(57)【要約】【課題】パラゴムノキ根白腐病の早期発見のために、土壌や植物中に生息しているパラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラスを高感度かつ特異的に検出する方法の提供。【解決手段】微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのＩＴＳ領域中の特定の領域と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマーと、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのＩＴＳ領域中の特定の領域と特異的にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号４１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号４１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号４１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号４２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号４４で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号４４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号４４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号４３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
【請求項２】
前記フォワードプライマーが、配列番号４１で表される塩基配列を３’末端に有しており、前記リバースプライマーが、配列番号４３で表される塩基配列を３’末端に有している、請求項１に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
【請求項３】
検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号４１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号４１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号４１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号４２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号４４で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号４４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号４４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号４３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病の診断方法。
【請求項４】
（Ｆ１−１）配列番号４１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号４１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号４１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号４２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
【請求項５】
（Ｒ１−１）配列番号４４で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号４４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号４４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号４３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
【請求項６】
微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号４７で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号４７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号４７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号４８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号５０で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号５０で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号５０で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｐ２−１）配列番号５１で表される塩基配列、
（Ｐ２−２）配列番号５１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、又は
（Ｐ２−３）配列番号５１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
を含み、かつ蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとなるレポーター物質とアクセプターとなる消光物質とが結合したプローブと、
を用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行うことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
【請求項７】
前記フォワードプライマーが、配列番号４７で表される塩基配列を３’末端に有しており、前記リバースプライマーが、配列番号５０で表される塩基配列を３’末端に有している、請求項６に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
【請求項８】
検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号４７で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号４７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号４７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号４８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号５０で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号５０で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号５０で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｐ２−１）配列番号５１で表される塩基配列、
（Ｐ２−２）配列番号５１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、又は
（Ｐ２−３）配列番号５１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
を含み、かつ蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとなるレポーター物質とアクセプターとなる消光物質とが結合したプローブと、
を用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行い、前記レポーター物質由来の蛍光シグナルが検出された場合には前記土壌又は植物は前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病の診断方法。
【請求項９】
（Ｆ２−１）配列番号４７で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号４７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号４７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号４８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
【請求項１０】
（Ｒ２−１）配列番号５０で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号５０で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号５０で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
【請求項１１】
（Ｐ２−１）配列番号５１で表される塩基配列、
（Ｐ２−２）配列番号５１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、又は
（Ｐ２−３）配列番号５１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラス（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ）を特異的に検出し得るプライマー、並びに当該プライマーを用いてパラゴムノキ根白腐病菌を検出する方法、及びパラゴムノキ根白腐病を診断する方法に関する。  
【背景技術】
【０００２】
パラゴムノキ根白腐病は、原因菌であるリジドポラス・マイクロポラスが植物の根に感染することにより引き起こされる土壌病害の一種である（例えば、非特許文献１参照。）。病症が進行すると、感染した植物は枯れてしまう。特に、ゴムノキのプランテーションにおいては、最も深刻な土壌病害の１つであり、パラゴムノキ根白腐病の早期発見とパラゴムノキ根白腐病菌の防除が重要な課題となっている。しかし、現在のところ、立ち枯れ等の病徴が現れる前の早期にパラゴムノキ根白腐病を発見するための有効な手段は知られていない。
【０００３】
分子生物学的手法を利用して、感染が疑われる土壌や植物中に原因菌が存在しているか否かを調べることにより、早期に土壌病害を発見することができる。例えば特許文献１には、オイルパームの茎枯れ病の原因菌であるガノデルマ・ボニネンセ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ）を、リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）のＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ、）領域中のガノデルマ・ボニネンセに特異的な塩基配列を特異的に検出可能なプライマーを用いたＰＣＲを行うことによって検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−３１４１９９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S. Kaewchai, et.al., African Journal of Microbiology Research,  (2009) vol.3, pp.641-648.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、パラゴムノキ根白腐病の早期発見のために、土壌や植物中に生息しているパラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラスを高感度かつ特異的に検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、土中生息菌のｒＤＮＡ遺伝子群のＩＴＳ領域塩基配列のうち、パラゴムノキ根白腐病菌に特異的な領域の塩基配列を見出し、当該塩基配列を特異的に検出可能なプライマー又はプローブを設計し、当該プライマー又はプローブを用いて、検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ又はＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行うことにより、パラゴムノキ根白腐病菌を高感度かつ特異的に検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法、パラゴムノキ根白腐病の診断方法、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー、及びパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プローブを提供するものである。
（１）  微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号４１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号４１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号４１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号４２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号４４で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号４４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号４４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号４３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
（２）  前記フォワードプライマーが、配列番号４１で表される塩基配列を３’末端に有しており、前記リバースプライマーが、配列番号４３で表される塩基配列を３’末端に有している、前記（１）に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
（３）  検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）のいずれかを含むリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病の診断方法。
（４）  前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかを含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
（５）  前記（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）のいずれかを含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
（６）  微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号４７で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号４７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号４７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号４８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号５０で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号５０で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号５０で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｐ２−１）配列番号５１で表される塩基配列、
（Ｐ２−２）配列番号５１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、又は
（Ｐ２−３）配列番号５１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
を含み、かつ蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとなるレポーター物質とアクセプターとなる消光物質とが結合したプローブと、
を用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行うことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
（７）  前記フォワードプライマーが、配列番号４７で表される塩基配列を３’末端に有しており、前記リバースプライマーが、配列番号５０で表される塩基配列を３’末端に有している、前記（６）に記載のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法。
（８）  検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、前記（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）のいずれかを含むリバースプライマーと、前記（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）のいずれかを含み、かつ蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとなるレポーター物質とアクセプターとなる消光物質とが結合したプローブと、を用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行い、前記レポーター物質由来の蛍光シグナルが検出された場合には前記土壌又は植物は前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病の診断方法。
（９）  前記（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）のいずれかを含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
（１０）  前記（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）のいずれかを含むことを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー。
（１１）  前記（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）のいずれかを含み、かつ蛍光共鳴エネルギー移動のドナーとなるレポーター物質とアクセプターとなる消光物質とが結合していることを特徴とする、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プローブ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー又は検出用プローブ、及びこれらを用いたパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法により、感染が疑われる土壌や植物中に生息しているパラゴムノキ根白腐病菌リジドポラス・マイクロポラスを高感度かつ特異的に検出することができる。このため、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー及びパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法は、パラゴムノキ根白腐病の早期発見、診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域に基づいて作成した分子系統樹を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ｒＤＮＡのスキーム図（図２の上段）及び１４種類の土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域（５．８Ｓ  ｒＤＮＡを含む。）の塩基配列のアラインメント図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ｂのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、図２Ｃのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、図２Ｄのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、図２Ｅのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、図２Ｆのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、図２Ｇのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、図２Ｈのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、図２Ｉのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｋ】図２Ｋは、図２Ｊのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｌ】図２Ｌは、図２Ｋのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｍ】図２Ｍは、図２Ｌのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｎ】図２Ｎは、図２Ｍのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｏ】図２Ｏは、図２Ｎのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｐ】図２Ｐは、図２Ｏのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｑ】図２Ｑは、図２Ｐのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｒ】図２Ｒは、図２Ｑのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｓ】図２Ｓは、図２Ｒのアラインメント図の続きを示す。
【図２Ｔ】図２Ｔは、図２Ｓのアラインメント図の続きを示す。
【図３】図３は、実施例１における、単離された菌から抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例２における、人工汚染土壌（黒ボク土使用）から抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例２における、人工汚染土壌（くみあいニッピ園芸培土１号使用）から抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、実施例２における、人工汚染土壌（スーパーミックスＡ使用）から抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、実施例２における、汚染土壌から抽出されたＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図５】図５は、実施例３における、リアルタイムＰＣＲの各サイクル数（横軸）における蛍光強度（縦軸）を示した図である。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例４における、人工汚染土壌（黒ボク土使用）から抽出されたＤＮＡを鋳型として行ったリアルタイムＰＣＲの各サイクル数（横軸）における蛍光強度（縦軸）を示した図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例４における、人工汚染土壌（くみあいニッピ園芸培土１号使用）から抽出されたＤＮＡを鋳型として行ったリアルタイムＰＣＲの各サイクル数（横軸）における蛍光強度（縦軸）を示した図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例４における、人工汚染土壌（スーパーミックスＡ使用）から抽出されたＤＮＡを鋳型として行ったリアルタイムＰＣＲの各サイクル数（横軸）における蛍光強度（縦軸）を示した図である。
【図７】図７は、実施例５における、蛍光強度が３．４となった時点のサイクル数（Ｃｔ値）を縦軸に、添加したリジドポラス・マイクロポラスP.2.1.AB.1株のＤＮＡの濃度のＬｏｇ［ｎｇ／１０μＬ］値を横軸にして、３つの標準試料についてプロットした結果（標準曲線）を示した図であり、本発明の第２の検出方法における定量性を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜第１のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法＞
本発明の第１のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法（以下、「本発明の第１の検出方法」ということがある。）は、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域中のパラゴムノキ根白腐病菌に特異的な領域と特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて、微生物を含む試料から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする。当該試料中にパラゴムノキ根白腐病菌が存在していた場合には、ＰＣＲによってプライマー設計から期待される大きさのＰＣＲ産物が得られる。本発明においては、パラゴムノキ根白腐病菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズするプライマーをパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーとして用いることにより、パラゴムノキ根白腐病菌を特異的かつ高感度に検出することができる。
【００１２】
パラゴムノキ根白腐病菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズするプライマーを設計するために、本発明者らは、まず、パラゴムノキ根白腐病菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を調べた。具体的には、パラゴムノキ根白腐病にかかったパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が植えられているインドネシアの４つの圃場（Ｐ、ＫＰ、ＰＢ、ＳＲ）から土壌を採取し、これらの土壌からそれぞれ、パラゴムノキ根白腐病菌を単離した。この結果、インドネシアのＰの土壌から５株（P.2.3.A株、P2.5.A株、P.2.2.H株、P.2.6株、P.2.1.AB.1株）、ＫＰの土壌から２株（KP.2.1.C株、KP.2.5.A株）、ＰＢの土壌から２株（PB.260.A株、PB.260株）のリジドポラス・マイクロポラスが単離された。
【００１３】
各株のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を解析し、既知の土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列と比較した。土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域に基づいて作成した分子系統樹を図１に示す。リジドポラス・マイクロポラスとの比較対象として、リジドポラス・マイクロポラス以外の土中生息菌も用いた。比較対象の担子菌には、「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ」(ＮＣＢＩ（米国立生物工学情報センター）のアクセッション番号：ＡＹ５９３８６８)（配列番号５）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｃｏｒｔｉｃｏｌａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＤＱ８７３６４１）（配列番号６）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｃｕｎｅａｔｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＤＱ３８４５７５）（配列番号７）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｐｏｐｕｌｉｎｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＦ０１１１２１）（配列番号８）、「Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ２８６０６７）（配列番号９）、「Ｃａｌｖａｔｉａ  ｔｕｒｎｅｒｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＤＱ１１２５９６）（配列番号１０）、「Ｈａｎｄｋｅａ  ｆｕｍｏｓａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ８３３６５５）（配列番号１１）、「Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ  ｒｉｍｕｌａｔｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ８３３６６４）（配列番号１２）、「Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｕｂｉｎｃａｒｎａｔａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＪ２３７６２６）（配列番号１３）、「Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｒａｃｅｍｏｓａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ２７４３７５）（配列番号１４）、「Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ５２０１９２）（配  列番号１５）、「Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｐｐｌａｎａｔｕｍ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＲ６８６５５６) （配列番号１６）、「Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＭ２０８１５４）（配列番号１７）、「Ｃｏｎｏｃｙｂｅ  ｂｕｌｂｉｆｅｒa」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ９０７８２４）（配列番号１８）、「Ｃｏｎｏｃｙｂｅ  ｓｕｂｐｕｂｅｓｃｅｎｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ９０７８３３）（配列番号１９）、「Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ１８８４３５）（配列番号２０）、「Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｌａｓｃｉｖｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ３７７２０５）（配列番号２１）、「Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＧＵ０８０２３０）（配列番号２２）、「Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＲ８７８０８７）（配列番号２３）を使用した。比較対象の接合菌には、「Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＮ９４２８７９) （配列番号２４）、「Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ０１４６８５) （配列番号２５）、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂｉｎａｒｉａｅ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６５４０９０) （配列番号２６）を使用した。比較対象の��嚢菌には、「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６９４５００）（配列番号２７）、「Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ４９９６７６) （配列番号２８）、「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６９６９０６) （配列番号２９）、「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＮ５６１２６６）（配列番号３０）、「Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ７９３５４０）（配列番号３１）を使用した。また、土壌から単離した菌株として、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．  １Ａ−１株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２３）（配列番号３２）、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．  ＢＳＲＥ１Ａ．４＿１株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２４）（配列番号３３）、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．  ＢＳＲＥ１Ａ＿４株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２５）（配列番号３４）、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．  Ｐ．１．４株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２６）（配列番号３５）、「Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＴＢ．１．２株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２７）（配列番号３６）、「Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＴ．２．２株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７３１）（配列番号３７）、「Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐ．  ＳＴ．１．１株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２８）（配列番号３８）、「Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＳＲＥ１Ｂ＿１．１株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２９）（配列番号３９）、「Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＳＲＥ１Ｂ＿１株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７３０）（配列番号４０）を使用した。
【００１４】
図１に示すように、インドネシアの土壌中に生息するパラゴムノキパラゴムノキ根白腐病菌は、概ね分子系統的に１つであることがわかった。本願明細書の以降においては、代表株とし、P.2.1.AB.1株を用いた。
【００１５】
分子系統樹において、リジドポラス・マイクロポラスが１つのクラスターを形成することは、リジドポラス・マイクロポラスに特異的な塩基配列が存在すること、及びリジドポラス・マイクロポラスがクローナルな集団であることを意味する。そこで、新規に単離されたリジドポラス・マイクロポラス９株と、データベース上のマレーシア産リジドポラス・マイクロポラス３株と公知の土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を解析し、リジドポラス・マイクロポラスに特異的な塩基配列からなる領域を特定した。
【００１６】
図２Ａ〜２Ｔに、ｒＤＮＡのスキーム図（図２Ａの上段）及び４０菌株の土中生息菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域（ＩＴＳ−１領域からＩＴＳ−２領域まで。５．８Ｓ  ｒＤＮＡを含む。）の塩基配列のアラインメント図を示す（図２Ａの下段、図２Ｂ〜Ｔ）。４０菌株のうち、リジドポラス・マイクロポラスとしては、単離菌である「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ P.2.1.AB.1株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２２）（配列番号１）に加え、同種の対照菌株として、マレーシアで単離された「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ＦＲＩＭ６４２株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７０８）（配列番号２）、「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ＦＲＩＭ６４６株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７０９）（配列番号３）、及び「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ５９０株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７０６）（配列番号４）を使用した。また、リジドポラス・マイクロポラス以外の３６菌株は、図１で系統樹作成に使用した菌株を用いた。
【００１７】
ＰＣＲ産物の塩基対長が５０〜５００となるようにＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することによって、ＰＣＲ効率を高め、ＰＣＲ産物の検出を比較的容易に行うことができる。そこで、リジドポラス・マイクロポラスに特異的な領域の中から、互いの距離が５０〜５００塩基長程度となる２つの領域を選択し、それらの領域と特異的にハイブリダイズし得るプライマーを、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーとして設計した。具体的には、ＩＴＳ−１領域（１８Ｓ  ｒＤＮＡと５．８Ｓ  ｒＤＮＡの間のＩＴＳ）中の１箇所（Ｒｍｓｐ１領域）と、ＩＴＳ−２領域（５．８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡの間のＩＴＳ）中の１箇所（Ｒｍｓｐ２領域）を選択し、アンチセンス鎖のＲｍｓｐ１領域と特異的にハイブリダイズするプライマー（Ｒｍｓｐ１プライマー）をフォワードプライマーとして設計し、センス鎖のＲｍｓｐ２領域と特異的にハイブリダイズするプライマー（Ｒｍｓｐ２プライマー）をリバースプライマーとして設計した。当該２領域間の距離（当該領域を含む。）は４０２塩基長であった。図２Ａ〜２Ｔのアラインメントの上段に、Ｒｍｓｐ１領域及びＲｍｓｐ２領域をそれぞれ示した。また、図２Ａ上段のスキーム図中に、Ｒｍｓｐ１プライマー（図中、「Ｒｍｓｐ１」）及びＲｍｓｐ２プライマー（図中、「Ｒｍｓｐ２」）の位置も示した。表１に、Ｒｍｓｐ１領域のセンス鎖の塩基配列（配列番号４１）と、Ｒｍｓｐ１領域のアンチセンス鎖の塩基配列（配列番号４２）と、Ｒｍｓｐ２領域のセンス鎖の塩基配列（配列番号４３）と、Ｒｍｓｐ２領域のアンチセンス鎖の塩基配列（配列番号４４）と、をそれぞれ示す。
【００１８】
【表１】
2013198447.tif 000002
【００１９】
本発明においては、多種多様な土中生息菌の中からリジドポラス・マイクロポラスのみを特異的に精度よく検出することが重要である。このため、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー中のリジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域は、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
【００２０】
すなわち、本発明の第１の検出方法は、微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、アンチセンス鎖のＲｍｓｐ１領域と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマー（Ｒｍｓｐ１プライマー）と、センス鎖のＲｍｓｐ２領域と特異的にハイブリダイズするリバースプライマー（Ｒｍｓｐ２プライマー）とを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００２１】
フォワードプライマーとして用いられるＲｍｓｐ１プライマーは、具体的には、下記の（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ１−１）配列番号４１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号４１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号４１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号４２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００２２】
リバースプライマーとして用いられるＲｍｓｐ２プライマーは、具体的には、下記の（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ１−１）配列番号４４で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号４４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号４４で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号４３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００２３】
なお、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎｇーＡ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２４】
フォワードプライマーとして用いられるＲｍｓｐ１プライマーは、アンチセンス鎖のＲｍｓｐ１領域と特異的にハイブリダイズする領域以外にも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域を有していてもよい。例えば、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのＲｍｓｐ１領域及び当該領域に隣接する短い領域を含む領域とハイブリダイズするプライマーも、Ｒｍｓｐ１プライマーとして用いられる。具体的には、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域として、表２に示す配列番号４５で表される塩基配列又は当該塩基配列の配列番号４１で表される塩基配列を含む部分配列を有するプライマーが挙げられる。その他、配列番号４５で表される塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよく、配列番号４５で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列であってもよく、配列番号４５で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であってもよい。なお、配列番号４５で表される塩基配列は、Ｒｍｓｐ１領域の５塩基上流側からＲｍｓｐ１領域の５塩基下流側までを含む領域（Ｒｍｓｐ１＿ｌｏｎｇ領域）である。
【００２５】
リバースプライマーとして用いられるＲｍｓｐ２プライマーは、センス鎖のＲｍｓｐ２領域と特異的にハイブリダイズする領域以外にも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域を有していてもよい。例えば、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのＲｍｓｐ２領域及び当該領域に隣接する短い領域を含む領域とハイブリダイズするプライマーも、Ｒｍｓｐ２プライマーとして用いられる。具体的には、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域として、表２に示す配列番号４６で表される塩基配列又は当該塩基配列の配列番号４４で表される塩基配列を含む部分配列を有するプライマーが挙げられる。その他、配列番号４６で表される塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよく、配列番号４６で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列であってもよく、配列番号４６で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であってもよい。なお、配列番号４６で表される塩基配列は、アンチセンス鎖のＲｍｓｐ２領域の５塩基上流側からＲｍｓｐ２領域の５塩基下流側までを含む領域（Ｒｍｓｐ２＿ｌｏｎｇ領域（アンチセンス鎖））である。
【００２６】
【表２】
2013198447.tif 000003
【００２７】
より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるＲｍｓｐ１プライマーは、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号４１で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号４１で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。同様に、リバースプライマーとして用いられるＲｍｓｐ２プライマーは、前記（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号４４で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号４４で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。配列番号４１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、４０２塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００２８】
フォワードプライマーとして用いられるＲｍｓｐ１プライマー及びリバースプライマーとして用いられるＲｍｓｐ２プライマーは、いずれも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域の５’端側に、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとはハイブリダイズしないその他の塩基配列からなる領域を有していてもよい。当該その他の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列等、ＰＣＲプライマーに一般的に付加される塩基配列が挙げられる。
【００２９】
本発明の第１の検出方法に供される微生物を含む試料は、特に限定されるものではないが、パラゴムノキ根白腐病菌が含まれていることが期待される又はそのおそれのある試料であることが好ましく、土壌又は植物であることがより好ましい。
【００３０】
検査対象となる土壌又は植物は、土壌又は植物であれば特に限定されるものではない。パラゴムノキ根白腐病菌による土壌病害が大きな問題となっていることから、本発明においては、パラゴムノキ等のゴムノキや、ゴムノキの圃場の土壌を検査対象とすることが好ましい。なお、パラゴムノキ根白腐病菌は感染する植物の種類が限定されることはないため、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー及びこれらを用いたパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法が、ゴムノキ以外の植物や、ゴムノキ以外の植物が植えられている土壌に対しても有効であることは、言うまでもない。なお、検査対象である土壌又は植物からのＤＮＡの抽出及び精製は、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。
【００３１】
本発明の第１の検出方法は、特定のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーを用いる以外は、常法により実施することができる。すなわち、ＰＣＲに用いるポリメラーゼ、反応用バッファー、ｄＮＴＰ等の各種試薬は、当該技術分野で使用されている公知の試薬等を通常の態様で使用することができる。また、ＰＣＲの温度サイクル条件は、使用するポリメラーゼの特性及び用いるプライマーのＴｍ値等を考慮して適宜決定される。
【００３２】
また、ＰＣＲ産物の検出も、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。本発明の第１の検出方法では、Ｒｍｓｐ１プライマー及びＲｍｓｐ２プライマーを用いてＰＣＲを行うため、検査対象である土壌又は植物がパラゴムノキ根白腐病菌に汚染（感染）していた場合には、これらの土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合に、４００〜４５０塩基長程度という検出が容易な大きさのＰＣＲ産物を得ることができる。このため、例えば、電気泳動法等の汎用されている簡便な手法により、ＰＣＲ産物を検出することができる。
【００３３】
本発明の第１の検出方法により、パラゴムノキ根白腐病菌を高感度かつ特異的に検出することができる。このため、当該方法を用いることにより、実際に植えられている植物が立ち枯れ等の病徴を示す前に、当該植物又はそれが植えられている圃場の土壌がパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されているか否かを調べることができる。例えば、検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、Ｒｍｓｐ１プライマー及びＲｍｓｐ２プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られた場合には前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することができる。
【００３４】
＜第２のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法＞
本発明の第２のパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法（以下、「本発明の第２の検出方法」ということがある。）は、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域中の白根病原因菌に特異的な領域と特異的にハイブリダイズするプライマーと、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域中の白根病原因菌に特異的な領域と特異的にハイブリダイズし、かつ蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとなるレポーター物質及びアクセプターとなる消光物質が結合したプローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を用いて、微生物を含む試料から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型としてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行うことを特徴とする。当該試料中に白根病原因菌が存在していた場合には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲによって蛍光シグナルが検出される。本発明においては、白根病原因菌のｒＤＮＡのＩＴＳ領域と特異的にハイブリダイズするプライマー及びプローブを白根病原因菌の検出用プライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして用いることにより、白根病原因菌を特異的かつ高感度に検出することができる。
【００３５】
ｒＤＮＡのＩＴＳ領域中、最もリジドポラス・マイクロポラスへの特異性が高い領域をＰｒｏｂｅ領域と命名し、アンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズするプローブを設計し、当該プローブにＦＲＥＴのアクセプターとなる蛍光物質と、ドナーとなる蛍光物質又は消光物質とを結合させることによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを構築した。さらに、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域中、Ｐｒｏｂｅ領域よりも上流にあるリジドポラス・マイクロポラスへの特異性が高い領域を選択してｓｐＲｍ．Ｆｗ領域と命名し、アンチセンス鎖のｓｐＲｍ．Ｆｗ領域と特異的にハイブリダイズするプライマー（ｓｐＲｍ．Ｆｗプライマー）をフォワードプライマーとして設計した。同様に、ｒＤＮＡのＩＴＳ領域中、Ｐｒｏｂｅ領域よりも下流にあるリジドポラス・マイクロポラスへの特異性が高い領域を選択してｓｐＲｍ．Ｒｖ領域と命名し、センス鎖のｓｐＲｍ．Ｒｖ領域と特異的にハイブリダイズするプライマー（ｓｐＲｍ．Ｒｖプライマー）をリバースプライマーとして設計した。
【００３６】
図２Ａ〜２Ｔのアラインメントの上段に、Ｐｒｏｂｅ領域、ｓｐＲｍ．Ｆｗ領域及びｓｐＲｍ．Ｒｖ領域をそれぞれ示した。また、表３に、ｓｐＲｍ．Ｆｗ領域のセンス鎖の塩基配列（配列番号４７）と、ｓｐＲｍ．Ｆｗ領域のアンチセンス鎖の塩基配列（配列番号４８）と、ｓｐＲｍ．Ｒｖ領域のセンス鎖の塩基配列（配列番号４９）と、ｓｐＲｍ．Ｒｖ領域のアンチセンス鎖の塩基配列（配列番号５０）と、Ｐｒｏｂｅ領域のセンス鎖の塩基配列（配列番号５１）と、をそれぞれ示す。
【００３７】
【表３】
2013198447.tif 000004
【００３８】
本発明の第１の検出方法と同様に、本発明の第２の検出方法においても、多種多様な土中生息菌の中からリジドポラス・マイクロポラスのみを特異的に精度よく検出することが重要である。このため、パラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ中のリジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域は、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
【００３９】
すなわち、本発明の第２の検出方法は、微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、アンチセンス鎖のｓｐＲｍ．Ｆｗ領域と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマー（ｓｐＲｍ．Ｆｗプライマー）と、センス鎖のｓｐＲｍ．Ｒｖ領域と特異的にハイブリダイズするリバースプライマー（ｓｐＲｍ．Ｒｖプライマー）と、アンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズするＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとを用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００４０】
本発明の第２の検出方法において用いられるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、アンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに、ＦＲＥＴのドナーとなるレポーター物質と、アクセプターとなる消光物質とを結合させて得られる。レポーター物質としては蛍光物質が、消光物質としては、アクセプターとなる物質の吸収スペクトルが蛍光放出スペクトルと重なる蛍光物質やダーククエンチャーが用いられる。レポーター物質となる蛍光物質や、消光物質となる蛍光物質及びダーククエンチャーは、ＦＲＥＴを利用した各種手法において用いられている蛍光物質及びダーククエンチャーの中から、検出装置等を考慮して適宜選択して用いることができる。例えば、レポーター物質としてフルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等を用い、消光物質としてＤＡＢＣＹＬ等のダーククエンチャーやテトラメチルローダミン等を用いることができる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲにおいて、蛍光シグナルのノイズを低くすることができるため、消光物質としてはダーククエンチャーを用いることが好ましい。
【００４１】
ドナーとなる物質及びアクセプターとなる物質は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに結合している状態で互いに充分に近接しており、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により加水分解された際に、互いに解離されるような態様で、アンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに結合させていればよく、当該オリゴヌクレオチド中のいずれの位置に結合させてもよい。例えば、当該オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれか一方にドナーとなる物質を結合させ、他方にアクセプターとなる物質を結合させることができる。当該オリゴヌクレオチドにドナーとなる物質及びアクセプターとなる物質を結合する方法は、特に限定されるものではなく、オリゴヌクレオチドに蛍光標識する際に通常用いられる化学合成方法により結合させることができる。
【００４２】
アンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、具体的には、下記の（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｐ２−１）配列番号５１で表される塩基配列、
（Ｐ２−２）配列番号５１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、又は
（Ｐ２−３）配列番号５１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列。
【００４３】
本発明の第２の検出方法においてフォワードプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｆｗプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ２−１）配列番号４７で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号４７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号４７で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号４８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４４】
本発明の第２の検出方法においてリバースプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｒｖプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ２−１）配列番号５０で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号５０で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号５０で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４５】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、アンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズする領域以外にも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域を有していてもよい。例えば、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのＰｒｏｂｅ領域及び当該領域に隣接する短い領域を含む領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにレポーター物質と消光物質とを結合させたものも、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして用いられる。具体的には、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域として、表４に示す配列番号５４で表される塩基配列又は当該塩基配列の配列番号５１で表される塩基配列を含む部分配列を有するプライマーが挙げられる。その他、配列番号５４で表される塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよく、配列番号５４で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列であってもよい。なお、配列番号５４で表される塩基配列は、Ｐｒｏｂｅ領域の５塩基上流側からＰｒｏｂｅ領域の５塩基下流側までを含む領域（Ｐｒｏｂｅ＿ｌｏｎｇ領域）である。
【００４６】
フォワードプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｆｗプライマーは、アンチセンス鎖のｓｐＲｍ．Ｆｗ領域と特異的にハイブリダイズする領域以外にも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域を有していてもよい。例えば、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのｓｐＲｍ．Ｆｗ領域及び当該領域に隣接する短い領域を含む領域とハイブリダイズするプライマーも、ｓｐＲｍ．Ｆｗプライマーとして用いられる。具体的には、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域として、表４に示す配列番号５２で表される塩基配列又は当該塩基配列の配列番号４７で表される塩基配列を含む部分配列を有するプライマーが挙げられる。その他、配列番号５２で表される塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよく、配列番号５２で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列であってもよく、配列番号５２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であってもよい。なお、配列番号５２で表される塩基配列は、ｓｐＲｍ．Ｆｗ領域の５塩基上流側からｓｐＲｍ．Ｆｗ領域の５塩基下流側までを含む領域（ｓｐＲｍ．Ｆｗ＿ｌｏｎｇ領域）である。
【００４７】
リバースプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｒｖプライマーは、センス鎖のｓｐＲｍ．Ｒｖ領域と特異的にハイブリダイズする領域以外にも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域を有していてもよい。例えば、リジドポラス・マイクロポラスのｒＤＮＡのｓｐＲｍ．Ｒｖ領域及び当該領域に隣接する短い領域を含む領域とハイブリダイズするプライマーも、ｓｐＲｍ．Ｒｖプライマーとして用いられる。具体的には、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域として、表４に示す配列番号５３で表される塩基配列又は当該塩基配列の配列番号５０で表される塩基配列を含む部分配列を有するプライマーが挙げられる。その他、配列番号５３で表される塩基配列において１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であってもよく、配列番号５３で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列であってもよく、配列番号５３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であってもよい。なお、配列番号５３で表される塩基配列は、ｓｐＲｍ．Ｒｖ領域の５塩基上流側からｓｐＲｍ．Ｒｖ領域の５塩基下流側までを含む領域（ｓｐＲｍ．Ｒｖ＿ｌｏｎｇ領域）である。
【００４８】
【表４】
2013198447.tif 000005
【００４９】
より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｆｗプライマーは、配列番号４７で表される塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号４７で表される塩基配列のみであることがより好ましい。同様に、リバースプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｒｖプライマーは、配列番号５０で表される塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号５０で表される塩基配列のみであることがより好ましい。また、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が前記（Ｐ２−１）〜（Ｐ２−３）のいずれかの塩基配列のみであることが好ましく、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号５１で表される塩基配列のみであることがより好ましい。
【００５０】
本発明の第１の検出方法と同様に、本発明の第２の検出方法においても、フォワードプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｆｗプライマー及びリバースプライマーとして用いられるｓｐＲｍ．Ｒｖプライマーは、いずれも、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域の５’端側に、リジドポラス・マイクロポラスの染色体ＤＮＡとはハイブリダイズしないその他の塩基配列からなる領域を有していてもよい。当該その他の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列等、ＰＣＲプライマーに一般的に付加される塩基配列が挙げられる。
【００５１】
本発明の第２の検出方法では、前記のフォワードプライマー、リバースプライマー、及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて、検査対象である試料から抽出されたＤＮＡを鋳型としてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行う。検査対象である試料に白根病原因菌が含まれていた場合には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲのアニーリング工程において白根病原因菌由来のゲノムＤＮＡ中のＰｒｏｂｅ領域にＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブがハイブリダイズし、その後のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程において、ゲノムＤＮＡにハイブリダイズしていたＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、消光物質から切り離されたレポーター物質から蛍光が発される。つまり、検査対象である試料に白根病原因菌が含まれていた場合には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲによってレポーター物質由来の蛍光シグナルが検出される。検査対象である試料に白根病原因菌が含まれていなかった場合には、蛍光シグナルは検出されない。
【００５２】
ＰＣＲのサイクルが少なすぎる場合には、レポーター物質から発される蛍光が弱く、蛍光シグナルが検出できない。一方、ＰＣＲのサイクルが多くなりすぎると、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的な加水分解反応が起こり、検査対象である試料に白根病原因菌が含まれていなかった場合にも蛍光シグナルが検出されてしまうおそれがある。そこで、所定のサイクルが経過した時点における蛍光シグナルの検出の有無により、白根病原因菌が検出されたか否かを判断することも好ましい。例えば、３０サイクル目までに蛍光シグナルが検出された場合には、検査対象である試料に白根病原因菌が含まれていた、と判断することができる。
【００５３】
本発明の第２の検出方法は、特定の白根病原因菌の検出用プライマー及びプローブを用いる以外は、常法により実施することができる。すなわち、ＰＣＲに用いるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、反応用バッファー、ｄＮＴＰ等の各種試薬は、当該技術分野で使用されている公知の試薬等を通常の態様で使用することができる。また、ＰＣＲの温度サイクル条件は、用いるプライマーのＴｍ値等を考慮して適宜決定される。なお、蛍光シグナルの検出は、エンドポイントで検出してもよく、リアルタイムに検出してもよい。リアルタイムＰＣＲ装置を用いることにより、より簡便に蛍光シグナルを検出できる。
【００５４】
本発明の第２の検出方法に供される微生物を含む試料は、本発明の第１の検出方法に供される微生物を含む試料として挙げられたものを用いることができる。
【００５５】
本発明の第２の検出方法により、パラゴムノキ根白腐病菌を高感度かつ特異的に検出することができる。このため、当該方法を用いることにより、実際に植えられている植物が立ち枯れ等の病徴を示す前に、当該植物又はそれが植えられている圃場の土壌がパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されているか否かを調べることができる。例えば、検査対象である土壌又は植物から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、ｓｐＲｍ．Ｆｗプライマー、ｓｐＲｍ．Ｒｖプライマー、及びアンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにＦＲＥＴのドナーとなるレポーター物質とアクセプターとなる消光物質とが結合したプローブとを用いてＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを行い、前記レポーター物質由来の蛍光シグナルが検出された場合には、前記土壌又は植物はパラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていると診断することができる。
【００５６】
なお、パラゴムノキ根白腐病菌は、ＤＧＧＥ法（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）によっても検出することができる。具体的には、検査対象である土壌又は植物からＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型としてＧＣクランプのついたプライマーを用いてＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ産物を尿素やホルムアミド等の変性剤の濃度勾配をつけたゲル中で電気泳動し、バンドの泳動度やそのパターンを調べる。
【実施例】
【００５７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５８】
以下の実施例においては、ジャガイモ煎汁寒天（ＰＳＡ）培地上で培養した菌体を培地ごと１ｃｍ四方切り出し、これに０．１５ｇの土壌を加えたものを、人工汚染土壌とした。
また、土壌からのＤＮＡの抽出は、圃場の土壌０．２５ｇから、ＦａｓｔＤＮＡ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ（ＭＰ Ｂｉｏ社）を用いて行った。抽出はキットに付属の説明書通り実施した。但し、人工汚染土壌から抽出する場合、人工汚染土壌に予め２００μＬの１０％スキムミルク溶液を添加し、かつ、当該スキムミルク溶液を添加した分だけＳｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒの添加量を減らして行った。
単離された菌からのＤＮＡの抽出は、Ｓａｉｔｏｈらの方法（Journal  of  General  Plant  Pathology，2006，Vol.72，p348−350.）に従って行った。鋳型には、ＰＳＡ培地上で約１週間培養した菌糸体５ｃｍ四方を用いた。
【００５９】
［実施例１］
分離された各種微生物から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として、本発明の第１の検出方法を行った。フォワードプライマーとして配列番号４１で表される塩基配列からなるプライマー（Ｒｍｓｐ１（０）プライマー）を、リバースプライマーとして配列番号４４で表される塩基配列からなるプライマー（Ｒｍｓｐ２（０）プライマー）を用いてＰＣＲを行った。
ポジティブコントロールとして、リジドポラス・マイクロポラスP.2.1.AB.1株の培養物から抽出されたＤＮＡを用い、ネガティブコントロールとして、「Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＧＵ０８０２３０）、「Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＲ８７８０８７）、「Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ５２０１９２）、「Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ２８６０６７）、「Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＮ９４２８７９)、「Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ０１４６８５)、「Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ７９３５４０）、「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６９４５００）、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．  １Ａ−１株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２３）の培養物から抽出されたＤＮＡを用いた。
具体的には、まず、２０ｎｇの鋳型ＤＮＡに、２．０μＬのバッファー（タカラバイオ社製）、１．６μＬのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）（タカラバイオ社製）、８ｐＭのＲｍｓｐ１（０）プライマー、８ｐＭのＲｍｓｐ２（０）プライマー、及び０．５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を添加し、さらに適量の水を添加して２０μＬの反応溶液を調製した。当該反応溶液をＰＣＲ装置（Ｄｉｃｅ、タカラバイオ社製）にセットし、９４℃で３０秒間の変性工程後、１サイクルが９４℃で３０秒間、６７℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の伸長工程を行う温度条件で、ＰＣＲを行った。また、鋳型ＤＮＡに代えて等量の水を添加し、同様にＰＣＲを行った。
【００６０】
ＰＣＲ後の各反応液を、１．５％のアガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図３に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。図３中、レーン１はリジドポラス・マイクロポラスP.2.1.AB.1株由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン２はＳｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン３はＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン４はＰｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン５はＬｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン６はＭｕｃｏｒ  ｓｐ．由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン７はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン８はＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン９はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン１０はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．１Ａ−１由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン１１は鋳型ＤＮＡ無添加の反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。この結果、レーン１にのみ４００塩基対長付近に１本のバンドが検出され、約４００塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。その他のレーンでは全くバンドは検出されなかったことから、ＰＣＲ産物が得られなかったことがわかった。これらの結果から、Ｒｍｓｐ１（０）プライマー及びＲｍｓｐ２（０）プライマーを用いた本発明の第１の検出方法により、パラゴムノキ根白腐病菌を特異的に検出できることがわかった。
【００６１】
［実施例２］
本発明の第１の検出方法により、ＰＳＡ培地上で培養した各菌株を滅菌土壌に混ぜた人工汚染土壌、パラゴムノキ根白腐病菌に汚染されている土壌からパラゴムノキ根白腐病菌を検出した。人工汚染土壌の調整法は既述の通りである。また、滅菌土壌としては、黒ボク土、くみあいニッピ園芸培土１号（日本肥糧社製）、及びスーパーミックスＡ（サカタのタネ社製）の３種類をそれぞれ用いた。
一方、パラゴムノキ根白腐病菌に汚染されている土壌としては、生えているパラゴムノキに立ち枯れ等のパラゴムノキ根白腐病の病徴が観察されたため、パラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていることが確認されている４つのインドネシアの汚染圃場（ＰＢ．２６０．Ｂ、ＳＲ．２、ＭＤＵ．２４、ＭＤＩ．２９）から採取された土壌を用いた。
次いで、各土壌からそれぞれＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、ＰＣＲ後の各反応液をアガロースゲル電気泳動した後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。
【００６２】
図４Ａ〜Ｄに、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。図４Ａ〜Ｃ中、レーン１はリジドポラス・マイクロポラスP.2.1.AB.1株を添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン２はＳｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉを添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン３はＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉを添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン４はＰｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉを添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン５はＬｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓを添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン６はＭｕｃｏｒ  ｓｐ．を添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン７はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．を添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン８はＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓを添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン９はＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍを添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン１０はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．１Ａ−１を添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン１１は鋳型ＤＮＡ無添加の反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。この結果、レーン１のみで４００塩基対長付近に１本のバンドが検出され、約４００塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。また、図４Ｄ中、レーン１は汚染土壌ＰＢ．２６０．Ｂ由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン２は汚染土壌ＳＲ．２由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン３は汚染土壌ＭＤＵ．２４由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン４は汚染土壌ＭＤＩ．２９由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液、レーン５は鋳型ＤＮＡ無添加の反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。この結果、レーン１〜３では４００塩基対長付近に１本のバンドが検出され、約４００塩基対長のＰＣＲ産物が得られたことが確認された。以上の結果から、Ｒｍｓｐ１（０）プライマー及びＲｍｓｐ２（０）プライマーを用いた本発明の第１の検出方法により、パラゴムノキ根白腐病の汚染土壌中のパラゴムノキ根白腐病菌を検出できることが確認された。一方で、図４Ｄにおけるレーン４では全くバンドは検出されなかったことから、汚染土壌ＭＤＩ．２９はパラゴムノキ根白腐病菌以外の病原菌により汚染されており、当該圃場に生えているパラゴムノキは、パラゴムノキ根白腐病ではなく、病徴の類似したその他の病であることが示唆された。
【００６３】
［実施例３］
分離された各種微生物から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として、本発明の第２の検出方法を行った。フォワードプライマーとして配列番号４７で表される塩基配列からなるプライマー（ｓｐＲｍ．Ｆｗ（０）プライマー）を、リバースプライマーとして配列番号５０で表される塩基配列からなるプライマー（ｓｐＲｍ．Ｒｖ（０）プライマー）を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして配列番号５１で表される塩基配列からなり、５’末端にＦＡＭ色素を結合させ、３’末端に非蛍光クエンチャーとＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ）を結合させたオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎ（登録商標）（０）プローブ）を用いた。
ポジティブコントロールとして、リジドポラス・マイクロポラスP.2.1.AB.1株の培養物から抽出されたＤＮＡを用い、ネガティブコントロールとして、「Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＧＵ０８０２３０）、「Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＲ８７８０８７）、「Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ５２０１９２）、「Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ２８６０６７）、「Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＮ９４２８７９)、「Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ０１４６８５)、「Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ７９３５４０）、「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６９４５００）、「Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．  １Ａ−１株」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２３）の培養物から抽出されたＤＮＡを用いた。
【００６４】
具体的には、まず、２０ｎｇの鋳型ＤＮＡに、２５μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （２Ｘ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、４５ｐＭのｓｐＲｍ．Ｆｗ（０）プライマー、４５ｐＭのｓｐＲｍ．Ｒｖ（０）プライマー、１２．５ｐＭのＴａｑＭａｎ（登録商標）（０）プローブを添加し、さらに適量の水を添加して５０μＬの反応溶液を調製した。当該反応溶液をリアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし、５０℃で２分間のＵＮＧ活性化工程後、９５℃で１０分間、１サイクルが９５℃で１５秒間、６２℃で１分間を４０サイクル行った。また、鋳型ＤＮＡに代えて等量の水を添加し、同様にＰＣＲを行った。
【００６５】
図５に、リアルタイムＰＣＲにおいて、各サイクル数における蛍光強度を示す。この結果、リジドポラス・マイクロポラス株の染色体ＤＮＡを鋳型とした反応溶液では、カーブが大きく上がっており、３０サイクル目で蛍光シグナルが検出された。これに対して、鋳型ＤＮＡを添加しなかった反応溶液では４０サイクル目でも蛍光シグナルは検出されなかった。また、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ、Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．１Ａ−１株由来の染色体ＤＮＡを鋳型とした反応溶液では、いずれも３０サイクル目では全く蛍光シグナルは検出されなかった。これらの結果から、ｓｐＲｍ．Ｆｗプライマー、ｓｐＲｍ．Ｒｖプライマー、及びアンチセンス鎖のＰｒｏｂｅ領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにＦＲＥＴのドナーとなるレポーター物質とアクセプターとなる消光物質とが結合したプローブを用いることにより、リジドポラス・マイクロポラスを特異的に検出可能であることが確認された。
【００６６】
［実施例４］
本発明の第２の検出方法により、実施例３で用いた各菌株をＰＳＡ培地上で培養したものを滅菌土壌に混ぜた人工汚染土壌から、パラゴムノキ根白腐病菌を検出した。人工汚染土壌の調整法は既述の通りである。また、滅菌土壌としては、黒ボク土、くみあいニッピ園芸培土１号（日本肥糧社製）、及びスーパーミックスＡ（サカタのタネ社製）の３種類をそれぞれ用いた。
次いで、各土壌からそれぞれＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型として、実施例３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。
【００６７】
図６Ａ〜Ｃに、リアルタイムＰＣＲにおいて、各サイクル数における蛍光強度を示す。この結果、人工汚染土壌の作製に用いた滅菌土壌の種類にかかわらず、リジドポラス・マイクロポラスP.2.1.AB.1株を添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液では、カーブが大きく上がっており、３０サイクル目で蛍光シグナルが検出された。これに対して、その他の菌株を添加した人工汚染土壌由来のＤＮＡを鋳型とした反応溶液では、いずれも３０サイクル目では全く蛍光シグナルは検出されなかった。
【００６８】
［実施例５］
本発明の第２の検出方法により、土壌からパラゴムノキ根白腐病菌を検出した。試料は、生えているパラゴムノキに立ち枯れ等のパラゴムノキ根白腐病の病徴が観察されたため、パラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていることが確認されている３つのインドネシアの汚染圃場（ｍｉ３、ｍｉ４、ｍｉ６）と、生えているパラゴムノキにパラゴムノキ根白腐病の病徴が観察されていないため、パラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていないことが確認されているインドネシアの２つの健全圃場（ｍｈ．８、ｍｈ．９）から、それぞれ採取された土壌を用いた。
【００６９】
各土壌からそれぞれＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型として、実施例３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行った。また、標準試料として、パラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていない土壌から抽出されたＤＮＡに、リジドポラス・マイクロポラスP.2.1株の培養物から抽出されたＤＮＡを０．１ｎｇ／１０μＬ（Ｐ．２．１−０．１）、１ｎｇ／１０μＬ（Ｐ．２．１−１）、又は１０ｎｇ／１０μＬ（Ｐ．２．１−１０）添加したものを鋳型ＤＮＡとして用いた。ネガティブコントロールとして、パラゴムノキ根白腐病菌に汚染されていない土壌から抽出されたＤＮＡに、健全圃場から採取された土壌より単離したＰｕｒｗａｋａｒｔａの培養物から抽出されたＤＮＡをそれぞれ１０ｎｇ／１０μＬ添加したものを鋳型ＤＮＡとして用いた（ｐｈ．ｐｒ．２５５）。さらに、鋳型ＤＮＡに代えて等量の水を添加し、同様にリアルタイムＰＣＲを行った（Ｗａｔｅｒ）。
【００７０】
各反応溶液について、蛍光強度が３．４となった時点のサイクル数（Ｃｔ値）を表５に示す。この結果、汚染圃場から抽出されたＤＮＡを鋳型とした場合には、ほぼ３５サイクル目には蛍光シグナルが観察されていた。これに対して、鋳型ＤＮＡを添加しなかった場合や健全圃場から抽出されたＤＮＡ（ｍｈ８、ｍｈ９、Ｐｈ．ｐｒ．２５５）を鋳型とした場合には、４０サイクル目まで蛍光シグナルは検出されなかった。
【００７１】
また、３つの標準試料についての反応溶液中のリジドポラス・マイクロポラスP.2.1株のＤＮＡの濃度と蛍光強度の関係を図７に示す。蛍光強度が３．４となった時点のＣｔ値を縦軸に、添加したリジドポラス・マイクロポラスP.2.1株のＤＮＡの濃度のＬｏｇ［ｎｇ／１０μＬ］値を横軸にして、３つの標準試料についてプロットした結果（標準曲線）である。図中のプロットは、左から０．１ｎｇ／１０μＬ、１ｎｇ／１０μＬ、又は１０ｎｇ／１０μＬの結果である。ＤＮＡ濃度が低いほどＣｔ値は大きくなり、標準曲線は線形となった。この結果から、本発明の第２の検出方法により、リジドポラス・マイクロポラスを定量的に検出できることが明らかである。
【００７２】
図７で得られた標準曲線に基づいて、蛍光強度が３．４となった時点のＣｔ値から、各反応溶液のリジドポラス・マイクロポラスの濃度を算出した。算出結果を表５に示す。表５中、「Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ」は４０サイクル目でも蛍光強度が設定した閾値に達しなかったことを意味する。Ｃｔ値が小さいｍｉ４及びｍｉ６汚染圃場由来のＤＮＡには、リジドポラス・マイクロポラスの含有濃度が高かった。
【００７３】
【表５】
2013198447.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００７４】
パラゴムノキ根白腐病は産業上有用な植物、特にゴムノキにおいて重大な土壌病害であり、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマーや検出用プローブ、及びこれらを用いたパラゴムノキ根白腐病菌の検出方法は、パラゴムノキ根白腐病の早期発見や予防に有効である。よって、本発明のパラゴムノキ根白腐病菌の検出用プライマー等は、特にパラゴムノキ等のゴムノキの栽培の分野で有用である。
【図１】
2013198447.tif 000007
【図２Ａ】
2013198447.tif 000008
【図２Ｂ】
2013198447.tif 000009
【図２Ｃ】
2013198447.tif 000010
【図２Ｄ】
2013198447.tif 000011
【図２Ｅ】
2013198447.tif 000012
【図２Ｆ】
2013198447.tif 000013
【図２Ｇ】
2013198447.tif 000014
【図２Ｈ】
2013198447.tif 000015
【図２Ｉ】
2013198447.tif 000016
【図２Ｊ】
2013198447.tif 000017
【図２Ｋ】
2013198447.tif 000018
【図２Ｌ】
2013198447.tif 000019
【図２Ｍ】
2013198447.tif 000020
【図２Ｎ】
2013198447.tif 000021
【図２Ｏ】
2013198447.tif 000022
【図２Ｐ】
2013198447.tif 000023
【図２Ｑ】
2013198447.tif 000024
【図２Ｒ】
2013198447.tif 000025
【図２Ｓ】
2013198447.tif 000026
【図２Ｔ】
2013198447.tif 000027
【図５】
2013198447.tif 000028
【図６Ａ】
2013198447.tif 000029
【図６Ｂ】
2013198447.tif 000030
【図６Ｃ】
2013198447.tif 000031
【図７】
2013198447.tif 000032
【図３】
2013198447.tif 000033
【図４Ａ】
2013198447.tif 000034
【図４Ｂ】
2013198447.tif 000035
【図４Ｃ】
2013198447.tif 000036
【図４Ｄ】
2013198447.tif 000037
【配列表】
2013198447000001.app