(57)【要約】      （修正有）【課題】始原生殖細胞を用いる配偶子の産生方法を提供する。【解決手段】ドナートリ種から始原生殖細胞を提供するステップと、その始原生殖細胞をレシピエントトリ種にｉｎ  ｏｖｏ投与するステップと、そのレシピエントトリ種をインキュベートして孵化させるステップと、レシピエントトリ種を育てて性的に成熟させるステップと、次いで、ドナートリ種の配偶子をレシピエントトリ種から回収するステップとを含み、ドナートリ種とレシピエントトリ種がアメリカシロヅルとカナダヅル、もしくはシチメンチョウとニワトリである、トリ配偶子の産生および回収方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナートリ種から始原生殖細胞を提供するステップと、
前記始原生殖細胞を、レシピエントトリ種にｉｎ  ｏｖｏ投与するステップであって、前記レシピエントトリ種が前記ドナートリ種と異なる種であるステップと、
前記レシピエントトリ種をインキュベートして孵化させるステップと、
前記レシピエントトリ種を育てて性的に成熟させるステップと、次いで、
前記ドナートリ種の配偶子を前記レシピエントトリ種から回収するステップと
を含む、トリ配偶子の産生および回収方法。
【請求項２】
前記ドナートリ種がアメリカシロヅルである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レシピエントトリ種がカナダヅルである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ドナートリ種がシチメンチョウである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記レシピエントトリ種がニワトリである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記投与ステップがｉｎ  ｏｖｏ注入よって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記始原生殖細胞が性腺始原生殖細胞および血液始原生殖細胞からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与ステップがレシピエント胚発生のステージ１３からステージ１８で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記始原生殖細胞が一対のオス決定（Ｚ）染色体を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記始原生殖細胞がメス決定（ｗ）染色体を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与ステップが、前記トリを事前にｉｎ  ｏｖｏで不妊化することなしに行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
オス（ＺＺ）トリ始原生殖細胞をメストリにｉｎ  ｏｖｏ投与するステップと、
前記メストリをインキュベートして孵化させるステップと、
前記メストリを育てて性的に成熟させるステップと、次いで、
前記トリを交配させて、複数の受精したトリ卵を産生するステップと
を含んでなり、
前記トリから産生されるトリ卵のメスに対するオスの比率が、前記オス始原生殖細胞を前記トリにｉｎ  ｏｖｏ投与せずに得られる比率より大きい、複数のトリ卵から孵化するオストリの数を増加させる方法。
【請求項１３】
前記始原生殖細胞が前記メストリと同一の種である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記メストリがニワトリである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記メストリがシチメンチョウである請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与ステップがｉｎ  ｏｖｏ注入によって行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記始原生殖細胞が性腺始原生殖細胞および血液始原生殖細胞からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与ステップがレシピエント胚発生のステージ１３からステージ１８で行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与ステップが、前記メストリを事前にｉｎ  ｏｖｏで不妊化することなしに行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数のトリ卵をインキュベートして孵化させるステップをさらに含んでなり、
前記複数の卵から産生されるトリのメスに対するオスの比率が、前記オス始原生殖細胞を前記メストリにｉｎ  ｏｖｏ投与せずに産生される比率より大きい、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与ステップが前記トリに始原生殖細胞を注入することによって行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与ステップが前記トリに胚盤葉細胞を注入することによって行われ、前記胚盤葉細胞が前記トリ内で始原生殖細胞に分化する請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、始原生殖細胞をトリに移入して、配偶子をそこで産生する方法に関する。このような方法は、絶滅寸前のトリ種の保存や、シチメンチョウ等のゆっくり成熟する種から精子を産生するのに要する時間の減少、繁殖する群れを維持する経費の削減、子孫群の性比の変化（例えば、産生効率を高めるため）に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ある特定のトリ種の配偶子をより容易に産生することができれば、鳥獣医学および家禽産生分野に極めて有用であろう。アメリカシロヅル等の絶滅寸前の種の場合、オス精子が容易に供給されることは極めて有用であろう。シチメンチョウ等の商業的なトリの場合、もっと速く且つ経済的にオス精子を産生することが望ましいであろう。食肉産生群の場合、群れにおけるオスドリの比率を上昇させる方法を有することが望ましいであろう。従って、トリ精子を得るための新しい方法が必要である。
【０００３】
キメラは、１つより多い接合体から誘導される細胞からなる複合生物である。実験的キメラは、発生における細胞間相互作用および細胞系譜解析を研究するために使用されている（Ａ．ＭｃＬａｒｅｎ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（１９７６））。非常に初期の胚に由来する物質を使用してキメラを作るとき、体組織の全混合物を含む生物が発生する。出発物質が初期生殖細胞またはそれらの前駆体を含む場合、結果として得られる個体は、ドナー遺伝子型とレシピエント遺伝子型の両者の配偶子を産生する。加えて、キメラは、種内、すなわち、同一種の２つの接合体の間であってもよく、種間、すなわち、２つの異なる種の間であってもよい。
【０００４】
トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、他の脊椎動物の生殖細胞と同様に、性腺外に起源をもっており、性腺に到達するために、複雑な行路を経なければならない。胚盤葉細胞および始原生殖細胞の移入により、トリ生殖系列キメラが作られている。
【０００５】
トリ生殖系列キメラの産生における先駆者であるＲｅｙｎａｕｄ（Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２１：４８５−５０７（１９６９））は、解離したシチメンチョウ三日月状生殖細胞を、血管内移入によって、前もって不妊化したニワトリ胚（レシピエント三日月状生殖細胞を紫外線に曝露することによって遂行される）に導入するシチメンチョウ−ニワトリ生殖系列キメラの産生について報告した。三日月状生殖細胞の内胚葉（ステージ５）の機械的解離によって得られたＰＧＣを、ニワトリ胚（３〜５日間のインキュベーション）の血管に注入した。注入前に、ステージ８〜１０（Ｈ＆Ｈ）で、レシピエント胚を紫外線で不妊化したが、不妊化は完全ではなかった。核細胞質比のみに基づいて、ニワトリ胚におけるシチメンチョウＰＧＣを同定した。この同定方法は難しく且つ不明瞭であり、分裂中の生殖細胞は異常な核細胞質比を与えるため、活発に分裂しているシチメンチョウＰＧＣに使用することはできなかった。次の研究で、移入されたＰＧＣを宿主の性腺内で成熟させると、明らかに配偶子を生じさせることができたが、その配偶子は、受精に適さなかった（Ｗｉｌｈｅｌｍ  Ｒｏｕｘ  Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．１７９：８５−１１０（１９７６））。この精子は、シチメンチョウ卵を受精させることができなかった。この精子は、ニワトリ卵を受精させることができたが、正常に発生しなかった。ニワトリ精子は、メス種間キメラから得た卵を活性化することができたが、胚を生じさせることはなかった。卵がシチメンチョウ精子によって受精したとき、ステージ３８（Ｈ＆Ｈ）を過ぎて生存しない異常胚になった。Ｒｅｙｎａｕｄは、シチメンチョウ生殖細胞を、ニワトリ生殖細胞と識別しようとして、形態学を単なる際立った特徴として使用した。形態学のみではキメラの識別に不十分であり、他のマーカーを用いて立証しなければならない。加えて、Ａｉｇｅ−Ｇｉｌ  ａｎｄ  Ｓｉｍ−ｋｉｓｓ（Ｂｒｉｔ．ＰｏｕＬ  Ｓｃｉ．３２：４２７−４３８（１９９１））によれば、シチメンチョウ配偶子の存在は、試験交配で確認されなかった。従って、トリ配偶子の産生および移入を遂行する新しい方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００６】
トリ精子の産生および回収方法は、ドナートリ種から始原生殖細胞を提供するステップと、この始原生殖細胞をレシピエントトリ種にｉｎ  ｏｖｏ投与するステップと、このレシピエントトリ種をインキュベートして孵化させるステップと、次いで、レシピエントトリ種からドナートリ種の精子を回収するステップとを含む。たとえば、ドナートリ種は、アメリカシロヅルであってもよく、レシピエントトリ種は、カナダヅルであってもよい。別の例では、ドナートリ種は、シチメンチョウであってもよく、レシピエントトリ種は、ニワトリであってもよい。
【０００７】
トリの場合、哺乳動物と違って、同型配偶子性（ＺＺ）がオスであり、異型配偶子性（Ｚｗ）がメスである。従って、トリの場合、メスが、Ｚ染色体またはｗ染色体のいずれかを有する卵細胞を産生するため、子の性別を決定するのはメスである。従って、後述する通り、オス始原生殖細胞をメス胚宿主に移入することにより、その宿主によって産生されるＺを持つ卵細胞のパーセンテージが上昇し、オス子孫のパーセンテージが上昇する。ブロイラーの群れでオス子孫のパーセンテージが上昇すると、これに対応して飼料転換比が向上するとともに、より能率的な食肉産生が得られるので、経済的に望ましい。
【０００８】
従って、本発明の第２の態様は、メストリにオス（ＺＺ）トリ始原生殖細胞をｉｎ  ｏｖｏ投与するステップと、このメストリをインキュベートして孵化させるステップと、このメストリを育てて性的に成熟させるステップと、次いで、このトリを交配して、複数の受精したトリ卵（そのトリから産生されるトリ卵のメスに対するオスの比率は、オス始原生殖細胞をメストリにｉｎ  ｏｖｏ投与せずに得られる比率より大きい）を産生するステップとを含む、複数のトリ卵から孵化されるオストリの数を増加させる方法である。一般に、この方法は、複数のトリ卵をインキュベートして孵化させる（複数の卵から産生されるトリのメスに対するオスの比率は、オス始原生殖細胞をメストリにｉｎ  ｏｖｏ投与せずに産生される比率より大きい）ステップをさらに含む。メストリは、ニワトリまたはシチメンチョウ等の任意の適当な種であってもよく、投与する始原生殖細胞は、投与の対象であるメストリと同一の種からのものであることが好ましい。
【０００９】
本発明の前述の目的および態様、並びに他の目的および態様を、本明細書の以下に詳細に説明する。
【００１０】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本明細書で使用する「トリ」または「トリ種」は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、およびダチョウを含むがその限りではない、任意のトリ種を指す。特に、アメリカシロヅル（この場合、レシピエント種は、カナダヅルであろう）等の絶滅寸前の種の保存に使用されるとき、本発明を実行するために、多数の他の種のいずれを使用してもよい。
【００１１】
本明細書で使用する「卵」は、生きているトリ胚を含有するトリ卵を指す。
【００１２】
本明細書で使用する「始原生殖細胞」または「ＰＧＣ」は、最終的に半数体の配偶子（精子または卵細胞のいずれか）になる、胚において最も分化した二倍体の細胞系を指す。
【００１３】
「ＳＳＥＡ−１抗体」は、ステージ特異的胚性抗原−１（ＳＳＥＡ−１）に特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を指す（Ｍ．ＢｕｃｈｒＥｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３２，１９４−２０７（１９９７））。ＳＳＥＡ−１は、ガラクトースβ１→４フコースα１→３Ｎアセチルグルコサミン連結によって決定される炭水化物エピトープである（Ｈ．Ｇｏｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５６−１５８（１９８１））。ＳＳＥＡ−１に対するモノクローナル抗体は、Ｆ９奇形癌腫細胞で免疫化しておいたマウスからの脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞とを融合させることによって発生させた（Ｄ．Ｓｏｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．４ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５，５５６５−５５６９（１９７８））。ＳＳＥＡ−１抗体は、トリ免疫化学的生殖細胞マーカーとして知られる（Ｌ．Ｋａｒａｇｅｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９，２９０−３０１（１９９６））。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡから入手することが可能な、クローンＭＣ４８０が特に好ましい。
【００１４】
始原生殖細胞は、本発明を実行するために、適当な技術によって、提供して製剤化することができ、使用前に、要求通りに保存、凍結、培養等を行うことができる。たとえば、適切な胚ステージに、ドナー胚から始原生殖細胞を回収することが可能である（たとえば、（Ｖ．Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．Ｌ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｓｔａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｃｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｒｐｇｏｌｏｇｙ，８８，４９−９２（１９５１）（本明細書では、これらのステージを、Ｈ＆Ｈステージと呼ぶ）ステージ４または三日月状生殖細胞ステージから、その後のステージで血液または性腺から細胞を回収するステージ３０までを参照）。始原生殖細胞は、一般に、体細胞の２倍のサイズであるため、サイズに基づいて、容易に体細胞と区別して分離される。適当な技術（たとえば、特定のドナーから生殖細胞を回収し、そのドナーからの他の細胞を類別すること）によって、オス（すなわち同型配偶子）始原生殖細胞（ＺＺ）を、異型配偶子始原生殖細胞（Ｚｗ）と区別することができ、回収される細胞は、類別された細胞と同一の染色体型である。動物に投与するために、細胞を解離することによって（たとえば、機械的解離によって）、細胞を製剤化することができ、この細胞を、製剤学上許容できる担体（たとえば、リン酸緩衝食塩水）とよく混合する。始原生殖細胞は、性腺始原生殖細胞か、または血液始原生殖細胞であることが好ましく（「性腺」または「血液」は、元の胚ドナーにおける起源の組織を指す）、性腺始原生殖細胞が最も好ましい。投与する始原生殖細胞は、投与の個々の目的に応じて、異型配偶子（Ｚｗ）であってもよく、同型配偶子（ＺＺ）であってもよい。ＰＧＣは、生理学的に許容できる担体で、好ましくは、約６〜約８または８．５のｐＨで、所望の効果を達成するのに適した量で（たとえば、胚当たり１００〜１０００ＰＧＣ）投与することが好ましい。ＰＧＣは、他の成分または細胞なしで投与してもよく、他の細胞および成分をＰＧＣと一緒に投与してもよい。
【００１５】
ＰＧＣが発生中の性腺にまだ移行することができる適当な時期に、始原生殖細胞をレシピエント動物にｉｎ  ｏｖｏ投与することが可能である。一般に、投与は、胚発生のステージ１３またはステージ１４からステージ１８（Ｈ＆Ｈ）まで実施することが好ましく、最も好ましくは、ステージ１５に実施する。従って、ニワトリの場合、投与時期は、胚発生の１、２、３または４日の間であり、最も好ましくは、２日から２．５日である。投与は、一般に、羊膜によって画定される領域（胚を含む）、卵黄嚢等の、適当な標的部位への注入による。胚そのもの（胚体壁を含む）への注入が好ましく、胚内への血管内または体腔内注入が特に好ましい。本発明の方法は、レシピエントトリを事前にｉｎ  ｏｖｏで不妊化を行ってまたは行わずに、実行することが可能である。（「不妊化」は、実質的に配偶子を産生できなくすることを意味する）。本発明の好ましい実施形態では、始原生殖細胞は、事前に不妊化されていないレシピエント被験体に便利にｉｎ  ｏｖｏ投与される。このようなレシピエントからドナー配偶子を回収するとき、ドナー配偶子は、ドナー配偶子との混合物として回収することができ、そのような混合物として、またはその中のドナー配偶子の割合を高めるように処理された混合物として、使用することができる。
【００１６】
ＰＧＣの投与は、ＰＧＣそれ自体を投与することによって、または、被験体内でＰＧＣになる前駆体細胞を投与することによって（特に、本発明を使用して、子の性比を変える場合）、実行することができる。たとえば、トリの中で、胚盤葉細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで始原生殖細胞に分化する場合、投与は、トリに胚盤葉細胞を注入することによって、実行することが可能である。
【００１７】
トリ配偶子（精子、卵細胞）の産生および回収に使用するとき、始原生殖細胞は、ＰＧＣを得るドナー種とは異なるレシピエント種に、ｉｎ  ｏｖｏ投与される。次いで、全て、標準技術に従って、シピエントをインキュベートして孵化させ、性的に成熟させ、レシピエント動物からドナー種の精子細胞または卵細胞を回収する。たとえば、絶滅寸前の種の場合、ドナートリ種は、アメリカシロヅルであってもよく、レシピエントトリ種は、カナダヅルであってもよい。商業的な家禽産生に関する別の例では、ドナートリ種は、シチメンチョウであってもよく、レシピエントトリ種は、ニワトリであってもよい。
【００１８】
一群の卵から孵化するオストリの数または比率を増加させるために使用するとき、本発明は、オストリ始原生殖細胞を、メストリにｉｎ  ｏｖｏ投与することを含む。ｉｎ  ｏｖｏで、トリの性別は、前もって決定することも可能であり、孵化後に決定することも可能である。次いで、このトリを、インキュベートして孵化させ、必要であれば、トリの性別を決定し、性的に成熟させ、周知の技術に従って、このトリと、適当なオス繁殖用ストックとを交配することによって繁殖させる。次いで、このトリが産んだ、複数の受精卵を回収し、一般にインキュベートして、孵化させ、このようにして得られたトリを、少なくとも２〜３週間、成長させる。メストリから産生されるトリ卵（またはトリ）のメスに対するオスの比率は、オス始原生殖細胞をそのトリにｉｎ  ｏｖｏ投与せずに得られる比率より大きい。このような方法は、一般に、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ等の食肉製造用に飼育されるトリの種に使用される。
【００１９】
始原生殖細胞のｉｎ  ｏｖｏ投与は、適当な技術によって、手動または自動化の様式のいずれでも、実行することが可能である。注入が好ましい。ｉｎ  ｏｖｏ投与の手段は重要ではないが、投与によって、孵化速度が不当に低下しないように、この方法は、胚の組織および器官または胚を包囲する胚外膜を不当に損傷しないことが好ましい。約１８〜２６ゲージの針を取り付けた皮下投与用注入器がこの目的に適する。発生の精確なステージおよび胚の位置によって、１インチの針は、ニワトリ上の流体中またはニワトリ自身の中のいずれかで停止する。針の損傷または鈍化を防止するために、針を挿入する前に、殻にパイロット穴をあけてもよい。後で、望ましくない細菌が進入するのを防止するために、要求に応じて、実質的に細菌が透過できないシーリング材料、たとえば、ワックス等で、卵をシールすることができる。トリ胚用高速注入システムが、本発明を実行するのに特に適することも予見される。このような多数の装置を入手することができ、その代表例は、商標ＥＭＢＲＥＸ  ＩＮＯＶＯＪＥＣＴシステムである（Ｈｅｂｒａｎｋに付与された米国特許第４，６８１，０６３号および第４，９０３，６２５号、並びにＭｉｌｌｅｒに付与された米国特許第４，０４０，３８８号、第４，４６９，０４７号および第４，５９３，６４６号に記載されている）。本明細書に引用されている全ての米国特許文献の開示内容全体は、引用することで本明細書の一部をなすものとする。本発明を実行するために改変された全てのこのような装置は、本明細書に記載の始原生殖細胞の調合物が入った注入器を含み、その注入器は、機器により支持されている卵に、上述した卵内の適切な位置に注入するために配置されている。加えて、卵に注入した後、卵の穴をシールするために、注入装置と動作可能なシーリング装置を提供することも可能である。
【００２０】
以下の非限定的な実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２１】
［実施例１〜８］  材料と方法
【００２２】
＜実施例１＞  プラスミド単離および検証
Ｄｒ．Ｍ．Ｍａｔｚｋｅにより提供された形質転換ＤＨ５α細胞を、抗生物質アンピシリン（２０μｇ／ｍｌ）＋メチシリン（８０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上に画線し、３７℃で一晩成長させた。別個のコロニー６個を採取し、上記抗生物質を含む１０ｍｌのＬＢで、一晩成長させた。Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコールを使用して、６つの異なるコロニーから、プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドの同一性を検証するために、未消化のプラスミド、直線化したプラスミド（ＥｃｏＲＩ）および二重消化産物（ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ）を、２％アガロースゲルで分離した。続いて、挿入物を含むコロニー６個中２個を大規模プラスミド単離（Ｑｉａｇｅｎ）に使用した。単離したプラスミドの同一性を確認するために、未消化の親プラスミド（ｐｕｃ１８）、未消化の組換えプラスミド、直線化プラスミド（ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ）および二重消化プラスミド（ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩ）を、２％ゲルで分離した。
【００２３】
＜実施例２＞  ＴＭ１プローブのＰＣＲ標識
親ｐｕｃ１８プラスミドのマルチクローニング部位における挿入物を増幅できる力に基づいて、１対のプライマーを合成した。それらは、Ｍ１３ｐｕｃ逆方向＝５’ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ  およびＭ１３ｐｕｃ順方向＝５’ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴであった。最適化されたＰＣＲ混合物は、Ｔａｑ緩衝溶液（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈ）中３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各プライマー０．５μＭ、ＤＮＡ（ＴＭ１）環状変性プラスミド５０ｎｇ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）５単位、ＰＣＲ  ｄｉｇ標識ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１０μｌで構成されていた。反応体積は、滅菌水で１００μｌにし、ＰＣＲ条件は、９６℃にて５分間の初回変性に続いて、変性（９４℃）４５秒間、アニーリング（５０℃）５５秒間、続いて７２℃にて６０秒間の伸長からなる３０サイクルで構成されていた。「Ｔｈｅ  Ｍｉｎｉ  Ｃｙｃｌｅｒ」Ｍｏｄｅｌ  ＰＴＣ  １５０（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で、ＰＣＲを実施した。増幅後、全サンプルを、２％ゲルによる電気泳動にかけた。Ｑｉａクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造業者の勧告に従って、標識挿入物をゲルから溶離した。プローブを−２０℃で保存し、ドットブロットおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用した。フィルターハイブリダイゼーションのためのＧｅｎｉｕｓシステム・ユーザーガイド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従って、保存前に、ＤＩＧ標識ＤＮＡの収率を見積もった。
【００２４】
＜実施例３＞  ドットブロットハイブリダイゼーション
ＴＭ１挿入物の精度、感度および特異性を検証するために、オスおよびメスのシチメンチョウＤＮＡの段階希釈（０〜５００ｎｇ）、オスおよびメスのニワトリＤＮＡ（０〜２μｇ）、およびＴＭ１挿入物（１０ｎｇ〜１ｐｇ）を含む親プラスミドを変性させ、およびニトロセルロースペーパー上にスポットをつけた。ブロットを、８０℃で１時間ベークし、次いで、ハイブリダイゼーションに使用した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、Ｅｎｇｌｅｒ−Ｂｌｕｍ法を使用して実行した（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０：２３５−２４４（１９９３））．ハイブリダイゼーションは、６８℃で一晩実行し、使用したプローブ濃度は、２．５ｎｇ  ｃＤＮＡプローブ／ｍｌであった。
【００２５】
ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシー洗浄の後、ブロットを洗浄用緩衝液（Ｏ．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）中に入れた。膜を、ブロック用溶液（洗浄用緩衝液＋３％Ｔｗｅｅｎ２０）中で３０分間インキュベートし、次いで、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ複合物を含むブロック用溶液中に３０分間入れた。次いで、この膜を洗浄用緩衝液で２回洗浄し、次いで、検出用緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．１ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ９．５）中でインキュベートした。最後に、化学発光基質商標ＣＤＰ−ＳＴＡＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ハイブリッドを検出した。ブロットをＸ線フィルムに少なくとも５分間曝露した。
【００２６】
＜実施例４＞  種間シチメンチョウ−ニワトリ胚性生殖系列キメラの産生
受精したシチメンチョウ卵を、３８．５℃で８〜８．５日間（ステージ２７〜２８Ｈ＆Ｈ）、インキュベートした。性腺を得るために、胚を解剖した。ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ中に性腺を回収し、３０ゲージの針を通過させることによって分散させた。細胞を、密集するまで（３〜５日）、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳで培養した。間質細胞は分散して密集層を形成し、生殖細胞は、間質細胞に緩く付着した。この生殖細胞を、穏やかなピペット操作で回収し、計数した。培地３〜５μｌ中のおよそ１５０〜３００細胞を、６０時間または７２時間ニワトリ胚の終末静脈に注入した。次いで、この胚を、１００ｍｍペトリ皿内か、それ自身の卵殻内で、３８．５℃にて２〜５日間、インキュベートした。インキュベーション後、ＤＮＡを胚（ｎ＝１８）から単離し、ｄｉｇ標識プローブＴＭ１を用いたドットブロット分析に使用した。
【００２７】
＜実施例５＞  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
パラフィン切片および凍結切片で、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。この手順は、若干の改変を加えたＲｏｌｉｇｈｅｄ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ（Ｊ．Ｒｏｌｉｇｈｅｄ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ  １１  ＤＮＡ  ｉｎ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＩＧ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ．Ｉｎ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  Ｂｅｏｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ  １２２−１２５（１９９６）参照）によるプロトコールに基づく。
【００２８】
パラフィン切片作製：性腺を、シチメンチョウ胚（９日）および対応するステージのニワトリ胚から単離し、４℃にて一晩、４％パラホルムアルデヒドで固定した。性腺をＰＢＳで３回、合計９０分間、洗浄した。性腺を脱水し、パラフィンに包埋し、薄切した（１０μｍ）。切片を商標Ｐｒｏｂｅ−Ｏｎ  Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に集めた。この切片を６０℃で３０分間ベークし、キシレンで蝋を取り、段階的エタノール系列（９９％−水）で再水和した。この切片を、ＴＥＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ  ＮａＣｌ）中のプロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）で、３７℃および室温にて１２〜２５分間処理した。
【００２９】
凍結切片作製：シチメンチョウ胚（８．５日）の躯幹領域を、４℃で一晩、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定した。３７℃で１０、１５または２０分間、ＴＥＳ中のプロテイナーゼＫの濃度を０から４５μｇ／ｍｌまで変えて試験した。０．６７μｇ／ｍｌおよび１．２５μｇ／ｍｌ、３７℃にて１５分間が、胚組織に最適なタンパク質分解処理であった。
【００３０】
プローブ／ブラインド反応混液の調製：プローブ反応混液は、Ｘ  Ｄｅｎｄｈａｒｔｓ溶液１０μｌ、硫酸デキストラン（５０％）５０μｌ、サケ精子ＤＮＡ（９．４ｍｇ／ｍｌ）１０μｌ、２０ＸＳＳＣ１００μｌ、ジゴキシゲニン標識ＴＭ１プローブ５００ｎｇからなり、最終体積が２５０μｌになるように蒸留水を加えた。最後に、ホルムアミド２５０μｌを、この反応混液に加えた。ブラインド反応混液は、標識ＴＭ１プローブを除く全ての上記成分を含んでいた。この反応混液は、渦巻攪拌によって混合し、−２０℃で保存した。
【００３１】
ハイブリダイゼーション：タンパク質分解的消化後、パラフィン切片および凍結切片を、４℃にて５分間、０．４％パラホルムアルデヒドで固定した。次いで、切片を蒸留水で洗浄し（５分）、風乾した。次いで、プローブ反応混液またはブラインド反応混液（陰性対照）１０または１５μｌを、各切片上に加えた。９５℃で６分間の変性前に、シリコン処理したカバーガラスを切片に載せた。次いで、このスライドを、氷上に１分間置き、４２℃にて１６〜２０時間、湿潤なチャンバ内に入れた。ハイブリッドのストリンジェンシー洗浄および検出は、既製のアルカリホスファターゼ基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ）を、ハイブリッドの検出に使用したこと以外は、Ｒｏｌｉｇｈｅｄ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｂｅｒｇ（上記参照）と同様であった。検出後、スライドを水性エオシンで数秒間、対比染色し、洗浄した。ゼラチン１０ｇを７０℃〜８０℃の水６０ｍｌに溶解し、これにグリセリン７０ｍｌおよびフェノール１ｍｌを加えて作られた水性封入剤でサンプルを封入した。
【００３２】
＜実施例６＞  種間ニワトリ−シチメンチョウ胚性キメラの作製
Ｂａｒｒｅｄ  Ｒｏｃｋニワトリ胚を、ステージ２３〜２５（Ｈ＆Ｈ）までインキュベートした。生殖隆起を、胚１０個からの隣接組織の一部と共に、１０％ＦＢＳ、グルタミン、抗生物質および抗真菌剤溶液を加えたＤＭＥＭ中に回収した。次いで、ＰＢＳで２回洗浄し、０．０２％ＥＤＴＡ中で３７℃にて１５分間、インキュベートした。新鮮な培地を加え、針を使用して、隆起を刺激した。細胞懸濁液全部を、１５ｍｌ試験官に回収し、凝集塊を２〜３分沈澱させた。この細胞懸濁液を回収し、１５００ｒｐｍで５分間、回転させた。培地を取り替え、トリパンブルー排除法を使用して、細胞生存能力を決定した。細胞懸濁液のアリコートを採取し、ＳＳＥＡ−１抗体で染色して、注入した生殖細胞の数を決定した。２５〜３０ＰＧＣを含む細胞懸濁液（細胞懸濁液中のＰＧＣのパーセンテージは、およそ３．２％）およそ５μｌを、発生のステージ１３〜１４（Ｈ＆Ｈ）に、各Ｎｉｃｈｏｌａｓシチメンチョウ胚（ｎ＝１０）の血管に注入した。この胚を、プラスチックラップで覆われたガラス皿の中で、３７．５℃で、ステージ２１〜２５までインキュベートした。レシピエント胚の躯幹領域全部を、４℃にて一晩、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回、合計９０分洗浄し、ゼラチン／スクロース中に包埋し、凍結し、薄切した。
【００３３】
シチメンチョウ性腺ＰＧＣは、ＳＳＥＡ−１陰性であり、ニワトリ性腺ＰＧＣは、ＳＳＥＡ−１陽性であるため、ＳＳＥＡ−１に対する抗体を使用して、胚生殖系列キメラで、移入ドナーニワトリＰＧＣを同定することができる。
【００３４】
＜実施例７＞  種間シチメンチョウ−ニワトリ胚性生殖系列キメラの作製
受精したシチメンチョウ卵を、３８．５℃で８〜８．５日間（ステージ２７〜２８Ｈ＆Ｈ）、インキュベートした。性腺を得るために、胚を解剖した。性腺をＰＢＳ中に回収し、０．０２％ＥＤＴＡ中、３７℃にて１２分間、インキュベートした。新鮮な培地を加え、針を使用して、隆起を穏やかに刺激した。細胞懸濁液全部を回収し、１５００ｒｐｍで５分間回転させた。培地を取り替え、細胞生存能力を決定した。細胞懸濁液全部を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、３７℃で６〜７時間、プレプレーティングした。培養後、非接着細胞を穏やかに回収し、遠心分離した。次いで、およそ１５０ＰＧＣを含む細胞懸濁液２〜３μｌを、血管ステージ１４（Ｈ＆Ｈ）ニワトリ胚に注入した。レシピエント卵をシールし、３７．５℃でインキュベートした。ステージ１９からステージ２５までの、インキュベーションの異なるステージで、レシピエント胚を回収した。この胚をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、４％パラホルムアルデヒドに、４℃で一晩包埋した。これを、ＰＢＳで３回洗浄した。時間総計は、胚の厚さによって異なった。胚を５０％エタノールに入れ、パラフィンに包埋した。切片から蝋を取り、再水和し、ＰＢＳですすいだ。
【００３５】
二重染色技術（以下参照）用の対照は、ステージ２６のニワトリ胚２個およびステージ２４のシチメンチョウ胚２個の横断切片であった。ニワトリ生殖領域の４２切片およびシチメンチョウ生殖領域の全ての連続切片を染色した。
【００３６】
合計８個のレシピエントニワトリ胚を連続的に薄切した。８個中５個の胚をステージ１９および２０で固定した。胚２個は、ステージ２２および２３で固定した。最後の胚は、ステージ２５で固定した。ステージ１９および２０における切片の大部分を二重染色に使用した。ステージ２２、２３および２５の胚に関しては、１つ置きの切片のみを二重染色に使用した。
【００３７】
＜実施例８＞  ＳＳＥＡ−１抗体染色およびＰＡＳ染色による二重染色
Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、免疫組織化学的研究を実施した。切片を、ＰＢＳで３回、計３０分間すすいだ。次いで、この切片を、ＰＢＳ中１．５％ヤギ血清で２０分間ブロックし、非特異的結合を除去した。次に、切片を、ＳＳＥＡ−１に対する一次モノクローナル抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，Ｉｏｗａから入手したクローンＭＣ４８０）中で１時間インキュベートした。ＰＢＳですすいだ後、胚の切片を、ビオチニル化二次抗体（３０分）中でインキュベートし、次いで、ＰＢＳですすぎ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰ試薬中でインキュベートした。（３０分）。ＰＢＳで最後の洗浄を行った後、アルカリホスファターゼ基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，Ｏｈｉｏ）で２０分間染色した。
【００３８】
免疫化学的染色後、この切片を水道水ですすぎ、過ヨウ素酸の中に６分間入れた。次いで、この切片を水で１０分間すすぎ、Ｓｃｈｉｆｆ試薬で１５分間染色した。切片を水道水ですすいだ後、水性封入剤で封入した。
【００３９】
［実施例９〜１５］  結果
Ｍａｔｚｋｅら（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ  １０２：９−１４（１９９２））は、シチメンチョウミクロソームで富化される反復ＤＮＡを特性決定した。これは、ゲノムの５％上に提示される４１ｂｐの反復エレメントである（細胞の複相ゲノム中におよそ２．２×１０６コピー）。そこで、ニワトリ胚におけるシチメンチョウＤＮＡを同定することができるかどうかを試験するために、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで、この種特異的ＤＮＡ配列を使用した。
【００４０】
＜実施例９＞  プラスミド単離および検証
ゲル電気泳動分析に基づけば、親プラスミド：ｐｕｃ１８は、２．６９ｋｂ長であり、Ｄｒ．Ｍａｔｚｋｅから得た直線化組換えプラスミドは、およそ２．８ｋｂ長であった。コロニー番号２および５からのプラスミドＤＮＡの二重消化によって、およそ０．１５〜０．１７ｋｂの挿入物が放出された。このことから、我々に送られた形質転換ＤＨ５細胞は、適切な組換えプラスミドを含んでいることが証明された。このプラスミドは、シチメンチョウ特異的４１ｂｐ反復のコピー３個からなるＴＭ１フラグメント（１４９ｂｐ）を含んでいた。
【００４１】
＜実施例１０＞  ＴＭ１プローブのＰＣＲ標識
環状プラスミドＤＮＡを、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドと共にＰＣＲ増幅することにより、およそ０．１９〜０．２０ｋｂの増幅産物が生成した。挿入物（０．１５〜０．１７ｋｂ）と比較して増幅産物のサイズが増加したのは、多数のＤＩＧ標識ヌクレオチドが組み込まれたためと考えられる。次に、このＰＣＲ標識プローブを、ドットブロットハイブリダイゼーション実験とＤＮＡ−ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの両方で使用した。
【００４２】
＜実施例１１＞  ドットブロットハイブリダイゼーション
ドットブロットハイブリダイゼーションの結果（データ示さず）から、プローブは、同じ強さで、オスシチメンチョウＤＮＡサンプルとメスシチメンチョウＤＮＡサンプルの両方に結合することがわかった。従って、プローブは、性特的ではないことが証明された。シチメンチョウＤＮＡ  ５００ｎｇ〜０ｎｇの、シチメンチョウＤＮＡの段階希釈で、ハイブリダイゼーションを行った。プローブは、０．３０ｎｇという少量のシチメンチョウＤＮＡを検出した。オスならびにメスニワトリＤＮＡ  ０〜２μｇとのハイブリダイゼーションで、プローブは種特異的であり、ニワトリＤＮＡに結合しないことが証明された。シチメンチョウＤＮＡの濃度を変えて（１０ｎｇ〜０ｎｇ）、０〜２μｇのニワトリＤＮＡと混合した。このＤＮＡ混合物とのハイブリダイゼーションは、ニワトリＤＮＡ１μｇ中に１．２５ｎｇという少量のシチメンチョウＤＮＡを検出できることを示した。
【００４３】
＜実施例１２＞  種間シチメンチョウ−ニワトリ胚の生殖系列キメラの生成
上記ドットブロットハイブリダイゼーションプロトコールを使用して、種間シチメンチョウ−ニワトリ胚の生殖系列キメラを検出することはできなかった。キメラを検出できなかったのは、シチメンチョウ性腺ＰＧＣがニワトリ性腺に移行するのを防止する、固有の生物学的バリヤーに起因すると考えられる。また、技術的な問題のためでもある、すなわち、この方法（ドットブロットハイブリダイゼーション）は、ニワトリ性腺中の数個のドナー生殖細胞を確認できるほど感度がよくなかった。後者の理由の方が公算が高く、そこで、レシピエント中のドナーＰＧＣを定位するために、もっと高感度の技術、すなわち、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを開発しようと試みた。
【００４４】
＜実施例１３＞  シチメンチョウ切片のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
理論的には、ｉｎ  ｓｉｔｕマーカーシステムは、キメラ中のドナーシチメンチョウ）細胞を同定するのに適したマーカーであろう。マーカーは核内にあるため、マーカーは遍在し、他の細胞に漏出したり、レシピエント胚の発生に影響したりしない。本研究では、ＴＭ１配列は、シチメンチョウ核中のＤＮＡに選択的に結合した（データ示さず）。陽性のシグナルは、ニワトリ細胞（データ示さず）またはブラインド反応混液と共にインキュベートした切片（データ示さず）で検出されず、プローブは種特異的であり、非特異的シグナルはないことがわかった。理論上、シチメンチョウ胚の陽性対照切片では、各核は、陽性に染色されるはずであった。しかし、ごく一部の細胞が陽性に染色されただけであった（データ示さず）。加えて、同一消化条件下、同一切片中の異なる細胞集団の間で、シグナル強度に変動があった。このことから、この技術と関連した擬陰性があることがわかった。擬陰性の割合は、ストリンジェンシー条件を下げることによって減少させることが可能であろう。しかし、ストリンジェンシー条件を下げることは、擬陽性につながる可能性もある。胚生殖系列キメラでは、ドナー細胞は、全胚切片または細胞のごく一部を表す。加えて、このマーカーシステムは、陽性シチメンチョウ細胞のごく少数を同定するに過ぎない。従って、ＴＭ１プローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、キメラ同定の能率的な方法ではないであろう。
【００４５】
＜実施例１４＞  ＳＳＥＡ−１染色を使用した、種間ニワトリ−シチメンチョウ胚性キメラの同定
手順と関連した技術的問題がなかったことを確認するために、ニワトリ性腺生殖細胞の血管内移入によって種間ニワトリ−シチメンチョウ生殖系列キメラを作製した。ニワトリおよびシチメンチョウ性腺ＰＧＣ上でのＳＳＥＡ−１抗原発現に種差があるため、ＳＳＥＡ−１抗体を使用して、ニワトリ−シチメンチョウ胚の生殖系列キメラを同定できるという仮説を立てた。生存した胚５個中のうち４個を凍結薄切した。胚４個のうち１個では、１９個のＳＳＥＡ−１陽性細胞が、シチメンチョウ胚の背側腸間膜で同定され（データ示さず）、さらに４個のＳＳＥＡ−１標識ニワトリ生殖細胞が、シチメンチョウ生殖隆起同定された（データ示さず）。第２の胚では、ＳＳＥＡ−１陽性細胞２個が、性腺付近で同定された。残りの２個の胚では、ドナーＰＧＣは同定されなかった。
【００４６】
以上の結果を基に、５日のニワトリ胚（ＰＧＣがＳＳＥＡ−１陽性であるステージ）からの性腺ＰＧＣは、ステージ１３シチメンチョウ胚に血管内注入したとき、再移動し、性腺にコロニーを形成し、生殖系列キメラを生じさせることができる。従って、シチメンチョウ性腺によって産生される化学走性誘因物質は種特異的でないと考えられる。再確認される。ニワトリ性腺ＰＧＣは、性腺にコロニー形成した後でも移動できる能力を保持している。この研究で、生殖系列キメラの有効性が低いのは、注入された細胞懸濁液中のドナーＰＧＣの数が少ないことに起因する可能性がある。
【００４７】
＜実施例１５＞  ＳＳＥＡ−１およびＰＡＳ染色を使用した種間シチメンチョウ−ニワトリ胚性キメラの同定
先の研究で、シチメンチョウＰＧＣおよびニワトリＰＧＣによるＳＳＥＡ−１の発現の種差が確認された。この抗原性の変動は、標準ＰＡＳテストと一緒に、シチメンチョウ−ニワトリ生殖系列キメラの確認に使用できる可能性がある。二重染色されたニワトリ胚切片の観察によって、ニワトリＰＧＣは、ＰＡＳ陽性およびＳＳＥＡ−１陽性の両方であることが確認された（データ示さず）。ＰＡＳ陽性、ＳＳＥＡ−１陰性生殖細胞は、ニワトリ対照切片で確認されなかった。ＰＡＳおよびＳＳＥＡ−１によるステージ２４シチメンチョウ切片の二重染色で、背側腸間膜を通って移動し、性腺にコロニーを形成するシチメンチョウＰＧＣはＰＡＳ陽性であり、ＳＳＥＡ−１エピトープを発現しないことが証明された（データ示さず）。従って、ニワトリおよびシチメンチョウ胚の二重染色で、二重染色技術を、ニワトリ性腺中のシチメンチョウ生殖細胞を同定するためのマーカーとして使用できることが証明された。標準ＰＡＳ染色法と一緒にＳＳＥＡ−１抗体を使用して、８個中４個のレシピエントニワトリ胚で、生殖系列キメラを検出した（表１）。シチメンチョウＰＧＣを、ニワトリ胚血管に注入したおよそ２４時間後、ＳＳＥＡ−１陰性およびＰＡＳ陽性シチメンチョウ生殖細胞がニワトリ胚で同定された。肥厚した体腔上皮で、シチメンチョウＰＧＣがニワトリＰＧＣと共に確認された（データ示さず）。この上皮は、体腔角と、さらなる性腺部位である中腎との間に位置する。古い胚（ステージ２２および２３）では、ドナーシチメンチョウＰＧＣが両レシピエントニワトリ胚で確認された。背側腸間膜に位置する生殖細胞もあり（データ示さず）、さらに移動して、ニワトリ性腺にコロニーを形成した生殖細胞もあった（データ示さず）。二重染色技術を用いた潜在的キメラの分析で、シチメンチョウ性腺ＰＧＣを使用して、種間キメラを作製できることが確認された。
【００４８】
【表１】
2013240347.tif 000002
【００４９】
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは種特異的であったが、この方法は、キメラを検出することができなかった。ドットブロットハイブリダイゼーション法は、ドナーＰＧＣを同定できるほど十分に感度が高くなかった。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は、ハイブリダイゼーション法と関連した擬陰性の比率が高かった。二重染色法は、成功するシチメンチョウ−ニワトリキメラの同定方法と思われる。上記結果を基に、ニワトリおよびシチメンチョウ胚からの性腺ＰＧＣは、血管内注入したとき、性腺に再移動して、生殖系列キメラを生じさせることができる。従って、トリ性腺により産生される化学走性誘因物質は種特異的ではないようである。性腺ＰＧＣは、性腺にコロニーを形成した後でも、移行する能力を保持することも立証される。
【００５０】
シチメンチョウ−ニワトリキメラの作製は、用途が広い。オスシチメンチョウＰＧＣの移入は、ニワトリ性腺におけるシチメンチョウ精子形成に有用である。ニワトリでの精子産生に要する時間が１８週であるのに対して、シチメンチョウでは、３０〜３２週であるため、これによって、精子形成を加速することができる。ＰＧＣを培養して生殖系列キメラを作れることによって、子を作るのに現在必要な優れたシチメンチョウのオス親の数を減らすことができる。小さくて安いトリからシチメンチョウ精子を産生できることは、家禽産業にも有益であろう。
【００５１】
実験用キメラは、異なる遺伝子型の生殖細胞と体細胞との間の相互作用を研究するためのモデルを提供することもでき、それによって、その隣接細胞が、生殖細胞特性のいずれかを生殖細胞に課するかどうかを調査することができるようになる。この技術は、多産能力が低い種から、多産性のトリにＰＧＣを移入たり、予期せぬ死亡または病気の場合に、またはあるトリ種が自然の交配条件で絶滅寸前の場合に、ＰＧＣを保存するのに利用することもできた（Ａ．Ｔａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ４０：５０９−５１９（１９９３））。
【００５２】
前述のものは、例を挙げて本発明を説明するものであって、本発明を限定するものと考えるべきではない。本発明は、クレームによって明確に規定され、クレームの均等物はその中に含まれる。
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月29日(2013.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナートリ種から始原生殖細胞を提供するステップと、
前記始原生殖細胞を、レシピエントトリ種にｉｎ  ｏｖｏ投与するステップであって、前記レシピエントトリ種が前記ドナートリ種と異なる種であるステップと、
前記レシピエントトリ種をインキュベートして孵化させるステップと
を含む、トリ配偶子の産生および回収方法。