(57)【要約】【課題】バラスト水に含まれるＬサイズ生物及びＳサイズ生物の各個体数を短時間で精度良く検査できるバラスト水の検査方法を提供する。【解決手段】バラスト水に含まれる微生物の検査方法であって、最小サイズが５０μｍ以上の微生物については、スキャナにより取得した画像データに基づいて個体数を検査し、最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物については、スキャナにより取得した画像データに基づく以外の方法により個体数を検査することを特徴とする。【選択図】図２
2013050375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラスト水に含まれる微生物の検査方法であって、
最小サイズが５０μｍ以上の微生物については、スキャナにより取得した画像データに基づいて個体数を検査し、
最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物については、スキャナにより取得した画像データに基づく以外の方法により個体数を検査することを特徴とするバラスト水の検査方法。
【請求項２】
前記最小サイズが５０μｍ以上の微生物については、
微生物の画像データをスキャナにより取得し、
該画像データを二値化処理し、
該二値化処理した二値画像に基づいて前記微生物に対応する画素の連結領域を特定し、
該画素の連結領域において輪郭を構成する画素を順次特定し、
該輪郭を構成する画素の一つを起点として、該輪郭を構成する画素に沿って二点を時計回り又は反時計回りに移動させるに際し、第一の点は第一の方向に移動させ、第二の点は前記第一の方向と反対の第二の方向に移動させるとともに前記第一の点との直線距離が５０μｍ以上となる場合にのみ前記第一の方向に移動させ、前記第一の点が前記輪郭を構成する画素を一巡し前記起点となる画素に戻るまでの間に、前記輪郭を構成するすべての画素を前記第一の点と第二の点の少なくともいずれかが通過した段階で該第一の点と第二の点とが一致していなければ、前記微生物の最小サイズが５０μｍ以上と判断し、
最小サイズが５０μｍ以上と判断される前記微生物に対応する画素の連結領域を計数することで、前記個体数を検査する請求項１記載のバラスト水の検査方法。
【請求項３】
前記第二の点は、前記第一の点を第一の方向に一画素移動させる毎に、前記第一の点との直線距離が５０μｍ未満の範囲で第二の方向に連続して移動させ、又は前記第一の点との直線距離が５０μｍ未満となるまで第一の方向に連続して移動させる請求項２記載のバラスト水の検査方法。
【請求項４】
植物プランクトンをもって、前記最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物とする請求項１乃至３の何れか一項記載のバラスト水の検査方法。
【請求項５】
パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定により、前記植物プランクトンの個体数を検査する請求項４の記載のバラスト水の検査方法。
【請求項６】
前記バラスト水のサンプルにパルス変調された測定光を照射し、
該測定光が照射されている前記バラスト水のサンプルにパルス光を照射し、
前記測定光を照射した際に前記サンプルに含まれるクロロフィルが放出する最低限の蛍光強度Ｆｏを測定し、
前記パルス光を照射した際に前記サンプルに含まれるクロロフィルが放出する最大限の蛍光強度Ｆｍを測定し、
前記最低限の蛍光強度Ｆｏ及び最大限の蛍光強度Ｆｍの測定値から前記サンプルに含まれるクロロフィルの最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍ＝（Ｆｍ−Ｆｏ）／Ｆｍを算出し、
前記最低限の蛍光強度Ｆｏ及び前記最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍと、予め設定された植物プランクトンの個体数との関係に基づいて、前記バラスト水のサンプルに含まれる植物プランクトンの個体数を間接的に検査する請求項４又は５記載のバラスト水の検査方法。
【請求項７】
前記スキャナは、蛍光スキャナである請求項１乃至６の何れか一項記載のバラスト水の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラスト水の検査方法に関し、特にバラスト水に含まれるプランクトン等の微生物の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
荷物を積載していない船舶は、当該船舶を安定させるためにバラスト水を搭載して航行し、荷物を積載する海域において前記バラスト水を排出する。
バラスト水は、通常、搭載する海域と異なる海域に排出されるため、該バラスト水に含まれるプランクトンや細菌等の微生物を本来の生息地以外の海域に運び、生態系を破壊する等の問題を引き起こす虞がある。
【０００３】
このような問題に対処するため、バラスト水の規制に関する国際的なルールが策定され、「船舶のバラスト水および沈殿物の規制および管理のための国際条約（バラスト水管理条約）」が採択されている。
【０００４】
上記バラスト水管理条約に関連する「バラスト水サンプリングに関するガイドライン（Ｇ２）」は、「バラスト水排出基準（Ｄ−２）」において、船舶から排出されるバラスト水に含まれる微生物の許容個体数を、例えば、最小サイズが５０μｍ以上の微生物（以下、「Ｌサイズ生物」という。）については１０個／ｍ３以下、最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物（以下、「Ｓサイズ生物」という。）については１０個／ｍＬ以下と、前記微生物の最小サイズにより区分して規定している。
【０００５】
また、上記ガイドライン（Ｇ２）は、上記排出基準（Ｄ−２）における微生物の「最小サイズ」について、「刺、鞭毛あるいは触覚を除く生体の最小寸法を意味するものである」旨定義している。
そのため、近年、上記排出基準（Ｄ−２）を満たすよう、バラスト水の処理装置の開発が盛んに行われている。
【０００６】
ところで、従来、バラスト水に含まれる微生物を、画像データを利用して検査する方法が提案されている（特許文献１参照。）。
【０００７】
特許文献１に記載された検査方法は、蛍光顕微鏡を用いて微生物のデジタル画像を取得し、該デジタル画像を二値化して得られた二値画像において画素の連結領域を１微生物と認識し、該微生物の面積を算出し、該算出された面積と等しい面積を有し短径と長径が１：１．１〜１：８の任意の比を有する楕円形の短径を算出し、該算出した短径を前記微生物の最小サイズであるとして、前記認識した微生物を、上記バラスト水排出基準（Ｄ−２）における微生物の最小サイズ毎に区分して計数するものである。
【０００８】
ところが、上記特許文献１に記載された検査方法は、微生物の形状を、当該微生物と同面積の楕円形であると仮定し、その短径を該微生物の最小サイズとするものであり、当該楕円形の短径は、上記ガイドライン（Ｇ２）における「最小サイズ」の定義とは明らかに異なるものである。
また、微生物には様々な形状を有するものがあるが、上記特許文献１に記載された方法は、微生物の形状を単に楕円形と仮定するものであり、実測とのバラツキが大きく、信頼性に乏しいものである。
【０００９】
さらに、上記特許文献１に記載された検査方法において使用される蛍光顕微鏡は高価であり、操作も煩雑なので、日常的な簡易検査には不向きである。
【００１０】
そこで、本発明者らは、蛍光スキャナにより取得した画像データを利用して、バラスト水に含まれる微生物を精度良く検査できる方法を開発した（特許文献２参照。）。
【００１１】
特許文献２に記載された検査方法は、微生物の二次元形状が二次元空間である所定長さのスリットを通過するか否かにより、当該微生物の最小サイズが所定サイズ以上か否かを検査するものである。
【００１２】
当該特許文献２に記載された検査方法によれば、バラスト水に含まれる微生物を、上記バラスト水排出基準（Ｄ−２）における微生物の最小サイズ毎に精度良く区分して計数することができる。
また、当該特許文献２に記載された検査方法は、蛍光スキャナにより取得した画像データを利用するので、日常的な簡易検査に適する。
【００１３】
しかしながら、当該検査方法は、Ｌサイズ生物とＳサイズ生物のそれぞれの検体について、ろ過したフィルターを蛍光スキャナにより走査し、画像データを取得する必要があり、検査に時間を要する。
また、Ｓサイズ生物の撮像には、蛍光スキャナに高い解像度が要求され、画像データの取得にも時間を要する。
さらに、植物プランクトンには個体が連なって群体を形成するものがあるが、該植物プランクトンは、大多数がＳサイズ生物に区分されるものであり、個体間の隙間が１０μｍ以下である場合が多く、蛍光スキャナにより取得される画像データから前記群体を形成する植物プランクトンの各個体を認識するのは困難である。
【００１４】
一方、国際海事機関（ＩＭＯ）の会議において、バラスト水に含まれるＳサイズ生物を、パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定を利用して検査する方法が提案されている（非特許文献１参照。）。
当該検査方法は、Ｓサイズ生物に区分される微生物の大多数を占める植物プランクトンがクロロフィルを持つ点に着目したものであり、パルス変調蛍光測定器を用いて、バラスト水のサンプルに含まれるクロロフィルの最大量子収率を測定し、該測定値等と予め設定された植物プランクトンの個体数との関係に基づいて、前記サンプルに含まれる植物プランクトンの個体数を間接的に検査するものである。
【００１５】
当該検査方法によれば、市販のパルス変調クロロフィル蛍光測定器（例えば、ドイツＷalz社製のパルス変調クロロフィル蛍光測定器（Ｗａｔｅｒ−ＰＡＭ））を利用して、バラスト水のサンプル中に生息するＳサイズ生物の個体数を精度良く簡単に検査することができる。
しかしながら、当該検査方法は、Ｌサイズ生物に区分される微生物の大多数を占める動物プランクトンには対応できない問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２０１０−６３４０３号公報
【特許文献２】特願２０１０−２７７５４３号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】BLG/15/5/4 ‘DEVELOPMENT OF GUIDELINES AND OTHER DOCUMENTS FORUNIFORM IMPLEMENTATION OF THE 2004 BWM CONVENTION’, Annex, Paragraph 9.14〜9.16,9.25 , [online];INTERNATIONAL MARITIME ORGANIZATION, [retrieved on 21 December 2010].Retrieved from the Internet: ＜URL:http://docs.imo.org/Category.aspx?cid=53＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そこで、本発明は、バラスト水に含まれるＬサイズ生物（最小サイズが５０μｍ以上の微生物）及びＳサイズ生物（最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物）の各個体数を、短時間で精度良く検査できるバラスト水の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的を達成するため、本発明のバラスト水の検査方法は、バラスト水に含まれる微生物の検査方法であって、最小サイズが５０μｍ以上の微生物については、スキャナにより取得した画像データに基づいて個体数を検査し、最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物については、スキャナにより取得した画像データに基づく以外の方法により個体数を検査することを特徴とする。
【００２０】
ここで、本発明において、微生物の「最小サイズ」は、「刺、鞭毛あるいは触覚を除く生体の最小寸法を意味するものである」旨の上記「バラスト水サンプリングに関するガイドライン（Ｇ２）」における定義に従うものである。
【００２１】
本発明のバラスト水の検査方法は、前記最小サイズが５０μｍ以上の微生物については、微生物の画像データをスキャナにより取得し、該画像データを二値化処理し、該二値化処理した二値画像に基づいて前記微生物に対応する画素の連結領域を特定し、該画素の連結領域において輪郭を構成する画素を順次特定し、該輪郭を構成する画素の一つを起点として、該輪郭を構成する画素に沿って二点を時計回り又は反時計回りに移動させるに際し、第一の点は第一の方向に移動させ、第二の点は前記第一の方向と反対の第二の方向に移動させるとともに前記第一の点との直線距離が５０μｍ以上となる場合にのみ前記第一の方向に移動させ、前記第一の点が前記輪郭を構成する画素を一巡し前記起点となる画素に戻るまでの間に、前記輪郭を構成するすべての画素を前記第一の点と第二の点の少なくともいずれかが通過した段階で該第一の点と第二の点とが一致していなければ、前記微生物の最小サイズが５０μｍ以上と判断し、最小サイズが５０μｍ以上と判断される前記微生物に対応する画素の連結領域を計数することで、前記個体数を検査することが好ましい。
【００２２】
本発明のバラスト水の検査方法は、前記第二の点が、前記第一の点を第一の方向に一画素移動させる毎に、前記第一の点との直線距離が５０μｍ未満の範囲で第二の方向に連続して移動させ、又は前記第一の点との直線距離が５０μｍ未満となるまで第一の方向に連続して移動させることが好ましい。
【００２３】
本発明のバラスト水の検査方法は、植物プランクトンをもって、前記最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物とすることが好ましい。
【００２４】
本発明のバラスト水の検査方法は、パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定により、前記植物プランクトンの個体数を検査することが好ましい。
【００２５】
本発明のバラスト水の検査方法は、前記バラスト水のサンプルにパルス変調された測定光を照射し、該測定光が照射されている前記バラスト水のサンプルにパルス光を照射し、前記測定光を照射した際に前記サンプルに含まれるクロロフィルが放出する最低限の蛍光強度Ｆｏを測定し、前記パルス光を照射した際に前記サンプルに含まれるクロロフィルが放出する最大限の蛍光強度Ｆｍを測定し、前記最低限の蛍光強度Ｆｏ及び最大限の蛍光強度Ｆｍの測定値から前記サンプルに含まれるクロロフィルの最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍ＝（Ｆｍ−Ｆｏ）／Ｆｍを算出し、前記最低限の蛍光強度Ｆｏ及び前記最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍと、予め設定された植物プランクトンの個体数との関係に基づいて、前記バラスト水のサンプルに含まれる植物プランクトンの個体数を間接的に検査することが好ましい。
【００２６】
本発明のバラスト水の検査方法は、前記スキャナが、蛍光スキャナであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明におけるバラスト水の検査方法は、最小サイズが５０μｍ以上の微生物（Ｌサイズ生物）については、スキャナにより取得した画像データに基づいて個体数を検査し、最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物（Ｓサイズ生物）については、スキャナにより取得した画像データに基づく以外の方法により個体数を検査するので、Ｌサイズ生物については、スキャナを用いた簡易な方法で検査を行い、Ｓサイズ生物については、他の適当な方法により前記Ｌサイズ生物の検査と並行して検査を行うことができるため、バラスト水に含まれるＬサイズ生物及びＳサイズ生物の個体数を短時間で精度良く検査することができる。
【００２８】
本発明におけるバラスト水の検査方法は、前記最小サイズが５０μｍ以上の微生物については、微生物の画像データをスキャナにより取得し、該画像データを二値化処理し、該二値化処理した二値画像に基づいて前記微生物に対応する画素の連結領域を特定し、該画素の連結領域において輪郭を構成する画素を順次特定し、該輪郭を構成する画素の一つを起点として、該輪郭を構成する画素に沿って二点を時計回り又は反時計回りに移動させるに際し、第一の点は第一の方向に移動させ、第二の点は前記第一の方向と反対の第二の方向に移動させるとともに前記第一の点との直線距離が５０μｍ以上となる場合にのみ前記第一の方向に移動させ、前記第一の点が前記輪郭を構成する画素を一巡し前記起点となる画素に戻るまでの間に、前記輪郭を構成するすべての画素を前記第一の点と第二の点の少なくともいずれかが通過した段階で該第一の点と第二の点とが一致していなければ、前記微生物の最小サイズが５０μｍ以上と判断し、最小サイズが５０μｍ以上と判断される前記微生物に対応する画素の連結領域を計数することで、前記個体数を検査することとすれば、Ｌサイズ生物の個体数を画像処理技術により精度良く簡単に検査することができる。
【００２９】
本発明におけるバラスト水の検査方法は、植物プランクトンをもって、前記最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物とすれば、Ｓサイズ生物の個体数を簡単に検査することができる。
【００３０】
本発明におけるバラスト水の検査方法は、パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定により、前記植物プランクトンの個体数を検査することとすれば、市販のパルス変調クロロフィル蛍光測定器を利用して、サンプル中に生息するＳサイズ生物の個体数を精度良く簡単に検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】蛍光顕微鏡によるプランクトンの画像例。
【図２】Ｌサイズ生物の検査方法のフロー図。
【図３】二値画像のイメージ図。
【図４】ラスタスキャンの説明図。
【図５】輪郭追跡手法の説明図。
【図６】図３において輪郭追跡順に輪郭番号を付した図。
【図７】Ｌサイズ生物判断のフローチャート。
【図８】Ｌサイズ生物の判断例１についての説明図１。
【図９】Ｌサイズ生物の判断例１についての説明図２。
【図１０】Ｌサイズ生物の判断例１についての説明図３。
【図１１】Ｌサイズ生物の判断例１についての説明図４。
【図１２】Ｌサイズ生物の判断例１についての説明図５。
【図１３】二値画像のイメージ図。
【図１４】Ｌサイズ生物の判断例２についての説明図１。
【図１５】Ｌサイズ生物の判断例２についての説明図２。
【図１６】Ｌサイズ生物の判断例２についての説明図３。
【図１７】Ｌサイズ生物の判断例２についての説明図４。
【図１８】Ｌサイズ生物の判断例２についての説明図５。
【図１９】パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定の原理を示す説明図。
【図２０】クロロフィルに照射する光と蛍光強度の関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
図１は、本発明の実施の形態において検査対象となる微生物の蛍光顕微鏡画像の一例を示す。
図１（ａ）はフジツボの幼生（動物プランクトン）、（ｂ）はカイアシ類（動物プランクトン）、（ｃ）及び（ｄ）はケイ藻類（植物プランクトン）の画像を示す。
各画像において、矢印で示す部分が、前記バラスト水管理条約のガイドライン（Ｇ２）で定義される微生物の「最小サイズ」に対応する。
【００３３】
＜Ｌサイズ生物（最小サイズが５０μｍ以上の微生物）の検査＞
本実施の形態におけるＬサイズ生物の検査において、微生物の「最小サイズ」は、画像中の微生物の平面形状が通過することのできるスリット長さの最小サイズであると仮定する。
【００３４】
そして、本実施の形態におけるＬサイズ生物の検査方法は、画像中における微生物に対応する画素の連結領域が、長さ５０μｍのスリットを通過できないことにより、前記微生物の最小サイズが５０μｍ以上であると判断し、最小サイズが５０μｍ以上と判断された前記微生物に対応する画素の連結領域を計数することで、当該Ｌサイズ生物の個体数を検査するものである。
【００３５】
図２は、Ｌサイズ生物の検査方法のフローを示す。
本実施の形態において、Ｌサイズ生物の検査は、撮像工程（Ｓ１）、二値化処理工程（Ｓ２）、ラベリング工程（Ｓ３）、輪郭追跡工程（Ｓ４）、サイズ判断工程（Ｓ５）、計数工程（Ｓ６）の各工程を経て行われる。
【００３６】
（１）撮像工程：Ｓ１
本工程では、バラスト水の検体をフィルターでろ過し、該フィルター上の微生物の画像をスキャナで取得する。
ここで、バラスト水中の微生物を予め蛍光染色剤、好ましくはカルセインＡＭで染色し、前記フィルター上の微生物の画像を蛍光スキャナで取得すれば、生細胞をもつ微生物を容易に判別することができる。
【００３７】
（２）二値化処理工程：Ｓ２
本工程では、前記撮像工程（Ｓ１）で取得した画像データの二値化処理を行い、二値画像を取得する。
ここで、図３は前記二値化処理により取得される二値画像のイメージを示す。図３における白又は黒の複数の四角は、それぞれ画素を示す。なお、図３において、微生物に対応する画素は白で示される。
【００３８】
（３）ラベリング工程：Ｓ３
本工程では、前記二値化処理工程（Ｓ２）で取得した二値画像の中から、ラスタスキャンなどの手法により微生物に対応する画素の領域を特定し、各々の画素の領域が区別できるようにラベリングを行う。
ここで、前記画素の領域は、画素値１の一つの画素が独立した一画素領域、又は画素値１の複数の画素が連結した連結領域のことである。
図３に示す例は、微生物に対応する画素の連結領域を示すものである。
【００３９】
（４）輪郭追跡工程：Ｓ４
本工程では、前記ラベリング工程（Ｓ３）で特定された画素の連結領域について、輪郭を構成する画素（輪郭画素）の一つを起点とし、該連結領域の輪郭を画素単位で追跡する。ここで、本実施の形態において輪郭とは、前記画素の連結領域の外輪郭を指す。
この時、前記起点となる第一輪郭画素は、例えばラスタスキャンにより特定することができる。また、前記輪郭の追跡は、連結画素の境界を求める４近傍追跡や８近傍追跡などの公知の手法により行うことができる。
【００４０】
図４は、図３に示す二値画像においてラスタスキャンにより第一輪郭画素を探索する例を示す。ラスタスキャンは、画像の左上を起点とし、左端から右に画素を調べ、右端に到達した後、行を１つ下がって左端から右に画素を調べることを順次繰り返す走査手法である。
また、図５（ａ）は前記４近傍追跡により輪郭を追跡する手法を、図５（ｂ）は前記８近傍追跡により輪郭を追跡する手法をそれぞれ示す。図５（ａ），（ｂ）に示す各近傍追跡は、それぞれ探索した輪郭画素Ｏを中心として、追跡方向から時計回りに図示する番号順に次の輪郭画素を探索する手法である。
【００４１】
本実施の形態では、画素の連結領域において、第一輪郭画素をラスタスキャンにより特定し、該第一輪郭画素から８近傍追跡により時計回りに順次輪郭画素を探索する。そして、当該輪郭の追跡は、探索した画素が前記第一輪郭画素であり、かつ次に探索する画素が探索済みの画素である場合に終了する。
図６は、図３に示す二値画像において、第一輪郭画素を輪郭Ｎｏ．（１）とし、輪郭画素の追跡順に輪郭番号（輪郭Ｎｏ．（２）〜Ｎｏ．（１６））を付したものである。
【００４２】
（５）サイズ判断工程：Ｓ５
本工程では、前記輪郭追跡工程（Ｓ４）で輪郭画素が特定された連結領域について、該連結領域に対応する微生物の最小サイズが５０μｍ以上か否かを判断する。
本実施の形態では、図６に示す二値画像において、前記輪郭Ｎｏ．（１）を起点画素Ａとし、当該起点画素Ａから二点Ｂ，Ｃを前記輪郭番号順に輪郭画素に沿って移動させる。
【００４３】
第一の点Ｂについては、輪郭Ｎｏ．（１）→Ｎｏ．（２）→Ｎｏ．（３）→・・・と時計回りに第一の方向に移動させる。また、第二の点Ｃについては、輪郭Ｎｏ．（１）→Ｎｏ．（１６）→Ｎｏ．（１５）→・・・と反時計回りに第二の方向に移動させる。
ここで、第二の点Ｃについては、前記第一の点Ｂを次の輪郭番号の画素に移動させる毎に、前記第一の点Ｂとの距離が前記５０μｍ未満の範囲で、前記輪郭番号順に前記第二の方向に連続して移動させる。また、前記第一の点Ｂとの距離が前記５０μｍ以上となる場合には、当該距離が前記５０μｍ未満となるまで、前記輪郭番号順に前記第一の方向に連続して移動させる。
【００４４】
そして、前記第一の点Ｂが前記輪郭番号順に輪郭画素を一巡し輪郭Ｎｏ．（１）の起点画素Ａに戻るまでの間に、前記第一の点Ｂと第二の点Ｃとが同じ輪郭番号の画素で交差した場合、即ち、前記輪郭画素のすべてを前記第一の点Ｂと第二の点Ｃの少なくともいずれかが通過した段階で該第一の点Ｂと第二の点Ｃとが一致した場合、前記連結領域は５０μｍのスリットを通過することができるとして、当該連結領域に対応する微生物の最小サイズが５０μｍ未満であると判断する。
【００４５】
一方、前記第一の点Ｂが、前記第二の点Ｃと同じ輪郭番号の画素で一致することなく前記輪郭画素を一巡し、輪郭Ｎｏ．（１）の起点画素Ａに戻れば、前記連結領域は長さ５０μｍのスリットを通過することができないとして、前記連結領域に対応する微生物の最小サイズが５０μｍ以上であると判断する。
【００４６】
（６）計数工程：Ｓ６
本工程では、前記サイズ判断工程（Ｓ５）で微生物の最小サイズが５０μｍ以上であると判断された前記画素の連結領域を順次計数する。本工程で計数された前記画素の連結領域の数が、本実施の形態において検査するＬサイズ生物の個体数となる。
【００４７】
以下、本実施の形態における微生物の「最小サイズ」の判断について、例に基づいて説明する。
【００４８】
（微生物の最小サイズを５０μｍ未満と判断する例）
図７は、画像処理を用いて微生物の最小サイズを判断するためのフローチャートを示す。また、図８〜１２は、図７に示すフローチャートを図３に示す二値画像へ適用する例を示す。図８〜図１２の各図とも（ａ）は二値画像のイメージを、（ｂ）は図６に示す輪郭番号に基づいて作成される輪郭リストを示す。
なお、本例において、Ｂ点とＣ点との間の距離（ＢＣ点間距離）は、各点が位置する画素中心間の距離とする。また、本例において、５０μｍは２．５画素とする。
【００４９】
まず、図８（ａ）に示すように、輪郭Ｎｏ．（１）を起点画素Ａと決定する。この時、Ｂ点及びＣ点は、ともに起点画素Ａ上に位置するため、図８（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離は０．０画素である。
【００５０】
次に、前記Ｂ点及びＣ点を前記輪郭番号順に移動させる。まず、図９に示すように、Ｂ点を輪郭Ｎｏ．（１）→Ｎｏ．（２）と時計回りに第一の方向に一画素移動させる。この場合、図９（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離は１．０画素であるから５０μｍ未満と判断し、次にＣ点を輪郭Ｎｏ．（１）→Ｎｏ．（１６）と反時計回りに第二の方向に一画素移動させる。そして、この場合、図１０（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離は１．４画素であるから５０μｍ未満と判断し、続けてＣ点を輪郭Ｎｏ，（１６）→Ｎｏ，（１５）と前記第二の方向に一画素移動させる。
【００５１】
その後、ＢＣ点間距離を５０μｍ以上と判断するまで、輪郭リストに従いＣ点を輪郭Ｎｏ．（１５）→Ｎｏ．（１４）→Ｎｏ．（１３）→・・・と前記第二の方向に連続して移動させる。そして、図１０に示すように、Ｃ点を輪郭Ｎｏ．（１２）に移動させた際、図１０（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離が３．２画素となり５０μｍ以上と判断すると、次に図１１に示すように、Ｃ点を輪郭Ｎｏ．（１２）→Ｎｏ．（１３）と、これまでとは逆に時計回りに第一の方向に一画素移動させる。そうすると、図１１（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離が２．２画素となるから５０μｍ未満と判断し、次にＢ点を輪郭Ｎｏ．（２）→Ｎｏ．（３）と前記第一の方向に一画素移動させる。
【００５２】
上記のようにＢ点とＣ点の移動を繰り返し、図１２に示すように、Ｂ点を輪郭Ｎｏ．（７）→Ｎｏ．（８）と前記第一の方向に一画素移動させる。この場合、図１２（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離を５０μｍ以上と判断するまで、Ｃ点を輪郭Ｎｏ．（１２）→Ｎｏ．（１１）→Ｎｏ．（１０）→Ｎｏ．（９）→Ｎｏ．（８）と前記第二の方向に連続して移動させる。
【００５３】
このように、本例ではＢ点及びＣ点が輪郭Ｎｏ．（８）の画素で一致する。したがって、本例において、図３に示す二値画像の連結領域に対応するプランクトンの最小サイズは５０μｍ未満であると判断する。
【００５４】
（微生物の最小サイズを５０μｍ以上と判断する例）
図１３は、本例において使用する二値画像のイメージを示す。図１３に示す二値画像は、輪郭追跡工程（Ｓ４）で探索した輪郭画素に、第一輪郭画素を輪郭Ｎｏ．（１）として追跡順に輪郭番号（輪郭Ｎｏ．（２）〜Ｎｏ．（１６））を付したものである。
また、図１４〜１８は、図７に示すフローを図１３に示す二値画像へ適用する例を示す。図１４〜図１８の各図とも（ａ）は二値画像のイメージを、（ｂ）は図１３に示す輪郭番号に基づいて作成される輪郭リストを示す。
なお、本例においても、ＢＣ点間距離は、各点が位置する画素中心間の距離であるものとする。また、本例においても、５０μｍは２．５画素とする。
【００５５】
まず、図１４（ａ）に示すように、輪郭Ｎｏ．（１）を起点画素Ａと決定する。この時、Ｂ点及びＣ点は、ともに起点画素Ａ上に位置するため、図１４（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離は０．０画素である。
【００５６】
次に、前記Ｂ点及びＣ点を前記輪郭番号順に移動させる、まず、図１５に示すように、Ｂ点を輪郭Ｎｏ．（１）→Ｎｏ．（２）と時計回りに第一の方向に一画素移動させる。この場合、図１５（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離は１．０画素であるから５０μｍ未満と判断し、次にＣ点を輪郭Ｎｏ．（１）→Ｎｏ．（１６）と反時計回りに第二の方向に一画素移動させる。そして、この場合、図１５（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離は１．４画素であるから５０μｍ未満と判断し、続けてＣ点を輪郭Ｎｏ．（１６）→Ｎｏ．（１５）と前記第二の方向に一画素移動させる。
【００５７】
その後、ＢＣ点間距離を５０μｍ以上と判断するまで、輪郭リストに従いＣ点を輪郭Ｎｏ．（１５）→Ｎｏ．（１４）→Ｎｏ．（１３）→・・・と前記第二の方向に連続して移動させる。そして、図１５に示すように、Ｃ点を輪郭Ｎｏ．（１２）に移動させた場合、図１５（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離が３．２画素となり５０μｍ未満でないと判断すると、次にＣ点を輪郭Ｎｏ．（１２）→Ｎｏ．（１３）と、これまでとは逆に時計回りに第一の方向に一画素移動させる。そうすると、ＢＣ点間距離が２．２画素となるから５０μｍ未満と判断し、次にＢ点を輪郭Ｎｏ．（２）→Ｎｏ．（３）と前記第一の方向に一画素移動させる。
【００５８】
上記のようにＢ点とＣ点の移動を繰り返し、図１６に示すように、Ｂ点を輪郭Ｎｏ．（４）→Ｎｏ．（５）と前記第一の方向に一画素移動させる。この場合、図１６（ｂ）の輪郭リストに示すように、Ｃ点は輪郭Ｎｏ．（１３）に位置しているから、ＢＣ点間距離が２．８画素となり５０μｍ以上と判断し、前記ＢＣ点間距離を５０μｍ未満と判断するまで、Ｃ点を輪郭Ｎｏ．（１３）→Ｎｏ．（１４）→Ｎｏ．（１５）→Ｎｏ．（１６）→Ｎｏ．（１）→Ｎｏ．（２）→Ｎｏ．（３）と第一の方向に連続して移動させる。
【００５９】
さらに、上記のようにしてＢ点とＣ点の移動を繰り返し、図１７に示すように、Ｂ点を輪郭Ｎｏ．（１５）→Ｎｏ．（１６）と前記第一の方向に一画素移動させる。この場合、図１７（ｂ）の輪郭リストに示すように、ＢＣ点間距離を５０μｍ未満と判断するまで、Ｃ点を輪郭Ｎｏ．（７）→Ｎｏ．（８）→Ｎｏ．（９）→Ｎｏ．（１０）→Ｎｏ．（１１）→Ｎｏ．（１２）→Ｎｏ．（１３）と第一の方向に連続して移動させる。
【００６０】
そして、図１８に示すように、Ｂ点を輪郭Ｎｏ．（１６）→Ｎｏ．（１）と前記第一の方向に一画素移動させる。
【００６１】
このように、本例では、Ｂ点及びＣ点が同じ輪郭番号の画素で交差することがないままに、該Ｂ点が輪郭画素を一巡し、輪郭Ｎｏ．（１）の起点画素Ａに戻る。したがって、本例において、図１３に示す二値画像の連結領域に対応する微生物の最小サイズは５０μｍ以上であると判断する。
【００６２】
なお、上記各例では、画像の連結領域の輪郭を、輪郭画素の中心を結ぶラインと仮定し、ＢＣ点間距離を、各点が位置する画素中心間の距離であるとしたが、前記連結領域の輪郭を、輪郭画素の最外郭にある頂点を結ぶラインと仮定し、ＢＣ点間距離を、各点が位置する画素の四隅の頂点を使った距離であるとすれば、より精度良く微生物の最小サイズを判断することが可能となる。
【００６３】
上記本発明の実施の形態は、微生物の平面形状が、二次元空間である長さ５０μｍのスリットを通過できないことにより、当該微生物の最小サイズが５０μｍ以上であると判断するものであるが、微生物の立体形状を特定できれば、該立体形状が二次元空間である直径５０μｍの円内を通過できないことにより、当該微生物の最小サイズが５０μｍ以上であると、より精度良く判断することができる。
【００６４】
なお、Ｌサイズ生物の検査は、上記実施の形態に限るものでなく、スキャナにより取得した微生物の画像を用いるものであれば、他の画像処理手法により微生物のサイズを判断するものであってもよい。
【００６５】
＜Ｓサイズ生物（最小サイズが１０μｍ以上５０μｍ未満の微生物）の検査＞
本実施の形態におけるＳサイズ生物の検査では、植物プランクトンの大多数がＳサイズ生物に区分され、動物プランクトンの大多数がＬサイズ生物に区分される特徴を利用し、Ｓサイズ生物が植物プランクトンであると仮定する。
そして、本実施の形態におけるＳサイズ生物の検査方法は、パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定により、バラスト水のサンプルに含まれる植物プランクトンの個体数を検査する。
【００６６】
パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定は公知の技術であり、例えば、ドイツＷalz社製のパルス変調クロロフィル蛍光測定器（Ｗａｔｅｒ−ＰＡＭ）を用いることで、前記バラスト水のサンプルに含まれる植物プランクトンの個体数を簡単に検査することができる。
【００６７】
ここで、クロロフィル蛍光とは、クロロフィル（光化学系II複合体に結合するクロロフィルａ）に測定光を照射した際、該クロロフィルが放出する蛍光である。
また、パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定とは、クロロフィル（光化学系II複合体に結合するクロロフィルａ）にパルス変調された測定光（Measuring beam）を照射した際に、該クロロフィルが放出する蛍光の中で、前記測定光に基づいて放出される蛍光を、他の光に基づいて放出される蛍光と区別して測定できる技術である。
【００６８】
図１９は、パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定の原理を示す。図２０は、クロロフィルに照射する光と蛍光強度の関係を示す。
本実施の形態におけるＳサイズ生物の検査では、まず、図１９（ａ）に示すように、バラスト水のサンプルにパルス変調された測定光を照射し、該測定光の照射により前記サンプルに含まれるクロロフィルが放出する最低限の蛍光強度Ｆｏを測定する。
【００６９】
次に、図１９（ｂ）に示すように、前記測定光が照射されている前記バラスト水のサンプルに強いパルス光（Flash)を照射し、該パルス光により前記クロロフィルが光合成に利用するエネルギーを飽和させることで、前記測定光の照射により前記クロロフィルが放出する最大限の蛍光強度Ｆｍを測定する。
【００７０】
そして、前記最低限の蛍光強度Ｆｏ及び最大限の蛍光強度Ｆｍの測定値から前記サンプルに含まれるクロロフィルの最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍ＝（Ｆｍ−Ｆｏ）／Ｆｍを算出し、前記最低限の蛍光強度Ｆｏ及び前記最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍと、予め設定された前記バラスト水のサンプルに含まれる植物プランクトンの個体数との関係に基づいて、前記バラスト水のサンプルに含まれる植物プランクトンの個体数を間接的に検査する。
【００７１】
ここで、前記最低限の蛍光強度Ｆｏ及び前記最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍと、前記バラスト水のサンプルに含まれる植物プランクトンの個体数との関係は、予め精緻な実験により求めておくことができる。
【００７２】
この点について、国際海事機関（ＩＭＯ）の文書（非特許文献１参照。）では、前記蛍光強度Ｆｏが２０以上、前記最大量子収率Ｆｖ／Ｆｍが０．３以上の条件を満たす場合、バラスト水のサンプルに含まれるＳサイズ生物の個体数は２０以上との関係づけを行っている。
【００７３】
なお、Ｓサイズ生物の検査は、上記実施の形態に限るものでなく、植物プランクトンの個体数を検査する他の方法や、スキャナにより取得した微生物の画像を用いる以外の他の適当な方法により個体数を検査するものであってもよい。
【００７４】
本実施の形態におけるバラスト水の検査方法は、Ｌサイズ生物については、スキャナを用いた簡便な方法により個体数を検査し、Ｓサイズ生物については、例えばパルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定などの他の適当な方法により、Ｌサイズ生物とＳサイズ生物を並行して検査することができるため、バラスト水に含まれるＬサイズ生物及びＳサイズ生物の個体数を短時間で精度良く検査することが出来る。
【００７５】
本発明は、上記実施の形態に限るものでなく発明の範囲を逸脱しない限りにおいて、その構成を適宜変更できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明のバラスト水の検査方法は、バラスト水に含まれるＬサイズ生物及びＳサイズ生物の個体数を短時間で精度良く検査できるものであり、極めて実用性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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