(57)【要約】【課題】  ヒドラジドビーズなどの担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、予め修飾を行うことで、アミノ化合物による標識を行い、その後シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能になるシアロ糖鎖の修飾方法を提供すること。【解決手段】  ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、非水系の有機溶媒中でアミド化を行うことにより、その後アミノ化合物による標識を行い、シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能になることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を遊離する工程、
（ｂ）遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する固相担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
（ｃ）捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
を含む方法。
【請求項２】
非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）において、アミド化反応の縮合剤としてＰｙＡＯＰを用いる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
アミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料を調製する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を遊離する工程、
（ｂ）遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
（ｃ）捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
（ｄ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
を含む方法。
【請求項６】
さらに、
（ｅ）再遊離した糖鎖に対し、アミノ基を有する化合物を作用させて還元的アミノ化反応を行い、アミノ基を有する化合物で当該糖鎖を標識する工程、
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）において、アミド化反応の縮合剤としてＰｙＡＯＰを用いる、請求項５から８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法、及びアミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は疾患により構造が変化することが知られていることから、新たな診断マーカーとして糖鎖が注目されている。例えば、シアロ糖鎖を有するタンパク質は、がんなどの疾患と関連する新たな診断マーカー開発の標的として注目されている。
【０００３】
診断マーカーの探索を目的として糖鎖を鋭敏に検出する方法としては、糖鎖の質量分析を行う方法、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により糖鎖を分離した後に、分離した糖鎖の質量分析を行う方法が有力な手段となっている。しかしながら、シアロ糖鎖におけるシアル酸は不安定で分解し易いため、安定化のための化学修飾を行った後に、分析することが行われている。
【０００４】
シアル酸を定量的に化学修飾するには、反応系内に過剰量の試薬の添加を要するため、試薬除去の工程が必要となる。そして、過剰試薬の除去を簡便に行うために、担体に糖鎖を固定化した後に化学修飾する方法が利用されている。
【０００５】
担体に糖鎖を固定化した後にシアル酸を化学修飾する方法としては、例えば、ヒドラジドビーズに糖鎖を固定化した後、ＭＴＴ試薬で糖鎖をメチルエステル化する方法が知られている（ＭＴＴ試薬で糖鎖をメチルエステル化する方法については、非特許文献１を参照のこと）。また、メチルエステル化されたシアロ糖鎖を、ビーズから外し標識を行った後に質量分析を行う方法として、例えば、ヒドラジドビーズに固定化された糖鎖を外した後、ａｏＷＲ試薬で標識し質量分析を行う方法が知られている。
【０００６】
一方、ＨＰＬＣによる分離を行った後に糖鎖の質量分析を行うには、ＨＰＬＣによる糖鎖の分離の向上と高感度検出のために２ＡＢ試薬やＰＡ試薬などのアミノ化合物で糖鎖を標識する方法が利用されている。しかしながら、これらアミノ化合物による標識は、酸性条件下で反応を行うため、メチルエステル化された部位が加水分解されやすいという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Miura  Y.  et  al.,  Chemistry.  2007;13(17),  4797-804.
【非特許文献２】Toyoda  M.  et  al.,  Anal.  Chem.  2008;80(13),  5211-8.
【非特許文献３】Liu  X.  et  al.,  Anal.  Chem.  2010:82(19),  8300-6.
【非特許文献４】Sekiya  S.  et  al.,  Anal.  Chem.  2005:77(15),  4962-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒドラジドビーズなどの担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対し、予め修飾を行うことで、アミノ化合物による標識を行い、その後シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能になるシアロ糖鎖の修飾方法を提供することにある。
【０００９】
さらなる本発明の目的は、このような修飾方法により修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料の調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
アミド誘導体はエステル誘導体より加水分解されにくく安定であることが知られている。そして、シアル酸のカルボン酸をアミド化できる既知の方法としては、求核剤としてアミノ基を有する化合物であるアセトヒドラジドを用いる方法が採用されている（非特許文献２を参照のこと）。
【００１１】
そこで、本発明者らは、まず、ヒドラジドゲルに捕捉されたシアロ糖鎖に対してアミド化修飾を行い、次いで、アミド化修飾されたシアロ糖鎖に対し、アミノ化合物による標識を行った。ここで、シアロ糖鎖のアミド化反応を、アミノ化合物による標識を行う際の条件と同様の酸性条件下で行った場合には、その後の逆相ＨＰＬＣにより、標識された化合物が検出されなかった。
【００１２】
本発明者らは、この原因について、シアロ糖鎖のアルデヒド基とヒドラジドゲルのヒドラジド基によるヒドラゾン結合が、アミド化の際の酸性条件下で加水分解し、糖鎖の標識前にゲルから糖鎖が遊離したことにあると仮定した。
【００１３】
そこで、次に、本発明者らは、ヒドラゾン結合が加水分解されないよう、非水系の有機溶媒であるジメチルスルホキシド中で、シアロ糖鎖のアミド化反応を行い、その後、酸性条件下でアミノ化合物による標識を行い、逆相ＨＰＬＣに供した。その結果、逆相ＨＰＬＣにおいて標識化合物のピークが検出された。本発明者らは、さらに、このピークの化合物について、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに供したところ、アミド化されたシアロ糖鎖との同一性を示すシグナルが検出された。これら事実から、ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、非水系の有機溶媒中でアミド化を行うことにより、その後、シアロ糖鎖のアミノ化合物による標識を行い、シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能であることが判明した。
【００１４】
さらに、本発明者らは、非水系の有機溶媒中でアミド化を行う場合において、使用する求核剤などの諸条件について詳細な検討を行った。その結果、求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる方法（非特許文献３を参照のこと）を利用することにより、シアル酸のカルボン酸のアミド化の効率を飛躍的に高めることができることをも見出した。
【００１５】
すなわち、本発明は、ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して、非水系の有機溶媒中でアミド化を行うことを特徴とする、シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法、及びアミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料の調製方法に関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
【００１６】
（１）シアロ糖鎖をアミド化修飾する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を遊離する工程、
（ｂ）遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する固相担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
（ｃ）捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
を含む方法。
【００１７】
（２）非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、（１）に記載の方法。
【００１８】
（３）工程（ｃ）において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、（１）または（２）に記載の方法。
【００１９】
（４）工程（ｃ）において、アミド化反応の縮合剤としてＰｙＡＯＰを用いる、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（５）アミド化修飾されたシアロ糖鎖を含む糖鎖試料を調製する方法であって、
（ａ）生体試料から糖鎖を遊離する工程、
（ｂ）遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する工程、
（ｃ）捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程、
（ｄ）捕捉した糖鎖を再遊離する工程、
を含む方法。
【００２１】
（６）さらに、（ｅ）再遊離した糖鎖に対し、アミノ基を有する化合物を作用させて還元的アミノ化反応を行い、アミノ基を有する化合物で当該糖鎖を標識する工程、を含む、（５）に記載の方法。
【００２２】
（７）非水系の溶媒がジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、およびメタノールからなる群より選択される溶媒である、（５）または（６）に記載の方法。
【００２３】
（８）工程（ｃ）において、アミド化反応の求核剤としてメチルアミン塩酸塩を用いる、（５）から（７）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（９）工程（ｃ）において、アミド化反応の縮合剤としてＰｙＡＯＰを用いる、（５）から（８）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ヒドラジド基を有する担体に捕捉されたシアロ糖鎖に対して予め修飾を行うことで、アミノ化合物による標識を行った後に、効率的に、シアロ糖鎖のＨＰＬＣによる分離や、その分離後の質量分析を行うことが可能となった。また、新たな糖鎖バイオマーカー開発を目指した、シアロ糖鎖の比較定量解析が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】上段：アセトヒドラジドを用いてアミド化されたα２−６シアル酸を有する糖鎖を表１に記載の条件で逆相ＨＰＬＣにより検出した結果を示すグラフである。下段：アセトヒドラジドを用いてアミド化されたα２−３シアル酸を有する糖鎖を表１に記載の条件で逆相ＨＰＬＣにより検出した結果を示すグラフである。
【図２】左：図１におけるピーク１を質量分析により検出した結果を示すグラフである。右：図１におけるピーク２を質量分析により検出した結果を示すグラフである。
【図３】上段：アミド化されたα２−６シアル酸を有する糖鎖を表２に記載の条件で逆相ＨＰＬＣにより検出した結果を示すグラフである。下段：アミド化されたα２−３シアル酸を有する糖鎖を表２に記載の条件で逆相ＨＰＬＣにより検出した結果を示すグラフである。
【図４】上段左：図３におけるピーク１を質量分析により検出した結果を示すグラフである。上段右：図３におけるピーク２を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段左：図３におけるピーク３を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段右：図３におけるピーク４を質量分析により検出した結果を示すグラフである。
【図５】上段：メチルアミン塩酸塩を用いてアミド化されたα２−６シアル酸を有する糖鎖を表２に記載の条件で逆相ＨＰＬＣにより検出した結果を示すグラフである。下段：メチルアミン塩酸塩を用いてアミド化されたα２−３シアル酸を有する糖鎖を表２に記載の条件で逆相ＨＰＬＣにより検出した結果を示すグラフである。
【図６】上段左：図５におけるピーク５を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段左：図５におけるピーク６を質量分析により検出した結果を示すグラフである。下段右：図５におけるピーク７を質量分析により検出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（生体試料から糖鎖を遊離する工程）
本発明において糖鎖の遊離に用いる生体試料としては、例えば全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織、ウイルス、植物組織などが挙げられる。また、本発明においては、精製された、あるいは未精製の糖タンパク質を用いることができる。試料は脱脂、脱塩、タンパク質分画、熱変性などの方法により前処理されていてもよい。
【００２８】
糖鎖遊離手段を用いて上記生体試料に含まれる糖鎖を含む分子（例えば、糖タンパク質）から糖鎖を遊離させる。糖鎖を遊離させる手段としては、Ｎ−グリコシダーゼあるいはＯ−グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離などの方法を用いることができる。Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、Ｎ−グリコシダーゼを用いる方法が好ましい。グリコシダーゼ処理に先立って、トリプシンやキモトリプシンなどを用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。
【００２９】
（遊離した糖鎖を担体に捕捉する工程）
本発明においては、次いで、遊離させた糖鎖のアルデヒド基を、その表面にヒドラジド基を有する固相担体に接触させ、ヒドラゾン結合により、糖鎖を担体に捕捉する。
【００３０】
糖鎖は生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は水溶液などの状態で環状のヘミアセタール型と、非環状型のアルデヒド型とが平衡で存在する。タンパク質や核酸、脂質など糖鎖以外の生体内物質にはアルデヒド基が含まれていない。このことから、アルデヒド基と特異的に反応して安定な結合を形成するヒドラジド基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。
【００３１】
糖鎖を捕捉するための担体としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子は、少なくとも表面の一部にヒドラジドを有した固体あるいはゲル粒子であることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。
【００３２】
ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状またはそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５〜１０００μｍであり、より好ましくは０．０５〜２００μｍであり、さらに好ましくは０．１〜２００μｍであり、最も好ましくは０．１〜１００μｍである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ）」（住友ベークライト株式会社製、＃ＢＳ−４５６０３）を好適に用いることができる。
【００３３】
糖鎖を特異的に捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４〜９０℃、より好ましくは４〜７０℃、さらに好ましくは３０〜８０℃であり、最も好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
【００３４】
ポリマー粒子を用いた場合、担体表面には糖鎖以外の莢雑物が非特異的に吸着しているため、これらを洗浄除去する必要がある。洗浄液としては、水、緩衝液、界面活性剤を含む水または緩衝液、有機溶剤などを適宜組み合わせて用いることが好ましい。特に好ましい形態は、界面活性剤を含む水または緩衝液で十分に洗浄したのち、有機溶剤で洗浄し、最後に水で洗浄する方法である。これらの洗浄により、非特異的吸着物がポリマー粒子表面から除去される。
【００３５】
担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用して、キャッピングすることができる。
【００３６】
（捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する工程）
本発明においては、次いで、担体に捕捉した糖鎖のシアル酸を非水系の溶媒中でアミド化する。
【００３７】
アミド化反応に用いる非水系の溶媒としては、アミド化反応中にヒドラゾン結合の加水分解を生じさせない溶媒であれば特に制限はない。このような溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシドやＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの極性非プロトン性溶媒やメタノールなどの極性プロトン性溶媒が挙げられる。
【００３８】
アミド化試薬としては、求核剤として作用するものであれば特に制限はないが、例えば、アセトヒドラジド、メチルアミン塩酸塩（非特許文献３）、塩化アンモニウム（非特許文献４）を好適に用いることができる。シアロ糖鎖のアミド化の効率の観点からは、メチルアミン塩酸塩が特に好ましい。反応に用いるアミド化試薬の濃度は、１ｍＭ以上、好ましくは１Ｍ〜１０Ｍである。
【００３９】
ｐＨを調製するために、必要に応じて、酸性あるいはアルカリ性の有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、例えば、酢酸やトリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）が挙げられる。
【００４０】
また、縮合剤として、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）、ＨＡＴＵ、ＰｙＡＯＰ、ＣＯＭＵ、ＤＭＴ−ＭＭを好適に用いることができる。アミド化試薬としてメチルアミン塩酸塩を使用する場合には、縮合剤としてＰｙＡＯＰを使用するとシアロ糖鎖のアミド化の効率を高めることができる。
【００４１】
本発明においては、シアロ糖鎖が担体に捕捉されているため、洗浄によって簡便に過剰試薬を除去することができ、また、これにより簡便にアミド化反応を繰り返すことができる。シアロ糖鎖のアミド化の効率を高めるために、アミド化反応は、２回以上、より好ましくは５回以上（例えば、１０回以上）、繰り返すことが好ましい。
【００４２】
（捕捉した糖鎖を再遊離する工程）
本発明においては、次いで、捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離し、精製された糖鎖試料を得る工程を含むことができる。ヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理によって容易に切断されるため、糖鎖を捕捉したのち、糖鎖を担体から簡単に切り離すことができる。この工程では、捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離するために、酸と有機溶媒の混合溶媒あるいは酸と水と有機溶媒の混合溶媒にて酸処理を行うことが好ましい。酸と水と有機溶媒の混合溶媒の場合、水の含有率は好ましくは０．１％〜９０％、より好ましくは０．１％〜８０％、さらに好ましくは０．１％〜５０％である。水の代わりに水性緩衝液を含有しても良い。緩衝液の濃度は好ましくは０．１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは０．１ｍＭ〜５００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭである。反応溶液のｐＨは好ましくは２〜９、より好ましくは２〜７であり、さらに好ましくは２〜６である。使用する酸は例えば、酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、塩酸、クエン酸、リン酸、硫酸が好ましく、より好ましくは酢酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、さらに好ましくは酢酸、トリフルオロ酢酸である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。反応は、糖鎖を遊離させる反応を効率よく行う観点から、開放系で行って溶媒を完全に蒸発させることが好ましい。
【００４３】
（再遊離した糖鎖を標識する工程）
本発明においては、再遊離した糖鎖に対し、アミノ基を有する化合物を作用させて還元的アミノ化反応を行い、アミノ基を有する化合物で当該糖鎖を標識する工程を含むことができる。
【００４４】
反応系においてｐＨが酸性から中性の条件であるのが好ましく、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃が好ましく、好ましくは２５〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜９０℃である。アミノ化合物の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましく、還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍであるのが好ましい。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、より好ましくは１０分間〜３時間である。
【００４５】
ここで、アミノ基を有する化合物は、紫外可視吸収特性又は蛍光特性を有することが好ましく、例えば下記の群から選ばれる少なくとも１つの化合物であることが好ましい。
【００４６】
２−Ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＰＡ）、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（２ＡＢ）、８−Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ−１、３，６−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、８−Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３，６−ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ、７−ａｍｉｎｏ−１，３−ｎａｐｈｔａｌｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２−Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ、５−Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、７−Ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、２−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、３−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、７−Ａｍｉｎｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ、３−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）−６−ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ、２−Ａｍｉｎｏ−６−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ、Ｅｔｈｙｌ  ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ、ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｎｉｔｒｉｌｅ、及び７−ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，３−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ。
【００４７】
特に、アミノ化合物が２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅの場合、ｐＨが酸性から中性の条件で、好ましくは２〜９、より好ましくは２〜８であり、さらに好ましくは２〜７である。反応温度に関しては４〜９０℃、好ましくは３０〜９０℃で、さらに好ましくは４０〜８０℃である。アミノ化合物の濃度は１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍで、さらに好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍである。還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０ｍＭ〜１０Ｍ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２Ｍである。反応時間は、１０分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜８時間、さらに好ましくは１時間〜３時間である。
【００４８】
また、還元剤は例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、メチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボランなどが使用可能であるが、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用するのが反応性の面から考えて好ましい。
【００４９】
この工程後、得られる溶液は標識された糖鎖と過剰量加えた未反応アミノ化合物、還元剤が存在するため、これら余剰試薬を除去する工程を行うのが好ましい。シリカカラムによる除去、ゲル濾過による除去、イオン交換樹脂による除去、いずれの方法を用いても良いが、シアル酸の離脱を防ぐために使用する溶媒は中性であるのが好ましい。
【００５０】
（標識されたシアロ糖鎖を分析する工程）
得られた標識されたシアロ糖鎖については、ＨＰＬＣに代表されるクロマトグラフィーにより分離することができる。さらに、クロマトグラフィーにより分離されたシアロ糖鎖は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに代表される質量分析に供することより、質量電荷比（ｍ/ｚ値）を読み取ることができ、そのピークが検出される。質量電荷比やピーク強度（ピーク高さ、ピーク面積など任意の指標）から、糖鎖の定量や糖鎖の構造分析を行うことができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＭｏｄ、Ｇｌｙｃｏｓｕｉｔｅなど）を利用することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
[比較例１]
α２−６シアル酸を有する糖鎖Ａ（上記の式（Ａ）、５ｎｍｏｌ）、α２−３シアル酸を有する糖鎖Ｂ（上記の式（Ｂ）、５ｎｍｏｌ）を、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット（住友ベークライト株式会社製）のゲルに結合させた。
【００５３】
【化１】
2013068594.tif 000002
【００５４】
【化２】
2013068594.tif 000003
【００５５】
各シアロ糖鎖が固定化されたゲルを、ＨＣｌを用いてｐＨ３．５に合わせた１Ｍのアセトヒドラジド水溶液３０μｌに溶解し、１ＭのＥＤＡＣ溶液４μlを添加し、２時間室温で反応させアミド化を行った。反応後、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットの洗浄方法に従って過剰試薬を除去し、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットの再遊離した糖鎖を標識する方法に従って糖鎖のＰＡ標識を行った。得られたアミド化糖鎖ＡとＢを逆相ＨＰＬＣにて分析した。逆相ＨＰＬＣの条件を表１に示す。
【００５６】
【表１】
2013068594.tif 000004
【００５７】
なお、表１のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整するようになっている。また、表１において、「Ｂ：ａ％（Ｔ1分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ2分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ2−Ｔ1）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ1、Ｔ2、ａ、ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表１において％は体積を基準とした百分率を表わす。
【００５８】
[実施例１]
比較例１におけるアミド化の条件は糖鎖とヒドラジドゲルの結合であるヒドラゾン結合を分解し易い条件であることから、修飾時にヒドラゾン結合が加水分解し、糖鎖のＰＡ標識前にゲルから糖鎖が遊離したため、洗浄工程で糖鎖が除去され検出されなかったと考えられる。
【００５９】
そこで、アミド化の修飾時にヒドラゾン結合が加水分解されないよう、非水系の有機溶媒であるＤＭＳＯ中で反応させた。具体的には、各シアロ糖鎖が固定化されたゲルを、ＤＭＳＯに溶解した２Ｍのアセトヒドラジド溶液１００μｌに溶解し、ＤＭＳＯに溶解した１ＭのＥＤＡＣ溶液４μlを添加し、２時間室温で反応させアミド化を行った。反応後、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットの洗浄方法に従って過剰試薬を除去し、さらにＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットの再遊離した糖鎖を標識する方法に従って糖鎖のＰＡ標識を行った。得られたアミド化糖鎖ＡとＢを上記表１の条件で逆相ＨＰＬＣにて分析した。
【００６０】
その結果、図１の上段、下段に示すように、ピーク１と２がみられた。
【００６１】
また、２つのピークをＭＡＬＤＩ−ＭＳに供したところピーク１からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７９０．３５のシグナル（図２の左）、ピーク２からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７９０．４３のシグナル（図２の右）が検出された。
【００６２】
これらの質量電荷比（ｍ／ｚ）の値は、糖鎖ＡとＢがアミド化されＮａイオンが付加した質量数（７９０．３０）にほぼ一致することから、アミド化されたシアロ糖鎖が得られたことが判明した。
【００６３】
[実施例２]
実施例１において、アミド化されたシアロ糖鎖のシグナルが検出されたが、アミド化されていないシアロ糖鎖のシグナルも同時に検出された。シアロ糖鎖の修飾効率をより評価し易くするために、修飾されたシアロ糖鎖と未修飾のシアロ糖鎖が分離される条件（表２）で逆相ＨＰＬＣを行った。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
なお、表２のＡ液及びＢ液は、それぞれ移動相を構成する液体であり、これらＡ液とＢ液とを混合して移動相の極性を調整するようになっている。また、表２において、「Ｂ：ａ％（Ｔ1分）→Ｂ：ｂ％（Ｔ2分）」という記載は、Ｂ溶液の濃度を、（Ｔ2−Ｔ1）分間で、ａ％からｂ％まで変化させたことを意味する。ただし、Ｔ1、Ｔ2、ａ、ｂはそれぞれ実数を表わす。また、表２において％は体積を基準とした百分率を表わす。
【００６６】
その結果、図３の上段と下段に示すように、ピーク１〜４が検出された。また、４つのピークの質量分析をネガティブイオンモードで行ったところ、ピーク１からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７６６．２８のシグナル（図４の左上）、ピーク２からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７１０．２４のシグナル（図４の右上）、ピーク３からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７６６．２８のシグナル（図４の左下）、ピーク４からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７１０．２４のシグナル（図４の右下）がそれぞれ検出された。７６６．２８の質量電荷比（ｍ／ｚ）の値は、糖鎖ＡとＢがアセトヒドラジドでアミド化された質量数（７６６．３０）にほぼ一致し、７１０．２４の質量電荷比（ｍ／ｚ）の値は、未修飾の糖鎖ＡとＢの質量数（７１０．２６）にほぼ一致した。本実施例においては、修飾された糖鎖ＡとＢが１０％以下であることが判明した。
【００６７】
[実施例３]
シアル酸を有する糖鎖ＡとＢをより効率的に修飾できる方法について検討を行った。その結果、アミド化試薬としてメチルアミン塩酸塩（非特許文献３）を求核剤として用いる手法を改良することにより、より効率的に修飾することが可能になった。
【００６８】
具体的には、各シアロ糖鎖が固定化されたゲルに、ＤＭＳＯに溶解した２．５Ｍのメチルアミン塩酸塩溶液を５０μＬ及び９９％の純度以上のＮ-メチルモルホリンを７．４５μＬを添加し、さらに、ＤＭＳＯに溶解した０．５ＭのＰｙＡＯＰ溶液をｐＨが８．５から７．５の間になるように添加し、１５分間室温で反応させアミド化を行った。反応後、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットの洗浄方法に従って過剰試薬を除去した。この修飾工程を、合計１０回繰り返した後、ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキットの再遊離した糖鎖を標識する方法に従って糖鎖のＰＡ標識を行った。得られたアミド化糖鎖ＡとＢを表２に示した条件で逆相ＨＰＬＣを行った。
【００６９】
その結果、図５の上段と下段に示すように、ピーク５〜７が検出された。また、３つのピークの質量分析をネガティブイオンモードで行ったところ、ピーク５からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７２３．２６のシグナル（図６の左上）、ピーク６からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７２３．２６のシグナル（図６の左下）、ピーク７からは質量電荷比（ｍ／ｚ）の値が７１０．２３のシグナル（図６の右下）がそれぞれ検出された。７２３．２６の質量電荷比（ｍ／ｚ）の値は、糖鎖ＡとＢがメチルアミンでアミド化された質量数（７２３．２９）にほぼ一致し、７１０．２４の質量電荷比（ｍ／ｚ）の値は、未修飾の糖鎖ＡとＢの質量数（７１０．２６）にほぼ一致した。本実施例においては、糖鎖ＡとＢは９０％以上が修飾されていることが判明した。
【００７０】
[比較例２]
実施例３において、縮合剤としてＨＡＴＵを用いた場合は、ＰｙＡＯＰの反応効率を１００％とすると３０％以下の収率でしか修飾物が得られなかった。なお、縮合剤としてＥＤＡＣ、ＤＭＴ−ＭＭを試したが、修飾物は検出されなかった。
【００７１】
[比較例３]
実施例３において、アミド化工程が１回の場合には、修飾物の収率は１０％〜４０％であった。
【００７２】
[比較例４]
実施例３において、アミド化試薬（求核剤）としてアセトヒドラジドを用いて、アミド化の工程を１０回繰返した場合、修飾物の収率は約４５％であった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、シアロ糖鎖の分離や分析を効率的に行うことが可能となるため、本発明は、例えば、シアロ糖鎖を標的とした新たなバイオマーカーの開発に有用である、従って、本発明は、例えば、医療分野において大きく貢献しうるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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