(57)【要約】【課題】より効率よくアゾ染料を分解可能なアゾ染料分解剤及びこれを用いたアゾ染料分解器を提供する。【解決手段】カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）及びペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）からなる群より選択された少なくとも１種の糸状菌由来の粗酵素を含むアゾ染料分解剤、及びこれを含むアゾ染料分解器。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）及びペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）からなる群より選択された少なくとも１種の糸状菌由来の粗酵素を含むアゾ染料分解剤。
【請求項２】
Ｔｗｅｅｎ８０、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）及び２，２，６，６−テトラメチルピペリジル−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）からなる群より選択された少なくとも１種を更に含む請求項１記載のアゾ染料分解剤。
【請求項３】
前記粗酵素と、
前記粗酵素を内包し、イオン透過性を有する第一の膜と、
前記粗酵素及び前記第一の膜よりも外側に配置された前記Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯからなる群より選択された少なくとも１種の化合物と、
前記粗酵素、第一の膜、及び前記化合物を内包する第二の膜と、
を備えた請求項２又は請求項３記載のアゾ染料分解剤。
【請求項４】
カワラタケＵ９７株由来の粗酵素と、
ＴＥＭＰＯ及びＨＢＴからなる群より選択された少なくとも１種と、
を含む請求項２又は請求項３記載のアゾ染料分解剤。
【請求項５】
ペスタロッチアＮＧ００７株由来の粗酵素と、
Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ、又は、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯの組み合わせと、
を含む請求項２又は請求項３記載のアゾ染料分解剤。
【請求項６】
カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）。
【請求項７】
ペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）。
【請求項８】
請求項１〜請求項５のいずれか１項記載のアゾ染料分解剤と、
前記アゾ染料分解剤を収容する収容部と、
前記収容部に設けられ、分解対象となるアゾ染料を含む液体を該収容部の内部へ供給可能な供給口と、
を備えたアゾ染料分解器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアゾ染料分解剤およびアゾ染料分解器に関する。
【背景技術】
【０００２】
アゾ染料は、現在最も多く用いられている合成染料であり、アゾ基によって二つの有機基が連結されたアゾ化合物で構成されている。アゾ染料は比較的安定であり、容易に分解され難いほか、有毒であり、その代謝物質などが突然変異誘発性や発がん性を有する可能性があるため、環境中への流出が大きな環境問題となっている。
【０００３】
そこで、このような難分解性のアゾ染料を分解する方法が種々提案されている。アゾ染料の分解方法として、例えば活性汚泥法、凝集沈殿法、またはこれらを組み合わせて処理する方法が実施されているが、多大なコストがかかる。また微生物を用いてアゾ染料を分解する方法として、例えば、特許文献１には、バチルス属に属する菌株微生物を用いる方法が、特許文献２には、ロドバクター属に属する菌株を用いる方法が開示されている。そのほか、過酸化酵素の一種であるマンガンペルオキシダーゼによってアゾ染料を分解する方法も開示されている。
【０００４】
例えば、アゾ染料を分解する他の手段として、白色腐朽菌を用いる方法がある。白色腐朽菌が産出する粗酵素について、種々の機能が知られており、その機能のひとつとしてアゾ染料分解機能が挙げられる。例えば非特許文献１には、上記粗酵素を用い、分解時のｐＨ、Ｈ２Ｏ２濃度、ＭｎＳＯ２濃度、メディエータの種類［Ｔｗｅｅｎ８０、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）など］を適切に制御すれば、難分解性のアゾ染料を短時間で分解できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−６５２６２号公報
【特許文献２】特開２００２−４５１７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「白色腐朽菌由来の粗酵素を用いたアゾ染料の分解」、第５３回リグニン討論会講演集、静岡、ｐ．１３６−１３７（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記非特許文献１に記載したように白色腐朽菌由来の粗酵素を用いれば、難分解性物質のアゾ染料を効率よく分解することができる。しかし、白色腐朽菌は環境負荷に最も敏感な微生物のひとつであり、白色腐朽箘の種類によっては、急激な環境変化や他の微生物との生存競争によって死滅する恐れがある。そのため、非特許文献１のように白色腐朽菌由来の粗酵素を、固定化することなく直接、アゾ染料で汚染された廃水や土壌などに用いると、環境条件などによっては所望の分解能が有効に発揮されない場合があった。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アゾ染料を分解可能な新規なアゾ染料分解剤及びこれを用いたアゾ染料分解器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下のとおりである。
［１］  カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）及びペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）からなる群より選択された少なくとも１種の糸状菌由来の粗酵素を含むアゾ染料分解剤。
［２］  Ｔｗｅｅｎ８０、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）及び２，２，６，６−テトラメチルピペリジル−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）からなる群より選択された少なくとも１種を含む［１］記載のアゾ染料分解剤。
［３］  前記粗酵素と、前記粗酵素を内包し、イオン透過性を有する第一の膜と、前記粗酵素及び前記第一の膜よりも外側に配置された前記Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯからなる群より選択された少なくとも１種の化合物と、前記粗酵素、第一の膜、及び前記化合物を内包する第二の膜と、を備えた［２］又は［３］に記載のアゾ染料分解剤。
［４］  カワラタケＵ９７株由来の粗酵素と、ＴＥＭＰＯ及びＨＢＴからなる群より選択された少なくとも１種と、を含む［２］又は［３］に記載のアゾ染料分解剤。
［５］  ペスタロッチアＮＧ００７株由来の粗酵素と、Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ、又はＨＢＴ及びＴＥＭＰＯとの組み合わせと、を含む［２］又は［３］に記載のアゾ染料分解剤。
［６］  カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）。
［７］  ペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）。
［８］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のアゾ染料分解剤と、前記アゾ染料分解剤を収容する収容部と、前記収容部に設けられ、分解対象となるアゾ染料を含む液体を該収容部の内部へ供給可能な供給口と、を備えたアゾ染料分解器。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アゾ染料を分解可能なアゾ染料分解剤及びこれを用いたアゾ染料分解器を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のアゾ染料分解剤の一例を示す概念図である。
【図２】本発明のアゾ染料分解器の一例を示す概念図である。
【図３】本発明の実施例にかかるＵ９７培養物のアゾ染料分解活性（図３上）及びＮＧ００７培養物のアゾ染料分解活性（図３下）をそれぞれ示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のアゾ染料分解剤は、カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）及びペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）からなる群より選択された少なくとも１種の糸状菌由来の粗酵素を含むアゾ染料分解剤である。
本発明は、カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）及びペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）に由来する粗酵素に強いアゾ染料分解能を有することを見いだしたことに基づくものである。従って、本発明によれば、これらの粗酵素単独で、又はこれらの粗酵素に加えてＴｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯからなる群より選択された少なくとも１種を組み合わせることにより、アゾ染料を分解することができる。
【００１３】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本発明において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明において、酵素活性に関するＵ（ユニット）とは、酵素量を表すために規定された量であり、酵素活性の強さ、すなわち一定条件において、一定時間に酵素によって触媒された反応量で表される。通常、１分間に１μｍｏｌの変化を報じる酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）とする。
以下、本発明について説明する。
【００１４】
［アゾ染料分解剤］
本発明のアゾ染料分解剤は、カワラタケＵ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）及びペスタロッチアＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）からなる群より選択された少なくとも１種の糸状菌由来の粗酵素を含む。
このような特定の糸状菌に由来する粗酵素を用いることによりアゾ染料を分解することができる。
【００１５】
カワラタケ（トラメテス・ベルジコロル［Trametes versicolor］）Ｕ９７株は、日本国愛媛県の土壌より分離した白色腐朽菌であり、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、２０１２年２月１４日付けで寄託されている（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）。本菌を麦芽エキス液体培地で培養した場合、培地にマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性、ラッカーゼ（Ｌａｃ）活性が認められる。Ｕ９７株は、主としてマンガンペルオキシダーゼの活性によりアゾ染料を分解すると推測される。
【００１６】
ペスタロッチア属細菌（Pestalotiopsis sp.）ＮＧ００７株は、日本国愛媛県の土壌より分離した非白色腐朽菌であり、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、２０１２年２月１４日付で寄託されている（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）。
本箘株を麦芽エキス液体培養で培養した場合、培地にカテコール１，２−ジオキシゲナーゼ活性が見られた。ＮＧ００７株は、主としてカテコール１，２−ジオキシゲナーゼの活性によって、アゾ染料を分解すると推測される。
【００１７】
本発明における粗酵素とは、Ｕ９７又はＮＧ００７の培養物から後述する緩衝液を用いて得られた２以上の酵素の混合物を意味する。また、粗酵素中の１又は２以上の酵素のアミノ酸配列が既知のものについては、遺伝子組み換え技術により得られた酵素が含まれていてもよい。
前記菌株由来の粗酵素は共に、０．００１Ｕ／ｍＬ〜０．０１Ｕ／ｍＬのラッカーゼ活性、０．０００１Ｕ／ｍＬ〜０．００５Ｕ／ｍＬのマンガンペルオキシダーゼ活性、０．０００１Ｕ／ｍＬ〜０．０５Ｕ／ｍＬのカテコール１，２−ジオキシゲナーゼ活性、及び０．０００１Ｕ／ｍＬ〜０．０１Ｕ／ｍＬのリグニンペルオキシダーゼ活性を示す。このような複数の酵素活性を有する粗酵素であることが、アゾ染料分解に有利である。
【００１８】
粗酵素の調製は、前記糸状菌を所定の栄養培地にて培養（培養工程）した後、緩衝液を加えて抽出（抽出工程）する公知の方法をそのまま適用することができる。
具体的には、粗酵素抽出のための培地又は菌床を用意する。前記培地としては、Ｃｚａｐｅｋ―Ｄｏｘ寒天培地、麦芽エキス寒天培地、馬鈴薯−デキストロース寒天（ＰＤＡ）培地などが挙げられる。前記菌床としては、植物残渣（例えば木屑、おが屑、鋸屑、米糠、おから、油粕、大豆粕等）などが挙げられる。
【００１９】
前記培地や菌床には、菌株の生育促進の目的で、菌株の栄養源や界面活性剤を添加することが好ましい。
前記栄養源としては、グルコース等の炭素源；ポリペプトン等の窒素源；マグネシウム塩、又はマンガン塩等の微量元素源；植物繊維の破砕物（パルプ）等の植物材料などを挙げることができる。例えば、昭和産業社製の「しいたけの里」など糸状菌の栄養源として市販されているものを用いてもよい。
前記界面活性剤としては、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤などが挙げられるが、前記菌株への生育状態の点で非イオン界面活性剤が好適である。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができる。非イオン性界面活性剤の具体例としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０等を挙げることができる。
【００２０】
前記栄養源の培地又は菌床への添加量は、菌体の量などに応じて適宜調整すればよい。前記菌株の生育、アゾ染料の分解及び環境への影響の観点から、添加する栄養源の量は、培地または菌床の全質量に対しておおむね、５質量％〜３０質量％であることが好ましい。
【００２１】
前記界面活性剤の培地又は菌床への添加量は、培地または菌床の全質量中におおむね、０．０５質量％以上、１．０質量％以下程度にすることが好ましく、０．１質量％以上、０．７５質量％以下程度にすることがより好ましい。０．０５質量％以上であれば、菌株の生育促進作用が有効に発揮されて、所望とするアゾ染料分解作用が得られる傾向がある。一方、１．０質量％以下であれば、白色腐朽菌の生育を損なわない傾向がある。
【００２２】
前記培地又は菌床には、クエン酸等のｐＨ調整剤等を添加してもよい。
前記培地又は菌床のｐＨは、前記菌株の生育の観点から、一般に４．０〜７．０とすることができる。
【００２３】
前記培養工程では、前記培地または菌床に前記菌株を接種し、菌糸蔓延した状態まで培養する。菌株の接種量や培養条件は、処理対象である廃液や汚染土壌などに含まれるアゾ染料の含有量などに応じて適宜調整すればよい。
【００２４】
前記抽出工程では、前記菌株の培養物に緩衝液を加え、粗酵素を抽出する。
前記緩衝液としては、マロン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などが用いられる。抽出方法としては、前記菌株の培養物に前記緩衝液を添加して、ホモジナイズした後に、吸引濾過して、濾過抽出する方法が挙げられる。前記緩衝液の菌株の培養物への添加量は、前記培養物（乾燥質量）当たり、おおむね２〜３倍とすることができる。
前記粗酵素は、上述のようにして抽出された抽出液（上澄み液）として用いてもよく、前記抽出液を凍結乾燥させて粉末状にしたものを冷凍保存しておき、使用時に上記緩衝液で適宜希釈して用いてもよい。
【００２５】
本発明のアゾ染料分解剤は、更に、Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯからなる群より選択された少なくとも１種（以下、メディエータ成分と称する）を含むことが好ましい。これらのメディエータ成分は、アゾ染料分解処理中にラジカルを発生させて染料脱色を高める。この結果、これらのメディエータ成分を粗酵素に組み合わせて用いることにより、前記粗酵素によるアゾ染料分解活性を高めることができる。
詳細には、前記粗酵素はそれぞれ、アゾ染料を分解するためにラジカルを発生させる。メディエータは、メディエータそれ自体でラジカルを発生する作用を有する、又は溶液中で酵素と接触することによりアゾ染料を分解するためのラジカルを発生する作用を有すると推測されている。
【００２６】
メディエータ成分の含有量は、用いられる粗酵素の種類及び活性、メディエータ成分の種類によって異なるが、一般に、粗酵素（Ｕ９７由来粗酵素の場合にはマンガンペルオキシダーゼを基準とし、ＮＧ００７由来粗酵素の場合は、１，２−ジオキシゲナーゼを基準とする）１Ｕあたり０．１３ｍｇ〜１３９ｍｇ、好ましくは、０．３ｍｇ〜５５．６ｍｇとすることが好ましい。
【００２７】
特に、Ｕ９７株由来の粗酵素については、ＴＥＭＰＯ及びＨＢＴからなる群より選択された少なくとも１種をメディエータ成分として用いることが、アゾ染料分解能の観点から好ましく、ＴＥＭＰＯ及びＨＢＴを組み合わせて用いることが最も好ましい。
この場合、ＴＥＭＰＯの含有量の含有量は、粗酵素のアゾ染料分解効果の観点から、粗酵素１Ｕあたり、０．１３ｍｇ〜２．２ｍｇとすることができ、０．３５ｍｇ〜１．３ｍｇとすることが好ましく、０．４３ｍｇ〜０．８６ｍｇとすることがより好ましい。
またＨＢＴの含有量としては、粗酵素１Ｕあたり、０．１９ｍｇ〜１．９ｍｇとすることができ、０．３０ｍｇ〜１．１３ｍｇとすることが好ましく、０．３８ｍｇ〜０．７６ｍｇとすることがより好ましい。
【００２８】
またＮＧ００７株由来の粗酵素については、Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ、又は、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯとの組み合わせをメディエータ成分として用いることが、アゾ染料分解能の観点から好ましく、Ｔｗｅｅｎ８０又は、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯの組み合わせをメディエータ成分として用いることが更に好ましい。
この場合、Ｔｗｅｅｎ８０の含有量としては、粗酵素のアゾ染料分解効果の観点から、粗酵素１Ｕあたり、１４ｍｇ〜１３９ｍｇとすることができ、２２．２ｍｇ〜８３．３ｍｇとすることが好ましく、２４．８ｍｇ〜５５．６ｍｇとすることがより好ましい。
ＴＥＭＰＯの含有量の含有量は、粗酵素のアゾ染料分解効果の観点から、粗酵素１Ｕあたり、０．１３ｍｇ〜２．２ｍｇとすることができ、０．３５ｍｇ〜１．３０ｍｇとすることが好ましく、０．４３ｍｇ〜０．８６ｍｇとすることがより好ましい。
またＨＢＴの含有量としては、粗酵素１Ｕあたり、０．１９ｍｇ〜１．９ｍｇとすることができ、０．３ｍｇ〜１．１３ｍｇとすることが好ましく、０．３８ｍｇ〜０．７６ｍｇとすることがより好ましい。
【００２９】
本発明にかかるアゾ染料分解剤は、粗酵素のアゾ染料分解活性の持続性、使用効率等の観点から、単層又は複数の膜で覆われたカプセル構造の形態であることが好ましい。
【００３０】
また、アゾ染料分解剤が、前記メディエータ成分を含む形態の場合には、前記アゾ染料分解剤は、前記粗酵素と、前記粗酵素を内包し、イオン透過性を有する第一の膜と、前記粗酵素及び前記第一の膜よりも外側に配置された前記Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯからなる群より選択された少なくとも１種と、前記アゾ染料分解剤の表面を覆う第二の膜と、を備えたものであること好ましい。
【００３１】
このようないわゆる多層カプセル構造を有することにより、粗酵素を固定化酵素として利用可能であり、良好な酵素活性を得ることができる。また、（１）粗酵素の安定性が増大すること、（２）粗酵素とアゾ染料分解後の生成物との分離が容易になり、粗酵素の繰返し使用が可能となること、（３）アゾ染料分解反応の開始・停止を固定化酵素の添加、除去により容易に制御可能となること、などの利点を有する。
【００３２】
以下、本発明のアゾ染料分解剤の一形態を、図面を参照して説明する。
図１に、カプセル形態のアゾ染料分解剤の一例を示す。
アゾ染料分解剤１０は、粗酵素１２を内部に有しており、粗酵素１２は、その周囲を内膜１４で覆われている。アゾ染料分解剤１０の表面は、外膜１８によって被覆されており、外膜１８と内膜１４との間には、メディエータ成分１６は配置されている。
メディエータ成分１６は、内膜１４を挟んで粗酵素１２の周囲に存在している。内膜１４はイオン透過性を有するので、粗酵素１２と、メディエータ成分１６との接触を効果的に行うことができる。また内膜１４は、粗酵素１２を透過させないので、粗酵素の機能を長時間持続させることができる。
アゾ染料の分解能の観点から、内膜１４と外膜１８が共にイオン透過性をすることが好ましい。これにより、アゾ染料分解剤１０の内部で発生した粗酵素１２によるラジカルが効果的にアゾ染料分解剤１０の外部へ放出されてアゾ染料を分解することができる。
【００３３】
これらの膜を構成する成分としては、好ましくは、アルギン酸カルシウム、若しくはκ−カラギーナンカリウム、又はι−カラギーナンカルシウムなどを挙げることができ、これらが単独で又は２種以上を組み合わせてゲル化した半透膜であることが好ましい。これらの成分はいずれも、安全性が高く、また、イオン透過性の被膜として最も効果的に作用する。
【００３４】
外膜１８と内膜１４との間には、本発明の作用を損なわない限度において、前述したメディエータ成分１６以外の他の成分を含んでいてもよい。このような他の成分としては、ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ２、ビオルル酸（ＶＬＡ）、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）等を挙げることができ、中でも、ＭｎＳＯ４及びＨ２Ｏ２が染料脱色の点で、好ましい。
【００３５】
前記アゾ染料分解剤１０は、内膜１４及び外膜１６以外にも、粗酵素１２を内包する構造であれば、更に単数又は複数の膜を有していてもよく、この結果、本発明の作用を損なわない範囲で、三重以上の多重カプセル構造を有していてもよい。多重カプセル構造の例として、例えば、外膜１６と内膜１４との間に、イオン透過性を有する他の膜を１又は２以上有することができる。他の膜を備えた場合には、他の膜と外膜１８との間、メディエータ成分と共存可能な成分として、又はメディエータ成分１６を含まない層の成分として、他の成分を含むことができる。このような他の層に含まれうる他の成分としては、例えば、上記のＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ２、ビオルル酸（ＶＬＡ）や２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）等を挙げることができる。
【００３６】
［アゾ染料分解剤の調製方法］
本発明のアゾ染料分解剤は、前記粗酵素を含むものであれば、その製造方法に特に制限はなく、前記粗酵素を適当な溶媒に溶解して調製することができ、また、前記粗酵素を適当な担体に固定化して調製してもよい。
また、前記アゾ染料分解剤が、メディエータ成分を含むものである場合には、粗酵素とメディエータとを混合して調製してもよく、別個に調製して使用時に混合してアゾ染料分解剤を構成してもよい。
以下に、本発明の好ましい態様としてのカプセル構造を有するアゾ染料分解剤の製造方法について、説明する。
【００３７】
カプセル構造を有するアゾ染料分解剤は、前述した方法によって得られた粗酵素を用い、酵素固定化手段として通常用いられる包括法を用いて調製することができる。上記包括法は、例えば下記文献に記載されている公知の酵素固定化手段であり、マイクロカプセル型と格子型が代表的に例示される。いずれもゲル化剤等のカプセル化剤などによって酵素を内部に格納（固定化）する方法であり、包括法によれば、酵素が直接外気と接触することなく、酵素活性を長時間持続させることができる。
Zorica,Knezevic, Svetleana Bobic, Aleksandra Milutinovic, Bojana Obradovic, Ljiljana Mojovic, Branko Bugarski: Alginate-immobilized lipase by electrostatic extrusion for the purpose of palm oil hydrolysis in lecithin/isooctane system, Process Biochemistry, 38 (2002) 313-318.
【００３８】
前記カプセル化剤として、アルギン酸カルシウム、カラゲーナン、セルロース、ポリアミド、アクリルアミドゲルなどが挙げられる。これらのカプセル化剤は、原料物質の形態で用いることもできる。例えばアルギン酸カルシウムと塩化カルシウムを反応させてアルギン酸カルシウムのゲル化半透膜を作製することができる。具体的には、アルギン酸ナトリウムなどのカプセル化剤を含有した成分原料液を塩化カルシウムなどの塩化物溶液に一滴ずつ滴下することにより、その界面でこれらが反応してアルギン酸カルシウムとなり、カルシウムが架橋構造を作り、ゲル化する。この性質を利用してゲルの内側に粗酵素１２を包み込み、カプセル構造のアゾ染料分解剤を作製することができる。
【００３９】
アゾ染料分解剤の作製方法は、例えば前述した特開２００８−２２２７２７号公報に記載の方法を参照することができる。
【００４０】
以下、更に好ましい形態として、粗酵素とメディエータ成分とを含むアゾ染料分解剤であって、アルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムを用いて粗酵素１２を内包した二重カプセル構造のアゾ染料分解剤１０を作製する方法を説明するが、本発明はこれに限定する趣旨ではない。
なお、アゾ染料分解剤１０には、粗酵素１２として、例えば、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）が用いられる場合、おおむね、約２Ｕ〜２００Ｕ程度に相当する量の粗酵素であることが好ましい。また、粗酵素１２として、例えば、カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ（Ｃ１，２Ｏ）が用いられる場合、おおむね、Ｃ１，２Ｏ活性が２Ｕ〜２００Ｕ程度に相当する量の粗酵素であることが好ましい。
【００４１】
まず、上記のようにして抽出して得られた粗酵素１２を、約１０ｍＭ〜５０ｍＭのマロン酸緩衝液１０ｍＬ〜２０ｍＬに溶解し、この溶液中に１．０質量％〜５．０質量％に相当するアルギン酸ナトリウム０．１ｇ〜１．０ｇを滴下し、粗酵素原料液を得る。
【００４２】
このようにして得られた粗酵素原料液を、軽く攪拌している０．１Ｍ〜０．２Ｍの塩化カルシウムを溶解した２０ｍＭ〜５０ｍＭマロン酸緩衝１００ｍＬに滴下する。滴下された粗酵素原料液は、外径が約３ｍｍ〜５ｍｍ程度の略球状体となり、その表面では、前記アルギン酸ナトリウムと前記塩化カルシウムが反応してアルギン酸カルシウムのゲル化半透膜の内膜１４が形成される。得られた略球状体を上記溶液から引き上げることにより、一重カプセルの固定化酵素が得られる。
【００４３】
次に、メディエータ成分１６をそれぞれ所定量、約２０ｍＭ〜５０ｍＭのマロン酸緩衝液５０ｍＬ〜６０ｍＬに溶解し、この全溶液に対して１．０質量％〜５．０質量％に相当するアルギン酸ナトリウム０．５ｇ〜３．０ｇを加えて溶解してメディエータ成分液を用意する。メディエータ成分１６の使用量は、例えば、ＨＢＴを用いる場合には１３．６ｍｇ〜２７．２ｍｇとすることができ、例えば、ＴＥＭＰＯの場合には１５．６ｍｇ〜１２．２ｍｇとすることができる。
【００４４】
次いで、前記一重カプセルの固定化酵素を、前記メディエータ成分液に添加して、これらを、軽く攪拌している０．１Ｍ〜０．２Ｍの塩化カルシウムが溶解された２０ｍＭ〜５０ｍＭのマロン酸緩衝液１００ｍＬ中に撹拌しながら滴下する。滴下された液滴は、前記の一重カプセルの固定化酵素の場合と同様に、アルギン酸カルシウムのゲル化半透膜の外膜１８がその表面に形成される。これをから引き上げることにより、二重カプセル構造のアゾ染料分解剤１０が得られる。
【００４５】
上記では、１．０質量％〜５．０質量％に相当するアルギン酸ナトリウムを用いたが、この代わりに、１．０質量％〜５．０質量％に相当するκ−カラギーナンを用いてもよく、この場合は、前記０．１Ｍ〜０．２Ｍに相当する塩化カルシウムの代わりに０．５Ｍ〜１．０Ｍに相当する塩化カリウムを用いることが好ましい。また、前記の１．０質量％〜５．０質量％に相当するアルギン酸ナトリウムの代わりに、１．０質量％〜５．０質量％に相当するι−カラギーナンを用いてもよく、この場合は、前記０．１Ｍ〜０．２Ｍの塩化カルシウムをそのまま用いることが好ましい。ただし、κ−カラギーナンやι−カラギーナンを用いるよりも、アルギン酸ナトリウムを用いる方が、アゾ染料分解率が大幅に向上するので好ましい。
【００４６】
［アゾ染料の分解方法］
本発明のアゾ染料の分解方法は、前記アゾ染料分解剤を用いてアゾ染料を分解するものであり、具体的には、アゾ染料分解剤とアゾ染料とを接触させること（接触工程という）を含む。前述の通り前記アゾ染料分解剤はアゾ染料の分解効果が高いため、このようなアゾ染料分解剤を用いることにより、良好にアゾ染料を分解することができる。
【００４７】
分解対象であるアゾ染料としては、染料として用いられるアゾ化合物であれば特に限定されず、モノアゾ化合物（例えばＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４、Ｒｅａｃｔｉｖｅ、Ｙｅ１ｌｏｗ  ８６など）、ジアゾ化合物（例えばＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｂ１ａｃｋ  ５、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｅｅｎ  １９、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  １２０など）などが挙げられる。また、上記の以外にも、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  １５９、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５及びＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ６４、Ｒｅａｃｒｉｖｅ  Ｒｅｄ  ２２２、Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｎａｖｙ  Ｂｌｕｅ  ＲＵＮ、Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５Ｒ  ９０％等を挙げることができる。
【００４８】
接触工程では、上記アゾ染料を含む処理対象物に前記アゾ染料分解剤を接触させ、アゾ染料を分解する。上記処理対象物としては、アゾ染料を含む土壌などの固体であってもよいし、アゾ染料で汚染された廃水などの液体であってもよい。上記処理対象物へのアゾ染料の混入割合は、アゾ染料の含有量、アゾ染料の種類などに応じて適宜調製することができる。例えば、処理対象物１ｋｇまたは１Ｌに対して、マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）の場合には、おおむね、ＭｎＰ活性が約２Ｕ〜２００Ｕ程度に相当する量の粗酵素を含む分解剤を導入することが好ましい。また、カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ（Ｃ１，２Ｏ）の場合には、おおむね、Ｃ１，２Ｏ活性が２Ｕ〜２００Ｕ程度に相当する量の粗酵素を含む分解剤を導入することが好ましい。
【００４９】
前記アゾ染料分解剤を用いてアゾ染料を分解する場合、アゾ染料の分解活性の観点から、ｐＨ４．０〜８．０の範囲のｐＨ条件で行うことが好ましく、ｐＨ４．５〜７．０の範囲のｐＨ条件で行うことがさらに好ましい。ｐＨ９．０以上であれば、酵素が働かなくなるので染料脱色が低下する傾向があり、ｐＨ４．０以下でも、染料脱色が低下する傾向がある。特に、Ｕ９７株由来の粗酵素の場合には、ｐＨ４．５〜７．０であることが好ましく、ＮＧ００７株由来の粗酵素の場合には、ｐＨ４．５〜８．０であることが好ましい。
接触工程における接触温度には、特に制限はなく、一般に１５℃〜４０℃とすることができ、２０〜３５℃であることが好ましい。
また接触時間としては、特に制限はなく、一般に６０分〜３０００分とすることができ、効率のよい分解処理の観点から、６０分〜３６０分とすることができる。
【００５０】
前記アゾ染料分解剤を用いてアゾ染料を高い分解率で分解する為には、振とう時の振とう速度を適切に制御することが好ましい。具体的には、処理対象であるアゾ染料の種類や濃度、用いられる分解剤の種類、振とう条件［用いられる容器の種類（例えば三角フラスコ、試験管など）や、そのサイズなど］、振とう速度などに応じで適切に制御すればよい。例えば、振とう速度としては、が、おおむね、１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍの範囲内に制御することが好ましい。詳細には、幅を４ｃｍとしたときに、振とう速度を１００ｍＬ容の三角フラスコでは１０ｒｐｍ〜１２０ｒｐｍ、２０ｍＬ容の試験管では１０ｒｐｍ〜１５０ｒｐｍの範囲内に制御することが好ましく、より好ましくは、上記三角フラスコでは３０ｒｐｍ〜９０ｒｐｍであり、上記試験管では６０ｒｐｍ〜１２０ｒｐｍである。
【００５１】
［アゾ染料分解器］
本発明にかかるアゾ染料分解器は、前記のアゾ染料分解剤と、前記アゾ染料分解剤を収容する収容部と、前記収容部に設けられ、分解対象となるアゾ染料を含む液体を該収容部の内部へ供給可能な供給口と、を備えたものである。前記アゾ染料分解器では、アゾ染料分解剤を収容する収容部を備えているので、取り扱い性に優れる。また、収容部に供給口を備えているので、分解対象となるアゾ染料を含有する処理液を、供給口から収容部内部へ供給することにより、簡便にアゾ染料分解剤と処理液とを接触させることができる。
【００５２】
以下に、本発明のアゾ染料分解器の一形態を、図面を参照して説明する。
図２には、本発明のアゾ染料分解器に一例を示す。
アゾ染料分解器２０は、円筒状の外筒２２と、外筒２２の端部にそれぞれ配置された開口部２４、２６と、外筒２２の内部に充填されたアゾ染料分解剤１０（図１参照）とで構成されている。
外筒２２は、アゾ染料分解剤を収容できることが可能な材質で構成されていればよく、特に制限はない。また外筒２２の形状は、円筒形に限定されず、矩形、球状等のいずれであってもよい。また、外筒２２に設けられた開口部２４、２６は、それぞれ外筒２２の端部に設けられているので、分解処理対象物を、開口部２４から外筒２２内部へ供給すると、開口部２６から排出可能となる。
【００５３】
開口部２４、２６周辺には、図示しないメッシュが配置されており、外筒２２の内部に充填されたアゾ染料分解剤１０を内部に保持可能にしている。メッシュの径は、二重カプセル構造を有するアゾ染料分解剤１０の直径よりも小さければ特に制限はない。アゾ染料分解器２０は、開口部２４を流入側、開口部２６を排出側として接続された図示しないチューブを介して図示しないバイオリアクターに連結される。
【００５４】
バイオリアクターを作動させて、分解処理対象液（アゾ染料溶液）の流入を開始すると、開口部２４から分解処理対象溶液がアゾ染料分解器２０へ注入され、開口部２６から排出される。この間、分解処理対象溶液は、アゾ染料分解器２０の内部に充填されたアゾ染料分解剤１０と接触する。分解処理対象溶液中のアゾ染料は、アゾ染料分解剤１０と接触することによって分解される。アゾ染料が分解されて脱色された処理済み液は、開口部２６を介して、アゾ染料分解器２０の外部へ排出される。
このように、分解処理対象溶液中のアゾ染料は、アゾ染料分解器２０内に供給されてアゾ染料分解剤１０と接触することにより、分解される。
【００５５】
アゾ染料分解器２０は、流速調整機構を備えたバイオリアクターに接続することができる。これにより、アゾ染料分解器２０をバイオリアクターの一部として利用することができ、流速制御による分解速度のコントロールや、分解剤の繰り返し使用などのメリットを得ることができる。バイオリアクターを用いた分解方法は、特にアゾ染料で汚染された工場廃水などの液体試料を浄化するのに有効であり、当該工場廃水などを巡回させることによって繰返し何回でも当該工場廃水を浄化処理することができる。
【００５６】
アゾ染料分解器２０では、端部にそれぞれ開口部２４、２６を有する外筒２２の内部に前記アゾ染料分解剤１０を充填したが、市販のカラムにアゾ染料分解剤１０を充填することによってアゾ染料分解器２０を得てもよい。市販のカラムとしては、特に制限はないが、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製の「Ｅｃｏｎｏ−Ｃｏ１ｕｍｎ」等を挙げることができる。
【００５７】
なお、アゾ染料分解器２０では開口部を２つ設けたが、これに限定されない。例えば、分解処理対象溶液の流入側に１つと、排出側に２つとしてもよく、収容部内に分解処理液を収容して、いわゆるバッチ処理する場合には、開口部は１つとしてもよい。
また、アゾ染料分解器２０では、開口部２４と開口部２６とを、アゾ染料分解器２０の長手方向に沿った直線上に設けたが、これに限定されない。例えば、開口部２４及び開口部２６のいずれか一方を、外筒２２の長手方向側面側に設けてもよい。
【００５８】
また、アゾ染料分解器２０の外筒２２に開口部２４、２６が設けられているが、これに限定されない。例えば、外筒２２を、周面の少なくとも一部をメッシュ状とし且つ両端を封止した筒状の外筒としてもよい。
【００５９】
本発明に用いられるバイオリアクターは、連続分解処理性などを考慮し、下記構成のものが好ましく用いられる。
槽数：約２〜４槽
槽構成：好気槽約２〜４槽（嫌気槽はなし）
各槽の容量：約０．１Ｌ〜１０Ｌ
【００６０】
また、バイオリアクター中で分解処理を行う場合には、バイオリアクター内で循環する分解処理対象溶液の流速を適切に制御することが好ましく、これによりアゾ染料の分解率が向上する傾向がある。具体的には、処理対象であるアゾ染料の種類や濃度、用いられる分解剤の種類、バイオリアクターの構成、大きさなどに応じて適切に制御すればよい。例えば、おおむね、０．５ｍＬ／ｍｉｎ以上に分解処理体対象溶液の流速を制御することが好ましく、流速が速くなるほど、分解能も増加する傾向にある。詳細には上述した好ましい構成の場合、おおむね、流速を０．５ｍＬ／ｍｉｎ〜２０ｍＬ／ｍｉｎの範囲内に制御することが好ましく、より好ましくは、１ｍＬ／ｍｉｎ〜１０ｍＬ／ｍｉｎである。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。また、特に断らない限り、実施例中の「％」は質量基準である。
【００６２】
［実施例１］
（１）糸状菌によるアゾ染料分解
糸状菌としては、カワラタケ（トラメタス・ベルジコロル［Trametes versicolor］）Ｕ９７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３２）及びペスタロッチア属細菌（Pestalotiopsis sp.）ＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）を用いた。
【００６３】
カワラタケＵ９７株は、日本国愛媛県東温市の山林の腐朽した木材より分離した糸状菌であり、以下の特徴から、白色腐朽菌の一種であるカワラタケとして分類された。
薄い黒色から灰色の半円形の傘（大きさ約２〜７ｃｍ）を持ち、多数重生すること。
胞子は白色の胞子（長さ：５μｍ〜７μｍ、直径：２〜３μｍ）であること。
培地上で白色の菌糸として生育。菌糸にクランプコネクションが見られること。
麦芽エキス液体培地で培養した場合、培地にマンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性、ラッカーゼ（Ｌａｃ）活性が見られたこと。
【００６４】
ペスタロッチア属細菌ＮＧ００７株（ＮＩＴＥ  ＡＰ−１２３３）は、日本国愛媛県松山市内の枯れ木材より分離した糸状菌であり、以下の特徴から、ペスタロッチア属細菌として分類された。
気生菌糸は、白色で各壁を有し、その表面は滑らかで、直径約１〜３μｍである。
分生子柄は、褐色から暗黒色で気生菌糸上に直立して形成され、その表面は平滑で棍棒状をしていること。
分生胞子は、紡錘形または楕円形であり、分生胞子の構成細胞数５細胞（内、有色細胞３）であり、３本の付属糸を有する糸状菌であること。
付属糸を除いた大きさは、長さ：約１０〜２５μｍ、幅：５μｍ〜１０μｍであり、先端細胞の付属糸の大きさは約５μｍ〜１５μｍ、後部細胞の小柄の大きさは約２μｍ〜６μｍであること。
培地上で白色の菌糸として生育し、約２〜３週間後に褐色から暗黒色の分生胞子を形成すること。
麦芽エキス液体培養で培養した場合、培地にカテコール１，２−ジオキシゲナーゼ活性が見られたこと。
【００６５】
Ｕ９７株の継代には、下記に示す組成のＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地を用いた。ＮＧ００７株の継代には、下記に示す麦芽エキス寒天培地を用いた。
【００６６】
Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地（１Ｌ）
グルコース                            １０ｇ
スクロース                              ２ｇ
酵母エキス                              ２ｇ
ポリペプトン                            １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                          ０．５ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０                  ０．５ｇ
ＫＣｌ                              ０．０１ｇ
リグニンスルホン酸ナトリウム塩        １５ｇ
滅菌水                                  １Ｌ
寒天                                  １０ｇ
ｐＨ                                  ４．５
【００６７】
麦芽エキス寒天培地（１Ｌ）
麦芽抽出物                            ２０ｇ
グルコース                            ２０ｇ
ペプトン                                １ｇ
寒天                                  ２０ｇ
滅菌水                                  １Ｌ
ｐＨ                                  ４．５
【００６８】
上記のように培養を行ったＵ９７菌又はＮＧ００７菌をまず、クリーンベンチ内でＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地の入ったプラスチックシャーレに接種し、２５℃で１６８時間培養した。
【００６９】
各菌株を、ｐＨ４．５の麦芽エキス培地（２０ｇ／Ｌ麦芽エキス、２０ｇ／Ｌグルコース、及び１ｇ／Ｌポリペプトン含有）にて７日間前培養した後に、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ２２２（ＲＲ２２２）、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  １５９（ＲＲ１５９）、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５（ＲＶ５）及びＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ６４（ＲＯ６４）の各アゾ染料を、最終濃度１０ｍｇ／Ｌとして培養物へ添加して、２４時間、４８時間及び７２時間反応させた。なお、各染料はいずれも愛媛県産業技術研究所繊維産業技術センターから提供されたものを使用した。
【００７０】
反応後、以下のようにしてアゾ染料分解率を測定した。
紫外可視分光光度計（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製のＵＶ−ＶＩＳＩＢＬＥ  ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ  ＵＶ−１６００）を用い、反応前と、反応後の各アゾ染料の極大吸収波長（ＲＲ２２２：５０８ｎｍ、ＲＲ１５９：５２２ｎｍ、ＲＶ５：５５９．５ｎｍ、ＲＯ６４：４８８ｎｍ）における吸光度を測定し、下記の式に基づいて分解率を求めた。結果を図３に示す。なお、図３において、白丸はＲＶ５、白菱形はＲＲ２２２、白四角はＲＯ６４、白△はＲＲ１５９を示す。また図３の上のグラフは、Ｕ９７によるアゾ染料分解の結果を示し、図３の下のグラフは、ＮＧ００７によるアゾ染料分解の結果を示す。
Ｒ（％）＝［（Ａｉｎｉｔｉａｌ−Ａｏｂｓｅｒｖｅｄ）／Ａｉｎｉｔｉａｌ］×１００
【００７１】
図３に示されるように、Ｕ９７（図３上）及びＮＧ００７（図３下）はいずれのアゾ染料分解能を有することがわかった。
【００７２】
（２）粗酵素の調製
木粉（具体的にはブナ木粉）８００（乾重）ｇと、木粉の乾燥重量１５質量％の栄養体（昭和産業社製の「しいたけの里」）１２０ｇを混合した後、含水率６０％となるように水を０．４７Ｌ添加してよく撹絆し、１５００ｍＬの種菌ボトルに入れた。これをオートクレーブに入れ、１２１℃で３時間加熱滅菌した。
【００７３】
上記（１）で調製した各菌株の培養物をコルクボーラーで打ち抜き、打ち抜いたものを、それぞれ上記の種菌ボトルに接種し、暗所下にて２５℃で１ヶ月間培養した。培養後、ＪＡえひめ菌床センターに依頼し、菌床(１袋：３ｋｇ木粉＋木粉に対して１５質量％の栄養体）を作製した。詳細には、５Ｌ容のプラスチックバッグ一袋に３ｋｇの木粉としいたけの里（菌床に対して１５質量％）を混合したものを加えた後、含水率６０％質量に調整してオートクレーブに入れ、１２１℃で６時間加熱滅菌した。これを無菌室で冷却した後、これに予め種菌ボトルで培養した培養物（２５ｇ）を無菌的に接種して、２５℃で１ケ月間培養して菌床を作成した。
【００７４】
次に、上記のようにして各菌株を培養した菌床（３００ｇ）に氷冷した０．０５Ｍマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）６００ｍＬを加え、ホモジナイザーで１００００ｒｐｍ、１０分間ホモジナイズした。ホモジナイズ後、二重にしたガーゼでろ過した濾液を、更に８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清に硫酸アンモニウム（７５％）を加えた後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた沈殿物に０．０５Ｍマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を６０ｍＬ加え、再溶解させた。次いで、−２０℃で予備凍結を行なった後、−５０℃で３日間凍結乾燥し、各菌株由来の粉末状粗酵素（約９ｇ）を得た。このようにして得られた粗酵素は、使用時まで−３４℃で保存した。
【００７５】
上記のようにして得られた粗酵素の酵素活性（１ｍｇ／マロン酸緩衝液１ｍＬに溶解）は表１の示す通りであった。
なお、各酵素活性は、以下の通りである。
マンガンペルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性は、Ｂｒｏｗｎらの方法（J. Bacteriology，Vol.172(6)，pp.3125-3130(1990)）により求めた（モル吸光度係数ε：４９６００ｍｏｌ-１ｃｍ-１）。
リグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）活性は、ＴｉｅｎとＫｉｒｋの方法（Methods in Enzymology,Vol.161,pp.238-249(1988)）により求めた（モル吸光度係数ε：９３００ｍｏｌ-１ｃｍ-１）
ラッカーゼ（Ｌａｃ）活性は、ＬｅｏｎｏｗｉｃｚとＧｒｚｙｗｎｏｗｉｃｚの方法（Enzyme and Microbial Technology,Vol.3,pp,55-58(1981)）によりを求めた（モル吸光度係数ε：６５００ｍｏｌ-１ｃｍ-１）。
カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ（Ｃ１，２Ｏ）活性ＮａｋａｚａｗａとＮａｋａｚａｗａの方法（Methods in Enzymology,Vol.17,pp,518-522(1970)）によりを求めた（モル吸光度係数ε：１６０００ｍｏｌ-１ｃｍ-１）。
カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ（Ｃ２，３Ｏ）活性は、ＮａｋａｚａｗａとＮａｋａｚａｗａの方法（Methods in Enzymology,Vol.17,pp,518-522(1970)）によりを求めた（モル吸光度係数ε：４４０００ｍｏｌ-１ｃｍ-１）。
【００７６】
【表１】
2013183713.tif 000002
【００７７】
表１に示されるように、Ｕ９７株はＣ２，３Ｏ及びＭｎＰ活性が高く、ＭｎＰ活性によりアゾ染料を分解していると推定される。しかし、ＭｎＰ活性が主として分解に関係していると推定される。また、リグニナーゼの一種と考えられているＬａｃ及びＬｉｐ活性も、アゾ染料の分解に関係していると推測される。
一方、ＮＧ００７株は、Ｃ１，２Ｏ活性が特に高く、Ｃ１，２Ｏ活性により主としてアゾ染料を分解していると推測される。また、Ｌａｃ、ＬｉＰおよびＭｎＰ活性もアゾ染料の分解に関係していると推定される。
【００７８】
（３）Ｕ９７由来粗酵素含有バイオリアクターの製造
（３−１）二重カプセル構造の作製
上記のようにしてＵ９７から抽出した粗酵素マンガンペルオキシダーゼ活性３６Ｕに、１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液２０ｍＬを加えて撹絆しながら均一な溶液を得た（１．８Ｕ／ｍＬ）。パスツールピペットを用いて上記溶液２０ｍＬを採取し、０．１Ｍ塩化カルシウム溶液１００ｍＬ中に１滴ずつ滴下することにより、アルギン酸カルシウムのゲル化半透膜を表面に有し、前記粗酵素が内包された一重カプセルの固定化酵素を得た。
【００７９】
次に、得られた一重カプセルの固定化酵素をろ過により採取し、０．０２２７質量％（１３．６ｍｇ：１ｍＭ）のＨＢＴ若しくは０．０２６０質量％（１５．６ｍｇ：１ｍＭ）のＴＥＭＰＯの各成分を含む又は含まない１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液６０ｍＬ中に加え、一重カプセルが分散された懸濁液を得た。ピペットを用いて上記の一重カプセルを含む懸濁液を、０．１Ｍ塩化カルシウム溶液１００ｍＬ中に一滴ずつ滴下することにより、粗酵素を内部に含み、その周囲にＨＢＴ又はＴＥＭＰＯを有する又はメディエータを含まない二重カプセルアゾ染料分解剤を得た。ここで粗酵素とＨＢＴ又はＴＥＭＰＯとを区別する内膜と外膜は、いずれもアルギン酸カルシウムのゲル化半透膜で構成されている。
【００８０】
（３−２）バイオリアクターの作製
上記（３−１）で得られた二重カプセルを、カラムに充填し、アゾ染料分解器を得た（二重カプセルの充填量５０ｍＬ）。上記カラムは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製の「Ｅｃｏｎｏ−Ｃｏ１ｕｍｎ」であり、外径３４ｍｍ、内径２８ｍｍで長さ１３０ｍｍのカラムの上下に流入ロ、排出口（外径３ｍｍ、高さ１０ｍｍ）を有している。上記カラムはポンプ（Cole-Parmer Instrument 社製のMasterFlex L/S）を備えている。
【００８１】
上記のようにして得られたアゾ染料分解器（Ｕ９７由来粗酵素を含むアゾ染料分解剤のＭｎＰ活性：０．３６Ｕ／ｍＬ）を、槽数が１槽、容量が１００ｍＬの好気槽を備え、嫌気槽を有しないバイオリアクターにセットし、Ｕ９７株由来粗酵素含有バイオリアクターを得た。
【００８２】
（４）アゾ染料の分解１
上記のようにして得られたＵ９７由来粗酵素含有バイオリアクターを用いて、アゾ染料の分解を行った。流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ又は１．５ｍＬ／ｍｉｎとし、ｐＨ４．５のマロン酸緩衝液又はｐＨ８の水溶液（１／１０Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを調整）を用いた。処理は、暗所下で２５℃で、０〜４８時間行った。なお、バイオリアクター内での循環量や処理効率などを考慮し、全液量（二重カプセル充填量＋アゾ染料液）を２００ｍＬとした。
【００８３】
アゾ染料として、Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｎａｖｙ  Ｂｌｕｅ  ＲＵＮ  Ｎｏ．４（以下、染料Ｎｏ．４という）、Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｖｉｏｌｅｔ  ５Ｒ  ９０％  Ｎｏ．９（以下、染料Ｎｏ．９という）、を、それぞれ最終濃度０．０１質量％用いた。染料はいずれも愛媛県産業技術研究所繊維産業センターから提供されたものを使用した。
Ｕ９７由来の粗酵素と各メディエータとを含むアゾ染料分解剤を用いた結果を表２及び表３に示す。
【００８４】
【表２】
2013183713.tif 000003
【００８５】
【表３】
2013183713.tif 000004
【００８６】
表２及び表３に示されるように、Ｕ９７株由来の粗酵素では、４８時間までに２種のアゾ染料をいずれも約５０％分解することがわかった。特に、ＨＢＴ又はＴＥＭＰＯをメディエータ成分として使用した場合には、分解率が大幅に向上し、４８時間までに７０％以上を分解できることがわかった。
また、染料Ｎｏ．９のときにはＨＢＴ、染料Ｎｏ．４のときにはＴＥＭＰＯを、それぞれメディエータとして使用した場合には、ｐＨを８．０に変更しても、それぞれ４８時間で７６．７％及び７０．５％という高い分解率を示すことがわかった。
【００８７】
［実施例２］
１ｍＭの硫酸マンガン（Ｍｎ２＋）、及び１ｍＭのＨ２Ｏ２を含む１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液６０ｍＬを、メディエータ成分として、バイオリアクターで処理する反応液量に対して１ｍＭのＨＢＴ及び１ｍＭのＴＥＭＰＯの組み合わせ、又は、１質量％（６００ｍｇ）のＴｗｅｅｎ８０を含有する１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液６０ｍＬに代えた以外は、実施例１（３）と同様にして他のＵ９７株由来粗酵素含有バイオリアクターを作製した。
また、粗酵素を含まない一重カプセルを得た後に、メディエータ成分として、バイオリアクターで処理する反応液量に対して１質量％Ｔｗｅｅｎ８０、１ｍＭのＨＢＴ、及び１ｍＭのＴＥＭＰＯを含む１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液６０ｍＬを添加した以外は、上記と同様にして、Ｕ９７株由来粗酵素を含有しない比較用バイオリアクターを作製した。
【００８８】
実施例１で作製したＵ９７株由来粗酵素のみを含むＵ９７株由来粗酵素含有バイオリアクター、ＴＥＭＰＯのみをメディエータとして含有するＵ９７株由来粗酵素含有バイオリアクター、ＨＢＴのみをメディエータとして含有するＵ９７株由来粗酵素含有バイオリアクター、ＨＢＴ及びＴＥＭＰＯをメディエータとして含有するＵ９７株由来粗酵素含有バイオリアクター、並びに５成分のメディエータ成分を含有する比較用バイオリアクターを用いて、アゾ染料の分解を行った。
【００８９】
アゾ染料として、Ｌｅｖａｆｉｘ  ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１６（以下、染料Ｎｏ．１６という）を最終濃度０．０１質量％で使用し、ｐＨ４．５、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎの条件で、２４時間、アゾ染料分解処理を行った。結果を表４に示す。なお表４において「Ｂｌａｎｋ」とは、粗酵素及びメディエータを含まない染料のみものを意味する。
【００９０】
【表４】
2013183713.tif 000005
【００９１】
表４に示されるように、Ｕ９７株由来の粗酵素は、単独でも、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴＥＭＰＯ、ＨＢＴ、ＴＥＭＰＯ及びＨＢＴの組み合わせのいずれにおいても、アゾ染料を高い分解率で分解できることがわかった。
特に、Ｕ９７株由来の粗酵素は、Ｔｗｅｅｎ８０又はＴＥＭＰＯをメディエータ成分として用いることにより、アゾ染料Ｎｏ．１６を１２時間でほぼ１００％分解できることがわかった。
【００９２】
［実施例３］
ＮＧ００７由来の粗酵素を、カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ活性０．３６Ｕ／ｍＬとし、１ｍＭのＭｎ２＋、及び１ｍＭのＨ２Ｏ２を含む１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液６０ｍＬを、メディエータ成分として、バイオリアクターで処理する反応液量に対して１ｍＭのＨＢＴ、１ｍＭのＴＥＭＰＯ、又は、１ｍＭのＨＢＴ及び１ｍＭのＴＥＭＰＯの組み合わせ、１質量％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液６０ｍＬに代えた以外は実施例１（３）と同様にして、ＮＧ００７由来粗酵素含有バイオリアクターを作製した。
また、粗酵素を含まない一重カプセルを得た後に、これを、メディエータ成分として、バイオリアクターで処理する反応液量に対して１質量％Ｔｗｅｅｎ８０、１ｍＭのＨＢＴ、及び１ｍＭのＴＥＭＰＯを含む１．５質量％アルギン酸ナトリウム溶液６０ｍＬに添加した以外は、上記と同様にして、ＮＧ００７株由来粗酵素を含有しない比較用バイオリアクターを作製した。
【００９３】
アゾ染料として、Ｌｅｖａｆｉｘ  ｂｌｕｅ  Ｎｏ．１６（以下、染料Ｎｏ．１６という））を最終濃度０．０１質量％で使用し、ｐＨ４．５、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎの条件で、２４時間、アゾ染料分解処理を行った。結果を表５に示す。染料Ｎｏ．１６は、愛媛県産業技術研究所繊維産業センターから提供されたものを使用した。なお表５において「Ｂｌａｎｋ」とは、粗酵素及びメディエータを含まない染料のみものを意味する。
【００９４】
【表５】
2013183713.tif 000006
【００９５】
表５に示されるように、ＮＧ００７株由来の粗酵素では、１２時間でアゾ染料を約５０％分解することがわかった。特に、Ｔｗｅｅｎ８０、ＨＢＴ、又はＨＢＴとＴＥＭＰＯの組み合わせをメディエータ成分として用いることによって、アゾ染料の分解率が向上し、中でもＴｗｅｅｎ８０をメディエータ成分として使用すると、６時間で７０％以上が分解することがわかった。
また、ＮＧ００７由来粗酵素については、ＮＧ００７由来粗酵素のみを含むバイオリアクターとして用いて他のアゾ染料Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ２２２を分解対象とした場合に、ｐＨ８．０の条件下で、２４時間で７０％以上の高い分解率を示すことがわかった。
【００９６】
［実施例４］
アゾ染料を、染料４及び染料９（それぞれ、０．０１質量％）に変更した以外は、実施例３と同様にして、Ｔｗｅｅｎ８０をメディエータ成分として含有するＮＧ００７由来粗酵素含有バイオリアクター及びＴＥＭＰＯをメディエータ成分として含有するＮＧ００７由来粗酵素含有バイオリアクターによるｐＨ４．５の条件下での染料４及び染料９の分解を確認した。結果を表６及び表７に示す。表６及び表７に示されるようにＮＧ００７由来粗酵素は、染料４及び染料９も同様に分解することができることがわかった。なお表６及び表７において「Ｗｉｔｈｏｕｔ ＮＧ００７」とは、酵素及びメディエータ成分の双方を含まない染料のみのものを示し、「Ｏｎｌｙ ＮＧ００７」とは、メディエータ成分を含まない粗酵素と染料のみものを示す。
【００９７】
【表６】
2013183713.tif 000007
【００９８】
【表７】
2013183713.tif 000008
【００９９】
このように、Ｕ９７及びＮＧ００７それぞれの菌株由来の粗酵素を含むアゾ染料分解剤では、各種アゾ染料を効果的に分解することができた。
【符号の説明】
【０１００】
１０    アゾ染料分解剤
１２    粗酵素
１４    内膜
１６    メディエータ成分
１８    外膜
２０    アゾ染料分解器
２２    外筒（収容部）
２４    開口部（供給口）
２６    開口部
【図２】
2013183713.tif 000009
【図１】
2013183713.tif 000010
【図３】
2013183713.tif 000011