が２０質量％以上であることが好ましく、４０質量％以上であることがより好ましく、４５質量％以上であることが更に好ましく、５０質量％以上がより更に好ましい。なお、本発明において、ホロセルロースの含有量とは、セルロースとヘミセルロースの合計含有量をいう。
【００２０】
セルロース原料中の水分量は、粉砕効率の向上、及び結晶化度低減などの観点から、セルロース原料の乾燥重量に対して４０質量％以下であることが好ましい。水分量の下限はセルロース原料に対して０質量％であるが、セルロース原料中の水分量を０質量％にすることは困難であるため、該水分量はセルロース原料の乾燥重量に対して０．０１〜４０質量％であることが好ましく、０．１〜３５質量％であることがより好ましく、１〜３０質量％であることが更に好ましい。
なお、セルロース原料を公知の方法で乾燥させることにより（以下、「乾燥処理」ともいう。）、水分量を適宜調整することができる。
セルロース原料中の水分量は市販の赤外線水分計などを用いて測定することができ、具体的には実施例に記載の方法により測定することができる。
【００２１】
（無機塩基性化合物（Ｂ））
工程（１）において用いられる無機塩基性化合物（Ｂ）（以下、単に「（Ｂ）成分」ということがある。）としては、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、酸化物、及び硫化物からなる群から選択される１種以上が挙げられる。
アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどが挙げられる。また、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の酸化物としては、酸化ナトリウム、酸化カリウム、酸化マグネシウム、酸化カルシウムなどが挙げられ、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の硫化物としては、硫化ナトリウム、硫化カリウム、硫化マグネシウム、硫化カルシウムなどが挙げられる。
上記の無機塩基性化合物のうち、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物を用いることが好ましく、アルカリ金属水酸化物を用いることがより好ましく、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを用いることが更に好ましい。これらの無機塩基性化合物は、単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２２】
工程（１）において、無機塩基性化合物（Ｂ）の使用量は、セルロース原料中のホロセルロースをすべてセルロースとして仮定した場合に、該セルロースを構成するアンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）に対して０．０１〜１０倍モルであることが好ましく、０．０５〜８倍モルであることがより好ましく、０．１〜５倍モルであることが更に好ましく、０．１〜１．５倍モルであることがより更に好ましい。無機塩基性化合物（Ｂ）の使用量が０．０１倍モル以上であれば、後述する工程（２）において糖化効率が向上する。また、該使用量が１０倍モル以下であれば、無機塩基性化合物（Ｂ）の中和及び／又は洗浄容易性の観点、及び無機塩基性化合物（Ｂ）のコストの観点から好ましい。
【００２３】
無機塩基性化合物（Ｂ）を添加する際の形態には特に制限はないが、セルロース原料の粉砕効率の観点から、セルロース原料中に固体状態または溶液状態で添加することが好ましい。無機塩基性化合物（Ｂ）を固体状態で添加する場合、製造時の取り扱い性の観点、及び無機塩基性化合物（Ｂ）をセルロース原料中に均一に分散させる観点から、無機塩基性化合物（Ｂ）はペレット状、粒状、粉末状、または液体状であることが好ましい。なお、無機塩基性化合物（Ｂ）が固体状態であることは、水分を含有しないことを意味するものではなく、空気中の水分の吸湿などにより水分を含有していてもよい。
【００２４】
（添加方法）
セルロース原料への無機塩基性化合物（Ｂ）の添加方法には特に限定はなく、同時に添加しても、個別に添加してもよい。また、セルロース原料中に（Ｂ）成分を一括添加してもよく、分割添加してもよい。一括添加する場合は、セルロース原料中に（Ｂ）成分を均一に分散させる観点から、セルロース原料に（Ｂ）成分を添加した後に撹拌混合するか、セルロース原料を撹拌しながら（Ｂ）成分を添加して混合することが好ましい。
【００２５】
前記（Ｂ）成分の添加は、後述する粉砕処理を行う装置の中で行ってもよいし、別途撹拌及び混合を行う装置で行ってもよい。
上記撹拌及び混合を行う装置は、（Ｂ）成分をセルロース原料中に分散可能な装置であれば特に限定はない。例えば、リボン型混合機、パドル型混合機、円錐遊星スクリュー型混合機、粉体、高粘度物質、樹脂などの混錬に用いられるニーダーなどの混合機が挙げられる。これらの中では、水平軸型パドル型混合機がより好ましく、具体的には、チョッパー翼を有する水平軸型のパドル型混合機であるレディゲミキサー（中央機工株式会社製；特徴的なスキ状ショベルを用いる混合機、チョッパー翼を設置可能）、プロシェアミキサー（太平洋機工株式会社製；独自形状のショベル翼による浮遊拡散混合と多段式チョッパー翼による高速剪断分散の２つの機能を備えた混合機）が更に好ましい。
【００２６】
（水分量）
工程（１）は、セルロース原料の乾燥重量に対する水分量が４０質量％以下の条件下で行うことが好ましい。該水分量がセルロース原料の乾燥重量に対して４０質量％以下であれば、セルロース原料の粉砕効率、及びセルロース原料と前記（Ａ）成分や前記（Ｂ）成分との混合・浸透・拡散性が向上し、工程（２）の糖化処理が効率よく進行する。水分量の下限は０質量％である。
セルロースの結晶化度の低減、生産性及び糖化効率の向上の観点から、工程（１）における水分量は、セルロース原料の乾燥重量に対し０．１〜３５質量％であることがより好ましく、０．５〜３５質量％であることが更に好ましく、１〜３０質量％であることが更に好ましく、１〜２５質量％であることがより更に好ましく、１〜２０質量％がより更に好ましい。
工程（１）の粉砕処理時の水分量は、セルロース原料の乾燥重量に対する水分量を意味し、乾燥処理などによりセルロース原料、前記（Ａ）成分ならびに（Ｂ）成分に含まれる水分量を低減することや、粉砕処理時に水を添加して水分量を上げることなどにより、適宜調整することができる。
【００２７】
（粉砕処理）
粉砕処理は、セルロース原料を小粒径化し、かつ該セルロース原料中に前記（Ｂ）成分、又は（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を可及的に均一に分散させる操作である。
【００２８】
粉砕処理は、公知の粉砕機を用いて行うことができる。用いられる粉砕機に特に制限はなく、セルロース原料を小粒子化することができ、前記（Ｂ）成分、又は（Ａ）成分及び（Ｂ）成分をセルロース原料中に可及的に分散できる装置であればよい。
粉砕機の具体例としては、高圧圧縮ロールミルや、ロール回転ミルなどのロールミル、リングローラーミル、ローラーレースミル又はボールレースミルなどの竪型ローラーミル、転動ボールミル、振動ボールミル、振動ロッドミル、振動チューブミル、遊星ボールミル又は遠心流動化ミルなどの容器駆動媒体ミル、塔式粉砕機、攪拌槽式ミル、流通槽式ミル又はアニュラー式ミルなどの媒体攪拌式ミル、高速遠心ローラーミルやオングミルなどの圧密せん断ミル、乳鉢、石臼、マスコロイダー、フレットミル、エッジランナーミル、ナイフミル、ピンミル、カッターミルなどが挙げられる。これらの中では、セルロース原料の粉砕効率、及び生産性の観点から、容器駆動式媒体ミル又は媒体攪拌式ミルが好ましく、容器駆動式媒体ミルがより好ましく、振動ボールミル、振動ロッドミル又は振動チューブミルなどの振動ミルが更に好ましく、振動ロッドミルがより更に好ましい。
【００２９】
粉砕方法としては、バッチ式、連続式のどちらでもよい。
粉砕に用いる装置及び／又は媒体の材質としては特に制限はなく、例えば、鉄、ステンレス、アルミナ、ジルコニア、炭化珪素、チッ化珪素、ガラスなどが挙げられるが、セルロースの結晶化度低下効率の観点から、鉄、ステンレス、ジルコニア、炭化珪素、窒化珪素が好ましく、更に工業的利用の観点から、鉄又はステンレスが好ましい。
用いる装置が振動ミルであって、媒体がロッドの場合には、セルロース原料の粉砕効率の観点から、ロッドの外径は好ましくは０．１〜１００ｍｍ、より好ましくは０．５〜５０ｍｍの範囲である。ロッドの大きさが上記の範囲であれば、セルロース原料を効率的に小粒径化させることができるとともに、ロッドのかけらなどが混入してセルロースが汚染されるおそれが少ない。
ロッドの充填率は、振動ミルの機種により好適な範囲が異なるが、好ましくは１０〜９０％、より好ましくは１５〜８０％である。充填率がこの範囲内であれば、セルロース原料とロッドとの接触頻度が向上するとともに、媒体の動きを妨げずに、セルロース原料の粉砕効率を向上させることができる。ここで充填率とは、振動ミルの攪拌部の容積に対するロッドの見かけの体積をいう。
【００３０】
粉砕処理時の温度に特に限定はないが、操作コスト及びセルロース原料の劣化抑制の観点から、−１００〜２００℃が好ましく、０〜１５０℃がより好ましく、５〜１００℃が更に好ましい。
粉砕時間は、粉砕後のセルロース原料が小粒子化されるよう適宜調整すればよい。用いる粉砕機や使用するエネルギー量などによって変わるが、通常１分〜１２時間であり、セルロース原料の粒子径の低下の観点、及びエネルギーコストの観点から、２分間〜６時間が好ましく、５分間〜３時間がより好ましく、５分間〜２時間が更に好ましい。
【００３１】
以上のようにして工程（１）を行うことにより、セルロース粉砕物が得られる。ここで、工程（１）で用いた前記（Ｂ）成分、又は（Ａ）成分及び（Ｂ）成分や、セルロース原料中に含まれる夾雑物を除去するために、工程（２）の前に、以下のような中和工程及び／又は洗浄工程を有していてもよい。
【００３２】
（中和工程）
本発明の製造方法において、後述する工程（２）における糖化効率を向上させる観点から、工程（２）の前に、工程（１）で得られたセルロース粉砕物を酸で中和する工程（以下、これを「中和工程」と称する場合がある）を有することが好ましい。
用いられる酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸などの無機酸や、酢酸、クエン酸などの有機酸が挙げられるが、生産性、糖化効率並びに糖の収率向上の観点から、塩酸、酢酸、硫酸、硝酸又はリン酸を用いることがより好ましく、塩酸、酢酸又は硫酸を用いることが更に好ましい。
また塩酸、硫酸などの無機酸を用いた場合には、中和工程において生成する塩の糖化反応に対する悪影響が少ないため、糖の収率向上の観点からは無機酸を用いることが好ましい。
中和工程は、例えば、セルロース粉砕物を０．１〜５０質量％の濃度となるように水に分散した後に、中和熱による過度の発熱に注意しながら、０．０１〜３７％の塩酸や０．０１〜７５％の硫酸などの酸を、中性付近になるまで適量添加することにより行うことができる。その際、懸濁液を適度に攪拌し、均一化させることが好ましい。
【００３３】
（洗浄工程）
工程（１）で用いた前記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分や、セルロース原料中に含まれる夾雑物を除去し、工程（２）における糖化効率を向上させる観点から、工程（１）で得られたセルロース粉砕物を、工程（２）に供する前に水で洗浄する工程を有していてもよい（以下、これを「洗浄工程」と称する場合がある）。
セルロース粉砕物の洗浄は、例えば、セルロース粉砕物を０．１〜５０％の濃度となるようにイオン交換水に分散し、遠心分離器により固形分を沈殿させ分離し、再度イオン交換水に同程度の濃度となるように分散させ、遠心分離するという操作をｐＨが中性付近になるまで繰り返す方法などにより行うことができる。
【００３４】
上記中和工程及び洗浄工程は、いずれか一方の工程のみを行ってもよく、中和工程を行った後に更に洗浄工程を行ってもよい。糖の収率向上の観点から、無機酸を用いた中和工程のみを行うことが好ましい。
【００３５】
＜工程（２）＞
工程（２）は、工程（１）で得られたセルロース粉砕物を酵素で糖化処理する工程である。
工程（１）で得られたセルロース粉砕物は、非晶化・小粒径化され、また脱リグニン化・脱ヘミセルロース化されているため、酵素で処理することにより、グルコースもしくはキシロースといった単糖や、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロトリオースといったオリゴ糖などの混合物を効率よく得ることができると考えられる。糖化処理後にエタノール発酵や乳酸発酵に使用する場合などを考慮すると、単糖まで分解することが好ましい。
【００３６】
工程（２）において用いられる酵素としては、糖化効率の向上の観点から、セルラーゼやヘミセルラーゼが挙げられる。
ここで、セルラーゼとは、セルロースのβ−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素を指し、エンドグルカナーゼ、エクソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼなどと称される酵素の総称である。本発明に使用されるセルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤や、動物、植物、微生物由来のものが含まれる。
【００３７】
セルラーゼの具体例としては、セルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）などのトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ製剤やバチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  ＫＳＭ−Ｎ１４５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２７）株由来のセルラーゼ、またはバチルス  エスピー  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  ＫＳＭ−Ｎ２５２（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７４）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ１１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２６）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ４４０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２８）、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）  ＫＳＭ−Ｎ６５９  （ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７３０）などの各株由来のセルラーゼ、更には、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、アスペルギルス  アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｌｅａｔｕｓ）、クロストリジウム  サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）、クロストリジウム  ステルコラリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ）、クロストリジウム  ジョスイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｊｏｓｕｉ）セルロモナス  フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）、アクレモニウム  セルロリティクス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｒｉｔｉｃｕｓ）、イルペックス  ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼ混合物やパイロコッカス  ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の耐熱性セルラーゼなどが挙げられる。これらの中で、糖化効率向上の観点から、トリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、あるいはフミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルラーゼ、例えばセルクラスト１．５Ｌ（ノボザイムズ社製、商品名）、ＴＰ−６０（明治製菓株式会社製、商品名）、ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ  ＤＵＥＴ（ジェネンコア社製、商品名）、あるいはウルトラフロＬ（ノボザイムズ社製、商品名）が好ましい。
【００３８】
また、セルラーゼの１種であるβ−グルコシダーゼの具体例としては、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の酵素（例えば、ノボザイムズ社製ノボザイム１８８（商品名）やメガザイム社製β-グルコシダーゼ）やトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム  エメルソニイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）由来の酵素などが挙げられる。
【００３９】
また、ヘミセルラーゼの具体例としては、ＣｅｌｌｉｃＨＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）などのトリコデルマ  リーゼ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のヘミセルラーゼ製剤やバチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９７２９）由来のキシナラーゼのほか、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、バチルス  アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）由来のキシラナーゼ、更には、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、カルドセラム（Ｃａｌｄｏｃｅｌｌｕｍ）、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属由来のキシラナーゼなどが挙げられる。
【００４０】
工程（２）において用いられる酵素は、糖化効率の向上の観点から、上記セルラーゼ及びヘミセルラーゼから選ばれる１種以上であることが好ましい。
【００４１】
工程（２）において、セルロース粉砕物を酵素で糖化処理する場合の処理条件は、該粉砕物中のセルロースの結晶化度や、使用する酵素の種類により適宜選択することができる。
例えば、０．５〜４０％（ｗ／ｖ）に調製したセルロース粉砕物の懸濁液に対して、酵素を０．００１〜１５％（ｖ／ｖ）となるように添加し、ｐＨを２〜１０に調整して、反応温度１０〜９０℃で、３０分〜５日間反応させることにより糖を製造することができる。
上記懸濁液のｐＨは、用いる酵素の種類により適宜選択することが好ましく、糖化効率向上の観点から、好ましくはｐＨ３〜７、より好ましくはｐＨ４〜６である。
また、上記反応温度は、用いる酵素の種類により適宜選択することが好ましく、糖化効率向上の観点から、好ましくは２０〜７０℃、より好ましくは４０〜６０℃である。
また、上記反応時間は、用いる酵素の種類により適宜選択することが好ましく、糖化効率向上の観点から、好ましくは０．５〜３日間、より好ましくは０．５〜２日間である。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例において、「％」は特に断りのない場合、及び結晶化度（％）を除き、「質量％」を意味する。セルロース原料中のセルロース含有量として、ホロセルロース含有量を用いた。
【００４３】
（１）セルロース原料中のホロセルロース含有量の算出
粉砕したセルロース原料を、エタノール−ジクロロエタン混合溶剤（１：１）で６時間ソックスレー抽出を行い、抽出後のサンプルを６０℃で真空乾燥した。得られた試料２．５ｇに水１５０ｍＬ、亜塩素酸ナトリウム１．０ｇ及び酢酸０．２ｍＬを添加し、７０〜８０℃で１時間加温した。引き続き亜塩素酸ナトリウム及び酢酸を添加して加温する操作を、試料が白く脱色するまで３〜４回繰り返し行った。白色の残渣をグラスフィルター（１Ｇ−３）でろ過し、冷水及びアセトンで洗浄した後、１０５℃で恒量になるまで乾燥し、残渣重量を求めた。下記式によりホロセルロース含有量を算出し、これをセルロース含有量とした。
セルロース含有量（質量％）＝［残渣重量（ｇ）／セルロース原料の採取量（ｇ：無機塩基性化合物ならびに窒素含有化合物を除いた乾燥原料換算）］×１００
【００４４】
（２）アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）モル数の算出
ＡＧＵモル数は、セルロース原料中のホロセルロースをすべてセルロースと仮定して、以下の式に基づき算出した。
ＡＧＵモル数＝ホロセルロース重量（ｇ）／１６２
【００４５】
（３）セルロース原料の水分量の測定
セルロース原料の水分量の測定には、赤外線水分計（株式会社ケット科学研究所製、製品名「ＦＤ−６１０」）を使用した。１５０℃にて測定を行い、３０秒間の重量変化率が０．１％以下となる点を測定の終点とした。測定された水分量の値を、セルロース原料の乾燥重量に対する質量％に換算した。
【００４６】
（４）還元糖量及び糖化率の測定
実施例及び比較例において、ＤＮＳ法（「生物化学実験法  還元糖の定量法」学会出版センター）に基づき、以下の手順で糖の定量を行った。
工程（２）の糖化処理終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離した。ＤＮＳ溶液（０．５％−３，５−ジニトロサリチル酸、３０％−酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、１．６％−水酸化ナトリウム）１ｍＬに適量の上清液を加え、１００℃で５分間加熱発色させ、冷却後、波長５３５ｎｍで比色定量した。グルコースを標準糖とした検量線より、上清液中の還元糖量を定量した。
得られた還元糖量の値から、糖化率を求めた。糖化率は下記の計算式により算出した。
糖化率（％）＝上清中の還元糖量濃度（ｇ／ｍｌ）／（セルロース粉砕物濃度（ｇ／ｍｌ（無機塩基性化合物ならびに窒素含有化合物を除いた乾燥原料換算））×ホロセルロース含有量（ｇ／ｇ−セルロース原料）／０．９（グルコースの分子量／ＡＧＵの分子量））
【００４７】
（５）ポリマーの重量平均分子量の測定
ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、株式会社日立製作所製のＬ−６０００型高速液体クロマトグラフを用いて下記の条件下でゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を測定し、ポリエチレングリコール換算分子量として求めた。
＜ＧＰＣ測定条件＞
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−２２０ＨＱ（昭和電工株式会社製、排除限界分子量３，０００）及びＡｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−６２０ＨＱ（昭和電工株式会社製、排除限界分子量２００万）を２本接続、カラム温度：３０℃
展開溶媒：０．４ｍｏｌ／ｌ−塩化ナトリウム水溶液
試料濃度：０．５ｇ／１００ｍｌ、試料注入量：２０μｌ、流速：１．０ｍｌ／分
検出器：示差屈折計（昭和電工株式会社製；Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩＳＥ−６１）
【００４８】
実施例１
（乾燥処理）
バガス〔サトウキビの搾りかす、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量７．０質量％〕を減圧乾燥機（アドバンテック東洋株式会社製、商品名「ＶＯ−３２０」）の中に入れ、窒素流通下の条件で２時間減圧乾燥し、ホロセルロース含有量７１．３質量％、結晶化度２９％、水分量２．０質量％の乾燥バガスを得た。
（工程（１））
得られた乾燥バガス１００ｇと粒径０．７ｍｍの粒状の水酸化ナトリウム（東ソー株式会社製、商品名「トーソーパール」）４．４ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し０．２５モル相当量）、及び窒素含有化合物であるラウリルトリメチルアンモニウムクロリドの２７％水溶液（花王株式会社製、商品名「コータミン２４Ｐ」）４．３０ｇ（有効分：１．１６ｇ、ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し窒素原子換算で０．０１モル相当量）を、バッチ式振動ミル（中央化工機株式会社製、商品名「ＭＢ−１」：容器全容積３．５Ｌ、ロッドとして、φ３０ｍｍ、長さ２１８ｍｍ、断面形状が円形のＳＵＳ３０４製ロッドを１３本使用、ロッド充填率５７％）に投入し、１時間粉砕処理してセルロース粉砕物を得た。
（中和工程）
工程（１）で得られたセルロース粉砕物１５０ｍｇ（無機塩基性化合物ならびに窒素含有化合物を除いた乾燥原料換算）を、蓋つきスクリュー管（株式会社マルエム製、Ｎｏ．５，φ２７×５５ｍｍ）に投入し、１Ｎ−ＨＣｌで中和した。
さらに水と１００ｍＭ酢酸緩衝液０．３ｍｌを添加して３ｍｌとし、ｐＨが５．０となるように調整した。
（工程（２））
中和後のセルロース粉砕物（無機塩基性化合物ならびに窒素含有化合物を除いた乾燥原料換算で１５０ｍｇ相当）に対して、セルラーゼ酵素標品ＣｅｌｌｉｃＣＴｅｃ２（ノボザイムズ社製、商品名）を７．５μｌ加えて、振とう攪拌しながら５０℃で２４時間糖化処理を行った。
反応終了後、遠心分離によって沈殿物と上清液を分離し、上清液に遊離した還元糖量を上述したＤＮＳ法によって定量して糖化率を求めた。結果を表１に示す。
【００４９】
実施例２
工程（１）において、窒素含有化合物としてアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの５０％水溶液（花王株式会社製、商品名「サニゾールＢ−５０」）３．１２ｇ（有効分：１．５６ｇ、ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し窒素原子換算で０．０１モル相当量）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５０】
実施例３
工程（１）において、窒素含有化合物としてテトラメチルアンモニウムクロリド（和光純薬株式会社製）０．４９ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し窒素原子換算で０．０１モル相当量）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５１】
実施例４
工程（１）において、窒素含有化合物として塩化アンモニウム（和光純薬株式会社製）０．２４ｇ（ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し窒素原子換算で０．０１モル相当量）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５２】
実施例５
工程（１）において、窒素含有化合物としてジアリルジメチルアンモニウムクロリド重合体（Ｍｗ４０，０００）の２８％水溶液（ニットーボーメディカル株式会社製、商品名「ＰＡＳ−Ｈ−５Ｌ」）５．００ｇ（有効分；１．４０ｇ、ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し窒素原子換算で０．０２モル相当量）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５３】
実施例６
工程（１）において、窒素含有化合物としてジアリルアミン塩酸塩・二酸化硫黄共重合体（Ｍｗ５，０００）の２０％水溶液（ニットーボーメディカル株式会社製、商品名「ＰＡＳ−９２Ｓ」）５．００ｇ（有効分；１．００ｇ、ホロセルロースを構成するＡＧＵ１モルに対し窒素原子換算で０．０２モル相当量）を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５４】
実施例７
ラウリルトリメチルアンモニウムクロリドの２７％水溶液（花王株式会社製、商品名「コータミン２４Ｐ」）を工程（１）の替わりに工程（２）において添加したこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５５】
実施例８
ジアリルジメチルアンモニウムクロリド重合体（Ｍｗ４０，０００）の２８％水溶液（ニットーボーメディカル株式会社製、商品名「ＰＡＳ−Ｈ−５Ｌ」）を工程（１）の替わりに工程（２）において添加したこと以外は、実施例５と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５６】
比較例１
無機塩基性化合物及び窒素含有化合物のいずれも添加せずに工程（１）を行ったこと、及び、中和処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５７】
比較例２
無機塩基性化合物を添加せずに工程（１）を行ったこと、及び、中和処理を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の方法で糖の製造を行った。結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
表１より、本発明の糖の製造方法は、比較例１、２と比べ、セルロースの糖化率が向上し、また、得られる糖の収量が向上することから生産性にも優れることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の糖の製造方法は、生産性に優れ、セルロース原料から糖を効率的に得ることができる。得られた糖はエタノールや乳酸などの発酵生産などに有用である。